(57)【要約】      （修正有）【課題】界面活性剤と治療剤とを有する組成物を、ある患者に投与することにより、その患者のある領域を標的化するための方法の提供。【解決手段】気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含み、前記気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアが油、界面活性剤、および治療学的化合物を含む標的化治療剤輸送系。標的化治療剤輸送系を製造する方法も、油および界面活性剤を含む溶液を気体前駆体の存在下、界面活性剤のゲルから液晶への相転移温度以下の温度で処理して気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを形成させ、そして前記マイクロスフェアに治療学的化合物を添加して標的化治療剤輸送系をもたらすことを含む態様とされ、前記処理は、調節下での撹拌、調節下での乾燥、およびそれらの組み合わせ物からなる群より選択される。【選択図】図１
2010280678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含んでなり、前記気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアが油、界面活性剤、および治療用化合物を含むものである標的化治療剤輸送系。
【請求項２】
請求項１記載の標的化治療剤輸送系であって、マイクロスフェアが、フッ素、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、六フッ化硫黄、ヘキサフルオロプロピレン、ブロモクロロフルオロメタン、オクタフルオロプロパン、１，１  ジクロロ、フルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロ−２−ブチン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロブテン、オクタフルオロ−２−ブテン、ヘキサフルオロブタ−１，３−ジエン、オクタフルオロシクロペンテン、ヘキサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレン、三フッ化ホウ素、１，２−ブタジエン、１，３−ブタジエン、１，２，３−トリクロロ−２−フロロ−１，３−ブタジエン、２−メチル−１，１，３−ブタジエン、ヘキサフルオロ−１，３−ブタジエン、ブタジエン、１−フルオロ−ブタン、２−メチル−１−ブタン、デカフルオロブタン、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、ペルフルオロ−１−ブテン、ペルフルオロ−２−ブテン、４−フェニル−３−ブテン−２−オン、２−メチル−１−ブテン−３イン、硝酸ブチル、１−ブチン、２−ブチン、２−クロロ−１，１，１，４，４，４−ヘキサフルオロ−ブチン、３−メチル−１−ブチン、ペルフルオロ−２−ブチン、２−ブロモ−ブチルアルデヒド、硫化カルボニル、クロトンニトリル、シクロブタン、メチル−シクロブタン、オクタフルオロ−シクロブタン、ペルフルオロ−シクロブテン、３−クロロ−シクロペンテン、シクロプロパン、１，２−ジメチル−シクロプロパン、１，１−ジメチル−シクロプロパン、１，２−ジメチルシクロプロパン、エチルシクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、３−エチル−３−メチルジアジリデン、１，１，１−トリフルオロジアゾエタン、ジメチルアミン、ヘキサフルオロ−ジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス−（ジメチルホスフィン）アミン、２，３−ジメチル−２−ノルボルネン、ペルフルオロジメチルアミン、塩化ジメチルオキソニウム、１，３−ジオキソラン−２−オン、４−メチル−１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１−トリフルオロエタン、１，１，２，２，−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロ−１，２，２，２−テトラフルオロエタン、１，２−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２，２−ペンタフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２−テトラフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、クロロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ニトロ−ペンンタフルオロエタン、ニトロソペンタフルオロエタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロエチルアミン、エチルビニルエーテル、１，１−ジクロロ−エチレン、１，１−ジクロロ−１，２−ジフルオロエチレン、１，２−ジフルオロエチレン、メタン、メタン−スルホニルクロリド−トリフルオロ、メタン−スルホニルフロリド−���リフルオロ、メタン（ペンタフルオロチオ）トリフルオロ、メタン−ブロモジフルオロニトロソ、メタン−ブロモフルオロ、メタン−ブロモクロロ−フルオロ、メタン−ブロモ−トリフルオロ、メタン−クロロジフルオロニトロ、メタン−クロロジニトロ、メタン−クロロフルオロ、メタン−クロロトリフルオロ、メタン−クロロ−ジフルオロ、メタン−ジブロモジフルオロ、メタン−ジクロロジフルオロ、メタン−ジクロロ−フルオロ、メタン−ジフルオロ、メタン−ジフルオロ−ヨード、メタン−ジシラノ、メタン−フルオロ、メタン−ヨード−トリフルオロ、メタン−ニトロ−トリフルオロ、メタン−ニトロソ−トリフルオロ、メタン−テトラフルオロ、メタン−トリクロロフルオロ、メタン−トリフルオロ、メタンスルフェニルクロリド−トリフルオロ、２−メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、乳酸メチル、硝酸メチル、メチルスルフィ
ド、メチルビニルエーテル、ネオン、ネオペンタン、窒素、酸化窒素、１，２，３−ノナデカントリカルボン酸−２−ヒドロキシトリメチルエステル、１−ノネン−３−イン、酸素、１，４−ペンタジエン、ｎ−ペンタン、ペンタン−ペルフルオロ、２−ペンタノン−４−アミノ−４−メチル、１−ペンテン、２−ペンテン｛シス｝、２−ペンテン｛トランス｝、１−ペンテン−３−ブロモ、１−ペンテン−ペルフルオロ、フィチン酸−テトラクロロ、ピペリジン−２，３，６−トリメチル、プロパン、プロパン−１，１，１，２，２，３−ヘキサフルオロ、プロパン−１，２−エポキシ、プロパン−２，２−ジフルオロ、プロパン−２−アミノ、プロパン−２−クロロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロソ、プロパン−ペルフルオロ、プロペン、プロピル−１，１，１，２，３，３−ヘキサフルオロ−２，３−ジクロロ、プロピレン−１−クロロ、プロピレン−クロロ−｛トランス｝、プロピレン−２−クロロ、プロピレン−３−フルオロ、プロピレン−ペルフルオロ、プロピン、プロピン−３，３，３−トリフルオロ、スチレン−３−フルオロ、六フッ化硫黄、硫黄（ジ）−デカフルオロ（Ｓ２Ｆ１０）、トルエン−２，４−ジアミノ、トリフルオロアセトニトリル、過酸化トリフルオロメチル、硫化トリフルオロメチル、六フッ化タングステン、ビニルアセチレン、ビニルエーテル、キセノン、１−ブロモフルオロブタン、およびペルフルオロエーテル、からなる群より選択される気体前駆体を含む標的化治療剤輸送系。
【請求項３】
前記界面活性剤が、脂質、ポリマー、蛋白質、ポリペプチド、多糖、糖、およびアクリレートからなる群より選択される、請求項１記載の治療剤輸送系。
【請求項４】
前記脂質が、脂肪酸；リソ脂質；ホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルコリン；ジペンタデカノイルホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン；ジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴ脂質；スフィンゴミエリン；糖脂質；ガングリオシド  ＧＭ１；ガングリオシドＧＭ２；グルコ脂質；スルファチド；グリコスフィンゴリピド；ホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；ポリマーを保持する脂質（例えば、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸、もしくはポリビニルピロリドン）；スルホン化されたモノ−、ジ−、オリゴ−、もしくはポリサカリド（多糖）を保持する脂質；コレステロール、硫酸コレステロール；コレステロールヘミスクシネート；トコフェノールヘミスクシネート、エーテルおよびエステルが結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、リン酸ジアセチル、ステアリルアミン、カルジオリピン、長さが６〜８の炭素の短鎖脂肪酸を有するリン脂質、不斉アシル鎖を有する合成リン脂質、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）−カルボニル）−メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；コレステリル（４’−トリメチル−アンモニオ）−ブタノエート；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノール−アミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１．３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、および／またはそれらの組み合わせ物；臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム
、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム、もしくは臭化セチルピリジニウム；ヨウ化ペンタフルオロオクタデシル、臭化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ヨウ化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロトリプロピルアミン、およびペルフルオロトリブチルアミン、ならびにさらには共有結合により結合したポリマーを保持する脂質、からなる群より選択される、請求項３記載の治療剤輸送系。
【請求項５】
前記蛋白質が、コラーゲン、フィブリン、およびアルブミンからなる群より選択される、請求項３の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびコポリマーからなる群より選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項７】
前記多糖が、スターチ、ＨＥＴＡ−スターチ、アルギン酸、ヒアルロン酸、セルロース、およびサッカリドからなる群より選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項８】
前記セルロースがメチルセルロースである、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記サッカリドがデキストランである、請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
前記糖が、グルコースおよびガラクトースからなる群より選択される、請求項３記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリマーが、合成ポリマー、天然ポリマー、および半合成ポリマーからなる、請求項３記載の組成物。
【請求項１２】
前記合成ポリマーがポリ乳酸である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記コポリマーが、ポリラトシデコグリコリドおよびポリエチレン−ポリプロピレングリコールからなる群より選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項１４】
前記アクリレートがメタクリレートである、請求項３記載の組成物。
【請求項１５】
前記メタクリレートがメチルメタクリレートである請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記油が、シリコン油、タラ肝油、鉱油、植物油、フッ素化されたトリグリセリドを含む油、生物適合性の飽和脂肪酸、生物適合性不飽和脂肪酸、および生物適合性の部分的に水素化された脂肪酸、シリコンベースの油、ならびに合成油からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記治療剤が前記マイクロスフェアの表面に結合する、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療剤が前記マイクロスフェア内に被包される、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
前記マイクロスフェアが、凍結乾燥マイクロスフェア、噴霧乾燥マイクロスフェア、ボールミルマイクロスフェア、撹拌マイクロスフェア、およびそれらのいずれかの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
前記植物油が、ピーナッツ油、カノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、コーン油、およびマゾーラ油からなる群より選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２１】
前記シリコンベースの油が、ビニル末端をもつ、ヒドリド末端をもつ、シラノール末端をもつ、アミノ末端をもつ、エポキシ末端をもつ、カルビノール末端をもつ液体、メルカプト誘導化させたシリコン液、飽和シリコン油、不飽和シリコン油、アリールアルキル飽和シリコン油からなる群より選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２２】
前記合成油が、Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸の飽和鎖、およびＣ１２〜Ｃ２４脂肪酸の不飽和鎖からなる群より選択される、請求項１６記載の組成物。
【請求項２３】
前記合成油が、オレイン酸のグリセロールトリグリセリドエステルからなる群より選択される、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
更に標的化用リガンドを含む、請求項１記載の標的化治療剤輸送系。
【請求項２５】
気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含む標的化治療剤輸送系を製造する、気体前駆体の存在下で油および界面活性剤を含む溶液を処理する段階、および前記マイクロスフェアに治療学的組成物を添加する段階を含み、前記処理が調節下での撹拌、調節下での乾燥、およびその組み合わせ物からなる群より選択される方法。
【請求項２６】
前記方法が、気体前駆体の活性化温度で気体前駆体を用いて実施される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
調節下での撹拌が、ボールミル、震盪、ボルテックルミキサーでの撹拌、およびそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
調節下での乾燥が、凍結乾燥、噴霧乾燥、およびそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
更に前記脂質水溶液の濾過段階および熱滅菌段階を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
（ｉ）患者に、油、界面活性剤、気体もしくは気体前駆体、および治療剤を含む標的化治療剤輸送系を投与すること；
（ｉｉ）標的化治療剤輸送系を、その領域の標的化治療剤輸送系の存在を決定するためのエネルギーを用いてモニターすること；ならびに
（ｉｉｉ）その領域内で標的化治療剤輸送系から治療剤を放出させること：
を含む、標的化治療剤輸送系の制御下輸送のための方法。
【請求項３１】
黄斑変性症の治療の際の使用のための、前記治療剤がα−トコフェロールおよびレチン酸を含み、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、および８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
網膜芽細胞腫を治療する際の使用のための、前記治療剤がタキソールおよびレチン酸を含み、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、および８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコ
ール５０００を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記治療剤がアンフォテリシン−Ｂであり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
真菌性眼炎を治療するために用いられる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
色素性網膜症を治療するための、前記治療剤がベンダゾックであり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
良性前立腺肥大を治療するための、前記治療剤がドキサゾシンであり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
前記治療剤がα−トコフェロールであり、前記界面活性剤がＣＦ３（ＣＦ２）８（ＣＨ２）６ＣＯＯＨを含み、前記油がカノーラ油であり、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
前記治療剤が染料であり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、および１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸を含み、前記気体前駆体がペルフルオロプロパンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
前記治療剤がデキサメサゾンであり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、および１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸を含み、前記気体前駆体がペルフルオロブタンおよび窒素である、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
前記治療剤がアンホテリシンであり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、および１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸を含み、前記気体前駆体がペルフルオロブタンおよび窒素から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
前記治療剤が染料を含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項４２】
前記染料が、蛍光染料および比色分析用染料からなる群より選択される、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
前立腺癌もしくは良性前立腺肥大を治療するための、前記治療剤が、テストステロン、メチルテストステロン、フルオキシメステロン、フィナステリド、および５ａレダクターゼ酵素阻害剤からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項４４】
前記染料が、スダンブラック、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、テキサスレッド、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、オレゴングリーン、ローダミンレッド−Ｘ、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＹＯＹＯ−１、ＤＡＰＩ、インド−１（Ｉｎｄｏ−１）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）、フラ−２，アミノメチルクマリン、ＦＭ１−４３、ＮＢＤ、カルボシ−ＳＮＡＲＦ、ルシフェルイエロー、ダンシル＋Ｒ−ＮＨ２、ヨウ化プロピジウム、メチレンブルー、ブロモクレゾールブルー、アクリジンオレンジ、ブロモフェノールブルー、７−アミノ−アクチノマイシンＤ、アロフィコシアニン、９−アジドアクリジン、ベンゾキサンテン−イエロー、ビスベンジジンＨ３３２５８蛍光色素、３ＨＣｌ、５−カルボキシフルオレッセインジアセテート、４−クロロ−１−ナフトール、クロモマイシン−Ａ３、ＤＴＡＦ、ＤＴＮＢ、臭化エチジウム、フルオレセイン−５−マレイミドジアセテート、ミスラマイシンＡ、ローダミン１２３、ＳＢＦＩ、ＳＩＳＴ、テトラメチルベンジジン、テトラメチルプルプレート、チアゾリルブルー、およびＴＲＩＴＣからなる群より選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記フルオレセインがフルオレセインイソチオシアネートである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記フルオレセインイソチオシアネートが、フルオレセインイソチオシアネートアルブミン、フルオレセインイソチオシアネート抗体複合体、フルオレセインイソチオシアネートα−ブンガロトキシン、フルオレセインイソチオシアネート−カゼイン、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン、フルオレセインイソチオシアネート−インスリン、フルオレセインイソチオシアネート−レクチン（Ｌｅｃｔｉｎ）、フルオレセインイソチオシアネート−ペルオキシダーゼ、およびフルオレセインイソチオシアネート−プロテインＡからなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的化された治療薬を輸送するのに有用な新規の組成物および方法に関する。一層具体的には本発明は、界面活性剤と治療剤とを有する組成物を、ある患者に投与することにより、その患者のある領域を標的化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
投与部位から活性領域へ活性試薬の移動を実現させることは、研究者にとっては果てしない挑戦であった。薬剤の完全性を保ちながらも局所放出をも同時に可能にさせる安定な薬剤輸送用ビヒクルを提供することによりこれらの努力を免れることができる。糖尿病性網膜症および網膜色素変性症のような眼性疾患は、作用部位への治療薬の輸送を利用する非侵襲的技法による治療に特に適する。標的化放出（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）が重要となる多くの他の疾患の中では良性前立腺肥大（ＢＰＨ）およびその薬理学的治療法が薬剤輸送用ビヒクルの影響を特に大きく受ける。
【０００３】
界面活性剤および場合によっては担体、好ましくは非極性担体中での薬剤の可溶化は極性媒質が不適切となる多くの薬剤の輸送を至適化するのに役立つであろう。本発明の態様は、安定で局在化した非極性薬剤輸送および局在性薬剤放出のニーズを満たす。
【０００４】
親水性ドメインもしくは層と比較的疎水性のドメインもしくは層とからなるマイクロスフェアが当該技術分野で知られている。特許文献１においてＣｏｏｍｂｅｓらは親水性ポリマーの外側コーティングおよび疎水性コアーポリマーを有し、この２層がポリエチレンングリコールにより連結されている組成物を開示している。
【０００５】
ナノ粒子のボールミル操作は例えばＷｏｎｇの特許文献２の開示内のものとして知られており、そこでは硫酸化非イオン性ブロックコポリマーが治療剤もしくは診断用試薬の封入のための外殻を形成する。同様に、核酸を疎水性賦形剤と合わせ、その後に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥により乾燥させることにより別の乾式粉末組成物が処方されている。例えばＥｌｊａｍｅｌら、特許文献３を参照されたい。
【０００６】
生物活性分子の調製物の安定化のための界面活性剤の使用は刊行物に報告されている。しかしながら全ての界面活性剤や使用条件が特定の薬剤の輸送用ビヒクルへの収着もしくは結合を促進するわけではない。ある系が、非特許文献１に報告された。Ｈａｒｍｉａらは凍結乾燥前の臨界ミセル濃度以下にある非イオン性界面活性剤がピロカルピンのポリメタクリレートへの収着を改善したことを報告している。
【０００７】
生体高分子のための有用な輸送形態の処方に際し克服すべき別の問題は、蛋白質、特に酵素の変性に関連する。噴霧乾燥、特に高温および／または高圧下でのものは選択的に幾つかの蛋白質を変性させる。しかしながら非特許文献２は、活性β−ガラクトシダーゼの７０％の収率を保持する噴霧乾燥の条件を報告している。
【０００８】
数々の疾患の治療は薬剤輸送用技術の改善により高められるであろう。例えば網膜性疾患は現在では治療が難しい。この最も一般的な疾患に使える効果的な治療法は存在しない。他の眼科疾患である糖尿病性網膜症は糖尿病の一般的な合併症である。この疾患では血管新生により血管の増殖がもたらされ、このことにより網膜が破壊される。糖尿病性網膜症は糖尿病の医学的管理（血糖値をうまくコントロールすること）およびレーザー光凝固術での新生血管の切除により処置される。
【０００９】
黄斑変性症はおそらくは盲目をもたらす最も一般的な原因であり、網膜が侵される。この疾患には２つの主要形態が存在し、血管新生と主要光受容体の死滅化である。血管新生により、網膜に不可逆的な傷害を及ぼす血管の増殖がもたらされる。主要光受容体細胞の死滅化はドルーゼ（Ｄｒｕｓｅｎ）形成に関連する。ドルーゼ形成は光受容体からの破壊産物を表すものと考えられる。ドルーゼ沈着物は黄斑変性症が進行するにつれて増加する。現在では黄斑変性症に対する優れた治療法は存在しない。
【００１０】
血管閉鎖性疾患は網膜血管内の静脈血栓により生じ、そして網膜出血により診断される。網膜血管閉塞性疾患に対する効果的治療法は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９５／２６３７６号
【特許文献２】米国特許第５，５６９，４４８号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９６／３２１１６号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｈａｒｍｉａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１９８６  ３３：４５−５４
【非特許文献２】Ｂｒｏａｄｈｅａｄら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．１９９４  ４６：４５８−４６７
【発明の概要】
【００１３】
従って、新規および／またはより良く標的化された治療剤、ならびにそういった治療剤を輸送および作成する方法が必要とされる。本発明はそれら、および他の重要な結果に関する。
【００１４】
本発明は、気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含む標的化治療剤輸送系に関し、ここにおいて、前記気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアは油、界面活性剤、および治療用化合物を含む。標的化治療剤輸送系を調製する方法も本発明による態様とされる。本発明は、界面活性剤のゲル／液晶相転移温度以下の温度における気体前駆体の存在下で油および界面活性剤を含む溶液を処理して気体もしくは気体充填マイクロスフェアを形成させ、そして前記マイクロスフェアに治療用化合物を添加して標的化治療剤輸送系をもたらす方法を含んでなり、ここにおいて前記処理は、制御下撹拌、制御下乾燥、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１５】
本発明の組成物を投与する方法も本明細書に記載される。
【００１６】
本発明のこれらの態様および別の態様は、以下の詳細な説明により一層明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】通常の気体充填リン脂質マイクロスフェアを表す。
【図２】本発明に従う治療剤輸送系を表す。
【図３】泡止め剤としての治療剤輸送系の構造を表す。
【図４】治療剤輸送系での輸送に適する新規な脂質可溶性複合体であるＮＢＤ−ＤＰＰＥ−デキサメタゾンを表す。
【図５】混合後に治療剤輸送系を形成する非混合構成成分を表す。
【図６】図５の治療剤輸送系を形成するためのシェーカー、ならびに震盪前および震盪後の外観を図示する。
【図７】大豆油／１  ｍｇ／ｍｌ  ＤＰＰＣ  混合物への１００  ｋＨｚ超音波の印加ありおよびなしでの治療剤輸送系の様々な製剤の経時的減衰を示す。
【図８】カノーラ油／１  ｍｇ／ｍｌ  ＤＳＰＣ  混合物への１００  ｋＨｚ超音波の印加ありおよびなしでの治療剤輸送系の様々な製剤の経時的減衰を示す。
【図９】カノーラ油／５  ｍｇ／ｍｌ  ＤＳＰＣ  混合物への１００  ｋＨｚ超音波の印加ありおよびなしでの治療剤輸送系の様々な製剤の経時的減衰を示す。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
定義
先に利用される場合および本開示全体を通し、以下の用語は他に特別に指示されない限り、以下の意味を持つと理解されるべきである。
【００１９】
「サーファクタント］もしくは「界面活性剤」は、一例では表面活性を示す合成有機化合物のような、界面のエネルギー関係を変化させる物質を意味し、中でも湿潤剤、洗剤、浸透剤、展着剤、分散剤、および発泡剤を含む。本発明に有用な界面活性剤の好ましい例は疎水性化合物であり、そしてリン脂質、油、およびフルオロ界面活性剤を含む。
【００２０】
「エマルジョン」は、２つもしくはそれを上回る数の一般的には非混和性液体の混合物を意味し、そして一般的にはコロイドの形態にある。この混合物は、例えばエマルジョン中に均質もしくは不均質に分散されていてよい脂質であることができる。また、これらの脂質は例えばクラスター、あるいは単層もしくは二重層を初めとする層の形態で凝集していてもよい。
【００２１】
「乾燥」およびその変型は、脱水されたもしくは無水である、すなわち実質的には液体を含まない物理的状態を意味する。乾燥は例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、および真空乾燥を含む。
【００２２】
「噴霧乾燥」は、噴霧の状態をとる界面活性剤と治療剤とのエマルジョンもしくはその部分を例えば空気のような気体に接触させ、そして乾燥したエマルジョンの形態で回収することによる乾燥を意味する。例えば塩化メチレンのような発泡剤は例えば界面活性剤により安定化されてよい。
【００２３】
「凍結乾燥する」もしくは凍結乾燥は、急速凍結および凍結された状態での脱水による乾燥形態にある脂質組成物の調製を意味する（時としては昇華として称される）。凍結乾燥は脂質マトリックスを形成するような脂質の結晶化をもたらす温度で行われる。この過程は、周囲温度の保持容器を用いておおよその室温で凍結産物を維持するのに十分な圧力、好ましくは約５００ｍＴｏｒｒを下回る圧力、一層好ましくは約２００ｍＴｏｒｒを下回る圧力、更に一層好ましくは約１ｍＴｏｒｒを下回る圧力での真空下で行われてよい。本発明の脂質組成物を調製するのに用いられる脂質の量が少量であるため、凍結乾燥を行うのは困難ではない。本発明の脂質組成物は通常のマイクロスフェア組成物に対する改善物である。なぜならば、従来の技術と比較して脂質の量が減少しており、そして巨大（＞０．２２μｍ）粒子状物の濾過に起因する低減を極小化するように処方されるからである。総計で負の電荷を有する脂質（すなわちリン脂質）に関しては後者は特に重要であり、なぜなら水性ベースの希釈物中でのそれらの可溶性は下限に近いからである。
【００２４】
「真空乾燥」は、完全圧で必要とされるより低い温度での乾燥をもたらす低い空気圧下での乾燥を意味する。
【００２５】
「ボールミル処理」は、例えば鋼球のような小さな玉状物質、および場合によっては液体を含む中空、通常では円筒状ドラム内での微粉砕を意味し、そのドラムは小さな玉がド
ラムの回りを回転する際に粉砕作用を生じるように回転もしくは撹拌される。
【００２６】
「再懸濁」は、ある物質の乾燥物理状態を液体物理状態に変化させるために液体を添加することを意味する。例えば、乾燥治療剤輸送系は乾燥状態および再懸濁状態では類似する特徴を有するため、液体内に再懸濁されてよい。この液体は例えば水性の液体か、もしくは有機性の液体であってよい。それに加え、再懸濁用媒質は低温保存性であってよい。ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、フルクトース、マンノース、トレバロース、グリセロール、プロピレングリコール、および塩化ナトリウムは再懸濁用媒質として有用であるかも知れない。
【００２７】
「担体」は、非極性疎水性溶媒であり、そして再構築用媒質として役立ちうる薬剤学的に許容されるビヒクルを意味する。この担体は水性ベースもしくは有機性ベースであってよい。担体はなかでも、脂質、蛋白質、多糖、糖、ポリマー、コポリマー、およびアクリレートを含む。
【００２８】
「脂質」は、一般的には両親媒性の天然、合成、もしくは半合成（すなわち改変された天然）化合物を意味する。脂質は典型的には親水性構成成分と疎水性構成成分とを含む。例示的な脂質は例えば、脂肪酸、中性脂肪、リン脂質、油、糖脂質、界面活性剤（サーファクタント）、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン、およびステロイドを含む。成句「半合成（もしくは改変された天然）は、何らかの様式で化学的に改変された天然化合物を表す。
【００２９】
「ポリマー」もしくは「高分子の」は、２つもしくはそれを上回る数の反復単位の化学的結合から形成される分子を意味する。従って、用語「ポリマー」には例えばダイマー、トリマー、およびオリゴマーが含まれてよい。ポリマーは合成、天然、もしくは半合成であってよい。好ましい形態では「ポリマー」は、１０もしくはそれを上回る数の反復単位を含む分子を意味する。
【００３０】
「蛋白質」は、ペプチド結合の複数のα−アミノ酸を含んでなり、好ましくはそれらを本質的なものとする分子を意味する。用語「蛋白質」には、例えばアルブミン、グロブリン、およびヒストンのような球状蛋白質、ならびに例えばコラーゲン、エラスチン、およびケラチンのような線維状蛋白質が含まれる。用語「蛋白質」には更には、例えば核蛋白質、ムコ蛋白質、リポ蛋白質、および金属蛋白質のような非蛋白質分子と蛋白質分子が結合している「複合蛋白質」も含まれる。蛋白質は天然、合成、もしくは半合成性であってよい。
【００３１】
「安定化剤」もしくは「安定化化合物」は、気体、気体前駆体、ステロイドプロドラッグ、標的用リガンド、および／または本明細書に記載される他の生物活性物質を含む組成物の安定性を改善することができ、例えば混合物、懸濁物、エマルジョン、分散物、もしくは小胞などを含むいずれかの物質を意味する。「安定化剤」の定義に包含されるのは現存の生物活性物質の内の所定のものである。改善された安定性には例えば、比較的均衡が取れた状態の維持が包含され、そして例えば破壊、分解、および変性などに対する組成物の耐性の増加により例示されてよい。気体、気体前駆体、液体、ステロイドプロドラッグ、および／または生物活性物質で充填される小胞に関する好ましい態様の場合には安定化化合物は、前記放出が所望されるまではその小胞からの気体、気体前駆体、ステロイドプロドラッグ、および／または生物活性物質の漏れを最低限に抑えるかもしくは実質的に（完全に抑えるを含む）妨げるかのために作用するいずれかの様式で小胞を形成するかもしくは小胞を安定化させるかのいずれかのために役立ってよい。用語「実質的に」は、小胞からの気体、気体前駆体、ステロイドプロドラッグ、および／または生物活性物質の漏れを予防する本文脈で用いられる際には、約５０％を上回る割合が、放出が所望されるまで
は小胞内に閉じ込められて維持されることを、そして好ましくは約６０％を上回る割合、一層好ましくは約７０％を上回る割合、更に一層好ましくは約８０％を上回る割合、それよりも更に好ましくは約９０％を上回る割合が放出が所望されるまでは小胞内に閉じ込められて維持されることを意味する。特に好ましい態様では、約９５％を上回る割合の気体、気体前駆体、ステロイドプロドラッグ、および／または生物活性物質が閉じ込められて維持される。気体、気体前駆体、液体、ステロイドプロドラッグ、および／または生物活性物質は更には、放出が所望されるまでは完全に閉じ込められて維持されてもよい（すなわち約１００％が閉じ込められた状態で維持される）。例示的な安定化剤は例えば、脂質、蛋白質、ポリマー、炭水化物、および界面活性剤を含む。得られる混合物、懸濁物、もしくはエマルジョンなどはステロイドプロドラッグ、生物活性物質、気体、および／または気体前駆体の周囲の壁（すなわちフィルム、および膜など）を含んでよいか、あるいは所望される場合には壁もしくは膜を実質的に持たなくてもよい。安定化は、所望される場合には小滴を形成してもよい。安定化剤は塩および／または糖も含んでよい。所定の態様では安定化剤は実質的には（完全に含む）架橋形成していてよい。安定化剤は中性、陽性、もしくは陰性に帯電していてよい。
【００３２】
「小滴」は実質的には液体であってよいか、または液体と固体、固体と気体、液体と気体、もしくは液体と固体と気体を含んでよい球状もしくは回転楕円状の実体を意味する。
【００３３】
「小胞」は、一つもしくは複数の内部空隙を形成する一つもしくは複数の壁もしくは膜の存在を一般的特徴とする実体であることを意味する。小胞は例えば、本明細書に記載される多種多様な脂質を初めとする脂質、本明細書に記載される多種多様な蛋白質を初めとする蛋白質、および本明細書に記載される多種多様な高分子物質を初めとする高分子物質のような安定化剤から製剤されてよい。本明細書に論議されるように小胞は、所望される場合には炭水化物、界面活性剤、および他の安定化剤から製剤されてもよい。脂質、蛋白質、ポリマー、および／または他の小胞形成性安定化剤は天然、合成、もしくは半合成であってよい。好ましい小胞は脂質から処方される壁もしくは膜を含むものである。壁もしくは膜は同軸もしくはそうでないものであってよい。安定化化合物は一つもしくは複数の単層もしくは二重層の形態をとってよい。一つを上回る数の単層もしくは二重層の場合には、その単層もしくは二重層は同軸であってよい。安定化化合物は単層板小胞（一つの単層もしくは二重層からできている）オリゴ層板小胞（おおよそ２つもしくはおおよそ３つの単層もしくは二重層でできている）、または多層板小胞（おおよそ３を上回る数の単層もしくは二重層からできている）を形成するのに用いられてよい。小胞の壁もしくは膜は実質的に固体（均一）であってよいか、または孔性もしくは半孔性であってよい。本明細書に記載される小胞は、例えばリポソーム、リポスフェア、パーティクル、ナノパーティクル、ミセル、バブル、マイクロバブル、マイクロスフェア、脂質コーティングバブル、ポリマーコーティングバブル、および／または蛋白質コーティングバブル、マイクロバブル、および／またはマイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロバルーン、マイクロカプセル、エアロゲル、クラスレート結合小胞、およびヘキサゴナルＨ  ＩＩ相構造などとして一般的に称される実体を含む。小胞の内部空隙は、例えば水、油、気体、気体前駆体、液体、フッ素化させた液体、液体ペルフルオロカーボン、液体ペルフルオロエーテル、治療薬、および所望される場合には生物活性試薬、および／または他の物質を初めとする多種多様の物質で充填されてよい。小胞は更には所望される場合には標的用リガンドを含んでもよい。
【００３４】
「リポソーム」は、典型的には一つもしくは複数の同軸層（一例では二重層）の形態をとる、脂質化合物を初めとする両親媒性化合物の一般的には球状もしくは回転楕円状クラスターもしくは凝集物を意味する。これらは本明細書では更に脂質小胞としても引用されてよい。リポソームは例えばイオン性脂質および／または非イオン性脂質から製剤されてよい。非イオン性脂質から製剤されるリポソームはニオソームとして称される場合もある
。
【００３５】
「リポスフェア」は一つもしくは複数の壁もしく膜により囲われる液体もしくは固体油を含む実体を意味する。
【００３６】
「ミセル」は、脂質から処方されるコロイド状実体を意味する。所定の好ましい態様ではミセルは、単層、二重層、もしくはヘキサゴナルＨ  ＩＩ相構造を含む。
【００３７】
「エアロゲル」は一般的には複数の小内部空隙を特徴とする球状もしくは回転楕円状実体を意味する。エアロゲルは合成物質（例えば、レゾルシノールおよびホルムアルデヒドをベーキングすることにより調製される泡）、ならびに例えば炭水化物（多糖）もしくは蛋白質のような天然物質から処方されてよい。
【００３８】
「クラスレート」は、小胞と会合することもできる固形、半孔性、もしくは孔性粒子を意味する。好ましい形態では、クラスレートは、所望される場合にはクラスレートに結合する一つもしくは複数の小胞を含む間隙を含むカゴ様構造を意味する。安定化剤は所望される場合にはクラスレートと会合して、小胞とクラスレートとの会合を促進してよい。クラスレートは例えば、ヒドロキシアパタイトカルシウムのような多孔性アパタイト、およびカルシウム塩で沈降させたアルギン酸のようなポリマーと金属イオンとの沈降物から処方されてよい。
【００３９】
「泡止め剤」は、一例ではペルフルオロカーボンのような気体、液体、もしくは気体／液体混合物により囲まれており、それが更に次には一例では界面活性剤もしくは油のような安定化剤により囲まれている中心スフェアを有する組成物を意味する。一つもしくは複数の標的用リガンドが、図３に示される用に泡止め剤の表面に取り込まれてよい。
【００４０】
「気体充填小胞」は、気体が封入されている小胞を意味する。「気体前駆体充填小胞」は、気体前駆体が封入されている小胞を意味する。これらの小胞は、最低限、部分的、実質的、もしくは完全に気体および／または気体前駆体で充填されてよい。気体および／または気体前駆体で充填される小胞に言及する際に用いられる用語「実質的に」は、実質的に充填される小胞の内部空隙の内の約３０％より多くが気体および／または気体前駆体を含むことを意味する。所定の態様では実質的に充填される小胞の内部空隙の内の約４０％より多くが気体および／または気体前駆体を含み、約５０％を上回る割合であることが更に好ましい。一層好ましくは、実質的に充填される小胞の内部空隙の内の約６０％を上回る割合が気体および／または気体前駆体を含み、約７０％もしくは７５％を上回る割合が一層好ましい。更に一層好ましくは、実質的に充填される小胞の内部空隙の内の約８０％を上回る割合が気体および／または気体前駆体を含み、約８５％もしくは９０％を上回る割合が一層好ましい。特に好ましい態様では、小胞の内部空隙の内の約９５％を上回る割合が気体および／または気体前駆体を含み、約１００％の割合が一層好ましい。また、小胞は気体もしくは気体前駆体を全くもしくは実質的には全く含まなくてもよい。
【００４１】
「懸濁物」もしくは「分散物」は、一例では液体中液体、および固体中固体などのような二つもしくはそれを上回る数の相（固体、液体、もしくは気体）からなり、好ましくは微細に分割されており、好ましくは長期間安定であることができる混合物を意味する。
【００４２】
「ヘキサゴナルＨ  ＩＩ相構造」は、脂質の親水性部分（一つもしくは複数）が管の内側の水性液体環境と組合わされて一般的に内側に向いている例えば水性媒質のような液体媒質中の脂質の一般的には管状凝集物を意味する。脂質の疎水性部分（一つもしくは複数）は一般的には外向きに四方に広がり、そしてこの複合体は六面形の管の形状をとる。一般的には複数の管を六面相構造にして一度に充填する。
【００４３】
「患者」は、哺乳類、好ましくはヒトを初めとする動物を意味する。
【００４４】
「患者の領域」は患者の特定領域もしくは部分を意味し、そして幾つかの事例では患者の全体にわたる領域を意味する。このような領域の例は、眼、胃腸管、心臓血管領域（心筋組織を含む）、腎臓領域、ならびに脈管系および循環器系を初めとする他の身体領域、組織、白血球、レセプター、および器官などで、ならびに例えば前立腺および乳房のような癌性組織を初めとする疾病組織である。「患者の領域」は、例えば診断用画像化により像形成される領域、生物活性部質での処理を受ける領域、生物活性試薬の輸送用に標的化される領域、および高温領域を含む。「患者の領域」は内部領域であることが好ましいが、所望される場合には外部領域であってもよい。成句「脈管」は、血管（動脈、および静脈などを含む）を表す。成句「胃腸領域」は、食道、胃、小腸と大腸、および直腸により特定される領域を含む。成句「腎臓領域」は、腎臓、腎臓から直接行き来する脈管により定義される領域を意味し、そして腹部大動脈を含む。
【００４５】
「処置を受ける予定の領域」もしくは「処置を受けた領域」は、治療薬の輸送が所望される患者の領域を意味する。「画像化される予定の領域」もしくは「画像化用領域」は診断用画像化が所望される患者の領域を意味する。
【００４６】
「治療薬」は、患者の病気、疾患、疾病、もしくは創傷の治療（予防、診断、軽減、もしくは治癒を含む）に用いられてよいいずれかの薬剤、薬もしくは予防用物質を意味する。治療学的に有用なペプチド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチオドは用語「薬剤もしくは薬」の意味に含まれてよい。
【００４７】
「遺伝物質」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを一般的に意味する。遺伝物質は当業者に知られる合成化学技術によるか、あるいは組換え技術の使用によるか、あるいはその組み合わせにより作成されてよい。ＤＮＡとＲＮＡとは場合によっては非天然ヌクレオチドを含んでよく、そして一本鎖のしくは二本鎖であってよい。「遺伝物質」は更にはセンスおよびアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡを意味し、これはすなわちＤＮＡおよび／またはＲＮＡ中のヌクレオチドの特定の配列に相補的なヌクレオチド配列である。
【００４８】
「生物活性試薬」は、例えばある患者中の疾患の有無を診断するための方法、および／または患者内の疾患の治療のための方法のような、すなわち治療的もしくは診断的適用法と組み合わせて用いられてよい物質を意味する。「生物活性試薬」は更にはインビトロおよび／またはインビボで生物学的効果を発揮することが可能な物質をも意味する。生物活性試薬は、中性、陽性、もしくは陰性に帯電してよい。例示的生物活性試薬は例えば、プロドラッグ、標的化用リガンド、診断用試薬、薬剤学的試薬薬、合成有機化学分子、蛋白質、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイドアナログ、ならびにヌクレオシド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドを初めとする遺伝物質を含む。
【００４９】
「標的用リガンド」は、本発明の組成物を用いて組織および／またはレセプターのインビボもしくはインビトロでの標的化を促進することのできるいずれかの材料もしくは物質を意味する。標的化用リガンドは合成、半合成、もしくは天然のものであってよい。標的化用リガンドとして作用しうる材料もしくは物質は例えば、抗体、抗体断片、ホルモン、ホルモン類似物、糖蛋白質、およびレクチンを初めとする蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、糖、単糖および多糖を初めとするサッカライド、炭水化物、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似物、ホルモン、コファクター、生物活性試薬、ならびにヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸構築物、およびポリヌクレオチドを初めとする遺伝物質を含む。
【００５０】
