(57)【要約】【課題】細胞毒性が低く、高効率かつ簡便な機能性核酸の細胞への導入システムを提供する。【解決手段】アルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下である細胞透過性を示すポリペプチドと、核酸結合性を示すポリペプドとが、グリシン−プロリン−グリシンからなるスペーサーを介して結合している核酸導入用ベクターと機能性核酸とを混合し、該混合物を細胞に接触させることにより、機能性核酸を細胞へ導入する。【選択図】図１
2010259371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列におけるアルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下である細胞透過性を示すポリペプチドと、核酸結合性を示すポリペプドとが、グリシン−プロリン−グリシンからなるスペーサーを介して結合していることを特徴とする、核酸導入用ベクター。
【請求項２】
細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
核酸結合性を示すポリペプチドが、５〜２０個の連続する塩基性アミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクターと、機能性核酸とを混合し、該混合物を被導入細胞と接触させる工程を含む、機能性核酸の細胞への導入方法。
【請求項５】
機能性核酸のモル数に対し２〜２０倍のモル数の核酸導入用ベクターを混合することを特徴とする、請求項４に記載の導入方法。
【請求項６】
機能性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項４または５に記載の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性核酸を細胞に導入するための核酸導入用ベクター及び該導入用ベクターを用いた機能性核酸の細胞への導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
機能性核酸を細胞内へ導入する技術については、リポカチオン系試薬が開示されており、市販化されている。具体的には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＮＡｉＭａｘやＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｄａｒｍａｃｏｎ社のＤａｒｍａｆｅｃｔシリーズなどがこれに該当する。また、細胞通電装置を用いた電気穿孔法による核酸導入技術が知られており、Ａｍａｘａ社のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍがその代表である。さらに、ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の産生に必要な遺伝子領域をコードするＤＮＡを組み込んだレトロウイルスベクターを用いた核酸導入法についても開示されている（非特許文献１および２）。
【０００３】
しかしながら、リポカチオン系試薬は細胞毒性を有する問題があり、この点に焦点を当て改良が重ねられているが、いまだ問題点を十分克服するに至っておらず、臨床応用も困難な状況である。また、リポカチオン系試薬を用いた場合、細胞種によって導入効率が大きく異なり、特に血球系細胞や神経系細胞においては、導入効率が極端に低いという欠点がある。また、上記導入技術は、局所注入を除き、全身投与などの広範囲な生体内送達を目的とした生体への導入は手法上困難である。さらに、核酸導入試薬と核酸導入装置を組み合わせた市販の電気穿孔システム（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、ａｍａｘａ社等）は、導入対象となる細胞が通電により死滅・変性する問題や導入条件の変更が複雑であるといった問題があり、臨床への応用は期待できない上、核酸導入装置の価格が約３００万円と高価であり、細胞系により変更が必要な個々の導入試薬も６万円前後と高価である。
【０００４】
一方、ウイルスベクターを用いた導入法については、感染性病原体をバックボーンしており、その安全性については未だ確立されていない。また、ウイルスベクターを用いた導入法は、反復投与により生体内で中和抗体の産生が起こり、核酸の導入効率が低下することが大きな弱点である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Berns K,et al., Nature. 2004 Mar 25;428(6981):431-7.
