(57)【要約】【課題】被検出物質を極めて高感度に検出可能とする。【解決手段】液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップ１０を用意し、該センサチップに試料Ｓを接触させることにより、該センサ部上に被検出物質の量に応じた量の結合物質を結合させつつ、異なる複数の時刻にセンサ部１４からの信号を測定し、複数の時刻における信号値のＳ／Ｎを算出し、信号値のＳ／Ｎ最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値として、該決定値を用いて被検出物質の量を求める。【選択図】図１
2010216982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップと、該流路型センサチップの前記センサ部からの信号を検出する信号検出系とを備えた検出システムを用い、前記液体試料中に含まれる被検出物質の量を検出する検出方法であって、
前記液体試料を前記固定層に接触させるように流下させることにより、前記被検出物質の量に応じた量の、前記２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質を前記固定層に特異的に結合させつつ、異なる複数の時刻に前記信号を測定して、前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎを算出し、該Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、該決定値を用いて、前記被検出物質の量を求めることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記信号を連続的に測定しつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを算出し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正からゼロ以下に転じた場合には測定を中止し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正を維持している場合には、予め定めた所定時間まで測定を行うことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記被検出物質の量を、予め前記検出システムに記憶されている、異なる複数の反応時間ごとの前記被検出物質の濃度と前記信号値との関係を示す複数の検量線データを参照して、前記決定値の時刻近傍の時刻における前記検量線データを選択して、前記被検出物質の量を求めることを特徴とする請求項１または２記載の検出方法。
【請求項４】
前記検出システムが、前記複数の検量線データとして、液体試料と被検出物質との異なる複数の組み合わせについてのデータを備えており、該複数の組み合わせから指定された組み合わせのデータを用いることを特徴とする請求項３記載の検出方法。
【請求項５】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップと、
該流路型センサチップの前記センサ部からの信号を検出する信号検出系と、
該信号検出系に接続され、異なる複数の時刻に、前記信号検出系により検出された前記信号を取得して、前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎを算出するデータ取得部と、
前記Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、該決定値を用いて、前記液体試料中に含まれる被検出物質の量を求める演算部とを備えたことを特徴とする検出システム。
【請求項６】
前記データ取得部が、前記信号検出系により検出された前記信号を連続的に取り込みつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを算出し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正からゼロ以下に転じた場合には、測定を中止し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正を維持している場合には、予め定めた所定時間まで測定を行うものであることを特徴とする請求項５記載の検出システム。
【請求項７】
液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップと、
該流路型センサチップの前記センサ部からの信号を検出する信号検出系と、
該信号検出系に接続され、異なる複数の時刻に、前記信号検出系により検出された前記信号を取得して、前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎを算出するデータ取得部と、
前記Ｓ／Ｎの時系列データを表示する表示手段と、
外部入力により、前記表示手段に表示されたＳ／Ｎの時系列データに基づいて所望の信号値を決定値として選択指定する選択手段とを備え、
前記選択手段により選択指定された前記決定値を用いて、前記液体試料中に含まれる被検出物質の量を求める演算部とを備えたことを特徴とする検出システム。
【請求項８】
前記データ取得部が、前記信号検出系により検出された前記センサ部からの信号を連続的に取り込みつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを逐次算出するものであり、
前記表示手段が、前記Ｓ／Ｎの時系列データとして、前記データ取得部により逐次算出されたＳ／Ｎを逐次表示するものであり、
予め設定されている所定時間になる前に、外部から強制的に測定を中止する強制終了指示手段を備えていることを特徴とする請求項７記載の検出システム。
【請求項９】
前記演算部が、前記被検出物質の量を、予め前記検出システムに記憶されている、異なる複数の反応時間ごとの前記被検出物質の濃度と前記信号値との関係を示す複数の検量線データを参照して、前記決定値の時刻近傍の時刻における前記検量線データを選択して、前記被検出物質の量を求めることを特徴とする請求項５から８いずれか１項記載の検出システム。
【請求項１０】
前記検量線データとして、液体試料と被検出物質との異なる複数の組み合わせのデータを記憶しているものであることを特徴とする請求項9記載の検出システム。
【請求項１１】
前記センサチップが、前記液体試料と被検出物質との異なる複数の組み合わせのデータのうちいずれのデータを用いるかを特定する情報を備えた情報記憶部を備えている請求項１０記載の検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路型センサチップを用いて試料中の被検出物質の量を検出する方法、および検出システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として標識免疫アッセイ法が広く用いられている。このアッセイ法は、被検出物質の量に応じた標識物質を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。
【０００３】
バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている標識からの信号を検出するサンドイッチ法や、被検出物質と競合して１次抗体と特異的に結合する、標識された競合抗原を被検出物質と競合的に１次抗体と結合させ、１次抗体と結合した競合抗原からの標識信号を検出する競合法などのアッセイがなされる。
【０００４】
また、簡易かつ迅速な免疫測定法として微細な流路内で免疫反応をし、被検出物質の量を定量する方法が広く知られている。流路内で反応を行うのはマイクロプレートなどの静置系に比べて反応領域に反応液を供給し続けやすいために拡散律速が解消されやすいという利点がある。
【０００５】
