(57)【要約】      （修正有）【課題】補体因子Ｃｌｑに結合しない抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その医薬組成物の提供。【解決手段】抗ＯＸ４０Ｌ抗体、特にヒト起源に由来するＦｃ部分を含有しそして補体因子Ｃ１ｑに結合しない抗ＯＸ４０Ｌ抗体およびその変異体。これらの抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ヒトサブクラスＩｇＧ４であり、重鎖における突然変異Ｓ２２８Ｐを含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＸ４０Ｌに結合し、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含有しそして補体因子Ｃ１ｑに結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ヒト抗体であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、１０−８Ｍ未満のＫＤ値でＯＸ４０Ｌに結合する、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
ＫＤの範囲が１０−１２〜１０−９Ｍである、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ＰＶＡ２３６、ＧＬＰＳＳ３３１および／またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＥＵインデックスに従う番号付け）からの１つ以上の突然変異を含むヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
突然変異Ｓ２２８Ｐを含有することを特徴とする、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
突然変異Ｌ２３５Ｅを含有することを特徴とする、請求項８または９に記載の抗体。
【請求項１１】
補体因子Ｃ３を活性化しないことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しないことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発しないことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、１ｎＭ〜４ｎＭの範囲のＩＣ５０値で０．５μｇ／ｍｌＯＸ４０Ｌのコーティング濃度で可溶性ＯＸ４０と固定化されたＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロッキングすることにより、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて阻害を示すことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体。
【請求項１５】
抗体であって、該抗体がＯＸ４０Ｌに結合することを特徴とし、そして該抗体が、下記の組合せ、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２により規定された重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号４により規定された重鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号６により規定された重鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号８により規定された重鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０により規定された重鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１１または１６のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１２により規定された重鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインおよび配列番号１７により規定された重鎖（ＶＨ）可変ドメイン、
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９により規定された重鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０により規定された重鎖可変ドメイン、
からなる群より独立に選ばれる可変領域組合せを含むことを特徴とする抗体。
【請求項１６】
ヒト軽鎖可変領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１６および１８からなる群より独立に選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体。
【請求項１７】
ヒト重鎖可変領域が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１７、１９および２０からなる群より独立に選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列により規定される軽鎖可変ドメインおよび配列番号２、１７または２０により規定された重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、補体因子Ｃ１ｑへの非結合を引き起こすＦｃ部分における少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号１３により規定されたκ軽鎖定常領域または配列番号６１、６５もしくは６９の軽鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、配列番号１４または配列番号１５により規定された重定常領域または配列番号５８の重鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の抗体。
【請求項２２】
可変軽鎖および可変重鎖を含む、ＯＸ４０Ｌに結合する抗体であって、該可変重鎖が配列番号３３〜３８から選ばれるＣＤＲ３を含むこと、および／または該可変軽鎖が、配列番号５１〜５７から選ばれるＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗体。
【請求項２３】
可変重鎖が、配列番号２１〜２５から選ばれるＣＤＲ１および配列番号２６〜３２から選ばれるＣＤＲ２を含むこと、および／または可変軽鎖が、配列番号３９〜４４から選ばれるＣＤＲ１および配列番号４５〜５０から選ばれるＣＤＲ２を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
細胞系、
ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．００１、
ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．００５、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０１０、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０１９、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０２９、およびｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０３３
からなる群より選ばれる細胞系により産生されることを特徴とする抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、または一本鎖フラグメントであることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体。
【請求項２６】
請求項１〜２５に記載の抗体の産生方法であって、１０−８Ｍ未満のＫＤ値でＯＸ４０Ｌに結合する抗体の重鎖をコードする第１核酸の配列を、改変された抗体が補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しないような方式で改変し、該改変された第１核酸および該抗体の軽鎖をコードする第２核酸を発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物宿主細胞もしくは真核生物宿主細胞に挿入し、該宿主細胞を該抗体の合成を可能とする条件下に培養し、そして該抗体をこの培養物から回収することを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記抗体の重鎖をコードする前記第１核酸の配列が、請求項２２に記載の抗体の重鎖をコードすることを特徴とする、請求項２６に記載の抗体の産生方法。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれかの抗体分子をコードする核酸分子。
【請求項２９】
請求項２８の核酸分子を含むベクター。
【請求項３０】
請求項２９のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１２〜２５のいずれかに記載の抗体分子の製造方法であって、該抗体分子の合成を可能とする条件下に請求項３０の宿主細胞を培養し、そして該抗体分子をこの培養物から回収することを含む方法。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体分子又は請求項２６もしくは２７の方法により産生された抗体分子を含む組成物。
【請求項３３】
医薬組成物又は診断組成物である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜２５のいずれかの抗体と少なくとも１種の薬学的に許容されうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３５】
治療を必要としている患者に、治療的に有効量の請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体を投与することを特徴とする、治療を必要としている患者の処置方法。
【請求項３６】
治療のための請求項１〜２３に記載の抗体の使用。
【請求項３７】
炎症性疾患の予防及び処置のための請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項３８】
炎症性疾患の予防及び処置用の医薬の製造のための請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項３９】
請求項１〜２５のいずれかの抗体分子、請求項２８の核酸分子、請求項２９のベクターまたは請求項３０の宿主細胞を含むキット。
【請求項４０】
配列番号２１〜３８からなる群より選ばれる親抗体重鎖ＣＤＲおよび／または配列番号３９〜５７からなる群より選ばれる親抗体軽鎖ＣＤＲの最初のアミノ酸配列を改変する方法であって、該最初のアミノ酸配列をコードする核酸を提供し、１つのアミノ酸が重鎖ＣＤＲ１において改変され、１〜２つのアミノ酸が重鎖ＣＤＲ２において改変され、１〜２つのアミノ酸が重鎖ＣＤＲ3において改変され、１〜３つのアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ１において改変され、１〜３つのアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ２において改変されおよび／または１〜３つのアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ３において改変されるように、該核酸を改変し、該改変されたＣＤＲアミノ酸配列を抗体構造において発現し、該抗体が１０−８Ｍ未満のＫＤでＯＸ４０Ｌに結合するかどうかを測定し、そしてもしも該抗体が１０−８Ｍ未満のＫＤでＯＸ４０Ｌに結合するならば、該改変されたＣＤＲを選ぶことを特徴とする方法。
【請求項４１】
抗体であって、該抗体がＯＸ４０Ｌに結合し、ヒトＩｇＧ1クラスでありそしてγ重鎖として配列番号５８、６２又は６６を含むことを特徴とする抗体。
【請求項４２】
ａ）γ重鎖として配列番号５８およびκ軽鎖として配列番号６１、
ｂ）γ重鎖として配列番号６２およびκ軽鎖として配列番号６５、または
ｃ）γ重鎖として配列番号６６およびκ軽鎖として配列番号６９、
を含む請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
抗体であって、該抗体が、ＯＸ４０Ｌに結合し、突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含有するＩｇＧ１クラスであり、そしてγ重鎖として配列番号５９、６３または６７を含むことを特徴とする抗体。
【請求項４４】
ａ）γ重鎖として配列番号５９およびκ軽鎖として配列番号６１、
ｂ）γ重鎖として配列番号６３およびκ軽鎖として配列番号６５、または
ｃ）γ重鎖として配列番号６７およびκ軽鎖として配列番号６９、
を含む、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４５】
抗体であって、該抗体が、ＯＸ４０Ｌに結合し、突然変異Ｓ２２８Ｐを含有するＩｇＧ４クラスであり、そしてγ重鎖として配列番号６０、６４または６８を含むことを特徴とする抗体。
【請求項４６】
ａ）γ重鎖として配列番号６０およびκ軽鎖として配列番号６１、
ｂ）γ重鎖として配列番号６４およびκ軽鎖として配列番号６５、または
ｃ）γ重鎖として配列番号６８およびκ軽鎖として配列番号６９、
を含む、請求項４５に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、特に、補体因子Ｃｌｑに結合しない抗ＯＸ４０Ｌ抗体、その医薬組成物および使用に関する。好ましくは、これらの抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
【０００２】
ヒトＯＸ４０Ｌ（gp34、SwissProt P23510）は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌライゲーションすると活性化されたＢ細胞および樹状細胞に発現されそして炎症性組織において内皮細胞に発現される（Review: Weinberg, A.D., Trends Immunol. 23(2002)102-109）。それは、ＨＴＬＶ−１感染したヒト白血病細胞（ＯＸ４０を有するオートクリンループの発生によりこれらのＴ細胞の不死化）から単離された。ＯＸ４０Ｌおよび対する抗体は、例えば、WO 95/12673; WO 95/21915; WO 99/15200; Baum, P.R., et al., EMBO J. 13(1994)3992-4001; Imura, A., et al., Blood 89(1997)2951-2958; Imura, A., et al., J. Exp.Med. 183(1996)2185-2195; Kjaergaard, J., et al., I. Immunol. 167(2001)6669-6677; Lane, P., J.Exp. Med. 191(2000)201-206; Mallett, S., and Barclay, A. N., Immunol. Today 12(1991)220-223; Mallett, S., et al., EMBO J. 9(1990)1063-1068; Ndhlovu, L.C., et al., J.Immunol. 167(2001)2991-2999; Ohshima, Y., et al., J.Immunol. 159(1997)3838-3848; Rogers, P.R., et al., Immunity 15(2001)445-455; Stueber, E., and Strober, W., J. Exp.Med. 183(1996)979-989; Stueber, E., et al., Gastroenterology 115(1998)1205-1215; Takahashi, Y., et al., J.Virol. 75(2001)6748-6757; Takasawa, N., et al., Jpn. J.Cancer Res. 92(2001)377-382; Taylor, L., and Schwarz, H., J.Immunol. Meth. 255(2001)67-72; Weinberg, A.D., et al., Nature Medicine 2(1996) 183-189; Weinberg, A.D., et al., Semin. Immunol. 10(1998) 471-480; Weinberg, A.D., Trends Immunol. 23(2002) 102-109; Wu, T., et al., Transplant. Proc. 33(2001) 217-218; Higgins, L.M., et al., J. Immunol. 162(1999) 486-493; and Yoshioka, T., et al., Eur. J. Immunol. 30(2000) 2815-2823）に記載されている。ヒトＯＸ４０Ｌは、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上に一過性に発現されるヒトＯＸ４０（ＣＤ１３４）に対するリガンドである。そのリガンドによるＯＸ４０のエンゲージメントは、Ｔ細胞活性化のための共刺激性シグナルをもたらす。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用は、両方向性シグナルを創り出すことが記載されている（Matsumura, Y., et al., J. Immunol. 163(1999) 3007-3011; Kotani, A., et al., Immunol. Lett. 84(2002) 1-7）。さらにＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用は、炎症性組織における内皮細胞への活性化されたＴ細胞の付着を媒介する。ＯＸ４０Ｌは、活性化されたＢ細胞、ＤＣおよび内皮細胞上に一過性にのみ発現されるので、ＯＸ４０Ｌに対する抗体は炎症性応答期間中Ｔ細胞活性化および内皮細胞付着を選択的にブロッキングするであろうが、不活性化されていない末梢Ｔ細胞を変化させない。Yoshioka, A等（Eur. J. Immunol. 30(2000)2815-2823）は、慢性関節リウマチのマウスモデルにおける中和性抗ｍＯＸ４０Ｌ  mAｂの治療的潜在力を証明した。その投与は、疾患の重度を劇的に軽減した。この抗体は、他の関連した疾患モデル、例えば、炎症性皮膚疾患、実験的自己免疫疾患（ＥＡＥ）、ＧＶＨＤ、尿炎症性腸疾患における同様な活性を示した（Yoshioka, A., et al., Eur. J. Immunol 30(1999) 2815-2823; Salek-Ardakani, S., et al., J.Exp.Med. 198(2003) 315-324; Burgess, J.K., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 113(2004) 683-689; Hoshino, A., et al., Eur. J. Immunol. 33(2003) 861-869; Arestides, R.S., et al., Eur. J. Immunol. 32(2002) 2874-2880; Nohara, C., et al., J. Immunol. 166(2001) 2108-2115; Weinberg, A. D., et al., J. Immunol. 162(1999)1818-1826; Higgins, L.M., et al., J. Immunol. 162(1999) 486-493 ; Humphreys, I.R., et al., J.Exp.Med. 198(2003) 1237-1242; Akiba, H. et al., J.Exp. Med. 191(2003) 375-380; Ishii, N., et al., Eur. J. Immunol. 33(2003) 2372-2381; Blazar, B. R., et al., Blood 101(2003) 3741-3748; Tsukada, N., et al., Blood 95(2000) 2434-2439; Akiba, H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 251(1998) 131-136。
【０００３】
ＯＸ４０Ｌに対する抗体は種々の疾患モデルにおけるそれらの抗炎症性効果について調べられた（Sugamura, K., et al., Nat. Rev. Immunol;. 4(2004)420-431）。
【０００４】
Tanaka, Y., et al, Int. J. Cancer 36, (1985)549-555; Tozawa, H., et al., Int. J. Cancer 41(1998)231-238; and Miura, S., et al., Mol. Cell. Biol. 11(1991) 1313-1325は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を有するヒトリンパ球の系統の表面抗原と反応するＴＡＲＭ−３４およびＴＡＧ−３４と名づけられたマウスモノクローナル抗体を記載している。ＴＡＧ−３４抗体は、MBL International Corporationから市販されている。ＴＡＧ−３４はＯＸ４０Ｌにも結合する。
【０００５】
本発明の要約
本発明は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、該抗体は、ＯＸ４０Ｌに結合し、ヒト起源のＦｃ部分を含有しそしてヒト補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しないことを特徴とする抗体、好ましくはモノクローナル抗体に関する。
【０００６】
本発明は、更に、抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、該抗体は、ヒト起源のＦｃ部分を含有し、１００ngの抗体濃度でＯＸ４０Ｌに結合しそして変性されたＯＸ４０Ｌに結合する（ウエスタンブロットにおいて）ことを特徴とする抗体、好ましくはモノクローナル抗体に関する。この抗体は、モノクローナル抗体ＬＣ．００１が結合するエピトープと同じＯＸ４０Ｌポリペプチドエピトープに結合する。このような抗体は、例えば、ＬＣ．００１、ＬＣ．０３３およびＬＣ．０６０である。これらの抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ１型（野生型）であるか、またはヒト補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しない。
【０００７】
本発明は、さらに可変軽鎖および可変重鎖を含むことを特徴とし、該可変重鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことを特徴とし、該ＣＤＲ３は配列番号３３〜３８から選ばれることを特徴とするＯＸ４０Ｌに結合する抗体に関する。ＣＤＲ１が配列番号２１〜２５から選ばれ、ＣＤＲ２が配列番号２６〜３２から選ばれそしてＣＤＲ３が配列番号３３〜３８から選ばれることは特に好ましい。
【０００８】
本発明に従う抗体は、好ましくは、可変軽鎖および可変重鎖を含むことを特徴とし、該可変軽鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことを特徴とし、該ＣＤＲ３は配列番号５１〜５７から選ばれることを特徴とする。ＣＤＲ１が配列番号３９〜４４から選ばれ、ＣＤＲ２が配列番号４５〜５０から選ばれそしてＣＤＲ３が配列番号５１〜５７から選ばれることが特に好ましい。
【０００９】
本発明に従う抗体は、好ましくは、可変重鎖および可変軽鎖を含むことを特徴とし、該可変重鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことを特徴とし、重鎖のＣＤＲ３は配列番号３３〜３８から選ばれそして軽鎖のＣＤＲ３は配列番号５１〜５７から選ばれることを特徴とする。可変重鎖は、配列番号２１〜２５から選ばれるＣＤＲ１、配列番号２６〜３２から選ばれるＣＤＲ２および配列番号３３〜３８から選ばれるＣＤＲ３を含み、そして可変軽鎖は、配列番号３９〜４４から選ばれるＣＤＲ１、配列番号４５〜５０から選ばれるＣＤＲ２および配列番号５１〜５７から選ばれるＣＤＲ３を含むことが特に好ましい。
【００１０】
すべてのＣＤＲｓは互いに独立に、しかし当然のこととして、抗体がＯＸ４０Ｌに結合するような方法で選ばれる。したがって、同じＬＣ抗体の軽鎖及び重鎖のＣＤＲｓを組み合わせることができ、またはＬＣ．００１の軽鎖ＣＤＲｓはＬＣ．００１、ＬＣ．０５９またはＬＣ．０６３の重鎖ＣＤＲｓと組み合わせることができる。各鎖上のＣＤＲｓはフレームワークアミノ酸により分離されている。
【００１１】
