(57)【要約】      （修正有）【課題】アレル特異的ＰＣＲを高精度に行うことを目的とし、プライマー中のＳＮＰ部位を３’末端以外の部位に設定したプライマーを提供する。【解決手段】ＳＮＰ部位を含む標的核酸１０１をアレル特異的に増幅するために次の３種のプライマーを用いる。（i）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみにＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマー１０５。（ii）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみにＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマー１０７。（iii）標的核酸の相補鎖１０３の、前記ＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記ＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマー１０９。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＮＰ部位を含む標的核酸をアレル特異的に増幅する方法であって、
（i）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマーと、
（ii）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマーと、
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記ＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記ＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のＰＣＲ反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
前記第１の順方向プライマーが、前記ＳＮＰ部位を３’末端から数えて３番目に有する請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記第２の順方向プライマーが、前記ＳＮＰ部位を３’末端から数えて３番目に有する請求項１または２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとが異なる標識を有する請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸増幅方法に用いるプライマーのセットであって、
（Ａ）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマーと、
（Ｂ）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマーと、
（Ｃ）前記標的核酸の相補鎖の、前記ＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記ＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を含むことを特徴とするプライマーセット。
【請求項６】
前記第１の順方向プライマーが、前記ＳＮＰを３’末端から数えて３番目に有する請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項７】
前記第２の順方向プライマーが、前記ＳＮＰを３’末端から数えて３番目に有する請求項５または６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとが異なる標識を有する請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセット。
【請求項９】
５’側に第１のＳＮＰ部位を有し、３’側に第２のＳＮＰ部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
（１）（i）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記第１のＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマーと、
（ii）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記第１のＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマーと、
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記第２のＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記第２のＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程と、
（２）前記工程（１）の結果として得られる産物を、
