(57)【要約】【課題】本発明の課題は、分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、前記センサータンパク質によって特異的に認識される核酸とを利用して、被検試料中の分析物を検出及び／又は定量することのできる、コスト、操作性、迅速性の面で優れた方法を提供することにある。【解決手段】本発明者らは、ヒ素と結合するセンサータンパク質であるＡｒｓＲタンパク質とグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とを融合させたＡｒｓＲ−ＧＦＰを作製し、この融合タンパク質が特異的認識配列（Ｐａｒｓ−ＤＮＡ）と結合すること、さらに、亜ヒ酸によりそれらの結合が阻害されることを確認した。次に、Ｐａｒｓ−ＤＮＡを固相化したプレートを作製し、Ｐａｒｓ−ＤＮＡ固相化プレートへのＡｒｓＲ−ＧＦＰの結合量が、亜ヒ酸の濃度依存的に低下することを見出し、本発明を完成するに至った。【選択図】図２
2010035555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、被検試料中の分析物を水系で検出又は定量する方法。
（Ａ）前記の分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む、支持体に固相化された核酸とを、被検試料の存在下で反応させる工程
（Ｂ）固相化された核酸に結合したセンサータンパク質を検出又は測定する工程
【請求項２】
センサータンパク質が、検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
センサータンパク質が、検出可能なマーカータンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、被検試料中の分析物を水系で検出又は定量する方法。
（Ａ）支持体に固相化された前記の分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸とを、被検試料の存在下で反応させる工程
（Ｂ）固相化されたセンサータンパク質に結合した核酸を検出又は測定する工程
【請求項５】
核酸が、検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
センサータンパク質と核酸との結合が、分析物により阻害されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
センサータンパク質が、金属応答オペロンによりコードされるタンパク質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
金属応答オペロンによりコードされるタンパク質が、ＡｒｓＲタンパク質又はＣａｄＣタンパク質であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
分析物が、重金属化合物であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
重金属化合物が、ヒ素（Ａｓ）化合物、カドミウム（Ｃｄ）化合物及び鉛（Ｐｂ）化合物から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
あらかじめ５価のヒ素（Ａｓ（Ｖ））化合物を還元処理して３価のヒ素（Ａｓ（III））化合物に変換することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
センサータンパク質と該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸との反応を、５０ｍＭ以上のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で行うことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
センサータンパク質と該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸との反応を、４０ｍＭ以上の塩化ナトリウム溶液中で行うことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む、支持体に固相化された核酸とを備えたことを特徴とする、被検試料中の分析物の検出又は定量用キット。
【請求項１５】
支持体に固相化された分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸とを備えたことを特徴とする、被検試料中の分析物の検出又は定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される核酸とを利用して、被検試料中の分析物を検出及び／又は定量する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、鉛やカドミウム、ヒ素などの有害金属化合物による土壌や地下水、表層水などの汚染が報告されており、世界各地で大きな問題となっている。環境中有害金属汚染の分析に用いられる手法としては、フレーム原子吸光分光法（ＡＡＳ）、フレームレス原子吸光分光法（ＦＬＡＡ）、誘導結合プラズマ発光分光分析法(ＩＣＰ−ＡＥＳ)、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）などが知られている。しかし、これらの機器分析法は、分析を行うために試料の前処理が必要であり、現場での迅速な分析に対応できない上に、ランニングコストが高いといった短所がある。
【０００３】
このような機器分析法の短所を補う、有害金属の簡易検出法の開発が急がれている。検出対象物質を識別する生物由来の酵素、抗体、受容体などの被験分子をセンサー素子として用いるバイオセンサーもそのような簡易検出法の１つとして注目される。バイオセンサーにおいては検出反応が生化学的な反応や結合の特異性に基づくため、高感度測定が可能、測定・検出が迅速かつ簡便、ランニングコストが低い、センサー自体が小型で可搬性に優れるといった長所が挙げられる。また酵素反応、抗原抗体反応、リガンドのレセプターへの結合といった生化学的反応を利用することにより、特定物質との特異性が高い分析ができるという特徴を有するため、試料が少量で済み、センシングシステムの微小化も可能となる。
【０００４】
様々なバイオセンサーが研究されている中で、微生物細胞を利用したバイオセンサーは培養が容易で遺伝子操作が容易であるため、検出対象物質やレポーター遺伝子の幅広い選択が可能となり、用途の広がりが期待されている。組換え微生物バイオセンサーは宿主細胞、特定の物質に応答して下流遺伝子への転写を促進する誘導性プロモーター、そしてプロモーターの下流のレポーター遺伝子の三要素からなり、場合によってレポーターの発するシグナルを検出する装置を組み合わせたシステムを利用するものである。このシステムの場合、レポーターとしてよく利用されているのが細菌やホタル由来のルシフェラーゼ（非特許文献１〜３参照）、オワンクラゲ由来のＧＦＰ(非特許文献２及び４参照)、大腸菌由来のＬａｃＺ(非特許文献２及び５参照)などである。
【０００５】
本発明者らは、カロテノイド合成系酵素ＣｒｔＡをレポーターとし、海洋性光合成細菌ロドブラム・サルフィドフィラム（Rhodovulum sulfidophilum）を宿主としたヒ素応答バイオセンサーを既に開発している(非特許文献６)。ロドブラム・サルフィドフィラムはカロテノイド合成系の一種、スフェロイデン経路を有しており、本来はその最終産物であるスフェロイデノンを蓄積し、赤色を呈する細菌である。そしてこのセンサーはスフェロイデン経路の最終段階を触媒するスフェロイデンモノオキシゲナーゼ（ＣｒｔＡ）をコードするｃｒｔＡを破壊して得られたｃｒｔＡ欠損株を用いているため、スフェロイデノンの前駆体のスフェロイデンを蓄積して黄色を呈している。そのためｃｒｔＡをレポーター遺伝子とし、その上流にヒ素誘導性のプロモーターを組み込んだプラスミドをロドブラム・サルフィドフィラムの菌体内に導入することで、ヒ素存在下においてＣｒｔＡ活性が復活し、黄色から赤色への色調変化が起こる。このような色調の変化を指標としてヒ素の存在を判定することができる。
【０００６】
さらに本発明者らは、嫌気条件下で培養できる淡水性紅色細菌であるロドシュードモナス・パルストリスと、ロドシュードモナス・パルストリスが有するスピリロキサンチン経路におけるフィトエンからリコペンへのフィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）による不飽和化反応に注目し、大腸菌由来のヒ素誘導性オペレーター／プロモーター領域の下流にレポーター遺伝子ｃｒｔＩを組み込んだプラスミドを、ロドシュードモナス・パルストリスの菌体内に導入し、ヒ素存在下においてＣｒｔＩ活性を復活させることで、振盪培養器を必要としないヒ素応答バイオセンサーを開発している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特願２００７−３４０８０４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wilson T, Hastings JW (1998) Bioluminescence Annu Rev Cell Dev Biol 14: 197-230
【非特許文献２】Stocker J, Balluch D, Gsell M, Harms H, Feliciano J, DaunertS,Malik KA, van der Meer JR (2003) Environ Sci Technol37: 4743-4750
【非特許文献３】Trang PT, Berg M,Viet PH, van MuiN, van derMeer JR (2005) Environ SciTechnol 39: 7625-7630
