(57)【要約】【課題】従来より簡便に麻疹ウイルスを検出可能な麻疹ウイルス検出方法を提供する。【解決手段】  図１に示される試験キットは、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法に用いられる試験キットであって、試料を収容するための試験容器１と、一端側４ａから試験容器１に挿入されて用いられるメンブレンアッセイ用試験具４と、検体と混合することによって測定試料を調製するための検体処理液１５を収容した検体処理容器１４とを備える。このような試験キットを作製することにより、簡便に麻疹ウイルスを検出することができる。【選択図】図１
2010122205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能な第１のモノクローナル抗体と、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合し、且つ標識された第２のモノクローナル抗体とを用いて、検体に含まれる麻疹ウイルスを検出する麻疹ウイルス検出方法。
【請求項２】
検体と、非イオン性界面活性剤を含む検体処理液とを混合して測定試料を調製する工程をさらに備え、
調製された測定試料に含まれる麻疹ウイルスを検出する請求項１に記載の麻疹ウイルス検出方法。
【請求項３】
検体が、唾液、鼻汁、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液および咽頭拭い液からなる群から選択される請求項１又は２に記載の麻疹ウイルス検出方法。
【請求項４】
第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、麻疹ウイルス核タンパク質の１３５位から２４１位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体、麻疹ウイルス核タンパク質の４８５位から５２５位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体、および麻疹ウイルス核タンパク質の９１位から１３４位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１乃至３に記載の麻疹ウイルス検出方法。
【請求項５】
第２のモノクローナル抗体が、麻疹ウイルス核タンパク質の９１位から１３４位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体である、請求項４に記載の麻疹ウイルス検出方法。
【請求項６】
麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能な第１のモノクローナル抗体が担持された判定部を含む展開用膜担体と、
麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合し且つ標識された第２のモノクローナル抗体を保持する標識保持部材とを備える、検体に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのメンブレンアッセイ用試験具。
【請求項７】
判定部は、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１および第２のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合する第３のモノクローナル抗体をさらに担持する請求項６に記載のメンブレンアッセイ用試験具。
【請求項８】
請求項６又は７のいずれかに記載のメンブレンアッセイ用試験具と、
非イオン性界面活性剤を含み、検体と混合して測定試料を調製するための検体処理液と、を備える、測定試料に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのメンブレンアッセイ用試験キット。
【請求項９】
測定試料を収容可能であり、前記メンブレンアッセイ用試験具が挿入可能に構成された試験容器をさらに備える請求項８に記載のメンブレンアッセイ用試験キット。
【請求項１０】
麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能な第１のモノクローナル抗体が担持された判定部を含む膜担体を備える試験具と、
麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合し且つ標識された第２のモノクローナル抗体を含む標識液を備える、検体に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのメンブレンアッセイ用試験キット。
【請求項１１】
判定部は、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１および第２のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合する第３のモノクローナル抗体をさらに担持する請求項１０に記載のメンブレンアッセイ用試験キット。
【請求項１２】
標識液は、非イオン性界面活性剤をさらに含有する請求項１０又は１１のいずれかに記載のメンブレンアッセイ用試験キット。
【請求項１３】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６４、ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６５およびＮＩＴＥ  ＢＰ−５６６からなる群から選択されるハイブリドーマ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麻疹ウイルス抗原に結合可能な抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を用いて、試料中の麻疹ウイルスを検出するための麻疹ウイルス検出方法に関する。また、本発明は、麻疹ウイルスを検出するためのラテラルフロー式メンブレンアッセイ用試験具、およびこれを用いたメンブレンアッセイ用試験キットに関する。また、本発明は、麻疹ウイルスを検出するためのフロースルー式メンブレンアッセイ用試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属し、直径１００〜２５０ｎｍのエンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。麻疹ウイルスに感染すると、麻疹ウイルスは呼吸器上皮細胞にて最初に増殖し、その後リンパ節、脾臓、胸腺など全身のリンパ組織を中心に増殖してリンパ球減少や免疫抑制などを発症させる。麻疹ウイルスは感染力が非常に強く、一旦ヒトに感染すれば二次感染を引き起こす虞もあるため、麻疹感染の検査は極めて重要である。
【０００３】
麻疹感染の有無を検査する方法として、被験者の体内に存在する、麻疹ウイルスに対する抗体を検出する方法が知られている。例えば特許文献１には、麻疹特異的免疫グロブリンＩｇＭによって認識される少なくとも1つのエピトープを含む組み換え麻疹核タンパク質抗原と、ヒト血清試料とを接触させ、前記抗原に結合した麻疹特異的免疫グロブリンＩｇＭの存在を検出する方法が記載されている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法には、次の点で問題がある。すなわち、麻疹ウイルスに感染しても、感染者の体内においてＩｇＭの抗体価が上昇するまでには少なくとも３日程度の時間がかかるため、上記の方法では麻疹ウイルスの感染を早期に発見することができない。そればかりか、麻疹ウイルスに感染してからＩｇＭの抗体価が上昇するまでの間に上記の方法によって検査を行えば、擬陰性と判断してしまうおそれもある。
【０００５】
特許文献１における問題を解決する方法として、特許文献２には、検体試料中に含まれる麻疹ウイルスを検出する方法が記載されている。具体的には、微小固体担体の表面にウイルス表層のタンパク質に親和性のある分子を固定させたウイルス凝集検査薬として、抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を微小固体担体の表面に固定させた麻疹ウイルス検査薬が記載されている。
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９３／２２６８３号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９７／０７４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載の方法によれば、麻疹ウイルスの感染を早期に発見することはできるものの、上記方法においては、検体の測定とは別に陽性対照の測定と陰性対照の測定とを行う必要があるため、検査に要する作業が煩雑である。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、陽性対照および陰性対照の測定を行う必要がなく、従来より簡便に麻疹ウイルスを検出することが可能な麻疹ウイルス検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記の麻疹ウイルス検出方法を実現可能なメンブレンアッセイ用試験具、およびメンブレンアッセイ用試験キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題に鑑み、本発明の第１の観点による麻疹ウイルス検出方法は、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能な第１のモノクローナル抗体と、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合し、且つ標識された第２のモノクローナル抗体とを用いて、検体に含まれる麻疹ウイルスを検出することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の第２の観点による、検体に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのメンブレンアッセイ用試験具は、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能な第１のモノクローナル抗体が担持された判定部を含む展開用膜担体と、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合し、且つ標識された第２のモノクローナル抗体を保持する標識保持部材とを備えることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の第３の観点による、測定試料に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのメンブレンアッセイ用試験キットは、上記のようなメンブレンアッセイ用試験具と、非イオン性界面活性剤を含み、検体と混合して測定試料を調製するための検体処理液と、を備えることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の第４の観点による、検体に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのメンブレンアッセイ用試験キットは、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能な第１のモノクローナル抗体が担持された判定部を含む膜担体を備える試験具と、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であって第１のモノクローナル抗体と異なるエピトープに結合し、且つ標識された第２のモノクローナル抗体を含む標識液とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、検体に含まれる麻疹ウイルスの核タンパク質を第１のモノクローナル抗体によって捕捉するとともに、第２のモノクローナル抗体によって捕捉された麻疹ウイルス核タンパク質を標識することができる。したがって、標識された麻疹ウイルス核タンパク質を検出することで検体に含まれる麻疹ウイルス核タンパク質の存否を判定することができ、陽性対照あるいは陰性対照の測定を行うことなく、検体の測定のみで簡便に麻疹ウイルスを検出することができる。さらに、本発明によれば、簡便に麻疹ウイルスを検出可能なラテラルフロー式メンブレンアッセイ用試験具、およびこれを用いたメンブレンアッセイ用試験キットを提供することができる。さらに、本発明によれば、簡便に麻疹ウイルスを検出可能なフロースルー式メンブレンアッセイ用試験キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ラテラルフロー式メンブレンアッセイ用（イムノクロマトグラフィー用）試験キットの概略構成図である。
