(57)【要約】【課題】核酸ベースの試験のために生体内の転写プロフィールを保護する、血液および他の生物学的試料のための改良された方法および収集装置を提供すること。【解決手段】所定の体積の生物学的試料、特に全血試料を収集するための収集容器および方法は、遺伝子誘導を安定化させ抑制するのに有効な量で、少なくとも１種の遺伝子誘導阻止剤を含む。遺伝子誘導阻止剤は、収集時点で生物学的試料中の核酸を安定化させ、室温で保管される場合に、試料中の生体外遺伝子誘導を阻止することができる。安定化剤には、陽イオン性化合物、洗剤、特に陽イオン性洗剤、カオトロピック塩、リボヌクレアーゼ阻害物質、キレート剤、有機溶媒、有機還元試薬、およびこれらの混合物が含まれる。生物学的試料は、動物から直接収集され、いずれの中間の処理または取扱いなしに、すぐに遺伝子誘導阻止剤と混合される。【選択図】図１
2010217198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料を収集し安定化するための装置であって、前記装置が
前記生物学的試料を受け入れるために寸法設定された内部チャンバを画定する容器であって、前記容器が開口端部と、前記開口端部を密閉するクロージャとを有し、前記容器に所定の体積の前記生物学的試料を引き込むための大気圧未満の内圧を有するもの、および、
前記生物学的試料中での生体外遺伝子誘導を阻止し、核酸の酵素分解に対して前記生物学的試料を安定化させるための、前記容器内に含まれる遺伝子誘導阻止剤
を含み、
前記遺伝子誘導阻止剤が陽イオン性化合物を含み、かつ前記試料中で核酸を安定化するためのプロトン供与体を含まないことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記生物学的試料は、全血であり、前記容器は、前記遺伝子誘導阻止剤で予備充填され、血液試料を含むように寸法設定されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記陽イオン性化合物は、式ＹＲ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘを有する安定化剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
（式中、Ｙは、窒素またはリンであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、分岐アルキル、非分岐アルキル、Ｃ6〜Ｃ20アリール、およびＣ6〜Ｃ26アラルキルから成る群から独立して選択され、
Ｘは、陰イオンである。）
【請求項４】
前記分岐アルキルは、Ｃ3〜Ｃ20アルキルであり、前記非分岐アルキルは、Ｃ1〜Ｃ20アルキルであることを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
Ｘは、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、スクシネート、シトレート、ブロミド、およびクロリドから成る群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記Ｒ1は、１２、１４、または１６個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、メチルであることを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項７】
前記遺伝子誘導阻止剤は、前記生物学的試料中の細胞を溶解させるものであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記遺伝子誘導阻止剤は、網状赤血球、バクテリア、赤血球、および白血球を溶解させることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記遺伝子誘導阻止剤は、前記生物学的試料中の核酸を保護し、安定化させるものであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
生物学的試料中の生体外遺伝子誘導を阻止する方法であり、
試料収集容器を提供する工程であって、前記容器が生物学的試料の生体外遺伝子誘導を安定化させ阻止する、少なくとも１種の遺伝子誘導阻止剤を含む内部チャンバを有し、大気圧未満の内圧を有し、前記方法は、前記陰圧によって所定体積の前記生物学的試料を前記容器内に直接引き込んで、前記遺伝子誘導阻止剤と混合することを含み、前記遺伝子誘導阻止剤が陽イオン性化合物を含み、かつ、前記遺伝子誘導阻止剤は前記試料中で核酸を安定化するためのプロトン供与体を含まない工程と、
生物学的試料を動物から前記試料収集容器内に直接収集し、すぐに前記生物学的試料を前記遺伝子誘導阻止剤と混合して、安定化された生物学的試料を形成する工程
とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記生物学的試料は全血であり、前記方法は、前記全血試料を動物から取り出し、前記試料収集容器内の前記遺伝子誘導阻止剤に直接接触するように前記全血試料を導入し、前記全血試料中の細胞を溶解させ、核酸を安定化させる工程を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的試料は、赤血球濃縮液、血小板濃縮液、白血球濃縮液、腫瘍細胞、骨髄吸引物、組織、細針吸引物、および頸部試料から成る群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的試料は、血漿、血清、尿、ならびに脳脊髄液および唾液から成る群から選択される体液であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的試料は、バクテリアおよび真核微生物から成る群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料は、体液、組織、体物質スワブ、および体物質スミアから成る群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子誘導阻止剤は、式ＹＲ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘを有する安定化剤を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
（式中、Ｙは、窒素またはリンであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、分岐アルキル、非分岐アルキル、Ｃ6〜Ｃ20アリール、およびＣ6〜Ｃ26アラルキルから成る群から独立して選択され、
Ｘは、陰イオンである。）
【請求項１７】
前記分岐アルキルは、Ｃ3〜Ｃ20アルキルであり、前記非分岐アルキルは、Ｃ1〜Ｃ20アルキルであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘは、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、スクシネート、シトレート、ブロミド、およびクロリドから成る群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｒ1は、１２、１４、または１６個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、メチルであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
安定な全血試料を調製する方法であって、前記方法が、
内部チャンバを有する試料収集容器であって、前記容器が、全血試料中の生体外遺伝子誘導を安定化させ阻止する遺伝子誘導阻止剤の水溶液または分散液で予備充填され、大気圧未満の内圧を有しており、前記方法が、前記陰圧によって所定体積の前記生物学的試料を前記容器内に直接引き込むことを含むものを提供する工程と、
全血試料を患者から前記試料収集容器内に直接収集し、前記血液試料を前記遺伝子誘導阻止剤と混合して、室温で安定な全血試料を形成する工程
とを含み、