【非特許文献４】Tsien RY (1998) Ann Rev Biochem 67: 509-544
【非特許文献５】Silhavy TJ, Beckwith JR (1985) Microbiol Rev 49: 398-418
【非特許文献６】Fujimoto et al., (2006) Appl Microbiol Biotechnol 73(2): 332-338
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のような微生物を用いたバイオセンサーは、培養のための器具や時間が必要になる上に、細胞によるばらつきが大きい等の問題があり、これらの問題を解決するためには無細胞系バイオセンサーの開発が必要である。本発明の課題は、分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、前記センサータンパク質によって特異的に認識される核酸とを利用して、被検試料中の分析物を検出及び／又は定量することのできる、コスト、操作性、迅速性の面で優れた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者らは、まず蛍光共鳴エネルギー移動を利用した方法、すなわち、ＤＮＡとタンパク質の相互作用を介した複合体分子の高次構造の変化を検出する蛍光共鳴エネルギー移動 (Fluorescence Resonance Energy Transfer; ＦＲＥＴ) を利用した系の開発を試みた。ＦＲＥＴとは、ドナーとなるエネルギー供与体からアクセプターとなるエネルギー受容体へ励起エネルギーが移動する現象である。ここで重要なのがドナーとなる蛍光分子の発光エネルギーレベルとアクセプターとなる蛍光分子の吸収エネルギーレベルが重なるような２つの異なる蛍光分子を選択しておくことである(図２４)。励起状態にあるドナーの近くにアクセプターが存在すると、ドナーからの発光が起こらないうちにその励起エネルギーがアクセプターを励起させ、その発光を検出することができる。距離が近いほどＦＲＥＴは起きやすいため、分子間の相互作用や分子の構造変化を検出する手段として用いられている。
【００１１】
そこで、鉛及びカドミウムセンサータンパク質ＺｎｔＲを利用したバイオセンサーについて検討することにした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には重金属を細胞外に排出する働きをする酵素をコードする遺伝子ｚｎｔＡが存在している。このｚｎｔＡの転写開始地点から上流の−１０塩基と−３５塩基の領域にはプロモーター領域ＤＮＡ（以降、プロモーターＤＮＡ）の塩基配列が存在し、鉛及びカドミウムセンサータンパク質ＺｎｔＲはこのプロモーターＤＮＡに結合して、ＺｎｔＲタンパク質−プロモーターＤＮＡの複合体を形成する。鉛やカドミウム化合物といった重金属の非存在下では、プロモーターＤＮＡは高次構造として折れ曲がった状態にある。一方、重金属存在下では重金属がＺｎｔＲタンパク質に結合して高次構造が変化し、それに伴いプロモーターＤＮＡは直鎖状になる。この重金属の有無によるＺｎｔＲタンパク質−プロモーターＤＮＡ複合体の高次構造の変化を利用して重金属バイオセンサーの開発が可能ではないかと考えられた。
【００１２】
この重金属有無による高次構造変化を、ＦＲＥＴを用いて外部提示するために考案された原理を図２５に示す。まず、プロモーターＤＮＡの両末端に異なる２つの蛍光物質であるフルオレセインイソチオシアネート(Fluorescein isothiocyanate;ＦＩＴＣ)とテトラメチルローダミン（Tetramethylrodamine;ＴＡＭＲＡ)を結合させる。このとき、ＦＲＥＴによりＴＡＭＲＡがＦＩＴＣの発する蛍光を吸収して励起し、蛍光を発する。重金属非存在下では、プロモーターＤＮＡの高次構造は折れ曲がった状態にあり、ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡが接近しているので、ＦＩＴＣの励起光を照射すると、発せられたＦＩＴＣの蛍光でＴＡＭＲＡが励起し、主としてＴＡＭＲＡの蛍光が検出されると考えられる。しかし、重金属存在下では、プロモーターＤＮＡの高次構造が直鎖状に変化するため、ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡ間の距離が長くなりＴＡＭＲＡはＦＩＴＣの蛍光を吸収しにくくなる。そのためＴＡＭＲＡは励起しにくくなり、主としてＦＩＴＣの蛍光が検出されると考えられた。この重金属の有無による蛍光波長の変化を蛍光光度計で測定することで鉛やカドミウム化合物を検出あるいは定量することができると考えた。
【００１３】
同様に、ヒ素センサータンパク質ＡｒｓＲを利用したバイオセンサーについて検討することにした。大腸菌には細胞にヒ素耐性を与えるヒ素耐性オペロンが存在する。ヒ素耐性オペロンの発現は遺伝子ａｒｓＲがコードするヒ素センサータンパク質ＡｒｓＲによって制御される。ＡｒｓＲタンパク質はヒ素化合物の非存在下ではプロモーターＤＮＡと結合し、ＡｒｓＲタンパク質−プロモーターＤＮＡ複合体を形成する。そのためＲＮＡポリメラーゼはプロモーターＤＮＡに結合することができず、ヒ素耐性オペロンの転写が抑制される。しかし、ヒ素化合物の存在下ではＡｒｓＲタンパク質とヒ素化合物が結合しその高次構造が変化してＡｒｓＲタンパク質はプロモーターＤＮＡから解離するため、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターＤＮＡに結合してヒ素耐性オペロンの転写が開始される。こうしたヒ素化合物の有無によるＡｒｓＲタンパク質とプロモーターＤＮＡの結合と解離の変化を外部提示することでヒ素化合物を検出するバイオセンサーの開発が可能であると考えられた。
【００１４】
また、ＺｎｔＲタンパク質を用いる場合と同様にタンパク質とＤＮＡの結合・解離の変化をＦＲＥＴにより外部提示する系が考えられた（図２６）。まず、プロモーターＤＮＡの一方の末端にＴＡＭＲＡを結合させる。また、ＡｒｓＲタンパク質を蛍光修飾するためにＡｒｓＲタンパク質に緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；ＧＦＰ）を融合させたＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質を用いた。このとき、ＦＲＥＴによりＴＡＭＲＡはＧＦＰの発する蛍光を吸収して励起し蛍光を発すると考えられた。ヒ素化合物の非存在下では、プロモーターＤＮＡとＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質は結合した状態であり、ＴＡＭＲＡとＧＦＰが近接しているので、ＧＦＰの励起光を照射すると発せられたＧＦＰの蛍光でＴＡＭＲＡが励起し、主としてＴＡＭＲＡの蛍光が検出される。しかし、ヒ素化合物の存在下では、プロモーターＤＮＡ鎖とＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質は解離した状態となるため、ＴＡＭＲＡとＧＦＰ間の平均距離が長くなりＴＡＭＲＡはＧＦＰの蛍光を吸収しにくくなる。そのためＴＡＭＲＡは励起しにくくなり、主としてＧＦＰの蛍光が検出される。このヒ素化合物の有無による蛍光波長の変化を蛍光光度計で測定することでヒ素化合物を検出あるいは定量することができると考えられた。
【００１５】
しかし、後述する比較例から明らかなように、ＦＲＥＴ法では本発明の課題を解決することはできなかった。そこで、本発明者らは、異なるアプローチの開発に迫られ、ヒ素と結合するセンサータンパク質であるＡｒｓＲタンパク質と、カドミウム及び鉛と結合するセンサータンパク質であるＣａｄＣタンパク質とに注目し、それぞれのタンパク質をグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合させたＡｒｓＲ−ＧＦＰ、ＣａｄＣ−ＧＦＰを作製した。これらの融合タンパク質が各々の特異的認識配列ＤＮＡと結合すること、さらに、金属イオンによりそれらの結合が阻害されることを確認した。次に、ＡｒｓＲタンパク質の認識配列ＤＮＡ（Ｐａｒｓ−ＤＮＡ）を固相化したプレートを作製し、ＡｒｓＲ−ＧＦＰのＰａｒｓ−ＤＮＡ固相化プレートへのＡｒｓＲ−ＧＦＰの結合量が、亜ヒ酸の濃度依存的に低下することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、
（１）以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、被検試料中の分析物を水系で検出又は定量する方法
（Ａ）前記の分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む、支持体に固相化された核酸とを、被検試料の存在下で反応させる工程；
（Ｂ）固相化された核酸に結合したセンサータンパク質を検出又は測定する工程；や、
（２）センサータンパク質が、検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする上記（１）記載の方法や、
（３）センサータンパク質が、検出可能なマーカータンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする上記（１）記載の方法や、
（４）以下の（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、被検試料中の分析物を水系で検出又は定量する方法
（Ａ）支持体に固相化された前記の分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸とを、被検試料の存在下で反応させる工程；
（Ｂ）固相化されたセンサータンパク質に結合した核酸を検出又は測定する工程；や、
