(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病に罹患している個体を処置するため、およびその疾患にかかる危険性のある個体においてその疾患を予防するための新規な免疫調節法を提供する。【解決手段】β−アミロイド斑と関連した抗原（例えば、β−アミロイドペプチドおよびそのフラグメント）の粘膜投与は、この斑と関連した疾患のための有効な処置である。β−アミロイドペプチドまたはそのフラグメントあるいはそのアナログを有効成分として含むアルツハイマー病を処置または予防するための経鼻投与製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病にかかる危険性のある哺乳動物またはアルツハイマー病にかかっている哺乳動物に対してエアゾル形態での経鼻投与するための薬学的製剤であって、有効成分としてβ−アミロイドペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログを含んでなり、かつ、該有効成分が
（ｉ）該哺乳動物における１つ以上の炎症促進性Ｔｈ１サイトカインの産生；
（ｉｉ）該哺乳動物における１つ以上の抗炎症性Ｔｈ２もしくはＴｈ３サイトカインの量の減少；または
（ｉｉｉ）該疾患の少なくとも１つの臨床的症状の出現、
のうちの少なくとも１つの発症を阻害もしくは遅延するものである、薬学的製剤。
【請求項２】
有効成分が、β−アミロイドペプチド（１〜３９）Ａβ、β−アミロイドペプチド（１〜４０）Ａβ、β−アミロイドペプチド（１〜４２）Ａβ、β−アミロイドペプチド（１〜４３）、Ａββ−アミロイドペプチド（２５〜３５）Ａβおよびβ−アミロイドペプチドの少なくとも連続するアミノ酸残基２０を有するペプチドからなる群より選ばれるペプチドである、請求項１記載の薬学的製剤。
【請求項３】
有効成分が、β−アミロイドペプチド（１〜３９）Ａβ、β−アミロイドペプチド（１〜４０）Ａβ、β−アミロイドペプチド（１〜４２）Ａβおよびβ−アミロイドペプチド（１〜４３）からなる群より選ばれるペプチドである、請求項１記載の薬学的製剤。
【請求項４】
用量が１日当たり５０μｇより多いい請求項１または２に記載の薬学的製剤。
【請求項５】
噴霧器、加圧定量型吸入器または乾燥粉末吸入器を介して投与するのに適する請求項１〜４のいずれかの一項に記載の薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜寛容化に基づくアルツハイマー病のための処置用医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
（１．アルツハイマー病）
アルツハイマー病は、高齢者における認知退行の最も通常の原因である（非特許文献１）。広範なシナプス損失は、進行性の記憶喪失、心理学的不安定性、抽象的論法の衰え、身体機能の損失、昏睡、および究極的に死を生じることとともに起こる。老人斑として公知の細胞外病変は、アルツハイマー被害者の脳においてジストロフィー軸索により囲まれるβ−アミロイド（Ａβ）タンパク質の不溶性凝集物を発生する（非特許文献２）。β−アミロイドは、３９〜４３アミノ酸残基を含む疎水性ペプチドであり；それは、凝集物を形成する高い傾向により特徴付けられ、そしてアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）として公知の９０〜１４０ｋＤａの完全な膜タンパク質前駆体のタンパク質分解性のプロセシングから生じる。
【０００３】
以前に、β−アミロイドペプチド自体は、そのペプチドがインビトロでニューロンを殺傷し得るので、アルツハイマー病における神経変性について応答性であると考えられたが、ＡＰＰ前駆体が、健康な脳およびアルツハイマー病の脳の両方の脳細胞において発現されることが現在公知である（非特許文献３）。一方、β−アミロイドペプチドの存在は、それ自体によりその疾患とみなすのに十分でない。
【０００４】
注意は、炎症のような免疫学的プロセスのアルツハイマーにおいて、潜在的な関与（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）または関与（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）に最近変化した。免疫学的事象とアルツハイマー病との間の特定の平行性を示す巨大な研究証拠が、蓄積した。アルツハイマー病の脳は、インターロイキン１およびα１抗キモトリプシンとしての炎症性サイトカインおよび炎症関連薬剤を発現し、そして主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩと免疫反応性であるミクログリア細胞および星状細胞の増加した集団を含む、免疫媒介脳損傷の種々の構造特徴を示す（非特許文献４）。ミクログリア細胞は、中枢神経系においてマクロファージの機能的等価物であると考えられる（非特許文献５）。免疫媒介およびアルツハイマーの脳損傷の両方で観察される他の特徴は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ糖タンパク質、サイトカイン、補体レセプターおよび調節因子のような免疫反応性マーカーを含む（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。また、アルツハイマーの脳で見出される炎症性メディエーターインターロイキン６（ＩＬ−６）は、α−２−マクログロブリン（α２Ｍ）（アルツハイマーの脳のニューロンにより産生される高度に強力なヒトプロテアーゼインヒビター）を刺激することが公知であり、そしてβ−アミロイドを形成するためのＡＰＰの正常なタンパク質分解プロセシングを妨害すると考えられる（非特許文献９）。β−アミロイドタンパク質の生理学的産生およびアルツハイマー病の機構は、非特許文献１０にさらに記載される。
【０００５】
アルツハイマー脳斑中で不溶性形態で存在するβ−アミロイドペプチドが、抗体タンパク質（例えば、免疫グロブリン）の非存在下で、インビトロで古典的な補体タンパク質（Ｃｌｑ）を結合し得、そして活性化し得ることもまた公知である。対照的に、可溶相Ａβは、液相インヒビターにより保護性の調節を受け、これは、神経毒性のあるＡβの不溶性型であることを示唆し、そして可溶性Ａβの明らかな無害性を説明している（非特許文献１１）。ＭｃＧｅｅｒおよびＲｏｇｅｒｓならびに共同研究者らは、凝集したβ−アミロイドがニューロン破壊し得るタンパク質の生成を導く相補カスケードを活性化し得ること
を提唱した（非特許文献１２）。アミロイド斑沈着と免疫応答との間のリンク機構のさらなる支持において、脳の免疫細胞であるミクログリア細胞が、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および［１〜４２］Ａβで、それぞれの刺激単独よりもニューロンにさらに有意な損傷を与えるために活性化され得ることが見出された（非特許文献１３）。この知見は、反応性窒素中間体（例えば、毒性の遊離ラジカル）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のような神経変性物質のミクログリア細胞による生成をトリガーすることにおいて、ＡβとＩＦＮ−γとの間の相乗的な効果を示唆する。炎症促進性サイトカインのアルツハイマー患者における増加された分泌、およびサイトカインレベルと疾患の段階との間の相関を報告する非特許文献１４もまた参照のこと。
【０００６】
疫学的な証拠もまた、免疫学的活性とアルツハイマー病との間の関連を支持する（非特許文献１５）。人の被験体を調査したＲｏｔｔｅｒｄａｍ研究において、非ステロイド性抗炎症薬物は、アルツハイマー病を発症する危険性への保護効果および減少した認識機能の疾患成分への寛解の効果を有することが示された。アルツハイマー病の誘導における免疫系の役割を示すこれらの研究にもかかわらず、真に有効な治療レジメは、これらの研究結果に基づいて現れなかった。
【０００７】
アルツハイマー病のための現在の処置は、一般にほとんどなく、そして不十分である。ＴＡＣＲＩＮＥTM（１，２，３，４−テトラヒドロ−９−アクリジンアミン一塩酸塩一水和物；ＣＯＧＮＥＸTMとして市販される）は、アルツハイマー病を処置するためのいくらかの効力を有する可逆的コリンエステラーゼインヒビターである（非特許文献１６）。ＴＡＣＲＩＮＥは、軽度または中程度の痴呆を有する共同住宅の被験体において部分的にのみ有効であった（非特許文献１７）。その限定的効力はさておき、その使用のための安全性の懸念があった。これらは、肝細胞傷害を示し得る血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇を含む。他の危険は、肝臓壊死、黄疸、または特に感受性の患者において重篤または致命的であり得る肝炎を発症する危険性を含む。
【０００８】
選択的セロトニン再取り込みインヒビター（例えば、パロキセチン、フルオキセチン、またはトラゾドン）を用いるアルツハイマー病の心理学的症状の処置、およびコリン作動性のアゴニストまたは前駆体（例えば、レシチンおよびニコチン）の投与のような他のアプローチが試みられたが、同様に限定された成功を経験した。試験的な臨床研究は、ニコチンがアルツハイマー病から生じる注意および情報処理における、欠乏を処置するために有用であり得ることを示唆する（非特許文献１８）。しかし、ニコチンは、生物学的利用可能性が乏しく、それゆえ臨床処置として有用でない。
【０００９】
慢性の炎症性状態としてのアルツハイマー病を考えると、ＭｃＧｅｅｒおよびＲｏｇｅｒｓは、この疾患を処置するためのインドメタシン（シクロオキシゲナーゼの作用をブロックすることにより炎症を抑制する薬物）のような抗炎症剤を用いることを計画した（特許文献１）。初期段階の痴呆を有する４４人の被験体の研究において、薬物インドメタシンを受け入れるグループが研究中に精神機能において悪化しないことが見出された（非特許文献１２）。しかし、インドメタシンの種々の副作用（胃腸管効果を含む）は、その臨床使用を不確実にする。
【００１０】
特許文献２は、認識機能を増強するとされるが、アルツハイマー病を直接処置するようではない特定のイソキサゾール、イソチアゾールおよびピラゾール化合物を開示する。
【００１１】
一般的に、アルツハイマー病を処置するための全ての公知の方法は、顕著な成功を経験していない。従って、この疾患を処置する改善された方法についての明白な必要性が存在する。
【００１２】
（２．経口寛容化、さらに一般には粘膜寛容化）
Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を処置するための粘膜寛容化アプローチは、特許文献３に広範に議論される。この方法は、自己免疫攻撃の標的（「バイスタンダー抗原」）自体であってもよいし、そうでなくともよい自己免疫攻撃下で、その組織に特異的な抗原の経口または粘膜投与を含む。これらの（「バイスタンダー抗原」）の経口または粘膜投与は、活性な抑制（すなわち、腸関連リンパ様組織（ＧＡＬＴ）において、または吸入投与の場合、気管支関連リンパ様組織（ＢＡＬＴ）における調節（サプレッサー）Ｔ細胞の誘導）を引き起こす（非特許文献１９）。もまた参照のこと。これらの調節性サプレッサーＴ細胞は、血液またはリンパ組織に放出され、次いで自己免疫疾患に罹患した器官または組織に転移し、ここで、これらは、罹患した器官または組織に対して増加した自己免疫攻撃を抑制する。バイスタンダー抗原により誘発されたＴ細胞（それらを誘発するために使用されたバイスタンダー抗原の少なくとも１つのエピトープを認識する）は、自己免疫攻撃の部位に標的化され、ここで、これらは、１つ以上の免疫調節サイトカイン（例えば、免疫応答をダウンレギュレートするトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、またはインターロイキン１０（ＩＬ−１０））の局所放出を媒介する。
【００１３】
これらのうち、ＴＧＦ−βは、これらの現象をトリガーする抗原にもかかわらず、放出の近傍において、全ての免疫攻撃の現象を抑制するという点で、抗原非特異的免疫抑制因子である（しかし、バイスタンダー抗原での経口寛容化は、自己免疫攻撃の近傍においてのみ免疫調節物質の放出を引き起こすので、全身性の免疫抑制が続かない）。
