(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬品化合物の消化管での吸収を改善し、経口投与等において充分な治療効果が期待できる血中濃度が得られる医薬製剤、及びその製法を提供する。【解決手段】プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物とｐＨ感受性高分子を含む製剤であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を含有してなる、消化管での吸収性が良好な製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物とｐＨ感受性高分子を含む製剤であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を含有してなる、消化管での吸収性が良好な製剤。
【請求項２】
プロトン駆動型トランスポーターが、小腸の上皮細胞に発現する吸収輸送系トランスポーターである請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
プロトン駆動型トランスポーターが、ペプチドトランスポーター、モノカルボン酸トランスポーター、及びＤ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターからなる群から選ばれる１種である請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
プロトン駆動型トランスポーターが、ペプチドトランスポーターである請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
ペプチドトランスポーターに認識される化合物が、ペプチド、β-ラクタム抗生物質、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、及びω−アミノカルボン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
プロトン駆動型トランスポーターが、モノカルボン酸トランスポーターである請求項３に記載の製剤。
【請求項７】
モノカルボン酸トランスポーターに認識される化合物が、乳酸、ピルビン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、グリコール酸、ニコチン酸、サリチル酸、安息香酸、パラアミノ安息香酸及びホスカルネットからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
プロトン駆動型トランスポーターが、Ｄ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターである請求項３に記載の製剤。
【請求項９】
Ｄ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターに認識される化合物が、L-アラニン、β-アラニン、L-プロリン及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨが、該プロトン駆動型トランスポーターを発現した細胞を使用し、各種ｐＨ条件における該化合物の細胞内取り込み量を評価して測定されたものである項１に記載の製剤。
【請求項１１】
プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨが、イン シチュ クローズド ループ法を用いて該化合物の消化管内移行量を評価して測定されたものである項１に記載の製剤。
【請求項１２】
ｐＨ感受性高分子が、乾燥メタクリル酸コポリマー、メタアクリル酸コポリマーLD、メタアクリル酸コポリマーL、メタアクリル酸コポリマーS、ポリアクリル酸、マレイン酸-n-アルキルビニルエーテル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
ｐＨ感受性高分子が、オイドラギットL100-55、オイドラギット 30D-55、オイドラギット L100、オイドラギット S100、オイドラギットP-4135F、ポリアクリル酸、マレイン酸-n-アルキルビニルエーテル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の経口投与用製剤。
【請求項１５】
下記の(1)及び(2)の工程を含む消化管での吸収性が良好な製剤の製法：
(1) プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の該プロトン駆動型トランスポーターにおける至適細胞内取り込みｐＨを測定する工程、及び
(2) 上記至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を該化合物に配合する工程。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製法により得られる製剤。
【請求項１７】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させるための製剤であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子と、プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物とを含有してなる製剤。
【請求項１８】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させる方法であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨに制御することを特徴とする方法。
【請求項１９】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させるために、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を配合する方法。
【請求項２０】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させるための、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子の使用。
