(57)【要約】【課題】疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む免疫担当細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて効率よく誘導させることができる活性化抗原提示細胞、該活性化抗原提示細胞を含む医薬、該活性化抗原提示細胞を用いた治療・予防方法、該活性化抗原提示細胞を用いて誘導された疾病抗原特異的ＣＴＬを含む免疫担当細胞の誘導方法、該方法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、及び該免疫担当細胞を用いた治療・予防方法の提供。【解決手段】抗原提示細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、ビスホスホネート及び細胞壁骨格成分で共感作することにより、共感作しない場合に比較して、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの割合及び細胞数を増加させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞の活性化処理方法であって、ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で前記抗原提示細胞を共感作する工程を含むことを特徴とする抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項２】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される請求項１に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項３】
前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
【化１】
2010259373.tif 000011
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求項１又は２に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項４】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選択される請求項１から３いずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項５】
前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項６】
前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである請求項５に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項７】
前記細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳである請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項８】
前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白質、がん抗原又は感染症抗原ペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される請求項１から７のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項９】
前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項１０】
前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである請求項９に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法。
【請求項１１】
活性化抗原提示細胞の生産方法であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の活性化処理方法で抗原提示細胞を処理することを含む活性化抗原提示細胞の生産方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の生産方法により生産された活性化抗原提示細胞。
【請求項１３】
がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、請求項１２に記載の活性化抗原提示細胞を含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、請求項１２に記載の活性化抗原提示細胞を投与することを含む予防・治療方法。
【請求項１６】
前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項１５に記載の予防・治療方法。
【請求項１７】
免疫担当細胞の誘導方法であって、下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含むことを特徴とする免疫担当細胞の誘導方法。
（ｉ）  ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程。
（ｉｉ）前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程。
【請求項１８】
誘導される免疫担当細胞が、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む請求項１８に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される請求項１７又は１８に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２０】
前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
【化１】
2010259373.tif 000012
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求項１７から１９に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２１】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選択される請求項１７から２０のいずれかに一項に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２２】
前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである請求項１７から２１のいずれか一項に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２３】
前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである請求項２２に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２４】
前記細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳであることを特徴とする請求項１７から２３のいずれか一項に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２５】
前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白質、そのペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及びそれらの熱処理物からなる群から選択される請求項１７から２４いずれか一項に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２６】
前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである請求項１７から２５のいずれか一項に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２７】
前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである請求項２６に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【請求項２８】
免疫担当細胞の生産方法であって、請求項１７から２７のいずれか一項に記載の誘導方法により免疫担当細胞を誘導することを含む免疫担当細胞の生産方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の生産方法により生産された免疫担当細胞。
【請求項３０】
がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、請求項２９に記載の免疫担当細胞を含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記免疫担当細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項３０に記載のがん及び／又は感染症のための医薬組成物。
