(57)【要約】【課題】５−アミノレブリン酸−光線力学的療法（ＡＬＡ−ＰＤＴ）又は５−アミノレブリン酸−光線力学的診断（ＡＬＡ−ＰＤＤ）の施術前に、生体内に投与する５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の有効性の判定方法、及びそれらのためのキットを提供すること。【解決手段】がん患者から採取した生体試料における、ＰＥＰＴ１（ペプチドトランスポーター１）の発現量が多い場合、また、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を検出する場合に、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与することが、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤに有効であることを確認した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸−光線力学的療法（ＡＬＡ−ＰＤＴ）又は５−アミノレブリン酸−光線力学的診断（ＡＬＡ−ＰＤＤ）の施術前に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与することの有効性を予測する方法であって、
がん患者から採取した生体試料における、ＰＥＰＴ１（ペプチドトランスポーター１）の発現量の多寡を指標として、ＰＥＰＴ１の発現量が多いときに、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類がＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定することを特徴とする有効性予測方法。
【請求項２】
がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異の有無を指標とし、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を検出しないときに、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定することを特徴とする、請求項１記載の有効性予測方法。
【請求項３】
ＰＥＰＴ１の発現量を、ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより測定することを特徴とする請求項１又は２記載の有効性予測方法。
【請求項４】
ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、又はリアルタイムＰＣＲ法により検出することを特徴とする請求項３記載の有効性予測方法。
【請求項５】
ＰＥＰＴ１の発現量を、ウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法により測定することを特徴とする請求項１又は２記載の有効性予測方法。
【請求項６】
がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を、１１７〜１４２番目のコドン、１７１〜１８１番目のコドン、２３４〜２５８番目のコドン又は２７０〜２８６番目のコドンにおいて検出することを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の有効性予測方法。
【請求項７】
がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を、１７３番目、２４５番目又は２７３番目のコドンにおいて検出することを特徴とする請求項６記載の有効性予測方法。
【請求項８】
がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を、ダイレクトシークエンシング法、ＭＡＳＡ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＤＮＡ  ＦＩＳＨ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、又はＤＮＡ−ＦＩＳＨ法により検出することを特徴とする請求項２〜７のいずれか記載の有効性予測方法。
【請求項９】
さらに、がん患者から採取した生体試料に、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与した後における、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質の発現量の多寡を指標として、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質の発現量が多いときに、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の有効性予測方法。
【請求項１０】
ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質を、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３抗体を用いて検出することを特徴とする請求項９記載の有効性予測方法。
【請求項１１】
ＰＥＰＴ１の発現量を測定する試薬を備えたことを特徴とする、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの施術前に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与することの有効性を判定するためのキット。
【請求項１２】
ＰＥＰＴ１のｍＲＮＡを検出するためのプライマー対、若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
ＰＥＰＴ１に特異的に結合する抗体、又は抗体の標識物を備えたことを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を検出するための、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子の１１７〜１４２番目のコドン、１７１〜１８１番目のコドン、２３４〜２５８番目のコドン又は２７０〜２８６番目のコドンを含む１又は２以上の遺伝子をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを備えたことを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
さらに、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３を検出するための、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３抗体を備えたことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−アミノレブリン酸類投与による光線力学治療の有効性を手術前に判断しうる有効性予測方法に関し、さらに詳しくは、５−アミノレブリン酸類投与後のＰＥＰＴ１発現とｐ５３の変異の有無を確認することを特徴とする５−アミノレブリン酸−光線力学的療法や５−アミノレブリン酸−光線力学的診断の手術前有効性予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内のがんによる死亡率の年次推移は、２０年前から大きな変化が見られていない。このことは、現在の治療だけでは、がんを克服することが困難であることを示している。がんという疾患を克服するためには、全身に存在するがん細胞や目に見えない微小ながんの転移に適用可能で、進行がん（再発がん、転移がん）を食い止める必要があるが、今後高齢化社会を迎えるにあたり、生活の質（Quality of Life：ＱＯＬ）を高いレベルで維持できる新しい治療技術の普及が急務であり、その要請はますます強くなると考えられる。