特許文献１には、流路内の免疫反応において、あらかじめ決められた一定時間経った後に信号を取得して、被検出物質を定量する方法が開示されている。
【０００６】
また、特許文献２では、可逆的な抗原抗体反応を利用した被検出物質の定量を特徴としており、測定値をリアルタイム測定することで、被検出物質の量の変動を計測する方法が提案されている。
【０００７】
特許文献３および４では、被検出物質と標識物質が競合反応する過程をリアルタイム観察し、標識物質量の時間変化の傾きから被検出物質の量を定量する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−１９６９２０号公報
【特許文献２】国際公開２００４／０２７４２４号公報
【特許文献３】特開２００７−１７１２１３号公報
【特許文献４】特開平１１−１８３４７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
免疫アッセイを用いて試料中の被検出物質の量を定量する場合、免疫反応の進行に伴って信号量の時間変化が見られる。また、免疫アッセイにおいてしばしば問題となる非特異吸着による誤信号も同様に時間変化する。特異吸着物質が免疫反応で結合するのに対し、非特異吸着物質は疎水結合などで結合するために、両者の反応速度は異なることが多い。また、結合量が飽和に達する時刻も両者で異なることがある。このため、Ｓ／Ｎは時間に対して単調増加するとは限らず、時間経過とともにＳ／Ｎが低下する場合もありうる。従来法では必ずしもＳ／Ｎが有利な反応時間で測定できているとは言えず、被検出物質の量の決定精度が十分ではなかった。
【００１０】
既述の通り、特許文献１では、流路内の免疫反応において、被検出物質の量をあらかじめ決められた一定時間経った後に測定しており、反応開始からＳ／Ｎは時間変動し、測定時間帯によってはＳ／Ｎが低下するため、被検出物質量を決定するのに用いる信号値が最もＳ／Ｎがよい時刻の値と必ずしも一致せず、被検出物質量の決定精度が悪化することが起こりうる。
【００１１】
特許文献２、３および４では、抗原抗体反応の過程をリアルタイムで測定し被検出物質の量の変動を計測する方法、あるいはその時間変化の傾きから被検出物質の量を定量する方法が提案されている。これらの文献では、通常の測定条件下では蛍光性を示さないが抗体と結合することにより蛍光性を発現する色素が標識物質として用いられており、該色素を被検体と結合させた被検体色素複合体を被検体と競合させ、複合体が抗体と反応して生じる蛍光を検出している。該色素を用いることにより、被特異吸着によるバックグラウンドノイズを減少することができる。しかし、該色素として用いることができる物質は、抗体と結合したときに色素分子内の振動・回転が抑制され、励起状態から基底状態への非放射遷移過程が抑制されなければならず、有すべき色素骨格が特殊で、汎用性があるとは言えない。また、このような標識物質を用いることによりノイズは低減できるが、Ｓ／Ｎの時間的な変化については考慮されておらず、必ずしもＳ／Ｎの良い信号値から被検出物質の量を特定できているとはいえない。
【００１２】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、一般的な標識物質を用いることができ、かつＳ／Ｎよく生体反応を検出することができる検出方法および検出システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の検出方法は、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップと、該流路型センサチップの前記センサ部からの信号を検出する信号検出器とを備えた検出システムを用い、前記液体試料中に含まれる被検出物質の量を検出する検出方法であって、
前記液体試料を前記固定層に接触させるように流下させることにより、前記被検出物質の量に応じた量の、前記２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質を前記固定層に特異的に結合させつつ、異なる複数の時刻に前記信号を測定して、前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎを算出し、該Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、該決定値を用いて、前記被検出物質の量を求めることを特徴とするものである。
【００１４】
「前記２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質」とは、センサ部において検出可能な、光学的、電気的、あるいは磁気的な信号を発生する性質を備えるものであり、該被検出物質自体、被検出物質に標識が付与されてなるもの、あるいは、被検出物質を含まず、該被検出物質と競合して固定層に結合する物質からなるものなどいずれであってもよい。なお、前記結合物質が被検出物質自体、あるいは被検出物質に標識が付与されてなるものである場合、被検出物質が他方の物質を構成し、被検出物質を含まない場合には、該被検出物質と競合して固定層に結合する物質が前記他方の物質を構成する。結合物質は、主として光学的、電気的あるいは磁気的な信号を発生する標識を含み、該標識の存在により前述の性質を備えるものとなるが、被検出物質自体が信号を発生する性質を備える（例えば、蛍光色素を備えている、あるいはイオン化されている）場合には、必ずしも標識が付与されていなくてもよい。
【００１５】
例えば、抗原抗体反応を検出する方法において、抗原が被検出物質であるとき、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、固定層は該抗原と特異的に結合する抗体から構成され、結合物質は、前記他方の物質である抗原と標識抗体とからなり、競合法によるアッセイを行う場合には、結合物質は、抗原と競合して固定化抗体と結合する標識競合抗原から構成される。
【００１６】
光学的信号を生じる標識としては、例えば、励起光に対し光応答性を有するものであればよく、励起光の照射により蛍光を生じる蛍光色素分子、蛍光微粒子、量子ドット（半導体微粒子）のみならず、励起光の照射により散乱光を生じる金属微粒子などであってもよい。電気的信号を生じる標識としては、電荷を有するイオン化物質を用いることができ、磁気的信号を生じる標識としては、磁性体をそれぞれ用いることができる。他の物質自体が蛍光色素を備えている場合、あるいは他の物質自体がイオン化物質である場合などには他の物質自体が結合物質となり得る。
【００１７】
さらに、標識は、放射性物質、酵素を含み、免疫アッセイで用いられる標識方法に供され得るものであれば特に限定されない。放射性物質は放射性同位元素であれば、特に制限はない。また、標識を励起するは励起光に限らず、電場、熱、音波、摩擦、電子線、化学反応などからエネルギーを受け取り発光する物質であってもよい。
【００１８】
従って、「センサ部からの信号」は、主として固定層と結合した結合物質からの信号である。この信号を検出する具体的手段としては、光学的信号を検出するためには、蛍光検出器などの光検出器を用いればよく、電気的信号を検出するためには、ＦＥＴ（Field Effect Transistor)などの電荷検出器を用いればよく、磁性信号を検出するためには、ＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉計）や磁気抵抗効果素子などの磁気センサを用いればよい。
【００１９】
「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
【００２０】
「異なる複数の時刻」とは、一定時間間隔の複数の時刻であってもよいし、異なる時間間隔の複数の時刻であってもよい。また、前記Ｓ／Ｎの時間変化率に応じて時間間隔を変動させてもよい。たとえば、前記Ｓ／Ｎの時間変化率が大きい場合は時間間隔を短くし、時間変化率が小さい場合は時間間隔を長くするなどである。
【００２１】
