(57)【要約】【課題】担体に固定化したい物質（固定化対象物質）の特性を適切に発揮し得るような態様で、固定化対象物質が固定化された物質固定化担体、および、特異的かつ簡便な操作で、固定化対象物質を担体に固定化する方法を提供すること。【解決手段】固定化対象物質にバイオ直交性反応点を導入することにより、特異的かつ簡便に、バイオ直交性反応点を介して担体に固定化対象物質を固定化させることが可能となることを見出したことによる。バイオ直交性反応点による結合構造を含み、かつ一般式X-S-Rで表される物質固定化担体であって、式中、Xは任意の担体、Sはスペーサー、Rは固定化用物質である、物質固定化担体による。【選択図】図１
2010122071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ直交性反応点による結合構造を少なくとも１つ含み、かつ一般式X-S-Rで表される物質固定化担体であって、式中、Xは任意の担体、Sはスペーサー、Rは固定化用物質である、物質固定化担体。
【請求項２】
バイオ直交性反応点による結合構造が、(i)少なくとも固定化用物質とスペーサーの結合部分に存在する、または(ii)少なくとも固定化用物質内に含まれる、請求項１に記載の物質固定化担体。
【請求項３】
固定化用物質における固定化対象物質が、タンパク質、ペプチドおよび低分子化合物からなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載の物質固定化担体。
【請求項４】
バイオ直交性反応点による結合構造が、炭素−炭素間の三重結合を有する官能基とアジド基とが結合してなり、下記の化学式Iで表される炭素−炭素間の二重結合と３個の窒素原子から構成される含窒素五員環構造である、請求項１〜３のいずれか１に記載の物質固定化担体。
【化１】
2010122071.tif 000024
【請求項５】
バイオ直交性反応点による結合構造が、
(ア)固定化対象物質がタンパク質もしくはペプチドである場合、下記の化学式XVで表される官能基が、タンパク質もしくはペプチドに付与されたアジド基と結合してなり；または
(イ)固定化対象物質が低分子化合物である場合、下記の化学式XVで表される官能基が、低分子化合物中のアジド基と結合してなり；
バイオ直交性反応点による結合構造が下記の化学式XVIで表される構造である、請求項１〜４のいずれか１に記載の物質固定化担体。
【化２】
2010122071.tif 000025
【化３】
2010122071.tif 000026
化合物XVとXVIにおいて、R1, R2, R3, R4はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成し、R3とR4がそれぞれ任意の置換基である、または、R3とR4が環状構造を形成し、R1とR2はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成しR3とR4が環状構造を形成する。
【請求項６】
バイオ直交性反応点による結合構造が、
(ウ)固定化対象物質がタンパク質もしくはペプチドである場合、下記の化学式XIIIで表される官能基が、タンパク質もしくはペプチドに付与されたアジド基と結合してなり；または
(エ)固定化対象物質が低分子化合物である場合、下記の化学式XIIIで表される官能基が、低分子化合物中のアジド基と結合してなり；
バイオ直交性反応点による結合構造が下記の化学式XIVで表される構造である、請求項１〜５のいずれか１に記載の物質固定化担体。
【化４】
2010122071.tif 000027
【化５】
2010122071.tif 000028
【請求項７】
固定化対象物質が固体化対象タンパク質またはペプチドであって、固体化対象タンパク質またはペプチドのアミノ末端が塩基性アミノ酸であり、当該塩基性アミノ酸にバイオ直交性反応点を有するアミノ酸が結合している、請求項１〜６のいずれかに記載の物質固定化担体。
【請求項８】
一般式X-Sで表される固定化用担体であって、Xは任意の担体、Sはバイオ直交性反応点を有するスペーサーであり、
スペーサーに存在するバイオ直交性反応点と反応するバイオ直交性反応点を有する固定化用物質を固定化するための、固定化用担体。
【請求項９】
固定化用担体に固定化される固定化用タンパク質もしくはペプチドであって、
固定化用担体が、一般式X-Sで表わされ、Xは任意の担体、Sはスペーサーであり、
固定化用タンパク質もしくはペプチドが、バイオ直交性反応点による結合構造もしくはバイオ直交性反応点を有する、固定化用タンパク質もしくはペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体を作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）一般式X-Sで表される固定化用担体を準備する工程；
（ｂ）固定化対象物質にバイオ直交性反応点を付与し、固定化用物質を作製する工程； 
（ｃ）前記固定化用担体と前記固定化用物質を接触させることにより、物質固定化担体を作製する工程。
【請求項１１】
工程（ｂ）または工程（ｃ）にバイオ直交性反応が含まれ、当該バイオ直交性反応が触媒を用いないものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
固定化対象物質がタンパク質またはペプチドであって、（ｂ）の工程が、固定化対象タンパク質もしくはペプチド、バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を含む混合溶液を用いるものである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
１以上の固定化対象物質を含む請求項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体からなる、アレイ。
【請求項１４】
１以上の固定化対象物質を含む請求項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体からなる、クロマトグラフィー用ゲル。
【請求項１５】
１以上の固定化対象物質を含む請求項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体からなる、固定化触媒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化対象物質を固定化した物質固定化担体、物質固定化担体を作製するための固定化用担体および固定化用物質、ならびに物質固定化担体を作製する方法に関する。さらに本発明は、１以上の固定化対象物質を含む物質固定化担体からなるアレイ、クロマトグラフィー用ゲル、および固定化触媒に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、担体への固定化対象物質としてタンパク質やペプチドをゲルや基板などの担体上に固定化したタンパク質アレイやペプチドアレイ（プロテインチップやペプチドチップ）が作製されている。タンパク質アレイは、タンパク質とタンパク質、タンパク質と核酸、タンパク質と低分子化合物との相互作用を迅速に検出することを可能とするものであり、基礎研究、臨床診断や創薬研究等に大きな威力を発揮すると期待されている。
【０００３】
タンパク質アレイの他に、固定化対象物質を担体上に固定化したものとして、遺伝子の解析ツールの１つであるDNAマイクロアレイ（DNAチップ）が挙げられる。DNAマイクロアレイは、固定化対象物質であるDNAが基板等の担体に固定化されプローブとしての機能するものであり、担体上のDNAと解析対象の分子（アナライト）との相互作用等を網羅的に解析する目的に使用される。その他に、固定化対象物質として糖鎖が担体に固定化された糖鎖アレイ（糖鎖チップ）なども開発されている。糖鎖アレイは、糖鎖とアナライトとの相互作用等の解析や、細菌やウイルスの検出等を目的として使用されている。さらに、固定化対象物質として低分子化合物が担体に固定化されたアレイ（チップ）も開発されている。このチップは、タンパク質の内在性リガンドの探索やアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング等に使用されている。このように種々の固定化対象物質が担体に固定化されたアレイが、基礎研究、臨床診断や創薬研究等に用いられている。