本発明に従う抗体は、好ましくは、抗体が、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列の軽鎖（ＶＬ）可変ＣＤＲｓおよび配列番号２の重鎖（ＶH）可変ＣＤＲｓ、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲｓおよび配列番号４の重鎖可変ＣＤＲｓ、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲｓおよび配列番号６の重鎖可変ＣＤＲｓ、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲｓおよび配列番号８の重鎖可変ＣＤＲｓ、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲｓおよび配列番号１０の重鎖可変ＣＤＲｓ、
ｆ）配列番号１１または１６のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲｓおよび配列番号１２の重鎖可変ＣＤＲｓ、
ｇ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインおよび配列番号１７により規定された重鎖（ＶH）可変ドメイン、
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９により規定された重鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０により規定された重鎖可変ドメイン、または
そのＯＸ４０Ｌに結合性のフラグメント
からなる群より独立に選ばれるＣＤＲｓを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明に従う抗体は、好ましくは、該抗体が、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインおよび配列番号２により規定された重鎖（ＶH）可変ドメイン、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号４により規定された重鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号６により規定された重鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号８により規定された重鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０により規定された重鎖可変ドメイン、
ｆ）配列番号１１または１６のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１２により規定された重鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインおよび配列番号１７により規定された重鎖（ＶH）可変ドメイン、
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９により規定された重鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０により規定された重鎖可変ドメイン、
またはそのＯＸ４０Ｌに結合性のフラグメント、
からなる群より独立に選ばれる可変領域を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明に従う抗体は、好ましくは、ヒト軽鎖可変領域が、配列番号１、３、５、７、９、１１，１６および１８からなる群より独立に選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明に従う抗体は、好ましくは、ヒト重鎖可変領域が、配列番号２、４、６、８、１０、１２，１７、１９および２０からなる群より独立に選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【００１５】
重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域は配列番号２１〜３８および３９〜５７に示される。
【００１６】
本発明に従う抗体は、好ましくは、該抗体が配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２、１７または２０により規定された重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明に従う抗体は、好ましくは、ヒト重鎖定常領域が配列番号１４および１５からなる群より独立に選ばれるアミノ酸配列または配列番号５８の重鎖定常領域を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明に従う抗体は、好ましくは、該抗体が配列番号１３のκ軽鎖定常領域または配列番号６１、６５もしくは６９の軽鎖定常領域を含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、本発明に従う抗体は、ＯＸ４０Ｌに結合することおよびヒトＩｇＧ１クラス（野生型）であることにより特徴付けられそしてγ重鎖として配列番号５８、６２または６６を含む。特に好ましいのは、
ａ）γ重鎖として配列番号５８およびκ軽鎖として配列番号６１、
ｂ）γ重鎖として配列番号６２およびκ軽鎖として配列番号６５、または
ｃ）γ重鎖として配列番号６６およびκ軽鎖として配列番号６９、
を含む抗体である。
【００２０】
本発明の更なる態様は、ＯＸ４０Ｌに結合する抗体であって、細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．００１、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．００５、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０１０、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０１９、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０２９、またはｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０３３により産生されることを特徴とする抗体である。
【００２１】
本発明な従う抗体は、好ましくはキメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００２２】
本発明に従う抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０-8Ｍ未満（１０-12〜１０-8Ｍ）のＫD値でＯＸ４０Ｌに結合することにより特徴付けられ、更に好ましくは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０-12〜１０-9ＭのＫD範囲により特徴付けられる。
【００２３】
本発明に従う抗体は、好ましくは、４nM以下のＩＣ５０値で０．５μg/mlのコーティング濃度で固定化されたＯＸ４０Ｌ（好ましくはストレプトアビジン表面に固定化されたビオチニル化ＯＸ４０Ｌ）を使用するＥＬＩＳＡにおいてＯＸ４０ＬのＯＸ４０との相互作用を阻害する。さらに好ましくは、ＩＣ５０値は１〜４nMの範囲にある。
【００２４】
本発明に従う抗体は、好ましくは、補体因子Ｃ１ｑへの抗体の非結合（non-binding）は、Ｃ１ｑに対する１０μg/mlの濃度での抗体の最大結合（Ｂｍａｘ）が抗体ＬＣ．００１のＢｍａｘに比較して３０％以下、好ましくは２０％以下であるＥＬＩＳＡアッセイ測定値を指すことを特徴とする。
【００２５】
好ましくは、抗体は、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡに結合しない。特に好ましくは、抗体はＮＫエフェクター細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しない。
【００２６】
本発明に従う抗体は、好ましくは、ＮＫ細胞上のＦｃγレセプターへの抗体の非結合は、ＮＫ細胞に対する２０μg/mlの濃度での抗体の最大結合（Ｂｍａｘ）が抗体ＬＣ．００１のＢｍａｘに比較して２０％以下、好ましくは１０％以下である、アッセイを指すことを特徴とする。
【００２７】
本発明に従う抗体は、好ましくは、それがＦｃγＲＩに結合しないことを特徴とする。これは、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＩＩＢを欠いているがリコンビナントＦｃγＲＩを発現しているＢ細胞リンパ腫細胞に対する０．０７８〜１０μg/mlの範囲の濃度の抗体の結合を試験するアッセイで測定されるとき、ＬＣ．００１のＥＣ５０値に比べて５倍以上、好ましくは７倍以上、例えば８倍以上であるＥＣ５０により抗体が特徴付けられることを意味する。
【００２８】
本発明に従う抗体は、好ましくは、補体因子Ｃ１ｑへの非結合および／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターへの非結合を引き起こす、好ましくはヒトＦｃ部分における少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＩｇＧ４抗体またはＩｇＧ１抗体であるとして特徴付けられる。
【００２９】
本発明に従う抗体は、好ましくは、それが補体因子Ｃ３を活性化しないことを特徴とする。
【００３０】
本発明に従う抗体は、好ましくは、ヒトサブクラスＩｇＧ４であることにより特徴付けられる。本発明のさらなる好ましい態様では、抗体は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１および／またはＰ３２９（ＥＵインデックスに従う番号付け）における少なくとも１つの突然変異を含む、任意のＩｇＧクラス、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４であることにより特徴付けられる。特に好ましいのは、ＩｇＧ１突然変異ＰＶＡ２３６、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａおよび／またはＧＬＰＳＳ３３１ならびにＩｇＧ４突然変異Ｌ２３５Ｅである。ＩｇＧ４サブクラスの抗体が、突然変異Ｓ２２８Ｐまたは突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含有することが更に好ましい（Ａｎｇａｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０（１９９３）１０５−１０８）。
【００３１】
したがって、本発明に従う抗体は、好ましくは、ＰＶＡ２３６、ＧＬＰＳＳ３３１および／またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＥＵインデックスに従う番号付け）からの１つ以上の突然変異を含む、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体である。
【００３２】
好ましくは、本発明に従う抗体は、ＯＸ４０Ｌに結合すること、突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含有するＩｇＧ１クラスであることにより特徴付けられ、そしてγ重鎖として配列番号５９、６３または６７を含む。
【００３３】
特に好ましいのは、
ａ）γ重鎖として配列番号５９およびκ軽鎖として配列番号６１、
ｂ）γ重鎖として配列番号６３およびκ軽鎖として配列番号６５、または
ｃ）γ重鎖として配列番号６７およびκ軽鎖として配列番号６９、
を含む抗体である。
【００３４】
好ましくは、突然変異Ｓ２２８Ｐを含有するＩｇＧ４クラスであることにより特徴付けられる本発明に従う抗体は、γ重鎖として配列番号６０、６４または６８を含む。
【００３５】
特に好ましいものは、
ａ）γ重鎖として配列番号６０およびκ軽鎖として配列番号６１、
ｂ）γ重鎖として配列番号６４およびκ軽鎖として配列番号６５、または
ｃ）γ重鎖として配列番号６８およびκ軽鎖として配列番号６９、
を含む抗体である。
【００３６】
本発明に従う抗体は、好ましくは、それが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しないことを特徴とする。
【００３７】
本発明に従う抗体は、好ましくは、それが抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発しないことを特徴とする。
【００３８】
したがって、本発明は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体または単一重鎖もしくは単一軽鎖であって、それらのＣＤＲｓ、可変領域、完全アミノ酸配列またはハイブリドーマにより特徴付けられ、そしてＦｃ部分を含まないか、または任意の型のＦｃ部分を含み、好ましくは、ヒト起源の改変されていないまたは上記した突然変異により改変されている、ヒトＩｇＧ１  ＦｃもしくはヒトＩｇＧ４  Ｆｃを含む、抗ＯＸ４０Ｌ抗体または単一重鎖もしくは単一軽鎖を含む。
【００３９】
したがって、本発明は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、該抗体は、ＯＸ４０Ｌに結合し、ヒト由来のＦｃ部分を含有しそしてヒト補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合せず、ヒトＩｇＧ４型であるかまたは上記した突然変異により改変されたヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４であることを特徴とする抗体、好ましくはモノクローナル抗体も含む。
【００４０】
従って、本発明は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体であって、該抗体は、１００ngの抗体濃度で、ＯＸ４０Ｌにおよび変性されたＯＸ４０Ｌに結合する（ウエスタンブロットにおいて）ことを特徴とする抗体、好ましくはモノクローナル抗体も含む。この抗体は、モノクローナル抗体ＬＣ．００１が結合するエピトープと同じＯＸ４０Ｌポリペプチドエピトープに結合する。抗体は、Ｆｃ部分含まないか、または任意の型のＦｃ部分を含み、好ましくは、野生型もしくは上記した突然変異により修飾されたヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４を含む。
【００４１】
本発明に従う抗体は、ＯＸ４０Ｌに対する抗体による治療を必要としている患者、特に炎症性疾患、特に慢性関節リウマチ、アレルギー性喘息および移植におけるＧｖＨＤ（Sugamura, K., et al., Nat. Rev. Immunol. 4(2004)420-431も参照）に罹患している患者に有益な新規で発明的な性質を有する。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う抗体分子、その可変鎖またはそのＣＤＲドメインをコードする核酸分子である。
【００４３】
本発明の好ましい態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、または一本鎖フラグメントである。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う核酸分子を含むベクターである。
【００４５】
本発明のさらなる態様は本発明に従うベクターを含む宿主細胞である。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う抗体の製造方法であって、該抗体分子の合成を可能とする条件下に本発明に従う宿主細胞を培養し、そしてこの培養物から該抗体分子を回収することを含む方法である。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物である。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う抗体および少なくとも１種の薬学的に許容されうる賦形剤を含む医薬組成物である。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う治療的に有効量の抗体を患者に投与することを特徴とする治療を必要としている患者の処置のための方法である。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、治療、好ましくは炎症性疾患の処置のための、特に慢性関節リウマチ、喘息およびＧｖＨＤ（宿主に対する移植片疾患）の処置および／または予防のための本発明に従う抗体の使用である。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、炎症性疾患の予防および／または処置のための、好ましくは慢性関節リウマチ、喘息およびＧｖＨＤの処置用の医薬の製造のための本発明に従う抗体の使用である。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、本発明に従う抗体、本発明に従う核酸分子、本発明に従うベクターまたは本発明に従う宿主細胞を含む診断キットである。
【００５３】
発明の詳細な説明
用語「ＯＸ４０Ｌ」は、ＴＮＦリガンドファミリーに属するＩＩ型膜タンパク質を指す。更なる名称は、ＡＣＴ−４レセプター、ＣＤ１３４Ｌ、ｇ３４またはＴＮＦ４＿Ｈｕｍａｎである。それは３４kDaの分子量を有しそしてアクセッションナンバーＰ２３５１０でＳｗｉｓｓＰｒｏｔに保存されている。
【００５４】
用語「ＯＸ４０」は、ＯＸ４０Ｌに結合するレセプターを指す。それはＴＮＦレセプターファミリーに属するＩ型膜タンパク質である。さらなる名称は、ＡＣＴ−４、ＯＸ４０Ｌレセプター、ＣＤ１３４抗原、ＡＣＴ３５抗原、ＴＮＲ４＿Ｈｕｍａｎである。それは５０kDaの分子量を有しそしてアクセッションナンバーＰ４３４８９でＳｗｉｓｓＰｒｏｔに保存されている。
【００５５】
用語「抗体」は、種々の形態の抗体、好ましくは、完全抗体、抗体フラグメント、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（humanized antibodies）および本発明に従う特性が保持されている限り、遺伝子工学的に作成された抗体（変異体または突然変異体抗体）を含むが、それらに限定されない種々の形態の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を包含する。特に好ましいのは、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体、特にリコンビナントヒト抗体である。
【００５６】
本明細書で使用された用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
【００５７】
用語「キメラ抗体」は、通常リコンビナントＤＮＡ技術により作成された、１種のソースもしくは種からの可変領域、即ち結合領域および異なるソースもしくは種に由来する定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される他の好ましい形態の「キメラ抗体」は、定常領域を元の抗体の定常領域から改変しまたは変化させて、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して、本発明に従う性質を発生させたキメラ抗体である。このようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体（class-switched antibodies）」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生するための方法は、慣用のリコンビナントＤＮＡを含みそして遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野で周知されている。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238 and 5,204,244参照。
【００５８】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されて親免疫グロブリンの特異性と比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含む抗体を指す。好ましい態様では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植させて「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332(1988)323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314(1985)268-270参照。特に好ましいＣＤＲｓは、キメラおよび二官能性抗体について上記した抗原を認識する配列を示すＣＤＲｓに相当する。本発明により包含された他の形態の「ヒト化抗体」は、定常領域を元の抗体の定常領域からさらに改変もしくは変化させて、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関して、本発明に従う性質を発生させたヒト化抗体である。
【００５９】
本明細書で使用された用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、当技術水準で周知されている（van Dijk, M. A.., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001)368-374）。ヒト抗体は、免疫感作されると、内因性免疫グロブリン産生の不存在下にヒト抗体のフルレパートリーまたは選択を生じさせることができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生させることもできる。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレーのトランスファーは、抗原チャレンジによるヒト抗体の産生をもたらすであろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362(1993)255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7(1993)33-40参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーにおいて産生させることもできる（Hoogenboom, H. R.., and Winter, G., J. Mil. Biol. 227(1992)381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。Cole et al. and Boerner et al.,の技術も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147(1991)86-95）。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に述べたとおり、本明細書で使用された用語「ヒト抗体」は、定常領域において改変されて特にＣ１４ｑ結合および／またはＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチ」、即ちＦｃ部分の変化または突然変異（ＩｇＧ１からＩｇＧ４へのおよび／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、本発明に従う性質を発生させたこのような抗体も含む。さらに、本発明は、Ｃ１ｑおよび／またはＦｃＲに結合するＯＸ４０Ｌに対するモノクローナルヒト抗体を含む。このようなヒト抗体は、マウスＯＸ４０Ｌと比較してヒトＯＸ４０Ｌについて高い選択性により特徴付けられ（ヒトＯＸ４０Ｌへの結合よりもマウスＯＸ４０Ｌへの結合が＞３０倍低い）そして５００nMの濃度のまでＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌへの非特異的結合を示さない。このような抗体は、Ｃ１ｑおよび／またはＦｃＲに結合しない抗体の発生のために有用である。
【００６０】
本明細書で使用された用語「リコンビナントヒト抗体」は、リコンビナント手段により調製され、発現され、創生されまたは単離されるすべてのヒト抗体、例えばＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞からまたはヒト免疫グロブリン遺伝子用のトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクションされたリコンビナント発現ベクターを使用して発現された抗体を含むことを意図する。このようなリコンビナントヒト抗体は、再配列された形態において可変領域と定常領域を有する。本発明に従うリコンビナントヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞超突然変異を受けている。したがって、リコンビナント抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来するおよび関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリーの範囲内に天然に存在しないことがありうる配列である。
【００６１】
