(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト癌タンパク質MDM2とヒト癌抑制タンパク質p53との相互作用を阻害することにより、抗癌作用を示す薬剤を提供する。【解決手段】Xaa1 Xaa2 Phe Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 Xaa12のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とし、Xaa1は、Lys、Pro、Arg、Ser、Leu、Ala又はMet、Xaa2は、Ser、Thr、Arg、Val、Gly、Tyr又はPro、Xaa4は、Trp、Gln、Glu、Pro、Ala又はLeu、Xaa5は、Glu、Gln、Asp、Phe、Ala、Trp又はSer、Xaa6は、Tyr、His、Leu又はGlu、Xaa7は、Trp又はLeu、Xaa8は、Leu、Gln、Glu、Val、Ser又はMetである（Xaa9、Xaa11、Xaa12は記載省略）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とするヒト癌タンパク質MDM2-ヒト癌抑制タンパク質p53相互作用阻害剤。
Xaa1 Xaa2 Phe Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 Xaa12 （配列番号４）
Xaa1は、Lys、Pro、Arg、Ser、Leu、Ala又はMetである。
Xaa2は、Ser、Thr、Arg、Val、Gly、Tyr又はProである。
Xaa4は、Trp、Gln、Glu、Pro、Ala又はLeuである。
Xaa5は、Glu、Gln、Asp、Phe、Ala、Trp又はSerである。
Xaa6は、Tyr、His、Leu又はGluである。
Xaa7は、Trp又はLeuである。
Xaa8は、Leu、Gln、Glu、Val、Ser又はMetである。
Xaa9は、Glu、Arg、Met、Asp、Gln、Asn又はLysである。
Xaa11は、Met、Val、Leu、Ile又はTyrである。
Xaa12は、Leu、Glu、Ser、Gly又はTrpである。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号３７〜４１のいずれかのアミノ酸配列からなる請求項１記載の阻害剤。
【請求項３】
前記ペプチドが配列番号３７のアミノ酸配列からなる請求項１記載の阻害剤。
【請求項４】
下記のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とする抗癌剤。
Xaa1 Xaa2 Phe Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 Xaa12 （配列番号４）
Xaa1は、Lys、Pro、Arg、Ser、Leu、Ala又はMetである。
Xaa2は、Ser、Thr、Arg、Val、Gly、Tyr又はProである。
Xaa4は、Trp、Gln、Glu、Pro、Ala又はLeuである。
Xaa5は、Glu、Gln、Asp、Phe、Ala、Trp又はSerである。
Xaa6は、Tyr、His、Leu又はGluである。
Xaa7は、Trp又はLeuである。
Xaa8は、Leu、Gln、Glu、Val、Ser又はMetである。
Xaa9は、Glu、Arg、Met、Asp、Gln、Asn又はLysである。
Xaa11は、Met、Val、Leu、Ile又はTyrである。
Xaa12は、Leu、Glu、Ser、Gly又はTrpである。
【請求項５】
前記ペプチドが配列番号３７〜４１のいずれかのアミノ酸配列からなる請求項４記載の抗癌剤。
【請求項６】
前記ペプチドが配列番３７のアミノ酸配列からなる請求項４記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト癌抑制タンパク質p53とヒト癌タンパク質MDM2の相互作用を阻害するペプチド、更にはヒトの癌治療におけるこのようなペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト癌抑制タンパク質であるp53は、通常、細胞内では低濃度で存在するが、DNA損傷、癌遺伝子の活性化、低酸素などの細胞ストレスに伴い発現誘導される(Chene,P., 等 (2003) Nature Rev. Cancer, 3, 102-109; Zondlo,S.C., 等 (2006) Biochemistry, 45, 11945-11957; Schon,O., 等 (2002) J. Mol. Biol., 323, 491-501; Zhang,R., Wang,H. (2000) Curr. Pharm. Des., 6, 393-416)。発現したp53タンパク質は四量体を形成後、核内へ移行し自身のターゲットを転写活性化する。この際発現されるp53ターゲットのうちの一つである、p21Waf1/Cip1は細胞周期の調節に関わるタンパク質である(佐谷秀行 (1998) 細胞工学別冊:p53 癌制御の分子メカニズムと臨床応用; 中山敬一 (2001) わかる実験医学シリーズ:細胞周期がわかる,羊土社; Gartel,A.L., Radhakrishnan,S.K. (2005) Cancer Res., 65, 3980-3985; Chene, P., 等 (2002) FEBS Lett., 529, 293-297)。細胞周期は、転写因子E2Fが、DNA合成に重要なタンパク質をコードする遺伝子を転写活性化することでG1期からS期へと移行する。E2Fの活性はRBとの結合によって抑制されているが、RBがサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ2 (CDK2) 複合体によりリン酸化されるとE2Fから解離し、活性化されたE2Fにより細胞周期が進行する(佐谷秀行 (1998) 細胞工学別冊:p53
癌制御の分子メカニズムと臨床応用,秀潤社; 中山敬一 (2001) わかる実験医学シリーズ:細胞周期がわかる,羊土社)。p21はCDKの阻害因子として知られており、主にサイクリン/CDK2複合体を阻害することで、細胞周期をG1期で停止させ、その間にDNAを修復する。しかし、DNA損傷の程度によっては、DNA修復を行わずにアポトーシスを誘導する(佐谷秀行 (1998) 細胞工学別冊:p53 癌制御の分子メカニズムと臨床応用,秀潤社)。
【０００３】
このように、異常のある細胞の増殖を抑制するような働きから、p53はゲノムの守護神として知られている(Stiewe,T. (2007) Nature Rev. Cancer, 7, 165-168)。すなわち、このp53が活性を失い、上述したような細胞応答を行えない場合、様々な遺伝子に変異が生じたままの細胞を増殖することになり、癌化に繋がると考えられている(佐谷秀行 (1998) 細胞工学別冊:p53 癌制御の分子メカニズムと臨床応用,秀潤社)。実際、ヒト癌細胞の約50%で、p53の変異あるいは欠失による不活性化が見られる(Shangary, S., 等 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105, 3933-3938)。また、その他の癌細胞では、野生型のp53が発現しているにも関わらず、細胞内の阻害因子により、その癌抑制作用が阻害されている。これらの阻害因子には、p53に直接作用するものや、p53経路下流のアポトーシス促進因子を阻害するものがあり、ほぼ全ての癌において、p53経路が関与していると考えられている(Shangary, S., 等 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105, 3933-3938)。
【０００４】
癌タンパク質MDM2 (mouse double minute) は、発現誘導されたp53タンパク質により転写活性化されるp53ターゲットのひとつである( Shangary, S., 等 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105, 3933-3938; Hu,B., 等 (2007) Cancer Res., 67, 8810-8817; Chene, P., 等 (2000) J. Mol. Biol., 299, 245-253 (2000)。発現したMDM2は、核内へ移行し、p53の転写活性化領域に結合することで、逆にp53の転写因子としての活性を阻害する。さらにMDM2はユビキチンリガーゼとしても働き、p53のプロテアソーム依存性の分解を促進することで、互いに負のフィードバックループを形成している(Kussie,P. H., 等 (1996) Science, 274, 948-953)。このように、MDM2はp53と直接相互作用することで、p53の活性および、その癌抑制作用を阻害する。MDM2-p53タンパク質複合体の結晶構造から、
MDM2の17-125番目の領域のαヘリックスおよびβシートにより疎水性の間隙が形成されており、この領域にp53の15-29番目の領域(SQETFSDLWKLLPEN(配列番号１):一文字表記)の15アミノ酸残基のαヘリックス構造をとったペプチド部分が結合することが知られている(Kussie,P. H., 等 (1996) Science, 274, 948-953)。癌タンパク質MDM2は癌抑制タンパク質p53と結合し、その癌抑制作用を阻害することから、抗癌剤デザインのターゲットとなっている(Kussie, P.H., 等 (1996) Science, 274, 948-953; Chene, P., 等 (2003) Nature Rev. Cancer, 3, 102-109; Zondlo,S.C., 等 (2006) Biochemistry, 45, 11945-11957; Schon, O., 等 (2002) J. Mol. Biol., 323, 491-501; Zhang, R., Wang, H. (2000) Curr. Pharm. Des., 6, 393-416)。現在までに、MDM2のこの領域に結合する抗体や、MDM2のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することで、p53の活性化を誘導できることが明らかにされた(Chene,P., 等 (2000) J. Mol. Biol., 299, 245-253; Blaydes,
