(57)【要約】【課題】チオール基を有する化合物の化学変化の制御、またはタンパク質やペプチド中のシステインの酸化による分子内あるいは分子間のジスルフィド結合の形成に基づく立体構造の安定化を促進することによる、目的物質の収率向上を図る方法を提供する。【解決手段】チオール基を有する化合物にマイクロ波を照射することにより、化合物にジスルフィド結合を形成させる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール基を有する化合物にマイクロ波を照射することにより、前記化合物にジスルフィド結合を形成させる方法。
【請求項２】
前記化合物の分子間および分子内の少なくとも一方で、前記ジスルフィド結合を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物を還元した後に、マイクロ波を照射する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物を溶媒に混合する工程と、
前記溶媒の温度を８５℃以下の状態に保持してマイクロ波を照射する工程と、
を備える請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロ波は、１００ＭＨｚ〜１００ＧＨｚである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記化合物がペプチドまたはタンパク質である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドまたは前記タンパク質は鎖状である請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール基を有する化合物にジスルフィド結合を簡便に形成させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオール基を有する医薬品等有機化合物は、反応性に富み、酸化されることにより構造変化をもたらされることが知られている。また、タンパク質を構成する必須アミノ酸のひとつであるシステインはチオール基を有するため、タンパク質中のシステインが酸化反応によって二量化したシスチンに変化することにより、タンパク質分子内あるいはタンパク質分子間でジスルフィド結合による架橋構造を形成することも知られている。このような架橋構造を形成する過程は、タンパク質やペプチドにおける特定の立体構造の安定化に寄与することから、タンパク質やペプチドを生産する場合にそれらの反応収率に大きく影響する。
【０００３】
これまでに、システインを含めチオール基の酸化を制御する方法として、酸素による酸化、その他の酸化剤を用いた酸化、酵素反応による酸化、保護基の選択的な除去を単独または組み合わせて行われた例がある（たとえば非特許文献１および非特許文献２参照）。
【０００４】
しかしながら、上述の方法では、分子内あるいは／および分子間の複数のチオール基を選択的に酸化させて特定の構造のものを得るために、濃度、ｐＨ、変性剤や安定剤の有無、温度といった条件を網羅的に試行することにより目的物が得られる条件を探すといった過程が必要であった。そして、上述の方法を経てもなお目的とするものが得られないことがあるといった欠点があった。
【０００５】
すなわち、複数のチオール基の酸化速度を調節することにより、チオール基含有化合物の化学変化の過程を制御する、あるいはタンパク質やペプチドの立体構造の形成過程に影響を与えることにより、目的とする物質の収率を高める手段が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，著者  Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ，Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，  出版社  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ｐｐ．３２０−３２２
【非特許文献２】タンパク質のフォールディング  原理・機構・応用、著者  Ｒ．Ｈ．ペイン  編、崎山文夫  監訳、出版社  シュプリンガー・フェアラーク東京、ｐｐ．１１３−１４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、試料中のチオール基含有化合物を短時間で酸化させる方法を考案し、チオール基含有化合物の化学変化の制御、またはタンパク質やペプチド中のシステインの酸化による分子内あるいは分子間のジスルフィド結合形成に基づく立体構造の安定化を促進することによる、目的物質の収率向上を図る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、試料中のチオール基含有物質の酸化過程を制御することにより、目的とする立体構造を選択的に得る合成手段を開発するために鋭意研究を重ね、マイクロ波を照射することによりシステインの酸化によるジスルフィド結合の形成を促進する方法と、それをタンパク質およびペプチドに応用することにより、特定の立体構造を有する物質の収率を高めることが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００９】
本発明は、チオール基を有する化合物にマイクロ波を照射することにより、化合物にジスルフィド結合を形成させる方法に関する。
【００１０】
また、本発明の方法において、化合物の分子間および分子内の少なくとも一方で、ジスルフィド結合を形成させることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の方法において、化合物を還元した後に、マイクロ波を照射することが好ましい。
【００１２】
また、本発明の方法において、化合物を溶媒に混合する工程と、溶媒の温度を８５℃以下の状態に保持してマイクロ波を照射する工程とを備えることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の方法において、マイクロ波は、１００ＭＨｚ〜１００ＧＨｚであることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の方法において、化合物がペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明の方法において、ペプチドまたはタンパク質は鎖状であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