【請求項２１】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性が向上された製剤を製造するための、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトン駆動型トランスポーター介在型消化管吸収改善剤及びその製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に多くの慢性疾患領域において、経口投与法は、利便性もしくはコストの点から望ましい投与経路であると考えられている。しかしながら、多くの医薬品候補化合物は、消化管における膜透過性が低いもしくは消化管内において不安定であるため経口での吸収性が低下し、充分な薬理効果を得る血中濃度を維持できないという現状に直面する。
【０００３】
また、小腸上皮細胞に発現する吸収輸送系トランスポーターに認識される有機化合物が報告されているにもかかわらず、該有機化合物の中には難吸収性を示す傾向のあるものも存在することも知られている（例えば、非特許文献１、２など）。
【０００４】
このような状況の中で、医薬品候補化合物の吸収改善に種々の吸収促進剤もしくは酵素阻害剤を利用することが検討されている。例えば、非特許文献３及び４には、ペプチドの吸収改善のために吸収促進剤を利用する方法が記載されている。しかし、この方法は、本来吸収を促進するために添加する吸収促進剤により細胞が障害を受けるという問題点がある。
【０００５】
一方、非特許文献５及び６には、消化管における分解を抑制し吸収をさせる目的で、酵素阻害剤を添加する方法が記載されている。しかし、この方法を用いた場合には、吸収に基質特異性が得られないといった問題点がある。
【０００６】
また、消化管における排出輸送系に認識されるフロセミドの吸収を改善するために、ｐＨ感受性高分子を添加するなどの方法も知られているが（例えば、非特許文献７）、トランスポーターを利用した消化管吸収の改善を示唆するものではなく、上記と同様、消化管吸収に基質特異性は得られないといった問題点がある。
【０００７】
また、従来、吸収輸送系トランスポーターの基質でありながら難吸収性を示す有機化合物の吸収を促進させた例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sakamato et al., J. Antibiot. 38: 496-504 (1985)
【非特許文献２】Kelly et al., Clin. Pharmacokinet. 19:177-196 (1990)
【非特許文献３】Swenson et al., Adv. Drug. Del. Rev. 8: 39-92 (1992)
【非特許文献４】Kompella et al., Adv. Drug. Del. Rev. 46: 211-245 (2001)
【非特許文献５】Hayakawa et al., Pharm. Res. 9: 535-540 (1992)
【非特許文献６】Zhou et al., J. Control. Rel. 29: 239-252 (1994)
【非特許文献７】Terao et al., J. Pharm. Pharmacol. 53: 433-440 (2000)
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、医薬品化合物の細胞内への吸収を改善し、経口投与等において充分な治療効果が期待できる血中濃度が得られる医薬製剤、及びその製法を提供することにある。具体的には、プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物と、該プロトン駆動型トランスポーターにおいて該化合物の消化管内における至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子とを含む、消化管での吸収性が良好な製剤及びその製法を提供することにある。
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、以下の新規な知見(1)及び(2)を得た。
(1) ペプチドトランスポーター（プロトン駆動型トランスポーターの１つ）で認識される化合物（以下「基質」ともいう）が消化管で難吸収性の傾向を示す場合があるのは、ペプチドトランスポーターの基質輸送駆動力であるプロトン（Ｈ＋）が消化管下部にいくにつれて減少し基質輸送能力が低下するためであること、及び
(2) 特定量のｐＨ感受性高分子を基質に添加することによりペプチドトランスポーターの駆動力が向上し、難吸収性傾向を示す基質の消化管からの吸収性が改善されること。
【００１１】
本発明者らは、これらの知見に基づき、プロトン駆動型トランスポーターがその至適細胞内取り込みｐＨにおいて基質の取り込みが最も促進されることを見出し、これを更に発展させて本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の技術を提供する。
【００１３】
項１．  プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物とｐＨ感受性高分子を含む製剤であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を含有してなる、消化管での吸収性が良好な製剤。
【００１４】
項２．  プロトン駆動型トランスポーターが、小腸の上皮細胞に発現する吸収輸送系トランスポーターである項１に記載の製剤。
【００１５】
項３．  プロトン駆動型トランスポーターが、ペプチドトランスポーター、モノカルボン酸トランスポーター、及びＤ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターからなる群から選ばれる１種である項２に記載の製剤。
【００１６】
項４．  プロトン駆動型トランスポーターが、ペプチドトランスポーターである項３に記載の製剤。
【００１７】
項５．  ペプチドトランスポーターに認識される化合物が、ペプチド、β-ラクタム抗生物質、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、及びω−アミノカルボン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである項４に記載の製剤。
【００１８】
項６．  プロトン駆動型トランスポーターが、モノカルボン酸トランスポーターである項３に記載の製剤。
【００１９】
項７．  モノカルボン酸トランスポーターに認識される化合物が、乳酸、ピルビン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、グリコール酸、ニコチン酸、サリチル酸、安息香酸、パラアミノ安息香酸、及びホスカルネットからなる群から選ばれる少なくとも１つである項６に記載の製剤。
【００２０】
項８．  プロトン駆動型トランスポーターが、Ｄ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターである項３に記載の製剤。