本明細書で使用された「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖および重鎖のペアーの各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有しそして各ドメインは、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲｓ）により接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採用しておりそしてＣＤＲｓはβシート構造を接続するループを形成することができる。各鎖におけるＣＤＲｓは、フレームワーク領域によりそれらの三次元構造に保持されそして他の鎖からのＣＤＲｓと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて特に重要な役割を演じ、したがって本発明のさらなる目的を与える。
【００６２】
本明細書で使用されるとき用語「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」は、抗原結合の責任を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲｓ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義されたとおりの超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲｓは、このようなフレームワークアミノ酸により分離されている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準定義に従って決定される。
【００６３】
本明細書で使用された用語「核酸または核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６４】
核酸は、それが他の核酸配列との機能的関係に置かれているとき「作用可能に連結されている（operably linked）」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしもそれがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのためのＤＮＡに作用可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーはもしもそれが配列の転写に影響を与えるならば、コード化配列に作用可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するように位置しているならば、コード化配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり（contiguous）そして分泌リーダーの場合には、連続的でありそしてリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は都合の良い制限部位においてライゲーションにより達成される。このような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用の実施に従って使用される。
【００６５】
本明細書に使用された、「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」という表現は、交換可能に使用されそしてすべてのこのような命名は子孫を含む。従って、語「トランスフォーマント」および「トランスフォーメーションされた細胞」は、トランスファーの数に関係なく初代対象細胞（primary subject cell）およびそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的な突然変異または故意でない突然変異により、ＤＮＡ内容において正確に同一でなくてもよいことも理解される。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は含まれる。別の命名が意図される場合には、それは状況から明らかであろう。
【００６６】
「定常ドメイン」は、抗体を抗原に結合することに直接関与していないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体または免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分けられ、そしてこれらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に更に分けられうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、ε、γおよびμと呼ばれる。本発明に従う抗体は好ましくはＩｇＧ型である。
【００６７】
本発明に従う抗体は、Ｆｃ部分として、好ましくはヒト起源に由来するＦｃ部分および好ましくはヒト定常領域のすべての他の部分を含有する。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化およびＦｃレセプター結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響はある条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合はＦｃ部分における規定された結合部位により引き起こされる。このような結合部位は、当技術分野の技術水準で知られておりそして例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127(1981)2555-2560; Brunhouse, R.., and Cebra, J. J., Mol. Immunol. 16(1979)907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288(1980)338-344; Thommesen, J. E., et al., Mol. Immunol. 37(2000)995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 264(2000)4178-4184; Hezareh, M.., et al., J. Virol. 75(2001)12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86(1995)319-324; およびEP 0 307 434により記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う番号付け、下記参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は、通常補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化を示すが、これに対してＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑに結合せずそしてＣ３を活性化しない。本明細書で使用された用語「ヒト起源由来のそしてヒト補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃ□レセプターに結合しないＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、または下記に定義されたＣ１ｑ結合、Ｃ３活性化および／またはＦｃＲ結合が検出できないような方法で改変されているサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３のヒト抗体のＦｃ部分である、Ｆｃ部分を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知のそして抗体のパパイン開裂に基づいて定義された用語である。好ましくは、Ｆｃ部分はヒトＦｃ部分でありそしてヒトＩｇＧ４サブクラスからの、好ましくはヒンジ領域において突然変異した（例えば、Ｓ２２８Ｐおよび／またはＬ２３５Ｅ）Ｆｃ部分またはヒトＩｇＧ１サブクラスからの突然変異したＦｃ部分である。最も好ましいのは、配列番号１４および１５に示された領域あるいは配列番号５８，５９、６０、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する配列番号１４または突然変異Ｓ２２８Ｐもしくは突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有する配列番号１５に含まれる領域から選ばれる重鎖定常領域を含むＦｃ部分である。
【００６８】
本発明は、ＯＸ４０Ｌに結合しそして補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＦｃレセプターに結合しない抗体を指す。本発明の好ましい態様では、これらの抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発しない。好ましくは、この抗体は、それがＯＸ４０Ｌに結合し、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含有しそして補体因子Ｃ１ｑに結合しないことを特徴とする。さらに好ましくは、この抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。
【００６９】
抗体Ｆｃ領域のＦｃ部分により媒介されるエフェクター機能は、抗体の抗原への結合の後に作動するエフェクター機能を指す（これらの機能は、Ｆｃレセプターによる補体カスケードの活性化および／または細胞活性化を含む）。
【００７０】
補体カスケードの機能は、ＣＨ５０アッセイにより評価されうる。抗赤血球抗体（ＥＡ）で感作されたヒツジ赤血球を試験血清に加えて溶血をもたらす古典的経路を活性化する。赤血球の５０％を溶解するのに必要な血清の容積は、ＣＨ５０単位を決定する。ＡＰ−ＣＨ５０は、代替経路（alternative pathway）およびターミナル経路（terminal pathway）を測定する。手順はウサギ赤血球を使用することを除いては同様である。代替経路は試験血清を添加すると活性化される。
【００７１】
Ｃ１ｑおよび２つのセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒおよびＣｌｓは、複合体Ｃ１、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１成分を形成する。補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑは、抗原性標的に結合されたＩｇＧ１の少なくとも２つの分子またはＩｇＭの１つの分子に結合する（Ward, E. S.., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2(1995)77-94)。Burton, D. R.,は、アミノ酸残基３１８〜３３７を含む重鎖領域が、補体結合反応（complement fixation）に関与していると述べている（Mol. Immunol. 22(1985)161-206)。Duncan, A. R., およびWinter, G. (Nature 332(1988)738-740）は、部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２がＣ１ｑへの結合部位を形成することを報告した。Ｃ１ｑの結合におけるＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基の役割は、これらの残基を含有する短い合成ペプチドの補体媒介溶解を阻害する能力により確かめられた。
【００７２】
用語「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、補体の存在下に本発明に従う抗体による、ＯＸ４０Ｌ発現ヒト内皮細胞の溶解を指す。ＣＤＣは、好ましくは、補体の存在下に本発明に従う抗体によるＯＸ４０Ｌ発現ヒト内皮細胞の処理により測定される。細胞は、好ましくはカルセインで標識される。もしも抗体が３０μg/mlの濃度で標的細胞の２０％以上の溶解を誘導するならば、ＣＤＣが見出される。本発明者は、本発明に従う抗体の性質について、ＥＬＩＳＡアッセイにおける補体因子Ｃ１ｑへの減少した結合が必須であることを見出した。このようなアッセイにおいて、一般に、ＥＬＩＳＡプレートをある濃度範囲の抗体でコーティングし、それに精製されたヒトＣ１ｑまたはヒト血清を加える。Ｃ１ｑ結合は、Ｃ１ｑに対して指向された抗体により、続いてペルオキシダーゼで標識されたコンジュケートにより検出される。結合の検出（最大結合Ｂｍａｘ）は、ペルオキシダーゼ基質、ＡＢＴＳ（登録商標）（２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート（６）］について４０５nmにおける光学濃度（ＯＤ４０５）として測定される。したがって、本発明は、補体因子Ｃ１ｑへの抗体の非結合は、１０μg/mlの抗体の濃度での本発明に従う抗体へのＣ１ｑの最大結合（Ｂｍａｘ）が抗体ＬＣ．００１で観察されたＢｍａｘの２０％以下、好ましくは１０％以下である、このようなＥＬＩＳＡアッセイ測定値を指す。
【００７３】
本発明に従う抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおける補体因子Ｃ３の減少した活性化を示すことが更に好ましい。このアッセイはＣ１ｑアッセイと同じ方式で行われる。このようなアッセイにおいて、一般にＥＬＩＳＡプレートを所定の濃度範囲の抗体でコーティングし、それにヒト血清を加える。Ｃ３結合は、Ｃ３に対して指向された抗体により、次いでペルオキシダーゼで標識されたコンジュゲートにより検出される。結合（最大結合Ｂｍａｘ）の検出は、ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳ（登録商標）について４０５nmにおける光学濃度（ＯＤ４０５）として測定される。したがって、本発明は、補体因子Ｃ３への抗体の非結合は、１０μg/mlの抗体の濃度で抗体へのＣ３の最大結合（Ｂｍａｘ）が抗体ＬＣ．００１のＢｍａｘの１０％以下、好ましくは５％以下である、このようなＥＬＩＳＡアッセイ測定値を指す。
【００７４】
用語「抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」は、Ｆｃレセプター結合により媒介される機能であり、そしてエフェクター細胞の存在下に本発明に従う抗体によるＯＸ４０Ｌ発現標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、エフェクター細胞、例えば単離されたばかりのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）またはバフィーコートから精製されたエフェクター細胞、例えば単球またはＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の存在下に、本発明に従う抗体によるＯＸ４０Ｌ発現赤血球系細胞（例えばリコンビナントヒトＯＸ４０Ｌを発現するＫ５６２細胞）の調製物の処理により測定される。標的細胞を、51Ｃｒで標識し、次いで抗体と共にインキュベーションする。標識された細胞をエフェクター細胞と共にインキュベーションし、そして上清を放出された51Ｃｒについて分析する。コントロールは、抗体なしで標的内皮細胞のエフェクター細胞とのインキュベーションを含む。ＡＤＣＣを媒介する最初の段階を誘導する抗体の能力を、Ｆｃγレセプター発現細胞、例えばＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩＡをリコンビナント的に発現する細胞またはＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）へのそれらの結合を測定することにより調べた。好ましくはＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合を測定する。
【００７５】
Ｆｃレセプター結合性エフェクター機能は、造血細胞上の特殊化された細胞表面レセプターであるＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）と抗体のＦｃ領域の相互作用により媒介されうる。Ｆｃレセプターは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そして抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、免疫複合体のファゴサイトーシスによる抗体でコーティングされた病原体の除去ならびに、対応する抗体でコーティングされた赤血球および種々の他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示された。Van de Winkel, J. C., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49(1991)511-524）。ＦｃＲｓは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性により定義され；ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターは、ＦｃγＲと呼ばれ、ＩｇＥに対してはＦｃεＲと呼ばれ、ＩｇＡに対してはＦｃαＲと呼ばれる等である。Ｆｃレセプター結合は、例えば、Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9(1991)457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4(1994)25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126(995)330-341; and Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76(1998)231-248に記載されている。
【００７６】
ＩｇＧ抗体のＦｃドメインに対するレセプター（ＦｃγＲ）の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞性細胞傷害および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体産生の調節を含む広範な種類のエフェクター機能をトリガーする。ヒトでは、３つのクラスのＦｃγＲが特徴付けられており、それらは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）であり、
−ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高いアフィニティーで一量体ＩｇＧに結合し、そしてマクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現される。Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７およびＰ３２９の少なくとも１つのＩｇＧにおける改変は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４中に置換された位置２３３〜２３６におけるＩｇＧ２残基はＦｃγＲＩへの結合を１０3倍減少させそして抗体感作された赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29(1999)2613-2624）。
−ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化されたＩｇＧに中〜低アフィニティーで結合しそして広く発現される。これらのレセプターは２つの重要なタイプ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、キリング（killing）に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）上に見出されそしてキリングプロセスを活性化することができると思われる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を演じると思われ、そしてＢ細胞、マクロファージおよびマスト細胞および好酸球上に見出される。Ｂ細胞上では、それはさらなる免疫グロブリン産生および例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチを抑制するように機能すると思われる。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡにより媒介されるファゴサイトーシスを抑制するように作用する。好酸球およびマスト細胞上では、該ｂ形態は、その別のレセプターへのＩｇＥ結合を通じてこれらの細胞の活性化を阻害するのを助けることができる。ＦｃγＲＩＩＡに対する減少した結合は、例えば、Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２およびＫ４１４の少なくとも１つのＩｇＧ突然変異で見出される。
−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ＩｇＧに中〜低アフィニティーで結合しそして２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球およびいくらかの単球およびＴ細胞上に見出され、そしてＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上に高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＩＡへの減少した結合は、例えば、Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６の少なくとも１つの突然変異で、見出される。
【００７７】
Ｆｃレセプターに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上記した突然変異部位およびＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Shields, R.L., et al. JBC276(2001)6591-6604に記載されている。
【００７８】
本明細書で使用される用語「Ｆｃレセプター」は、該レセプターと会合した（associated）細胞質ＩＴＡＭ配列の存在により特徴付けられた活性化レセプターを指す（例えば、Ravetch, J. V.., and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19(2001)275-290）。このようなレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡである。本発明に従う抗体は、好ましくは、Ｆｃγレセプター、好ましくはＦｃγＩＩＩＡへの減少した結合を示す。好ましくは、用語「ＦｃγＲの非結合」は、１０μg/mlの抗体濃度においてＮＫ細胞への本発明に従う抗体の結合が抗体ＬＣ．００１について見出された結合の１０％以下であることを意味する。
【００７９】
ＩｇＧ４は減少したＦｃＲ結合を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の損失）、Ｐｒｏ３２９および２３４、２３５、２３６および２３７  Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５も、もし変えられるならば減少したＦｃＲ結合を与える残基である（Shields, R. L., et al. J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604; Lund, J., et al. FASEB J. 9(1995)115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86(1995)319-324; およびEP 0 307 434）。好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスの本発明に従う抗体は、突然変異ＰＶＡ２３６、ＧＬＰＳＳ３３１および／またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む。ＩｇＧ４サブクラスの本発明に従う抗体は、好ましくは突然変異Ｌ２３５Ｅを含む。さらなる好ましいＩｇＧ４突然変異はＳ２２８ＰまたはＬ２３５ＥおよびＳ２２８Ｐである（表１参照）。
【００８０】
本明細書で使用される用語「ＯＸ４０Ｌへの結合」は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおけるヒトＯＸ４０Ｌへの抗体の結合を意味する（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）。更なる確認のために、ＯＸ４０Ｌへの結合は、精製されたＯＸ４０ＬがマイクロタイタープレートにコーティングされているＥＬＩＳＡまたは直接もしくは間接に標識された抗体を、ＯＸ４０Ｌを発現するＫ５６２細胞に結合させるＦＡＣＳアッセイにおいて決定することもできる。
【００８１】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいては、抗体を表面に結合させそしてＯＸ４０Ｌの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される。結合のアフィニティーは、用語ｋａ（抗原への抗体の会合にたいする速度定数）、ｋｄ（解離に対する速度定数）およびＫD（ｋｄ／ｋａ）により定義される。本発明に従う抗体は、１０-8以下、好ましくは約１０-12〜１０-9ＭのＫDを示す（実施例参照）。したがって、本発明は、抗体がＢＩＡｃｏｒｅアッセイにおいて１０-8Ｍ未満のＫD値でＯＸ４０Ｌに結合する、好ましくは、ＫD範囲は１０-12〜１０-9Ｍである、上記した抗体を指す。
