(57)【要約】      （修正有）【課題】脳内のβ−アミロイドの沈着による疾患の治療および予防用に使用するための治療剤の提供。【解決手段】β−アミロイドペプチド（Ａβペプチド）に対する抗体である。別の治療剤はＡβペプチドを患者に投与して免疫応答を誘導するものであり、Ａβペプチドに対する免疫応答を増強するアジュバント（例えばミョウバンまたはＭＰＬ）とともに投与される。該ＡβペプチドはＡβ１−４２のペプチドであり、Ａβペプチドは凝集化形態または解離化形態において投与される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内のアミロイドの沈着に特徴を有する疾患の治療または予防において使用するためのＡβペプチドに特異的に結合する抗体または該抗体を誘導する薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および医学の技術的分野に関し、より具体的には、β−アミロイドペプチド（Ａβ）の沈着を特徴とする疾患の治療及び予防用の抗体またはその抗体を誘発する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年痴呆を生じる進行性の疾患である（一般的には、非特許文献１；特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと。）。概して、この疾患は２つのカテゴリーに分類される；後期発症（老年期（６５歳以上）に発生する）および初期発症（老年期のかなり前（すなわち、３５歳と６０歳との間）に発生する）。疾患の両方の型において、その病理学は同じであるが、異常性はより若い年齢で始まる症例において、より重篤およびより広範囲になる傾向がある。この疾患は、脳内における病変の２つの型、老人斑および神経細線維もつれ、により特徴付けられる。老人斑とは、脳組織切片の顕微鏡解析により可視され得る中心での細胞外アミロイド沈積物を横切る１５０μｍまでの組織の破壊された神経網の領域である。神経細線維もつれとは、対において互いにねじられた２つのフィラメントから構成されるタウタンパク質の細胞内沈積物である。
【０００３】
斑の主成分は、Ａβまたはβ−アミロイドペプチドと呼ばれるペプチドである。Ａβペプチドはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質のアミノ酸３９〜４３の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質中のいくつかの変異は、アルツハイマー病の存在と相関している（例えば、非特許文献５（バリン717をイソロイシンに
）；非特許文献６（バリン717をグリシンに）；非特許文献７（バリン717をフェニルアラニンに）；非特許文献８（リジン595−メチオニン596をアスパラギン595−ロイシン596に変換する二重変異）を参照のこと。）。そのような変異は、ＡＰＰのＡβへのプロセシングを増加または変化させることにより、特にＡβの長形態（すなわち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）を増量するようにＡＰＰをプロセシングすることにより、アルツハイマー病を生じるものと考えられている。他の遺伝子（例えば、プレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２）における変異は、増加した量のＡβの長形態を産生するＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を及ぼすと考えられる（例えば、非特許文献９を参照のこと）。これらの観察から、Ａβ、そして特にその長形態は、アルツハイマー病における原因要素であることが示される。
【０００４】
特許文献２は、予め確立されたＡＤの患者に対する、ホメオパシー用量（１０-2ｍｇ／１日以下）のＡβの投与を提案する。約５リットルの血漿を有する代表的なヒトにおいては、この用量の上限でさえ、２ｐｇ／ｍｌ以下の濃度を産生すると予期される。ヒト血漿におけるＡβの標準的な濃度は、代表的には５０〜２００ｐｇ／ｍｌの範囲内である（例えば、非特許文献１０参照）。特許文献３の提案される用量は、内因性循環Ａβのレベルをほとんど変化しないため、そして特許文献４はアジュバントの使用を推奨しないため、治療的利点を生じることは信じがたく思われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ ９２／１３０６９
【特許文献２】ＥＰ５２６，５１１
【特許文献３】ＥＰ ５２６，５１１
【特許文献４】ＥＰ ５２６，５１１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｌｋｏｅ、ＴＩＮＳ １６、４０３−４０９（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｏｌｋｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３、４３８−４４７（１９９４）
【非特許文献３】Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３、４７６−４７７（１９９５）
【非特許文献４】Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３，５２３（１９９５）
【非特許文献５】Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９、７０４（１９９１）
【非特許文献６】Ｃｈａｒｔｉｅｒ Ｈａｒｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３，８４４（１９９１）
【非特許文献７】Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４，９７（１９９１）
【非特許文献８】Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１，３４５（１９９２）
【非特許文献９】Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ ２０、１５４（１９９７）
【非特許文献１０】Ｓｅｕｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ３５９，３２５−３２７（１９９２）
【発明の概要】
【０００７】
対照的に、本発明はとりわけアルツハイマー病および他のアミロイド性疾患の、患者における有益な免疫応答を生じる条件下で、その患者にＡβまたは他の免疫原を投与することによる処置に関する。従って本発明は、アルツハイマー病の神経病理学を予防または寛解するための治療プログラムに対する長期にわたる要求を満たす。
【０００８】
１つの局面において、本発明は患者におけるアミロイド沈積により特徴付けられる疾患を、予防または処置する方法を提供する。そのような方法は、患者におけるアミロイド沈積物のペプチド成分に対する免疫応答を誘導する工程を包含する。そのような誘導は、免疫原の投与により能動的であり得るか、または抗体または抗体の活性フラグメントもしくは誘導体の投与により受動的であり得る。何人かの患者において、アミロイド沈積物は凝集化されたＡβペプチドであり、そして疾患はアルツハイマー病である。いくつかの方法において、患者は無症候性である。いくつかの方法において、患者は５０歳以下の年齢である。いくつかの方法において、患者はアルツハイマー病に感受性を示す、遺伝される危険因子を有する。そのような危険因子は、プレセニリン遺伝子ＰＳ１またはＰＳ２における変異型の対立遺伝子および変異型形態のＡＰＰを含む。他の方法において、患者はアルツハイマー病に対する公知の危険因子を全く有さない。
【０００９】
アルツハイマー病に罹患した患者の処置について、１つの処置レジメンは、Ａβペプチドのある用量を患者に投与して免疫応答を誘導する工程を包含する。いくつかの方法において、ＡβペプチドはＡβペプチドに対する免疫応答を増強するアジュバントとともに投与される。いくつかの方法において、アジュバントはミョウバンである。いくつかの方法において、アジュバントはＭＰＬである。患者に投与されるＡβペプチドの用量は、アジュバントとともに投与される場合、代表的には少なくとも１μｇまたは１０μｇ、そしてアジュバントを伴わずに投与される場合、少なくとも５０μｇである。いくつかの方法において、その用量は少なくとも１００μｇである。
【００１０】
いくつかの方法において、ＡβペプチドはＡβ１−４２である。いくつかの方法において、Ａβペプチドは凝集化形態において投与される。他の方法において、Ａβペプチドは解離化形態において投与される。いくつかの方法において、治療剤はＡβまたはその活性なフラグメントもしくは誘導体をコードする有効用量の核酸である。Ａβまたはそのフラグメントをコードする核酸は、患者において発現され、免疫応答を誘導するＡβまたはその活性なフラグメントを産生する。そのような方法のいくつかにおいて、核酸は皮膚を通
して、必要に応じてパッチを介して投与される。いくつかの方法において、治療剤は、Ａβに対する抗体に反応性の化合物を同定するために、化合物のライブラリーをスクリーニングする工程、および化合物を患者に投与して免疫応答を誘導する工程によって同定される。
【００１１】
いくつかの方法において、免疫応答は、解離化Ａβペプチドに対して向けられるのでなく、凝集化Ａβペプチドに向けられる。例えば、免疫応答は解離化Ａβペプチドに結合せず、凝集化Ａβペプチドに結合する抗体を含み得る。いくつかの方法において、免疫応答はＣＤ８またはＣＤ４細胞上でＭＣＨＩまたはＭＣＨＩＩと複合体を形成したＡβに結合するＴ細胞を含む。他の方法において、免疫応答はＡβに対する抗体を患者に投与することによって誘導される。いくつかの方法において、免疫応答は、患者からＴ細胞を取り出す工程、Ｔ細胞が感作される条件下でＴ細胞とＡβペプチドを接触させる工程、および患者中にＴ細胞を戻す工程により誘導される。
【００１２】
治療剤は、代表的には経口的に、鼻腔内的に、皮内的に、皮下的に、筋肉内的に、局所的に、または静脈内的に投与される。いくつかの方法において、患者は投与後に、免疫応答を評価するためにモニターされる。モニタリングが長期にわたる免疫応答の減少を示す場合、患者は１以上のさらなる用量の薬剤を与えられ得る。
【００１３】
別の局面において、本発明はＡβおよび、経口および他の投与経路に適切な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、患者においてＡβに対する免疫原応答を誘導するのに効果的な薬剤、および薬学的に許容され得るアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。いくつかのそのような組成物において、薬剤はＡβまたはその活性フラグメントである。いくつかの組成物において、アジュバントはミョウバンである。いくつかの組成物において、アジュバントは水中油エマルジョンを含む。いくつかの組成物において、Ａβまたは活性フラグメントはポリラクチドポリグリコリドコポリマー（ＰＬＰＧ）または他の粒子の成分である。本発明はさらに、患者の血流へのＡβの送達を促進し、そして／またはＡβに対する免疫応答を促進するコンジュゲート（または結合体）分子に連結されたＡβまたは活性フラグメントを含む組成物を提供する。例えば、コンジュゲートはＡβに対する免疫応答を促進するために役立ち得る。いくつかの組成物において、コンジュゲートはコレラ毒素である。いくつかの組成物において、コンジュゲートは免疫グロブリンである。いくつかの組成物において、コンジュゲートは弱毒化されたジフテリア毒素ＣＲＭ１９７（Ｇｕｐｔａ、Ｖａｃｃｉｎｅ１５、１３４１−３（１９９７））である。
【００１４】
本発明はまた、組成物が完全フロイントアジュバントを含まないという条件下で、患者においてＡβに対する免疫応答を誘導する効果のある薬剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、Ａβに対する免疫応答を誘導するのに有効な、Ａβまたはその活性フラグメントをコードするウイルスベクターを含む組成物を提供する。適切なウイルスベクターは、ヘルペス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、シンドビス、セムリキ森林ウイルス、痘疹またはトリ痘疹を含む。
【００１５】
本発明はさらに、アルツハイマー病を予防または治療する方法を提供する。そのような方法において、有効用量のＡβペプチドが患者に投与される。本発明はさらに、アルツハイマー病の予防または治療のための医薬の製造におけるＡβまたはそれに対する抗体の使用を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、患者におけるアルツハイマー処置方法の効力を評価する方法を提供する。これらの方法において、Ａβペプチドに対して特異的な抗体の基線量（ベースライン）は、薬剤処置前の患者由来の組織サンプルにおいて決定される。その薬剤処置後の患者由来の組織サンプルにおけるＡβペプチドに特異的な抗体の量は、Ａβペプ
チド特異的抗体の基線量と比較される。Ａβペプチド特異的抗体の基線量よりも有意に多い、処置後に測定されたＡβペプチド特異的抗体の量は、陽性の処置結果を示す。
【００１７】
患者におけるアルツハイマーの処置方法の効力を評価する他の方法において、薬剤処置前の患者由来の組織サンプルにおける、Ａβペプチドに特異的な抗体の基線量が決定される。その薬剤処置後の被験者由来の組織サンプルにおけるＡβペプチドに特異的な抗体の量は、Ａβペプチド特異的抗体の基線量と比較される。Ａβペプチド特異的抗体の基線量に比較される、処置後に測定されるＡβペプチド特異的抗体の量の間の有意な差異の減少または欠如は、陰性の処置結果を示す。
【００１８】
患者におけるアルツハイマー病処置方法の効力を評価する他の方法において、Ａβペプチドに特異的な抗体の対照量を、対照集団由来の組織サンプルにおいて決定する。薬剤投与後の患者由来の組織サンプルにおけるＡβペプチドに特異的な抗体の量を、Ａβペプチド特異的抗体の対照量と比較する。Ａβペプチド特異的抗体の対照量よりも有意に多い、処置後に測定されるＡβペプチド特異的抗体の量は、陽性の処置結果を示す。
【００１９】
患者におけるアルツハイマー処置方法の効力を評価する他の方法において、対照集団由来の組織サンプルにおけるＡβペプチドに特異的な抗体の対照量が決定される。薬剤投与後の患者由来の組織サンプルにおけるＡβペプチドに特異的な抗体の量は、Ａβペプチド特異的抗体のその対照量と比較される。Ａβペプチド特異的抗体の対照量と比較される、その処置の開始後に測定されるＡβ特異的抗体の量の間の有意な差異の欠如は、陰性の処置結果を示す。
【００２０】
患者におけるアルツハイマー病またはそれに対する感受性をモニターする他の方法は、患者由来のサンプルにおけるＡβペプチドに対する免疫応答を検出する工程を含む。そのようないくつかの方法において、患者はアルツハイマー病を処置または予防するのに有効な薬剤を投与されており、そしてその応答レベルが患者の将来の処置レジメンを決定する。
【００２１】
患者におけるアルツハイマー処置方法の効力を評価する他の方法において、薬剤で処置された患者由来の組織サンプルにおけるＡβペプチドに特異的な抗体の量の値が決定される。その値は、その薬剤での処置に起因する、アルツハイマー病の症状の回復、または脱却を経験した患者集団から決定される対照値と比較される。少なくとも対照値に等しい患者の値は、処置に対する陽性の応答を示す。
【００２２】
本発明はさらに、上記方法を実施するための診断用キットを提供する。そのようなキットは、代表的にＡβに対する抗体に特異的に結合する試薬、またはＡβと反応性のＴ細胞の増殖を刺激する試薬を含む。
【００２３】
（定義）
用語「実質的な同一性」は、２つのペプチド配列が、最適に整列された場合に（例えば、初期設定ギャップウェイトを使用するＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより）、少なくとも６５％の配列同一性を、好ましくは少なくとも８０または９０％の配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも９５％以上の配列同一性（例えば、９９％以上の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００２４】
配列比較について、代表的には１つの配列は参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列はコンピューター内に入力され、必要であれば、配列座標が指示され、そして配列アルゴリズム
プログラムのパラメーターが指示される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指示されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較される試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００２５】
比較についての配列の最適な整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方
法により、コンピュータ処理されたこれらのアルゴリズムの実行（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳ
ＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または視覚的検査（一般的に、前出のＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと）により実行され得る。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に入手し得る。代表的には、初期設定のプログラムパラメーターが配列比較を実施するために使用され得るが、カスタマイズされたパラメーターもまた使用され得る。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として文字長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
【００２６】
アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のために、アミノ酸は以下のように分類される；Ｉ群（疎水性側鎖）：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；ＩＩ群（中性親水性側鎖）：システイン、セリン、トレオニン；ＩＩＩ群（酸性側鎖）：アスパラギン酸、グルタミン酸；ＩＶ群（塩基性側鎖）：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン；Ｖ群（鎖の配向に影響する残基）：グリシン、プロリン；およびＶＩ群（芳香性側鎖）：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。保存的置換は同じクラス内のアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのうちの１つのクラスのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換からなる。
【００２７】
本発明の治療剤は、代表的には、実質的に純粋である。このことは、薬剤が代表的には、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純度であること、および妨害タンパク質および夾雑物を実質的に含まない状態を意味する。時として、薬剤は少なくとも約８０％ｗ／ｗおよび、より好ましくは少なくとも９０％ ｗ／ｗ純度または約９５％ ｗ／ｗ純度である。しかし、従来のタンパク質精製技術を使用して、少なくとも９９％ｗ／ｗの均質ペプチドが得られ得る。
【００２８】
２つの実体間の特異的結合は、少なくとも１０6、１０7、１０8、１０9Ｍ-1、または１０10Ｍ-1の親和力を意味する。１０8Ｍ-1より大きな親和性が好ましい。
【００２９】
用語「抗体」とは、インタクトな抗体およびその結合フラグメントを含めるために使用される。代表的には、フラグメントは、抗原に対する特異的な結合について、フラグメントが由来するインタクトな抗体と競合する。必要に応じて、抗体またはその結合フラグメントは、他のタンパク質と化学的に連結され得るか、または他のタンパク質との融合タン
パク質として発現され得る。
【００３０】
ＡＰＰ695、ＡＰＰ751、およびＡＰＰ770とはそれぞれ、ヒトＡＰＰ遺伝子によりコー
ドされる６９５、７５１および７７０アミノ酸残基長のポリペプチドをいう。Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ３２５、７７３（１９８７）；Ｐｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１、５
２５（１９８８）；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１、５３０（１９
８８）を参照のこと。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０イソ型の配列に従う数が割り当てられる。Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３のような用語はアミノ酸残基１−３９、１−４０、１−４１、１−４２、および１−４３を含むＡβペプチドをいう。
【００３１】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。Ｂ−細胞のエピトープは、タンパク質の三次元的な折り畳みによって並列される隣接するアミノ酸または隣接しないアミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、代表的には、変性溶媒への曝露において保持されるが、三次元的な折り畳みによって形成されるエピトープは、代表的に、変性溶媒を用いる処理において失われる。エピトープは、代表的には、固有の空間的構造の中に少なくとも３、そしてより通常には少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ
編（１９９６）を参照のこと。同一のエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対するある抗体の結合を阻止する別の抗体の能力を示す単純なイムノアッセイにおいて同定され得る。Ｔ−細胞は、ＣＤ８細胞に対する約９のアミノ酸の連続するエピトープまたはＣＤ４細胞に対する約１３〜１５アミノ酸の連続するエピトープを認識する。このエピトープを認識するＴ細胞は、エピトープに応答する初回刺激されたＴ細胞による3Ｈ-チミジン取り込みによって（Ｂｕｒｋｅら、Ｊ．Ｉｎｆ． Ｄｉｓ．１７０、１１１０〜１９（１９９
４））、抗原依存性殺傷によって（細胞傷害性 Ｔリンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓら、
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６、３９０１〜３９１０）またはサイトカイン分泌によって決定されるような、抗原依存性増殖を測定するインビトロアッセイによって同定され得る。
【００３２】