前記遺伝子誘導阻止剤が、式ＹＲ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ（式中、Ｙは、窒素あり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、分岐または非分岐アルキルから独立して選択され、Ｘは、陰イオンである。）であり、かつ、前記遺伝子誘導阻止剤は前記試料中の核酸を安定化するプロトン供与体を含まないことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記クロージャは、隔壁であり、前記方法は、前記隔壁をカニューレで穿孔し、前記カニューレを通じて前記全血試料を前記収集容器に導入する工程を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記水溶液または分散液は、ｐＨ２からｐＨ５のｐＨを有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記水溶液または分散液は、前記血液試料と混合する前に、ｐＨ３．６からｐＨ３．８のｐＨを有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子誘導阻止剤は、３．９から４．１のｐＨを有する前記血液試料との混合物を生成することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記血液試料と前記遺伝子誘導阻止剤とを、血液対阻害剤の体積比１：２．５から１：３．１で混合する工程を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子誘導阻止剤は、室温で安定な前記血液試料との混合物を形成することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子誘導阻止剤は、−２０℃から−８０℃の温度で安定な前記血液試料との混合物を形成し、前記混合物は、実質的に核酸の分解なしに解凍できることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、特願２００２−５５６２３４に基づく分割出願である。
本発明は、生物学的試料、特に全血試料を、患者から直接収集し、保管し、輸送し、安定化させるための方法および装置を指向する。より詳細には、本発明は、生物学的試料を収集した後すぐに核酸を安定化させ、保管中の生体外での（ｅｘ  ｖｉｖｏ）遺伝子の誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）および分解を抑制する安定化添加剤がその中に含まれた液体試料用の陰圧容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
長年にわたり、血液および他の体液または試料を収集し保管するために、試料収集容器が一般に使用されてきた。通常、収集容器は、弾性の栓を有するガラスまたはプラスチックチューブである。これらのガラスまたはプラスチックチューブは、血液の収集に使用されることが多い。
【０００３】
ある体積の血液をチューブ内に引き込むように陰圧にされた血液収集チューブが利用可能である。チューブには、特定の試験用に血液試料を調製するためにチューブ中に含有されるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような様々な添加剤を入れることができる。一般的な添加剤は、抗凝固剤である。通常、抗凝固添加剤は、緩衝されたシトレートまたはヘパリンの水溶液である。シトレート水溶液を規定量の血液試料と組み合わせて、ある試験を実施するのに必要な抗凝固剤の量が決定される。添加剤が試料中の核酸を安定化させないので、これらの装置は、血清試験にしか使用することができない。出荷中に、不安定なＲＮＡ分子が酵素的に分解されるので、その後のＲＮＡの分離および分析が困難になる。さらに、機械的刺激または物理条件の変化、例えば血液の収集および輸送中の温度や細胞の破砕などが、遺伝子転写の誘導と、それに付随してある種のｍＲＮＡ種の産生過剰または産生不足とを引き起こす。
【０００４】
血液試料を抗凝固状態に維持する抗凝固剤を含め、一般的な添加剤は、様々な処理ステップを実施するために使用される。例えば、通常は、抗凝固剤を血液試料中で使用してから遠心分離し、血液を細胞の層に分離させる。このタイプの、抗凝固剤を含む試料チューブの例が、Ｓｍｉｔｈ他の米国特許公報に開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
近年、生物学、医学、および薬理学科学の分野で、生物学的試料から得られる遺伝子活性および核酸の研究に関心が高まってきている。特に、リボ核酸から、細胞の遺伝的起源および機能的活性に関する幅広い情報を得ることができる。この情報を臨床行為で使用して、感染症を診断し、癌遺伝子を発現している細胞の存在を検出し、遺伝疾患を検出し、ホストの防御メカニズムの状態を監視し、代謝疾病を調査・診断し、患者での遺伝子発現に対する薬物の影響を調査し、薬物の副作用および毒性作用を調査し、ＨＬＡ型または他のマーカの同一性を決定することができる。
【０００６】
細胞の破砕を伴ってＲＮＡを単離し、ＲＮＡを溶液中に遊離させる、多くの方法がある。内因性リボヌクレアーゼによってＲＮＡが酵素消化されるのを防止する、他の方法もある。これで、ＲＮＡと共に可溶化されたＤＮＡおよびタンパク質から、ＲＮＡを分離することができる。これらのプロセスは、通常、同時に、細胞を溶解するため、ＲＮＡを可溶化するため、およびリボヌクレアーゼを抑制するために実施されるよりも、むしろ段階的に実施される。グアニジニウムのカオトロピック塩を使用する、細胞を溶解してリボヌクレアーゼを抑制するいくつかの方法が知られている。
【０００７】
一般に使用されているＲＮＡ単離プロセスは、グアニジニウムイソチオシアネート中で細胞を均質化し、その後、酢酸ナトリウムおよびフェノール、ならびにクロロホルム／イソアミルアルコールを順次添加することを含む。遠心分離後にアルコールを加えることによって上層からＲＮＡを沈殿させる。他の方法は、細胞懸濁液に高温のフェノールを加え、次いでアルコール沈殿させることを含む。
【０００８】
細胞を溶解させ、細胞質ＲＮＡを分離するために、陰イオン性界面活性剤および陽イオン性界面活性剤が使用される。細胞を溶解させ、同時に溶液からＲＮＡおよびＤＮＡを沈殿させる方法の一例が、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅの米国特許公報に開示されている（例えば、特許文献２参照。）。このプロセスでは、ＲＮＡを不溶化する。界面活性剤であるベンジルジメチルｎ−ヘキサデシルアンモニウムクロリドの２％溶液を、４０％の尿素および他の添加剤と共に細胞懸濁液に加える。次いで、懸濁液を遠心分離して、不溶性物質のペレットを回収する。ペレットをエタノールに再懸濁させ、塩を加えることによってＲＮＡおよびＤＮＡを沈殿させる。
【０００９】
血液から単離されたＲＮＡの分析方法は、微量中のＲＮＡ配列を検出するポリメラーゼ連鎖反応を含む増幅方法を使用する。ＲＮＡ分析での困難なことの１つは、ヌクレアーゼによってＲＮＡが分解する前に、細胞中のタンパク質およびＤＮＡからＲＮＡを分離することである。リボヌクレアーゼおよび他のヌクレアーゼは、保護されていないＲＮＡを破壊する十分な量で血液中に存在する。したがって、ヌクレアーゼによるＲＮＡの加水分解を防止する形で細胞からＲＮＡを単離する方法を用いることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，６６７，９６３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０１０，１８３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８６０，９３７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，７２８，８２２号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９９０，３０１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在一般的に使用されている血液収集方法は、血液を収集して、後で分析するために血液を保持することができる。収集装置には、保管中の凝固を防止するために抗凝固剤を含めることができる。しかし、保管および輸送の間に、血液中に存在するヌクレアーゼが一部のＲＮＡ種を加水分解し、同時に、血液収集中の温度または破砕のような機械的な刺激または物理条件の変化が、一部のＲＮＡ種の誘導を引き起こす。これら分析前の試料取扱い要因が、分子診断試験法によって決定される、ｍＲＮＡ種の過少発現または過剰発現、ならびに最終的な総ＲＮＡの分解をまねく。加えて、遺伝子誘導は、試料中のＲＮＡ濃度の増加をまねくことがあり、それが誤った結果を与えることがある。したがって、核酸ベースの試験のために生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の転写プロフィールを保護する、血液および他の生物学的試料のための改良された方法および収集装置が、当業界で継続して必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生物学的試料を収集するための方法および装置を指向する。より詳細には、本発明は、収集容器、および、生物学的試料を収集し、該試料をすぐに安定化添加剤に接触させて試料中の生体外遺伝子誘導を阻止し、それによって生体内転写プロフィールを保護する方法に関する。
【００１３】
