(57)【要約】【課題】イオンチャネル型膜タンパク質におけるイオンやイオン以外の分子の透過の測定、及び代謝型膜タンパク質の活性の測定の両方に応用できる膜タンパク質機能測定基板、及びそれを用いた膜タンパク質機能測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】蛍光を利用した膜タンパク質の機能の測定に用いる基板であって、穴部１１を有し、穴部１１の開口１１ａが膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１２で覆われており、穴部１１の内部１４に、蛍光を発する蛍光物質（Ｉ）、又は該蛍光物質（Ｉ）と結合して蛍光強度を増強させる物質（ＩＩ）が配置されていることを特徴とする膜タンパク質機能測定基板１。また、膜タンパク質機能測定基板１を用いた膜タンパク質機能測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を利用した膜タンパク質の機能の測定に用いる基板であって、
穴部を有し、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜で覆われており、前記穴部の内部に、蛍光を発する蛍光物質（Ｉ）、又は該蛍光物質（Ｉ）と結合して蛍光強度を増強させる物質（ＩＩ）が配置されていることを特徴とする膜タンパク質機能測定基板。
【請求項２】
前記穴部の内部に、前記蛍光物質（Ｉ）として、前記膜タンパク質を透過するイオンに結合して蛍光強度が変化するイオン感受性蛍光色素が配置されており、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質である、請求項１に記載の膜タンパク質機能測定基板。
【請求項３】
前記穴部の内部に、前記物質（ＩＩ）として核酸が備えられており、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質である、請求項１に記載の膜タンパク質機能測定基板。
【請求項４】
前記穴部の内部に、前記蛍光物質（Ｉ）が、細胞外情報伝達物質に結合した状態で配置されており、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質である、請求項１に記載の膜タンパク質機能測定基板。
【請求項５】
前記穴部の内部に、細胞質抽出画分と、蛍光物質（Ｉ）としてカルシウムイオン感受性蛍光色素とが配置されており、前記膜タンパク質がＧタンパク質共役型受容体である、請求項１に記載の膜タンパク質機能測定基板。
【請求項６】
請求項２に記載の膜タンパク質機能測定基板を用い、前記穴部の外部に、前記膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液を配置して、前記イオンチャネル型膜タンパク質のイオン透過性を蛍光強度の変化により定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項７】
請求項３に記載の膜タンパク質機能測定基板を用い、前記穴部の外部に、前記蛍光物質（Ｉ）として前記核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液を配置して、前記核酸結合性蛍光色素の前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した透過性、及び前記イオンチャネル型膜タンパク質のチャネルポアサイズの変化を、蛍光強度の変化により定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項８】
請求項４に記載の膜タンパク質機能測定基板を用いて、前記細胞外情報伝達物質の前記穴部の内部から外部への前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した移動を、蛍光強度の変化により定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項９】
請求項５に記載の膜タンパク質機能測定基板を用いて、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を、前記カルシウムイオン感受性蛍光色素により蛍光強度の変化として検出し、Ｇタンパク質共役型受容体の活性を定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項１０】
発光波長の異なる２種以上の蛍光物質（Ｉ）を備えた請求項１に記載の膜タンパク質機能測定基板を用いて、膜タンパク質の異なる反応を同時に測定する膜タンパク質機能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質機能測定基板及び膜タンパク質機能測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜上に発現した膜タンパク質の機能測定においては、膜タンパク質をアゴニスト（作働薬）で刺激し、細胞外から細胞内へのイオン流入、及び細胞内から細胞外へのイオン流出や、細胞質に存在する細胞内セカンドメッセンジャーの濃度変化を検出することが行われる。
【０００３】
細胞外から細胞内へのイオン流入や細胞内から細胞外へのイオン流出を引き起こすような膜タンパク質はイオンチャネル型膜タンパク質と呼ばれる。なかでも、イオンチャネル型膜タンパク質に対して選択的に分子（以下、「リガンド」という。）が結合することでチャネルの開閉を制御する膜タンパク質はイオンチャネル型受容体と呼ばれる。イオンチャネル型受容体には、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオンなどの他、特定の条件下で有機イオンと呼ばれる前記イオンよりも大きな分子を透過するものが存在する。
このような膜タンパク質の機能測定の指標としては、例えば、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオンなどが用いられる。これらのイオンに結合して蛍光を発する蛍光色素を用いることにより、膜タンパク質を介したイオン透過を、蛍光強度の変化により測定することが可能となる。また、イオン透過性の測定には、前記蛍光色素を用いた測定の他、脂質二分子膜内外の電流値を測定することによってイオン透過性を判定する電気生理学的手法もある。
【０００４】
