(57)【要約】【課題】血中滞留性を向上させた、生体適合性製剤の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、複合粒子を含む生体適合性製剤であって、前記複合粒子は、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子である。この微粒子は、シリカ、金属、金属酸化物または金属硫化物であるのが好ましい。本発明の生体適合性製剤は、標的とする患部への薬剤運搬用であるのが好ましい。【選択図】  図４
2010280594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合粒子を含む生体適合性製剤であって、
前記複合粒子が、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子である製剤。
【請求項２】
前記高分子グラフト鎖のグラフト密度が、０．１〜１．２本鎖／ｎｍ2である請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）が、１０，０００〜３２０，０００である請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記高分子グラフト鎖が、微粒子表面上の重合開始基を基点としたアクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体およびスチレン誘導体からなる群から選択される１以上のリビングラジカル重合によって得られる請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
前記微粒子が、ケイ素酸化物、金属、金属酸化物または金属硫化物である請求項１〜４のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
前記高分子グラフト鎖の分子量分布が、１〜１．５である請求項１〜５のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
前記微粒子が、３ｎｍ〜５μｍの粒径を有する微粒子である請求項１〜６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
標的とする患部への薬剤運搬用の請求項１〜７のいずれかに記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合粒子を含む生体適合性製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む動物に薬物を投与するためには、血中へ薬物を投与する必要がある。また、ヒトを含む動物を診断するために、血中へ診断薬を投与する必要がある。いずれの場合も、薬物または診断薬は、必要な時間、必要な量で血中で滞留する必要がある。
【０００３】
薬物または診断薬を動物の血中へ投与するためには、その薬物または診断薬を投与用担体で抱合したり、担体と結合あるいは複合体化させたりする方法がある。その担体として、ポリマー等が知られている。一方、薬物または診断薬は、動物にとって異物であるため、異物排除システムが作動し、通常は血中から速やかに除去される。例えば前記ポリマー等は、生体適合性が低い傾向があった。具体的には、担体にオプソニンという血清抗体タンパク質が付着することにより、補体の助けをかりながら肝臓、脾臓などに存在する貪食細胞によって貪食（補足・分解）される（非特許文献１、２参照）。あるいは血液中の分解酵素などによって分解されることから担体は血中から速やかに排除される傾向がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】“アドバンスド・マテリアルズ（Advanced Materials）”、2004年、第16巻、p.１９５９−１９６６。
【非特許文献２】“アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）”、2008年、第80巻、p.９５９７−９６０３。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、血中滞留性を向上させた、生体適合性製剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、複合粒子を含む生体適合性製剤であって、前記複合粒子は、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、生体適合性が向上し、その結果、血中滞留性が向上したという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、複合粒子（表１、Ｅｎｔｒｙ９）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真である。