（Ｉ）該第２のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第２のＳＮＰ部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプローブ及び
（II）該第２のＳＮＰ部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第２のＳＮＰ部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第２のプローブ、
の両方と反応させて、これらの第１及び第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とするハプロタイプの決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレル特異的PCRを高精度に行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレル特異的ポリメラーゼチェインリアクション（PCR）は、多型を検出する際に用いられる手法である。特に、一塩基多型（SNP）の検出の際に用いられる手法である。具体的には、標的とするSNP部位を含むプライマーを用いて、標的核酸の増幅の有無を検出する方法が挙げられる。本手法で用いられるプライマーは、その３’末端にSNP部位を有する。標的核酸中のSNPとプライマーの３’末端の塩基が相補的である場合（完全一致プライマー）、DNAポリメラーゼによる鎖伸長反応が進行し、増幅シグナルが観測される。一方、標的核酸中のSNPとプライマーの３’末端の塩基が相補的でない場合（不完全一致プライマー）にDNAポリメラーゼによる鎖伸長反応が進行しないと増幅シグナルは観測されない。このように、アレル特異的PCRは、３’末端に野生型もしくは変異型ヌクレオチドを配したプライマーを用いることで、その増幅結果からSNPを判定する手法である。
【０００３】
上記手法を用いた応用例として、ハプロタイプ検出が挙げられる。ハプロタイプとは、単一染色体上に存在する２つまたはそれ以上の多型の組み合わせを指す。近年の研究において、ハプロタイプが疾患の発症や薬剤応答性（薬効・副作用）と関係があることが明らかになりつつある。
【０００４】
上記ハプロタイプを実験的に直接決定する方法として、アレル特異的PCRと電気泳動による解析を組み合わせたものがある（特許文献１参照）。この方法は、２つのSNPのハプロタイプを決定するもので、２箇所のSNP部位に対してアレル特異的プライマーを２種類ずつ、計４種類用意する。上記プライマーは、2箇所のSNP部位が含まれるように設計した順方向および逆方向プライマーである。４種類の上記プライマーを用いて、アレル特異的PCRを行う。得られた増幅産物が、いずれの順方向および逆方向プライマー対で増幅されたかを、電気泳動にて解析することで、ハプロタイプを決定する。
【０００５】
本手法で用いられるプライマーについて具体的に記述する。第一のSNPを含む順方向プライマーは５’末端にアレルによって異なるシグナルを与える標識が修飾されており、３’末端にSNP部位を有する。また、第二のSNP部位を含む逆方向プライマーは、５’末端に標的配列には存在しないフラップ配列が付加されており、３’末端にSNP部位を有する。これらのプライマーを用いてアレル特異的PCRを行うことで、第一のSNPを蛍光波長で、第二のSNPを増幅産物長で判定することが可能となる。
【特許文献１】特開2002-272482
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記方法では、３’末端にSNP部位を設けたプライマーが用いられている。しかしながら、３’末端にSNP部位が設けられている場合、多くの条件でアレル特異的PCRが成功しない。これは、酵素の特異性の低さに由来する。即ち、DNA伸長酵素は、３’末端で標的核酸とプライマーとの間でミスマッチが存在しても、多くの場合、伸長してしまうのである。したがって、アレル特異的PCRを達成するためには、反応条件の最適化が必須となる。しかしながら、反応条件の最適化は容易ではなく、例え最適化が行えたとしても、同時に完全一致プライマーによる増幅効率も著しく低下するため、判定能が低下する問題点がある。
【０００７】
そこで、本発明では、アレル特異的PCRを高精度に行うことを目的とし、プライマー中のSNP部位を３’末端以外の部位に設定したプライマーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のＳＮＰ部位を含む標的核酸をアレル特異的に増幅する方法は、
（i）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマーと、
（ii）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマーと、
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記ＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記ＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のＰＣＲ反応を行うことを特徴とする。