【請求項３２】
がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、請求項２９に記載の免疫担当細胞を投与することを含む予防・治療方法。
【請求項３３】
前記免疫担当細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である請求項３２に記載のがん及び／又は感染症の予防・治療方法。
【請求項３４】
ビスホスホネートと細菌細胞壁骨格成分とを含む抗原提示細胞の活性化剤。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される請求項３４に記載の抗原提示細胞の活性化剤。
【請求項３６】
前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
【化１】
2010259373.tif 000013
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される請求項３４又は３５に記載の抗原提示細胞の活性化剤。
【請求項３７】
前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選択される請求項３４から３６いずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化剤。
【請求項３８】
前記細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳであることを特徴とする請求項３４から３７のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で共感作する工程を含む抗原提示細胞の活性化処理方法に関する。また本発明は、該抗原提示細胞を含む医薬、該抗原提示細胞を用いた治療・予防方法、該抗原提示細胞を用いた免疫担当細胞の誘導方法、該誘導方法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、該免疫担当細胞を用いた治療・予防方法、及び抗原提示細胞の活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療方法としては手術による切除、放射線、抗がん剤を用いた化学療法が行われている。近年ではそれらの療法以外にも様々な治療方法が研究され、実用化されている。その中の一つに免疫細胞を利用した免疫細胞療法がある。
【０００３】
免疫細胞療法には、リンパ球を体外でリンフォカインにより活性化して体内に戻すＬＡＫ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ）療法、病変を特異的に認識・傷害する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下ＣＴＬとも記す）を用いたＣＴＬ療法、及び樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ、以下ＤＣとも記す）を用いた樹状細胞療法等が含まれる。
【０００４】
前記樹状細胞療法は、疾病抗原を直接又は細胞内でプロセッシングした後にＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、主要組織適合抗原複合体）に提示させた樹状細胞を用い、体内で病原を選択的に攻撃する疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導し、治療を行う療法である。提示させる前記疾病抗原には、例えば、がん抗原蛋白質若しくはペプチド、感染症抗原蛋白質若しくはペプチド、又はその一部が含まれる（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００５】
疾病抗原で感作した樹状細胞とリンパ球を混合培養して樹状細胞でリンパ球を刺激することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ（体外）で疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導できる。例えば、がん抗原蛋白質若しくはペプチド又は感染症抗原蛋白質若しくはペプチドを感作した樹状細胞を使用した場合、１回の混合培養で誘導される疾病抗原ＣＴＬの増加は、前記樹状細胞を使用しない場合に比べて５〜２０倍である。
【０００６】
がん抗原蛋白質若しくはペプチド又は感染症抗原蛋白質若しくはペプチドを感作した樹状細胞を用いた樹状細胞療法では、ｉｎ  ｖｉｖｏ（体内）の疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率、すなわち、全リンパ球に占めるＣＴＬの割合が２〜１４倍まで上昇することが知られている。
【０００７】
樹状細胞による疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率を高めることにより樹状細胞療法の効果を一層良好なものにするため様々な方法が行われている。
【０００８】
１つは、樹状細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、さらに樹状細胞上のＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＴＬＲと記す）と反応する薬剤等を樹状細胞に反応させて樹状細胞の抗原提示能力を高めることにより、直接的に疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率を高める方法である（ＴＬＲを介してのアジュバント効果、例えば、非特許文献３、非特許文献４参照）。例えば、ＢＣＧ−ＣＷＳ(Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｆ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｇｕｅｒｉｎ−Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｓｋｅｌｔｏｎ)はマイコバクテリウムボビス（牛結核菌）のカルメットーゲラン菌から抽出・精製した成分であり、主成分はミコール酸アラビノガラクタン・ペプチドグリカンから構成される。そのためＢＣＧ−ＣＷＳは細菌ペプチドグリカンのレセプターとして働くＴＬＲ２／４を介して刺激し樹状細胞の抗原提示能を高める。
【０００９】
他の手法としては、樹状細胞を疾病抗原で感作するのに加えて、樹状細胞上のＭＨＣ分子以外の抗原提示分子、例えばＣＤ１ｄ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １ｄ）分子上に糖脂質等のようなものを提示させ、疾病抗原特異的ＣＴＬ以外のｉＮＫＴ細胞（ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）等を含む免疫担当細胞を活性化し、この活性化した免疫担当細胞を介して間接的に疾病抗原特異的ＣＴＬの誘導効率を高める方法である（疾病抗原特異的ＣＴＬ以外の免疫担当細胞を介してのアジュバント効果、例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）。
【００１０】
また、ビスホスホネートと疾病抗原で共感作することで樹状細胞を活性化し、ＣＴＬの誘導効率を高める方法も知られている（特許文献１、非特許文献７）。
【００１１】
しかしながら、上記のＴＬＲを介しての直接的なアジュバンド効果、又は疾病抗原特異的ＣＴＬ以外の免疫担当細胞を介しての間接的なアジュバント効果による疾病抗原特異的ＣＴＬ誘導の上昇では未だ不十分であり、さらに効率よく疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導できる技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０２９６８９
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ  ２００４，１０３，３８３−３８９
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００１，９８，８８０９−８８１４
【非特許文献３】Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００４，４，４４９−５１１
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４，６４，５４６１−５４７０
【非特許文献５】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００４，１１４，１８００−１８１１
【非特許文献６】Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２００２，１９５，６１７−６２４