【００１４】
ＩＬ−４およびＩＬ−１０もまた、抗原非特異的免疫調節サイトカインである。ＩＬ−４は、特にＴｈ２応答を増強する（すなわち、それはＴ細胞前駆体に作用し、そしてそれらがＴｈ２細胞へ優先的に分化するのを引き起こす）。ＩＬ−４はまた、Ｔｈ１悪化を間接的に阻害する。ＩＬ−１０は、Ｔｈ１応答の直接的なインヒビターである。
【００１５】
自己免疫疾患に罹患した哺乳動物を粘膜寛容化した後、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の増加したレベルは、腸関連リンパ様組織において観察され（非特許文献２０）、そして免疫系に関連したサイトカイン（および特にＴ細胞活性化（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γなど））における付随した減少が観察される。炎症性サイトカインのダウンレギュレーションおよびＴＧＦ−βおよびＩＬ−４のアップレギュレーションは、これらの動物の粘膜寛容化に続いて、ＥＡＥラットの脳において観察された（非特許文献２１）。
【００１６】
ネイティブなＴ細胞は、それらのサイトカイン分泌パターンおよび調節機能により定義される明白な集団に分化する。Ｔｈ１細胞は、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＦＮ−γを優先的に分泌し、そして古典的に遅延された型の高感受性反応に関与するが、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を優先的に分泌するＴｈ２細胞は、選択された免疫グロブリン分泌を誘導し、そしてＴｈ１媒介免疫応答をダウンレギュレーションし得る（非特許文献２２；非特許文献２３）。従って、活性化後のＴ細胞により分泌されたサイトカインは、免疫応答の性質に定性的に影響する。最近の報告は、優先的にＴｈ１またはＴｈ２細胞のいずれかのネイティブなＴ細胞の成熟化を決定する優性の因子が、サイトカイン、特にＴｈ１に対してＩＬ−２およびＩＦＮ−γならびにＴｈ２に対してＩＬ−４であることが示唆された（非特許文献２４）。他の因子は、抗原の用量および型、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の型、および活性化に関与する同時刺激分子を含む。一旦Ｔｈ１またはＴｈ２型に分化されると、Ｔ細胞は、再刺激の際にリンホカインの所定のセットの生成に関係付けられると以前に考えられた。しかし、ミエリン塩基性タンパク質で経口寛容化されたＳＪＬマウス、およびミエリンで経口寛容化されたＭＳ患者のＧＡＬＴから単離され、そしてそれらのＴ細胞レセプター使用法、ＭＨＣ拘束およびエピトープ認識の点でＴｈ１疾患誘導クローンに構造的に同一な特定のＭＢＰ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞が、疾患を誘導するのではなく
抑制し、そしてＴｈ１および他の免疫細胞と比較して、粘膜のＴヘルパー機能およびダウンレギュレーション特性の両方を有する新規のＴ細胞サブセット（Ｔｈ３）を示し得ることが最近発見された。
【００１７】
特定のサイトカインのＴ細胞分泌はまた、自己免疫炎症性疾患の誘導および調節に関係し、これは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子の状況で自己組織特異的抗原を認識する活性化自己反応性Ｔ細胞により媒介される。多発性硬化症のモデルである実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦのＴ細胞分泌が炎症および組織損傷を媒介するが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）反応性Ｔ細胞によるＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１の分泌は、強力なサプレッサー活性および中枢神経系炎症のダウンレギュレーションと関連することが考えられる（非特許文献２５）。ＴＧＦ−β１を含む抗炎症性サイトカインの誘導は、ＥＡＥを調節することにおいて特に重要であるようである。例えば、抗ＴＧＦ−β１モノクローナル抗体は、調節性のＭＢＰ反応性Ｔ細胞のサプレッサー効果を阻害する（非特許文献２０）。従って、自己反応性Ｔ細胞は、必ずしも病的でなく、そして局所的に組織炎症と関連した免疫応答をダウンレギュレーションするように機能し得る。類似の知見は、多発性硬化症に罹患したヒトにおいて作成された。ＴＮＦは、ＭＳ患者の中枢神経系斑から単離され、ＩＦＮ−γは発作を悪化させ、ＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−４および／またはＩＬ−１０は、ミエリンで寛容化されたＭＳ患者のＴ細胞により分泌される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、１９９３年３月９日発行の米国特許番号第５，１９２，７５３号
【特許文献２】Ｇａｒｖｅｙら、１９９５年４月２５日に発行された米国特許番号第５，４０９，９４６号
【特許文献３】ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０１７０５
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、８７３−８７７（１９８７）
【非特許文献２】Ｍｕｌｌａｎ，Ｍ．およびＣｒａｗｆｏｒｄ，Ｆ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６、３９８−４０３（１９９３）
【非特許文献３】Ｋｏｎｉｇ，Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９、２５９−２６２（１９９１）
【非特許文献４】Ａｂｒａｈａｍら、Ｃｅｌｌ、５２、４８７（１９８８）
【非特許文献５】Ｓｔｒｙｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１０、９３（１９９０）
【非特許文献６】ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１０７、３４１−３４４（１９８９）
【非特許文献７】ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５４４、３１５−３２０（１９９０）
【非特許文献８】Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｗ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６、７６１１−７６１５（１９８９）
【非特許文献９】Ｂａｕｅｒ，Ｊ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．２８５、１１１−１１４（１９９１）
【非特許文献１０】：Ｓｅｌｋｏｅ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．１６：４０３−４０９（１９９３）
【非特許文献１１】Ｒｏｇｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、１００１６−１００２０（１９９２）
【非特許文献１２】Ｃｆ．Ｓｃｈｎａｂｅｌ，Ｊ．、Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、１３８、２２（１９９３年６月１９日）
【非特許文献１３】Ｍｅｄａ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３７４、６４７−６５０（１９９５）
【非特許文献１４】Ｈｕｂｅｒｍａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５２：１４７−１５２、１９９４
【非特許文献１５】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．ら、Ｎｅｕｒｏｌ．、４５、１４４１−１４４５（１９９５）。
【非特許文献１６】Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、２７１、９９２（１９９４）
【非特許文献１７】Ｗｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｆ．Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔ、３５、３１３（１９９５）
【非特許文献１８】Ｓａｈａｋｉａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈ．１５４、７９７（１９８９）
【非特許文献１９】Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４、７９１−７９８（１９９１）
【非特許文献２０】Ｃｈｅｎ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、１２３７−１２４０（１９９４）
【非特許文献２１】Ｋｈｏｕｒｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６、１３５５−１３６４（１９９２）
【非特許文献２２】Ｍｏｓｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３６、２３４８−５７（１９８６）
【非特許文献２３】Ｒｏｍａｇｎａｎ，Ｓ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２、２２７−５７（１９９４）
【非特許文献２４】Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２、６３５−６７３（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
アルツハイマー病に罹患している個体を処置するため、およびその疾患にかかる危険性のある個体においてその疾患を予防するための新規な免疫調節法を提供することが、本発明の目的である。
【００２１】
本発明の別の目的は、動物モデルにおいてアルツハイマー病の誘導を予防するため、およびその疾患に罹患している哺乳動物を処置するために有用な組成物および薬学的処方物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、粘膜様式の投与により個体におけるアルツハイマー病と関連した特定のサイトカイン応答を抑制するため、およびその疾患と関連した炎症性応答の抑制と関連した特定の他のサイトカイン応答を増強するための方法および組成物を発明することである。
【００２３】
β−アミロイドの沈着を予防することが、本発明の別の目的である。
【００２４】
本発明のこれらの目的および別の目的は、以下の記載を考慮し当業者に明白である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
β−アミロイド斑と関連した抗原（例えば、β−アミロイドペプチドおよびそのフラグメント）の粘膜投与は、この斑と関連した疾患のための有効な処置であることが、本発明により意外にも発見された。１つの局面において、本発明は、全β−アミロイドペプチドまたはβ−アミロイドペプチドの有効なフラグメント、特に宿主のＴ細胞に認識されるフ
ラグメント（ペプチド［１〜４０］Ａβ、［１〜４２］Ａβおよび［２５〜３５］Ａβを含むがこれらに限定されない）を含む薬剤の有効量を哺乳動物に経口（またはさらに一般的に、粘膜に）投与することを含む、このような処置の必要な哺乳動物においてアルツハイマー病を処置するための方法に関する。好ましくは、投与は、少なくとも以下のうちの１つに達するために十分な時間続けられる：
（ｉ） １つ以上の炎症促進性Ｔｈ１サイトカインのレベルの減少；
（ｉｉ） １つ以上の抗炎症性Ｔｈ２またはＴｈ３サイトカインのレベルの増加；
