(57)【要約】【課題】うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の研究に使用できる動物モデルを提供する。【解決手段】ゲノムがGNMT遺伝子座における組み換えを行うことによって乱された哺乳類動物である。また、動物モデルの作製方法は、GNMT遺伝子座における組み換えを行うことによって動物のGNMT遺伝子を乱す方法を含む。そして、動物モデルを用いる薬物候補のスクリーニング方法は、(a)薬物候補を動物モデルに投与し、(b)その薬物候補に対する動物の反応を測定し、(c)その動物反応と野生型GNMT遺伝子を持っている動物の薬物候補に対する反応を比較し、(d)観測から得たその動物と、野生型GNMT遺伝子を持つ動物との異なった反応に基づいてその薬物候補をスクリーニングする。【選択図】図１
2010259431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病に関連する動物モデルであって、
前記動物は、ゲノムがGNMT遺伝子座における組み換えを行うことによって乱された哺乳類動物であることを特徴とする動物モデル。
【請求項２】
前記動物は霊長類または齧歯類であることを特徴とする請求項１に記載の動物モデル。
【請求項３】
前記齧歯動物はマウスであることを特徴とする請求項２に記載の動物モデル。
【請求項４】
うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の病理状態を現す動物モデルの作製方法であって、
GNMT遺伝子座における組み換えを行うことによって、動物のGNMT遺伝子を乱す方法を含む動物モデルの作製方法。
【請求項５】
先行刺激抑制反応において有意な先行刺激抑制の低下、尾部懸垂実験および強制水泳実験において不動時間の増加、及び、アルツハイマ病関連遺伝子の発現量の増加を前記病理状態の特徴とする請求項４に記載の動物モデルの作製方法。
【請求項６】
アルツハイマ病関連遺伝子はBACE1、BACE2、APH-1、GSK-3、MAPT、及びIDEであることを特徴とする請求項５に記載の動物モデルの作製方法。
【請求項７】
前記動物は霊長類または齧歯類であることを特徴とする請求項４に記載の動物モデルの作製方法。
【請求項８】
前記動物はマウスであることを特徴とする請求項４に記載の動物モデルの作製方法。
【請求項９】
うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の予防または治療に対する薬物候補をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記薬物候補を請求項1に記載の動物モデルに投与し、
（ｂ）前記薬物候補に対する動物の反応を測定し、
（ｃ）前記モデル動物の反応と、野生型GNMT遺伝子を持っている動物の前記薬物候補に対する反応とを比較し、
（ｄ）観察し得た前記モデル動物と野生型GNMT遺伝子を持つ動物の異なった反応に基づいて前記薬物候補をスクリーニングする薬物スクリーニング方法。
【請求項１０】
聴覚性驚愕反応、尾懸垂実験、または、強制水泳実験で前記薬物候補に対する動物の反応を測定することを特徴とする請求項９に記載の薬物候補のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物モデルに関し、詳しくは、グリシンN‐メチルトランスフェラーゼ(GNMT)ノックアウト動物モデル、その作製方法、および、その用途に関連する。
【背景技術】
【０００２】
グリシンN‐メチルトランスフェラーゼ(GNMT)は4S多環芳香族炭化水素(PAH)結合たんぱく質とも呼ばれて、多種の機能を持っている。主要な葉酸結合たんぱく質である(Yeo EJ、 et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:210-214)ほか、グリシンからクレアチンを合成する過程を促進することにより、S-アデノシルメチオニン(SAM)とS-アデノシルホモシステイン(SAH)の比率を調整する(Kerr SJ. J Biol Chem 1972;247:4248-4252)。前の研究報告によると、肝臓ガン細胞中GNMT遺伝子の発現量は減少する(Liu HH、 et al. J Biomed Sci 2003;10:87-97)。遺伝疫学の研究結果では、肝臓ガンにとってGNMTは腫瘍感受性遺伝子であることを示した(Tseng TL、 et al. Cancer Res 2003;63:647-654)。そしてGNMTがベンゾピレンと結合し、DNA結合を阻害することが発表されている。
【０００３】