【００２１】
項９．  Ｄ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターに認識される化合物が、L-アラニン（α−アラニン）、β-アラニン、L-プロリン、及びグリシンからなる群から選ばれる少なくとも１つである項８に記載の製剤。
【００２２】
項１０．  プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨが、該プロトン駆動型トランスポーターを発現した細胞を使用し、各種ｐＨ条件における該化合物の細胞内取り込み量を評価して測定されたものである項１に記載の製剤。
【００２３】
項１１．  プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨが、イン シチュ クローズド ループ法を用いて該化合物の消化管内移行量を評価して測定されたものである項１に記載の製剤。
【００２４】
項１２．  ｐＨ感受性高分子が、乾燥メタクリル酸コポリマー、メタアクリル酸コポリマーLD、メタアクリル酸コポリマーL、メタアクリル酸コポリマーS、ポリアクリル酸、マレイン酸-n-アルキルビニルエーテル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートからなる群から選ばれる少なくとも１つである項１に記載の製剤。
【００２５】
項１３．  ｐＨ感受性高分子が、オイドラギットL100-55、オイドラギット 30D-55、オイドラギット L100、オイドラギット S100、オイドラギットP-4135F、ポリアクリル酸、マレイン酸-n-アルキルビニルエーテル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートからなる群から選ばれる少なくとも１つである項１に記載の製剤。
【００２６】
項１４．  項１〜１３のいずれかに記載の経口投与用製剤。
【００２７】
項１５．  下記の(1)及び(2)の工程を含む消化管での吸収性が良好な製剤の製法：
(1) プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の該プロトン駆動型トランスポーターにおける至適細胞内取り込みｐＨを測定する工程、及び
(2) 上記至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を該化合物に配合する工程。
【００２８】
項１６．  項１５に記載の製法により得られる製剤。
【００２９】
項１７．  プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させるための製剤であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子と、プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物とを含有してなる製剤。
【００３０】
項１８．  プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させる方法であって、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨに制御することを特徴とする方法。
【００３１】
項１９．  プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させるために、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を配合する方法。
【００３２】
項２０．  プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性を向上させるための、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子の使用。
【００３３】
項２１．  プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の消化管での吸収性が向上された製剤を製造するための、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける該化合物の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子の使用。
【００３４】
本発明は、プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物（基質）とｐＨ感受性高分子を含む製剤であり、消化管内を該プロトン駆動型トランスポーターにおける基質の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を含有してなる製剤であり、消化管での吸収性が良好な製剤に関する。
【００３５】
本発明について以下詳細に説明する。
【００３６】
プロトン駆動型トランスポーター
本発明におけるプロトン駆動型トランスポーターとは、哺乳動物（特に、ヒト）の消化管から細胞内に向けてプロトン（Ｈ＋）勾配を利用し輸送を行う能動輸送型のトランスポーターをいう。プロトン駆動型トランスポーターは、消化管、具体的には消化管刷子縁膜側表面近傍（特に、小腸上皮細胞刷子縁膜側表面）等に発現しており、細胞内に栄養物質や薬物を能動的に取り込む吸収輸送型のトランスポーターである。上記の小腸には、十二指腸、空腸、回腸が含まれる。
【００３７】
本発明におけるプロトン駆動型トランスポーターの具体例としては、ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）、モノカルボン酸トランスポーター、Ｄ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーター等が挙げられる。
【００３８】
上記ペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）は、ジペプチド、トリペプチド、それらの類似化合物の輸送を媒介するトランスポーターであり、生体における蛋白質の吸収やペプチド性窒素源の維持に寄与する。具体的には、７１０個のアミノ酸からなり主に小腸や腎臓に発現しているペプチドトランスポーター１（ＰＥＰＴ１）、及び７２９個のアミノ酸からなり主に腎臓や、脳、肺、脾臓等に発現しているペプチドトランスポーター２（ＰＥＰＴ２）が挙げられる。
【００３９】
なお、上記の吸収輸送型ペプチドトランスポーターにより小腸上皮細胞内に取り込まれた化合物は、小腸上皮細胞の側底膜に存在する側底膜型ペプチドトランスポーターにより血中に輸送される。側底膜型ペプチドトランスポーターは、濃度勾配に従った輸送を媒介する促進拡散型のトランスポーターである。
