(57)【要約】      （修正有）【課題】二光子吸収断面積が大きく、しかも水への溶解性に優れた二光子吸収材料を提供すること。【解決手段】下記一般式１で表される水溶性デンドリマーからなることを特徴とする二光子吸収材料。2010133887.tif 000029式中、Ｐｉｇは色素二光子吸収性及び蛍光性を有する色素を示し、Ｄは前記色素に結合するデンドロン、および前記デンドロンに結合する官能基を最外部に持つ構造を示す。この官能基は、置換基を有してもよい芳香族基と、Ｘは親水性基から構成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表される水溶性デンドリマーからなることを特徴とする二光子吸収材料。
【化１】
2010133887.tif 000023
（式中、Ｐｉｇは二光子吸収性及び蛍光性を有する色素であって、Ｄと結合した色素を示し、Ｄは前記色素に結合するデンドロン、および前記デンドロンに結合する下記一般式２で表される基を最外部に持つ構造を示す。ｍは１〜４である。）
【化２】
2010133887.tif 000024
（式中、Ａｒ１は置換基を有してもよい芳香族基を示し、Ｘは親水性基を示す。）
【請求項２】
デンドロンの最外部に結合する基が下記一般式３で表される基であることを特徴とする請求項１記載の二光子吸収材料。
【化３】
2010133887.tif 000025
（式中、Ａｒ１は置換基を有してもよい芳香族基を示し、Ｍ＋は水素又はアルカリ金属を示す。）
【請求項３】
二光子吸収断面積が５５０ＧＭ以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の二光子吸収材料。
【請求項４】
一般式１のＤが下記一般式４〜６のいずれかで表されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の二光子吸収材料。
【化４】
2010133887.tif 000026
【化５】
2010133887.tif 000027
【化６】
2010133887.tif 000028
（式中、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立して置換基を有してもよい芳香族基を示し、Ｘは親水性基を示す。）
【請求項５】
ＸがＣＯＯ−Ｍ＋で表される基（ただし、式中、Ｍ＋は水素又はアルカリ金属を示す。）であることを特徴とする請求項４記載の二光子吸収材料。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の二光子吸収材料からなることを特徴とする蛍光プローブ。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の二光子吸収材料からなることを特徴とするバイオイメージング材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は二光子吸収材料に関し、特に水への溶解性に優れた二光子吸収断面積の大きい二光子吸収材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
二光子吸収とは、物質が二個の光子を吸収して励起状態へと遷移する現象である。二光子吸収における光吸収量は、入射光強度の二乗に比例する。したがって、入射光をレンズで集光すると、光強度の高い焦点付近でのみ二光子吸収が生じ、焦点以外では光吸収が生じない状態を作り出すことが可能である。
二光子蛍光バイオイメージングは、二光子吸収により蛍光ブロープを励起し、生体内を観察する技術である（非特許文献１）。二光子吸収を利用すると、焦点付近の蛍光ブロープのみを励起することが可能なため、細胞の断層イメージングが可能となる。
二光子吸収を利用したバイオイメージングは、通常の一光子励起バイオイメージングと比べ、次のような特徴がある。
（１）散乱を受けにくい長波長の光を励起光源に使用するので、試料深部の情報も取得できる、
（２）焦点付近以外では光吸収が起こらないので、光による試料の損傷が少ない、
（３）一波長励起二波長検出が可能で、二種類の対象を色分けして同時に観察することが容易である。
【０００３】
Green  Fluorescent  Protein（以下、ＧＦＰという）が開発されてからＧＦＰ融合タンパク質を細胞に発現させることで、細胞内でのタンパク質の分布や動きが可視化できるようになり、生物学に格段の進歩がもたらされた。
現在、ＧＦＰを二光子蛍光バイオイメージングでのブロープとして用いられているが、ＧＦＰを生きた細胞内での動的な二光子イメージングに利用する際には、以下のような問題点がある。
（１）分子量が３００００程度とかなり大きいため、ＧＦＰで標識化されたタンパク質の動態は、本来のタンパク質、すなわち、ＧＦＰ未標識のタンパク質とは異なる可能性が高い、
（２）ＧＦＰの二光子吸収効率は低いため、高価で大型の光源と高感度な検出器が必要である、
（３）充分な発光強度を得るために大量のＧＦＰを細胞に導入すると毒性が問題となる、
（４）光によるブリーチングが起きやすく、長時間の観察が行えない。
そこで、生体内でのタンパク質の動きを観察する際には、分子量が小さいローダミン類を蛍光ブロープとして用いることが試みられてきた。しかし、ローダミン類にも
（１）二光子吸収効率が極めて低い、
（２）ローダミン類の発光効率は生体内で極端に低下してしまう、
（３）検出に必要な発光強度を得るためには大量のローダミン類を投与する必要があるが、ローダミン類の水への溶解度は低いので、生体に高濃度で直接投与することは不可能である、