マウスの体内で、GNMTの発現は成長ホルモンの影響を受ける、雌マウス肝臓細胞中のGNMT発現量は雄マウスの発現量より8倍高い。3人の子供患者(2人男の子、1人女の子)の病例報告から、先天性GNMT欠損はGNMT遺伝子のミスセンス変異によるものであることを示した。(Augoustides-Savvopoulou P、 et al. J Inherit Metab Dis 2003;26:745-759)。この3人の子供患者はみんな高メチオニン血症、肝腫大および慢性肝炎のような臨床症状を示した(Augoustides-Savvopoulou P、 et al. J Inherit Metab Dis 2003;26:745-759)。中でも、女の子患者は発育遅延と知力障害を示した(IQ=87)。
前の技術はGNMTノックアウトマウスが肝機能異常を現し、肝糖原病になることを示した(US Application No. 11/832、304)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第１１／８３２、３０４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の研究に使用できる動物モデルを提供することを目的とする。
また、本発明は、うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の病理状態を現す動物モデルの作製方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、うつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の治療に対する薬物候補のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明の請求項１に記載の動物モデルは、ゲノムがGNMT遺伝子座における組み換えを行うことによって乱された哺乳類動物である。
また、本発明の請求項４に記載の動物モデルの作製方法は、GNMT遺伝子座における組み換えを行うことによって動物のGNMT遺伝子を乱す方法を含む。
さらに、本発明の請求項９に記載の薬物候補のスクリーニング方法は、(a)薬物候補を本発明の請求項1に記載の動物モデルに投与し、(b)その薬物候補に対する動物の反応を測定し、(c)その動物反応と野生型GNMT遺伝子を持っている動物の薬物候補に対する反応を比較し、(d)観測から得たその動物と、野生型GNMT遺伝子を持つ動物との異なった反応に基づいてその薬物候補をスクリーニングする。
【発明の効果】
【０００７】
細胞モデルにおいて、マウスの神経前駆幹細胞がGNMTを発現することが見られるが、マウスモデルにおいて、GNMT遺伝子の発現は神経前駆幹細胞との幾つかの脳区域、例えば大脳皮質層、線条体および黒質(substantia nigra)などで観察されることができる。そのほか、うつ病と精神分裂症に類似する行動は主にGNMTノックアウトマウスに現れる。これらの結果は脳の機能および発達過程においてGNMTが重要な役割を担っていることを示す。
【０００８】
本研究の実験結果によると、GNMTノックアウトマウスの脳内でドーパミンおよびドーパミン代謝産物(2-ヒドロキシフェニル酢酸)の顕著な減少が見られた。また、我々は野生型マウスと比較してGNMTノックアウトマウスは聴覚性驚愕テスト(acoustic startle test)の先行刺激抑制反応において著しい低下状況を呈した。同時にGNMTノックアウトマウスが尾部懸垂実験および強制水泳実験において簡単に抵抗をやめて、不動時間が顕著に増加した。
【０００９】
ロータロッド(RotaRod)実験の結果によると、GNMTノックアウトマウスは野生型より運動能力が低下していた。GNMTノックアウトマウスはうつ病と精神分裂症に似たような行動を表す。マイクロアレイ解析によると、GNMTノックアウトマウスでアルツハイマ病関連遺伝子の有意な増加が見られた。そのため、本発明の動物モデルはうつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の研究に使用することができる。
【００１０】
本発明の動物モデルにおいて、その動物には哺乳動物、霊長類動物と齧歯動物を含めている（しかし、これらに限られていない）。好適な実施例はマウスである。
本発明はまたうつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の病理状態を現す動物の作製する方法を提供する。この方法には、GNMT遺伝子座における組み換えを行うことによってこの動物のGNMT遺伝子を破壊する方法も含まれている。病理状態の特徴としては、先行刺激抑制反応において有意な先行刺激抑制の低下を呈し、尾部懸垂実験および強制水泳実験において不動時間が増加されるのとアルツハイマ病関連遺伝子の発現量の増加である。アルツハイマ病関連遺伝子の発現において、BACE 1、BACE 2、APH-1、GSK-3、MAPTおよびIDEを含む (しかし、これらに限られていない)遺伝子の発現量が有意に増加する。
