(57)【要約】【課題】簡便に細胞の物質生産効率を上げることのできる物質生産方法、並びにエリスロアスコルビン酸の新規用途並びに、エリスロアスコルビン酸の効率よく製造する製造方法を提供する。【解決手段】物質生産細胞を用いて目的物質を生産する物質生産方法であって、細胞活性化剤としてのエリスロアスコルビン酸の存在下で、前記物質生産細胞による目的物質の生産を行う生産工程と、前記生産工程で生産された目的物質を回収する回収工程と、を含む物質生産方法；増殖促進有効量のエリスロアスコルビン酸を含有する細胞増殖促進剤、及び発現増強有効量のエリスロアスコルビン酸を含有する発現増強剤；ユビキチンの存在下で、アスコルビン酸分解細菌にアスコルビン酸又はそのデヒドロアスコルビン酸を接触させてエリスロアスコルビン酸を生成することと、前記接触後の反応系からエリスロアスコルビン酸を回収すること、を含むエリスロアスコルビン酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質生産細胞を用いて目的物質を生産する物質生産方法であって、
細胞活性化剤としてのエリスロアスコルビン酸の存在下で、前記物質生産細胞による目的物質の生産を行う生産工程と、
前記生産工程で生産された目的物質を回収する回収工程と、
を含む物質生産方法。
【請求項２】
前記エリスロアスコルビン酸の濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌである請求項１に記載の物質生産方法。
【請求項３】
前記物質生産細胞が動物細胞である請求項１又は請求項２記載の物質生産方法。
【請求項４】
前記物質生産細胞が、前記目的物質を発現するための組換えタンパク質発現機構を備えている請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の物質生産方法。
【請求項５】
増殖促進有効量のエリスロアスコルビン酸を含有する細胞増殖促進剤。
【請求項６】
発現増強有効量のエリスロアスコルビン酸を含有する発現増強剤。
【請求項７】
ユビキチンの存在下で、アスコルビン酸分解細菌にアスコルビン酸又はデヒドロアスコルビン酸を接触させてエリスロアスコルビン酸を生成することと、
前記接触後の反応系からエリスロアスコルビン酸を回収すること、
を含むエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項８】
前記ユビキチンが動物由来のユビキチンである請求項７に記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項９】
前記ユビキチンがウシ由来のユビキチンである請求項７に記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法。
【請求項１０】
前記アスコルビン酸分解細菌の培養系に、ユビキチン又はユビキチン生産細胞を添加することを含む請求項７〜請求項９のいずれか１項記載のエリスロアスコルビン酸製造方法。
【請求項１１】
前記ユビキチンが、天然型ユビキチン又はＫ６を含むユビキチン変異体である請求項７〜請求項１０のいずれか１項記載のエリスロアスコルビン酸製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、物質生産方法、細胞増殖促進剤及び発現増強剤、並びにエリスロアスコルビン酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  本来は体内で生合成されるインスリン、成長ホルモン、抗体などの生理活性物質を、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌、酵母、または動物細胞に生産させる技術が実用化され、この技術を用いて生産された生理活性物質が医薬品として用いられている。
これに関連して、培養細胞における組換えタンパク質の生産性を向上させる技術の開発が、細胞株の選択、遺伝仕組換えに用いるベクターの設計、細胞増殖を促進させる化合物の探索、培地組成の検討といった面から進められている。【０００３】  例えば、組換えタンパク質を発現する哺乳動物宿主細胞に分子シャペロンを導入する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この方法によれば、分泌型組換えタンパク質産物の生産量を増大させることができるとされている。
また、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの内在性のシグナルペプチド配列をヒト成長ホルモンのシグナルペプチド配列に置換する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。この方法によれば、哺乳動物細胞において発現される組換えタンパク質の均質性および／または分泌が改良されるとされている。
細胞増殖を促進させる化合物としては、例として、直鎖ポリリン酸やフルクタンを培地に添加すると細胞増殖が促進されるとされている（例えば、特許文献３及び４参照）。【０００４】  エリスロアスコルビン酸は、グルコースを原料とした化学合成やアスコルビン酸の酸化分解によって得られる化合物である（例えば、非特許文献１及び２参照）。エリスロアスコルビン酸については、酵母における抗酸化作用や、スズメガの幼虫（ｔｏｂａｃｃｏ  ｈｏｒｎｗｏｒｍ）におけるビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）様の作用が報告されている（例えば、非特許文献３及び４参照）。さらに、最近になって微生物を用いたアスコルビン酸からの変換反応によって、エリスロアスコルビン酸を生産することが可能となった（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２４３８１号公報
【特許文献２】特表２００４−５１６８３０号公報
【特許文献３】特開２０００−０６９９６１号公報
【特許文献４】特開２００８−２２８５８７号公報
【特許文献５】特開２００７−１３５４４５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２２０，１１７−１２５（１９９１）
【非特許文献２】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５５，９−１４（１９９８）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，８９５−９０３（１９９８）
【非特許文献４】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４１，１３９１−１３９６（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  しかしながら、特許文献１に記載の方法においては、哺乳動物細胞株を、シャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入して形質転換する操作が必要であり、作業効率及びコスト面の課題が残る。
また、特許文献２に記載の方法は、ヒト成長ホルモンのシグナルペプチドをコードするＤＮＡと目的のタンパク質をコードするＤＮＡとが融合された発現ベクターを、新たに哺乳動物細胞に導入する方法であり、既に目的のタンパク質を発現するように形質転換した哺乳動物細胞をそのまま使用するわけではなく、やはり作業効率及びコスト面に課題がある。
