(57)【要約】      （修正有）【課題】化粧品分野、バイオ分野および医薬品分野における有効成分である成長因子を皮膚外用剤またはバイオ製剤または医薬品としての長期保存可能な保存方法の提供。【解決手段】化粧品分野、バイオ分野および医薬品分野における有効成分である成長因子、例えば繊維芽細胞増殖因子や上皮細胞増殖因子を水溶液と分離させて固体乾燥状態で保存し、使用時にそれらを混合して用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体状態の成長因子を容器中に密封保存し、この容器中に水溶液を使用時に注入することにより作成された皮膚外用剤及びバイオ製品
【請求項２】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子である請求項１に記載の皮膚外用剤及びバイオ製剤
【請求項３】
成長因子が上皮細胞増殖因子であるである請求項１に記載の皮膚外用剤及びバイオ製剤
【請求項４】
皮膚外用剤が、化粧品、化粧水、毛髪剤、育毛促進剤、毛髪水、毛髪クリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メイカップベース、ファウンデーション、シャンプー、リンス、ボディーソープであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤
【請求項５】
水溶液中に成長因子の安定化剤を含有することを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤及びバイオ製剤
【請求項６】
固体状態の成長因子とともにその成長因子の安定化剤を容器中に密封保存することを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤及びバイオ製剤
【請求項７】
成長因子と水溶液がフィルムを隔てて分離されている保存瓶を用い、使用時にフィルムを破損させて、成長因子と水溶液を混合させて調製することを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤及びバイオ製品の保存方法
【請求項８】
成長因子が繊維芽細胞増殖因子であることを特徴とする請求項７記載の保存方法
【請求項９】
成長因子が上皮細胞増殖因子であることを特徴とする請求項７記載の保存方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品分野、バイオ分野および医薬品分野における成長因子を含有する皮膚外用剤または医薬品及びその保存方法に関する。より詳しくは、成長因子と水溶液を分離して保存し、使用時にそれらを混合させて、成長因子含有した皮膚外用剤またはバイオ製剤または医薬品とその保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子は、増殖因子あるいは細胞増殖因子とも呼称されており、動物体内において、特定の細胞の増殖や分化を促進させる内因性のタンパク質の総称である。様々な細胞学的・生理学的過程の調節に働いており、標的細胞の表面の受容体タンパク質に特異的に結合することにより、細胞間の信号物質として働くことが可能である。
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ)は、主に上皮細胞に対して細胞増殖を促進させる蛋白質である。１９８６年にノーベル賞を受賞したコーエンは、成長因子の研究を続けていくうちに、マウスの顎下腺から得た成分を新生マウスに注射したところ、正常の動物に比べて眼瞼の開裂や歯の発育が早期から起こることを見出した。コーエンはマウスの顎下腺からこの熱に安定な蛋白質を分離し、この蛋白質のマウスに対する作用を顕微鏡的に確認したところ、目瞼や歯に対する作用は上皮系細胞の増殖の結果であることを明らかとして、ＥＧＦと命名した。すなわち、医薬品あるいはバイオ製品としてのみならず、ＥＧＦを化粧品成分として用いることにより、皮膚の上皮層の新生が活発となり、若々しい皮膚に改質させることが期待されている。
【０００３】
一方、繊維芽細胞成長（増殖）因子（ＦＧＦ）は繊維芽細胞に対して細胞増殖を促進させる蛋白質である。すなわち、150から300個のアミノ酸の連なった蛋白質であり、当初は脳の抽出物から精製された。ＦＧＦは当初２種類発見され、aＦＧＦ（acidicＦＧＦまたはＦＧＦ-1またはＦＧＦ1）とbＦＧＦ（basicＦＧＦまたはＦＧＦ-2またはＦＧＦ2）と命名されている。現在では、ＦＧＦ-1、ＦＧＦ-2、ＦＧＦ-7（ＫＧＦ）を含めて、ヒトで２２種類のＦＧＦが同定されている。これらのＦＧＦの機能解析が進むことにより、ＦＧＦは単なる繊維芽細胞増殖因子ではなく、様々な細胞に対する細胞増殖・分化活性を有する形態形成因子、組織障害のときに働く組織修復因子、生体の恒常性を維持するための代謝調節因子、細胞に栄養分を送るために新たな血管を構築させる血管新生因子として働くことが明らかになっている。したがって、ＦＧＦは医薬品、バイオ製剤として発生生物学や再生医療の分野で注目されている。さらに、ＦＧＦ-1の化粧品成分としての応用として、真皮等に作用して、細胞新生を促し、肌の若返り効果が期待されている。
