(57)【要約】【課題】本発明は、長期保存においても精子活性が維持され、安全かつ低価格で、作業性のよい、新たな精子活性化剤、精子活性化方法を提供する。【解決手段】上記課題を解決するために、本発明は、プロタミンが、プロタミン硫酸塩として、精液希釈後の溶液中で０．１ｇ〜０．５ｇ／Ｌの範囲で含まれことを特徴とする前記精子活性化剤の構成とした。また、プロタミンをプロタミン硫酸塩として、精液希釈後の溶液中で０．１ｇ〜０．５ｇ／Ｌの範囲になるよう精液に添加することを特徴とする精子活性化方法の構成とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロタミンを含むことを特徴とする精子活性化剤。
【請求項２】
前記プロタミンが、プロタミン硫酸塩として、精液希釈後の溶液中で、０．１ｇ〜０．５ｇ／Ｌの範囲で含まれことを特徴とする請求項１に記載の精子活性化剤。
【請求項３】
前記精子が、豚の精子であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の精子活性化剤。
【請求項４】
プロタミンを精液に添加し、精子べん毛運動活性を上げることを特徴とする精子活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精子の希釈液中でのべん毛運動活性を上げる精子活性化剤及びべん毛運動活性を上げる精子活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に家畜の精液は希釈され、低温或いは凍結して流通している。豚の精液の希釈液として、「モデナ液（商品名）」、「アンドロヘップ溶液」などが知られている。これら希釈保存溶液は、中温域希釈保存液であり、１６℃前後で、数日間豚精液を希釈保存することができる。
【０００３】
従来の体外受精方法においては、精子の受精能獲得を誘起し、その生存性を高めるために、ヘパリン、テオフィリン等の試薬が添加されている。また、酸化ストレスが精子の活性に与える影響を解明した上で、安全性が高い有効成分からなり、操作上の問題点もなく、且つ効率良く哺乳動物の精子を活性化する活性化剤及び活性化方法として、特許文献１が公開されている。
【０００４】
特許文献１は、カテキンを含有することを特徴とする哺乳動物の精子の活性化剤、並びに、哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加えることを特徴とする哺乳動物の精子の活性化方法。また、哺乳動物の精子がウシ精子又はブタ精子であることを特徴とする。
【０００５】
特許文献１に係る発明によれば、哺乳動物の精子が活性化する際に、過剰に存在すると阻害的な働きをする活性酸素をカテキンが除去するため、効率良く活性化することができる。このカテキンは、食品の一種である緑茶由来成分であることから、安全性も保証されている。しかも、本発明によれば、カテキン１種類のみを有効成分とするので、操作上の問題点もない。このような本発明により活性化された精子は、人工授精及び体外受精のいずれにも利用することができる。従って、本発明は、畜産業、再生医療をはじめとする哺乳動物の生殖に関するあらゆる分野で有用であるとされる。
【特許文献１】特開２００５−２１３１４７号公報
【０００６】
その他、精子の運動性を高める新しい精子活性化剤として、特許文献２が公開されている。特許文献２の精子活性化剤は、精巣特異的なサクシニールCoA転移酵素（SCOT-t）および／またはその脂質代謝産物であるケトン体の薬効量を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００７】
