(57)【要約】【課題】罹患率改善調製物である代替の安定かつ生物活性な調製物を生成すること。【解決手段】亜硝酸塩は、一般に、活性一酸化窒素の除去によりヘモグロビンを酸素化するという現在の考えに反して、脱酸素化ヘモグロビンは、低濃度の無機亜硝酸塩と反応して、非常に安定な鉄ニトロシル化ヘモグロビンを生成し、これは、体内への送達時に、一酸化窒素送達の可能なヘモグロビンに変換され、そして、血管拡張活性および抗血小板活性を提供する。このことは、血液製剤輸液の危険性を改善するための基盤を提供する。本発明は、体内でＳ−ニトロシル化ヘモグロビンに変換される安定な鉄ニトロシル化ヘモグロビンを調製するための方法であって、脱酸素化ヘモグロビンおよび無機亜硝酸塩を、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンのモル比で反応させて鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成する工程を包含する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛星研究所の助成金番号ＨＬ５２５２９、ＨＬ５９１３０およびＨＬ６６１７９−０２ならびに国立科学財団の助成金番号ＭＣＢ００９８１２２８の下で、少なくとも一部は、米国政府の援助によりなされた。米国政府は、本発明の一部の権利を有する。
【０００２】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００２年１２月１２日出願の米国仮特許出願番号６０／４３２，６１６の利益を主張する。
【０００３】
（技術分野）
本明細書中の発明は、輸液の危険性を緩和するための一つの事例に関し、赤血球またはヘモグロビンベースの治療剤を提供するための別の事例に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
代用血液、ヘモグロビンおよび赤血球の輸液を受ける患者は、罹患率および／または死亡率が増加することは、公知である。この罹患率および／または死亡率の増加は、一酸化窒素の過剰な除去により血管の狭窄を引き起こした結果と考えられている。Ｓ−ニトロシル化ヘモグロビン（ＳＮＯ−Ｈｂ）は、血管拡張剤であることが知られているが、代用血液中または輸液において有効には使用されていない。これは、不安定であり、劣化せずに容易に保存することができないことにかなりの部分が起因する。従って、罹患率改善調製物である代替の安定かつ生物活性な調製物を生成するという動機が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本明細書中で、無機亜硝酸塩が、体内で非常に安定かつ酸素化された鉄ニトロシル化ヘモグロビンの形成を仲介し、血管拡張活性および抗血小板活性を有するＳＮＯ−Ｈｂを形成し得る（すなわち、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成するための無機亜硝酸塩反応が、体内への送達時に血管拡張活性および抗血小板活性を与えられ、かつ輸液により増加した罹患および死亡の危険性を緩和し、ヘモグロビンおよび赤血球ベースの治療剤と関連した罹患率を緩和するために機能的である分子を作り出す）こと、ならびに、鉄ニトロシル化ヘモグロビンが、低いヘモグロビン  対  亜硝酸塩の割合で、デオキシヘモグロビンとの亜硝酸塩インキュベーション（ここで、酸素化によりＳＮＯ−Ｈｂを生成する）により形成され得ることが発見された。
【０００６】
ヘモグロビンは、二個のαサブユニットおよび二個のβサブユニットからなる四量体である。ヒトヘモグロビンでは、各サブユニットは、一つのヘムを含むのに対して、βサブユニットはまた、高い反応性のＳＨ（チオール）を含む基（β−ｃｙｓ９３）をも含む。亜硝酸塩は、ヘモグロビンの酸化剤であり、ヘモグロビンとの亜硝酸反応の結果は、硝酸塩への変換によるか、または一酸化窒素生物活性をクエンチするαサブユニット第一鉄ヘムに対する酸化に由来する一酸化窒素（ＮＯ）の複合化による、亜硝酸塩の除去であると考えられる。低（生理学的）濃度の亜硝酸塩がオキシヘモグロビンを酸化しないことが、本明細書中で発見された。これは、その代わりに、脱酸素化ヘモグロビンと結合し、ヘモグロビン四量体のヘムβサブユニット上にＮＯを蓄積し、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成するためであり、酸素化に関しては、ＮＯは、βサブユニットのヘムからβ−ｃｙｓ９３のチオールに移動し、ＳＮＯ−Ｈｂを産生すると考えられる。
【０００７】