【図２】図２は、複合粒子（微粒子はシリカ粒子）の高分子グラフト鎖の分子量と体内動態との関係を示すグラフである（実施例２）。
【図３】図３は、複合粒子（微粒子はシリカ粒子）の微粒子のコア粒径と体内動態との関係を示すグラフである（実施例２）。
【図４】図４は、複合粒子（微粒子はシリカ粒子）の血中残存率の経時変化を示すグラフである（実施例２）。
【図５】図５は、複合粒子（微粒子はシリカ粒子）の体内分布を示すグラフである（実施例２）。
【図６】図６は、複合粒子（微粒子はシリカ粒子）のマウスにおける蛍光イメージングの画像である（実施例３）。
【図７】図７は、複合粒子（微粒子は酸化鉄ナノ微粒子）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真である（実施例４）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子が、担癌マウスの静脈内投与後１時間において高い血中残存率を示し、かつ担癌マウスにおいて高い割合でガン組織に集積することを新たに見出した。この知見に基づき、本発明者らは上記課題を解決した。
【００１０】
すなわち、本発明は、前記のとおり、複合粒子を含む生体適合性製剤であって、前記複合粒子は、グラフト鎖間で立体反発が生じるまでに超高密度で高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合した複合粒子である。
【００１１】
本発明において、「高分子グラフト鎖」とは、微粒子表面から重合反応によってモノマーを２個以上伸長して形成されたポリマー鎖を意味する。また、「超高密度」とは、グラフト鎖間で立体反発が生じる程度までグラフト鎖が密集した場合のグラフト鎖の密度を意味し、この場合、グラフト鎖は、表面に垂直な方向にほぼ伸びきった形態をとる。また、「結合」とは、一般的な化学反応により形成される結合を意味し、例えば、共有結合、イオン結合等が挙げられる。
【００１２】
本発明の生体適合性製剤において、前記高分子グラフト鎖のグラフト密度は、０．１〜１．２本鎖／ｎｍ2であるのが好ましく、０．３〜１．２本鎖／ｎｍ2であるのがより好ましい。このグラフト密度を制御することにより、本発明の生体適合性製剤における複合粒子の血中滞留性を制御することが可能である。本発明において、「グラフト密度」または「密度」とは、微粒子表面の単位面積（ｎｍ2）あたりの表面に結合したグラフト鎖の本数を意味する。グラフト密度（σ）は、元素分析により微粒子表面から伸長して形成された高分子グラフト鎖の量（グラフト量、ｗ）を求め、その値とコア微粒子の表面積（Ｓ、ｎｍ2）、グラフトポリマーの数平均分子量Ｍｎならびにアボガドロ数（Ａｖ）を用いて以下のようにして算出される。
算出方法：σ＝（ｗ／Ｍｎ）Ａｖ／Ｓ
本発明の生体適合性製剤において、前記高分子グラフト鎖の数平均分子量（Ｍｎ）は、１０，０００〜３２０，０００であるのが好ましく、１３，０００〜２９０，０００であるのがより好ましい。このグラフト鎖の数平均分子量を制御することにより、本発明の生体適合性製剤の血中滞留性を制御することが可能である。具体的には、グラフト鎖の数平均分子量が大きい場合、生体適合性製剤の血中滞留性は向上する。また、前記高分子グラフト鎖の重合度は、例えば１０〜１００，０００である。
【００１３】
本発明の生体適合性製剤において、前記高分子グラフト鎖は、例えば微粒子表面上の重合開始基を基点としたモノマーのリビングラジカル重合によって得ることができる。上記モノマーの種類としては、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体およびスチレン誘導体からなる群から選択される１以上が好ましいが、これらに限定されず、当業者の認識する範囲で適宜選択されてもよい。この高分子グラフト鎖は、別の高分子グラフト鎖と結合していてもよい。具体的にはリビングラジカル重合において、モノマーの１種として架橋性モノマーを用いてブロック共重合体をグラフトし、導入した架橋性基を反応させてもよい。またリビングラジカル重合は、ランダム重合、ブロック重合、組成傾斜型等であってもよい。高分子グラフト鎖は、その末端および末端近傍に特異的なリガンドを導入されていてもよい。そのようなリガンドを有する複合粒子を含む生体適合性製剤は、選択的にリガンドを患部へ届けることができるので好ましい。特異的なリガンドとしては、当該分野で知られる特異的なリガンドであれば特に限定されない。
【００１４】