したがって、本発明の第一の側面は、安定剤の存在下で、生物学的試料、特に全血を患者から直接収集し、保管中に試料中の遺伝子誘導を抑制または阻止することによってＲＮＡを安定化し保護するための方法および装置を提供することである。安定化添加剤は、核酸、特にＲＮＡを安定化し、遺伝子誘導を抑制または阻止するのに有効な量で存在する。
【００１４】
本発明の一側面は、遺伝子誘導がほとんど起こらないかまたは全く起こらずに、室温で長期間安定な生物学的試料を調製することである。したがって、保管中に遺伝子誘導がほとんど起こらないかまたは全く起こらずに、室温で安定な生物学的試料を生成する方法が提供される。
【００１５】
本発明の更なる側面は、生物学的試料中の核酸の遺伝子誘導を抑制するための方法および装置を提供し、細胞、バクテリア、ウイルス、および網状赤血球を溶解させることである。
【００１６】
本発明の他の態様側面は、生物学的試料を収容し収集するための収集容器であって、該容器が正確に測定された量の遺伝子誘導阻止剤で予備充填されたものを提供することである。
【００１７】
本発明の更なる側面は、試料を室温で保管するときに遺伝子誘導を抑制または防止するために、生物学的試料、特に全血を、患者から収集した後すぐに安定化させる方法を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる側面は、生物学的試料、特に全血を、患者から収集した後すぐに安定し、安定化された血液試料を、室温未満の温度、通常は２℃から約８℃で保管するとき、または、試料を長期保存（ａｒｃｈｉｖｉｎｇ）するのに適した温度、例えば−２０℃から−８０℃の温度で保管するときに、遺伝子誘導または核酸の分解を抑制または防止する方法を提供することである。凍結された試料は、核酸を単離するために室温で解凍することができる。
【００１９】
本発明のさらに他の側面は、生体試料を収集した後すぐに生体試料中の生体外遺伝子誘導を阻止する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の他の態様は、有効量の遺伝子誘導阻止剤で予備充填された陰圧容器であって、該容器が、所定の体積の生物学的試料を容器内に引き込むのに十分に低い内圧を有するものを提供することである。
【００２１】
本発明の更なる側面は、ある量の血液を収集し、収集の時点で血液を遺伝子誘導阻止剤と混合して、後に試料の核酸を分析できるように遺伝子誘導を防止することによって室温で安定な生物学的試料を生成するための血液収集容器を提供することである。
【００２２】
本発明の他の態様は、遺伝子誘導阻止剤と緩衝液とを有する容器内に血液試料を収集することによって血液を安定化させる方法を提供することである。遺伝子誘導剤は、洗剤、カオトロピック塩、リボヌクレアーゼ抑制剤、キレート剤、またはこれらの混合物とすることができる。得られる混合物のｐＨは、核酸の分解または遺伝子誘導を抑制または阻止し、検体の効率的な回収を促進するように調整される。
【００２３】
本発明のさらに他の側面は、少なくとも１種の遺伝子誘導阻止剤の存在下において、約ｐＨ２から約ｐＨ５で収集装置内の血液試料を安定化させる方法を提供することである。
【００２４】
本発明の側面は、基本的には、生物学的試料を収集するための器具を提供することによって達成される。器具には、内部チャンバを画定する、側壁、底壁、および開口端部を含む容器と、開口端部を密閉するクロージャとが含まれる。容器には、生物学的試料を保護し、生体外遺伝子誘導を阻止または抑制するのに有効な量の、少なくとも１種の遺伝子誘導阻止剤が含まれる。容器は、安定化剤で予備充填することができる。
【００２５】
本発明の側面は、さらに、室温で安定な生物学的試料を調製する方法を提供することによって達成され、この方法は、内部チャンバを画定する、側壁および底壁を有する試料収集容器であって、該容器が生体外遺伝子誘導を阻止し、生物学的試料を保護するのに十分な量かつ濃度で、少なくとも１種の遺伝子誘導阻止剤を含むものを提供するステップを含む。生物学的試料を得て、すぐに容器に導入し、そしてその生物学的試料を遺伝子誘導阻止剤と混合して、安定化された生物学的試料を形成する。
【００２６】
また本発明の側面は、全血または他の生物学的試料を収集し安定化させる方法を提供することによって達成される。この方法は、内部チャンバを形成する側壁、底壁、およびクロージャ部材を有する、試料収集容器を提供することを含む。容器は、有効量の核酸安定化剤の水溶液または分散液で予備充填され、全血試料中の核酸および／または転写プロフィールを安定化し保護する。内部チャンバの圧力は、大気圧未満である。全血試料を患者から収集容器内に直接収集し、この血液試料を安定化剤と混合して、安定な全血試料を形成する。
【００２７】
本発明のこれらの側面、利点、および他の顕著な特徴は、添付の図面および以下の発明の詳細な説明から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施形態の容器の側面の断面図である。
【図２】第１血液ドナーのｍＲＮＡ含量の変化を示すグラフである。
【図３】第２血液ドナーのｍＲＮＡ含量の変化を示すグラフである。
【図４】第３血液ドナーのｍＲＮＡ含量の変化を示すグラフである。
【図５】第４血液ドナーのｍＲＮＡ含量の変化を示すグラフである。
【図６】安定化試薬を用いない場合の、血液試料の５日間にわたる、全血試料中の特定のインターロイキンおよび他のｍＲＮＡ種の量のグラフである。
【図７】安定化剤を用いない場合の、５日間にわたる、血液試料のＩＬ−８およびＩＬ−１０ｍＲＮＡの量の変化を示すグラフである。
【図８】テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび酒石酸を用いた場合に、５日間にわたって室温で保管された全血中の特定のｍＲＮＡ種の量を示すグラフである。
【図９】図８の試料中のＩＬ−８およびＩＬ−１０の量の、５日間にわたる変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、生体内の遺伝子転写数を高い精度で決定できる、生物学的試料を安定化させ保護するための方法および装置を指向する。より詳細には、本発明は、収集、輸送、および保管中に、生物学的試料内の遺伝子誘導を抑制または阻止するための方法および装置を指向する。本発明の好ましい実施形態では、装置は、予備充填された容器であって、試料を収集した後すぐに生物学的試料と混合するための、ある量の遺伝子誘導阻止剤を含むものである。遺伝子誘導阻止剤の量は、生物学的試料と混合して安定化させるのに有効な量で含まれることが好ましい。生物学的試料は、動物、特に人間の患者から直接収集されることが好ましい。
【００３０】
生物学的試料は、動物、特に人間の患者から取り出された体液にすることができる。一実施形態では、生物学的流体は、全血である。他の生物学的試料の例には、赤血球濃縮液、血小板濃縮液、白血球濃縮液、腫瘍細胞、骨髄、吸引物、組織、細針吸引物、頸部試料のような細胞含有組成物が含まれる。他の実施形態では、生物学的試料は、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液のような体液である。また、生物学的試料をバクテリアおよび真核微生物にすることもできる。一実施形態では、生物学的試料は、体液、組織、体物質スワブ（ｂｏｄｙ  ｓｗａｂｓ）、および体物質スミア（ｂｏｄｙ  ｓｍｅａｒｓ）から成る群から選択される。本発明の遺伝子誘導阻止剤は、生物学的試料の保管中の生体外遺伝子誘導の発生を抑制、防止、または低減させることのできる適切な薬剤である。この薬剤は、血液試料のような生物学的試料を安定化させて、生物学的試料中に存在する核酸の誘導された転写を抑制または防止する、室温で安定な組成物を生成する。
【００３１】
一実施形態では、装置１０は、収集の時点ですぐに核酸を安定化させ遺伝子転写を阻止するために、動物、特に人間の患者から血液試料を直接引き込むための装置である。図を参照すると、装置１０には、チャンバ１４を画定する容器１２が含まれる。例示した実施形態では、容器１２は、側壁１６と、閉じた底端部１８と、開口上端部２０とを有する中空チューブである。容器１２は、適切な体積の生物学的流体を収集するために寸法設定されている。弾性のクロージャ２２は、容器１２を密閉するように開口上端部２０配置されている。クロージャ２２が、効果的に容器１２を密閉し、生物学的試料をチャンバ１４内に保持できる、シールを形成することが好ましい。クロージャ２２には、保護シールド２３が重ねられている。
【００３２】
容器１２は、ガラス、プラスチック、または他の適切な材料で作製することができる。プラスチック材料は、酸素不透過性材料にすることができ、または、酸素不透過性層を含むことができる。その他には、容器１２を水および空気透過性のプラスチック材料で作製することもできる。チャンバ１４は、大気圧未満の圧力で、大気圧との圧力差を維持することが好ましい。チャンバ１４内の圧力は、所定の体積の生物学的試料をチャンバ１４内に引き込むように選択される。通常、生物学的試料は、当該技術分野で公知の針２４またはカニューレでクロージャ２２を穿孔することによって、チャンバ１４に引き込まれる。適切な容器１２およびクロージャ２２の一例が、Ｃｏｈｅｎの米国特許公報に開示されており（例えば、特許文献３参照。）、その全体を参照によりここに援用する。