【非特許文献７】Ｂｌｏｏｄ  ２００７，１１０，９２１−９２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬをｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて効率よく誘導させるための抗原提示細胞（例えば、樹状細胞等）の活性化処理方法、該活性化抗原提示細胞を含む医薬、該活性化抗原提示細胞を用いた治療・予防方法、該活性化抗原提示細胞を用いた疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの誘導方法、該方法によって誘導された免疫担当細胞、該免疫担当細胞を含む医薬、該免疫担当細胞を用いた治療・予防方法、及び抗原提示細胞の活性化剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決するために研究を行った。その結果、樹状細胞を疾病抗原で感作するのに加えてビスホスホネート及び細菌細胞壁骨格成分で共感作すると、ビスホスホネート及び細菌細胞壁骨格成分を添加しない場合に比べ、疾病抗原特異的ＣＴＬの全リンパ球に占める割合及び細胞数が著しく増加することを見出し、本発明を完成した。例えば、ビスホスホネート及び細菌細胞壁骨格成分添加することにより、添加しない場合に比べて全リンパ球に占める疾病抗原特異的ＣＴＬの割合が約６．０倍高くなり、細胞数として疾病抗原特異的ＣＴＬが約１９倍になりうる。ただし、本発明は、これらの数値に限定されない。ビスホスホネートも細菌細胞壁骨格成分も樹状細胞を活性化する作用は知られているが、両方を合わせて使用することにより、単なる効果の上乗せではなく、想定していた以上の相乗効果が見られることが確認された。本発明によれば、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導してがん及び／又は感染症を治療・予防する免疫細胞療法のさらなる発展が促される。
【００１６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１７】
（１）抗原提示細胞の活性化処理方法であって、ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で前記抗原提示細胞を共感作する工程を含むことを特徴とする抗原提示細胞の活性化処理方法；
（２）前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される（１）に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（３）前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
【化１】
2010259373.tif 000002
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される（１）又は（２）に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（４）前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される（１）から（３）のいずれか一つに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（５）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである（１）から（４）のいずれかに一つに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（６）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである（５）に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（７）前記細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳであることを特徴とする（１）から（６）に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（８）前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白質、がん抗原又は感染症抗原ペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される（１）から（７）のいずれか一つに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（９）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである（１）から（８）のいずれか一つに記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（１０）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである（９）に記載の抗原提示細胞の活性化処理方法；
（１１）活性化抗原提示細胞の生産方法であって、（１）から（１０）のいずれか一つに記載の活性化処理方法で抗原提示細胞を処理することを含む活性化抗原提示細胞の生産方法；
（１２）（１１）に記載の生産方法により生産された活性化抗原提示細胞、
（１３）がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、（１２）に記載の活性化抗原提示細胞を含む医薬組成物；
（１４）前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（１３）に記載の医薬組成物；
（１５）がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、（１２）に記載の活性化抗原提示細胞を投与することを含む予防・治療方法；
（１６）前記抗原提示細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（１５）に記載の予防・治療方法。
【００１８】
（１７）免疫担当細胞の誘導方法であって、下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含むことを特徴とする免疫担当細胞の誘導方法。
（ｉ）  ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程、
（ｉｉ）前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程；
（１８）誘導される免疫担当細胞が、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む（１７）に記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（１９）前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される（１７）又は（１８）に記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２０）前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
【化１】
2010259373.tif 000003
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアルキル基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成し、上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される（１７）から（１９）いずれか１つに記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２１）前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及び、それらの水和物からなる群から選択される（１７）から（２０）のいずれか一つに記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２２）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜２０μＭである（１７）から（２１）のいずれか一つに記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２３）前記共感作における前記ビスホスホネートの濃度が、０．００１〜５μＭである（２２）に記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２４）前記細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳである（１７）から（２３）のいずれか一つに記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２５）前記疾病抗原が、がん抗原又は感染症抗原蛋白質、がん抗原又は感染症抗原ペプチド、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物からなる群から選択される（１７）から（２４）のいずれか一つに記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２６）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．０１〜２０μｇ／ｍＬである（１７）から（２５）のいずれか一つに記載の免疫担当細胞の誘導方法；
