(57)【要約】【課題】Ｅｔ７４３の化合物の顕著な抗腫瘍活性に関して、同等なまたはより高いレベルの抗腫瘍活性を有する関連構造の提供。【解決手段】以下の構造式：2010215656.tif 000011を有する、新規な抗腫瘍活性を有する化合物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2010215656.tif 000009
を有する、実質的に精製されたＥＴＭ−３０５。
【請求項２】
以下の構造：
【化２】
2010215656.tif 000010
を有する、実質的に精製されたＥＴＭ−２０４。
【請求項３】
哺乳動物白血病の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載のＥＴＭ−３０５の使用。
【請求項４】
哺乳動物肺カルシノーマの治療のための医薬の製造における、請求項１に記載のＥＴＭ−３０５の使用。
【請求項５】
哺乳動物大腸アデノカルシノーマの治療のための医薬の製造における、請求項１に記載のＥＴＭ−３０５の使用。
【請求項６】
哺乳動物悪性メラノーマの治療のための医薬の製造における、請求項１に記載のＥＴＭ−３０５の使用。
【請求項７】
ＥＴＭ−３０５及び製薬学的に許容可能な担体、希釈液または賦形剤を含む製薬組成物。
【請求項８】
ＥＴＭ−２０４、ＥＴＭ−３０５及びＥＴＭ−７７５より成る群から選択される一つ以上の代謝産物の存在について試験サンプルをモニターすることを含む、エクテイナシジン７４３のヒトチトクロームＣＹＰ３Ａ４代謝のアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
エクテイナシジン(ecteinascidine；以下ＥｔまたはＥｔ’ｓと省略）は、海洋被嚢動物Ecteinascidia turbinataから単離された非常に強力な抗腫瘍試薬である。特にＥｔ’ｓ７２９，７４３及び７２２は、Ｐ１８８ネズミ白血病、Ｂ１６メラノーマ、Ｌｅｗｉｓ肺カルシノーマ、及びマウスにおけるいくつかのヒト異種移植片モデルに対する活性を含む、in vivoでの期待できる効力を示している。
【背景技術】
【０００２】
天然Ｅｔ７４３の単離及び特徴付けは、米国特許第5,089,273号に教示され、それは参考としてここに取り込まれる。合成Ｅｔ７４３の調製は、米国特許第5,721,362号に教示され、それは参考としてここに取り込まれる。
【０００３】
エクテイナシジン化合物、特にＥｔ７２９及びＥｔ７４３の抗腫瘍活性は、化学文献に十分に開示されている。例えば、Goldwasser等、Proceedings of the American Association for Cancer Reserach, 39: 598 (1998); Kuffel等, Proceedings of the American Association for Cancer Reserch, 38: 596 (1997); Moore等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 38: 314 (1997); Mirsalis等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 38: 309 (1997); Reid等, Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 38: 329-334 (1996); Faircloth等, European Journal of Cancer, 32A, Supp. 1, pp. S5 (1996); Garcia-Rocha等, British Journal of Cancer, 73: 875-883 (1996); Eckhardt等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 37: 409 (1996); Hendriks等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 37: 389 (1996)を参照。これらの開示は、参考としてここに取り込まれる。エクテイナシジン７４３（Ｅｔ７４３）は、以下の構造を有する：
【化１】
2010215656.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Goldwasser等、Proceedings of the American Association for Cancer Reserach, 39: 598 (1998)
【非特許文献２】Kuffel等, Proceedings of the American Association for Cancer Reserch, 38: 596 (1997)
【非特許文献３】Moore等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 38: 314 (1997)
【非特許文献４】Mirsalis等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 38: 309 (1997)
【非特許文献５】Reid等, Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 38: 329-334 (1996)