【０００４】
ＦＧＦ-７は別名ＫＧＦともよばれており、ＫＧＦは角化細胞増殖因子、角質細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子とも訳されている。ＫＧＦ受容体は、舌、口腔、粘膜、食道、胃、腸、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、乳腺、皮膚 (毛嚢と脂腺)、眼球水晶体といった多くの組織の上皮細胞に存在していることがわかっており、この受容体型チロシンキナーゼと結合して細胞内にシグナルが送られる。 
ＫＧＦの医薬品、バイオ製剤、化粧品成分の応用として、発毛作用が注目されている。これは、ＫＧＦは毛乳頭細胞から産生され、毛母細胞に作用し、毛母細胞の増殖、分裂を促すことで毛髪成長させると解釈されているからである。 
【０００５】
以上の細胞成長因子は、皮膚外用剤、バイオ製剤、医薬品の成分として期待される半面、成長因子の不安定性が問題となってきている。
成長因子は、常温で、特に水分の存在下で非常に不安定である（特許文献１）。例えば、ＦＧＦ-1水溶液は、３７度の条件下では、１２時間後には生物活性度は、初期値の０．１％にまで低下してしまうことが報告されている（非特許文献１）。また、ＥＧＦ水溶液は、３７度の条件下では、４８日後には生物活性度は、初期値の６２％にまで低下してしまうことが報告されている（特許文献２）。
【０００６】
成長因子を安定化させるために、これまで様々な方法が開発されてきた。ＥＧＦを安定化させる方法として、ＥＧＦ水溶液中に酸性高分子であるカルボキシビニルポリマーを含有させてＥＧＦ製剤を製造し、皮膚外用剤並びに化粧品として、有用に使用することが報告されている（特許文献１）。さらに、ハイドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体をＥＧＦ水溶液中に含有させることにより、ＥＧＦ水溶液中におけるＥＧＦ生物活性度を長期的に維持させる試みが報告されている（特許文献２）。
また、ＥＧＦ水溶液中に亜鉛等の金属陽イオンを添加させて、ＥＧＦと亜鉛とのイオン結合により、水溶液中でのＥＧＦの生分解を防いで、ＥＧＦを安定化させることも報告されている（特許文献３）。
【０００７】
しかし、いずれの場合も、成長因子を水溶液中に保存した場合には、生物活性の経時的な減少は避けることができないでいる。安定化剤がＥＧＦ水溶液中に含有していても、通常、ＥＧＦ水溶液の安定性は、４℃に保存したとして約２ヶ月間程度である（特許文献１）。
【０００８】
ＦＧＦ−１を安定化させる方法として、ＦＧＦ−１のアミノ酸配列のうち、１箇所から数箇所アミノ酸の種類を変化させた遺伝子改変ＦＧＦ−１を調製して、ＦＧＦ−１の安定化を行なうことが報告されている（非特許文献１並びに非特許文献２）。しかしながら、ヒトに対する使用するときの安全性の見地から、遺伝子改変ＦＧＦ−１をヒトに対する医薬品並びに皮膚外用剤並びに化粧品としての使用には疑問の余地が残る。
【０００９】
ＦＧＦ−１水溶液にヘパリンを含有させると、ＦＧＦ−１の安定性が増加することが報告されている。通常のＦＧＦ−１水溶液中であると、１２時間後には、ＦＧＦ−１の生物活性は初期値の０．１％にまで減少してしまうが、ヘパリン存在下では、９６時間後でも２０％前後の生物活性値を維持していることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、ＦＧＦ−１水溶液を１ヶ月以上活性を保持した状態に保つことは、これまで困難であった。
【００１０】
もし、成長因子の生物活性を長期的に維持することが可能であれば、成長因子を含む皮膚外用剤及びバイオ製品を長期的に保存することが可能となり、成長因子が有効に作用している皮膚外用剤及びバイオ製品を開発することができる。さらに、ＥＧＦ，ＦＧＦ−１の活性を保った皮膚外用剤をヒトに対して使用することにより、皮膚の新生並びに若返り、発毛の促進が期待される。また、成長因子含有細胞培地を長期的に保存することも可能となり幹細胞研究あるいは、幹細胞の臨床応用に大いに貢献することが期待される。
【特許文献１】特公２００３−５２３３９９号公報
【００１１】