【非特許文献２】Moffat J, et al.,Cell. 2006 Mar 24;124(6):1283-98
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞毒性が低く、簡便かつ高効率に機能性核酸を細胞に導入することができる核酸の導入システムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下である細胞透過性を示すポリペプチドと、核酸結合性を示すポリペプドとが、グリシン−プロリン−グリシンからなるスペーサーを介して結合している核酸導入用ベクターを用いることで、機能性核酸を簡便、高効率かつ低細胞毒性で細胞に導入できることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］
アミノ酸配列におけるアルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下である細胞透過性を示すポリペプチドと、核酸結合性を示すポリペプドとが、グリシン−プロリン−グリシンからなるスペーサーを介して結合していることを特徴とする、核酸導入用ベクター。［２］
細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列からなる、［１］に記載のベクター。
［３］
核酸結合性を示すポリペプチドが、５〜２０個の連続する塩基性アミノ酸配列を有する、［１］または［２］に記載のベクター。
［４］
［１］〜［３］のいずれかに記載のベクターと、機能性核酸とを混合し、該混合物を被導入細胞と接触させる工程を含む、機能性核酸の細胞への導入方法。
［５］
機能性核酸のモル数に対し２〜２０倍のモル数の核酸導入用ベクターを混合することを特徴とする、［４］に記載の導入方法。
［６］
機能性核酸がｓｉＲＮＡである、［４］または［５］に記載の導入方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の核酸導入用ベクターを用いることで、機能性核酸を簡便かつ高効率に細胞へ導入することができる。また、本発明の核酸導入用ベクターは、被導入細胞に対する毒性が低いため、細胞がダメージを受けにくく、導入された核酸が該細胞内で十分に機能することができる。さらに、機能性核酸としてｓｉＲＮＡを用いた場合には、ＲＮＡインターフェアレンスによる遺伝子のノックアウトを効率よく行うことができる。本発明の具体的な特徴を以下に示す。
【００１０】
（i）本発明の核酸導入用ベクターを用いることで、リポフェクションや電気穿孔法に比べ、高い効率で機能性核酸を細胞内へ導入できる。すなわち、本発明の核酸導入用ベクターを用いることで、核酸導入操作に供された細胞のほぼ１００％に機能性核酸を導入することができる。
（ii）本発明の核酸導入用ベクターと機能性核酸との結合は、該ベクター中の核酸結合性ポリペプチドと、機能性核酸との非共有結合であるため、細胞内ｐＨやペプチド消化系などの生理環境下で、導入された機能性核酸がベクターから効率よく遊離する。
（iii）本発明の核酸導入用ベクターと機能性核酸との結合は、核酸結合性ポリペプチドと機能性核酸との電荷を利用したイオン結合であるため、本発明の核酸導入用ベクターはあらゆる機能性核酸を結合させることができ、高度の汎用性を有する。
（iv）本発明の核酸導入用ベクターはオリゴペプチドであり、細胞内における生理的分解・代謝を受ける点で、有機化合物・リピッド系導入試薬などと比較して、細胞毒性及び組織侵襲性が有意に低い。
（v）本発明の核酸導入用ベクターは低分子量であるため、組み替えウイルスベクターと異なり、免疫原性が低く、該ベクターに対する生体の中和免疫応答が非常に弱い。したがって、生体応用を目的として反復導入を行っても、導入効率が低下することがない。
（vi）本発明の機能性核酸の細胞への導入方法は、ＰＮＡなどの核酸修飾やプラスミドＤＮＡの構築・導入などの間接技術を要さず、機能性核酸としてｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ（ＰＮＡ化などの化学修飾を要しない）のｓｍａｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ, ｍｉＲＮＡ)を直接導入できる点で簡便性を有し、しかも迅速に効果を発揮する。
（vii）本発明の核酸導入用ベクターは、通常のアミノ酸合成費レベルで製造がまかなえることから、特別な装置の購入などが不要な点で安価である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の核酸導入用ベクターのデザインと、該ベクターとｓｉＲＮＡとを混合する事により形成される複合体の概念を示す模式図である。
【図２】連続するアルギニン配列の長さとｓｉＲＮＡに対する結合能との関係を、ＢＩＡＣＯＲＥシステムを用いて表面プラズモン共鳴により調べた結果である。
【図３】Ｋ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞へのＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡの取り込みを調べた図である。Ａは本発明に係る核酸導入用ベクターとｓｉＲＮＡの混合物を細胞と接触させた場合、ＢはｓｉＲＮＡのみを細胞と接触させた場合、Ｃは既存のリポカチオン系導入試薬を用いた場合の結果を示す（顕微鏡写真）。
