(57)【要約】【課題】検体の定量可能レンジを従来よりも大幅に広げることによって低濃度域及び高濃度域での定量を可能となるようなイムノクロマトグラフ方法を提供すること。【解決手段】被験物質を検出するクロマトグラフ方法において、（ａ）捕捉した標識物質を定量するための第一の光学濃度測定を行う工程、（ｂ）捕捉した標識物質を増幅する工程、（ｃ）増幅後の標識物質を定量するための第二の光学濃度測定を行う工程、及び（ｄ）第一の光学濃度測定及び／又は第二の光学濃度測定の値から該被験物質の量を定量する工程、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質を検出するクロマトグラフ方法において、
（ａ）捕捉した標識物質を定量するための第一の光学濃度測定を行う工程、
（ｂ）捕捉した標識物質を増幅する工程、
（ｃ）増幅後の標識物質を定量するための第二の光学濃度測定を行う工程、及び
（ｄ）第一の光学濃度測定及び／又は第二の光学濃度測定の値から該被験物質の量を定量する工程、を含む方法。
【請求項２】
第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値が、予め決めてある測定切り替え光学濃度値よりも大きい場合は、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値から該被験物質の量を定量し、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値が、予め決めてある測定切り替え光学濃度値以下の場合は、増幅後の第二の光学濃度測定において測定した光学濃度値から該被験物質の量を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験物質を含まない被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値にその標準偏差の２倍を足した値に比べ、所定の既知量の被験物質を含む被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値からその標準偏差の２倍の値を引いた値の方が大きくなるような既知量を、第一の光学濃度測定において定量できる定量限界濃度として設定し、該定量限界濃度の被験物質を含む被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値を測定切り替え光学濃度値とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イムノクロマトグラフ方法である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質とをこれらを混合させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識物質を捕捉して該被験物質を検出する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
該不溶性担体が多孔性担体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一の結合物質及び／または第二の結合物質が、抗体又は断片化抗体である、請求項５又は６に記載の測定方法。
【請求項８】
工程（ａ）と工程（ｃ）の間に、
（ｅ）洗浄液を展開させることにより洗浄を行う工程、
を含む、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
増幅を、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて行う、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
銀イオンのための還元剤が２価の鉄イオンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該標識物質が金属コロイドである、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
該金属コロイドが金コロイドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第二の光学濃度測定を行う際の増幅後の標識物質の平均粒子サイズが1μｍ以上20μｍ以下のサイズである、請求項１から１２の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅クロマト法を用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。しかし、９６穴プレ−トを用いた酵素免疫測定法やラテックス凝集法のような従来の免疫学的測定法は、必ずしも測定の迅速簡便性又は検出感度を満たすものではなかった。
【０００３】
また他のニーズとしては、現在スワブ液や血液と言った比較的侵襲的な検体を用いている検査においても、高感度化が達成されることで、鼻水やうがい液、尿、といった比較的低侵襲的な検体中にごく少量含まれる被験試料を検出することができるようになることで、患者の負担の少ない検査方法が可能となることも期待できる。
【０００４】
近年、特に迅速な診断が求められる感染症の検査に、イムノクロマトグラフ法を用いた検査キット（以後の説明において、イムノクロマトグラフキットと記す。）が多く使用されるようになってきている。これらキットの普及により、患者の感染を迅速・簡便な方法で特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことが可能となってきている。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、分析対象物（例えば、抗原）に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、分析対象物と特異的に結合する標識化第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、分析対象物を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
