(57)【要約】【課題】新規抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】本発明の抗腫瘍剤は、STK24タンパク質の機能を抑制することを特徴とする。例えば、STK24遺伝子の発現を抑制することにより、STK24タンパク質の機能を抑制してもよい。その場合、抗腫瘍剤が、STK24遺伝子の発現を抑制するshRNA、siRNA、またはmiRNAを含有してもよい。この場合のshRNAは配列番号１を有してもよい。また、本発明にかかる抗腫瘍剤は腫瘍増殖抑制剤、腫瘍浸潤抑制剤や腫瘍転移抑制剤、あるいは、宿主免疫抑制解除剤であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
STK24タンパク質の機能を抑制する抗腫瘍剤。
【請求項２】
STK24遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
STK24遺伝子の発現を抑制するshRNA、siRNA、またはmiRNAを有効成分として含有することを特徴とする請求項１または２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
STK24遺伝子の発現を抑制するshRNAを有効成分として含有し、前記shRNAが配列番号１または配列番号３を有することを特徴とする請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
腫瘍浸潤抑制剤または腫瘍転移抑制剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
宿主免疫抑制解除剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腫瘍細胞が、宿主の免疫機構から逃れるための様々な免疫抑制機構を有していることが明らかになってきた。
【０００３】
一つには、腫瘍細胞自体が変化することによって、宿主の免疫を受けないようにする機構であり、例えば、組織適合性抗原の発現が低下したり、腫瘍抗原の発現が低下したり、Fas抗原やTRAILレセプターの変異によってアポトーシス抵抗性を獲得したりすることによる。
【０００４】
もう一つは、腫瘍細胞がエフェクター因子を産生することにより、宿主の免疫応答を抑制する機構であり、例えば、腫瘍細胞内で、活性化STAT-3シグナル伝達系（例えば、非特許文献１参照）やBRAF-MAPKシグナル伝達系（例えば、非特許文献２参照）によって複数の免疫抑制エフェクター因子が産生されることが知られている。
【０００５】
そこで、これらの腫瘍細胞内のシグナル伝達経路を抑制することにより、エフェクター因子の産生を抑制し、腫瘍細胞が有する免疫抑制機構を機能しないようにする抗腫瘍戦略が考えられている。
【非特許文献１】Wang et al., Nature Med. vol.10 P.48, 2004
【非特許文献２】Sumimoto et al., JEM vol.203, p.1651, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、その機能を抑制することにより、腫瘍細胞による宿主免疫抑制を解除できるエフェクター因子を新たに同定し、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明にかかる抗腫瘍剤は、STK24タンパク質の機能を抑制することを特徴とする。例えば、STK24遺伝子の発現を抑制することにより、STK24タンパク質の機能を抑制してもよい。その場合、抗腫瘍剤が、STK24遺伝子の発現を抑制するshRNA、siRNA、またはmiRNAを含有してもよい。この場合のshRNAは配列番号１を有してもよい。
【０００９】
また、本発明にかかる腫瘍の治療方法は、STK24タンパク質の機能を抑制する工程を含む。例えば、STK24遺伝子の発現を抑制することにより、STK24タンパク質の機能を抑制してもよい。そして、例えば、RNAi法を用いてSTK24遺伝子の発現を抑制してもよい。この場合に用いるshRNAは配列番号１または配列番号３を有してもよい。
【００１０】
本発明にかかる抗腫瘍剤は腫瘍細胞の増殖を抑制する腫瘍増殖抑制剤、腫瘍細胞の浸潤や転移を抑制する腫瘍浸潤抑制剤や腫瘍転移抑制剤、あるいは、腫瘍細胞による宿主免疫抑制を解除する宿主免疫抑制解除剤であってもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、新規抗腫瘍剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１４】
