(57)【要約】【課題】エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの生物由来の生理活性物質とＬＡＬとの反応を利用して前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定する際に、より高い測定精度を得ることが可能な測定方法及び、それを用いた測定装置を提供する。【解決手段】生物由来の生理活性物質とＬＡＬとのリムルス反応の開始時刻を判定して、この反応開始時刻から前記生物由来の生理活性物質の濃度を求める場合に、リムルス反応の状態と関係なく発生する漸次減少／上昇の影響を除外するために、測定試料とＬＡＬとの混和液からの透過光あるいは散乱光の強度を検出し、透過率あるいはゲル粒子数についての一定時間あたりの変化量（差分）を取得し、この変化量（差分）が閾値を超える時刻をもって反応開始時刻とする。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬとを反応させることで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記試料とＬＡＬとの混和後において、前記試料とＬＡＬとの混和液中に光を入射するとともに該入射した光のうちの前記混和液を透過した光または前記混和液により散乱した光の強度を取得し、
前記取得された光の強度より得られた、所定の時間間隔で設定された取得時刻における所定の物理量を検出値とし、
一の取得時刻における検出値と、より前の取得時刻における検出値との差または差の絶対値が閾値を超えた時刻をもって反応開始時刻とし、
前記反応開始時刻に基づいて前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記取得された光の強度は、前記混和液を透過した光の強度であり、
前記検出値は百分率で表した前記混和液の透過率であり、
前記所定の時間間隔を約２分とし、
前記一の取得時刻における前記透過率と、前回の取得時刻における前記透過率との差の絶対値が１を超えた時刻をもって反応開始時刻とすることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記取得された光の強度は、前記混和液により散乱した光の強度であり、
前記検出値は前記散乱した光の強度における所定のピーク数に基づいて導出された前記混和液に入射した光を散乱させる粒子数であり、
前記所定の時間間隔を約１００秒とし、
前記一の取得時刻における前記粒子数と、前回の取得時刻における前記粒子数との差が２００を超えた時刻をもって反応開始時刻とすることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項５】
所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬとの混和液を光の入射可能に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＬＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備え、
前記判定手段は、所定の時間間隔で設定された取得時刻における、前記電気信号に所定の演算を加えた信号または前記電気信号を検出信号値とし、一の取得時刻における検出信号値と、より前の取得時刻における検出信号値との差または差の絶対値が閾値を超えた時刻をもって反応開始時刻を判定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項６】
前記検出信号値は百分率で表した前記混和液の透過率であり、
前記所定の時間間隔は約２分であり、
前記閾値は１であることを特徴とする請求項５に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項７】
前記検出信号値は前記混和液に入射した光を散乱させる粒子数であり、
前記所定の時間間隔は約１００秒であり、
前記閾値は２００であることを特徴とする請求項５に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項８】
前記所定の時間間隔および／または前記閾値を可変としたことを特徴とする請求項５に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【請求項９】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項５から８のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、ＬＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。
【０００３】
ところで、カブトガニの血球抽出物(以下、「ＬＡＬ : Limulus amoebocyte lysate」ともいう。)の中には、エンドトキシンによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＬＡＬとエンドトキシンとが反応する際には、エンドトキシンの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＬＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと水解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＬＡＬの特性を用いて、エンドトキシンを高感度に検出することが可能である。