J.P., 等 (1997)  Oncogene, 14, 1859-1868)。この構造情報を元にした低分子化合物のライブラリーから、MDM2に結合し同様の効果を示す化合物として、Nutlin-3が同定された(Chen, L., 等 (1997)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 195-200)。また近年, p53の19-23番目の領域に対応する5アミノ酸残基からなるモチーフFxxLW(配列番号２) (ここでF,L,Wはアミノ酸の一文字表記でそれぞれフェニルアラニン,ロイシン,トリプトファンを意味し, xは任意のアミノ酸)を含むp53ペプチドフラグメント(非特許文献１; 特許文献１, 特許文献２), p53の17-26番目の領域に対応する10アミノ酸残基からなるp53ペプチドフラグメントR1-X-F-X-R2-R3-W-X-X-R4(配列番号３)(R1はプロリン(P),ロイシン(L),グルタミン酸(E),システィン(C),またはグルタミン(Q); Xは任意の天然アミノ酸; Fはフェニルアラニン; R2はアルギニン(R),ヒスチジン(H),グルタミン酸(E),システィン(C),セリン(S),またはアスパラギン酸(D); R3はヒスチジン(H),フェニルアラニン(F),またはチロシン(Y); R4はフェニルアラニン(F),グルタミン(Q),またはロイシン(L);特許文献３), p53の17-28番目の領域に対応する12アミノ酸残基からなるp53ペプチドフラグメント pDI(LTFEHYWAQLTS(配列番号４９); 非特許文献２)が,p53とMDM2の相互作用の阻害に特に適していることが明らかにされている.しかしながら, 上に述べた種々のp53ペプチドフラグメントのMDM2への親和性はかなり弱く、一番強い親和性のpDIでもBiacoreで測定した解離定数(KD)は4×10-4M程度であり, 薬剤として利用するには親和性が弱い. それ故、MDM2に対する親和性が強く, MDM2-p53相互作用を強く阻害するペプチドフラグメントが求められている。
【非特許文献１】Picksley, S.M.,等 (1994) Oncogene 9, 2523-2529
【非特許文献２】Baoli, H., 等 (2007) Cancer Res. 67,8810-8817
【特許文献１】特表平10-506525
【特許文献２】特開2007-222170
【特許文献３】特表2001-500365
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒト癌タンパク質MDM2とヒト癌抑制タンパク質p53の相互作用を阻害し、癌細胞増殖抑制効果をもつ薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、遺伝子型と表現型の対応付け技術であるin vitro virus (IVV) 法(Nemoto, N., 等(1997) FEBS Lett., 414, 405-408; Miyamoto-Sato, E., 等 (2003) Nucleic Acids Res., 31, e78)により、p53と競合的にMDM2に結合するペプチドをランダムライブラリーからスクリーニングし、MDM2とp53の相互作用を阻害するペプチドを取得することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、下記のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とするヒト癌タンパク質MDM2-ヒト癌抑制タンパク質p53相互作用阻害剤又は抗癌剤を提供する。
Xaa1 Xaa2 Phe Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 Xaa12 （配列番号４）
Xaa1は、Lys、Pro、Arg、Ser、Leu、Ala又はMetである。
Xaa2は、Ser、Thr、Arg、Val、Gly、Tyr又はProである。
Xaa4は、Trp、Gln、Glu、Pro、Ala又はLeuである。
Xaa5は、Glu、Gln、Asp、Phe、Ala、Trp又はSerである。
Xaa6は、Tyr、His、Leu又はGluである。
Xaa7は、Trp又はLeuである。
Xaa8は、Leu、Gln、Glu、Val、Ser又はMetである。
Xaa9は、Glu、Arg、Met、Asp、Gln、Asn又はLysである。
Xaa11は、Met、Val、Leu、Ile又はTyrである。
Xaa12は、Leu、Glu、Ser、Gly又はTrpである。
前記ペプチドは、配列番号３７〜４１のいずれかのアミノ酸配列からなることが好ましく、また、配列番号３７のアミノ酸配列からなることがさらに好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヒト癌タンパク質MDM2とヒト癌抑制タンパク質p53の相互作用を阻害し、癌細胞増殖抑制効果をもつ薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書における、塩基およびアミノ酸の一文字並びにアミノ酸の三文字の記号は、WIPO Standard ST.25によるものである。
【００１０】
本発明の阻害剤および助長剤の有効成分は、下記のアミノ酸配列を含むペプチドである。
Xaa1 Xaa2 PheXaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Leu Xaa11 Xaa12 （配列番号４）
Xaa1は、Lys、Pro、Arg、Ser、Leu、Ala又はMetであり、好ましくは、Lys、Pro、Arg又はSerであり、さらに好ましくはLys又はProである。
Xaa2は、Ser、Thr、Arg、Val、Gly、Tyr又はProであり、好ましくは、Ser、Thr、Arg又はValであり、さらに好ましくはSer、Thr又はArgである。
Xaa4は、Trp、Gln、Glu、Ala、Pro又はLeuであり、好ましくは、Trp、Gln、Glu、Ala又はProであり、さらに好ましくはTrpである。
Xaa5は、Glu、Gln、Asp、Ala、Phe、Trp又はSerであり、好ましくは、Glu、Gln、Asp又はPheであり、さらに好ましくはGluである。
Xaa6は、Tyr、His、Leu又はGluであり、好ましくは、Tyr又はHisであり、さらに好ましくはTyrである。
Xaa7は、Trp又はLeuであり、好ましくはTrpである。
Xaa8は、Leu、Gln、Glu、Val、Ser又はMetであり、好ましくは、Leu、Gln又はMetであり、さらに好ましくはLeuである。
Xaa9は、Glu、Arg、Met、Asp、Gln、Asn又はLysであり、好ましくは、Glu、Arg又はAspであり、さらに好ましくはGlu又はArgである。
Xaa11は、Met、Val、Leu、Ile又はTyrであり、好ましくは、Met、Val又はLeuであり、さらに好ましくはMetである。
Xaa12は、Leu、Glu、Ser、Gly又はTrpであり、好ましくは、Leu、Glu又はTrpであり、さらに好ましくはLeu又はGluである。
【００１１】
Xaa9-Leu-Xaa10は、Arg-Leu-Met又はGlu-Leu-Metであることが好ましい。
【００１２】
上記ペプチドの例としては、配列番号３７〜４１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。本発明の阻害剤および助長剤の有効成分は、また、配列番号３７のアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００１３】
上記ペプチドは、血液等の生物学的液体に可溶のものが好ましい。
【００１４】
有効成分のペプチドは、医薬的に許容可能な担体を用いて製剤（医薬組成物）にすることができる。医薬的に許容可能な担体としては、賦形剤または基剤などが挙げられる。また、製剤は、通常に用いられる添加剤を含んでいてもよい。剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。製剤には、有効成分のペプチドと、他の抗癌剤と別個に包装して一体としたものも包含される。また、有効成分の投与量は、対象とする抗癌剤治療、患者の状態などにより適宜選択される。本発明の阻害剤または助長剤は、抗癌剤治療を受けているまたは受ける予定の患者に投与することができる。
【００１５】
ペプチドは、その大きい分子量から、高い合成コストおよび注射による体内投与を必要とし、また、溶解度や細胞膜透過性が低く、生体内で分解されやすく不安定であることなど、低分子化合物と比較して、医薬品としては不利な点が多い(Chemical & Engineering News, 83, 17-24, 2005)。そのため、天然または合成されたペプチドは、これまで現実的な医薬品としては考えられていなかった(Borghouts,C., 等 (2005) J. Peptide Sci., 11, 713-726)。しかし近年、天然に存在するL-アミノ酸ではなく、非天然のD-アミノ酸に変換することで、元々のペプチドと同様の生理活性をもちながら、生体内のプロテアーゼにより分解されないペプチドの合成や(Borghouts,C., 等 (2005) J. Peptide Sci., 11, 713-726; Sakurai,K., J.,等 (2004) J. Am. Chem. Soc., 126, 16288-16289)、細胞膜透過配列を融合することで膜透過能を向上させる(Borghouts,C., 等 (2005) J. Peptide Sci., 11, 713-726; Sakurai,K., J.,等 (2004) J. Am. Chem. Soc., 126, 16288-16289; Prive,G.G., 等 (2006) Curr. Opin. Genet. Dev., 16, 71-77)といった工夫によりペプチドの生体内での安定性や細胞膜透過性が改善され、ペプチド医薬としての展望が開けてきた(Borghouts,C., 等 (2005) J. Peptide Sci., 11, 713-726)。これらの手法は、本発明で用いるペプチドに適用できる。