（ｉｉｉ） アルツハイマー病の少なくとも１つの臨床的または組織学的症状の寛解、遅延または抑制；あるいは
（ｉｖ） β−アミロイド沈着の抑制。
本発明に従って粘膜投与されたβ−アミロイドペプチドは、ニューロンにおいてβ−アミロイドの沈着の予防および／またはニューロン細胞破壊を予防、遅延もしくは阻止する被験体において、免疫学的応答を開始し得る。
【００２６】
本発明はまた、アルツハイマーの脳斑と関連し（例えば、β−アミロイドペプチドまたはそのフラグメント）、そしてアルツハイマー病の処置に有用な抗原を含む、粘膜投与に適合した処方、および／または粘膜投与に適合した送達系に関する。本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、詳細な説明に記載される。
【００２７】
本発明の別の局面において、β−アミロイドペプチド（またはその有効なフラグメントもしくはそのアナログ）は、ダウン症候群、アミロイドーシスオランダ型を有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）、散発性および家族性β−アミロイド血管障害、またはβ−アミロイドの大脳蓄積を含む他の疾患と関連したアミロイド斑形成を処置するために粘膜投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】コントロール、および［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（７５μｇ／摂食×５）させるか、またはβ−アミロイドペプチドで経鼻的に処置（２５μｇ／適用×３）されたかのいずれかであり、そして最後の処置の２日後に、マウスあたり５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドで免疫化された実験ＳＷＩＳＳＸＢＤＦ１マウスの脾臓由来のＴ細胞の増殖（刺激指数（Ｓ．Ｉ．）として表される）を例示する。増殖を、免疫の１０日後に決定した。
【図１Ｂ】マウスあたり５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドを用いて足のパッドにおいて免疫化された１０日後に決定した、コントロールならびに［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食させたか、または経鼻投与された実験ＳＷＩＳＳＸＢＤＦ１マウスおよびマウス由来の膝窩リンパ節Ｔ細胞の増殖（Ｓ．Ｉ．として表される）を例示する。コントロールマウス（「非処置」と名付けられる）は、免疫化のみさせた。
【図２Ａ】［１−４０］β−アミロイドペプチドで免疫化されるが、ペプチドを全く摂食させない、ＳＪＬ／Ｊ、ＤＢＡ／１、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／Ｃ、およびＣ３Ｈ／ＥＢマウスからの膝窩リンパ節由来のＴ細胞の増殖（非免疫マウスと比較したΔＣＰＭとして表される）を例示する。
【図２Ｂ】［１−４０］β−アミロイドペプチドで免疫化されるが、ペプチドを全く摂食させない、ＳＪＬ／Ｊ、ＤＢＡ／１、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／Ｃ、およびＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の脾臓Ｔ細胞の増殖（図２Ａ中と同様、ΔＣＰＭとして表される）を例示する。
【図３Ａ】［１−４０］β−アミロイドペプチドで免疫化されるが、ペプチドを全く摂食させない、ＳＪＬ／Ｊ、ＤＢＡ／１、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／Ｃ、およびＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節Ｔ細胞におけるサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−βの分泌（非免疫のコントロールと比較したΔｐｇ／ｍｌとして表される）を例示する。
【図３Ｂ】［１−４０］β−アミロイドペプチドで免疫化されるが、ペプチドを全く摂食させない、ＳＪＬ／Ｊ、ＤＢＡ／１、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／Ｃ、およびＣ３Ｈ／ＥＢマウスの脾臓から単離されたＴ細胞におけるサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−βの分泌（図３Ａ中と同様、Δｐｇ／ｍｌとして表される）を例示する。
【図４Ａ】５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドでの免疫化（最後の摂食または経鼻適用の２日後）前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（５、５０、または５００μｇ／摂食、５日間）させるか、または経鼻投与（５または５０μｇ／適用、３日間）されるかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウスの膝窩リンパ節由来のＴ細胞におけるサイトカインＩＬ−１０の分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図４Ｂ】５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドでの免疫化（最後の摂食または経鼻適用の２日後）前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（５、５０、または５００μｇ／摂食、５日間）させるか、または経鼻投与（５または５０μｇ／適用、３日間）されるかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウスの脾臓由来のＴ細胞におけるサイトカインＩＬ−１０の分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図５Ａ】５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドでの免疫化（最後の摂食または経鼻適用の２日後）前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（５、５０、または５００μｇ／摂食、５日間）させるか、または経鼻投与（５または５０μｇ／適用、３日間）されるかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節Ｔ細胞におけるサイトカインＩＬ−２の分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図５Ｂ】５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドでの免疫（最後の摂食または経鼻適用の２日後）前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（５、５０、または５００μｇ／摂食、５日間）させるか、または経鼻投与（５または５０μｇ／適用、３日間）されるかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウスの脾臓由来のＴ細胞におけるＴＧＦ−βサイトカインＩＬ−２の分泌（図３Ａ中と同様に表される）を例示する。
【図６Ａ】５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドでの免疫化（最後の摂食または経鼻適用の２日後）前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（５、５０、または５００μｇ／摂食、５日間）させるか、または経鼻投与（５または５０μｇ／適用、３日間）されるかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節Ｔ細胞におけるＴＧＦ−βの分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図６Ｂ】５０μｇのＣＦＡ中の１００μｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドでの免疫化（最後の摂食または経鼻適用の２日後）前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食（５、５０、または５００μｇ／摂食、５日間）させるか、または経鼻投与（５または５０μｇ／適用、３日間）されるかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウスの脾臓由来のＴ細胞におけるＴＧＦ−βの分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図７Ａ】０または７５ｍｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドを５回摂食させるか、あるいは２５ｍｇの同ペプチドを３回経鼻投与されたＳＷＩＳＳＸＢＤＦ１マウスからの膝窩リンパ節Ｔ細胞由来のＩＦＮ−γの分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図７Ｂ】図７Ａについて記載されたような、Ｔ細胞由来のＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、およびＴＧＦ−βの分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図８Ａ】図６Ｂにおいて記載されるように、Ｔ細胞由来のＩＦＮ−γの分泌（図３Ａと同様に表される）を例示する。
【図８Ｂ】図６Ｂにおいて記載されるように、Ｔ細胞由来のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−βの分泌を説明する。
【図９Ａ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウスから得られた脳切片の試験に基づいた、プラーク荷重、サイトカイン分泌、および炎症性マーカーの評価からの結果を列挙する。
【図９Ｂ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウスから得られた脳切片の試験に基づいた、プラーク荷重、サイトカイン分泌、および炎症性マーカーの評価からの結果を列挙する。
【図９Ｃ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウスから得られた脳切片の試験に基づいた、プラーク荷重、サイトカイン分泌、および炎症性マーカーの評価からの結果を列挙する。
【図９Ｄ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウスから得られた脳切片の試験に基づいた、プラーク荷重、サイトカイン分泌、および炎症性マーカーの評価からの結果を列挙する。
【図１０Ａ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウス間の種々の群の比較のための、１末尾の（１−ｔａｉｌｅｄ）マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算されたＰ値を示す。
【図１０Ｂ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウス間の種々の群の比較のための、１末尾の（１−ｔａｉｌｅｄ）マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算されたＰ値を示す。
【図１０Ｃ】［１−４０］β−アミロイドを経口または経鼻投与されたＰＤＡＰＰマウス間の種々の群の比較のための、１末尾の（１−ｔａｉｌｅｄ）マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算されたＰ値を示す。
【図１１】β−アミロイドに対する抗体の種々のサブタイプの存在を決定するために、ＰＤＡＰＰマウスから得られたマウス抗血清に関して行われるイムノアッセイの結果を示す。