などの問題があり、二光子吸収を活用した動的な観察が現状では不可能な対象が極めて多い。
したがって、二光子バイオイメージングの長所を生体の中でのタンパク質の動態の監視に存分に活用するには、GFPやローダミン類の問題点を克復した、新しい高効率二光子励起蛍光プロープ分子の開発が不可欠である。
【０００４】
二光子蛍光バイオイメージングに用いられている前記ローダミン類やＧＦＰの二光子吸収断面積（二光丁吸収の効率を表す値）は１〜２００ＧＭ（１ＧＭ＝１０−５０ｃｍ４ｓmolecule−１photon−１）程度と小さく、観察できる対象に制限がある。
一方、現在では、二光子吸収断面積が大きい新規な色素が開発されている。例えば、１００００ＧＭ以上の大きな二光子吸収断面積を示す二光子吸収化合物はいくつか開発されている。ところが、それら二光子吸収化合物は、全て、光記録材料への応用を主目的に開発されていることもあり、極めて疎水性が高いうえに、溶解度が低く、水やアルコールのような生体内に投与可能な溶媒はもちろんのこと、クロロホルムやベンゼンなど疎水性の溶媒にすら高濃度では溶解することが出来ない。したがって、現在報告されている高効率二光子吸収化合物を、バイオイメージングに利用することは出来ない。
そこで、二光子吸収断面積が大きいことと水溶性が高いことを両立した二光子蛍光ブロープの開発が渇望されている。
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（２００７）９６７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記技術の流れからも明らかなように、本発明の課題は二光子吸収断面積が大きく、しかも水への溶解性に優れた二光子吸収材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決しようとの考えから、水溶性かご錯体やシクロデキストリンで高効率な二光子吸収色素を包接し、高効率な二光子吸収色素の水溶性の向上を目指した。しかし、高効率な二光子吸収色素を前記手段にて包接すると、高効率な二光子吸収色素の水溶性は確かに向上するものの、一度包接された前記色素が水中へ放出され、結晶化するという問題が生じた。
そこで、本発明者は、高効率な二光子吸収色素をコアとし、周囲を水溶性部位で直接修飾した水溶性デンドリマーを設計・合成したところ、意外にも二光子吸収断面積が大きく、しかも水への溶解性に優れているが前記結晶化するという問題のない二光子吸収材料を得ることが出来るという知見を得た。その知見に基づきさらに研究を重ね、遂に本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は次のとおりである。
本発明の請求項１の発明は、下記一般式１で表される水溶性デンドリマーからなることを特徴とする二光子吸収材料である。
【化７】
2010133887.tif 000002
（式中、Ｐｉｇは色素二光子吸収性及び蛍光性を有する色素であって、Ｄと結合した色素を示し、Ｄは前記色素に結合するデンドロン、および前記デンドロンに結合する下記一般式２で表される基を最外部に持つ構造を示す、ｍは１〜４である。）
【化８】
2010133887.tif 000003
（式中、Ａｒ１は置換基を有してもよい芳香族基を示し、Ｘは親水性基を示す。）
本発明の請求項２の発明は、デンドロンの最外部に結合する基が下記一般式３で表される基であることを特徴とする請求項１記載の二光子吸収材料である。
【化９】
2010133887.tif 000004
（式中、Ａｒ１は置換基を有してもよい芳香族基を示す。Ｍは水素原子またはアルカリ金属を示す。）
本発明の請求項３の発明は、二光子吸収断面積が５５０ＧＭ以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の二光子吸収材料である。
【０００９】
本発明の請求項４の発明は、一般式１のＤが下記一般式４〜６のいずれかで表されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の二光子吸収材料である。
【化１０】
2010133887.tif 000005
【化１１】
2010133887.tif 000006
【化１２】
2010133887.tif 000007
（式中、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立して置換基を有してもよい芳香族基を示し、Ｘは親水性基を示す。）
本発明の請求項５の発明は、ＸがＣＯＯ−Ｍ＋  で表される基（ただし、式中、Ｍ＋は水素又はアルカリ金属を示す。）であることを特徴とする上記請求項４記載の二光子吸収材料である。
本発明の請求項６の発明は、上記請求項１〜５のいずれか記載の二光子吸収材料からなることを特徴とする蛍光プローブである。
本発明の請求項７の発明は、上記請求項１〜５のいずれか記載の二光子吸収材料からなることを特徴とするバイオイメージング材料である。
また、本発明は二光子吸収性及び蛍光性を有する色素を、樹木状の化合物であって、最外部に前記一般式２で表される基を有する化合物と反応させることをと特徴とする上記一般式で表される水溶性デンドリマーの製造方法でもある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、水への溶解性に優れ、二光子吸収断面積がさらに大きい高効率な新規二光子吸収色素が提供される。この新色素は生体内への導入が容易であり、これまでの手法では可視化できなかった生命現象の可視化が可能となり、光診断や三次元光線力学治療を含めた光治療への利用・応用など広い分野での応用が期待できる。また、
