(57)【要約】【課題】本発明の目的は、生体適合性に優れ検出性に優れる生体物質蛍光標識剤を与えるＳｉ粒子蛍光体、それを作製するＳｉ粒子の作製方法およびそれを用いた生体物質蛍光標識剤を提供することにある。【解決手段】基板上に、スパッタリングによりＳｉ（シリコン）を含有するＧｅＯ２膜を形成し、該ＧｅＯ２膜を加熱処理してＳｉ粒子を形成することを特徴とするＳｉ粒子の形成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に、スパッタリングによりＳｉ（シリコン）を含有するＧｅＯ２膜を形成し、該ＧｅＯ２膜を加熱処理してＳｉ粒子を形成することを特徴とするＳｉ粒子の形成方法。
【請求項２】
前記加熱処理の後に、ｐＨ８．０以上のアルカリ溶液により前記ＧｅＯ２膜を溶解することを特徴とする請求項１に記載のＳｉ粒子の形成方法。
【請求項３】
前記加熱処理の温度が、７００℃以上１０００℃以下であることを特徴とする請求項１に記載のＳｉ粒子の形成方法。
【請求項４】
前記加熱処理の時間が、３０分以上１２０分以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＳｉ粒子の形成方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のＳｉ粒子の形成方法により形成されたことを特徴とするＳｉ粒子蛍光体。
【請求項６】
前記Ｓｉ粒子の、平均粒径が、３．５ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項５に記載のＳｉ粒子蛍光体。
【請求項７】
前記Ｓｉ粒子の、波長７５０ｎｍの励起光による発光波長が、７００ｎｍ〜１１００ｎｍであることを特徴とする請求項５または６に記載のＳｉ粒子蛍光体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のＳｉ粒子蛍光体に分子標識物質が有機分子を介して結合していることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質蛍光標識剤に好適に用いることができるシリコンナノ粒子の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体物質を標識する手段として、分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が知られている。標識剤に蛍光材料が用いられる場合には励起光として用いられる波長の短い紫外域の光が細胞にダメージを与えることが問題となっており、ダメージの少ない長波長励起・発光の蛍光体が求められている。
【０００３】
一方、特に近年、小動物を対象としたｉｎ  ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し、出てきた発光を外部でモニターする方法である。
【０００４】
このように、生体内の蛍光材料を励起し・発光を外部に取り出すためには、励起光・発光が生体を透過する必要がある。紫外光・可視光は生体の吸収が高く、ほとんど透過することが出来ないので好ましくない。また、１０００ｎｍ以上の波長では、水の吸収が立ち上がり透過率が低くなり、好ましくない。しかしながら近赤外線の７００ｎｍ〜１０００ｎｍは、「生体の窓」・「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域であり、この範囲内で励起・発光を示す蛍光材料が求められている。
【０００５】
上記方法で従来使用されてきた有機蛍光色素などのマーカー物質は、励起光照射時の劣化が激しく寿命が短いことが欠点であり、また発光効率が低く、感度も十分ではなかった。
【０００６】
一方、有機蛍光色素を用いない生体物質蛍光標識剤としては、所謂量子ドットと呼ばれる半導体ナノ粒子を用いるものが知られており、例えば環境や、生体に与える影響が比較的少ない、シリコンと酸化シリコンとから構成される半導体ナノ粒子を利用する方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００７】
そして、Ｓｉ（シリコン）ナノ粒子を形成させる方法として、例えば液相法で形成させる方法（特許文献２参照）、スパッタリングで形成したＳｉＯ２の膜中のＳｉをアニール処理（加熱処理）してＳｉの結晶化させる方法（特許文献３参照）が知られている。
【０００８】
