(57)【要約】【課題】  ゲノムＤＮＡアレイ実験データのシグナル値からゲノムＤＮＡ断片末端メチル化率をコンピュータソフトウェアにより高精度に算出し、ゲノムワイドにメチル化プロファイリングを行う。【解決手段】  始めに制限酵素認識部位で無条件切断後、制限酵素認識部位にメチル化がある場合のみ増幅、メチル化の有無に関わらず増幅としたゲノムＤＮＡ断片の混合物を作用させた２色法ゲノムＤＮＡアレイ実験データのシグナル値に対し１次元または２次元混合分析による解析を行い、各プローブのシグナル値を元にプローブ単位でのメチル化率を求め、プローブとゲノムＤＮＡ断片とのゲノムＤＮＡ配列の位置関係から対応付けと個数による平均化を行い、ゲノムワイドに高精度なメチル化プロファイリングを行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータを利用して、制限酵素認識部位で無条件切断後、末端がメチル化されているもののみを増幅させ蛍光染色したゲノムＤＮＡ断片と、末端のメチル化を問わずに増幅させ前者と異なる色素で蛍光染色したゲノムＤＮＡ断片との混合物をハイブリダイズさせた２色法ゲノムＤＮＡアレイ実験データのシグナル値から、ゲノムワイドなメチル化プロファイリング結果を出力するためのコンピュータソフトウエアプログラムであって、前記コンピュータに、２色法ゲノムＤＮＡアレイ実験データのシグナル値を読み込み記憶させる第１の指令と、ゲノムＤＮＡアレイ上の各プローブに対する２色シグナル値のスキャッタプロット、シグナル値の比の集合作成他の前処理を行う第２の指令と、１次元混合分布解析または２色のシグナル値を用いた２次元混合分布解析を行う第３の指令と、上記で算出した解析結果を元にゲノムＤＮＡ断片末端メチル化率を求める第４の指令と、上記で求めた結果を元にゲノムワイドなメチル化プロファイリング結果を出力する第３の指令とを有することを特徴とするプログラム。
【請求項２】
請求項１記載のプログラムにおいて、前記第３の指令の解析方法を限定された領域の回帰分析に置き換えたことを特徴とするプログラム。
【請求項３】
制限酵素認識部位で無条件切断後、末端がメチル化されているもののみを増幅させ蛍光染色したゲノムＤＮＡ断片と、末端のメチル化を問わずに増幅させ前者と異なる色素で蛍光染色したゲノムＤＮＡ断片との混合物をハイブリダイズさせた２色法ゲノムＤＮＡアレイ実験データのシグナル値から、ゲノムワイドなメチル化プロファイリング結果を得る方法であって、（ａ）２色法ゲノムＤＮＡアレイ実験データのシグナル値を読み込む工程と、（ｂ）ゲノムＤＮＡアレイ上の各プローブに対する２色シグナル値のスキャッタプロット、シグナル値の比の集合作成他の前処理を行う工程と、（ｃ）１次元混合分布解析または２色のシグナル値を用いた２次元混合分布解析を行う工程と、（ｄ）上記で算出した解析結果を元にゲノムＤＮＡ断片末端メチル化率を求める工程と、（ｅ）上記で求めた結果を元にゲノムワイドなメチル化プロファイリング結果を出力する工程とを、有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、（ｃ）の工程の解析方法を限定された領域の回帰分析に置き換えたことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ゲノムＤＮＡ配列の制限酵素認識部位のメチル化率を定量的に算出する、高精度でゲノムワイドなメチル化プロファイリング手法に関する。
【背景技術】
【０００２】  多細胞生物の細胞の分化、癌化の抑制、促進等には、遺伝子機能の発現に負の影響を与えるゲノムＤＮＡ配列上のシトシン塩基のメチル化が関与していることが生命科学系の論文で報告されている。【０００３】  このゲノムＤＮＡのシトシン塩基のメチル化を検出する方法としては、例えば非特許文献１に示されるｂｉｓｕｌｆｉｔｅ法、ＭＳＰ法、ＣＯＢＲＡ法が良く用いられており、更にゲノムＤＮＡアレイを用いる方法としては、特許文献２、特許文献３に示されるＭＡＤ法が知られている。【０００４】  ところが上記のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ法、ＣＯＢＲＡ法、ＭＳＰ法でゲノムワイドなメチル化プロファイリングを行うためには、制限酵素により切断されたゲノムＤＮＡ断片を個別に増幅後電気泳動パターンを確認するか、個々のＤＮＡ断片に対し蛍光標識したプローブ付与後ＰＣＲ増幅し蛍光強度を測定するかが必要であり、ゲノム上に数十万箇所も存在する制限酵素認識部位のメチル化の判定には時間とコスト面で困難がある。アレイを用いるＭＡＤ法は時間とコスト面での問題は解消されているが、特許文献３に示されているように２つの異なる検体のメチル化部位の違いを検出することを目的としており、単一のサンプル中のメチル化部位の推定によるプロファイリングには対応していない。