用語「免疫学的」または「免疫」応答とは、（抗体媒介性の）有益な体液性応答および／またはレシピエント患者のアミロイドペプチドに対する（抗原特異的Ｔ細胞またはこれらの分泌産物によって媒介される）細胞の応答の発生である。このような応答は、免疫原の投与によって誘導される能動的な応答であり得るか、または抗体もしくは初回刺激されたＴ−細胞の投与によって誘導される受動的な応答であり得る。細胞性免疫応答は、抗原特異的ＣＤ４+ Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８+ 細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するクラスＩＭＨＣ分子またはクラスＩＩＭＨＣ分子に関連するポリペプチドエピトープの存在によって誘発される。この応答はまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、好酸球または他の本質的な免疫性の成分の活性化に関与し得る。細胞媒介性の免疫学的応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４+ Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイ（Ｂｕｒｋｅ（前出）；Ｔｉｇｇｅｓ（前出）を参照のこと）によって決定され得る。免疫原の保護的または治療的効果に応答する、体液性および細胞性応答に関連する寄与は、免疫化された同系の動物からＩｇＧおよびＴ−細胞を別々に単離し、そして２番目の被験体における保護的または治療的効果を測定することによって区別され得る。
【００３３】
「免疫原性物質」または「免疫原」は、必要に応じてアジュバントを組み合わせて、患者への投与におけるそれ自体に対する免疫学的応答の誘導が可能である。
【００３４】
用語「裸のヌクレオチド」とは、コロイド状物質と複合体化しないポリヌクレオチドをいう。裸のポリペプチドは、時にプラスミドベクターにおいてクローン化される。
【００３５】
用語「アジュバント」とは、抗原を組み合わせて投与される場合は、抗原に対する免疫応答を増大し、しかし単独で投与される場合は、抗原に対する免疫応答をもたらさない化合物をいう。アジュバントは、リンパ球補充、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含む種々の機構による免疫応答を増大し得る。
【００３６】
用語「患者」には、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物被験体が挙げられる。
【００３７】
脱凝集したＡβまたは単量体Ａβとは、Ａβの可溶性の単量体のペプチド単位を意味する。単量体Ａβを調製する１つの方法は、超音波処理を用いて、純粋なＤＭＳＯ中に凍結乾燥されたペプチドを溶解することである。この生じる溶液は、いくらかの不溶解性粒子を除去するために遠心分離される。凝集したＡβは、単量体単位が非共有結合によって結合される、オリゴマーの混合物である。
【００３８】
１以上の列挙されているエレメントを「含む」組成物または方法は、具体的には列挙されていない他のエレメントを含み得る。例えば、Ａβペプチドを含む組成物は、単離されたＡβペプチドおよびより大きなポリペプチド配列の成分としてのＡβペプチドの両方を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】トランスジェニックマウスへのＡβ１−４２注射後の抗体力価
【図２】海馬におけるアミロイド負荷量。Ａβ特異的ｍＡβ ３Ｄ６との反応性により規定される、アミロイド斑により占められる海馬領域の面積の割合は、免疫反応した脳切片の、コンピューターを使用した定量的画像解析により決定された。各マウスに対する値は処置群により分類されて示される。各群についての水平方向の線は、分布の中央値を示す。
【図３】海馬における神経炎性形成異常（Ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）。ヒトＡＰＰ特異的ｍＡβ ８Ｅ５との反応性により規定される、形成異常の軸索により占められる海馬領域の面積の割合は、免疫反応した脳切片の、定量的なコンピューターを使用する画像解析により決定された。各マウスについての値は、ＡＮ１７９２処置群およびＰＢＳ処置対照群に対して示される。各群についての水平方向の線は、分布の中央値を示す。
【図４】後方板状（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ）皮質における星状細胞増加。神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）−陽性星状細胞により占められる皮質領域の面積の割合は、免疫応答した脳切片の、定量的なコンピューターを使用する画像解析により決定された。各マウスについての値は処置群により分類されて示され、そして中央群の値は水平方向の線により示される。
【図５】ＡＮ１７９２の８つの用量（０．１４、０．４、１．２、３．７、１１、３３、１００、または３００μｇを含む）の範囲で免疫後の、Ａβ１−４２に対する抗体力価の幾何平均。
【図６】ＡＮ１７９２免疫に対する抗体応答の速度論。力価は各群において６匹の動物に対する値の幾何平均として表現される。
【図７】ＰＢＳ処置マウスおよびＡＮ１７９２処置マウスにおける皮質性アミロイド負荷量の定量的画像解析。
【図８】ＰＢＳ処置マウスおよびＡＮ１７９２処置マウスにおける神経炎斑負荷量の定量的画像解析。
【図９】ＰＢＳ処置マウスおよびＡＮ１７９２処置マウスにおいて星状細胞増加により占められる後方板状皮質の割合に関する定量的画像解析。
【図１０】ＡＮ１７９２処置（上方パネル）またはＰＢＳ処置（下方パネル）由来の脾細胞でのリンパ球増殖アッセイ。
【図１１】皮質における総Ａβレベル。フロイントアジュバントと組み合わせられたＡβまたはＡＰＰ誘導体で免疫されたマウスにおける各Ａβプロフィールの散布プロット。
【図１２】皮質におけるアミロイド負荷量は、Ａβペプチド結合体Ａβ１−５、Ａβ１−１２、およびＡβ１３−２８；全長Ａβ凝集体ＡＮ１７９２（Ａβ１−４２）およびＡＮ１５２８（Ａβ１−４０）、ならびにＰＢＳ処置対照群で免疫されたマウスについての、免疫反応した脳切片の定量的画像解析により決定された。
【図１３】フロイントアジュバントと組み合わせられたＡβまたはＡＰＰ誘導体で免疫されたマウス群に対するＡβ特異的抗体の力価の幾何平均。
【図１４】種々のアジュバントと組み合わせられたＡＮ１７９２、またはそのパルミトイル化された誘導体で免疫されたモルモット群に対するＡβ特異的抗体の幾何平均力価。
【図１５Ａ】異なるアジュバントを用いてＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８で処置された１２月齢ＰＤＡＰＰマウスの皮質におけるＡβレベル。
【図１５Ｂ】異なるアジュバントを用いてＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８で処置された１２月齢ＰＤＡＰＰマウスの皮質におけるＡβレベル。
【図１５Ｃ】異なるアジュバントを用いてＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８で処置された１２月齢ＰＤＡＰＰマウスの皮質におけるＡβレベル。
【図１５Ｄ】異なるアジュバントを用いてＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８で処置された１２月齢ＰＤＡＰＰマウスの皮質におけるＡβレベル。
【図１５Ｅ】異なるアジュバントを用いてＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８で処置された１２月齢ＰＤＡＰＰマウスの皮質におけるＡβレベル。
【００４０】
（詳細な説明）
Ｉ．概略
本発明は、アミロイド沈着の蓄積によって特徴付けられる疾患の予防的処置および治療的処置に対する薬学的組成物および方法を提供する。アミロイド沈着は、不溶性塊に凝集されたペプチドを含む。このペプチドの性質は、異なる疾患において変化するが、しかし多くの場合において、この凝集体はβ−ひだ状シート構造を有し、そしてコンゴーレッド色素を用いて染色する。アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患は、早期および後期発症のアルツハイマー病（ＡＤ）の両方を含む。両方の疾患において、このアミロイド沈着は、Ａβと呼ばれるペプチドを含み、これは発症される個体の脳において蓄積される。いくつかの他の疾患の例は、アミロイド沈着が、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、および海綿状脳障害（狂牛病、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ヒツジスクラピー、およびミンク海綿状脳障害を含む）によって特徴付けられる（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７、６９５〜７０
０（１９９７）；Ｓｍｉｔｓら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ １９、１０１〜１０５（１９９７）；Ｎａｔｈａｎｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１
４５、９５９〜９６９（１９９７）を参照のこと）。これらの疾患において凝集体を形成するペプチドは、最初の３つに対してはそれぞれ、血清アミロイドＡ、シスタンチン（ｃｙｓｔａｎｔｉｎ）Ｃ、ＩｇＧ κ軽鎖であり、そして他のものに対してはプリオンタン
パク質である。
【００４１】
ＩＩ．治療剤
１．アルツハイマー病
本発明における使用のための治療剤は、Ａβペプチドに対する免疫応答を誘導する。こ
れらの薬剤は、Ａβペプチド自体ならびにその改変体、Ａβペプチドに対する抗体を誘導するかおよび／またはＡβペプチドに対する抗体と交差反応するＡβペプチドのアナログおよびＡβペプチドの模倣物、ならびにＡβペプチドと反応性のある抗体もしくはＴ−細胞を含む。免疫反応の誘導は、免疫原が患者におけるＡβと反応性のある抗体またはＴ−細胞を誘導するために投与される場合に、活性であり得、または抗体が、抗体それ自体が患者におけるＡβに結合するように投与される場合に、受動的であり得る。
【００４２】
βアミロイドペプチドとしても知られているＡβ、またはＡ４ペプチド（ＵＳ４，６６６，８２９；ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０、１１３１（１９８４）を参照のこと）は、３９〜４３アミノ酸のペプチドであり、これはアルツハイマー病の特徴的なプラークの主要な成分である。Ａβは、２つの酵素（βセクレターゼおよびγセクレターゼと呼ばれている（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ２０、１５４（１９９７）を参照のこと））による、より大きなタンパク質であるＡＰＰのプロセシングによって生成される。アルツハイマー病と関連するＡＰＰにおける公知の変異体は、βセクレターゼおよびγセクレターゼの部位に近接して、またはＡβ内部に生じる。例えば、７１７位は、ＡβへのＡＰＰのプロセシングにおけるＡＰＰのγセクレターゼ切断の部位に近接し、そして６７０／６７１位は、βセクレターゼ切断の部位に近接する。この変異は、それによってＡβが、生成されるＡβの４２／４３アミノ酸形態の量を増大するために形成される、切断反応との相互作用によって、ＡＤ疾患を引き起こす。
【００４３】
Ａβは、古典的および代替的な補体カスケードの両方で結合し、そして活性化し得る、異常な特性を有する。特に、これは、Ｃｌｑおよび最終的にはＣ３ｂｉに結合する。この結合は、Ｂ細胞の活性化を導くマクロファージへの結合を促進する。さらに、Ｃ３ｂｉはさらに崩壊し、次いでこれらの細胞の活性化を１０，０００増加することを導くＴ−細胞依存様式において、Ｂ−細胞上でＣＲ２に結合する。この機構は、他の抗原の免疫応答以上の免疫応答を生成するためにＡβを生じる。
【００４４】
本願方法において使用される治療剤は、Ａβペプチドの任意に天然に生じる形態であり得、そして特に、ヒトの形態であり得る（すなわち、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、またはＡβ４３）。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体へのそれらの関連性は、Ｈａｒｄｙら、ＴＩＮＳ２０、１５５〜１５８（１９９７）の図１に図示されている。例えば、Ａβ４２は以下の配列を有する：Ｈ2Ｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨ。
【００４５】
Ａβ４１、Ａβ４０およびＡβ３９は、Ｃ末端からそれぞれＡｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ、およびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの脱落によって、Ａβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端でのスレオニン残基の存在によってＡβ４２と異なる。この治療剤はまた、ヒトへの投与における同様の防御的または治療的免疫応答を誘導するエピトープを含む、天然のＡβペプチドの活性フラグメントまたはアナログであり得る。代表的には、免疫原性フラグメントは、天然のペプチド由来の、少なくとも３、５、６、１０または２０の連続するアミノ酸の配列を有する。免疫原性フラグメントは、Ａβ１〜５、１〜６、１〜１２、１３〜２８、１７〜２８、２５〜２５、３５〜４０および３５〜４２を含む。ＡβのＮ末端から半分由来のフラグメントは、いくつかの方法において好ましい。アナログは、対立遺伝子、種、および誘導される改変体を含む。代表的に、アナログは、１または２、３の位置において、天然に存在するペプチドと異なる（しばしば保存的置換による）。代表的には、アナログは、天然のペプチドと少なくとも８０％または９０％の配列同一性を示す。いくつ
かのアナログはまた、非天然のアミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸の改変を含む。非天然のアミノ酸の例は、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニンである。フラグメントおよびアナログは、以下に記載されるように、トランスジェニック動物モデルにおける予防的能力または治療的能力についてスクリーニングされ得る。
【００４６】
Ａβ、そのフラグメント、アナログおよび他のアミロイド形成ペプチドは、固相ペプチド合成もしくは組換え体の発現によって合成され得、または天然の供給源から得られ得る。自動ペプチドシンセサイザーは、多数の業者（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されている。組換え
体の発現は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞中であり得る。組換え体の発現の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ 第
２版、１９８９）によって記載される。Ａβペプチドのいくつかの形態もまた、市販されている（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡおよびＣａｌｉｆｏｒｎｉａＰｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
Ｉｎｃ．，Ｎａｐａ、ＣＡ）。
【００４７】
治療剤はまた、他のアミノ酸とともに、例えば、Ａβペプチド、活性フラグメントまたはアナログを含む、より長いポリペプチドを含む。例えば、Ａβペプチドは、インタクトなＡＰＰタンパク質またはそのセグメント（例えば、ＡβのＮ末端で始まり、そしてＡＰＰの端まで連続するＣ−１００フラグメント）として存在し得る。このようなポリペプチドは、以下に記載されるような動物モデルにおける予防的効力または治療的効力についてスクリーニングされ得る。このＡβペプチド、アナログ、活性フラグメントまたは他のポリペプチドは、会合した形態において（すなわち、アミロイドペプチドとして）、または解離した形態において投与され得る。治療剤はまた、単量体免疫原性物質の多量体を含む。
【００４８】
さらなる変化において、免疫原性ペプチド（例えば、Ａβ）は、ウイルス性ワクチンまたは細菌性ワクチンとして提供され得る。免疫原性ペプチドをコードする核酸は、ウイルスもしくは細菌のゲノムまたはエピソーム中に組み込まれる。必要に応じて、免疫原性ペプチドが分泌タンパク質として、またはウイルスの外表面タンパク質を有する融合タンパク質もしくは細菌の膜貫通タンパク質として発現され様に核酸が組み込まれるので、該ペプチドが呈示される。このような方法において使用されるウイルスまたは細菌は、非病原性であるかまたは弱毒化されるべきである。適切なウイルスには、アデノウイルス、ＨＳＶ、ワクシニアおよび鶏痘が挙げられる。ＨＢＶのＨＢｓＡｇに対する免疫原性ペプチドの融合は、とくに適切である。治療剤にはまた、Ａβとの有意なアミノ酸配列類似性を有する必要がないにも関わらず、Ａβの模倣物として役立ち、そして同様の免疫応答を誘導するペプチドおよび他の化合物が挙げられる。例えば、β−ひだ状シートを形成する任意のペプチドおよびタンパク質は、適切にスクリーニングされ得る。Ａβまたは他のアミロイド形成ペプチドへのモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた、使用され得る。このような抗−Ｉｄ抗体は、抗原を模倣し、そして抗原への免疫応答を生成する（ＥｓｓｅｎｔｉａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｉｔ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、第６版）、１８１頁を
参照のこと）。
【００４９】
ペプチドまたは他の化合物の無作為なライブラリーはまた、適切にスクリーニングされ得る。コンビナトリアルライブラリーは、段階的な様式で合成され得る多くの型の化合物
について産生され得る。このような化合物には、ポリペプチド、β−ターン模倣物、ポリサッカライド、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、Ｎ−置換グリシンオリゴマーおよびオリゴカルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ９５／１２６０８、Ａｆｆｙｍａｘ、ＷＯ ９３／０６１２１、Ｃｏｌｕｍ
ｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＷＯ ９４／０８０５１、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、ＷＯ９５／３５５０３およびＳｃｒｉｐｐｓ、ＷＯ ９５／３０６４２（これらの各々は、
あらゆる目的のために、引用することにより本明細書の内容となる）に記載されるコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築され得る。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法によって生成され得る。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ９１／１８９８０を参照のこと。
【００５０】
コンビナトリアルライブラリーおよび他の化合物は、最初に、Ａβもしくは他のアミロイド形成ペプチドに特異的であることが公知な抗体またはリンパ球（ＢまたはＴ）に結合するそれらの能力を決定することによって、適切にスクリーニングされる。例えば、最初のスクリーニングは、Ａβあるいは他のアミロイド形成ペプチドへの任意のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて実施され得る。次いで、このようなスクリーニングによって同定された化合物は、Ａβあるいは他のアミロイド形成ペプチドへの抗体または反応性のリンパ球を誘導する能力について、さらに分析される。例えば、血清の複数希釈液は、Ａβペプチドであらかじめコートされたマイクロタイタープレート上で試験され得、そして標準ＥＬＩＳＡは、Ａβへの反応性抗体について試験するために実施され得る。次いで、化合物は、実施例に記載されるような、アミロイド形成疾患に前もって感染されたトランスジェニック動物における予防的効果または治療効果について試験され得る。このような動物には、例えば、前出のＧａｍｅｓらによって記載されるＡＰＰの７１７変異を有するマウス、およびＡＰＰのＳｗｅｄｉｓｈ変異を有するマウス（例えば、ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第５，６１２，４８６号およびＨｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４、９９（１９９６）；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、１３２８７〜１３２９２（１９９７）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、１３２８７〜１３２９２（１９９７）；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ １９、９３９〜９４５
（１９９７）によって記載される）が挙げられる。同様のスクリーニングのアプローチは、他の潜在的な薬剤（例えば、上記のＡβのフラグメント、ＡβのアナログおよびＡβを含む、より長いペプチド）において使用され得る。
【００５１】
本発明の治療剤はまた、Ａβと特異的に結合する抗体を含む。このような抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。いくつかのこのような抗体は、解離形態に結合することなくＡβの凝集形態に特異的に結合する。いくつかは、凝集形態に結合することなくこの解離形態に特異的に結合する。いくつかは、凝集形態および解離形態の両方に結合する。非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウスまたはラット）の産生は、例えば、Ａβで動物を免疫化することによって達成され得る。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ ＮＹ、１９８８）を参照のこと（あらゆる目的のために引用することにより本明細書の内容となる）。このような免疫原は、ペプチド合成によって、または組換え発現によって天然の供給源から得られ得る。
【００５２】
マウス抗体のヒト化形態は、組換えＤＮＡ技術による、ヒトの定常領域への非ヒト抗体のＣＤＲ領域の連結によって生成され得る。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，１００２９〜１００３３（１９８９）およびＷＯ ９０／０７
８６１を参照のこと（あらゆる目的のために引用することにより本明細書の内容となる）。
【００５３】
ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を使用して得られ得る。例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ ９２／０１０４７を参照のこと
。これらの方法において、メンバーがファージの外表面上に異なる抗体を表示する、ファージのライブラリーが、産生される。抗体は、通常ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして表示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージは、Ａβ、またはそのフラグメントに対する親和性の豊富さによって選択される。Ａβに対するヒト抗体はまた、少なくともヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントおよび不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座をコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から産生され得る。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７（１９９３）；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、ＷＯ ９１／１０７４１（１９９１）を参照のこと（これらの各々は、あら
