(57)【要約】【課題】キク品種を識別する方法、それに用いるプライマーセット、およびキク品種識別用プライマーの作製方法を提供すること。【解決手段】キク品種間で多型を有するマイクロサテライトマーカーを増幅し得るように設計されたプライマーセットを用いて、識別対象のキクから抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、増幅産物を解析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キク品種間で多型を有するマイクロサテライトマーカーを増幅し得るように設計されたプライマーセットを用いて、識別対象のキクから抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、増幅産物を解析することを特徴とする、キクの品種識別方法。
【請求項２】
プライマーセットが、以下の(a)〜(f)のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
(a)配列番号３と配列番号４のプライマーセット
(b)配列番号５と配列番号６のプライマーセット
(c)配列番号７と配列番号８のプライマーセット
(d)配列番号９と配列番号１０のプライマーセット
(e)配列番号１１と配列番号１２のプライマーセット
(f)配列番号１３と配列番号１４のプライマーセット
【請求項３】
識別されるキク品種が、以下のキク品種の少なくとも１種である、請求項１または２に記載の方法。
ウッドペッカー、キングフィッシャー、ゴールドストックダークリネカー、ジャジー、スケアリー、トゥアーマリン、バロック、フィアイビス、フィーリンググリーン、フィヴァチカン、フィウォッカライム、フィエナジー、フィガーネット、フィキャンドール、フィスワン、フィファルコン、フィプラネット、フィムーンライト（ピンクムーン）、フィレクシーレッド、フィロリポップ、プーマサニー、フェリー、フェリスオーラ、フェリスハーモニー、フルーリーピンク、フロッギー、ペリカン、マラボウ、デックモナ、エバーグレース、ゴールデンピンポン、スーパーピンポン（ただし、フィーリンググリーンとフロッギー間の品種識別、およびゴールデンピンポンとスーパーピンポン間の品種識別を除く。）
【請求項４】
以下の(a)〜(f)のいずれかである、プライマーセット。
(a)配列番号３と配列番号４のプライマーセット
(b)配列番号５と配列番号６のプライマーセット
(c)配列番号７と配列番号８のプライマーセット
(d)配列番号９と配列番号１０のプライマーセット
(e)配列番号１１と配列番号１２のプライマーセット
(f)配列番号１３と配列番号１４のプライマーセット
【請求項５】
請求項４に記載のプライマーセットを少なくとも１つ含む、キク品種識別用キット。
【請求項６】
キクのゲノムＤＮＡから作製された２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーと、任意のマイクロサテライトを含むプローブとを、ＲｅｃＡタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質の存在下で接触させ、プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離し、単離されたプラスミドに挿入されたゲノムＤＮＡの断片の塩基配列を決定し、該塩基配列に基づいて、キク品種間で多型を有するマイクロサテライトマーカーを増幅するプライマーを作製することを含む、キクの品種識別用プライマーの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キクの品種識別方法に関する。さらに本発明は、キク品種識別用プライマーセット、およびキク品種識別用プライマーの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、核酸の塩基配列の違いを利用した、遺伝子型や個体、あるいは品種や種などを識別する方法が多く開発されてきた（例えば特許文献１、２、３および４）。これらの方法は、ＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡの部分を増幅させるプライマーを開発し、該プライマーを使用して対象のＤＮＡ断片を増幅し、ＤＮＡ断片の有無あるいは分子量の相違によって、多型を解析することにより識別を行っている。
【０００３】
一方、キク属植物の遺伝子型および品種の識別に関しては、従来、形状や栽培特性による識別が行われてきた。しかし、このような識別方法は、栽培中における外的要因によって影響を受けやすく、正確な識別ができない場合がある。また、識別するキクの栽培に労力、面積、時間を要するという問題もある。特に、キク属植物は栄養繁殖性であるため、一つの個体から多くのクローン個体を得ることが可能であり、登録品種の盗難や、育成者権者の許諾無しの栽培が行われることがある。このような事情に鑑み、栽培・販売されている品種について、より正確かつ迅速な品種識別方法が求められている。
【０００４】