さらに、細胞増殖を促進させるとされる化合物は、細胞種によって効果が異なることがあるため、使用可能な候補化合物を数多く開発することは重要である。【０００８】  一方、エリスロアスコルビン酸については、培養細胞の増殖やタンパク質発現に対する作用に関して知見が得られていなかった。【０００９】  エリスロアスコルビン酸の製造については、特許文献５に記載の方法では、微生物の培養液にアスコルビン酸を添加して変換反応を行うため、培養液および変換に用いる微生物の生産物が、生成するエリスロアスコルビン酸に混在する。このため、変換後の精製操作が煩雑であり、製造コストの点で解決すべき問題が残されていた。【００１０】  本発明は上記に鑑みなされたものであり、簡便に細胞の物質生産効率を上げることのできる物質生産方法、並びにエリスロアスコルビン酸の新規用途を提供することを目的とする。【００１１】  また本発明は上記に鑑みなされたものであり、エリスロアスコルビン酸の簡便な製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明の物質生産方法は、物質生産細胞を用いて目的物質を生産する物質生産方法であって、細胞活性化剤としてのエリスロアスコルビン酸の存在下で、前記物質生産細胞による目的物質の生産を行う生産工程と、前記生産工程で生産された目的物質を回収する回収工程と、を含む物質生産方法である。【００１３】  前記エリスロアスコルビン酸の濃度は、０．１〜１０００μｇ／ｍｌであることが好ましい。また、前記物質生産細胞は、動物細胞であることが好ましい。さらに、前記物質生産細胞は、前記目的物質を発現するための組換えタンパク質発現機構を備えていることが好ましい。【００１４】  本発明の細胞増殖促進剤は、増殖促進有効量のエリスロアスコルビン酸を含有する細胞増殖促進剤である。
本発明の発現増強剤は、発現増強有効量のエリスロアスコルビン酸を含有する発現増強剤である。【００１５】  本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法は、ユビキチンの存在下で、アスコルビン酸分解細菌にアスコルビン酸又はデヒドロアスコルビン酸を接触させてエリスロアスコルビン酸を生成することと、前記接触後の反応系からエリスロアスコルビン酸を回収すること、を含むものである。
【発明の効果】
【００１６】  本発明によれば、簡便に細胞の物質生産効率を上げることのできる物質生産方法、並びにエリスロアスコルビン酸の新規用途を提供することができる。【００１７】  また本発明によれば、簡便にエリスロアスコルビン酸を生産する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ウシ赤血球由来の精製ユビキチンを用いた、Ｌ−アスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸生成を示すＴＬＣの結果である。
【図２】実施例１に係るエリスロアスコルビン酸生成を確認したＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図３】ウシ赤血球由来の精製ユビキチンを用いた、デヒドロアスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸生成を示すＴＬＣの結果である。
【図４】組み換えヒト型ユビキチンを用いた、アスコルビン酸あるいはデヒドロアスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸生成を示すＴＬＣの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】  以下、本発明の物質生産方法並びに細胞増殖促進剤及び発現増強剤について詳細に説明する。
（物質生産方法）
本発明の物質生産方法は、物質生産細胞を用いて目的物質を生産する物質生産方法であって、細胞活性化剤としてのエリスロアスコルビン酸の存在下で、前記物質生産細胞による目的物質の生産を行う生産工程と、前記生産工程で生産された目的物質を回収する回収工程と、を含むものである。
本発明の物質生産方法は、前記物質生産細胞を用いた目的物質の生産をエリスロアスコルビン酸の存在下で行うことにより、簡便に効率よく目的物質を生産することができる。
【００２０】  前記生産工程は、細胞活性化剤としてのエリスロアスコルビン酸の存在下で、物質生産細胞による目的物質の生産を行うものである。
【００２１】  本発明に係る物質生産細胞とは、目的物質を生産する細胞をいう。細胞種には特に制限はなく、例えば、細菌、酵母、菌類、藻類、植物細胞、動物細胞などのいずれでもよい。高次の折り畳み構造および／または翻訳後修飾を有するタンパク質の生産に供することができる点で、動物細胞であることが好ましく、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞が挙げられる。
【００２２】  昆虫細胞の例としては、ヨトウガ、カイコ、等の細胞株を挙げることができ、具体的には、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、等である。
哺乳動物細胞の例としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ等の各種組織に由来する細胞株を挙げることができ、具体的には、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）、ＮＳＯ細胞（マウス骨髄腫由来細胞）、ＢＨＫ細胞（ハムスター腎由来細胞）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎由来細胞）、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）、等である。
【００２３】  前記物質生産細胞は、前記目的物質を発現するための組換えタンパク質発現機構を備えていることが好ましい。組換えタンパク質発現機構とは、目的のタンパク質を選択的に発現させるための機構で、本発明においては周知の組換えタンパク質発現機構を用いることができる。組換えタンパク質発現機構を備えることで、目的のタンパク質を大量に発現させることができる。組換えタンパク質発現機構を備える物質生産細胞は、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入することにより得ることができる。
【００２４】  前記物質生産細胞が生産する目的物質は、細胞が作る化合物であれば特に限定はない。有機物でも無機物でもよく、細胞中に保持される物でも細胞外に分泌される物でもよく、合成による物、分解による物の別を問わない。例えば、核酸、アミノ酸、糖、糖タンパク質、脂肪酸、ビタミン、ペプチド、抗体、ホルモン、などが挙げられる。
【００２５】  前記エリスロアスコルビン酸は、前記生産工程において、物質生産細胞に対する細胞活性化剤として作用し得るものである。
細胞活性化剤とは、細胞を活性化する機能を有する薬剤を意味する。活性化とは、細胞増殖であっても発現増強であってもよく、両者が明確に区別されていなくてもよい。前記物質生産細胞はエリスロアスコルビン酸と接触することにより、細胞増殖および／または発現増強がなされ、目的物質の生産量が増大し得る。
【００２６】  上記の細胞増殖とは、一般的に当業界で用いられる意味で用いられ、例えば、細胞が分裂を繰り返し細胞集団の細胞数が増加したことをいい、一部の細胞が分裂する一方で一部の細胞が死滅していてもよい。細胞増殖は、この目的で一般に用いられている方法で評価すればよく、細胞数の計測、指標化合物量の測定などであってもよい。
上記の発現増強とは、目的物質を生産する細胞中、または該細胞からの分泌物のいずれかにおいて、目的物質量の増加が認められればよい。発現増強は、例えば、該細胞を培養した後の液体培地に含まれる目的物質の濃度に基づき評価することができる。
