(57)【要約】      （修正有）【課題】髄膜炎菌ワクチンの提供。【解決手段】髄膜炎菌莢膜多糖、アジュバント量のインターロイキン−１２および明礬の水性懸濁物の混合物を含んでおり、かつ、生理学的に許容できるベヒクルを含んでいてもよい、ワクチン組成物または免疫原性組成物。該インターロイキン−１２は明礬の懸濁物上に吸着されており、該明礬が、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムであり、該髄膜炎菌莢膜多糖が破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンおよびそれらの非毒性の変異体などの担体分子に複合化されていてもよいものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎菌莢膜多糖、アジュバント量のインターロイキン−１２および明礬の水性懸濁物の混合物を含んでおり、かつ、生理学的に許容できるベヒクルを含んでいてもよい、ワクチン組成物。
【請求項２】
インターロイキン−１２が明礬の懸濁物上に吸着されている、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
インターロイキン−１２がヒトインターロイキン−１２である、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
明礬が、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムである、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項５】
髄膜炎菌莢膜多糖が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のタイプＣ莢膜多糖である、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６】
髄膜炎菌莢膜多糖が担体分子に複合化されている、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７】
担体分子が、破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンおよびそれらの非毒性の変異体より成る群から選択される、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
担体分子がＣＲＭ１９７である、請求項６または７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
髄膜炎菌の抗原、アジュバント量のインターロイキン−１２および懸濁液状の鉱物の混合物を含んでおり、かつ、生理学的に許容できるベヒクルをさらに含んでいてもよいワクチン組成物の有効量を哺乳動物宿主に投与することを含んで成る、髄膜炎菌の抗原に対する免疫応答を導き出す方法。
【請求項１０】
インターロイキン−１２が明礬の懸濁物上に吸着されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インターロイキン−１２がヒトインターロイキン−１２である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
明礬が、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムである、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
髄膜炎菌莢膜多糖が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のタイプＣ莢膜多糖である、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
髄膜炎菌莢膜多糖が担体分子に複合化されている、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
担体分子が、破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンおよびそれらの非毒性の変異体より成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
担体分子がＣＲＭ１９７である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
髄膜炎菌莢膜多糖、アジュバント量のインターロイキン−１２および明礬の水性懸濁物の混合物を含んでおり、かつ、生理学的に許容できるベヒクルをさらに含んでいてもよい、免疫原性組成物。
【請求項１８】
インターロイキン−１２が明礬の懸濁物上に吸着されている、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
インターロイキン−１２がヒトインターロイキン−１２である、請求項１７または１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
明礬が、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムである、請求項１７〜１９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
髄膜炎菌莢膜多糖が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のタイプＣ莢膜多糖である、請求項１７〜２０のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
髄膜炎菌莢膜多糖が担体分子に複合化されている、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
担体分子が、破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンおよびそれらの非毒性の変異体より成る群から選択される、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
担体分子がＣＲＭ１９７である、請求項２２または２３に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１２および明礬とともに処方された髄膜炎菌のワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は病原体を攻撃するため多くの機構を使用するが；しかしながら、これらの機構の全部が必ずしも免疫感作後に活性化されるわけではない。ワクチン接種により誘導される保護的免疫は、病原体に抵抗するもしくはそれを排除するための適切な免疫応答を導き出すワクチンの能力に依存する。病原体に依存して、これは細胞媒介性のおよび／もしくは体液性の免疫応答を必要とすることができる。
【０００３】
免疫応答におけるヘルパーＴ細胞の役割についての現在の模範は、それらをそれらが産生するサイトカインに基づいてサブセットに分離し得ること、および、これらの細胞で観察される独特なサイトカインの特徴がそれらの機能を決定することである。このＴ細胞モデルは２種の主要なサブセット、すなわち細胞性および体液性双方の免疫応答を増加するＩＬ−２およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生するＴＨ−１細胞、ならびに、体液性免疫応答を増加するＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生するＴＨ−２細胞を包含する（非特許文献１）。免疫されている生物体中でより強い免疫応答を得るため、および抗原をもつ病原体（ａｇｅｎｔ）に対する宿主抵抗性を強めるために、抗原の免疫原性能力を高めることがしばしば望ましい。それがともに投与される抗原の免疫原性を高める物質はアジュバントとして知られている。例えば、ある種のリンホカインはアジュバント活性を有し、それにより抗原に対する免疫応答を高めることが示されている（非特許文献２；特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第２８５４４１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：２３４８（１９８６）
【非特許文献２】ネンチオニ（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：８００−８０４（１９８７）
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、１種もしくはそれ以上の肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の抗原、インターロイキンＩＬ−１２、および懸濁液状の鉱物の混合物を含んで成るワクチン組成物に関する。ＩＬ−１２は、鉱物懸濁液上に吸着されるかもしくは単純にそれらと混合されるかのいずれかであり得る。本発明の特定の一態様において、ＩＬ−１２は明礬（例えば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム）のような鉱物懸濁液上に吸着される。これらのワクチン組成物は抗原に対する保護的免疫応答を調節する；すなわち、当該ワクチン組成物は、ワクチン接種された宿主の抗体応答を定量的にかつ定性的に向上させること、また、病原体に対する保護的応答のため細胞媒介性の免疫を定量的に増大させることが可能である。本発明の特定の一態様において、抗原は肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の抗原であり；当該抗原は、肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の複合糖質におけるように担体分子に場合によっては結合される。
【０００７】
本明細書に記述される研究は、ＩＬ−１２が、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）とともに処方された肺炎球菌および髄膜炎菌の複合糖質ワクチンで免疫されたマウスの体液性応答を改変し得ることを示す。本明細書で例示される特定の肺炎球菌多糖の血清型は、血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ（Ｐｎ１、Ｐｎ４、Ｐｎ５、Ｐｎ６Ｂ、Ｐｎ９Ｖ、Ｐｎ１４、Ｐｎ１８Ｃ、Ｐｎ１９Ｆ、Ｐｎ２３Ｆ）であり、また、髄膜炎菌の多糖はタイプＣ（Ｍｅｎ  Ｃ）である。これらの血清型は、しかしながら、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。なぜなら、他の肺炎球菌および髄膜炎菌の血清型もまた本明細書で使用に適するからである。さらに、本明細書で例示されるＣＲＭ１９７タンパク質のような担体分子への結合が、選択された肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の抗原の免疫原性に依存して任意であることが当業者に明らかであろう。