【０００９】
本発明のプライマーセットは、上記の標的核酸をアレル特異的に増幅する方法に用いるプライマーのセットであって、
（Ａ）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマーと、
（Ｂ）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマーと、
（Ｃ）前記標的核酸の相補鎖の、前記ＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記ＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の５’側に第１のＳＮＰ部位を有し、３’側に第２のＳＮＰ部位を有する標的核酸のハプロタイプの決定方法であって、
（１）（i）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記第１のＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマーと、
（ii）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記第１のＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマーと、
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記第２のＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記第２のＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマーと、
を用いて前記標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程と、
（２）前記工程（１）の結果として得られる産物を、
（Ｉ）該第２のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第２のＳＮＰ部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプローブ及び
（II）該第２のＳＮＰ部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第２のＳＮＰ部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第２のプローブ、
の両方と反応させて、これらの第１及び第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るアレル特異的プライマーを用いることで、高精度なアレル特異的PCRを行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＳＮＰ部位を含む標的核酸をアレル特異的に増幅する核酸増幅方法では以下の３種のプライマーが用いられる。
（i）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として野生型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第１の順方向プライマー。
（ii）３’末端から数えて２塩基目及び３塩基目の一方のみに前記ＳＮＰ部位として変異型ヌクレオチドを有する以外は、前記標的核酸内のＳＮＰ部位を含む部分領域と同一の塩基配列を有する第２の順方向プライマー。
（iii）前記標的核酸の相補鎖の、前記ＳＮＰ部位よりも５’末端側で、前記ＳＮＰ部位に対応する部位を含まない部分領域と同一の塩基配列を有する逆方向プライマー。
【００１３】
第１のプライマー及び第２のプライマーは、標的核酸のＳＮＰ部位を含む部分領域、すなわち標的核酸内のＳＮＰ部位を含む一部の領域に対応し、ＳＮＰ部位を除いた部分については、標的核酸と同一の塩基配列からなる。これらのプライマーのＳＮＰ部位としては、第１のプライマーにおけるＳＮＰ部位として野生型であり、第２のプライマーにおけるＳＮＰ部位として変異型を設定する。また、このＳＮＰ部位は、各プライマーの３’末端から２番目または３番目に設定され、ともに３番目であることが好ましい。
【００１４】
上記の第１〜第３のプライマーを用いて、ＳＮＰ部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅方法用のプライマーセットを構成することができる。また、後述する第１及び第２のＳＮＰを有する標的核酸におけるハプロタイプの決定方法におけるプローブと組み合わせて、ハプロタイプの決定方法に用いるプライマー及びプローブセットを構成することもできる。
【００１５】
第１及び第２のプライマーとで検出用の標識を異ならせておくことで、増幅した核酸断片が、どのプライマーから増幅されたものであるかを効率良く検出可能となる。
【００１６】