本明細書中の発明の一実施形態（一番目の実施形態を示す）は、容易にＳＮＯヘモグロビンに変換可能な安定な鉄ニトロシル化ヘモグロビンを調製するための方法に関し、この方法は、低濃度の無機亜硝酸塩をデオキシヘモグロビンと反応させて（１：１０〜１：１０００のデオキシヘモグロビン  対  亜硝酸塩のモル比）、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成する工程を包含する。この鉄ニトロシル化ヘモグロビンは、安定で、酸素化によりＮＯ送達を可能にするヘモグロビン製剤（例えば、ＳＮＯ−Ｈｂ）を産生するので、非常に好ましい生成物である。
【０００８】
本明細書中の発明の別の実施形態（二番目の実施形態を示す）は、罹患および／または死亡の危険性を低下した、血液製剤輸液の必要なヒト患者への血液製剤輸液の方法に関し、この方法は、無機亜硝酸塩と、脱酸素化ヘモグロビンを含む代用血液もしくは赤血球もしくは血液ヘモグロビンまたはこれらの二つ以上の組合せとを、１：１０〜１：１０００の範囲の脱酸素化ヘモグロビン  対  亜硝酸のモル比でインキュベートし、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含む代用血液または赤血球またはヘモグロビンまたは組合せ製剤を形成する工程、ならびに鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含む製剤をヒト患者内へ輸液する工程を包含する。
【０００９】
本明細書中の発明のなお別の実施形態（三番目の実施形態を示す）は、従来の輸液に比べて輸液由来の罹患および／または死亡の危険性の低下した、血液製剤輸液の必要なヒト患者への血液製剤輸液の方法に関し、この方法は、代用血液または赤血球（一時間あたり１〜２５０ｃｍ３の速度で）、および無機亜硝酸塩（１分間あたり０．０１〜１０マイクロモルの速度で）の同時輸液工程を包含する。
【００１０】
本明細書中の発明のなお別の実施形態（四番目の実施形態を示す）は、後に使用するための一酸化窒素との混合物中または無機亜硝酸塩の前処理後の保存血液、保存代用血液、保存赤血球、保存ヘモグロビン、または、保存用のこれらの二つ以上の組合せに関し、そして、機能および全ての赤血球細胞を維持するために、一酸化窒素との混合物中または無機亜硝酸塩の前処理後の血液、代用血液、赤血球、血液ヘモグロビン、またはこれらの二つ以上の組合せを含有する保存組成物を含む、後で使用するための輸液のための組成物を提供する方法に関する。
【００１１】
本明細書中の発明のなお別の実施形態（五番目の実施形態を示す）は、一酸化窒素治療の必要な患者を処置する方法に関し、この方法は、赤血球または血液ヘモグロビンベースの治療剤を投与する工程を包含し、この治療剤は、脱酸素化ヘモグロビンを含む赤血球または血液ヘモグロビンを無機亜硝酸塩とともに、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンのモル比でインキュベートすることにより入手され、それによって、該治療剤は、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含有する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
体内でＳ−ニトロシル化ヘモグロビンに変換される安定な鉄ニトロシル化ヘモグロビンを調製するための方法であって、該方法は、脱酸素化ヘモグロビンおよび無機亜硝酸塩を、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンのモル比で反応させて鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成する工程を包含する、方法。
（項目２）
血液製剤輸液の必要なヒト患者への血液製剤輸液の方法であって、該方法は、無機亜硝酸塩と、脱酸素化ヘモグロビンを含む代用血液または赤血球とを、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンの初期モル比で同時インキュベートし、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含有する代用血液または赤血球製剤を形成する工程、ならびに鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含有する製剤を該患者に輸液する工程を包含する、方法。
（項目３）
血液製剤輸液の必要なヒト患者への血液製剤輸液の方法であって、該方法は、代用血液もしくは赤血球、および無機亜硝酸塩を該患者に同時注入する工程であって、該無機亜硝酸塩を、１分間あたり０．０１〜１０マイクロモルの速度で注入する工程を包含する、方法。
（項目４）
後で使用するための輸液のための組成物を提供する方法であって、該方法は、一酸化窒素との混合物中で、または無機亜硝酸塩前処理後に、機能および全ての赤血球を維持するために、血液、代用血液、赤血球、血液ヘモグロビンまたはこれらの二つ以上の組合せを含有する組成物を保存する工程を包含する、方法。
