(57)【要約】【課題】本発明は、乳癌の診断および乳癌の転移を判断するための新規腫瘍マーカー及び当該マーカーを用いた乳癌の検査方法を提供することを課題とする。さらには当該マーカーを用いて検査するための検査用試薬キットを提供することを課題とする。【解決手段】生体から分離された生体検体について、ＥＰＨＡ１０および／またはＲＲＥＢ１を、乳癌の腫瘍マーカーとして検出することを特徴とする、乳癌の検査方法による。当該乳癌の検査方法ではＥＰＨＡ１０およびＲＲＥＢ１を腫瘍マーカーとしてもよい。さらに、当該乳癌の検査方法に用いる乳癌検査用試薬、および、乳癌検査用試薬キットによる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された生体検体について、ＥＰＨＡ１０および／またはＲＲＥＢ１を、乳癌の腫瘍マーカーとして検出することを特徴とする、乳癌の検査方法。
【請求項２】
ＥＰＨＡ１０およびＲＲＥＢ１を検出する、請求項１に記載の乳癌の検査方法。
【請求項３】
ＥＰＨＡ１０および／またはＲＲＥＢ１のタンパク質の検出を免疫学的手法により行う、請求項１または２に記載の乳癌の検査方法。
【請求項４】
免疫学的手法が免疫組織染色である、請求項３に記載の乳癌の検査方法。
【請求項５】
生体検体中のＥＰＨＡ１０もしくはＲＲＥＢ１を検出するための、抗ＥＰＨＡ１０抗体もしくは抗ＲＲＥＢ１抗体、または、ＥＰＨＡ１０もしくはＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを含む、請求項１〜４のいずれか１に記載の乳癌の検査方法に用いる、乳癌検査用試薬。
【請求項６】
抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体を含む、請求項５に記載の乳癌検査用試薬。
【請求項７】
請求項５に記載の抗ＥＰＨＡ１０抗体および抗ＲＲＥＢ１抗体を各々乳癌検査用試薬として、または、ＥＰＨＡ１０およびＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを各々乳癌検査用試薬として含む、請求項２〜４のいずれか１に記載の乳癌の検査方法に用いる、乳癌検査用試薬キット。
【請求項８】
抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体を、各々乳癌検査用試薬として含む、請求項７に記載の乳癌検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の発症、乳癌の悪性度および乳癌の転移を診断するための新規腫瘍マーカー及び当該マーカーを用いた乳癌の検査方法に関し、さらには当該乳癌検査方法のための検査用試薬および検査用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに成人の死亡原因を二分する疾患であり、なかでも乳癌の罹患率は女性では第１位である。乳癌は、早期に診断と治療が行われれば治癒も望める病気であるため、有効な診断のための検査方法の開発が切望されている。
【０００３】
近年腫瘍マーカーについての研究が盛んに行われており、既に癌のスクリーニングテストとして活用されている腫瘍マーカーや、現在機能を評価中の腫瘍マーカーが存在する。腫瘍マーカーとしては、癌発症や再発などの診断マーカー、予後予測マーカー、治療奏効性予測マーカー、原発巣切除後の経過観察のためのマーカー、進行癌治療モニターのためのマーカーなどとしての活用が期待されている。
【０００４】
乳癌の一般的なスクリーニング検査としては、問診、触診、軟Ｘ線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が実施され、臨床的に乳癌の疑いが生じた場合は、細胞診や生検を行い病理学的診断により乳癌であるかどうかが判別されている。これらの診断方法のほか、乳癌に発現する腫瘍マーカーを検出する方法も汎用されており、ＣＡ１５−３ (carbohydrate antigen 15-3)、ＣＥＡ (carcinoembryonic antigen)、ＢＣＡ２２５ (breast cancer antigen-225) 、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ｃ−ｅｒｂＢ−２、Ｈｅｒ−２などが乳癌マーカーとして用いられている。
【０００５】
また、乳癌の悪性度については、癌細胞の分化の程度、リンパ節、血管侵襲の有無などの病理学的所見に応じて判断するのが一般的である。しかしながら、生検により得られた検体について癌細胞の分化程度を判断するのは、必ずしも容易ではない。乳癌について悪性度を診断可能な腫瘍マーカーがあれば、例えば外科的療法の場合に、より効果的な切除方法を選択することができ、患者にとって肉体的、精神的負担を軽減化することができる。乳癌の悪性度判断のためのマーカーとして、ＨＥＲ−２やＥＲ、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１などが提案されている（非特許文献１）。
【０００６】
乳癌のスクリーニングや、悪性度の判断に用いられるＨｅｒ−２は、免疫組織染色やFISH法などにより検出される。また、ＨＥＲ−２陽性の場合の治療方法として、ＨＥＲ−２に対するヒト化マウスモノクロナール抗体（ハーセプチン(R)(Trastuzumab)）を投与する抗体療法が行われ、ＨＥＲ−２は治療奏効性予測マーカーとしても利用されている。しかしながら、ＨＥＲ−２は乳癌患者の２０〜３０％でしか発現しておらず、診断マーカー等として用いるには特異度が低い（非特許文献２）。
【０００７】