上記のＳＮＰ部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅方法は、２つのＳＮＰ（第１のＳＮＰ部位及び第２のＳＮＰ部位）を有する標的核酸のハプロタイプの決定に好適に用いることができる。このハプロタイプの決定方法は以下の工程により行うことができる。
（１）先に挙げた（i）〜（iii）の全てのプライマーを用いて標的核酸のＰＣＲ反応を行う工程。
（２）前記工程（１）の結果として得られる産物を、以下のプローブの両方と反応させて、これらの第１及び第２のプローブとのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程。
（Ｉ）該第２のＳＮＰ部位が野生型ヌクレオチドである該標的核酸内の該第２のＳＮＰ部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のプローブ。
（II）該第２のＳＮＰ部位が変異ヌクレオチドである該標的核酸内の該第２のＳＮＰ部位を含む検出対象領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有する第２のプローブ。
【００１７】
なお、２種のプローブとの反応は、同一反応領域内で行ってもよいし、個々のプローブと個別に反応させてもよい。また、ＳＮＰの変異型が複数ある場合は、第２のプライマーおよび第２のプローブを、検出目的に応じて複数用意しても良い。
【００１８】
以下、本発明の一例について図面を参照して説明する。
【００１９】
図１は、１つのＳＮＰ部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅における第１〜第３のプローブ、ＳＮＰ部位を一箇所有する標的核酸及びその相補鎖の塩基配列上の位置関係を示す図である。図１において、標的核酸１０１は、その相補鎖１０３と二本鎖核酸を構成している。標的核酸１０１は、検出対象としてのＳＮＰ部位を有する。従って、相補鎖１０３は、核酸１０１の検出対象としてのＳＮＰ部位に対応する位置にその相補核酸からなる相補ＳＮＰ部位を有していることとなる。ここで、標的核酸１０１側のＳＮＰ部位における野生型ヌクレオチドは「Ｃ」、変異型ヌクレオチドは「Ｔ」とする。従って、相補鎖１０３側のＳＮＰ部位における野性型ヌクレオチドは「Ｇ」、変異型ヌクレオチドは「Ａ」となる。
【００２０】
次いで、標的核酸１０１側のＳＮＰに対してアレル特異的な２種類の順方向プライマー１０５、１０７を用意する。第１の順方向プライマー１０５は、５’末端に第１の標識１０６を有し、３’末端付近にヌクレオチド「Ｃ」を有する。第２の順方向プライマー１０７は、５’末端に第２の標識１０８を有し、３’末端付近にヌクレオチド「Ｔ」を有する。ここで、第１の標識１０６と第２の標識１０８とは、互いに区別し得るシグナルを生じるものであることが好ましい。例えば、異なる波長の蛍光を発する2種の標識の組み合わせが挙げられる。具体的には、下記１）と２）との組み合わせが挙げられる。
１）１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネート（商品名：Ｃｙ３；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）
２）１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネート（商品名：Ｃｙ５；GEヘルスケアバイオサイエンス社製）
一方、逆方向プライマー１０９も用意する。逆方向プライマー１０９は、相補鎖１０３側のＳＮＰ部位よりも５’側の、このＳＮＰ部位を含まない部分領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するものとする。
【００２１】
なお、プライマーの長さ（塩基数）は、目的とする増幅ができるように、標的核酸においてＳＮＰを含む部分領域として設定される領域の塩基配列に応じて選択することができ、例えば１５〜１９塩基の範囲から選択することが好ましい。
【００２２】
そして第１、第２の順方向プライマー１０５、１０７と、逆方向プライマー１０９とを用いて該標的核酸１０１のＰＣＲを行う。
【００２３】
図１に示すＳＮＰの場合、第１の順方向プライマー１０５は、相補鎖１０３側のＳＮＰ部位にヌクレオチド「Ｇ」を有するため、伸長される。一方、第２の順方向プライマー１０７は、相補鎖１０３の第２のＳＮＰ部位に相補的なヌクレオチドを有さないため伸長しない。即ち、ＰＣＲ産物中には、図２に示した第１の順方向プライマー由来の増幅産物１１０が存在することとなる。増幅産物１１０は、５’末端に第１の標識１０６を有し、第１のＳＮＰに対応する部位にヌクレオチド「Ｃ」を有する。一方、第２の順方向プライマー由来の増幅産物は存在しない。
【００２４】
次に、標的核酸１０１側のＳＮＰが「Ｔ」であった場合について説明する。上述の原理に基づいてＰＣＲ産物中には、第２の順方向プライマー１０７由来の、５’末端に第２の標識１０８を有し、第１のＳＮＰに対応する部位にヌクレオチド「Ｔ」を有する増幅産物が含まれることとなる。
【００２５】
