(57)【要約】【課題】口腔扁平上皮癌におけるゲノム構造の変化を指標として、口腔扁平上皮癌の悪性度を含めて検出する手段を提供すること。【解決手段】口腔扁平上皮癌におけるゲノム構造の変化を指標として口腔扁平上皮癌の悪性度を含めた検出を可能にすることを見出した。また、本発明は、口腔扁平上皮癌において、遺伝子の不活性化を回復することにより、口腔扁平上皮癌の増殖を抑制することも見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、４ｑ３５の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することを含む、癌の検出方法。
【請求項２】
変化を検出する遺伝子が、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上である、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
遺伝子の変化が、遺伝子の欠失及び／又は不活性化である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
遺伝子の変化が、ＣｐＧアイランドのメチル化による遺伝子の不活性化である、請求項１から３の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項５】
遺伝子がＭＴＮＲ１である、請求項１から４の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項６】
遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１から５の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項７】
検体において、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することを含む、癌の検出方法。
【請求項８】
蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、請求項７に記載の癌の検出方法。
【請求項９】
検体が、口腔由来の組織である、請求項１から８の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１０】
癌が、口腔扁平上皮癌である、請求項１から９の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１１】
検体の悪性度を含めた癌化を検出する、請求項１から１０の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項１２】
ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、あるいはＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子によりコードされる蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１３】
ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、あるいはＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子によりコードされる蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体において、特定の染色体領域に存在する遺伝子の変化を検出することを含む癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔扁平上皮癌［ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＯＳＣＣ）］は、頭頚部癌に分類され、主として口腔粘膜上皮などから発生する腫瘍である。頭頚部癌の中で３５％程度と発生割合が高く、全世界で毎年２７万人に何らかの影響を与えている（非特許文献１）。発生部位では舌がもっとも多く、次いで歯肉（歯茎）に発生することが多い。他に頬粘膜、口蓋、口底といったその他の口腔粘膜、さらに顎の骨や唾液腺にも発生することが知られている。
【０００３】
近年、口腔扁平上皮癌のための診断と治療の手順は進歩しているにもかかわらず、その予後は改善されていない。このため、口腔扁平上皮癌における原因遺伝子を見つけ出し、その機能を解明することは、効果的な治療法、化学的予防のための新しい戦略の知見を築くためにも望まれている。
【０００４】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異や量的変化に起因することは古くから知られている。近年の遺伝子工学の発達は特定タンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与するいわゆる癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに癌抑制遺伝子として網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが発見されている。ＷＴ１遺伝子を活用した癌抑制剤の例も報告されている（特許文献１）。
【０００５】
また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになっており、さらに多くの未同定の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。癌抑制効果を有する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その選別には患者の遺伝子の変異を、染色体ＤＮＡを染色することにより視覚化して見つけ出すアプローチ（非特許文献２）や、遺伝子の欠失をＬＯＨ（Ｌｏｓｓ  Ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）解析で大まかな範囲を選定した後、重要な遺伝子領域を絞り込むという方法がこれまで行われてきた（特許文献２）。しかし、これらの方法では、判別できるＤＮＡ欠失領域が莫大なものとなり、重要な遺伝子領域を絞り込む作業に大量の時間と手間を必要とする欠点を持っており、癌抑制遺伝子を探し出す手段としては限界があった。また、従来の癌病態の分離・識別法では悪性度の判定は困難であった。
【０００６】
本発明者等は、これらの問題を解決するため、新たながん抑制遺伝子として、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子，ＣＤＨ１遺伝子，ＭＧＭＴ遺伝子，ＲＡＲＢ遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子，ＤＡＰＫ遺伝子，ＭＬＨ１遺伝子，ＬＲＰ１Ｂ遺伝子を見出し報告している（非特許文献３）。また、ＦＡＴ遺伝子ががん抑制遺伝子として働いており、ＦＡＴ遺伝子のホモ欠失により口腔がんの腫瘍化が引き起こされる可能性が報告されている（非特許文献４）。しかしながら、がん原因の遺伝子レベルでの機構を解析し、診断に役立てるためには、さらに多くの遺伝子変異を検討する必要があった。
【０００７】
【非特許文献１】Parkin,DM., et al.,CA Cancer J Clin.55,74-108,2002
【非特許文献２】Yasuhide Yamashita,et al.,World J Gastroenterol ,11(33):5129-5135,2005
【非特許文献３】Nakagawa T, Pimkhaokham A, Suzuki E, Omura K, Inazawa J, Imoto I. Genetic or epigenetic silencing of low density lipoprotein receptor-related protein 1B expression in oral squamous cell carcinoma. Cancer Sci 2006; 97: 1070-4.