【０００４】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
【０００５】
β−Ｄ−グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ−Ｄ−グルカンによって凝固（ゲル凝固）する特性を利用して、β−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。
【０００６】
このエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、カブトガニの血球抽出成分によって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う方法としては、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＬＡＬとを混和した混和液を静置し、ＬＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法がある。
【０００７】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セルに測定試料とＬＡＬとの混和液を生成させる。そして、混和液のゲル化を外部から光学的に測定する。しかしながら、比濁法においては特に所定生理活性物質の濃度が低い試料においてＬＡＬがゲル化するまでに非常に多くの時間を要する場合があるので、所定生理活性物質の短時間での測定が可能な方法が求められている。
【０００８】
これに対し、測定試料とＬＡＬとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル微粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光の強度、あるいは、混和液を透過する光の強度から、試料中の所定生理活性物質の存在を短時間で測定できるレーザー光散乱粒子計測法（以下、単に光散乱法ともいう。）、あるいは、比濁法の一形態ではあるものの測定試料を攪拌して混和液におけるゲル化の状態を均一化し反応を促進する攪拌比濁法が提案されている。比濁法及び攪拌比濁法では光透過率を検出しており
、光散乱法では生成された粒子を検出している点が異なるが、いずれも混和液からの透過光の強度あるいは、散乱光における強度またはピーク数から求められる粒子数が閾値を超えるまでの時間を計測する閾値法を判定の基礎にしている。
【０００９】
ここで、上記の測定法において、比濁法及び攪拌比濁法では測定開始直後から、所定生理活性物質とＬＡＬとの反応（以下、リムルス反応ともいう）の状態とは関係なく透過光強度が減少し、光散乱法では散乱光強度またはピーク数が上昇する現象が観察されている（以下、この現象を漸次減少／上昇ともいう。）。この漸次減少／上昇は、上記の測定法において透過光の強度あるいは、散乱光の強度やピーク数から求められる粒子数が閾値を超えるまでの時間に影響を及ぼすので、上記の測定法の測定精度を低下させるおそれがある。上記の測定法においては所定生理活性物質の濃度が低くなるほど透過光の強度あるいは、散乱光の強度やピーク数から求められる粒子数が閾値を超えるまでの測定時間は長くなるため、所定生理活性物質の濃度が低いほど漸次減少／上昇の影響を受けやすく、ゲル化あるいは凝集が始まったとされる反応開始時刻が正しく評価できない場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献２】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、生物由来の生理活性物質の検出または濃度測定において、より測定精度を向上させることが可能な測定方法及び、それを用いた測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明においては、上述の所定生理活性物質の測定における漸次減少／上昇の影響を除外するために、測定試料とＬＡＬとの混和液からの透過光あるいは散乱光の強度やピーク数より、透過率あるいはゲル粒子数についての一定時間あたりの変化量（差分）を取得し、この変化量（差分）が閾値を超える時刻をもって反応開始時刻とすることを最大の特徴とする。
【００１３】
より詳しくは、試料中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬとを反応させることで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記試料とＬＡＬとの混和後において、前記試料とＬＡＬとの混和液中に光を入射するとともに該入射した光のうちの前記混和液を透過した光または前記混和液により散乱した光の強度を取得し、
前記取得された光の強度より得られた、所定の時間間隔で設定された取得時刻における所定の物理量を検出値とし、
一の取得時刻における検出値と、より前の取得時刻における検出値との差または差の絶対値が閾値を超えた時刻をもって反応開始時刻とし、
前記反応開始時刻に基づいて前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定することを特徴とする。
【００１４】
ここで、上述の漸次減少／上昇が生じた場合には、透過光の強度あるいは、散乱光の強度やピーク数は、所定生理活性物質の濃度と関係なく、時間とともに概略直線状に変化することが分かってきた。これに対し本発明では、前記混和液からの透過光または散乱光の
