(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸の検出、及び、核酸からタンパク質を翻訳させるための、核酸チップにおいて、DNAなどの核酸を担体上に効率よく固定化する技術の提供。【解決手段】担体上に固定化されたキトサン及び該キトサンのアミノ基を介して固定化された核酸を含む、核酸固定化担体。核酸がビオチン標識核酸であり、該ビオチン標識核酸がキトサンのアミノ基に導入されたアビジンとビオチンの相互作用により固定化された、核酸固定化担体。該核酸チップに固定化された核酸からタンパク質を翻訳させる、タンパク質の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上に固定化されたキトサン及び該キトサンのアミノ基を介して固定化された核酸を含む、核酸固定化担体。
【請求項２】
核酸がビオチン標識核酸であり、該ビオチン標識核酸がキトサンのアミノ基に導入されたアビジンとビオチンの相互作用により固定化された、請求項１に記載の核酸固定化担体。
【請求項３】
担体が基板であり、基板上の複数箇所に核酸が固定化された、請求項１または２記載の核酸固定化担体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸固定化担体を含む、核酸チップ。
【請求項５】
担体上にキトサンを固定化し、該キトサンのアミノ基を介して核酸を固定化することを含む、核酸固定化担体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸固定化担体または請求項４に記載の核酸チップに固定化された核酸からタンパク質を翻訳させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項７】
担体上に固定化されたキトサン及び該キトサンのアミノ基を介して固定化されたアビジンを含む、核酸固定化用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸固定化担体、該担体を含む核酸固定化チップおよびそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現解析や多型解析の目的でＤＮＡチップなどの核酸固定化チップが頻繁に使用されている。より微量の核酸試料からシグナルを検出するためにはより効率よく基板などの担体に核酸を固定化する必要がある。核酸固定化チップにおいて核酸を固定化する方法として、エポキシを用いる方法が報告されている（非特許文献１）。しかし、この方法では固定化される核酸の量が十分でなく、検出感度に問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Oligonucleotide microarrays: immobilization of phosphorylated oligonucleotides on epoxylated surface., Mahajan S, Kumar P, Gupta KC., Bioconjug Chem. 2006 Sep-Oct;17(5):1184-1189.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子の発現解析や多型解析などに用いられる核酸固定化担体において、固定化される核酸の量を高めるための技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、担体上にキトサン残基を固定化し、該キトサンのアミノ基を介して核酸を固定化させることにより、核酸を効率よく固定化できることを見出して本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）担体上に固定化されたキトサンおよび該キトサンのアミノ基を介して固定化された核酸を含む、核酸固定化担体。
（２）核酸がビオチン標識核酸であり、該ビオチン標識核酸がキトサンのアミノ基に導入されたアビジンとビオチンの相互作用により固定化された、（１）の核酸固定化担体。
（３）担体が基板であり、基板上の複数箇所に核酸が固定化された、（１）または（２）の核酸固定化担体。
（４）（１）〜（３）のいずれかの核酸固定化担体を含む、核酸チップ。
（５）担体上にキトサンを固定化し、該キトサンのアミノ基を介して核酸を固定化することを含む、核酸固定化担体の製造方法。
（６）（１）〜（３）のいずれかの核酸固定化担体または（４）の核酸チップに固定化された核酸からタンパク質を翻訳させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
（７）担体上に固定化されたキトサン及び該キトサンのアミノ基を介して固定化されたアビジンを含む、核酸固定化用担体。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、アミノ基を豊富に含む多糖類であるキトサンを用いることでガラス基板などの担体上に固定化される核酸の量を増大させることができるので、従来法に比べて高密度な核酸アレイの作製が可能である。
具体的には、エポキシ修飾基板を用いたDNA固定化法と比べ、基板上に固定化されるDNA量
が約1.5倍に増大した。固定化量の増大によりDNA自体の検出感度やDNAアレイからのタンパク質発現量増加などが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の固定化方法（キトサン法）と従来の方法（エポキシ法）におけるDNA固定化効率の比較を示す図（写真）。
