(57)【要約】【課題】本発明は、好中球の機能を調節するための新規な薬剤、特に好中球機能異常症の治療、好中球の走化性及び走触性の増加、炎症性疾患の治療のための新規な薬剤を提供することを課題とする。【解決手段】即ち、本発明は好中球の機能を調節するための、ミッドカインまたはその阻害剤を有効成分とする薬剤に関し、より具体的には、（１）ミッドカインを有効成分として含む、好中球の走化性を刺激するための薬剤、（２）好中球の走化性が走触的機構によるものである、（１）に記載の薬剤、（３）ミッドカインを有効成分として含む、好中球機能異常症治療剤、（４）ミッドカインに対する阻害剤を有効成分として含む、炎症性疾患治療剤、（５）炎症性疾患が慢性関節リウマチまたは変形性関節症である、（４）に記載の炎症性疾患治療剤、（６）ミッドカインに対する阻害剤が抗ミッドカイン抗体である、（４）に記載の炎症性疾患治療剤、（７）ミッドカインに対する阻害剤がミッドカインアンタゴニストである、（４）記載の炎症性疾患治療剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球の移動を刺激又は阻害するのに十分な条件下で所定量のミッドカインタンパク質又はミッドカインタンパク質に対する抗体に好中球をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる工程を含む、好中球の機能を調節するための方法。
【請求項２】
好中球の移動を刺激するのに十分な条件下で所定量のミッドカインタンパク質に好中球をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミッドカインタンパク質が走触的機構によって好中球の移動を刺激する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
好中球の移動を阻害するのに十分な条件下で所定量のミッドカインタンパク質に対する抗体に好中球をｅｘ ｖｉｖｏで接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
好中球の移動の障害によって特徴付けられる疾患を治療するための医薬の調製におけるミッドカインタンパク質の使用であって、前記医薬の適合性が好中球の移動を刺激するミッドカインタンパク質の機能に基づく、使用。
【請求項６】
前記医薬がミッドカインタンパク質と、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、及びＭ−ＣＳＦからなる群から選択される追加の因子とを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記疾患がなまけもの白血球症候群である、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
炎症性疾患を治療するための医薬の調製におけるミッドカインタンパク質に対する抗体の使用。
【請求項９】
前記炎症性疾患を治療するための医薬の適合性が、好中球の移動を阻害するミッドカインタンパク質に対する抗体の機能に基づく、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記炎症性疾患が、ミッドカインタンパク質が関与する好中球の移動と関連する炎症によって特徴付けられる、請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
前記炎症性疾患が、ミッドカインタンパク質が関与する走触性の好中球の移動と関連する炎症によって特徴付けられる、請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１２】
前記炎症性疾患が関節リウマチである、請求項８から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記炎症性疾患が変形性関節症である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球の機能を調節するための、ミッドカインまたはその阻害剤を有効成分とする薬剤に関する。これら薬剤は、好中球機能異常症や炎症性疾患などの好中球に関連した疾患の治療などに利用される。
【背景技術】
【０００２】
好中球は、顆粒球の一つであり、遊走能、貧食能、殺菌能などの機能を有し、細菌や真菌などの感染から生体を防御するという重要な役割を担っている。好中球に関連して、いくつかの疾患が知られている。
【０００３】
好中球において上記の一つ又は複数の機能が障害されている好中球機能異常症としては、例えば、好中球遊走不全症であるなまけもの白血球症候群（ｌａｚｙ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ／走化性欠損白血球症候群ともいう）が知られている。この疾患では、好中球は骨髄中に正常に存在するが、末梢血中では好中球が顕著に減少しており、好中球の遊走能の低下がみられる。しかしながら、好中球機能異常症については、その患者数が非常に少なく、現在この疾患に適用されるような薬剤は流通していない。
【０００４】
