(57)【要約】【課題】安全性の高い植物抽出物を有効成分として含有する抗炎症組成物（薬剤組成物、飲食品組成物、飼料組成物又は化粧料組成物）を提供する。【解決手段】抗炎症組成物に、その有効成分としてノブドウ抽出物、好ましくは水溶性有機溶媒、含水水溶性有機溶媒又は水を抽出溶媒とした抽出処理により得られたノブドウ抽出物を含有させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノブドウ抽出物を有効成分として含有する抗炎症組成物。
【請求項２】
前記ノブドウ抽出物が、ヒアルロニダーゼ阻害作用及び／又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有する請求項１記載の抗炎症組成物。
【請求項３】
前記ノブドウ抽出物が、水溶性有機溶媒、含水水溶性有機溶媒又は水を抽出溶媒とした抽出処理により得られたものである請求項１又は２記載の抗炎症組成物。
【請求項４】
薬剤組成物、飲食品組成物、飼料組成物又は化粧料組成物である請求項１〜３のいずれかに記載の抗炎症組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性の高い植物抽出物を有効成分として含有する抗炎症組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノブドウは別名蛇葡萄とも呼ばれる学名Ampelopsis brevipedunculata Trautv.のぶどう科植物であって、北海道から沖縄、中国、朝鮮半島の山野に自生する落葉つる植物である。
中国ではノブドウの葉部及び蔓部が利尿、胃熱嘔吐に効果があるとされ、古くから煎じて飲用されており、大腸菌、ブドウ球菌の抑制作用、止血作用も認められている。
【０００３】
また、ノブドウの果実をアルコールで浸出した浸出液を主成分して成る肝硬変の予防及び治療剤（特許文献１参照）、ノブドウ根のメタノール冷浸エキスを酢酸エチル−水混合溶媒で分配し、酢酸エチル層を濃縮して得られるノブドウ根抽出物よりなる肝疾患治療剤（特許文献２参照）、ノブドウに含まれる没食子酸エステルの有効量を含む線維化抑制剤（特許文献３参照）、ノブドウのエキスを主成分とする免疫調節剤（特許文献４参照）等が知られている。
しかしながら、ノブドウ抽出物の抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用及び脂質代謝改善作用については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公昭６０−７９７４号公報
【特許文献２】特開平２−４８５３３号公報
【特許文献３】特開平５−２７１０６７号公報
【特許文献４】特開平８−３０５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性の高い天然物の中から、ヒアルロニダーゼ阻害作用及び／又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有する物質を見出し、それを有効成分とした抗炎症組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、ノブドウ抽出物を有効成分として含有する抗炎症組成物を提供する。
【０００７】
本発明の抗炎症組成物において、前記ノブドウ抽出物が、ヒアルロニダーゼ阻害作用及び／又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有することが好ましい。また、本発明の抗炎症組成物において、前記ノブドウ抽出物が、水溶性有機溶媒、含水水溶性有機溶媒又は水を抽出溶媒とした抽出処理により得られたものであることが好ましい。また、本発明の抗炎症組成物は、薬剤組成物、飲食品組成物、飼料組成物又は化粧料組成物であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、安全性の高いノブドウ抽出物を有効成分として含有する抗炎症組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「ノブドウ抽出物」には、ノブドウを抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１０】
抽出原料として使用するノブドウの部位は特に限定されるものではないが、例えば、地上部を使用することができ、その中でも特に茎部、蔓部及び葉部の１種又は２種以上を使用することが好ましい。
【００１１】
抽出原料として使用するノブドウは、採取後ただちに乾燥し粉砕したものが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、ノブドウの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１２】
抽出処理の際には、抽出溶媒として極性溶媒を使用することが好ましい。ノブドウに含まれる抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用又は脂質代謝改善作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって容易に抽出することができる。
【００１３】
極性溶媒の具体例としては、水、水溶性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これら極性溶媒のうち、水溶性有機溶媒又は含水水溶性有機溶媒を使用することが好ましい。
【００１４】
抽出溶媒として使用し得る水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が含まれる。
【００１５】
抽出溶媒として使用し得る水溶性有機溶媒としては、低級脂肪族アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等が挙げられ、低級脂肪族アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の１価アルコール；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール等の多価アルコール等が挙げられる。
抽出溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルセロソルブ等の中間極性溶媒を使用することもできる。
