(57)【要約】【課題】ＰＤＬＩＭ２の創傷治癒反応における役割を解明し、その知見を創薬に応用すること。【解決手段】本発明は、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質を含む、創傷治療剤を提供する。ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質は、好ましくは、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質が、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである。また、本発明は、被験物質が、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価することを含む、創傷を治療し得る物質のスクリーニング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質を含む、創傷治療剤。
【請求項２】
ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質が、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである、請求項１の治療剤。
【請求項３】
被験物質が、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価することを含む、創傷を治療し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
１）ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞を用いたＰＤＬＩＭ２の発現の測定、２）ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な再構成系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能の測定、３）ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な細胞系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能の測定、及び４）動物を用いたＰＤＬＩＭ２の発現又は機能の測定からなる群から選択されるいずれかにより行われる、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
該評価が、被験物質がＰＤＬＩＭ２によるＳｍａｄ２又は３のユビキチン化を抑制するか否かの評価に基づき行われる、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
該評価が、被験物質がＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体の形成を抑制するか否かの評価に基づき行われる、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治療剤及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒とは、何らかの原因で皮膚などの上皮組織が欠損した場合に、これを修復するための一連の反応のことで、最も組織化された免疫又は炎症反応の１つである。創傷治癒反応は、（１）炎症期（２）肉芽組織形成期（３）再構築期の３つの過程に大きく分けられる。炎症期においては、組織損傷に伴って局所の炎症反応が惹起され、好中球やマクロファージが創傷部位に遊走してくる。マクロファージは各種炎症性サイトカインやケモカインを分泌することにより炎症反応をさらに増強する。これに続く肉芽組織形成期においては、血管内皮細胞の増殖により血管新生が誘導されるとともに、創部に浸潤してきた線維芽細胞が増殖してコラーゲン等の細胞外マトリックスを産生することにより肉芽組織を形成し組織の再生を図る。さらに、肉芽組織内の線維芽細胞は、アクチンを多く含み収縮力に富む筋線維芽細胞へと分化する。この時期にみられる創収縮は、この筋線維芽細胞が主となっておこる現象で、効率よく創面積を縮小させるための有用な方法である。そして再構築期においては、肉芽組織の上部に上皮細胞の形成が誘導され、元の正常な構造が再構築される。もし、個体あるいは局所の病的な状態によって正常な創傷治癒反応が傷害されると、褥創、手術後の創部感染、糖尿病性潰瘍、熱傷など難治性の創傷となる。ところが一方では、この反応が過剰におこると、さまざまな病的な線維化、たとえば、皮膚においてはケロイドや瘢痕化を、また肺においては気管支喘息にともなう気道リモデリングをひきおこすことが明らかになっている。さらに重症の例としては、強皮症、肺線維症、肝硬変などの原因となることも示唆されている。よって、これらの一連の創傷治癒反応は厳密に制御される必要がある。これまでの研究において、ＴＧＦβやＩＬ−６などのサイトカイン、および、ＰＤＧＦやＦＧＦなどの増殖因子が創傷治癒反応の進行に重要な役割を果たしていることが報告されているが、これらの反応がどのように調節されているかについては、十分には明らかになっていない。
【０００３】
ＰＤＬＩＭ２(PDZ and LIM domain protein-2)は、ＳＬＩＭ(STAT-interacting LIM protein)とも呼ばれ、本発明者らが単離したＬＩＭタンパク質ファミリーに属する核内ユビキチンリガーゼであり、ＰＤＺおよびＬＩＭドメインを有する。ＰＤＬＩＭ２は、Ｔ細胞におけるＴｈ１細胞分化に必須の転写因子の１つであるＳＴＡＴ４に核内で結合し、これをユビキチン化及び分解することによりＳＴＡＴ４によるシグナル伝達を終息させる（非特許文献１、特許文献１）。その後の解析により、ＰＤＬＩＭ２がＮＦ−κＢに対する核内ユビキチンリガーゼであり、樹状細胞においてＮＦ−κＢをユビキチン化、分解及び不活性化することにより、ＮＦ−κＢによる炎症反応を終息させることが明らかになった（非特許文献２、特許文献２）。ＰＤＬＩＭ２欠損樹状細胞では、ＮＦ−κＢの分解が傷害されており、炎症性サイトカインの産生量も２〜３倍に増加していた。しかしながら、ＰＤＬＩＭ２が個体レベルでどのような生理学的機能を有しているのかに関しては、まだ十分には解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／２４６５４３号明細書
【特許文献２】特開２００７−２５４４６５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tanaka et al, Immunity, 22, 729-736, 2005
【非特許文献２】Tanaka et al, Nat.Immunol. 8, 584, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＰＤＬＩＭ２の創傷治癒反応における役割を解明し、その知見を創薬に応用することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはＰＤＬＩＭ２欠損マウスを用いて創傷治癒の試験を実施した。その結果、ＰＤＬＩＭ２欠損マウスでは、野生型マウスと比較して創傷治癒が促進された。インビトロ解析から、ＰＤＬＩＭ２は、Ｓｍａｄ２および３の核内ユビキチンリガーゼとして、これらの転写因子をユビキチン化及び分解することにより、ＴＧＦβによるＳｍａｄの活性化を負に調節していることが明らかになった。ＴＧＦβにより誘導される筋線維芽細胞への分化がＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞において亢進されていた。更に、ＴＧＦβにより誘導される筋線維芽細胞への分化がＰＤＬＩＭ２に対する特異的ｓｉＲＮＡにより亢進された。これらの結果から、創傷治癒反応においては、ＰＤＬＩＭ２はＴＧＦβ依存性のシグナル伝達経路を負に調節することにより、創傷治癒反応が過剰にならないように適切な時点で創傷治癒反応を終息させる役割を果たすことが示唆された。また、創傷モデルマウスにＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡを投与すると、創傷の治癒反応が促進された。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質を含む、創傷治療剤。
［２］ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質が、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターである、［１］の治療剤。
［３］被験物質が、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価することを含む、創傷を治療し得る物質のスクリーニング方法。
［４］１）ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞を用いたＰＤＬＩＭ２の発現の測定、２）ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な再構成系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能の測定、３）ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な細胞系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能の測定、及び４）動物を用いたＰＤＬＩＭ２の発現又は機能の測定からなる群から選択されるいずれかにより行われる、［３］のスクリーニング方法。
［５］該評価が、被験物質がＰＤＬＩＭ２によるＳｍａｄ２又は３のユビキチン化を抑制し得るか否かの評価に基づき行われる、［３］のスクリーニング方法。
［６］該評価が、被験物質がＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体の形成を抑制し得るか否かの評価に基づき行われる、［３］のスクリーニング方法。