ゆる目的のためにその全体が引用することにより本明細書の内容となる）。ヒト抗体は、競合的結合実験によって、さもなくば、特定のマウス抗体として同一のエピトープ特異性を有するように選択され得る。このような抗体はおそらく、特にマウス抗体の有用な機能的特性を共有する。ヒトポリクローナル抗体はまた、免疫原性剤で免疫化されたヒト由来の血清形態において提供され得る。必要に応じて、このようなポリクローナル抗体は、アフィニティー試薬としてＡβまたは他のアミロイドペプチドを用いたアフィニティー精製によって濃縮され得る。
【００５４】
ヒト抗体またはヒト化抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域、ならびに任意のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）を有するように設計され得る。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、重鎖、軽鎖を分離するように、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖとして、または
単鎖抗体として、発現され得、ここで重鎖および軽鎖の可変ドメインは、スペーサーを介して連結される。
【００５５】
本方法における使用のための治療剤はまた、Ａβペプチドに結合するＴ−細胞を含む。例えば、Ｔ−細胞は、昆虫細胞株からのヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子およびヒトβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現によってＡβペプチドに対して活性化され得、これによって空の複合体が、細胞の表面上に形成され、かつＡβペプチドに結合し得る。この細胞株に接触するＴ−細胞は、このペプチドに対して特異的に活性化されるようになる。Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３１４，８１３号を参照のこと。ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する昆虫細胞株は、同様に使用されて、ＣＤ４Ｔ細胞を活性化し得る。
【００５６】
２．他の疾患
同一のまたは類似の原理によって、他のアミロイド形成疾患の処置に対する治療剤の産生を決定する。一般に、アルツハイマー病の処置に使用するために上記に述べた薬剤はまた、ダウン症候群に関連するアルツハイマー病の初期発症の処置のために使用され得る。狂牛病において、プリオンペプチド、活性フラグメント、およびアナログ、ならびにプリオンペプチドに対する抗体は、アルツハイマー病の処置におけるＡβペプチド、活性フラグメント、アナログ、およびＡβペプチドに対する抗体の代わりに使用される。多発性骨髄腫の処置において、ＩｇＧ軽鎖およびアナログならびにそれらに対する抗体は、他の疾患の場合と同様に使用される。
【００５７】
３．キャリアタンパク質
免疫応答の誘導のためのいくつかの物質は、アミロイド沈着に対する免疫応答の誘導のための適切なエピトープを含むが、あまりにも小さくて免疫原性になり得ない。この状態において、ペプチド免疫原は、適切なキャリアに連結されて免疫応答の誘発を補助し得る。適切なキャリアには、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、または他の病原
性細菌（例えば、ジフテリア、Ｅ．ｃｏｌｉ、コレラ、もしくはＨ．ｐｙｌｏｒｉ、）由来のトキソイド、または弱毒化されたトキシン誘導体が挙げられる。免疫応答の刺激または増強のための他のキャリアには、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１αペプチドおよびＩＬ−１βペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、およびケモカイン（例えば、Ｍ１Ｐ１αおよびＭ１Ｐ１βおよびＲＡＮＴＥＳ）が挙げられる。免疫原性剤はまた、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ、ＷＯ ９７／１７６１３およびＷＯ ９７／１７６１４に記載されるように、組織を横切る輸送を増強するペプチドに連結され得る。
【００５８】
免疫原性剤は、化学的架橋によってキャリアに連結され得る。免疫原のキャリアへの連結のための技術は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用するジスルフィド結合の形成を含む（このペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、これはシステイン残基の付加によって提供され得る）。これらの試薬は、１つのタンパク質において、それら自体のシステイン残基とペプチドのシステイン残基との間でジスルフィド結合を作製し、そしてリジンにおけるε−アミノ基、または他のアミノ酸の他の遊離のアミノ基によってアミド結合を作製する。このような種々のジスルフィド／アミド−形成試薬は、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２，１８５（１９８２）によって記載される。他の二官能性のカップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテルを形成する。これらの多くのチオ−エーテル−形成剤は、市販されており、そして６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性のエステルを含む。これらのカルボキシル基は、スクシンイミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と、それらを組み合わせることによって活性化され得る。
【００５９】
免疫原性ペプチドはまた、キャリアを有する融合タンパク質として発現され得る。この免疫原性ペプチドは、アミノ末端、カルボキシル末端、またはこのキャリアの内部で結合され得る。必要に応じて、免疫原性ペプチドの複数の繰り返しは、融合タンパク質において存在し得る。
【００６０】
４．免疫原をコードする核酸
アミロイド沈着物に対する免疫応答はまた、Ａβペプチドまたは他の免疫原ペプチドをコードしている核酸の投与によっても誘導され得る。そのような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。免疫原をコードしている核酸セグメントは、代表的には、患者の意図した標的細胞中のＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような制御エレメントと連結されている。免疫応答の導入に望ましい血液細胞での発現のために、免疫グロブリン遺伝子の軽鎖または重鎖由来のプロモーターおよびエンハンサーエレメント、あるいはＣＭＶ主要中間初期プロモーターおよびエンハンサーが、直接発現に適している。連結された制御エレメントおよびコード配列は、しばしばベクターにクローニングされる。
【００６１】
以下を含む多くのウイルスベクター系が、利用可能である：レトロウイルス系（例えば、ＬａｗｒｉｅおよびＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３、１０２−１０９（１９９３）を参照のこと）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、５９１１（１９９３）を参照のこと）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９、１８６７（１９９４）を参照のこと）、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含むポックス科由来のウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルス由来のウイルスベクターのようなアルファウイルス属由来ウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、５０８−５１９（１９９６）を参照のこと）、ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ６、３２５−３３３
（１９９５）；Ｗｏｏら、ＷＯ ９４／１２６２９ならびにＸｉａｏおよびＢｒａｎｄｓ
ｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４、２６３０−２６２２（１９９６））
。
【００６２】
免疫原をコードしているＤＮＡ、または免疫原を含有するベクターは、リポソームにパッケージングされ得る。適切な脂質および関連アナログは、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号に記載される。ベクターおよび免疫原をコードしているＤＮＡはまた、粒子状キャリアに吸収され得るか、または粒子状キャリアと結合し得る（キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリ乳酸およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）を含む）（例えば、ＭｃＧｅｅら、Ｊ．ＭｉｃｒｏＥｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと）。
【００６３】
遺伝子治療ベクターまたは裸のＤＮＡは、インビボにおいて、個々の患者に投与されることによって、代表的には、全身的な投与（例えば、静脈内、腹腔内、鼻、胃、皮内、筋肉内、歯根下、または頭蓋内への注入）、または局所的な適用（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）によって送達され得る。ＤＮＡはまた、遺伝子銃を用いて投与され得る。ＸｉａｏおよびＢｒａｎｄｓｍａ、前出を参照のこと。免疫原をコードしているＤＮＡは、微小な金属ビーズの表面上に沈殿させられる。この微粒子は、衝撃波、またはヘリウムガスの拡張により加速され、そしていくつかの細胞層の深さまで組織を貫通する。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ、Ｉｎｃ．ＭｉｄｄｌｅｔｏｎＷＩにより製造される、ＡｃｃｅｌTM Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｄｅｖｉｃｅが、適している。あるいは
、裸のＤＮＡは、化学的または機械的な刺激を用いて、ＤＮＡを皮膚へ単にスポットすることにより、皮膚を通して血流中へと通過させ得る（ＷＯ９５／０５８５３を参照のこと）。
【００６４】
さらなる別法において、免疫原をコードするベクターは、エキソビボで細胞へ送達され得る。そのような細胞は、例えば、個々の患者から移殖される細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引、組織生検）であり、または患者への細胞の再移植に続く、万能供血者造血幹細胞であり、その後ベクターを組込まれた細胞が、通常選抜される。
【００６５】
ＩＩＩ．処置を受ける余地がある患者
処置を受ける余地がある患者は、現在症状を示している患者と同様に、症状を示していないが、疾患の危険性がある個体を含む。アルツハイマー病の場合において、彼または彼女が充分長く生きている場合、実質的に誰であってもアルツハイマー病を患う危険性がある。従って、本発明の方法は、被検体の患者の危険の評価を全く用いず、一般的な集団に対して予防的に投与され得る。本発明の方法は、特にアルツハイマー病の公知の遺伝的危険性を有する個体にとって有用である。このような個体は、この疾患の経験を持つ親族を有する患者を含み、そしてそのような患者の危険性は、遺伝子的または生化学的マーカーを用いた分析により決定される。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーは、ＡＰＰ遺伝子における変異を含み、特に７１７位、そしてＨａｒｄｙおよびＳｗｅｄｉｓｈ変異に参照される６７０位、および６７１位の変異をそれぞれ含む（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、前出を参照のこと）。他の危険性のマーカーは、プレセニリン遺伝子（ＰＳ１およびＰＳ２）、およびＡｐｏＥ４（ＡＤの家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症）における変異である。現在アルツハイマー病を患っている個体は、上記の危険性因子の存在と同様に特有の痴呆により認識され得る。さらに、多くの診断試験が、ＡＤを有する個体を同定するために利用可能である。これらは、ＣＳＦｔａｕおよびＡβ４２レベルの測定を含む。ｔａｕレベルの増加およびＡβ４２レベルの減少は、ＡＤの存在を示す。アルツハイマー病を患っている個体はまた、実施例の節に記載される、ＭＭＳＥまたはＡＤＲＤＡ診断基準により、診断され得る。
【００６６】
無症候性の患者への処置は、任意の年齢（例えば、１０、２０、３０）において開始され得る。しかし、通常、処置は、患者が４０歳、５０歳、６０歳または７０歳に達するまで開始する必要はない。代表的には、処置は、一定の時間にわたる複数の投薬を伴う。処置は、抗体のアッセイによりモニターされ得るか、または治療剤（例えば、Ａβペプチド）に対する時間にわたる、活性なＴ細胞応答またはＢ細胞応答によりモニターされ得る。反応が低下した場合、ブースター投薬が指示される。潜在性ダウン症候群の患者の場合、処置は、治療的薬剤の妊娠中の母体への投与、または誕生後すぐの投与が開始され得る。
【００６７】
ＩＶ．処置レジメ（または処置プログラム）
予防的な適用において、薬学的組成物または薬剤は、特定の疾患に対して感受性または別の危険性がある患者ヘ十分な量が投与され、危険性を除去または減少させる、あるいは疾患の発病を遅らせる。治療的な適用に、組成物または薬剤の、そのような疾患の疑わしい患者、またはすでにそのような疾患を患っている患者への、疾患の症状およびその合併症の治癒に十分な量、または少なくとも一部分の停止に十分な量が投与される。この達成に適切な量は、治療的にまたは薬学的に効果的な量として定義される。予防的および治療的レジメの両方において、薬剤は、通常、十分な免疫応答が達されるまでいくつかの投薬量で投与される。代表的には、免疫応答は、モニターされ、そして免疫応答が衰え始めた場合、投薬がくり返される。
【００６８】
本発明の組成物の、上述した状態への処置に効果的な用量は、以下を含む、多くの異なる要因に依存して変化する：投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の薬剤の投与、および処置が予防的であるか治療的であるか。通常、患者は、ヒトであるが、狂牛病（ｍａｄｃｏｗ ｄｉｓｅａｓｅ）のようないくつかの
疾患において、患者は、ウシのようなヒトではない哺乳動物であり得る。処置投薬量は、安全性かつ効力を最適にするように滴定する必要がある。免疫原の量はまた、アジュバントの非存在下で要求される高投薬量で、アジュバントが投与されるかどうかに依存している。投与のための免疫原の量は、時には、患者当たり１μｇ〜５００μｇ、そしてより通常は、ヒトへの投与について、１回の注射当たり５〜５００μｇで変化する。ときおり、１回の注射当たり１〜２ｍｇの高用量が用いられる。代表的には、それぞれのヒトへの注射当たり、約１０、２０、５０、または１００μｇが、用いられる。注射のタイミングは、１日に１回から、１年に１回、１０年に１回まで有意に変化し得る。任意の投与日に、免疫原の投薬量が投与され、その投薬量は、アジュバントもまた、投与される場合、１μｇ／患者より多く、そして通常は１０μｇ／患者よりも多く、そしてアジュバントの非存在下では、１０μｇ／患者よりも多く、そして通常は、１００μｇ／患者よりも多い。代表的なレジメは、６週間間隔のブースター注射に続く、免疫化からなる。別のレジメは、１、２、および１２ヶ月後のブースター注射に続く免疫化からなる。別のレジメは、生涯にわたる２ヶ月ごとの注射を伴う。あるいは、ブースター注射は、免疫応答をモニターすることにより示されるように不規則な基準であり得る。抗体を用いる受動的な免疫化のための、この投薬量の範囲は、宿主体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびさらに通常は、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。免疫原をコードする核酸の用量の範囲は、患者当たり、約１０ｎｇ〜１ｇＤＮＡ、１００ｎｇ〜１００ｍｇＤＮＡ、１μｇ〜１０ｍｇＤＮＡ、または３０〜３００μｇＤＮＡである。感染性ウイルスベクターのための用量は、用量当たり１０〜１０9ビリオン、またはそれ以上に変化する。
【００６９】
免疫応答を誘導するための薬剤は、非経口的、局所的、静脈、口腔、皮下、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内を含む手順によって、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。投与の最も代表的な経路は、他も等しく効果的であり得るが、皮下である。次に最も一般的であるのは、筋肉内への注射である。この注射のタイプは、最も代表的には、腕または足の筋肉に行なわれる。腹腔内注射、動脈内、頭蓋内、あるいは皮内への注射
と同様に静脈内への注射はまた、免疫応答の発生に効果的である。いくつかの方法において、薬剤は、沈着物が蓄積した、特定の組織へ直接注射される。
【００７０】
本発明の薬剤は、アミロイド形成疾患の処置において少なくとも部分的に効果的である他の薬剤と組み合わせて必要に応じて投与され得る。アミロイド沈着が脳内で生じる、アルツハイマーおよびダウン症候群の場合、本発明の薬剤はまた、本発明の薬剤の血液脳関門の通過を増大させる、他の薬剤との組み合わせにより投与され得る。
【００７１】
ペプチドのような本発明の免疫原性の薬剤は、ときおりアジュバントと組み合わせて投与される。種々のアジュバントは、免疫応答を誘発するＡβのようなペプチドと組み合わせて用いられ得る。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響する免疫原の構造変化を起こさずに、免疫原に対する固有の応答を増強する。好ましいアジュバントは、ミョウバン、３脱Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む（ＧＢ ２２２０２
１１を参照のこと）。ＱＳ２１は、南アメリカで発見されたＱｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏ
ｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａｔｒｅｅの皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサ
ポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら、ＶａｃｃｉｎｅＤｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）。他のアジュバントには、水中油乳濁液（例えば、スクアレンまたはピーナッツ油）であり、必要に応じて、モノホスホリル脂質Ａのような免疫賦活薬との組み合わせである（Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６、８６−９１（１９９７）を参照のこと）。別のアジュバントは、ＣｐＧである（ＢｉｏｗｏｒｌｄＴｏｄａｙ、Ｎｏｖ．１５、１９９８）。あるいは、Ａβは、アジュバントと結合し得る。例えば、Ａβのリポペプチドバージョンは、Ｂ型肝炎抗原ワクチン接種について記述されたように、ＡβのＮ末端に、パルミチン酸または他の脂質が直接結合することにより調製され得る（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、１３８３−１３９２（１９９７））。しかし、そのような結合は、それらに対する免疫応答の性質に影響するようなＡβの実質的な構造の変化を起こすべきではない。アジュバントは、活性薬剤とともに治療的組成物の成分として投与され得るか、あるいは治療的薬剤の投与とは別々に、事前に、同時に、または事後に投与され得る。
【００７２】
好ましいアジュバントのクラスは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩（ミョウバン）である。そのようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、重合体のまたは単量体のアミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸またはポリリシン）のような、他の特定の免疫賦活薬剤と共に用いられ得るか、または共にではなく用いられ得る。別のアジュバントのクラスは、水中油乳濁液処方物である。そのようなアジュバントは、以下のような他の特定の免疫賦活薬剤と共に用いられ得るか、または共にではなく用いられ得る：ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ）プロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）ｔｈｅｒａｍｉｄｅTM）または他の細菌細胞壁構成成分。水中油乳濁液は、以下を含む：（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含
む）を含み、モデル１１０Ｙマイクロフルイタイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ＮｅｗｔｏｎＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いたサブミクロン粒子に処方された、ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７）（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ 
８０、５％ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳濁液にマイクロフルイダイズされるかまたは、より大きな粒子サイズの乳濁液を生成するためにボルテックスされたＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および１つ以上の以下からなる群から選択される細菌細胞壁組成物を含むＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）：モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジマイコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）。好ましいアジュバントの別のクラスは、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のようなサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭｓ（免疫賦活複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのようなそれらから生成される粒子である。他のアジュバントは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む。他のアジュバントは、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカインを含む。
【００７３】
