(57)【要約】【課題】安定性、安全性及び皮膚美白活性が高い馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを有効成分に含む皮膚美白用組成物を提供する。また、馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームの製造方法を提供する。【解決手段】馬油及び済州馬の馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを有効成分として含む皮膚美白用組成物とする。また、馬胎盤抽出物を親水性溶媒に溶解させる段階、上記溶液にクラスターデキストリンを添加して５０℃から６０℃まで加温する段階、上記加温された溶液を０℃から４℃まで冷却させる段階、上記溶液に攪拌下に馬油と乳化剤を徐々に添加する段階、及びアミノ酸を添加して０℃〜４℃に保ちながら攪拌して水溶性ナノリポソームを形成する段階を含む馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法とする。【選択図】図１
2010215605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
馬油及び済州馬から採取した馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを有効成分として含む皮膚美白用組成物。
【請求項２】
上記馬油は、ナノリポソーム総重量に対して２〜１０重量％で含有される請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
上記馬胎盤抽出物は、ナノリポソーム総重量に対して１〜５重量％で含有される請求項１に記載の膚美白用組成物。
【請求項４】
上記ナノリポソームは、上記皮膚美白用組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％で含有される請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項５】
上記ナノリポソームは、乳化剤、クラスターデキストリン及び親水性溶媒を含む請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項６】
上記ナノリポソームは、アミノ酸を更に含む水溶性ナノリポソームである請求項５に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項７】
上記アミノ酸は、アルギニン、アラニン、フェニルアラニン、ライシン及びヒスチジンで構成された群から選択される請求項６に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項８】
上記乳化剤はレシチンである請求項５に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項９】
上記皮膚美白用組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ジェル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸及びスプレーで構成された群から選択される形態からなる請求項１〜８のいずれかに記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１０】
済州馬から採取した馬胎盤抽出物を親水性溶媒に溶解させる段階、
上記溶液にクラスターデキストリンを添加して５０℃から６０℃まで加温する段階、
上記加温された溶液を０℃から４℃まで冷却させる段階、
上記溶液に攪拌下に馬油と乳化剤を徐々に添加する段階、及びアミノ酸を添加して０℃〜４℃に保ちながら攪拌して水溶性ナノリポソームを形成する段階を含む馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法。
【請求項１１】
上記馬胎盤抽出物及び上記クラスターデキストリンを含む加温された溶液を０℃〜４℃まで冷却させる段階は、０．２℃／分〜０．５℃／分の冷却速度で遂行させる請求項１０に記載の馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法。
【請求項１２】
上記乳化剤は、レシチンである請求項１０に記載の馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを有効成分として含む皮膚美白用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人間の皮膚色は皮膚内部のメラニン色素の濃度及び分布によって決定する。正常状態ではメラニンの過多生成は起きないが、皮膚が紫外線、環境汚染、ストレスなどのような外部刺激や、ホルモン、炎症誘発因子などの内的要因に対して反応すると、メラニン色素が過多生成され、正常な皮膚から排出出来ずに皮膚に蓄積され、色素沈着が誘発される。このように、皮膚の色素沈着は、皮膚に炎症反応以降の体内ホルモン異常、遺伝疾患、及び紫外線照射などさまざまな要因によって誘発されるが、主な要因はメラニン色素合成異常及び分布異常である。
【０００３】