【００３３】
容器１２を透明材料で作製することが好ましい。適切な透明熱可塑性材料の例には、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートが含まれる。容器１２は、収集される生物学的試料の必要な体積に応じて選択される、適切な寸法を有する。一実施形態では、容器１２は、軸方向長さ約１００ｍｍ、直径約１３ｍｍから１６ｍｍのチューブ形である。
【００３４】
クロージャ２２は、大気圧未満の内部圧力差を維持でき、生物学的試料を容器１２に導入するために針または他のカニューレによって穿孔できる、弾性材料で作製することができる。クロージャに適した材料には、例えば、シリコーンゴム、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム、エチレンプロピレンコポリマー、およびポリクロロプレンが含まれる。
【００３５】
容器１２にはまた、血液試料を安定化するための遺伝子誘導阻止剤２６も含む。遺伝子誘導阻止剤２６は、安定化剤を含む液体であることが好ましく、生物学的試料と混合し、核酸を安定化させ、細胞またはその中に含まれる核酸の遺伝子誘導を阻止または抑制するのに有効な量で含まれる。一実施形態では、容器１２の内圧および安定化添加剤２６の体積は、収集される生物学的試料の体積に対して必要な濃度の安定化剤を提供するように選択される。好ましい一実施形態では、所定の体積である約２．５ｍｌの生物学的試料を、その体積の試料を安定化させるのに有効な体積の遺伝子誘導阻止剤２６を含む容器１２に引き込むように、容器１２の内圧を選択する。代替的な実施形態では、容器１２の内圧を実質的に大気圧にすることもできる。容器１２が、製造業者によって遺伝子誘導阻止剤で予備充填され、すぐに使用できる形態に包装されていることが好ましい。通常、包装された容器は、無菌であり、無菌包装材料内に包装されている。
【００３６】
一実施形態では、容器１２は、水および気体透過性のプラスチックで作製される。容器の透過性壁面を通って安定剤が揮発することによって水が失われると、安定剤の濃度が増加し、容器内の圧力が減少する。チューブの壁面を通した酸素の拡散は、容器内の真空度を低下する効果を有する。容器の水および酸素透過性特性は、容器の所望の貯蔵寿命を得るために、容器内の所望の圧力差を維持するように選択される。貯蔵寿命は、酸素透過性と水の損失とのバランスを取ることによって最適化される。容器の貯蔵寿命は、少なくとも約１年であり、さらに長いことが好ましい。
【００３７】
遺伝子誘導阻止剤２６は、少なくとも１種の活性安定化剤の固形物または水溶液若しくは水分散液であり、これは予備充填容器としての容器内に含まれている。固形の遺伝子誘導剤は、噴霧乾燥物質や凍結乾燥物質のような乾燥粉末または微粒子にすることができる。固形の遺伝子誘導剤は、容器内に入ったばらばらの微粒子物質または容器内表面上の乾燥被覆にすることができる。
【００３８】
遺伝子誘導阻止剤２６は、生物学的試料、特に全血試料中の核酸を安定化できる濃度で少なくとも１種の安定化剤を含むことが好ましい。通常、遺伝子誘導阻止剤２６は、１種の安定化剤または複数の安定化剤の混合物の水溶液である。安定化剤は、ＤＮＡ、およびｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、低分子量（ＬＭＷ）ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｃＲＮＡを含めたＲＮＡを効果的に安定化でき、室温保管中の生物学的試料中の生体外遺伝子誘導を阻止または抑制できることが好ましい。核酸を安定化し、かつ保護し、および／または遺伝子誘導を防止するのに適した安定化剤の例には、陽イオン性化合物、洗剤、カオトロピック塩、リボヌクレアーゼ阻害物質、キレート剤、四級アミン、およびこれらの混合物が含まれる。適切なリボヌクレアーゼ阻害物質は、胎盤リボヌクレアーゼ阻害因子タンパク質である。カオトロピック塩の例には、尿素、ホルムアルデヒド、グアニジニウムイソチオシアネート、グアニジニウムヒドロクロリド、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、およびテトラフルオロアセテートが含まれる。他の実施形態では、遺伝子誘導剤は、有機溶媒または有機還元剤である。適切な有機溶媒の例は、フェノール、クロロホルム、アセトン、およびアルコールから成る群から選択される。アルコールは、一般に低級アルコールである。有機還元剤の例は、メルカプトアルコール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、およびこれらの混合物から成る群から選択される。
【００３９】
また安定化剤には、生物学的試料を処理する他の成分も含めることができる。例えば、生物学的試料中の細胞を膜透過性にするため、または溶解させるために、化学薬品を含めることができる。安定化剤が、網状赤血球、バクテリア、赤血球、および白血球を溶解させることが好ましい。他の成分には、プロテアーゼ、フェノール、フェノール／クロロホルム混合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、および有機酸が含まれる。
【００４０】
洗剤は、陰イオン性洗剤、陽イオン性洗剤、または非イオン性洗剤にすることができる。陰イオン性洗剤は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムにすることができる。非イオン性洗剤は、例えば、多価アルコールのエトキシル化脂肪酸エステルのようなエチレンオキシド縮合生成物にすることができる。好ましい非イオン性洗剤は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から商品名ＴＷＥＥＮ２０として販売されるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである。他の適切な洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウムである。洗剤は、細胞を溶解させるのに有効な量で含まれる。また洗剤は、核酸とのミセルおよび他の複合体を形成し、他のメカニズムによってＲＮＡおよび／またはＤＮＡを保護することができる。
【００４１】
好ましい実施形態では、安定化剤は、一般式ＹＲ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘを有する陽イオン性化合物であり、式中、Ｙは、窒素またはリンであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、独立に、分岐または非分岐アルキル、Ｃ6〜Ｃ20アリール、またはＣ6〜Ｃ26アラルキルであり、Ｘは、有機または無機の陰イオンである。一実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、独立に、Ｃ3〜Ｃ20分岐アルキルまたはＣ1〜Ｃ20非分岐アルキルである。
【００４２】
陰イオンは、ＨＸ（式中、Ｘは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である）などの無機酸の陰イオンにすることができ、、塩素および臭素が好ましい。また、陰イオンは、モノカルボン酸、ジカルボン酸、またはトリカルボン酸の陰イオンにすることもできる。通常、陽イオン性化合物の陰イオンは、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、スクシネート、シトレート、ブロミド、およびクロリドから成る群から選択される。