アジュバントは、単一組成物として免疫原と共に投与され得るか、あるいは免疫原投与に先だって、同時に、または投与後に投与され得る。免疫原およびアジュバントは、パッケージングされ得、そして同じバイアルに供給され得るか、または別々のバイアルにパッケージングされ得、そして使用前に混合され得る。代表的には、免疫原およびアジュバントは、ラベルが意図した治療への適用を示すようにパッケージングされる。免疫原およびアジュバントが、別々にパッケージングされる場合、代表的には、そのパッケージングは、使用前の混合のための説明書を含む。アジュバントおよび／またはキャリアの選択は、アジュバントを含むワクチンの安定性、投与の経路、投薬スケジュール、ワクチンを受ける種についてのアジュバントの有効性に依存し、そしてヒトにおいては、薬学的に受容可能なアジュバントは、承認されているアジュバント、または体の適切な制御によるヒトへの投与が認可されているアジュバントである。例えば、完全フロイントアジュバントは、ヒトへの投与には適さない。ミョウバン、ＭＰＬおよびＱＳ２１は、好ましい。必要に応じて２つ以上の異なるアジュバントが、同時に用いられ得る。好ましい組み合わせは、ミョウバンとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ２１、ＭＰＬとＱＳ２１、ならびにミョウバン、ＱＳ２１およびＭＰＬを共に含む。また、不完全フロイントアジュバント（Ｃｈａｎｇら、ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇ ＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ ３２、１７３−１８６（１９９８））も、必要に応じて、ミョウバン、ＱＳ２１およびＭＰＬの任意の組み合わせ、ならびにそれら全ての組み合わせで用いられ得る。
【００７４】
本発明の薬剤は、しばしば活性な治療的薬剤（すなわち、および種々の他の薬学的に受容可能な組成物）を包含する薬学的処方物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ 
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８０）を参照
のこと。好ましい形態は、投与および治療的適用を意図した態様に依存する。この組成物はまた、動物またはヒトに投与されるための薬学的組成物の処方のために一般的に用いられるビヒクルとして定義される、所望される処方に依存した薬学的に受容可能な非毒性キャリアまたは賦形薬もまた含み得る。賦形薬は、組み合わせでの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような賦形薬の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝化食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、およびハンクス溶液である。さらに、薬学的組成物または処方物はまた、他のキャリア、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。しかし、完全フロイントアジュバントのような動物への投与に適しているいくつかの試薬は、ヒトへの使用のための組成物には、代表的には含まれない。
【００７５】
薬学的組成物はまた、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリ
マー（例えば、ラテックス機能性セファロース、アガロース、セルロースなど）、アミノ酸重合体、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）のような、大きく、ゆっくりと代謝される高分子を含み得る。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激薬剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。
【００７６】
非経口的な投与のための本発明の薬剤は、水油、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのような滅菌した液体であり得る薬学的キャリアでの生理学的に許容され得る賦形薬中の物質の溶液または懸濁物の、注入可能な投薬量として投与され得る。さらに、湿った薬剤または乳化した薬剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝化物質などのような、補助的な物質が、組成物中に含まれ得る。薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、野菜、または合成の起源の成分（例えば、ピーナッツ油、大豆油または鉱油）である。一般的にプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、特に注射溶液としての、好ましい液体キャリアである。
【００７７】
代表的には、組成物は、液体溶液または、懸濁液としてのいずれかで注射可能となるように調製される；注射に先立ち液体ビヒクルへの溶解、または懸濁に適した固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、リポソーム、またはポリ乳酸、ポリグリコリド、あるいは上述のようなアジュバントの効果を増大させるコポリマーのような微粒子中に、乳化され得るかまたはカプセルに包まれ得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９、１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ ＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ ２８、９７−１１９（１９９７）参照のこと）。本発明の薬剤は、活性な
成分の持続性または拍動性放出を可能にする様式で処方され得る調製物を、貯蔵注射または移殖の形態で投与され得る。
【００７８】
投与の他の形態に適しているさらなる処方物は、経口、鼻腔内、および肺への処方物、坐薬、および経皮的適用を含む。
【００７９】
坐薬、結合剤およびキャリアについては、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む；そのような坐薬は、０．５％〜１０％の、好ましくは１％〜２％の範囲の活性な成分を含有する混合物から形成され得る。経口処方物は、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続性の放出処方物または粉末の形態をとり、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性な成分を含有する。
【００８０】
局所的な適用は、経皮的または皮内への送達を生じ得る。局所的な投与は、薬剤とコレラ毒素または解毒誘導体、あるいはそれらのサブユニットまたは他の類似した細菌毒素との同時投与により促進され得る（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３９１、８５１（１９９８）を参照のこと）。同時投与は、組成物を混合物として、あるいは融合タンパク質の化学的架橋または発現により得られる連結された分子として用いることにより達成され得る。
【００８１】
あるいは、経皮的送達は、スキンパス（ｓｋｉｎ ｐａｔｈ）の使用またはトランスフ
ェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）の使用により達成され得る（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５、３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３６８、２０１−１５（１９９８））。
【００８２】
Ｖ．診断の方法
本発明は、アルツハイマー病を患っている、または感受性である患者におけるＡβペプチドに対する免疫応答を検出する方法を提供する。この方法は、患者への投与による処置の経過をモニターするのに特に有用である。この方法は、症状のある患者への治療的処置
、および症状のない患者への予防的処置の両方をモニターするために、用いられ得る。
【００８３】
いくつかの方法が、薬剤の投薬量を投与する前の患者の免疫応答の底値の決定を伴い、そしてこれと処置後の免疫応答の値との比較を伴う。免疫応答シグナルの値における有意な増加（すなわち、同じサンプルを繰り返し測定することでの実験誤差の代表的な限度より大きい、そのような測定の平均からの任意の標準偏差として表される）は、陽性処置結果（すなわち、薬剤の投与が、免疫応答を達成または増強した）を示す。免疫応答の値が、有意に変化しない、または減少した場合は、陰性の処置結果が示される。一般的に、薬剤による最初の処置過程を受けている患者は、最終的にプラトーになるまで継時的な用量での免疫応答の増加を示すことが予測される。薬剤の投与は、一般的に、免疫応答が増加している間、継続される。プラトーへの到達は、処置による投与が、投薬量または頻度において非継続的または減少となり得る指標である。
【００８４】
他の方法において、免疫応答のコントロール値（すなわち、平均および標準偏差）は、コントロール集団によって決定される。代表的には、コントロール集団における個体は、事前の処置を受けていない。次いで、治療薬投与後の患者における免疫応答の測定値は、コントロール値と比較される。コントロール値に対する有意な増加は（例えば、平均からの標準偏差よりも大きい）、陽性の治療結果を示す。有意な増加の欠如または減少は、陰性の処置結果を示す。薬剤の投与は、一般的に、コントロール値に対して免疫応答が明らかに増加している間、継続される。すでに述べたように、プラトーの指標は、処置投与が投薬量または頻度において、非継続的または減少し得る指標においてコントロール値に関連する。
【００８５】
他の方法において、免疫応答のコントロール値（例えば、平均および標準偏差）は、治療的薬剤による処置が行なわれた個体のコントロール集団より決定され、その個体の免疫応答は、処置に対する応答がプラトーとなる。患者の免疫応答の測定値は、コントロール値と比較される。患者における測定レベルが、コントロール値と有意に異ならない（例えば、ある標準偏差以上）場合、処置は、中断され得る。患者におけるレベルが、コントロール値より有意に低い場合、薬剤の投与の継続が正当化される。患者におけるレベルが、コントロール値未満で持続する場合は、次いで、処置レジメンの変更、例えば、異なるアジュバントの使用が示され得る。
【００８６】
他の方法において、現在処置を受けていないが、以前に処置過程を受けたことがある患者は、処置の再開が必要であるかどうかを決定するために、免疫応答についてモニターされる。患者の免疫応答の測定値は、以前の処置過程後の患者において以前に達成された、免疫応答値と比較され得る。以前の測定値に対する、有意な減少（すなわち、同じサンプルの反復測定の代表的な誤差範囲よりも大きい）は、処置が再開され得る指標である。あるいは、患者の測定値は、処置過程を受けた後の患者の集団において決定された、コントロール値（平均プラス標準偏差）と比較され得る。あるいは、患者の測定値は、疾患の症状を示していない予防的処置された患者の集団におけるコントロール値、または疾患の特徴の改善を示す治療的処置患者の集団におけるコントロール値と比較され得る。これらの全ての場合において、コントロールレベルに対する有意な減少（すなわち、標準偏差より大きい）は、患者の処置が再開されるべきであることの指標である。
【００８７】
分析のための組織サンプルは、代表的には、患者からの、血液、血漿、血清、粘液、または脳髄液である。このサンプルは、Ａβペプチド、代表的にはＡβ４２の任意の形態に対する、免疫応答の印について分析される。この免疫応答は、例えば、Ａβペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞の存在により決定され得る。Ａβに対して特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡ法を、実施例の節に記載する。Ｔ細胞に対する反応性を検出する方法は、上述した（定義を参照のこと）。
【００８８】
本発明はさらに、上述した診断の方法を行なうための診断キットを提供する。代表的には、そのようなキットは、Ａβに対する抗体と特異的に結合するか、またはＡβに特異的なＴ細胞と反応する、薬剤を含むキットである。このキットはまた、標識を含む。Ａβに対する抗体の検出のために、この標識は、代表的には、標識化された抗イディオタイプの抗体の形態である。抗体検出のための薬剤は、マイクロタイター皿のウェルのような固相に前もって結合して供給され得る。反応性のＴ細胞の検出のために、標識は、増殖応答の測定のために3Ｈ−チミジンとして供給され得る。キットはまた、代表的には、キットの
使用法についてラベルに提供された指示書を含む。このラベルはまた、Ａβに対する抗体、Ａβまたはと反応するＴ細胞のレベルと、測定した標識のレベルに関係した図表または他の対応するレジメを含み得る。ラベルという用語は、製造、輸送、販売、または使用の間の任意の時期にキットに付属するあるいは付随しない、任意の書面または記録された材料をいう。例えばラベルという用語は、宣伝用パンフレット、および小冊子、パッケージ材料、説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピューターディスク、ならびにキットに直接書かれた印刷を含む。
【実施例】
【００８９】
（Ｉ．ＡＤに対するＡβの予防的効果）
これらの実施例は、アルツハイマー様の神経病理を引き起こす素因となる、７１７番目の位置に変異を持つＡＰＰ（ＡＰＰ717V→F）を過剰発現しているトランスジェニックマ
ウスに対するＡβ４２ペプチドの投与を述べる。これらのマウス（ＰＤＡＰＰマウス）の産生および特徴はＧａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、前出に述べられている。ヘテロ接合体であるこれらの動物では、６ヶ月齢の前からＡβが沈着し始める。１５ヶ月齢までにアルツハイマー病で見られるのと同じくらいの程度までＡβの沈着を示す。ＰＤＡＰＰマウスに凝集したＡβ42（凝集Ａβ42）またはリン酸緩衝化生理食塩水を注射した。Ａβの複数のエピトープに対して抗体を誘導する能力のために、凝集Ａβ42を選択した。
【００９０】
（Ａ．方法）
（１．マウスの供給源）
３０匹の異型遺伝子型の雌性ＰＤＡＰＰマウスを次のグループに無作為に分けた。１０匹には凝集Ａβ42を注射（１匹は輸送中に死亡）、５匹にはＰＢＳ／アジュバントまたはＰＢＳを注射、そして１０匹には注射しないコントロールとした。５匹には血清アミロイドタンパク質（ＳＡＰ）を注射した。
【００９１】
（２．免疫原の調製）
凝集Ａβ42の調製：２ｍｇのＡβ42（ＵＳ ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｃ、ロット番号Ｋ−
４２−１２）を０．９ｍｌの水に溶解し、０．１ｍｌの１０×ＰＢＳを加えることによって１ｍｌにした。これをボルテックスして、ペプチドが凝集する条件である３７℃で一晩インキュベートさせた。未使用のＡβは凍結乾燥粉末として−２０℃で次の注射まで保管した。
【００９２】
（３．注射液の調製）
最初の免疫のために、マウス１匹あたりＰＢＳ中に１００μｇの凝集Ａβ42を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１の割合で乳化し、最終的な容量を４００μｌのエマルジョンとした。次に２週間後に同量の免疫原を不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で追加免疫した。１ヶ月間隔で、さらに２回の用量をＩＦＡ中で投与した。次に１ヶ月間隔で５００μｌのＰＢＳ中で引き続き免疫した。注射は腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。
【００９３】
ＰＢＳを同じスケジュールに従って注射し、マウスに１匹あたり４００μｌのＰＢＳ／
アジュバントの１：１の混合物、または１匹あたり５００μｌのＰＢＳを注射した。同様に、ＳＡＰを同じスケジュールに従って、１回の注射に１００μｇの投与量を用いて注射した。
【００９４】
（４．マウス血液の力価測定、組織の調製、および免疫組織化学的検査）
上記の方法は後述の一般的な材料および方法において述べる。
【００９５】
（Ｂ．結果）
ＰＤＡＰＰマウスに凝集したＡβ42（凝集Ａβ42）、ＳＡＰペプチド、またはリン酸緩衝化生理食塩水のどれかを注射した。１グループのＰＤＡＰＰマウスもポジティブコントロールとして注射せずに残した。凝集Ａβ42に対するマウスの力価を、４回目の追加免疫からマウスが１年齢になるまで、１ヶ月おきに測定した。マウスを１３ヶ月で屠殺した。調査した全ての時点で、９匹の凝集Ａβ42を投与したマウスのうち８匹は高い抗体力価を示し、これは一連の注射の間、高いままであった（１／１００００以上の力価）。９匹目のマウスの力価は低かったが、約１／１０００の力価にかなり近かった（図１、表１）。ＳＡＰＰを注射したマウスはこの免疫原に対して１：１，０００から１：３０，０００の力価を示し、１匹のマウスのみが１：１００，０００を超えた。
【００９６】
【表１】
2010215651.tif 000002
【００９７】
ＰＢＳで処置したマウスで、６、１０、および１２ヶ月に凝集Ａβ42に対する力価を測定した。１／１００の希釈で、ＰＢＳマウスの凝集Ａβ42に対する力価を測定したとき、１つのデータポイントのみでバックグラウンドの４倍を超える力価を示したが、他の点で
は全ての時点でバックグラウンドの４倍以下であった（表１）。これらの時点で、ＳＡＰに特異的な応答はごくわずかであり、全ての力価は３００未満であった。
【００９８】
凝集Ａβ１−４２グループの９匹のうち７匹は、脳にアミロイドは検出されなかった。対照的に、ＳＡＰおよびＰＢＳグループのマウス由来の脳組織は、海馬ならびに前頭および帯状回（ｃｉｎｇｕｌａｔｅ）皮質に多くの３Ｄ６−陽性アミロイド沈着を含んでいた。沈着のパターンは未処置のコントロールのものと同様であり、海馬歯状回の外側分子層のような攻撃されやすい小領域が特徴的に関与している。Ａβ１−４２を注射したグループの１匹のマウスでは、海馬に限ればアミロイドの生産量が大きく抑制された。別のＡβ１−４２処置マウスでは孤立したプラークが同定された。
【００９９】
海馬におけるアミロイド生産量の定量的画像分析は、ＡＮ１７９２処置動物で劇的な抑制が達成されたことを検証した（図２）。ＰＢＳグループ（２．２２％）、および未処置のコントロールグループ（２．６５％）のアミロイド生産量の中央値は、ＡＮ１７９２で免疫したグループに比べて有意に大きかった（０．００％、ｐ＝０．０００５）。対照的に、ＳＡＰペプチド（ＳＡＰＰ）で免疫したグループの中央値は５．７４％であった。未処置のコントロールマウスの脳組織は、海馬および後方板状（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ）皮質に、Ａβ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）３Ｄ６で視覚化される多くのＡβアミロイド沈着を含んでいた。アミロイド沈着の同様のパターンがＳＡＰＰまたはＰＢＳで免疫したマウスにも見られた（図２）。それに加えて、後者の３つのグループにおいては、３つのグループ全てにおいて、典型的にＡＤで見られる、海馬歯状回の外側分子層のような攻撃されやすい脳の小領域が特徴的に関与していた。
【０１００】
Ａβの沈着を含まない脳は、代表的にヒトＡＰＰ抗体８Ｅ５によってＰＤＡＰＰマウスで視覚化される老人斑（ｎｅｕｒｉｔｉｃｐｌａｑｕｅｓ）も全く無かった。残りのグループ（ＳＡＰ注射、ＰＢＳ、および注射していないマウス）由来の全ての脳は、未処置のＰＤＡＰＰマウスに典型的な老人斑を多く含んでいた。ＡＮ１７９２で処置した１匹のマウスに少数の老人斑が存在し、ＡＮ１７９２で処置した２番目のマウスで、異栄養（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ）軸索の集団が１つ見られた。図３に示したように、海馬の画像分析は、ＡＮ１７９２で処置したマウスでは、ＰＢＳを注射したマウスに比べて（中央値０．２８％、ｐ＝０．０００５）、事実上異栄養（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ）軸索が排除された（中央値０．００％）ことを実証した。
【０１０１】
プラークに関連する炎症に特有な星状細胞特性も、Ａβ１−４２を注射したグループの脳には存在しなかった。他のグループのマウス由来の脳は、Ａβプラークに関連するグリオーシスに典型的な、多くの密集したＧＦＡＰ陽性星状細胞を含んでいた。１組のＧＦＡＰ反応スライドグラスを、Ａβ沈着の局在を見るためにチオフラビンＳで対比染色した。ＳＡＰ、ＰＢＳ、未処置のコントロールグループでは、ＧＦＡＰ陽性星状細胞はＡβプラークと関連していた。プラークの存在しないＡβ１−４２処置マウスではそのような関連は見られなかったが、ＡＮ１７９２で処置したマウスの１匹で、わずかなプラークに関連したグリオーシスが同定された。
【０１０２】
後方板状皮質に関しては、図４に示したように、画像分析は、ＳＡＰペプチド、ＰＢＳで免疫した、または未処置のグループの中央値が６％以上であるのに対して、ＡＮ１７９２で処置したグループの中央値が１．５６％であり、星状細胞増加の抑制が有意であることを実証した（ｐ＝０．００１７）。
【０１０３】
１組のＡβ１−４２およびＰＢＳを注射したマウスのサブセットからの証拠は、プラークに関連するＭＨＣ ＩＩ免疫応答性がＡβ１−４２を注射したマウスには存在しないこ
とを示した。これはＡβに関連する炎症性反応が無いことと一致する。
【０１０４】
マウス脳の切片を、細胞表面タンパク質であるＭＡＣ−１特異的ｍＡβとも反応させた。ＭＡＣ−１（ＣＤ１１ｂ）はインテグリンファミリーのメンバーでＣＤ１８とのヘテロダイマーとして存在する。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体は単球、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラー細胞に存在する（ＭａｋおよびＳｉｍａｒｄ）。脳内に存在するＭＡＣ−１応答性細胞の型は、ＭＡＣ−１免疫応答切片における同様な表現型形態に基づくと、小グリア細胞である可能性がある。プラークに関連したＭＡＣ−１の標識は、ＰＢＳコントロールグループに比べてＡＮ１７９２で処置したマウスの脳ではより低かった。この結果はＡβ誘導による炎症性反応が存在しないことと一致する。
【０１０５】
（Ｃ．結論）
Ａβ１−４２を注射したマウスの脳においてＡβプラークならびに、神経およびグリア細胞の反応性変化が存在しないことは、それらの脳にアミロイドが沈着しないか、ごくわずかなアミロイドしか沈着せず、グリオーシスおよび神経炎の病状のような病的な結果が起こらなかったことを示している。Ａβ１−４２で処置したＰＤＡＰＰマウスは、コントロールの非トランスジェニックマウスと本質的に同様な病状の欠如を示している。従って、Ａβ１−４２の注射は脳組織からのヒトＡβの沈着予防または除去、その次に起こる神経性および炎症性変性変化を排除するのに、高い効果がある。従って、Ａβペプチドの投与はＡＤの予防に治療的な利益がある。
【０１０６】
（ＩＩ．用量反応性試験）
５週齢、雌Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスのグループ（グループあたりＮ＝６）を
、ＣＦＡ／ＩＦＡ中で調剤した３００、１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、または０．１３μｇのＡβを腹腔内に投与して免疫した。２週間おきに３回投与し、次に１ヵ月後に４回目の投与を行った。最初の投与はＣＦＡで乳化し、残りの投与はＩＦＡで乳化した。抗体力価を測定するために、２回目の投与後から始めて、それぞれの免疫から４−７日後に動物から採血した。１１、３３、または３００μｇの抗原で免疫した１組の３グループの動物から、４回目の免疫から約１ヶ月間隔で４ヶ月間、さらに採血して、ワクチンの用量のある範囲にわたって抗体応答の減衰をモニターした。これらの動物には、試験開始後７ヶ月目に最終的な５回目の免疫を行った。それらを１週間後に屠殺し、ＡＮ１７９２に対する抗体応答を測定し、毒性分析を行った。
【０１０７】
減少する用量反応性は、３００から３．７μｇまで観察され、最も低用量の２つでは反応が見られなかった。平均抗体力価は、１１−３００μｇの抗原の、３回目の投与後で約１：１０００、４回目の投与後で約１：１０，０００であった（図５参照のこと）。
【０１０８】