しかしながら、これらの半導体ナノ粒子は、Ｓｉ粒子を形成する方法が複雑である、粒子として取り出す際にフッ酸を使用するため生体適合性が不十分である、といった問題があった。
【特許文献１】特開２００５−１７２４２９号公報
【特許文献２】特開２００７−１２７０２号公報
【特許文献３】特開２００４−２９６７８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、生体適合性に優れ検出性に優れる生体物質蛍光標識剤を与えるＳｉ粒子蛍光体、それを作製するＳｉ粒子の作製方法およびそれを用いた生体物質蛍光標識剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の上記目的は、下記構成により達成される。
１．基板上に、スパッタリングによりＳｉ（シリコン）を含有するＧｅＯ２膜を形成し、該ＧｅＯ２膜を加熱処理してＳｉ粒子を形成することを特徴とするＳｉ粒子の形成方法。
２．前記加熱処理の後に、ｐＨ８．０以上のアルカリ溶液により前記ＧｅＯ２膜を溶解することを特徴とする１に記載のＳｉ粒子の形成方法。
３．前記加熱処理の温度が、７００℃以上１０００℃以下であることを特徴とする１に記載のＳｉ粒子の形成方法。
４．前記加熱処理の時間が、３０分以上１２０分以下であることを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載のＳｉ粒子の形成方法。
５．２〜４のいずれか１項に記載のＳｉ粒子の形成方法により形成されたことを特徴とするＳｉ粒子蛍光体。
６．前記Ｓｉ粒子の、平均粒径が、３．５ｎｍ以上１０．０ｎｍ以下であることを特徴とする５に記載のＳｉ粒子蛍光体。
７．前記Ｓｉ粒子の、波長７５０ｎｍの励起光による発光波長が、７００ｎｍ〜１１００ｎｍであることを特徴とする５または６に記載のＳｉ粒子蛍光体。
８．５〜７のいずれか１項に記載のＳｉ粒子蛍光体に分子標識物質が有機分子を介して結合していることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の上記構成により、生体毒性が弱く生体適合性に優れ、赤外領域での検出が可能であり検出性に優れる生体物質蛍光標識剤を与えるＳｉ粒子蛍光体およびそれを用いた生体物質蛍光標識剤が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳述する。
【００１３】
本発明は、基板上に、スパッタリングによりＳｉ（シリコン）を含有するＧｅＯ２膜を形成し、該ＧｅＯ２膜を加熱処理してＳｉ粒子を形成することを特徴とする。
【００１４】
本発明は、特にＧｅＯ２膜中でＳｉ粒子を生成させることにより、生体毒性が弱く生体適合性に優れ、赤外領域での検出が可能であり検出性に優れる生体物質標識剤を与えるＳｉ粒子を効率的に作製できる。
【００１５】
本発明のＳｉ粒子の形成方法を図１を用いて説明する。
【００１６】
図１は、本発明に用いられるスパッタリング装置の一例を示す。
【００１７】
スパッタリングによりＳｉを含有するＧｅＯ２膜１は、下記のように形成される。
【００１８】
アルゴンガスを真空チャンバー１６に導入し、アルゴンガスをイオン化する。
【００１９】
イオン化されたアルゴンイオンを高周波電極２２上のターゲット材料２４であるシリコンチップ２４ａとＧｅ薄片２４ｂとへ衝突させ、ターゲット材料から放出された原子や分子を基板ホルダー２０に保持された基板１１に堆積させ、Ｓｉを含有するアモルファス酸化ゲルマニウム（ＧｅＯｘ）膜を形成する。
【００２０】
ターゲット材料におけるシリコンチップとＧｅ薄片の、アルゴンイオンのターゲットとなる各々の面積の割合および下述する加熱処理の条件を調整することにより、粒径の異なるＳｉ粒子を形成することができる。
【００２１】
本発明においては、ＧｅＯ２の面積に対するシリコンチップの面積の割合（Ｓｉ／ＧｅＯ２）は、０．１〜０．５であることが好ましい。
【００２２】
また、スパッタリング条件である高周波電力やガス圧を変化させてもＳｉ粒子のサイズを制御することができる。高周波電力は１０〜５００Ｗ、ガス圧は１．３３×１０−２〜１．３３×１０Ｐａの範囲であることが好ましい。
【００２３】
本発明においては、さらに基板上に形成されたＧｅＯ２膜を加熱処理してＳｉ粒子を形成させる。
【００２４】
加熱処理の温度としては、７００℃以上１２００℃であることが好ましく、特に７００℃以上１０００℃以下であることが好ましい。また加熱処理の時間としては、１５以上１２０分以下が好ましく、特に３０〜１２０分が好ましい。