【００４３】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4がアリール基のときには、そのアリール基は、独立に、例えば、フェニル、低級アルキル置換ベンジル、および／またはハロゲン化ベンジルにすることができる。一実施形態では、Ｒ1がＣ12、Ｃ14、またはＣ16アルキルであり、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4がメチル基である。好ましい一実施形態では、Ｙが窒素で、安定化剤が四級アミンである。適切な四級アミンには、アルキル基が１２、１４、または１６個の炭素を有する、アルキルトリメチルアンモニウムが含まれる。好ましい陽イオン性化合物の１つは、テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートである。他の適切な四級アミンには、アルキル基が１２、１４、１６、または１８個の炭素を含む、アルキルトリメチルアンモニウムが含まれる。一般に、２０個より多くの炭素原子を有するアルキル基を溶解させて溶液で保持するのは困難なことがあるので、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4の炭素原子数を２０個以下にすることが望ましい。適切な四級アミン界面活性剤の例が、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅの米国特許公報に開示されており（例えば、特許文献４参照。）、その全体を参照によりここに援用する。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、安定化剤は、陽イオン性化合物であり、核酸を安定化させるのに有効な量のプロトン供与体を含む。陽イオン性化合物にプロトン供与体を加えると、生物学的試料中の核酸を安定化させる陽イオン性化合物の能力が増大することがわかった。適切なプロトン供与体の例には、モノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、脂肪族ケトジカルボン酸、アミノ酸、鉱酸、およびこれらの混合物が含まれる。一実施形態では、プロトン供与体は、アルケニルカルボン酸、Ｃ1〜Ｃ6脂肪族モノカルボン酸、脂肪族Ｃ2〜Ｃ6ジカルボン酸、トリカルボン酸、ヒドロキシモノカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、ヒドロキシトリカルボン酸、脂肪族ケトモノカルボン酸、脂肪族ケトジカルボン酸、アミノ酸、およびこれらの混合物から成る群から選択される。適切な脂肪族カルボン酸の例には、酢酸、プロピオン酸、ｎ−ブタン酸、ｎ−ペンタン酸、イソペンタン酸、２−メチルブタン酸、２，２ジメチルプロピオン酸、ｎ−ヘキサン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、ドデカン酸のようなＣ1〜Ｃ6アルキルカルボン酸が含まれる。アルケニルカルボン酸の例には、アクリル酸、メタクリル酸、ブテン酸、イソブテン酸、およびこれらの混合物が含まれる。
【００４５】
一実施形態における、プロトン供与体のジカルボン酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、およびこれらの混合物から成る群から選択される。水酸基含有酸の例には、酒石酸およびリンゴ酸が含まれる。適切なアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびこれらの混合物から成る群から選択される。プロトン供与体のトリカルボン酸は、クエン酸およびイソクエン酸から成る群から選択することができる。
【００４６】
容器１２内の遺伝子誘導阻止剤２６の量は、容器１２の内部容積、内圧、および容器内に引き込まれる生物学的試料の体積によって決定される。例示した実施形態では、容器１２は、軸方向長さ約１００ｍｍ、直径約１６ｍｍであり、約２．５ｍｌの生物学的試料を引き込む内圧を有する。安定化添加剤２６は、通常、キャリア液１ｍｌ当り約５０ｍｇから約９０ｍｇを含む。遺伝子誘導阻止剤２６が、約６０ｍｇ／ｍｌから約８０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌを含む水性媒体であることが好ましい。容器１２内の安定化添加剤２６の体積は、約６から８ｍｌ、好ましくは約７ｍｌである。
【００４７】
好ましい一実施形態では、遺伝子誘導阻止剤２６は、生体外遺伝子誘導を阻止または抑制できる約７０ｍｇ／ｍｌの核酸安定化剤を含んでおり、患者から直接引き込まれた全血と混合される。血液は、体積比約１：２から約１：３．５、好ましくは約１：２．５から約１：３．１、最も好ましくは約１：２．７から約１：２．８でその液体と混合される。
【００４８】
安定化剤の濃度は、核酸を安定化し、生体外遺伝子誘導を阻止または抑制するのに十分なものである。好ましい一実施形態では、生物学的試料は全血である。血液と混合した後の安定化剤の濃度は、混合物１ｍｌ当り、約４５ｍｇ／ｍｌから約５５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌから約５３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５１ｍｇ／ｍｌから約５２ｍｇ／ｍｌである。
【００４９】
本発明の方法は、生物学的試料を得て、その試料を遺伝子誘導阻止剤を含む容器に導入することによって実施される。好ましい実施形態では、生物学的試料を調製し、すぐに収集容器に直接導入する。好ましい実施形態では、生物学的試料は、いずれの介在するプロセスもまたは取扱いステップも用いることなく収集容器内に直接患者から引き込まれ、その結果として、該試料が、直ちに遺伝子誘導阻止剤と混ざり、核酸分解を防止または抑制する。全血試料を収集するときのような、患者から生物学的試料を直接収集し、その試料を安定化剤を含む容器に直接導入することで、その試料が安定化剤と組み合わせる前に保管されている場合に発生する遺伝子の転写および核酸の分解が、実質的に防止または低減されることがわかった。生物学的試料の収集または調整後すぐに生物学的試料を遺伝子誘導阻止剤と組み合わせると、生物学的試料の保管中の生体外遺伝子誘導が低減または防止されることがわかった。
【００５０】
陽イオン性化合物は、好ましい安定化剤である。陽イオン性化合物によって、試料から核酸を単離できる実験室まで周囲温度または室温未満の温度で輸送できる、安定化された全血試料が生成される。また、安定化された全血試料は、室温より低い温度、例えば約２℃から約８℃で、保管し、輸送することもできる。また、安定化された全血試料は、凍結された条件下で保管することもできる。さらに長く保管し、長期保存するには、試料を約−２０℃で保管することができる。後に核酸を単離するために、試料を解凍し、さらに処理することができる。安定化剤によって、後にＲＮＡ単離するための血液試料の信頼性のある凍結が実施できることがわかった。生物学的試料、特に血液試料は、安定化剤なしで凍結すると、解凍プロセスの際に核酸および特にＲＮＡの分解を示す。他の実施形態では、生物学的試料を、約０℃から約−８０℃、好ましくは約０℃から約−７０℃で保管することができる。
【００５１】
生物学的試料中の核酸の回収および安定化は、生物学的試料および安定化剤のｐＨに左右されることがわかった。得られる混合物のｐＨは、約２から約１２、好ましくは約２から約１０、より好ましくは約３から約８の範囲にすることができる。この範囲内の核酸の寿命は、生物学的試料、生物学的試料の量と安定化剤の量の比、および使用される個々の安定化剤によって異なる。このｐＨで、安定化された核酸の貯蔵寿命は、室温で約２４時間から数日の範囲にすることができる。このｐＨ範囲で、安定化された核酸の貯蔵寿命は、約２℃から約８℃の冷蔵庫内では数週間までにすることができる。安定化された核酸は、−２０℃、またはさらに低い温度、例えば−７０℃から−８０℃で冷凍して長期保存することができる。
【００５２】
得られる混合物のｐＨは、安定化される生物学的試料によって異なる。本発明の一実施形態では、生物学的試料が全血であり、全血と安定化剤の混合物は、ｐＨ約２からｐＨ約５に調整される。ｐＨ約２からｐＨ約５に調整された陽イオン性化合物で安定化された核酸は、周囲温度では数日間、２℃から約８℃では数週間安定であり、または、−２０℃以下の温度で凍結して長期保存することができる。全血と安定化剤との混合物中の核酸の最適長期安定性は、ｐＨ約３．９から約４．１で得られることがわかった。
【００５３】
好ましい一実施形態では、収集装置内の安定化溶液は、生物学的試料を加える前で約３．６から約３．８の最適ｐＨを有する。血液試料を収集装置に加えて安定化溶液と混合した後、得られる混合物のｐＨは、約３．９から約４．１である。好ましい一実施形態では、収集装置は、血液と安定化剤の体積比約１：２．５から約１：３．１で全血と混合したときに、得られる混合物のｐＨが約３．９から約４．１になるような量の安定化剤を含んでいる。他の生物学的試料では、ｐＨは、混合物を安定化させるように適切に調整される。例えば、培養真核細胞は、ｐＨが４から約８、好ましくは約６から約８で安定化されることがわかった。
【００５４】
生物学的試料と安定化剤の混合物のｐＨは、適切な緩衝液を加えることによって調整することができる。生物学的試料のｐＨを調整するのに有効であることがわかっている緩衝液の一例が、酒石酸である。また、当該技術分野で公知の他の緩衝液およびｐＨ調整剤も使用することができる。緩衝液のｐＨは、水酸化ナトリウムを加えることによって所望の範囲に調整することができる。
【００５５】
核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該技術分野で公知の様々なプロセスを使用して、安定化された生物学的試料から分離することができる。精製された核酸を得るために、実験室内で実施される精製プロトコル中で、安定化剤は核酸から分離できることがわかった。
