(57)【要約】【課題】  低コストで煩雑な処理が必要でなく、かつ非特異反応の低減効果が高い測定法を提供することである。【解決手段】  ウイルス由来の抗原に対する抗体を測定する免疫測定法において、ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体、ウイルス由来の抗原に対する抗体を含む検体及び両性界面活性剤を含む緩衝液を混合して免疫反応させる工程を有することを特徴とする免疫測定法であり、両性界面活性剤はベタイン型両性界面活性剤であることが好ましく、ウイルスはＣ型肝炎ウイルスであることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス由来の抗原に対する抗体を測定する免疫測定法において、ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体、ウイルス由来の抗原に対する抗体を含む検体及び両性界面活性剤を含む緩衝液を混合して免疫反応させる工程を有することを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】
両性界面活性剤がベタイン型両性界面活性剤である請求項１記載の免疫測定法。
【請求項３】
免疫反応時の反応液における両性界面活性剤の濃度が０．５〜６０ｇ／Ｌである請求項１又は２記載の免疫測定法。
【請求項４】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項１〜３のいずれか記載の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス由来の抗原に対する抗体を測定する免疫測定に関するものである。更に詳しくは、ウイルス由来の抗原に対する抗体を測定する免疫測定において非特異反応を低減した免疫測定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス由来の抗原に対する抗体の免疫測定法において、非特異反応を低減する方法として、特殊な不溶性担体を使用する方法（例えば、特許文献１参照）、ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体に特別なブロッキングを施す方法（例えば、特許文献２参照）及び反応液中に非イオン界面活性剤を存在させる方法（例えば、特許文献３及び特許文献４参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２１６２３７号公報
【特許文献２】特開２００６-４７２５５号公報
【特許文献３】特開平８−２４０５９０号公報
【特許文献４】特開平６−６６７９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら特許文献１及び２に記載の方法では、特別な不溶性担体を用意する等高コストであり、煩雑な処理が必要であるという問題があった。また、非イオン性界面活性剤を用いる特許文献３及び４に記載の方法は、非特異反応の低減効果が十分でないという問題があった。本発明の目的は、低コストで煩雑な処理が必要でなく、かつ非特異反応の低減効果が高い測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、ウイルス由来の抗原に対する抗体を測定する免疫測定法において、ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体、ウイルス由来の抗原に対する抗体を含む検体及び両性界面活性剤を含む緩衝液を混合して免疫反応させる工程を有することを特徴とする免疫測定法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のウイルス由来の抗原に対する抗体を測定する免疫測定法は、検体に起因する非特異反応が低減される。従って、本発明の免疫測定法では、信頼性の高い測定結果が得られるという効果がある。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明において、ウイルス由来の抗原に対する抗体（以後、ウイルス抗体と記載する。）は従来公知のものであり、ウイルスの体内への感染により生体内で生じたものである。ウイルス抗体としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対する抗体（ＨＢｓ抗体）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体（ＨＢｃ抗体）、Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原（コア抗原、ＮＳ３抗原、ＮＳ４抗原及びＮＳ５抗原等）に対する抗体（ＨＣＶ抗体）、トレポネーマ パリダム由来の抗原に対する抗体（ＴＰ抗体）、ヒト免疫不全ウイルス由来の抗原に対する抗体（ＨＩＶ抗体）、成人Ｔ細胞性白血病ウイルス由来の抗原に対する抗体（ＡＴＬ抗体）、サイトメガロウイルス由来の抗原に対する抗体（ＣＭＶ抗体）及びパルボＢ１９ウイルス由来の抗原に対する抗体（ＰＢ１９抗体）等が挙げられる。これらの内、臨床的に測定頻度が高い観点から好ましいのは、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＴＰ抗体、ＨＩＶ抗体であり、更に好ましいのはＨＢｓ抗体及びＨＣＶ抗体、特に好ましいのはＨＣＶ抗体である。
【０００８】