「前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎ」とは、信号値（シグナル値）Ｓとノイズ値Ｎとの比であり、信号値Ｓは取得した信号値そのものであってもよいし、取得信号値からノイズ値を減じた値としてもよい。信号値Ｓとノイズ値Ｎとの取得方法は一般的に用いられる方法を適宜使用することができる。例えば、前記複数の時刻において、前記流路型センサチップに設けられた前記センサ部から取得した信号を信号値Ｓとし、該流路型センサチップにノイズ部を設けて、該ノイズ部から取得した信号をノイズ値Ｎとすることができる。また、前記センサ部から取得した信号からノイズ部の信号値を減じた値を前記信号値Ｓとしてもよい。前記ノイズ部はセンサ部が設けられたチップとは別のチップ上に設けて、別々に試料を流下させても良いし、同一チップ上の分岐した流路内にそれぞれ分けて設置しても良く、さらには同一チップ上の同一流路内の上流部、下流部に分けて設置しても良い。特にセンサ部とノイズ部とを同一チップ上の同一流路内の上流部、下流部に分けて設置することが好ましい。前記ノイズ部からの信号は前記センサ部の信号取得と同時刻に取得したものであってもよいし、前記センサ部の信号取得に続いて取得したものであってもよい。
【００２２】
「該Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値」とは、算出したＳ／Ｎの最大値の８０％以上のS／N値、あるいは最大値に最も近いＳ／Ｎを持つ時刻のＳ／Ｎ値である。なお、測定した複数の時刻におけるＳ／Ｎ値のうち最大となるものをＳ／Ｎの最大値とすることができる。また、Ｓ／Ｎが最大値となる時刻の前後の時刻にそれぞれ、複数のデータを取得した場合、Ｓ／Ｎ値の時間変化データを算出し、該Ｓ／Ｎが最大値となる時刻より前に取得した複数データからの近似曲線と、該時刻より後に取得した複数のデータからの近似曲線の交点をＳ／Ｎの最大値とすることもできる。
【００２３】
流路型センサチップで検出する被検出物質は異なる二種類以上の物質であってもよく、それぞれ被検出物質毎にセンサ部とノイズ部を設けることができる。異なる被検出物質を検出するアッセイ方法は、同一であっても良いし、異なるアッセイ方法の組合せでもよい。ノイズ部については複数の被検出物質に対して同一のノイズ部を共有してもよい。また、流路上にはセンサ部、ノイズ部以外にも流動状態や免疫反応物質の反応状態を測定するための領域を設けてもよい。
【００２４】
本発明の検出方法においては、前記信号を連続的に測定しつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを算出し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正からゼロ以下に転じた場合には測定を中止し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正を維持している場合には、予め定めた所定時間まで測定を行うようにしてもよい。
【００２５】
ここで「連続的に測定」とは測定開始から測定を停止するまでに3点以上のデータ点を取得すればよいこととする。しかしながら、測定精度を上げるためには、データ点数は多いほうがより好ましい。
【００２６】
「Ｓ／Ｎの時間変化率」とはＳ／Ｎの時間変化データの時間微分を意味し、前進差分、後退差分などの数学的処理を用いて求めることができる。
【００２７】
「正からゼロ以下に転じた場合」とはＳ／Ｎの時間変化率の値が正の値からゼロ以下に転じることで、Ｓ／Ｎデータが減少していく振る舞いが見られた場合である。測定開始直後のデータ値がゼロ付近の時や取得データのばらつきが多い時は、測定誤差によって時間変化率が正からゼロに変化することはあるが、その前後の時間変化率も考慮して時間変化率の転換点を判断する。すなわち、転換点前は時間変化率が正の値で支配的であり、転換点後には時間変化率が負の値で支配的であることを判断の基準とする。これには一般的な統計処理方法を用いることができる。
【００２８】
「該Ｓ／Ｎの時間変化率が正を維持している場合」とはＳ／Ｎの時間変化率が正の値を示し、Ｓ／Ｎの傾向が変化しないことを意味する。取得データのばらつきが多い時は、測定誤差によって時間変化率が正からゼロ以下に変化することはあるが、その前後の時間変化率も考慮して時間変化率の転換点を判断する。すなわち、転換点前は時間変化率が正の値で支配的であり、転換点後には時間変化率が負の値で支配的であることを判断の基準とする。これには一般的な統計処理方法を用いることができる。
【００２９】
「予め定めた所定時間」は、測定時間としてシステムに予め保存されていても良いし、チップの付帯情報として保存されていても良い。また、検出システムがユーザーインターフェースを持つ場合は、測定前に測定者によって指定された測定時間である。
【００３０】
本発明の検出方法において、「該決定値を用いて、前記被検出物質の量を求める」方法としては、予め前記検出システムに記憶されている、異なる複数の反応時間ごとの前記被検出物質の濃度と前記信号値との関係を示す複数の検量線データを参照して、前記決定値の時刻近傍の時刻における前記検量線データを選択して、前記被検出物質の量を求める方法が好適である。
【００３１】
「複数の検量線データ」は異なる複数の反応時間ごとの被検出物質の濃度と信号値の関係を示したもので、例えば、濃度が既知のコントロール液を用いて予め取得されたデータである。
【００３２】
「前記決定値の時刻近傍の時刻における前記検量線データを選択」とは決定値の時刻に最も近い時刻の検量線データをそのまま選択しても良いし、決定値の時刻近傍の二つ以上の検量線データから該時刻の検量線データを演算によって求めた検量線データであってもよい。例えば、二つの検量線データから外挿、内挿するなどして決定値の時刻の検量線データを算出するといったことである。なお、決定値の時刻と同一時刻における検量線データが存在する場合には、同一時刻のものを選択すればよい。
【００３３】
前記検量線データとしては、測定対象となる液体試料（血液、尿など）と被検出物質（ｈCG、トロポニンＴなど）の異なる複数の組み合わせのデータが予め前記検出システムに記憶されていることが好ましくどの組合せの検量線データを用いるかは測定時に測定者が指定してもよいし、チップに予め保存されている情報から指定してもよい。
【００３４】
本発明の第１の検出測定システムは、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップと、
該流路型センサチップの前記センサ部からの信号を検出する信号検出系と、
該信号検出系に接続され、異なる複数の時刻に、前記信号検出系により検出された前記信号を取得して、前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎを算出するデータ取得部と、
前記Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、該決定値を用いて、前記液体試料中に含まれる被検出物質の量を求める演算部とを備えてなることを特徴とするものである。
【００３５】
前記信号検出系は、前記センサ部からの信号、すなわち固定層と結合した物質から生じる光、放射線などの物理的信号を検出する機構を持つ。
【００３６】
前記信号検出系および前記データ取得部は、信号値Ｓとノイズ値Ｎとしてそれぞれ、同一チップ上の異なる領域に設けられたセンサ部とノイズ部からの信号を、チップあるいは信号検出器を掃引して取得しても良いし、信号検出器を二つ用意して取得しても良い。異なるチップを用いて信号値Ｓとノイズ値Ｎを取得する場合は、取得したデータをシステムに保存しておき、信号値Ｓとノイズ値Ｎを取得した後にＳ／Ｎの算出を行ってもよい。
【００３７】