【０００８】
約８ｎｇから約１，０００ｎｇまでの範囲にわたるＩＬ−１２の用量は、明礬に吸着されたＰｎ１４もしくはＰｎ６Ｂに対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３応答を増大させた。加えて、それらは、Ｐｎ４およびＰｎ９Ｖに対するＩｇＧ２ａ応答を増大させた。約５，０００ｎｇのＩＬ−１２の用量は、Ｐｎ１４に対する全ＩｇＧ力価、そしてとりわけＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂの力価を顕著に低下させた。
【０００９】
本発明はまた、懸濁液状の鉱物との抗原およびＩＬ−１２の混合物を含んで成る免疫原性組成物もしくはワクチン組成物の製造方法にも関する。とりわけ、ＩＬ−１２は鉱物懸濁液上に吸着される。本発明はまた、生理学的に許容できる溶液中の抗原、ＩＬ−１２および懸濁液状の鉱物の混合物を含んで成るワクチン組成物の有効量を、哺乳動物、例えばヒトもしくは霊長類の宿主に投与することを含んで成る、保護的免疫応答のためのワクチンのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞および補体結合ＩｇＧ抗体を導き出すもしくは増大させる方法にも関する。とりわけ、ＩＬ−１２は鉱物懸濁液上に吸着される。
【００１０】
＜発明の詳細な記述＞
本明細書に記述される研究は、補体固定ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の比率を増大させるための、明礬を基礎とした肺炎球菌ワクチン、とりわけ血清型１４および血清型６Ｂの肺炎球菌複合糖質ワクチン、ならびに髄膜炎菌ワクチン、とりわけタイプＣに対する免疫応答を増大させるＩＬ−１２の能力を示す。本明細書で使用されるところのＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７ワクチンは、ＣＲＭ１９７と呼称されるジフテリアトキソイドの非毒性の突然変異体（交差反応する物質）に結合された血清型１４の肺炎球菌多糖を含んで成り、また、ＰｎＰｓ６Ｂ−ＣＲＭ１９７ワクチンは、ＣＲＭ１９７に結合された血清型６Ｂの肺炎球菌多糖を含んで成る。ＩＬ−１２を、マウスにおいて肺炎球菌ワクチンの強力なアジュバントであるＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ  イミュノケム  リサーチ  インク（ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、モンタナ州ハミットン）と比較した。Ｂａｌｂ／ｃマウスで実施された別個の実験で、明礬上の例示的複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ワクチンにより誘導されるＣＲＭ特異的Ｔ細胞のサイトカインの特徴に対するＩＬ−１２の効果を検査した。
【００１１】
ＩＬ−１２は、多様な抗原提示細胞、主としてマクロファージおよび単球により産生される。それは、免疫感作を受けたことのない（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞からのＴＨ−１細胞の誘導において決定的に重要な一要素である。ＩＬ−１２の産生、もしくはそれに対し応答する能力は、例えば寄生虫感染症、最も著しくはリーシュマニア症の間の保護的ＴＨ−１様応答の発生で決定的に重要であることが示されている（スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、米国特許第５，５７１，５１５号）。ＩＬ−１２の効果は、ＮＫ細胞およびＴヘルパー細胞により産生されるＩＦＮ−γにより媒介される。元はナチュラルキラー細胞刺激因子と呼ばれたインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ヘテロ二量体サイトカインである（小林（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：８２７（１９８９））。組
換え宿主細胞におけるＩＬ−１２タンパク質の発現および単離は、１９９０年５月１７日に公開された国際特許出願第ＷＯ  ９０／０５１４７号に記述される。
【００１２】
本明細書に記述される研究は、肺炎球菌もしくは髄膜炎菌ワクチン、およびとりわけ肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の複合糖質ワクチン中のアジュバントとしてのＩＬ−１２の有用性を示す。従って、本発明は、こうした抗原、ＩＬ−１２および懸濁液状の鉱物の混合物を含んで成るワクチン組成物に関する。本発明の特定の一態様において、ＩＬ−１２は明礬（例えば、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム）のような鉱物懸濁液上に吸着される。これらのワクチン組成物は、抗原に対する保護的免疫応答を調節し；すなわち、当該ワクチン組成物は、病原体に対する保護的応答のため、ワクチン接種された宿主の補体結合抗体を導き出すことが可能である。本発明の特定の一態様において、抗原は肺炎球菌の抗原、とりわけ肺炎球菌の多糖であり；肺炎球菌の抗原は、場合によっては、肺炎球菌の複合糖質でのような担体分子に複合される。本明細書で例示される特定の肺炎球菌の多糖の血清型は、血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆであるが；しかしながら、これらの血清型は本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。なぜなら他の血清型もまた本明細書で使用に適するからである。
【００１３】
本発明の別の態様において、抗原は髄膜炎菌の抗原、とりわけ髄膜炎菌の多糖であり；髄膜炎菌の抗原は、場合によっては、髄膜炎菌の複合糖質でのように担体分子に複合される。タイプＣの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が本明細書に例示されるが；しかしながら、この型は本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。なぜなら他の型もまた本明細書で使用に適するからである。
【００１４】
ＩＬ−１２はいくつかの適する供給源から得ることができる。それは組換えＤＮＡの方法論により産生し得；例えば、ヒトＩＬ−１２をコードする遺伝子をクローン化しそして宿主系中で発現させて大量の純粋なヒトＩＬ−１２の製造を可能にする。ＩＬ−１２の生物学的に活性のサブユニットもしくはフラグメントもまた本発明で有用である。組換えのヒトおよびマウスのＩＬ−１２の商業的供給源は、ジェネティックス  インスティテュート  インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）を包含する。
【００１５】
本発明の抗原、例えば肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の抗原、または肺炎球菌もしくは髄膜炎菌の複合糖質は、哺乳動物宿主中で抗原に対する免疫応答を導き出すのに使用し得る。例えば、抗原は、血清型１４もしくは６Ｂの肺炎球菌の多糖、または免疫応答を刺激する能力を保持するその一部分であり得る。付加的な適する抗原は、他の被包性細菌およびその複合体、分泌性トキシンならびに外膜タンパク質からの多糖を包含する。
【００１６】
当該方法は、肺炎球菌の抗原もしくは肺炎球菌の複合体のような抗原、および懸濁液状の鉱物上に吸着されたアジュバント量のＩＬ−１２の混合物を含んで成るワクチン組成物の免疫学的に有効な量を哺乳動物、例えばヒトもしくは霊長類に投与することを含んで成る。
【００１７】
本明細書で使用されるところの、ワクチン組成物の「免疫学的に有効な」用量は、免疫応答を導き出すのに適する用量である。ＩＬ−１２および抗原の特定の投薬量は、治療されるべき哺乳動物の齢、体重および医学的状態、ならびに投与方法に依存することができる。適する用量は当業者により容易に決定されるであろう。当該ワクチン組成物は、場合によっては、生理学的生理的食塩水またはグリセロールもしくはプロピレングリコールのようなエタノール多価アルコールのような、製薬学的もしくは生理学的に許容できるベヒクル中で投与し得る。
【００１８】
当該ワクチン組成物は、場合によっては、植物油もしくはそれらの乳濁液、界面活性物質、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リソレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジコクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌｓ）；ポリアミン、例えばピラン、デキストラン硫酸、ポリＩＣ、カルボポール、；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン；免疫刺激複合体；油乳濁液；ＭＰＬ（商標）のようなリポ糖ならびに鉱物ゲルのような付加的アジュバントを含んでよい。本発明の抗原はまた、リポソーム、コケレート（ｃｏｃｈｅｌｅｔｅｓ）、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびポリラクチドコグリコリドのような生物分解性ポリマー、もしくはＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）中にも組み込み得、かつ、補足の有効成分もまた使用してよい。本発明の抗原はまた、細菌のトキシンおよびそれらの弱毒化誘導体と共同しても投与し得る。本発明の抗原はまた、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを包含するがしかしこれらに制限されない他のリンホカインと共同しても投与し得る。
【００１９】
当該ワクチンは、非経口、皮内、経皮（遅延放出ポリマーの使用によるような）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻内の投与経路を包含するがしかしこれらに制限されない多様な経路によりヒトもしくは動物に投与し得る。こうしたワクチンで使用される抗原の量は抗原の本体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に依存して変動することができる。本ワクチンへの適応のため伝統的な担体抗原とともに使用される確立された投薬量範囲の調節および操作は、当業者の能力内に十分にある。本発明のワクチンは、未熟なおよび成体双方の温血動物、そしてとりわけヒトの治療での使用に意図される。典型的には、ＩＬ−１２および抗原は共投与することができるが；しかしながら、いくつかの例においては、当業者は、ＩＬ−１２を抗原でのワクチン接種から緊密に遅れずにしかしその前もしくはその後に投与し得ることを認識するであろう。