【０００５】
イムノクロマトグラフ法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約５分〜１０分間静置するだけで測定結果が得られるように迅速であるので、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
【０００６】
また、天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質、更にはウイルス感染症の感染初期の検体は、従来の一般的イムノクロマトグラフ法では検出できない極微量で作用する物質が多く、それらの迅速、簡便、且つ高感度なイムノクロマトグラフ法の開発が求められている。
【０００７】
また、一方でイムノクロマトグラフ法の原理を利用し、その検出部位の光学濃度を光学測定するリーダーを用いることで、被験物質の定量を行うこともできる。ロシュ・ダイアグノスティックス社のコバスh232シリーズのように、イムノクロマトグラフ法を用い定量することで、心筋マーカーと呼ばれるようなタンパク質の血中濃度を、１５分程度と迅速に測定している例もある。
【０００８】
しかしながら、従来、金コロイドを標識として用いる定量イムノクロマト法での測定可能レンジは、金微粒子１個当りの吸光度の限界から低濃度域に限界を持っていた。また、銀増幅で金コロイドのシグナルを増幅すると、銀量が増えても遮蔽面積としてはあまり変わらなくなってくるために、高濃度域の吸光度が飽和してくるという問題があった。
従来から酵素法や銀増幅法による高感度化法は知られている（特許文献１及び２）。しかしながら、酵素法においては酵素反応を行うことによって初めてシグナルが生じる系であり、増幅前のシグナルを定量することはできない。また、従来の銀増幅法では、洗浄が行われていなかったために十分なシグナル／ノイズ比が得られず、実際には低濃度域に十分な感度を得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許３３０９９７７号公報
【特許文献２】特開２００２−２０２３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の通り、従来の金コロイドを用いたイムノクロマト法においては定量測定可能レンジが狭いという問題があった。また、低濃度の定量を可能にするために、増幅後のシグナルを測定するだけでは高濃度の検体の場合はその定量が困難であった。即ち、本発明は、検体の定量可能レンジを従来よりも大幅に広げることによって低濃度域及び高濃度域での定量を可能となるようなイムノクロマトグラフ方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、金コロイド標識で吸光度を測定した後、洗浄を行い非特異吸着によるノイズを下げた上で金コロイド標識の増幅を行い、吸光度を再度測定するという、増幅前と増幅後に２回の測定を行って定量をするという測定方法により、低濃度域及び高濃度域での定量が可能となり、検体の定量可能レンジを従来よりも大幅に広げることができた。
【００１２】
即ち、本発明によれば、被験物質を検出するクロマトグラフ方法において、
（ａ）捕捉した標識物質を定量するための第一の光学濃度測定を行う工程、
（ｂ）捕捉した標識物質を増幅する工程、
（ｃ）増幅後の標識物質を定量するための第二の光学濃度測定を行う工程、及び
（ｄ）第一の光学濃度測定及び／又は第二の光学濃度測定の値から該被験物質の量を定量する工程、を含む方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値が、予め決めてある測定切り替え光学濃度値よりも大きい場合は、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値から該被験物質の量を定量し、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値が、予め決めてある測定切り替え光学濃度値以下の場合は、増幅後の第二の光学濃度測定において測定した光学濃度値から該被験物質の量を定量する。
【００１４】
好ましくは、被験物質を含まない被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値にその標準偏差の２倍を足した値に比べ、所定の既知量の被験物質を含む被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値からその標準偏差の２倍の値を引いた値の方が大きくなるような既知量を、第一の光学濃度測定において定量できる定量限界濃度として設定し、該定量限界濃度の被験物質を含む被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値を測定切り替え光学濃度値とする。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法は、イムノクロマトグラフ方法である。
好ましくは、被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質とをこれらを混合させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識物質を捕捉して該被験物質を検出する。
【００１６】
好ましくは、不溶性担体は多孔性担体である。
好ましくは、第一の結合物質及び／または第二の結合物質は、抗体又は断片化抗体である。
【００１７】
好ましくは、本発明の方法は、工程（ａ）と工程（ｃ）の間に、
（ｅ）洗浄液を展開させることにより洗浄を行う工程、
を含む。
【００１８】
好ましくは、増幅を、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて行う。
好ましくは、銀イオンのための還元剤が２価の鉄イオンを含む。
【００１９】
好ましくは、標識物質が金属コロイドである。
好ましくは、金属コロイドが金コロイドである。