キクの形状や栽培特性による識別方法以外では、植物組織から抽出したフラボノイドの組成比率により品種を識別する方法（特許文献５）や、遺伝子を利用する方法が開発されている。しかし、後者の遺伝子を利用する方法については、汎用性に欠ける限定的な識別技術が報告されているに過ぎない。例えば、特許文献６は、キクレトロトランスポゾン配列内に設計されたプライマーを含むプライマーセットを用いてキク由来のゲノムＤＮＡを核酸増幅し、得られる増幅産物のパターンに基づいて白系輪ギク品種を識別することを特徴とするキク品種の識別方法を記載しているが、この方法はイオンビームにより得られた特定の突然変異品種を識別するものである。また、非特許文献１および２は、各種の手法による品種識別が可能であることについての報告に過ぎない。さらに、特許文献７は、特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、その菊繁殖体のＲＮＡを検査することにより菊の品種識別を行う方法を記載しているが、この方法は登録品種の正規品と侵害品を識別するものであって、具体的なキク品種を識別するものではない。このように、既存の技術は、特定のキク品種等にのみ適用可能な識別技術であり、またその適用範囲も限られていた。
【０００５】
従って、従来のキク品種だけでなく、将来生まれる新品種にも適応可能な汎用性、発展性のある品種識別技術の確立が望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特許第２８１８４８６号公報
【特許文献２】特許第３２１８３１８号公報
【特許文献３】特表２００２−５４０７９９号公報
【特許文献４】特許第３２３６２９５号公報
【特許文献５】特開２００８−０９６３１７号公報
【特許文献６】特開２００７-２４４３３４号公報
【特許文献７】特開２００７-１８５１４３号公報
【非特許文献１】Theor Appl Genet (1995) 91:439-447
【非特許文献２】J. Amer. Soc. Hort. Sci. (1996) 121:1043-1048
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、種々のキク品種を識別する方法、それに用いるプライマーセット、およびキク品種識別用プライマーの作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、キクのゲノムＤＮＡのマイクロサテライトを利用することにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]  キク品種間で多型を有するマイクロサテライトマーカーを増幅し得るように設計されたプライマーセットを用いて、識別対象のキクから抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅し、増幅産物を解析することを特徴とする、キクの品種識別方法。
[２]  プライマーセットが、以下の(a)〜(f)のうちの少なくとも１つである、[１]に記載の方法。
(a)配列番号３と配列番号４のプライマーセット
(b)配列番号５と配列番号６のプライマーセット
(c)配列番号７と配列番号８のプライマーセット
(d)配列番号９と配列番号１０のプライマーセット
(e)配列番号１１と配列番号１２のプライマーセット
(f)配列番号１３と配列番号１４のプライマーセット
[３]  識別されるキク品種が、以下のキク品種の少なくとも１種である、[１]または[２]に記載の方法。
ウッドペッカー、キングフィッシャー、ゴールドストックダークリネカー、ジャジー、スケアリー、トゥアーマリン、バロック、フィアイビス、フィーリンググリーン、フィヴァチカン、フィウォッカライム、フィエナジー、フィガーネット、フィキャンドール、フィスワン、フィファルコン、フィプラネット、フィムーンライト（ピンクムーン）、フィレクシーレッド、フィロリポップ、プーマサニー、フェリー、フェリスオーラ、フェリスハーモニー、フルーリーピンク、フロッギー、ペリカン、マラボウ、デックモナ、エバーグレース、ゴールデンピンポン、スーパーピンポン（ただし、フィーリンググリーンとフロッギー間の品種識別、およびゴールデンピンポンとスーパーピンポン間の品種識別を除く。）
[４]  以下の(a)〜(f)のいずれかである、プライマーセット。
(a)配列番号３と配列番号４のプライマーセット
(b)配列番号５と配列番号６のプライマーセット
(c)配列番号７と配列番号８のプライマーセット
(d)配列番号９と配列番号１０のプライマーセット
(e)配列番号１１と配列番号１２のプライマーセット
(f)配列番号１３と配列番号１４のプライマーセット
[５]  [４]に記載のプライマーセットを少なくとも１つ含む、キク品種識別用キット。
[６]  キクのゲノムＤＮＡから作製された２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーと、任意のマイクロサテライトを含むプローブとを、ＲｅｃＡタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質の存在下で接触させ、プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離し、単離されたプラスミドに挿入されたゲノムＤＮＡの断片の塩基配列を決定し、該塩基配列に基づいて、キク品種間で多型を有するマイクロサテライトマーカーを増幅するプライマーを作製することを含む、キクの品種識別用プライマーの作製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、上記プライマーセットを１つ、あるいは複数のプライマーセットを組み合わせて用いることにより、数多くのキク品種を識別することができる。また、形状や栽培特性の比較による従来の品種識別方法と比べて、外的要因によって影響を受けることが無くなり、用いる試料がより少なくて済み、少労力かつ短時間で、正確な品種識別結果を得ることができる。さらに、上記プライマーセットでは識別できないキク品種または新品種についても、それらの品種識別に用いることができるプライマーを適宜作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１．マイクロサテライトマーカーを増幅するプライマーセットの設計および作製