【非特許文献６】Faircloth等, European Journal of Cancer, 32A, Supp. 1, pp. S5 (1996)
【非特許文献７】Garcia-Rocha等, British Journal of Cancer, 73: 875-883 (1996)
【非特許文献８】Eckhardt等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 37: 409 (1996)
【非特許文献９】Hendriks等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, 37: 389 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このクラスの化合物の顕著な抗腫瘍活性に関して、同等なまたはより高いレベルの抗腫瘍活性を有する関連構造に対する研究が継続している。本発明は、Ｅｔ７４３の天然代謝産物の単離及び特徴付けに向けられたものであり、これらの継続する研究の結果である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ヒトチトクロームＣＹＰ３Ａ４によるＥｔ７４３の代謝のいくつかの生成物の精製及び構造解析がなされた。これらの化合物は、「ＥＴＭ」としてここで略称され、その後に見かけの分子量を表す数値が続く。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＣＤＣｌ３中のＥＴＭ−ＳｉＯＨ−１（非極性不純物）の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を表す図である。
【図２】図２は、ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−４（ＥＴＭ７７５）のＨＰＬＣクロマトグラフを表す図である。
【図３】図３は、ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−３（ＥＴＭ３０５）のＨＰＬＣクロマトグラフを表す図である。
【図４】図４は、ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−２（トレース代謝産物）のＨＰＬＣクロマトグラフを表す図である。
【図５】図５は、Ｍ．Ｂ．（マジックビュレット４）中のＥＴＭ３０５のＬＲＦＡＢマススペクトルを表す図である。
【図６】図６は、ＥＴＭ３０５のＥＳＩマススペクトルを表す図である。
【図７】図７は、ＣＤ３ＯＤ中のＥＴＭ３０５の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（７５０ＭＨｚ）を表す図である。
【図８】図８は、ＥＴＭ３０５のＦＡＢ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す図である。
【図９】図９は、ＥＴＭ３０５のＵＶスペクトルを表す図である。
【図１０】図１０は、ＥＴＭのＵＶスペクトルを表す図である。
【図１１】図１１は、Ｍ．Ｂ．中のＥＴＭ７７５のＬＲＦＡＢマススペクトルを表す図である。
【図１２】図１２は、ＥＴＭ７７５（ポジティブモード）のＥＳＩマススペクトルを表す図である。
【図１３】図１３は、ＥＴＭ７７５（ネガティブモード）のＥＳＩマススペクトルを表す図である。
【図１４】図１４は、ＥＴＭ７７５（ｍ／ｚ１３８−３０２）のＦＡＢ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す図である。
【図１５】図１５は、ＥＴＭ７７５（ｍ／ｚ４４０−６２０）のＦＡＢ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す図である。
【図１６】図１６は、ＣＤ３ＯＤ中のＥＴＭ７７５の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（７５０ＭＨｚ）を表す図である。
【図１７】図１７は、ＥＴＭ７７５のＵＶスペクトルを表す図である。
【図１８】図１８は、ＥＴＭ３０５のＨＰＬＣクロマトグラフを表す図である。
【図１９】図１９は、ＥＴＭ３０５のＵＶスペクトルを表す図である。
【図２０】図２０は、ＥＴＭ３０５のＥＳＩマススペクトルを表す図である。
【図２１】図２１は、ＥＴＭ２０４のＥＳＩマススペクトルを表す図である。
【図２２】図２２は、ＣＤ３ＯＤ中のＥＴＭ２０４の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を表す図である。
【図２３】図２３は、ＥＴＭ２０４のＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
例えば、ＥＴＭ３０５及びＥＴＭ７７５は、PharmaMar, SpainのAnalytical Chemistry Departmentによって実施された生化学的研究から得られた代謝混合物から単離された。Mayo Clinicによって実施された同様な代謝研究により、ＥＴＭ２０４の同定が導かれた。これらのエクテイナシジン代謝産物の構造は、以下のものである：
【化２】
2010215656.tif 000003