【非特許文献４】Nakaya K, Yamagata HD, Arita N, et al. Identification of homozygous deletions of tumor suppressor gene FAT in oral cancer using CGH-array. Oncogene 2007; 26: 5300-8.
【特許文献１】ＷＯ２００３／００２１４２号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０３２８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
口腔由来、主に口腔上皮由来細胞の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける口腔由来細胞の癌化の発見や、口腔扁平上皮癌の悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、口腔扁平上皮癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、口腔扁平上皮癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法及び細胞増殖抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＣＧＨ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失、あるいは遺伝子の不活性化に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌化並びに癌の悪性化などに関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する８００種類、４５００種類のＢＡＣ/ＰＡＣ  ＤＮＡを選別する（ＭＣＧ  ＣａｎｃｅｒＡｒｒａｙ-８００、ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ‐４５００；Ｔａｋａｄａ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６，１００−１０５，２００５、Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９５，５５９−５６３，２００４）ことにより、癌で高頻度に欠失した遺伝子をスクリーニングした。さらに、本発明者らは、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）法（Xiong Z  ａｎｄ Laird PW.，  Nucleic Acids Res 25: 2532-2534.１９９７）とＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせ、口腔由来の細胞の癌化を促進する癌関連遺伝子、すなわち、Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １Ａ（ＭＴＮＲ１Ａ）遺伝子の同定に成功した。そして、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の欠失、または不活性化、すなわち、ＭＴＮＲ１Ａ蛋白質の減少が口腔扁平上皮癌の増殖を顕著に促進することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明によれば、検体において、４ｑ３５の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することを含む、癌の検出方法が提供される。
好ましくは、変化を検出する遺伝子は、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上である。
好ましくは、遺伝子の変化は、遺伝子の欠失及び／又は不活性化である。
好ましくは、遺伝子の変化は、ＣｐＧアイランドのメチル化による遺伝子の不活性化である。
【００１１】
好ましくは、遺伝子はＭＴＮＲ１である。
好ましくは、遺伝子の変化を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、アレイＣＧＨ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する。
【００１２】
好ましくは、検体において、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子から翻訳される蛋白質の量を検出することを含む、癌の検出方法。
好ましくは、蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する。
好ましくは、検体は、口腔由来の組織である。
好ましくは、癌は、口腔扁平上皮癌である。
好ましくは、検体の悪性度を含めた癌化を検出する。
【００１３】
本発明によればさらに、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、あるいはＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子によりコードされる蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
【００１４】
本発明によればさらに、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、あるいはＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子によりコードされる蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、口腔由来の細胞検体における癌化、悪性度を的確に把握することが可能となった。また、口腔扁平上皮癌において、ＭＴＮＲ１遺伝子又はその転写産物を導入することにより、口腔扁平上皮癌の増殖を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体において、４ｑ３５の染色体領域に存在する遺伝子の変化を少なくとも１つ以上を検出することを特徴とする。好ましくは、検出される遺伝子は、ＭＴＮＲ１遺伝子である。
【００１７】
ヒトゲノムプロジェクトの成果により、ＭＴＮＲ１遺伝子の転写産物は既に知られており、４ｑ３５染色体領域に存在する遺伝子である。ＭＴＮＲ１遺伝子がコードする蛋白質は、松果体のホルモンであるメラトニンの受容体蛋白質の一つであることはわかっているが、このＭＴＮＲ１遺伝子が、口腔扁平上皮癌の発症、または悪性度に関わる重要な癌関連遺伝子であることは知られていない。
【００１８】