まず、任意のキクのゲノムＤＮＡを抽出する。任意のキクは栽培ギク（市販されるキク）が好ましいが、特に限定されない。ゲノムＤＮＡを抽出するための試料は、キク植物から採取した任意の組織（例えば、葉、花弁、茎、根、萼片、茎頂、カルスなど）でよく、特に限定されないが、新しい組織のものが好ましい。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、当技術分野で慣用される方法を用いればよく、例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられ、これらの方法を適宜改変してもよい。また、ＤＮＡの抽出後、必要に応じて、クロロホルム−イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール−クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱などの精製処理を行ってもよい。ゲノムＤＮＡの抽出には、市販の植物ゲノムＤＮＡ抽出キット（例えば、Plant Genomic DNA Extraction Mini（VIOGENE社））を用いることもできる。
【００１２】
得られたゲノムＤＮＡを、超音波破砕や適切な制限酵素等で断片化し、ＤＮＡ断片をプラスミドベクター（pBluescriptベクターあるいはpUCベクターなど）に挿入し、大腸菌などに形質転換してプラスミドベクターを増幅させ、ライブラリーを作製する。増幅したプラスミドを、例えばアルカリＳＤＳ法、煮沸法等で抽出し、マイクロサテライトを含むプラスミドをClone Capture法（国際公開特許公報ＷＯ２００６／０５９３８６参照）などの手法を用い、濃縮する。Clone Capture法は、単純反復配列(ＳＳＲ；Simple Sequence Repeat)を含む２本鎖ＤＮＡの単離方法であって、２本鎖ＤＮＡプラスミドライブラリーを、単離すべきＳＳＲを含むプローブと、ＲｅｃＡタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質（Ｒａｄ５１タンパク質、Ｒａｄ５２タンパク質など）の存在下でインキュベーションし、プローブとハイブリダイズしたプラスミドを単離する工程を含む方法である。ここで用いるプローブは、任意のマイクロサテライト（ＳＳＲ）を含むように作製する。プローブの塩基配列には、ＳＳＲを構成する塩基配列そのもの、あるいはその相補配列が含まれる。また、プローブをビオチン、蛍光色素などで修飾することが好ましい。Clone Capture法は、例えば、ｐＨ７〜８の緩衝液中で、プローブとＲｅｃＡタンパク質をＡＴＰとともに、２０〜４０℃、５分〜２時間インキュベーションを行う。次に、プラスミドを添加し、ＲｅｃＡタンパク質による２本鎖ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイズが可能な条件、例えば２０〜４０℃、５分〜３０分でインキュベーションする。プローブがプラスミドとハイブリダイズしたところは、２本鎖の間にプローブが入り込んだ３本鎖構造が形成される。ハイブリダイズしたプラスミドを単離すれば、目的とするＳＳＲを含むクローンを得ることができる。プローブをビオチンで修飾しておけば、固相化したアビジンと結合させることにより、ハイブリダイズしたクローンを容易に回収することができる。なお、ハイブリダイズしたプラスミドを単離する前に、適宜、ＲｅｃＡタンパク質をプロティナーゼ等により分解してもよい。
【００１３】
濃縮したプラスミドをコンピテントセル（大腸菌など）に形質転換し、該プラスミドを有するセルを単離すれば、目的とするＳＳＲを含むＤＮＡを保持したプラスミドがクローニングされる。クローニングされたプラスミドを精製し、プラスミドが保持するＳＳＲを含む塩基配列を決定する。
【００１４】
得られた塩基配列の情報から、マイクロサテライトマーカーを決定し、該マイクロサテライトマーカーを検出するためのプライマーの設計を行う。マイクロサテライトマーカーは、例えば、ＳＳＲマーカー自動設計システム「Read2Marker」(Biotechniques.(2005) 39:472-476)を用いて決定することができる。このシステムを用いれば、ＳＳＲ配列領域の検出、クローンの重複や多重遺伝子族と示唆される配列の排除などを自動的に行うことができる。マイクロサテライトマーカーは、１〜６塩基の繰り返し配列を含むＤＮＡであり、キク品種間で多型を有する。本発明では、マイクロサテライトマーカーの反復配列のモチーフは特に限定されないが、例えば２塩基（ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ）のＳＳＲのモチーフでは、ＣＡまたはＴＡの繰り返しをモチーフに含み、繰り返しの数が５〜１５０回のものが好ましい。このようなマイクロサテライト（ＳＳＲ）を含む５’上流および３’下流側の塩基配列に相補的な配列を用い、候補のプライマーセットを設計する。各プライマーの長さは特に限定されないが、好ましくは１５〜３０ｂｐ、より好ましくは１８〜２７ｂｐである。さらにプライマーは、適宜、５’末端、３’末端に標識物質（蛍光分子、色素分子、放射性同位元素、ジゴキシゲニンやビオチンなど）を有していてもよく、５’末端がリン酸化またはアミン化されていてもよく、デオキシイノシン、デオキシウラシル、Ｓ化塩基などの修飾塩基やペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでいてもよい。
【００１５】
