(57)【要約】【課題】  リンパ腫の治療剤および治療方法を提供すること。【解決手段】  骨形成因子（bone morphogenetic protein ; BMP）または骨形成因子受容体に対するアゴニストを有効成分とするリンパ腫治療剤が開示される。BMPがリンパ腫細胞に対して強い細胞死誘導活性があることが見出された。好ましくは、BMPはBMP-2、BMP-4またはBMP-7であり、特に好ましくはBMP-4である。また、BMPまたは骨形成因子受容体に対するアゴニストを有効成分とするリンパ腫細胞のアポトーシス誘導剤、ならびにリンパ腫細胞に骨形成因子受容体を介したシグナルを伝達することによりアポトーシスを誘導する方法も開示される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
BMP；または
骨形成因子受容体に対するアゴニスト
を有効成分とするリンパ腫治療剤。
【請求項２】
BMPがBMP-2、BMP-4またはBMP-7である請求項１に記載のリンパ腫治療剤。
【請求項３】
BMPがBMP-4である請求項２に記載のリンパ腫治療剤。
【請求項４】
BMP；または
骨形成因子受容体に対するアゴニスト
を有効成分とするリンパ腫細胞のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
BMPがBMP-2、BMP-4またはBMP-7である請求項４に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
BMPがBMP-4である請求項５に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
リンパ腫細胞に骨形成因子受容体を介したシグナルを伝達することによりアポトーシスを誘導する方法。
【請求項８】
BMP-4を用いてシグナルを伝達することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ腫の治療剤および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成因子（Bone morphogenetic protein：BMP) は、TGF-β (transforming growth factor β) スーパーファミリーに属する分泌蛋白質である。当初、骨および軟骨形成に関わる蛋白質として同定されたが（非特許文献１，２）、その後の研究により、BMPが骨形成以外にも初期発生過程で細胞分化の調節など、多様な生理機能を有していることが明らかにされている（非特許文献３）。
【０００３】
現在まで約20種類のBMP蛋白質が同定されているが、とりわけBMP-2と-4は成熟蛋白質部分のアミノ酸配列の相同性が両者で94%と酷似しており、BMP-7と同様、非常に強力な骨形成活性を有していることが知られている。実際、この骨形成活性を利用して、リコンビナントBMP-2蛋白質が骨疾患領域において臨床開発されている（非特許文献３）。
【０００４】
TGF-βと同様に、BMP蛋白質も細胞膜上に発現するセリンスレオニンキナーゼ受容体を介することにより細胞内にシグナルを伝達する。BMP-2/4/7蛋白質の受容体としては、2種類の受容体、すなわちtype I受容体（BMPR-IAおよびBMPR-IB）およびtype II受容体(BMPR-II)が同定されている。BMP-2/4/7蛋白質は、type Iおよびtype II受容体と結合し、3者が複合体を形成することで、シグナル伝達メディエーターであるSmad転写因子をリン酸化する。リン酸化を受けたSmad転写因子が核にその信号を伝達することによって、様々な生理作用が引き起こされる（非特許文献４）。
【０００５】
BMP-2/4/7は正常細胞ばかりでなく癌細胞に対しても、増殖促進、分化誘導、細胞運動そして細胞死誘導といった作用を発揮することが多くの研究により明らかにされている。血液癌細胞に対する細胞死誘導活性に関しても、複数のグループにより報告されている。たとえば、BMP-2が、マウスB細胞ハイブリドーマ（非特許文献５,６）、さらには、ヒト骨髄腫細胞株（U266）に対して細胞死を誘導することが報告がされており（非特許文献７）、BMP-4についてもヒト骨髄腫細胞株（OH-2, IH-1, ANML-6）を用いた系で細胞死誘導が確認されている（非特許文献８）。
【０００６】
一般に血液癌は、大きく分けて、骨髄由来の白血病とリンパ節由来の悪性リンパ腫に分類される。さらに、白血病または悪性リンパ腫に分類できない病型もあり、その代表が、形質細胞由来の多発性骨髄腫である。
【０００７】
これまでの報告にあるとおり、BMP-2/4が、血液癌の１つに分類される骨髄腫細胞に対して細胞死を誘導する活性は見出されているものの、リンパ腫や白血病などの他の血液癌に対する作用については詳しい解析がなされていない。
【０００８】
【非特許文献１】Urist MR.. Bone: formation by autoinduction. Science. 1965 Nov 12;150(698):893-9.