また、前記細胞内セカンドメッセンジャーと呼ばれる因子としては、小胞体由来のカルシウムイオンがよく知られている。細胞内セカンドメッセンジャーは、細胞内に存在する様々な酵素が活性化し、細胞内の分子を代謝することによって産生される。そのため、このような代謝反応に関わる膜タンパク質は代謝型膜タンパク質と呼ばれる。なかでも、特にリガンドを有するものは代謝型受容体と呼ばれる。代謝型受容体の代表的なものとしては、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）がよく知られている。代謝型受容体は多くの場合、電気的に不活性な細胞で発現している。このような場合、前記電気生理学的手法は代謝型受容体の機能測定には不向きであるため、前記細胞内セカンドメッセンジャー、つまりカルシウムイオンに結合して蛍光を発する蛍光色素を用い、その蛍光強度を指標として代謝型受容体の活性を測定する。
【０００５】
このように、膜タンパク質の機能は、細胞内のイオン濃度の変化を指標にして測定することができる。２０００年度における創薬の標的においては膜タンパク質（特に受容体）が全体の４５％を占めているといわれている。また、２０００年度米国でのトップ２０の薬品の売り上げにおいては、膜タンパク質（ＧＰＣＲ、イオンチャネル型を含む。）が全体の約５０％を占める（非特許文献１）。そのため、様々な病気の発生やその治療に関連する膜タンパク質の機能を正確に測定することは非常に重要である。
【０００６】
しかしながら、通常、細胞膜上には目的とする膜タンパク質以外の膜タンパク質も複数存在しており、薬剤で刺激しても、目的の膜タンパク質から該膜タンパク質に隣接する別の膜タンパク質へのトランス活性化と呼ばれる機構で情報伝達が行われる場合もある。そのため、薬剤で刺激して得られた反応が目的の膜タンパク質のみを介したものであるかが不明瞭な場合がある。したがって、精製した膜タンパク質を用いて、膜タンパク質を個別に測定できるｉｎ  ｖｉｔｒｏの測定系が必要である。
【０００７】
精製したイオンチャネル型膜タンパク質の機能測定においては、以下のことに留意する必要がある。すなわち、イオンチャネル型膜タンパク質は、病態時を含む様々な条件下において、通常の機能とは異なる役割を果たす。例えば、イオンチャネルは、イオンの他にリガンドを透過することによって細胞外のシグナルを受容したり、近接する細胞へシグナルを伝達する役割を果たす（非特許文献２〜４）。一方、イオンチャネルが活性化して通常よりも大きな分子を通す状態となることで、細胞死を誘導する機構として作用したり、周辺の組織の炎症を引き起こす機構や、痛覚過敏などの病的な状況を引き起こす機構として作用したりすることがある（非特許文献５〜７）。このような例は特殊ではあるものの、イオンチャネルの機能が病態時のメカニズムと非常に密接に関連している場合が多く、そのような条件下でイオンチャネルの機能を測定することは創薬研究などの観点から非常に重要である。
精製したイオンチャネル型膜タンパク質の測定では、電気生理学的手法を用いた測定系によりイオンの透過を電流及び電圧の変化として検出することができる。しかし、イオンの透過を指標としてイオンチャネルの活性を測定することは重要であるが、電気生理学的手法では前述のようなイオン以外の分子の透過を測定することが困難である。また、生理条件下で観察される膜タンパク質を介したイオン流入と、特殊な条件下で観察されるリガンドなどの透過とを同時に観察することも難しい。これら複数の反応を同時に測定することはイオンチャネルの機能をより詳細に検討するために非常に重要である。
【０００８】
また、精製した代謝型膜タンパク質の場合、電気生理学的手法ではその活性の測定が難しい。これは、前述のように代謝型膜タンパク質の活性の測定にはセカンドメッセンジャーが用いられるが、代謝型膜タンパク質単体ではセカンドメッセンジャーを産生することができないためである。
例えば、小胞体からのカルシウムイオン放出には、以下の（１）〜（５）の工程が関与する。（１）ＧＰＣＲが活性化する、（２）ＧＰＣＲに結合したＧタンパク質にグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が結合する、（３）ホスホリパーゼＣが活性化する、（４）細胞膜に存在するイノシトールリン脂質の一種であるホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）から、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＧ）が産生される、（５）ＩＰ３が小胞体膜上に存在するＩＰ３受容体に結合し、小胞体から細胞質へカルシウムイオンが放出される（非特許文献８）。このように、代謝型膜タンパク質の場合、セカンドメッセンジャーを指標として活性を測定するには、目的のタンパク質だけでなく関連する細胞内シグナル伝達因子も必要とする。
以上の理由から、イオンチャネル型膜タンパク質において、イオンの透過だけでなく、イオン以外の分子の透過を測定でき、また代謝型膜タンパク質の機能測定にも応用できる方法が望まれている。
【非特許文献１】Drews J. Science, 287; 1960-1964 (2000)
【非特許文献２】Suadicani S.O. et al. J. Neurosci., 26; 1378-1385 (2005)
【非特許文献３】Zhao H.B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 102; 18724-18729 (2005)
【非特許文献４】Ye Z. C. et al. J. Neurosci., 23: 3588-3596 (2003)
【非特許文献５】Pelegrin P. and Surprenant A. EMBO J., 25: 5071-5082 (2006)
【非特許文献６】Pelegrin P. and Surprenant A. J. Biol. Chem., 282: 2386-2394 (2007)
【非特許文献７】Chung M-K. et al. Nat. Neurosci. 11: 555-564 (2008)
【非特許文献８】Mikoshiba K. J. Neurochem., 105: 1426-1446 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明では、イオンチャネル型膜タンパク質におけるイオンやイオン以外の分子の透過の測定、及び代謝型膜タンパク質の活性の測定の両方に応用できる膜タンパク質機能測定基板、及びそれを用いた膜タンパク質機能測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］蛍光を利用した膜タンパク質の機能の測定に用いる基板であって、穴部を有し、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜で覆われており、前記穴部の内部に、蛍光を発する蛍光物質（Ｉ）、又は該蛍光物質（Ｉ）と結合して蛍光強度を増強させる物質（ＩＩ）が配置されていることを特徴とする膜タンパク質機能測定基板。