標的化用リガンドに対する「前駆体」は、標的化用リガンドに転換されうるいずれかの材料もしくは物質を意味する。このような転換は例えば、前駆体の標的用リガンドへの固定することを含んでよい。例示的標的化用前駆体部分は、マレイミド基、オルト−ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド基、ビニルスルホン基、アジド基、およびα−ヨードアセチル基を含む。
【００５１】
「診断用試薬」は、ある患者の内部領域の画像化および／またはある患者内の疾患の有無を診断するための方法と組み合わせて用いられてよいいずれかの物質を意味する。例示的な診断用試薬は例えば、患者の超音波画像化、核磁気共鳴画像化、もしくはコンピューター断層画像化と組み合わせた使用のための造影剤を含む。診断用試薬は、画像化法が用いられようと、用いられまいと、患者の疾患もしくは他の症状の診断を容易にさせるのに有用ないずれかの他の試薬をも含んでよい。
【００５２】
「小胞安定性」は、約１００ミリメーター（ｍｍ）の水銀（Ｈｇ）の存在に約１分間露出させた後の、閉じ込められている気体、気体前駆体、および／または他の生物活性試薬を保持する小胞の能力を意味する。小胞安定性はパーセンテージ（％）で測定され、これは小胞内にもともと閉じ込められていた気体の量と圧力の解除後に保持される気体の量の割合である。小胞安定性は更には、圧力の解除後にそのもともとのサイズに小胞が戻る能力である「小胞弾性」をも含む。
【００５３】
「架橋」、「架橋された」、および「架橋する」は一般的には、脂質、蛋白質、ポリマー、炭水化物、界面活性剤安定化剤、および／または生物活性試薬を初めとする二つもしくはそれを上回る数の安定化剤の一つもしくは複数の架橋による結合を意味する。この橋渡し部分は一つもしくは複数の要素、基、もしくは化合物でできていてよく、そして一般的には第一の安定化剤分子を第二の安定化剤分子に連結させるよう作用する。架橋の橋渡し部分は共有結合および／または非共有結合を含むことができる。多種多様の要素、基、および／または化合物が架橋中の橋渡し部分を形成してよく、そして安定化試薬は自然に架橋するか、もしくは合成手段を通して架橋してよい。例えば、架橋は、ケラチン、インスリン、および他の蛋白質内にあるようなシスチン残基のジスルフィド結合により連結されるペプチド結合から処方される材料内にもともと存在してよい。また、架橋は、安定化剤のような架橋形成用試薬と、例えば加熱、高エネルギー照射、および超音波照射などに対する露出により反応を起こしうる架橋形成剤として作用してよい化学物質とを組み合わせることなどによる適切な化学的修飾によりもたらされてよい。その例には、ジスルフィド結合を形成するための硫黄による架橋形成、有機過酸化物を使用する架橋、高エネルギー照射による不飽和物質の架橋、およびジメチチロールカルバメートでの架橋などがある。所望される場合には、安定化化合物および／または生物活性試薬は実質的に架橋されてよい。用語「実質的に」は、約５０％上回る割合の安定化化合物が架橋橋を含むことを意味する。所望される場合には、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を上回るか、もしくは更には１００％の安定化化合物がこのような架橋橋部分を含む。また、安定化剤は非架橋性であることができ、これはすなわち約５０％の割合を上回る安定化用化合物が架橋橋部分を含まず、そして所望される場合には、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を上回る割合、そして更には１００％の安定化剤が架橋橋部分を含まない。
【００５４】
「共有会合」は、二つの原子の結合性軌道内での電子の共有を必要とする分子間会合もしくは結合を意味する。「非共有結合」は、共有結合を必要としない二つもしくはそれを上回る数の個別の分子の間での分子内相互作用を意味する。分子内相互作用は、例えば関与する分子の極性、および存在する場合には関与する分子の電荷（陽性もしくは陰性）を初めとする多種多様の因子に依存する。非共有会合は、イオン相互作用、双極子−双極子相互作用、ファンデルワールス力、およびその組み合わせから選択される。
【００５５】
「イオン性相互作用」もしくは「静電相互作用」は、各々が陽性もしくは陰性に帯電する二つもしくはそれを上回る数の分子の間の分子間相互作用を意味する。従って例えば「イオン性相互作用」もしくは「静電相互作用」は、第一の陽性に帯電した分子と第二の陰性に帯電した分子との間の引力を意味する。イオン性もしくは静電相互作用は例えば、一例では遺伝物質のような陰性に帯電した安定化剤と、臭化ラウリルトリメチルアンモニウムのようなカチオン性脂質を一例とする陽性に帯電した脂質との間の引力を含む。
【００５６】
「双極子−双極子相互作用」は一般的には、二つもしくはそれを上回る数の極性分子の間に生じることができる引力を意味する。従って「双極子−双極子相互作用」は、通常δ＋と表示される第一の極性分子の帯電していない部分的陽性末端の、通常δ−と表示される第二の極性分子の帯電していない部分的に陰性末端に対する引力を意味する。双極子−双極子相互作用は、ホスファチジルコリンの例えばコリン頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）のような電子陽性頭部基と、多糖のような安定化剤内に存在する酸素、窒素、もしくは硫黄のようなヘテロ原子を一例とする電子陰性原子との間の引力により例示される。「双極子−双極子相互作用」もやはり、水素原子が個別の分子上の電子陰性原子間の橋渡し部分として作用し、そして水素原子が共有結合により第一分子に、そして静電力により第二分子に結合する分子間水素結合をも意味する。
【００５７】
「ファンデルワールス力」は、量子メカニズムにより説明される非極性分子間の引力を意味する。ファンデルワールス力は一般的には近隣する分子により誘導され、そして電子分布の変化を必要とする一瞬の双極子モーメントに関連する。
【００５８】
「水素結合」は、一例では酸素、硫黄、もしくは窒素のような電子陰性原子に対して共有結合により結合する水素原子と、別の電子陰性原子との間に生じることがあってよい引力もしくは橋渡しを意味する。水素結合は、第一分子内の水素原子と第二分子内の電子陰性原子との間に生じてよい（分子間水素結合）。更には水素結合は、単一分子内に双方ともが保持される水素と電子陰性原子との間に生じてもよい（分子内水素結合）。
【００５９】
「疎水性相互作用」は、水に実質的には結合せず、水に吸収、および／または溶解しない分子もしくは分子の部分を関連する。
【００６０】
「親水性相互作用」は、実質的には水に結合、吸収、および／または溶解してよい分子もしくは分子の部分に関連する。これが可逆ゲルの膨潤および／または形成をもたらしうる。
【００６１】
「生物適合性」は、生物学的機能に対して一般に有害ではなく、そしていずれかの程度の、アレルギー性応答を初めとする許容されない毒性および疾患状態をもたらすことがない物質を意味する。
【００６２】
「〜と組み合わせて」は、エマルジョン、懸濁物、および小胞を初めとする本発明の組成物内の生物活性試薬、ステロイドプロドラッグ、および／または標的化用リガンドの取り込みを意味する。ステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的用リガンドは多種多様の方法の内のいずれかで治療剤輸送系および／または安定化剤（小胞を含む）と組み合わせることができる。例えばステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的化用リガンドは輸送系もしくは安定化剤と共有結合および／または非共有結合により会合してよい。ステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的化用リガンドは輸送系もしくは小胞の内部空隙（一つもしくは複数）内に閉じ込められうる。ステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的化用リガンドは更には、例えば小胞の層（一つもしくは複数）もしくは壁（一つもしくは複数）を形成するかも
しくはその中に含まれる安定化剤内に散在させることにより輸送系もしくは小胞の層（一つもしくは複数）もしくは壁（一つもしくは複数）内に統合されてよい。それに加え、ステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的化用リガンドが輸送系もしくは小胞、もしくは非小胞性安定化剤の表面に位置してよいことも企図される。ステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的化用リガンドは、輸送系もしくは小胞の内部空隙内に同時に閉じ込められ、そして／または輸送系もしくは小胞の層（一つもしくは複数）もしくは壁（一つもしくは複数）内に統合され、そして／または輸送系もしくは小胞、もしくは非小胞性安定化剤の表面に位置してよい。いずれの場合であっても、ステロイドプロドラッグ、生物活性試薬、および／または標的化用リガンドは、例えば輸送系である小胞の内部および／または外部表面を初めとする輸送系である小胞の壁と化学的に相互作用してよく、そして実質的にそこに付着したままでいてよい。このような相互作用は、本開示を照らし合わせれば当業者には容易に明らかであるように、例えば非共有会合もしくは結合、イオン性相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、共有会合もしくは結合、架橋結合、あるいはいずれかの他の相互作用の形態をとってよい。所定の態様ではこの相互作用は小胞の安定化をもたらしてよい。生物活性試薬は更には、限られた方法で輸送系または小胞もしくは非小胞性安定化剤の内部もしくは外部表面とも相互作用してよい。このような限られた相互作用により、例えば第一小胞の表面から第二小胞の表面への、または第一非小胞性安定化剤の表面から第二非小胞性安定化剤の表面への生物活性試薬の移動が可能になる。また、このような限られた相互作用により例えば、輸送系、小胞、および／または非小胞性安定化剤の壁内から輸送系、小胞、および／または非小胞性安定化剤の表面へ、およびその逆方向へ、あるいは小胞および／または非小胞性安定化剤の内部から小胞および／または非小胞性安定化剤の壁内への、およびその逆方向への生物活性試薬の移動が可能になってよい。
【００６３】
「組織」は一般的には特定の機能を行うことができてよい特化された細胞を意味する。用語「組織」は、例えば膜、血液、もしくは臓器のような個別の細胞、もしくは複数の細胞、もしくは細胞の凝集物を意味してよい。用語「組織」は更には異常な細胞、もしくは複数の異常な細胞に対する引用も含む。例示的な組織は、心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｉｔｅ）を初めとする心筋組織、内皮細胞および上皮細胞を初めとする膜組織、平板、腸組織を初めとする結合組織、ならびに腫瘍を含む。
【００６４】
「レセプター」は、一般的には特定物質の選択的結合を特徴とする細胞内もしくは細胞表面上の分子構造を意味する。例示的レセプターは、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体分画、免疫グロブリン、およびステロイドホルモンのための細胞質顆粒レセプターを含む。
【００６５】
「細胞内」もしくは「細胞内での」は、原形質、細胞質、および／または核質を初めとする細胞の原形質膜内の領域を意味する。
【００６６】
「細胞内輸送」は、細胞の原型質膜内の領域への、標的化用リガンドおよび／またはステロイドプロドラッグのような生物活性物質の輸送を意味する。
【００６７】
「細胞」は、有核細胞および無核細胞を初めとする、膜で囲まれている大量の原型質を含む組織化された組織を構成する微細な原型質の塊の内のいずれか一つを意味する。
【００６８】
「アルキル」は、直鎖、分岐鎖、もしくは環状の炭化水素基を意味する。好ましくはアルキルは直鎖もしくは分岐鎖の炭化水素基であり、一層好ましくは直鎖の炭化水素基である。例示的な直鎖および分岐鎖のアルキル基は例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル
、ノニル、およびデシル基を含む。例示的な環状炭化水素基（シクロアルキル基）は例えば、シクルペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチル基を含む。「フルオロアルキル」は例えば、式ＣＦ３（ＣＦ２）ｎ（ＣＨ２）ｍ−、（式中、各ｍおよびｎは独立に、０から約２２までの整数である）のフルオロアルキル基を初めとする、一つもしくは複数のフッ素原子で置換されるアルキル基を意味する。例示的なフルオロアルキル基は、ペルフルオロメチル、ペルフルオロエチル、ペルフルオロプロピル、ペルフルオロブチル、ペルフルオロシクロブチル、ペルフルオロペンチル、ペルフルオロヘキシル、ペルフルオロヘプチル、ペルフルオロオクチル、ペルフルオロノニル、ペルフルオロデシル、ペルフルオロウンデシル、およびペルフルオロドデシルを含む。
【００６９】
「アシル」は、アルキル−ＣＯ−基（式中アルキルは先に記載されるとうりである）を意味する。好ましいアシル基は１〜約３０の炭素原子のアルキルを含む。例示的アシル基は、アセチル、プロパノイル、２−メチルプロパノイル、ブタノイル、およびパルミトイルを含む。「フルオロアシル」は、ペルフッ化アシル基までを含む、一つもしくは複数のフッ素原子で置換されるアシル基を意味する。
【００７０】
「アリール」は、約６〜約１０の炭素原子を含む芳香族炭素環基を意味する。アリール基は場合によっては同一もしくは異なってよい一つもしくは複数のアリール基置換基により置換されてよく、この場合「アリール基置換基」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、カルボキシ、アロイル、ハロ、ニトロ、トリハロメチル、シアノ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシ、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、および−ＮＲＲ’（式中ＲおよびＲ’は各々独立に水素、アルキル、アリール、およびアラルキルである）を含む。例示的なアリール基は置換されたもしくは非置換のフェニル、および置換されたもしくは非置換のナフチルを含む。
【００７１】
「アルキルアリール」は、アルキル−アリール基（例えばＣＨ３−（Ｃ６Ｈ４）−）およびアリール−アルキル基（例えば、（Ｃ６Ｈ５）−ＣＨ２−）を意味し、この場合、アリールおよびアルキルは先に記載されたとおりである。例示的なアルキルアリール基は、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチル−メチルを含む。「フルオロアルキルアリール」は、ペルフッ素化されたアルキルアリール基までを含む、一つもしくは複数のフッ素原子で置換されたアルキルアリール基を意味する。
【００７２】
「アルキレン」は、１〜約３０の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖の二価脂肪族炭化水素を意味する。アルキレン基は直鎖、分岐鎖、もしくは環状であってよい。アルキレン基は更には場合によっては不飽和であり、そして／またはフッ素原子のようなハロゲン原子を含む一つもしくは複数の「アルキル基置換基」で置換されてよい。一つもしくは複数の酸素、硫黄、または置換もしくは非置換の窒素原子が場合によってはアルキレン基に挿入されてよく、この場合窒素置換基は先に記載されたアルキルである。例示的アルキレン基は、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−（ＣＨ２）３−）、シクロヘキシレン（−Ｃ６Ｈ１０−）、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−（ＣＦ２）ｎ（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｎは約１〜約２２の整数であり、ｍは０〜約２２の整数である）、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍおよびｎは各々独立に０〜約３０の整数であり、そしてＲは水素もしくはアルキルである）、メチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）、ならびにエチレンジオキシ（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）を含む。アルキレン基が約２〜約３の炭素原子を有することが好ましい。
【００７３】
「ハロ」、「ハライド」、もしくは「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素、もしくはヨウ素原子を意味する。
【００７４】
溶媒
本発明の溶媒は水性溶媒もしくは有機溶媒であってよい。本発明の好ましい溶媒は、アルキル化アルコール、エーテル、アセトン、アルカン、ジメチルスルホキシド、トルエン、環状炭化水素、ベンゼン、および気体前駆体からなる群より選択される。エーテルは、メトキシル化エーテル、アルキル化エーテル、ジエーテル、トリエーテル、オリゴエーテル、ポリエーテル、環状エーテル、およびクラウンエーテルからな群より選択され；アルキル化アルコールはメタノールであってよく；そしてアルカンはヘキサンであってよい。溶媒は部分的もしくは完全にフッ素化されてよい。
【００７５】
溶媒は治療剤輸送系の調製の際に界面活性剤を治療剤と会合させるための懸濁用媒質である。治療剤は典型的には溶媒には僅かに可溶化するのみである。
【００７６】
本発明の調製に有用な溶媒は治療剤輸送系の処理工程中に除去されてよい。噴霧乾燥中には例えば、溶媒、界面活性剤、および治療剤は、溶媒の内の相当部分が噴霧乾燥中には蒸発するように発泡剤と共に気流中に組合わされてよい。その結果、界面活性剤と治療剤からなる治療剤輸送系が調製される。
【００７７】
油、ワックス、脂質
本発明の目的のためには、本出願全体を通して用いられる「油」、「油類」およびそれらの変型は、ワックスおよび脂肪を含むとして理解される。好ましい油、ワックス、および脂肪は、１００℃以下の融点を有するものである。特に好ましいのは、−２０℃と６６℃との間の融点を有する合成油、一層好ましくは６０℃を下回る温度で融解するもの、そして最も好ましいのは４２℃を下回る温度で融解するものである。この点では油およびワックスは一般的には薬を溶解するのに用いられるが、更には例えばエトポシドもしくはブレオマイシンのような乾燥薬の結晶を懸濁するのにも用いられてよい。６０℃以上の温度で融解するワックスも用いられてよいが、一般的には一層低めの融点のワックスが好ましい。刊行物に知られる多くの天然油は本発明に有用でありうる。幾つかの通常の油の融点は、状態変化の際に分解する多成分特性のため決定が困難である。
【００７８】
商品として入手可能な他の合成油およびサーファクタントも、音響活性リポスフェアとして先に列挙される油用として適切である。中でも、これらは本明細書に引用することにより取り込まれるＯｗｅｎらに対する米国特許題５，６３３，２２６号内に列挙されているものを含み、そしてＣａｐｔｅｘ  ２００（第５，６３３，２２６号に記載される組成物）、Ｗｈｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ−１５、およびＭＹＶＡＣＥＴ  ９−４５Ｋを含む。同一の引用文献からのＡＡＬ内に場合によっては含まれ得る界面活性剤は、カプムル（ｃａｐｍｕｌ）ＭＣＭ、Ｍｙｖｅｒｏｌ  １８−９２、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｃｅｎｔｒｏｐｈａｓｅ  ３１、ポリオキシエチレンの誘導体、およびＢｒｏｗｎに対する米国特許第５，５７３，７８１号に記載されるもの（その全体が引用することにより本明細書に取り込まれる開示）を含む。
【００７９】
本発明のマイクロスフェアに適する油、ワックス、および脂肪の例は限定されるわけではないが、以下の表に列挙されるものを含む：
【００８０】
【表１−１】
2010280678.tif 000003
【００８１】
【表１−２】
2010280678.tif 000004
【００８２】
【表１−３】
2010280678.tif 000005
【００８３】
【表１−４】
2010280678.tif 000006
【００８４】
界面活性剤
本発明の界面活性剤は好ましくは疎水性、非イオン性であり、そして限定されるものではないがリン脂質および油のような脂質、ならびにフルオロ界面活性剤を含む。
【００８５】
界面活性剤は例えば、ダイズ油、ピーナッツ油、カノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、コーン油、およびマゾーラ油、肝油、鉱油、シリコン油、フッ素化トリグリセリドからなる油、飽和、不飽和、および／または部分的に水素化された脂肪酸からなる全ての生物適合性油、中でもビニル−末端、水素末端、シラノール末端、アミノ末端、エポキシ末端、カルビノール末端を有する液体を初めとするシリコンベースの油および他のシリコンベースの油を含み、それらは例えば（１）メルカプト修飾されたシリコン液、ならびに飽和、不飽和、もしくはアリール−アルキル置換されたシリコン油、Ｃ１２−Ｃ２４脂肪酸の飽和および不飽和鎖からなるトリグリセリドのような合成油であり、例えばオレイン酸のグリセロールトリグリセリドエステル、テルペン、リノレン、スクアレン、スクアラミン、または本明細書の教示に従う安定化化合物としての使用に適し、消化可能であることが一般的に知られるいずれかの他の油である。追加的な界面活性剤は、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（ドデシル−）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ヘキサデシル−）、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム（テトラデシル−）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（この場合、アルキルはＣ１２、Ｃ１４、もしくはＣ１６である）、臭化／塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化／塩化ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウム、臭化／塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化／塩化セチルジメチルエチルアンモニウム、または臭化／塩化セチルピリジニウムを含む。他の界面活性剤が、例えば米国特許第０８／４４４，７５４号、米国特許第０８／４６５，８６８号、米国特許第４，６８４，４７６号（Ｄ’Ａｒｒｉｇｏ）および第５，２１５，６８０号（Ｄ’Ａｒｒｉｇｏ）、および第５，５６２，８９３号（Ｌｏｒｈｍａｎｎ）に開示されており、この各開示はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００８６】
フッ素化トリグリセリド油は、例えばフッ素気体のようなフッ素化された反応種を不飽和トリグリセリド油と反応させて所望のフッ素化トリグリセリドを産生することにより製造されてよい。
【００８７】
本発明における界面活性剤としての使用に適する蛋白質もしくはその誘導体は例えば、アルブミン、ヘモグロビン、α−１−アンチトリプシン、α−フェトプロテイン、コラーゲン、フィブリン、アミノトランスフェラーゼ、アミラーゼ、Ｃ−反応性蛋白質、胎児性癌抗原、セルロプラスミン、補体、クレアチンホスホキナーゼ、フェリチン、フィブリノーゲン、フィブリン、トランスペプチダーゼ、ガストリン、血清グロブリン、ミオグロブリン、免疫グロブリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リポ蛋白質、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、α−１−血清蛋白質分画、α−２−血清蛋白質分画、β−蛋白質分画、γ−蛋白質分画、およびγ−グルタミルトランスフェラーゼを含む。本
発明に用いられてよい他の蛋白質は例えば、米国特許第４，５７２，２０３号、第４，７１８，４３３号、４，７７４，９５８号、および第４，９５７，６５６号に記載されており、これらの開示はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。先に記載されたものおよび記述の特許に記載されたものに加え、他の蛋白質ベースの界面活性剤は、本開示を参考にすれば当業者には明らかであろう。ポリグルタミン酸およびポリリシンのようなポリペプチドも本発明に有用であってよい。
【００８８】
脂質および／または蛋白質から処方される界面活性剤に加え、本発明の態様は天然、半合成（改変された天然）、もしくは合成起源であってよいポリマーから処方されてもよい。ポリマーは、二つもしくはそれを上回る数の反復性モノマー単位、および好ましくは１０もしくはそれを上回る数の反復性モノマー単位でできている化合物を意味する。半合成ポリマー（もしくは改変された天然ポリマー）は、何らかの様式で化学的に修飾された天然ポリマーを意味する。適切な天然ポリマーの例は、例えばアラビナン、フルクタン、フルカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリンのようなもの）、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラクトカロロース、ペクチン酸、ペクチンのような天然に存在する多糖を含み、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プスタリン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンガム、ＨＥＴＡ−スターチのようなスターチ、ならびに多種多様の他の天然ホモポリマーもしくはヘテロポリマーを含み、それらは以下のアルドース、ケトース、酸、もしくはアミンの内の一つもしくは複数を含むものであり：それらはエリスロース、スレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキストロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリスルロース、リブロース、キシルロース、シコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、フルクトース、ロルボース、タガトース、マニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカン酸、ガラクトウロン酸、マヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸、ならびにそれらの天然に存在する誘導体である。従って、適切なポリマーは例えばアルブミンのような蛋白質を含む。例示的な半合成ポリマーは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、およびメトキシセルロースを含む。本発明の使用に適する例示的合成ポリマーは、ポリホスファゼン、ポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ、により市販品として入手可能なＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）として引用される種類の化合物を含む）、ポリオキシエチレン、およびポリエチレントレフタレート）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコール）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、塩化ポリビニル、およびポリビニルピロリドン）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素ポリマー、フッ素化炭素ポリマー（例えば、ポリテトラヒドロエチレン）、アクリレート、メタクリレート、およびポリメチルメタクリレート、ならびにそれらの誘導体を含む。好ましいものは、モノマーから調製された生物適合性合成ポリマーもしくはコポリマーであり、そのモノマーは例えばアクリル酸、メタクリル酸、エチレンイミン、クロトン酸、アクリルアミド、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、乳酸、グリコール酸、ε−カプロラクトン、アクロレイン、シアノアクリレート、ビスフェノールＡ、エピクロルヒドリン、ヒドロキシアルキル−アクリレート、シロキサン、ジメチルシロキサン、酸化エチレン、エチレングリコール、ヒドロキシアルキル−メタクリレート、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２，４−ペンタジエン−１−オール、ビニルアセテート、アクリロニトリル、スチレン、ｐ−アミノ−スチレン、
ｐ−アミノ−ベンジル−スチレン、スチレン硫酸ナトリウム、２−スルホキシエチル−メタクリル酸ナトリウム、ビニルピリジン、アミノエチルメタクリレート、塩化２−メタクリロイルオキシトリメチルアンモニウム、およびポリビニリデン、ならびにＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、２，２’−（ｐ−フェニレンジオキシ）−ジエチルジメタクリレート、ジビニルベンゼン、トリアリルアミン、ポリラトキドコグリコリド（ｐｏｌｙｌａｔｃｉｄｅｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール、およびメチレンビス−（４−フェニルイソシアナート）のような多機能性架橋結合用モノマー、およびそれらの組み合わせ物である。好ましいポリマーは、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、エポキシ樹脂、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリアミド（ナイロン）ポリマーを含む。好ましいコポリマーは以下のものを含む：ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン−ポリアクリロビトリル−ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン−ポリアクリロニトリル、およびポリ  ｄ−１，ラクチド  コ−グリコシドポリマー。好ましいコポリマーはポリビニリデン−ポリアクリロニトリルである。他の適切な生物適合性モノマーおよびポリマーは、本開示を参考にすれば当業者には明らかになるであろう。
【００８９】
界面活性剤は、安定性および本明細書に記載される他の基準を満たす限り、他の物質から製造されてよい。本発明の範囲内に含まれる薬莢物質（ｓｈｅｌｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）に適するポリマーを形成するのに用いることができる追加的合成有機モノマー反復単位はヒドロキシ酸、ラクトン、ラクチド、グリコリド、アクリル含有性化合物、アミノトリアゾル、オルトエステル、無水物、エステルイミド、イミド、アセタール、ウレタン、ビニルアルコール、エノールケトン、および有機シロキサンである。
【００９０】
薬莢物質内へのフッ素の導入は、いずれかの既知の方法により達成され得る。例えば、ペルフルオロ−ｔ−ブチル部分の導入は、米国特許第５，２３４，６８０号；ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＯＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ（Ｓｐｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５）；Ｚｅｉｆｍａｎ，Ｙ．Ｖ．ら、Ｕｓｐｅｋｈｉ  Ｋｈｉｍｉｉ（１９８４）５３  ｐ．４３１；およびＤｙａｔｋｉｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｕｓｐｅｋｈｉ  Ｋｈｉｍｉｉ（１９７６）４５、ｐ．１２０５、に記載されており、これらの開示はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。これらの方法は、以下の：
（ＣＦ３）３Ｃ＜−＞＋Ｒ−Ｘ＞（ＣＦ３）３Ｃ−Ｒ
［式中、Ｒは宿主分子であり、そしてＸは、例えばＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、もしくはスルホネート基のような良好な遊離基である］
の宿主分子とのペルフルオロアルキルカルバニオンの反応を一般的には必要とする。当該技術分野によく知られる方法を用いる既述のモノマー性薬莢物質に対する遊離基の付加の後、ペルフルオロ−ｔ−ブチル部分を、先に記載される方法では誘導化された薬莢物質（宿主分子）内に容易に導入することができる。
【００９１】
トリフルオロメチル基の様々な有機化合物への導入については追加的な方法が知られている。そのような方法の一つは、ペルフルオロアルキル−トリアルキルシランを用いる求核ペルフルオロアルキル化によるトリフルオロメチル基の導入を記載している。（ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＦＬＵＯＲＩＮＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ｐｐ．２２７−２４５（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。
【００９２】
フッ素はモノマーもしくはポリマー形態のいずれかで既述の物質の内のいずれかに取り込ませることができる。好ましくはフッ素部分を例えば脂肪酸、アミノ酸、もしくは重合
化可能な合成有機化合物のようなモノマー内に取り込ませ、これをその後にマイクロスフェア薬莢形成用物質としての後続使用のために重合化させる。
【００９３】
界面活性剤内へのフッ素の導入も、ペルフルオロ炭素気体の存在下でマイクロスフェアを形成することにより達成されてもよい。例えばマイクロスフェアが、例えばヒト血清アルブミンのような蛋白質から、例えばペルフルオロプロパンのようなペルフルオロカーボンの存在下で、機械による空洞形成法を用いて形成させる場合には、気相からのフッ素は形成中に蛋白質薬莢に結合するようになる。薬莢物質中のフッ素の存在はその後に、破壊されたマイクロスフェアから精製された薬莢破片のＮＭＲにより検出され得る。フッ素は更には、超音波処理、噴霧乾燥、もしくは乳化技術のようなマイクロスフェアを形成するための他の技術を用いてマイクロスフェア薬莢内に導入することができる。
【００９４】
フッ素を導入することができる他の方法は、フッ素含有性反応性化合物を用いることによる。用語「反応性化合物」は、フッ素部分が共有結合により結合する様式でフッ素を界面活性剤と相互作用させることができる化合物を意味する。界面活性剤が蛋白質である場合には、好ましい反応性化合物は、アクリル化反応を介してアミド結合を形成するために蛋白質のアミノ酸基と反応させることができるアルキルエステルもしくはアシルハライドのいずれかである（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ｐｐ．４１７−４１８（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，４ｔｈ  ｅｄ．、１９９２）を参照されたく、この開示はその全体が引用により本明細書に取り込まれる）。反応性化合物はマイクロスフェア形成中のいずれかの段階で導入することができるが、マイクロスフェア形成以前に気相に添加されることが好ましい。例えばマイクロスフェアが、機械もしくは超音波空洞形成技術を用いて作成される場合には、マイクロスフェアの形成に用いられる気体（出発気体）にその反応性化合物の溶液を通じて気泡を通すことにより気相に反応性化合物を添加することができる。この溶液を、所望の量の反応性化合物を気相内に導入するに十分な一定温度に保つ。得られる気体混合物はここでは出発気体と反応性化合物を含んでおり、これをその後に用いてマイクロスフェアを形成する。マイクロスフェアは、米国特許第４，９５７，６５６号（この開示は、全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載されるように、気体混合物の存在下でヒト血清アルブミンの超音波処理により形成されることが好ましい。
【００９５】
適切なフッ素含有性アルキルエステルおよびアシルハライドが表２に提供される：
【００９６】
【表２】
2010280678.tif 000007
【００９７】
先に記載されるアルキルエステルおよび酸ハライドの使用に加え、合成有機化学における当業者には、他の多くのフッ素含有性反応性化合物を合成することができることはよく知られており、その例は、ペルフルオロ炭素部分（−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ４、−Ｃ（ＣＦ３）３）を含むアルデヒド、イソチアナート、イソチオシアナート、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、無水物、酸ハライド、およびスルホン酸アルキルである。これらの反応性化合物をその後に用い、フッ素部分の共有結合による結合を達成するのに適切な組み合わせを選択することにより既述の物質の内のいずれか内にフッ素部分を導入することができる。
【００９８】
界面活性剤を調製するための材料は基本的かつ基準的なものであってよく、そして気体および気体前駆体充填小胞を作成もしくは確立するための第一の基本を形成してよい。一例として、界面活性剤およびフルオロ界面活性剤は小胞を調製するための基本的かつ標準的材料であってよい。一方で、これらの材料は補助的なものであってよく、そして、基本的界面活性剤の機能を促進するかもしくは基本的界面活性剤により可能となるものに加えて幾つかの所望される特性に寄与することがある副次的もしくは相補的試薬として作用してよい。
【００９９】
所定の材料が基本的試薬かもしくは補助的試薬であるかどうかを決定するのは必ずしも可能ではなく、なぜならこの材料の機能は例えば界面活性剤を産生することに関連して生じる結果により経験的に決定されるためである。基本的および補助的材料がどのように機能してよいかの例として、生物適合性脂質と水もしくは食塩水との単純な組み合わせ物を滅菌のためのオートクレーブの前に震盪した場合には不透明の溶液が得られる事がよくあることが観察されている。このような不透明な溶液は造影剤として機能することがあって
よいが、美的には好ましくなく、かつ溶解していないもしくは分散していない脂質粒子の形態では不安定であることが意味されてよい。不透明な溶液はさらには、溶解していない粒子性物質の直径が約７μｍを上回る大きさ、特に約１０μｍを上回る大きさである場合には好ましくない。滅菌濾過のような製造段階も、溶解していない粒子性物質を含む溶液に関しては問題を含むことがあってよい。従ってプロピレングリコールが、脂質粒子の分散もしくは溶解を促進させることによりこの不透明性を除去する目的で添加されてよい。プロピレングリコールは更には、小胞膜もしくは被膜の表面張力を増加させることにより小胞形成および安定化を改善することができる湿潤剤として機能してよい。プロピレングリコールが、小胞の膜もしくは皮膚をコーティングし、そして追加的な安定性を提供することがあってよい追加層として機能し得ることが可能である。混合ミセル系を作成するのに用いられる化合物も、基本的もしくは補助的安定化剤として用いられてよい。クラスレートも、本発明における使用には界面活性剤の製造の際に有用であってよく、この一例としては国際公開第９０／０１９５２号を参照されたい（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。
【０１００】
陰性に帯電した脂質の内、利用される脂質の総量に基づき、例えば約１〜約１０モルパーセントという少なくとも僅かな量を界面活性剤中に取り込ませることにより界面活性剤の安定性を促進させることが可能であってよい。適切な陰性に帯電する脂質は例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、および脂肪酸を含む。操作のいずれかの理論もしくは複数の理論に拘束されることを意図する訳ではないが、このような陰性に帯電する脂質が、互いの融合により小胞が破壊する傾向に対抗する手段を取ることにより追加的な安定性を提供することが企図される。したがって、陰性に帯電する脂質は小胞の外表面上で一様に陰性に帯電した層を確立するように作用することがあってよく、このような小胞はそれに近接する他の小胞上の類似の状態に帯電する外層による反発をうける。このようにして小胞は互いに近接して接触するようになる可能性が低くなってよく、互いに近接して接触することにより個別の小胞の膜もしくは被膜の破壊、ならびに接触した小胞が単一で巨大な小胞に統合される現象がもたらされてよい。この統合過程の継続により、当然のことながら小胞の有意な破壊がもたらされる。
【０１０１】
特に小胞に関連して用いられる脂質は柔軟性があることが好ましい。これは本発明の文脈では、小胞は例えば、小胞の直径を下回る大きさの直径を有する開口部を通過するためその形状を変化させることが可能であることを意味する。
【０１０２】
小胞の安定性は少なくとも部分的には小胞が作成される材料に起因してよく、その材料には例えば先に示される脂質、ポリマー、蛋白質、および／または界面活性剤が含まれ、そして追加的安定化剤は場合によっては用いられ、かつ用いられることが好ましくてよいものの、それを利用する事は必ずしも必要でないことがしばしばある。先に論議される脂質、蛋白質、および／またはポリマー化合物に加え、もしくはそれらの代わりに本明細書に記載される組成物は、一つもしくは複数の別の安定化剤を含んでよい。例示的安定化剤は例えば、界面活性剤および生物適合性ポリマーを含む。安定化剤は、小胞の形成を好ましい形で補佐するおよび／または気体、気体前駆体、および／または治療薬の実質的被包化を確実に行うために利用されてよい。例えばペルフルオロプロパンもしくは六フッ化硫黄のような比較的不溶性の非分散性気体についてでさえも、一つもしくは複数の安定化剤を気体および／または気体前駆体充填小胞の形成の際に利用する場合には改善された小胞組成物が取得されてよい。これらの化合物は、サイズ、形状、および／または他の属性に関して小胞の安定性および完全性を改善する手助けとなってよい。
【０１０３】
先に論議されるポリマー同様、気体および／または気体前駆体充填小胞を製造するための安定化剤として有用な生物適合性ポリマーは天然、半合成（改変された天然）、もしくは合成起原のものであってよい。例示的天然ポリマーは天然に存在する多糖を含み、その
例は、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリン）、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラクトカロロース、ペクチン酸、アミロースを含むペクチン、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、スターチ、および様々な他の天然のホモポリマーもしくはヘテロポリマーを含み、それらは例えば一つもしくは複数の以下のアルドース、ケトース、酸、もしくはアミンを含むものであり：それらは、エリスロース、スレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキストロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリスルロース、リブロース、キシルロース、ピシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セルビオース、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカン酸、ガラクトウロン酸、マヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸であり、更には天然に存在するそれらの誘導体が含まれる。従って、適切なポリマーは例えば、アルブミンのような蛋白質を含む。例示的半合成ポリマーは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、およびメトキシセルロースを含む。例示的な合成ポリマーは、ポリホスファゼン、ポリエチレン（例えば、ポリエチレンングリコール（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ、から商品として入手可能なＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）として引用される化合物の種類を含む）、ポリオキシエチレン、およびポリエチレンテレフタレート）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコール）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、塩化ポリビニル、およびポリビニルピロリドン）、ナイロンを初めとするポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化された炭化水素ポリマー、フッ素化された炭素ポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン）、アクリレート、メタクリレート、およびポリメチルメタクリレート、ならびにそれらの誘導体を含む。安定化用化合物としてポリマーを用いる小胞の製造法は、本開示を参照すれば、Ｕｎｇｅｒに対する米国特許第５，２０５，２９０号（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載および引用されるような当該技術分野に知られる情報と組み合わせる際には当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１０４】
本発明の特に好ましい態様は以下の３つの構成成分を含む小胞を含み、それらは：（１）例えば非イオン性もしくは両性イオン性脂質のような中性脂質、（２）陰性に帯電している脂質、および（３）例えば親水性ポリマーのような安定化剤を保持する脂質、である。好ましくは、陰性に帯電した脂質の量は、存在する総脂質の約１モルパーセントを上回り、そして親水性ポリマーを保持する脂質の量は存在する総脂質の約１モルパーセントを上回るであろう。例示的かつ好ましい陰性に帯電する脂質はホスファチジン酸を含む。親水性ポリマーを保持する脂質は、そのポリマーに共有結合で結合する脂質であることが所望され、そしてそのポリマーは好ましくは約４００〜約１００，０００の平均分子量を有することが好ましい。適切な親水性ポリマーは好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドン、ならびにそれらのコポリマーからなる群より選択され、ＰＥＧポリマーが好ましい。好ましくは、ＰＥＧポリマーは約１０００〜約７５００の分子量を有し、約２０００〜約５０００の分子量が一層好ましい。ＰＥＧもしくは他のポリマーは、例えばアミド、カルバメート、もしくはアミン結合のような共有結合を通し、例えばＤＰＰＥのような脂質に結合してよい。それに加え、ＰＥＧもしくは他のポリマーは、例えばアミド、エステル、エーテル、チオエーテル、チオアミド、もしくはジスルフィド結合を初めとする共有結合で、標的化用リガンドもしくは他のリン脂質に連結されてよい。親水性ポリマーがＰＥＧ
である場合には、そのようなポリマーを保持する脂質は「ペギレートされる（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）」と呼ばれる。好ましい形態では、親水性ポリマーを保持する脂質はＤＰＰＥ−ＰＥＧであってよく、これには例えばＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００が含まれ、これは結合される約５０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールポリマーを有するＤＰＰＥを意味する（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００）。他の適切なペギレートされた脂質はジステアロイルホスファチジルエタノール−アミン−ポリエチレングリコール５０００（ＰＳＰＥ−ＰＥＧ５０００）である。
【０１０５】