【００１６】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、含水水溶性有機溶媒を使用する場合、一価アルコール、多価アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等の含有量が１０重量％以上であることが好ましい。
【００１７】
抽出処理は、ノブドウに含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（重量比）の抽出溶媒にノブドウを浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理、液−液向流分配処理等によって行うことができる。得られた抽出液はそのままでも抗酸化組成物、皮膚老化防止用組成物、抗炎症組成物又は脂質代謝改善用組成物の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が利用しやすい。
【００１８】
ノブドウ抽出物は、活性酸素消去作用及び／又はラジカル消去作用に基づいて抗酸化作用を発揮することができる。ここで、「活性酸素」には、スーパーオキサイド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素等が含まれる。また、「ラジカル」とは、不対電子を１つまたはそれ以上有する分子または原子を意味し、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、ＤＰＰＨ等が含まれる。
【００１９】
ノブドウ抽出物は、抗酸化作用を発揮することができるので、抗酸化組成物の有効成分として使用することができる。なお、ノブドウ抽出物は、活性酸素消去作用又はラジカル消去作用を有しているので、活性酸素消去用組成物又はラジカル消去用組成物の有効成分として使用することもできる。
【００２０】
本発明の抗酸化組成物は、体内における活性酸素濃度の上昇（例えば、体内における活性酸素過剰産生による活性酸素濃度の上昇、老人等におけるスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）作用低下による活性酸素濃度の上昇）に起因する疾患、例えば、関節リウマチ、心筋梗塞、糖尿病、腎炎、肩こり、冷え性等を効果的に予防及び／又は改善することができる。また、本発明の抗酸化組成物は、薬剤、飲食品、化粧料等に配合される油脂類等、活性酸素の働きにより酸化又は劣化する成分の変質を効果的に防止することができる。
【００２１】
皮膚は紫外線等の環境因子の影響を直接受けるため活性酸素が発生しやすい器官であるから、何らかの理由により生体の抗酸化作用が十分に働かないと活性酸素濃度が上昇し、それに起因してメラニンの異常産生、シワ、たるみ、肌荒れ等の皮膚老化現象が生じる。また、加齢により皮膚の細胞増殖能が鈍化すると細胞の更新が行われにくくなるとともに、細胞により生産されるコラーゲン等の細胞間成分の供給も不十分となり、それに起因してシワ、たるみ、くすみ等の皮膚老化現象が生じる。さらに、皮膚の弾性に関与するエラスチンが加水分解酵素であるエラスターゼにより分解されると、皮膚の弾力が減少し、シワ、たるみ等の皮膚老化現象が生じる。したがって、ノブドウ抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、線維芽細胞増殖作用及びエラスターゼ阻害作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用に基づいて皮膚老化防止作用を発揮することができる。
【００２２】
ノブドウ抽出物は、皮膚老化防止作用を発揮することができるので、皮膚老化防止用組成物の有効成分として使用することができる。なお、ノブドウ抽出物は、線維芽細胞増殖作用又はエラスターゼ阻害作用を有しているので、線維芽細胞増殖用組成物又はエラスターゼ阻害用組成物の有効成分として利用することもできる。
本発明の皮膚老化防止用組成物は、皮膚の弾力低下、シワ、たるみ、肌荒れ等の皮膚老化現象を効果的に予防及び／又は改善することができる。
【００２３】
ヒアルロニダーゼは生体内の様々な組織に通常不活性な状態で存在するが活性化すると毛細血管の透過性を亢進すること、種々の炎症においてヒアルロニダーゼ活性が上昇すること、ヒアルロニダーゼを用いて実験的に急性炎症モデルを作製できること等の事実により、ヒアルロニダーゼが炎症反応に関与することが確認されており、ヒアルロニダーゼは起炎酵素とも呼ばれている。また、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼによりサイクリックＡＭＰが分解され、サイクリックＡＭＰ濃度が低下すると血小板凝集が生じ、血小板凝集はアラキドン酸カスケードのホスホリパーゼＡ２の活性化を招き、それにより放出されたロイコトリエンＢ４やプロスタグランジンＥ２等が炎症反応を引き起こす。したがって、ノブドウ抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害作用及び／又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用に基づいて抗炎症作用を発揮することができる。
【００２４】
ノブドウ抽出物は、抗炎症作用を発揮することができるので、抗炎症組成物の有効成分として使用することができる。なお、ノブドウ抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有しているので、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害用組成物の有効成分として利用することもできる。
本発明の抗炎症組成物は、炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡等を効果的に予防及び／又は改善することができる。
【００２５】
脂質の代謝促進に関与しているサイクリックＡＭＰが、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼによって分解されると、脂質の代謝が抑制され、体脂肪の過剰蓄積等が生じる。したがって、ノブドウ抽出物は、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用に基づいて脂質代謝改善作用を発揮することができる。すなわち、ノブドウ抽出物は、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を阻害し、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度を上昇させ、脂質の代謝を活発化させることにより、脂質代謝改善作用を発揮することができる。