【図４】本発明の核酸導入用ベクターを用いて、ＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡを、ヒト正常末梢血リンパ球に導入した結果（Ａ）、１２時間ＩＬ−２刺激を加えた非腫瘍性Ｔブラスト細胞に導入した結果（Ｂ）、ヒト正常皮膚線維芽細胞に導入した結果（Ｃ）、正常マウス肝細胞に導入した結果（Ｄ）を示す（顕微鏡写真）。
【図５】本発明の核酸導入用ベクターであるＫＳＨ４−１５Ｒを用いて、Ｄｒｐ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡをＨｅｌａ細胞に導入し、その細胞抽出物を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す（写真）。抗体は抗Ｄｒｐ１抗体と抗Ａｃｔｉｎ抗体を用いた。
【図６】本発明の核酸導入用ベクターであるＫＳＨ４−１５Ｒを用いて、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子に対するｓｉＲＮＡをＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞に導入し、その細胞抽出物を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す（写真）。抗体は抗ＡＢＬ抗体を用いた。
【図７】本発明の核酸導入用ベクターを用いて、ｂｃｒ−ａｂｌ ｃｈｉｍｅｒａ ｍＲＮＡを標的とする非標識ｓｉＲＮＡをＫ５６２細胞に導入し、その増殖抑制効果を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）核酸導入用ベクター
本発明の核酸導入用ベクターは、アミノ酸配列におけるアルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下である細胞透過性を示すポリペプチドと、核酸結合性を示すポリペプチドとが、グリシン−プロリン−グリシンからなるスペーサー（以下これを「ＧＰＧスペーサー」と称することがある）を介して結合している構造を有する。
【００１３】
アミノ酸配列におけるアルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下である細胞透過性を示すポリペプチドとは、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数に対するアルギニンとリジンの数の和の割合が３５％以下であり、かつ、細胞と接触することで細胞膜を透過できる性質を有するポリペプチドをいう。アミノ酸配列におけるアルギニンとリジンの構成比率の和が３５％以下であるポリペプチドとして、細胞透過性を示す１５ｍｅｒのポリペプチドの場合では、アルギニンとリジンの数の和が５ｍｅｒ以下、好ましくは４ｍｅｒ以下、さらに好ましくは３ｍｅｒ以下のものが挙げられる。細胞透過性を示すポリペプチドの好ましい長さは１０〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは１０〜２０ｍｅｒである。
【００１４】
このような細胞透過性を示すポリペプチド（以下、細胞透過性ポリペプチドと呼ぶことがある）として、具体的には、配列番号１〜４７のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられるが、配列番号１〜６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましく、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがさらに好ましい。また、上記アミノ酸配列のＮ末及び／又はＣ末に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸配列が、全体としてアルギニン及びリジンの構成比率の和が３５％を超えないように付加されたものも本発明の細胞透過性ポリペプチドとして用いることができる。さらに、細胞透過性ポリペプチドとして知られているＨＩＶ−１ ＴＡＴ、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１、ｐＡｎｔｐ４３−５８（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、Ｔｒａｍｓｐｏｒｔａｎ、ＭＡＰ、ＳＮ５０（ＮＦ−ｋＢ ｐ５０  ＮＬＳ）、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ｐｏｌｙ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈａｌｆ ｏｆ ＨＳＶ ＶＰ２２等も用いることができるが、これらのポリペプチドのアルギニンとリジンの構成比率の和が３５％よりも高い場合には、変異を入れて塩基性アミノ酸の構成比率を低くして用いることもできる。