強度を取得する。そして、所定の時間間隔で設定された取得時刻において取得された光の強度または、取得された光の強度を目的に応じて前記取得時刻において加工した値を検出値とし、一の取得時刻における検出値と、より前の取得時刻における検出値との差分（すなわち、検出値の一定時間における変化量）または差分の絶対値が閾値を超えた時刻をもって反応開始時刻とする。これにより、所定生理活性物質の測定に対する漸次減少／上昇の影響をキャンセルすることが可能となる。
【００１５】
従って本発明によれば、より精度よく、試料中の所定生理活性物質とＬＡＬとの反応開始時刻を判定できる。その結果、より精度よく、所定生理活性物質の検出または濃度の測定を行うことができる。
【００１６】
また、本発明においては、前記取得された光の強度は、前記混和液を透過した光の強度であり、
前記検出値は百分率で表した前記混和液の透過率であり、
前記所定の時間間隔を約２分とし、
前記一の取得時刻における前記透過率と、前回の取得時刻における前記透過率との差の絶対値が１を超えた時刻をもって反応開始時刻とするようにしてもよい。
【００１７】
この場合は、所定生理活性物質とＬＡＬとの混和液に入射した光のうち、混和液の透過光を取得して透過率を取得する比濁法に関する。比濁法においては前述のように、所定生理活性物質とＬＡＬとの反応により混和液が濁り、混和液の透過率は時間とともに低下する。ここで、比濁法における透過率の低下曲線の形状は、所定生理活性物質の濃度によって異なる。例えば、所定生理活性物質の濃度が高い場合には透過率は急峻に低下する。一方、所定生理活性物質の濃度が低い場合には透過率は緩やかに低下する。
【００１８】
所定生理活性物質の濃度が高く透過率が急峻に低下する場合に、検出値の取得間隔を長く設定してしまうと、各検出値の１回の低下幅が大き過ぎて充分なデータ数も確保できないため、高精度の測定が困難になる。一方、所定生理活性物質の濃度が低く透過率が緩やかに低下する場合に、検出値の取得間隔を短く設定し過ぎると各検出値の１回の低下幅が小さ過ぎ、差分を充分な精度をもって検出できない。このように、本発明においては、測定対象となる試料における所定生理活性物質の濃度に応じて、検出値取得の時間間隔を調整することが望ましい。
【００１９】
これに対し、発明者らの鋭意研究により、透過率を百分率で表した場合には、検出値（透過率）の取得間隔を２分程度とした場合に、本発明においてより広い所定生理活性物質の濃度範囲で高精度に透過率の低下曲線を得ることが可能であることが分かってきた。そして、その場合、２分間における透過率の減少量が１％を超えた時刻をもって反応開始時刻とすることで、所定生理活性物質の濃度を高精度に測定可能であることが分かってきた。
【００２０】
従って本発明においては、所定生理活性物質とＬＡＬとの混和液からの透過光を取得して透過率を演算し、所定の時間間隔における透過率の差（変化量）を取得する場合に、所定の時間間隔は２分程度とし、２分間における透過率の減少量が１％を超えた時刻をもって反応開始時刻とすることとした。これにより、より広範な試料に対してより精度よく所定生理活性物質の検出または濃度の測定を行うことができる。
【００２１】
また、本発明においては、前記取得された光の強度は、前記混和液により散乱した光の強度であり、
前記検出値は前記散乱した光の強度における所定のピーク数に基づいて導出された前記混和液に入射した光を散乱させる粒子数であり、
前記所定の時間間隔を約１００秒とし、
前記一の取得時刻における前記粒子数と、前回の取得時刻における前記粒子数との差が２００を超えた時刻をもって反応開始時刻とするようにしてもよい。
【００２２】
この場合は、所定生理活性物質とＬＡＬとの混和液に入射した光のうち、混和液からの散乱光を取得して散乱光における（測定精度向上のための所定条件を満たす）ピーク数から混和液中の（ゲル）粒子数を取得する光散乱法に関する。前述のように光散乱法においては、所定生理活性物質とＬＡＬとの反応時に混和液を攪拌することで混和液中にゲル粒子が発生し、反応の進行とともにゲル粒子の大きさ及び数が増加していく。従って、反応の進行とともに混和液からの散乱光において観察されるピーク数は増加する。
【００２３】
また、光散乱法における散乱光のピーク数の増加曲線の形状は、所定生理活性物質の濃度によって異なる。例えば、所定生理活性物質の濃度が高い場合にはピーク数は急峻に増加するのに対し、所定生理活性物質の濃度が低い場合には、ピーク数は緩やかに増加する。従って、比濁法の場合と同様、光散乱法に関しても、測定対象となる試料における所定生理活性物質の濃度に応じて、検出値取得の時間間隔を調整することが望ましい。
【００２４】
これに対し、発明者らの鋭意研究により、光散乱法においては、検出値（散乱粒子数）の取得間隔を約１００秒程度とした場合に、より広い所定生理活性物質の濃度範囲においてより高精度にピーク数の増加曲線を得ることが可能であることが分かってきた。そして、その場合、１００秒間における散乱粒子数の増加量が２００を超えた時刻をもって反応開始時刻とすることで、所定生理活性物質の濃度を高精度に測定可能であることが分かってきた。
【００２５】
従って本発明においては、所定生理活性物質とＬＡＬとの混和液からの散乱光を取得して散乱粒子数を検出し、所定の時間間隔における散乱粒子数の差（変化量）を取得する場合に、所定の時間間隔は１００秒程度とし、１００秒間における散乱粒子数の増加量が２００を超えた時刻をもって反応開始時刻とすることとした。これにより、より広範な試料に対してより精度よく所定生理活性物質の検出または濃度の測定を行うことができる。