２．プライマーセットの選抜
識別対象のキク品種から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、候補のプライマーセットを用いてＰＣＲによる増幅を行う。１つの反応液にプライマーセットを１つ、あるいは２つ以上用いることもできるが、別々の反応液に各プライマーセットを用いることが好ましい。ＰＣＲを行う際の反応液組成やサイクリング条件は、当業者であれば、プライマーのＴｍ値、サーマルサイクラーの仕様などに合わせて適宜定めることができる。例えば、鋳型となる抽出ＤＮＡに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーを添加し、約９０〜９６℃の変性、約４０〜７０℃のアニーリング、約７０〜７５℃の伸長の３工程を２０〜６０サイクル繰り返す。これらＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。
【００１６】
得られた増幅産物を、分子量サイズ、塩基長、塩基配列、または存在量（相対量もしくは絶対量）等に基づいて解析する。解析は、例えば、増幅産物の電気泳動、塩基配列決定などにより行うことができるが、本発明では電気泳動が好ましい。電気泳動としては、例えばアガロースゲル、変性及び非変性のアクリルアミドゲルを用いる方法等が挙げられる。電気泳動条件は、特に限定されないが、例えば０．５ｘＴＢＥバッファーで作製した３％アガロースゲルを用い、０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分行う。電気泳動バンドの検出はエチジウム染色により行うが、標識物質を用いた場合はその標識に応じて、例えば蛍光色素を付加したプライマーを用いた場合は、蛍光発色を指標として行ってもよい。電気泳動像に基づいて、多数の候補のプライマーセットのなかから、キク品種の識別に有用な、多型性に富み、増幅効率の高いプライマーセットを選抜する。
【００１７】
以上のようにして選抜された本発明のプライマーセットは、上記の通りである。
また、これらのプライマーセットの少なくとも１つを含んでなるキットの形態にすることができる。このようなキットは、以下の３．で述べるように、キク品種識別のために使用することができる。
【００１８】
３．選抜されたプライマーセットを用いたキクの品種識別方法
本発明のキクの品種識別方法では、上記のようにして選抜された、キク品種間で多型を有するマイクロサテライトマーカーを増幅し得るように設計されたプライマーセットを用いて、識別対象のキクから抽出されたＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、増幅産物を解析し、品種識別を行う。識別対象となるキク品種は、特に限定されないが、例えば、ウッドペッカー、キングフィッシャー、ゴールドストックダークリネカー、ジャジー、スケアリー、トゥアーマリン、バロック、フィアイビス、フィーリンググリーン、フィヴァチカン、フィウォッカライム、フィエナジー、フィガーネット、フィキャンドール、フィスワン、フィファルコン、フィプラネット、フィムーンライト（ピンクムーン）、フィレクシーレッド、フィロリポップ、プーマサニー、フェリー、フェリスオーラ、フェリスハーモニー、フルーリーピンク、フロッギー、ペリカン、マラボウ、デックモナ、エバーグレース、ゴールデンピンポン、スーパーピンポン（ただし、フィーリンググリーンとフロッギー間の品種識別、およびゴールデンピンポンとスーパーピンポン間の品種識別を除く。）が挙げられる。
【００１９】
識別対象のキクのゲノムＤＮＡを上記方法で抽出する。ＤＮＡ抽出試料は特に限定されないが、新しい組織が好ましい。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーセット(a)〜(f)を用いて、上記条件でＰＣＲ増幅を行う。プライマーセットは、１つでもよいが、複数組み合わせてもよい。得られた増幅産物を、例えば上記条件で電気泳動に供試し、用いたプライマーセットに対応した増幅産物の有無に基づいて、品種識別を行う。具体例を、後述の実施例の表１および表２、図１Ａ〜図１Ｆおよび図２Ａ〜図２Ｆに挙げる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２１】
〔実施例１〕プライマーセットの設計
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク品種「セイプリンス」（販売元：有限会社精興園）の未展開葉１ｇ（１０〜１２個）を液体窒素に浸漬させ凍結し、パウダー状になるまで粉砕した。凍結状態のサンプルに沸騰直前まで温めた１．５×ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）抽出バッファーを５ｍｌ加えてＤＮＡを抽出し、等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、遠心機で遠心分離（３０００回転、常温、３０分間）の後に上清を採取することによる除タンパク質処理を２回行った。
【００２２】
その後ＣＴＡＢ沈殿バッファー７．５ｍｌを加え析出したＤＮＡをイノキュレーションループで掬いとり、１０ｎｇ/ｍｌ ＲＮａｓｅを含む１Ｍ塩化ナトリウム２ｍｌに再溶解した。水溶性の夾雑物と塩類を除去するために、エタノール２．５倍量を加え混和した後に、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液１００μｌに溶解した。
【００２３】
（２）ＤＮＡライブラリーの作製