上述したように、本検出方法は、口腔由来の細胞や口腔扁平上皮癌におけるＭＴＮＲ１遺伝子の欠失や不活性化を検出することを特徴とする方法である。
ＭＴＮＲ１遺伝子の欠失や不活性化を検出する対象となる口腔由来の細胞や口腔扁平上皮癌は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
【００１９】
この検体組織細胞は、健常人の口腔に由来する細胞か、口腔扁平上皮癌患者の癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、口腔粘膜や舌、歯茎などに癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または口腔扁平上皮癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある口腔扁平上皮癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００２０】
本検出方法により、「検査等の結果、口腔に由来する組織や細胞に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるＭＴＮＲ１遺伝子の欠失や不活性化が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか或いは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「口腔扁平上皮癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある口腔扁平上皮癌の組織」におけるＭＴＮＲ１遺伝子の欠失や不活性化が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された口腔扁平上皮癌組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或いはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００２１】
次に、本発明の一例として、ＭＴＮＲ１遺伝子の欠失、または不活性化の検出について説明する。なお、本発明においては、ＭＴＮＲ１遺伝子以外にも、４ｑ３５の染色体領域に存在する遺伝（例えば、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３など）の変化を、ＭＴＮＲ１遺伝子の場合と同様に検出してもよい。
【００２２】
（ｉ）ＭＴＮＲ１遺伝子の欠失の検出
ＭＴＮＲ１遺伝子の欠失の検出を直接的におこなうことができる代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ＭＴＮＲ１遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、ＭＴＮＲ１遺伝子の有無、すなわち欠失を検出することができる。具体的には、ＭＴＮＲ１遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとしては、ＲＰ１１−２１３Ａ１９、ＲＰ１１−１７８Ｃ１２等を上げることができる。
【００２３】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２４】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２５】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２６】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２７】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２８】
また、このＭＴＮＲ１遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００２９】
（ｉｉ）ＭＴＮＲ１遺伝子の不活性化の検出
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ  ＡＰ．，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｃｅｌｌ，９９，４５１−４５４，１９９９）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域の高度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６９４−６７０２，２００２）。後述するように、実際、ＭＴＮＲ１遺伝子のエキソンに存在するＣｐＧアイランドはプロモーター活性を有している。また、このＣｐＧアイランドのメチル化の度合いは、一部の口腔扁平上皮癌でのＭＴＮＲ１遺伝子発現の抑制と強く相関していた。
【００３０】
そして、口腔扁平上皮癌を、脱メチル化試薬である５−アザデオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）存在下で培養することにより、ＣｐＧアイランドを脱メチル化することができ、その結果、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子発現を回復させることができた。これらの結果により、ＣｐＧアイランドの高度メチル化が口腔扁平上皮癌における癌抑制遺伝子の発現抑制を高頻度で起こす原因の一つであることが判明した。
【００３１】
上述した検出手段により、ＭＴＮＲ１遺伝子の発現量が減少していることが判明した検体細胞（癌組織に由来するプライマリー癌細胞）に対して、脱メチル化剤（５−アザデオキシシチジンなど）を作用させて、遺伝子発現量の回復を検討することができる。すなわち、検体細胞に脱メチル化剤を作用させて、ＭＴＮＲ１遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ＣｐＧアイランドのメチル化であり、検体提供者に、脱メチル化作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。
【００３２】
（２）細胞増殖の抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によればさらに、ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子、または、該遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記遺伝子又は蛋白質を含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３３】
ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法によりＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３４】
ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２nd  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００３５】
ＭＴＮＲ１、Ｆ１１、ＫＬＫＢ１、ＣＹＰ４Ｖ２、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ、又はＴＲＬ３から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３６】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３７】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３８】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３９】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００４０】
本発明の細胞増殖抑制剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００４１】
有効成分である上記遺伝子又は蛋白質を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４２】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖抑制剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４３】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：口腔扁平上皮癌における遺伝子の変化
口腔扁平上皮癌での新規な遺伝子変化を検出するために、２５種類の口腔扁平上皮癌細胞株（ＯＭ−１、ＯＭ−２、ＴＳＵ、ＺＡ、ＮＡ、Ｃａ９−２２、ＨＯＣ−３１３、ＨＯＣ−８１５、ＨＳＣ−２、ＨＳＣ−３、ＨＳＣ−４、ＨＳＣ−５、ＨＳＣ−６、ＨＳＣ−７、ＫＯＮ、ＳＫＮ−３、ＨＯ−１−Ｎ−１、ＫＯＳＣ−２、Ｓａ３、ＳＡＳ、ＫＯＳＣ−３，ＨＯ−１−ｕ−１、Ｔ３Ｍ１Ｃ１２，Ｔ３Ｍ１ＣＩ−１０，ＨＳＱ８９）および１４種類の口腔扁平上皮癌細胞株（Ｔｏｓｃａ−２Ｓ、７,１８,２３，２４，３０，３２，３６，４５，５０，５２，５５，５８Ｓ１，６５）のうち最初の１８種類を除いた２１種類の細胞株から調製したゲノムＤＮＡを用いてＭＧＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ−８００とＭＧＣ Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ Ａｒｒａｙ−４５００を使用したＣＧＨアレイ解析をおこなった。なお、対象として正常な口腔上皮由来の細胞株（ＲＴ７）から抽出したゲノムを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして口腔扁平上皮癌細胞株から調整したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．６ｍＭ ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（口腔扁平上皮癌細胞）或るいは０．３ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識ｄＣＴＰはＧＥ  ヘルスケア社より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ/１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７．０）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションマシーン（ＧｅｎｅＴＡＣ；ハーバードバイオサイエンス社）にＣＧＨアレイをセットし、４８−７２時間ハイブリダイゼーションをおこなった。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド/２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ６．０イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３/Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝０）である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで０．４以上）の時にゲノムの増幅があり、４以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで２以上）の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−０．４以下）の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−２以下）の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。その結果を図１ａ，ｂおよび表１、２に示す。
【００４６】
【表１】
2010035525.tif 000002
【００４７】
【表２】
2010035525.tif 000003
【００４８】
高レベルの遺伝子増幅は、２１種類の口腔扁平上皮癌中８種類で、１３遺伝子座に確認することができた。また、遺伝子欠失は、２１種類の口腔扁平上皮癌中１６種類で、７遺伝子座を確認することができた。
【００４９】
実施例２：口腔扁平上皮癌における４ｑ３５染色体欠失領域に含まれる遺伝子の単離
アレイＣＧＨで４ｑ３５領域のホモ欠失が確認された口腔扁平上皮癌細胞（ＴＯＳＣａ−２４，３６，５２，５５、ＳＡＳ）におけるホモ欠失領域の範囲を決定するため、一連のＳＴＳマーカー（１，  ＳＨＧＣ−８０５０；  ２，  ＲＨ４８６８８；  ３，  ＳＨＧＣ−１５６０１８；  ４，  ＲＨ４５８２６；  ５，  ＳＧＧＣ−１４０６５９；  ６，  ＧＤＢ：３１５９１７；  ７，  ＳＨＧＣ−５０７２３；  ８，  ＳＨＧＣ−１４０３７６；  ９，  ＷＩ−３１６０）を用いたゲノミックＰＣＲを行い、１Ｍｂ程度の領域内で３領域（図１ｃ）ホモ欠失領域の範囲があることを見出した。
【００５０】