（２７）前記共感作における前記疾病抗原の濃度が、０．１〜２μｇ／ｍＬである（２６）に記載の免疫担当細胞の誘導方法。
【００１９】
（２８）免疫担当細胞の生産方法であって、（１７）から（２７）のいずれか一つに記載の誘導方法により免疫担当細胞を誘導することを含む免疫担当細胞の生産方法；
（２９）（２８）に記載の生産方法により生産された免疫担当細胞；
（３０）がん及び／又は感染症のための医薬組成物であって、（２９）に記載の免疫担当細胞を含む医薬組成物；
（３１）前記免疫担当細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（３０）に記載のがん及び／又は感染症のための医薬組成物、
（３２）がん及び／又は感染症の予防・治療方法であって、（２９）に記載の免疫担当細胞を投与することを含む予防・治療方法；
（３３）前記免疫担当細胞が、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来である（３２）に記載のがん及び／又は感染症の予防・治療方法。
【００２０】
（３４）ビスホスホネートと細菌細胞壁骨格成分とを含む抗原提示細胞の活性化剤；
（３５）前記抗原提示細胞が、樹状細胞、未成熟樹状細胞、人工抗原提示細胞からなる群から選択される（３４）に記載の抗原提示細胞の活性化剤；
（３６）前記ビスホスホネートが下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物であって、
【化１】
2010259373.tif 000004
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、アリール基又は置換されたアリール基、アルキル基又は置換されたアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、又はＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成し、
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基からなる群から選択される（３４）又は（３５）記載の抗原提示細胞の活性化剤；
（３７）前記ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩、及びそれらの水和物からなる群から選択される（３４）から（３６）のいずれか一つに記載の抗原提示細胞の活性化剤；
（３８）前記細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳであることを特徴とする（３４）から（３７）のいずれか一つに記載の抗原提示細胞の活性化剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
第一の実施形態：活性化抗原提示細胞の調製
まず、本発明の活性化抗原提示細胞について詳説する。
【００２２】
本発明の活性化抗原提示細胞とはビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で共感作した抗原提示細胞である。
【００２３】
本発明に用いる前記抗原提示細胞は、特に制限されず、例えば、未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、その他の抗原提示細胞、人工抗原提示細胞及びそれらの混合物のいずれを用いてもよい。その中でも、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞が好ましく、より好ましくは、未成熟樹状細胞である。ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分と疾病抗原とで共感作した場合には未成熟樹状細胞のほうがより好適に疾病抗原特異的ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞を誘導させることができるためである。また、前記人工抗原提示細胞とは、人為的に作製した抗原提示細胞であって、例えば、少なくとも主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ及び補助刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）を発現させるよう遺伝子工学的に作製した細胞が挙げられる。さらに、前記人工抗原提示細胞は、腫瘍由来の細胞株を上述のようにＭＨＣクラスＩ及び補助刺激分子を発現するよう改変したものであってもよい。前記細胞株の例としては、乳がん由来のＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１）、腎がん由来のＴＵＨＲ１０ＴＫＢ（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ＊０２０１／Ａ＊２４０２）、胃がん由来のＪＲ‐ｓｔ株（クラスＩ抗原ＨＬＡ‐Ａ＊２４０２）等が挙げられる。これらの細胞株は、例えば、ＡＴＣＣやＲＩＫＥＮ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ等から入手できる。前記人工抗原提示細胞の作製については、米国公開公報ＵＳ−２００５−００４８６４６−Ａ１に開示され、この引用によりその内容の全体がここに組み込まれる。
【００２４】
本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、ピロリン酸のアナログであって、ピロリン酸骨格のＰ−Ｏ−ＰのＯ（酸素原子）をＣ（炭素原子）で置換した化合物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、その塩、及び、それらの水和物が挙げられる。
【００２５】
【化１】
2010259373.tif 000005
【００２６】
上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、またＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成してもよい。
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される。
【００２７】
本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、臭素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ペンタデカニル基等の直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ３０アルキル基等；低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル基等；アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等；アルアルキル基としては、例えば、アリール−低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、シクロオクチル、アダマンチル等のＣ１−Ｃ１０シクロアルキル基等；複素環式基としては、ピリジル、フリル、ピロリジニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ示す。
【００２８】
また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましく、例えば、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されるものが挙げられる。その例として、ゾレドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばゾレドロン酸ナトリウム水和物（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）、ノバルティスファーマ））、パミドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばパミドロン酸二ナトリウム・五水和物（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）、ノバルティスファーマ））、アレンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばアレンドロン酸ナトリウム三水和物（ＯＮＣＬＡＳＴ（登録商標）、萬有製薬））、リセドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばリセドロン酸ナトリウム水和物）、イバンドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばイバンドロン酸ナトリウム）、インカドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばインカドロン酸二ナトリウム）、エチドロン酸、その塩及び／又はそれらの水和物（例えばエチドロン酸二ナトリウム）等が挙げられる。これらの中で、とりわけゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、それらの塩及び／又はそれらの水和物が好ましい。
