(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ３タンパク質に結合し、補体活性化を阻害することができるペプチド及びペプチド擬態を有する化合物を提供する。【解決手段】現在利用可能な化合物と比較して、改良された補体活性化阻害活性を示す、特定の配列を有するペプチド及び、上記ペプチドの部分ペプチド擬態を有する化合物。並びに、前記ペプチドをコードする単離核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体活性化を阻害する化合物であって、
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２―Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４（配列ＩＤ番号：１５）の配列を持つペプチドを有するものであり、
ここで、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ａｃ−Ｉｌｅ（アセチル−イソロイシン）、Ａｃ−Ｖａｌ（アセチル−バリン）、Ａｃ−Ｌｅｕ（アセチル−ロイシン）、若しくはＧｌｙ（グリシン）−Ｉｌｅ（イソロイシン）を有するジペプチドであり、
Ｘａａ２は、Ｔｒｐ（トリプトファン）、若しくはＴｒｐのペプチド性或いは非ペプチド性類似体であり、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、若しくはＴｒｐ（トリプトファン）であり、
Ｘａａ４は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｌ−スレオニン）、Ｄ−Ｔｈｒ（Ｄ−スレオニン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｇｌｙ（グリシン）、若しくはＴｈｒ（スレオニン）−Ａｌａ（アラニン）−Ａｓｎ（アスパラギン）を有するトリペプチドであり、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、若しくはＡｓｎのあらゆるカルボキシ末端―ＯＨが任意に−ＮＨ２に置換されるものであり、
２つのＣｙｓ（システイン）残基はジスルフィド結合によって結合されているものである、化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ１はＡｃ−Ｉｌｅである、化合物。
【請求項３】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ３はＡｌａである、化合物。
【請求項４】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ２は、置換型或いは非置換型二環式芳香環構成要素、若しくは２或いはそれ以上の置換型或いは非置換型単環式芳香環構成要素を有するＴｒｐの類似体である、化合物。
【請求項５】
請求項４記載の化合物において、
前記Ｔｒｐの類似体は、２−ナフチルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−インダニルグリシンカルボン酸、ジヒドロトリプトファン、及びベンゾイルフェニルアラニンからなる群から選択されるものである、化合物。
【請求項６】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ１はＡｃ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ２はＴｒｐ、若しくは置換型か非置換型のインドール、ナフチル或いはジベンゾイル成分を有するＴｒｐの類似体であり、Ｘａａ３はＡｌａであり、Ｘａａ４はＬ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｌ−スレオニン）若しくはＤ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｄ−スレオニン）である、化合物。
【請求項７】
請求項６記載の化合物であって、
配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、及び配列ＩＤ番号：１３からなる群から選択された配列を有する、化合物。
【請求項８】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ１はＧｌｙ−Ｉｌｅジペプチドであり、Ｘａａ４はＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎトリペプチドである、化合物。
【請求項９】
請求項８記載の化合物であって、
配列ＩＤ番号：１４を持つペプチドを有するものである、化合物。
【請求項１０】
補体活性化を阻害する化合物であって、
非ペプチド若しくは請求項１の化合物の部分ペプチド擬態を有し、
ここで、前記化合物はＣ３に結合し、配列ＩＤ番号：１を有するペプチドに比べて、少なくとも５倍以上の活性で補体活性化を阻害するものである、化合物。
【請求項１１】
補体活性化を阻害する１若しくはそれ以上のペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ペプチドは、
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４（配列ＩＤ番号：１５）の配列を有し、
ここで、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、若しくはＧｌｙ−Ｉｌｅを有するジペプチドであり、
Ｘａａ２は、Ｔｒｐであり、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり、
Ｘａａ４は、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、若しくはＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎを有するトリペプチドであり、
２つのＣｙｓ残基はジスルフィド結合によって結合しているものである、単離核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１記載の単離核酸分子であって、
Ｘａａ３がＡｌａであるペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２記載の単離核酸分子であって、
配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３記載の単離核酸分子であって、
配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドの２若しくはそれ以上の鎖状体（コンカテマー）をコードするものであり、
このコード化鎖状体はヒドラジンによって切断可能で、配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドの多様性を形成するものである、単離核酸分子。
【請求項１５】
請求項１１記載の単離核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載の発現ベクターを有する細胞。
【請求項１７】
細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、若しくは哺乳類細胞である、請求項１６記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００２年９月２０日に出願された米国出願番号第６０／４１２，２２０号明細書に対して優先権を主張しており、その全体はこの参照によってここに組み込まれる。
【０００２】
