(57)【要約】  【課題】  本発明は、トロポロン化合物において、さらに効果が高い物質を検索することにより、美白効果の高いチロシナーゼ活性阻害成分等を提供することを目的とする。  【解決手段】  ヒトチロシナーゼの活性中心近傍に位置するアスパラギン（Ａｓｎ３６４）、アラニン（Ａｌａ３６５）、イソロイシン（Ｉｌｅ３６８）のいずれかまたは複数と１つ以上の水素結合または疎水結合を形成する置換基をγ位に有し、ヒトチロシナーゼ活性阻害作用を有するトロポロン化合物、および、該化合物を有効成分として含む美白外用剤。【選択図】  図１
2010006732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ位に置換基を持ち、ヒトチロシナーゼ活性抑制作用を有するトロポロン化合物。
【請求項２】
γ位の置換基がヒトチロシナーゼの活性中心近傍に位置するアスパラギン（Ａｓｎ３６４）、アラニン（Ａｌａ３６５）、イソロイシン（Ｉｌｅ３６８）のいずれかまたは複数と１つ以上の水素結合または疎水結合を形成する構造である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の化合物を有効成分とする美白外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚美白剤として有効なヒトチロシナーゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シミ、ソバカスや日焼けによる皮膚の黒化現象は、皮膚の表皮基底層に存在するメラノサイトにおけるメラニン色素の生成によるものである。メラノサイトではチロシンを基質として酵素チロシナーゼによる酸化が行われ、ドーパ、ドーパキノン等を経てメラニン色素が生合成されることが知られている。
【０００３】
このため、メラニン色素の生合成を抑制する目的で、チロシナーゼの活性を阻害する化合物が開発されている。
【０００４】
化粧品などの外用剤に利用されている代表的な化合物としては、基質チロシンとの競合阻害をするアルブチン、銅イオンとのキレートによる非競合阻害のコウジ酸などが挙げられる。
【０００５】
一方、古くからトロポロン化合物は、２価以上の金属イオンと、きわめて容易に錯体を形成することが知られている（非特許文献１）。このため、トロポロン化合物がチロシナーゼ酵素の銅イオンと錯体を作り、酵素活性を抑制（非競合阻害）することで美白作用を示すことは容易に想定されることである。
【非特許文献１】「大有機化学  非ベンゼン系芳香環化合物  １３」、朝倉書店、昭和３５年、ｐ．１４８
【０００６】
このことは、特開昭５６−８３０９号公報に開示されたトロポロン系化合物を有効成分とする美白化粧料においても示されている。この文献では、トロポロン化合物は、１位のカルボニル基と２位の水酸基が銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）と錯体を作りキレートするが故に、チロシナーゼ酵素活性中心の金属と結合すると説明している。実施例においては、トロポロン、３−イソプロピルトロポロン（α−ツヤプリシン）、４−イソプロピルトロポロン（β−ツヤプリシン）及び５−イソプロピルトロポロン（γ−ツヤプリシン）、コルヒチンが紹介されており、チロシナーゼ活性阻害作用についてはほぼ同じであったと記載されている。
【特許文献１】特開昭５６-８３０９号公報
【０００７】
もっとも、出願時の技術水準を考慮すれば、特許文献１におけるチロシナーゼ活性阻害作用の評価は、トロポロン化合物のチロシナーゼ活性阻害作用の実験をマッシュルーム由来チロシナーゼを用いて実施した結果か、各トロポロン化合物の銅イオンとの錯体形成能の測定結果から、チロシナーゼ活性阻害についてほぼ同じと判断したものと推測される。
【０００８】
一方、非特許文献２においては、トロポロン化合物の一つであるヒノキチオール（４−イソプロピルトロポロン、β−ツヤプリシン）のチロシナーゼ活性阻害作用は、一般に使用されている美白剤と比較しても非常に強いことが示されている。
【非特許文献２】「Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２２巻４号、１９９９年、ｐ．３３５−３３９
【０００９】
非特許文献２によると、ヒノキチオール（４−イソプロピルトロポロン、β−ツヤプリシン）の作用は、基質のチロシンとの競合阻害であると説明されており、トロポロン化合物の錯体形成によるチロシナーゼ活性阻害作用を明記している特許文献１とは異なる見解が示されている。
【００１０】
このように、トロポロン化合物のチロシナーゼ活性阻害メカニズムについては諸説あり、明確でない状況であるといえる。
【００１１】
また、生物種間のアミノ酸配列の違いが近年明らかにされつつあり、ヒトとマッシュルームのチロシナーゼのアミノ酸配列の違いを考慮すれば、過去において美白成分評価として行われてきたマッシュルームチロシナーゼに対する活性阻害作用の実験が、必ずしもヒトチロシナーゼに対する効果と同一となるかは明らかでない。
【００１２】
他方、近年Ｘ線結晶構造解析により、放線菌由来のチロシナーゼの活性中心近傍の構造が明らかとなってきた。（非特許文献３）。そこで本発明者らは、未だ明確にされていないヒトチロシナーゼの活性中心の構造を、放線菌チロシナーゼの構造を参考にコンピューターモデリングし、その結果をもとに、チロシナーゼ活性阻害作用が強いといわれているトロポロン化合物を再度検証すれば、従来知られていなかった優れた活性阻害作用を有するトロポロン化合物を発見し、シミやソバカスなどの色素沈着に対する有効な外用剤の開発につながるのではないかと考えた。
【非特許文献３】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２８１巻１３号、２００６年、ｐ．８９８１−８９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