本発明にかかる抗腫瘍剤は、STK24タンパク質の機能を抑制することにより効果を発揮する。従って、抗腫瘍剤の有効成分は、STK24の機能タンパク質を抑制するものであれば限定されず、STK24タンパク質分子の機能を直接阻害しても良いが、RNAi法などを用いて、細胞内でのSTK24遺伝子の発現を阻害しても良い。その有効成分として、例えば、STK24タンパク質の機能を抑制する低分子化合物、STK24遺伝子の発現を抑制するアンチセンスRNA、shRNA、RNAi、miRNAなどを例示できる。これらの核酸の配列は、公知の方法に従って決定すれば良いが、shRNAの場合、例えば、配列番号１または配列番号３に示した配列を用いて作製してもよい。
【００１５】
抗腫瘍剤の形状、成分、投与方法等は、有効成分に適した公知のものまたは方法を用いればよく、特に限定されない。
【００１６】
治療対象となる腫瘍の種類も特に限定されないが、悪性黒色腫であることが好ましい。
【００１７】
なお、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の増殖を抑制するだけでなく、腫瘍細胞の浸潤・転移を抑制し、腫瘍細胞による宿主免疫抑制を解除することができるので、腫瘍増殖抑制剤、腫瘍浸潤抑制剤、腫瘍転移抑制剤、宿主免疫抑制解除剤としても用いることができ、増殖能の強い腫瘍だけでなく、浸潤能、転移能、宿主免疫抑制能の強い腫瘍に対しても、好適に用いることができる。
【実施例】
【００１８】
（実施例１）STK24 RNAiによる細胞増殖抑制効果
本実施例では、腫瘍細胞においてSTK24タンパク質の機能を抑制するためにRNAiでSTK24遺伝子の発現を抑制し、細胞増殖に対する効果を調べた。ここでは、腫瘍細胞株としてA375（ヒト悪性黒色腫細胞株、BRAFV600E陽性）を用いた。また、培養用培地には、RPMI1640+10%FCS+ penicillin/streptomycinを使用した。
【００１９】
ルシフェラーゼ遺伝子に対するshRNA（GL3B）及びSTK24遺伝子の発現を抑制するためのshRNA(STK24 #1及びSTK24 #2)を合成し、センス鎖及びアンチセンス鎖をアニールした後、BspMIで切断して、HIVベクターHIV-U6i-GFPのBspMI部位に挿入し、（１）HIV-GL3B（２）HIV-STK24 #1（３）HIV-STK24 #2の各発現ベクターを作製した（Sumimoto  et al., Oncogene 23: 6031-39, 2004）。用いたshRNAの配列は、以下の通りである。
STK24 #1 sense
5’ - CACCGTGTTCAAAGGTATTGACATTCAAGAGATGTCAATGCCTTTGAACACTTTTT - 3’（配列番号１）
STK24 #1 antisense 
5’ - GCATAAAAAGTGTTCAAAGGCATTGACATCTCTTGAATGTCAATACCTTTGAACAC - 3’（配列番号２）
STK24 #2 sense
5’ - CACCGAGGCCTTTCTCTTAGTGTTTCAAGAGAACACTGAGAGAAAGGCCTCTTTTT - 3’（配列番号３）
STK24 #2 antisense
5’ - GCATAAAAAGAGGCCTTTCTCTCAGTGTTCTCTTGAAACACTAAGAGAAAGGCCTC - 3’（配列番号４）
【００２０】
A375細胞を5×104 cells/wellで6-well plateに播種し、各発現ベクターを150 moi (multiplicity of infection)で感染させた。感染後３日目と６日目にトリプシン処理で細胞を回収し、トリパンブルー色素法で生細胞数を計測し、増殖を比較した。有意差検定はunpaired Student t-testを用いた。代表的な実験結果を図１に示す。
【００２１】
感染後６日目の平均細胞数+/-標準偏差は、HIV-GL3B、HIV-STK24 #1、HIV-STK24 #2のそれぞれについて、2.83×107±1.36×106、2.06×107±8.49×105、2.44×107±6.66×105となり、コントロールのHIV-GL3Bに対し、HIV-STK24 #1及びHIV-STK24 #2ともに、細胞増殖を有意に（p<0.05）抑制した（図１）。