メラニンの重要な機能は、酸素ラジカルを除去し、これによる損傷から皮膚を保護することである。従って、メラニンが多いということは物理的、化学的毒性物質から皮膚を保護する為の効果的な対応システムをもっていることを意味する。メラニンは、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）内でチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）がチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の作用によってドーパキノン（ｄｏｐａｑｕｉｎｏｎｅ）に転換された後、酵素作用及び自発的な酸化反応によって生成される。
【０００４】
そこで、メラニンの生成を抑制して皮膚美白を保ち、また改善する為に多様な方法が用いられている。例えば、紫外線をカットしてメラニン生成の主な原因を除去する為に、光散乱剤または光遮断剤を含有した化粧品を利用する方法や、チロシナーゼの活性化のために必ず必要となるグルコサミン（ｇｕｌｃｏｓａｍｉｎｅ）のようなコア炭水化物の合成を妨げてメラニン生成を抑制する方法である。
【０００５】
さらに、コウジ酸（ｋｏｊｉｃ  ａｃｉｄ）やアルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ）の様に、メラニン生成に関与する酵素であるチロシナーゼの活性化を妨げる物質を利用する方法や、ハイドロキノン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）の様に、メラニンを生成する細胞であるメラニン細胞に対して特異な毒性を持つ物質を利用してメラニン細胞の分裂を阻害する方法が用いられている。その他に生成されたメラニンを還元させて脱色する方法がある。
【０００６】
代表的には、天然物から収得されたハイドロキノン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、コウジ酸（ｋｏｊｉｃ  ａｃｉｄ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びその誘導体などが、チロシナーゼ活性化の抑制による皮膚美白の目的や、日差しによるシミやそばかすなどの皮膚過色素沈着症改善の目的で、軟膏、エッセンスなどの化粧品に添加剤として利用された。
【０００７】
しかし、ハイドロキノンは、所定の美白効果を発揮するものの皮膚に対して刺激性が高いという安全性の問題によって化粧品原料として使用できなくなっている。またコウジ酸は、溶液内において安全ではなく、化粧品の製造工程が複雑になるという短所がある。また、アスコルビン酸は、酸化しやすく、これを配合した化粧品は変色、変種するなどの問題が生じ、美白原料には適さない。したがって、メラニン色素の過多生成を抑制し、皮膚に対する毒性が低く安全性が高い皮膚美白用活性物質に対する要求がなお存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国特許出願公開  第２００８‐０１００３１３号
【特許文献２】大韓民国特許出願公開  第２００８‐０１０３４９０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｉｇｍｅｎｔ  ＣＥｌｌ  Ｒｅｓ．Ｆｅｂ  １８（１）２５‐３３，２００５
【非特許文献２】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ  ２００２；７６：６５７-６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者たちは、高い美白効果と安定性及び安全性を有する皮膚美白活性物質を探求した。そして、ナノリポソームに内包された馬油及び済州馬から採取した馬胎盤抽出物が変廃する現象を防止し、安全性を増進させるとともに細胞毒性がなく、高いメラニン生成抑制活性を持つことを発見し、本発明を完成した。
この発明の目的は、安定性、安全性及び皮膚美白活性が高い馬油及び済州馬から採取した馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを有効成分に含む皮膚美白用組成物を提供することにある。
また本発明の他の目的は、馬油及び済州馬から採取した馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームの製造方法を提供することにある。
ここで、済州馬とは、大韓民国済州島における在来種の馬をいう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１の発明は、馬油及び済州馬から採取した馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを有効成分として含む皮膚美白用組成物である。
【００１２】
請求項２の発明は、請求項１に記載の皮膚美白用組成物において、上記馬油は、ナノリポソーム総重量に対して２〜１０重量％で含有される皮膚美白用組成物。
【００１３】
請求項３の発明は、請求項１に記載の皮膚美白用組成物において、上記馬胎盤抽出物は、ナノリポソーム総重量に対して１〜５重量％で含有される。
【００１４】
請求項４の発明は、請求項１に記載の皮膚美白用組成物において、上記ナノリポソームは、上記皮膚美白用組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％で含有される。
【００１５】