【００４０】
上記モノカルボン酸トランスポーターは、乳酸の輸送を媒介するトランスポーターであり、生体における嫌気的解糖の最終生成物である乳酸の維持に寄与する。
【００４１】
上記Ｄ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターは、アミノ酸の輸送を媒介するトランスポーターであり、生体におけるアミノ酸の維持に寄与する。
【００４２】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物（基質）
本発明におけるプロトン駆動型トランスポ−ターに認識される化合物とは、プロトン駆動型トランスポーターに認識され消化管から細胞内（例えば、小腸上皮細胞）に取り込まれ得る化合物をいう。まず、化合物がプロトン駆動型トランスポーターに認識されるか否かは、例えば次のようにして判定される。
【００４３】
対象となるプロトン駆動型トランスポーターが発現している細胞及び発現していない細胞を使用して、該化合物の細胞内取り込み量を測定する。プロトン駆動型トランスポーターが発現している細胞で該化合物の取り込みが高い場合には、該化合物の細胞内移行にプロトン駆動型トランスポーターが関与することが考えられる。
【００４４】
ここで、プロトン駆動型トランスポーターが発現している細胞とは、内在的にプロトン駆動型トランスポーターを発現している細胞を意味する。例えば、内因的にペプチドトランスポーターを発現している細胞として、Caco-2細胞、HT-29細胞、COLO-320細胞、HT-1080細胞、AsPc-1細胞、Capan-2細胞およびSK-ChA-1細胞等が挙げられる。
【００４５】
さらに、該化合物の取り込みが観察された細胞を使用し、プロトン駆動型トランスポーターに認識されることが既に判っている基質（例えば、セファドロキシル(CDX)）を該化合物と同時に試験溶液に添加し、細胞内取り込みを評価したときに、該化合物の細胞内取り込み阻害効果が観察されれば、評価した該化合物はプロトン駆動型トランスポーターに認識されると判定される。
【００４６】
或いは、プロトン駆動型トランスポーターが発現している細胞を、例えば、ＰＥＰＴ１ｃＤＮＡを哺乳類培養細胞発現ベクターに組み込み、ＰＥＰＴ１ｃＤＮＡを含むベクターをトランスフェクトした後、モデル細胞（例えば、HeLa細胞）に過剰発現させる等の公知の方法により作製し、該化合物の細胞内取り込み量を測定してもよい。
【００４７】
化合物の細胞内取り込み量の測定は、プロトン駆動型トランスポーターを発現している細胞及び発現していない細胞における、単位細胞タンパク質重量あたりの化合物の細胞内移行量（細胞に含まれる全タンパク質量を基準とした細胞内に移行した該化合物量）を評価して測定される。例えば、ペプチドトランスポーターの場合は、ペプチドトランスポーターを発現した及び発現していない細胞に対する該当化合物移行量を測定し、両細胞における単位細胞タンパク質重量あたりの細胞内移行量（μＬ／ｍｇ protein）を比較し、取り込みに及ぼすトランスポーターの寄与を評価して測定される。
【００４８】
プロトン駆動型トランスポーターのうち上記のペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ）は、他の栄養物質トランスポーターに比べて広範な基質認識性を有している。そのため、ＰＥＰＴ（特に、ＰＥＰＴ１）において認識され小腸上皮細胞内に取り込まれる化合物としては、ペプチドのみならず、β-ラクタム抗生物質、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、ω−アミノカルボン酸等の広範な医薬化合物が挙げられる。
【００４９】
具体的には、ペプチドとしては、ジペプチド、トリペプチドが挙げられる。ジペプチドとしては、天然又は合成アミノ酸から選ばれる任意の２つのアミノ酸をアミド結合して得られるものであればよく、そのうち好ましいものとしてはグリシルサルコシン、カルノシン、リジノプリル等が例示される。トリペプチドとしては、天然又は合成アミノ酸から選ばれる任意の３つのアミノ酸をアミド結合して得られるものであればよく、そのうち好ましいものとしてはPhe-Cys-Val、Glu-His-Pro、Phe-Ala-Proが例示される。
【００５０】
β-ラクタム抗生物質としては、例えば、ペニシリン系、セフェム系抗生物質等が挙げられ、具体的には、アモキシリン、アンピシリン、シクラシリン、フェノキシ−メチルペニシリン（phenoxy-methylpenicillin）、プロピシリン、カルフェシリン（carfecillin）、カルベニシリン（carbenicillin）、バカムピシリン（bacampicillin）、ピバムピシリン（pivampicillin）、セファドロキシル、セフィキシム、セフチブテン、セファクロル、セファレキシン、セフラジン、SCE-100、セファトリジン、セファロチン、セフジニル、ロラカロベフ（loracarobef）、 FK089、ラタモキセフ（latamoxef）、ピブセファレキシン（pivcefalexine）、セファゾリン、セフォペラゾン、セフォキシチン、セフォチアム、セフメタゾール等が例示される。
【００５１】
アンジオテンシン変換酵素阻害剤としては、カプトプリル、エナラプリル、キナプリル、ベナゼプリル（benazepril）、フォシノプリル（fosinopril）、リシノプリル（lisinopril）、SQ 29852、エナラプリラート、キナプリラート、ベナセプリラート（benazeprilat）、フォシノプリラート（fosinoprilat）等が例示される。
【００５２】
抗ウイルス薬としては、バラシクロビル等が例示される。
【００５３】
抗腫瘍薬としては、ベスタチン等が例示される。
【００５４】
ω−アミノカルボン酸としては、一般式[１]：
Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ          [１]
（式中、ｎは４〜１１の整数を示す）
で示される化合物が挙げられる。
【００５５】
この他にも、L-ドーパ-L-フェニルアラニン（L-dopa-L-Phe）、4-アミノフェニル酢酸（4-aminophenyl acetic acid (4-APAA)）、δ-アミノレブリン酸（δ-aminolevulinic acid (ALA)）等が例示される。
【００５６】