【特許文献１】特表２００２−５３５９９８号公報
【特許文献２】特開２００３−３８１８３号公報
【特許文献３】特開２００６−４２６４１号公報
【特許文献４】特願２００８−１１５３５５号
【非特許文献１】波平昌一  他  実験医学２０（７）：１−１９−１０２４，２００２
【非特許文献２】Ｘｉｏｎｇ，Ｚ．ａｎｄ  Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１）：２５３２−２５３４，１９９７
【非特許文献３】Ｈａｔａｄａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４７（８）：４４８−４５１，２００２
【非特許文献４】Ｃｒｉｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＭＣＬＵＳＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３  ｆｏｒ  Ｒ：Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．５０４，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、特許文献４で示されるＭｃＢＴ法などにより得られるようなメチル化の有無に関係する２つのＤＮＡ断片群からそれぞれデータが得られる場合において、それらのデータを元にメチル化サイトを判別する方法を提供することにある。また、本発明を用いることにより、時間とコスト、精度的な問題を大幅に改善しつつ、単一の検体に対し、ゲノムワイドで定量的なメチル化プロファイリングを高精度に行うソフトウェア、手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明では、たとえば、ＭｃＢＴ法などを用いることにより、メチル化の可能性のあるサイト（一般にＣｐＧアイランドと呼ばれているシトシンとグアニンが結合している部位）が末端になるような処理が施され、対象となるゲノムＤＮＡサンプルの各メチル化位置がメチル化されていた場合にのみに特異的な遺伝子増幅処理を行わせることで、それぞれのメチル化サイトが末端に位置して蛍光色素で標識された第一のＤＮＡ断片群が得られる。また、さらに、メチル化を問わず、それぞれのメチル化サイトが末端になるような別の蛍光色素で染色した第２のＤＮＡ断片群をも得る。この２群を用いて得られた蛍光強度データを本発明では用いる。【０００７】  上記で得た二つのＤＮＡ断片群の混合物を、あらかじめ準備したＤＮＡ断片ごとに共通のキャプチャープローブをアレイ化したＤＮＡマイクロアレイ（以下、ゲノムＤＮＡアレイと呼ぶ）を用いて、競合的にハイブリダイゼーション反応を行わせる。このゲノムＤＮＡアレイ実験データの２色シグナル値の比を用いることで１次元混合分布解析または２色のシグナル値を用いた２次元の混合分布解析を行う。この２種類のゲノムＤＮＡ遺伝子増幅断片のアレイ実験データを用いることにより、シグナル値の比の上限、下限を設定し、はずれ値を除去してメチル化の判定を行うことで、信頼性の高いデータを得ることができる。また、混合分布解析を用いることでシグナル値に応じ、ゲノムＤＮＡアレイ上のプローブにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片の末端メチル化率を定量することが可能になる。なお２次元混合分布解析はコンピュータで処理する場合大量のメモリを必要とするため、数万以上のプローブに対してはメモリ不足の発生により解析不能となる場合がある。このような場合には２色のシグナル値の比による１次元混合分布解析を行うことでメモリ不足の発生を防止し、ゲノムワイドに定量的なメチル化プロファイリングを高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】  以下に本発明を実施する場合の一形態を図面を用い、具体的に説明する。