ここに記載された本発明は、米国国立衛生研究所からの助成金（グラント番号ＡＩ３００４０及びＧＭ６２１３４）で一部なされたものであり、米国政府が権利を有することができることは、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．第２０２（ｃ）条に従って認知されるものである。
【０００３】
本発明は、体内の補体カスケードの活性化に関するものである。特に、本発明は、Ｃ３タンパク質と結合し補体活性化を阻害することができるペプチド及びペプチド擬態を提供するものである。
【背景技術】
【０００４】
補体システムは、外来性病原体に対する第１次の免疫学的防御である。古典的経路、第二経路、若しくはレクチン経路を通じたその活性化は、アナフィラトキシンペプチドＣ３ａ及びＣ５ａの生成、及びＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を導く。補体構成因子Ｃ３は、３つの経路全ての活性化において中心的な役割を果たす。補体経路Ｃ３転換酵素によるＣ３の活性化と、その後に続く標的表面への結合は、膜侵襲複合体の集合と、最終的には標的細胞の損傷と溶解とを引き起こす。Ｃ３は、免疫監視や免疫反応経路において重要である様々なリガンド結合部位の多様性を提供するリッチ構造を所有しているという点でユニーク（独特）である。
【０００５】
補体の不適切な活性化は、宿主細胞の損傷を引き起こすであろう。補体は、様々な自己免疫疾患を含むいくつかの病状に関係しており、成人性呼吸器症候群、心発作、異物移植の後の拒絶、及びやけど外傷などの他の臨床症状の原因となることが見出された。補体仲介組織損傷もまた、透析若しくは心肺バイパスを受けている患者が遭遇するような生体不適合性状況に起因することが見出された。
【０００６】
補体仲介組織損傷は、膜侵襲複合体によって直接的に仲介され、Ｃ３ａ及びＣ５ａの生成によって間接的に仲介されている。これらのペプチドは、それらのニュートロフィンやマスト細胞への影響を通じた損傷を誘導する。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｃ３及びＣ５活性化工程での補体の制御は、プラズマ及び膜タンパク質の両方によって提供される。プラズマタンパク質インヒビター（阻害剤）は、ファクターＨ及びＣ４−結合タンパク質であり、細胞表面に位置する調節性膜タンパク質は、補体受容体１（ＣＲ１）、ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ：減衰促進因子）、及び膜コファクタータンパク質（ＭＣＰ）である。これらのタンパク質は、マルチサブユニットの解離を促進することによって、及び／若しくはタンパク質分解（ファクターＩによる触媒）を介した複合体の不活性化によって、Ｃ３及びＣ５変換（マルチサブユニットプロテアーゼ）を阻害する。補体活性を制御若しくは修飾するいくつかの薬理学的因子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって同定されたが、そのほとんどはｉｎ  ｖｉｖｏで低活性若しくは毒性であると示された。
【０００７】
現在まで、特に、可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）として知られた補体受容体１の組替え体や、ヒト化モノクローナル抗Ｃ５抗体（５Ｇ１．１−ｓｃＦｖ）など臨床での使用を目的とした特定の候補は存在したが、臨床で用いられた補体活性化の阻害剤（インヒビター）はない。これら両方の物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験において補体の活性化を抑制すると示された（Ｋａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ.、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ.Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ.１５：４１７〜４３１、１９９４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９３：８５６３〜８５６８、１９９６）。しかしながら、各物質は、高分子量タンパク質（それぞれ２４０ｋＤａ及び２６，０００ｋＤａ）であり、製造するのが難しく、注入によって投与されなくてはならないという欠点を有している。従って、最近の研究は、運搬が容易であり、且つより安定で製造コストが安い、より小さい活性因子の開発に焦点が当てられてきた。
【０００８】
Ｌａｍｂｒｉｓらの米国特許番号第６，３１９，８９７号では、Ｃ３に結合し補体活性化を阻害する、２７残基ペプチドを同定するためにファージディスプレイ  コンビナトリアムランダムペプチド  ライブラリーの使用を記載している。このペプチドは、補体活性を維持した１３残基サイクリック断片（セグメント）に切断され、これは本分野においてコンプスタチン（Ｃｏｍｐｓｔａｔｉｎ）として言及されている。コンプスタチンは、Ｃ３転換酵素によるＣ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの切断を阻害する。コンプスタチンは、一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及びｉｎ  ｖｉｖｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ干渉実験でテストされ、（１）ヒト血清中の補体活性化を阻害する（Ｓａｈｕ  ｅｔ  ａｌ.、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５７：８８４〜８９１、１９９６）、（２）著しい副作用なしに霊長類中のヘパリン／プロタミン誘導性補体活性化を阻害する（Ｓｏｕｌｉｋａ  ｅｔ  ａｌ.、Ｃｌｉｎ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.９６：２１２〜２２１、２０００）、（３）ヒト血液で灌流しているブタ〜ヒトの異種移植の寿命を延長する（Ｆｉａｎｅ  ｅｔ  ａｌ.、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ.Ｐｒｏｃ.３１：９３４〜９３５,１９９９a；Ｆｉａｎｅ  ｅｔ  ａｌ.Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６：５２〜６５、１９９９ｂ；Ｆｉａｎｅ  ｅｔ  ａｌ.、Tｒａｎｓｐｌａｎｔ.Ｐｒｏｃ.３２：８９９〜９００、２０００）、（４）心肺バイパス、プラズマフェレーシス、及び透析生体外循環のモデルにおける補体活性化を阻害する（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１６６１〜１６６７、１９９８）、及び（５）低毒性である（Ｆｕｒｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ.、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４８：１９９〜２１２、２０００）、と明らかにされた。
【０００９】