前記データ取得部は、前記信号検出系により検出された前記信号を連続的に取り込みつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを算出し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正からゼロ以下に転じた場合には、測定を中止し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正を維持している場合には、予め定めた所定時間まで測定を行うものであることが好ましい。
【００３８】
本発明の第２の検出システムは、液体試料が流下されるマイクロ流路を有する流路部材の該流路内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質が固定層として固定されてなるセンサ部が設けられた流路型センサチップと、
該流路型センサチップの前記センサ部からの信号を検出する信号検出系と、
該信号検出系に接続され、異なる複数の時刻に、前記信号検出系により検出された前記信号を取得して、前記複数の時刻における前記信号の信号値のＳ／Ｎを算出するデータ取得部と、
前記Ｓ／Ｎの時系列データを表示する表示手段と、
外部入力により、前記表示手段に表示されたＳ／Ｎの時系列データに基づいて所望の信号値を決定値として選択指定する選択手段とを備え、
前記選択手段により選択指定された前記決定値を用いて、前記液体試料中に含まれる被検出物質の量を求める演算部とを備えたことを特徴とするものである。
【００３９】
前記表示手段は、Ｓ／Ｎの時系列データを測定者に示す機能を有する。
【００４０】
前記選択手段は前記表示手段により表示されたＳ／Ｎの時系列データから測定者の望む信号値を決定値として選択するための機能を有する。選択は汎用コンピュータに一般的に用いられるキーボード操作やマウスによるポインタ操作により行ってもよいし、タッチパネルの機能を備えている前記表示手段のパネル上から行ってもよい。
【００４１】
また、前記データ取得部が、前記信号検出系により検出された前記センサ部からの信号を連続的に取り込みつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを逐次算出するものであり、
前記表示手段が、前記Ｓ／Ｎの時系列データとして、前記データ取得部により逐次算出されたＳ／Ｎを逐次表示するものであり、
予め設定されている所定時間になる前に、外部から強制的に測定を中止する強制終了指示手段をさらに備えていてもよい。
【００４２】
「外部から強制的に測定を中止する強制終了指示手段」とは逐次算出したＳ／Ｎデータの逐次表示を見ながら、測定者が測定を中止したい場合に測定を中止するための手段である。終了指示は汎用コンピュータに一般的に用いられるキーボード操作やマウスによるポインタ操作により行ってもよいし、タッチパネルの機能を備えている前記表示手段で行ってもよい。例えば、測定中にＳ／Ｎが減少し始め、それ以後の測定データを取得する意味がないと判断した場合に、測定者により測定終了の指示がなされる。
【００４３】
前記演算部は、前記被検出物質の量を、予め前記検出システムに記憶されている、異なる複数の反応時間ごとの前記被検出物質の濃度と前記信号値との関係を示す複数の検量線データを参照して、前記決定値の時刻近傍の時刻における前記検量線データを選択して、前記被検出物質の量を求めるものとすることができる。
【００４４】
前記複数の検量線データは、検出システムを構成するいずれかの構成要素に備えられている情報記憶部に記憶されていればよいが、特に、前記センサチップの一部に設けられた情報記憶部に記憶されていることが好ましい。
【００４５】
さらに、検出システムとしては、前記検量線データとして、液体試料と被検出物質との異なる複数の組み合わせのデータを記憶しているものであることが好ましい。
【００４６】
なお、本検出システムに関する記載のうち上記検出方法と同一の文言については上記検出方法において既述した定義と同一である。
【００４７】
本発明は、流路型センサチップを用いたアッセイにおいて、反応開始直後から短時間の間に、Ｓ／Ｎが大きく変動する要因として、特異吸着物質と非特異吸着物質の結合反応速度の違いに着目し、特異吸着量に応じたシグナルと非特異吸着量に応じたノイズの時間変化を測定し、Ｓ／Ｎの時間依存性を算出することにより、従来の構成に比して格段に被検出物質の量を高感度、高精度に決定することを可能とするものである。
【００４８】
本発明が解決しようとする課題は、リアルタイム測定やシグナルの時間変化率を用いるだけでは、解決できるものではなく、流路内の免疫アッセイにおいてＳ／Ｎが低下する局面もあることに着目し、Ｓ／Ｎの時間依存性データを演算することを用いることによってはじめて解決しえたものである。したがって、本発明は従来技術の項で挙げた特許文献から容易に発明しえたものではない。
【発明の効果】
【００４９】
上記のように構成された本発明の検出方法あるいは検出システムでは、Ｓ／Ｎの時間依存性データからＳ／Ｎの良い測定時間、測定値を抽出できるので、被検出物質の量を高感度、かつ高精度に決定することができる。流路を用いた免疫アッセイでは、効率的に反応を行えることを利用して、短時間で被検出物質の量を決定したいという要望があるが、流路内の反応初期では、液体試料先端の複雑かつ不安定な流動といった流路特有の影響が大きく、Ｓ／Ｎがダイナミックに変動することが起こる。本発明の検出方法はこのような反応初期段階においても最もＳ／Ｎの良い測定値を得ることができるので、流動が安定するまで測定が行えない他の測定方法に比べて、短時間で被検出物質の定量を行うことができる。
【００５０】
本発明の検出方法あるいは検出システムでは、シグナルのみならずノイズの時間依存性データも用いて、被検出物質量を決定するので、非特異吸着物質を引き起こす夾雑物を多く含む生体試料を扱うのに非常に有利である。液体試料に尿や血液などの生体物質を用いる場合、被検出物質の他にもさまざまな生体物質が試料内に高濃度で存在し、検体毎に含まれる生体物質の種類や量が大きく異なるので、これらの生体物質を扱える利点は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の第１実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図２Ａ】本発明の第１実施形態の検出システムのセンサチップを示す斜視図
【図２Ｂ】図２Ａに示すセンサチップの側断面図
【図２Ｃ】図２Ａに示すセンサチップの平面図
【図３】本発明の第１実施形態によるシグナル値Ｓとノイズ値Ｎの時系列取得データ
【図４】図３から算出したＳ／Ｎの時系列データ
【図５】本発明の第１実施形態による検量線データ
【図６】本発明の第２実施形態の検出システムを示す概略構成図
【図７】本発明の第２実施形態によるシグナル値Ｓとノイズ値Ｎの時系列取得データ
【図８】図７から算出したＳ／Ｎの時系列データ
【図９】本発明の第２実施形態による検量線データ
【図１０】本発明の第３実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図１１】本発明の第４実施形態による検出システムを示す概略構成図
【図１２】情報記憶部を備えたセンサチップの斜視図
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各図の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００５３】
＜第１の実施形態の検出システム＞
まず、本発明の第１の実施形態の検出システムおよび検出方法について説明する。図１は本発明の第１の実施形態の検出システム１の概略構成を模式的に示す全体図であり、図２A〜２Cは本検出システム１において用いられる流路型センサチップの一形態を示す斜視図（図２A）、断面図（図２B）および平面図（図２C）である。
【００５４】