図６に、上記の１つのＳＮＰ部位を含む標的核酸のアレル特異的増幅を利用したハプロタイプの決定方法の一例における標的核酸、プライマー及びプローブの関係を示す。図６において、標的核酸１０１は、第１のＳＮＰ（ＳＮＰ１）と第２のＳＮＰ（ＳＮＰ２）を有する。図６の例では、これらのＳＮＰの組合によりハプロタイプが決まる。このハプロタイプの決定には、プライマー１０５及び１０９を用いる。これらのプライマーは図１で説明した場合と同様の機能を有する。なお、第３のプライマー１０９は、標的核酸１０１の第２のＳＮＰよりも３’側、すなわち標的核酸の相補鎖１０３の第２のＳＮＰ部位よりも５’側の部分領域から選択される。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、標的核酸が図６に示す１０１である場合は、図６（ｂ）に示す核酸断片が増幅される。この増幅過程は先に図１で説明したとおりである。こうして得られた増幅産物の第２のＳＮＰを検討するために、この部分を検出可能なプローブを用意してハイブリダイゼーション法により第２のＳＮＰを決定する。こうして、標的核酸における第１及び第２のＳＮＰを決定することでそのハプロタイプを決定することができる。ハイブリダイゼーション法による第２のＳＮＰの決定は定法により行うことができ、プローブの長さやその反応条件も検出すべき領域の塩基配列などに応じて適宜選択できる。また、ＳＮＰとして複数の変異型がある場合は、これらの変異型のそれぞれに対応するプライマー及びプローブを用意してＰＣＲ及びハイブリダイゼーションを行えばよい。
【実施例】
【００２６】
(ターゲットの準備)
検体由来の核酸の増幅反応(PCR)の例を以下に説明する。
【００２７】
先ず、増幅反応液を用意する。増幅反応液の組成の例を以下に示す。
--PCR溶液組成--
Expand Long Enzyme Mix (Roche)：0.3μl
Template Genome DNA：〜5ng
Forward/Reverse Primer：各々0.12μM each
dNTP：0.7μl
buffer 1：2 μl
H2O：11.4μl
合計：20μl
上記組成の反応液を、図７に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製）を用いてPrimerを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）により、増幅産物の定量を行う。
【００２８】
（アレル特異的PCR）
前述の増幅したPCR産物を用い、アレル特異的PCRを行う。増幅ではCy3標識およびCy5標識された順方向プライマーを用いる。このときのプロトコルの例を以下に示す。
--PCR溶液組成--
AmpliTaq Gold (Applied Biosystems)：0.2μl
Template Genome DNA：4 ng
Forward/Reverse Primer：0.4μM each
dNTP mix：各々0.1 mM
10xbuffer：2.5 μl
H2O：9.3μl
合計：25 μl
上記組成の反応液を図８に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。反応終了後、精製用カラム（QUIAGEN QIAquick PCR Purification Kit: QUIGEN社製）を用いてPrimerを除去した後、電気泳動（BioAnalyzer: Agilent社製）により、増幅産物の定量を行う。
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００３０】
（実施例１）
１つのＳＮＰとして「Ｃ」を有する標的核酸に関し、先に記載した方法に従ってアレル特異的ＰＣＲを行った。標的核酸調製は上述した方法に従った。ただし、アレル特異的ＰＣＲの際のアニーリング温度は、６２℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、以下の配列１）〜９）から、不完全一致順方向プライマーとして、以下の配列１０）〜１８）から、それぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列１９）を用いた。以下に各配列を示す。
配列１）  ５’  Cy3-GGGCTGCACGCTACC  ３’（配列番号：１）
配列２）  ５’  Cy3-GGCTGCACGCTACCC  ３’（配列番号：２）
配列３）  ５’  Cy3-GCTGCACGCTACCCA  ３’（配列番号：３）
配列４）  ５’  Cy3-GCTGCACGCTACCCAC  ３’（配列番号：４）
配列５）  ５’  Cy3-CTGCACGCTACCCACC  ３’（配列番号：５）
配列６）  ５’  Cy3-GCACGCTACCCACCAG  ３’（配列番号：６）
配列７）  ５’  Cy3-CACGCTACCCACCAGG  ３’（配列番号：７）
配列８）  ５’  Cy3-GCTACCCACCAGGCC  ３’（配列番号：８）
配列９）  ５’  Cy3-TACCCACCAGGCCCC  ３’（配列番号：９）
配列１０）  ５’  Cy5- GGGCTGCACGCTACT  ３’（配列番号：１０）