チオール基を有する化合物を短時間で酸化させる方法を考案し、チオール基を有する化合物の化学変化の制御、またはタンパク質やペプチド中のシステインの酸化による分子内あるいは分子間のジスルフィド結合の形成に基づく立体構造の安定化を促進することによる、目的物質の収率向上を図る方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１におけるアミノ酸分析装置（日立Ｌ８８００Ａ）の分析データを示す。
【図２】実施例１、比較例１、比較例２におけるそれぞれの１０試料の分析結果を示す。
【図３】耐熱性エンテロトキシンの一部アミノ酸配列を示す。
【図４】逆相ＨＰＬＣによる分析データを示し、Ａは実施例２におけるＳＴｐ（５−１７）の酸化状態を分析したデータであり、Ｂは比較例３におけるＳＴｐ（５−１７）の酸化状態を分析したデータであり、Ｃは比較例４におけるＳＴｐ（５−１７）の酸化状態を分析したデータである。
【図５】実施例２における酸化型が溶出した画分に対するタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ、島津製作所ＬＣ−ＩＴＴＯＦ質量分析計）測定のデータを示す。
【図６】実施例３において［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）が酸化されているか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認したデータを示す。
【図７】比較例５において［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）が酸化されているか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認したデータを示す。
【図８】実施例３において［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）が酸化されているか、ＬＣ−ＭＳ分析による分子量測定により確認したデータを示す。（Ａ）はｍ（分子量）/ｚ（電荷）が６６６．６８のイオン検出量をｙ軸、逆相ＨＰＬＣの保持時間をｘ軸とするクロマトグラムを示し、（Ｂ）は６６６．６８のイオンピークが検出された測定回の積算により得られた質量分析スペクトラムを示す。
【図９】Ａは実施例３の図８において酸化型［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）に相当するイオン（ｍ（分子量）/ｚ（電荷）が６６６．６８）のうちピークＩに対しタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定を行ったデータを示し、Ｂは開裂パターンから予想されるジスルフィド架橋様式の模式図を示す。
【図１０】Ａは実施例３の図８において酸化型［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）に相当するイオン（ｍ（分子量）/ｚ（電荷）が６６６．６８）のうちピークＩＩに対しタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定を行ったデータを示し、Ｂは開裂パターンから予想されるジスルフィド架橋様式の模式図を示す。
【図１１】Ａは実施例３の図８において酸化型［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）に相当するイオン（ｍ（分子量）/ｚ（電荷）が６６６．６８）のうちピークＩＩＩに対しタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定を行ったデータを示し、Ｂは開裂パターンから予想されるジスルフィド架橋様式の模式図を示す。
【図１２】ラット由来グアニリンのアミノ酸配列を示す。
【図１３】逆相ＨＰＬＣによる分析データを示し、Ａは実施例４におけるグアニリンの酸化状態を分析したデータであり、Ｂは比較例６におけるグアニリンの酸化状態を分析したデータであり、Ｃは比較例７におけるグアニリンの酸化状態を分析したデータである。
【図１４】実施例４においてグアリニンが酸化されているか、ＬＣ−ＭＳ分析による分子量測定により確認したデータとして、ｍ（分子量）/ｚ（電荷）が７５８．２８のイオン検出量をｙ軸、逆相ＨＰＬＣの保持時間をｘ軸とするクロマトグラムを示す。
【図１５】図１４におけるイオンクロマトグラムのピーク群ＡおよびＢを積算した質量スペクトルを示す。
【図１６】４個のシステインを有するグアニリン分子中に生じる、理論的に考えられるジスルフィド結合の架橋様式を示す。
【図１７】Ａは、図１４に示されたピーク群Ａの７５８．４４０４のｍ／ｚ値をもつ２価イオンの開裂様式をタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により求めたデータを示し、Ｂは、グアニリン中のｙ４、ｙ５、ｙ６、ｂ２、ｂ３、ｂ８、ｂ９、ｂ１１の開裂位置を示す模式図である。
【図１８】Ａは、図１４に示されたピーク群Ｂの７５８．４４０４のｍ（分子量）／ｚ（電荷）値をもつ２価イオンの開裂様式をタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により求めたデータを示し、Ｂは、図１４ピーク群Ｂに含まれるペプチドのジスルフィド結合の架橋様式を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、チオール基を有する化合物にマイクロ波を照射することにより、その化合物にジスルフィド結合を形成させる方法に関する。このことは、化合物にマイクロ波を照射することによって、化合物におけるチオール基がエネルギー的に活性化し、近傍に存在する他のチオール基、および溶媒中に存在する酸素分子と反応し、酸化を受け易い状況となる。そして、結果としてジスルフィド結合を生じることができるとの新規の発見に基づく。
【００１９】
マイクロ波による照射は、該化合物が酸素と接触した状態（たとえば大気中）で行なうことが好ましい。これは、化合物にマイクロ波を照射してチオール基を酸化させることでジスルフィド結合を形成させる際に、酸素が酸化剤としての役割を果たすことができるためである。また、酸素と接触した状態でない場合には、公知の酸化剤を該化合物と接触できる状態としてもよい。
【００２０】