【０００４】
担体上にタンパク質やDNAなどの固定化対象物質を固定化する方法として、物理吸着や、担体上の官能基と、固定化対象物質の官能基とを共有結合させる方法や、光反応性基を利用して固定化対象物質を担体に固定化する方法などがこれまでに検討されている。例えば、タンパク質を担体上に固定化するには、タンパク質表面に存在するリジン残基と担体とを非特異的に化学反応させる方法が知られている。しかし、この方法では、タンパク質の配向を揃えて固定化することは不可能であり、しばしば固定化対象タンパク質を失活させてしまう、複数種のタンパク質が存在する場合、固定化対象タンパク質のみを特異的に固定化することができない、などの問題があった。
【０００５】
これらの問題を解決するために、固定化対象物質を担体に結合させる方法が種々提案されている。例えば、ホスホパンテテニル転移酵素（Phosphopantetheinyl transferase）という酵素触媒の存在下で、この酵素に認識されるペプチドタグ配列を持たせたタンパク質と、担体とを混ぜる方法がMicklefieldらにより報告されている（非特許文献１）。また、タンパク質のSH基をシアノ化することによる方法、フッ素化合物同士の親和力を利用する方法、タンパク質中に存在するα−アミノ基を利用する方法が開示されている（特許文献１〜３）。
【特許文献１】特許2990217号
【特許文献２】特開2007-187647号
【特許文献３】特開2008-266221号
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 130, 12456 (2008)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、担体に固定化したい物質（本明細書において「固定化対象物質」とも称する）の特性を適切に発揮し得るような態様で、固定化対象物質が固定化された物質固定化担体、および、特異的かつ簡便な操作で、固定化対象物質を担体に固定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、固定化対象物質にバイオ直交性反応点を導入することにより、特異的かつ簡便に、バイオ直交性(bioorthogonal)反応点を介して担体に固定化対象物質を固定化させることが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．バイオ直交性反応点による結合構造を少なくとも１つ含み、かつ一般式X-S-Rで表される物質固定化担体であって、式中、Xは任意の担体、Sはスペーサー、Rは固定化用物質である、物質固定化担体。
２．バイオ直交性反応点による結合構造が、(i)少なくとも固定化用物質とスペーサーの結合部分に存在する、または(ii)少なくとも固定化用物質内に含まれる、前項１に記載の物質固定化担体。
３．固定化用物質における固定化対象物質が、タンパク質、ペプチドおよび低分子化合物からなる群から選択されるものである、前項１または２に記載の物質固定化担体。
４．バイオ直交性反応点による結合構造が、炭素−炭素間の三重結合を有する官能基とアジド基とが結合してなり、下記の化学式Iで表される炭素−炭素間の二重結合と３個の窒素原子から構成される含窒素五員環構造である、前項１〜３のいずれか１に記載の物質固定化担体。
【化１】
2010122071.tif 000003
５．バイオ直交性反応点による結合構造が、
(ア)固定化対象物質がタンパク質もしくはペプチドである場合、下記の化学式XVで表される官能基が、タンパク質もしくはペプチドに付与されたアジド基と結合してなり；または
(イ)固定化対象物質が低分子化合物である場合、下記の化学式XVで表される官能基が、低分子化合物中のアジド基と結合してなり；
バイオ直交性反応点による結合構造が下記の化学式XVIで表される構造である、前項１〜４のいずれか１に記載の物質固定化担体。
【化２】
2010122071.tif 000004
【化３】
2010122071.tif 000005
化合物XVとXVIにおいて、R1, R2, R3, R4はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成し、R3とR4がそれぞれ任意の置換基である、または、R3とR4が環状構造を形成し、R1とR2はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成しR3とR4が環状構造を形成する。
６．バイオ直交性反応点による結合構造が、
(ウ)固定化対象物質がタンパク質もしくはペプチドである場合、下記の化学式XIIIで表される官能基が、タンパク質もしくはペプチドに付与されたアジド基と結合してなり；または
(エ)固定化対象物質が低分子化合物である場合、下記の化学式XIIIで表される官能基が、低分子化合物中のアジド基と結合してなり；
バイオ直交性反応点による結合構造が下記の化学式XIVで表される構造である、前項１〜５のいずれか１に記載の物質固定化担体。
【化４】
2010122071.tif 000006
【化５】
2010122071.tif 000007
７．固定化対象物質が固体化対象タンパク質またはペプチドであって、固体化対象タンパク質またはペプチドのアミノ末端が塩基性アミノ酸であり、当該塩基性アミノ酸にバイオ直交性反応点を有するアミノ酸が結合している、前項１〜６のいずれかに記載の物質固定化担体。
８．一般式X-Sで表される固定化用担体であって、Xは任意の担体、Sはバイオ直交性反応点を有するスペーサーであり、
スペーサーに存在するバイオ直交性反応点と反応するバイオ直交性反応点を有する固定化用物質を固定化するための、固定化用担体。
９．固定化用担体に固定化される固定化用タンパク質もしくはペプチドであって、
固定化用担体が、一般式X-Sで表わされ、Xは任意の担体、Sはスペーサーであり、
固定化用タンパク質もしくはペプチドが、バイオ直交性反応点による結合構造もしくはバイオ直交性反応点を有する、固定化用タンパク質もしくはペプチド。
１０．前項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体を作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）一般式X-Sで表される固定化用担体を準備する工程；
（ｂ）固定化対象物質にバイオ直交性反応点を付与し、固定化用物質を作製する工程； 
（ｃ）前記固定化用担体と前記固定化用物質を接触させることにより、物質固定化担体を作製する工程。
１１．工程（ｂ）または工程（ｃ）にバイオ直交性反応が含まれ、当該バイオ直交性反応が触媒を用いないものである、前項１０に記載の方法。
１２．固定化対象物質がタンパク質またはペプチドであって、（ｂ）の工程が、固定化対象タンパク質もしくはペプチド、バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を含む混合溶液を用いるものである、前項１０または１１に記載の方法。
１３．１以上の固定化対象物質を含む前項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体からなる、アレイ。
１４．１以上の固定化対象物質を含む前項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体からなる、クロマトグラフィー用ゲル。
１５．１以上の固定化対象物質を含む前項１〜７のいずれか１に記載の物質固定化担体からなる、固定化触媒。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の物質固定化担体は、固定化対象物質の特性、例えば触媒作用等を担体上で適切に発揮することのできるものである。また、本発明の固定化用担体、固定化用物質、および物質固定化担体の作製方法によれば、特異的に、かつ配向を揃えて固定化対象物質を担体に固定化することができ、高密度に固定化対象物質が固定化された物質固定化担体を得ることができる。さらに、バイオ直交性反応点を導入可能な固定化対象物質であれば、いかなる固定化対象物質であっても担体に固定化することが可能である。特異的固定化が可能であるため、例えば細胞抽出液などの様々な夾雑タンパク質が混じった状態で固定化対象物質の固定化操作を行うことができ、簡便に物質固定化担体を作製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、一般式X-S-Rで表される物質固定化担体に関する。式中、Xは任意の担体、Sはスペーサー、Rは固定化用物質を示す。本発明の物質固定化担体は、バイオ直交性反応点による結合構造を含むことを特徴とする。固定化用物質（R）には、固定化対象物質が含まれる。物質固定化担体において、固定化対象物質は特性を発揮し得るような態様で固定化されている。固定化対象物質の特性とは、例えばプローブとしての機能や、触媒機能などが挙げられる。