【特許文献２】米国特許４７１７７１７号公報
【００１２】
【特許文献３】米国特許５,１３０,２９８号公報
【００１３】
【非特許文献１】Zakrzewska M, Krowarsch D, Wiedlocha A, Olsnes S., Otlewski J., J. Mol. Bio., 352, 860-875 (2005)
【００１４】
【非特許文献２】Zakrzewska M, Krowarsch D, Wiedlocha A, Otlewski J., Protein Eng.Des. Sel., 17, 603-611 (2004)
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１５】
長期保存可能な成長因子を含有した皮膚外用剤またはバイオ製剤または医薬品を容易に製造することが可能となる。高活性な成長因子含有皮膚外用剤またはバイオ製剤または医薬品を社会に提供することが可能とある。生物活性のある成長因子は、皮膚の白色化、新生並びに若返り、老化防止効果、並びに育毛効果に寄与するために、本発明の分離型成長因子保存法は、生物活性のある成長因子含有皮膚外用剤、バイオ製剤の製造並びに保存に最適である。
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
成長因子を水溶液中に溶解させることなく固体状で保存し、使用時に水溶液中に混合させることにより、長期保存可能な成長因子を含む皮膚外用剤及びバイオ製品およびその保存方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、以上のような点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、成長因子を水溶液に溶解させることなく固体状で保存し、使用時に水溶液中に混合させることにより、成長因子の生物活性を長期的に維持することが可能であることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明にかかわる成長因子は、（１）上皮細胞成長因子であるＥＧＦ、（２）繊維芽細胞成長因子であるＦＧＦ-1（酸性ＦＧＦ:ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ:ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ−４（hst-1/kaposi-ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、 ＦＧＦ−６(hst-2)、ＦＧＦ−７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０等ＦＧＦ、（３）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、（４）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（５）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等である。
【００１９】
成長因子を水溶液中に溶解した場合には、成長因子の生物活性が経時的に低下してしまう。従って、成長因子含有皮膚外用剤あるいはバイオ製剤を購入しても、使用前に有る程度の期間保存しておくと、使用時には、成長因子の生物活性は著しく低下しているのが常であった。これを防ぐ最善の策として、使用前では、成長因子とこれを溶解させる水溶液とを分離保存し、使用時に初めて成長因子と水溶液を混合することである。この場合、成長因子の固体を一つの容器に注入し、密封保存し、他の容器に水溶液を注入しておき、使用時に（１）成長因子含有容器中に水溶液を注入させるか、（２）水溶液含有容器中に固体の成長因子を注入する、方法が考えられる。さらに、同一容器中に成長因子と水溶液とをフィルムを用いて隔離し、使用時にフィルムを破損させて、成長因子を水溶液中に溶解させる方法も有効である。
【００２０】
上記の成長因子含有容器内、あるいは水溶液内、さらには、両方の容器中に成長因子の安定化剤を注入しておくのは、さらなる成長因子を含む皮膚外用剤及びバイオ製品の長期保存に最適である。安定化剤としては、（１）負電荷を有する高分子並びにポリペプチド、（２）蛋白質、（３）糖並びに多糖類、（４）親水性高分子、（５）脂質等が考えられる。（１）負電荷を有する高分子並びにポリペプチドとしては、ポリアクリル酸、カルボマー、ポリイタコン酸あるいはこれらを含有する共重合体、ポリアルギン酸、等が成長因子の安定化剤として有用である。（２）蛋白質として、アルブミンやリゾチーム等が成長因子の安定化剤として有用である。３）糖並びに多糖類としては、グルコース、ガラクトース、マンニトール、シュークロース、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸等が成長因子の安定化剤として有用である。安定化剤の含有量として、成長因子の重量の０．１倍から１０００倍程度含めるのが有効である。