好ましくは、第二の光学濃度測定を行う際の増幅後の標識物質の平均粒子サイズが1μｍ以上20μｍ以下のサイズである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によるクロマトグラフ方法によれば、検体の定量可能レンジが従来よりも広げることが可能になり、低濃度域及び高濃度域での定量が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明で用いることができるイムノクロマトグラフキットの縦断面を模式的に示す縦断面図である。１はバック粘着シート、２は金コロイド抗体保持パッド、３は抗体固定化メンブレン、３ａは捕捉部位、３１は検出部、３２はコントロール部、４は吸収パッド、５は試料添加パッド、６は増感シートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明について更に具体的に説明する。
本発明による被験物質を検出するクロマトグラフ方法は、
（ａ）捕捉した標識物質を定量するための第一の光学濃度測定を行う工程、
（ｂ）捕捉した標識物質を増幅する工程、
（ｃ）増幅後の標識物質を定量するための第二の光学濃度測定を行う工程、及び
（ｄ）第一の光学濃度測定及び／又は第二の光学濃度測定の値から該被験物質の量を定量する工程、を含む方法である。好ましくは、本発明によるクロマトグラフ方法は、イムノクロマトグラフ方法である。本発明によるクロマトグラフ方法では、例えば、被験物質に対する第一の結合物質で修飾した標識物質とをこれらを混合させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合物質、又は被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識物質を捕捉して該被験物質を検出することができる。
【００２３】
工程（ｂ）、（ｃ）は、第一の光学濃度測定の結果に応じて、省略しても良い。
【００２４】
上記の通り、本発明においては、増幅液による増幅工程の前に第一の光学濃度測定を行い、上記増幅工程の後に、第二の光学濃度測定を行う。本発明で言う光学濃度測定とは、適切な光学測定装置を用いた測光であり、捕捉した標識物質を反映した光学濃度を測定できれば、透過測光でも反射測光でもなんでもよい。また測定する波長も、捕捉した標識物質を反映した光学濃度を測定できれば、特定の単一波長であっても、複数の波長であっても、広い波長にわたる光の光学濃度であっても構わない。
【００２５】
工程（ｄ）において好ましくは、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値が、予め決めてある測定切り替え光学濃度値よりも大きい場合は、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値から該被験物質の量を定量し、第一の光学濃度測定において測定した光学濃度値が、予め決めてある測定切り替え光学濃度値以下の場合は、増幅後の第二の光学濃度測定において測定した光学濃度値から該被験物質の量を定量することができる。
【００２６】
上記の通り測定切り替え光学濃度値を予め決めておくことにより、被験物質の濃度について低濃度域から高濃度域までの定量を簡便に行うことが可能になる。
【００２７】
測定切り替え光学濃度値の決定方法は特に限定されるものではないが、一例としては、被験物質を含まない被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値にその標準偏差の２倍を足した値に比べ、所定の既知量の被験物質を含む被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値からその標準偏差の２倍の値を引いた値の方が大きくなるような既知量を、第一の光学濃度測定において定量できる定量限界濃度として設定し、該定量限界濃度の被験物質を含む被験液を用いて第一の光学濃度測定を複数回行うことによって得られる平均値を測定切り替え光学濃度値とすることができる。即ち、本発明においては、下記の式：
［検体を含まない検体液の場合のシグナル測定値の平均値＋2×ＳＤ（標準偏差）］＜［Ａという濃度の検体を含む検体液の場合のシグナル測定値の平均値−2×ＳＤ（標準偏差）］
を満たすような濃度Ａを第一の光学濃度測定において定量できる定量限界濃度（検出限界）とすることができる。
【００２８】
１．クロマト
一般に、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被分析物を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被分析物と結合可能な固定化試薬（抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの反応部位を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、分析対象物結合可能な試薬によって修飾された標識物質が分散されてなる分散液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記分析対象物と標識物質とが特異的に結合しながら、前記反応部位まで到達する。前記反応部位において、前記分析対象物と標識物質の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に分析対象物が存在する場合にのみ、前記固定化試薬部に標識物質が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被験出物が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００２９】
本発明におけるクロマトグラフ方法を行う装置は、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記分析対象物と標識物質の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。
【００３０】
２．被験試料
本発明のクロマトグラフ方法で分析することのできる被験試料としては、分析対象物を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
【００３１】
３．被験試料の前処理
本発明のクロマトグラフ方法では、前記被験試料をそのままで、あるいは、前記被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００３２】