【００２０】
本発明の肺炎球菌および髄膜炎菌の抗原は、免疫応答を調節するもしくは高めるために担体分子に結合し得る。適する担体タンパク質は、哺乳動物への投与のために化学的もしくは遺伝子的手段により安全にかつ担体として免疫学的に有効にされる細菌のトキシンを包含する。例は、百日咳、ジフテリアおよび破傷風のトキソイド、ならびに、ジフテリアトキソイドの非毒性の変異体ＣＲＭ１９７のような非毒性の突然変異体タンパク質（交差反応物質（ＣＲＭ））を包含する。最低１種のＴ細胞エピトープを含有する天然のトキシンもしくはトキソイドのフラグメントもまた、外膜タンパク質複合体がそうであるように抗原の担体として有用である。肺炎球菌の抗原および担体分子の複合体の製造方法は当該技術分野で公知であり、そして例えばディック（Ｄｉｃｋ）とバレット（Ｂｕｒｒｅｔ）、Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４８−１１４（クルーズ（Ｃｒｕｓｅ  ＪＭ）、ルイス（Ｌｅｗｉｓ  ＲＥ  Ｊｒ）編；バーゼル（Ｂａｓｅｌ）、クレーガー（Ｋｒａｇｅｒ）（１９８９））および米国特許第５，３６０，８９７号（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら）に見出し得る。
【００２１】
ＩＬ−１２のアジュバント作用は多数の重要な意味を有する。ＩＬ−１２のアジュバント性は、ワクチン接種された生物体中で抗原に対し産生される保護的な機能性抗体の濃度を増大させ得る。アジュバントとしてのＩＬ−１２の使用は、免疫応答を導き出すのに弱く抗原性もしくは乏しく免疫原性である抗原の能力を高め得る。それは、抗原が有効な免疫感作に通常必要とされる濃度で毒性である場合により安全なワクチン接種もまた提供することができる。抗原の量を低下させることにより、毒性反応の危険が低下される。
【００２２】
典型的には、ワクチン接種のレジメンは、「保護的」免疫応答を刺激するために、数週間もしくは数ヶ月の期間にわたる抗原の投与を要求する。保護的免疫応答は、ワクチンが
向けられる特定の病原体もしくは複数の病原体による増殖性の感染症から免疫された生物体を保護するのに十分な免疫応答である。
【００２３】
実施例に示されるとおり、ＡｌＰＯ４上に吸着されたＩＬ−１２およびＣＲＭ１９７に複合された血清型１４もしくは血清型６Ｂの肺炎球菌多糖を含んで成る明礬を処方されたワクチン（これは通常はＩｇＧ１により支配される応答を誘導する）において、０．２μｇのＩＬ−１２は、Ｂａｌｂ／ｃおよびスイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）双方のマウスでＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３のサブクラスを本質的に増加させたが、しかしＩｇＧ１に対してはほとんどもしくは全く効果を有しなかった。Ｐｎ１４に対するＩｇＧ２ｂの増強がスイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスでみられ；０．２μｇのＩＬ−１２はＰｎ１４に対するＩｇＧサブクラスの応答に対して２５μｇのＭＰＬ（商標）と同一の効果を有し、ＩＬ−１２がこの点に関してＭＰＬ（商標）より最低１００倍より生物学的に活性であることを示唆した。ＩｇＧのサブクラスの分布、とりわけ高められたＩｇＧ２ａ応答から期待されるとおり、０．２μｇのＩＬ−１２を受領するマウスからのＰｎ１４肺炎球菌に対する抗血清のオプソニン食作用活性は対照のものより高く、そして、ずっとより大量のＭＰＬ（商標）を用いて処方されたワクチンで免疫されたマウスのものと同等であった。
【００２４】
簡潔には、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体は補体系の活性化で非常に効率的である一方、ＩｇＧ１抗体はそうでない。補体系は、抗原（例えば細菌）に結合されたＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂの周囲で一緒になって大分子複合体を形成する一連の血漿タンパク質より成る。この複合体の細菌の表面上への付着は、細胞膜を穿孔すること（殺細菌活性）、もしくは細菌を取り込みそしてそれらを殺す（オプソニン食作用）（本研究で使用された多核白血球（ＰＭＮ）のような）食作用細胞による細菌の認識を助長することにより、細菌の殺傷をもたらす。
【００２５】
ＩＬ−１２の用量を増大させることは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂの応答を大いに低下させた。これらの免疫グロブリンのサブクラスの減少は、卵リゾチーム（ＨＥＬ）系で観察された（ブキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ）、ファン・クレーブ（Ｖａｎ  Ｃｌｅａｖｅ）とメツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）、要旨＃１９４５；第９回国際免疫学会議（９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９９５））ように、単純に抗体応答の力学の変化によるものではなかった。なぜなら、これらのサブクラスは試験された全時間点で減少したからである。ＩｇＧ１に対する影響が、Ｂ細胞のこのサブクラスへのスイッチングがＩＬ−４（その産生がＩＬ−１２により阻害されるＴＨ−２サイトカイン）を必要とすることを考えれば、期待された。しかしながらＩｇＧ２ｂの減少は期待されなかった。なぜなら以前の研究でＩｇＧ２ｂの増大されたレベルがＴＨ−１様のＴ細胞の存在と相関したからである。ＩＦＮ−γ以外のもしくはそれに加えてのサイトカインがＩｇＧ２ｂの調節に関与していることがありそうである。例えば、ジャーマン（Ｇｅｒｍａｎｎ）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：８２３−８２９（１９９５））は、抗ＩＦＮ−γでのマウスの処理がＩｇＧ２ａ応答を促進するがしかしＩｇＧ２ｂはしないＩＬ−１２の能力を阻害したことを見出した。他の研究は、ＩｇＧ２ｂの誘導における重要な因子としてＴＧＦ−βを巻き込んでいた（スタヴネザー（Ｊ．Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１６４７−１６５１（１９９５）により総説される）。理論により束縛されることを願わず、高用量のＩＬ−１２はＴＧＦ−β産生もしくはそれに対する応答性に影響を及ぼし得可能性がある。
【００２６】
ＩＦＮ−γは、Ｔ依存性タンパク質抗原に対するＩｇＧ２ａ抗体の誘導（フィンケルマン（Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ）とホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３０３−３３（１９９０））、およびＴ非依存性抗原に対するＩｇＧ３の応答（スナッパー（Ｓｎａｐｐｅｒ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１３６７−１３７１
（１９９２））に決定的に重要である。増大されたＩＦＮ−γ応答は、ＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４を含有するワクチン（ＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７）での単回のワクチン接種後および追加抗原刺激後に一貫して見出された。ＴＨ−２サイトカインＩＬ−５およびＩＬ−１０に対するＩＬ−１２の効果は、リンパ様細胞がワクチン接種後に収穫されるときに、そしておそらく特定のサイトカインに依存するように思われる。外因性のＩＬ−１２は、一次ワクチン接種１週間後に収穫されたリンパ節細胞（ＬＮＣ）による抗原特異的なＩＬ−５およびＩＬ−１０産生を完全に廃止した。第二のワクチン接種後、差異がこれらの２種のサイトカインの間でみられ；ＬＮＣもしくは脾細胞のいずれかによるＩＬ−５産生はワクチン中の１μｇのＩＬ−１２により完全に廃止されたが、しかし、ＩＬ−１０産生は追加抗原刺激後に大きく影響を及ぼされたわけではなかった。これらの差異が異なる時間での培養物の構成によるかどうか、もしくは、その後の再ワクチン接種に際してのＴＨ−２様集団の拡大を反映しているかどうかは不明である。後者の可能性は、ウォルフ（Ｗｏｌｆ）および共同研究者（ブリス（Ｂｌｉｓｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：８８７−８９４（１９９６））からのデータと矛盾せず、ＩＬ−４産生Ｔ細胞を、ＩＬ−１２を含有するワクチンで既に免疫されかつ可溶性抗原で追加抗原刺激されたＢａｌｂ／ｃマウスから回収し得ることを示す。彼らの研究で、ＩＬ−４は、ＩＬ−１２を第二のワクチン中に包含した場合でさえ検出された。追加抗原刺激後のＴＨ−２サイトカインの存在は、Ｂａｌｂ／ｃマウスで高レベルのＩＬ−１２でさえ二次的ＩｇＧ１応答を対照レベル（明礬上の複合体ワクチン）より下に低下し得なかった理由を説明するのかも知れない。Ｂａｌｂ／ｃマウスと異なり、高用量のＩＬ−１２はスイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスのＩｇＧ１応答をひどく阻害した。これが第二のワクチン接種後のＴＨ−２サイトカインの減少された産生と関連するかどうかは不明である。
【００２７】
本研究において、ＩＬ−１２は、免疫調節活性を示したのみか、もしくはワクチンに依存して「古典的」アジュバントおよび免疫調節物質の双方として挙動したかのいずれかであった。ＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７を用いた研究において、当該ワクチンに対するＩｇＧ応答（とりわけ一次応答）は、サイトカインの存在により本質的に上昇しなかったが、しかしある種のサブクラスすなわちＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３は上昇した一方、他者は変化しないかもしくは減少した。従って、ＩＬ−１２は、既に免疫原性のワクチンに対する体液性応答を変えるために有用である。これらの研究において、ＩＬ−１２のアジュバント活性が、独力で高度に免疫原性のＰｎＰｓ−１４複合体の十分なアジュバントである明礬の存在により遮蔽され得る。ＩＬ−１２のアジュバント性は、複合体の用量を低下させるか、もしくは乏しく免疫原性の複合体を使用することにより、明礬の非存在下でより良好に立証されるかも知れない。従って、さらなる評価を、スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスでＰｎＰｓ−１４複合体ワクチンより小さく免疫原性であるＰｎＰｓ６Ｂ複合体ワクチンを用いて、明礬の存在および非存在下でＩＬ−１２を使用して実施した。
