(57)【要約】【課題】５’側の伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドおよび３’側の選択マーカーエレメントに隣接した発現可能な核酸を含むポリヌクレオチドおよびベクターを提供すること。【解決手段】このようなポリヌクレオチドおよびベクターは、隣接した発現可能な核酸の高レベルな発現を取得するための手段を提供する。好ましい実施形態は、５’側の伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドおよび３’側の抗生物質耐性遺伝子の組合せを含む。単離されたポリヌクレオチドであって、以下：ａ．伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、ｂ．ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、ｃ．プロモーターに作動可能に連結された選択マーカーを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、選択マーカーエレメントとともに遍在性クロマチン開放エレメント（Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｏｐｅｎｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）を含むポリヌクレオチドに関する。隣接した発現可能な核酸配列に作動可能に連結された場合、エレメントの組合せは、高レベルかつ再現性のあるレベルの遺伝子発現を提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチド配列を含むベクター、このベクターを含む宿主細胞、および、治療においてか、または細胞培養におけるタンパク質発現に関する適用のための、このポリヌクレオチド、ベクターもしくは宿主細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」中に組織化されることを仮定する（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｎ．およびＧｒｏｓｖｅｌｄ  Ｆ．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４，２６０−２６４（１９９４）；Ｈｉｇｇｓ，Ｄ．Ｒ．Ｄｏ  ＬＣＲｓ  ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ？  Ｃｅｌｌ  ９５，２９９−３０２（１９９８））。クロマチンドメインは、凝縮され、「閉ざされた」転写的に静的な状態か、または、脱縮され、「開放された」転写的に能力のある構造のいずれかで存在することと認識される。増大したＤＮａｓｅＩ感受性、ＤＮＡ低メチル化およびヒストン過剰アセチル化によって特徴付けられる開放クロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始に予め不可欠であると考えられる。
【０００３】
クロマチン領域の開放された性質および閉ざされた性質は、無作為に宿主細胞ゲノムに組み込まれる導入遺伝子の挙動に反映される。同一の構築物は、マウスゲノム中の異なる位置で組み込まれた場合、異なるパターンの組織特異的発現および発達段階特異的発現のを与える（Ｐａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．  ＆  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｆ．Ｇｅｎｅｔ．２０，４６５−４９９（１９８６）；Ａｌｌｅｎ，Ｎ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，８５２−８５５（１９８８）；Ｂｏｎｎｅｒｏｔ，Ｃ．，Ｇｒｉｍｂｅｒ，Ｇ．，Ｂｒｉａｎｄ，Ｐ．  ＆  Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３３１−６３３５（１９９０））。
【０００４】
所定のトランスジェニックマウス組織内での変化に富んだ発現パターン（位置効果斑入り様（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）（ＰＥＶ）として知られる）はまた、頻繁に観察される（Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，Ｄ．  ＆  Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７，６１４−６１９（１９９７））。外因性遺伝子が、インビトロでの哺乳動物細胞培養物の染色体中に組み込まれる場合、組込み事象の多くが、導入遺伝子の迅速なサイレンシングを生じ、そして残りの物が、発現レベルに大きな変動を与える（Ｐｉｋａａｒｔ，，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，Ｆ．  ＆  Ｆｅｌｓｅｎｆｉｅｌｄ，Ｇ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，２８５２−２８６２（１９９８）；Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｈａｕｓｅｒ，Ｈ．  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｐ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，３５−４２（１９９９））。これらの位置効果は、潜在的に、基礎研究およびバイオテクノロジー適用の両方にとって非効率な導入遺伝子発現を与える。
【０００５】
遺伝子組織化のクロマチンドメインモデルは、転写的にコンピテントな開放クロマチン構造を確立し、そして維持し得る遺伝的制御エレメントが、ゲノムの活性領域に連結されるべきであることを示唆する。
【０００６】
遺伝子座制御領域（Ｌｏｃｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｉｏｎ）（ＬＣＲ）は、長期のクロマチンリモデリング能力を有する転写調節エレメントのクラスである。ＬＣＲは、ｃｉｓに連結された遺伝子（特に、単一コピー導入遺伝子）に、組込み部位非依存的で導入遺伝子コピー数依存的な、生理学的な発現レベルを与える能力によって、トランスジェニックマウス中で機能的に定義される（Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．  ＆  Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０，３６１−３６５（１９９８）；Ｌｉ，Ｑ．，Ｈａｒｊｕ，Ｓ．  ＆  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：４０３−４０８（１９９９））。決定的に、このような発現は、組織特異的である。ＬＣＲは、ヘテロクロマチンの広がりを妨げ、ＰＥＶを防ぎ（Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，Ｄ．  ＆  Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７，６１４−６１９（１９９７））、そして、このＬＣＲが調節する遺伝子の５’かまたは３’のいずれかに位置し得る、一連のＤＮａｓｅ  Ｉ高感受性（ＨＳ）部位からなる（Ｌｉ，Ｑ．，Ｈａｒｊｕ，Ｓ．  ＆  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：４０３−４０８（１９９９））。
【０００７】
ＬＣＲは、独立した構成要件である必要はないが、２つの別個の構成要件から構成されることが明らかである。１つ目は、「開放クロマチンドメイン（ｏｐｅｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ）」の確立であり、そして２つ目は、発現に依存する導入遺伝子コピー数を供する優性転写活性能である（Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．＆Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０，３６１〜３６５（１９９８））。ＬＣＲがその機能を及ぼす分子機構は、論点を残したままである（Ｈｉｇｇｓ，Ｄ．Ｒ．Ｃｅｌｌ  ９５，２９９〜３０２（１９９８）；Ｂｕｌｇｅｒ，Ｍ．＆  Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｍ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，２４６５〜２４７７（１９９９）；Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９  １５２〜１５７（１９９９）；Ｂｅｎｄｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｕｌｇｅｒ，Ｍ．，Ｃｌｏｓｅ，Ｊ．＆Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５，３８７〜３９３（２０００））。
【０００８】
高レベルの治療タンパク質生成物を生成する培養された哺乳動物細胞株の作製は、主に発達している産業である。クロマチン位置効果は、プロセスを困難で、時間がかかり、そして高価なプロセスにする。このような哺乳動物「細胞工場（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ）」を生成するために最も一般に使用されるアプローチは、薬剤耐性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５，５３７〜５６６（１９９０））とストリンジェントな選択圧維持との組み合わせによって誘導される遺伝子増幅に依存する。適切な組織に由来する細胞を用いて、高度に発現した遺伝子ドメイン由来のＬＣＲを含むベクターを使用することは、一般に手順を単純化し、安定した高レベルの発現を示すクローンの細胞株の大きな割合を与える（Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｍ，Ｇｏｏｄｉｎｇ  Ｃ，Ｈｕｄｓｏｎ  Ｋ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｍ，Ｇｒｏｓｆｅｌｄ  ＦおよびＨｏｌｌｉｓ  Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０，９９７〜１００３（１９９２）；Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｍ，Ｅｇｅｒｔｏｎ  Ｍ，Ｍｉｌｌｅｓｔ  Ａ，Ｅｖａｎｓ  Ｓ，Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ  Ｍ，Ｃｅｒｉｌｏ  Ｇ，ＭｃＰｈｅａｔ  Ｊ，Ｍｏｎｋ  Ａ，Ｊａｃｋ  Ａ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＤおよびＨｏｌｌｉｓ  Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ６，１２４〜１３１（１９９５））。
【０００９】
しかし、いくつかの状況において有用であるにも関わらず、ＬＣＲの組織特異性はまた、多くの適用（例えば、発現が要求される組織についていかなるＬＣＲも知られていない場合、または多くの組織もしくは全ての組織において発現が要求される場合）に関する主な制限である。
【００１０】
本明細書中で参考として援用される、本研究者らの同時係属中の特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（ＷＯ  ００／０５３９３）、ＵＳ  ０９／３５８０８２、ＧＢ  ００２２９９５．５およびＵＳ  ６０／２５２，０４８は、単独の遍在して発現されるハウスキーピング遺伝子からなる遺伝子座に渡る開放クロマチン構造を確立することについて、その天然の染色体の脈絡における原因となるエレメントを記載する。これらのエレメントは、ＬＣＲに由来せず、そして伸長されたメチル化されていない（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ）ＣｐＧアイランド（ｉｓｌａｎｄ）を含む。本発明者らは、このようなエレメントを説明するために用語、遍在性クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）を使用している。
【００１１】