４．構成
本発明のクロマトグラフ方法において使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。例えば、図１は、本発明のクロマトグラフ用ストリップの一例の断面図を模式的に示す。
【００３３】
本発明のクロマトグラフ用ストリップは、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド５、標識化物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）２、クロマトグラフ担体（例えば抗体固定化メンブレン）３、及び吸収パッド４がこの順に、粘着シート５上に配置されている。
【００３４】
前記クロマトグラフ担体３は、補足部位３ａを有し、分析対象物と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域である検出ゾーン（検出部と記載することもある）３１を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール部と記載することもある）３２を更に有する。
【００３５】
前記標識化物質保持パッド２は、標識化物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
【００３６】
前記試料添加パッド１としては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。
【００３７】
４−１．標識物質
標識物質は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、０．００１〜１μｍの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１〜５０ｎｍがさらに好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。また、検出時の標識物質の大きさは好ましくは1μｍ以上、20μｍ以下であり、さらに好ましくは3μｍ以上20μｍ以下である。検出前の大きさから、検出時の大きさに変化させる方法としては、例えば銀イオンと、還元剤を用いた増幅反応がある。
【００３８】
本発明によれば、標識物質として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるイムノクロマトグラフにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、前記分析対象物と標識物質の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、分析対象物の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００３９】
本発明のクロマトグラフ方法では、分析対象物（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のクロマトグラフ方法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。
【００４０】
４−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被験物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。
【００４１】
本発明では、多孔性担体は、（ａ）被験物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）第一の結合物質への結合性を有する物質を有している。 該被験物質に対する第二の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。被験物質に対する第一の結合物質への結合性を有する物質とは、被験物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被験物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。
【００４２】
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／または第二の結合物質が抗体である。本発明のイムノクロマトグラフ方法においては、分析対象物に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その分析対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。
【００４３】
４−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
【００４４】
通常クロマトグラフ担体の一部に検出用物質を固定化させて検出ゾーンを作製する。検出用物質は、検出用物質をクロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、検出用物質をラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００４５】
４−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された分析対象物を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の分析対象物が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。
【００４６】
４−５．標識化物質保持パッド
標識化物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した標識物質を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００４７】
４−６．吸収パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により分析対象物の測定に合った速度を設定することができる。