【００２８】
追加の研究を、乏しく免疫原性の肺炎球菌の複合体に関するＩＬ−１２のアジュバント活性の論点を取り扱うために設計した。Ｐｎ１８Ｃ複合体を選んだ。なぜならそれはＡｌＰＯ４とともに処方される場合に乏しく免疫原性である、すなわち、それは低いＩｇＧ力価を誘導しかつ全部のマウスがそれに応答するわけではないからである。ＭＰＬもしくはＱＳ−２１とともに処方される場合、より高いＩｇＧ力価および応答体のより大きな頻度を達成し得る。
【００２９】
ＡｌＰＯ４を含む１００μｇのＭＰＬ（商標）もしくは２０μｇのＱＳ−２１（商標）は、Ｐｎ１８Ｃ応答について本研究で最良のアジュバントであった。なぜなら、それらは、この血清型に対する応答体の最高の頻度を誘導したからである。にもかかわらず、ＩＬ−１２は、この複合体で免疫されたマウスでの担体タンパク質ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ応答に対する顕著な効果を有した。さらに、このサイトカインの効果は、ワクチン中で
のＡｌＰＯ４の存在により改変された。ＩＬ−１２は、ＡｌＰＯ４を含まず処方されたワクチンのアジュバントとして明確に作用し、一次および二次ワクチン接種後ＩｇＧ力価の用量依存性の増大を引き起こした。ＩＬ−１２はＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ２ａ応答を高め、これはＴＨ−１様ヘルパー細胞（ＩＦＮ−γ産生体）の誘導に味方するその能力と矛盾しない。しかしながら、ＩＬ−１２は、一次および二次ワクチン接種後のＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ１応答もまた高めた。ＩｇＧ１抗体は、通常、ＩＬ−４を産生するＴＨ−２様ヘルパー細胞に関連する。
【００３０】
ＡｌＰＯ４を基礎としたＰｎ１８Ｃ複合体ワクチン（独力で１０倍より高いＣＲＭ１９７応答を誘導した）中への０．１μｇのＩＬ−１２の包含は、ＩｇＧ１に対する効果を有しなかったが、しかしＩｇＧ２ａ力価を本質的に増大させた。０．１μｇのＩＬ−１２で達成されたＩｇＧ２ａ力価は、ＡｌＰＯ４の非存在下で、少なくとも５μｇのＩＬ−１２で得られたと同じくらい高かった。しかしながら、ＡｌＰＯ４の存在は、ＩＬ−１２によるＩｇＧ１応答の増強を除外しないことに注目すべきである。ＡｌＰＯ４上のＰｎ１４複合体で免疫されたマウスでは、０．２μｇ用量のＩＬ−１２は、ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの力価を高めた。ＩｇＧ１に対する効果の差異はＣＲＭ１９７のＩｇＧ応答についての２種の複合体の免疫原性の差異を反映しているのかも知れず；ＡｌＰＯ４上のＰｎ１４複合体は、ＩｇＧ１応答を高めるＩＬ−１２のための余地が存在したように１０倍より低いＣＲＭ１９７のＩｇＧ力価を誘導したが、しかしマウスをＡｌＰＯ４上のＰｎ１８Ｃ複合体で免疫した場合にはしなかった。ＭＰＬ（商標）およびＱＳ−２１（商標）が、ＡｌＰＯ４上のＰｎ１８Ｃ複合体で免疫されたマウスでのＩｇＧ１力価を顕著に増大させたという事実は、ＩｇＧ１応答が最大には刺激されていなかったことを示す。あるいは、複合体上の糖の性質が一要因であるかも知れない。双方の実験において、より高用量のＩＬ−１２は、ＡｌＰＯ４の非存在下で見られなかった影響、すなわちＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ力価の顕著な減少をもたらした。
【００３１】
ＩＬ−１２は、おそらく、ＭＰＬ（商標）もしくはＱＳ−２１（商標）と異なってそのアジュバント効果を発揮する。ＩＬ−１２はＰｎ１８Ｃ複合体で免疫されたマウスでＣＲＭ１９７のＩｇＧ２ａ力価を顕著に高めたが、しかし、ＩｇＧ２ｂに対して最小の効果を有した。対照的に、ＭＰＬ（商標）およびＱＳ−２１（商標）は双方のＩｇＧサブクラスの力価を高めた。これらの２サブクラスの解離は、ＩｇＧ２ｂが、ＩｇＧ２ａへのスイッチングを駆動しかつＩＬ−１２の免疫調節効果を媒介することが知られているＩＦＮ−γ以外のもしくはそれに加えてのサイトカインにより誘導されることを示唆する。ＩｇＧ２ｂ産生を駆動するための一候補はＴＧＦｂである。しかしながら、抗原の性質を排除し得ない。なぜなら、Ｐｎ１４複合体で免疫されたマウスでは、０．２μｇのＩＬ−１２が、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂを、２５μｇのＭＰＬ（商標）により促進される力価に同等であった類似のレベルまで上昇させたからである。
【００３２】
ＣＲＭ１９７に共有結合された血清型６Ｂの肺炎球菌からの莢膜多糖の複合体（ＰｎＰｓ６Ｂ−ＣＲＭ１９７）と混合されたＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７複合体より成る二価のワクチンを利用する研究は、上述された知見を確認かつ拡大した。ＩＬ−１２は、Ｐｎ６Ｂ複合体に対するＩｇＧ応答を改変したのみならず、しかしまたこの複合体に対する全ＩｇＧ力価も高めた。さらに、本研究は、比較的低用量のＩＬ−１２のアジュバント活性が、それをＡｌＰＯ４とともに処方することにより高められることをさらに立証する。ＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７複合糖質を用いた上述された研究と異なり、ＩＬ−１２／ＡｌＰＯ４はＰｎ６Ｂに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ双方のサブクラスを高め、ＩＬ−１２によるＰｎ１４のＩｇＧ１応答の増強の見かけの欠如はおそらく一般化可能な現象でないことを示した。本研究は、ＩＬ−１２およびＭＰＬ（商標）によるアジュバント活性の機構は同等でないという概念をさらに支持する。双方のアジュバントはＰｎ６ＢのＩｇＧ
１およびＩｇＧ２ａ力価を類似のレベルまで高めたが、しかし、ＭＰＬ（商標）はＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３抗体の促進でより有効であった。
【００３３】
ＩＬ−１２／ＡｌＰＯ４はＰｎ１４のＩｇＧ応答のためのアジュバントとして作用しなかった。この理由は明らかでないが；しかしながら、理論により拘束されることを意図するものでないが、これは、もっともありそうには、以前の研究ではマウスを１μｇの用量（すなわちＰｎ６Ｂの研究でより１０倍より高い）のＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７複合糖質で免疫したという事実を反映する。より複雑な肺炎球菌ワクチンへのＩＬ−１２の応用可能性は、血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの肺炎球菌からの複合糖質を含有する九価のワクチンを使用して立証された。ＡｌＰＯ４とのＩＬ−１２の組み合わせは、ＰｎＰｓ６ＢおよびＰｎＰｓ１４に加えて、ＰｎＰｓ４およびＰｎＰｓ９Ｖに対するＩｇＧ２ａ抗体を高め、そして、マウスで乏しく免疫原性である血清型１８Ｃの肺炎球菌の糖（ＰｎＯｓ−１８Ｃ−ＣＲＭ１９７）とともに調製された複合糖質に応答するマウスの能力を増大させた。
【００３４】
さらなる例で、ＩＬ−１２を、タイプＣの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＭｅｎＣ）に対する複合糖質ワクチン、およびタイプＢのインフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＨｂＯＣ）に対する複合糖質ワクチンとともに試験した。そのワクチンを５０ｎｇのＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４を含んで処方することは、ＭｅｎＣの莢膜多糖に対するＩｇＧ２ａ力価を高めたとは言え、ＨｂＯＣに対してはしなかった。
【００３５】
本明細書に提示されるデータは、ＡｌＰＯ４が、本質的により低用量のサイトカインを使用し得るようにＩＬ−１２の効力を大きく高め得ることを示す。可能な一機構は、ＩＬ−１２がＡｌＰＯ４に結合し、それにより動物中でのその持続性を高めることであり；追加の研究はＩＬ−１２が迅速に明礬に結合することを示す（データは示されない）。あるいは、ＡｌＰＯ４の局所炎症効果が、ＩＬ−１２の生物学的活性を増強するサイトカインを誘導するかも知れない。
【００３６】
ＡｌＰＯ４とのＩＬ−１２の物理的相互作用を理解することに加え、いくつかの他の論点が、ＩＬ−１２とともに処方された肺炎球菌ワクチンを用いる本研究から生じる。ＡｌＰＯ４がＩＬ−１２の活性を高めることを考えると、肺炎球菌の複合糖質に対するＩｇＧ応答を補助する（ａｄｊｕｖａｎｔ）のに必要とされるサイトカインの最小用量、ならびに、ＩＬ−５産生Ｔ細胞がＩＬ−１２を含有する複合糖質ワクチンにより活性化されるかどうかを知ることが有用であるとみられる。これら２疑問は実施例４で記述されたＢａｌｂ／ｃマウスでの研究で取り扱った。
【００３７】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するという目的上提供され、そして本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。本明細書で引用される全部の参考文献の教示はこれにより引用により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
実施例
【実施例１】
【００３９】
リン酸アルミニウム上のＣＲＭ１９７に複合された血清型１４の肺炎球菌莢膜多糖（ＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ／ＡｌＰＯ４）に対するスイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスのＩｇＧ応答に対するＩＬ−１２の効果
【００４０】
研究デザイン
スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウス（１群あたり１０匹）を