［２］前記穴部の内部に、前記蛍光物質（Ｉ）として、前記膜タンパク質を透過するイオンに結合して蛍光強度が変化するイオン感受性蛍光色素が配置されており、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質である、［１］に記載の膜タンパク質機能測定基板。
［３］前記穴部の内部に、前記物質（ＩＩ）として核酸が備えられており、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質である、［１］に記載の膜タンパク質機能測定基板。
［４］前記穴部の内部に、前記蛍光物質（Ｉ）が、細胞外情報伝達物質に結合した状態で配置されており、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質である、［１］に記載の膜タンパク質機能測定基板。
［５］前記穴部の内部に、細胞質抽出画分と、蛍光物質（Ｉ）としてカルシウムイオン感受性蛍光色素とが配置されており、前記膜タンパク質がＧタンパク質共役型受容体である、［１］に記載の膜タンパク質機能測定基板。
［６］［２］に記載の膜タンパク質機能測定基板を用い、前記穴部の外部に、前記膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液を配置して、前記イオンチャネル型膜タンパク質のイオン透過性を蛍光強度の変化により定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
［７］［３］に記載の膜タンパク質機能測定基板を用い、前記穴部の外部に、前記蛍光物質（Ｉ）として前記核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液を配置して、前記核酸結合性蛍光色素の前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した透過性、及び前記イオンチャネル型膜タンパク質のチャネルポアサイズの変化を、蛍光強度の変化により定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
［８］［４］に記載の膜タンパク質機能測定基板を用いて、前記細胞外情報伝達物質の前記穴部の内部から外部への前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した移動を、蛍光強度の変化により定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
［９］［５］に記載の膜タンパク質機能測定基板を用いて、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を、前記カルシウムイオン感受性蛍光色素により蛍光強度の変化として検出し、Ｇタンパク質共役型受容体の活性を定量的に測定する膜タンパク質機能測定方法。
［１０］発光波長の異なる２種以上の蛍光物質（Ｉ）を備えた［１］に記載の膜タンパク質機能測定基板を用いて、膜タンパク質の異なる反応を同時に測定する膜タンパク質機能測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の膜タンパク質機能測定基板は、イオンチャネル型膜タンパク質のイオンの透過やイオン以外の分子の透過の測定に応用することができ、代謝型膜タンパク質の活性の測定にも応用することができる。
また、本発明の膜タンパク質機能測定方法は、イオンチャネル型膜タンパク質のイオンの透過やイオン以外の分子の透過を測定することができ、かつ代謝型膜タンパク質の活性も測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の膜タンパク質機能測定基板は、蛍光を利用した膜タンパク質の機能の測定に用いる基板であって、穴部を有し、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜で覆われており、前記穴部の内部に、蛍光を発する蛍光物質（Ｉ）、又は該蛍光物質（Ｉ）と結合して蛍光を増強させる物質（ＩＩ）が配置されていることを特徴とする。本発明における蛍光強度の測定は、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡により行うことができる。
【００１３】
図１に、本発明の膜タンパク質機能測定基板の一実施形態例の概念図を示す。膜タンパク質機能測定基板１（以下、「基板１」という。）は、図１に示すように、基板本体１０に穴部１１が形成されており、穴部１１の開口１１ａが膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１２で覆われている。基板１は、イオンチャネル型膜タンパク質の機能の測定に用いることができる。
【００１４】
基板本体１０の材質は、蛍光顕微鏡により蛍光画像及び透過光画像あるいは反射光像が良好に取得できるものであればよく、例えば、プラスチック、ガラス、シリコンなどが挙げられる。
基板本体１０の形状は特に限定されず、用途に応じた形状のものを使用することができ、例えば、平板状の基板が挙げられる。また、基板本体１０の厚みは特に限定されず、０．３ｍｍ〜２ｍｍであることが好ましい。
【００１５】
また、基板本体１０は、穴部１１を有している。基板本体１０における穴部１１の数は特に限定されず、１〜１０，０００個であることが好ましい。
基板本体１０への穴部１１の形成方法は、例えば、フォトリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術を適用することができる。また、プラスチックの基板本体１０であれば、加熱した注射針を刺すことにより形成してもよい。
【００１６】
穴部１１は、凹状の穴であってもよく、貫通孔であってもよい。この例では、穴部１１は凹状の穴である。
穴部１１の開口１１ａの形状は、特に限定されず、脂質二分子膜１２をより安定に形成できる点から、円形状であることが好ましい。
開口１１ａの直径は、１００ｎｍ〜１ｍｍであることが好ましい。開口１１ａの直径が１００ｎｍ以上であれば、イオンチャネル型タンパク質（膜タンパク質１３）の機能測定が容易になる。開口１１ａの直径が１ｍｍ以下であれば、脂質二分子膜１２をより安定に形成することができる。
また、穴部１１の深さは、基板本体１０の厚みに応じて設定すればよく、５０ｎｍ〜２ｍｍであることが好ましい。
【００１７】
脂質二分子膜１２は、両親媒性分子であるリン脂質などの脂質分子が二層構造を形成した膜であり、生体膜の最も基本的な構造の膜である。脂質分子は、疎水性部分と親水性部分を有し、疎水性部分同士が会合することにより安定な二重膜構造を形成する。