（５）核酸が、検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする上記（４）記載の方法に関する。
【００１７】
また本発明は、
（６）センサータンパク質と核酸との結合が、分析物により阻害されることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の方法や、
（７）センサータンパク質が、金属応答オペロンによりコードされるタンパク質であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の方法や、
（８）金属応答オペロンによりコードされるタンパク質が、ＡｒｓＲタンパク質又はＣａｄＣタンパク質であることを特徴とする上記（７）記載の方法や、
（９）分析物が、重金属化合物であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の方法や、
（１０）重金属化合物が、ヒ素（Ａｓ）化合物、カドミウム（Ｃｄ）化合物及び鉛（Ｐｂ）化合物から選択されることを特徴とする上記（９）記載の方法や、
（１１）あらかじめ５価のヒ素（Ａｓ（Ｖ））化合物を還元処理して３価のヒ素（Ａｓ（III））化合物に変換することを特徴とする上記（１０）記載の方法や、
（１２）センサータンパク質と該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸との反応を、５０ｍＭ以上のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で行うことを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか記載の方法や、
（１３）センサータンパク質と該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸との反応を、４０ｍＭ以上の塩化ナトリウム溶液中で行うことを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか記載の方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、
（１４）分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む、支持体に固相化された核酸とを備えたことを特徴とする、被検試料中の分析物の検出又は定量用キットや、（１５）支持体に固相化された分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸とを備えたことを特徴とする、被検試料中の分析物の検出又は定量用キットに関する。また本発明の実施の態様には、センサータンパク質が、検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする上記キットや、センサータンパク質が、検出可能なマーカータンパク質との融合タンパク質であることを特徴とする上記キットや、核酸が、検出可能なマーカーで標識されていることを特徴とする上記キットが含まれる。
【００１９】
また本発明の実施の態様には、センサータンパク質と核酸との結合が、分析物により阻害されることを特徴とする上記のいずれか記載のキットや、センサータンパク質が、金属応答オペロンによりコードされるタンパク質であることを特徴とする上記のいずれか記載のキットや、金属応答オペロンによりコードされるタンパク質が、ＡｒｓＲタンパク質又はＣａｄＣタンパク質であることを特徴とする上記キットや、分析物が、ヒ素（Ａｓ）、カドミウム（Ｃｄ）、鉛（Ｐｂ）等の重金属の化合物であることを特徴とする上記のいずれか記載のキットが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】細菌の有害金属耐性オペロンの転写制御機構を示す図である。有害金属イオンが環境に存在しないときにはセンサータンパク質遺伝子とその下流遺伝子の発現がセンサータンパク質のプロモーターＤＮＡへの結合により抑えられる。
【図２】ＤＮＡを素子とした有害金属バイオセンサーの原理を示す図である。
【図３】ＤＮＡを素子としたヒ素化合物バイオセンサーの構成要素を示す図である。
【図４】組換えＡｒｓＲ−ＧＦＰ産生のために、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）に導入されたプラスミド（ｐＥＴａｒｓＲｇｆｐ）の作製手順を示す図である。
【図５】ネーティブ−ＰＡＧＥによるＰａｒｓ−ＤＮＡとＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質の複合体形成ならびに亜ヒ酸添加による複合体の解離を示す図である。
【図６】Ｐａｒｓ−ＤＮＡ固定化ウェルに添加後のタンパク質を、電気泳動より解析した結果を示す図である。レーン１、タンパク質粗抽出液をウェルに添加し反応後に抽出液を除去しウェル洗浄を行った後、結合したタンパク質を回収した画分；レーン２、タンパク質粗抽出液をウェルに添加し反応後に抽出液を除去しウェル洗浄を行った後、タンパク質を回収した画分；レーン３、タンパク質租抽出液；レーン４、分子量マーカー。
【図７】添加するタンパク質租抽出液量の変化に伴う、Ｐａｒｓ−ＤＮＡ固定化プレートへのＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質結合量の変化を示す図である。
【図８】Ｐａｒｓ−ＤＮＡを素子としたバイオセンサーによる亜ヒ酸の検出結果を示す図である。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．００５の有意差をそれぞれ示す。
【図９】洗浄条件（緩衝液）によるＰａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体量の変化を示す図である。各測定値は各回の洗浄終了後に測定した蛍光強度を表す。
【図１０】５価のヒ素Ａｓ（Ｖ）の３価のヒ素Ａｓ（III）への還元処理の流れを示す図である。
【図１１】ＡｒｓＲ−ＧＦＰの形態別ヒ素に対する応答性の違いを示す図である。グラフはｎ＝３の平均値±標準偏差を表す。
【図１２】チオ硫酸ナトリウム還元処理によるＡｓ（Ｖ）の検出結果を示す図である。ヒ素濃度は共に１００μｇ／Ｌとした。グラフはｎ＝３の平均値±標準偏差を表す。
【図１３】緩衝液とｐＨの違いがヒ素検出へ及ぼす影響を示す図である。調製時の緩衝液ｐＨが示されている。グラフはｎ＝３の平均値±標準偏差を示す。
【図１４】Ａｓ（III）検出におけるＡｒｓＲ−ＧＦＰの標準曲線を示す図である。プロットはｎ＝３の平均値±標準偏差を示す。Ｒ２＝０．９５。
【図１５】ヒ素センサーの交差応答性の検討結果を示す図である。グラフは金属非添加（-）の試料の蛍光強度を１として評価し、ｎ＝３の平均値±標準偏差を示す。
【図１６】組換えＣａｄＣ−ＧＦＰタンパク質産生のためにＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）に導入されたプラスミド（ｐＥＴｃａｄＣｇｆｐ）の作製手順を示す図である。
【図１７】ネーティブ−ＰＡＧＥによるＰｃａｄ−ＤＮＡとＣａｄＣ−ＧＦＰタンパク質の複合体形成ならびに２価鉛添加による複合体の解離を示す図である。
【図１８】マイクロプレートにおけるＰｃａｄとＣａｄＣ−ＧＦＰの複合体形成の確認を示す概略図である。Ｅ１、Ｅ２はＰｃａｄ３４を固定化したウェル、Ｅ３は固定化していないウェルを示す。
【図１９】Ｐｃａｄ３４固定化ウェルに残存するタンパク質の解析結果を示す図である。レーン１、３、４の試料は図１８を参照。レーン２はＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液、レーン５は分子量マーカー（Presteined Protein Marker、 Broad Range（６−１７５ｋＤａ）、New England Biolabs社）
【図２０】Ｐｃａｄ３４のウェルへの添加濃度に応じたＣａｄＣ−ＧＦＰ結合量の変化を示す図である。
【図２１】ＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液の添加量の検討結果を示す図である。上図はＰｃａｄ３４固定化ウェルへ添加後に測定した。下図はウェルを２回洗浄後に測定した。プロットはｎ＝３の平均値±標準偏差を示す。
【図２２】インキュベーション前のＮａＣｌ添加が鉛の検出試験に及ぼす影響を示す図である。グラフはｎ＝３の平均値±標準偏差を示す。
【図２３】Ｐｂ（II）及びＣｄ（II）検出におけるＣａｄＣ−ＧＦＰの標準曲線を示す図である。プロットはｎ＝３の平均値±標準偏差を示す。＊と＊＊は０μｇ／Ｌとの間にそれぞれ５％水準と１％水準の有意差があることを示す。
【図２４】ＦＲＥＴが起こるときのドナーとアクセプター蛍光分子のスペクトルの重なりを示す図である。
【図２５】バイオセンサーにおけるＦＲＥＴを介した鉛及びカドミウム化合物の検出原理を示す図である。
【図２６】バイオセンサーにおけるＦＲＥＴを介したヒ素化合物の検出原理を示す図である。
【図２７】Ｈｉｓタグ非修飾のＺｎｔＲタンパク質発現用大腸菌株の育種の概要を示す図である。
【図２８】組み換えＺｎｔＲタンパク質発現の確認結果を示す図である。
【図２９】ヘパリンカラムによるＺｎｔＲタンパク質精製におけるクロマトグラムの結果を示す図である。
【図３０】ヘパリンカラムによる精製画分におけるＺｎｔＲタンパク質の確認結果を示す図である。
【図３１】タンパク質の部分精製品に含まれるＺｎｔＲタンパク質の確認結果を示す図である。
【図３２】ＦＩＴＣ（左）あるいはＴＡＭＲＡ（右）で標識したプローブＤＮＡを用いたＥＭＳＡの結果を示す図である。
【図３３】ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡで２重標識したプローブＤＮＡを用いたＥＭＳＡの結果を示す図である。