【図１２】屠殺前に［１−４０］β−アミロイドペプチドで、免疫化されたＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、ＩＬ−２の産生について試験したインビトロ実験の結果を示す棒グラフである。
【図１３】屠殺前に［１−４０］β−アミロイドペプチドで、免疫化されたＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、［１−４０］β−アミロイドペプチド存在下での増殖について試験したインビトロ実験の結果を示す棒グラフである。
【図１４】屠殺前に［１−４０］β−アミロイドペプチドで、免疫化されたＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、ＩＦＮ−γの産生について試験したインビトロ実験の結果を示す棒グラフである。
【図１５】屠殺前に［１−４０］β−アミロイドペプチドで、免疫化されたＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、ＩＬ−６の産生について試験したインビトロ実験の結果を示す棒グラフである。
【図１６】屠殺前に［１−４０］β−アミロイドペプチドで、免疫化されたＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、ＩＬ−１０の産生について試験したインビトロ実験の結果を示す棒グラフである。
【図１７】屠殺前に［１−４０］β−アミロイドペプチドで、免疫化されたＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、ＴＧＦ−βの産生について試験したインビトロ実験の結果を示す棒グラフである。
【図１８】ＩＬ−４またはＩＬ−１０の経鼻投与と共に、および［１−４０］β−アミロイドでのマウスの免疫化前に、［１−４０］β−アミロイドを、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスに経鼻的に投与した実験からの結果を示す。この図は、［１−４０］β−アミロイドペプチド存在下のマウス由来の脾臓細胞のインビトロでの増殖を示す。
【図１９】ＩＬ−４またはＩＬ−１０の経鼻投与と共に、および［１−４０］β−アミロイドでのマウスの免疫化前に、［１−４０］β−アミロイドを、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスに経鼻的に投与した実験からの結果を示す。この図は、［１−４０］β−アミロイドペプチド存在下のマウス由来の脾臓細胞におけるＩＦＮ−γのインビトロでの産生を示す。
【図２０】ＩＬ−４またはＩＬ−１０の経鼻投与と共に、および［１−４０］β−アミロイドでのマウスの免疫化前に、［１−４０］β−アミロイドを、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスに経鼻的に投与した実験からの結果を示す。この図は、［１−４０］β−アミロイドペプチド存在下のマウス由来の脾臓細胞におけるＩＬ−６のインビトロでの産生を示す。
【図２１】ＩＬ−４またはＩＬ−１０の経鼻投与と共に、および［１−４０］β−アミロイドでのマウスの免疫化前に、［１−４０］β−アミロイドを、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスに経鼻的に投与した実験からの結果を示す。この図は、［１−４０］β−アミロイドペプチド存在下のマウス由来の脾臓細胞におけるＩＬ−１０のインビトロでの産生を示す。
【図２２】ＩＬ−４またはＩＬ−１０の経鼻投与と共に、および［１−４０］β−アミロイドでのマウスの免疫化前に、［１−４０］β−アミロイドを、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスに経鼻的に投与した実験からの結果を示す。この図は、［１−４０］β−アミロイドペプチド存在下のマウス由来の脾臓細胞におけるＴＧＦ−βのインビトロでの産生を示す。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に列挙される全ての刊行物および特許出願は、本明細書に参考として援用される。
【００３０】
本開示において使用される以下の用語は、以下の、それらに帰する意味を有する。
【００３１】
「哺乳動物」は、免疫系を有し、そしてアルツハイマー病に罹患しやすい任意の温血高等脊椎動物生物体（ヒトを含む）あるいはその誘発性または自発性の動物モデルとして、本明細書において定義される。
【００３２】
「β−アミロイドペプチド」は、約１０〜４３（好ましくは１３〜４３）の間のアミノ酸残基のペプチドフラグメントを含むことが意図され、β−アミロイド前駆体タンパク質由来の配列は、酵素学的方法または生合成方法（例えば、天然の組織培養物を含む、任意の供給源からのペプチドフラグメントの単離による）を含む、ペプチドの分野で公知の化学的合成方法によるか、あるいは組換え遺伝子工学的方法によるかの、いずれかにより調製され得る。β−アミロイドペプチドフラグメントの限定されない例は、本方法に含まれ、そして処方物は、［１−４０］Ａβ、［１−４２］Ａβ、［２５−３５］Ａβ、ならびに実質的に類似の配列、および選択された残基に対する相同的、非ペプチド性、または等配電子性の置換を含む、それらのアナログを含む。効果的なペプチドフラグメントは、炎症誘発性のＴｈ１サイトカインの抑制、炎症性マーカー量の減少、抗炎症性Ｔｈ２またはＴｈ３サイトカイン量の増加、あるいはβ−アミロイドの沈着の抑制の特性を有するフラグメントを含む。相同的置換は、関連構造のアミノ酸残基を必要とし、そしてメチレン基の数における相異のみが、その残基中に存在する。非ペプチド性置換は、それらの天然のアミノ酸残基と類似する立体配置的特性を有する有機的構造物を含む。等配電子性置換とは、単原子置換（例えば、チロシン中の芳香族の水酸基におけるＯに対するＳ）か、または１つの部分の、それと類似の空間容積を占有する別のものでの置換（例えば、メチル基に対するアミノ基）のいずれかを有する残基をいう。本発明に従って投与される有用なβ−アミロイドペプチドは、中でも、ヒト、ウシ、およびマウスβ−アミロイドの配列を有するそれらを含む。ヒトまたはウシＡβペプチド［１−４３］のアミノ酸配列を有する精製されたＡβペプチド、あるいはアルツハイマー病に関連する自己免疫反応を抑制する宿主Ｔ細胞により認識されるそれらのフラグメントを、ヒトに投与することが好ましい。そのペプチドは、Ｔ細胞認識部位が妨害されない限り、より長いアミノ酸配列の部分を形成し得る。
【００３３】
免疫応答あるいは免疫反応の「寛解」、「抑制」、または「減少」は、発作または反応の１以上の症状の部分的減少あるいは回復（例えば、活性化されたＴ細胞の数、もしくは抗体の数、または少なくとも１つの炎症誘発性サイトカイン（例えば、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−２、ＩＬ−６もしくはＴＮＦ）のレベルにおける減少、あるいは少なくとも１つの抗炎症性サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）のレベルの増加）を含む。
【００３４】
アルツハイマー病の「処置」は、以下の１以上の事項を含むことを意図されるが、これらに限定されない。
（ｉ）認知性の障害を有さない、性および年齢に調和した被験体のサイトカインの性質に適合するか、または近づくような、アルツハイマーの患者または動物モデルにおける、１以上のサイトカインまたは炎症性マーカーの性質の変化。
（ｉｉ）血球計数、血液化学、ビタミンＢ１２、葉酸、ＶＤＲＬ、甲状腺機能、電子脳造影図、コンピュータ断層撮影法、またはｔｈｅ Ｒｅｃｏｒｄ ｆｏｒ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｖｉｎｇに従った判断基準を含むが、制限されない、認知性の障害および他のＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＦＡ判定基準（ＭｃＫｈａｎら、１９８４）の少なくとも１つにより評価されるような、痴呆に関連したアルツハイマーの進行の遅延。
（ｉｉｉ）１以上の症状、因子、およびこの定義の項目（ｉｉ）において詳細に渡る判断基準により、またはアルツハイマー病を専門とする医師による観察により評価される痴呆の回復。または
（ｉｖ）その処置より他に観察されないような、プラークに関連するβ−アミロイド量の減少。
【００３５】
本発明に従った粘膜寛容は、少なくとも以下の理由により、アルツハイマー病、機能障害の処置のための有利な方法である。
【００３６】
（１）毒性の非存在。例えば、多発性硬化症に罹患したヒトに対するウシミエリン（ＭＢＰおよびＰＬＰを含む）のような、他のタンパク質の抗原の経口もしくは他の粘膜投与、または慢性関節リウマチ（または対応する動物モデル疾患）に罹患したヒトもしくはげっ歯類に対するニワトリＩＩ型コラーゲンの経口または吸入による投与；またはブドウ膜網膜炎に罹患するヒトに対するウシＳ抗原の経口投与；または健康なボランティアに対するインシュリンの経口投与を含む、臨床試験あるいは動物実験において観察される毒性はない。
【００３７】
（２）治療の簡便性。粘膜投与は、投与の非経口的、または他の形態より簡便である。
【００３８】
本発明者は、一連の実験を行い、粘膜性の寛容化技術が、アルツハイマー病のβ−アミロイドに関連する炎症の特徴を引き起こすか否かを発見した。自己免疫応答に対する寛容を誘導するための粘膜経路の使用は、動物モデルにおいて、アルツハイマー病に関連する所望しない免疫応答を抑制し、そして動物モデルにおけるその疾患の組織学的症状を減少するために有効であることが見出された。抗原摂食は、末梢の寛容を生成する手段として、試験動物において実行され、そしてＣ３Ｈ／ｅｂおよびＤＢＡ／１マウスにおいて、抗炎症性サイトカイン応答の増加ならびに膝窩リンパ節増殖の減少を含む、Ｔｈ２およびＴｈ３リンパ球の応答の増加に加え、Ｔｈ１型応答の寛容化を成功した。β−アミロイドの沈着を刺激するアルツハイマー病のマウスモデルにおいて、ＰＤＡＰＰモデルの、抗炎症性Ｔｈ１型応答は、β−アミロイドの粘膜投与により抑制された。
【００３９】
本発明の粘膜投与に基づくアルツハイマー病の処置の方法は、１つの実施態様において、その疾患に関与すると考えられる特異的な免疫応答の調節を生じる。理論により縛られることを望まないが、本発明者は、この応答の抑制は、活性な抑制機構、すなわち、抗炎症性サイトカインの性質により特徴付けられるＴ細胞の誘発により主にもたらされると考える。また、以下に議論されるように、本発明の方法は、β−アミロイドの抗体の誘導に関連し、本発明の任意の理論に束縛されることを望むことなく、観察される有利な結果における役割を有し得る。
【００４０】
以下に記載される結果に示されるように、本発明の方法はまた、β−アミロイドの沈着の抑制を生じ得る。実施例において記載される実験は、β−アミロイドの沈着が、マウスアルツハイマー病モデルにおいて抑制されたことを示す。
【００４１】
「粘膜」投与は、経口、腸内、胃内、経鼻、口腔内または肺内投与を含み、そしてより一般に、粘膜に関連するリンパ様組織（ＭＡＬＴ）（腸の、鼻の、口腔の、気管支の、または肺の粘膜のそれを含む）において、処置される被験体の免疫系とその成分を接触させる活性成分の任意の投与方法（例えば、吸入による）を含む。本発明の１つの実施態様において、本発明に従って投与される経口組成物は、胃の粘膜に主に指向され；このことは、例えば、活性成分を経口粘膜に対して実質的に投与しない投薬形態で、達成される。また、以下に記載される実験において、吸入による投与は、特に効果的であることが見出された。
【００４２】
１つの実施態様において、本発明は、β−アミロイドペプチド（例えば、［１−４０］β−アミロイド、［１−４２］β−アミロイド、［２５−３５］β−アミロイド、または長さ約１０アミノ酸より大きい他のβ−アミロイドペプチド）を含む有効量の組成物を、その哺乳動物に対して粘膜投与することを含む、アルツハイマー病に罹患する（または発生の危険がある）哺乳動物の処置のための方法を提供する。１つの実施態様において、そのβ−アミロイドペプチド配列は、長さ１５アミノ酸より大きく、そして別の実施態様においては、長さ２０アミノ酸より大きい。投与は、好ましくは上記のパラメータの１つに