また、他の好中球が関連した疾患としては、炎症性疾患が挙げられる。炎症反応は、起炎刺激（細菌などの異物や物理化学的刺激など）により生じた組織障害に対する生体防御反応である。炎症反応は、基本的には生体から有害な刺激を排除し、局所の構造、機能を回復させる反応であるが、この場合に活性化されるシステムは正常な組織、細胞にとっても障害性のあるものであり、強く発現された炎症反応は病的現象として治療の対象となる。
【０００５】
炎症反応は、１）感染部位への血液供給量の増大、２）血管内皮細胞の反応による血管透過性の亢進、３）白血球、特に好中球や一部のマクロファージの毛細血管から組織中への移行および感染部位への遊走、という３つの主要な過程からなり、結果として好中球やマクロファージの集積、浸潤を呈する。このため好中球の機能の抑制は、炎症反応を制御するための有力な手段であると考えられている。
【０００６】
抗炎症薬は、非特異的抗炎症薬（ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬）と特異的抗炎症薬（抗リウマチ薬、抗痛風薬、免疫抑制薬など）に分類され、様々な薬剤が開発されている。慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）においては、薬物治療は、鎮痛・抗炎症剤（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ，ＮＳＡＩＤｓ）を第１選択薬とし、抗リウマチ薬（ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｎｔｉ−ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｒｕｇｓ，ＤＭＡＲＤｓ）、ステロイド剤などを用いて行われている。しかし、ＮＳＡＩＤｓ投与による急性胃粘膜病変（ａｃｕｔｅ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ，ＡＧＭＬ）の発現が問題となり、ＡＧＭＬを回避する目的でプロドラッグ化される場合が多い。
【０００７】
近年、１３ｋＤａのヘパリン結合性タンパクであり、レチノイン酸応答性遺伝子の産物として、ミッドカイン（ＭＫ）が発見された。ミッドカインの機能として、胚の神経の生存維持、分化及び神経突起の伸張を促進すること、特定のセルラインに対して分裂を促進すること（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７：６５２−６５８，１９９１；Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３５：５３０−５３９，１９９３；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）、胚発生の制御に関与していること（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６０７−６１６，１９９０；Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：３７−５１，１９９５）、抗ミッドカイン抗体がインビトロにおいて歯芽の分化を阻害すること（Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：２６７−２８１，１９９５）などが示されている。
【０００８】
さらに、組織の修復や疾患におけるミッドカインの重要性も、徐々に明らかになってきている。多くのヒトの癌でミッドカインの発現が調べられた結果、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、胸部癌、及び肝臓癌のような様々な癌においてミッドカインの発現が増強していることが判明した（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：１２８１−１２８５，１９９３；Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：６５５−６６１，１９９５；Ｇａｒｖｅｒ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ７４：１５８４−１５９０，１９９４）。また、ミッドカインの高レベルの発現は神経芽細胞腫の患者の予後不良と相関があり（Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１７９２−１７９７，１９９５）、ほとんどのアルツハイマー病の老人斑にミッドカインが集積しており（Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：２４６−２５１，１９９３）、脳梗塞の初期の段階の浮腫領域にミッドカインが発現する（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５：２５−３０，１９９５）ことなどが明らかになっている。これらの知見により、ミッドカインが、組織の修復及び疾患を引き起こす組織の異常性に関連している可能性が高まった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７：６５２−６５８，１９９１
【非特許文献２】Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３５：５３０−５３９，１９９３