【００５６】
陽イオン性化合物は、試料中の細胞およびウイルスを溶解させ、化合物との複合体中として核酸を沈殿させる。沈殿した核酸は、当該技術分野で公知のように、フェノール抽出によって、またはホルムアミド緩衝液によって、複合体から抽出することができる。他の実施形態では、洗剤を可溶化して、複合体を解離させ、不溶性の核酸を残すことができる。化合物は、濃塩化リチウム溶液、または例えばグアニジニウムイソチオシアネートやグアニジニウムヒドロクロリドのような他の高塩分濃度溶液で複合体を処理することによって可溶化することができる。核酸を単離して精製する他の方法は、Ｃｏｌｐａｎ他の米国特許公報に開示されており（例えば、特許文献５参照。）、その全体を参照によりここに援用する。
【実施例１】
【００５７】
実施例１−ヒト血液中のＲＮＡの安定化
この例では、血液と安定化剤の比、ならびに安定化剤の濃度の影響を実証する。
【００５８】
この比較のために、２４個の試料を調製した。各試料は、血液２．５ｍｌから調製し、クエン酸ナトリウムを含む血液収集装置で引き込み、１２ｍｌポリエチレンチューブ内で、３％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートと、それぞれ１２５ｍＭおよび２００ｍＭの酒石酸を含む安定化緩衝液７．５ｍｌと混合した。緩衝液のｐＨは、水酸化ナトリウムで、それぞれ３．３、３．５、３．７に調整した。試料は、室温でそれぞれ２５時間および７２時間保管した。細胞性ＲＮＡを単離するために、チューブを５０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを水で１回洗浄した。５０００×ｇでさらに１０分間遠心分離した後、ペレットを３００μｌの溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）、すなわちＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）に溶解させ、水３６０μｌで希釈し、プロテイナーゼＫ４０μｌを加えた。５５℃で１０分間のプロテイナーゼ消化後、試料を２０，０００×ｇで３分間遠心分離し、上清を新しいチューブ内に移動して、９８％エタノール３５０μｌを加えた。次いで、８０００×ｇで１分間遠心分離することによって、試料をシリカ膜の入ったスピンカラムに適用した。スピンカラムを、ＧＩＴＣを含む洗浄緩衝液様の緩衝液ＲＷ１（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で１回洗浄し、エタノール洗浄液を含む緩衝液様の緩衝液ＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で２回洗浄した。次いで、リボヌクレアーゼを含まない水２×４０μｌで、シリカ膜からＲＮＡを溶出させた。すべての試料は、複製して処理した。
【００５９】
単離されたＲＮＡの収率は、分光光度計で波長２６０ｎｍでの光学密度を測定し、１ＯＤ２６０がＲＮＡ４０μｇ／ｍｌの濃度に相当することを計算することによって決定した。単離したＲＮＡの完全性は、エチジウムブロミドで染色した変性アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で溶出液３０μｌを電気泳動することによって検証した。ＲＮＡの収量を、表１および表２に示す。
【００６０】
表１
１２５ｍＭ酒石酸
試料      ｐＨ        保管期間（時間）        収量（μｇ）
１      ３．３          ２４                  ８．４
２      ３．３          ２４                  ７．６
３      ３．５          ２４                  ９．５
４      ３．５          ２４                  ９．８
５      ３．７          ２４                １３．３
６      ３．７          ２４                １７．２
７      ３．３          ７２                  ７．２
８      ３．３          ７２                  ６．８
９      ３．５          ７２                １０．３
１０      ３．５          ７２                １０．９
１１      ３．７          ７２                １４．８
１２      ３．７          ７２                １６．１
【００６１】
表２
２００ｍＭ酒石酸
試料      ｐＨ        保管期間（時間）        収量（μｇ）
１３      ３．３          ２４                  ５．９
１４      ３．３          ２４                  ７．４
１５      ３．５          ２４                １０．６
１６      ３．５          ２４                １０．９
１７      ３．７          ２４                １７．２
１８      ３．７          ２４                １８．５
１９      ３．３          ７２                  ５．１
２０      ３．３          ７２                  ５．３
２１      ３．５          ７２                  ７．２
２２      ３．５          ７２                  ７．１
２３      ３．７          ７２                １３．３
２４      ３．７          ７２                １６．６
【００６２】
この結果は、体積２．５ｍｌの血液を、３％（ｗ／ｖ）のテトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートとそれぞれ１２５ｍＭまたは２００ｍＭの酒石酸を含む安定化緩衝液７．５ｍｌと混合した場合、総ＲＮＡの収量および完全性には、ｐＨ３．７が最適であることを示している。リボソームＲＮＡの完全性から判断したＲＮＡの安定性は、すべてのｐＨ値で非常に優れていたが、単離されたＲＮＡの収率は、ｐＨ３．７に調整した緩衝液を使用した場合よりも、ｐＨ３．３および３．５にそれぞれ調整した緩衝液を使用した場合の方が低かった。しかし、ｐＨ３．３に調整した安定化緩衝液で得られた低い収率でも、対照方法、すなわちＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．５２３０３）によるＲＮＡの単離で得られた収量（平均収量が血液２．５ｍｌ当りＲＮＡ６．８μｇ）と同等またはそれよりわずかに高いものであった。
【実施例２】
【００６３】
実施例２−ノーザンブロット分析
この例は、室温で１時間、２４時間、４８時間、および７２時間保管した、３人の異なるドナー由来の血液試料で実施したノーザンブロット分析の結果を示す。
【００６４】
クエン酸ナトリウムを含む血液収集装置で引き込んだ２．５ｍｌの血液試料を、１６×１００ｍｍポリエチレンチューブ内で、４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートと２００ｍＭ酒石酸を含む安定化緩衝液６．９ｍｌと混合した。試料は、それぞれ室温で１時間、２４時間、４８時間、および７２時間保管した。細胞性ＲＮＡを単離するために、チューブを５０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを水で１回洗浄した。５０００×ｇでさらに１０分間遠心分離した後、ペレットを、３００μｌの溶解緩衝液、すなわちＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）に溶解させ、水３６０μｌで希釈してプロテイナーゼＫ４０μｌを加えた。５５℃で１０分間のプロテアーゼ消化の後、試料を２０，０００×ｇで３分間遠心分離し、上清を新しいチューブ内に移動して、９８％エタノール３５０μｌを加えた。
【００６５】
