(57)【要約】【課題】  ヒト皮膚由来細胞を用いる評価試験によって検証されるコラーゲン産生量向上成分とその用途提供することを課題とし、該コラーゲン産生量向上成分を含む化粧用組成物を提供すること。【解決手段】    本発明によれば、レシチンまたは、レシチンとアスコルビン酸との併用による成分のコラーゲン産生向上作用をヒト皮膚由来の線維芽細胞試験によって検証することで見出し、これら成分とその用途を確立することで前記課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシチンを有効成分として含んでなるコラーゲン産生向上剤。
【請求項２】
レシチンとアスコルビン酸とを有効成分として含んでなる請求項１記載のコラーゲン産生向上剤。
【請求項３】
コラーゲン産生向上作用が検証されたレシチンを有効成分とすることを特徴とする化粧用組成物。
【請求項４】
コラーゲン産生向上作用が検証されたレシチンとアスコルビン酸との混合物を有効成分とすることを特徴とする請求項３記載の化粧用組成物。
【請求項５】
レシチンに含まれるホスファチジルコリンの含有量が、化粧用組成物全量の１〜１５重量％である請求項３または請求項４に記載の化粧用組成物。
【請求項６】
アスコルビン酸の配合量が、化粧用組成物全量の０．１〜２０重量％である請求項４に記載の化粧用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚用化粧料に関し、より詳しくは、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生を活性化する作用を有するコラーゲン産生促進剤、及びこのコラーゲン産生促進剤を配合することによる皮膚老化の予防及び/又は改善作用を有する皮膚用化粧料に関するものである。  
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮及び真皮は、線維芽細胞等の皮膚細胞及び細胞外マトリックスであるコラーゲン等により構成されている。これら皮膚組織間相互作用の恒常性が保たれることによって、皮膚の水分保持、柔軟性、弾力性等が保持されて肌の外見は艶があり、かつ張りもあるみずみずしい状態に維持されている。
【０００３】
しかしながら、加齢等に伴う皮膚老化等によって細胞外マトリックスの主成分であるコラーゲンの産生量が減少と架橋によって弾力低下を起こす。皮膚の保湿性は低下し、角質の剥離をも引き起こし、結果肌のハリを失い、艶を失い、しわ等の肌の老化症状を呈するようになる。このような皮膚の老化によるしわやくすみの増大、弾力低下、艶の消失等には、コラーゲン等の真皮細胞間マトリックスの減少や架橋変性が深く関与していることが知られている。
【０００４】
このため、皮膚の老化防止及び／または皮膚の状態改善等を目的として、皮膚のコラーゲン量を増加させる化粧品や医薬品組成物の開発が進められてきた。例えば、下記特許文献並びに非特許文献に示すようなものがある。
【特許文献１】特開２００４−０７５６４６号公報
【特許文献２】特開平１１−２４６３３３号公報
【特許文献３】特開２００６−１５１８６０号公報
【非特許文献１】CEJB, 1(3), 2006, pp.430-450
【０００５】
上記特許文献１及び２に記載のものは、真皮マトリックス成分安定作用やコラーゲン合成を刺激する作用を有する成分として、アスコルビン酸等を含有させたものが報告されている。しかし、従来の製品の多くはコラーゲン量の分解を抑制することによって皮膚のコラーゲン量を維持するものであった。
【０００６】
一方、特許文献３には、コラーゲンの産生を向上させる化合物を有効成分とするコラーゲン産生向上剤が開示されている。また、非特許文献１には、ショウガ抽出成分がインターロイキン1βに関与したコラーゲンタイプＩＩ遺伝子の発現に影響を与える旨が記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
コラーゲン産生量の向上は、皮膚状態の改善等に有効と考えられるため、このような作用について更なる検討が求められていた。
【０００８】