本発明の所定の好ましい態様では脂質組成物は、約７７．５モル％ＤＰＰＥ、１２．５モル％ＤＰＰＡ、および１０モル％ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を含んでよい。やはり好ましいのは、約８０〜９０モル％ＤＰＰＥ、約５〜約１５モル％ＤＰＰＡ、および約５〜約１５モル％ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を含む組成物である。特に好ましいのはＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ、およびＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を各々８２：１０：８のモル％比率で含む組成物である。ＤＰＰＣは実質的には中性であり、というのはホスファチジル部分は陰性に帯電しており、そしてコリン部分は陽性に帯電しているためである。結果的には陰性に帯電しているＤＰＰＡは先に記載されるメカニズムに従って安定化を促進させる目的で添加されてよい。ＤＰＰＥ−ＰＥＧは、小胞膜もしくは皮膚を随意に囲むことができるＰＥＧ部分と共にＤＰＰＥ部分により小胞の脂質膜もしくは被膜に結合するペギレートされた物質を提供し、そしてこのことにより、そういった外来性物質を減らすことが機能である体内の多種多様の酵素性物質もしくは他の内因性物質に対する物理的障壁を形成する。ＤＰＰＥ−ＰＥＧは、先の所定の比率で例えばＤＰＰＣおよびＤＰＰＡのような他の脂質と共に組み合わせた際に安全かつ圧力に対して安定な、一層小さなサイズの小胞をより多く提供してよい。水に構造が類似するため、ペギレートされた物質は、別の場合には外来性物質を取り囲みかつ除去する傾向にあるヒト免疫系のマクロファージの作用を打ち負かすことができてよいことも理論的には考えられる。この結果、安定化された小胞が診断画像化用造影剤として機能してよい時間を増加させることになる。広域にわたる標的化用リガンドをＰＥＧの遊離末端に連結させてよい。典型的にはＰＥＧはスペーサーとして機能し、かつ標的化を改善させる。
【０１０６】
用語「安定な」もしくは「安定化された」は小胞が、有用期間の間は、例えば小胞構造の喪失、または被包された気体、気体前駆体、および／または生物活性物質の喪失を初めとする分解に対して実質的に耐性を示してよいことを意味する。典型的には本発明に利用される小胞は所望される貯蔵寿命を有し、時としては通常の周囲の条件下で少なくともおおよそ２〜３週間の期間の間は、もともとの構造の少なくとも約９０重量％を保持する。好ましい形態では小胞は少なくとも約１カ月、一層好ましくは少なくとも約２カ月、更に一層好ましくは少なくとも約６カ月、更に一層好ましくは約１８カ月、そしてそれよりも更に好ましくは最高約３年の期間の間、安定であることが所望される。気体および／または気体前駆体充填小胞を初めとする、本明細書に記載される小胞は更には、通常の周囲の条件下で経験される以上もしくはそれ以下の温度や圧力といった不利な条件下でさえも安定であってよい。
【０１０７】
本発明に用いられる気体および／または気体前駆体充填小胞は、本明細書に記載される多種多様な追加的もしくは補助的な安定化剤の中から選択することによりサイズ、溶解度、および熱安定性に従って調節されてよい。これらの物質は、膜との物理学的相互作用によるばかりでなく、気体および／または気体前駆体充填小胞の表面の稠度および表面張力を改変する能力によっても、小胞、特に脂質から製剤される小胞のパラメーターに影響を及ぼすことができる。従って本発明に用いられる気体および／または気体前駆体充填小胞は好ましくは改変および更なる安定化を受けることがあってよく、それは例えば、多種多様の（ｉ）例えば炭水化物、ならびにそれらのリン酸化およびスルホン化された誘導体；好ましくは４００と１００，０００との間の分子量の範囲を有するポリエーテル：ならび
に好ましくは２００と５０，０００との間の分子量の範囲を有するジ−およびトリヒドロキシアルカンおよびそれらのポリマーを初めとする稠度改変剤；（ｉｉ）例えばアカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、一ステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レクチン、モノ−およびジ−グリセリド、モノ−エタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８１）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシ３５ひまし油、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシ４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、二酢酸プロピレングリコール、一ステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミタン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、および乳化ワックスを初めとする乳化用および／または可溶化用試薬；（ｉｉｉ）例えば、アカシア、アガー、アルギン酸、一ステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース、カルシウムおよびナトリウム、およびナトリウム１２、カラゲナン、セルロース、デキストラン、ゼラチン、ガーゴム、ローカストビーンガム、ベーガム（ｖｅｅｇｕｍ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、Ｚｅｏｌｉｔｅｓ（商標）、メチルセルロース、ペクチン、酸化ポリエチレン、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化シリコン、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム、α−ｄ−グルコノラクトン、グリセロール、およびマニトールを初めとする懸濁用および／または稠度増加用試薬；（ｉｖ）例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、およびポリソルベートのような合成懸濁用試薬；ならびに（ｖ）例えばソルビトール、マニトール、トレハロース、スクロース、プロピレングリコール、およびグリセロールを初めとする安定化および張度を付加する稠度増加剤、の内の一つもしくは複数の添加により修飾もしくは更に安定化させることが好ましくてよい。
【０１０８】
これらの組成物は脂質を誘導することができる水性環境内で製剤されることが所望されるが、それはそのような環境下で達成され得る最も安定な構造であってよい小胞を形成させるための疎水性−親水性特性のためである。このような水性環境を作成するために用いることができる稀釈剤は例えば、脱イオン水、または塩もしくは糖のようなひとつもしくは複数の可溶化した溶質を含む水を含む、好ましくは小胞の形成および／または安定性、または超音波造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、および光学画像用造影剤のような診断用試薬としてのそれらの使用を妨げることがない水；ならびに通常の食塩水および生理学的食塩水を含む。
【０１０９】
合成有機ポリマーも、マイクロスフェア薬莢を形成するのに適する。これらのポリマーは、ランダム、交互、もしくはブロックタイプのコポリマーを形成する単一反復性単位もしくは異種反復性単位でできていることができる。これらの有機ポリマーは架橋結合された高分子電解質を含み、それは例えばホスファゼン、イミノ置換されたポリホスファゼン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルアセテート、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、およびそれらのイオン性塩である。これらの高分子電解質の架橋結合は逆の電荷の多価イオンとの反応により達成される。更なる安定化は高分子電解質としての同一の電荷をもつポリマーを添加することにより達成され得る。米国特許第５，１４９，５４３号を参照されたい（これは引用により本明細書に取り込まれる）。それに加え、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（商標）（オクトキシノール）、Ｔｗｅｅｎｓ（商標）（ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｂｒｉｊ（商標）（ポリオキシエチレンエーテル）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）（ポリエチレングリコール）、Ｚｏｎｙｌｓ（商
標）（フルオロ界面活性剤）、およびＦｌｕｏｒａｄｓ（商標）からなる群から選択される非イオン性界面活性剤は本発明において有用であってよい。
【０１１０】
所定の態様では、組成物は全体もしくは部分的にフッ素化された化合物を含んでよい。適切なフッ素化された化合物は例えば、アルキル界面活性剤を初めとするフッ素化界面活性剤、ならびに両親媒性化合物を含む。多種多様のこのような化合物を利用することがあってよく、それには例えば末端ホスフェートもしくはスルフェート基を有するＺＯＮＹＬ（商標）リン酸塩（［Ｆ（ＣＦ２ＣＦ２）３−８ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］１，２Ｐ（Ｏ）（Ｏ−ＮＨ４＋）２，１）およびＺＯＮＹＬ（商標）硫酸塩（Ｆ（ＣＦ２ＣＦ２）３−８ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３−ＯＳＯ２ＯＣＨ３・）を初めとするＺＯＮＹＬ（商標）フルオロ界面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）として商業的に入手可能な種類の化合物を含む。適切なＺＯＮＹＬ（商標）界面活性剤は更には例えば、ペギレートされた（すなわち、少なくとも一つのポリエチレングリコール基が結合された）Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂ界面活性剤を初めとするＴｅｌｏｍｅｒ  Ｂとして同定されるＺＯＮＹＬ（商標）界面活性剤であって、ＰＥＧ−Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂとしても知られ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なものも含む。
【０１１１】
多種多様の脂質が本発明の組成物の製造に適していてよい。脂質は、天然、合成、もしくは半合成起源のものであってよく、これらには例えば脂肪酸、中性脂質、リン脂質、油、糖脂質、界面活性性試薬（界面活性剤）、脂肪族アルコール、ワックス、テルペン、およびステロイドが含まれる。
【０１１２】
本発明の準備をするのに用いられてよい例示的脂質には例えば、脂肪酸、リソ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄｓ）、フルオロ脂質、ホスホコリン（これは例えば血小板活性化因子（ＰＡＦ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）と会合するものであり、これには１−アルキル−２−アセトイル−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスホコリン、および１−アルキル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスホコリン（これらは血液凝固物を標的とする）が含まれる）；飽和および不飽和脂質の両方を含むホスファチジルコリン（これにはジオレオイルホスファチジルコリンが含まれる）；ジミリストイルホスファチジルコリン；ジペンタデカノイルホスファチジル−コリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；ジステアリルホスファチジジルコリン（ＤＳＰＣ）；およびジアラコイドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）；ホスファチジルエタノールアミン（例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール（これにはジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）が含まれる）；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴリピド（例えば、スフィンゴミエリン）；糖脂質（例えばガングリオシドＧＭ１およびＧＭ２）；グルコリピド；スルファチド；グリコスフィンゴリピド；ホスファチジン酸（例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、およびジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；ポリマーを保持する脂質（例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、これは更には「ペギレートされた脂質」としても引用され、ポリマーを保持する好ましい脂質にはＤＰＰＥ−ＰＥＧ（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ）を含み、これは結合するＰＥＧポリマーを有する脂質ＤＰＰＥを意味し、これには例えばＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００が含まれ、これは約５０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーが連結しているＤＰＰＥを意味する））；スルホン化されたモノ−、ジ−、オリゴ−、もしくはポリサカリド（多糖）を保持する脂質；コレステロール、硫酸コレステロール、およびヘミスクシネート；トコフェロールヘミスイクシネート；エーテルおよびエステルが結合して脂肪酸を有する脂質；重合脂質（これは多種多様のものが当該技術分野で知られている）
；リン酸ジアセチル：リン酸ジセチル；ステアリルアミン；カルジオリピン；長さが約６〜約８の炭素の短鎖脂肪酸を有するリン脂質；
不斉アシル鎖を含む合成リン脂質（例えば、約６炭素の、あるアシル鎖および約１２炭素の別のアシル鎖）；セラミド；非イオン性リポソーム（これにはニオソームが含まれ、その一例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコール、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル（一例では例えば、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ、から商品として入手可能なＴＷＥＥＮ（商標）として引用される種類の化合物）であり、これにはポリオキシエチル化されたソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリチノレート、エトキシル化ソルビタンステロール、エトキシル化ひまし油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー、およびポリオキシエチレン脂肪酸ステアレートが含まれる）；ステロール脂肪酸エステル（硫酸コレステロール、ブチル酸コレステロール、イソブチル酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール、およびｎ−ブチル酸フィトステロールが含まれる）；糖酸のステロールエステル（これにはコレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−ジヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロール、およびグルコン酸エルゴステロールが含まれる）；糖酸およびアルコールのエステル（これには、ラウリルグルクロニド、ステアリルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコネート、ミリストイルグルコネート、およびステアリルグルコネートが含まれる）；糖および脂肪酸のエステル（ラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸、およびポリウロン酸を含む）；サポニン（サラササポゲニン、シミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノン酸、およびジギトキシゲニンを含む）；二ラウリン酸グリセロール、三ラウリン酸グリセロール、二パルミチン酸グリセロール、およびグリセロールエステル（三パルミチン酸グリセロール、二ステアリン酸グリセロール、三ステアリン酸グリセロール、二ミリスチン酸グリセロール、三ミリスチン酸グリセロールを含む）；長鎖アルコール（ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、およびｎ−オキタデシルアルコールを含む）；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド；１２（（（７’−ジエチルアミノ０クマリン−３−イル）−カルボニル）−メチルアミノ−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）−カルボニル）−メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；コレステリル（４’−トリメチル−アンモニオ）−ブタノエート；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノール−アミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン、およびパルミトイルホモシステイン、および／またはそれらのいずれかの組み合わせ物を含む。
【０１１３】
高分子化脂質の例は不飽和親油性鎖であり、それは例えば最高約５０炭素原子までを含むアルケニルもしくはアルキニルのようなものである。更なる例は、高分子化可能な基を保持するホスホグリセリドおよびスフィンゴリピドのようなリン脂質、ならびにヒドロキシル基を有する飽和および不飽和脂肪酸誘導体であり、この例は、ｄ−１２−ヒドロキシオレイン酸のトリグリセリドであり、これにはひまし油および麦角油が含まれる。高分子
化は、生物分解によりもたらされる主鎖残基が水溶性となるように分散度を亢進させる目的でのカルボキシルもしくはヒドロキシル基のような親水性置換基を含むように設計されてよい。本発明の組成物に用いられてよい例示的高分子化脂質化合物は以下のように説明される。
【０１１４】
【化１】
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【０１１５】
好ましい態様では界面活性剤は、一つもしくは複数のＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＧ、およびＤＡＰＣ（２０炭素原子）を含むリン脂質を含む。
【０１１６】
所望される場合には安定化剤はカチオン性脂質を含んでよく、それは例えば、塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；および１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）である。所望されるカチオン性脂質が安定化剤に用いられる場合には、非カチオン性脂質に対するカチオン性脂質のモル比は例えば、約１：１０００〜約１：１００であってよい。好ましくは非カチオン性脂質に対するカチオン性脂質のモル比は約１：２〜約１：１０であってよく、約１：１〜約１：２．５の比率が好ましい。更に一層好ましくは非カチオン性脂質に対するカチオン性脂質のモル比が約１：１であってよい。
【０１１７】
所望される場合には組成物は一つもしくは複数のポリマーを保持する脂質と会合している、場合によっては一つもしくは複数の中性脂質と会合している一つもしくは複数の帯電した脂質でできていてよい。帯電している脂質はアニオン性もしくはカチオン性のいずれかであってよい。典型的には脂質は、帯電された脂質とは逆の電荷となっている対イオンのような多価種の存在下で凝集物を形成する。プロドラッグおよび／または生物活性試薬などの治療剤のインビボでの選択された部位への輸送用には、本発明の治療剤輸送系はミクロンもしくはサブミクロンサイズのものであってよい。好ましくは治療剤輸送系は約１０ミクロンを下回る大きさ、一層好ましくは約２ミクロン以下、一層好ましくは約１ミク
ロンを下回る大きさ、一層好ましくは約０．５ミクロン以下、そして更に一層好ましくは約２００ｎｍ以下であることが所望される。一層好ましくは脂質凝集体は２００ｎｍ以下のサイズであり、そして約５〜約１０ｎｍのサイズぐらい小さくてもよい。治療剤輸送系も約１００ミクロン〜約１ミリメートルのサイズであってよい。静脈内（ＩＶ）投与および肺投与のためには一層小さめの治療剤輸送系が好ましい。
【０１１８】
例示的アニオン性脂質は、ホスファチジン酸およびホスファチジングリセロールおよびならびにそれらの脂肪酸エステル、ホスファチジルエタノールアミンのアミド（例えばアナンドアミドおよびメタナンダアミド）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ならびにそれらの脂肪酸エステル、カルジオリピン、ホスファチジルエチレングリコール、酸性リソ脂質、スルホ脂質、およびスルファチド、遊離脂肪酸、飽和および不飽和の両方、ならびに陰性に帯電しているそれらの誘導体を含む。ホスファチジン酸およびホスファチジルグリセロール、ならびにそれらの脂肪酸エステルが好ましいアニオン性脂質である。
【０１１９】
帯電している脂質がアニオン性である場合には、多価（二価、三価など）のカチオン性物質が用いられてよい。有用なカチオンは例えば、アルカリ土類金属（例えばベリリウム（Ｂｅ＋２）、マグネシウム（Ｍｇ＋２）、カルシウム（Ｃａ＋２）、ストロンチウム（Ｓｒ＋２）、およびバリウム（Ｂａ＋２））に由来するカチオン；両性イオン（例えばアルミニウム（Ａｌ＋３）、ガリウム（Ｇａ＋３）、ゲルマニウム（Ｇｅ＋３）、錫（Ｓｎ＋４）、および鉛（Ｐｂ＋２とＰｂ＋４））；遷移金属（例えばチタニウム（Ｔｉ＋３とＴｉ＋４）、バナジウム（Ｖ＋２とＶ＋３）、クロム（Ｃｒ＋２とＣｒ＋３）、マンガン（Ｍｎ＋２とＭｎ＋３）、鉄（Ｆｅ＋２とＦｅ＋３）、コバルト（Ｃｏ＋２とＣｏ＋３）、ニッケル（Ｎｉ＋２とＮｉ＋３）、銅（Ｃｕ＋２）、亜鉛（Ｚｎ＋２）、ジルコニウム（Ｚｒ＋４）、ニオビウム（Ｎｂ＋３）、モリブデン（Ｍｏ＋２とＭｏ＋３）、カドミウム（Ｃｄ＋２）、インディウム（Ｉｎ＋３）、タングステン（Ｗ＋２とＷ＋４）、オスミウム（Ｏｓ＋２、Ｏｓ＋３、とＯｓ＋４）、イリジウム（Ｉｒ＋２、Ｉｒ＋３、とＩｒ＋４）、水銀（Ｈｇ＋２）、およびビスマス（Ｂｉ＋３）；ならびに稀土類ランタニド（例えばランタン（Ｌａ＋３）、およびガドリニウム（Ｇｄ＋３））、からのカチオンを含む。全ての通常の原子価状態にあるカチオンが凝集物および架橋結合された脂質を形成するのに適するであろうことが企図される。好ましいカチオンは、カルシウム（Ｃａ＋２）、マグネシウム（Ｍｇ＋２）、および亜鉛（Ｚｎ＋２）、ならびにマンガン（好ましくはＭｎ＋２）およびガドリニウム（Ｇｄ＋３）のような常磁性カチオンを含む。特に好ましいのはカルシウム（Ｃａ＋２）である。当業者には明らかになるであろうが、先のイオンの内の幾つか（特に鉛とニッケル）は毒性に関連していることがあってよく、そしてそのためインビボでの使用には不適切であることがある。
【０１２０】
帯電している脂質がカチオン性である場合には、アニオン性物質が例えば用いられてよい。アニオン性物質が多価であることが好ましく、それは例えば二価などである。有用なアニオン性物質の例は単原子性および多原子性アニオンを含み、それは例えばカルボキシレートイオン、スルフィドイオン、スルファイトイオン、オキシドイオン、ナイトライドイオン、カルボネートイオン、およびホスフェートイオンである。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および１，４，７，１０−テトラアゾシクロドデカン−Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸（ＤＯＴＡ）も用いられてよい。有用なアニオン性物質の更なる例には、アクリル酸、メタクリル酸、他のポリアクリレート、およびメタクリレートのポリマーおよびコポリマー、ペンダントＳＯ３Ｈ基のポリマー（例えば、スルホン酸ポリスチレン）、ならびにカルボン酸基を含むポリスチレンのアニオンを含む。
【０１２１】
カチオン性脂質の例は先に列挙されるものを含む。凝集物の形成にとって好ましいカチ
オン性脂質は、塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（「ＤＯＴＭＡ」）である。合成カチオン性脂質も用いられてよい。これらは一つもしくは複数の塩基性官能基を含むように誘導化された通常の天然脂質を含む。そのように修飾することができる脂質の例は、臭化ジメチルジオクタデシル−アンモニウム、スフィンゴリピド、スフィンゴミエリン、リソリピド、グリコリピド（例えばガングリオシドＧＭ１）、スルファチド、グリコスフィンゴリピド、コレステロールとコレステロールエステルと塩、Ｎ−スクシニルジオレオニルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール、１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスファチジルエタノールアミン、およびパルミトイルホモシステインを含む。
【０１２２】
特別に合成されたカチオン性脂質は更には本発明の態様でも機能する。これらの中には１９９５年２月２１日に出願された係争中の米国特許第０８／３９１，９３８号（この開示は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる）において開示されるものがあり、そして例えば、四ヨウ化Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニル−メチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチル−アミノカルボニルメチレンエチレン−ジアミン；五ヨウ化Ｎ，Ｎ”−ビスヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−Ｎ”−トリス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレンジエチレントリアミン；四ヨウ化Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ”−ビス（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノ−カルボニルメチレン）シクロヘキシレン−１，４−ジアミン；七ヨウ化１，１，７，７−テトラ−（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−３−ヘキサデシルアミノカルボニル−メチレン−１，３，７−トリアアザヘプタン；および四ヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラホスホエタノールアミノカルボニルメチレン）ジエチレントリアミンを含む。
【０１２３】
カチオン性および非カチオン性脂質の両方を含む界面活性剤の場合には、例えば先に記載されるもののような多種多様の脂質が非カチオン性脂質として利用できる。好ましくは非カチオン性脂質が一つもしくは複数のＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む。先に列挙されるカチオン性脂質の代わりに例えばポリリシンもしくはポリアルギニンのようなカチオン性ポリマーを保持する脂質、ならびにアルキルホスホネート、アルキルホスフィネート、およびアルキルホスファイトも安定化剤に用いられてよい。本開示を参照にすると当業者は、陽性に帯電する部分を保持する他の天然もしくは合成変異物も本発明で機能するであろうことを認識するであろう。
【０１２４】
安定化剤として利用されてよい飽和および不飽和脂肪酸は、直鎖もしくは分岐鎖形態をとる、約１２炭素原子〜約２２炭素原子を好ましくは含む分子を含む。イソプレノイド単位および／またはプレニル基からなる炭化水素基を用いることができる。適切な飽和脂肪酸の例は例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸を含む。適切な不飽和脂肪酸の例は例えば、ラウロレン酸、フィセテリン酸、ミリストレン酸、パルミトレン酸、ペトロセリン酸、およびオレイン酸を含む。適切な分岐鎖脂肪酸の例は例えば、イソラウリン酸、イソミリスチン酸、イソパルミチン酸、およびイソステアリン酸を含む。
【０１２５】
本発明の精神内に留まり、当業者には明らかである他の有用な脂質もしくはその組み合わせ物も本発明により包含される。例えば米国特許第４，３１０，５０５号（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載される炭水化物を保持する脂質が利用されてよい。
【０１２６】
また、フッ素化化合物、特にペルフルオロカーボン化合物を用いることが所望されてよく、このような化合物は、脂質および／または小胞組成物、そして特には気体充填小胞の安定性を補助もしくは亢進させるために、例えばヒト身体のインビボ温度を初めとする使用温度で液体状態をとってよい。使用されてよい適切な液体ペルフルオロカーボンは例えばペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ペルフルオロオクチルイオダイド、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロトリプロピルアミン、およびペルフルオロトリブチルアミンを含む。一般的には約６もしくはそれを上回る数の炭素原子を含むペルフルオロカーボンは通常のヒト体温では液体であろう。中でも、室温で液体であるペルフルオロカーボン、ペルフルオロオクチルブロミド、およびペルフルオロヘキサンが好ましい。存在する気体は例えば、窒素もしくはペルフルオロプロパンであってよく、または例えばペルフルオロペンタンのようなペルフルオロカーボンでもあることができる気体前駆体に由来してよい。後者の場合には安定化剤および／または小胞組成物は例を挙げるとしたらペルフルオロプロパン（気体）もしくはペルフルオロペンタン（気体前駆体）、およびペルフルオロオクチルブロミド（液体）であろうペルフルオロカーボンの混合物から製造されてよい。操作の理論（一つもしくは複数）に限定することを意図する訳ではないが、小胞組成物の場合には液体フッ素化化合物は、気体と、小胞の膜もしくは壁表面との間の界面に位置してよい。このようにして例えば小胞を形成するために用いられる生物適合性脂質のような小胞の内部表面上の液体フッ素化化合物の一層安定化された層が形成されてよく、そしてこのペルフルオロカーボン層が小胞膜を通す拡散から気体を保護してもよい。本発明の文脈内では気体前駆体は製造および／または保存の温度では液体であるが、少なくとも使用時もしくは使用時間中では気体になる。
【０１２７】
本明細書に記載される脂質および／または小胞を作成するのに通常用いられる気体および／または気体前駆体と組合わされる場合には例えばペルフルオロカーボンのような液体フッ素化化合物は、気体および／または気体前駆体単独のみでは取得されないある程度追加された安定性を付与することができる。従って、気体および／または気体前駆体（例えばペルフルオロオクチルブロミドのような患者への投与（すなわちこの化合物の液体から気体への相転移温度はこの患者の体温以上である）後に液体のままとなるペルフルオロカーボンと共に例えばペルフルオロペンタンのようなペルフルオロカーボン気体前駆体のようなもの）を利用することは本発明の範囲内に含まれる。例えばＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ社のＺＯＮＹＬ（商標）フッ素化界面活性剤、ＺＯＮＹＬ（商標）リン酸塩、ＺＯＮＹＬ（商標）硫酸塩、およびＺＯＮＹＬ（商標）界面活性剤（これはペギレートされ（すなわち、少なくとも一つのポリエチレングリコール基が連結されている）、かつＰＥＧ−Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂとしても知られるＴｅｌｏｍｅｒ  Ｂ界面活性剤を初めとするＴｅｌｏｍｅｒ  Ｂとして同定される）のようなペルフルオロ化界面活性剤を用いて脂質および／または小胞組成物を安定化させてよく、そしてまたこれらは例えば小胞のためのコーティングとして作用してもよい。好ましいペルフルオロ化界面活性剤は部分的にフッ素化されたホスホコリン界面活性剤である。これらの好ましいフッ素化界面活性剤では二重（ｄｕａｌ）アルキル化合物は末端アルキル鎖でフッ素化されてよく、そして近位炭素が水素化されてよい。これらのフッ素化ホスホコリン界面活性剤は本発明の組成物を作成するために用いられてよい。
【０１２８】
本発明の安定化剤としての使用のための他の適切なフッ素化化合物は米国特許第５，５６２，８９３号に記載されており、この開示はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。例えば合成有機単量体性反復単位は本発明における安定化剤として適するポリマーを形成するために用いられてよく、これにはヒドロキシ酸、ラクトン、ラクチド、グリコリド、アクリル含有化合物、アミノトリアゾル、オルトエステル、無水物、エステルイミド、イミド、アセタール、ウレタン、ビニルアルコール、エノールケトン、およびオルガノシロキサンが含まれる。
【０１２９】
これらの物質の内のいずれかの中にフッ素を導入する方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、ペルフルオロ−ｔ−ブチル部分の導入は米国特許第５，２３４，６８０号に記載されており、この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。これらの方法は一般的にはペルフルオロアルキルカルバニオンの、以下のホスト分子との反応を必要とする：（ＣＦ３）３Ｃ−＋Ｒ−Ｘ→（ＣＦ３）３Ｃ−Ｒ［式中、Ｒはホスト分子であり、そしてＸは例えば臭素、塩素、ヨウ素、もしくはスルホネート基のような良好な遊離基である］。遊離基を前述の安定化剤に、当該技術分野でよく知られる方法を用いて添加した後には、ペルフルオロ−ｔ−ブチル部分をその後には容易に、先に記載されるこれらの誘導化安定化剤に取り込ませることができる。
【０１３０】
トリフルオロメチル基の様々な有機化合物内への誘導のために知られる付加方法は当該技術分野ではよく知られている。例えば、トリフルオロメチル基はペルフルオロアルキル−トリアルキルシランを用いる求核性ペルフルオロアルキル化により導入されてよい。
【０１３１】
フッ素は、単量体もしくは高分子形態のいずれかで既述の安定化剤もしくは小胞の内のいずれかの中に導入することができる。好ましくはフッ素部分は例えば脂肪酸、アミノ酸、もしくは重合可能な合成有機化合物のような単量体内に誘導し、これをその後に安定化剤および／または小胞としてのその後の使用のために重合化させる。
【０１３２】
フッ素の安定化剤および／または小胞内への導入はペルフルオロカーボン気体の存在下での小胞の形成により達成されてもよい。例えば、ヒト血清アルブミンのような蛋白質から例えばペルフルオロプロパンのようなペルフルオロカーボン気体の存在下で、機械的空洞形成法を用いて小胞を形成する際には、気相からのフッ素が形成中に蛋白質小胞に結合される。小胞および／または安定化剤内でのフッ素の存在は、破壊された小胞から既に精製されている小胞破片のＮＭＲにより検出され得る。フッ素は更には、超音波処理、噴霧乾燥、もしくは乳化技術のような他の方法を用いて安定化剤および／または小胞内に導入され得る。
【０１３３】
フッ素を外殻物質内に導入することができる他の方法は、フッ素含有性反応化合物を用いることによる。用語「反応性化合物」は、フッ素部分が安定化剤および／または小胞に共有結合により連結する様式で安定化剤および／または小胞と相互作用することが可能な化合物を意味する。安定化剤が蛋白質である場合には、好ましい反応性化合物は、アシル化反応を介してアミド結合を形成するための蛋白質のアミノ基との反応を行うことができるアルキルエステルもしくはハロゲン化アシルのいずれかである。この反応性化合物は小胞形成中のいずれかの段階で導入することができるが、小胞形成前の気相に添加されることが好ましい。例えば小胞が機械的もしくは超音波による空洞形成技術を用いて作成される予定の際には、反応性化合物は、反応性化合物の溶液を通して小胞（出発気体）の形成の際に用いられるべき気体を気相中に気泡として通過させることにより気相に添加することができる。得られる気体混合物はここでは出発気体と反応性化合物を含み、これをその後に用いて小胞を形成する。小胞は、米国特許第４，９５７，６５６号（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載される要領で、気体混合物の存在下でヒト血清アルブミンの超音波処理により形成されることが好ましい。
【０１３４】
本発明の安定化剤および／または小胞形成用物質としての使用に適するフッ素含有性アルキルエステルもしくはハロゲン化アシルは例えば、ヘキサフルオログルタール酸ジエチル、テトラフルオロコハク酸ジエチル、ヘプタフルオロブチル酸メチル、ヘプタフルオロブチル酸エチル、ペンタフルオロプロピオン酸エチル、ペンタフルオロプロピオン酸メチル、ペルフルオロオクタン酸エチル、ペルフルオロオクタン酸メチル、塩化ノナフルオロペンタノイル、塩化ペルフルオロプロピオニル、塩化ヘキサフルオログルタリル、および塩化ヘプタフルオロブチリルを含む。
【０１３５】
他のフッ素含有性反応性化合物は合成されることもでき、そして本発明における安定化剤および／または小胞形成用物質として用いることもでき、これは例えばアルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、無水物、酸ハロゲン化物、およびスルホン酸アルキルを含み、これは−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ４、および−Ｃ（ＣＦ３）３を初めとするペルフルオロカーボン部分を含む。これらの反応性化合物を用いてフッ素部分を既述の安定化剤内に、フッ素部分の共有結合による連結を達成するのに適切な組み合わせを選択することにより導入することができる。
【０１３６】
水性環境に対する小胞の透過性を減少するには、十分なフッ素を導入する必要がある。このことにより水性環境との気体交換の速度が減少し、この減少は耐圧性が向上することにより確認される。小胞を安定化させるために必要なフッ素の具体的な量は小胞およびそこに含まれる気体の構成成分に依存するものの、フッ素の導入後には小胞は好ましくは０．５〜２０重量％、一層好ましくは約１〜１０重量％のフッ素を含むであろう。
【０１３７】
治療薬
例えば遺伝物質および生物活性物質のような治療薬は、標的化された治療薬輸送系に連結されてよく、というのも治療薬はマイクロスフェアの空隙内、または内部もしくは外部マイクロスフェア表面上に取り込まれるためである。
【０１３８】
オクタノール／水分配係数の高い治療薬は気体を取り巻く層もしくは壁内に直接取り込まれてよいが、界面活性剤もしくは担体のいずれかの表面上への取り込みが一層好ましい。これを達成するためには、治療薬に結合可能な基が一般的には界面活性剤もしくは担体内にとりこまれてよく、これがその後にそれらの物質に結合する。遺伝物質の場合には、これは乾燥した出発物質内に取り込まれてよいカチオン性脂質もしくはカチオン性ポリマーの使用を通して容易に達成される。
【０１３９】
オクタノール分配係数は、オクタノールと水とに分配する薬剤の量を測定することにより様々な薬剤について測定することができる。以下の表３は、多種多様の薬剤のオクタノール／水分配係数を示す。一般的には音響活性リポスフェア（ＡＡＬ）は１．０を上回るオクタノール分配係数、更に一層好ましくは１０〜１を上回る分配係数、そして更に一層好ましくは５０を上回る分配係数を有する薬剤に最適である。タキソールはＡＡＬに良好に適する例示的薬剤であり、なぜならそのオクタノール分配係数は９９であるためである。オクタノール／水分配係数が低い薬剤はその親油性を増大させるためにアルキル化もしくはアシル化されてよい。別法では親水性薬剤をＡＡＬの油内での不溶性結晶として懸濁させることができる。
【０１４０】
【表３−１】
2010280678.tif 000009
【０１４１】
【表３−２】
2010280678.tif 000010
【０１４２】
薬剤が例えば１０を下回る比較的低いオクタノール／水分配係数を有する場合には、その薬剤は、場合によってはフッ素化されてよいアルキルもしくはアリールアルキル部分のような疎水性基との反応によりその親油性を増大するように修飾できる。親油性薬剤もこの様式でも修飾できる。例えばデキサメサゾンは米国特許第０８／８５１，７８０号に記載されるようにＤＰＧＳ−デキサメサゾンへの転化により一層両親媒性を強くするように作成することができ、あるいはコレステロールをヘミコハク酸コレステロールもしくは反応性部分で改変してある他のコレステロール誘導体として用いることができる。当業者は認識するであろうように、疎水性化学物質のこのような両親媒性形態は容易に有機溶媒中に分配されるが、それでもある程度の水溶性は保持するため、少量の血清中では沈降しないことになる。親水性薬剤もやはり、界面活性剤により周囲を取り囲まれるミクロ−もしくはナノ結晶性物質を形成し、そしてその後に油相中に懸濁させることによりＡＡＬ中に用いることができる。これは一般的には粉末化させ乾燥させた薬剤の量を油もしくはワックス中に混合させて溶媒中でマイクロスフェアを形成させることにより達成される。ブレオマイシンおよびエトポシドのような化学療法剤がこの様式で用いられてよい。一般的には油もしくはワックス中の０．００１重量％〜９０重量％の比率の乾燥薬剤がこの様式で調製されてよい。
【０１４３】
他の適切な治療薬は抗真菌剤および生物活性試薬を含み、それらは例えば、抗新生物試薬（例えば、プラチナ化合物（一例ではスピロプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン）、メトトレキセート、アドリアマイシン、タキソール、マイトマイシン、アンサミトシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリシン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブシル、メルファラン（例えば、Ｌ−サロリシン（Ｌ−ＰＡＭ、これはアルケラン（Ａｌｋｅｒａｎ）としても知られる）、およびフェニルアラニンマスタード（ＰＡＭ））、メルカプトプリン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、ダクチオマイシン（アクチノマイシンＤ）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸ナトリウム、フルタミド、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲステロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アマサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼ）エルゥイナ（Ｅｒｗｉｎａ）
アスパラギナーゼ、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、テニポシド（ＶＭ−２６）、硫酸ビンブラスチン（ＶＬＢ）、硫酸ビンクリスチン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、カルゼレシン、およびアラビノシル）；血液製剤（例えば、非経口鉄剤、ヘミン、ヘマトポルフィリン、およびそれらの誘導体）；生物応答改変剤（例えば、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド、プロスタグランジン、微生物細胞壁構成成分、リンホカイン（例えば、一例ではリポ多糖のような細菌性エンドトキシン、マクロファージ活性化因子）、細菌のサブユニット（一例ではミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびコリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ））、合成ジペプチドＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；抗真菌剤（例えば、ケタコナゾール、ニスタチン、グリセロフルビン、フルキトシン（５−ｆｃ）、ミコナゾール、アンフォテリシンＢ、リシン、およびβ−ラクタム抗生物質（例えば、スルファゼシン））；ホルモン（例えば、成長ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、エストラジオール、ジプロピオン酸ベクロメサゾン、ベタメサゾン、酢酸ベタメサゾン、およびリン酸ナトリウムベタメサゾン、リン酸二ナトリウムベタメサゾン、リン酸ナトリウムベタメサゾン、酢酸コルチゾン、デキサメサゾン、酢酸デキサメサゾン、リン酸ナトリウムデキサメサゾン、フルノシド、ハイドロコルチゾン、酢酸ハイドロコルチゾン、ハイドロコルチゾンシピオネート、リン酸ナトリウムハイドロコルチゾン、コハク酸ナトリウムハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸ナトリウムメチルプレドニゾロン、酢酸パラメサゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、リン酸ナトリウムプレドミゾロン、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾン、トリアムキノロン、トリアムキノロンアセトニド、トリアムキノロンジアセテート、トリアムキノロンヘキサアセトニド、フルドロコルチゾンアセテート、プロゲステロン、テステステロン、および副腎皮質刺激ホルモン）；ビタミン（例えば、シアノコバラミンニコチン酸、レチノイド、および誘導体（例えば、パルミチン酸レチノール）、α−トコフェノール、ナフトキノン、コレカルシフェロール、葉酸、およびテトラヒドロ葉酸）；ペプチド（例えば、アンジオスタチン、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、グルタチオン、インスリン、ドーパミン、ＧＰＩＩｂＩＩＩａレセプターについて親和性を有するペプチド（通常は活性化されたレセプター血小板上に見いだされる）（この例は、ＲＧＤ、ＡＧＤ、ＲＧＫ、ＫＧＤ、ＫＧＥ、およびＫＱＡＧＤＶ、オピエートペプチド（一例ではエンケファリンおよびエンドルフィン））、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、コレシストキニン、ブラディキニン、ブラディキニンのプロモーター、ブラディキニンの阻害剤、エラスチン、バソプレッシン、ペプシン、グルカゴン、サブスタンスＰ（痛覚改変ペプチド）、インテグリン、アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓ���ｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル、エナラプリル、およびリシノプリル）、副腎皮質刺激ホルモン、オキシトシン、カルシトニン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、エフェクター細胞プロテアーゼレセプター（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のためのリガンド、トロンビン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロテインキナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）Ｃ、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ）、コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、リンホトキシン、上皮成長因子、繊維芽細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、エリスロポイエチン、トランスフォーミング成長因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン（例えば、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、およびインターロイキン１２）、メタロポイエチンキナーゼリガンド、およびコラーゲナーゼ）；酵素（例えば、アルカリ性ホスファターゼおよびシクロオキシゲナーゼ）；抗アレルギー試薬（例えば、アメレキサノックス）；抗凝結性試薬（例えば、フェンプロクモ