また、マイクロ波による照射は、溶液（水分）中で行なうことがなお好ましい。これは、溶媒に化合物が溶解している状態である場合には、自由に動くことができ、化合物が所望の立体構造をとりやすくなるためである。このとき、溶媒は水溶性のものであっても有機溶媒であってもよい。また、本発明において、マイクロ波は該化合物の温度を上昇させるために行なうものではないため、該化合物の温度は８５℃以下で、より好ましくは室温（２５℃）以下で行なうことが好ましい。溶媒は、水性のもののほか、有機溶媒も含む概念とする。ただし、化合物が後述するようなタンパク質である場合には、水性であることが好ましい。それは、有機溶媒中では該タンパク質がその活性を失活してしまう虞があるため、および／または、溶解性が低く析出および凝集してしまう虞があるためである。また、マイクロ波を照射する際に、該溶液はｐＨがアルカリ性側であることが好ましい。これは、溶液のｐＨがアルカリ性側であるとき、マイクロ波の吸収を制御しやすくなり、好ましい条件にシフトできるためである。また、ｐＨや酸素飽和度、溶液中におけるチオール基を有する化合物の濃度を制御することで、分子間におけるジスルフィド結合と分子内におけるジスルフィド結合とを選択的に制御することも可能である。
【００２１】
本発明において、チオール基を有する化合物の分子量は１００，０００程度まで応用することができる。酸化の制御が容易である点では、より分子量が小さい方が好ましい。分子量が大きくなると、チオール基同士の衝突が妨げられ、酸化を制御することが困難になる虞があるためである。
【００２２】
また、本発明において、チオール基を有する化合物は、タンパク質あるいはペプチドであることが好ましい。本発明において、タンパク質は、２０種類の必須アミノ酸からなる、生体における天然の化合物をいうものの他、特定の立体構造を作るものであれば特に限定されない。そして、ペプチドは、必須アミノ酸のみでなく、人工のアミノ酸や、一部非アミノ酸を含むものを含むものとする。
【００２３】
そして、ペプチドはホモメリックペプチドとヘテロメリックペプチドとの双方を含む概念であり、情報伝達、酵素活性阻害、毒性等に関与するペプチドを含むものとし、Ｌ−アミノ酸からなるものだけではなく、Ｄ−アミノ酸からなるものも含むものとする。したがって、具体的には、天然アミノ酸ではない構造（例えばメルカプトヘキサメチレンアミンがＣ末端に付加されてなる化合物、非天然型アミノ酸であるホモシステインが含まれていて、ジスルフィド形成に関与する化合物などを挙げることができる。また、本発明におけるタンパク質およびペプチドは２〜１０００個程度のアミノ酸から形成されるものにまで、応用することができる。
【００２４】
本発明において、ジスルフィド結合は、分子間結合および分子内結合の少なくとも一方を示す。これは、たとえば、化合物において、分子内結合が生じることで、ペプチドやタンパク質のフォールディングが生じたり、分子間結合が生じることで、ペプチドやタンパク質の生理活性の制御等を生じることにも繋がる。
【００２５】
マイクロ波を照射することによって、生体内における安定した立体構造が安定的に形成されるものであって、簡便にしかも、早急に、大量に所望の酸化状態のペプチドを得ることができ、かつ立体構造を制御することができる。また、チオール基を含む医薬品のプロドラッグとしてジスルフィドを含む医薬品が想定される。たとえば、本発明によると、従来の溶存酸素による酸化法では、２０時間程度必要であった反応を２０分程度にまで短縮することができる。
【００２６】
また、化合物は、一度還元された後にマイクロ波を照射することが好ましい。これは、化合物が、望まない架橋等をされているために、所望のジスルフィド結合が生じることを防止するために、一度チオール基を還元することで、その後マイクロ波を照射することで所望のジスルフィド結合を生じさせるためである。還元することによって、タンパク質、ペプチドを鎖状にして、エネルギー的に好ましいフォールディングが生じるように誘導しやすくなる。そして、本発明は、チオール基やジスルフィド結合を含む化合物の構造形成の制御を可能とするものであって、生体内で安定になるコンフォメーションをとることができるものである。
【００２７】
また、本発明において、マイクロ波は、１００ＭＨｚ〜１００ＧＨｚであることが好ましく、１５０ＭＨｚ〜２４ＧＨｚであることが特に好ましい。
【００２８】
また、上述のペプチドまたはタンパク質は鎖状であることが好ましい。鎖状である場合には、立体構造の自由度が大きく、２つのチオール基が衝突する確率が大きくなり、ジスルフィド結合の形成の効率がより高まるといった利点があるためである。
【００２９】
上述のジスルフィド結合は、例えば、ＨＰＬＣによるペプチドマッピング分析やタンデム型質量分析装置を用いたＭＳ／ＭＳ分析、あるいはこれらを組み合わせた方法によって、化合物における形態を確認することができる。
【００３０】
ここで、本願発明によると、マイクロ波照射によって、タンパク質およびペプチドのいわゆる活性型の収量があがることが期待できる。マイクロ波照射によると、化合物における互いに近接した２つ以上のチオール基が酸化反応によりジスルフィド結合を形成しやすくなり、立体構造の形成（フォールディング）が促進される。通常、フォールディングに伴い、該タンパク質の構造はエネルギー的に安定化する。自然界におけるタンパク質のフォールディングにおいては、このエネルギー安定化は最大値を取り、活性型構造は該タンパク質がとりうる構造のなかで熱力学的に最安定であるとみなされる。この最安定構造にいたるためには、チオール基の酸化反応は遅いほうが好ましい。一方、マイクロ波照射により、チオール基の酸化が促進されると、フォールディングの過程で準安定的な必ずしも最安定でない構造が得られやすくなる。これは、完全に最安定な構造にいたる前にジスルフィド結合が形成されてしまうためである。このような、過程で得られる立体構造は、タンパク質を人工的にフォールディングさせるプロセスにより、活性型を得るために有力な解決法を与える。なぜなら、人工的なフォールディングプロセスにより得たいタンパク質・ペプチドの立体構造は、必ずしも最安定構造ではないからである。
【００３１】
例えば、このような方法は、変異型タンパク質・ペプチドをフォールディングさせる場合に有効である。なぜなら、変異型タンパク質・ペプチドは、そのアミノ酸配列の変化により活性型が最安定構造でない場合が多いためである。また、このような変異型タンパク質・ペプチドには、プレプロ配列を含まない天然型タンパク質・ペプチドも含まれる。なぜなら、自然のフォールディング過程ではプレプロ配列がその過程に影響し、活性型構造が得られた後、除去されるメカニズムが働くためである。すなわち、本体部分のみからなるタンパク質・ペプチドの活性型構造は最安定構造でないことがある。このような、タンパク質・ペプチドの本体部分をフォールディングさせ、活性型収量を増大させることに本願発明は有効である。