【００１５】
核酸結合性を示すポリペプチド（以下、核酸結合性ポリペプチドと呼ぶことがある）は、核酸結合性を有するものであれば特に制限はないが、５個以上、好ましくは８個以上、さらに好ましくは１４個以上の連続する塩基性アミノ酸配列を含むものが好ましい。この場合、連続する塩基性アミノ酸は２０個以下であることが好ましい。塩基性アミノ酸は同一のものが連続していても、異なる塩基性アミノ酸同士が隣り合う形で連続していてもよい。ここで、塩基性アミノ酸とは、分子内に２つ以上のアミノ基（イミダゾイル基を含む）を有するアミノ酸を意味し、アルギニン、リジン、ヒスチジン等がこれに該当する。このような核酸結合性ポリペプチドの好ましい例として、アルギニンが１４〜２０個連続したアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
【００１６】
本発明の核酸導入用ベクターは、上記細胞透過性ポリペプチドと核酸結合性ポリペプチドとが、グリシン−プロリン−グリシンからなるスペーサーを介して結合しているものである。本発明の核酸導入用ベクターにおける、細胞透過性ポリペプチドと核酸結合性ポリペプチドの結合順序はいずれでもよいが、Ｎ末から〔細胞透過性ポリペプチド〕−〔スペーサー〕−〔核酸結合性ポリペプチド〕の順で結合しているものが好ましい。
【００１７】
本発明の核酸導入用ベクターは、それ自体公知の化学合成方法により製造することもできるし、該ベクターのポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを取得して、公知の方法により転写・翻訳することにより製造することもできる。
【００１８】
（２）機能性核酸の細胞への導入方法
本発明の核酸導入用ベクターを機能性核酸と混合した後に、該混合物を被導入細胞と接触させることにより、該機能性核酸を細胞に導入することができる。
【００１９】
機能性核酸とは、被導入細胞中で何らかの機能をする核酸であれば如何なるものでもよい。被導入細胞中での機能として、例えば、特定の遺伝子の発現をＲＮＡインターフェアレンス等により抑制する機能（ｓｉＲＮＡとしての機能やｍｉＲＮＡとしての機能）や、細胞に特定の機能を発揮させるための分化シグナルの誘導機能等が挙げられる。
【００２０】
機能性核酸は、上記核酸導入用ベクター中の核酸結合性ポリペプチドに結合するものであれば何れでもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ（２’−Ｏ,４'−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ａｃｉｄｓ）などのオリゴ核酸の何れでもよい。但し、本発明の方法によって細胞内へ導入された後、機能性核酸は核酸導入用ベクターから切り離されて機能できるようにするために、核酸結合性ポリペプチドとの結合は、共有結合等の強固な結合ではなく、イオン結合等の非共有結合である必要がある。
【００２１】
機能性核酸は、具体的には、直鎖の２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、環状２本鎖ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）等が挙げられる。核酸の塩基数は特に制限はないが、１０〜１００塩基程度が好ましい。これらの機能性核酸として、最も好ましくは２１〜２３塩基対から成る低分子の２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））である。
【００２２】
また、機能性核酸には必要に応じて蛍光物質や発光物質等の標識を結合させることもできる。このような機能性核酸を本発明の方法により細胞に導入した後、結合した標識に適した検出方法で該細胞を観察することにより、機能性核酸の細胞内での動きや細胞内への導入効率等を観察、測定することもできる。
【００２３】
本発明の核酸導入用ベクターと機能性核酸を混合した後に、該混合物を被導入細胞と接触させることにより機能性核酸を該細胞へ導入する方法を、図１の概略図に沿って以下に説明する。
【００２４】
本発明の核酸導入用ベクターと機能性核酸を混合すると（以下、これを「混合物」と称することがある）、図１に示すように一個の機能性核酸に対して複数の核酸導入用ベクター分子がその核酸結合ポリペプチドを介して会合する。このとき形成される複合体は、水溶液中で機能性核酸を中心に複数の細胞浸透性（透過性）ドメインを有する状態となり、飛躍的な取り込み効率の増強が期待される。
【００２５】
この複合体を形成させるために、核酸導入用ベクターと機能性核酸の混合比率が重要となる。混合比率としては、機能性核酸に対し２〜２０倍のモル数、さらに好ましくは５〜１０倍のモル数の核酸導入用ベクターを混合することが好ましい。混合する際の溶媒としては、生化学分野において、核酸の取り扱いに使用され得る緩衝液であればいずれのものでもよいが、ＤＮａｓｅやＲＮａｓｅを含んでいないものを用いることが望ましい。具体的な濃度としては、例えば核酸導入用ベクターを最終濃度で０．５〜１０μＭにすることができ、該ベクターのモル数の１/２０〜１/２倍のモル数になるように機能性核酸を混合することができる。
【００２６】