配列１１）  ５’  Cy5- GGCTGCACGCTACTC  ３’（配列番号：１１）
配列１２）  ５’  Cy5- GCTGCACGCTACTCA  ３’（配列番号：１２）
配列１３）  ５’  Cy5- GCTGCACGCTACTCAC  ３’（配列番号：１３）
配列１４）  ５’  Cy5- CTGCACGCTACTCACC  ３’（配列番号：１４）
配列１５）  ５’  Cy5- GCACGCTACTCACCAG  ３’（配列番号：１５）
配列１６）  ５’  Cy5- CACGCTACTCACCAGG  ３’（配列番号：１６）
配列１７）  ５’  Cy5- GCTACTCACCAGGCC  ３’（配列番号：１７）
配列１８）  ５’  Cy5- TACTCACCAGGCCCC  ３’（配列番号：１８）
配列１９）  ５’  GCATCCCATTCCCAGATGA  ３’（配列番号：１９）
ここで完全一致順方向プライマー１）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端にＳＮＰである「Ｃ」を有する。また、プライマー２）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端から２番目にＳＮＰである「Ｃ」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー３）〜９）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端からｎ番目にＳＮＰである「Ｃ」を有する。
【００３１】
また、不完全一致順方向プライマー１０）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端にＳＮＰである「Ｔ」を有する。また、不完全一致プライマー１１）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端から２番目にＳＮＰである「Ｔ」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー１２）〜１８）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端からｎ番目にＳＮＰである「Ｔ」を有する。さらに、逆方向プライマーはＰＣＲ産物が標的核酸に対する相補鎖側のＳＮＰを含まないよう設計した。
【００３２】
アレル特異的ＰＣＲは、完全一致順方向プライマー１種、不完全プライマー１種、逆方向プライマーを用いて行った。各実験で用いたプライマーの組み合わせは、表１のとおりである。
【００３３】
【表１】
2010035532.tif 000003
【００３４】
標的核酸および上記プライマーセットを用いてアレル特異的PCRを行った。その後、精製を行い、電気泳動にて定量を行った。アレル特異的PCRおよび精製、電気泳動の各工程は、先に記載した方法に従った。
【００３５】
得られた解析結果を図示し、アレル特異的ＰＣＲにおけるプライマー中のＳＮＰ位置の評価を行う。図３は、ＳＮＰとして「Ｃ」を有する標的核酸を用いて、アレル特異的ＰＣＲを行った結果である。縦軸は生成した産物量、横軸はプライマーセットを示す。図中の四角は完全一致順方向プライマー、丸は不完全一致順方向プライマーを用いた場合の結果である。図３に示したとおり、不完全一致プライマーによる増幅産物量は、配列１２）の時、最少になる。一方、完全一致プライマーによる増幅産物量は、全ての配列でほぼ同じである。このことから、３’末端から３番目にＳＮＰ部位を有するプライマーセットを用いた時、不完全一致プライマーによる増幅産物量が最少になり、完全一致プライマーによる増幅産物量が変化しないといえる。したがって、アレル特異的ＰＣＲを高精度で行うためには、３’末端から３番目にＳＮＰ部位を有するプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３６】
（実施例２）
ＳＮＰとして「Ｃ」を有する標的核酸に関し、アレル特異的ＰＣＲを行った。標的核酸調製は先に記載した方法に従った。ただし、アレル特異的ＰＣＲの際のアニーリング温度は、５６℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、配列２０）〜２７）から、不完全一致順方向プライマーとして、配列２８）〜３５）からそれぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列３６）を用いた。以下に各配列を示す。
配列２０）  ５’  Cy3-AATGCCCTTCTCCAGGAC  ３’（配列番号：２０）
配列２１）  ５’  Cy3-GCCCTTCTCCAGGACG  ３’（配列番号：２１）
配列２２）  ５’  Cy3-CCCTTCTCCAGGACGT  ３’（配列番号：２２）
配列２３）  ５’  Cy3-CCCTTCTCCAGGACGTC  ３’（配列番号：２３）
配列２４）  ５’  Cy3-CCTTCTCCAGGACGTCC  ３’（配列番号：２４）
配列２５）  ５’  Cy3-CTTCTCCAGGACGTCCC  ３’（配列番号：２５）