【非特許文献２】Wozney JM et al., Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 1988 Dec 16;242(4885):1528-34.
【非特許文献３】Chen D et al., Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 2004 Dec;22(4):233-41.
【非特許文献４】Von Bubnoff et al., Intracellular BMP signaling regulation in vertebrates: pathway or network? Dev Biol. 2001 Nov 1;239(1):1-14. Review.
【非特許文献５】Ishisaki A et al., Differential inhibition of Smad6 and Smad7 on bone morphogenetic protein- and activin-mediated growth arrest and apoptosis in B cells. J Biol Chem. 1999 May 7;274(19):13637-42.
【非特許文献６】Kimura N et al., BMP2-induced apoptosis is mediated by activation of the TAK1-p38 kinase pathway that is negatively regulated by Smad6. J Biol Chem. 2000 Jun 9;275(23):17647-52.
【非特許文献７】Kawamura C et al., Bone morphogenetic protein-2 induces apoptosis in human myeloma cells with modulation of STAT3. Blood. 2000 Sep 15;96(6):2005-11.
【非特許文献８】Hjertner et al., Bone morphogenetic protein-4 inhibits proliferation and induces apoptosis of multiple myeloma cells. Blood. 2001 Jan 15;97(2):516-22.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、血液癌細胞株に対するBMPの作用を調べた結果、BMPがリンパ腫細胞に対して強い細胞死誘導活性があることを見出した。
【００１０】
本発明は、骨形成因子（bone morphogenetic protein ; BMP）または骨形成因子受容体に対するアゴニストを有効成分とするリンパ腫治療剤を提供する。好ましくは、BMPはBMP-2、BMP-4またはBMP-7であり、特に好ましくはBMP-4である。
【００１１】
本発明はまた、骨形成因子（bone morphogenetic protein ; BMP）または骨形成因子受容体に対するアゴニストを有効成分とするリンパ腫細胞のアポトーシス誘導剤を提供する。本発明はさらに、リンパ腫細胞に骨形成因子受容体を介したシグナルを伝達することによりアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
骨形成因子（BMP）
骨形成因子（Bone morphogenetic protein ; BMP）は、TGF-β (transforming growth factor β) スーパーファミリーに属する蛋白質であり、現在まで約20種類のBMP蛋白質が同定されている。本発明で用いられるBMPの例としては、例えば、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9などを挙げることができる。好ましいBMPはBMP-2、BMP-4またはBMP-7であり、特に好ましいBMPはBMP-4である。BMP-2、BMP-4またはBMP-7のアミノ酸配列は公知である（BMP-2のGenBank Accession No : M22489、BMP-4のGenBank Accession No : M22490またはBAA06410,、BMP-7のGenBank accession No : X51801）。BMP-2、BMP-4、BMP-7のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３に記載する。
【００１３】
本発明においては如何なるBMPを用いてもよいが、哺乳動物BMP、特にヒトBMPと実質的に同じ生物学的活性を有するものが好ましい。また、高度に精製されたBMPを用いることが好ましい。
【００１４】
本発明で用いられるBMPは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したBMPなどを用いることができる。また、BMPは既に市販されているので、市販のBMPを用いることも可能である（R&D Systems社、等）。
【００１５】
本発明で用いられるBMPは、BMP受容体へのシグナル伝達能を有する限り、上述のアミノ酸配列から１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された変異体でもよい。このような変異体は、好ましくは、上述のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１６】
アミノ酸配列の同一性は、比較すべき２つの配列において、同一である残基の数を残基の総数で割り、１００を乗ずることにより表される。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能である。
【００１７】
ある蛋白質のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾しても、その蛋白質の生物学的活性が維持されることはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
【００１８】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００１９】
当業者であれば公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、アミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と同等の生理学的活性を有する蛋白質を調製することが可能である。