【００２９】
本発明で用いられる細菌細胞壁骨格成分とは、細菌の細胞壁骨格を構成する成分である。細菌としては例えばマイコバクテリア属、ノカルディア属、コリネバクテリア属等が挙げられる。細菌細胞壁骨格成分はこれらの細菌を物理的に粉砕し、除核酸、除蛋白質、脱脂等の精製工程を経て得られる不溶性残渣であり、長鎖ヒドロキシ脂肪酸であるミコール酸やペプチドグリカンを含む高分子である。特に制限はされないが、例えばＢＣＧ−ＣＷＳが挙げられる。ＢＣＧ−ＣＷＳは牛結核菌から抽出・精製した成分であり、主成分はミコール酸アラビノガラクタン・ペプチドグリカンから構成される。
【００３０】
本発明で使用する疾病抗原において、前記「疾病」とは、特に制限されないが、例えば、がんや感染症等である。前記がんとしては、特に制限されず、あらゆるがんを含み、例えば、治療が困難であるがん（前がん状態を含む）等が挙げられる。前記感染症としては、特に制限されず、例えば、エイズ、Ｂ型・Ｃ型肝炎等のウイルス感染症や、細胞感染、細菌感染、真菌感染、若しくは原虫による感染症等が挙げられる。本発明において使用する疾病抗原の形態は特に制限されず、例えば、がん抗原又は感染症抗原蛋白質及びそのペプチドが挙げられる。また、前記疾病抗原としては、例えば、がん細胞又は感染症細胞の細胞融解物、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、及び、それらの熱処理物を使用できる。
【００３１】
前記疾病抗原ががん抗原である場合、そのがん抗原のがんの種類は問わずどのような抗原も用いることができる。例えば、前立腺がん、肝がん、すい臓がん等のどのようながん抗原であっても利用できる。前記がん抗原としては、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＲＡＧＥ等のＭＡＧＥ遺伝子ファミリーにコードされるものが挙げられる。他のがん抗原としては、例えば、ｐ５３、Ｋ‐ｒａｓ、ＣＤＫ４及びｂｃｌ‐ｃ‐ａｂｌ遺伝子産物等の変異により生じるがん抗原、ｃ‐ｅｒｂ２（ｎｅｕ）蛋白質等のがん細胞で過剰発現されるがん抗原、および、ＨＰＶ‐１６のＥ７蛋白質等の発がんウイルス抗原等が挙げられる。さらに、がん胎児抗原（ＣＥＡ）やα‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍胎児抗原、ならびに前立腺特異的抗原や、白血病およびリンパ腫のＢ細胞で発現するＣＤ‐１０（ＣＡＬＬＡ抗原）等の分化抗原も使用することができる。
【００３２】
また、感染症抗原の感染症の種類も特に制限されず、例えば、エイズやＢ型・Ｃ型肝炎、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染症、ＨＰＶ感染症等のウイルス性感染症の中でも難治性疾患も挙げられる。また、マラリア原虫のスポロゾイド周囲蛋白質のような寄生虫の抗原も用いることができる。
【００３３】
また、本発明では前記疾病抗原ペプチドとして合成ペプチドを用いることができる。これにより、自己のがん組織等から採取したがん抗原を使用する場合と比べて患者の負担を少なくすることが可能となる。前記がん抗原蛋白質又はペプチドとしては、例えば、下記表１〜３に記載のものが使用でき、これらは当該分野の当業者が容易に入手又は合成できる。
【００３４】
【表１】
2010259373.tif 000006
【００３５】
【表２】
2010259373.tif 000007
【００３６】
【表３】
2010259373.tif 000008
【００３７】
本発明において、抗原提示細胞をある物質で感作するとは、抗原提示細胞をその物質と反応させることをいい、好ましくは、前記物質を抗原提示細胞の表面上に直接的に又は間接的に提示させることをいう。また、抗原提示細胞を共感作するとは、同時、連続的、又は断続的に２以上の物質で抗原提示細胞を感作することをいう。前記物質として好ましくは、ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び／又は疾病抗原である。
【００３８】
次に、本発明の抗原提示細胞の活性化処理方法、及び本発明の活性化抗原提示細胞の生産方法について樹状細胞を抗原提示細胞として用いた下記一例に基づき詳説する。本発明において、抗原提示細胞の活性化処理とは、上述のとおり、抗原提示細胞をビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で共感作することを含む処理をいう。
【００３９】
まず、抗原提示細胞（この例では、樹状細胞）の調製について説明する。樹状細胞の調製は、樹状細胞の前駆細胞を得るための試料を取得することから始める。前記試料としては末梢血、骨髄液、臍帯血等が利用できる。入手の容易さ、患者への負担の少なさを考慮して末梢血を利用することが好ましい。採血量は提供者の負担とならない程度の量を採血するのが好ましい。採血する方法としては真空採血管、採血バッグ等による全血採取を利用することができる。また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取する方法を用いれば、直接末梢血単核球を入手することが可能である。上記採取した血液には凝固が起こらないようにヘパリンやクエン酸を加えてもよい。
【００４０】
次に、採取した血液から樹状細胞の前駆細胞を含む単核細胞を分離する。分離する方法としては、有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いることもできる。例えばフィコール分画つまりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配又は溶出を利用する方法が一般的に使用される。なお、回収した細胞は血小板等を除去するために培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと記す）等を用いて数回洗浄することが好ましい。
【００４１】
次に、回収した単核細胞から樹状細胞の前駆細胞である単球（ＣＤ１４陽性細胞）を分離する。ＣＤ１４は樹状細胞の前駆細胞である単球に発現しているマーカーとして知られている。そのため、抗ＣＤ１４抗体マグネットビーズを用いたＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、以下、ＭＡＣＳと記す）を利用して単球を単離・回収できる。この方法は、簡単でかつ単球細胞の回収率が高いため好ましい。あるいは、回収した単核細胞を培養フラスコに移し、３４℃〜３８℃、より好ましくは３７℃、２％〜１０％、より好ましくは５％ＣＯ２の条件下で１時間以上培養し、付着細胞を樹状細胞の前駆細胞として用いる方法等を使用してもよい。
【００４２】
その後、得られた樹状細胞の前駆細胞から未成熟樹状細胞あるいは成熟樹状細胞への分化誘導を行う。培養のための培地としてＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）を使用する。またＡＩＭ−Ｖ培地のほかに、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン、以下、ＤＭＥＭと記す）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）、表皮角化細胞培地（コージンバイオ株式会社、以下、ＫＢＭと記す）、イスコフ培地（インビトロジェン、以下、ＩＭＥＭと記す）等、細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて０．５〜２０％の牛血清、牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す）、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
【００４３】
未成熟樹状細胞を得る場合、培養培地に分化誘導因子を添加して樹状細胞の前駆細胞を培養することにより未成熟樹状細胞を得る。分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできる。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦと記す）、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４と記す。他のインターロイキンについても同様に記す）、ステムセルファクター（以下、ＳＣＦと記す）、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α（以下、ＴＮＦ−αと記す）等が、効率よく未成熟樹状細胞を誘導できる。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等を添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４との組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。培養は３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養期間は５〜７日間が好ましい。