哺乳動物ＤＮＡにおいて、ジヌクレオチドＣｐＧは、シトシンを５−メチルシトシンにメチル化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素によって認識される。しかし、５−メチルシトシンは、不安定であり、チミンに転化される。結果として、ＣｐＧジヌクレオチドは、偶然に予測されるよりも遥かに少ない頻度で存在する。ゲノムＤＮＡのいくつかの区分は、予測されるのに近い頻度のＣｐＧを有するにも関わらず、これらの配列は「ＣｐＧアイランド」として公知である。本明細書中で使用される場合、「ＣｐＧアイランド」は、少なくとも５０％のＧＣ含量、および観察される／予測される少なくとも０．６のＣｐＧ含量比（すなわち、偶然に予測される少なくとも６０％のＣｐＧジヌクレオチド含量）を有する、少なくとも２００ｂｐのＤＮＡの配列として規定される（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇｒｅｅｎ  ＭおよびＦｒｏｍｍｅｒ  Ｍ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６，２６１〜２８２（１９８７）；Ｒｉｃｅ  Ｐ，Ｌｏｎｇｄｅｎ  ＩおよびＢｌｅａｓｂｙ  Ａ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １６，２７６〜２７７（２０００））。
【００１２】
メチル化されていないＣｐＧアイランドは、当該分野において周知であり（Ｂｉｒｄら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０：９１〜９９，ＴａｚｉおよびＢｉｒｄ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：９０９〜９２０）そして実質的な割合のシトシン残基がメチル化されず、そして通常、２つの近い間隔（０．１〜３ｋｂ）の多岐に転写される遺伝子の５’末端に渡って伸長するＣｐＧアイランドと規定され得る。ＤＮＡのこれらの領域は、発達を通じて全ての組織で低メチル化されたままであると報告されている（ＷｉｓｅおよびＰｒａｖｔｃｈｅｖａ（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６０：２５８〜２７１）。これらは、しばしば遍在して発現される遺伝子、および組織制限発現プロフィールを示す推定４０％の遺伝子の５’末端と関連し（Ａｎｔｅｑｕｅｒａ，Ｆ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，１１９５〜１１９９９（１９９３）；Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．Ｈ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５，３０９〜３１４（１９９５））、そして活性クロマチンの領域に配置されることが公知である（Ｔａｚｉ，Ｊ．＆Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｃｅｌｌ  ６０，９０９〜９２０（１９９０））。
【００１３】
「伸長された」メチル化されていないＣｐＧアイランドは、１つよりも多い転写開始部位を包含する領域に渡って伸長し、そして／または３００ｂｐ、好ましくは５００ｂｐよりも長く伸長する、メチル化されていないＣｐＧアイランドである。伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドの境界は、その認識配列でＤＮＡを消化（切断）する能力が、存在する任意のＣｐＧ残基のメチル化状態に感受性である、制限エンドヌクレアーゼ酵素と組み合わせた領域に渡るＰＣＲの使用を通じて機能的に規定される。１つのこのような酵素は、ＨｐａＩＩであり、これは、中央のＣＧ残基がメチル化されない場合に限り、通常ＣｐＧアイランド内に見出される部位ＣＣＧＧを認識して消化する。故に、ＨｐａＩＩ消化ＤＮＡを導き、そしてＨｐａＩＩ部位を含む領域に渡るＰＣＲは、ＤＮＡがメチル化されていない場合、ＨｐａＩＩ消化に起因する増幅産物を提供しない。ＰＣＲは、ＤＮＡがメチル化される場合にのみ増幅産物を提供する。故に、メチル化されていない領域に及ばないＨｐａＩＩは、ＤＮＡを消化せず、ＰＣＲ増幅産物が観察され、これによって「伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド」の境界を規定する。
【００１４】
本発明者らは、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）／プロテオソーム成分Ｂ１（ＰＳＭＢＩ）、および異種核リボ核タンパク質Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２）／ヘテロクロマチンタンパク質１Ｈｓγ（ＨＰ１Ｈｓγ）遺伝子座由来の二重の多岐に転写されるプロモーターを包むメチル化されていないＣｐＧアイランドを架橋する領域が、再現性のある、生理学的レベルの遺伝子発現を提供すること、ならびにこれらが、変化を付けられた発現パターン、および動原体性ヘテロクロマチン内に組み込まれた導入遺伝子で通常生じるサイレンシングを妨げ得ることを実証している（ＷＯ  ００／０５３９３）。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「再現性のある発現」は、本発明のポリヌクレオチドは、そのクロマチン環境に関わり無く、そして好ましくは、本発明のポリヌクレオチドがあり得る細胞型または組織型に関わり無く、実質的に同じレベルで発現可能な遺伝子の発現を指向することを意味する。当業者は、作動可能に連結された発現可能な遺伝子の実質的に同じレベルの発現が、特許請求されたポリヌクレオチドのクロマチン環境に関わり無く、そして好ましくは、細胞が活性な遺伝子発現を可能にすると想定する細胞型と関わり無く達成される。
【００１６】
本発明者らは、活性に転写をするプロモーターと関連するメチル化されていないＣｐＧアイランドがクロマチンを再造形する能力を保有し、従ってハウスキーピング遺伝子座でのオープンドメインの確立および維持における主用な決定因子であると考えられることを、示している（ＷＯ  ００／０５３９３）。
【００１７】
ＵＣＯＥは、導入遺伝子発現のレベルおよび安定性に関する改良を伴った生産的遺伝子送達事象の割合を増加させる。これは、トランスジェニック動物および培養細胞における組換えタンパク質生成物の生成を含む、重要な研究および生物工学的適用を有する。本発明者らは、ＣＭＶ−ＥＧＦＰレポーター構築物の発現におけるＵＣＯＥの有益な効果、および分泌を伴う薬学的に価値のあるタンパク質エリトロポイエチンを示している（ＷＯ  ００／０５３９３）。ＵＣＯＥの性質はまた、遺伝子治療における利用性、低い頻度の生産的遺伝子送達事象によってしばしば制限される効果、ならびに不適切なレベルの発現および発現の持続を示唆する（Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．＆Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９〜２４２（１９９７））。
【００１８】
これらの有意な関連および広範な適用を提供して、導入遺伝子発現レベルをさらに最適化することが所望される。ＵＣＯＥ単独での使用、特にインビボ遺伝子治療の分野および組換えタンパク質のインビトロ生成における使用によって入手可能な発現のレベルをさらに増加する必要がある。
【００１９】
５’ＵＣＯＥに作動可能に連結された核酸の発現は、驚いたことに、発現可能な核酸配列が、５’ＵＣＯＥおよび３’選択マーカーに隣接されるような、発現された核酸の３’の選択エレメントの存在によって、さらに増加され得る。
【００２０】
ベクターにおける機能（例えば、選択マーカーを提供すること、および作動可能に連結された遺伝子の発現を増加すること）の１つよりも多くを実行する選択エレメントは、より小型かつ効果的な発現ベクターの構築を可能にする。
【００２１】
Ｍｅｉ，ＫｏｔｈａｒｙおよびＷａｌｌ（Ｍｅｉ，Ｑ，Ｋｏｔｈａｒｙ  ＲおよびＷａｌｌ  Ｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６０，３０４〜３１２（２０００））は、ＬＣＲおよびｐｇｋ／プロマイシン耐性エレメントに作動可能に連結された発現可能な遺伝子（β−グロビン）を含む構築物を開示する。しかし、この研究は、ネガティブコントロールとして使用されるｐｇｋ／プロマイシン耐性エレメントを用いた遺伝子発現における位置効果を課すことにおいて重要なのが、発現可能な遺伝子、ならびにＬＣＲおよびｔｋ／ネオマイシン耐性エレメントの組み合わせであることを教示する。この論文は、ｐｇｋ／プロマイシン耐性エレメントの使用から得られる任意の有利な効果を教示する。この論文は、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド（またはＵＣＯＥ）、発現可能な遺伝子およびｐｇｋ／プロマイシン耐性エレメントを含む構築物を開示しない。なぜならば、この構築物は、ＬＣＲを含むからである。同様に、この論文は、発現可能な遺伝子が天然には連結していないプロモーターに作動可能に連結している遺伝子、またはｐｇｋ／プロマイシン耐性エレメントに作動可能に連結している遺伝子を開示しない。なぜならば、それぞれの場合において、β−グロビン遺伝子は、その内因性プロモーターの制御下で発現されるからである。
【００２２】
Ａｒｔｅｌｔらは、真核生物発現ベクターにおけるｃｉｓ連結遺伝子上のネオマイシン耐性遺伝子およびプロマイシン耐性遺伝子の影響を比較する（Ａｒｔｅｌｔ  Ｐ，Ｇｒａｎｎｅｍａｎｎ  Ｒ，Ｓｔｏｃｋｉｎｇ  Ｃ，Ｆｒｉｅｌ  Ｊ，Ｂａｒｔｓｃｈ  ＪおよびＨａｕｓｅｒ  Ｈ  Ｇｅｎｅ  ９９，２４９〜２５４（１９９１））。彼らは、ネオマイシン耐性遺伝子は、連結された遺伝子においてサイレンシング効果を有し得るが、「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来のプロマイシンに対する耐性を供する遺伝子は、隣接するプロモーターに影響しない」ことを結論付ける。従って、この論文中には、特許出願に開示されるような耐性遺伝子の使用の配置または間隔の重要性を開示または示唆するものはない。
【００２３】
本発明者らの係属中の特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（ＷＯ  ００／０５３９３）、ＵＳ  ０９／３５８０８２、ＧＢ  ００２２９９５．５およびＵＳ  ６０／２５２，０４８は、伸長された、抗生物質耐性遺伝子を有する発現可能な核酸に作動可能に連結されたメチル化されていないＣｐＧアイランドを含むポリヌクレオチドおよびベクターを開示する。しかし、開示される実施例において、抗生物質遺伝子は、発現可能な核酸に隣接せず、そして３’にもない。このような隣接する選択マーカーの驚くべき構築物は、開示または暗示されないようである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
（発明の記載）
本発明は、作動可能に連結された核酸配列のアップレギュレート発現について伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド（ＵＣＯＥ）の影響が、選択エレメントの存在によってさらに増加され得る（但し、上記の選択マーカーは、発現可能な核酸配列３’に置かれるか、あるいはそれに隣接する）ことを開示する。そして、本発明は、以下をも提供する。
（１）単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ．伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、
ｂ．ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、
ｃ．プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー
を含み、ここで、該ＣｐＧアイランドおよび該選択マーカーの両方が、該発現可能な核酸に作動可能に連結され、これらの成分は、該発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’〜３’の方向で、以下の順序：該伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、該発現可能な核酸、該選択マーカー、で位置付けられ、そして、該発現可能な核酸の３’末端の該ポリアデニル化シグナルは、該選択マーカーの近位末端の２０００ｂｐ以内である、単離されたポリヌクレオチド。
（２）  単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ．伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、
ｂ．ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、
