(57)【要約】【課題】本発明はアテローム性動脈硬化症（アテローム性硬化症）の分野に関する。特に本発明は、経口投与が可能で、１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を改善するペプチド類の特定に関する。本発明は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善する新規なペプチドを提供する。【解決手段】前記ペプチドは少なくとも１つのクラスＡ両親媒性らせんおよび少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む。前記ペプチドは高度に安定であり、経口ルートにより容易に投与することができる。【選択図】図２３
2010280718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化症の症状を改善するペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｆ−Ｆ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ｆ−Ｆ（配列番号７）を含む、前記アテローム性動脈硬化症の症状を改善するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列が配列Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｆ−Ｆ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ｆ−Ｆ（配列番号７）からなる請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが全て「Ｌ」アミノ酸から構成される請求項１〜２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが全て「Ｄ」アミノ酸から構成される請求項１〜２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドがさらに少なくとも１つの保護基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも1つの保護基がアミノ末端および／またはカルボキシル末端に結合している請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
第一の保護基がアミノ末端に結合しており、第二の保護基がカルボキシル末端に結合している請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記第一の保護基および前記第二の保護基が、存在する場合、それぞれ別個に
アセチル、アミド、３から２０個の炭素のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ），４，４−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメンチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル基、カルボベンゾキシ基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）
から成る群から選択される請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記第一の保護基が、ベンゾイル基、アセチル、プロペオニル、カルボベンゾキシ、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよび３から２０個の炭素のアルキルから成る群から選択される保護基である請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記第二の保護基がアミドである請求項７に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記第一の保護基がアセチルであり、前記第二の保護基がアミドである請求項７に記載のペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドを含む医薬製剤であって、前記ペプチドが薬理学的に許容できる賦形剤と混合される前記医薬製剤。
【請求項１３】
前記薬理学的に許容できる賦形剤が、非経口投与、局所投与、経口投与、経鼻投与、吸入投与、直腸投与、および末梢投与から成る群から選択される経路での投与に適している請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
前記薬理学的に許容できる賦形剤が経口投与に適している請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
前記薬理学的に許容できる賦形剤が哺乳類への非経口投与に適している請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症の予防または治療のための組成物であって、前記組成物は治療的に有効な量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の医薬製剤を含む前記組成物。
【請求項１７】
前記哺乳類がヒトである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記哺乳類がヒト以外の哺乳類である請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアテローム性動脈硬化症（アテローム性硬化症）の分野に関する。特に本発明
は、経口投与が可能で、１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を改善するペプ
チド類の特定に関する。
【背景技術】
【０００２】
心脈管系疾患は、特に米国および西欧諸国では罹患率および死亡率の第一位である。心
脈管系疾患の発生においていくつかの原因因子が示唆されているが、これらには、前記疾
患に対する遺伝的素因、性別、生活様式因子（例えば喫煙および食事）、年齢、高血圧お
よび高脂血症（高コレステロール血症を含む）が含まれる。前記因子のいくつか、特に高
脂血症および高コレステロール血症（高コレステロール血中濃度）は、アテローム性硬化
症の顕著な危険因子を提供する。
【０００３】
コレステロールは、血中では、リポタンパク質粒子内で遊離コレステロールおよびエス
テル化コレステロールとして存在する。前記リポタンパク質粒子は、一般にキロミクロン
、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度
リポタンパク質（ＨＤＬ）として知られている。血中の全コレステロール濃度は、（１）
消化管からのコレステロールの吸収、（２）食物成分（例えば炭水化物、タンパク質、脂
肪およびエタノール）を基にするコレステロールの合成、および（３）組織（特に肝臓）
による血液からのコレステロールの排除およびそれに続くコレステロールの胆汁酸、ステ
ロイドホルモンおよび胆汁コレステロールへの変換によって影響される。
【０００４】
血中コレステロールの維持は遺伝因子および環境因子によって影響を受ける。遺伝因子
には、コレステロール生合成の律速段階の酵素の濃度、肝臓の低密度リポタンパク質のレ
セプター濃度、コレステロール胆汁酸変換の律速段階の酵素の濃度、リポタンパク質の合
成速度および分泌速度、並びに個体の性別が含まれる。ヒトの血中コレステロール濃度の
ホメオスタシスに影響を与える環境因子には、食事の組成、喫煙の程度、運動量および種
々の薬剤の使用が含まれる。食事に関する変動性因子には脂肪の量およびタイプ（飽和脂
肪酸およびポリ不飽和脂肪酸）、コレステロールの量、線維の量およびタイプ、並びにお
そらくはビタミン（例えばビタミンＣおよびＤ）およびミネラル（例えばカルシウム）の
量が含まれる。
【０００５】
疫学的研究によって、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びアポリポタンパク質（アポ
）Ａ−Ｉレベルはアテローム硬化の発生に関して負の相関を有することが示された（Wils
on et al.(1988)Arteriosclerosis 8:737-741）。アテローム誘発性食餌を与えられたウ
サギにＨＤＬを注射することによってアテローム硬化病巣が抑制されることが示された（
Badimon et al.(1990)J. Clin. Invest. 85:1234-1241）。
ヒトのアポＡ−Ｉは、その抗アテローム誘発特性のために熱心に研究されてきた。相互
に取り替えることができるアポリポタンパク質（アポＡ−Ｉを含む）は、脂質付随ドメイ
ンを有する（Brouilletteand Anantharamaiah (1995) Biochem. Biophys. Acta 1256:10
3-129; Segrestet al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253）。アポＡ−Ｉは８個のタンデム
に繰り返される２２量体配列（これらの大半はクラスＡの両親媒性らせん構造を形成する
能力をもつ）を有するといわれている（Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:247-253
）。クラスＡ両親媒性らせんの特徴には、極性−非極性境界に陽性荷電残基および極性表
面の中心に陰性荷電残基が存在することである（Segrest et al. (1974) FEBS Lett. 38:
247-253;Segrest et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:103-
117）。
アポＡ−Ｉはリン脂質に強く結合し、複合体を形成しコレステロールに富む細胞からコレ
ステロールの流出を促進させることが示された。アポＡ−Ｉの配送および血清レベルの維
持が、なぜ１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を効果的に緩和するのかは、
これまで明らかではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ウィルソンら、アーテリオスクレロシス（１９８８）、８巻７３７−７４１ページ（Wilsonet al.(1988) Arteriosclerosis 8:737-741）
【非特許文献２】セグレストら、プロテインズ：ストラクチャーファンクションアンドジェネティクス（１９９０）８巻１０３−１１７ページ(Segrest et al. (1990) Proteins: Structure,Function and Genetics 8:103-117）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
関連出願の相互引用
本出願は、ＵＳＳＮ０９／８９６８４１号（2001年6月29日出願）の部分継続出願であ
り、前記はさらにＵＳＳＮ０９／６４５４５４号（2000年8月24日出願）の部分継続出願
である。前記両出願は参照により本明細書に含まれる。
【０００８】
米国政府の研究開発支援により達成された発明の権利に関する記載
本研究は米国公衆衛生局および米国立循環器研究所（National Heart, Lung and Blood
Institute）のグラントＨＬ３０５６８およびＨＬ３４３４３により補助を受けた。米国
政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００９】
本発明は、その投与によって１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状が緩和さ
れる新規なペプチドを提供する。特に、本発明の発見は、“Ｄ”アミノ酸残基とともに製
剤化されるか、および／または保護アミノ末端およびカルボキシル末端を有する、クラス
Ａ両親媒性らせんを含むペプチドは、生物に経口投与することが可能で、容易に取り込ま
れ、血清に送られて効果的に１つまたは２つ以上のアテローム性硬化症の症状を緩和する
ということであった。
【００１０】
したがって、ある実施態様では、本発明はアテローム性硬化症の症状を改善するペプチ
ドを提供する。前記ペプチドの長さは約１０から約３０アミノ酸の範囲で、少なくとも１
つのクラスＡ両親媒性らせんを含み、少なくとも１つの“Ｄ”アミノ酸残基を含み、酸化
物質による酸化からリン脂質を保護し、さらにＤ−１８Ａペプチドではない（例えば、全
てＤ型アミノ酸残基を有するＤ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ
−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ（配列識別番号：１））。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは
さらにアミノおよびカルボキシル末端と結合した保護基を含む。好ましい保護基には以下
が含まれるが、ただしこれらに限定されない：アセチル、アミドおよび３から２０個の炭
素のアルキル基、Ｆｍｏｃ、ｔ−ｂｏｃ、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカ
ルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベン
ジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチ
ル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル
−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ），４，４−ジ
メトキシベンゾヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメ
チルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メ
トキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、
ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，
４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジク
ロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２
−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシ
メチル（Ｂｏｍ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘ
Ｏ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ
）、アセチル（Ａｃ）およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）。特に好ましいある種の実
施態様では、前記ペプチドはさらに、アミノ末端に結合された第一の保護基およびカルボ
キシル末端に結合された第二の保護基を含む。特に好ましいペプチドは、ヒトまたはマウ
スのアポＡ−ＩのクラスＡ両親媒性らせんに極めて類似している。ある種の実施態様では
、好ましいペプチドは、ヒトまたはマウスのアポＡ−ＩのクラスＡ両親媒性らせんをコー
ドするエクソンによってコードされるポリペプチドと約５０％を越えるアミノ酸配列同一
性を含む。ある種の好ましい実施態様では、鏡像異性アミノ酸の少なくとも約１０％、好
ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少な
くとも約５０％、さらにまた好ましくは少なくとも約７５％、もっとも好ましくは少なく
とも９０％および１００％すらが“Ｄ”アミノ酸である。前記ペプチドは、薬学的に許容
できる賦形剤（例えば哺乳類への経口投与に適した賦形剤）と結合させてもよい。
【００１１】
特に好ましいある種の実施態様では、前記ペプチドは、D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-
K-E-A-F- (配列識別番号2),D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L,K-E-A-F- (配列識別番号3), 
D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号4), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-
F-K-E-A-F- (配列識別番号5),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号6)
,D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号7), D-W-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-
K-F-K-E-F-F- (配列識別番号8),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号
9),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号10), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F
-E-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号11), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別
番号12),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号13), E-W-L-K-L-F-Y-E-
K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号14), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配
列識別番号15),E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号16), E-W-L-K-A-
F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号17), E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F
- (配列識別番号18),E-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号19), E-W-L
-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号20), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (
配列識別番号21),A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号22), A-F-Y-D-K-V-A-E-
K-F-K-E-A-F- (配列識別番号23),A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号24), A-
F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号25), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識
別番号26),A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号27), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-
E-A-F- (配列識別番号28),A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号29), A-F-Y-D-
K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号30), K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F- (配列識別番
号31),L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F- (配列識別番号32), A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-
F- (配列識別番号33),A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号34), A-F-Y-D-K-V-
F-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号35),A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F- (配列識別番号36),
A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号37), A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配
列識別番号38),D-W-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号39), D-W-F-K-A-
F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号40),D-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-
(配列識別番号41),E-W-L-K-A-L-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L- (配列識別番号42), E-W-L-
K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号43), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E
-F-F- (配列識別番号44),E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F- (配列識別番号45), E
-W-L-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号46), E-W-F-K-A-F-Y-E-K-F-F-E-K-
F-K-E-F-F- (配列識別番号47),D-F-L-K-A-W-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号4
8),E-F-L-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-W- (配列識別番号49), D-F-W-K-A-W-Y-D-K-V-A
-E-K-L-K-E-W-W-(配列識別番号50), E-F-W-K-A-W-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-W-W- (配列識別
番号51),D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-(配列識別番号52), D-K-W-K-A-V-Y-D-K
-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(配列識別番号53), E-K-L-K-A-F-Y-E-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F- (配列
識別番号54),E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-(配列識別番号55), D-W-L-K-A-F-V
-D-K-F-A-E-K-F-K-E-A-Y-(配列識別番号56), E-K-W-K-A-V-Y-E-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L- (
配列識別番号57),D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号58), E-W-L-K-A
-F-V-Y-E-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号59), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-
F- (配列識別番号60),E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号61), D-W-L
-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号62), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-
E-A-F- (配列識別番号63),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号64), E
-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号65), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-
L-R-E-A-F- (配列識別番号66),E-W-L-K-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F-(配列識別番号67
),D-W-L-K-A-F-Y-D-R-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号68), E-W-L-K-A-F-Y-E-R-V-A-
E-R-L-K-E-A-F-(配列識別番号69), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別
番号70),E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-K-L-R-E-A-F- (配列識別番号71), D-W-L-R-A-F-Y-D-
R-V-A-E-K-I-K-E-A-F-(配列識別番号72), E-W-L-R-A-F-Y-E-R-V-A-E-K-L-K-E-A-F- (配
列識別番号73),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F- (配列識別番号74), E-W-L-K-A-
F-Y-E-K-V-A-E-R-L-R-E-A-F-(配列識別番号75), D-W-L-R-A-F-Y-D-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F
- (配列識別番号76),E-W-L-R-A-F-Y-E-K-V-A-E-R-L-K-E-A-F- (配列識別番号77), D-W-L
-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別
番号78),D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F
-F- (配列識別番号79),D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-
A-E-K-L-K-E-A-F-(配列識別番号80),D-K-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-W-A-K-E-A-F-P-D-K-L-K-
A-F-Y-D-K-V-F-E-W-L-K-E-A-F-(配列
識別番号81),D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K-E-F-L-P-D-K-W-K-A-V-Y-D-K-F-A-E-A-F-K
-E-F-L- (配列識別番号82),D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-W-F-K-A-F-Y-D-
K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(配列識別番号83), D-W-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-W
-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-(配列識別番号84), D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-
K-E-F-F-P-D-W-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-(配列識別番号85) から選ばれる、１
つまたは２つ以上の以下のアミノ酸配列、その切端形、その多量体（例えば好ましくは２
量体から３量体、４量体、５量体、８量体または１０量体の範囲である）、その配列の保
存的置換、および／またはアミノ酸類似体を含む前記配列を含む。
【００１２】
前記配列の鏡像異性アミノ酸は、好ましくは少なくとも１つの“Ｄ”アミノ酸を含む。
ある種の好ましい実施態様では、本明細書で述べるように、前記鏡像異性アミノ酸の少な
くとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、もっとも好ましくは少なくとも９０％
および１００％すらが“Ｄ”アミノ酸である。前記のペプチドはまた、そのアミノ末端ま
たはカルボキシ末端に結合された保護基（例えばアミド、アセチル、プロペオニル、およ
び３から２０個の炭素のアルキルなど）を含むことができる。ある種の実施態様では、前
記カルボキシル末端に結合された保護基はアミドである。ある種の実施態様では、前記ア
ミノ末端に結合された保護基は、アセチル、プロペオニルまたは３から２０個の炭素のア
ルキルである。ある種のペプチドは、カルボキシル末端保護基およびアミノ末端保護基の
両方を含む。前記のような実施態様の１つでは、前記アミノ末端の保護基はアセチル、プ
ロペオニルおよび３から２０炭素のアルキルから成る群から選択される保護基で、前記カ
ルボキシル末端の保護基はアミドである。
【００１３】
ある種の実施態様では、前記ペプチドは、例えば過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ
、１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥおよびＨＥＴＥから成る
群から選択される酸化物質による酸化からリン脂質を保護するペプチドである。前記リン
脂質は以下から成る群から選択されるリン脂質であろう：１−パルミトイル−２−アラキ
ドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）、１−ステアロイル−２
−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロ
イル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＡＰＥ
）。したがって、前記ペプチドは、例えば以下の脂質の生成を防止する：酸化１−パルミ
トイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ
）、１−パルミトイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン
（ＰＯＶＰＣ）、１−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリ
ルコリン（ＰＧＰＣ）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホリルコリン（ＰＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドノイル
−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−
オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステア
ロイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−
ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（
ＳＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
リルエタノールアミン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−
２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）およ
び１−ステアロイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエ
タノールアミン（ＳＥＩＰＥ）。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の症状を改善する経口投与に適した
組成物を提供する。前記組成物は、クラスＡの両親媒性らせんを含むヒトアポＡ−Ｉペプ
チドもしくはそのフラグメント、またはヒトアポＡ−Ｉペプチド類似体であるペプチドを
含み、ここで前記ペプチドは、アミノ末端に結合した第一の保護基およびカルボキシル末
端に結合した第二の保護基を有し、さらに前記ペプチドは複数のＤアミノ酸残基を含む。
前記保護基には本明細書で述べる保護基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。あ
る種の実施態様では、前記ペプチドを構成する鏡像異性アミノ酸の半分以上、より好まし
くは８０％以上、もっとも好ましくは９０％以上またはその全てすらがＤアミノ酸である
。前記組成物は、さらに医薬的に許容できる賦形剤（例えば経口投与に適した賦形剤また
は注射に適した賦形剤）を含むことができる。
【００１５】
好ましいペプチドは、酸化物質（例えば過酸化水素、１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５（
Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤＥ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥおよびＨＥＴＥ）による酸化から
リン脂質［例えば１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
リルコリン（ＰＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホリルコリン（ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＡＰＥ）］を保護することができる。したがっ
て、前記ペプチドは以下の生成を防ぐことができる：酸化１−パルミトイル−２−アラキ
ドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＰＡＰＣ）、１−パルミトイ
ル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＯＶＰＣ）、１
−パルミトイル−２−グルタロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＰＧＰＣ
）、１−パルミトイル−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリル
コリン（ＰＥＩＰＣ）、酸化１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホリルコリン（Ｏｘ−ＳＡＰＣ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＯＶＰＣ）、１−ステアロイル−２−グルタ
ロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＧＰＣ）、１−ステアロイル−２−
エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＳＥＩＰＣ）、酸化
１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミ
ン（Ｏｘ−ＳＡＰＥ）、１−ステアロイル−２−オキソバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホリルエタノールアミン（ＳＯＶＰＥ）、１−ステアロイル−２−グルタロイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（ＳＧＰＥ）および１−ステアロイル
−２−エポキシイソプロスタン−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルエタノールアミン（Ｓ
ＥＩＰＥ）。
【００１６】
本発明はまたアテローム性硬化症の症状を改善する方法を提供する。本方法は、生物（