【非特許文献３】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３
【非特許文献４】Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６０７−６１６，１９９０
【非特許文献５】Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：３７−５１，１９９５
【非特許文献６】Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：２６７−２８１，１９９５
【非特許文献７】Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：１２８１−１２８５，１９９３
【非特許文献８】Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８６：６５５−６６１，１９９５
【非特許文献９】Ｇａｒｖｅｒ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ７４：１５８４−１５９０，１９９４
【非特許文献１０】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８５：２５−３０，１９９５
【非特許文献１１】Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：２４６−２５１，１９９３
【非特許文献１２】Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１７９２−１７９７，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、好中球の機能を調節するための新規な薬剤、特に好中球機能異常症の治療、好中球の走化性及び走触性の増加、炎症性疾患の治療のための新規な薬剤を提供することを課題とする。
【００１１】
最近になって、ミッドカインが血管内皮細胞のプラスミノーゲンアクチベーターの活性を高めること、そして炎症部位への細胞の移動、癌の浸潤及び血管新生での細胞の移動に重要である線維素溶解活性を高めることが明らかとなった（Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９５９０−９５９６，１９９５）。そして、ミッドカインが炎症の最初の段階、すなわち白血球動員の引き金になることも示されている（Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ａ．Ｓ．，Ｃｅｌｌ ７６：３０１−３１４，１９９４）。ミッドカインに関するこれらの知見に刺激されて、本発明者らは、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）や変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＯＡ）に関連した炎症像においてミッドカインの発現を解析した。その結果、ミッドカインが好中球が深く関与する炎症状態において高いレベルを示すことを見出した。また、本発明者らは、好中球の遊走に対するミッドカインの効力を検討し、基質結合型のミッドカインが好中球の遊走を刺激することを見出した。
【００１２】
さらに、本発明者らは、このようにミッドカインと好中球の遊走との密接な関係、およびミッドカインと炎症との密接な関係が見出されたことから、ミッドカイン若しくはその阻害剤を利用して好中球の機能を調節することにより、好中球の機能に関連した疾患、例えば、好中球機能異常症や炎症性疾患の治療を行うことが可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
即ち、本発明は好中球の機能を調節するための、ミッドカインまたはその阻害剤を有効成分とする薬剤に関し、より具体的には、
（１）ミッドカインを有効成分として含む、好中球の走化性を刺激するための薬剤、
（２）好中球の走化性が走触的機構によるものである、（１）に記載の薬剤、
（３）ミッドカインを有効成分として含む、好中球機能異常症治療剤、
（４）ミッドカインに対する阻害剤を有効成分として含む、炎症性疾患治療剤、
（５）炎症性疾患が慢性関節リウマチまたは変形性関節症である、（４）に記載の炎症性疾患治療剤、
（６）ミッドカインに対する阻害剤が抗ミッドカイン抗体である、（４）に記載の炎症性疾患治療剤、
（７）ミッドカインに対する阻害剤がミッドカインアンタゴニストである、（４）記載の炎症性疾患治療剤
に関する。
【００１４】
なお、本発明において「好中球機能異常症治療剤」とは、好中球機能異常症を治療するための薬剤の他、好中球機能異常症の増悪を軽減するための薬剤も含む。また、本発明において「炎症性疾患治療剤」とは、炎症性疾患を治療するための薬剤の他、炎症性疾患の増悪を軽減するための薬剤も含む。
【００１５】