また、乳癌のスクリーニングに用いられるＣＡ１５−３は、原発性乳癌の場合、初期の陽性率が２％程度であり、早期診断における有用性は乏しいのが実情である。ＣＡ１５−３の再発症例における陽性率は再発部位によって大きく異なり、リンパ節や骨転移では約３０％であるのに対して、肝、胸膜などの内臓転移では７５％と高い陽性率を示す。ＣＡ１５−３は、乳癌以外の卵巣癌や子宮癌、膵臓癌においても陽性が見られ、特異度が低い。
【０００８】
従来、癌診断のための新規な腫瘍マーカーの同定にＤＮＡマイクロアレイ技術が用いられ、乳癌についてのマイクロアレイ分析も多数行われてきた。しかしながら従来のマイクロアレイ分析はゲノムにおける変異解析や、ｍＲＮＡレベルの発現解析にとどまるものが多く（特許文献１）、乳癌に対する感度および特異度の高い腫瘍マーカーを得ることが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2005-304497号公開公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Duffy MJ.: Eur J Intern Med. 2007 May;18(3):175-184
【非特許文献２】Ross JS, et al., : Oncologist. 2003;8(4):307-25
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、乳癌発症や、乳癌の悪性度の診断、および乳癌の転移を判断するための新規腫瘍マーカー及び当該マーカーを用いた乳癌の検査方法を提供することを課題とする。さらには当該マーカーを用いて検査するための検査用試薬および検査用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために、生体検体から分離した乳癌細胞と正常細胞とのプロテオーム比較を行うことにより、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１が有用な乳癌の腫瘍マーカーとなりうることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．生体から分離された生体検体について、ＥＰＨＡ１０および／またはＲＲＥＢ１を、乳癌の腫瘍マーカーとして検出することを特徴とする、乳癌の検査方法。
２．ＥＰＨＡ１０およびＲＲＥＢ１を検出する、前項１に記載の乳癌の検査方法。
３．ＥＰＨＡ１０および／またはＲＲＥＢ１のタンパク質の検出を免疫学的手法により行う、前項１または２に記載の乳癌の検査方法。
４．免疫学的手法が免疫組織染色である、前項３に記載の乳癌の検査方法。
５．生体検体中のＥＰＨＡ１０もしくはＲＲＥＢ１を検出するための、抗ＥＰＨＡ１０抗体もしくは抗ＲＲＥＢ１抗体、または、ＥＰＨＡ１０もしくはＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを含む、前項１〜４のいずれか１に記載の乳癌の検査方法に用いる、乳癌検査用試薬。
６．抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体を含む、前項５に記載の乳癌検査用試薬。
７．前項５に記載の抗ＥＰＨＡ１０抗体および抗ＲＲＥＢ１抗体を各々乳癌検査用試薬として、または、ＥＰＨＡ１０およびＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを各々乳癌検査用試薬として含む、前項２〜４のいずれか１に記載の乳癌の検査方法に用いる、乳癌検査用試薬キット。
８．抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体を、各々乳癌検査用試薬として含む、前項７に記載の乳癌検査用試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検査方法において用いられる新規腫瘍マーカーのうち、ＥＰＨＡ１０は乳癌患者の４９．２％に発現が認められ、ＲＲＥＢ１は４３．９％に発現が認められ、ＥＰＨＡ１０もしくはＲＲＥＢ１のいずれかは５７．２％に発現が認められ、感度の高いものである。また、乳癌患者中、Ｈｅｒ−２陰性患者は７２．０％であったが、ＥＰＨＡ１０はＨｅｒ−２陰性患者の４４．１％に発現が認められ、ＲＲＥＢ１は３３．８％に発現が認められ、ＥＰＨＡ１０もしくはＲＲＥＢ１のいずれかは４７．８％に発現が認められ、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１は、Ｈｅｒ−２よりも高い感度を有する。また、リンパ節転移陽性患者のうち６２．４％にＥＰＨＡ１０が発現しており、５０．６％にＲＲＥＢ１が発現しており、リンパ節転移と各タンパク質発現は高い相関が見られる。
ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１は、乳癌の診断、乳癌の悪性度の判断、および乳癌の転移診断において、強力なマーカーとなることが確認された。さらに、Ｈｅｒ−２陰性の患者においても発現が確認されたことにより、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１の両方について検査を行うことにより、より正確に乳癌の診断、乳癌の悪性度の判断、および乳癌の転移診断を行うことが可能であることが確認され、本発明の検査方法を用いて検査することにより、適切な治療方法を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳癌患者における、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１のタンパク質発現解析の結果を示す図である。（実施例１）