【図３４】２重標識したプローブＤＮＡとＺｎｔＲタンパク質部分精製液を混合した反応液における、Ｐｂ添加の有無における各蛍光スペクトルを示す図である。
【図３５】組み換えＡｒｓＲタンパク質発現用大腸菌株の育種の概要を示す図である。
【図３６】組み換えＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質発現用大腸菌株の育種の概要を示す図である。
【図３７】組み換えＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現確認結果を示す図である。
【図３８】ヘパリンカラム精製におけるＡ２８０とＧＦＰの蛍光強度を指標としたクロマトグラム結果を示す図である。
【図３９】ヘパリンカラム精製フラクション中のＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の確認結果を示す図である。
【図４０】イオン交換カラム精製におけるＡ２８０とＧＦＰの蛍光強度を指標としたクロマトグラム結果を示す図である。
【図４１】イオン交換カラム精製フラクション中のＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の確認結果を示す図である。
【図４２】ＰａｒｓＲ-３５０プローブＤＮＡとＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質を使用したＡｓの検出試験の結果を示す図である。
【図４３】ＰａｒｓＲ-５０プローブＤＮＡとＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質を使用したＡｓの検出試験の結果を示す図である。
【図４４】Ｒ７７３-５０プローブＤＮＡとＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質を使用したＡｓの検出試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の被検試料中の分析物を検出又は定量する方法としては、［１］被検試料中の分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む、支持体に固相化された核酸とを、被検試料の存在下で反応させ、固相化された核酸に結合したセンサータンパク質を水系（水の存在下）で検出及び／又は測定する方法や、［２］支持体に固相化された、該分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸とを、被検試料の存在下で反応させ、固相化されたセンサータンパク質に結合した核酸を水系で検出及び／又は測定する方法であれば特に制限されるものではなく、上記［１］の方法においては、検出可能なマーカーで標識されたセンサータンパク質や、検出可能なマーカータンパク質と融合させたセンサータンパク質を用い、固相化された核酸に結合しなかったセンサータンパク質を系外に排出することにより、固相化された核酸に結合したセンサータンパク質を水系で検出及び／又は測定することができ、また、上記［２］の方法においては、検出可能なマーカーで標識された核酸を用い、固相化されたセンサータンパク質に結合しなかった核酸を系外に排出することにより、固相化されたセンサータンパク質に結合した核酸を水系で検出及び／又は測定することができる。また、被検試料としては、特に制限されないが、重金属を含む河川水、汚水、井戸水、工場排水、汚染土壌等を好適に挙げることができ、汚染土壌等の固形物の場合、その水縣濁液や水抽出液を用いることができる。
【００２２】
また、本発明の被検試料中の分析物の検出又は定量用キットとしては、［３］分析物に特異的に結合するセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む、支持体に固相化された核酸とを備えたことを特徴とする、被検試料中の分析物の検出又は定量用キットや、［４］分析物に特異的に結合し、支持体に固相化されたセンサータンパク質と、該センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸とを備えたことを特徴とする、被検試料中の分析物の検出又は定量用キットであれば特に制限されるものではなく、上記［３］のキットにおいては、検出可能なマーカーで標識されたセンサータンパク質や、検出可能なマーカータンパク質と融合させたセンサータンパク質を用いることにより固相化された核酸に結合したセンサータンパク質を検出／測定することができ、また、上記［４］のキットにおいては、検出可能なマーカーで標識された核酸を用いることにより固相化されたセンサータンパク質に結合した核酸を検出／測定することができる。
【００２３】
本発明の被検試料中の分析物を検出及び／又は定量する方法に用いるセンサータンパク質としては、所定の配列を含む核酸と特異的に結合しうるタンパク質であって、かつ、所定の分析物によって上記核酸との結合が阻害されるタンパク質であれば特に制限されるものではないが、金属応答オペロンによってコードされるセンサータンパク質を好例として挙げることができる。上記金属応答オペロンとしては、特に制限されるものではないが、具体的には、ＡｒｓＲタンパクをコードするａｒｓや、ＣｚｃＲをコードするｃｚｃや、ＣａｄＣをコードするｃａｄや、ＣｈｒＢをコードするｃｈｒや、ＭｅｒＲ１及びＭｒｅｒ２をコードするｍｅｒや、ｐｂｒＲをコードするｐｂｒ等を例として挙げることができ、なかでもａｒｓやｃａｄを好適に示すことができる。上記金属応答オペロンによりコードされるセンサータンパク質は、それぞれ特定の金属応答オペロン領域ＤＮＡ配列を認識するが、特定の金属イオンの存在下では、これらのセンサータンパク質は金属イオンと結合して高次構造が変化することにより、ＤＮＡに結合することができなくなる。例えば、上記ＡｒｓＲタンパク質はａｒｓ領域ＤＮＡと結合するが、その結合はヒ素により阻害される。また、上記ＣａｄＣタンパク質はｃａｄ領域ＤＮＡと結合するが、その結合はカドミウムや鉛により阻害される。
【００２４】
上記［１］の本発明の被検試料中の分析物を検出及び／又は定量する方法においては、センサータンパク質は検出可能なマーカーで標識されていることが好ましく、上記検出可能なマーカーとしては、従来知られているペプチド標識用のマーカーであれば特に制限されるものではなく、例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ等の放射性同位体や、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、サイバーグリーン、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質や、ビオチン、ジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造や、生物発光化合物や、化学発光化合物等を具体的に挙げることができる。また、上記センサータンパク質は、検出可能なマーカータンパク質と融合された融合タンパクであってもよく、上記マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などのマーカータンパク質や、ＭＢＰ、レクチン、アビジン等の結合能を有する結合性タンパク質や、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグタンパク質などを具体的に例示することができる。なかでも、ＡｒｓＲタンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質ＡｒｓＲ−ＧＦＰは、ＡｒｓＲタンパク質の認識配列であるＰａｒｓ−ＤＮＡとの結合能を有するとともに、その結合は亜ヒ酸により濃度依存的に阻害されることから、優れた亜ヒ酸バイオセンサータンパクとして、本発明の亜ヒ酸を検出及び／又は定量する方法に利用できる。
【００２５】
また、上記［２］の本発明の被検試料中の分析物を検出及び／又は定量する方法においては、センサータンパク質によって特異的に認識される配列を含む核酸は検出可能なマーカーで標識されていることが好ましく、上記検出可能なマーカーとしては、従来知られている核酸標識用のマーカーであれば特に制限されるものではなく、例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ等の放射性同位体や、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、サイバーグリーン、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質や、ビオチン、ジゴキシゲニンのような生物学的に関連する結合構造や、生物発光化合物や、化学発光化合物等を具体的に挙げることができる。
【００２６】
本発明の被検試料中の分析物（アナライト）を検出及び／又は定量する方法において、センサータンパク質又は核酸を固相化させる支持体としては、公知の支持体であれば特に制限されるものではなく、具体的には、プラスティック（ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等）、アガロース、セルロース、親水性ポリビニールアルコール、アクリレート系ポリマー、ポリアクリルアミドガラス、金属などを例示することができる。また、これらの支持体にセンサータンパク質又は核酸を固相化させる方法としては、公知の方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、物理的吸着法や、ジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法）、アルキル化法等の架橋試薬による担体結合法などの共有結合法を採用することができ、なかでも物理的吸着法が好ましい。また、支持体にセンサータンパク質又は核酸を固相化させる場合には、他の物質を介して間接的に固相化させてもよい。具体的には、下記の実施例に示すように、核酸をビオチン標識し、ビオチンと支持体（プラスティックプレート）とを物理的吸着により結合させることにより、核酸を支持体に固相化することができる。