本発明のミッドカインを有効成分として含む薬剤は、好中球の走化性を刺激することができる。走化性（化学走性）とは、好中球をはじめとする白血球が、走化性因子の濃度勾配に伴って、炎症部位（感染部位）に遊走し集合する過程をいう。好中球は、この遊走の後、細菌などの微生物を吸着し、取り込んで（食菌）、様々な機構によりそれを殺菌する。このように、走化性は、好中球がその機能を発揮するための重要な過程である。またさらに、遊走の機構としては、走化的機構および走触的機構が考えられる。走化的機構においては、化学誘因物質は、それが産生される場所、すなわちその濃度が最も高い場所から拡散できる液性因子であり、細胞は化学誘因物質の濃度が増大する方向へ遊走するのに対して、走触性機構においては、化学誘因物質は、血管内皮細胞又は細胞外マトリックスに付着しており、細胞は化学誘因物質の密度が最も高い領域に向かって遊走する。本発明者らによって、ミッドカインは走化的機構ではなく、走触的機構により作用することが示された。
【００１６】
また、本発明のミッドカインを有効成分として含む薬剤は、好中球機能異常症を治療するために用いることができる。好中球の機能は遊走能、貧食能、殺菌能に大別されるが、好中球機能異常症とは、これらの一つ又は複数の機能が障害されている状態をいう。その例としては、好中球遊走不全症であるなまけもの白血球症候群（ｌａｚｙ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ／走化性欠損白血球症候群ともいう）が挙げられる。上記のように本発明者らによって、ミッドカインが、好中球の遊走を刺激することが見出された。従って、機能、特に遊走能が不全となった好中球にミッドカインを作用させることにより、本来の機能を回復させることができると考えられる。
【００１７】
好中球機能異常症を治療するための本発明の薬剤は、好中球の機能を増大させることができる他の因子と組み合わせて使用することも可能である。そのような因子としては、例えばＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＬ−８（インターロイキン−８）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）が挙げられる。
【００１８】
本発明の薬剤において使用されるミッドカインは、ヒト由来（特開平９−９５４５４号公報、実施例参照）、マウス由来（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１，１３１２−１３１８，１９８８）、又はラット由来など哺乳動物由来のものであれば何れでも良い。また、本発明において使用されるミッドカインは、ミッドカインもしくはその生物活性を発現するミッドカインの部分ペプチドの一部のアミノ酸が置換、欠失した誘導体又は類縁体をも包含する。さらにまた、本発明のミッドカインは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。
【００１９】
一方、本発明のミッドカインに対する阻害剤を有効成分として含む薬剤は、炎症性疾患の治療に適用することができる。本発明者らにより、ミッドカインは炎症性疾患において高濃度に存在することが示された。当技術分野において周知の通り、炎症には好中球の遊走が深く関与している。このため、ミッドカインに対する阻害剤は、好中球の遊走の抑制効果により、炎症を治療することができると考えられる。炎症性疾患とは、炎症が原因と考えられるが、結果として炎症を併発するか、つまり、病態として炎症症状を随伴する疾患である。高等動物の炎症は刺激に対応する一連の微小循環系の反応により特徴づけられる。すなわち、通常の炎症では、微小循環系は一過性に収縮した後、拡大し、通常は閉じている毛細血管床が開き、血流量が増加する。さらに、細静脈領域の内皮細胞間隙が開くことにより、この間隙を通じて血漿成分が組織間質へ滲出する血管透過亢進現象が起こる。この血管透過亢進は普通２相性に起こり、第１相はヒスタミンまたはセロトニンによって起こる弱い反応であり即時型透過と呼ばれ、第２相の遅延型透過が炎症における血管透過の主体をなす。引き続いて、多核白血球、単球（組織内に遊出したあとはマクロファージと呼ばれる）、リンパ球などが、やはり細静脈領域から組織間質へと放出する。これらの血漿成分、細胞成分によって生成される活性因子系の作用が組織細胞の増殖を促し、修復へと導く。この一連の過程は古くから発赤（ｒｕｂｏｒ）、疼痛（ｄｏｌｏｒ）、発熱（ｃａｌｏｒ）、腫脹（ｔｕｍｏｒ）として記載されてきた。基本的には炎症は局所の防衛反応であるが、組織傷害作用をも示しうるので、機能障害も炎症の主徴に加えられる。炎症反応は局所組織、細胞の変性、循環障害、増殖が組み合わさった複合反応であり、その動的過程全体をさす。このような種々の側面のうち、どの様相が強いかにより、変質性炎、滲出性炎、増殖性炎に分類され、その経過により、急性炎、慢性炎に分類される。炎症性疾患の例として、慢性関節リウマチ（ＲＡ）や変形性関節症（ＯＡ）が挙げられる。
【００２０】
本発明において好適に使用されるミッドカインに対する阻害剤としては、例えば、適当な濃度のヘパリン（Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９，１１５０−１１５６（１９９６）参照）、ミッドカインの結合部位を奪って活性を抑えるヒト・リュードカン （Ｈｕｍａｎ Ｒｙｕｄｏｃａｎ） （Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．，Ｋａｔｓｕｍｉ，Ａ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｎａｇａｓａｋａ，Ｔ．，Ｏｈｓｕｍｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１０，５９１４−５９２０（１９９６）参照）が挙げられるが、抗ミッドカイン抗体が最も好ましい。抗ミッドカイン抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