【図２】乳癌のリンパ節転移患者における、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１のタンパク質発現解析の結果を示す図である。（実施例１）
【図３】各種組織におけるＥＰＨＡ１０のｍＲＮＡ発現解析の結果を示す図である。（実施例２）
【図４】ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を強制発現させた場合の、細胞の浸潤能に対する影響を示す図である。（参考例２）
【図５】ＥＰＨＡ１０の発現を抑制した場合の、癌細胞の浸潤能に対する影響を示す図である。（参考例３）
【図６】ＥＰＨＡ１０発現細胞の培養上清の、血管新生に対する影響を示す図である。（参考例４）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の乳癌の検査方法は、新規腫瘍マーカーであるＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を単独で、あるいはこれらの２つを併せて検出することによる。ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を単独でマーカーとしてもよいが、これらを併せてマーカーとして確認することにより、より効果的な乳癌の診断、乳癌の悪性度の判断、もしくは乳癌転移の診断等のための検査を行うことが可能となる。
【００１７】
本発明者らは、乳癌細胞と正常細胞とについてプロテオーム比較を行うことにより、約２０種類の発現変動タンパク質を同定した。これらに対する抗体を用いて、約１８０症例の臨床組織切片が固定化された組織マイクロアレイの免疫染色により発現プロファイルを解析したところ、ＥＰＨＡ１０（ephrin receptor A10）およびＲＲＥＢ１（ras-responsive element binding protein 1）が、正常組織にはほとんど発現せず、乳癌組織で約４０〜５０％という高い陽性率を示すことを見出し、これらを新規乳癌関連タンパク質として同定した。
【００１８】
本発明の乳癌関連タンパク質のうち、ＥＰＨＡ１０はエフリン受容体の一種であり、リガンドとしてＥＦＮＡ３、ＥＦＮＡ４、ＥＦＮＡ５が結合することが知られていた。ＥＰＨＡ１０は、浸潤性乳癌と消化管癌において、染色体レベルの変異（ＳＮＰｓ）が確認さているが、当該変異と乳癌との関連は解明されていなかった（Nature 446: 153-158, 2007）。また、ＥＰＨＡ１０がｍＲＮＡレベルで前立腺癌で発現していることが確認されているが、乳癌での発現は確認されていない（Biochem Biophys Res Commun 342: 1263-1272, 2006）。
【００１９】
ＥＰＨＡ１０にはアイソフォームが３つあり、isoform 1は全長からなるタンパク質であり（GenBank Accession No. AJ872185）、isoform 2は、細胞外ドメインのみ（GenBank Accession No. AJ872185）、isoform 3はisoform 1において細胞内Ｃ末端のSAMドメインが欠失したもの（GenBank Accession No. AJ872185）である。
【００２０】
本発明者らがＥＰＨＡ１０について解析を行った結果、ＥＰＨＡ１０は乳癌患者のほぼ半数でタンパク質の発現が認められ、Ｈｅｒ−２陰性患者のほぼ半数でタンパク質発現が認められた。また、ＥＰＨＡ１０はリンパ節転移陽性患者の半数以上においてタンパク質発現が認められた。よって、ＥＰＨＡ１０は、乳癌およびリンパ節転移に対して極めて感度の高い腫瘍マーカーであることが確認された。さらにＥＰＨＡ１０は、正常な乳房および乳房以外の組織での発現が認められず、乳癌組織のみで発現が認められたため、乳癌に対する特異度が高いことが確認された。
【００２１】
ＥＰＨＡ１０について、本発明者らがさらに解析を行ったところ、ＥＰＨＡ１０を強制発現させた細胞では細胞の浸潤能が促進され、ＥＰＨＡ１０を発現する乳癌細胞においてＥＰＨＡ１０発現を抑制すると、細胞の浸潤能が抑制されることから、ＥＰＨＡ１０は乳癌細胞の浸潤において重要な役割を担うことが示唆された。また、ＥＰＨＡ１０を発現する細胞の培養上清を用いて血管内皮細胞を培養したところ、管腔形成が促進されたことから、ＥＰＨＡ１０が血管新生に関与していることが示唆された。これらの結果から、ＥＰＨＡ１０の発現が認められる乳癌は、乳癌細胞の増殖速度が速い、再発や転移の可能性が高いといった、悪性度の高いものであると考えることができる。ＥＰＨＡ１０の発現を確認することは、乳癌のスクリーニングや乳癌の転移診断のみならず、乳癌の悪性度の診断のための検査方法においても有用性が高いと考えられる。
【００２２】
ＲＲＥＢ１は、遺伝子プロモータのRAS-responsive elementsに結合する転写因子の一種であり、カルシトニン発現上昇によるRas/Raf依存性の細胞増殖、アンジオテンシン遺伝子の発現抑制、ＡＲの転写活性を負に制御し、ＮＵＲＯＤ１の転写活性を増強するといった機能が報告されていた。ＲＲＥＢ１と甲状腺癌との関連がｍＲＮＡレベルで確認されているが（Mol Cell Biol 16: 5335-5345, 1996）、乳癌と関連性についてはこれまで報告がなかった。
【００２３】