例えばヒトまたはヒト以外の哺乳類）に１つまたは２つ以上の本明細書に記載するペプチ
ドを投与することを含む。特に好ましい実施態様では、前記ペプチドは複数の“Ｄ”アミ
ノ酸を含み、および／または本明細書に記載するように保護されている。前記ペプチドは
好ましくは前記生物に経口投与され、さらに前記生物は好ましくはアテローム性硬化症の
１つまたは２つ以上の症状があるまたはそのおそれがあると診断された生物である。ある
種の実施態様では、前記ペプチドは単離ペプチドとして提供されるか、または本明細書に
記載する薬理学的賦形剤と一緒に提供することができる。投与は好ましくは、アテローム
性硬化症の１つもしくは２つ以上の症状を改善させるか、及び／またはアテローム性硬化
症の１つもしくは２つ以上の症状の発生のおそれを顕著に減少させるために十分な用量で
提供される。
【００１７】
さらに別の実施態様では、本発明はアテローム性硬化症症状を改善するキットを提供す
る。好ましいキットは、本明細書に記載する１つまたは２つ以上のペプチドを収納した容
器を含む。前記ペプチドは好ましくは、本明細書に記載するように複数の“Ｄ”アミノ酸
を含み、および／または保護されている。ある種の実施態様では、前記キットは場合によ
ってさらに医薬的に許容できる賦形剤を含み、および／または前記ペプチドは医薬的に許
容できる賦形剤と結合された状態で（例えば個別投薬形態として）提供される。好ましい
キットは経口投与用の個別投薬形態を提供する。前記キットはまた、場合によって、アテ
ローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善するために、および／またはアテロー
ム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の発生のおそれを減少させるために前記ペプチド
の使用を説明する指示物を含む。
ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および／またはGarberらの
文献（Arteriosclerosisand Thrombosis, 12:886-894(1992)）に開示されたいずれのペ
プチドも除外する。ある種の実施態様では、本発明は、米国特許第4,643,988号および／
またはGarberら（1992）の文献に開示されたペプチドであって、全ての鏡像異性アミノ酸
がＬアミノ酸であるものから合成されたもの、またはＤアミノ酸であるものから合成され
たものをいずれも除外する（ここで前記ペプチドは封鎖基である）。ある種の実施態様で
は、本発明は、式Ａ1−Ｂ1−Ｂ2−Ｃ1−Ｄ−Ｂ3−Ｂ4−Ａ2−Ｃ2−Ｂ5−Ｂ6−Ａ3−Ｃ3−
Ｂ7−Ｃ4−Ａ4−Ｂ8−Ｂ9（配列識別番号：８７）を有するペプチドを除外する。前記式
中、Ａ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、ま
たはその同族体もしくは類似体であり、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5、Ｂ6、Ｂ7、Ｂ8および
Ｂ9はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン、チロシ
ン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアラニン、またはその同族体もしくは類
似体であり、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3およびＣ4はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであり、
Ｄはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体もしくは類
似体であるが、ただし、Ａ1およびＡ2がアスパラギン酸であるときは、Ａ3およびＡ4はグ
ルタミン酸であり、Ｂ2およびＢ9はロイシンであり、Ｂ3およびＢ7はフェニルアラニンで
あり、Ｂ4はチロシンであり、Ｂ5はバリンであり、Ｂ6、Ｂ8およびＤはアラニンであり、
さらにＣ1、Ｃ2、Ｃ3およびＣ4はリジンであり、Ｂ1はトリプトファンではないことを条
件とする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、アポＥ欠損マウスにおける14Ｃ−Ｄ−５Ｆと血液成分との結合を示す。14Ｃアミノ酸で標識したアポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５Ｆを、経口経管投与によりアポＥ欠損マウス（ｎ＝５）に投与するか、または前記マウスの血漿とともにinvitroでインキュベートした。空腹時血液を経管投与後６時間で採集し、血液、血漿およびリポタンパク質と結合した14Ｃを測定した。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、アポＥ欠損マウスにおける14Ｃ−Ｄ−５Ｆと血液成分との結合を示す。14Ｃアミノ酸で標識したアポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５Ｆを、経口経管投与によりアポＥ欠損マウス（ｎ＝５）に投与するか、または前記マウスの血漿とともにinvitroでインキュベートした。空腹時血液を経管投与後６時間で採集し、血液、血漿およびリポタンパク質と結合した14Ｃを測定した。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、アポＥ欠損マウスにおける14Ｃ−Ｄ−５Ｆと血液成分との結合を示す。14Ｃアミノ酸で標識したアポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５Ｆを、経口経管投与によりアポＥ欠損マウス（ｎ＝５）に投与するか、または前記マウスの血漿とともにinvitroでインキュベートした。空腹時血液を経管投与後６時間で採集し、血液、血漿およびリポタンパク質と結合した14Ｃを測定した。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、アポＥ欠損マウスにおける14Ｃ−Ｄ−５Ｆと血液成分との結合を示す。14Ｃアミノ酸で標識したアポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５Ｆを、経口経管投与によりアポＥ欠損マウス（ｎ＝５）に投与するか、または前記マウスの血漿とともにinvitroでインキュベートした。空腹時血液を経管投与後６時間で採集し、血液、血漿およびリポタンパク質と結合した14Ｃを測定した。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、経口的に投与したＤペプチドが活性を有することを示す。アポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５ＦおよびＬ−５Ｆ（１００μｇ／動物）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与によって投与した。血液を6時間後に採集し、ＬＤＬおよびＨＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）で単離し、動脈壁モデル系でＨＤＬ保護能力（図２Ａ）およびＬＤＬの酸化耐性（図２Ｂ）について生じた単球の走化性活性を測定することによって調べた。図に示されたように、Ｄ−５ＦはＨＤＬの防御性を顕著に高め（ただしＬ−５Ｆはそうではない）、Ｄ−５Ｆ後にはＬＤＬは酸化に対して強い耐性を得た。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、経口的に投与したＤペプチドが活性を有することを示す。アポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−５ＦおよびＬ−５Ｆ（１００μｇ／動物）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与によって投与した。血液を6時間後に採集し、ＬＤＬおよびＨＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）で単離し、動脈壁モデル系でＨＤＬ保護能力（図２Ａ）およびＬＤＬの酸化耐性（図２Ｂ）について生じた単球の走化性活性を測定することによって調べた。図に示されたように、Ｄ−５ＦはＨＤＬの防御性を顕著に高め（ただしＬ−５Ｆはそうではない）、Ｄ−５Ｆ後にはＬＤＬは酸化に対して強い耐性を得た。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、経管投与後のＤ対Ｌペプチドの血漿濃度を示している。アポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−４Ｆ（図３Ｂ）およびＬ−４Ｆ（図３Ｂ）を125Ｉで標識し、経口経管投与によってＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝４）に投与した。血液を３時間後に採集し、血漿をＦＰＬＣで分画し、溶出分画中の放射能活性を測定した。Ｌペプチドの１５％未満が完全な１８量体として溶出し、一方、Ｄ−４Ｆの７０％以上が完全であった。前記の実験は、ＤペプチドはＬペプチドと比較してin vivoで分解に対して極めて耐性を有することを示している。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、経管投与後のＤ対Ｌペプチドの血漿濃度を示している。アポＡ−Ｉ類似ペプチドＤ−４Ｆ（図３Ｂ）およびＬ−４Ｆ（図３Ｂ）を125Ｉで標識し、経口経管投与によってＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝４）に投与した。血液を３時間後に採集し、血漿をＦＰＬＣで分画し、溶出分画中の放射能活性を測定した。Ｌペプチドの１５％未満が完全な１８量体として溶出し、一方、Ｄ−４Ｆの７０％以上が完全であった。前記の実験は、ＤペプチドはＬペプチドと比較してin vivoで分解に対して極めて耐性を有することを示している。
【図４】図４は、処置マウスでＤ−４Ｆに対する抗体が存在しないことを示す。Ｄ−４Ｆに対する抗体（白色の沈澱線）が存在しないことが、５ｍｇ／日（下図）のペプチドによる処置後６週のＬＤＬレセプター欠損マウスの血漿で見出された。ポジティブコントロール（上図）は、マウス血漿のアポＡ−Ｉに対する沈澱線の存在を示している。上図：中央＝ウサギ抗アポＡ−Ｉ、および周囲＝Ｄ−４Ｆマウスの血漿。下図：中央＝Ｄ４Ｆで処置したＬＤＬＲ−／−マウスの血漿、および周囲＝０〜８０μｇの純粋Ｄ−４Ｆペプチド。
【図５】図５は、西洋風食事を与えたＬＤＬレセプター欠損マウスにおける大動脈根の脂肪線病巣発生率を示す。ＬＤＬレセプター欠損マウス群に西洋風食餌を与え、さらに経口的に賦形剤（コントロール）（ｎ＝９）またはペプチドＤ−４Ｆ（ｎ＝６）を１日に２回６週間投与した。続いてマウスを殺し、大動脈弓を固定し切片を作製して脂肪線病巣を定量した。Ｄ−４Ｆを与えたマウスは病巣面積が８１％減少した（ｐ＜０．０１）。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、腹腔内注射後のペプチド５ＦまたはアポＡ−Ｉの血中分布を示す。ヒトアポＡ−Ｉ、マウスアポＡ−Ｉおよびペプチド５Ｆを125Ｉで標識し、アテローム誘発食餌を少なくとも３週間与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に注射した。表３に記載した動態実験中にサンプルを採取した。代表的なサンプルをＣＬｉＰ法で分析し、分画を採集して放射能活性を測定した。溶出容積はカラムポンプの速度だけを基準にし、酵素試薬ポンプが影響を与える容積は無視した。提示したデータはコレステロール（恣意単位による５００ｎｍでの吸収；実線）および放射能活性（カウント／分、点線）である。Ａ＝ヒトアポＡ−Ｉ（注射後１時間）；Ｂ＝マウスアポＡ−Ｉ（１時間）；Ｃ＝５Ｆ（１．５時間）。
【図６Ｂ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、腹腔内注射後のペプチド５ＦまたはアポＡ−Ｉの血中分布を示す。ヒトアポＡ−Ｉ、マウスアポＡ−Ｉおよびペプチド５Ｆを125Ｉで標識し、アテローム誘発食餌を少なくとも３週間与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に注射した。表３に記載した動態実験中にサンプルを採取した。代表的なサンプルをＣＬｉＰ法で分析し、分画を採集して放射能活性を測定した。溶出容積はカラムポンプの速度だけを基準にし、酵素試薬ポンプが影響を与える容積は無視した。提示したデータはコレステロール（恣意単位による５００ｎｍでの吸収；実線）および放射能活性（カウント／分、点線）である。Ａ＝ヒトアポＡ−Ｉ（注射後１時間）；Ｂ＝マウスアポＡ−Ｉ（１時間）；Ｃ＝５Ｆ（１．５時間）。
【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、腹腔内注射後のペプチド５ＦまたはアポＡ−Ｉの血中分布を示す。ヒトアポＡ−Ｉ、マウスアポＡ−Ｉおよびペプチド５Ｆを125Ｉで標識し、アテローム誘発食餌を少なくとも３週間与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に注射した。表３に記載した動態実験中にサンプルを採取した。代表的なサンプルをＣＬｉＰ法で分析し、分画を採集して放射能活性を測定した。溶出容積はカラムポンプの速度だけを基準にし、酵素試薬ポンプが影響を与える容積は無視した。提示したデータはコレステロール（恣意単位による５００ｎｍでの吸収；実線）および放射能活性（カウント／分、点線）である。Ａ＝ヒトアポＡ−Ｉ（注射後１時間）；Ｂ＝マウスアポＡ−Ｉ（１時間）；Ｃ＝５Ｆ（１．５時間）。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、マウスリポタンパク質とヒトの動脈壁細胞との相互作用を示す。アテローム誘発食餌を与えたマウスおよび賦形剤（ＰＢＳ）またはペプチド５Ｆ（２０μｇ／マウス／日）を注射したマウスの血漿からＦＰＬＣによってＬＤＬおよびＨＤＬを単離した。混合培養を以下のもので処置するかまたは処置しなかった（図中では無添加と表示）：ヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）（２００μｇ／ｍｌＬＤＬタンパク質）もしくはマウスＬＤＬ（ＭｏＬＤＬ）（２００μｇ／ｍｌ）、またはヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍｌ）＋ヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇ／ｍｌＨＤＬタンパク質）もしくはマウスＨＤＬ（ＭｏＨＤＬ）（３００μｇ／ｍｌ）。混合培養に上記を添加し１０％のリポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ）の存在下で８時間３７℃でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化水素等価物についてアッセイした（Ａ図）。続いて前記混合培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない新しい培養液でさらに８時間インキュベートした。前記調整培養液を採集し、単球走化性活性についてアッセイした（Ｂ図）。無細胞ブランクを比較のために両図に加えた。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、マウスリポタンパク質とヒトの動脈壁細胞との相互作用を示す。アテローム誘発食餌を与えたマウスおよび賦形剤（ＰＢＳ）またはペプチド５Ｆ（２０μｇ／マウス／日）を注射したマウスの血漿からＦＰＬＣによってＬＤＬおよびＨＤＬを単離した。混合培養を以下のもので処置するかまたは処置しなかった（図中では無添加と表示）：ヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）（２００μｇ／ｍｌＬＤＬタンパク質）もしくはマウスＬＤＬ（ＭｏＬＤＬ）（２００μｇ／ｍｌ）、またはヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍｌ）＋ヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇ／ｍｌＨＤＬタンパク質）もしくはマウスＨＤＬ（ＭｏＨＤＬ）（３００μｇ／ｍｌ）。混合培養に上記を添加し１０％のリポタンパク質欠損血清（ＬＰＤＳ）の存在下で８時間３７℃でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化水素等価物についてアッセイした（Ａ図）。続いて前記混合培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない新しい培養液でさらに８時間インキュベートした。前記調整培養液を採集し、単球走化性活性についてアッセイした（Ｂ図）。無細胞ブランクを比較のために両図に加えた。
【図８】図８は病巣横断面積を示す。提示のデータは、各動物の平均病巣横断面積（白丸）および各群の全動物の平均±ＳＥＭ（黒丸）を誤差幅とともに示している。略語：ＰＢＳ＝アテローム誘発食餌を与え、さらに毎日２００μＬのリン酸緩衝食塩水を注射したマウス；５Ｆ＝アテローム誘発食餌を与え、さらに毎日２００μＬのリン酸緩衝食塩水中の２０μｇの５Ｆを注射したマウス；ＭｏＡＩ＝アテローム誘発食餌を与え、さらに毎日２００μＬのリン酸緩衝食塩水中の５０μｇのマウスアポＡ−Ｉを注射したマウス。*＝ｐ＜０．００２（２テール（two-tailed）ｔ−検定によって決定）。有意差は階層上の変数の一方向分析によってもまた示された（ｐ＜０．００１）。
【図９】図９は、アポＡ−Ｉペプチド類似物質のＤおよびＬ異性体は両者ともに、invitroで穏やかに酸化されたＬＤＬによって誘発される単球の走化性活性を防止することを示している。培養液単独（図中ではＬＤＬ、無細胞または細胞、ＬＤＬ無し）、正常動物由来コントロールＬＤＬ（２５０μｇ／ｍＬ）（図中ではＬＤＬ）、およびＬＤＬ＋正常動物由来ＨＤＬ（３５０μｇ／ｍＬ）（図中では＋ＨＤＬ）。他の混合培養は、種々の量（横座標に示したマイクログラム）のＤ−２ＦもしくはＬ−２Ｆ（左から３番目の図、２Ｆ）とともに、またはＤ−３７ｐＡもしくはＬ−３７ｐＡ（右側の最後の図、３７ｐＡ）とともにコントロールＬＤＬとインキュベートされた。データは４回の混合培養から得られた値の平均±ＳＤを示している。ＨＤＬまたは添加ペプチドの値は全て、ＬＤＬ単独（左側の最初の図）とはｐ＜０．０１で有意差を示した。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、本発明のアポＡ−Ｉペプチド類似物質をマウスに与えることによって赤血球がin vitro溶解に対して耐性になることを示している。図１０Ａおよび１０Ｂは、１８時間（図１０Ａ）および４８時間（図１０Ｂ）のin vitro赤血球細胞溶解アッセイの結果を示している。星印は、賦形剤を与えられた動物の赤血球細胞溶解と前記ペプチドを与えられた動物の赤血球細胞溶解との間に有意差（ｐ＜０．００１）が存在することを示している。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、本発明のアポＡ−Ｉペプチド類似物質をマウスに与えることによって赤血球がin vitro溶解に対して耐性になることを示している。図１０Ａおよび１０Ｂは、１８時間（図１０Ａ）および４８時間（図１０Ｂ）のin vitro赤血球細胞溶解アッセイの結果を示している。星印は、賦形剤を与えられた動物の赤血球細胞溶解と前記ペプチドを与えられた動物の赤血球細胞溶解との間に有意差（ｐ＜０．００１）が存在することを示している。
【図１１】図１１は、本発明のアポＡ−Ｉ類似Ｄペプチドをマウスに与えることによって循環ＬＤＬが酸化に対して耐性になることを示している。ＬＤＬレセプター欠損マウス群（ｎ＝３）にＤペプチドまたは賦形剤（食塩水）を経管投与によって与えた。各動物に１００μＬの食塩水、１００μｇ／１００μＬのペプチドＤ−２ＦまたはペプチドＤ−３７ｐＡを与えた。１７時間後に後眼窩洞から軽度の麻酔下で血液を採集した。ＦＰＬＣによって血漿からＬＤＬを単離した。動脈壁の混合培養を培養液単独（図中では無添加）、正常動物のコントロールＬＤＬ（図中ではＬＤＬ）、ＬＤＬ＋正常動物のコントロールＨＤＬ（図中では＋ＨＤＬ）とともにインキュベートした。他の混合培養は、食塩水（図中では食塩水ＬＤＬ）、Ｄ−２Ｆ（図中ではＤ−２Ｆ ＬＤＬ）またはＤ−３７ｐＡペプチド（図中ではＤ−３７ｐＡ ＤＤＬ）を経管投与した後のネズミのＬＤＬとともにインキュベートした。前記混合培養は１０％のＬＰＤＳの存在下で３７℃で４時間インキュベートした。続いて上清を廃棄し、前記混合培養を洗浄し、さらに血清またはＬＰＤＳを含まない培養液とともにさらに４時間インキュベートした。前記調整培養液を採集し、単球の走化性活性について分析した。値は４回の混合培養の平均±ＳＤである。星印はｐ＜０．００１を示している。
【図１２】図１２は、Ｄ型またはＬ型ペプチドを経管投与で与えられたマウスのリポタンパク質を比較する走化性アッセイの結果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、コントロールＨＤＬとＤ型ペプチドを経管投与で与えられたマウスのＨＤＬを比較する走化性アッセイの結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｄ型ペプチドを経管投与で与えられたマウスのＬＤＬとＶＬＤＬ／ＩＤＬを比較する走化性アッセイの結果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび１４Ｂは２Ｆの電気泳動で、その自己結合を示す。図１４Ａ：２ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％）。レーン１は分子量スタンダードを示し、レーン２は、最小の分子量スタンダード（３．５−２．５ｋＤａ）よりもわずかに遅く移動する２Ｆ（分子量２２４２）に対応するバンドを示している。図１４Ｂ：１００μｇ／ｍＬ（レーン２）および２５０μｇ／ｍＬ（レーン1）の２Fの移動度を示す非変性ＰＡＧＥ（４−１２％）で、溶液中での自己結合を示している。レーン３は高分子量スタンダードの移動度を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂは２Ｆの電気泳動で、その自己結合を示す。図１４Ａ：２ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％）。レーン１は分子量スタンダードを示し、レーン２は、最小の分子量スタンダード（３．５−２．５ｋＤａ）よりもわずかに遅く移動する２Ｆ（分子量２２４２）に対応するバンドを示している。図１４Ｂ：１００μｇ／ｍＬ（レーン２）および２５０μｇ／ｍＬ（レーン1）の２Fの移動度を示す非変性ＰＡＧＥ（４−１２％）で、溶液中での自己結合を示している。レーン３は高分子量スタンダードの移動度を示す。
【図１５】図１５は、同種ペプチドシリーズはＤｉＰｏＰＥ二重膜の６相転移を安定化させることを示す。添加ペプチドのモル分画の関数としてのＤｉＰｏＰＥのＴHシフトは、３７°／ｈの加熱スキャン速度でＤＳＣによって測定された。２Ｆ（黒丸）；３Ｆ3（白丸）；４Ｆ（黒四角）；５Ｆ（白四角）；６Ｆ（逆黒三角）；７Ｆ（黒三角）；アポＡ−Ｉ（白三角）。
【図１６】図１６は、同種ペプチドシリーズによるＥＰＣ・ＭＬＶの時間の関数として分解の相対直角光分散モニター（relative right angle light scattering monitoring）を示す。代表的なＥＰＣ・ＭＬＶ清澄曲線が同種ペプチドの各々について示される。等モル濃度のペプチドおよびＥＰＣを用いた（１０５μＭ）。励起および放射波長はともに４００ｎｍであった。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は最終濃度１ｍＭで完全な溶解を達成した。ＥＰＣ（黒丸）；２Ｆ（白丸）；３Ｆ3（黒四角）；３Ｆ14（白四角）；４Ｆ（黒三角）；５Ｆ（白三角）；６Ｆ（逆黒三角）；７Ｆ（逆白三角）；ヒトアポＡ−Ｉ（白菱形）；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（黒菱形）。
【図１７】図１７は同種ペプチドのＬＣＡＴ活性化能を示す。柱状図はＦ−ペプチドによるＬＣＡＴの活性化を示す。ＬＣＡＴ活性は、ＥＰＣ−コレステロールの単層小胞を用いて測定し、活性は、アポＡ−Ｉ活性（これを１００％とする）に対するパーセントとして表した。各値は３回の値の平均値である。用いたペプチド濃度は２０μｇ／ｍＬであった。
【図１８】図１８は、ＬＤＬ誘発単球走化性は同種ペプチドシリーズによって抑制されることを示す。ＬＤＬ単独またはヒトＨＤＬもしくは同種ペプチドシリーズと一緒にインキュベートしたＬＤＬをヒト動脈壁細胞混合培養に１０％のＬＰＤＳ存在下で８時間添加した。上清を除き、前記混合培養を血清またはＬＰＤＳを含まない培養液で洗浄した。続いて前記調整培養液を採集し、単球の走化性活性について分析した。データは平均±ＳＥＭ値（各事例でｎ＝９）を表す。ＬＤＬとのペア比較によれば、３Ｆペプチドを除く全てのペプチドが顕著に有効であった（少なくともｐ＜０．００１、長十字および星印によって示されている）。全てのペプチド間の比較は一方向ＡＮＯＶＡによって分析した。星印は、ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆは同族体の２Ｆおよび７Ｆよりも有意に有効であることを示している（デュケット（Duckett）比較によってｐ＜０．０５）。表中のかぎ括弧は、これら３つのペプチド間ではＬＤＬ誘発走化性の抑制能力に有意差はないことを示している。
【図１９】図１９は、インフルエンザＡの感染は肝臓の酸化リン脂質を感染後２日で増加させることを示す。固形飼料で飼育したＣ５７ＢＬ／６マウスに、文献（Van Lenten  et al.Circulation, 103:2283-2288(2001)）に記載されたようにウイルス血症が生じないような投与量のインフルエンザＡウイルスを経鼻的に感染させた。感染後０、２、３、５、７および９日後に、肝臓を取り出し、酸化リン脂質含有量をＥＳＩ−ＭＳで測定した。
【図２０】図２０は、Ｄ−４ＦはインフルエンザＡ感染後のパラオキソゲナーゼ活性の低下を防止することを示す。図１９のマウス数匹の腹腔内に２０μｇのＤ−４Ｆを毎日注射し、他のマウスにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。パラオキソゲナーゼ活性（ＰＯＮ）を感染後０、２、７および９日に測定した。
【図２１】図２１は、Ｄ−４ＦはインフルエンザＡ感染マウスの大動脈で酸化リン脂質の誘発を防止することを示す。図１９のマウス数匹の腹腔内に２０μｇのＤ−４Ｆを毎日注射し、他のマウスにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。前記マウスの大動脈を感染後０、２、７および９日に採取し、ＥＳＩ−ＭＳで酸化リン脂質含有量を測定した。
【図２２Ａ】図２２Ａから２２Ｃは、経口投与後に、Ｄ−４ＦはＬＤＬレセプター欠損マウスの循環血流中で完全なままで（ただしＬ−４Ｆはそうではなかった）、さらにＨＤＬの能力を強化しヒト大動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護してＬＤＬ誘発単球走化性活性を低下させることを示す。図２２Ａ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆをヨードビーズ試薬を用いて放射能標識し、ＬＤＬレセプター欠損マウスに経口経管投与によって与えた［非標識ペプチド＋125Ｉ−標識ペプチド（比活性１１×１０6ｃｐｍ／μｇ／動物）の１００μｇを含む１００μＬの食塩水、ｎ＝３］。血液を４時間後に採集し、血漿を分離し脂質を除去し、参考文献１２に記載されたように逆相ＨＰＬＣで分析した。図ＢおよびＣ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆ（各動物に１００μＬの食塩水中の１００μｇ）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与で与えた。血液を６時間後に採集し、血漿ＨＤＬおよびＬＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）によって単離し、混合培養で調べた。図２２Ｂ：ヒト動脈壁細胞による酸化からコントロールのヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）を保護するマウスおよびヒトＨＤＬの能力、およびＬＤＬ−誘発単球走化性活性を抑制する同能力が示される。２００μｇタンパク質／ｍＬの濃度のヒトＬＤＬをヒト動脈壁細胞の混合培養にヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇタンパク質／ｍＬ）またはマウスＨＤＬ（ｍＨＤＬ）（１００μｇコレステロール／ｍＬ）［前記マウスＨＤＬは、食塩水投与マウス（図中では食塩水Ｒｘ）またはＬ−４Ｆ（図中ではＬ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（図中ではＤ−４ＦＲｘ）投与マウスから採取］とともに添加し、本明細書に記載したように単球の走化性活性を決定した。図２２Ｃ：マウスＬＤＬの単球走化性活性誘発能力を示す。アッセイコントロールは図Ｂのように左側に示されている。右側については、食塩水投与マウス（食塩水Ｒｘ）、またはＬ−４Ｆ（Ｌ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（Ｄ−４ＦＲｘ）投与マウスからマウスＬＤＬ（ｍＬＤＬ）を単離し、これをＨＤＬ無しに動脈壁細胞混合培養に１００μｇ／ｍＬで添加し、単球の走化性活性を測定した。値は、２つの別個の実験での４つのウェルの平均±ＳＤである。
【図２２Ｂ】図２２Ａから２２Ｃは、経口投与後に、Ｄ−４ＦはＬＤＬレセプター欠損マウスの循環血流中で完全なままで（ただしＬ−４Ｆはそうではなかった）、さらにＨＤＬの能力を強化しヒト大動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護してＬＤＬ誘発単球走化性活性を低下させることを示す。図２２Ａ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆをヨードビーズ試薬を用いて放射能標識し、ＬＤＬレセプター欠損マウスに経口経管投与によって与えた［非標識ペプチド＋125Ｉ−標識ペプチド（比活性１１×１０6ｃｐｍ／μｇ／動物）の１００μｇを含む１００μＬの食塩水、ｎ＝３］。血液を４時間後に採集し、血漿を分離し脂質を除去し、参考文献１２に記載されたように逆相ＨＰＬＣで分析した。図ＢおよびＣ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆ（各動物に１００μＬの食塩水中の１００μｇ）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与で与えた。血液を６時間後に採集し、血漿ＨＤＬおよびＬＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）によって単離し、混合培養で調べた。図２２Ｂ：ヒト動脈壁細胞による酸化からコントロールのヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）を保護するマウスおよびヒトＨＤＬの能力、およびＬＤＬ−誘発単球走化性活性を抑制する同能力が示される。２００μｇタンパク質／ｍＬの濃度のヒトＬＤＬをヒト動脈壁細胞の混合培養にヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇタンパク質／ｍＬ）またはマウスＨＤＬ（ｍＨＤＬ）（１００μｇコレステロール／ｍＬ）［前記マウスＨＤＬは、食塩水投与マウス（図中では食塩水Ｒｘ）またはＬ−４Ｆ（図中ではＬ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（図中ではＤ−４ＦＲｘ）投与マウスから採取］とともに添加し、本明細書に記載したように単球の走化性活性を決定した。図２２Ｃ：マウスＬＤＬの単球走化性活性誘発能力を示す。アッセイコントロールは図Ｂのように左側に示されている。右側については、食塩水投与マウス（食塩水Ｒｘ）、またはＬ−４Ｆ（Ｌ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（Ｄ−４ＦＲｘ）投与マウスからマウスＬＤＬ（ｍＬＤＬ）を単離し、これをＨＤＬ無しに動脈壁細胞混合培養に１００μｇ／ｍＬで添加し、単球の走化性活性を測定した。値は、２つの別個の実験での４つのウェルの平均±ＳＤである。
【図２２Ｃ】図２２Ａから２２Ｃは、経口投与後に、Ｄ−４ＦはＬＤＬレセプター欠損マウスの循環血流中で完全なままで（ただしＬ−４Ｆはそうではなかった）、さらにＨＤＬの能力を強化しヒト大動脈壁細胞による酸化からＬＤＬを保護してＬＤＬ誘発単球走化性活性を低下させることを示す。図２２Ａ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆをヨードビーズ試薬を用いて放射能標識し、ＬＤＬレセプター欠損マウスに経口経管投与によって与えた［非標識ペプチド＋125Ｉ−標識ペプチド（比活性１１×１０6ｃｐｍ／μｇ／動物）の１００μｇを含む１００μＬの食塩水、ｎ＝３］。血液を４時間後に採集し、血漿を分離し脂質を除去し、参考文献１２に記載されたように逆相ＨＰＬＣで分析した。図ＢおよびＣ：ペプチドＬ−４ＦおよびＤ−４Ｆ（各動物に１００μＬの食塩水中の１００μｇ）をＬＤＬレセプター欠損マウス（ｎ＝５）に経口経管投与で与えた。血液を６時間後に採集し、血漿ＨＤＬおよびＬＤＬをゲルろ過（ＦＰＬＣ）によって単離し、混合培養で調べた。図２２Ｂ：ヒト動脈壁細胞による酸化からコントロールのヒトＬＤＬ（ｈＬＤＬ）を保護するマウスおよびヒトＨＤＬの能力、およびＬＤＬ−誘発単球走化性活性を抑制する同能力が示される。２００μｇタンパク質／ｍＬの濃度のヒトＬＤＬをヒト動脈壁細胞の混合培養にヒトＨＤＬ（ｈＨＤＬ）（３５０μｇタンパク質／ｍＬ）またはマウスＨＤＬ（ｍＨＤＬ）（１００μｇコレステロール／ｍＬ）［前記マウスＨＤＬは、食塩水投与マウス（図中では食塩水Ｒｘ）またはＬ−４Ｆ（図中ではＬ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（図中ではＤ−４ＦＲｘ）投与マウスから採取］とともに添加し、本明細書に記載したように単球の走化性活性を決定した。図２２Ｃ：マウスＬＤＬの単球走化性活性誘発能力を示す。アッセイコントロールは図Ｂのように左側に示されている。右側については、食塩水投与マウス（食塩水Ｒｘ）、またはＬ−４Ｆ（Ｌ−４ＦＲｘ）もしくはＤ−４Ｆ（Ｄ−４ＦＲｘ）投与マウスからマウスＬＤＬ（ｍＬＤＬ）を単離し、これをＨＤＬ無しに動脈壁細胞混合培養に１００μｇ／ｍＬで添加し、単球の走化性活性を測定した。値は、２つの別個の実験での４つのウェルの平均±ＳＤである。
【図２３】図２３は、Ｄ−４Ｆの経口投与は西洋風食餌を与えたＬＤＬレセプター欠損マウスで劇的に病巣を減少させることを示す。ＬＤＬレセプター欠損マウス群に西洋風食餌を与え、さらに１００μＬの食塩水単独（図中では食塩水）（ｎ＝４）、またはＤ−４Ｆを含まない１００μＬのリポソーム（図中ではリポソーム）（ｎ＝５）、または１００μＬのリポソーム中の２．５ｍｇのＤ−４Ｆペプチド（図中ではＤ−４Ｆリポソーム）（ｎ＝６匹の動物）を経口経管投与により１日２回６週間与えた。マウスから採血し、その後殺して大動脈根を固定し、切片を作製し、脂肪線病巣のオイルレッドＯ染色の程度を定量した。
【図２４】図２４は、Ｄ−４Ｆの経口投与は固形飼料を与えたアポＥ欠損マウスで劇的に病巣を減少させることを示す。４週齢の数匹のアポＥ欠損マウスの飲料水にＤ−４Ｆを添加し、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤ−４Ｆを与えた（ｎ＝４マウス）。別の群のマウスの飲料水には２ｍｇ／ｍＬの濃度のＤ−４Ｆを添加し（ｎ＝４）、さらに第三の群のマウスの飲料水にはペプチドを添加しなかった（ｎ＝５）。全てのマウスは１日あたり約２．５ｍＬの水を消費し、したがって１つの群のマウスはペプチドを全く投与されず（図中では水）、第二の群は２．５ｍｇのＤ−４Ｆ／マウス／日（図中では２．５ｍｇＤ−４Ｆ）を投与され、さらに第三の群は５．０ｍｇのＤ−４Ｆ／マウス／日（図中では５．０ｍｇＤ−４Ｆ）を投与された。全マウスは５週間固形飼料で飼育され、前記５週間の時点でマウスから採血し、その後殺して大動脈根を固定し、切片を作製し、脂肪線病巣のオイルレッドＯ染色の程度を定量した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書ではア
ミノ酸残基ポリマーを指すために互換的に用いられる。前記用語は、天然に存在するアミ
ノ酸ポリマーと同様に、１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するア
ミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸にも適用される。
【００２０】
“クラスＡ両親媒性らせん”という用語は、極性および非極性表面の分離をもたらすα
−らせんを形成し、陽性荷電残基を極性−非極性境界面に、陰性荷電残基を極性表面の中
心部に有するタンパク質構造を指す（例えば以下の文献を参照されたい：Segrest et al.