このような状況下、真皮層線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進して皮膚の老化を防止、改善することのできるコラーゲン産生向上物質を有効成分とする天然物質を提供することが課題であった。また、コラーゲン産生向上作用を有し、且つ皮膚浸透性の優れた皮膚の老化防止や改善に有用な皮膚化粧料を提供することも強く求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、ヒト皮膚由来の線維芽細胞を用いる試験によって、レシチン、またはレシチンとアスコルビン酸との併用による成分のコラーゲン産生向上作用を見出し、該成分を有効成分として含有する皮膚化粧料としての用途展開を可能とする発明をなすに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、前記課題を解決する為、下記のコラーゲン産生向上剤及び皮膚化粧料を提供する。
【００１１】
請求項１の発明は、レシチンを有効成分として含んでなるコラーゲン産生向上剤であり、又、請求項２の発明は、レシチンとアスコルビン酸とを有効成分として含んでなるコラーゲン産生向上剤である。請求項３の発明は、コラーゲン産生量向上作用が検証されたレシチンを有効成分とすることを特徴とする化粧用組成物である。さらに請求項４の発明は、該向上作用が検証されたレシチンとアスコルビン酸との混合物を有効成分とすることを特徴とする化粧用組成物である。請求項５の発明は、レシチンに含まれるホスファチジルコリンの含有量が、化粧用組成物全量の１〜１５重量％である請求項３に記載の化粧用組成物であり、請求項６の発明は、アスコルビン酸の配合量が、化粧用組成物全量の０．１〜２０重量％である請求項４に記載の化粧用組成物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化粧用組成物は、皮膚の線維芽細胞におけるコラーゲン産生を顕著に向上、促進させる作用を有し、皮膚の老化防止および改善、皮膚のハリや艶の維持改善用、又は皮膚の保湿機能の維持改善等として利用可能である。本発明に係る皮膚用化粧料は、レシチンまたは、レシチンとアスコルビン酸との混合物をコラーゲン産生向上剤として化粧用組成物に添加共存させることによる化粧料による皮膚への効果を期待するものであるが、特にレシチンとアスコルビン酸の混合により皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生能の亢進が期待できた。さらにポリオールをレシチンでゲル化した化粧料を試作した結果、ポリオールがクリーム状となり、手にとって肌に伸ばしやすいものとなり、使用感が良好で、保湿感が高まり、高度に硬化した角質を効果的に柔軟化することができ、皮膚の老化を防止、改善することができる。それ故、本発明に係る皮膚用化粧料は、化粧品等の分野で効果的に使用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。本発明のレシチンは、ホスファチジルコリンを主成分とし、天然の動物、植物、微生物など生体に広く分布するもので、肝臓、卵黄、大豆、酵母等に多く含まれることが知られている。レシチンとしては、ホスファチジルコリンの含有量が５５〜６５重量％程度のものがこのましい。この範囲のものは、クリーム状となりやすく、適度の稠度があり、肌につけたときに流れ落ちたりせず、使用感が良好である。天然のレシチンは、Ｌ−α−形のみであるが、それ以外のものも使用可能である。天然のレシチンは酸化しやすく、不安定であるので、使用に際しては、公知の方法により水素添加しておけばよい。
【００１４】
＜化粧用組成物＞
本発明のコラーゲン産生向上剤は、皮膚の老化を改善をすることが出来ると共に、皮膚に適用した場合の安全性に優れている為、皮膚化粧料に配合するのに好適である。本発明の化粧用組成物は、定法に従って作成することができる。例えば、前記コラーゲン産生向上剤を適当な媒体又は担体と共に調整することにより、作成することが出来る。本発明によるコラーゲン産生向上剤の配合量は、皮膚化粧料の種類や抽出物の活性等によって適宜調整することが出来るが、好適な配合比率は標準的なアスコルビン酸を用いる場合、化粧用組成物全体に対して、レシチンが１〜３０重量％であり、最適には、レシチンが５重量％、アスコルビン酸が４重量％である。
【００１５】