抗体力価は最も低用量のグループを除いた全てにおいて、３回目の免疫後、劇的に増加し、ＧＭＴは、５から２５倍増加した。次いで、０．４μｇを投与したグループにおいてさえ、低い抗体応答が検出された。１．２および３．７μｇのグループは同等の力価であり、ＧＭＴは約１０００であった。３３μｇ用量のグループではＧＭＴが３０００と低かったのを除いて、最も高用量の４つのグループはＧＭＴが約２５，０００で密集していた。４回目の免疫後、力価の増加はほとんどのグループにおいてよりゆるやかになった。０．１４μｇから１１μｇまでのより低い抗原用量のグループにおいては明らかな用量反応性があり、０．１４μｇのグループでの抗体未検出から、１１μｇのグループでのＧＭＴ３６，０００までの範囲にわたっていた。ここでも、１１から３００μｇの４つの高用量グループの力価は密集していた。従って、次の２回の免疫では、抗体力価は０．４から３００μｇまでの広い範囲で抗原の用量に依存していた。３回目の免疫までは、４つの高用量グループの力価はすべて同等で、さらなる免疫後もプラトーのままであった。
【０１０９】
４回目の免疫から１ヶ月後、３００μｇのグループにおいて、免疫から５日後採血した
血液で測定したものよりも、力価は、２倍から３倍高かった（図６）。この観察は、既往性の抗体応答が最高点に達するのは免疫から５日後以降であることを示唆している。３３μｇのグループにおいて、この時点でよりゆるやかな（５０％）増加が見られた。３００μｇ投与グループにおいて最後の投与から２ヵ月後、ＧＭＴは急速に約７０％まで減少した。さらに１ヵ月後、減少はより急激ではなくなり４５％（１００μｇ）、および３３および１１μｇで約１４％であった。従って、免疫中止後の循環している抗体力価の減少率は２相性であり、応答が最高点に達してから最初の１ヶ月は急激に減少し、その後はよりゆるやかな減少率であるようである。
【０１１０】
これらのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの抗体力価および応答の反応速度論は、対
応する方法で免疫した若いヘテロ接合体ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスと同様である。ヒトにおいて免疫応答を引き起こすのに有効な用量は、代表的にはマウスで有効な用量と同様である。
【０１１１】
（ＩＩＩ．確立したＡＤに対する治療的効果のスクリーニング）
免疫原性製剤が老齢動物においてＡＤの神経病理学的な特徴を阻止または逆転させる活性を調べるために、このアッセイを設計する。ＰＤＡＰＰマウスの脳にアミロイドプラークが既に存在する時点から、４２アミノ酸長のＡβ（ＡＮ１７９２）を用いて免疫を始めた。
【０１１２】
この試験の期間中、未処置のＰＤＡＰＰマウスは、ＡＤにおいて見られるものと類似した多くの神経変性変化を起こす（Ｇａｍｅｓら、前出、およびＪｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、１５５０−１５５５（１９９７））。アミロイドプラークへのＡβの沈着は、異栄養（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ）軸索と呼ばれる異常型の軸索および樹状要素を含む変性的な神経反応と関連している。異栄養（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ）軸索に囲まれ、それを含むアミロイド沈着は、老人斑と呼ばれる。ＡＤおよびＰＤＡＰＰマウスのどちらにおいても、異栄養軸索は区別できる球状の構造を持ち、ＡＰＰおよび細胞骨格構成要素を認識する一対の抗体に対して免疫応答性であり、超微細構造レベルにおいて、複雑な細胞レベル下の変性変化を示す。これらの特徴は、ＰＤＡＰＰの脳において、疾患に関連する、選択的な、および再現性のある老人斑形成の測定を可能にする。ＰＤＡＰＰ老人斑の異栄養性神経構成要素は、ヒトＡＰＰに特異的な抗体（ｍＡβ ８Ｅ５）を用いて簡単に視覚化され、コンピューターによる画像分析によ
って簡単に測定できる。従って、ＡＮ１７９２のアミロイドプラーク形成における効果を測定するのに加えて、我々は軸索の異栄養発達における、この処置の効果をモニターした。
【０１１３】
星状細胞および小グリア細胞は非神経細胞であり、神経の障害の程度に反応してその程度を反映する。ＧＦＡＰ陽性星状細胞およびＭＨＣＩＩ陽性小グリア細胞は一般にＡＤで観察され、疾患の重篤度と共にその活性が増加する。従って、本発明者らは、ＡＮ１７９２処置マウスにおける反応性星状細胞および小グリア細胞の発達もモニターした。
【０１１４】
（Ａ．材料および方法）
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した１１から１１．５ヶ月齢の、４８匹のヘテロ
接合体の雌性ＰＤＡＰＰマウスを２つのグループに無作為に分けた。すなわち、２４匹のマウスを１００μｇのＡＮ１７９２で、２４匹のマウスをＰＢＳで、それぞれフロイントアジュバントと組み合せて免疫した。それらが１５ヶ月齢に達したとき、ＡＮ１７９２およびＰＢＳのグループを再び分けた。１５ヶ月齢の時、ＡＮ１７９２およびＰＢＳ処置動物の、それぞれのグループの約半数を安楽死させ（それぞれｎ＝１０および９）、残りを１８ヶ月で終了するまで免疫し続けた（それぞれｎ＝９および１２）。全体で８匹の動物（ＡＮ１７９２で５匹、ＰＢＳで３匹）が試験中に死亡した。免疫した動物に加えて、１
年齢（ｎ＝１０）、１５ヶ月齢（ｎ＝１０）、および１８ヶ月齢（ｎ＝１０）の未処置ＰＤＡＰＰマウスを、脳内のＡβおよびＡＰＰレベルを測定するＥＬＩＳＡでの比較のために含めた；１年齢の動物を免疫組織化学的分析にも含めた。
【０１１５】
方法論は、他に示されない限り実施例１と同じであった。ＵＳ Ｐｅｐｔｉｄｅｓのロ
ット番号１２、およびＣａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅｓのロット番号ＭＥ０３３
９のＡＮ１７９２を使用して、１５ヶ月の時点までに投与する６回の免疫のための抗原を調製した。ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＰｅｐｔｉｄｅｓのロット番号ＭＥ０３３９およびＭＥ０４３９を使用して、１５ヶ月から１８ヶ月の間に投与してさらに３回、免疫した。
【０１１６】
免疫のために、ＰＢＳ２００μｌ中１００μｇのＡＮ１７９２、またはＰＢＳ単独を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）またはＰＢＳと１：１（容量：容量）で乳化し、最終的な容量を４００μｌとした。最初の免疫はアジュバントとしてＣＦＡと共に投与し、次の４回はＩＦＡと共に投与し、最後の４回はアジュバントを加えずにＰＢＳ単独と共に投与した。全体として９回の免疫を７ヶ月間で、最初の３回の投与は２週間おきに、次に残りの注射は４週間おきに投与した。４ヶ月間処置するグループは１５ヶ月齢で安楽死させ、最初の６回の免疫のみを行った。
【０１１７】
（Ｂ．結果）
１．アミロイド産生量に対するＡＮ１７９２処置の効果 定量的画像分析によって決定
した皮質のアミロイド産生量に対するＡＮ１７９２処置の結果を図７に示す。皮質のアミロイド産生量の中央値は、未処置１２ヶ月齢ＰＤＡＰＰマウスのグループで０．２８％であり、この値は試験開始時のマウスにおけるプラーク産生量をあらわす。１８ヶ月で、ＰＢＳ処置マウスではアミロイド産生量は１７倍以上増加して４．８７％となったが、ＡＮ１７９２処置マウスではアミロイド産生量が大きく抑制され０．０１％だけであり、１２ヶ月の未処置、１５ヶ月および１８ヶ月のＰＢＳ処置マウスのグループより著しく低かった。アミロイド産生量はＡＮ１７９２を投与したもので、１５ヶ月（９６％の抑制、ｐ＝０．００３）および１８ヶ月（９９％以上の抑制、ｐ＝０．０００２）の両方で有意に抑制された。
【０１１８】
一般的に、ＰＤＡＰＰマウスにおける皮質のアミロイド沈着は前頭および後方板状皮質（ＲＳＣ）から始まり、腹側−側面の方向へ進行し側頭および内側嗅領皮質（ＥＣ）へ達する。ＡＮ１７９２が最初に投与された年齢に近い、１２ヶ月齢のマウスにおいてはＥＣにアミロイドは少ししか見られないか、または全く見られない。ＡＮ１７９２処置の４ヵ月後、アミロイド沈着はＲＳＣにおいて大きく減少し、ＥＣへ達する進行はＡＮ１７９２処置により完全に排除された。後者の観察は、ＡＮ１７９２が通常側頭および腹側の皮質を侵すアミロイドの進行を完全に停止させること、ならびにＲＳＣにおける沈着を阻止または逆転し得ることを示した。
【０１１９】
ＰＤＡＰＰマウスにおける皮質アミロイド産生量の発達に対するＡＮ１７９２処置の著明な効果は、７ヶ月間処置した１８ヶ月のグループでさらに示された。皮質アミロイドのほとんど完全な欠如がＡＮ１７９２処置マウスで見られ、びまん性のプラークが完全に欠如、および密集した沈着が抑制された。
【０１２０】
（２．ＡＮ１７９２処置に関連する細胞および形態学的な変化）
Ａβ陽性細胞の集団は、代表的的にはアミロイド沈着を含む脳の領域に見られた。驚くべきことに、ＡＮ１７９２レシピエント由来のいくつかの脳では、細胞外皮質アミロイドプラークが極めて少ないか、または全く見られなかった。ほとんどのＡβ免疫応答性は大きな小葉または凝集体の細胞中に含まれているようであった。表現型では、これらの細胞は活性化した小膠細胞または単球に類似していた。それらは活性化した単球および小膠細
胞に発現されるリガンド（ＭＨＣＩＩおよびＣＤ１１ｂ）を認識する抗体に免疫応答性を示し、時折血管壁または内腔に結合していた。ＡβおよびＭＨＣ ＩＩ特異的抗体を用い
て標識した、近接した切片との比較により、これらの細胞の類似したパターンが両方のクラスの抗体により認識されることが明らかになった。ＡＮ１７９２処置した脳の詳細な調査により、ＭＨＣＩＩ陽性細胞はこれらの動物に残っている、限られたアミロイドの付近に限られることが明らかになった。使用した固定条件化では、細胞はＴ細胞（ＣＤ３、ＣＤ３ｅ）またはＢ細胞（ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ）リガンドまたは白血球共通抗原（ＣＤ４５）を認識する抗体には免疫応答性を示さなかったが、単球と交差反応するロイコシアリン（ｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎ）（ＣＤ４３）を認識する抗体には反応を示した。どのＰＢＳ処置マウスでも、そのような細胞は見られなかった。
【０１２１】
ＰＤＡＰＰマウスでは、海馬歯状回の外側分子層に必ず高度のアミロイド沈着が起きる。沈着は、ＡＤにおいて典型的にアミロイドプラークを含む小領域である穿孔性（ｐｅｒｆｏｒａｎｔ）の経路内に区別できる筋を形成する。ＰＢＳ処置マウスにおけるこれらの沈着の特徴的な外見は、未処置のＰＤＡＰＰマウスで以前に述べた特徴と類似していた。アミロイド沈着は、びまん性のものと、連続的な帯状に密集したプラークの両方からなっていた。対照的に、ＡＮ１７９２処置マウス由来の多くの脳では、このパターンは大きく変化していた。海馬のアミロイド沈着はびまん性のアミロイドを含まず、帯状のパターンは完全に崩壊していた。そのかわりに、多くの異常な斑点状の構造が存在した。それらは抗Ａβ抗体に反応性であり、そのいくつかはアミロイドを含む細胞のようであった。
【０１２２】
ＡＮ１７９２処置動物では、細胞外アミロイドの付近にＭＨＣ ＩＩ陽性細胞が頻繁に
観察された。ＡＮ１７９２処置マウス由来のいくつかの脳では、Ａβ陽性細胞とアミロイドの結合のパターンは非常に類似していた。これらの単球様の細胞の分布は沈着アミロイドの周辺に限られており、Ａβプラークが全く無い脳の他の領域には全く存在しなかった。
【０１２３】
ＭＨＣ ＩＩおよびＭＡＣ Ｉ標識切片の定量的画像分析により、ＰＢＳ群に比べて、ＡＮ１７９２処置マウスのＲＳＣおよび海馬では免疫応答性が増加する傾向があり、海馬でＭＡＣ１反応性を測定すると有意であることが明らかになった。
【０１２４】
これらの結果はプラークを保有する脳の領域で、アミロイドの活発細胞媒介性除去の指標である。
【０１２５】
（３．Ａβレベルに対するＡＮ１７９２の効果：ＥＬＩＳＡによる決定）
（ａ）皮質のレベル
未処置のＰＤＡＰＰマウスでは、1２ヶ月の皮質における全Ａβレベルの中央値は１，
６００ｎｇ／ｇであり、１５ヶ月までに８，７００ｎｇ／ｇまで増加した（表２）。１８ヶ月時の値は２２，０００ｎｇ／ｇであり、実験の期間中に１０倍以上増加した。ＰＢＳ処置動物は１５ヶ月で全Ａβは８，６００ｎｇ／ｇであり、１８ヶ月で１９，０００ｎｇ／ｇまで増加した。対照的に、ＡＮ１７９２処置動物では１５ヶ月で、ＰＢＳで免疫した群に比べて全Ａβが８１％少なかった（１，６００ｎｇ／ｇ）。ＡＮ１７９２およびＰＢＳ群を比べると１８ヶ月で有意に低い（ｐ＝０．０００１）全Ａβ（５，２００ｎｇ／ｇ）が見られた（表２）。これは他の見方では存在するＡβが７２％減少したことを示している。同様の結果がＡβ４２の皮質レベルを比較した時に得られた。すなわち、ＡＮ１７９２処置群はより少ないＡβ４２を含んだが、この場合、ＡＮ１７９２およびＰＢＳ群の差は１５ヶ月（ｐ＝０．０４）および１８ヶ月（ｐ＝０．０００１、表２）の両方で有意であった。
【０１２６】
【表２】
2010215651.tif 000003
【０１２７】
（ｂ）海馬のレベル
未処置のＰＤＡＰＰマウスでは、１２ヶ月齢での海馬における全Ａβレベルの中央値は１５，０００ｎｇ／ｇであり、１５ヶ月で５１，０００ｎｇ／ｇ、および１８ヶ月でさらに８１，０００ｎｇ／ｇまで増加した（表３）。同様に、ＰＢＳで免疫したマウスでは１５ヶ月および１８ヶ月でそれぞれ４０，０００ｎｇ／ｇおよび６５，０００ｎｇ／ｇの値を示した。ＡＮ１７９２で免疫した動物はより少ない全Ａβを示し、具体的には１５ヶ月および１８ヶ月の時点で、それぞれ２５，０００ｎｇ／ｇおよび５１，０００ｎｇ／ｇであった。１８ヶ月のＡＮ１７９２処置群の値は、ＰＢＳ処置群の値に比べて有意に低かった（ｐ＝０．０１０５、表３）。Ａβ４２の測定は同じパターンの結果を示した。すなわち１８ヶ月の評価では、ＡＮ１７９２処置群のレベルはＰＢＳ群より有意に低かった（それぞれ３９，０００ｎｇ／ｇ対５７，０００ｎｇ／ｇ、ｐ＝０．００２２）（表３）。
【０１２８】
【表３】
2010215651.tif 000004
【０１２９】
（ｃ）小脳のレベル
１２ヶ月の未処置ＰＤＡＰＰマウスでは、小脳における全Ａβレベルの中央値は１５ｎｇ／ｇであった（表４）。１５ヶ月では、この中央値は２８ｎｇ／ｇまで増加し、１８ヶ月までには３５ｎｇ／ｇまで増加した。ＰＢＳ処置マウスでは、全Ａβ値の中央値は、１５ヶ月で２１ｎｇ／ｇ、および１８ヶ月で４３ｎｇ／ｇであった。ＡＮ１７９２処置動物では１５ヶ月で全Ａβは２２ｎｇ／gであり、１８ヶ月では対応するＰＢＳ群に比べて有
意に低い（ｐ＝０．００２）全Ａβであった（２５ｎｇ／ｇ）（表４）。
【０１３０】
【表４】
2010215651.tif 000005
【０１３１】
（４．ＡＰＰレベルにおけるＡＮ１７９２処置の効果）
ＡＰＰ−αおよび全長のＡＰＰ分子はどちらも、Ａβ配列の全てまたは一部を含み、従ってＡＮ１７９２特異的免疫応答の生成によって、潜在的に影響を受け得る。現在までの研究では、ＰＤＡＰＰマウスにおける神経病理学的な増加として、ＡＰＰレベルのわずかな増加が言及されている。皮質においては、ＡＰＰ−α／ＦＬ（全長）またはＡＰＰ−αどちらかのレベルは、処置によって本質的には変化しなかった。例外として１８ヶ月の時点でＡＮ１７９２処置群において、ＰＢＳ処置群に比べてＡＰＰ−αが１９％減少された。１８ヶ月におけるＡＮ１７９２処置群のＡＰＰの値は、未処置群の１２ヶ月および１５ヶ月、ならびにＰＢＳ群の１５ヶ月の値とは有意に違わなかった。全ての場合で、ＡＰＰの値はＰＤＡＰＰマウスで正常に見られる範囲内にとどまった。
【０１３２】
（５．神経変性および神経膠症の病状におけるＡＮ１７９２処置の効果）
神経炎性局面過重は、１５ヶ月齢（８４％、ｐ＝０．０３）および１８ヶ月齢（５５％、ｐ＝０．０１）の両方で、ＰＢＳ群に比べてＡＮ１７９２処置マウスの前頭皮質で有意に減少した（図８）。神経炎性局面過重の中央値は、ＰＢＳ群で１５ヶ月と１８ヶ月との間に０．３２％から０．４９％まで増加した。これと対照的に、ＡＮ１７９２群では神経炎性局面の発達が大きく減少し、神経炎性局面過重の中央値は、１５ヶ月および１８ヶ月の群でそれぞれ０．０５％および０．２２％であった。
【０１３３】
ＡＮ１７９２による免疫はよく耐用性があるようであり、反応性星状細胞もまた、ＰＢＳ群と比べると、１５ヶ月齢（５６％、ｐ＝０．０１１）および１８ヶ月齢（３９％、ｐ＝０．０２８）の両方で、ＡＮ１７９２処置マウスのＲＳＣで有意に減少した（図９）。ＰＢＳ群における星状細胞の割合の中央値は、１５ヶ月と１８ヶ月との間に４．２６％から５．２１％に増加した。ＡＮ１７９２処置は、両方の時点でそれぞれ１．８９％および３．２％まで星状細胞増加の発達を抑制した。これは神経網が除去の過程で損傷していなかったことを示唆している。
【０１３４】
（６．抗体応答）
上記で述べたように、１１ヶ月齢のヘテロ接合性のＰＤＡＰＰマウス（Ｎ＝２４）に、フロイントアジュバントで乳化した１００μｇのＡＮ１７９２を用いて一連の免疫を５回行った。０、２、４、８、および１２週に腹腔内に投与し、１６週にＰＢＳ単独（フロイントアジュバントなし）で６回目の免疫を行った。ネガティブコントロールとして、並行して１組の２４匹の月齢を一致させたトランスジェニックマウスを、同じアジュバントで乳化したＰＢＳを用いて、同じスケジュールで投与して免疫した。２回目の投与後から始めて、それぞれの免疫後３から７日以内に動物から採血した。ＡＮ１７９２に対する抗体反応をＥＬＩＳＡによって測定した。ＡＮ１７９２で免疫した動物の相乗平均力価（ＧＭＴ）は、２回目、３回目および最後（６回目）の投与後それぞれ約１，９００、７，６０
０、および４５，０００であった。コントロールの動物では６回目の免疫後、Ａβ特異的な抗体は測定されなかった。
【０１３５】
約半数の動物をさらに３ヶ月処置し、約２０、２４、および２７週に免疫した。これらはそれぞれＰＢＳビヒクル単独でフロイントアジュバント無しで投与した。平均抗体力価はこの期間中変化しなかった。実際、抗体力価は５回目から９回目の注射の時期に対応する４回目から８回目の採血まで安定したままのようであった。
【０１３６】
ＡＮ１７９２処置マウスの血清に検出される、免疫によって惹起されたＡβ特異的抗体もまた、沈着した脳のアミロイドと関連しているかどうかを決定するために、ＡＮ１７９２およびＰＢＳ処置マウス由来の一組の切片を、マウスＩｇＧに特異的な抗体と反応させた。ＰＢＳ群とは対照的に、ＡＮ１７９２処置した脳のＡβプラークは内因性のＩｇＧで覆われていた。この２つの群の間の違いは１５ヶ月および１８ヶ月の群で見られた。特に印象的なのは、ＰＢＳ群のマウスでは重度なアミロイド産生が存在するにもかかわらず、これらの群で標識が欠如していることであった。これらの結果は合成Ａβタンパク質を用いた免疫は、インビボでアミロイドプラーク中のＡβを認識し、結合する抗体を産生することを示している。
【０１３７】
（７．細胞媒介性の免疫応答）
９匹のＡＮ１７９２で免疫した、および１２匹のＰＢＳで免疫した１８ヶ月齢のＰＤＡＰＰマウスから、９回目の免疫から７日後に脾臓を取り出した。脾臓細胞を単離し、Ａβ４０、Ａβ４２、またはＡβ４０−１（逆順のタンパク質）の存在下で７２時間培養した。マイトジェンＣｏｎＡをポジティブコントロールとして使用した。１．７μＭより多いタンパク質で最高の応答が得られた。９匹全てのＡＮ１７９２処置動物由来の細胞は、Ａβ１−４０またはＡβ１−４２タンパク質のどちらかに応答して増殖し、どちらのタンパク質に対しても同じレベルの取り込みを示した（図１０、上のパネル）。Ａβ４０−１逆向きタンパク質に対する反応は無かった。コントロール動物由来の細胞はどのＡβタンパク質にも反応しなかった（図１０、下のパネル）。
【０１３８】
（Ｃ．結論）
この研究の結果は、アミロイド沈着が存在するＰＤＡＰＰマウスをＡＮ１７９２で免疫すると、アミロイド沈着の進行を遅くし、および阻止し、その次に起こる老齢ＰＤＡＰＰマウスの脳内での神経病理学的な変化を遅らせることを示している。ＡＮ１７９２を用いた免疫は、アミロイドが通常アミロイドーシスへと至る構造に発展するのを本質的に停止させた。従って、Ａβペプチドの投与はＡＤの処置に処置上の利益がある
（ＩＶ．Ａβフラグメントのスクリーニング）
９〜１１ヶ月齢の１００匹のＰＤＡＰＰマウスを、９つの異なったＡＰＰおよびＡβの領域で免疫し、どのエピトープが応答を伝達するのか決定する。９つの異なった免疫原および１つのコントロールを、上記で述べたようにｉ．ｐ．で投与する。免疫原は、すべてシスチン結合によってヒツジ抗マウスＩｇＧと結合している４つのヒトＡβペプチド結合体１−１２、１３−２８、３２−４２、１−５、およびＡＰＰポリペプチドａａ５９２−６９５、凝集ヒトＡβ１−４０、および凝集ヒトＡβ２５−３５、および凝集げっ歯類Ａβ４２を含む。凝集Ａβ４２およびＰＢＳをコントロールとして使用する。１つの処置群あたり１０匹のマウスを使用する。力価を上記のように測定し、注射の４ヶ月後マウスを安楽死させる。組織化学、Ａβレベル、および毒性を死後に決定する。
【０１３９】
（Ａ．材料および方法）
（１．免疫原の調製）
結合Ａβペプチドの調製：４つのヒトＡβペプチド結合体（アミノ酸残基１−５、１−１２、１３−２８、および３３−４２、それぞれヒツジ抗マウスＩｇＧに結合している）
を、架橋剤スルホＥＭＣＳを用いてＡβペプチドに加えた人工的なシステインにより結合することによって調製した。Ａβペプチド誘導体を、次の最終的なアミノ酸配列で合成した。それぞれの場合で挿入したシステイン残基の位置を下線で示す。示されているように、Ａβ１３−２８ペプチド誘導体は、カルボキシル末端のシステインの前に加えられた２つのグリシン残基を有した。
【０１４０】
Ａβ１−１２ペプチド ＮＨ2−ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＣＣＯＯＨ Ａβ１−５ペプ
チド ＮＨ2−ＤＡＥＦＲＣ ＣＯＯＨＡβ３３−４２ペプチド ＮＨ2−Ｃ−アミノ−ヘプ
タン酸−ＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＣＯＯＨ Ａβ１３−２８ペプチド Ａｃ−ＮＨ−ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＧＣ−ＣＯＯＨ。
【０１４１】
結合反応を準備するために、１０ｍｇのヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ８．５に対して一晩透析した。透析した抗体を次にＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒ
ｉｐｒｅｐチューブを用いて容量２ｍｌまで濃縮した。１０ｍｇのスルホ−ＥＭＣＳ［Ｎ（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃｕｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．）を１ｍＬの脱イオン水に溶解した。４０倍モル過
剰のスルホ−ＥＭＣＳを攪拌しながらヒツジ抗マウスＩｇＧに１滴ずつ加え、次に溶液をさらに１０分間攪拌する。活性化されたヒツジ抗マウスＩｇＧを、０．１ＭのＮａＰＯ4
、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５で平衡化した１０ｍＬのゲル濾過カラム（ＰｉｅｒｃｅＰｒｅｓｔｏ Ｃｏｌｕｍｎ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓから入手）に通して精製
し、緩衝液を交換した。２８０ｎｍでの吸光度で同定された抗体を含む画分をプールして、吸光係数として１．４ｍｇ／ＯＤを用いて約１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。４０倍モル過剰のＡβペプチドを２０ｍＬの１０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ８．０に溶解した。例
外として、Ａβ３３−４２ペプチドは１０ｍｇを最初に０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解して、次に１０ｍＭのＮａＰＯ4緩衝液で２０ｍＬに希釈した。ペプチド溶液をそれぞれ１０