【００１６】
本発明で用いるペプチドは、低分子化合物よりもターゲットに対する特異性や親和性が高いため、副作用の原因となるターゲット以外のタンパク質への結合も少ない(Chemical & Engineering News, 83, 17-24 (2005))、と考えられる。さらに低分子化合物では困難な、巨大なタンパク質同士の相互作用を阻害することにも適している(Sakurai,K., 等J. Am. Chem. Soc., 126,16288-16289)、と考えられる。このようにより効果的な薬剤活性を持つペプチドは、医薬品として有用であると期待される。
【００１７】
本発明で用いるペプチドが、ヒト癌タンパク質MDM2とヒト癌抑制タンパク質p53の相互作用阻害剤又は抗癌剤として有効であることは、以下の理由によると考えられるが、本発明はこれにより限定されるものではない。
いくつかの悪性腫瘍で過剰発現が見られる癌タンパク質MDM2は、癌抑制タンパク質p53によって転写活性化される。発現したMDM2はp53タンパク質に結合し、ユビキチン／プロテアソーム依存性経路によりp53タンパク質を分解することにより、その癌抑制作用を阻害することで細胞の癌化を促進する。この結合にはp53タンパク質の15〜29番目の15アミノ酸残基が関与していることが知られており、MDM2-p53相互作用を阻害できる新規ペプチドが抗癌剤の候補として期待される。そこで、in vitro virus (IVV) 法(Nemoto, N., 等
(1997) FEBS Lett., 414, 405-408; Miyamoto-Sato,E., 等 (2003) Nucleic Acids Res., 31, e78)により、 MDM2に結合し、癌細胞の増殖を抑制するペプチドのスクリーニングを行った。まず16アミノ酸残基からなるランダムペプチドIVVライブラリーを作製し、ビーズに固定したMDM2に結合するペプチドをスクリーニングした。得られたペプチド配列では、3つの疎水性アミノ酸残基 (F19，W23，L26) がよく保存されていた。次に、この配列を最適化するために、これら3つの疎水性アミノ酸残基 (F，W，L) を固定し、残りの9アミノ酸残基がランダム配列である12アミノ酸残基からなるIVVライブラリーを作製し、MDM2に結合するペプチドのスクリーニングを行った。このスクリーニング方法によって選択
されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ヒト癌タンパク質MDM2-ヒト癌抑制タンパク質p53相互作用を高度に阻害できると期待される。
【００１８】
実際に、このうち最も多く重複して得られたペプチド配列 (MDM2 inhibitory peptide,
MIP) のN末端にGFPを融合させたタンパク質 (GFP-MIP) をヒト大腸癌細胞株HCT116細胞内で発現させたところ、細胞内におけるGFP-MIPとMDM2の結合、p53タンパク質の発現量増加、それに伴うp53の下流遺伝子（MDM2およびp21）のmRNAおよびタンパク質発現量の増加が確認された。さらに、HIV-Tatの細胞膜透過配列をN末端に融合したペプチド (Tat-MIP)
により、HCT116細胞の生存率が低下したことから、MIPが細胞死を誘導することが示唆された。
【００１９】
本発明の阻害剤及び抗癌剤の有効成分は、その製造法により限定されるものではないが、例えば、(1)ペプチドをコードするDNAのライブラリーを準備し、(2)そのライブラリーから、DNAとそのDNAによりコードされるペプチドとが結合した分子のライブラリーを調製し、(3)MDM2に結合するペプチドを含む分子を選択し、(4)選択された分子のDNAをテンプレートとしてPCRによりDNAを増幅し、(5)増幅されたDNAを工程(2)のライブラリーとして用いて、(2)から(4)の工程を繰り返すことを含むスクリーニング方法により得ることができる。
【００２０】
この方法においては、標的物質として、MDM2を用いる他は、in vitro virus(IVV)法に基づくスクリーニング法（例えば、WO 02/48347、特開2002-176987参照）に従って行うことができる。IVVおよびスクリーニング法について説明する。
【００２１】
IVVは、対応付け分子とも呼ばれ、IVV法による対応付け分子は、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質を含む表現型分子と、該タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、タンパク質をコードする領域を、その領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー部とが結合してなる。説明の便宜のため、対応付け分子における、表現形分子に由来する部分、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、デコード部、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。また、遺伝子型分子における、スペーサー分子に由来する部分、および、コード分子に由来する部分をそれぞれ、スペーサー部およびコード部と呼ぶ。
【００２２】
この態様におけるスペーサー分子は、核酸の3'末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたPEG領域と、PEG領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。PEG領域はなくてもよい。
【００２３】
核酸の3'末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
【００２４】
ドナー領域の5'末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とスペーサー部をライゲーションさせるためには、少なくとも1残基以上を含むことが必要であり、ポリA配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
【００２５】
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が20塩基以下、又は、ポリエチレング
リコールの平均分子量が400以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が10塩基以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が2000以上であることを意味する。
【００２６】
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、400〜30,000、好ましくは1,000〜10,000、より好ましくは2,000〜8,000である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約400より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Liu, R., Barrick, E., Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology,
vol. 318, 268-293）、分子量1000以上、より好ましくは2000以上のPEGを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量1000以上で良好であり、分子量400以下ではDNAスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
【００２７】
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、3'-N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、バリンのPANS-Val、アラニンのPANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するPANS-全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として3'-アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった3'-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonucleoside, AANS-アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのAANS-Gly、バリンのAANS-Val、アラニンのAANS-Ala、その他、全アミノ酸に対応するAANS-全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
【００２８】
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と1残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、PANS-アミノ酸、AANS-アミノ酸などが挙げられる。
【００２９】
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、5'末端側に1残基以上のDNAおよび/またはRNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、dC-ピューロマイシン, rC-ピューロマイシンなど、より好ましくはdCdC-ピューロマイシン, rCrC-ピューロマイシン, rCdC-ピューロマイシン, dCrC-ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル-tRNAの3'末端を模倣したCCA配列（Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377）が適当である。塩基の種類としては、C>U又はT>G>Aの順で好ましい。