本発明に係る化粧用組成物は、基本的には上記のとおりレシチン（ホスファチジルコリン）又は、レシチン（ホスファチジルコリン）とアスコルビン酸とを有効成分として含むものであるが、このうちフォスファチジルコリンの量は、化粧用組成物全量の１〜１５重量％とするのが好ましく、１．５〜５重量％とするのがより好ましい。フォスファチジルコリンの量が多過ぎると、粘度が高くなり過ぎて使用感が悪くなり、少な過ぎると、所望の粘度が得られない。化粧料を使用感の良いクリーム状にするには、上記範囲が好ましい。また、アスコルビン酸の添加量は、化粧用組成物全量の０．１〜２０重量％とするのが好ましく、２〜１０重量％とするのがより好ましい。アスコルビン酸の添加量がこれよりも少ないと、所望の効果が得られない。逆に、多過ぎるのは無駄であり、安定性の面でも好ましくない。
【００１６】
また、本発明の化粧用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、他の成分を配合することが出来る。他の成分としては例えば、美白剤、保湿剤、殺菌・抗菌剤、収斂剤、紫外線吸収剤等があげられる。
【００１７】
本発明の化粧用組成物は、所望に応じて、適当な形態、例えば、液状、乳液状、クリーム状、粉末状、顆粒状等に適宜調整することが出来る。特にクリーム状の化粧品組成物として用いる場合には、例えばグリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等のポリオール類を用いる皮膚用化粧料として使用する場合には、レシチンでゲル化し、これによって皮膚に塗るに適したクリーム状とすることが推奨される。また、ポリオール類だけでゲル化した場合、皮膚に使用する際にクリームが白化する、べたつき感があるといった使用感上の問題があるので、スクワランオイル・オリーブ油・ホホバ油・パラフィン油などのオイル類をあわせて使用することで使用感の改善をはかり、保湿効果も高めることができる。
【００１８】
上記のポリオールを添加することにより、有効成分が皮膚の角質の隅々まで行き渡って、老化した角質を軟質化する化粧料として効果的なものであるが、さらに皮膚用化粧料としての効果を高めるため、ビタミンＢ、ビタミンＥ等や、各種香料等の成分を添加しておくこともできる。また、アスコルビン酸をより安定して配合するために、パルミチン酸アスコルビル等のアスコルビン酸誘導体を使用することができる。さらにまた、ヒノキチオールやフコイダン、サリチル酸等の抗菌作用をもつ成分を添加すれば、角質に存在する真菌や細菌などに対応することも可能である。さらに、グルチルリチン酸等の植物性消炎／保湿成分を配合しておくと、硬化した角質が裂傷して炎症を起こしている状態における鎮静／保湿作用を期待することができる。また、べたつきを防止するため、シリカ、シリコンパウダー、アクリル酸アルキルコポリマー等の粉末を添加することもできる。
【００１９】
また、本発明の化粧用組成物を用いて、化粧水、ローション、トニック、乳液、クリーム、軟膏、パック、口紅、入浴剤、整髪料等の各種化粧品や化粧料を、定法に従って製造する事もできる。
【００２０】
化粧用組成物の適用部位も本発明の効果が奏される範囲内であれば特に限定されず、顔面用、ボディ用、頭髪用等、種々の部位に利用できる。
【００２１】
＜コラーゲン産生向上作用の試験＞
ヒト皮膚由来の線維芽細胞試験を用いるコラーゲン産生量向上作用の検証は以下の評価試験法で実施されるが、この方法について、以下に詳述する。
【００２２】
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞であるCCD-1059SK細胞をカルチャースライドに播種し、前培養を一日行った後、レシチンおよびアスコルビン酸の各試料を添加し24時間培養（本培養）する。その後、カルチャースライド上の細胞を定法により固定したのち、抗Ｉ型コラーゲン抗体により免疫染色をおこない、その染色像を画像としてパソコンに取り込み解析をする。        
【００２３】
レシチンおよびアスコルビン酸の各試料の調製は、それぞれ以下の通りである。即ち、レシチンでは、５〜２0 mg/mlの溶液となるようにエチルアルコールに溶解し、また、アスコルビン酸の場合は、２〜８mg/mlの溶液となるよう超純水に溶解した溶液を試験に供して濃度依存性を評価する。
【００２４】