［７］ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能の抑制という、これまでにない新たなメカニズムに立脚した創傷治療剤や、そのスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおいて促進された創部の縮小。（ａ）創傷７日後における野生型マウス（＋／＋）及びＰＤＬＩＭ２欠損マウス（−／−）の創傷治癒の様子。１群につき５匹の動物を用いた３回の独立した試験からの代表的な結果を示す。（ｂ）最初の創面積と比較した、各時点における創面積の変化。（ｃ）創傷７日後における野生型マウス及びＰＤＬＩＭ２欠損マウスの組織学的試験。Ｈ＆Ｅ染色、原拡大率  ×１０。（ｄ）野生型線維芽細胞及びＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞により媒介されたＩ型コラーゲンゲルの収縮。細胞をコラーゲンゲル中に包埋し、ゲルを浮遊させ、ＴＧＦβを加えずに又はＴＧＦβと共に培養した。ゲルの表面積を、ゲルの遊離から０、８及び２４時間後に測定した。
【図２】ＰＤＬＩＭ２はＳｍａｄ２／３に結合し、ＴＧＦβ−Ｓｍａｄ媒介転写を負に制御する。（ａ）ｃ−Ｍｙｃタグ化したＰＤＬＩＭ２と内在性のＳｍａｄ転写因子との相互作用。２９３Ｔ細胞へｃ−Ｍｙｃタグ化したＰＤＬＩＭ２発現プラスミド（ｃ−Ｍｙｃ ＰＤＬＩＭ２）をトランスフェクトし、又はトランスフェクトせずに、全細胞抽出物を調製し、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し（ＩＰ）、抗Ｓｍａｄ２、３又は４抗体で免疫ブロット（ＩＢ）した。（ｂ）マウス胎児由来線維芽細胞におけるルシフェラーゼ活性。ＰＤＬＩＭ２をコードするプラスミドと共に、又は該プラスミドを伴わずに、ＴＡＲＥルシフェラーゼレポーター（ｐＴＡＲＥ−Ｌｕｃ）をコードするプラスミドを該細胞へトランスフェクトし、その後ヒトＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激し、測定した。
【図３】ＰＤＬＩＭ２は、Ｓｍａｄ２及び３のポリユビキチン化及び分解を促進するが、Ｓｍａｄ４についてはしない。（ａ）２９３Ｔ細胞におけるＳｍａｄのユビキチン化アッセイ。２９３Ｔ細胞へ、ＨＡタグ化したＰＤＬＩＭ２発現プラスミド（ＨＡ−ＰＤＬＩＭ２）と共に、又はそれを伴わずに、Ｈｉｓ−ユビキチン（Ｈｉｓ−Ｕｂ）、ｃ−Ｍｙｃタグ化したＳｍａｄ２、３又は４をコードするプラスミドをトランスフェクトした。ユビキチン化したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡビーズで精製し、Ｓｍａｄのユビキチン化（Ｕｂ−Ｓｍａｄ）については抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で、ＰＤＬＩＭ２自体のユビキチン化(Ｕｂ−ＰＤＬＩＭ２)については抗ＰＤＬＩＭ２抗体で、免疫ブロットした。（ｂ）２９３Ｔ細胞の核Ｓｍａｄ２及び３に対するＰＤＬＩＭ２の効果。ｃ−Ｍｙｃタグ化したＰＤＬＩＭ２発現プラスミドと共に、又はそれを用いずに、ｃ−Ｍｙｃタグ化したＳｍａｄ２又は３をコードするプラスミドを２９３Ｔ細胞へトランスフェクトし、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体による免疫ブロットで解析した。
【図４】ＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞において促進されたＳｍａｄ２／３活性化。ヒトＴＧＦβ（０、２、１０ｎｇ／ｍｌ）で１時間刺激した野生型及びＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞の細胞質（Ｃｙｔ）及び核（Ｎｕｃ）抽出物を抗Ｓｍａｄ２、３又は４抗体で免疫ブロットした。抗ＨＳＰ９０抗体及び抗Ｓｐ１抗体を対照として用いた。
【図５】ＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞において促進された筋線維芽細胞への分化。（ａ）ヒトＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で３日間刺激した、野生型（＋／＋）線維芽細胞及びＰＤＬＩＭ２欠損（−／−）線維芽細胞の形態。（ｂ）（ａ）で述べた紡錘形の細胞の百分率を示す。（ｃ）ヒトＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で０、３及び６時間刺激した野生型及びＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞におけるα平滑筋アクチン（ＳＭＡ）発現。
【図６】ｓｉＲＮＡを用いたＰＤＬＩＭ２ノックダウンにより促進された筋線維芽細胞分化。（ａ）マウスＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ又は対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした線維芽細胞の形態。（ｂ）（ａ）において記載した紡錘形細胞の百分率を示す。（ｃ）マウスＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ又は対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトして、ヒトＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１時間刺激した線維芽細胞の核抽出物の、抗Ｓｍａｄ２又は３抗体による免疫ブロット。抗ＤＮＡポリメラーゼδ（ＤＮＡｐｏｌ）を対照として用いた。（ｄ）ヒトＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ又は対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした正常ヒト皮膚線維芽細胞における紡錘形細胞の百分率を示す。
【図７】ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡにより促進された、創傷の治癒反応。縦軸は傷の面積の相対値（治療前の傷の面積に対するパーセント）を、横軸は傷を作成してからの日数を示す。四角はコントロール群を、黒丸はＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡの投与群を、それぞれ示す。
【図８】ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡにより、縮小したマウスの創傷の写真（創傷作成から７日目）。ｓｉＰＤＬＩＭ２は、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡを投与した群を示す。
【図９】マウス胎児由来線維芽細胞の核抽出物の、抗ＰＤＬＩＭ２抗体による免疫ブロット。マウス胎児由来線維芽細胞へ、マウスＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ（配列番号５（siPDLIM2-1）又は配列番号８（siPDLIM2-2））或いは対照オリゴヌクレオチド（コントロール）をトランスフェクトした。抗Ｓｐ−１抗体を対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１．創傷治療剤）
本発明は、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質を含む、創傷治療剤を提供するものである。
【００１２】
ＰＤＬＩＭ２(PDZ and LIM domain protein-2)は、ＳＬＩＭ(STAT-interacting LIM protein)とも呼ばれ、ＬＩＭタンパク質ファミリーに属する公知の核内ユビキチンリガーゼであり、ＰＤＺおよびＬＩＭドメインを有する（非特許文献１）。
【００１３】
本明細書中、ＰＤＬＩＭ２は通常、温血動物（哺乳動物又は鳥類）由来のものを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。ＰＤＬＩＭ２は、好ましくは哺乳動物由来のものであり、より好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）由来のものである。
【００１４】
「ＰＤＬＩＭ２が哺乳動物由来である」とは、ＰＤＬＩＭ２の配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列）が哺乳動物のものであることを意味する。
【００１５】
ＰＤＬＩＭ２のヌクレオチド配列やアミノ酸配列は公知である。ヒト及びマウスのＰＤＬＩＭ２の代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が、ＮＣＢＩに以下の通りに登録されている。
[ヒトＰＤＬＩＭ２]
ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号  NM_176871（バージョンNM_176871.2）（配列番号１）
アミノ酸配列：アクセッション番号  NP_789847（NP_789847.1）（配列番号２）
[マウスＰＤＬＩＭ２]
ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号  NM_145978（バージョンNM_145978.1）（配列番号３）
アミノ酸配列：アクセッション番号  NP_666090（バージョンNP_666090.1）（配列番号４）
【００１６】
なお、本明細書においてヌクレオチド配列は、特にことわりのない限りＤＮＡの配列として記載するが、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に適宜読み替えるものとする。
【００１７】
ＰＤＬＩＭ２の機能としては、Ｓｍａｄ２又は３との結合、Ｓｍａｄ２又は３のユビキチン化等を挙げることが出来る。
【００１８】
ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質としては、例えば、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物が挙げられる。好ましくは、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターが用いられる。
【００１９】
本明細書中、「特異的な遺伝子発現の抑制」とは、標的とする遺伝子の発現を、それ以外の遺伝子の発現よりも強く抑制することを意味する。
【００２０】
ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡとしては、例えば