【０００３】
光線力学的療法（Photodynamic Therapy：以下「ＰＤＴ」ともいう。）は、光に反応する化合物を投与し、光を照射することにより標的箇所を治療する方法であり、治療が簡便で、生体侵襲性が小さく、臓器温存が可能であることなどから、近年、ＱＯＬを考慮した新たながん治療法として注目されている。ＰＤＴは、投与されたポルフィリン関連化合物が直接腫瘍組織や新生血管へ特異的に集積した後、レーザー光などの光の励起により生ずる一重項酸素が細胞を変性、壊死に陥らせることにより治療効果を発揮するものである。
【０００４】
現在、ＰＤＴは、早期肺がん（病期０期又は病期Ｉ期肺がん），表在型早期胃がん，表在型食道がん，子宮頸部初期がん及び異形成に対して保険適用されている。がん治療を目的に国内で承認されている光増感剤にはヘマトポルフィリン誘導体のポルフィマーナトリウム（商品名：フォトフリン）や、植物クロロフィル由来のタラポルフィンナトリウム（商品名：レザフィリン）がある。ポルフィマーナトリウムは代謝が遅く、表皮組織付近に集積しやすい性質を持っているため、日光過敏症をおこす。患者は治療後約１ヵ月間、遮光された環境で生活する必要がある。タラポルフィンナトリウムは皮膚への残留性が低く、日光過敏症がより軽度で、組織透過性のよりよい長波長側(６６４ｎｍ)でのレーザー光で励起可能であるという特徴を有している。その他、がん治療以外にも、ベルテポルフィン(ビスダイン)が滲出型加齢性黄班変性症による脈絡膜新生血管に対して優れた治療効果を持つことが証明され、国内においては２００３年１０月に承認されている。
【０００５】
また、５−アミノレブリン酸（以下「ＡＬＡ」ともいう）は動物や植物や菌類に広く存在する、生体内に含まれる天然アミノ酸の一種であり、クロロフィルやヘムの共通前駆体として細胞内で代謝を受ける。ＡＬＡは他のポルフィリン関連化合物と同様に腫瘍組織に選択的に集積する性質を有するが、それ自体には光感受性はなく、細胞内でヘム生合成経路の一連の酵素群によりプロトポルフィリンＩＸ（以下「ＰｐＩＸ」ともいう）に代謝活性化され、がん細胞内で蓄積した後に、光線を照射すると細胞内で一重項酸素を生じ、細胞を変成・壊死させることができるとされており、５−アミノレブリン酸−光線力学的療法（以下「ＡＬＡ−ＰＤＴ」ともいう）の研究が進められている。ＰｐＩＸは４０５ｎｍの励起光を受けると、６３５ｎｍにピークを持つ赤色蛍光を発することから、光線力学的診断（Photodynamic diagnosis：以下「ＰＤＤ」ともいう。）による腫瘍の診断において、ＡＬＡを用いる５−アミノレブリン酸−光線力学的診断（以下「ＡＬＡ−ＰＤＤ」ともいう、特許文献１参照）への応用が可能であり、現在、ＡＬＡは脳腫瘍や膀胱がんの診断、貧血予防やアトピー対策などでの用途が期待されている。
【０００６】
一方、ペプチドトランスポーター１（以下「ＰＥＰＴ１」ともいう）は、１９９４年以降ウサギ、ヒト及びラットの小腸からクローニングされ（例えば、非特許文献１〜４参照）、ＰＥＰＴ１を介した輸送研究が急速に発展してきた。ヒトＰＥＰＴ１は、小腸上皮細胞の刷子縁膜側に高い発現が認められるプロトン共輸送型ペプチドトランスポーターであり（例えば、非特許文献５参照）、小腸からの栄養吸収のために短鎖ペプチドを輸送するのみならず、βラクタム抗生物質、抗がん剤ベスタチン、抗ウイルス薬バラシクロビルなど、多様な薬剤の消化管吸収に大きな役割を果たしていることで注目を集めている。
【０００７】
他方、ｐ５３は全長３９３アミノ酸からなり、Ｎ末端ドメイン、コアドメイン、Ｃ末端ドメインの３つの領域から構成されているペプチドであり、コアドメインはＤＮＡ結合に関与する領域で、がんに認められる変異のほとんどがこの領域に集中していることが知られている。ｐ５３タンパク質は多彩な活性によって遺伝子の異常から生体を守る機能を担っており、その主な活性としては、遺伝子に異常が発生した細胞における、遺伝子転写制御を介した細胞周期進行の制御・遺伝子修復酵素の活性化・アポトーシス誘導能等を挙げることができる。ｐ５３遺伝子自体に突然変異が生じるとこれらのｐ５３タンパク質の機能が欠損し、腫瘍の発生に至るというメカニズムが考えられている。ヒトがん細胞におけるｐ５３遺伝子の変異は、大腸・胃・乳腺・肺・脳・食道など多くのヒトの腫瘍においてｐ５３遺伝子が突然変異を起こしていることが見い出され、変異したｐ５３タンパク質の異常な蓄積が多くの腫瘍組織において観察されている。さらにがん高発家系においてｐ５３遺伝子に変異が見られることが報告されている(Li-Fraumeni症候群)。また、ＤＮＡに損傷が起こると、リン酸化酵素であるＡＴＭ（ataxia telangiectasia, mutated）が活性化されて、ｐ５３のセリン１５をリン酸化することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２７３１０３２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 270, 6456-63, 1995
【非特許文献２】Nature 368, 563-6, 1994
【非特許文献３】J. Pharma. Exp. Ther. 275, 1631-7, 1995
【非特許文献４】Biochim. Biophys. Acta, 1305,34-8, 1996
【非特許文献５】Pharm. Res. 13, 963-77, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤについて、広く研究・開発が行われるようになったが、ＡＬＡを生体内に投与しても、がんの種類によっては、がん細胞に取り込まれるＡＬＡ量に差が生じて、がん細胞内でＡＬＡが変換されたＰｐＩＸにレーザー光を照射した場合に、がん細胞を死滅させる効果に差が生じるという問題があった。本発明の課題は、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの施術前にＡＬＡの有効性を予測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため、ＡＬＡをがん細胞に取り込む、細胞表面に存在するトランスポーターの発現と、がん抑制タンパク質ｐ５３の変異との関係に注目して鋭意研究を重ねた結果、がん細胞から、ｍＲＮＡを採取し、既に知られているＰＥＰＴ１の塩基配列（ヒトＰＥＰＴ１：GenBank NM_005073、増幅産物４０２ｂｐ）から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー： 5’-GAGGGCCAGGAGAAACAAAGAAACAG-3’(forward)(配列番号１)及び5’-CAGGAACATCACCCTCGTAACCATCT-3’(reverse)(配列番号２)を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、ＰＥＰＴ１の発現が確認された場合に、ＡＬＡが効率よくがん細胞に取り込まれ、ＡＬＡ−ＰＤＴ及び／又はＡＬＡ−ＰＤＤに効果があることを確認し、また、がん細胞におけるがん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子配列を決定し、がん抑制タンパク質ｐ５３が変異せずに野生型として存在する場合に、ＡＬＡの投与が、ＡＬＡ−ＰＤＴ及び／又はＡＬＡ−ＰＤＤに有効であることを見い出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、がん細胞におけるｐ５３の１５番目のセリンがリン酸化されている場合に、ＡＬＡの投与がＡＬＡ−ＰＤＴ及び／又はＡＬＡ−ＰＤＤに効果があることを見い出した。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１２】