次いで、８０００×ｇで１分間遠心分離することによって、試料をシリカ膜が入ったスピンカラムに適用した。スピンカラムを、ＧＩＴＣを含む洗浄緩衝液様の緩衝液ＲＷ１（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で１回洗浄し、エタノール洗浄液を含む緩衝液様の緩衝液ＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で２回洗浄した。次いで、リボヌクレアーゼを含まない水２×４０μｌで、シリカ膜からＲＮＡを溶出させた。各変異体について単一試料を調製した。単離したＲＮＡ２．５μｇを、変性アガロース／ホルムアルデヒドゲル上に載せ、電気泳動した後、ＲＮＡがナイロン膜上に移動した。続いて、ナイロン膜を、ＩＦＮガンマ誘導遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ０７６３３）の配列を含む放射性標識したＲＮＡプローブによって６０℃で一晩ハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳから０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液で６０℃で数回洗浄した。続いて、ナイロン膜をＸ線フィルムに露光させた。対照試験として、同じドナーからのＲＮＡを、血液引き込み後に、直接ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離し、前述のように分析した。
【００６６】
その結果から、単離されたＲＮＡをハイブリダイズするプローブとして使用したＩＦＮガンマ誘導遺伝子の転写レベルが、目に見える発現レベルの変化なしに、期間全体にわたって保護されたことが示された。転写レベルは、ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳによる対照試験と同等であった。これらの対照試験は、血液を引き込んだ時点での試料の生体内条件を表している。なぜならば、ＴＲＩｚｏｌ試薬が、グアニジニウムイソチオシアネートと併せてフェノールを含んでおり、すぐに細胞を破壊しタンパク質を変性させて生物活性を完全に抑制する試薬とみなされるからである。ノーザンブロット分析で、保管された試料の信号強度とＴＲＩｚｏｌ対照試験の信号強度とを比較すると、ＩＦＮガンマ誘導遺伝子の転写レベルが、血液試料に安定化緩衝液を加えた直後に「凍結」されて、保管中にそれ以上変化しなかったことが示される。
【実施例３】
【００６７】
実施例３−血液収集装置と従来のＥＤＴＡチューブとの比較
この例では、本発明の収集装置によるＲＮＡの安定化と、従来のＥＤＴＡの入ったチューブによるＲＮＡの安定化とを比較する。
【００６８】
ＨＥＭＯＧＡＲＤ（商標）クロージャ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で密閉され、ドナーの静脈に連結したときに血液２．５ｍｌを引き込む所定の真空度まで陰圧にされた１６×１００ｍｍのポリエチレンチューブ内に、６．９ｍｌの安定化緩衝液（４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート、２００ｍＭ酒石酸、ｐＨ３．７）を含む血液収集装置によって、１人のドナーから２．５ｍｌの血液を引き込んだ。試料は、それぞれ室温で１時間、１日、３日、７日、および１０日間保管した。
【００６９】
細胞性ＲＮＡを単離するために、チューブを５０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを水で１回洗浄した。５０００×ｇでさらに１０分間遠心分離した後、ペレットを、酢酸アンモニウムを含む再懸濁緩衝液３６０μｌに溶解させ、次いで溶解緩衝液、すなわちＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）３００μｌと、プロテイナーゼＫ４０μｌを加えた。５５℃で１０分間のプロテイナーゼ消化の後、試料を２０，０００×ｇで３分間遠心分離し、上清を新しいチューブ内に移動して、９８％エタノール３５０μｌを加えた。次いで、８０００×ｇで１分間遠心分離することによって、試料をシリカ膜を含むスピンカラムに適用した。スピンカラムを、ＧＩＴＣを含む洗浄緩衝液様の緩衝液ＲＷ１（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で１回洗浄し、エタノールを含む緩衝液様の緩衝液ＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で２回洗浄した。
【００７０】
ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７９２５４）の説明書の指示に従って、シリカ膜上で、少量のＲＮＡと共精製できる残留ゲノムＤＮＡの消化を行った。溶出緩衝液２×４０μｌによって、ＲＮＡをシリカ膜から溶出させた。すべての試料は、複製して処理した。分析のために、溶出液を１２５倍に希釈し、希釈した溶出液１μｌをリアルタイムＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）によって開発されたアッセイを用いて増幅した。各試料は、ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲ増幅で複製して分析した。
【００７１】
対照試験として、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のバキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）ＥＤＴＡチューブで、同一ドナーから血液を引き出し、前述と同じ期間このチューブ内で保管した。ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＬＳ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する各時点で、保管した血液試料１ｍｌからＲＮＡを単離した。続いて、単離したＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップ（ＲＮＡ  ｃｌｅａｎ  ｕｐ）（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０３）に関するＲＮｅａｓｙ（商標）Ｍｉｎｉプロトコルに従ってクリーンアップした。ＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含まない水２×４０μｌで溶出させた。試料チューブ内の血液２．５ｍｌに比べて体積の少ない、ＴＲＩｚｏｌ（商標）法で処理した試料を補償するために、溶出物を１：５０倍に希釈した。試料は、やはりＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）から得られるＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用して分析した。
【００７２】
表３は、ヒト血液中の細胞性ＲＮＡの安定化に関する結果を示している。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果は、保護されていないＥＤＴＡ血液では、時間が経過すると、転写レベルが７から１０日後（この時点で、ｍＲＮＡがもはや検出不可能になる）の分解の程度まで減少する（ＴａｑＭａｎ分析のｃｔ値の増加によって示される）ことを示している。一方、保護された試料中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡでは、ＴａｑＭａｎアッセイの誤差範囲が±１ｃｔ値であることを考慮すると、コピー数のいずれの減少も示していない。この誤差範囲内では、ｃｔ値のすべての変化は、増幅システムの正常な変動と考えるべきであり、分解は全く見られない。この結果から、新規に開発された血液収集装置の利点がＥＤＴＡ血液収集チューブに勝ることが明らかに示され、さらに、ＲＮＡの安定化が試料材料の分子分析にとって欠くことのできないものであることが明白にされている。
【００７３】
【表１】
2010217198.tif 000003
【実施例４】
【００７４】
実施例４−全血中のゲノムＲＮＡの安定化
また、安定化された血液試料からゲノムＤＮＡを単離することも可能であった。クエン酸ナトリウムを含む血液収集装置で血液２．５ｍｌを引き込み、１６×１００ｍｍポリエチレンチューブ内で、４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび２００ｍＭ酒石酸を含む安定化緩衝液６．９ｍｌと混合した。試料は、それぞれ室温で２４時間および７２時間保管した。ゲノムＤＮＡを単離するために、チューブを５０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを水で１回洗浄した。さらに５０００×ｇで１０分間遠心分離した後、ペレットを、ＥＤＴＡと塩化ナトリウムを含む緩衝液３００μｌ、および溶解緩衝液、すなわちＡＬ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）４００μｌに溶解させ、２０μｌのプロテイナーゼＫを加えた。６５℃で１０分間のプロテイナーゼ消化の後、９８％エタノール４２０μｌを加えた。次いで、８０００×ｇでの１分間の遠心分離によって、試料をシリカ膜を含むスピンカラムに適用した。スピンカラムを、グアニジニウムヒドロクロリドを含む洗浄緩衝液様の緩衝液ＡＷ１（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で１回洗浄し、エタノールを含む緩衝液様の緩衝液ＡＷ２（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で１回洗浄した。次いで、３００μｌのトリス緩衝液によってＤＮＡをシリカ膜から溶出させた。