コンプスタチンは、配列ＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ−ＮＨ２（配列ＩＤ番号：１）を有するペプチドであり、Ｃｙｓ２及びＣｙｓ１２がジスルフィド結合を形成している。その３次元構造は、実験的に抑制された２つの別々の計算方法と組み合わされたホモ核酸（ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ）２Ｄ  ＮＭＲ分光計を用いて決定された。第１の方法は、距離幾何学、分子動態学、及び疑似アニーリングに関連し（Ｍｏｒｉｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ.、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７：６１９〜６２７、１９９８）、第２の方法は、大域的最適化（ｇｌｏｂａｌ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）に関連していた（Ｋｌｅｐｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ.、Ｊ.Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０：１３４４〜１３７０,１９９９）。コンプスタチンの構造は極性パッチ及び非極性パッチを有する分子表面を示した。極性部分はタイプＩβ−ターンを含み、非極性部分はジスルフィド結合を含む。加えて、アラニン置換（アラニンスキャン）を有する一連の類似体を合成し、活性をテストして、阻害活性にとって重要である疎水性クラスターを周囲に有するβ−ターンの４残基とジスルフィド結合とが明らかになった（Ｍｏｒｉｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ.、１９９８、ｓｕｐｒａ）。
【００１０】
代替経路仲介エリスロサイト溶解の測定を有する補体活性アッセイを使用して、コンプスタチンのＩＣ５０は、１２μＭと測定された。以前テストされた特定の類似体は、コンプスタチンと同等、若しくはわずかに大きい活性を示した。より効果的な活性を有するコンプスタチン類似体若しくは擬態の開発は、本分野において著しく発展しつづけているであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、補体阻害性ペプチドであるコンプスタチン（ＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴ−ＮＨ２；配列ＩＤ番号：１）の類似体及び擬態を提供し、これはコンプスタチンと比較して改善された補体阻害性活性を有している。
【００１２】
１つの観点において、本発明は、補体活性化を阻害する合成物を特色とし、これは以下の配列：
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４（配列ＩＤ番号：１５）
を有するペプチドからなるものであり、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ａｃ−Ｉｌｅ（アセチル−イソロイシン）、Ａｃ−Ｖａｌ（アセチル−バリン）、Ａｃ−Ｌｅｕ（アセチル−ロイシン）、若しくはＧｌｙ（グリシン）−Ｉｌｅ（イソロイシン）を有するジペプチドであり、
Ｘａａ２は、Ｔｒｐ（トリプトファン）若しくはＴｒｐのペプチド性或いは非ペプチド性類似体であり、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、若しくはＴｒｐ（トリプトファン）であり、
Ｘａａ４は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｌ−スレオニン）、Ｄ−Ｔｈｒ（Ｄ−スレオニン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｇｌｙ（グリシン）、若しくはＴｈｒ（スレオニン）−Ａｌａ（アラニン）−Ａｓｎ（アスパラギン）を有するトリペプチドであり、
ここにおいてＬ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、若しくはＡｓｐのあらゆるカルボキシル基末端−ＯＨは、任意で−ＮＨ２に置換され、２つのＣｙｓ残基はジスルフィド結合によって結合されているものである。
【００１３】
特定の実施形態において、Ｘａａ１はアセチル化されており、典型的にはＡｃ−Ｉｌｅである。別の実施形態において、Ｘａａ３はＡｌａである。他の実施形態において、Ｘａａ２はＴｒｐの類似体であり、置換型若しくは非置換型芳香環構成要素を有しており、好ましくは、二環式（例えば、インドール、ナフチル）、若しくは２つの環状構造（例えば、ジベンゾイル）を有するものである。例示的な実施形態において、Ｔｒｐの類似体は２−ナフチルアラニン、１−ｎａｐｈｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ、２−ｉｎｄａｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、ジヒドロトリプトファン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、若しくはベンゾイルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｏｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）である。
【００１４】
特定の実施形態において、Ｘａａ１はＡｃ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ２はＴｒｐ若しくは置換性或いは非置換性インドール、ナフチル、若しくはジベンゾイル成分を有するＴｒｐの類似体であり、Ｘａａ３はＡｌａであり、Ｘａａ４はＬ−スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）若しくはＤ−スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）である。例示的な配列は、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２及び配列ＩＤ番号：１３から成る群から選択される。
【００１５】
別の特定の実施形態において、Ｘａａ１はＧｌｙ−Ｉｌｅのジペプチドであり、Ｘａａ４はＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎのトリペプチドである。例示的な実施形態は、配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドである。
【００１６】
本発明の別の観点は、補体活性化を阻害する化合物を特色とし、これは非ペプチド性若しくは上述のペプチドの部分ペプチド擬態を有しており、１若しくはそれ以上の残基若しくは類似体が補体活性化阻害活性の保持若しくは増強を可能にする化合物によって置換されている。
【００１７】
これらの化合物は、本分野で知られているように、コンプスタチン自体が利用されたようなあらゆる目的に対して実質的に有用である。
【００１８】
本発明の別の観点は、補体活性化を阻害する１若しくはそれ以上のペプチドをコードする、単離核酸分子を特色とし、前記ペプチドは以下の配列：
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４（配列ＩＤ番号：１５）を有しており、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、若しくはＧｌｙ（グリシン）−Ｉｌｅ（イソロイシン）を有するジペプチドであり、
Ｘａａ２は、Ｔｒｐ（トリプトファン）であり、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、若しくはＴｒｐ（トリプトファン）であり、