評価試験で使用される細胞および培地は、以下のとおりである。
細胞：CCD-1059SK（ヒト正常皮膚由来線維芽細胞）[DSファーマメディカル株式会社製]。
培地：10% fetal bovＩne serum (FBS)を含むDMEM培地[日水製薬株式会社製]。
【００２５】
＜評価試験実施の方法＞
以下の手順を標準的な手法として行うが、この方法に準拠して行うことも可能である。培養方法：「前培養」：カルチャースライド（NUNC社製）に細胞数が3 x 104個になるように調整し、10% FBSを含むDMEM培地で24時間培養することによって細胞をスライドに接着させた。「本培養」：10% FBSを含むDMEM培地に交換し、同時に各サンプルを0.22 μの滅菌フイルターを用いて濾過滅菌後、培地1 ml あたり10 μl 添加して24時間培養した。
細胞の形態観察
サンプルを添加して24時間培養後、倒立顕微鏡下で細胞の形態を観察した。
コラーゲン検出法
抗Ｉ型コラーゲン抗体を用いた免疫組織化学的解析についてその手順をフローチャートで以下に表記する。
本培養終了後、カルチャースライドをリン酸バッファー(PBS)で洗浄（5分x 3 回）
↓
4%パラホルムアルデヒド溶液で固定（4℃、１晩）
↓
0.1% TrＩton-X Ｉn PBSで洗浄（5分x 3 回）
↓
3% H2O2でブロッキング（内因性ペルオキシダーゼのブロッキング）（5分）
↓
10% 正常ヤギ血清でブロッキング（非特異的反応のブロッキング）（5分）
↓
一次抗体の反応（60分）
抗Ｉ型コラーゲン抗体（LSL社製）300倍希釈液
↓
PBSで洗浄（5分x 3 回）
↓
二次抗体の反応（30分）
ビオチン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（DAKO社製）400倍希釈
↓
PBSで洗浄（5分 x 3 回）
↓
酵素溶液の反応（30 min）
ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンービオチン複合体（DAKO社製）400倍希釈
↓
PBSで洗浄（5分 x 3 回）
↓
基質溶液の反応（ペルオキシダーゼ発色反応）（5 min）
DAB (3, 3’-ジアミノベンジジンーテトラヒドロクロリド) 溶液
↓
PBSで洗浄（5分 x 3 回）
↓
水溶性封入剤で封入し、標本を作製
【００２６】
次に、評価試験結果の判定法について説明する。まず細胞形態を観察する。この段階においてはそれぞれの試験における異常な形態を示す細胞の有無を観察することで、皮膚線維芽細胞におよぼす毒性などが認められないことを確認する。次いで、Ｉ型コラーゲンの染色を行う（例示の写真を参照）。この結果の見かたであるが、細胞内にコラーゲンが存在すれば黒く染色されるので、黒色が濃いほど皮膚線維芽細胞のコラーゲンの産生が強く行われていることを示す。また、細胞内の染色されていない白い部分（ほぼ円形）は核で、コラーゲンの産生は核の周りにある細胞質で行われる。したがって、核の周りの黒く染色されている部分が濃いほど、コラーゲンの産生量が多いことを示す。
【実施例】
【００２７】
以下、製造例、実施例及び比較例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
＜実施例１〜３及び比較例１、２＞
（１）コラーゲン産生向上作用の評価
ヒト皮膚由来線維芽細胞をもちいて上記成分の相乗効果を免疫組織化学的解析によって検討した。ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（CCD-1059SＫ）を用いて、詳細な説明記載の評価試験実施の方法に従って、各サンプル群のコラーゲン産生量を測定して、得られた標本における陽性反応箇所における染色強度を、ＮＩＨイメージソフトを用いて画像解析によって定量化し、Ｉ型コラーゲンの産生量を解析した。具体的には、上記線維芽細胞の本培養の過程で、各サンプル濃度が表１に記載の所望最終濃度になる様に事前調製した水溶液をDMEM培地1 ml あたり10 μl 添加して後24時間培養した。                      
【００２９】
＜Ｉ型コラーゲンの発現量解析結果＞