ポリクローナル抗体は、以下のような方法により作成することができる。適当な方法で生産した組換えヒト型ミッドカインをフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と等量混合し、均一な乳濁液（エマルジョン）を得る。これをウサギ（ニュージーランドホワイト、２５００〜３０００ｇｒ．）の７０％アルコール綿で消毒した皮下１０ケ所程度に注入し、初回免疫とする。２回目以降の免疫には、アジュバントとしてフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）を使用する。免疫は、２週間に１回の割合で行い、３回目の免疫終了後、１週間経過したところで、予備採血を行う。得られた血液を４℃、１６００回転で遠心し、血清を得る。この血清中のヒトミッドカインに対する抗体価を測定する。抗体価の充分な上昇が確認されたら、計４〜５回の免疫終了後、全採血を実施する。得られた血液は、同様に４℃、１６００回転で遠心し、血清とする。この血清をプロテインＡを利用して精製する。プロテインＡ精製後、ヒトミッドカインタンパクを同相化したアフィニティー精製用カラムを利用して、抗血清のアフィニティー精製を行う。このような過程でウサギ抗ミッドカインポリクローナル抗体の作製は行われる。但し、免疫動物は、ウサギに限定されるものではなく、同様な手法で様々な動物に免疫して抗体を得ることが可能である。
【００２２】
また、モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５））によって作成できる。
【００２３】
さらに、抗ミッドカイン抗体には、ヒト化抗体（野口浩、東隆親：抗体工学によるキメラ抗体の作製とその応用、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：６２８−６３８，１９９１、野口浩：キメラ抗体・ヒト型化抗体の原理と臨床応用、医学のあゆみ １６７：４５７−４６２，１９９３、中谷知右、野口浩：抗体のヒト化、ファルマシア ３３：２４−２８，１９９７参照）、ヒト抗体（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，８７７（１９８９）、Ｒｏｇｕｓｋａ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，９６９（１９９４）、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，４３３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６（１９９４）参照）、又はキメラ抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１（１９８４）、野口浩、東隆親、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２，６２８（１９９１）参照）も含まれる。
【００２４】
抗ミッドカイン抗体の作製において用いられるミッドカインは、ヒト由来（特開平６−２１７７７８号公報参照）、マウス由来（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１，１３１２−１３１８，１９８８）、又はラット由来など哺乳動物由来のものであれば何れでも良い。また、抗ミッドカイン抗体の作製において用いられ抗原としては、ミッドカインの生物活性を発現するミッドカインの部分ペプチドであってもよく、また、ミッドカインまたはその部分ペプチドの一部のアミノ酸が置換、欠失した誘導体又は類縁体であってもよい。さらに、抗原として用いるミッドカインは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。また、ミッドカインアンタゴニストは、例えば、好中球の活性化に重要であるアミノ酸配列を同定し、該配列を欠失させることにより、作製することができる。
【００２５】
本発明の薬剤の有効成分であるミッドカインまたはその阻害剤を、好中球の走化性を刺激するため、好中球機能異常症を治療するため、または炎症性疾患の治療を行うために投与する場合の投与量は、患者の性別、体重、症状などにより変化するが、一般に、一日当たり０．１〜１０００ｍｇであり、１回から数回に分けて投与することができる。投与形態としては、水溶液で、又は薬学的に許容される担体と混合して、静脈内注射、皮下注射、又は筋肉注射により投与することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、滑液中のＭＫの酵素免疫測定の結果を示すグラフである。当アッセイにおけるＭＫの検出限界は９ｐｇ／ｍＬであった。便宜上、検出限界以下の場合には、図の一番下にプロットすることとした。