ＲＲＥＢ１はGenBank Accession No. BC131599に開示されている。本発明者らがＲＲＥＢ１について解析を行った結果、ＲＲＥＢ１は乳癌患者のほぼ半数でタンパク質の発現が認められ、Ｈｅｒ−２陰性患者の３分の１以上でタンパク質発現が認められた。また、ＲＲＥＢ１はリンパ節転移陽性患者の半数以上においてタンパク質発現が認められた。よって、ＲＲＥＢ１は、乳癌およびリンパ節転移の診断マーカーとして感度が高く、有用であることが判明した。
【００２４】
本明細書において、生体から取得した検体を生体検体といい、各種検査や試験に供するために前処理された検体を試料ということとする。本発明の乳癌の検査方法に供するための生体検体は、乳癌患者もしくは乳癌発症の可能性のある患者の血液や乳癌組織に由来するものであり、好ましくは乳癌細胞を含む検体であれば良い。生体検体は、患者から採取された検体であり、本発明の検査方法のために取得した検体であってもよいが、他の検査に供するために取得した検体や、手術により採取した検体であってもよい。例えば検体を免疫組織染色検査に供する場合、検査に供する試料として、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば検体をウェスタンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法に供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液、またはｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。
【００２５】
本発明の乳癌の検査方法において、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を腫瘍マーカーとして検出する方法は、生体検体中のＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を確認可能な方法であれば良く、定性的であってもよいし、定量的であってもよい。例えば、単にＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の有無を検出するものであってもよく、またＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現量を相対的若しくは絶対的に決定するものでもよい。ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現は、タンパク質レベルで検出または定量してもよく、またｍＲＮＡレベルで検出または定量してもよい。例えば、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１が、各遺伝子の発現を制御する遺伝子の突然変異等に起因して、各タンパク質の発現が影響を受けるのであれば、各遺伝子の発現を制御する遺伝子について、遺伝子レベルで野生型や突然変異型を確認するといった方法を用いてもよい。
【００２６】
本発明において、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現が認められる場合に、乳癌細胞である、もしくはリンパ節転移陽性であると判断する。またＥＰＨＡ１０の発現が認められる場合には、乳癌の悪性度が高いと判断することができる。さらに、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の両方について検査をした場合は、これらの何れかの発現が認められる場合に、乳癌細胞である、もしくはリンパ節転移陽性であると判断することができる。
【００２７】
ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現のタンパク質レベルでの検出は、免疫学的手法によるのが簡便であり、好適である。例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。また、ｍＲＮＡレベルでの検出を行ってもよく、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）法、ノーザン・ブロッティング法、Branched DNAアッセイ等により行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合は、実施例に記載のプライマーを用いればよい。
【００２８】
免疫組織染色法は自体公知の方法を採用することができる。その具体例を以下に示すが、以下は例示であって、本方法に限定されるものではない。
【００２９】
乳癌である患者もしくは乳癌発症の可能性のある被験者から、生検や手術切除等により分離した生体検体を、常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋してミクロトームにて厚さ４μｍ程度の組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用する。切片試料は完全にパラフィンを除き、１００％から徐々に濃度を下げたアルコール溶液にくぐらせ親水化し水洗する。その後、抗体の浸透性を高めるために耐熱ガラス容器に入れた約ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中に切片試料を漬け、例えばオートクレーブ等の加熱処理により抗原を賦活化する。室温まで放置し冷却し流水で緩衝液を水洗後、例えば市販の免疫組織染色キットを用いて免疫組織染色を行う。非特異的反応等をブロッキングした後、切片試料を抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体を滴下し常温で反応させる。洗浄後、標識抗体、増幅試薬等を用いてそれぞれ反応させる。洗浄後、発色試薬を用いて発色を行なったのち、流水にて洗浄を行う。その後、染色液にて検体の細胞核を染色する。流水にて水洗後、アルコール溶液、次いでキシレン溶液をくぐらせ脱水し、検体上に封入剤を滴下しカバーグラスを被せて顕微鏡にて観察する。顕微鏡下では乳癌のＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１タンパク質の発色を観察する。