【００２２】
なお、HIV-STK24 #1及びHIV-STK24 #2がSTK24遺伝子の発現を抑制することは、PCR及びウェスタンブロット法によりmRNAレベル及びタンパク質レベルで確認済である。
【００２３】
このように、腫瘍細胞においてSTK24タンパク質の機能を抑制することにより、当該腫瘍細胞の増殖を抑制できるため、生体内での腫瘍においてSTK24タンパク質の機能を抑制することにより、当該腫瘍の増殖を抑制することが可能である。特に、増殖能の強い腫瘍に好適である。
【００２４】
（実施例２）STK24 RNAiによる悪性黒色腫細胞のマトリゲル浸潤能力抑制効果
本実施例では、腫瘍細胞においてSTK24タンパク質の機能を抑制した場合の、細胞増殖に対する効果を調べた。
【００２５】
実施例１で作製した各HIVベクター感染A375細胞を、2.5×104個/chamberの密度でBioCoat Matrigel invasion chambers (Becton-Dickinson社)に播種し、37℃, 5% CO2下で24時間培養した。その後、Matrigel invasion chambersの上部に残存するA375細胞を綿棒で除去し、chamber membraneの裏側に浸潤してきた細胞をDiff-Quik stain (Sysmex, Kobe, Japan)を用いて固定・染色し、浸潤細胞数を顕微鏡下で計測した。各細胞につき、6視野の平均と標準偏差を算出し、統計学的有意差検定は、unpaired Student t-testを用いた。代表的な実験結果を図２に示す。
【００２６】
感染後６日目にマトリゲルを浸潤した平均細胞数+/-標準偏差は、HIV-GL3B、HIV-STK24 #1、HIV-STK24 #2のそれぞれについて、151±17.8、94.3±8.1、90.2±13.3となり、コントロールのHIV-GL3Bに対し、HIV-STK24 #1及びHIV-STK24 #2ともに、細胞増殖を有意に（p<0.05）抑制した。
【００２７】
このように、腫瘍細胞においてSTK24タンパク質の機能を抑制することにより、当該腫瘍細胞の浸潤能力を抑制できるため、生体内での腫瘍においてSTK24タンパク質の機能を抑制することにより、当該腫瘍の転移を抑制することが可能である。特に、浸潤能の強い腫瘍に好適である。
【００２８】
（実施例３）STK24 RNAiによる樹状細胞活性化抑制からの回復効果
本実施例では、STK24タンパク質の機能を抑制した場合の、樹状細胞活性化抑制からの回復効果を調べた。
【００２９】
まず、ヒト健常成人末梢血より、Lymphoprep（Axis-Shield PoC AS社, Oslo, Norway）を使用して比重遠心法により単核球を分離し、CD14 MicroBeadsとAutoMACS (Miltenyi Biotech Japan社)を用いて、CD14陽性単球を分離した。GM-CSF (Peprotech社)100ng/mlとIL-4(Peprotech社) 50ng/mlを含有するRPMI1640/10%FCSで4日間培養し、単球から樹状細胞へ分化誘導した。この樹状細胞を回収して、2×104個/wellで96-well plateに播種した。
【００３０】
一方、実施例１で作製した各HIVベクター感染A375細胞を、2.0×106個/2mlの密度でφ6cm-dishに播種し、37℃、5% CO2下で24時間培養した。培養上清をチューブに回収し、1,500 rpm、5分遠心することにより浮遊した細胞を除去した。この培養上清をそれぞれ20%になるように添加したRPMI1640/10%FCS （GM-CSF 100ng/mlとIL-4 50ng/ml）及び、コントロールとして、上清無添加の上記培地を用い、樹状細胞を培養した。
24時間培養後、LPS(Sigma)を最終1μg/mlの濃度で添加し、樹状細胞の成熟・活性化刺激を加えた。
さらに24時間培養後に培養上清を回収し、上清中のIL-12濃度をHuman IL-12 ELISA Set (BD OptEIA, BD Bioscience社)を用いてELISA法により測定した。なお、統計学的有意差検定は、unpaired Student t-testを用いた。代表的な結果を図３に示す。
【００３１】