請求項５の発明は、請求項１に記載の皮膚美白用組成物において、上記ナノリポソームは、乳化剤、クラスターデキストリン及び親水性溶媒を含む。
【００１６】
請求項６の発明は、請求項５に記載の皮膚美白用組成物において、上記ナノリポソームは、アミノ酸を更に含む水溶性ナノリポソームである。
【００１７】
請求項７の発明は、請求項６に記載の皮膚美白用組成物において、上記アミノ酸は、アルギニン、アラニン、フェニルアラニン、ライシン及びヒスチジンで構成された群から選択される。
【００１８】
請求項８の発明は、請求項５に記載の皮膚美白用組成物において、上記乳化剤はレシチンである。
【００１９】
請求項９の発明は、請求項１〜８のいずれかに記載の皮膚美白用組成物において、上記皮膚美白用組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ジェル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸及びスプレーで構成された群から選択される形態もつ。
【００２０】
請求項１０の発明は、済州馬から採取した馬胎盤抽出物を親水性溶媒に溶解させる段階、上記溶液にクラスターデキストリンを添加して５０℃から６０℃まで加温する段階、上記加温された溶液を０℃から４℃まで冷却させる段階、上記溶液に攪拌下に馬油と乳化剤を徐々に添加する段階、及びアミノ酸を添加して０℃〜４℃に保ちながら攪拌して水溶性ナノリポソームを形成する段階を含む馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法である。
【００２１】
請求項１１の発明は、請求項１０に記載の馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法において、上記馬胎盤抽出物及び上記クラスターデキストリンを含む加温された溶液を０℃〜４℃まで冷却させる段階は、０．２℃／分〜０．５℃／分の冷却速度で遂行させる馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法である。
【００２２】
請求項１２の発明は、請求項１０に記載の馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法において、上記乳化剤は、レシチンである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の皮膚美白用組成物は、馬油及び馬胎盤抽出物をナノリポソームに内包させる際に従来問題となっていた馬油及び馬胎盤の変廃現象を防止し、安全性を増進させて、高濃度で使用しても皮膚刺激がなく、メラニン合成を抑制し、優れた皮膚美白効果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の具体例による馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームの層構造模式図である。
【図２】本発明の具体例による馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームが精製水に溶解された状態を表す図である。
【図３】Ｍｅｌ‐Ａｂメラニン細胞の顕微鏡観察結果を示す図である。
【図４】本発明の具体例によるエッセンスの安定性を示す図である。
【図５】本発明の具体例によるエッセンスの皮膚刺激性テスト結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
上記目的を達成するために、本発明は馬油及び済州馬から採取した馬胎盤抽出物（以下単に「馬胎盤抽出物」という。）が内包されたナノリポソームを有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。
まず、馬胎盤抽出物は、チロシンからメラニン顆粒生成を促進する酵素であるチロシナーゼの活性化を阻害する効果がある。そして、馬胎盤抽出物は、メラニン色素形成を抑制するとともにメラニン色素を含む細胞の排出を促進する作用を発揮し、シミの予防及び改善にも効果があり、色素沈着を予防する作用だけではなく、美白作用も発揮する（Ｍａｌｌｉｃｋ  Ｓ  ｅｔ  ｅｌ，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｆｅｂ１８（１），２５  ‐３３，２００５）。
【００２６】
しかし、馬胎盤抽出物は、その美白効能は優れていても、特有の匂いを有するという短所や、製品生産時にその不安定性によって容易に変廃されるという短所、また高濃度で使用される時に皮膚に刺激が現われる等の短所がある。よって、馬胎盤抽出物を製品化するためには安全性を増加させ、皮膚刺激を減少させなければならない。
馬胎盤抽出物の安全化及び皮膚毒性を減少させるために、馬胎盤抽出物をリポソーム形態でカプセル化することができる。更に、ナノリポソームは、内包された有効成分の皮膚の透過を増加させ、細胞に対する直接的な効果も増幅させることができるため、安全性及び生体利用率を増加させるのに有用に利用されている。
【００２７】