(1990)Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117）。
【００２１】
“改善する”という用語は、“アテローム性（動脈）硬化症の１つまたは２つ以上の症
状を改善する”という場合に用いられるときは、アテローム性硬化症および／または付随
する病変の１つまたは２つ以上の症状の減少、防止または排除を指す。前記の減少には酸
化リン脂質の減少または排除、アテローム性硬化症プラーク形成および断裂の減少、臨床
症状（心臓発作、狭心症または卒中発作等）の減少、高血圧の低下、炎症性タンパク質の
生合成の低下、血漿コレステロールの減少などが含まれるが、ただしこれらに限定されな
い。
【００２２】
“鏡像異性アミノ酸”という用語は、互いに重ね合わすことができない少なくとも２つ
の形態として存在することができるアミノ酸を指す。ほとんどのアミノ酸（グリシンを除
く）は鏡像異性であり、いわゆるＬ型（Ｌアミノ酸）またはＤ型（Ｄアミノ酸）として存
在する。天然に存在するほとんどのアミノ酸は“Ｌ”アミノ酸である。“Ｄアミノ酸”お
よび“Ｌアミノ酸”という用語は、平面偏光の特定の回転方向ではなくアミノ酸の絶対配
置を指すために用いられる。本明細書での用い方は当業者の標準的な用い方と一致してい
る。
【００２３】
“保護基”という用語は、アミノ酸の官能基に結合させたとき前記官能基の特性を阻害
するかまたは覆い隠す化学基（例えば側鎖、アルファアミノ基、アルファカルボキシル基
など）を指す。好ましいアミノ末端保護基にはアセチルまたはアミノ基が含まれるが、た
だしこれらに限定されない。他のアミノ末端保護基には、脂肪酸の場合のようなアルキル
基、プロペオニル、フォルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されな
い。好ましいカルボキシル末端保護基には、アミドまたはエステルを形成する基が含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。
【００２４】
“酸化物質による酸化からリン脂質を保護する”という語句は、リン脂質が酸化物質（
例えば、過酸化水素、１３−（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ、１５−（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ、ＨＰＯＤ
Ｅ、ＨＰＥＴＥ、ＨＯＤＥ、ＨＥＴＥなど）と接触したとき、リン脂質の酸化速度（また
は生成される酸化リン脂質の量）を減少させることができる化合物の能力を指す。
【００２５】
“低密度リポタンパク質”または“ＬＤＬ”という用語の定義は当業者の通常の取り扱
いと一致する。一般に、ＬＤＬは、超遠心によって単離されたとき、ｄ＝１．０１９から
ｄ＝１．０６３の範囲の密度で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
【００２６】
“高密度リポタンパク質”または“ＨＤＬ”という用語の定義は当業者の通常の取り扱
いと一致する。一般に、“ＨＤＬ”は、超遠心によって単離されたとき、ｄ＝１．０６３
からｄ＝１．２１の範囲の密度で見出される脂質−タンパク質複合体を指す。
【００２７】
“Ｉ群ＨＤＬ”という用語は、酸化脂質を還元するか（例えば低密度リポタンパク質に
おいて）、または酸化物質による酸化から酸化された脂質を保護する高密度リポタンパク
質またはその成分（例えばアポＡ−Ｉ、パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒ
ドラーゼなど）を指す。
【００２８】
“ＩＩ群ＨＤＬ”という用語は、酸化から脂質を保護する活性または酸化された脂質を
修復（例えば還元）する活性が低いかまたは前記活性がないＨＤＬを指す。
【００２９】
“ＨＤＬ成分”という用語は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を構成する成分（例えば
分子）を指す。酸化から脂質を保護するかまたは修復する（例えば酸化脂質を還元する）
ＨＤＬについてのアッセイはまた、前記の活性を示すＨＤＬの成分（例えばアポＡ−Ｉ、
パラオキソナーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼなど）についてのアッセイを含
む。
【００３０】
“ヒトアポＡ−Ｉ”という用語は、完全長のヒトアポＡ−ＩペプチドまたはクラスＡ両
親媒性らせんを含むそのフラグメントもしくはドメインを指す。
【００３１】
本明細書で用いられる“単球反応”は、アテローム性硬化症プラーク形成に付随する“
炎症反応”に特徴的な単球の活動を指す。前記単球反応は、血管壁の細胞（例えば血管内
皮の細胞）への単球の付着、および／または内皮下腔への走化性、および／または単球の
マクロファージへの分化を特徴とする。
【００３２】
“変化がない”という語句は、酸化リン脂質の量を指すときは、検出可能な変化を欠く
こと、より好ましくは統計的に有意な変化を欠くこと（例えば少なくとも８５％、好まし
くは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは少なくと
も９８％または９９％の信頼度）を指す。検出可能な変化がないとはまた、酸化リン脂質
レベルが変化するが、本明細書に記載するタンパク質が存在しない場合の変化より多くな
いか、または陽性もしくはネガティブコントロールに対する場合ほど多くないアッセイも
指すことができる。
【００３３】
本明細書では以下の略語が用いられる：ＰＡＰＣ＝Ｌ−α−１−パルミトイル−２−ア
ラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＶＰＣ＝１−パルミトイル−２
−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＧＰＣ＝１−パルミ
トイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ＝１−パルミ
トイル−２−（５，６−エポキシイソプロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン；ＣｈＣ１８：２＝コレステリルリノレート；ＣｈＣ１８：２−ＯＯＨ＝コレステリ
ルリノレートヒドロペルオキシド；ＤＭＰＣ＝１，２−ジテトラデカノイル−ｒａｃ−グ
リセロール−３−ホスホコリン；ＰＯＮ＝パラオキソナーゼ；ＨＰＦ＝標準化高倍率視野
；ＰＡＰＣ＝Ｌ−α−１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホコリン；ＰＯＶＰＣ＝１−パルミトイル−２−（５−オキソバレリル）−ｓｎ−グリ
セロ−３−ホスホコリン；ＰＧＰＣ＝１−パルミトイル−２−グルタリル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン；ＰＥＩＰＣ＝１−パルミトイル−２−（５，６−エポキシイソプ
ロスタンＥ2）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯＮ＝パラオキソナーゼ；ＢＬ
／６＝Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｃ３Ｈ＝Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ。
【００３４】
“保存的置換”という用語はタンパク質またはペプチドについて用いられ、実質的に前
記分子の活性（特異性（例えばリポタンパク質に対する））または結合親和性（例えば脂
質またはリポタンパク質に対する）を変化させないアミノ酸置換を意味する。典型的には
、保存的アミノ酸置換には、１つのアミノ酸を同様な化学的特性（例えば荷電または疎水
性）を有する別のアミノ酸と置換することが含まれる。以下の６群の各々は、互いに典型
的な保存置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（
Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グル
タミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシ
ン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロ
シン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３５】
２つまたは３つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して“同一”またはパーセント
“同一性”という用語は、最大の重なりとなるようアラインメントを実施して比較し、以
下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、または直接目視で測定したとき、同じであ
るか、または一定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである２つ
以上の配列またはサブ配列を指す。本発明のペプチドについては、配列同一性はペプチド
の全長にわたって決定された。
【００３６】
配列を比較する場合、典型的には１つの配列はリファレンス配列として機能し、それに
対してテスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列およびリ
ファレンス配列をコンピューターにインプットし、必要な場合にはサブ配列コーディネー
トを指定し、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。続いて、配列
比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターを基にして、リファレンス配列に
対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３７】
比較のための配列の最適なアラインメントは以下によって実施することができる：局所
相同性アルゴリズム（Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)）、相同性アラ
インメントアルゴリズム（Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)）、類似性
検索法（Pearson& Lipman, Proc, Natl. Acad. Sci.
USA85:2444(1988)）、これらアルゴリズムのコンピューターによる実行（GAP, BESTFIT,
FASTAおよびTFASTA（WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group
, 575 ScienceDr., Madison, WI））、または目視による精査（一般的には上
掲書（Ausubelet al.）を参照されたい）。
【００３８】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性とパーセン
ト配列同一性を示すために、対毎に進めていく累積アラインメントを用いて一群の関連配
列から多数の配列アラインメントを作製する。ＰＩＬＥＵＰはまた、前記アラインメント
を作製するために用いられたクラスター形成（clustering）関係を示す系統樹または樹状
図を作製する。ＰＩＬＥＵＰは、漸進アラインメント法（Higgins & Sharp, CABIOS 5:15
1-153(1989)）を簡易化させたものを用いる。使用される方法は上掲書（Higgins& Sharp
, (1989)）に記載された方法に類似する。前記プログラムは、３００配列（各々最大の長
さが５０００ヌクレオチドまたはアミノ酸である）のアラインメントを実施することがで
きる。
【００３９】
前記のマルチアラインメントの実施手順は、２つのもっとも類似する配列を対毎にアラ
インメントを実施することで開始し、アラインされた２つの配列で構成されるクラスター
を作製する。続いて、前記クラスターをその次に関連を有する配列またはアラインされた
配列クラスターに対してアラインメントを実施する。２つの個々の配列を対毎にアライン
したものを単純に伸張させていくことによって２つの配列クラスターのアラインメントを
実施する。最終的なアラインメントは一連の漸進的な対毎のアラインメントによって達成
される。前記プログラムは、配列比較領域について特定の配列およびそれらのアミノ酸ま
たはヌクレオチド座標を指定することにより、さらにプログラムパラメーターを指定する
ことにより実行される。例えば、以下のパラメーター、デフォルトギャップ加重値（３．
００）、デフォルトギャップ長過重値（０．１０）および過重エンドギャップを用いてリ
ファレンス配列を他のテスト配列と比較し、パーセント配列同一性関係を決定できる。
【００４０】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したまた別のアルゴリズムの例はＢ
ＬＡＳＴアルゴリズムで、前記は文献（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410(19
90)）に報告されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトは公的施設（NationalCenter
forBiotechnology Information（ HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/））を介して一般に利用可能である。前記アルゴリズムは、先ず
初めに問題の配列中に存在する、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメン
トを実施したとき、いくつかの正の値をもつ閾値スコアＴと適合するか、またはこれを満
たす長さがＷの短いワードを特定することによって高いスコアをもつ配列対（ＨＳＰ）を
特定する。前記高スコアの配列対は、。Ｔは近縁ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul
et al. 上掲書）。前記の最初の近縁ワードヒットは検索開始の種子として機能し、前記
近縁ワードを含むより長いＨＳＰを発見することができる。続いて前記ワードヒットを各
配列の両方向に、累積アラインメントが増加するかぎり伸長する。ヌクレオチド配列の場
合、パラメーターＭ（適合対に対する褒賞スコア、常に＞０）およびパラメーターＮ（非
適合対に対する罰則スコア、常に＜０）を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列の
場合は、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを用いる。各方向におけ
るワードヒットの伸長は以下の時に停止させる：累積アラインメントスコアがその最大達
成値から量Ｘだけ減少したとき；累積スコアが、１つまたは２つ以上の負のスコアをもつ
残基のアラインメントのために０または０未満になったとき；またはいずれかの配列の末
端に達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは前記アルゴリズ
ムの感度および速度を決定する。ヌクレオチド配列用ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォ
ルトとしてワード長（Ｗ）に１１、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の
比較を用いる。アミノ酸配列用ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（
Ｗ）に３、期待値（Ｅ）に１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用
いる（例えば以下の文献を参照されたい：Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA89:10915(1989)）。
【００４１】
パーセント配列同一性の計算に加えて、前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配
列間の類似性の統計分析も実施する（例えば以下の文献を参照されたい：Karlin & Altsc
hul, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787(1993)）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムに
よって提供される測定値は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチ
ドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、リファレン
ス核酸とテスト核酸の比較で前記最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０
１未満、もっとも好ましくは０．００１未満ならば、核酸はリファレンス配列と類似であ
ると考えられる。
【００４２】
“Ｄ−１８Ａペプチド”という用語は以下の配列を有するペプチドを指す：Ｄ−Ｗ−Ｌ
−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ（配列識別番号：１）
。前記配列で、鏡像異性アミノ酸のいずれもＤ型アミノ酸である。
【００４３】
Ｉ．アテローム性硬化症の症状の軽減
本発明は、クラスＡ両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチ
ド（Segrestet al. Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117(1990)）
はリン脂質と結合し、ヒトアポＡ−Ｉと同様な多くの生物学的特性を示すことができると
いう発見に関する。特に、前記ペプチドがＤアミノ酸を用いて製剤化されるとき、前記ペ
プチドは劇的な血中半減期の増加を示し、特にアミノ末端および／またはカルボキシ末端
を封鎖されたときは経口的にすら投与することができるというのが、本発明の発見である
。
【００４４】
さらにまた、前記Ｄ型ペプチドは対応するＬ型ペプチドの生物学的活性を保持するとい
うことは、本発明の驚くべき発見であった。前記Ｄ型ペプチドを用いたIn vivoでの動物
実験は、経口による効果的な薬剤送達、血中半減期の増加およびアテローム性硬化症の１
つまたは２つ以上の症状の緩和または防止／抑制能力を示した。
【００４５】
正常なＨＤＬは穏やかに酸化されたＬＤＬの生成において３つの工程を抑制することを
我々は発見した。これらの実験（同時係属中の特許出願USSN09/541,468（2000年3月31日
出願）を参照されたい）では、ヒトＬＤＬをin vitroでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ類似
ペプチド（３７ｐＡ）で処理することによって、ＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むＬＤ
Ｌからシーディング（seeding）分子が除去されることを我々は示した。これらのシーデ
ィング分子は、ヒト動脈壁細胞混合培養がＬＤＬを酸化することを可能にするために、お
よびＬＤＬが動脈壁細胞に単球走化性活性を産生させるために必要である。我々はまた、
アポＡ−Ｉのマウスへの注射またはヒトへの輸液の後、マウスまたは実験協力者から単離
されたアポＡ−Ｉ注射／輸液後単離ＬＤＬは、ヒト動脈壁細胞による酸化に対して耐性を
示し、さらに動脈壁細胞の混合培養において単球の走化性活性を誘発しないことを見出し
た。
【００４６】
本発明のＤペプチドの前記保護機能は図１から図５に示されている。図1Ａ、Ｂ、Ｃお
よびＤは、アポＥ欠損マウスにおける血液成分と14Ｃ−Ｄ−５Ｆの結合を示している。本
明細書ではまた、アテローム誘発性食餌を与えたマウスおよびＰＢＳを注射したマウスの
ＨＤＬは、ヒトＨＤＬの酸化を抑制することができず、さらにヒトの動脈壁混合培養でＬ
ＤＬ誘発単球走化性活性を抑制することができないことが示されている。対照的に、アテ
ローム誘発性食餌を与え、さらに本明細書に記載するペプチドを毎日注射したマウスのＨ
ＤＬは、正常なヒトＨＤＬと同じように、ヒトＬＤＬの酸化の抑制および混合培養でのＬ
ＤＬ誘発単球走化性活性の防止に有効であった（図２Ａおよび２Ｂ）。さらにまた、アテ
ローム誘発性食餌を与え、さらにＰＢＳを毎日注射したマウスから採取したＬＤＬは、同
じ食餌を与えたが日量２０μｇのペプチド５Ｆを注射したマウスから採取したＬＤＬより
も容易に酸化され、さらに容易に単球走化性活性を誘発した。前記Ｄペプチドは免疫原性
を有しないようであった（図４）。
【００４７】
アテローム誘発性食餌を与え、さらに本発明のペプチドを注射したマウスのＨＤＬおよ
びＬＤＬに対するヒト動脈壁細胞のin vitro反応は、前記ペプチドによって示されたin v
ivoでの保護作用と一致する。総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＩＤＬ＋Ｖ
ＬＤＬ−コレステロールレベルが同じで、ＨＤＬ−コレステロールの総コレステロールに
対するパーセントが低いにもかかわらず、アテローム誘発性食餌を与えられ、さらに前記
ペプチドを注射された動物は顕著に低い病巣スコアを有していた（図５）。したがって、
本発明のペプチドは、アテローム誘発性食餌を与えられたマウスでアテローム性硬化症病
巣の進行を防止した。
【００４８】
したがってある実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の
症状を改善および／または防止する方法を提供する。好ましくは前記方法は、生物（好ま
しくは哺乳類、より好ましくはヒト）に本発明の１つまたは２つ以上のペプチド（または
前記ペプチドの摸倣体）を投与することを含む。本明細書に記載するように、前記ペプチ
ドは、標準的な多数の任意の方法（注射、座薬、経鼻スプレー、経時的放出移植物、経皮
パッチなどを含むがただしこれらに限定されない）にしたがって投与することができる。
特に好ましいある実施態様では、前記ペプチドは経口的に（例えばシロップ、カプセルま
たは錠剤として）投与される。
【００４９】
前記方法は、本発明のただ１つのポリペプチドの投与、または２つ以上の異なるポリペ
プチドの投与を含む。前記ポリペプチドは、モノマーとしてまたはダイマー、オリゴマー
もしくはポリマー形で提供することができる。ある種の実施態様では、前記多量体形は（
例えばイオン結合または疎水性結合による）結合したモノマーを含んでいてもよいし、他
方、別の多量体は（直接結合またはリンカーを介する）共有結合したモノマーを含んでい
てもよい。
【００５０】
本発明は人間で使用することについて述べているが、一方、本発明は動物にも（例えば
獣医学的使用にも）適している。したがって好ましい生物には、ヒト、ヒト以外の霊長類
、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、有蹄類、ウサギ類などが含まれるが、ただしこれらに限定さ
れない。
【００５１】
本発明の方法は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状［例えば高血圧、プ
ラーク形成および断裂、臨床事象における転化（例えば心臓発作、狭心症または卒中発作
）、高レベルの血漿コレステロール、高レベルの低密度リポタンパク質、高レベルの超低
密度リポタンパク質または炎症性タンパク質など］を示すヒトまたはヒト以外の動物に限
定されず、予防的な意味でも有用である。したがって、本発明のペプチド（またはその摸
倣体）はアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の開始／進行を防止するために
生物に投与することができる。前記の意味で特に好ましい対象は、アテローム性硬化症の
１つまたは２つ以上の危険因子（例えば家族歴、高血圧、肥満、アルコールの大量摂取、
喫煙、高血中コレステロール、高血中トリグリセリド、高血中ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ
もしくは低ＨＤＬ、糖尿病、または糖尿病、高血中脂質、心臓発作、狭心症または卒中発
作の家族歴など）を示す対象者である。
【００５２】
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドの使用方法の他に、本発明はまた前記ペプチ
ド自体、医薬として製剤化されたペプチド（特に経口送達用）、およびアテローム性硬化
症の１つまたは２つ以上の症状の治療および／または予防のためのキットも提供する。
【００５３】
ＩＩ．急性炎症反応に付随するアテローム性硬化症の症状の緩和
本発明のアテローム性硬化症抑制ペプチドはまた他の多くの場合に有用である。特に、
我々は心脈管系合併症（例えばアテローム性硬化症、卒中発作など）はしばしば急性期炎
症反応の開始を伴い、またはこれに付随することを見出した。前記のような急性炎症反応
はしばしば、再発性炎症疾患（例えば癩、結核、全身性紅斑性狼瘡および慢性関節リウマ
チ）、ウイルス感染（例えばインフルエンザ）、細菌感染、真菌感染、器官移植、創傷も
しくは他の外傷、人工器官、バイオフィルムなどに付随する。
【００５４】
本明細書に記載するペプチドの１つまたは２つ以上の投与によって、急性期反応時また
はその後の酸化リン脂質の生成が減少または防止され、それによって前記の症状に付随す
る心脈管系合併症を緩和または排除できるということは本発明の驚くべき発見であった。
【００５５】
したがって例えば、我々は、インフルエンザ感染の結果ＨＤＬのパラオキソナーゼおよ
び血小板活性化アセチルヒドラーゼ活性が低下することを示した。特定の理論に拘束され
ないが、これらのＨＤＬ酵素活性の低下の結果として、さらにまた急性期反応時のプロオ
キシダントタンパク質とＨＤＬの結合の結果として、ＨＤＬはもはやＬＤＬの酸化を防ぐ
ことができず、もはや内皮細胞によるＬＤＬ誘発単球走化性活性の生成を防止することが
できないのだと我々は考えている。
【００５６】
我々は、インフルエンザＡウイルス感染後に、一日当たり非常に低用量の本発明のポリ
ペプチド（例えばマウス当たり２０μｇ）を注射された対象動物では、パラオキソナーゼ
レベルは低下せず、生物学的に活性を有する酸化リン脂質はバックグラウンド以上には生
成されないことを見出した。これは、インフルエンザ感染時または急性期炎症反応を生じ
る他の事象時に（例えばウイルス感染、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫疾患など
のために）、既知の冠状動脈疾患をもつ患者にＤ−４Ｆ（および／または本発明の他のペ
プチド）を（例えば経口的または注射によって）投与することができ、したがってこの短
期間処置によって、前記炎症性症状を生じる病変に付随する心臓発作および卒中発作の発
生の増加を防止することができることを示唆している。
【００５７】
したがってある種の実施態様では、本発明は、急性炎症反応のおそれがあるかもしくは
急性反応を示している対象者、またはアテローム性硬化症のおそれがあるかもしくはアテ
ローム性硬化症の症状を示している対象者に本発明の１つまたは２つ以上のペプチドを投
与することを意図する。
【００５８】
したがって例えば、冠状動脈疾患またはそのおそれのある対象者に流感の季節に予防的
に本発明のポリペプチドを投与することができる。再発性炎症症状（例えば慢性関節リウ
マチ、種々の自己免疫疾患など）を有する対象者（または動物）は、本発明のポリペプチ
ドで処置してアテローム性硬化症の進行または卒中発作を緩和または防止することができ
る。外傷（例えば急性損傷、組織移植など）を受けた対象者（または動物）は、本発明の
ポリペプチドで処置してアテローム性硬化症の進行または卒中発作を緩和または防止する
ことができる。
【００５９】
ある種の例では、前記方法は、急性炎症性反応の出現またはおそれがあると診断するこ
とを含むであろう。急性炎症性反応は、典型的には代謝の変化および肝臓における遺伝子
調節を伴う。急性炎症性反応は、免疫系、心脈管系および中枢神経系に加え身体の主要な
システムの全てを巻き込む動的なホメオスタシスの過程である。通常は、急性期反応は数
日続くだけであるが、慢性炎症または再発性炎症の場合には、急性期反応のいくつかの局
面の異常な継続は前記疾患に付随する下部組織損傷の一因となり、さらにまた別の合併症
、例えば心脈管系疾患またはタンパク質沈着疾患（例えばアミロイド症）をもたらすこと
になるであろう。
【００６０】
急性期反応の重要な局面は、肝臓の生合成プロフィルの急激な変化である。正常な状況
下では、肝臓は固有の範囲内で一定の濃度の血漿タンパク質を生合成する。これらタンパ
ク質の多くは重要な機能を有し、これら急性期反応物質（ＡＰＲ）または急性期タンパク
質（ＡＰＰ）のより高い血中レベルが、炎症刺激に続く急性期反応の間に必要とされる。
ほとんどのＡＰＲは肝細胞によって合成され、いくつかは他の細胞タイプ（単球、内皮細
胞、線維芽細胞および脂肪細胞を含む）によって産生される。ほとんどのＡＰＲは、正常
レベルを越える５０％から数倍の範囲で誘発される。対照的に、主要なＡＰＲは正常レベ
ルの１０００倍に増加することが可能である。いおの群には血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）
およびヒトのＣ−反応性タンパク質またはマウスホモログ、血清アミロイドＰ成分（ＳＡ
Ｐ）が含まれる。いわゆる陰性ＡＰＲは急性期反応時に血中濃度が減少し、肝臓の誘発さ
れるＡＰＲ生合成能力を増加させる。
【００６１】
ある種の実施態様では、急性期反応またはそのおそれは、したがって１つまたは２つ以
上のＡＰＰを測定することによって検定される。前記のようなマーカーの測定は当業者に
は周知で、そのような測定を提供する業者が存在する（例えばカルディオテック・サービ
ス（CardiotechServices, Lousiville, KY）はＡＧＰを測定する）。
【００６２】
ＩＩＩ．冠状動脈石灰沈着および骨粗しょう症に付随する症状の緩和
我々はまた、冠状動脈石灰沈着および骨粗しょう症の原因として酸化脂質を特定した。
さらにまた、特定の理論に拘束されないが、我々は、石灰化大動脈狭窄の病理発生に同じ
メカニズムが存在すると考えている。
【００６３】
したがって、ある実施態様では、本発明は、本明細書に記載するペプチドを使用して、
例えばリウマチ性多発性筋痛、多発性結節性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞
性肺疾患、アルツハイマー病、エイズ、冠状動脈石灰沈着、骨粗鬆症、石灰化大動脈狭窄
などの疾患の症状を抑制または防止することを意図する。
【００６４】
ＩＶ．好ましいペプチドおよびそれらの調製
好ましいペプチド
クラスＡペプチドはアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を緩和することが
できるということは本発明の発見であった。クラスＡペプチドは、極性残基および非極性
残基の分離をもたらすα−らせんを形成し、それによって極性−非極性境界に陽性に荷電
した残基を位置し、さらに極性表面の中心に陰性に荷電した残基を位置する極性および非
極性表面を形成することを特徴とする（例えば以下を参照されたい：Anantharamaiah, Me
th. Enzymol.,128:626-668(1986)）。アポＡ−Ｉの４番目のエクソンは、３．６６７残
基／ターンに折り畳まれるときクラスＡ両親媒性らせん構造を生じることは特筆されよう
。
【００６５】
特に好ましいクラスＡペプチド（１８Ａと称される）（表1および上掲書（Anantharama
iah）を参照されたい）を本明細書に記載するように改変し、経口投与が可能であり、さ
らにアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状の抑制または防止に極めて有効なペ
プチドを製造した。特定の理論に拘束されないが、ＬＤＬの酸化を緩和する本発明のペプ
チドは、おそらくシーディング分子を摘み取ることによってin vivoで機能すると考えら
れる。
【００６６】
我々は、１８Ａの疎水性表面上のＰｈｅ残基の数を増すことによって理論上脂質親和性
を増すことができることがPalgunachariら（Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular 
Biology16:328-338(1996)）が記載したコンピュータ処理により分かった。理論的には、
１８Ａの非極性面の残基をＰｈｅによって系統的に置換することによって６つのペプチド
が得られるであろう。２、３および４つのＰｈｅが付加されたペプチドは、それぞれ１３
、１４および１５ユニットの理論的脂質親和性（λ）値を有するであろう。しかしながら
、さらに付加Ｐｈｅが４から５に増加するならば前記の値は一挙に４ユニット増加するで
あろう（１９λユニットへ）。６つまたは７つのＰｈｅの増加は前記ほど劇的な増加をも
たらさない（それぞれ２０および２１λユニット）。したがって、我々は５つの付加Ｐｈ
ｅを選択した（したがってペプチドの名称は５Ｆ）。特に好ましい実施態様では、前記５
Ｆペプチドのアミノ末端残基をアセチル化し、カルボキシル末端残基をアミド化してブロ
ックした。
【００６７】
前記新規なクラスＡペプチド類似体、５Ｆは、アテローム性硬化症感受性マウスで病巣
の成長を抑制した。前記新規なペプチド類似体、５Ｆは、Levineら（Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA90:12040-12044(1993)）の実験を基にしたペプチド投与量を用いて前記マウス
で食餌誘発性アテローム性硬化症の抑制効果についてマウスのアポＡ−Ｉ（ＭｏＡ−Ｉ）
と比較された。
【００６８】
他の多数のクラスＡペプチドもまた製造し、これらは、アテローム性硬化症の１つまた
は２つ以上の症状の軽減においてばらつきはあるものの、有意な程度の有効性を示した。
前記多数のペプチドは表１に示す。
【００６９】
表１：本発明に用いられる好ましいペプチド
2010280718.tif 000003
【００７０】
2010280718.tif 000004
【００７１】
2010280718.tif 000005
【００７２】
2010280718.tif 000006
【００７３】
表１に示した種々のペプチドはアミノ末端を保護するアセチル基およびカルボキシル末
端を保護するアミド基を有するが、これら保護基のいずれか一方または両方を除去しても
、および／または本明細書に記載するまた別の保護基で置換してもよい。特に好ましい実
施態様では、前記ペプチドは、本明細書に記載するように１つ以上のＤ型アミノ酸を含む
。ある種の実施態様では、表１の各アミノ酸（例えば各鏡像異性アミノ酸）がＤ型アミノ
酸である。
【００７４】
さらにまた表１は全てを網羅したものではないことを特記する。本明細書に提供した説
明を用いて、他の適切なペプチドを典型的なやり方で製造することができる［例えば保存
的または半保存的置換（例えばＤをＥに置換）、伸長、欠失など］。したがって例えば、
ある実施態様では、配列識別番号：２から２０および３９から８５によって特定されるペ
プチドのいずれか１つまたは２つ以上の切端形が利用される。したがって例えば、配列識
別番号：２１は、１８ＡのＣ−末端から１４アミノ酸を含み１つまたは２つ以上のＤアミ
ノ酸を含むペプチドを示し、配列識別番号：２２から３８は別の切端形を示す。より長い
ペプチドもまた適している。前記のより長いペプチドは全体がクラスＡ両親媒性らせんを
形成してもよいし、または前記クラスＡ両親媒性らせんは１つまたは２つ以上のペプチド
ドメインを形成するものでもよい。さらに、本発明は前記ペプチドの多量体型も包含する
。したがって例えば、表１に示すペプチドは、［直接または１つもしくは２つ以上の介在
アミノ酸をもつリンカー（例えば炭素リンカーまたは１つもしくは２つ以上のアミノ酸）
を介して］一緒に結合させることができる。実例を挙げれば、ポリマーペプチドには１８
Ａ−Ｐｒｏ−１８Ａおよび配列識別番号：７９から８５のペプチドが含まれ、前記は好ま
しくは１つまたは２つ以上のＤアミノ酸を含み、より好ましくは本明細書に記載するよう
に各アミノ酸はＤアミノ酸で、および／または一端もしくは両端が保護されている。
【００７５】
（例えば表１に例示されているような）クラスＡペプチドがＤアミノ酸を含むとき、前
記ペプチドはその活性を保持し、しかも経口的に投与できるということは、本発明の驚く
べき発見であった。さらにまた、この経口投与は、比較的効果的な取込みおよび顕著な血
中半減期をもたらし、それによってアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を軽
減する効果的な方法を提供する。
【００７６】
本明細書で提供される開示を用いて、当業者は前記例示したクラスＡペプチドを典型的
なやり方で改変し、本発明の他の適切なクラスＡペプチドを製造することができる。例え
ば典型的な保存的または半保存的置換（例えばＥでＤを置換）を現在存在するアミノ酸に
実施することができる。得られたペプチドの種々の置換がもつ脂質親和性に対する影響は
、Palgunachariら（Arteriosclerosis,Thrombosis & Vascular Biology, 16:328-338(19
96)）が記載したコンピュータによる方法を用いて予測することができる。クラスＡαら
せん構造が保存されるかぎり、前記ペプチドは長くしても短くしてもよい。さらに、得ら
れるペプチドを対象の種自身によって産生されるペプチドにいっそう類似させるために置
換を施すことができる。
【００７７】
ある種の実施態様では、本発明のペプチドは、米国特許第4,643,988号に記載されたペ
プチドの“Ｄ”型を含み、より好ましくは一端または両端が保護基と結合した“Ｄ”型を
含む。そのようなペプチドには、式Ａ1−Ｂ1−Ｂ2−Ｃ1−Ｄ−Ｂ3−Ｂ4−Ａ2−Ｃ2−Ｂ5
−Ｂ6−Ａ3−Ｃ3−Ｂ7−Ｃ4−Ａ4−Ｂ8−Ｂ9（配列識別番号：８６）をもつペプチドが含
まれる。式中、Ａ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4はそれぞれ別個にアスパラギン酸もしくはグルタ
ミン酸またはその同族体もしくは類似体であり；Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ4、Ｂ5、Ｂ6、Ｂ7、
Ｂ8およびＢ9はそれぞれ別個にトリプトファン、フェニルアラニン、アラニン、ロイシン
、チロシン、イソロイシン、バリンもしくはα−ナフチルアミンまたはその同族体もしく
は類似体であり；Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3およびＣ4はそれぞれ別個にリジンまたはアルギニンであ
り；さらにＤはセリン、スレオニン、アラニン、グリシン、ヒスチジンまたはその同族体
もしくは類似体であり（ただし、Ａ1およびＡ2がアスパラギン酸であるときは、Ａ3およ
びＡ4はグルタミン酸、Ｂ2およびＢ9はロイシン、Ｂ3およびＢ7はフェニルアラニン、Ｂ4
はチロシン、Ｂ5はバリン、Ｂ6、Ｂ8およびＤはアラニン、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3およびＣ4はリ
ジンであり、Ｂ1はトリプトファンではないことを条件とする）、さらに式中、少なくと
も１つの鏡像異性アミノ酸は“Ｄ”型アミノ酸である。好ましくは前記鏡像異性アミノ酸
の少なくとも５０％が“Ｄ”型であり、より好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくと
も８０％が“Ｄ”型であり、もっとも好ましくは前記鏡像異性アミノ酸の少なくとも９０
％が“Ｄ”型アミノ酸である。
【００７８】
好ましい実施態様では、本発明のペプチドは天然に存在するアミノ酸または天然に存在
するアミノ酸のＤ型を利用する一方で、天然には存在しないアミノ酸（例えばメチオニン
スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、ノルロイシン、エプシロン−アミノカプ
ロン酸、４−アミノブタン酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、８−アミノ
カプリル酸、４−アミノブチル酸、Ｌｙｓ（Ｎ（エプシロン）−トリフルオロアセチル）
，α−アミノイソブチル酸など）の置換物もまた意図される。
【００７９】
本明細書に記載するクラスＡペプチドの他に、ペプチド摸倣体もまた本明細書で意図さ
れる。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性に類似する特性を有する非ペプチド薬とし
て製薬工業では一般的に用いられる。前記のタイプの非ペプチド化合物は“ペプチド摸倣
体”（peptidemimeticsまたはpeptidomimetics）（Fauchere(1986) Adv. Drug Res., 15
:29; Veber& Freidinger(1985) TINS p.392; Evans et al.(1987) J. Med. Chem., 30:1
229）と称され、通常はコンピューター支援分子モデリングによって開発される。治療的
に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド摸倣体を用いて、同等な治療効果または予
防効果を得ることができる。
【００８０】
一般に、ペプチド摸倣体は模範ペプチド（すなわち本明細書に記載する５Ｆ）と構造的
に類似するが、１つまたは２つ以上のペプチド結合を含み、前記ペプチド結合は、場合に
よって−ＣＨ2ＮＨ−、ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトラン
ス）、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＳＯ−などから成る群から選択
される結合によって置換される。前記置換は、当業者に公知の方法および以下の文献に記
載されている方法によって実施される： Spatola (1983) p.267 "Chemistry and Biochem
istry of AminoAcids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker,
NewYork; Spatola (1983) Vega Data 1(3) Peptide Backbone Modifications（一般的
解説）；Morley(1980) Trends Pharm Sci. pp.463-468（一般的解説）；hudson et al.(
1979) Int. J.Pept. Prot. Res., 14:177-185（−ＣＨ2ＮＨ−，ＣＨ2ＣＨ2−）；Spato
la et al.(1986)Life Sci., 38:1243-1249（−ＣＨ2−Ｓ）；Hann (1982) J. Chem. Soc
. Perkin.Trans. I307-314（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Almquist et al.