脂質分子としては、常温で充分な流動性を持つ脂質であればよく、各脂質の疎水部のアルキル鎖長、二重結合の部位と数は特に限定されない。脂質分子の種類としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。
これら脂質分子は、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
脂質二分子膜１２の形成方法としては、例えば、ｎ−デカンなどの有機溶媒に溶解した脂質分子を用いる方法が挙げられる。まず、穴部１１に水溶液を配置し、その上部にｎ−デカンに溶解した脂質分子を配置する。すると、ｎ−デカン中の脂質分子の親水部がｎ−デカンと穴部１１との界面に次第に集まり、均一な層を形成する。次いで、穴部１１のｎ−デカン上に緩衝液などの水溶液を配置する。これにより、ｎ−デカンと、該ｎ−デカンの上側（外部１５側）の水溶液との界面にも脂質分子の親水部が次第に集中してくる。ｎ−デカンは室温で揮発するため、最終的に穴部１１の開口１１ａを覆う均一な脂質二分子膜１２が形成される。
【００１９】
膜タンパク質１３としては、イオンチャネル型膜タンパク質を用いる。
イオンチャネル型膜タンパク質としては、例えば、イオンチャネル型受容体が挙げられ、細胞間情報伝達や温度の感受、炎症や痛みに関与するＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャンネル（サブユニットはＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＶ５、ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ２、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、ＴＲＰＣ５、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＣ７、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ３、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ６、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭＬ１、ＴＲＰＭＬ２、ＴＲＰＭＬ３、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＰ３、ＴＲＰＰ４、ＴＲＰＰ５）、細胞間情報伝達や痛みに関与するＡＴＰ受容体（サブユニットはＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６、Ｐ２Ｘ７）、細胞間情報伝達や情動に関与するセロトニン受容体（サブユニットは５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７）、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するＮＭＤＡ受容体（サブユニットはＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ、ＮＲ２Ｄ、ＮＲ３Ａ、ＮＲ３Ｂ）、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するＡＭＰＡ受容体（サブユニットはＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４）、細胞間情報伝達や興奮性神経伝達に関与するカイニン酸受容体（サブユニットはＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ−１、ＫＡ−２）、細胞間情報伝達や抑制性神経伝達に関与するＧＡＢＡ受容体（サブタイプはＧＡＢＡＡ、ＧＡＢＡＣ）もしくはＧＡＢＡ受容体（サブユニットはα、β、γ）等が挙げられる。
これらイオンチャネル型受容体は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２０】
脂質二分子膜１２に膜タンパク質１３を再構成する方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、ベシクルフュージョンを用いた方法が挙げられる。具体的には、プロテオリポソームと呼ばれる、膜タンパク質１３を含有する球状小胞体（ベシクル）を脂質二分子膜１２上に添加することにより、プロテオリポソームの脂質二分子膜と脂質二分子膜１２とが融合する事により膜タンパク質１３を脂質二分子膜１２中に再構成する方法が挙げられる。
【００２１】
以上のような基板１の穴部１１の内部１４に、蛍光を発する蛍光物質（Ｉ）、又は該蛍光物質（Ｉ）と結合して蛍光を増強させる物質（ＩＩ）を配置し、膜タンパク質の機能の測定に用いる。
以下、本発明の膜タンパク質機能測定基板とそれを用いた本発明の膜タンパク質機能測定方法の実施形態例を示して詳細に説明する。
【００２２】
［第１実施形態］  
本実施形態の膜タンパク質機能測定基板１Ａ（以下、「基板１Ａ」という。）は、図２に示すように、穴部１１の内部１４に、蛍光物質（Ｉ）として、膜タンパク質１３を透過するイオン１６に結合して蛍光強度が変化するイオン感受性蛍光色素（図２のＩ−Ａ）が配置されている。基板１Ａにおいて、基板１と同じ部分については同符号を付して説明を省略する。
基板１Ａは、イオンチャネル型膜タンパク質のイオン透過性の測定に用いることができる。
【００２３】
イオン感受性蛍光色素は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部１４に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、膜タンパク質１３の機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００２４】
膜タンパク質１３を透過するイオン１６は、生体内で膜タンパク質を介して細胞膜を透過するイオンであればよく、例えば、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオンが挙げられる。
【００２５】
イオン感受性蛍光色素としては、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を検出できるｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）を検出できるＳＢＦＩ、ＣｏｒｏＮａ、カリウムイオン（Ｋ＋）を検出できるＰＢＦＩ、塩化物イオン（Ｃｌ−）を検出できるＭＱＡＥなどが挙げられる。