（Ａ）ＰＤＬＩＭ２をコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は１８塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本鎖のＲＮＡ、及び
（Ｂ）ＰＤＬＩＭ２をコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と治療対象動物（好ましくはヒト）の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る１８塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりＰＤＬＩＭ２の転写を抑制する２本鎖のＲＮＡを挙げることができる。
【００２１】
本明細書中、「特異的なハイブリダイゼーション」とは、核酸が、標的とするヌクレオチドに対して、それ以外のヌクレオチドよりも強くハイブリダイズすることを意味する。
【００２２】
ＰＤＬＩＭ２をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（ヒトＰＤＬＩＭ２）、配列番号３で表されるヌクレオチド配列（マウスＰＤＬＩＭ２）を挙げることが出来る。
【００２３】
短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として注目されている。
【００２４】
ｓｉＲＮＡは、代表的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列（以下、標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる２本鎖オリゴＲＮＡである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖ＲＮＡであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造を形成するＲＮＡ（small hairpin RNA: shRNA）もｓｉＲＮＡの好ましい態様の１つである。
【００２５】
ｓｉＲＮＡに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約１８塩基以上、好ましくは約１９塩基以上、より好ましくは約２１塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。ｓｉＲＮＡが２３塩基よりも長い場合には、該ｓｉＲＮＡは細胞内で分解されて、約２０塩基前後のｓｉＲＮＡを生じ得るので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列の全長である。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約５０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、最も好ましくは約２３塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、通常、約１８〜約５０塩基、好ましくは約１９〜約２５塩基、より好ましくは約２１〜約２３塩基である。
【００２６】
また、ｓｉＲＮＡを構成する各ＲＮＡ鎖の長さも、通常、約１８塩基以上、好ましくは約１９塩基以上、より好ましくは約２１塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されず、理論的には各ＲＮＡ鎖の長さの上限はない。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、siRNAの長さは、例えば約５０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、最も好ましくは約２３塩基以下である。即ち、各ＲＮＡ鎖の長さは、例えば通常、約１８〜約５０塩基、好ましくは約１９〜約２５塩基、より好ましくは約２１〜約２３塩基である。なお、ｓｈＲＮＡの長さは、２本鎖構造をとった場合の２本鎖部分の長さとして示すものとする。
【００２７】
標的ヌクレオチド配列と、ｓｉＲＮＡに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異（少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）については、完全にＲＮＡ干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下し得る。
【００２８】
ｓｉＲＮＡは、５’及び／又は３’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常５塩基以下、例えば２〜４塩基である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
ｓｈＲＮＡのヘアピンループのループ部分の長さは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されないが、通常、５〜２５塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、ｓｈＲＮＡが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。
【００３０】
「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。
【００３１】
ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るアンチセンス核酸としては、例えば
（Ａ）ＰＤＬＩＭ２をコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は１２塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
（Ｂ）ＰＤＬＩＭ２をコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と治療対象動物（好ましくはヒト）の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る１２塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でＰＤＬＩＭ２ポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
等を挙げることが出来る。
【００３２】
アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制する限り特に制限はなく、通常、約１２塩基以上であり、長いものでｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、該長さは好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、通常、約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約１２〜約２００塩基、好ましくは約１５〜約５０塩基、より好ましくは約１８〜約３０塩基である。
【００３３】
アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制可能であれば特に制限はなく、ＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）の全長配列であっても部分配列（例えば約１２塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、好ましくは、標的配列はＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。
【００３４】
アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の同一性を有するものである。
【００３５】
アンチセンス核酸の大きさは、通常約１２塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。
【００３６】
さらに、アンチセンス核酸は、ＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＰＤＬＩＭ２遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００３７】
天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明において使用されるｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のP=OをP=Sに置換）や2’-O-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
【００３８】
ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、ＰＤＬＩＭ２のｍＲＮＡ配列（例えば配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列）や染色体ＤＮＡ配列に基づいて標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を合成することにより調製できる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い２本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。
【００３９】
本発明の創傷治療剤は、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を発現し得る（コードする）発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターにおいては、上述のｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸或いはそれをコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である哺乳動物（好ましくはヒト）の細胞（例えば、肉腫細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
【００４０】
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。