以下に各サンプルでの画像解析の結果の例を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2010120885.tif 000003
【００３１】
表中の強度の値は、未添加（比較例2）を１００とした時の各サンプルの染色強度（１スライドにつき細胞20個について測定した平均値）の割合として表わしたものである。
【００３２】
各サンプル群の細胞形態観察像を図1（写真１）に示すが、この細胞形態観察からは、アスコルビン酸添加群、レシチン添加群、および混合群のすべての群で異常な形態を示す細胞は観察されなかった。この事実は、皮膚線維芽細胞におよぼす毒性などは見られないことを示している。また、細胞内にコラーゲンがあれば黒く染色されるため、黒色が濃いほど皮膚線維芽細胞のコラーゲンの産生が強く行われていることを示すことから、アスコルビン酸やレシチン単独の添加によってコラーゲンの産生の亢進は認められることが観察された。更に、アスコルビン酸とレシチンとを共存させることによりコラーゲンの産生が相加的に亢進されていることが確認された。
【００３３】
＜実施例４〜９および比較例３〜４＞
＜化粧料の製造と、評価＞
水素添加レシチンとして２種の大豆レシチン、すなわちフォスファチジルコリン（ＰＣ）含有量２５〜３０重量％の大豆レシチンＡと、ＰＣ含有量５５〜６５重量％の大豆レシチンＢの２種、及び、通常化粧料に使用される他の種々の成分を配合した化粧料を定法により試作した。その内容は表２に示すとおりであり、各成分の配合量の割合は、すべて重量％で表されている。
【００３４】
上記試作した化粧料を実際に皮膚に塗布して、その官能的評価を行った。加えて製剤の経時安定性も評価し、官能評価と総合した結果を総合評価とした。官能評価法としては、１０人(女性)をモニターとして化粧料を使用してもらい、使用後のしっとり感等をアンケート方式で回答を得てそれを集計した。１０人中８人以上が使用感が良かったと答えた場合、「良い」◎、１０人中５人から７人が良かったと回答した場合「やや良い」○、１０人中３人から４人が良いと回答した場合は、「やや悪い」△、と評価した。それ２人以下の場合は「悪い」Ｘ、とした。経時安定性についても同様◎、○、△、Ｘで評価し、これと官能評価とを総合してさらに評価した。その結果は、表２に示すとおりであった。
【００３５】
【表２】
2010120885.tif 000004
【００３６】
これら実施例と比較例に対する所見は以下の通りであった。比較例No.1（比較例３）は、グリセリンを無水ケイ酸にて増粘させたものであるが、のびは良いものの経時で粘度が低下し、安定性に問題があった。比較例NO.2（比較例４）は、グリセリンをデカグリセリンのエステルで増粘させたものだあるが、べたつきがでた。
【００３７】
処方例No1（実施例４）は、グリセリンに水素添加大豆レシチン（ＰＣ含有量２５〜３０％）および無水ケイ酸を配合してクリーム状にしたものであるが、経時でクリームの粘度が低下しやや安定性に問題があった。処方例No.2（実施例５）は、ＰＣ含有量の多い（５５〜６５％）大豆レシチンでグリセリンを乳化することによって、処方例１よりもなめらかなクリーム状になり、肌にのばしやすかった。しかし、のばしている途中でクリームが白化するのでやや浸透感に劣った。処方例No.3（実施例６）は、処方例２にオイルを添加することで、肌にのばす際のクリームの白化がおさえられ、べたつきも改善された。処方例No.4（実施例７）は，アスコルビン酸の配合量を増やし、より高いコラーゲン産生効果をめざしたが、人により肌にぴりつきを感じる場合があった。処方例No.5（実施例８）では，しっとりしたのびとすぐれた浸透感が得られた。処方例No.6（実施例９）は、処方例No.5にアスコルビン酸を加えてより高いコラーゲン産生効果をめざしたが、経時でクリームの粘度がやや低下する傾向があった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明に係る皮膚用化粧料は、化粧品等の分野で効果的に使用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】各サンプル群のヒト由来線維芽細胞の細胞形態観察像を示す図面（写真１）である。
【図１】
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