Ｘａａ４は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｌ−スレオニン）、Ｄ−Ｔｈｒ（Ｄ−スレオニン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、若しくはＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎを有するトリペプチドであり、
２つのＣｙｓ残基はジスルフィド結合で結合しているものである。
【００１９】
前記単離された核酸分子は、一般的にペプチドをコードしており、Ｘａａ３はＡｌａである。例示的な実施形態において、前記単離された核酸分子は、配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドをコードしている。別の実施形態において、前記核酸は、配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドの２若しくはそれ以上の鎖状体（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）をコードするものであり、このコードされた鎖状体は配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドの多様性を形成するためにヒドラジンによって切断される。
【００２０】
上述のあらゆる単離された核酸分子を有する発現ベクターは、発現ベクターを有する細胞とともに、細菌、真菌、昆虫、植物、若しくは哺乳類の細胞であり得、本発明の別の観点において特徴付けられる。これら単離された核酸分子によってコードされたペプチドは、コンプスタチンが有用であるあらゆる目的に対して効果的である。
【００２１】
本発明の様々な特徴及び利点は、以下に続く詳細な説明、図面、及び実施例を参照することによって理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）及びＡｃ−４Ｗ−９Ａ−１３ｄＴ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：６）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図２】図２は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、Ａｃ−４（２Ｎａｌ）−９Ａ（配列ＩＤ番号：７）、Ａｃ−４（２Ｎａｌ）−９Ａ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：８）、及びＡｃ−４（１Ｎａｌ）−９Ａ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：９）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図３】図３は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、及びＡｃ−４（Ｉｇ１）−９Ａ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：１１）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図４】図４は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、及びＡｃ−４（Ｉｇ１）−９Ａ（配列ＩＤ番号：１０）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図５】図５は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、及びＡｃ−４（Ｄｈｔ）−９Ａ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：１２）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図６】図６は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、及び＋Ｇ−４Ｗ−９Ａ−１５Ｎ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：１３）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図７】図７は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、及びＡｃ−４（Ｄｈｔ）−９Ａ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：１２）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【図８】図８は、コンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）、Ａｃ−コンプスタチンン（配列ＩＤ番号：２）、Ａｃ−４Ｗ−９Ａ（配列ＩＤ番号：５）、及びＡｃ−４Ｗ−９Ａ−ＯＨ（配列ＩＤ番号：４）による補体活性化の阻害度を示した図。Ｘ軸はペプチド濃度（μＭ）、Ｙ軸は実施例２に記載されたアッセイで測定された補体活性化の阻害度を示し、ネガティブコントロールはリニア（直鎖状）ペプチド（"リニア"）であり、これは２及び１２位のシステインをアラニンに置換し修飾したコンプスタチンを有するものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
上記で及びこの開示全体を通して用いられる、以下の用語は、特に指示しない限り、以下の意味を有していると理解されるべきである。
【００２４】
"薬理学的に活性"及び"生物学的に活性"という用語は、Ｃ３若しくはその断片に結合し、補体活性化を阻害する本発明の化合物の能力を意味している。この生物学的な活性は、ここに詳細に記載されている、本分野では認められているいくつかのアッセイの１若しくはそれ以上によって測定される。
【００２５】
ここで用いられるように、"アルキル"という用語は、飽和直鎖、分枝、若しくは環状の約１〜約１０炭素原子（及びこれらの炭素原子の範囲での全組合わせ及びサブコンビネーションと、これらの炭素原子の特定の数とを含む）、好ましくは約１〜約７の炭素原子、からなる炭化水素を意味する。アルキル基は、これに限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロオクチル、アダマンチル（ａｄａｍａｎｔｙｌ）、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチルを含む。
【００２６】
ここで用いられる、"ハロ"は、Ｆ（フッ素）、Ｃｌ（塩素）、Ｂｒ（臭素）、若しくはＩ（ヨウ素）を意味する。
【００２７】
ここで用いられる、"アリル"は、約５〜約１４の炭素原子（及びこれらの炭素原子の範囲での全ての組み合わせ及びサブコンビネーションと、これらの炭素原子の特定の数とを含む）、好ましくは約６〜約１０の炭素原子からなる、任意で置換されたモノ−若しくは二環式−芳香環システムを言及する。これに限定されるものではないが、例としてはフェニルとナフチルである。
【００２８】
ここで用いられている、"アラルキル"は、アリル置換基を有し、約６〜約２０の炭素原子（及びこれらの炭素原子の範囲での全組合わせ及びサブコンビネーションと、これらの炭素原子の特定の数とを含む）、好ましくは約６〜約１２の炭素原子からなる、アルキルラジカル（遊離基）を意味する。アラルキル基は、任意に置換され得る。これに限定されるものではないが、例としてはベンジル、ナフチルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチル、及びジフェニルエチルである。
【００２９】