さらに本発明は、物質固定化担体を作製するための、固定化用担体（一般式X-S）および固定化用物質（一般式R）に及ぶ。
【００１１】
なお本発明における化学式や図面に示す構造式は、特に明記しない限り、単一の異性体のみが記載されていても、全ての異性体を含むことを意図するものである。
【００１２】
本発明においてバイオ直交性反応点による結合構造は、(i)少なくとも固定化用物質（R）とスペーサー（S）の結合部分に存在する、または(ii)少なくとも固定化用物質（R）内に含まれることが好ましい。
【００１３】
本発明において、「バイオ直交性反応点」とは、バイオ直交性(bioorthogonal)反応点を含む化合物が、どの他の化合物とも誤認識されないことを可能にする官能基であり、生物の元来持っている官能基（リジンのアミノ基、システインのチオール基など）とは反応せずに、人工的に設計・導入した官能基とのみ反応する官能基を意味する。バイオ直交性反応点は対になるバイオ直交性反応点が存在することにより相互にバイオ直交性を発揮し、反応を遂行することが可能となる。バイオ直交性反応点として例えば、炭素−炭素三重結合を有する官能基とアジド基（Ning et al., Angew. Chem.Int. Ed. Engl., 47, 2253 (2008)； J. A. Codelli, C. R. Bertozzi et al, J Am Chem Soc. 2008 Aug 27;130(34):11486-93）、および、テトラジン残基とトランスシクロオクテン残基（Melissa L. Blackman et al, J Am Chem Soc. 2008 ;130:13518）などが挙げられる。上記炭素−炭素間の三重結合は、芳香環や複素環などでひずみのある環状構造に含まれていることが好ましい。また、上記炭素−炭素三重結合を含む官能基はフッ素原子を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明において、バイオ直交性反応点による結合構造は、対になるバイオ直交性反応点が互いに結合してなる構造であれば特に制限されない。バイオ直交性反応点による結合構造は、炭素−炭素間の三重結合を有する官能基が、固定化用物質に含まれるアジド基と結合してなり、下記の化学式Iで表される、炭素−炭素間の二重結合と３個の窒素原子から構成される含窒素五員環構造であることが好ましい。
【化６】
2010122071.tif 000008
【００１５】
さらに、バイオ直交性反応点による結合構造は、下記化学式VIで表される含窒素五員環構造に環状構造が結合した構造であることが好ましい。
【化７】
2010122071.tif 000009
式中、Aは含窒素五員環構造中で二重結合している炭素原子とともに環状構造を完成するための原子群を表す。形成される環はいかなる環系であってもよく、さらに別の環と縮合環を形成しても良い。またAの原子群には、バイオ直交性反応を妨げないものであれば、さらに、アルキル基等のいかなる官能基が含まれていてもよい。Aはひずみを有する環状構造であることが好ましい。
【００１６】
好ましくは、バイオ直交性反応点による結合構造は、以下の化学式XVIに表される構造である。
【化８】
2010122071.tif 000010
化合物XVIにおいて、R1, R2, R3, R4はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成し、R3とR4がそれぞれ任意の置換基である、または、R3とR4が環状構造を形成し、R1とR2はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成しR3とR4が環状構造を形成する。任意の置換基とは、水素原子を含むあらゆる置換基であり、例えばフッ素原子２個であってもよい。
【００１７】
より好ましくは、バイオ直交性反応点による結合構造は、以下の化学式Xに含まれるいずれか１の構造である。
【化９】
2010122071.tif 000011
【００１８】
さらに、バイオ直交性反応点による結合構造は、下記化学式Vで表される構造のいずれかであるであることが好ましい。
【化１０】
2010122071.tif 000012
【００１９】
本発明において、固定化用担体とは、固定化対象物質が固定化される際の土台となる担体（X）とスペーサー（S）を含んでなるものである。
担体（X）は、シリカ、ガラス、ポリオエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アガロース、アクリルアミドに代表されるポリマーやハイドロゲルなどの材質のものを幅広く利用可能である。また、本発明の担体には、粒子状の担体、モノリスタイプの担体、板状やシート状の基板等、物質を固定化し得る不溶性のものならば、いずれも含まれる。市販の担体としては、Ultralink Biosupport（Pierce社製）、プロテインチップ用ヒドロゲルスライド（Nexterion（登録商標）Slide H、SCHOTT社製、#1070936）などを利用することが可能である。
【００２０】
本発明において、スペーサー（S）は担体に結合され、さらに固定化用物質と結合することによって、担体に固定化用物質を結合させる機能を有するものである。スペーサーは、固定化用物質を結合させるための反応点（B1）が、スペーサー化合物に付与されてなるものである。つまり、スペーサーの機能（担体に固定化用物質を結合させる機能）は、固定化用物質を結合させるための反応点（B1）を持つことにより、達成される。
【００２１】
前記反応点（B1）は、物質と物質との結合を可能とするものであれば、特に制限されない。反応点（B1）は、バイオ直交性反応点であってもよいし、アビジンやストレプトアビジンなどの自体公知のものを用いることもできる。これらの反応点（B1）は、固定化用物質に存在する反応点（B2）、例えばバイオ直交性反応点またはビオチンなどと、それぞれ結合する。スペーサーの反応点（B1）が、バイオ直交性反応点である場合、具体的には、炭素−炭素三重結合を有する官能基、テトラジン残基またはトランスシクロオクテン残基などが例示される。炭素−炭素三重結合を有する官能基にはフッ素原子が含まれていてもよい。
【００２２】
炭素−炭素三重結合を有する官能基として、好ましくは、下記化学式IXで表される環状構造に存在する炭素−炭素三重結合を有する官能基が挙げられる。
【化１１】
2010122071.tif 000013
式中、Aは三重結合している炭素原子とともに環状構造を完成するための原子群を表す。形成される環は、いかなる環系であってもよく、さらに別の環と縮合環を形成しても良い。またAの原子群には、反応点（B1）による反応を妨げないものであれば、さらに、アルキル基等のいかなる官能基が含まれていてもよい。Aはひずみを有する環状構造であることが好ましい。
【００２３】
好ましくは、バイオ直交性反応点による結合構造は、以下の化学式XVに表される構造である。
【化１２】
2010122071.tif 000014
化合物XVにおいて、R1, R2, R3, R4はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成し、R3とR4がそれぞれ任意の置換基である、または、R3とR4が環状構造を形成し、R1とR2はそれぞれ任意の置換基である、または、R1とR2が環状構造を形成しR3とR4が環状構造を形成する。任意の置換基とは、水素原子を含むあらゆる置換基であり、例えばフッ素原子２個であってもよい。
【００２４】
ひずみのある環状構造に存在する炭素−炭素三重結合を有する官能基には、下記の化学式XIにより表されるシクロアルキンに炭素−炭素三重結合を有する官能基も含まれる。
【化１３】
2010122071.tif 000015
【００２５】
また、ひずみのある環状構造に存在する炭素−炭素三重結合を有する官能基は、特に下記の化学式IIまたは化学式XIIにより表される官能基であることが好ましい。