【００２６】
また、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。
【００２７】
そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、β−Ｄ−グルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。
【００２８】
また、本発明は、所定の生物由来の生理活性物質を含む試料とカブトガニの血球抽出物であるＬＡＬとの混和液を光の入射可能に保持するとともに該混和液における反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の前記混和液を攪拌する攪拌手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における透過光または散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から前記試料中における前記生理活性物質とＬＡＬとの反応開始時刻を判定する判定手段と、
予め定められた、前記反応開始時刻と前記生理活性物質の濃度との関係より、前記試料
中の前記生理活性物質の存在または濃度を導出する導出手段と、を備え、
前記判定手段は、所定の時間間隔で設定された取得時刻における、前記電気信号に所定の演算を加えた信号または前記電気信号を検出信号値とし、一の取得時刻における検出信号値と、より前の取得時刻における検出信号値との差または差の絶対値が閾値を超えた時刻をもって反応開始時刻を判定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
【００２９】
本発明における所定生理活性物質の測定装置によれば、所定生理活性物質とＬＡＬとの混和液からの透過光または散乱光を受光手段で受光し電気信号に変換する。そして、変換された電気信号から混和液における反応開始時刻を判定手段において判定する。判定手段は、得られた電気信号に基づいて所定の時間間隔で検出信号値を取得し、所定の時間間隔における検出信号値の変化量が閾値を超えた時刻をもって反応開始時刻を判定する。
【００３０】
本発明の測定装置によれば、所定生理活性物質の測定に対する漸次減少／上昇の影響を自動的にキャンセルすることができる。従って、所定生理活性物質の検出または濃度測定をより高精度に行うことが可能となる。
【００３１】
また、その際、検出信号値を百分率で表した混和液の透過率とした場合には、所定の時間間隔は約２分とし、閾値を１とするとよい。また、検出信号値を混和液に入射した光を散乱させる粒子数とした場合には、所定の時間間隔は約１００秒とし、閾値を２００とするとよい。そうすることにより、より広範な所定生理活性物質の濃度を対象としてより高い測定精度を得ることが可能となる。
【００３２】
また、本発明に係る所定生理活性物質の測定装置においては、所定の時間間隔および／または閾値を可変としてもよい。そうすれば、予想される所定生理活性物質の濃度に応じて検出信号値の取得時間間隔や、反応開始時刻の判定のための閾値を最適化することができ、予想される濃度に対してより高い測定精度を得ることが可能となる。さらに、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。
【００３３】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明にあっては、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの生物由来の生理活性物質とＬＡＬとの反応を利用して、前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定する際に、より高い測定精度を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の実施例１における比濁計測装置の概略構成を示す図である。
【図２】本発明の実施例１における漸次減少について説明するための、光透過率の時間的変化を示すグラフである。
【図３】従来の閾値法により得られたエンドトキシン濃度とエンドトキシン検出時間との関係を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１における、差分法により得られたエンドトキシン濃度とエンドトキシン検出時間との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２における、光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図６】本発明の実施例２における漸次上昇について説明するための、検出粒子数の時間的変化を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例２における、閾値法及び差分法により得られたエンドトキシン濃度とエンドトキシン検出時間との関係を示すグラフである。