【００２７】
以上のように、本発明においては、細菌のプロモーター領域ＤＮＡとセンサータンパク質を素子としたヒ素、鉛・カドミウム検出用バイオセンサーにより重金属検出が可能であることが原理的に示されている。このセンサーは、細菌の転写スイッチで起きる変化を直接的に捉える無細胞型センサーであり、転写スイッチを構成するセンサータンパク質とプロモーター領域ＤＮＡの間で起こる結合と解離という二状態間の変化を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光を利用して捉えることを特徴とする。以下、より具体的に説明する。
【００２８】
本発明の検出・定量方法においては、センサー部を交換・脱着可能なモジュールとするために、９６ウェルのマイクロプレートのウェル内にセンサー素子が固定化されている。固定化する素子は、プロモーター領域ＤＮＡとセンサータンパク質の二通りが考えられる。プロモーター領域ＤＮＡを固定化する場合、ストレプトアビジンが固定化された９６ウェルマイクロプレートに、３’末端にビオチンを標識したプロモーター領域ＤＮＡを反応させることによりＤＮＡの固定化を行うことができる。プロモーター領域ＤＮＡを固定化したマイクロプレートのウェル内において、センサータンパク質−ＧＦＰ溶液を反応させた後に洗浄操作を行い、ウェル内でプロモーター領域ＤＮＡと結合状態を保つセンサータンパク質−ＧＦＰの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーで測定するシステムである。
【００２９】
本発明方法においては、例えば、センサータンパク質であるＡｒｓＲ−ＧＦＰとＣａｄＣ−ＧＦＰをそれぞれ生産する大腸菌株を育種して、これらの組み換えタンパク質がプロモーター領域ＤＮＡそして重金属に結合することを確認し、さらに、ＡｒｓＲ−ＧＦＰを用いたバイオセンサー開発においては、Ａｓ（III）を含む試料とＡｒｓＲ−ＧＦＰを混合することで蛍光強度が減少することが明らかにされた。次に、プロモーター領域ＤＮＡとセンサータンパク質−ＧＦＰとの結合を安定化させる条件、あるいは複合体への結合と複合体の解離の状態変化を顕著化させる条件の検討を行った。さらに、ＣａｄＣ−ＧＦＰを用いたバイオセンサー開発において、Ｐｂ（II）やＣｄ（II）を含む試料とＣａｄＣ−ＧＦＰを混合することで蛍光強度が減少することを明らかにした。
【００３０】
その結果、まず、検出試験の手順においては、センサータンパク質−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液と試料、サケ精子ＤＮＡ、緩衝液とを混合し、室温もしくは氷上で３０分間のインキュベートを行うことが重要であることが示された。センサータンパク質−ＧＦＰをウェルに添加し先にＤＮＡ−センサータンパク質−ＧＦＰ複合体を形成させた後に試料を添加し、タンパク質の解離の度合いを測定する方法も考えられたが、こちらの手順は有効に機能しなかった。また、３０分間のインキュベート時に４０ｍＭ以上のＮａＣｌが存在することが、後の測定時に蛍光強度の変量を顕著化する上で重要であることが示された。
【００３１】
ヒ素の検出においては、チオ硫酸ナトリウムによる還元処理を施すことでＡｓ（III）と同等にＡｓ（Ｖ）を検出することが可能であった。この場合はまず、塩酸を加え酸性条件にした後にチオ硫酸ナトリウムを加え、最終的に水酸化ナトリウムで中和を行う。この過程を経て試料中にＮａＣｌを添加したときと同様に一定濃度のイオンが存在することになる。また、緩衝液の至適ｐＨの検討により、ｐＨ７．４付近でセンサー素子の機能が最も発揮されることが確認された。そして、ｐＨだけが重要なのではなく使用する緩衝液の種類によっても効果が変わることが判明し、ＡｒｓＲ−ＧＦＰではリン酸緩衝液が、ＣａｄＣ−ＧＦＰではトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液が適することが確認された。検出下限はヒ素では５μｇ／Ｌ、鉛では１０μｇ／Ｌ、カドミウムでは１μｇ／Ｌであり、世界保健機構が定める飲料水基準値以下での検出が可能であることが示された。今後の研究次第でさらなる高感度化が達成される可能性もある。検出に要する時間は、試料とタンパク質抽出液を混合して最初に行う１５分間のインキュベーションも含めて４０分間以内に完了することが見込まれる。ＡｒｓＲ−ＧＦＰとＣａｄＣ−ＧＦＰ共に、１００μＭの他の金属に対して交差応答性を示さず、目的金属に選択的に応答することが認められた。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
［バイオセンサーの原理］
蛍光標識センサータンパク質とＤＮＡの相互作用を利用した有害金属バイオセンサーの開発を試みた。図１に示すように、ＡｒｓＲタンパク質やＣａｄＣタンパク質などのセンサータンパク質は、大腸菌（E.coli）や黄色ブドウ球菌（S.aureus）における有害金属耐性オペロンの転写活性を制御する働きを担っている。これらのタンパク質は、有害金属イオンの非存在下ではプロモーターＤＮＡと結合し、センサータンパク質−プロモーターＤＮＡ複合体を形成する。以上のようなセンサータンパク質の性質を利用して、ヒ素、鉛及びカドミウム化合物検出のためのバイオセンサーを開発した。図２にバイオセンサーの原理を示す。
【００３４】
基材表面へのＤＮＡの固定化は、低分子ビタミンであるビオチンと塩基性糖タンパク質であるストレプトアビジンの二物質に着目した。これらの物質間で形成される結合は、１０１５Ｍ−１以上という極めて高い結合定数を有し、不可逆に近い結合とされる。この結合に着目した理由として、ビオチンでＤＮＡ鎖の修飾が可能である点と、ストレプトアビジンの９６穴マイクロプレート基材への固定化が可能である点、酵素結合免疫吸着法で汎用されている点、結合がＤＮＡの鎖に直接的に影響を与えない点で有利であると考えたからである。さらに９６穴マイクロプレートを利用することで多試料を一括して処理が可能になるため、ハイスループットスクリーニングの検出系の構築が期待できる。基材にはストレプトアビジンが修飾された９６穴マイクロプレート(Reacti-Bind Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates : PIERCE社)を採用した。蛍光強度の測定はコロナ蛍光マイクロプレートリーダーMTP-601Lab(日立ハイテクノロジーズ社)を使用した。測定条件は励起フィルターに４９０ｎｍ、蛍光測定フィルターに５３０ｎｍのものを使用し、検出感度は「ＡＵＴＯ」とした。
【００３５】
［バイオセンサーの構成要素］
ヒ素化合物のバイオセンサーの構成要素を図３に示す。大腸菌においてヒ素の細胞外排出ポンプをコードするａｒｓＢ及びａｒｓＣ遺伝子と、ＡｒｓＲセンサータンパク質をコードするａｒｓＲ遺伝子はａｒｓＲ−ａｒｓＢ−ａｒｓＣの順でオペロンを形成し、その転写活性はＡｒｓＲタンパク質により制御される。ヒ素化合物バイオセンサーには、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質と、ａｒｓＲ遺伝子上流のＡｒｓＲタンパク質結合サイト（オペレーター配列）を中心とした５０塩基対からなるプロモーター領域ＤＮＡ（Ｐａｒｓ−ＤＮＡ）を選択した。プロモーター領域ＤＮＡについては、表１に示すＰａｒｓＲ−５０−Ｓ−３−Ｂ（配列番号１にＰａｒｓＲ−５０−Ｓの配列を示す）とＰａｒｓＲ−５０−Ａ（配列番号２）を等量混合し、プロモーター配列下流の３’末端にビオチンが標識された二本鎖ＤＮＡ（Ｐａｒｓ−ビオチンと表記）を形成させた。次に、Ｐａｒｓ−ビオチンを濃度が２５ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し固定化に用いた。
【００３６】
【表１】
2010035555.tif 000003
【００３７】
一方、黄色ブドウ球菌において鉛やカドミウムの細胞外排出ポンプをコードするｃａｄＡ遺伝子と、ＣａｄＣセンサータンパク質をコードするｃａｄＣ遺伝子はｃａｄＣ−ｃａｄＡの順でオペロンを形成し、その転写はＣａｄＣタンパク質により制御される。鉛及びカドミウム化合物のバイオセンサーには、ＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質と、ＣａｄＣ遺伝子上流のＣａｄＣタンパク質結合サイト（オペレーター配列）を中心とした３４塩基対からなるプロモーター領域ＤＮＡ（Ｐｃａｄ−ＤＮＡ）を選択した。プロモーター領域ＤＮＡについては、表２に示すＰｃａｄＣ３４−Ｓ−３−Ｂ（配列番号３にＰｃａｄＣ３４−Ｓの配列を示す）とＰｃａｄＣ３４−Ａ（配列番号４）を等量混合し、プロモーター配列下流の３’末端にビオチンが標識された二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｐｃａｄ３４−ビオチンと表記）を形成させた。次に、Ｐｃａｄ３４−ビオチンを濃度が２０ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し固定化した。
【００３８】
【表２】
2010035555.tif 000004
【実施例２】
【００３９】
［実験材料と方法］
（１）菌株（大腸菌株）