ノブドウ抽出物は、脂質代謝改善作用を発揮することができるので、脂質代謝改善用組成物の有効成分として使用することができる。
本発明の脂質代謝改善用組成物は、脂質代謝を改善することにより肥満を予防及び／又は改善することができる。
【００２６】
本発明の各組成物において、「有効成分」とは、抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用又は脂質代謝改善作用を有する成分を意味し、ノブドウ抽出物が本発明の各組成物の主成分である必要はなく、また、本発明の各組成物にはノブドウ抽出物以外に抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用又は脂質代謝改善作用を有する成分が含まれていてもよい。
【００２７】
本発明の各組成物の形態は、目的とする作用効果が発揮され得る限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、薬剤組成物、飲食品組成物、飼料組成物、化粧料組成物等が挙げられる。本発明の各組成物におけるノブドウ抽出物以外の成分は、組成物の形態に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
薬剤組成物としては、例えば、内用又は外用の医薬品又は医薬部外品（すなわち内用剤又は外用剤）、飲食品や化粧料等に添加される添加剤等が挙げられる。薬剤組成物は、例えば、ノブドウ抽出物に薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の助剤（例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等）を配合することにより製造することができる。薬剤組成物の剤形としては、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、液剤、噴霧剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。薬剤組成物の投与経路は、剤形等に基づいて適宜選択することができ、投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等に応じて適宜調節することができる。
【００２９】
飲食品組成物及び飼料組成物は、ノブドウ抽出物に、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造することができる。
【００３０】
飲食品組成物は、ノブドウ抽出物をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合することにより製造することもできる。ノブドウ抽出物を配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、パン等が挙げられる。本発明の飲食品組成物は、飲料、錠剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、顆粒等の形態に加工すると簡便に飲食することができる。ノブドウ抽出物は、脂質を含有しない飲食品に配合してもよいが、脂質を含有する飲食品に配合することが好ましい。こうして製造された飲食品組成物は、抗肥満用飲食品としてばかりでなく、美肌、痩身等の美容を目的とした飲食品、すなわち美容用飲食品としても使用することができる。
【００３１】
飼料組成物は、ノブドウ抽出物をその活性を妨げないような任意の飼料に配合することにより製造することもできる。ノブドウ抽出物を配合し得る飼料は特に限定されないが、その具体例としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００３２】
化粧料組成物は、ノブドウ抽出物に、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を配合することにより製造することができる。
また、化粧料組成物は、ノブドウ抽出物をその活性を妨げないような任意の化粧料に配合することにより製造することもできる。ノブドウ抽出物を配合し得る化粧料は特に限定されないが、その具体例としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、入浴剤、リップクリーム、口紅等の皮膚化粧料が挙げられる。
【００３３】
本発明の各組成物におけるノブドウ抽出物の配合量は、組成物の形態や抽出物の活性等に応じて適宜調整することができる。例えば、薬剤組成物に標準的なノブドウ抽出物を配合する場合、好適な配合率は、１〜１００重量％であり、特に好ましい配合率は１０〜５０重量％であり、飲食品組成物又は飼料組成物に標準的なノブドウ抽出物を配合する場合、好適な配合率は、０．０１〜５０重量％であり、特に好ましい配合率は０．１〜１０重量％であり、化粧料組成物に標準的なノブドウ抽出物を配合する場合、好適な配合率は、０．００１〜１重量％であり、特に好ましい配合率は０．０１〜０．１重量％であり、
【実施例】
【００３４】
以下、製造例、試験例及び配合例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
〔製造例１〕
ノブドウの葉部及び蔓部の乾燥粉砕物１００ｇを１Ｌの３０％エタノール、５０％エタノール、８０％エタノールに浸漬し、２時間還流下に加熱した。その後、濾過して残渣を再び１Ｌのエタノールで同様に処理した。上記２回の処理により得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、それぞれ１４ｇ、９．９ｇ、７．８ｇの含水エタノール抽出エキスを得た。
【００３５】
〔製造例２〕
ノブドウの葉部及び蔓部の乾燥粉砕物１００ｇを１Ｌの熱水で２時間抽出処理した。その後、濾過して残渣を再び１Ｌの熱水で同様に処理した。上記２回の処理により得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、１０ｇの熱水抽出エキスを得た。
【００３６】
〔試験例１〕スーパーオキサイド消去作用試験
製造例１及び２で得られたエキスについてスーパーオキサイド消去作用を調べた。試験方法（ＮＢＴ法）は次の通りである。
１．試薬
（１）０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０.２）