【図２】図２は、変形関節炎（ＲＡ）の活動性の炎症性の滑液を持った患者の炎症を起こした滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す顕微鏡写真である。Ａは滑膜内細胞と新生血管の間の領域の染色を示し、Ｂは滑膜の管壁細胞の染色を示し、Ｃは新生血管の血管内皮細胞の染色を示す。顕微鏡の倍率は、Ａについては１０４倍、ＢおよびＣについては２０８倍であった。
【図３Ａ】図３は、滑膜組織の抽出物のウエスタンブロット解析を示す写真である。レーン１はＯＡ患者から得られた活動性の滑膜炎の組織、レーン２はＲＡ患者から得られた活動性の滑膜炎の組織、レーン３は非活動性の滑膜炎の組織、レーン４は人工関節への置換を行った患者から得られた組織学的に重大な炎症を伴わない滑膜組織に関する。
【図３Ｂ】図３は、滑膜組織の抽出物のウエスタンブロット解析を示す写真である。レーン１はＯＡ患者から得られた活動性の滑膜炎の組織、レーン２はＲＡ患者から得られた活動性の滑膜炎の組織、レーン３は非活動性の滑膜炎の組織、レーン４は人工関節への置換を行った患者から得られた組織学的に重大な炎症を伴わない滑膜組織に関する。
【図４】図４は、ＭＫ反応性の好中球移動の程度を示すグラフである。ＭＫは表示された濃度で下方のウェルに加えられた。ＭＫと共に３時間インキュベートした後フィルターの下側表面に移動した好中球の数をプロットした。結果は、測定野当たりの移動した細胞数の平均値として表されている。なお、斜線は、濃度勾配のない測定視野当たりの細胞数の平均値を示す。
【図５】図５は、ＭＫによる好中球遊走のチェッカーボード解析の結果を示す図である。データは１視野当たりの移動した細胞数の平均値±標準偏差（ｎ＝４）で表した。
【図６】図６は、走触的機構のアッセイにおける好中球移動の濃度反応曲線を示す図である。走触性のアッセイ（白四角）ではフィルターの下側の表面を予めＭＫでコートし、走化的機構のアッセイ（黒菱形）では、フィルターの両側を予めＭＫでコートし、陰性コントロール（白丸）としては、フィルターの上側の表面を予めＭＫでコートした。３０分間のインキュベーションの後フィルターの下側の表面に移動した好中球の数をプロットした。結果は測定野当たりの移動した細胞数の平均値として表した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に本発明の実施例を記載するが、本実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１ ＥＬＩＳＡによるミッドカイン（以下、「ＭＫ」と称する）の検出
滑液を、ＯＡ又はＲＡの炎症性滑膜炎のヒト患者（２６〜７２歳、平均年令５２歳）から吸引によって採取し、ＥＬＩＳＡ法によって、滑液中のＭＫを検出した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：１１７１−１１７５，１９９６）。３名の健常人の滑液中には、ＭＫは検出されなかったが、６名のＲＡ患者全ての滑液中にＭＫが検出され（図１、６２〜１００００ｐｇ／ｍｌ）、６名のＯＡ患者中４名の滑液中にも有意な量のＭＫが含まれていた（図１、検出限界以下〜１２２５ｐｇ／ｍｌ）。従って、本発明者らは、滑液中のＭＫの存在と、滑膜炎の炎症状態とは有意に関連した現象であると結論づけた。
【００２９】
実施例２ 免疫組織化学によるＭＫの検出
滑膜の組織を、３人のＲＡ患者及び２人のＯＡ患者の全膝部分から採取した。全ての生検標本は過形成の炎症骨膜組織を含んでいた。それは、滑膜内層細胞の増殖、リンパ球及びマクロファージの広範囲にわたる浸潤、そして多数の血管新生によって組織学的に特徴づけられるものであった。免疫組織化学をムラマツらの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）に従って行った。まず、標本を、中性緩衝ホルマリン液で固定し、ついでパラフィン中に包埋し、固定した標本を５ｍｍの厚さにスライスした。次に、切片を、０．２％牛血清アルブミンと２％正常ヤギ血清を含むＰＢＳに溶解した抗ヒトＭＫ抗体（１５ｍｇ／ｍＬ）とともに４℃で一晩インキュベートした。なお、抗ヒトＭＫ抗体は、ペプチド研究所から購入した化学合成ヒトＭＫを用いて、ムラマツらの方法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９：１１７１−１１７５，１９９６参照）に従ってウサギで作製した。コントロールの切片は、２％になるように牛血清を添加したＰＢＳか又は正常ウサギ血清とともにインキュベートした。ついで切片を、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（希釈、１：２５０／ＰＢＳ）とともにインキュベートした後洗浄し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ベクター・ラボラトリーズＩｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｕ．Ｓ．Ａのとともにインキュベートした。ペルオキシダーゼを、１％過酸化水素を含む３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）とともにインキュベートすることによって発色させた。
【００３０】