特許文献２に係る発明によれば、受精時の精子の生理学的機能では、受精能獲得と活発な精子運動性（超活性化）が最も重要である。第1発明および第2発明の精子活性化剤は、精子運動能、特に精子の超活性化に強く作用することによって受精を促進する。ヒトおよび有用動物の受精・妊娠促進剤として、あるいはヒト男性不妊症の治療薬剤として有用である。また、ヒトおよび有用動物の体外受精時や人工授精時における受精促進剤としても有用である。なお、この精子活性化剤の有効成分であるSCOT-tおよびケトン体はヒトおよび動物体内に内在的に存在する物質であり、安全性には全く問題はないとされる。
【特許文献２】特開２００５−２５５６７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記精子活性化剤及び活性化方法以外、余り知られていない。そこで、本発明は、長期保存においても精子活性が維持され、安全かつ低価格で、作業性のよい、新たな精子活性化剤、精子活性化方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の課題を解決するために、プロタミンを含むことを特徴とする精子活性化剤とした。さらには、前記プロタミンが、プロタミン硫酸塩として、精液希釈後の溶液中で、０．１ｇ〜０．５ｇ／Ｌの範囲で含まれことを特徴とする前記精子活性化剤の構成、また、前記精子が、豚の精子であることを特徴とする前記記載の精子活性化剤の構成とした。
【００１０】
加えて、プロタミンを精液に添加し、精子べん毛運動活性を上げることを特徴とする精子活性化方法の構成とした。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、プロタミンを精液希釈液に添加することで、精子運動活性を高めることができる。よって、受精率をさらに高めることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
長期保存においても精子活性が維持され、安全かつ低価格で、作業性のよい、新たな精子活性化剤、精子活性化方法を提供する目的を、プロタミンが、プロタミン硫酸塩として、精液希釈後の溶液中で０．１ｇ〜０．５ｇ／Ｌの範囲で含まれことを特徴とする前記精子活性化剤の構成とした。また、プロタミンをプロタミン硫酸塩として、精液希釈後の溶液中で０．１ｇ〜０．５ｇ／Ｌの範囲になるよう精液に添加することを特徴とする精子活性化方法の構成とすることで実現した。
【実施例１】
【００１３】
以下、添付図面に基づき、本発明である精子活性化剤及び精子活性化方法について詳細に説明する。
【００１４】
図１は、実施例１の試験区における希釈液への添加物及びその添加量を示す表である。精子の活性化を比較するため、希釈液であるモデナ液（ｍ）、アンドロヘプ液（ａ）に図１に記載の添加物を、記載の添加量を添加して、顕微鏡下で観察した。
【００１５】
［被験体］
全国農業協同組合連合会  種豚開発センター繁殖豚舎所有の豚（デュロック種）９頭の精液を使用した。試験の都度、採取固体を変更し、計９回試験を行った。
【００１６】
［希釈液］
１、モデナ液（ｍ）
組成：グルコース５．５０、クエン酸ＮＡ１．３８、重曹０．２０、ＥＤＴＡ０．４７、クエン酸０．５８、トリス１．１３（ｇ／２００ｍｌ）。
２、アンドロヘップ液（ａ）／ミニチューブ社製
【００１７】
これら希釈液を図１記載の添加物の溶媒とし、図１に記載の添加物の添加し、採取した精液の所定の濃度に希釈する希釈液とした。
【００１８】
［添加物］
プロタミンは、プロタミン硫酸塩（鮭製）／キシダ化学(株)特級／ＴＣＩ０２１２８５を使用した。なお、物質Ａ、物質Ｂは、以後の統計処理の精度を上げるため用いたもので、具体的な説明は省略する。以下、プロタミン硫酸塩を含め単に、「プロタミン」という。
【００１９】
ここで、プロタミンとは、精子核タンパク質の１種であり、精子形成過程において非常に重要な役割を果たしている。精原細胞から精子が形成される過程の中で最終段階である成熟段階において、精子核タンパク質がヒストンからプロタミンに置換される。
【００２０】