また、目的物質の発現増強とは、細胞単位の発現量が増加したことにより、細胞集団の発現量が増加したことのほか、細胞増殖が促進され細胞数が増えたことにより、細胞集団の発現量が増加したことをもいい、両者が明確に区別されていなくてもよい。
【００２７】  本発明に係るエリスロアスコルビン酸は、市販品でもよく、アスコルビン酸分解能を有する真菌による生成物でもよい。真菌の生成物であるエリスロアスコルビン酸を使用する場合、このエリスロアスコルビン酸は例えば、アスコルビン酸分解真菌にアスコルビン酸を接触させてエリスロアスコルビン酸を生成すること（生成工程）と、アスコルビン酸から生成されたエリスロアスコルビン酸を回収すること（回収工程）とを含む製造方法により得られたものとすることができる。
【００２８】  エリスロアスコルビン酸の製造に用いられる真菌は、アスコルビン酸分解能を有する菌であればよく、無性世代及び有性世代のいずれであってもよい。中でもペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、及びドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）属から成る群より選択された真菌、特にペニシリウム属が好ましい。このようなペニシリウム属としては、ペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９８、２００５年７月２１日付で受領）が生成能の観点から特に好ましい。
【００２９】  上記真菌の培養に用いられる培地は、真菌が生育することが知られている培地であればいずれでもよく、特に制限されない。例えば、ポテトデキストロース寒天培地（培地組成：馬鈴薯（２００ｇ）抽出液１０００ｍｌ、グルコース２０ｇ、寒天２０ｇ）などの培地において２５℃の好気条件下、静置培養で維持、増殖することができる。また液体培地及び固体培地のいずれであってもよいが、菌体を回収する際には菌体の回収の観点、アスコルビン酸と接触させる際には生成物の回収の観点から、液体培地であることが好ましい。
【００３０】  真菌の液体培養に用いられる培地は、真菌が生育することが知られている培地であればいずれであってもよく、一例としては、グルコース２質量％、デンプン２質量％、乾燥ブイヨン０．５質量％、酵母抽出物０．２質量％、大豆ミール０．５質量％、消泡剤０．０１質量％による培地を挙げることができるが、菌の種類及び状態に応じて適宜変更可能である。
【００３１】  培養条件は、真菌の種類や前培養における菌の生育状態・数によって異なるが、一般に、湿重量で０．０１〜０．１ｇ／ｍｌになるまで培養することが好ましい。但し、さらに増やすことも可能である。
【００３２】  本製造方法における生成工程は、真菌を培養中の培地にアスコルビン酸を添加することによって行うことができる。例えば特開２００７−１３５４４５号公報に記載のエリスロアスコルビン酸の製造方法が挙げられる。
【００３３】  菌体を含む液に添加するアスコルビン酸は、真菌と接触して代謝することができる形態であれば、粉体及び液体のいずれであってもよい。アスコルビン酸溶液を得るための溶媒としては、いずれのものであってもよく、水、メタノール、エタノール等を挙げることができる。
アスコルビン酸の添加量は、真菌の種類及び生育状態によって異なるが、一般に、０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは３〜３０ｍｇ／ｍｌの量で添加すればよい。０．１ｍｇ／ｍｌよりも少ないとエリスロアスコルビン酸が得られない場合があり、一方、２００ｍｇ／ｍｌを超えると変換が不完全になる場合があるため、それぞれ好ましくない。
【００３４】  アスコルビン酸の添加後は、室温（２５℃）に静置しても、振盪してもよい。振盪する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェーカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの液とした場合に３０〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０〜２００ｒｐｍとすることができる。振盪の際の温度は、種々の温度における真菌の生育条件に応じて適宜設定することができるが、一般に４〜５０℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃、最も好ましくは室温（２５℃）である。４℃よりも低いとエリスロアスコルビン酸への変換が起こらない場合があり好ましくなく、一方５０℃よりも高いと変換のための酵素活性が低下する場合があり、好ましくない。
【００３５】  上記の静置または振盪は、すべてのアスコルビン酸がエリスロアスコルビン酸に変換されるまで継続することができ、真菌の種類及び生育状態によって異なるが、一般に１０〜８０時間、好ましくは２４〜４８時間であればよい。この間に、真菌がアスコルビン酸と接触してアスコルビン酸を代謝してエリスロアスコルビン酸に変換・生成し、菌体外へ放出する。なお、上記継続時間は、アスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸への変換状態によって適宜変更することができる。このような変換状態の確認は、例えば薄層クロマトグラフィーなどの既知の手段を用いて容易に行うことができる。
【００３６】  本製造方法における回収工程では、上記生成工程で得られたエリスロアスコルビン酸を回収する。
菌体外へ放出されたエリスロアスコルビン酸を回収する方法としては、液体中の化合物を回収または精製できることが知られている手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー）、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
各回収手段を使用する前には、エリスロアスコルビン酸が放出された溶液から菌体を除去することが好ましい。菌体の除去には、濾過等を用いればよい。
得られたエリスロアスコルビン酸は、公知の化学分析、機器分析によって確認することができる。
【００３７】  上記製造方法において、回収工程におけるエリスロアスコルビン酸を効率よく回収する観点から、前記生成工程を、洗浄液を用いて洗浄されたアスコルビン酸分解真菌にアスコルビン酸を接触させて生成用緩衝液中でエリスロアスコルビン酸を生成する工程とすることが好ましい。このように洗浄された菌体を生成用緩衝液中で用いてエリスロアスコルビン酸を生成するので、夾雑物が少ない系からエリスロアスコルビン酸を回収することができる。この結果、エリスロアスコルビン酸の精製工程を簡略化することができる。
【００３８】  菌体を洗浄する洗浄液としては、一般に菌体を洗浄するために用いられるものであればよく、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、等を挙げることができる。これらの中でも、等張圧であり、さらに構成成分が少ないという観点から、生理食塩水が好ましい。
洗浄は菌体に付着している培養液成分を除去することができれば特に制限はない。
【００３９】  なお、洗浄菌体は、本生成工程に用いられる前に、エリスロアスコルビン酸の製造に用いられる前に所定の菌数にするため又は生成可能な活性状態にするために前培養に供されたものであることが好ましい。このような前培養後の洗浄菌体を用いることによって、エリスロアスコルビン酸の生成効率を高めることができる。前培養の条件は、通常の培養条件であればよく、前述した培養条件をそのまま適用し得る。