【００３２】
また、天然型のタンパク質・ペプチドであったとしても、本願発明は有効である。フォールディング過程における中間体は、不安定で凝集しやすいことが知られている。このような凝集が著しいタンパク質・ペプチドにおいては、フォールディングを促進し、短時間で反応を終結させることが、活性型収量の増大につながる。本願発明は、このような凝集しやすいタンパク質・ペプチドの活性型収量を高めるためにも有効である。
【００３３】
また、本発明によると、チオール基を有する化合物の酸化反応を促進することにより、ジスルフィド結合を有する化合物の合成またはタンパク質、ペプチドの立体構造形成（フォールディング）過程を制御する機器、システムの開発においても応用することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
＜実施例１＞  マイクロ波照射によるシステインの酸化効果（分子間のジスルフィド結合）
まず、５００ｎｍｏｌのシステインを、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解してなる試料を調整した。次に、試料に対して２０分間２．４５ＧＨｚのマイクロ波を照射した。その際、マイクロ波を照射することによって試料の温度は上昇したが、８５℃以上にならないようにした。マイクロ波を照射した後の試料に６００ｎｍｏｌのヨードアセトアミドを加えて、酸化されていないシステインをカルボキシアミドメチル化した。カルボキシアミドメチル化することによって、システインのチオール基が空気酸化されることを防止されるため、以下の操作に誤差を与えない。
【００３６】
アミノ酸分析装置（日立Ｌ８８００Ａ）により、還元型システイン（カルボキシアミドメチル化システイン）および酸化型システイン（シスチン）を定量した。このアミノ酸分析装置によると、アミノ酸分離用イオン交換クロマトグラフィーカラムに通して、還元型システインおよび酸化型システイン（シスチン）を溶出することができ、溶出された還元型システインおよび酸化型システインをニンヒドリンにより発色させて計測されるピーク面積の値により酸化率を求めることができる。あらかじめ、アミノ酸分離用イオン交換クロマトグラフィーカラムに還元型システインと酸化型システインを通して、還元型システインは保持時間６分付近に溶出され、酸化型システインは保持時間１４分付近に溶出されることを確認した。
【００３７】
そして、還元型システインとは、マイクロ波照射によって酸化されなかったシステインを示し、酸化型システイン（シスチン）とは、マイクロ波照射によって酸化されたシステインを示す。そして、酸化型システイン量／（還元型システイン＋酸化型システイン）量を酸化率と定義し、酸化率を求めた。なお、上記一連の操作を別個に独立して１０回行なった。
【００３８】
＜比較例１＞  未処理システインの酸化
５００ｎｍｏｌのシステインを、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解してなる試料を調整した。次に試料を２０分間２５℃（室温）で保持し、続けて６００ｎｍｏｌのヨードアセトアミドを加えて酸化されていないシステインをカルボキシアミドメチル化した。
【００３９】
そして、試料についてアミノ酸分析装置（日立Ｌ８８００Ａ）により、還元型システイン（カルボキシアミドメチル化システイン）および酸化型システイン（シスチン）を定量した。なお、上記一連の操作を別個に独立して１０回行ない、１０試料得た。
【００４０】
＜比較例２＞  通常加熱によるシステインの酸化
５００ｎｍｏｌのシステインを、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解してなる試料を調整した。次に試料を恒温層に静置することによって、２０分間、８５℃の状態で維持された。
【００４１】
そして、試料についてアミノ酸分析装置（日立Ｌ８８００Ａ）により、還元型システイン（カルボキシアミドメチル化システイン）および酸化型システイン（シスチン）を定量した。なお、上記一連の操作を別個に独立して１０回行ない、１０試料得た。
【００４２】
≪結果検討１≫
図１は、実施例１におけるアミノ酸分析装置（日立Ｌ８８００Ａ）の分析データを示す。図２は、実施例１、比較例１、比較例２におけるそれぞれの１０試料の分析結果を示す。
【００４３】
まず、図１について説明する。図１の横軸は試料がアミノ酸分離用イオン交換クロマトグラフィーカラムに通されてからの保持時間（分）を示し、縦軸はニンヒドリンの発色の信号強度（ｍＶ）を示す。上述したとおり、還元型システインは保持時間６分付近に溶出され、酸化型システインは保持時間１４分付近に溶出された。そして、ピーク面積の値を計算して酸化率を求めることができた。
【００４４】
次に、図２について説明する。図２の縦軸は酸化率（％）を示す。図２によると、比較例１における１０試料は、ほぼ酸化が生じていなかった。また、比較例２における１０試料は、酸化率はいずれも６％以下であった。一方、実施例１における１０試料のうち５試料について酸化率が１０％以上であった。また、実施例１における１０試料のうち、酸化率の最大値は３３％だった。
【００４５】
以上から、本発明に係るマイクロ波照射によって、チオール基が効率よく酸化されていることが分かった。
【００４６】
＜実施例２＞  チオール基を含有するペプチドへのマイクロ波照射による迅速酸化（分子内ジスルフィド結合）
図３は、耐熱性エンテロトキシンの一部配列を示す。以下、図３に基づいて説明する。本実施例においては、システインを含有するペプチドの代表例として毒素原生大腸菌の産生する耐熱性エンテロトキシンの一部配列（ＳＴｐ（５−１７）：アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号１））を化学合成した。なお、ＳＴｐ（５−１７）（配列番号１）配列のペプチドは、チオール基が図３に示す組み合わせの架橋様式をとった際にのみ毒性を有する構造となることが知られており、図３に示す組み合わせの架橋様式を有するペプチドを以下、活性型ペプチドと呼ぶ。なお、自然界に存在する（天然である）耐熱性エンテロトキシンにおけるＳＴｐ（５−１７）は、図３に示す組み合わせの架橋様式を有することが知られている。
【００４７】