ここで用いられている、"アルコキシ"及び"アルコキシル"という用語は、任意に置換されたアルキル−Ｏ−基を意味し、アルキルの定義は以前にした通りである。例示的なアルコキシ基及びアルコキシル基は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、及びヘプトキシを含む。
【００３０】
ここで用いられる、"カルボキシ"は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基を意味する。
【００３１】
ここで用いられる、"アルコキシカルボニル"は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル基を意味し、ここにおいてアルキルの定義は以前にした通りである。
【００３２】
ここで用いられるように、"アロイル"は、−Ｃ（＝Ｏ）−アリル基を意味し、ここにおいてアリルの定義は以前にした通りである。例示的なアロイル基は、ベンゾイル及びナフトイルを含む。
【００３３】
一般的に、置換化学部分（基）は、水素を置換した１若しくはそれ以上の置換基を含む。例示的な置換基は、例えばハロ、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリル、スルフヒドリル、ヒドロキシル（−ＯＨ）、アルコキシル、シアノ（−ＣＮ）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、アミノカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）、−Ｎ−置換アミノカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ"）、ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、および同種のものを含む。前述した置換基に関連して、各部分Ｒ"は独立して、例えば、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリル、若しくはアラルキルのいずれかであってよい。
【００３４】
ここで用いられる、"Ｌ−アミノ酸"は、タンパク質に通常存在するあらゆる天然由来の左旋性アルファ−アミノ酸、若しくはそれらアルファ−アミノ酸のアルキルエステルを意味する。"Ｄ−アミノ酸"という用語は、右旋性アルファ−アミノ酸を意味する。特に指定がない限り、ここに言及された全てのアミノ酸はＬ−アミノ酸である。
【００３５】
本発明に従って、コンプスタチンの生物学的及び物理化学的特性に関する情報は、親コンプスタチンペプチドと比較して著しく改良された活性を有する、コンプスタチン類似体を設計するために用いられた。好ましい実施形態において、前記類似体は、好ましくは実施例２に記載されたアッセイを用いて、コンプスタチンより少なくとも５倍の活性を有するものである。より好ましくは、前記類似体は、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍の活性を有し、実施例２に記載されたアッセイを用いて、さらに好ましくはコンプスタチンより６０、７０、８０倍、若しくはそれ以上の活性を有するものである。
【００３６】
他のアプローチに従って合成されたコンプスタチン類似体は、親ペプチドと比べて、いくらか改良された、すなわち６倍の活性を有することが示された（Ｋｌｅｐｅｉｓ，ｅｔ  ａｌ．２００３，ＪＡＣＳ  １２５：８４２２〜８４２３）。本発明に従って産生された前記類似体は、図面及び以下の表１に示されたようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって明らかなように、親ペプチド若しくは現在までに産生されたその類似体に比べて、さらに高い活性を有する。
【００３７】
表１は、アミノ酸配列と、コンプスタチン及び著しく改良された活性を有する選択された類似体の補体阻害活性とを示している。前記選択された類似体は、親ペプチドであるコンプスタチンと比較して、指定された位置（１〜１３）の特異的な修飾によって言及される。
【００３８】
【表１】
2010280688.tif 000002
【００３９】
Ｎ−終端における修飾
Ｎ−終端のアセチル化は、配列ＩＤ番号：１と配列ＩＤ番号：２との比較によって具体的に見られるように、コンプスタチンとその類似体の補体阻害活性を一般的に増加する。従って、ペプチドのＮ−アセチル化は、本発明の好ましい実施形態の１つであり、ペプチドが合成によって調整される場合、特に有用である。ただし、原核生物或いは真核生物発現システムにおけるペプチド−コード化核酸分子の発現によって、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳によって、ペプチドを調整することがしばしば有利である。これらの実施形態に対しては、天然由来Ｎ−終端が用いられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ  ｖｉｖｏでの発現に適切なコンプスタチンの１実施例は、配列ＩＤ番号：１４であり、ここでは、アセチル基はＮ−終端で非修飾グリシンによって置換されている。Ｘ４位がＴｒｐ、Ｘ９位がＡｌａ、及びＸ１４位とＸ１５位でＡｌａ（アラニン）−Ａｓｎ（アスパラギン）のＣ−末端伸長を付加的に有している配列ＩＤ番号：１４は、ここに記載された補体阻害アッセイにおいて、コンプスタチンの３８倍の活性を有している。
【００４０】
ペプチド内の修飾
コンピュータを利用した方法である順位低位エネルギー配列（ｔｈｅ  ｒａｎｋ  ｌｏｗ  ｌｙｉｎｇ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いて、前記ペプチドの安定性及び活性を支持するために４位にはＴｙｒ（チロシン）及びＶａｌ（バリン）が最も適していると、以前に決定された（Ｋｌｅｐｅｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ）。この決定を考慮して、４位はＴｒｐ（トリプトファン）であり、特に９位がＡｌａであることを組合わせた本発見は、親ペプチドに比べ多数倍も高い活性を生み、これは予想されなかったことである（例えば、配列ＩＤ番号：４、５、及び６の活性と、配列ＩＤ番号：２と３との活性の比較）。Ｔｒｐは、１、２、３、４、１２及び１３位の残基に関与する疎水性クラスターに寄与することが予想されたが、その大きな（ｂｕｌｋｙ）側鎖は、Ｔｒｐを有するペプチドがその活性高次構造を維持するための能力を付与する。それにも関わらず、本発明に従うと、前記ペプチド４位のＴｒｐは、前記ペプチドの活性に対し著しく寄与することが実験的に決定された。
【００４１】
あらゆる特有の作用メカニズムによって限定されることを意図せず、前記ペプチド４位のＴｒｐは、Ｔｒｐ芳香側鎖と、ペプチド相互作用を有するＣ３領域の陽イオン素との陽イオン−π相互作用によって、活性を増強することができる。陽イオンと、シンプルπシステムの表面に関係した負静電ポテンシャルとの間の静電引力である陽イオン−π相互作用は、広範囲のタンパク質種類に対するリガンドの結合に実質的に寄与できる（Ｚａｃｈａｒｉａｓ  &  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ２００２，ＴＩＢＳ  ２３：２８１〜２８７を概説として参照のこと）。
【００４２】