【００４８】
５．免疫検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法及び競合法について説明する。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第2抗体を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、被験物質（抗原）を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被験試料中に被験物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００４９】
サンドイッチ法では、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、第一の不溶性担体における固定化第2抗体を固定した領域について第一の光学濃度測定を行うことによいって標識物を定量し、被験試料中の被験物質の量を測定することができる。次いで、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅した後に、第二の光学濃度測定を行うことによって、増幅後の標識物質を定量し、被験試料中の被験物質の量を測定することができる。
【００５０】
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。
【００５１】
まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体を予め調製しておく。また、第1抗体を、予め金属コロイドなどで標識化しておく。第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定しておく。被験物質（抗原）を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と接触させると、その被験試料中に被験物質が存在しない場合には、標識化された第一抗体と、第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物とにより、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が起きる。一方、被験物質が存在する場合には、標識された第1抗体に被験物質（抗原）が結合するため、その後の第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物との、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が阻害され、抗原抗体反応による結合が起こらない。
【００５２】
第一抗体に対して結合性を有する固定化物と標識化された第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、第一の不溶性担体における第一抗体に対して結合性を有する物質について第一の光学濃度測定を行うことによって、標識物量を定量し、被験試料中の被験物質の量を測定することができる。次いで、固定した領域に、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅した後に、第二の光学濃度測定を行うことによって、増幅後の標識物質を定量し、被験試料中の被験物質の量を測定することができる。
【００５３】
６．洗浄
本発明では、捕捉した標識物質を定量するための第一の光学濃度測定を行う工程と、増幅後の標識物質を定量するための第二の光学濃度測定を行う工程との間に、洗浄液を展開させることにより洗浄を行うことができる。
【００５４】
（洗浄液）
前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去するための洗浄液は、洗浄の機能があればどんなものでもよい。
【００５５】
洗浄液は特異的な結合反応以外でクロマトグラフ担体内に残存している、つまり非特異的に残存している標識物質を洗浄するための液体であれば特に限定されるものではなく、単なる水やエタノールなどの溶剤単独でも良いし、例えば１％BSA入りのPBSバッファーや界面活性剤等の溶液等を用いることができる。また、洗浄液として、後述する銀イオンを含む液体、銀イオンの還元剤を含む液体を用いることもできる。なお、洗浄液は展開途中に非特異的に残存した標識物質を洗浄しながら展開するので標識物質を含みながら展開されることになるが、展開される前の洗浄液は洗浄効果を高めるために、標識物質を含んでいない液を用いる。なお、洗浄効果を上げる為にそのpHを調整したり、界面活性剤成分やBSAなどのタンパク質、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物を加えた洗浄液を用いてもよい。
【００５６】
（洗浄液の展開、その方向）
洗浄液は、検体液を展開した後に、クロマトグラフ用ストリップに添加しクロマトグラフ用ストリップに残存する抗原抗体反応で結合した以外の標識物を洗浄する。洗浄液の送液方法としては、検体液を展開した後にそのまま試料滴下部に添加する方法や、予めストリップに洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットを付着させておき、その洗浄液添加パットに添加し吸水パット方向へ送液する方法、予めストリップに洗浄液の添加部位を備えておき、検体液の展開後にその洗浄液の添加部位に洗浄液を添加する方法、などがあるが、より好ましくは、検体液をストリップに展開した後に洗浄液送液の為の洗浄液添加パット、吸水パットをストリップに付着させ、洗浄液添加パットに洗浄液を供給し、洗浄液を展開させる方法である。洗浄液添加パットに洗浄液を供給する方法としては、洗浄液の入ったポットに洗浄液添加パットを挿入してもいいし、洗浄液添加パットに洗浄液を滴下しても良い。
【００５７】
本明細書中では、該被験物質の液の展開方向とは、試料添加パッドと吸収パッドとを結ぶ方向と定義し、洗浄液の展開方向とは、洗浄液送液の為の洗浄液添加パットと吸水パットとを結ぶ方向と定義する。
【００５８】