ｃ．プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー
を含み、ここで、該ＣｐＧアイランドおよび該選択マーカーの両方が、該発現可能な核酸に作動可能に連結され、これらの成分は、該発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’〜３’の方向で、以下の順序：該伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、該発現可能な核酸、該選択マーカー、で位置付けられ、そして、該発現可能な核酸の３’末端の該ポリアデニル化シグナルは、該選択マーカーの近位末端の１５００ｂｐ以内である、単離されたポリヌクレオチド。
（３）  単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ．伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、
ｂ．ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、
ｃ．プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー
を含み、ここで、該ＣｐＧアイランドおよび該選択マーカーの両方が、該発現可能な核酸に作動可能に連結され、これらの成分は、該発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’〜３’の方向で、以下の順序：該伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、該発現可能な核酸、該選択マーカー、で位置付けられ、そして、該発現可能な核酸の３’末端の該ポリアデニル化シグナルは、該選択マーカーの近位末端の１０００ｂｐ以内である、単離されたポリヌクレオチド。
（４）  単離されたポリヌクレオチドであって、以下：
ａ．伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、
ｂ．ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、
ｃ．プロモーターに作動可能に連結された選択マーカー
を含み、ここで、該ＣｐＧアイランドおよび該選択マーカーの両方が、該発現可能な核酸に作動可能に連結され、これらの成分は、該発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’〜３’の方向で、以下の順序：該伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、該発現可能な核酸、該選択マーカー、で位置付けられ、そして、該発現可能な核酸の３’末端の該ポリアデニル化シグナルは、該選択マーカーの近位末端の５００ｂｐ以内である、単離されたポリヌクレオチド。
（５）  前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子である、項目１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（６）  前記抗生物質耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から得られる、項目５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（７）  前記抗生物質耐性遺伝子が、プロマイシン耐性遺伝子である、項目６のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
（８）  前記プロマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、項目７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（９）  前記プロマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来の改変プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、項目８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１０）  図１４に記載の配列を含む、項目９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１１）  前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子である、項目６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１２）  前記ネオマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、項目１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１３）  前記抗生物質耐性遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子である、項目６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１４）  前記抗生物質耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、項目１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１５）  前記抗生物質耐性遺伝子が、ブレオマイシン耐性遺伝子である、項目６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１６）  前記ブレオマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ由来のブレオマイシン結合タンパク質である、項目１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１７）  前記ブレオマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ由来のブレオマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼである、項目１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１８）  前記抗生物質耐性遺伝子が、ブラスチシジン耐性遺伝子である、項目６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１９）  前記ブラスチシジン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ由来のブラスチシジンＳ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、項目１８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２０）  前記抗生物質耐性遺伝子が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼである、項目５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２１）  前記抗生物質耐性遺伝子が、トランスポゾンＴｎ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、項目５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２２）  前記伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドが、ヒトｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子にわたる８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む、項目１〜２１のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２３）  前記伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドが、マウスｈｎＲＮＰ
Ａ２遺伝子にわたる８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む、項目１〜２１のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２４）  前記伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドが、図１９の配列のヌクレオチド１〜７８９８を含む、項目２３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２５）  前記伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドが、ヒトβ−アクチンＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる２．０ｋｂのＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む、項目１〜２１のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（２６）  項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（２７）  直鎖化され、そして、染色体に組込まれた場合、項目１〜２５のいずれか１項にポリヌクレオチドを送達するように構築されたベクター。
（２８）  前記ベクターが、エピソームベクターである、項目２６に記載のベクター。
（２９）  前記ベクターが、組込みベクターである、項目２６に記載のベクター。
（３０）  前記ベクターがプラスミドである、項目２６に記載のベクター。
（３１）  前記発現可能な核酸が、治療的核酸配列である、項目２６〜３０のいずれか１項に記載のベクター。  
（３２）  前記発現可能な核酸が、インビトロ細胞培養系での発現のための組換えタンパク質をコードする、項目２６〜３０のいずれか１項に記載のベクター。
（３３）  ベクターであって、
ａ．伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、
ｂ．マルチクローニングサイト、
ｃ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から得られた抗生物質耐性遺伝子
を含み、ここで、該ＣｐＧおよび該選択マーカーの両方が、該発現可能な核酸に作動可能に連結され、そして、これらの成分は、該発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’〜３’の方向で、以下の順序：該伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、マルチクローニングサイト、該選択マーカー、で位置付けられ、そして、該マルチクローニングサイトは、該選択マーカーの近位末端の２０００ｂｐ以内である、ベクター。
（３４）  前記マルチクローニングサイトが、プロモーターにさらに作動可能に連結される、請求項３３に記載のベクター。
（３５）  前記プロモーターが、サイトメガロウイルス最初期／初期プロモーターである、項目３４に記載のベクター。
（３６）  図１０の配列のヌクレオチド１〜１０５５１を含む、項目２６〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
（３７）  ベクターＣＥＴ  ７１０。
（３８）  図１２の配列のヌクレオチド１〜１３５４５を含む、項目２６〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
（３９）  ベクターＣＥＴ  ７２０。
（４０）  ベクターＣＥＴ  ７４０。
（４１）  ベクターＣＥＴ  ７６０。
（４２）  ベクターＣＥＴ  ７８０。
（４３）  ベクターＣＥＴ  ８２０。
（４４）  ベクターＣＥＴ  ８２３。
（４５）  図２１の配列のヌクレオチド１〜１２０３９配列を含むベクター。
（４６）  ベクターＣＥＴ  １０１０。
（４７）  図２３の配列のヌクレオチド１〜１１６４６を含むベクター。
（４８）  ベクターＣＥＴ  １０２０。
（４９）  図２５の配列のヌクレオチド１〜９０２７を含むベクター。
（５０）  ベクターＣＥＴ  １０３０。
（５１）  図２７の配列のヌクレオチド１〜１２２２１を含むベクター。
（５２）  ベクターＣＥＴ  １１１０。
（５３）  図２９の配列のヌクレオチド１〜１１８２８を含むベクター。