本発明の高効率二光子ブロープ材料を用いると、
（１）少量のブロープ分子で十分な感度が得られるので、細胞内へのプロープの導入が細胞の活性を妨げる問題を大幅に軽減することができる、
（２）弱い光で十分な信号が得られるため、光毒性が軽減できる、
（３）感度が大幅に向上するので、観察可能な対象が格段に拡がる、
（４）安価で使いやすい光源が利用できるので、通常の（一光子の）蛍光顕微鏡を使う手軽さで二光子吸収蛍光顕微鏡が使えるようになる、などの効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でいう二光子吸収材料は上記一般式１で表されるデンドリマーである。ここでいうデンドリマーは中心のコアとそのコアから規則的に枝分れしたデンドロンであって、そのデンドロンは樹木状化合物の最外部に下記一般式２で表される基が結合する構造を有するのであり、中心のコアにｍ個のデンドロンから成る化合物を意味する。ここでｍは１〜４である。
【００１２】
前記一般式１における（Ｐｉｇ）は前記コアに相当し、二光子吸収性及び蛍光性を有する色素であって、前記デンドロンと結合することができる色素に由来する。前記色素は二光子吸収性及び蛍光性を有する色素であって、前記デンドロンと結合することができる色素であればどのような色素でも使用することができる。
ここで、二光子吸収性を有する色素とは二個の光子を吸収して励起状態へと遷移する色素を意味する。本発明では、二光子吸収性に優れ、前記デンドロンと結合することができる官能基を有する色素が好ましい。前記官能基は、デンドロンと結合することができる官能基である限り特に制限されないが、例えば、−ＯＨ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｎ〔（ＣＨ２）ｑ（ＯＨ）〕２、エチニル基等を例示できる。ここで、ｑは０又は１〜４である。
【００１３】
前記色素の中では、とくに下記色素が好ましい。
【化１３】
2010133887.tif 000008
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、又は有機置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は同一でもそれぞれ異なっていてもよい。Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、置換基を有するかもしくは置換を有しないアルキル基、置換基を有するかもしくは置換を有しないアルケニル基、置換基を有するかもしくは置換を有しないアリール基又は置換基を有するかもしくは置換を有しないヘテロ環基を表し、Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に置換基を有するかもしくは置換を有しない５又は６員環を形成する原子群を表す。前記Ｒ７、Ｒ８及びＺ１、Ｚ２の少なくもとのひとつは置換基を有する。前記置換基は−（Ｒ１５）ｐＸ１３示し、Ｒ１５は炭素数が１〜４のアルキル基を示し、Ｘ１３は−ＯＨ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｎ〔（ＣＨ２）ｑ（ＯＨ）〕２又はエチニル基等を例示できる。ここで、ｐは０又は１であり、ｑは０又は１〜４である。
【００１４】
【化１４】
2010133887.tif 000009
式中Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４はそれぞれ独立に、水素原子又は有機置換基を示し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｍ１およびｎ１はそれぞれ独立に０〜４の整数であり、ｍ１およびｎ１が２以上の場合、複数個のＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１３およびＲ１４は同一でもそれぞれ異なっていてもよい。Ｘ１１およびＸ１２は置換基を有するアリール基、または置換基を有するヘテロ環基を示し、同一でもそれぞれ異なっていてもよい。Ｙ１１は電子吸引性基を示す。前記置換基は−（Ｒ１５）ｐＸ１３示し、Ｒ１５は炭素数が１〜４のアルキル基を示し、Ｘ１３は−ＯＨ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｎ〔（ＣＨ２）ｑ（ＯＨ）〕２又はエチニル基等を例示できる。ここで、ｐは０又は１であり、ｑは０又は１〜４である。
【００１５】
前記有機置換基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の炭素数５〜１０のシクロアルキル基、ビニル基、アリル基等の炭素数２〜１０のアルケニル基、フェニル基、３−メチルフェニル基、１−ナフチル基等の炭素数６〜１０のアリール基、３−スルホプロピル基、４−スルホブチル基、２−クロロフェニル基等の炭素数６〜１０の異種原子含有炭化水素基、メトキシ基、エトキシ基、ブトトキシ基、シクロヘキシルオキシ基等の炭素数１〜１０のアルコキシ基、フェノキシ基、１−ナフトキシ基等の炭素数６〜１０のアリールオキシ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジブチルアミノ基等の炭素数１〜１０のアミノ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基等の炭素数２〜１０のアルコキシカルボニル基、例えばカルバモイル基、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基等の炭素数１〜１０のカルバモイル基、ホルミルアミノ基等の炭素数１〜１０のアシルアミノ基、ピリジル基、チエニル基、フリル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基等の炭素数１〜１０のヘテロ環基等が好ましい。