【００３０】
ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１発現の分類は、患者からの生体検体における各タンパク質の発現量を、コントロールにおけるＥＰＨＡ１０やＲＲＥＢ１の発現量と比較することにより行うことが好ましい。各タンパク質の発現結果を分類する段階の数に応じて、複数のコントロールを用いることが好ましい。
例えば、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１発現の結果を２種類の段階（発現あり、なし）に分類する場合は、各段階に対応した２種類のコントロール（ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現が認められるコントロールおよびＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現が認められないコントロール）を用いることが好ましい。また、発現の認められないコントロールとして、乳癌でない健常者またはリンパ節転移のない乳癌患者に由来する生体検体を用いることが好ましい。
【００３１】
免疫組織染色法による発現の有無の判断は、以下のようにすることができる。ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１については、乳癌組織の癌細胞の染色強度を、「染色あり」および「染色なし」の２段階に分類し、「発現あり」と「発現なし」の判定をする。
【００３２】
上記免疫組織染色法において用いられる抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体は、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現を検出しうる抗体であればよく、自体公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル、ポリクローナル抗体や、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。例えば、ＥＰＨＡ１０に対するIgG型抗体（ウサギポリクローナル抗体）が、ABGENT社（USA）から販売されており（製品番号#RB13036）、ＲＲＥＢ１に対するIgG型抗体（ウサギポリクローナル抗体）が、ABCAM社（USA）から販売されており（製品番号# ab64168）、これらを免疫組織染色法に用いてもよい。
【００３３】
抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体は、次のようにして作製することができる。各タンパク質をドットブロット装置を用いてニトロセルロース膜に固定化し、固相化抗原に対して、ナイーブファージ抗体ライブラリ（およそ24億種類の多様性のscFv型抗体を発現するファージのライブラリ）を作用させ、結合するファージ抗体を濃縮（パンニング）、選択する。そして濃縮したファージをモノクローン化し、抗原タンパク質に対する結合性をＥＬＩＳＡにより評価する。免疫組織染色法には、得られたファージ発現型のscFv抗体を用いてもよいし、scFv抗体を遺伝子組換えによりIgG型抗体等を作製して用いてもよい。
【００３４】
本発明は、乳癌発症の可能性のある患者についての乳癌の診断、乳癌患者における乳癌の悪性度もしくは乳癌の転移の診断を行うための検査用試薬並びに検査用試薬キットも含まれる。当該キットにより、患者から得られた生体検体におけるＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現を検出または定量することができる。すなわち、タンパク質レベルでＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現を検出または定量するための検査用試薬キットとして、免疫学的手法、例えば免疫組織染色やウェスタンブロット法などに使用される検査用キットが挙げられる。免疫学的手法によりＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の検査を行う場合には、少なくとも抗ＥＰＨＡ１０抗体または抗ＲＲＥＢ１抗体のいずれかが検査用試薬に含まれる。あるいは、ｍＲＮＡレべルでＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現を検出または定量するための検査用試薬キットとして、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いる場合は、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーのいずれかが検査用試薬に含まれる。さらに、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の両方について検査を行う場合には、抗ＥＰＨＡ１０抗体を含む検査用試薬および抗ＲＲＥＢ１体を含む検査用試薬、あるいは、ＥＰＨＡ１０のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを含む検査用試薬およびＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを含む検査用試薬が必要である。