（５４）  ベクターＣＥＴ  １１２０。
（５５）  図３１の配列のヌクレオチド１〜９２０９を含むベクター。
（５６）  ベクターＣＥＴ  １１３０。
（５７）  項目２６〜５６のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
（５８）  発現可能な核酸の発現を得るための、項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２６〜５６に記載のベクター、または項目５７に記載の宿主細胞の使用。
（５９）  所望の遺伝子産物の発現を得るための、細胞培養系における項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２６〜５６に記載のベクター、または項目５７に記載の宿主細胞の使用。
（６０）  治療のための、項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２６〜５６に記載のベクター、または項目５７に記載の宿主細胞の使用。
（６１）  遺伝子治療での使用のための組成物を製造するための、項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２６〜５６に記載のベクター、または項目５７に記載の宿主細胞の使用。
（６２）  薬学的に有効な量の、項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６〜５６に記載のベクター、または項目５７に記載の宿主細胞を、このような処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、処置方法。
（６３）  薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、項目１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目２６〜５６に記載のベクター、または項目５７に記載の宿主を含む、薬学的組成物。
（６４）  人工的に導入された伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドエレメント、および人工的に導入された選択マーカーを含む非ヒトトランスジェニック動物であって、ここで、該ＣｐＧアイランドおよび該選択マーカーの両方は、発現可能な核酸に作動可能に連結され、そして、これらの成分は、該発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’〜３’の方向で、以下の順序：該伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、該発現可能な核酸、該選択マーカー、で位置付けられ、そして、該発現可能な核酸の３’末端の該ポリアデニル化シグナルは、該選択マーカーの近位末端の２０００ｂｐ以内である、非トランスジェニック動物。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、「空の」ベクターＣＥＴ２００．１、ＣＥＴ２１０、ＣＥＴ７１０およびＣＥＴ７２０のマップを示す。増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子のマルチクローニングサイトへの挿入によって、それぞれＣＥＴ２３０、ＣＥＴ７１１およびＣＥＴ７２１を得る。全てのベクターは、挿入された遺伝子が発現されるＣＭＶプロモーターを含む。しかし、ＣＥＴ２１０（およびそのＥＧＦＰ発現誘導体であるＣＥＴ２３０）の場合、そのような挿入された遺伝子には、プラスミド中でＵＣＯＥおよびｐｇｋ／プロマイシン耐性要素が隣接するが、後者は、すぐ隣ではない。より重要なことには、ベクターは、トランスフェクションの前にプラスミドを線形化するために使用されるＰｖｕＩ部位によって切り離される。宿主細胞染色体への組込み後、ＵＣＯＥおよびｐｇｋ／プロマイシン耐性要素の両方が遺伝子の同じ側に組込まれるので、このことによって、もはやどの遺伝子も隣接しなくなる。ＣＥＴ７１０（およびそのＥＧＦＰ発現誘導体であるＣＥＴ７１１）およびＣＥＴ７２０（およびそのＥＧＦＰ発現誘導体、ＣＥＴ７２１）の場合、ＰｖｕＩ線形化によって、片側でＵＣＯＥに密接に隣接した遺伝子の組込みを生じ、もう片側でｐｇｋ／プロマイシン耐性要素に密接に隣接した遺伝子の組込みを生じる。ＣＥＴ２１０（およびＣＥＴ２３０）およびＣＥＴ７２０（およびＣＥＴ７２１）が、ｈｎＲＮＰ誘導性ＵＣＯＥを保持するのに対して、ＣＥＴ７１０（およびＣＥＴ７１１）は、「人工的な」βアクチン／ＰＤＣＤ２誘導性ＵＣＯＥを保持する。
【図２】図２は、トランスフェクション後、示された日に測定したＦＡＣＳ分析の蛍光の中央値によって測定された、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトされた種々のベクターからのＥＧＦＰの発現を示す。「ＥＧＦＰ」は、コントロール（ｐＥＧＦＰ）非ＵＣＯＥ含有プラスミドでトランスフェクトした細胞を示す。ＣＥＴ２２０は、ＥＧＦＰ発現ユニットがｈｎＲＮＰ誘導性ＵＣＯＥに作動可能に結合されるが、ｐｇｋ／プロマイシン耐性要素には結合されないプラスミドでトランスフェクトした細胞を示す。そのかわりに、ＳＶ４０／ネオマイシン耐性要素を使用する。残存する細胞を、図１において示される構造物であるＣＥＴ２３０、ＣＥＴ７１１またはＣＥＴ７２１でトランスフェクトする。
【図３】図３は、トランスフェクション後、示された日の発現がポジティブであると判断された、図２に示された細胞集団の割合を示す。
【図４】図４は、ＦＡＣＳｃａｎの検出能力を超えずに比較を可能にするように補正された蛍光の中央値によって測定された、ベクターＣＥＴ２２０、ＣＥＴ２３０、ＣＥＴ７２１およびＣＥＴ７１１でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＥＧＦＰの発現を示す。このことは、選択マーカー（ｐｕｒｏｒ）を、発現可能な導入遺伝子（ＥＧＦＰ）の５’（ＣＥＴ２３０）または３’（ＣＥＴ７２１）のいずれかに配置することに匹敵する効果を明らかに示す。
【図５】図５は、ＦＡＣＳｃａｎの検出能力を超えずに比較を可能にするように補正された蛍光の中央値によって測定された、ベクターＣＥＴ７０１、ベクターＣＥＴ７２１、ベクターＣＥＴ７０４、ベクターＣＥＴ７４１、ベクターＣＥＴ７０５、ベクターＣＥＴ７５１、ベクターＣＥＴ７０６、ベクターＣＥＴ７６１、ベクターＣＥＴ７０８およびベクターＣＥＴ７８１でトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＥＧＦＰの発現を示す。
【図６】図６は、５’側のヒトｈｎＲＮＡ  ＵＣＯＥおよびマウスｈｎＲＮＡ  ＵＣＯＥを３’側のプロマイシン耐性遺伝子と比較した、ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＥＧＦＰの発現レベルを示す。
【図７】図７は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓネオマイシン耐性遺伝子の位置のＥＧＦＰ発現に対する効果を示す。ＣＥＴ７４１は、導入遺伝子の３’側に選択マーカーを有し、ＣＥＴ７４５は、導入遺伝子およびＵＣＯＥの５’側にこのマーカーを有する。このＵＣＯＥは、両方の場合においてヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥである。
【図８】図８は、プラスミドＣＥＴ７００のマップを示す。
【図９】図９は、プラスミドＣＥＴ７１０のマップを示す。
【図１０−１】図１０は、ＣＥＴ７１０のヌクレオチド配列を示す。
【図１０−２】図１０の続き。
【図１０−３】図１０の続き。
【図１０−４】図１０の続き。
【図１０−５】図１０の続き。
【図１０−６】図１０の続き。
【図１０−７】図１０の続き。
【図１０−８】図１０の続き。
【図１１】図１１は、プラスミドＣＥＴ７２０のマップを示す。
【図１２−１】図１２は、ＣＥＴ７２０のヌクレオチド配列を示す。
【図１２−２】図１２の続き。
【図１２−３】図１２の続き。
【図１２−４】図１２の続き。
【図１２−５】図１２の続き。
【図１２−６】図１２の続き。
【図１２−７】図１２の続き。
【図１２−８】図１２の続き。
【図１２−９】図１２の続き。
【図１２−１０】図１２の続き。
【図１３】図１３は、野生型Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１４】図１４は、改変されたＳ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１５】図１５は、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】図１６は、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１７】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏｒ）遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１８】図１８は、トランスポゾンＴｎ５（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図１９−１】図１９は、マウスｈｎＲＮＰ  Ａ２  ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図１９−２】図１９の続き。
【図１９−３】図１９の続き。
【図１９−４】図１９の続き。
【図１９−５】図１９の続き。
【図１９−６】図１９の続き。
【図２０】図２０は、プラスミドＣＥＴ１０１０のマップを示す。
【図２１−１】図２１は、ＣＥＴ１０１０のヌクレオチド配列を示す。
【図２１−２】図２１の続き。
【図２１−３】図２１の続き。
【図２１−４】図２１の続き。
【図２１−５】図２１の続き。
【図２１−６】図２１の続き。
【図２１−７】図２１の続き。
【図２１−８】図２１の続き。
【図２１−９】図２１の続き。
【図２２】図２２は、プラスミドＣＥＴ１０２０のマップを示す。
【図２３−１】図２３は、ＣＥＴ１０２０のヌクレオチド配列を示す。
【図２３−２】図２３の続き。
【図２３−３】図２３の続き。
【図２３−４】図２３の続き。
【図２３−５】図２３の続き。
【図２３−６】図２３の続き。
【図２３−７】図２３の続き。
【図２３−８】図２３の続き。
【図２３−９】図２３の続き。
【図２４】図２４は、プラスミドＣＥＴ１０３０のマップを示す。
【図２５−１】図２５は、ＣＥＴ１０３０のヌクレオチド配列を示す。
【図２５−２】図２５の続き。
【図２５−３】図２５の続き。
【図２５−４】図２５の続き。
【図２５−５】図２５の続き。
【図２５−６】図２５の続き。
【図２５−７】図２５の続き。
【図２６】図２６は、プラスミドＣＥＴ１１１０のマップを示す。
【図２７−１】図２７は、ＣＥＴ１１１０のヌクレオチド配列を示す。
【図２７−２】図２７の続き。
【図２７−３】図２７の続き。
【図２７−４】図２７の続き。
【図２７−５】図２７の続き。
【図２７−６】図２７の続き。
【図２７−７】図２７の続き。
【図２７−８】図２７の続き。
【図２７−９】図２７の続き。
【図２８】図２８は、プラスミドＣＥＴ１１２０のマップを示す。
【図２９−１】図２９は、ＣＥＴ１１２０のヌクレオチド配列を示す。
【図２９−２】図２９の続き。
【図２９−３】図２９の続き。
【図２９−４】図２９の続き。
【図２９−５】図２９の続き。
【図２９−６】図２９の続き。
【図２９−７】図２９の続き。
【図２９−８】図２９の続き。
【図２９−９】図２９の続き。
【図３０】図３０は、プラスミドＣＥＴ１１３０のマップを示す。
【図３１−１】図３１は、ＣＥＴ１１３０のヌクレオチド配列を示す。
【図３１−２】図３１の続き。
【図３１−３】図３１の続き。
【図３１−４】図３１の続き。
【図３１−５】図３１の続き。
【図３１−６】図３１の続き。
【図３１−７】図３１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
用語５’および３’は、本明細書中で発現可能な核酸配列のセンス鎖に関連して使用される。故に、上記の配列の５’末端は、３’方向に進む転写の開始に対応する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、本発明のポリヌクレオチド中のエレメント間の作動可能性の関係をいう。「作動可能に連結された」は、当業者に周知の用語であって、これはシス作用ＤＮＡ配列間の機能的関係を説明する。正確な構造関係は、直接的に関連していても、関連していなくともよく、異なる型のエレメントに対して相違する。プロモーターについて、用語「作動可能に連結された」は、プロモーターが駆動するオープンリーディングフレームに本質的に隣接する（通常１００ｂｐよりも少ない）５’部位を示す。伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドの場合、クロマチン構造における局部効果が、遺伝子発現のレベルおよび定常性の増加を担うことを示す。例として、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドを含むエレメントは、発現可能な遺伝子の５’の直ぐ側に配置される。しかし「作動可能に連結された」は、明らかな機能の効果が実証され得る限り、いずれかに配置される可能性を包含する。