次に、馬油は、傷及び火傷治療、皮膚再生、抗炎作用、アトピー附炎の治療に効果があることで知られているオレイン酸、レノーレイン酸、及びパーミトオレイン酸と同じ不飽和脂肪酸が６０％以上多量含有された天然オイルとして知られており、特に紫外線に損傷された皮膚を保護する効能があるαーリノレン酸を含有することが知られている（Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｄｉｅｔａｒｙ  ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｏｐｉｃａｌ  ，ａｌｐｈａ‐ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ＵＶＢ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｋｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｈａｉｒｌｅｓｓ  ｍｉｃｅ  ｗｈｅｎ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ」Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｔｏｂｉｏｌ  ２００２；７６：６５７‐６３）。従って、馬油を使用して馬胎盤抽出物をナノリポソーム化すれば、馬胎盤抽出物の安全性が改善され、炎症を減少させ、皮膚刺激も減少させることができる。
【００２８】
本発明の具体例による馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを製造するために用いる馬油及び馬胎盤抽出物は、本出願人が韓国特許出願した方法によって準備した（韓国特許出願公開  第２００８‐０１００３１３号  及び  第２００８‐０１０３４９０号）。
具体的には、馬油に尿素を添加して形成された結晶を除去する段階、収得したろ液に活性炭と活性白土を添加して真空下で反応させる段階、ろ過によって活性炭と活性白土を除去する段階、収得されたろ液を常温で冷却させる段階及び上記ろ液に水を添加して真空下に薄膜蒸発を遂行する段階を含む方法によって、精製された馬油を収得できる。上記方法によって収得された馬油は色と匂いが全くなく、馬油の効能及び生体吸収率が高い。
【００２９】
次に、馬胎盤抽出物は、馬胎盤にパパインと同じタンパク質分解酵素を添加して１次反応させる段階、上記反応物に上記タンパク質分解酵素を追加して２次反応させる段階、及び上記反応物に活性炭を入れて真空下に匂い及び色を除去する段階を含む方法によって収得できる。上記方法によって収得される馬胎盤抽出物は、馬胎盤内の生理活動物質の破壊を最小化し、有効成分の含量を上げる。
【００３０】
本発明の具体例において、皮膚美白用組成物に含まれた馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームは、前記組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％で含まれ、より望ましくは０．０１〜５重量％で含まれるとよい。馬油及び馬胎盤抽出物が内包されるナノリポソームの含量が前記組成物の総重量に対して０．００１重量％未満の場合は皮膚美白効果が取るに足りず、１０重量％を超過した場合は使用量の増加による皮膚美白効果の増加が取るに足りないからである。
【００３１】
本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームにおける馬油と馬胎盤抽出物の含量は特に限定されておらず、美白機能を持つ馬胎盤抽出物は、リポソームの相の安定性を考慮し、望ましくは、ナノリポソームの総重量対比１〜５重量％である。また、抗炎、火傷、傷治療、抗アトピー作用がある馬油は、望ましくは、リポソーム製造時、リポソームの相の安定性を考慮してナノリポソームの総重量対比２〜１０重量％である。
【００３２】
本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームは乳化剤、クラスターデキストリン及び親水性溶媒を含むことができる。
また、本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームは、アミノ酸を更に含む水溶性ナノリポソームであってもよい。
馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームの製造時に、アミノ酸及びクラスターデキストリンを一緒に使用することで、ナノリポソームを水溶性とし、水溶性製品にナノリポソームを使用できるようにした。そうすることにより、上記ナノリポソームが、予想できない著しいメラニン生成抑制効果を持つことを確認した。すなわち、本発明の具体例による馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームは、皮膚美白効果を有する馬胎盤抽出物の含量対比効能を大きく増加させることを確認した。
【００３３】
本発明の具体例において、皮膚美白用組成物の有効成分である、馬油及び馬胎盤抽出物が内包される水溶性ナノリポソームは、馬胎盤抽出物にクラスターデキストリンを利用し、分子レベルで抱接（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）させる分子カプセル製形化を遂行して形成された分子カプセルに乳化剤を利用して馬油とリポソーム化した後、両イオン性高分子のアミノ酸を利用して安全性をいっそう増加させる水溶性脂質に転換させる方法を使用して製造される。
【００３４】
本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームに含まれた親水性溶媒は、蒸留水、精製水、脱イオン水、及びエタノール水溶液を含むが、これに限定されない。