ウイルス抗体を含む検体は、動物の体液であれば特に限定されないが、ヒトの疾患を判定するという目的の観点から、ヒト由来の血液（全血、血清又は血漿）及び尿が好ましい。これらの内、更に好ましいのはヒト由来の血液（全血、血清又は血漿）であり、特に好ましいのはヒト由来の血液から得た血清又は血漿である。
【０００９】
本発明において、ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体としては、ウイルス由来の抗原［例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス由来抗原（コア抗原、ＮＳ３抗原、ＮＳ４抗原、ＮＳ５抗原等）、トレポネーマ パリダム由来の抗原、ヒト免疫不全ウイルス由来の抗原、成人Ｔ細胞性白血病ウイルス由来の抗原及びサイトメガロウイルス由来の抗原等］を不溶性担体に結合したものが使用できる。これらの内好ましいのは、Ｃ型肝炎ウイルス由来抗原［コア抗原、ＮＳ３抗原、ＮＳ４抗原及びＮＳ５抗原等］である。ＨＣＶ抗体の測定には、少なくともコア抗原、ＮＳ３抗原、ＮＳ４抗原及びＮＳ５抗原を結合した不溶性担体を用いることが好ましい。尚、不溶性担体における不溶性とは、１〜５０℃のいずれの温度においても、水に対する溶解度が０．０１ｇ／水１００ｇ以下であることを意味し、担体とは１〜５０℃のいずれの温度においても固体（ゲルを含む）であってウイルス由来の抗原と結合できる物質を意味する。
【００１０】
不溶性担体としては、特開平２−２０５７７４号公報に記載の担体等が使用でき、例えば、セルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英、シリコン及びセラミックス等の有機物及び無機物が挙げられる。これらの内、コスト及び非特異反応低減の観点からポリスチレン、ガラス、石英及びシリコンが好ましく、更に好ましいのはポリスチレン及びガラス、特に好ましいのはガラスである。
【００１１】
不溶性担体の形状は、使用する試薬の構成や測定条件等に合わせて自由に決定でき、真球状や円盤状のビーズ、板状や棒状のスティック、試験管及び不織布やフィルターのストリップ（短冊状の細片）及び微粒子等が挙げられる。これらの内、測定感度、測定時の扱いやすさ等の観点からビーズ及び微粒子が好ましく、更に好ましいのは真球状のビーズである。
【００１２】
不溶性担体の大きさは、使用する試薬の構成や測定条件等に合わせて自由に決定できるが、通常は内径４〜１０ｍｍ、深さ１０〜２０ｍｍ程度の円柱形反応容器（ビーカー等）に投入できる大きさである（水不溶性担体が試験管の場合を除く。）。真球状ビーズの場合、直径（ｍｍ）は１〜１０が好ましく、更に好ましくは２〜８、特に好ましくは３〜７である。円盤状ビーズの場合、直径（ｍｍ）は１〜１０が好ましく、更に好ましくは２〜８、特に好ましくは３〜７であり、厚さは（ｍｍ）は０．１〜５が好ましく、更に好ましくは０．２〜２、特に好ましくは０．３〜１である。スティックの場合、長さ（ｍｍ）は２〜１０が好ましく、更に好ましくは３〜８、特に好ましくは４〜７である。また、スティックの断面積（ｍｍ2）は１〜２５が好ましく、更に好ましくは２〜１６、特に好ましくは３〜９である。尚、断面積とは、長軸方向に対して垂直に切断した際の切断部分の断面積を意味する。試験管の場合、長さ（ｍｍ）は５〜１００が好ましく、更に好ましくは８〜８０、特に好ましくは１０〜２０である。また、試験管の内径（ｍｍ）は、５〜２０が好ましく、更に好ましくは６〜１６、特に好ましくは８〜１２である。ストリップの場合、長さ（ｍｍ）は、５〜１００が好ましく、更に好ましくは１０〜８０、特に好ましくは１０〜５０である。また、ストリップの幅（ｍｍ）は、１〜２０が好ましく、更に好ましくは２〜１６、特に好ましくは３〜１０である。厚さは（ｍｍ）は０．１〜２が好ましく、更に好ましくは０．１〜０．５である。不織布やフィルターの平均孔径（μｍ）は、０．１〜１０が好ましく、更に好ましくは０．３〜５である。微粒子の場合、平均粒子径（μｍ）は０．０１〜２００が好ましく、更に好ましくは０．１〜５０、特に好ましくは０．２〜１０である。平均粒子径は、透過型電子顕微鏡法及び光学顕微鏡による整列測定法等で測定できる。
【００１３】
ウイルス由来の抗原と不溶性担体とを結合する方法としては、化学的に結合する方法及び物理吸着により結合する方法等の従来公知の方法等で行うことができる。
化学的に結合する方法としては、不溶性担体の表面に導入されたアミノ基及び／又はスルフヒドリル基等の官能基と、抗原のアミノ基及び／又はスルフヒドリル基等の官能基とを結合剤（グルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル及びｏ−フェニレンビスマレイミド等）で架橋する方法（米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書等参照）等が挙げられる。