【００２８】
特に、５’末端でのＵＣＯＥ、およびその他での選択マーカーと発現可能な遺伝子とが隣接することは、約２倍発現を増加させる。いくつかの場合において、この増加は、単一のＵＣＯＥのみで得られる発現の５倍よりも多い。
【００２９】
本発明に従って、作動可能に連結されたＵＣＯＥまたは伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドを単独で用いて入手可能な発現レベルと比較して、得られるべき作動可能に連結された遺伝子の発現のレベルを増加可能にする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００３０】
この単離されたポリヌクレオチドは以下を含む：伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸およびプロモーターに作動可能に連結された選択マーカー（ここで、ＣｐＧアイランドおよび選択マーカーの両方が、発現可能な核酸に作動可能に連結され、そしてその成分は順序に従って配置される）：発現可能な核酸のセンス鎖に関する５’から３’の方向における、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、発現可能な核酸、選択マーカー、そして発現可能な核酸の３’末端でのポリアデニル化シグナルは、選択マーカーの近位末端の２０００ｂｐ以内である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「近位末端」は、そのポリアデニル化シグナルによってマークされる、発現可能な核酸の３’末端に最も近い選択マーカー遺伝子（そのプロモーターを含む）の末端を意味する。発現可能な核酸に関する近位末端が、選択マーカーの５’プロモーター末端または選択マーカーのセンス鎖に従う５’および３’を取る転写末端の３’終点のいずれかであり得るように、選択マーカーはいずれかの方向であり得ることが想定される。
【００３２】
好ましくは、選択マーカーの転写開始は、後者のそのポリアデニル化シグナルによってマークされるような発現可能な核酸配列の３’末端の１５００ｂｐ以内である。より好ましくは、これは、１０００ｂｐ以内である。最も好ましくは、これは、５００ｂｐ以内である。
【００３３】
本発明の１つの局面において、選択エレメントは、抗生物質耐性遺伝子である。好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から得られる抗生物質耐性遺伝子である。より好ましくは、上記の抗生物質耐性遺伝子は、ホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される。最も好ましくは、これは、マウスｐｇｋ遺伝子のプロモーターである（Ａｄｒａ，ＣＮ，Ｂｏｅｒ  ＰＨおよびＭｃＢｕｒｎｅｙ，ＭＷ．Ｇｅｎｅ  ６０，６５〜７４（１９８７））。あるいは、これは、別の哺乳動物ｐｇｋプロモーターであり得る。
【００３４】
好ましい実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のプロマイシン耐性遺伝子である。最も好ましくは、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子である（Ｖａｒａ  ＪＡ、Ｐｏｒｔｅｌａ  Ａ，Ｏｒｔｉｎ  Ｊ，Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４，４６１７〜４６２４（１９８６））。
【００３５】
あるいは、抗生物質耐性遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来の改変された形態のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子である。好ましくは、この遺伝子は、細菌遺伝子を哺乳動物宿主細胞における発現に適応させるために通常行われる様式で、そのコドン使用頻度を操作することによって改変されている。このようなコドン改変は、発現された酵素が、野生型プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼから変化されていないという結果と共に、コードされたアミノ酸配列を変化されないままにする。最も好ましくは、改変された遺伝子は、図１５に示される配列を有する。
【００３６】
あるいは、抗生物質耐性遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種由来のネオマイシン耐性遺伝子である。好ましくは、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＪおよびＧｒａｙ  ＧＳ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０，５１９０〜５１９４（１９８３））。
【００３７】
代替の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子である。好ましくは、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００３８】
さらなる代替の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ブレオマイシン耐性遺伝子である。好ましくは、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ由来のブレオマイシン結合タンパク質である。あるいは、これはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ由来のブレオマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼである。
【００３９】
別の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ブラスチシジン耐性遺伝子である。好ましくは、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ由来のブラスチシジンＳ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００４０】
本発明の別の局面において、抗生物質耐性遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から得られたものではない。１つの好ましい実施形態において、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼをコードするハイグロマイシン耐性遺伝子である。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、これは、本来、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する、トランスポゾンＴｎ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００４２】
本発明の代替の局面において、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子ではない。代替の選択機構は、チミジン化シンターゼ、チミジンキナーゼまたはジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子の使用を含む。このような選択機構は、当業者に周知である。メチオニン欠乏培地において、グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子は、内因性グルタミンシンテターゼを欠損する細胞か、またはインヒビター（例えば、メチオニンスルホキサミン）の使用がそれを不活性にする場合のいずれかで、選択の手段として使用され得る（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５，５３７〜５６６（１９９０））。
【００４３】
さらなる局面において、スクリーニング可能なマーカーが使用され得る。例えば、蛍光タンパク質（例えば、Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはその増強された改変体（ＥＧＦＰ））をコードする遺伝子は、選択マーカーとして使用され得る。本発明によるポリヌクレオチドを含むトランスフェクト体（ここで、選択マーカーは、ＧＦＰをコードする）は、当該分野において周知のプロセスによってＦＡＣＳ上の蛍光の明るさにより分類され得る。本発明のポリヌクレオチドを用いて、発現可能な構築物をＵＣＯＥの５’か、または導入遺伝子（発現可能な核酸）から離れた３’のいずれかに配置される選択マーカーと比較することによって、より高いレベルの導入遺伝子の発現が、比較可能なレベルの明るさについて見出される。故に、最も明るい細胞の選択は、最も高いレベルの導入遺伝子発現を有する細胞の選択を可能にする。
【００４４】
本発明の１つの局面において、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドは、５ｋｂ  ５’に隣接する配列および１．５ｋｂ  ３’に隣接する配列を有するヒトｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子にわたる１６ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドは、ヒトｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子（ＷＯ  ００／０５３９３）にわたる８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。
【００４５】
あるいは、開示されたポリヌクレオチドの伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドは、本発明者らの係属中の出願ＧＢ  ００２２９９５．５およびＵＳ  ６０／２５２，０４８に開示される「人工ＵＣＯＥ」（ヒトβ−アクチンＣｐＧアイランド／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む）である。好ましくは、このフラグメントは、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲のサイズであり、そしてヒトβ−アクチンＣｐＧアイランド／プロモーター領域またはそのフラグメントにわたる。好ましくは、人工ＵＣＯＥはまた、ヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧアイランド／プロモーター領域またはそのフラグメントを含む。より好ましくは、ヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧアイランド／プロモーター領域は、１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲のサイズ内のフラグメントを含む。さらに好ましくは、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドは、ヒトβ−アクチンＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲のサイズ内のＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜３．０ｋｂの範囲のサイズ内のＤＮＡフラグメントを含む。
【００４６】
最も好ましくは、本発明のこの実施形態の特許請求されるポリヌクレオチドは、ヒトβアクチンＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる２．０ｋｂのＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２  ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１．８ｋｂＤＮＡフラグメントを含む、人工的なＵＣＯＥを含む。
【００４７】