穴部１１の内部１４におけるイオン感受性蛍光色素の濃度は、蛍光強度の変化によりイオン透過性を定量的に測定できる量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭであることが好ましく、１μＭ〜１００μＭであることがより好ましい。
【００２６】
（測定方法）
本実施形態の膜タンパク質機能測定方法は、前記基板１Ａを用い、イオンチャネル型膜タンパク質（膜タンパク質１３）のイオン透過性を蛍光強度の変化により定量的に測定する方法である。
本実施形態では、基板１Ａの穴部１１の外部１５に、膜タンパク質を透過するイオン１６を含む緩衝液を配置する。
イオン１６を含有させる緩衝液は、穴部１１の内部１４においてイオン感受性蛍光色素を含有させる緩衝液と同じものが使用できる。
【００２７】
例えば、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４などのカルシウムイオン感受性蛍光色素を穴部１１の内部１４に配置し、穴部１１の外部１５にカルシウムイオン（イオン１６）を含む緩衝液を配置する。これにより、イオンチャネル型膜タンパク質（膜タンパク質１３）を刺激することで、カルシウムイオンがイオンチャネル型膜タンパク質を介して脂質二分子膜１２を透過して外部１５から内部１４に移動すると、その透過したカルシウムイオンとカルシウムイオン感受性蛍光色素とが内部１４において結合し、蛍光強度が増強される。これにより、イオンチャネル型膜タンパク質のカルシウムイオンの透過を定量的に測定することができる。
【００２８】
イオン１６の濃度は、測定の目的に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、１０μＭ〜２ｍＭであることがより好ましい。
【００２９】
また、イオンチャネル型膜タンパク質の刺激は、従来公知の方法を用いることができ、イオンチャネル型受容体を用いている場合は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グルタミン酸などのリガンドを用いることができる。また、刺激には、前記リガンド以外の化学物質や、電位、光や圧力などを利用してもよい。
【００３０】
また、イオン１６としてカルシウムイオン以外の他のイオンを用いる場合も同様に、該イオン１６に対応するイオン感受性蛍光色素を用いることで、イオンの透過を定量的に測定することができる。
【００３１】
［第２実施形態］
本実施形態の膜タンパク質測定基板１Ｂ（以下、「基板１Ｂ」という。）は、図３に示すように、穴部１１の内部１４に、蛍光物質（Ｉ）と結合して蛍光強度を増強させる物質（ＩＩ）として核酸（図３のＩＩ−Ｂ）が配置されている。基板１Ｂにおいて、基板１と同じ部分については同符号を付して説明を省略する。
基板１Ｂは、イオンチャネル型膜タンパク質のイオン以外の分子（蛍光分子（Ｉ））の透過の測定に用いることができる。
【００３２】
核酸は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部１４に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、膜タンパク質１３の機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００３３】
核酸としては、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。核酸は、人工的に合成したものであっても、細胞から抽出したものであってもよい。また、核酸の塩基対数は、蛍光強度の変化を定量的に測定することができれば特に限定されない。
穴部１１の内部１４における核酸の濃度は、核酸の種類、長さによっても異なるが、１ｎｇ／μｌ〜５００μｇ／μｌであることが好ましく、１〜１００μｇ／μｌであることがより好ましい。
【００３４】
（測定方法）
本実施形態の膜タンパク質機能測定方法は、基板１Ｂを用いて、核酸結合性蛍光色素のイオンチャネル型膜タンパク質（膜タンパク質１３）を介した透過性、及びイオンチャネル型膜タンパク質のチャネルポアサイズの変化を、蛍光強度の変化により定量的に測定する方法である。
本実施形態では、基板１Ｂの穴部１１の外部１５に、蛍光物質（Ｉ）として核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素（図３のＩ−Ｂ）を含む緩衝液を配置する。
【００３５】
核酸結合性蛍光色素を含有させる緩衝液は、穴部１１の内部１４において核酸を含有させる緩衝液と同じものが使用できる。
核酸結合性蛍光色素としては、例えば、臭化エチジウムやプロピディウムイオダイドが挙げられる。
【００３６】
核酸を穴部１１の内部１４に配置し、穴部１１の外部１５に核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液を配置することで、イオンチャネル型膜タンパク質（膜タンパク質１３）を刺激し、核酸結合性蛍光色素が膜タンパク質１３を介して脂質二分子膜１２を透過して外部１５から内部１４に移動すると、その透過した核酸結合性蛍光色素が内部１４において核酸に結合し、内部１４における蛍光強度が増強される。これにより、イオンよりも大きい分子である核酸結合性蛍光色素のイオンチャネル型膜タンパク質の透過を定量的に測定することができる。また、核酸結合性蛍光色素の透過を検出することにより、イオンチャネル型膜タンパク質のチャネルポアサイズの大きさが該核酸結合性蛍光色素の大きさよりも大きくなっていることを検出することができる。
【００３７】
イオンチャネル型膜タンパク質の刺激は、第１実施形態で説明した方法と同じ方法を用いることができる。
核酸結合性蛍光色素の濃度は、測定の目的に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜５００μＭであることが好ましく、１〜１０μＭであることがより好ましい。
【００３８】
［第３実施形態］
本実施形態の膜タンパク質測定基板１Ｃ（以下、「基板１Ｃ」という。）は、図４に示すように、穴部１１の内部１４に、蛍光物質（Ｉ）が、細胞外情報伝達物質に結合された状態（図４における化合物１７（細胞外情報伝達物質と蛍光物質（Ｉ）が結合された化合物））で配置されている。基板１Ｃにおいて、基板１と同じ部分については同符号を付して説明を省略する。
基板１Ｃは、イオンチャネル型膜タンパク質の細胞外情報伝達物質の透過の測定に用いることができる。
【００３９】