市場には多くの美白外用剤が存在するものの、十分に満足できる効果が得られるものはない状況である。その中でも比較的効果の高いことが報告されているトロポロン化合物において、現在の科学技術に照らして、さらに効果が高い物質を検索することは、効果的な美白剤の開発につながると期待される。本発明はかかる美白剤の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者は、鋭意研究の結果、本発明に係るγ位に置換基を有するトロポロン化合物が、ヒトチロシナーゼに対して高い活性阻害作用を発揮することを見出した。
【００１５】
すなわち、請求項１記載の発明は、下記一般式（１）で示されるγ位に置換基を持ちチロシナーゼ阻害活性を有するトロポロン化合物に関するものである。（式中Ｒは炭素原子を含む化合物を表す。）
【００１６】
【化１】
2010006732.tif 000003
【００１７】
さらに一般式（１）のγ位の置換基は、ヒトチロシナーゼの活性中心近傍に位置するアスパラギン（Ａｓｎ３６４）、アラニン（Ａｌａ３６５）、イソロイシン（Ｉｌｅ３６８）のいずれかまたは複数と１つ以上の水素結合または疎水結合を形成する構造を有するものであることが望ましい。
【００１８】
本発明のトロポロン化合物の利用分野としては、皮膚外用剤が挙げられる。
【００１９】
本発明のトロポロン化合物を皮膚外用剤として用いる場合の投与方法は、一般的に、皮膚外用剤として皮膚に塗布することが行われる。該皮膚外用剤としては、軟膏剤、クリーム、乳液、ローション、パック、粉末状等、公知の外用製剤に配合できる。
【００２０】
これらの皮膚外用製剤は、本発明にかかるトロポロン化合物に、一般に用いられる各種成分、例えば、水性成分、粉末成分、保湿剤、界面活性剤、防腐剤、増粘剤、紫外線吸収剤及び香料等を配合して、公知の製剤技術を用いて製造することができるが、これらの各種成分は本発明の効果を損なわない程度の量的、質的範囲内で用いることができる。
【００２１】
本発明のトロポロン化合物を皮膚外用剤として用いる場合、製剤中の配合量が０．０００１％〜１％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは０．００１％〜０．５％（Ｗ／Ｗ）となるように調製し、皮膚に１日１回乃至数回、適量塗布すれば良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に試験例及び実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
［試験例］
１．ヒトチロシナーゼとトロポロン化合物の親和性評価
参考文献１の放線菌チロシナーゼのＸ線構造解析の結果をもとに、既知のヒトチロシナーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：登録商標）から、鋭意研究の末、活性中心近傍の構造をモデリングした。モデリングの手法は、Ａｎｄｒｅｊ  Ｓａｌｉらの方法を参考にした。
（参考文献１：「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２３４巻３号、１９９３年、ｐ．７７９−８１５）
【００２４】
続いて、モデリングしたヒトチロシナーゼの活性中心近傍の構造（図１）をもとに、入手可能性のあるトロポロン化合物との親和性指数をＯｌｇｕｎ  Ｇｕｖｅｎｃｈらの方法を参考に算出した。ここでいう親和性指数とは、ヒトチロシナーゼと各化合物の親和性を算出した値であり、負の値が大きいものほど両者の親和性が高いことを示している。（参考文献２：「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２３巻２号、２００２年、ｐ．２１４−２２１）
【００２５】
【表１】
2010006732.tif 000004
【００２６】
その結果、表１に示したごとく、γ位に置換基を有するトロポロン化合物６および７が、他の位置に置換基を有するものと比べて、特に高い親和性指数を示すことが明らかになった。
【００２７】
２．トロポロン化合物のヒトチロシナーゼ活性阻害効果評価実験
ヒトチロシナーゼとの親和性が示されたトロポロン化合物の中で、同一の置換基（イソプロピル基）をα位、β位、γ位に有する化合物（化合物１：α−ツヤプリシン、化合物４：β−ツヤプリシン、化合物７：γ−ツヤプリシン）を用いて、親和性指数と、実際のヒトチロシナーゼの活性阻害効果を評価した。
【００２８】
実験で用いたβ−ツヤプリシンは試薬を、試薬として入手不可能であったα−ツヤプリシン、γ−ツヤプリシンは合成品を使用した。合成品の純度は９９％以上であることを確認した。
【００２９】
正常ヒト表皮由来のメラノサイトを常法にて培養し、Ｆｕｎａｙａｍａらの方法（参考文献３：「Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、５７巻１０号、１９９３年、ｐ．１６６６−１６６９）を改良した方法にて、細胞よりチロシナーゼを抽出した。
【００３０】
得られたヒトチロシナーゼを用いて、各種化合物のヒトチロシナーゼ活性阻害実験を実施した。各種化合物溶液を終濃度１０μＭとなるように加え、Ｌ−ＤＯＰＡを基質として反応させ、３７℃、３０分後の波長４７５ｎｍにおける吸光度（Ａ４７５）を測定した。
【００３１】
一方、対照として各種化合物溶液の代わりに緩衝液を添加したものを、同様に試験し、３０分後のＡ４７５を測定した。
【００３２】
対照のＡ４７５に対する、各化合物添加試験溶液のＡ４７５の比を用いて、次式にて阻害率を算出した。
【００３３】
【数１】
2010006732.tif 000005
【００３４】
【表２】
2010006732.tif 000006