また、先の実施形態のうちの任意の１つのポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。このベクターは、代替的に、エピソームベクターまたは組み込みベクターのいずれかである。意図される使用に依存して、エピソームベクターは、組み込みを必要せずに自己複製および自己存続するので、望ましくあり得る。このタイプのエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載される。また、非複製の非組み込みベクターも好ましい。
【００４８】
また、直鎖化されてそして染色体に組み込まれる場合、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、およびプロモーターと作動可能に連結された選択マーカーを含む、ポリヌクレオチドを送達するよう構築されたベクターも提供され、ここで、ＣｐＧアイランドおよび選択マーカーの両方は、発現可能な核酸と作動可能に連結され、そしてこれらの成分は、発現可能な核酸のセンス鎖について５’から３’の方向で、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、発現可能な核酸、選択マーカー、の順番に配置され、そして発現可能な核酸の３’末端のポリアデニル化シグナルは、選択マーカーの近位末端から２０００ｂｐ以内にある。
【００４９】
好ましくは、このベクターはプラスミドである。あるいは、このベクターは、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたは他のレトロウイルス）であり得る。
【００５０】
好ましくは前述のベクターは、真核生物の遺伝子発現に適応される発現ベクターである。代表的に、前述の適応とは、例として、細胞／組織特異的な発現を媒介する、発現制御配列（プロモーター配列）の供給が挙げられるが、それに限定されない。プロモーターおよびエンハンサーは、当該分野で周知の用語であり、そして単なる例として提供される以下の特徴を含むが、それに限定されない。プロモーターは、転写の開始に直接的に関連する５’シス作用調節配列である。プロモーターエレメントは、いわゆる、転写開始部位を選択するよう機能する、ＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始の選択を促進するよう機能するポリペプチドを結合する。
【００５１】
エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位の５’側にしばしば見出される、シス作用性核酸配列である（エンハンサーはまた遺伝子配列の３’側にも見出され得るか、またはイントロン配列中にすら位置され得、従ってエンハンサーは位置非依存性である）。エンハンサーは、エンハンサーが連結される遺伝子の転写率を増大させるよう機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性は、中間代謝物（例えば、グルコース）、環境的エフェクター（例えは、熱）（例示のためであってこれらに限定されない）を含む、多くの環境的原因に応答性である。（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｓ  Ｌａｔｃｈｍａｎによる、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）
適応はまた、選択マーカーおよび自律複製配列の供給を含み、これらは共に、真核生物細胞宿主または原核生物細胞宿主のいずれかにおいて、前述のベクターの維持を促進する。真核生物細胞中で自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと称される。ベクターにコードされる遺伝子の発現を促進させる他の適応は、転写終結／ポリアデニル化の供給を含む。このことはまた、２シストロン性発現カセットまたは多シストロン性発現カセットに配置されるベクターにコードされる遺伝子発現を最大化するように機能する内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の供給を含む。これらの適応は、当該分野で周知である。一般的に、発現ベクター構築および組み換えＤＮＡ技術に関する公開された文献が多量に存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹおよびその参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ．ＩＩＩ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ  Ｍ  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００５２】
本発明の好ましい方法において、前述のベクターは分泌シグナルをコードして（従って前述のポリペプチドはこれと共に提供される）、前述のポリペプチドの精製を容易にする。
【００５３】
あるいは、他の好ましい実施形態は、発現される組み換えタンパク質の精製を容易にするよう、さらなる改良点（例えば、アフィニティータグもしくはエピトープ、または酵素切断部位）を含み得る。
【００５４】
好ましくは、発現可能な核酸は、治療的核酸である。
【００５５】
あるいは、発現可能な核酸は、インビトロの細胞培養系における発現のための組み換えタンパク質をコードする。
【００５６】
あるいは、発現可能な遺伝子は、非ポリペプチド産物（例えば、ＲＮＡ）をコードする。このようなＲＮＡは、転写後レベルで特定の遺伝子の発現を阻害し得るアンチセンスＲＮＡであり得るか、または酵素（リボザイム）もしくは他の機能（例えば、リボソームＲＮＡ）を有し得る。
【００５７】
１つの好ましい実施形態は、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、ポリアデニル化シグナルによって終結される発現可能な核酸、およびプロモーターに作動可能に連結された選択マーカーを含むベクターであり、ここで、ＣｐＧアイランドおよび選択マーカーの両方は、発現可能な核酸に作動可能に連結され、そしてその成分は、発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’から３’の向きで、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、発現可能な核酸、選択マーカー、の順番で配置され、そして発現可能な核酸の３’末端のポリアデニル化シグナルは、選択マーカーの近位末端から２０００ｂｐ以内にある。好ましくは、発現可能な核酸の３’末端のポリアデニル化シグナルは、選択マーカーの近位末端から１５００ｂｐ以内にある。さらに好ましくは、それは１０００ｂｐ以内にあり、最も好ましくは、５００ｂｐ以内である。
【００５８】
好ましい実施形態は、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、マルチクローニングサイト、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から取得される抗生物質耐性遺伝子を含むベクターであり、ここで、ＣｐＧアイランドおよび選択マーカーの両方は、マルチクローニングサイトと作動可能に連結され、そしてその成分は、発現可能な核酸のセンス鎖に関して５’から３’の向きで、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド、マルチクローニングサイト、選択マーカー、の順番で配置され、そしてマルチクローニングサイトは、選択マーカーの近位末端から２０００ｂｐ以内にある。
【００５９】
より好ましくは、このマルチクローニングサイトはさらに、プロモーターと作動可能に連結される。さらに好ましくは、このプロモーターはＣＭＶ、ＥＦ−１α、ＲＳＶ  ＬＴＲもしくはＨＩＶ２  ＬＴＲまたはこれらに由来する配列の組み合わせから選択される。より好ましくは、このプロモーターは、ＣＭＶ最初期／初期プロモーターである。最も好ましくは、マウスＣＭＶ最初期／初期プロモーターである。好ましい実施形態において、ベクターは、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリアデニル化配列および適切な制御エレメントの下に選択マーカーをコードする遺伝子を含む。
【００６０】
このベクターの好ましい実施形態は、図９の配列のヌクレオチド１〜１０５５１を含む。最も好ましい実施形態は、ベクターＣＥＴ７１０である。
【００６１】
あるいは、このベクターは図１０の配列のヌクレオチド１〜１３５４５を含み、そして好ましくはベクターＣＥＴ７２０である。
【００６２】
さらなるベクターの好ましい実施形態は以下の通りである。
【００６３】
ＣＥＴ７４０；ＣＥＴ７２０のプロマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｆｒａｄｉａｅ由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（図１５に列挙される）で置換されている。また、ＣＥＴ７４１のような、ＣＥＴ７４０のマルチクローニングサイトに挿入された発現可能な核酸配列を有するベクターも好ましい。
【００６４】
ＣＥＴ７６０；ＣＥＴ７２０のプロマイシン耐性遺伝子が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ遺伝子（図１７に列挙される）で置換されている。また、ＣＥＴ７６１のような、ＣＥＴ７６０のマルチクローニングサイトに挿入された発現可能な核酸配列を有するベクターも好ましい。
【００６５】
ＣＥＴ７８０；ＣＥＴ７２０のプロマイシン耐性遺伝子が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｏｎｉｇｅｒ由来のプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（図１４に列挙される）の改変形態で置換されている。また、ＣＥＴ７８１のような、ＣＥＴ７８０のマルチクローニングサイトに挿入された発現可能な核酸配列を有するベクターも好ましい。
【００６６】
ＣＥＴ８２０；マルチクローニングサイトに挿入された発現可能な核酸配列の発現を駆動するようにマルチクローニングサイトに作動可能に連結されるヒトＩＥ  ＣＭＶプロモーターが、マウスＩＥ  ＣＭＶプロモーターで置換されている。また、ＣＥＴ８２１のような、ＣＥＴ８２０のマルチクローニングサイトに挿入された発現可能な核酸配列を有するベクターも好ましい。
【００６７】
ＣＥＴ８２３；ヒトｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子にわたる８ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを含む、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドが、マウスｈｎＲＮＰ  Ａ２遺伝子にわたる８ｋｂｐのフラグメントを含む、伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランド（図１９の配列に示される）で置換される。また、ＣＥＴ８２４のような、ＣＥＴ８２３のマルチクローニングサイトに挿入された発現可能な核酸配列を有するベクターも好ましい。
【００６８】
また、開示されたベクターの任意の実施形態でトランスフェクトされた宿主細胞も提供される。
【００６９】
あるいは、前述のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞は、所望の遺伝子産物の発現を獲得するために、細胞培養系において使用され得る。適切な細胞培養系は当該分野で周知であり、そして当業者に公知の文献に完全に記載される。本発明に従った、ポリペプチドの生産のために提供される方法は、以下の工程を包含する：
ｉ）本発明に従う、核酸分子で形質転換／トランスフェクトされた細胞を提供する工程；ｉｉ）前述のポリペプチドの生産を導く条件において、その細胞を増殖させる工程；および
ｉｉｉ）その細胞から、またはその増殖環境から、前述のポリペプチドを精製する工程。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態において、前述の核酸分子は本発明に従うベクターである。
【００７１】
本発明はまた、治療における使用のための、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を提供する。
【００７２】
本発明はまた、遺伝子治療における使用のための組成物の生産における、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【００７３】
本発明はまた、処置方法を提供し、この方法は、本発明の薬学的有効量のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を、その処置を必要とする患者に対して投与する工程を包含する。好ましくは、その患者は遺伝子治療によって処置可能な疾患に罹患している。