すなわち本発明は、［１］５−アミノレブリン酸−光線力学的療法（ＡＬＡ−ＰＤＴ）又は５−アミノレブリン酸−光線力学的診断（ＡＬＡ−ＰＤＤ）の施術前に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与することの有効性を予測する方法であって、がん患者から採取した生体試料における、ＰＥＰＴ１（ペプチドトランスポーター１）の発現量の多寡を指標として、ＰＥＰＴ１の発現量が多いときに、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類がＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定することを特徴とする有効性予測方法や［２］がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異の有無を指標とし、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を検出しないときに、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定することを特徴とする、上記［１］記載の有効性予測方法に関する。
【００１３】
また本発明は、［３］ＰＥＰＴ１の発現量を、ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより測定することを特徴とする上記［１］又は［２］記載の有効性予測方法や、［４］ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、又はリアルタイムＰＣＲ法により検出することを特徴とする上記［３］記載の有効性予測方法や、［５］ＰＥＰＴ１の発現量を、ウエスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法により測定することを特徴とする上記［１］又は［２］記載の有効性予測方法や、［６］がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を、１１７〜１４２番目のコドン、１７１〜１８１番目のコドン、２３４〜２５８番目のコドン又は２７０〜２８６番目のコドンにおいて検出することを特徴とする上記［２］〜［５］のいずれか記載の有効性予測方法や、［７］がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を、１７３番目、２４５番目又は２７３番目のコドンにおいて検出することを特徴とする上記［６］記載の有効性予測方法や、［８］がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を、ダイレクトシークエンシング法、ＭＡＳＡ法、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法、ＤＮＡ  ＦＩＳＨ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、又はＤＮＡ−ＦＩＳＨ法により検出することを特徴とする上記［２］〜［７］のいずれか記載の有効性予測方法や、［９］さらに、がん患者から採取した生体試料に、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与した後における、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質の発現量の多寡を指標として、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質の発現量が多いときに、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定することを特徴とする上記［１］〜［８］のいずれか記載の有効性予測方法や、［１０］ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質を、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３抗体を用いて検出することを特徴とする上記［９］記載の有効性予測方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、［１１］ＰＥＰＴ１の発現量を測定する試薬を備えたことを特徴とする、ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの施術前に５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）類を投与することの有効性を判定するためのキットや、［１２］ＰＥＰＴ１のｍＲＮＡを検出するためのプライマー対、若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする上記［１１］記載のキットや、［１３］ＰＥＰＴ１に特異的に結合する抗体、又は抗体の標識物を備えたことを特徴とする上記［１１］記載のキットや、［１４］がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異を検出するための、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子の１１７〜１４２番目のコドン、１７１〜１８１番目のコドン、２３４〜２５８番目のコドン又は２７０〜２８６番目のコドンを含む１又は２以上の遺伝子をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを備えたことを特徴とする上記［１１］記載のキットや、［１５］さらに、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３を検出するための、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３抗体を備えたことを特徴とする上記［１１］〜［１４］のいずれか記載のキットに関する。
【発明の効果】
【００１５】
ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの施術前に５−アミノレブリン酸類を投与することの有効性を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細胞の種類によるＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２の発現を示す図である。