【００４０】  生成用緩衝液は、洗浄菌体によるエリスロアスコルビン酸生成を維持できる程度に洗浄菌体を維持できるものであればよく、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、等を挙げることができ、上記洗浄液と同一であっても異なっていてもよい。また生成用緩衝液のｐＨは、通常３．０〜１０．０であり、アスコルビン酸の非特異的分解抑制という観点から４．５〜８．０が好ましい。
【００４１】  生成用緩衝液への菌体の懸濁濃度は、真菌の種類又は生育状態によって異なるが、通常、湿重量で０．０１〜１．０ｇ／ｍｌである。但し、さらに増やすことも可能である。
生成用緩衝液での生成反応は、用いられる洗浄菌体の数量、種類等によって異なるが、通常１８時間〜７２時間としてもよく、エリスロアスコルビン酸生成量とアスコルビン酸残存量の比率という観点から３６時間〜４８時間とすることが好ましい。
【００４２】  本発明の物質生産方法おける前記生産工程においては、物質生産細胞による物質生産時の反応系にエリスロアスコルビン酸が存在していればよい。エリスロアスコルビン酸と物質生産細胞との反応系における接触は、目的物質の種類、細胞の種類、培養温度などの培養条件に応じて任意の方法で行えばよい。例えば、物質生産細胞を培養中の培地に、エリスロアスコルビン酸を添加してもよく、エリスロアスコルビン酸を溶解した培養液に物質生産細胞を投入してもよい。また、反応系にエリスロアスコルビン酸を連続的に添加してもよく、定期的に添加してもよい。
【００４３】  前記エリスロアスコルビン酸は、物質生産に有効な量で反応系に存在していれば使用濃度に特に制限はなく、細胞種によって異なるが０．１〜１０００μｇ／ｍｌで使用することができる。０．１μｇ／ｍｌ以上であれば、充分に物質生産細胞を活性化して物質生産を行うことができ、１０００μｇ／ｍｌ以下であれば、細胞の活性を損なわずに添加量に応じた効率よい物質生産が期待できる。物質生産細胞によって充分量の物質が生産される観点から、１〜５００μｇ／ｍｌの使用濃度であることが好ましく、１０〜５００μｇ／ｍｌの使用濃度であることがより好ましく、３０〜３００μｇ／ｍｌが特に好ましい。
本発明において使用濃度とは、細胞の置かれた環境におけるエリスロアスコルビン酸濃度であって人為的に調整することが可能な最終濃度をいう。例えば、物質生産細胞を培養中の培地にエリスロアスコルビン酸を添加して使用する場合、添加直後の培地におけるエリスロアスコルビン酸濃度をいう。
【００４４】  本発明の物質生産方法における前記回収工程では、前記生産工程で生産された目的物質を回収する。回収する方法としては、細胞中または細胞外（例えば、培地中）の化合物を抽出し精製できることが知られている手段であればいずれであってもよい。細胞の溶解または破砕は公知の方法で行うことができ、溶液中の目的物質の精製方法としては、液体クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー）、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。目的物質の精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。また、本発明の物質生産方法における前記回収工程は、細胞そのものの回収であってもよい。
得られた目的物質は、目的物質の種類に応じた公知の化学分析、機器分析によって確認することができる。
【００４５】（細胞増殖促進剤及び発現増強剤）
上記のようにエリスロアスコルビン酸は細胞に対する活性化剤として作用し、細胞の増殖及び発現増強を促進させ得る。
従って、本発明の細胞増殖促進剤は、増殖促進有効量のエリスロアスコルビン酸を含有するものである。また、本発明の発現増強剤は、発現増強有効量のエリスロアスコルビン酸を含有するものである。
【００４６】  本発明の細胞増殖促進剤の使用対象となる細胞としては、エリスロアスコルビン酸と接触したときに増殖促進作用が認められる細胞であれば特に制限はなく、前記物質生産方法に用いる物質生産細胞に限定されない。例えば、細胞そのものを目的とする用途にも適用して、細胞の増殖を促進し、目的細胞を大量に得るために用いてもよい。このような目的細胞としては、細胞シートを構成する表皮細胞及び上皮細胞、血液細胞などを挙げることができる。
また、本発明の発現増強剤の使用対象となる細胞としては、目的物質を生産する細胞であって、エリスロアスコルビン酸と接触したときに発現増強作用が認められる細胞であれば特に制限はなく、前記物質生産方法に用いる物質生産細胞に限定されない。
細胞種には特に制限はなく、前記物質生産方法におけるものと同様の細胞を対象とすることができ、好ましい態様も同様である。
【００４７】  本発明の細胞増殖促進剤及び発現増強剤は、使用時に細胞と接触させればよい。その使用態様に特に制限はなく、細胞の種類、培養温度などの培養条件に応じて任意に選択できる。
【００４８】  本発明の細胞増殖促進剤及び発現増強剤は、それぞれ増殖促進有効量及び発現増強有効量であればよい。本発明における増殖促進有効量とは、使用時に、対象となる目的細胞の増殖が促進し得る量を意味する。一方、発現増強有効量とは、使用時に、対象となる目的細胞における物質生産のための遺伝子発現系の機能が増強され得る量を意味し、特に、遺伝子組換え細胞において導入遺伝子に基づく目的物質の生産量が増加し得る量を意味する。
本発明における増殖促進有効量及び発現増強有効量は、細胞種によって異なるが、細胞の活性を損なわずに充分な効果を得る観点から、０．１〜１０００μｇ／ｍｌの使用濃度とすることができ、１〜５００μｇ／ｍｌとすることが好ましく、更には１０〜５００μｇ／ｍｌとすることが好ましく、３０〜３００μｇ／ｍｌが特に好ましい。ここで使用濃度とは前述のとおりである。
【００４９】  本発明の細胞増殖促進剤及び発現増強剤は、エリスロアスコルビン酸単独で構成してもよく、また、公知の製剤用添加剤を含んで構成していてもよい。公知の製剤用添加剤としては、増量剤、賦形剤、乳化剤、湿潤剤等を挙げることができ、細胞増殖促進剤及び発現増強剤の使用形態に応じて、適宜選択することができる。
また、本発明の細胞増殖促進剤及び発現増強剤の形態は特に限定されず、当業者が任意に選択することができる。例えば、乳剤、液剤、水溶液、水和剤、粉剤、粒剤、微粒剤、等の形態とすることができる。
このような各種の使用形態とした場合には、最終濃度が上述した使用濃度に調整可能であれば、使用濃度そのものでエリスロアスコルビン酸を含有するものであっても、濃縮形態で含有するものであってもよい。
【００５０】（エリスロアスコルビン酸の製造方法）
次に、本発明のエリスロアスコルビン酸製造方法ついて詳細に説明する。
なお、物質生産、前記のエリスロアスコルビン酸の製造方法等に関して前述した記載は適宜、以下に述べるエリスロアスコルビン酸の製造方法についても適用可能である。
【００５１】  本発明のエリスロアスコルビン酸製造方法は、ユビキチンの存在下で、アスコルビン酸分解真菌にアスコルビン酸又はデヒドロアスコルビン酸を接触させてエリスロアスコルビン酸を生成すること（以下、生成工程）と、前記接触後の反応系からエリスロアスコルビン酸を回収すること（以下、回収工程）、を含むものである。
【００５２】  本発明のエリスロアスコルビン酸の製造方法では、アスコルビン酸分解真菌がアスコルビン酸等からエリスロアスコルビン酸を変換する際に、変換反応活性化剤としてユビキチンを存在させるので、より効率よくアスコルビン酸等からエリスロアスコルビン酸の製造することができる。