【００８２】
ＯＸ４０Ｌ特異的結合ＥＬＩＳＡにおいて、ＯＸ４０Ｌをマイクロタイタープレート上にコーティングし、そしてＯＸ４０Ｌへの抗体の結合は、ＨＲＰをコンジュゲーションした抗ヒトＩｇＧおよびＥＬＩＳＡの通常の段階により検出される。このアッセイにおけるＥＣ50値は、好ましくは３nM〜８nMの範囲にある。
【００８３】
本明細書で使用された「ＯＸ４０ＬへのＯＸ４０の結合を阻害する」という用語は、ヒトＯＸ４０Ｌに本発明に記載の抗体を結合させ、それによりＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害し、それによりＯＸ４０Ｌで誘導されるシグナル伝達を阻害することを指す。
【００８４】
本発明の抗体は、ｈＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０相互作用を、好ましくは、
ｉ）１nM〜４nMの範囲のＩＣ５０値で０．５μg/mlのビオチニル化ＯＸ４０Ｌの（固相）コーティング濃度で抗体により可溶性ＯＸ４０とビオチニル化され固定化されたＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロッキングすることによりＥＬＩＳＡアッセイにより示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルにおいて、
ii）１nM〜１０nMの範囲のＩＣ５０値で０．７８〜１００nMの抗体濃度で抗体により可溶性ＯＸ４０Ｌ（１０nM、好ましくはｈＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓとして）と固定化されたＯＸ４０との相互作用をブロッキングすることによりＢｉａｃｏｒｅアッセイにより示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルにおいて、
iii）抗体が、４〜２０nMの範囲のＩＣ５０値でＯＸ４０と２×１０5細胞／サンプルの濃度のＯＸ４０Ｌを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌ）との相互作用をブロッキングする、ＦＡＣＳアッセイにより示された細胞レベルにおいて、
iv）抗体が、１〜５nMの範囲のＩＣ５０でＮＦκＢ活性化のブロッキングをもたらす、サンプル当たり３×１０4個のＯＸ４０を発現するＨｅＬａ細胞への、Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌにより誘導されるＯＸ４０シグナル伝達をブロッキングする、ＯＸ４０シグナル伝達アッセイにより、
ｖ）抗体が、１nM〜１０nMの範囲のＩＣ５０値で１．５×１０5細胞／サンプルの濃度および０．７５μg/mlのＰＨＡ濃度でＫ５６２＿ＯＸ４０ＬによるＯＸ４０Ｌで誘導されるＴ細胞活性化をブロッキングする、Ｔ細胞活性化アッセイにより、および／または
ｖｉ）抗体が、１０μg/mlの抗体濃度で活性化されたＢ細胞または樹状細胞によるＯＸ４０Ｌで誘導されるＴ細胞活性化をブロッキングする、Ｔ細胞活性化アッセイ（Tetanus assay）により、阻害し、４０％〜６０％の阻害が得られた。
【００８５】
１nM〜４nMの範囲のＩＣ５０値で０．５μg/mlＯＸ４０Ｌのコーティング濃度で可溶性ＯＸ４０と固定化されたＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロッキングすることによりＥＬＩＳＡアッセイにおいて阻害を示す抗体が好ましい。
【００８６】
したがって、本発明の更なる好ましい態様は、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害し、それによりＯＸ４０Ｌで誘導されるシグナル伝達を阻害することを特徴とする抗体を指す。
【００８７】
本発明に従う抗体は、ＴＮＦαまたはＣＤ４０Ｌ  ５００nMの濃度までＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌへの非特異的結合を示さないことが更に好ましい。
【００８８】
本発明に従う抗体はヒトＯＸ４０Ｌに比較してマウスＯＸ４０Ｌへの少なくとも３０倍低い結合を示すことが更に好ましい。
【００８９】
１０μg/mlの濃度の本発明に従う抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞上のＯＸ４０Ｌ発現のダウンレギュレーションを誘導しないことが更に好ましい。
【００９０】
さらなる好ましい態様では、本発明の抗体は、それらが組合せ、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された抗体ＬＣ．００１の軽鎖可変ドメインおよび配列番号２により規定された抗体ＬＣ．００１の重鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列により規定された抗体ＬＣ．００５の軽鎖可変ドメインおよび配列番号４により規定された抗体ＬＣ．００５の重鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列により規定された抗体ＬＣ．０１０の軽鎖可変ドメインおよび配列番号６により規定された抗体ＬＣ．０１０の重鎖可変ドメイン；
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列により規定された抗体ＬＣ．０２９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号８により規定された抗体ＬＣ．０２９の重鎖可変ドメイン；
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列により規定された抗体ＬＣ．０１９の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０により規定された抗体ＬＣ．０１９の重鎖可変ドメイン；
ｆ）配列番号１１または１６のアミノ酸配列により規定された抗体ＬＣ．０３３の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１２により規定された抗体ＬＣ．０３３の重鎖可変ドメイン；
ｇ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインおよび配列番号１７により規定された重鎖（ＶH）可変ドメイン；
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９により規定された重鎖可変ドメイン；
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０により規定された重鎖可変ドメイン；
からなる群より独立に選ばれる可変ドメインの組合せを含むことを特徴とする。
【００９１】
さらなる好ましい態様では、本発明の抗体は、それらが、
ｋ）配列番号１３の配列により規定された軽／κ鎖；
ｌ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、ＰＶＡ２３６またはＧＬＰＳＳ３３１から選ばれる１つ以上の突然変異を有するＩｇＧ１アイソタイプ配列番号１４の重／γ鎖；
ｍ）ＩｇＧ４アイソタイプ配列番号１５の重／γ鎖；
ｎ）突然変異Ｓ２２８Ｐまたは突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有するＩｇＧ４アイソタイプ配列番号１５の重／γ鎖；
ｏ）配列番号６１、６５または６９に含まれる軽定常鎖（light constant chain）、
ｐ）配列番号５８、５９、６０、６２、６３、６４、６６、６７または６８に含まれる重定常鎖（heavy constant chain）、
からなる群より独立に選ばれる定常領域を含むことを特徴とする。
【００９２】
更に好ましいのは、各可変抗体ドメイン組合せａ）〜ｉ）とγ鎖ｌ）、ｍ）、ｎ）またはｐ）および好ましくはκ鎖ｋ）またはｏ）とのすべての組合せである。特に好ましいのは、抗体ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３、ＬＣ．０５９、ＬＣ．０６０またはＬＣ．０６３の可変鎖を、各々、配列番号１３の配列により規定されたκ鎖または配列番号６１、６５もしくは６９に含まれる軽定常鎖および突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するＩｇＧ１アイソタイプ配列番号１４の重／γ鎖または配列番号５９、６３もしくは６７に含まれる重定常鎖と共に含む抗体；抗体ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３、ＬＣ．０５９、ＬＣ．０６０またはＬＣ．０６３の可変鎖を、各々、配列番号１３の配列により規定されたκ鎖または配列番号５９、６３もしくは６７に含まれる重定常鎖およびＩｇＧ４アイソタイプ配列番号１５の重／γ鎖または配列番号６０、６４もしくは６８（３つのすべてがＳ２２８Ｐ突然変異を有していない）に含まれる重定常鎖と共に含む抗体；抗体ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３、ＬＣ．０５９、ＬＣ．０６０またはＬＣ．０６３の可変鎖を、各々、配列番号１３の配列により規定されたκ鎖または配列番号６１、６５もしくは６９に含まれる軽定常鎖および突然変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４アイソタイプ配列番号１５の重／γ鎖または配列番号６０、６４もしくは６８に含まれる重定常鎖と共に含む抗体である。
【００９３】
好ましくは、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲおよび配列番号２、１７もしくは２０の重鎖可変ＣＤＲ、または配列番号１８のアミノ酸配列の軽鎖可変ＣＤＲおよび配列番号１９の重鎖可変ＣＤＲを含む。
【００９４】
好ましい抗体は、該抗体が、補体因子Ｃ１ｑへの非結合および／またはＦＣＲ結合の損失を引き起こす少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むヒトＩｇＧ４サブクラスまたは他のヒトサブクラス（好ましくはＩｇＧ１）であることを特徴とする。このような好ましい変異体抗体は、例えば、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する配列番号１４のアミノ酸配列または突然変異Ｓ２２８Ｐを有するもしくは有さない配列番号１５を含む。
【００９５】
本発明に従う好ましい抗体は、ＩｇＧ１ｖ１（Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ｖ；Ｌ２３５Ａ；ΔＧ２３６；Ａ３２７Ｇ；Ａ３３０Ｓ；Ｐ３３１Ｓにより特定されたＰＶＡ−２３６；ＧＬＰＳＳ３３１）、ＩｇＧ１ｖ２（Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ）およびＩｇＧ４ｖ１（Ｓ２２８Ｐ；Ｌ２３５Ｅ）およびＩｇＧ４ｘ（Ｓ２２８Ｐ）として定義された抗体である。
【００９６】
本発明に従うハイブリドーマ細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．００１は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６７２の下に２００４年７月２７日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、Germanyに寄託された。
【００９７】
本発明に従うハイブリドーマ細胞系ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．００５（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６８５）、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０１０（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６８６）、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０１９、ｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０２９（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６８８）およびｈｕ−Ｍａｂ＜ｈＯＸ４０Ｌ＞ＬＣ．０３３（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６８９）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に、２００４年９月２日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、Germanyに寄託された。
【００９８】
前記細胞系から得られうる抗体は、本発明の好ましい態様でありそして補体因子Ｃ１ｑに結合しないおよび／またはヒトＦｃγレセプターに結合しない本発明に従う抗体の発生のための中間物質として特に有用である。
【００９９】
本発明の更なる好ましい態様は、ＯＸ４０Ｌに結合し、そして寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０またはＬＣ．０２９も結合する同じＯＸ４０Ｌエピトープに結合する、単離された抗ＯＸ４０Ｌ抗体である。
【０１００】
本発明の更なる態様は、補体因子Ｃ１ｑおよび／またはヒトＦｃγレセプターに結合しない、ＯＸ４０Ｌに対する抗体の産生方法であって、１０-8Ｍ未満のＫＤ値でＯＸ４０Ｌに結合する抗体の重鎖をコードする核酸の配列を、改変された抗体が補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しないような方式で改変し、該改変された核酸および該抗体の軽鎖をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物もしくは真核生物宿主細胞に挿入し、コードされたタンパク質を発現しそして宿主細胞または上清から回収することを特徴とする方法である。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、補体因子Ｃ１ｑに結合しないおよび／またはヒトＦｃγレセプターに結合しない本発明に従う抗体の産生方法であって、前記細胞系の１つから得られうる抗体を、「クラススイッチ」、即ち、好ましくは、ＩｇＧ１ｖ１（Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ｖ；Ｌ２３５Ａ；ΔＧ２３６；Ａ３２７Ｇ；Ａ３３０Ｓ；Ｐ３３１Ｓにより特定されたＰＶＡ−２３６；ＧＬＰＳＳ３３１）、ＩｇＧ１ｖ２（Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ）およびＩｇＧ４ｖ１（Ｓ２２８Ｐ；Ｌ２３５Ｅ）およびＩｇＧ４ｘ（Ｓ２２８Ｐ）として定義されたＦｃ部分の変化または突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４へのおよび／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により改変することを特徴とする方法である。
【０１０２】
更なる好ましい態様では、これらの抗体は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）2および一本鎖フラグメントからなる群より選ばれる抗体フラグメントも含む。
【０１０３】
したがって、「変異体」抗ＯＸ４０Ｌ抗体は、本明細書では、親抗体配列における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により「親」抗ＯＸ４０Ｌ抗体アミノ酸配列とはアミノ酸配列において異なる分子を指す。好ましい態様では、変異体は、親抗体の１つ以上の定常領域もしくは可変領域における、好ましくは定常領域における１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、変異体は、親抗体の１つ以上の可変領域における少なくとも１つ、例えば約１〜約１０、好ましくは約２〜約５の置換を含むことができる。通常、変異体は、親抗体定常および／または可変ドメイン配列との少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。
【０１０４】
本発明は、配列番号２１〜３８からなる群より選ばれる親抗体重鎖ＣＤＲおよび／または配列番号３９〜５７からなる群より選ばれる抗体軽鎖ＣＤＲの最初のアミノ酸配列を改変する方法であって、該最初のアミノ酸配列をコードする核酸を提供し、該核酸を、１つのアミノ酸が重鎖ＣＤＲ１において改変され、１〜２つのアミノ酸が重鎖ＣＤＲ２において改変され、１〜２つのアミノ酸が重鎖ＣＤＲ３において改変され、１〜３つのアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ１において改変され、１〜３つのアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ２において改変されおよび／または１〜３つのアミノ酸が軽鎖ＣＤＲ３において改変されるように改変し、該改変されたＣＤＲアミノ酸配列を抗体構造において発現し、該抗体が１０-8Ｍ未満のＫDでＯＸ４０Ｌに結合するかどうかを測定し、そしてもしも該抗体が１０-8Ｍ未満のＫDでＯＸ４０Ｌに結合するならば、該改変されたＣＤＲを選ぶことを特徴とする方法を含む。好ましくは、このような改変は保存的配列改変である。
【０１０５】
配列に関する同一性又は相同性は、本明細書では、配列をアラインメントしそして必要ならばギャップを導入して、最大百分率配列同一性を達成した後に、親抗体残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。抗体配列におけるＮ末端、Ｃ末端もしくは内部の延長、欠失または挿入のどれも配列同一性または相同性に影響を与えるものとみなすべきではない。変異体は、ヒトＯＸ４０Ｌに結合する能力を保持し、そして好ましくは親抗体の性質より優れた性質を有する。例えば、変異体は、慢性関節リウマチおよび喘息の処置期間中減少した副作用を有することができる。何故ならば、ＯＸ４０Ｌは、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージ上に一過性に発現されるのみならず内皮細胞（Kotani, A., et al., Immunol. Lett. 84(2002)1-7）、気道平滑筋細胞（＝ＡＳＭ）（Burgess, J. K., J. Allergy Clin. Immunol 113(2004)683-689）およびミクログリア細胞（Weinberg, A.D., et al., J.Immunol. 162(1999)1818-1826）上にも一過性に発現されるからである。内皮細胞、ＡＳＭおよびミクログリア細胞へのＯＸ４０Ｌに対する抗体の結合は、血管漏洩をもたらす内皮細胞の細胞損傷、肺破壊をもたらすＡＳＭ細胞の細胞損傷、ミクログリアの損傷をもたらすミクログリア細胞の細胞損傷をもたらすことがありうる。
【０１０６】
本明細書における「親」抗体は、変異体の調製のために使用されるアミノ酸配列によりコードされている親抗体である。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、そしてもし存在するならば、ヒト抗体定常領域（１つまたは複数）を有する。例えば親抗体は、好ましくはＩｇＧ１型のヒト化抗体またはヒト抗体であることができる。
【０１０７】
本発明に従う抗体は、更に、本発明に従う抗体の上記した特徴に影響を与えないまたは該特徴を変えない、「保存性配列改変」、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変を有するこのような抗体を含む。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で知られている標準技術により導入することができる。保存性アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているアミノ酸置換を含む。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷のない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、ヒト抗ＯＸ４０Ｌ抗体における予想される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができる。
【０１０８】
アミノ酸置換は、Riechmann, L., et al., Nature 332(1988)323-327 and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86(1989)10029-10033により記載された分子モデル化に基づく突然変異誘発により達成されうる。
【０１０９】
本発明は、抗体の産生方法であって、１０-8Ｍ未満のＫＤ値でＯＸ４０Ｌに結合する抗体の重鎖をコードする第１核酸の配列を、改変された抗体が補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しないような方法で改変し、該改変された第１核酸および該抗体の軽鎖をコードする第２核酸を発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物宿主細胞に挿入し、該抗体の合成を可能とする条件下に該宿主細胞を培養し、そしてこの培養物から該抗体を回収することを特徴とする方法を更に含む。
【０１１０】
本発明は、本発明に従うそしてヒト起源に由来するＦｃ部分を含む抗体の産生方法であって、ａ）本発明に従う親ヒト抗体の軽鎖をコードする第１核酸配列およびＦｃ部分が補体因子Ｃ１ｑおよび／またはＦｃレセプターに結合しないようにＦｃ部分が改変されている該親ヒト抗体の重鎖をコードする第２ＤＮＡ配列で宿主細胞をトランスフォーメーションし；ｂ）該第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列を、該抗体重鎖および軽鎖が産生されるように発現しそしてｃ）該抗体を宿主細胞または宿主細胞培養物から回収する段階を含む方法を更に含む。
【０１１１】
本発明は、上記した抗体をコードする核酸分子、これらの核酸を含む対応するベクターおよびこれらのベクターのための対応する宿主細胞も含む。本発明は、抗体の製造方法であって、該抗体分子の合成を可能とする条件下に対応する宿主細胞を培養しそしてこの培養物から該抗体を回収することを含む、例えば、原核生物または真核生物宿主細胞において重鎖をコードする核酸および軽鎖をコードする核酸を発現しそしてこのポリペプチドを該細胞から回収することによる、抗体の製造方法を包含する。
【０１１２】
抗体の診断的使用及び治療的使用が包含される。１つの診断用途では、本発明は、ＯＸ４０Ｌを含有する疑いのあるサンプルを抗ＯＸ４０Ｌ抗体に曝露しそしてサンプルへの抗体の結合を決定することを含む、ＯＸ４０Ｌタンパク質の存在を決定する方法を提供する。ＯＸ４０Ｌタンパク質は、ＯＸ４０Ｌ発現細胞の細胞膜中にその膜貫通ドメインにより挿入されることができ、またはシェディング（shedding）もしくはタンパク質分解放出のような機構により放出された体液中の可溶性細胞外ドメインとして存在することができる。この使用のために、本発明は、抗体を使用してＯＸ４０Ｌタンパク質を検出するための抗体および指示を含むキットを提供する。
【０１１３】
本発明の抗体は、哺乳動物、好ましくは炎症性疾患を有するまたは炎症性疾患に罹っている疑いがある患者における炎症性疾患の予防および／または処置のために有用である。このような疾患は、アレルギー反応、例えば喘息を含む。他の適応は慢性関節リウマチを含む自己免疫疾患の処置である。
【０１１４】
本発明は、上記した炎症性疾患、特に喘息および慢性関節リウマチに罹っている哺乳動物を処置する方法を提供する。
【０１１５】
好ましくは、本発明の抗体は、その症状が吸入されたコルチコステロイドで十分にコントロールされない患者における重い持続性喘息の処置のために使用することができる。患者集団は、不十分にコントロールされた重い持続性喘息を有する成人および青年（１２歳以上）を含む。抗体は、１月に１回または２回好ましくは皮下に送達されるであろう。主要な最終目標は、好ましくは急性増悪の減少であろう。他の最終目標は、ピークフロー、日中の喘息症状、夜間の目覚め、クオリティーオブライフ、救急室診察、喘息のない日、β−２アゴニスト使用、ステロイド減少または漸減および過敏性（hyper-responsiveness）に対する効果を含む。
【０１１６】
中程度〜重度の活性慢性関節リウマチを有する成人の処置のために単独療法のためまたはメトレキセートもしくは他のＤＭＡＲＤｓ（Disease Modifying Anti-Rheumatic Drugs）との併用において本発明に従う抗体を使用することは更に好ましい。それは２または４週間毎に皮下注射として投与されるであろう。それは、１種以上のＤＭＡＲＤｓが効かなかった患者における慢性の治療であろう。最終目標は、活性な慢性関節リウマチを有する成人患者における兆候及び症状の減少および構造的損傷の進行の抑制を含むであろう。ＡＣＲ基準により測定された障害の防止、兆候及び症状の改善（ＡＣＲ２０＞６０％、ＡＣＲ５０＞３５％、ＡＣＲ７０＞１５％；米国リウマチ学会からのインデックス；www.rheumatology.com）。
