(57)【要約】【課題】環境適合性に優れた、植物由来の原料を用いながら、溶融加工時の結晶化速度が向上した樹脂組成物を提供すること【解決手段】式（１）［−Ｏ−ＣＨＲ１−ＣＨ２−ＣＯ−］          （１）（ここでＲ１はＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１〜１５の整数）で示される一種以上の繰り返し単位からなる重合体（以下、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）：略称はＰ３ＨＡ）、及び、インジゴまたはその誘導体、を含有する脂肪族ポリエステル系樹脂組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
［−Ｏ−ＣＨＲ１−ＣＨ２−ＣＯ−］          （１）
（ここでＲ１はＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１〜１５の整数）
で示される一種以上の繰り返し単位からなる重合体（以下、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）：略称はＰ３ＨＡ）、及び
インジゴまたはその誘導体、を含有する脂肪族ポリエステル系樹脂組成物。
【請求項２】
Ｐ３ＨＡ１００重量部に対して、インジゴまたはその誘導体０．００１〜１０重量部を含有する請求項１に記載の脂肪族ポリエステル系樹脂組成物。
【請求項３】
Ｐ３ＨＡが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（以下、略称はＰＨＢＨ）である請求項１又は２に記載の脂肪族ポリエステル系樹脂組成物。
【請求項４】
ＰＨＢＨを構成する繰り返し単位のうち、３−ヒドロキシヘキサノエート単位が１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％を占める、請求項３に記載の脂肪族ポリエステル系樹脂組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）（略称：Ｐ３ＨＡ）を含有する脂肪族ポリエステル系樹脂に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、プラスティックが多量に使用、廃棄されるにつれ、その埋め立て地の不足、非分解性のプラスチックが環境に残存することによる生態系への影響、燃焼時の有毒ガス発生、大量の燃焼熱量による地球温暖化等、地球環境保護の見地から廃棄物処理に関する問題は、大きくクローズアップされている。そこで、プラスチック廃棄物の問題を解決できるものとして、生分解性プラスチックの開発が活発に行われている。
【０００３】
一般的に生分解性プラスチックは、(i)ポリヒドロキシアルカノエート（以下、略称はＰＨＡ）といった微生物生産系脂肪族ポリエステル、(ii)ポリ乳酸やポリカプロラクトン等の化学合成系脂肪族ポリエステル、(iii)澱粉や酢酸セルロース等の天然高分子物といった、３種類に大別される。化学合成系脂肪族ポリエステルのなかでもポリ乳酸、ポリカプロラクトンは耐熱性に問題があり、また、天然高分子物は非熱可塑性であることや耐水性に劣るといった問題がある。
【０００４】
一方、ＰＨＡは好気性、嫌気性下での分解性に優れ、燃焼時には有毒ガスを発生せず、植物原料を使用した微生物に由来するプラスチックで高分子量化が可能であり、地球上の二酸化炭素を増大させない、カーボンニュートラルである、といった優れた特徴を有している。特に嫌気性下で分解する性質や、高分子量化が可能である点は特筆すべき性能である。該ＰＨＡは脂肪族ポリエステルに分類されるが、先に述べた化学合成系の脂肪族ポリエステルとは、ポリマーの性質が大きく異なる物である。
【０００５】
この様にＰＨＡは、天然成分からなり、廃棄物の問題が解決され、環境適合性に優れるため、包装材料、食器材料、建築・土木・農業・園芸材料、吸着・担体・濾過材等に応用可能な成形体が望まれている。
【０００６】
しかしながら、ＰＨＡの加工上の問題として、溶融加工時の結晶化が極めて遅い点が挙げられる。例えばフィルム成形の場合、押出機先端のダイス部分から押し出される溶融フィルムが、巻き取り用ロールに粘着し、ロールの引取速度を上げることが出来ず、生産性が低くなる等の問題が挙げられる。
【０００７】
そこで、結晶化速度向上に関する取り組みとして、ＰＨＡ類であるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（以下、略称はＰＨＢＨ）を用いた例を挙げると、ＰＨＢＨのホモポリマーであるポリ（３−ヒドロキシブチレート）（以下、略称はＰＨＢ）等のより高い融解温度を有するＰＨＡを添加し微分散させた組成物を得ることで、結晶化速度が速くなる事が明示されている。しかしながら、ＰＨＢの融解温度以上の高い温度で加工した場合は、結晶化速度の効果が得られず、幅広い加工温度に適用できる結晶核剤の効果を得るには至っていない（特許文献１、２）。また、ＰＨＡに対する結晶核剤として、シアヌル酸を用いた例があるが（特許文献３）、本発明者らは、その効果を確認すべく、ヘキサノエート成分が１２モル％のＰＨＢＨを用い、追試した結果、必ずしもこの方法で得られる組成物の結晶化速度が改善される結果ではなかった。
【０００８】
また、ＰＨＢＨ以外のＰＨＡ類としてポリ乳酸を用いた例が挙げられる。ポリ乳酸に結晶核剤としてインジゴを用いると、結晶化率向上に伴い、結晶化速度が速くなる結果が示されているが、実際の加工条件でどの程度効果があるのかは不明であり、かつ、ポリ乳酸そのものが硬質素材である為、柔軟性が要求される用途には適さない（特許文献４）。
