(57)【要約】      （修正有）【課題】高質量のタンパク質をはじめとする生体高分子化合物の質量分析のためのイオン化法を提供する。【解決手段】アミノ酸，ペプチド，たんぱく質，核酸あるいは糖およびその他の物質（生体分子化合物）について、複数の電荷を有する官能基、即ちプローブ、を温和な条件で多数付加することにより生体高分子の１価または２価以上の多価イオンを生成し、質量分析に供する。プローブは、ｃｈａｒｇｅｄ−ｓｉｔｅとｌｉｎｋｅｒとａｎｃｈｏｒｉｎｇ−ｓｉｔｅの３部分から構成され、これらは共有結合により連結されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸，ペプチド，たんぱく質，核酸あるいは糖およびその他の物質（生体分子化合物）についての、次式（１）
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（式（１）中のｃｈａｒｇｅｄ−ｓｉｔｅは種類及び価数を自在に変えることができる金属と配位子からなる錯体を示し、ｌｉｎｋｅｒは長さを自在に調整できる炭化水素鎖，含酸素炭化水素鎖，含窒素炭化水素鎖または含硫黄炭化水素鎖を示し、ａｎｃｈｏｒｉｎｇ−ｓｉｔｅは生体分子化合物の特定の構造または官能基に選択的に結合する構造を有するものを示し、これらは共有結合により連結されていることを示す。）で表される、電荷を有する官能基（プローブ）を１個以上付加することによりイオン化することを特徴とする、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブを生体分子化合物に２個以上付加し、このものと結合する金属を介して連結することで生じる、生体分子化合物多量体についての、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項３】
請求項１に記載のプローブを２種類以上の生体分子化合物にそれぞれ１個以上付加し、これらと結合する金属を介して連結することで生じる、生体分子化合物複合体についての、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項４】
請求項１に記載のプローブを生体分子化合物とともに低分子化合物にも１個以上付加し、これらと結合する金属を介して連結することで生じる、生体分子化合物−低分子化合物複合体についての、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項５】
生体分子化合物が、リジン残基或いはアルギニン残基を含むペプチド或いはたんぱく質である、請求項１ないし４に記載の１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項６】
プローブを構成する金属が遷移金属である、請求項１ないし５に記載の１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項７】
質量分析（ＭＳ）法が、エレクトロ・スプレイ・イオン化（ＥＳＩ）法或いはコールド・スプレイ・イオン化（ＣＳＩ）法である、請求項１ないし６に記載の１価または２価以上の多価イオン生成法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に少なくとも一つの同位体元素を導入することにより、同位体標識機能を付帯する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、温和なイオン化を用いた質量分析（ＭＳ）によることを特徴とする、アミノ酸，ペプチド，たんぱく質，核酸あるいは糖およびその他の物質（生体分子化合物）を分析する手法に関する。
【背景技術】
【０００２】近年、質量分析による生体分子化合物の分析が広く行われるようになったが、数百キロダルトンを超える生体分子化合物については感度および分解能の低下が著しく現状では測定困難である。【０００３】これまでの報告例として、エレクトロ・スプレイ・イオン化（ＥＳＩ）法を用いたたんぱく質の分析で、酸を加え加熱することでプロトネーションを誘起しこれによる多価イオンを観察しているが、この場合たんぱく質は酸と熱により変性している事が多い（非特許文献１）。【０００４】近年開発されたコールド・スプレイ・イオン化（ＣＳＩ）法によれば、低温でイオンを生成するため変性は免れるが、プロトネーションは起こりにくく、イオン生成が困難であった（特許文献１，２）。【０００５】一方、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄらは重水素化されたビオチンをたんぱく質と結合させることでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの炭素源のたんぱく質変動を解析し、Ｇｕｏらは水銀と硫黄の親和性を利用し、リゾチームのジスルフィド結合を有機水銀化合物を用いてイオン化することで質量分析を行った例が報告されている。しかしながら、これらのいずれの手法をしても数十万ダルトン以上のたんぱく質をイオン化することは依然として困難であり、新たな解析法の開発が望まれていた（非特許文献２，３）。
【特許文献１】特許第３１３７９５３号（平成１２年１２月８日）
【特許文献２】特許第３６１６７８０号（平成１６年１１月）
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４６，６４．
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，１７，９９９．
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００８．１９，１１０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】本発明は、以上のとおりの背景から、温和な条件で生体分子化合物の１価または２価以上の多価イオン生成し、これらの質量分析を可能とする手法を提供することを目的とする。