【００３０】
スペーサー分子は、ドナー領域とPEG領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも1残基のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはHis-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
【００３１】
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合したポリA配列を持ち、かつポリA配列の5'上流に親和性タグ配列を含む核酸である。
【００３２】
コード分子は、DNAでもRNAでもよく、RNAの場合、5'末端にCap構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
【００３３】
3'末端領域は、親和性タグ配列とその下流にポリA配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては3'末端領域のポリA配列が重要であり、ポリA配列は、少なくとも２残基以上のdAおよび/またはrAの混合または単一のポリA連続鎖であり、好ましくは、3残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリA連続鎖である。
【００３４】
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる5'UTR、および、ポリA配列を含む3'末端領域の組み合わせがある。3'末端領域のポリA配列の効果は通常には10残基以下で発揮される。5'UTRの転写プロモーターはT7/T3またはSP6などが利用でき、特に制限はない。好ましくはSP6であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はSP6を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、TMVのオメガ配列の一部(O29; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、及び、WO 02/48347の図３参照)を含んだものが好ましい。
【００３５】
親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるFlag-tag配列やHis-tag配列である。
【００３６】
ORF領域については、DNAおよび/またはRNAからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の5'UTRをSP6+O29とし、3'末端領域を、たとえば、Flag+XhoI+An(n=8)とすることで、各長さは、5'UTRで約60bp、3'末端領域で約32bpであり、PCRのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやcDNAライブラリーからPCRによって、5'UTRと3'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はORF領域を超えてされてもよい。すなわち、ORF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
【００３７】
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含む核酸である。
【００３８】
遺伝子型分子は、上記コード分子を、必要により、タンパク質をコードする領域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後（例えば転写した後）、コード分子の3'末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、PEG領域を含むスペーサー分子のPEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、15℃で0.5〜４時間に短縮することも可能である。
【００３９】
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード部の3'末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のDNAおよび/またはRNAのポリA配列があること、さらに、5'UTRの翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列(O29)が好ましく、スペーサー部のドナー領域としては、少なくとも１残基のdC(デオキシシチジル酸)または２残基のdCdC(ジデオキシシチジル酸)が好ましい。このことによって、RNAリガーゼを用いることでDNAリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を60〜80%に保つことができる。
【００４０】
(a)転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む5'非翻訳領域と、5'非翻訳領域の3'末端側に結合した、タンパク質をコードするORF領域と、ORF領域の3'末端側に結合した、ポリA配列を含む3'末端領域を含むRNAであるコード分子の3'末端と、(b)上記スペーサー分子のドナー領域であってRNAからなるものとを、スペーサー分子内のPEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、RNAリガーゼにより結合させることが好ましい。
【００４１】
ライゲーション反応時に、PEG領域を含むスペーサー部のPEG領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー部のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が80〜90%以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
【００４２】
この態様の対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のORF領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することができる。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽又はウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、25〜37℃で15〜240分の条件が挙げられる。また、この態様の対応付け分子の核酸部分は、翻訳後に逆転写によりRNAとDNAとのハイブリッドとすることができる。
【００４３】
IVV法に基づくスクリーニング方法は、通常には、核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、前記核酸ライブラリーから、本発明の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、遊離した核酸を回収する工程を含む。
【００４４】
対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、対応付け分子の被標的タンパク質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。この条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。
【００４５】
標的物質に結合した対応付け分子の分離は、標的物質に結合した対応付け分子と、標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、通常には、標的物質を固相に固定化しておくことによって、対応付け分子と混合後の標的分子を固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。洗浄の条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。ここで固相に固定化するとは、対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子から分離可能になっていることを意味し、例えば、標的物質が膜タンパク質の場合、細胞の細胞膜等に発現した膜タンパク質や人工膜中に埋め込まれたタンパク質も、固相に固定化された標的物質に包含される。
【００４６】
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させることは、開裂型リンカーを用い、それに応じた条件で行うことができる。標的物質が固相に固定化されている場合、核酸を遊離させることは、溶出とも呼ばれる。本発明において「遊離」とは「溶出」も包含する意味で用いる。また、遊離される核酸は、核酸の塩基配列が解析可能な限り、改変されたものであってよい。
【００４７】
遊離した核酸の回収は、通常の方法によって行うことができる。例えば、電気泳動により回収する方法、遊離した核酸以外の成分を沈殿させて上清を回収する方法などが挙げられる。回収された核酸は、機能解析、進化工学などの目的に応じて増幅や配列の解析が行われる。目的に応じて、回収されたDNAの配列解析を行ったり、PCRにより増幅して、上記の工程を繰り返したりすることができる。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法で用いられるDNAのライブラリーは、ヒト癌抑制タンパク質p53のF19,W23,L26に対応する三つの疎水性アミノ酸が保存されているアミノ酸配列をコードするDNAからなることが好ましく、このようなアミノ酸配列としてXXFXXXWXXLXX（配列番号５）(Xは任意のアミノ酸)が挙げられる。
【００４９】