ｍＬの活性化ヒツジ抗マウスＩｇＧに加え、室温で４時間振とうした。得られた結合体を、最終的な容量が１０ｍＬ未満になるまで、ＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを用いて濃縮し、次にＰＢＳに対して透析して緩衝液を交換し、遊離のペプチドを除去した。結合体を滅菌のために０．２２μサイズの穴をもつフィルターに通し、次に１ｍｇのアリコートに分けて−２０℃で凍結保存した。結合体の濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、標準曲線にウマＩｇＧを用いて決定した。結合は、活性化ヒツジ抗マウスＩｇＧの分子量と比較した、結合ペプチドの分子量の増加によって証明した。Ａβ１−５ヒツジ抗マウス結合体は２つの結合のプールであり、他は１回の調製で作られた。
【０１４２】
（２．凝集Ａβペプチドの調製）
ヒト１−４０（ＡＮ１５２８；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．、ロット番号ＭＥ０５４１）、ヒト１−４２（ＡＮ１７９２；ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．、ロット番号ＭＥ０３３９およびＭＥ０４３９）、ヒト２５−３５、
およびげっ歯類１−４２（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．、ロット番号ＭＥ０２１８）ペプチドを、それぞれの組の注射を調製するために、−２０℃で乾燥して保存してあった凍結乾燥粉末から新しく可溶化した。この目的のために、２ｍｇのペプチドを０．９ｍｌの脱イオン水に加え、混合物をボルテックスして比較的均一な溶液または懸濁液を作成した。４つのうち、ＡＮ１５２８のみがこの段階で可溶性のペプチドであった。次に、１０×ＰＢＳ（１×ＰＢＳ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の１００μｌのアリコートを、ＡＮ１５２８が沈殿し始めた時点で加えた。懸濁液を再びボルテックスして翌日使用するために３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４３】
ｐＢｘ６タンパク質の調製：１００アミノ酸のバクテリオファージＭＳ−２ポリメラーゼＮ末端リーダー配列の次に、ＡＰＰの５９２−６９５アミノ酸（βＡＰＰ）からなる融合タンパク質であるｐＢｘ６をコードする発現プラスミドを、Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、４４９２−４４９７（１９９０）によって記載されるように構築した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、タンパク質をプロモーターの誘導後発現させた。細菌を８Ｍの尿素中で溶菌し、ｐＢｘ６を分離用ＳＤＳＰＡＧＥによって部分的に精製した。ｐＢｘ６を含む画分を、ウサギ抗ｐＢｘ６ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによって同定し、プールし、ＡｍｉｃｏｍＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブを用いて濃縮してＰＢＳに対して透析した。クーマシ−ブルー染色ＳＤＳＰＡＧＥによって判断した調製物の純度は約５から１０％であった。
【０１４４】
（Ｂ．結果および考察）
（１．実験計画）
１００匹の雄および雌、９から１１ヶ月齢のヘテロ接合性のＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＴａｃｏｎｉｃ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。マウスを１０の群に分けて、フロイントアジュバントと組み合せたＡβまたはＡＰＰの異なった領域で免疫した。動物は動物の性別、月齢、血統および供給源が群内でできるだけ近くなるように分けた。免疫原は、それぞれヒツジ抗マウスＩｇＧと結合したヒト配列由来の４つのＡβペプチド、１−５、１−１２、１３−２８、および３３−４２；４つの凝集Ａβペプチド、ヒト１−４０（ＡＮ１５２８）、ヒト１−４２（ＡＮ１７９２）、ヒト２５−３５、およびげっ歯類１−４２；およびＡＰＰアミノ酸残基５９２−６９５を含むｐＢｘ６と呼ばれる融合ポリペプチドを含んだ。１０番目の群はコントロールとしてアジュバントと組み合せたＰＢＳで免疫した。
【０１４５】
それぞれの免疫のために、２００μｌのＰＢＳ中の、１００μｇのそれぞれのＡβペプチド、または同じ容量のＰＢＳ中の、２００μｇのＡＰＰ誘導体ｐＢｘ６、またはＰＢＳ単独を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１（容量：容量）の割合で乳化し、最初の免疫のために最終的な容量を４００μｌとした。次に、次の４回の投与のために不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の同量の免疫原で追加免疫し、最後にＰＢＳで免疫した。免疫は腹腔内投与で行い、最初の３回の投与は２週間おき、その後は１ヶ月おきのスケジュールで投与した。抗体力価を測定するために、２回目の投与後から始めてそれぞれの免疫から４から７日後に動物から採血した。動物を最後の投与から約１週間後に安楽死させた。
【０１４６】
（２．脳におけるＡβおよびＡＰＰのレベル）
様々なＡβペプチドまたはＡＰＰ誘導体で免疫してから約４ヵ月後、生理食塩水で灌流した動物から脳を取り出した。半球の一つを免疫組織化学的分析のために調製し、そしてもう１つをＡβおよびＡＰＰレベルを定量するために使用した。様々な形態のベータアミロイドペプチドおよびアミロイド前駆体タンパク質の濃度を測定するために、この半球を解剖し、そして海馬、皮質、および小脳領域のホモジネートを５Ｍグアニジン中で調製した。これらを希釈し、そしてアミロイドまたはＡＰＰのレベルをＥＬＩＳＡフォーマットで、既知の濃度の標準ＡβペプチドまたはＡＰＰの、一連の希釈液と比較して定量した。
【０１４７】
ＰＢＳで免疫したコントロールグループの総Ａβ濃度の中央値は、皮質中に比べて海馬中で５．８倍より高かった（皮質では４，２１１ｎｇ／ｇであるのに比べて海馬組織での中央値は２４，３１８ｎｇ／ｇ）。コントロールグループの小脳における中央値レベル（２３．４ｎｇ／ｇ組織）は海馬より約１，０００倍低かった。これらのレベルは、我々が以前にこの月齢のヘテロ接合体のＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスで報告したものと同様である（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、１９９７、前出）。
【０１４８】
皮質については、処置グループのサブセットでは総ＡβおよびＡβ１−４２レベルの中央値は、コントロールグループの値と有意に違っていた（ｐ＜０．０５）。ＡＮ１７９２、げっ歯類Ａβ１−４２、またはＡβ１−５ペプチド結合体を投与した動物の値を図１１に示す。これらの処置グループでは、コントロールに比べて総Ａβレベルの中央値はそれぞれ７５％、７９％、および６１％減少した。どのグループにおいても、Ａβ特異的抗体の力価と、脳の皮質領域におけるＡβレベルとの間には識別し得る相関関係は認められなかった。
【０１４９】
海馬においては、ＡＮ１７９２処置に伴う総Ａβの中央値の減少は（４６％、ｐ＝０．０５４３）、皮質で見られたほど（７５％、ｐ＝０．００２１）大きくなかった。しかし、減少の大きさは海馬において皮質におけるよりはるかに大きく、海馬では正味の減少が１１，１８６ｎｇ／ｇ組織であったのに対して、皮質では３，１７１ｎｇ／ｇ組織であった。げっ歯類Ａβ１−４２またはＡβ１−５を投与した動物のグループでは、総Ａβレベルの中央値はそれぞれ３６％および２６％減少した。しかし、グループの大きさが小さいこと、および両方のグループ内で動物によってアミロイドペプチドのレベルが大きく変動することのために、これらの減少は有意ではなかった。海馬でＡβ１−４２レベルを測定した場合、処置で誘導された減少はどれも有意ではなかった。従って、皮質でのＡβ負荷がより低いために、この領域での変化はより高感度の処置効果の指標である。皮質においてＥＬＩＳＡで測定されたＡβレベルの変化は同様であるが、免疫組織化学的分析からの結果によれば同じではない（下記参照）。
【０１５０】
総Ａβを、代表的にはＡＤの病状においては影響されない領域である小脳でも測定した。様々なＡβペプチドまたはＡＰＰ誘導体で免疫したどのグループにおけるＡβ濃度の中央値も、脳のこの領域におけるコントロールグループの値と違わなかった。この結果は非病理学的なＡβのレベルは処置によって影響されないことを示唆している。
【０１５１】
処置およびコントロールマウス由来の皮質および小脳において、ＡＰＰ濃度もまた、ＥＬＩＳＡによって決定した。２つの異なったＡＰＰアッセイを利用した。ＡＰＰ−α／ＦＬと呼ばれる最初のものは、ＡＰＰアルファ（α、Ａβ配列の中で切断されたＡＰＰの分泌形態）およびＡＰＰの全長形態（ＦＬ）の両方を認識するが、その一方２番目のものはＡＰＰ−αのみを認識する。処置グループのサブセットにおける処置にともなうＡβの減少とは対照的に、ＡＰＰレベルはすべての処置グループにおいてコントロール動物と比べて変化しなかった。これらの結果はＡβペプチドを用いた免疫はＡＰＰを枯渇させず、どちらかと言えば処置効果はＡβに特異的であることを示している。
【０１５２】
まとめると、総ＡβおよびＡβ１−４２レベルは、ＡＮ１７９２、げっ歯類Ａβ１−４２、またはＡβ１−５結合体を用いた処置により、皮質において有意に減少した。海馬においては、総Ａβは、ＡＮ１７９２処置によってのみ有意に減少した。海馬、皮質、または小脳領域における、処置に伴う他のどのＡβまたはＡＰＰレベルの変化も有意ではなかった。
【０１５３】
（２．組織化学的分析）
６グループのサブセット由来の脳を免疫組織化学的分析のために調製した。Ａβペプチド結合体Ａβ１−５、Ａβ１−１２、およびＡβ１３−２８で免疫した３つのグループ、全長Ａβ凝集物ＡＮ１７９２およびＡＮ１５２８で免疫した２つのグループ、およびＰＢＳで処置したコントロールグループである。これらのグループからの脳切片におけるアミロイド負荷のイメージ分析の結果を図１２に示す。コントロール動物に比べて、３つの処置グループの皮質領域においてアミロイド負荷の有意な減少がみられた。アミロイド負荷の一番大きな減少はＡＮ１７９２を投与したグループで観察され、平均値は９７％減少した（ｐ＝０．００１）。ＡＮ１５２８（９５％、ｐ＝０．００５）およびＡβ１−５ペプ
チド結合体（６７％、ｐ＝０．０２）で処置した動物においても有意な減少が観察された。
【０１５４】
ＥＬＩＳＡによる総ＡβまたはＡβ１−４２の定量から得られた結果と、イメージ分析によるアミロイド負荷から得られた結果はいくらか違っている。ＡＮ１５２８による処置は、定量的イメージ分析によって測定した場合は皮質アミロイド負荷のレベルに有意な影響を与えたが、ＥＬＩＳＡで測定した場合同じ領域で総Ａβ濃度に有意な影響を与えなかった。これら２つの結果の相違は、アッセイの特異性によるものと思われる。イメージ分析はプラークに凝集した不溶性のＡβのみを測定する。対照的に、ＥＬＩＳＡは、全ての形態のＡβ、可溶性および不溶性、単量体および凝集体の両方を測定する。疾患の病状は不溶性のプラーク結合形態のＡβと関連していると考えられるので、処置効果を示すためにはイメージ分析技術のほうがより高い感受性を持ち得る。しかし、ＥＬＩＳＡはより速く、かつより簡単なアッセイであるので、スクリーニングの目的には非常に有用である。その上、それは処置に関連するＡβの減少は、総Ａβよりもプラーク結合形態についてより大きいことを明らかにし得る。
【０１５５】
処置した動物において、免疫によって誘発されたＡβ特異的抗体が、沈着した脳アミロイドと反応したか否かを決定するために、処置マウスおよびコントロールマウス由来の切片のサブセットをマウスＩｇＧに特異的な抗体と反応させた。ＰＢＳグループとは対照的に、Ａβペプチド結合体Ａβ１−５、Ａβ１−１２、およびＡβ１３−２８；および全長Ａβ凝集物ＡＮ１７９２、およびＡＮ１５２８で免疫した動物では、Ａβを含むプラークは内因性のＩｇＧで覆われていた。他のＡβペプチドまたはＡＰＰペプチドｐＢｘ６で免疫した動物由来の脳はこのアッセイでは分析されなかった。
【０１５６】
（３．抗体力価の測定）
第２回目の免疫の後から始めて、それぞれの免疫から４から7日後にマウスから採血し
、全部で５回採血した。抗体力価を、Ａβ１−４２結合抗体として、Ａβ１−４２でコートしたプラスチックマルチウェルプレートでサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。図１３に示したように、最も高い力価のＡＮ１７９２特異的抗体を誘発した４つのワクチンでは、第４回目の投与後にピークの抗体力価が誘発された。すなわち、ＡＮ１７９２（ＧＭＴピーク値：９４，６４７）、ＡＮ１５２８（ＧＭＴピーク値：８８，２３１）、Ａβ１−１２結合体（ＧＭＴピーク値：４７，２１６）およびげっ歯類Ａβ１−４２（ＧＭＴピーク値：１０，７６６）であった。これらのグループにおける力価は、第５回目および６第回目の用量後にいくらか減少した。残りの５つの免疫原では、第５回目または第６回目の用量後にピーク力価に達し、そしてこれらは４つの最も高い力価を示すグループの値よりもかなり低かった。すなわち、Ａβ１−５結合体（ＧＭＴピーク値：２，３５６）、ｐＢｘ６（ＧＭＴピーク値：１，９８６）、Ａβ１３−２８結合体（ＧＭＴピーク値：１，１８３）、Ａβ３３−４２結合体（ＧＭＴピーク値：６５８）、Ａβ２５−３５（ＧＭＴピーク値：１２５）であった。同じＥＬＩＳＡサンドイッチフォーマットを用い、免疫原のサブセット、Ａβ１−５、Ａβ１３−２８、Ａβ２５−３５、Ａβ３３−４２またはげっ歯類Ａβ１−４２で免疫したグループについて、相同性ペプチドに対する抗体の力価もまた測定した。これらの力価はＡβ１−４２に対して測定した力価とほぼ同じであったが、例外としてげっ歯類Ａβ１−４２免疫原について相同性免疫原に対する抗体力価が約２倍高かった。個々の動物のＡＮ１７９２特異的抗体力価の大きさまたは処置グループの平均値は、皮質におけるＡβの減少として測定される効力と相関しなかった。
【０１５７】
（４．リンパ球増殖反応）
Aβ依存的リンパ球増殖を、最後の６回目の免疫から約１週間後に採取した脾臓細胞を
用いて測定した。ウェルあたり１０5個の新しく採取した細胞を、刺激のために５μＭの
濃度のＡβ１−４０存在下で５日間培養した。１０グループのうち７グループのサブセッ
ト由来の細胞は、逆ペプチドＡβ４０−１の存在下でも培養した。ポジティブコントロールとして、追加の細胞をＴ細胞分裂促進剤であるＰＨＡと共に培養し、そしてネガティブコントロールとしてペプチドを加えずに細胞を培養した。
【０１５８】
大部分の動物由来のリンパ球はＰＨＡに応答して増殖した。Ａβ４０−１逆ペプチドに対しては有意な応答はなかった。より大きく凝集したＡβペプチド、ＡＮ１７９２、げっ歯類Ａβ１−４２およびＡＮ１５２８で免疫した動物由来の細胞は、Ａβ１−４０で刺激した場合強く増殖し、ＡＮ１７９２のレシピエントにおいて最も高いｃｐｍを示した。Ａβ１−１２結合体、Ａβ１３−２８結合体およびＡβ２５−３５で免疫したそれぞれのグループにおける１匹の動物は、Ａβ１−４０に応答して増殖した。Ａβ１−５結合体、Ａβ３３−４２結合体、ｐＢｘ６またはＰＢＳを投与した残りのグループでは、Ａβ刺激による応答を示した動物はいなかった。これらの結果を下記の表５にまとめる。
【０１５９】
【表５】
2010215651.tif 000006
【０１６０】
これらの結果はＡＮ１７９２およびＡＮ１５２８は、Ｔ細胞応答、おそらくはＣＤ４+
表現型を強く刺激することを示している。より短いペプチドは時にはより少ない効力で機能し得るが、ＣＤ４+Ｔ細胞によって認識されるペプチドエピトープは通常約１５アミノ
酸の長さであるので、Ａβ１−５で免疫した動物においてＡβ特異的Ｔ細胞応答が見られないことは、驚くべきことではない。従って、４つの結合体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞エピトープの大部分は、おそらくＡβ領域ではなくＩｇＧ結合体のパートナー内にあると思われる。この仮説は、これらの処置グループそれぞれの動物における増殖応答の発生率が非常に低いことによって支持される。Ａβ特異的Ｔ細胞が明らかに欠如した状態で、Ａβ１−５結合体は、脳内のＡβレベルを有意に減少するのに有効であったので、このペプチドを用いた免疫により誘導される免疫応答の鍵となるエフェクターは抗体であろう。
【０１６１】
Ａβ残基を全て含むＡＰＰアミノ酸５９２−６９５を含む融合ペプチドｐＢｘ６からのＴ細胞の欠如および低い抗体応答は、この特定の調製物の低い免疫原性が原因であり得る。Ａβ２５−３５凝集物の低い免疫原性は、ペプチドが小さすぎて抗体応答を誘発するのを助ける良好なＴ細胞エピトープを含まない可能性があるためであろう。このペプチドをキャリアタンパク質と結合させれば、おそらくより免疫原性が高い。
【０１６２】
（Ｖ．受動的な保護のためのポリクローナル抗体の調製）
２０匹の非トランスジェニックマウスを、Ａβまたは他の免疫原を用い、必要に応じてアジュバントを加えて免疫し、４−５ヶ月で安楽死させる。免疫したマウスから血液を採集する。必要に応じてＩｇＧを他の血液成分から分離する。免疫原に特異的な抗体は、アフィニティークロマトグラフィーで部分的に精製し得る。マウスあたり平均約０．５−１ｍｇ、全体で５−１０ｍｇの免疫原特異的抗体が得る。
【０１６３】
（ＶＩ．Ａβに対する抗体を用いた受動免疫）
７−９ヶ月齢のＰＤＡＰＰマウスのグループに、それぞれＰＢＳ中の０．５ｍｇのポリクローナル抗Ａβ抗体、または特異的抗Ａβモノクローナル抗体を下記に示すように注射する。全ての抗体製剤をエンドトキシンレベルが低くなるように精製する。Ａβのフラグメントまたはより長い形態をマウスに注射して、ハイブリドーマを調製し、そしてこのハイブリドーマを、望ましいＡβの所望のフラグメントに特異的に結合してＡβの他の重複しないフラグメントに結合しない抗体に関してスクリーニングし、フラグメントに対するモノクローナル抗体を調製し得る。
【０１６４】
【表６】
2010215651.tif 000007
【０１６５】
Ａβ４２または他の免疫原に対して、ＥＬＩＳＡ力価で測定される循環抗体濃度を、ＥＬＩＳＡで規定される１／１０００より大きくに保つために、４ヶ月間以上に亘って必要な時にマウスにｉｐ注射する。力価を上記のようにモニターし、そしてマウスを注射の４ヶ月後安楽死させる。組織化学、Ａβレベルおよび毒性を死後に試験する。１グループあたり１０匹のマウスを使用する。
【０１６６】
（ＶＩＩ．異なるアジュバントの比較）
この実施例はＣＦＡ、ミョウバン、水中油型エマルジョンおよびＭＰＬを、免疫応答を刺激する能力に関して比較する。
【０１６７】
（Ａ．材料および方法）
（１．実験計画）
Elm Ｈｉｌｌから入手した１００匹の雌Ｈａｒｔｌｅｙ種、６週齢のモルモットを１０グループに分け、ＡＮ１７９２またはそのパルミトイル化誘導体で、様々なアジュバントと組み合せて免疫した。７グループにはＡＮ１７９２（明記しなければ３３μｇ）を、ａ）ＰＢＳ、ｂ）フロイントアジュバント、ｃ）ＭＰＬ、ｄ）スクアレン、ｅ）ＭＰＬ／ス
クアレン、ｆ）低用量のミョウバン、またはｇ）高用量のミョウバン（３００μｇのＡＮ１７９２）と組み合せて注射した。２グループには、ＡＮ１７９２のパルミトイル化誘導体（３３μｇ）を、ａ）ＰＢＳ、またはｂ）スクアレンと組み合せて注射した。最後に、１０番目のグループには抗原または追加のアジュバント無しにＰＢＳ単独を投与した。フロイントアジュバントを投与したグループでは、最初の用量はＣＦＡと乳化し、そして残りの４回の用量はＩＦＡと乳化した。高用量のミョウバングループに３００μｇのＡＮ１７９２を投与した以外は、全てのグループに抗原を３３μｇの用量で投与した。注射はＣＦＡ／ＩＦＡは腹腔内、そして他の全てのグループでは左右交互の後足四頭筋に筋肉内投与した。最初の３回の用量は２週間おきのスケジュールで投与し、次に２回の用量を１ヶ月おきに投与した。抗体力価を測定するために、２回目の投与後から始めて、それぞれの免疫から６から７日後に採血した。
【０１６８】
（２．免疫原の調製）
２ｍｇのＡβ４２（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ロット番号ＭＥ０３３９
）を０．９ｍｌの脱イオン水に加え、そしてこの混合物をボルテックスして比較的均一な懸濁液を作成した。１０×ＰＢＳ（１×ＰＢＳは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の１００μｌのアリコートを加えた。この懸濁液を再びボルテックスし、そして翌日使用するために３７℃で一晩インキュベートした。未使用のＡβ１−４２は乾燥剤と共に凍結乾燥粉末として−２０℃で保存した。
【０１６９】
フッ化水素酸処理によって樹脂から発生期の（ｎａｓｃｅｎｔ）ペプチドを除去する前に、ジメチルホルムアミドに溶解したパルミチン酸無水物を、ＡＮ１７９２のアミノ末端残基に結合させることによって、ＡＮ１７９２のパルミトイル化誘導体を調製した。
【０１７０】
最初の免疫のために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いたワクチン用量を調製するために（グループ２）、２００μｌのＰＢＳ中、３３μｇのＡＮ１７９２をＣＦＡと１：１（容量：容量）の割合で乳化して、最終的な容量を４００μｌとした。後の免疫のために、抗原を、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と同様に乳化した。
【０１７１】
グループ５および８のＭＰＬを用いたワクチン用量を調製するために、凍結乾燥粉末（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）を、０．２％トリエチルアミン水溶液に最終的な濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように加え、ボルテックスした。この混合物を６５から７０℃まで３０秒間温めて、わずかに不透明な均一なミセル懸濁液を作成した。この溶液は、各セットの注射のために用時調製した。グループ５の各注射のために、１６．５μｌのＰＢＳ中３３μｇのＡＮ１７９２、５０μｇのＭＰＬ（５０μｌ）および１６２μｌのＰＢＳを、ホウ珪酸塩チューブ中で使用の直前に混合した。
【０１７２】
水中低油型エマルジョンを用いたワクチン用量を調製するために、ＰＢＳ中のＡＮ１７９２を、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、ＰＢＳ中０．５％Ｓｐａｎ ８５に
加え、最終の１回の用量の濃度が２５０μｌ中で３３μｇのＡＮ１７９２となるようにした（グループ６）。この混合物を、１５から２０回、顕微鏡で見た時エマルジョンの粒子が直径１．０μｍの標準ラテックスビーズと同じくらいの直径に見えるまで２チャンバの手持デバイスに通して乳化した。その結果できた懸濁液はオパールのような光彩を放つ（ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ）乳白色であった。このエマルジョンは、各一連の注射のために用時調製した。グループ８については、上記で述べたように乳化するために、０．２％トリエチルアミン中のＭＰＬを、スクアレンおよび界面活性剤の混合物に、用量あたり５０μｇの濃度で加えた。パルミトイル誘導体については（グループ７）、用量あたり３３μｇのパルミトイル−ＮＨ−Ａβ１−４２をスクアレンに加え、そしてボルテックスした。次にＴｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ ８５をボルテックスしながら加えた。この混合物を、
ＰＢＳに、最終的な濃度が５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０、０．５％の
Ｓｐａｎ ８５となるように加え、そしてこの混合物を上記で述べたように乳化した。
【０１７３】
ミョウバンを用いたワクチン用量を調製するために（グループ９および１０）、ＰＢＳ中のＡＮ１７９２をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウムゲル、Ａｃｃｕｒａｔｅ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）に加え、最終用量容積２５０μｌ中、５ｍｇのミョウバンあたり３３μｇ（低用量、グループ９）または３００μｇ（高用量、グループ１０）のＡＮ１７９２濃度になるようにした。この懸濁液を室温で４時間、静かに攪拌した。