【００３５】
本発明は、上記に使用する検査用試薬キットも含まれる。本発明の検査用キットには、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１をマーカーとして検出または定量する場合は、抗ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１抗体、あるいは、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１のｍＲＮＡを増幅可能なプライマーを含むことができる。さらには、緩衝液、逆転写酵素、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬、および、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００３７】
（参考例１）乳癌関連タンパク質のスクリーニング
乳癌細胞と対照となる正常細胞について、二次元電気泳動および画像解析を行い、発現変動タンパク質スポットを同定した。発現変動が認められたスポットからゲルを切りだし、タンパク質を抽出した。抽出タンパク質の一部を用いて質量分析によりタンパク質の同定を行った。この結果、２１種類のタンパク質を、発現変動タンパク質として同定した。
【００３８】
（実施例１）免疫学的組織染色を用いた検査方法
参考例１にして同定した２１種類の各タンパク質に対する抗体を用いて、臨床サンプルを用いた組織アレイ解析を行った。各タンパク質に対する抗体は次のようにして作製した。各タンパク質をドットブロット装置を用いてニトロセルロース膜に固定化し、固相化抗原に対して、ナイーブファージ抗体ライブラリ（およそ24億種類の多様性のscFv型抗体を発現するファージのライブラリ）を作用させ、結合するファージ抗体を濃縮（パンニング）、選択した。そして濃縮したファージをモノクローン化し、抗原タンパク質に対する結合性をＥＬＩＳＡにより評価した。得られたファージ発現型のscFv抗体を用いて、１８９症例の癌患者の生体検体、および１５の正常組織である生体検体について、組織アレイ解析を行った。
【００３９】
その結果、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１が、正常組織では発現がほとんど認められず、乳癌患者のほぼ半数において発現が認められることがわかった（表１）。また、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１を併せて検討した結果、乳癌患者の半数以上５７．２％に、いずれかのタンパク質の発現が認められることがわかった。
【表１】
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【００４０】
さらに従来より使用されているＨｅｒ−２の発現解析と比較すると（図１参照）、Ｈｅｒ−２陰性患者のうち、４４．１％にＥＰＨＡ１０の発現が認められ、３３．８％にＲＲＥＢ１の発現が認められた。Ｈｅｒ−２陰性患者のうち、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１のいずれかの発現が認められる患者は、４７．８％であり、Ｈｅｒ−２陰性患者のほぼ半数をＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１により検出可能であることがわかった。
【００４１】
ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１と、リンパ節転移との関連についての解析結果を図２に示す。リンパ節転移陽性患者の６２．４％に、ＥＰＨＡ１０の発現が認められ、５０．６％にＲＲＥＢ１の発現が認められた。一方リンパ節転移陰性患者においては、いずれも３８．５％にしか、発現が認められなかった。ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１の発現は、リンパ節転移と相関があることが判明し、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１によりリンパ節転移を検出可能であることがわかった。
【００４２】
（実施例２）ＥＰＨＡ１０遺伝子発現の検査方法
乳癌患者の癌組織由来ｍＲＮＡ（図３の白丸１〜10）と、正常組織である乳房（図３の黒丸１〜３）ならびに他の組織（脳(Br)、肺(Lu)、大腸(Co)、肝臓(Li)、脾臓(Sp)、皮膚(Sk)、胃(St)、精巣(Te)、腎臓(Ki)）由来ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを調製し、下記プライマーを用いて半定量的ＰＣＲを行った。
Her-2 Forward：ccataacacccacctctgct（配列番号１）
Her-2 Reverse：gggatcccatcgtaaggttt（配列番号２）
EPHA10 Forward：aaaaaaaaaaaaaaaaaaccatgggaattcatggagacctgcgccggt（配列番号３）
EPHA10 Reverse：tttttttttttttttttttgcggccgccactcccaccccacgg（配列番号４）
アニ―リングを60℃で1分、伸長反応を68℃で1分に設定し、ポリメラーゼはAmpliTaq Gold（Applied biosystems）を用いてPCR反応を35サイクル行い、PCR産物を1.5% TAEアガロースゲルを用いて電気泳動した。