また、ＣＧＨアレイの結果とヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）から、この領域には７つの遺伝子（ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子、ＫＬＫＢ１遺伝子、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子、Ｆ１１遺伝子、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子、ＦＡＴ遺伝子）が存在することを確認した。
【００５１】
さらに、これらの遺伝子がホモ欠失していることを確認するため、前述の３９種類の細胞株について、補足表１記載のプライマーセットを用いたゲノミックＰＣＲを行い、ＴＲＬ３が２つの細胞株で、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊが３つの細胞株で、ＣＹＰ４Ｖ２が３つの細胞株で、ＫＬＫＢ１が３つの細胞株で、Ｆ１１が３つの細胞株で、ＭＴＮＲ１Ａが２つの細胞株で、ＦＡＴ２つの細胞株で欠失していることを見出した（図２ａ）。
【００５２】
実施例３：口腔扁平上皮癌細胞株におけるＭＴＮＲ１Ａ  ｍＲＮＡ発現の消失
前述の３９細胞株、および正常口腔上皮細胞の不死化細胞株ＲＴ７、および正常な口腔粘膜からの初代培養上皮細胞における上記７種の遺伝子（ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子、ＫＬＫＢ１遺伝子、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子、Ｆ１１遺伝子、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子、ＦＡＴ遺伝子）のｍＲＮＡの発現量を決定するため、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）−ＰＣＲをおこなった。
【００５３】
具体的には、培養した細胞株からの抽出ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、表３に示すプライマー配列を用いて、ＰＣＲをおこなった。また、コントロールとして、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。
【００５４】
【表３】
2010035525.tif 000004
【００５５】
解析の結果、ＦＡＴ遺伝子はほぼ全ての細胞株で発現し、正常細胞との差も無いことから、口腔扁平上皮癌のターゲットとしては好ましくないことがわかった。
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子、ＴＲＬ３遺伝子，ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１１遺伝子は、発現パターンが細胞株ごとに異なっており、正常細胞との差も小さいが、口腔扁平上皮癌のターゲットとできることがわかった（図２ｂ）。
【００５６】
さらに、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子は、ＲＴ７細胞、正常な口腔粘膜からの初代培養上皮細胞では明確に発現しているときに、ホモ欠失が見られない細胞株においても、高頻度にｍＲＮＡの発現が消失しており、４ｑ３５ホモ欠失、および、不活性化のターゲット遺伝子として特に好ましいことを見出した。
【００５７】
実施例４：脱メチル化によるＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現回復
ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現の抑制が、ＤＮＡのメチル化による原因かどうかを調べるため、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現していない口腔扁平上皮癌細胞株（ＴＯＳＣａ−５０、ＺＡ、ＮＡ）を用い、脱メチル化試薬５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを１μＭ、５μＭで５日間、および／あるいは、脱アセチル化阻害剤ＴＳＡを１００ｎｇ／ｍｌで１２時間処理をおこなった。それらの細胞由来からＲＮＡを抽出し、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた（図２ｃ）。その結果、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子は、５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄの処理により、遺伝子発現を回復することがわかった。この結果は、明らかに、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現抑制には、ＤＮＡのメチル化が関与していることが推定される。また、ＴＳＡ処理では、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現に差が見られないことから、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現調節にヒストンの脱アセチル化の影響は少ないことが明らかとなった（図２ｃ）。
【００５８】
一方、ＣＹＰ４Ｕ２遺伝子、およびＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子では５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄ処理による遺伝子発現の回復は見られなかった。このことから、ＣＹＰ４Ｕ２遺伝子、およびＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子における不活性化にはメチレーションが関与していないことがわかった（図６）。
【００５９】
実施例５：口腔扁平上皮癌細胞株におけるＭＴＮＲ１Ａ  ＣｐＧアイランドのメチル化状態
ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の不活性化におけるＣｐＧアイランドのメチル化状態の潜在的な役割を明らかにするために、ＭＴＮＲ１Ａが発現していない口腔扁平上皮癌細胞株（ＮＡ，ＨＳＣ−６，ＺＡ，ＨＳＣ−４，ＴＯＳＣａ―６５）あるいは発現している口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ−５）および、ＲＴ７細胞のＭＴＮＲ１Ａ  ＣｐＧ−ｉｓｌａｎｄ（領域１−３  図３ａ）周辺のＣｐＧサイトのメチル化の度合いをｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，２３０７，１９９９）により確認した（図３ａ）。