前記一般式で表される式において、ヘテロ環基、アルキル基、アルケニル基、アリール基又は５又は６員環は上記と同じである。
前記電子吸引性基としては、−ＣＮ、＝Ｏ、＝ＳＯ２、＝Ｃ（ＣＮ）２、＝Ｎ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−が好ましい。
【００１６】
前記一般式７で表される色素の中では、特に、Ｒ１とＲ４、Ｒ２とＲ３、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８、Ｚ１とＺ２、ｍとｎはそれぞれ同じである色素が好ましく、前記一般式８で表される色素の中では、特に、Ｒ１１とＲ１４、Ｒ１２とＲ１３、Ｘ１１とＸ１３、ｍ１とｎ１はそれぞれ同じである色素が好ましい。
さらに、有機置換基の中では、特に、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基、ビニル基、アリル基等の炭素数２〜１０のアルケニル基、３−スルホプロピル基、４−スルホブチル基等の炭素数２〜１０の異種原子含有アルキル基、メトキシ基、エトキシ基、ブトトキシ基、シクロヘキシルオキシ基等の炭素数１〜１０のアルコキシ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジブチルアミノ基等の炭素数１〜１０のアミノ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブチルカルボニル基等の炭素数２〜１０のアルコキシカルボニル基、例えばカルバモイル基、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基等の炭素数１〜１０のカルバモイル基、ホルミルアミノ基等の炭素数１〜１０のアシルアミノ基、ピリジル基、チエニル基、フリル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピロリジノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基等の炭素数１〜１０のヘテロ環基等が好ましい。
前記電子吸引性基の中では、特に、＝Ｏ、＝Ｃ（ＣＮ）２が好ましい。
【００１７】
前記一般式１におけるＤはデンドロン、および前記デンドロンに結合する上記一般式２で表される基を最外部に持つ構造を取る。ｍはデンドロンの数であり、１〜４である。上記一般式１で表されるデンドリマーは上記一般式２で表される基を最外部に持つ構造を取ることが本発明の大きな特徴の一つである。
前記一般式１におけるＤを構成するデンドロンは前記色素と結合することができ、しかも前記一般式２で表される基と結合することができる限りとくに制限されない。
本発明のデンドロンは下記一般式９で表されるサブユニットから構成されることが好ましい。
【化１５】
2010133887.tif 000010
（式中、Ａｒ２は置換基を有してもよい芳香族環を示す。）で表される。
前記一般式３でのＡｒ２としては、芳香族環、置換基を有する芳香族環を例示でき、置換基としてはメチル基等がある。
このサブユニットが最外部のサブユニットであるときには、下記一般式１０で表されるサブユニットが好ましい。
【化１６】
2010133887.tif 000011
（式中、Ａｒ２は前記と同じである。）
上記サブユニットに前記一般式２で表される基を持たせると下記一般式１１で表されることになる。
【化１７】
2010133887.tif 000012
（式中、Ａｒ１及びＡｒ２は前記と同じである。）
【００１８】
本発明の前記一般式１におけるＤとして、前記一般式４〜６のいずれかで表されることが好ましい。
【００１９】
前記一般式１におけるＤを構成する前記一般式２で表される基は、前記デンドロンと結合している。とくに、デンドロンを構成するサブユニットであって、コアとしての色素から最も離れた位置にあるサブユニットと結合しており、水への溶解性に優れた色素をもたらす。すなわち、前記一般式２で表される基の数が多ければ、水溶性という観点では有利となる。
前記一般式２でのＡｒ１としては、フェニレン基、置換基を有するフェニレン基を例示でき、置換基としてはメチル基等がある。前記一般式２でのＸとしては、−ＯＨ、−ＣＯＯ−Ｈ＋、−ＣＯＯ−Ｍ＋（式中、Ｍはアルカリ金属を示す）、−ＮＨ２、−Ｎ（ＣＨ３）３＋Ｃｌ−、−ＳＯ３−Ｈ＋などの親水性基を例示できる。
【００２０】
前記一般式２で表される基が前記デンドロンと結合する手段方法はとくに制限されないのであって、前記一般式２で表される基の種類や、前記デンドロンに応じて最良の手段方法を適宜選択すれば良い。
【００２１】
