(57)【要約】      （修正有）【課題】公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供すること。【解決手段】野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特性、及び／または、安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨであり、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径１２オングストローム以内の距離にあるアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項２】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とする請求項１記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項３】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が、改変前と比較して、分子量の大きなアミノ酸に置換していることを特徴とする請求項１記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項４】
改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項５】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５３位またはそれと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項６】
配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５３位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ５３Ｃ、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｔ及びＧ５３Ｖからなる群のうちいずれか１つのアミノ酸置換を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項７】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列における（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）および（Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養し、該培養物からフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法。
【請求項１２】
請求項１〜７項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコース測定用試薬。
【請求項１３】
請求項１〜７項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースセンサ。
【請求項１４】
請求項１〜７項のいずれか１項に記載されるフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコース測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をコードする遺伝子、該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の製造法及び該フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体のグルコース測定試薬への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１３９  （２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１３９  （２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１４６  （２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９６７  ；１４６  （２）：３２８−３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は熱安定性に優れかつ溶存酸素の受けない点で優位であるが、キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の１０％程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血液を測定する場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【０００６】
そこで我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、キシロースに作用性を低下させ、かつ十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。
【０００７】
他方、特許文献２には、アスペルギルス・テレウス属野生株を液体培養または小麦フスマ培養することによりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを得たこと、および、アスペルギルス・テレウス属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、組換え大腸菌、組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）、組換え酵母（Ｃａｎｄｉｄａ属）でそれぞれ発現させ得られた酵素を精製したことが記載されている。
また、特許文献２には、それらの酵素の性質試験、および、センサーに適用したときの特性比較についていくつかの事例が開示されている。
【特許文献２】ＷＯ  ２００６／１０１２３９
【０００８】
しかし、特許文献２には、産業上の要請の重要な要件の１つである大量生産に最も適していると思われた大腸菌で発現させた酵素について、極めて重要な要件である温度安定性の記載がなかった。そこで本願発明者は、酵素の安定供給という観点から、該酵素のアミノ酸配を改変することに加えて、該酵素を遺伝子組み換えにより生産することをも視野に含めて先行技術を再検討した。
その結果、意外にも、最も大量生産に適していると思われた大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒＦＡＤＧＤＨ）は、熱安定性が野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて大きく劣る場合があることが判明した。
例えば、発明者らが後述の方法によりアスペルギルス・オリゼから取得したａＦＡＤＧＤＨは、５０℃・１５分処理において約７７％の活性を維持していたが、大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒａＦＡＤＧＤＨ）の熱安定性は、５０℃・１５分処理において約１３％程度であった。また、アスペルギルス・テレウスＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒｔＦＡＤＧＤＨ）の熱安定性も、５０℃・１５分処理において約２８％程度であった。（特許文献１では、アスペルギルス・テレウスＢＰ−０８５７８を培養して取得した酵素の熱安定性は、５０℃・１５分処理において８９％と開示されている。）
特許文献２にその構造や製造方法が記載されている酵素についても、同様に、大腸菌で発現させて取得した酵素は、熱安定性が、野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて劣る可能性が高いと考えられた。
【０００９】
そこで我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、キシロースに作用性を低下させ、さらに、大腸菌で発現させた場合にも十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。
その結果、上述のような公知の血糖センサ用酵素の基質特異性ならびに安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。
【００１０】
すなわち本発明は、改変することにより基質特異性、及び／または、安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨである。好ましくは真核生物由来であり、更に好ましくは糸状菌由来であり、更に好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来である。
（１）本発明は、野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における５３位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨである。
（２）本発明は、アミノ酸置換を、配列番号２における、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ及びＧ５３Ｃからなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置に有する、上記（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨであることができる。
（３）本発明は、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における１６３位、１６７位および５５１位からなる群のうちいずれか１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、上記（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨであることができる。
（４）本発明は、配列番号２のアミノ酸配列における（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）および（Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、上記（３）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨであることができる。
（５）本発明は、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子であり、さらに、該遺伝子を含むベクターであり、さらに、該ベクターで形質転換された形質転換体であり、さらに、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法であることができる。
（６）本発明は、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットであり、また、グルコースセンサーであることができる。
（７）本発明は、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定方法であることができる。
（８）本発明の（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも五炭糖類に対する作用性が低下している。五炭糖としてはキシロースが例示できる。本発明の（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のＦＡＤＧＤＨよりもキシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の５．０％以下である。なお、キシロースに対する作用性とは、グルコースを基質とした場合とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％（グルコースを１とする）を意味する。