【００６０】
その結果、ＭＴＮＲ１Ａが発現していない口腔扁平上皮癌細胞株（ＮＡ，ＨＳＣ−６，ＺＡ，ＨＳＣ−４，ＴＯＳＣａ―６５）は全領域において、メチル化されており、一方、ＭＴＮＲ１Ａが発現している口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ−５）および、ＲＴ７細胞については、全領域が低メチル化状態であることが明らかとなった（図３ａ）。
【００６１】
さらに、より多くの細胞株について、メチル化状態と、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現状態の関係をＣｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法（Xiong Z  ａｎｄ Laird PW.，  Nucleic Acids Res 25: 2532-2534.１９９７）を用いて比較した。
【００６２】
その結果は、前記ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法の結果と一致しており、メチル化されていないアレルは主にＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現している細胞株（ＨＳＱ８９，ＨＳＣ−５，ＯＭ２，ＳＫＮ３）およびＲＴ−７細胞で検出され、ホモ欠失を伴わず、かつ、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現していない細胞株は、全ての領域において、高度なメチル化が見出された（図３ｂ）。
【００６３】
実施例６：ＭＴＮＲ１Ａ  ＣｐＧアイランドのプロモーター活性について
プロモーター活性を測定するため、２つの扁平上皮癌細胞（ＯＭ２：ＭＴＮＲ１Ａ発現あり、ＮＡ：ＭＴＮＲ１Ａ発現無し）について、プロモーター・レポーター・アッセイを用いて、推定領域をカバーする４つの断片領域を調べた。具体的には４つの断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １〜４）をルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入し、口腔扁平上皮癌細胞株（ＯＭ２，ＮＡ）へトランスフェクションした。Ｄｕａｌ-Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、マニュアルに従ってルシフェラーゼ活性を測定し、各Ｆｒａｇｍｅｎｔを有するｐＧＬ３ベクターに由来するルシフェラーゼ活性を測定した（図３ｃ）。その結果、領域２および３に存在するエクソン１およびイントロン１を含むＦｒａｇｍｅｎｔ３のルシフェラーゼ活性が高いことがわかった（図３ｃ）。この結果から、Ｆｒａｇｍｅｎｔ３は、メチル化による遺伝子不活性化のための重要な配列を含んでいることがわかった。
【００６４】
実施例７：原発性口腔扁平上皮癌臨床検体におけるＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のプロモータ領域のメチル化の解析
異常なメチル化が口腔扁平上皮癌臨床検体に存在するかどうかをより高感度に検出するため、バイサルフェート処理がなされたＤＮＡについて補足表Ｓ１に記載されたプライマーセットを用いＰＣＲ解析を行うＭＳＰ法（メチレーション特異的ＰＣＲ法）により、１６検体の口腔扁平上皮癌臨床検体について解析を行った。
【００６５】
コントロールとして、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法、ＣＯＢＲＡ法の解析結果と同様に、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現していない細胞（ＮＡ細胞）では顕著なメチル化パターンをしめし、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現している細胞（ＨＳＣ−５細胞）では、非メチル化状態を示すことが確認された。１６検体のうち１０の口腔扁平上皮癌臨床検体に、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の高度なメチル化がみとめられた（図４ａ）。ＭＳＰ法の結果を検証するため、１６検体の口腔扁平上皮癌臨床検体について、前述と同様にｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンス法を実施し、ＭＳＰ解析と同様の結果になることを確認した（図４ｂ）。
【００６６】
さらに、６組の検体のがん部および非がん部（臨床検体１０１〜１０６）について、同様にＭＳＰ解析を行い、がん部の方が非癌部に対し、相対的に高度にメチル化されていることを見出した。
【００６７】
実施例８：口腔扁平上皮癌臨床検体における、ＭＴＮＲ１Ａタンパクの発現量と、臨床病理学的特長の関係。
口腔扁平上皮癌臨床検体におけるＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の臨床的意義を明らかにするため、ＭＴＮＲ１Ａ特異的抗体を用いて口腔扁平上皮癌臨床検体におけるＭＴＮＲ１Ａ蛋白質の発現レベルを免疫組織化学染色により評価することにした。具体的な方法としては、パラフィン包埋した組織切片をホルマリン固定することでおこなった。シランコートされたガラススライド上の切片は、脱パラフィン化とエタノールによる段階的な脱水をおこなった。抗原は、９５℃で１０分間ｈｉｇｈ  ｐＨ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ）中でオートクレーブ前処理により取り出した。内因性ペルオキシダーゼは５％過酸化水素を用いて阻害した。非特異的染色は２％標準ブタ血清で阻害した。そのスライドは抗ヒトＣＴＧＦヤギポリクローナル抗体（Ｌ−２０、１：１００希釈；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて４℃で一晩インキュベートした。スライドはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ  シンプルステインＭＡＸ  ＰＯ（Ｇ）（Ｎｉｃｈｒｅｉ社）を用いて室温で２時間反応させた。抗原―抗体反応は０．２％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと過酸化水素により可視化した。そのスライドはＭａｙｅｒ’ｓ  ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００６８】
その結果、正常の口腔粘膜細胞において、ＭＴＮＲ１Ａは陽性の免疫反応を示した。一方、コントロールとした粘膜細胞に比べ、プロモーター境界領域で高度なメチル化がなされている癌部において、ＭＴＮＲ１Ａタンパク質の発現が不活性化することが明らかとなった（図４ｃ、図７Ｃ）。