【化１４】
2010122071.tif 000016
【化１５】
2010122071.tif 000017
【００２６】
スペーサー化合物は、固定化対象物質の機能を妨げないものであればどのようなものであっても使用可能である。スペーサー化合物は、［1］担体に付与された反応点（B1）を外側に向けさせ、反応点（B1）の溶媒和を促進する機能を有する、または［2］反応の際にバイオ直交性反応点同士の立体障害を緩和する、と考えられる。スペーサー化合物の例としては、各種アミノ酸あるいは、ポリエチレングリコール、ポリペプチドまたは、その他各種のポリマーからなる化合物が挙げられる。スペーサー化合物の種類、長さ、分子量等を調節することにより、固定化対象物質と担体表面との距離を調節することができる。さらに、固定化対象物質の周囲の環境（例えば、親水的環境など）を整えることが可能となる。これにより、例えば、固定化対象物質と他の物質（例えばアナライト）との相互作用が適切に行われ、解析などをより正確かつ効率的に行なうことができる。市販のスペーサー化合物としては、Bocジアミノプロパン酸（Bachem社）や、O-(2-Aminoethyl)-O'-[2-(Boc-amino)ethyl]decaethylene glycol（Fluka社 製  #77090）、H2N-(CH2CH2O)44-CH2CH2-NH2（Fluka社製、#14501）を使用することが可能である。
【００２７】
スペーサー化合物への反応点（B1）の付与は、自体公知の方法により可能である。
【００２８】
本発明において、固定化用物質（R）は固定化対象物質を含み、かつ、バイオ直交性反応点による結合構造もしくは固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点を含む。また固定化用物質（R）は反応点（B2）を含み、かかる反応点（B2）は、前記スペーサーに付与された反応点（B1）と反応性を有するものである。
【００２９】
固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点はスペーサーと結合する機能を有し、反応点（B2）自体として機能する場合がある。あるいは、固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点は、反応点（B2）を固定化対象物質に付与する機能を有する場合がある。つまりこの場合は、固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点が、反応点（B2）を有する化合物中のバイオ直交性反応点と反応して、反応点（B2）を有する化合物と結合し、バイオ直交性反応点による結合構造をなす場合があることを意味する。
【００３０】
固定化対象物質は、担体に固定化された状態で、固定化対象物質の特性を発揮し得ることを期待されるものである。固定化対象物質の特性とは、例えばプローブとしての機能や、触媒機能などを意味する。
固定化対象物質は、バイオ直交性反応点を付与可能な物質であれば特に制限されないが、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、低分子化合物、および高分子化合物などが挙げられる。固定化対象物質は、タンパク質、ペプチド、低分子化合物からなる群から選択される物質であることが好ましい。本発明において、核酸とはDNAまたはRNAなどを意味し、タンパク質とは分子量5000以上のペプチドを意味し、ペプチドとは２個以上のアミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するものを意味する。低分子化合物とは、分子量が10,000以内、好ましくは3,000以内の化合物であり、核酸、タンパク質およびペプチドを除く化合物を意味する。高分子化合物とは分子量が10,000よりも大きい化合物であり、核酸およびタンパク質を除く化合物を意味する。固定化対象物質は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、例えば種々の生物の生体内から単離して得たもの、有機合成や遺伝子工学的手法などの自体公知の手法を用いて、産生したものを用いることができる。
【００３１】
本発明において、固定化対象物質にはバイオ直交性反応点が付与される。
【００３２】
まず、固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点が、固定化用物質における反応点（B2）自体として機能する場合について説明する。固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点は、スペーサーの反応点（B1）とバイオ直交性を有するものであればよい。スペーサーの反応点（B1）が、ひずみのある環状構造に含まれる三重結合を有する官能基である場合は、固定化対象物質の反応点（B2）はアジド基であることが好ましい。固定化対象物質がタンパク質もしくはペプチドである場合、アジド基は下記の化学式IIIで表される官能基として付与され、固定化対象物質が低分子化合物である場合、アジド基は下記の化学式IVで表される官能基として付与されることが好ましい。
【化１６】
2010122071.tif 000018
【化１７】
2010122071.tif 000019
また、スペーサーの反応点（B1）が、テトラジン残基またはトランスシクロオクテン残基である場合は、固定化対象物質に付与される反応点（B2）は、トランスシクロオクテン残基またはテトラジン残基が好ましい。
【００３３】
固定化対象物質としてタンパク質またはペプチドを用いる場合は、バイオ直交性反応点が、固定化対象タンパク質またはペプチドのアミノ末端やカルボキシル末端、タンパク質またはペプチドの内部などといった、どこか１カ所に付与されていればよい。バイオ直交性反応点がアミノ末端に付与されることが好ましい。
【００３４】
固定化対象タンパク質またはペプチドにバイオ直交性反応点を付与するために、バイオ直交性反応点自体、例えばアジド基を含む官能基自体をタンパク質またはペプチドに導入することも可能であるし、バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸を固定化対象タンパク質またはペプチドに導入することも可能である。バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸としては、例えばアジド基、テトラジン残基またはトランスシクロオクテン残基を含むものが例示され、さらに具体的にはアジドフェニルアラニンやフェニル基のついていないアジド基を持った非天然アミノ酸（Link, A. J.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 11164-11165など）が挙げられる。
【００３５】
固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点が、反応点（B2）を固定化対象物質に付与する機能を有する場合について説明する。なお、反応点（B2）はバイオ直交性反応点であってもバイオ直交性反応点以外のものであってもよく、スペーサーの反応点（B1）と反応性を有するものであればよい。例えばスペーサーの反応点（B1）が、アビジンまたはストレプトアビジンである場合は、固定化用物質の反応点（B2）は、ビオチンが好ましく、ビオチンはバイオ直交性反応点を介して固定化対象物質に結合する。
【００３６】
例えば、下記化学式VIIIのように、ビオチンとひずみのある環状構造に含まれる三重結合を有する官能基とが共有結合されている場合は、固定化対象物質にはアジド基が付与されており、これらのバイオ直交性反応点が互いに結合することによりビオチンが固定化対象物質に結合される。例えば、下記化学式VIIのような結合構造にてビオチンが固定化対象物質に結合していることが好ましい。
【化１８】
2010122071.tif 000020
【化１９】
2010122071.tif 000021
【００３７】
固定化対象物質へのバイオ直交性反応点の付与、および反応点（B2）を含む化合物へのバイオ直交性反応点の付与は、自体公知の方法により可能である。例えば、固定化対象物質へのバイオ直交性反応点の付与は、バイオ直交性反応点を有する化合物を固定化対象物質に結合させることにより達成することができる。