本発明の一つの大きな特徴として、本発明の請求項で記載する二光子吸収材料はきわめて大きな二光子吸収断面積を有するということであり、しかも水への溶解性に優れるということでもある。上記二光子吸収材料は５５０ＧＭ以上の二光子吸収断面積を有する。この数値は、最も一般的に用いられているローダミンよりも二光子吸収断面積が２．８倍も大きい。なお、二光子吸収断面積なお、二光子吸収断面積の上限は特に制限されない。
本発明での二光子吸収断面積の評価は、Ｚ−ｓｃａｎ法で行った。Ｚ−ｓｃａｎ法は、非線形光学定数の測定方法として広く用いられている方法であり、集光したレーザービームの焦点付近で、測定試料をビームに沿って移動させ、透過する光量の変化を記録する方法である。
【００２２】
本発明の請求項で記載する色素含有デンドリマーは、水に溶解した状態でもその蛍光性が保持された。すなわち、高濃度のイオンが存在する環境下でも蛍光を発した。具体的には、ｐＨ１４の水酸化カリウム水溶液に本発明が規定するデンドロンで覆われた色素（実施例１ｃ）を溶かし、紫外線を当てると蛍光を発した。このときの二光子吸収断面積の波長分散測定を行った。その結果、二光子吸収断面積は大きいことが分かった。
【００２３】
本発明の請求項１で記載するデンドリマーの調製法を代表的な例に基づいて説明する。
芳香環を含むポリヒドロキシ化合物を原料として、ウイリアムソンのエーテル合成法により上記一般式９で表されるサブユニットから構成されるデンドロンを調製する。前記芳香環を含むポリヒドロキシ化合物としては、３，５−ジヒドロキシベンジルアルコール、メチル基置換３，５−ジヒドロキシベンジルアルコールを例示できる。
次いで、当該デンドロンに前記一般式２で表される基を結合させてもよいが、一般式２で表される基を含む化合物（ここでの化合物には、基が保護された化合物及び後の処理により当該基をふくむことになる化合物等を含む。以下、同様）を芳香環を含むポリヒドロキシ化合物と予め反応させた化合物を原料として用いることが有利であり、所謂第２世代や第３世代のデンドロンを調製するときには必要に応じて、芳香環を含むポリヒドロキシ化合物を原料として用いることが有利である。前記一般式２で表される基を含む化合物としては、４−（ブロモメチル）安息香酸、４−（ブロモメチル）安息香酸メチル、メチル基置換４−（ブロモメチル）安息香酸、メチル基置換４−（ブロモメチル）安息香酸メチル、４−（クロロメチル）ベンゼンスルホン酸、４−（ブロモメチル）フェノール、４−アミノベンジルブロマイド等を例示できる。
【００２４】
前記一般式２で表される基を有する構造のデンドロンを、当該デンドロンと反応できる色素と反応させて上記請求項１記載の水溶性デンドリマーを調製することができる。この反応条件は当該デンドロンと色素が反応できる条件である限り特に制限されない。
【００２５】
本発明が規定する前記色素と反応できる官能基を有する、一般式２で表される基を有する構造のデンドロンを調製すれば、当該デンドロンを色素と反応させ、上記請求項１記載の水溶性デンドリマーを調製することができる。前記色素と反応できる官能基としては、例えば、−ＯＨ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−Ｎ〔（ＣＨ２）ｑ（ＯＨ）〕２を例示できる。ここで、ｑは０又は１〜４である。これら官能基を有するデンドロンは、前記一般式２で表される基を有する構造のデンドロンを基にして、最適な原料及び反応条件を選ぶことにより調製することができる。
なお、一般式２で表される基を有する構造のデンドロンの官能基が−ＯＨのときには、色素の官能基である−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＯＯＨと反応し、一般式２で表される基を有する構造のデンドロンの官能基が−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉのときには、色素の官能基である、−ＯＨ、エチニル基と反応する。
本発明の請求項で記載するデンドリマーの調製法は上記方法に何ら限定されない。例えば、コアとなる色素に第一世代や第二世代等のデンドロンを順次結合させた後、最外部に前記一般式２で表わされる基を導入してもよい。
【００２６】
本発明でいう二光子吸収材料は、水への溶解性に優れ、きわめて大きな二光子吸収断面積を有する。前記二光子吸収材料は生きた細胞内に容易に導入することが可能であり、細胞内での蛍光の強さや色調の変化を顕微鏡を通して観察することができるので、蛍光プローブとして有効である。
【００２７】
本発明でいう二光子吸収材料は、きわめて大きな二光子吸収断面積を有するということであり、しかも水溶性でもある。しかも、８００ｎｍの波長の光子が２つほとんど同時に飛び込めば、その蛍光分子は励起される。波長の長い光は、散乱を受けにくいため奥深くまで届くことができるので、生体内のより深い場所での様子や活動を可視化できる。したがって、本発明でいう二光子吸収材料はバイオイメージング材料としても有効である。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明を実施例及び参考例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではなく、また、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させることは可能である。
本発明で用いた分析機器は次の通りである。
ＮＭＲ測定：ＮＭＲ（独）ブルカー社製  ＡＶＡＮＣＥ４００Ｓ
吸収スペクトル：日立製作所社製  Ｕ-３３００型ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計