【図２】ダイレクトシークエンシング法によるｐ５３遺伝子の変異の検出の様子を示す図である。
【図３】ＡＬＡ−ＰＤＴにより誘導されるｐ５３の安定性とｓｅｒ１５のリン酸化に対するｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−αの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの施術前にＡＬＡ類を投与することの有効性を予測する方法としては、がん患者から採取した生体試料における、ＰＥＰＴ１（ペプチドトランスポーター１）の発現量の多寡を指標として、ＰＥＰＴ１の発現量が多いときに、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定する有効性予測方法であれば特に制限されないが、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子変異の有無を検出し、遺伝子変異を検出しない場合、すなわち、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子が野生型である場合に、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤに有効であると判定する有効性予測方法を併用することが好ましい。
【００１８】
上記ＡＬＡ−ＰＤＴは、光に反応する化合物を投与し、光を照射することにより標的箇所を治療するＰＤＴを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を投与し、色素生合成経路を経て誘導されたＰｐＩＸががん細胞内に特異的に集積し、がん細胞内に蓄積したＰｐＩＸが、光照射されることにより周囲の酸素分子を光励起し、その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力による殺細胞効果を有することを利用するがんの治療方法であり、上記ＡＬＡ−ＰＤＤは、腫瘍の治療（手術）において、腫瘍の箇所を判断するＰＤＤを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を投与し、色素生合成経路を経て誘導されたＰｐＩＸががん細胞内に特異的に集積し、がん細胞内に蓄積したＰｐＩＸが青紫色の光（例えば４０５ｎｍ±１０ｎｍ）をあてると赤色の蛍光（例えば６３６ｎｍ±５ｎｍ）を発することを利用して、腫瘍の浸潤範囲を評価することにより、切除すべき腫瘍の箇所を判断する方法である。
【００１９】
本発明の有効性予測方法に用いられるがん患者から採取した生体試料としては、がん患者の骨、脳組織、乳房組織、結腸組織、筋組織、神経組織、卵巣組織、前立腺組織、網膜組織、皮膚組織等のがん細胞や、脳脊髄液、心膜液、腹腔液、唾液、血清、尿等を含む体液の他、新生物を有することが疑われる任意の組織や、新生物を有すると考えられる任意の組織を挙げることができ、がん患者から採取する生体試料は標準的手順を用いて取り出すことができ、例えば、バイオプシーによって組織を取り出すことができる。
【００２０】
本発明におけるＰＥＰＴ１の発現量を測定する方法としては、がん患者から採取した上記生体試料において、ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法や、ＰＥＰＴ１タンパク質の発現量を測定する方法を挙げることができる。
【００２１】
上記ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、リアルタイムＰＣＲ法等を挙げることができる。これらの方法に用いられるプローブやプライマーは、ＰＥＰＴ１遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計し、適当なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて適宜作製することができる。
【００２２】
上記ＲＴ−ＰＣＲ法としては、当業者において周知の技術を用いて容易に行なうことができるが、具体的には、被検者のがん細胞中のＰＥＰＴ１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又はその断片に対して相補的な一本鎖ＤＮＡを合成し、該ＤＮＡ又はその断片を特異的に増幅することができるプライマーにより該ＤＮＡ又はその断片をＰＣＲ増幅した後、増幅産物を電気泳動などで検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法については、例えば、Ishikawaら, J.Clin. Oncol., 28:723-728, 1998などを参照して行なうこともできる。また、ＦＩＳＨ（Fluorescent in situ hybridization）法により、被検者のがん細胞中のＰＥＰＴ１遺伝子の転写状態を検出することができる。
【００２３】
上記ノーザンハイブリダイゼーション法におけるハイブリダイゼーションとしては、例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning, A laboratory manual）、第３版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載の方法で行うことができる。使用されるプローブの標識化に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素、スピン試薬を例示することができる。上記放射性同位元素としては、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕、〔５９Ｆｅ〕を例示することができる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素を例示することができ、上記蛍光物質としては、シアニン蛍光色素（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートを例示することができ、上記発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリンを例示することができる。
【００２４】
上記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、細胞内のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし解析する方法を挙げることができる。リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Molecular Probes社製）ＧｒｅｅｎＩや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Applied Biosystems社製）プローブ等を挙げることができる。
【００２５】
前記ＰＥＰＴ１タンパク質の発現量を測定する方法としては、がん患者から採取した生体試料において、ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法を用いて測定する方法を例示することができる。
【００２６】