【０１７４】
（３．抗体力価の測定）
２回目の免疫後から始めて、免疫の６から７日後にモルモットから採血し、全部で４回採血した。Ａβ４２に対する抗体力価を一般的な材料および方法で述べたようにＥＬＩＳＡで測定した。
【０１７５】
（４．組織の調製）
約１４週後、全てのモルモットにＣＯ2を投与した。脳脊髄液を採取し、そして脳を取
り出して、３つの脳領域（海馬、皮質および小脳）を解剖して総Ａβタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡで測定するために使用した。
【０１７６】
（Ｂ．結果）
（１．抗体応答）
免疫後ＡＮ１７９２に対する抗体応答として測定される場合、種々のアジュバントの強度（ｐｏｔｅｎｃｙ）の広範な範囲が存在した。図１４に示すように、ＡＮ１７９２をＰＢＳ中で投与した場合、２または３回の免疫後には抗体は検出されず、そして４回目および５回目の投与後にわずかな応答が検出され、相乗平均力価（ＧＭＴ）はわずかに約４５であった。ｏ／ｗエマルジョンは３回目の投与後に大きくない力価（ＧＭＴ２５５）を誘導し、この力価は４回目の投与後に維持され（ＧＭＴ ３０１）、そして最後の投与で減
少した（ＧＭＴ ５４）。ミョウバンに結合したＡＮ１７９２に関しては明らかな抗原用
量応答が存在し、３００μｇは３３μｇに比べて全ての時点でより免疫原性であった。４回目の免疫後の、抗体応答のピーク点では、２つの投与間の差は４３％、ＧＭＴは約１９４０（３３μｇ）および３４００（３００μｇ）であった。３３μｇのＡＮ１７９２プラスＭＰＬに対する抗体応答は、ミョウバンに結合した約１０倍高用量の抗原（３００μｇ）で生じる応答と非常に類似していた。ｏ／ｗエマルジョンにＭＰＬを加えると、ＭＰＬを単独のアジュバントとして使用した時に比べて７５％ほどワクチンの強度が減少した。ＡＮ１７９２のパルミトイル化誘導体は、ＰＢＳ中で投与した場合に完全に非免疫原性であり、そしてｏ／ｗエマルジョン中で提示した場合大きくない力価を示して、３回目および４回目の採血についてＧＭＴは３４０および１０５であった。最も高い抗体力価はフロイントアジュバントで産生され、ＧＭＴのピーク値は約８７，０００で、２つの次に最も強力なワクチンであるＭＰＬおよび高用量ＡＮ１７９２／ミョウバンの約３０倍大きい値であった。
【０１７７】
この研究で同定された最も有望なアジュバントは、ＭＰＬおよびミョウバンである。これら２つのうち、ミョウバンで得られるのと同じ抗体応答を起こすのに必要な抗原投与量が１０倍低いので、ＭＰＬが好ましいようである。抗原および／またはアジュバントの用量を増すことによって、および免疫のスケジュールを最適化することによって、応答を増加し得る。ｏ／ｗエマルジョンはＡＮ１７９２の非常に弱いアジュバントであり、そしてＭＰＬアジュバントにｏ／ｗエマルジョンを加えると、ＭＰＬ単独での本来のアジュバント活性が減少した。
【０１７８】
（２．脳内のＡβレベル）
約１４週でモルモットを深く麻酔し、群のサブセットであるフロイントアジュバント（群２）、ＭＰＬ（群５）、高用量のＡＮ１７９２３００μｇとミョウバン（群１０）で免疫した群、およびＰＢＳで免疫したコントロール群（群３）の動物から、脳脊髄液（ＣＳＦ）を採取し、そして脳を摘出した。Ａβペプチドのレベルを測定するために、１つの半球を解剖して、海馬、皮質、および小脳領域のホモジネートを５Ｍグアニジン中で調製した。これらを希釈し、そしてＥＬＩＳＡ形式で、既知の濃度のＡβ標準タンパク質の一連の希釈液と比較して定量した。海馬、皮質および小脳のＡβタンパク質レベルは、これらのワクチンで惹起されるＡβに対する抗体応答が広い範囲にわたるにもかかわらず、４つのグループ全てで非常に類似していた。測定されたＡβレベルの平均値は、海馬においては約２５ｎｇ／ｇ組織、皮質では２１ｎｇ／ｇ、および小脳では１２ｎｇ／ｇであった。従って、これらの動物のいくつかで、ほとんど３ヶ月間Ａβに対する高い循環抗体力価が存在することは、それらの脳での全Ａβレベルを変化させなかった。ＣＳＦ中のＡβレベルもグループ間で非常に類似していた。ＡＮ１７９２による免疫が内因性のＡβに大きな影響を与えないことは、免疫応答がＡβの病的な形成に焦点を合わせていることを示している。
【０１７９】
（ＶＩＩＩ．マウスにおける異なったアジュバントに対する免疫応答）
この研究のために６週齢の雌性Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを１グループあたり
１０−１３匹使用した。０、１４、２８、６０、９０、および１２０日目に２００μｌの投与量で皮下に投与し、免疫を行った。全ての処方でＰＢＳを緩衝液として使用した。ＥＬＩＳＡによって抗体力価を分析するために、２回目の投与後から始めて、それぞれの免疫から７日後に動物から採血した。それぞれのグループの処置レジメを表７にまとめる。
【０１８０】
【表７】
2010215651.tif 000008
【０１８１】
それぞれのグループにおけるＡβ４２に対する抗体のＥＬＩＳＡ力価を、下記の表８に示す。
【０１８２】
【表８】
2010215651.tif 000009
【０１８３】
（ＩＸ．異なったアジュバントの治療的効果）
治療的効果の研究を、ヒトでの使用に適当な一連のアジュバントを用いて、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスで行い、Ａβに対する免疫応答を増強する能力、および脳内のアミロイド沈着の免疫媒介性の除去を誘発する能力を決定した。
【０１８４】
１８０匹の雄性および雌性の、７．５から８．５ヵ月齢のヘテロ接合性のＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスをＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入
手した。このマウスを１グループあたり１５から２３匹の動物を含む９つのグループに分け、様々なアジュバントと組み合せたＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８で免疫した。動物はグループ内で動物の性別、月齢、および血統ができるだけ近く適合するように分けた。アジュバントは、それぞれ両方の抗原と組み合せたミョウバン、ＭＰＬ、およびＱＳ２１、ならびにＡＮ１７９２のみと組み合せたフロイントアジュバント（ＦＡ）を含んでいた。もう１つのグループをアジュバント無しにＰＢＳ緩衝液中で保存剤チメロサールを添加して調製したＡＮ１７９２で免疫した。９番目のグループをネガティブコントロールとしてＰＢＳ単独で免疫した。
【０１８５】
凝集Ａβペプチドの調製：ヒトＡβ１−４０（ＡＮ１５２８；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．、Ｎａｐａ、ＣＡ；ロット番号ＭＥ０５４１）およびヒトＡ
β１−４２（ＡＮ１７９２；ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．、ロット
番号ＭＥ０４３９）ペプチドを、それぞれ一連の注射液を調製するために、−２０℃で乾燥して保存してあった凍結乾燥粉末から新しく可溶化した。この目的のために、２ｍｇのペプチドを０．９ｍｌの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックスして比較的均一な溶液または懸濁液を作成した。ＡＮ１７９２とは対照的に、ＡＮ１５２８はこの段階で可溶性であった。次いで、１０×ＰＢＳ（１×ＰＢＳ：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）の１００μｌのアリコートをＡＮ１５２８が沈殿し始める時点で加えた。懸濁液を再びボルテックスし、そして翌日使用するために３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８６】
ミョウバンを用いたワクチン投与を調製するために（グループ１および５）、ＰＢＳ中のＡβペプチドをＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウムゲルの２％水溶液、Ｓａｒｇｅａｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に加えて、ミョウバン１ｍｇあたり１００μｇのＡβペプチド濃度になるようにした。１０×ＰＢＳを最終的な用量の１×ＰＢＳ中２００μｌの容量まで加えた。次いで、この懸濁液を注射の前に室温で約４時間、静かに混合した。
【０１８７】
ＭＰＬを用いたワクチン投与を調製するために（グループ２および６）、凍結乾燥粉末（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍ
Ｔ；ロット番号６７０３９−Ｅ０８９６Ｂ）を０．２％トリエチルアミン水溶液に加え、最終的な濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにし、そしてボルテックスした。この混合物を６５から７０℃で３０秒間加熱し、わずかに不透明な均一なミセル懸濁液を作成した。この溶液を４℃で保存した。それぞれの組の注射のために、５０μｌＰＢＳ中の１用量あたり１００μｇのペプチド、１用量あたり５０μｇのＭＰＬ（５０μｌ）および１用量あたり１００μｌのＰＢＳをホウ珪酸塩チューブ中で使用の直前に混合した。
【０１８８】
ＱＳ２１を用いたワクチン用量を調製するために（グループ３および７）、凍結乾燥粉末（Ａｑｕｉｌａ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ；ロット番号Ａ７０１８Ｒ）をＰＢＳ、ｐＨ６．６−６．７に加え、最終的な濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにし、そしてボルテックスした。この溶液を−２０℃で保存した。それぞれの組の注射のために、５０μｌＰＢＳ中の１用量あたり１００μｇのペプチド、２５μｌＰＢＳ中の１用量あたり２５μｇのＱＳ２１、および１用量あたり１２５μｌのＰＢＳをホウ珪酸塩チューブ中で使用の直前に混合した。
【０１８９】
フロイントアジュバントを用いたワクチン用量を調製するために（グループ４）、最初の免疫のために２００μｌＰＢＳ中の１００μｇのＡＮ１７９２を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１（容量：容量）で乳化し、最終的な容量を４００μｌとした。後の免疫のために、抗原を同様に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と乳化した。アジュバントであるミョウバン、ＭＰＬまたはＱＳ２１を含むワクチンのために、最終的な容量である２００μｌのＰＢＳ中で、１用量あたり１００μｇのＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８を、ミョウバン（１用量あたり１ｍｇ）またはＭＰＬ（１用量あたり５０μｇ）またはＱＳ２１（１用量あたり２５μｇ）と組み合せて、肩甲骨の間の背中に皮下注射で投与した。ＦＡを投与するグループのために、１００μｇのＡＮ１７９２を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と１：１（容量：容量）で乳化して最終的な容量を４００μｌとし、そして最初の免疫では腹腔内に投与した。次に、後の５回の投与では不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の同量の免疫原で追加免疫した。アジュバントなしのＡＮ１７９２を受けるグループのために、最終的な容量である５０μｌのＰＢＳ中で、１０
μｇのＡＮ１７９２を５μｇのチメロサールと組み合せて、そして皮下に投与した。９番目のコントロールグループは、皮下に投与された２００μｌのＰＢＳのみを受けた。免疫は最初の３回の投与は２週間ごと、その後は１ヵ月ごとのスケジュールで行い、０、１６、２８、５６、８５および１１２日目に行った。抗体力価を測定するために、２回目の投与後から始めてそれぞれの免疫から６〜７日後に動物を採血した。最後の投与から約1週
間後に動物を安楽死させた。脳内のＡβおよびＡＰＰレベルのＥＬＩＳＡアッセイによって、および脳切片におけるアミロイドプラークの存在を免疫組織化学的に評価することによって結果を測定した。さらに、Ａβ特異的抗体力価、およびＡβ依存的増殖およびサイトカイン応答を決定した。
【０１９０】
表９はＡβ１−４２に対する最も高い抗体力価が、ＦＡおよびＡＮ１７９２によって惹起されたことを示している。力価は４回目の免疫後最高値に達し（ＧＭＴ最高値：７５，３８６）、次いで最後の６回目の免疫後５９％まで減少した。ＡＮ１７９２と組み合せたＭＰＬによって惹起された平均力価の最高値は、ＦＡによって得られた値よりも６２％低く（ＧＭＴ最高値：２８，８６７）、そしてこれも免疫計画の初期、３回の投与後に達し、６回目の免疫後、最高値の２８％にまで減少した。ＡＮ１７９２と組み合せたＱＳ２１によって得られた平均力価の最高値（ＧＭＴ：１，５１１）は、ＭＰＬによって得られた値より約５倍低かった。さらに、最高の応答に達するために追加の免疫が必要であったので、応答の反応速度論がより遅かった。ミョウバンに結合したＡＮ１７９２によって産生された力価は、ＱＳ２１によって得られた値よりわずかに大きく、そして応答の反応速度論はより速かった。チメロサールと共にＰＢＳ中で投与したＡＮ１７９２では、力価の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）および大きさがＰＢＳ単独よりもわずかに大きかった。ＭＰＬおよびＡＮ１５２８によって産生された力価の最高値（ＧＭＴ最高値３０９９）は、ＡＮ１７９２による値よりも約９倍低かった。ミョウバンに結合したＡＮ１５２８は免疫原性が非常に乏しく、いく匹かの動物でのみ低い力価が得られた。ＰＢＳ単独で免疫したコントロール動物では、抗体応答は見られなかった。
【０１９１】
【表９】
2010215651.tif 000010
【０１９２】
１２ヶ月齢のマウスにおいてＥＬＩＳＡによって決定された皮質のアミロイド生産量に対する、種々のアジュバントまたはチメロサールと組み合せたＡＮ１７９２またはＡＮ１５２８による処置の結果を図１５に示す。ＰＢＳコントロールＰＤＡＰＰマウスでは、１２ヶ月時、皮質での全Ａβレベルの中央値は１，８１７ｎｇ／ｇであった。Ａβレベルの著しい抑制が、ＡＮ１７９２プラスＣＦＡ／ＩＦＡ、ＡＮ１７９２プラスミョウバン、ＡＮ１７９２プラスＭＰＬおよびＱＳ２１プラスＡＮ１７９２で処置したマウスで観察された。その抑制はＡＮ１７９２プラスＣＦＡ／ＩＦＡでのみ統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。しかし、実施例ＩおよびＩＩＩで示したように、Ａβレベルの抑制に対する免疫の効果は、１５ヶ月および１８ヶ月齢のマウスで実質上より大きくなる。従って、少なくともＡＮ１７９２プラスミョウバン、ＡＮ１７９２プラスＭＰＬおよびＡＮ１７９２プラスＱＳ２１組成物では、より老齢のマウスの処置において統計学的に有意になること
が期待される。対照的に、ＡＮ１７９２プラス保存剤チロメサールは、ＰＢＳで治療したマウスとほとんど同じＡβレベルの中央値を示した。Ａβ４２の皮質レベルを比較した場合、同様の結果が得られた。ＰＢＳコントロールにおけるＡβ４２レベルの中央値は１６２４ｎｇ／ｇであった。ＡＮ１７９２プラスＣＦＡ／ＩＦＡ、ＡＮ１７９２プラスミョウバン、ＡＮ１７９２プラスＭＰＬおよびＡＮ１７９２プラスＱＳ２１で処置したマウスで著しく抑制された中央値が観察され、それぞれ４０３、１１４９、６２０、および７１４であり、ＡＮ１７９２プラスＣＦＡ／ＩＦＡ処置グループでは統計学的に有意な（ｐ＝０．０５）抑制であった。ＡＮ１７９２プラスチメロサールで処置したマウスでの中央値は、１６１９ｎｇ／ｇのＡβ４２であった。
【０１９３】
（Ｘ．毒性分析）
実施例２、３および７で記載したように、研究終了時に組織病理学的調査のために組織を採取した。さらに、血液学的、および臨床化学的検査を、実施例３および７由来の最終の血液試料で行った。脳、肺、リンパ節、胃腸、肝、腎、副腎および生殖巣を含むほとんどの主要な臓器を評価した。研究動物において散発的な病変が観察されたが、影響を受けた組織または病変の重症度のいずれにおいても、ＡＮ１７９２で処置された動物と未処置の動物の間で明らかな違いは見られなかった。ＰＢＳで処置した、または未処置の動物と比べて、ＡＮ１７９２で免疫した動物において独特な組織病理学的病変は見られなかった。実施例７において、アジュバントグループおよびＰＢＳ処置グループ間で、臨床化学的プロファイルにおいても違いは見られなかった。実施例７において、ＰＢＳ処置動物に比べてＡＮ１７９２とフロイントアジュバントで処置した動物との間で、いくつかの血液学的パラメーターが有意に上昇していたが、この種の影響はフロイントアジュバント処置およびそれに伴う腹膜炎から予想され、ＡＮ１７９２処置による副作用を示すものではない。毒性評価の一部分ではないが、ＰＤＡＰＰマウスの脳の病変を有効性のエンドポイントの一部として広範囲に調査した。どの研究においても、脳形態学において処置に関連する有害作用の徴候は見られなかった。これらの結果はＡＮ１７９２による処置は、十分耐用性があり、少なくとも実質的に副作用がないことを示している。
【０１９４】
（ＸＩ．被験体における予防および治療）
安全性を決定するために単回投与の第１相試験を行う。治療薬を、投与量を増やしながら異なった患者に投与する。有効性が推定されるレベルの約０．０１から始めて、マウスで有効な投与量の約１０倍のレベルに達するまで３倍ずつ増加させる。
【０１９５】
治療的効果を決定するために第２相試験を行う。Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａ
ｓｅ ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ ＤｉｓｏｒｄｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＲＤＡ）基準を用いて推定（ｐｒｏｂａｂｌｅ）ＡＤと定義される初期から中期のアルツハイマー病患者を選択する。適当な患者はＭｉｎｉ−ＭｅｎｔａｌＳｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳ
Ｅ）の点数が１２−２６点の範囲である。他の選択基準は患者が試験期間中生存する可能性が高く、干渉し得る併用薬の使用のような複雑な問題がないことである。患者の機能の基準となる評価は、ＭＭＳＥ、およびＡＤＡＳのような伝統的な精神測定法を用いて行う。ＡＤＡＳはアルツハイマー病患者の状態および機能を評価する総合的な指標である。これらの精神測定の指標は、アルツハイマー状態の進行の測定法を提供する。適当な生活の質の指標も処置をモニターするために使用し得る。疾患の進行はＭＲＩによってもモニターし得る。免疫原特異的抗体およびＴ細胞応答のアッセイを含む患者の血液プロファイルも観察し得る。
【０１９６】
基準の測定の後、患者の処置を始める。患者を無作為に分けて、治療薬またはプラセボのどちらかで盲検法で治療する。患者を少なくとも６ヶ月ごとに観察する。プラセボグループに対する治療グループの有意な進行の抑制によって、有効性を決定する。
【０１９７】
加齢に伴う記憶障害（ＡＡＭＩ）と時折、呼ばれる非アルツハイマー病の初期の記憶喪失から、ＡＤＲＤＡ基準によって定義される推定（ｐｒｏｂａｂｌｅ）アルツハイマー病への患者の移行を評価するために、２つ目の第２相試験を行う。記憶喪失の初期の徴候または前アルツハイマー病の総合的症状に伴う他の困難、アルツハイマー病の家族歴、遺伝的危険因子、年齢、性別およびアルツハイマー病の高いリスクを予想することがわかっている他の特徴について、参考（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）集団をスクリーニングすることによって、アルツハイマー病へ移行する高いリスクを持つ患者を、非臨床集団から選択する。より正常な集団を評価するために設計した、他の測定基準と共にＭＭＳＥおよびＡＤＡＳを含む適当な測定基準の基準となる点数を集める。これらの患者集団を、プラセボと薬剤の代替の投与を比較する適当なグループに分ける。これらの患者集団を約６ヶ月ごとに追跡する。それぞれの患者のエンドポイントは、患者が観察終了時にＡＤＲＤＡ基準で定義される推定アルツハイマー病に移行したかどうかである。
【０１９８】
（ＸＩＩ．一般的な材料および方法）
（１．抗体力価の測定）
マウスを、尾静脈を小さく切開して採血し、そして約２００μｌの血液を微量遠心チューブに採取した。モルモットを、まず後足のかかと部分の毛を剃り、次いで、１８ゲージの針で中足静脈を切開して採血し、血液を微量遠心チューブに採取した。血液を室温（ＲＴ）で１時間凝固させ、ボルテックスして、次に１４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、血清から血餅を分離した。次に、血清を清潔な微量遠心チューブに移して、力価を測定するまで４℃で保存した。
【０１９９】
抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルマイクロタイタープレート（ＣｏｓｔａｒＥＩＡ ｐｌａｔｅｓ）を、個々の報告の各々で述べたように、ＷｅｌｌＣｏａ
ｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５、０．１％アジ化ナト
リウム）中の１０μｇ／ｍｌのＡβ４２またはＳＡＰＰまたは他の抗原のいずれかを含む１００μｌの溶液でコートし、室温で一晩置いた。ウェルを吸引して、ＳｐｅｃｉｍｅｎＤｉｌｕｅｎｔ（０．０１４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．６％ウシ血清アルブミン、０．０５％チメロサール）中の１／１００の希釈から始めて、血清をウェルに加えた。７つの連続した試料の希釈液を、３倍ずつ最終的には１／２１８，７００の希釈になるようにプレート中で直接作製した。コートしたプレートウェル中で、希釈液を室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。２次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化したヤギ抗マウスＩｇ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから入手）を、Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ中、１／３０００希釈の１００μｌとしてウェルに加え、室温
で１時間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した
。クロモゲンを発色させるために、Ｓｌｏｗ ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）１００μｌをそれぞれのウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。２５μｌの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えるこ
とによって反応を停止させた。次いで、色の強度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘを用いて（４５０ｎｍ−６５０ｎｍで）読み取った。
【０２００】
力価を、最大ＯＤの半分を与える血清の希釈の逆数として定義した。非常に力価が高い場合を除いて、最大ＯＤは通常最初の１／１００希釈物からとった。その場合、最大ＯＤを確立するためにより高い最初の希釈物が必要であった。５０％の点が２つの希釈の間にある場合、最終的な力価を計算するのに線形外挿を行った。抗体力価の相乗平均を計算するために、１００未満の力価を任意に力価値２５とした。
【０２０１】
（２．リンパ球増殖アッセイ）
マウスをイソフルランで麻酔した。脾臓を取り出し、１０％の熱非働化ウシ胎仔血清を