【図８】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＬＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ＬＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。すなわち、図８に示すように、エンドトキシンがＬＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となる、活性型Ｃ因子はＬＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を水解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を水解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＬＡＬ中のコアギュロゲンを水解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＬＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００３７】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＬＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を水解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＬＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００３８】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＬＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００３９】
エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの所定生理活性物質を定量することが可能な測定法としては前述のように比濁法、攪拌比濁法ならびに、光散乱法が挙げられる。図８に示すように、これらの測定法はこのＬＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００４０】
比濁法は、特別な試薬が不要である点と、測定可能な所定生理活性物質の濃度範囲が広い点などにおいて、現場での使い勝手のよさがあるという評価がある。しかしながら一方で、比濁法は、低濃度の所定生理活性物質を測定する場合には非常に長い時間を要する問題があった。これは、比濁法がプロテアーゼカスケードの最終産物であるコアギュリンそのものの生成量を見ているのではなく、それがさらに会合して形成されたゲルによって光の透過率が減少していく過程を見ているためである。
【００４１】
すなわち、コアギュリンの濃度がある程度以上の濃度に達しないとゲル化は生じないため、比濁法において所定生理活性物質が検出されるにはゲルが生じるまで待つ必要がある。そのため、所定生理活性物質濃度が高い場合には速やかに必要充分濃度のコアギュリンが生成してゲル化が始まるため測定時間は短くなるが、所定生理活性物質濃度が低いとゲル化に必要なコアギュリン濃度に達するのに時間がかかり測定時間が長くなってしまう。その点、攪拌比濁法においては所定生理活性物質とＬＡＬとの混和液を攪拌することで両者の反応を促進し測定時間の短縮が図られている。
【００４２】
また、光散乱法は試料を攪拌する点とレーザーによりゲル化ではなく粒子を検出する点が比濁法からの改良点であり、比濁法に比べると測定時間を大幅に短縮することができる
。比濁法及び攪拌比濁法と、光散乱法とでは、見ている物理量は異なるものの、ある一定の閾値を越えた時点を反応の開始点として捉えるという点では共通である（以下、この方法を便宜的に閾値法と呼ぶ）。
【００４３】
ここで、上記のいずれの測定法においても、測定開始直後からリムルス反応の状態とは関係なく、比濁法と攪拌比濁法では混和液の光透過率が減少し、光散乱法では混和液におけるゲル粒子数が増加する漸次減少／上昇の現象が観察された。この原因については明確にはなっていないが、例えば、混和液に炭酸ガスなどが溶け込み、混和液のｐＨが変化することにより蛋白質が変性することなどが原因の一つとして考えられる。
【００４４】
また、攪拌比濁法及び光散乱法では、混和液は測定容器中に内蔵している攪拌子によって攪拌されており、この攪拌によってリムルス反応の状態を均一にしたり、反応を促進したりしている。この攪拌の際に、攪拌の回転軸が不適切であったり測定容器の底面形状が不適切である場合に、漸次減少／上昇が発生し易くなる傾向も認められており、原因については鋭意究明中である。
【００４５】
測定試料中の所定生理活性物質の濃度が高い場合には、漸次減少／上昇の影響を受ける前に混和液のゲル化が進み、凝集判定が完了するため、漸次減少／上昇の影響で測定精度が低下する危険性は比較的少ない。しかしながら、測定試料中の所定生理活性物質の濃度が低い場合には、濃度測定に長時間を要するため、漸次減少／上昇の影響で光透過率やゲル粒子数の変化曲線が閾値を実際より早期に超えてしまい、反応開始時刻の判定の精度が低下するおそれがある。
【００４６】
本実施の形態においては、所定生理活性物質の検出または濃度測定において、漸次減少／上昇の現象が発生することに備え、試料とＬＡＬとの混和液における光透過率やゲル粒子数そのものが閾値を超えることに基づいて反応開始時刻を判定する手法は採用しないこととした。新たに、一定の時間間隔で光透過率やゲル粒子数を取得し、その時間間隔における光透過率やゲル粒子数の変化量が閾値を超えた時刻を反応開始時刻と判定する手法を採用した。この閾値は当然、濁りやゲル粒子数そのものを閾値と比較する場合のものとは異なる。このことにより、漸次減少／上昇が発生しても、その影響を除去することができ、所定生理活性物質とＬＡＬとの反応開始時刻の判定をより高精度に行うことができる。（以下、この方法を便宜的に差分法と呼ぶ）