また、本発明の生体適合性製剤の複合粒子において、微粒子に近い領域の高分子グラフト鎖が、薬物担持層であり、微粒子から遠い領域の高分子グラフト鎖が、外部刺激に応答する高分子である二層構造の複合粒子であってもよい。このような粒子であれば、外部刺激により、微粒子から遠い領域の高分子グラフト鎖の物理化学的性質が変化し、その結果、微粒子に近い領域の高分子グラフト鎖からの薬物放出が制御される。前記薬物担持層は、高分子グラフト鎖と薬物とを、疎水性相互作用、錯体形成等の作用により結合させてもよい。そのような作用による結合は、外部刺激（例えばｐＨ、熱、光）により結合が切断されるからである。前記薬物としては、治療薬、または予防薬等が挙げられる。また、前記薬物の代わりに化粧品等を用いてもよい。
【００１５】
本発明の生体適合性製剤において、前記微粒子は、例えばシリカ等のケイ素酸化物；金属；金属酸化物；金属硫化物等が挙げられ、ケイ素酸化物；金属；金属酸化物が好ましい。前記金属としては、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ等の貴金属；Ｔｉ、Ｚｒ、Ｔａ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｖ、Ｓｂ、Ｉｎ、Ｈｆ、Ｙ、Ｃｅ、Ｓｃ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｆｅ等の遷移金属等が挙げられる。微粒子の種類に応じて、本発明の生体適合性製剤は様々な用途に用いられることができる。具体的には、例えば微粒子が金属または金属酸化物であれば、本発明の生体適合性製剤は、診断用に用いることができる。また、この微粒子は、単分散型の粒子が好ましい。
【００１６】
本発明の生体適合性製剤において、前記微粒子は、３ｎｍ〜５μｍの粒径を有する微粒子であるのが好ましく、１０ｎｍ〜３μｍの粒径を有する微粒子であるのがより好ましい。この微粒子の粒径を制御することにより、本発明の生体適合性製剤の血中滞留性を制御することが可能である。具体的には、微粒子の粒径が小さい場合、生体適合性製剤の血中滞留性は向上する。また、本発明の生体適合性製剤の大きさはこの微粒子の粒径と高分子グラフト鎖の長さ（数平均分子量）とにより、制御することができる。すなわち、前記微粒子の粒径を大きくすれば、高分子グラフト鎖の長さが同じであっても、生体適合性製剤の大きさは大きくなる。なお、本発明の生体適合性製剤において、前記微粒子の粒径は、１種類であっても２種類以上の混合であってもよい。微粒子の粒径が１種類である場合、生体適合性製剤の大きさが均一となり、ＤＤＳ用途のためには、好ましい。
【００１７】
本発明の生体適合性製剤において、前記高分子グラフト鎖の分子量分布は、１〜１．５であるのが好ましく、１〜１．３であるのがより好ましい。分子量分布が１〜１．５の範囲で或る場合、生体適合性製剤は均質なグラフト表面を有するからである。
【００１８】
本発明の生体適合性製剤は、例えば、標的とする患部（臓器、組織、細胞、病原体等）へ、好ましくは癌細胞への薬剤運搬用に用いられるのが好ましい。本発明の生体適合性製剤は、血中からの除去のために働くタンパク質の吸着が抑制されており、その結果、血中残存率が高いことが特徴である。そのため、本発明の生体適合性製剤は癌組織への集積が高い。この理由としては、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeability and Retention Effect）が考えられる。５０〜２５０ｎｍの分子サイズをもつ物質は癌組織の血管の解剖学特徴によって、集積することが知られている（“キャンサー・リサーチ（Cancer Research）”、1986年、第46巻、p.6387−6392）。本発明の生体適合性製剤は血中滞留性が高く、その結果として、血流を介して癌組織を通過する確率が高くなる。この結果として、癌により多く集積すると考えられる。
【００１９】
また、複合粒子の微粒子が金ナノ粒子である本発明の生体適合性製剤は、Ｘ線増感剤として用いることができる。金ナノ粒子がＸ線吸収特性を有するからである。また、複合粒子の微粒子が金ナノロッドである本発明の生体適合性製剤は、近赤外光温熱療法における剤等として用いることができる。金ナノロッドが熱を吸収次いで発熱することができるからである。複合粒子の微粒子が酸化鉄粒子である本発明の生体適合性製剤は、磁性剤、ＭＲＩ造影剤、温熱療法における剤等として用いることができる。また、複合粒子の微粒子が量子ドット（例えばＣｄＳｅ、ＣｄＳ）である本発明の生体適合性製剤は、蛍光プローブにおける剤として用いることができる。複合粒子の微粒子が中空微粒子である本発明の生体適合性製剤は、ガス内包粒子、超音波造影剤等として用いることができる。微粒子の複合化も可能である。例えば、Ｘ線吸収Ａｕ粒子とＭＲＩプローブ酸化鉄粒子とを混合したものが複合粒子の微粒子である本発明の生体適合性製剤は、マルチモダリティをもつ診断分子プローブとして用いることができる。