【特許文献１】国際公開第０２／５０１５６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／２８０７０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０５／６６２５６号パンフレット
【特許文献４】特開２００３−２３８７７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記問題点に鑑み、環境適合性に優れた、植物由来の原料を用いながら、溶融加工時の結晶化速度が向上した樹脂組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｐ３ＨＡに対してインジゴ又はその誘導体を添加することによって、溶融加工時の結晶化速度が著しく速くなることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、式（１）
［−Ｏ−ＣＨＲ１−ＣＨ２−ＣＯ−］          （１）
（ここでＲ１はＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１〜１５の整数）
で示される一種以上の繰り返し単位からなる重合体（以下、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）：略称はＰ３ＨＡ）、及び、インジゴまたはその誘導体、を含有する脂肪族ポリエステル系樹脂組成物に関する。
【００１２】
Ｐ３ＨＡ１００重量部に対して、インジゴまたはその誘導体０．００１〜１０重量部を含有することが好ましい。
【００１３】
Ｐ３ＨＡが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（以下、略称はＰＨＢＨ）であることが好ましい。
【００１４】
ＰＨＢＨを構成する繰り返し単位のうち、３−ヒドロキシヘキサノエート単位が１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％を占めることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、環境適合性に優れており、かつ溶融加工時の結晶化速度が向上した脂肪族ポリエステル系樹脂組成物を得ることが出来る。これにより幅広い成形加工用途に好適に使用することが可能になる。本発明の脂肪族ポリエステル系樹脂組成物から得られる成形体は、地球上の二酸化炭素を積極的に固定化して得られる植物由来の成形体であり、地球温暖化防止が期待できる。さらには廃棄時に好気性、嫌気性何れの環境下でも微生物などの作用により分解し、地球上の炭素循環系に還る成形体が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
【００１７】
本発明の脂肪族ポリエステル系樹脂は、式（１）
［−Ｏ−ＣＨＲ１−ＣＨ２−ＣＯ−］          （１）
（ここでＲ１はＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１〜１５の整数）
で示される一種以上の繰り返し単位からなる重合体（以下、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）：Ｐ３ＨＡともいう）である。
【００１８】
本発明のＰ３ＨＡとは、前記式（１）で示される３−ヒドロキシアルカノエートよりなる繰り返し単位を有し、かつ微生物から生産される脂肪族ポリエステルである。具体的なＰ３ＨＡとしては、前記３−ヒドロキシアルカノエートのホモポリマー、またはｎの異なる２種以上の３−ヒドロキシアルカノエートからなる共重合体、前記ホモポリマー及び前記共重合体の群より選ばれる２種以上をブレンドした混合物が挙げられ、中でもｎ＝１の３−ヒドロキシブチレート単位、ｎ＝２の３−ヒドロキシバリレート単位、ｎ＝３の３−ヒドロキシヘキサノエート単位、ｎ＝５の３−ヒドロキシオクタノエート単位、ｎ＝１５の３−ヒドロキシオクタデカノエート単位からなる群より構成されるホモポリマー、共重合体及び混合物が好ましく、ｎ＝１の３−ヒドロキシブチレート単位とｎ＝３の３−ヒドロキシヘキサノエート単位の共重合体であるポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（以下、ＰＨＢＨともいう）がより好ましく、さらにその組成比が、３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシヘキサノエート＝９９／１〜８０／２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることが更に好ましい。比較的硬質素材を得ようとすると、組成比が３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシヘキサノエート＝９９／１〜９０／１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であるが、一方比較的軟質素材を得ようとすると、組成比が３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシヘキサノエート＝９０／１０〜８０／２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である事が好ましい。３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシヘキサノエート組成比が９９／１より大きいと、ホモポリマーであるポリヒドロキシブチレートと融点に差がなく、高温で加熱加工する必要があり、加熱加工時の熱分解による分子量低下が激しく品質の制御が困難となる場合がある。また３−ヒドロキシブチレート／３−ヒドロキシヘキサノエート組成比が８０／２０より小さいと、加熱加工時の再結晶化に時間がかかるため生産性が悪くなる場合がある。