【００２０】
本発明で用いられるBMPは、後述するBMPを産生する細胞や宿主によって、あるいは精製方法によって、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。例えば、BMPを原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のBMPのアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明におけるBMPにはこのような蛋白質も包含される。
【００２１】
本発明で用いられるBMPは、BMP受容体へのシグナル伝達能を有する限りそれらの断片であってもよい。断片の大きさは特に限定されないが、通常３０アミノ酸以上であり、好ましくは６０アミノ酸以上であり、さらに好ましくは１００アミノ酸以上である。
【００２２】
本発明においては、BMPと他の蛋白質との融合蛋白質を用いることも可能である。融合蛋白質を作製するためには、例えば、BMPをコードするＤＮＡと他の蛋白質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のBMPとの融合に付される他の蛋白質は特に限定されない。
【００２３】
また、化学修飾したBMPを用いることも可能である。化学修飾したBMPの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったBMPや、細胞障害性物質を結合したBMP、ポリエチレングリコール、ビタミンＢ１２等の、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたBMPなどを挙げることができる。
【００２４】
骨形成因子（BMP）受容体に対するアゴニスト
本発明において、骨形成因子（BMP）受容体に対するアゴニストとは、骨形成因子受容体（BMP受容体）を発現する細胞において、BMP受容体に結合して、アゴニスト活性を示す物質をいう。ここで、アゴニスト活性とは、BMP受容体に結合したときに、細胞内に、BMP（例えば、BMP-4）がBMP受容体に結合した場合と同様のシグナルを伝達することができる能力を意味する。BMP受容体に対するアゴニストとしては、例えば蛋白質、ペプチド、抗体、低分子化合物等を挙げることができる。
【００２５】
本発明において、骨形成因子受容体とは、BMPが結合したときに細胞内にそのシグナルを伝達する受容体を意味する。本発明の骨形成因子受容体は、特に限定されないが、例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-7などの受容体が挙げられる。
【００２６】
骨形成因子受容体の好ましい例としては、typeＩ受容体（BMPR-IAまたはBMPR-IB）およびType II受容体（BMPR-II）を挙げることができる。BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-IIの塩基配列・アミノ酸配列は既に公知である（BMPR-IAのGenBank Accession No : Z22535、BMPR-IBのGenBank Accession No : D89675、U89326、BC047773、BMPR-IIのGenBank Accession No : D50516、Z48923）。BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-IIのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６に記載する。
【００２７】
本発明で用いられるBMP受容体に対するアゴニストの１つの好ましい態様として、BMP受容体に対するアゴニスト抗体を挙げることができる。アゴニスト抗体は、BMP受容体に結合し、アゴニスト活性を有する限りいかなる抗体でもよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。
【００２８】
本発明のアゴニスト抗体としては、特に限定されないが、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などを用いることができる。抗体がヒトに投与される場合には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などの、ヒトに対する抗原性を低下させた抗体を用いることが好ましい。
【００２９】
抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいがモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３０】
本発明で使用されるアゴニスト抗体は、公知の手段を用いて抗BMP受容体抗体を取得し、アゴニスト活性を有する抗体を選択することにより得ることができる。抗BMP受容体抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものを含む。
【００３１】
抗BMP受容体抗体は、基本的な公知技術を使用して、例えば以下の方法によって得ることが可能である。
【００３２】
まず、BMP受容体をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、このベクターで適当な宿主細胞を形質転換させる。次に、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトBMP受容体蛋白質を公知の方法で精製することができる。
【００３３】
この精製BMP受容体蛋白質またはその部分ペプチドを感作抗原として用いる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
【００３４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００３５】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、 P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００３７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００３８】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、アゴニスト活性を有する抗BMP受容体抗体抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。アゴニスト活性の測定法は下記に説明する。