【００３５】
本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームに水溶性を附加するアミノ酸は、アルギニン、アラニン、フェニルアラニン、ライシン、及びヒスチジンで構成された必須アミノ酸の群から選択できる。
【００３６】
本発明の具体例において、ナノリポソームの製造時に使用される乳化剤はレシチンであり、望ましいのは大豆レシチンである。
【００３７】
本発明の具体例の水溶性ナノリポソームにおいて、アミノ酸は、リポソームの水に対する溶解度を大きく増加させ、油相（ｏｉｌ  ｐｈａｓｅ）を水上から留置、保護する非常に有用な材料として使用され、アルギニン、アラニン、フェニルアラニンなど全て必須アミノ酸の中から選択して使用できる。
【００３８】
本発明の具体例において、ナノリポソームの形成は０℃〜４℃の低温で遂行することが望ましい。
【００３９】
図１は、本発明の具体例に係る馬油２及び馬胎盤抽出物３が内包されるナノリポソーム１の層構造模式図である。図２は本発明の具体例に係る馬油２及び馬胎盤抽出物３が内包されたナノリポソーム１を精製水に溶解させた状態を示す図（写真）である。
図１に示すように、本発明の具体例において、馬油２及び馬胎盤抽出物３が内包されたナノリポソーム１の構造は、化学的結合を形成した複合体ではなく、馬胎盤抽出物３がクラスターデキストリン４に抱接された状態（図１（ｂ））でナノリポソーム１の一番中の方に位置し（図１（ａ））、その最外層は、馬油２とレシチン５がアミノ酸６と物理的結合を形成した層構造を作っている（図１（ａ））。
また、図２から明らかなように、本発明のナノリポソーム１は、水溶性を向上させるアミノ酸６を使用して水溶性を有することがわかる。
【００４０】
本発明の具体例において、馬油２及び馬胎盤抽出物３が内包されたナノリポソーム１を含む皮膚美白用組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ぺイスト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸及びスプレーで構成された群から選択される形態を有する。
例えば、本発明の具体例において、皮膚美白用組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、パック、皮膚接着用パッチ及び皮膚接着用ゲルなどと同じ様々な形態での化粧品の製造に用いることができる。さらに、本発明の具体例による馬油２及び馬胎盤抽出物３が内包されたナノリポソーム１を含む皮膚美白用組成物は、皮膚外用軟膏などでも使用可能である。
【００４１】
また、本発明は、馬油と馬胎盤抽出物を乳化剤、アミノ酸及びクラスターデキストリンと混合して水溶性で乳化させる段階を含む馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法を提供する。
【００４２】
本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物が内包された水溶性ナノリポソームを製造する方法は、馬胎盤抽出物を親水性溶媒に溶解させる段階、上記溶液にクラスターデキストリンを添加して５０〜６０℃まで加温する段階、上記加温された溶液を０〜４℃まで冷却させる段階、上記溶液に攪拌下で馬油と乳化剤を徐々に添加する段階、及びアミノ酸を添加して０〜４℃で保ちながら攪拌し、水溶性ナノリポソームを形成する段階を含むことができる。
【００４３】
本発明の具体例において、水溶性ナノリポソームを製造する方法は、形成された水溶性ナノリポソームを凍結乾燥させる段階を更に含むことができる。
【００４４】
本発明の具体例において、水溶性ナノリポソームを製造する方法で使用する馬油及び馬胎盤抽出物は、本出願人が出願した韓国特許出願公開第２００８‐０１００３１３号及び第２００８‐０１０３４９０号に記載された方法によって製造できる。
【００４５】
また、本発明の具体例において、馬胎盤抽出物及びクラスターデキストリンを含む加温された溶液を０〜４℃まで冷却させる段階は０．２〜０．５℃/分の冷却速度で遂行できる。
【００４６】
本発明の具体例において、馬胎盤抽出物は、蒸留水、精製水及び脱イオン水を含むがこれらに限定されない親水性溶媒に溶解される。
【００４７】
本発明の具体例において、水溶性ナノリポソームの製造の為に使用される乳化剤は、リン脂質である。そして、アミノ酸は、アルギニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、スレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、ライシン、トリプトパン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）及びヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）で構成された群から選択される必須アミノ酸である。
【００４８】
本発明の具体例において、馬油及び馬胎盤抽出物を含む水溶性ナノリポソームは下記のように製造できる。
まず、水（３次蒸留水）１ｋｇに馬胎盤抽出粉末１０〜５０ｇを常温で完全に溶解させる。その後、クラスターデキストリン５０〜２５０ｇを入れて５０〜６０℃で混合させた後、４℃まで冷却速度０．２〜０．５℃/分で超精密制御冷却を遂行する。