【００３５】
表２に示したごとく、各トロポロン化合物のヒトチロシナーゼとの親和性指数と実際のヒトチロシナーゼの活性阻害効果との間に相関性が見られ、γ−ツヤプリシンが最も高い活性阻害効果を示すことを確認した。
【００３６】
このように、今回モデリングしたヒトチロシナーゼを用いた、トロポロン化合物の親和性指数より、γ位に置換基を有するトロポロン化合物が高いチロシナーゼ活性阻害作用を示すことを明らかとした。
【００３７】
３．γ位に置換基を有し、強い親和性を示すトロポロン化合物の検索
次に、モデリングしたヒトチロシナーゼの活性中心近傍の構造から、γ位に置換基を持つトロポロン化合物のヒトチロシナーゼとの親和性をさらに高めるための検討を行った。その結果、γ位の置換基が、ヒトチロシナーゼの活性中心近傍に存在するアスパラギン（Ａｓｎ３６４）と水素結合を形成し、一方でアラニン（Ａｌａ３６５）およびイソロイシン（Ｉｌｅ３６８）と疎水結合を形成することにより、トロポロン化合物の親和性指数がさらに高まることを明らかにした。
【００３８】
ここでいう水素結合を形成する構造を持つ置換基とは、具体的にはヒドロキシ、アミノ、ニトロ、オキシ、カルボニル、カルボキシ、フェニル、チオ又はスルホニルなどが挙げられ、また疎水結合を形成する置換基とは、疎水性の高い置換基、例えば直鎖又は分岐のアルキル（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシルなど）、シクロアルキル、フェニル、ナフチル又は複素環（ピロール、イミダゾール、インドール、チアゾールなど）などが挙げられる。
【００３９】
そして、アスパラギン（Ａｓｎ３６４）と水素結合を形成し、かつアラニン（Ａｌａ３６５）およびイソロイシン（Ｉｌｅ３６８）と疎水結合を形成する構造を持つ置換基が結合したトロポロン化合物を分子設計し、これらの化合物は親和性が高く、チロシナーゼ活性阻害効果に優れていると予想した。このようにして分子設計した化合物９および１０について、モデリングしたヒトチロシナーゼとの親和性を評価した結果を表３に例示する。
【００４０】
【表３】
2010006732.tif 000007
【００４１】
図１は、化合物１０とモデリングしたヒトチロシナーゼとの結合予測図である。図１において、α位付近は置換基を許容するに十分な空間的余裕がないことから、この位置に置換基が結合した化合物は親和性が低いと考えられるのに対して、γ位付近は十分な空間的余裕があり、かつ近傍の側鎖と水素結合または疎水結合を形成する可能性があると考えられる。したがって、この位置に置換基を結合することによりチロシナーゼ活性阻害効果を高められると考えられる。
【００４２】
また、ヒトチロシナーゼの活性中心近傍において、アスパラギン（Ａｓｎ３６４）は、置換基の周辺で活性中心に比較的近い位置にあり、アラニン（Ａｌａ３６５）およびイソロイシン（Ｉｌｅ３６８）は活性中心から比較的遠い位置にあると考えられる。そこで、化合物１０のアミノ基がチロシナーゼのアスパラギンと水素結合し、化合物１０のシクロアルキルがチロシナーゼのアラニンおよびイソロイシンと疎水結合することにより、さらにチロシナーゼの活性中心に入り込みやすく、チロシナーゼ活性阻害効果を高められると考えられる。
【００４３】
以下に、処方例を示す。
処方例１  化粧水                                
化合物７                                      ０．００１（重量％）
グリチルリチン酸ジカリウム                    ０．５
水素添加大豆リン脂質                          １．０
エゾウコギエキス                              ２．０
ヒドロキシエチルセルロース                    ０．５
１，３−ブチレングリコール                    ３．０
パラベン                                      ０．２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                ０．３
アルコール                                    ５．０
香料                                          ０．０３
精製水                                        残  量
【００４４】
処方例２  乳液                                  
化合物７                                      ０．０１（重量％）
パルミチン酸レチノール                        ０．１
フォスファチジルエタノールアミン              １．０
セラミド                                      ０．１
甘草エキス                                    １．０
カルボキシビニルポリマー                      ０．３
１，３−ブチレングリコール                    ５．０
パラベン                                      ０．２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                ０．１
ポリグリセリン脂肪酸エステル                  １．０
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル    ０．３
流動パラフィン                                ３．０