おける変化を達成するために十分な時間の期間で続けられる。好ましい実施態様において、本発明は、記載されたような方法を提供し、ここでその哺乳動物はヒトである。
【００４３】
本発明はまた、上記の処置の手段の１つを達成するために十分なβ−アミロイドペプチドを含有する有効量の組成物を含む、経口または他の粘膜性の投薬形態および送達系を含む、アルツハイマー病に罹患する哺乳動物に対する投与のための薬学的処方物を提供する。
【００４４】
１つの実施態様において、本発明は、上記の薬学的処方物を提供し、ここで、その経口投薬形態は、錠剤、カプセル剤、およびカプレット（ｃａｐｌｅｔ）からなる群より選択される固体の投薬形態である。上記のように、本発明のその経口投薬形態の好ましい実施態様は、β−アミロイドペプチドを含む組成物を、主に胃の粘膜に送達する。そのような実施態様は、口における実質的な溶解を回避する（例えば、その投薬形態中の活性成分の１０％未満、好ましくは５％未満が、口内で放出される場合）錠剤、カプセル剤、カプレット（ｃａｐｌｅｔ）または他の投薬形態を含む。別の実施態様において、本発明は、上記の薬学的処方物を提供し、ここで、その経口投薬形態は、β−アミロイドペプチドの水性懸濁物溶液を含む。さらなる実施態様において、本発明は、さらに薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、上記の薬学的処方物を提供する。
【００４５】
本発明はまた、アルツハイマー病に罹患している哺乳動物に対する投与のための薬学的処方物を提供し、経鼻投与または気管支への投与のために適合される本発明に従った投薬の形態を含む。１つの好ましい実施態様において、本発明は、上記のような吸入により送達されるべきエアロゾル形態またはスプレー形態の薬学的処方物を提供し、さらに薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。この処方物は、例えば、噴霧器または吸入器で投与し得る。このような投薬形態を使用し、本発明者らにより、吸入による投与（例えば、経鼻投与による）と関連があると決定された、特に有益な結果を達成する。
【００４６】
（耐性を誘導するために使用され得る抗原）
本発明における使用に適切な抗原は、アルツハイマー病に特異的な抗原（すなわち、ヒト宿主または動物宿主の免疫Ｔ細胞により認識される抗原）を含む。制限されない例は、合成β−アミロイドペプチドまたは生合成β−アミロイドペプチド（１０残基と４３残基との間、好ましくは１３残基と４３残基との間を含む、そのペプチドフラグメントを含む）を含む。このような抗原の例は、β−アミロイドペプチド（１〜４０）Ａβ、（１〜４２）Ａβおよび（２５〜３５）Ａβを含む。少なくとも１つのこのようなＴ細胞認識部位をβ−アミロイドペプチドと共有する種々の関連物質が、本発明の範囲内に包含される。このような物質は、長さまたは組成が変化するβ−アミロイドペプチドのアナログを含むが、実質的に同様の（すなわち、有意なレベル（例えば、約４０％と約９５％との間）の一次配列の相同性を有する）配列を含む。このような物質はまた、そのβ−アミロイドペプチド（または前述の）アナログおよびネイティブのβ−アミロイドタンパク質に見出される１つ以上の隣接アミノ酸配列、またはβ−アミロイド起源外の１つ以上の隣接アミノ酸配列のペプチド構築物を含む。本発明は、アミロイド前駆体タンパク質の投与、およびこのタンパク質のホモログの投与を含み、例が、米国特許第５，５２５，７１４号、同第５，４４１，９３１号、および同第５，４３６，１５３号に記載される。アミロイド前駆体タンパク質もまた、米国特許第５，３１８，９５８号および同第５，２１８，１００号に記載される。アミロイドをコードするｃＤＮＡクローンもまた、米国特許第４，９１２，２０６号に記載される。本発明はまた、天然に存在するβ−アミロイドペプチドに関する保存的なアミノ酸置換を有する（例えば、ヒト、ウシ、またはマウス配列に関する１つ以上（好ましくは５つ未満）の保存的なアミノ酸置換を有する）ペプチドも包含する。このようなβ−アミロイドペプチド、β−アミロイドペプチドアナログ、およびβ−アミロイドペプチドと少なくとも１つのＴ細胞認識部位を共有する構築物を評価する方法は、当
該分野で周知である。例えば、重複ペプチド法を使用して、β−アミロイドペプチドＡβ（１〜３９）（またはＡβ（１〜４３）の場合があり得る）の種々のフラグメント（少なくとも１０アミノ酸残基、そして好ましくは２０アミノ酸残基を有する）を、アルツハイマー病に罹患している宿主から単離された免疫Ｔ細胞を含む調製物に接触してこれらを配置し、そしてこのようなＴ細胞の増殖を評価することにより、試験し得る。さらに、このようなＴ細胞のサイトカインパターンを、以下の実施例において提供される方法論を使用して分析し、ペプチドの選択をさらに正確にし得る。１つの実施態様において、このペプチドは、Ｔ細胞分泌抗炎症サイトカインが増殖する原因となるペプチドである。別の実施態様において、このペプチドは、このペプチドがＴ細胞分泌抗炎症サイトカインが増殖する原因となるか、またはこのペプチドがなければこのような分泌抗炎症サイトカインの生成を増加するのかどうかに関わらず、１つ以上の炎症応答の抑制の原因となるペプチドである。β−アミロイド沈着を抑制するペプチドもまた、例えば、実施例に記載されるマウスモデルにおいて示されるように、含まれる。別の実施態様において、血清中（例えば、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の疾患モデルに、罹患しているかまたは罹患しやすくされた、ヒト宿主または非ヒト宿主の血清中）に存在する抗β−アミロイド抗体の量の増加の原因となるペプチドが、含まれる。β−アミロイドペプチドの配列を有するペプチドもまた含まれるが、アルツハイマー患者から得られる細胞を使用する当該分野で公知の方法により決定されるように、ＭＨＣレセプターまたはＴ細胞レセプターに対する１つ、２つ、または３つの変更された接触点を含む。
【００４７】
（粘膜への投与のための処方物）
１つを越える抗原の投与が可能であり、そして（例えば、患者の免疫Ｔ細胞が１つよりも多い抗原を認識する場合）妥当であり得る。
【００４８】
本発明に従う適切な処方物は、経口投与、経腸投与、口腔内投与、経鼻投与、気管支への投与、または肺内投与のために適合された処方物を含む。このような処方物の調製は、当該分野の技術に十分含まれる。使用される抗原が合成起源であり、そして感染の危険を避けるために（特に、排他的にではないが、クロイツフェルト−ヤーコプ病の原因となる因子の伝達を避けるために）、生物的供給源から単離されていないということが好ましい。さらに、この処方物が、吸収促進剤、またはタンパク質分解を防ぐ成分を含まないことが望ましい。しかし、以下にさらに記載されるように、抗原を、１つ以上の増強剤（例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−１０）と組合せて、この処方物の有効性を増加し得る。
【００４９】
本発明に従うＴ細胞媒介免疫応答の寛容化における使用のための適切な経口処方物は、任意の適切な経口投与可能な形態（例えば、有効量の抗原を含むピル、液体、あるいはカプセルまたはカプレット（ｃａｐｌｅｔ））であり得る。各経口処方物は、当該分野で周知であるように、以下を含む不活性成分をさらに含み得る：薬学的に受容可能な、キャリア、希釈剤、賦形剤、崩壊剤、人工香味料、安定剤、保存剤、可溶化剤、または乳化剤および塩。例えば、錠剤は、当該分野で周知の、固体キャリアおよび他の賦形剤を使用する従来手順に従って、処方され得る。カプセルは、任意の薬学的に受容可能な物質（例えば、ゼラチンまたはセルロース誘導体）から作製され得る。固体キャリアの制限されない例は、デンプン、糖、ベントナイト、シリカおよび他の一般に使用される不活性成分を含む。液体経口処方物のための希釈剤は、特に、生理食塩水、シロップ、ブドウ糖および水を含み得る。
【００５０】
本発明において使用される抗原はまた、液体処方物または、例えば、生理的に受容可能な水性液体媒体中の懸濁液または溶液のような投薬形態で、作製され得る。このような液体媒体は、患者が、その日の間中間隔を空けて飲むのに都合が良い水、または適切な飲料（例えば、果汁または茶）を含む。液体処方物中で、経口的に与えられる場合、この抗原は、生理的に受容可能な液体媒体中に溶解または懸濁し得、そしてこの目的のために、こ
の抗原は、その分子の操作（例えば、加水分解、部分的な加水分解、またはトリプシン処理）または生理的に受容可能な限界内のｐＨの調節（たとえば、３．５〜８）により、可溶化し得る。あるいは、この抗原は、微紛形態に縮小し、そして生理的に受容可能な液体媒体中、または溶液中に懸濁し得る。
【００５１】
持続放出性経口送達系もまた企図され、そして好ましい。持続放出性経口投薬形態の制限されない例は、以下において記載される持続放出性経口投薬形態を含む：１９８７年１１月３日に発行された米国特許第４，７０４，２９５号；１９８５年１２月３日に発行された米国特許第４，５５６，５５２号；１９８２年１月５日に発行された米国特許第４，３０９，４０４号；１９８２年１月５日に発行された米国特許第４，３０９，４０６号；１９９５年４月１０日に発行された米国特許第５，４０５，６１９号；１９８５年５月２３日に公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ ８５／０２０９２；１９９５年５月１６日に発行された米国特許第５，４１６，０７１号；１９９４年１２月６日に発行された第５，３７１，１０９号；１９９４年１０月１８日に発行された米国特許第５，３５６，６３５号；１９９３年８月１７日に発行された米国特許第５，２３６，７０４号；１９９２年９月２９日に発行された米国特許第５，１５１，２７２号；１９９１年１月１５日に発行された米国特許第４，９８５，２５３号；１９９０年１月２３日に発行された米国特許第４，８９５，７２４号；１９８７年６月２３日に発行された米国特許第４，６７５，１８９号。
【００５２】
生物接着剤で被覆された持続放出性経口投薬形態もまた使用し得る。例は、以下において開示される組成物である：ＥＰ ５１６，１４１；米国特許第４，２２６，８４８号、１９８０年１０月；米国特許第４，７１３，２４３号；米国特許第４，９４０，５８７号；ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ ８５／０２０９２；ＥＰＯ ０ ２０５ ２８２；Ｓｍａｒｔら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３６、２９５〜９９（１９８４）；Ｓａｌａら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｍ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、１６、４２０〜２１（１９８９）；Ｈｕｎｔｅｒら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１７、５９〜６４（１９８３）；「Ｂｉｏａｄｈｅｎｓｉｏｎ−Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ，Ｋｅｌｌａｗａｙ」コース番号４７０、１９８９年５月２２〜２４日。
【００５３】
市販の持続放出性処方物および持続放出性デバイスは、商品名ＡＬＺＥＴ、ＩＮＦＵＳＥＴ、ＩＶＯＳ、ＯＲＯＳ、ＯＳＭＥＴで、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡにより市販されるか、または以下のような１つ以上の米国特許において開示される持続放出性処方物および持続放出性デバイスを含む：１９９４年２月９日に発行された第５，２８４，６６０号；１９９２年８月２５日に発行された第５，１４１，７５０号；１９９２年５月５日に発行された第５，１１０，５９７号；１９９０年４月１７日に発行された第４，９１７，８９５号；１９８９年６月６日に発行された第４，８３７，０２７号；１９７６年１１月２３日に発行された第３，９９３，０７３号；１９７６年４月６日に発行された第３，９４８，２６２号；１９７６年３月１６日に発行された第３，９４４，０６４号；および第３，６９９，９６３号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／１００７７およびＰＣＴ／ＵＳ９３／１１６６０；および欧州出願公開ＥＰ ２５９０１３およびＥＰ ３５４７４２。