プロトン駆動型トランスポーターのうち上記のモノカルボン酸トランスポーターにおいて認識され細胞内に取り込まれる化合物としては、乳酸、ピルビン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、グリコール酸、ニコチン酸、サリチル酸、安息香酸、パラアミノ安息香酸及びホスカルネット等の化合物が挙げられる。
【００５７】
プロトン駆動型トランスポーターのうち上記のＤ−サイクロセリンを輸送するアミノ酸トランスポーターにおいて認識され細胞内に取り込まれる化合物としては、L-アラニン、β-アラニン、L-プロリン及びグリシン等の化合物が挙げられる。
【００５８】
基質のｐＨプロファイル
本発明において、プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物（基質）のｐHプロファイルとは、ｐＨを変化させたときのプロトン駆動型トランスポーターにおける該基質の細胞内取り込み量の特徴（ｐＨに応じた基質の細胞への移行特性）を意味する。これにより、特定のプロトン駆動型トランスポーターが特定の基質を細胞内に取り込むのに最も適したｐＨを求めることができる。
【００５９】
各種ｐＨにおける基質の細胞内取り込み量（基質の細胞内移行量）の測定は、次のようにして行われる。プロトン駆動型トランスポーターを発現した細胞を使用し、in vitro条件下にて各種ｐＨ条件下における基質の細胞内取り込み量を測定する。例えば、ＰＥＰＴ１に認識される各基質のｐＨプロファイルは、消化管モデル細胞であるヒト大腸ガン由来Caco-2細胞等のＰＥＰＴ１を発現した細胞を使用し、in vitro条件下にて各種ｐＨ条件下（例えば、ｐＨ 5.4-7.5程度）における基質の細胞内取り込み量を測定すればよい。
【００６０】
具体的な測定方法は、報告された方法 (Tsuji A, Takanaga H, Tamai I, Terasaki T. Transcellular transport of benzoic acid across Caco-2 cells by a pH-dependent and carrier-mediated transport mechanism. Pharm Res, 11: 30-37 (1994))に従って行われる（例えば、実施例１を参照）。
【００６１】
In vitro条件下における細胞内移行性は、in vivo消化管における膜透過性を評価する指標となりうる。生理的条件下での消化管のｐＨは通常ヒトで５．４〜７．５と報告されているので(Davies B. and Morris T., Physiological parameters in laboratory animals and humans, Pharm. Res. 10: 1093-1095 (1993))、実際にはin vivoでの消化管からの吸収はこの条件に支配されるものと考えられる。
【００６２】
或いは、各種ｐＨにおける基質の細胞内取り込み量は、ラット消化管ループ（腸管ループ）を用いて各種ｐＨにおける基質の消化管内移行量を測定して見積もることも可能である（イン シチュ クローズド ループ 法(in situ closed loop method)）。ラット消化管ループを使用する場合には、以下の文献記載の方法を参考にして行われる。Barr WH, Riegelman S. Intestinal drug absorption and metabolism. I. Comparison of methods and models to study physiological factors of in vitro and in vivo intestinal absorption. J Pharm Sci, 59: 154-163 (1970)。吉冨博則, 基本的な消化管吸収実験, 「生物薬剤学実験マニュアル」, 後藤  茂 (編), 清至書院, 東京, 2-22 (1985)。
【００６３】
例えば、ラットをペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）腹腔内投与により麻酔する。その後、正中線に沿って開腹し腸管を露出させて、回腸にループを作製する（例えば、図６に模式図を示す）。薬液及び高分子を含むMES buffer (5 mM KCl, 100 mM NaCl, 10 mM 2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid） (MES), 85 mM マンニトール（mannitol）, ポリエチレングリコール（polyethylene glycol） 0.01%; pH 6.0; 浸透圧 290 mOs/kg)を腸管ループ内に入れ両端を結紮する。その後、直ちに腸管ループを腹腔内に戻し、白熱ランプを使用して体温を維持する。投与20分後、腸管ループ内溶液を回収し、pHをpHメーターで測定し及び薬物量をHPLCにより測定する。
【００６４】
また、ＰＥＰＴ１における各基質のｐＨプロファイルは、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞（X. laevis Oocyte）にcRNA hPEPT1を注入し、各種ｐＨにおける卵母細胞への取り込みを測定してもよい。あるいは電気生理学的手法により、ペプチドトランスポーターの基質を添加した時の電位差を検出して測定してもよい。
【００６５】
具体的には、Fei YJ, Kanai Y, Nussberger S, Ganapathy V, Leibach FH, Romero MF, Singh SK, Boron WF, Hediger MA. Expression cloning of a mammalian proton-coupled oligopeptide transporter. Nature, 368: 563-566 (1994)に記載の方法に準じて測定する。
【００６６】
一般に、消化管における基質の至適取り込みｐＨは、対象となるプロトン駆動型トランスポーター及びその基質の種類により変動する。しかし、上記の手法を用いて測定されるｐＨプロファイルにより、各ｐＨでのプロトン駆動型トランスポーターにおける基質の細胞内取り込み量が明らかとなり、プロトン駆動型トランスポーターにおける基質の「至適細胞内取り込みｐＨ」が求められる。
【００６７】
ｐＨ感受性高分子
本発明で用いられるｐＨ感受性高分子とは、生体内における特定部位（例えば、消化管）のｐＨを検知してプロトンの放出を制御する高分子をいう。例えば、ｐＨが高くなればプロトンを放出し、溶解もしくは膨潤する高分子をいう。このｐＨ感受性高分子の一定量を、基質と共に配合することにより、消化管内（特に、消化管刷子縁膜側表面近傍）が上記のプロトン駆動型トランスポーターの基質の至適細胞内取り込みｐＨになるように調節される。
【００６８】