ンおよびヘパリン）；循環性試薬（例えば、プロプラノロール）；代謝増強剤（例えば、グルタチオン）；抗結核薬（例えば、パラ−アミノサリチル酸、イソニアジド、硫酸カプレオマイシンシクロセリン、水酸化エタンブトールエチオナミド、ピラジナミド、リファンピン、および硫酸ストレプトマイシン）；抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル、アマンタジンアジドチミジン（ＡＴＺもしくはジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ））、ラバビリン、アマンダジン、ビダラビン、およびビダラビン一水和物（アデニンアラビノシド、ａｒａ−Ａ）；抗狭心症薬（例えば、ジルチアゼム、ニフィデピン、バラパミル、（四）硝酸エリスリチル、（二）硝酸イソソルビド、ニトログリセリン（（四）硝酸グリセリル）、および（四）硝酸ペンンタエリスリトール）；抗凝結剤（例えば、フェンプロクモン、ヘパリン）；抗生物質（例えば、ダプソン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ケファクロール、ケファドロキシル、ケファレキシン、ケファラジン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ジクロキサシリン、シクラシリン、ピクロキサシリン、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、チカルシリン、リファンピン、およびテトラサイクリン）；抗炎症剤（例えば、ジフニサル、イブプロフェン、インドメサチン、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナプロキセン、オキシフェンブラゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダック、トロメチン、アスピリン、およびサリチレート）；抗原虫剤（例えば、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、メトロニダゾール、キニン、およびアンチモン酸メグルミン）；抗リューマチ剤（例えば、ペニシラミン）；麻酔薬（例えば、アヘン安息香チンキ、ナラビニコデイン、ヘロイン、メサドン、モルヒネ、およびアヘン製剤）；強心配糖体（デスラノシド、ジギトキシン、ジゴキシン、ジギタリン、およびジギタリス）；神経筋遮断薬（アトラクリウムベシレート、ガラミントリエチオジド、臭化ヘキサフルオレニウム、ヨウ化メトクリン、臭化パンクロニウム、塩化スクシニルコリン（塩化スキサメトニウム）、塩化ツボクラリン、および臭化ベクロニウム）；鎮静剤（催眠剤）（例えば、アモバルビタール、アモバルビタールナトリウム、アプロバルビタール、ブタバルビタールナトリウム、抱水クロラール、エトクロルビノル、エチナメート、塩酸フラゼパム、グルテチミド、塩酸メトトリメプラジン、メチプリロン、塩酸ミダゾラム、パルアルデヒド、ペンタバルビタール、ペンントバルビタールナトリウム、フェノバルビタールナトリウム、セコバルビタールナトリウム、タルブタール、テマゼパム、およびトリアゾラム）；局所麻酔剤（例えば、塩酸ブビバカイン、塩酸クロロプロカイン、塩酸エチドカイン、塩酸リドカイン、塩酸メピバカイン、塩酸プロカイン、および塩酸テトラカイン）；全身麻酔剤（例えば、ドロペリドール、エトミデート、ドロペリドールとのクエン酸フェンタニル、塩酸ケタミン、メトヘキシタールナトリウム、およびチオペンタールナトリウム）；ならびに放射性活性粒子もしくはイオン（例えば、ストロンチウム、ヨウ化レニウム、テクネチウム、コバルト、およびイットリウム）、を含む。所定の好ましい態様では生物活性試薬はモノクローナル抗体であり、それは例えばメラノーマ抗原に結合可能なモノクローナル抗体である。
【０１４４】
眼科疾患および前立腺癌の治療のためのもののような所定の好ましい治療薬は例えば、ガンシクロビル、血管内皮成長因子、フォスカルネット、Ｓ−（１，３ヒドロキシル−２−ホスホニルメトキシプロピル）シトシン、酸化窒素シンターゼインヒビター、アルドースレダクターゼインヒビター（例えば、ソルビニルおよびトルレスタット）、ＬＹ３３３５３１（プロテインキナーゼＣ−βのアイソザイム−選択性インヒビター、Ｆａｕｌら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＬＹ３３３５３１，ａｎ  ｉｓｏｚｙｍｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ−β」、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｐａｐｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １９９７  ２１３，ｐａｒｔ２，５６７、を参照されたい（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる））、キドフォビル、ビタミンＥ、オウリントリカルボン酸、ソマツリン、Ｔｒｏｌｏｘ（商標）、ソルブジン、α−インターフェロン、エトフィブレート、フィルガストリム、アミノグアニジン、チクロピジン、ポナル
レスタット、エパルレスタット、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ジピリダモル＋アスピリン、ニパラジロール、ハロペリドール、ラタノプロスト、ジピフェブリン、血管内皮成長因子、チモロール、ドルゾラミド、アダプロロールエナンチオマー、塩酸ビフェメラン、塩酸アパラクロニジン、ンバニノロール、ベタキソロール、エトプシド、３−α，５−β−テトラヒドロコルチゾル、ピロカルピン、生物侵食性ポリ（オルトエステル）、レボブノロール、プロスタノン酸、Ｎ−４スルファノール  ベンジル−イミダゾール、イミダゾピリジン、３−（ビシクリルメチレン）オキシインドール、１５−デオキシスペルグアリン、ベンゾイルカルビノール塩、フマギリン、レコシム、ベンダザック、Ｎ−アシル−５−ヒドロキシトリプタミン、酢酸ケトロレリックス、１７−α−アシルステロイド、アザアンドロステロン、５−α−レダクターゼインヒビター、および抗エストロゲン薬（例えば２−４−｛１，２−ジフェニル−１−ブテニル｝フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン）を含む。
【０１４５】
他の好ましい治療剤例えば天然もしくは合成のいずれかの起源の核酸、ＲＮＡ、およびＤＮＡのような遺伝物質を含み、これには組換えＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる。用いられてよい遺伝物質の種類は、例えばプラスミド、ファゲミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、および欠損もしくは「ヘルパー」ウイルスのような発現ベクター上に保持される遺伝子、抗原核酸、一本鎖および二本鎖の両方のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにそれらのアナログを含み、これは例えばホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートオリゴデオキシヌクレオチドである。追加的にはこの遺伝物質は、例えば蛋白質もしくは他のポリマーと組合わされてよい。本発明のリポソームを用いて適用されてよい遺伝物質の例は例えば、ＬＦＡ−３の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ、ＨＬＡ遺伝子の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ、ジストロフィンの少なくとも一部分をコードするＤＮＡ、ＣＦＴＲの少なくとも一部分をコードするＤＮＡ、ＩＬ−２の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ、ＴＮＦの少なくとも一部分をコードするＤＮＡ、およびＲａｓの少なくとも一部分をコードするＤＮＡに結合可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【０１４６】
所定の蛋白質をコードするＤＮＡが多くの異なる種類の疾患の治療に用いられてよい。例えばアデノシンジアミナーゼがＡＤＡ欠損症を治療するのに提供されてよく；腫瘍壊死因子および／またはインターロイキン−２が進行性の癌を治療するのに提供されてよく；ＨＤＬレセプターが肝臓疾患を治療するのに提供されてよく；チミジンキナーゼが卵巣癌、脳腫瘍、もしくはＨＩＶ感染を治療するのに提供されてよく；ＨＬＡ−Ｂ７が悪性黒色腫を治療するのに提供されてよく；インターロイキン−２が神経芽細胞腫、悪性黒色腫、もしくは腎臓癌を治療するのに提供されてよく；インターロイキン−４が癌を治療するのに提供されてよく；ＨＩＶ  ｅｎｖがＨＩＶ感染を治療するのに提供されてよく；アンチセンスｒａｓ／ｐ５３が肺癌を治療するのに提供されてよく；そして第ＶＩＩＩ因子が血友病Ｂを治療するのに提供されてよい。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅｆ２５８：７４４−７４６、を参照されたい。
【０１４７】
染料が治療剤の定義内に含まれる。染料は患者の身体もしくは患者の身体の特別な領域内の小胞の位置を同定するのに有用であってよい。小胞組成物の投与、およびエネルギーを用いて治療予定の患者身体の領域内のこのような組成物の位置決定の後に、この染料は組成物から放出され、そしてエネルギーにより可視化されてよい。本発明に有用な染料は蛍光染料および比色分析用染料を含み、それは例えばスダンブラック、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、テキサスレッド、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、オレゴングリーン、ローダミンレッド−Ｘ、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＹＯＹＯ−１、ＤＡＰＩ、インド−１（Ｉｎｄｏ−１）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）、フラ−２、アミノメチルクマリン、ＦＭ１−４３、ＮＢＤ、カルボシ−ＳＮＡＲＦ、ルシフェルイエロー、ダンシル
＋Ｒ−ＮＨ２、ヨウ化プロピジウム、メチレンブルー、ブロモクレゾールブルー、アクリジンオレンジ、ブロモフェノールブルー、７−アミノ−アクチノマイシンＤ、アロフィコシアニン、９−アジドアクリジン、ベンゾキサンチン−イエロー、ビスベンジジドＨ３３２５８フルオロクローム、３ＨＣｌ、二酢酸５−カルボキシフルオレセイン、４−クロロ−１−ナフトール、クロモマイシン−Ａ３、ＤＴＡＦ、ＤＴＮＢ、臭化エチジウム、二酢酸フルオレセイン−５−マレイミド、ミスラマイシンＡ、ローダミン１２３、ＳＢＦＩ、ＳＩＳＴ、テトラメチルベンジジン、テトラメチルプルプレート、チアゾリルブルー、およびＴＲＩＴＣなどである。フルオレセインはイソチオシアン酸フルオレセインであってよい。イソチオシアン酸フルオレセインは中でも、イソチオシアン酸フルオレセインアルブミン、イソチオシアン酸フルオレセイン抗体複合体、イソチオシアン酸フルオレセインα−ブンガロトキシン、イソチオシアン酸フルオレセイン−カゼイン、イソチオシアン酸フルオレセイン−デキストラン、イソチオシアン酸フルオレセイン−インンシュリン、イソチオシアン酸フルオレセイン−レクチン（Ｌｅｃｔｉｎ）、イソチオシアン酸フルオレセイン−ペルオキシダーゼ、およびイソチオシアン酸フルオレセイン−プロテインＡを含む。
【０１４８】
先に記載される治療薬に加え本発明の安定化剤は、診断用および治療用超音波を初めとする超音波（ＵＳ）と組み合わせると特に有用である。本発明の安定化剤および／または小胞は単独で用いられてよいか、または診断用画像化用の造影剤としての有効性を増加させるよう作用してよい通常の造影剤を初めとする様々な造影剤と組合わせて用いられてよい。
【０１４９】
この安定化剤は所望される場合には、コンピューター断層法（ＣＴ）画像化、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、光学画像化、もしくは当業者によく知られる他の様々な形態の診断用画像化に利用されてもよい。光学画像化用には気体気泡が例えば画像化データセット上での血管の可視化を改善する。ＣＴでは例えば十分高い濃度の本造影剤、そして特に気体充填小胞が目的の領域（例えば、血塊）に輸送される場合には、その血塊の全体の密度が下がっているため血塊をＣＴ画像化で検出することができる。一般的には約１／１０〜１％の気体充填小胞の濃度もしくはそれを上回る濃度（容積を基にする濃度）が、ＣＴにより検出される予定の、既述の血塊を初めとする目的の領域に輸送される必要があってよい。
【０１５０】
この安定化剤との組み合わせ使用に適する造影剤の例は例えば、安定なフリーラジカル（例えば、安定なニトロキシド）、ならびにランタニドおよびアクチニド系遷移元素を含む化合物を含み、これらは所望される場合には塩の形態をとってよく、あるいは複合体形成用試薬（これらの試薬にはそれらの親油性誘導体が含まれる）もしくは蛋白質性マクロ分子に共有結合もしくは非共有結合により結合してよい。好ましいランタニドおよびアクチニド系遷移元素は例えば、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、およびＤｙ（ＩＩＩ）を含む。一層好ましくはこれらの元素はＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、およびＤｙ（ＩＩＩ）であってよく、最も好ましくはＭｎ（ＩＩ）およびＧｄ（ＩＩＩ）であってよい。既述の元素は塩の形態をとってよく、これには無機塩（例えば、マンガン塩、（その一例は塩化マンガン、炭酸マンガン、酢酸マンガンである））および有機塩（例えば、グルコン酸マンガンおよびマンガンヒドロキシルアパタイト）が含まれる。他の例示的塩は鉄の塩（この例は二硫化鉄）および第二鉄塩（例えば、塩化第二鉄）を含む。
【０１５１】
先の元素は更には、共有結合もしくは非共有結合を通して複合体形成用試薬（その親油性誘導体を含む）もしくは蛋白質性マクロ分子に結合してもよい。好ましい複合体形成用試薬は例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレン−ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”
−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＤＯＴＡ）、３，６，９−トリアザ−１２−オキサ−３，６，９−トリカルボキシメチレン−１０−カルボキシ−１３−フェニル−トリデカン酸（Ｂ−１９０３６）、ヒドロキシベンジル−エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ピリドキシル−５−リン酸）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＤＰＤＰ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−四酢酸（ＴＥＴＡ）、クリプタンド（大環状複合体）、およびデスフェロキサミンを含む。一層好ましくは、複合体形成用試薬がＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、およびクリプタンドであり、最も好ましくはＤＴＰＡである。好ましい親油性複合体は複合体形成用試薬ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡのアルキル化誘導体を含み、それは例えばＮ，Ｎ’−ビス−（カルボキシデシルアミドメチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＤＤＰ）；Ｎ，Ｎ’−ビス−（カルボキシ−オクタデシルアミド−メチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＤＰ）；およびＮ，Ｎ’−ビス（カルボキシ−ラウリルアミドメチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＬＤＰ）であり；米国特許第５，３１２，６１７号に記載されるものを含む（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。好ましい蛋白質性マクロ分子は例えば、アルブミン、コラーゲン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、γ−グロブリン、およびβ−グロブリンであり、アルブミン、ポリアルギニン、ポリリシン、およびポリヒスチジンが一層好ましい。従って適切な複合体は、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＴＰＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＯＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＯ３Ａ、Ｍｎ（ＩＩ）−クリプタンド、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＯＴＡ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＯ３Ａ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−クリプタンド、Ｃｒ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｃｕ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、もしくは鉄−デスフェリオキサミンを含み、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＴＰＡもしくはＧｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡが一層好ましい。
【０１５２】
ニトロキシドは、ニトロキシド分子内の不対電子の存在のためＭＲＩ上でのＴ１およびＴ２緩和率の両方を増加させる常磁性造影剤である。当業者に知られるように、ＭＲＩ造影剤としての所定の化合物の常磁性効果は少なくとも部分的には常磁性核もしくは分子内の不対電子数、そして特に不対電子数の二乗に関連してよい。例えば、ガドリニウムは７つの不対電子を有する一方でニトロキシド分子は一つの不対電子を有する。従ってガドリニウムは一般的にはニトロキシドよりも一層強力なＭＲＩ造影剤である。しかしながら造影剤の効果を評価するためのもう一つの重要なパラメーターである有効相関時間によりニトロキシドの可能性としての緩和性は高くなる。例えば常磁性造影剤を巨大分子に連結させることによりタンブリング速度がゆっくりになる場合には、タンブルの仕方は一層ゆっくりになり、そしてそのことにより水のプロトンの緩和を促進するように一層効果的にエネルギーを転化する。しかしガドリニウムの場合には電子スピン緩和時間は速く、そしてゆっくりとした回転相関時間が緩和度を増加する程度が限定される。しかしながらニトロキシドに関しては、電子スピン相関時間は一層好ましく、そして緩和度のかなりの増大が、これらの分子の回転相関時間をゆっくりにさせることにより達成されてよい。本発明の気体充填小胞は、ゆっくりとした回転相関時間およびその結果得られる緩和度の改善という目的を達成することに関しては理想的である。操作のいずれかの特別な理論に縛られることは意図しないものの、ニトロキシドは例えばそのアルキル誘導体を作成することにより小胞の外辺部をコーティングするように設計されてよいため、得られる相関時間を至適化することができることが企図される。それに加え、本発明の得られる造影剤は磁性球体、すなわち緩和度（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）を最大にさせる幾何学的構造として見なされてよい。
【０１５３】
本発明の組成物における使用に適する例示的超磁性体造影剤は、強磁性ドメインとなる
金属酸化物および金属硫化物、強磁性もしくはフェリ磁性化合物を含み、その例は純粋な鉄、磁性酸化鉄（一例では、磁鉄鉱、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、マンガンフェライト、コバルトフェライト、およびニッケルフェライト）である。常磁性気体もこの組成物に利用することができ、それは酸素１７気体（１７Ｏ２）のようなものである。それに加え、過分極キセノン、ネオン、もしくはヘリウム気体も利用されてよい。その後にＭＲ全身画像化を利用して、例えば血栓症について全身を迅速にスクリーニングしてよく、そして所望される場合には超音波を血栓破壊の補助のために適用してよい。
【０１５４】
先に記載される常磁性および超常磁性造影剤のような造影剤は、脂質および／または小胞組成物内の構成成分として利用されてよい。小胞組成物の場合には既述の造影剤をその内部空隙内に閉じ込めるか、小胞を用いて溶液として投与するか、いずれかの追加的安定化剤と共に取り込ませるか、あるいは小胞の表面もしくは膜上にコーティングしてよい。この組成物内ではいずれかの一つもしくは複数の常磁性試薬および／または超常磁性試薬の混合物が用いられてよい。常磁性試薬および超常磁性試薬は所望される場合には個別に同時投与されてもよい。
【０１５５】
所望される場合には常磁性試薬もしくは超常磁性試薬は組成物、特に小胞の脂質壁内に取り込まれるアルキル化されたもしくは他の誘導体として輸送されてよい。特にニトロキシド２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカルと２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカルは、例えばアセチルオキシ結合を初めとする多種多様の結合を介し、メチル基により占有されていない環の位置で長鎖脂肪酸との付加物を形成することができる。このような付加物は、本発明の脂質および／または小胞組成物内に非常に取り込まれ易い。
【０１５６】
本発明の安定化剤および／または小胞、そして特に小胞は、先に記載される超常磁性試薬の効率的担体として作用してよいばかりでなく、造影剤に対する磁化率の効果を改善もしてよい。超常磁性造影剤は金属酸化物、特に鉄酸化物を含むが、これらにはマンガン酸化物が含まれ、そして鉄酸化物としては多種多様の量のマンガン、コバルト、およびニッケルを含み、これらが強磁性ドメインとなる。これらの試薬はナノもしくはミクロ粒子であり、そしてバルク磁化率および横緩和速度が非常に大きい。例えば約１００ｎｍの直径を有する粒子のように、粒子が大きくなると、Ｒ１緩和度と比較する際、Ｒ２緩和度は一層大きくなる。例えば約１０〜約１５ｎｍの直径を有する粒子のように、粒子が小さくなると、Ｒ２緩和度はいくぶん小さくなるが、Ｒ１とＲ２の値はよりよくバランスが取れたものになってくる。例えば約３〜約５ｎｍの直径を有するモノ結晶性鉄酸化物粒子のように更に一層粒子が小さくなると、Ｒ２緩和度は小さくなるが、Ｒ１とＲ２緩和時間のバランスは多分一番よく取れているであろう。フェリチンも非常に高い緩和時間の超常磁性鉄のコアを被包するように製剤することができる。脂質および／または小胞組成物、特に気体充填小胞を初めとする小胞組成物がこのような通常の鉄酸化物ベースのＭＲＩ造影剤の効力および安全性を増加させることを我々は見いだした。
【０１５７】
鉄酸化物は安定化物質および／または小胞内に単純に取り込ませてよい。好ましくは、脂質から製剤された小胞の場合には鉄酸化物は、例えば小胞の表面内に吸収されることによるか、もしくは米国特許第５，０８８，４９９号（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載される要領で小胞の内部に閉じ込めることにより小胞の壁内に取り込まれてよい。
【０１５８】
操作のいずれかの特定の理論もしくは複数の理論に拘束されるものでないが、本発明の小胞は幾つかのメカニズムにより超常磁性造影剤の効力を増加させると考えられる。第一に、小胞は鉄酸化物粒子の見かけ上の磁性濃度を増加させるように機能すると考えられる。そしてまた、小胞は常磁性および超常磁性試薬を初めとするＭＲＩ造影剤の見かけ上の
回転相関時間を増加させるため、緩和率が増加すると考えられる。それに加え、小胞は本明細書のこれ以降に記載される様式に従って造影剤の見かけ上の強磁性ドメインを増大させるように思われる。
【０１５９】
本発明の所定の小胞、および特に脂質から製剤された小胞は、例えば造影剤の水性懸濁物、または例えば静脈内注入もしくは他の体の部位内への注入の場合には血液もしくは他の体液を初めとする懸濁用媒質とは磁化率が異なる耐屈曲性のある球状ドメインとして可視化されてよい。フェライトもしくは鉄酸化物粒子の場合には、これらの試薬により提供されるコントラストは粒子サイズに依存することを特筆すべきである。この現象は非常に一般的であり、かつ水分子の「永年（ｓｅｃｕｌａｒ）」緩和としてよく引用される。一層物理学的な用語で記載すると、この緩和メカニズムは、一つの常磁性原子もしくは常磁性分子、または複数の分子が存在する分子複合体の有効サイズに依存する。ある物理学的説明は、常磁性イオンによる摂動を受けるジャイロ磁気係数ｇのスピン１／２核のＴ１およびＴ２緩和時間の関数としての常磁性寄与を特定する以下のソロモン−ブロムベルゲン（Ｓｏｌｏｍｏｎ−Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇｅｎ）等式において記載されてよい：
【０１６０】
【数１】
2010280678.tif 000011
【０１６１】
［式中：Ｓは電子スピン量子数；ｇは電子ｇ因子；βはボーア（Ｂｏｈｒ）磁子；ω１およびωｓ（６５７ｗ１）は核スピンおよび電子スピンについてのラルモー（Ｌａｒｍｏｒ）角歳差周波数であり；ｒはイオン−核距離であり；Ａは超微細カップリング係数；τｃおよびτｅは各々双極子相互作用およびスカラー相互作用についての相関時間であり；そしてｈはプランク係数（Ｐｌａｎｃｋ’ｓ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）である］。例えば、Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｉ．，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｖｏｌ．９９，ｐ．５５９（１９５５）、およびＢｌｏｅｍｂｅｒｇｅｎ，Ｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．５７２、５９５（１９５７）、を参照されたい（これらの開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。
【０１６２】
幾つかの巨大粒子は多数の小さめな粒子よりも一層大きな効果をもってよく、それは主に相関時間が大きいためである。しかしながら鉄酸化物を非常に巨大に作成しようとするならば、毒性の増大が引き起こされてよく、かつ肺塞栓を生じることがあってよく、あるいは補体カスケード系が活性化されてよい。更には、粒子の総計サイズは、その縁もしくは外表面での粒子直径ほどには重要ではないと考えられている。磁化のドメインもしくは磁化率効果は粒子の表面から指数関数的に減衰する。一般的に言うと、双極子（空間を通しての）緩和メカニズムの場合には、この指数関数的減衰は常磁性双極子−双極子相互作用についてはｒ６依存性を示す。文字どうり解釈すると、常磁性表面から４オングストロームは離れている水分子は、同一の常磁性表面から２オングストローム離れている水分子よりも６４倍小さな影響を受けることになる。コントラスト効果を極大化することに関する理想的状況は、鉄酸化物粒子を可能な限り中空、柔軟、かつ大きく作成することであろう。これまでにはこの作業を達成するのは可能ではなく、そしてその作業に関する利益さえも認識されていなかった。小胞の内部もしくは外部表面を造影剤でコーティングすることにより、例えば一例では鉄酸化物ナノ粒子もしくは常磁性鉄のような個別の造影剤が比
較的小さな構造であったとしても、これらの造影剤の効果は非常に亢進されてよい。そうすることで造影剤は効果的には一層大きな球体として機能してよく、この場合には、磁化の効果的ドメインは小胞の直径により決定され、かつ小胞の表面で極大となる。これらの試薬により、耐屈曲性すなわちコンプライアンスという利点が与えられる。堅い小胞は肺もしくは他の臓器内にひっかかってしまうかもしれない一方で、これらの耐屈曲性小胞は毛細血管をもっと容易に通り抜ける。
【０１６３】
先に記載される耐屈曲性小胞とは対照的に、所定の条件下では例えばポリメチルメタクリレートのような実質的には不透過性高分子物質から小胞を製剤することが所望されてよい。この作業により一般的には実質的に不透過性かつ比較的非弾力性および砕け易くてよい小胞の形成がもたらされる。例えば超音波のような診断用画像化を必要とする態様では、そのような砕け易い小胞を含む造影剤は一般的には耐屈曲性のある小胞が提供してよい所望の反射能は提供されない。しかしながら超音波の出力電力を増加させることにより砕け易いマイクロスフェアを破裂させることができ、そのことにより超音波変換器により検出され得る音波放出が生じる。
【０１６４】
核医学画像化（ＮＭＩ）も、本発明の診断および治療方法の態様と組み合わせて用いられてよい。例えばＮＭＩは、先に論議される気体に加えてか、もしくはそのような気体の代わりに本組成物中に取り込まれてよい例えばＸｅ１３３のような放射活性気体を検出するのに用いてよい。このような放射活性気体は例えば血栓症を検出する際の使用のための小胞内に閉じ込められてよい。恐らく二官能性キレート誘導体は小胞の壁内にとりこまれ、そして得られる小胞はＮＭＩと超音波の両方に利用されてよい。この場合には例えばテクネチウム９９ｍもしくはインジウム１１１のような高エネルギーで高質量の核医学画像化用アイソトープを小胞の壁内に取り込ませることができる。全身用ガンマー操作型カメラをその後に用いて容易にインビトロでの小胞取り込みの領域の位置決定を行うことができる。所望される場合には超音波を用いて、例えば血管内の血塊の存在を確認することもでき、なぜなら超音波は一般的には核医学技術に比較すると高い解像度を提供するためである。ＮＭＩは更には血管の血栓症の領域を検出するために患者の身体全体をスクリーニングするのに用いられてよく、そして超音波を小胞の破壊および血塊の治療を促進するためにそれらの領域に局所的に適用することができる。
【０１６５】
光学的画像化のためには例えばアルゴンもしくはネオンのような光学的に活性な気体を本組成物内に取り込ませてよい。それに加え、例えばポルフィリン誘導体を初めとする例えば蛍光物質のような光学的活性物質が用いられてもよい。エラストグラフィー（ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）は、１ＭＨｚ以上の周波数を必要とし得る超音波と比較して例えば約６０ＫＨｚという一層低めの周波数を一般的には利用する画像化技術である。エラストログラフィーでは音響エネルギーは一般的には組織に適用され、そして組織の弾性がその後に決定されてよい。弾性が高い小胞を必要とする本発明の好ましい態様に関連し、例えば血塊へのそのような小胞の沈着はその血塊を取り巻く組織および／または空間の局所的弾性を増加させる。この上昇した弾性はその後にエラストグラフィーで検出されてよい。所望される場合には、エラストグラフィーを例えばＭＲＩおよび超音波のような他の画像化技術と組み合わせて用いることができる。
【０１６６】
気体および気体前駆体
本標的化された治療剤輸送系は恐らくは例えば不活性気体のような気体を含む。この気体は、特にその気体が担体内に閉じ込められる標的化された治療剤輸送系と組合わされて反射率が増加している標的化された治療剤輸送系を提供する。このことにより造影剤もしくは輸送用ビヒクルとしてのそれらの有効性が増加してよい。
【０１６７】
好ましい気体は不活性かつ生物適合性であり、そして例えば空気、希ガス（例えば、ヘ
リウム、ルビジウム、過分極キセノン、過分極アルゴン、過分極ヘリウム、ネオン、アルゴン、キセノン）、二酸化炭素、窒素、フッ素、酸素、硫黄ベースの気体（例えば、六フッ化硫黄および四フッ化硫黄）、フッ素化気体（例えば部分的にフッ素化された気体もしくは完全にフッ素化された気体を含む）、ならびにそれらの混合物を含む。例示的なフッ素化気体は例えばペルフルオロカーボン気体のようなフルオロカーボン気体、ならびにそれらの混合物を含む。例えば１７Ｏ２のような常磁性気体も安定化剤および小胞内に用いられてよい。
【０１６８】
所定の好ましい態様では、例えば空気もしくはペルフルオロカーボン気体のような気体は、例えばペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ペルフルオロオクチルイオダイド、ペルフルオロオクチルブロマイド、ペルフルオロトリプロピルアミン、およびペルフルオロトリブチルアミンのような液体ペルフルオロカーボンと組合わさる。
【０１６９】
本発明の組成物内に、ある気体物質の前駆体を取り込ませることも所望されてよい。このような前駆体はインビボで気体に転化されることができる物質を含み、好ましくはこの場合はこの気体前駆体および産生される気体は生物適合性である。
【０１７０】
気体が好ましいものの、液体ペルフルオロカーボンおよび液体ペルフルオロエーテルは融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）（例えば膜に融合する能力もしくは膜に結合する傾向）および有効性のような所望の特性を、得られる治療剤輸送系に付加する。
【０１７１】
中でも、本明細書に記載される組成物における使用に適する気体前駆体はｐＨに対して敏感な試薬である。これらの試薬は、例えば中性もしくは酸性のｐＨに露出される際に気体を放出することができる物質を含む。このようなｐＨ感受性試薬の例は、無機酸、有機酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される酸の塩を含む。炭酸（Ｈ２ＣＯ３）は適切な有機酸の例であり、そしてアミノマロン酸は適切な有機酸の例である。無機および有機酸を初めとする他の酸は、本開示を参照する際には当業者には容易に明らかになるであろう。
【０１７２】
塩から生じる気体前駆体は、アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。一層好ましくは塩は、炭酸塩、重炭酸塩、セスキ炭酸塩、アミノマロン酸塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される。塩から取得される適切な気体前駆体物質の例は例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸リチウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、セスキ炭酸アンモニウム、セスキ炭酸ナトリウム、アミノマロン酸ナトリウム、およびアミノマロン酸アンモニウムを含む。アミノマロネートは当該技術分野でよく知られており、そしてその製造法は例えばＩｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（３）：５６８−５７４（１９７４）；およびＳｔｅｌｍａｎｓｈｏｋら，Ｋｏｏｒｄｉｎａｔｓｉｏｎｎａｙａ  Ｋｈｉｍｉｙａ，３（４）：５２４−５２７（１９７７）に記載されており、これらの開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０１７３】
ｐＨの変化に対して感受性を示すことに加え、もしくはそうである代わりに、気体前駆体物質は温度の変化に感受性を示す化合物を含んでもよい。温度の変化に感受性を示す適切な気体前駆体の例はペルフルオロカーボンである。当業者は理解するであろうように、特別なペルフルオロカーボンは、液体組成物が最初に作成され、そしてその後に気体前駆体として用いられる場合には液体状態として存在してよい。別法ではペルフルオロカーボンは液体組成物が作成され、そしてその後に直接気体として用いられる場合には気体状態として存在してよい。ペルフルオロカーボンが液体もしくは気体として用いられるかどう
かは、一般的には液体／気体相転移温度、もしくは沸点に依存する。例えば好ましいペルフルオロカーボンであるペルフルオロペンタンは２９．５℃の液体／気体相転移温度（沸点）を有する。これは、ペルフルオロペンタンが一般的には室温（約２５℃）では液体であるが、通常の温度がペルフルオロペンタンの相転移温度以上である約３７℃である人体内では気体に転化することを意味する。従って通常の環境下ではペルフルオロペンタンは気体前駆体となる。更に別の例としてはペルフルオロペンタンの同族体、すなわちペルフルオロブタンおよびペルフルオロヘキサンがある。ペルフルオロブタンの液体／気体転移は４℃であり、そしてペルフルオロヘキサンのものは５７℃である。従ってペルフルオロブタンは一層気体に類似しているものの気体前駆体としては有用であり得、一方で沸点が比較的高いためにペルフルオロヘキサンは気体前駆体として有用であり得る。当業者に知られるように、ある物質の有効沸点はその物質が露出される圧力に関連してよい。この関係は理想気体の法則により例示される：ＰＶ＝ｎＲＴ［式中、Ｐは圧力、Ｖは容積、ｎは物質のモル数、Ｒは気体定数、そしてＴは温度である］。この理想気体の法則は圧力が上昇するに従って有効沸点も上昇することを示す。逆に、圧力が減少する際には、有効沸点は減少する。
【０１７４】
多種多様の物質を担体内に捕獲するための液体、気体、および気体前駆体として用いることができる。気体前駆体としては、その物質が適切な温度を通過する際に気体への相転移を受けることができることのみが必要となる。本発明における使用のための例示的気体および気体前駆体は例えば、ヘキサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレン、三フッ化ホウ素、１，２−ブタジエン、２，３−ブタジエン、１，３−ブタジエン、１，２，３−トリクロロ−２−フルオロ−１．３−ブタジエン、２−メチル−１．３−ブタジエン、ヘキサフルオロ−１，３−ブタジエン、ブタジエン、１−フルオロブタン、２−メチルブタン、ペルフルオロブタン、デカフルオロブタン、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、ペルフルオロ−１−ブテン、ペルフルオロ−２−ブテン、４−フェニル−３−ブテン−２−オン、２−メチル−１−ブテン−３−イン、硝酸ブチル、１−ブチン、２−ブチン、２−クロロ−１，１，１，４，４，４−ヘキサフルオロブチン、３−メチル−１−ブチン、ペルフルオロ−２−ブチン、２−ブロモブチルアルデヒド、硫化カルボニル、クロトンニトリル、シクロブタン。メチルシクロブタン、オクタフルオロシクロブタン、ペルフルオロシクロブテン、３−クロロシクロペンテン、ペルフルオロシクロペンタン、オクタフルオロシクロペンテン、シクロプロパン、ペルフルオロシクロプロパン、１，２−ジメチルシクロプロパン、１，１−ジメチルシクロプロパン、１，２−ジメチルシクロプロパン、エチルシクロ−プロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、３−エチル−３−メチルジアジリジン、１，１，１−トリフルオロ−ジアゾエンタン、ジメチルアミン、ヘキサフルオロジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス（ジメチル−ホスフィン）アミン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、オクタフルオロシクロペンテン、１．１−ジシクロフルオロエタン、ヘキサフルオロ−２−ブチン、オクタフルオロ−２−ブテン、ヘキサフルオロブタ−１，３−ジエン、２，３−ジメチル−２−ナルボルナン、ペルフルオロジメチルアミン、塩化ジメチルオキソニウム、１，３−ジオキソロアン−２−オン、４−メチル−１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１−トリフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロ−エチレン、１，１−ジクロロ−１，２−ジフルオロエチレン、１，１−ジクロロ−１，２，２，２−テトラフルオロエタン、１，２−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２，２−ペンタフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、１，１−ジクロロ−２−フルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２−テトラフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、クロロエタン、クロロペンタフルオロエ
タン、ジクロロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ニトロペンタ−フルオロエタン、ニトロソペンタフルオロエタン、ペルフルオロエチルアミン、エチルビニルエーテル、１，１−ジニトロエタン、１，１−ジクロロ−１，２−ジフルオロエタン、１，２−ジフルオロエタン、１，２−ジフルオロエチレン、メタン、塩化トリフルオロメタンスルホニル、塩化トリフルオロメタンスルフェニル、（ペンンタフルオロチオ）−トリフルオロメタン、フッ化トリフルオロメタンスルホニル、ブロモジフルオロニトロソメタン、ブロモフルオロメタン、ブロモクロロフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロジフルオロニトロメタン、クロロジニトロメタン、クロロフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジフルオロメタン、ジフルオロヨードメタン、ジシラノメタン、フルオロメタン、ペルフルオロメタン、ヨードメタン、ヨードトリフルオロメタン、ニトロトリフルオロメタン、ニトロソトリフルオロメタン、テトラフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、トリフルオロメタン、２−メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチルラクテート、メチルニトリル、メチルスルフィド、メチルビニルエーテル、ネオン、ネオペンタン、窒素、窒素酸化物、１，２，３−ノナデカントリカルボン酸２−ヒドロキシトリメチルエステル、１−ノネン−３−イン、酸素、１，４−ペンタジエン、ｎ−ペンタン、ペルフルオロペンタン、４−アミノ−４−メチルペンタン−２−オン、１−ペンテン、２−ペンテン（シスおよびトランス）、３−ブロモペント−１−エン、ペルフルオロペント−１−エン、テトラクロロフタル酸、２，３，６−トリメチル−ピペリジン、プロパン、１，１，１，２，２，３−ヘキサフルオロプロパン、１，２−エポキシプロパン、２，２−ジフルオロプロパン、２−アミノプロパン、２−クロロプロパン、ヘプタフルオロ−１−ニトロプロパン、ヘプタフルオロ−１−ニトロソプロパン、ペルフルオロプロパン、プロペン、ヘキサフルオロプロパン、１，１，１，２，３，３−ヘキサフルオロ−２，３−ジクロロプロパン、１−クロロプロパン、１−クロロプロピレン、クロロプロピレン−（トランス）、クロロプロパン−（トランス）、２−クロロプロパン、２−クロロプロピレン、３−フルオロプロパン、３−フルオロプロピレン、ペルフルオロプロピレン、ペルフルオロテトラヒドロピラン、ペルフルオロメチルテトラヒドロフラン、ペルフルオロブチルメチルエーテル、ペルフルオロメチルペンチルエーテル、プロピン、３，３，３−トリフルオロプロピン、３−フルオロスチレン、硫黄（ジ）−デカフルオリド（Ｓ２Ｆ１０）、硫黄−ヘキサフルオリド、２，４−ジアミノトルエン、トリフルオロアセトニトリル、過酸化トリフルオロメチル、硫化トリフルオロメチル、六フッ化タングステン、ビニルアセチレン、ビニルエーテル、キセノン、１−ブロモノナフルオロブタン、およびペルフルオロエーテルを含む。
【０１７５】
好ましい気体および気体前駆体は、水中での溶解度に乏しいが、幾つかの場合では例えば低分子量アルカンおよびそれらのフッ素化アナログのような脂溶性であってよい化合物である。好ましい気体および気体前駆体は例えば窒素、ペルフルオロカーボン、六フッ化硫黄、ペルフルオロエーテル化合物、およびそれらの組み合わせ物を含む。ペルフルオロカーボンとペルフルオロエーテルは好ましくは１〜４の炭素原子、および４〜１０のフッ素原子、一層好ましくはペルフルオロブタン（Ｃ４Ｆ１０）を有する。好ましい気体前駆体は一般的には約４〜８の炭素原子、一層好ましくは５〜６の炭素原子、そして約１２〜１５のフッ素原子を有する。ペルフルオロエーテルは一般的には一つもしくは二つの酸素原子、好ましくは一つの酸素原子を含む。好ましい気体前駆体はペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロトリプロピルアミン、臭化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロブチルメチルエーテル、ペルフルオロテトラヒドロピラン、ペルフルオロメチルテトラヒドロフラン、ペルフルオロメチルペンチルエーテル、ならびに４と６との間の炭素原子を含み、そして場合によっては一つのハロゲン化物原子、好ましくはＢｒ−１を含む他のペルフルオロエーテルアナログを含む。例えば構造ＣｎＦｙＨｘＯＢｒ［式中、ｎは１〜６との整数、ｙは０〜１３の整数、そしてｘは０〜１３の整数］を有する化合物は気体前駆体としては有用である。この式を有する有用な気体
の例は臭化ペルフルオロプロピルオキシルおよび２−ブロモオキシペルフルオロプロパンを含む。
【０１７６】
本発明における気体前駆体として有用なものは、約３０℃〜約６０℃の沸点をおそらくは有する部分的もしくは完全にフッ素化されたエーテルでもある。フッ素化エーテルは、一つもしくは複数の水素原子がフッ素原子により置換されているエーテルである。本発明の目的のためには、フッ素化エーテルは一般式ＣＸ３（ＣＸ２）ｎ−Ｏ−（ＣＸ２）ｎＣＸ３［式中、ＸはＦ、もしくはＸの内の少なくとも一つがフッ素であるとすると他のハロゲンである］を有する。一般的には、約４〜約６の炭素原子を含むフッ素化エーテルは本発明のために好ましい範囲内の沸点を有するであろうが、一層短めもしくは長めの鎖のフッ素化エーテルも適切な条件下で利用されてよい。例示的フッ素化エーテルは式ＣＦ３ＣＦ２ＯＣＦ２ＣＦ３、ＣＦ３Ｏ（ＣＦ２）２ＣＦ３、およびＣＦ３ＯＣＦ（ＣＦ３）２を有する化合物を含む。
【０１７７】
好ましい態様では気体はフッ素化気体を含み、これは一つもしくは一つを上回る数のフッ素原子を含む気体を含む。一つを上回るフッ素気体を含む気体が好ましく、ペルフルオロカーボン（完全にフッ素化されたフルオロカーボン）が一層好ましい。ペルフルオロカーボン気体は飽和、不飽和、もしくは環状であり、例えばペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロシクロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、およびそれらの混合物を含む。一層好ましくはペルフルオロカーボン気体はペルフルオロプロパンもしくはペルフルオロブタンであり、ペルフルオロプロパンが特に好ましい。別の好ましい気体は六フッ化硫黄である。更に別の好ましい気体はヘプタフルオロプロパンであり、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンおよびその異性体１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンを含む。異なる種類の気体の混合物（例えばペルフルオロカーボン気体と別の種類の気体（例えば空気もしくは窒素）との混合物）も本発明の組成物に用いることができる。先に例示される気体を含む別の気体は本開示を参照することで当業者には明らかになるであろう。
【０１７８】
気体前駆体物質は光活性化物質であってもよく、その一例はジアゾニウムイオンおよびアミノマロネートである。本明細書中この後に一層完全に論議されるように、所定の担体、特に小胞は、気体が標的組織で、もしくは担体上での音の作用により作成されるように製剤されてよい。気体前駆体の例は例えば米国特許第５，０８８，４９９号および第５，１４９，３１９号に記載されており、これらの開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。先に例示されるものに加え、他の気体前駆体は本開示を参照すれば当業者には明らかになるであろう。
【０１７９】