本発明では解析対象となるゲノムＤＮＡのサンプルを制限酵素認識部位で無条件に切断後、末端がメチル化されているもののみを遺伝子増幅させ蛍光染色したゲノムＤＮＡ断片（以下、末端メチル化ゲノムＤＮＡ断片と呼ぶ）と、末端のメチル化を問わずに遺伝子増幅させ前者と異なる色素で蛍光染色したゲノムＤＮＡ断片（以下、トータルゲノムＤＮＡ断片と呼ぶ）を用いる。これらのゲノムＤＮＡ断片は特許文献４で示されるＭｃＢＴ法により得られる。【０００９】  図１はゲノムＤＮＡのメチル化プロファイリングを行うシステムのブロック図である。本システムは、ゲノムＤＮＡ断片を作用させたゲノムＤＮＡアレイのシグナルデータの入力、シグナルデータの前処理、前処理済みデータの混合分布解析処理、ゲノムＤＮＡ断片末端メチル化算出処理、メチル化プロファイリング情報の出力を行う中央処理装置１００、中央処理装置１００での処理に必要なプログラムを格納するプログラムメモリ１０１、キャラクタ及びグラフィック画面を表示する表示装置１０２、本システムへの値の入力を行うためのキーボード１０３、マウス１０４、ゲノムＤＮＡアレイシグナルデータ１１０、最終出力となるメチル化プロファイリング情報１１１を備える。【００１０】  プログラムメモリ１０１は、末端メチル化ゲノムＤＮＡ断片とトータルゲノムＤＮＡ断片との混合物をハイブリダイズさせた２色法ゲノムＤＮＡアレイシグナルデータ入力部１０５、１次元混合分布を行うためにゲノムＤＮＡアレイ上の各プローブ単位に２色のシグナルデータの対数変換とスキャッタプロット作成、変換後の比を算出するシグナルデータ前処理部１０６、前処理済みデータを入力とする１次元混合分布解析処理部１０７、１次元混合分布解析結果で得られる分布データ、分布所属確率を基にゲノムＤＮＡアレイ上のプローブ単位のメチル化率を平均化しゲノムＤＮＡ断片の末端メチル化率とするゲノムＤＮＡ断片末端メチル化率算出処理部１０８、検出された全てのゲノムＤＮＡ断片のメチル化率データを整形し他の付加情報とともにデータ出力するメチル化プロファイリング情報出力部１０９とからなる。【００１１】  図２は、本発明の概略フローを示した図である。まず末端メチル化ゲノムＤＮＡ断片とトータルゲノムＤＮＡ断片の混合物をハイブリダイズさせた２色法ゲノムＤＮＡアレイシグナルデータを読み込む（ステップ２００）。【００１２】  次に２色のシグナルデータ（Ｓｍ，Ｓｔ）に対し前処理として、まず対数変換後のデータのスキャッタプロットを作成する。本ステップで得られるスキャッタプロットを図３に示す。図中、横軸Ｃ５３２＿ＯＫ＄Ｓｉｇｎａｌ＿ｌｏｇはｌｏｇ（Ｓｔ）のデータであり、縦軸Ｃ６３５＿ＯＫ＄Ｓｉｇｎａｌ＿ｌｏｇは、ｌｏｇ（Ｓｍ）を表している。図３から読み取れるように、対数変換後のシグナル値（ｌｏｇ（Ｓｍ）、ｌｏｇ（Ｓｔ））が接近した対角線方向に伸びる濃い分布（メチル化された部位を示す）部分と、そこから離れた所に位置するような両者のシグナル値が大きく異なる分布（非メチル化部位のシグナルを示す）とに分かれていることが読み取れる。非メチル化領域のサイト��得るためには、この２群を合理的に分離しなければならない。そのため、ｌｏｇ（Ｓｍ）、ｌｏｇ（Ｓｔ）両者を例えば３．０〜３．１の区部などのように０．１の刻み幅で、データを取得し、それらの区分でのｌｏｇ（Ｓｍ）、ｌｏｇ（Ｓｔ）の分布を対象にｔ検定を行う。帰無仮説「２群のデータの分布には差がない」として、ｔ検定を行うことで、ｐ値が得られる。得られたｐ値が例えば０．０５以下であれば、仮説が棄却され、両者が同じ分布から得られたものではないことになる。もしある区分での分布が、同一の正規分布からのデータではないと判定された場合、その区分の開始点（本図では３．５）から上の領域は比較的明確に２群を分けることが可能である。図３では、３．５以上の領域では２群に分けられると判断され、実施した図である。なお、分布の相違を判定するしきい値ｐ値は、２群をどの程度に明確に分けるかにより、ユーザの好みで任意に与えられるものである。【００１３】  次に、個々のプローブの対数変換後のシグナル値の比（ｌｏｇ（Ｓｍ）／ｌｏｇ（Ｓｔ））による１次元化データを作成する。（ステップ２０１）。この処理を行うことにより、データは非常にシンプルになり、後の解析が高速で容易に扱える。【００１４】  次に１次元化データに対し、詳細を非特許文献４に示す１次元混合分布解析処理を行う。１次元混合分布解析は、複数の正規分布を持つ集団が混合されていることを前提に、それらを分離するための手法である。この処理では、図４に示すようなデータ分布プロット（確率密度関数）および図５に示すような分布不確定率プロットを用い、メチル化されている部位の集団とそうでない非メチル化サイトに分ける処理を行う。