【００４１】
ｓｉＲＮＡの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することが好ましい。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター等を挙げることができる。
【００４２】
上記発現ベクターは、好ましくは上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００４３】
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
【００４４】
本発明の創傷治療剤は、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。
【００４５】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４６】
ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質として、ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを用いる場合、核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の創傷治療剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。また、核酸導入試薬としては、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（LipofectamineRNAiMAX）、インビボフェクタミン（Invivofectamine）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。また、発現ベクターとしてレトロウイルスを用いる場合には、導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。
【００４７】
本発明の創傷治療剤の投与単位形態としては、液剤、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、浣腸剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤、エアゾール剤などが例示される。
【００４８】
医薬組成物中のＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質の含有量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、医薬組成物全体の約０．０１ないし１００重量％である。
【００４９】
本発明の創傷治療剤は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。例えば、外用剤の場合には、皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接噴霧、貼付または塗布され、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節腔内もしくは腹腔内投与され、坐剤の場合には直腸内投与される。
【００５０】
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。
【００５１】
本発明の創傷治療剤は、通常、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質が、創傷部位に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト）に対して安全に投与される。
【００５２】
本発明の創傷治療剤を用いると、創傷治癒反応を促進することが出来る。特に、後述の実施例に示すように、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を阻害すると、創収縮に重要な筋繊維芽細胞への分化が促進されること等から、本発明の創傷治療剤は、創収縮を促進する効果（創面積を縮小させる効果）に優れている。従って、本発明の創傷治療剤は、種々の創傷（例、褥創、手術後感染、糖尿病性潰瘍、熱傷、ドライアイに伴う角膜潰瘍などにおける創傷）の治療用医薬として有用である。
【００５３】
（２．スクリーニング方法）
本発明は、被験物質がＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価することを含む、創傷を治療し得る物質のスクリーニング方法、ならびに当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を含む剤を提供する。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法においては、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制する物質を、創傷を治療し得る物質又は創傷治療薬の候補物質として得ることが出来る。
【００５５】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法は、被験物質がＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法は、
１）ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞を用いたＰＤＬＩＭ２の発現の測定、
２）ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な再構成系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能の測定、
３）ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な細胞系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能の測定、
４）動物を用いたＰＤＬＩＭ２の発現又は機能の測定
などに基づき行われ得る。
【００５７】
上記１）において、ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質とＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＰＤＬＩＭ２の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
【００５８】
上記方法の工程（ａ）では、被験物質がＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞に対する被験物質の接触は、培地中で行われ得る。
【００５９】
ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞とは、ＰＤＬＩＭ２の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＰＤＬＩＭ２の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＰＤＬＩＭ２発現細胞であり得、一方、ＰＤＬＩＭ２の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞は、哺乳動物の細胞であり得る。
【００６０】
ＰＤＬＩＭ２発現細胞は、ＰＤＬＩＭ２を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。また、ＰＤＬＩＭ２発現細胞として、マクロファージ等の免疫細胞や線維芽細胞を使用することもまた好ましい。
【００６１】
ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節領域は、ＰＤＬＩＭ２の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、各ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つこれらのＰＤＬＩＭ２の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００６２】
ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＰＤＬＩＭ２遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＰＤＬＩＭ２に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＰＤＬＩＭ２の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＰＤＬＩＭ２発現細胞が好ましい。
【００６３】
被験物質とＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００６４】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、上述した自体公知の方法により行われ得る。また、ＰＤＬＩＭ２の発現を測定可能な細胞として、ＰＤＬＩＭ２転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００６５】
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００６６】
上記方法の工程（ｃ）では、ＰＤＬＩＭ２の発現量を減少させる被験物質が選択される。ＰＤＬＩＭ２の発現量を減少させる（発現を抑制する）被験物質は、創傷を治療し得る物質として選択することができ、創傷の治療薬の候補物質として有用である。特に、ＰＤＬＩＭ２の発現量を減少させる被験物質は、創収縮を促進する効果（創面積を縮小させる効果）に優れていることが期待される。
【００６７】
上記２）において、ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な再構成系とは、ＰＤＬＩＭ２（タンパク質）及びその他の因子（例、タンパク質）を含む、被験物質によるＰＤＬＩＭ２の機能の抑制を評価可能な非培養細胞系をいう。
【００６８】