なお上記ＥＰＨＡ１０のプライマーは、全アイソフォームに共通の配列を対象とするものである。
【００４３】
結果を、図３に示す。ＥＰＨＡ１０は正常な乳房組織およびその他の正常組織に発現はしておらず、乳癌組織特異的に発現することがわかった。一方、Ｈｅｒ−２は、正常な大腸、皮膚、腎臓にも発現が認められた。
【００４４】
（参考例２）ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１の細胞の浸潤能に与える影響
まず、以下のようにして各遺伝子を強制発現させた細胞を作製した。
乳がん細胞株MCF-7を100mmφの培養ディッシュで24時間前培養した。Opti-MEM培地（Invitrogen）3 mlに対して、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１発現プラスミド（Invitrogen）15μgとPlus Reagent（Invitrogen）15μlを加え、室温で5分間インキュベーションし、さらにLipofectamine LTX（Invitrogen）を37.5μl加え、室温で30分間インキュベーションした。得られたDNA-Lipofectamine complexを細胞に添加し、24時間培養後、以下のアッセイに使用した。なお、蛍光蛋白質VENUS発現プラスミドを同様に強制発現させた結果から、本実験系での遺伝子導入効率は６０％以上であった。ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１強制発現細胞について、各遺伝子の導入の有無を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施例２と同様に確認した。ＥＰＨＡ１０についてのプライマーは、実施例２と同様であり、ＲＲＥＢ１のプライマーは以下の通りである。
RREB1 Forward：ttttttttttttttttttttccatgggaattcatgctcacacacactggtcagaaac
（配列番号５）
RREB1 Reverse：ttttttttttttttttttttgcggccgcctccatccccacgagctg（配列番号６）
【００４５】
次に、得られたＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を強制発現した細胞を用いて、以下のようにin vitro細胞浸潤能試験を行った。
In vitro細胞浸潤能試験にはCultrex 96 well BME cell invasion Assay Kit（Trevigen Inc.）を使用した。Top chamberのメンブランをBME(basement membrane extract)でコートした。Bottom chamberに150μlの血清入り培地を、Top chamberに無血清培地で24時間前培養したMCF-7細胞（control）、あるいは、ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１を強制発現させたMCF-7細胞（1×106 cells/ml）を50μl/well播種し、72時間培養した。Bottom chamberの培地を除去後、Cell Wash Bufferで2回洗浄し、その後、底面に接着した細胞をcalcein-AM solutionで蛍光染色するとともに分散させた。蛍光光度計にて各wellの蛍光強度を測定し、播種した全細胞の蛍光強度を100%として、bottom chamberに浸潤した細胞の割合（% invasion）を算出した。
【００４６】
結果を、図４に示す。図４の上部の写真は、ＭＣＦ−７細胞において目的遺伝子（ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１）が強制発現されているか否かを、ｍＲＮＡレベルで確認したものである。コントロールの細胞では、いずれの遺伝子のバンドも見られず、それぞれ目的遺伝子を強制発現させた細胞では、各遺伝子の発現が認められた。
図４の下部のグラフは、浸潤した細胞の割合を示したものである。ＲＲＥＢ１を強制発現させた場合は、浸潤した細胞の割合がコントロールの場合と同程度であったが、ＥＰＨＡ１０を強制発現させた場合は、浸潤した細胞の割合が有意に増加した。
【００４７】
（参考例３）ＥＰＨＡ１０発現抑制の癌細胞の浸潤能に与える影響
シャーレに乳癌細胞株MDA-MB-231を播種し、37℃、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で24時間培養した。Opti-MEM（Invitrogen）3 mlに対して下記４種類の配列をターゲットとするＥＰＨＡ１０ ｓｉＲＮＡ（カタログ番号 : SI03081141、SI03091928、SI03096954、SI03097269 : QIAgen）あるいは対照ｓｉＲＮＡ（control）（カタログ番号 : 1027280 : QIAgen）50 nMとHiPerFect Transfection Reagent（QIAgen）40 μlを加え、室温で5〜10分間インキュベーションした。siRNA-transfection reagent complexをシャーレに加え、24時間培養した。なお、以下４種類のｓｉＲＮＡを用いることにより、ＥＰＨＡ１０の全アイソフォームの発現を抑制することが可能と考えられる。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ＥＰＨＡ１０の細胞外ドメイン（全アイソフォームに共通の部分）について、発現抑制を確認した。