【００３８】
固定化対象物質が固定化対象タンパク質やペプチドである場合、固定化対象タンパク質やペプチドの構造は特に制限されないが、固定化対象タンパク質やペプチドにバイオ直交性反応点を付与する方法に応じて、特定の位置に特定のアミノ酸が存在するといった構造上の特徴を必要とする場合がある。具体的には、本発明者らの発明した特願2008-181303号に記載の方法（Nexta法とも称する）を用いる場合は、固定化対象タンパク質やペプチドのアミノ末端が、リジンもしくはアルギニン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニンなどであることが好ましい。特願2008-181303号に記載の方法にて、特にアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素としてロイシル／フェニルアラニルタンパク質転移酵素を用いる場合は、固定化対象タンパク質もしくはペプチドのアミノ末端に、塩基性のアミノ酸（例えばリジンもしくはアルギニン、ヒスチジン）が存在することが好ましい。この場合、固定化対象タンパク質もしくはペプチドの塩基性アミノ酸に、バイオ直交性反応点を有するアミノ酸を結合させ、固定化対象タンパク質もしくはペプチドへのバイオ直交性反応点の付与を達成することができる。
【００３９】
本発明はさらに、物質固定化担体を作製する方法にも及ぶ。物質固定化担体を作製する方法は、一般式X-Sで表される固定化用担体を準備する工程；（ｂ）固定化対象物質にバイオ直交性反応点を付与し、固定化用物質を作製する工程； （ｃ）前記固定化用担体と前記固定化用物質を接触させることにより、物質固定化担体を作製する工程を含む。
【００４０】
工程（ａ）において、固定化用担体は、自体公知の方法によって作製することにより準備することができる。例えば、担体にスペーサー化合物を付与し、さらに反応点（B1）を付与する、あるいはスペーサー化合物が予め付与された担体を入手し、反応点（B1）を付与することにより作製することができる。
【００４１】
市販の担体としてUltralink Biosupport（Pierce社製）を使用し、市販のスペーサー化合物として、Bocジアミノプロパン酸（Bachem社）や、O-(2-Aminoethyl)-O'-[2-(Boc-amino)ethyl]decaethylene glycol（Fluka社 製  #77090）を使用する場合について例示する。Bocジアミノプロパン酸（Bachem社）またはO-(2-Aminoethyl)-O'-[2-(Boc-amino)ethyl]decaethylene glycol（Fluka社 製  #77090）、Ultralink Biosupport、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジイソプロピルエチルアミン等を混合し、50℃で7時間混和させることにより、担体にスペーサー化合物を付与することができる。
あるいは、市販の担体として、プロテインチップ用ヒドロゲルスライド（Nexterion（登録商標）Slide H、SCHOTT社製、#1070936）を使用し、市販のスペーサー化合物として、H2N-(CH2CH2O)44-CH2CH2-NH2（Fluka社製、#14501）を使用する場合について例示する。H2N-(CH2CH2O)44-CH2CH2-NH2（Fluka社製、#14501）を溶かしたDMSO溶液をヒドロゲルスライド上にスポットし、チャンバー内で室温・終夜インキュベートすることにより、担体にスペーサー化合物を付与することができる。
【００４２】
担体に付与されたスペーサー化合物に、反応点（B1）としてバイオ直交性反応点を付与する方法は自体公知の方法により行うことができる。バイオ直交性反応点として、ひずみのある環状構造に含まれる三重結合を有する官能基を、スペーサー化合物に付与するために、化合物６（Carbonic acid 7, 8- didehydro-1,2:5,6-dibenzocyclooctene-3-yl ester 4-nitrophenyl ester）を用いることができる（実施例１（２）参照）。化合物６を用いる場合には、例えば、まず市販の化合物（フェニルアセトアルデヒド、アルドリッチ社）から6段階の有機合成を行って化合物６を合成し、スペーサー化合物を持つゲルもしくはスライドに、化合物６、ジメチルホルムアミド（DMF）、トリエチルアミンなどを接触させ、30℃（室温でもよい）で終夜混和させることにより、バイオ直交性反応点の付与された固定化担体を作製することができる。
【００４３】
担体に付与されたスペーサー化合物に、反応点（B1）として、バイオ直交性反応点以外の反応点、例えばストレプトアビジンを付与する方法も、自体公知の方法により行うことができる。また、各社から市販されているstreptavidin-agaroseなどの担体を用いてもよい。例えば、Streptavidin-Agarose from Streptomyces avidinii（シグマ−アルドリッチ社  ＃S1638）などである。
【００４４】
工程（ｂ）において、固定化対象物質にバイオ直交性反応点を付与して固定化用物質を作製する工程は、自体公知の方法により可能である。例えば、バイオ直交性反応点を有する化合物を、固定化対象物質に結合させることにより、固定化対象物質にバイオ直交性反応点を付与することができる。かかる固定化用物質のバイオ直交性反応点は、それ自体が反応点（B2）として機能してもよいし、反応点（B2）を有する化合物を結合する機能を有してもよい。
【００４５】
固定化対象物質としてタンパク質またはペプチドを用いる場合は、バイオ直交性反応点が、固定化対象タンパク質またはペプチドのアミノ末端やカルボキシル末端、固定化対象タンパク質またはペプチドの内部などといった、どこか１カ所に付与されるようにすればよい。バイオ直交性反応点がアミノ末端に付与されることが好ましい。
【００４６】
固定化対象タンパク質またはペプチドにバイオ直交性反応点を付与するために、バイオ直交性反応点自体、例えばアジド基を含む官能基自体を、固定化対象タンパク質またはペプチドに導入することも可能であるし、バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸を固定化対象タンパク質またはペプチドに導入することも可能である。バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸を、固定化対象タンパク質またはペプチドに結合させることにより、バイオ直交性反応点を固定化対象物質に付与することが好ましい。
バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸としては、例えばアジド基、テトラジン残基またはトランスシクロオクテン残基を含むものが例示され、さらに具体的にはアジドフェニルアラニンやフェニル基のついていないアジド基を持った非天然アミノ酸（Link, A. J.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 11164-11165など）が挙げられる。
【００４７】
バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸の固定化対象タンパク質またはペプチドへの導入は、タンパク質翻訳系を用いて位置特異的に導入する非天然アミノ酸変異法（Alexander Deiters et al, J Am Chem Soc. 2003 ;125:11782；Link, A. J.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 11164-11165）；ロイシル／フェニルアラニルタンパク質転移酵素と、非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたtRNAとを用いて、固定化対象タンパク質またはペプチドのアミノ末端に非天然アミノ酸を酵素的に結合させる方法（M. Taki, M. Sisido, Biopolymers: Peptide Science, 88, 263 (2007)；R. E. Conner, D. A. Tirrell et al., ChemBioChem, 9, 366 (2008)）；特願2008-181303号に記載の方法（tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素およびアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素の反応を利用した方法：Nexta法とも称する）；ペプチド固相合成法を用いて固定化対象タンパク質またはペプチドを合成する際、固定化対象タンパク質またはペプチドの末端または内部に、アジド基を持つ非天然アミノ酸を１カ所だけ、合成の過程で導入する方法などで、行うことができる。