一実施形態では、ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な再構成系を用いる本発明のスクリーニング方法は、被験物質がＰＤＬＩＭ２及びその結合対（例、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３）を含む複合体の形成能を抑制するか否かを評価することにより行われ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ１）〜（ｃ１）を含み得る：
（ａ１）被験物質、ならびにＰＤＬＩＭ２及びその結合対を接触させる工程；
（ｂ１）被験物質を接触させた場合におけるＰＤＬＩＭ２及びその結合対を含む複合体量を測定し、該複合体量を被験物質を接触させない場合の複合体量と比較する工程；
（ｃ１）上記（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＰＤＬＩＭ２及びその結合対を含む複合体量を抑制する被験物質を選択する工程。
【００６９】
上記方法の工程（ａ１）では、ＰＤＬＩＭ２及びその結合対を含む複合体の形成が可能であるアッセイ系において、被験物質、ＰＤＬＩＭ２及びその結合対が接触される。その結合対としては、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３が挙げられる。なお、ＰＤＬＩＭ２及びその結合対の一方又は双方は、それらの複合体の検出を容易にするため標識されていてもよい。標識としては、例えば、標識用物質（例、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質）による標識の他、レポーター遺伝子によりコードされ得るタンパク質との融合が挙げられる。また、本アッセイ系では、ＰＤＬＩＭ２及び／又はその結合対等を含む細胞ホモジネート（例、ＰＤＬＩＭ２発現ベクター及び／又はＰＤＬＩＭ２結合対の発現ベクターをトランスフェクトした細胞のホモジネート）も使用することができる。
【００７０】
上記方法の工程（ｂ１）では、先ず、被験物質を接触させた場合における複合体量が測定される。ＰＤＬＩＭ２及びその結合対を含む複合体としては、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２を含む複合体、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ３を含む複合体、ＰＤＬＩＭ２、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３を含む複合体等を挙げることが出来る。複合体量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、免疫学的手法（例、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴を利用する相互作用解析法（例、BiacoreＴＭの使用）が挙げられる。
【００７１】
次いで、被験物質を接触させた場合の複合体量が、被験物質を接触させない場合の複合体量と比較される。複合体量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない場合の複合体量は、被験物質を接触させた場合の複合体量の測定に対し、事前に測定した複合体量であっても、同時に測定した複合体量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した複合体量であることが好ましい。
【００７２】
上記方法の工程（ｃ１）では、複合体量を減少させる被験物質が選択される。ＰＤＬＩＭ２及びその結合対（例えば、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３）を含む複合体の量を減少させる被験物質は、創傷を治療し得る物質として選択することができ、創傷の治療薬の候補物質として有用である。特に、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体量を減少させる被験物質は、創収縮を促進する効果（創面積を縮小させる効果）に優れていることが期待される。
【００７３】
別の実施形態では、ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な再構成系を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、被験物質がＰＤＬＩＭ２によるＳｍａｄ２又は３のユビキチン化を抑制し得るか否かを評価することにより行われ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ２）〜（ｃ２）を含み得る：
（ａ２）被験物質、ならびにＰＤＬＩＭ２、Ｓｍａｄ２又は３及びユビキチン化反応に必要な因子を接触させる工程；
（ｂ２）被験物質を接触させた場合におけるユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量を測定し、該ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量を被験物質を接触させない場合のユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量と比較する工程；
（ｃ２）上記（ｂ２）の比較結果に基づいて、ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量を抑制する被験物質を選択する工程。
【００７４】
上記方法の工程（ａ２）では、Ｓｍａｄ２又は３のユビキチン化が可能であるアッセイ系において、被験物質、ＰＤＬＩＭ２、Ｓｍａｄ２又は３及びユビキチン化反応に必要な因子が接触される。ユビキチン化反応に必要な因子としては、例えば、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２が挙げられる。
【００７５】
上記方法の工程（ｂ２）では、先ず、被験物質を接触させた場合におけるユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３が測定される。ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、ウエスタンブロッティング法等の免疫学的手法が挙げられる。
【００７６】
次いで、被験物質を接触させた場合のユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量が、被験物質を接触させない場合のユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量と比較される。ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない場合のユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量は、被験物質を接触させた場合のユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量の測定に対し、事前に測定したユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量であっても、同時に測定したユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量であることが好ましい。
【００７７】
上記方法の工程（ｃ２）では、ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量を減少させる（即ち、Ｓｍａｄ２又は３のユビキチン化を抑制する）。被験物質が選択される。ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量を減少させる被験物質は、創傷を治療し得る物質として選択することができ、創傷の治療薬の候補物質として有用である。特に、ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量を減少させる（即ち、Ｓｍａｄ２又は３のユビキチン化を抑制する）被験物質は、創収縮を促進する効果（創面積を縮小させる効果）に優れていることが期待される。なお、ユビキチン化アッセイの詳細については、例えば、Tanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005) を参照のこと。
【００７８】
上記３）において、ＰＤＬＩＭ２の機能を測定可能な細胞系を用いたＰＤＬＩＭ２の機能を測定するスクリーニング方法は、例えば、ｉ）被験物質がＰＤＬＩＭ２によるＳｍａｄ２又は３のユビキチン化を抑制するか否か、あるいはｉｉ）ＰＤＬＩＭ２及びその結合対（例、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３）を含む複合体量を減少させるか否かの評価により行われ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質とＰＤＬＩＭ２発現細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＰＤＬＩＭ２の機能レベルを測定し、該機能レベルを、被験物質を接触させない対照細胞における機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＰＤＬＩＭ２の機能レベルを抑制する被験物質を選択する工程。
【００７９】
上記方法の工程（ａ）では、被験物質がＰＤＬＩＭ２発現細胞と接触条件下におかれる。ＰＤＬＩＭ２発現細胞に対する被験物質の接触は、培地中で行われ得る。ここで用いられるＰＤＬＩＭ２発現細胞は、タンパク質レベルでのＰＤＬＩＭ２のアッセイが可能な程度にＰＤＬＩＭ２を発現し得る細胞であり得る。このようなＰＤＬＩＭ２発現細胞の好ましい例としては、ＰＤＬＩＭ２発現ベクター及び／又はＳｍａｄ２発現ベクター及び／又はＳｍａｄ３発現ベクターがトランスフェクトされた細胞（例、肥満細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞）、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２及び／又はＳｍａｄ３の天然発現細胞（例、マクロファージ等の免疫細胞、線維芽細胞）が挙げられる。ＰＤＬＩＭ２発現細胞に対する被験物質の接触は、培地中で行われ得る。