【図２】図１のメンブレンアッセイ用試験キットの試験具の（ａ）平面図、（ｂ）側面図である。
【図３】検体処理容器の分解平面図である。
【図４】図１のメンブレンアッセイ用試験キットの使用状態を示す図である。
【図５】メンブレンアッセイ用試験具の他の一例を示す図である。
【図６】フロースルー式メンブレンアッセイ用試験キットの概略構成図である。
【図７】図６の試験具の（ａ）平面図、（ｂ）Ｘ−Ｘ矢視断面図である。
【図８】エピトープ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書における「モノクローナル抗体」とは、モノクローナル抗体のフラグメントおよびその誘導体をも含む。モノクローナル抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなどが例示される。モノクローナル抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭでもよい。
【００１６】
抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体は、麻疹ウイルスの核タンパク質に結合可能なものが用いられる。核タンパク質は、エンベロープのような他の構造タンパク質に比べて抗原性が強く、患者検体中に多く含まれ得ると考えられることから、抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体による検出感度を高くすることが可能だからである。
【００１７】
抗麻疹モノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、麻疹ウイルス抗原を被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。２６４９抗体を産生することができるハイブリドーマＭＶ２−２６４９は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６３、３２４１抗体を産生することができるハイブリドーマＭＶ２−３２４１は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６４、３７０７抗体を産生することができるハイブリドーマＭＶ２−３７０７は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６５、３２０抗体を産生することができるハイブリドーマＭＶ３−３２０は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−５６６として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている（受託日：２００９年７月２２日）。
【００１８】
麻疹ウイルス抗原は、麻疹感染者の生体試料から精製して得ることができる。また、麻疹ウイルス抗原は、麻疹ウイルス核タンパク質をコードするＤＮＡをプラスミドに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。
【００１９】
抗原を被免疫動物に免疫する際は、アジュバントを投与することが好ましい。アジュバントを用いることによって被免疫動物の抗原への免疫応答性を高めることができる。アジュバントの種類は特に限定されないが、例えばフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、モノフォスフォリルリピッドＡ（ＭＰＬ、商品名Ｒｉｂｉ）、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ、商品名ＲＩＢＩ）、モノフォスフォリルリピッドＡおよびトレハロースジマイクレート混合液（ＭＰＬ＋ＴＤＭ、商品名RIBI Adjuvant System）、百日咳ワクチン（Bordetella pertussis Vaccine）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）などが用いられる。また、これらのうち複数のアジュバントを組み合わせて用いてもよい。初回免疫時にＦＣＡ、二回目以降の免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉを用いるのが好ましい。
【００２０】
アジュバント投与の有無や投与経路、被免疫動物の種類などによって免疫のスケジュールを適宜変更させることができる。以下は、被免疫動物としてマウスを用いた場合の免疫について説明する。
初回免疫として、アジュバント混合麻疹ウイルス抗原溶液を腹腔内、皮下又は筋肉内に注射する。注射するアジュバント混合麻疹ウイルス抗原溶液の体積は０．０５ｍｌ〜１ｍｌであることが好ましく、含まれる麻疹抗原の質量は１０〜２００μｇであることが好ましい。アジュバントを用いない場合は、麻疹ウイルス抗原の含有量を多くして腹腔内注射することにより免疫してもよい。初回免疫から約２〜４週間毎に１〜６回追加免疫を行う。追加免疫から約１〜４週間後に、麻疹ウイルス抗原溶液を静脈注射することにより最終免疫を行う。最終免疫から約３〜５日後、マウスからの脾細胞を分離して、抗体産生細胞を得ることができる。
【００２１】
上記のようにして作製された抗体産生細胞は、骨髄腫細胞と融合される。骨髄腫細胞の由来は特に限定されず、マウス、ラット、ヒトなどを由来とするものが用いられるが、被免疫動物と同種の動物由来の骨髄腫を用いることが好ましく、さらに好ましくは同種同系統の動物由来の骨髄腫が用いられる。骨髄腫の由来としてマウスを用いる場合には、例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ−６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８／６５３などの株化骨髄腫細胞を用いるのが好ましい。骨髄腫細胞にはイムノグロブリン軽鎖を産生しているものがあり、このような骨髄腫細胞を融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生するイムノグロブリン重鎖とこの軽鎖とが結合する場合がある。そのため、好ましくはイムノグロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが好ましい。
【００２２】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが挙げられる。ＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地又は緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１：１から１０：１、好ましくは５：１から１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７度、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄し、ＰＥＧ溶液を除いてヒポキサンチン−チミジン培地（ＨＴ培地）などに再懸濁し、例えばマイクロタイタープレート中に播種して培養を続けることができる。
【００２３】
融合後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地としては、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖し得る培地であれば特に限定されない。通常はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１日後に、選択培地を添加、または、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、７〜10日間培養することによって行う。
【００２４】
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているか否かは、培養上清を採取して抗体価アッセイを行うことによって確認することができる。抗体価アッセイとしては公知の方法を用いることができ、特に限定されない。例えば、固相化した抗原に段階希釈した上記上清を添加して反応させ、さらに蛍光物質、酵素、又は放射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させれば、上記上清中に産生されている抗体を検出することができ、また抗体価を測定することができる。このようにプレートの各ウェルの培養上清をスクリーニングし、所望の抗体を産生しているハイブリドーマを得ることができる。
【００２５】
次に、単一クローンを分離する。分離法としては、公知の方法を用いることができ特に限定されない。例えば、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法などが挙げられる。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマを１cell/wellとなるように培地で段階希釈し、培養プレートへ播き込こんだ後、培養する。約10日間培養後、1 colony/wellの培養上清中に目的とするモノクローナル抗体が産生されているか確認することで、目的のハイブリドーマクローンを単離することができる。得られたハイブリドーマクローンは、約１０ｗ／ｖ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍結させて−１９６〜−７０度で保存すると、半永久的に保存可能である。細胞は用時３７度前後の恒温槽中で急速に融解して使用できる。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用することが好ましい。
【００２６】
ハイブリドーマが産生する抗体のイムノグロブリンサブクラスを調べるためには、ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いるとよい。
【００２７】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択して用いる。例えば、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数ｍｇ／ｍｌの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。in vivoで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクローナル抗体の取得方法は、in vivoで行なう方法に比べて、抗体産生量は少ないがマウス腹腔内に含まれるイムノグロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく生成が容易であるという利点を有する。