【００４８】
バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸の固定化対象タンパク質もしくはペプチドへの導入を、特願2008-181303号の方法にて行う場合、アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素としてロイシル／フェニルアラニルタンパク質転移酵素を用いれば、固定化対象ペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端に、バイオ直交性反応点を有する非天然アミノ酸を導入することができる。なお、特願2008-181303号の内容は、参照により本出願に全て記載されているものとする。
【００４９】
特願2008-181303号に記載の方法（Nexta法とも称する）を用いる場合は、アミノ末端が、リジンもしくはアルギニン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニンなどである固定化対象タンパク質またはペプチドを用いることが好ましい。特願2008-181303号に記載の方法にて、特にアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素としてロイシル／フェニルアラニルタンパク質転移酵素を用いる場合は、固定化対象タンパク質もしくはペプチドのアミノ末端に、塩基性のアミノ酸（例えばリジンもしくはアルギニン、ヒスチジン）が存在することが好ましい。
【００５０】
特願2008-181303号に記載のNexta法を用いて、固定化対象ペプチドもしくはタンパク質に、非天然アミノ酸のアジドフェニルアラニンを付加させる方法は、例えば、tRNA、緩衝液、ATP(Na)-KOH、固定化対象タンパク質もしくはペプチド、アジドフェニルアラニン、アミノアシルtRNA合成酵素およびアミノアシルtRNAタンパク質転移酵素を混合してインキュベートするものである。インキュベートの温度は約0℃〜50℃、好ましくは約4℃〜37℃であり、インキュベートの時間は約15分〜120分でよいが、数分（5分程度）でもよい。例えば37℃で60分間インキュベートを行ってもよい。
【００５１】
固定化対象物質として低分子化合物を用いる場合を例示する。固定化対象低分子化合物としてのTAMRA-OSu(Sigma社；正式名：(5(6)-carboxytetramethylrhodamine N-hydroxysuccinimide ester：2種類の異性体の混合物)と、アジド基を有する化合物である11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine（Fluka社）を混合し、室温終夜インキュベートすることにより、バイオ直交性反応点を低分子化合物に付与することができる。
【００５２】
固定化対象物質に付与されたバイオ直交性反応点が、反応点（B2）を有する化合物を結合する機能を有する場合について説明する。以下、反応点（B2）を有する化合物がビオチンであり、ビオチンにひずみのある環状構造に含まれる炭素−炭素三重結合を有する官能基が付与されており、固定化用物質がアジド基を有する場合を例示して説明する。
【００５３】
まず、ビオチンにバイオ直交性反応点を付与した化合物を得る。かかる化合物は、例えば、Ning et al., Angew. Chem.Int. Ed. Engl., 47, 2253 (2008)の方法に従って、合成、精製、同定することが可能である。
【００５４】
次に、バイオ直交性反応点を付与された固定化対象物質と、ビオチンにバイオ直交性反応点を付与した化合物との結合反応を行う。かかる結合反応は、例えばバイオ直交性反応点を付与された固定化対象化合物に対して、ビオチンにバイオ直交性反応点を付与した化合物を含むメタノール溶液を混合し、インキュベートを行えばよい。この結合反応では、特定の触媒、例えば銅触媒をさらに用いる必要はなく、むしろ用いないことが好ましい。炭素−炭素三重結合がひずみを持つ環状構造に含まれていれば、銅触媒を用いなくても、バイオ直交性反応は速やかに進行可能である。インキュベーションの時間、温度などは適宜設定可能であるが、例えば室温〜37℃程度で、20分〜1時間程度行えばよい。
【００５５】
工程（ｃ）において、前記固定化用担体と前記固定化用物質を接触させることにより、物質固定化担体を作製することができる。
【００５６】
反応点（B1,B2）がバイオ直交性反応点である場合は、前記固定化用担体と前記固定化用物質を接触させた状態でインキュベートして反応を行えばよく、特定の触媒などをさらに添加する必要はない。例えば、前記固定化用担体と前記固定化用物質を、炭素−炭素三重結合とアジド基により結合する場合、銅触媒を用いてもよいが、用いないことが好ましい。炭素−炭素三重結合がひずみを持つ環状構造に含まれていれば、銅触媒を用いなくても、バイオ直交性反応は速やかに進行可能である。前記固定化用担体と前記固定化用物質を接触させるためのインキュベーションの時間、温度などは適宜設定可能であるが、例えば室温で、20分〜1時間程度行えばよい。
【００５７】
反応点（B1,B2）がバイオ直交性反応点以外のものである場合、反応点の種類に応じて、反応条件等を決定することができる。例えば、反応点（B1）がストレプトアビジンで、反応点（B2）がビオチンである場合は、J. N. Rybak et al., Proteomics, 4，2296（2004）の方法を参考にして反応を行えばよい。また、市販のStreptavidin-agaroseを用いる場合は、製造元のプロトコルに従って反応を行えばよい。
【００５８】
本発明はさらに、１以上の固定化対象物質を含む物質固定化担体からなる、アレイ、クロマトグラフィー用ゲル、または固定化触媒にも及ぶ。アレイはタンパク質アレイ（プロテインチップとも称する）を意味し、クロマトグラフィー用ゲルは液体クロマトグラフィー用のカラム等に充填されるゲル等が例示され、固定化触媒は固定化酵素などが例示され、さらに具体的にはマイクロリアクター上に固定化される酵素が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
（実施例１）  固定化用担体の作製
（１）担体へのスペーサー化合物の付加
市販のアクリルアミド由来のゲル（Ultralink Biosupport、Pierce社製）を出発原料とし、短いスペーサー化合物を持つゲル７および長いスペーサー化合物を持つゲル８を合成した（図２）。スペーサー化合物を持つゲルは、Bocジアミノプロパン酸（Bachem社）またはO-(2-Aminoethyl)-O'-[2-(Boc-amino)ethyl]decaethylene glycol  180μmol、Ultralink Biosupport 0.1g （30μmolの反応点を持つ；製品の添付書に記載）、ジメチルスルホキシド（DMSO） 800μL、ジメチルホルムアミド（DMF） 800μL、ジイソプロピルエチルアミン 200μLを混合し、50℃で7時間混和させ反応を行うことにより作製した。上清を取り除き、1.5M Tris-HCl緩衝溶液(pH8.8)を800μL加え、50℃で30分間混和させ、ゲル上の未反応の官能基を潰した。上清を取り除き、水でゲルを洗浄した。次に、氷上でトリフルオロ酢酸（1mL）を加え、氷上に30分放置した。トリフルオロ酢酸を取り除き、ゲルをジエチルエーテルで洗浄したのち、真空ポンプで乾燥させた。
【００６１】
（２）バイオ直交性反応点を有する化合物の合成