ｓｉＲＮＡの配列（QIAGEN社でプレデザインされた４種類のｓｉＲＮＡ）
Cat. no.: GS284656
製品名称:   FlexiTube GeneSolution siRNA 1 nmol  EPHA10
ターゲット配列:  
SI03081141   Hs_EPHA10_6  CCGCGGGTACCTGCAAGGAGA（配列番号７）
SI03091928   Hs_EPHA10_7  CTCGGTGCGCGTCTACTACAA（配列番号８）
SI03096954   Hs_EPHA10_8  CTGGACTGCACTGCCAAGTAA（配列番号９）
SI03097269   Hs_EPHA10_9  CTGGAGGGCGTTGTTACCCGA（配列番号１０）
【００４８】
結果を図５に示す。図５の上部の写真は、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すものであり、コントロールでは、ＥＰＨＡ１０の発現が認められるが、ＥＰＨＡ１０のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、いずれのアイソフォームも発現していないことが確認された。
図５の下部のグラフは、浸潤した細胞の割合を示したものである。コントロールでは浸潤した細胞の割合が２０％程度であったのに対し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合には、約１２％程度に、有意に浸潤能が抑制された。
【００４９】
（参考例４）ＥＰＨＡ１０の血管新生に与える影響
まず、Conditioned medium（CM）を調製した。100mmφの培養ディッシュにMCF-7細胞あるいはＥＰＨＡ１０を強制発現させたMCF-7細胞（参考例２と同様にして作製）を播種し、微小血管内皮細胞用培地で48時間培養した。培養上清を回収し、1000 rpm、5分間遠心後、0.2μmポアのメンブランフィルターでろ過して、それぞれ「control CM」あるいは「EPHA10 CM」とした。
得られたそれぞれのCMを用いて、血管内皮細胞のin vitro 管腔形成試験を行った。24 well培養プレートにBD Matrigel Matrix（BD Bioscience）を300 μl/well加え、37℃で30分間静置してゲル化させた。ゲル上に、ヒト肺由来血管内皮細胞（BECs）を3.0×104 cells/wellで播種し、MCF-7細胞のCM（control CM）あるいはＥＰＨＡ１０強制発現MCF-7細胞のCM（EPHA10 CM）の存在下で、37 ℃で24時間培養した。その後PBSで洗浄し、Calcein-AMで蛍光染色後、CCDカメラにて蛍光像を取得した。管腔形成の程度は、撮影した蛍光顕微鏡画像をMetaXpressソフトウェア（Molecular Devices, Inc.）で解析し、管腔全長を測定することにより定量評価した。
【００５０】
結果を図６に示す。図６上部に、各処理における管腔形成の写真を示す。図６の下部のグラフより、コントロールに比べて、ＥＰＨＡ１０強制発現細胞の培養上清（EPHA10 CM）により、有意に管腔形成が促進されたことがわかった。これにより、ＥＰＨＡ１０発現細胞が、転移等に関わる血管新生を促進することが判明し、ＥＰＨＡ１０を発現する癌細胞は、悪性度が高いことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上詳述したように、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１が、乳癌患者のほぼ半数において発現が認められることがわかった。また、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１を併せて検討した結果、乳癌患者の半数以上に、いずれかのタンパク質の発現が認められることがわかった。また、従来より使用されている腫瘍マーカーのＨｅｒ−２と比較すると、Ｈｅｒ−２陰性患者にもＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１の発現が認められた。ＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１は、リンパ節転移陽性患者においても高い発現率が認められ、リンパ節転移と相関があることが判明した。さらにＥＰＨＡ１０の機能解析の結果、ＥＰＨＡ１０は血管新生機能や癌の浸潤能といった、癌の悪性度に深く関与していることが示唆された。
【００５２】
以上の結果より、生体検体中の癌細胞のＥＰＨＡ１０またはＲＲＥＢ１をマーカーとして検出することにより、乳癌のスクリーニング、乳癌の悪性度の診断、乳癌の転移の診断などを行うことができ、ＥＰＨＡ１０とＲＲＥＢ１を併せて検出することによりＨｅｒ−２陰性の患者についても、診断を行うことが可能となり、より的確な治療法を選択することができる。
【００５３】
本発明の免疫組織染色による検査を行うことで、外科的手術の場合には組織の適切な切除範囲を決定することができ、また術前後の化学療法、放射線療法、免疫療法などにおいて、適切な治療方法を選択することができる。また、経過を観察（医療監視下に）すべき期間も決定することができる。これにより、患者に対する経済的、肉体的、精神的な過度の負担が軽減化され、医療費の節減にも繋がるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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