（項目５）
一酸化窒素との混合物中の、または無機亜硝酸塩前処理後の、後で使用するための、保存血液、保存代用血液、保存赤血球、保存血液ヘモグロビンまたはこれらの二つ以上の組合せ。
（項目６）
一酸化窒素治療の必要な患者を処置する方法であって、該方法は、赤血球または血液ヘモグロビンベースの治療剤を該患者に投与する工程を包含し、該治療剤は、脱酸素化ヘモグロビンを含む赤血球または血液ヘモグロビンを、無機亜硝酸塩とともに、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンのモル比でインキュベートすることにより入手され、それによって、該治療剤は鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含有する、方法。
【００１２】
血液輸液由来の死亡率は、増加すると考えられ、血液輸液ならびにヘモグロビンおよびエリスロポエチン（ヘモグロビンを増加する）は両方とも、一般に血圧および肺動脈圧を増加し、組織灌流を減少し得ると考えられる。本発明の二番目の実施形態および三番目の実施形態は、この死亡率および後に記載する疾患率を低減する。
【００１３】
用語「脱酸素化ヘモグロビン」は、本明細書中で、平均３個未満の酸素を有するヘモグロビン分子を意味して使用される。ヘモグロビンの脱酸素化は、脱酸素化され、より少ない酸素を有するデオキシヘモグロビンを提供する。
【００１４】
用語「鉄ニトロシル化ヘモグロビン」は、本明細書中で、ヘモグロビンのβサブユニットのヘム鉄に結合した一酸化窒素を意味して使用される。
【００１５】
用語「酸素化」は、本明細書中で、酸素の導入を意味して使用される。
【００１６】
用語「血液製剤」は、本明細書中で、赤血球、血液ヘモグロビンまたはこれらの組合せを含有する組成物を意味して使用される。
【００１７】
用語「代用血液」は、本明細書中で、ヘモグロビンを含む血液に対する代替物を意味して使用される。
【００１８】
用語「インキュベートする」は、本明細書中で、反応に好ましい条件を維持することを意味して使用され、「同時インキュベートする」は、本明細書中で、このような条件下で一つより多い化合物を維持することを意味して使用される。
【００１９】
用語「同時輸液」は、本明細書中で、同時に輸液すること、または別の輸液のすぐ前またはすぐ後に輸液を行なうことを意味する。
用語「赤血球または血液ヘモグロブリンベースの治療剤」は、本明細書中で、平均ヘモグロブリンレベルを有意に増加させるのには不十分である（すなわち、平均ヘモグロブリンレベルを少なくとも１０％増加させるには不十分である）が、血液中の一酸化窒素レベルを有意に、すなわち少なくとも１０％増加させる量の、赤血球または血液ヘモグロブリンを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ブタにおける、一酸化窒素（アスタリスク）、硝酸塩（丸）およびコントロール（四角）についての時間  対  肺胞−動脈勾配のグラフであり、背景実施例２の結果を示している。図１において、ΔＡａは、ブタにおける肺胞−動脈勾配を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
ここで、本発明の第１の実施形態を参照すると、この実施形態は、血流に導入された場合、ＳＮＯ−ヘモグロビンに変換する安定な鉄ニトロシル化ヘモグロビンを調製するための方法に関し、その方法は、無機亜硝酸塩をデオキシヘモグロブリンと、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  デオキシヘモグロビン（ヘモグロブリンベースで）のモル比で反応させ、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成する工程を包含する。
【００２２】
デオキシヘモグロビンは、ヘモグロビンの脱酸素化または赤血球の脱酸素化（例えば、ヘモグロビンまたは赤血球中に通常存在する酸素の５０％未満の酸素が存在するようになるまで、ヘモグロビンまたは赤血球に不活性ガスを撒布すること）によって提供され得る。不活性ガスは、例えば、アルゴンまたは窒素であり得る。この反応は、４℃〜３７℃の範囲の温度で容易に実施されて室温で簡便に実施され得るが、体内で（体温で）実施され得る。無機亜硝酸塩は、ヘモグロビンと共に溶媒中に溶け得る任意の無機亜硝酸塩である。無機亜硝酸塩は、例えば、亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリウムであり得る。この反応のための溶媒は、ヘモグロビンがその生理学的機能を行うことを不活性化しない任意の溶媒であり得、例えば、ＨＥＰＥＳまたは１０ｍｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）であり得る。