ゲルにバイオ直交性反応点を持たせるため、市販の化合物（フェニルアセトアルデヒド、アルドリッチ社）から6段階の有機合成を行って、化合物６（Carbonic acid 7, 8- didehydro-1,2:5,6-dibenzocyclooctene-3-yl ester 4-nitrophenyl ester）を合成した。合成、およびNMR等による化合物の同定は、Ning, Angew. Chem.Int. Ed. Engl., 47, 2253 (2008) の方法に従い行った（下記のスキーム１）。化合物１〜６は全てシリカゲルカラムクロマトにて精製を行い、NMRおよびMSスペクトルにて同定した。
【化２０】
2010122071.tif 000022
【００６２】
（３）担体へのバイオ直交性反応点の付与
スペーサー化合物を持つ乾燥ゲル（10mg；およそ3μmolのアミノ基（反応点）が含まれていると考えられる）に対し、化合物６(4.6 mg; 12μmol)、ジメチルホルムアミド（DMF） 200μLトリエチルアミン (0.9μL; 9μmol)を混合し、30℃終夜混和させ反応を行った。翌日、上清を取り除き、ゲルをジメチルスルホキシド（DMSO）で3回洗浄し、次に水で2回洗浄を行った。これにより、ひずみのある三重結合をバイオ直交性反応点として持つゲル９および１０を作製した（図２）。
【００６３】
（４）ゲル９および１０上のバイオ直交性反応点のモル数の決定
TAMRA-OSu(Sigma社；正式名：(5(6)-carboxytetramethylrhodamine N-hydroxysuccinimide ester；2種類の異性体の混合物)および11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine（Fluka社）を用いて、下記のスキーム２により、バイオ直交性反応点（アジド基）を持つ蛍光性化合物１１（肉眼では赤色）を合成した。HPLCを用いて精製を行い、NMRおよびMSスペクトルにて同定した。
【化２１】
2010122071.tif 000023
化合物１１を水に溶かし、ゲル９または１０と混合し、反応性を確認した。
【００６４】
結果を図３に示す。ゲル９および１０と混合後、即座にバイオ直交性反応点である官能基同士が反応してゲルが赤く染まり（図３の右（ゲル１０）；ゲル９でも同様の結果が得られるが、写真は示していない）、溶液の赤色は消失し、ゲルが赤く染まった。ひずみを持つ三重結合を持たないゲル７または８と化合物１１とを混合した結果、ゲルは白いままであり、溶液の色は消失しなかった（図３の左（ゲル８）；ゲル７でも同様の結果が得られるが、写真は示していない）。これはゲル７または８と化合物１１とでは反応が起こらなかったことを示す。
【００６５】
結果を図３に示す。ゲル９および１０と混合後、即座にバイオ直交性反応点である官能基同士が反応してゲルが赤く染まり（図３の右（ゲル１０）、ゲル９でも同様の結果が得られるが、写真は示していない）、溶液の赤色は消失し、ゲルが赤く染まった。ひずみを持つ三重結合を持たないゲル７または８と化合物１１とを混合した結果、ゲルは白いままであり、溶液の色は消失しなかった（図３の左（ゲル８）、ゲル７でも同様の結果が得られるが、写真は示していない）。これはゲル７または８と化合物１１とでは反応が起こらなかったことを示す。
【００６６】
また、ゲル９および１０を化合物１１で滴定して、ゲル上のバイオ直交性反応点（三重結合）のモル数を求めた結果、ゲル９および１０いずれも、ゲル1mLあたり8〜10μモルのバイオ直交性反応点を有していた。
【００６７】
（実施例２）固定化用ペプチドの作製（Nexta法）
0.1 O.D./μl E. coli tRNAPhe 3μl(0.3OD; 460 pmol)、5×aat緩衝液（アミノアシル化緩衝液; 50mM MgCl2, 5mM Spermine, 250mM Hepes buffer(pH7.6), 100mM KCl） 7.2μl、250mM ATP(Na)-KOH (pH7.0) 0.36μl、350 pmol/μl 蛍光ペプチドLys-Ala-AMC（Lys-Ala-7-amido-4-methylcoumarin dihydrochloride ；Sigma社#L8139） 6μl(2.1nmol)、アジドフェニルアラニン 60nmol、33μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 3μl(100 pmol)、26μM L/F転移酵素(野生型) 3μl(78 pmol)を混合した混合溶液（超純水で全量64μlに調節）を作製した。37℃で60分間インキュベートした。
その結果、アジド基の付加された蛍光ペプチドが得られた（図４左側）。
【００６８】
（実施例３）ペプチド固定化担体の作製
実施例２で作製した固定化用ペプチドに、スペーサー化合物のみを持ちバイオ直交性反応点を持たないゲル７（負対照、図２参照）またはゲル９を6μL加え、室温で30分間攪拌しながらインキュベートした（図４）。反応後、ゲルと上清とを分けた。上清を水で希釈し、320nmの波長で励起して蛍光測定を行った。ゲルは洗浄後、365nmの波長で励起して蛍光イメージングを行った。
【００６９】
結果を図５に示す。蛍光測定の結果、９８％の蛍光ペプチドをN末端特異的にゲル９上に固定化することができた。
【００７０】
（実施例４）タンパク質固定化担体の作製
（１）固定化対象タンパク質の作製
タンパク質発現用酵母（JD55；Ubr1遺伝子欠損型; A. Varshavsky et al., JBC, 274, 18135 (1999)）および、アミノ末端にそれぞれR（アルギニン）、M（メチオニン）、およびL（ロイシン）を持つβガラクトシダーゼを当該酵母内で発現させるためのプラスミド遺伝子（それぞれpUB23-R-betaGal, pUB23-M-betaGal, pUB23-L-betaGal; A. Varshavsky et al., Science, 234, 179 (1986) ）を、カリフォルニア工科大のA. Varshavsky氏より入手した。これら3種類の遺伝子をそれぞれ、JD55酵母に形質転換したのち、ガラクトースを添加することにより、酵母内でアミノ末端にそれぞれR（アルギニン）、M（メチオニン）、およびL（ロイシン）を持つβガラクトシダーゼを発現させた。細胞培養物をビーズで破砕したのち、その上清を細胞抽出液として回収した。細胞抽出液中に活性を持ったβガラクトシダーゼが含まれるかどうかについて、基質X-galを用いて定法に従い、酵素活性の測定を行った。
【００７１】
結果を図６上段に示す。左から右に向けて、アミノ末端にそれぞれR（アルギニン）、M（メチオニン）、およびL（ロイシン）を持つβガラクトシダーゼの遺伝子を含むプラスミドにより形質転換した酵母の細胞抽出液である。細胞抽出液はどれも青色を呈色したことから、細胞抽出液に活性を持ったβガラクトシダーゼが含まれていることが確認された。
【００７２】
（２）固定化用タンパク質の作製（Nexta法）
350 pmol/μl 蛍光ペプチドLys-Ala-AMC 6μl(2.1nmol)の代わりに、実施例４（１）にて得られた細胞抽出液（酵母懸濁液を0.8mLスケールで培養して遠心したものを破砕し調製したもので、合計約18μL）を用いて、非天然アミノ酸（アジドフェニルアラニン；60nmol, 2mM）の存在下で、37℃、1時間反応させた（30μLスケール）。
【００７３】
（３）タンパク質固定化担体の作製
実施例４（２）にて得られた反応混合物に、1.1Mシステインを6.9μLを加えたのち、実施例１にて得られたゲル９ 7.5μLと混合した。室温で30分間混和してバイオ直交性反応をさせたのち、上清を捨て、ゲルを洗浄した。
ゲル上に活性を持ったβガラクトシダーゼが含まれるかどうか、基質X-galを用いて定法に従って、実施例４（１）と同様の手法により、酵素活性の測定を行った。
【００７４】
結果を図６下段に示す。アミノ末端にR（アルギニン）を持ったβガラクトシダーゼのみ青色に呈色していることを確認した。これは、アミノ末端にR（アルギニン）を持ったβガラクトシダーゼのみ、アジドフェニルアラニンが転移したのち、アミノ末端のアジドフェニルアラニンとゲルの環状構造とがバイオ直交性反応して共有結合を形成し、活性を保ったままゲルに固定化されたためと考えられる。一方、アミノ末端にメチオニンまたはロイシンを持ったβガラクトシダーゼは、ゲルは白いままであった。これは、アミノ末端にメチオニンまたはロイシンを持ったβガラクトシダーゼはN末端にアジドフェニルアラニンを転移させることができなかったためと考えられる。このように、多数の蛋白質が混じっている酵母細胞抽出液中から、アミノ末端にアルギニンを持った固定化対象タンパク質だけを特異的に、活性を保ったままゲルに固定化できることが示された。