気体および／または気体前駆体は組成物の物理的性質には関係なく標的化された治療剤輸送系内に取り込まれるのが好ましい。従って、気体および／または気体前駆体は例えば一例ではエマルジョン、分散物、もしくは懸濁物のような界面活性剤内にランダムに、同様に例えばミセルおよびリポソームのように脂質から製剤される小胞を含む担体中に取り込まれてよいことが企図される。界面活性剤中の気体および／または気体前駆体の取り込みは、多数の方法の内のいずれかを用いることにより達成されてよい。例えば、脂質を基にする小胞の場合には気体充填小胞の製剤は、気体および／または気体前駆体ならびに一つもしくは複数の脂質を含む水性混合物を震盪もしくはそうでなければ撹拌により達成され得る。このことにより、気体および／または気体前駆体が被包される安定化された小胞の製剤が促進されてよい。
【０１８０】
それに加え、気体は界面活性剤の水性混合物中に直接気泡として送られてよい。別法で
は例えば米国特許第５，３５２，４３５号および第５，２２８，４４６号（これらの開示は全体が引用により本明細書にとりこまれる）に開示されるような気体取り込み法を用いることができる。カチオン性脂質組成物中へ気体および／または気体前駆体を取り込ませるのに適する方法は米国特許第４，８６５，８３６号にも開示されており、この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。他の方法は本開示に基づくと当業者には明らかになるであろう。好ましくは気体が、界面活性剤の添加後もしくは添加中、および／または本発明の組成物の形成中に界面活性剤中に取り込まれてよい。
【０１８１】
態様は、小胞組成物中に取り込まれた気体および／または気体前駆体を含み、ミセルおよびリポソームが好ましい。気体もしくは気体前駆体、またはその両方が被包される小胞は、それらがインビトロでの反射率を改善するという点では有利である。
【０１８２】
界面活性剤が脂質および場合によっては安定化用化合物から製剤されて、先に詳細に論議されるように安定な小胞の形成を促進することが好ましい。それに加え、その界面活性剤が同様にかなり安定な気体を含むことが好ましい。成句「かなり安定な気体」は水性媒質中での限定された溶解度および拡散性を有する気体を意味する。例示的なかなり安定な気体はペルフルオロカーボンを含み、なぜならそれらは一般的には水性媒質中では分散性に乏しくかつ比較的不溶性であるためである。従ってそれらの使用によりかなり安定な小胞の製剤が促進される。
【０１８３】
本明細書で利用される組成物は、それらの製造、製剤、および使用については温度、ｐＨ、光、およびエネルギー（例えば超音波）により液体もしくは固体状態から気体に変化するための活性化を受けることができる気体前駆体をも含んでよい。気体前駆体は減圧下で前駆体を貯蔵することにより気体にさせられてよい。例えば減圧下で貯蔵されたバイアルが、注入以前には予め形成された気体を作成するのに有用であるペルフルオロペンタンもしくはペルフルオロヘキサンのヘッドスペースを作成してよい。好ましくは気体前駆体は温度により活性化されてよい。これ以降には、通常の体温（３７℃）に比較的近い温度もしくはそれ以下の温度で液体から気体状態への相転移を受ける一連の気体前駆体、ならびに１０μｍの最大サイズの小胞を形成するのに必要であろう乳化された液滴のサイズを列挙する表が示される。
【０１８４】
【表４】
2010280678.tif 000012
【０１８５】
先に記載されるように、限定された溶解度の気体を用いることにより界面活性剤、特に脂質から製剤された小胞の利用性を至適化することが好ましい。成句「限定された溶解度」は、気体が、囲まれる水性媒質中での溶解度により小胞の外に拡散する能力を意味する。水性媒質中での可溶性が大きくなれば小胞内での気体に関する勾配ができるため、気体は小胞の外に拡散する傾向を有してよい。一方で水性環境中での溶解度が低くなれば小胞と界面との間の勾配が低下もしくは消失するため、小胞の外への気体の拡散は妨げられてよい。好ましくは小胞内に閉じ込まれる気体が酸素のものよりも低い溶解度、すなわち約３２容量部の水中の約１容量部の気体よりも低い溶解度を有する。例えば、Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｇａｓ  Ｄａｔａ  Ｂｏｏｋ，１９６６，Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．、を参照されたい。一層好ましくは小胞内に閉じ込まれる気体は空気のものよりも低い水中溶解度を保持し；そして更に一層好ましくは小胞中に閉じ込まれる気体は窒素のものよりも低い水中溶解度を保持する。
【０１８６】
所定の態様では、実質的に不透過性の高分子物質から小胞を製剤することが所望される
。これらの態様では一般的にはかなり不溶性が高い気体を利用することは不要である。例えば実質的に不透過性の高分子物質を含む安定な小胞は、例えば空気もしくは窒素のような、かなり高い溶解度を有する気体で製剤されてよい。
【０１８７】
製造方法
本発明の組成物は多種多様の適切な方法の内のいずれかを用いて製造されてよい。これらは、油、界面活性剤、治療剤、および気体を含む標的化治療剤輸送系、ならびに油、界面活性剤、治療剤、および気体前駆体を含む、気体前駆体充填小胞を初めとする標的化治療剤輸送系を必要とする態様について個別にこれ以降に記載される。標的化用リガンドは、ステロイドプロドラッグ、脂質、蛋白質、ポリマー、および／または補助用物質を初めとする、組成物作成に利用される一つもしくは複数の物質への結合により標的化治療剤輸送系の界面活性剤へ連結されてよい。
【０１８８】
製造法のいずれかの特別な理論もしくは複数の理論に縛られる意図はないものの、現在では一般的理論では油もしくはワックス中の親油性薬剤の溶解は、好ましくは２を上回る、更に一層好ましくは１０を上回るオクタノール／水分配係数を有するものから選択された薬剤を用いて行うことを必要とすると考えられている。最も好ましいのは２５を上回る分配係数を有する薬剤である。タキソールは９９の分配係数を有するよりすぐりの例である。
【０１８９】
親油性試薬が油と混合された後にはこれを単純に、一つもしくは複数の界面活性剤および安定化用媒質を含む水相内に添加もしくは分散させる。図５に示されるように、これは懸濁用媒質を含むバイアル中で行われてよい。このバイアルは予め選択された気体のヘッドスペースを有する状態で密封される。その後にこのバイアルを実施例に詳細が記載される要領で震盪する。この過程により好ましくは結晶化した薬剤および中央の気泡を含むリポスフェアがもたらされることが好ましく、図２を参照されたい。
【０１９０】
油／薬剤懸濁物を製造する過程では、溶媒が液体状態をとることが好ましい。薬剤結晶が完全に溶媒中に、好ましくは気体とも混合された後では、温度を低下させて結晶薬剤を捕獲している固形薬莢を形成するためにその油を乳化もしくは固化させてよい。好ましくは薬剤の量は０．０１重量％〜９０重量％の間である。一層好ましくは薬剤は油と比較して５重量％〜７５重量％の範囲にわたる。
【０１９１】
我々はバイアル中の気体のヘッドスペースは重要であることを見いだした。バイアルが歯科のアマルガメーター内でのように機械的に撹拌される際には、振動によりマイクロスフェアの崩壊および破壊がもたらされる。マイクロスフェアが振動する際にはマイクロスフェアを取り囲む油は不安定になり、被包されている薬剤の放出がもたらされる。薬剤放出はマイクロスフェアの音響活性によりモニターすることができる。減衰および後方散乱が減少する際には薬剤放出が確認される。別法では、低調波および超調波特性をモニターして薬剤放出を評価することができる。
【０１９２】
好ましくはバイアルが１０容量％と８０容量％との間の気体を、そして最も好ましくは約５０容量％〜６０容量％の気体を含む。ヘッドスペース内の気体は一般的には粒子サイズの有意に一層均一な分散をもたらす。例えばペルフルオロプロパンを導入させてあるカノーラ油の音響活性リポスフェアは、３．８７ミクロンの中央値サイズでかつ８５％の集団が８ミクロン以下である場合にはモード分散（ｍｏｄａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示した。それとは逆に、バイアルを気体ヘッドスペースなして充填した場合に作成された同じ組成物リポスフェアは、識別可能なピークサイズを持たない１〜１０ミクロンの間の粒子サイズでは比較的平坦な分布カーブを示した。
【０１９３】
この理念は図５および６に説明される。図５では油は一般的には水性媒質には非混和性である。水性相の密度に依存し、油／薬剤混合物は底に沈降するか、もしくは上部に浮遊し；たいていの場合には疎水性相の密度が高くなっている。
【０１９４】
図６は図５からのバイアルを含むＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ  Ｓｈａｋｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅを説明する。Ｃａｍｉｘの前にはバイアルＡおよびＢが示されており、この場合、Ａは震盪以前の混合物を示し、そしてＢは震盪後のものを示す。バイアルＢの内容物は均一泡状物として表される。液体層は、リポスフェアの中央に気体が取り込まれているためにバイアル内ではやや高さが高くなっている。
【０１９５】
多種多様のこのような脂質−不溶性薬剤が油内に取り込まれてよい。例えば、エトポシドもしくはブレオマイシンがダイズ油に添加され、そしてその後には例えばワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレンダーもしくはシルベルソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）ミキサー内で撹拌されてよい。ボールミルも用いられてよい。一つもしくは複数の乳化用試薬も油内に取り込まれてよく、それは例えばリン脂質、脂肪酸、ポリエチレングリコール、またはプルロン酸、Ｔｗｅｅｎ、およびＺｏｎｙｌなどの別の界面活性剤であり、その目的は結晶薬剤の均一懸濁物の製造を補助することである。別法では、薬剤はまず最初に例えば水、エタノール、もしくは低沸点共沸混合物のような水性溶媒中に溶解し、そして機械的撹拌下で油と混合されてよい。圧力を低下させ、そして／または温度を上昇させるにつれて溶媒は蒸発し、油もしくはワックス相内に薬剤の結晶が残る。同一過程を噴霧乾燥機内で達成してよい。
【０１９６】
一層細かいサイズの結晶薬剤エマルジョンも例えばミクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）内でのミクロ乳化により製造さる得る。粘着性油もしくは融点が約２０℃以上の油を用いて油中での結晶化薬剤の安定な分散物を製造することができることを銘記されたい。好ましくは油中の薬剤の最終形態をその後に図５に示される要領でバイアルに入れ、そしてアマルガメーター内で震盪する。
【０１９７】
多種多様の方法が、ミセルおよび／またはリポソームのような小胞を初めとする標的化治療剤輸送系の製造に利用することができる。これらの方法に含まれるものは例えば、震盪、乾燥、気体導入、および噴霧乾燥などである。小胞組成物を製造するのに適する方法は例えば米国特許第５，４６９，８５４号に記載されており、この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。小胞はゲル状態のままに留まる脂質から製造されることが好ましい。
【０１９８】
ミセルは、当業者には明らかになるであろう多種多様の通常のミセル製造方法の内のいずれか一つを用いて製造されてよい。これらの方法は典型的には、有機溶媒中での例えば脂質組成物のような界面活性剤の懸濁、溶媒の蒸発、水性媒質中での再懸濁、超音波処理、および遠心分離を必要とする。既述の方法および他の方法は例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ
ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８９：４１８−４２２（１９９）；Ｅｌ−Ｇｏｒａｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３０６：５８−６６（１９７３）；Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ，Ｓｈｉｎｏｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｇａｎａ，Ｔａｍａｍｕｓｈｉ  ａｎｄ  Ｉｓｅｊｕｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９６３）（特に、「Ｔｈｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅｌｌｓ」、Ｓｈｉｎｏｄａ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｐｐ．１−８８）；Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅｌｌａｒ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆｅｎｄｌｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９７５）、に論議されている。既述の刊行物の各々の開示は全体が引用により本明細書にとりこまれる。
【０１９９】
リポソームでは脂質化合物（一つもしくは複数）は単層もしくは二重層の形態をとってよく、そして単層もしくは二重層の脂質を用いて一つもしくは複数の単層もしくは二重層が形成されてよい。一つを上回る単層もしくは二重層の場合には、その単層もしくは二重層は一般的には同心となる。従って、脂質を用いてユニラメラー（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソーム（一つの単層もしくは二重層でできている）、オリゴラメラーリポソーム（二つもしくは三つの単層もしくは二重層でできている）、またはマルチラメラーリポソーム（三つを上回る単層もしくは二重層でできている）を形成してよい。
【０２００】
多種多様の方法を、リポソームを初めとする小胞の製造と組み合わせて用いることができる。従ってリポソームは、当業者には明らかになるであろう多種多様の通常のリポソーム製造方法の内のいずれか一つを用いて製造されてよく、それらには例えば溶媒透析、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレス、押し出し（凍結−解凍ありもしくはなし）、逆相蒸発、単純な凍結−解凍、超音波処理、キレート透析、均質化、溶媒注入、ミクロ乳化、自発形成、溶媒蒸発、溶媒透析、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）圧力セル技術、調節下でのセッケン透析、およびその他を含み、各々は様々な様式での小胞の製造を必要とする。例えば、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，５３：３７−４６（１９９０）を参照されたい（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。適切な凍結−解凍技術は例えば、１９８９年１１月８日に出願された国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号に記載される（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。凍結−解凍技術を必要とする方法はリポソームの製造法と組合わされることが好ましい。リポソームの製造法は例えば、食塩水溶液、リン酸緩衝水溶液、もしくは滅菌水のような溶液中で実施されてよい。リポソームはさらには震盪もしくはボルテックスミキサーでの撹拌を必要とする様々な過程により製造されてよく、この震盪もしくはボルテックスミキサーでの撹拌は例えば機械的震盪装（一例では、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ（商標）（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ，Ｌｙｏｎｓ、ＩＬ）、Ｄｅｇｕｓｓａ  ＡＧ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙにより販売されるＭｉｘｏｍａｔ、Ｅｓｐｅ  Ｆａｂｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒａｅｐａｒａｔｅ  ＧＭＢＨ＆Ｃｏ．，Ｓｅｅｆｅｌｄ，Ｏｂｅｒａｙ  Ｇｅｒｍａｎｙにより販売されるＣａｐｍｉｘ、Ｖｉｖａｄｅｎｔ，Ｌｅｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎにより販売されるＳｉｌａｍａｔ  Ｐｌｕｓ、もしくはＱｕａｙｌｅ  Ｄｅｎｔａｌ，Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄにより販売されるＶｉｂｒｏｓ）の使用により達成されてよい。例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＷｏｂｕｒｎｍＭＡ）のような通常のマイクロ乳化装置も利用されてよい。
【０２０１】
噴霧乾燥は気体充填小胞を製造するのに利用されてよい。この方法を利用することで例えば脂質のような安定化剤が水性環境内で予備混合され、そしてその後に噴霧乾燥されて気体充填小胞を製造してよい。小胞は所望の気体のヘッドスペース下に貯蔵されてよい。
【０２０２】
小胞組成物の製造の際の使用のために適用されてよい多くのリポソーム製造技術が例えば、米国特許第４，７２８，５７８号、第４，７２８，５７５号、第４，７３７，３２３号、第４，５３３，２５４号、第４，１６２，２８２号、第４，３１０，５０５号、および第４，９２１，７０６号；英国特許出願第ＧＢ  ２１９３０９５Ａ号；国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号；Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，８５８：１６１−１６８（１９８６）；Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，８１２：５５−６５（１９８５）；Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４９：６４−７７（１９８７）；Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，７５５：１６９−７４（１９８４）；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２２：４７−５５（１９８７）；国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号；およ
びＬｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２９−３１，５１−６７，および７９−１０８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９８４）に論議されており、これらの各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０２０３】
安定化剤、および特に小胞の形態を取る脂質組成物と組み合わせると、その脂質のゲルから液晶への相転移温度以下の温度で脂質組成物を製造することが有利であってよい。この相転移温度は脂質二重層がゲル状態から液晶状態へ転化するであろう温度である。例えば、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：２５１２−２５２１（１９７４）を参照されたい（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）。一般的にはゲル状態から液晶状態への相転移温度が高い脂質から製造される小胞はいずれかの所定の温度では不透過性が亢進している傾向にあると考えられる。飽和ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリンの主鎖溶解転移については、Ｄｅｒｅｋ  Ｍａｒｓｈ，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９９０）、ｐ１３９、を参照されたい。様々な脂質のゲル状態から液晶状態への相転移温度は当業者には容易に明らかになるであろうし、例えば、Ｇｒｅｆｏｒｉａｄｉｓ，ｅｄ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，１−１８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４）に記載される。以下の表は代表的脂質およびそれらの相転移温度の内の幾つかのものを列挙する。
【０２０４】
【表５】
2010280678.tif 000013
【０２０５】
例えば、Ｄｅｒｅｋ  Ｍａｒｓｈ，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉ
ｌａｙｅｒｓ，ｐ１３９（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９９０）を参照されたい。
【０２０６】
気体を含む安定化剤（例えば脂質）は、気体の存在下で、所望される場合には安定化剤を含む水性溶液を撹拌することにより製造され得る。用語「撹拌」は、水性溶液のいずれかの震盪運動を意味し、このことにより気体が局所的周囲の環境から水性溶液内に取り込まれる。この撹拌は、脂質のゲルから液晶相転移温度以下の温度で行われることが好ましい。溶液の撹拌に関わる震盪は、小胞組成物を初めとする脂質組成物、および特に気体充填小胞を含む小胞組成物の形成をもたらすに十分な力のものであることが好ましい。この震盪は例えばボルテックスミキサーによるもののような渦巻き運動、横揺れ、もしくは上下運動によるものであってよい。異なる種類の動きが組合わされてよい。更には、震盪は、水性脂質溶液を保持する容器を震盪させることによるか、または容器そのもの自体を震盪させることなく容器内の水性溶液を震盪させることにより生じてよい。
【０２０７】
震盪は手動もしくは機械により生じてよい。用いられてよい機械的震盪は例えば、震盪台（一例ではＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｅｒｒｉｔｏｓ，ＣＡ）震盪台）、ならびに本明細書のこれ以降に記載される震盪用器具の内のいずれかのものを含み、Ｃａｐｍｉｘ（Ｅｓｐｅ  Ｆａｂｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒａｅｐａｒａｔｅ  ＧＭＢＨ＆Ｃｏ．，Ｓｅｅｆｅｌｄ，Ｏｂｅｒａｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が好ましい。震盪もしくはボルテックスミキサーによる混合の所定の様式を用いて好ましいサイズ範囲内の小胞を作成することができることを見いだした。震盪が好ましく、そしてその震盪をＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ機械的震盪機を用いて実施することが好ましい。好ましい方法に従うと、往復運動を用いて脂質組成物、および特に小胞を作成することが好ましい。その動作が弓形の形態での往復であることが更に一層好ましい。往復の速度、ならびにその弓形は小胞の形成に関連して特に重要であることが企図される。好ましくは往復もしくは振動の完全周期の数は１分間約１０００〜約２０，０００である。一層好ましくは往復もしくは振動の数は約２５００〜約８０００であり、往復もしくは振動が約３３００〜約５０００であることが更に一層好ましい。当然のことながら振動の数は撹拌される内容物の量に依存し得る。一般的に言うと量が多ければ少ない振動で済む。震盪を作成する別の方法は高速もしくは高圧下で発射される気体の作用を含む。
【０２０８】
大容量の水性溶液に関しては、力の総量はそれに対応して増加するであろうことが好ましいとして理解されるであろう。激しい震盪は１分あたり少なくとも約６０回の震盪運動として特定され、そして好ましい。１分当たりに約６０回〜約３００回の回転でのボルテックスミキサーでの混合が一層好ましい。１分当たりに約３００回〜約１８００回の回転でのボルテックスミキサーでの混合が更に一層好ましい。
【０２０９】
先に記載される単純震盪方法に加え、一層巧みな方法も利用することができる。そのような巧みな方法は例えば、液晶震盪気体取り込み法および真空乾燥気体取り込み法を含み、それらは米国特許第５，４６９，８５４号、第５，５８０，５７５号、第５，５８５，１１２号、および第５，５４２，９３５号、ならびに１９９４年９月１６日に出願された米国特許第０８／３０７，３０５号に記載されるようなものであり、これらの各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。乳化過程も本発明に従う組成物の製造の際に利用されてもよい。このような乳化過程は例えば、Ｑｕａｙ、米国特許第５，５５８，０９４号、第５，５５８，８５３号、第５，５５８，８５４号、および第５，５７３，７５１号に記載されており、これら各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。噴霧乾燥も気体前駆体充填小胞を製造するために利用されてよい。この方法を利用すると、脂質は水性環境中で予め混合され、そしてその後に噴霧乾燥されて気体前駆体充填小胞を製造してよい。この小胞は所望される気体のヘッドスペース下で保存されてよい。多数の異なる技術の内のいずれかを用いることができるものの、本発明に利用される小胞組
成物は震盪技術を用いて製造されることが好ましい。好ましくは震盪技術は、例えばＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ，Ｏｂｅｒａｙ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のような機械的震盪用具での、例えば１９９３年１１月３０日に出願された米国特許第１６０，２３２号に開示される（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）技術を用いる撹拌を必要とする。それに加え、詳細はこれ以降に記載される押し出しおよび滅菌過程の後に、撹拌もしくは震盪により、残りの溶液中には残存性無水脂質相を実質的には全く含まないか、もしくは最低限の量のみを含むことができる小胞組成物が提供されてよい（Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２（１９６５））。他の製造技術は米国特許第５，２０５，２９０号に記載されるものを含み、この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０２１０】
泡状物は本発明の追加的態様を構成する。泡状物には、薬剤の局所輸送、組織増強、創傷治癒、および腹膜癒着のためのインプラントの際の生物医学的適用法が見いだされている。リン脂質泡状物は、リン脂質の濃度を増加させること、および例えばセチルアルコールのような物質、界面活性剤、シメチコン、または例えばメチルセルロースのようなポリマーと混合することにより作成され得る。フッ素化リン脂質も、安定で長期持続性の泡状物を作成するのに用いられてよい。最も安定な泡状物は一般的には、重合化されたかもしくは架橋結合される（例えば重合可能なリン脂質のような）物質から製造される。泡形成は表面張力減少の作用でもあるため、洗剤は一般的には有用な泡形成試薬である。
【０２１１】
泡状物は気体充填小胞を震盪することによっても作成でき、この場合泡状物は水性溶液の上端に出現し、そしてこれを泡状物の形成の際の水性溶液の容積の減少と連動する。好ましくは、泡状物の最終容積は安定化用水溶液の初期容積の少なくとも２倍であり；一層好ましくは泡状物の最終容積が水性溶液の初期容積の少なくとも約３倍であり；更に一層好ましくは泡状物の最終容積が水性溶液の初期容積の少なくとも約４倍であり；そして最も好ましくは安定化剤水溶液の全てが泡状物に転化することである。
【０２１２】
震盪時間の必要期間は泡状物の形成の検出により決定されてよい。例えば、５０ｍｌの遠心管内の１０ｍｌの液体溶液を約１５〜２０分間か、もしく気体充填リポソームの粘度が十分粘着になり、かき回した際には側壁にもはやまつわりつかないようになるまでボルテックスミキサーにて撹拌してよい。この際、泡状物は気体充填リポソームを含む溶液を３０〜３５ｍｌのレベルにまで隆起させてよい。
【０２１３】
好ましい泡状物レベルを形成するために必要とされる脂質の濃度は用いられる脂質の種類に依存して変化するであろうし、そして本開示を参照すれば当業者により容易に決定されてよい。例えば好ましい態様では、本発明の方法に従う気体充填リポソームを形成するのに用いられる１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の濃度は約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ食塩水溶液である。好ましい態様で用いられるジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）の濃度は約５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ食塩水溶液である。
【０２１４】
特に２０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＰＰＣは震盪の際には懸濁物単独の容積と比較すると４倍大きな懸濁物および捕獲気体の総容積を生じる。１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＳＰＣは震盪の際にはいずれかの液体懸濁物容積を全く含まない総容積を生じ、そして泡状物を全体に含む。
【０２１５】
マイクロ乳化は泡状物前駆体のエマルジョンを製造する一般的方法である。温度上昇および／または圧力低下により、液体中に気泡が発生する際には泡状物が形成されるであろう。先に記載されるように、泡状物は例えば界面活性剤、洗剤、もしくはポリマーにより安定化されてよい。
【０２１６】
気体充填小胞のサイズは所望される場合には多種多様の方法により調節することができ、それには例えば、マイクロ乳化、ボルテックス撹拌、押し出し、濾過、超音波処理、均質化、反復凍結および解凍周期、特定されたサイズの孔を通過させる圧力下での押し出し、および類似の方法を含む。本明細書に記載される方法に従って製造される気体充填小胞は、約１μｍを下回るサイズから約１００μｍを上回るサイズにまでわたる範囲であり得る。それに加え、以下に詳細が記載される押し出しおよび滅菌工程の後には撹拌および震盪により、溶液の残存物中に無水脂質相を実質的には全く生じないかもしくは最小値のみを生じる小胞組成物が提供される。（Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：２３８−２５２（１９６５））。所望される場合には、本発明の小胞はそのサイズの更なる改変を加えることなく、そのまま用いられてよい。静脈内使用のためには小胞は好ましくは約３００μｍを下回る直径、および一層好ましくは約１２μｍを下回る直径を有する。例えば一例では癌組織のような所定の組織への結合を初めとする標的化された静脈内使用のためには、小胞は例えば約１００ｎｍの直径を下回るように有意に小さめであり得る。腸もしくは胃腸使用のためには小胞は例えば最高でミリメートルレベルのサイズのように有意に大きめであり得る。好ましくは小胞は約２μｍ〜約１００μｍの直径を有するようにサイズ設定される。
【０２１７】
気体充填小胞はフィルターを通す押し出しという単純な過程によりサイズ設定され、この場合、フィルターの孔サイズが得られる気体充填小胞のサイズ分布を調節する。例えば１０μｍのフィルターおよびその後の８μｍｌのフィルターというように、２枚もしくはそれを上回る枚数のカスケード状もしくは重ね合わせた一連のフィルターを用いることにより、気体充填小胞を、約７〜９μｍの非常に狭いサイズ分布を有するように選択することができる。濾過後、これらの気体充填小胞は２４時間にわたり安定であり続けることができる。
【０２１８】
サイズ設定もしくは濾過段階は、例えば組成物が使用前に滅菌バイアルから取り出される際にフィルター組み立て物の使用により達成されてよく、もしくは一層好ましくはフィルター組み立て物が使用中に注射器内に取り込まれてよい。小胞のサイズ設定の方法はその後には、一本の筒、少なくとも一枚のフィルター、および一本の注射針を含む注射器を用いることを含み；そして抽出段階により実施され、この段階は筒と注射針との間で注射器にはめ込まれたフィルターを通して筒から小胞を押し出し、そのことにより患者に投与される前に小胞のサイズを設定することを含む。この抽出段階は更には小胞を注射器内に引き込むことをも含んでよく、この注射器ではフィルターは注射器内への侵入の際に小胞のサイズ設定をする目的では同一の様式で機能する。別の方法は、幾つかの別の方法により既にサイズ設定されている小胞でそのような注射器を充填することであり、この場合にはフィルターは今度は所望のサイズ範囲内によりある、もしくは所望の最大サイズのものである小胞のみが注射器からの押し出しによりその後に確実に投与されるように機能する。所定の好ましい態様では、小胞組成物は熱滅菌もしくはフィルター滅菌され、そして震盪以前にフィルターを通して押し出される。一般的に言うと、気体を含む小胞組成物は熱滅菌されてよく、そして気体前駆体を含む小胞組成物はフィルター滅菌されてよい。気体充填小胞がいったん形成されると、それらは先に記載される要領で濾過されてよい。気体および／または気体前駆体充填小胞の形成以前にこれらの段階を実施することで、患者に対する投与の準備が調った滅菌気体および／気体前駆体充填小胞が提供される。例えば一例ではバイアルもしくは注射器のような混合用容器を濾過した脂質組成物で満たしてよく、そしてその組成物を例えばオートクレーブにより混合容器内で滅菌してよい。気体は滅菌容器を震盪することにより気体充填小胞を形成させる目的で組成物内に染み込ませてよい。好ましくは滅菌容器はフィルターが装着されており、このことにより気体充填小胞は患者に接触する以前にフィルターを通過する。
【０２１９】
フィルターを通す脂質化合物の溶液の押し出し段階は、いずれかの乾燥物質を破壊し、そして水和のために一層大きな表面領域を露出することにより非水和物質の量を減少させる。好ましくはフィルターは約０．１〜約５μｍの、一層好ましくは約０．１〜約４μｍの、更に一層好ましくは約０．１〜約２μｍの、そして更に一層好ましくは約１μｍの孔径を有する。一般的には所望されない非水和化合物は不均一サイズの無定型凝集塊として現れる。
【０２２０】
滅菌工程は、例えば超音波もしくはＣＴを初めとする診断用画像化のために患者に容易に投与できてよい組成物を提供する。所定の好ましい態様では、滅菌は熱滅菌により、好ましくは少なくとも約１００℃の温度での溶液のオートクレーブにより、そして一層好ましくは約１００℃〜約１３０℃での、更に一層好ましくは約１１０℃〜約１３０℃での、更に一層好ましくは約１２０℃〜約１３０℃での、そして更に一層好ましくは約１３０℃でのオートクレーブにより達成されてよい。好ましくは加熱は少なくとも約１分間、一層好ましくは約１〜約３０分間、更に一層好ましくは約１０〜約２０分間、そして更に一層好ましくは約１５分間生じる。
【０２２１】
所望される場合には先に概要が記載される押し出しおよび加熱段階は逆行して行われてよいか、あるいはその２段階の内のひとつのみを用いてよい。滅菌の他の様式を用いてもよく、これには例えばガンマー放射線に対する露出が含まれる。
【０２２２】
先に記載される態様に加え、活性化の際には例えば高温、異なるｐＨ、光り、もしくは温度に露出させることにより例えば液体（これには小胞内に捕獲されている液体が含まれる）から気体への相転移を受けて本明細書に記載される気体充填小胞を作成するために膨潤する小胞中に含まれる気体前駆体を製剤することができる。この技術は詳細が１９９３年１１月３０日に出願された（米国）特許第０８／１５９，６８７号、および米国特許第５，５４２，９３５号に記載されており、これらの開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０２２３】
気体前駆体を活性化させる好ましい方法は高温への露出による。活性化もしくは転移温度、およびそのような用語は気体前駆体の沸点を意味し、そして気体前駆体の液体から気体への相転移が生じる温度である。有用な気体前駆体は、約−１００℃〜約７０℃の範囲に沸点を有するそのような物質である。活性化温度は各々の気体前駆体に特別である。約３７℃もしくはおおよそのヒト体温の活性化温度は本発明の文脈中での気体前駆体には好ましい。従って好ましい形態では、液体の気体前駆体は約３７℃もしくはそれ以下で気体になるように活性化される。気体前駆体は本発明の方法における使用のためには液相もしくは気相をとってよい。
【０２２４】
気体前駆体充填小胞を製造する方法は、気体前駆体の沸点以下で実施されてよく、このことにより液体が例えば小胞に取り込まれる。それに加え、この方法は気体前駆体の沸点で実施されてよく、このことにより気体が例えば小胞内に取り込まれる。低い沸点温度を有する気体前駆体については液体前駆体が低い温度に冷却されたマイクロフルイダイザーを用いて乳化されてよい。沸点は更には液体形態をとる前駆体を利用するために液体媒質中で溶媒を用いることで低下されてよい。更には、温度が全工程を通して上昇し、そのことにより工程は液体としての気体前駆体で開始し、そして気体で終了する方法が実施されてよい。
【０２２５】
気体前駆体は標的組織もしくは液体内ではインサイチューで、患者もしくは動物への挿入の際にはインビボで、使用前、貯蔵中、もしくは製造中に気体を形成するように選択されてよい。温度により活性化された気体前駆体充填小胞を製造する方法は気体前駆体の沸点以下の温度で実施されてよい。この態様では気体前駆体は小胞内に閉じ込められるため
、相転移は製造中には生じない。その代わりに、気体前駆体充填小胞は気体前駆体の液相で製造される。相転移の活性化は温度がその前駆体の沸点を越えるいずれかの点で生じてよい。更には液体の気体前駆体の液滴での液体の量を知ることにより、気体状態を閉じ込めた際の小胞のサイズが決定されてよい。
【０２２６】
別法では気体前駆体は使用前に予め形成される安定な気体充填小胞を作成するのに利用されてよい。この態様では気体前駆体は、各々の気体前駆体の液体−気体相転移温度以下の温度で液体組成物を保持する容器に添加される。温度が上昇し、そしてエマルジョンが気体前駆体と液体溶液との間に形成される際には、この気体前駆体は液体から気体状態への転移を受ける。この加熱および気体形成の結果、気体前駆体の気体、周囲の気体（例えば空気）を閉じ込めるか、あるいは気体状態の気体前駆体と周囲の空気とを同時に閉じ込める気体充填小胞が形成されるように、液体混合物上のヘッドスペース内の空気の代わりにこの気体が入りこむ。この相転移を造影剤の至適混合および形成に用いることができる。例えば、気体前駆体、すなわちペルフルオロブタンを液体小胞内に閉じ込めることができ、そして温度がペルフルオロブタンの沸点（４℃）以上に上昇する際にはペルフルオロブタン気体は小胞内に閉じ込められる。従って気体前駆体はインビボで気体充填小胞を形成するように選択できるか、あるいは製造工程中、保存の際、もしくは使用前の幾らかの時期にインサイチューで気体充填小胞を産生するように設計されてよい。水
槽、超音波発生装置、もしくは密閉されたコックの栓に対して注射器のプランジャーを引くことによる流体力学的活性化を用いて、静脈注射前に温度−感受性気体前駆体からの標的化気体充填小胞を活性化させてよい。
【０２２７】
本発明の更に別の態様として、液体状態をとる気体前駆体を水性エマルジョンに予め作成することにより、小胞の最大サイズは、いったん気体状態からの転移が実現したら、理想気体の法則を用いることにより推定することができる。気体前駆体から気体充填小胞を作成する目的では、気相はすぐさま形成されるものと想定され、そして一般的には水性の性質をもつ液体内への拡散のために涸渇してしまう新規に形成される小胞内の気体は実質的には全く存在しない。従って、エマルジョン内の既知の液体容量から気体充填小胞のサイズに対する上限を検出することができるであろう。
【０２２８】
本発明の態様では、特定サイズの液体液滴を含む脂質組成物と気体前駆体の混合物が、例えば気体前駆体の沸点のような特定温度に達する際にはその液滴が特定サイズの気体充填小胞に膨張するように製剤されてよい。特定サイズは実際のサイズの上限を表し、なぜなら理想気体の法則は、液体への気体拡散、大気への気体の喪失、および加圧の効果のような因子を計算することができないためである。
【０２２９】
液体から気体状態への転移の際の気泡の容積の増加を計算するために用いることができる理想気体の法則は以下のとおりである：
ＰＶ＝ｎＲＴ
［式中：Ｐは大気中の圧力（ａｔｍ）；Ｖはリットルでの容積（Ｌ）；ｎは気体のモル数；Ｔはケルビン（ｄｅｇｒｅｅ  Ｋｅｌｖｉｎ）での温度（Ｋ）；そしてＲは理想気体定数（２２．４Ｌ−ａｔｍ／Ｋモル）］。
【０２３０】
液体混合物中の液体の容積、密度、および温度の知識があれば、液体前駆体の例えばモル数での量および容積は計算されてよい（これは気体に転化する際には既知の容積の小胞へと膨潤するであろう）。算出容積は、気体充填小胞への即時膨潤および膨潤期間にわたる気体の無視可能な拡散を当然のことと考えると、気体充填小胞のサイズの上限を反映するであろう。
【０２３１】
従って、混合物中で液体状態をとる前駆体の安定化のためには（この場合、前駆体液滴
が球状である）、前駆体液敵の容積は以下の等式により決定されてよい：容積（球状小胞）＝４／３  πｒ３［式中、ｒは球の半径である］。
【０２３２】
いったん容積が予想され、そして所望される温度での液体の密度が分かれば、液滴中の液体気体前駆体の量が決定されてよい。一層記述的な用語では、以下を適用することができる：
Ｖｇａｓ＝４／３π（ｒｇａｓ）３
理想気体の法則により
ＲＶ＝ｎＲＴ
置換により
Ｖｇａｓ＝ｎＲＴ／Ｐｇａｓ
もしくは、
（Ａ）  ｎ＝４／３［πｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ
量  ｎ＝４／３［πｒｇａｓ３Ｐ／ＲＴ］・ＭＷｎ
液体容積に転換し直すと
（Ｂ）  Ｖｌｉｑ＝［４／３［πｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ］・ＭＷｎ／Ｄ］
［式中、Ｄは前駆体の密度である］。
液体液滴の直径について解くと、
（Ｃ）  直径／２＝［３／４π［４／３・［πｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ］ＭＷｎ／Ｄ］１／３
これを以下のように要約する、
直径＝２［［ｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ］ＭＷｎ／Ｄ］］１／３。
【０２３３】
本発明の方法における使用のための所望されるサイズの小胞を製造する更に別の方法として、そして液体液滴の容積、および特に半径が分かっている場合には、適切なサイズのフィルターを用いて気体前駆体を適切な直径の球へとサイズ設定することができる。
【０２３４】
代表的な気体前駆体は、例えば１０μｍの直径のような特定されるサイズの小胞を形成するのに用いられてよい。この例では小胞はヒトの血流中で形成され、従って典型的温度は３７℃もしくは３１０Ｋであろう。１大気圧の圧力下では、そして（Ａ）における等式を用いると、１０μｍ直径の小胞の容積を充填するのには７．５４×１０−１７モルの気体前駆体が必要となる。
【０２３５】
先に計算された量の気体前駆体、および分子量が７６．１１、沸点が３２．５℃、そして２０℃での密度が０．７７８９ｇ／ｍＬの１−フルオロブタンを用いると、更なる計算により、５．７４×１０−１５グラムのこの前駆体が１０μｍの小胞に必要とされることが予想される。更なる外挿を行い、そして密度が分かっているとすると、式（Ｂ）により更に、８．４７×１０−１６ｍＬの液体前駆体が１０μｍの上限の小胞を形成するのに必要とされることが予想される。最終的には式（Ｃ）を用い、例えば半径０．０２７２μｍもしくは対応直径０．０５４４μｍの液滴を含むエマルジョンである混合物が形成されて、１０μｍ小胞の上限をもつ気体前駆体充填小胞が作成される。
【０２３６】
この特別なサイズのエマルジョンは、適切なサイズのフィルターの使用により容易に達成されるであろう。それに加え、特定されたサイズの気体前駆体液滴を形成するのに必要なフィルターのサイズにより理解されるように、フィルターのサイズもいずれかの可能な細菌混入物を除去するのに十分であり、そしてそのため同様に滅菌濾過としても利用することができる。
【０２３７】
気体充填小胞を製造するためのこの態様は、温度により活性化される全ての気体前駆体に適用されてよい。事実、溶媒系の凝固点の落ち込みにより、０℃以下の温度で液体−気
体相転移を受ける気体前駆体の使用が可能になる。溶媒系は気体前駆体の懸濁用の媒質を提供するように選択できる。例えば、緩衝化食塩水中に混和性を示す２０％プロピレングリコールは、水単独の凝固点をはるかに下回る凝固点降下を呈する。プロピレングリコールの量を増加することによるか、もしくは塩化ナトリウムのような物質を添加することにより凝固点を更に引き下げることができる。
【０２３８】
適切な溶媒系の選択は同様に物理的方法により決定されてよい。本明細書内に溶質として引用される物質が固体であれ液体であれ、例えば水ベースの緩衝液中に溶解される場合には、凝固点は溶液の組成に依存する量により低下する。従ってＷａｌｌにより定義されるように、溶媒の凝固点降下を以下の等式により表すことができる：
Ｉｎｘａ＝Ｉｎ（１−ｘｂ）＝ΔＨｆｕｓ／Ｒ（１／Ｔ０−１／Ｔ）
［式中、ｘａは溶媒のモル分率であり；ｘｂは溶質のモル分率であり；ΔＨｆｕｓは溶媒の融解熱であり；そしてＴ０は溶媒の通常の凝固点である。
【０２３９】
溶媒の通常の凝固点は、等式を解くことにより取得することができる。ｘｂがｘａに比較して小さい場合には、先の等式は以下のように書き直されてよい：
ｘｂ＝ΔＨｆｕｓ／Ｒ［Ｔ−Ｔ０／Ｔ０Ｔ］≒ΔＨｆｕｓΔＴ／ＲＴ０２
先の等式は、温度の変化ΔＴはＴ２に比べて小さいと仮定している。この等式は重量モル濃度ｍ（溶媒の１０００グラムあたりの溶質のモル数）に関して溶質の濃度を表現することにより簡潔にすることができる。従って等式は以下のように書き換えられる。
Ｘｂ＝ｍ／［ｍ＋１０００／ｍａ］≒ｍＭａ／１０００
［式中、Ｍａは溶媒の分子量である］。
従って、分数ｘｂについて置換すると：
ΔＴ＝［ＭａＲＴ０２／１０００ΔＨｆｕｓ］ｍ
もしくは
ΔＴ＝Ｋｆｍ
［式中、Ｋｆ＝ＭａＲＴ０２／１０００ΔＨｆｕｓ、
Ｋｆはモル凝固点であり、そして１体気圧での水についてのモル濃度の単位当たり１．８６度に等しい］となる。先の等式を用いて気体前駆体充填小胞の溶液のモル凝固点が正確に決定されてよい。従って、先の等式を凝固点降下を評価するため、および適切な値にまで溶媒凝固温度を下げるのに必要な液体もしくは固体の溶質の適切な濃度を決定するのに適用し得る。
【０２４０】
温度により活性化される気体前駆体充填小胞を製造する方法は：
（ａ）気体前駆体と所望される場合には追加的物質（例えば安定化剤、増粘剤、および／または分散剤を初めとするもの）との混合物をボルテックスミキサーにかけるおよび／または震盪すること。場合によって用いられるこの方法の変法は、ボルテックスミキサーでの撹拌もしくは震盪以前のオートクレーブ処理；気体前駆体の水性混合物の加熱；混合物／懸濁物を含む容器のガス抜き；気体前駆体充填ベシルの震盪もしくはその自発的な生成の促進、および気体前駆体充填小胞の懸濁物の冷却；ならびに約０．２２μｍのフィルターを通す気体前駆体水性懸濁物の押し出しを含む。別法ではフィルター処理は小胞のインビボ投与の間に実施されてよく、そのため約０．２２μｍのフィルターが用いられる；
（ｂ）気体前駆体の水性混合物が撹拌により乳化され、そして患者への投与以前に加熱されて例えば小胞を形成するマイクロ乳化；
（ｃ）撹拌ありもしくは無しの状態での混合物中の気体前駆体の加熱（このことにより密度の低い気体前駆体充填小胞は膨張および容器内の他の小胞と置き換わることにより溶液の上部に浮遊する）および空気を放出するための容器のガス抜き；ならびに
（ｄ）既述の方法の内のいずれかで気体前駆体の水性懸濁物を保持する目的で密封容器を用い、そして気体前駆体の相転移温度以下の温度に懸濁物を維持し、その後に相転移温度以上に温度を上昇させる目的で場合によっては震盪しながらオートクレーブにかけるか
、あるいは気体前駆体小胞を自発的に形成させ（このことにより密封容器内で膨潤した気体前駆体は容器内圧を上昇させる）、そして気体充填小胞懸濁物を冷ますこと（この後に震盪が行われてもよい）、
を含む。
【０２４１】