プロタミンは、ＤＮＡと結合し、プロタミン分子間にジスルフィド結合を形成する。この結合により精子のＤＮＡが束ねられるためＤＮＡは極めてコンパクトな形態を取る。この現象は精子核の凝縮と呼ばれており、精子形成には必須の過程である。他方、成熟精子のプロタミンとＤＮＡ間のジスルフィド結合は、精子形成直後と比較して減少することが報告されている（Zubkova
EV, Wade M, Robaire B,Fertil steril 2005 Oct;84 Suppl 2:1191-8「Changes in spermatozoal chromatin packaging and
susceptibility to oxidative challenge during aging.」）。
【００２１】
このジスルフィド結合の減少により精子は酸化によるダメージに対し脆弱になることが推測される。従って、精子の運動能力の低下、生存率の低下等が発生するものと考えられる。しかしながら、精子活性化を目的として、プロタミンを成熟精子に添加する技術、その影響は知られていない。なお、本発明は、精子形成終了後の成熟精子に対し、プロタミンを添加するものであって、上記精子核の凝集に関与するものではない。
【００２２】
［試験方法］
・希釈精液の調整
採取した精液及び上記希釈液は、３７℃の恒温水槽でインキュベートし、温度を調整後、精子が約5億／ｍｌの濃度になるように精液を図１に記載の各希釈液で希釈した。
・希釈精液の保管
調整した希釈精液は、１〜２時間室温で放置後、１６℃に保持したインキュベーター内で、１０日間保存した。
【００２３】
［精子活性の評価］
精液の採取日を０日とし、０、１、４、７、１０日後に、その一部を用いて精子の運動性の評価を行った。評価は、４００倍の倒立顕微鏡で、精子を目視し、図２に示した得点表を用いて、精子運動を点数化した。
【００２４】
図２は、実施例１における精子運動を点数化するための基準テーブルである。「精子の活性基準」は、一般的な精子運動の評価であり、＋＋＋〜＋、±、−の５段階評価である。「運動得点」が、今回の評価点数であり、１０段階評価とした。図２の左右の「精子の活性基準」と「運動得点」が対応し、例えば、従来の＋＋＋に相当するものを９とし、＋＋に相当するものを７とした。今回、精子運動をより詳細に分類した。
【００２５】
［観察結果及び検定］
図３は、モデナ液中での精子運動の観測結果及び検定結果である。図３（Ａ）が、上記評価を９回繰り返したときの各試験区の運動得点の中央値の推移グラフである。図３（Ｂ）が、中央値である。
【００２６】
プロタミン添加区（６ｍ区、７ｍ）では、１０日目までのいずれの観察日においても、添加物無添加のモデナ液（１ｍ区／−▲−）中の精子に比べ、図２の得点表に基づく、平均運動得点は、大きく上回っていた。特に、プロタミン０．５ｇ／Ｌ添加区（７ｍ区）では、無添加区（１ｍ区）よりも非常に運動性が高い様子が観察された。物質Ａ、Ｂ添加区では、７日目までは同等以上あった。但し、全般に、プロタミン添加区ほどの活性は確認できなかった。
【００２７】
図３（C）が、モデナ液で希釈した希釈精液中の精子の運動得点の中央値のフリードマン検定の結果である。
【００２８】
本発明では、モデナ液で希釈した希釈精液にプロタミンもしくは物質Ａ、Ｂをそれぞれ添加することにより、各調査日（希釈0、１、４、７、１０日後）における精子の運動得点に差が生じるかを検定した。
【００２９】
ここで、運動得点は、目視により評価であるため、実際の精子の運動性と上記評価の運動得点表の間に誤差が生じている可能性もある。また、精子の活性は採取した雄豚により個体差が生じるため、運動得点の値による比較では個体差を考慮できない可能性が高い。そのため、フリードマン検定を用いて検定を行った。
【００３０】
フリードマン検定とはノンパラメトリック２元分散分析による検定方法であり、いくつかの群（通常ブロックと呼ばれる）のそれぞれに特定の処理を与えたときの反応を解析するものである。また、フリードマン検定ではブロック内の順位に基づいて検定する方法である。
【００３１】