【００７５】
（実施例５）低分子化合物固定化担体の作製
（１）固定化用担体の作製
市販のプロテインチップ用ヒドロゲルスライド（Nexterion（登録商標）Slide H、SHOTT社製、#1070936）を出発原料とした。H2N-(CH2CH2O)44-CH2CH2-NH2（Fluka社製、#14501）を溶かした40mM DMSO溶液を0.3μLずつ、ヒドロゲルスライド上にスポットし、チャンバー内で室温・終夜インキュベートした。翌日スライドをDMFで洗浄し、表面を軽く乾燥させた。スライド上の未反応の反応点（OSu残基）を潰すため、ジグリコールアミン（Wako社 製、#019-10922）を溶かした40mM DMSO溶液をスライド上に全面に塗り、チャンバー内で室温・終夜インキュベートした。翌日スライドをDMFで洗浄し、表面を軽く乾燥させスライド１２を得た。化合物６(23 mg; 60μmol)、ジメチルホルムアミド（DMF） 1mLトリエチルアミン (4.5μL; 45μmol)を混合し、スライド１２上に塗り、チャンバー内で室温・終夜インキュベートした。翌日、上清を取り除き、スライドをDMFで５回洗浄し、次に水で2回洗浄を行った。これにより、ひずみのある三重結合をバイオ直交性反応点として持つスライド１３を作製した（図７）。
【００７６】
（２）固定化用低分子化合物の作製
TAMRA-OSu(Sigma社；正式名：(5(6)-carboxytetramethylrhodamine N-hydroxysuccinimide ester)および11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine（Fluka社）を用いて、実施例１（４）に記載の方法（スキーム2）と同様の方法により、アジド基を持つ低分子化合物１１を合成した。
【００７７】
（３）低分子化合物固定化担体の作製
上記スライド１３上の各スポット上に、水に溶かした化合物１１を1μL/spotでスポットし、湿度のあるチャンバー内で室温・3時間インキュベートし、スライド１４を作製した。負対照実験として、バイオ直交性反応点を持たないスライド１２と、水に溶かした化合物１１とを混合し、同様にインキュベートした。反応後、TBST緩衝溶液で20分3回スライドの洗浄を行い、488nmの光で励起して蛍光イメージャーにてスライド上のスポットの蛍光画像を撮影した。
【００７８】
結果を、図８に示す。上段は、スライド１３を用いてスライド１４を作製した結果を示す。下段はスライド１２を用いたもの（負対照）の結果を示す。下段では蛍光が観察されなかったことから、蛍光基を持つ化合物１１が全くスライド上に結合していないことがわかった。これらの結果から、バイオ直交性反応点特異的な反応が起こって、化合物１１がスライド１３上に固定化されたと考えられた。
図８において、スポットした溶液1μL中に含まれる化合物１１の量は、左から順に、1nmol、100pmol、10pmol、1pmolであり、表示幅（スライドの横幅）は約1.5cmである。本実施例条件での化合物１１の検出限界は、10pmolであることがわかった。また、1nmol（一番左）のスポットの蛍光強度と、100pmol（左から２番目）の蛍光強度とが等しいことから、スライド上の各スポットに含まれるバイオ直交性反応点のモル数は、100pmol/spotと算出された。
【００７９】
（実施例６）ビオチン化した固定化用ペプチドの作製
アジドフェニルアラニンを化合物１５（蛍光ペプチドLys-Ala-AMC）に結合させるために、以下の反応を行った（図９）。
0.025 O.D./μl E. coli tRNAPhe 24μl(0.6OD; 920 pmol)、ATP(Na)-KOH (pH7.0)を含む5×aat緩衝液（50mM MgCl2, 5mM Spermine, 250mM Hepes buffer(pH7.6), 100mM KCl） 24μl、350 pmol/μl 蛍光ペプチドLys-Ala-AMC（化合物１５）  12μl(4.2nmol)、アジドフェニルアラニン96nmol、20μM E. coli PheRS(Ala294→Gly) 6μl(120 pmol)、5.7μM L/F転移酵素(野生型) 27μl(160 pmol)を混合した混合溶液（超純水で全量120μlに調節）を作製した。混合溶液を37℃で120分間インキュベートした。反応後の混合物をYM10フィルターを用いて濾過し、分子量10000以上の酵素を取り除いた。
濾過した溶液のうち30μL分をHPLCで分析した。HPLC条件は、カラム：GRACE Vydac 218TP、検出：蛍光( Ex: 324 nm , Em: 320 nm )、A溶媒：0.1% TFA 水溶液、B溶媒：アセトニトリル、HPLCプロファイル（B溶媒の割合）：0-5min  0%、5-7min  0-10%、7-27min  10-50%、27-37min  50-100%である。
【００８０】
残り90μLの溶液のうち30μL分を次の反応に用いた。20mMの化合物１７（ビオチン誘導体）（Ning et al., Angew. Chem.Int. Ed. Engl., 47, 2253 (2008)に従って、合成、精製、同定したもの）を含むメタノール溶液  5μLを、上記アジドフェニルアラニンと化合物１５の反応溶液に加え、合計35μLとし、37℃で60分間反応を行った。反応混合物を、DISMIC 03フィルターを用いて濾過し、全量をHPLCで分析した。
【００８１】
結果を図１０に示す。上から下へそれぞれ、化合物１５，１６，１８のHPLCクロマトグラムを示す。これらピークに存在する化合物の質量が理論値と同一であることは、MALDI-TOF-MSスペクトルにて確認を行った。HPLCの結果から、化合物１５から化合物１６への変換効率、および、化合物１６から化合物１８への変換効率を求めた。その結果、ほぼ定量的（100%）に化合物１８を合成することができた。また、MALDI-TOF-MSスペクトルにて化合物１８の同定も行った。なお、化合物１８のクロマトにて、ピークが３種類（以上）存在するのは、化合物１８の異性体が４種類存在するためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の固定化用担体、固定化用物質、および物質固定化担体の作製方法によれば、特異的に、かつ配向を揃えて物質を担体に固定化することができ、高密度に物質が固定化された物質固定化担体を得ることができる。また、バイオ直交性反応点を導入可能な物質であれば、いかなる物質であっても担体に固定化することが可能となり、細胞抽出液などの様々な夾雑タンパク質が混じった状態で固定化操作を行うことができる。このような本発明の物質固定化担体は、固定化された固定化対象物質の特性を適切に発揮し得ることができるものであり、解析用などのアレイのみならず、クロマトグラフィー用ゲル、マイクロリアクター用の固定化触媒等としても利用することができ、極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明の概念を示す図である。
【図２】固定化用ゲルの作製工程を示す図である。（実施例１（１）（２））
【図３】ゲル上にバイオ直交性反応点が導入されたことを示す写真である。（実施例１（３））
【図４】ペプチド固定化ゲルまたはタンパク質固定化ゲルの作製工程を示す図である。（実施例２〜４）
【図５】ゲル上へのペプチドの固定化率を確認した図である。（実施例３）
【図６】ゲル上へのタンパク質の固定化を確認した写真である。（実施例４）
【図７】低分子化合物固定化担体の作製工程を示す図である。（実施例５）
【図８】スライド上への蛍光低分子化合物の固定化を確認した写真である。（実施例５（３））
【図９】ビオチン化ペプチドの作製工程を示す図である。（実施例６）
【図１０】ビオチン化ペプチドに関する分析結果を示す図である。（実施例６）
【図２】
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【図９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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