（２）３ｍＭ キサンチン溶液：キサンチン４５．６４ｍｇを上記（１）の緩衝液に溶解して１００ｍＬとした。
（３）３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液：ＥＤＴＡ・２Ｎａ １１１．７ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
（４）ＢＳＡ溶液：ウシ血清アルブミン（Sigma）１５ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
（５）０．７５ｍＭ ＮＢＴ溶液：ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）６１．３２ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
（６）キサンチンオキシダーゼ溶液：キサンチンオキシダーゼを蒸留水で希釈した。濃度は下記「２．操作」の空試験における吸光度が０．２０〜０．２３の範囲に入るようにした。
（７）６ｍＭ ＣｕＣｌ２溶液：ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０２．２９ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
【００３７】
２．操作
試験管にＮａ2ＣＯ３緩衝液２．４ｍＬをとり、これにキサンチン溶液、ＥＤＴＡ溶液、ＢＳＡ溶液、ＮＢＴ溶液、各０．１ｍＬを加えた。試料溶液（８０％エタノール溶液）０．１ｍＬを加え、２５℃で１０分間放置後、キサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍＬを加え、手早く攪拌し、２５℃でインキュベートした。２０分後にＣｕＣｌ２溶液０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。別に、試料溶液の代わりに蒸留水を用いて空試験を行った。ＩＣ５０（スーパーオキサイド５０％消去濃度）（μｇ／ｍＬ）を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2010120946.tif 000002
【００３９】
表１に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキス、熱水抽出エキスがともにスーパーオキサイド消去作用を有していることが判明した。
【００４０】
〔試験例２〕一重項酸素消去作用試験
製造例１及び２で得られたエキスについて一重項酸素消去作用を調べた。試験法（赤血球溶血法）は次の通りである。
透明ガラス瓶（１０ｍＬ容）中で２％赤血球懸濁液５ｍＬ、試料を所定濃度で含むｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍＬ、及び光増感剤（１０ｍＭ ヘマトポルフイリン−２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液）０．０１ｍＬを混合した。得られた溶液をメリーゴーランド上、７．５Ｗハロゲンランプで３５分間均一に照射して一重項酸素（１Ｏ2）を発生させ、赤血球の溶血を生じさせた。この反応溶液１ｍＬを採取し、等張リン酸緩衝液２ｍＬを加えて混合後、４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。次いで、上清を採取し、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。別に、赤血球を一部溶血させた上記反応溶液１ｍＬをとり、これに蒸留水２ｍＬを加えて完全に溶血させたものをコントロールとし、同様に吸光度測定を行った。測定された吸光度より次式により一重項酸素消去率を求めた。
【００４１】
一重項酸素消去率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
なお、式中、「Ａ」はコントロールの吸光度、「Ｂ」は反応溶液上清の吸光度である。
試料濃度を段階的に減少させて上記消去率の測定を行い、一重項酸素消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。ＩＣ５０（一重項酸素５０％消去濃度）（μｇ／ｍＬ）を表２に示す。
【００４２】
【表２】
2010120946.tif 000003
【００４３】
表２に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキス、熱水抽出エキスがともに一重項酸素消去作用を有していることが判明した。
【００４４】
〔試験例３〕ラジカル消去作用試験
製造例１及び２で得られたエキスについてラジカル消去作用を調べた。試験法（ＤＰＰＨ法）は次の通りである。
１．５×１０４Ｍ ＤＰＰＨメタノール溶液３ｍＬに試料溶液３ｍＬを加え、直ちに容器を密栓して振り混ぜ、３０分間静置した。その後、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照試験として、試料溶液の代わりにその溶媒を用いて同様に操作し、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また空試験として、メタノール試料溶液３ｍＬを加えた後、直ちに５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された各吸光度により、次式によりラジカル消去率を算出した。
【００４５】
ラジカル消去率（％）＝〔１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ〕×１００
なお、式中、「Ａ」は対照試験の吸光度、「Ｂ」は試料溶液を添加した場合の吸光度、「Ｃ」は空試験の吸光度を表す。
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカル消去率が５０％になる試料溶液の濃度を内挿法により求めた。ＩＣ５０（ラジカル５０％消去濃度）（μｇ／ｍＬ）を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2010120946.tif 000004
【００４７】
表３に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキス、熱水抽出エキスがともにラジカル消去作用を有していることが判明した。
【００４８】
〔試験例４〕エラスターゼ阻害作用試験