上記の方法でスクリーニングされたヒト癌タンパク質MDM2に結合するペプチドに対して、p53タンパク質に対して競合するか否かを測定することにより、本発明の阻害剤または抗癌剤の有効成分となるペプチドを同定することができる。競合するか否かは、後述の実施例に記載したような方法によって測定することができる。
【００５０】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【実施例】
【００５１】
IVV法(Nemoto, N., 等 (1997) FEBS Lett., 414, 405-408; Miyamoto-Sato,E., 等 (2003) Nucleic Acids Res., 31, e78)により、ランダムライブラリーからMDM2に強く結合するペプチドをスクリーニングした。まず16アミノ残基からなるランダムペプチドIVVライブラリーのスクリーニングを行った。4ラウンドのスクリーニングで得られたほとんどの配列でp53のF19，W23，L26に対応する3つの疎水性アミノ酸が保存されていた。そこで、これらの配列を最適化するため、上述した3つのアミノ酸を固定した12アミノ酸残基からなるランダムペプチドIVVライブラリーを新たにデザインし、より厳しい選択圧で、5ラウンドのスクリーニングを行った。この結果、最も重複して得られたペプチド配列PRFWEYWLRLME (配列番号３７、以下MDM2 inhibitory peptide, MIP) のN末端にGFPを融合させたタンパク質 (GFP-MIP) が、野生型p53ペプチド断片よりも高い親和性でMDM2と結合すること、また細胞内においてもMDM2と結合することを確認した。
【００５２】
野生型p53発現細胞であるHCT116細胞内でGFP-MIPを発現させたところ、p53タンパク質の発現量が増加した。これはGFP-MIPのMDM2-p53相互作用阻害によるものであると推測される。また、MDM2、p21などのp53ターゲットのタンパク質量、mRNA量が増加したことから、GFP-MIPの発現により、p53経路が活性化されることがわかった。さらに、細胞膜透過配列であるHIV-TatをN末端に融合したTat-MIPにより、HCT116細胞の生存率が低下した (IC50 = 13.2 μM)。p53欠損細胞であるSaos-2では、IC50 = 19.2 μMであり、約1.5倍程度の野生型p53発現細胞特異性が見られた。この結果から、Tat-MIPは、p53経路依存性の細胞死を誘導することがわかった。
本発明により、IVV法によりMDM2タンパク質に高い親和性で結合するペプチドをスクリーニングできた。また、得られたペプチドがMDM2とp53のin vitro およびin vivoでの相互作用を強く阻害し、癌細胞の増殖抑制活性を持つことを確認した。
以下、実施例の詳細を説明する。
【００５３】
［実施例1］
1. ベイトタンパク質調製
A549細胞由来のcDNAライブラリーからEx Taq DNA polymerase (Takara) を用い、MDM(1-294)-fおよびMDM(1-294)-rプライマー (表1) で95℃で60秒、60℃で60秒、72℃で60秒のサイクルを30回繰り返すプログラムでPCRを行った。得られたPCR産物をPCR purification
kit (Qiagen) で精製後、今度はこれをテンプレートとし、5'adaptorO29T7EcoRおよびFlag1A-libプライマー (表１) で同様にPCRを行った。PCR産物を再びPCR purification kitで精製後、pDrive cloning vector (Qiagen) にTAクローニングした。このプラスミドをテンプレートとし、Phusion DNA polymerase (Finnzymes) を用い、Bam-MDM-fおよびMDM-294-Xho-rプライマーで98℃で10秒、62℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを25回繰り返すプログラムでPCRを行った。これによりPCR産物の両側にそれぞれBamHIおよびXhoIの制限酵素部位を組み込んだ。得られたPCR産物をPCR purification kitで精製後、BamHIおよびXhoIにより切断し再びPCR purification kitで精製した。この断片をT4 DNA Ligase (Promega) を用いて、N末端側にT7タグ、C末端側にTAPタグを有するベクター、pCMV-CBPzz(Vassilev., L. Y., 等 (2004) Science, 844-848)のBamHI/XhoIサイトにサブクローニングした。これをテンプレートとし、Ex Taq DNA polymeraseを用い、SP6-O'-T7および3'FosCBPzzプライマー (表１) で95℃で60秒、60℃で60秒、72℃で120秒のサイクルを20回繰り返すプログラムでPCRを行い、SP6プロモーターおよびΩ配列の一部を付加した。このPCR産物を、PCR purification kitで精製した。
【００５４】
【表１】
2010120881.tif 000002
【００５５】
このDNA 1 μgをRiboMAX large-scale RNA production systems-SP6 (Promega) を用い、37℃で2時間、その後DNase I (Promega) を加え、さらに37℃で15分インキュベートした。得られたmRNAをRNeasy mini kit (Qiagen) で精製後、小麦胚芽由来無細胞翻訳系Wheat Germ extract systems (Promega) を用い、25℃で2時間インキュベートしタンパク質を合成した。
【００５６】
まずスクリーニングのベイトとして用いる、MDM2タンパク質を調製した。ビーズに固定
・溶出用のTAPタグを付加したMDM2を無細胞翻訳系で発現し、このタンパク質がTAPタグによりビーズに固定され、なおかつ溶出されること、またp53との結合活性を維持していることをp53全長タンパク質との結合を調べることにより確認した。
【００５７】
p53ペプチド (15〜29) とMDM2 (17〜125) の複合体の結晶構造から、MDM2の25〜109アミノ酸残基がp53結合ドメインであることが明らかにされている(Kussie,P.H.,等(1996) Science, 274, 948-953)。今回はこの領域を含むMDM2の7〜300アミノ酸残基のC末端側に、カルモジュリン結合ペプチド (CBP)、TEVプロテアーゼ認識配列およびプロテインAのIgG結合ドメイン (ZZ) をタグとして融合させた (図１) タンパク質を小麦胚芽由来無細胞翻訳系により合成した。
【００５８】
このタンパク質が図２に示すように、IgG固定ビーズにIgG結合ドメインを介して結合し、TEVプロテアーゼにより切断され溶出されることを確認した (図３，A)。それぞれの画分のタンパク質量を泳動量から補正したところ、インプットの40%がビーズに固定されており (図３，B)、残りの60%のタンパク質は、ビーズに固定されなかったか、あるいは洗浄中に取り除かれたと推測される。TEVプロテアーゼで処理した後は、ビーズに固定されたタンパク質の45%が溶出され、残りは切断されていないか、切断された後もIgG結合ドメイン以外でビーズに非特異的に結合してしまっているために溶出されていないと推測される。
【００５９】
ビーズに固定したMDM2に対し、p53 (15〜29) および全長のIVV分子の結合アッセイを行った (図４)。p53 (15〜29) のIVVはMDM2に結合しなかったのに対し、全長ではタンパク質部分での結合が見られた。p53全長のIVVが結合したことにより、調製したベイトタンパク質MDM2がp53結合活性を有していることが示唆された。また、p53 (15〜29) とMDM2の間の解離定数は600 nM程度(Kussie,P.H.,等 (1996) Science, 274, 948-953)であるにも関わらず、IVVでは結合しなかったことから、mRNAと連結したペプチド部分が立体構造を保持できていなかった可能性が高い。p53 (15〜29) はαヘリックス構造をとり、このヘリックス構造をとりやすいp53変異体 (P27S) ペプチド断片が野生型のものよりも高い親和性でMDM2と結合する(Schon,O., 等(2002)  J. Mol. Biol., 323, 491-501)ことからも、ヘリックス構造をとりやすく、MDM2との親和性が高いペプチド断片でないと、以後のIVVスクリーニングで選択されてこない可能性が高いため、p53と競合してMDM2に結合するペプチドを取得するには、好条件である。また、p53全長は、ペプチド断片と比べ立体構造が保持されやすかった可能性があると推測される。
【００６０】
2. ランダムライブラリーの構築
一本鎖DNA、G4SG4S (NNS) 16FLAGA6r (表1) をテンプレートとし、Ex Taq DNA polymeraseを用い、priSP6OGfおよびpriFLAGA6rプライマー (表1) で95℃を60秒、60℃を60秒、72℃を60秒のサイクルを25回繰り返すプログラムでPCRを行った。得られたPCR産物をPCR purification kitで精製し、ランダムな16アミノ酸残基をコードしたDNAを調製した。
【００６１】
また、一本鎖DNA、X12(FWL)-r (表１) をテンプレートとし、Phusion DNA polymeraseを用い、5'O29-T7-EcoRIおよび3'Flag1A-libプライマー (表1) で98℃を10秒、62℃を30秒、72℃を30秒のサイクルを25回繰り返すプログラムでPCRを行った。得られたPCR産物をPCR purification kitで精製し、12アミノ酸残基のうち3アミノ酸を固定し、残りの9アミノ酸残基がランダムである配列をコードしたDNAを調製した。
【００６２】
これらのDNA 1 μgをRiboMAX large-scale RNA production systems-SP6を用い、37℃で2時間、その後DNase Iを加え、さらに37℃で15分インキュベートした。得られたmRNAをRNeasy mini kitで精製後、T4 RNA Ligase (Takara) を用いて、16℃で14時間インキュベートすることで、PEG-Puroスペーサーを連結し、再びRNeasy mini kitで精製しIVVテンプ