【００４７】
また、これにより、混和液の濁りやゲル粒子数の変化量が急激に変化した時刻を見極めることができる。従って、高濃度の試料はもちろん、低濃度の試料に対する測定精度を向上させることが可能である。また、これによれば、所定生理活性物質の測定時に得られたデータの解析過程のみを変更することで、漸次減少／上昇の影響を除去することができる。
【００４８】
以下に本発明の実施形態の詳細を示す。しかしながら本発明は以下に示す形態に限定されるものではない。なお、以下の実施形態においては所定生理活性物質がエンドトキシンである場合について説明するが、所定生理活性物質がβ−Ｄ−グルカンである場合についても同様の形態を考えることができる。
【００４９】
ここで、上述した各測定法によってエンドトキシンの測定を行う場合の検出対象は各々異なっている。比濁法及び攪拌比濁法においてはＬＡＬ試薬にエンドトキシンが作用して、混和液がゲル化あるいは凝集する際の混和液の濁りを検出する。従って、混和液の透過光を取得し、混和液における光透過率が予め設定された閾値を下回った時刻をもってエンドトキシンとＬＡＬとの反応開始時刻と判定している。
【００５０】
比濁法及び攪拌比濁法において、リムルス反応の状態と関係なく混和液の光透過率が減少する傾向が認められた場合は、まず検出値のノイズを除去するため２分間の移動平均をとる。次に、測定開始直後はデータが不安定であるため、測定開始２分後における光透過率を１００％とする。そして、もともと１０秒毎に取得された光透過率（％）の予め定められた時間間隔ΔＴにおける差分をとり、その二乗値が３回連続１を超えたときの最初の時刻を反応開始時刻として採用する。差分の時間間隔ΔＴは１分〜５分が好ましく、特に約２分が好ましい。低濃度の試料の場合は光透過率の変化量が小さいため、時間間隔ΔＴを５分とすることが好ましい。ここで、光透過率（％）の時間間隔ΔＴにおける差分を二乗するのは、差分の値が１前後となる場合における変化を増大させ分解能を向上させるためである。よって、必ずしも差分を二乗する必要はない。
【００５１】
一方、光散乱法では比濁法及び攪拌比濁法と同様に混和液がゲル化あるいは凝集する過程を観察するが、混和液における凝集塊(ゲル粒子)によって散乱された光を取得する点が異なる。すなわち、当初透明でゲル粒子を含んでいない試料中にリムルス試薬を混和することで凝集が発生してゲル粒子の数が増加する。このゲル粒子の数が増加すると散乱光におけるピークの発生頻度が高まるので、この散乱光のピーク数をゲル粒子数として取得する。そして、一定時間に検出されたゲル粒子数の積算値に閾値を設け、検出粒子数がその閾値を超えた時刻をもって反応開始時間としている。
【００５２】
光散乱法において検出されるゲル粒子数がリムルス反応の状態と関係なく増加する傾向が認められた場合、ある時間間隔ΔＴの検出値（ゲル粒子数）の差分、すなわち粒子増加数を取得する。リムルス反応の反応開始時刻の判定については、ノイズの影響を考慮してゲル粒子数の差分が１０回連続閾値２００を超えた最初の時刻を反応開始時刻として採用する。差分の時間間隔ΔＴはエンドトキシン濃度の高い試料にも対応できるように、３０秒〜２００秒が好ましく、特に約１００秒とすることが好ましい。
【００５３】
上記の測定において、検出値の取得に対する時間間隔ΔＴの値はエンドトキシン濃度が低い場合には比較的大きく、エンドトキシン濃度が高い場合には比較的小さく設定する必要がある。なぜなら、エンドトキシン濃度が低濃度であるほど、試料とＬＡＬ試薬とを混和させた後の濁りやゲル粒子数の変化量が少ないため、時間間隔ΔＴ前後の検出値において充分大きな差分を確保するのに充分な時間間隔が必要となるからである。
【００５４】
一方、エンドトキシン濃度が高い場合には、エンドトキシンとＬＡＬとのリムルス反応が比較的迅速に進行するため、設定した時間間隔ΔＴの間に凝集が開始してしまっていることが考えられるからである。よって、混和液の濁りあるいはゲル粒子数の検出値の変化を逐次検出し、エンドトキシン濃度が低濃度か高濃度かを早期に概算して、その概算値を元に場合分けをして時間間隔ΔＴを変更することで、エンドトキシンの濃度をより精度良く測定することが可能である。従って、必要に応じて上記のような概算法を取り入れても良い。
【００５５】
〔製造例１〕
ガラス製の容器（外径φ７ｍｍ、長さ５０ｍｍ。以下、キュベットと略す。）にステンレス製の攪拌子（φ１ｍｍ、長さ５ｍｍ）を入れた。キュベットの開口部にアルミホイルで蓋をし、それを２０本まとめてアルミホイルでさらに覆い、２５０℃の温度で３時間に亘り加熱処理し、キュベットを乾熱処理した。これにより、キュベットに付着したエンドトキシンは熱分解を受け不活性化される。
【００５６】
〔実施例１〕
図１には、本実施例のエンドトキシンの測定装置としての比濁計測装置１の概略構成を示す。本実施例の比濁計測装置１では、攪拌比濁法によってエンドトキシンの測定を行う