上記ウエスタンブロット法としては、タンパク質を、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗体により検出する方法を挙げることができ、フィルターへ付着したタンパク質はこれらタンパク質に対する抗体をプローブとすることによって同定できる。抗体検出には標識化二次抗体法を用いることができる。ゲルからフィルターへのトランスファーは多くの場合エレクトロブロッティングによって行われる。ＰＥＰＴ１がコードするタンパク質に対する抗体はモノクローナル抗体のほかポリクローナル抗体でもよく、これらの抗体は常法により作製することができる。
【００２７】
上記ＥＬＩＳＡ法としては、サンドイッチ法（非競合法）と競合法の二つを挙げることができるが、サンドイッチ法によれば、マイクロプレートのウェルやプラスチックチューブなどの固相に、本発明におけるＰＥＰＴ１等の、目的物質に対する抗体をあらかじめ結合させておき、これにサンプルを添加してサンプル中の目的物質を抗原抗体反応により固相に結合させ、夾雑物を洗い流した後、酵素標識した第二の抗体を添加すると再度抗原抗体反応が起きることで、固相化抗体−目的物質−酵素標識抗体のサンドイッチ構造が構築され、その後遊離の酵素標識抗体を洗い流し、発色基質を添加することで、サンドイッチ構造の量（すなわちサンプル中の目的物質量）に比例して生起する発色反応により目的物質量を定量することができる。一方、競合法によれば、あらかじめ目的物質に対する抗体を結合させた固相に、サンプルと酵素標識抗原を添加して抗原抗体複合体を形成させ、固相に結合しなかった酵素標識抗原を洗い流した後に発色基質を添加し、生成した発色物質の吸光度を吸光度計で測定することによりサンプル中の目的物を定量することができる。
【００２８】
本発明におけるｐ５３タンパク質遺伝子の変異を検出する方法としては、１塩基置換（点突然変異）等の遺伝子変異部位を検出することができる方法であれば特に制限されないが、かかる変異を野生型のがん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子の塩基配列と上記ｐ５３タンパク質遺伝子の塩基配列とを対比することにより見い出すために、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの合成を塩基特異的に停止させるジデオキシ法等の、公知のダイレクトシークエンシング法を好適に例示することができる。また、特定位置の塩基置換だけを検出する場合に有用な、２０塩基の合成オリゴヌクレオチドと標的塩基配列とのハイブリッド形成の有無を利用したアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法（ＭＡＳＡ法）（Hum. Mutation 2, 112-117, 1993）や、ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅する際に、その一端にＧＣに富んだ塩基配列（ＧＣクランプ）をつけ、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis：ＤＧＧＥ）を行って１塩基置換を検出する方法（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 232-236, 1989）や、特定の遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅して得られた増幅産物を試料ＤＮＡとして、２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖に解離し、熱変性させた一本鎖ＤＮＡが僅かな塩基配列の違いにより高次構造に変化することを応用したＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Single Strand Conformation Polymorphism：一本鎖コンフォメーション多型解析法）や、塩基配列特異的プローブ（ＳＳＯＰ）を用いたハイブリダイゼーション法（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法）や、ある領域をＰＣＲ法で増幅した後、点突然変異が生じた部位を切断部位と認識する制限酵素で処理して点突然変異を生じなかったＤＮＡとはサイズの違ったアリルとして検出するＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（特開平５−３０８９９９号公報）や、クローン化された遺伝子やＤＮＡ断片を非アイソトープ化合物で標識後、スライドグラス上の染色体ＤＮＡとハイブリダイゼーションし、その分子雑種形成部位を蛍光シグナルとして直接染色体上に検出する方法であるＤＮＡ  ＦＩＳＨ法（ＤＮＡ fluorescence in situ hybridization）等を用いることができる。
【００２９】
かかる塩基配列の決定により見い出される本発明におけるがん抑制タンパク質ｐ５３としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５３７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができ、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００５４６で表される塩基配列を有する遺伝子）の変異としては、野生型の（正常な）がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子のＤＮＡの塩基配列において、少なくとも１の塩基の変異の結果、アミノ酸配列レベルで野生型のがん抑制タンパク質ｐ５３をコードする遺伝子とはいえなくなる遺伝子変異を挙げることができ、ここにおける塩基の変異の種類としては、当該塩基の他の塩基への置換や、当該塩基の欠失や、当該塩基の配列部位への他の塩基の挿入を例示することができる。かかる遺伝子変異の存在する位置としては、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子の中央部のＤＮＡ結合ドメインを含むコアドメイン（１０２〜２９２番目のコドン）における、ホットスポットと呼ばれる変異頻度のきわめて高い４ヶ所の保存領域であるII;１１７〜１４２番目のコドン、III;１７１〜１８１番目のコドン、IV;アミノ酸コドン２３４〜２５８番目のコドン、V;２７０〜２８６番目のコドンを例示することができ、具体的には、２４５番目のコドンにおいて見い出される、塩基配列ＧＧＣがＧＡＣに変異することによるグリシン（Ｇｌｙ）からアスパラギン酸（Ａｓｐ）へのアミノ酸の変異や、２７３番目のコドンにおいて見い出される、塩基配列ＣＧＴがＣＡＴに変異することによるアルギニン（Ａｒｇ）からヒスチジン（Ｈｉｓ）へのアミノ酸の変異（Proc. Natl. Acad Sci. USA. 87 : 7555 -7559, 1990）や、１７３番目のコドンにおいて見い出される、バリン（Ｖａｌ）からメチオニン（Ｍｅｔ）へのアミノ酸の変異(Gut. 44:366-71, 1999)等を挙げることができる。
【００３０】