得られた「セイプリンス」のゲノムＤＮＡ約３．０μｇを超音波破砕した後、０．５ μｌ Ｔ４  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、３７℃で５分放置して末端の平滑化を行った。このＤＮＡをアガロースゲル(１．２％)電気泳動（１．０％、０．５ｘＴＢＥバッファー、１００Ｖ、１５分）により分離した後、１ｋｂから１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片３．５μｌ、ライゲーションバッファー０．５μｌ、プラスミドベクター（ｐＵＣ１８）０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ（１Ｕ/μｌ）を加えた反応液を調製し、一晩反応させてＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入した。ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドベクターは、エレクトロポレーション法にてコンピテントセル（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ）へ形質転換させた。形質転換した細胞は、２５ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％ Polypepton、０．５％ Yeast Extract、１％塩化ナトリウム、１．５％ Bacto Agar）上で、３７℃で一晩培養し、生育するコロニーからなるライブラリーを作製した。得られた形質転換体約６０万クローンをプール化し、アルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００２４】
（３）ＤＮＡライブラリーの濃縮
まず、以下の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。（Ａ）３０は、３０ｍｅｒからなるａの連鎖を、（ＣＡ）２５と（ＴＧ）２５は、それぞれｃａとｔｇの２５回の繰り返しを示す。
【００２５】
ＣＡ−オリゴ：５’−（Ａ）３０（ＣＡ）２５−３’（配列番号１、８０ｍｅｒ）
ＴＧ−オリゴ：５’−（Ａ）３０（ＴＧ）２５−３’（配列番号２、８０ｍｅｒ）
【００２６】
これらのプローブを、Amersham社のMegaprime DNA labeling systemを利用してビオチン化した。具体的な操作は次のとおりである。まず、ＣＡ−オリゴ２００ｐｍｏｌ とＴＧ−オリゴ２００ｐｍｏｌ をアニーリング（室温で混合）させた。次いで、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０ｐｍｏｌ加え、最後に、ビオチン２１−ｄＵＴＰを１０００ｐｍｏｌ加えた。更に、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を２ユニット加えて、室温で２時間反応させた。作製したビオチン化プローブを５分間煮沸後に氷上で急冷して１本鎖化した。１本鎖化したビオチン化プローブに２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２、ＡＴＰ (ＡＴＰとＡＴＰ−ｇｕｍｍａ−Ｓの混合液)、およびＲｅｃＡタンパク８μgを加えて、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、上記（２）で精製されたプラスミドライブラリー１０μｇを加えて３７℃で１時間インキュベートして、３重鎖を形成させた。その後、０．１％ＳＤＳ存在下でプロティナーゼＫ処理によってＲｅｃＡを分解し、さらにPhenylmethylsulfonyl Fluoride(ＰＭＳＦ)を加えてプロティナーゼＫを不活化した。ビオチン化プローブとプラスミドベクターを含む液を、緩衝液で平衡化したStreptavidin 磁気ビーズと混合した。室温で放置後、ストレプトアビジンと結合しなかったＤＮＡを洗浄液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ)で洗浄した。洗浄後にアルカリ液(０．１Ｎ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）によって結合したＤＮＡを溶出した。溶出されたプラスミドベクターはエタノール沈殿法で精製し、エレクトロポレーション法にてコンピテントセル（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ）へ形質転換させた。
【００２７】
（４）挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列決定
つづいて、整列化したクローンに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を解読した。まず、大腸菌クローンを３７℃で一晩、５０ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ（１％ Polypepton、０．５％ Yeast Extract、１％ 塩化ナトリウム）液体培地で培養し、４，８００クローンからアルカリ法（Molecular Cloning Second Edition 1.25-1.28 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、MultiScreen NAとMultiScreen F（Millipore社）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、Big Dye Terminater Ver. 3.1（アプライドバイオシステムズ社)を用いて反応させ、精製用磁性樹脂（CleanSeq（Beckman Coulter社）で未反応分の余剰色素を除去した。精製後のサンプルを、キャピラリーシーケンサ（ABI3730xl（アプライドバイオシステムズ社））を用いて解読した。