。本実施例においては、調製した希釈系列のエンドトキシンを含んだ試料を製造例１で製作した混和液保持手段としてのキュベット２に移注する。キュベット２の周囲を囲うように保温器５が設けられている。この保温器５の内部には図示しない電熱線が備えられており、この電熱線に通電されることにより、キュベット２を約３７℃に保温するようになっている。このキュベット２の中にはステンレス製の攪拌子３が備えられている。この攪拌子３は、キュベット２の下部に設置された攪拌器４の作用によってキュベット２の中で回転する。すなわち、攪拌器４はモータ４ａとモータ４ａの出力軸に設けられた永久磁石４ｂとからなっている。そして、モータ４ａに通電されることで永久磁石４ｂが回転する。この永久磁石４ｂからの磁界が回転するために、ステンレス製の攪拌子３が回転磁界の作用で回転する。この攪拌子３と攪拌器４とは攪拌手段に相当する。本実施例では攪拌子３の回転速度は１０００ｒｐｍとした。
【００５７】
なお、比濁計測装置１には光入射手段としての光源６と受光手段としての受光素子９が設置されている。光源６から出射した光はアパーチャ７を通過した後、保温器５に設けられた入射孔５ａを通過してキュベット２中の試料に入射される。キュベット２中の試料を透過した光は保温器５に設けられた出射孔５ｂから出射され、アパーチャ８を通過して受光素子９に照射される。受光素子９では、受光した光の強度に応じた光電信号を出力する。この光電信号の出力は、判定手段及び導出手段としての演算装置１０入力される。演算装置１０においては、予め格納されたプログラム（アルゴリズム）に従い、反応開始時刻の判定及び、エンドトキシン濃度の導出が行われる。なお、この他に導出されたエンドトキシン濃度を表示する表示装置を含めて比濁計測装置１としてもよい。
【００５８】
図２には、本実施例において観察された漸次減少について示す。この漸次減少は、図に示すＡの部分に顕著に現れる現象である。これは、混和液におけるエンドトキシンとＬＡＬの反応状態と関係なく、測定開始直後から光透過率のベースラインが減少していく現象である。そして、エンドトキシンとＬＡＬとの反応が進行すると、その後変曲点を経てさらに傾きの大きい変化へと続いていく様子が確認された。
【００５９】
従来の攪拌比濁法においては、光透過率が９５％を下回る時刻をもって反応開始時刻としていた。しかしながら、漸次減少が発生した場合にはこのベースラインの低下の影響から、光透過率が閾値９５％を下回る時刻が異常に早くなる場合がある。あるいは、光透過率の減少曲線が変曲点に到達する以前に光透過率の値が閾９５％を下回る場合がある。このように、漸次減少によって、反応開始時刻の判定の精度が低下するおそれがある。
【００６０】
従来の閾値法を用いて、エンドトキシン濃度を横軸に、従来法の閾値９５％を下回った時間を縦軸にとりプロットした結果を図３に示す。このグラフは両対数をとると直線に乗ることは知られている。図３に示す結果における相関係数を見てみると、その絶対値が０．９７５であった。日本薬局法によれば「相関係数の絶対値が０．９８０以上でなければならない」という条件が課されているが、図３に示す結果はこの条件を満たしていない。
【００６１】
図４には、本実施例に係る差分法を用いた場合の結果を示す。この場合の時間間隔ΔＴは２分、反応開始時刻の判定のための閾値は光透過率（％）の変化量の絶対値が１％を超えたときとした。図より分かるように、差分法を適用することにより、エンドトキシン濃度とエンドトキシン検出時間との関係における相関係数の絶対値は０．９８７となった。すなわち、差分法の適用によってより強い相関がある結果が得られ、直線性が向上し、上記の日本薬局法における条件を満足することができた。このように、本実施例においては、比濁計測装置１の演算装置１０におけるプログラム（アルゴリズム）を変更するだけで、漸次減少の影響を除去することができ、比濁計測装置１の測定精度を向上させることができる。
【００６２】
なお、本実施例においては、光透過率の値が検出値及び検出信号値に相当する。また、本実施例に係る比濁計測装置１では、時間間隔ΔＴ及び閾値は装置において調整可能にするとよい。これにより、より容易に、上述した概算法を実行することが可能となる。
【００６３】
〔実施例２〕
次に、実施例２として、光散乱法を用いた測定について説明する。図５には、本実施の形態におけるエンドトキシンの測定装置としての光散乱粒子計測装置１１の概略構成を示す。光散乱粒子計測装置１１に使用される光源１２にはレーザー光源が用いられているが、他に、超高輝度ＬＥＤなどを用いてもよい。光源１２から照射された光は、入射光学系１３で絞られ、試料セル１４に入射する。この試料セル１４にはエンドトキシンの測定をすべき試料とＬＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル１４に入射した光は、混和液中の粒子（コアギュロゲンモノマー、ならびに、コアギュロゲンオリゴマーなどの測定対象）で散乱される。
【００６４】
試料セル１４の、入射光軸の側方には出射光学系１５が配置されている。また、出射光学系１５の光軸の延長上には、試料セル１４内の混和液中の粒子で散乱され出射光学系１５で絞られた散乱光を受光し電気信号に変換する受光素子１６が配置されている。受光素子１６には、受光素子１６で光電変換された電気信号を増幅する増幅回路１７、増幅回路１７によって増幅された電気信号からノイズを除去するためのフィルタ１８、ノイズが除去された後の電気信号のピーク数からゲル粒子数を演算し、さらに反応開始時刻を判定してエンドトキシンの濃度を導出する演算装置１９及び、結果を表示する表示器２０が電気的に接続されている。
【００６５】
また、試料セル１４には、外部から電磁力を及ぼすことで回転し、試料としての混和液を攪拌する攪拌子２１が備えられており、試料セル１４の外部には、攪拌器１２が備えられている。これらにより、攪拌の有無及び攪拌速度の調整が可能となっている。
【００６６】