【００３９】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでBMP受容体に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、BMP受容体への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるBMP受容体を投与して抗BMP受容体抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からBMP受容体に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 94/25585 号公報、WO 93/12227 号公報、WO 92/03918 号公報、WO 94/02602 号公報参照）。
【００４０】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。
【００４１】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
【００４２】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、BMP受容体に結合し、アゴニスト活性を有する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Fab、F（ab'）2、Fv、1個のFabと完全なFcを有するFab/c、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）、sc(Fv)2などが挙げられる。これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００４３】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００４４】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体はBMP受容体分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がtype I BMP受容体を認識し、他方の抗原結合部位がtype II BMP受容体を認識してもよい。
【００４５】
本発明で用いられる抗BMP受容体抗体のアイソタイプは特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDの如何なるアイソタイプの抗体を用いてもよい。
【００４６】
アゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。たとえば、BMP蛋白による骨芽細胞の分化誘導活性を指標にアゴニスト活性の測定が可能である。具体的には、MC3T3-E1細胞などの骨芽細胞にBMPを添加し、数日後に細胞を溶解し、骨芽細胞の分化マーカーの１つであるアルカリフォスファターゼ活性を測定することが可能である。
【００４７】
また、アゴニスト活性の測定は、本来の活性を指標に測定するだけでなく、他の活性を指標に測定することも可能である。例えば、細胞増殖を指標にアゴニスト活性を測定する方法により判定することも可能である。より具体的には、BMP依存性増殖を示す細胞にアゴニスト活性を測定したい抗BMP受容体抗体を添加し、培養する。その後、WST-8のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標にアゴニスト活性を測定することが可能である。BMP依存性増殖を示す細胞は当業者に公知の方法で得ることができ、例えば、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、ＢＭＰ受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればよい。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、G-CSF受容体、mpl、neu、GM-CSF受容体、EPO受容体、c-kit、FLT-3等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、BaF3、NFS60、FDCP-1、FDCP-2、CTLL-2、DA-1、KT-3等を挙げることができる。
【００４８】
その他、アゴニスト活性を測定する為に用いる検出指標としては、量的および／または質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系(cell free assay)の指標、細胞系(cell-based assay)の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応や蛋白質、DNA、RNAの量的および／または質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、蛋白質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、DNA、RNAの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在する蛋白質のリン酸化を検出指標とすることができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的および／または質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌蛋白質、表面抗原、細胞内蛋白質、mRNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成および／または突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、mRNA量、Ca2+やcAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内蛋白質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、蛋白質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
【００４９】