製造例１で得られたエキスについてエラスターゼ阻害作用を調べた。試験方法は次の通りである。
９６穴マイクロプレートを用意し、１穴に対して試料溶液（溶媒：ＤＭＳＯ＋水）５０μＬ、基質溶液(2mM N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)２５μＬ及びエラスターゼ溶液（ヒト好中球由来エラスターゼ；6μg/mL）を添加した。２５℃で３０分間反応させた後、反応液を採取して４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。上記と同様の酵素反応と吸光度測定を、試料溶液の代わりに試料溶液と等量の溶媒のみを添加して行った。さらにそれぞれの場合について、エラスターゼ溶液を添加せずに同じ操作と測定を行った。測定結果より、下記の式によりエラスターゼ阻害率を算出した。
【００４９】
エラスターゼ阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
なお、式中、「Ａ」は酵素添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｂ」は酵素無添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｃ」は酵素添加・試料溶液無添加時の吸光度、「Ｄ」は酵素無添加・試料溶液無添加時の吸光度を表す。
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。ＩＣ５０（エラスターゼ５０％阻害濃度）（μｇ／ｍＬ）を表４に示す。
【００５０】
【表４】
2010120946.tif 000005
【００５１】
表４に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスがエラスターゼ阻害作用を有していることが判明した。
【００５２】
〔試験例５〕線維芽細胞増殖作用試験
製造例１で得られたエキスについてNB1RBG細胞増殖作用を調べた。試験方法はＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ, ９３，１５７，１９８６）に準拠して行った。
２５ｃｍ２の培養フラスコに入れた１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）にヒト正常新生児皮膚繊維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）１×１０６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。次いでトリプシン処理し、遠心分離して細胞を集めた。沈殿として得られた細胞を５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯ ＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）に懸濁し、９６穴プレートの１穴につき７×１０３個／１００μＬずつ分注した。２４時間培養後、試料を溶解した５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有培地を１穴につき１００μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で３日間培養した。培養後、培地を１穴につき１００μＬずつ除去し、ＭＴＴ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙ１−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ, ５ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ(−)溶液）２０μＬを添加し、４．５時間インキュベーションした（増殖した細胞中のミトコンドリア由来の活性酸素がＭＴＴ試薬と反応し、黄色であった試薬の色が５７０ｎｍに吸収のピークを有する青黄色に変わる）。その後、各穴に１０重量％ドデシル硫酸ナトリウム−０．０２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を１００μＬずつ分注し、１８時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。別に、試料の有無、細胞の有無を変えて、同様の操作を行い吸光度の測定を行った。また、各吸光度測定値は、同時に測定した６５０ｎｍの吸光度を差し引いて、増殖した細胞による濁度の影響を補正した。補正後の各吸光度より次式により細胞増殖促進率を求めた。
【００５３】
細胞増殖促進率（％）＝{（Ａ−Ｃ）−（Ｂ−Ｄ）}／（Ｂ−Ｄ）×１００
なお、式中、「Ａ」は試料添加時の吸光度、「Ｂ」は試料無添加時の吸光度、「Ｃ」は試料添加・細胞無添加時の吸光度、「Ｄ」は試料無添加・細胞無添加時の吸光度を表す。
試料濃度を段階的に減少させて上記消去率の測定を行い、線維芽細胞増殖率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表５に示す。
【００５４】
【表５】
2010120946.tif 000006
【００５５】
表５に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスが線維芽細胞増殖作用を有していることが判明した。
【００５６】
〔試験例６〕ヒアルロニダーゼ阻害作用試験
製造例１で得られたエキスについてヒアルロニダーゼ阻害作用を調べた。試験方法は次の通りである。
ヒアルロニダーゼ溶液（４００ユニット／ｍＬ，ｐＨ３．５酢酸緩衝液）０．１ｍＬと試料溶液０．２ｍＬとを混合し、３７℃で２０分間インキュベートした後、活性化剤溶液（２．５ｍＭ−ＣａＣｌ２）０．２ｍＬを加え、３７℃で２０分間インキュベートして酵素を活性化した。ヒアルロン酸カリウム緩衝液０．５ｍＬを加え、３７℃で４０分間インキュベートした後、０．４Ｎ 水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加えると共に氷冷して反応を停止させた。次いで０．８Ｍ ホウ酸溶液（ｐＨ９．１）０．２ｍＬを加え、沸騰浴中で３分間加熱後、直ちに２０分間氷冷した。Ｐ−ＤＡＢＡ試薬（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１０ｇを１０Ｎ 塩酸１２．５ｍＬと酢酸８７．５ｍＬの混合液に溶解し、酢酸で１０倍に希釈したもの）６．０ｍＬを加えて３７℃で２０分間インキュベートしたことにより、上記酵素反応で遊離したＮ−アセチルグルコサミンを発色させ、波長５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の操作と吸光度測定を、酵素を添加せずに行った。さらに試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行い、次式によりヒアルロニダーゼ阻害率を求めた。