【００２８】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する場合、例えば予めプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したマウスの腹腔内へハイブリドーマを移植し、約１週間後から貯留した腹水を採取する。異なる動物種の細胞を融合させたハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
【００２９】
細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法、高密度培養方法、スピナーフラスコ培養方法などの培養法を用いることができる。これらのうち何れかの方法を用いることにより、ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。
【００３０】
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることによって行なうことができる。イムノグロブリン精製法としては特に限定されず、例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などが挙げられる。
【００３１】
さらに、モノクローナル抗体がマウスＩｇＧである場合、プロテインＡ結合担体或いは抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能である。
【００３２】
以上のようにして作製された抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体は、検体または検体を用いて調製された試料に含まれる麻疹ウイルスを検出するためのイムノアッセイに用いることができる。麻疹ウイルスを検出するためのイムノアッセイ法としては、麻疹ウイルスに対する第１及び第２の抗体を用い、固相に固定された第１の抗体と、標識された第２の抗体と、麻疹ウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含む、いわゆるサンドイッチ法を検出原理とするものが好ましい。
【００３３】
さらに、本発明は、抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体として、麻疹ウイルス核タンパク質の１３５位から２４１位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体（１３５−２４１抗体）、麻疹ウイルス核タンパク質の４８５位から５２５位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体（４８５−５２５抗体）、および麻疹ウイルス核タンパク質の９１位から１３４位のアミノ酸配列を認識して結合するモノクローナル抗体（９１−１３４抗体）の３種のモノクローナル抗体を提供する。ここで、麻疹ウイルス核タンパク質のアミノ酸配列としては、配列番号９に記載のものが挙げられる。
サンドイッチ法による麻疹ウイルスの検出においては、上記３種のモノクローナル抗体のうち一の抗体を標識される抗体として、他の抗体を固相に固定される抗体として用いることができる。使用される抗体の組み合わせは特に限定されないが、固相に固定される第１の抗体として、１３５−２４１抗体または４８５−５２５抗体を使用し、標識される第２の抗体として、９１−１３４抗体を使用することが検出感度を向上させる観点から好ましい。なお、第１の抗体に加えて、第１および第２の抗体と異なる第３の抗体を固相に固定してもよく、１３５−２４１抗体および４８５−５２５抗体の両方を同じ固相に固定して用いる形態であってもよい。
【００３４】
サンドイッチ法によって麻疹ウイルスを検出するに際して、抗体が固定される固相としては、抗体を従来公知の方法によって固定可能なものを用いることができ、例えば、メンブレン、ビーズ、粒子、ナノ粒子、試験管、マイクロタイタープレートなど公知のものを用いることができる。また、抗体を標識するための標識物質としては、酵素、放射性同位元素、蛍光発光性標識物質、着色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。
【００３５】
上記において示した種々のサンドイッチ法を検出原理とするイムノアッセイ法の中でも、特に検査の簡便性、ひいては迅速性の観点から、固相にメンブレンを用いたメンブレンアッセイ法が好ましい。メンブレンアッセイ法としては、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法と、フロースルー式メンブレンアッセイ法が挙げられ、本実施形態による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体は、そのいずれの方法にも適用することができる。
【００３６】
ここで、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法とは、捕捉物質が固定化された判定領域を含むメンブレンに試料を滴下し、試料をメンブレンに対して平行に展開させることで、判定領域に捕捉された測定対象物を検出する方法である。一方、フロースルー式メンブレンアッセイ法とは、測定対象物（抗原）を捕捉するための捕捉物質（抗体）を表面に固定化させたメンブレンに、被測定対象物を含む試料を滴下し、試料をメンブレンに対して垂直に通過させることで膜表面に捕捉された測定対象物を検出する方法である。いずれの方法においても、測定対象物は所定の標識物質によって標識されるため、メンブレン上に標識が現れるか否かによって測定対象物の存否を確認することができる。
以下、本実施形態によるメンブレンアッセイ用試験キットについて、図面を参照しながら説明する。
【００３７】
図１は、第１の実施形態によるメンブレンアッセイ用試験キット（以下、試験キットと呼称する）の外観を示した図である。この試験キットは、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法（ラテラルフロー式イムノクロマトグラフィー法）に用いられる試験キットであって、試料を収容するための試験容器１と、一端側４ａから試験容器１に挿入されて用いられるメンブレンアッセイ用試験具４（以下、試験具４と呼称する）と、検体と混合することによって測定試料を調製するための検体処理液１５を収容した検体処理容器１４とを備える。図２は、図１の試験具４の（ａ）平面図、（ｂ）側面図である。
【００３８】
試験具４は、図２に示すように、表面に粘着層を有するプラスチック板からなる基材１２上に、コットンの不織布からなる試料添加用部材５と、グラスファイバーの不織布からなる標識保持部材７と、ニトロセルロースの多孔体からなるクロマトグラフィー用膜担体（以下、クロマト用膜担体と呼称する）９と、セルロースの不織布からなる吸収部材１１とを備える。
標識保持部材７は、試料添加用部材５に接触して配置され、麻疹抗原に特異的に結合可能であり、且つ標識された抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体（以下、標識化抗体と呼称する）と、対照用標識物質を保持する。標識化抗体は、青色ラテックス粒子で標識された抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体であり、対照用標識物質は、赤色ラテックス粒子で標識されたストレプトアビジンである。クロマト用膜担体９は、標識保持部材７に接触して配置され、上流側から順に、ライン状の判定部９Ａおよび対照部９Ｂを有する。判定部９Ａには麻疹ウイルス抗原に特異的に結合可能な抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体（以下、捕捉用抗体と呼称する）が、対照部９Ｂにはビオチンが固定されている。
吸収部材１１は、クロマト用膜担体９と接触するように配置されている。
【００３９】
試料中に麻疹ウイルスが含まれていると、標識保持部材７に保持された標識化抗体は、麻疹ウイルスの所定部位を認識して、抗原抗体反応により結合して複合体を形成する。次に、クロマト用膜担体９の判定部９Ａに固定された捕捉用抗体は、麻疹ウイルスの別の部位を認識して複合体を捕捉する。複合体が捕捉されると、判定部９Ａには青色のラインが現れ、麻疹ウイルスの存在が目視により判定される。
【００４０】
また、アビジンは、クロマト用膜担体９にある捕捉用抗体には捕捉されないが、ビオチンと特異的に結合するので、対照用標識物質は対照部９Ｂに固定されたビオチンに捕捉される。対照用標識物質が捕捉されると、対照部９Ｂには赤色のラインが現れ、対照用標識物質が対照部９Ｂに到達したことが目視によって確認される。対照部９Ｂは、判定部９Ａの下流に設けられるので、赤色のラインを確認することにより、試料が判定部９Ａを通過したことが確認される。
【００４１】
試験容器１は、開口１ｂを有するテーパー状の受け入れ部１６と、底部１ａに試料を収容する試料収容部１７とを有する試験管状の有底筒状の容器から構成されている。
【００４２】
試験容器１の外壁面には、ラベル３が貼付されている。ラベル３は、試験具４を試験容器１に挿入した際の試験具４の判定部９Ａおよび対照部９Ｂに対応する位置に、試験具４の判定部９Ａおよび対照部９Ｂを示す表示２４ａ、２４ｂを有している。図に示すように、このラベル３の表示２４ａ、２４ｂは、それぞれ、「T」、「！」である。
【００４３】
図３は、検体処理容器１４の分解平面図である。図に示すように、検体処理容器１４は、プラスチックボトル１４１、ノズル１４２およびキャップ１４３を備えて構成されている。ボトル１４１は、その内部に検体処理液１５を収容しており、キャップ１４３によりボトル１４１の開口が密閉された状態で保存されている。ノズル１４２は先端に試料排出口を備えており、内側にはろ過部材が装着されている。
【００４４】
ノズル１４２の内側に装着されたろ過部材は、第１ガラス繊維濾紙と、第１ガラス繊維濾紙より膜口径が大である第２ガラス繊維濾紙と、不織布状のガラスフィルターとが、この順に積層されたものである。また、このろ過部材は、ガラスフィルターがノズル１４２のボトル１４１との装着部側に、第１ガラス繊維濾紙が試料排出口側になるようにノズル１４２に装着されている。なお、ろ過部材は、この構成に限定されるものではないが、検体中の粘性成分を除去するために不織布状のガラスフィルターを用いることが好ましく、この不織布状のガラスフィルターにガラス繊維濾紙を１枚もしくは２枚組み合わせて用いることが好ましい。
【００４５】
検体処理液１５は、界面活性剤を含有する水溶液であることが好ましい。これは麻疹ウイルスが外皮（エンベロープ）を有しているため、界面活性剤により外皮に孔をあけて内部の抗原タンパク質を検体処理液中に放出させるためである。
【００４６】
界面活性剤の種類は特に限定されず、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、あるいは非イオン性界面活性剤など広範のものを使用することができる。
【００４７】
非イオン性界面活性剤は、好ましくはポリオキシエチレン系のものを使用することができ、より好ましくはエーテル型のものを使用することができる。具体的には、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の混合物が好ましく用いられる。
【００４８】
両性界面活性剤は、特に限定されないが、3-〔（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕-1-プロパンスルホネート（CHAPS）等が好ましく用いられる。また、非イオン性界面活性剤の検体処理液１５への添加量を多くする場合には、その溶解性を向上させて検体処理液の保存安定性を高めるために両性界面活性剤を併用するようにしてもよい。
【００４９】
陰イオン性界面活性剤は、特に限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が好ましく用いられる。