配列２６）  ５’  Cy3-TCCAGGACGTCCCCC  ３’（配列番号：２６）
配列２７）  ５’  Cy3-ACGTCCCCCAAACCTG  ３’（配列番号：２７）
配列２８）  ５’  Cy5-AATGCCCTTCTCCAGGAA  ３’（配列番号：２８）
配列２９）  ５’  Cy5-GCCCTTCTCCAGGAAG  ３’（配列番号：２９）
配列３０）  ５’  Cy5-CCCTTCTCCAGGAAGT  ３’（配列番号：３０）
配列３１）  ５’  Cy5-CCCTTCTCCAGGAAGTC  ３’（配列番号：３１）
配列３２）  ５’  Cy5-CCTTCTCCAGGAAGTCC  ３’（配列番号：３２）
配列３３）  ５’  Cy5-CTTCTCCAGGAAGTCCC  ３’（配列番号：３３）
配列３４）  ５’  Cy5-TCCAGGAAGTCCCCC  ３’（配列番号：３４）
配列３５）  ５’  Cy5-AAGTCCCCCAAACCTG  ３’（配列番号：３５）
配列３６）  ５’  GCTTTGCAGGCTTCAGG  ３’（配列番号：３６）
ここで完全一致順方向プライマー２０）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端にＳＮＰである「Ｃ」を有する。また、プライマー２１）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端から２番目にＳＮＰである「Ｃ」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー２２）〜２７）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端からｎ番目にＳＮＰである「Ｃ」を有する。また、不完全一致順方向プライマー２８）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端にＳＮＰである「Ａ」を有する。また、不完全一致プライマー２９）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端から２番目にＳＮＰである「Ａ」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー３０）〜３５）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端からｎ番目にＳＮＰである「Ａ」を有する。さらに、逆方向プライマーはＰＣＲ産物が標的核酸に対する相補側のＳＮＰを含まないよう設計した。
【００３７】
アレル特異的ＰＣＲは、完全一致順方向プライマー１種、不完全プライマー１種、逆方向プライマーを用いて行った。各実験で用いたプライマーの組み合わせは、表２のとおりである。
【００３８】
【表２】
2010035532.tif 000004
【００３９】
標的核酸および上記プライマーセットを用いてアレル特異的ＰＣＲを行った。その後、精製を行い、電気泳動にて定量を行った。アレル特異的ＰＣＲおよび精製、電気泳動の各工程は先に記載した方法に従った。
【００４０】
得られた解析結果を図示し、アレル特異的ＰＣＲにおけるプライマー中のＳＮＰ位置の評価を行う。図４は、ＳＮＰとして「Ｃ」を有する標的核酸を用いて、アレル特異的ＰＣＲを行った結果である。縦軸は生成した産物量、横軸はプライマーセットを示す。図中の四角は完全一致順方向プライマー、丸は不完全一致順方向プライマーを用いた場合の結果である。図に示したとおり、不完全一致プライマーによる増幅産物量は、配列３０）の時、最少になる。一方、完全一致プライマーによる増幅産物量は、全ての配列でほぼ同じである。このことから、３’末端から３番目にＳＮＰ部位を有するプライマーセットを用いた時、不完全一致プライマーによる増幅産物量が最少になり、完全一致プライマーによる増幅産物量が変化しないといえる。したがって、アレル特異的ＰＣＲを高精度で行うためには、３’末端から３番目にＳＮＰ部位を有するプライマーセットを用いることが好ましい。
【００４１】
（実施例３）
第１のＳＮＰとして「Ｔ」を有する標的核酸に関し、アレル特異的ＰＣＲを行った。標的核酸調製は実施様態例に従った。ただし、アレル特異的ＰＣＲの際のアニーリング温度は、６０℃とした。また、完全一致順方向プライマーとして、配列３７）〜４２）から、不完全一致順方向プライマーとして、配列４３）〜４８）からそれぞれ選択し、逆方向プライマーとして、配列４９）を用いた。以下に各配列を示す。
配列３７）  ５’  Cy3-GACCTGTAGTCTGGGGT  ３’（配列番号：３７）
配列３８）  ５’  Cy3-ACCTGTAGTCTGGGGTG  ３’（配列番号：３８）
配列３９）  ５’  Cy3-CCTGTAGTCTGGGGTGA  ３’（配列番号：３９）
配列４０）  ５’  Cy3-CCTGTAGTCTGGGGTGAT  ３’（配列番号：４０）
配列４１）  ５’  Cy3-AGTCTGGGGTGATCCTG  ３’（配列番号：４１）
配列４２）  ５’  Cy3-GGTGATCCTGGCTTGAC  ３’（配列番号：４２）