化合物１７は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部１４に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、膜タンパク質１３の機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００４０】
化合物１７は、細胞外情報伝達物質に蛍光物質（Ｉ）が結合した化合物である。
細胞外情報伝達物質は、細胞間での情報伝達に用いられる物質であり、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グルタミン酸が挙げられる。
前記細胞外情報伝達物質に結合する蛍光物質（Ｉ）としては、ＮＢＤ（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｆｕｒａｚａｎ）、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ  ｄｙｅが好ましい。
【００４１】
すなわち、化合物１７としては、例えば、ＡＴＰ−ＦＩＴＣ、ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ＦＩＴＣが挙げられる。細胞外情報伝達物質にＦＩＴＣを結合させる方法は、公知の方法を用いることができる。
化合物１７の濃度は、測定の目的に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１００μＭであることがより好ましい。
【００４２】
（測定方法）
本実施形態の膜タンパク質機能測定方法は、基板１Ｃを用いて、細胞外情報伝達物質の穴部１１の内部１４から外部１５へのイオンチャネル型膜タンパク質（膜タンパク質１３）を介した移動を、蛍光強度の変化により定量的に測定する方法である。
本実施形態では、基板１Ｃにおいて、化合物１７を穴部１１の内部１４に配置し、穴部１１の外部１５に蛍光物質（Ｉ）が結合されていないＡＴＰ、グルタミン酸などのリガンド（図示せず）を含む緩衝液を配置する。
【００４３】
イオンチャネル型膜タンパク質（膜タンパク質１３）が外部１５のリガンドにより刺激され、細胞外情報伝達物質が膜タンパク質１３を介して脂質二分子膜１２を透過して内部１４から外部１５に移動すると、穴部１１の内部１４の蛍光物質（Ｉ）の量が減少し、内部１４における蛍光強度が減少する。この蛍光強度の変化により、イオンチャネル型膜タンパク質を介した細胞外情報伝達物質の透過を定量的に測定することができる。
【００４４】
また、本発明の膜タンパク質機能測定基板及び膜タンパク質機能測定方法は、前述のイオンチャネル型膜タンパク質の機能測定だけでなく、代謝型膜タンパク質の活性の測定にも用いることができる。
図５に、代謝型膜タンパク質の活性測定に用いる膜タンパク質機能測定基板の実施形態の概念図を示す。膜タンパク質機能測定基板２（以下、「基板２」という。）は、図５に示すように、基板本体２０に穴部２１が形成されており、穴部２１の開口２１ａが膜タンパク質２３を含む脂質二分子膜２２で覆われている。基板本体２０、穴部２１、開口２１ａ、脂質二分子膜２２については、前述の基板１における基板本体１０、穴部１１、開口１１ａ、脂質二分子膜１２と同じである。
【００４５】
本実施形態の基板２では、膜タンパク質２３として代謝型膜タンパク質を用いる。代謝型膜タンパク質としては、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が挙げられる。
Ｇタンパク質共役型受容体としては、例えば、細胞間情報伝達に関与するアデノシン受容体（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３）、細胞間情報伝達に関与するＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、Ｐ２Ｙ１４）細胞間情報伝達に関与するセロトニン受容体（５−ＨＴ３）細胞間情報伝達や痛みに関与するアドレナリン受容体（α１、α２、β１、β２）、細胞間情報伝達に関与する代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ８）、細胞間情報伝達に関与するＧＡＢＡ受容体、細胞間情報伝達や鎮痛に関与するオピオイド受容体（ν受容体、δ受容体、κ受容体）等が挙げられる。
これらＧタンパク質共役型受容体は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４６】
脂質二分子膜２２に膜タンパク質２３を再構成する方法は、第１実施形態のイオンチャネル型膜タンパク質の場合と同様に、公知の方法を用いることができ、例えば、ベシクルフュージョンを用いた方法が挙げられる。
【００４７】
本発明では、基板２を用いて、蛍光を利用することにより、代謝型膜タンパク質の活性の測定を行うことができる。以下、実施形態の一例を示して説明する。
［第４実施形態］
本実施形態の膜タンパク質測定基板２Ｄ（以下、「基板２Ｄ」という。）は、図６に示すように、穴部２１の内部２４に、細胞質抽出画分２６が配置されると共に、前記蛍光物質（Ｉ）として、カルシウムイオン感受性蛍光色素（図６、Ｉ−Ｄ）が配置される。基板２Ｄにおいて、基板２と同じ部分については同符号を付して説明を省略する。
基板２Ｄにより、小胞体から放出されるカルシウムイオンを指標として、代謝型膜タンパク質であるＧタンパク質共役型受容体の活性を測定することができる。
【００４８】
細胞質抽出物２６は、Ｇタンパク質共役型受容体を発現する細胞や組織から公知の方法により調製することができる。
例えば、細胞の場合は、培養ディッシュ（直径１０ｃｍ）に播種した細胞を細胞間の隙間がなくなるまで培養する。次いで、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３度洗浄し、セルスクレーバーで細胞を掻き取り、１．５ｍｌセーフロックチューブに入れ、５０００ｒｐｍ（４℃）で遠心して細胞を回収する。次いで、得られた細胞のペレットに純水５０μｌを加え、１０分間氷上にて静置し、低浸透圧刺激により細胞膜を破壊する。その後、ペレットを吸い込まないように上清をとり、プロテアーゼ阻害剤を加えて細胞質抽出画分２６とする。
【００４９】
カルシウムイオン感受性蛍光色素としては、例えば、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４などが挙げられる。
穴部２１の内部２４におけるカルシウムイオン感受性蛍光色素の濃度は、蛍光強度の変化によりＧタンパク質共役型受容体の活性を定量的に測定できる量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭであることが好ましく、１μＭ〜１００μＭであることがより好ましい。