具体的には、乾燥メタクリル酸コポリマー、メタアクリル酸コポリマーLD、メタアクリル酸コポリマーL、メタアクリル酸コポリマーS、ポリアクリル酸、マレイン酸-n-アルキルビニルエーテル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等が例示される。より具体的には、オイドラギット（Eudragit）（登録商標、以下同じ） L100-55、オイドラギット 30D-55、オイドラギット L100、オイドラギット S100、オイドラギットP-4135F等が例示される。これらは、いずれも市販されているもの又は公知の方法で製造できるものを採用することができる。
【００６９】
これらのｐＨ感受性高分子のうち、本発明の製剤に好適に用いられるものとしては、例えば、オイドラギット L100-55、オイドラギット L100、オイドラギット S100、オイドラギットP-4135F等が挙げられ、より好ましくはオイドラギット L100-55、オイドラギット L100である。
【００７０】
製剤
本発明の製剤は、上述のプロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物のｐＨプロファイルに基づき、該化合物に、消化管内を基質の至適細胞内取り込みｐＨとするのに足る量のｐＨ感受性高分子を配合して調製される。上記の消化管内とは、例えば小腸内のことを意味し、具体的には消化管刷子縁膜側表面近傍、より具体的にはプロトン駆動型トランスポーターが発現する小腸上皮細胞刷子縁膜側表面及びその近傍を意味する。
【００７１】
ｐＨ感受性高分子の配合量は、例えば、設定した基質吸収量になるように、実験により求めることができる。In situ closed loop法、ラットへの経口投与試験法等を用いて、基質に対するpH感受性高分子の配合量を変化させて、設定した基質吸収量になるようpH感受性高分子の配合量を求める（例えば、実施例３を参照）。
【００７２】
本発明の製剤におけるｐＨ感受性高分子の配合量は、基質の特性により変化するが、例えば、基質１重量部に対し、１〜１０００重量部程度、好ましくは５０〜５００重量部程度、より好ましくは 100 〜 300 重量部程度を配合すればよい。或いは、ｐＨ感受性高分子の配合量は、製剤全体の重量に対し５〜４０重量％程度、好ましくは10 〜 20 重量％程度配合されていてもよい。
【００７３】
プロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物とｐＨ感受性高分子を含む本発明の製剤の好ましい配合形態としては、例えば、ジペプチドとメタクリル酸コポリマーを配合したもの、β−ラクタム抗生物質とメタクリル酸コポリマーを配合したもの等が挙げられる。
【００７４】
ジペプチドとメタクリル酸コポリマーを配合したもののうち、ジペプチドの具体例としては、グリシルサルコシン、カルノシン、リジノプリル等が挙げられ，メタクリル酸コポリマーの具体例としては、乾燥メタクリル酸コポリマー（例えば、オイドラギットL100-55）、メタアクリル酸コポリマーＬＤ（例えば、オイドラギット30D-55）、メタアクリル酸コポリマーＬ（例えば、オイドラギットL100）、メタアクリル酸コポリマーＳ（例えば、オイドラギットS100）等が挙げられる。より好ましい配合形態としては、グリシルサルコシン又はカルノシンとオイドラギットL100-55とを配合したものが挙げられる。
【００７５】
β−ラクタム抗生物質とメタクリル酸コポリマーを配合したもののうち、β−ラクタム抗生物質としては、ペニシリン系、セフェム系抗生物質等が挙げられ、その具体例としては、アモキシリン、アンピシリン、シクラシリン、フェノキシ−メチルペニシリン、プロピシリン、カルフェシリン、カルベニシリン、バカムピシリン、ピバムピシリン、セファドロキシル、セフィキシム、セフチブテン、セファクロル、セファレキシン、セフラジン、SCE-100、セファトリジン、セファロチン、セフジニル、ロラカロベフ、 FK089、ラタモキセフ、ピブセファレキシン、セファゾリン、セフォペラゾン、セフォキシチン、セフォチアム、セフメタゾール等が挙げられる。メタクリル酸コポリマーの具体例としては、上述のものが挙げられる。より好ましい配合形態としては、セファドロキシル、セフィキシム又はＦＫ０８９とオイドラギットL100-55とを配合したもの等が挙げられる。
【００７６】
本発明の製剤は、上記のプロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物（基質）と所定量のｐＨ感受性高分子を含有してなり、そのまま哺乳動物（特に、ヒト）における経口投与用の散剤として用いることができるが、さらに種々の方法により製剤化し投与することも可能である。例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注腸剤として用いることもできる。これらの製剤中には、必要に応じて製剤上知られる賦形剤、崩壊剤、滑沢剤等の種々の添加剤を配合することができる。
【００７７】
特に、消化管全域に渡って薬物及びｐＨ感受性高分子を送達することが可能な、腸溶性の徐放化製剤等とするのが好ましい。或いは、ｐＨ感受性高分子と薬剤を含む液状の製剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤など）としてもよく、これにより、水分含量の点で通常の錠剤と比較して、消化管全域に渡って薬物及びｐＨ感受性高分子を送達することが可能となる。これらの製剤は、いずれも公知の方法に従い製造することが可能である。
【００７８】
本発明の製剤によれば、共存するｐＨ感受性高分子により消化管内が基質の至適細胞内取り込みｐＨに制御されるため、消化管内においてプロトン駆動型トランスポーターに認識される化合物の吸収性が向上する。特に、本発明の製剤によれば、至適細胞内取り込みｐＨを維持する適量のｐＨ感受性高分子が配合されているため、プロトンが減少する消化管下部（回腸など）においてもプロトン駆動型トランスポーターの輸送能力が低下せず良好な薬物（基質）の吸収性を示すという特徴を有している。そのため、本発明の製剤は、経口投与においても充分な薬物血中濃度を得ることができ、高いバイオアベイラビリティーが達成される。なお、ｐＨ感受性高分子により消化管内のｐＨが制御されるのは一過的であり、消化管内に何ら悪影響を与えるものではない。ここで一過的にとは、基質が細胞内に吸収されるのに必要な時間及び部位において一時的にｐＨが制御されること意味する。
【発明の効果】
【００７９】