、１００μｇのＡｌＰＯ４およびＩＬ−１２なし、０．２μｇ、１μｇもしくは５μｇのＩＬ−１２のいずれかとともに処方された１μｇのＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７で２回（第０および３週）免疫した。全部のワクチンは、低濃度で使用される場合にＩＬ−１２を安定化する目的上、０．２５％の正常マウス血清を包含した。ＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７は、還元的アミノ化により遺伝子的に解毒されたジフテリアトキシンＣＲＭ１９７に共有結合された血清型１４の肺炎球菌からの莢膜多糖の複合体である。別の群は、ＩＬ−１２の代わりに２５μｇのＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ、ＲＩＢＩ  イミュノケム  リサーチ  インク（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、モンタナ州ハミルトン）を受領した。ワクチン接種は、３週間離れて皮下に与えた。血清を、第３週（一次応答）ならびに第５および７週（追加抗原刺激後２および４週間の二次応答）に収集した。血清を、ＰｎＰｓ−１４に対するＩｇＧ抗体について分析した。
【００４１】
血清を、ヒト多核白血球（ＰＭＮ）によるタイプ１４の肺炎球菌のオプソニン食作用的殺傷を促進する能力についてもまた分析した。タイプ１４の肺炎球菌を、補体の供給源としての抗血清およびＣ８枯渇血清の希釈物でオプソニン化した。それらをその後ヒト多核白血球（ＰＭＮ）とともにインキュベーションし、そして生存する細菌のパーセントをコロニー計数により測定した。
【００４２】
結果
表１は、１μｇおよび５μｇのＩＬ−１２が、ＡｌＰＯ４とともに処方された複合体で免疫されたマウスで抗ＰｎＰｓ−１４のＩｇＧ応答を本質的に抑制したことを示す。最低用量（０．２μｇ）のサイトカインは総ＩｇＧ応答に対し影響を有しなかったが、しかし、個々の免疫グロブリンのサブクラスのレベルの大きな変化を生じた。第５および７週（それぞれ、追加抗原刺激後２および４週間）には、０．２μｇのＩＬ−１２は本質的により高いＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３力価を誘導したが、しかし、ＩｇＧ１レベルは本質的に変えられずに残した。０．２μｇのＩＬ−１２により誘導されたＩｇＧサブクラスの特徴は２５μｇのＭＰＬ（商標）で得られたものと区別がつかず、また、これらのアジュバントを受領したマウスからの血清は、ＡｌＰＯ４のみを含有するワクチンで免疫されたマウスからのものより高いオプソニン食作用活性を有した（表２）。
【００４３】
より高用量のＩＬ−１２はＩｇＧ１抗体を顕著に低下させ；５μｇのサイトカインで、ＩｇＧ１力価はＩＬ−１２を用いずに免疫されたマウスでより少なくとも１０倍より低かった。この効果は、一次応答の間および追加抗原刺激後の双方で明らかであった。ＩＬ−１２の用量を増加させることは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のさらなる増大を引き起こさず、そして、ＩｇＧ１と同様に、それらもまた減少したとは言え、変動する程度までであった。ＩｇＧ２ｂは、１μｇもしくは５μｇのＩＬ−１２を含有するワクチンがアジュバントを含まないものと同一のＩｇＧ２ｂ力価を誘導したように、最大の抑制を示した。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３は高ＩＬ−１２用量の効果に対しより小さく感受性であり；５μｇのＩＬ−１２ででさえ、第二のワクチン接種後、これらのサブクラスは対照においてよりもより高かった。
【００４４】
これらの研究は、ＩＬ−１２がＡｌＰＯ４を含んで処方されたＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７複合体ワクチンに対するＩｇＧサブクラスの応答を調節し得たことを示した。０．２μｇ用量のＩＬ−１２は、ＩｇＧ１応答に影響を及ぼすことなく，Ｐｎ１４に対するＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３応答を増大させた。より高用量のＩＬ−１２はＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ力価の顕著な低下をもたらした。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３力価もまたこれらの用量で減少するようであったが、しかしそれらは未だＩＬ−１２の非存在下で免疫されたマウスでよりもより高かった。実施例２は、ＩｇＧサブクラスの変化が、ＩＦＮ−γを産生するＣＲＭ１９７特異的Ｔ細胞の高められた誘導、および抗原特異的ＩＬ−
５産生の顕著な低下と関連したことを立証し、Ｔヘルパー細胞の表現型のＴＨ−２様からＴＨ−１様への変化を示唆する。
【００４５】
【表１】
2010006827.tif 000002
【００４６】
【表２】
2010006827.tif 000003
【実施例２】
【００４７】
ＩＬ−１２とともに処方された肺炎球菌複合体ワクチン（ＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７／ＡｌＰＯ４）により誘導されたＴヘルパー細胞の性質
【００４８】
研究デザイン
８匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群を、１００μｇのＡｌＰＯ４および多様な用量のＩＬ−１２とともに処方された１μｇのＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７複合体で尾の基部で皮下に免疫した。正常マウス血清（０．２５％）を担体タンパク質として包含した。１週間後に、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節細胞懸濁液を各群のマウスの半分から調製し、そして、ＣＲＭ１９７、リゾチーム、ＣｏｎＡとともにもしくは培地単独中で６日間培養した。平行の培養物からの培養上清を第３日および第６日に収穫し、そしてＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−１０についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【００４９】
３週で、残存するマウスを採血し、そして第一の免疫感作で使用された同一のワクチン処方で再免疫した。第二の免疫感作の１４日後（第５週）にマウスをもう一度採血した。４日後、それらの排出リンパ節細胞および脾細胞を収穫し、そして、ＣＲＭ１９７、リゾチーム、ＣｏｎＡとともに、もしくは培地単独中で６日間培養した。平行の培養物からの培養上清を第３日および第６日に収穫し、そして、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−１０についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【００５０】
結果
ＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７／ＡｌＰＯ４ワクチンを、より低用量のＩＬ−１２（０．２μｇおよび１．０μｇ）を含んで処方することは、第５週でのＰｎ１４に対するＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３応答を大きく高めたがしかしＩｇＧ１はしなかった（表３を参照されたい）。いくつかの差異が、Ｂａｌｂ／ｃマウスで得られた結果と以前の実験でスイス
ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスで得られた結果との間にみられ；本実験では、ＩＬ−１２はＰｎ１４に対するＩｇＧ２ｂ抗体を劇的に増大させず、５μｇのＩＬ−１２の用量も、サイトカインを含まない対照群に関してＩｇＧ１力価の劇的な（＞１０倍）低下を引き起こさなかった。
【００５１】
免疫感作の１週間後、ＩＬ−１２を用いずに免疫されたマウスからのリンパ節細胞は、インビトロでＣＲＭ１９７で刺激された場合にＩＦＮ−γ、ＩＬ−１およびＩＬ−１０を産生した（表４）。ＩＬ−１２をワクチンに添加することは、ＩＦＮ−γの抗原特異的産生を劇的に増加させ、また、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生するリンパ系細胞の能力を廃止させた。最大のＩＦＮ−γ産生は最低用量のＩＬ−１２（０．２μｇ）で得；より高用量（とりわけ５μｇ）はこのサイトカインのレベルを低下させるようであった。これは、１μｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７で刺激された培養物中で最もはっきりとみられた。より高用量のＩＬ−１２でのＩＦＮ−γの抑制は、一般化された抑制現象を反映していないかも知れない。なぜなら、ＣｏｎＡに応答するＩＦＮ−γ産生はワクチン中のＩＬ−１２の用量に関係なく同一であったからである。
【００５２】
第二の免疫感作の２週間後に、ＩＬ−１２を含有するワクチンで免疫されたマウスからのリンパ節細胞および脾細胞は、ＩＬ−１２を伴わずに免疫されたマウスに比較してＣＲＭ１９７での刺激に応答して上昇されたレベルのＩＦＮ−γを産生し続けた（表５）。一次ワクチン接種後７日で観察されたとおり、０．２μｇないし１．０μｇのＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γ応答の強化についてのＩＬ−１２の至適用量であった。対照的に、しかしながら、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生は差別的に影響を及ぼされた。１．０および５．０μｇ用量のＩＬ−１２はＩＬ−５応答を本質的に排除したが、しかし、比較により、ＩＬ−１０産生に対する小さな効果のみを有した。ＩＬ−１２（５．０μｇ）はＩＬ−１０を産生する脾細胞の能力を廃止したが、しかしリンパ節細胞の能力はしなかった（表５およ
び６）。
【００５３】
【表３】
2010006827.tif 000004
【００５４】
【表４】
2010006827.tif 000005
【００５５】
【表５】
2010006827.tif 000006
【００５６】
【表６】
2010006827.tif 000007
【実施例３】
【００５７】
乏しく免疫原性の肺炎球菌複合体を伴うＩＬ−１２のアジュバント活性
【００５８】
研究デザイン
スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウス（１群あたり１０匹）を、１００μｇのＡｌＰＯ４を含みもしくは含まず処方された１μｇのＰｎ１８Ｃ複合体で免疫した。ワクチンは、ＩＬ−１２（０．２、１もしくは５μｇ）、１００μｇのＭＰＬ（商標）もしくは２０μｇのＱＳ−２１（商標）のいずれかで補充した。正常マウス血清（最終０．５％）を、希釈されたＩＬ−１２を安定化するために使用し、そして組成に関係なく全部のワクチンに添加した。３週間後にマウスを採血し、そして一次免疫感作で使用された同一のワクチン処方で追加抗原刺激した。出血（ｂｌｅｅｄｓ）は試験の第５および７週（それぞれ追加抗原刺激後２および４週間）にもまた採取した。プールされた血清を、第５週に、Ｐｎ１８ＣおよびＣＲＭ１９７の全ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスについて試験した。Ｐｎ１８Ｃに対する応答体の頻度を測定するため、個々のマウスの血清を５００倍希釈し、そしてＰｎ１８Ｃに対するＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡにより試験した。結果は光学濃度として報告する。