【００８０】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた細胞におけるＰＤＬＩＭ２の機能レベルが測定される。例えば、ｉ）については、ユビキチン化Ｓｍａｄ２又は３量の測定（実施例及びTanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005) 参照）により行われ得る。ｉｉ）については、上記２）の（ｂ１）の方法の他、ツーハイブリッドシステムにより測定できる。なお、本工程（ｂ）における機能レベルの比較は、上記方法２）と同様に行われ得る。
【００８１】
上記方法の工程（ｃ）では、ＰＤＬＩＭ２の機能レベルを減少させる（機能を抑制する）被験物質が選択される。ＰＤＬＩＭ２の機能レベルを減少させる被験物質は、創傷を治療し得る物質として選択することができ、創傷の治療薬の候補物質として有用である。特に、ＰＤＬＩＭ２の機能レベルを減少させる被験物質は、創収縮を促進する効果（創面積を縮小させる効果）に優れていることが期待される。
【００８２】
上記４）において、動物を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物質を投与した動物におけるＰＤＬＩＭ２の発現量又は機能レベルを測定し、該発現量又は機能レベルを被験物質を投与しない対照動物におけるＰＤＬＩＭ２の発現量又は機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＰＤＬＩＭ２の発現量又は機能レベルを抑制する被験物質を選択する工程。
なお、本方法論は、（ｂ）及び（ｃ）の工程のみを必須とすることもできる。
【００８３】
上記方法の工程（ａ）では、動物として、任意の温血動物、例えば、上述の哺乳動物が使用され得る。被験物質の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。
【００８４】
上記方法の工程（ｂ）では、ＰＤＬＩＭ２の発現量又は機能レベルの測定は自体公知の方法により測定され得る。例えば、動物から単離又は採取された免疫細胞におけるＰＤＬＩＭ２の発現量又は機能レベルが、上記１）〜３）の方法の工程（ｂ）と同様の方法論により測定され得る。本工程（ｂ）における発現量の比較及び上記方法の工程（ｃ）もまた、上記１）〜３）の方法論と同様に行われ得る。
【００８５】
（３．その他）
本発明は、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体、並びにその作製方法及び検出方法を提供する。ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を含む複合体としては、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２を含む複合体、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ３を含む複合体、ＰＤＬＩＭ２、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３を含む複合体等を挙げることが出来る。本発明の複合体は、本発明のスクリーニング方法に有用である。
【００８６】
Ｓｍａｄ２及び３は、ＴＧＦβシグナリングを媒介する公知の転写因子である。
【００８７】
本明細書中、Ｓｍａｄ２及び３は通常、温血動物（哺乳動物又は鳥類）由来のものを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。Ｓｍａｄ２及び３は、好ましくは哺乳動物由来のものであり、より好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）由来のものである。
【００８８】
本発明の複合体における、ＰＤＬＩＭ２とＳｍａｄ２又は３との結合の強度は、免疫沈降試験においてＰＤＬＩＭ２とＳｍａｄ２又は３とが共沈降し得る程度の強度である。
【００８９】
ＰＤＬＩＭ２、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、目的とするタンパク質を天然に発現する細胞から回収され得るタンパク質、又は組換えタンパク質であり得る。ＰＤＬＩＭ２は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）天然のＰＤＬＩＭ２発現細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）からＰＤＬＩＭ２を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＰＤＬＩＭ２発現ベクターを導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるＰＤＬＩＭ２を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＰＤＬＩＭ２を合成してもよい。Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３もまた同様に調製できる。ＰＤＬＩＭ２、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜単離又は精製される。
【００９０】
本発明の複合体は、このようにして得られたＰＤＬＩＭ２とＳｍａｄ２又は３とを、適切な緩衝液中で混合し、結合させることにより製造することが出来る。得られた複合体は、好ましくは更に、ゲルろ過等により目的とする複合体以外のタンパク質を除去し、単離又は精製される。
【００９１】
このような複合体の検出は、抗ＰＤＬＩＭ２抗体及び／或いは抗Ｓｍａｄ２抗体又は抗Ｓｍａｄ３を用いる抗体免疫学的手法により行われ得る。
【００９２】
本発明はまた、ＰＤＬＩＭ２発現ベクターが導入されたＳｍａｄ２又は３天然発現細胞、Ｓｍａｄ２又は３発現ベクターが導入されたＰＤＬＩＭ２天然発現細胞、ＰＤＬＩＭ２及びＳｍａｄ２又は３を発現する１又は２個のベクター（例、発現ベクターの組合せ、共発現ベクター）が導入された細胞を提供する。本発明のこのような細胞は、本発明のスクリーニングに有用である。
【００９３】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００９４】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００９５】
［実施例１］
［方法］
（プラスミド）
Ｓｍａｄ発現コンストラクトを作成するため、マウスｓｍａｄ２、３又は４のコード配列をｐＣＭＶ−Ｍｙｃ(Clontech)内へ挿入した。ｃ−Ｍｙｃタグ化ＰＤＬＩＭ２の発現プラスミドは、マウスｐｄｌｉｍ２のコーディング領域をｐＣＭＶ−Ｍｙｃ (Clontech)内へサブクローニングすることにより作成した。ＨＡ−タグ化ＰＤＬＩＭ２コンストラクトのため、ＰＤＬＩＭ２−ｐＣＭＶ−Ｍｙｃコンストラクトのｃ−Ｍｙｃタグ化ｐｄｌｉｍ２を、ＰＣＲ増幅したＨＡタグが付加したマウスｐｄｌｉｍ２のコーディング領域で置換した。ｐＴＡＲＥルシフェラーゼレポーターコンストラクトは、STRATAGENEより購入した。
【００９６】
（試薬及び抗体）
ヒト組み換えＴＧＦβは和光純薬より購入した。抗Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ４抗体は、セルシグナリングテクノロジーより購入した。抗Ｓｍａｄ３抗体はＡｂｃａｍより購入した。抗ＨＳＰ９０抗体、抗Ｓｐ１抗体及び抗ＤＮＡポリメラーゼδ触媒サブユニット抗体は、サンタクルズバイオテクノロジーより購入した。抗アクチン抗体はシグマより購入した。抗Ｍｙｃ抗体はＭＢＬより購入した。
【００９７】
（創傷治癒試験）
Ｐｄｌｉｍ２-／-マウスの作成については以前に記載している(Tanaka et al, Nat. Immunol. 8, 584-591, 2007)。マウスをＳＰＦ（specific pathogen-free）条件下で維持し、Ｂａｌｂ／ｃへ少なくとも７回バッククロスした後で用いた。全ての試験は理研横浜研究所動物使用委員会により許可されたガイドラインに従ったものである。全厚皮膚切除創傷を、背部皮膚の中心に作成した（直径６ｍｍ）。創傷から０、３、５及び７日後に創面積を測定した。創傷組織を７日目に採集し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００９８】
（コラーゲンゲル収縮アッセイ）
このアッセイには、コラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン株式会社）を使用した。Ｉ型コラーゲン溶液を製造者のプロトコールに従って調製した。コラーゲン溶液を野生型胚性線維芽細胞及びＰＤＬＩＭ２欠損胚性線維芽細胞と混合し、１２穴細胞培養プレート（各ウェル中に１ｍｌ）中に注ぎ、３７℃で３０分ゲル化させた。血清不含ＤＭＥＭ（１ｍｌ）を更にゲル上に注いだ。１２時間のインキュベーション後、ゲルを各ウェルから分離し、浮遊させ、ＴＧＦβの存在下又は非存在下でインキュベートした。ゲルの表面積をゲルの遊離から０、８及び２４時間後に測定した。
【００９９】
（細胞、トランスフェクション、レポーターアッセイ）
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を１３．５ｄｐｃ胚から調製し、表示したパーセントのＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。正常ヒト線維芽細胞は、Lonza Walkersville Incより購入し、線維芽細胞培養培地キット(Lonza）又は１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。２９３Ｔ細胞は１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で維持した。エフェクテントランスフェクション試薬（QIAGEN）を一過性トランスフェクションに使用した。レポーターアッセイのため、ＭＥＦをｐＴＡＲＥルシフェラーゼコンストラクト及び野生型ＰＤＬＩＭ２分子又はフレームシフト変異体ＰＤＬＩＭ２分子をコードする発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの全量は、対照プラスミドを添加することにより一定に維持した。ルシフェラーゼ活性を製造者（Promega）のプロトコールに従って測定した。
【０１００】
（細胞内分画、免疫沈降及び免疫ブロット）