(1980) J. Med.Chem. 23:1392-1398（−ＣＯＣＨ2−）；Jennings-White et al.(1982) 
TetrahedronLett. 23:2533（−ＣＯＣＨ2）；M. Szelke et al.欧州特許出願EP45665(19
82)CA:97:39405(1982)（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−）；Holladayet al.(1983) Tetrahedron
Lett.24:4401-4404（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ2−）；およびHruby (1982) Life Sci., 31:189
-199（−ＣＨ2−Ｓ−）。
【００８１】
特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ2ＮＨ−である。前記のようなペプチド摸倣体は
ポリペプチドよりも顕著な利点を有するであろう。前記利点には、例えばより経済的な製
造、より高い化学的安定性、薬理学的特性の強化（半減期、吸収性、高い性能、有効性な
ど）、抗原性の減少などが含まれる。
【００８２】
さらにまた、本明細書に記載されるペプチドを環状に配列したもの、またはコンセンサ
ス配列もしくは実質的に同一なコンセンサス配列変種を含む構造的に拘束されたペプチド
（環状化ペプチドを含む）もまた、当分野で公知の方法（Rizo & Gierasch (1992) Ann. 
Rev. Biochem.61:387）によって、例えばペプチドを環状化させる分子内ジスルフィド架
橋を形成することができる内部システイン残基の付加によって生成することができる。
【００８３】
ペプチドの調製
本発明で用いられるペプチドは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて化学的に合
成するか、または、特にペプチドが“Ｄ”アミノ酸残基を含まない場合は組換えによって
発現される。ポリペプチドが組換えによって発現される場合、１つまたは２つ以上のアミ
ノ酸がもっぱらＤ型で前記生物に提供される環境下で、ホスト生物（例えば細菌、植物、
真菌細胞など）を培養すると、組換えによって発現されたペプチドはしたがって前記Ｄア
ミノ酸を含んでいる。
【００８４】
好ましい実施態様では、ペプチドは、当業者に公知の多数の液相または固相ペプチド合
成技術のいずれかによって化学的に合成される。配列のＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体
に結合され、続いて前記配列の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相合成は、本発明
のポリペプチドの化学合成のために好ましい方法である。固相合成のための技術は当業者
には周知で、例えば以下の文献に記載されている：Barany & Merrifield (1963) Solid-P
hase PeptideSynthesis; pp.3-284, "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. V
ol.2: SpecialMethods in Peptide Synthesis, Part A.；Merrifield et al.(1963) J. 
Am. Chem. Soc.85:2149-2156；Stewart et al.(1984) Solid Phase Peptide Synthesis,
2nded. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill.。
【００８５】
もっとも好ましい実施態様では、ペプチドは、固相支持体としてベンズヒドリルアミン
樹脂（BeckmanBioproducts, ０．５９ミリモルＮＨ2／ｇの樹脂）を用いて固相ペプチド
合成法によって合成される。ＣＯＯＨ末端アミノ酸（例えばｔ−ブチルカルボニル−Ｐｈ
ｅ）は、４−（オキシメチル）フェナセチル基により固相支持体に結合される。前記は、
通常のベンジルエステル結合よりも安定な結合で、しかも完成したペプチドを水素添加に
よって切断することができる。水素供与体としてギ酸を用いる水素転移添加がこの方法に
用いられる。ペプチド合成および合成されたペプチドの分析のための詳細なプロトコルは
、Anantharamaiahらの文献（J.Biol. Chem., 260(16):10248-10255(1985)）に付随する
補充ミニプリントに記載されている。
【００８６】
ペプチド、特にＤアミノ酸を含むペプチドの化学合成では、所望の完全長の生成物の他
に合成によって通常末端が切り縮められた多数のペプチドが生成されることは特筆されよ
う。精製過程（例えばＨＰＬＣ）で、典型的には顕著な量の完全長の生成物が失われる。
【００８７】
Ｄペプチド（例えばＤ−４）の合成では、最長の形態を精製する際に損失を防ぐために
その混合物を透析して使用し、それによって最後のＨＰＬＣ精製を除くことができるとい
うことは本発明の発見であった。前記のような混合物は、高度に精製された生成物の性能
の約５０％（例えばタンパク質生成物の重量当たり）を失うが、前記混合物は約６倍多い
ペプチドを含み、したがって総活性は高くなる。
【００８８】
Ｄ型アミノ酸
Ｄアミノ酸は、化学合成でＤ型誘導アミノ酸残基を用いることによってペプチド内の１
つまたは２つ以上の位置に簡単に取り込まれる。固相ペプチド合成のためのＤ型アミノ酸
残基は多数の供給元から市販されている（例えば、Advanced Chem Tech, Louisville; No
va Biochem, SanDiego; Sigma, St Louis; Bachem California Inc., Torranceなど）。
Ｄ型アミノ酸はペプチド内の任意の位置に所望のように取り込ませることができる。した
がって例えば、ある実施態様では、ペプチドはただ１つのＤ−アミノ酸を含み、一方、別
の実施態様では、ペプチドは少なくとも２つ、一般的には少なくとも３つ、より一般的に
は少なくとも４つ、もっとも一般的には少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、よ
り好ましくは少なくとも７つ、さらにもっとも好ましくは少なくとも８つのＤアミノ酸を
含む。特に好ましい実施態様では、実質的に（鏡像異性）アミノ酸１つおきにＤ型アミノ
酸が存在する。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９０％
、より好ましくは少なくとも９５％の鏡像異性アミノ酸がＤ型アミノ酸である。特に好ま
しいある実施態様では、基本的に全ての鏡像異性アミノ酸がＤ型アミノ酸である。
【００８９】
保護基
ある種の実施態様では、構成アミノ酸および／または末端アミノ酸の１つまたは２つ以
上のＲ基は保護基で封鎖されている。特定の理論に拘束されないが、本発明のペプチドの
特にアミノ末端および／またはカルボキシル末端の封鎖は経口投与による薬剤送達を極め
て改善し、さらに血中半減期を顕著に高めるということは本発明の発見であった。
【００９０】
多くの保護基が前記の目的に適している。そのような保護基には、アセチル、アミドお
よびアルキル基が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにアセチル基およびア
ルキル基がＮ末端の保護に特に好ましく、アミド基はカルボキシル末端の保護に好ましい
。特に好ましいある種の実施態様では、前記保護基には脂肪酸の場合のようなアルキル鎖
、プロペオニル、フォルミルおよび他のものが含まれるが、ただしこれらに限定されない
。特に好ましいカルボキシル保護基には、アミド、エステルおよびエーテル形成保護基が
含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミ
ド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。前記封鎖基はペプチドのらせん形成傾向を
強化する。ある種の特に好ましい封鎖基には、種々の長さのアルキル基、例えば式、ＣＨ
3−（ＣＨ2）n−ＣＯ−を有する基が含まれる。式中、ｎは約１から約２０、好ましくは
約１から約１６または１８、より好ましくは約３から約１３、もっとも好ましくは約３か
ら約１０の範囲である。
【００９１】
特に好ましいある種の実施態様では、保護基には、脂肪酸の場合のようなアルキル基、
プロペオニル基、フォルミル基および他の基が含まれるが、ただしこれらに限定されない
。特に好ましいカルボキシル保護基には、アミド、エステルおよびエーテル形成保護基が
含まれる。ある好ましい実施態様では、アセチル基がアミノ末端の保護に用いられ、アミ
ド基がカルボキシル末端の保護に用いられる。前記封鎖基はペプチドのらせん形成傾向を
強化する。ある種の特に好ましい封鎖基には、種々の長さのアルキル基、例えば式、ＣＨ
3−（ＣＨ2）n−ＣＯ−を有する基が含まれる。式中、ｎは約３から約２０、好ましくは
約３から約１６、より好ましくは約３から約１３、もっとも好ましくは約３から約１０の
範囲である。
【００９２】
他の好ましい保護基には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：Ｆｍｏｃ、
ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカ
ルボン酸基、９−フルオレンカルボン酸基、９−フルオレノン−１−カルボン酸基、ベン
ジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチ
ル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ２，３，６−トリメチル
−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ），４，４−ジ
メトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメ
チルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）、４−メ
トキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、
ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，
４−ジメンチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジ
クロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（
２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキ
シメチル（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ
）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、およびトリ
フルオロアセチル（ＴＦＡ）。
【００９３】
保護基／封鎖基は、本発明のペプチドを構成する適切な残基に前記のような基を結合さ
せる方法と同様に当業者には周知である（例えば以下を参照されたい：Greene at al. (1
991) ProtectiveGroups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc. So
merset, NJ）。ある好ましい実施態様では、例えばアセチル化は、合成中にペプチドが樹
脂上に在るときに無水酢酸を用いて実施される。アミド保護は、そのような合成に適した
樹脂を選択することによって達成できる。本明細書の実施例で述べるペプチド合成時には
リンクアミド樹脂が用いられた。合成が終了した後、酸性二官能基アミノ酸（例えばＡｓ
ｐおよびＧｌｕ）および塩基性アミノ酸Ｌｙｓの半永久的保護基、Ｔｙｒのヒドロキシル
は全て同時に除去される。前記のような樹脂から酸性処理を用いて遊離させたペプチドは
、Ｎ末端がアセチルとして保護され、カルボキシル末端がＮＨ2として保護され、さらに
全ての他の保護基が同時に除去されて得られる。
【００９４】
Ｖ．ペプチド取り込みの強化
全てがＬアミノ酸のペプチド（例えばその他の点では本発明のペプチドの配列を有する
もの）をＤ型（すなわち本発明のペプチド）と一緒に投与したとき、前記Ｄ型ペプチドの
取り込みが増加するということもまた、本発明の驚くべき発見であった。したがって、あ
る種の実施態様では、本発明は、Ｄ型およびＬ型ペプチドを組み合わせて本発明の方法で
用いることを含む。前記Ｄ型ペプチドおよびＬ型ペプチドは異なるアミノ酸配列を有する
ことができるが、好ましい実施態様では、それらはともに本明細書に記載するペプチドの
アミノ酸配列を有し、さらに好ましい実施態様では、それらは同じアミノ酸配列を有する
。
【００９５】
本発明のクラスＡ両親媒性ペプチドのコンカテマーもまたアテローム性硬化症の１つま
たは２つ以上の症状の緩和に有効であるということも本発明の発見であった。前記コンカ
テマーを含むモノマーを直接一緒に結合させるか、またはリンカーによって結合させても
よい。ある種の実施態様では、前記リンカーはアミノ酸リンカー（例えばプロリン）、ま
たはペプチドリンカー（例えばＧｌｙ4Ｓｅｒ3）である。ある種の実施態様では、前記コ
ンカテマーは２量体、より好ましくは３量体、さらに好ましくは４量体、もっとも好まし
くは５量体、８量体または１０量体である。
【００９６】
ＶＩ．医薬製剤
本発明の方法を実施するために、本発明の１つもしくは２つ以上のペプチドまたはペプ
チド摸倣体を、例えばアテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を有すると診断さ
れたか、またはアテローム性硬化症のおそれがあると診断された個体に投与する。前記ペ
プチドまたはペプチド摸倣体はその“元々の形態”で投与してもよいし、所望の場合には
塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などの形態で投与してもよい。ただし、前
記塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体は薬理学的に適切であること、すな
わち本方法で有効であることを条件とする。活性物質の塩、エステル、アミド、プロドラ
ッグ、および他の誘導体は、合成有機化学分野の業者にとって周知であり、さらに例えば
下記文献に記載されている標準的な方法を用いて製造することができる：March (1992) A
dvanced OrganicChemistry; Reactions, Mechanism and Structure, 4th Ed. NY. Wiley
-Interscience。
【００９７】
例えば酸付加塩は、典型的には適切な酸との反応を伴う通常の方法を用いて遊離塩基か
ら調製される。一般的には、薬剤の塩基形を極性有機溶媒、例えばメタノールまたはエタ
ノールに溶解し、それに酸が添加される。生成された塩を沈澱させるか、またはより極性
の小さい溶媒を添加して溶液から取り出すことができる。酸付加塩を製造するために適し
た酸には有機酸および無機酸の両方が含まれる。前記は、例えば酢酸、プロピオン酸、グ
リコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマ
ル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンス
ルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などであり、後者は、例えば塩酸、臭化
水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などである。酸付加塩は、適切な塩基で処理することによっ
て遊離塩基に再度変換することができる。活性物質の特に好ましい酸付加塩はハロゲン化
塩、例えば塩酸または臭化水素酸で製造できるようなものである。逆に、前記ペプチドま
たは摸倣体の塩基性塩調製物は、医薬的に許容できる塩基（例えば水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなど）を用い
て同様な態様で製造できる。特に好ましい塩基性塩にはアルカリ金属塩（例えばナトリウ
ム塩）および銅の塩が含まれる。
【００９８】
エステルの調製は、前記薬剤の分子構造内に存在しうるヒドロキシルおよび／またはカ
ルボキシル基の機能化を必要とする。エステルは、典型的には遊離アルコール基［すなわ
ち、式ＲＣＯＯＨ（式中Ｒはアルキル、好ましくは低級アルキル）のカルボン酸に由来す
る成分］のアシル置換誘導体である。エステルは、所望の場合は、通常の水素添加分解ま
たは加水分解によって遊離酸に再度変換することができる。
【００９９】
アミドおよびプロドラッグもまた、当業者に公知であるか、または適切な文献に記載さ
れている技術を用いて製造できる。例えば、アミドは適切な反応物を用いてエステルから
調製するか、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンとの反応によって無水物また
は酸塩化物から調製できる。プロドラッグは、典型的には、個体の代謝系によって改変さ
れるまでは治療活性をもたない化合物を生じる成分を共有結合させて調製される。
【０１００】
本明細書で特定されるペプチドまたは摸倣体は、アテローム性硬化症および／またはそ
の症状の予防的および／または治療的処置のために、非経口的、局所的、経口的、経鼻的
（また別には吸入）、直腸、末梢投与（例えばエアロゾルまたは経皮的）で有用である。
本医薬組成物は、投与方法に応じて多様な個別投薬形態として投与できる。適切な個別投
薬形態には、粉薬、錠剤、ピル、カプセル、舐剤、座薬、パッチ、鼻腔スプレー、注射剤
、植え込み用徐放性製剤、脂質複合剤などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１０１】
本発明のペプチドおよび／またはペプチド摸倣体は、典型的には医薬的に許容される担
体（賦形剤）と結合させて薬理学的組成物が生成される。医薬的に許容される担体は、１
つまたは２つ以上の生理学的に許容される化合物、例えば組成物を安定化させるか、活性
物質の吸収を増加もしくは低下させるために機能するものを含むことができる。生理学的
に許容される化合物には、例えば炭水化物（例えばグルコース、シュクロースまたはデキ
ストラン）、抗酸化物質（例えばアスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低
分子量タンパク質、保護および取り込み増進剤（例えば脂質）、活性物質のクリアランス
および加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤および／または
緩衝物質が含まれる。
【０１０２】
他の生理学的に許容できる化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤または特に微生物の増
殖または作用を防止するために有用な保存料が含まれる。種々の保存料が周知であり、こ
れらには例えばフェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。医薬的に許容される担体（
生理的に許容される化合物を含む）の選択は、例えば活性物質の投与経路および活性物質
の個々の生理化学的特性に左右されることは、当業者には理解されよう。
【０１０３】
賦形剤は、好ましくは無菌的であり、一般的には望ましくない物質を含まない。前記組
成物は通常の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。
【０１０４】
治療のために用いる場合には、本発明の組成物はアテローム性硬化症の１つまたは２つ
以上の症状をもつか、またはアテローム性硬化症のおそれのある患者に、前記疾患および
／またはその合併症を治癒または少なくとも部分的に防止もしくは停止させるために十分
な量で投与される。前記を達成するために適切である量は“治療的に有効な投与量”と定
義される。前記の使用に有効な量は、前記疾患の重篤度および患者の一般的健康状態に左
右されるであろう。必要とされる用量および頻度並びに患者が許容できる用量および頻度
に応じて、組成物を単回または多数回投与することができる。いずれの事例でも、患者を
効果的に治療（１つまたは２つ以上の症状を改善）するために、本発明の製剤の活性物質
の十分量が組成物によって提供されねばならない。
【０１０５】
ペプチドおよび模倣体の濃度は広範囲に変動させることが可能で、選択される具体的な
投与態様および患者の必要性にしたがって、原則として液体容積、粘度、体重などを基準
に選択されるであろう。しかしながら、濃度は典型的には、約０．１または1ｍｇ／ｋｇ
／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で、さらに時にはそれよりも多い。典型的な用量は
、約３ｍｇ／ｋｇ／日から約３．５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約３．５ｍｇ／ｋｇ／日
から約７．２ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約７．２ｍｇ／ｋｇ／日から約１１．０ｍ
ｇ／ｋｇ／日、もっとも好ましくは約1１．０ｍｇ／ｋｇ／日から約１５．０ｍｇ／ｋｇ
／日の範囲である。ある種の好ましい実施態様では、用量は約1０ｍｇ／ｋｇ／日から約
５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。前記の用量は、個々の対象者または対象群の治療計画
を最適化させるために変動しうることは理解されよう。
【０１０６】
ある種の好ましい実施態様では、本発明のペプチドまたはペプチド摸倣体は、当業者に
周知の標準的方法にしたがって経口的に（例えば錠剤により）、または注射物として投与
される。他の好ましい実施態様では、ペプチドはまた、通常の経皮的薬剤送達系を用いて
皮膚を通して送達することができる。前記はすなわち経皮“パッチ”であり、この場合活
性物質は典型的には、皮膚に貼り付ける薬剤送達装置として機能する層状構造物内に含ま
れる。前記構造物では、薬剤組成物は、典型的には層内又は上側の裏打ち層の下にある“
貯蔵部”に含まれる。この場合の“貯蔵部”という用語は、皮膚表面への送達のために最
終的に利用可能なある量の活性成分を指すことは理解されよう。したがって、例えば“貯
蔵部”はパッチの裏打ち層上の粘着物質内にまたは当業者に公知の多様な種々のマトリッ
クス構成のいずれかの内部に活性成分を含むことができる。パッチはただ１つの貯蔵部を
含んでいても、多数の貯蔵部を含んでいてもよい。
【０１０７】
ある実施態様では、前記貯蔵部は、薬剤送達の間、前記系を皮膚に固定するために機能
する医薬的に許容される接触粘着物質のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触粘
着物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート
、ポリウレタンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には、薬剤含有
貯蔵部および皮膚接触粘着物質は分離した別個の層として存在し、貯蔵部の下に粘着物質
が存在し、この場合には前記貯蔵部は、上記で述べたようなポリマーマトリックスであっ
ても、液体もしくはヒドロゲル貯蔵部であっても、または他の何らかの形態をとってもよ
い。これらの層状物中の考案物の上側面として機能する裏打ち層は、好ましくは“パッチ
”の基本構造成分として機能し、前記考案物にその高い柔軟性を提供する。前記裏打ち層
のために選択された物質は、活性成分および含有される他のいずれの物質に対しても好ま
しくは実質的に非浸透性である。
【０１０８】
局所薬剤送達のための好ましい他の製剤には軟膏およびクリームが含まれるが、ただし
これらに限定されない。軟膏は半固形調製物で、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導
体をベースにする選択した活性物質を含むクリームは、典型的には粘稠な液体または半固
形乳液で、しばしば水中油または油中水である。クリームの基剤は典型的には水で洗浄可
能で、油相、乳化剤および水相を含む。前記油相はまた時に“内部相”と呼ばれ、一般に
ワセリンおよび脂肪族アルコール（例えばセチルまたはステアリルアルコール）で構成さ
れ、水相は通常は油相の容積を越え（ただし必ずしもそうではないが）、一般に湿潤剤を
含んでいる。クリーム製剤中の乳化剤は一般には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性ま
たは両親媒性界面活性剤である。使用される個々の軟膏またはクリーム基剤は、当業者に
は理解されるように、最適な薬剤送達を提供するものである。他の担体または賦形剤の場
合のように、軟膏基剤は不活性で、安定で、非刺激性で、さらに非感作性でなければなら
ない。
【０１０９】
典型的なペプチド製剤とは異なり、Ｄ型アミノ酸を含む本発明のペプチドは、経口的に
さえも投与することが可能で、胃酸などによるタンパク質分解に対して防御する必要がな
い。それにもかかわらず、ある種の実施態様では、ペプチド送達は、保護的な賦形剤によ
って強化することができる。前記は、典型的には、酸加水分解および酵素加水分解に対し
て耐性を付与する組成物とポリペプチドの複合体形成によるか、または適切な抵抗性を有
する担体（例えばリポソーム）にポリペプチドを包み込むことによって達成される。経口
送達のためのポリペプチド保護手段は当分野で周知である（例えば、治療薬剤の経口送達
のための脂質組成物を開示する米国特許第5,391,377号を参照されたい）。
【０１１０】
血中半減期の延長は、徐放性タンパク質“包装”系を使用することによって維持できる
。前記のような徐放系は当業者には周知である。ある好ましい実施態様では、タンパク質
およびペプチドのためのプロリース（ProLease）生物分解性微小球（microsphere）送達
系が用いられる（Tracy(1998) Biotechnol. Prog. 14:108; Johnson et al.(1996) Natu
re Med. 2:795;Herbert et al.(1998) Pharmaceut. Res. 15:357）。前記は、ポリマー
マトリックス内にタンパク質を含む生物分解性ポリマー微小球で構成された乾燥粉末で、
前記ポリマーマトリックスは、他の薬剤とともにまたは他の薬剤を含まずに乾燥製剤とし
て混ぜ合わせることができる。
【０１１１】
プロリース微小球の製造方法は、タンパク質の完全性を維持しながら高いタンパク質封
入効率を達成できるように特にデザインされている。前記方法は以下の工程から成る：（
ｉ）薬剤溶液を安定化賦形剤とともに噴霧凍結乾燥させることによって、原料タンパク質
から凍結乾燥タンパク質粒子を調製する；（ｉｉ）薬剤−ポリマー懸濁物を調製し、続い
て超音波処理または均質化処理を実施して薬剤の粒子サイズを減少させる；（ｉｉｉ）液
体窒素中に噴霧化することによって凍結薬剤−ポリマー微小球を製造する；（ｉｖ）エタ
ノールでポリマー溶媒を抽出する；（ｖ）ろ過および真空乾燥を実施し最終的な乾燥粉末
生成物を製造する。得られた粉末は固形のタンパク質を含み、前記タンパク質は多孔質の
ポリマー粒子内に均一に固定されて分散している。前記方法でもっとも一般的に使用され
るポリマー、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）は生体適合性および生物分解