混合時間は５〜６０分程度が好ましく、混合の際の温度は、被導入細胞及び機能性核酸に応じて適宜選択することができるが、１０〜３０℃の室温で行うことが好ましい。
【００２７】
続いて混合物を被導入細胞と接触させる。被導入細胞は、機能性核酸を機能させる細胞であり、目的に応じて適宜選択される。被導入細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、単細胞生物に由来する細胞であっても、多細胞生物に由来する細胞であっても良い。真核細胞は動物細胞であることが好ましいが、植物細胞であっても、細胞壁を取り除いたプロトプラストの状態であれば本発明における被導入細胞になり得る。動物細胞としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ヒトを含む哺乳類に由来する細胞が挙げられる。哺乳類に由来する被導入細胞の例として、上皮系悪性腫瘍細胞（肺癌、大腸がん、胃がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、乳がん、及びこれらに対するがん幹細胞）、間葉系悪性腫瘍細胞（骨肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、消化器間葉系腫瘍、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫）、造血器腫瘍（骨髄球性白血病、リンパ球性白血病、悪性リンパ腫）、脳腫瘍細胞（グリオーマ）等の腫瘍細胞が挙げられる。また、非腫瘍細胞は、神経細胞、グリア細胞、末梢血リンパ球、多分化能幹細胞などの非腫瘍細胞であってもよい。
【００２８】
上記被導入細胞を混合物と接触させる前に、被導入細胞は各細胞に適した方法で培養調製される。混合物と被導入細胞の接触方法は特に制限はないが、具体的には、被導入細胞を含む培養液に、混合物を添加する方法が挙げられる。混合物を添加する際の細胞数は、細胞５万〜１００万個であることが好ましく、細胞１０万個あたり、１０〜５００ｐｍｏｌの混合物（絶対量）を、０．５〜５μＭ（濃度）となるように添加することが好ましい。
【００２９】
被導入細胞と上記混合物を接触させた後、機能性核酸が被導入細胞に導入されるのに十分な時間、該細胞を培養する。培養時間、温度、条件などは用いられる被導入細胞や、機能性核酸の機能に応じて適宜選択される。通常、１２〜４８時間程度培養すれば、本発明の核酸導入用ベクターにより機能性核酸が被導入細胞内へ導入される。
【００３０】
（３）本発明の核酸導入用ベクターの用途
本発明の核酸導入用ベクターは、機能性核酸を細胞に導入するために用いられる。
本発明の核酸導入用ベクターは、ヒト等の未知遺伝子の機能探索に用いることができる。また、トランスレーショナル・リサーチを通じて近未来的な「制がん」や中枢神経などの「変性疾患」を対象とする治療法の開発にも用いられる。すなわち、本発明の核酸導入用ベクターを用いることで、新たな「ＲＮＡ干渉薬」の実現やＲＮＡの医薬化が実現する可能性があり、本発明は、わが国発信の実用的新技術として、世界的に大きな克服課題となっているがんなどの成人病や難治性疾患の治療に大きく貢献できると期待される。また、本発明が実用化されれば、医学・生物学分野における有用な研究ツールとして使用できるため、キット製品等の販売による直接的な経済的効果、また技術波及によるＲＮＡ研究分野の活性化という間接的な経済効果も期待される。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、任意に変形して実施することができる。
【００３２】
［参考例１］
核酸結合性ポリペプチドとしてのポリアルギニンの評価
８個、１０個、１４個の各連続したアルギニン配列からなる合成ペプチドをそれぞれＧＰＧスペーサーに結合させたポリペプチドを、分子間相互作用解析装置（ＢＩＡＣＯＲＥ）用センサーチップに固定し、配列番号４９に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（シグマジェノシス社に依頼して合成した）を０．０４μＭ、０．２μＭ、１μＭ又は８μＭの濃度で含むの流体系に注入し、チップ上のアルギニンとｓｉＲＮＡとの間の結合力を検証した。この結果を図２に示す。図２に示されるように、８、１０、１４個の塩基性アミノ酸である連続アルギニン配列はいずれもｓｉＲＮＡと結合することが判明した。さらに注目すべき点として、アルギニンの個数を１４個にした場合、１０個以下のものに比べｓｉＲＮＡの結合力が３倍程度まで上昇することが明らかとなった。
【００３３】
［実施例１］
（１）核酸導入用ベクター及び機能性核酸としてのｓｉＲＮＡの調製