【００６９】
５０種の口腔扁平上皮癌臨床検体については、３４が陽性を１６が陰性を示した。タンパクの発現と臨床病理的性質の関係を表４に示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
タンパクの発現は、ＴＮＭ分類中のＴステージと大きく相関しており、Ｔ３，Ｔ４ステージの腫瘍でＭＴＮＲ１Ａタンパクの発現が消失する傾向があることがわかる。しかしながら、患者の年齢、性別、分化度、ステージ、Nステージとは、関連しないことがわかる。
また、MTNR1Aの免疫活性が陰性の場合、全てのステージにおいて、全生存率が悪いことが明らかとなった（図４ｄ）。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
実施例９：ＯＳＣＣ細胞株の成長に対するＭＴＮＲ１Ａ遺伝子による成長抑制効果の確認
これまでの結果をふまえ、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子発現を活性化することで、ＯＳＣＣ細胞の成長が抑制されるかどうかどうかを検討した。まず、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のＭｙｃタグを発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ＦＬＡＧ−ＭＴＮＲ１Ａ）を構築した。本プラスミドは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したＭＴＮＲ１ＡのｃＤＮＡをｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＭｙｃタグと翻訳フレームがあうように挿入して作製した。対照として、ＩＴＣＨ遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ｍｏｃｋ）を使用した。これらの発現プラスミドを、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、ＨＳＣ−７細胞またはＮＡ細胞へトランスフェクションした。２４時間後細胞を回収し、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ  社）および、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたウエスタンブロットによりＭＴＮＲ１Ａ蛋白質の発現を確認した（図５Ａ）。
【００７４】
また、トランスフェクションの２週間後に、ネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で増殖した細胞を７０％エタノールで固定し、クリスタルバイオレッドで染色することによりカウントした。
【００７５】
その結果、空ベクターでトランスフェクションした細胞と比べて、ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ＦＬＡＧ−ＭＴＮＲ１Ａでトランスフェクションした細胞は顕著にコロニー数が減少した（図５ｂ）。この結果から、明らかにＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現を活性化することで、ＯＳＣＣ細胞の増殖を抑制できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】（Ａ）２１種の口腔扁平上皮癌細胞株におけるＭＣＧ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｒｒａｙ−８００により決定したコピー数の増幅と欠失のゲノム全体の頻度を示している（増幅：０以上は緑、欠失：０以下は赤）。クローンは、ＵＣＳＣマッピング位置（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／［ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｍａｙ，２００４］に基づいて１−２２、Ｘ、Ｙ染色体の順番で整列した。アスタリスクは、高レベルの増幅（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＞ −２）、またはホモ欠失（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ＜ −２）の認められた領域を示す。（Ｂ）ＴＯＳＣａ―５２およびＳＡＳ細胞株のアレイＣＧＨ解析（ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００）における代表的な画像を示している。４ｑ３５におけるＴＯＳＣａ−５２細胞におけるＲＰ１１−２１３Ａ１９の顕著な欠失、ＳＡＳ細胞におけるＲＰ１１−１７８Ｃ１２の顕著な欠失が、赤のシグナル（赤矢印）で示されている。（Ｃ）ＴＯＳＣａ−２４、３６，５２，５５およびＳＡＳ細胞株での４ｑ３５染色体のホモ欠失領域をカバーするマップ。アレイにスポットしたＢＡＣは水平線で示す（赤線はＬｏｇ２比が−２より小さいホモ欠失領域のＢＡＣを示している）。５つの細胞株のホモ欠失関連領域の詳細なマッピングはＳＴＳマーカー（１，  ＳＨＧＣ−８０５０；  ２，  ＲＨ４８６８８；  ３，  ＳＨＧＣ−１５６０１８；  ４，  ＲＨ４５８２６；  ５，  ＳＧＧＣ−１４０６５９；  ６，  ＧＤＢ：３１５９１７；  ７，  ＳＨＧＣ−５０７２３；  ８，  ＳＨＧＣ−１４０３７６；  ９，  ＷＩ−３１６０）を用いたゲノミックＰＣＲにより作成した。ホモ欠失領域および残存領域は赤の●および赤の○で示した。一つ以上の細胞株が欠失している３つの独立領域（領域Ａ−Ｃ）は５つの細胞株で検出された。ＳＴＳマーカーにより決定された、５つの細胞株の約１Ｍｂのホモ欠失領域は水平の塗りつぶし赤矢印により示されている。この領域周辺の遺伝子が矢印（ホモ欠失  ７遺伝子：赤矢印、残存  １遺伝子：黒矢印）で示されている（向きは転写方向を示す）。