レートを調製した。これを小麦胚芽由来無細胞翻訳系Wheat Germ extract systemsを用い、25℃で2時間インキュベートしIVVライブラリーとした。
【００６３】
3. IgGビーズ調製
Immutex-MAG (MAG2101) (JSR)  20 mgを0.01% Triton X-100で3回洗浄し、0.25 mg/ml EDCを加え、室温で90分回転混和した。これに0.57 mgのChempure rabbit IgG (Jackson immunoresearch) を加え室温で16時間回転混和した。上清を除去後、洗浄バッファー (PBS，0.1% BSA，0.01% Triton X-100) を加え室温で1時間インキュベートした。その後、洗浄バッファーで5回洗浄し、保存バッファー (PBS，0.1% BSA，0.01% Triton X-100，0.02% NaN3) に懸濁し、IgG-Immutex-MAGビーズ (2% slurry) を調製した。
【００６４】
4. IVVスクリーニング
IgG-Immutex-MAGビーズ40 μlを結合バッファーIPP150 (1 M Tris-HCl pH 8.0，150 mM
NaCl，0.1% NP-40) で3回洗浄し、ベイトであるMDM2 (7-300アミノ酸残基の領域)-CBPzz
を加え、4℃で1時間回転混和することでビーズに固定した。その後再びIPP150で3回洗浄し、IVVライブラリーを加え4℃で10分回転混和した (3ラウンド目以降は5分)。IPP150で8回 (3ラウンド目以降は13回)、TEVバッファー (1 M Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% NP-40，1 mM DTT，5 mM EDTA) で2回洗浄した後、TEV protease (10 U/μl) (Invitrogen) 2 μlを混ぜ、16℃で2時間回転混和した。この上清を溶出画分として回収した。
【００６５】
回収した溶出画分1 μlをテンプレートとし、Onestep RT-PCR kit (Qiagen) で5'O29-fおよび3'Flag1Aプライマーを用いて、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で120秒のサイクルを14〜30回繰り返すプログラムでRT-PCRを行った。この中から増幅量が飽和していないバンドパターンのものを選択し、同じ条件で大量にRT-PCRすることにより、ライブラリーを再構築し、2ラウンド目のスクリーニングを行った。同様の操作を繰り返し、スクリーニングを5ラウンド目まで行った。5ラウンド終了後のDNAライブラリーをPCR Cloning kit (Qiagen) でクローニングし、ABI3700 PRISM Genetic Analyzer  (Applied Biosystems) により配列を解析した。また、ペプチド配列中のアミノ酸出現頻度解析にはweblogo (http://weblogo.berkeley.edu/) を用いた。
【００６６】
5. 高親和性MDM2結合ペプチドの同定
上記のスクリーニング法に従い, MDM2と強く結合するという点で最適なペプチド配列を同定するために2段階のスクリーニングを行った。まず、配列の種類の多いライブラリーでスクリーニングを行い、得られた配列中で多く保存されているアミノ酸残基のいくつかをMDM2との結合に重要である残基として決定した。続いてこれらのアミノ酸残基を固定したランダムライブラリーを設計し、二度目のスクリーニングを行うことで、より強くMDM2と結合するペプチド配列を同定した。
【００６７】
まず16アミノ酸残基からなるランダムペプチドIVVライブラリーのスクリーニングを行った。4ラウンドのスクリーニング終了後のDNAライブラリーをクローニング、配列解析したところ、3種類の配列が重複して得られた (表2)。これらのペプチドのIVVはMDM2に結合し、N末端にGFPを融合したもの (図５A) でも結合が見られた (図５，B)。GFPを融合した野生型p53ペプチド断片もMDM2には結合しなかったため、これよりもMDM2に対する親和性の高いペプチド配列を取得できるスクリーニング系を構築することができたと言える。このスクリーニングで得られた、ほとんどの16アミノ酸残基のペプチド配列で、p53のF19、W23、L26に対応する3つの疎水性アミノ酸が保存されていた。これらの疎水性アミノ酸は、p53がMDM2と結合する際に重要であることが知られており(Kussie,P.H.,等 (1996) Science, 274, 948-953; Fukuda,I.,等 (2006) Nucleic Acids Res., 34, e127; Blaydes,J.P., (1997)Oncogene, 等 14, 1859-1868)、今回の結果を踏まえても、他のアミノ酸に置換不可能なアミノ酸であることが示唆された。
【００６８】
【表２】
2010120881.tif 000003
【００６９】
16アミノ酸残基のランダムペプチド配列の可能な組み合わせの数は、2016 = 6.6×1020であり、IVVライブラリーのライブラリーサイズ (〜1013) では網羅できていなかった。そこで、これらの配列を最適化するため、上述した3つの疎水性アミノ酸 (F，W，L) を固定し、9アミノ酸残基がランダムである12アミノ酸残基のIVVライブラリーをスクリーニングした。このIVVライブラリーでは、209 = 5.1×1011種類の全ての配列を十分網羅できる。
【００７０】
このライブラリーのスクリーニングを計4ラウンド行った後、配列を解析した結果、重複した配列は存在しなかった。得られた配列のうち、いくつかのIVVはMDM2と結合したことから、アミノ酸残基数が16から12に減少したために結合する分子が無くなったわけではないことがわかる。おそらく、3つの疎水性アミノ酸を固定したことで、初期ライブラリー中に、MDM2に高い親和性のある分子が多数存在しており、また用いた選択圧が適切でなかったために、特定の分子の濃縮が見られなかったためと推測される。
【００７１】
そこで、MDM2に結合する分子が多く存在するであろう、4ラウンド終了後のライブラリーを用い、(1) ライブラリーとMDM2との結合時間を1〜2時間から10分に短縮、(2) 結合後の洗浄回数を3回から10回に増加、(3) 結合バッファー中の塩濃度を2倍に増加、の3種類の条件下で結合アッセイを行い、より厳しい選択圧でのスクリーニング条件を検討した (図６)。ライブラリーのMDM2に対する結合量が減少した結合時間の短縮および洗浄回数の増加の条件を、より厳しい選択圧として採用した。
【００７２】
上記の選択圧で、再度12アミノ酸残基からなるランダムライブラリーのスクリーニングを行ったところ、3ラウンド終了後から結合分子の濃縮が見られた (図７)。5ラウンド終了時点で結合分子が十分濃縮されたと判断し、このライブラリー中のDNAをクローニングし配列解析を行った結果、7種類の配列が重複して得られた (表3)。
【００７３】
【表３】
2010120881.tif 000004
【００７４】
この中で最も多く重複して得られたペプチド配列 (PRFWEYWLRLME（配列番号３７）、以下MDM2 inhibitory peptide、MIP) およびp5317-28の解離定数を測定した結果 (表 4)、MIPはp5317-28の約100倍程度、MDM2との親和性が高いことがわかった。また、スクリーニングにより得られたペプチド配列の各ポジションにおけるアミノ酸の出現頻度 (図８) から、固定した3つのアミノ酸残基以外では、Y6、E9、M11がよく保存されていた。そこで、今回はMIPの配列中のM11をアラニンに置換した、MIP (M11A) の解離定数を測定した。その結果、元のMIPと比べ、MDM2との親和性が10倍程度低下していた。この位置は、p5317-28ではプロリンであり、これをセリンに置換すると、よりαヘリックス構造をとりやすくなり、MDM2に対する親和性が約25倍向上することが報告されている（Zondlo, S.C.,等 (2006) Biochemistry 45, 11945-11957）。今回の場合も、M11によりヘリックス構造をとりやすくなっていると推測される。
【００７５】
【表４】
2010120881.tif 000005
【００７６】
残るY6はファージディスプレイ法を用いたランダムライブラリーのスクリーニングでも、よく保存されており、MDM2との親和性を高めるという点で重要なアミノ酸であることが報告されている(Bottger, V., 等 (1996) Oncogene, 13, 2141-2147)。
【００７７】
MIPのIVVおよびN末端にGFPを融合したもの (以下GFP-MIP) が試験管内でMDM2に結合することを確認した (図9,A)。さらに、GFP-MIPが、細胞内においてもMDM2と結合することを確認するため、ヒト大腸癌細胞であり、野生型p53が発現していることが知られているHCT116細胞内でGFP-MIPを発現させ、α-GFP抗体を用いた免疫沈降を行った結果、GFP-MIPはMDM2と結合することがわかった (図９，B)。MDM2のバンドが2本検出されたが、分子量が小さいほうのバンドは、MDM2のスプライスバリアントのうちの一つであると推測される(Bartel, F., 等 (2004) Mol. Cancer Res., 2, 29-35)。
【００７８】
6. ビオチン化MDM2の大量発現および精製
プラスミドDNA、MDM2-Bio-H10を用いてBL21 star(DE) を形質転換し、50 μg/mlアンピシリン含有LB寒天プレートに撒き37℃で16時間インキュベートした。形成されたコロニーを50 μg/mlカルベニシリン含有LB培地5 mlに植菌し、37℃で16時間培養した。培養した大腸菌を50 μg/mlカルベニシリン含有TB培地250 mlに全量加え、OD600 が 0.4〜0.5になるまで培養した。その後、IPTGを1 mMの濃度で加え、さらに37℃で6時間培養した。この培養液を6000 g、20分遠心後、上清を除去することで集菌した。これに溶菌バッファー (TBS，pH 7.4，1 mM β-ME) 20 ml、Protease inhibitor cocktail (Sigma) 40 μl およびDNase I 8 μlを加え懸濁後、超音波破砕を15分×2回行い、6000 g、20分遠心後の上清を可溶性画分として回収した。