従って、４位のＴｒｐの修飾（例えば、本分野の当業者にはよく知られた方法に従って側鎖の構造を変換する）、若しくは前述の陽イオン−π相互作用を維持若しくは増強するＴｒｐ類似体の置換が、より高い活性を有する類似体を産生するために本発明で検討された。例えば、４位にトリプトファン類似体２−ナフチルアラニン（配列ＩＤ番号：７、８）、１−ナフチルアラニン（配列ＩＤ番号：９）、２−インダニルグリシンカルボン酸（配列ＩＤ番号：１０、１１）、若しくはジヒドロトリプトファン（配列ＩＤ番号：１２）を有するペプチドは全て、コンプスタチンより９倍〜６６倍の範囲で増加した補体阻害活性を有することが判明した。加えて、４位がベンゾイルフェニルアラニンであるフェニルアラニン類似体（配列ＩＤ番号：１３）を有するペプチドは、コンプスタチンの活性より５５倍高い活性を有していた。インドール、ナフチル若しくはジベンゾイル化合物の平面二環構成は、４位の類似体によって産生されるπ相互作用を増強し、それによりペプチドの活性が増強すると考えられる。従って、２若しくはそれ以上の芳香環を有するＴｒｐ類似体を、本発明で使用することが好ましい。そのような類似体は本分野ではよく知られており、ここに例示された類似体に限定されるものではないが、それらの非置換型の若しくは置換型の誘導体も同様に含む。適切な類似体の例として、以下の刊行物や多数の他の刊行物の引用文献によって見出される：Ｂｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１０２６２〜１０２６９（ｉｎｔｅｒ  ａｌｉａ、ｓｉｎｇｌｙ‐（一重）、及びｍｕｌｔｉｐｌｙ‐（多重）ハロゲン化Ｔｒｐ類似体を記載している）；Ｂａｂｉｔｚｋｅ  &  Ｙａｎｏｆｓｋｙ（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２４５２〜１２４５６（ｉｎｔｅｒ  ａｌｉａ、メチル化、及びハロゲン化Ｔｒｐ及び他のＴｒｐとインドール類似体を記載している）、及び米国特許第６，２１４，７９０号、第６，１６９，０５７号、第５，７７６，９７０号、第４，８７０，０９７号、第４，５７６，７５０号、及び４，２９９，８３８号。
【００４３】
カルボキシ終端の修飾
合成方法によって産生されたペプチドは、共通してカルボキシ終端が修飾され、酸の変わりにアミドを有しており、この共通した修飾は、表１にあるようにコンプスタチン（配列ＩＤ番号：１）及びいくつかの類似体において見ることができる。実際、ある場合には、末端アミド含有ペプチドは末端酸含有ペプチドの活性より高い活性を有することが認められた（例えば、配列ＩＤ番号：５及び７と、配列ＩＤ番号：４及び８とをそれぞれ比較した場合）。従って、本発明の好ましい１実施形態は、Ｃ−末端アミド修飾を用いる。ただし、いくつかの状況では、Ｃ−終端に酸を用いることが好ましい。そのような状況としては、限定されるものではないが、溶解度検討、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドコード化核酸分子からのペプチドの発現を含む。
【００４４】
コンプスタチンのカルボキシ−末端残基はスレオニンである。本発明のいくつかの実施形態において、Ｃ−末端スレオニンは、１若しくはそれ以上の天然由来アミノ酸若しくは類似体によって置換される。例えば、配列ＩＤ番号：６のペプチドはＬ−スレオニンの代わりにＤ−スレオニンを有しており、さらに、Ｃ−終端にＣＯＯＨ基を有している。このペプチドは、Ｃ−終端にＬ−スレオニン及びＣＯＮＨ２を有する配列ＩＤ番号：５のペプチドと同等の活性を示す。さらに、Ｉｌｅ（イソロイシン）は１３位のＴｈｒ（スレオニン）の代わりに置換されており、コンプスタチンの活性より２１倍高い活性を有するペプチドを得る。加えて、Ｃ−終端のＣＯＯＨ及び非アセチル化Ｎ−終端と共に、Ａｌａ−ＡｓｎのＣ−末端ジペプチド伸長を有する配列ＩＤ番号：１４のペプチドは、コンプスタチンの活性より３８倍高い活性を示す。これは、以下に詳細に記載しているように、原核生物若しくは真核生物発現システムを解して産生することにも適している。
【００４５】
コンプスタチンと比較して活性の増加を示す別のペプチドは、Ｎ−末端残基及びペプチド内に修飾を有するものである。このペプチドは、１位にＡｃ−Ｌｅｕ（ロイシン）、９位にＴｒｐ、及び１３位にＧｌｙを有しているが、４位は非修飾である。
【００４６】
本発明のコンプスタチン類似体は、従来通りのペプチド合成方法に従った、１若しくはそれ以上のアミノ酸残基の縮合を介したペプチド合成の様々な合成方法によって調整される。好ましくは、ペプチドは、メーカーの使用説明書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａペプチド合成器（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行され得るような、標準の固相方法論に従って合成される。固相法若しくは液相法によるペプチド若しくはペプチド擬態を合成する他の方法は、本分野の当業者にはよく知られている。ペプチド合成過程の間、分枝鎖アミノ基及びカルボキシル基は、一般的に知られた保護基を用いて、必要に応じて保護／脱保護され得る。好ましいペプチド合成方法の実施例は、実施例１に説明している。ペプチドやペプチド誘導体に対する代替保護基を用いた修飾は、本分野の当業者には明らかである。
【００４７】
あるいは、本発明の特定のペプチドは、適切な原核生物若しくは真核生物システムでの発現によって産生される。例えば、ＤＮＡコンストラクトは、バクテリア細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）など）若しくは酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）での発現に適合したプラスミドベクターに挿入される、若しくは昆虫細胞での発現に対するバキュロウイルスベクター、或いは哺乳動物細胞での発現に対するウイルス性ベクターに挿入される。そのようなベクターは、宿主細胞中でＤＮＡを発現するために必要である調節性要素を有しており、この調節性要素は宿主細胞中でＤＮＡの発現を可能にするように位置付けられている。発現に必要なこのような調節性要素は、プロモーター配列、転写開始配列、及び任意でエンハンサー配列を含む。
【００４８】
配列ＩＤ番号：１４のペプチド、及び同様に設計された他のペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸分子の発現による産生に特に好ましい。配列ＩＤ番号：１４の鎖状体（コンカテマー）（例えば、配列ＩＤ番号：１４の２若しくはそれ以上で、上限は用いられる発現システムに依存する）をコードしているＤＮＡコンストラクトは、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現システムに導入される。鎖状体が産生された後、Ｃ−末端Ａｓｎとその後のＮ−末端Ｇとの間での切断が、このポリペプチドをヒドラジンへさらすことによって達成される。
【００４９】
原核生物若しくは真核生物組換えシステムでの遺伝子発現によって産生されたペプチドは、本分野で知られた方法に従って精製される。好ましい実施形態において、商業的に利用可能な発現／分泌システムが用いられ、それにより組換えペプチドが発現し、その後宿主細胞から分泌され、周囲の培養液から容易に精製される。
【００５０】
コンプスタチンの構造は本分野では知られており、前述の類似体の構造は同様な手段によって決定される。短ペプチドの特定の望ましい高次構造が一旦確定された場合、この高次構造に適合するペプチド若しくはペプチド擬態を設計する方法は本分野でよく知られている。例えば、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９３），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４９：３５４７〜３５５８、Ｈｒｕｂｙ  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖｉｃｈ（１９９１），（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｐ．Ｂａｌａｒａｍ  &  Ｓ．Ｒａｍａｓｅｈａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄ．ｏｆ  Ｓｃｉ．，Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，ＰＰ．４２９〜４５５）などを参照のこと。本発明に特に関連するものとして、ペプチド類似体の設計は、上述したように、アミノ酸残基の様々な側鎖の寄与（すなわち、官能基の影響に対する、若しくは立体考慮に対する）を考えることによってさらに絞り込まれる。