本発明は、本明細書に添付された図面を参考としてよりよく理解されるであろう。
【実施例】
【０００９】
Ｉ．Ｅｔ７４３代謝研究
Ａ．代謝混合物−ＥＴＭの調製：
Ｅｔ７４３（５０μＭ）を、ＮＡＤＰＨ生産系（０．４ｍＭ ＮＡＤＰ＋、２５ｍＭ グルコース−６−リン酸、０．５Ｕ／ｍｌ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び３．３ｍＭ 塩化マグネシウム）を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）中のヒトリンパ芽球発現ＣＹＰ３Ａ４アイソフォーム(Gentest Corporation, Woburn, MA)の０．４ｍｇ／ｍｌと共にインキュベーションした。３７℃で４時間後、氷冷アセトニトリルで反応を停止し、遠心分離（１２，０００ｇ、４分）で固体を除去した。上清をＨＰＬＣで分析した。
【００１０】
Ｂ．ＥＴＭ３０５及びえＴＭ７７５の精製
２．６ｍｇのＥＴＭ（上記Ａで生産された）を、少量のＣＨＣｌ３中に溶解し、シリカゲルカラム（シリカゲル／ＣＨＣｌ３スラリーを充填した８×１００ｍｍのガラスカラム）中に配置した。最初に、カラムをＣＨＣｌ３で溶出し、次いでＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ混合物（９８，９６，９４，９２及び９０％）で溶出した。全部で１０の試験チューブを回収し（各３ｍＬ）、ＴＬＣに基づいて組み合わせ、４個の分画を生じた（表１）。より極性がなく細胞毒性ではない分画（ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−１、２ｍｇ）は、１Ｈ ＮＭＲスペクトルによって明らかにされるように、Ｅｔ７４３と構造的に関連しない脂質より成った。
残りの細胞毒性分画を、ＨＰＬＣ(Phenomenex-Ultracarb ODS、１０μｍ、１０×１５０ｍｍ、３：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、０．０２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬ／分、Da Dection: ２１０，２２０，２５４及び２８０ｎｍ）によってさらに精製した。最も極性の分画（ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−４、０．２ｍｇ）は、０．１ｍｇのＥＴＭ７７５を生じた（図２）。ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−３は、０．３ｍｇのＥＴＭ３０５を生じ（図３）、ＥＴＭ−ＳｉＯＨ−２は、トレース代謝産物の複合した混合物より成った（図４）。
【００１１】
表１．ＥＴＭ−ＳｉＯＨ分画：Ｒτ重量及び細胞毒性
【表１】
2010215656.tif 000004
ａ移動相として９：１のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨを使用するシリカゲルＴＬＣ。
ｂ２５０ｎｇで５０％阻害。
【００１２】
Ｃ．ＥＴＭ３０５の構造
ＥＴＭ３０５（ＩＣ５００．２μｍ／ｍＬ ｖｓ Ｌ１２１０細胞）は、ＨＲＦＡＢ／ＭＳによって３０６．０９７７で分子イオンを示した（図５）。このデータは、分子式Ｃ１５Ｈ１６ＮＯ６と一致する（Δ０．１ｍｍｕ）。ＥＳＩ／ＭＳ分析により、ＥＴＭ３０５の分子量を確認した（図６）；ｍ／ｚ３０６での分子イオンを、ナトリウムアダクト（ｍ／ｚ３２８）と共に観察した。ＥＴＭ３０５の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図７）は、構造分析について非常に重要であった。δ２．０４、２．２８及び６．０９での共鳴は、Ｅｔ７４３中のＭｅ−６（δ２．０３）、−ＯＣＯＣＨ３（δ２．２９）及びジオキシメチレンプロトン（δ６．１１及び６．０１）のものとそれぞれほぼ同一であった１。
【００１３】
さらに、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨＣＨＯユニット（δ７．０９、ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１５Ｈｚ；δ６．１９、ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１５Ｈｚ；δ８．０４、ｓ、１Ｈ）２、並びにさらなるメチル基（δ２．５２，ｓ、３Ｈ）に相当する共鳴が観察された。このメチル基の化学シフトは、アセトフェノン３（δ２．５５）のメチル基のものと非常によくマッチした。ＥＴＭ３０５の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが、−ＮＨ−ＣＨＯ結合の周囲の回転子のために、二つのセットの共鳴（４：１比）より成ることに気付くと興味深い。ＭＳデータと共に１Ｈ ＮＭＲデータは、ＥＴＭ３０５がスキーム１に示されたビニルホルムアミドユニット及びメチルケトンに付着したＥｙ７４３のＢユニット芳香環系を有することを示唆した。ｍ／ｚ３０６に対するＦＡＢ／ＭＳ／ＭＳは、提案された構造を支持した（図８）。
【００１４】
スキーム１
【化３】
2010215656.tif 000005
【００１５】
Ｄ．ＥＴＭ７７５の構造