【００７４】
本発明はまた、薬学的組成物を提供し、その組成物は、疾患の処置のためか、または有利なタンパク質または機能を有する特定の組織の細胞を提供するために、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との混合において、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞を含む。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターもしくは宿主細胞、または薬学的に受容可能な組成物は、全身的な筋肉内注入、静脈内注入、エアロゾル注入、経口（固体形態または液体形態）注入、局所的注入、眼内注入、直腸注入、腹腔内注入および／または髄腔内注入ならびに局所的な直接注入を含む経路を介して投与され得る。
【００７６】
正確な投薬量レジメンは、無論、個々の患者について個々の臨床医によって決定される必要があり、次いで、このレジメンは、目的の遺伝子および処置のために標的化されている組織型によって発現されるタンパク質の正確な性質によって制御される。
【００７７】
投薬量はまた、疾患の指標および投薬経路に依存する。投薬数は、疾患、および臨床試験からの有効性データに依存する。
【００７８】
本発明に従う効果的な遺伝子治療のために送達されるポリヌクレオチドまたはベクターＤＮＡの量は、好ましくは、体重１ｋｇ当たり５０ｎｇ〜１０００μｇの間の範囲のベクターＤＮＡであり；そしてより好ましくは、体重１ｋｇ当たり約１〜１００μｇの間の範囲のベクターＤＮＡである。
【００７９】
本発明に従って、インビボの細胞取り込みのために哺乳動物にポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を投与することは好ましいが、エクソビボのアプローチを利用して、これによって細胞を動物から取り出し得、ポリヌクレオチドまたはベクターを形質導入し得、次いで動物に再移植し得る。例えば、肝臓は、動物から肝細胞を取り出し、インビトロでその肝細胞に形質導入し、そしてその形質導入された肝細胞を動物に再移植することによるエクソビボのアプローチによって、利用され得る（例えば、ウサギについては、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１８０２−１８０５，１９９１によって、またはヒトにおいては、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１７９−２２２，１９９２によって記載される通り）。このような方法はまた、循環系またはリンパ系における種々の細胞集団（例えば、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞または血球幹細胞）への送達に効果的であり得る。
【００８０】
本発明の別の局面は、天然で作動可能に連結されていない、発現可能な遺伝子に作動可能に連結される第一のプロモーター、ならびにｐｇｋプロモーターおよびプロマイシン耐性遺伝子を含む選択エレメント（これもまた作動可能に連結され、そして発現遺伝子の３’側である）を含む単離されたポリヌクレオチド、を提供する。少なくとも２つの組織型または細胞型において、前述の発現可能な遺伝子の再現性のある発現を獲得するようなポリヌクレオチドの使用もまた、提供される。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、人工的に導入された伸長されたメチル化されていないＣｐＧアイランドエレメント、および人工的に導入された選択マーカーエレメントを含む非ヒトのトランスジェニック動物を提供し、ここで、両方のエレメントがそれらの間に位置する発現可能な遺伝子に作動可能に連結され、そしてここで、前述の発現可能な遺伝子の再現性のある発現が少なくとも２つの組織型または細胞型において起こる。トランスジェニックマウス作製方法（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３８０（１９８０）；Ｈａｒｂｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ２９３：５４０（１９８１）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５０１６（１９８１）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３７６（１９８１）、トランスジェニックヒツジ作製方法、トランスジェニックブタ作製方法、トランスジェニックニワトリ作製方法（Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０（１９８５）を参照のこと）などは、当該分野で周知であり、そして本発明に従った使用が企図される。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドを含むこのようなトランスジェニック動物はまた、目的のタンパク質の長期生産のために使用され得る。
【００８３】
また、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を使用する遺伝子治療の有効性を決定するための哺乳動物モデルが提供される。この哺乳動物モデルは、細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を含む。これらのような動物は、ヒトにおける臨床試験前の試験を可能とする。
【００８４】
本発明はまた、トランスジェニック植物の作製における本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００８５】
増加した生産性または疾患、害虫、乾燥または塩類に対する増加した耐性を有するトランスジェニック植物の作製は、当業者に周知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。人工のＵＣＯＥを含む細胞のいくつかまたはその全ては、植物からの起源であり得る。
【００８６】
本発明はまた、機能性ゲノム科学適用における本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能性ゲノム科学は根本的に、特定の細胞型または疾患状態において特異的に発現される遺伝子の同定に関し、そしてここでは薬物発見または遺伝子治療の目的のための、数千の潜在的な目的の新規遺伝子配列を提供する。新規治療法開発のために本情報を使用することにおける主要な問題は、これら遺伝子の機能を決定する方法に在る。本発明のポリペプチドは、多くの機能性ゲノム科学適用において使用されて、遺伝子配列の機能を決定し得る。本発明の機能性ゲノム科学適用とは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）本発明のポリヌクレオチドを使用して、遺伝子配列のアンチセンス種またはリボザイムノックダウンライブラリーの持続性発現を達成し、それによって細胞の表現系に対するその遺伝子の不活性化効果を決定する。
（２）本発明のポリヌクレオチドを使用して、遺伝子配列発現ライブラリーを調製し、そして細胞内への送達がその遺伝子配列の信頼性ある、再現性のある、持続性の発現を生じる。その遺伝子配列を発現する生じた細胞を、機能決定および薬物発見への種々のアプローチにおいて使用し得る。例えば、遺伝子産物に対する中和抗体の惹起；構造研究、機能研究もしくは薬物スクリーニング研究における使用のための、遺伝子自体からのタンパク質産物の迅速な精製；または細胞ベースの薬物スクリーニングにおいて、である。
（３）マウス胚性幹（ＥＳ）細胞およびトランスジェニックマウスに関するアプローチにおいて本発明のポリヌクレオチドを使用する。最も強力な機能性ゲノム科学アプローチのうちの１つは、発現される遺伝子中への挿入に引き続いて薬物選択を単に可能とする構築物のマウスＥＳ細胞において、遺伝子中へのランダムな挿入に関連し、そしてこれは配列決定のために容易にレスキューされ得る（Ｇ．Ｈｉｃｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６、３３８−３３４）。次いで、新規配列を有する遺伝子中にノックアウト変異を有するトランスジェニックマウスは、遺伝子機能を探るために容易に作製され得る。現在では、本技術は、マウスＥＳ細胞においてうまく発現するマウス遺伝子の１０％に対して上手く作用する。本発明のポリヌクレオチドの組み込み構築物中への包含は、本技術がマウスにおいて発現される全ての遺伝子を同定するよう拡張されることを可能とする。
【００８７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、例のみの目的でここに記載され、そして本明細書に添付される図面を参照して記載される。
【実施例】
【００８８】
（実施例）
（実施例１）
（ＵＣＯＥおよび選択エレメントと隣接する発現可能遺伝子）
（材料および方法）
（ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ  ＣＥＴ発現ベクターの構築）
（ＣＥＴ７００）
ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐＡカセットを、ＡｓｅＩ／ＡｆｌＩフラグメントとしてＣＥＴ３１（Ａ  ＣＭＶ  ＭＣＳ  ｐＡ  ＳＶ４０Ｎｅｏベースのプラスミド）から取り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そしてＥｃｏＲＶで消化したｐＰＧＫ−Ｐｕｒｏ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の、ｍＰＧＫプロモーター、プロマイシン耐性遺伝子、ｂＧＨｐＡ）に連結させた。
【００８９】
（ＣＥＴ７２０）
ＣＥＴ２０（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の８．３ｋｂ  ｈｎＲＮＰＡ２フラグメント）を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、８ｋｂのＲＮＰ  ＵＣＯＥを得、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＣＥＴ７００中に連結させた。
【００９０】
（ＣＥＴ７１０）
人工的なＵＣＯＥを、ＸｂａＩ／ＣｌａＩフラグメントとしてＣＥＴ２１（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の人工的なＵＣＯＥ）から取り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＣＥＴ７００中に連結させ、そして再度、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。
【００９１】
（ＣＥＴ２３０）
約１６０ｂｐを取り出すために、ｐＵＣ１９をＮａｒＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、平滑末端化および再連結することによってこのベクターを構築した。これによって、ベクター骨格中の２つのＰｖｕＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位の１つを除去した。（ＭＣＳが除去された）ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＳＶ４０ｐＡカセットを、ＡｓｅＩ／ＡｆｌＩＩ消化物としてｐＥＧＦＰＮ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切り取り、その後平滑末端化し、次いで、ＮｄｅＩおよびＥｃｏ１０９Ｉで消化しそして再度平滑末端化したｐＵＣ１９ベクター骨格中に挿入した。
【００９２】
次いで、ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ｂＧｐＡカセットを、ｐＰＧＫ−ＰｕｒｏからＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ平滑末端化フラグメントとして取り出し、上記ベクターの単一のＰｖｕＩＩ部位に挿入した。最後に、８．３ｋｂ  ｈｎＲＮＰＡ２フラグメントを、ＣＥＴ２０由来のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、このベクターの単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
【００９３】
明確さのために：
ＣＥＴ２３０は、「空の」ベクターＣＥＴ２１０のＥＧＦＰ発現バージョンであり、ＣＥＴ７１１は、「空の」ベクターＣＥＴ７１０のＥＧＦＰ発現バージョンであり、ＣＥＴ７２１は、「空の」ベクターＣＥＴ７２０のＥＧＦＰ発現バージョンである。
【００９４】