ここで、試料セル１４は製造例１で製造されたキュベットであり本実施例の混和液保持手段に相当する。光源１２及び入射光学系１３は光入射手段に相当する。攪拌子２１及び攪拌器２２は攪拌手段に相当する。出射光学系１５及び受光素子１６は受光手段に相当する。演算装置１９は判定手段及び導出手段に相当する。
【００６７】
図６には、光散乱法を用いた場合の、検出粒子数の時間的変化の例について示す。この例では、攪拌比濁装置と同様の試料の攪拌状態で、３７℃に保温してエンドトキシンの測定を行った。測定装置としては具体的には興和製ＰＡ−２００を用いた。図６のＢから分かるように、光散乱法においても、検出（ゲル）粒子数がエンドトキシンとＬＡＬとの反応の状態に関係なく増加する現象が確認された。この反応によって、本来検出すべきである「急激な粒子数増加」の前に閾値（検出粒子数２００）を超えてしまい、正確な判定が困難となった。
【００６８】
次に光散乱法に対して差分法を適用した本実施例における測定プロセスについて説明する。演算装置１９においては、まず、ノイズが除去された後の電気信号から１秒毎に１秒間のピークのヒストグラムデータが作成される。そして、このヒストグラムデータより１秒間に検出された総粒子数が算出される。さらに、粒子数のばらつきを平滑化するために、１秒毎に算出される総粒子数を１０秒間移動加算する。移動加算して得られた１０秒間の移動加算値を時間間隔ΔＴ（＝１００秒）だけ前に得られた同値と比較し、その差分（増加量）が１０回（１０秒間）連続して閾値２００を超えた場合の最初のヒストグラムデータ取得時刻をもって反応開始時刻と判定する。
【００６９】
図７には、光散乱法に対して閾値法と差分法を適用し、エンドトキシン濃度を横軸に、
反応開始時刻を縦軸にとりプロットした結果を示す。単純に粒子数を検出対象としたものは相関係数の絶対値が０.９４３と線形性が大きく崩れたのに対し、時間間隔ΔＴを１００秒とし、１００秒間の粒子増加量が閾値２００を超えた場合を反応開始時刻としたものは相関係数の絶対値が０.９９９と強い相関を得た。以上より、１００秒間における粒子増加量を検出対象としたアルゴリズムは、従来の粒子数を検出対象としたものと比較して、より安定したアルゴリズムであると考えられる。このように、本実施例においては、光散乱粒子計測装置１１の演算装置１９におけるプログラム（アルゴリズム）を変更するだけで、漸次上昇の影響を除去することができ、光散乱粒子計測装置１１の測定精度を向上させることができる。
【００７０】
なお、本実施例においては、検出粒子数（ゲル粒子数）の値が検出値及び検出信号値に相当する。また、本実施例に係る光散乱粒子計測装置１１では、時間間隔ΔＴ及び閾値は装置において調整可能にするとよい。これにより、より容易に、上述した概算法を実行することが可能となる。
【００７１】
また、本実施例では上述したように、演算装置１９において、ヒストグラムデータより１秒間に検出された総粒子数が算出され、この総粒子数を１０秒間移動加算し、１０秒間の移動加算値を時間間隔ΔＴだけ前に得られた同値と比較し、その差分（増加量）が１０回（１０秒間）連続して閾値を超えた場合の最初のデータ取得時刻をもって反応開始時刻と判定した。しかしながら、この測定プロセスは一例に過ぎず、ヒストグラムデータの検出時間、移動加算の有無あるいは移動加算時間、反応開始時刻を判定する際の、差分（増加量）が閾値を越える回数などは、本実施例の値に限定されるものではなく、適宜変更が可能である。
【００７２】
〔実施例３〕
従来の比濁法のための装置である、トキシノメーター（和光純薬株式会社）を使ってエンドトキシンの測定を行った。試料の攪拌を行わないトキシノメーター（比濁法）においても、光透過率の時間的変化において原因不明のベースラインの漸次減少が確認された。従って、９５％を超えた時点を反応開始時刻とする閾値法を用いているトキシノメーターも、測定結果は漸次減少の影響を受ける。そこで測定精度を向上させるため、同様に差分法を用いて再解析を行った。その結果、回帰直線の直線性が増し、差分法により検出誤差によるエンドトキシン測定への影響が抑えられ、改善が見られた。
【００７３】
なお、上記の各実施例において差分が閾値を超えるというのは、必ずしも差分が閾値より小さい状態から大きい状態に変化することを意味しない。例えば減少傾向にある差分が閾値より大きい状態から小さい状態に変化することも含んでいることは当然である。
【符号の説明】
【００７４】
１・・・比濁計測装置
２・・・ガラス製容器
３・・・攪拌子
４・・・攪拌器
４ａ・・・モータ
４ｂ・・・磁石
５・・・保温器
５ａ・・・入射孔
５ｂ・・・出射孔
６・・・光源
７・・・アパーチャ
８・・・アパーチャ
９・・・受光素子
１０・・・演算装置
１１・・・測定系
１２・・・光源
１３・・・入射光学系
１４・・・試料セル
１５・・・出射光学系
１６・・・受光素子
１７・・・増幅回路
１８・・・ノイズ除去フィルタ
１９・・・演算装置
２０・・・表示器
２１・・・攪拌子
２２・・・攪拌器
【図１】
2010216878.tif 000003
【図２】
2010216878.tif 000004
【図３】
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【図４】
2010216878.tif 000006
【図５】
2010216878.tif 000007
【図６】
2010216878.tif 000008
【図７】
2010216878.tif 000009
【図８】
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