【００５１】
ペプチド擬態が、Ｃ３に結合し補体活性を阻害するために必要とされる、特定のバックボーン高次構造と側鎖官能性とを提供する目的に対して、ペプチドと同等によく働くであろうことは本分野の当業者によって理解されるであろう。従って、適切なバックボーン高次構造の形成に関係することができる天然由来アミノ酸、アミノ酸誘導体、類似体、若しくは非アミノ酸分子の使用を介して、Ｃ３結合性で補体阻害する化合物を産生することは本発明の範囲内であると考えられる。非ペプチド類似体、若しくはペプチド及び非ペプチド成分を有する類似体は、"ペプチド擬態"若しくは"同種立体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）擬態"としてしばしばここで言及され、同じバックボーン高次構造特性及び／若しくは他の官能性を有し、補体活性を阻害する例示的なペプチドと十分に類似するような、本発明のペプチドの置換若しくは誘導を意味する。
【００５２】
高親和性ペプチド類似体の開発のためにペプチド擬態を用いることは、本分野ではよく知られている（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１１３１〜１１３７、Ｂｅｅｌｙ，Ｎ．（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：２１３〜２１６、Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．（１９９３），Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３〜１０８２、を参照のこと）。ペプチド内のアミノ酸残基のそれらと同様な回転制約を仮定すれば、既知技術のうちの、ラマチャンドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ）プロットの方法（Ｈｒｕｂｙ  &  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖｉｃｈ，ｓｕｐｒａを参照のこと）によって、非アミノ酸部分を有する類似体を解析し、それらの高次構造モチーフを検証することができる。
【００５３】
コンプスタチン類似体及びペプチド擬態の補体活性化阻害活性は、本分野で知られている様々なアッセイによってテストされ得る。好ましい実施形態において、実施例２に記載されたアッセイが用いられる。他のアッセイの非完全な表は、米国特許第６，３１９，８９７号で説明されており、これに限定するものではないが、（１）Ｃ３及びＣ３フラグメントへのペプチド結合、（２）様々な溶血アッセイ、（３）Ｃ３転換酵素を介したＣ３の切断の測定、及び（４）因子Ｄ（Ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）による因子Ｂ（Ｆａｃｔｏｒ  Ｂ）の切断の測定、を含む。
【００５４】
ここに記載されたペプチド及びペプチド擬態は、本分野で知られているようなコンプスタチン自体を用いるあらゆる目的に対して実用的に有用である。そのような使用は、これに限定するものではないが、（１）患者（ヒト若しくは動物）の血清中の補体活性化の阻害、（２）人工臓器若しくは移植片の使用の間に生じる補体活性化の阻害（例えば人工臓器若しくは移植片を本発明のペプチドでコーティングする若しくは処理することにより）、（３）生理的液体（血液、尿）の体外短絡術の間に起こる補体活性化の阻害（例えば、前記液体が短絡するチューブを本発明のペプチドでコーティングすることにより）、及び（４）コンプスタチン活性化の他の阻害剤を同定するための小分子ライブラリーのスクリーニングにおいて（例えば、Ｃ３若しくはＣ３フラグメントとの結合でコンプスタチン類似体と競合するテスト化合物の能力を測定するために設計された液相若しくは固相高処理アッセイ）、が含まれる。
【００５５】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供する。これらは本発明を説明することを意図するものであって、限定を意図したものではない。
【００５６】
実施例１
ペプチド合成
ペプチド合成と精製は、Ｓａｈｕら（（１９９６）ｓｕｐｒａ、（２０００）ｓｕｐｒａ）によって記載されたように実行した。簡潔に言えば、ペプチドをＦｍｏｃアミド樹脂と標準側鎖保護基とを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍペプチド合成器（モデル４３１Ａ）で合成した。５％フェノール、５％チオアニソール（ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）、５％水、２．５％エタネジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ）、及び８２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する溶媒混合液で２２℃で３時間インキュベーションすることにより、ペプチドを前記樹脂から切断した。この反応混合液をフリット漏斗を通して濾過し、冷エーテルで沈殿化し、５０％アセトニトリル含有０．１％ＴＦＡに溶解し、凍結乾燥した。切断後に得られた粗ペプチドを１０％アセトニトリル含有０．１％ＴＦＡに溶解し、逆相Ｃ−１８カラム（マサチューセッツ州、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。試薬Ｔｈａｌｌｉｍｕ（ＩＩＩ）トリフルオロ酢酸を用いてジスルフィド酸化を樹脂上環化方法によって行った。この方法は、希釈溶液酸化工程と、その後に続く逆相ＨＰＬＣの前の凍結乾燥工程を通じて時間のかかる濃縮をなくすものである。この方法を用いて、多量体形成は存在せず、高レベル（〜９０％）の完全に非保護で、酸化若しくは環化された物質を得た。全てのペプチドの同定と精製を、レーザー脱離マス分光法及びＨＰＬＣによって確認した。
【００５７】
実施例２
補体阻害アッセイ
補体システムにおけるコンプスタチン及びその類似体の阻害活性は、免疫複合体による補体システムの活性化におけるそれらの効果を測定することにより決定された。補体活性化阻害は、正常ヒト血漿中のオボアルブミン−抗オボアルブミン複合体に対するＣ３固定化阻害を測定することにより評価された。マイクロタイターウェルを、５０μのオボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ）で、２５℃で２時間（４℃で一晩）コーティングした。このウェルを、２００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで、２５℃で１時間飽和し、次にラビット抗オボアルブミン抗体を添加し、補体を活性化する免疫複合体を形成した。様々な濃度のペプチドの３０マイクロリットルと、続いて３０μｌの１：８０希釈ヒト血漿とを各ウェルへ直接添加した。３０分のインキュベーション後、Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂ結合をヤギ抗ヒトＣ３  ＨＲＰ−結合抗体を用いて検出した。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質を添加することにより色を発し、４０５ｎｍで光学密度を測定した。Ｃ３Ｂ／ｉ３ｂ沈殿の５０％阻害を引き起こすペプチドの濃度をＩＣ５０とし、様々なペプチドの活性を比較するために用いた。