【００５０】
（測定方法）
本実施形態の膜タンパク質測定方法は、基板２Ｄを用いて、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を、カルシウムイオン感受性蛍光色素により蛍光強度の変化として検出し、Ｇタンパク質共役型受容体の活性を定量的に測定する方法である。基板２Ｄの穴部２１の外部２５には、膜タンパク質２３を安定に存在させ、生体内と同様の状態で活性を発現しやすくなる点から、緩衝液を配置しておくことが好ましい。
【００５１】
基板２Ｄにおいては、細胞質抽出画分２６により細胞内シグナル伝達系に必要な成分が供給されており、細胞質に存在していた成分は穴部２４内に配置される。
【００５２】
活性の測定は以下のようにして行われる。外部２５の緩衝液にリガンドを加えると、脂質二分子膜２２に再構成したＧＰＣＲ（膜タンパク質２３）が活性化し、穴部２４においてＧＰＣＲに結合したＧタンパク質にグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が結合する。次に、ホスホリパーゼＣが活性化し、脂質二分子膜２２にあるイノシトールリン脂質の一種であるホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）から、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＧ）が産生され、ＩＰ３が小胞体膜上に存在するＩＰ３受容体に結合し、小胞体から内部２４内にカルシウムイオンが放出される。そして、内部２４内において、小胞体から放出されたカルシウムイオンとカルシウムイオン感受性蛍光色素とが結合し、蛍光強度が増強する。これにより、小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化として検出することで、Ｇタンパク質共役型受容体の活性を定量的に測定することができる。
【００５３】
本発明の膜タンパク質機能測定方法では、発光波長が異なる２種以上の蛍光物質（Ｉ）を用いることにより、異なる反応を同時に測定することができる。
例えば、穴部１１の内部１４にイオン感受性蛍光色素（蛍光物質Ｉ−Ａ）および核酸（物質ＩＩ−Ｂ）を配置し、穴部１１の外部１５に前記イオン感受性蛍光色素に対応するイオン１６および核酸結合性蛍光色素（蛍光物質Ｉ−Ｂ）を配置することにより、イオンチャネル型膜タンパク質におけるイオンの透過と、核酸結合性蛍光色素の透過を同時に測定できる。
また、穴部１１の内部１４にイオン感受性蛍光色素（蛍光物質Ｉ−Ａ）および化合物１７を配置し、穴部１１の外部１５に前記イオン感受性蛍光色素に対応するイオン１６を配置することにより、イオンチャネル型膜タンパク質におけるイオンの透過と、細胞外情報伝達物質の透過を同時に測定できる。
また、同様にして、核酸結合性蛍光色素の透過と、細胞外情報伝達物質の透過とを同時に測定するようにしてもよく、イオン、核酸結合性蛍光色素、および細胞外情報伝達物質の透過を同時に測定するようにしてもよい。
また、脂質二分子膜にイオンチャネル型膜タンパク質と代謝型膜タンパク質の両方を再構成し、第１実施形態〜第３実施形態のようなイオンチャネル型膜タンパク質の機能の測定と、第４実施形態のような代謝型膜タンパク質の活性の測定とを同時に行うようにしてもよい。
【００５４】
以上説明した本発明の膜タンパク質機能測定基板及びこれを用いた膜タンパク質機能測定方法は、膜タンパク質の機能を蛍光強度の変化を指標として測定するものであり、単一種類の膜タンパク質を介した反応を検出することができる。イオンチャネル型膜タンパク質の場合、イオンの透過や、リガンド、核酸結合性色素などのイオンよりも大きな分子の透過の解析に利用できる。また、励起波長及び発光波長の異なる２種以上の蛍光物質を用いることにより、膜タンパク質の異なる反応を同時に測定することもできる。
創薬にあたってターゲットとなるのは健康な状態の膜タンパク質ではなく、病気になった状態の膜タンパク質である。そのため、生理条件で起こる通常のイオン透過と、病態時に相当する条件で起こる色素透過とを、同時に又は区別して観察できることは、創薬のスクリーニングにおいて非常に重要な技術である。
また、本発明では、基板の穴部に細胞質抽出画分を配置することにより、代謝型膜タンパク質の活性の測定を行うこともできるため、非常に有用な測定系である。
【００５５】
また、本発明の膜タンパク質機能測定基板及びこれを用いた膜タンパク質機能測定方法は、基板にプラスチックなどの安価な材料を用いることができ、また測定には蛍光顕微鏡を用いるだけで特別な機材を必要としないため、非常に低コストかつ簡便である。創薬のスクリーニングでは、化合物ライブラリに含まれる莫大な数の化合物の活性を測定する必要があるため、一回あたりの測定にかかる単価を低くする必要があり、この点でも本発明の測定系は非常に有用である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例における蛍光顕微鏡による透過光による観察、蛍光強度の測定は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０、ツァイス製）を用いて行った。
【００５７】
（実施例１）
以下、図２に例示した基板１Ａを用いた、イオンチャネル型膜タンパク質のイオン透過性の測定について説明する。
２５ゲージ（直径５００μｍ）の注射針をガスバーナーであぶり、プラスチックプレート（基板本体１０）に直径約５００μｍの穴（穴部１１）を開けた。穴周辺のプラスチックのバリはカミソリで取り除いた。得られた基板の透過光像を図７に示す。
次いで、穴部１１の内部１４に、ｆｌｕｏ−３（５０μＭ）を含む水溶液（約０．２μｌ）加え、その上に脂質混合物（ホスファチジルコリン：ホスファチジセリン＝１：１、２ｍＭ）をｎ−デカンに溶解した脂質溶液（２μｌ）を加え、さらにその上に緩衝液Ｘ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２μｌ）を加えて、室温にて５分静置してデカンを揮発させ、穴部１１の開口１１ａを覆う脂質二分子膜１２を形成した。
次いで、穴部１１の外部１５に、膜タンパク質１３であるＰ２Ｘ４受容体（イオンチャネル型膜タンパク質、１３２１Ｎ１ヒトアストロサイトーマ細胞より精製、１０ｎｇ）を再構成した脂質ベシクル（以下、「プロテオリポソーム」という。）を含む緩衝液Ｙ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、０．０２％ＮａＮ３）０．５μｌを加え、さらに５分間静置した。その後、外部１５のプロテオリポソームを含む緩衝液Ｙを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む緩衝液Ｚ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２μｌ）で置換した。