ＥＴＭ７７５（ＩＣ５００．２μｇ／ｍＬ ｖｓ Ｌ１２１０細胞）は、ＨＲＦＡＢ／ＭＳによって７７６．２４８９で分子イオンを示した。このデータは、分子式Ｃ３９Ｈ４２Ｎ３Ｏ１２Ｓと一致する（Δ０．０ｍｍｕ）、それはＥＴＭ７７５がＥｔ７４３の酸化生産物であることを示した。ポジティブ及びネガティブモードのＥＳＩ／ＭＳスペクトルの両者は、ＥＴＭ７７５の分子量を確認した（図１２及び１３）。制限された量のＥＴＭ７７５のため、構造解析を主にマススペクトルデータの解釈により実施した。ＥＴＭ７７５（ｍ／ｚ７７６）のＭ＋Ｈに対するＦＡＢＭＳ／ＭＳは、ｍ／ｚ２７６及び２６０（２７６−酸素）でのピークによって明らかにされるようにＮ−オキシドの形態でＮ−２で外部酸素が配置されていることを示すのに必須であった。Ｅｔ７４３では観察されないｍ／ｚ２３２の断片イオンは、カルビノールアミン酸素が、アミドに酸化されていることを示唆した（スキーム３）。ＥＴＭ７７５中のＡ及びＣユニットの構造は、ｍ／ｚ２０４（Ａユニット）及びｍ／ｚ２２４及び２５０（Ｃユニット）での特徴的なマススペクトルピークの存在によって明らかにされるように、完全なままであった１。７５０ ７５０Ｍｈｚ １Ｈ ＮＭＲ（図１６）及びＵＶ（図１７）の両者のスペクトルは、Ｅｔ７４３のものと類似した１。
【００１６】
スキーム２
【化４】
2010215656.tif 000006
【００１７】
ＩＩ．Ｅｔ７４３−Mayo代謝研究
Ａ．Ｍ１代謝産物（ＥＴＭ３０５）
ＥＴＭサンプルを、Ｃ１８ｓｅｐ−ｐａｃｋを通して濾過し、溶出物（３：１ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）を窒素還流の下で濃縮した。ＨＰＬＣ（上述と同じ条件）による生じた残余物の精製により、ＥＴＭ３０５のものと同一の溶出時間を有する化合物の存在が明らかとなった（図１８）。Ｍ１のＵＶ（図１９）及びＥＳＩ／ＭＳ（図２０）スペクトルの両者は、ＥＴＭ３０５のものと同一であった。かくして、Ｍ１代謝産物は、ＥＴＭ３０５と同じ化学構造を有することが結論付けられた。
【００１８】
Ｂ．Ｍ２代謝産物（ＥＴＭ２０４）
提供されたサンプルを、Ｃ１８ｓｅｐ−ｐａｃｋを通して濾過し、溶出物（３：１ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）を窒素還流の下で濃縮し、生じた残余物をＦＡＢ／ＭＳ、ＥＳＩ／ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲによって分析した。
【００１９】
Ｃ．ＥＴＭ２０４（Ｍ２）の構造
ＥＴＭ２０４は、ＨＲＦＡＢ／ＭＳにより２０４．１０２４で分子イオンを示した。このデータは、分子式Ｃ１２Ｈ１４ＮＯ２と一致する（Δ０．０ｍｍｕ）。ＥＳＩ／ＭＳ分析により、２０４での分子量が確認された（図２１）。分子式は、Ｅｔ７４３中のａユニットの分子式にマッチした。かくしてＥＴＭ２０４の化学構造は、スキーム３に示される芳香族アンモニウム塩誘導体であると提案された。この単純な化合物（並びに他の代謝産物）は、in vivoでＥｔ７４３の分解をアッセイするために容易にモニターできる。
【００２０】
スキーム３
【化５】
2010215656.tif 000007
【００２１】
ＥＴＭ２０４の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、提案された構造を支持する共鳴を示した：４個の芳香環シグナル（δ９．２、δ７．８、ｄ、Ｊ＝５Ｈｚ、及びδ６．８、ｓ）並びに３個のメチルシグナル（δ４．２、δ３．９及びδ２．４）。ＥＴＭ２０４のＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ（図２３）は、Ｎメチル基（２０４−ＣＨ３）の見かけのロスに相当する１８９での顕著なピークを示した。
【００２２】
ＥＴＭ−３０５及びＥＴＭ−７７５の生物学的研究
化合物ＥＴＭ−３０５及びＥＴＭ−７７５を、以下の腫瘍細胞系に対する一般的なプロトコールを使用してアッセイした；Ｐ−３８８（ネズミ白血病）；Ａ−５４９（ヒト肺カルシノーマ）；ＨＴ−２９（ヒト大腸アデノカルシノーマ）；並びにＭＥＬ−２８（ヒト悪性メラノーマ）。例えばBergeron等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1984, 121(3) 848-854並びにSchroeder等, J. Med. Chem., 1981, 24 1078-1083参照。これらの結果は、以下の表２に示されている：
【００２３】
【表２】
2010215656.tif 000008
【００２４】
治療方法
本発明は、生体活性化合物を含み、従って本発明の実施態様は、上記化合物を使用する治療方法に向けられる。上述のように、本発明の化合物は、腫瘍細胞系に対してin vitro細胞毒性を発揮する。これらのin vitro活性は、in vivoでの有用性に同様に拡大されるものと予測される。
【００２５】
これらの化合物を、実質的な精製形態、即ちその物理的及び生物学的特徴を許容するのに十分な純度で単離した。これらの化合物は、哺乳動物、特にヒトにおける医薬品として有用であるように、特異的な抗腫瘍活性を有することが見出された。それ故本発明の別の特徴点は、ここで同定された活性化合物を含む製薬組成物、並びに上記製薬組成物を使用する治療方法に関する。