【００２８】
（５）プライマーセットの設計
次に、このようにして得られた塩基配列情報を用いて、ＳＳＲマーカーを検出するためのプライマー情報の作成を行った。プライマー情報の作成には、ＳＳＲマーカー自動設計システム「Read2Marker」を使用した。得られた結果のうち２塩基（ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ）の単純反復配列のみを検出対象とするようなプライマーセットを抽出し、４８０プライマーセットを合成した。
【００２９】
〔実施例２〕プライマーセットの選抜
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク８品種（ウッドペッカー、トゥアーマリン、フィアイビス、フィーリンググリーン、フェリスオーラ、エバーグレース、ユーロおよび神馬（いずれも販売元キリンアグリバイオ株式会社））のさし穂茎頂から、「DNeasy Plant Mini Kits」（QIAGEN社）を使用し、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、２ｎｇ/μｌに希釈し、以降の実験に供試した。
【００３０】
（２）多型の確認
設計したプライマーは、上記８品種から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認した。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＮＡ（２ｎｇ/μｌ）1μl、Go-Taq Green Master Mix（プロメガ社）５μl、プライマー(２０μＭ)各０．２μl、滅菌水３．６μlとした。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃（配列番号３および４のプライマーセット(a)のみ６０℃）で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長反応）を３５サイクル、最後に７２℃で５分間行った。増幅産物を０．５ｘＴＢＥバッファーで作製した３％アガロースゲルを用い０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外光下で増幅産物を検出した。電気泳動像は、ゲル撮影装置（ＢＩＯ−Ｄｏｃ−Ｉｔ  ＵＶＰ社）により画像データとするとともに印刷し、多型の有無を評価した。なお、分子量マーカーとしてOneSTEP Ladder 50 (0.05-2.0kbp)（ニッポンジーン社）あるいは50bp DNA Step Ladder(プロメガ社）を同時に電気泳動した。このようにして、４８０プライマーセットから、多型性に富み、増幅のよい６プライマーセット（(a)配列番号３および４、(b)配列番号５および６、(c)配列番号７および８、(d)配列番号９および１０、(e)配列番号１１および１２、(f)配列番号１３および１４）を選抜した。
【００３１】
〔実施例３〕プライマーセットを使用した品種識別
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク３２品種（ウッドペッカー、キングフィッシャー、ゴールドストックダークリネカー、ジャジー、スケアリー、トゥアーマリン、バロック、フィアイビス、フィーリンググリーン、フィヴァチカン、フィウォッカライム、フィエナジー、フィガーネット、フィキャンドール、フィスワン、フィファルコン、フィプラネット、フィムーンライト（ピンクムーン）、フィレクシーレッド、フィロリポップ、プーマサニー、フェリー、フェリスオーラ、フェリスハーモニー、フルーリーピンク、フロッギー、ペリカン、マラボウ、デックモナ、エバーグレース、ゴールデンピンポン、スーパーピンポン：いずれも販売元キリンアグリバイオ株式会社）のさし穂茎頂から、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、添付のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、２ｎｇ/μｌに希釈し、以降の実験に供試した。
【００３２】
（２）ＤＮＡ断片の増幅
上記(a)〜(f)の６プライマーセットのそれぞれについて、３２品種のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＮＡ（２ｎｇ/μｌ）1μl、Go-Taq Green Master Mix（プロメガ社）５μl、プライマー（２０μＭ）各０．２μl、滅菌水３．６μlとした。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃（プライマーセット(a)のみ６０℃）で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長反応）を３５サイクル、最後に７２℃で５分間行った。
【００３３】
（３）増幅産物の可視化
増幅産物を、０．５ｘＴＢＥバッファーで作製した３％アガロースゲルを用い、０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外光下で増幅産物を検出した。電気泳動像は、ゲル撮影装置（BIO-Doc-It  UVP社）により画像データとするとともに印刷し、以降の解析に用いた（図１）。なお、分子量マーカーとしてOneSTEP Ladder 50 (0.05-2.0 kbp)（ニッポンジーン社）あるいは50bp DNA Step Ladder（プロメガ社）を同時に電気泳動した。