遺伝子クローニングにはＪＭ１０９、ＤＨ５α（TaKaRa社製）を用いた。また、組換えタンパク質生産には、ｐＡｃＧＦＰ１プラスミドＤＮＡのＡｃｇｆｐ１遺伝子の上流に大腸菌Ｋ１２のａｒｓＲ遺伝子をＡｃｇｆｐ１遺伝子と同じ読み枠で挿入した、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen社）をそれぞれ用いた。また、形質転換株の培養はＬＢ培地を用い、必要に応じてアンピシリン（Ａｍｐ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）をそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍＬ、３４μｇ／ｍＬとなるように加えた。
【００４０】
（２）ＰＣＲによるａｒｓＲ、ｃａｄＣ及びＡｃｇｆｐ１塩基配列の増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、Pfx50 DNA Polymerase（Invitrogen社製）を用いた。大腸菌Ｋ１２のａｒｓＲ、黄色ブドウ球菌ＮＣＴＣ５０５８１の内在性プラスミドＤＮＡであるｐＩ２５８にコードされるｃａｄＣ、ｐＡｃＧＦＰ１プラスミドＤＮＡ（Clontech社製）にコードされるＡｃｇｆｐ１をそれぞれ増幅した。
【００４１】
（３）試薬
亜ヒ酸はsodium metaarsenite 98%（Ａｓ（III））（Sigma社製）を、２価鉛は酢酸鉛（II）三水和物特級（和光純薬社製）をそれぞれ用いた。
【００４２】
（４）プラスミドＤＮＡ
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片のクローニングの際にはｐＧＥＭ−ＴベクタープラスミドＤＮＡ（Promega社製）を、組み換えタンパク質生産のための発現ユニットの作製の際にはｐＥＴ−３ａプラスミドＤＮＡ（Novagen社製）をそれぞれ用いた。
【００４３】
（５）組換えタンパク質の生産条件と調製法
組換えタンパク質の発現用ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換株を、ＡｍｐとＣｍを添加した培地（Ａｍｐ＋Ｃｍ＋ＬＢ）５ｍＬで、３７℃、一晩培養し、得られた一晩培養液を０．５ｍＬのＡｍｐ＋Ｃｍ＋ＬＢに植菌した。これを３７℃で約１２時間、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加せずに培養した。培養後、集菌し５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で２回の洗菌を行った後に、４ｍＬの細胞破砕用緩衝液（１５％グリセロールを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ）に再懸濁し−８０℃で１回の凍結融解を行った。超音波破砕を行った後、１５０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、得られた上清を組み換えタンパク質粗抽出液とした。このタンパク質粗抽出液は−８０℃で凍結保存し、試験時に融解し使用した。マイクロプレートを利用した亜ヒ酸（Ａｓ（III））の検出時には上述のＴｒｉｓ−ＨＣｌの代わりに１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．０）を用いた。また、超音波破砕時には２ｍＬの細胞破砕用緩衝液（１５％グリセロールを含むＰＢＳ）に細胞を懸濁させた。
【００４４】
（６）ゲルシフト法（Electrophoresis Mobility Shift Assay；ＥＭＳＡ）
プロモーターＤＮＡと組み換えタンパク質と金属イオンを表３に示す組成で混合し、氷上で３時間（ＡｒｓＲ−ＧＦＰを用いた試験）あるいは１時間（ＣａｄＣ−ＧＦＰを用いた試験）のインキュベートを行った。反応液に表４のネーティブ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液５μＬを加えて計２５μＬとした。その後、ネーティブ−ＰＡＧＥにより反応液中のＤＮＡとタンパク質を展開したゲルに暗条件下ＬＥＤ光源ビジレイズ（ＡＥ−６９３５Ｂ、ATTO社製）により青色光を照射しＧＦＰ融合タンパク質を可視化した。
【００４５】
【表３】
2010035555.tif 000005
【００４６】
【表４】
2010035555.tif 000006
【００４７】
（７）マイクロプレートを利用した亜ヒ酸（Ａｓ（III））の検出試験
１１０μＬのＤＮＡ固定化用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液−生理食塩水（ＴＢＳ））に３０ｐｍｏｌのＰａｒｓ−ＤＮＡを溶解させた溶液をマイクロプレート（Reacti-Bind Streptavidin Coated High Binding Capacity (HBC) Black 96-Well Plates、Pierce社製）に添加し、２時間室温でインキュベートすることにより、ウェル表面にＰａｒｓ−ＤＮＡを固定化した。２００μＬのＤＮＡ固定化用緩衝液で２回洗浄を行った後、２００μＬのＴＢＳで１回洗浄を行った。タンパク質粗抽出液と亜ヒ酸溶液を表５に示す組成で混合し、氷上で２時間インキュベートを行った。その後、混合液をプレートに添加し室温で１時間インキュベートを行った。上清を除き、２００μＬの洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ６．０）で３回の洗浄を行い、最終的に１５０μＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９）を添加し、１０分後にFluorescent Microplate Reader MTP-601Lab（コロナ−日立ハイテクノロジーズ社製）にて蛍光強度を測定した。この際のバンドパスフィルターとして励起光側は４９２ｎｍ、検出器側は５３０ｎｍのものを用いた。
【００４８】
【表５】
2010035555.tif 000007
【実施例３】
【００４９】
［結果及び考察：亜ヒ酸バイオセンサー］
(１)ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の作製
まず、ｐＡｃＧＦＰ１プラスミドＤＮＡのＡｃｇｆｐ１遺伝子の上流に大腸菌Ｋ１２のａｒｓＲ遺伝子をＡｃｇｆｐ１遺伝子と同じ読み枠で挿入した、ｐＡｃＧＦＰａｒｓＲを鋳型にしてＰＣＲを行い、ａｒｓＲとＡｃｇｆｐ１を含むＤＮＡフラグメント、ａｒｓＲｇｆｐを増幅した。この際に用いたプライマーはａｒｓＲ遺伝子の５’末端とＡｃｇｆｐ１遺伝子の３’末端に相補的な２０塩基からなり、更にその５’側にはそれぞれＮｄｅＩサイトを付加した。ａｒｓＲｇｆｐをｐＧＥＭ−ＴベクタープラスミドＤＮＡに挿入しクローニングすることでｐＧＥＭａｒｓＲｇｆｐを得た（図４）。ｐＧＥＭａｒｓＲｇｆｐをＮｄｅＩ消化することでプラスミドＤＮＡより切り出されたａｒｓＲｇｆｐをアガロースゲル電気泳動で分離し回収した。ｐＥＴ−３ａをＮｄｅ１消化し、回収したａｒｓＲｇｆｐとつなぎ合わせることでｐＥＴａｒｓＲｇｆｐを得た。ｐＥＴａｒｓＲｇｆｐで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換することによりＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質生産株を育種した。
【００５０】
(２)ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の機能評価
このようにして得られた組換えタンパク質がＡｒｓＲタンパク質としての機能性を有するか否かをゲルシフト法により確認した。ゲルシフト法ではタンパク質と核酸が特異的な結合を介して複合体を形成すると核酸単体あるいはタンパク質単体の場合と比較し電気泳動時の各分子の移動距離に差が生じ、ゲル上のバンドの位置に差異が生じる。これによりタンパク質と核酸の特異的な結合の有無を判別することが可能となる。ＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質を含むタンパク質粗抽出液とＰａｒｓ−ＤＮＡを混合した結果、図５に示すように、Ｐａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体と推察されるバンドが確認された。また、Ｐａｒｓ−ＤＮＡを添加せずタンパク質粗抽出液の反応液を泳動した場合には、このバンドが確認されないことから、このバンドがＰａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体のものであることが裏付けられる。また、亜ヒ酸を反応液に添加した場合には、添加した亜ヒ酸の濃度が増加するにつれてＰａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体のバンドが薄くなることが確認された。以上の結果から、ＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質はＰａｒｓ−ＤＮＡと特異的に結合して複合体を形成すること、亜ヒ酸の存在によりＰａｒｓ−ＤＮＡとの結合が阻害されることが確認された。さらに、これらの結果は、ＧＦＰ蛍光修飾によりＡｒｓＲタンパク質の機能が損なわれないことを意味している。
【００５１】
(３)マイクロプレートを利用した亜ヒ酸検出系の開発