二光子吸収断面積の測定：波長可変フェムト秒レーザー（Spectra Physics社製millennia Pro、Tsunami、Empower、Spitfire
Pro、OPA-800Cを組み合わせたもの）を光源にＺスキャン測定用光学系を独自に組み立てた装置
なお、特に言及しない限り、％は質量％、部は質量部を意味するものとする。
【００２９】
参考例１：原料の調製
【化１８】
2010133887.tif 000013
４−（ブロモメチル）安息香酸メチル２．０ｇ（８．７３ｍｍｏｌ）、３，５−ジヒドロキシベンジルアルコール０．５９７ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム１．４７ｇ（１０．６ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６０．２３ｇ（０．０８７ｍｍｏｌ）を脱水したテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解させ、７０℃の油浴中で２４時間加熱還流した。反応溶液を放冷後、蒸留水を加えた。粗生成物をクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで水を除去した後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：酢酸エチル＝１０：１（容量比）（以下、同様））で精製し、実施例１ｂで用いる化合物２の原料となる化合物  １．４９ｇ（収率８０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄ１）：３．９３（ｓ，６Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，４Ｈ），６．５２（ｔ，１Ｈ），６．６４（ｄ，２Ｈ），７．４７（ｄ，４Ｈ），８．１０（ｄ，４Ｈ）
【００３０】
【化１９】
2010133887.tif 000014
前記化合物２の原料となる化合物１．５０ｇ（３．４４ｍｍｏｌ）を脱水したテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解させ、四臭化炭素１．０９ｇ（３．２９ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン０．８６５ｇ（３．３０ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、蒸留水を加えて反応を停止し、粗生成物をクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで水を除去した後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：ヘキサン＝５：１）で精製し、実施例１ｂで用いる化合物２  １．４６ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄ１）：３．９３（ｓ，６Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，４Ｈ），６．５２（ｔ，１Ｈ），６．６４（ｄ，２Ｈ），７．４７（ｄ，４Ｈ），８．１０（ｄ，４Ｈ）
【００３１】
実施例１ａ：色素の調製
【化２０】
2010133887.tif 000015
４−（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）べンズアルデヒド１．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）とシクロペンタノン０．１９ｇ（２．３ｍｍｏｌ）をエタノール（３０ｍｌ）に溶解させた。カリウム−ｔ−プトキシド０．１ｇ（０．９０ｍｍｏｌ）を加えた後、８０℃で６時間還流した。反応溶液を放冷後、水（３０ｍｌ）をくわえ、析出した結晶をろ別した。得られた粗結晶をクロロホルム／エタノール（１０：１）の混合溶媒を用いて再結晶した後、化合物（１）の深赤色結晶  ０．７０ｇ（収率：６５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．９９（ｓ，４Ｈ），３．４９（ｔ，８Ｈ），３．５６（ｔ，８Ｈ），４．８０（ｔ，４Ｈ），６．７７（ｄ，４Ｈ），７．２７（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，４Ｈ）
【００３２】
実施例１ｂ：二光子吸収性材料の前駆体の調製
【化２１】
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【化２２】
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原料化合物（１）０．２５ｇ（０．５４ｍｍｏｌ）とナトリウムハイドライド０，１０ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）に溶解させ、５時間攪拌した。攪拌した後、参考例１で調製した原料化合物（２）０．６７ｇ（１．３ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌した。クロロホルムで５回抽出した後、硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮し、ＨＰＬＣにより精製し、化合物３の橙色結晶  ６７ｍｇ（収率：１０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄｌ）：２．９０（ｓ，４Ｈ），３．６２（ｔ，４Ｈ），３．７０（ｔ，８Ｈ），３．８４（ｔ，４Ｈ），３．８９（Ｓ，１２Ｈ），４．４７（ｓ，４Ｈ），５．００（ｓ，８Ｈ），６．４８（ｔ，２Ｈ），６．５０（ｄ，４Ｈ），６．７１（ｄ，４Ｈ），７．４４（ｓ，２Ｈ），７．４６（ｄ，８Ｈ），７．４７（ｄ，４Ｈ），８．０２（ｄ，８Ｈ）