【００３４】
（４）電気泳動像の解析
図１Ａ〜１Ｆ、図２Ａ〜２Ｆに示す計１２種の電気泳動像を用いて、キク３２品種の多型解析による品種識別を試みた。図１Ａ〜１Ｆではいずれの図においても、分子量マーカー（Ｍ）を除いて左から右に、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）である。図２Ａ〜２Ｆではいずれの図においても、分子量マーカー（Ｍ）を除いて左から右に、フィプラネット（１７）、フィムーンライト（ピンクムーン）（１８）、フィレクシーレッド（１９）、フィロリポップ（２０）、プーマサニー（２１）、フェリー（２２）、フェリスオーラ（２３）、フェリスハーモニー（２４）、フルーリーピンク（２５）、フロッギー（２６）、ペリカン（２７）、マラボウ（２８）、デックモナ（２９）、エバーグレース（３０）、ゴールデンピンポン（３１）、スーパーピンポン（３２）である。また、プライマーセット(a)を用いた増幅産物の電気泳動像は図１Ａと図２Ａに、プライマーセット(b) を用いた増幅産物の電気泳動像は図１Ｂと図２Ｂに、プライマーセット(c) を用いた増幅産物の電気泳動像は図１Ｃと図２Ｃに、プライマーセット(d) を用いた増幅産物の電気泳動像は図１Ｄと図２Ｄに、プライマーセット(e) を用いた増幅産物の電気泳動像は図１Ｅと図２Ｅに、プライマーセット(f) を用いた増幅産物の電気泳動像は図１Ｆと図２Ｆに示した。
【００３５】
電気泳動像に現れる増幅産物のバンドは、電気泳動ごとに、バンドの位置がずれたり、薄いバンドによる誤認が生じうる。そこで、電気泳動像の増幅産物のバンドの区別化のため、各図において、以下のように分子量に基づいた領域を設定し、該領域を四角で囲んだ。
【００３６】
図１Ａと図２Ａでは、領域(i)（２５０ｂｐ近辺）、領域(ii)（２００ｂｐ近辺）、領域(iii)（約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ）、領域(iv)（約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ）、領域(v)（１００ｂｐ近辺）を設定した。
【００３７】
図１Ｂと図２Ｂでは、領域(i)（約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐ）、領域(ii)（２００ｂｐ近辺）、領域(iii)（１００ｂｐ近辺）を設定した。
【００３８】
図１Ｃと図２Ｃでは、領域(i)（約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ）、領域(ii)（約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ）を設定した。
【００３９】
図１Ｄと図２Ｄでは、領域(i)（約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ）、領域(ii)（約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ）を設定した。
【００４０】
図１Ｅと図２Ｅでは、領域(i)（約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ）、領域(ii)（約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ）、領域(iii)（２００ｂｐ近辺）を設定した。
【００４１】
図１Ｆと図２Ｆでは、領域(i)（約５５０ｂｐ〜約７００ｂｐ）、領域(ii)（約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ）を設定した。
【００４２】
これらの設定された合計１７の領域について、各領域に１つ以上のバンドが明確に認められれば「１」とし、当該領域に明確に認められるバンドがなければ「０」とした。「１」または「０」を用いて、図１Ａ〜１Ｆと図２Ａ〜２Ｆの各領域のバンドについてまとめたものが、それぞれ表１と表２である。なお、表１に記載の品種番号１〜１６は、図１Ａ〜１Ｆの付番と、表２に記載の品種番号１７〜３２は、図２Ａ〜２Ｆでの付番と一致する。
【００４３】
【表１】
2010035499.tif 000002
【００４４】
【表２】
2010035499.tif 000003
【００４５】
キク３２品種のうち、「１」と「０」の異なるパターンを示す２８品種は、個別のマーカー型を持ち、相互に識別が可能であることが示された。しかし、品種番号９（フィーリンググリーン）と品種番号２６（フロッギー）間、および品種番号３１（ゴールデンピンポン）と品種番号３２（スーパーピンポン）間は、それぞれ「１」と「０」のパターンが同一であったため、プライマーセット(a)〜(f)を用いたときに他の２８品種とは識別できるものの、それぞれ２品種間の識別ができないことが示された。特に、品種番号３１と３２は枝変わり間であり、遺伝的に非常に近縁であることが予想された。
【００４６】