【００５８】
ここに記載された全ての科学論文、特許及び刊行物のその全体は、この参照により組み込まれる。本発明は、記載された実施形態や上記の例示に限定されるものではなく、添付の請求項の範囲内で変更及び修正が可能である。
【図１】
2010280688.tif 000003
【図２】
2010280688.tif 000004
【図３】
2010280688.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月30日(2010.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体活性化を阻害する化合物であって、
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２―Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４（配列ＩＤ番号：１５）の配列を持つペプチドを有するものであり、
ここで、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ａｃ−Ｉｌｅ（アセチル−イソロイシン）、Ａｃ−Ｖａｌ（アセチル−バリン）、Ａｃ−Ｌｅｕ（アセチル−ロイシン）、若しくはＧｌｙ（グリシン）−Ｉｌｅ（イソロイシン）を有するジペプチドであり、
Ｘａａ２は、Ｔｒｐ（トリプトファン）、若しくはＴｒｐのペプチド性或いは非ペプチド性類似体であり、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、若しくはＴｒｐ（トリプトファン）であり、
Ｘａａ４は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｌ−スレオニン）、Ｄ−Ｔｈｒ（Ｄ−スレオニン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｇｌｙ（グリシン）、若しくはＴｈｒ（スレオニン）−Ａｌａ（アラニン）−Ａｓｎ（アスパラギン）を有するトリペプチドであり、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、若しくはＡｓｎのあらゆるカルボキシ末端―ＯＨが任意に−ＮＨ２に置換されるものであり、
２つのＣｙｓ（システイン）残基はジスルフィド結合によって結合されているものである、化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ１はＡｃ−Ｉｌｅである、化合物。
【請求項３】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ３はＡｌａである、化合物。
【請求項４】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ２は、置換型或いは非置換型二環式芳香環構成要素、若しくは２或いはそれ以上の置換型或いは非置換型単環式芳香環構成要素を有するＴｒｐの類似体である、化合物。
【請求項５】
請求項４記載の化合物において、
前記Ｔｒｐの類似体は、２−ナフチルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−インダニルグリシンカルボン酸、ジヒドロトリプトファン、及びベンゾイルフェニルアラニンからなる群から選択されるものである、化合物。
【請求項６】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ１はＡｃ−Ｉｌｅであり、Ｘａａ２はＴｒｐ、若しくは置換型か非置換型のインドール、ナフチル或いはジベンゾイル成分を有するＴｒｐの類似体であり、Ｘａａ３はＡｌａであり、Ｘａａ４はＬ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｌ−スレオニン）若しくはＤ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｄ−スレオニン）である、化合物。
【請求項７】
請求項６記載の化合物であって、
配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１２、及び配列ＩＤ番号：１３からなる群から選択された配列を有する、化合物。
【請求項８】
請求項１記載の化合物において、
Ｘａａ１はＧｌｙ−Ｉｌｅジペプチドであり、Ｘａａ４はＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎトリペプチドである、化合物。
【請求項９】
請求項８記載の化合物であって、
配列ＩＤ番号：１４を持つペプチドを有するものである、化合物。
【請求項１０】
補体活性化を阻害する１若しくはそれ以上のペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ペプチドは、
Ｘａａ１−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ２−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘａａ３−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ４（配列ＩＤ番号：１５）の配列を有し、
ここで、
Ｘａａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、若しくはＧｌｙ−Ｉｌｅを有するジペプチドであり、
Ｘａａ２は、Ｔｒｐであり、
Ｘａａ３は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり、
Ｘａａ４は、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、若しくはＴｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎを有するトリペプチドであり、
２つのＣｙｓ残基はジスルフィド結合によって結合しているものである、単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０記載の単離核酸分子であって、
Ｘａａ３がＡｌａであるペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１記載の単離核酸分子であって、
配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２記載の単離核酸分子であって、
配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドの２若しくはそれ以上の鎖状体（コンカテマー）をコードするものであり、
このコード化鎖状体はヒドラジンによって切断可能で、配列ＩＤ番号：１４を有するペプチドの多様性を形成するものである、単離核酸分子。
【請求項１４】
請求項１０記載の単離核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターを有する細胞。
【請求項１６】
細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、若しくは哺乳類細胞である、請求項１５記載の細胞。
【外国語明細書】
2010280688000001.pdf
2010280688000002.pdf
2010280688000003.pdf
2010280688000004.pdf