【００２１】
以下、本発明を実施例により説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
１００μｇの上皮細胞成長因子(ＥＧＦ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を１００ｍｌの蓋付きガラス管に乾燥状態で挿入した。さらに、５０ｍｌの純水（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）を別の蓋付きガラス管に挿入した。乾燥ＥＧＦ並びに純水入りガラス管を各６本、３７℃で１ヶ月から６ヶ月の間保存した。各１ヶ月ごとに、ガラス管に保存した純水をＥＧＦ入りガラス管に注入した後に、ＥＧＦ含量をQuantikine EGF ELISA kit (R&D, U.S.A.)を用いて計測した。
【００２３】
その結果を表１（No.１）に示す。なお、表１中の数値は、EGFの初期濃度と比較したパーセンテージを示している。
【００２４】
【表１】
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【実施例２】
【００２５】
１００μｇの上皮細胞成長因子(ＥＧＦ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と１０ｍｇのマンニトールを１００ｍｌの蓋付きガラス管に乾燥状態で挿入した。さらに、５０ｍｌの純水（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）を別の蓋付きガラス管に挿入した。乾燥ＥＧＦ並びに純水入りガラス管を各６本、３７℃で１ヶ月から６ヶ月の間保存した。各１ヶ月ごとに、ガラス管に保存した純水をＥＧＦ入りガラス管に注入した後に、ＥＧＦ含量をQuantikine EGF ELISA kit (R&D, U.S.A.)を用いて計測した。
その結果を表１（No.２）に示す。ＥＧＦをマンニトール等の安定化剤と一緒に固体状態で保存した方（表１中No.２)が、マンニトール無添加の場合（表１中Ｎｏ．１）に比べて、ＥＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例３】
【００２６】
１００μｇの上皮細胞成長因子(ＥＧＦ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と５０ｍｌの純水を１００ｍｌの蓋付きガラス管に挿入した。このＥＧＦ水溶液入りガラス管を各６本、３７℃で１ヶ月から６ヶ月の間保存した。各１ヶ月ごとに、ガラス管に保存したＥＧＦ水溶液中のＥＧＦ含量をQuantikine EGF ELISA kit (R&D, U.S.A.)を用いて計測した。
その結果を表１（No.３）に示す。ＥＧＦ水溶液として保存した場合に比べて、ＥＧＦを固体状態で保存した方（表１中No.１）が、ＥＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００２７】
１００μｇの上皮細胞成長因子(ＥＧＦ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と１０ｍｇのマンニトール並びに５０ｍｌの純水を１００ｍｌの蓋付きガラス管に挿入した。このＥＧＦ水溶液入りガラス管を各６本、３７℃で１ヶ月から６ヶ月の間保存した。各１ヶ月ごとに、ガラス管に保存したＥＧＦ水溶液中のＥＧＦ含量をQuantikine EGF ELISA kit (R&D, U.S.A.)を用いて計測した。
その結果を表１（No.４）に示す。ＥＧＦ水溶液として保存した場合に比べて、ＥＧＦを固体状態で保存した方（表１中No.２）が、ＥＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例５】
【００２８】