【００１１】
本発明はさらにうつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の予防または治療に対する薬物候補をスクリーニングする方法を提供し、それは(a)ある薬物候補を本発明の動物モデルに投与し、(b) その薬物候補に対する動物の反応を測定し、(c)そのモデル動物の反応と野生型GNMT遺伝子を持っている動物の薬物候補に対する反応を比較し、(d)観察し得たそのモデル動物と野生型GNMT遺伝子を持つ動物の異なった反応に基づいてその薬物候補を選び出すといったことからなる。
【００１２】
本文中に用いられる用語”薬物候補”というのは、その薬理活性または他の活性を持っているかどうか研究途中である構成物質、または、すでにその活性と他の活性が知られているが、まだ特定固体中でいかなる活性があるか測定中のもののことであり、その薬物候補には核酸、ポリペプチド、及び化合物を含む。また、臨床結果は候補薬物の活動の特徴になることができます。
【００１３】
本発明はさらにうつ病、精神分裂症とアルツハイマ病の予防または治療に対する薬物候補をスクリーニングする方法を提供すし、それは  （a）哺乳動物細胞の内因性GNMT遺伝子の破壊を提供し、その破壊は同じ状況下で、その哺乳動物のGNMT生物活性レベルが野生型の細胞と比べて低下され、(b)有望の薬物候補をステップ(a)に投与し、（c）その細胞の反応と野生型GNMT遺伝子を持つ細胞の反応と比較し、そして(d)観察し得たその細胞と野生型GNMT遺伝子を持つ細胞との異なった反応に基づいてその薬物候補を選び出すといったことからなる。本発明方法において、その細胞はノックアウトした人以外の哺乳動物に存在し、好適な細胞は脳の神経細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態の動物モデルの目標ベクターを構築することを示す模式図である。
【図２】本発明の一実施形態の動物モデルのGNMT遺伝子座に対する標的修正を示す模式図であって、(A)は、GNMTエクソン1-4と一部分のエクソン5でネオマイシン耐性遺伝子に入れ替わるという設定がされている目標ベクター、及び、ネオマイシン正の選択マーカーは二つの相同の部分がついており、そして目標ベクターの3’末端でTK（チミジンキナーゼ）負の選択マーカーが付け加えられることを示す模式図であり、(B)は、胚性幹細胞（ES細胞）クローンについてのサザンブロット分析を行い、BamHI (B)-BamHI DNA断片サイズが7.9kb（野生型対立遺伝子）から5.3kb（組み換え型対立遺伝子）に減少したことを示す特性図であり、(C)は、PCR(遺伝子増幅)法によるGNMTノックアウトマウスの遺伝子型を分析し、正常なGNMT対立遺伝子は772bp断片を生じ、分離された対立遺伝子は409bp断片を生じ、+/+  野生型、+/-  GNMTヘテロ型、-/-  GNMT ノックアウトマウスを示す特製図であり、（D）は、ウェスタンプロット分析により確認されたGNMTタンパク質の発見を示す特性図であり、個々のレーンは10 μｇの肝臓ライセートを含み、GNMT分子量：32 kDa、GAPDH：内部標準である。
【図３】雄のGNMT‐/‐マウスが先行刺激抑制反応において有意な先行刺激抑制の低下を示したことが表す特性図であり、データは平均値± S.E.M.で示し；*p < 0.01である。
【図４】TSTとFSTにおいて、GNMT-/-は有意な不動時間の増加を示したことが表されている特性図であり、データは平均値± S.E.M.で示し；*p < 0.05である。
【図５】開放式空間活動力において、GNMTノックアウトマウスと野生型マウスは有意な差が呈しなかったことが表されている特性図である。
【図６】ロータロット実験の短期潜伏において、GNMTノックアウトマウスは運動障害の低下傾向があることが表されている特性であり、データは平均値± S.E.M.で示し；*p < 0.05である。
【図７】Q-PCR解析の結果、雄GNMTノックアウトマウス大脳皮質中アルツハイマ病と関連する遺伝子にはAPP、BACE1、BACE2、APH-1α、GSK-3β、MAPT、SNCαおよびIDEなどのmRNAの発現が見られたことを表された特性図であり、データは平均値± S.E.M.で示し；*p < 0.05である。