異なる抗生物質耐性遺伝子および代替的プロモーターまたはＵＣＯＥを有するＣＥＴ７２０に基づくベクターは、以下の様式で構築され得る。ＰＧＫプロモーター（ｂｐ１１３８４〜１１８９４）およびｂｇｈｐＡ（ｂｐ１２５６７〜１２８９３）を、制限酵素消化によってＣＥＴ７２０から取り出した。これらのエレメントは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格に挿入され得、その結果、制限酵素部位は、その遺伝子を発現可能な様式で、ＰＧＫプロモーターおよびｂｇｈｐＡの間の（ＰＣＲまたは制限酵素消化に由来する）任意の耐性遺伝子配列の挿入に関して利用可能である。ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐＡ発現カセットをまた、ＣＥＴ７２０から取り出し（ｂｐ１０５３３〜１１３８０）、そして上記ベクターのＰＧＫプロモーターに対して５’側に挿入し得；あるいは、ｍＣＭＶ−ＭＣＳ−ＳＶ４０ｐＡ発現カセットを、同じ位置（ＣＥＴ８０１−ＥＧＦＰ発現バージョン、ＣＥＴ８２１−ＥＧＦＰ発現バージョン、ＣＥＴ８２４−ＥＧＦＰ発現バージョン）に配置し得る。ｈｎＲＮＰＡ２  ＵＣＯＥを、制限酵素消化によってＣＥＴ７２０から取り出し（ｂｐ２２４０〜１０５２５）、そして上記ベクターのＣＭＶ発現カセットに対して５’側に挿入し得るか、あるいは他のＵＣＯＥ（例えば、マウスｈｎＲＮＰＡ２）を同じ位置に挿入し得る（ＣＥＴ８２４−ＥＧＦＰ発現バージョン）。
【００９５】
明確さのために：
ＣＥＴ７４１は、「空の」ベクターＣＥＴ７４０のＥＧＦＰ発現バージョンであり、５’側にヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥおよび３’側にＳ  ｆｒａｄｉａｅ  ｎｅｏｒ遺伝子を含む。
【００９６】
ＣＥＴ７６１は、「空の」ベクターＣＥＴ７６０のＥＧＦＰ発現バージョンであり、５’側にヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥおよび３’側にＥ．ｃｏｌｉアミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏｒ）遺伝子を含む。
【００９７】
ＣＥＴ７８１は、「空の」ベクターＣＥＴ７８０のＥＧＦＰ発現バージョンであり、５’側にヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥおよび３’側に改変されたＳ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
【００９８】
ＣＥＴ８２１は、「空の」ベクターＣＥＴ８２０のＥＧＦＰ発現バージョンであり、５’側にヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥおよび３’側に野生型Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ＥＧＦＰ導入遺伝子の発現は、（ヒトよりむしろ）マウスＣＭＶ  ＩＥプロモーターによて駆動される。
【００９９】
ＣＥＴ８２４は、「空の」ベクターＣＥＴ８２３のＥＧＦＰ発現バージョンであり、５’側に（ヒトよりむしろ）マウスＲＮＰ  ＵＣＯＥおよび３’側に野生型Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒプロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
【０１００】
（ｐＣＩＡベクター）
これは、染色体に組込まれた場合、最終的に最適な配置（ＵＣＯＥ−発現カセット−耐性カセット）でのＵＣＯＥ発現ベクターの構築を容易にする一連のベクターである。
【０１０１】
ＣＥＴ９００は、ＭＣＳに隣接する希少な制限酵素部位の対をその中に有する空のクローニングベクターである。ＣＥＴ９０１およびＣＥＴ９０２は、それぞれｈＣＭＶプロモーターおよびｍＣＭＶプロモーターである、ＭＣＳおよびＳＶ４０ｐＡを含む。この希少な制限部位の同じ対はまた、これらのカセットに隣接する。
【０１０２】
ベクターのＣＥＴ１０００シリーズは、ＵＣＯＥおよび耐性発現カセットの種々の組合せを含む。これらはまた、ＣＥＴ９００シリーズと同じ希少な制限部位を、ＵＣＯＥの３’位および耐性カセットの５’位に含む。このベクターはまた、ＵＣＯＥの５’側および耐性カセットの３’側に、線形化部位を含む。
【０１０３】
従って、任意の導入遺伝子についての発現カセットを、ＣＥＴ９００シリーズに構築し、次いで、ＣＥＴ１０００シリーズ中に容易に移し得、その結果、染色体に組込まれた場合、最終的な配置は、所望のＵＣＯＥ−発現カセット−耐性カセットである。
【０１０４】
上記に記載されるように、抗生物質遺伝子は、制限消化またはＰＣＲによってＣＥＴ１０００シリーズ内で交換可能であり得る。
【０１０５】
（トランスフェクション）
ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、トランスフェクトし、そして標準的方法に従って、そして、参考として援用される同時係属中の出願に記載されるように、選択した。
【０１０６】
（結果）
図２を特に参照すると、ＣＥＴ７２１およびＣＥＴ２３０でトランスフェクトされた細胞の比較は、ＣＥＴ７２１によって得られる、一貫して高いレベルの発現を示す。これら２つのベクターは、両者がＥＧＦＰ遺伝子に駆動されるＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された８ｋｂのｈｎＲＮＰ由来ＵＣＯＥを有し、そして両者がｐｇｋ／プロマイシン耐性遺伝子エレメントを有するという点で類似する。しかし、ＰｖｕＩによる線形化に続いて、宿主細胞染色体へのＣＥＴ２３０の組込みによって、エレメントがｐｇｋ／Ｐｕｒｏ、ｈｎＲＮＰ  ＵＣＯＥ、ＥＧＦＰ遺伝子の順で配置されるエレメントを生じる。ＣＥＴ７２１を用いた同じプロセスによって、ＥＧＦＰ遺伝子がＵＣＯＥおよびｐｇｋ／Ｐｕｒｏによって隣接されるようになる。ＣＥＴ２３０を用いて得られる発現レベルは、ｐｇｋ／Ｐｕｒｏエレメントを有さないが、同じＵＣＯＥおよびＥＧＦＰ発現を駆動するプロモーターを有するベクターである、ＣＥＴ２２０を用いて得られた発現レベルよりも、有意に高くはない。全てのＵＣＯＥ保持ベクターは、基準のＥＧＦＰ発現プラスミドと比較して増加した発現を示す。
【０１０７】
図３は、蛍光の中央値によって示された増加した発現は、トランスフェクション後の全ての時点において、発現に関してポジティブであると判断されるトランスフェクトされた集団内の増加した細胞集団にもまた反映されることを示す。これは、位置の効果の欠如の尺度である。なぜなら、この構築物のランダムな組み込みは、トランスフェクトされた細胞の（クローン化されない）集団内の発現レベルの範囲の結果を通常生じるからである。このことは、５’側のＵＣＯＥおよび３’側の選択エレメントの組合せによって、克服され、同質で高度に発現する集団を生じる。
【０１０８】
図２のいくつかの細胞プールにおける発現レベルは、非常に高いので、生成された蛍光は、検出器の能力を超過した。
【０１０９】
図４において、測定は、検出器の応答の直線領域に補正し、構築物間の比較を可能にする。これは、ＣＥＴ７２１に使用されるＵＣＯＥおよび３’側に隣接する選択エレメントの組合せが、ＵＣＯＥ単独（ＣＥＴ２２０）で得られるＥＧＦＰの発現レベルまたはＵＣＯＥの５’側に配置された選択エレメント（ｐｕｒｏｒ）で得られるＥＧＦＰの発現レベルに比べて約７倍に増加した発現レベルを生成することを示す。ＵＣＯＥおよび選択マーカーに隣接する発現された導入遺伝子が、発現のブーストを得るために必要とされることは明らかである。
【０１１０】
この効果は、特定の選択マーカーに限定されない。図７は、ヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥの５’側に作動可能に連結されたＥＧＦＰの発現と、５’側（ＣＥＴ７４５）または３’側（ＣＥＴ７４１）のいずれかに配置されたＳ．ｆｒａｄｉａｅネオマイシン耐性遺伝子の発現とを比較する。既に高い発現レベルのほぼ２倍を生じる。
【０１１１】
（実施例２  他の３’側に隣接する選択マーカーの効果）
（結果）
図５は、５’側にヒトＲＮＰ  ＵＣＯＥおよび３’側に隣接する種々の抗原物質耐性遺伝子にＥＧＦＰ導入遺伝子を隣接する効果を示す。ＣＥＴ７０１は、ＵＣＯＥを含まないが、野生型Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ  ｐｕｒｏｒを有するコントロールである。ＣＥＴ７２１は、５’側にＵＣＯＥおよび３’側にｐｕｒｏｒの両方を有する。ＣＥＴ７０４は、Ｓ  ｆｒａｄｉａｅ  ｎｅｏｒを含むが、ＵＣＯＥを含まず、ＣＥＴ７４１は、両方を含む。ＣＥＴ７０５は、Ｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｈｙｇｒｏｒを含むが、ＵＣＯＥを含まず、ＣＥＴ７５１は、両方を含む。ＣＥＴ７０６は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｙｇｒｏｒを有するが、ＵＣＯＥを有さず、ＣＥＴ７６１は、両方を有する。ＣＥＴ７０８は、コドン改変ｐｕｒｏｒを有するが、ＵＣＯＥを有さず、ＣＥＴ７８１は、両方を有する。全ての場合において、３’側に隣接する耐性遺伝子のブースト効果は、明白である。
【０１１２】
（実施例３  他のＵＣＯＥおよびＰｕｒｏ選択エレメントの組合せ）
（結果）
図２および図３に示されるように、人口的に構築したＵＣＯＥ（ＣＥＴ７１１）を有する匹敵するプラスミドからの発現は、蛍光の中央値およびポジティブ細胞の集団の両方について、ＲＮＰ  ＵＣＯＥで得られた発現に匹敵する。このことは、隣接する第２のＣｐＧリッチエレメントによるＵＣＯＥの効果の増幅の現象がＲＮＰ  ＵＣＯＥおよびｐｇｋ／Ｐｕｒｏエレメントの特定の組合せに制限されず、一般的な現象であることを実証する。図４におけるＣＥＴ７１１発現およびＣＥＴ７２１発現の比較は、わずかに低いレベルの発現がＣＥＴ７１１で得られたが、この発現は、ＵＣＯＥ単独で得られた発現よりもなお少なくとも６倍高かったことを示す。
【０１１３】
図６は、発現を駆動するためにマウスＣＭＶプロモーターを使用したヒトｈｎＲＮＡ  ＵＣＯＥ（ＣＥＴ８２１）およびマウスの等価物（ＣＥＴ８２４）のいずれかで得られた匹敵する効果を示す。ＣＥＴ７２１は、ヒトｈｎＲＮＰ  ＵＣＯＥを含み、ヒトＣＭＶプロモーターを使用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２３−７】
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【図２３−８】
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【図２３−９】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２５−６】
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【図２５−７】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２７−６】
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【図２７−７】
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【図２７−８】
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【図２７−９】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図２９−５】
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【図２９−６】
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【図２９−７】
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【図２９−８】
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【図２９−９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３１−５】
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【図３１−６】
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【図３１−７】
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【配列表】
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