【００５０】
検体処理液１５は、非特異反応を防止するためにチオシアン酸系化合物を含有することが好ましい。チオシアン酸系化合物は、チオシアン酸（ＨＮＣＳ）の他、チオシアン酸エステルやチオシアン酸塩等水溶性であれば、特に制限はない。チオシアン酸を構成する塩としては、ナトリウム、カリウム等の金属を含む無機塩基、あるいは有機塩基アンモニウム塩等が挙げられる。さらに、その塩の水和物や溶媒和物をも包含する。具体的には、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸グアニジン等が挙げられる。好ましくはチオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジンが適用される。
【００５１】
また、検体処理液１５は、検体（特に鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液および咽頭ぬぐい液）中に存在する高粘性物質の粘性を低下させるために、還元剤を含有することが好ましい。また、還元剤としては含硫還元性化合物が好ましく、例えば、メルカプトエチルアミン、メルカプトエチルアミン塩酸塩、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、Ｎ−アセチル−Ｌシステイン、二臭化水素酸Ｓ−２アミノエチルイソチオ尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ハイドロサルファイト塩、亜硫酸塩等が挙げられる。
【００５２】
また、検体処理液１５は、抗原タンパクを分解する酵素活性を抑えたり、非特異反応を低下させるためにキレート剤を含有しても良い。キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン４酢酸、１，２−シクロヘキサンジアミン４酢酸、ヘキサメチレンジアミン４酢酸、イミノ２酢酸、ヒドロキシエチルイミノ２酢酸、１，３−ジアミノプロパン−２−オール４酢酸、ジエチレントリアミン５酢酸、エチレンジアミン２酢酸、エチレンジアミン２酢酸２プロピオン酸、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）４酢酸、エチレンジアミン−テトラキス（メチレンホスホン酸）、エチレンジアミン２プロピオン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシルエチル）エチレンジアミン３酢酸、ニトリロ３酢酸、ニトリロ３プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、２（ヒドロキシエチル）グリシンおよび１，２−ジアミノプロパン４酢酸、およびこれらの塩を挙げることができる。
【００５３】
また、検体処理液１５にアルカリ金属イオンを含有させるようにしてもよい。アルカリ金属イオンとしては、リチウム＋（Ｌｉ＋）、ナトリウム＋（Ｎａ＋）、カリウム＋（Ｋ＋）、ルビジウム＋（Ｒｂ＋）、セシウム＋（Ｃｓ＋）、フランシウム＋（Ｆｒ＋）等が例示されるが、好ましくはナトリウム、カリウムを使用することができる。又アルカリ金属イオンは一種又は二種以上使用することができる。このようなアルカリ金属イオンを生じうる化合物は特に限定されないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ＥＤＴＡナトリウム塩、アジ化ナトリウムからなる群より選ばれる一種又は二種以上の混合物を使用することができる。アルカリ金属イオンの添加により非特異反応を抑制することができる。アルカリ金属イオンの含有量は、０．３Ｍ〜２．０Ｍ、好ましくは０．４Ｍ〜１．５Ｍ、より好ましくは０．４５Ｍ〜１．０Ｍである。
【００５４】
また、検体処理液１５は、緩衝剤を含有することが好ましく、例えば、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPSなどのGood緩衝剤を挙げることができ、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPSが好ましく、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPESがより好ましい。検体処理液のｐHは５〜１０、好ましくは５．５〜９．０、より好ましくは６．０〜８．０である。
【００５５】
検体処理液１５と混合される検体は、被検者から採取された生体成分であれば特に限定されない。例えば、血液、血清、尿、鼻汁、唾液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液または咽頭拭い液が挙げられ、特に麻疹感染者において麻疹ウイルスが検出されやすい唾液、鼻汁、鼻腔拭い液または咽頭拭い液が好ましい。
【００５６】
次に、本実施形態による試験キットの使用方法について、図４を用いて説明する。
まず、検体処理容器１４のキャップ１４３を開け、採取した検体をボトル１４１内に加え、検体処理液１５と混和し、測定試料１３を調製する。その後、キャップ１４３に代えてノズル１４２をボトル１４１の開口部に装着し、測定試料１３をろ過部材４４を介して試料排出口４６から試験容器１に供給する。次に、試験具４を一端４ａから試験容器１に挿入し、一端４ａを試験容器１の底部１ａに接触させる（なお、ここでいう「底部」とは、試験容器１の丸みを帯びた部分を意味する）。これにより、試験具４と試験容器１とが上下方向に位置合わせされる。この状態で、１０〜２０分程度放置すると、測定試料１３が毛管現象により、試料添加用部材５、標識保持部材７、クロマト用膜担体９、吸収部材１１を順次移動する。測定試料１３が、標識保持部材７を通過する際に、標識保持部材７に保持されている標識物質（標識化抗麻疹モノクローナル抗体及び対照用標識物質）が測定試料中に溶出する。測定試料１３に麻疹ウイルスが含まれていると、上述した作用により、判定部９Ａには青色のラインが現れる。また、ウイルスの有無に関わらず、対照部９Ｂに赤色のラインが現れる。
【００５７】
なお、以上においては特定の実施形態を例にとって説明したが、本実施形態による試験キットは、このような例に限られず、種々の変更を伴ない得るものである。
【００５８】
例えば、試料添加用部材５として、コットンに代えて、グラスファイバー、セルロースファイバーなどの材質のものを用いてもよい。また、標識保持部材７として、グラスファイバーに代えて、セルロースファイバーを用いてもよい。また、標識化抗体および対照用標識物質は、着色ラテックス粒子以外にも、酵素、蛍光発光性標識、磁性体標識、放射性同位元素、金コロイド等によって標識されていてもよい。また、クロマト用膜担体９として、ニトロセルロースに代えて、ナイロン（例えば、カルボキシル基やアルキル基を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、セルロースアセテートを用いてもよい。また、吸収部材１１として、セルロースに代えて、グラスファイバーを用いてもよい。
このように、試料添加用部材５、標識保持部材７、クロマト用膜担体９及び吸収部材１１には、不織布又は多孔質部材以外にも、毛管現象により試料を展開可能な種々の構造のものを用いることができる。
【００５９】
また、上記実施形態においては、判定部９Ａが一種類の抗麻疹モノクローナル抗体のみを担持した構成を例示したが、このような構成に限らず、判定部は二種類以上の抗麻疹モノクローナル抗体を担持した構成であってもよい。例えば、試験具４を、二種類以上の抗麻疹モノクローナル抗体を含む試料をクロマト用膜担体９に塗布することによって作製してもよい。このように二種類以上の抗麻疹モノクローナル抗体を判定部に備えた構成とすることにより、麻疹ウイルスの検出感度が向上し、ひいては偽陰性のおそれを低減することができる。また、二種類の抗麻疹モノクローナル抗体を、クロマト用膜担体９上に別々に担持させることにより、判定部を二つ以上設けた構成としてもよい。
【００６０】
また、上記実施形態においては、測定試料１３を収容するための試験容器１を備え、試験具４を試験容器１に挿入することによって検査を行う構成を例示したが、このような構成に限らず、試験容器１を備えない構成であってもよい。例えば、検体処理液１５によって調製された測定試料１３を試料添加用部材５に直接に滴下するように構成してもよい。このように構成する場合には、試験具４を、例えば、試料添加用部材５、クロマト用担体９および吸収部材１１に対応する位置に開口を有するケースに収容した構成とすることが好ましい。このような構成の試験具４の一例を図５に示す。図５に示すように、試験具４をケース４０に収容することにより、試験具４の各部材から測定試料が漏れ出ることを防止でき、衛生的に検査を行うことができる。加えて、ケース４０に設けられた複数の開口によって、測定試料１３に含まれる液体成分が蒸発し易くなり、測定試料の展開が促進される。
なお、図５に示した構成においては、ケース４０の試料添加用部材５に対応する位置に設けられた開口５０は、内側に向かって開口面積が小さくなるように、いわゆるテーパー状に形成されている。このような構成により、試料用添加部材５に滴下された測定試料は、開口５０に一定量貯留されるため、過剰に測定試料を滴下したとしても、測定試料が試験具４から溢れにくくなっている。また、測定試料が一定量貯留されることにより、貯留された測定試料が試験具４上を順次展開していくため、少量の測定試料を定期的に滴下する手間が省け、検査を簡便に行うことができる。
【００６１】
以上においては、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ用試験キットについて説明したが、本実施形態による抗麻疹モノクローナル抗体は、フロースルー式メンブレンアッセイ用試験キットに適用することも可能である。以下、図面を参照しながら、フロースルー式メンブレンアッセイ用試験キットについて説明する。
【００６２】
図６は、第２の実施形態によるメンブレンアッセイ用試験キットを示す図である。この試験キットは、フロースルー式メンブレンアッセイ法に用いられる試験キットであって、試験具３１と、検体と混合して測定試料を調製するための検体処理液３７を収容する検体処理容器３６とを備える。
【００６３】
図７（ａ）は、試験具３１の平面図、図７（ｂ）は、Ｘ−Ｘ矢視断面図である。試験具３１は、下層から順に吸収部材３５と、膜担体３４と、カバー部材３２とを備え、これらが積層されて構成されている。カバー部材３２は開口３３を有し、この開口３３を介して、下層に配置された膜担体３４の判定部３４Ａが露出されるように構成されている。判定部３４Ａには、捕捉用抗体が担持されている。
【００６４】
検体処理容器３６は、第１の実施形態における検体処理容器１４と同様の構成である。検体処理容器３６に収容された検体処理液３７は、第１の実施形態における検体処理液１５と同様の成分を含み、さらに本実施形態における検体処理液３７は、標識化抗体を含有している。
【００６５】
次に、本実施形態による試験キットの使用方法について説明する。
まず、第１の実施形態において説明したように、検体を検体処理液３７に懸濁し、測定試料を調製する。検体に麻疹ウイルスが含まれていると、検体処理液３７に含まれる標識化抗体と麻疹ウイルスとが抗原抗体反応により結合し、測定試料中に麻疹ウイルス−標識化抗体からなる複合体が形成される。
次に、調製された測定試料を、第１の実施形態において説明した手順と同様にして、試験具３１の開口３３に所定量滴下する。この状態で２０分程度放置すると、測定試料が膜担体３４を通過し、その下層に配置された吸収部材３５によって吸収される。測定試料に麻疹ウイルスが含まれていると、膜担体３４の判定部３４Ａに担持された捕捉用抗体が、標識化抗体と麻疹ウイルスとの結合部位と異なる部位を認識して麻疹ウイルスに結合し、判定部３４Ａ上に標識化抗体−麻疹ウイルス−捕捉用抗体からなる複合体が形成される。これにより、判定部３４Ａに青色のラインが現れる。よって、判定部３４Ａに青色のラインが現れたか否かを目視で判定することにより、麻疹ウイルスの存在を知ることができる。