１００μｇの上皮細胞成長因子(ＥＧＦ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と１０ｍｇのヒアルロン酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入) を１００ｍｌの蓋付きガラス管に乾燥状態で挿入した。さらに、５０ｍｌの純水（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）を別の蓋付きガラス管に挿入した。上記乾燥ＥＧＦ並びに純水入りガラス管を各６本、３７℃で１ヶ月から６ヶ月の間保存した。各１ヶ月ごとに、ガラス管に保存した純水をＥＧＦ入りガラス管に注入した後に、ＥＧＦ含量をQuantikine EGF ELISA kit (R&D, U.S.A.)を用いて計測した。その結果を表１（No.５）に示す。ＥＧＦをヒアルロン酸等の安定化剤と一緒に固体状態で保存した方（表１中No.５)が、ヒアルロン酸無添加の場合（表１中Ｎｏ．１）に比べて、ＥＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例６】
【００２９】
１００μｇの線維芽細胞成長因子(ＦＧＦー１、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を１００ｍｌの蓋付きガラス管に乾燥状態で挿入した。さらに、５０ｍｌの純水（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）を別の蓋付きガラス管に挿入した。上記乾燥ＦＧＦ並びに純水入りガラス管を各６本、２５℃で６ヶ月間保存した。６ヶ月後に、ガラス管に保存した純水をＦＧＦー１入りガラス管に注入した後に、ＦＧＦー１生物活性量を文献（M. Zakrzewska et al., J. Nol. Bio., 352, 860 (2005))に準ずる方法により計測した。その結果を表２（No.６）に示す。以下に、ＦＧＦー１生物活性量（ＥＤ５０)測定法を記す。
NIH 3T3 細胞（ATCC)を２０％牛胎児血清含有DMEM培地中で培養して細胞増殖させた。この細胞を2.5μg/mlのインスリンと2.5μg/ml のトランスフェリン含有DMEM培地中で２４時間細胞培養した。その後、様々な濃度に希釈した上記記載のＦＧＦー１水溶液を培地中に添加してさらに１２時間細胞培養を行った。細胞をトリプシン処理によりフラスコ中から剥離させた後、プロピレンアイオダイドを用いて核染色を行った後に、フローサイトメトリー測定よりＤＮＡ量の計測を行った。全細胞数のうちＳ期、Ｍ期、Ｇ２期に対応する細胞数のパーセンテージ（ＦＧＦー１生物活性度）を各ＦＧＦー１濃度ごとに計測した。同様な実験を、冷凍保存された新鮮なＦＧＦー１を用いても実験を行った。以上より、培地中１００ng/mlのＦＧＦー１（冷凍保存された新鮮なＦＧＦー１）濃度の時に計測されたＦＧＦ生物活性度の５０％の値を示すＦＧＦ水溶液の濃度（ＥＤ５０)を各ＦＧＦー１水溶液に対して計測した。
【００３０】
【表２】
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【実施例７】
【００３１】
１００μｇの線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ−１、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)並びに５０ｍｌの純水を１００ｍｌの蓋付きガラス管に挿入した。このＦＧＦー１水溶液入りガラス管を各６本、２５℃で６ヶ月間保存した。６ヶ月後に、ガラス管に保存したＦＧＦ水溶液中のＦＧＦ生物活性量（ＥＤ５０)測定法を行った。
その結果を表２（No.７）に示す。ＦＧＦ−１水溶液として保存した場合に比べて、ＦＧＦを固体状態で保存した方が（表１中No.６）、ＦＧＦ−１活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例８】
【００３２】
１００μｇの線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ−１、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と１０ｍｇのヒアルロン酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入) を１００ｍｌの蓋付きガラス管に乾燥状態で挿入した。さらに、５０ｍｌの純水（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）を別の蓋付きガラス管に挿入した。上記乾燥ＦＧＦ−１並びに純水入りガラス管を各６本、２５℃で６ヶ月間保存した。６ヶ月後に、ガラス管に保存したＦＧＦ−１水溶液中のＦＧＦ−１生物活性量（ＥＤ５０)測定法を行った。その結果を表２（No.８）に示す。ＦＧＦ−１をヒアルロン酸等のＦＧＦ−１安定化剤と一緒に固体状態で保存した方が、安定化剤無添加の場合（No.６）に比べて、ＦＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００３３】