【００７９】
可溶性画分にTALON Metal Affinity Resin を加え、４℃で2時間回転混和し、全量をカラムに通した。溶菌バッファー80 mlおよび洗浄バッファー (TBS pH 7.4，1 mM β-ME，10 mMイミダゾール) 10 mlで洗浄後、溶出バッファー (TBS，pH 7.4，1 mM β-ME，250 mM
イミダゾール) 5 mlで溶出した。
【００８０】
7. 表面プラズモン共鳴分光法によるペプチドの解離定数(KD)の測定
合成ペプチドの解離定数(KD)の測定をBiacore3000 (Biacore) により、HBS-EPバッファーを用いて25℃で行った。まず精製したビオチン化MDM2をセンサーチップSA上に4300 RU固定した。このセンサーチップを用い、解離定数を決定するため、3種類の異なる濃度 (2-200 nM) の、合成したペプチドを注入した。インジェクションの流速は20 μl/min、結合と解離時間はそれぞれ3分で行った。その後、Glycine 2.0 (Biacore) 5 μlでセンサーチップ表面を再生した。結合データをBIAevaluationソフトウェア ver. 4.1 (Biacore) の‘Steady state affinty’モデルにより解析した。
【００８１】
In vitro virus (IVV) 法によるスクリーニングにより得られたMDM2結合ペプチドMIP (MDM2 inhibitory peptide、PRFWEYWLRLME) は、既存の配列であるpDI (LTFEHYWAQLTS(配列番号４９)) と比べ(Hu,B., 等 (2007) Cancer Res., 67, 8810-8817)、約8×103倍程度の親和性を示した (表4)。MIPは、野生型p53ペプチド (17-ETFSDLWKLLPE-28(配列番号４２)) およびpDIとは異なる配列であるが、MDM2のポケットに結合することが知られている、3つの疎水性アミノ酸 (Phe19，Trp23，Leu26，下線部) は保存されていた。これら3つの疎水性アミノ酸を含む、MIPの配列中の6つのアミノ酸をAlaに置換した6種類のペプチドのMDM2に対する親和性も同時に測定した。その結果、スクリーニングにより得られたクローン間で出現頻度の高かった (図８) Arg9およびMet11をAla置換することにより、MDM2に対する解離定数の値が、それぞれMIPの約50倍、900倍に上昇した。また、既存のモチーフであるTyr6(Bottger,V., 等 (1996) Oncogene, 13, 2141-2147) や、上述した3つの疎水性アミノ酸に相当するPhe3、Trp7、Leu10をそれぞれAla置換したペプチドに関しても、大幅な解離定数の上昇が見られた。
【００８２】
本発明では、IVV法によりヒト癌タンパク質MDM2に結合する新規ペプチド配列MIPを同定した。MIPは既存のMDM2結合ペプチドと比べ、親和性が非常に高いことがわかった。また、スクリーニングにおいて出現頻度の高かったArg9およびMet11をAlaに置換するとMDM2との親和性が大幅に低下したことから、これら2つのアミノ酸残基とそのポジションを、新規モチーフとして決定した。特にMet11に関しては、出現頻度も非常に高く、Ala置換することによりTrp7と同程度の親和性低下が見られたことから、MDM2との結合に重要であるアミノ酸である可能性が高い。
【００８３】
8. GFP融合ペプチド調製
一本鎖DNA、GFP-fus-MIPfおよびGFP-fus-MIPr (表１) の5'末端をそれぞれ、T4 polynucleotide kinase (Takara) を用いて37℃で30分インキュベートすることでリン酸化した。これらをエタノール沈殿後、全量を混合し、98℃で20秒変性させ、ゆっくり室温に戻すことでアニールさせた。得られたカセットをT4 DNA Ligaseを用い、pQBI25f発現ベクターのペプチドリンカーをHL4リンカーに置き換えた pQBI25-HL4のHindIII/EcoRIサイトにクローニングすることで、元のHindIIIおよびEcoRI部位を除去し、よりインサート側に、新たにEcoRIおよびHindIII部位を作製した。こうして得たプラスミドpQBI25-HL4-MIPを小麦胚芽由来無細胞転写翻訳系TNT Coupled Wheat Germ extract systems (Promega) によりGFP融合ペプチドを発現させた。
【００８４】
9. 細胞培養および形質移入
HCT116細胞は10% (vol/vol) FBS (Gibco)、1% (vol/vol) ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco) を含んだMcCoy's 5A培地 (Gibco) で、SW480細胞は10% (vol/vol) FBS、1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含んだDMEM培地 (Gibco) で培養し、またSaos-2細胞は15% (vol/vol) FBS (Gibco)、1% (vol/vol) ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco)
を含んだMcCoy's 5A培地 (Gibco) で培養した。これらの細胞にLipofectamine 2000 (In
vitrogen) を用いて、プラスミドpQBI25-HL4-MIPおよびGFPのC末端にFLAGタグを融合したタンパク質をコードしたプラスミドDNA、pQBI25-HL4-FLAGそれぞれの形質移入をプロトコル通りに行った。
【００８５】
上記の方法に従い, MDM2結合ペプチドによるp53経路の活性化について調べた. MDM2-p53相互作用の阻害やMDM2の発現抑制が、p53の安定化およびp53経路の活性化に繋がることが示されている(Shangary, S.,等 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105, 3933-3938 ; Hu,B., 等 (2007) Cancer Res., 67, 8810-8817; Chene,P., 等 (2000) J. Mol. Biol., 299, 245-253; Blaydes,J.P., 等(1997) Oncogene, 14, 1859-1868; Chen,L.,等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 195-200; Vassilev,L.T., 等 (2004) Science, 303, 844-848)。GFP-MIPをHCT116細胞内で発現させると、期待通りp53タンパク質発現量の増加と下流遺伝子 (MDM2，p21) のmRNA量増加およびタンパク質発現誘導が見られた (図１０、図１１)。一方、コントロールであるGFPのみを発現させた場合には、同様の結果は得られなかった。それ故これらの結果は、GFP-MIPによるMDM2-p53相互作用阻害によりp53が活性化され核移行し、自身のターゲットであるMDM2、p21を転写活性化したことを示唆している。また、p53のmRNA量はコントロールと比べて変化が無かった。転写活性化能を欠損したp53変異体発現細胞であるSW480細胞においても、同様の操作を行ったが、p53経路の活性化は確認できなかった。
【００８６】
10. 免疫沈降
形質移入から24時間後のHCT116細胞をTNEバッファー (10 mM Tris-HCl，pH 7.8，0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) 500 μlで可溶化後、12,000 gで20分遠心分離し、上清400 μlにAgarose conjugated Anti-GFP (Medical & biological laboratories) 20 μlを加え、4℃で2時間回転混和した。その後、TNEバッファーで5回洗浄し、1×サンプルバッファーを加え95℃で5分加熱することにより溶出した。
【００８７】
11. ウェスタンブロッティング
細胞を1×サンプルバッファーで回収し、10% SDS-PAGEにより分離後、ウェスタンブロッティングを行った。用いた抗体は、抗p53抗体 (Cell signaling)、抗MDM2抗体 (SMP14,
Santa cruz)、抗p21抗体 (SX118, BD Pharmingen)、抗β-actin抗体 (AC-15, Sigma)。２次抗体にはHRP標識された抗体を用い、ECL chemi- luminescence reagents (Amersham)
により検出した。また、ビーズに固定したベイトタンパク質MDM2の検出には、抗T7タグ抗体 (Novagen) を用いた。バンドからのタンパク質量定量はImage J (http://rsbweb.nih.gov/ij/) により行った。
【００８８】
12. リアルタイムRT-PCR
細胞からのRNA抽出はRNeasy mini kitのプロトコル通りに行った。このRNAをテンプレートとし、QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen) を用いてp53、MDM2、p21およびGAPDHのmRNA量を測定した。プライマーにはそれぞれ、p53 Fとp53 R、mdm2 Fとmdm2 R、p21 Fとp21 Rを用い (表1)、GAPDHの測定にはLight cyclerプライマーセット (Roche、配列は非公表) を用いた。GAPDHのmRNA量で規格化後、それぞれの遺伝子のmRNA量を決定した。
【００８９】
12. WST-1アッセイ