【００４４】
また、成熟樹状細胞を得る場合には、培養開始後５〜７日目にさらなる分化誘導因子を添加して更に培養する。分化誘導因子としてはサイトカイン類のいずれを使用することもできるが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、プロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２と記す）等で効率よく成熟樹状細胞を誘導することが好ましい。必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等の添加することが好ましい。より好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２及びＴＮＦ−αの組合せを用いると効率よく誘導することが可能である。培養は３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃、２％〜１０％、好ましくは５％ＣＯ２条件下で行い、培養時間としては２４〜４８時間が好ましい。
【００４５】
また、樹状細胞の前駆細胞として造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αとｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）、又はトロンボポエチン（ＴＰＯ）を単独、又はこれらの組合せで添加し、未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞を得る方法や、血液又は末梢血単核球を分離したものからパーコール等の比重液を用いて直接樹状細胞分画を回収する方法も利用することができる。
【００４６】
次に、得られた抗原提示細胞（この例では、前記未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞）をビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で共感作する。
【００４７】
ビスホスホネートの濃度は通常細胞をビスホスホネートにより感作する濃度であればよく、特に限定はされないが、例えば、文献［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，Ｖｏｌ．１６６，５５０８−５５１４、又は、Ｂｌｏｏｄ，２００１，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．５，１６１６−１６１８］に記載されているように０．００１μＭから２０μＭであることが好ましく、さらには０．００１μＭから５μＭであることが好ましい。
【００４８】
細菌細胞壁骨格成分の濃度は、通常細胞を細菌細胞壁骨格成分により感作する濃度であればよく、特に限定はされない。例えば、ＢＣＧ−ＣＷＳの場合２０μｇ／ｍＬである。
【００４９】
疾病抗原の濃度は、通常樹状細胞を疾病抗原により感作する濃度であればよく、特に限定はされない。例えば、上述のような疾病抗原蛋白質又はペプチドの場合、文献［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，Ｖｏｌ．５９，２１６７−２１７３、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．１５４，２２５７−２２６５、又は、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１５３，９９６−１００３］に記載されているように、０．０１〜２０μｇ／ｍＬであることが好ましく、さらには０．１〜２μｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００５０】
また、疾病抗原としてアポトーシス細胞及び／又はネクローシス細胞を含む細胞群で樹状細胞を感作する場合、前記細胞群の調製方法として、例えば、１）がん細胞又はがん細胞株を培養し自然発生的に形成させる、２）がん細胞又はがん細胞株に対しＵＶ照射（１Ｊ／ｃｍ２・ｓｅｃを２分間）して形成させる、３）がん細胞又はがん細胞株を８５℃、１０分間熱処理をして形成させる方法等が挙げられる。
【００５１】
ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で共感作するタイミングは特に制限されず、それぞれの成分を含む溶液を順に添加したり、３成分を同一の液に懸濁して添加したりすることができる。
【００５２】
このような本発明の活性化処理方法により調製（生産）された本発明の活性化抗原提示細胞（この例では活性化樹状細胞）は、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを効率よく誘導することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれの場合でも、本発明の活性化抗原提示細胞は、疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる医薬として使用することができる。特に、医薬としては、がん及び／又は感染症の治療・予防剤用途が好ましい。本発明において、免疫担当細胞とは、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等を含む抗原の特異性を認識したり及び／若しくは特異的免疫反応に携わったりする能力がある細胞、又はこれらの１種類若しくは２種類以上を含む細胞群をいう。本発明の活性化抗原提示細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する場合、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導することができる組成物として利用することが可能である。また、本発明の活性化抗原提示細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合、遊離ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原を洗浄、除去したのち、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導することができる樹状細胞ワクチンなどのワクチンとして使用可能である。また、本発明の活性化抗原提示細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで用いるいずれの場合にも、必要に応じて、例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−２）やその他の蛋白質（例えばアルブミン）等を併用してもよい。
【００５３】
第二の実施形態：本発明の活性化抗原提示細胞を含む医薬
次に、本発明の活性化抗原提示細胞を用いた医薬について、上述と同様に、樹状細胞を抗原提示細胞として用いた一例に基づき説明する。
【００５４】
まず、前述の第一の実施形態で得られた活性化抗原提示細胞（活性化樹状細胞）を遠心分離法等によって回収する。次に、回収した前記細胞を洗浄する。洗浄する液体としては等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能である。この後患者に投与することを考えると、生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。そして、回収された樹状細胞は生理食塩水に懸濁されることで医薬として用いることが可能となる。また、必要に応じてアルブミン等の血清成分やサイトカインを添加することができる。特に、当該医薬としてはがん及び／又は感染症の治療・予防剤用途であることが好ましい。したがって、関連する実施形態として、本発明はがん及び／又は感染症のための医薬の製造するための本発明の活性化抗原提示細胞の使用を含む。
【００５５】
第三の実施形態：本発明の活性化抗原提示細胞を用いた治療・予防方法
次に、本発明の樹状細胞を用いた治療・予防方法について、上述と同様に、樹状細胞を抗原提示細胞として用いた一例に基づき説明する。
【００５６】
前述の第一の実施形態で得られた本発明の活性化抗原提示細胞（活性化樹状細胞）、又は、第二の実施形態により得られた本発明の医薬を投与することにより、がん及び／又は感染症に対する治療・予防を行うことができる。
【００５７】
投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であり、特に制限されない。通常一回の投与で１０６〜１０８個／人であることが好ましく、より好ましくは１０７個／人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、通常４〜６回を１クールとして投与する。投与間隔は投与する樹状細胞数に依存し、特に制限されない。通常１週間から１ヶ月に一度であることが好ましく、さらには投与する樹状細胞数が５×１０６個である場合には２週間に１度、２×１０７以上であるならば１ヶ月に一度投与することが好ましい。投与する方法は、特に制限されないが、静脈、皮下、皮内等へ注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。