（１０）本発明の（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上していることが好ましい。本発明の（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であり、好ましくは４０％以上であり、更に好ましくは７０％以上である。このような安定性を維持することができれば、製剤時に加熱乾燥することが可能となる。
（１１）本発明の（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりもｐＨ安定性が向上していることが好ましい。本発明の（１）に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．０において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上であるか、または、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上、好ましくは９０％以上である。
【００１１】
これまで、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上する方策に関する報告としては特許文献３があり、その中で遺伝子レベルでのＦＡＤＧＬＤ改変手段を用いた検討が報告されている。
しかしながら、ＦＡＤＧＤＨの基質特異性を向上する方策として遺伝子レベルでの改変は行われていなかった。
【特許文献３】ＷＯ２００８／０５９７７７
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるＦＡＤＧＤＨの基質特異性の向上は測定精度の向上を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の詳細を説明する。
【００１４】
本発明の一実施形態は、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径１２オングストローム以内の距離にあるアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して基質特異性が向上したフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体である。（以下、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）
【００１５】
本発明において、改変前のＦＡＤＧＤＨは、特に限定されるものではないが、自然界に存在する種々の公知のＦＡＤＧＤＨが挙げられる。具体的には、アスペルギルス属、ペニシリウム属由来のものなどが挙げられ、好ましくはアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨ、さらに好ましくは配列番号２で示したアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨが挙げられる。配列番号２のＦＡＤＧＤＨは特許文献１の方法により取得することが可能である。
【特許文献１】特開２００７−２８９１４８
【００１６】
本発明における、ラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの結晶構造解析結果を図１に示す。
【００１７】
本発明における、ラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの結晶構造解析結果はｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ  ２．０（ＤＳ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて可視化することができる。
【００１８】
本発明における、ラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの結晶構造解析の活性中心の結果を図２に示す。
【００１９】
本発明において、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素から１２オングストローム以内の距離にあるアミノ酸とは、改変前のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性デヒドロゲナーゼの活性中心近傍に位置するアミノ酸のことを指す。
活性中心とはｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ  ２．０（ＤＳ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの立体構造により定義される部位である。フラビンアデニンジヌクレオチドからの距離も同ソフトを用いることで定義できる。
配列番号２のアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨの立体構造を例示する。これによれば、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素は活性中心に位置する。フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素から１２オングストローム以内の距離にあるアミノ酸は、基質の出入り口を構成するアミノ酸と定義することができる。基質の出入り口を構成するアミノ酸を、改変前のアミノ酸よりも分子量の大きなアミノ酸に置換することで、基質に対する立体的な障害が起こり、グルコースよりも小さな分子が活性中心に侵入することを制限されることから、この部位を標的として置換を行うことで基質特異性が向上すると考えられる。
このことから、活性中心近傍に位置し、基質の出入り口と考えられる部位を構成するアミノ酸を標的として欠失、置換もしくは付加することが熱安定性を向上させるのに効果的であると考えられる。
活性中心近傍に位置し、基質の出入り口と考えられる部位を構成するアミノ酸とは具体的には５３位のアミノ酸を示す。
【００２０】
本発明の一実施形態は、改変前のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列のうち、フラビンアデニンジヌクレオチドの５位の窒素原子から半径１２オングストローム以内の距離にあるアミノ酸を欠失、置換もしくは付加することにより、改変前と比較して基質特異性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体であって、改変前のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が、改変前と比較して、他のアミノ酸に置換していることを特徴とするＦＡＤＧＤＨ改変体である。
【００２１】
上記で示される本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するものであっても良い。配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものが、さらに好ましい。
また、改変前のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するものであっても良い。
【００２２】
本発明のＦＡＤＧＤＨは、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有するＦＡＤＧＤＨ改変体であり、例えば、配列番号２において、５３位、または、それらと同等の位置、すなわち他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体である。
【００２３】
より詳細には、５３位及びまたはそれらと同等の位置からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸は、改変前のアミノ酸と比較して分子量が大きいアミノ酸に置換することで、基質特異性を向上することが可能である。
具体的には５３位のグリシンがヒスチジン、アスパラギン、リジン、メチオニン、スレオニン、バリン及びシステインに置換したことで、基質の出入り口を狭くしたことにより基質特異性が向上したＦＡＤＧＤＨ改変体。
【００２４】
本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列における上記で示されるいずれかの位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
本発明において「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２のアミノ酸配列と、配列番号２と高い相同性（好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上）のアミノ酸配列を有する他のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼとを、相同性分析においてアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００２５】
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５３位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換がＧ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ及びＧ５３Ｃのいずれかに置換されているＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
【００２６】
あるいは、本発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、好ましくは配列表の配列番号２に記載されるアミノ酸配列の５３位またはそれと同等の位置のアミノ酸置換が（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）および（Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）及び（Ｋ１２０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ＋Ｋ３６９Ｒ）からなる群のうちいずれか１つのアミノ酸置換を有するＦＡＤＧＤＨ改変体が例示できる。
【００２７】
本願発明のＦＡＤＧＤＨ改変体は、種々の公知の手段で作製することが出来る。
以下に、配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変したＦＡＤＧＤＨ改変体の製造法を例示する。製造法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。
フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，  ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００２８】
作製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５・、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００２９】
なお、これらの過程で得られた、ＦＡＤＧＤＨ改変体をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体も、本発明の実施形態として含まれる。
配列番号１で示される塩基配列は、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列を示す。また、
配列番号１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も適用できる。
【００３０】
配列番号４１で示される塩基配列は、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列にゲノム情報よりシグナルペプチドと推測される塩基配列を付加した配列を示す。また、
配列番号４１で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も適用できる。