Ｐａｒｓ−ＤＮＡを固定化したウェルにＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質を含むタンパク質粗抽出液を添加し、ウェル表面上でＰａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体を形成させた。その後、タンパク質粗抽出液を除去し洗浄を行わずにウェル上のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル緩衝液で変性させ回収した。電気泳動による解析の結果、ＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質の推定分子量４１．８ｋＤａの位置に濃いバンドが検出されたが、これ以外にも複数のバンドが確認された（図６レーン２）。同様の解析を、ウェル表面上でＰａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体を形成させ洗浄を行った後に回収したサンプルで行った場合、ＡｒｓＲ−ＧＦＰの位置にほぼ完全に精製されたタンパク質が確認された（図６レーン１）。いずれのレーンのサンプルにおいても、タンパク質粗抽出液をそのまま展開した場合（図６レーン３）と比較し、飛躍的に目的タンパク質の精製が進んだことを示している。以上の結果から、ウェル表面にＰａｒｓ−ＤＮＡを固定化し、タンパク質粗抽出液を添加しインキュベートするだけで、Ｐａｒｓ−ＤＮＡとＡｒｓＲ−ＧＦＰが高い特異性を維持しつつウェル表面でも結合し得ることが示された。この結果は、さらに、タンパク質精製のための煩雑なカラム操作が不要であることを示しており、バイオセンサーの作製にかかるコストを低減化することが可能である。
【００５２】
（４）ＡｒｓＲ−ＧＦＰ含有タンパク質粗抽出液の添加量
次に、ウェル表面にＰａｒｓ−ＤＮＡを固定化した後に、添加するタンパク質粗抽出液量の変化により、ウェル洗浄後に残存する蛍光強度がどのように変化するかを調べた。図７の横軸はウェル中の１００ｍＬ液量当りのタンパク質粗抽出液の液量、縦軸はウェル上においてＰａｒｓ−ＤＮＡと複合体を形成しているＡｒｓＲ−ＧＦＰの蛍光強度を示す。蛍光強度は粗抽出液の液量が増加するとそれに伴い増加したが、４０ｍＬでプラトーに到達した。このことは、ウェル表面で固定化されたほぼ全てのＰａｒｓ−ＤＮＡに対してＡｒｓＲ−ＧＦＰとの複合体を形成させるためには１００ｍＬ液量当り４０ｍＬのタンパク質粗抽出液の液量で十分であることを示している。これ以上の量の抽出液を添加した場合には、遊離ＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質が反応系に過剰量存在することになり、亜ヒ酸を検出する際に過剰に存在する遊離ＡｒｓＲ−ＧＦＰがＰａｒｓ−ＤＮＡに結合することで検出感度の低下を招くことも予測される。従って、暫定的に４０ｍＬのタンパク質粗抽出液に相当するＡｒｓＲ−ＧＦＰの量を適用して亜ヒ酸の検出を行った。
【００５３】
亜ヒ酸の検出を行うにあたり、上述のタンパク質粗抽出液４０ｍＬに相当する量を５ｍＬにまで濃縮した粗抽出液を調製した。そしてタンパク質粗抽出液と亜ヒ酸を５：９５の割合で混合し、実施例２の［実験材料と方法］に記載の手順に従い３時間後に蛍光強度の測定を行った。その結果、亜ヒ酸添加により蛍光強度の有意な減少が観察され、減少幅は５０μｇ／Ｌよりも１００μｇ／Ｌの方が大きくなる傾向が認められた。マイクロプレートを利用したＤＮＡを素子とする亜ヒ酸検出用バイオセンサーが原理的に５０μｇ／Ｌの亜ヒ酸を検出可能であることが示された（図８）。
【００５４】
（５）洗浄条件の検討
前記のように、センサー素子となるＰａｒｓとＡｒｓＲ−ＧＦＰからなる複合体を９６穴マイクロプレート上で構築することが可能であると判断した。また、余剰のＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質溶液をＰａｒｓ固定化ウェルから除去し、表６に示す１０ｍＭ  ＰＢ−Ｔによる洗浄を行ったところ、洗浄回数を重ねる毎にウェル内ＧＦＰ由来の蛍光強度の減少が認められた。この減少はＡｒｓＲ−ＧＦＰが洗浄操作でＰａｒｓから解離したことによると考えられたため、基材上でセンサー素子複合体が維持され、かつ余剰のＡｒｓＲ−ＧＦＰや夾雑タンパク質の系内からの排除が可能な洗浄条件が必要であると考えた。そこでＡｒｓＲ−ＧＦＰを利用して、下記のｐＨが異なる二つの緩衝液（表６）で洗浄操作を行い、蛍光強度の減少度を調べた。
【００５５】
【表６】
2010035555.tif 000008
【００５６】
一回の洗浄操作において２００μＬの緩衝液をウェルへ添加し、９６穴マイクロプレートを手に持ち、５秒間、軽く振盪させ緩衝液を振り落とした。再度、２００μＬの緩衝液をウェルへ添加して蛍光測定を行った。この操作を４回繰り返し、最後は１００μＬのＴＢＳ−Ｔ（表６）を全ウェルへ添加し、ｐＨを７．４として蛍光強度の測定を行った（図９）。
【００５７】
ＧＦＰ等の蛍光タンパク質はｐＨに依存して蛍光強度が変化する性質が知られており、ＧＦＰの場合、中性付近においてｐＨが高くなるに連れて蛍光強度が高くなることが知られている。ＰＢ−Ｔでの洗浄１〜３回目の蛍光強度は、ｐＨ６．０の弱酸性下での測定であったためＴＢＳ−Ｔでの洗浄でｐＨ７．４の弱塩基性下での測定で得られた蛍光強度よりも低いことが考えられる。二つの緩衝液ともに洗浄回数を重ねる毎に蛍光強度の減少が見られたが、４回目の洗浄操作終了後にｐＨ７．４のＴＢＳ−Ｔを加えることによりｐＨを７．４にして蛍光強度を測定すると、ＰＢ−Ｔでの洗浄ではＴＢＳ−Ｔの１回目の洗浄終了時の蛍光強度とほぼ同じ値であった。洗浄操作による複合体の減少率はＴＢＳ−ＴよりもＰＢ−Ｔの方が小さかったため、ＰＢ−Ｔの方が洗浄用緩衝液に適すると判断した。以降の試験ではＰＢ−Ｔ（ｐＨ６．０）を洗浄用緩衝液に採用し、洗浄時における回数や時間などを適宜変えて使用することにした。
【００５８】
（６）ヒ素の還元処理法の検討
センサータンパク質であるＡｒｓＲは無機ヒ素である３価のヒ素Ａｓ（III）と５価のヒ素Ａｓ（Ｖ）に対して、それぞれ親和性が異なり、Ａｓ（III）に対して親和性が高いことが知られている。しかし、飲料水基準値で示されるヒ素は亜ヒ酸とヒ酸の区別をしておらず、ＡｒｓＲ−ＧＦＰを素子とするセンサーでＡｓ（III）とＡｓ（Ｖ）のヒ素を同等の感度で検出することが好ましい。そこでＡｓ（Ｖ）をＡｓ（III）へと還元することでＡｓ（Ｖ）をＡｓ（III）と同等に検出可能であるか否かを検討した。試験では、Ａｓ（Ｖ）としてヒ酸ナトリウムを、Ａｓ（III）として亜ヒ酸ナトリウム、還元剤としてチオ硫酸ナトリウムをそれぞれ用いた。
【００５９】
試料の還元処理は図１０に示す手順で行った。試料の４５０μＬに２Ｎ塩酸溶液の２０．０μＬを添加し、ｐＨを１付近にした。次に、用事調製した２５０ｍＭチオ硫酸ナトリウム水溶液の１．０μＬを添加後、室温で１０分間のインキュベーションを行った。１０分後に２．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液の１６．０μＬを添加し中和した。なお、ｐＨの確認はｐＨ試験紙により行った。
【００６０】
Ａｓを既定濃度に調製し還元処理を行わない試料もしくは還元処理を行った試料の９２μＬとＡｒｓＲ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液の７．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡの０．５μＬを混合し、氷上で３０分間のインキュベーションを行った。その後、混合液をＰａｒｓ固定化ウェルに添加し、室温で２時間の振盪を行った。２時間後にウェル内の混合液を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間の洗浄を１回行った。洗浄後、ウェルに１５０μＬの蛍光測定用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Tween-20）を添加し、蛍光測定を行った。
【００６１】
還元処理を行わない既定濃度のＡｓを含む試料では、Ａｓ（III）で濃度と相関して蛍光強度の減少幅が増加したが、Ａｓ（Ｖ）では１００μｇ／Ｌにおいてもほとんど蛍光強度の減少が見られなかった（図１１）。しかし、還元処理を行うことによりＡｓ（Ｖ）においてもＡｓ（III）と同等の蛍光強度の減少が認められた（図１２）。また、超純水を試料とした時の蛍光強度を還元処理ありとなしで比較すると有意な差が認められないことから、還元処理そのものは検出に影響を及ぼさないことが判る。
【００６２】
開発したヒ素センサーＡｒｓＲ−ＧＦＰでは１００μｇ／ＬのＡｓ（Ｖ）にさえも蛍光強度の変化を示さなかったことから、ＡｒｓＲ−ＧＦＰはＡｓ（Ｖ）に対して極めて応答性が低いことが確認された。しかし、チオ硫酸ナトリウムによる還元処理を施すことでＡｓ（III）と同等の蛍光強度の変化を示したことから、Ａｓ（Ｖ）からＡｓ（III）への還元を介してセンサーがＡｓ（Ｖ）もＡｓ（III）と同等に検出できることが示された。なお、データでは示していないが、還元処理においてｐＨを強酸性域にした上でチオ硫酸ナトリウム処理を行わない限り、Ａｓ（Ｖ）を検出できないことが明らかとなった。そのため、還元処理において塩酸などの酸を加えることは必要不可欠であると考えられる。
【００６３】
（７）還元処理後に試料に添加する緩衝液とそのｐＨの最適化
開発したヒ素センサー素子はタンパク質であるため、極端なｐＨ条件下では素子自身が変性を起こし、センサーとして機能しなくなる可能性がある。そのため、どのようなｐＨの試料に対しても、センサーとしての機能が発揮される至適ｐＨに近づける必要があると考えられる。そこで、ヒ素検出試験時のｐＨの影響を確認した。検出試験に際しては、亜ヒ酸を含まない試料と１００μｇ／ＬのＡｓ（III）を含む試料の各４４５μＬに２Ｎ塩酸の２０．０μＬ、５００ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８．０）の５．０μＬ、２５０ｍＭ  チオ硫酸ナトリウムの１．０μＬ、２．５Ｎ  水酸化ナトリウムの１６．０μＬを順次加えることで還元処理を行った。その後、表７に示す緩衝液の２５.０μＬを添加し試料のｐＨ条件の影響を検討することとした。緩衝液の緩衝能を高めるために濃度を１Ｍ（終濃度５０ｍＭ）とした。
【００６４】
【表７】
2010035555.tif 000009
【００６５】