【００５３】  本発明に係るユビキチンとは、真核生物の細胞内に含まれるユビキチンであって、ヒト、ウシ、酵母などの生物においては、７６アミノ酸で構成されていることが知られているタンパク質である。真核生物の種には特に制限はなく、例えば、真菌、酵母、藻類、植物、動物などのいずれでもよい。ユビキチンは進化の過程で高度に保存されたタンパク質であり、種間のアミノ酸配列の差は極めて小さいが、真菌、酵母あるいは動物由来のユビキチンであることが好ましい。
【００５４】  真菌あるいは酵母由来のユビキチンの例としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属が挙げられ、動物由来のユビキチンの例としては、ウシを挙げることができる。なお、これらは天然由来のユビキチンでも、組換え体として大腸菌などを宿主として生産されたユビキチンでもよい。
【００５５】  このようなユビキチンとしては、天然型ユビキチン（配列番号１及び配列番号２）又は６番目のリシン（以下、「Ｋ６」）が保存されたユビキチン変異体であることが好ましい。配列番号１は、例えばヒト及びウシの配列と一致しており、配列番号２は例えば酵母の配列と一致している。なお本発明における「Ｋ６が保存されたユビキチン変異体」とは、天然型ユビキチンの６番目のリシンが保存され且つ変換反応活性化剤としての機能を有する変異体であればいずれでもよく、例えば、６番目以外のリジンを他のアミノ酸に置換した変異体が該当する。
【００５６】  生成反応の基質となるアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸は、通常市販されているアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸であれば、何ら問題なく使用することができる。また、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−アスコルビン酸、のいずれも使用できる。さらに、デヒドロアスコルビン酸は臭素などの酸化剤でアスコルビン酸を酸化することによっても調製できる。
【００５７】  前記生成工程に用いるユビキチンは、高度に精製されたものであっても、細胞抽出物のような夾雑物を含むものでも、あるいは、ユビキチンを生成可能な細胞であれば、生成細胞そのものとしても利用できる。
【００５８】  これらのユビキチンを上述したアスコルビン酸分解真菌と接触させるために、本製造方法は、前記アスコルビン酸分解細菌の培養系に、ユビキチン又はユビキチン生産細胞を添加することを含むものであってもよい。ここでユビキチン生産細胞とは、ユビキチン生産能を有するものであれば特に制限はなく、生来より生産する細胞以外にも、ユビキチン産生系を有する組換え体が導入された導入細胞であってもよい。なお、藻類などの単細胞生物であれば、微生物そのものを添加することも、ユビキチン産生細胞の添加に包含される。
また、これらのユビキチンは、溶液（組成物）であっても、固体であってもよく、固体の場合、ポリマーなどの担体に固定化されたものであってもよい。担体に固定化されたものの場合、担体そのものを反応系に配置することも、「添加」の一形態として包含される。
【００５９】  接触させるアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸は、前述のユビキチン、ユビキチンを含有する組成物、あるいはユビキチンを含む細胞と接触して代謝することができる形態であれば、粉体及び液体のいずれであってもよい。アスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸の溶液を得るための溶媒としては、いずれのものであってもよく、水、緩衝液、メタノール、エタノール等の有機溶媒を挙げることができる。
【００６０】  アスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸の添加量は、精製物や組成物或いは生成細胞など、ユビキチンの添加形態によって異なるが、一般に、０．０１〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．３〜３０ｍｇ／ｍｌの量で添加すればよい。０．０１ｍｇ／ｍｌよりも少ないとエリスロアスコルビン酸が得られない場合があり、一方、２００ｍｇ／ｍｌを超えると変換が不完全になる場合があるため、それぞれ好ましくない。
【００６１】  生成工程に用いる溶媒は、通常の培養液であってもよいが、前述したように精製工程の簡略化及び効率の観点から、生成用緩衝液であることが好ましい。生成用緩衝液は前述したように、エリスロアスコルビン酸生成を維持できるものであればよく、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、等を挙げることができる。また生成工程に用いる緩衝液のｐＨは、通常３．０〜１２．０であり、エリスロアスコルビン酸の生成効率とアスコルビン酸の非特異的分解抑制という観点から４．０〜１０．０が好ましい。
【００６２】  生成工程に用いる緩衝液へのユビキチンの添加量は、ユビキチンの形態によって異なるが、通常、精製ユビキチン相当の含量として、０．００１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌである。但し、さらに増減することも可能である。
【００６３】  アスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸の添加後は、静置しても、振盪してもよい。振盪する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェーカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの液とした場合に３０〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０〜２００ｒｐｍとすることができる。振盪の際の温度は、種々の温度における反応の進行状況に応じて適宜設定することができるが、ユビキチンあるいはユビキチンを含有する組成物を用いる反応では、一般に４〜１００℃を、ユビキチンを含む細胞を用いる反応では、４〜５０℃を用いることができる。４℃よりも低いとエリスロアスコルビン酸への変換が起こらない場合があり好ましくなく、ユビキチンを含む細胞を用いる反応では、５０℃よりも高いと変換活性が低下する場合があり、好ましくない。
【００６４】  上記の静置または振盪は、すべてのアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸がエリスロアスコルビン酸に変換されるまで継続することができ、変換反応の状態によって異なるが、一般に１分から２４時間、好ましくは３分から１２時間であればよい。この間に、ユビキチンがアスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸と接触して、エリスロアスコルビン酸に変換・生成する。なお、上記継続時間は、アスコルビン酸またはデヒドロアスコルビン酸からエリスロアスコルビン酸への変換状態によって適宜変更することができる。このような変換状態の確認は、例えば薄層クロマトグラフィーなどの既知の手段を用いて容易に行うことができる。
【００６５】  本製造方法における回収工程では、上記生成工程で得られたエリスロアスコルビン酸を回収する。生産されたエリスロアスコルビン酸を回収する方法としては、液体中の化合物を回収または精製できることが知られている手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー）、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