【０１１７】
本発明の更なる態様は、これらの疾患の処置用の医薬の製造のための本発明に従う抗体の使用である。
【０１１８】
本発明は、医薬組成物の製造のために上記に定義した抗体の使用にも関しそして薬学的有効量で本発明に従う抗体を、場合により緩衝液および／または薬学的目的での抗体の処方のために有用な佐剤と共に含有する医薬組成物を含む。
【０１１９】
本発明は、薬学的に許容されうる担体中にこのような抗体を含む医薬組成物を更に提供する。１つの態様では、医薬組成物は、製造物又はキットに含ませることもできる。
【０１２０】
本発明に従う抗体は好ましくはリコンビナント手段により産生される。このような方法は、当技術分野の技術水準で広く知られておりそして抗体ポリペプチドのその後の単離および通常薬学的に許容されうる純度への精製を伴う原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を標準方法により発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母またはＥ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において行われ、そして抗体は細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。
【０１２１】
抗体のリコンビナント産生は、当技術分野の技術水準でよく知られておりそして例えばMakrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17(1999)183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8(1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-161; Werner, R.C., et al., Arzneimittelforschung 48(1998)870-880の概説論文に記載されている。
【０１２２】
抗体は、完全細胞中に、細胞溶解物中にまたは部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。精製は、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質を除去するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技術を含む標準技術により行われる。Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
【０１２３】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L. M., et al., Cytotechnology 32(2000) 109-123; and Barnes, L. M., et al.,Biotech. Bioeng. 73(2001) 261-270により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30(2002）Ｅ９により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989)3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992) 4285-4289; およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204(1997)77-87により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30(1999) 71-83 および Schlaeger, E-J., in J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199により記載されている。
【０１２４】
原核生物に適当なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【０１２５】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的に関連させられているとき、「作用可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしもそれがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのためのＤＮＡに作用可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与えるならばコード化配列に作用可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されているならばコード化配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結されている」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり（contiguous）そして分泌リーダーの場合には、連続的であり且つリーディングフレーム内にある。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、都合の良い制限部位におけるライゲーションにより達成される。もしもこのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用の実施に従って使用される。
【０１２６】
モノクローナル抗体は、慣用の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーにより培養培地から適当に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、容易に単離されそして慣用の手順を使用して配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡのソースとして役立つことができる。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに挿入することができ、次いでこれを、宿主細胞、例えば他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはミエローマ細胞にトランスフェクションして、宿主細胞においてリコンビナントモノクローナル抗体の合成を達成する。
【０１２７】
ヒトＯＸ４０Ｌ抗体のアミノ酸配列変異体（または突然変異体）は、抗体ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することまたはヌクレオチド合成により調製される。しかしながら、このような改変は、例えば上記した非常に限られた範囲においてのみ行うことができる。例えば、改変は、上記した抗体の特性、例えばＩｇＧアイソタイプ及びエピトープ結合を変えないが、リコンビナント産生の収率、タンパク質安定性を改良することができまたは精製を容易にすることができる。
【０１２８】
抗ＯＸ４０Ｌ抗体の特有のコンフォメーションを維持するのに関与しないいかなるシステイン残基も、一般にセリンにより置換することができ、それにより分子の酸化安定性を改良しそして異常な架橋を防止することができる。反対に、システイン結合（１つまたは複数）を抗体に加えて、その安定性（特に、抗体がＦｖフラグメントの如き抗体フラグメントである場合）を改良することができる。
【０１２９】
抗ＯＸ４０Ｌ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で知られている種々の方法により調製される。これらの方法は、天然のソース（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合に）からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびヒト化抗ＯＸ４０Ｌ抗体の以前に調製された変異体または非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による調製を含むが、それらに限定されない。
【０１３０】
本発明は、化学療法剤、毒素（例えばバクテリア、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメント）、放射性同位元素（即ち、放射性コンジュゲート）、などの細胞傷害剤にコンジュゲーションされた本発明に従う抗体を含む免疫コンジュゲートにも関する。抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えばトリエン２，６−ジイソシアナート）およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して製造される。例えばリシンイムノトキシンは、Vitetta, E.S., et al., Science 238(1987) 1098-1104）に記載のとおりに製造することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲートのための例示的キレート剤である。WO 94/11026参照。
【０１３１】
別のタイプの抗体の共有結合改変は、US Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192または4,179,337に記載された方法において、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結することを含む。
【０１３２】
なお別の局面では、本発明は、ヒト抗ＯＸ４０Ｌ抗体（本発明に従う抗体を産生するハイブリドーマ細胞からなる群より選ばれる細胞系により産生された親抗体）を発現するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスからの単離されたＢ細胞を提供する。好ましくは、単離されたＢ細胞は、精製されたもしくはリコンビナント形態のＯＸ４０Ｌ抗原および／またはＯＸ４０Ｌを発現する細胞で免疫感作されたトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られる。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスは、本発明の抗体のすべてもしくは一部をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。単離されたＢ細胞を次いで不死化してヒト抗ＯＸ４０Ｌ抗体のソース（例えばハイブリドーマ）を提供する。したがって、本発明は、本発明に従うヒトモノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマも提供する。１つの態様では、ハイブリドーマは、不死化された細胞に融合された、本発明の抗体のすべてもしくは一部をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含む。
【０１３３】
特定の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の抗体のすべてもしくは一部をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスである。トランスジェニック非ヒト動物は、ＯＸ４０Ｌ抗原の精製されたもしくは濃縮された調製物および／またはＯＸ４０Ｌを発現する細胞で免疫感作されうる。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスは、ＯＸ４０Ｌに対するヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを産生することができる。
【０１３４】
本発明に従うヒトモノクローナル抗体は、本発明の抗体のすべてもしくは一部をコードするヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスを、ＯＸ４０Ｌ抗原の精製されたもしくは濃縮された調製物および／またはＯＸ４０Ｌを発現する細胞で免疫感作させることにより産生することができる。次いで動物のＢ細胞（例えば、脾臓Ｂ細胞）を得そしてミエローマ細胞と融合して、ＯＸ４０Ｌに対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成する。
【０１３５】
好ましい態様では、ＯＸ４０Ｌに対して指向されたヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりはむしろヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックマウスを使用して発生させることができる。本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれるこれらのトランスジェニックマウスは、内在性μおよびκ鎖ローカスを不活性化するターゲティングされた突然変異と共に、重（μおよびγ）鎖およびκ軽鎖（定常領域遺伝子）を含む再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニローカスを含有する（Lonberg, N., et al., Nature 368(1994) 856-859）。したがって、このマウスは、マウスＩｇＭまたはＫの減少した発現を示し、そして免疫感作に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高アフィニティーヒトＩｇＧモノクローナル抗体を発生する（Lonberg, N., et al., Nature 368(1994)856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101に概説されている; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25(1995)65-93; およびHarding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci. 764(1995) 536-546)）。ＨｕＭＡｂマウスの調製は、Taylor, L., et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., et al., Int. Immunol. 5(1993) 647-656; Tuaillon, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993) 3720-3724; Choi, T. K., et al., Nat. Genet. 4(1993)117-123; Chen, J., et al., EMBO J. 12(1993) 821-830; Tuaillon, N., et al.,J. Immunol. 152(1994) 2912-2920; Lonberg, N., et al., Nature 368(1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101; Taylor, L., et al., Int. Immunol. 6(1994) 579-591; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25(1995)65-93; およびHarding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci. 764(1995) 536-546; Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14(1996) 845-851;に記載されており、それらのすべての内容はそのまま参照により本明細書に組み込まれる。更に、US Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,545,807; 5,770,429; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; and WO 92/03918を参照のこと。
【０１３６】
ＯＸ４０Ｌに対するヒトモノクローナル抗体を完全に発生させるために、ＨｕＭＡｂマウスを、Ｌonberg, N., et al., Nature 368(1994)856-859; Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14(1996) 845-851およびWO 98/24884により記載のとおり、一般的方法に従ってＯＸ４０Ｌ抗原の精製されたもしくは濃縮された調製物および／またはＯＸ４０Ｌを発現する細胞で免疫感作させることができる。好ましくは、マウスは、最初の免疫感作時に６〜１６週齢であろう。例えば、ＫＬＨにカップリングされたもしくはＰＢＳ中の可溶性ＯＸ４０Ｌ抗原の精製されたもしくは濃縮された調製物（例えば、ＯＸ４０Ｌ発現細胞から精製された）を使用して、ＨｕＭＡｂマウスを腹腔内に免疫感作させることができる。これは、単離されたＯＸ４０Ｌタンパク質による免疫感作とＯＸ４０Ｌを発現する細胞、例えば腫瘍細胞系による免疫感作を交互に行うことにより組み合わせて、免疫応答を促進させることができる。種々の抗原による累積した経験は、完全フロイントアジュバント中の抗原で腹腔内に（ｉｐ）最初に免疫感作され、次いで不完全フロイントアジュバント中の抗原で隔週毎にｉｐ免疫感作（例えば、総計６回まで）されると、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは最善に応答することを示した。免疫応答は、眼窩後方の出血（retroorbital bleeds）により得られる血漿サンプルにより、免疫感作プロトコールの経過にわたって監視することができる。血漿は、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができ、そして十分な力価の抗ＯＸ４０Ｌヒト免疫グロブリンを有するマウスを、対応するＢ細胞の不死化のために使用することができる。マウスを抗原で３〜４日静脈内に追加抗原刺激した後殺し、そして脾臓およびリンパ節を除去することができる。いくつかのマウスは、各抗原について免疫感作されるであろう。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系統の総計１２匹のＨｕＭＡｂマウスを免疫感作させることができる。
【０１３７】
ＨＣｏ７マウスは、それらの内在性軽鎖（κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（JKD disruption)(Chen, J., et al., EMBO J. 12(1993)821-830)、それらの内在性重鎖遺伝子におけるＣＭＤ破壊（WO 01/14424の実施例１に記載のとおり）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14(1996) 845-851に記載のとおり）およびＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子（US Patent No.5,770,429に記載のとおり）を有する。
【０１３８】
ＨＣｏ１２マウスは、それらの内在性軽鎖（κ）遺伝子におけるＪＫＤ破壊（Chen, J., et al., EMBO J. 12(1993)821-830）、それらの内在性重鎖遺伝子におけるＣＭＤ破壊（WO 01/14424の実施例１に記載のとおり）、ＫＣｏ５ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14(1996) 845-851に記載のとおり）およびＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子（WO 01/14424の実施例２に記載のとおり）を有する。マウスリンパ球を単離しそして標準プロトコールに基づいてＰＥＧを使用してマウスミエローマ細胞系と融合させてハイブリドーマを発生させることができる。得られるハイブリドーマを、次いで抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。例えば免疫感作されたマウスからの脾臓およびリンパ節由来のリンパ球の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧによりＳＰ２／０非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）の数の６分の１に融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレート中に約２×１０5でプレートし、続いて選択培地中で約２週間インキュベーションする。
【０１３９】
次いで個々のウエルをヒト抗ＯＸ４０ＬモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。一旦多量のハイブリドーマ増殖が起こると、培地を通常１０〜１４日後に分析する。抗体分泌ハイブリドーマを再びプレートし、再びスクリーニングし、そしてもしもヒトＩｇＧについて依然としてポジティブであるならば、抗ＯＸ４０Ｌモノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次いで安定なサブクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して特徴付けのために組織培養培地中で抗体を産生させる。
【０１４０】
アッセイツリー（assay tree）は、主として、ＩｇＧに関する非特異的アッセイ（「ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ」）、次いで精製されたＯＸ４０Ｌタンパク質またはＯＸ４０Ｌ発現細胞への抗原結合の決定のための特異的ＥＬＩＳＡおよび見かけのＦＡＣＳアッセイからなる。次の段階は、抗ＯＸ４０Ｌ抗体の、精製されたＯＸ４０Ｌまたは細胞上に発現されたＯＸ４０Ｌに対するその天然の相互作用パートナー、例えば可溶性の精製されたＯＸ４０との競合を決定する機能的アッセイ、例えば競合ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳを含む。次の段階は、ＯＸ４０シグナル伝達の抗ＯＸ４０Ｌ抗体の阻止能力を決定する機能的アッセイ、例えばＮＦκＢ活性化（＝「ＮＦκＢアッセイ」）を含む。次の段階は、Ｔ細胞活性化に関する抗ＯＸ４０Ｌ抗体の阻止能力を決定する機能的アッセイ（「Ｔ細胞活性化アッセイ」および「ＴＴアッセイ」）を含む。
【０１４１】
ＣＤＲ配列は抗体−抗原相互作用について責任を担っているので、異なるヒト抗体からのフレームワーク配列上に本発明に従うＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより本発明に従うリコンビナント抗体を発現することが可能である（例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332(1998) 323-327; Jones, P., et al., Nature 321(1986) 522-525; and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989)10029-10033参照）。このようなフレームワーク配列は、生殖系列ヒト抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖系列配列は、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。何故ならば、それらはＢ細胞成熟期間中にＶ（Ｄ）Ｊ結合により形成される完全にアセンブリーされた可変遺伝子を含まないからである。生殖系列遺伝子配列は、各々可変領域にまんべんなく、高アフィニティー二次レパートリー抗体の配列とも異なるであろう。
【０１４２】
本発明は、好ましくはサンプルのＯＸ４０Ｌ（可溶性または膜に結合した）と本発明に従う抗体との結合を決定する免疫学的アッセイにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＯＸ４０Ｌの診断のための本発明に従う抗体の使用をさらに含む。
【０１４３】
他の局面では、本発明は、薬学的に許容されうる担体と共に処方された、本発明のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分の１つまたは組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。更に詳しくは、組成物は、医薬組成物または診断組成物であり、なおさらに詳しくは、医薬組成物は、上記に定義した抗体と少なくとも１種の薬学的に許容されうる賦形剤を含む。組成物は無菌でなければならず、そして組成物が注射器により送達可能である程度に流動性でなければならない。
【０１４４】