【図８】蛍光免疫画像を利用し、ネスチン(A)とGNMT(B)が神経前駆細胞表面に発現することが表されている特性図である。
【図９】RT-PCR解析を利用し野生型マウスにおけるGNMT mRNAの発現状況を示したものが表されている特性図であり、(A)は、GNMT mRNAは異なる脳区域に分布していることを示し、(1)嗅球(2)皮質層(3)線条体(4)中脳(5)小脳(6)脊髄(7)海馬(8)視床と視床下部(9) 脳橋と延髄(10)脳幹、(B)は、免疫組織化学的染色法を利用し野生型マウス脳におけるGNMT発現を観察した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（一実施形態）
以下、本発明の一実施形態を実施実験及び図に基づいて説明する。
（実施実験1:GNMTノックアウトマウスの作製）
目標ベクターを構築し、バクテリオファージ純系株3-2及び5-3に切断されるDNA断片をプラスミド-pBluescriｐII KSの中に挿入した。左アームはPst Iを用いてファージクローン5-3から切断され、pNEOベクターに挿入された。右アームはHinc IIを用いてファージクローン3-2から切断され、TKベクターに挿入された。図1に示すように、右アームとTK遺伝子を含んでいる断片がNot Iを用いて切断され、左アームを含んでいるpNEOベクターに挿入されることによって目標ベクターが作り出される。
【００１６】
（マウスGNMT遺伝子のエクソン 1-4およびエクソン5の一部分を入れ替える）ネオマイシン遺伝子は、目標ベクターで2つのDNA断片（3.1kbと3.7kb）に挟まれる。図2Aに示すように、チミジンキナーゼ遺伝子が負の選択マーカーとして使われた。40μg目標ベクターは、AscIを用いて線形化され、エレクトロポーレーションによってES細胞（129/Sv-derived）に導入された。図2Bに示すように、サザンブロット分析を使って278個の純系クローンをスクリーニングした後、組み換え純系クローンを分離し、マイクロインジェクション法によって胚盤細胞に注入した。得られた4匹の雄キメラマウスは生み出され、雌C57BL/6マウスを繁殖するのに用いられた。灰色のF1世代の崩壊された対立遺伝子における生殖細胞系の遺伝を検知するため、PCRを行った。ヘテロ接合性のF1雄マウスと野生型C57B/6の雌マウスをと戻し交配し、C57BL/6ゲノム遺伝的背景を持つマウスを得る。
【００１７】
PCRは、野生型（+/+）とGNMTヘテロ接合性（+/-）、GNMT‐/‐マウスを区別するために行われ、下記のプライマーが使用された。
GNMTにおいて：GNMT−F（5'-GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC）とGNMT−R（5'-TTGCAGTCTGGCAAGTGAGC）;
ネオマイシンにおいて：ネオマイシンＦ（5'-GTTCCTTGCGCAGCTGTGCT）とネオマイシンＲ（5'-CGGCCACAGTCGATGAATCC）。
【００１８】
図2Cに示すように、正常のGNMT対立遺伝子はGNMTプライマーにより772bp断片が産生され、崩壊された対立遺伝子はそうしたネオマイシンプライマーにより409bp断片が産生された。肝臓におけるGNMTタンパク質の発現は、ウエスタンブロット法で分析され、その結果、図2Dに示すように、野生型と比較したら、GNMT+/-マウスは肝臓におけるGNMT発現がおよそ50%が減って、GNMT-/-マウスはその肝臓でGNMTが検知されることができなかった。
【００１９】
（実施実験2: 先行刺激抑制反応）
この装置は二つの脅嚇室(Med Associates、 Georgia、 VT)を含んでいる。野生型コントロール群から一匹のマウスを選び、GNMT欠損群からもう一匹のマウスを選んで同時に実験を行う。マウスを脅嚇室に入れ、60デシベルの背景ノイズ音を聞かせながら5分間環境に順応させる。次いで、10回の驚愕刺激を与え、平均15秒ごとに一回刺激を与える(120デシベル、40m秒時間)。続いての20分間内に、刺激を与えてないパタン（背景ノイズ、68デシベル）、先行刺激のみ与えたパタン（72、76、及び84デシベル、持続時間20m秒）、驚愕刺激のみのパタン、および先行刺激を与えた80m秒後に驚愕刺激を与えたパタンの4種類の刺激に対しランダムの順位で各6回の驚愕反応の大きさを記録する。
【００２０】
先行刺激抑制反応(PPI)は先行刺激が存在する状況での驚愕の大きさと、先行刺激がない状況下での驚愕の大きさとを比べて減少した量であると定義されている。%PPI = [1 - (先行刺激テスト/個別驚愕テスト)]×100。図3に示すように、GNMTノックアウトマウスは先行刺激反応で有意な先行刺激抑制の低下を呈した。
【００２１】