性の両方を有する。
【０１１２】
封入化は低温（例えば−４０℃）で達成できる。封入時に、前記タンパク質は水の非存
在下で固体で維持され、したがって水によって誘発されるタンパク質のコンフォーメーシ
ョン移動度を最小にし、反応物質として水を含むタンパク質分解反応を防止し、さらにタ
ンパク質が変性を受ける有機相−水相境界面を回避できる。好ましい方法では、タンパク
質が不溶で、したがって高い封入効率（例えば９５％を越える）を得ることができる溶媒
が使用される。
【０１１３】
別の実施態様では、１つまたは２つ以上の成分溶液が、“濃縮物”として例えば直ぐに
希釈できるように（例えば予め測定した容積で）保存容器内で、または一定の容積の水に
直ぐに添加できる可溶性カプセルとして提供することができる。
【０１１４】
前述の製剤および投与方法は例示を目的としており、制限を意図するものではない。本
明細書に提供した開示を用いて、他の適切な製剤および投与態様が容易に考案されること
は理解されよう。
【０１１５】
ＶＩＩ．脂質ベース製剤
ある種の実施態様では、本発明のペプチドは１つまたは２つ以上の脂質と一緒に投与さ
れる。前記脂質は、ペプチドの保護および／または輸送／取込みの強化のための賦形剤と
して製剤化してもよいし、または前記脂質は別々に投与してもよい。
【０１１６】
特定の理論に拘束されないが、ある種のリン脂質の投与（例えば経口投与）は顕著にＨ
ＤＬ／ＬＤＬ比を増加させることができるということは本発明の発見であった。さらに、
ある種の中等度の長さのリン脂質は、一般的脂質輸送とは異なるプロセスによって輸送さ
れると考えられる。したがって、ある種の中等度の長さのリン脂質を本発明のペプチドと
一緒に同時投与することによって多くの利点が付与される。すなわち、それらは、消化ま
たは加水分解からリン脂質を保護し、ペプチドの取込みを改善し、ＨＤＬ／ＬＤＬ比を改
善する。
【０１１７】
前記脂質は本発明のポリペプチドを封入するリポソームに成形してもよいし、および／
または前記脂質は本発明のポリペプチドと単純に複合体化／混合してもよい。リポソーム
の製造方法および試薬の封入方法は当業者に周知である（例えば以下の文献を参照された
い：Martin& Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem., 257:286-288; Papahadjapoulos
et al.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11460-11464; Huang et al.(1992) Cance
r Res.,52:6774-6781; Lasic et al.(1992) FEBS Lett., 312:255-258など）。
【０１１８】
これらの方法で使用される好ましいリン脂質は、ｓｎ−１およびｓｎ−２の位置に約４
炭素から約２４炭素の範囲の脂肪酸を有する。ある種の実施態様では、脂肪酸は飽和され
ている。他の好ましい実施態様では、脂肪酸は不飽和でもよい。種々の好ましい脂肪酸は
表２に示されている。
表２：Ｄポリペプチドの投与に好ましいリン脂質のｓｎ−１および／またはｓｎ−２位の
好ましい脂肪酸
2010280718.tif 000007
【０１１９】
前記の位置の脂肪酸は同じでも異なっていてもよい。特に好ましいリン脂質はｓｎ−３
位にホスホリルコリンを有する。
【０１２０】
ＶＩＩＩ．追加的な薬理学的に活性な物質
追加的な薬理学的に活性な物質は、前記主要活性物質、例えば本発明のペプチドととも
に送達することができる。ある実施態様では、そのような活性な物質にはアテローム性硬
化症および／またはその合併症発生のおそれを減少させる物質が含まれるが、ただしこれ
に限定されない。前記物質には、ベータブロッカー、ベータブロッカーとチアジド利尿剤
の組み合わせ、スタチン、アスピリン、ＡＣＥインヒビター、ＡＣＥレセプターインヒビ
ター（ＡＲＢ）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２１】
適切なベータブロッカーには、心選択性剤（選択性ベータブロッカー）、例えばアセブ
トール（セクトラール（登録商標）（Sectral））、アテノロール（テノルミン（登録商
標）（Tenormin））、ベータキソロール（カーロン（登録商標）（Kerlone））、ビソプ
ロロール（ゼベタ（登録商標）（Zebeta））、メトプロロール（ロプレッサー（登録商標
）（Lopressor））などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な非選択性ブ
ロッカー（ベータ１およびベータ２を等しく遮断する）には、カーテオロール（カルトロ
ール（登録商標）（Cartrol））、ナドロール（コルガード（登録商標）（Corgard））、
ペンブトロール（レバトール（登録商標）（Levatol））、ピンドロール（ビスケン（登
録商標）（Visken））、プロプラノロール（インデラール（登録商標）（Inderal））、
チモロール（ブロッカドレン（登録商標）（Blockadren））、ラベタロール（ノルモダイ
ン（登録商標）（Normodyne）、トランデート（登録商標）（Trandate））などが含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。
【０１２２】
適切なベータブロッカーとチアジド利尿剤の組み合わせには、ロプレッサーＨＣＴ、Ｚ
ＩＡＣ、テノレチック（Tenoretic）、コルジド（Corzide）、チモリド（Timolide）、イ
ンデラル（Inderal）ＬＡ４０／２５、インデリド（Inderide）、ノルモジド（Normozide
）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２３】
適切なスタチンには、プラバスタチン（プラバコール（Prabachol）／Bristol-Meyers 
Squibb）、シムバスタチン（ゾカー（Zocor）／Merck）ロバスタチン（メバコー（Mevaco
r）／Merck）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２４】
適切なＡＣＥインヒビターには、カプトプリル（例えばカポテン（登録商標）（Capote
n）、Squibbから）、ベナゼプリル（例えばロテンシン（登録商標）（Lotensin）、Novar
tisから）、エナラプリル（例えばバゾテック（登録商標）（Vasotec）、Merckから）、
フォシノプリル（例えばモノプリル（登録商標）（Monopril）、Bristol-Meyersから）、
リシノプリル（例えばプリニビル（登録商標）（Prinivil）、Merckから、またはゼスト
リル（登録商標）（Zestril）、Astra-Zenecaから）、キナプリル（例えばアキュプリル
（登録商標）（Accupril）、Parke-Davisから）、ラミプリル（例えばアルテース（登録
商標）（Altace）、HoechstMarion Roussel、King Pharmaceuticalsから）、イミダプリ
ル、ペリンドプリルエルブミン（例えばアセオン（登録商標）（Aceon）、Rhone-Poulenc
Rorerから）、トランドラプリル（例えばメービック（登録商標）（Mavik）、KnollPhar
maceuticalから）などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切なＡＲＢＳ（Ａ
ＣＥレセプターブロッカー）には、ロサルタン（例えばコザール（登録商標）（Cozaar）
、Merckから）、イルベサルタン（例えばアバプロ（登録商標）（Avapro）、Sanofiから
）、カンデサルタン（例えばアタカンド（登録商標）（Atacand）、Astra Merckから）、
バルサルタン（例えばジオバン（登録商標）（Diovan）、Novartisから）などが含まれる
が、ただしこれらに限定されない。
【０１２５】
ＩＸ．アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善するキット
別の実施態様では、本発明は、アテローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を改善
するか、またはアテローム性硬化症のおそれがある対象（ヒトまたは動物）を予防的に処
置するキットを提供する。前記キットは、好ましくは、本発明の１つまたは２つ以上のペ
プチドまたはペプチド摸倣体を収納した容器を含む。前記ペプチドまたはペプチド摸倣体
は個別投薬形態（例えば座薬、錠剤、カプセル、パッチなど）で提供することができ、お
よび／または場合によって１つまたは２つ以上の医薬的に許容できる賦形剤と結合させて
もよい。
【０１２６】
前記キットは、場合によってさらに、心疾患および／またはアテローム性硬化症の治療
で使用される１つまたは２つ以上の他の薬剤を含んでもよい。前記薬剤には、例えば上記
で述べたようなベータブロッカー、血管拡張剤、アスピリン、スタチン、ＡＣＥインヒビ
ターまたはＡＣＥレセプターインヒビター（ＡＲＢ）などが含まれるが、ただしこれらに
限定されない。
【０１２７】
さらに、前記キットは場合によって標識物質および／または指示用物質を含む。後者は
、本発明の“治療薬”または“予防薬”の実施方法または使用についての説明を提供する
。好ましい指示用物質は、本発明の１つまたは２つ以上のポリペプチドを使用して、アテ
ローム性硬化症の１つまたは２つ以上の症状を緩和し、および／またはアテローム性硬化
症のおそれがある個体で前記の１つまたは２つ以上の症状の開始または進行を予防するこ
とについて説明する。前記指示用物質はまた、場合によって好ましい用量／治療計画、対
比指示などについて説明することができる。
【０１２８】
前記指示物質は典型的には手書きまたは印刷物質を含むが、指示物質はそのようなもの
に限定されない。前記の指示を保存し、さらに末端ユーザーにそれらを伝達することがで
きる任意の媒体が本発明に包含される。前記媒体には、電子記録媒体（例えば磁気ディス
ク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤＲＯＭ）などが含まれるが
、ただしそれらに限定されない。前記媒体には前記指示物質を提供するインターネットの
サイトのアドレスを含むことができる。
【０１２９】
以下の実施例は本発明の説明のために提供され、本発明の請求の範囲を制限するもので
はない。
【実施例１】
【０１３０】
実施例１
いくつかの合成クラスＡペプチド類似体が、ヒトアポＡ−Ｉの多くの特性と類似する
特性をinvitroで提示することが示された。本実施例では、両親媒性が強化された新規な
ペプチド（５Ｆ）が、アテローム性硬化症誘発飼料を与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２
０μｇ／日で１６週間腹腔内に注射された。マウスアポＡ−Ｉ（ＭｏＡＩ）（５０μｇ／
日）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）注射をコントロールとして他のマウスに実施した
。総血中コレステロールレベルおよびリポタンパク質プロフィルは前記処置群とコントロ
ール群とで顕著には相違しなかったが、ただし５ＦまたはＭｏＡＩを投与したマウスでは
、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）−コレステロールは、総コレステロールのパーセント
として計算したとき低かった。
【０１３１】
注射物質に対する毒性または抗体の生成は観察されなかった。５Ｆを注射した動物から
ＬＤＬを採取し、これをヒト動脈壁細胞にin vitroで与えたとき、前記ＬＤＬは、コント
ロールから採取したＬＤＬよりも少ない脂質過酸化水素およびＬＤＬ誘発走化性活性をも
たらした。さらに、５Ｆを注射したマウスからＨＤＬを採取し、これをヒトＬＤＬと一緒
にヒト動脈壁細胞にinvitroで与えたとき、脂質ヒドロペルキシド生成は大幅に少なく、
さらにＬＤＬ誘発単球走化性活性は大幅に低かった。ペプチド５Ｆを投与されたマウスの
大動脈アテローム病巣面積は、ＰＢＳを投与されたマウスと比較して顕著に小さかった。
ＭｏＡＩを投与されたマウスの病巣面積はＰＢＳ注射動物のそれと類似していた。我々は
、５Ｆはアテローム性硬化症の予防および治療に有効であると結論した。
【０１３２】
材料と方法
ペプチド
ペプチド５Ｆ（Ａｃ−１８Ａ［ＡｓｐＴｒｐＬｅｕＬｙｓＡｌａＰｈｅＴｙｒＡｓｐＬ
ｙｓＶａｌＰｈｅＧｌｕＬｙｓＰｈｅＬｙｓＧｌｕＰｈｅＰｈｅ］−ＮＨ2）を固相ペプ
チド合成によって合成した（例えば以下を参照されたい：Anantharamaiah & Garber (199
6) Meth.Enzymol. 263:267-282; Palgunachari et al.(1996) Arteriosclerosis, Throm
bosis &Vascular Biology 16:328-338）。前記合成ペプチドの純度は分析用ＨＰＬＣお
よびイオンスプレー質量分析法によって確定した。前記ペプチドは蒸留水に対して透析し
、使用前に凍結乾燥させた。
【０１３３】
ＭｏＡＩは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血漿から単離した［ＥＤＴＡ血漿は業者（Harl
an Bioproductsfor Science, Indianapolis, IN）から購入した］。ＭｏＡＩは、サイズ
排除クロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラフィーの組み合わせを用いて単離
した。簡単に記せば、ＫＢｒを添加して血漿密度を１．２１ｇ／ｍＬに調節し、５０００
０ｒｐｍで２４時間、４℃で遠心沈澱を実施した（Ｔｉ７０ローター；Beckman, Fullert
on, CA ）。上部分画を採集し水に対して透析してＫＢｒを除去し、凍結乾燥させて脱脂
した。ペレットはＧｎ：ＤＴＴ：トリス溶液（３Ｍ塩酸グアニジン、１ｍＭジチオスレイ
トールおよび１０ｍＭトリス；ｐＨ＝８．０）に溶解し、続いて同じ溶液に対して１２０
００ＭＷカットオフ透析チューブを用いて透析し、サンプルからアポＡ−ＩＩおよびＣア
ポリポタンパク質の大半を除去した。続いて前記サンプルを水に対して透析し凍結乾燥さ
せた。ペレットは新鮮なＧｎ：ＤＴＴ：トリス溶液に溶解し、タンパク質をサイズ排除カ
ラムクロマトグラフィーによって分離した。カラムはＸＫ２６／１００カラム（２．６×
１００ｃｍ）を使用し、バルクフェース・スーパーロース１２（Pharmacia Biotech, Pis
cataway, NJ）を充填し、Ｇｎ：ＤＴＴ：トリス溶液で平衡化させた。流速は０．５ｍＬ
／分で、２．５ｍＬで分画を採集した。アポＡ−Ｉピークに一致する分画をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析し、さらに調製用Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣによって精製した（Anantharamaiah
& Garber(1996) Meth. Enzymol. 263:267-282）。
【０１３４】
マウス
雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）を用いて全実験
を行った。マウスは６週齢で購入し、食餌実験は８週齢のマウスを用いて開始した。代謝
回転実験では体重が２０から２２グラムのマウスを用いた。全ての動物実験は、当該大学
（Universityof Alabama, Birmingham）の動物管理および使用委員会（Institutional A
nimal Care andUse Committee）の事前検査を受け承認された。
【０１３５】
消長動態実験
５Ｆペプチド、ＭｏＡＩおよびヒトアポＡ−Ｉを文献（Bilheimer et al.(1972) Bioch
im. Biophys.Acta 260:212-221）の方法によって125Ｉで標識した。マウスに改変トーマ
ス・ハートロフト（Thomas-Hartroft）アテローム性硬化症誘発飼料（#TD88051;Teklad,
Madison,WI）を４週間与え、この時点で２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶
解したペプチドまたはタンパク質の毎日の腹腔注射を開始した。ＭｏＡＩまたはヒトアポ
Ａ−Ｉ（５０μｇ／動物）を注射した動物、５Ｆ（２０μｇ／動物）を注射した動物は本
消長動態実験では絶食させず、血液サンプルはキシラジン：ケタミン麻酔下で後眼窩洞か
ら注射後１５、３０、４５分後、および１、１．５、２、３、４、６、８、１２および２
４時間後に採取した。
【０１３６】
各動物は異なる時点で３つの血液サンプルを提供し（全て後眼窩洞および交互の眼から
入手）、さらに別個の動物から少なくとも３つのサンプルが各時点で採集された。サンプ
ルはヘパリン添加毛細管に採集し、続いて微量遠心管に入れ、遠心により血漿を分離した
。各サンプルから１０μＬを２組づつ放射能活性の測定のために取り、サンプルにつき１
０分間のガンマ計測（Corba; Packard Instruments, Downers Grove, IL）に用いた。全
血漿容積を体重の４．２％として計算した。各サンプルは、全血漿中の注射されたＣＰＭ
のパーセントとして表した。遊離125Ｉはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱によって決定し
た（１０μＬの血漿サンプルにつき１０％ＴＣＡを１ｍＬ）。消長動態モデルへの当ては
めは、各時点での平均ではなく、全てのデータポイントを用いて実施した（ＰＫアナリス
ト（PKAnalyst）、MicroMathScientific Software, Salt Lake City, UT）。
【０１３７】
病巣実験のための注射プロトコルおよびサンプル採取
マウスは６週齢で入手し、任意に２０匹の群に分け（ただし処置を与えられないネガテ
ィブコントロール群は１０匹）、標準的なげっ歯類の固形飼料を与えた。８週齢で、処置
群に改変トーマス・ハートロフトアテローム性硬化症誘発飼料（#TD88051; Teklad, Madi
son, WI）を与え、注射を開始した。前記飼料は４℃で保存し、脂質の酸化を最小限にす
るために製造日より３ヶ月を過ぎないものを使用した。動物に毎日１６週間腹腔内注射を
施した（週末および休日を含む）。各群の２０匹のマウスに２００μＬのＰＢＳ（ポジテ
ィブコントロールとして）または２００μＬのＰＢＳ中の５Ｆ（２０μｇ）または２００
μＬのＰＢＳ中のＭｏＡＩ（５０μｇ）を毎日注射した。
【０１３８】
凍結乾燥５Ｆペプチドをバイアルで調製した。各バイアルは１日の注射に十分なペプチ
ドを含有していた。５ＦペプチドはＰＢＳ中で凍結乾燥させ、注射の日にオートクレーブ
したミリＱ（Milli-Q）水（MilliporeCorp., Bedford, MA）に溶解した。全群について
注射容積を２００μＬ／マウス／日で維持した。
【０１３９】
血液サンプルは麻酔下で、実験開始時（食餌前）および器官採取時に後眼窩洞採血によ
って採取した。実験終了時（１６週）の最後の採血で心臓および肝臓を摘出した。心臓は
血液を除去し、さらに心筋を弛緩させるため、０．９％食塩水溶液に約１時間保持した。
前記器官を続いてリン酸緩衝４％ホルムアルデヒド中で切片作製まで少なくとも１週間固
定した。肝臓は取り出し重量を測定した。
【０１４０】
組織学的評価
組織学的評価は文献の方法（Paigen et al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323）に
いくつかの改変を加えて実施した。簡単に記せば、心臓をリン酸緩衝ホルムアルデヒド溶
液中で少なくとも１週間固定した。心臓の下部２／３を除去し、残りの組織をＯＣＴ媒質
体（Tissue-Tek,Miles Inc., Elkhart, IN）中で凍結し、−２０℃で低温槽中で切片を
作製した。大動脈根の開始部について２０μｍ毎の切片をスライド上に確保し、観察した
。続いて切片をさらに６００μｍ分採集するか、または大動脈の横断切片が円形化し弁の
尖頭がもはや明瞭でなくなるまで切片を採集した。スライドをオイルレッドＯで染色し、
さらにヘマトキシリンで対比染色した。染色した病巣の横断面積を８０μｍ離れた連続切
片で画像分析（SigmaScanPro, SPSS Scientific, Chicago, IL）で測定し、平均病巣面
積を各大動脈洞について４００μｍ（５枚のスライド）の長さにわたって決定し、最大平
均病巣面積を示した。
【０１４１】
混合培養、単球の単離、リポタンパク質の単離、脂質過酸化水素の測定、および単球走
化性活性
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常なヒトドナーの血漿から超遠心沈澱によ
るリポタンパク質の単離およびマウス血漿からＦＰＬＣによるリポタンパク質の単離、並
びに脂質過酸化水素および単球走化性活性の測定は、標準的な方法にしたがって実施した
。全ての参加対象者は、ＵＣＬＡヒト対象保護委員会（UCLA Human Subjects Protection
Committee）によって承認されたインフォームドコンセントを示した。マウスリポタンパ
ク質を混合培養でテストするためのプロトコルはまた以下のように実施した：簡単に記せ
ば、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらに賦形剤（ＰＢＳ）またはペプチド５Ｆ（
２０μｇ／マウス／日）を注射したマウスの血漿からＬＤＬおよびＨＤＬをＦＰＬＣによ
って単離した。混合培養は、ヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍＬのＬＤＬタンパク質）、また
はマウスＬＤＬ（２００μｇ／ｍＬ）、またはヒトＬＤＬ（２００μｇ／ｍＬ）＋ヒトＨ
ＤＬ（３５０μｇ／ｍＬのＨＤＬタンパク質）もしくはマウスＨＤＬ（３００μｇ／ｍＬ
）、またはマウスＨＤＬ（３００μｇ／ｍＬ）単独で処理した。前記混合培養を上記添加
物とともにまたは上記添加物を含まずに８時間３７℃で１０％のリポタンパク質欠損血清
（ＬＰＤＳ）の存在下でインキュベートした。上清を採集し、アウエルバッハ脂質過酸化
水素同等物について分析した。続いて混合培養を洗浄し、血清またはＬＰＤＳを含まない
新しい培養液でさらに８時間インキュベートした。この調整培養液を採集し、単球走化性
活性について分析した。
【０１４２】
化学的および分析的方法：カラムコレステロールリポタンパク質プロフィル（ＣＬｉＰ
）
血漿コレステロールリポタンパク質プロフィルは、我々が最近開発したＣＬｉＰ法（Ga
rber etal.(2000) J. Lipid Res. 41:1020-1026）を用いて測定した。簡単に記せば、５
から１０μＬの血漿を１回のスーパーローズ（Superose）６（Pharmacia, Piscataway NJ
）カラムを用いて分析した。カラムの直ぐ後でコレステロール試薬をＴ字型混合装置から
導入し、溶出剤：試薬混合物はポストカラム反応コイルに入れた。溶出剤混合物中のコレ
ステロール含有量は分光光度法によって５００ｎｍで検出し、検出値はコンピュータに採
集した。得られたプロフィルは成分ピークに分解し、ピークフィット（PeakFit, SPss Sc
ience, Chicago,IL）を用いて相対面積を分析した。総コレステロールに対する絶対コレ
ステロール値および各成分ピークは、既知の値をもつコントロールサンプルとの比較によ
って決定した。いくつかの事例では、分画を採集し放射能活性の分布を決定した。ＣＬｉ
ｐ法は、プールしたサンプルを使用することなく個々のマウスサンプルを分析することを
可能にした。
【０１４３】
抗体の検出
ペプチドを毎日注射することによって何らかの免疫反応をマウスで誘発するか否かを決
定するために、器官採集時にマウスから採取した血漿（１６日間の毎日の注射の後）を用
いて間接ＥＬＩＳＡ力価測定（Engvall (1980) Meth. Enzymol. 70:419-439）を実施した
。注射に用いたペプチドまたはＭｏＡＩ（１０μｇ／ｍＬ）でプレートを被覆し、一晩イ
ンキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ８．２）
で完全に洗浄し、緩衝液（ホウ酸緩衝液中の０．１％ゼラチンおよび０．１％ＢＳＡ）で
１時間ブロックした後、２００μＬの希釈マウス血漿（１：１００希釈）サンプルをホウ
酸緩衝食塩水で段階的に１：１で希釈した。マウスＩｇＧに対するビオチン付加ヤギ抗体
（０．１μｇ／ｍＬ）を続いてウェルに添加し、さらにＳＡ−ＨＲＰ（ストレプトアビジ
ン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ）で１時間処理し、さらにＡＢＴＳおよび過酸
化物を基質として用いて反応を進行させた。抗原／抗体のそれぞれの添加後には、プレー
トを一晩室温でインキュベートし、さらに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むホウ酸緩衝
食塩水（ｐＨ８．２）で完全に洗浄し、次の添加の前に１時間緩衝液（ホウ酸緩衝液中の
０．１％ゼラチンおよび０．１％ＢＳＡ）でブロックした。
【０１４４】
統計的方法
処置群を２テール（two-tailed）ｔ−検定または変数の一方向分析（この場合データは
正常に分布していた）によって比較するか、または階層上の変数（variance on ranks）
の一方向分析（SigmaStat;SPSS Science, Chicago, IL）によって比較した。インプット
速度およびアウトプット速度が等しくないと仮定するファーストオーダー・ワンコンパー
トメント・キネティックモデル（PKAnalyst; MicroMath Scientific Software, Salt Lak
e City, UT）へのあてはめによって、ペプチドまたはタンパク質の代謝回転の消長動態を
分析した。
【０１４５】
結果
消長動態実験
腹腔内注射の後、マウスの血漿からペプチド５Ｆ並びにヒトおよびマウスのアポＡ−Ｉ
が浄化除去される動態は表３に要約されている。
【０１４６】
表３：消長動態実験から得られた適合度検定データの要約
2010280718.tif 000008
【０１４７】
表示のデータは、インプット速度およびアウトプット速度が等しくないと仮定するファ
ーストオーダー・ワンコンパートメント・キネティックモデル（PKAnalyst; MicroMath S
cientificSoftware, Salt Lake City, UT）に対する適合検定データの結果を示している
。略語：Ｔ１／２＝血漿から浄化除去される半減期；血漿中の最大％＝全血漿中に見出さ
れる注射された投与量のピークレベルのパーセント；ｒ2＝前記キネティックモデルの統
計適合度
ヒトおよびマウスアポＡ−Ｉは、５Ｆペプチドと比較して非常に長いクリアランスを示
した。ヒトアポＡ−Ｉおよび５Ｆは、マウスアポＡ−Ｉよりもピーク血漿レベルまでの時
間が長かったが、ただし達成されたピークレベルはほぼ類似していた（ヒトアポＡ−Ｉは
他の物質よりも高いピークレベルに達した）。カラムクロマトグラフィーによる血漿サン
プルの分析によって、ペプチド５ＦおよびアポＡ−Ｉ（ヒトおよびマウスの両方）は血漿
リポタンパク質（特にＨＤＬサイズ領域の粒子）と結合することが示された（図６）。５
Ｆの注射後１．５時間のペプチド放射能活性のＨＤＬ：ＶＬＤＬ比は４．１９±０．５８
（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）であった。同様な結果が５Ｆの注射後５時間で見出された（６