【００２０】
本発明の生体適合性製剤において、複合粒子は、例えば以下のようにして製造することができる。まず、重合開始基含有カップリング剤としての化合物を、化学吸着法により微粒子表面に固定する。そして、１種類以上のモノマーを供給してリビングラジカル・グラフト重合を行う。重合開始基含有カップリング剤を予め微粒子表面に固定することにより、微粒子表面上でグラフト密度を一定に保持しつつグラフト重合を進行させることができる。つまり、グラフト量はグラフト鎖のＭｎ（数平均分子量）に比例して増大させることができ、重合をリビング的に進行させ、微粒子表面上のほぼすべてのグラフト鎖をほぼ均等に成長させることができる。すなわち、本発明の複合粒子においては、微粒子表面上の隣接グラフト鎖間の立体障害が軽減されているのである。なお、リビングラジカル・グラフト重合の間、微粒子の表面に固定していない重合開始剤を共存させてもよい。
【００２１】
重合開始基含有カップリング剤としての化合物は、微粒子との親和性等を考慮して選択することができる。具体的には、例えば微粒子が金や銀、白金などの金属である場合、その重合開始基含有カップリング剤としては、例えば、下式（Ｉ）に示すジスルフィド化合物が好ましい。
(Ｂｒ（ＣＨ3）2ＣＣＯＯ（ＣＨ2）11Ｓ）2−      （Ｉ）
微粒子が金や銀、白金などの金属である場合、その重合開始基を含有しないカップリング剤としては、アルキルジスルフィド化合物等が挙げられる。
【００２２】
また、微粒子がケイ素酸化物、金属酸化物、または金属硫化物の粒子である場合、その重合開始基含有カップリング剤としては、下式（ＩＩ）に示すシラン化合物が好ましい。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
前記式中、ｎは整数であり、３〜１０が好ましく、４〜８がより好ましい。Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基であり、Ｃ1またはＣ2アルキル基が好ましい。Ｒ2は、Ｃ1またはＣ2アルキル基である。Ｘはハロゲン原子であり、臭素または塩素原子が好ましい。式（ＩＩ）で表わされる化合物としては、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）、（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン（ＢＨＥ）等が挙げられる。
【００２５】
微粒子がケイ素酸化物、金属酸化物、または金属硫化物である場合、その重合開始基を含有しないカップリング剤としては、アルキルシランカップリング剤等が挙げられる。
【００２６】
微粒子表面のグラフト密度は、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合を調整することで、変更することができる。具体的には、微粒子がケイ素酸化物の粒子である場合、重合開始基含有カップリング剤と重合開始基を含有しないカップリング剤との割合が１：０であれば、グラフト密度は０．１本鎖／ｎｍ2以上である。
【００２７】
重合終了後、目的とする複合粒子は、反応液から当該分野で通常用いられる方法、例えば抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈殿、ろ過、乾燥、吸着、析出、クロマトグラフィーなどの方法を単独または組み合わせることにより、単離することができる。
【００２８】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
【００２９】
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｃｙ５．５：１Ｈ−ベンザ［ｅ］インドリウム，２−［５−［３−［６−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］−１，３−ジヒドロ−１，１−ジメチル−６，８−ジスルホ−２Ｈ−ベンザ［ｅ］インドール−２−イリデン］−１，３−ペンタジエン−１−イル］−３−エチル−１，１−ジメチル−６，８−ジスルホ−，分子内塩，ナトリウム塩（１：３）；1H-Benz[e]indolium, 2-[5-[3-[6-[(2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl]-1,3-dihydro-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-2H-benz[e]indol-2-ylidene]-1,3-pentadien-1-yl]-3-ethyl-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-, inner salt, sodium salt (1:3)