【００１９】
本発明の脂肪族ポリエステル系樹脂組成物においては、前記脂肪族ポリエステル系樹脂に、Ｐ３ＨＡ以外の樹脂をブレンドしても良く、好ましくは他の脂肪族ポリエステル系樹脂が挙げられる。Ｐ３ＨＡ以外の脂肪族ポリエステル系樹脂の例として、ポリ乳酸系樹脂、ポリコハク酸エステル、ポリジグリコール酸ブチレン、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリシュウ酸エステル等が挙げられる。脂肪族ポリエステル系樹脂以外に、好ましくは生分解性樹脂が挙げられる。例えば、セルロース、デンプン、キチン等の多糖誘導体等が挙げられ、本発明でも用いることが可能である。また、本発明で用いられるＰ３ＨＡ以外の樹脂は、公知の方法に従って製造することができ、市販品を使用してもよい。
【００２０】
本発明の脂肪族ポリエステル系樹脂組成物は、インジゴまたはその誘導体を含有する。インジゴまたはその誘導体を配合することによって、Ｐ３ＨＡの溶融加工時の結晶化速度が向上する。
【００２１】
インジゴは植物由来の物質であり、木綿への藍染めで知られている。インジゴはこれまでの使用に非常に長い歴史があり、人体や環境に対しても影響が非常に少ないものと考えられる。インジゴを含む藍は、インドや中国が原産地であり、含藍植物は多品種存在している。本発明においては、天然物由来のインジゴを用いてもよいし、合成のインジゴを用いてもよい。インジゴの工業的製造方法としては、例えば、フェニルグリシン法やｏ−カルボキシフェニルグリシン法等が挙げられる。さらに、前者の改良法としてホイマン・プフレガー改良法があり、該方法によって製造されたインジゴを使用してもよい。
【００２２】
インジゴの誘導体としては、公知の誘導体を使用することができ、インジゴの異性体等も含まれる。例えばインジゴ骨格に炭素数が１〜１０のアルキル基、アルコキシ基等が導入されたもの、インジゴ骨格に塩素等のハロゲンが導入されたもの、インジゴ骨格に硫黄が導入されたチオインジゴおよびその誘導体等が挙げられる。インジゴおよびチオインジゴの構造式を以下に示す。
【００２３】
【化１】
2010006944.tif 000002
【００２４】
具体的に誘導体とは、分子の両端に位置するベンゼン環に、化学的に許容できる置換基、例えば上記したアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン、アミノ基、カルボキシル基等の置換基を有するものが挙げられる。また、異性体としては、下記に示すようなインジルビン等の構造異性体等が挙げられる。
【００２５】
【化２】
2010006944.tif 000003
【００２６】
上記インジゴ誘導体のうち、ハロゲンが導入されたものも使用可能ではあるが、近年、樹脂において、ハロゲンフリーが進められており、この点からハロゲンを含有しないインジゴ誘導体が好ましく使用される。
【００２７】
本発明で用いるインジゴ及びその誘導体は、できるだけ微細な粉体であることが好ましく、数ミクロンから数１０ミクロンの微結晶の粉体が特に好ましい。
【００２８】
インジゴ又はその誘導体は、Ｐ３ＨＡ１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部の範囲で配合することが好ましく、０．０１〜１重量部の範囲がより好ましい。この範囲内では、Ｐ３ＨＡの性能に影響なく、溶融加工時の結晶化速度を改善することができる。
【００２９】
本発明の樹脂組成物には、結晶性を著しく妨げない限りにおいて、例えば、酸化防止剤、光安定剤、紫外線吸収剤、顔料、着色剤、帯電防止剤、離型剤、香料、滑剤、難燃剤、可塑剤、充填剤など、従来公知の各種添加剤が配合されていても良い。
【００３０】
本発明にかかる樹脂組成物の製造方法として、原料であるＰ３ＨＡ及びインジゴまたはその誘導体、所望により滑剤や無機フィラー等を混合し、押出機を用いて溶融混練する方法が挙げられる。インジゴまたはその誘導体の分散性の点から、好ましくは二軸押出機を用いる。その他、上記製造方法としては、いわゆる溶液法を用いることができる。ここでいう溶液法とは、各成分を分散溶解できる任意の溶媒を用いて、原料となる各成分及び溶媒を良く攪拌し、スラリーを作り、溶媒を乾燥除去する方法である。しかし、本発明の樹脂組成物を製造する方法は、これらに制限されるものではなく、これら以外の従来知られている方法を用いることができる。
【００３１】
本発明の樹脂組成物は、成形品に広く使用することができる。例えば、テレビ、携帯型音楽再生機、ラジオ、ステレオ、ＣＤプレーヤー、ビデオ又はパソコン等の筐体や、買い物袋、レジ袋等の袋、洋服等の繊維形態、その他医療用途、衛生用途、農業・漁業・林業・工業・建築土木・運輸交通を包含する一般産業用用途、及び、レジャー、スポーツを包含するレクリエーション用途等に用いられる。特に使用後には生分解処理に付して廃棄すればよく、廃棄に余分なエネルギーが消費されないという利点がある。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。また、実施例において「部」は重量基準である。本発明で使用した物質は以下の様に略した。