【００５８】
これら疾病抗原特異的ＣＴＬは直接的にがん細胞や感染細胞を殺傷するばかりでなく、インターフェロンγ（以下、ＩＦＮγと記す）等のサイトカインを介して間接的にこれら細胞を傷害することができるため、例えば、がんや感染症等、様々な治療・予防に有効に用いることが可能である。本発明の活性化抗原提示細胞をワクチンとして用いることの利点としては、以下のことが挙げられる。すなわち、従来の疾病抗原のみで感作した樹状細胞ワクチンでは、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬのみが活性化される。それに対して、本発明の活性化抗原提示細胞のワクチンは、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの活性化に加えてγδＴ細胞を活性化することもできる。さらには、これら疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及び／又はγδＴ細胞から誘導されたサイトカインは、ヘルパーＴ細胞、ＮＫ細胞やｉＮＫＴ細胞及びＢ細胞を活性化することができる。これにより、生体内全体の液性及び細胞性免疫系が活性化され、その結果、治療・予防効果の向上をもたらすことができる。また、活性化処理に用いる抗原提示細胞は、患者の自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることが好ましい。患者に投与された際に患者自身の免疫に排除されることなく、その機能を発揮することが可能となるからである。
【００５９】
第四の実施形態：疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む免疫担当細胞の誘導方法
次に、本発明の免疫担当細胞の誘導方法について説明する。本発明の免疫担当細胞の誘導方法は、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む免疫担当細胞を誘導する方法であって、より具体的には、ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分及び疾病抗原で抗原提示細胞を共感作する工程（ｉ）、及び前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞とリンパ球とを混合培養する工程（ｉｉ）を含む誘導方法である。ここで、免疫担当細胞とは、上述のとおり、Ｔ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等を含み、抗原の特異性を認識したり及び／若しくは特異的免疫反応に携わったりする能力がある細胞、又はこれらの１種類若しくは２種類以上を含む細胞群をいう。
【００６０】
まず、第一の実施形態と同様に抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の活性化処理を行う（工程（ｉ））。そして、前記共感作と同時又はその後に、前記抗原提示細胞と反応細胞を培養容器に播種して混合培養をする（工程（ｉｉ））。これにより、前記活性化処理された抗原提示細胞からの疾病抗原特異的刺激を受け、前記反応細胞中の疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬが活性化され得る。さらに、ビスホスホネート感作による抗原提示細胞代謝系阻害によって抗原提示細胞表面上に提示されたＩＰＰ（Ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、イソペンテニル二リン酸）様分子からの刺激を受け、前記反応細胞中のγδＴ細胞が活性化され得る。γδＴ細胞から産生されたＩＦＮγは、前記疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの更なる活性化と増殖を助けることができる。
【００６１】
また、細菌細胞壁骨格成分（ペプチドグリカン等）により感作された抗原提示細胞、例えば未成熟樹状細胞はペプチドグリカンのレセプターとして働くＴＬＲ２／４を介して刺激され成熟化が促進される。ＢＣＧ−ＣＷＳにより成熟化された樹状細胞はＴＮＦα、ＰＧＥ２などで成熟化した樹状細胞と異なり貪食能を保持しているため、がん抗原蛋白質等の疾病抗原を取り込んでプロセッシングして、疾病抗原分子をＨＬＡ上に提示することができる。また樹状細胞上のＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びまたはＣＤ８６等の共刺激分子の発現が向上しているため、ＣＴＬを活性化することができる。
【００６２】
なお、ここでいう反応細胞とは、例えば、ヒトリンパ球であって、末梢血由来の単核球等が好ましい。この反応細胞は、自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることが好ましい。
【００６３】
前記培養容器は特に限定されるものではなく、通常、当該分野で使用される培養用プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ等を利用することができる。各々の細胞群を播種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。
【００６４】
前記抗原提示細胞が樹状細胞の場合、樹状細胞と反応細胞との混合培養には、例えば、ＡＩＭ−Ｖ培地を用いて培養することができる。また、ＡＩＭ−Ｖ培地のほか、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ、ＴＩＬ、ＫＢＭ、ＩＭＥＭ等、細胞培養に使用されている市販の培地を利用することができる。さらに必要に応じて５％〜２０％の牛血清、ＦＢＳ、ヒト血漿等の血清、サイトカイン等を添加してもよい。培養は、例えば、３４℃〜３８℃、好ましくは３７℃で、例えば、２％〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２条件下で行う。培養期間としては、特に制限されないが、５〜２１日間が好ましく、さらに７〜１４日間が好ましい。播種する樹状細胞及び反応細胞の数は播種する容器及び用途に応じて設定することができる。また、樹状細胞と反応細胞を混合する割合は状況に応じて適宜設定することが可能であり、特に制限されない。反応細胞中の疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの割合を増加させるという目的から、反応細胞と樹状細胞の割合は２０：１から２：１が好ましい。
【００６５】
このような本発明の誘導方法により、疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む本発明の免疫担当細胞を調製（生産）することが可能である。また、このようにして得られた本発明の免疫担当細胞は、そのまま又は本発明の活性化抗原提示細胞で繰り返し刺激することにより、より高い割合で疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む免疫担当細胞として免疫細胞療法に用いることができ、がんや感染症に対してより高い治療・予防効果が期待できる。
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の免疫担当細胞を調製することの利点としては、本発明の活性化抗原提示細胞によって反応細胞を繰り返し刺激することにより、がん細胞や感染症細胞を直接殺傷可能な多量の免疫担当細胞を簡便に調製できることが挙げられる。
【００６７】
第五の実施形態：本発明の免疫担当細胞を含む医薬
次に、本発明の免疫担当細胞を含む医薬について説明する。
【００６８】
まず、前述の第四の実施形態で得られた疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む本発明の免疫担当細胞を遠心分離法等によって回収する。次に、回収した細胞を洗浄する。洗浄する液体は、等張であり、医薬品として用いることできる液体であればいずれを用いることも可能である。この後、患者に投与することを考えると生理食塩水、ＰＢＳ等を利用することが好ましい。そして、回収された疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含む免疫担当細胞は、生理食塩水に懸濁されることで医薬として用いることが可能となる。また、必要に応じてサイトカイン等を添加することができる。当該医薬としては特に、がん及び／又は感染症の治療・予防剤用途が好ましい。したがって、関連する実施形態として、本発明は、がん及び／又は感染症のための医薬の製造するための本発明の活性化抗原提示細胞の使用を含む。
【００６９】
第六の実施形態：本発明の免疫担当細胞を用いた治療・予防方法
次に、本発明の免疫担当細胞を用いた治療・予防方法について説明する。
【００７０】
前述の第四の実施形態で得られた本発明の免疫担当細胞、又は、第五の実施形態により得られた本発明の医薬を投与することにより、がん及び／又は感染症に対する治療・予防を行うことができる。