（実施実験3：尾部懸垂実験）
8-12週齢の雄及び雌のマウスの尾を固定し懸垂して置く。マウスは”興奮”または”逃避”の行動過程を経て、最終的に静止姿勢になるのは落胆状態を反映するのである。それで、5分間の測定期間中の不動時間を記録する。図4Aの結果により、GNMT- / -マウスは不動時間の有意な増加を示した。
【００２２】
（実施実験4：強制水泳実験）
8-12週齢の雄及び雌のマウス（野生型n=11、ノックアウト型n＝13）をそれぞれ水深12cmの長方形水槽（高さ30cm、直径15cm）（温度22 ± 1℃）に6分間入れておく。すべての過程で動かさないように固定し、最後の5分間に記録を行う。図4でGNMT - / -マウスの動きが減少する。動きというのは主動的な運動及び受動的な揺れ動が少ないと定義されている。
【００２３】
（実施実験5：活動力テスト）
8-12週齢のGNMT - / -マウスと野生型マウスとを長さ90cm× 幅90cm× 高さ30cmの開放空間に置いてテストを行う。
マウスごと10分間発動テストを行い、テスト時間はすべて17:00から19:00の間に行われた。図5で示した結果は観測ソフトウェアによって得られた。2種類の性別の野生型とGNMT - / -マウスとの間には有意な差がなかった。  
【００２４】
（実施実験6：ロータロッド(RotaRod)実験）
測定を行う当日、すべての動物は測定ルームへ移動され最低30分間新環境に順応された。次いで、マウスをrotarod装置の回転バー（直径3cm、堅固で滑り止めが入ったプラスチック製品）に載せて測定を行った。すべてのマウスを装置の回転スピードに慣れさせるため最低連続4回の先行測定を行い、測定期間中装置の回転バーは一定の回転スピード（1回は0rpmほかの3回は5rpm）に固定された。毎回の先行測定は5分間の間隔を置いて行った。訓練を受けた動物は連続3回の5rpmで60秒間のテストで乗り続けることができる。3つの試験は5段階の回転スピード(14、18、22、26及び30rpm)に固定し、各段階の回転スピードにおいて動物が落ちるまで150秒持続して行われる。動物ごとについてバーの各回転スピードで乗り続ける時間を記録する（落ちるまで）。ゴールしたか落ちたかを問わず、毎回の単独の測定と30分の測定が終わった後、各動物は少なくとも5分の休憩が許されている。3つのテスト中で、すべてマウスの全体の平均様子(ORP)の計算方法は、台形曲線の下面積であって、回転バーの上に乗った時間にバーの回転スピードをかけた数値になる（図6）。
【００２５】
（実施実験７：RNA分離とRT-PCR）
RNA抽出試薬のRNA抽出液を使用し組織からトータルRNAを抽出した。嗅球、線条体、中脳、小脳、脊髄、海馬、視床下部、髄質と脳幹から抽出し得たリボ核酸(5μg)に対して、逆転写酵素キット(Invitrogen)を使用して逆転写を行い、相補DNAを合成した。PCRの条件は94℃で5分間加熱変性させてから30サイクルの増幅を行う：94℃-30秒、60°C-30秒、72℃-1分、この後に72℃-10分のステップを行う。プライマーとして、GNMTに用いる m-GNMT-F (5’-GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC)およびm-GNMT-R (5’-TTG CAGTCTGGCAAGTGAGC)と、β-アクチンに用いるβ-アクチン-F (5’-GGGCGCCCCAGGCACCA) およびβ-アクチン-R (5’-CTCCTTAATGTCACGCCGATTTC)とを使用した。
【００２６】
（実施実験8：リアルタイムPCR）
アルツハイマ病の形成過程における10個の関連遺伝子をリアルタイムPCRで分析した。プライマー発現ソフトを利用しリアルタイムPCRのプライマーを設計し、BLASTを使用し配列の特異性を検証した。希釈した総容量が10μl のcDNAサンプル、プライマー(100 nM)と蛍光色素で標識したヌクレオチドを混合液の中で反応を起せる。そして、配列検出システムを用いて解析を行った。
【００２７】
図７に示すように、1サイクルの循環を経て、PCR増幅産物がゆっくり変性し熔解曲線を描くようになり、増幅の特異性を検証する。予定のサイクル閾値（CT）は表計算ソフトで分析しえる。CTを比較する方法でGAPDHに対する相対遺伝子発現倍率を決定する。リアルタイムPCRにはプライマーとして、APPに用いるAPP-F(5’-GCCAGCCAATACCGAAAATG)及びAPP-R(5’-GATGTTTGTCAGCCCAGAACCT)と、BACE1及びBACEに用いるBACE1-F(5’- ACGACTCTTTGGAGCCCTTCT)及びBACE1-R(5’- AGAGCTGCAGGGAAAAGATGTT)と、BACE2に用いるBACE2-F(5’-CACGGAAGACATAGCCAGCAA)及びBACE2-R(5’-TCAGGGCATAGGACACAATCC)と、 IDEに用いるIDE-F(5’-CGTCCAATCTGATGGCGATT)及びIDE-R(5’-GAACAGCTTCACCACCAGGTTA)と、SNCAに用いるSNCA-F(5’-AAACACCTAAGTGACTACCACTTATTTCTAAA)およびSNCA-R(5’-TCTTGGAGCAAATCACAACTTCTT)と、