【００３３】
【化２３】
2010133887.tif 000018
実施例１ｃ：二光子吸収性材料の調製
原料化合物（３）６０ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍｌ）に溶解させた。水（５ｍｌ）に水酸化カリウム１．０ｇ（１７．８ｍｍｏｌ）を溶解させ、エタノール（５ｍｌ）とともに反応溶液に加え、１００℃で２４時間還流した。反応溶液を放冷後、蒸留水を加えて希塩酸で中和し、クロロホルムで抽出した。得られた化合物を、水（５ｍｌ）に水酸化カリウム０．１１ｇ（２ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液に溶解させ、再結晶することにより化合物Ａ−１の赤色結晶６３ｍｇ（収率：９８％）であった。
【００３４】
実施例２
（水への溶解度の評価）
本発明での水への溶解度は、以下の手順で測定した。それぞれのデンドリマーを過剰量溶かした水溶液を作製し、メンブランフィルター（ADVANTECのMIXED CELLULOSE ESTER 60508100）で水溶液だけを分集した。この溶液の紫外一可視吸収スペクトルを測定し、その吸光度をあらかじめ算出しておいたモル吸光係数で割り、水溶液の濃度を決定した。
その結果、化合物Ａ−１の水への溶解度は、１０−２Ｍと現在二光子バイオイメージングに用いられているローダミン類に匹敵する高い水溶性を示した。
【００３５】
実施例３
（二光子吸収断面積の評価）
実施例１ｃの二光子吸収材料を蒸留水に溶解させ、１．０×１０−４ｍｏｌ／ｌの濃度の水溶液を調製した。
本発明での二光子吸収断面積の評価はＺ−ｓｃａｎ法で行った。
すなわち、集光したレーザービームの焦点付近で、測定試料をビームに沿って移動させ、透過する光量の変化を記録する。試料の位置により、入射光のパワー密度が変化するため、非線形吸収がある場合には、焦点付近で透過光量が減衰する。透過光量の変化を入射光強度．集光スポットサイズ、試料厚み、試料濃度などから予測される理論曲線でフィッティングを行うことにより二光子吸収断面積を算出した。二光子吸収断面積測定用の光源には、Ti：Sapphireパルスレーザーを光源に、再生増幅器を通して得られた光（パルス幅ｌ２０ｆｓ、繰り返し１ｋＨｚ、平均出力ＩＷ）を種光とし、オプティカルパラメトリック増幅器により波長を変換したレーザー光（波長範囲４００ｎｍから１２００ｎｍ）を用いた。
前記水溶液を試料として前記方法で測定した。その結果、波長９００ｎｍにおける二光子吸収断面積は５５０ＧＭであった。
【００３６】
従来から多用されているローダミンＢの二光子吸収断面積は２００ＧＭ（８３０ｎｍ）であり、ＧＦＰの二光子吸収断面積は７ＧＭ（８００ｎｍ）であるとの報告と比較すると、前記実施例１の色素はローダミン類に比べ２．５倍、ＧＦＰに比べ、７８．５倍も大きな値であった。
【００３７】
実施例４
（二光子吸収断面積の評価）
実施例１ｃの二光子吸収材料をｐＨ１４の水酸化カリウム水溶液に溶解させ２．０×１０−３ｍｏｌ／ｌの濃度の水溶液を調製した。
この水溶液を１ｃｍセルに入れ、実施例３と同様に操作し、二光子吸収断面積を測定した。照射したレーザー光の特性は、波長によって異なり、パルス幅１３０から２５０ｆｓ、平均パワー０．１から０．４Ｗ、繰り返し１ｋＨｚである。
測定結果を図２に示した（破線）。
図２の実線は前記試料の紫外−可視吸収スペクトルを示す。
【００３８】
実施例５
（二光子吸収材料の蛍光観察）
左図は化合物実施例１ｃの二光子吸収材料をｐＨ１４の水酸化カリウム水溶液に溶解させ１．０×１０−４ｍｏｌ／ｌの濃度の水溶液を調製した。
この水溶液を１ｃｍセルに入れ、蛍光灯の下に配置した。また、前記水溶液を１ｃｍセルに入れ、紫外線を照射した。それぞれのセルを写真撮影した。
その写真を図１に示す。図１の右図は紫外線を照射したセルの写真であり、図１の左図は蛍光灯の下に配置したセルの写真である。図１の左図の写真から前記水溶液は蛍光を発することを認めた。また、図１の右図の写真から前記水溶液は強い蛍光を発することを認めた。
本発明により得られた二光子吸収材料は、強アルカリ溶液中かつ高濃度イオンの存在下でも十分に蛍光を発することがわかった。また、本発明により得られた二光子吸収材料はバイオイメージングに有用であるといえる。
【００３９】
参考例２：原料の調製
参考例２ａ：原料化合物Ｂの調製
（原料化合物Ｂ）
【化２４】