凍結乾燥は水および有機物質を震盪取り込み方法の前に除去するのに有用である。乾式取り込み方法を用いて小胞から水を除去してよい。乾燥される小胞（ｄｒｉｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（すなわち、乾燥前）中に気体前駆体を予め閉じ込めてから暖めることにより、気体前駆体が膨潤して小胞を充填してよい。気体前駆体を用い、乾燥される小胞を真空に供した後に、それらを充填することもできる。乾燥される小胞はゲル状態から液晶への（転化）温度以下の温度に維持されるため、乾燥用チェンバーを気体状態をとる気体前駆体でゆっくりと充填することができる。例えば、ペルフルオロブタンを用いて４℃（ペルフルオロブタンの沸点）以上の温度で乾燥される小胞を充填することができる。
【０２４２】
温度により活性化される気体前駆体充填小胞を製造するための好ましい方法は、気体前駆体の液体状態から気体状態への相転移温度以下の温度での気体前駆体の存在下で脂質化合物を有する水溶液を震盪することを含む。これは好ましくは、その脂質のゲル状態から液晶状態への相転移温度以下の温度で実施される。その後にこの混合物を、気体前駆体の液体状態から気体状態への相転移温度以上の温度に加熱し、このことにより前駆体が揮発および膨潤する。その後に加熱を停止し、そしてその後に混合物の温度を気体前駆体の液体状態から気体状態への相転移温度以下に低下させる。混合物の震盪は加熱段階中、もしくはその後に混合物が冷まされた後に行われてよい。
【０２４３】
気体前駆体充填小胞を製造するための他の方法は、例えば脂質および気体前駆体の水溶液の震盪、および得られる気体前駆体充填小胞の分離を含む。
【０２４４】
従来技術の通常の水充填リポソームは、それらを作成するのに用いられる脂質の相転移温度以上の温度で日常的に形成され、なぜならそれらは一層柔軟性に富み、そしてそのため液晶状態をとる生物系には有用であるためである。例えば、Ｓｚｏｋａ  ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）７５：４１９４−４１９８、を参照されたい。それとは対照的に、本明細書に記載される所定の好ましい態様に従って作成される小胞は気体前駆体で充填されており、そのことにより一層大きな柔軟性が与えられ、なぜなら気体形成後の気体前駆体は水溶液と比較すると圧縮性およびコンプライアンスが一層高くなっているためである。
【０２４５】
本発明により企図される方法は、温度により活性化される気体前駆体の存在下で脂質を含む水溶液を震盪することを提供する。好ましくはその震盪が、例えば約３０分、そして好ましくは約２０分以内、そして一層好ましくは約１０分以内の短期間のうちに泡状物が形成されるような十分な力のものである。震盪はマイクロ乳化、マイクロフルイダイゼーション、回転性撹拌（例えばボルテックスミキサーによる撹拌）、左右方向もしくは上下方向の動作を含む。液体状態をとる気体前駆体の添加の場合には、超音波を先に記載される震盪方法に加えて用いてよい。更には違う種類の動作を組み合わせてよい。更には震盪は、脂質水溶液を保持する容器を震盪することによるか、もしくは容器そのもの自体は震盪させずに容器内の水溶液を震盪させることによりもたらされてよい。更には震盪は手動、もしくは機械によりもたらされてよい。用いられてよい機械震盪は例えば、本明細書のこれまでに記載される機械震盪を含み、Ｅｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ，Ｏｂｅｒａｙ  Ｇｅｒｍａｎｙ）が好ましい。震盪をもたらすための他の手段は、高速もしくは高圧下で発せられる気体前駆体の作用を含む。
【０２４６】
本明細書に記載される方法に従うと、例えば空気のような気体も局所的周囲の気圧によ
り提供されてもよい。局所的周囲の圧力は密封容器内の圧力、ならびに外部環境を含むことができる。別法では例えば気体を、脂質水溶液を有する容器内により注入するか、もしくはそうでない場合にはそういった容器に添加するか、あるいは空気以外の気体をもたらす目的で脂質水溶液自体内に注入もしくは添加してよい。空気よりも軽い気体は一般的には密閉容器に添加される一方で、空気よりも重い気体は密封もしくは非密封容器に添加することができる。従って本発明は気体前駆体と一緒に行われる空気および／または他の気体の同時閉じ込めを含む。
【０２４７】
従って気体前駆体充填小胞を、宿主の組織に対する適用によりいったん活性化させたら（この場合、温度もしくはｐＨのような因子が気体の産生をもたらすために用いられてよい）、本明細書に記載される気体充填小胞と実質的には同様の様式で用いることができる。気体前駆体が液体から気体状態への相転移を宿主の通常の体温もしくは体温付近で受け、そしてそのことにより例えば宿主のインビボでの温度により活性化されてそこで気体状態への転移を受けることが好ましい。別法では、静脈注射以前の活性化を、例えば熱、機械、もしくは光学的手法により用いてよい。このような活性化は例えば宿主組織が約３７℃の通常温度を有するヒト組織であり、そして気体前駆体が３７℃付近で液体から気体状態への相転移を受ける場合に生じ得る。
【０２４８】
脂質ベースの小胞の製造方について先に記載される技術の内のいずれかでは、小胞の形成以前、形成中、もしくは形成後にステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを脂質内に取り込ませてよく、これは本開示を参照する際には当業者には明らかになるであろう。
【０２４９】
ステロイドとフッ素化界面活性剤との複合体もしくは標的化用リガンドとフッ素化界面活性剤との複合体は、本開示に記載され、そして例えばＱｕａｙらによる欧州特許第ＥＰ
０  ７２７  ２２５  Ａ２号に開示されるように（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）当業者に知られる方法に従う反応手順により示唆されるテーマに関する変法により合成することができる。よりすぐりのプロドラッグが例えばＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＮ−１０ｏのようなフッ素化界面活性剤を含む場合には、ＺＯＮＹＬ（商標）を減圧下で加熱して揮発性構成成分を取り除き、その後に油性残渣を複合体リンカーと反応させ、この複合体リンカーの選択は最終的にはプロドラッグに製剤されるステロイドの官能基の化学特性に依存する。別法では、ステロイドを当該技術分野でよく知られる方法により活性化させる。例えば、標的化用リガンドとフッ素化界面活性剤との複合体は以下の反応スキームにより製造することができ、この場合「ＬＩＧ」は本発明の標的化用リガンドを意味し、そして「Ｒｆ」は本発明のフッ素化界面活性剤を意味する。
【０２５０】
【化２】
2010280678.tif 000014
【０２５１】
ポリエチレングリコール含有性分画に関しては、以下のものを用いることができ、それらは例えば、ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−（ＶＳ）２、メトキシ−ＰＥＧ−ａｌｄ、ＰＥＧ−（ａｌｄ）２、メトキシ−ＰＥＧ−ｅｐｘ、ＰＥＧ−（ｅｐｘ）２、メトキシ−ＰＥＧ−Ｔｒｅｓ、ＰＥＧ−（Ｔｒｅｓ）２、メトキシ−ＰＥＧ−ＮＰＣ、ＰＥＧ−（ＮＰＣ）２、メトキシ−ＰＥＧ−ＣＤＩ、ＰＥＧ−（ＣＤＩ）２、ｍＰＥＧ−Ｇｌｙ−ＯＳｕ、ｍＰＥＧ−ＮＬｅ−ＯＳｕ、メトキシ−ＳＰＡ−ＰＥＧ、（ＳＰＡ）２−ＰＥＧ、メトキシ−ＳＳ−ＰＥＧ、（ＳＳ）２−ＰＥＧであり、これら全てはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ，（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）から入手できる。これらの種類の断片が用いられる場合、すなわちこれらの断片が所定の超音波造影用製剤にとって十分な界面活性特性をもたなくてよいか、もしくは界面活性剤としては弱く作用するのみでよい場合には、形成される複合体は最終製剤中では他の界面活性剤と組み合わせて用いることができる。
【０２５２】
例えばアルブミン小胞のような、蛋白質から製剤される小胞を含む小胞組成物は様々な方法により製造されてよく、それらは本開示を参照にすれば当業者には容易に明らかになるであろう。適切な方法は例えば米国特許第４，５７２，２０３号、第４，７１８，４３３号、第４，７７４，９５８号、および第４，９５７，６５６号に記載されるものを含み、これら各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。これらの方法の中には、蛋白質の溶液の超音波処理を必要とするものがある。好ましい形態では出発物質は熱変性性で水溶性の生物適合性蛋白質の水溶液であってよい。被包用蛋白質は熱感受性であることが好ましく、そうであれば超音波処理中の加熱により部分的に不溶性になり得る。適切な熱感受性蛋白質は例えばアルブミン、ヘモグロビン、およびコラーゲンを含み、好ましくはこの蛋白質はヒト蛋白質であり、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が一層好ましい。ＨＳＡは滅菌された５％水溶液として商品として入手可能であり、これは蛋白質ベースの小胞の製造における使用に適する。当業者に明らかであるように、アルブミンの他の濃度、ならびに熱変性性の他の蛋白質を用いて小胞を製造することができる。一般的にはＨＳＡの濃度は変化させることができ、そして約０．１〜２５重量％の範囲にわたってよく、そしてその範囲の全ての組み合わせおよびサブコンビネーション（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）であってよい。蛋白質ベースの小胞の製造のための所定の方法と組み合わせ、希釈された水溶液の形態をとる蛋白質を利用することが好ましくてよい。アルブミンについては
約０．５〜約７．５重量％のアルブミンを含む水溶液を利用することが好ましくてよく、約５重量％を下回る濃度が好ましく、その例は約０．５〜約３重量％である。
【０２５３】
蛋白質ベースの小胞は商品として入手可能な装置を使用して製造されてよい。例えば、米国特許第４，９５７，６５６号に開示されるようなフィード製造操作と組み合わせ、Ｗａｌｋｅｒ  Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．（Ｎｅｗ  Ｌｉｓｂｏｎ，ＷＩ）から商品として入手することができるステンレス綱タンクおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から商品として入手することができるプロセスフィルターが用いられてよい。
【０２５４】
超音波処理操作は、変熱器およびフロースルー超音波用容器の両方を連続して利用してよい。この種の変熱器装置は、ＩＴＴ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）から取得されてよい。熱変換器は超音波処理工程の操作温度を維持し、その温度調節範囲は溶媒の組成に依存して約６５℃〜約８０℃にわたる。超音波装置の振動周波数は広域にわたって変化してよく、その例は例えば約５〜約４０キロヘルツ（ＫＨｚ）であり、商品として入手可能な超音波装置の大半が約１０もしくは２０ＫＨｚで操作される。適切な超音波処理装置は例えばＳｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｉｎｃ．（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）から商品として入手可能で、平坦型（ｆｌａｔ−ｔｉｐｐｅｄ）超音波装置ホーンが装着されているＳｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌを含む。この超音波装置ホーンに適応する電力はＳｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  Ｍｏｄｅｌ  ＶＬ１５００を用いる際と同様に製造業者により１〜１０に等級分けされた電力設定値の範囲にわたって変化することができる。例えば５〜９の中間的な電力設定値を用いることができる。振動周波数および供給される電力は超音波処理される液体中に空洞を生じるのに十分であることが好ましい。フィードフロー速度は約５０ｍＬ／分〜約１０００ｍＬ／分にわたっていてよく、そしてその範囲の全ての組み合わせおよびサブコンビネーション（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）であってよい。超音波用容器内での滞留時間は約１秒〜約４分の範囲であり得、そして気体液体の添加速度は１０立法センチメートル（ｃｃ）／分〜約１００ｃｃ／分、もしくは５％〜２５％のフィードフロー速度の範囲であってよく、そしてその範囲の全ての組み合わせおよびサブコンビネーション（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）であってよい。
【０２５５】
溶液の泡状物形成のため、特に激しい泡状物形成のための方法において超音波処理が実施されることが好ましくてよい。一般的には激しい泡状物形成およびエアロソレーティング（ａｅｒｏｓｏｌａｔｉｎｇ）は濃度および安定性が増加している造影剤を取得するためには重要である。泡状物形成を促進するためには超音波装置ホーンの入力電力は増加してよく、そして工程は例えば約１〜約５ｐｓｉのような中程度の圧力下で操作されてよい。泡状物形成は溶液の混濁した様相により、そして産生される泡状物により容易に検出されてよい。
【０２５６】
蛋白質ベースの小胞の製造に適する方法も、その物質の変性もしくは固定のために水溶液中の蛋白質もしくは蛋白質誘導体を物理的もしくは化学的に変化させることを必要としてもよい。例えば、蛋白質ベースの小胞は、超音波を介しての造影剤の形成後もしくは形成中に加熱することによりＨＳＡの５％水溶液から製造されてよい。化学的変化は例えばアルデヒドのような二官能性アルデヒドで蛋白質を結合させることにより化学的に変性もしくは固定することを必要としてよい。例えば、小胞をｐＨ４．５で６時間、蛋白質のグラム当たり０．２５グラムの５０％グルタルアルデヒド水溶液と反応させてよい。反応しないグルタルアルデヒドをその後には蛋白質から洗浄により除去してよい。
【０２５７】
蛋白質ベースの安定化剤および／または小胞の製造のために先に記載される技術のいずれかにおいては、ステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドが、本開示に
基づき当業者に明らかになるように、小胞の形成前、形成中、もしくは形成後に蛋白質と共に取り込まれてよい。ポリマーから製剤される小胞を含む小胞組成物は様々な方法により製造されてよく、それは本開示を参照にすると当業者には容易に分かることであろう。例示的方法は例えば界面重合化、相分離とコアセルベーション、マルチオリフィス遠心分離法、および溶媒留去を含む。ポリマーから小胞を製造するために本開示に従って利用もしくは改変されてよい適切な方法は、米国特許第４，１７９，５４６号、第３，９４５，９５６号、第４，１０８，８０６号、第３，２９３，１１４号、第３，４０１，４７５号、第３，４７９，８１１号、第３，４８８，７１４号、第３，６１５，９７２号、第４，５４９，８９２号、第４，５４０，６２９号、第４，４２１，５６２号、第４，４２０，４４２号、第４，８９８，７３４号、第４，８２２，５３４号、第３，７３２，１７２号、第３，５９４，３２６号、および第３，０１５，１２８号；日本公開公報第６２  ２８６５３４号、英国特許第１，０４４，６８０号、Ｄｅａｓｙ，Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｃｈｓ．９および１０，ｐｐ．１９５−２４０（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８４）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．ｏｆ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４４：１１５−１２９（１９６６）、およびＣｈａｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４６：５２４−５２５（１９６４）に開示される方法を含み、これら各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０２５８】
好ましい合成プロトコールに従うと、小胞は例えば米国特許第４，９１７，５４６号、第３，９４５，９５６号、および第４，１０８，８０６号、英国特許第１，０４４，６８０号、ならびに日本公開特許公報第６２  ２８６５３４号に記載される方法のような熱膨潤方法を用いて製造されてよい。一般的に言うと熱膨潤方法は、空隙（空洞）内に揮発性液体（気体前駆体）を含んでよい膨潤可能なポリマーもしくはコポリマーの小胞を製造することにより実施されてよい。その後に小胞は加熱され、小胞の可塑化が生じ、そして揮発性液体が気体に転化し、小胞がそのもともとのサイズのおおよそ数倍にも膨張する。熱が取り除かれる際には熱可塑性ポリマーが少なくともその膨潤形状の内の幾つかを保持する。この過程により製造される小胞は特に低密度のものとなる傾向があり、そして従って好ましい。先に記載される方法は当業者にはよく知られており、そして低密度小胞を製造するための熱膨潤方法として引用されてよい。
【０２５９】
熱膨潤方法に有用なポリマーは当業者には容易に明らかになるであろうし、そして熱可塑性ポリマーもしくはコポリマーを含み、それらには先に記載される多くのモノマーのポリマーもしくはコポリマーを含む。先に記載される好ましいポリマーおよびコポリマーは以下のコポリマーを含む：ポリビニリデン−ポリアクリロ−ニトリル、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル−、ポリメチルメタクリレート、およびポリスチレン−ポリアクリロニトリル。最も好ましいコポリマーはポリビニリデン−ポリアクリロニトリルである。
【０２６０】
熱膨潤方法で有用な揮発性液体は当業者にはよく知られており、そして：脂肪属炭化水素（例えば、エタン、エチレン、プロパン、プロペン、ブタン、イソブタン、ネオブタン、アセチレン、ヘキサン、ヘプタン）；クロロフルオロカーボン（例えば、ＣＣｌ３Ｆ、ＣＣｌ２Ｆ３、ＣＣｌＦ３、ＣＣｌＦ２−ＣＣｌ２Ｆ２、クロロヘプタフルオロ−シクロブタン、および１，２−ジクロロヘキサフルオロシクロブタン）；テトラアルキシラン（例えば、テトラメチルシラン、トリメチルエチルシラン、トリメチルイソプロピルシラン、およびトリメチルｎ−プロピルシラン）；ならびに先に記載されるペルフルオロカーボンを初めとするペルフルオロカーボンを含む。一般的には揮発性液体が利用されるポリマーもしくはコポリマーのための溶媒でないことが重要である。揮発性液体が、関係するポリマーもしくはコポリマーの軟化点以下の沸点を有することが好ましい。様々な揮発性液体の沸点および様々なポリマーとコポリマーの軟化点は当業者には容易に識別されるであ
ろうし、そしてポリマーもしくはコポリマーと揮発性液体との適切な組み合わせ物は当業者には容易に明らかになるであろう。手引として、そして当業者は認識するであろうように、一般的には揮発性液体の炭素鎖の長さが増加するにつれてその液体の沸点も上昇する。また、限定的な加熱および膨潤の以前の過酸化水素の存在下での水中での小胞の緩和な予備加熱は、膨潤が一層容易に生じるように小胞を予め軟化してよい。
【０２６１】
例えば、合成ポリマーから小胞を産生するためにはビニリデンとアクリロニトリルを、一つもしくは複数の既述の改変もしくは非改変した文献により方法を用いてイソブタン液体の媒質中で共重合させてよく、そのことによりイソブタンが小胞内に捕獲される。その後にこのような小胞を約８０℃〜約１２０℃の温度にまで加熱する際にはイソブタン気体が膨潤し、そしてそれが次には小胞を拡張させる。加熱が除去された後には膨潤したポリビニリデンとアクリロニトリルコポリマー小胞は実質的にはそれらの膨潤した位置に固着したままとなる。得られる低密度小胞は乾燥状態および水性媒質中の懸濁状態の両方で極度に安定である。イソブタンは本明細書では単に説明的液体として用いられ、これらの小胞の合成および加熱した際の極低密度小胞の形成に有用な温度で液体／気体転移を受ける他の気体はイソブタンの代わりとなり得ることが理解される。同様にビニリデンおよびアクリロニトリル以外の他のモノマーを小胞を製造する際に利用することができる。
【０２６２】
所定の好ましい態様では、合成ポリマーから製剤され、かつ本発明の方法に利用されてよい小胞は一般的にはＥｘｐａｎｃｅｌ，Ｎｏｂｅｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｓｕｎｄｓｖａｌｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）から商品として入手することができ、これらにはＥＸＰＡＮＣＥＬ  ５５１ＤＭ（商標）マイクロスフェアが含まれる。ＥＸＰＡＮＣＥＬ  ５５１ＤＭ（商標）マイクロスフェアはイソブタン液体を被包させてあるビニリデンとアクリロニトリルとのコポリマーでできている。このようなマイクロスフェアは乾燥組成物として売られており、そしてサイズは約５０ミクロンである。ＥＸＰＡＮＣＥＬ  ５５１ＤＭ（商標）マイクロスフェアの比重は僅か０．０２〜０．０５であり、これは水の密度の１／５と１／１２との間である。
【０２６３】
ポリマーベースの安定化剤および／または小胞の製造のための先に記載される技術の内のいずれかではステロイドプロドラッグおよび／またはリガンドは小胞の形成以前、形成中、もしくは形成後に取り込まれてよく、このことは本開示に基づくと当業者には理解されるであろう。
【０２６４】
安定化剤および／または小胞の製造に関してと同様に、多種多様の技術が生物活性試薬（これにはステロイドプロドラッグおよび標的化用リガンドを含む）を含む安定化剤の製造に利用可能である。例えば、安定化剤および／または小胞組成物は脂質組成物、生物活性試薬、ならびに気体および／または気体前駆体の混合物から製造されてよい。この場合、脂質組成物は先に記載される要領で製造され、この場合この組成物は生物活性試薬をも含む。従って例えばミセルは生物活性試薬の存在下で製造することができる。気体を含む脂質組成物と関連すると、この製造法は例えば脂質組成物と一つもしくは複数の追加的物質との混合物内に気体を直接気泡として通すことを必要とし得る。別法では、脂質組成物は脂肪化合物ならびに気体および／気体前駆体から予め製造されてよい。後者の場合には生物活性試薬をその後、使用前に脂質組成物に添加する。例えばリポソームと気体との水性混合物が製造されてよく、これに生物活性試薬が添加され、そして撹拌されてリポソーム組成物が提供される。リポソーム組成物は容易に単離され得、なぜなら気体および／気体前駆体充填リポソーム小胞は一般的には水溶液の上端に浮遊するためである。余分な生物活性試薬を残りの水溶液から回収することができる。
【０２６５】
当業者は理解するであろうように、安定化剤および／または小胞組成物のうちのいずれかは保存用に凍結乾燥され、例えば激しい撹拌の助けを得て水性媒質（例えば、滅菌水、
リン酸緩衝化溶液、もしくは食塩水溶液）で再構成もしくは再水和されてよい。凍結乾燥された製造物は一般的には貯蔵期間が増大するという利点を有する。凍結乾燥の結果としての脂質および／または小胞の凝集もしくは融合を予防するためには、そのような融合もしくは凝集が生じるのを予防する添加物を含ませることが有用であってよい。有用であってよい添加物は、ソルビトール、マニトール、塩化ナトリウム、グルコース、デキストローズ、トレハロース、ポリビニル−ピロリドン、およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ  ４００）を含む。これらの添加物および他の添加物は刊行物に記載されており、それは例えばＵ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ＵＳＰ  ＸＸＩＩ、ＮＦ  ＸＶＩＩ、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，１２６０１  Ｔｗｉｎｂｒｏｏｋ  Ｐａｒｋｗａｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２であり、この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０２６６】
所望される安定化された小胞レベルを形成するのに必要とされる脂質の濃度は用いられる脂質の種類に依存して変化し得、そして日常的に行われる実験により容易に決定されてよい。例えば好ましい態様では、本発明の方法に従って安定化された小胞を形成するのに用いられる１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の濃度は食塩溶液の約０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、一層好ましくは食塩溶液の約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは食塩溶液の約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。好ましい態様に用いられるジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）の濃度は食塩溶液の約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、一層好ましくは食塩溶液の約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは食塩溶液の約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。患者に投与される組成物の量は異なり得る。
【０２６７】
典型的には静脈内投与量は７０Ｋｇの患者については約１０ｍＬを下回る量であってよく、それより低い用量が好ましい。
【０２６８】
標的化治療剤ステロイドプロドラッグ組成物を製造する他の態様は、少なくとも一つの生物適合性脂質および気体前駆体を組み合わせること；気体充填小胞が形成されるまでは撹拌すること；前記気体充填小胞にステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを添加すること（そのことによりステロイドプロドラッグおよび／または標的用リガンドは共有結合もしくは非共有結合により前記気体充填小胞に結合する）；ならびに気体充填小胞ならびにステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを含む輸送用小胞が生じるまで撹拌することを含む。ステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを添加する前に気体充填小胞が形成されるまで撹拌するよりはむしろ、気体前駆体が使用時まで気体前駆体のままであってよい。すなわち気体前駆体は輸送用ビヒクルを製造するのに用いられ、そしてその前駆体は例えば温度によりインビボで活性化される。
【０２６９】
別法では、標的化治療剤ステロイドプロドラッグ組成物を製造する方法は少なくとも一つの生物適合性脂質ならびにステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを組み合わせること（このことによりステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドは共有結合もしくは非共有結合により前記脂質に結合する）、気体前駆体を添加すること、ならびに気体充填小胞ならびにステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを含む輸送用小胞を生じるまで撹拌することを含んでよい。それに加え、気体前駆体が添加され、そして使用時までは気体前駆体のままでいてよい。すなわち気体前駆体は、インビボ使用のためにもたらされる、気体前駆体充填小胞ならびにステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを有する輸送用ビヒクルを製造するのに用いられる。
【０２７０】
別法では気体前駆体は使用前に予め形成される、ステロイドプロドラッグおよび／また
は標的化用リガンドを含む安定な気体充填小胞を作成するために用いられてよい。この態様では、気体前駆体ならびにステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドは、各々の気体前駆体の液体−気体相転移温度以下の温度で懸濁用および／または安定化用媒質を保持する容器に添加される。その後に温度を上昇させ、そして気体前駆体と液体溶液との間に乳化物が形成されるに従って、気体前駆体は液体から気体状態への転移を受ける。この加熱および気体形成の結果として、この気体は液体懸濁物の上のヘッドスペースで空気と入れ替わり、そのことにより、気体前駆体（すなわち周囲の気体で、その例は空気である）の気体を閉じ込める、または気体状態の気体前駆体および周囲の空気を同時に閉じ込める気体充填脂質スフェアを形成する。この相転移を輸送用ビヒクルの至適混合および安定化用に用いることができる。例えば、気体前駆体であるペルフルオロブタンを生物適合性脂質および他の安定化用化合物内に捕獲することができ、そして温度が上昇し、４℃（ペルフルオロブタンの沸点）を越える際にはフルオロブタン気体を捕獲した安定化用化合物が得られる。追加例として、気体前駆体フルオロブタンは例えばグリセロールもしくはプロピレングリコールのような乳化用および安定化用試薬を含む水性懸濁物内に懸濁し、そして商品として販売されているボルテックスミキサーで撹拌することができる。ボルテックルミキサーによる撹拌は気体前駆体が液体であるに十分低い温度で開始され、そして試料の温度が液体から気体状態への相転移温度を越えて上昇する際に継続される。その作業を行う最中には前駆体は、マイクロ乳化プロセスの最中に気体状態へと転化する。適切な安定化用試薬の存在下では驚くほど安定な気体充填小胞ならびにステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドが生じる。
【０２７１】
従って、気体前駆体は気体充填小胞をインビボで形成するために選択してよく、またはインサイチュー、製造工程、保存の際、もしくは使用前のしばらくの間に気体充填小胞を産生するように設計してよい。
【０２７２】
本発明により企図された方法に従い、例として引用するがこれに限定される訳ではない空気のような気体の存在も、局所的周囲の気圧により提供されてもよい。局所的周囲の気圧は密閉された容器内の気圧もしくは密閉されていない容器内の気圧であってよく、外部の環境であってもよい。別法では例えば気体は、液体水溶液を保持する容器内に注入されるかもしくはそうでない場合には添加されるか、または空気以外の気体を提供する目的で液体水溶液自体に注入もしくは添加されてよい。空気と比較して重くない気体は密閉容器に添加されてよく、その一方で空気と比較して重い気体は密閉されたもしくは密閉されていない容器に添加されてよい。従って本発明は空気および／または他の気体を気体前駆体と共に同時に閉じ込めることを含む。
【０２７３】
従って先に記載される安定化された小胞前駆体は、宿主の組織への適用によりいったん活性化されたら（この場合、温度もしくはｐＨのような因子が気体の産生をもたらすために用いられてよい）、本発明に用いられる他の安定化用小胞と同様の方法で用いることができる。この態様が、気体前駆体が液体から気体状態への相転移を前記宿主の通常の体温もしくは体温付近で受け、そしてそのことにより前記宿主組織の温度により活性化を受けて、そこでの気相への転移を受けるものであることが好ましい。更に一層好ましいことはこの方法が、約３７℃の通常の温度を有するヒト組織であり、そして気体前駆体が３７℃付近で液体から気体状態への相転移を受ける。
【０２７４】
本発明に用いられる安定化された気体充填小胞の製造を必要とする先の態様全ては、これらの過程が気体導入段階以前もしくは懸濁物中の温度感受性気体前駆体の温度による気体転化以前のいずれかに実施される場合には、オートクレーブもしくは滅菌濾過により滅菌されてよい。別法では、一つもしくは複数の抗菌剤および／または保存料で、例えば安息香酸ナトリウム、全ての第四級アンモニウム塩、アジ化ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、アスコルニルパルミテート、ブチル化されたヒドロキシ
アニソール、ブチル化されたヒドロキシトルエン、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エチレンジアミン、モノチオグリセロール、安息香酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、および有機水銀塩を初めとするものが組成物の製剤中に含まれてよい。例えば照射によるような他の通常の方法により達成されてよいような滅菌は、安定化されたマイクロスフェアが例えば静脈内投与もしくは腹膜内投与のような非侵襲的状況下での画像化に用いられる際には必要となるであろう。滅菌の適切な方法は安定化された気体充填小胞およびそれらの使用のこの記載により指示される当業者には明らかであろう。組成物は一般的には水性懸濁物として保存されるが、乾燥もしくは凍結乾燥された小胞または乾燥もしくは凍結乾燥された脂質性スフェアの場合には組成物は使用前に再構築もしくは再水和させる用意が整っている乾燥もしくは凍結乾燥された粉末として保存されてよい。
【０２７５】
用途
本発明の新規の標的化治療剤輸送系は診断画像化の際の造影剤として、そして診断用画像化が用いられる全ての領域においての使用に有用である。診断画像化は患者の内部身体領域を可視化させるための手段であり、そして例えば超音波（ＵＳ）、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピューター断層診断（ＣＴ）、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）；核医学（この場合には造影剤は放射活性性物質を含む）；ならびに至適画像化（特に蛍光造影媒質を用いるもの）を含む。診断用画像化は更には本発明の方法を介する小胞の破壊を促進させることを含む。例えば超音波は小胞を可視化させ、そして所定の組織内の小胞の局在化を検証するために用いられてよい。それに加え超音波は、いったん小胞が意図される標的（これには組織および／またはレセプターの到着先が含まれる）に到着したら小胞の破壊を促進し、そしてそのため例えばステロイドプロドラッグのような生物活性試薬を放出させるのに用いられてよい。
【０２７６】
本発明に従うと、患者の画像化を行う、一般的には患者内の疾患組織の存在の診断を行う、そして／または患者に生物活性物質を輸送する方法が提供される。本発明の画像化過程は、患者に対する本発明の組成物の投与、およびその後の、患者の内部領域および／またはその領域内のいずれかの疾患組織の可視像を取得するために例えば超音波、コンピューター断層診断、および／または磁気共鳴画像化を用いて患者をスキャンすることにとり実施されてよい。造影剤は例えば眼、心筋、内皮、および／または上皮組織、ならびに胃腸および循環器領域などの組織像を提供するのに特に有用であってよいが、更には脈管系の画像化、もしくは当業者には容易に明らかになるであろう他の方法で一層広域に利用され得る。循環器領域は、心臓ならびに心臓におよび心臓から直接つながる脈管系により特定される患者の領域を示す。用語「脈管」は、身体内の血管（動脈、静脈など）または臓器および身体の部分を意味する。患者はいずれかの種類の哺乳類であり得るが、最も好ましいのはヒトである。
【０２７７】
本発明は更に、疾患組織の存在を診断する方法を提供する。疾患組織は例えば癌組織、および疾患組織を支える脈管に由来する内皮組織を含む。その結果、通常の環境下では内皮組織には結合しない患者の領域への内皮組織の局在化および可視化により領域の疾患組織を示されることになる。この方法は更には患者の内部領域への例えばステロイドプロドラッグのような生物活性試薬の輸送と組み合わせて用いることができる。
【０２７８】
前立腺癌および良性前立腺肥大の治療は、本発明の標的化治療剤輸送系で行われてよい。前立腺癌および良性前立腺肥大の治療のための治療剤はテストステロン、メチルテストステロン、フルオキシルメステロン、フィナステリド（プロスカル）、およびステロイド５ａレダクターゼ酵素の阻害剤を含む。典型的には治療剤は静脈内的もしくは経尿道的に投与される。超音波は前立腺に、経腹膜的、経尿道的、もしくは直腸内超音波プローブを介してのいずれかで焦点を当ててよい。
【０２７９】
超音波は、眼科疾患のために例えば眼のような身体領域に、もしくは音響活性担体の投与前、投与後、もしくは投与中に前立腺疾患の治療のために前立腺に適用されてよい。一般的には本発明の組成物は静脈内的に投与されるが、眼内投与も実施されてよいことがある。投与の好ましい経路は静脈内投与である。最も好ましいのは標的化治療剤輸送系が超音波処理中に投与され、そして超音波処理が音響活性担体の投与後の例えば１分〜数時間の間のようにしばらくの間継続することである。最も好ましい超音波診断画像化は、小胞破壊および超音波治療を提供するための治療的超音波処理と連携させて実施される。追加的にはレーザーもしくは光学的画像化を実施して小胞破壊および網膜治療をモニターしてよい。例えばフオレセイン染料のような光学センサーは、治療をモニターしかつ網膜血流を可視化させるために音響活性担体内に同時投与されるもしくは取り込まれてよい。
【０２８０】
超音波は約２０ＫＨｚと１００ＭＨｚとの間の周波数で変動してよいが、１００ＫＨｚと２５ＭＨｚとの間が一層好ましい。更に一層好ましいのは超音波周波数が約５００ＫＨｚと約２０ＭＨｚとの間で変化することである。超音波治療周波数および画像化周波数は同一であってもよく、もしくは掃引されてもよい。ＰＲＩＣＨ（逓減）もしくはＣＨＩＲＰ（逓増周波数）が用いられてよい。画像化用および治療用周波数、ならびに画像化および治療用エネルギーは各々同一もしくは異なってよい。最も好ましいのは１×周波数パルスもしくは一連のパルス（連続波パルス）が眼に適用され、そして２×、３×、もしくは５×（２×が最も好ましい）をその後、１×パルスの初回バーストの後に眼に適用することである。第一および第二周波数の積層により気泡破裂および局所薬剤輸送が促進される。一般的には、用いられるエネルギーは気泡破壊については１ミリワット〜１０ワットの間で変化し、そして継続波については５％〜１００％の動作周期の間で変化する。網膜もしくは眼の癌の切除は別として、エネルギーは通常は致死細胞毒性の閾値以下に保たれる。網膜新生物切除が所望される場合には（例えば、黄斑部変性症に関連する網膜新生物の治療の際）、好ましい効果の手段は血管病変のアポトーシスもしくは血栓のいずれかを介するものである。一般的には超音波エネルギーの治療用パルスは５ワットを下回り、そして通常１ワット以下である。最も好ましくは、エネルギーレベルは２０ミリワットと約１ワットとの間となる。しかしながら当業者は理解するであろうように、選択されるピークエネルギーレベルは適用法、動作周期、パルス反復速度、周波数、および他の因子に依存して変化するであろう。一般的には治療学的超音波エネルギーの必要量は周波数の平方根の逆数に大まかには従って変化してよい。
【０２８１】
通常は超音波プローブは眼の上、通常は角膜前面上に直接置かれる。好ましくは音響伝達媒質が、超音波プローブの適用前に眼の表面に置かれる。例えば粘着性リドカイン（１％）のような麻酔試薬が最初に眼に置かれてよく、あるいは麻酔試薬は例えばシリコンゲルのような音響伝達媒質内に取り込まれてよい。その後に変換器を眼の表面に適用する。超音波画像化は網膜および眼構造を可視化するために実施される。一般的には治療はそれに先立って行われる光学検眼鏡検査の後に実施され、そしてこの情報を用いて超音波および音響活性担体を用いる治療法の計画を立てる。しかしながら、超音波単独で治療法設計に十分であってよい場合もある。
【０２８２】
水晶体への損傷を回避するためには超音波変換器を眼の周辺に設置することができ、そのことにより超音波ビームは水晶体を必ずしも通過しなくてよくなる。この様式で超音波ビームの焦点を例えば網膜のような後部構造上に当てるかもしくはビームをそこに向かわせることが依然として可能である。緑内障の治療のためには超音波ビームの焦点を毛様体に当てることができる。
【０２８３】
当業者は理解するように一層高目の周波数による画像化のための空間解像度が一層高くなり、かつまた治療のための空間局在度が一層高くなる。例えば１ＭＨｚの波長では超音
波＝０．１５５ｃｍとなり、そして１０ＭＨｚの波長では超音波＝０．０１６ｃｍとなる。眼の上に超音波変換器を注意深く空間設置し、患者を頭部固定器具（ｈｅａｄ  ｈｏｌｄ）により固定し、そして超音波ビームおよびフォーカルスポットの機械的もしくは電子的掃射（ｓｗｅｅｐｉｎｇ）により治療学的音波の焦点が眼および網膜上の小領域にあたってよい。頭部は網膜に対して超音波を局所的に適応させるための器具内で固定されてよい。理論的には本発明により病変の治療ならびに例えば１ＭＨｚでは１ｍｍそして１０ｍＨｚでは１０ミクロンを必要とする超音波波長が可能となる。周波数が高くなれば一層小さな病変を治療する精度が上昇することになるが、例えば１ＭＨｚのものに関しては約３．３倍といったように一層高いエネルギーを必要としてよいことを銘記されたい。例えば１ミクロン以下のように一層小さめの気泡は一般的には１０ＭＨｚでの治療にとっては一層効率の高い薬剤担体となるであろう。例えば１〜５ミクロンのように一層大きめの気泡は例えば１ＭＨｚのような低周波数で一層効果的となるであろう。
【０２８４】
本発明の好ましい態様では、気泡破壊の効率を極大化させるために基本周波数と高調波振動数との積層が必要となる。例えば継続波５ＭＨｚ超音波の破壊に次に治療予定の組織上に焦点を当てた１０ＭＨｚ継続波超音波での第二破壊が行われてよい。
【０２８５】
十分な血漿半減期を有する標的化治療剤輸送系を選択し、そして網膜もしくは他の標的組織上の所望される治療領域への超音波を継続的に適用することにより、適用可能な薬剤輸送が標的治療容積内で達成され得る。
【０２８６】
ステロイドプロドラッグを含む本発明の組成物は多種多様の異なる方法により患者に投与されてよい。投与の方法は意図される適用法に依存して変化するであろう。当業者は認識するように、ステロイドプロドラッグ、または本発明の安定化剤および／または小胞と組み合わせたステロイドプロドラッグの投与は多種多様の様式により実施することができ、その例は局所投与（これには眼投与、皮膚投与、眼および直腸投与、直腸内投与、経皮投与、経口投与、腹膜内投与、非経口投与、静脈内投与、リンパ管内投与、癌内投与、筋肉内投与、間質投与、動脈内投与、皮下投与、眼内投与、滑液包内投与、経上皮投与、吸引を介する肺への投与、眼科的投与、舌下投与、バッカルとしての投与、または例えばエアロゾルの輸送によるような通気法、噴霧療法を介する経鼻吸入を介する投与である。好ましくは、本発明のステロイドプロドラッグおよび／または安定化剤が静脈内経路によるかもしくは局所的／経皮的に投与される。吸入の場合には気体前駆体は本発明の組成物と共に輸送されるため、気体前駆体は液体気体、もしくは液体および気体形態をとる。
【０２８７】
本明細書に記載される一つもしくは複数の生物活性物質を含む小胞は局在化させた薬剤輸送のための超音波処理により活性化されてよい。しかしながら本発明の治療剤輸送系は超音波の投与なしでも有能な薬剤輸送用ビヒクルでもある。例えば、標的化用リガンドを含む薬剤輸送系が細胞と融合されてよい。
【０２８８】
図７は音響活性リポスフェアの音響応答を示す。一層高目のエネルギーでの超音波（実施例９に示されるように、好ましくは１００ｋＨｚ付近の低周波数を有するもの）の適用により音波活性の喪失および被包される薬剤の放出がもたらされる。超音波は音響振動および発振の形態での熱および機械エネルギーを伝達すると考えられる。
【０２８９】
超音波により媒介される標的化および薬剤放出および本発明のステロイドプロドラッグを用いる活性化は多種多様の異なる疾患および医学症状の治療に有利であり、それらは例えば自己免疫疾患、臓器移植、関節炎、および重症筋無力症である。患者へのステロイドプロドラッグ輸送用ビヒクルの全身投与の後に超音波が患部組織に適用されてよい。滑液が原因の炎症性関節炎を初めとする関節炎（例えば、リューマチ性関節炎）に関しては、超音波は疾患により侵された関節に適用されてよい。重症筋無力症に関しては、超音波は
胸腺に適応されてよい。移植片拒絶に関しては、超音波は例えば腎臓移植片のような臓器移植片に適用されてよい。
【０２９０】
局所適用のためにはステロイドプロドラッグは単独で使用されてよく、一つもしくは複数の安定化用試薬と共に混合されてよく、あるい輸送用ビヒクルと共に使用されてよく、そして皮膚もしくは粘膜に適用される。ステロイドプロドラッグの局所適用に有用な他の浸透剤および／または可溶化剤は例えば、ピロリドン（一例では、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、１−メチル−２−ピロリドン、５−メチル−２−ピロリドン、１−エチル−２−ピロリドン、２−ピロリドン−５−カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、Ｎ−シクロヘキシルピロリドン、Ｎ−ジメチルアミノプロピルピロリドン、Ｎ−ココアルキルピロリドン、Ｎ−タロウアルキルピロリドン、１−ラウリル−２−ピロリドン、および１−ヘキシル−２−ピロリドン）；脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノレイン酸、ヘプタノン酸、カプロン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、オクタデカン酸、パルミトイル酸、ミリスチン酸、およびパルミテライディック酸）；スルホキシド（例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、およびデシルメチルスルホキシド）；アミンおよび誘導体（一例ではＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、ドデシルアミン、エトキシル化されたアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）オレイルアミン、ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート、プリオグルタミン酸ナトリウム、およびＮ−ヒドロキシルエタンラクタミド）；テルペンおよびテルペノイド（例えば、ａ−ピネン、ｄ−リモネン、３−カレネ、ａ−テルピネオール、テルピネン−４−オール、カルネオール、アビサボロール、カルボン、プレゴン、ピペリトン、メントン、フェンコン、シクロヘキセンオキシド、リモネンオキシド、ピネンオキシド、シクロペンテンオキシド、アスカリドール、７−オキサビシクロ（２．２．１）ヘプタン、１，８−シネオール、サフロール、１−カルボン、テルペノイドシクロヘキサノン誘導体、アクリル性テルペン炭化水素鎖、炭化水素テルペン、環状エーテルテルペン、カルダモン種子抽出物、モノテルペンテルピネオール、およびアセチルテルピネオール）；ユーカリ、ケノポジ、およびイランイランノキの精油；界面活性剤（例えば、アニオン性ラウリル硫酸ナトリウム、フェニルスルフレートＣＡ、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム、エンピコールＭＬ２６／Ｆ、およびラウリル硫酸マグネシウム）；カチオン性臭化セチルトリメチル−アンモニウム；非イオン性−シンペロニック（ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）ＮＰシリーズおよびＰＥシリーズ、ならびにポリソルベート；両性イオン性−Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルベタイン；アルコール（例えば、エタノール、ラウリルアルコール、リノレニルアルコール、１−オクタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール）；尿素、環状不飽和尿素アナログ、グリコール、アゾン、ｎ−アルカノール、ｎ−アルカン、オルゲラーゼ、アルファデルムクリーム、および水を含む。浸透剤／可溶化剤は、例えばグリセロール、プロピレングリコール；ミリスチン酸イソプロピル；プロピレングリコール、エタノール、および水中の尿素；ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を初めとする当業者に知られる多種多様の物質を構築することができる基剤中に含まれても、もしくは含まれなくてもよい。
【０２９１】
当業者に知られ、そして先にも記載される浸透促進剤と共に製剤されるステロイドプロドラッグは、皮膚に適用される浸透性膜と共にパッチもしくはレザーバーとして経皮的に投与されてよい。破壊用超音波の使用は本発明のステロイドプロドラッグを初めとする治療剤化合物の経皮輸送を上昇させてよい。更には、画像化メカニズムを用いてステロイドプロドラッグの輸送をモニターおよび調節してよい。例えば、診断用超音波を用いて気体充填小胞の破壊を肉眼的にモニターし、そして薬剤輸送を調節してよく、そして／またはハイドロフォンを用いて気体充填小胞の破壊音を検出し、そして薬剤輸送を調節してよい。