【００６６】
なお、本実施形態においては、標識化抗体を検体処理液３７と同じ容器に収容した構成について説明したが、このような構成に限られない。例えば、標識化抗体と検体処理液３７とを別々の容器に収容した構成であってもよい。また、例えば、標識化抗体を測定試料に含まれる液体成分によって遊離可能に膜担体３４に保持させた構成であってもよい。
【００６７】
以上説明したように、本実施形態によれば、抗麻疹モノクローナル抗体を用いて簡便且つ迅速に麻疹ウイルスを検出可能な試験キットを提供することができる。さらに、第１の実施形態によるメンブレンアッセイ用試験キットであれば、試験容器１と、試験具４と、検体処理容器１４とによって、第２の実施形態によるメンブレンアッセイ用試験キットであれば、試験具３１と、検体処理容器３６とによって、少ない部品点数で麻疹ウイルスを検出することができ、簡便に検査を行うことができる。
【実施例】
【００６８】
１．モノクローナル抗体の作製
１−１．麻疹ウイルス核タンパク質の作製
野生の各麻疹ウイルス株より抽出したＲＮＡから、逆転写反応によって、ｃＤＮＡを合成した。合成した各ｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、麻疹ウイルス核タンパク質のＤＮＡ産物を合成し、小麦胚芽無細胞発現用試薬キット  ENDEXT（登録商標）Wheat Germ Expression TRI-GG Kit（セルフリーサイエンス社）を用いて、キット付属のベクターにＤＮＡ産物を組み込み、麻疹ウイルス核タンパク質を発現させ、抗原液を作製した。シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び配列解析ソフト（日立ソフト社製）を用いて、遺伝子配列解析及び予測アミノ酸配列解析を行った。ここで得られた麻疹ウイルス核タンパク質のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１〜９に示す。以下、配列番号１のアミノ酸配列からなる麻疹ウイルス核タンパク質をＡｇ１、配列番号２のアミノ酸配列からなる麻疹ウイルス核タンパク質を麻疹抗原Ａｇ２というように、配列番号Ｎのアミノ酸配列からなる麻疹ウイルス核タンパク質をＡｇＮと呼称する。
１−２．マウスの免疫
Advanced Biotechnologies Inc.（以下ＡＢＩ社）より入手した麻疹ウイルス株（商品名：Rubeola （Measles） Virus Infected Cell Extract）６０μｇを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１００μＬにフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）１００μｌを添加し、乳化させた後、ＦＣＡ混合麻疹ウイルス抗原溶液を２００μＬを調製した。また、ＦＣＡではなくフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いること以外は同様にしてＦＩＡ混合麻疹ウイルス抗原溶液２００μＬを作製した。
ＦＣＡ混合麻疹ウイルス抗原溶液２００μＬを７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与することにより初回免疫した。初回免疫後、二週間毎にＦＩＡ混合麻疹ウイルス抗原溶液２００μＬを用いて追加免疫を行った。最終免疫は、アジュバントを使用せず、ＡＢＩ社麻疹ウイルス株に代えて、１−１．において作製されたＡｇ５を５０μg含有するＰＢＳ５００μＬを静脈注射することにより行った（免疫実験１）。
【００６９】
免疫用抗原として、ＡＢＩ社麻疹ウイルス株に代えて１−１．において作製されたＡｇ５もしくはＡｇ８を使用した点を除いては上記免疫実験１と同様にして、マウスへの免疫を行った（免疫実験２）。
【００７０】
最終免疫から４日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製した。
【００７１】
１−２．ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマを２．５×１０６cells/mＬとなるようにＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０５cell/wellとなるように分注した。培養用プレートを３７度、８％ＣＯ２の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始した。翌日、ＨＡＴ培地を２５μＬずつ培養用プレートの各ウェルに添加し、さらに培養を継続した。１０日間培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行った。
【００７２】
１−３．ハイブリドーマのスクリーニング
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ, ｐＨ７．５）に、タンパク質濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるように希釈した麻疹ウイルス（ＡＢＩ社製）を添加し、感作用麻疹ウイルス溶液を調製した。この感作用麻疹ウイルス溶液１００μＬを９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに分注した（以下、抗原固定プレートとする）。４度で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、第１緩衝液とする）で三回洗浄した。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに１ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、第２緩衝液とする）３００μＬを添加し、２〜８℃で４時間以上静置保存した。抗原固定プレートは使用時まで２〜８℃で保存した。
【００７３】
第２緩衝液を抗原固定プレートの各ウェルに７５μＬずつ添加し、１−３．で作製したハイブリドーマ培養上清を培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μＬずつ添加した。第２緩衝液及び培養上清添加後、室温で一時間インキュベートした。インキュベート後、３００μＬの第１緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄した。洗浄後、第２緩衝液で１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した。室温で３０分間反応させた後、３００μＬの第１緩衝液で抗原固定プレートの各ウェルを洗浄した。洗浄後、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む反応停止液を抗原固定プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、作製されたハイブリドーマが、抗麻疹モノクローナル抗体を産生していることが確認された。
【００７４】
２．抗麻疹モノクローナル抗体の反応性の確認
上記１．において作製されたハイブリドーマによって産生された抗麻疹モノクローナル抗体の反応性を以下の実験によって確認した。
【００７５】
２−１．反応性試験
１−１．において作製されたＡｇ１〜Ａｇ９を含む抗原液を、それぞれ第２緩衝液によって１０倍に希釈した。
市販の抗マウスＩｇＧ抗体と、セファロースビーズ（Amersham Biosciences社製）とを結合させた粒子を１５ｖ／ｖ％の濃度で含有するセファロースビーズ−抗マウスＩｇＧ抗体懸濁液を調製した。このセファローズビーズ−抗マウスＩｇＧ抗体懸濁液と、Ａｇ１〜Ａｇ９を含む抗原液をそれぞれ第２緩衝液で０．２〜０．５μｇ／ｍLに希釈した抗原希釈液と、第２緩衝液とを等量で混合し、抗原試料調製した。
【００７６】
９６穴Ｖ字プレート（サンプラテック社製）の各ウェルに、抗原試料６０μＬと、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を第2緩衝液で１．０μｇ／mＬの濃度に希釈した抗体液を３０μＬずつ加え、室温で６０分間攪拌させたのち、１０分間静置し、セファロースビーズを沈降させた。
【００７７】
次に、以下の要領で、抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体が感作されたマイクロタイタープレートを調製した。マイクロタイタープレートに感作される抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体として、ハイブリドーマＭＶ１−２２５によって産生される２２５抗体を用いた。
２２５抗体液を、０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ, ｐＨ７．５）によって１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、この２２５抗体希釈溶液をマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに１００μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。第１緩衝液を用いて各ウェルを３回洗浄したのち、各ウェルに第２緩衝液を３００μＬずつ分注して、ブロッキングした（以下、このマイクロタイタープレートを２２５抗体感作プレートと呼称する）。ブロッキング後、２〜８℃で４時間以上静置保存した。２２５抗体感作プレートは使用時まで２〜８℃で保存した。
なお、ハイブリドーマＭＶ１−２２５は、シスメックス株式会社によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、受領番号ＮＩＴＥ  ＢＰ-５９９が付与されている（受託日：２００９年７月２２日）。
【００７８】
次に、ビオチン標識された抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体液が０．２５μｇ／ｍｌとなるように、また、ストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液が４０ｍU／ｍｌとなるように第２緩衝液にて混合し、ＰＯＤ標識化抗体液を調製した。
ビオチン標識される抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体として、ハイブリドーマＭＶ１−１１１７によって産生される１１１７抗体を用いた。ハイブリドーマＭＶ１−１１１７は、シスメックス株式会社によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、受領番号ＮＩＴＥ  ＮＰ−６００が付与されている（受託日：２００９年７月２２日）。
【００７９】
２２５抗体感作プレート中の第２緩衝液を除去した。除去後、上述のＰＯＤ標識化抗体液５０μＬおよび９６穴Ｖ字プレートの反応液の上清５０μＬを、２２５抗体感作プレートの各ウェルに加え、６０分間攪拌させた。その後、２２５抗体感作プレートの各ウェルを、第２緩衝液で３回洗浄した。
このとき、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体の抗原に対する反応性によって、９６穴Ｖ字プレートの反応液の上清に抗原が含まれる場合と、含まれない場合とがありうる。