配列４３）  ５’  Cy5-GACCTGTAGTCTGGGGG  ３’（配列番号：４３）
配列４４）  ５’  Cy5-ACCTGTAGTCTGGGGGG  ３’（配列番号：４４）
配列４５）  ５’  Cy5-CCTGTAGTCTGGGGGGA  ３’（配列番号：４５）
配列４６）  ５’  Cy5-CCTGTAGTCTGGGGGGAT  ３’（配列番号：４６）
配列４７）  ５’  Cy5-AGTCTGGGGGGATCCTG  ３’（配列番号：４７）
配列４８）  ５’  Cy5-GGGGATCCTGGCTTGAC  ３’（配列番号：４８）
配列４９）  ５’  GGCCTGTTTCATGTCCA  ３’（配列番号：４９）
ここで完全一致順方向プライマー３７）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端に第１のＳＮＰである「Ｔ」を有する。また、プライマー３８）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端から２番目にＳＮＰである「Ｔ」を有する。以下同様に、完全一致順方向プライマー３９）〜４２）は５’末端に「Ｃｙ３」標識、３’末端からｎ番目にＳＮＰである「Ｔ」を有する。また、不完全一致順方向プライマー４３）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端にＳＮＰである「Ｇ」を有する。また、不完全一致プライマー４４）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端から２番目にＳＮＰである「Ｇ」を有する。以下同様に、不完全一致順方向プライマー４５）〜４８）は５’末端に「Ｃｙ５」標識、３’末端からｎ番目にＳＮＰである「Ｇ」を有する。さらに、逆方向プライマーはＰＣＲ産物が第２のＳＮＰを含まないよう設計した。
【００４２】
アレル特異的ＰＣＲは、完全一致順方向プライマー１種、不完全プライマー１種、逆方向プライマーを用いて行った。各実験で用いたプライマーの組み合わせは、表３のとおりである。
【００４３】
【表３】
2010035532.tif 000005
【００４４】
標的核酸および上記プライマーセットを用いてアレル特異的ＰＣＲを行った。その後、精製を行い、電気泳動にて定量を行った。アレル特異的ＰＣＲおよび精製、電気泳動の各工程は、先に記載した方法に従った。
【００４５】
得られた解析結果を図示し、アレル特異的ＰＣＲにおけるプライマー中のＳＮＰ位置の評価を行う。図５は、ＳＮＰとして「Ｔ」を有する標的核酸を用いて、アレル特異的ＰＣＲを行った結果である。縦軸は生成した産物量、横軸はプライマーセットを示す。図中の四角は完全一致順方向プライマー、丸は不完全一致順方向プライマーを用いた場合の結果である。図に示したとおり、不完全一致プライマーによる増幅産物量は、配列４５）の時、最少になる。一方、完全一致プライマーによる増幅産物量は、全ての配列でほぼ同じである。このことから、３’末端から３番目にＳＮＰ部位を有するプライマーセットを用いた時、不完全一致プライマーによる増幅産物量が最少になり、完全一致プライマーによる増幅産物量が変化しないといえる。したがって、アレル特異的ＰＣＲを高精度で行うためには、３’末端から３番目にＳＮＰ部位を有するプライマーセットを用いることが好ましい。
【００４６】
上記実施例で示したとおり、本発明に基づき設計した不完全一致順方向プライマーを用いることで、非特異的な増幅反応が低減されることが明らかとなった。したがって、本発明で示されるプライマーは、高精度なアレル特異的ＰＣＲに有効であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】アレル特異的PCRの説明図である。
【図２】図１に係るアレル特異的PCRにより得られる増幅産物の説明図である。
【図３】アレル特異的PCR結果（C100T）を示す図である。
【図４】アレル特異的PCR結果（G310T）を示す図である。
【図５】アレル特異的PCR結果（T843G）を示す図である。
【図６】（ａ）及び（ｂ）はハプロタイプの決定方法の一例を説明するための図である。
【図７】ＰＣＲの温度サイクル条件を示す図である。
【図８】ＰＣＲの温度サイクル条件を示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１０１：標的核酸
１０３：標的核酸の相補鎖
１０５：第１の順方向プライマー
１０６：第１の標識
１０７：第２の順方向プライマー
１０８：第２の標識
１０９：逆方向プライマー
１１０：増幅産物
【図１】
2010035532.tif 000006
【図２】
2010035532.tif 000007
【図３】
2010035532.tif 000008
【図４】
2010035532.tif 000009
【図５】
2010035532.tif 000010
【図６】
2010035532.tif 000011
【図７】
2010035532.tif 000012
【図８】
2010035532.tif 000013
【配列表】
2010035532000001.app