物理吸着により結合する方法としては、不溶性担体がポリスチレンの場合、抗原の０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）炭酸緩衝水溶液（ｐＨ９．０）に水不溶性担体を適当時間浸漬する方法（バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年）等が挙げられる。この方法は、担体がポリスチレン以外の物質、例えばポリプロピレン、シリコン、ガラス及びセルロース等にも適用できる。また、特異的結合物質（例えば、抗原−抗体、アビジン−ビオチン、レクチン−糖鎖、相補的遺伝子鎖等）を利用して間接的に、抗原と不溶性担体とを結合することもできる。例えば、抗原をビオチンで修飾し、アビジンを結合した不溶性担体と反応することにより、抗原を不溶性担体に結合できる。アビジンとしては、卵白由来アビジン及びストレプトアビジン等が使用でき、ストレプトアビジンが好ましい。これら特異的結合物質の内抗原−抗体、アビジン−ビオチン、レクチン−糖鎖については、［生化学実験法１１「エンザイムイムノアッセイ」、東京化学同人社、１９８９年］に記載のもの、相補的な遺伝子としては公開特許公報平６−１８６２３２号に記載の相補的な遺伝子、例えばポリデオキシアデニル酸とポリチミジル酸の組み合わせ等が挙げられる。
【００１４】
両性界面活性剤としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤、硫酸エステル塩型両性界面活性剤、スルホン酸塩型両性界面活性剤及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤等が挙げられる。
【００１５】
カルボン酸塩型両性界面活性剤としては、アミノ酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤及びイミダゾリン型両性界面活性剤等が挙げられる。
アミノ酸型両性界面活性剤は、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、例えば、一般式（１）で示される化合物等が挙げられる。
［Ｒ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯ］mＭ                    （１）
［式中、Ｒは１価の炭化水素基、ｎは１又は２、ｍは１又は２、Ｍは水素イオン、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムカチオン、アミンカチオン又はアルカノールアミンカチオンである。］
【００１６】
一般式（１）で表される両面活性剤の具体例としては、例えば、アルキル（炭素数６〜４０）アミノプロピオン酸型両性界面活性剤（ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）及びアルキル（炭素数４〜２４）アミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００１７】
ベタイン型両性界面活性剤は、分子内に第４級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を有する両性界面活性剤であり、例えば、アルキル（炭素数６〜４０）ジメチルベタイン（ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）、炭素数６〜４０のアミドベタイン（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン及びラウリン酸アミドプロピルベタイン等）及びアルキル（炭素数６〜４０）ジヒドロキシアルキル（炭素数６〜４０）ベタイン（ラウリルジヒドロキシエチルベタイン等）等が挙げられる。
【００１８】
イミダゾリン型両性界面活性剤としては、イミダゾリン環を有するカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を有する両性界面活性剤であり、例えば、２−ウンデシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。
【００１９】
硫酸エステル塩型両性界面活性剤としては、高級アルキル（炭素数８〜１８）アミンの硫酸エステルナトリウム塩及びヒドロキシエチルイミダゾリン硫酸エステルナトリウム塩等が挙げられる。
スルホン酸塩型両性界面活性剤としては、ペンタデシルスルフォタウリン及びイミダゾリンスルホン酸等が挙げられる。
リン酸エステル塩型両性界面活性剤としては、グリセリン高級脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル化物のリン酸エステルアミン塩等が挙げられる。
【００２０】
これらの内、コストが安く、非特異反応の低減効果が高い点で好ましいのはカルボン酸塩型両性界面活性剤であり、更に好ましいのはベタイン型両性界面活性剤、特に好ましいのはヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン及びラウリン酸アミドプロピルベタインである。
【００２１】
本発明においては、両性界面活性剤を含む緩衝液は、緩衝液に上記両性界面活性剤を溶解したものが使用できる。緩衝液としては、特許２６８２６９７号公報、特開２００２−２５０７２８号公報又は特開２００２−３６５２９６号公報に記載されたもの等が使用でき、例えば、ｐＨ５．０〜１０．０（好ましくは６．０〜９．０）に緩衝作用を有する緩衝液［リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液及びホウ酸緩衝液等］等が挙げられる。尚、これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度（ｍＭ）は、緩衝作用及び免疫反応性に影響しないという観点から１〜５００が好ましく、更に好ましくは５〜３００、特に好ましくは１０〜２００である。
【００２２】