【００５７】
ヒアルロニダーゼ阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
なお、式中、「Ａ」は酵素添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｂ」は酵素無添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｃ」は酵素添加・試料溶液無添加時の吸光度、「Ｄ」は酵素無添加・試料溶液無添加時の吸光度を表す。
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表６に示す。
【００５８】
【表６】
2010120946.tif 000007
【００５９】
表６に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスがヒアルロニダーゼ阻害作用を有していることが判明した。
【００６０】
〔試験例７〕サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用試験
製造例１で得られたエキスについてサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を調べた。試験方法は次の通りである。
１．５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２ｍＬにウシ胎児血清アルブミン溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬ及びサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬを加え、さらに試料をそれぞれ含有する試料溶液０．０５ｍＬを加え、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、サイクリックＡＭＰ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応後、沸騰水上で３分間煮沸して反応を停止させ、４℃で遠心分離し、上清中の反応基質（サイクリックＡＭＰ）を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。
【００６１】
試料溶液を加えずに同様の酵素反応と反応基質の定量を行い、試料無添加時の反応基質量に対する試料添加時の反応基質の比率により、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害率（％）を求めた。
試料溶液の試料濃度を段階的に変化させてサイクリックAMPホスホジエステラーゼ阻害率（％）を測定し、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表７に示す。
【００６２】
【表７】
2010120946.tif 000008
【００６３】
表７に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスがサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有していることが判明した。
【００６４】
〔配合例１〕
下記の原料を均一に混合し、常法により顆粒状にした後、打錠し、錠剤状健康食品を製造した。
ノブドウ地上部５０％エタノール抽出物                      ７５重量部
ウコン抽出物                                              ５０重量部
甘草抽出物                                                  ５重量部
酵母エキス(アミノ酸、ビタミン含有)                        ２５重量部
粉糖                                                    １２３重量部
結晶セルロース                                            １０重量部
ショ糖脂肪酸エステル                                      １２重量部
【００６５】
〔配合例２〕
下記の原料を混合し、常法による打ち抜き法でソフトカプセル状の健康食品を製造した。
ノブドウ地上部水抽出物                                    ５０重量部
ビタミンＥ                                                ２５重量部
シリマリン                                                ６０重量部
牡蠣肉エキス                                              ２５重量部
植物油                                                  １１３重量部
グリセリン脂肪酸エステル                                  １２重量部
ミツロウ                                                  １５重量部
【００６６】
〔配合例３〕
下記の原料を均一に混合し、常法により顆粒状にし、顆粒状健康食品を製造した。
ノブドウ地上部エタノール抽出物                            ３０重量部
ギムネマエキス粉末                                        ２５重量部
大豆ペプチド                                              ６５重量部
マルチトール                                            １６０重量部
結晶セルロース                                            ２０重量部