本発明の製剤は、プロトン駆動型トランスポーターがその至適細胞内取り込みｐＨにおいて基質の取り込みが最も促進されるという新規な知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明の製剤は、基質のプロトン駆動型トランスポーターにおける至適細胞内取り込みｐＨに着目し、そのｐＨに適合する量のｐＨ感受性高分子を配合することによって製造されるものである。
【００８０】
そのため、本発明の製剤は、医薬品化合物の消化管での吸収を飛躍的に改善し、経口投与等において充分な治療効果が期待できる高い血中濃度が達成される。
【００８１】
また、これまで難吸収性として知られていたプロトン駆動型トランスポーターの基質においても、消化管全域において高い吸収率を達成することができる。
【００８２】
従って、本発明の製剤は、経口投与等での治療効果を低用量で有効に向上させることができるという、医薬製剤として優れた特性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】Caco-2細胞における、各ｐＨでのジペプチドの細胞内取り込み量（ｐＨプロファイル）を示すグラフである。
【図１Ｂ】Caco-2細胞における、各ｐＨでのβ-ラクタム抗生物質の細胞内取り込み量（ｐＨプロファイル）を示すグラフである。
【図２】酸性高分子のMES 緩衝液のpHに及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】β−ラクタム抗生物質（CDX又はCFIX）にオイドラギット L100-55を併用投与した場合の、ラット小腸下部における吸収率及びｐＨを示すグラフである。
【図４】CFIXに高分子を添加しラットに経口投与した場合の血中濃度推移を示すグラフである。
【図５】CFIX及びオイドラギット L100-55にCDXを添加しラットに経口投与した場合の、CFIXの血中濃度推移を示すグラフである。
【図６】In situ closed loop法で用いられる腸管ループを模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８５】
［実施例１］
PEPT1によるジペプチド及びβ-ラクタム抗生物質の細胞内取り込みに対して細胞外液が影響を及ぼすかどうかを明らかにするため、消化管モデル細胞Caco-2細胞を用いて、ジペプチドである [14C]グリシルサルコシン(Glycylsarcosine) ([14C]GlySar)及び[3H]カルノシン (carnosine) 、及びβ−ラクタム抗生物質であるセファドロキシル(cefadroxil) (CDX)、セフィキシム(cefixime) (CFIX)及びFK089について、それらのpH 5.0 〜 pH 7.0における細胞内取り込みを評価した。
【００８６】
４穴プレートに培養した細胞を37°Cに加温したHanks’-balanced salt solution (HBSS) (0.952 mM CaCl2, 5.36 mM KCl, 0.441 mM KH2PO4, 0.812 mM MgSO4, 136.7 mM NaCl, 0.385 mM Na2HPO4, 25 mM D-glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4; 浸透圧 315 mOs/kg) 1 mLで3回洗浄し、薬液を含むHBSS 250 μLを添加し取り込みを開始する。一定時間後に氷冷したHBSS 1 mLで3回洗浄することで取り込みを終了させる。取り込み終了後、5 N NaOH 0.25 mLを加えて2時間振盪して細胞を可溶化し、5 N HCl 0.25 mLで中和し、細胞抽出液に含有される薬物量を、液体シンチレーションカウンターもしくは液体クロマトグラフィー (HPLC)により定量する。細胞の蛋白量は、Bradford法に従い、Protein Assay Kit (Bio-Rad Richmond, CA, USA)を用いて定量する（Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248-254 (1976)）。
【００８７】
Caco-2細胞における上記のジペプチド及びβ−ラクタム抗生物質の取り込みに及ぼすpHの影響を、図１Ａ及び図１Ｂに示した。
【００８８】
図１Ａは、異なるｐＨにおける、３７℃で１０ mＭ［１４Ｃ］ＧｌｙＳａｒ（●）及び０．１５ mＭ［３Ｈ］カルノシン（▲）のCaco-2細胞における5 分までの取り込みを測定したものである。各値は３〜４の実験の平均±標準誤差を表す。
【００８９】
図１Ａによれば、[14C]GlySarの取り込みは明らかにpHに依存し、pH 5.0 〜 pH 6.0で最適な取り込みが観察された。これに対し、弱酸性領域においてはカチオン性を示す[3H] カルノシンの細胞内取り込みは、pH 6.0 〜 7.0において高いことが示された。すなわち、最適な取り込みを示すpHが[14C]GlySarと[3H] カルノシンでは異なることが示された。
【００９０】
図１Ｂは、２ ｍＭ CFIX（□）、２ ｍＭ FK089（○）及び２ ｍＭ CDX（△）の１５分までの取り込みを測定したものである。各値は３〜４の実験の平均±標準誤差を表す。
【００９１】
一方、図１Ｂで示すように、β-ラクタム抗生物質のCaco-2細胞による最適取り込みにおいても、顕著なpH依存が示された。細胞外液のpHを6.0から5.0に低下させた時、アニオン性β-ラクタム抗生物質であるCFIX及びFK089の細胞内取り込みは顕著に増加することが示された。これに対し、生理的pHにおいて両性イオンβ−ラクタム抗生物質であるCDXの場合には、pH 6.0において最適な取り込みが観察された。
【００９２】
［実施例２］
ｐＨ感受性高分子の添加によりにpHの制御が可能であるかどうかを明らかにするため、MES 緩衝液のpHに及ぼす高分子の影響について検討を行った。
【００９３】
pH感受性高分子としてメタアクリル酸コポリマー オイドラギット L100-55、pH非感受性高分子としてアミノアルキルメタクリレートコポリマー オイドラギット RS POを用いた。
【００９４】
MES 緩衝液(pH 6.0)に、高分子 (メタアクリル酸コポリマー オイドラギット L100-55 若しくはpH非感受性高分子としてアミノアルキルメタクリレートコポリマー オイドラギット RS PO)を添加し、溶液のpHを、pHメーターを使用して測定した。
【００９５】
緩衝液のpHは、オイドラギット L100-55の添加濃度に従って低下した（図２）。図２中、オイドラギット RS POを添加したMES緩衝液のｐＨ（●）、オイドラギット L100-55を添加したMES緩衝液のｐＨ（○）を示す。ポリマー未添加のpHと比較してオイドラギット L100-55の添加濃度が20%の場合には、およそpH 3.0まで低下した。一方、構造内にプロトン解離基を有さないオイドラギット RS POでは、pHの顕著な低下は観察されなかった。