本発明の有効性予測方法において、がん患者から採取した生体試料において、ＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤ施術前に、１５番目のセリンの位置でリン酸化しているがん抑制タンパク質ｐ５３を検出することで、ＡＬＡがＡＬＡ−ＰＤＴに有効であると判断する方法を併用することが好ましい。ｐ５３はＤＮＡ損傷、ＵＶ照射、化学療法剤や放射線処理などによるストレス応答によって活性化を受け、細胞をアポトーシスに導く。活性化される前のｐ５３タンパクの１８〜２６番目の領域にはユビキチンリガーゼのＭＤＭ２タンパクが結合し、ユビキチン−プロテアソーム系によるｐ５３の分解が促進され、不活性化されている。ストレスに応答した細胞ではＡＴＭ(放射線によるＤＮＡの二本鎖切断に反応)やＡＴＲ（紫外線と反応)等のリン酸化酵素が活性化し、ｐ５３の１５番目のセリンがリン酸化される。この１５番目のセリンのリン酸化はｐ５３の安定化や転写活性を亢進させると考えられている。１５番目のセリンの位置でリン酸化しているがん抑制タンパク質ｐ５３の検出方法としては、前記ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法をあげることができる。
【００３１】
上記ＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤにおいて投与されるＡＬＡ類としては、ＡＬＡ若しくはその誘導体又はこれらの塩が含まれ、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるＡＬＡは、式ＨＯＯＣ−（ＣＨ2)2−（ＣＯ）−ＣＨ2−ＮＨ2で表されるアミノ酸の一種であり、例えば特開平４−９３６０号公報等に記載された化学合成法や、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができ、粗精製物は、免疫機能向上に対して有害な物質を含まない限り分離精製することなくそのまま用いることができる。
【００３２】
上記ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡの誘導体としては、ＡＬＡのエステル基とアシル基を有するものを挙げることができ、好ましくはメチルエステル基とホルミル基、メチルエステル基とアセチル基、メチルエステル基とｎ−プロパノイル基、メチルエステル基とｎ−ブタノイル基、エチルエステル基とホルミル基、エチルエステル基とアセチル基、エチルエステル基とｎ−プロパノイル基、エチルエステル基とｎ−ブタノイル基の組合せを例示することができる。
【００３３】
また、ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等を挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用はＡＬＡ及びその誘導体の場合と同一である。以上のＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、いずれかを単独で又は２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３４】
本発明のＡＬＡ類の有効性を判定するためのキットとしては、ＰＥＰＴ１の発現量を測定する試薬を備えたＡＬＡ−ＰＤＴ又はＡＬＡ−ＰＤＤの施術前にＡＬＡ類を投与することの有効性を判定するためのキットであれば特に制限されず、例えば、ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのプライマー対、若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットや、ＰＥＰＴ１の発現量を測定するためのＰＥＰＴ１に特異的に結合する抗体、抗体の標識物等を備えたキットや、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子の変異を検出するための、がん抑制タンパク質ｐ５３の遺伝子の１１７〜１４２番目のコドン、１７１〜１８１番目のコドン、２３４〜２５８番目のコドン、２７０〜２８６番目のコドン等に位置する１又は２以上の遺伝子をコードする塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを備えたキットを挙げることができ、さらに、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３タンパク質を検出するための、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｅｒ１５ｐ５３抗体を備えるキットが好ましく、これらのキットを用いることにより、がん治療における５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の有効性をＡＬＡ−ＰＤＴ、及び／又は、ＡＬＡ−ＰＤＤの施術前により有効に予測することができる。
【００３５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（細胞の種類によるＡＬＡ−ＰＤＴ効果の違い）
【００３７】
ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５、ヒト胃がん細胞株ＫＫＬＳ、ヒト胃がん細胞株ＴＭＫ−１、及びヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９の各細胞株を３５ｍｍディッシュに２×１０５個播種し、１６時間後ＡＬＡ塩酸塩（コスモバイオ社製）最終濃度２００μＭを添加し、６時間後にＤＬＤ−Ｒ２レーザー照射装置（ミワテック）を用いて、２００ｍＷ、５ｍｉｎ、２１．６Ｊ／ｃｍ２相当を照射してＡＬＡ−ＰＤＴを行った。照射２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ溶液にクリスタルバイオレット溶液（0.5% crystal violet in 25% methanol）を添加し、室温にて５分反応させた。Crystal violet溶液を捨て、流水で洗い、２％デオキシコール酸ナトリウム溶液に溶解させ、室温で１０分放置した。イムノリーダー（日本インターメッド社製）を用いて６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、以下の式を用いて細胞増殖抑制率（inhibition ratio: IR）を算出した。
細胞増殖抑制率（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００
（但し、Ｔは各濃度における処理群の平均吸光度、Ｃは対照群の平均吸光度）
結果を以下の表１に示す。
【００３８】
【表１】
2010259353.tif 000002
【００３９】
次に、各薬剤濃度におけるＩＲ値を片対数グラフにプロットし、容量反応曲線よりＩＣ５０値を求めた。その結果を表２に示す。各細胞腫でＩＣ５０値に差が認められた。特にＭＫＮ−４５では、低濃度でＩＲが高かった。
【００４０】
【表２】
2010259353.tif 000003
【００４１】
［結果］
ＡＬＡ−ＰＤＴ最終濃度２００μＭを添加した場合、ＡＬＡ−ＰＤＴの効果は、ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５において最も大きく、ヒト胃がん細胞株ＴＭＫ−１においては最も小さいことを確認した。
【実施例２】
【００４２】
（ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡの検出）