【実施例１】
【００３０】
複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の製造例
（１）重合開始基含有カップリング剤（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＢＰＥ）の合成
【００３１】
【化２】
2010280594.tif 000004
【００３２】
ＢＰＥの合成は、２段階反応により行った。第１段階として、アリルアルコール（１７０ｇ）、トリエチルアミン（２３７ｇ）およびジクロロメタン（２Ｌ）の混合溶液を氷冷し、その中へ２−ブロモイソブチリルブロマイド（４５０ｇ）を滴下した。その後、反応液を０℃で３時間攪拌し、さらに室温で１０時間攪拌した。反応液を濃縮し、ＴＨＦを加え塩を析出させ、濾過し、濾液を濃縮した後、得られたものをクロロホルム（１Ｌ）により希釈し、それを１Ｎ塩酸水溶液（２×１Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２×１Ｌ）、純水（２×１Ｌ）の順で洗浄した。有機相を乾燥し、濃縮後、減圧蒸留により精製し、１−（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシ−２−プロペン（ＢＰＰ）を収率９０％で得た。
【００３３】
第２段階として、フラスコの中へＢＰＰ（１００ｇ）、トリエトキシシラン（１７０ｇ）およびカルステッド触媒（６００μＬ）を順次入れ、その混合液をアルゴン雰囲気下、室温で１２時間攪拌した。反応後減圧蒸留により精製し、ＢＰＥを収率７０％で合成した。
【００３４】
（２）シリカ微粒子表面への開始基の導入
シリカ微粒子としては、平均粒径１３０、２９０、７４０および１５５０ｎｍのシリカ微粒子（日本触媒（株）製、製品名「シーホスター（登録商標）ＫＥ−Ｅ１０」（平均粒径１３０ｎｍ）、「シーホスター（登録商標）ＫＥ−Ｅ３０」（平均粒径２９０ｎｍ）、「シーホスター（登録商標）ＫＥ−Ｅ７０」（平均粒径７４０ｎｍ）、「シーホスター（登録商標）ＫＥ−Ｅ１５０」（平均粒径１５５０ｎｍ））、リシン添加法により調製した平均粒径１５ｎｍのシリカ微粒子、および逆ミセル法により調製した平均粒径６０ｎｍのシリカ微粒子を用いた。
【００３５】
シリカ微粒子表面への開始基導入の典型例を以下に示す。シリカ微粒子のエタノール分散液（７．７ｗｔ％，３０ｍＬ）を２８％アンモニア水溶液（１３．９ｇ）とエタノール（２００ｍＬ）の混合液中へ加えた。その混合液を４０℃で２時間攪拌した後、エタノール（１０ｍＬ）に溶解したＢＰＥ（２ｇ）を滴下し、４０℃で１８時間攪拌した。その後、シリカ微粒子を遠心分離機により回収し、エタノール、次いでアニソールにより洗浄した後、開始基を有するシリカ微粒子を得た。この開始基を有するシリカ微粒子は、アニソール中で保存した。
【００３６】
（３）シリカ微粒子を用いた表面開始リビングラジカル重合
【００３７】
【化３】
2010280594.tif 000005
【００３８】
開始基を有するシリカ微粒子、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）、（４−ヒドロキシフェニル）エチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ、ジノニルビピリジンおよびエチル２−ブロモイソブチレート（ＥＢＩＢ）をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後７０℃で所定時間重合して、高分子グラフト鎖がシリカ微粒子表面に結合した複合粒子を得た。高分子グラフト鎖におけるモノマー転化率はＮＭＲにより、ＥＢＩＢから生成する遊離ポリマーの分子量及び分子量分布はゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により求めた。複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の精製は、遠心分離とアセトン、純水への再分散を繰り返すことにより行った。複合粒子は、純水に分散させ室温保存した。複合粒子をフッ化水素で処理することにより、高分子グラフト鎖をシリカ微粒子から切り出し、高分子グラフト鎖の分子量及び分子量分布をＧＰＣにより求めた。熱重量分析（ＴＧＡ）により求めたグラフト量から、グラフト密度を算出し、全てのサンプルにおいて、０．２鎖／ｎｍ2以上の高いグラフト密度を有していることを確認した。なお、ここで用いた重合条件、重合結果を表１にまとめ、また、それをサンプルリストとした。図１に、複合粒子（Ｅｎｔｒｙ９）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示した。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