【００９６】
［実施例３］
β-ラクタム抗生物質の生理的条件下におけるラット消化管からの吸収が、消化管腔内pHをコントロールすることにより改善されるかどうかを明らかにするため、pH感受性高分子（オイドラギット L100-55）の存在もしくは非存在下における両性化合物CDX及びアニオン性化合物CFIXの吸収を、イン シチュ クローズド ループ法（in situ closed loop method）により評価した（図６に模式図を示した）。
【００９７】
β-ラクタム抗生物質(CDX又はCFIX)を10 ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（pH 6.0）に、1 mM CDX、0.5 mM CFIXになるように添加し、更にオイドラギットL100-55を全量で10 wt％もしくは20wt％になるように配合し、本発明の経口組成物を調製した。また、対照としてオイドラギットL100-55を含まないβ-ラクタム抗生物質溶液をコントロール溶液として調製した。
【００９８】
ＳＤ系雄性ラットの盲腸接合部（回腸の終末端と盲腸開始部位との接合部）より胃に向かって14 ｃｍ離れたところまでに作成した腸管ループに、これらの組成物を投与した。投与後、20分後に腸管ループ内の残存液を回収し、回収液中のβ-ラクタム抗生物質濃度をＨＰＬＣにより測定した。また、pHメーターを用いて回収液のpHについても測定した。得られた回収液中のβ-ラクタム抗生物質濃度を、投与液中濃度より減じることにより吸収性を評価した。
【００９９】
図３のＡに示すように、オイドラギット L100-55未添加のCDXの吸収率は約40%であった。しかしながら、20wt%のオイドラギットL100-55を添加した場合には、CDXの吸収率は約80%であり顕著な増加が観察された。さらに、消化管腔内pHは、オイドラギットL100-55の添加により低下した（図３のＢ）。
【０１００】
一方、CFIXはラット回腸からはほとんど吸収されなかった (図３のＣ)。しかしながらCDXと同様に20wt%のオイドラギットL100-55の存在により、CFIXの吸収率は約35%と顕著に向上した。また、消化管内液のpHもオイドラギット L100-55の添加により減少した (図３のＤ)。
【０１０１】
［実施例４］
pH感受性高分子を用いて消化管内pHをコントロールすることにより、ペプチド性化合物のラットにおける経口吸収性が改善されるのかどうかを明らかにするため、ペプチド性化合物CFIXにpH感受性高分子（オイドラギット L100-55）もしくはpH非感受性高分子（オイドラギット RS PO）を同時に経口投与し、CFIXの血漿中濃度推移を評価した。
【０１０２】
CFIXの0.23 ｍｇ／ｍＬ水溶液に、オイドラギットL100-55を全量で5wt％になるように配合し、本発明の経口組成物を調製した。また、対照としてオイドラギットL100-55を含まないCFIX溶液をコントロール溶液として調製した。これらの組成物を、一昼夜絶食したＳＤ系雄性ラット（体重：190−220ｇ）に、CFIXの投与量として2.3 ｍｇ／ｋｇとなるように経口投与した。投与後15分から480分に渡り採血を行い、血漿中CFIX濃度をHPLCにより測定した。得られたCFIX血濃度プロファイルより、濃度時間曲線下面積（AUC）及び最高血漿中濃度（Cmax）を算出した。
【０１０３】
図４は、ラットに上記組成物（CFIX：２．３ ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後のCFIXの吸収プロファイルを示したものである。それぞれのプロットは、ポリマー非存在下のCFIXの濃度（○）、オイドラギットL100-55（５００ ｍｇ／ｋｇ）存在下のCFIXの濃度（●）、及びオイドラギットRS PO（５００ ｍｇ／ｋｇ）存在下のCFIXの濃度（□）を示す。各点は５つの実験の平均±標準誤差を表す。
【０１０４】
表１より、CFIXとpH非感受性オイドラギット RS POを同時投与した場合には、CFIX単独投与のコントロールと比べて、濃度時間曲線下面積（AUC）、最高血漿中濃度（Cmax）及び最高血漿中濃度時間（Tmax）に有意な差は認められず、CFIXの経口吸収性に変化は観察されなかった。
【０１０５】
しかしながら、CFIXとpH感受性酸性オイドラギット L100-55を同時投与した場合には、未添加のコントロールと比較して、AUC及びCmaxが顕著に増加し、CFIXの経口吸収性が顕著に増加した。
【０１０６】
［実施例５］
実施例４でみられたpH感受性酸性高分子によるCFIXの吸収改善効果が、小腸上皮細胞に発現するペプチドトランスポーター（PEPT1）を介在するのかどうかを明らかにするため、PEPT1の基質であるCDXを同時投与し、CFIXの経口吸収性に及ぼす影響について検討した（図５、表１）。
【０１０７】
実験操作は、CDXを同時投与する以外は実施例４と同様にして行った。
【０１０８】
図５は、ラットに組成物（CFIX：２．３ ｍｇ／ｋｇ）を投与後のCFIXの経口投与プロファイルにおけるCDXの影響を評価したものである。それぞれのプロットは、オイドラギットL100-55（５００ｍｇ／ｋｇ）＋CDX ０ ｍＭ（●）、オイドラギットL100-55（５００ｍｇ／ｋｇ）＋CDX ２ ｍＭ（▲）、及びオイドラギットL100-55（５００ｍｇ／ｋｇ）＋CDX １０ ｍＭ（■）のものを示す。各点は５つの実験の平均±標準誤差を表す。
【０１０９】
図５及び表１より、CDX 2 mMを同時投与した場合には、CDXを同時投与しない場合と比較して、CFIXのAUCに有意な差は認められなかったものの、Cmaxは有意に低下した。さらに、CDX 10 mMを同時投与した場合には、CFIXのAUC及びCmaxは顕著に低下した。
【０１１０】
以上より、オイドラギット L100-55併用投与によるCFIXの吸収改善効果には、ペプチドトランスポーターによる吸収が関与しているものと考えられる。
【０１１１】
図４及び図５における血中濃度推移データから、薬物動態パラメーターを算出した結果を表１にまとめた。
【０１１２】
【表１】
2010280705.tif 000002
【０１１３】
なお、本明細書に記載された公知文献は、参考として援用される。
【図１Ａ】
2010280705.tif 000003
【図１Ｂ】
2010280705.tif 000004
【図２】
2010280705.tif 000005
【図３】
2010280705.tif 000006
【図４】
2010280705.tif 000007
【図５】
2010280705.tif 000008
【図６】
2010280705.tif 000009