上清無添加の培地を用いた場合（図ではSup(-)）、樹状細胞から炎症性サイトカインであるIL−12が分泌される。しかし、コントロールのHIV-GL3Bを感染させた腫瘍細胞の培養上清を加えた場合は（図ではGL3B）、樹状細胞からのIL-12の分泌は抑制される。これに対し、HIV-STK24 #1及びHIV-STK24 #2を感染させ、STK24遺伝子の発現を抑制した腫瘍細胞の培養上清を加えると（図ではHIV-STK24 #1及びHIV-STK24 #2）、IL-12の分泌抑制が有意に（p<0.05）解除される。
【００３２】
このように、腫瘍細胞においてSTK24タンパク質の機能を抑制することにより、当該腫瘍細胞による樹状細胞の活性化を抑制できるため、生体内での腫瘍においてSTK24タンパク質の機能を抑制することにより、当該腫瘍による宿主免疫抑制を解除することが可能である。特に、宿主免疫抑制能の強い腫瘍に好適である。
【００３３】
（実施例４）STK24 RNAiによるTGF-β1, IL-10産生抑制効果
本実施例では、腫瘍細胞においてSTK24タンパク質の機能を抑制した場合の、当該細胞によるTGF-β1、IL-10産生に対する効果を調べた。
【００３４】
実施例３で作製した上清中のIL-10及びTGF-β1濃度をELISA キット(BD OptEIA, BD Bioscience社)を用いて測定した。また、培養上清回収時点における細胞数をトリパンブルー色素法で計測し、各サイトカイン濃度を回収時点における細胞数で補正した。代表的な実験結果を図４に示す。
【００３５】
また、実施例１と同様に細胞から抽出したRNAを用いて、IL-10及びTGF-β1のmRNAレベルをreal time PCR法により測定した(Assay-on-Demand, Gene Expression Products; Applied Biosystems)。代表的な実験結果を図５に示す。
【００３６】
なお、これらの実験において、統計学的有意差検定は、unpaired Student t-testを用いた。
【００３７】
コントロールのHIV-GL3Bに対し、HIV-STK24 #1及びHIV-STK24 #2を感染させたA375細胞の培養上清においては、IL-10及びTGF-β1の発現が、mRNAレベル及びタンパク質レベルの両方において、低下していた。実験ごとに発現低下の程度にバラつきはあったが、常に、発現低下は観察されたので、実施例３で観察されたような、樹状細胞活性化抑制の解除効果は、部分的に、当該腫瘍細胞におけるIL-10及びTGF-β1の発現低下によることが示唆された。
【００３８】
（実施例５）悪性黒色腫細胞株におけるSTK24タンパク質リン酸化レベルの上昇
本実施例では、悪性黒色腫細胞株において、STK24タンパク質のリン酸化レベルが上昇していることを示す。
【００３９】
まず、ヒト線維芽細胞初代培養株、293T, ヒト悪性黒色腫細胞株（A375, SKmel23, 526mel, 624mel, 888mel, 928mel, 1362mel, MMG1）から常法に従ってタンパクを抽出し、DC protein assay kit (BioRad社)を用いてタンパク濃度を測定した。25μM Phos-tag (NARD Institute, ltd社)を含む10% SDS-PAGEゲルで電気泳動後、PVDFメンブレンに転写し、抗STK24抗体(anti-MST3、Abcam社)でwestern blotを行った。HRP結合二次抗体を反応後、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce)を用いて化学発光させることによりリン酸化STK24タンパク質及び非リン酸化STK24タンパク質を検出した。なお、シグナルの標準化のために、Phos-tagを含まない10% SDS-PAGEゲルでも同様に電気泳動を行い、抗STK24抗体及び抗actin抗体 (Sigma)を用いて、総STK24タンパク質とactinの検出を行った。リン酸化STK24タンパクと非リン酸化STK24タンパクのシグナルをLAS-4000miniルミノ・イメージアナライザーを用いて定量化し、両者の比率を算出した。代表的な結果を以下に示す。
【００４０】
細胞                  比率（％）    
線維芽細胞            １６．４
293T                    ９．７
悪性黒色腫細胞株      比率（％）    
A375                   ８９．３