まず、３０ｎｍｏｌのＳＴｐ（５−１７）を、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５）に溶解し、ただちに２．４５ＧＨｚのマイクロ波を２０分間照射した。その際、マイクロ波を照射することによってＳＴｐ（５−１７）の温度は上昇したが、８５℃以上にならないようにした。次に、ＳＴｐ（５−１７）に対して２００ｎｍｏｌのヨードアセトアミドを加えて、酸化されていないシステインをカルボキシアミドメチル化した。以下、酸化されているＳＴｐ（５−１７）を酸化型とよび、酸化されていないＳＴｐ（５−１７）を還元型とよぶ。
【００４８】
そして、上記操作したＳＴｐ（５−１７）が酸化されているか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認した。ＨＰＬＣ分析にはＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ＡＲ−ＩＩ5Ｃ18、４．６×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を装備したＨＰＬＣシステム（ギルソン社製）を用い、２２０ｎｍ波長の紫外吸収を測定することにより溶出ピークを検出した。
【００４９】
次に溶出ピークを示した画分の検体を採取し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定による精密質量値およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により該検体の構造を同定した。
【００５０】
＜比較例３＞
まず、３０ｎｍｏｌのＳＴｐ（５−１７）を、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し一本鎖の状態にして、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５）に溶解した。そして、実施例２におけるマイクロ波を２０分間照射する代わりに、ＳＴｐ（５−１７）を２０分間室温（２５℃）で保持した。あとの操作は、実施例２と同様とした。
【００５１】
＜比較例４＞  システインを含有するペプチドの通常加熱処理による影響の確認
まず、３０ｎｍｏｌのＳＴｐ（５−１７）を、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し一本鎖の状態にして、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５）に溶解した。そして、実施例２におけるマイクロ波を２０分間照射する代わりに、恒温槽に静置することによって、ＳＴｐ（５−１７）が２０分間、８５℃の状態で維持された。あとは、実施例２と同様に操作した。
【００５２】
≪結果検討２≫
液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定により酸化型は、２価イオンにおいてｍ（分子量）／ｚ（電荷）の測定値が６４２．１８を示し、還元型はシステインがヨードアセトアミドと反応するためにｍ／ｚの測定値が８１６．２７を示すことから、逆相ＨＰＬＣにより溶出されるピークに含まれるペプチドを同定した。なお、酸化型のＳＴｐ（５−１７）の２価イオンのｍ／ｚの期待値は６４２．１９１９である。
【００５３】
図４Ａ〜Ｃは、逆相ＨＰＬＣによる分析データを示す。図４Ａは実施例２におけるＳＴｐ（５−１７）の酸化状態を分析したデータであり、図４Ｂは比較例３におけるＳＴｐ（５−１７）の酸化状態を分析したデータであり、図４Ｃは比較例４におけるＳＴｐ（５−１７）の酸化状態を分析したデータである。図４Ａ〜図４Ｃの横軸はＳＴｐ（５−１７）を含む試料がＯＤＳカラムに通されてからの保持時間（分）を示し、縦軸は２２０ｎｍ波長の紫外吸収を示す。還元型は保持時間８分付近に溶出され、酸化型は保持時間１３分付近に溶出された。
【００５４】
図４に示すように、実施例２においては、酸化型のＳＴｐ（５−１７）が主に検出され、還元型がほとんど検出されなかった。一方、比較例３および比較例４においては還元型のＳＴｐ（５−１７）が主に検出され、酸化型がほとんど検出されなかった。図４Ｃにおける還元型のピーク面積を１００％としたときの図４Ａにおける酸化型のピークの相対面積は、２１．５％であった。また、図４Ｃにおける還元型のピーク面積を１００％としたときの図４Ｂにおける酸化型は０％であり、還元型は実験誤差範囲内で図４Ｃと変わらなかった。
【００５５】
図５は、実施例２における酸化型が溶出した画分に対するタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定のデータを示す。図５は、横軸はｍ（分子量）／ｚ（電荷）を示し、縦軸は検出されたイオン量を示す質量スペクトラムである。図５Ａは、内部において開裂させていない検出イオンの質量スペクトラムを示す。ｍ／ｚの測定値が６４２．１７７０の２価イオンが顕著に認められ、この値は該ペプチドの酸化型における期待値（６４２．１９１９）とよく一致する。
【００５６】
この検出イオンを内部において開裂させることによりＭＳ／ＭＳ測定した結果を図５Ｂに示す。この質量スペクトラムにおいて６３４．０９８、６２０．６６５、６０７．６５１といった２価イオンが観測された。これらのイオンは、親イオンである６４２．１７７０の２価イオンから、水素原子、酸素原子、窒素原子、水酸基、アミノ基などが末端から解離したイオン種であり、その一方で、ペプチド分子の中央部から開裂したイオン種が認められない。このことから、分子内のジスルフィド結合が開裂を阻害していることが読み取れ、図５Ｂに示す開裂状態が図３に示したような入れ子型のジスルフィド結合構造を反映していることが読み取れた。
【００５７】
そして、図５Ｃは、還元型から空気酸化により生成させた該ペプチドの酸化型をＭＳ／ＭＳ測定した結果を示している。その開裂により生じる質量スペクトラムは、図５Ｂと各ピークの強度の差こそあれ同様の傾向を示すものである。この空気酸化により得られる酸化型のジスルフィド結合の架橋様式は天然のＳＴｐ（５−１７）と同一であることが知られている。結果として、実施例２において検出された酸化型は、図３に示す架橋構造を有する天然のＳＴｐ（５−１７）と同一であることが分かった。
【００５８】
以上の結果により、マイクロ波照射により迅速にシステインの酸化反応が起こり、活性型ペプチドが主生成物として得られたことがわかった。
【００５９】
＜実施例３＞  チオール基を含有するペプチドへのマイクロ波照射による活性型生成比率の改善効果