．４４±１．１０、ｐ＜０．０２）。注射されたペプチドは開始時３％未満の遊離125Ｉ
をＴＣＡ沈澱によって示した。しかしながら注射後１．５時間で、全溶出放射能活性のパ
ーセントとして表される血漿中の遊離125Ｉの放射能活性は５Ｆについて増加し２６．９
±９．４％で、５時間で３４．４±４．８％であった。これは、リポタンパク質およびリ
ポタンパク質結合ペプチドの予想されたクリアランスを示している。遊離ヨウ素による１
．５時間から５時間の放射能活性の増加速度は、注射から１．５時間までのそれよりも小
さく、おそらく腹腔内での開始時の顕著なペプチド分解を示唆しているのであろう。
【０１４８】
固形飼料またはアテローム性硬化症誘発飼料による生存度および全体的形態
長期間の食餌実験中に理由が不明の原因によって死亡したマウスは３匹のみであった。
前記動物のうち２匹はＭｏＡＩを与えられ、１匹は５Ｆペプチドを与えられた。器官採取
時には全体的な形態学的相違は群の間で認められなかった。肝臓はアテローム性硬化症誘
発飼料を与えられた全ての動物で増大したが、肝重量においても体重の百分率として表さ
れる肝重量においても群間で相違は認められなかった（表４）。アテローム性硬化症誘発
飼料を与えた全動物（ＰＢＳ注射動物を含む）の体重は、固形飼料を与えたコントロール
よりも軽かった（表４）。
【０１４９】
表４：処置後の体重および肝重量
2010280718.tif 000009
【０１５０】
表示のデータは、器官採集時（処置の１６週間後）に得られた重量の平均±ＳＥＭであ
る。固形飼料を与えた動物には注射しなかった。他のマウスは、方法の項に記載したよう
にアテローム性硬化症誘発飼料を与えられた。ＰＢＳ群は、２００μＬのリン酸緩衝食塩
水を毎日腹腔内に注射した。５Ｆ群は２００μＬのＰＢＳ中の５Ｆ（２０μｇ）を、Ｍｏ
ＡＩ群は２００μＬのＰＢＳ中のＭｏＡＩ（５０μｇ）を毎日腹腔内に注射した。*５Ｆ
についてはｐ＜０．０５；２テールｔ検定。
【０１５１】
抗原性
前記ペプチドに対する抗体の存在について、１６週の注射期間の終了時に採取した血液
サンプルを調べた。ペプチド５ＦまたはＭｏＡＩ（データは示されていない）に対する抗
体は検出されなかった。一連の動物に注射していないペプチドでＥＬＩＳＡプレートを被
覆した交差実験で得られた結果は、抗体の有無について前記直接的測定で示された結果と
本質的に同一であった（データは示していない）。
【０１５２】
リポタンパク質およびアポリポタンパク質の特性
ＣＬｉｐ法で決定した総コレステロール値およびリポタンパク質コレステロール値は表
３に示されている。総コレステロール値の正確さは手作業でのコレステロールアッセイ（
Cholesterol1000; Sigma, St.Louis, MO）によって確認された（データは示されていな
い）。総コレステロール値またはリポタンパク質分画コレステロール値について処置群の
間に顕著な相違は認められなかった。しかしながら、リポタンパク質分画を総コレステロ
ールのパーセントとして表した場合（表５）、ＨＤＬ−コレステロールは、ＰＢＳ群と比
較して５Ｆ群およびＭＯＡＩ群で極めて低い百分率を構成した。
【０１５３】
表５：固形飼料およびアテローム性硬化症誘発飼料で１６週間後の総コレステロールレ
ベルおよびリポタンパク質コレステロールレベル（ｍｇ／ｄｌおよび総コレステロールの
パーセント）
2010280718.tif 000010
【０１５４】
データは、平均ｍｇ／ｄｌ±ＳＥＭとして、さらに括弧内には総コレステロールのパー
セントとして表されている。略語：ＶＬＤＬ＝超低密度リポタンパク質；ＩＤＬ＝中間密
度リポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質；Ｔ
Ｃ＝総コレステロール；ＭｏＡＩ＝マウスアポＡ−Ｉ；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水。固形
飼料を与えた動物には注射を施さなかった。他のマウスは、方法の項に記載したようにア
テローム性硬化症誘発飼料で飼育された。ＰＢＳ群には２００μＬのＰＢＳを毎日腹腔に
注射した。５Ｆ群には２００μＬのＰＢＳ中の５Ｆ（２０μｇ）を毎日腹腔に注射した。
ＭｏＡＩ群には２００μＬのＰＢＳ中のＭｏＡＩ（５０μｇ）を毎日腹腔に注射した。動
物の数は表４に示されている。
*２テールｔ検定によりＰＢＳ群と比較した場合ｐ＜０．０５またはそれ未満。
【０１５５】
マウスリポタンパク質とヒト動脈壁細胞との相互作用
我々は最近、正常なＨＤＬは穏やかに酸化されたＬＤＬの生成で３つの工程を抑制する
ことを発見した。これらの実験（同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願）で
、我々は、ヒトＬＤＬをin vitroでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ摸倣ペプチド（３７ｐＡ
）で処理することによって、ＬＤＬからＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むシーディング
分子が除去されることを示した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培
養がＬＤＬを酸化する能力をもつために、さらにＬＤＬに動脈壁細胞の単球走化性活性の
産生を誘発させるために必要であった。我々はまた、アポＡ−Ｉのマウスへの注射後また
はヒトへの輸液後に前記マウスまたはヒト実験協力者から単離したＬＤＬはヒト動脈壁細
胞による酸化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しな
いことを示した。図７は、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにＰＢＳを注射した
本実験のマウスから得たＨＤＬは、ヒトＬＤＬの酸化を抑制することができず（図７Ａ）
、さらにヒト動脈壁混合培養でＬＤＬ誘発単球走化性活性を抑制できない（図７Ｂ）こと
を示している。対照的に、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにペプチド５Ｆを注
射したマウスのＨＤＬは、正常なヒトＨＤＬと同程度に、ヒトＬＤＬの酸化の抑制および
混合培養でのＬＤＬ誘発単球走化性活性の防止に有効であった。図７はまた、アテローム
性硬化症誘発飼料を与え、さらにＰＢＳを毎日注射したマウスから採取したＬＤＬは、同
じ飼料を与えたが２０μｇのペプチド５Ｆを毎日注射したマウスから採取したＬＤＬより
も容易に酸化され、より容易に単球走化性活性を誘発することを示している。いずれのリ
ポタンパク質で処理した動脈壁細胞にも細胞毒性は観察されなかった（データは示されて
いない）。同様な結果が３つの別個の実験（データは示されていない）の全てで得られた
。
【０１５６】
病巣の形成
平均病巣横断面面積は図８に提示されている。予想したように、通常のマウスの固形飼
料を与えた群では病巣は観察されなかった（データは示されていない）。以前に報告され
たように（Paigenet al.(1990) Arteriosclerosis 10:316-323）、病巣面積における顕
著なばらつきがアテローム性硬化症誘発飼料を与えた全ての群で観察された。しかしなが
ら、２テールｔ−検定（ｐ＜０．００２）で解析するか、または階層上の変数（variance
on ranks）の一方向分析（ｐ＜０．００１；平均病総面積の分布が正常でないために決
定した）で解析するかに関係なく、５Ｆを注射した動物は、ＰＢＳ注射動物よりも顕著に
小さな平均病巣を有していた。ＭｏＡＩ注射では、ＰＢＳ注射と比較して病巣面積に相違
は出現せず、病巣面積は、ｔ−検定（ｐ＜０．００２）および階層上の変数の一方向分析
（ｐ＜０．００１）の両方で５Ｆ注射動物の場合よりも顕著に大きかった。
【０１５７】
考察
クラスＡ両親媒性らせんモチーフに類似するようにデザインした合成ペプチドはリン脂
質と結合することができ、ヒトアポＡ−Ｉに類似する多くの生物学的特性を示すことを以
前に我々は明らかにした（３、８、１０、１４、１５、２０）。我々はまた、前記ペプチ
ドが動物の静脈内に投与されたとき、それらは血漿リポタンパク質と結合することを示し
た（１１）。本実験は、理論的脂質親和性が高められた新規なペプチド５Ｆは、抗アテロ
ーム性硬化症の特性を有するという仮説を立証するために考案した。
【０１５８】
ここに提示した実験は、ペプチド５Ｆは腹腔注射の後血漿に入り、ＭｏＡＩとほぼ匹敵
する（がヒトアポＡ−Ｉよりは低い）血漿レベルに達することを示した（表３および図６
）。腹腔内注射後の５Ｆの血中半減期は、マウスまたはヒトアポＡ−Ｉのいずれよりも短
かった。循環コレステロールの大半がアテローム性硬化症誘発飼料のＶＬＤＬ−、ＩＤＬ
−およびＬＤＬ−サイズ領域に存在するという事実にもかかわらず、注射後、大半の５Ｆ
は、ＨＤＬ領域に見出された（図６）。
【０１５９】
血漿コレステロールレベルおよびその分布は、アテローム性硬化症誘発飼料を与えられ
注射を受けた群間で顕著な相違は認められなかった（表５）。しかしながら、リポタンパ
ク質分画が総コレステロールのパーセントとして表されたとき（表５）、ＨＤＬコレステ
ロールは、ＰＢＳ群と比較して５Ｆ群およびＭｏＡＩ群で顕著に低いパーセンテージを構
成した。
【０１６０】
正常なＨＤＬは穏やかに酸化されたＬＤＬの生成で３つの工程を抑制する。我々は、ヒ
トＬＤＬをinvitroでアポＡ−ＩまたはアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドで処理することによって
、ＬＤＬからＨＰＯＤＥおよびＨＰＥＴＥを含むシーディング分子が除去されることを示
した。これらのシーディング分子は、ヒト動脈壁細胞の混合培養がＬＤＬを酸化する能力
をもつために、さらにＬＤＬに動脈壁細胞の単球走化性活性の産生を誘発させるために必
要であった（同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を参照されたい）。我々
はまた、アポＡ−Ｉのマウスへの注射後またはヒトへの輸液後に、前記マウスまたはヒト
実験協力者からアポＡ−Ｉの注射／輸液後に単離したＬＤＬは、ヒト動脈壁細胞による酸
化に抵抗性を有し、さらに動脈壁細胞混合培養で単球の走化性活性を誘発しないことを示
した。本実験では、アテローム性硬化症誘発飼料を与え、さらにＰＢＳを注射したマウス
から得たＨＤＬは、ヒトＬＤＬの酸化を抑制することができず（図７Ａ）、さらにヒト動
脈壁混合培養でＬＤＬ誘発単球走化性活性を抑制できなかった（図７Ｂ）。全く対照的に
、同じアテローム性硬化症誘発飼料を与えたが、ペプチド５Ｆを注射したマウスのＨＤＬ
は、正常なヒトＨＤＬと同程度に、ヒトＬＤＬの酸化の抑制および混合培養でのＬＤＬ誘
発単球走化性活性の防止に有効であった（図７）。アテローム性硬化症誘発飼料を与え、
さらに５Ｆを注射したマウスから採取したＬＤＬは、同じ飼料を与えたがＰＢＳを注射し
たマウスから採取したＬＤＬよりも酸化は容易ではなく、さらに単球走化性活性の誘発も
容易ではなかった（図７）。血液循環で５ＦはＬＤＬと相互作用し（ＨＤＬと結合する前
または結合後に）、ＬＤＬの酸化およびＬＤＬ誘発単球走化性活性に必要なシーディング
分子を、関連するペプチド３７ｐＡについて記載されたin vitroでの態様と同様な態様で
除去するということが可能である（同時係属出願USSN09/541,468; 2000年3月31日出願を
参照されたい）。
【０１６１】
アテローム性硬化症誘発飼料を与え、ペプチド５Ｆを注射したマウスから得たＨＤＬお
よびＬＤＬに対するヒト動脈壁細胞のin vitroでの反応は、５Ｆのin vivoでの保護作用
と一致する。総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＩＤＬ＋ＶＬＤＬ−コレステ
ロールレベルの類似性、および総コレステロールのパーセントとしてのＨＤＬ−コレステ
ロールの低さにもかかわらず、アテローム性硬化症誘発飼料を与え５Ｆを注射した動物は
、顕著に低い病巣スコアを示した（図８）。これらの結果は他の研究者の結果（Shah et 
al.(1998)Circulation 97:780-785）といくぶん類似する。前記研究者らは、高コレステ
ロール血症が続いているにもかかわらず、アポＡ−ＩMilanoは、アポＥ欠損マウスでアテ
ローム性硬化症病巣の進行を防止することを見出した。
【０１６２】
ヒトアポＡ−Ｉを用いて動物でアテローム性硬化症を防止／軽減できた（Wilson et al
.(1988)Arteriosclerosis 8:737-741; Rubin et al.(1991) Nature 353:265-267; Pazty
etal.(1994) J. Clin. Onvest. 94:899-903; Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA91:9607-9611; Shah et al.(1998) Circulation 97:780-785）が、前記実験で
一日５０μｇの用量のＭｏＡＩの注射では成功しなかった理由は明らかではない。ＭｏＡ
Ｉは、ヒトアポＡ−Ｉのように安定なタンパク質：脂質複合体を形成しないことが示され
ている（Gonget al.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342）。マウスＨＤＬは
また、ヒトＨＤＬよりもいっそう容易に塩酸グアニジンによって変性することが示され（
Gong etal.(1994) Biochim. Biophys. Acta 1213:335-342）、両親媒性らせんペプチド
は、ヒトＨＤＬからヒトアポＡ−Ｉを除去するよりもいっそう容易にマウスＨＤＬからＭ
ｏＡＩを除去する可能性が示唆される。これらの相違は、ＭｏＡＩが本実験で病巣を顕著
には減少させなかったことの説明になるかもしれない。さらにまた、我々が用いた条件下
ではさらに高用量のＭｏＡＩが必要である可能性もある。いずれの場合にも、５Ｆペプチ
ドはこれらの条件下で非常に有効であったが、ＭｏＡＩは有効ではなかった。
【０１６３】
注射プロトコル終了時の血漿のＥＬＩＳＡ分析によって、５Ｆペプチドに対する抗体は
生成されないことが示された。これらのペプチドはおそらく免疫反応を誘発するために必
要なエピトープの露出が妨げられた状態で脂質と結合しているため、脂質結合ペプチドは
抗体を生じないことが示されたということから考えると、このことは驚くに当たらない（
Muranishi(1997) J. Pharm. Soc. Japan 117:394-404; Fricker & Drewer (1996) J. Pe
ptide Sci.2:195-211）。
【０１６４】
我々が実施した予備的実験は、本実験で用いたペプチドよりも理論的に低い脂質親和性
を有するクラスＡ両親媒性らせんペプチド（３７ｐＡ）を発現する遺伝子導入マウスは、
アテローム性硬化症に対して抵抗性をもつ可能性を示唆した（Garber et al.(1997) Circ
ulation96:I-490）。これまでの実験は、ペプチド５Ｆは、アテローム性硬化症誘発に必
要なメカニズムを解明するために大きな可能性を有し、さらにまた治療のための潜在能力
も有することを示唆している。
【実施例２】
【０１６５】
実施例２
Ｄペプチドの有効性
本実施例は本発明のＤペプチドの有効性を明示する。ヒト大動脈壁混合培養を、培養液
単独（図では、ＬＤＬ、無細胞または細胞有り、ＬＤＬ無し）、健常対象者由来コントロ
ールＬＤＬ２５０μｇ／ｍＬ（図ではＬＤＬ）およびＬＤＬ＋健常対象者由来コントロー
ルＨＤＬ３５０μｇ／ｍＬ（図では＋ＨＤＬ）とともにインキュベートした。他の混合培
養はコントロールＬＤＬと、種々の量の（横座標に示したμｇ）のＤ−２ＦもしくはＬ−
２Ｆ（左から３番目の図、２Ｆ）、またはＤ−３７ｐＡもしくはＬ−３７ｐＡ（右側の最
後の図、３７ｐＡ）とともにインキュベートした。データは４つの混合培養から得た値の
平均±ＳＤを示す。ＨＤＬおよびペプチド添加の値は、ｐ＜０．０１のレベルでＬＤＬ単
独（左側の最初の図）の場合といずれも顕著な相違を示した。
【０１６６】
混合培養は、１０％のＬＰＤＳの存在下で３７℃で4時間インキュベートされ、穏やか
に酸化されたＬＤＬを生じた。続いて上清を廃棄し、混合培養を洗浄し、血清またはＬＰ
ＤＳを含まない培養液でさらに4時間インキュベートした。この調整培養液を集め、単球
の走化性活性について分析した。図9に示したように、ＬＤＬをＤペプチドでin vitroで
処理することによって、動脈壁細胞によるそれらの酸化が防止された。
【０１６７】
図10は、Ｄペプチドをマウスに投与することによって赤血球細胞が溶血（ビタミンＥに
より防止されることにより酸化による現象、データは示されていない）に対して抵抗性を
もつことを示している。アテローム性硬化症病巣形成の動物モデルとして一般的に用いら
れるＬＤＬレセプター欠損マウス群（ｎ＝３）にＤ−ペプチドまたは食塩水担体を経管投
与によって与えた。各動物に１００μＬの食塩水、１００μｇ／１００μＬのペプチドＤ
−２ＦまたはＤ−３７ｐＡを投与した。１７および４８時間後に軽度の麻酔下で後眼窩洞
から血液を採集した。赤血球を遠心沈澱によって分離し、ＰＢＳで１０％ヘマトクリット
まで希釈し、穏やかに攪拌しながら３７℃でインキュベートした。部分標本をｔ＝０、２
、６および１８時間の時点で取り出し、細胞ペレットを遠心沈澱させ、遊離ヘモグロビン
による光学密度を測定した。
【０１６８】
図１１は、経管投与でＤペプチドをマウスに投与し、続いてＬＤＬを単離することによ
って、単球走化性バイオアッセイで測定したときＬＤＬが動脈壁細胞酸化に抵抗性をもつ
ことを示している。
【０１６９】
別の実験は、Ｄ−ペプチドは胃から吸収され、我々のヒト動脈壁混合培養モデルではＬ
ＤＬが単球走化性活性を誘発できなくなるが、一方２ＦのＬ−ペプチドはこの特性をもた
ないことを示した。食塩水またはＤアミノ酸もしくはＬアミノ酸から合成した２Ｆを経管
投与（管による胃への注入）によってマウスの胃に注入した。経管投与後、マウスから採
血し、ＬＤＬを単離しヒト動脈壁細胞の混合培養に添加した。経管投与によって与えたと
きＤ−ペプチドはＬＤＬを保護し、これは、Ｄ−２Ｆペプチド（Ｄアミノ酸から合成され
た）を投与されたマウスから得たＬＤＬ（Ｄ２ＦＬＤＬ）によって誘発される単球走化性
活性は低いが、Ｌ−２Ｆ（天然のＬアミノ酸から合成された）を投与されたマウスから得
たＬＤＬ（Ｌ２ＦＬＤＬ）は単球走化性を容易に誘発したことによって立証されたとおり
である（図１２を参照されたい）。
【０１７０】
ＬＤＬにinvitroで提示される場合は、Ｌアミノ酸から合成された２Ｆは、Ｄアミノ酸
から合成された２Ｆと同じ程度に有効であった（図９参照）。したがって、ペプチドがin
vivoで経管投与によって与えられる本実験の結果における相違は、Ｄアミノ酸から合成
された２Ｆは完全なままで胃から吸収され、一方、我々の仮説のとおり、天然のＬアミノ
酸から合成された２Ｆペプチドは、消化過程において胃でおよび／または血漿中で分解さ
れたことによると思われる。別の実験で、Ｄ−２Ｆペプチドに対する抗体生成の証拠は認
められなかった。
【０１７１】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＬＤＬレセプターノックアウトマウスに５０μｇのＤ−５
Ｆを経管投与で与えた実験から得られた２つのグラフである。動物から１．５、３または
６時間後に採血し、そのＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ／ＩＤＬを単離した。グラフに
示したように、経管投与後１．５時間で採取したＨＤＬはコントロールＬＤＬを改変から
保護しなかったが、経管投与の３時間後および６時間後より少し前に採取したＨＤＬは、
コントロールＨＤＬと同じ程度でヒト動脈壁細胞によるＬＤＬ誘発単球走化性活性の産生
に対して保護能力を示した（図13Ａ）。別のグラフ（図１３Ｂ）では、５０μｇのＤ−５
Ｆの経管投与後１．５、３または６時間でマウスＬＤＬおよびＶＬＤＬ／ＩＤＬを単離し
た。左の図では、コントロールＬＤＬをヒト動脈壁細胞にコントロールＨＤＬとともにま
たはコントロールＨＤＬを伴わずに添加し、動脈壁細胞によって生成される単球走化性活
性を測定した。中央の図では、５０μｇのＤ−５Ｆの経管投与後１．５、３または６時間
で採取したマウスＬＤＬが動脈壁細胞に添加された。結果は、３時間および６時間後のＬ
ＤＬが誘発した単球走化性活性は顕著に低いことを示した。グラフの右側では、リポタン
パク質のＶＬＤＬ／ＩＤＬ分画（図ではＶ／ＩＬＤＬ）が添加され、図に示されているよ
うに３時間では単球走化性活性の誘発は顕著に低かった。
【実施例３】
【０１７２】
実施例３
クラスＡ両親媒性らせんペプチドの物理化学的および生物学的特性に対する疎水性増加
の影響
略語リスト
Ａｃ2Ｏ＝無水酢酸；アポＡ−Ｉ＝アポリポたんぱく質Ａ−Ｉ；ＢＳＡ＝ウシ血清アル
ブミン；ＣＡＤ＝冠状動脈疾患；ＣＤ＝円偏光二色性；ＤＭＰＣ＝ジミリストイルホスフ
ァチジルコリン；ＤｉＰｏＰＥ＝ジ（１６：１）パルミトオレオイルホスファチジルエタ
ノールアミン；ＤＳＣ＝示差走査熱分析（Differential Scanning Calorimetry）；ＥＤ
ＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸；ＥＰＣ＝卵黄ホスファチジルコリン；ＦＭＯＣ＝フ
ルオリニルメチルオキシカルボニル；ＧｄｎＨＣｌ＝塩酸グアニジン；ＨＡＥＣ＝ヒト大
動脈内皮細胞；ＨＡＳＭＣ＝ヒト大動脈平滑筋細胞；ＨＢＴＵ＝２−（Ｈ−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェ
ート；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＬＣＡ
Ｔ＝レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ；ＭＣＰ−１＝単球走化性タンパ
ク質−１；Ｍ−ＣＳＦ＝マクロファージコロニー刺激因子；ＭＬＶ＝多層（multilamella
r）小胞；ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルフォリン；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水；ＰＩＰＥＳ＝
ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−エタンスルホン酸］；ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体
クロマトグラフィー；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
要約
我々は最近、両親媒性が増強されたクラスＡ両親媒性ペプチド５Ｆは、食餌誘発性アテ
ローム性硬化症からマウスを防御することを示した。我々は、現に存在する極性アミノ酸
を系統的にフェニルアラニンで置換することによって、アテローム性硬化症抑制に関する
物理的および機能的特性に対する一連のクラスＡ両親媒性ペプチド同族体（５Ｆを含む）
の疎水性増強の影響を調査した。前記ペプチドは、配列Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−
Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ−ＮＨ2（配列識別番号：１、Ａｃ−
１８Ａ−ＮＨ2または２Ｆ）を基にして以下のとおりであった：３Ｆ3（Ａｃ−Ｆ3１８Ａ
−ＮＨ2）、３Ｆ14（Ａｃ−Ｆ14１８Ａ−ＮＨ2）、４Ｆ（Ａｃ−Ｆ3,14１８Ａ−ＮＨ2）
、５Ｆ（Ａｃ−Ｆ11,14,17１８Ａ−ＮＨ2）、６Ｆ（Ａｃ−Ｆ10,11,14,17１８Ａ−ＮＨ2
）、および７Ｆ（Ａｃ−Ｆ3,10,11,14,17１８Ａ−ＮＨ2）。水への溶解度、ＨＰＬＣ保持
時間、卵黄ＰＣ単層膜中への浸透に対する排除圧（exclusion pressure）、および卵黄Ｐ
Ｃ可溶化速度の測定によってペプチド４Ｆと５Ｆの間で突然疎水性が増加することが明ら
かになった。これは、リン脂質との結合能力増加を伴った。ペプチド６Ｆと７Ｆは影響が
より少なく、これらのペプチドで脂質との相互作用の促進に対する疎水性増強の限界を示
唆した。脂質親和性における前記の顕著な増強にもかかわらず、これらのペプチドは、血
漿酵素、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化にお
いてアポＡ−Ｉよりも有効性は低かった。すなわち、５ＦがＬＣＡＴをもっとも強く活性
化し、それはアポＡ−Ｉの８０％であった。ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆは、ＬＤＬ誘
発単球走化性活性の抑制に等しく有効であった。これらの実験は、ペプチド−ペプチドお
よびペプチド−脂質相互作用間の適切なバランスが、両親媒性ペプチドの最適な生物学的
活性に要求されることを示している。これらの実験は、アテローム性硬化症抑制能力が強
化された小型アポＡ−Ｉ摸倣体のデザインのための理論的根拠を提供する。
【０１７３】
序論
高密度リポタンパク質およびアポＡ−Ｉ（ＨＤＬの主要なタンパク質構成成分）の血漿
レベルは、冠状動脈疾患と反比例する（Sprecher et al.(1993) Arterioscler. Thromb. 
13:495-504;Philips et al.(1993) Circulation 88:2762-2770）。ヒトアポＡ−Ｉは２
４３残基のタンパク質で、２２量体の両親媒性らせんリピートを８つ含み、前記リピート
の大半はクラスＡモチーフを有することが示された（Segrest et al.(1990) Proteins 8:
103-117;Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Ep
and ed.), CRCPress, Boca Raton, FL）。クラスＡ両親媒性らせんは特徴的な電荷分布
を有する。すなわち、それらは、αらせんの極性／非極性境界に陽性荷電アミノ酸集団を
、さらに極性面の中心に陰性荷電残基を有する（Segrest et al.(1990) Proteins 8:103-
117;Anantharamaiah et al.(1993) pp.109-142, "The Amphipathic Helix (R.M. Epand
ed.), CRCPress, Boca Raton, FL; Segrest et al.(1992) J. Lipid Res. 33:141-166）
。前記ユニークな二次構造モチーフは、アポＡ−Ｉの脂質結合特性に寄与していると説明
されている（Segrestet al.(1990) Proteins 8:103-117）。クラスＡ両親媒性らせんの
合成類似体に関する多くの実験が前記の考えを支持した（Segrest er al.(1994) Adv. Pr
ot. Chem.,45:303-369; Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim. Biophys. Act
a 1256:103-129）。
【０１７４】
最近我々は、ヒトアポＡ−Ｉに存在する仮想の２２量体らせんの各々をモノマーおよび
タンデムダイマーとして合成し、そのＮ−末端およびＣ−末端両親媒性らせんが最大の脂
質結合能をもつことを示した（Mishra et al.(1998) Biochemistry 37:10313-10324）。
アポＡ−Ｉのエクソン４（４４−２４３残基）のＸ線結晶構造および分子モデリング研究
によって、全長のアポＡ−Ｉ分子同士の結合状態が脂質の結合に必要であることが示唆さ
れた（Borhaniet al.(1999) Proc.