【００５９】
結果
Ｐｎ１８ＣのＩｇＧ応答を表７に提示する。明礬を処方された複合体ワクチンへのＩＬ−１２の添加は、Ｐｎ１８Ｃに対するＩｇＧ応答に対する一貫した効果を有しなかった。５μｇの用量のＩＬ−１２は、プールされた第５週の血清のＩｇＧ力価の３倍の上昇を引き起こした一方、１μｇのＩＬ−１２とともに処方されたワクチンはＰｎ１８Ｃ応答を誘
導しないようであった。最低用量のＩＬ−１２（０．１μｇ）はＩＬ−１２を含有しないＡｌＰＯ４を処方されたワクチンと同一の応答を誘導した。ＭＰＬ（商標）／ＡｌＰＯ４とともに処方されたワクチンは最高頻度の応答を誘導し；７／１０のマウスが、ＱＳ−２１（商標）／ＡｌＰＯ４およびＡｌＰＯ４単独（そのそれぞれは４／１０の応答体を誘導した）と対照的にＯＤ＞０．２を生じた。ＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４を含有するワクチンで免疫されたマウスは、０．１μｇ、１．０μｇおよび５μｇのＩＬ−１２用量でそれぞれ２／１０、０／１０および１／１０の応答体を誘導した。
【００６０】
本実験で、ＭＰＬ（商標）およびＱＳ−２１（商標）は、Ｐｎ１８ＣのＩｇＧ応答のせいぜい３ないし４倍の増大を引き起こした。ＡｌＰＯ４の非存在下で、ＩＬ−１２はＰｎ１８ＣのＩｇＧ応答に対する甚大なアジュバント効果を有しなかった。１μｇ用量のＩＬ−１２を含有するワクチンは、ＩＬ−１２を含まないワクチンと同一のＰｎ１８Ｃ応答を誘導した。より低いおよびより高い用量のＩＬ−１２を含有するワクチンは、対照ワクチンより低い応答を誘導するようであった。ＭＰＬ（商標）もＱＳ−２１（商標）もＰｎ１８ＣのＩｇＧ応答を高めると思われなかった。ＡｌＰＯ４を含まずに処方されたワクチンのあいだで、ＱＳ−２１（商標）が最大の頻度の応答体（７／１０がＯＤ＞０．２を伴う）を誘導した一方、全部の他の処方はせいぜい４／１０の応答体を誘導した。
【００６１】
ワクチン中のＩＬ−１２が実際に活性であったことを確認するため、これらのマウスでのＣＲＭ１９７のＩｇＧ応答を評価した。表８および９は、一次（第３週）および二次（第５週）のワクチン接種後、ＩＬ−１２が、ＡｌＰＯ４を含まずに処方されたワクチンで免疫されたマウスでＣＲＭ１９７のＩｇＧ応答の用量依存性の増大を引き起こすことを示す。さらに、第３および５週でＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ双方の力価のＩＬ−１２の用量依存性の増大、ならびに第５週でＩｇＧ２ｂの増加が存在した。第５週のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価は１００μｇのＭＰＬ（商標）とともに処方されたワクチンにより誘導されたものに類似であった。対照的に、ＩＬ−１２により促進されたＩｇＧ２ｂ力価はＭＰＬ（商標）により誘導されたものより２０倍より低かった。これらのデータは、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂが異なる機構により制御されることを示唆し、ＩｇＧ２ａはＩＬ−１２により活性化される機構に依存性であり、そしてＩｇＧ２ｂはＩＬ−１２非依存性の機構により制御される。これらのデータは、ＩＬ−１２がタンパク質抗原に対するＩｇＧ応答のアジュバントとして作用する可能性があることをはっきりと示す。さらに、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ双方の力価の増大は、少なくともこのモデル内では、ＩＬ−１２がＡｌＰＯ４の非存在下でＰｎＯｓ１８Ｃ−ＣＲＭ１９７複合体によるＴＨ−１様およびＴＨ−２様双方のヘルパー細胞のプライミングを高めることを示唆する。
【００６２】
ＡｌＰＯ４とともに処方されたＰｎ１８Ｃ複合体ワクチンに添加される場合、０．１μｇ用量のＩＬ−１２は、第３週のＣＲＭ１９７に対する全ＩｇＧ応答のもしあればわずかな増大を、しかし、第５週で３倍の増大を引き起こした。しかしながら、この用量のＩＬ−１２は第５週でＩｇＧ２ａ力価を増大させ、ＭＰＬもしくはＱＳ−２１を含有するワクチンにより誘導されたものに類似の力価を促進した。ＩＬ−１２はＩｇＧ２ｂ力価を顕著に増大させなかった。以前の実験でみられたとおり、より高用量のＩＬ−１２はＩｇＧ力価の鋭い減少をもたらし、全部のサブクラスが影響を及ぼされた。
【００６３】
【表７】
2010006827.tif 000008
【００６４】
【表８】
2010006827.tif 000009
【００６５】
【表９】
2010006827.tif 000010
【実施例４】
【００６６】
ＰｎＰｓ６Ｂ−ＣＲＭ１９７およびＰｎＰｓ−１４−ＣＲＭ１９７を含有する二価ワクチンに対するスイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスのＩｇＧ応答に対するＩＬ−１２の効果
【００６７】
研究デザイン
スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスを、投与あたり０．１μｇのＰｎＰｓ６Ｂ−ＣＲＭ１９７複合糖質（ＣＲＭ１９７に共有結合された血清型６Ｂの肺炎球菌からの莢膜多糖の複合体）および投与あたり０．１μｇのＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７複合糖質を含んで成るワクチンで第０および３週に皮下に免疫した。ワクチンは、単独でもしくは１００μｇの明礬（ＡｌＰＯ４）と組み合わせてのいずれかで、０、８、４０もしくは２００ｎｇのＩＬ−１２とともに投与した。正常マウス血清（０．２５％）を、低濃度のＩＬ−１２を安定化させるための担体タンパク質として包含した。対照群のマウスは１００μｇのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））とともに処方されたワクチンで免疫した。マウスを第３週（一次応答）および第５週（二次応答）で採血した。血清を、Ｐｎ６ＢおよびＰｎ１４莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡにより試験した。
【００６８】
結果
ＰｎＰｓ６Ｂ複合体に対する応答
表１０は、二価ワクチンのＰｎ６Ｂ成分に対するプールされた血清のＩｇＧ応答を具体的に説明する。Ｐｎ６Ｂに対する応答は、ワクチンがアジュバントを含有しないもしくはＡｌＰＯ４単独とともに処方された場合は第３週でほとんどもしくは全く検出されなかった。単回のワクチン接種後の最高力価は、明礬と共処方された（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＭＰＬ（商標）もしくは８〜４０ｎｇのＩＬ−１２のいずれかを含有するワクチンにより誘導されたようであった。これらの力価はしかしながら低かった（すなわち３，０００未満）。第５週の応答は、追加抗原刺激後、４０ｎｇのＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４もしくはＭＰＬ（商標）とともに処方されたワクチンがＰｎ６Ｂに対する最高のＩｇＧ力価を誘導したことを示す。明礬の非存在下で、８ないし２００ｎｇの用量範囲のＩＬ−１２はＰｎ６Ｂに対するＩｇＧ力価を高めなかった。
【００６９】
第５週でのＰｎ６Ｂに対するＩｇＧサブクラスの応答を表１０に示す。個々のＩｇＧサブクラスの力価は、アジュバントを含有しないワクチンもしくはＡｌＰＯ４とともに処方されたワクチン（ＩＬ−１２なし）で免疫されたマウスで類似であった。さらに、ＡｌＰＯ４の非存在下で８〜２００ｎｇのＩＬ−１２を含むワクチンを処方することは、ＩｇＧサブクラスの応答を変えなかった。対照的に、これらの用量のＩＬ−１２は、ＡｌＰＯ４と組み合わせられた場合に、Ｐｎ６Ｂに対する本質的に増大されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価をもたらした。これらの力価はＭＰＬ（商標）とともに処方されたワクチンで得られたものに類似であった。ＩＬ−１２はまた、ＡｌＰＯ４とともに処方されたワクチンにより誘導されるＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３力価も増大させたが；しかしながら、これらの力価はＭＰＬ（商標）とともに処方されたワクチンにより誘導されるものより本質的により低いようであった。
【００７０】
ＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４の組み合わせで得られた増大が統計学的に有意であったかどうかを決定するため、選択された群の個々のマウスのＰｎ６ＢのＩｇＧ力価を測定した。幾何平均力価（ＧＭＴ）を表１１に提示する。このデータは、アジュバントを含まずもしくはＡｌＰＯ４単独とともに処方されたワクチンで免疫された群が、Ｐｎ６Ｂに対する類似のＧＭＴを有したことを示す。ＡｌＰＯ４および４０ｎｇのＩＬ−１２を含んでワクチンを処方することは、アジュバントを含有しないワクチンにより誘導されたものを上回る力価の２９倍の増大をもたらした。全部のデータをＡＮＯＶＡ（ＪＭＰソフトウェアによる分散分析；ＳＡＳ  インスティテュート（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ノースカロライナ州ケアリー）により検定した場合、統計学的有意差は見出されなかった。データのサブセットの比較に際して、ＡＮＯＶＡは、アジュバントを含有しないワクチンにより誘導された第５週の応答ならびにＡｌＰＯ４および多様な用量のＩＬ−１２とともに処方されたワクチンを比較する場合に、統計学的有意差を示した。これらのうち、ＡｌＰＯ４および４０ｎｇのＩＬ−１２とともに処方されたワクチンが、アジュバントを含まずに処方されたワクチンよりも有意により高いＰｎ６Ｂ力価を誘導した。その処方の高められた免疫原性のさらなる表示として、その群の１０匹のマウスの７匹が、アジュバントを含まずにもしくはＡｌＰＯ４単独を含んで処方された複合体でワクチン接種された群でのそれぞれ１および２匹のみのマウスに比較して、５０，０００より大きいもしくはそれに等しいＰｎ６Ｂ力価を有した。
【００７１】
【表１０】
2010006827.tif 000011
【００７２】
【表１１】
2010006827.tif 000012
【００７３】
ＰｎＰｓ１４複合体に対する応答