システインを含有するペプチドの代表例である毒素原生大腸菌の産生する耐熱性エンテロトキシンにおいて、１アミノ酸置換（１１位ＡｓｎがＴｙｒに置換された変異型）を含む一部配列を化学合成し（［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）：アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）の酸化効率について調べることにした。この［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）は、活性型へのフォールディング効率が悪く、酸化反応を経て主に３種類の異なるシステイン架橋様式を持つ異性体を生成することが知られている。したがって、［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）は、マイクロ波照射による活性型へのフォールディング効率も合わせて検討した。
【００６０】
まず、３０ｎｍｏｌの［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）を、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５）に溶解し、ただちに２．４５ＧＨｚのマイクロ波を２０分間照射した。その際、マイクロ波を照射することによってＳＴｐ（５−１７）の温度は上昇したが、８５℃以上にならないようにした。次に、ＳＴｐ（５−１７）に対して２００ｎｍｏｌのヨードアセトアミドを加えて、酸化されていないシステインをカルボキシアミドメチル化した。以下、酸化されている［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）を酸化型［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）とよび、酸化されていない［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）を還元型［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）とよぶ。
【００６１】
そして、上記操作した［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）が酸化型であるか還元型であるか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認した。ＨＰＬＣ分析にはＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ＡＲ−ＩＩ  ５Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を装備したＨＰＬＣシステム（ギルソン社製）を用い、２２０ｎｍ波長の紫外吸収を測定することにより溶出ピークを検出した。
【００６２】
次に溶出ピークを示した画分の検体を採取し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定による精密質量値およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により該検体の構造を同定した。
【００６３】
＜比較例５＞  システインを含有するペプチドの空気酸化による活性型生成比率
ペプチドの空気酸化については、従来法として、固相法により合成されたペプチドを脱保護し、溶媒中に遊離させ、これをｐＨ８程度の水溶液に希釈し、４８時間程度攪拌することにより、システインを自然酸化させ、酸化型システイン（シスチン）に変換する方法が知られている。この方法により［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）に含有されるシステインを酸化させることを試みた。
【００６４】
Ｆｍｏｃ固相合成により合成した［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）担持樹脂２１．４ｍｇをトリフルオロ酢酸で処理して、遊離した５ｍｍｏｌの［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）を１ｍｌの３０％酢酸に抽出した。３０％酢酸に抽出してなる試料を１００ｍｌの水に希釈し、アンモニア水を加えてｐＨ８．０にした。そして、この試料を４８時間攪拌したのち、逆相ＨＰＬＣにより、上述の酸化反応を経て主に３種類の異なるシステイン架橋様式を持つ異性体の生成比率を求めた。
【００６５】
<<結果検討３>>
図６は、実施例３において［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）が酸化されているか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認したデータを示す。逆相ＨＰＬＣ分析の条件は上述の実施例２の場合と同様とした。実施例３において［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）にマイクロ波を照射することで、構造異性体として主に３種類（ＨＰＬＣの溶出ピークとして３本）が認められた。この生成比率は、図６においてＩ：３７．９％、ＩＩ：３２．１％、ＩＩＩ：３０．０％の比率であった。
【００６６】
図７は、比較例５において［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）が酸化されているか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認したデータを示す。逆相ＨＰＬＣ分析の条件は上述の実施例２の場合と同様とした。比較例５において、［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）を従来法に従って空気酸化することで、構造異性体として主に３種類（ＨＰＬＣの溶出ピークとして３本）が認められた。この生成比率は、図７においてＩ：３２．６％、ＩＩ：４１．６％、ＩＩＩ：２５．８％の比率であった。
【００６７】
この実施例３と比較例５との結果の比較により、マイクロ波照射によりＩおよびＩＩＩの構造異性体の生成比率が増大することがわかった。
【００６８】
図８〜図１１は、図６における溶出ピークを示した画分の検体を採取し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定による精密質量値およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により該検体の構造を同定したデータである。