Natl. Acad.Sci. USA, 94:12291-12296; Segrest et al.(2000) Current Opin. Lipidol
. 11:105-115）。このモデルでは、アポＡ−Ｉの２つの分子は頭−尾結合のダイマー形で
配列され、１つのモノマーが互いに相互作用してアポＡ−Ｉの脂質結合構造を安定化させ
る。
【０１７５】
実験により得られた証拠は、冠状動脈疾患に対するアポＡ−ＩおよびＨＤＬの保護効果
は、“逆コレステロール輸送”におけるそれらの役割によるものであろうということを示
唆している（Fielding& Fielding (1995) J. Lipid Res. 36:211-228; Glomset (1968) 
J. Lipid Res.9:155-167）。逆コレステロール輸送は、ＨＤＬ／アポＡ−Ｉを必要とす
る以下の３つの工程の合算である：ａ）ｘｘ細胞からのコレステロールの流出（Johnson 
et al.(1991)Biochim. Biophys. Acta.1085:273-298; Oram & Yokoyama (1996) J. Lipi
d Res.37:2473-2491）、ｂ）ＨＤＬ結合コレステロールのＬＣＡＴによるエステル化（F
ielding etal.(1972) Biochem. Biophys. Res. Comm. 46:1493-1498; Jonas (1991) Bio
chim. Biophys.Acta 1084:205-220）およびｃ）肝臓へのコレステロールエステルのレセ
プター介在輸送（Kreiger(1991) Ann. Rev. Biochem. 68:523-558）。In vivo実験によ
って、ヒトアポＡ−ＩおよびクラスＡ合成両親媒性らせんペプチドは、両方とも逆コレス
テロール輸送とは独立したメカニズムによって、血漿コレステロールレベルを変化させる
ことなくアテローム性硬化症を抑制することが示された（Shah et al.(1998) Circulatio
n 97:780-785）。最近我々は、動脈壁細胞内へのＬＤＬ誘発単球走化性の抑制は、アテロ
ーム性硬化症の防止においてアポＡ−ＩおよびＨＤＬが演じるまた別の主要な役割である
ことを示唆した（Navabet al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000
) J. LipidsRes. 41:1495-1508）。
【０１７６】
ヒトアポＡ−Ｉの特性と類似することが示されたペプチド、１８Ａはまた、ＬＣＡＴ活
性化能（Anantharamaiahet al.(1990) Arteriosclerosis 10:95-105; Epand et al. (19
87) J. Biol.Chem. 262:9389-9396）およびコレステロール流出能（Davidson et al.(19
94) J. Biol.Chem. 269:22975-22982; Yancey et al.(1995) Biochemistry 34:7955-796
5）を有することが示された。１８Ａの末端荷電を中和して、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ2を生成
することによって、その脂質親和性および生物学的活性が増強されることが示された（Ya
ncey etal.(1995) Biochemistry 34:7955-7965; Venkatachalapathi et al.(1993) Prot
eins:Structure, Function and Genetics 15:349-359）。この“親”分子、１８Ａのア
ミノ酸配列のいくつかの改変が、そのアポＡ−Ｉ類似特性を改善するために実施された（
Brouillette& Anantharamaiah (1995) Biochim Biophys. Acta 1256:103-1291; Mishra 
et al.(1994) J.Biol. Chem. 269:7185-7191; Mishra et al.(1995) J. Biol. Chem. 27
0:1602-1611）。
【０１７７】
我々の以前の実験（Brouillette & Anantharamaiah (1995) Biochim Biophys. Acta 12
56:103-1291;Epand et al.(1987) J. Biol. Chem. 262:9389-9396）は、このペプチドの
疎水性の増加は、その脂質親和性およびアポＡ−Ｉ類似特性を増加させることを示した。
合成ペプチド５Ｆ（両親媒性が増強されたＡｃ−１８Ａ−ＮＨ2の類似体）は食餌誘発性
アテローム性硬化症をマウスで抑制することが示された（例えば実施例１および２を参照
されたい）。しかしながら、ペプチド２Ｆは、Ｃ５７ＢＬ６マウスでは食餌誘発病巣形成
を顕著には抑制しなかった（Garber et al.(1999) Circulation 100:I538）。１８Ａダイ
マーペプチドの実験は、ペプチド−ペプチド結合の増加はペプチド：脂質結合を低下させ
ることを示した（Mishraet al.(1995) J. Biol. Chem. 270:1602-1611）。
【０１７８】
脂質結合特性およびアポＡ−Ｉ類似特性を伴いつつ、１８Ａペプチドの脂質親和性を増
加させることができる最大限度を決定するために、非極性面の疎水性アミノ酸（例えばＬ
ｅｕおよびＡｌａ）をＰｈｅで置換することによってＰｈｅ残基が系統的に増加する一連
の同種ペプチドをデザインした。Wimley & White（Nature Struc. Biol. 3:842-848(1996
)）の実験的に決定された疎水度基準にしたがえば、ＴｒｐおよびＰｈｅは、それらが水
相から膜内への最大の分配を示すという意味でもっとも疎水性のアミノ酸である。膜活性
ペプチドにおいてＰｈｅがもっとも耐酸性疎水性アミノ酸であり、さらにＰｈｅ含有ペプ
チドはＴｒｐ含有ペプチドよりも容易に合成できるので、我々はＰｈｅをペプチドの疎水
性の増加に用いた。物理的特性および脂質結合特性、並びにアポＡ−Ｉに類似する生物学
的特性（例えばＬＣＡＴ活性化およびＬＤＬ誘発走化性活性の抑制）に対する前記疎水性
増加の影響を調べた。
【０１７９】
実験方法
ペプチド合成
ペプチドは、自動固相合成装置（PS3 Protein Technologies, Woburn, MA）を用いて固
相法によって合成した。ＦＭＯＣ−アミノ酸をリンクアミド樹脂（０．５３６ｍＥｑ／ｇ
）（PeninsulaLaboratories, Inc. Belmont, CA）とＨＢＴＵおよびＮＭＭの存在下で結
合させ、Ｎ−末端を無水酢酸でアセチル化した。アニソール（１％）、メルカプトエタノ
ール（０．１％）およびトリプトファン（ペプチド樹脂の重量の２０％）の存在下で、ジ
クロロメタン中の７０％のＴＦＡを用いてペプチドを固相支持体から切断し、ＶＹＤＡＣ
Ｃ−４（２２ｍｍ×２５ｃｍ、粒子サイズ１０μｍ）逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カ
ラム上で、水に２５％から５８％の０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルのグラディエント
（２２分）を用い４．８ｍＬ／分の流速で６６分かけて精製した。ペプチドの純度は、Ｃ
18カラム（ＶＹＤＡＣ、４．６ｍｍ×２５ｃｍ、５μｍ）およびアセトニトリル−水（０
．１％ＴＦＡ含有）の２５％から５８％の直線グラディエントを用い３３分かけて分析用
ＲＰ−ＨＰＬＣによって確認し、さらに質量分析によって確認した。
【０１８０】
円偏光二色性
ＣＤスペクトルはＡＶＩＶ・６２ＤＳ分光偏光計で文献（Mishra et al.(1994) J. Bio
l. Chem.269:7185-7191）にしたがって記録した。簡単に記せば、通過窓の長さが０．１
ｃｍのセルを用いてスペクトルを得て、測定値は、２６０ｎｍから１９０ｎｍまで１ｎｍ
毎に２５℃で採取した。全てのＣＤスペクトルは４つのスキャンを合算することによって
平均化したシグナルであった。基準線は修正し凹凸を無くした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中
のペプチド溶液は１１μＭの濃度で用いた。ペプチド−ＤＭＰＣ複合体（１：２０ｍｏ
ｌ：ｍｏｌ）を用いて、これらペプチドのらせんに対するペプチド結合の影響を決定した
。これら複合体は、適切な容積のペプチド溶液をＤＭＰＣ多層小胞に添加することによっ
て調製した。ＤＭＰＣ多層小胞は以下のようにして調製した：既知量の脂質をエタノール
に溶解し、希薄な窒素流の下でゆっくり蒸発させることによって溶媒を除去した。残留溶
媒は脂質フィルムを真空下に一晩保存することによって除去した。適切な容積のＰＢＳ（
ｐＨ７．４）を薄い脂質フィルムに添加して、要求される最終濃度のＤＰＭＣを得た。脂
質−ペプチド複合体は必要な容積のペプチド溶液を添加することによって調製し、２０：
１の脂質：ペプチドモル比を得た。これらペプチドの溶解度が小さいので、１１μＭのペ
プチド濃度を用いた。２２２ｎｍの平均残基楕円率、[θ]MRE（ｄｅｇ．ｃｍ2．ｄｍｏｌ
-1）は以下の等式を用いて計算した：
[θ]MRE＝ＭＲＷ[θ]／１０ｃｌ
式中、ＭＲＷはペプチドの平均残基重量であり、θは度で表した観察された楕円率であり
、ｃはｇ／ｍＬで表したペプチドの濃度であり、ｌはセンチメートルで表したセルの観察
窓の長さである。ペプチドのパーセントらせん度は、Morrisettら（Biochemistry 12:129
0-1299(1973)）が記載した以下の等式から概算した：
％αらせん度＝（[θ]222＋３０００）／（３６０００＋３０００）
式中、[θ]222は２２２ｎｍでの平均残基楕円率である。
【０１８１】
示差走査熱分析
ＤＳＣ実験は、マイクロカルＭＣ−２走査熱分析計（MicroCal, Inc., Amherst, MA）
を用い、ＤＭＰＣについては走査速度２０℃／時間で、ＤｉＰｏＰＥについては走査速度
３７℃／時間で文献（Mishra et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7185-7191）に記載さ
れた方法を用いて実施した。既知量のリン脂質をクロロホルムに溶解した。サンプル１組
について、ペプチドをメタノールに溶解し、クロロホルム／メタノール（２：１、ｖ：ｖ
）中のＤｉＰｏＰＥの溶液に添加した。純粋な脂質サンプルおよび脂質とペプチドの有機
溶液の両方について、溶媒をゆっくりとした窒素流の下で除去した。残留溶媒は真空下で
除去した。緩衝液（ＤＭＰＣ用はｐＨ７．４、ＰＢＳ、ＤｉＰｏＰＥ用はｐＨ７．４、２
０ｍＭＰＩＰＥＳ，１ｍＭＥＤＴＡ，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．００２％ＮａＮ3）
単独、または固有の脂質／ペプチドモル比を提供するために緩衝溶液中の既知濃度のペプ
チドを前記乾燥フィルムに添加し、さらに室温で３０分ボルテックスミキサーで水和させ
た。ＤＭＰＣの場合は、スキャンの間に６０分の平衡化時間を含む４つの連続スキャンを
実施した。ＤＳＣサーモグラムは、マイクロカル社（MicroCal Inc., Amherst, MA）が提
供するソフトおよびオリジン（Origin）バージョン５．０を用いて分析した。
【０１８２】
表面圧測定
単層排除圧（monolayerexclusion pressure）測定は、脂質−水境界面に対するペプチ
ドの親和性を提供し、PhillipsとKrebsの方法（Phillips & Krebs (1986) Methods Enzym
ol.128:387-403; Ibdah et al.(1989) Biochim. Biophys. Acta 1004:300-308）に従っ
た。卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）の不溶性単層膜をテフロン（登録商標）皿内の
空気−水境界面に室温で広げて５−４５ｄｙｎ／ｃｍの最初の表面圧（πi）を提供した
。１．５Ｍの塩酸グアニジンを含むＰＢＳ中のペプチド溶液を下相に注意深く注入し、５
０μｇ／ｄＬの最終濃度を提供した。塩酸グアニジンをサブフェース中で１ｍＭ以下の最
終濃度に希釈して、ペプチドを再生させた。サブフェースを持続的に攪拌しＥＰＣ単層膜
の表面圧の増加（Δπ）を定常値が得られるまで記録した。ペプチドがもはやＥＹＰＣ単
層膜に進入しない最初の表面圧（πi），すなわち排除圧（πe）は、πi対Δπ直線回帰
適合をΔπ＝０ｄｙｎ／ｃｍに外挿することによって計算した。
【０１８３】
直角光散乱測定
これらペプチドと卵黄ホスファチジルコリンとの結合は、文献（Mishra et al.(1994) 
J. Biol. Chem.269:7185-7191）に記載されたように、ＳＬＭ８０００Ｃ光子計測スペク
トロフルオロメーターを用いて直角光散乱により、ＥＰＣ多層小胞の分解を追跡すること
によって決定した。ＥＰＣＭＬＶは、ＥＰＣ（Avanti Polar, AL）の溶液を窒素下で蒸発
させ、さらに脂質フィルムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で水和させることによって
調製した。１０５μＭのＥＰＣおよび等モル量のペプチドを含むサンプルを２５℃で維持
し、持続的に攪拌した。濁り度の清澄化を３０分モニターした。ＥＰＣ小胞の完全な溶解
は、最終濃度１ｍＭのＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加によって達成された。
【０１８４】
レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の精製
ＬＣＡＴを新鮮な血中脂肪値正常血漿から文献（Albers et al.(1986) MethodsEnzymol
. 129:763-783）の方法にいくつかの改変を加えて単離した。血漿密度を１．２１ｇ／ｍ
Ｌに調節し、１７５０００ｇで２４時間遠心した。ＬＣＡＴ含有分画をアフィ−ゲル（Af
fi-Gel）ブルークロマトグラフィーに、続いてＤＥ−５２クロマトグラフィーに付した。
トリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）中の７５から２００ｍＭのＮａＣｌグラディエン
トを用いてＬＣＡＴをＤＥ−５２カラムから溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ヒト
アポＡ−Ｉが夾雑していない９０％を越える純度の酵素であると分かった。
【０１８５】
ＬＣＡＴ活性のアッセイ
微量の７α−3Ｈコレステロールを含む卵黄ＰＣ／コレステロール（９０：２０モル／
モル）をブランソン２５０ソニケーターで１２分超音波処理し、小さい単層小胞を作製し
て基質を調製した。前記基質（５０μＬ）を５μｇのペプチドまたはヒトアポＡ−Ｉおよ
び５０μＬのＢＳＡ（４０μｇ／ｍＬ）とともに１時間３７℃でインキュベートした。総
容積を１５０μＬまで増やした。１時間インキュベートした後、１００μＬのＬＣＡＴを
添加し、３７℃で１時間インキュベートし、さらにシリカ片上に１０μＬを滴下すること
によって反応を停止させた。ヘキサン：クロロホルム（２：１ｖ／ｖ）混合物中でシリカ
片の薄層クロマトグラフィーによって、コレステロールとコレステリルエステルを分離さ
せた。コレステロールおよびコレステリルオレエート標準物は、３％の酢酸第二銅、８％
のリン酸緩衝液中にＴＬＣプレートを浸漬し加熱することによって可視化した。標準物の
位置を用いて前記プレートを２つに切断し、この２つの部分をパッカードトリカーブ（Tr
i Carb）４５３０中でシンチレーション液で計測した。全反応を３組ずつ実施した。ペプ
チドによるＬＣＡＴの活性化は、アポＡ−Ｉによる全活性化の百分率で表される。
【０１８６】
電気泳動
非変性ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥはLaemmliの方法（Nature 227:680-685(1970)
）を用いて実施した。プリメードノベックス（Premade Novex）ゲルを用い、さらにゲル
はクーマシーブルーで染色してタンパク質バンドを特定した。
【０１８７】
ＬＤＬ誘発単球走化性活性
ヒト動脈壁細胞の混合培養、単球の単離、健常者ドナー血漿からの超遠心沈澱による、
またはマウス血漿からのＦＰＬＣによるリポタンパク質の単離、並びに脂質ペルオキシド
および単球走化性活性の測定は、文献の記載にしたがって実施した（Navab et al.(1991)
J. Clin.Invest. 88:2039-2046; Navab et al.(1977) J. Clin. Invest. 99:2005-2019
）。簡単に記せば、ＬＤＬおよびＨＤＬをヒト血漿からHavelら（J. Clin. Invest. 43:1
345-1353(1955)）の方法によって単離した。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）および平滑
筋細胞（ＨＡＳＭＣ）を文献（Navab et al.(1991) J. Clin. Invest. 88:2039-2046）に
記載にされたように単離した。マイクロタイタープレートを０．１％のゼラチンで３７℃
で一晩処理した。ＨＡＳＭＣを１×１０5細胞／ｃｍ2の密集成長した密度で添加した。細
胞を２日間培養し、このとき細胞はウェルの表面全体を覆い、かなりの量の細胞外マトリ
ックスを産生していた。続いてＨＡＥＣを２×１０5細胞／ｃｍ2で添加して増殖させ、２
日間で密集成長したＨＡＥＣの完全な単層培養が形成された。全ての実験で、ＨＡＥＣお
よび同一個体由来のＨＡＳＭＣを４代から６代の継代レベルで用いた。単球は健常なドナ
ーから文献（Fogelmanet al.(1988) J. Lipid Res. 29:1243-1247）に記載されたように
単離した。混合培養は天然のＬＤＬ（２５０μｇタンパク質／ｍＬ）で処理するか、また
はＨＤＬ（３５０μｇタンパク質／ｍＬ）もしくはペプチドの存在下で８時間処理した。
続いて前記混合培養を洗浄し、メディウム１９９でさらに８時間インキュベートした。得
られた混合培養上清を文献（Navab et al.(1997) J. Clin. Invest. 99:2005-2019）の記
載にしたがって単球走化性活性についてアッセイした。
【０１８８】
結果
ペプチドの分析
表６は、合成した種々の１８Ａ類似体の配列を示す。ペプチドＡｃ−１８Ａ−ＮＨ2（
前記は２つのＰｈｅ残基を６位および１８位（境界面のリジン残基の近く）に有する）は
２Ｆと称される。２つの３Ｆペプチド、３Ｆ3または３Ｆ14を合成した。前記ペプチドで
は、３位および１４位のＬｅｕ（両方とも非極性面の中心に存在する）がそれぞれＰｈｅ
によって置換されている。ペプチド４Ｆは、非極性面の中心に２つのＰｈｅを有し、これ
は２つの中心部のＬｅｕ残基が置換された結果である。ペプチドの置換（３Ｆから７Ｆ）
は表６に示されている。Ｐｈｅ残基の数が増加するにつれて、非極性面上の残基当たりの
理論的疎水性が、ペプチド２Ｆに対する２．０５から７Ｆに対する３．１５に増加する。
【０１８９】
表６：疎水性を増加させるためのＡｃ−１８Ａ−ＮＨ2の改変
2010280718.tif 000011
【０１９０】
1基本配列１８Ａ  ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列識別番号：２）
2疎水性は非極性面上の残基当たりの疎水性として表されている。
3理論的脂質親和性は文献（Palgunachari etal.(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. B
iol. 16:328-338）の記載に示されているように計算した。
【０１９１】
ペプチドは、調製用ＶｙｄａｃＣ4カラムで逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣにより、水（０．
１％トリフルオロ酢酸含有）とアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸含有）を用い
て精製した。ペプチドの純度および保持時間は、分析用ＶｙｄａｃＣ18カラムで水にアセ
トニトリル２５％−５８％のグラディエント（０．１％ＴＦＡ含有）を用いて決定した。
前記ペプチドの純度はまた質量分析法によって確認した。前記質量は計算によって得られ
た分子量と一致した。ペプチドの保持時間は表７に示されている。３Ｆペプチドおよび４
Ｆペプチドはともに２Ｆと比較して付加されたＰｈｅ残基を有するが、Ｃ18カラムにおけ
るこれらペプチドの保持時間は大きくは相違しない（〜２２分）。保持時間における突然
の増加は５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆで明白である（〜２６分）。Ｐｈｅ残基の数が増すにつれ
、これらペプチドのＰＢＳ中の溶解度は減少する。表７から明らかなように、２Ｆ、３Ｆ
3，３Ｆ14および４Ｆの溶解度（１．２５から１．４ｍｇ／ｍＬ）は、５Ｆ、６Ｆおよび
７Ｆの溶解度（０．０３から０．１ｍｇ／ｍＬ）よりも顕著に高い。
【０１９２】
表７：Ｆ−ペプチドの物理的特性
2010280718.tif 000012
【０１９３】
1質量分析によって決定した質量は、理論的に計算で得られた分子量と極めて近かった。
2保持時間は、水にアセトニトリル２５％−５８％（３３分）のグラディエント（０．１
％ＴＦＡ含有）を用いＶｙｄａｃＣ18カラムから溶出したペプチドについて得られた時間
である。
3溶解度はＰＢＳ中で決定された。
4これらの測定の再現性は±１ｄｙｎ／ｃｍである。
【０１９４】
これらの両親媒性ペプチドの自己結合を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）で調べた。図１４は、変性ＳＤＳゲル（図１４Ａ）および非変性ゲル（図１４Ｂ）
の両方での２Ｆの移動度を示している。２Ｆの分子量は２２４２であり、もっとも小さい
分子量標準物質（３．５−２．５ｋＤａ）よりもわずかに遅く移動する単一のバンドとし
てＳＤＳゲル（図１４Ａ）上に認められる。しかしながら、図１４Ｂで認められるように
、前記は非変性条件下では濃度依存態様で凝集物を形成する。低濃度（１００μｇ／ｍＬ
）では、前記は２つのサイズの凝集物を形成するが、高濃度（２５０μｇ／ｍＬ）では、
より大きな凝集物のみが形成される（図１４Ｂ）。調べた他の全てのペプチドもまた非変
性条件下で凝集物を示し、これらペプチドは強い自己結合傾向を有することを示唆してい
る。
【０１９５】
円偏光二色性
ペプチドの二次構造は円偏光二色性分光分析によって決定した。表８は、ＰＢＳ中およ
びＤＭＰＣ存在下でのペプチドのパーセントらせんを示している。ＰＢＳ中では、同族体
２Ｆ、４Ｆ、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆは、３Ｆ3および３Ｆ14よりも高いらせんパーセント
を有する（表８）。５Ｆ、６Ｆおよび７ＦはＰＢＳに難溶であるので、ＣＤ実験は１１μ
Ｍのペプチド（それらが完全に溶解する濃度）を用いて実施した。ペプチド２Ｆは、溶液
中の５Ｆに匹敵する５５％らせんを示した。６Ｆおよび７Ｆは両方ともわずかに高いらせ
ん（それぞれ６７％および５８％）を示し、４Ｆはわずかに低かった（４５％）。３Ｆペ
プチドは両方ともはるかに低いらせんを示した（〜２０％）。しかしながら、ＤＭＰＣへ
の結合は、６Ｆを除いて全てのペプチドのらせんを顕著に増加させた（表８）。脂質環境
下では、２Ｆ、５Ｆおよび７Ｆは高いらせん含有量（６８％から７６％）を示した。ペプ
チド３Ｆ3および３Ｆ14はＰＢＳ中ではらせん含有量は非常に少ないが、脂質環境下では
顕著ならせんの増加があった（３Ｆ3については約２２％から４２％に、３Ｆ14について
は１９％から５５％に増加）。ペプチド６Ｆおよび４Ｆのらせんは、脂質の存在下でもそ
れほど変化しなかった。しかしながら、これらのペプチドはなお２Ｆおよび５Ｆペプチド
よりもらせん的でなかった。ＣＤの結果は、Ｐｈｅによる置換の増加に関してペプチドの
らせん形成に系統的な変化は存在しないことを示唆している。ペプチド２Ｆおよび５Ｆは
溶液中およびリン脂質の存在下で最大らせんを示した。
表８：水性環境および脂質環境下でのＦペプチドのらせん形成
2010280718.tif 000013
【０１９６】
1１１μＭのペプチド溶液を用いた。用いたペプチド：ＤＭＰＣ比は１：２０（ｍｏｌ／
ｍｏｌ）であった。３回の測定を実施し、±１０％の誤差を得た。
ＤＭＰＣ及びＤｉＰｏＰＥを用いたＤＳＣの研究
ＤＭＰＣの多層小胞の鎖溶融遷移に対するこれら１８Ａ類似体の影響をペプチド−脂質
混合物（脂質／ペプチドモル比１００：１）を用いて調べた。表９は、ペプチドの存在下
および非存在下でのＤＭＰＣの鎖溶融遷移の遷移温度並びにエンタルピーを示す。純粋な
脂質は１３℃で予備遷移を、２３℃で主要な鎖溶融遷移を示す。ＤＭＰＣへのペプチドの
添加は、ゲルから液晶への遷移の拡大、および遷移エンタルピーの低下をもたらした（表
９）。予備遷移はいずれのペプチドの存在下でも認められなかった。調べたペプチドの中
で２Ｆ、３Ｆ3、５Ｆおよび６Ｆが遷移エンタルピーを最も大きく減少させた（表９）。
いずれのペプチドも遷移温度の変化は０．２℃を越えなかった。
【０１９７】
表９：ＤＭＰＣの鎖溶融遷移パラメーターに対するＦペプチドの影響
2010280718.tif 000014
【０１９８】
用いたＤＭＰＣ／ペプチド比は１００：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。用いたＤＭＰＣ
の濃度は１．５ｍＭであった。ＴCMは鎖溶融遷移が生じる温度で、ΔＨCMは遷移のエンタ
ルピーで、ΔT1/2は遷移の最大値の半値幅である。
【０１９９】
二重層から六方晶形相への遷移温度（ＴＨ）におけるシフトは、リン脂質の固有の屈曲
特性に対するペプチドの影響を評価するために用いられた（Epand (1998) Biochim. Biop
hys. Acta1376:353-368）。２ＦはＤｉＰｏＰＥのＴHを上昇させることが以前に示され
た（Tytleret al.(1993) J. Biol. Chem. 268:22112-22118）。これまでの実験で我々は
２つの方法でペプチド−脂質混合物を調製した。１つは、有機溶媒中のペプチドを有機溶
媒中の脂質に添加し、続いて前記物質をフィルムとして沈積させ、さらに緩衝液で水和さ
せる方法である。他の方法では、ペプチドおよび脂質を別々に水和させた後でそれらを混
合する。混合物がＤＳＣ分析の前に平衡化すれば、ペプチドと脂質が最初にどのようにし
て混合されたかは重要ではない。しかしながら、膜系はゆっくりと平衡化させることがで
き、その場合には、ペプチドが脂質フィルムに高濃度で取り込まれるときはより多くのペ
プチドが脂質中に存在することができる。一般に、両方法によるサンプル調製の結果は同
様であるが（結果は示されていない）、ＴHのシフトは、脂質とペプチドで構成されたフ
ィルムにペプチドが取り込まれたサンプルでより大きい傾向がある。ペプチドのモル濃度
分画に関するＴHのばらつきは、種々のペプチドおよびアポＡ−Ｉについて示されている
（図１５）。ＴHにおける直線状の増加が２Ｆおよび５Ｆについて観察されるが、４Ｆは
、より迅速な増加が低いペプチド濃度で観察されるという点においてアポＡ−Ｉに類似す
る態様を示す。他方、２つの３Ｆ類似体は、６Ｆおよび７Ｆと同様にＴHに顕著な影響を
与えない。
【０２００】
ペプチドとリン脂質単層膜との相互作用
単層の排除圧（πe）は、ペプチドがもはやＥＰＣ単層膜に侵入できない表面圧である
。πeの値はペプチドの理論的脂質親和性を反映する。Ｆペプチドの排除圧はＰｈｅ残基
の数が増加するにつれ増加する（表７）。ここで調べた全てのペプチドが、アポＡ−Ｉお
よび親ペプチド１８Ａよりも高い排除圧を有していた。πeの値は２Ｆから４Ｆへと（３
８から４０ｄｙｎ／ｃｍ）徐々に増加した。これは３７ｐＡ（プロリンが間に入った１８
Ａのタンデムリピート）について観察された範囲内である。排除圧値は５Ｆ、６Ｆおよび
７Ｆについて顕著に増加した（４０から４５ｄｙｎ／ｃｍ）。排除圧によって決定された
ように、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆ同族体は、ＥＰＣ単層膜と類似の相互反応能力を有するこ
とは明白である。表７に挙げたＦペプチドは、ＨＰＬＣ保持時間および単層膜排除圧につ
いて類似傾向を有し、４Ｆと５Ｆの間で急激な増加を示すことは興味深い。
【０２０１】
直角光散乱
図１６で認められるように、アポＡ−Ｉ（ＥＰＣＭＬＶを清澄化できない）と異なり、
全てのペプチドがＥＰＣＭＬＶを清澄化することができた。３Ｆの２つの同族体ペプチド