【００５４】
持続放出性組成物および持続放出性デバイスは、本発明における使用のために適切である。なぜならば、持続放出性組成物および持続放出性デバイスは、抗体と腸管随伴リンパ組織（ＧＡＬＴ）との間の接触を長引かせるために役立ち、従って、抗原と免疫系との間の接触を長引かせるからである。さらに、持続放出性組成物は、抗原の別々の多用量投与についての必要性を除去し、そして必要とされる量の抗原を、１日量または２日量でＧＡＬＴに送達することを可能にする。これは、患者のコンプライアンスを改善すると予測さ
れる。
【００５５】
１つ以上のβ−アミロイドペプチドのような抗原を含む経口投与可能な薬学的処方物は、調製され、そしてアルツハイマー病の明らかな症状を有する動物に対して投与される。さらに、アルツハイマー病が進展する危険がある（すなわち、この疾患を進展させる遺伝的素因を有する）、と適切な手段（例えば、遺伝的研究およびその脳の画像診断分析）を通じて決定された被験体は、β−アミロイドペプチドの同様な経口調製物を用いて処置される。
【００５６】
アルツハイマー病を処置するための経口投与または経腸投与のための薬学的処方物は、β−アミロイドペプチドおよび経口摂取に適する薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物から調製される。β−アミロイドペプチドの量は、１日に０．０１ｍｇと１日に１０００ｍｇとの間であり得る。本発明の１つの実施態様において、用量は、１日に０．０５ｍｇよりも多い。別の実施態様において、用量は、１日に０．１ｍｇよりも多く、そして１日に１ｍｇを超え得る。さらなる実施態様において、用量は、１日に０．０５ｍｇと１日に１ｍｇとの間である。しかし、処置に必要とされる総用量は、個体およびその状態の重症度に従って変化し得る。この量は、投薬のマトリックスおよび投与の頻度を確立するような周知の方法により、さらに正確にされ得る。
【００５７】
吸入による投与（すなわち、気管支肺粘膜への送達）のために、適切なスプレーおよびエアロゾルが使用され得、例えば、以下に記載されるスプレーおよびエアロゾルのような噴霧器を使用する：１９８６年１１月２５日に発行された米国特許第４，６２４，２５１号；１９７２年１１月２１日に発行された同第３，７０３，１７３号；１９７１年２月９日に発行された同第３，５６１，４４４号；および１９７１年１月１３日に発行された同第４，６３５，６２７号。
【００５８】
エアロゾル送達の他の系（例えば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｓ，Ｐ． Ａｅｒｏｓｏｌｓ ａｎｄ
ｔｈｅ Ｌｕｎｇ、Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．およびＤａｖｉａ，Ｄ．編、１９７〜２２４頁、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８４において開示されるような加圧定量噴霧型吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器）が、本発明を実施する場合に、使用され得る。
【００５９】
本明細書中に開示される型のエアロゾル送達系は、Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ Ｃｏ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含む多数の商業的供給源から入手可能である。
【００６０】
経鼻投与のための処方物は、乾燥粉末として、または水性溶液中で投与し得る。好ましいエアロゾル薬学的処方物は、例えば、本発明のβ−アミロイド抗原を含む生理的に受容可能な緩衝化生理食塩水溶液を含み得る。
【００６１】
液体中に溶解または懸濁されない、細かく分割された固体β−アミロイド粒子の形態の乾燥エアロゾルは、本発明の実施において有用である。抗原は、散布剤の形態であり得、そして、約１ｕｍと５ｕｍとの間、好ましくは２ｕｍと３ｕｍとの間の平均粒子サイズを有する細かく分割された粒子を含み得る。細かく分割された抗原粒子は、当該分野で周知の技術を使用する粉砕およびスクリーン濾過により調製し得る。この粒子は、予め決定された量のこの細かく分割された物質（粉末の形態であり得る）を吸入することにより投与し得る。
【００６２】
本発明の薬学的処方物において有用であるキャリアおよび／または希釈剤の特定の制限
されない例は、水および、リン酸緩衝化生理食塩水溶液ｐＨ７．０〜８．０のような生理的に受容可能な緩衝化生理食塩水溶液含む。
【００６３】
本発明の経鼻投与される処方物は、体温での鼻粘膜との接触により、粘性が増加する熱硬化性ゲルを含み得る。
【００６４】
経鼻投与のための処方物は、有効量のβ−アミロイド抗原と混合された粘膜付着剤を含み得る。有効量は、使用される処方物に従って変化することが予期される。吸入により投与される処方物に関して、その有効量は、経口用量の有効量よりも少なそうである。
【００６５】
ヒトにおける処置の期間は、最低で２週間、そして代表的には３ヶ月であるべきであり、そして無期限に、または恩恵が持続する限り、継続し得る。この処置は、所望ならば（主治医の判断で）中断し得、そしてこの患者は、再発の徴候について監視される。臨床的症状または他の疾患の指標が、その患者が再発しているということを示す場合、処置は再開し得る。
【００６６】
当業者に理解されるように、投薬量は、投与される抗原により変わり、そして性別、年齢、および患者の身体状態により、ならびに投与される他の併用処置により変化し得る。結果的に、使用される投薬量および投与スケジュールの１つまたは両方を調整および洗練することは、好ましくはこれらの要素に基づき、そして特にこの処置に対する患者の応答に基づき決定される。しかし、このような決定は、以下に提供される実施例に例示されるように、単なる慣用的な実験法を必要とするにすぎない。
【００６７】
β−アミロイド抗原の投与は、１つ以上の増強剤（すなわち、このβ−アミロイド抗原の１つ以上の有益な効果を増強する物質）の粘膜投与と組合せ得る。このような増強剤は、ＬＰＳ、脂質Ａ（ＷＯ ９１／０１３３３として公開された米国出願番号第０８／２０２，６７７号において記載される）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩ型インターフェロン（α−インターフェロンおよびβインターフェロン（例えば、米国出願番号第０８／４２０，９８０号および同第０８／４２０，９７９号ならびにＷＯ ９５／２７４９９およびＷＯ ９５／２７５００を参照のこと）、コレラ毒素Ｂサブユニット、ならびにＬＴＢ（非耐熱性エンテロトキシン））を含む。さらに以下に記載される実験を行った。この実験において、β−アミロイドペプチドと組合せたＩＬ−４の投与は、特に効果的であることを見出した。この段落において使用される場合、「と組合せた」は、これら抗原の投与の前、これら抗原の投与と実質的に同時、またはこれら抗原の投与の後を意味する。自然に、この組合せた物質の投与は、最初に投与された物質の関連の効果が徐々に消滅するほど長い時間の間隔の分、抗原の投与に先行も後続もすべきではない。従って、増強剤は、通常、β−アミロイド抗原の約２４時間前、または２４時間後以内（そして好ましくは、約１時間以内）に投与されるべきである。
【００６８】
本発明は、実施例への言及により、以下にさらに記載され、その目的は、本発明の範囲を制限することなく本発明を例示することである。本明細書中で引用されるすべての文献を参考として援用する。
【００６９】
（実施例１）
（実験動物）
メスＢＡＬＢ／Ｃ（６〜８週齢）；ＤＢＡ／２；Ｃ３Ｈ／ｅｂ；Ｃ４７ｂ１／６；ＳＷＩＳＳＸＢＤＦ１またはＳＨＬ／Ｊマウスを使用した。これら動物を、餌および水を自由に利用できる、温度制御および光制御された環境に維持した。各実験グループは、５匹以上のマウスを含む。
【００７０】
（免疫化）
マウスを５０μｇＣＦＡ（Ｄｉｆｉｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ．）に乳化した１００μｇの（１〜４０）β−アミロイドペプチド（（１〜４０）Ａβ）で免疫化した。１０日目に、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン生成のために膝窩リンパ節および脾臓を回収した。
【００７１】
（増殖アッセイ）
細胞（各ウェルにつき５×１０5）を、三通りの９６ウェル丸底プレート（ＦａｌｃｏｎTM、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）において抗原（１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間培養した。（3Ｈ）チミジン（１μＣｉ／ウェル）を、この細胞の収集前の最後の７時間の培養の間添加した。（3Ｈ）チミジンの取り込みを、Ｂｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して決定した。増殖応答を、Δｃｐｍ（ｃｐｍ（試験）−抗原なしのｃｐｍ（コントロール））として測定した。刺激指数（ＳＩ）を、平均ｃｐｍ（抗原あり）／平均ｃｐｍ（抗原なし）として算出した。
【００７２】
図１Ａは、（１〜４０）β−アミロイドペプチドを給餌された（７５μｇ／給餌 ×５）かまたは経鼻処置され（２５μｇ／経鼻粘膜への直接適用 ×３）、そしてマウスにつき５０μｇＣＦＡ中１００μｇ（１〜４０）β−アミロイドペプチドでの最後の処置の２日後に免疫された、ＳＷＩＳＳＸＢＤＦ１マウス（アルツハイマー型の非トランスジェニックｌｉｔｅｒｍａｔｅ）由来の脾臓細胞の増殖の有意な抑制を示す。図１Ｂは、マウスにつき５０μｇＣＦＡ中１００μｇ（１〜４０）β−アミロイドペプチドで脚のパッドに免疫化されて１０日後に測定した、（１〜４０）β−アミロイドペプチドを給餌されたかまたは経鼻処置された、ＳＷＩＳＳＸＢＤＦ１マウス由来の膝窩リンパ節における増殖の抑制を示す。この結果は、（１〜４０）β−アミロイドペプチドに対する脾臓Ｔ細胞および膝窩リンパ節Ｔ細胞の増殖が、未処置のコントロールと比較して（（１〜４０）β−アミロイドペプチドを給餌されたかまたは経鼻投与された）処置されたマウスにおいて、有意に抑制されたことを示す。これらの結果は、増殖応答について試験されたこれらの細胞が、免疫化のちょうど１０日後、免疫効果が鎮静する前に収集されたと仮定すれば、特に有意義である。
【００７３】
図２Ａは、[１〜４０]β−アミロイドペプチドで免疫したＳＪＬ／Ｊマウス、ＤＢＡ／１マウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、およびＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節Ｔ細胞の増殖を比較する。図２Ｂは、[１〜４０]β−アミロイドペプチドで免疫したＳＪＬ／Ｊマウス、ＤＢＡ／１マウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／Ｃマウス、およびＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の脾臓細胞における増殖を比較する。この実験は、正常なマウス（トランスジェニックマウスではなく、アルツハイマーモデルではない）の多くの系統が、免疫後の短時間内に、[１〜４０]β−アミロイドペプチドに応答することを示す。本実施例で示された実験のためのＴ細胞を、増殖アッセイの前にインビトロで一度だけ抗原で刺激することに注意すべきである。さらなる刺激は、明らかに非応答動物の系統Ｃ５７ＢＬ／６および（ＤＢＡ／１）から応答を得る。この実験は、種々の系統由来の細胞の応答能力についての情報を与え、そして以下に記載する後の実験の設計において有用であった。それは、「望ましい応答動物」（例えば、Ｃ３Ｈ／ＥＢ）の選択には有利であるが、「高すぎる応答動物」には有利ではない（従って、ＳＪＬ／Ｊは、選択されない）と思われる。