【００６９】
図８Ａは、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定において、［Ｔｙｒ11］ＳＴｐ（５−１７）の酸化型分子量の期待値である６６６．７０のｍ（分子量）／ｚ（電荷）値をもつ２価イオンの検出量により示したクロマトグラムである。図８Ｂは、図８ＡにおけるイオンクロマトグラムのピークＩ、ＩＩ、ＩＩＩを積算した質量スペクトルであり、該ペプチドの期待値とよく一致する６６６．６８３９のｍ／ｚ値をもつ２価イオンが顕著に検出されたことを示すデータである。なお、図８ＡにおけるイオンクロマトグラムのピークＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、図６および７に示されたＨＰＬＣクロマトグラムに示されたピークＩ、ＩＩ、ＩＩＩと同一のものである。
【００７０】
図９Ａは、図８Ａに示されたピークＩの６６６．６８３９のｍ／ｚ値をもつ２価イオンの開裂様式をＭＳ／ＭＳ測定により求めた結果である。この測定結果の質量スペクトラム中で、３５１．０８１８、４２２．１２１４、５１９．１７５の開裂イオンは、それぞれｙ４、ｙ５、ｙ６の期待値と一致した（開裂イオンの略号の意味については次の文献を参照。Biomedical Mass Spectrometry (1984) 11:601, Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Roepstorff P, Fohlman J.）。図９Ｂの模式図は、該ペプチド中のｙ４、ｙ５、ｙ６イオンの開裂位置を示しており、この位置で開裂が観察されることは、ピークＩ画分に含まれる該ペプチドが必然的に図９Ｂの模式図に示されるジスルフィド結合の架橋様式であることを示す。
【００７１】
図１０Ａは、図８Ａに示されたピークＩＩの６６６．６８３９のｍ（分子量）／ｚ（電荷）値をもつ２価イオンの開裂様式をＭＳ／ＭＳ測定により求めた結果である。この測定結果の質量スペクトラム中で、３５１．０８１８、５１９．１７５の開裂イオンは、それぞれｙ４、ｙ６の期待値と一致した。図１０Ｂの模式図は、該ペプチド中のｙ４、ｙ６イオンの開裂位置を示しており、この位置で開裂が観察されることは、ピークＩＩ画分に含まれる該ペプチドが必然的に図１０Ｂの模式図に示されるジスルフィド結合の架橋様式であることを示す。
【００７２】
図１１Ａは、図８Ａに示されたピークＩＩＩの６６６．６８３９のｍ（分子量）／ｚ（電荷）値をもつ２価イオンの開裂様式をＭＳ／ＭＳ測定により求めた結果である。この測定結果の質量スペクトラム中で、分子中央部で開裂した分子種に由来するイオンピークは観察されず、図５Ｂに示したような天然型のジスルフィド結合の架橋様式をもつペプチドから得られるＭＳ／ＭＳスペクトラムに類似していた。このことは、ピークＩＩＩ画分に含まれる該ペプチドが必然的に図１１Ｂの模式図に示されるジスルフィド結合の架橋様式であることを示す。
【００７３】
図８〜図１１から、ＬＣ質量分析による精密質量値およびＭＳ／ＭＳ測定の結果により、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの構造異性体のうち、天然のシステイン架橋構造（活性型）であるのはＩＩＩであることがわかった。従来法である自然酸化法と比較して、マイクロ波照射による酸化では、活性型ＩＩＩの生成比率が２５．８％（比較例５）から３０．０％（実施例３）に変化した。すなわち生成量において１６％向上したことがわかった。
【００７４】
＜実施例４＞
本実施例では、システイン（チオール基）を含有する難溶性ペプチドの一例として、グアニリンにマイクロ波を照射することにより、ジスルフィド結合を形成させた。ラットの腸管から単離されたホルモンであるグアニリンは、システインを４個含み、これらが架橋して２本の分子内ジスルフィド結合を形成することによりフォールディングを達成する。図１２にグアニリンのアミノ酸配列（グアニリン：アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ―Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（配列番号３））を示す。図中の線は架橋状態（分子内ジスルフィド結合）を示す。
【００７５】
該ペプチドを化学合成により直鎖状の還元型を作成し、空気酸化により２本の分子内ジスルフィド結合を形成させようとしても、難溶性であるためにたちまち凝集して、目的とする酸化型が得られないことが知られている。従来は、これを回避するために、２段階のジスルフィド結合の形成により、１本ずつジスルフィド結合を形成させていたため、コストを要した。
【００７６】
本実施例では、ラット由来グアニリンを化学合成し、マイクロ波を照射することによる酸化効率について調べることにした。
【００７７】
まず、３０ｎｍｏｌのグアニリンを、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、ただちに２．４５ＧＨｚのマイクロ波を２０分間照射した。その際、マイクロ波を照射することによってグアニリンの温度は上昇したが、８５℃以上にならないようにした。次に、グアニリンに対して２００ｎｍｏｌのヨードアセトアミドを加えて、酸化されていないシステインをカルボキシアミドメチル化した。以下、酸化されているグアニリンを酸化型グアニリンとよび、酸化されていないグアニリンを還元型グアニリンとよぶ。
【００７８】
＜比較例６＞  システインを含有する難溶性ペプチドの通常加熱処理による影響の確認
まず、３０ｎｍｏｌのグアニリンを、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し一本鎖の状態にして、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）に溶解した。そして、実施例４におけるマイクロ波を２０分間照射する代わりに、恒温槽に静置することによって、グアニリンが２０分間、８５℃の状態で維持された。あとは、実施例４と同様に操作した。
【００７９】
＜比較例７＞
まず、３０ｎｍｏｌのグアニリンを、１５０ｎｍｏｌのジチオスレイトールで還元し一本鎖の状態にして、５００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）に溶解した。そして、実施例２におけるマイクロ波を２０分間照射する代わりに、グアニリンを２０分間室温（２５℃）で保持した。あとの操作は、実施例４と同様とした。