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実施例１ｂで用いた化合物２を２．２ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）、３，５−ジヒドロキシベンジルアルコール０．３０２ｇ（２．１５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム０．７４３ｇ（５．３８ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６０．１１４ｇ（０．４３１ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（２５ｍｌ）に溶解させ、７０℃で２４時間加熱還流した。反応溶液を放冷後、蒸留水を加えてクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：酢酸エチル＝４：１）で精製し、原料化合物Ｂ  １．６５ｇ（収率７９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄ１）：３．９２（ｓ，１２Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｓ，４H），５．１０（ｓ，８Ｈ），６．４５（ｔ，１Ｈ），６．５３（ｔ，２Ｈ），６．５５（ｄ，２Ｈ），６．６５（ｄ，４H），７．４７（ｄ，８Ｈ），８．０４（ｄ，８Ｈ）
【００４０】
参考例２ｂ：原料化合物Ｃの調製
（原料化合物Ｃ）
【化２５】
2010133887.tif 000020
原料化合物Ｂ１．５０ｇ（１．５４ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解させ、１５分間隔で四臭化炭素０．６１１ｇ（１．８４ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン０．４８３ｇ（１．８４ｍｍｏｌ）を４回加えた。蒸留水を加えてクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム：ヘキサン＝３：１）で精製し、原料化合物Ｃ  １．３３ｇ（収率８３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄ１）：３．９２（ｓ，１２Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｓ，４H），５．１０（ｓ，８Ｈ），６．４５（ｔ，１Ｈ），６．５３（ｔ，２Ｈ），６．５５（ｄ，２Ｈ），６．６５（ｄ，４H），７．４７（ｄ，８Ｈ），８．０４（ｄ，８Ｈ）
【００４１】
参考例２ｃ：原料化合物Ｄの調製
（原料化合物Ｄ）
【化２６】
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原料化合物Ｃ３．０ｇ（２．８８ｍｍｏｌ）、３，５−ジヒドロキシベンジルアルコール０．３０２ｇ（１．４１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム０．４８８ｇ（３．５３ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６０．０７５ｇ（０．２８２ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（３０ｍｌ）に溶解させ、７０℃で２４時間加熱還流した。反応溶液を放冷後、蒸留水を加えてクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：ジエチルエーテル＝９：１）で精製し、原料化合物Ｄ  １．９４ｇ（収率６７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄ１）：３．９２（ｓ，２４Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ），４．９４（ｓ，１２H），５．０８（ｓ，１６Ｈ），６．４５−６．６５（ｍ，２１H），７．４６（ｄ，１６Ｈ），８．０２（ｄ，１６Ｈ）
【００４２】
参考例２ｄ：原料化合物Ｅの調製
（原料化合物Ｅ）
【化２７】
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原料化合物Ｄ２．０ｇ（０．９７１ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（２５ｍｌ）に溶解させ、１５分間隔で四臭化炭素０．３８８ｇ（１．１７ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン０．３０７ｇ（１．１７ｍｍｏｌ）を４回加えた。蒸留水を加えてクロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：ジエチルエーテル＝１００：３）で精製し、原料化合物Ｅ  １．３３ｇ（収率８０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＣＤＣｌ３−ｄ１）：３．９２（ｓ，２４Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），４．９４（ｓ，１２H），５．０８（ｓ，１６Ｈ），６．４５−６．６５（ｍ，２１H），７．４６（ｄ，１６Ｈ），８．０２（ｄ，１６Ｈ）
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１の右図は、本発明の二光子吸収材料の水溶液に紫外線を照射したときの写真である。図１の左図は、本発明の二光子吸収材料の水溶液に蛍光灯を照射したときの写真である。
【図２】図２は、本発明の二光子吸収材料の水溶液での二光子吸収断面積の測定結果及び紫外−可視吸収スペクトルを示す。
【図２】
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【図１】
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