【０２９２】
超音波を用いる本発明に従う生物活性試薬の輸送は、超音波エネルギーの伝達のために
は良好な音波ウインドウを有する組織については最善の状態で達成される。例えば筋肉、心臓、肝臓、および大半の他の生命維持構造のような身体内の組織についてはこの状況があてはまる。脳では超音波エネルギーが頭蓋骨を通過するよう指令を出すためには外科的手法によるウインドウが必要になってよい。
【０２９３】
本発明の気体充填小胞は、水性媒質中あるいは酸素および／または大気中の空気への露出の際に分解してよい生物活性試薬にとっては特に有用である。例えば小胞は、不安定な生物活性試薬と一緒の使用のためには一例では窒素もしくはアルゴンのような不活性気体で充填されてよい。追加的には、気体充填小胞は不活性気体で充填されてよく、そして例えば皮膚および眼への適用のように大気中の空気に対して通常治療剤が通常露出されるであろう患者の領域内への使用のための不安定な生物活性試薬を被包するのに用いてよい。
【０２９４】
本発明は、患者の肺への生物活性試薬の輸送に有用である。ステロイドプロドラッグの肺適用のためには、乾燥させたかもしくは凍結乾燥させた粉末状リポソームが吸入を介して投与されてよい。リポソームもしくはミセル（好ましくは気体／気体前駆体充填されたもの）の水性懸濁物が噴霧器を介して投与されてよい。本発明の気体充填リポソームは例えば、肺の末梢に到達するよりはむしろ中央近位気道内に一般的には沈着してしまう通常の液体充填リポソームと比較すると軽い。従って、本発明の気体充填リポソームは、末端気道および気胞を初めとする肺の末梢への生物活性試薬の輸送を改善してよい。肺への適用のためには、気体充填リポソームは噴霧器を通して適用されてよい。
【０２９５】
脂質が周囲に並ぶ肺の標的化のような適用法では、生物活性試薬はその脂質が標的化組織に沿って並ぶ気体充填リポソームの凝集の際に放出されてよい。それに加え、気体充填リポソームは超音波の使用なしでの投与の後に破損してよい。従って、超音波は先の種類の投与の際の薬剤の放出のためには適用される必要はない。
【０２９６】
血管投与のためにはステロイドプロドラッグは一般的には、例えば好ましくは気体もしくは気体前駆体含有性リポソームのような処方用ビヒクルとして静脈系内に注入される。
【０２９７】
本発明の更に別の態様では超音波活性化によりステロイドプロドラッグの部位特異的輸送が可能となる。一般的には気体および／または気体前駆体含有性ビヒクルはエコー源性であり、かつ超音波上で可視できる。超音波を用いて標的組織を画像化し、そして薬剤を保持するビヒクルが治療領域を通り過ぎる際にそれをモニターすることができる。増加レベルの超音波を治療領域に適用する際には、超音波により治療領域内で輸送用ビヒクルが破壊され、そして／または薬剤が放出される。「薬剤の放出」もしくは「ステロイドの放出」は：（１）輸送用ビヒクルからのステロイドプロドラッグの放出（ただし、結合基および脂質部分からのものではない）；（２）共有結合により結合された脂質部分および／または結合基からのステロイドの放出（ただし、輸送用ビヒクルからのものではない）；ならびに（３）輸送用ビヒクルと、共有結合により結合された脂質部分および／または結合基の両方からのステロイドの放出、を含む。好ましくは「薬剤／ステロイドの放出」は、（１）輸送用ビヒクルからのステロイドプロドラッグの放出（ただし、結合基および脂質部分からのものではない）、あるいは（３）輸送用ビヒクルと、共有結合した脂質部分および結合基の両方からのステロイドの放出、である。
【０２９８】
薬剤放出および／または小胞破壊は数々の異なるメカニズムにより超音波によりモニターすることができる。気泡もしくは小胞の破壊は超音波シグナルの最終的な消滅をもたらす。しかしながらシグナル消滅以前に輸送用ビヒクル／小胞はシグナルの初期破壊を提供する。言い換えると、増加レベルの超音波エネルギー輸送用ビヒクル／小胞を含む治療領域に適用される場合には、一過性のシグナル増大が生じる。このシグナルの一過性増加は基本周波数、高調波調波数、奇数調波数、もしくは超調波振動数で記録されてよい。
【０２９９】
投与予定の有用な投与量および投与の特別な様式は、年齢、体重、および特別な哺乳類、および捜査すべきその領域、そして利用される具体的な造影剤に依存して変化するであろう。典型的には投与量は低めのレベルで開始し、そして所望の造影向上が達成されるまで増加させる。脂質組成物のさまざまな組み合わせを使用して、所望される場合には、粘度、浸透圧モル濃度、もしくは嗜好性を初めとする特性を変化させてよい。
【０３００】
一般的には本発明のステロイドプロドラッグ、安定化剤、および／または小胞は例えば水もしくは食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化食塩水）のような水性懸濁物の形態で投与されてよい。好ましくは水は滅菌される。更には好ましくは食塩水溶液は等張食塩水溶液であるが、所望される場合には食塩水溶液は低張であってよい（例えば、約０．３〜約０．５％  ＮａＣｌ）。この溶液は所望される場合には約５〜約７．４のｐＨ範囲を提供するように緩衝化されてよい。好ましくはデキストローズもしくはグルコースが媒質中に含まれる。気体充填リポソームの投与のために用いてよい他の溶液は例えば、アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、ピーナッツ油、杏仁油、ゴマ油、ダイズ油、およびスクアレンを含む。
【０３０１】
本発明の安定化剤および／または小胞のサイズは意図される使用に依存するであろう。リポソームが小さめである場合には、共鳴振動数超音波は一般的には大きめのリポソームと比較すると高くなるであろう。サイズ決定も、得られるリポソーム生体分布およびクリアランスを調節するのに役立つ。濾過に加え、リポソームのサイズは所望される場合には当業者に知られる方法により調節され得、その方法は例えば、震盪、マイクロ乳化、ボルテックスミキサーによる撹拌、濾過、反復凍結および解凍周期、押し出し、特定サイズの孔を通しての圧力下での押し出し、超音波処理、ホモゲネーション、液体の不混和性シース内に導入される液体のコアの層流の使用である。例えば、米国特許第４，７２８，５７８号、第４，７２８，５７５号、第４，７３７，３２３号、第４，５３３，２５４号、第４，１６２，２８２号、第４，３１０，５０５号、および第４，９２１，７０６号；英国特許出願公開第ＧＢ  ２１９３０９５Ａ号；国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号および第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，８５８：１６１−１６８（１９８６）；Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，８１２：５５−６５（１９８５）；Ｍａｙｈｅｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４９：６４−７７（１９８７）；Ｍａｙｈｅｗら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，７５５：１６９−７４（１９８４）；Ｃｈａｎｇら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２２：４７−５５（１９８７）；ならびにＬｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２９−３７、５１−６７、および７９−１０８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８４）を参照されたい。既述の特許、刊行物、および特許出願の各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。特定サイズの孔を通しての圧力下での押し出しはリポソームのサイズを調節する好ましい方法である。
【０３０２】
小胞サイズは生体分布に影響を及ぼすため、異なるサイズの小胞が様々な目的のために選択されてよい。例えば静脈内適用のためには好ましいサイズ範囲は約３０ｍｍと約１０μｍとの間の平均外径であり、好ましい平均外径は約５μｍである。一層具体的には静脈内適用のためには小胞のサイズは好ましくは約１０μｍもしくはそれを下回るサイズの平均外径であり、そして好ましくは約７μｍを下回り、そして一層好ましくは約５μｍを下回る平均外径である。好ましくは小胞は平均外径で約３０ｍｍを下回らない。例えば肝臓のような臓器への治療剤の輸送を提供するため、および正常組織からの腫瘍の識別を可能にするためには、約３０ｍｍと約１００ｎｍの間の平均外径という小さめの小胞が好まし
い。例えば腎臓もしくは肺のような組織の塞栓形成のためには、小胞は好ましくは平均外径で約２００μｍを下回る大きさであることが好ましい。鼻内、直腸内、もしくは局所投与のためには、小胞は好ましくは平均外径で約１００μｍを下回ることが好ましい。１および約１０μｍのサイズの間の大きな小胞は一般的には、例えばマクロファージのような血管に沿って並ぶ貪食性因子および洞様毛細血管に沿って並ぶクッパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞により清掃されるまで血管内空間に閉じ込められているであろう。洞様毛細血管の向こう側にある細胞まで進行してゆくためには、例えば平均外径が約１μｍを下回り、例えばサイズが約３００ｎｍを下回るような小さめの小胞が利用されてよい。好ましい態様では小胞は例えばマトリックス内に包埋されるよりはむしろ個別に投与される。
【０３０３】
細胞培養物用途のようなインビトロ使用では、気体充填小胞は培養物中の細胞に添加され、そしてその後にインキュベートされる。その後に音波エネルギーを、細胞およびリポソームを含む培養媒質に印加することができる。
【０３０４】
本発明の画像化方法を実施する際には、安定化剤および小胞組成物を単独でか、あるいは診断用試薬、生物活性試薬、もしくは他の試薬と組み合わせて用いることができる。そのような他の試薬は例えば矯味・矯臭剤もしくは着色用試薬のような賦形剤を含む。
【０３０５】
診断適用の場合には、例えば、超音波、ＣＴ、ならびに例えば超音波エネルギーのようなエネルギーが、標的組織を画像化するために患者の少なくとも一部分に適用される。患者の内部領域の可視像がその後に取得され、そのため疾患組織の存在もしくは非存在を確認することができる。超音波に関しては、第二調波画像化および同期イメージ画像化を初めとする超音波画像化技術が当業者に知られており、そして例えばＵｈｌｅｎｄｏｒｆ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃｓ，ａｎｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，１４（１）：７０−７９（１９９４）、およびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ，７（５）：４４１−４５８（１９９４）に記載され、これら各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。利用されるＣＴ画像化技術は通常のもので、そして例えばＣｏｍｐｕｔｅｄ  Ｂｏｄｙ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｌｅｅ，Ｓａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，ｅｄｓ．，１９８３，Ｒａｖｅｎｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，特に「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｔｅｒ−Ｐｏｇｏｓｓｉａｎ、および「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｒｏｎｂｅｒｇと題される最初の２章に記載されており、これら各々の開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０３０６】
超音波は診断および治療の両方の目的のために使用できる。診断用超音波の場合には、超音波もしくは超音波のパルス列が変換器を用いて印加されてよい。超音波は一般的には継続的というよりはむしろパルスとされるが、所望される場合には継続的であってよい。従って、診断用超音波は一般的にはエコーのパルスの適用を必要とし、この後、聴音期間の間に超音波変換器は反射シグナルを受信する。調波、超調波、もしくは分数調波が用いられてよい。第二調波モードは有利に利用されてよく、この場合、２×周波数が受信され、ここで×は派生的周波数（ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）である。このことはバックグラウンド物質からのシグナルを減少させ、そして例えば血塊のような所望の部位へ標的化させてよい本発明の標的化造影剤を用いて変換器からのシグナルを亢進させるのに役立つ。例えば奇数調波（一例では３×もしくは５×）のような他の調波はこの方法を用いることで同様に受信されるであろう。例えば×／２および×／３のような分数調波も受信されてよく、そして像を形成するように処理されてよい。
【０３０７】
パルス法に加え、持続波超音波（例えばＰｏｗｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ）が適用されてよ
い。これは堅い小胞（例えばポリメチルメタクリレートから製剤される小胞）が利用される際には特に有用であってよい。この場合、Ｐｏｗｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒの比較的高いエネルギーが作成されて小胞を共振させ、そしてそのことによりその破壊を促進させてよい。このことにより、分数調波もしくは超調波の範囲内となってよい、あるいは場合によっては適用された超音波と同一の周波数であってよい音響発振が行われ得る。この過程において放出されるあるスペクトラムの音響特性図が存在するであろうし、そしてそのように利用される変換器は例えば血塊の存在を検出するための音響発振を受信してよいことが企図される。それに加え、小胞破壊の過程を利用して、例えば血塊溶解を促進させるための血塊試料のような表面に対して運動エネルギーを移転してよい。従って治療学的塞栓形成は診断的および治療的超音波の組み合わせ中に達成されてよい。Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｏｐｐｌｅｒも利用されてよい。一般的には診断用超音波からのエネルギーレベルは小胞の破壊を促進し、そして生物活性試薬の放出および細胞によるその取り込みを促進させるには不十分である。先に記載されるように、診断用超音波は一つもしくは複数の音響パルスの適用を必要としてよい。パルス間のポーズ（一時的停止）により、反射された音響シグナルの受信および分析が可能となる。診断用超音波に用いられるパルスの限定数により検査対象となっている組織に輸送される効果的エネルギーが制限される。
【０３０８】
例えば、治療用超音波装置により作成される超音波のような高目のエネルギー超音波は一般的には小胞組成物の破壊をもたらすことができる。一般的には治療用超音波のための器具は約１０〜約１００％の動作周期を利用し、それは超音波で治療予定の組織の領域に依存する。例えば背中や大腿のような大量の筋肉塊を一般的には特徴とする身体領域、ならびに例えば心臓組織のような高度に血管が分布する組織は、例えば最高約１００％までの多きめな動作周期を必要としてよい。
【０３０９】
治療用超音波では、持続波超音波を用いて一層高目のエネルギーレベルが輸送される。小胞の破壊のためには、持続波超音波が好ましいものの、音響エネルギーもパルスされてよい。パルスされる音響エネルギーが用いられる場合には、音響は一般的には一度に約８〜約２０もしくはそれを上回るパルスからなるエコー列長さでパルスされるであろう。好ましくは、エコー列長さが一度に約２０パルスである。それに加え、用いられる音の周波数は約０．０２５〜約１００メガヘルツ（ＭＨｚ）に変化してよい。一般的には治療用超音波の周波数は約０．７５と約３ＭＨｚとの間の範囲に入ることが好ましく、約１〜約２ＭＨｚが一層好ましい。それに加え、エネルギーレベルは平方センチメートル（ｃｍ２）当たり約０．５ワット（Ｗ）〜約５．０Ｗ／ｃｍ２に変化してよく、約０．５〜約２．５Ｗ／ｃｍ２のエネルギーレベルが好ましい。温熱療法に必要となる治療用超音波のためのエネルギーレベルは一般的には約５Ｗ／ｃｍ２〜約５０Ｗ／ｃｍ２である。例えば約０．５μｍを下回る直径を有する小胞のような極小小胞については、一層高い音周波数が一般的には好ましく、なぜなら一層小さな小胞は一層高い音周波数で一層効果的に音響エネルギーを吸収することができるためである。例えば約１０ＭＨｚを上回るような極高周波数が用いられる場合には、音響エネルギーは一般的には、限られた深度でのみまでではあるが液体および組織を貫通するであろう。従って音響エネルギーの外部適用は皮膚もしくは他の表在組織には有用であってよい。しかしながら一般的には深部構造にとっては超音波エネルギーの焦点を合わせることが必要であり、そのため超音波エネルギーが焦点領域内に向けられることが好ましい。別法では超音波エネルギーは間質プローブ、静脈内超音波カテーテル、もしくは管腔内カテーテルを介して適用されてよい。先に論じられる治療用使用に加え、本組成物は食道癌に関連させて、もしくはアテローム性動脈硬化の治療のための冠状動脈の際、および例えば米国特許第５，１４９，３１９号（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載されている治療学的使用の際に利用することができる。
【０３１０】
２周波数の超音波を利用する治療学的超音波器具が用いられてよい。最初の周波数は×
であってよく、そして第二周波数は２×であってよい。好ましい形態ではこの装置は第一および第二周波数の焦点領域が単一焦点領域に収束するように設計されるであろう。この器具の焦点領域はその後に標的化組織内の例えば標的化小胞組成物のような標的化組成物に向けられてよい。この超音波器具は、×および２×周波数の超音波エネルギーの同時印加を用いる第二調波療法を提供してよい。小胞を必要とする超音波の場合には、この第二調波療法が単一周波数を必要とする超音波エネルギーと比較すると改善された小胞の破壊を提供してよいことが企図される。また、好ましい周波数範囲は小胞の基本調波周波数内に存在してよいことが企図される。低めのエネルギーもこの器具と共に用いてよい。既述の第二調波療法に関連して利用されてよい超音波器具は例えば、Ｋａｗａｂａｔａら、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３：１−５（１９９６）に記載されており、この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０３１１】
超音波画像化における使用のためには、好ましくは本発明の小胞は２ｄＢを上回る、一層好ましくは約４ｄＢと約２０ｄＢとの間の反射率を保持する。これらの範囲以内では本発明の小胞にとっての最高反射率は、大きめの小胞により、小胞の高目の濃度により、そして／または高目の超音波周波数が利用される際に示される。
【０３１２】
治療用薬剤輸送のためには、本発明の標的化治療剤輸送系を含む生物活性試薬の破壊は、例えば標的用リガンドでの輸送を介し、その領域にリポソームが投与されるか、そうでない場合にはその領域にリポソームが到達した後に、治療が所望される患者の領域に所定の周波数の超音波を適応することにより驚くほど容易に実施される。具体的には、気体充填小胞を含む生物活性試薬のピーク共振周波数に対応する周波数で超音波が適用される際には小胞は破裂し、そしてそこに内容物を放出することを、我々は予期せずして発見した。ピーク共振周波数はインビボもしくはインビトロのいずれかで決定され得るが、好ましくはインビボで、安定化剤もしくは小胞（これにはリポソームを含む）を超音波に露出させ、反射される共振周波数シグナルを受信し、そして通常の方法を用いてピークを決定するために受信されたシグナルのスペクトルを分析することにより決定される。そのように決定されるピークはピーク共振周波数もしくは第二調波（時としてはそう称される）に対応する。
【０３１３】
好ましくは本発明の組成物は、約０．５と約１０ＭＨｚとの間のピーク共振周波数を有する。当然のことながら本発明の気体充填小胞のピーク共振周波数は、外径、およびある程度はリポソームの耐屈曲性もしくは柔軟性に依存して変化するであろるが、一層大きく、かつ一層耐屈曲性が高いもしくは柔軟であるリポソームは、小さく、かつ耐屈曲性が低いもしくは柔軟でない小胞と比較すると、その共振周波数は低くなる。
【０３１４】
気体充填小胞を含む生物活性試薬は高目の強度（ワット数）および期間（時間）と組合わされて非ピーク共振周波数超音波に露出される際にも破裂するであろう。しかしながらこの高目のエネルギーにより、所望されなくてよいかなりの高熱がもたらされる。ピーク共振周波数に適合するようエネルギーの周波数を調節することにより、破裂および放出の効率は改善し、感知できるほどの組織加熱は一般的には生じることがなく（約２℃以上の温度上昇は全く見られないことがほとんどである）、そして必要総体エネルギーは低くなる。従って、必要とはされないものの、ピーク共振周波数での超音波適用は最も好ましい。
【０３１５】
診断用もしくは治療用超音波のためには、様々な種類の診断用超音波画像化器具の内のいずれかが本発明の実施の際に利用されてよく、器具の特別な種類もしくはモデルは本発明にとっては重要ではない。やはり適切なのは、超音波温熱療法を施すために設計された器具であり、このような器具は米国特許第４，６２０，５４６号、第４，６５８，８２８号、および第４，５８６，５１２号に記載されており、これら各々の開示は全体が引用に
より本明細書に取り込まれる。好ましくはこの器具が共振震盪数（ＲＦ）スペクトル分析機を利用する。変換器プローブは外部から適用されてよく、もしくは移植されてもよい。超音波は一般的には低めの強度および短めの期間から開始し、そしてその後に、強度、時間、および／または共振周波数を、小胞が超音波上で可視化されるか（診断用超音波適用法用）もしくは破裂するまで（治療用超音波適用法用）増加させる。
【０３１６】
平均外径が約１．５〜約１０μｍの気体充填小胞については多種多様の理論の適応法は当業者には、本開示を参照にし、一般的手引きにより容易に理解されるであろうが、共振振動数は一般的には約１〜約１０ＭＮｚの範囲内に入るであろう。標的組織（例えば、腫瘍）の中心に焦点領域を調整することにより、気体充填小胞をリアルタイム超音波下で可視化させることができ、なぜならそれらは標的組織内に蓄積するためである。一例では７．５ＭＨｚの湾曲アレー（ｃｕｒｖｅｄ  ａｒｒａｙ）変換器を用い、最大限にまで変換器に輸送される電力を調節し、そして標的組織内に焦点領域を調節すれば、空間ピーク時間平均（ＳＰＴＡ）出力はその後に水中でおおよそ５．３１ｍＷ／ｃｍ２の最大値になるであろう。この電力により気体充填小胞からの生物活性試薬の幾分かの放出がなされるであろうが、一層大きな放出は一層高い電力を用いることにより達成することができる。
【０３１７】
ドプラーモードへ変換器をスイッチングすることにより同一変換器からの最高２．５Ｗ／ｃｍ２までの高い電力出力が可能となる。ドップラーモードでの機械操作により、電力を標的組織内の選択された焦点領域に輸送することができ、かつ気体充填小胞から生物活性試薬を初めとするその内容物を放出させることができる。気体充填小胞の共振周波数を適合させるために変換器を選択することによりこの放出過程は更に一層効率的になるであろう。
【０３１８】
例えば平均外径が３μｍを上回る大きな直径の気体充填小胞については、低めの周波数の変換器が、治療剤放出を達成させる上で一層効果的であってよい。例えば、３．５ＭＨｚ（２０ｍｍ湾曲アレーモデル）の低周波数変換器が気体充填小胞の共振周波数に対応するように選択されてよい。この変換器を使用すると、１０１．６ｍＷ／ｃｍ２が焦点に輸送されてよく、そしてドップラーモードへのスイッチングにより電源出力（ＳＰＴＡ）が１．０２Ｗ／ｃｍ２に増加するであろう。
【０３１９】
気体充填安定化剤および／または小胞内でプロドラッグを放出および／または活性化させるための空洞形成の現象の使用のためには低い周波数エネルギーを使用してよく、なぜなら空洞形成は低い周波数で一層効果的に生じるためである。高電圧（３００ボルトの高さ）で駆動させる０．７５７ＭＨｚ変換器を用いることで、気体充填リポソーム溶液の空洞形成は約５．２気圧の閾値で生じるであろう。
【０３２０】
以下の表は、例えばレシーバーパルサー１９６６  Ｍｏｄｅｌ  ６６１つきのＰｉｃｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｔｙｎｇｓｂｏｒｏ，ＭＡ）Ｐｏｒｔａｓｃａｎ一般目的用スキャナー；８０Ｃ  Ｓｙｓｔｅｍを初めとするＰｉｃｋｅｒ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）Ｅｃｈｏｖｉｅｗ  ８Ｌ  ＳｃａｎｎｅｒもしくはＭｅｄｉｓｏｎｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）Ｍｏｄｅｌ  Ｄ−９  Ｖｅｒｓａｔｏｎｅ  Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｄｏｐｐｌｅｒのような通常に用いられる装置において診断用超音波から組織に伝達されるエネルギーの範囲を示す。一般的にはパルス反復に利用されるこれらのエネルギー範囲は診断および気体充填リポソームのモニターには有用であるが、本発明の気体充填リポソームの破壊には不十分である。
【０３２１】
【表６】
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【０３２２】
固定周波数もしくは変調周波数のいずれかの超音波が用いられてよい。固定周波数は音波の周波数が長時間一定である場合として特定される。変調周波数は、波周波数が長時間の内には例えば高い値から低い値に（ＰＲＩＣＨ）もしくは低い値から高い値に（ＣＨＩＰＲ）変化するものである。例えば、初期周波数が１０ＭＨｚの音波エネルギーでのＰＲＩＣＨパルスが１〜５ワットの増加電力で掃射される。焦点を合わせ、周波数を変調してある高エネルギー超音波は、リポソーム内での局在気体膨潤および治療剤の局所輸送を提供するための破裂の速度を増加させてよい。
【０３２３】
気体充填標的化治療剤輸送系が薬剤輸送（ステロイドプロドラッグおよび／または標的化用リガンドを含む）用に用いられる場合には、輸送予定の生物活性試薬は小胞の壁内に埋め込まれ、小胞内に閉じ込められ、および／または小胞の表面に連結されてよい。成句「〜に連結される」もしくはその変形物は、生物活性試薬の位置に関連させて本明細書内で用いされる際には、生物活性試薬が、例えば共有結合もしくはイオン結合、または他の化学的もしくは電気化学的連結もしくは相互作用の手段を通して、マイクロスフェアの壁の内側および／または外側に何らかの様式で連結して結合することを意味する。成句「〜に被包される」もしくはその変形物は生物活性試薬の位置に関連して用いられる場合には、その生物活性物質が内部マイクロスフェア空隙内に位置することを意味する。成句「〜内に包埋される」もしくはその変形物は生物活性物質の位置に関連して用いられる場合には、小胞壁（一つもしくは複数）または層（一つもしくは複数）内での生物活性試薬の位置決定を意味する。成句「生物活性試薬を含む」は、小胞に関連する様々な種類の位置決定の全てを意味する。従って、生物活性試薬の位置は様々に決定することができ、例えば気体充填小胞の内部空隙内に捕獲され、気体と気体充填小胞の内壁との間に位置し、気体充填小胞の外部表面上に取り込まれ、小胞構造自体の中に巻き込ませ、そして／またはそれらのいずれかの組み合わせ物であることができる。輸送用ビヒクルは更には、安定化剤および／または小胞の内部および外部の両方での薬剤の対称もしくは非対称分散が存在するように設計されてよい。
【０３２４】
多種多様の生物活性試薬の内のいずれかは小胞内に被包されてよい。所望される場合には一つを上回る数の生物活性試薬が小胞を用いて適用されてよい。例えば単一小胞が一つもしくは複数の生物活性試を含んでよいか、または異なる生物活性試薬を含む小胞が同時投与されてよい。一例として、黒色腫抗原に結合することができるモノクローナル抗体とＩＬ−２の一部分を少なくともコードするオリゴヌクレオチドとが同時に投与されてよい。成句「少なくとも一部分」は、示される遺伝子の部分が有効ブロックを遺伝子発現に提供する限りはそのオリゴヌクレオチドにより示される必要はない遺伝子全体を意味する。好ましくは少なくとも一つの生物活性試薬がステロイドプロドラッグである。一層好ましくは生物活性試薬の内の一つがステロイドプロドラッグであり、そして他の生物活性試薬が標的リガンドである。
【０３２５】
酸素気体で充填される気体充填小胞は空隙作成と共に多量のフリーラジカルを作成するはずである。また、遷移系列からの金属イオン、特にマンガン、鉄、および銅は酸素からの反応性酸素中間体の形成速度を増加することができる。小胞内に金属イオンを被包することによりインビボでのフリーラジカル形成を増加させることができる。これらの金属イオンは、遊離塩として、例えばＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、もしくはデスフェリオキサミンのような複合体として、または金属イオンのオキシドとしてリポソーム内に取り込まれてよい。それに加え、金属イオンの誘導化複合体を脂質頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）に結合させてよく、またはイオンの親油性複合体が例えば脂質二重層内に取り込まれてよい。例えば空洞形成のような熱刺激に露出される場合にはこれらの金属イオンは反応性酸素中間体の形成速度を上昇させるであろう。更には例えばメトロニダゾールおよびミソニダゾールのような放射線増刊剤が熱刺激の際にフリーラジカルを作成するように気体充填小胞内に取り込まれてよい。
【０３２６】
いずれかの特別な操作理論に縛られることは意図していないものの、本発明のステロイドプロドラッグの使用の例は、血清中の酵素作用によりインビボで容易に開裂するエステル結合を介するステロイドへのアシル化化学基を連結させることを含む。その後にアシル化ステロイドプロドラッグを気体充填小胞もしくは安定化剤内に取り込ませてよい。その後にステロイドプロドラッグを標的リガンドを介して適切な組織もしくはレセプターに輸送してよい。所望される組織もしくはレセプターに到達する際には気体充填小胞は超音波からの音響パルスにより破壊もしくは弾けてよく、そして小胞により被包されるステロイドプロドラッグがその後に血清に露出されてよい。その後にはエステル結合は血清注のエステラーゼにより開裂されてよく、そのことによりステロイドが生成される。しかしながらそのステロイドが治療学的に効果的となるためにそのステロイドがアシル化された化学結合およびエステル結合から開裂される必要はない。言い方を代えると、ステロイドプロドラッグはステロイドの生物活性を保持してよい。
【０３２７】
同様に、超音波は気体充填小胞を破壊するのみならず、プロドラッグからの活性試薬の化学開裂およびその放出（例えば、結合基および脂質部分からのステロイドの放出）の速度を増加させてよい熱効果を引き起こすのに利用されてよい。生物活性試薬の特別な化学構造は所望される可溶性を達成するように改変されてよく、そのため生物活性試薬は、小胞の内部気体充填空間内に被包され、小胞表面に連結され、小胞内部に埋め込まれ、および／またはそれらのいずれかの組み合わせ物のいずれかであってよい。表面に結合された生物活性試薬は一つもしくは複数のアシル鎖を保持してよく、そのため小胞が破壊もしくは加熱されるか、または空洞形成により破壊される際にはアシル化された生物活性試薬はその後に表面を離れてよく、そして／または生物活性試薬はアシル鎖化学基から開裂されてよい。同様に他の生物活性試薬は、芳香性であるかもしくは構造がステロールである疎水性基と共に製剤されて小胞の表面内に取り込まれてよい。
【０３２８】
例えばリューマチ性関節炎により引き起こされる炎症性関節のような高体温は、温度感
受性前駆体マトリックスを含む小胞の壁から被包されたステロイドプロドラッグを輸送するための補足メカニズムとして用いることができる。いずれかの特別な操作理論に縛られることは意図していないものの、この方法は部分的には典型的には疾患、炎症、感染症などに関連する局所的温度上昇の現象に基づく。生理学的ストレス状態としても引用されてよいこのような状態はある程度の分数分または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、もしくはそれを上回る程度で患者の領域の温度を上昇させてよい。例えば通常のヒト体温は約３７℃であるものの、疾患、炎症、感染症により侵されている組織は例えば一例では約４０℃のような約３７℃を上回る温度を有することができる。通常の生理学的温度では液体であり（すなわち、通常の状態下では特別な哺乳類の体温）、そして高温では気体を形成するための相転移を受ける物質を取り込ませることにより、本発明の方法はステロイドプロドラッグが患部組織に効率的に輸送され、そしてその部位で有利に放出できるようにさせる。気体前駆体が例えば液体もしくは固体から気体への相転移を受ける場合には、気体前駆体内に保持されるステロイドプロドラッグは組織の領域内に放出されてよく、そこのことにより必要が生じている領域へのステロイドプロドラッグの輸送に影響が及ぼされる。従って本方法に従うと、高温という領域区分された状態により影響を受けない他の患者領域は迂回され、そしてステロイドプロドラッグは必要が生じている領域に選択的に輸送される。
【０３２９】
身体の所望される組織もしくは領域へのステロイドプロドラッグの輸送は、局所温度が気体前駆体の相転移温度もしくはそれ以上によりなる時に活性化される。小胞もしくは非小胞性組成物、または気体前駆体を含む小胞は患者の身体を循環するため、そういった小胞は脈管系を介して組織を通過するであろう。その気体前駆体の相転移温度にある組織もしくは領域を通過する際には気体前駆体は気体状態への転移を受ける。いずれかの特別な操作理論に縛られることは意図していないものの、相転移の間の気体前駆体の膨張は小胞もしくは非小胞性組成物からのステロイドプロドラッグを患者の所望の領域に強制的に沈着させる。本発明の好ましい態様ではステロイドプロドラッグの輸送は、疾患、感染症、炎症などに関連する組織もしくは領域内の温度の上昇に単に起因して、その組織もしくは領域内で達成される。
【０３３０】
好ましくは気体前駆体は、疾患、感染症、炎症などに起因する通常の体温と比較すると高温であってよい身体の所望組織もしくは領域で気体を形成する。しかしながら、外部加熱（すなわち、その領域の生理学的高体温以外の源からの加熱）も、所望される場合には患者の領域もしくは組織内の体温を上昇させるために適応されてよい。外部加熱は当該技術分野に知られるいずれかの方法により適応されてよく、それらは例えばマイクロ波、高周波、超音波、および加熱の他の局所適用である。加熱の他の局所適用は例えば、水浴槽もしくは毛布により達成されてよい。身体の所望組織もしくは領域内での温度上昇は、振動磁界もしくは超音波エネルギーの適用と組合わされて間質プローブの埋め込みもしくはカテーテルの挿入により達成されてよい。超音波エネルギーが用いられる場合には、超音波エネルギーは気体前駆体および／または安定化剤と相互作用してよく、そして気体前駆体の気体への転移および／または生物活性試薬の放出を促進させてよい。当業者には明らかなように、適用される超音波エネルギーは、気体前駆体および安定化剤との相互作用を促進させる目的でパルスにされるか、掃射されるか、もしくは変化させられてよい。診断用超音波は気体が形成される際に気体前駆体を可視化させ、そして目的の組織もしくは領域を可視化させる目的で用いられてよい。
【実施例】
【０３３１】
本発明は以下の実施例に更に詳細に記載される。実施例２、１６、２０、および２１は実際の実施例であり、そして実施例１、３〜１５、１７〜１９、および２２は予想としての実施例である。これらの実施例は説明を目的とし、そして本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【０３３２】
ＡＡＬは０．５モルのＭＲＸ１１５前駆体を３２０μｌの大豆油と混合することにより作成した。７−ニトロ，２，１−ベンゾキサジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）でラベルしたジパルミトイルホスホエタノールアミンを、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で大豆油に添加した。この混合物を２ｍｌのウイートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）バイアル内に入れ、そしてヘッドスペースを除去し、そしてペルフルオロブタンで入れ替えた。その後にこのバイアルをＥｓｐｅ  ＣＡＰＭＩＸ上で６０秒間震盪した。スクロースグラジエントを、１０％および９０％スクロース溶液の等量部を混合する事により５０ｍｌオークリッジ（ｏａｋｒｉｄｇｅ）チューブ内で作成した。この遠心分離機用チューブを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６卓上式遠心機内のＴＨ−４スイング式バケットローター内に３０分かけて入れてグラジエントを形成させた。３つの試料を合わせ、そして各グラジエントチューブに添加した。泡状物高さをＴｏｙｏディジタルマイクロメーターで測定した。その後にこの混合物を３０分間遠心にかけて遊離物質から気泡保有物質を分離した。泡状物高さを再度マイクロメーターにより測定して総計泡状物転化を決定した。その後に試料をバイアル（プレ）から、およびグラジエントチューブから取り出した。これらを９６ウエルプレートにアリコートとして分け入れ、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆＭａｘフルオロメーターでアッセイした。以下のデータが得られ、これにより類似サイズのＡＡＬおよび特に５および１０ｍｇ／ｍｌリン脂質濃度でのＭＲＸ−１１５としてのリン脂質組成物についての捕獲ＮＢＤの増加負荷が示される。
【０３３３】
【表７】
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【実施例２】
【０３３４】
実施例１に用いられる方法は以下のとおりであり、０．５ｍｌ単位／ｍｌのウロキナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を実験試料中のラベル化ＤＰＰＥに添加する。以下に示されるデータは大豆ＡＡＬ中の捕獲効率を示す。数字は蛍光測定値を示す（溶液内に放出され、リポソーム破壊を意味するラベル化ＤＰＰＥの量に比例する）。
対照−ウロキナーゼなし、大豆油なし              ８８１．３
脂質中のウロキナーゼ（油状物なし）              ７０４．２
脂質中のウロキナーゼ＋大豆油                    ７０７．６
このデータは、大豆油とウロキナーゼが幾分かは破壊から脂質小胞を安定化させることを示し、そしてウロキナーゼはＡＡＬ内および通常のリポソーム内に取り込まれることをよく示している。
【実施例３】
【０３３５】
ＰＦＣなしでのリポスフェアの製造。大豆油（容積＝１６０マイクロリットル）（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ社、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を、８：１：１の重量比で通常の食塩水対ポリエチレングリコール対グリセロールを含む混合物１ｍｌ中に懸濁させた。この脂質は更にはｍｌ当たりに１ｍｇの８２モルパーセントジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＥ）、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、および８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５，０００）を含んでいた。全脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂｓｔｅｒ，Ａｌａ、から購入した。この溶液を２ｍｌのバイアル内に密封し、そしてＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（商標）歯科用アマルガーター上で４５秒間、４，５００ＲＰＭで震盪した。得られるリポスフェアを５００×の倍率でＮｉｈｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ２００顕微鏡で検査した。平均粒子サイズは約５ミクロンであり、サイズが５０ミクロン以上でも適用可能な粒子となる。この粒子は、周辺脂質層および油の中心均一部分からなる同心スフェアであるように見えた。
【実施例４】
【０３３６】
ＰＦＣなしでスダンブラック染料（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｄｙｅ）が添加されているリポスフェアの製造。先の実施例＃１が実質的には実施されるが、例外は１５０マイクログラムの親油性染料スダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、大豆油が脂質の液体懸濁物に添加される以前に１６０マイクロリットルの大豆油に溶解された点であった。リポスフェアが先の要領での撹拌を介して製造された後には再度顕微鏡での検査を実施した。均一で灰色がかった内部がリポスフェアの内部に観察された。このスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）はリポスフェア内に捕獲されているのが観察され、そしてリポスフェアの外側には認識できる程のスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）は全く存在しなかった。スダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）の量を３２０マイクロリットルに増加させた際にはリポスフェアの見かけは一層黒っぽくなったが、スダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）はリポスフェアの外側には全く存在しなかった。顕微鏡により示されるリポスフェアのサイズはスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）があってもなくても類似していた。
【実施例５】
【０３３７】
ＰＦＣでのリポスフェアの製造−音響活性ポリスフェア（ＡＡＬ）の形成。サイズが小さくなると粒子数が多くなることの証明。先の実施例＃１を反復させたが、例外は２０マイクロリットルのペルフルオロヘキサンがバイアルに添加されたことであった。
【０３３８】
以下の表２に示されるように、脂質／油懸濁物内に存在するＰＦＣと共に震盪するＡＡＬは粒子数が多くなりかつ平均粒子サイズは減少していた。
【０３３９】
【表８】
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【実施例６】
【０３４０】
実施例３における方法を反復したが、例外は３２０マイクロリットルのスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）を震盪以前に脂質／油／ＰＦＣ混合物に添加したことであった。実施例２に示されるように、黒色染料はマイクロスフェア内に含まれ、そして周囲の媒質内には存在しないように見えた。粒子のサイズおよび計数値は実施例３に類似していた（表２を参照されたい）。顕微鏡検査では、ペルフルオロヘキサンマイクロスフェアは灰色もしくは暗色物質の周辺縁（スダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）染料）および中央の透明球状領域を含むように見えた。
【実施例７】
【０３４１】
実施例１の方法を反復したが、例外はバイアルのヘッドスペースを排気させ、そしてペルフルオロブタン気体で入れ替えた事であった。ペルフルオロブタン気体のヘッドスペースを有するバイアルをアマルガメーター上で震盪した。粒子サイズ決定を行い、それに関しては表１を参照されたい。顕微鏡により、粒子は半透明な周辺（恐らく油）および透明な中央領域（恐らく気体）を有するように見えた。
【実施例８】
【０３４２】
実施例２の方法を反復したが、例外は実施例５におけるようにペルフルオロブタンでヘッドスペースを置き換えたことであった。暗色染料が粒子の周辺に見られ（染料および油）そして中央（気体）は透明に見えた。粒子サイズ（下記の表２を参照されたい）は実施例５の粒子に類似していた。
【実施例９】
【０３４３】
先の実施例５の表のライン１に具体的に示されるＡＡＬの減衰量を、パルス−エコーモードで２．２５ＭＨｚ変換器（ＫＢ−Ａｅｒｏｔｅｃｈ，Ｌｅｗｉｓｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いて検査した。この変換器はＰａｎａｍｅｔｒｉｃ  ５０５２ＰＲパルサー／レシーバー（Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）により稼働させた。その試薬の１／１０ｍｌを室温でｄｄＩ水で充填された４５０ｍｌのシリンダー型チャンバー内に注入した。後部壁からの反射エコーは同一の変換器により受信され、そしてオシロスコープに表示された。ピーク間増幅を検査期間直前および期間中に測定し、そして造影剤の注入後に１分の間隔で３０分間記録した。１００ｋＨｚ変換器（Ｍａｔｅｃ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）は、ＡＡＬの活性化のために造影剤の注入後５分間スイッチを入れておいた。２つの事なる音響場を、この目的のために用いた。まず変換器をその中央周波数で持続モードで作動させた。ピーク間音圧の最大増幅は２．６キロパスカルであった。次には変換器を１ｋＨｚのパルス周波数およびバースト数７でのパルス様式で作動させた。この設定でのピーク間音圧の最大増幅は５．５キロパスカルであった。音響活性化の効能を調査するために、この実験を１００ｋＨｚ変換器なしで反復させた。
減衰計数は以下のように算出される：
［ｄＢ／ｃｍ］でのＡ．Ｃ．＝２０（ｌｏｇ１０｛［Ｐ−ＰＡＰＣ］／［Ｐ−ＰＡＯＰＣ］｝）を２×チェンバー直径で除算する（この場合、ＡＰＣは増幅プレコントラストであり、そしてＡＯＰＣは増幅ポストコントラストである）。
【０３４４】
図７に示されるように１００ｋＨｚ変換器は本質的にはパルスモードでは全てのマイクロバブルを破壊する。このパルスモードは小胞の破壊については持続波モードよりも一層効率が高い。これはパルスモードが、持続モードと比較すると大きなピーク圧を生じるためである。好ましくは超音波のピーク圧は１キロパスカルと１０メガパスカルとの間であり、そして一層好ましくは１０キロパスカルと５メガパスカルとの間である。周波数範囲は約２０ｋＨｚ〜５０ＭＨｚの間で変化する。
【実施例１０】
【０３４５】
場合によっては存在する標的化用部分を有するＡＡＬの使用
直鎖ペプチドＣＲＧＤＣを、アルファーアミノ−ＦＭＯＣ保護を用いて標準固相法により合成した。この方法は、保護されたアミノ酸のα−アミノ部分上のフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基の使用を必要とするであろう。この場合、保護されたバリン（ＦＭＯＣ−Ｖａｌ）はジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）および酢酸エチルを用い、その後に還流することにより樹脂に結合させる。簡潔に述べると３−ニトロ−ブロモメチル−ベンゾイルアミドポリスチレン樹脂はＲｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．ａｎｄ  Ｇｕｒａｗａ，Ｓ．Ｋ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９７：６，１５７５−１５７９、Ｍａｒｃｈ  １９，１９７９（これらの開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）に記載される要領で製造されるであろう。この樹脂に、Ｂｏｃ−Ｖａｌｉｎｅ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）（０．６ｍモル、１等量）と共に酢酸エチル（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中のジイソプロピルエチルアミン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．６ｍモル、１等量）が添加され、そして還流される。その後に残りの保護されたアミノ酸が標準カップリング法を用いてカップリングされる。Ｂｏｃ基の脱保護は、その樹脂を無水塩化メチレン中の４５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）に２分間露出し、そしてその後に酸を回収することにより達成される。その後に４５％  ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２を２０分間用いて第二回目のすすぎ