本明細書で使用された、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、いかなるおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗バクテリア剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入（infusion）により）のために適当である。好ましくは、このような担体は、好ましくは、等張性であり、好ましくは更に無機塩、糖、ポリオールおよび／または界面活性剤を含有する、水性のｐＨ緩衝化された溶液（例えば酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩またはヒスチジン）である。薬学的に許容されうる担体は、Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)に記載されたようなものでもある。
【０１４５】
抗体濃度は、好ましくは０．１mg/ml〜５０mg/mlである。好ましくは、緩衝化された溶液のｐＨ値は、１mM〜２００mMの緩衝剤濃度で４．０〜８．０の範囲にある。好ましい塩は、１mM〜２００mMの範囲にある塩化ナトリウムおよび／またはリン酸ナトリウムである。好ましい糖は、１％〜１５％（重量／容積）の範囲にあるスクロースおよび／またはトレハロースである。好ましいポリオールは、１％〜１５％（重量／容積）の範囲にあるグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび／または同様なものである。界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．５％（重量／容積）の範囲のポリソルベート（例えばポリソルベート２０または８０）および／またはポロキサメール（poloxamere）である。このましい医薬組成物は、０．１mg/ml〜５０mg/mlの抗体と１mM〜２００mMのリン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ４．０〜８．０を含有する。
【０１４６】
本発明の組成物は、それを必要としている患者に当技術分野で知られている多様の方法により投与することができる。当業者により認識されるとおり、投与の経路および／または方式は所望の結果に依存して変わるであろう。
【０１４７】
薬学的に許容されうる賦形剤または担体は、無菌の水性溶液剤または無菌の注射可能な溶液剤もしくは分散液剤の処方に応じて調合される製剤用の無菌の散剤を含む。このような媒体および薬学的有効物質のための作用物質の使用は当技術分野で知られている。
【０１４８】
本明細書で使用された語句「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、通常注射による腸内および局所的投与以外の投与方式を意味し、そして静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、カプセル内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内注射および注入を含むが、それらに限定されない。
【０１４９】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、患者に毒性であることなく、特定の患者、組成および投与方式について所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得るように変えることができる。選ばれる投与レベルは、使用される本発明の特定の組成物、または又はそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出の速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性、体重、状態、一般に健康及び以前の医学的経歴および医学分野で周知の同様な因子を含む種々の薬物動態学的因子に依存するであろう。典型的な毎週の投与量（weekly dosage）は、上記した因子に依存して約０．１mg/kg〜約２０mg/kg以上の範囲にあることができる。
【０１５０】
下記の実施例、参考文献、配列リストおよび図は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく前記した手法において改変がなされうることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１ａ】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３についての「結合ＥＬＩＳＡ」を示す。
【図１ｂ】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３についての「阻止ＥＬＩＳＡ」＋ＩＣ５０データを示す。
【図２】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１、ＬＣ．００５についての「阻止ＦＡＣＳ」を示す。
【図３】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１、ＬＣ．０１９およびＬＣ．０２４についての「ＮＦκＢ−アッセイ」を示す（非結合抗体）。
【図４】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１およびＬＣ．００５についての「Ｔ細胞活性化アッセイ」およびＩＣ５０値（図４：ＩＬ−２放出、図５：阻害）を示す。
【図５】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１およびＬＣ．００５についての「Ｔ細胞活性化アッセイ」およびＩＣ５０値（図４：ＩＬ−２放出、図５：阻害）を示す。
【図６】ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１およびＬＣ．０３３についての「ＴＴ−アッセイ」データを示す。
【図７】本発明の抗体のマウスＯＸ４０Ｌとのクロス反応性を示す。Ａ）トランスフェクションされた細胞上の及びＷＴ細胞上のｈＯＸ４０Ｌ発現のためのコントロール、Ｂ）ｈＯＸ４０Ｌ発現Ｋ５６２細胞への抗体の結合、Ｃ）トランスフェクションされた細胞およびＷＴ細胞上のｍＯＸ４０Ｌ発現のためのコントロール、Ｄ）ｍＯＸ４０Ｌ発現Ｋ５６２細胞への抗体の結合、およびＥ）ＷＴ  Ｋ５６２細胞への抗体の結合（ｎ＝３）。
【図８】本発明の抗体のＣ１ｑに結合する能力を示す（ｎ＝３）。
【図９】本発明の抗体のＣ３ｃを活性化する能力を示す（ｎ＝３）。
【図１０】本発明の抗体のＦｃγＲＩ（ｎ＝４）、ＦｃγＲＩＩａ（ｎ＝４）およびＦｃγＲＩＩＢ（ｎ＝４）に結合する能力を示す。
【図１１】本発明の抗体のＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）に結合する能力を示す（６つのドナーの平均±ＳＥＭ）。
【図１２】ウエスタンブロット；レーン１、４、７：マーカー；レーン２，５，８：１００ngＯＸ４０Ｌ；レーン３，６，９：４０ngＯＸ４０Ｌ。
【０１５２】
配列リストの説明
配列番号１  ＬＣ．００１のκ軽鎖、可変領域
配列番号２  ＬＣ．００１のγ重鎖可変領域
配列番号３  ＬＣ．００５のκ軽鎖、可変領域
配列番号４  ＬＣ．００５のγ重鎖可変領域
配列番号５  ＬＣ．０１０のκ軽鎖、可変領域
配列番号６  ＬＣ．０１０のγ重鎖可変領域
配列番号７  ＬＣ．０２９のκ軽鎖、可変領域
配列番号８  ＬＣ．０２９のγ重鎖可変領域
配列番号９  ＬＣ．０１９のκ軽鎖、可変領域
配列番号１０  ＬＣ．０１９のγ重鎖可変領域
配列番号１１  ＬＣ．０３３のκ軽鎖、可変領域
配列番号１２  ＬＣ．０３３のγ重鎖可変領域
配列番号１３  κ軽鎖定常領域
配列番号１４  γ１重鎖定常領域
配列番号１５  γ４重鎖定常領域
配列番号１６  ＬＣ．０３３のκ軽鎖、突然変異体可変領域
配列番号１  ＬＣ．０５９のκ軽鎖、可変領域
配列番号１７  ＬＣ．０５９のγ重鎖可変領域
配列番号１８  ＬＣ．０６０のκ軽鎖、可変領域  
配列番号１９  ＬＣ．０６０のγ重鎖可変領域
配列番号１    ＬＣ．０６３のκ軽鎖、可変領域
配列番号２０  ＬＣ．０６３のγ重鎖可変領域
配列番号２１〜５７  ＣＤＲ配列
配列番号５８  ＬＣ．００１のγ重鎖（ヒトＩｇＧ１型）
配列番号５９  ＬＣ．００１のγ重鎖（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡヒトＩｇＧ１突然変異体）
配列番号６０  ＬＣ．００１のγ重鎖（Ｓ２２８ＰヒトＩｇＧ４突然変異体）
配列番号６１  ＬＣ．００１のκ軽鎖
配列番号６２  ＬＣ．００５のγ重鎖（ヒトＩｇＧ１型）
配列番号６３  ＬＣ．００５のγ重鎖（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡヒトＩｇＧ１突然変異体）
配列番号６４  ＬＣ．００５のγ重鎖（Ｓ２２８ＰヒトＩｇＧ４突然変異体）
配列番号６５  ＬＣ．００５のκ軽鎖
配列番号６６  ＬＣ．０６０のγ重鎖（ヒトＩｇＧ１型）
配列番号６７  ＬＣ．０６０のγ重鎖（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡヒトＩｇＧ１突然変異体）
配列番号６８  ＬＣ．０６０のγ重鎖（Ｓ２２８ＰヒトＩｇＧ４突然変異体）
配列番号６９  ＬＣ．０６０のκ軽鎖
【０１５３】
略号
アミノ酸は、３文字コード（Ｌｅｕ）または１文字コード（Ｌ）において略記される。
Ｓ２２８Ｐは、ＩｇＧ４重鎖の位置２２８におけるセリンのプロリンへの交換を意味する。
Ｌ２３４は、ＥＵ番号付け（Ｋａｂａｔ）に従う位置２３４におけるアミノ酸ロイシンを意味する。
Ｌ２３４Ａは、位置２３４におけるアミノ酸ロイシンがアラニンに変えられていることを意味する。
Ｌ２３５Ａは、位置２３５におけるアミノ酸ロイシンがアラニンに変えられていることを意味する。
ＰＶＡ２３６は、２３６領域において、ＩｇＧ１のＥＬＬＧまたはＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡに修正されていることを意味する。
ＧＬＰＳＳ３３１は、３３１領域において、ＩｇＧ１のＡＬＰＡＰまたはＩｇＧ２のＧＬＰＡＰがＧＬＰＳＳに変えられていることを意味する。
ΔＧ２３６は、位置２３６におけるアミノ酸が欠失していることを意味する。
ＩｇＧ４ｘは、ＩｇＧ４における突然変異Ｓ２２８Ｐを意味する。
ＬＣ２０１０−００１は、ＬＣ．００１と同義である。
Ｆｃｇは、Ｆｃガンマ（Ｆｃγ）の同義語である。
【０１５４】
抗体の他の配列修正は、同様に命名される。
ヒスチジンタグに融合されたリコンビナント可溶性ヒトＯＸ４０Ｌ
ｈＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓ
ヒスチジンタグに融合されたリコンビナント可溶性マウスＯＸ４０Ｌ
ｍＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓ
フラッグタグに融合されたリコンビナント可溶性ヒトＯＸ４０Ｌ
ｈＯＸ４０Ｌ−Ｆｌａｇ
フラッグタグに融合されたリコンビナント可溶性マウスＯＸ４０Ｌ
ｍＯＸ４０Ｌ−Ｆｌａｇ
ヒトＦｃγに融合されたリコンビナント可溶性ヒトＯＸ４０
ｈＯＸ４０−ｈＦｃ
ウサギ抗マウスＦｃγモノクローナル抗体      Ａｎｔｉ−ｍＦｃ
ヤギ抗ヒトＦｃγモノクローナル抗体          Ａｎｔｉ−ｈＦｃ
マウス抗ヒスチジンモノクローナル抗体        Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ
マウスＦｃγに融合されたリコンビナント可溶性ヒトＯＸ４０
ｈＯＸ４０−ｍＦｃ
マウス抗ＴＮＦαモノクローナル抗体          Ａｎｔｉ−ＴＮＦα
マウス抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体        Ａｎｔｉ−ＣＤ４０Ｌ
腫瘍壊死因子アルファ                        ＴＮＦα
ＣＤ４０リガンド                            ＣＤ４０Ｌ
ラット抗ヒトＯＸ４０Ｌモノクローナル抗体    ＴＡＧ３４
ヒト抗ヒトＯＸ４０Ｌモノクローナル抗体      ＬＣ．００１、ＬＣ．００５
ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９
ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３
ＬＣ．０５９、ＬＣ．０６０
ＬＣ．０６３
フィトヘマグルチニン                        ＰＨＡ
【０１５５】
実施例
実施例１
抗ＯＸ４０Ｌ抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の発生
ハイブリドーマの培養
ＨｕＭＡｂハイブリドーマを、ＩＭＤＭ（Cambrex）、胎仔クローン１ウシ血清（Perbio Science）、起源ハイブリドーマクローニング因子（Ｉｇｅｎ）、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、２−メルカプトエタノール、ＨＡＴ（Sigma-Aldrich）およびカナマイシン（Invitrogen）中で３７℃で、５％ＣＯ2において培養した。
【０１５６】
トランスジェニックマウスの免疫感作手順
ＬＣ．２０１０−００１：６匹のＨＣｏ７（２匹のオスと４匹の雌）、系統ＧＧ２２０１（Medarex, San Jose, CA, USＡ）および４匹のＨＣｏ１２（４匹の雄）、系統ＧＧ２１９８（Mesarex, San Jose, CA, USA）を、ヒトＯＸ４０Ｌ（ｈＯＸ４０Ｌ）のための発現ベクターで一過性にトランスフェクションされた１×１０６ＨＥＫ２９３細胞、およびｈＯＸ４０Ｌの可溶性細胞外ドメイン２０μgで交互に免疫感作させた。８回の免疫感作を、ｈＯＸ４０Ｌ発現細胞による総計４回の腹腔内（ｉ．ｐ）免疫感作およびリコンビナントタンパク質による尾基部（tail base）での４回の皮下（ｓ．ｃ）免疫感作により行った。最初の免疫感作では、１×１０６ＨＥＫ２９３−ｈＯＸ４０Ｌ細胞１００μlを完全フロイントアジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA）１００μlと混合した。すべての他の免疫感作では、ＰＢＳ中の細胞１００μlを使用するかまたはリコンビナントタンパク質を不完全フロイントアジュバント（ICFA;Difco）１００μlと混合した。
【０１５７】
抗ｈＯＸ４０Ｌの血清力価が十分であることが見出されると、マウスを、融合の４日および３日前にＰＢＳ２００μl中のｈＯＸ４０Ｌ細胞外ドメイン１５μgで静脈内に（ｉ．ｖ）２回さらに追加抗原刺激した。
【０１５８】
ＬＣ．２０１０−００１、ＬＣ．０５９、ＬＣ．０６０およびＬＣ．０６３はＨＣｏ１２マウスに由来していた。
【０１５９】
ＬＣ．２０１０−００５、−０１０、−０１９、−０２９および−０３３：５匹のＨＣｏ７（４匹の雄と１匹の雌）、系統ＧＧ２２０１（Medarex, San Jose, CA,USA）を、ｈＯＸ４０Ｌの可溶性細胞外ドメイン２０μgで免疫感作させた。７回の免疫感作を、総計４回の腹腔内（ｉ．ｐ）免疫感作および尾基部での３回の皮下（ｓ．ｃ）免疫感作により行った。最初の免疫感作では、リコンビナントタンパク質１００μlを、完全フロイントアジュバント（CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA）１００μlと混合した。すべての他の免疫感作では、リコンビナントタンパク質１００μlを不完全フロイントアジュバント（ICFA; Difco）１００μlと混合した。
【０１６０】
抗ｈＯＸ４０Ｌの血清力価が十分であることが見出されると、マウスを、融合の４日および３日前にＰＢＳ２００μl中のｈＯＸ４０Ｌ細胞外ドメイン１５μgで静脈内に（ｉ．ｖ）２回さらに追加抗原刺激した。
【０１６１】
ハイブリドーマ発生
マウスを殺しそして脾臓および腹大動脈と大静脈をフランキングする（flanking）リンパ節を採集した。脾臓細胞およびリンパ節細胞の融合パートナーＳＰ２．０細胞との融合は、標準操作手順に従って行った。
【０１６２】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ
免疫感作されたマウスの血清における抗ＯＸ４０Ｌ力価を、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。プレート（９６平底ＥＬＩＳＡプレート、Greiner）を、ＰＢＳ中に溶解した精製されたＯＸ４０Ｌ０．１μg/mlでコーティングしそして室温で一夜コーティングした。次いで、ウエルを、ＰＢＳＴＣ（Tween 20、0.05%(Sigma-Aldrich Chemie BV）および２％ニワトリ血清（Gibco）を含有するＰＢＳ）で室温で１時間ブロッキングした。
【０１６３】
試験した血清タップ（serum taps）を、ＰＢＳＴＣ中に１：５０に希釈しそしてウエルに加えた。免疫感作の前にマウスから得られた血清をＰＢＳＴＣ中に１：１００で溶解しそしてネガティブコントロールとして使用した。ヒトＯＸ４０Ｌに対して指向されたマウス抗体をＰＢＳＴＣ中に１：５０で溶解しそしてポジティブコントロールとして使用した。プレートを室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ  ２０、００５％を含有するＰＢＳ）を使用して２回洗浄した。Ｇｔ−α−ｈｕｌｇＧ−ＨＲＰ（Jackson）をＰＢＳＴＣ中に１：５０００に希釈しそして試験されたタップおよびネガティブコントロールを含有するウエルに加えた。Ｒｂ−α−ｍＩｇＧ（Jackson）をＰＢＳＴＣ中に１：３０００に希釈しそしてポジティブコントロールを含有するウエルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションした。最後に、プレートをＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、そして調製されたばかりのＡＢＴＳ（登録商標）溶液（１mg/ml）（ＡＢＴＳ：２，２’−アジノ  ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）で暗所で室温（ＲＴ）で３０分間発色させた。吸光度を４０５nmで測定した。
【０１６４】
κ−ＥＬＩＳＡ
融合から生じたハイブリドーマがヒト抗体を発生するかどうかを決定するために、κ−ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中に１／１００００に希釈したラット抗ヒトＩｇＧκ軽鎖抗体（ＤＡＫＯ）で、４℃での一夜のインキュベーションによりコーティングした。ウエルを捨てた後に、プレートを、ＰＢＳＴＣ（Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％を補充したＰＢＳＣ（ＰＢＳＴＣ））との室温で１時間のインキュベーションによりブロッキングした。次いでウエルをＰＢＳＴＣ中に１／２に希釈したハイブリドーマ培養上清とインキュベーションした。ＰＢＳＴＣ中に１／２に希釈した培養培地をネガティブコントロールとして使用し、ＰＢＳＴＣ中に１／１００に希釈したκ鎖ポジティブマウス血清をポジティブコントロールとして使用した。次いで、ウエルを３回洗浄しそしてＰＢＳＴＣ中に１／２０００に希釈したＨＲＰをコンジュゲーションしたラット抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）2（ＤＡＫＯ）と３７℃で１時間インキュベーションした。ウエルを３回洗浄しそしてアッセイを、調製されたばかりのＡＢＴＳ（登録商標）溶液（１mg/ml）で暗所で室温（ＲＴ）で３０分間発色させた。吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４０５nmで測定した。
【０１６５】
実施例２
抗ＯＸ４０ＬＨｕＭａｂ可変ドメインのクローニングおよび配列分析
（κ軽鎖およびγ１重鎖）
ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂｓの軽鎖可変領域ＶＬおよび重鎖可変領域ＶHをコードするヌクレオチド配列を、標準ｃＤＮＡ合成／ＰＣＲ法により単離した。
【０１６６】
トータルＲＮＡを、GeneRacer（商標）Ｋｉｔ（Invitrogen）を使用して１×１０6〜１×１０7ハイブリドーマ細胞から調製した。ハイブリドーマ由来のＲＮＡを、第１鎖ｃＤＮＡ合成およびGeneRacer（商標）Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーのライゲーシヨンのためのテンプレートとして使用した。第２鎖ｃＤＮＡ合成およびＶＬおよびＶHコード化ｃＤＮＡフラグメントのさらなるＰＣＲ増幅を、それぞれ、カッパ軽鎖およびγ１重鎖定常領域のヌクレオチド配列に相補性のリバース軽鎖及び重鎖プライマーならびに５’−特異的GeneRacer（商標）プライマーにより行った。ＰＣＲ産物を、Invitrogen（商標）Life TechnologiesからのＴＯＰＯ（商標）ＴＡクローニングキットおよびクローニングベクターとしてｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（商標）を使用してクローニングした。クローニングされたＰＣＲ産物を、消化のためのＥｃｏＲＩを使用して適切なプラスミドの制限マッピングにより同定し、そして、それぞれ、ＶＬおよびＶHのための約７４０および７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントサイズを予測／計算した。
【０１６７】
クローニングされたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列を二本鎖配列決定により決定した。
【０１６８】
ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウエアパッケージバージョン１０．２およびＶｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ８（InforMax,Inc）を一般的データプロセッシングのために使用した。ＤＮＡおよびタンパク質配列を、ＧＣＧモジュールＣＬＵＳＴＡＬＷを使用してアライメントさせた。配列アライメントは、プログラムＧＥＮＥＤＯＣ（バージョン２．１）を使用して作成された。
【０１６９】
実施例３
抗ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ１  ＨｕＭａｂのための発現プラスミドの構築
抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂ軽鎖及び重鎖コード化遺伝子を哺乳動物細胞発現ベクター中に別々にアセンブリーした。
【０１７０】
それにより、抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂ軽鎖可変領域（ＶＬ）およびヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ、配列番号１３、または配列番号６１、６５もしくは６９からの）をコードする遺伝子セグメントを、抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂ重鎖可変領域（ＶH）およびヒトγ１重鎖定常領域（ＣH1−Ｈｉｎｇｅ−ＣH2−ＣH3、配列番号１４または配列番号５８、６２もしくは６６からの）のための遺伝子セグメントが接合されたと同様にして、接合させた。
【０１７１】
コドン使用頻度を推定することができるヒト軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth ed., NIH Publication No.91-3242(1991)に与えられる。
【０１７２】
抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂκ軽鎖の転写単位は、下記のエレメント：
−ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期（immediate early）エンハンサーおよびプロモーター
−コザック配列を含む合成５’−ＵＴ、
−シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−５’端部における独特のＢｓｍＩ制限部位およびスプライスドナー部位および３’端部における独特のＮｏｔＩ制限部位を持って配列された（arranged）クローニングされた抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂ可変軽鎖ｃＤＮＡ、
−イントロン２マウスＩｇ−κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域［Picard, D., and Schaffner, W., Nature 307(1984)80-82］および
−ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリＡ」シグナル配列、
からなる。
【０１７３】
抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂγ１重鎖の転写単位は、下記のエレメント：
−ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサーおよびプロモーター
−コザック配列を含む合成５’−ＵＴ、
−シグナル配列イントロンを含む改変されたマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−５’における独特のＢｓｍＩ制限部位およびスプライスドナー部位および３’端部における独特のＮｏｔＩ制限部位を持って配列されたクローニングされた抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂ可変重鎖ｃＤＮＡ、