（４）複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の放射性同位元素（ＲＩ）による標識
複合粒子（微粒子がシリカ粒子、実施例１（３）において製造）の分散液（濃度＝１ｗｔ％、溶媒＝純水、１００μＬ）をマイクロ遠心チューブに入れ、さらにＮａ125Ｉ（５μＬ、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ＮＥＺ０３３）、次いでＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ  Ｔ溶液（濃度＝０．２ｍｇ／ｍｌ、溶媒＝０．５Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有、１００μＬ））を加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。そこへＳｏｄｉｕｍ  ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆｉｔｅ溶液（濃度＝４ｍｇ／ｍＬ、溶媒＝純水、１００μＬ）をさらに加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。得られた混合物をＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で分離精製（溶出液：生理食塩水）し、微粒子（125Ｉ標識複合粒子）含有留出分を125Ｉ標識複合粒子分散液として回収した。
【実施例２】
【００４１】
ＲＩ標識複合粒子の体内動態評価
125Ｉ標識複合粒子分散液（実施例１（４）において製造、１００μＬ）を、健常および担癌マウス（６週齢）の尾より静脈内投与した。マウス眼より採血しガンマカウンター（ＡＲＣ−３０１Ｂ，アロカ（株））により放射活性を測定し、複合粒子の血中濃度を求めた。また、所定時間経過後にマウスを犠牲死させ、各組織の放射活性を測定し、複合粒子の体内分布を評価した。
【００４２】
なお、従来の微粒子製剤（シリカ微粒子それ自体、シリカ微粒子の表面にポリエチレングリコールを結合させた微粒子等）の血中滞留性は、“アドバンスド・マテリアルズ（Advanced Materials）”、2004年、第16巻、p.１９５９−１９６６および“アナリティカル・ケミストリ（Analytical Chemistry）”、2008年、第80巻、p.９５９７−９６０３を参照。
【００４３】
図２に、複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の体内動態におけるグラフト鎖長依存性を示す。ここで用いた複合粒子のシリカ微粒子の平均粒径は１３０ｎｍであり、グラフト鎖の分子量は１３０００（表１中エントリー１）、４９０００（表１中エントリー２）、９５０００（表１中エントリー３）および２９００００（表１中エントリー５）である。図２には、投与１時間後の血中残存率を示した。図２から、本発明の生体適合性製剤は、５０〜７０％程度の高い血中残存率を示すとともに、グラフト鎖長が大きくなるにともない血中残存率が高くなる傾向にあることが確認できた。
【００４４】
図３に、複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の体内動態におけるコア（微粒子）粒径依存性を示す。ここで用いた複合粒子のシリカ微粒子（コア）の平均粒径は、１５ｎｍ（表１中エントリー９）、６０ｎｍ（表１中エントリー１０）、１３０ｎｍ（表１中エントリー３）、２９０ｎｍ（表１中エントリー６）、７４０ｎｍ（表１中エントリー７）および１５５０ｎｍ（表１中エントリー８）である。図３には、投与１時間後の複合粒子の血中残存率を示した。本発明の生体適合性製剤は、コア粒径が大きくなるにともない血中残存率が低くなるものの、コア粒径が１３０ｎｍ以下の場合、５０％以上の高い血中残存率を示すことが確認できた。
【００４５】
図４に、複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の血中残存率の経時変化を示す。ここでは、健常及び担癌マウスを用いた。用いた複合粒子のシリカ微粒子の平均粒径は、１５ｎｍ（表１中エントリー９）および２９０ｎｍ（表１中エントリー６）であり、グラフト鎖の分子量は、それぞれ９８０００（表１中エントリー９）および１１３０００（表１中エントリー６）である。図４中、「１５ｎｍＳｉＰ＿健常」は健常マウスを用いて複合粒子として表１中エントリー９の複合粒子を、「１５ｎｍＳｉＰ＿担癌」は担癌マウスを用いて複合粒子として表１中エントリー９の複合粒子を、「２９０ｎｍＳｉＰ＿健常」は健常マウスを用いて複合粒子として表１中エントリー６の複合粒子を、「２９０ｎｍＳｉＰ＿担癌」は担癌マウスを用いて複合粒子として表１中エントリー６の複合粒子を用いた場合の結果を示す。図３の結果と同様、本発明の生体適合性製剤は、微粒子（コア）粒径が小さい（１５ｎｍ）場合、長期にわたって血中を滞留し、２４時間後においても４０％程度の高い血中残存率が確認できた。また、本発明の生体適合性製剤の担癌マウスでの血中残存率は、健常マウスの場合と比較し、低くなる傾向にあることが確認できた。