含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＢＳ）５ｍｌで２回リンスし、次に１．５ｍｌのＰＢＳ−ＦＢＳ中の５０μのＣｅｎｔｒｉｃｏｎユニット（ＤａｋｏＡ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で、Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ（Ｄａｋｏ）を用いて１００ｒｐｍ、１０秒間ホモジナイズした。次に１００μサイズの孔を持つナイロンメッシュで濾過した。脾臓細胞を１５ｍｌのＰＢＳ−ＦＢＳで１回洗浄し、次いで、２００×ｇで５分間遠心分離してペレット化した。ペレットを０．１５ＭＮＨ4Ｃｌ、１Ｍ ＫＨＣＯ3、０．１Ｍ ＮａＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍＬに、室温で５分間再懸濁することにより赤血球を溶解した。次に、白血球を上記のように洗浄した。新しく単離した脾臓細胞（ウェルあたり１０5細胞）を３組
、９６ウェルＵ底組織培養用処理マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上で、２．０５ｍＭＬグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％熱非働化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）中で、３７℃、９６時間培養した。様々なＡβペプチド、Ａβ１−１６、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、またはＡβ４０−１逆向き配列タンパク質もまた、５μＭから０．１８μＭの範囲の投与量で、４段階で加えた。コントロールウェルの細胞は、タンパク質を加えずにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ｃ−５２７５、１μｇ／ｍｌ）とともに培養した。細胞を最後の２４時間3
Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬから入手）でパルスした。次に細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒプレートに回収し、Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏ
ｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＤｏｗｎｅｒｓＧｒｏｖｅ、Ｉ
Ｌ）でカウントした。結果は不溶性の高分子に組み込まれた放射活性の1分あたりのカウ
ント（ｃｐｍ）として表す。
【０２０２】
（４．脳組織の調製）
安楽死させた後、脳を取り出し一方の半球を免疫組織化学的分析のために調製し、他方の半球から３つの脳の領域（海馬、皮質および小脳）を分離して、様々なＡβタンパク質の濃度およびＡＰＰの形を特異的なＥＬＩＳＡを用いて測定するのに使用した（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、前出）。
【０２０３】
ＥＬＩＳＡに使用する組織を、１０容量の氷冷グアニジン緩衝液（５．０Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中でホモジナイズした。ホモジネートをＡｄａｍｓＮｕｔａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて室温で３から４時間、静かに攪拌して混合し、次にＡβおよびＡＰＰを定量する前に−２０℃で保存した。以前の実験で分析物はこの保存条件で安定であり、そしてマウス同腹仔由来のコントロール脳組織のホモジネートに加えた場合、合成Ａβタンパク質（Ｂａｃｈｅｍ）を定量的に回収し得ることが示された（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、前出）。
【０２０４】
（５．Ａβレベルの測定）
脳ホモジネートを氷冷Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ（０．２５％カゼイン、ＰＢＳ、
０．０５％アジ化ナトリウム、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１０μｇ／ｍｌロイペプチン）で１：１０に希釈し、次に１６，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。合成Ａβタンパク質標準物質（１−４２アミノ酸）およびＡＰＰ標準物質を、最終的な組成物中に０．５Ｍグアニジンおよび０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むように調製した。「全」ＡβのサンドイッチＥＬＩＳＡは、Ａβの１３−２８アミノ酸に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡβ）２６６（Ｓｅｕｂｅｒｔら）を捕獲抗体として利用し、Ａβの１−５アミノ酸に特異的なビオチン化ｍＡβ ３Ｄ６（
Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら）をリポーター抗体として利用する。３Ｄ６ｍＡβは分泌されたＡＰＰまたは全長のＡＰＰを認識せず、アミノ末端のアスパラギン酸を持つＡβ種のみを検出する。このアッセイの感受性の下限は、約５０ρｇ／ｍｌ（１１ρＭ）であり、そして１ｎｇ／ｍｌまでの濃度では内因性のマウスＡβタンパク質に交差反応性を示さな
い（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、前出）。
【０２０５】
Ａβ１−４２特異的サンドイッチＥＬＩＳＡは、Ａβの３３−４２アミノ酸に特異的なｍＡβ ２１Ｆ１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら）を捕獲抗体として利用する。このア
ッセイでもビオチン化ｍＡβ ３Ｄ６がリポーター抗体であり、このアッセイの感受性の
下限は約１２５ρｇ／ｍｌ（２８ρＭ、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら）である。ＡβのＥＬＩＳＡについては、１００μｌのｍＡβ ２６６（１０μｇ／ｍｌ）またはｍＡβ ２１Ｆ１２（５μｇ／ｍｌ）のどちらかを、９６ウェルイムノアッセイプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）のウェルに、室温で一晩インキュベートすることによりコートした。溶液を吸引して除去し、ウェルをＰＢＳ緩衝液中２００μｌの０．２５％ヒト血清アルブミンを室温で少なくとも１時間加えることによりブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、使用するまでプレートを乾燥して４℃で保存した。プレートをＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ[Ｔｒｉｓ
緩衝化生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）、プラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０]で使用前に再水和した。試料および標準物質を３連で、ウェルあたり１００μｌのアリコートで加え、次に４℃で一晩インキュベートした。アッセイのそれぞれの段階の間に、プレートをＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで少なくとも３回洗浄した。Ｃａｓｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（０．２５％カゼイン、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）で０．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化ｍＡβ ３Ｄ６を加え、室温で１時間、ウェル中でインキュベートした。ＣａｓｅｉｎＡｓｓａｙ 
Ｂｕｆｆｅｒで１：４０００に希釈したアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから入手したアビジン−ＨＲＰ）を室温で１時間、ウェルに加えた。比色定量基質であるＳｌｏｗＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、そして室温で１５分間反応させた。その後、酵素反応を２５μｌの２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えることにより停止させた。反応生成物を、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍでの吸
収の差を測定するＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘを用いて定量した。
【０２０６】
（６．ＡＰＰレベルの測定）
２つの異なったＡＰＰアッセイを利用した。ＡＰＰ−α／ＦＬと呼ばれる第１のアッセイは、ＡＰＰ−アルファ（α）および全長（ＦＬ）の形のＡＰＰの両方を認識する。２つ目のアッセイはＡＰＰ−αに特異的である。ＡＰＰ−α／ＦＬアッセイは、Ａβの最初の１２アミノ酸を含む分泌ＡＰＰを認識する。リポーター抗体（２Ｈ３）は、ＡＰＰ６９５のアミノ酸６１２−６１３の間で起こるα切断部位（ｃｌｉｐ−ｓｉｔｅ）に特異的でない（Ｅｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８、１１２２−１１２４（１９９０））ので、このアッセイは全長ＡＰＰ（ＡＰＰ−ＦＬ）もまた認識する。ＡＰＰ−ＦＬの細胞質側尾部に対する固定化ＡＰＰ抗体を用いて、脳ホモジネートからＡＰＰ−ＦＬを涸渇させる予備実験は、ＡＰＰ−α／ＦＬ ＡＰＰの約３０−４０％がＦＬであることを示唆している（デ
ータは示していない）。ＡＰＰ−α／ＦＬおよびＡＰＰ−αアッセイの両方に対する捕獲抗体は、ＡＰＰ６９５形態のアミノ酸４４４から５９２に対して惹起されたｍＡβ ８Ｅ
５（Ｇａｍｅｓら、前出）である。ＡＰＰ−α／ＦＬアッセイについてのリポーターｍＡβは、ＡＰＰ６９５のアミノ酸５９７から６０８に特異的なｍＡβ ２Ｈ３（Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ−Ｗｏｏｄら、前出）であり、ＡＰＰ−αアッセイについてのリポーター抗体はＡＰＰのアミノ酸６０５から６１１に対して惹起されたｍＡβ １６Ｈ９のビオチン化誘導体
である。ＡＰＰ−α／ＦＬアッセイの感受性の下限は約１１ｎｇ／ｍｌ（１５０ρＭ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら）であり、そしてＡＰＰ−α特異的アッセイの感受性の下限は２２ｎｇ／ｍｌ（０．３ｎＭ）である。どちらのＡＰＰアッセイでも、ｍＡβ ２６６
に関して上記で述べたように、ｍＡβ ８Ｅ５を９６ウェルＥＩＡプレートのウェルにコ
ートした。精製した組換え分泌ＡＰＰ−αを、ＡＰＰ−αアッセイおよびＡＰＰ−α／ＦＬアッセイの参照標準物質として使用した（Ｅｓｃｈら、前出）。５Ｍグアニジン中の脳ホモジネート試料をＥＬＩＳＡＳｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ（０．０１４Ｍリン酸
緩衝液、ｐＨ７．４、０．６％ウシ血清アルブミン、０．０５％チメロサール、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％ ＮＰ４０）中で１：１０に希釈した。それらを次に０．５Ｍグアニジンを含むＳｐｅｃｉｍｅｎＤｉｌｕｅｎｔ中で１：４に希釈した。次いで、希釈したホモジネートを１６，０００×ｇで１５秒間、室温で遠心分離した。ＡＰＰ標準物質および試料を、２連のアリコートでプレートに加え、室温で１．５時間インキュベートした。ビオチン化リポーター抗体２Ｈ３または１６Ｈ９を試料と共に室温で１時間インキュベートした。試料希釈液で１：１０００に希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）をウェル中で、室温で１時間インキュベートした。蛍光基質４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを加えて室温で３０分間インキュベートし、そしてＣｙｔｏｆｌｕｏｒｔｍ ２３５０蛍光計（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）を用いて３６５ｎｍの励起および４５０ｎｍの発光でプレートを読み出した。
【０２０７】
（７．免疫組織化学）
脳をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで、４℃で３日間固定し、次いで、切片にするまでにＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで、４℃で１〜７日間保存した。４０ミクロンの厚さの、冠状切片を室温でビブラトームを用いて切断し、免疫組織化学的処理の前に凍結防止剤（リン酸緩衝液中３０％グリセロール、３０％エチレングリコール）中、−２０℃で保存した。それぞれの脳について、背側海馬のレベルでの６つの切片（それぞれ連続する２４０μｍの間隔で分離した）を、以下の抗体：（１）ＰＢＳおよび１％ウマ血清中で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈した、ビオチン化抗Ａβ（ｍＡβ、３Ｄ６、ヒトＡβに特異的）、または（２）ＰＢＳおよび１．０％ウマ血清中で３μｇ／ｍｌの濃度に希釈した、ヒトＡＰＰに特異的なビオチン化ｍＡβ、８Ｅ５、または（３）Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）中で、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１％ウマ血清で１：５００に希釈した、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に特異的なｍＡβ、または（４）ＴＢＳ中で、０．２５％Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００および１％ウサギ血清で１：１００に希釈した、ＭＡＣ−１抗原ＣＤ
１１ｂ（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に特異的なｍＡβ、または（５）ＴＢＳ中で、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１％ウサギ血清で１：１００
に希釈したＭＨＣ ＩＩ抗原（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的なｍＡβ、または（６）
ＰＢＳ中１％ウサギ血清で１：１００に希釈したＣＤ４３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的なラットｍＡβ、または（７）ＰＢＳ中１％ウサギ血清で１：１００に希釈したＣＤ４５ＲＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的なラットｍＡβ、または（８）ＰＢＳ中１％ウサギ血清で１：１００に希釈したＣＤ４５ＲＢ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的なラットモノクローナルＡβ、または（９）ＰＢＳ中１％ウサギ血清で１：１００に希釈したＣＤ４５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的なラットモノクローナルＡβ、または（１０）ＰＢＳ中１％ウサギ血清で１：１００に希釈したＣＤ３ｅ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的なビオチン化ポリクローナルハムスターＡβ、または（１１）ＰＢＳ中１％ウサギ血清で１：２００に希釈したＣＤ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ）に特異的なラットｍＡβ、または（１２）１％正常ウマ血清を含む、一次抗体を含まないＰＢＳ溶液、の１つとともに一晩インキュベートした。
【０２０８】
上記の１、２および６−１２に列挙した抗体溶液と反応させた切片を、内因性のペルオキシダーゼをブロッキングするために、ＰＢＳ中の１．０％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、０．４％過酸化水素で、室温で２０分間前処理した。それらを次に一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。３Ｄ６または８Ｅ５またはＣＤ３ｅｍＡβと反応させた切片を次に、ＰＢＳ中で１：７５に希釈したキット成分「Ａ」および「Ｂ」を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン−複合体と室温で１時間反応させた（ＶｅｃｔｏｒＥｌｉｔｅ ＳｔａｎｄａｒｄＫｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５、ＣＤ３に特異的な抗体および一次抗体が存在しないＰＢＳ溶液と反応させた切片を、それぞれＰＢＳ中で１：７５に希釈したビオチン化抗ラットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、またはＰＢＳ中で１：７５に希釈したビオチン
化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）と、室温で１時間インキュベートした。切片を次に、ＰＢＳ中で１：７５に希釈したキット成分「Ａ」および「Ｂ」を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン−複合体と室温で１時間反応させた（ＶｅｃｔｏｒＥｌｉｔｅ ＳｔａｎｄａｒｄＫｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）。
【０２０９】
切片を０．０１％過酸化水素、０．０５％３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で、室温で発色させた。ＧＦＡＰ−、ＭＡＣ−１−、およびＭＨＣＩＩ−特異的抗体とインキュベーションするために脱色させた切片を、内因性のペルオキシダーゼをブロッキングするために、室温で０．６％過酸化水素を用いて前処理し、次に４℃で一次抗体と一晩インキュベートした。ＧＦＡＰ抗体と反応させた切片を、ＴＢＳで１：２００に希釈したウマで作製したビオチン化抗マウスＩｇＧ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣＫｉｔ）と、室温で１時間インキュベートした。切片を次に、ＴＢＳで１：１０００に希釈したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣＫｉｔ）と、１時間反応させた。一次抗体としてＭＡＣ−１−またはＭＨＣ ＩＩ−特
異的ｍＡβとインキュベートした切片を次に、ＴＢＳで１：２００に希釈したウサギで作製したビオチン化抗ラットＩｇＧと、室温で１時間反応させ、次にＴＢＳで１：１０００に希釈したアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体と１時間インキュベートした。ＧＦＡＰ−、ＭＡＣ−１−、およびＭＨＣＩＩ−特異的抗体とインキュベートした切片を次に、０．０５％ ＤＡＢ、０．０１％過酸化水素、０．０４％塩化ニッケル、ＴＢＳで
、室温でそれぞれ４分間および１１分間処理することにより視覚化した。
【０２１０】
免疫標識した切片をガラススライド（ＶＷＲ、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔｓｌｉｄｅｓ）にマウントし、一晩空気乾燥し、Ｐｒｏｐａｒ（Ａｎａｔｅｃｈ）に浸して、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）をマウント用媒体として使用して、カバーグラスで覆った。
【０２１１】
Ａβプラークを対比染色するために、ＧＦＡＰ陽性切片のサブセットをＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドにマウントし、免疫組織化学的処理の後で１％チオフラビンＳ（Ｓｉｇｍａ）水溶液中で７分間インキュベートした。切片を次に脱水しＰｒｏｐａｒ中で清澄にし、次にＰｅｒｍｏｕｎｔでマウントしてカバーグラスで覆った。
【０２１２】
（８．画像分析）
ＣＣＤビデオカメラおよびＳｏｎｙ Ｔｒｉｎｉｔｒｏｎモニターを通してＮｉｋｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸ顕微鏡と連結したＶｉｄｅｏｍｅｔｒｉｃ １５０ ＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、
ＭＤ）を、免疫反応性のスライドグラスの定量に使用した。切片の画像をビデオバッファーに保存し、色調および彩度を基礎とした閾値を決定し、免疫標識された構造によって占められた全画素領域（ｐｉｘｅｌａｒｅａ）を選択し、計算した。それぞれの切片について、海馬は手動で輪郭を描き、海馬によって占められる全画素領域を計算した。アミロイド負荷のパーセントを次のように測定した：（ｍＡβ ３Ｄ６に免疫反応性のＡβ沈着を
含む海馬領域の割合）×１００。同様に、神経炎負荷のパーセントを次のように測定した：（ｍＡβ ８Ｅ５に反応性のジストロフィーの軸索を含む海馬領域の割合）×１００。
Ｓｉｍｐｌｅ ３２ ＳｏｆｔｗａｒｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎプログラムを作動させるＣ−Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｍｐｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｃｒａｎｂｅｒｒｙ Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＰＡ）を、Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓカメラを通してＮｉｋｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｈ
ｏｔ−ＦＸ顕微鏡に連結し、ＧＦＡＰ−陽性星状細胞ならびにＭＡＣ−１−およびＭＨＣＩＩ−陽性小グリア細胞によって占められる後方板状回の（ｒｅｔｒｏｓｐｅｎｉａｌ）皮質のパーセントを定量するのに使用した。免疫反応させた切片の画像をビデオバッファーに保存し、単色を基礎とした閾値を決定し、免疫標識された細胞によって占められた全
画素領域を選択し、計算した。それぞれの切片について、後方板状回の（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ）皮質（ＲＳＣ）は手動で輪郭を描き、ＲＳＣによって占められる全画素領域を計算した。星状細胞のパーセントは次のように定義した：（ＧＦＡＰ−反応性星状細胞に占められるＲＳＣの割合）×１００。同様に、小グリア細胞のパーセントを次のように定義した：（ＭＡＣ−１−またはＭＨＣＩＩ−反応性小グリア細胞に占められるＲＳＣの割合）×１００。全ての画像分析について、背側海馬のレベルでの６つの切片（それぞれ連続して２４０μｍの間隔で分離された）を、それぞれの動物で定量した。全ての場合で動物の処置状態は観測者には未知であった。
【０２１３】
理解を明快にするために前述の発明は詳しく述べられているが、特定の変更が添付の請求の範囲内で行われ得ることは明らかである。本明細書中で引用した全ての刊行物および特許書類は、引用することにより、全ての目的のために、それぞれが個々に示されたように同程度、その全体が本明細書内容となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【配列表】
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