−マウスＩｇμエンハンサーを含むゲノムヒトγ１重遺伝子定常領域（Neuberger, M.S., EMBO J.2(1983)1373-1378）、
−ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」シグナル配列、
からなる。
【０１７４】
抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂκ軽鎖およびγ１重鎖発現プラスミドの機能的エレメント：抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂκ軽鎖またはγ１重鎖発現カセットの外に、これらのプラスミドは、
−ヒグロマイシン耐性遺伝子
−エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の複製の起点、ｏｒｉＰ
−Ｅ．ｃｏｌｉにおいてこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製の起点および
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
【０１７５】
実施例４
抗ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ４  ＨｕＭａｂのための発現プラスミドの構築
抗ＯＸ４０Ｌγ４重鎖プロトタイプ発現プラスミドは、ヒトゲノムγ１定常領域およびγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列をヒトゲノムγ４定常領域（配列番号１５、または配列番号６０，６４もしくは６８からの突然変異していないγ４定常領域からの）およびγ４免疫グロブリンポリアデニル化シグナル配列により置き換えることにより、抗ＯＸ４０Ｌγ１重鎖発現プラスミドから誘導された。
【０１７６】
抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂκ軽鎖の発現のために、同じ発現プラスミドを、ＩｇＧ１について説明したとおりに使用した（上記参照）。
【０１７７】
実施例５
ＬＣ．００１に基づく突然変異体（変異体）抗ＯＸ４０Ｌ  ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のための発現プラスミドの構築
突然変異体抗ＯＸ４０Ｌγ１−およびγ４−重鎖をコードする発現プラスミドは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を使用する野生型発現プラスミドの部位特異的突然変異誘発により創生された。アミノ酸は、ＥＵ番号付けに従って番号を付けられた（Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD(1991)）。
【０１７８】
【表１】
2010280673.tif 000002
【０１７９】
実施例６
リコンビナント抗ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂｓの産生
１０％超低ＩｇＧ  ＦＣＳ（Gibco）、２mMグルタミン（Gibco）、１％容積／容積非必須アミノ酸（Gibco）および２５０μg/mlＧ４１８（Roche）を補充されたＤＭＥＭ（Gibco）中で培養された付着ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１０８５２）の一過性トランスフェクションによりリコンビナントＨｕＭａｂｓを発生させた。トランスフェクションのために、Fugene（商標）6（Roche）トランスフェクション試薬を３：１〜６：１の範囲の試薬（μl）対ＤＮＡ（μg）の割合で使用した。免疫グロブリン軽鎖および重鎖を、１：２〜２：１の軽鎖対重鎖コード化プラスミドのモル比を使用して２つの異なるプラスミドから発現させた。ＨｕＭａｂ含有細胞培養上清を、トランスフェクションの４〜１１日後に回収した。上清を精製まで−２０℃に保存した。
【０１８０】
例えば、ＨＥＫ２９３におけるヒト抗体のリコンビナント発現に関する一般的情報は、Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75(2001)197-203に与えられる。
【０１８１】
実施例７
抗体ＴＡＧ−３４、ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３のアフィニティー分析
機器：Biacore 3000、ランニングバッファーおよび反応バッファー：ＨＢＳ−Ｐ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）、２５℃。アナライトの注射は、０．７８nM〜１００nMの７つの濃度で３分間行いそしてＨＢＳ−Ｐで５分間洗浄した。表面（カルボキシメチル化されたデキストラン表面、ＣＭ）の再生は、１０mMグリシンｐＨ２．０の各々１分間の２回の注射により行った。チップ、アッセイフォーマットおよび注射のシーケンスおよび速度論的データは、下表における説明に対応する。速度論的データは、１：１ラングミュア結合モデルに速度論的データを適合させることにより計算された。
【０１８２】
【表２】
2010280673.tif 000003
ＴＡＧ３４とｍＯＸ４０Ｌとの相互作用は測定できなかった。
【０１８３】
すべてのＢｉａｃｏｒｅアッセイについてのデータ評価およびデータ寄託
ネガティブコントロールデータ（例えば、緩衝曲線）は、システム固有のベースラインドリフトの補正およびノイズシグナル減少のためにサンプル曲線から差し引いた。BiaEvaluationバージョン４．０１をセンサーグラムの解析およびアフィニティーデータの計算のために使用した。
【０１８４】
実施例８
ｈＯＸ４０Ｌの固定化されたｈＯＸ４０との相互作用を阻害する抗ｈＯＸ４０Ｌ抗体の阻害競合アッセイ
機器：Biacore 3000、ランニングバッファーおよび反応バッファー：ＨＢＳ−Ｐ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）、２５℃。注射の前に、アナライト（１０mM）および競合剤（０．７８nM〜１００nMの８つの濃度）を２２℃で少なくとも２０分間プレインキュベーションした。アナライト＋／−競合剤の注射を３分間行いそしてＨＢＳ−Ｐで３分間洗浄した。表面の再生は、１０mMグリシンｐＨ２．０の各１分の２回の注射により行った。チップ、アッセイフォーマットおよび注射のシーケンスおよび速度論的データは、下表３における説明に対応する。
【０１８５】
【表３】
2010280673.tif 000004
【０１８６】
すべての抗体は、溶液中のＯＸ４０へのＯＸ４０Ｌの結合を阻害する（溶液アフィニティー）。ＬＣ．００１およびＬＣ．００５は、ＴＡＧ３４よりも低いＩＣ５０値を示す。
【０１８７】
実施例９
抗ＯＸ４０Ｌ抗体ＴＡＧ３４、ＬＣ．００１、ＬＣ．００５、ＬＣ．０１０、ＬＣ．０１９、ＬＣ．０２９、ＬＣ．０３３、ＬＣ．０６０のエピトープ特徴付け
機器：Biacore 3000、ランニングバッファーおよび反応バッファー：ＨＢＳ−Ｐ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）、２５℃。エピトープグループを、列挙された抗体間の交差競合（cross competition）により決定した。注射の前に、アナライト（５０mM）および競合剤（１００nM）を２２℃で少なくとも２０分間プレインキュベーションした。アナライト＋／−競合剤の注射を２分間行いそしてＨＢＳ−Ｐで３分間洗浄した。表面の再生は、１０mMグリシンｐＨ２．０の各１分の２回の注射により行った。チップ、アッセイフォーマットおよび注射のシーケンスおよび速度論的データは、下表４における説明に対応する。
【０１８８】
【表４】
2010280673.tif 000005
【０１８９】
ＴＡＧ３４により認識されたＯＸ４０Ｌエピトープは、エピトープＡとして定義された。しかしながら、ＴＡＧ３４は、１００ngの抗体濃度において変性されたＯＸ４０Ｌに結合しない（ウエスタンブロットにおいて）。１つのエピトープグループ（ＡまたはＢ）内の抗体は、交差阻害活性（cross inhibitory activity）を示すが、異なるグループからの抗体は、相加結合シグナル（additive binding signal）を示す。ＬＣ．０１９は、グループＡからおよびグループＢからの他の抗体を中和する。
【０１９０】
実施例１０
ＴＡＧ３４、ＬＣ．００１およびＬＣ．００５のＣＤ４０ＬおよびＴＮＦαへの結合特異性
機器：Biacore 3000、ランニングバッファーおよび反応バッファー：ＨＢＳ−Ｐ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）、２５℃。アナライトの注射は、１００nMおよび５００nMで３分間行いそしてＨＢＳ−Ｐで２分間洗浄した。表面の再生は、１００mMＨＣｌの各々１分間の２回の注射により行った。チップ、アッセイフォーマットおよび注射のシーケンスおよび速度論的データは、下表５における説明に対応する。
【０１９１】
【表５】
2010280673.tif 000006
【０１９２】
このアッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌは、すべての抗体に対するまたはチップ表面に対するいくらかの非特異的結合を示したが、バックグラウンドシグナルを差し引いた後にこのアッセイは、固定化された抗体ＴＡＧ３４、ＬＣ．００１およびＬＣ．００５に対するＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ（５００nMまで）の非特異的結合がないことを示した。
【０１９３】
実施例１１
抗体ＬＣ．００１−ＩｇＧ１およびＬＣ．００１−ＩｇＧ４ｘのアフィニティー分析
機器：Biacore 3000、ランニングバッファーおよび反応バッファー：ＨＢＳ−Ｐ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐｈ７．４）、２５℃。アナライトの注射は、０．７８nM〜１００nMの８つの濃度で３分間行いそしてＨＢＳ−Ｐで５分間洗浄した。表面の再生は、１００mM  ＨＣｌの各々１分間の２回の注射により行った。チップ、アッセイフォーマットおよび注射のシーケンスおよび速度論的データは、下表における説明に対応する。速度論的データは、１：１ラングミュア結合モデルに速度論的データを適合させることにより計算された。
【０１９４】
【表６】
2010280673.tif 000007
【０１９５】
ＬＣ．００１およびＬＣ．００１−ＩｇＧ４ｘは、ｈＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓに対する同じアフィニティーを示す。
【０１９６】
実施例１２
ＯＸ４０Ｌに結合する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＳＡコーティングしたプレート（９６平底ＥＬＩＳＡブレート、Microcoat）をインキュベーションバッファー（ＩＢ＝０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Serva）および１％遮断タンパク質を含有するＰＢＳ）中に溶解された０．５μg/mlビオチニル化ＯＸ４０Ｌで室温で１時間コーティングした。次いでプレートを洗浄バッファー（ＷＢ＝０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する生理食塩水）を使用して２回洗浄した。
【０１９７】
サンプル（細胞培養上清または精製した抗体）をＩＢ中に段階希釈しそしてウエルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＷＢを使用して２回洗浄した。次いで、ヒトＩｇＧに対するヤギ抗体とＰＯＤ（Dianova）のコンジュゲートをＩＢ中に５０ng/mlに希釈しそしてウエルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションした。最後に、プレートをＷＢを使用して２回洗浄しそしてすぐ使用できるＡＢＴＳ（登録商標）溶液（Roche）で暗所で室温（ＲＴ）で発色させた。最も高い濃度の吸光度が十分なＯＤに達した後に、４０５nmで吸光度を測定した（図１ａ）。３nM〜８nMの範囲のＥＣ５０値が得られた。
【０１９８】
実施例１３
ヒトＯＸ４０／ヒトＯＸ４０Ｌの相互作用を阻害する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＳＡコーティングしたプレート（９６平底ＥＬＩＳＡプレート、Microcoat. Germanｙ）をＩＢ中に溶解された０．５μg/mlビオチニル化ＯＸ４０Ｌで室温で１時間コーティングした。次いでプレートをＷＢ（ＰＢＳ緩衝液、０．１％（重量／容量）Ｔｗｅｅｎ（商標）２０）を使用して２回洗浄した。
【０１９９】
サンプルをＩＢ中に１μg/mlの濃度に希釈しそして段階希釈物においてウエルに加えた。ＯＸ４０ＬへのＯＸ４０の最大結合を達成するために、いくらかのウエルにおいてＩＢのみを加えた。次いで各ウエルに、０．２μg/mlの濃度の、Digoxigenin(Roche Diagnostics GmbH, DE）とコンジュゲーションされたヒトＯＸ４０の溶液を加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＷＢを使用して２回洗浄した。ヒツジ＜Digoxigenin＞−ＰＯＤ（Roche）をＩＢ中に５０mU/mlに希釈しそしてウエルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションした。最後に、プレートをＷＢを使用して２回洗浄しそしてすぐ使用できるＡＢＴＳ（登録商標）溶液（Roche）により暗所で室温（ＲＴ）で発色させた。吸光度を、１０〜２０分後に４０５nmで測定した（図１ｂ）。１nM〜４nMの範囲のＩＣ５０を得た。
【０２００】
実施例１４
Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌ細胞）上に発現されたヒトＯＸ４０ＬとヒトＯＸ４０の相互作用を阻害するＨｕＭａｂｓの検出のためのＦＡＣＳアッセイ
目的：Ｄｉｇ標識されたｈＯＸ４０：ｈＦｃ融合タンパク質のｈＯＸ４０Ｌ発現細胞系Ｋ５６２＿ｈＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロッキングするためのＨｕＭａｂ  ｈＯＸ４０Ｌの性質の決定のためのアッセイ
【０２０１】
手順：このアッセイは、「アッセイ試薬」としてＤｉｇ標識されたｈＯＸ４０：ｈＦｃおよび「競合剤」としてＨｕＭａｂ  ｈＯＸ４０Ｌを使用して行われた。
【０２０２】
アッセイ試薬：ストック０．５μg／μl−ＰＢＳ中に１：１０に希釈された）、１００μl抗ジオキシゲニンＦＬＵＯＳ、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／１％ブロッキング試薬中に１：２５に希釈された（Roche Diagnostics GmbH, DE）。
【０２０３】
２×１０5Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌ細胞（ＩＳＦ−０中で成長させた）を、ＰＢＳ２ml中で洗浄しそしてＰＢＳ１００μl中に再懸濁させた。この後ＰＢＳ中の競合剤（０：１／１：１／１．５：１／２：１／２．５：２／５：１競合剤／試薬関係）を添加した。次いで室温で日光において３０分間インキュベーションした。次いで試薬（ＰＢＳ中の）を加えた；インキュベーション時間：３０分、室温および日光。細胞をＰＢＳ２mlで洗浄しそして遠心によりペレット化した。染色用の二次抗体（抗ジゴキシゲニン−フルオレセイン）、Ｆａｂフラグメント（Roche, 1207741）を加えそして暗所で４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳ２mlで洗浄しそして遠心によりペレット化した。その後細胞をＰＢＳ０．５ml中に再懸濁させた。サンプルの測定をＦＡＣＳ−Ｓｃａｎにおいて行った（図２）。
【０２０４】
実施例１５
ｈＯＸ４０／ｈＯＸ４０Ｌシグナリングについての抗体の阻害能力の決定のための機能的アッセイ（「ＮＦκＢアッセイ」）
Ｈｅｌａ野生型（ｗｔ）およびヒトＯＸ４０を発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ＿ＯＸ４０）を、最小必須培地（ＭＥＭ）、１×ピルビン酸Ｎａ、１×非必須アミノ酸（Gibco）、１０％ＦＣＳにおいてそしてリコンビナント細胞の場合には＋６００μg/mlＧ４１８において成長させた。Ｋ５６２およびＯＸ４０Ｌを発現するＫ５６２をＩＳＦ−Ｏ培地中で成長させそしてリコンビナント細胞の場合には、２００μg/mlＧ４１８を加えた。
【０２０５】
ＨｅＬａ＿ｗｔまたはＨｅＬａ＿ＯＸ４０細胞を、９６ウエルプレートｗ／ｏＧ４１８中に３×１０4細胞／１００μlの細胞密度で播種しそしてＣＯ2インキュベータ中で一夜インキュベーションした。Ｋ５６２＿ｗｔまたはＨ５６２＿ＯＸ４０Ｌ細胞を１：１の細胞対細胞関係において加えた。ＯＸ４０を発現するホルマリン固定された又はホルマリン固定されていないＫ５６２（−７０℃で凍結された）を解凍しそしてＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で１：１に希釈し；Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌ細胞を、ＯＸ４０Ｌに対する抗体と共に室温で３０分間プレインキュベーションした。Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌ細胞による刺激時間は３０分〜１５０分であった。細胞核からのタンパク質抽出をActive MotifからのＮＥ−Ｋｉｔにより供給者の指示に従って行った。Active MotifからのＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦκＢ−ＥＬＩＳＡ（供給者の指示に従ってアッセイを行った）を使用して、ＮＦκＢ活性化をもたらす、ＯＸ４０シグナリングを決定した。Ｔｅｃａｎ  ＭＴＰ−Ｒｅａｄｅｒにおいて波長４５０／６２０nmで吸光度の測定を行った（図３）。すべてのＬＣ抗体について０．６〜５nMの範囲のＩＣ５０値を得た。
【０２０６】
実施例１６
Ｔ細胞活性化アッセイ
アッセイ原理
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＬ）を、最適より低い濃度のＴ細胞マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化し、そしてＯＸ４０Ｌを過発現するＫ５６２細胞で共刺激する（co-stimulated）。アッセイ条件下に、活性化されたＴ細胞を３７℃で２４時間インキュベーションして、ＩＬ−２を産生させる。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して上清中のサイトカインを測定する。Ｍａｂのブロッキグ効果を決定するために、Ｋ５６２＿ＯＸ４０Ｌ細胞をＰＢＬとの共培養の前に抗体の適切な希釈物と１時間プレインキュベーションした。
【０２０７】
手順
Histopaque（登録商標）-1077（Sigma）における密度勾配遠心によりヘパリンを添加された全血から、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＬ）を分離する。Hanksで洗浄した後に、細胞をTurkの溶液を使用して係数し、そして細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン（Gibco 10378-016）および１０％ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ  １６４０（Gibco）中に１０6／mlの濃度で再懸濁させる。Ｋ５６２コントロール細胞（野生型）を上記したとおりに補充された同じＲＰＭＩ培地中に維持する。ＯＸ４０ＬによりトランスフェクションされたＫ５６２細胞をGeneticin（G418、Gibco）を補充された同じ培地中に５０mg/mlの最終濃度に維持する。Ｋ５６２細胞（ＷＴまたはＯＸ４０Ｌ＋）を、１．５×１０5細胞／mlに同じ培地で希釈しそして５０μl／ウエル（０．７５×１０４／ウエル）において９６ウエル組織培養プレートの各ウエルに分配する。Ｍａｂの適切な希釈物を２０μl／ウエルの容積において細胞に加えそして３７℃で１時間インキュベーションする。各希釈物を二重測定ウエル（duplicate wells）において試験する。ＰＢＬを、１００μl／ウエル（１０5細胞／ウエル）の容積で加える。ＰＢＬ対Ｋ５６２細胞の最終比は〜１３：１である。ＰＨＡ（１０Ｘ）（Sigma L-9132）を２０μl／ウエルで加える（最終濃度０．７５μg/ml）。ウエル当たりの総容積はＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２００μlにする。プレートを５％ＣＯ2−給湿されたインキュベータ中で３７℃で２４時間インキュベーションする。プレートの遠心の後、上清を集めそして製造者の指定に従ってＥＬＩＳＡ（BD,San Diego, CA, Cat No2627K1）によりＩＬ−２を試験する（図４）。ＩＣ５０（ＯＸ４０Ｌで刺激されたＰＢＬによるＩＬ−２放出の５０％を阻止するＭａｂ濃度）を計算するために、コントロール培養物（ＰＢＬ＋ＰＨＡ＋Ｋ５６２ＷＴ）において産生されたバックグラウンドＩＬ−２濃度を、Ｋ５６２ｘＯＸ４０Ｌ＋細胞により刺激されたＰＢＬにより産生された総ＩＬ−２から差し引いた（図５）。ＩＣ50  ＴＡＧ３４：０．０７μＭ；ＬＣ．００１：２nM；ＬＣ．００５：１０nM。ＩＣ50値は２〜１０nMの範囲にある。
【０２０８】
実施例１７
破傷風トキソイドにより刺激された末梢血リンパ球に対する抗体の阻害効果を試験する破傷風アッセイ「ＴＴ−アッセイ」）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll Hypaqueにより、ヘパリンを添加された血液から単離した。大部分の場合に、単離されたばかりのＰＢＭＣをこのアッセイのために使用した。ある場合には冷凍保存されたＰＢＭＣも使用した。このアッセイのための培地は、１０％ヒト男性ＡＢ血清（Sigma-Aldrich）；２mMグルタミンおよびPen/Strep（抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシンのすぐ使用できる混合物（Roche Diagnostics GmbH DE）；２０mlに再構成された凍結乾燥物；１０００ml培地当たり２mlの使用）を含有するＲＰＭＩであった。
【０２０９】
プラスチックに付着させるために、ウエル当たり３００．０００ＰＢＭＣを、９６ウエル平底プレートにおいて一夜プレインキュベーションした。
【０２１０】
次の日に破傷風トキソイド（ＴＴ）（Chiron Behring）を２〜５μg/mlの最終濃度でウエルに加えた。ポジティブコントロールウエル（最大増殖／刺激）はＴＴのみを含有しており、すべての他のウエルに、抗体（精製されたＩｇＧ）を１０μg/mlの最終濃度になるように加えた。マウスＭａｂＴＡＧ３４は、このアッセイにおいて含まれた（最終濃度１０μg/ml）。非刺激性バックグラウンドとして、コントロール培地のみを使用した。すべてのアッセイは三重測定するように（in triplicates）セットアップされた。
【０２１１】
６日のさらなるインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ2、９５％湿度）の後、3Ｈチミジンを１μキューリー／mlの最終濃度となるように加え、１６時間の追加のインキュベーション期間の後に、プレートを回収しそして取り込まれた3Ｈチミジンをβ計数器において決定した（図６）。
【０２１２】
実施例１８
ＯＸ４０Ｌ抗体のマウスＯＸ４０Ｌとの交差反応性
本発明の抗体のマウスＯＸ４０Ｌと交差反応する能力を決定するために、段階的に希釈した抗体およびコントロール抗体を、ｍＯＸ４０Ｌを安定に発現するＫ５６２−ｍＯＸ４０Ｌ細胞と共にインキュベーションした。Ｋ５６２  ＷＴ細胞およびｈＯＸ４０Ｌを安定に発現するＫ５６２−ｈＯＸ４０Ｌ細胞への結合も評価した。ネガティブコントロールとして、スカシ貝ヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin）（α−ＫＬＨ）に対して指向されたＨｕＭａｂ抗体を使用した。抗体ＲＭ１３４Ｌ、ラット抗ｍＯＸ４０Ｌ（eBioscience, San Diego, CA）が、ｍＯＸ４０Ｌ発現のためのポジティブコントロールとして含まれた。抗体ＴＡＧ−３４、マウス抗ｈＯＸ４０Ｌ（MBL, Nagoya, Japan）がｈＯＸ４０Ｌ発現のためのポジティブコントロールとして含まれた。結合したヒト抗体の検出のために、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲーションされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した。結合したＲＭＩ３４Ｌの検出のために、ビオチニル化ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（DAKO、Glostrup, Denmark）を、フィコエリトリン（ＰＥ）（ＤＡＫＯ）とコンジュゲーションされたストレプトアビジンと組み合わせて使用した。結合したＴＡＧ−３４の検出のために、ＦＩＴＣコンジュゲーションされたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。ＥＣ５０値または試験したＨｕＭａｂの２０μg/mlでの最大結合（Ｂｍａｘ）に関する計算を、Graphpad Prismソフトウエアを使用する非線形回帰（可変スロープを有するＳ字状用量−応答）を使用して決定した。