カプセル化が完了したらパルミトオレイン酸を含む馬油（パルミトオレイン酸含有量８％）２０〜１００ｇと大豆レシチン３〜４ｇを徐々に注入し、５０００〜８０００ｒｐｍの速度に攪拌する。その後、アミノ酸１０〜５０ｇを入れて４℃を保ちながら５０００ｒｐｍ以上の速度で攪拌してナノリポソームを製造する。その後、使用便宜性に応じて、この液状態から凍結乾燥を経た水溶性粉末に製造できる。
以下実施例を通して、本発明をより詳しく説明する。実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明がこれらによって限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例１．馬胎盤抽出物の製造及び馬油の精製〕
（１）酵素を利用した馬胎盤抽出物の製造
済州馬の冷凍された馬胎盤１．５ｋｇを解氷させた後、氷の粉砕機を利用して粉砕させた。粉砕された胎盤を攪拌機に入れ、血が除去されるまで洗浄した後、ろ過して脱水させた。脱水させた胎盤１．２ｋｇにパパイン９ｇ及び蒸留水３ｋｇを添加して６０℃で５時間反応させ、胎盤を水に完全に溶解させた。その後、完璧な分解のために、パパイン３ｇを分解された胎盤溶液にさらに添加させた後、７０℃で２時間の間攪拌した。
その後、ビューレット反応及びトリクロロ硝酸反応を通して完全なタンパク質ガス分解を確認した。そして、食品や化粧品の原料に適合した色度と匂いの為に、活性化された活性炭３０ｇを入れ、０．２気圧の真空圧及び７０℃の反応温度の下で、攪拌機によって３０分間攪拌して色と匂いを除去した。この後、上記溶液をろ過して活性炭を除去した。この時、１次ろ過は２μｍフィルターで、２次ろ過は０．４５μｍフィルターで、３次ろ過は０．２μｍフィルターを使用して遂行し、馬胎盤抽出物を収得した。
【００５０】
（２）馬油の精製
精製されてない馬油１ｋｇに対して尿素１００ｇを反応機に添加し、一定の攪拌速度で常温下で反応させた。反応を進行させながら、尿素表面が膨張する現象を観察した後、１時間後にろ過を行った。収得された溶液に活性炭と活性白土を２：８程度の比率で混合し、５０ｇをろ液に添加し、２００ｍｍＨｇの真空圧、７５℃の反応温度の下で２時間反応させた。上記反応後に、ろ過工程を通して活性炭と活性白土を除去した。これによって収得された精製された馬油は８２５ｇであった。上記精製された馬油を常温まで０．２度／分の冷却速度と攪拌速度０ｒｐｍ、すなわち静置結晶下で冷却させた。この過程で白色結晶体が析出され、常温まで冷却後、ろ過を行った。
ろ過後、収得された高純度で分離精製された馬油の脱臭のため、ろ過液に１８０ｇの水を入れて攪拌させながら薄膜蒸発を行った。薄膜蒸発は６０℃、真空圧０．０５気圧で原液を０．５Ｌ／時の投入速度で投入し、揮発性を有する匂いの成分と水とを同時に完全に除去させた。
【００５１】
〔実施例２．馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームの製造〕
水（３次蒸留水）１ｋｇに、実施例１の方法で製造された馬胎盤抽出粉末１０〜５０ｇを常温で完全に溶解させた。その後、クラスターデキストリン５０〜２５０ｇを入れて５０〜６０℃で混合させた後、４℃まで冷却速度０．２〜０．５℃／分で超精密制御冷却を行った。結晶化が完了すると、パルミトオレイン酸を含む馬油（パルミトオレイン酸含有量８％）２０〜１００ｇと、大豆レシチン３〜４ｇとを徐々に注入しながら、５０００〜８０００ｒｐｍの速度で攪拌した。
【００５２】
その後、アルギニン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン及びヒスチジンで構成された群から選択されるアミノ酸１０〜５０ｇを入れ、４℃を保ちながら５０００ｒｐｍ以上の速度で攪拌し、馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを製造した。その後、使用便宜性に応じ、この液状態から凍結乾燥を経た水溶性粉末を製造して使用してもよい。
一方、馬胎盤抽出物を溶解させる段階を除外して上記と同様な馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを製造する方法を遂行し、馬油を含む馬油‐ナノリポソームを製造した。
【００５３】
〔実施例３．メラニン細胞からのメラニン合成抑制実験〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の色素細胞であるＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞を利用し、実施例２の馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソーム（以降、「馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム」と記載する。）のメラニン合成抑制効果、即ち、美白効果を観察した。
馬胎盤抽出物、馬油‐ナノリポソーム及び実施例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームのメラニン生成抑制実験を、各々１０、２０、５０μＭの濃度で実施した。
【００５４】