【図２】ビオチン化DNA作製に用いたプラスミドの図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の核酸固定化担体は、担体上に固定化されたキトサン及び該キトサンのアミノ基を介して固定化された核酸を含む。
【００１０】
担体として用いることのできる素材としては、プラスチック、無機高分子、天然高分子およびセラミックなどが挙げられる。プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびアクリル樹脂などが、無機高分子としては、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル、およびグラファイト等が、天然高分子としては、セルロース、セルロース誘導体、キチン、キトサン、アルギン酸およびアルギン酸塩等が、セラミックとしては、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等などが例示される。
上記担体の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレート、膜、スライド、細胞培養容器など）、ラテックスを挙げることができ、またその大きさについては特に制限はない。
【００１１】
キトサンは天然由来でも合成物でもよい。アミノ基が核酸の固定化用にある程度intactであれば（保存されていれば）修飾体であってもよい。分子量も特には制限されないが、分子量が1万以上、100万以下の高分子キトサンが好ましい。
担体上へのキトサンの固定化方法は特に制限されないが、キトサンのアミノ基を介して担体上のカルボキシル基やアルデヒド基と結合させることが好ましい。例えば、担体をアミノシラン処理して担体をアミノ基で修飾し、該アミノ基にグルタルアルデヒドを反応させて担体上にアルデヒド基を形成し、このアルデヒド基とキトサンの一部のアミノ基を反応させて、キトサンを固定化することができる。
そして、キトサンの残りのアミノ基を利用して核酸を結合させることが好ましい。
核酸をキトサンのアミノ基に結合させる方法は特に限定されるものではなく、核酸にキトサンのアミノ基と反応する基を導入して核酸を直接結合させてもよいが、好ましくは、核酸にビオチンなどの修飾物質を結合させ、該修飾物質と相互作用する物質を用いてキトサンのアミノ基に結合させることが好ましい。例えば、キトサンの残りのアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させてアルデヒド基を形成し、これに前記修飾物質と相互作用し、かつアミノ基を含む物質（アビジンなど）を反応させて結合させ、さらに修飾物質と相互作用物質の相互作用を使用して核酸を結合させることができる。例えば、修飾物質としてビオチンを採用する場合、ビオチンに相互作用し、アミノ基を有する物質として、アビジンが挙げられる。ビオチン修飾は通常DNAの末端に行われる。この場合、DNAを標的配列とのハイブリダイズ能を維持したまま基板上へ特異的に結合できるので好ましい。
なお、キトサンの固定化量は固定化担体の使用目的に応じ適宜調整される。 
【００１２】
以下、本発明の核酸固定化担体の作製法を例示する。ただし、この作製法は一例にすぎず、本発明の核酸固定化担体は以下の方法により作製されるものには限定されない。
まず、ガラスをアミノシラン、グルタルアルデヒド、キトサン、グルタルアルデヒド、アビジンの順で以下のように修飾する。
ガラス基板を洗浄するため水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した後、超純水、アセトン、エタノールの順で洗浄、風乾を行う。
洗浄されたガラス基板に3-Aminopropyltriethoxysilan（例えば、0.05〜2％）を蒸着反応させた後、加熱処理する。
3-Aminopropyltriethoxysilan処理されたガラス基板をグルタルアルデヒド溶液に浸漬した後、超純水、アセトン、エタノールの順で洗浄し風乾する。
グルタルアルデヒドで処理されたガラス基板をキトサン溶液に浸漬処理した後、超純水で洗浄する。これにより、グルタルアルデヒドのアルデヒド基にキトサンのアミノ基が共有結合し、基板上に多数のアミノ基が得られ、核酸を結合させるための表面積が増大する。次に、キトサンが導入されたガラス基板をグルタルアルデヒド溶液に浸漬した後、超純水、アセトン、エタノールの順で洗浄し風乾する。
得られたガラス基板上にアビジン溶液を滴下し、静置することで、アルデヒド基とアビジンのアミノ基が結合し、アビジンがキトサンを介してガラス基板上に固定される。
そして、アビジンが固定化されたガラス基板上にビオチン標識された核酸溶液を滴下して反応させることにより、キトサンを介して核酸が固定化されたガラス基板が得られる。
【００１３】
固定化する核酸としては特に制限はないが、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドなどが挙げられる。また、ランダムなDNAを固定化し、DNAライブラリー固定化担体として用いてもよい。
【００１４】
標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドを固定化することで、発現解析用マイクロチップやＳＮＰ解析用マイクロチップなどとして利用することができる。
また、タンパク質を翻訳させることのできるDNA配列を固定化し、Rabbit Reticulocyte LysateやWheat Germ Extractなどの無細胞翻訳用試薬を加えることで、本発明の核酸固定化担体からタンパク質を発現させることができる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に制限されない。
【００１６】
実施例１：キトサンを利用したDNAの固定化