【０２１３】
結果：
本発明に従うＬＣ．００１は、５．１６±２．９３μg/mlのＥＣ５０値および３８５．２２のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値により示されたとおりｈＯＸ４０Ｌに結合することができたが、それぞれ１１．４１および９．６７のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値により示されたとおりｍＯＸ４０ＬまたはＷＴ細胞に結合することができなかった。さらに、本発明に従うＬＣ．００１（ＩｇＧ４）は、８．１９±１．０５μg/mlのＥＣ５０値および３１１．３０のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値により示されたとおりｈＯＸ４０Ｌにも有効に結合することができたが、それぞれ１３．４７および９．５８のＢｍａｘ（ＭＦＩ）により示されたとおりｍＯＸ４０ＬまたはＷＴ細胞に結合することができなかった。予想されるとおり、ネガティブコントロールα−ＫＬＨはいかなる細胞にも結合しなかった（図７）。したがって、本発明に従うＯＸ４０Ｌ抗体は、ヒトＯＸ４０Ｌと比較してマウスＯＸ４０Ｌへの少なくとも３０倍低い結合を示す。
【０２１４】
実施例１９
ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂの補体系を活性化する潜在力
Ｃ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡ
本発明の抗体のＣ１ｑ結合およびＣ３活性化を誘導する能力を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートを段階的に希釈した抗体およびコントロール抗体でコーティングした。ネガティブコントロールとして、Ｃ１ｑに非常に弱く結合するヒトＩｇＧ４（Tke Binding Site, Birmingham, England）を使用した。ヒトＩｇＧ１（The Binding Site）およびα−ＫＬＨ（ＩｇＧ１）は、ポジティブコントロールとして含まれた。次いで、コーティングされた抗体を、リコンビナントＣ１ｑおよびＣ３のソースとしてヒトのプールされた血清と共にインキュベーションした。結合したＣ１ｑの検出のために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲーションされたブタ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）と組み合わせたＣ１ｑに対して指向されたウサギ抗体（ＤＡＫＯ）を使用した。活性化されたＣ３ｃ（Ｃ３の活性化により発生した）の検出のために、ＨＲＰとコンジュゲーションしたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）と組み合わせてマウス抗ヒトＣ３ｃ抗体（ＤＡＫＯ）を使用した。コーティング有効性の差を評価するために、コーティングされた抗体を、ＨＲＰとコンジュゲーションされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で可視化した。ＥＣ５０値または試験されたＨｕＭａｂ１０μg/mlにおける最大結合（Ｂｍａｘ）に関する計算を、Graphpad Prismソフトウエアを使用する非線形回帰（可変スロープを有するＳ字状用量−応答）を使用して決定した。
【０２１５】
結果：  
本発明に従うＬＣ．００１は、２．１９±０．４２μg/mlのＥＣ５０値および３．０８９のＢｍａｘ（ＯＤ４０５）値により示されたとおり、Ｃ１ｑに有効に結合することができた。さらに、両ポジティブコントロールヒトＩｇＧ１および抗ＫＬＨは、それぞれ４．１７±１．０８μg/mlおよび２．５７±１．５１μg/mlのＥＣ５０値、ならびにそれぞれ２．６８５および３．３０６のＢｍａｘ（ＯＤ４０５）値により示されたとおり、Ｃ１ｑに有効に結合することができた。予想されるとおり、ネガティブコントロールヒトＩｇＧ４は、０．３５３のＯＤ４０５Ｂｍａｘ値により示されたとおり、Ｃ１ｑに結合しなかった。さらに、本発明に従うＬＣ．００１ＩｇＧ４ｘは、０．３５７のＯＤ４０５Ｂｍａｘ値により示されたとおり、Ｃ１ｑに結合する能力を失っていた。
【０２１６】
Ｃ１ｑ結合能力と一致して、ＬＣ．００１によるＣ３ｃ沈着（deposition）が、２．６７±０．１６μg/mlのＥＣ５０値および２．６１４のＢｍａｘ（ＯＤ４０５）値で、抗体濃度依存性方式で起こった。さらに、両ポジティブコントロールヒトＩｇＧ１および抗ＫＬＨは、それぞれ５．４５±０．３６μg/mlおよび２．１６±０．２６μg/mlのＥＣ５０値、ならびにそれぞれ２．５４３および２．６３３のＢｍａｘ（ＯＤ４０５）値により示されたとおり、Ｃ３ｃを有効に沈着することができた。予想されるとおり、ネガティブコントロールヒトＩｇＧ４は、０．０９５のＯＤ４０５Ｂｍａｘ値により示されたとおり、Ｃ３ｃを沈着しなかった。さらに、本発明に従うＬＣ．００１ＩｇＧ４ｘは、０．０９０のＯＤ４０５Ｂｍａｘ値により示されたとおり、Ｃ３ｃを沈着する能力を失っていた（図８および図９）。
【０２１７】
実施例２０
ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂｓのＦｃγレセプターＩ、ＩＩａおよびＩＩｂに結合する潜在力
ＩｇＧで誘導される抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、エフェクター細胞に対するＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）により媒介される。本発明の抗体のＦｃγＲｓに結合する能力を決定するために、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂで安定にトランスフェクションされたＩＩＡ１．６細胞（ＩＩＡ１細胞から限界希釈により誘導された；Jones, B., et al., J. Immunol. 136(1986) 348-356）および野生型細胞を、段階希釈された抗体およびコントロール抗体と共にインキュベーションした。ネガティブコントロールとして、ＦｃγＲＩに結合しないヒトＩｇＧ２（The Binding Site Ltd）およびＦｃγＲＩＩに結合しないヒトＩｇＧ４（The Binding Site）を使用した。ヒトＩｇＧ１（The Binding Site）は、ＦｃγＲＩ結合のためのポジティブコントロールとして含まれ、そしてヒトＩｇＧ３（The Binding Site）はＦｃγＲＩＩ結合のためのポジティブコントロールとして含まれた。結合した抗体を、フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲーションされたヒトＩｇＧに対して指向された抗体を使用するＦＡＣＳ分析により検出した。ＥＣ５０値または試験されたＨｕＭａｂ１０μg/mlにおける最大結合（Ｂｍａｘ）に関する計算を、Graphpad Prismソフトウエアを使用する非線形回帰曲線適合（可変スロープ）を使用して決定した。
【０２１８】
ＬＣ．００１は、０．１１±０．０３μg/mlのＥＣ５０値および８０４１．５４のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値により示されたとおりＦｃγＲＩに有効に（コントロールＩｇＧ１抗体に匹敵しうる）結合することができたが、それぞれ２５．０６および２１．１８のＢｍａｘ（ＭＦＩ）により示されたとおりＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに結合することができなかった。
【０２１９】
ＬＣ．００１ＩｇＧ４ｘは、０．８６±０．１２μg/mlのＥＣ５０値および６０３０．０７のＢｍａｘ（ＭＦＩ）で、ＬＣ．００１に比較してＦｃγＲＩへの結合においてより少なく有効でありそしてコントロールＩｇＧ４抗体に匹敵していた。ＬＣ．００１ＩｇＧ４ｘのＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂへの結合は観察されなかったが（それぞれ２１．４０および１９．２７のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値）、これに対してコントロールＩｇＧ３抗体は、結合することができた（それぞれ５３６．６５および４１８．５９のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値）（図１０）。したがって、ＦｃγＲＩへの結合のＥＣ５０値は、抗体ＬＣ．００１のＥＣ５０値に比較してＬＣ．００１ＩｇＧ４ｘでは８倍である。
【０２２０】
実施例２１
ＯＸ４０Ｌ  ＨｕＭａｂｓのＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに結合する潜在力
本発明の抗体のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合する能力を決定するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を単離しそして、ＦｃγＲＩＩＩａに対するブロッキングマウス抗体（抗ＣＤ−１６、クローン３Ｇ８、ＲＤＩ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）２０μg/mlの存在下または不存在下にＨｕＭａｂ抗体およびコントロール抗体２０μg/mlとインキュベーションして、ＦｃγＲＩＩＩａを介する結合を証明した。ネガティブコントロールとして、ＦｃγＲＩＩＩａに結合しないヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４（The Binding Site）を使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３（The Binding Site）は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合のためのポジティブコントロールとして含まれた。ＮＫ細胞上の結合した抗体を、ＰＥ標識されたマウス抗ヒトＣＤ５６（ＮＫ細胞表面マーカー）抗体（BD Bioscience Pharmingen, San Diego,CA）を、ＦＩＴＣ標識されたヤギＦ（ａｂ）2抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Protos immunoresearch, Burlingame,CA）と組み合わせて使用するＦＡＣＳにより検出した。試験されたＨｕＭａｂ２０μg/mlにおける最大結合（Ｂｍａｘ）を決定した。
【０２２１】
ＬＣ．００１は、６４１．３７のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値により示されたとおり、ＦｃγＲＩＩＩａに有効に（コントロールＩｇＧ１抗体に匹敵しうる）結合することができた。ＦｃγＲＩＩＩａに対するブロッキング抗体の添加は、ＮＫ細胞へのＬＣ．００１の結合を無効にした（１４５．３８のバックグラウンド染色に比較して１９４．６１のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値）。ＬＣ．００１  ＩｇＧ４ｘは、ＦｃγＲＩＩＩａに結合せずそして１７０．５２のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値で、コントロールＩｇＧ４抗体に匹敵しうる挙動をして、ＬＣ．００１のＢｍａｘの約１０％にすぎないＬＣ．００１  ＩｇＧ４ｘのＢｍａｘをもたらした。ＦｃγＲＩＩＩａに対するブロッキング抗体の添加は、ＬＣ．００１  ＩｇＧ４ｘ結合に対する効果を示さなかった（１７４．２６のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値）（図１１）。
【０２２２】
実施例２２
ＨＵＶＥＣ（初代ヒト臍帯静脈内皮細胞／Promo Cell）へのｈＭａｂ＿ｈＯＸ４０ＬおよびＭａｂ  ＴＡＧ３４結合の効果
内皮細胞は、ｈＯＸ４０Ｌを発現することが記載されている（Kotani, A., et al., Immunol. Lett. 84(2002)1-7）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、当然ｈＯＸ４０Ｌを発現し、したがって「内皮細胞モデル」として使用することができる。このアッセイの目的は、抗体ＴＡＧ−３４およびＬＣ．００１への結合後のＨＵＶＥＣ細胞上のｈＯＸ４０Ｌの運命を決定することであった。
【０２２３】
ＨＵＶＥＣを解凍しそしてＴ１７５フラスコ（Sarstedt）中でＥＣＧ−Ｍ培地＋２％ＦＣＳ中で４日間増大させた。細胞を２４ウエルプレート中にプレートした（１０．０００細胞／ウエル）。
【０２２４】
３日後、培地をＥＣＧ−Ｍ培地＋０．５％ＦＣＳに変えた。１０μg/mlの抗体（＜ＫＬＨ＞（スカシ貝ヘモシアニンに対する抗体）、ダウンモデュレーション（down-modulation）の誘導のためのＴＡＧ−３４またはＬＣ．００１）の添加および２，５時間または２４時間のインキュベーション。ＴＡＧ−３４またはＬＣ．００１によるＨＵＶＥＣ細胞の再染色。Ａｌｅｘａ４８８（＝＜ｍ＞）で標識されたマウスＩｇＧに対する二次抗体またはＡｌｅｘａ４８８（＝＜ｈ＞）で標識されたヒトＩｇＧに対する二次抗体、各々１０μg/mlによるＦＡＣＳ染色。ＦＡＣＳ測定は、ＦＡＣＳ−ｓｃａｎ（Becton Dickinson）において行いそして平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。
【０２２５】
前記＜ＫＬＨ＞抗体を非特異的ネガティブコントロールとして使用した。
【０２２６】
表７は、ＬＣ．００１の添加は、２．５時間後も２４時間後もＨＵＶＥＣ細胞上のＯＸ４０Ｌのダウンモデュレーションをもたらさない（ライン４をライン５および６と比較する）ことを示す。しかしながら、ＴＡＧ３４の添加は、２．５時間後、そして２４時間後にＨＵＶＥＣ細胞上のｈＯＸ４０Ｌの強い（約３倍）ダウンモデュレーションを示す（ライン１０をライン１１および１２と比較する）。
【０２２７】
１０μg/mlの濃度の本発明に従う抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞上のＯＸ４０Ｌ発現のダウンレギュレーションを誘導しない。
【０２２８】
【表７】
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【０２２９】
実施例２３
ＴＡＧ３４、ＬＣ．００１およびＬＣ．００５のウエスタンブロット分析
４０および１００ngｈＯｘ４０Ｌ−Ｈｉｓ（R&D Systems, 28〜34kDaの理論的サイズ）および分子量マーカーMagik Mark XP（Invitrogen; 20, 30, 40, 50, 60, 80 , 100, 120, 220 kDa）をゲル電気泳動のために調製した。したがって、ｘμlタンパク質、２．５μlＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ（ドデシルサルフェートのリチウム塩）サンプルバッファー（４ｘ）、１μlＮｕＰａｇｅ還元剤（１０ｘ）および１０μlとする量のＨ2Ｏを一緒にしそして１０分間７０℃で変性した。その後サンプルをＮｕＰａｇｅゲル（Novex; 10%Bis-Tris）上にローディングしそして１×ＭＯＰＳランニングバッファー（Novex）中で１５０Ｖで１時間ランニングした。
【０２３０】
ゲルを半乾燥チャンバ中で１時間／５０mA、１×ＮｕＰａｇｅトランスファーバッファー（１×バッファー、０．１％Antioxidance、１０％メタノール）を使用してＰＶＤＦ膜（Millipore; メタノール中の５分間のインキュベーションおよび１×トランスファーバッファー中の１０分のインキュベーションによる膜の活性化）上に半乾燥ブロットによりブロッティングした。膜を、室温で１時間振とう下に１×ＰＢＳ／５％ミルク／０．５％Ｔｗｅｅｎ中でブロッキングした。一次抗体（ｐＡＢ）を１×ＰＢＳ／１％ミルク／０．５％Ｔｗｅｅｎ中に希釈し、加え、４℃で一夜インキュベーションした。
ＬＣ．００１：      全容積４ml中の１．９μl（１．６μg）
ＬＣ．００５：      １．１μl（１．６μg）／４ml
ＴＡＧ３４：        １．６μl（１．６μg）／４ml
【０２３１】
膜を１×ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ中で１０分間３回洗浄した。二次抗体を（ｓＡＢ）を１×ＰＢＳ／１％ミルク／０．５％Ｔｗｅｅｎ中に希釈し、加えそして室温で１．５時間インキュベーションした。ＬＣ．００１およびＬＣ．００５については、１：１００００希釈におけるヒトＩｇＧに対するポリクローナル抗体（Pierce）をｓＡＢとして使用し；ＴＡＧ３４では、１：４００希釈におけるLumi Light Western Blotting Kit（Roche）からのマウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体をｓＡＢとして使用した。膜を１×ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎで３０分間２回洗浄した。検出のために、Lumi Light Western Blotting Kit（Roche）を、製造者の指示に従って使用した。ウエスタンブロットからの結果を図１２に示す。ＬＣ．００１は（ドデシルサルフェート）変性されたＯＸ４０Ｌを検出することができるが、これに対してＬＣ．００５およびＴＡＧ３４は変性されたＯＸ４０Ｌに結合しない。
【０２３２】
【表８】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010280673.tif 000021
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月12日(2010.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＸ４０Ｌに結合し、ヒト起源に由来するＦｃ部分を含有しそして補体因子Ｃ１ｑに結合しないことを特徴とする抗体であって、ヒトサブクラスＩｇＧ４であり、重鎖における突然変異Ｓ２２８Ｐを含有する、抗体、ただし、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２により規定された重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号４により規定された重鎖可変ドメイン、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号６により規定された重鎖可変ドメイン、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号８により規定された重鎖可変ドメイン、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０により規定された重鎖可変ドメイン、
の組合せを除く。
【請求項２】
突然変異Ｌ２３５Ｅを含有することを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ＮＫ細胞上のヒトＦｃγレセプターに結合しないことを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、ヒト抗体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、１０−８Ｍ未満のＫＤ値でＯＸ４０Ｌに結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
ＫＤの範囲が１０−１２〜１０−９Ｍである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
補体因子Ｃ３を活性化しないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発しないことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、１ｎＭ〜４ｎＭの範囲のＩＣ５０値で０．５μｇ／ｍｌＯＸ４０Ｌのコーティング濃度で可溶性ＯＸ４０と固定化されたＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロッキングすることにより、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて阻害を示すことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号２により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号４により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号６により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号８により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号１０により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
ｆ）配列番号１１または１６のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号１２により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
ｇ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインＣＤＲおよび配列番号１７により規定された重鎖（ＶＨ）可変ドメインＣＤＲ、
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９により規定された重鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインＣＤＲおよび配列番号２０により規定された重鎖可変ドメインＣＤＲ、
のＣＤＲの組み合わせからなる群より選択される軽鎖可変ドメインＣＤＲと重鎖可変ドメインＣＤＲの組合せを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
下記の組合せ、
ｆ）配列番号１１または１６のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１２により規定された重鎖可変ドメイン、
ｇ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖（ＶＬ）可変ドメインおよび配列番号１７により規定された重鎖（ＶＨ）可変ドメイン、
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９により規定された重鎖可変ドメイン、
ｉ）配列番号１のアミノ酸配列により規定された軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０により規定された重鎖可変ドメイン、
からなる群より選ばれる可変領域組合せを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの抗体と少なくとも１種の薬学的に許容されうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
治療を必要としている患者に、治療的に有効量の抗体を投与することを特徴とする、治療を必要としている患者の処置のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
治療のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
炎症性疾患の予防及び処置のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
炎症性疾患の予防及び処置用の医薬の製造のための請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【外国語明細書】
1. Title of the Invention
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2. Detailed Description of the Invention
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1. Claims
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1. Abstract
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2. Representative Drawing
None
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【配列表】
2010280673000002.app