核酸導入用ベクターとして、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、ＧＰＧスペーサー及び１４個の連続アルギニン配列を、Ｎ末端からＣ末端の方向においてこの順に結合させたポリペプチド(ＫＳＨ４−１５Ｒ）を、化学合成法（シグマジェノシス社に依頼して合成）により合成した。また、機能性核酸として、ｂｃｒ−ａｂｌ ｃｈｉｍｅｒａ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ(配列番号４８)の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを合成した（シグマジェノシス社に依頼して合成した。３’末端の２塩基のみがＤＮＡ（チミン）となっている、ＲＮＡとＤＮＡのキメラ配列からなる）。さらに、該ＲＮＡ鎖にアミノリンカーを用いてＦＩＴＣで標識した（以下、これを「ＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡ」と称する）。
【００３４】
（２）ｓｉＲＮＡの細胞への導入
上記で調製した１００μＭのＫＳＨ４−１５Ｒの水溶液（ＲＮＡａｓｅフリー）５μＬと、１０μＭのＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡの水溶液（ＲＮＡａｓｅフリー）５μLを４０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地(ＧＩＢＯＣＯ社製)で混和し、２０分間室温で放置した。その後、該混合物を１０万個のＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞（ＡＴＣＣ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ＣＣＬ−２４３）を４５０μＬのＤＭＥＭ培地中に懸濁した培養液中に添加し、２４時間後に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な上記培地に再懸濁した。この細胞懸濁液について、ｓｉＲＮＡの取り込みを、蛍光顕微鏡で観察して確認した（図３Ａ）。
【００３５】
また、ＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡのみを培養液中に添加したものをコントロールとして、同様に蛍光顕微鏡で観察した（図３Ｂ）。
【００３６】
図３Ａより明らかなとおり、本発明の核酸導入用ベクターを用いた方法では、ＦＩＴＣによる蛍光が細胞内で多く観察され、ほぼ１００％の細胞にｓｉＲＮＡが導入されていることが確認できた。また、細胞の生存率(ｖｉａｂｉｌｉｔｙ)もよく、機能性核酸の導入により細胞が損傷を受けていないことも確認できた。さらに、取り込みの効率を表す細胞蛍光シグナルが強いことが判明した。一方、図３Ｂに示されるように、核酸導入用ベクターを用いずに、ＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡのみで導入操作を行ったものは、細胞内へのＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡの導入が観察されなかった。
【００３７】
また、従来法との比較のために、リポカチオン導入試薬（インビトロジェン社製）を用いてＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡを導入し、同様に蛍光顕微鏡で観察した（図３Ｃ）。
【００３８】
図３Ｃに示されるように、リポカチオン導入薬を用いてＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡを導入すると、細胞にアポトーシス像が目立ち、また取り込みムラがあり、取り込み細胞数も少なかった。
【００３９】
（３）各種プライマリー細胞へのｓｉＲＮＡの導入
次に本発明の核酸導入用ベクターの他の細胞への導入についても観察した。
１０万個のヒト正常末梢血リンパ球（健常者から２０ｍＬ採血し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２倍希釈したのち、１５ｍＬ ｔｕｂｅに入れたＦｉｃｏｌｌ ｈｙｐｅｒｑｕｅ上に重層した後遠心し、境界部の分離成分を回収して調製した）、１２時間ＩＬ−２刺激を加えた非腫瘍性Ｔブラスト細胞、ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｎｏｒｍａｌ； Ｈｕｍａｎ， Ｎｅｏｎａｔａｌ ＃ＰＣＳ−２０１−０１０）、及び正常マウス肝細胞（Ｂａｌｂ／ｃマウスの門脈から、コラゲナーゼ及びＤＮａｓｅ Ｉが入ったＰＢＳ溶液をゆっくりと注入して肝臓組織を切除、採取し、ハサミで細分化した後、３７℃で約２０分静置し、さらにコラゲナーゼ及びＤＮａｓｅ Ｉ入りＰＢＳ溶液を加えて反応後、メッシュを通し、通過した細胞を遠心して回収することにより調製した）を被導入細胞として、上記と同様にしてＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡの導入を蛍光顕微鏡及び位相差顕微鏡にて観察した。結果を図４に示す。
【００４０】
図４のＡは本発明の核酸導入用ベクターを用いてヒト正常末梢血リンパ球にｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、同様にＢは１２時間ＩＬ−２刺激を加えた非腫瘍性Ｔブラスト細胞、Ｃはヒト正常皮膚線維芽細胞、Ｄは正常マウス肝細胞にｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。図４Ａ〜Ｄから明らかなとおり、いずれの細胞においても効率よくｓｉＲＮＡが細胞内に導入されていることがわかった。