【００３１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列を示す。また、
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も本発明に適用できる。
【００３２】
配列番号４２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、本願発明者が同定した、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列の全配列にゲノム情報よりシグナルペプチドと推測される塩基配列を付加した配列を示す。また、
配列番号４２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も本発明に適用できる。
【００３３】
本発明の塩基配列は本グルコースデヒドロゲナーゼの発現を向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変えたものを含まれる。
【００３４】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し買い変体朴質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００３５】
培養物中のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、フラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００３６】
このようにして得られたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を得ることができる。
【００３７】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を含むグルコースアッセイキット（本発明で「グルコース測定用試薬」と「グルコースアッセイキット」は同義である。）、を特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体に加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００３８】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００３９】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のフラビンアデニン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００４０】
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ  ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００４１】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００４２】
実施例１：グルコース測定系を用いた改変型ＦＡＤＧＤＨ熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のＦＡＤＧＤＨ活性の測定方法に準じて行った。
まず、改変型ＦＡＤＧＤＨを約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々の改変型ＦＡＤＧＤＨ（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【００４３】
実施例２：ＦＡＤＧＤＨ遺伝子への変異導入  
野生型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン（５０・ｇ／ｍｌ；ナカライテスク社製）を含んだ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ；ｐＨ７．３）を摂取し、３０℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として５３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号１１の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、  グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００４４】
実施例３：改変型ＦＡＤＧＤＨを含む粗酵素液の調整
実施例２で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｓ２で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天；ｐＨ７．３）に塗布した後、３０℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ液体培地に摂取し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調整した。
【００４５】
実施例４：基質特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、７種の基質特異性が向上した変異体を取得した。これら７種の改変体をコードするプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７と命名した。
【００４６】
ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７の変異箇所を同定するためにＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１で配列番号２記載の５３番目のグリシンがシステイン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ３で配列番号２記載の５３番目のグリシンがリジン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ４で配列番号２記載の５３番目のグリシンがメチオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ６で配列番号２記載の５３番目のグリシンがスレオニン、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ７で配列番号２記載の５３番目のグリシンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2010035448.tif 000002
【００４８】
実施例５：基質特異性、及び／または、熱安定性が向上した変異体の作製
実施例４で調整したプラスミドｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ５を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号１２の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ２を鋳型として、１６３番目のグリシンをアルギニンに置換するよう設計した配列番号１３の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、さらに５５１番目のバリンをシステインに置換するよう設計した配列番号１４の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに実施例２の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び／または、熱安定性に優れた改変型ＦＡＤＧＤＨを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇所を同定するため実施例４の方法と同様にＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７００ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジンに、１６７番目のセリンがプロリンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６７番目のセリンがプロリンに、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６３番目のグリシンがアルギニンに、５５１番目のバリンがシステインに置換していることが確認された。実施例４と同様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０は基質特異性が向上していることが確認された。熱安定性を測定するため実施例３の方法と同様に、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を５０℃で１５分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０は熱安定性が向上していることが確認された。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2010035448.tif 000003
【００５０】
実施例５：改変型ＦＡＤＧＤＨの取得
改変型ＦＡＤＧＤＨ生産菌として、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ８、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ９、ｐＡＯＧＤＨ−Ｍ１０で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５・；ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＴＢ培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型ＦＡＤＧＤＨサンプルとした。表３に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００５１】
【表３】
2010035448.tif 000004
【００５２】
実施例６：ｐＨ安定性
実施例５で得た精製標品についてｐＨ安定性を知るために、ｐＨ３．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ３．５〜６．３：０．１Ｍ  酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．５：０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：０．１Ｍ  リン酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図３に示す。図３に示すようにｐＨ安定域の幅が広がっていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサ作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】フラビンアデニンジムクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶構造解析（全体図）
【図２】フラビンアデニンジムクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶構造解析（活性中心）
【図３】ＷＴ（野生型）、改変型ＦＡＤＧＤＨ精製標品のｐＨ安定性を示す。ｐＨ３．５〜６．３：酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．８：トリス塩酸バッファー、ｐＨ６．０〜７．７：リン酸バッファーをそれぞれ用いた。
【図１】
2010035448.tif 000005
【図２】
2010035448.tif 000006
【図３】
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【配列表】
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