ＰＨＢＨ：ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシヘキサノエート）
ＨＨ率：ＰＨＢＨ中のヒドロキシヘキサノエートのモル分率（ｍｏｌ％）
【００３３】
＜脂肪族ポリエステル系樹脂の結晶融解温度（Ｔｍ）＞
示差走査熱量測定は、実施例及び比較例にある樹脂組成物約５ｍｇを精秤し、示差走査熱量計（セイコー電子工業（株）製、ＳＳＣ５２００）にて１０℃／分の昇温速度で０℃から２００℃まで昇温を実施し、得られたＤＳＣ曲線より、結晶融解温度（Ｔｍ）を得た。
【００３４】
＜脂肪族ポリエステル系樹脂組成物の結晶化挙動観察＞
結晶化挙動観察は、実施例及び比較例にある樹脂組成物を適当量切り出し、偏光顕微鏡（オリンパス製、ＢＸ−５１）にて、５０℃／分の昇温速度で２５℃から２００℃まで昇温し、２分間保持した後、２０℃／分の降温速度で６０℃まで降温し、６０℃保持後の結晶発生時間、結晶飽和時間、結晶サイズを観察した。
【００３５】
（製造例１）  ３ＨＨ率１２ｍｏｌ％のＰＨＢＨの作製
＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１および配列番号２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ−５Ｐ＋Ｅｃｏとした。
【００３６】
次に、特開2008-029218号公報［0038］に記載のＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
【００３７】
特開2008-029218号公報［0036］に記載のＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号３および配列番号４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。
【００３８】
ＰＡｃ−５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ−Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ−５Ｐ＋Ｂａｍとした。
【００３９】
次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号５および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａとした。
【００４０】
ｂＰａｃ−５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ−５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号３および配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
【００４１】
続いて、特開2008-029218号公報［0037］に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した。
【００４２】
＜遺伝子挿入株Ｐａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
次に、ＫＮＫ−００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ−００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ−００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
【００４３】
この遺伝子挿入株をＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
【００４４】
＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
クロトニル−ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ  １０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号７及び配列番号８記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（J. Bacteriol., 179, 4821 (1997)）を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。
【００４５】
＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
配列番号１１を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開2007-228894号公報［0031］に記載のＨＧ：：ＰＲｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。
発現ベクターｐＣＵＰ２−６３１は以下のようにして構築した。
【００４６】
C. necatorにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず実施例７で構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次に実施例８で作製したｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２−６３１ベクターを構築した。
【００４７】
＜形質転換体の作製＞
ｐＣＵＰ２−６３１ベクターの種々の細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体を取得した。
【００４８】
＜形質転換体の培養＞
上記で作製した形質転換体の培養を行った。前培地の組成は１％(w/v)Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１％(w/v)Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２％(w/v)Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、および、０．１５％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４で、ｐＨ６．７に調整した。
【００４９】
ポリエステル生産培地の組成は１．１％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．６％(w/v)（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％(v/v)微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％(w/v)ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％(w/v)ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％(w/v)ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％(w/v)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％(w/v)ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１％(w/v)ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてＰＫＯＯ（Palm kernel olein、パーム核油オレイン画分）を流加する流加培養にて行った。
【００５０】
それぞれの形質転換体のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、２．５Ｌのポリエステル生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ−５００型）に１０％(v/v)接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには１４％のアンモニア水を使用した。培養は６５時間まで行った。培養後遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、ＰＨＢＨを得た。
【００５１】
生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＢＨの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＢＨ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＢＨ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、３ＨＨ比率が１２％のＰＨＢＨであった。
【００５２】
（実施例１）
３ＨＨ率１２ｍｏｌ％のＰＨＢＨ（Ｔｍ１１９℃、Ｍｗ５２万、比重１．２ｇ／ｍｌ）１００重量部に対し、インジゴ（和光純薬製）０．２重量部をハンドブレンドした後、小型溶融混練機（東洋精機製、ラボプラストミル）にて、２００℃・２分間混練後に樹脂組成物を得た。得られた樹脂組成物を適当量切り出し、偏光顕微鏡にて結晶化挙動を観察した。観察結果より、６０℃保持直後に約１０μｍ程度の結晶が視野全体に発現し、５分後には球晶が全体を埋め尽くした状態で成長した。
【００５３】
（実施例２）
３ＨＨ率１２ｍｏｌ％のＰＨＢＨ（Ｔｍ１１９℃、Ｍｗ５２万、比重１．２ｇ／ｍｌ）１００重量部に対し、インジゴ（和光純薬製）１．０重量部をハンドブレンドした後、小型溶融混練機（東洋精機製、ラボプラストミル）にて、２００℃・２分間混練後に樹脂組成物を得た。得られた樹脂組成物を適当量切り出し、偏光顕微鏡にて結晶化挙動を観察した。観察結果より、６０℃保持直後に約１０μｍ程度の結晶が視野全体に発現し、５分後には球晶が全体を埋め尽くした状態で成長した。
【００５４】
（比較例１）
３ＨＨ率１２ｍｏｌ％のＰＨＢＨ（Ｔｍ１１９℃、Ｍｗ５２万、比重１．２ｇ／ｍｌ）を小型溶融混練機（東洋精機製、ラボプラストミル）にて、２００℃・２分間混練後に樹脂組成物を得た。得られた樹脂組成物を適当量切り出し、偏光顕微鏡にて結晶化挙動を観察した。観察結果より、６０℃保持直後には結晶は見えず、約７分経過後に約３０μｍ程の結晶が数少なく発現し、約４０分経過後に球晶が全体を埋め尽くした状態で成長した。
【００５５】
以上の結果を、表１にまとめた。
【００５６】
【表１】
2010006944.tif 000004
【配列表】
2010006944000001.app