実施例１で用いた細胞株から全ｍＲＮＡを採取し、ヒトＰＥＰＴ１遺伝子[GenBank:SLC15A1 NM_005073]又はヒトＰＥＰＴ２遺伝子[GenBank:SLC15A2 NM_021082]中の特定の配列を増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＰＥＰＴ１遺伝子又はＰＥＰＴ２遺伝子の断片を増幅した。 
ＰＥＰＴ１遺伝子に対するプライマー：5’-GAGGGCCAGGAGAAACAAAGAAACAG-3’(forward)(配列番号１)及び5’-CAGGAACATCACCCTCGTAACCATCT-3’(reverse)(配列番号２)
（増幅産物４０２ｂｐ）。
ＰＥＰＴ２遺伝子に対するプライマー：
5’-AGCCATGAATCCTTTCCAGAAAAATGAGTC-3’(forward)(配列番号３)及び5’-AATCAAGCTCCCTGCATTGATGGAC-3’(reverse)(配列番号４)
（増幅産物５９５ｂｐ）。
【００４３】
さらに、全ｍＲＮＡ量について、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて各組織におけるβ−アクチンレベルを測定することにより標準化した。
β−アクチン遺伝子[GenBank:X00351]に対するプライマー：5’-GAAAATCTGGCACCACACCTT-3’(forward)(配列番号５)及び5’-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’(reverse)(配列番号６)
（増幅産物５９１ｂｐ）。
結果を図１に示す。
【００４４】
［結果］
実施例１でＡＬＡ−ＰＤＴで用いた細胞株のうち、ＩＣ５０値の低い細胞ほど、ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量が高かったことが示された（図１参照）。このことは、ＰＥＰＴ１の発現が高いほどＡＬＡの取込みが多く、ＡＬＡ−ＰＤＴの効果が大きいものと示唆された。
【実施例３】
【００４５】
ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡ発現とＡＬＡ取込み量との関連性を明らかにするため、実施例１で用いた細胞株において、ＡＬＡを添加後の細胞内におけるＰｐＩＸ量をＨＰＬＣ法により測定し、ＰＥＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量と比較した。各種ヒトがん細胞１ｘ１０７ｃｅｌｌｓを１５ｃｍディッシュに播種し、２４時間後２００μＭのＡＬＡを培地に添加した。培養４時間後に細胞を回収し、ＨＰＬＣにより細胞内ＰｐＩＸを測定し、ＰｐＩＸを算出した。結果を以下の表３に示す。
【００４６】
【表３】
2010259353.tif 000004
【００４７】
［結果］
ＰＥＰＴ１の発現を認めたＭＫＮ−４５において高濃度のＰｐＩＸが検出され、ＡＬＡ取込み量はＰＥＰＴ１の発現量に相関するものと示唆された。
【実施例４】
【００４８】
（各細胞における変異ｐ５３変異）
がん細胞におけるｐ５３変異の解析では、まずアミノ酸コード領域内のホットスポットを含むｃＤＮＡ（GenBank:NM_000546）断片をＲＴ−ＰＣＲにより作製し、ダイレクトシークエンシング法によりその塩基配列を決定した。ＤＮＡの塩基配列は、Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（Amersham Biosciences社製）を用いて解析した。プラスミドＤＮＡ２μｇにreaction buffer３．５μＬ、２μＭプライマー２μＬ、Thermo Sequenase  ＤＮＡポリメラーゼ２μＬを添加し、蒸留水で全量を３１．５μＬに調製し、反応混合溶液とした。予め１μＬずつ分注しておいたＤＮＡ／ｄｄＡＴＰ−ｍｉｘ、ＤＮＡ／ｄｄＣＴＰ−ｍｉｘ、ＤＮＡ／ｄｄＧＴＰ−ｍｉｘ、及びＤＮＡ／ｄｄＴＴＰ−ｍｉｘに反応混合溶液を７μＬずつ添加した。ＰＣＲ反応は、９４℃にて３分間の加熱後、９４℃にて５０秒、５７℃にて５０秒、７２℃にて２分を３２回繰り返した。反応終了後、各反応チューブに１０ｍｇ／ｍＬグリコーゲン溶液２μＬ、７．５Ｍ ammonium acetate ２μＬ、氷冷エタノール３０μＬを添加し、よく撹拌し、氷中に２０分間インキュベートした。４℃で１２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心した後、上清を捨てた。２００μＬの７０％氷冷エタノールを添加し、４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を捨てた後、乾燥させた。その後、６μＬのloading bufferを添加し、７０℃にて３分間の熱変性を行った。ＳＥＱ４×４ personal sequencing system（Amersham Biosciences社製）を用いて１,５００Ｖにて、４５分間の泳動後、ＳＥＱ４×４ Basecaller software（Amersham Biosciences）を用いてＤＮＡ塩基配列の解析を行った。ホットスポットを含む領域のＤＮＡ断片の作製に用いたプライマーは、
p53-37seq 
(5’-ttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtc-3’)(forward)(配列番号７)
及び、
p53-2seq 
(5’-gcggagattctcttcctctgtgcgccggtctctccca-3’)(reverse)(配列番号８)であった。
また、塩基配列の決定には以下のプライマーを用いた；
p53-37seq
(5’-ttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtc-3’)(forward)(配列番号９)、
p53-seq5
(5’-GATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCT-3’)(forward)(配列番号１０)、
p53-1seq
(5’-acctgccctgtgcagctgtgggttgattccaca-3’)(forward)(配列番号１１)、
p53-seq4
(5’-TTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTT-3’)(forward)(配列番号１２)、
p53-44seq
(5’-gcaagtcacagacttggctgtcccagaatgcaag-3’)(reverse)(配列番号１３)、
p53-seq6
(5’-tctcccaggacaggcacaaacatgca-3’)(reverse)(配列番号１４)、
p53-2seq
(5’-gcggagattctcttcctctgtgcgccggtctctccca-3’)(reverse)(配列番号１５)。
図２に結果を示す。
【００４９】
［結果］
図２に示すとおり、上述のダイレクトシークエンシング法により、胃がん細胞株ＫＫＬＳでは２４５番目のアミノ酸がＧｌｙからＡｓｐに変異していることを確認した。また、大腸がん細胞株ＨＴ−２９では２７３番目のＡｒｇがＨｉｓに変異していることを確認したが、ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５は野性型のｐ５３遺伝子を有し、変異は確認されなかった。この結果は、ヒト胃がんＭＫＮ−４５株は野性型のｐ５３遺伝子を有し（Mol Carcinog. 19:243-53, 1997）、大腸がん細胞株ＨＴ−２９では２７３番目のＡｒｇがＨｉｓに変異しているという報告(Proc. Natl. Acad Sci. USA. 87 : 7555 -7559, 1990)と一致する。