以下の手順で、DNA固定化基板を作製した。
【００１７】
ガラス基板洗浄（1M  NaOH）
高撥水性印刷スライドグラス（MATSTUNAMI GLASS Non-Coatタイプ、２４穴）を1M  NaOH
に漬け、１日放置した。
↓
超純水（ミリQ水）、アセトン、エタノールの順で洗浄した後、風乾した。
↓
アミノシラン処理
デシケーター内でアミノシラン (1% 3-Aminopropyltriethoxysilane：信越シリコーン) を少量バイアルにとり、上記ガラス基板とともにデシケーター内に置いて、減圧し、2時間放置して基板にアミノシランを蒸着させた。
↓
ガラス基板を100℃で2時間ベークした。
↓
グルタルアルデヒド処理
0.5v/v％グルタルアルデヒド溶液（0.1M HEPES pH7、グルタルアルデヒド(Wako）)100mlにガラス基板を漬け、３日間静置した。
↓
超純水、アセトン、エタノールの順で洗浄した後、風乾した。
↓
キトサン処理
0.05％キトサン溶液（0.1M HEPES pH8、キトサン（SIGMA Cat. No.3646、85%以上脱アセチル化済））100mlにガラス基板をつけ、バットに入れたままスターラーで1日間撹拌した。
↓
超純水でガラス基板を洗浄。
↓
グルタルアルデヒド処理
0.5v/v％グルタルアルデヒド溶液（上記と同じ）100mlに、ガラス基板を入れバットに入れたままスターラーで1日間撹拌した。
↓
超純水、アセトン、エタノールの順で洗浄した後、風乾した。
↓
Avidin処理
1mg/ml Avidin（Jackson ImmunoResearch社）溶液をガラス基板に6μlずつ４箇所スポットし、30分間静置した。
↓
超純水で洗浄した。
↓
ビオチン化ＤＮＡ処理
前もって作製したビオチン標識ＤＮＡ溶液（後述の参考例参照）（8.13ng/μl）を各４μｌ、上記基板のアビジン固定化部位にスポットし、30分間静置したのち、超純水で洗浄し、DNAがキトサンを介して固定化されたDNA固定化基板を得た。
【００１８】
比較例１：エポキシを利用したDNAの固定化
ガラス基板洗浄（アセトン）
高撥水性印刷スライドグラス（MATSTUNAMI GLASS Non-Coatタイプ、２４穴）をアセトンに漬けて洗浄した後、風乾した。
↓
エポキシ処理
ガラス基板をデシケーター内で１％ 3-グルシドキシプロピルトリメトキシシランに1時間浸漬した。
↓
ガラス基板を100℃で2時間ベークした。
↓
Avidin処理
1mg/ml Avidin（Jackson ImmunoResearch社）溶液をガラス基板に6μlずつ４箇所スポットし、１日間静置した。
↓
超純水で洗浄したのち、各スポット部位に2mMアスパラギン酸を6μlずつ滴下し、30分間静置した。なお、アスパラギン酸はavidinと結合しなかった3-グルシドキシプロピルトリメトキシシランが他のタンパク質と結合することにより実験データのエラーを防ぐためのブロッキング（不活化）に使用した。
↓
ビオチン化ＤＮＡ処理
前もって作製したビオチン標識ＤＮＡ溶液（後述の参考例参照）（4.06ng/μl、8.13ng/μl、16.26ng/μl、32.51ng/μl）を各４μｌ、上記基板のアビジン固定化部位にスポットし、30分間静置した後、超純水で洗浄した。これにより、DNAがエポキシを介して固定
化されたDNA固定化基板を得た。
【００１９】
＜DNA固定化量の評価＞
上記実施例１および比較例１で作製したDNA固定化基板のDNA固定化部位のそれぞれに10μg/mlのエチジウムブロマイド溶液を2.2μlと超純水5.8μlを滴下し、遮光状態で30分間静置した。なお、ネガティブコントロールとしてDNA非固定化部位に10μg/mlのエチジウムブロマイド溶液を2.2μlと超純水5.8μlを滴下した。
その後、トランスイルミネーター（TFML-20E、フナコシ）を用い、365nmの紫外光を照射して基板上に固定化されたDNAの蛍光を観察した（図１）。この蛍光像を画像解析ソフトImageJ 1.40gで取り込み、キトサン固定の場合とエポキシ固定の場合のそれぞれについて検量線を作成してDNA固定化効率を比較した。その結果、キトサン法を用いたスポット1-4の固定化量は、1:2.72ng、2:2.90ng、3:3.58ng、4:6.29ng、平均3.87ngエポキシ法を用いたスポット5-8の固定化量は、5:2.81ng、6:2.65ng、7:2.45ng、8:2.50ng、平均2.60ngとなり、キトサン固定の場合、エポキシ固定の場合の約1.5倍固定化効率が優れることがわかった。
【００２０】
参考例
ビオチン化DNAの調製
図２に示すプラスミドpGGFPH（A picoliter chamber array for cell-free protein synthesis. ,Kinpara T, Mizuno R,Murakami Y,Kobayashi M, Yamaura S,Hasan Q, Morita Y,Nakano H,Yamane T,Tamiya E. J Biochem. 2004 Aug;136(2):149-54.）を鋳型に用い、下記のプライマーを用いてPCRを行い、ビオチン標識DNAを得た。これをアガロースゲル電気泳動した後、精製して固定化に用いた。
5'-biotin-TAATACGACTCACTATAGGG-3' （配列番号１）
5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' （配列番号２）
【図２】
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【図１】
2010259405.tif 000004
【配列表】
2010259405000001.app