すなわち、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体が抗原に対して反応性がある（抗体と抗原とが結合している）場合には、反応液中にはセファロースビーズ−抗マウスＩｇＧ−抗麻疹モノクローナル抗体−抗原からなる複合体が形成される。この複合体は、セファロースビーズの重みによって９６穴Ｖ字プレートのウェルにおいて沈降するため、上清には抗原が含まれない。一方、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体が抗原に対して反応性がない（抗体と抗原とが結合していない）場合には、反応液中に上記のような複合体は形成されず抗原が沈降しないため、上清には抗原が含まれることになる。
よって、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体が抗原に対して反応性を示さなかった場合には、上記の操作によって２２５抗体−抗原−ＰＯＤ標識化抗体からなる複合体が２２５抗体感作プレートのウェルに形成され、反応性を示した場合には、上記複合体は形成されない。
【００８０】
ついで２２５抗体感作プレートの各ウェルに、ＰＯＤに対する基質であるＯＰＤを含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。その後、反応停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む）を２２５抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、各ウェル中の反応液の吸光度をマイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。ここで得られた吸光度を吸光度Ａとする。
なお、上記の説明から明らかなように、吸光度Ａは２２５抗体感作プレートのウェル上の複合体の有無を示している。すなわち、吸光度が低いほど複合体が少なく、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体と抗原との反応性が高いことを示す。
【００８１】
対照実験として、１．０μｇ／ｍL抗体液に換えて第２緩衝液を用いた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した。ここで得られた吸光度を吸光度Ｂとする。
また、対照実験として、１．０μｇ／ｍL抗体液と抗原試料に換えて第２緩衝液を用いた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した。ここで得られた吸光度を吸光度Ｃとする。
【００８２】
得られた吸光度Ａ〜Ｃを用いて、下記式（１）により、本実施例によって得られた抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を用いて得られた測定試料の吸光率を求めた。得られた吸光率を表１に、吸光率に基づく反応性の評価結果を表２に示した。表２において、「＋＋＋」は式（１）によって求められる吸光率が９０％以上、「＋＋」は５０％以上、「＋」は３０％以上、「−」は３０％であることを示している。
吸収率（％）＝{１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）}×１００  ・・・（１）
【００８３】
【表１】
2010122205.tif 000003
【００８４】
【表２】
2010122205.tif 000004
【００８５】
表１および表２に示したとおり、本実施例によって得られた２６４９抗体、３７０７抗体、３２４１抗体および３２０抗体のいずれも、麻疹ウイルス核タンパク質Ａｇ１〜Ａｇ９の全てに対して高い反応性を示した。
この結果から、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体は、麻疹ウイルス核タンパク質に結合可能であり、且つ、核タンパク質のアミノ酸配列の一部の置換変異によっては結合能が変化しないことがわかった。
【００８６】
３．抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体の麻疹ウイルス抗原に対する結合部位のスクリーニング
本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体の麻疹ウイルス核タンパク質に対する結合部位を、以下の実験によって確認した。
【００８７】
３−１．抗原試料の調製
上記１−１．において調製された麻疹ウイルス核タンパク質Ａｇ３を含む抗原液を第２緩衝液によって０．１５μｇ／ｍLに希釈し、Ａｇ３を含む抗原試料を調製した。
【００８８】
３−２．阻害試験
上記２−１．において記載した要領と同様にして、２２５抗体感作プレートを作製した。この２２５抗体感作プレートの各ウェルに、Ａｇ３を含む抗原試料１００μＬを加え、３０分間攪拌した。その後、２２５抗体感作プレートの各ウェルを、第１緩衝液で３回洗浄した。
【００８９】
ビオチン標識された３７０７抗体溶液が０．５μｇ／ｍｌとなるように、また、ストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液が４０ｍU／ｍｌとなるように第２緩衝液にて混合し、ＰＯＤ標識化抗体液を調製した。
【００９０】
２２５抗体感作プレートの各ウェルに、本実施例によって得られた２６４９抗体を第2緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した抗体液５０μＬと、上述のＰＯＤ標識抗体液５０μＬとを加え、室温で６０分間攪拌した。攪拌したのち、２２５抗体感作プレートを第１緩衝液で３回洗浄した。
【００９１】
ついで、２２５抗体感作プレートの各ウェルに、ＯＰＤを含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。反応停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む）を２２５抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えたのち、マイクロプレートリーダを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。ここで得られた吸光度を吸光度Ｄとする。
【００９２】
対照実験として、１０μｇ／ｍL抗体液に換えて第２緩衝液を用いた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した。ここで得られた吸光度を吸光度Ｅとする。
また、対照実験として、１０μｇ／ｍL抗体液と抗原試料に換えて第２緩衝液を用いた対照試料を調製し、同様の実験を行って吸光度を測定した。ここで得られた吸光度を吸光度Ｆとする。
【００９３】
得られた吸光度Ｄ〜Ｆを用いて、下記式（２）により、上記実験例における測定試料の吸光率を求めた。そして、得られた吸光率に基づいて、２６４９抗体および３７０７抗体の、麻疹ウイルス核タンパク質に対する結合部位の相同性を評価した。
得られた吸光率を表３に、吸光率に基づく相同性の評価結果を表４に示した。表４において、「＋＋＋」は式（２）によって求められる吸光率が９０％以上、「＋＋」は５０％以上、「＋」は３０％以上、「−」は３０％であることを示している。
なお、上記実験例を例にとれば、（２）によって求められる吸光率が高ければ高いほど、２６４９抗体と３７０７抗体の、麻疹ウイルス核タンパク質に対する結合部位の相同性が高いことを意味する。
吸収率（％）＝{１−（Ｄ−Ｆ）／（Ｅ−Ｆ）}×１００  ・・・（２）
【００９４】
この実験は、上記実験例における１０μｇ／ｍLの抗体液に含まれる抗体と、ビオチン標識される抗体との組み合わせを、２６４９抗体、３７０７抗体、３２４１抗体および３２０抗体の中から選択されうるすべての組み合わせについて行った。
【００９５】
【表３】
2010122205.tif 000005
【００９６】
【表４】
2010122205.tif 000006
【００９７】
表３および表４の結果から、２６４９抗体と３７０７抗体とは、麻疹ウイルス核タンパク質に対する結合部位の相同性が低く、両抗体は、麻疹ウイルス核タンパク質の異なる部位を認識して結合しうる抗体であることが示唆された。また、２６４９抗体と３２４１抗体の組み合わせ、３２０抗体と３７０７抗体との組み合わせ、３２０抗体と３２４１抗体との組み合わせについても同様のことが示唆された。
【００９８】
以上の結果から、本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を、特定の組み合わせにしたがって用いることにより、抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を麻疹ウイルス核タンパク質の互いに異なる第１の結合部位と第２の結合部位とに結合させることができ、サンドイッチ法によって麻疹ウイルスを検出できることが示唆された。
【００９９】
４．試験具の作製
本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体を用いて、図１に示されるようなラテラルフロー式メンブレンアッセイ用試験具を作製した。
試験具１
標識保持部材７に保持される第１のモノクローナル抗体として、３２０抗体を使用した。クロマト用膜担体９の判定部９Ａに担持される第２モノクローナル抗体として、２６４９抗体と３７０７抗体を使用した。
まず、図１に示すように、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマト用膜担体９の判定部９Ａに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２．０ｍｇ  ＩｇＧ／ｍＬの濃度になるように希釈した３７０７抗体を含む抗体液を、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて１ｍｍ幅で塗布し、さらに１ｍｍ位置をずらして、同様に２６４９抗体を含む抗体液を塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。
乾燥後のクロマト用膜担体９をＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬し、クロマト用膜担体９上に抗体を固定した。その後、洗浄液（ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、４０℃で１２０分間乾燥させ、クロマト用膜担体９を得た。
【０１００】
次に、３２０抗体を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）に感作し、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、３２０抗体感作ラテックス粒子懸濁液を作製した。３２０抗体の濃度は、１％ラテックス粒子懸濁液１ｍＬ中に２００μｇ  ＩｇＧとなる濃度とした。この３２０抗体感作ラテックス粒子懸濁液を、ガラス繊維製パッドに添加後、真空乾燥機で乾燥させ、標識保持部材７を得た。
試料添加部材５、吸収部材１１、および基材１２については、上記実施形態において説明したとおりの部材を使用して、試験具１を得た。
クロマト用膜担体９の判定部９Ａに担持される抗体として、３７０７抗体に代えて３２４１抗体を用いた点を除いては上記と同様にして、試験具２を得た。
【０１０１】
５．性能試験
５−１．培養麻疹ウイルスの検出実験
４．において作製された試験具１および試験具２を使用して、試料中の麻疹ウイルスを検出する実験を行った。
本試験例では、下記の表５に示した２種類の野生型麻疹ウイルスをVero/SLAM細胞にて培養し、得られたウイルスを１％ＢＳＡを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で希釈したものをウイルス液として用いた。なお、ＩＣ−Ｂ株およびEdmonston株は、いずれも野生型の麻疹ウイルス株であり、ＩＣ−Ｂ株のアミノ酸配列は配列番号１０に示したとおりである。また、Edmonston株のアミノ酸配列は、配列番号９によって示されたものと同じである。