更に緩衝液は、免疫反応を妨げない範囲で両性界面活性剤に加えて、タンパク質、非イオン界面活性剤（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、無機塩（塩化ナトリウム等）及び／又は防腐剤等（アジ化ナトリウム等）を含有することが好ましい。
【００２３】
タンパク質としては、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン（カゼインナトリウム等の塩も含む）及び正常動物イムノグロブリン（馬イムノグロブリンＧ等）等が挙げられる。また、これらは組み合わせて用いることもできる。これらの内好ましいのは、牛血清アルブミン、カゼイン、正常動物イムノグロブリン及びこれらの併用であり、非特異反応低減の観点から更に好ましいのは、カゼインと正常動物イムノグロブリンの併用である。
【００２４】
タンパク質、非イオン界面活性剤、無機塩及び／又は防腐剤を含む場合、両性界面活性剤を含む緩衝液の重量に基づいて、タンパク質の含有量は０．１〜１０重量％、非イオン界面活性剤の含有量は０．０２〜５重量％、無機塩の含有量は０．０１〜５重量％、防腐剤の含有量は０．００１〜０．１重量％であることが好ましい。
【００２５】
本発明における両性界面活性剤の使用量は、免疫反応時の反応液の容量に対して、好ましくは０．５〜６０ｇ／Ｌ、更に好ましくは５〜４０ｇ／Ｌ、特にに好ましくは１０〜３０ｇ／Ｌとなる量である。免疫反応時の反応液は、ウイルス抗体を含む検体（通常１０〜１００μＬ）と両性界面活性剤を含む緩衝液（通常５０〜４００μＬ）とを混合して得られることから、緩衝液中の両性界面活性剤の濃度は、ウイルス抗体を含む検体と混合した際に、上記濃度範囲となるように調整する必要がある。
【００２６】
ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体、ウイルス抗体を含む検体及び両性界面活性剤を含む緩衝液を混合して免疫反応させる際の温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は、通常５〜６０分、好ましくは５〜２０分である。
【００２７】
本発明の工程（ウイルス由来の抗原を結合した不溶性担体、ウイルス抗体を含む検体及び両性界面活性剤を含む緩衝液を混合して免疫反応させる工程）は、不溶性担体にウイルス抗体を捕捉する工程である。よって、ウイルス抗体の免疫測定における洗浄工程及び標識抗体（又は抗原）との反応工程等の本発明の工程以外の工程については、従来公知の工程等を適宜組み合わせて用いることができる。
本発明の工程以外の工程の具体例としては、特開２００４−２６４２９４号公報に記載されているＢ／Ｆ分離工程及び標識体との反応工程等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜免疫反応用緩衝液の調製＞
以下の通り、免疫反応用緩衝液（Ｍ１）〜（Ｍ１５）及び比較用の免疫反応用緩衝液（Ｈ１）〜（Ｈ１２）を調製した。尚、調製に使用した界面活性剤の商品名、製造会社及び各商品の主成分の名称は表１に示す通りである。
【００２９】
［調製例１］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びレボン２０００を１．１ｇ（３０％溶液であるため、界面活性剤としては０．３３ｇとなる）加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１）を得た。
【００３０】
［調製例２〜９］
レボン２０００の重量を２．２３ｇ、２２．２ｇ、４４．４ｇ、８８．９ｇ、１３３．３ｇ、１７７．８ｇ、２２２．２ｇ、２６６．７ｇ（３０％溶液であるため、界面活性剤としては各々０．６７ｇ、６．６６ｇ、１３．３２ｇ、２６．６７ｇ、３９．９９ｇ、５３．３４ｇ、６６．６６ｇ、８０．０１ｇとなる）とした以外は調製例１と同様にして、免疫反応用緩衝液（Ｍ２）〜（Ｍ９）を得た。
【００３１】
［調製例１０］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びレボン２０００Ｌを８８．９ｇ（３０％溶液であるため、界面活性剤としては２６．６７ｇとなる）加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１０）を得た。
【００３２】
［調製例１１］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びレボンＬＤ−３６を７４．０７ｇ（３６％溶液であるため、界面活性剤としては２６．６７ｇとなる）加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１１）を得た。
【００３３】
［調製例１２］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びレボン１０５を７６．２ｇ（３５％溶液であるため、界面活性剤としては２６．６７ｇとなる）加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１２）を得た。
【００３４】
［調製例１３］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びレボン１０１−Ｈを１０６．６８ｇ（２５％溶液であるため、界面活性剤としては２６．６７ｇとなる）加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１３）を得た。