【００２５】
本発明のＳｉ粒子は、ＧｅＯ２膜をｐＨ８．０以上のアルカリ溶液によりＧｅＯ２膜を溶解することで、単離し、Ｓｉ粒子の集合体であるＳｉ粒子蛍光体とすることができる。
【００２６】
ｐＨ８．０以上のアルカリ溶液としては、アルカリ金属の水酸化物の水溶液などを用いることができ特に水酸化ナトリウムが好ましく用いられる。
【００２７】
本発明の上記方法によりＳｉのナノ粒子（粒径が１００ｎｍ以下の粒子）が得られるが、本発明においては、平均粒径が３．５ｎｍから１０．０ｎｍであるＳｉ粒子蛍光体が好ましい。これらの粒子蛍光体は、波長７５０ｎｍの励起光による発光波長が、７００ｎｍ〜１１００ｎｍであり生体標識物質に用いられる蛍光体として適している。
【００２８】
平均粒径は、ＴＥＭを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めて、その算術平均を平均粒径とする。ＴＥＭで撮影する粒子数は、本願においては、１００個の粒子の算術平均を平均粒径とする。
【００２９】
本発明のＳｉ粒子蛍光体は、上述のように生体物質蛍光標識剤に適用することができる。生体物質蛍光標識剤は、標的（追跡）物質を有する生細胞もしくは生体に生体物質蛍光標識剤を添加することで、標的物質に結合もしくは吸着する。生体物質蛍光標識剤が結合もしくは吸着して生じた、結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じてＳｉ粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的（追跡）物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。
【００３０】
即ち、本発明に係る生体物質標識剤は、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。
【００３１】
上述したＳｉ粒子の表面は一般的には疎水性であるため、例えば、生体物質標識剤として使用する場合は、水分散性、粒子の凝集の面から、Ｓｉ粒子の表面を親水化処理することが好ましい。
【００３２】
親水化処理の方法としては、例えば、表面の親油性基をピリジン等で除去した後に粒子表面に、表面修飾剤を化学的および／または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基としてカルボキシル基、アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどが挙げられる。
【００３３】
本発明に係る生体物質蛍光標識剤は、上述した親水化処理されたＳｉ粒子蛍光体と分子標識物質とを有機分子を介して結合させて得られる。
【００３４】
本発明に係る生体物質蛍光標識剤は、分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合および／または反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００３５】
該分子標識物質としては、例えば、ヌクレオチド、抗体、抗原およびシクロデキストリン等が挙げられる。
【００３６】
当該有機分子としてはＳｉ粒子と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はない。例えば、有機分子としてアルブミン、ミオグロビン、カゼイン、アビジンおよびビオチン等のタンパク質が挙げられ、これらは単独で用いてもよいし２種以上併用してもよい。特にアビジンとビオチンとを併用して用いる態様が好ましい態様である。
【００３７】
上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００３８】
生体物質蛍光標識剤としては、例えば、Ｓｉ粒子蛍光体をメルカプトウンデカン酸で親水化処理し、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いたものが挙げられる。
【００３９】
この場合親水化処理されたＳｉ粒子のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンが更にビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさら分子標識物質と結合することにより生体物質蛍光標識剤となる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１