【００７５】
溶出物５μｌを、エチジウムブロミドで染色した０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分析した。単離されたＤＮＡの収量を、分光光度計の２６０ｎｍ波長での光学密度を測定し、１ＯＤ２６０がＤＮＡ５０μｇ／ｍｌの濃度に相当することを計算することによって決定した。室温で２４時間および７２時間保管後に単離されたゲノムＤＮＡは、高分子量のものであった。主バンドは、２０ｋｂを越える長さに移動した。収量は、血液２．５ｍｌ当り４７μｇから８０μｇの範囲内であった。これは、この血液量についての予想収量範囲内である。またＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ消化およびＰＣＲ増幅のような酵素反応にも利用可能であった。
【００７６】
またゲノムＤＮＡを、制限酵素消化またはＰＣＲ増幅のような酵素反応にも適用した。制限エンドヌクレアーゼ消化では、ＤＮＡ２μｇを、６ＵのＥｃｏＲＩ（Ｅ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）によってそれぞれ３７℃で３時間消化し、続いて０．８％アガロースＴＢＥゲル上で分析した。ＰＣＲ増幅では、ＤＮＡ１５０ｎｇおよび３００ｎｇを、総体積５０μｌのＰＣＲ反応混合物に加え、巨大幼虫遺伝子（ｇｉａｎｔ  ｌａｒｖａｅ−ｇｅｎｅ）のヒト相同体の１．１ｋｂ断片を増幅した。ＰＣＲ生成物を、１．２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分析した。
【実施例５】
【００７７】
この例は、安定化剤なしに試料を室温で保管したときの、生物学的試料中のＲＮＡの本来の不安定性および転写を実証する。ドナー１、２、３、４として識別される４人のドナーから、全血試料を収集した。各ドナーについて、第１群の試料をＥＤＴＡ血液収集チューブ内に引き込み、−７０℃で保管した。第２群の試料を同一のＥＤＴＡ血液収集チューブ内に収集し、室温で保管した。
【００７８】
第２群の試料は、室温の同一条件下で保管し、定量ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲによって、総インターフェロンガンマｍＲＮＡについて、１、３、５、および７日目に分析した。第１群の試料は、−７０℃の同一条件下で保管し、定量ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲによって、総インターフェロンガンマｍＲＮＡについて分析した。各試料の測定されたｍＲＮＡ含量を、ドナー１〜４について、それぞれ図２〜図５のグラフに示す。グラフに示されるように、−７０℃で保管した血液試料は、１日後にインターフェロンガンマｍＲＮＡの総量のわずかな減少を示している。−７０℃の試料のうちの３つは、１日から５日の間にｍＲＮＡのわずかな増加を示したが、これは、技術の誤差範囲内の変動として解釈することができる。
【００７９】
ＥＤＴＡと併せて室温で保管した血液試料は、３日後に総インターフェロンガンマｍＲＮＡの有意な増加を示した。これは、遺伝子誘導の割合が高いことを示している。３日目以降、試料は、総インターフェロンガンマｍＲＮＡの減少を示した。これは、有意な分解を示している。この例のデータは、室温でＥＤＴＡ処理した全血が安定でなく、試料中の総ｍＲＮＡが、遺伝子誘導および分解の結果として連続的に変化することを実証している。試料中の総ｍＲＮＡの一定の変化は、本来血液試料中にあるｍＲＮＡの精確な決定および分析の妨げとなる。
【実施例６】
【００８０】
この例は、ＥＤＴＡと組み合わせて、室温で保管した全血対照試験試料と、テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび酒石酸の組成物によって安定化させて室温で保管した全血試験試料とで、特定のインターロイキンｍＲＮＡ種および他のｍＲＮＡ種の経時変化を比較する。血液試料は、同一対象から直接得て、すぐにそれぞれの安定化剤と組み合わせた。得られた試料を、同一条件下において室温で保管した。
【００８１】
収集装置は、４％（ｗ／ｖ）テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートと２００ｍＭ酒石酸を含む安定化緩衝液６．９ｍｌが入った、１６×１００ｍｍポリエチレンチューブであった。ドナーから血液試料を収集装置内に直接引き込み、すぐに装置内でテトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび酒石酸と混合した。対照試験試料は、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）バキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）ＥＤＴＡチューブ内に引き込んだ新鮮な血液２．５ｍｌによって調製した。選択した時間間隔で、対照試験試料および試験試料を、前述の実施例のように、定量ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【００８２】
図６〜９は、血液試料中の、特定のインターロイキンｍＲＮＡ種および他のｍＲＮＡ種の量の経時変化を示すグラフである。血液試料の収集直後に、ｍＲＮＡ種の量を測定する標準手順によって試料を分析して基準線を設定した。
【００８３】
試料を室温で保管し、４時間後、８時間後、２４時間後、３日後、および５日後に分析した。図６は、基準線からの変化によって測定した、５日間保管後の、ＥＤＴＡと混合した血液試料中のｍＲＮＡ種の量を示す。測定した特定のｍＲＮＡ種は、水平軸に沿ったグラフ底部で識別される。垂直軸は、ｍＲＮＡ種の量の変化を示し、桁数の変化で測定している。図６に示すように、一部のｍＲＮＡ種は、５日後にほとんどまたは全く変化を示さなかったが、他のｍＲＮＡ種は、有意な増加または減少を示した。増加は遺伝子誘導の結果であり、一方、減少は分解の結果と理解される。
【００８４】
図７のグラフは、ＥＤＴＡで安定化した血液試料に関する、ＩＬ−８およびＩＬ−１０の転写量の変化を示す。転写量は、４時間後、８時間後、２４時間後、３日後、および５日後に測定したものであり、グラフの各棒で示されている。図のように、試料中に存在するＩＬ−８ｍＲＮＡの量は、最初の３日間は遺伝子誘導の結果として一様な割合で増加し、その後分解の結果として減少し始める。対照的に、ＩＬ−１０ｍＲＮＡのレベルは、最初の３日間で減少し、その後、５日目には３日目に比べてわずかな増加を示す。図７に表すデータは、ＥＤＴＡを用いて室温で保管した血液試料の不安定性を実証している。
【００８５】
テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートと酒石酸との組成物によって安定化された血液試験試料を収集直後に分析して、ｍＲＮＡ種の量を測定し、基準線を設定した。試料は、室温（約１８〜２２℃）で保管し、やはり３日後に分析した。その結果を、ｍＲＮＡ種の変化を示す図８のグラフに表す。これらのデータから示されるように、ＥＤＴＡによって安定化した血液試料と比べて、血液試料中のｍＲＮＡ種は、著しく小さい変化を示した。
【００８６】
図９は、４時間後、８時間後、２４時間後、３日後、および５日後に測定した場合の、５日間にわたるＩＬ−８ｍＲＮＡおよびＩＬ−１０ｍＲＮＡの量の変化を示すグラフである。このデータは、図７に記載したＥＤＴＡ全血試料の非常に大きな変化に比べて、ＩＬ−８ｍＲＮＡのレベルの変化が非常に小さいものにすぎないことを示している。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの量は、５日後に緩やかな増加を示すことがわかるが、ＥＤＴＡ全血試料（図７）では非常に大きな変化が測定された。
【００８７】
本発明を実証するために様々な実施形態を選択したが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修正および追加を行えることは当業者によって理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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