被験物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角が45度から170度の場合、洗浄効果が大きくなる。さらに、該被験物質の液の展開方向と洗浄液の展開方向との成す角は、好ましくは60度から170度、さらに好ましくは60度から150度である。
【００５９】
洗浄液添加パット（第二の不溶性担体とも標記する）は、洗浄液を添加できればなんでもよく、グラスファイバーパッドやセルロースメンブレン、ニトロセルロースメンブレンなどを用いることができる。
吸水パットは、吸水することができる物質ならばなんでもよく、セルロース、ニトロセルロース、グラスファイバー、それらの混合体などを用いることができる。
【００６０】
７．増幅液
増幅溶液は、含まれる薬剤が標識物質や被験物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液であり、例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液や、ペルオキシダーゼ標識と過酸化水素の作用により色素となる、フェニレンジアミン化合物とナフトール化合物の溶液などが挙げられる。
【００６１】
詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅溶液として用いることができる。
【００６２】
増幅液の具体例としては、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いることができる。以下、銀を含む化合物と銀イオンのための還元剤等について説明する。
【００６３】
（銀（イオン）を含む化合物）
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
【００６４】
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル／ｍ2〜0.2モル／ｍ2、好ましくは0.01モル／ｍ2〜0.05モル／ｍ2含有されることが好ましい。
【００６５】
（銀イオンのための還元剤）
銀イオンのための還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
【００６６】
なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。
【００６７】
還元剤としては、アスコルビン酸還元剤が好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
【００６８】
８．色素増幅液
色素増幅液は、「臨床検査  Vol.41  no.9  1020  H2O2-POD系を利用した染色」に記載されているような、西洋わさびペルオキシダーゼ検出の発色基質などを、好適に用いることがでる。また、特願2007-332287号記載の発色基質は特に好ましく用いることができる。
【００６９】
９．検出溶液
検出溶液とは、含まれる薬剤が標識物質や被験物質などと反応し、変色、着色した化合物の生成、発光等の変化が生じる溶液を意味例えば、被験物質であるカルシウムイオンと錯体化することで呈色するオルソクレゾールフタレインコンプレキソンや、被験物質であるタンパク質と反応し変色する銅イオン溶液などが挙げられる。また、被験物質に対して特異的に結合する標識化された複合体の溶液もこれに含まれる。例えば、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡやＲＮＡを検出する標識化ＤＮＡや標識化ＲＮＡ、抗原を検出する抗体感作粒子や抗体標識化酵素などが挙げられる。
【００７０】
１０．その他の助剤
増幅溶液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。
またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈである。
【００７１】
１１．検出時の平均粒子サイズの算出方法
検出時（増幅後）、テストライン部を切り出し、試料裏面をカーボンペーストで試料台に取り付けた後、断面を切り、カーボン蒸着し、走査型電子顕微鏡にて、形状と大きさを観察する。例えば、日立ハイテクノロジーズ製ＦＥ-ＳＴＥＭ  Ｓ-5500で、加速電圧10ＫＶで反射電子による試料表面の観察をＳＥＭで行う事が出来る。その後、シグナル粒子を100粒子選び、粒子の投影面積の円相当直径を測定し、平均値を算出し、検出時の平均粒子サイズとする。
【００７２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
（１）インフルエンザA型B型検出イムノクロマトキットの作成
（1-1）抗インフルエンザA型B型抗体修飾金コロイドの作成
（1-1-1） F(ab')2断片化抗インフルエンザA型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザA型ウイルス抗体（品番7307、メディックスバイオケミカ社）を使用し、ImmunoPureR IgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit（品番 44880、ピアース社）を用いて作製した。
【００７４】
（1-1-2） F(ab')2断片化抗インフルエンザＢ型ウイルス抗体の作製
抗インフルエンザB型ウイルス抗体（品番1131（ヴァイロスタット社））とリシルエンドペプチダーゼ（品番125-05061、和光純薬）をモル比で1：100となるように50 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.5)で希釈し,37℃で3時間反応させた。その後、ImmunoPure (A) IgG Purification Kit（品番 44667、ピアース社）で  F(ab')2化抗体を精製した。
【００７５】
（1-1-3）抗インフルエンザA型断片化抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.5）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、160 μg / mLの抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5  7307、Medix Biochemica社）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【００７６】