【００７１】
投与する細胞数としては、投与方法、患者の状態に応じて適宜選択することが可能であり、特に制限されない。通常１回の投与数は１０８〜１０１２個／人であることが好ましく、より好ましくは１０９個／人以上である。投与回数は患者の状態により異なるが、通常４−６回を１クールとして投与する。投与間隔は、特に制限されないが、例えば２週間に１回又は１ヶ月に１回投与することが好ましい。投与する方法は、特に制限されないが、静脈、皮下、皮内等への注射により注入することも、所属リンパ節へ直接注入することも、直接病変部に注入することも、点滴として全身投与することも可能である。あるいは、病変部近辺の動脈から注入することも可能である。また、本発明の免疫担当細胞は、患者の自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることが好ましい。患者の自己由来又はＨＬＡを同じくする他家由来であることで、患者に投与された際に、患者自身の免疫系に排除されることなく、その機能を発揮することが可能となるからである。
【００７２】
第七の実施形態：抗原提示細胞の活性化剤
次に、本発明の抗原提示細胞の活性化剤について説明する。
【００７３】
本発明の抗原提示細胞の活性化剤はビスホスホネートと細菌細胞壁骨格成分を含むものである。本発明の抗原提示細胞の活性化剤はｅｘ  ｖｉｖｏで抗原提示細胞を培養する際に、培地に添加して抗原提示細胞の活性化を促すことができる。ビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分の量は最終濃度が実施形態１に記載された量となるように適宜設定することができる。
【００７４】
また、適当な溶媒、例えば生理食塩水等に懸濁して体内に投与し、体内に存在する抗原提示細胞を活性化することもできる。体内に投与する場合の投与量はビスホスホネート、細菌細胞壁骨格成分の添付文書に記載された量に基づき適宜設定することができる。
【００７５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００７６】
＜実施例１−１：樹状細胞の採取及び調製＞
健常人ドナーから末梢血を７５ｍＬ採血した。この健常人末梢血から単核細胞を取得した。この際、血球分離用比重液を用いて単核細胞層を回収した。回収した細胞から血小板等を除去するために１０％  ＦＢＳを添加したＡＩＭ−Ｖで数回洗浄し、次いでＭＡＣＳにより単球（ＣＤ１４陽性細胞）を単離した。
【００７７】
得られた単球（樹状細胞前駆細胞）から樹状細胞への分化誘導を行った。単球をＡＩＭ−Ｖに５００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（ＩＭＭＵＮＥＸ）、５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−４（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、５％ＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地により培養した。５日間培養を行い、未成熟樹状細胞を調製した。
【００７８】
＜実施例１−３：ゾレドロン酸、ＢＣＧ−ＣＷＳ及び疾病抗原ペプチドで共感作した樹状細胞の調製及び反応細胞の調製＞
上述のとおり調製した末梢血由来の未成熟樹状細胞の懸濁液に、ゾレドロン酸としてＺＯＭＥＴＡ（ノバルティスファーマ）を０．１μＭとなるように添加した。また同時にＢＣＧ−ＣＷＳ（２０μｇ／ｍＬ）を加え２４時間培養し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製した。
【００７９】
反応細胞として、樹状細胞調製のためにＣＤ１４陽性細胞を単離したあとの残りの細胞（ＣＤ１４陰性細胞集団、主にＴ細胞集団）であって、１０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して凍結保存された細胞を解凍、洗浄して用いた。
【００８０】
疾病抗原ペプチドとしてメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１改変抗原Ａ２７Ｌ（アミノ酸配列：ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を最終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、ＡＰＣとリンパ球（抗原提示細胞と同じドナー由来）による混合リンパ球培養反応（Ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＭＬＲ）を行った。培養は３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間及び１４日間行った。７日後、１４日後に抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を検出するため、テトラマーアッセイを行った。
【００８１】
ＭＬＲ開始から１４日後に標識抗体と抗原（Ａ２７Ｌ）特異的テトラマーを用いてフローサイトメーターで全細胞中にしめるＡ２７Ｌ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ（疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ）の割合を測定した。
【００８２】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  Ａ２７Ｌテトラマー陽性、ＣＤ８陽性細胞が占める割合を算出する手順として、まずＰＥ標識されたＡ２７Ｌテトラマー（ＭＢＬ）を培養後ＰＢＳで洗浄した細胞に添加した。遮光の状態で室温２０分染色後、ＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、遮光の状態で４℃、２０分間染色した。コントロールには各抗体のアイソタイプを利用した。細胞の測定はＥｐｉｃｓ  ＸＬ・ＭＣＬを用い、測定結果の解析にはＥｐｉｃｓ３２を用いた。
【００８３】
その結果を下記表１に示す。同表に示すとおり、ｉｍＤＣに比べＢＣＧ−ＣＷＳを感作したＤＣはリンパ球との１４日間の培養でＡ２７Ｌ陽性細胞数を増加させることが確認された。また、ゾレドロン酸を添加することでその効果は増強された。
【００８４】
【表４】
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【００８５】
また、ＪＣＯＣＢ細胞株（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍａｒｔ１＋）を標的細胞としてＭＬＲにより誘導されたリンパ球の細胞傷害活性をテラスキャンアッセイにより測定した。
【実施例２】
【００８６】
＜細胞傷害活性の測定＞
実施例１と同様の方法によりＭＬＲを行った。
【００８７】
ＭＬＲを開始してから１４日目のリンパ球を回収した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性、ＭＡＲＴ１陽性のヒトメラノーマ細胞株ＪＣＯＣＢをカルセイン（同仁化学）で標識し、標的細胞とした。回収したリンパ球をエフェクター細胞とし、エフェクター細胞：標的細胞が２０：１、もしくは４０：１となるように混合して９６ｗｅｌｌ  ｈａｌｆ  ｐｌａｔｅに播種した。４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行った。
【００８８】
混合培養後の細胞を回収し、テラスキャン（ミネルバテック）を用いてＷｅｌｌ内の傾向強度を測定し細胞傷害活性測定した。
【００８９】
下記表２に、ＺＯＭＥＴＡ、ＢＣＧ−ＣＷＳ及びＡ２７Ｌで感作した活性化樹状細胞によって誘導されたＡ２７Ｌ抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬによりアポトーシス細胞の割合（％）を測定した結果を示す。ｉｍＤＣで誘導されたリンパ球でも細胞株に対して傷害活性を有しており、その効果はゾレドロン酸を加えることで増強される。さらに、ＢＣＧ−ＣＷＳを感作されたＤＣでより強い細胞傷害活性を有していることが確認された。
【００９０】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００９１】
以上説明したように、本発明の活性化抗原提示細胞は疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを従来のペプチドのみで感作した樹状細胞と比較して、非常に効率よく誘導することができる。そのため投与用組成物として患者に投与することでｉｎ  ｖｉｖｏにおいて疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導し、がんや感染症に対する治療・予防効果が期待できる。さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏでは疾病抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを誘導するための組成物として利用することができる。