まず、およそ１．０にピークがあり、メチル化されているサイトはこの周辺に集まっていることが読み取れる。ここから大幅にずれているものが非メチル化サイトである。ステップ２０２では、メチル化されていることを示す部分を決定する。この方法は図５に示すようにまず不確定率のグラフを求める。すると同図に示すように１．０を含む不確定さの小さい領域を見つけることができる。これがメチル化されているサイトのデータである。この領域を決めるため、１．０を挟む谷が決定できるように所望のしきい値を決定する。本実施例では、両側の不確定率のピークや隣の谷の大きさなどを参考にそれらの約半分である０．２とした。この不確定率０．２に水平線５０１を引き、不確定率の曲線と交わるところから垂線を下ろしたのが垂線５０２と５０３である。それぞれ本実施例では、０．９５、１．０２である。この区間のデータはメチル化されているサイトとみなすことができる。【００１５】  次にシグナルスレッショルド値を超えるシグナルをもつゲノムＤＮＡアレイのプローブを抽出し、１次元化データとメチル化不確定率の対応表よりプローブ単位のメチル化率を求め、プローブとのハイブリダイズ関係に応じその平均値をゲノムＤＮＡ断片末端メチル化率とする（ステップ２０３）。なおゲノムＤＮＡアレイのプローブとゲノムＤＮＡ断片との関係は染色体塩基座標軸を介し、図６に示す関係があるため、両者の対応関係を一意に決定できる。【００１６】  最終的に各ゲノムＤＮＡ断片に対し名称を付与し、断片長、所属染色体名、染色体上の位置、ハイブリダイズするプローブ数を含むメチル化プロファイリングデータを出力する。例えば、図６で左側からゲノムＤＮＡ断片名称をＧＤ１，ＧＤ２、ゲノムＤＮＡ断片長をＧＤＬ１，ＧＤＬ２、染色体名をＳＮ、ゲノムＤＮＡ断片位置をＧＤＰ１，ＧＤＰ２、プローブ名をＰ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ５とし、プローブ単位メチル化率をＰＭ１，ＰＭ２，ＰＭ３，ＰＭ４，ＰＭ５とすると、図７に示すようなプロファイリングデータを得ることができる（ステップ２０４）【００１７】  なお精度的にやや劣ると予想されるが、混合分布解析の代わりに、前述のｔ検定を用いる方法で図３よりメチル化または非メチル化を明確に示す領域を選択し、その領域に属するプローブのシグナルデータのみを抽出、回帰分析を行うことでも、対応するゲノムＤＮＡ断片末端のメチル化率を推定することが可能である。
【発明の効果】
【００１８】  本発明により、ゲノムワイドなメチル化プロファイリングを精度良く定量的に行うことが可能となる。このことはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、幹細胞、通常細胞間でのエピジェネティックな相違を精度良く分析できることを意味し、分化・発生のメカニズムの解明に大きく役立つ。また抗がん剤の癌細胞に対する効果や育毛剤の毛根細胞に対する効果をエピジェネティックに評価することも可能になり、創薬研究の発展にも大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】  本発明実施時のブロック図
【図２】  本発明実施時の概略処理フロー
【図３】  ２色法ゲノムＤＮＡアレイシグナルデータのスキャッタプロット
【図４】  １次元化データの分布プロット
【図５】  １次元化データの分布不確定率プロット
【図６】  ゲノムＤＮＡ断片とゲノムＤＮＡアレイのプローブとの関係図
【図７】  メチル化プロファイリングデータ例
【符号の説明】
【００２０】１００  中央処理装置
１０１  プログラムメモリ
１０２  表示装置
１０３  キーボード
１０４  マウス
１０５  ２色法ゲノムＤＮＡアレイシグナルデータ入力部
１０６  シグナルデータ前処理部
１０７  １次元混合分布解析処理部
１０８  ゲノムＤＮＡ断片末端メチル化率算出処理部
１０９  メチル化プロファイリングデータ出力部
１１０  ２色法ゲノムＤＮＡアレイシグナルデータ
１１１  メチル化プロファイリングデータ
２００〜２０４  本発明の概略処理フロー
【図１】
2010133912.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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