(57)【要約】【課題】新規な中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中性エンドペプチダーゼは、エンケファリンなどのオピオイドペプチド、サブスタンスＰ、ブラジキニンなどの神経ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドなどの血管作動性ペプチドを分解する酵素として知られている。そのため、中性エンドペプチダーゼの活性を阻害する作用を持った物質は、モルヒネ系物質の代謝物質、すなわち鎮痛剤（非特許文献１参照）として、あるいは降圧剤（非特許文献２参照）として有用であることが報告されている。
このように、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害することで得られる効果は多岐にわたるが、従来知られている中性エンドペプチダーゼ阻害剤は安全性に問題があるものが多く、また、阻害効果が十分とはいえない等の問題点を有していた。そのため、新たな中性エンドペプチダーゼ阻害剤の探索が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Malfroy  B，Swerts  JP，Guyon  A，Roques  BP，Schwartz  JC．（1978）Nature，276，523-526.
【非特許文献２】Kubota  E，Dean  RG，Balding  LC，Burrell  LM．(2002)Essays  Biochem.，38，129-139.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、高い阻害効果を有する新規な中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物が中性エンドペプチダーゼ活性を阻害する作用を有することを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００６】
本発明は、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する中性エンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、阻害活性の高い中性エンドペプチダーゼ阻害剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明について、その好ましい実施態様の基づき詳細に説明する。
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物を有効成分として含有する。
【０００９】
本発明に用いられるヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物としては、ヤマモモ、シロコヤマモモ、ヤチヤナギ、セイヨウヤチヤナギ、ナガバヤマモモなどが挙げられる。なかでも、本発明ではヤマモモ、シロコヤマモモを用いることが好ましい。
ヤマモモは、ヤマモモ科ヤマモモ属に属する植物で、学名はMyrica rubra  Sieb．et  Zucc．である。ヤマモモにはタンニンが豊富に含まれ、止瀉作用や整腸作用があることが知られている。
シロコヤマモモは、ヤマモモ科ヤマモモ属に属する植物で、学名Myrica ceriferaである。シロコヤマモモには、収斂作用、抗菌作用があることが知られている。
ヤチヤナギは、ヤマモモ科ヤマモモ属に属する植物で、学名はMyrica gale  L．var．tomentosaである。
セイヨウヤチヤナギは、ヤマモモ科ヤマモモ属に属する植物で、学名はMyrica gale  L．var．galeである。
ナガバヤマモモは、ヤマモモ科ヤマモモ属に属する植物で、学名はMyrica rubra  var．acuminataである。
ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物が中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有することについては全く知られていなかった。
【００１０】
本発明のヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物を得るためには、上記植物の全ての任意の部分、例えば、全草、葉、樹皮、枝、果実または根などが使用可能である。中でも、ヤマモモについては樹皮を、シロコヤマモモについては根皮を用いるのが好ましい。
本発明において、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物の調製に、上記植物の各部位をそのまま、又は乾燥粉砕して用いることもできるが、その水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもでき、また市販品を利用することもできる。上記植物の部位又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。
また、本発明に用いるヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物は、上述の植物２種以上から得られた混合物であってもよい。
【００１１】
本発明に用いるヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物を得る方法は特に限定されず、適当な溶媒を用いた常法の抽出方法によって調製することができる。
抽出に用いる溶媒としては、通常植物成分の抽出に用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；及びピリジン類等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。本発明において、抽出溶媒としては、水性アルコールが好ましく、９５質量％エタノールを用いることが特に好ましい。
また抽出条件も通常の条件を適用でき、例えば上記植物を３〜１００℃で数時間〜数週間浸漬又は加熱還流するのが好ましく、室温付近の温度で１日〜３週間浸漬するのが特に好ましい。
【００１２】