２名のＲＡ患者から得られた標本においては、滑膜管壁細胞と新生血管との間の領域が、抗ＭＫ抗体によって広範囲に染色された（図２Ａ）。興味深いことに、滑膜の管壁細胞（図２Ｂ）及び毛細血管内皮細胞（図２Ｃ）がＭＫで強く染色されることが見出された。ＲＡ患者の１名では、染色性が他の患者の場合ほど強くなかったが、それは病状が活発な状態でなかったためであると考えられる。ＯＡ患者の炎症性滑膜の２例では、抗ＭＫ抗体での免疫染色性は、ＲＡ患者の炎症性滑膜の染色性とほぼ同様であった。健常人の滑膜は解析のために入手することができなかったため、人工関節置換の、炎症性の滑膜の症状のない患者の生検材料を調べた。その結果、これらの標本では免疫染色性は検出されなかった。
【００３１】
実施例３ ウエスタンブロット解析によるＭＫの検出
さらに、滑膜組織抽出物のウエスタンブロット解析を行った。サンプルをレムリィーの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５，１９７０）に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ゲル中のタンパク質をトーウィンらの方法 （Ｔｏｗｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７６：４３５０−４３５４，１９７９）に従ってニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、スキムミルクを５％になるように添加したダルベッコのリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）中で４℃一晩インキュベートした後、室温で２時間、希釈した抗ヒトＭＫ抗体（５％スキムミルク溶液で２０ｍｇ／ｍＬに調製）とともにインキュベートした。ニトロセルロース膜を０．１％トゥィーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したアフィニティー精製抗ウサギＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズＩｎｃ．、ボルチモア、アメリカ合衆国）とともにインキュベートし、ついで４−クロロ−１−ナフトールで染色した。
【００３２】
ＯＡ患者の活動性の炎症滑膜炎症例の抽出物中に高いレベルのＭＫが検出された（図３、レーン１）。ＲＡ患者の活動性の滑膜炎の炎症部位のＭＫレベルは中程度であった（図３、レーン２）が、当該患者の活動性でない炎症性部位のＭＫレベルは低かった（図３、レーン３）。人工関節の患者及び炎症性の滑膜炎でない患者の滑膜にはＭＫは検出されなかった（図３、レーン４）。従って、免疫反応性の物質は、ＭＫであることが確証された。さらに、免疫組織化学で観察されたＭＫの発現の強さが炎症の激しさに相関するという傾向は、ウエスタンブロット解析においても観察された。
【００３３】
実施例４ ヒト好中球の遊走に対するＭＫの効力
炎症反応の初期の段階での白血球の動員におけるＭＫの役割を評価するために、好中球に対するＭＫの走化性を調べた。健常人の末梢血から好中球を分離するために、末梢血をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠心法によって分画した（Ｖｅｎａｉｌｌｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５４：３８５−３９１，１９９４）。細胞をＲＰＭＩ１６４０培養液で洗浄した後、ヒトＡＢ型血清を１０％濃度で補充したＲＰＭＩ１６４０培養液で２．５ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞濃度に調製した。ＭＫによって誘導される好中球の遊走は、上方のチャンバーとして用いたケモタキシセル（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｃｅｌｌ／クラボウＣｏ．Ｌｔｄ．大阪、日本）で測定した。このケモタキシセルは、ポリカーボネイトフィルターを装着したボイデンチャンバーと全く同一のものである。下方のチャンバーとして、２４ウェル（穴）のプレート（３０４７、ファルコン）を使用した。ＭＫを１０％ＡＢ型血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培養液で希釈し２４ウェルプレートに加え、ついで同培養液中の好中球（５ｘ１０５個）をケモタキシセルに加えた。チャンバーを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃の湿潤下３時間インキュベートした。５μｍのフィルターを通って移動した細胞を、１００％エタノールで固定し、染色し、それからカウントした。カウントは各々のアッセイで１０視野（オリンパスＡＸ８０マイクロスコープ、拡大４００倍）行った。また、各々のサンプルは３連でアッセイを行った。データは平均±標準偏差として表現した。下方のチャンバーに入れられたＭＫは上方のチャンバーに入れられた好中球の遊走を刺激することが判明した（図４）。好中球を誘引するＭＫの至適濃度は１０ｎｇ／ｍＬ（危険率ｐ＜０．０１）であった（図４）。
【００３４】
さらに、ＭＫに応答する好中球の遊走能が走化性因子の濃度勾配を認識して方向性をもって移動する運動（走化性）であるか、又は方向性を持たずに無秩序に動きまわる運動（化学運動性）であるかを判別するためにチェッカーボード解析を実施した（Ｚｉｇｍｏｎｄ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３７：３８７−４１０，１９７３）。その結果を図５に示す。