当該ワクチンのＰｎＰｓ１４成分に対するＩｇＧ応答を表１２に示す。このデータは、単独もしくはＡｌＰＯ４とともに処方された場合のいずれかの８〜４０ｎｇの用量範囲のＩＬ−１２が、一次もしくは二次ワクチン接種後のＰｎＰｓ１４に対する応答を高めなかったことを示す。さらに、サブクラス分析は、ＩＬ−１２はＩＬ−１２とともに処方された場合にＩｇＧ２ａ力価を高めなかったことを示した。本研究において、ＭＰＬ（商標）は、以前の研究で少なくともプールされた血清をアッセイする場合に観察された、ＰｎＰｓ１４応答に対する甚大なアジュバント効果を有しなかった。各群の応答の変動の程度の概念を得るために、個々の血清を３００倍希釈でＰｎ１４のＩｇＧ抗体についてアッセイした。表１３に提示される結果は、各群で大きな範囲の応答が存在した、すなわち、変動係数（ＣＶ）が０．０５１であったＭＰＬ（商標）を含有するワクチンで免疫された群を除き、ＣＶが０．２２９から０．５８７までの範囲にわたったことを示唆する。従って、ＭＰＬ（商標）は、Ｐｎ１４のＩｇＧ応答のアジュバントとして作用したかも知れず、また、マウス間の変動を低下させたかも知れないが、しかしＩＬ−１２はそうでないようである。
【００７４】
【表１２】
2010006827.tif 000013
【００７５】
【表１３】
2010006827.tif 000014
【実施例５】
【００７６】
一価のＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７複合体ワクチンに対するマウスの免疫応答に対する明礬の存在もしくは非存在下でのＩＬ−１２の効果の比較
【００７７】
研究デザイン
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり８匹）を、１００μｇのＡｌＰＯ４を含むもしくは含まずかつＩＬ−１２がないかもしくは８、４０、２００、１，０００もしくは５，０００ｎｇのＩＬ−１２とともにのいずれかで処方された１μｇのＰｎＰｓ１４−ＣＲＭ１９７複合体で、第０週に皮下で免疫した。正常マウス血清（０．２５％）を、低濃度のＩＬ−１２を安定化させるための担体タンパク質として包含した。第１週に、リンパ節細胞懸濁液を各群の半分のマウスから調製し、そしてインビトロで抗原特異的サイトカイン産生について評価した。それらの脾もまた収穫しそして重量測定した。第３週に、残存するマウスを採血し、そして最初のワクチン接種で使用された同一のワクチン処方で再免疫した。第５週に、２回免疫されたマウスを放血し、それらの脾を重量測定しそしてそれらの脾細胞をサイトカイン産生について評価した。ＰｎＰｓ１４およびＣＲＭ１９７のＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの力価をプールされた血清で測定した。アッセイを個々のマウスからの血清を使用して実施した場合は、結果を幾何平均力価（ＧＭＴ）として表現する。
【００７８】
結果
免疫感作後１週間の脾重量に対するＩＬ−１２の効果
最初の免疫感作の１週間後に、ＡｌＰＯ４の非存在下で５，０００ｎｇのＩＬ−１２（しかしより低用量のＩＬ−１２ではなく）を受領したマウスは、明礬もＩＬ−１２もいずれも含有しないワクチンを受領するものより有意により大きい脾重量を有したが、（表１４）。ＡｌＰＯ４を含有するワクチンは、４０ないし５０００ｎｇのＩＬ−１２とともに処方された場合により大きな脾重量を誘導した。対にした比較は、２００もしくは１０００ｎｇのＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４とともに処方されたワクチンが、ＡｌＰＯ４の非存在下で同一用量のＩＬ−１２とともに処方されたものより大きな脾重量を誘導したことを示した。全体として、このデータは、ＡｌＰＯ４とともにＩＬ−１２を処方することは、サイトカインの生物学的活性、すなわちワクチン接種後１週間の増大された脾重量を引き起こすその能力を大きく高めたことを示す。
【００７９】
ＰｎＰｓ１４に対するＩｇＧ応答に対するＩＬ−１２の効果
最初に、プールされた血清をＰｎＰｓ１４に対するＩｇＧ抗体についてアッセイした（表１５）。アジュバント効果の最も明瞭な表示は、ＡｌＰＯ４および８ないし４０ｎｇのＩＬ−１２を含有するワクチンでの一次免疫感作後に示された。この組み合わせは、ＡｌＰＯ４もＩＬ−１２もいずれも含まず処方されたワクチンで免疫されたマウスに関して、ＩｇＧ力価の１７ないし２１倍の増大をもたらした。ＡｌＰＯ４およびＩＬ−１２の組み合わせは、個々に使用された場合より大きな応答をもたらし；独力で、ＡｌＰＯ４および４０ｎｇの用量のＩＬ−１２は第３週のＩｇＧ力価でそれぞれ４倍および５倍の増大を引き起こした。ＡｌＰＯ４を含有するワクチンで免疫されたマウスからの個々の血清の分析（表１６）は、８ｎｇのＩＬ−１２が、一次ワクチン接種後に、ＡｌＰＯ４のみで補助された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチンよりも５倍より高いＰｎＰｓ１４のＩｇＧ力価を誘導したことを示した。力価のこの差異は統計学的に有意であった。より高用量のＩＬ−１２は応答を高めなかった。１，０００ないし５，０００ｎｇの用量のＩＬ−１２はＰｎＰｓ１４のＩｇＧ力価の顕著な減少を引き起こした。第二の免疫感作後、４０ｎｇの用量のＩＬ−１２のみが、ＡｌＰＯ４を基礎とするワクチンにより誘導されたＰｎＰｓ１４力価の有意の上昇（３倍）を引き起こした。
【００８０】
プールされた血清のデータは、ＡｌＰＯ４および８〜４０ｎｇのＩＬ−１２の組み合わせが一次免疫感作後にＩｇＧ１力価を高めたことを示唆する。２回のワクチン接種後、ＩＬ−１２は、プールされた（表１５）および個々の血清（表１７）の分析により示されるとおり、ＡｌＰＯ４の非存在下に複合体で免疫されたマウスでのＰｎＰｓ１４に対するＩｇＧ１力価を高めなかった。さらに、ＡｌＰＯ４を含有するワクチンで免疫されたマウスのあいだで、８ないし２００ｎｇのＩＬ−１２の添加は、２回のワクチン接種後のより高いＩｇＧ１力価をもたらさなかった（表１７）。
【００８１】
ＩＬ−１２の最も甚大な効果は、第５週でＰｎＰｓ１４のＩｇＧ２ａ応答を本質的に増大させたことであった。これは、ワクチンがＡｌＰＯ４を含有した場合もしくはＡｌＰＯ４を含まずに処方された場合の双方でみられた（表１８）。ＡｌＰＯ４の非存在下では、ＩｇＧ２ａのＧＭＴの統計学的に有意の増大（１４ないし４２倍）が、８ないし１，０００ｎｇのＩＬ−１２で得られた。同様に、８〜１，０００ｎｇのＩＬ−１２は、ＩｇＧ２ａ抗体を誘導するＡｌＰＯ４含有ワクチンの能力を高めたとは言え、本研究で、８および４０ｎｇの用量のＩＬ−１２により誘導された力価のみが統計学的により高かった。全体として、最高のＩｇＧ２ａ力価は、ＡｌＰＯ４および４０ｎｇのＩＬ−１２とともに処方された複合体により誘導された。これは、ＡｌＰＯ４の非存在下で４０ｎｇのＩＬ−１２により誘導されたＩｇＧ２ａ力価と有意に異なり、再度、ＩＬ−１２のアジュバント活性が明礬により高められたことを示した。
【００８２】
ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３力価を、プールされた血清のみでアッセイした（表１５）。８ないし１，０００ｎｇの範囲のＩＬ−１２の用量は、ＡｌＰＯ４とともに共処方された場合に、一次および二次免疫感作後にＩｇＧ３力価の本質的な増大を促進したが、しかしＡｌＰＯ４の非存在下ではしなかった。ＩｇＧ２ｂ力価に対するＩＬ−１２の一貫した効果は示されなかった。
【００８３】
ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ応答に対するＩＬ−１２の効果
ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ応答もまた、タンパク質担体対複合体の多糖部分に対するＩＬ−１２の効果の間に差異が存在したかどうかをみるために評価した（表１９）。ＡｌＰＯ４の非存在下で、４０ｎｇのＩＬ−１２は、２回のワクチン接種後にＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ力価を適度に増大させるようであった。しかしながら、ＣＲＭ１９７に対する最高のＩｇＧ力価は、ワクチンをＡｌＰＯ４および８〜４０ｎｇのＩＬ−１２双方とともに処方した場合に得られた。ＡｌＰＯ４とともに共処方されたＩＬ−１２の高められたアジュバント活性は、独力で、４０ｎｇのＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４が第５週でＩｇＧ力価の６倍および１７倍の増大をもたらしたが、しかし、一緒に組み合わせられた場合は増大は１４７倍であったという知見により示される。ＩＬ−１２は、ワクチンがＡｌＰＯ４を含んで処方されたかそれを含まずに処方されたかに関係なく、ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ１応答を高めた（表１９および２０）。ＩＬ−１２は、ＡｌＰＯ４を含有するワクチンでの免疫感作後にＣＲＭ１９７に対する第５週のＩｇＧ２ａ力価を本質的に増大させた（表１９）。再度、ＩＬ−１２の至適用量は４０ｎｇであると思われた。このサイトカインは、ＡｌＰＯ４を含有するワクチンにより誘導されたＩｇＧ２ｂ力価を増大させるように思われた。
【００８４】
ＣＲＭ１９７特異的Ｔ細胞のサイトカインの特徴に対するＩＬ−１２の効果
第二のワクチン接種後２週間（第５週）に採取された脾細胞によるサイトカイン産生は、ＩＦＮ−γ産生細胞およびＩＬ−５産生細胞双方のプライミングに対するＩＬ−１２の効果を示した。ＡｌＰＯ４およびＩＬ−１２の非存在下で免疫されたマウスからの脾細胞は、インビトロでＣＲＭ１９７で刺激された場合に検出可能なレベルのＩＬ−５を産生したが、しかしＩＦＮ−γはしなかった（表２１）。ワクチンをＩＬ−１２を含んで処方することは、ＩＬ−５産生細胞の誘導を高めると思われ、ピークの活性は４０ｎｇのサイトカインで生じた。より高用量のＩＬ−１２はＩＬ−５の減少された産生をもたらし、事実上、サイトカインは、１，０００ないし５，０００ｎｇのＩＬ−１２を含有する複合体ワクチンで免疫されたマウスにより産生されなかった。ＩＦＮ−γ産生を確信させることは、５，０００ｎｇのＩＬ−１２とともに処方されたワクチンで免疫されたマウスの脾細胞からのみ検出された。ワクチンをＡｌＰＯ４を含んで処方した場合、８ｎｇのＩＬ−１２の添加は夥しい量のＩＦＮ−γを産生した細胞のプライミングをもたらした一方、このサイトカインの非存在下では、抗原特異的ＩＬ−５産生のみが検出された。最大のＩＦＮ−γ産生のためのプライミングは４０ないし１，０００ｎｇのＩＬ−１２で発生するようである。５，０００ｎｇのＩＬ−１２の添加は、ＩＬ−５産生細胞についてプライミングするワクチンの能力を廃止させた。
【００８５】
【表１４】
2010006827.tif 000015
【００８６】
【表１５】
2010006827.tif 000016
【００８７】
【表１６】
2010006827.tif 000017
【００８８】
【表１７】
2010006827.tif 000018
【００８９】
【表１８】
2010006827.tif 000019
【００９０】
【表１９】
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【００９１】