本発明では精液を採取した雄をブロックとし、精子の運動得点のブロック内順位を比較している。さらに、運動得点のブロック内順位において同順位が発生した場合、同順位の平均を求め、その平均を順位とする調整済み順位を用いて検定を行った。
【００３２】
ボールド文字ｐ値は有意差があること、下線付ｐ値は有意な傾向であることを示す。即ち、１日目、４日目においては有意差があり、０日目においては有意な傾向であった。
【００３３】
図４は、アンドロヘップ液中での精子運動の観測結果及び検定結果である。図４（Ａ）が、上記評価を９回繰り返したときの各試験区の中央値の推移グラフである。図３（Ｂ）が、中央値である。
【００３４】
プロタミン添加区（６ｍ区、７ｍ）では、１０日目までのいずれの観察日においても、添加物無添加のアンドロヘップ液（１ａ区／−◆−）中の精子に比べ、図２の得点表に基づく、平均運動得点は、大きく上回っていた。物質Ａ、Ｂ添加区においても、プロタミン添加区に及ばない傾向ではあるが、全観測日において、運動得点が高かった。
【００３５】
図４（C）が、アンドロヘップ液で希釈した希釈精液中の精子の運動得点の中央値の運動得点の中央値のフリードマン検定の結果である。モデナ液希釈と同様の方法で、アンドロヘップ液で希釈した希釈精液にプロタミンもしくは物質Ａ、Ｂをそれぞれ添加することにより、各調査日（希釈0、１、４、７、１０日後）における精子の運動得点に差が生じるかをフリードマン検定を用いて検定した。
【００３６】
ボールド文字ｐ値は有意差があること、下線付ｐ値は有意な傾向であることを示す。即ち、０日目、１日目、４日目においては有意差があり、７日目は有意な傾向で、１０日目では有意差はなかった。
【００３７】
図３、４で示した運動得点の中央値は試験を9回繰り返し行った時の中央値である。しかし、フリードマン検定ではブロック内の順位を用いて検定を行う方法であるため、試験全体の中央値よりも、ブロック内の平均順位がフリードマン検定の結果を忠実に表すことになる。そこでフリードマン検定の方法に基づいて、図３、図４について、精子の運動得点のブロック内順位の平均（平均運動得点順位という。）を示した。
【００３８】
図５がモデナ液、図６がアンドロヘップ液中の精子の運動得点のブロック内順位に基づくフリードマン検定結果（太枠内）である。
【００３９】
図５（Ａ）は、モデナ液中での精子の運動得点のブロック内平均順位の推移グラフ、図５（Ｂ）はその有意差の有無を示す図である。フリードマン検定では、運動得点の値ではなく、ブロック内平均順位に基づいて検定を行うが、このブロック内平均順位は統計ソフトが自動的に計算する。そのため、検定の基となるブロック内平均順位の結果を可視できるように図示した。
【００４０】
異なる符号間に５％未満の危険率で有意差がある試験区に数値の後に異なる符号（ａ、ａｂ、ｂ）を付した。さらに、試験区１ｍ区と有意差がある試験区（枠）をグレーに着色した。
【００４１】
例えは、４日目の１ｍ区（５．１ａ）と、７ｍ区（２．７ｂ）は異符号のみであるので、有意差があることを意味し、４日目の１ｍ区（５．１ａ）と、６ｍ区（３．６ａｂ）では同符号（ａ）を含むため、有意差がないことを意味する。
【００４２】
フリードマン検定の結果（図５（Ｂ））、１日〜１０日の期間において、添加物を含まないモデナ液（１ｍ区）と、プロタミン添加区（７ｍ区）の間に有意差があることが分かる。なお、６ｍ区の４日目では、有意差は認められなかった。
【００４３】
図６（Ａ）は、アンドロヘップ液中での精子の運動得点のブロック内平均順位の推移グラフ、図６（Ｂ）はその有意差の有無を示す図である。
【００４４】
異なる符号間に５％未満の危険率で有意差がある試験区に数値の後に異なる符号（ａ、ａｂ、ｂｃ、ｃ、ｄなど）を付した。さらに、試験区１ｍ区と有意差がある試験区（枠）をグレーに着色した。
【００４５】
例えは、１日目の１ａ区（６．１ａ）と、７ａ区（２．５ｄ）は異符号のみであるので、有意差があることを意味し、１日目の１ａ区（６．１ａ）と、２ａ区（５．１ａｂ）では同符号（ａ）を含むため、有意差がないことを意味する。