本検出システム１は、液体試料Ｓが流下されるマイクロ流路１１を有する流路部材１２の該流路１１内に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質Ｂ1（以下においては抗体Ｂ1）が固定層１３として固定されてなるセンサ部１４が設けられた流路型センサチップ１０と、流路型センサチップ１０のセンサ部１４からの信号を検出する信号検出系３０と、信号検出系３０に接続され、信号検出系３０による信号取得を制御する信号制御装置４０とを備えている。
【００５５】
信号制御装置４０は、異なる複数の時刻に、信号検出系３０により検出された信号を取得して、複数の時刻における信号の信号値のＳ／Ｎを算出するデータ取得部４１および、Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、該決定値を用いて、液体試料Ｓ中に含まれる被検出物質Ａの量を求める演算部４２を備えている。
【００５６】
流路型センサチップ１０は、液体試料が流下されるマイクロ流路１１を有する流路部材１２の該流路１１の壁面に、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質からなる固定層１３を備えてなるものである。本実施形態では、抗原抗体反応において、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合を例とし、固定層１３として、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する抗体Ｂ1（所謂、１次抗体）を備え、抗原Ａに対して、前述の固定層１３を構成する抗体Ｂ1とは異なるエピトープに特異的に結合する抗体Ｂ2（所謂、２次抗体）と標識Ｆとから構成される標識抗体（Ｂ2−Ｆ、以下においてＢF）を用いる場合について説明する。この場合、標識抗体ＢFとそれに結合した抗原Ａとにより「互いに特異的に結合する２つの物質のうちの他方の物質を含む結合物質」が構成されている。
【００５７】
流路型センサチップ１０は、図２Ａ〜図２Ｃに示すように、マイクロ流路１１を有する流路部材１２と、液だめ１６ａ、１６ｂと、該液だめ１６ａ、１６ｂの底部に設けられた開口１５ａ、１５ｂとを備えた上板部材１７とが、超音波融着により接続されて構成されている。流路部材１２および上板部材１７は、ポリスチレン等の透明材料からなり、射出成型によりそれぞれ成型することができる。流路サイズは、一例として、流路の幅が２ｍｍ、流路の深さが１００μｍ程度である。流路型センサチップ１０には、少なくともセンサ部１４の上流側および下流側にそれぞれ１つずつ開口（空気口）が流路内の流体の流速を調整するために必要である。本実施形態においては、上流側の開口１５ａは液体試料を注入する注入口として用いられ、下流側の開口１５ｂにはポンプ２０が接続されて、流速の調整が可能とされている。（図１参照）。なお、本実施形態では、液体試料Ｓを流下させるためにポンプを用いるものとするが、ポンプを用いずに毛管現象を利用して液体試料Ｓをセンサ部１４に流下させてもよい。
【００５８】
本実施形態において用いられる標識抗体は、標識Ｆが抗体Ｂ2に比して大きく、標識抗体は標識に抗体が表面修飾されて構成されている。ここでは、標識Ｆとしては、複数の蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料１８とからなる蛍光物質を用いる（以下において、蛍光物質Ｆとする）。蛍光物質Ｆは複数の蛍光色素分子ｆが内包されていれば蛍光量を増加させることができるため好ましい。材料１８としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。
【００５９】
蛍光物質Ｆは、例えば、以下のようにして作製することができる。
まず、ポリスチレン粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ社、φ５００ｎｍ、１０％ｓｏｌｉｄ、カルボキシル基、製品番号Ｋ１―０５０）を調液して０．１％ｓｏｌｉｄ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ポリスチレン溶液：ｐＨ７．０）を作製する。
次に、蛍光色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、ＢＯＤＩＰＹ―ＦＬ―ＳＥ、製品番号Ｄ２１８４）０．３ｍｇの酢酸エチル溶液（１ｍＬ）を作製する。
上記ポリスチレン溶液と蛍光色素溶液を混合し、エバポレートしながら含浸を行った後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、２０分を２回）を行い、上清を除去する。以上の工程により、ポリスチレンにより蛍光色素を内包してなる蛍光物質Ｆを得ることができる。このような手順で、ポリスチレン粒子に蛍光色素を含浸させて作製された蛍光物質Ｆの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一（上記例ではφ５００ｎｍ）となる。
【００６０】
本実施形態において信号検出系３０は、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射し、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４から生じた蛍光を検出するものであり、励起光Ｌｏを射出する光源２１と、励起光Ｌｏをセンサ部１４に向けて反射すると共に、センサ部１４からの蛍光Ｌｆを透過するダイクロイックミラー２２と、センサ部１４からの蛍光Ｌｆを検出する光検出器３４と、該光検出器３４の信号を増幅するアンプ３５を備えている。すなわち、本実施形態においては、流路型センサチップ１０に対し、励起光Ｌｏを入射させることにより、センサ部１４に固定された結合物質の標識Ｆを励起し、標識Ｆから発せられた蛍光を光検出器３４で検出し、アンプ３５で増幅するよう構成されている。ダイクロイックミラー２２は励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過する性質を持つミラーで、検出器に励起光が迷光となって入射するのを防ぎ、蛍光Ｌｆだけを測定する役割を持つ。
【００６１】
光源２１は標識を励起する波長を含むものならば制限は無く、半導体レーザ（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）などを適宜用いることができる。
【００６２】
光検出器３４としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳなどを適宜用いることができる。なお、光検出器３４の受光面の前方には、適宜、波長選択フィルタを備え、所望の光信号（ここでは、蛍光信号）のみを検出できるようにすることが望ましい。
【００６３】
信号制御装置４０は、具体的にはパーソナルコンピュータなどで構成することができる。データ取得部４１は、光検出器３４が検出し、アンプ３５で増幅された信号を取得し、該信号値のＳ／Ｎを算出するものであり、演算部４２は、データ取得部４１で得られたＳ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、該決定値を用いて、予め検出システム１内に記憶されている検量線データと照合して被検出物質の量を決定するものである。
【００６４】
データ取得部４１は、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正からゼロ以下に転じた場合には、所定時間に到達していなくても測定を中止し、該Ｓ／Ｎの時間変化率が正を維持している場合には所定時間まで測定し続けるよう構成することが望ましい。
【００６５】
＜第１の実施形態の検出方法＞