鉄ニトロシル化ヘモグロビンは、ヘモグロビンβサブユニットのヘムに対するＮＯ結合を非常に活性な状態で含み、これは、体内で呼吸器系により、ＳＮＯ−ヘモグロビンに容易に変換される。ＳＮＯ−ヘモグロビンは、血管拡張作用および抗血小板作用を有し、体内における形成によって、これらの効果に対し機能的になるが、不安定になり、保存で残存しない。従って、第１の実施形態の反応は、体内への送達または体内での形成に際して、血管拡張作用を有し、その結果、代用血液または赤血球の輸液と併用して使用される場合、このような輸液に通常伴う病的状態および死亡の危険性の増加を軽減するために有用である分子を、作製する。
【００２３】
ここで、本発明の第２の実施形態を参照すると、この実施形態は、血液製剤を必要とするヒト患者への血液製剤の輸液の方法に関し、この方法は、無機亜硝酸塩および代用血液または赤血球（脱酸素化ヘモグロビンを含む）を、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンの初期モル比で同時インキュベートし、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含む代用血液または赤血球製剤を形成する工程、および鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含有する製剤を患者に輸液する工程を包含する。
【００２４】
同時インキュベーションは、好ましくは、例えば、生理食塩水中の無機亜硝酸塩溶液または１μＭ〜１ｍＭの無機亜硝酸塩を含む他の生理的緩衝液を、脱酸素化ヘモグロビンを含む代用血液または赤血球と、１：１０〜１：１０００（例えば、１：１００〜１：５００）の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンの初期モル比で混合し、そして温度を４℃〜３７℃（好ましくは体温）に維持して、例えば、１０分〜１時間混合することによって実施される。
【００２５】
脱酸素化ヘモグロビンを含む代用血液または赤血球を提供するための、代用血液または赤血球の脱酸素化は、例えば、代用血液または赤血球に不活性ガス（例えば、アルゴンまたは窒素）を撒布することによって実施され得る。
【００２６】
無機亜硝酸塩は、脱酸素化ヘモグロビンに可溶でありかつ適合し、脱酸素化ヘモグロビンを分解しない、任意の無機亜硝酸塩であり得、亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリウムであり得る。
【００２７】
同時インキュベーションによって形成された鉄ニトロシル化ヘモグロビンは、体内で呼吸系によって、ＳＮＯ−ヘモグロビン形態に変換され、これは、血管拡張を引き起こし、従来の血液製剤輸液に伴う血管狭窄に対抗する。
【００２８】
血液製剤輸液を必要とする患者は、血液を失ったかもしくは失いつつある患者、または腎機能不全の症例で体の老廃物の除去を必要とする患者、または中毒の症例で血液から有害物質を除去する必要のある患者、または一酸化窒素または酸素の欠陥を伴う任意の疾患（例えば、アンギナまたは脳卒中）を処置するために赤血球またはヘモグロビンを必要とする患者である。
【００２９】
輸液は、従来通りの速度で従来通りの時間にわたって実施される。例えば、４時間で１単位未満の代用血液または赤血球を、１８ゲージ以上の必要（ｎｅｅｄ）を用いて、例えば、この１ユニットを３０分〜２時間の時間で輸液する。
【００３０】
代用血液または赤血球製剤の活性を、この製剤をグルタチオンまたは他のチオールと同時インキュベーションすることによって増強し得る。
【００３１】
ここで、本明細書中の本発明の第３の実施形態を参照すると、この実施形態は、血液製剤輸液を必要とするヒト患者内に血液製剤を輸液する方法であって、従来の輸液と比較して輸液の死亡または病的状態の危険性を減少した方法に関し、この方法は、１時間あたり１〜１０００ｃｍ３の速度で代用血液または赤血球を、そして１分間あたり０．０１〜１０μｍｏｌの速度（例えば、１分間あたり０．１〜２μｍｏｌの速度）で無機亜硝酸塩を、同時注入する工程を包含する。
【００３２】
患者は、第２の実施形態についての患者と同一である。
【００３３】
無機亜硝酸塩は、第２の実施形態の無機亜硝酸塩と同一であり、そして水溶液の形態（例えば、生理食塩水中またはリン酸緩衝化生理食塩水中、１μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度）で使用される。
【００３４】
代用血液または赤血球の輸液は、従来通りに実施され得る。
【００３５】
亜硝酸塩溶液の輸液は、１分間あたりの上記のμｍｏｌの亜硝酸塩を提供する速度（従来の代用血液および赤血球輸液速度と一致する）で、容易に実施される。