【００４６】
フリードマン検定の結果（図６（Ｂ））、０日〜４日の期間において、添加物を含まないアンドロヘップ液（１ａ区）と、プロタミン添加区（６ａ区、７ａ区）の間に有意差があることが分かる。
【００４７】
図７は、モデナ液中での精子運動得点順位におけるマンホイットニーのＵ検定結果である。フリードマン検定では具体的にどの区間において有意差が生じているかについて示すことはできない。そのため、フリードマン検定において有意差があった場合についてマンホイットニーのＵ検定を用いて、無添加区とプロタミン添加区を比較して有意差が生じているかについて検定を行った。なお、２ｍ〜５ｍ区は検定には用いたが結果の記載は省略した。
【００４８】
検定の結果、添加物無添加のモデナ液区（１ｍ区）とプロタミン添加区（６ｍ区、７ｍ区）とには、観察日全期間で、精子活性に有意差（ｐ＜０．０５）があった。
【００４９】
図８は、アンドロヘップ液中での精子運動得点順位におけるマンホイットニーのＵ検定結果である。なお、２ｍ〜５ｍ区は検定には用いたが結果の記載は省略した。検定の結果、添加物無添加のアンドロヘップ液区（１ａ区）とプロタミン添加区（６ａ区、７ａ区）とには、観察日全期間で、精子活性に有意差（ｐ＜０．０５）があった。
【００５０】
［まとめ］
モデナ液、アンドロヘップ液何れの精液希釈液であっても、プロタミン添加区で、保存期間中において、精子活性が、無添加より高いことが確認できた。さらに、プロタミン添加量は、０．１ｇ／Ｌ添加区（６ｍ、６ａ区）より、０．５ｇ／Ｌ添加区（７ｍ、７ｍ区）が高かった。
【実施例２】
【００５１】
図９は、プロタミン添加量を変え精子活性を比較したときの結果である。図９（Ａ）が、各試験区の運動得点の中央値の推移データである。図９（Ｂ）が図９（Ａ）に基づくフリードマン検定結果である。
【００５２】
モデナ液にプロタミンをそれぞれ０、０．１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ添加し、プロタミン無添加区と比較して精子の活性が向上するか調査した。精液の採取日を０日とし、０、１、４、７、１０日後に、その一部を用いて精子の運動性の評価を実施例１と同様に行った。
【００５３】
図９（Ｂ）の検定の結果、プロタミン０．０１ｇ／Ｌ添加区及びプロタミン０．０５ｇ／Ｌ添加区は、無添加区と比較してわずかに精子の活性が向上する傾向が見られるものの統計的な有意差は見られなかった。このことから精子の運動得点を向上させるプロタミン添加量の下限は０.０５ｇ／Ｌと推測された。
【００５４】
プロタミンによる精子の活性化は、実施例で示した他、牛においても、上記同様の添加量において、精子の活性化が認められた（データ示さず）。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】実施例１の試験区における希釈液への添加物及びその添加量を示す表である。
【図２】実施例１における精子運動を点数化するための基準テーブルである。
【図３】モデナ液中での精子運動の観測結果及び検定結果である。
【図４】アンドロヘップ液中での精子運動の観測結果及び検定結果である。
【図５】モデナ液中での精子の運動得点のブロック内平均順位の推移及びその有意差の有無を示す図である。
【図６】アンドロヘップ液中での精子の運動得点のブロック内平均順位の推移及びその有意差の有無を示す図である。
【図７】モデナ液中での精子運動得点順位におけるマンホイットニーのＵ検定結果である。
【図８】アンドロヘップ液中での精子運動得点順位におけるマンホイットニーのＵ検定結果である。
【図９】プロタミン添加量を変え精子活性を比較したときの結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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