【００８０】
<<結果検討４>>
上記実施例４および比較例６、７で操作したグアニリンが酸化型であるか還元型であるか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認した。ＨＰＬＣ分析にはＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ＡＲ−ＩＩ  ５Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を装備したＨＰＬＣシステム（ギルソン社製）を用い、２２０ｎｍ波長の紫外吸収を測定することにより溶出ピークを検出した。結果を図１３に示す。
【００８１】
図１３Ａは、実施例４においてグアニリンが酸化されているか、逆相ＨＰＬＣ分析により確認したデータを示す。逆相ＨＰＬＣ分析の条件は上述の実施例２の場合と同様とした。実施例４において還元型グアニリンにマイクロ波を照射することで、構造異性体として複数の分子種が認められた。
【００８２】
一方、図１３ＢおよびＣに示すように、比較例６、７においては、還元型および酸化型のグアニリンのいずれもがほとんど検出されなかった。これは、難溶性ペプチドである該ペプチドが、操作の過程で凝集沈殿してしまったためと考えられた。
【００８３】
次に溶出ピークを示した画分の検体を採取し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定による精密質量値およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により該検体の構造を同定した。図１４、１５、１７Ａ、１８Ａは、図１３Ａにおける実施例４のマイクロ波処理により得られた溶出ピークを含む検体を採取し、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定による精密質量値およびタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）測定により該検体の構造を同定したデータである。
【００８４】
図１４は、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定において、グアニリンの酸化型分子量の期待値である７５８．２８０６のｍ／ｚ値をもつ２価イオンの検出量を示したイオンクロマトグラムである。複数のピークが認められることから、同じ分子量を持ち、ジスルフィド結合の架橋様式の異なる構造異性体が複数生成していることが示された。図１５は、図１４におけるイオンクロマトグラムのピーク群ＡおよびＢを積算した質量スペクトルであり、グアニリンの期待値とよく一致する７５８．４４０４のｍ／ｚ値をもつ２価イオンが顕著に検出されたことを示すデータである。
【００８５】
図１６は、４個のシステインを有するグアニリン分子中に生じる、理論的に考えられるジスルフィド結合の架橋様式を示す。図１６Ａに示す架橋様式Ａはジスルフィド結合が両末端に限定されており、一方図１６Ｂに示す架橋様式Ｂはジスルフィド結合が入れ子型になっている。天然型のグアニリンは架橋様式Ｂに含まれる。
【００８６】
図１７Ａは、図１４に示されたピーク群Ａの７５８．４４０４のｍ／ｚ値をもつ２価イオンの開裂様式をＭＳ／ＭＳ測定により求めた結果である。この測定結果の質量スペクトラム中で、３８１．１３４１、４５２．１８０３、５２３．２３５９、８３０．４１２６、９９３．５５０９、１１３６．５９５２の開裂イオンは、それぞれｙ４、ｙ５、ｙ６、ｂ８、ｂ９、ｂ１１の期待値と一致した。図１７Ｂの模式図は、該ペプチド中のｙ４、ｙ５、ｙ６、ｂ８、ｂ９、ｂ１１の開裂位置を示しており、この位置で開裂が観察されることは、ピーク群Ａに含まれる該ペプチドが必然的に図１７Ｂの模式図に示されるジスルフィド結合の架橋様式であることを示す。
【００８７】
図１８Ａは、図１４に示されたピークＢ群の７５８．４４０４のｍ（分子量）／ｚ（電荷）値をもつ２価イオンの開裂様式をＭＳ／ＭＳ測定により求めた結果である。この測定結果の質量スペクトラム中で、１２１．１３６６、２１２．１３４８、３１３．１９５９、１２０３．６０５５の開裂イオンは、それぞれｙ１、ｂ２、ｂ３、ｙ１２の期待値と一致した。一方で、図１７Ａにおいてピーク群Ａに含まれる該ペプチドのＭＳ／ＭＳ測定で観察されたｙ４、ｙ５、ｙ６、ｂ８、ｂ９、ｂ１１といったイオンは観察されなかった。図１８Ｂの模式図は、該ペプチド中のｙ１、ｂ２、ｂ３、ｙ１２イオンの開裂位置を示しており、この位置で開裂が観察されることは、図１４のピーク群Ｂに含まれる該ペプチドが必然的に図１８Ｂの模式図に示されるジスルフィド結合の架橋様式であることを示す。
【００８８】
図１３〜図１８に示す結果から、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）測定による精密質量値およびＭＳ／ＭＳ測定の結果により、マイクロ波照射によってのみ生じたグアニリンの構造異性体は、天然のジスルフィド結合の架橋構造（活性型）と非天然型のジスルフィド結合による架橋構造の両方が含まれる混合物として得られることが示された。一方、通常の加熱あるいは室温においた還元型グアニリンは、ただちに凝集して回収できなくなることが示された。
【００８９】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図１】
2010215537.tif 000002
【図２】
2010215537.tif 000003
【図３】
2010215537.tif 000004
【図４】
2010215537.tif 000005
【図５】
2010215537.tif 000006
【図６】
2010215537.tif 000007
【図７】
2010215537.tif 000008
【図８】
2010215537.tif 000009
【図９】
2010215537.tif 000010
【図１０】
2010215537.tif 000011
【図１１】
2010215537.tif 000012
【図１２】
2010215537.tif 000013
【図１３】
2010215537.tif 000014
【図１４】
2010215537.tif 000015
【図１５】
2010215537.tif 000016
【図１６】
2010215537.tif 000017
【図１７】
2010215537.tif 000018
【図１８】
2010215537.tif 000019
【配列表】
2010215537000001.app