免疫ブロット解析のために用いた全ての可溶化バッファーは、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含有するものであった。細胞質抽出物および核抽出物は以下のように調製した。細胞を、低張性のバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０％  グリセロール）により、氷上にて１０分間可溶化した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１分）後、上清を回収し、細胞質画分として使用した。次に、ペレットを高張性のバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％  グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４００ｍＭ  ＮａＣｌ）により、短時間のボルテックスをしたあと、氷上にて２０分間可溶化した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分）後、上清を回収し、核画分として用いた。得られた画分の精製度を、抗ＨＳＰ９０抗体（細胞質用）、抗Ｓｐ１抗体（核画分用）を用いて確認した。免疫沈降のため、細胞をバッファー（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０及び０．５％  ＮＰ−４０）中で可溶化することにより、全細胞抽出物を調製した。抽出物を抗Ｍｙｃ抗体及びプロテインＧセファロース（AmershamBioscience）と共にインキュベートし、４回洗浄し、表示した抗体による免疫ブロット解析に付した。
【０１０１】
（ユビキチン化アッセイ）
２９３Ｔ細胞へ、ｃ−Ｍｙｃタグ化Ｓｍａｄ２、３又は４、Ｈｉｓタグ化ユビキチン及びＨＡタグ化野生型ＰＤＬＩＭ２分子又はフレームシフト変異体ＰＤＬＩＭ２分子をコードする発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＰＨ８.０、１０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いた変性条件下で抽出した。抽出物をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Novagen）で３時間インキュベートしたあと、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８及び２０ｍＭ  イミダゾールを含有するバッファーで洗浄した。精製したタンパク質を抗ｃ−Ｍｙｃ抗体による免疫ブロットに付した。
【０１０２】
（筋線維芽細胞分化試験）
野生型線維芽細胞及びＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞を１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中に播種した。２４時間後、培地をＦＣＳを含有しないＤＭＥＭに交換し、細胞を更に２４時間培養した。その後、細胞をヒトＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で３日間刺激した。細胞の形態を解析し、紡錘形細胞の百分率を算出した。
【０１０３】
（ＲＴ−ＰＣＲ解析）
野生型線維芽細胞及びＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞をＦＣＳ不含ＤＭＥＭ中に播種し、２４時間培養した。次に、細胞をヒトＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で３又は６時間刺激した。全ＲＮＡをRNeasy micro RNA extraction kit (Qiagen)を用いて抽出した。PrimeScript RT reagent kit (TAKARA)を用いてｃＤＮＡを合成し、7000シークエンスディテクター(Applied Biosystems)を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ解析に付した。反応は、１８Ｓ  ｒＲＮＡ（内部対照）及びα-smooth muscle actin(TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems)に対するプライマーを用いて実施した。
【０１０４】
（ｓｉＲＮＡ）
二重鎖ｓｉＲＮＡを合成し、ステルスｓｉＲＮＡ（Invitrogen）へ改変した。ｓｉＲＮＡの標的部位は、Invitrogen からのオンラインツールであるBLOCK-iT RNAidesignerを用いて選択した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである；
マウスＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ：5’-CAGAGATTTCCACACACCCATCATT-3’（配列番号５） 
対照ｓｉＲＮＡ（マウス）：5’-CAGTTTACACCCACATACCCGAATT-3’（配列番号６）
ヒトＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ：5’-TGATGGCCACGATTATGTCTCCAGG-3’（配列番号７）
ステルスＲＮＡｉ陰性対照二量体(Invitrogen, Cat#12935-115)を、ヒト線維芽細胞における対照として使用した。ｓｉＲＮＡは、リポフェクタミンRNAiMAX（Invitrogen）を用いて、マウス胎児由来線維芽細胞又は正常ヒト皮膚線維芽細胞へトランスフェクトした。
【０１０５】
［結果］
（ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおける創傷治癒反応の促進）
マウスの背部の皮膚を直径６ｍｍの円形に切り取り、この部分の修復治癒過程を７日間観察した。野生型およびＰＤＬＩＭ２欠損マウスの７日目の創部を図１ａに示した。ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおける７日目の創部の大きさは、野生型マウスに比べて明らかに縮小しており、ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおいて、創傷治癒が著明に促進していることが示唆された。また、ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおいては、創部の周りの発毛が顕著に促進していた。図１ｂは野生型マウスおよびＰＤＬＩＭ２欠損マウスの創部の大きさを経時的に示したものである。ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおいては、創作製後５日目以後で特に顕著に創部の面積の縮小が認められた。次に、創部の皮膚および皮下組織を組織学的に観察したところ、肉芽組織の形成、血管新生、再上皮化に関しては、ＰＤＬＩＭ２欠損マウスと野生型マウスでは差が認められず、肉眼的な創部の収縮のみがＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおいて亢進していることが明らかになった（図１ｃ）。そこで次に、野生型およびＰＤＬＩＭ２欠損マウス由来の胎児初代培養線維芽細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの創収縮モデルの実験を行った。これまでの研究から、この実験系における創収縮は、ＴＧＦβ刺激によって促進されることが明らかになっている。そこで、線維芽細胞をコラーゲンゲル溶液に包埋し、これを１２時間培養した。その後ゲルを培養プレートから剥離して浮遊させ、ＴＧＦβ存在下および非存在下で経時的にコラーゲンゲルの表面積を測定することにより、それぞれの線維芽細胞を含むゲルの収縮の程度を評価した。ＰＤＬＩＭ２欠損マウス由来線維芽細胞を包埋したゲルにおいては、ＴＧＦβで刺激したときの収縮が、野生型マウスの場合と比べて有意に促進していた（図１ｄ）。このことから、ＰＤＬＩＭ２欠損マウスにおいては、ＴＧＦβ依存性のシグナル伝達が亢進していることが示唆された。そこで、次にＰＤＬＩＭ２がＴＧＦβ依存性のシグナル伝達をどのように制御しているのかに関して解析を行った。
【０１０６】
（ＰＤＬＩＭ２はＳｍａｄ２／３に結合し、ＴＧＦβ依存性シグナル伝達を抑制する）
ＴＧＦβが細胞表面の受容体に結合すると、受容体はまず転写因子Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のセリン残基を直接リン酸化する。これにより活性化されたＳｍａｄ２／３はさらにＳｍａｄ４と複合体を形成し、核に移行してさまざまな標的遺伝子の発現を誘導する。これらの活性化されたＳｍａｄは、ユビキチン化及び分解されることにより不活性化されることが報告されており、このユビキチン化を担うユビキチンリガーゼもすでにいくつか同定されている。ＰＤＬＩＭ２は、核内蛋白であり、ＳＴＡＴ４およびＮＦ−κＢに対するユビキチンリガーゼとしてはたらくことから、ＰＤＬＩＭ２がＳｍａｄに対しても核内ユビキチンリガーゼとして機能している可能性を検討した。
まず、ＰＤＬＩＭ２がこれらのＳｍａｄ転写因子と会合するかどうかについて、共免疫沈降法を用いて検討を行った。ｃ−Ｍｙｃタグ化したＰＤＬＩＭ２を２９３細胞に強制発現し、この細胞の蛋白抽出物をｃ−Ｍｙｃに対する抗体で免疫沈降した。そしてＳｍａｄ２、３および４に対する抗体を用いて、それぞれのＳｍａｄのＰＤＬＩＭ２に対する結合を調べた。ＰＤＬＩＭ２は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３と選択的に会合し、Ｓｍａｄ４とは結合しなかった（図２ａ）。次に、レポーターアセッイを用いてＳｍａｄ依存性の遺伝子発現に対するＰＤＬＩＭ２の効果を調べた。線維芽細胞株に、Ｓｍａｄの結合配列を３個上流に有するルシフェラーゼレポータープラスミドを移入した。この細胞をＴＧＦβで刺激するとレポーターが活性化されたが、ここにＰＤＬＩＭ２を同時に強制発現させるとレポーターの活性化を有意に阻害した（図２ｂ）。これらのことから、ＰＤＬＩＭ２がＴＧＦβ依存性のＳｍａｄの活性化に対して抑制的にはたらくことが明らかになった。
【０１０７】
（ＰＤＬＩＭ２はＳｍａｄ２および３をユビキチン化及び分解する）