この状態で蛍光強度を測定したところ、穴部１４に蛍光は観察されなかった（図８（ａ））。
【００５８】
穴部１１の外部１５の緩衝液Ｚに、Ｐ２Ｘ４受容体のリガンドであるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ、１００μＭ）を加えて刺激したところ、穴部１１の内部１４の蛍光強度（緑色、励起波長５０３ｎｍ、発光波長５３０ｎｍ）が著しく増強した（図８（ｂ）、刺激から３００秒経過後）。
また、この蛍光増強は、Ｐ２Ｘ受容体拮抗薬であるＴＮＰ−ＡＴＰ（１００μＭ）を緩衝液Ｚに添加することにより著しく抑制された。このことからＡＴＰの刺激による穴部１４の蛍光増加は、Ｐ２Ｘ４受容体を介したカルシウムイオンの透過によるものであると考えられる。
また、ＡＴＰによる刺激から３００秒後までの穴部１４における蛍光強度を図８（ｃ）に示す。図８（ｃ）に示すように、０秒の時点でＡＴＰを加えた後に蛍光強度の増加が起こり、その後増加した蛍光強度が持続された。この結果から、少なくとも５分程度の測定時間内では、脂質二分子膜１２が破れることなく安定に維持されていることが示された。
【００５９】
（実施例２）
Ｐ２Ｘ４受容体は、カルシウムイオン透過の他に、外側のカルシウムイオンがない場合には色素などの大きな分子を透過することが報告されている（Khakh BS et al., Nat. Neurosci. 2: 322-330 (1999)）。そこで、図３に例示した基板１Ｂを用いて、イオンチャネル型膜タンパク質の核酸結合性蛍光色素の透過性を測定した。
【００６０】
実施例１用いた基板の穴部１１に、ＤＮＡ（ラット大脳皮質由来初代培養アストロサイトより精製、５μｇ／μｌ）を配置し、実施例１と同様にしてイオンチャネル型膜タンパク質膜（タンパク質１３）を含む脂質二分子膜１２を形成した後、穴部１１の外部１５に配置した緩衝液ＺにＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡの５ｍＭを加えることによりＣａＣｌ２を取り除き、該緩衝液Ｚに核酸結合性蛍光色素である臭化エチジウム（２０μＭ）を加えた。
この状態で蛍光強度を測定したところ、穴部１４に蛍光はほとんど観察されなかった（図９（ａ））。
【００６１】
次いで、緩衝液ＺにＡＴＰ（１００μＭ）を加えてＰ２Ｘ４受容体を刺激したところ、穴部１１において、ＤＮＡに結合した臭化エチジウム由来の蛍光（赤色、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ）が著しく増強した（図９（ｂ）、刺激から３００秒経過後）。ＡＴＰによる刺激前は臭化エチジウム由来の蛍光は全く観察されなかったことから、脂質二分子膜１２は充分安定に形成されていたと考えられる。
また、ＡＴＰによる刺激から３００秒後までの穴部１４における蛍光強度を図９（ｃ）に示す。図９（ｃ）に示すように、ＡＴＰ刺激後は赤色の蛍光強度がゆるやかに増加していった。
また、脂質二分子膜１２を界面活性剤などで破壊すると、瞬時に蛍光強度の増強が見られた。さらに、Ｐ２Ｘ受容体の拮抗薬ＴＮＰ−ＡＴＰを（１００μＭ）を緩衝液Ｚに添加すると、蛍光強度の増強が抑制された。これらの結果から、図９（ｃ）の緩やかな蛍光強度の増加は、Ｐ２Ｘ４受容体を介したものであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の膜タンパク質機能測定基板及びそれを用いた膜タンパク質機能測定方法は、蛍光強度の変化を指標として、特定の膜タンパク質の機能を個別に測定することができ、低コストかつ簡便に、イオンチャネル型膜タンパク質や代謝型膜タンパク質の機能を測定することができる。また、イオンチャネル型膜タンパク質においては、生理条件で起こる通常のイオン透過と、病態時に相当する条件で起こる色素透過の両方を、同時に又は区別して観察できるため、創薬のスクリーニングに非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の膜タンパク質機能測定基板において、脂質二分子膜にイオンチャネル型膜タンパク質を再構成した様子を示した概念図である。
【図２】本発明の膜タンパク質機能測定基板のイオンチャネル型膜タンパク質の機能を測定する実施形態の一例を示した概念図である。
【図３】本発明の膜タンパク質機能測定基板のイオンチャネル型膜タンパク質の機能を測定する実施形態の他の例を示した概念図である。
【図４】本発明の膜タンパク質機能測定基板のイオンチャネル型膜タンパク質の機能を測定する実施形態の他の例を示した概念図である。
【図５】本発明の膜タンパク質機能測定基板において、脂質二分子膜に代謝型膜タンパク質を再構成した様子を示した概念図である。
【図６】本発明の膜タンパク質機能測定基板の代謝型膜タンパク質の機能を測定する実施形態の一例を示した概念図である。
【図７】実施例１において穴部を形成した基板の共焦点レーザースキャン顕微鏡による透過光像である。
【図８】実施例１におけるイオンチャネル型膜タンパク質の機能測定の結果を示した図である。（ａ）刺激前の共焦点レーザースキャン顕微鏡画像、（ｂ）刺激から３００秒経過後の共焦点レーザースキャン顕微鏡画像、（ｃ）刺激から３００秒経過までの蛍光強度。
【図９】実施例２におけるイオンチャネル型膜タンパク質の機能測定の結果を示した図である。（ａ）刺激前の共焦点レーザースキャン顕微鏡画像、（ｂ）刺激から３００秒経過後の共焦点レーザースキャン顕微鏡画像、（ｃ）刺激から３００秒経過までの蛍光強度。
【符号の説明】
【００６４】
１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ  膜タンパク質機能測定基板  １０  基板本体  １１  穴部  １２  脂質二分子膜  １３  膜タンパク質  １４  穴部の内部  １５  穴部の外部  １７  細胞質抽出画分  ２、２Ｄ  膜タンパク質機能測定基板  ２０  基板本体  ２１  穴部  ２２  脂質二分子膜  ２３  膜タンパク質  ２４  穴部の内部  ２５  穴部の外部  Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ  蛍光物質（Ｉ）  ＩＩ−Ａ  物質（ＩＩ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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