本発明のキク品種識別用プライマーの作製方法を用いることにより、これらの識別できなかった品種も識別できる新たなプライマーの開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】プライマーセット(a)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは、Ｍ：分子量マーカー、１：ウッドペッカー、２：キングフィッシャー、３：ゴールドストックダークリネカー、４：ジャジー、５：スケアリー、６：トゥアーマリン、７：バロック、８：フィアイビス、９：フィーリンググリーン、１０：フィヴァチカン、１１：フィウォッカライム、１２：フィエナジー、１３：フィガーネット、１４：フィキャンドール、１５：フィスワン、１６：フィファルコンである。各領域は、(i)：２５０ｂｐ近辺、(ii)：２００ｂｐ近辺、(iii)：約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、(iv)：約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、(v)：１００ｂｐ近辺である。
【図１Ｂ】プライマーセット(b)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図１Ａと同様である。各領域は、(i)：約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐ、(ii)：２００ｂｐ近辺、(iii)：１００ｂｐ近辺である。
【図１Ｃ】プライマーセット(c)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図１Ａと同様である。各領域は、(i)：約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、(ii)：約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。
【図１Ｄ】プライマーセット(d)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図１Ａと同様である。各領域は、(i)：約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、(ii)：約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐである。
【図１Ｅ】プライマーセット(e)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図１Ａと同様である。各領域は、(i)：約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、(ii)：約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、(iii)：２００ｂｐ近辺である。
【図１Ｆ】プライマーセット(f)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図１Ａと同様である。各領域は、(i)：約５５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、(ii)：約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。
【図２Ａ】プライマーセット(a)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは、Ｍ：分子量マーカー、１７：フィプラネット、１８：フィムーンライト（ピンクムーン）、１９：フィレクシーレッド、２０：フィロリポップ、２１：プーマサニー、２２：フェリー、２３：フェリスオーラ、２４：フェリスハーモニー、２５：フルーリーピンク、２６：フロッギー、２７：ペリカン、２８：マラボウ、２９：デックモナ、３０：エバーグレース、３１：ゴールデンピンポン、３２：スーパーピンポンである。各領域は、図１Ａと同様である。
【図２Ｂ】プライマーセット(b)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図２Ａと同様である。各領域は図１Ｂと同様である。
【図２Ｃ】プライマーセット(c)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図２Ａと同様である。各領域は図１Ｃと同様である。
【図２Ｄ】プライマーセット(d)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図２Ａと同様である。各領域は図１Ｄと同様である。
【図２Ｅ】プライマーセット(e)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図２Ａと同様である。各領域は図１Ｅと同様である。
【図２Ｆ】プライマーセット(f)を用いたＰＣＲによる増幅産物の電気泳動像を示す。各レーンは図２Ａと同様である。各領域は図１Ｆと同様である。
【図１Ａ】
2010035499.tif 000004
【図１Ｂ】
2010035499.tif 000005
【図１Ｃ】
2010035499.tif 000006
【図１Ｄ】
2010035499.tif 000007
【図１Ｅ】
2010035499.tif 000008
【図１Ｆ】
2010035499.tif 000009
【図２Ａ】
2010035499.tif 000010
【図２Ｂ】
2010035499.tif 000011
【図２Ｃ】
2010035499.tif 000012
【図２Ｄ】
2010035499.tif 000013
【図２Ｅ】
2010035499.tif 000014
【図２Ｆ】
2010035499.tif 000015
【配列表】
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