（1-1-4）抗インフルエンザB型抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mMグリシンバッファー（pH 9.0 ）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、120 μg / mLの抗インフルエンザB型モノクローナル抗体（MONOTOPE aby Influenza B  Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA, 0.1 % NaN3）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【００７７】
（1-2）金コロイド抗体保持パットの作成
（1-1）で作成したインフルエンザA型、B型抗体修飾金コロイドを、1:1で混合し、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水により希釈し、520 nmのODが3.0となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。
【００７８】
（1-3）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
（1-3-1）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
25 mm×200 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF120、ミリポア社）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から７ mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5  7307、Medix Biochemica社）溶液をインクジェット方式の塗布機（BioDot社）を用いて幅0.7mm程度のライン状に塗布した。同様に、下から10 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した固定化用抗インフルエンザB型モノクローナル抗体（MONOTOPE aby Influenza B  Virus (nuclear) Purified 1131、ViroStat, Inc.）溶液を幅0.7mm程度のライン状に塗布した。さらに同様に、下から13 mmの位置に、0.5 mg / mLとなるように調製したコントロール用抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００７９】
（1-4）イムノクロマトグラフストリップの作製
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、（1-3）で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗インフルエンザA型抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように2で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18 mm×250 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド（80 mm×250 mmに切ったセルロース・グラス膜（CF6、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材（イムノクロマト本体部材）を、部材の長辺側を25 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、25 mm×55 mmのイムノクロマト用ストリップを作成した。これらを試験用イムノクロマトキットとした。
【００８０】
（1-5）洗浄液
ＰＢＳバッファー（和光純薬）に1重量％のBSA（シグマ社）を溶解した1％BSA入りPBSバッファーを洗浄液とした。
【００８１】
（1-6）銀増幅液の作成
（1-6-1）増幅液Ａの作成
（1-6-1-1)増幅液A-1の作成
水325gに、硝酸鉄（III）九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作成した1mol/Lの硝酸鉄水溶液40mL、クエン酸（和光純薬、038-06925）10.5g、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  0.44gを溶解させる。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%,）を40mL加える。この溶液80mLを測りとり、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を11.76g加えこれを増幅液A-1とした。
【００８２】
（1-7-1-2）増幅液A-2の作成
硝酸銀溶液10ｍＬ（10ｇの硝酸銀を含む）に水を加えて全体量が100gとなるようにし、増幅液A-2（10重量%硝酸銀水溶液）を作成した。
【００８３】
（1-7-1-3）増幅液Ａの作成
増幅液A-1 40mLを測りとり、増幅液A-2を4.25mL加え攪拌し、増幅液Ａとした。
【００８４】
（２）評価
（2-1）点着
（1-4）で作成した試験用イムノクロマトグラフキットの試料添加パットに、８連ピペットマンを用いて検体液計500μＬを均一になるように滴下し、１０分静置した。
【００８５】
（2-2）洗浄