【００３６】
第３の実施形態において、第１の実施形態の反応が提供される。何故なら、注入した亜硝酸塩は、非常にＰＯ２の低い循環系の中でヘモグロビンに遭遇し、その結果、循環系の中に、脱酸素化ヘモグロビンが現れて鉄ニトロシル化ヘモグロビンが形成され、これは、次に呼吸系によってＳＮＯ−ヘモグロビンに変換され、このＳＮＯ−ヘモグロビンは、これに伴う血管拡張および抗血小板物質形成を提供するからである。
【００３７】
ここで、本明細書中の本発明の第４の実施形態を参照すると、この実施形態は、後で使用するために一酸化窒素と混合されたかまたは無機亜硝酸塩前処理された後の、保存全血、保存代用血液、保存赤血球、保存血液ヘモグロビンまたはこれらの組み合わせ、および後の使用のための輸液用の組成物を提供する方法に関し、この方法は、一酸化窒素と混合されたかまたは無機亜硝酸塩前処理後の、全血、代用血液、赤血球、血液ヘモグロビンまたはこれらの２以上の組み合わせを含有する組成物を保存し、機能および全ての赤血球を維持する工程を包含する。この前処理は、第２の実施形態のインキュベーションに相当して呼ばれ、これは、無機亜硝酸塩を、全血、代用血液、赤血球、血液ヘモグロビンまたはこれらの２以上の組み合わせと共に、１：１０〜１：１０００の範囲の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンのモル比でインキュベートし、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含む組成物を形成する工程を包含する。インキュベーション条件および無機亜硝酸塩は、第２の実施形態に記載のインキュベーション条件および無機亜硝酸塩である。保存は、従来と同一条件下であり得、同一の保存薬を用い得る。現在、クエン酸−リン酸−デキストロース−アデニンと共に保存された全血または赤血球は、３５日間保存され得、そして赤血球は、アデニン−生理食塩水保存溶液が添加された場合、４２日間保存され得る。本明細書中で、本発明は、これらの保存期間を、少なくとも１０％延長し得る。
【００３８】
ここで、本明細書中の本発明の第５の実施形態を参照すると、この実施形態は、一酸化炭素治療を必要とする患者を処置する方法に関し、この方法は、この患者に、赤血球または血液ヘモグロビンベースの治療剤を投与する工程を包含し、この治療剤は、脱酸素化ヘモグロビンを含む赤血球または血液ヘモグロビンを無機亜硝酸塩と共に、１：１０〜１：１０００の範囲内の亜硝酸塩  対  脱酸素化ヘモグロビンのモル比でインキュベートすることによって得られ、その結果、この治療剤は、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含有する。インキュベーション条件および無機亜硝酸塩は、第２の実施形態に記載のインキュベーション条件および無機亜硝酸塩である。この処理は、一酸化窒素を赤血球成分のそれぞれに満たす。ここで留意すべきは、ＮＯは、赤血球の酸素送達能力および膜機能を改善することが公知であることである。本明細書中本発明の第５の実施形態の投与は、例えば、虚血（例えば、心筋虚血）を処置するために使用され得る。
【００３９】
本発明についての裏づけおよび要素は、「ＮＯ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｈｅｍｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：ｒｏｕｔｅｓ  ｔｏ  ＳＮＯ−ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  β−ｓｕｂｕｎｉｔｓ」と題された原稿において提供され、これは、米国仮特許出願第６０／４３２，６１６号の一部であり、この出願の全体は、本明細書中で参考として援用される。この原稿は、無機亜硝酸塩が、一酸化炭素をヘムに固定し、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを形成するために使用され得、鉄ニトロシル化ヘモグロビンが、呼吸系によって酸素化されてＳＮＯ−ヘモグロビンを形成することにより、身体への送達の際の血管拡張作用を有することを示す。
【００４０】
本明細書中で、本発明は、以下の背景実施例によって支持され、かつ、以下の作業実施例によって示される。
【実施例】
【００４１】
（背景実施例１）