【課題を解決する為の手段】
【０００７】本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、生体分子化合物に電荷を有する官能基（プローブ）を付加することによりイオン化できることを見出した。
【０００８】すなわち、本発明は以下のことを特徴としている。
【０００９】第１：次式（１）
【００１０】
【化１】
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（式（１）中のｃｈａｒｇｅｄ−ｓｉｔｅは種類及び価数を自在に変えることができる金属と配位子からなる錯体を示し、ｌｉｎｋｅｒは長さを自在に調整できる炭化水素鎖，含酸素炭化水素鎖，含窒素炭化水素鎖または含硫黄炭化水素鎖を示し、ａｎｃｈｏｒｉｎｇ−ｓｉｔｅは生体分子化合物の特定の構造または官能基に選択的に結合する構造を有するものを示し、これらは共有結合により連結されているものを示す。）で表される、電荷を有する官能基（プローブ）を１個以上付加することによりイオン化することを特徴とする、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１１】第２：上記第１に記載のプローブを生体分子化合物に２個以上付加し、このものと結合する金属を介して連結することで生じる、生体分子化合物多量体についての、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１２】第３：上記第１に記載のプローブを２種類以上の生体分子化合物にそれぞれ１個以上付加し、これらと結合する金属を介して連結することで生じる、生体分子化合物複合体についての、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１３】第４：上記第１に記載のプローブを生体分子化合物とともに低分子化合物にも１個以上付加し、これらと結合する金属を介して連結することで生じる、生体分子化合物−低分子化合物複合体についての、質量分析（ＭＳ）に供する目的に使用する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１４】第５：生体分子化合物が、リジン残基或いはアルギニン残基を含むペプチド或いはたんぱく質である、上記第１ないし第４に記載の１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１５】第６：プローブを構成する金属が遷移金属である、上記第１ないし第５に記載の１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１６】第７：質量分析（ＭＳ）法が、エレクトロ・スプレイ・イオン化（ＥＳＩ）法或いはコールド・スプレイ・イオン化（ＣＳＩ）法である、上記第１ないし第６に記載の１価または２価以上の多価イオン生成法。
【００１７】第８：上記第１ないし第７のいずれか１項に少なくとも一つの同位体元素を導入することにより、同位体標識機能を付帯する、１価または２価以上の多価イオン生成法。
【発明を実施する為の最良の形態】
【００１８】本発明は上記のとおりの特徴を有するものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１９】本発明における前記の式（１）として表わされるプローブは（イ）電荷部位（ｃｈａｒｇｅｄ−ｓｉｔｅ），（ロ）連結部（ｌｉｎｋｅｒ），（ハ）生体分子化合物付加部位（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ−ｓｉｔｅ）から構成され、共有結合により連結されている。
このプローブは標的となる生体分子化合物の性質に即した構造に調整できる機構を持ち（イ）は種類及び価数を自在に変えることができる金属と配位子からなる錯体であって、金属の対イオンが電荷を相殺することを免れるための、２個目の配位子を与えることが可能である。（ロ）は長さを自在に調整できる特徴を備えている、炭化水素鎖，含酸素炭化水素鎖，含窒素炭化水素鎖または含硫黄炭化水素鎖で構成される。（ハ）は標的とする生体分子化合物の特定の構造または官能基に選択的に結合する構造を有している。上記プローブを生体分子化合物に付加することにより、温和な条件でイオン化し、質量分析に供することができることを見出した。
【００２０】また、上記プローブを生体分子化合物に１個はもとより、複数，好適には出来うる限り多数付加することにより２価以上の多価イオンを生成することを見出した。さらに、上記プローブを複数の生体分子化合物，２種類以上の生体分子化合物の組合せ，または生体分子化合物と低分子化合物の組合せにそれぞれ付加しこれらと結合する金属を介して連結すれば、生体分子化合物多量体，生体分子化合物複合体，または生体分子化合物−低分子化合物複合体のそれぞれのイオンを生成することができ、生体分子化合物の機能解明や低分子化合物との相互作用の解明に有益な結果を提供できることを見出した。
【００２１】上記プローブを（イ）電荷部位（ｃｈａｒｇｅｄ−ｓｉｔｅ），（ロ）連結部（ｌｉｎｋｅｒ），（ハ）生体分子化合物付加部位（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ−ｓｉｔｅ）の３つに分類し、図１に示す。さらに、図２に示すように、本方法は従来の生体分子化合物のスペクトル解析と異なり標的を直接イオン化するのではなく、大量に導入したプローブをイオン化するため、従来の方法よりも温和な条件で多価イオンに導くことができ、不安定な生体分子化合物（例えば、たんぱく質）の測定や生体分子化合物−低分子化合物（例えば、たんぱく質−薬物）相互作用の解析に応用できる。また、図３に示すように上記プローブに少なくとも一つの同位体元素を導入することにより、同位体標識機能を持たせることができる。