得られたエリスロアスコルビン酸は、公知の化学分析、機器分析によって確認することができる。
【実施例】
【００６６】  以下に本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００６７】［実施例１］
＜真菌を用いたエリスロアスコルビン酸の生成＞
ペニシリウム属の真菌であるペニシリウムＮｏ．１９６Ｆ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９８）を、シード培地（グルコース２０ｇ／Ｌ、デンプン２０ｇ／Ｌ、乾燥ブイヨン（または、ペプトン）５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２ｇ／Ｌ、大豆ミール５ｇ／Ｌ、消泡剤ＣＢ４４２（日本油脂製）０．１ｇ／Ｌ）１００ｍｌを含むバッフル付きの５００−ｍｌ  Ｅｈｒｅｎｍｅｙｅｒフラスコに接種し、２５℃で４日間振盪培養した。【００６８】  次いで、この培養液の一部（５ｍｌ）を、生育培地（デンプン３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物３ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３  １０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ／Ｌ、消泡剤ＣＢ４４２  ０．１ｇ／Ｌ、ｐＨ５．５）１００ｍｌを含むバッフル付きの５００−ｍｌ  Ｅｈｒｅｎｍｅｙｅｒフラスコに接種し、２５℃で１日振盪培養した。【００６９】  この培養液を濾過して菌体を集め、生理食塩水で２回洗浄して得られた洗浄菌体の全量を、０．２２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌとなるようビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を添加した。続いて、バッフル付きの５００−ｍｌ  Ｅｈｒｅｎｍｅｙｅｒフラスコで、２５℃で３６〜４８時間振盪した。【００７０】  上記の処理により得たフラスコ１０本分の培養液を濾過して、合計１．１Ｌの濾液を得た。これに、５．５Ｌのメタノールを加え、４℃で一晩放置した。これを濾過して得た濾液を濃縮し凍結乾燥して、１５．７５ｇの乾固物を得た。
この乾固物をクロロホルム：メタノール：酢酸（３：１：１）５２５ｍｌに懸濁後、遠心により上清を回収し、これを濃縮して１３．８ｇの残渣を得た。【００７１】  上記残渣を水に溶解後、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２  Ｐ−１３０  ２８Ｆ（２８．０×３００ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製を行った。展開溶媒として４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含む０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸水を用い、２０ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、保持時間７５〜８５分の溶出物を回収した。合計８回の分取により、４９０ｍｇの精製物を得た。精製物がＬ−エリスロアスコルビン酸であることは、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、紫外吸収、赤外吸収、および比旋光度で確認した。【００７２】＜エリスロアスコルビン酸の細胞増殖促進作用の評価＞
上記で得たエリスロアスコルビン酸の細胞増殖促進作用を以下の方法で調べた。【００７３】  組換えヒト型ＢＬアンジオスタチン（ｒｈＢＬＡＳ）を生産するｒｈＢＬＡＳ生産株を、以下の方法で作製した。ＢＬアンジオスタチンは、プラスミノーゲンの特異的切断により生じる公知のタンパク質である。
ＨｅｐＧ２  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２を鋳型に逆転写反応を行い、ＰＣＲにより目的とするＢＬアンジオスタチンに相当したプラスミノーゲン部分配列のＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片の末端を平滑処理後、ｐＣＡＧＧＳ  １．ｄｈｆｒ．ｎｅｏベクターのＳａｌ  Ｉサイトにクローニングし、プラスミド構築物を得た。この構築物から常法によりトランスフェクション用プラスミドＤＮＡを大量調製した。
上記プラスミドＤＮＡを、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯを用いて導入し、常法によりｒｈＢＬＡＳ生産株を樹立した。【００７４】  上記ｒｈＢＬＡＳ生産株から得たｒｈＢＬＡＳ生産細胞を、１０％ウシ胎仔血清添加ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地に懸濁し、１×１０４個／ｍｌの懸濁液を調製した。この懸濁液を２４穴プレートに５００μｌ／ｗｅｌｌ播種した。【００７５】  播種した細胞を、５％炭酸ガス下、３７℃で７２時間静置培養した。その後、各ウェルからＤＭＥＭ培地をアスピレーターで除去し、ＤＭＥＭ培地（無血清）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。
次いで、ＤＭＥＭ培地で希釈したエリスロアスコルビン酸またはビタミンＣを、各ウェルに添加し、各ウェルの培養液の量が計５５０μｌで、エリスロアスコルビン酸またはビタミンＣの濃度が終濃度で、０μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌとなるようにした。
続いて、５％炭酸ガス下、３７℃で７２時間静置培養した。【００７６】  培養後、各ウェルの上清をアスピレーターで除去した。各ウェルを５００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、０．１Ｎ  ＮａＯＨを２５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、ｒｈＢＬＡＳ生産細胞を溶解させた。【００７７】  細胞を溶解させて得た溶液３０μｌに、ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬１５０μｌを添加し、ｂｒａｄｆｏｒｄ法により、５９５ｎｍで吸光度を測定した。検量線をもとにタンパク質濃度を算出した。結果を下記表１に示す。なお、表１は、エリスロアスコルビン酸またはビタミンＣの濃度が０μｇ／ｍｌの各ウェルの上清のタンパク質濃度を１００として相対値で示す。【００７８】
【表１】
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【００７９】  表１に示すように、エリスロアスコルビン酸（ＥＡＡ）を添加したときのｒｈＢＬＡＳ生産細胞の細胞増加率は、ビタミンＣ（ＡｓＡ）を添加したときよりも高く、ＥＡＡの添加量に比例して、細胞増殖は促進された。【００８０】［実施例２］
＜エリスロアスコルビン酸の組換えタンパク質発現増強作用の評価＞