上記検出システム１を用いた本発明の第１の実施形態の検出方法は、上述の流路型センサチップ１０を用い、マイクロ流路１１内に液体試料Ｓを流下させることにより、被検出物質Ａの量に応じた量の標識結合物質を固定層に結合させた後、センサ部１４への励起光の照射により、該標識結合物質の標識から生じる光に基づく信号を検出して、信号制御装置４０のデータ取得部４１を用いて信号量の時間依存性データを取得し、該信号値のＳ／Ｎを算出し、信号制御装置４０の演算部４２を用いて前記Ｓ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とし、予め記憶しておいた検量線データを用いて前記決定値から被検出物質の量を決定することを特徴とする。
【００６６】
本実施形態の検出方法における手順を説明する。ここでは、一例として、尿、血液などの生体試料Ｓに含まれる被検出物質として抗原Ａをサンドイッチ法を用いて検出する場合について説明する。
【００６７】
本実施形態において、流路型センサチップ１０として、マイクロ流路１１の流路型センサチップ１０上流側の一部に、抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と蛍光物質Ｆとからなる蛍光標識結合物質（標識抗体）ＢＦが予め吸着固定されているものを用いる。
【００６８】
１）まず、マイクロ流路の注入口１５aから分注装置２８により生体試料Ｓを注入し、開口１５ｂに接続された吸引ポンプ２０の吸引操作により生体試料Ｓをマイクロ流路１１内に導入する。
【００６９】
２）マイクロ流路１１に導入された試料は流路に吸着固定されている標識抗体ＢＦと混ぜ合わされ、抗原Ａが標識抗体ＢＦの２次抗体Ｂ２と結合し、さらに２次抗体Ｂ2と結合した抗原Ａが、センサ部１４上に固定されている固定層１３である１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と２次抗体Ｂ２（標識抗体ＢＦ）で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
【００７０】
３）光信号を検出する。光源２１から発した励起光はダイクロイックミラー２２で反射され流路型センサチップ１０に照射され、該流路型センサチップ１０のセンサ部１４に固定された標識抗体ＢＦの蛍光Ｌｆを励起する。該蛍光Ｌｆはダイクロイックミラー２２を透過し、光検出器３４で検出される。
【００７１】
４）信号値の時間依存性データを取得する。前記光検出器３４で検出された信号はアンプ３５で増幅され、信号制御装置４０のデータ取得部４１により信号値の時間依存性データとして取得される。
【００７２】
５）演算に用いる信号値を決定する。該信号値のＳ／Ｎの最大値近傍のＳ／Ｎ値を有する信号値を決定値とすることができる。Ｓ／Ｎの時間依存性データを取得するときは、シグナルＳとノイズＮはそれぞれ、同一チップ上の異なる領域に設けられたセンサ部とノイズ部からの信号を、チップあるいは信号検出系３０を掃引して取得しても良いし、信号検出系３０を二つ用意して取得しても良い。異なるセンサチップを用いてシグナルＳとノイズＮを取得する場合は、取得したデータを測定システムに保存しておき、シグナルＳとノイズＮを取得した後にＳ／Ｎの算出を行ってもよい。すなわち、最初に流路センサチップを用いて測定対象の液体試料を測定し、次に別の流路センサチップを用いて濃度ゼロのコントロール液体試料を流下させてノイズの時間依存性データを取得し、両者の時間依存性データから算出してもよい。
【００７３】
６）被検出物質の量を決定する。予め記憶しておいた検量線データを用いて前記決定値から被検出物質の量を決定する。
【００７４】
このように、取得した信号の時系列データからＳ／Ｎが高い信号値を得ることができ、該信号値を用いて被検出物質量を決定できるので、決定の信頼性を向上させることができる。
【００７５】
＜第１の実施形態の検出システムを用いた検出方法の具体例＞
ポリスチレン材料を射出成形して形成された流路部材の流路内壁面の一部にｈＣＧ抗体を固定化した固定層を設けて、ポリスチレン製の蓋材を接着させてマイクロ流路を備えた流路型センサチップを作製した。
【００７６】
流路内壁面への抗体固定化処理の詳細は以下の通りである。
１）セン特殊光源株式会社製の卓上型光表面処理装置（型式ＰＬ１６−１００）にポリスチレン製の流路部材を入れ、ＵＶ照射を行った。具体的には２５４ｎｍ波長のＵＶ光を３００ｍＪ／ｃｍ２照射した。
２）１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファを用いて抗ｈＣＧ抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、Ａｎｔｉ−ｈ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ６６０１  ＳＰＲ−５）を濃度１０μｇ／ｍＬに調液した。
３）抗ｈＣＧ抗体溶液を基板の抗体固定領域に点着させ、点着後、約６０分経過後に抗体溶液を廃液した。
４）ブロッキング液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ  品番３７５３２）５００ｍＬをバットに入れ、流路部材を浸漬しそのまま６０分間静置した。
５）ブロッキング液を廃液し、乾燥させた。
以上の手順により抗体の固定化を行った。
【００７７】
流路形状は図２Ａ〜図２Ｃに示した実施形態の流路型センサチップのものと同様であり、幅２．０ｍｍ、流路厚５０μｍで、ｈＣＧ抗体が固定されたセンサ部領域の上流側、下流側にそれぞれ、インレット、アウトレットを設けたものである。なお、ここでは流路内に標識抗体を備えていないものを用いた。
【００７８】
次に、作製した流路型センサチップを用いて、以下の手順で実験を行った。
１）まず、測定したい濃度の２倍の濃度を持つ抗原溶液を用意し、流路外で抗原溶液と標識抗体溶液を等体積混合して、測定したい濃度の混合液を作成し、２５℃、１２００ｒｐｍの条件下で１０分間インキュベートして一次反応を行った。標識抗体溶液は抗体に蛍光微粒子を標識したもので、濃度は０．０２ｗｔ％とした。蛍光粒子はＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製蛍光粒子（品番ＦＣ０３Ｆ／８１９６、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６９０ｎｍ）を用いた。
【００７９】
２）その後、抗原溶液と標識抗体溶液の混合液をインレットに点着させ、ポンプで吸引することにより流路中を流下させ、流路壁面に予め固定されている抗ｈＣＧ抗体と二次反応をさせ、サンドイッチアッセイを行った。反応液量３０μＬ、流速０．５μＬ／ｍｉｎで反応を行った。
【００８０】
３）混合液を流路内に流下させながらリアルタイム測定を行った。励起光源として波長６５６ｎｍのＬＤ光源（品番ＤＬ−３１４７−１６０Ｆ、ＤＬ−３３５７−１６５、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製）を用いて標識蛍光粒子を励起し、バンドパスフィルター（品番ＨＱ７２５／５０ｍ、クロマテクノロジー社製）を用いて励起光の迷光と分離して標識蛍光粒子からの蛍光をフォトダイオード（品番Ｓ６９３１−０１、浜松ホトニクス社製）で受光した。リアルタイム測定は混合液の先頭がセンサ部に到達したときを時刻ゼロとして測定を開始し、所定の時間経過後に測定を終了させた。
【００８１】
４）フォトダイオードで受光した信号はフォトセンサアンプ（品番Ｃ９３２９、浜松ホトニクス社製）で増幅され、パーソナルコンピュータに取り込まれた後、解析された。
【００８２】