次に、ＰＤＬＩＭ２がこれらのＳｍａｄをユビキチン化するかどうかを検討した。ｃ−Ｍｙｃタグ化したＳｍａｄ２、３、または４の発現ベクターを、ヒスチジンタグ化したユビキチン発現ベクター、および、ＰＤＬＩＭ２発現ベクターまたはコントロールベクターとともに２９３細胞に強制発現させた。これらの細胞の蛋白抽出物からニッケルＮＴＡビーズを用いてヒスチジン標識された蛋白を精製し、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いて、それぞれのＳｍａｄのユビキチン化を検出した（図３ａ）。ＰＤＬＩＭ２の共発現により、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３は強くユビキチン化されたが、Ｓｍａｄ４はほとんどユビキチン化されなかった。一般に、ユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームによって分解されることが知られている。そこで、ＰＤＬＩＭ２がＳｍａｄ２および３の分解を誘導し得るかどうかを調べた。ｃ−Ｍｙｃタグ化したＳｍａｄ２および３を、ＰＤＬＩＭ２発現ベクターまたはコントロールベクターとともに２９３細胞に強制発現させた。これらの細胞から核分画を抽出し、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いて核内のＳｍａｄ２／３の蛋白量を調べた（図３ｂ）。ＰＤＬＩＭ２の共発現により、核内のＳｍａｄ２および３のタンパク質量の減少が認められた。以上の結果より、ＰＤＬＩＭ２はＳｍａｄ２および３に選択的に結合して、これらの転写因子をユビキチン化及び分解することにより不活性化すること、すなわち、ＰＤＬＩＭ２がＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３のユビキチンリガーゼであることが明らかになった。
【０１０８】
（ＰＤＬＩＭ２欠損細胞におけるＳｍａｄ２／３の活性の亢進）
さらに、ＰＤＬＩＭ２欠損マウス胎児由来線維芽細胞を用いて、ＴＧＦβによるＳｍａｄの活性化に対するＰＤＬＩＭ２の効果を検討した。野生型およびＰＤＬＩＭ２欠損マウス由来線維芽細胞を、ＴＧＦβ（０、２、１０ｎｇ／ｍｌ）で１時間刺激し、細胞質分画および核分画を抽出した。そして、抗Ｓｍａｄ２、３および４抗体を用いて、それぞれのＳｍａｄの細胞質内および核内のタンパク質量を調べた（図４）。ＰＤＬＩＭ２欠損線維芽細胞においては、核内のＳｍａｄ２および３のタンパク質量が、野生型マウス由来細胞と比べて有意に増加していた。これに対し、核内のＳｍａｄ４のタンパク質量にはこれらの細胞間での差は認められなかった。また、細胞質内のＳｍａｄ２および３のタンパク質量に関しては、両細胞間での差は認められなかった（図４）。これらより、ＰＤＬＩＭ２欠損細胞においては、ＴＧＦβによるＳｍａｄ２／３の活性化が亢進していることが示唆された。これはＰＤＬＩＭ２がＳｍａｄ２／３の核内ユビキチンリガーゼであるという上記の知見とよく一致する。
【０１０９】
（ＰＤＬＩＭ２欠損細胞における筋線維芽細胞への分化の亢進）
前述のように、創傷治癒過程にみられる創収縮においては、肉芽組織内の線維芽細胞が筋線維芽細胞へと分化することが重要であるが、ＴＧＦβがこの分化を促進することが明らかになっている。そこで、野生型およびＰＤＬＩＭ２欠損マウス由来線維芽細胞を、ＴＧＦβ存在下および非存在下で培養し、これらの細胞の筋線維芽細胞への分化を調べた。典型的な線維芽細胞は星型の形態をとるが、筋線維芽細胞に分化すると、これが紡錘形になり、細胞質からの突起が顕著に認められるようになる。ＰＤＬＩＭ２欠損マウス由来線維芽細胞は、ＴＧＦβ存在下においては、野生型の細胞に比べて、紡錘型の細胞の割合が有意に増加していた（図５ａ、図５ｂ）。また、筋線維芽細胞の分化のマーカーであるα−smooth muscle actinの発現も、ＰＤＬＩＭ２欠損マウス由来線維芽細胞において亢進していた（図５ｃ）。このことから、ＰＤＬＩＭ２欠損細胞においては、ＴＧＦβ依存性の筋線維芽細胞への分化が亢進していることが明らかになった。
【０１１０】
（ＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡによる筋線維芽細胞への分化の亢進）
次に、ｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ干渉法）を用いて、線維芽細胞においてＰＤＬＩＭ２をノックダウンした場合の、筋線維芽細胞への分化に対する効果を検討した。まず、マウスのＰＤＬＩＭ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡおよびコントロールのｓｉＲＮＡを野生型マウス由来線維芽細胞に移入した。ＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡを移入した細胞においては、コントロールのｓｉＲＮＡを移入した細胞と比べて、紡錘型の細胞の割合が有意に増加していた（図６ａ、図６ｂ）。また、ＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡを移入した細胞においては、ＴＧＦβ刺激したときのＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３の核内蛋白量も、コントロールの細胞とくらべて亢進していた（図６ｃ）。このことから、ＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の分解を抑制し、ＴＧＦβ依存性のシグナル伝達を亢進させることにより、筋線維芽細胞への分化を促進させることが示唆された。さらに、ヒトのＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡを作製し、これをヒト皮膚由来正常二倍体線維芽細胞に移入したところ、コントロールのｓｉＲＮＡを移入した細胞と比べて、有意に紡錘型の細胞の割合が増加した（図６d）。以上より、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制することにより、ヒトにおいても、筋線維芽細胞への分化が亢進することが示唆された。
【０１１１】
以上より、ＰＤＬＩＭ２は、Ｓｍａｄ２および３の核内ユビキチンリガーゼとして、これらの転写因子をユビキチン化及び分解することにより、ＴＧＦβによるＳｍａｄの活性化を負に調節していることが明らかになった。創傷治癒反応においては、ＰＤＬＩＭ２はＴＧＦβ依存性のシグナル伝達経路を負に調節することにより、創傷治癒反応が過剰にならないように適切な時点で終息させるようにはたらくことが示唆された。従って、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制することにより、創傷治癒反応（特に、創部の収縮）が促進されることが示唆された。
【０１１２】
［実施例２］
二重鎖ｓｉＲＮＡを合成し、ステルスｓｉＲＮＡ（Invitrogen）へ改変した。ｓｉＲＮＡの標的部位は、Invitrogen からのオンラインツールであるBLOCK-iT RNAidesignerを用いて選択した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである；
マウスＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ：5’-CACACCTGTGAGAAATGCAGCGTCA-3’（配列番号８）
対照ｓｉＲＮＡ（マウス）：5’-CAGTTTACACCCACATACCCGAATT-3’（配列番号６）
マウス個体へsiRNAを投与する実験においては、Invivofectamine（Invitrogen社）を用いた。
InvivofectamineとｓｉＲＮＡ(ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡ又はコントロールのＲＮＡ)とを、製造者のプロトコールに従って混合した。反応終了後、Amicon Ultra-15 CentifugalDevice with Ultracel-50 membrane（Amicon社）を用いて、反応産物の溶媒を５％グルコースと置換することにより、投与用のｓｉＲＮＡ溶液を得た。
【０１１３】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを麻酔し、背部の毛を剃ったあと、背部の皮膚を直径約７ｍｍの円形に切除することにより、創傷を作成した。そして、得られたｓｉＲＮＡ溶液（ＰＤＬＩＭ２の発現を特異的に阻害するｓｉＲＮＡ又はコントロールのＲＮＡ）を、１匹あたり３０マイクロリットル(ＲＮＡとして２０マイクログラム)、傷の粘膜の上に滴下した。５−１０分ほどでsiRNA溶液は傷の粘膜に吸収された。この手術の間、マウスは麻酔のため、動かなかった。傷の長径と短径を経時的に測定し、治療前の傷の面積に対するパーセントを計算した。
【０１１４】
図７に創面積の経時的な変化を、図８にｓｉＲＮＡ投与群又はコントロール群の７日目の創部を示した。ＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡの投与により、コントロールと比較して傷の治癒が促進した。ＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡを投与した群では、傷の周りの発毛が顕著に促進されており、この効果は、ＰＤＬＩＭ２のノックアウトマウスの表現型と一致していた（実施例１参照）。
【０１１５】
以上の結果から、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能を抑制することにより、創傷治癒反応が促進することが示された。
【０１１６】
［参考例１］
実施例１及び２において使用したマウスＰＤＬＩＭ２に対するｓｉＲＮＡ（配列番号５（siPDLIM2-1）又は配列番号８（siPDLIM2-2））、或いは対照オリゴヌクレオチドを、リポフェクタミンRNAiMAX（Invitrogen）を用いて、マウス胎児由来線維芽細胞にトランスフェクトした。２日間培養したあと、核抽出物を調製し、抗PDLIM2抗体により免疫ブロットを行った。抗Sp-1抗体を対照として用いた。
図９に示すように、siPDLIM2-1およびsiPDLIM2-2のいずれのsiRNAも、同程度にPDLIM2の発現を抑制した。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明によれば、ＰＤＬＩＭ２の発現又は機能の抑制という、これまでにない新たなメカニズムに立脚した創傷治療剤や、そのスクリーニング方法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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