【００４６】
図５に、複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の体内分布を示す。測定試料は図４で用いたものと同じであり、図４の実験終了後（投与し４８時間後）の体内分布を評価した。本発明の生体適合性製剤は、シリカ微粒子（コア）の平均粒径が２９０ｎｍの複合粒子は、肝臓や脾臓などに多く集積することが確認できた。血中滞留性に優れる、シリカ微粒子（コア）の平均粒径が１５ｎｍの複合粒子の場合には、本発明の生体適合性製剤は肝臓や脾臓などへの集積が比較的少なく、腫瘍組織に５〜１０％程度集積することが確認できた。
【実施例３】
【００４７】
複合粒子の腫瘍組織へのターゲッティングと蛍光イメージング
（１）蛍光色素標識複合粒子の調製
開始基を有するシリカ微粒子（実施例１（２）において製造）、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）、ビニルベンジルフタルイミド（ＶＢＰ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｃｌ、ジノニルビピリジンおよびエチル２−ブロモイソブチレート（ＥＢＩＢ）をパイレックス製ガラス管に入れ凍結融解法により脱気し真空下で封管した後７０℃で所定時間重合して、高分子グラフト鎖がシリカ微粒子表面に結合した複合粒子を得た（出発原料の割合は表１のエントリー１３を参照）。複合粒子（微粒子がシリカ粒子）の精製は、遠心分離とアセトン、純水への再分散を繰り返すことにより行った。精製後、複合粒子エタノール分散液（３５ｍＬ）にヒドラジン１水和物（０．５１ｍＬ）を加え、９０℃で１時間還流した。その後、エタノール、アセトン、純水、炭酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ＝９．３）でそれぞれ２回、遠心、再分散を繰り返し、複合粒子を洗浄した。炭酸緩衝液に分散した複合粒子と反応性蛍光色素であるＣｙ５．５（登録商標、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製（#Q15408）、１本）、を室温で３日間反応させた。遠心、純水分散を繰り返すことにより精製し、蛍光標識複合粒子分散液（濃度＝１．３ｗｔ％）を調製した。
【００４８】
（２）高分子グラフト鎖を有さない蛍光標識シリカ微粒子の調製
アミノプロピルトリエトキシシラン（２０μｇ）、ジメチルアミノピリジン（１μｇ）、Ｃｙ５．５（登録商標、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製（#Q15408）、１本）およびＤＭＳＯ（１００ｍｇ）を８０℃で３日間混合してＤＭＳＯ溶液を調製した。純水（９６０ｍｇ）、Ｌ−リシン（１ｍｇ）およびオクタン（５０ｍｇ）を６０℃で混合し、次いで、前述のＤＭＳＯ溶液とテトラエトキシシラン（７２ｍｇ）を加え２４時間攪拌し、さらに、１００℃で２４時間攪拌した。反応液を純水に対して透析し精製した。微粒子分散液の最終濃度は１．１ｗｔ％であった。
【００４９】
（３）蛍光イメージング測定
蛍光標識複合粒子分散液（実施例３（１）において製造、１００μＬ）を、担癌マウス（６週齢）の尾より静脈内投与した。図６（図６上段、「ＰＰＥＧＭＡ−ＳｉＰ」参照）に、複合粒子分散液を投与後、１時間（ｔ＝１ｈ）、６時間（ｔ＝６ｈ）、２４時間（ｔ＝２４ｈ）および４８時間（ｔ＝４８ｈ）経過したときの蛍光強度、すなわち、複合粒子の分布状態を示す。蛍光イメージは、ＬＡＳ４０００イメージング装置（富士フイルム（株）製）により得た。腫瘍組織はマウスの左脚付け根付近にあり、その辺りが時間の経過とともに濃く色づいていることが分かる。つまり、複合粒子が腫瘍組織に高い割合で集積することが明らかとなった。これは、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeability and Retention Effect、ガン細胞においては正常細胞に比べて血管壁の透過性が亢進しており、ある程度の大きさまでの物質が集積しやすい）によって達成されたものであり、複合粒子が血中滞留性に優れていることに起因する。一方、高分子グラフト鎖を有さない蛍光標識シリカ微粒子（実施例３（２）において製造）の場合は、１時間（ｔ＝１ｈ）および２４時間（ｔ＝２４ｈ）経過したときの蛍光強度から、僅かに腫瘍組織に集積していることが確認できた（図６下段、「ＳｉＰ without brush」参照）。このことは、高分子グラフト鎖が微粒子表面に結合することが、長期の血中滞留性ならびに腫瘍組織への集積化に極めて有効であることを示している。