メラニン合成抑制実験の為に、３７℃、５％ＣＯ２の条件の下に、１０％牛胎児血清、１００ｎＭ１２‐Ｏ‐テトラデカノイルホルボール（ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ）‐１３‐アセテート及び１ｎＭコレラ毒素（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）でＭｅｌ‐Ａｂ細胞を培養した。
【００５５】
培養された細胞を、０．２５％トリプシンーＥＤＴＡではぎ取り、６‐ウェル培養接時に１０５（細胞/ウェル）の濃度で細胞を摂取し、テスト物質である馬胎盤抽出物、馬油‐ナノリポソーム及び馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームを、０μＭ,１０μＭ,２０μＭ,及び５０μＭの濃度で培養２日目から３日連続して各々添加し、４日間培養した。
【００５６】
上記培養された細胞を収集し、培養液を除去し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を処理し、メラニンを溶かし出し、４００ｎｍからＥＬＩＳＡプレートリーダで吸光度を測定した。また、上記実施例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームを添加してない細胞を対照群とし、上記方法と同一の方法で実験した。そして、メラニン合成濃度（５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ）の標準曲線を使用してメラニン生成抑制率を計算し、その結果を下記表１に示した。
【００５７】
ここでメラニン生成抑制率は、メラニン生成抑制率＝（Ｃ―Ａ）/Ｃ×１００（％）の数式で表される。上記の数式において、Ｃは対照群試料のメラニン濃度（メラニンμｇ／タンパク質μｇ）で、Ａはテスト試料のメラニン濃度（メラニンμｇ／タンパク質μｇ）である。
【００５８】
【表１】
2010215605.tif 000003
【００５９】
表１から明らかなように、馬‐馬胎盤抽出物ナノリポソームは馬胎盤抽出物単独成分に比べて優れたメラニン生成抑制効能をみせた。即ち、馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームは１０μＭ濃度で２９.９％の抑制効果があった。特に、馬胎盤抽出物と比較すると同じ濃度で２．１倍に該当する効果を見せ、２０μＭ、５０μＭでも各々２．３倍、１．６倍の効果を見せ、効能が大きく増加することがわかった。
【００６０】
また、３７℃、５％ＣＯ２の条件下に、１０％牛胎児血清、１００ｎＭ１２‐Ｏ‐テトラデカノイルホルボール‐１３‐アセテート及び１ｎＭコレラ毒素が添加されたＤＭＥＭで培養したＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞と、実施例２で製造された馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームで処理したＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞とを顕微鏡で観察して、その結果を図３に表した。
ここで、図３において、Ｘは馬胎盤抽出物で処理されたＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞の顕微鏡観察写真を示し、Ｙは、本発明の具体例による馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームで処理されたＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞の顕微鏡観察写真を示し、Ｚは、馬油ナノリポソームで処理されたＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞の顕微鏡観察写真を示す。
【００６１】
図３から明らかなように、上記ＤＭＥＭを用いて正常に培養したＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞の黒いメラニンが、本発明の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームで処理したＭｅｌ‐Ａｂメラニン細胞において、馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームの濃度に強く依存して減少することが観察された。このような結果から、馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームの方が馬胎盤抽出物に比べて、メラニン細胞からメラニン合成をより強く抑制するという知見を得ることができる。
【００６２】
〔実施例４．馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームの安定性テスト〕
馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム（１．１％＝馬胎盤抽出物含量に０．１％）と馬胎盤抽出物（０．１％）を含有したエッセンスを下記の実施例９の方法によって製造後、各々を常温と４５℃で放置し、時間経過による色相の変化を観察して、その結果を図４に表した。図４（ａ）は、常温で３０日保管されたサンプルを示し、図４（ｂ）は、４５℃で３０日保管されたサンプルを示す。さらに、図４において、「Ａ」は馬胎盤抽出物を有効成分に含むエッセンのサンプルを示し、「Ｂ」は馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソーム有効成分に含むエッセンスのサンプル示す。