抗原溶液と標識抗体溶液の混合液を９．０ｐＭ、０ｐＭの２種類の濃度用意し、それぞれ別の流路型センサチップに点着し、センサ部に混合液が到達した時刻をゼロとして、所定時間１９分まで測定を行った。ただし、濃度０ｐＭは抗原溶液調液の際の希釈液である１％ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳと標識抗体溶液の等体積混合液である。信号値の時間変化を図３に示した。ただし、図３に示した濃度９．０ｐＭの値は濃度９．０ｐＭの測定値から濃度０ｐＭの測定値を差し引いた値である。濃度０ｐＭの信号増加は非特異吸着の増加に伴うものであり、濃度０ｐＭの測定値はノイズ値である。濃度９．０ｐＭの測定値から濃度０ｐＭの測定値を差し引くことによって、非特異吸着によるノイズを除いた被検出物質による特異吸着量、すなわちシグナル値を得ることができる。このシグナル値をノイズ値で除したＳ／Ｎの時間変化を図４に示した。反応時間３．５分においてＳ／Ｎは最大となり、このときの信号値５８０ｐＡを決定値とした。図５はあらかじめ、同じ流路型センサチップを用いて得られた反応時間３．５分時の検量線データである。図３の抗原濃度９．０ｐＭの値は図５の検量線からこのときの濃度は９．２ｐＭと推定される。現実の濃度と測定結果から得られた濃度との濃度差は０．２ｐＭであり、現実の濃度の±５％の範囲で一致した。このようにして、未知の濃度の液体試料に対しても同様に濃度の推定を行うことができる。
【００８３】
＜第２の実施形態の検出システム＞
本発明の第２の実施形態の検出システム２について図６を参照して説明する。
本実施形態は、図１に示した第１の実施形態とは流路型センサチップおよび信号検出系の構成が異なる。本実施形態の流路型センサチップ１００は、マイクロ流路１１１の表面の一部に金属薄膜１１２を設けた構成を有する。また、励起光学系として、光源２３から出力された励起光Ｌｏがプリズム２４を透過し、全反射角以上の所定の角度で金属薄膜１１２に入射する表面プラズモン増強光学系を用いる。該表面プラズモン増強光学系は、励起光Ｌｏの照射により金属薄膜１１２に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光を励起させることによりＳ／Ｎを向上させるものである。マイクロ流路１１１は透明材料であれば、特に制限はないが、プリズム２４の屈折率に近い屈折率を持つ材料を用いると、励起光２３が金属薄膜へ入射する際に、反射や屈折が起こりにくくなるので、より好ましい。また、マイクロ流路１１１とプリズム２４の間は両者と屈折率が整合するマッチングオイルで満たされることが望ましい。なお、金属薄膜１１２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００８４】
金属薄膜１１２の表面には表面プラズモンによって増強された光電場が存在する増強場Eｗが形成される。この増強場Eｗは表面から離れるにつれて指数関数的に減衰し、表面から励起光Ｌｏの波長程度の領域に分布する。上述のサンドイッチアッセイを行い、金属薄膜１１２の表面に標識蛍光粒子を固定すると、前記増強場Ewによって蛍光Lｆが励起される。励起された蛍光Lｆは光検出器３４に取り込まれ電気信号に変換された後、アンプ３５で増幅され、信号制御装置４０に取り込まれて、解析に用いられる。
【００８５】
＜第２の実施形態の検出システムを用いた検出方法の具体例＞
ポリスチレン材料を射出成形して形成された流路部材の流路内壁面の一部にＡｕ薄膜層を設け、さらにそのＡｕ薄膜層上にｈＣＧ抗体を固定化した固定層を設けて、ポリスチレン製の蓋材を接着させてマイクロ流路を備えた流路型センサチップを作製した。
【００８６】
流路内壁面への抗体固定化処理の詳細は以下の通りである。
１）アルバック社製の蒸着装置（型式ＥＸ−２００）にポリスチレン製の流路部材を入れ、Ａｕ蒸着を行った。Ａｕ膜厚は４７ｎｍであった。Ａｕ薄膜の作製は真空蒸着法に限定されず、一般的な製膜方法を用いることができる。
２）１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファを用いて抗ｈＣＧ抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、Ａｎｔｉ−ｈ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ６６０１  ＳＰＲ−５）を濃度１０μｇ／ｍＬに調液した。
３）抗ｈＣＧ抗体溶液を基板の抗体固定領域に点着させ、点着後、約６０分経過後に抗体溶液を廃液した。
４）ブロッキング液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ  品番３７５３２）５００ｍＬをバットに入れ、流路部材を浸漬しそのまま３０分間静置した。
５）ブロッキング液を廃液し、乾燥させた。
以上の手順により抗体の固定化を行った。
【００８７】
流路形状は図２Ａ〜図Ｃ２に示した実施形態の流路型センサチップのものと同様であり、幅２．０ｍｍ、流路厚５０μｍで、ｈＣＧ抗体が固定されたセンサ部領域の上流側、下流側にそれぞれ、インレット、アウトレットを設けたものである。なお、ここでは流路内に標識抗体を備えていないものを用いた。
【００８８】
次に、作製した流路型センサチップを用いて、実施例１と同様の手順で実験を行った。
抗原溶液と標識抗体溶液の混合液を９０ｐＭ、０ｐＭの２種類の濃度用意し、それぞれ別の流路型センサチップに点着し、センサ部に混合液が到達した時刻をゼロとして、所定時間１５．２分まで測定を行った。ただし、濃度０ｐＭは抗原溶液調液の際の希釈液である１％ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳと標識抗体溶液の等体積混合液である。濃度９０ｐＭの測定値から濃度０ｐＭの測定値を差し引いたシグナル値と濃度０ｐＭのノイズ値を図７に示した。これらの値からＳ／Ｎを算出し、Ｓ／Ｎの時間変化を図８のように求めた。Ｓ／Ｎが最大となるのは反応時間が所定時間１５．２分のときであった。時間変化率が正からゼロ以下に転ずる時刻はないので、測定は所定時間１５．２分まで行った。
【００８９】
図９はあらかじめ、同じ流路型センサチップを用いて得られた反応時間１５．２分時の検量線データである。図７の抗原濃度９０ｐＭの値は反応時間１５．２分時に検出信号量４０４ｐＡと得られるので、図９の検量線からこのときの濃度は８７ｐＭと推定される。現実の濃度と測定結果から得られた濃度との濃度差は３ｐＭであり、現実の濃度の±５％の範囲内で一致する。このようにして、未知の濃度の液体試料に対しても同様に濃度の推定を行うことができる。
【００９０】
上記実施形態においては、標識として、蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料１８とからなる蛍光物質を例に挙げているが、抗原抗体反応を検出する検出方法は蛍光検出に限るものではなく、金微粒子による散乱光量やＲＩ標識による放射線量検出など通常知られている抗原抗体反応の定量方法を用いることができる。
【００９１】
さらに、標識は蛍光微粒子、蛍光色素分子、量子ドット、金属微粒子など、励起光の照射により何らかの光（蛍光、散乱光など）を生じる光応答性を有するものに制限されず、電気的、磁気的な信号を生じ、その信号により生体反応を検出可能なものであってもよい。なお、電気的信号を検出する方法としては、（ＦＥＴ（Field Effect Transistor)）バイオセンサによる、ゲート表面上に固定層として抗体を固定し、この固定層上に結合する抗原の電荷をFETで検出する方法が挙げられる。また、磁気的信号を検出する方法としては、特開2001-033455号公報に開示されているように、標識として磁性体を用い、固定層への結合物質の結合反応を磁気センサＳＱＵＩＤ（超電導量子干渉計）を用いて検出する方法や、磁気抵抗効果素子を用いて磁性を検出する方法（米国特許第5981297号）などが挙げられる。
【００９２】
本発明の流路型センサチップおよびそれを用いた検出方法においては、アッセイはサンドイッチ法に限らず競合法を用いてもよい。また、抗原抗体反応のみならず、他の生体反応を検出するよう構成することもできる。
【００９３】
＜第３の実施形態の検出システム＞
図１０は、本発明の第３の実施形態の検出システム３の概略構成を示す全体図である。ここでは、第１の実施形態の検出システム１と同じ構成については同一符号を付し、省略を説明する。
【００９４】
本実施形態の検出システム３は、第１の実施形態の検出システム１とは、信号制御装置４０の構成が異なり、さらに、Ｓ／Ｎの時系列データを表示する表示手段４３と、外部入力により、表示手段４３に表示されたＳ／Ｎの時系列データに基づいて所望の信号値を決定値として選択指定する選択手段４４とを備えている。