図１に示すスパッタリング装置を用いてＳｉ粒子を作製した。
【００４２】
真空チャンバー１６内にアルゴンガスを導入し、高周波コントローラ２３によりイオン化されたアルゴンイオンをＧｅ薄片２４ｂにシリコンチップ２４ａを貼り付けたターゲット材料２４に衝突させ、これから放出された原子および分子を基板１１（半導体）上に堆積し、アモルファス（Ｇｅ）Ｏｘ膜を形成する。アルゴンイオンが衝突するシリコンチップの面積／Ｇｅ薄片の面積を、表１のように変化させた。
【００４３】
（加熱処理（アニール処理））
得られたアモルファス（Ｇｅ，Ｓｉ）Ｏｘ膜を、アルゴン雰囲気中において、表−１に示す温度まで急速に昇温し熱処理を行い、膜中のＳｉ原子をナノサイズまで凝集させた。熱処理時間を表１に示す。
【００４４】
（溶解処理）
得られたＳｉ粒子含有ＧｅＯ２膜を水酸化ナトリウム水溶液（６モル（ＮａＯＨ）／Ｌ）に浸漬し、Ｓｉ粒子を含有する溶解処理溶液を得た。
【００４５】
〔分離処理〕
サイズ排除クロマトグラフィにより、溶解処理溶液中からＳｉ粒子を分離し、水溶液中に回収した。
【００４６】
以上の方法によりＳｉ粒子蛍光体１〜７を含有するＳｉ粒子蛍光体分散液１〜７を作製した。このＳｉ粒子蛍光体分散液を、堀場社製蛍光光度計ＳＰＥＸ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３を用いて発光スペクトルの測定を行った。励起光波長は７５０ｎｍとした。粒径測定は、高分解能ＴＥＭを用いて行った。１００個の粒子の粒径を測定しその平均値を平均粒径とした。
【００４７】
結果を表１に示す。
【００４８】
（比較例）
実施例１において、Ｇｅ薄片に換えてＳｉ薄片を用い、アモルファス（Ｇｅ）Ｏｘ膜に換えてアモルファス（Ｓｉ）Ｏｘ膜を形成し、形成されたアモルファス（Ｓｉ）Ｏｘ膜の溶解に、水酸化ナトリウム溶液に換えてＨＦ溶液（４８％）を用い、表１に記載の条件にした他は、実施例１と同様にしてＳｉ粒子８を作製し、Ｓｉ粒子蛍光体分散液８を得、上記と同様にして発光スペクトル、粒径の測定を行った。
【００４９】
【表１】
2010006895.tif 000002
【００５０】
表１から、本発明のＳｉ粒子の形成方法により、励起波長、発光波長共に赤外線領域にあるＳｉ粒子が得られることが分かる。
【００５１】
（生体物質蛍光標識剤の作製）
上記Ｓｉ粒子蛍光体分散液４（１．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）にアビジン２５ｍｇを添加し４０℃で１０分間攪拌を行い、アビジンコンジュゲートナノ粒子溶液を作製した。
【００５２】
得られたアビジンコンジュゲートナノ粒子溶液に、ビオチン化された塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを混合攪拌し、ナノ粒子でラベリングされたオリゴヌクレオチドを作製した。
【００５３】
さまざまな塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを固定化したＤＮＡチップ上に上記のラベリングしたオリゴヌクレオチドを滴下・洗浄したところ、ラベリングされたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチドのスポットのみが赤外線照射（波長７５０ｎｍの赤外光）により赤外発光（極大発光波長８５１ｎｍ）した。
【００５４】
このことより、本発明のＳｉ粒子でのオリゴヌクレオチドのラベリングを確認することができ、本発明のＳｉ粒子を用いた生体物質蛍光標識剤は、フッ化水素を用いることなく得られたＳｉ粒子を含有し生体適合性に優れ、赤外線照射、赤外発光を有し検出性に優れることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明のＳｉ粒子を作製するために用いられる高周波スパッタリング装置の一態様を示す図である。
【符号の説明】
【００５６】
１  ＧｅＯ２膜
１１  基板
１４  アルゴンガス導入口
１５  排気口
１６  真空チャンバー
１７  絶縁材料
１８  冷却管
１９  冷却水
２０  基板ホルダー
２１  陰極シールド
２２  高周波電極
２３  高周波コントローラ
２４  ターゲット材料
２４ａ  シリコンチップ
２４ｂ  Ｇｅ薄片
【図１】
2010006895.tif 000003