【００３５】
図から、上方チャンバーから下方チャンバーに向かって、ＭＫの濃度勾配が高くなる場合に、細胞数が増加していることが明らかであり、このことからＭＫが走化活性を有すると判断される。
【００３６】
実施例５ ＭＫの走化性の機構
細胞の運動性は接着依存的結果（Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ａ．Ｓ．，Ｃｅｌｌ ７６：３０１−３１４，１９９４）であり、ＭＫは、細胞表面へパラン硫酸プロテオグリカン（Ｅｌｅｎｉｕｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１４：５８５−５９５，１９９１）のファミリーであるシンデカン（Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：３７−５１，１９９５；Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，Ｎｏ．１０：５９１４−５９２０（１９９６））と強く結合するので、基質結合型ＭＫが好中球の移動を促進する能力についても検討した。すなわち、ＭＫが溶解性型（走化的機構）又は基質結合型（走触的機構）のいずれで機能するかを決定するために、ロット（Ｒｏｔ，Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．２３：３０３−３０６，１９９３）の記載に従い、走触的のアッセイを行った。
【００３７】
第一段階として、走触的機構のアッセイ系においては、下方のウェルにＭＫ（１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ）を満たすことにより、膜の下側の表面をＭＫでコートし、そして対応する上方のウェルにはＲＰＭＩ１６４０培養液を満たすことにより、ＭＫの正の勾配（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）を確立した。
【００３８】
陰性コントロールとしては、もう一つのセットの上方のウェルをＭＫ（１ｎｇから１００ｎｇ／ｍＬ）で満たすことにより膜の上側の表面をＭＫでコートし、対応する下方のウェルをＲＰＭＩ１６４０培養液で満たすことによって負の勾配（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）を確立した。
【００３９】
ＭＫの走化的機構のアッセイ系においては、上方と下方の両方のウェルをＲＰＭ１１６４０培養液で満たした（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）。
【００４０】
それぞれを３７℃で２０分間インキュベートした後、上方のチャンバーとポリカーボネートフィルターからなるケモタキシセルを、フィルターに結合していないＭＫ（溶解性型のＭＫ）を除去するために、ＲＰＭＩ溶液で入念に洗浄した。
【００４１】
第２段階として、走触的機構のアッセイ系および陰性コントロールでは、１０％ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ溶液で、上下のウェルを満たした。一方、走化的機構のアッセイ系では、底のチャンバーにおいてＭＫ（１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。
【００４２】
好中球（５ｘ１０５）を、第２段階の各上方のウェルに入れ、好中球の移動度について、３７℃、３０分間のインキュベーションの間にフィルターを通して移動した細胞の数をカウントすることによって計測した。カウントは各アッセイで１０視野ずつ、各サンプルは各々３連でアッセイした。全ての結果は、好中球の数±標準偏差として表した。
【００４３】
その結果、走触的機構のアッセイにおいては、フィルターに結合したＭＫは低濃度（１ｎｇ／ｍＬ（危険率ｐ＜０．０１））においてさえ、わずか３０分のインキュベーションの後、好中球の遊走を刺激した（図６、白四角）。走化的機構のアッセイにおいては、３０分のインキュベーションの後、好中球の遊走の刺激は検出されなかった（図６、黒菱形）。遊走の刺激は、陰性コントロールでも検出されなかった（図６、白丸）。これにより、ミッドカイン刺激による好中球の遊走は、走触的機構によるものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明により、ミッドカインまたはその阻害剤を有効成分とする、好中球の機能を調節するための新規な薬剤が提供された。これにより、好中球の遊走を刺激して、好中球機能異常症の治療を行ったり、また、好中球の遊走を抑制して炎症性疾患の治療を行うことが可能となった。
【図１】
2010215673.tif 000002
【図２】
2010215673.tif 000003
【図３Ａ】
2010215673.tif 000004
【図３Ｂ】
2010215673.tif 000005
【図４】
2010215673.tif 000006
【図５】
2010215673.tif 000007
【図６】
2010215673.tif 000008