【００９５】
本実施形態において信号制御装置４０のデータ取得部４１は、信号検出系３０により検出されたセンサ部１４からの信号を連続的に取り込みつつ、該信号の信号値のＳ／Ｎを逐次算出するものである。また。表示手段４３は、Ｓ／Ｎの時系列データとして、データ取得部４１により逐次算出されたＳ／Ｎを逐次表示するものである。
【００９６】
本実施形態においては、さらに、予め設定されている所定時間になる前に、外部から強制的に測定を中止する強制終了指示手段４５を備えている。
【００９７】
本実施形態の検出システム３によれば、データ取得部４１が算出したＳ／Ｎを時系列順で表示手段４３に表示し、その表示結果を元に選択手段４４を用いて、決定値として用いるべき信号値を選択することができる。さらに、強制終了指示手段４５を用いて測定を中止し、測定時間を短縮することができる。選択手段４４は具体的には、タッチパネルによって画面上で選択する方法や、一般的なコンピュータの入力方法であるマウスやキーボードを使って選択する方法が可能である。強制終了指示手段４５は具体的には上記選択方法に加えて、ボタンによる指示方法を用いることができる。
【００９８】
強制終了指示手段が有効となるのは、例えば、Ｓ／Ｎの時間変化率が正からゼロ以下に転じ、Ｓ／Ｎが減少する場合が考えられる。Ｓ／Ｎが最大のときを決定値とする場合は、所定時間まで信号を取り続ける必要がないためである。強制終了指示手段４５を用いることで、測定時間を短縮することが可能になる。
【００９９】
具体的には、図４に示すようなＳ／Ｎの時系列データを表示手段４３に表示させ、その表示結果を元に、Ｓ／Ｎ最大となる反応時間３．５分の信号値を選択手段４４によって選択することができる。さらに、図４で反応時間３．５分以降はＳ／Ｎが低下していることから、強制終了指示手段４５を用いて、所定時間１９分に達する以前に、反応時間３．５分以後の時刻に測定を中止することができる。このようにして、測定時間を短縮することができる。但し、上記第１および第２の実施形態の例で示したように、シグナルとノイズの信号を別のセンサチップを用いて順次測定する場合には、先に信号取得を行うシグナルもしくはノイズのいずれか一方は、所定時間まで測定しておく必要がある。その後、他方を測定する際に、データ取得部４１によりＳ／Ｎを算出させつつ表示手段４３にその時系列データを表示させることにより、測定の中止もしくは続行を判断することができる。
【０１００】
＜第４の実施形態の検出システム＞
本発明の第４の実施形態の検出システムについて図１１を参照して説明する。
上述の第１〜第３の実施形態においては、信号検出系３０を１つだけ備え、Ｓ／Ｎの時間依存性データを取得するときに、流路型センサチップを用意して、濃度ゼロのコントロール液体試料を流下させてノイズの時間依存性データを取得するよう構成されている。本実施形態の検出システム４においては、２つの信号検出系３０、３０’を備え、流路型センサチップ１０’としてセンサ部１４の上流側あるいは下流側にノイズ測定するための固定層１１３を設けたノイズ部１１４を設けたものを用いる。
【０１０１】
ノイズ部１１４はノイズ信号の原因となる蛍光物質Ｆの非特異吸着を測定するためのエリアである。センサ部１４とノイズ部１１４はそれぞれ、光を照射しながら、標識からの蛍光Ｌｆを別々の光信号検出系３０、３０’で検出する。
【０１０２】
すなわち、センサ部１４について光信号検出系３０による信号取得を行うと同時に、ノイズ部１１４について光信号検出系３０’による信号取得を行い、データ取得部４１でシグナルの時間依存性データと共にノイズの時間依存性データが取得される。
【０１０３】
なお、ここでは、光信号検出系３０、３０’にそれぞれ光源２１、２１’を備えるものとしたが、１つの光源からの光をハーフミラーなどを用いて二つに分割して励起光として用いても良い。また、励起光あるいは蛍光Ｌｆをチョッパーなどを用いてある周波数でオンオフ変調し、センサ部１４の信号とノイズ部１１４の信号を交互にタイムシェアリングして一つの信号検出系で検出してもよい。
【０１０４】
本実施形態に、上述の第３の実施形態の検出システム３のように、表示手段４３、選択手段４４、および強制終了指示手段４５を備えてもよい。その場合、センサ部１４からの信号（シグナル）とノイズ部からの信号（ノイズ）との信号取得を同時に行うことができ、順次データ取得部４１においてＳ／Ｎの時間依存性データを算出させつつ表示手段４３に表示させることができ、測定の中止もしくは続行を判断することができる。このように、シグナルとノイズを同時に取得する形態であれば、強制終了指示手段４５はよる測定時間の短縮の効果がより高い。
【０１０５】
なお、上述した各実施形態において、検量線データとしては、測定対象となる液体試料（血液、尿など）と被検出物質（ｈCG、トロポニンＴなど）の異なる複数の組み合わせのデータが予め検出システムに記憶されていることが好ましい。どの組合せの検量線データを用いるかは測定時に測定者が指定してもよいし、チップに予め保存されている情報から指定してもよい。
【０１０６】
たとえば、図１２に示すように、流路型センサチップ１０の上面の、信号測定に影響を生じない箇所に、液体試料と被検出物質との異なる複数の組み合わせのデータのうちいずれのデータを用いるかを特定する情報を備えた情報記憶部５１を備えるものとし、このセンサチップ１０を用いる測定時に、情報記憶部５１から情報を読み取って、検量線データを特定するように構成することができる。情報記憶部５１に備えられている情報とは、具体的には、検量線を特定するための液体試料名と被検出物質名などであり、検出システムに検量線情報が記憶されていない新たな測定項目については、検量線そのものを指す。
【０１０７】
情報記憶部５１には、例えば、二次元バーコード情報として情報を保存する。また、一般的な情報保存方式であるバーコード、ＩＣチップなどを用いることができる。情報記憶部５１からの情報を読取る情報読取手段としては、情報記憶部５１における情報の記録形態に応じ、バーコードリーダあるいはＩＣ読取装置などを備えればよい。
【符号の説明】
【０１０８】
１、２、３、４    検出システム
１０、１００  流路型センサチップ
１１、１１１  マイクロ流路
１２  流路部材
１３、１１３  固定層
１４  センサ部
１５ａ、１５ｂ  開口
１６ａ、１６ｂ  液だめ
１７  上板部材
１８  光透過材料
２０  吸引ポンプ
２１、２１’、２３  光源
２２  ダイクロイックミラー
２４  プリズム
３０、３０’  信号検出系
３４  光検出器
３５  アンプ
４０  信号制御装置
４１  データ取得部
４２  演算部
４３  表示手段
４４  選択手段
４５  強制終了指示手段
５１  情報記憶部
１１２  金属薄膜
１１４  ノイズ部
Ａ    抗原（被検出物質）
Ｂ１  １次抗体
Ｂ２  ２次抗体
ＢF  標識抗体
Ｆ    蛍光物質（標識）
ｆ    蛍光色素分子
Ｌｏ    励起光
Ｌｆ    蛍光
Ｓ    液体試料
【図１】
2010216982.tif 000003
【図２Ａ】
2010216982.tif 000004
【図２Ｂ】
2010216982.tif 000005
【図２Ｃ】
2010216982.tif 000006
【図３】
2010216982.tif 000007
【図４】
2010216982.tif 000008
【図５】
2010216982.tif 000009
【図６】
2010216982.tif 000010
【図７】
2010216982.tif 000011
【図８】
2010216982.tif 000012
【図９】
2010216982.tif 000013
【図１０】
2010216982.tif 000014
【図１１】
2010216982.tif 000015
【図１２】
2010216982.tif 000016