エリスロアスコルビン酸の組換えタンパク質発現増強作用を調べるため、ｒｈＢＬＡＳ生産細胞が生産したｒｈＢＬＡＳの定量を、以下の拮抗ＥＬＩＳＡによって行った。【００８１】  公知の方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４０：５９０−５９４，２００６）に従って調製されたヒト天然型ＢＬアンジオスタチンを２μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに希釈し、これを９６穴エライザプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ入れ、４℃で一晩固定化した。固定化後、各ウェルを１００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ（以下、「ＢＳＡ含有ＰＢＳ」という。）を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間静置することによってブロッキングした。【００８２】  ｒｈＢＬＡＳ生産細胞の懸濁濃度を２×１０４個／ｍｌとして各ウェルに播種した以外は実施例１と同様にして培養を行い、各ウェルから細胞上清を生産量測定用上清として採取した。得られた上清を終濃度１０％、抗プラスミノーゲン抗体（和光純薬工業（株）製）終濃度１．５μｇ／ｍｌとなるように、ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈し、室温で１時間置くことによってインキュベーションした。【００８３】  ブロッキング後のプレートの各ウェルを１００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、サンプル溶液またはスタンダード溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間インキュベーションした。
インキュベーション後、１００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、３μｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した２次抗体（ＨＲＰ−抗ウサギＩｇＧ、和光純薬工業（株）製）を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間静置することによってインキュベーションした。【００８４】  インキュベーション後、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、０．４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに希釈したｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（シグマ  アルドリッチ（株）製、１／２５００の過酸化水素水を直前に添加）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分静置することによって反応させた。続いて、３Ｎの硫酸を添加し反応を停止させた。
４９０ｎｍの波長で吸光値を測定し、スタンダード曲線からｒｈＢＬＡＳ濃度（μｇ／ｍｌ）を算出した。結果を下記表２に示す。表２中の数値はｒｈＢＬＡＳの生産量を示す（μｇ／ｍｌ）。【００８５】
【表２】
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【００８６】  表２に示すように、ｒｈＢＬＡＳ生産細胞によるｒｈＢＬＡＳの生産量は、エリスロアスコルビン酸（ＥＡＡ）を１００μｇ／ｍｌ添加したとき、無添加の約２．４倍に増加した。【００８７】  これらのことから、エリスロアスコルビン酸は、細胞増殖促進作用および発現増強作用を示すことが明らかである。したがって、エリスロアスコルビン酸は、細胞増殖促進剤および発現増強剤としての効果が期待でき、細胞を用いた物質生産に用いることができる。【００８８】  上記のことから、本発明によれば、簡便に細胞の物質生産効率を上げることができる。また、本発明によれば、細胞増殖促進剤及び発現増強剤というエリスロアスコルビン酸の新規用途を提供することができる。【００８９】［実施例３］
＜ユビキチンによる、アスコルビン酸の、エリスロアスコルビン酸への変換反応＞
ウシ赤血球由来の高度に精製されたユビキチン（配列番号１）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ  （カタログ番号Ｕ６２５３））（５μｇ／ｍｌ）あるいは緩衝液とＬ−アスコルビン酸（和光純薬）（１７ｍＭ）を、緩衝液（１０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、３７℃で、図１に示す時間インキュベートした。その後、反応液の１５μｌを１μｌのブチルヒドロキシトルエン（５７６ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）と混合し、その一部（３μｌ）をシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。試料をスポットしたシリカゲルプレートを、クロロホルム−メタノール−酢酸（６：３：１）で展開し、硝酸銀あるいは紫外線でスポットを検出した。【００９０】  その結果、図１に示すように、ユビキチンはアスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸生産をもたらした。この変換は反応５分後から検出できた。反応１２時間後にはアスコルビン酸は消失したが、エリスロアスコルビン酸も消失し、その代りにＵＶ吸収のない物質（＊印）が生成した。一方、ユビキチン非存在下ではアスコルビン酸はほとんど変化しなかった。図中のＯｒｉ、ＳＦ、ＡｓＡ、ｅＡｓＡ、ＤＨＡｓＡは、それぞれ、原点、溶媒先端、標準アスコルビン酸、標準エリスロアスコルビン酸、標準デヒドロアスコルビン酸の位置を示す（図３および図４においても同じ）。【００９１】［実施例４］
＜ユビキチンの作用でアスコルビン酸から生成したエリスロアスコルビン酸の確認＞
図１と同じ条件で、ユビキチンとアスコルビン酸を６時間反応させた反応液の一部をＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２  Ｐ−５０  ４Ｄを用いてＨＰＬＣ分析した。移動相：４０％アセトニトリルを含む０．０５％ギ酸水、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ（２５５ｎｍ）、温度：室温。【００９２】  ＨＰＬＣ分析の結果、図２に示すように、生成する物質は完全に標準Ｌ−エリスロアスコルビン酸と一致した。【００９３】［実施例５］
＜ユビキチンによる、デヒドロアスコルビン酸の、エリスロアスコルビン酸への変換反応＞