このメンブレンをケースから取り出し、サンプルパット、吸水パットをはずした。2本の捕捉部位（TL）の間のエリアのうちストリップの両端から真ん中になる点を、洗浄液添加用パットと吸水用パットとを結ぶ直線が通るようにし、この洗浄液展開方向と検体液展開方向とのなす角が90度となるようにして、洗浄液展開の上流端となる端に洗浄液添加用パット（18 mm×25mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）に13mm×25mmのバック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）を貼ったもの）をテーフ゜で貼り付け、下流端となる端に吸水用パット（100mm×25mmに切ったセルロースメンブレン（CF6、ワットマン社）に95mm×25mmに切ったバック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）を貼ったもの）を貼り付け、洗浄液を7mL入れた直方体の入れ物（縦9mm×横64mm×高25mm）に洗浄液添加用パットが液に漬かるように立てかけ、このまま10分間洗浄した。
【００８６】
本実験において、洗浄時の洗浄液入れ物の形状に依存する液面の高さ、及びイムノクロマトグラフキットの試料添加パッドの形状・材質、実験環境（温度、湿度）、吸収パットの材質・厚み、吸収パットとニトロセルロースメンブレンとの接合、などは洗浄液の吸水スピード・量を変化させる要因であり、実験において、一定に保つことが必要である。この洗浄液の吸水スピード・量は、最終的な洗浄の効果（金微粒子の残存量の減少）を左右する要因である。今回の実験は、気温22±3℃、湿度50±15%にて行った。
【００８７】
（2-3）増幅前測定
増幅前の検出ラインの反射吸収を、イムノクロマトグラフ用濃度測定器ICA-1000(浜松ホトニクス社）を用いて測定し、バックグランドとライン部との吸光度の差（ΔＯＤ）を求め評価した。
【００８８】
（2-4）増幅液によるシグナル増幅、バックグランド評価
吸水パットを取り除き、（1-6）で作成した増幅液Aを40mL入れたプラスチックトレイに浸漬し、振とう器で振とうしながら、4分間銀増幅を行った。このメンブレンを増幅液から取り出し、3分間よく水洗した。
【００８９】
（2-5）増幅後測定
これをイムノクロマトグラフ用濃度測定器ICA-1000（浜松ホトニクス）を用いて測定し、バックグランドとライン部との吸光度の差（ΔＯＤ、単位ｍＡＢＳ）を求め評価した。
【００９０】
（3-1）検量線の作成
１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにBD Flu エグザマンコントロールＡ+Ｂ-（ベクトン・ディッキンソン社）を溶解し、抗原希釈溶液を作製した。この抗原希釈液、×1、×1/8、×1/32、×1/128、を用いて増幅前のテストライン濃度を測定し（N=3）、テストライン濃度（mABS）をx軸、抗原濃度（BD陽性コントロール液希釈率）をy軸にとり、それらを線形近似することにより以下の検量線を立てた。
y= -0.011405+2.0795x    （式１）
【００９１】
また、同じく抗原希釈液、×1/10、1/100、×1/1000、×1/10000、を用いて増幅前のテストライン濃度を測定し（N=3）、テストライン濃度（mABS）をx軸、抗原濃度（BD陽性コントロール液希釈率）をy軸にとり、それらを4次関数に近似することにより以下の検量線を立てた。
y= 0.00067891 -0.06895x +2.375x^2 -17.261x^3 +42.734x^4    （式２）
【００９２】
(4)結果
(4-1)模擬検体作成
１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにBD Flu エグザマンコントロールＡ+Ｂ-（ベクトン・ディッキンソン社）を溶解し、抗原希釈溶液（×0.5、×0.1、×0.025、×0.0125、×0.00160、×0.0004、×0.0002、×0.0001）を作製した。
【００９３】
＜比較例＞増幅前のみの測定による定量
増幅前のテストライン濃度測定のみから、（式1）を用いて、抗原の定量値：算出濃度定量値を求めた。また、実際の濃度との誤差率（  （（実際の濃度-算出定量値）/実際の濃度）×100  ）を求めた。結果を表１に示す。
算出定量値が求められ、かつ誤差率35％以下であった場合を定量できていると定義したとき、希釈率0.5〜0.025まで定量できた。
【００９４】
＜実施例＞増幅前・増幅後の測定による定量
１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーを検体として用いた場合の第一の光学濃度値を10回測定し、その平均値0.0015にその標準偏差0.0002の2倍を足した値0.0019に比べ、１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーでBD Flu エグザマンコントロールＡ+Ｂ-を×0.013の濃度となるように希釈した既知濃度検体液での第一の光学濃度値を10回測定し、その平均値0.0112からその標準偏差0.001の2倍の値0.002を引いた値0.0092の方が十分に大きくなる。この検体濃度×0.013を定量できる定量限界濃度とし、このときの第一の光学濃度値の平均値0.0112を測定切り替え光学濃度値とし、第一の光学測定値が0.0112より小さい場合には第一の測定の値から被験物質の量を算出し、第一の光学測定値が0.0112以上の場合には第二の測定の値から被験物質の量を算出することとした。
【００９５】
増幅前の濃度値が0.0112以上である、抗原希釈率0.025までを増幅前の濃度値から（式1）を用いて抗原の定量値：算出濃度定量値を求めた。結果を表1に示す。
【００９６】
それ以下の増幅前の濃度値であった模擬検体に関しては、増幅後の濃度値から（式2）を用いて抗原の定量値：算出定量値を求めた。算出定量値が求められ、かつ誤差率35％以下であった場合を定量できていると定義したとき、希釈率0.5〜0.0002まで定量できた。よって、実施例では比較例に比べて、レンジが約２桁広がったことになる。
【００９７】
また、本実験で第二の光学測定を行った後のサンプルを、本明細書中の「１１．検出時の平均粒子サイズの算出方法」に記載した方法でSEM観察したところ、平均粒子サイズは5〜10μmの範囲であったことを確認した。
【００９８】
【表１】
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【図１】
2010217064.tif 000003