が実施される。この樹脂をＣＨ２Ｃｌ２を用いて２度洗浄し、そしてＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の２×２分の添加、およびその後のＣＨ２Ｃｌ２での２×２分のすすぎにより中和させる。アミノ酸を、適切なＢｏｃ−アミノ酸（１．２ｍモル、２等量）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）（１．２ｍモル、２等量）、ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢＴ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）（１．２等量）およびＮ−メチルピロリドン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加を介して脱保護させたバリン残基のアミノ末端にカップリングさせる。カップリングはＫａｉｓｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，５９５，１９７０（この開示は全体が引用により本明細書に取り込まれる）の方法を用いて完成しているかどうかをモニターする。不完全なカップリングは反復カップリングを必要とする。カップリング後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２の２×２分の洗浄により洗浄する。残りの保護されたアミノ酸は同一様式でカップリングさせてＣＲＧＤＣ−樹脂複合体を提供する。樹脂へのＦＭＯＣ−Ｖａｌの結合後、更なるカップリングを以下に記載される要領で開始させる。
【０３４６】
２０％ピリジン／Ｎ−メチルピロリドンの使用後の検出。ＦＭＯＣ−Ｖａｌ樹脂複合体は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）もしくはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）での５×１分間の洗浄にかける。ＦＭＯＣ基は２０％ピペリジン／ＮＭＰ×２０分で除去される。これを反復した後、ＤＭＰもしくはＮＭＰでの５×１分の洗浄を行う。
【０３４７】
適切なＦＭＯＣ保護アミノ酸（２等量）が２等量のＤＩＣもしくはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾル（２等量）およびＤＭＦ、もしくはＮＭＰと共に添加される。カップリング反応が完了したことは、Ｋａｉｓｅｒのニンヒドリン検出方法を用いてモニターされる。
【０３４８】
先に記載される段階は、追加的ＦＭＯＣ−保護アミノ酸のカップリングについて反復される。
【０３４９】
ペプチドＣＲＧＤＣはリシンの側鎖保護のみを必要とする。多数の保護基スキームはこの合成スキームに適合する。例えば、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）側鎖保護基を有するＢｏｃ−Ｌｙｓを用いて他のアミノ酸、ＰＥＧ、もしくは側鎖基を有するＤＰＧＳの反応を阻止してよい。それに加え、β−カルボキシフルオレニルメチル（ＯＦｍ）エステル結合を有するＢｏｃ−Ａｓｐを用いて側鎖カルボキシルを保護してよい。樹脂からのＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＣＲＧＤＣの除去の前に、２０％ピペリジンおよびＮ−メチルピロリドンという緩和な条件がリシンから両方のＦＭＯＣ基を除去するために開始されてよい。
【０３５０】
それに加え、ＦＭＯＣ法に適合するが、ただし除去のためには緩和な条件のみを必要とする多数の側鎖保護基が用いられてよい。例えば、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ−（Ｏ−Ｄｍａｂ）−ＯＨおよびＦＭＯＣ  Ｌｙｓ−（Ｄｄｅ）−ＯＨ［式中、Ｄｍａｂは４−（Ｎ）−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル］アミノ）ベンジルエーテルであり、そしてＤｄｅは１−（４，４ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチルである］をこの合成のパートＢで用いることができ、その後にはＮＭＰ、ＤＭＦ、もしくはＣＨ２Ｃｌ２中の２％ヒドラジンを１時間用いる側鎖基の開裂が行われる。側鎖の除去の後にはＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＣＲＧＤＣを２×２分のＮＭＰで洗浄する。
【０３５１】
よりすぐりの樹脂は、Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｇｕｒｗａｒａ，（１９７５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ９７：１５７５−１５７９、により用いられる光に対して不安定な樹
脂である。アルギニンの側鎖グアニジウムはＣｂｚ（カルボベンジルオキシ）基（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）により保護した。その後にＤＰＰＡを、標準ジイソプロピルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾルカップリングによりペプチドにカップリングさせた。Ｃｂｚ保護基は酸素化（Ｈ２＋ＰＤもしくはＰｔ）により除去した。複合化合物を、４５０Ｗ  Ｈａｎｏｖｉａ  ａｒｃランプからの照射を用いて樹脂から開裂させる。その後、この生成物をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて部分精製する。シスチエンチオール基の環化は、氷酢酸でｐＨを４．０に調節した水中にペプチドを溶解することにより達成される。フェリシアン酸カリウムを最終濃度が０．１Ｍになるようにペーストを撹拌しながら添加し、これを黄色が持続して存在するようになるまで持続させる。その後にｐＨをトリエチルアミンで７．０に調節し、そしてこの溶液を凍結および凍結乾燥させて未精製生成物を取得する。この物質は逆相ＨＰＬＣにより精製することができる。精製されたペプチド共役物をその後に、本発明のＡＡＬ組成物の内のいずれかのものと一緒にインキュベートする。
【実施例１１】
【０３５２】
デキサメサゾンが選択され、その理由はこれが非常に有能な疎水性抗炎症剤であるためである。デキサメサゾンは水中では１００ｍｇ／Ｌの溶解度を示す。この混合物は、８０ｍｇのＰＥＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂ（ＤｕＰｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を２０ｍｇのデキサメサゾンに添加することにより作成する。この混合物をメタノールに溶解し、そして乾式フィルムになるまで真空下でのロータリーエバポレーターにかける。このフィルムを高真空（１２ミリトール）に一晩供する。このフィルムを１０ｍｇ／ｍｌで脱イオン水中で再構成し、そして９０ワットで１５分間超音波処理する。得られる懸濁物は均一である。この混合物の内の１ミリリットルを１ｍｌ／分で脱イオン水中で溶出させるセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）  Ｓ−２００−ＨＲカラム（１／２インチ×７インチ）に投与し、分画を３ｍｌ毎に回収する。これらの分画を液体窒素中で凍結および凍結乾燥させる。凍結乾燥させた分画を各５ｍｌのメタノール中に溶解もしくは再構成させ、そしてＵＶ分光計で２３５ｎｍで走査する。メタノール中のデキサメサゾンに関する最大吸光は、メタノール中にデキサメサゾンを溶解させ、そして３２０ｎｍ〜２２０ｎｍを走査したことにより決定された所によると２３５〜２３８ｎｍであった。純粋なメタノールは３２０ｎｍと１９０ｎｍとの間で走査され、そして２１０ｎｍ以下には吸光が全く存在しないことが観察される。前の試料からの残存値を持ち越して測定してしまわないように、走査前には各試料毎に純粋エタノールを用いて基準地を０に合わせ直す。標準曲線は２３７ｎｍピーク吸光でのメタノール中デキサメサゾンから構築する。この標準曲線は２．５と２５μｇ／ｍｌとの間である。ＰＥＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂを含む分画は懸濁物であり、そして正確には走査されないことがある。残りの分画を走査し、そして恐らくは遊離状態をとり、捕獲されていないデキサメサゾンを含んでいる。デキサメサゾン吸光の大半は分画１１〜１５にある。回収された全ての遊離デキサメサゾンは僅か７．３μｇである。メタノールに溶解され、そしてＵＶ２３５ｎｍで測定される、１０ｍｇ／ｍｌの再構築溶液２００マイクロリットルにより、２０％のＰＥＧ−Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂ凝集複合体はデキサメサゾンであることが示される。この実験により蛍光界面活性剤凝集技術が高い負荷効率を有することが示された。
【０３５３】
実施例１からのデキサメサゾンおよび蛍光界面活性剤（２０ｍｇのＰＥＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒ  Ｂ）を含む凍結乾燥物質を、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）コートしたバイアル中の１．５ｍｌの大豆油中に懸濁する。懸濁物上のヘッドスペースに０．１ｍｌのペルフルオロブタンを添加するが、最初は０℃で開始する。この懸濁物をその後室温にまで暖め、そしてＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ上で震盪する。その後にこの懸濁物の試料をホーン超音波装置からの超音波に供し、そしてｄＢ反射率を測定した。デキサメサゾンは、ホーン（Ｈｏｒｎ）−超音波前に脂質分画中で、そしてホーン（Ｈｏｒｎ）−超音波後に非脂質分画中でＵＶ−可視分光計により検出され、薬剤の放出が成功していることが示される。
【実施例１２】
【０３５４】
音響活性リポスフェアの製造
１グラムのα−トコフェロール、１．０グラムのレチン酸、および３グラムの大豆油をボルテックスミキサーで撹拌する。この混合物に、８２モルパーセントのＤＰＰＣ、１０モルパーセントのＤＰＰＡ、および８モルパーセントのＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（全てのリン脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ、からのものである）からなる１．０ｇの脂質ブレンドを添加する。この混合物を５０℃で１０分間撹拌し、その後に２００ｍｌの通常の食塩水および１％  ｗ／ｖ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６５を保持する容器に移し、そして温度を５０℃に維持しながら１６，０００ｐｓｉ下、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（１０×）で乳化させる。その後にこの物質を１．５ｍｌバイアル中に１．０ｍｌアリコートとして分割する。このバイアルを真空排気させ、そしてその後にヘッドスペースをペルフルオロブタンで充填する。得られる生成物は、約０．４５重量％のα−トコフェロールおよび０．４５重量％のレチン酸を含む油充填リポソームもしくはリポスフェア中の薬剤の懸濁物である。このバイアルを密封し、そしてＷｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ，Ｌｙｏｎｓ  ＩＬ）に入れ、そして２分間２８００ｒｐｍで撹拌する。最終生成物はペルフルオロブタン気体を導入してある音響活性リポスフェアからなり、平均直径は１０μｍ以下である。この生成物をこの形態もしくは注入直前に２μｍｌの粒子を除去する目的で濾過して注入することができる。
【実施例１３】
【０３５５】
眼疾患を治療するための音響活性薬剤担体の使用
実施例１２に記載される生成物は、黄斑変性症を患う患者の前肘静脈内に注入する。超音波エネルギーを、３ＭＨｚ変換器およびＰｏｗｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒを用いてその眼に適用する。画像化も同時に実施する。電力は、マイクロバブルが網膜循環を通して流れる際にしっかりとした第二調波シグナルが眼から得られるように増加させる。高濃度の酸化防止剤を網膜に輸送する。患者の疾患の進行度合いは高濃度の酸化防止剤により緩和する。
【実施例１４】
【０３５６】
眼疾患を治療するための音響活性薬剤担体の使用
ホーン超音波機（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｂｅ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ  ＮＹ）をウサギの眼の角膜内に入れ、そして実施例１２に記載される音響活性リポスフェアの静脈内注入の後に超音波エネルギーを２５ＫＨｚ、電力レベル２で５分間適用させる。
【実施例１５】
【０３５７】
タキソール（Ｔａｘｏｌ）を含む音響活性リポソームの製造
実施例１２を、α−トコフェロールおよびレチン酸を等量のタキソールに入れ替えて反復する。この製造法を用いて、眼に超音波を適用することにより網膜芽細胞腫もしくは眼の黒色腫を患う患者の眼の新生物を治療する。
【実施例１６】
【０３５８】
アンフォテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）を含む音響活性リポソームの製造
アンフォテリシンＢ（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ
Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を２ｍｇ／ｍｌで大豆油内に溶解した。実施例１５からの１．５ｍｌの脂質混合物を８０μｌのアンフォテリシンＢ（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ）溶液と混合し、そして７．５μｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇａｒｄｅｎａ，ＣＡ）を添加した。バイアルの
ヘッドスペースを真空により排気させ、そしてペルフルオロブタンで置換した。この混合物をＥＳＰＥ−Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で１分間震盪した。気泡は可視できる状態でアンフォテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）を取り込み、これはその色が黄色であることにより示される。これらは音響活性を示し、そして１．５μｍの荷重平均サイズを有した。アンフォテリシンは、ホーン（Ｈｏｒｎ）−超音波前に脂質分画中で、およびホーン（Ｈｏｒｎ）−超音波後に非脂質分画中でＵＶ−可視分光器により検出され、薬剤の放出が成功したことが示された。
【実施例１７】
【０３５９】
真菌性眼炎を治療するための音響活性アンフォテリシン−充填マイクロスフェアの使用
重度の真菌性眼炎を患う患者では、実施例１６の音響活性リポスフェアを静脈内注入し、そして超音波を、０．５ワット／ｃｍ２および１０％動作周期での１ＭＨｚ持続波装置を用いて眼に適用する。超音波エネルギーを、リポスフェアの注入後に１０分間眼に適用させて眼から真菌疾患を根絶する。
【実施例１８】
【０３６０】
色素性網膜炎のためのベンダザックの音響活性油エマルジョン
ベンダザック塩、特にリシン誘導体は水溶性であるものの、遊離ベンダザックは脂溶性であり、そしてそのため油に溶かしたリポスフェアのための本発明の態様に従う。色素性網膜炎の治療のためのベンダザックの音響活性分散物は、実施例１６におけるアモフォテリシンＢについてと同様に製造し、そして実施例１７における要領で眼に適応されてよい。
【実施例１９】
【０３６１】
良性前立腺肥大の治療のためのドキサゾシンの音響活性エマルジョン
プラゾシンと命名されるドキサゾシンの光学活性形態（米国特許第４，１８８，３９０号、４−アミノ−２−［４−（１，４−ベンゾジオキサン−２−カルボニル）ピペラジン−１−イル］−６，７−ジメトキシキナゾリンの（＋）異性体であって、１−（４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−キナゾリニル）−４−［（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキサン−２−イル）カルボニル］ピペラジンとしても知られる）を、３ｍｇ／ｍｌの濃度で大豆油に溶かした。実施例１３からの脂質混合物１．５ｍｌを１００μｌのプラゾシン溶液と混合し、そして７．５μｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇａｒｄｅｎａ  ＣＡ）を添加した。バイアルのヘッドスペースを真空により排気し、そしてペルフルオロブタンで置換した。この混合物をＥＳＰＥ−Ｃａｐｍｉｘ上で１分間震盪した。リポスフェアは音響活性を示し、かつ１．２μｍｌの荷重平均サイズを有した。
【０３６２】
ノルアドレナリンにより収縮させた単離ヒト尿道をプラゾシンにより完全に弛緩させる。更にはプラゾシンは、ヒト前立腺腺腫組織および前立腺莢膜組織の両方にインビトロでα−アドレナリン受容体遮断効果を発揮する。この療法のためにはプラゾシンリポスフェアを直腸内経路で前立腺に適用し、そして実施例１７に記載される要領で超音波に露出する。
【実施例２０】
【０３６３】
インビボでの脂溶性物質の輸送の超音波亢進
音響活性リポスフェア（Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）（ＡＡＬ）を、スダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）染料を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で大豆油に添加することにより作成した。スダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）は、初回実験からマーカーとして選択したが、その初回実験ではスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）はクロロホルム中に溶出され、そして組織から抽出された化合物
の吸光度によってはマスクされない５７０〜６２０ｎｍの吸光度ピークを有していたことが示されている。この溶液の３２０μｌを、２ｍｌ  ウイートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）バイアル中の、１．５ｍｌのジパルミトイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール５０００カップリングさせてあるジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、およびジパルミトイルホスファチジン酸（おおよそ８２％：８％：１０％（モル％）の比率）ならびに気体ペルフルオロプロパンに添加した。ヘッドスペースをペルフルオロプロパンで置換し、そしてそのバイアルをＥＳＰＥｃａｐｍｉｘ上で６０秒間震盪した。１２匹のオスＢａｌｂ／Ｃマウスをこの研究に用いた。Ｒｉｃｈｍａｒ治療用超音波機器を用いて超音波を投与した。これらの動物を４群、すなわち治療なし対照、超音波なしスダンブラックＡＡＬ、１Ｗ／ｃｍ２超音波ありのスダンブラックＡＡＬ、２Ｗ／ｃｍ２超音波ありのスダンブラックＡＡＬに割り振った。マウスをシュバイツアー（Ｓｗｅｉｔｚｅｒ）固定化技術を用いて固定化した。５００μｌのＡＡＬの輸液を尾部静脈内のブタリー（ｂｕｔｔｅｒｌｙ）（２５ゲージの注入用セット）を介して１分間の期間にわたり投与した。超音波を投与された動物では、超音波を、注入の期間を通して左脚に投与し、そして余分にもう１分間投与した。動物はＣＯ２窒息により安楽死させた。その後に左脚を各動物から取り出し、そして組織を回収した。その後に組織を液体窒素で凍結させ、そして乳鉢と乳棒で挽いた。その後に組織をシンチレーションバイアルに移し、そして２ｍｌのクロロホルムを添加した。この組織を２時間抽出させ、そしてその後に溶媒セーフ（ｓａｆｅ）Ｇｅｌｍａｎフィルターを通して濾過して組織を取り出した。この試料を石英キュベット内に入れ、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ３分光光度計内で４８０〜７００ｎｍで走査した。データをＭａｃＩｎｔｏｓｈコンピューターに移転し、そしてＪＭＰ３．１．５統計学用パッケージを用いて分析した。
【０３６４】
【表９】
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【０３６５】
対照マウスには処理を施さなかった。第４群には第１群および第２群と同様に注射を施したが超音波を適用しなかった。
【実施例２１】
【０３６６】
ＡＡＬでの超音波画像化
インビボ超音波画像化はイヌにＡＡＬを用いて実施した。このイヌには全身麻酔を施し、挿管し、そして機械呼吸をさせた。このイヌに肺動脈圧および動脈圧力モニター、ならびにパルス酸素測定器およびＥＫＧ装置を装着させた。超音波画像化は、曲線状変換器を
伴うモデル５２００Ｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ臨床用超音波スキャナー（Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｅｍｐｅ，ＡＺ）の７．５ＭＨｚで実施した。画像化は、異なる製剤のＡＡＬのボーラスのＩＶ注入後に、造影前および造影後に実施した。画像化に関する比較注入も、ＤＰＰＣ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ：ＤＰＰＡ（８２％：８％：１０％（モル％））ペルフルオロブタン気体充填造影剤で実施した。検査を行ったＡＡＬ製剤は、デキサメサゾン、アンフォテリシン、もしくはスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）の内のいずれかの２つの異なる濃度を含む小胞を含む。ＡＡＬは、デキサメサゾン、アンフォテリシン、もしくはスダンブラック（Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ）の内のいずれかのもののｍｌ当たり１０マイクログラムを大豆油中に溶解することによりあらかじめ製造しておいた。８２：１０：８モルパーセントのＤＰＰＥ，ＤＰＰＡ、およびＤＰＰＥ−ＰＥＧ５，０００を含むリン脂質を、あらかじめ８：１：１重量比の食塩水：プロピレングリコール：グリセロール中に１ｍｇの脂質濃度で懸濁させた。滅菌バイアル中１．５ｍｌのリン脂質溶液に、８０マイクロリットルもしくは３２０マイクロリットルのいずれかの異なる保存油調製物を添加した。バイアルのヘッドスペースを排気し、そしてペルフルオロブタンで充填した。試料のヘッドスペースの幾つかを充填するのに窒素気体も用いた。その後に、得られるリン脂質／油懸濁物を各々、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ上で６０秒間撹拌して、低油濃度および高油濃度のＡＡＬを産生した。その後に、各異なるＡＡＬ調製物を２０μｌ／ｋｇの用量でイヌにＩＶ投与し、そして超音波画像化を実施した。各ＡＡＬ調製物については個別の注入を行って心臓および腎臓の画像化を行った。像はビデオテープに記録した。ＡＡＬは等用量のＤＰＰＣ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ：ＤＰＰＥ（８２％：８％：１０％（モル％））ペルフルオロブタン気体充填造影剤と比較するとコントラストの点では明確さが劣るものの、コントラストの持続期間はほぼ同等であった。コントラストは各ペルフルオロブテン含有性ＡＡＬ調製物について腎臓内および心臓内で可視化させることができた。大動脈および下大静脈の脈管系の両方でシグナルを増強させるＳｐｅｃｔｒａ  Ｄｏｐｐｌｅｒを大動脈および下大静脈について実施し、再循環するにはＡＡＬは十分安定であることが示された。比較として窒素を含むＡＡＬでは、心臓の左心室もしくは腎臓内ではシグナルの低下が見られた。ＡＡＬのボーラス注入の間には、このイヌには明確な血液動態変化は存在しなかった。
【０３６７】
先の実験により、どのようにＡＡＬが造影剤として薬剤輸送系のための高エネルギー超音波と共に用いることができるかが示される。
【実施例２２】
【０３６８】
不溶性気体を被包する脂質ベース物質からなるマイクロスフェアの製造
ホスファチジルコリンは以下のようにフッ素化される：オメガ−ブロモカルボン酸エステル（Ｂｒ（ＣＨ２（［ｎ］ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）およびペルフルオロイソブチレン（（ＣＦ３）２ＣＦ＝ＣＦ２）をＣｓＦおよびモノグリムの存在下、室温で反応させてフッ素化エステル（（ＣＦ３）３Ｃ（ＣＨ２）［ｎ］ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）を形成する。このエステルを加水分解して遊離酸（（ＣＦ３）３Ｃ（ＣＨ２）［ｎ］ＣＯＯＣＨ）を形成し、これをアシルクロリド（（ＣＦ３）３Ｃ（ＣＨ２）［ｎ］ＣＯＣｌ）に、それを塩化チオニルと反応させることにより転化する。このアシルクロリドを塩基の存在下でグリセロホスホコリンと反応させてフッ素化グリセロホスホコリンを形成する。
【０３６９】
用いられるブロモカルボン酸エステルの炭素鎖の長さは例えばＣ５とＣ２０との間で変化させることができる。
【０３７０】
マイクロスフェアを、最初に以下の成分を乳化させて水中油型エマルジョンを形成することにより作成する：フッ素化グリセロホスホコリン（単独もしくは他のレシチンとの組み合わせのいずれか）、不溶性気体、および水。場合によってはエマルジョンはトリオレイン、コレステロール、および／またはα−トコフェロールを含む。エマルジョンの均一
化は圧力下、およびフッ素化グリセロホスホコリンの転移温度以上の温度で実施し、その後に室温にまで冷ます。
【０３７１】
この書類に引用もしくは記載される各特許、特許出願、および刊行物は全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０３７２】
本発明の主たる態様または特徴は次のとおりである。
【０３７３】
態様１：気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含んでなり、前記気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアが油、界面活性剤、および治療用化合物を含むものである標的化治療剤輸送系。
【０３７４】
態様２：態様１の標的化治療剤輸送系であって、マイクロスフェアが、フッ素、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、六フッ化硫黄、ヘキサフルオロプロピレン、ブロモクロロフルオロメタン、オクタフルオロプロパン、１，１  ジクロロ、フルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロ−２−ブチン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロブテン、オクタフルオロ−２−ブテン、ヘキサフルオロブタ−１，３−ジエン、オクタフルオロシクロペンテン、ヘキサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレン、三フッ化ホウ素、１，２−ブタジエン、１，３−ブタジエン、１，２，３−トリクロロ−２−フロロ−１，３−ブタジエン、２−メチル−１，１，３−ブタジエン、ヘキサフルオロ−１，３−ブタジエン、ブタジエン、１−フルオロ−ブタン、２−メチル−１−ブタン、デカフルオロブタン、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、ペルフルオロ−１−ブテン、ペルフルオロ−２−ブテン、４−フェニル−３−ブテン−２−オン、２−メチル−１−ブテン−３イン、硝酸ブチル、１−ブチン、２−ブチン、２−クロロ−１，１，１，４，４，４−ヘキサフルオロ−ブチン、３−メチル−１−ブチン、ペルフルオロ−２−ブチン、２−ブロモ−ブチルアルデヒド、硫化カルボニル、クロトンニトリル、シクロブタン、メチル−シクロブタン、オクタフルオロ−シクロブタン、ペルフルオロ−シクロブテン、３−クロロ−シクロペンテン、シクロプロパン、１，２−ジメチル−シクロプロパン、１，１−ジメチル−シクロプロパン、１，２−ジメチルシクロプロパン、エチルシクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、３−エチル−３−メチルジアジリデン、１，１，１−トリフルオロジアゾエタン、ジメチルアミン、ヘキサフルオロ−ジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス−（ジメチルホスフィン）アミン、２，３−ジメチル−２−ノルボルネン、ペルフルオロジメチルアミン、塩化ジメチルオキソニウム、１，３−ジオキソラン−２−オン、４−メチル−１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１−トリフルオロエタン、１，１，２，２，−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロ−１，２，２，２−テトラフルオロエタン、１，２−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２，２−ペンタフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２−テトラフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、クロロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ニトロ−ペンンタフルオロエタン、ニトロソペンタフルオロエタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロエチルアミン、エチルビニルエーテル、１，１−ジクロロ−エチレン、１，１−ジクロロ−１，２−ジフルオロエチレン、１，２−ジフルオロエチレン、メタン、メタン−スルホニルクロリド−トリフルオロ、メタン−スルホニルフロリド���トリフルオロ、メタン（ペンタフルオロチオ）トリフルオロ、メタン−ブロモジフルオロニトロソ、メタン−ブロモフルオロ、メタン−ブロモクロロ−フルオロ、メタン−ブロモ−トリフルオロ、メタン−クロロジフルオロニトロ、メタン−クロロジニトロ、メタン−クロロフルオロ、メタン−クロロトリフルオロ、メタン−クロロ−ジフルオ
ロ、メタン−ジブロモジフルオロ、メタン−ジクロロジフルオロ、メタン−ジクロロ−フルオロ、メタン−ジフルオロ、メタン−ジフルオロ−ヨード、メタン−ジシラノ、メタン−フルオロ、メタン−ヨード−トリフルオロ、メタン−ニトロ−トリフルオロ、メタン−ニトロソ−トリフルオロ、メタン−テトラフルオロ、メタン−トリクロロフルオロ、メタン−トリフルオロ、メタンスルフェニルクロリド−トリフルオロ、２−メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、乳酸メチル、硝酸メチル、メチルスルフィド、メチルビニルエーテル、ネオン、ネオペンタン、窒素、酸化窒素、１，２，３−ノナデカントリカルボン酸−２−ヒドロキシトリメチルエステル、１−ノネン−３−イン、酸素、１，４−ペンタジエン、ｎ−ペンタン、ペンタン−ペルフルオロ、２−ペンタノン−４−アミノ−４−メチル、１−ペンテン、２−ペンテン｛シス｝、２−ペンテン｛トランス｝、１−ペンテン−３−ブロモ、１−ペンテン−ペルフルオロ、フィチン酸−テトラクロロ、ピペリジン−２，３，６−トリメチル、プロパン、プロパン−１，１，１，２，２，３−ヘキサフルオロ、プロパン−１，２−エポキシ、プロパン−２，２−ジフルオロ、プロパン−２−アミノ、プロパン−２−クロロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロ、プロパン−ヘプタフルオロ−１−ニトロソ、プロパン−ペルフルオロ、プロペン、プロピル−１，１，１，２，３，３−ヘキサフルオロ−２，３−ジクロロ、プロピレン−１−クロロ、プロピレン−クロロ−｛トランス｝、プロピレン−２−クロロ、プロピレン−３−フルオロ、プロピレン−ペルフルオロ、プロピン、プロピン−３，３，３−トリフルオロ、スチレン−３−フルオロ、六フッ化硫黄、硫黄（ジ）−デカフルオロ（Ｓ２Ｆ１０）、トルエン−２，４−ジアミノ、トリフルオロアセトニトリル、過酸化トリフルオロメチル、硫化トリフルオロメチル、六フッ化タングステン、ビニルアセチレン、ビニルエーテル、キセノン、１−ブロモフルオロブタン、およびペルフルオロエーテル、からなる群より選択される気体前駆体を含む標的化治療剤輸送系。
【０３７５】
態様３：前記界面活性剤が、脂質、ポリマー、蛋白質、ポリペプチド、多糖、糖、およびアクリレートからなる群より選択される、態様１の治療剤輸送系。
【０３７６】
態様４：前記脂質が、脂肪酸；リソ脂質；ホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルコリン；ジペンタデカノイルホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；ジオレオイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン；ジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルエタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴ脂質；スフィンゴミエリン；糖脂質；ガングリオシド  ＧＭ１；ガングリオシドＧＭ２；グルコ脂質；スルファチド；グリコスフィンゴリピド；ホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；ポリマーを保持する脂質（例えば、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸、もしくはポリビニルピロリドン）；スルホン化されたモノ−、ジ−、オリゴ−、もしくはポリサカリド（多糖）を保持する脂質；コレステロール、硫酸コレステロール；コレステロールヘミスクシネート；トコフェノールヘミスクシネート、エーテルおよびエステルが結合した脂肪酸を有する脂質、重合脂質、リン酸ジアセチル、ステアリルアミン、カルジオリピン、長さが６〜８の炭素の短鎖脂肪酸を有するリン脂質、不斉アシル鎖を有する合成リン脂質、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）−カルボニル）−メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；コレステリル（４’−トリメチル−アンモニオ）−ブタノエート；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタ
ノール−アミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１．３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、および／またはそれらの組み合わせ物；臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、臭化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム、もしくは臭化セチルピリジニウム；ヨウ化ペンタフルオロオクタデシル、臭化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ヨウ化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロトリプロピルアミン、およびペルフルオロトリブチルアミン、ならびにさらには共有結合により結合したポリマーを保持する脂質、からなる群より選択される、態様３の治療剤輸送系。
【０３７７】
態様５：前記蛋白質が、コラーゲン、フィブリン、およびアルブミンからなる群より選択される、態様３の組成物。
【０３７８】
態様６：前記ポリペプチドが、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびコポリマーからなる群より選択される、態様３の組成物。
【０３７９】
態様７：前記多糖が、スターチ、ＨＥＴＡ−スターチ、アルギン酸、ヒアルロン酸、セルロース、およびサッカリドからなる群より選択される、態様３の組成物。
【０３８０】
態様８：前記セルロースがメチルセルロースである、態様７の組成物。
【０３８１】
態様９：前記サッカリドがデキストランである、態様７の組成物。
【０３８２】
態様１０：前記糖が、グルコースおよびガラクトースからなる群より選択される、態様３の組成物。
【０３８３】
態様１１：前記ポリマーが、合成ポリマー、天然ポリマー、および半合成ポリマーからなる、態様３の組成物。
【０３８４】
態様１２：前記合成ポリマーがポリ乳酸である、態様１１の組成物。
【０３８５】
態様１３：前記コポリマーが、ポリラトシデコグリコリドおよびポリエチレン−ポリプロピレングリコールからなる群より選択される、態様６の組成物。
【０３８６】
態様１４：前記アクリレートがメタクリレートである、態様３の組成物。
【０３８７】
態様１５：前記メタクリレートがメチルメタクリレートである、態様１４の組成物。
【０３８８】
態様１６：前記油が、シリコン油、タラ肝油、鉱油、植物油、フッ素化されたトリグリセリドを含む油、生物適合性の飽和脂肪酸、生物適合性不飽和脂肪酸、および生物適合性の部分的に水素化された脂肪酸、シリコンベースの油、ならびに合成油からなる群から選択される、態様１の組成物。
【０３８９】
態様１７：前記治療剤が前記マイクロスフェアの表面に結合する、態様１の組成物。
【０３９０】
態様１８：前記治療剤が前記マイクロスフェア内に被包される、態様１の組成物。
【０３９１】
態様１９：前記マイクロスフェアが、凍結乾燥マイクロスフェア、噴霧乾燥マイクロスフェア、ボールミルマイクロスフェア、撹拌マイクロスフェア、およびそれらのいずれかの組み合わせ物からなる群より選択される、態様１の組成物。
【０３９２】
態様２０：前記植物油が、ピーナッツ油、カノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、コーン油、およびマゾーラ油からなる群より選択される、態様１６の組成物。
【０３９３】
態様２１：前記シリコンベースの油が、ビニル末端をもつ、ヒドリド末端をもつ、シラノール末端をもつ、アミノ末端をもつ、エポキシ末端をもつ、カルビノール末端をもつ液体、メルカプト誘導化させたシリコン液、飽和シリコン油、不飽和シリコン油、アリールアルキル飽和シリコン油からなる群より選択される、態様１６の組成物。
【０３９４】
態様２２：前記合成油が、Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸の飽和鎖、およびＣ１２〜Ｃ２４脂肪酸の不飽和鎖からなる群より選択される、態様１６の組成物。
【０３９５】
態様２３：前記合成油が、オレイン酸のグリセロールトリグリセリドエステルからなる群より選択される、態様２２の組成物。
【０３９６】
態様２４：更に標的化用リガンドを含む、態様１の標的化治療剤輸送系。
【０３９７】
態様２５：気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含む標的化治療剤輸送系を製造する、気体前駆体の存在下で油および界面活性剤を含む溶液を処理する段階、および前記マイクロスフェアに治療学的組成物を添加する段階を含み、前記処理が調節下での撹拌、調節下での乾燥、およびその組み合わせ物からなる群より選択される方法。
【０３９８】
態様２６：前記方法が、気体前駆体の活性化温度で気体前駆体を用いて実施される、態様２５に従う方法。
【０３９９】
態様２７：調節下での撹拌が、ボールミル、震盪、ボルテックルミキサーでの撹拌、およびそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、態様２５に従う方法。
【０４００】
態様２８：調節下での乾燥が、凍結乾燥、噴霧乾燥、およびそれらの組み合わせ物からなる群より選択される、態様２５に従う方法。
【０４０１】
態様２９：更に前記脂質水溶液の濾過段階および熱滅菌段階を含む、態様２５に従う方法。
【０４０２】
態様３０：（ｉ）患者に、油、界面活性剤、気体もしくは気体前駆体、および治療剤を含む標的化治療剤輸送系を投与すること；
（ｉｉ）標的化治療剤輸送系を、その領域の標的化治療剤輸送系の存在を決定するためのエネルギーを用いてモニターすること；ならびに
（ｉｉｉ）その領域内で標的化治療剤輸送系から治療剤を放出させること：
を含む、標的化治療剤輸送系の制御下輸送のための方法。
【０４０３】
態様３１：黄斑変性症の治療の際の使用のための、前記治療剤がα−トコフェロールおよびレチン酸を含み、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、および８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエ
チレングリコール５０００を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、態様３０の方法。
【０４０４】
態様３２：網膜芽細胞腫を治療する際の使用のための、前記治療剤がタキソールおよびレチン酸を含み、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、および８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、態様３０の方法。
【０４０５】
態様３３：前記治療剤がアンフォテリシン−Ｂであり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、態様３０の方法。
【０４０６】
態様３４：真菌性眼炎を治療するために用いられる、態様３３の方法。
【０４０７】
態様３５：色素性網膜症を治療するための、前記治療剤がベンダゾックであり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、態様３０の方法。
【０４０８】
態様３６：良性前立腺肥大を治療するための、前記治療剤がドキサゾシンであり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、およびプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８を含み、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである、態様３０の方法。
【０４０９】
態様３７：前記治療剤がα−トコフェロールであり、前記界面活性剤がＣＦ３（ＣＦ２）８（ＣＨ２）６ＣＯＯＨを含み、前記油がカノーラ油であり、そして前記気体前駆体がペルフルオロブタンである態様３０の方法。
【０４１０】
態様３８：前記治療剤が染料であり、前記油が大豆油であり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、および１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸を含み、前記気体前駆体がペルフルオロプロパンである、態様３０の方法。
【０４１１】
態様３９：前記治療剤がデキサメサゾンであり、前記界面活性剤が８２モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルコリン、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、および１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸を含み、前記気体前駆体がペルフルオロブタンおよび窒素である、態様３０の方法。
【０４１２】
態様４０：前記治療剤がアンホテリシンであり、前記界面活性剤が８２モルパーセントの
ジパルミトイルホスファチジルコリン、８モルパーセントのジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００、および１０モルパーセントのジパルミトイルホスファチジン酸を含み、前記気体前駆体がペルフルオロブタンおよび窒素から選択される、態様３０の方法。
【０４１３】
態様４１：前記治療剤が染料を含む、態様２５の組成物。
【０４１４】
態様４２：前記染料が、蛍光染料および比色分析用染料からなる群より選択される、態様４１の組成物。
【０４１５】
態様４３：前立腺癌もしくは良性前立腺肥大を治療するための、前記治療剤が、テストステロン、メチルテストステロン、フルオキシメステロン、フィナステリド、および５ａレダクターゼ酵素阻害剤からなる群より選択される、態様３０の方法。
【０４１６】
態様４４：前記染料が、スダンブラック、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、テキサスレッド、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、オレゴングリーン、ローダミンレッド−Ｘ、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＹＯＹＯ−１、ＤＡＰＩ、インド−１（Ｉｎｄｏ−１）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）、フラ−２，アミノメチルクマリン、ＦＭ１−４３、ＮＢＤ、カルボシ−ＳＮＡＲＦ、ルシフェルイエロー、ダンシル＋Ｒ−ＮＨ２、ヨウ化プロピジウム、メチレンブルー、ブロモクレゾールブルー、アクリジンオレンジ、ブロモフェノールブルー、７−アミノ−アクチノマイシンＤ、アロフィコシアニン、９−アジドアクリジン、ベンゾキサンテン−イエロー、ビスベンジジンＨ３３２５８蛍光色素、３ＨＣｌ、５−カルボキシフルオレッセインジアセテート、４−クロロ−１−ナフトール、クロモマイシン−Ａ３、ＤＴＡＦ、ＤＴＮＢ、臭化エチジウム、フルオレセイン−５−マレイミドジアセテート、ミスラマイシンＡ、ローダミン１２３、ＳＢＦＩ、ＳＩＳＴ、テトラメチルベンジジン、テトラメチルプルプレート、チアゾリルブルー、およびＴＲＩＴＣからなる群より選択される、態様４１の方法。
【０４１７】
態様４５：前記フルオレセインがフルオレセインイソチオシアネートである、態様４４の方法。
【０４１８】
態様４６：前記フルオレセインイソチオシアネートが、フルオレセインイソチオシアネートアルブミン、フルオレセインイソチオシアネート抗体複合体、フルオレセインイソチオシアネートα−ブンガロトキシン、フルオレセインイソチオシアネート−カゼイン、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン、フルオレセインイソチオシアネート−インスリン、フルオレセインイソチオシアネート−レクチン（Ｌｅｃｔｉｎ）、フルオレセインイソチオシアネート−ペルオキシダーゼ、およびフルオレセインイソチオシアネート−プロテインＡからなる群より選択される、態様４４の方法。
【図１】
2010280678.tif 000019
【図２】
2010280678.tif 000020
【図３】
2010280678.tif 000021
【図４】
2010280678.tif 000022
【図５】
2010280678.tif 000023
【図６】
2010280678.tif 000024
【図７】
2010280678.tif 000025
【図８】
2010280678.tif 000026
【図９】
2010280678.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月18日(2010.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
気体もしくは気体前駆体充填マイクロスフェアを含んでなり、前記気体もしくは気体前駆体マイクロスフェアが油、界面活性剤、および治療用化合物を含むものである標的化治療剤輸送系。