【表２０】
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【００９２】
【表２１】
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【実施例６】
【００９３】
九価の肺炎球菌複合糖質ワクチンに対する体液性応答に対するＩＬ−１２／ＡｌＰＯ４の効果
【００９４】
研究デザイン
肺炎球菌複合糖質ワクチンに対するＩｇＧ応答に対するＩＬ−１２の効果の評価を、血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから構成される九価の
ワクチンに拡大した。スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスを、第０および３週に、０．１、１もしくは５μｇのワクチン（炭水化物重量）で免疫した。当該ワクチンは、単独、ＡｌＰＯ４（１００μｇ）とともに、または５０、２００もしくは１，０００ｎｇのＩＬ−１２と混合されたＡｌＰＯ４とともに投与した。正常マウス血清はこのワクチンに包含しなかった。血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、および担体タンパク質ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ応答を、第５週（すなわち追加抗原刺激の２週間後）にＥＬＩＳＡにより評価した。
【００９５】
結果
第５週でのＣＲＭ１９７に対する応答
ＡｌＰＯ４を含有するワクチンへのＩＬ−１２の添加は、ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の用量依存性の増大をもたらした。これは試験された複合体の全部の用量でみられた（表２２）。増大されたＩｇＧ２ａ力価は５０ｎｇのサイトカインを受領するマウスで明らかであり、また、１，０００ｎｇで最大であった。これは他の研究と対照をなし、そこでは、最大のＩｇＧ２ａ力価が明礬を基礎としたワクチンに添加された４０〜１００ｎｇのサイトカインで得られ、また、より高用量のＩＬ−１２が減少された免疫応答をもたらした。研究の間の用量応答の差異の理由は未知である。それはワクチンの差異、すなわち多価対一価、もしくは、低濃度のサイトカインを安定化させるため以前の研究でワクチンに包含された正常マウス血清が省かれたことに関係するかも知れない。
【００９６】
肺炎球菌多糖に対する応答
ＡｌＰＯ４を含む九価のワクチンを処方することは、とりわけ最低用量の複合体（０．１μｇ）を使用した場合に、ＰｎＰｓ４、ＰｎＰｓ６Ｂ、ＰｎＰｓ９ＶおよびＰｎＰｓ１４を包含するいくつかの血清型に対するＩｇＧ応答を高めた（表２４〜２７）。ＩＬ−１２の添加はこれらの血清型に対するＩｇＧ応答をさらに高めると思われなかった。しかしながら、ＰｎＰｓ１８Ｃ応答の場合は、ＡｌＰＯ４を含有する５μｇのワクチンへの５０もしくは１，０００ｎｇのＩＬ−１２の添加は、この血清型に対するより高い幾何平均ＩｇＧ力価、および１０，０００より上のＰｎＰｓ１８ＣのＩｇＧ力価をもつマウスのより高い比率をもたらした（表２３）。ＰｎＰｓ１、５、１９Ｆおよび２３Ｆに対する応答は評価しなかった。
【００９７】
ＡｌＰＯ４を含有する九価のワクチンへのＩＬ−１２の添加は、ＰｎＰｓ４、ＰｎＰｓ６Ｂ、ＰｎＰｓ９ＶおよびＰｎＰｓ１４に対するＩｇＧ２ａ力価の用量依存性の増大をもたらした（表２４〜２７）。一般に、ＩｇＧ２ａの増大はＣＲＭ１９７応答のものに平行し、最高の力価は１，０００ｎｇのＩＬ−１２で得られた。一価のＰｎＰｓ１４複合体もしくは二価のＰｎＰｓ６Ｂ／ＰｎＰｓ１４ワクチンを使用する実験と対照的に、５０ｎｇの用量のＩＬ−１２はこれらの血清型に対するＩｇＧ２ａ応答に対する効果をほとんどもしくは全く有しなかった。例外はＰｎＰｓ１４に対するＩｇＧ２ａ応答である。なぜならこの用量のサイトカインはこの血清型に対する応答を高めるように思われたからである（表２７）。
【００９８】
全体として、本研究は、ＩＬ−１２が多価ワクチン中に存在する複数の肺炎球菌の血清型に対する補体結合ＩｇＧ２ａ抗体サブクラスの応答を促進することができることを示す。
【００９９】
【表２２】
2010006827.tif 000023
【０１００】
【表２３】
2010006827.tif 000024
【０１０１】
【表２４】
2010006827.tif 000025
【０１０２】
【表２５】
2010006827.tif 000026
【０１０３】
【表２６】
2010006827.tif 000027
【０１０４】
【表２７】
2010006827.tif 000028
【実施例７】
【０１０５】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タイプＣ（ｍｅｎＣ）複合糖質ワクチンに対する免疫応答に対するＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４の効果
【０１０６】
研究デザイン
本研究は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タイプＣ（ｍｅｎＣ）に対するワクチンを用いてＩＬ−１２を評価した。スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスを、第０および３週に、単独で、ＡｌＰＯ４（１００μｇ）、もしくはＩＬ−１２（５０ｎｇ）およびＡｌＰＯ４の組み合わせとともに処方された０．１μｇもしくは１μｇのＭｅｎＣ複合糖質で免疫した。正常マウス血清はワクチンに添加しなかった。マウスを第３および５週に採血し、そして、血清を、ｍｅｎＣの多糖に対するＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１０７】
結果
より高用量の複合体で免疫される場合、同等なｍｅｎＣのＩｇＧ力価がアジュバント処方に関係なく生じられた。しかしながら、ワクチンへのＩＬ−１２／ＡｌＰＯ４の添加は
、ＡｌＰＯ４（しかしＩＬ−１２でなく）とともに処方された、もしくはアジュバントのない場合より、多糖に対するより高いＩｇＧ２ａ力価をもたらした。
【０１０８】
より低用量の複合体で免疫されたマウスでは、より高いｍｅｎｉｎｇＣ力価が、ワクチンをＡｌＰＯ４とともに処方した場合に得られた（表２８）。アジュバントへのＩＬ−１２の添加は全ＩｇＧ力価を高めなかったが、しかし、ＩｇＧ２ａ抗体の＞１０倍の増加をもたらした。これらのデータは、ＡｌＰＯ４とともにのＩＬ−１２はｍｅｎＣ複合糖質ワクチンに対する補体結合ＩｇＧサブクラスの誘導を促進する可能性があることを示す。
【０１０９】
【表２８】
2010006827.tif 000029
【実施例８】
【０１１０】
インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂ複合糖質ワクチン（ＨｂＯＣ）に対する免疫応答に対するＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４の効果
【０１１１】
研究デザイン
本研究は、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂに対するワクチンを用いてＩＬ−１２を評価した。スイス  ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ
Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウス（１群あたり１０匹）を、第０および３週に、ＣＲＭ１９７に複合されたインフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂからの莢膜多糖（ＨｉｂＰｓ）より成る複合糖質ワクチン０．１μｇもしくは１．０μｇで免疫した。ワクチン（ＨｂＯＣ）を、単独で、またはＡｌＰＯ４（１００μｇ）もしくはＩＬ−１２（５０ｎｇ）およびＡｌＰＯ４の混合物と共同して投与した。正常マウス血清はワクチンに添加しなかった。マウスを第３および５週に採血した。ＨｉｂＰｓに対する抗体応答を、アイソタイプすなわちＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡに関係なく糖への全部の抗体結合を測定するファー（Ｆａｒｒ）アッセイを使用して測定した。ＩｇＧサブクラスの応答はＥＬＩＳＡにより測定した。加えて、ＣＲＭ１９７に対するＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの応答もまたＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１２】
結果
第３週の採血からプールされた血清における抗ＨｉｂＰｓ抗体の力価（一次応答）は、免疫感作に使用された複合体の用量に関係なく、単独で、ＡｌＰＯ４もしくはＩＬ−１２
およびＡｌＰＯ４とともに処方されたワクチンで免疫されたマウスの間で異ならなかった（表２９）。第５週の採血からのプールされた血清の分析は、ＩＬ−１２および明礬を含むＨｂＯＣ１μｇで免疫されたマウスでは、明礬とともにもしくはアジュバントを含まずに与えられた場合よりも少なくとも１０倍より高い抗ＨｉｂＰｓをもたらしたことを示唆した（表３０）。しかしながら、個々のマウス血清の分析は、これがおよそ１０，０００μｇ／ｍＬの力価を有する単一のマウスによったことを示した。この結果を幾何平均力価として表現する場合、ＩＬ−１２による高められたＨｉｂＰｓ応答の証拠が存在しなかった。ＨｉｂＰｓに対するＩｇＧサブクラスの応答を、プールされた血清でＥＬＩＳＡにより評価した。ＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４の組み合わせは、１μｇの複合体で免疫されたマウスでＩｇＧ２ａ力価を３倍高めたように思われた。しかしながら、これは、ＡｌＰＯ４単独で補助されたワクチンで得られた力価と異ならなかった。０．１μｇのＨｂＯＣで免疫されたマウスでは、ＩＬ−１２およびＡｌＰＯ４はＨｉｂＰｓに対するＩｇＧ２ａ力価を高めなかった。ＩＬ−１２／ＡｌＰＯ４のアジュバントの組み合わせが活性であったことが、抗ＣＲＭ１９７応答の分析により示され（表３１）、ここでは担体タンパク質に対する増大されたＩｇＧ２ａ力価がいずれかの用量の複合体で免疫されたマウスでみられた。
【０１１３】
【表２９】
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【０１１４】
【表３０】
2010006827.tif 000031
【０１１５】
【表３１】
2010006827.tif 000032
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、髄膜炎菌莢膜多糖原対する保護的免疫応答を調節するワクチン組成物を提供できる。したがって、少なくとも製薬業にて利用可能である。