図４では、上述した保管後であってもＢのサンプルの方がＡのサンプルに比べて白色を維持している様子を示している。図４から明らかなように、総時間３０日間の観察結果、馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームは馬胎盤抽出物と比較して褐変速度が鈍化され、安定性が増加したことが分かった。
【００６３】
〔実施例5．馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームの皮膚刺激性テスト〕
馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム（１．１％＝馬胎盤抽出物含量に０．１％）と馬胎盤抽出物（０．１％）を含有するエッセンスを下記の実施例９の方法によって製造した後、２０名の支援者を対象に皮膚パッチテストを施行した。１０名の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム適用者は全ての人に全く刺激反応がなかった反面、馬胎盤抽出物適用者は１０名中１名からわずかな刺激と紅斑現象が現れ、その結果を図５に表した。
【００６４】
図５（ａ）は、腕にパッチテストを施している様子を示す写真である。図５（ｂ）は、初期状態（パッチテスト適用前）の結果例を示す拡大写真例であり、図５（ｃ）は、適用後４８時間経過時の結果例を示す拡大写真である。また、図５（ａ´）は図５（ａ）を説明する線図であり、図５（ｂ´）は図５（ｂ）を説明する線図であり、図５（ｃ´）は図５（ｃ）を説明する線図である。なお、図５において（ア）は、馬胎盤抽出物パッチテスト部位を示し、（イ）は、馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソームパッチテスト部位を示し、黒点Ｇは、短冊状のテープＴの４隅を示す。
図５（ｃ）及び図５（ｃ´）に示すように、適用後４８時間経過時に、馬胎盤抽出物を有効成分に含むエッセンス適用部位に表れる刺激及び紅斑反応（ウ）を示している。よって、本原料の馬油−馬胎盤抽出物ナノリポソームは馬胎盤抽出物と比較して刺激が大きく減少したことが分かった。
【００６５】
〔実施例６．馬油‐馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを含む柔軟化粧水の製造〕
通常の方法によって、上記実施例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム１重量％、グリセロール３重量％、エタノール５重量％、１，３‐ブチレングリコール２重量％、香り  微量、及び精製水残量を混合して柔軟化粧水を製造した。
【００６６】
〔実施例７．馬油‐馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを含む収斂化粧水の製造〕
通常の方法によって、上記例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム１重量％、ミツロウ４重量％、流動パラフィン４重量％、スクアレン４重量％、グリセリン３重量％、防腐剤微量、香り微量、及び精製水残量を混合して収斂化粧水を製造した。
【００６７】
〔実施例８．馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを含む栄養クリームの製造〕
通常の方法によって、上記実施例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム１重量％、１，３―ブチレングリコール６重量％、グリセリン４重量％、流動パラフィン５重量％、スクアレン３重量％、ポリソルベート６０  １．５重量％、及び精製水残量を混合して栄養クリームを製造した。
【００６８】
〔実施例９．馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを含むエッセンスの製造〕
通常の方法によって、上記実施例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム１重量％、プロピレングリコール２重量％、グリセリン４重量％、エタノール７重量％、防腐剤微量、香り微量、及び精製水残量を混合してナノリポソームを含有するエッセンスを製造した。
【００６９】
〔実施例１０．馬油及び馬胎盤抽出物が内包されたナノリポソームを含むパックの製造〕
通常の方法によって、上記実施例２の馬油‐馬胎盤抽出物ナノリポソーム１重量％、プロピレングリコール６重量％、グリセリン４重量％、ミツロウ２重量％、流動パラフィン３０重量％、防腐剤微量、香り微量、及び精製水残量を混合してナノリポソームを含有するパックを製造した。
【符号の説明】
【００７０】
１  ナノリポソーム，水溶性ナノリポソーム
２  馬油
３  馬胎盤抽出物
４  クラスターデキストリン
５  レシチン
６  アミノ酸
【図１】
2010215605.tif 000004
【図２】
2010215605.tif 000005
【図３】
2010215605.tif 000006
【図４】
2010215605.tif 000007
【図５】
2010215605.tif 000008