【実施例４】
【００５０】
複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）の製造例
シリカ微粒子の代わりに、平均粒径１６ｎｍのマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）ナノ粒子（鉄−オレイン酸複合体法により調製、平均粒子径は透過型電子顕微鏡法により投影面積円相当径を測定）を用いる以外は実施例１（表１中エントリー１１）と同様にして複合粒子（微粒子が酸化鉄ナノ粒子）を合成した。図７にその電子顕微鏡写真を示す。得られた複合粒子の高分子グラフト鎖の分子量および分子量分布指数は、それぞれ１２０００および１．１８であった。
【実施例５】
【００５１】
複合粒子（微粒子が金ナノ粒子）の製造例
（１）リビングラジカル重合の開始剤を表面に有する金ナノ粒子の製造
沸騰した純水（１５００ｍＬ）の中に、純水（２０ｍＬ）に溶解したクロロ金酸（ＨＡｕＣｌ4，２２０ｍｇ）を加えて激しく攪拌した。そこへ、純水（２０ｍＬ）に溶解したクエン酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を加えた。５分間激しく攪拌した後、反応液を氷水で冷やし、その中へテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）に溶解した式（Ｉ）のジスルフィド開始剤（１．７０ｍｇ）を加え、１２時間室温で攪拌した。生成した金ナノ粒子を、遠心機により回収し、メタノールと水（メタノール：水＝１：１）の混合液、ヘキサンと酢酸エチル（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）の混合液で洗浄した後、風乾してリビングラジカル重合の開始剤を表面に有する金ナノ粒子を得た（収量：１００ｍｇ、平均粒子径：１２ｎｍ、平均粒径は透過型電子顕微鏡法により投影面積円相当径を測定）。
(Ｂｒ（ＣＨ3）2ＣＣＯＯ（ＣＨ2）11Ｓ）2−      （Ｉ）
（２）金ナノ粒子存在下におけるリビングラジカル重合
開始剤を表面に有する金ナノ粒子（実施例５（１）において製造、１００ｍｇ）、微粒子表面に結合していない重合開始剤２−ブロモイソ酪酸エチル（６４ｍｇ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ、１０ｇ）、スパルテイン（２４０ｍｇ）およびジメチルホルムアミド（９．４ｇ）の混合液を、ＣｕＢｒ（７１ｍｇ）の入ったガラス管の中に加え、その溶液を凍結融解法により脱気し、封管した。重合は、４０℃で３時間または１５時間行った。
【００５２】
重合終了後、アセトン／水系を用いた沈殿分別法により、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）の高分子グラフト鎖を微粒子表面に有する複合粒子(微粒子が金ナノ粒子）を回収した。
【００５３】
（３）金ナノ粒子表面の高分子グラフト鎖の分析
ＰＭＭＡの高分子グラフト鎖を微粒子表面に有する複合粒子(微粒子が金ナノ粒子、実施例５（２）において製造、２０ｍｇ）を、ヨウ素のジクロロメタン溶液（１ｍｇ／ｍＬ、２ｍＬ）に溶解し、１２時間攪拌することにより、高分子グラフト鎖を微粒子（金ナノ粒子）表面から切断した。切断された高分子グラフト鎖の分析を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより行った。これにより、次の結果を得た。
【００５４】
複合粒子（微粒子が金ナノ粒子）１（重合時間、３時間）
高分子グラフト鎖の数平均分子量＝１２，０００
高分子グラフト鎖の分子量分布指数＝１．２４。
【００５５】
複合粒子（微粒子が金ナノ粒子）２（重合時間、１５時間）
高分子グラフト鎖の数平均分子量＝２２，０００
高分子グラフト鎖の分子量分布指数＝１．３０。
【００５６】
また、Ｍｎおよび元素分析により測定したグラフト量から、グラフト密度は約０．３鎖/ｎｍ2と見積もられた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の生体適合性製剤は、薬物ナノキャリア、イメージング試薬等としての用途にも適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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