鉄ヘムと一酸化窒素との間の反応についてのモデルとして、ヒトメトヘモグロビンの還元性ニトロシル化を試験した。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳまたは１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．４）中のメトヘモグロビン溶液は、ヒトメトヘモグロビンＡ０（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＣ）およびＨＥＰＥＳまたはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．４）からＧｏｗ，Ａ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，９０２７（１９９９）に記載されるように調製した。還元性ニトロシル化反応を、亜硝酸ナトリウムがメタヘモグロビン溶液に０．０５〜０．７５までわずかに変化する［ＮＯ］０／［ヘム］のモル比で添加することにより行った（［ＮＯ］０は、このメタヘモグロビン溶液中のこの添加されたＮＯの最初の濃度である）。溶液を、アリコートの添加後すぐにボルテックスすることにより混合した。このタンパク質濃度を、全ての実験において７５μＭより多くで保持し、二量体へのヘモグロビンの分離を避けかつ理想的な溶液を維持するために２５０μＭより低く保持した。ＳＮＯ−ヘモグロビンを、反応生成物であると決定した。
【００４２】
（背景実施例２）
一酸化窒素（ＮＯ）または亜硝酸ナトリウムを、室温で１５分間、約５ｍＭの脱酸素化赤血球ヘム濃度で緩衝化生理食塩水中に濃縮脱酸素化赤血球と共に１：２５０（ＮＯまたはＮＯ２−／ヘモグロビン）のモル比でインキュベートした。
【００４３】
この赤血球の脱酸素化を、アルゴンを用いて脱ガス化することにより実施した。
【００４４】
脱酸素化赤血球を伴うＮＯまたはＮＯ２−のインキュベーションから生じる生成物の直接の測定は、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含む生成物を示す。代用血液（Ｈｃｔ  ３０）および５０ｃｃの代用血液から構成される生じた生成物を、総１ユニット（２００ｃｃ）の代用血液を４回に対して分けてブタへ輸液した。各注射の後、インビボでの肺胞−動脈勾配における変化が、３０分間続き、そしてコントロール、ＮＯインキュベーションおよびＮＯ２−インキュベーションの４回の注射についての平均を、プロットし、そして結果を、図１に示す（各点においてｎ＝４）。ネガティブの値は、ブタの酸素化における改善を反映する。図１に示すように、ＮＯおよび亜硝酸塩処理された脱酸素化赤血球は、わずかに肺機能を損傷したコントロールの赤血球と比較した場合肺機能における改善を生じた（５分の点を参照）。一酸化窒素および亜硝酸塩についての１０分の点についてコントロールと比較した（ｐ＜０．０１）。
【００４５】
（実施例Ｉ）
亜硝酸塩との反応を、オキシヘモグロビン溶液（ヘム中約４ｍＭ）と亜硝酸ナトリウムとを約１００：１（ヘム：亜硝酸）のモル比で混合することにより行った。この溶液を、数分間〜数時間室温に静置させ、次いでアルゴンを噴霧することにより脱酸素化した。サンプルを、生成物の特徴付けのために脱酸素化の直前および直後に回収した。脱酸素化前後のこの生成物は、脱酸素化後の生成物が、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含む点で異なる。反応後の生成物の酸化を、過剰量のフェリシアン化カリウムを用いて約２ｍＭの溶液中で実施した。その結果は、ＳＮＯ−ヘモグロビンの生成であった。
【００４６】
（実施例ＩＩ）
亜硝酸ナトリウムを、濃縮脱酸素化赤血球と共に室温で、１５分間インキュベートした。この生成物は、鉄ニトロシル化ヘモグロビンを含むことを示した。
【００４７】
重篤な冠状動脈性疾患を有する６７歳の男性は、自動車事故にあい、そのために輸液を必要とする。彼のヘマトクリットは、２４である。彼は、２ユニットの血液を与えられ、そして彼の血圧は、１０ｍｍＨｇに上がる。この患者は、胸の痛みを経験する。さらなる輸液が、継続する失血のために促される。上の段落で記載されるように亜硝酸塩で前処理された赤血球を、血圧の増加を伴うことなく与えそして胸部の痛みを解消する。この亜硝酸塩で前処理された赤血球を、現在認められているよりも１０％長く保存剤と供に貯蔵したとしても同じ結果を得た。
【００４８】
（実施例ＩＩＩ）
同一のシナリオを、実施例ＩＩにおけるように示すが、リン酸緩衝化生理食塩水中の亜硝酸ナトリウム溶液の注入を、一分あたり１μＭで開始した後、赤血球の輸液を副作用なく与える。
【００４９】
（実施例ＩＶ）
アンギナを有し、かつヘマトクリット４０を有する７５歳男性は、１００ｃｃの亜硝酸塩前処理された赤血球（実施例ＩＩに記載されるように前処理される）の注入を受け、この注入は、彼の血液の酸素運搬能力を変化させないが、それにもかかわらず、アンギナを解消しない。
（変更物）
変更物は、当業者に明白である。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲により規定される。
【図１】
2010120971.tif 000002