図３の左側に結果を示す実験においては、ウシ赤血球由来の高度に精製されたユビキチン（配列番号１）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ  （カタログ番号Ｕ６２５３））（５μｇ／ｍｌ）あるいは緩衝液とＬ−アスコルビン酸（和光純薬）（１７ｍＭ）、デヒドロアスコルビン酸（１７ｍＭ）（Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．Ｗｅｌｌｓ，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｏ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５（１９９８）９−１４．の方法により調製）、あるいは２，３−ジケト−Ｌ−グロン酸（１６ｍＭ）（Ｙ．Ｋａｇａｗａ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｉ．Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ２，３−ｄｉｋｅｔｏ−Ｌ−ｇｕｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１（１９６２）１３４−１４４．の方法により調製）を、緩衝液（１０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，ａｎｄ  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、３７℃で、０分、あるいは１０分間インキュベートした。その後、反応液の１５μｌを１μｌのブチルヒドロキシトルエン（５７６ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）と混合し、その一部（３μｌ）をシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。試料をスポットしたシリカゲルプレートを、クロロホルム−メタノール−酢酸（６：３：１）で展開し、硝酸銀でスポットを検出した。図１の注釈に加えて、ＤＫＧは標準２，３−ジケト−Ｌ−グロン酸の展開位置を示す。【００９４】  図３の左側に結果を示す実験においては、ウシ赤血球由来の高度に精製されたユビキチン（配列番号１）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ（カタログ番号Ｕ６２５３））（５μｇ／ｍｌ）とデヒドロアスコルビン酸（１７ｍＭ）（Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．Ｗｅｌｌｓ，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｏ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５（１９９８）９−１４．の方法により調製）を、緩衝液（１０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，ａｎｄ  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、３７℃で、１０分間インキュベートした。その際、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（３６ｍＭ）を含む反応液、あるいは、窒素ガスで置換した反応液も用いた。その後、反応液の１５μｌを１μｌのブチルヒドロキシトルエン（５７６ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）と混合し、その一部（３μｌ）をシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。試料をスポットしたシリカゲルプレートを、クロロホルム−メタノール−酢酸（６：３：１）で展開し、硝酸銀でスポットを検出した。ただし、窒素置換した反応液をスポットしたＴＬＣは、クロロホルム−メタノール−酢酸（５：４：１）で展開した。【００９５】  図３左に示すように、ユビキチンによるエリスロアスコルビン酸の生成は、アスコルビン酸あるいはデヒドロアスコルビン酸からは行われるが、２，３−ジケト−Ｌ−グロン酸からは起こらなかった。【００９６】  図３右に示すように、ユビキチンによるデヒドロアスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸生成は、抗酸化剤であるブチルヒドロキシトルエン（図中のＢＨＴ）あるいは、反応液の窒素ガス置換（図中のＮ２）により完全に阻害された。【００９７】［実施例６］
＜組み換えユビキチン変異体による、アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸の、エリスロアスコルビン酸への変換反応＞
ウシ赤血球由来の高度に精製されたユビキチン（配列番号１）（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ  （カタログ番号Ｕ６２５３））（５μｇ／ｍｌ）あるいは緩衝液、あるいは、組換えヒト型ユビキチン（Ｋ６Ｒ、あるいはＫ６  ｏｎｌｙ［Ｋ１１Ｒ／Ｋ２７Ｒ／Ｋ２９Ｒ／Ｋ３３Ｒ／Ｋ４８Ｒ／Ｋ６３Ｒ］、ともにＢｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡから購入。それぞれ、カタログ番号ＵＭ−Ｋ６ＲあるいはＵＭ−Ｋ６Ｏ）と、Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬）（１７ｍＭ）、あるいはデヒドロアスコルビン酸（１７ｍＭ）（Ｃ．Ｈ．Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｗ．Ｗｅｌｌｓ，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｏ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｏａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５５（１９９８）９−１４．の方法により調製）を、緩衝液（１０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，ａｎｄ  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、３７℃で、０分あるいは１０分インキュベートした。その後、反応液の１５μｌを１μｌのブチルヒドロキシトルエン（５７６ｍＭ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）と混合し、その一部（３μｌ）をシリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。試料をスポットしたシリカゲルプレートを、クロロホルム−メタノール−酢酸（６：３：１）で展開し、硝酸銀でスポットを検出した。【００９８】  図４に示すように、Ｋ６Ｒユビキチン変異体は、アスコルビン酸、あるいはデヒドロアスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸を生成する能力を持たなかったが、Ｋ６  ｏｎｌｙ変異体は、野生型ユビキチンと同等の活性をもっていた。これらの結果から、ユビキチンのＮ末端から６番目のアミノ酸であるリシンが、アスコルビン酸あるいはデヒドロアスコルビン酸からのエリスロアスコルビン酸変換活性に重要であることが示された。【００９９】  これらのことから、ユビキチンは、その分子内のＮ末端から６番目のリシン残基を含む構造上の特徴に基づき、アスコルビン酸あるいはデヒドロアスコルビン酸をエリスロアスコルビン酸に変換する活性を発揮することが明らかである。したがって、ユビキチンの利用は、エリスロアスコルビン酸の効率的な製造方法において極めて有効である【０１００】  上記のことから、ユビキチンンを利用することによってエリスロアスコルビン酸を効果的に製造することができる。
このように本発明によれば、エリスロアスコルビン酸の新規な製造方法を提供することができる。
【図１】
2010259414.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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