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はBEACON（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはBIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはARVOなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で2種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、2種以上の測定を同時および／または連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
【００５０】
リンパ腫治療剤
本発明のリンパ腫治療剤はリンパ腫の治療および／または予防に有用である。本発明の治療剤の対象疾患となるリンパ腫は如何なるリンパ腫でもよいが、悪性リンパ腫を対象とすることが好ましい。悪性リンパ腫には特に限定されないが、リンパ球様細胞からなる肉腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫が含まれる。
【００５１】
本発明のリンパ腫治療剤は当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で製剤化することができる。
【００５２】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００５３】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
【００５４】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００５５】
投与は特に限定されず、経口投与および非経口投与のいずれでもよいが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
【００５６】
本発明のリンパ腫治療剤の投与量は、特に限定されず、患者の症状、状態、年齢など様々な要因を基に適宜決定することが可能である。例えば、本発明の有効成分としてBMP-4またはアゴニスト抗体を用いる場合、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５８】
実験に使用した細胞株のリストを表１に示す。ARH77, U266, IM9, Jurkat, DaudiはATCCより、K562, Raji, Ramos, U937, Ki-JK, A4/FukはJCRBより購入した。すべての細胞は10％FCSを含むRPMI1640 (インビトロジェン)培地で培養した。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
各種血液癌細胞のBMP蛋白質に対する感受性を解析するため以下の実験を行った。まず、リンパ腫細胞（Daudi, Raji）、骨髄腫細胞（ARH77, U266, IM9）、白血病細胞（K562, Jurkat）を、それぞれ1〜10 x 104 細胞/ウエルで96ウエルプレートに撒き、BMP2、あるいはBMP4、あるいはBMP7 (いずれもR&D社) を、1μg/mlで細胞に添加した。48時間培養後、生細胞数をWST-8試薬（cell counting kit-8, 同仁）を用いて、添付の文書にしたがって計測した。
【００６１】
その結果、図１に示すとおり、リンパ腫細胞株であるDaudi細胞において、他の細胞株では見られない著しい増殖抑制が観察された。この作用は、BMP2, 4, 7すべてで確認された。
【００６２】
次に、Daudi細胞で見られたBMP分子による著しい増殖抑制作用がアポトーシスの誘導によるものかどうかを解析した。
【００６３】
K562細胞、および、Daudi細胞を、2 x 106 細胞/ウエルで6ウエルプレートに撒き、BMP4を終濃度100 ng/mlになるように添加した。37℃で24時間培養後、細胞を回収し、染色体DNAについて解析した（Apoptotic DNA Ladder kit, ロシュ社）。
【００６４】
その結果、図2に示すとおり、BMP4を添加したDaudi細胞において、アポトーシスに特徴的な染色体DNAのラダーフォーメーションが認められた。このことから、Daudi細胞に対するBMP蛋白質の作用は、アポトーシス誘導であることが明らかとなった。
【００６５】
図１で示したとおり、複数の血液癌細胞株の中で、リンパ腫細胞株のDaudi細胞でのみ、BMP2，4および7蛋白質による細胞死誘導が観察された。そこで次に、BMP2,4および7による細胞死誘導の濃度依存性について解析を行った。
【００６６】
段階希釈したBMP2, 4または7を加えた培地でDaudi細胞を培養し、48時間後にWST-8試薬を用いて生細胞数を解析した。その結果、BMP2, 4, 7が濃度依存的に細胞死を誘導することが確認された。また細胞死誘導活性は、BMP4が最も強く、ついでBMP2で認められ、BMP7の細胞死誘導活性はそれほど強くないことが分かった（図3）。
【００６７】
次に、BMP2, 4, 7による細胞死誘導作用が、Daudi細胞以外の他のリンパ腫細胞でも認められるか解析を行った。
【００６８】
5種類のリンパ腫細胞株（Daudi, U937, Ki-JK, A4/Fuk, Ramos）を1〜10 x 104 細胞/ウエルで96 ウエルプレートに撒き、これに段階希釈したBMP2, 4, 7を添加した。そして72時間培養後、WST-8試薬を用いて生細胞数を測定した。その結果、A4/Fuk細胞においてもBMP2, 4, 7による細胞死誘導が認められた。この作用は、Daudi細胞に対するものと同様、BMP4が最も強いことが分かった（図3）。
【００６９】
これらの結果は、BMP-2/4/7が悪性リンパ腫に対して高い細胞死誘導活性を発揮することを示す。この知見は、BMP-2/4/7、特にBMP-2/4の悪性リンパ腫に対する治療剤としての用途を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、リンパ腫細胞株に対するBMP2, 4および7の作用を示す。
【図２】図２は、BMP4によるDaudi細胞のアポトーシス誘導を示す。
【図３】図３は、BMP2, 4および7による細胞死誘導の濃度依存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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