１００μｇの線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ−１、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と２ｍｇのヘパリンナトリウム（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)  を１００ｍｌの蓋付きガラス管に乾燥状態で挿入した。さらに、５０ｍｌの純水（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入）を別の蓋付きガラス管に挿入した。上記乾燥ＦＧＦー１並びに純水入りガラス管を各６本、２５℃で６ヶ月間保存した。６ヶ月後に、ガラス管に保存したＦＧＦ水溶液中のＦＧＦ生物活性量（ＥＤ５０)測定法を行った。その結果を表２（No.９）に示す。ＦＧＦー１を安定化剤であるヘパリンと一緒に固体状態で保存した方が、安定化剤無添加の場合（表２中No.６）に比べて、ＦＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００３４】
図１に示すような、一瓶中にフィルムで２層に分離されており、Ａ層に、２０ｍｌの純水を挿入し、Ｂ層に上皮細胞成長因子(ＥＧＦ、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と１０ｍｇのマンニトールを乾燥状態で挿入した。上記乾燥ＥＧＦ並びに純水入りガラス管を各６本、２５℃で１ヶ月から６ヶ月の間保存した。各１ヶ月ごとに、図１中Ｃで示したピストンを押し下げることにより、ガラス管に注入してある純水とＥＧＦを混合させた。良く手で攪拌させた後に、ＥＧＦ含量をQuantikine EGF ELISA kit (R&D, U.S.A.)を用いて計測した。その結果を表１（No.１０）に示す。ＥＧＦを固体状態で保存した方が、水溶液中で保存する場合（表１No.４）に比べて、ＥＧＦ活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例１１】
【００３５】
図１に示すような、一瓶中にフィルムで２層に分離されており、Ａ層に１００μｇの線維芽細胞成長因子(ＦＧＦー１、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)を乾燥状態で挿入した。さらに、Ｂ層に２０ｍｌの純水を挿入した。上記乾燥ＦＧＦー１並びに純水入りガラス管を各６本、２５℃で６ヶ月間保存した。６ヶ月後に、図１中Ｃで示したピストンを押し下げることにより、ガラス管に注入してある純水とＦＧＦー１を混合させた。良く手で攪拌させた後、ガラス管に保存したＦＧＦー１水溶液中のＦＧＦー１生物活性量（ＥＤ５０)の測定を行った。その結果を表２（No.１１）に示す。ＦＧＦー１を固体状態で保存した方が、水溶液中で保存する場合（表２中No.７）に比べて、ＦＧＦー１活性を高く保持できることが明らかとなった。
【実施例１２】
【００３６】
図１に示すような、一瓶中にフィルムで２層に分離されており、Ａ層に１００μｇの線維芽細胞成長因子(ＦＧＦー１、シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入)と２ｍｇのヘパリンナトリウム（シグマ・アルドリッチ・ジャパン株式会社より購入) を乾燥状態で挿入した。さらに、Ｂ層に２０ｍｌの純水を挿入した。上記乾燥ＦＧＦー１並びに純水入りガラス管を各６本、２５℃で６ヶ月間保存した。６ヶ月後に、図１中Ｃで示したピストンを押し下げることにより、ガラス管に注入してある純水とＦＧＦー１を混合させた。良く手で攪拌させた後、ガラス管に保存したＦＧＦー１水溶液中のＦＧＦー１生物活性量（ＥＤ５０)の測定を行った。その結果を表２（No.１２）に示す。ＦＧＦー１を安定化剤であるヘパリンと一緒に固体状態で保存した方が、安定化剤無添加の場合に比べて、ＦＧＦー１活性を高く保持できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例１０，１１，１２に係る２層分離型成長因子保存瓶を示す図である。なお、図中Ａ並びにＢは、水溶液または固体状の成長因子が含まれており、水溶液相と固体の成長因子とはフィルムＤで隔離されている。ピストンであるＣを押し下げて、フィルムＤを破損させることにより、水溶液層と固体状の成長因子が混合することが可能となる。また、フィルムＤを破損させた後に、管Ｅより成長因子水溶液を取り出すことが可能である。
【図１】
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