MAPTに用いるMAPT-F (5’-AGCAATGAGAGATTTGAGACTTGGT)及びMAPT-R(5’-CCTTCGCTGTCGCTGTTTC)と、APH1αに用いるAPH1α-F (5’-ATGCACGGCTCCAGTATGG)及びAPH1α-R(5’-GCAAAACGGAACACTTCCTGTAG)と、GSK3βに用いるGSK3β-F(5’-CGGGACCCAAATGTCAAACT)及びGSK3β-R(5’-TCCGAGCATGTGGAGGGATA)と、GAPDHに用いるGAPDH-F (5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA)及びGAPDH-R(5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAG)とを使用した。
【００２８】
（実施実験9：蛍光免疫染色）
神経前駆細胞培養はZhouらが発表した方法に従って、7日から10日間の培地を使って培養し、0.1M冷たいPBSで3回洗ってから、4%のメタホルムアルデヒドで4時間固定した後0.1% TritonX-100に30分浸けて置く。(a)神経前駆細胞のネスチンに対する抗体(1:500)、または(b)GNMTに対する抗体(1:250)の免疫細胞化学的染色を用いて、神経球体の表現型を検討した。
【００２９】
（実施実験10：免疫組織化学的染色）
野生型マウスの脳組織を取り出し10%の中性ホルマリン緩衝剤で固定する。PBSで溶解した30%のスクロース液で脱水した後、凍結切片法で組織を切り出す。組織切片と1/100濃度のウサギ抗GNMT血清を混合し4℃でオーバーナイト反応させる。次いで、PBSの中で洗浄した後、切片を室温で抗ビオチン抗体およびペルオキシダーゼで標識した抗ストレプトアビジンと10分間反応させる。これらの切片と3.3'-ジアミノベンジジン溶液と混合し発色反応を起こせる(図9)。
【００３０】
（実施実験11：統計分析）
遺伝型に基づいてすべてのデータを集め、各グループごと平均値を確定する。結果は平均± SEMで表し、t-検定で分析を行い、P≦0.05を有意差がある標準と定めた。
【００３１】
本発明は特定の方法論や、プロトコル、細胞株、動物の種または属、構築物、記述された試薬に限られていないことは理解すべきである。そうしたものは、もちろん、変化させる可能性がある。もう一つ理解すべきことは、ここで使用される用語が特定の実施例を説明するという目的だけで使われ、本発明の範囲を制限しようとするのはその目的ではないということである。本発明は、添付した特許請求の範囲だけによって制限されるのである。
【００３２】
この技術を熟知している人が本発明の範疇に基づいて効果が同等な変更または修正を行うことは本発明の請求範囲に属するべきである。
【００３３】
すべての特許および出版物説明書中に言及されているのはその発明所属技術の一般的な方法である。すべての特許と出版物は同様な範囲の上でこの中の合併を参考にし、それぞれの出版物は明確に単独的に合併を参考することを表明する。
【００３４】
本発明の説明は元素のありまたはなし、制限または無制限の場合に実行に適していると述べられる。このような条件の使用といかなる同等の機能表示と陳述またはその中のある部分を排除することを意図しない、各種変更請求範囲内にあれば許可されることである。そのため、本発明はベストの実施例および選定した機能で具体的に示したが、本概念が指摘した改正と変化は発明の分野の技術を採用することができ、これらの改正と変化は本発明の特許請求の範囲に基づいて追加されたものである。
【図１】
2010259431.tif 000003
【図６】
2010259431.tif 000004
【図２】
2010259431.tif 000005
【図３】
2010259431.tif 000006
【図４】
2010259431.tif 000007
【図５】
2010259431.tif 000008
【図７】
2010259431.tif 000009
【図８】
2010259431.tif 000010
【図９】
2010259431.tif 000011