【００７４】
（実施例２）
（サイトカイン産生アッセイ）
上清中のＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＩＦＮγのレベルを、記
載されるように、獲得（ｃａｐｔｕｒｅ）ＥＬＩＳＡにより決定した。Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１，６６８８（１９９４）；Ｙａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，４３５４（１９９３）。簡単に言えば、上清をマイクロタイター（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートに加えた。このプレートは、ラット抗マウスＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βまたはＩＦＮγモノクローナル抗体（獲得抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；１μｇ／ｍｌ ４℃で一晩）で前もってコーティングし、そしてＢＳＡ希釈液／ブロッキング溶液（ＫＰＬ）でブロッキングした。プレートを洗浄し、そしてスタンダードおよびサンプルを、二度目の４℃で一晩のインキュベーションのために加えた。結合サイトカインを、ＡＢＴＳ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ）の添加により検出した。ウェルを洗浄し、そしてサイトカインレベルを、ビオチン化ラット抗マウスＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βまたはＩＦＮγモノクローナル抗体（検出抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ならびにペルオキシド可視化システム（ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン）を用いて決定した。ＩＬ−２およびＩＬ−４は、抗原と細胞のインキュベーションの２４時間後に分析し、ＩＬ−１０およびＩＮＦ−γは４０時間後、およびＴＧＦ−βは７２時間後に分析した。サイトカインレベルを、吸光度対組換えサイトカイン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の濃度の、対数−対数プロットから計算した。そして、この結果を、ｐｇ／ｍＬで表す（ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＩＦＮγに対して）。ＥＬＩＳＡアッセイの限界感度は、ＩＬ−４、ＩＬ−２、およびＩＦＮγに対して、それぞれ５ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬおよび２．５ｎｇ／ｍＬであった。
【００７５】
（統計学的分析）
実験集団間における差異の統計学的有意性は、アンペアード両側スチューデントｔ検定を用い、差異をＰ＜０．０５で有意とみなして、決定した。
【００７６】
（摂食または経鼻投与のいずれかでＡβペプチドに曝露したマウスが、インビボで、免疫刺激性（炎症誘発性）サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の抑制、ならびに免疫調節性（抗炎症性）サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）の増強を示すことの決定）
Ｃ３Ｈ／ｅｂマウスは、［１−４０］Ａβを、５００μｇ／摂食、５０μｇ／摂食、または５μｇ／摂食で、５日間毎日（２００μｌ／摂食）摂食した。経鼻投与を、５０μｇ／塗布または５μｇ／塗布で、３日間毎日（１０μｌ／塗布）投与した。最後の摂食または経鼻投与の２日後、摂食、経鼻、または無摂食マウスに、１匹のマウスあたり、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］Ａβ １００μｇを用いてフットパッド中に免疫した。
【００７７】
図３Ａは、[１〜４０]β−アミロイドペプチドで免疫したが摂食していないか、またはさもなければこのペプチドで処置をしていない、ＳＪＬ／Ｊマウス、ＤＢＡ／１マウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／ＣマウスおよびＣ３Ｈ／ＥＢマウスに由来する膝窩リンパ節における、サイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの分泌の比較を与える。図３Ｂは、[１〜４０]β−アミロイドペプチド（このペプチドでまた、処理していない）で免疫した同様の範囲のマウス系統に由来する脾臓細胞における、これらのサイトカインの分泌を比較する。図３Ａおよび図３Ｂの結果の比較は、脾臓由来のＴ細胞が、膝窩リンパ節由来のＴ細胞とは異なる性質のサイトカインを分泌し、しかもサイトカインの性質は、マウスの系統で異なることを示す。かさねて、この実験の根拠は、実験条件下で試験された性質の差異を示す応答動物を選別することにある。
【００７８】
図４Ａは、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］β−アミロイドペプチド１００μｇで免疫化（最後の摂食または経鼻塗布の２日後）する前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食したか（５μｇ／摂食、５０μｇ／摂食、または５００μｇ／摂食で、５日間）
、または経鼻投与されたか（５μｇ／塗布または５０μｇ／塗布で、３日間）、のいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節における免疫調節性サイトカインＩＬ−１０の分泌を示す。図４Ｂは、同様の条件下で［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食したか、または経鼻投与したかのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の脾臓細胞におけるサイトカインＩＬ−１０の分泌を示す。この実験もまた、このマウス系統に対する予備的な用量応答実験として役立った。もしＴ細胞が、インビトロで単一の刺激を受けたならば、そして免疫化の効果（試験した全てのマウスにおいてＩＬ−１０レベルを抑制する）が、鎮静化されていないならば、その結果は、少なくとも１用量で処理した脾臓細胞およびＰＬＮ細胞の少なくとも１つにおいてＩＬ−１０の有意な増加を示し、［１−４０］β−アミロイドペプチドを認識するＴ細胞のサイトカインの性質を同一の抗原に対する寛容化により変化し得るという成果を与える。
【００７９】
図５Ａは、種々の摂食レベル（５、５０および５００μｇ／摂食で５日間）で、およびＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］β−アミロイドペプチド１００μｇで免疫化（最後の摂食または経鼻塗布の２日後）する前に［１−４０］β−アミロイドペプチドを経鼻投与した（５μｇ／塗布または５０μｇ／塗布で、３日間）場合のＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節におけるＴｈ１免疫刺激性（炎症誘発性）サイトカインＩＬ−２の分泌の結果を示す。図５Ｂは、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］β−アミロイドペプチド１００μｇで免疫化（最後の摂食または経鼻塗布の２日後）する前に、［１−４０］β−アミロイドペプチドを摂食したか（より少ない用量で、例えば、５μｇ／摂食、５日間）、または経鼻投与したか（５０μｇ／塗布で３日間）のいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の脾臓細胞におけるサイトカインＩＬ−２の分泌を同様に示す。ＩＬ−２分泌を、脾臓Ｔ細胞またはＰＬＮ Ｔ細胞のいずれかにおいて少なくとも１用量の処置で抑制するという事実は、（免疫化の時期に関する）最適でない（ｉ）実験のタイミング；（ｉｉ）摂食量；そして（ｉｉｉ）インビトロにおける細胞の刺激（一度だけ）、にもかかわらず、Ｔｈ１応答の抑制を示す。ＩＬ−２分泌の抑制は、経鼻投与（図５Ａ）により、ならびに５μｇの摂食および、経鼻的に５０μｇ（図５Ｂ）で明らかであった。図５Ａ、および図５Ｂ、図６Ａ、図６Ｂおよび図７Ａ、図７Ｂの結果に基づき、次の実験において、経鼻的に２５μｇおよび経口的に７５μｇを用いることを決定した。最適な量は存在しない、採用された実験条件において差異を示す量を与える。以下の図８Ａおよび図８Ｂを参照のこと。
【００８０】
図６Ａは、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］β−アミロイドペプチド１００μｇで免疫化（最後の摂食または経鼻塗布の２日後）の前に、[１−４０]β−アミロイドペプチドを、摂食したか（より低用量で；５μｇおよび５０μｇ／摂食で５日間）、または経鼻投与した（５０μｇ／塗布で３日間）かのいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の膝窩リンパ節におけるＴＧＦ−βの分泌を示す。図６Ｂは、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］β−アミロイドペプチド１００μｇで免疫化（最後の摂食または経鼻塗布の２日後）の前に、[１−４０]β−アミロイドペプチドを、摂食したか（より低用量で；５μｇおよび５０μｇ／摂食で５日間）、または経鼻投与したか（５０μｇ／塗布で３日間）のいずれかのＣ３Ｈ／ＥＢマウス由来の脾臓細胞におけるＴＧＦ−βの増強した分泌を示す。
【００８１】
（実施例３）
（アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルの非トランスジェニックの同腹（ｌｉｔｅｒｍａｔｅ）のマウスの摂食または経鼻投与、そして免疫化後のサイトカインプロファイル）
摂食および免疫化：ＳＷＩＳＳＸＸＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに、[１−４０]Ａβを７５μｇ／摂食×５で摂食したか、または２５μｇ／塗布×３で経鼻投与した。そして最後の処置の２日後、マウスを、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］Ａβ１００μｇで免疫化した。１０日後、膝窩リンパ節Ｔ細胞および脾臓Ｔ細胞を、上記のようにサイトカイン産生に関して検査した。これらの実験の結果は、Ａβペプチドで前処理したマウス、およびＡβペプ
チドで免疫化したマウスは、炎症誘発性（Ｔｈ１）サイトカイン（そしてＩＦＮ−γおよびＩＬ−２が、２５μｇの経鼻投与に少なくとも応じる）に対する減少したインビトロでのＡβ刺激に対する応答、および抗炎症性（Ｔｈ２）サイトカイン（ＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０）に対する増加した応答を有することを示した。図８Ｂにおいて、非処置マウスで検出されたＴＧＦ−βがないことは、特に重要である。これらの観察は、増加した抗炎症性サイトカイン応答を示すいくつかの系統の正常マウス、ならびにＡβペプチドで粘膜寛容化された特定の系統のマウス（例えば、Ｃ３Ｈ／ＥＢおよびＤＢＡ／１）において減少したＰＬＮ増殖に関する実施例１〜２において開示された研究を確認した。
【００８２】
（実施例４）
（ヘテロ接合性ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウス（アルツハイマー病の動物モデル）の摂食、経鼻投与、および免疫化）