【００２６】
上述のように、本発明の活性化合物は、抗腫瘍活性を示す。かくして本発明はまた、疾患を有する患者に治療上の有効量の活性化合物、若しくは化合物の混合物、またはその製薬学的組成物を投与することを含む、これらの化合物に感受性の悪性腫瘍によって疾患を有するいずれかの哺乳動物を治療する方法を提供する。本発明はまた、活性成分として、本発明の化合物の一つ以上を含む製薬調製物、並びにその調製物のための方法に関する。
【００２７】
製薬組成物の例としては、適切な組成物を有し、経口、局所性または全身性の投与のための、いずれかの固体（錠剤、丸薬、カプセル、顆粒等）または液体（溶液、エマルションの懸濁液）が含まれ、それらは精製化合物若しくは薬理学的に活性の他の化合物のいずれかの担体との組み合わせを含んでもよい。これらの組成物は、全身性で投与される場合滅菌される必要があろう。
【００２８】
本発明に付随するものである用語、「ユニット投与量」は、動物のための単一の投与量として適切な物理的に分離したユニットを指し、各ユニットは、必要な希釈液、即ち担体若しくはビヒクルと関連して所望の抗腫瘍効果を生ずるように計算された活性物子の所定量を含む。本発明の新規なユニット投与量のための特定化は、（ａ）活性物質及び達成される特定の抗腫瘍効果の独特の特徴、並びに（ｂ）動物における抗腫瘍の使用のための上記活性物質を形成する本発明に固有の制限に支配され、これらに直接依存する。
【００２９】
単位投与量形態は、水、塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水のような生理学的に寛容な（即ち許容される）希釈液またはビヒクルを分散し、水性組成物を形成することによって、凍結若しくは乾燥活性化合物（またはその塩）から典型的に調製される。上記希釈液は本分野で周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 第１６版, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980), 第1465-1467頁に議論されている。
【００３０】
投与量形態はまた、希釈液の一部としてアジュバントを含み得る。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）及びミョウバンのようなアジュバントが本分野で周知の物質であり、いくつかの供給源から商業的に入手可能である。
【００３１】
投与される活性化合物の量は、治療される動物種、被験者動物のサイズ、腫瘍のサイズ（もし解れば）、存在する腫瘍のタイプ（例えば固い）、並びに活性化合物の利用に対する被験者の許容性に本質的に依存する。投与するために必要とされる活性化合物の正確な量は、臨床医の判断に依存し、特にヒトが治療される動物である場合、各個人で個別的である。しかしながら投与量の範囲は、治療上有効な血液濃度によって特徴付けでき、約０．０１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．１μＭから１０μＭの濃度範囲であろう。
【００３２】
初期投与及び追加の注射の適切な摂生もまた可変的であるが、初期投与に引き続き、１時間以上の間隔で後の注射または他の投与を繰り返す投与が典型的であろう。別法として、血液中に治療上有効な濃度を維持するのに十分な継続的な静脈点滴が企図される。
【００３３】
参考文献：
以下の参考文献は、本発明を理解する読者の手助けとして提供される。必要の範囲で、その内容はここに参考として取り込まれる。
1. A) Rinehart等, J. Org. Chem. 1990, 55, 4512, B) Rinehart等, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118 9017
2. Herbert等, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1987, 1593
3. Pretsch等, Tables of Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, Springer-Verla: Berlin, 1989: p. H125
4. Rinehart等, Biochem. Res. Commun, 1984, 124, 350
【００３４】
その好ましい実施態様を含む本発明は、詳細に記載されている。しかしながら、本発明の考慮に際して当業者は、本発明に対する修飾及び／または改良が可能であると予測されるが、それは本発明の範囲及び精神の内に未だあるであろう。
【図１】
2010215656.tif 000012
【図２】
2010215656.tif 000013
【図３】
2010215656.tif 000014
【図４】
2010215656.tif 000015
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2010215656.tif 000031
【図２１】
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【図２２】
2010215656.tif 000033
【図２３】
2010215656.tif 000034