【００２２】より具体的には、上記プローブは図４に例示するごとく、（イ）電荷部位（ｃｈａｒｇｅｄ−ｓｉｔｅ）としてオキサゾリン環を２個備えたピリジン誘導体（ピボックス）である配位子に、金属としてランタン系元素を配位させ，（ロ）連結部（ｌｉｎｋｅｒ）として鎖長を立体障害の及ばぬ値（例えばｎ＝３またはｎ＝４）に調整し，（ハ）生体分子化合物付加部位（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ−ｓｉｔｅ）としてＮ−ヒドロキシスクシイミドカルボニルを持つ構造である。本プローブをたんぱく質におけるアミノ基に温和な反応条件で付加させ、次に最適金属を選択、配位結合により導入した後、２個目の配位子によりこのイオンを保護する。
【００２３】図５のように、上記プローブは生体分子化合物−低分子化合物の相互作用の、質量分析による解析を可能とする。これは本プローブを生体分子化合物と低分子化合物の両方に付加させ、これらを金属を介して結合させることによって実現できる。また、本方法により生体分子化合物同士や通常相互作用を示さない化合物同士の相互作用も観測可能となる。上記プローブは様々な生体分子化合物の高次構造解析を可能とする。例えば、本プローブをたんぱく質表面に大量に反応させた後、たんぱく質をある程度の大きさを持つペプチドに分解する。これにより、プローブが付加したペプチドは高次構造の外側，付加していないペプチドは内側と判断できるので、本法はたんぱく質の高次構造情報を提供する。
【００２４】さらに、上記プローブは様々な生体分子化合物の高次構造解析を可能とする。例えば、図５のように、本プローブをたんぱく質表面に大量に反応させた後、たんぱく質をある程度の大きさを持つペプチドに分解する。これにより、プローブが付加したペプチドは高次構造の外側，付加していないペプチドは内側と判断できるので、本法はたんぱく質の高次構造情報を提供する。
【００２５】本発明における金属としては、遷移金属などを用いる。より好ましくはランタニドなどを挙げる事ができる。
本発明における配位子としては、ピボックスなどを用いる。より好ましくはアルキル基を備えたピボックスなどを挙げる事ができる。
本発明における対イオンとしては、ＰＦ６，ＢＦ４，アセチルアセトネートなどを用いる。より好ましくはＰＦ６などを挙げる事ができる。
本発明における連結部としては、直鎖状ないしは分岐を持つアルキル鎖，エチレン鎖およびこれに酸素，窒素，硫黄等ヘテロ原子が含まれるものなどを用いる。より好ましくはポリアルキル基などを挙げる事ができる。
【００２６】本発明方法に用いることができる質量分析法としてはイオン化法に、ＥＳＩ，ＣＳＩ，ＭＡＬＤＩ，およびＦＡＢなどを用いる。より好ましくはＥＳＩやＣＳＩなどを挙げる事ができる。
【００２７】質量分析計としては電場・磁場を用いるセクター型，四重極型，飛行時間型およびフーリエ変換イオンサイクロトロン型などと用いる．
【実施例】
【００２８】以下に本発明の実施例を説明する。もっとも、本発明はこれらに限定されるものではない。測定条件は以下の通りである。
金属としてランタン，配位子としてアルキルピボックス，リンカーとしてアルキル鎖（ｎ＝４）のプローブを用い，リジン付加体を図６に，アルギニン付加体を図７に，またペンタペプチド（ＴＴＫＴＴ），但し，Ｔはグリシン，Ｋはリジン，との付加体の質量分析スペクトルを図８に示す．いずれも各アミノ酸およびペプチドに１個のプローブが付加した２価イオンを明瞭に観測することができる．さらに，ペンタペプチド（ＴＫＴＫＴ）に同プローブが二分子付加した場合のスペクトルを図９に示す．最大４価までの分子イオンピークが明瞭に観測され，本法の実用性が示された．
【本発明の効果】
【００２９】当該分析に例えばＥＳＩ法或いはＣＳＩ法を用いると弱い相互作用の分析が可能になり，創薬リード化合物のスクリーニングに適用可能となる．
【００３０】本発明方法によって得られる質量スペクトルにおいては多価イオンに相当する分子量が明瞭に認められるので解析が容易であり従来法では難しかった生体分子化合物の分析に極めて有利である．
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明による多価プローブ本体の構造を模式的に説明する。１）ｃｈａｒｇｅｄ  ｓｉｔｅ，２）ｌｉｎｋｅｒ，３）ａｎｃｈｏｒｉｎｇより構成される。
【図２】タンパク質に本発明による多価プローブを付加し、電荷を複数付与する状況を模式的に説明する。
【図３】本発明による多価プローブのアミノ酸からの電荷付与部の合成、および全体の構築、さらにタンパク質（大円型図形で指示）との結合事例について説明している。
【図４】タンパク質とこれに作用する小分子との、本発明による多価プローブの結合について模式的に説明している。
【図５】畳み込まれたタンパク質分子に本発明による多価プローブを結合させる際、温和な条件では、タンパク質は変成しないため、外側にのみ結合される。これを後に化学的に解体して畳み込みの構造を解析するする手順を説明している。
【図６】リジンに多価プローブを結合した化合物の質量分析スペクトルを示す。２価イオンとして当該分子が観測される。
【図７】アルギニンに多価プローブを結合した化合物の質量分析スペクトルを示す。２価イオンとして当該分子が観測される。
【図８】ペンタペプチド（ＴＴＫＴＴ）多価プローブが結合した質量分析スペクトルを示す。当該ペプチドに本プローブが１個結合した２価の分子イオンピークが明瞭に観測される。
【図９】ペンタペプチド（ＴＫＴＫＴ）多価プローブが結合した質量分析スペクトルを示す。当該ペプチドに本プローブが２個結合した２価の分子イオンピーク等が明瞭に観測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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