はＥＰＣＭＬＶの清澄化でもっとも有効性が低かった。同族体ペプチド２Ｆ、５Ｆ、６Ｆ
および７Ｆは全てＥＰＣＭＬＶを同程度に清澄化した。ペプチド４Ｆは、ＥＰＣＭＬＶを
もっとも効果的に清澄化し、活性はＴｒｉｔｏｎＸ−１００のそれと類似していた。ＥＰ
ＣＭＬＶの濁り度の５０％クリアランスのための時間もまた４Ｆ同族体でもっとも短かっ
た。ペプチド７Ｆは５０％クリアランスの達成のためにもっとも長時間を要し、これは、
最初のラグ時間（〜３００秒）のためであった（図１６）。前記はおそらく、ＥＰＣＭＬ
Ｖと相互作用する前に自己結合した７Ｆ分子が分解し、それらを可溶化させる必要性があ
るからであろう。同族体２Ｆ、５Ｆおよび６Ｆによって示されたより遅いクリアランス速
度もまた、これらペプチドの高い自己結合が原因であるかもしれない。
【０２０２】
血漿酵素ＬＣＡＴの活性化
これらのペプチドの血漿酵素ＬＣＡＴを活性化する能力を、基質として卵黄ＰＣ−コレ
ステロール小胞を用いＬＣＡＴ反応の最初の粘度を測定することによって決定した（図１
７）。ＬＣＡＴ活性化は、アポＡ−Ｉによる活性化（これを１００％とする）との比較で
表される。２０μｇ／ｍＬのペプチドおよびアポＡ−ＩによるＬＣＡＴの活性化は図４に
示されている。この濃度では、アポＡ−Ｉはいずれのペプチドよりも良好にＬＣＡＴを活
性化する。ここで調べたペプチドの中では、しかしながら５Ｆが最良の活性化物質である
（アポＡ−Ｉの８０％）。ＬＣＡＴ活性化に関するかぎり、３Ｆ3および３Ｆ14は同様な
活性化能力を有している。したがって、それらは１本の棒線で表した（図１７）。
【０２０３】
ＬＤＬ誘発単球走化性活性
ＬＤＬをヒト動脈壁混合培養系とともにインキュベートしたとき、ＬＤＬは内皮下腔に
捕捉され、酸化されて生物学的に活性な脂質を生じる。これらの脂質は単球走化性を誘発
する。したがって、混合培養単球走化性は、生物学的に活性な脂質の生成についての十分
に確立されたアッセイである。走化性の抑制は “シーディング分子”の除去と正比例す
ることが示された。前記シーディング分子は、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の
分泌（Navabet al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid
Res.41:1495-1508）および分化因子、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）
の分泌に必要である。図１８は、ペプチドとインキュベートした後のＬＤＬが作用の変動
を表すことを示し、ＬＤＬの走化性特性は同族体４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆによりもっとも減
少する。ペプチド３Ｆは、２Ｆおよび７Ｆと比較して全く有効性がなく、２Ｆおよび７Ｆ
は、４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆよりも有効性は低かった。
【０２０４】
考察
クラスＡ両親媒性らせんペプチド類似体の疎水性増加によるその物理化学的特性および
脂質結合特性に対する影響
本明細書で調べたペプチドは親ペプチド１８Ａの同族体である。非極性面上の残基当た
りの計算による疎水性（改変ＧＥＳスケールによる（Palgunachari et al.(1996) Arteri
oscler. Thromb.Vasc. Biol. 16:328-338））は、Ｐｈｅ残基の数が増すにつれ増加する
。疎水性におけるこの増加（表６）は、理論的な脂質親和性、Λにおいて再現される（上
掲書）。しかしながら、Λ値は、２Ｆから４Ｆまで徐々に増加し（１３．０３から１４．
５９）、さらに突然１４．５９（４Ｆの場合）から１９．０７（５Ｆの場合）の値に増加
する。Λが徐々に増加するのが５Ｆの後に６Ｆおよび７Ｆに対する値で再び観察される（
表６）。これは、Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ2の３位および１４位のＬｅｕがＰｈｅで置換され
たことによる。Ｐｈｅは、非極性面の疎水性のわずかな増加をもたらし、したがって２つ
の３Ｆ類似体および４ＦのΛ値にわずかな増加が生じる。同族体５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆで
は、しかしながら、ＬｅｕからＰｈｅへの置換の他に、１１位および１７位のＡｌａもま
たＰｈｅで置換され、Λ値の顕著な増加がもたらされる（表６）。ＡｌａはＬｅｕよりも
疎水性が小さく、さらにＬｅｕはＰｈｅよりも疎水性が小さいので、ＡｌａからＰｈｅへ
の置換は、ＬｅｕからＰｈｅへの置換よりも、得られたペプチドにおいて疎水性および理
論的脂質親和性に大きな変化をひき起こす。
【０２０５】
これらペプチドのＣ18逆相ＨＰＬＣカラムにおける保持時間、溶解度、およびＥＰＣ単
層膜に侵入する能力は全て、理論的な脂質親和性値で認められる傾向と同様な傾向を示し
た（表７）。ペプチド２Ｆ、３Ｆ3、３Ｆ14および４Ｆの保持時間はほぼ同じで（２１か
ら２２分）、５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆ（これらは第二の群を構成する）の値（２６から２７
分）よりも顕著に小さい。ペプチド２Ｆから４Ｆは、同族体５Ｆから７Ｆ（これらは難溶
性である）よりも水への溶解度は顕著に高い。排除圧が２Ｆから４Ｆまで徐々に増加する
のが観察され、その後４０ｄｙｎ／ｃｍから４５ｄｙｎ／ｃｍへ急激に増加する。ペプチ
ド５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆの場合の排除圧は互いに大きな相違をもたず、アポＡ−Ｉのそれ
よりも顕著に高い（表７）。親ペプチド１８Ａ（３０ｄｙｎ／ｃｍ）および１８Ａのダイ
マー、３７ｐＡ（４０ｄｙｎ／ｃｍ）さえもまた、空気−水境界面に広げた卵黄ＰＣ単層
膜への侵入の効率は顕著に低かった。上記の物理的特性を基にして、Ｆペプチドは２つの
群に分けることができる。すなわち２Ｆ、３Ｆ3、３Ｆ14、４Ｆの群Ｉ並びに５Ｆ、６Ｆ
および７Ｆの群ＩＩである。
【０２０６】
ＣＤのデータ（表８）は、全てのペプチドのパーセントらせん値はＤＭＰＣの存在下で
増加することを示し、このことは、全てのペプチドが脂質と結合していることを示唆して
いる。ＤＳＣによって示唆されるように（表９）、これらペプチドのＤＭＰＣへの結合は
類似しているように思われる。しかしながら、ＤｉＰｏＰＥの二重膜構造の安定化に対す
るこれらのペプチドの影響は異なっている。４Ｆおよび５Ｆは他のペプチドよりも良好な
安定化物質のようであるので、ＤｉＰｏＰＥとより良好に相互作用するように思われる。
【０２０７】
一方、アポＡ−ＩはＥＰＣＭＬＶを清澄化できないが、全てのペプチド類似体は程度に
差はあるが清澄化することができる。水性緩衝液に容易に溶解し、３８から４０ｄｙｎ／
ｃｍの範囲の単層排除圧を示すＩ群ペプチド（２Ｆ、３Ｆ類似体および４Ｆ）の中で、４
Ｆはもっとも有効であるようで、調べたペプチド：脂質比では、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
のそれと同様な動的態様を示す（図１６）。ペプチド２Ｆおよび３Ｆの単層排除圧は類似
しているが、３Ｆ同族体はＥＰＣＭＬＶの清澄化がもっとも遅い。３Ｆ同族体のＥＰＣ清
澄化能力が低い理由は現時点では明らかではない。水性緩衝液に容易に溶解することがで
きず、表面圧値が４５ｄｙｎ／ｃｍの群ＩＩのペプチド（５Ｆ、６Ｆおよび７Ｆ）は比較
的ゆっくりとＥＰＣＭＬＶを可溶化する。これらの結果は、分解してからＥＰＣと相互作
用する必要があるペプチド凝集物と一致する。４Ｆの優れた反応性は、その疎水性が最適
であり、そのため自己結合に有利な疎水性ペプチド：ペプチド相互作用がペプチド：脂質
相互作用を妨げないという事実によって説明することができる。
【０２０８】
疎水性増加のＬＣＡＴ活性に対する影響
ＬＣＡＴの活性化は複雑な過程であり、脂質の親和性に左右されるだけではなく、両親
媒性らせんタンパク質と酵素ＬＣＡＴとの相互作用にも依存する（Jonas (2000) Biochim
. Biophys. Acta1529:245-256）。前記の記述と合致して、ＬＣＡＴを活性化する能力は
同族体ペプチドについて異なることが見出された。ペプチド５Ｆは最大のＬＣＡＴ活性化
能を示し、これは、表７に示した物理的特性と一致する（表７では、卵黄ＰＣ−水境界面
での排除圧値を含む急激な増加が４Ｆから５Ｆで認められた）。ペプチド６Ｆおよび７Ｆ
は５Ｆほど効果的ではないという事実は、これらペプチドの水への低い溶解度によって反
映されるように、ペプチド：ペプチド相互作用の増加（前記増加はペプチド：脂質または
ペプチド：ＬＣＡＴ相互作用を許容しない）によって説明することができるであろう。こ
れらの結果は、１８Ａダイマーに関する我々の以前の観察と合致する。以前の観察では、
ダイマー１８Ａ−１８Ａ（３６Ａ）におけるペプチドの自己結合の強化は、１８Ａ−Ｐｒ
ｏ−１８Ａペプチドと比較して脂質と相互作用する能力を低下させた（Jonas (2000) Bio
chim. Biophys.Acta 1529:245-256）。前記ペプチドによるＬＣＡＴの活性化はアポＡ−
Ｉのそれと匹敵したが、アポＡ−Ｉと前記の全てのペプチドはＥＰＣに対して異なる反応
性を有するので（図１６）、それらは違った態様で基質と相互作用するということは留意
されねばならない。同様な観察がChungらによって報告された。彼らは、合成ペプチド１
８Ａ−Ｐｒｏ−１８ＡおよびアポＡ−Ｉは異なる態様でＥＰＣと相互作用することを示し
た（Chunget al.(1985) J. Biol. Chem. 260:10256-10262）。
【０２０９】
非極性面の疎水性の増加のＬＤＬ誘発単球走化性に対する影響
我々が報告したように（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et 
al.(2000) J.Lipid Res. 41:1495-1508）、“シーディング分子”の除去はペプチドの両
親媒性度に左右されるので、我々はこれらペプチドのＬＤＬ誘発単球走化性抑制能力を調
べた。このアッセイでは、一方向変数分析を基にして、ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆ（
１００μｇ／ｍＬレベル）は、顕著かつ類似するＬＤＬ誘発走化性の抑制を示した。同族
体２Ｆはある程度の抑制活性を示し、（その理由は不明であるが）、類似体ペプチド３Ｆ
は抑制を示さずＬＤＬ単独と類似していた。これらの結果は、ペプチド３Ｆは脂質過酸化
水素を除去できない（データは示されていない）という事実およびＥＰＣＭＬＶを清澄化
する能力が低いことと一致した。ペプチド７Ｆは、ペプチド４Ｆ、５Ｆおよび６Ｆより顕
著に有効性が低かった（Ｐ＜０．００１）。７Ｆの能力の低下はまた前記ペプチドの自己
結合の増強によって説明できる（自己結合の増強はＥＰＣＭＬＶの清澄化実験で観察され
たように脂質との相互作用能力を低下させる）。これらの結果はあらためて、ペプチドの
疎水性が自己結合に与える影響間に存在する微妙なバランスがアポＡ−Ｉ摸倣特性に決定
的な影響を与えることを示している。
【０２１０】
ペプチド５Ｆ（ＬＣＡＴ活性化能力および“シーディング分子”除去能力が増強されて
いる）のinvivo投与によって、マウスは食餌誘発アテローム性硬化症から防御される。
対照的に、２Ｆ（ＬＣＡＴ活性化能力は４Ｆと同様であるが、“シーディング分子”をＬ
ＤＬから除去する能力は４Ｆおよび５Ｆよりも低い）の投与は、Ｃ５７ＢＬ６マウスにお
ける食餌誘発性病巣の形成を顕著には抑制しなかった（ＰＢＳを投与したコントロールマ
ウスの平均病巣面積は１４．７±１．８μｍ2×１０-3に対して、２Ｆ投与マウスでは１
３．２±１．７μｍ2×１０-3、ｎ＝１５）。したがって、前記のマウスモデルでは、Ｌ
ＤＬ誘発単球走化性の抑制が、ＬＣＡＴ活性よりもアテローム性硬化症誘発に対してより
強い対抗力を示す。ペプチド２Ｆおよび４ＦはＬＣＡＴの活性化においては類似し、４Ｆ
および５ＦはＬＤＬから“シーディング分子”を除去する能力において類似しているので
、ペプチド４Ｆは、異なるアテローム性硬化症感受性マウスモデルでＬＣＡＴ活性化とＬ
ＤＬ誘発単球走化性の抑制の重要性を識別する試薬として機能するかもしれない。ＬＤＬ
誘発走化性の抑制がＬＣＡＴ活性化能力よりも重要であるならば、４Ｆは５Ｆ、６Ｆおよ
び７Ｆよりもより可溶性であるのでアテローム性硬化症の抑制として用いることができる
より優れたペプチドであるはずである。
【実施例４】
【０２１１】
実施例４
ペプチドＤ−４Ｆは、急性炎症性反応時にパロキシナーゼレベルを維持し、酸化リン脂
質生成を阻害する
我々は、インフルエンザＡウイルスのマウス鼻腔内点滴によって惹起されるＨＤＬの抗
炎症性特性の時間依存性低下は接種後７から９日で最大に達することを観察した。選択し
た接種量はウイルス血症をひき起こさない量で、したがって、惹起される変化はウイルス
によって直接ひき起こされるものではなく、ウイルス感染に対するホストの全身反応によ
って誘発される炎症状態によるものであった。前記の反応は生来の免疫系の一部分であり
、急性期反応として知られている。
【０２１２】
結果の１つは、インフルエンザ感染後のマウスのＨＤＬにおけるパラオキソナーゼ活性
および血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性の低下であった。これらＨＤＬ酵素活性の
低下の結果として、さらにまた急性期反応時のプロオキシダントタンパク質とＨＤＬとの
結合の結果として、ＨＤＬはもはやＬＤＬの酸化を防止することができず、さらにＬＤＬ
により誘発される内皮細胞の単球走化性活性の産生を防止することができなかった。正常
なＨＤＬは、生物学的に活性な酸化リン脂質を破壊するために十分なパラオキソナーゼお
よび血小板活性化アセチルヒドロラーゼ活性を含むので、前記ＨＤＬは、ＬＤＬにより誘
発される内皮細胞の単球走化性活性の産生を防止することができる。
【０２１３】
本実施例では、インフルエンザＡ感染後初期には（２日）、感染マウスの肝臓はこれら
酸化されたリン脂質を生成し（図１９）、後期には（感染後７から９日）これら生物学的
に活性な酸化されたリン脂質はマウスの大動脈に出現した。しかしながら、インフルエン
ザＡウイルス感染後、マウスに２０μｇのＤ−４Ｆを毎日注射した場合、パラオキソナー
ゼレベルは低下せず（図２０）、生物学的に活性な酸化リン脂質もバックグラウンド以上
には生成されなかった（図２１）。
【０２１４】
これらのデータは、Ｄ−４Ｆ（および／または本発明の他のペプチド）は、既知の冠状
動脈疾患をもつ患者にインフルエンザ感染または他の急性期炎症反応を生じる事象（例え
ばウイルス感染、細菌感染、外傷、移植、種々の自己免疫症状などによる事象）時に経口
的または注射によって投与し、その結果この短期間の処置によって前記炎症性状態を生じ
る病変に伴う心臓発作および卒中発作の発生の増加を防止することができることを示して
いる。
【実施例５】
【０２１５】
実施例５
Ｄ−アミノ酸から合成されたアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドの経口投与はマウスのアテローム
性硬化症を劇的に減少させる
ＤまたはＬアミノ酸から合成されたアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドは、動脈壁細胞による酸化
に対して低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を防御するためにin vitroで有効であった。し
かしながら、前記ペプチドをＬＤＬレセプター欠損マウスに経口的に与え、そのＨＤＬを
単離し、ＬＤＬを酸化から保護する能力をin vitroで調べたとき、Ｄ−アミノ酸から合成
されたペプチドのみが有効であった。Ｄ−アミノ酸から合成されたペプチドは血液循環中
で安定であり、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の分画から見出された。Ｌアミノ酸から
合成されたペプチドは急速に分解され尿中に排泄された。Ｄ−４Ｆとして知られるＤ−ア
ミノ酸から合成されたペプチドを１日に２回経口的に、西洋風食餌を与えたＬＤＬレセプ
ター欠損マウスに投与したとき、病巣は７９％減少した。アポＥ欠損マウスの飲料水に添
加したとき、Ｄ−４Ｆは病巣を８４％以上減少させた。我々は、Ｄ−アミノ酸から合成し
たアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および酸化脂質によってひ
き起こされる他の慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であると結論した。
【０２１６】
背景
ＨＤＬ−コレステロール濃度はアテローム性硬化を示す冠状動脈疾患の危険性と反比例
する（Miller& Miller (1975) Lancet, 1:16-19）。アポＡ−Ｉ（ＨＤＬの主要なアポリ
ポタンパク質）の輸液（Badimon et al.(1990) J. Clin. Invest. 85:1234-1241）または
遺伝子導入による発現（Plump et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9607-961
1）は、動物モデルでアテローム性硬化症を防御できることが示された。アポＡ−Ｉがア
テローム性硬化症の進行を防御するメカニズムは、逆コレステロール輸送（Shah et al.(
2001)Circulation, 103:3047-3050）およびＬＤＬの酸化に必要な低レベルの酸化脂質（
“シーディング分子”）の除去（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494; Nav
ab et al.(2000)J. Lipid Res. 41:1495-1508; Navab et al.(2001) Arteriosclerosis 
Thromb. Vasc.Biol. 21:481-488）を含むのではないかと考えられている。クラスＡ両親
媒性らせんペプチド類似体は、ＬＤＬの酸化に必要な“シーディング分子”の除去（Nava
b et al.(2000)J. Lipid Res. 41:1481-1494; Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1
495-1508）を含むアポＡ−Ｉのいくつかのinvitroでの特性に類似する特性を有すること
が示された。前記には、。クラスＡ両親媒性らせんペプチドの腹腔内投与は、血漿コレス
テロールレベルに変化を生じないで食餌誘発アテローム性硬化症からマウスを保護するこ
とが最近示された（Garberet al.(2001) J. Lipid Res. 42:545-552）。病巣の減少に、
in vitroでのＬＤＬの酸化を抑制するＨＤＬの能力の顕著な改善が付随していた（上掲書
）。これまで、アポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドを薬理的物質として用いる場合
の主要な制限は、非経口ルートによる投与の必要性であった。
【０２１７】
哺乳類の酵素、例えばプロテアーゼは、Ｌアミノ酸から合成されたペプチドおよびタン
パク質を認識するが、Ｄ−アミノ酸から合成されたものはほとんど認識しない。本明細書
で我々は、Ｄ−アミノ酸から合成したアポＡ−Ｉ摸倣ペプチドの特別な製剤は、経口的に
投与してマウスで劇的にアテローム性硬化症を抑制できることを示す。
【０２１８】
方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系の雌のＬＤＬレセプター欠損マウスまたはアポＥ欠損マウスをジャ
クソンラボラトリー（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）から購入した。ＬＤＬレセ
プター欠損マウスは、プリナ固形飼料（Purina chow diet, Ralston Purina Co.）で４週
齢まで飼育し、その時点で西洋風食餌（Western diet, Tekland, Madison, WI, diet#881
37）に切り替え６週間用いた。アポＥ欠損マウスは実験を通してプリナ固形飼料で飼育し
た。ＬＤＬレセプター欠損マウスは、経管投与によって１日に２回テストペプチドまたは
担体コントロールを、図の説明文に示された期間投与された。４週齢で、アポＥ欠損マウ
スの幾匹かの飲料水に図の説明文に示した濃度でテストペプチドを添加し、アポＥ欠損マ
ウスには固形飼料を続けた。
【０２１９】
マウスは、ＵＣＬＡ動物実験委員会（Animal Research Committee）によって承認され
たプロトコルにしたがって麻酔下で後眼窩静脈叢から採血した。アテローム性硬化症病巣
は以前に記載したように測定した（９）。
【０２２０】
リポタンパク質
ＬＤＬおよびＨＤＬは、インフォームド・コンセントを得た後で実験協力者から、およ
び上記に記したようにマウスから文献（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-149
4; および本明細書実施例）の記載にしたがって単離した。
【０２２１】
混合培養、ＬＤＬの細胞性酸化、単球単離および単球走化性活性アッセイ
以前に述べたように（上掲書）、ヒト大動脈内皮細胞および平滑筋細胞を単離し培養し
た。ＨＤＬの存在下および非存在下でのＬＤＬの細胞性酸化は以前に述べたように（上掲
書）決定した。ヒト血液単球はインフォームド・コンセントを得た後で単離し、単球走化
性活性は以前に記載（５）されたように決定した。
【０２２２】
アポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドの合成および調製
アポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドは以前に記載（１１）されたように合成したが、ただしいく
つかの事例では、ペプチドの各アミノ酸は該当アミノ酸のＤ型立体異性体であった。前記
ペプチドは、Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ
−Ａ−Ｆ−ＮＨ2（配列識別番号：１）（Ａｃ−１８Ａ−ＮＨ2または２Ｆ）をベースにし
ている。２Ｆまたは２Ｆの類似体を用いてここに報告する実験に用いた。前記２Ｆ類似体
の一次アミノ酸配列は以下のとおりであった：Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−
Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ−ＮＨ2（配列識別番号：５、４Ｆとも称され
る）。Ｌ−アミノ酸から合成したペプチドはＬ（例えばＬ−４Ｆ）と称され、Ｄ−アミノ
酸から合成したペプチドはＤ（例えばＤ−４Ｆ）と称される。いくつかの事例では、前記
ペプチドはＩＯＤＯ−ＢＥＡＤ試薬（Pierce, Rockford, IL）を用い、製造元の推奨にし
たがってヨウ素化した。Ｄ−４ＦとともにまたはＤ−４Ｆを用いないで、Ｌ−α−１−パ
ルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Avanti Polar Lipids,
Alabaster,AL）から作製したリポソームは、製造元の推奨にしたがって製造した。完全
なペプチドのマウス血漿からの抽出および検出は、逆相ＨＰＬＣを用い文献（Garber et 
al.(1992)Arterioscler. Thromb. 12:886-894）の記載にしたがって実施した。
【０２２３】
その他の方法
リポタンパク質のタンパク質（Navab et al.(2000) J. Lipid Res. 41:1481-1494）お
よびコレステロール（Van Lenten et al.(2000) Circulation 103:2283-2288）の含有量
、並びに統計分析は、Ｐ＜０．０５と規定される有意差で、文献（Van Lenten et al.(20
01) Circulation103:2283-2288）の記載にしたがって実施した。
【０２２４】
結果
Iｎ vitroでは、Ｌ−２ＦおよびＤ−２Ｆは、両者とも等しくＬＤＬの酸化およびヒト
大動脈壁細胞混合培養でのＬＤＬ誘発単球走化性活性をブロックすることができた（デー
タは示していない）。しかしながらin vivoでは図２２Ａに示したように、経口投与の後
、Ｄ−４Ｆのみが血液循環中で無傷のままであり、ＨＤＬ保護能力を強化し（図２２Ｂ）
、ＬＤＬ誘発単球走化性活性を低下させることができた（図２２Ｃ）。125Ｉ−Ｌ−４Ｆ
または125Ｉ−Ｄ−４Ｆの経口投与後２時間で、Ｌ−４Ｆを投与されたマウスの尿は、Ｄ
−４Ｆを与えられたマウスの場合の約１５倍の放射能活性を示した（データは示されてい
ない）。
【０２２５】
図２３は、１日２回のＤ−４Ｆの経管投与によって、西洋風食餌を与えたＬＤＬレセプ
ター欠損マウスはアテローム性硬化症病巣が７９％減少することを示している。総血中コ
レステロールレベルは、Ｄ−４Ｆを投与されたＬＤＬレセプター欠損マウスとリポソーム
単独または食塩水単独投与マウスで顕著な違いはなかった。総コレステロールはＤ−４Ｆ
群で７６１±６９ｍｇ／ｄｌであり、リポソーム群で６７７±５２ｍｇ／ｄｌであり、食
塩水群で６９９±３１ｍｇ／ｄｌであった。平均ＨＤＬ−コレステロールレベルはＤ−４
Ｆ群でわずかに高く７３±８．７ｍｇ／ｄｌであったが、リポソーム群の６５．９±９．
２ｍｇ／ｄｌおよび食塩水群の６７．１±６．３ｍｇ／ｄｌと比較してこれらの相違は統
計的には有意でなかった。
【０２２６】
図２４では、飲料水でＤ−４Ｆを投与されたアポＥ欠損マウスでは病巣が８４％減少し
、２．５ｍｇ／日／マウスでの投与と５．０ｍｇ／日／マウスでの投与に顕著な相違はな
いことが示されている。ペプチドを投与されていないアポＥ欠損マウスと２．５ｍｇＤ−
４Ｆ／マウス／日または５．０ｍｇＤ−４Ｆ／マウス／日を投与されたマウスとの間に消
費された水の量（２．５ｍＬ／日／マウス）に顕著な差はなく、さらに３つの群のアポＥ
欠損マウスの体重、心臓重量、または肝重量にも顕著な相違はなかった（データは示され
ていない）。さらにまた、血中総コレステロール濃度についてはＤ−４Ｆを投与されたア
ポＥ欠損マウスで顕著な相違はなかった（ペプチドを含まない水を与えられたマウスで４
７８±１４９ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを２．５ｍｇ／マウス／日で投与されたマウスで５３
４±１２．３ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを５．０ｍｇ／マウス／日で投与されたマウスで５７
９±４．６ｍｇ／ｄＬ）。平均ＨＤＬ−コレステロールは、Ｄ−４Ｆを投与されたマウス
で軽度に増加したが、その相違は統計的な有意差に達しなかった（ペプチドを含まない水
を投与したマウスで３２．２±７ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを２．５ｍｇ／マウス／日で投与
されたマウスで３８．７±５ｍｇ／ｄＬ、Ｄ−４Ｆを５．０ｍｇ／マウス／日で投与され
たマウスで４３．４±６ｍｇ／ｄＬ）。
【０２２７】
考察
これまではアポＡ−ＩおよびアポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドを薬剤として使用することには
非経口的投与の必要性から制限があった。本実験でのアテローム性硬化症病巣の目ざまし
い減少は、血中総コレステロールに顕著な変化が存在しないにもかかわらず生じた。Ｄ−
４Ｆを投与されたマウスではＨＤＬ−コレステロールレベルはわずかに高くなったが、こ
の相違は統計的な有意差に達しなかった。本明細書に提示した実験は、Ｄ−アミノ酸で合
成したアポＡ−Ｉ摸倣体ペプチドの経口投与は、アテローム性硬化症および他の酸化脂質
によって惹起される慢性炎症性疾患の予防および治療に有用であろうということを示唆し
ている。
【０２２８】
本明細書で述べた実施例および実施態様は例示を目的としており、前記の記載を基にし
て種々の改変または変更が当業者には示唆されるであろうが、それらは本発明あるいは特
許請求の範囲の範囲内にあることは理解されるところである。本明細書に引用した全ての
刊行物、特許および特許出願は参照によりそっくり本明細書に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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