SKmel23                ８８．２
526mel                 ７０．８
624mel                 ９５．１
888mel               １０１．３
928mel                 ６５．３
1362mel                ７７．６
MMG1                     ０
【００４１】
このように、多くの悪性黒色腫細胞株では、STK24タンパクのリン酸化が亢進していた。
【００４２】
（実施例６）BRAF遺伝子の発現抑制によるSTK24タンパク質リン酸化レベルの低下
本実施例では、悪性黒色腫細胞株において、BRAFの発現抑制によってSTK24タンパク質のリン酸化レベルが低下していることを示す。
【００４３】
まず、BRAF遺伝子及びSTAT3遺伝子の発現を抑制するためのshRNA （BRAFV600E特異的BRAF#1’及びSTAT3)を実施例１と同様にHIVベクターHIV-U6i-GFPに挿入し、（１）HIV-BRAF#1’（２）HIV-STAT3（３）HIV-BRAF/STAT3(BRAFV600E特異的shRNAとSTAT3特異的shRNAを同時に発現するHIVベクター)の各発現ベクターを作製した。用いたshRNAの配列は、以下の通りである。
BRAFV600E #1’ sense
5’-CACCGCTACAGAGAAATCTCGATTTCAAGAGAATCGAGATTTCTCTGTAGCTTTTT-3’ （配列番号５）
BRAFV600E #1’ antisense
5’-GCATAAAAAGCTACAGAGAAATCTCGATTCTCTTGAAATCGAGATTTCTCTGTAGC-3’ （配列番号６）
STAT3 sense
5’-CACCATGGGAGGGTTTAGGGAGAACGTGTGCTGTCCGTTCTCCTTAAACCTTCCTATTTTTT-3’ （配列番号７）
STAT3 anti-sense
5’-GCATAAAAAATAGGAAGGTTTAAGGAGAACGGACAGCACACGTTCTCCCTAAACCCTCCCAT-3’ （配列番号８）
【００４４】
実施例１と同様に、各HIVベクターをA375細胞に感染させた。そして、実施例５と同様に、各HIVベクター感染A375細胞より抽出したタンパクを25μM Phos-tagを含む10% SDS-PAGEゲルで電気泳動後、PVDFメンブレンに転写し、抗STK24抗体でwestern blotを行った。代表的な結果を図６に示す。なお、各タンパク質の総発現量を確認するため、Phos-tagを含まない10% SDS-PAGEゲルでも同様に電気泳動し、抗STK24抗体、抗BRAF抗体(Santa Cruz社)、抗STAT3抗体(BD Biosceince社)でwestern blotを行った（図示せず）。
【００４５】
BRAF遺伝子の発現を抑制した場合には、STKタンパク質のリン酸化が減少したが、STAT3遺伝子の発現を抑制しても、STKタンパク質のリン酸化は減少しなかった。この結果より、STKタンパク質に関与するシグナル伝達系において、STKタンパク質はBRAFタンパク質の下流に位置し、活性化BRAFタンパク質がSTKタンパク質のリン酸化をポジティブに調節していることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明にかかる一実施例において、STK24 RNAiによる細胞増殖抑制効果を示す図である。
【図２】本発明にかかる一実施例において、STK24 RNAiによる細胞浸潤抑制効果を示す図である。
【図３】本発明にかかる一実施例において、STK24 RNAiによる樹状細胞活性化抑制からの回復効果を示す図である。
【図４】本発明にかかる一実施例において、STK24 RNAiによるTGF-β1, IL-10産生抑制効果をタンパク質レベルで示す図である。
【図５】本発明にかかる一実施例において、STK24 RNAiによるTGF-β1, IL-10産生抑制効果をmRNAレベルで示す図である。
【図６】本発明にかかる一実施例において、BRAF遺伝子の発現抑制によるSTK24タンパク質リン酸化レベルの低下を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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