ウイルス液中のウイルス濃度は、プラーク法によって定量し、その定量値をＰＦＵで表す。各ウイルス液中のウイルス濃度は、表５に示したとおりである。ＰＦＵ(plaque-forming unit)は、１００％コンフルエントの細胞にウイルスを感染させ、感染させた細胞が作るプラークによって確認できるウイルス感染細胞数から算出されたウイルス数を表す単位である。なお、表５にはおいては、ＰＦＵを対数表示によって表記してある。
【０１０２】
次に、０．３ｗ／ｖ％  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）  ８００μＬに、所定濃度のウイルス液１５０μＬを加えて混合し、抗原試料とした。
抗原試料約２００μＬをガラス試験管に滴下し、このガラス試験管に上記方法で作製した試験具１の上流（試料添加部材１）側を浸漬した状態で約１０分間静置した。その後、判定部９Ａにおけるラテックス粒子による呈色を肉眼で判定した。判定は、呈色が認められたものを（＋）、呈色が認められなかったものを（−）として評価した。これらの結果を表５に示す。
【０１０３】
【表５】
2010122205.tif 000007
【０１０４】
表５に示したように、抗原試料中のウイルス濃度が所定濃度以上である場合には、試験具１および試験具２のいずれの判定部９Ａにも呈色が認められ、麻疹ウイルスを検出することができた。以上より、本実施形態によるメンブレンアッセイ用試験キットによれば、麻疹ウイルスを確実に検出でき、さらに野生型の麻疹ウイルスをも検出できることが実証された。
【０１０５】
５−２．患者検体の麻疹ウイルス検出実験
４．において作製された試験具１および試験具２を使用して、患者から採取された検体中の麻疹ウイルスを検出する実験を行った。
なお、５−１．においては、判定部９Ａに塗布される２種類の抗体液を、別々の位置に塗布して得られた試験具を使用したが、本実験例においては、２種類の抗体液を混合して得られたものを判定部９Ａに塗布することにより試験具を作製し、使用した。
【０１０６】
ＲＴ−ＰＣＲ法によるスクリーニングにより麻疹感染陽性と判定された各患者から、綿棒を用いて咽頭拭い液を採取した。この綿棒を１ｗ／ｖ％ＳＤＳ溶液７５μＬに浸漬して、咽頭拭い液をＳＤＳ溶液に溶出させた。
溶液中のウイルス濃度は、リアルタイムPCR法によって得られたＣｔ値を、５−１．に記載の方法で定量した濃度既知試料のCT値と比較することにより算出した。
【０１０７】
ついで、０．３ｗ／ｖ％  ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）  ８００μＬに、上記のＳＤＳ溶液を添加して混合し、抗原試料とした。
この抗原試料を用いて、５−１．に記載の手順および判定条件に基づいて、判定部９Ａにおけるラテックス粒子による呈色を判定した。これらの判定結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
2010122205.tif 000008
【０１０９】
表６に示したとおり、本実施例によって作製された試験具１および試験具２のいずれによっても、患者検体すべてにおいて麻疹ウイルスを検出することができた。
この結果から、本実施例による試験具によって、患者検体中の麻疹ウイルスを確実に検出できることが実証された。また、この結果から、患者から検体を採取して測定試料を調製し、この測定試料とメンブレンアッセイ用試験具とを用いることにより、肉眼での判定という簡便な方法により、麻疹ウイルスを検出できることが実証された。
【０１１０】
６．エピトープ解析
本実施例による抗麻疹ウイルスモノクローナル抗体の麻疹ウイルス核タンパク質に対する抗原認識部位を、以下の実験によって確認した。
【０１１１】
６−１．麻疹ウイルス部位欠損核タンパク質の作製
グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴと呼称する）融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ＧＥヘルスケア社製）から、制限酵素ＮｏｔＩによる認識配列（以下、ＮｏｔＩ配列と呼称する）を含む配列番号１のプライマーと、制限酵素ＢａｍＨＩによる認識配列（以下、ＢａｍＨＩ配列と呼称する）を含む配列番号２のプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＧＳＴ配列の上流側にＮｏｔＩ配列を、下流側にＢａｍＨＩ配列を組み込んだcＤＮＡを合成した。
【０１１２】
合成されたcＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。同様に、小麦胚芽無細胞発現用試薬キット  ＥＮＤＥＸＴ（登録商標）Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＴＲＩ−ＧＧ  Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス社）付属のベクターを、制限酵素ＮｏｔＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。
【０１１３】
得られた制限酵素処理産物同士をライゲーションし、ＧＳＴ配列を含む小麦胚芽無細胞発現用ベクターを構築した。
【０１１４】
麻疹ウイルスのＥｄｏｍｏｎｓｔｏｎ株より抽出したＲＮＡから、逆転写反応によって、ｃＤＮＡを合成した。合成した麻疹ウイルスｃＤＮＡから、制限酵素ＸｈｏＩによる認識配列（以下、ＸｈｏＩ配列と呼称する）を含む配列番号３のプライマーと、配列番号４のプライマーとを用いてＰＣＲを行った。ついで、得られたＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号３のプライマーと、ＮｏｔＩ配列を含む配列番号５のプライマーとを用いてＰＣＲを行った。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の配列の上流側にＸｈｏＩ配列を含み、下流側にＮｏｔＩ配列を含むＤＮＡ産物が合成された。
【０１１５】
合成されたＤＮＡ産物を制限酵素ＸｈｏＩおよび制限酵素ＮｏｔＩで処理した。同様に、ＧＳＴ配列を含む小麦胚芽無細胞発現用ベクターを、制限酵素ＸｈｏＩおよび制限酵素ＮｏｔＩで処理した。得られた制限酵素処理産物同士をライゲーションし、麻疹ウイルス核タンパク質配列およびＧＳＴ配列を含む小麦胚芽無細胞発現用ベクター（以下、全長核タンパク質発現ベクターと呼称する）を構築した。構築した全長核タンパク質発現ベクターから、小麦胚芽無細胞発現用試薬キット  ＥＮＤＥＸＴ（登録商標）Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＴＲＩ−ＧＧ  Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス社）を用いて、核タンパク質全長を発現させた。
【０１１６】
２６４９抗体、３７０７抗体、３２４１抗体および３２０抗体の抗原認識部位解析のために、麻疹ウイルス核タンパク質全長からＣ末端を除去した、部位欠損核タンパク質Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１〜４を、以下に記載の方法によって作製した。作製した部位欠損核タンパク質を模式的に図９に示す。
【０１１７】
核タンパク質全長発現ベクターを基に、配列番号６のプライマーと、配列番号７のプライマーと、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社製）とを用いて、麻疹ウイルス核タンパク質の３９９位からＣ末端（５２５位）までのアミノ酸を除くプラスミド全周を増幅し、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１発現用ベクターを構築した。構築したＴｒｕｎｃａｔｅ−１発現用ベクターから、小麦胚芽無細胞発現用試薬キット  ＥＮＤＥＸＴ（登録商標）Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＴＲＩ−ＧＧ  Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス社）を用いて、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１を発現させた。これにより、３９９位からＣ末端までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１１８】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−２は、配列番号７のプライマーに代えて、配列番号８のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−1と同様の手法によって得られた。これにより麻疹ウイルス核タンパク質の３２１位からＣ末端までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１１９】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−３は、配列番号７のプライマーに代えて、配列番号９のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−1と同様の手法によって得られた。これにより麻疹ウイルス核タンパク質の２４２位からＣ末端までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２０】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−３は、配列番号７のプライマーに代えて、配列番号１０のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−1と同様の手法によって得られた。これにより麻疹ウイルス核タンパク質の１３５位からＣ末端までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２１】
つぎに、核タンパク質のＮ末端から３９８位のアミノ酸までを欠損したＴｒａｎｃａｔｅ−５を作製した。
【０１２２】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−５は、配列番号３のプライマーに代えて、配列番号１１のプライマーを用いた点を除いて、上述の核タンパク質全長発現ベクターの作製およびベクターの発現と同様の手法により得られた。なお、配列番号１１のプライマーは、麻疹ウイルス核タンパク質のｃＤＮＡの１１９５塩基から下流の塩基配列に対応するプライマーであって、ＸｈｏＩ配列を含むプライマーである。
【０１２３】
さらに詳細な２６４９抗体、３７０７抗体、３２４１抗体および３２０抗体の抗原認識部位解析のために、部位欠損核タンパク質Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６〜１４を作製した。作製した部位欠損核タンパク質を図９に示す。
【０１２４】