【実施例５】
【００５０】
（ＡＬＡ−ＰＤＴにより誘導されるｐ５３の安定性とｓｅｒ１５のリン酸化に対するがん抑制タンパク質ｐ５３特異的阻害剤の影響）
３５ｍｍ培養シャーレ上にＭＫＮ−４５(１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ)を播種し、２４時間３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ＡＬＡ塩酸塩を最終濃度０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように添加し、さらにｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−αを、最終濃度５０μＭになるようにＡＬＡ塩酸塩と同時に添加した。薬剤処理後４時間から６時間培養を行い、ＤＬＤ−Ｒ２レーザー照射装置を用いて、２００ｍＷ、４又は２分間、５又は２．５Ｊ／ｃｍ２相当を照射して、ＡＬＡ−ＰＤＴを行った。２４時間後、死細胞を含む培養上清を１５ｍＬのコニカルチューブに回収し、ＰＢＳ（−）溶液により洗浄した。付着細胞はＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ[150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% SDS, 1% デオキシコール酸ナトリウム, 1％ NP-40 (ナカライテスク株式会社製)、1mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、0.5％プロテアーゼインヒビターカクテル(SIGMA社製)]を用いて溶解し、先に回収した浮遊細胞ペレットに添加し、混合した。細胞溶解液は４℃にて３０分間振盪し、１５,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により不溶物を除去し、ウエスタンブロット解析に用いた。
【００５１】
タンパク抽出液に試料溶解液（50 mM Tris-HCl (pH 6.5), 10% glycerol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 40 mM dithiothreitol (DTT)）を添加後、９４℃にて３分間の熱変性を行い、泳動緩衝溶液（20 mM Tris, 200 mM glycine, 0.3% SDS）中、３６ｍＡの定電流で１２．５％ ｅ−ＰＡＧＥＬ(ATTO株式会社製)を用いて電気泳動を行った。泳動後のタンパクをポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（日本ミリポア・リミテッド社製）に転写した後、２．５％のスキムミルクを溶解した５％Ｔｗｅｅｎ−２０添加ＴＢＳ(TBS-Tween)溶液中室温で３０分間ＰＶＤＦ膜を振盪させた。その後、０．２５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液(洗浄液)で１０分、５分、５分と３回ＰＶＤＦ膜を洗浄した。５％Ｔｗｅｅｎ−２０添加ＴＢＳ（TBS-Tween）溶液で２０００倍希釈した一次抗体とＰＶＤＦ膜を室温で２時間反応させた後、洗浄液で同様に３回洗浄した。二次抗体としてペルオキシダーゼで標識された抗マウスＩｇＧ又は抗ウサギＩｇＧ溶液 (Amersham Pharmacia Biotech UK, Buckinghamshire, UK)を洗浄液で５，０００倍希釈し、室温にて４０分間反応させ、同様に３回洗浄後、ＥＣＬ Western blotting detection reagents (Amersham Pharmacia Biotech UK社製)にて目的のタンパクを検出した。なお、抗ｐ５３(ａｂ-６)モノクローナル抗体はCALBIOCHEM社(Cambridge,MA)より、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｒ１５・ｐ５３ポリクローナル抗体はCell Signaling社(Beverly,MA)より購入した。ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−αはALEXIS社(Lausen, Switzerland)より購入した。結果を図３に示す。
【００５２】
［結果］
図３に示されるように、ＡＬＡ存在下インビトロでＰＤＴを行った細胞において抗ｐ５３抗体と、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｒ１５ ｐ５３抗体が観察され、ｐ５３タンパクの安定化とｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｒ１５ｐ５３の発現は、ＡＬＡ存在下ＰＤＴを行った細胞においてのみ見られ、ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ-αの存在下では、それらの発現は共に減少することが確認された。
【実施例６】
【００５３】
（ＡＬＡ−ＰＤＴの殺細胞効果に対するｐ５３特異的阻害剤の影響）
３５ｍｍ培養シャーレ上にＭＫＮ−４５（２×１０５ｃｅｌｌｓ）を播種し、２４時間３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ＡＬＡ塩酸塩を最終濃度０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように添加し、さらに４時間から６時間培養を行った。ＤＬＤ−Ｒ２レーザー照射装置を用いて、２００ｍＷ、３分、３．７Ｊ／ｃｍ２相当を照射した。また、ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−αは最終濃度５０μＭを照射後に添加するもの、ＡＬＡ塩酸塩と同時に添加するもの、添加しないものの３群に分けた。照射７２時間後、培地を除去し、ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ溶液（0.5% crystal violet in 25% methanol）を５００μＬ添加し、室温で５分反応させた。Ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ溶液を捨て、流水で洗い、水を切った後５％デオキシコール酸ナトリウム溶液を１ｍＬ添加し、室温で１０分間反応させ、イムノリーダーを用いて５４０ｎｍで吸光度を測定し、実施例１と同様に、細胞増殖抑制率(％)を算出した。その結果、以下の表４に示すようにＡＬＡ塩酸塩と同時にｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−αを添加した場合、他の２群と比較すると細胞増殖抑制率の低下が認められた。
【００５４】
【表４】
2010259353.tif 000005
【図１】
2010259353.tif 000006
【図２】
2010259353.tif 000007
【図３】
2010259353.tif 000008
【配列表】
2010259353000001.app