【００３５】
［調製例１４］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びレボンＡＰＬを９１．９７ｇ（２９％溶液であるため、界面活性剤としては２６．６７ｇとなる）加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１４）を得た。
【００３６】
［調製例１５］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ、レボン２０００を８８．９ｇ（３０％溶液であるため、界面活性剤としては２６．６７ｇとなる）及びノニオンＮＳ−２７０を０．６７ｇ加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｍ１５）を得た。
【００３７】
［比較調製例１］
蒸留水５００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ及び馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇを加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して界面活性剤を含有しない免疫反応用緩衝液（Ｈ１）を得た。
【００３８】
［比較調製例２］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びノニオンＮＳ−２７０を０．６７ｇ加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｈ２）を得た。
【００３９】
［比較調製例３〜８］
ノニオンＮＳ−２７０の重量を６．６６ｇ、１３．３３ｇ、２６．７０ｇ、４０．００ｇ、５３．３３ｇ、６６．６６ｇに代えた以外は、比較調製例２と同様にして、免疫反応用緩衝液（Ｈ３）〜（Ｈ８）を得た。
【００４０】
［比較調製例９］
蒸留水４００ｍＬに０．５モルリン酸緩衝液（ｐＨ７．０５）２００ｍＬ、カゼインナトリウム１０ｇ、馬イムノグロブリンＧ５００ｍｇ及びノニオンＥ−２１５を２６．６７ｇ加えて攪拌溶解した。更に蒸留水を全量が１Ｌとなるまで加え、均一攪拌して免疫反応用緩衝液（Ｈ９）を得た。
【００４１】
［比較調製例１０〜１２］
ノニオンＥ−２１５をノニオンＳ−４０、ツイーン２０又はニューポールＰＥ−１０８に代えた以外は比較調製例９と同様にして、免疫反応用緩衝液（Ｈ１０）〜（Ｈ１２）を得た。
上記で得られた緩衝液中の界面活性剤の濃度を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2010216970.tif 000002
【００４３】
＜非特異検体の選択＞
本発明の効果を判定するためには、非特異反応を示す検体が必要である。非特異検体は次の通り選択した。
［測定方法］
体外診断用医薬品「スフィアライトＨＣＶ抗体」［三洋化成工業（株）製］を使用し、添付文書に準じて全自動分析装置スファイライト１８０（オリンパス製）を用いて測定を実施した。ただし、測定に用いる免疫反応用緩衝液として、界面活性剤を含有しない免疫反応用緩衝液（Ｈ１）を用いた。
【００４４】
測定の概要は次の通りである。ＨＣＶ抗原結合ビーズが１個入った反応槽に免疫反応用緩衝液（Ｈ１）１０５μＬ及び検体３５μＬを加え、３７℃、７分間免疫反応する。Ｂ／Ｆ分離を行った後、酵素標識抗体液２４０μＬを加え、３７℃、７分間免疫反応する。Ｂ／Ｆ分離を行った後、基質液７０μＬ及び過酸化水素液７０μＬを加え、３７℃、１分間反応させた後、発光量を計測する。
陰性コントロール及び陽性コントロールを同様に測定して得られた発光量からカットオフ発光量（ＣＯ発光量）を求める。検体の発光量とカットオフ発光量からカットオフインデックス（ＣＯＩ）を求める。ＣＯＩ１未満を陰性、ＣＯＩ１以上を陽性と判定する。
計算式は次の通りである。
ＣＯ発光量＝陰性コントロール発光量（ｃｐｓ）＋０．２５×陽性コントロール発光量（ｃｐｓ）
ＣＯＩ＝検体の発光量（ｃｐｓ）／ＣＯ発光量
【００４５】
［検体の測定結果］
ＨＣＶ非感染者１００名から得た血清を、上記測定法でＣＯＩを求めた結果、検体Ａ、検体Ｂ及び検体Ｃが陽性と判定された。ＨＣＶ非感染者からの検体であるため、これらの検体は非特異反応によるものと考えられ、非特異検体として選択した。
【００４６】
＜非特異反応低減の評価＞
上記の測定方法における免疫反応用緩衝液（Ｈ１）を、免疫反応用緩衝液（Ｍ１）〜（Ｍ１５）又は比較用の免疫反応用緩衝液（Ｈ２）〜（Ｈ１２）に代えた以外は同様に測定して、（Ｈ１）での測定を含めて実施例１〜１５、比較例１〜１２とした。
【００４７】
［結果］
結果を表２に示す。比較例では、検体Ａ〜ＣのＣＯＩはいずれも１以上で陽性判定であり、非特異反応の低減効果はほとんど認められなかった。実施例１〜１５では検体Ａ〜ＣのＣＯＩはいずれも１未満となり、陰性判定となった。特に実施例２〜１０及び実施例１５は非特異反応の低減効果に優れ、実施例１５はその効果が顕著であった。ただし、実施例８及び９では陽性コントロールの発光量が若干低下しており、免疫反応性がやや抑制されてることが判る。
【００４８】
【表２】
2010216970.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は臨床検査薬、特に免疫反応を利用したウイルスに対する抗体を測定する臨床検査薬に有用である。