【図２】（Ａ）３９の口腔扁平上皮癌の細胞株の４ｑ３５のホモ欠失領域周辺に存在する遺伝子のゲノミックＰＣＲ解析を示す。ＴＲＬ３，ＴＲＬ３，  ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ，  ＣＹＰ４Ｖ２，  ＫＬＫＢ１，  Ｆ１１，  ＭＴＮＲ１Ａ，  ａｎｄ  ＦＡＴのホモ欠失は、２あるいは３の扁平上皮癌細胞株から検出された。ＲＴ−７は正常口腔上皮細胞からの不死化細胞株であり、ＬＣＬはリンパ芽球細胞株である。（Ｂ）扁平上皮癌細胞株、ＲＴ７細胞株、および正常口腔粘膜のプライマリー細胞のＴＲＬ３遺伝子，  ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子，  ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子，  ＫＬＫＢ１遺伝子，  Ｆ１１遺伝子，  ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子，  ＦＡＴ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡ発現解析を示す。特筆すべきは、ＲＴ７、正常口腔粘膜のプライマリー細胞ではＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現しているのに対し、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のホモ欠失が無い３７の細胞株のうち３３個がこの遺伝子の発現量の低下を示していることである。（Ｃ）発現していなかった細胞の脱メチル化処理により、ＭＴＮＲ１Ａ発現が回復していることを示している。脱メチル化試薬５‐ａｚａ‐ｄＣｙｄを１μＭ、５μＭで５日間、およびあるいはまたは、脱アセチル化阻害剤ＴＳＡを１００ｎｇ／ｍｌで１２時間処理をおこなった。ＧＡＰＤＨは内部コントロールとして用いられている。
【図３】（Ａ）ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のＣｐＧアイランドを黒矢印で、エクソン１を四角囲みで示し、さらにバイサルフェートシーケンシングの結果を示している。ＣｐＧサイトは軸上の縦棒で示されている。転写開始位置は＋１と示している。プロモータアッセイを適用した断片は太線で示されている。ＣＯＢＲＡおよびバイサルフェートシーケンシングを適用した領域は薄腺の横棒で示されている。ＣＯＢＲＡにおけるＢｓｔＵＩおよびＴａｑＩの制限サイトは破線の下矢印で示されている。ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子が発現している口腔上皮癌細胞株（＋）および発現していない細胞株（−）に対するＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のＣｐＧサイトのバイサルフェートシーケンス法の結果が示されている。ＣｐＧサイトのそれそれの四角は、□は非メチル化、■がメチル化されていることを示している。メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）のＰＣＲプライマーが矢印で示されている。（Ｂ）口腔上皮癌細胞株およびＲＴ７の領域１および３のＢｓｔＵＩおよび領域２のＴａｑＩによる制限処理後のＣＯＢＲＡによるＭＴＮＲ１Ａ遺伝子ＣｐＧアイランドの解析結果を示している。矢印は、メチル化されたＣｐＧ  矢頭は非メチル化ＣｐＧを示している。（Ｃ）ＭＴＮＲ１Ａ  ＣｐＧアイランドのプロモーター活性を示している。ｐＧＬ３の空のベクターと、ＭＴＮＲ１Ａの高度にメチル化された領域の異なる３つの配列（断片１−４塩基長；１１８ｂｐ、１９０ｂｐ、２５７ｂｐ、５６５ｂｐ）を含むベクターをＮＡ細胞、およびＯＭ２細胞に形質導入した。ルシフェラーゼ活性は内部コントロールにより規格化された。
【図４】口腔扁平上皮癌の原発性臨床検体の、ＣｐＧアイランドのメチル化状態と、ＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現レベル。（Ａ）口腔扁平上皮癌原発性検体のＭＴＮＲ１Ａプロモータ領域のＭＳＰ解析の結果を示している。メチル化特異的プライマー（Ｍ）および非メチル化特異的プライマー（Ｕ）を用い、ＭＰＳにより、並行して増幅された。ＮＡおよびＨＳＣ−５細胞株はメチル化、非メチル化のコントロールとして使用されている。（Ｂ）ＭＳＰで解析された口腔扁平上皮癌原発性検体についてのＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のＣｐＧアイランドのバイサルフェートシーケンス法の結果を示している。図−３ａの説明を参照。ＭＳＰで使用したＰＣＲプライマーが矢印で示されている。（Ｃ）ＭＴＮＲ１Ａ蛋白質の免疫染色解析法の結果を示している。がん細胞の１０％以上が染色されている陽性例２例と、１０％未満が染色されている陰性例２例を示している。隣の正常な口腔細胞は陽性を示している。（Ｄ）原発性口腔扁平上皮癌の５０人の患者の全生存率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。腫瘍中のＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現が陰性の患者は、陽性の場合に比べ明らかに悪い予後を示している（Ｐ＝０．０２０８）。
【図５】ＯＳＣＣ細胞の成長に対するＭＴＮＲ１Ａ遺伝子の発現回復の効果。（Ａ）ＭＴＮＲ１Ａベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ＦＬＡＧ−ＭＴＮＲ１Ａ）および空ベクター（ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ４Ａ−ｍｏｃｋ）を形質導入したＨＳＣ−７およびＮＡ細胞ウエスタンブロッティング結果。形質導入２４時間後の細胞から得たタンパク１０μｇを、ウエスタンブロッティング法にて解析し、形質導入によりＭＴＮＲ１Ａタンパク質が発現していることを確認した。（Ｂ）ベクターによる形質導入および薬剤耐性コロニー選別後、２週間の培養結果。ＭＴＮＲ１Ａ導入細胞のコロニーは、空ベクター（ｍｏｃｋ）導入のコロニーより明らかに大きなコロニーの数が少ない（Ｂの左）。２ｍｍ以上の大きさのコロニーの計数結果（Ｂの右）。
【図６】図−６Ａ：ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子およびＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の発現量の減少が見られた細胞株に対し、５−ａｚａ−ｄＣｙｄ  および／またはＴＳＡ  で処理したあとの発現状態を示している。図−６Ｂ：ＣＯＢＲＡ法を用いた、ＤＫＦＺＰ５６４Ｊ遺伝子  および  ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の転写開始領域周辺のＣｐＧアイランドのメチレーション状態を示している。
【図７】図−７ＡおよびＢ：口腔扁平上皮癌の原発性臨床検体のがん部および非がん部のＭＴＮＲ１Ａ遺伝子のメチル化および発現の状態を示している。図−７Ｃ：ＭＴＮＲ１Ａ蛋白質の免疫染色解析法の結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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