水酸化カリウム                                ０．０７
香料                                          ０．０３
精製水                                        残  量
【００４５】
配合例３  クリーム                              
化合物９                                      ０．１（重量％）
グリチルレチン酸ステアリル                    ０．２
酢酸レチノール                                ０．１
ニコチン酸トコフェロール                      ０．２
コレステロール                                １．０
リゾフォスファチジルコリン                    １．０
オリーブ油                                    ５．０
グリセリン                                  １５．０
パラベン                                      ０．２
カルボキシビニルポリマー                      ０．３
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                ０．１
モノグリセリン脂肪酸エステル                  ５．０
プロピレングリコール脂肪酸エステル            ５．０
ポリエチレングリコール脂肪酸エステル          ０．５
スクワラン                                  １０．０
ベヘニルアルコール                            ３．０
ステアリン酸                                  １．０
植物エキス                                    ２．０
香料                                          ０．０３
精製水                                        残  量
【００４６】
配合例４  美容液                              
化合物１０                                    ０．１（重量％）
酢酸トコフェロール                            ０．５
サフラワー油                                  １．０
ヒドロキシエチルセルロース                    ０．６
ジプロピレングリコール                      １０．０
パラベン                                      ０．２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                ０．１
ポリグリセリン脂肪酸エステル                  ２．０
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル    ０．５
スクワラン                                    ５．０
ステアリン酸                                  １．０
植物エキス                                    ２．０
香料                                          ０．０３
精製水                                        残  量
【００４７】
上記の化合物９は、トロポロンから図２に示す反応により合成可能である。また、化合物１０は４−アセチルトロポロンから図３に示す反応により合成可能である。各反応の最終段階におけるアシル化剤としては、例えば３−メチルベンゾイルクロリドを用いることができる。
【００４８】
なお、本発明に該当する化合物はヒトチロシナーゼの活性中心近傍に位置するアスパラギン（Ａｓｎ３６４）、アラニン（Ａｌａ３６５）、イソロイシン（Ｉｌｅ３６８）のいずれかまたは複数と１つ以上の水素結合または疎水結合を形成する構造であればよく、例示した化合物９、１０に限られるものではない。
【００４９】
本発明にかかるトロポロン化合物は、高いヒトチロシナーゼ活性阻害作用を有する。古くより、トロポロンの金属イオンとの錯体形成能によりチロシナーゼ活性阻害作用を示すと考えられていたが、近年では基質チロシンとの競合阻害作用であるとの考えも示されていた。
【００５０】
そこで今回、ヒトチロシナーゼに対しては、トロポロン骨格のγ位に置換基を有し、さらにその置換基が活性中心近傍のアミノ酸と作用する構造を有することが活性阻害作用を発揮するためには重要であることを発見した。
【００５１】
従って、本発明のトロポロン化合物を配合した美白外用剤は、従来のチロシナーゼ活性阻害剤や、トロポロン化合物を配合した外用剤と比較して、ヒトに対して非常に優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】化合物１０とモデリングしたヒトチロシナーゼとの結合予測図
【図２】化合物９の合成経路を示す図
【図３】化合物１０の合成経路を示す図
【図２】
2010006732.tif 000008
【図３】
2010006732.tif 000009
【図１】
2010006732.tif 000010