HCT116およびSaos-2それぞれの細胞 (1×104 cells/well) を96ウェルプレートで培養した。これらの細胞を、膜透過配列としてHIV-Tatを付加したペプチド、Tat-MIP (YGRKKRRQRRRPRFWEYWLRLME(配列番号５０)、下線はHIV-Tat配列) を異なる濃度で含んだ培地で24時間培養した。その後、Cell proliferation reagent WST-1 (Roche) を10 μl/well加え、さらに30分インキュベートした。各ウェルの440 nm (参照波長600 nm ) の吸光度をプレートリーダーSAFIRE (Tecan) により測定した。
【００９０】
細胞内でp53経路が活性化されると、その細胞は細胞周期停止やアポトーシスなどの細胞応答を引き起こすことが知られている。細胞膜透過配列として、HIV由来のTat配列をN末端に融合したMIPペプチド (Tat-MIP) により、野生型p53発現細胞HCT116はp53欠損細胞Saos-2と比べ、より低いTat-MIP濃度で細胞生存率が低下した (図１２)。また、Tat配列を融合していないMIPペプチドではHCT116細胞の生存率が低下しなかった。これらのことから、Tat-MIPが細胞内に取り込まれ、p53経路依存的な細胞死を誘導することが示唆された。
【００９１】
HCT116細胞同様、野生型p53発現細胞であるSJSA-1細胞と、p53欠損細胞であるSaos-2細胞をNutlin-3で処理した場合、それぞれの細胞増殖におけるIC50が1.8 μMと20 μMであり、約10倍異なる（Shangary, S.,等(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 3933-3938）。これに対し、Tat-MIPの場合には、IC50がHCT116細胞では13.2 μM、Saos-2細胞では19.3 μMと、約1.5倍程度の差しか見られなかった。この結果は、SJSA-1細胞がHCT116細胞と比べ、内在性のMDM2の発現量が高く、MDM2-p53相互作用阻害により、アポトーシスを起こしやすいという結果(Chene,P., 等 (2002) FEBS Lett., 529, 293-297)から判断して妥当であると言える。
【００９２】
＜配列の説明＞
1: p5315-29
2: p53の19-23番目の領域に対応する5アミノ酸残基からなるモチーフ
3: p53の17-26番目の領域に対応する10アミノ酸残基からなるペプチド
4: 本発明で用いるペプチドのアミノ酸配列
5: ライブラリーのDNAがコードするアミノ酸配列
6: プライマーMDM(1-294)f
7: プライマーMDM(1-294)r
8: プライマー5'adaptorO29T7EcoR
9: プライマーFlag1A-lib
10: プライマーBam-MDM-f
11: プライマーMDM294-Xho-r
12: プライマーSP6-O'-T7
13: プライマー3'FosCBPzz
14: テンプレートG4SG4S(NNS)16FLAGA6r
15: プライマーpriSP6OGf
16: プライマーpriFLAGA6r
17: テンプレートX12(FWL)-r
18: プライマー5'O29-T7-EcoRI
19: プライマー5'O29-f
20: プライマー3'Flag1A
21: プライマーGFP-fus-MIPf
22: プライマーGFP-fus-MIPr
23: プライマーp53F
24: プライマーp53R
25: プライマーMdm2F
26: プライマーMdm2R
27: プライマーp21F
28: プライマーp21R
29: クローンX16-1
30: クローンX16-2
31: クローンX16-3
32: クローンX16-4
33: クローンX16-5
34: クローンX16-6
35: クローンX16-7
36: p5313-28
37: クローンX12-1, MIP
38: クローンX12-2
39: クローンX12-3
40: クローンX12-4
41: クローンX12-5
42: p5317-28
43: MIP改変体F3A
44: MIP改変体Y6A
45: MIP改変体W7A
46: MIP改変体R9A
47: MIP改変体L10A
48: MIP改変体M11A
49: pDI、p53の17-28番目の領域に対応する12アミノ酸残基からなるペプチド
50: Tat-MIP
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ベイトDNA調製。MDM27-300遺伝子をpCMV-Fos-CBPzzのBamHI/XhoIサイトにサブクローニングした。このプラスミドを元に、SP6プロモーターとオメガエンハンサーの一部 (Ω29) をPCRにより付加した。
【図２】ベイトタンパク質のビーズへの固定およびプロテアーゼ溶出の略図。プロテインAのIgG結合領域 (ZZ) を、TEVプロテアーゼ切断サイトを介してMDM2のC末端に融合した。このZZ領域によりベイトタンパク質をIgGビーズに固定でき、TEVプロテアーゼにより溶出することができる。
【図３】ベイトタンパク質のビーズ固定およびプロテアーゼ溶出の確認（電気泳動写真）。(A) T7タグ-MDM2-ZZタンパク質をWheat germ extractで発現させ、IgGビーズと共にインキュベートした。このビーズを5回洗浄後、ベイトを溶出するためにTEVプロテアーゼを加えた。それぞれの画分を10%SDS-PAGEにより分離後、抗T7タグ抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した (上)。I：インプット、F：素通り、W：5回目の洗浄、B1：溶出前のビーズ、B2：溶出後のビーズ。(B)それぞれのバンド強度を定量し、インプットに対する割合を示した。
【図４】ビーズに固定したMDM2とp5315-29および全長p53 IVVとの試験管内結合アッセイ（電気泳動写真）。IVVを無細胞系により作製し、結合アッセイを行った。それぞれの画分を8 M urea 8% SDS-PAGEにより分離し、PEG-Puroスペーサーに連結されたフルオレセインの蛍光を検出した。それぞれの泳動図の上方と下方のバンドはそれぞれ、IVVおよびタンパク質と連結していないmRNA-PEG-Puroスペーサーに相当する。I：インプット、F：素通り、B：ビーズ。
【図５】GFP融合ペプチドとビーズに固定したMDM2との試験管内結合アッセイ（電気泳動写真）。(A) GFP融合ペプチド発現用プラスミド。GFPとFLAGタグをIVVスクリーニングで得られたペプチドのN末端とC末端にそれぞれ融合した。CMVプロモーターとT7プロモーターを、このペプチドを培養細胞内および試験管内でそれぞれ転写できるようにORFの上流に付加した。(B) GFP融合ペプチドを無細胞転写翻訳系により合成し、結合アッセイを行った。I：インプット、F：素通り、B：ビーズ。
【図６】セレクション条件の最適化（電気泳動写真）。4ラウンドのセレクション後の12アミノ酸残基からなるランダムIVVライブラリーを無細胞翻訳系により翻訳し、試験管内結合アッセイを行った。3種類の条件下でのビーズ画分を8 M urea 8%SDS-PAGEにより分離し、PEG-Puroスペーサーに連結されたフルオレセインの蛍光を検出した。(1) 結合時間を1時間から10分に短縮。(2) 洗浄回数を3回から10回に増加。(3) 2倍の塩濃度。コントロールと比較した結合活性をバンド強度から定量した。
【図７】セレクション実験の経過状況（電気泳動写真）。各セレクションラウンド終了後における12アミノ酸残基からなるランダムIVVライブラリーを無細胞系により翻訳し、ビーズに固定したMDM2に対する結合アッセイを行った。初期ライブラリーと比較した結合活性をバンド強度から定量した。
【図８】5ラウンドのセレクション後のランダムIVVライブラリーから得られたペプチドの各ポジションにおけるアミノ酸出現頻度。配列のロゴをWebLogo version 2.8.2 (http://weblogo.berkeley.edu/) で作製した。それぞれの文字の高さは出現頻度の高さを反映している。
【図９】GFP-MIPとMDM2の結合アッセイ（電気泳動写真）。(A) GFP-MIPを無細胞系により翻訳し、ビーズに固定したMDM2に対する試験管内結合アッセイを行った。(B) HCT116細胞にGFP-HL4-FLAG (コントロール) あるいはGFP-MIPを形質移入した。24時間後、抗GFP抗体により免疫沈降し抗MDM2抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した。
【図１０】GFP-MIPによるp53経路の活性化(電気泳動写真)。HCT116細胞 (野生型p53発現細胞) およびSW480細胞 (変異型p53発現細胞) にGFP-FLAG (コントロール) あるいはGFP-MIPを形質移入した。24時間後、細胞可溶化液をp53、MDM2、p21およびβアクチンに対する抗体でそれぞれウェスタンブロットを行った。
【図１１】GFP-MIPによるp53経路の活性化。HCT116細胞 (野生型p53発現細胞) およびSW480細胞 (変異型p53発現細胞) にGFP-HL4-FLAG (コントロール) あるいはGFP-MIPを形質移入した。24時間後、p53、MDM2、p21のmRNA量を定量逆転写PCRにより、それぞれ定量した。
【図１２】Tat-MIPの細胞生存阻害効果。HCT116細胞 (野生型p53発現細胞) およびSaos-2細胞 (p53欠損細胞) をグラフ中に示した濃度のTat-MIPを含んだ培地で24時間培養した。その後、細胞生存率をWST-1アッセイにより評価した。
【図１】
2010120881.tif 000006
【図２】
2010120881.tif 000007
【図３】
2010120881.tif 000008
【図４】
2010120881.tif 000009
【図５】
2010120881.tif 000010
【図６】
2010120881.tif 000011
【図７】
2010120881.tif 000012
【図８】
2010120881.tif 000013
【図９】
2010120881.tif 000014
【図１０】
2010120881.tif 000015
【図１１】
2010120881.tif 000016
【図１２】
2010120881.tif 000017
【配列表】
2010120881000001.app