トランスジェニックＰＤＡＰＰマウスを、Ａｔｈｅｎａ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から入手した。これらのマウスは、β−アミロイド前駆体タンパク質の変異型をコードするヒトの遺伝子を発現し、そしてアルツハイマー病において見られるのに類似の様式で、海馬および大脳皮質においてβ−アミロイド沈着を進行的に発達させる。トランスジェニックマウスにおけるβ−アミロイド沈着は、活性化ミクログリア細胞、反応性アストロサイト、およびアルツハイマー病の脳で見られる周辺斑（ｐｅｒｉｐｌａｑｕｅ）の炎症性応答の他の特性と、関連するようになる。
【００８３】
４〜５月齢ＰＤＡＰＰマウスに、[１−４０]β−アミロイドペプチドまたはコントロールタンパク質（ミエリン塩基性タンパク質または卵白アルブミンを１摂食あたり５０μｇまたは５００μｇの量で）のいずれかを、摂食したか、または経鼻投与した。投与も、初めの１週間の間、３回（経鼻）、または５回連続して（経口）、そして次に、動物が１１月齢と１２月齢との間になるまで週１回を基本として実施した。経口投与したβ−アミロイドペプチドは、１０μｇまたは１００μｇの投薬量であり、そして経鼻投与したβ−アミロイドは、５μｇまたは２５μｇの投薬量であった。
【００８４】
β−アミロイドペプチド、または卵白アルブミンのＰＤＡＰＰマウスへの摂食および経鼻投与は、以下のマウス群の間で行った：
群０：非処置；マウス 番号０．１〜０．７
群１：摂食した、[１−４０]β−アミロイドペプチド１００μｇ／摂食；マウス 番号１．１〜１．９
群２：摂食した、[１−４０]β−アミロイドペプチド１０μｇ／摂食；マウス 番号２．１〜２．９
群３：経鼻の、[１−４０]β−アミロイドペプチド２５μｇ／処置；マウス 番号３．１〜３．９
群４：経鼻の、[１−４０]β−アミロイドペプチド５μｇ／処置；マウス 番号４．１〜４．７
群５：摂食した、卵白アルブミン５００μｇ／摂食；マウス 番号５．１〜５．６
群６：経鼻の、卵白アルブミン５０μｇ／処置；マウス 番号６．１〜６．６
群７：摂食した、ＭＢＰ ５００μｇ／摂食；マウス 番号７．１〜７．５
群８：経鼻の、ＭＢＰ ５０μｇ／処置；マウス 番号８．１〜８．６
【００８５】
１、５、および８の各群から２匹のマウスを、屠殺の１０日前にβ−アミロイドペプチドで免疫した。
【００８６】
処置期間の最後に、マウスを屠殺し、そして脳、膝窩リンパ節、および脾臓を除去した。脳を除去し、そして７０％エタノール固定液に浸し、続いてパラフィン包埋および切片
化を行った。一つの大脳半球を凍結させ、そして凍結切片作製機で切片化した。
【００８７】
この後、経口的に処置したマウスの大脳の切片を、抗体と組織学的染色を用いて試験した。グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体を、異常なアストロサイトを示すために使用し、そしてアミロイド前駆体タンパク質に対する抗体を、異常な神経突起を示すのに使用した。リンパ球を、β−アミロイドの存在下、インビボでのサイトカイン産生に関して試験した。
【００８８】
脳切片の試験で得られた結果を、図９Ａおよび図９Ｂに示す。特に、結果を、試験した８つの実験群のマウスで導かれたβ−アミロイド斑の蓄積（ｌｏａｄ）の視覚的、およびコンピュータを使った画像分析を兼ねて示す；値を、関連する群における各マウスについて示す。斑の蓄積のコンピュータ分析は、斑として同定された範囲のパーセントを表す。斑の蓄積の視覚的評価を、図９Ａの下のほうに示された表に従って点数化した。
【００８９】
これらの結果は、コントロール群とは反対に、β−アミロイドで処置したマウスにおいてβ−アミロイド沈着の発生における差異を示し、特定の卵白アルブミンで処置した群をのぞいて、さらに以下で議論することであるが、すなわち、処理した群は、わずかなβ−アミロイド沈着を発生した。この差異は、コントロールに対して２５μｇのβ−アミロイドを経鼻投与したマウスに対して統計学的に有意であった。種々の群の比較のために、片側マン−ホイットニーＵ検定を用いて計算したＰ値を、図１０に示す。
【００９０】
切片に行った免疫反応性試験の結果もまた、図９Ａおよび図９Ｂに示される。免疫学的マーカーを有する細胞で特異抗体の免疫反応性（ＩＲ）を示すこと、すなわちサイトカインを分泌することが、示される。結果は：Ｍａｃ−１、すなわち活性化抗原提示細胞（例えば、ミクログリア）に対するマーカー、；Ｆ４／８０、すなわち抗原提示細胞に対するマーカー；およびＭＨＣ−ＩＩの存在に対して詳細に示される。結果はまた、炎症性サイトカインＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αの免疫反応性に関して、および抗炎症性サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＧＦβに関して示されている。これらのデータは、β−アミロイドで粘膜を処置したマウスが、脳におけるミクログリア活性化低下、および炎症性サイトカインの産生減少を示したことを示す
【００９１】
マウス抗血清に行った免疫組織化学的な実験の結果を、図１１に示す。これらの実験において、この抗血清を、β−アミロイドに対するＩｇＧサブタイプの存在に関する免疫アッセイで試験した。免疫アッセイにおいて、大量のβ−アミロイドを含むダウン症候群脳切片を、「捕捉」抗原として使用した。マウス抗血清中のＩｇＧは、この切片に結合し、そして結合抗体におけるＩｇＧサブタイプの存在を、各サブタイプに対して特異的な第二の（２0）抗体により区別した。これらの結果は、コントロールにおいて観察を通じた、２５μｇのβ−アミロイドで経鼻処理したマウスの抗血清中のβ−アミロイドに対するＩｇＧ１クラス抗体の増加を示した。これらの抗体は、Ｔｈ２型細胞免疫応答に関連する。
【００９２】
図１２〜図１７は、屠殺前に[１−４０]β−アミロイドペプチドで免疫したＰＤＡＰＰマウス由来のＰＬＮを、ペプチドで刺激することにより試験し、そしてサイトカイン産生に関して試験した、インビトロ実験の結果を示す棒グラフである。 [１−４０]β−アミロイドペプチドを粘膜投与した動物において、ＰＬＮ免疫応答を、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの産生増加、およびＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、およびＩＬ−２の産生減少により特徴付けした。
【００９３】
上記のいくつかの実験において、この他のコントロールを使用することで得た結果とは実質的に異なる、全ての卵白アルブミンの投与についての結果を得、そして[１−４０]β−アミロイドを使用することで得た結果と同様であった。このために、さらなる実験を行
い、そこで全ての卵白アルブミンが、[１−４０]β−アミロイドと交差反応することを決定した。従って、卵白アルブミンは、[１−４０]β−アミロイドの免疫学的特性を試験するために設計した実験において、効果的なコントロールではない。
【００９４】
(実施例５）
（ＩＬ−４またはＩＬ−１０の組み合わせにおける、β−アミロイドの投与）
ＩＬ−４またはＩＬ−１０の経鼻投与の組み合わせで、かつ［１−４０］β−アミロイドを用いるマウスの免疫化の前に、［１−４０］β−アミロイドを、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスに経鼻投与する実験を行った。特に、（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１マウスは、以下の組成物で経鼻処理した：
１） ＰＢＳ；
２） ［１−４０］β−アミロイド；
３） ＩＬ−４；
４） ［１−４０］β−アミロイド＋ＩＬ−４；
５） ＩＬ−１０；または６） ［１−４０］β−アミロイド＋ＩＬ−１０；
【００９５】
［１−４０］β−アミロイドを、１用量２５μｇで投与し、そしてＩＬ−４およびＩＬ−１０を、１用量１μｇで投与した。この組成物を、２日間隔で、３回投与した。最後の処置の２日後、そのマウスを、ＣＦＡ５０μｇ中の［１−４０］β−アミロイド１００μｇで免疫化した。２週間後、マウスからの脾細胞を、増殖およびサイトカイン産生について、５０μｇ／ｍｌ［１−４０］β−アミロイド存在下、インビボで試験した。
【００９６】
これらの実験からの結果を、図１８〜図２２に示す。これらの実験において、ＩＬ−４の投与は、例えば、ＩＦＮ−γ産生の抑制、ＴＧＦ−β産生増加、および増殖性の応答の増大において示されるような、β−アミロイドペプチド投与によって誘発された抑制性の応答の増大に、特に効果的であることを示した。β−アミロイドペプチドと組み合わせたＩＬ−４の投与によって誘発されたＩＬ−６産生の実質的な減少は、アルツハイマー病がＩＬ−６産生の増加と相関するので、関連性がある。
【００９７】
(実施例６）
（ヒトの処置）
アルツハイマー病に罹患した個体に、０．０５ｍｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドを、一日１回、１〜２週間、初めに経口投与、または経鼻投与し、最後に患者のサイトカイン応答を、上記ＥＬＩＳＡ技術を用いて測定する。改善が全くが観察されない場合、一日の用量を、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇなど（そしてサイトカイン応答を、毎週または隔週で監視し）効果的な用量を決定するまで、（漸進的に）増加させる。（一日の用量数もまた、投与した抗原の一日の総量の増加のかわりに、または加えてのいずれかで、最高の一日６用量まで漸進的に増加し得る。）いったん効果的な量および投与計画を、この患者について確認すると（数週間を超えない、またはそれより長い治療単位にわたり）、治療を、この量でおよび計画で、利益を享受できる限りは継続する。定期的に、認知能力の試験を、進行の監視のために行う。
【００９８】
（実施例７）
（ヒトにおけるアルツハイマー病の予防）
個体を、アルツハイマー病の個人の家族歴の調査により、そして磁気共鳴分析、ポジトロン放出断層撮影、ＳＰＥＣＴガンマ線カメラ画像診断、および／または、現在入手可能な適切な画像増強剤と共に行う脳の他の画像診断による分析によって、この病気の罹患の危険性を決定した。この様式において、脳におけるアミロイド斑の形成の存在が観察する。さらに、海馬の大きさを測定し、そしてアルツハイマー病の発生において、代表的に見
られる海馬の大きさと比較する。これらの測定は、アルツハイマー病の発症の危険性の増大の適切な予測を与える。
【００９９】
アルツハイマー病の罹患の危険性のある個体に、０．０５ｍｇの［１−４０］β−アミロイドペプチドを、一日１回、１〜２週間、初めに経口投与、または経鼻投与し、最後に患者のサイトカイン応答および抗体応答を、上記ＥＬＩＳＡ技術を用いて測定する。有益な効果が観察されない場合、一日の用量を、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇなど（そしてこの応答を、毎週または隔週で監視し）効果的な用量を決定するまで、（漸進的に）増加する。（一日の用量数もまた、投与した抗原の一日の総量の増加のかわりに、または加えてのいずれかで、一日６用量まで漸進的に増加し得る。）いったん効果的な量および投与計画を、この患者について確認すると（数週間を超えない期間にわたり）、治療を、この量でおよび計画で少なくとも６ヶ月間継続する。定期的に、認知技術の試験を行って、疾患の症状の監視を行った。
【０１００】
本発明は、好ましい実施態様を参照して、上記のように記載されている。種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にあり得ることが理解される。本明細書で参照した全ての論文、特許および特許出願は、それらの全体を参考として援用する。コンフリクトする場合、本発明の定義を包含する本開示が調節する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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