核タンパク質全長発現ベクターを基に、配列番号１２のプライマーと配列番号１３のプライマーとを用いて、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡社製）の用法にしたがって麻疹ウイルス核タンパク質のＮ末端から４４位までのアミノ酸を除くプラスミド全周を増幅し、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６発現用ベクターを構築した。構築したＴｒｕｎｃａｔｅ−６発現用ベクターから、小麦胚芽無細胞発現用試薬キット  ＥＮＤＥＸＴ（登録商標）Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＴＲＩ−ＧＧ  Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス社）を用いて、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６を発現させた。これにより、Ｎ末端から４４位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２５】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−７は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号１４のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号１５のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の４５位から９０位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２６】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−８は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号１６のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号１７のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の９１位から１３４位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２７】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−９は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号１８のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号１０のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の１３５位から１７０位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２８】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１０は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号１９のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号２０のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の１７１位から２０６位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１２９】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１１は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号２１のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号２２のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の２０７位から２４１位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１３０】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１２は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号２３のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号７のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の３９９位から４４１位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１３１】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１３は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号２４のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号２５のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の４４２位から４８４位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１３２】
Ｔｒｕｎｃａｔｅ−１４は、配列番号１２のプライマーに代えて、配列番号６のプライマーを用い、配列番号１３のプライマーに代えて配列番号２６のプライマーを用いた点を除いては、Ｔｒｕｎｃａｔｅ−６と同様の手法によって得られた。これにより、麻疹ウイルス核タンパク質の４８５位から５２５位までのアミノ酸が欠損した核タンパク質が得られた。
【０１３３】
得られた全長核タンパク質およびＴｒａｎｃａｔｅ１〜１４を、Ｇｌｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ５０％（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ＧＳＴ結合タンパク質として精製した。
【０１３４】
陰性コントロールとして、小麦胚芽無細胞発現キット付属のベクターにＧＳＴ配列を付加したプラスミドを組み込み、転写・翻訳した後、タンパク質を精製した。得られたタンパク質を抗原認識部位の陰性コントロールとした。
【０１３５】
６−２．抗原認識部位の解析
上記６−１．において調製された全長核タンパク質およびＴｒａｎｃａｔｅ１〜１４の各抗原液を第２緩衝液によって希釈し、抗原試料を調製した。
【０１３６】
以下の要領で、抗ＧＳＴ抗体（ＧＥヘルスケア社製）が感作されたマイクロタイタープレートを調製した。
【０１３７】
抗ＧＳＴ抗体液を、０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ, ｐＨ７．５）によって５μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、この抗ＧＳＴ抗体希釈溶液をマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。第１緩衝液を用いて各ウェルを３回洗浄したのち、各ウェルに第２緩衝液を３００μＬずつ分注して、ブロッキングした（以下、このマイクロタイタープレートを抗ＧＳＴ抗体感作プレートと呼称する）。ブロッキング後、２〜８℃で４時間以上静置保存した。抗ＧＳＴ抗体感作プレートは使用時まで２〜８℃で保存した。
【０１３８】
抗ＧＳＴ抗体感作プレート中の第２緩衝液を除去した。除去後、上述の核タンパク質全長およびＴｒａｎｃａｔｅ１〜１４の各抗原試料５０μＬを、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルに加え、３０分間攪拌させた。その後、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルを、第２緩衝液で３回洗浄した。
【０１３９】
次に、２６４９抗体、３７０７抗体、３２４１抗体および３２０抗体が１０μｇ／ｍｌとなるように第２緩衝液にて希釈し、各抗体反応液を調製した。各抗体反応液５０μＬを、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルに加え、３０分間攪拌させた。その後、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルを、第２緩衝液で３回洗浄した。
【０１４０】
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）溶液が２０ｍＵ／ｍｌとなるように第２緩衝液にて希釈し、ＰＯＤ結合抗マウスＩｇＧ抗体液を調製した。ＰＯＤ結合抗マウスＩｇＧ抗体液５０μＬを、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルに加え、３０分間攪拌させた。その後、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルを、第２緩衝液で３回洗浄した。
【０１４１】
ついで、抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルに、ＯＰＤを含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置した。反応停止液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む）を抗ＧＳＴ抗体感作プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えたのち、マイクロプレートリーダを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【０１４２】
得られた吸光度を表７に、吸光度に基づく各抗体の核タンパク質全長およびＴｒａｎｃａｔｅ１〜１４の各抗原に対する評価結果を表８に示した。表８において、「＋＋＋」は吸光度が１．５以上、「＋＋」は０．５以上且つ１．５未満、「＋」は陰性コントロールの３ＳＤの値以上０．５未満、「−」は陰性コントロールの３ＳＤ以下であることを示している。
【０１４３】
【表７−１】
2010122205.tif 000009
【０１４４】
【表７−２】
2010122205.tif 000010
【０１４５】
【表７−３】
2010122205.tif 000011
【０１４６】
【表７−４】
2010122205.tif 000012
【０１４７】
【表８−１】
2010122205.tif 000013
【０１４８】
【表８−２】
2010122205.tif 000014
【０１４９】
【表８−３】
2010122205.tif 000015
【０１５０】
表７および表８の結果から、２６４９抗体は、麻疹ウイルス核タンパク質の１３５残基から２４１残基のアミノ酸配列を認識して結合することが示唆された。３７０７抗体と３２４１抗体は、麻疹ウイルス核タンパク質の４８５残基から５２５残基のアミノ酸配列を認識して結合することが示唆された。さらに、３２０抗体は、麻疹ウイルス核タンパク質の９１残基から１３４残基のアミノ酸配列を認識することが実証された。
【符号の説明】
【０１５１】
１      試験容器
１ａ    試験容器底部
１ｂ    開口
３      ラベル
４      メンブレンアッセイ用試験具
４ａ    試験具の一端
５      試料添加用部材
７      標識保持部材
９      クロマトグラフィー用膜担体
９Ａ    判定部
９Ｂ    対照部
１１    吸収部材
１２    基材
１３    試料
１４    検体処理容器
１５    検体処理液
３１    試験具
３２    カバー部材
３３    開口
３４    膜担体
３４Ａ  判定部
３５    吸収部材
【図１】
2010122205.tif 000016
【図２】
2010122205.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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