【００４１】
（４）本発明の核酸導入用ベクターによるｓｉＲＮＡ導入後の標的遺伝子の抑制効果の検討
（ｉ）Ｈｅｌａ細胞でのＤｒｐ１タンパク質の発現抑制
上記（１）で調製した核酸導入用ベクター（ＫＳＨ４−１５Ｒ）をＲＮＡａｓｅの混入していない水に溶かして調製した２００μＭの水溶液５μＬと、配列番号４９に記載のＤｒｐ１ ｓｉＲＮＡ(Ｄｈａｒｍａｃ社製)をＲＮＡａｓｅの混入していない水に溶かして調製した１０μＭの水溶液５μＬを、４０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地(ＧＩＢＯＣＯ社製)で混和し、２０分室温で放置した。その後、該混合物を４５０μＬのＤＭＥＭ培養液にて培養しておいたＨｅｌａ細胞(ＲＩＫＥＮより購入)に添加した。４８時間後にＨｅｌａ細胞の抽出液を調製し、抗Ｄｒｐ１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）と抗Ａｃｔｉｎ抗体（ケミコン社製）を用いてウエスタンブロットを行い、ｓｉＲＮＡのＤｒｐ１タンパク質の発現抑制効果を調べた（図５）。図５に示されるように、ｓｉＲＮＡをＫＳＨ４−１５Ｒと混合して培養液に添加した場合にのみ抑制効果が確認できた。
【００４２】
(ｉｉ)Ｋ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞でのＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の発現抑制及び細胞増殖抑制
上記（１）で調製した核酸導入用ベクター（ＫＳＨ４−１５Ｒ）をＲＮＡａｓｅの混入していない水に溶かして調製した２００μＭの水溶液２μＬと、ｂｃｒ−ａｂｌ ｃｈｉｍｅｒａ ｍＲＮＡを標的する非標識ｓｉＲＮＡ（配列番号４８、シグマジェノシス社に依頼して合成）を１０μＭの濃度でＲＮａｓｅの混入していない水に溶解した水溶液２μＬとを、１６μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地(ＧＩＢＯＣＯ社製)で混和し、２０分間室温で放置した。その後、該混合物を１８０μＬのＤＭＥＭ培養液にて培養しておいたＫ５６２細胞に添加した。４８時間後にＫ５６２細胞の抽出液を調製し、抗ＡＢＬ抗体（Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いてウエスタンブロットを行い、ｓｉＲＮＡのＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の発現抑制効果を調べた（図６）。図６に示されるように、ｓｉＲＮＡと導入ペプチドを混合した時のみ抑制効果が確認できた。また、この抑制効果はＡＢＬには作用しない事よりキメラ領域にのみ作用していることを示している。
【００４３】
続いて、このｂｃｒ−ａｂｌ ｃｈｉｍｅｒａ ｍＲＮＡを標的する非標識ｓｉＲＮＡによりＫ５６２細胞の増殖抑制効果を調べた。ＲＮａｓｅの混入していない水で１００μＭの濃度になるように調製したＫＳＨ４−１５Ｒ溶液を２μＬと、ｂｃｒ−ａｂｌ ｃｈｉｍｅｒａ ｍＲＮＡを標的する非標識ｓｉＲＮＡ（配列番号４８、シグマジェノシス社に依頼して合成）をＲＮａｓｅの混入していない水で１０μＭになるように調製した溶液２μＬを、１６μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地(ＧＩＢＯＣＯ社製)で混和し、２０分間室温で放置した。
【００４４】
２万個のＫ５６２細胞を２００μＬのＤＭＥＭ溶液で４８穴プレートの各ウェルにスプリットし、ここに上記のＫＳＨ４−１５ＲとｓｉＲＮＡとの混合液を添加し、４８時間後、７２時間後の細胞数の変動を解析した。細胞数の計測に当たっては、Ｔｒｙｐａｎ−ｂｌｕｅ染色によるｄｙｅ−ｅｘｃｌｉｓｉｏｎ法を用い、ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒで生細胞の１ｍＬ当たりの個数を算定した。対象群として、本発明の核酸導入用ベクターおよびｓｉＲＮＡの添加のないもの(ｎｏ ｔｒｅａｔ)、導入用ベクターのみ添加のもの（ＫＳＨ４−１５ ａｌｏｎｅ）、ｓｉＲＮＡのみ添加のもの（ｓｉＲＮＡ ａｌｏｎｅ）を用意し、各サンプル中の細胞数を縦軸に、経過時間を横軸としてグラフ化して比較した。この結果を図７に示す。図７から明らかなように、導入用ベクターとｓｉＲＮＡの混合物を添加したものでは、４８時間後でも増殖が抑制され、７２時間後ではさらに大きく増殖が抑制されていることが確認できた。尚、図７中左端の棒は培養開始時における細胞数（２万個）を示している。
【図１】
2010259371.tif 000003
【図２】
2010259371.tif 000004
【図３】
2010259371.tif 000005
【図４】
2010259371.tif 000006
【図５】
2010259371.tif 000007
【図６】
2010259371.tif 000008
【図７】
2010259371.tif 000009
【配列表】
2010259371000001.app