上記ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物は、そのまま本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の有効成分として使用できるが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により分画して用いることもできる。また、前記抽出物を希釈、濃縮または凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。本発明において、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物とは、前記のような抽出方法で得られた各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末を含むものである。
【００１３】
本発明において、前記ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物はそのまま中性エンドペプチダーゼ阻害剤として用いてもよい。または、必要に応じて上記抽出物に、例えば精製水、アルコール、界面活性剤、油性物質、保湿剤、皮膚老化防止剤、美白剤、高分子化合物、防腐剤、増粘剤、乳化剤、薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜加えて用いてもよい。この場合、中性エンドペプチダーゼ阻害剤中の前記ヤマモモ属に属する植物の抽出物の量は特に制限されないが、前記抽出物が固形分換算で０．００００１〜５０重量％含まれるのが好ましく、０．００１〜１０重量％程度含まれるのが特に好ましい。
【００１４】
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤は効果的に中性エンドペプチダーゼ活性を阻害することができ、その用途としては、抗しわ剤、発毛抑制剤、降圧剤、鎮痛剤等が挙げられる。
本発明の中性エンドペプチダーゼ阻害剤の形態は特に制限されないが、上記用途に応じて皮膚外用剤、経口剤、注射剤等とすることができる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１６】
（製造例１）ヤマモモ抽出液の調製
ヤマモモ樹皮（楊梅皮（広東省）、新和物産製）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間浸漬した。これをろ過し、ヤマモモ抽出液を得た。このヤマモモ抽出液を濃縮したところ、その固形分は６．２０ｇであった。抽出液の固形分濃度は１．５５％であった。調製したヤマモモ抽出液０．１ｍＬに９５％エタノール水溶液０．２４４ｍＬを加え、評価サンプルとした。
【００１７】
（製造例２）シロコヤマモモ抽出液の調製
シロコヤマモモ根（樹皮）（Bayberry  root  bark  powder(Moutain  Rose  Harbs)）４０ｇに９５％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間浸漬した。これをろ過し、シロコヤマモモ抽出液を得た。このシロコヤマモモ抽出液を濃縮したところ、その固形分は７．４８ｇであった。抽出液の固形分濃度は２．３０％であった。調製したシロコヤマモモ抽出液０．１ｍＬに９５％エタノール水溶液０．３６ｍＬを加え、評価サンプルとした。
【００１８】
（実施例）培養ヒト線維芽細胞由来の中性エンドペプチダーゼ活性抑制試験
Cell  System社より市販されている正常ヒト線維芽細胞を用いて、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継体培養し、以下の試験に供した。試験方法は、The  Journal  of  Biological  Chemistry,  266(34),  23041-23047(1991)に記載の方法を参照した。
ラバーポリスマンを用いてシャーレから剥がした細胞を、リン酸緩衝食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集めた後、同生理食塩水で３回洗浄した。得られた細胞を０．１％  Triton  X-100／０．２Ｍ  Tris-HClバッファー（pH8.0）に浮遊させ、超音波粉砕し、これをヒト線維芽細由来酵素液とした。酵素活性測定の基質には、１０ｍＭグルタリル−Ala−Ala−Phe−４−メトキシ−β−ナフチルアミンを用いた。酵素液１００μＬに対し、所定の濃度に希釈した前記植物抽出物（評価サンプル）を２μＬまたは０．６μＬ、基質を２μＬ添加し、３７℃で１時間反応させ、基質を分解した。その後、ホスホラミドン（Phosphoramidone）を最終濃度１μＭとなるように添加して、基質分解反応を停止させた。この酵素分解反応により、ヒト線維芽細由来酵素液に含まれる中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）が基質をＡｌａ−Ｐｈｅ間で切断、分解する。
コントロールとして、上記酵素反応系において、評価サンプル２μＬまたは０．６μＬのかわりに９５％エタノール水溶液を同量加えた以外は上記と同様にした試料を作成した。
さらに、反応系にロイシンアミノペプチダーゼ（Leucine  aminopeptidase）を最終濃度が０．５０ｍＵ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間反応させた。これにより、ＮＥＰ分解産物がロイシンアミノペプチダーゼによってさらに切断、分解され、４−メトキシ−２−ナフチルアミンを生じる。生成した４−メトキシ−２−ナフチルアミン量を、蛍光分光光度計で励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍにて蛍光強度を測定した。
得られた測定値をもとに、以下の式から植物抽出物（評価サンプル）の中性エンドペプチダーゼ活性阻害率を求めた。結果を表１に示す。
中性エンドペプチダーゼ活性阻害率(％)＝100−｛(評価サンプル添加時の4-メトキシ-2-ナフチルアミン量)／(コントロール添加時の4-メトキシ-2-ナフチルアミン量）｝×100
【００１９】
【表１】
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【００２０】
表１から明らかなように、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ属）に属する植物の抽出物が優れた中性エンドペプチダーゼ活性阻害効果を有することが認められた。