各緩衝液を加えた後の試料とＡｒｓＲ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液、サケ精子ＤＮＡを混合し、氷上で３０分間のインキュベーションを行った。その後、混合液をＰａｒｓ固定化ウェルに添加し、室温で２時間の振盪を行った。ウェル中の余剰のＡｒｓＲ−ＧＦＰタンパク質溶液を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間、１回の洗浄を行った。洗浄後にウェルに１５０μＬの蛍光測定用緩衝液を添加し蛍光強度の測定を行った（図１３）。
【００６６】
リン酸緩衝液の３条件を比較するとｐＨが高くなるにつれて亜ヒ酸を添加しない条件でＰａｒｓ−ＡｒｓＲ−ＧＦＰ複合体の形成量が増加し、さらにＡｓ（III）１００μｇ／Ｌ含有試料との蛍光強度の減少幅も増加した。しかしながら、ｐＨが７．４の二条件を比較するとトリス緩衝液では、減少幅が減少したことからセンサーの信号が弱められることが明らかとなった。この結果は、ｐＨを一定にしてヒ素検出試験を実施しなければ、ヒ素濃度が同じでも、異なる結果となり得ることを示唆している。緩衝液などの利用により試料のｐＨを調整することは不可欠であると考える。図１３と図９の結果より、試料のｐＨを一定にする際には１Ｍ程度の緩衝能の高いリン酸緩衝液により、ｐＨを７．４付近に、リン酸緩衝液終濃度を５０ｍＭ以上に調整してヒ素検出試験を実施するのが適当であると判断される。
【００６７】
（８）ヒ素検出における標準曲線
これまでの試験で得られた洗浄そして蛍光強度の測定条件にて亜ヒ酸の検出試験を行った。「（７）還元処理後に試料に添加する緩衝液とそのｐＨの最適化」で行った方法による試料の還元処理後にｐＨ７．４の１Ｍリン酸緩衝液の２５μＬを加えた。こうして得られた処理後の試料の９５μＬと４．５μＬのＡｒｓＲ−ＧＦＰ溶液、０．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを混合し氷上で３０分間のインキュベーションを行った。その混合液を３０分後にＰａｒｓ固定化ウェルに添加し、室温で１０分間の振盪を行った。１０分後に余剰の混合液を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間の洗浄を１回行った。洗浄後、ウェルに５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ、ｐＨ７．９の１５０μＬを添加し蛍光測定を行った。Ａｓ（III）検出におけるＡｒｓＲ−ＧＦＰの標準曲線を図１４に示す。
【００６８】
試験ではＡｓ（III）の濃度と蛍光強度に負の相関が認められた。また、蛍光強度はＡｓ（III）濃度０μｇ／Ｌと比較した場合、Ａｓ（III）濃度５μｇ／Ｌにおいて有意な減少を示し、５０μｇ／Ｌにおいての５０％の減少を示した。今回の結果から、測定条件を検討することにより、開発したヒ素センサーは世界保健機構の定める飲料水の基準値である１０μｇ／ＬのＡｓ（III）を検出することが可能であることを示すことができた。
【００６９】
（９）ヒ素センサーの交差応答性
ヒ素センサーは３価ヒ素のμｇ／Ｌオーダーの検出が可能であることが確認された。しかしながら、センサーの重要な要素である選択応答性を持つことは示されていない。そこで、ヒ素センサーのヒ素以外の金属に対する応答性について調べることにした。試料としては、１．０μＭ、１０μＭ、１００μＭの塩化カルシウム、塩化カドミウム、硫酸銅（II）、硫酸鉄（II）、塩化鉄（III）、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、酢酸鉛（II）、硫酸亜鉛を試験した。Ａｓ（III）とＡｓ（Ｖ）の同時検出においては、チオ硫酸ナトリウムによる試料の還元処理が必要であるため、本試験においても「（７）還元処理後に試料に添加する緩衝液とそのｐＨの最適化」で行った方法で試料の還元処理後にｐＨ７．４の１Ｍリン酸緩衝液の２５μＬを加えた。その後、前項と同様にＡｒｓＲ−ＧＦＰ溶液とサケ精子ＤＮＡを混合し、氷上で３０分間のインキュベーションを行った。混合液をＰａｒｓ固定化ウェルに添加し、室温で２時間の振盪を行った後に、ウェル内の余剰の混合液を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間、１回の洗浄を行った。洗浄後、ウェルに１５０μＬの蛍光測定用緩衝液を添加し蛍光測定を行った（図１５）。
【００７０】
図１４のヒ素検出標準曲線から、ヒ素センサーは１μＭ（＝７５μｇ／Ｌ）のＡｓ（III）に対して０μｇ／Ｌの値から５０％以上の減少幅を示すことが予測される。一方、本試験結果ではその１００倍濃度の各金属に対しても交差応答を示さなかった。このことから、ヒ素センサーは高い選択性を持って、ヒ素に応答していることが確認された。この結果は、本来ＡｒｓＲタンパク質がヒ素に対して持つ特異性の他に、試料の還元処理の際に加えたエチレンジアミン四酢酸の金属キレート作用も効果的に作用していることが推察される。
【実施例４】
【００７１】
［結果及び考察：鉛及びカドミウムバイオセンサー］
(１)ＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質生産大腸菌株の育種
実施例３に記載の、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質作製と同様の方法で、ＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質を作製した。ｐＧＥＭａｒｓＲｇｆｐをＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化し、切り出されたフラグメントを除去することでｐＧＥＭｇｆｐを得た（図１６）。ｐＩ２５８プラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｃａｄＣを含むＤＮＡフラグメントを増幅した。この際にプライマーは、ｃａｄＣ遺伝子の５’末端に相補的な２０塩基にＳｐｈＩとＮｄｅＩサイトを、３’末端に相補的な２０塩基にＢａｍＨＩサイトを付加したものを用いた。ｃａｄＣをＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化しｐＧＥＭｇｆｐとつなぎ合わせることでｐＧＥＭｃａｄＣｇｆｐを得た。ｐＧＥＭｃａｄＣｇｆｐをＮｄｅＩで消化することでプラスミドＤＮＡより切り出されたｃａｄＣｇｆｐをアガロースゲル電気泳動で分離し回収した。ｐＥＴ−３ａをＮｄｅＩ消化し、回収したｃａｄＣｇｆｐとつなぎ合わせることでｐＥＴｃａｄＣｇｆｐを得た。ｐＥＴｃａｄＣｇｆｐで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換することによりＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質生産株を育種した。
【００７２】
（２）ＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質の機能評価
実施例３と同様に、ＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質がＣａｄＣタンパク質の機能を有するか否かをゲルシフト法により確認した。ＣａｄＣ−ＧＦＰタンパク質を含むタンパク質粗抽出液とＰｃａｄ−ＤＮＡを混合すると、Ｐｃａｄ−ＣａｄＣ−ＧＦＰ複合体と推察されるバンドが確認された（図１７上）。Ｐｃａｄ−ＤＮＡを添加せずタンパク質粗抽出液の反応液を泳動した場合にはこのバンドが確認されないことから、このバンドがＰｃａｄ−ＣａｄＣ−ＧＦＰ複合体のものであることが裏付けられる。また、２価陽イオンである鉛、カルシウム、又はマグネシウムイオンをそれぞれ反応系に添加すると、いずれの場合においても、Ｐｃａｄ−ＣａｄＣ−ＧＦＰ複合体のバンドが薄くなることが確認された（図１７下）。しかしながら、２価鉛を添加したときにはカルシウムあるいはマグネシウムを添加したときよりも、より顕著にバンドが薄くなったことからＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質は一定の選択性を持って２価鉛と結合しＰｃａｄ−ＤＮＡとの結合定数あるいは解離定数を変化させることが推察される。
【００７３】
(３)マイクロプレートを利用した鉛とカドミウム検出系の開発
ＣａｄＣ−ＧＦＰ融合タンパク質を含むタンパク質粗抽出液とＰｃａｄ−ＤＮＡを固定化したマイクロプレートを用いて、亜ヒ酸検出系と同様の原理で鉛化合物とカドミウム化合物を検出するバイオセンサーを構築した。
【００７４】
ＣａｄＣ結合配列を持つＰｃａｄ３４−ビオチンを図１８に示すＥ１とＥ２のウェルに固定化した。Ｅ３のウェルにはＤＮＡ鎖を固定化しなかった。Ｅ１からＥ３のウェルへ１００μＬのＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液を添加し、室温で２時間の振盪を行った。２時間後に余剰のタンパク質粗抽出液を除去した。Ｅ１のウェルに１００μＬのタンパク質可溶化緩衝液（表８）を添加し、室温で３０分間の振盪を行った後に緩衝液を回収し電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のレーン３にロードした。これとは別にＥ２とＥ３のウェルに、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）を加えては取り除く操作を繰り返し２回の洗浄を行った。その後に１００μＬのタンパク質可溶化緩衝液を添加し、室温で３０分間の振盪を行いウェル内に残存するタンパク質を可溶化し、電気泳動のレーン４とレーン１にそれぞれロードした。回収されたタンパク質可溶化緩衝液は、ロードする前に９８℃で５分間のインキュベーションにより処理された。電気泳動は２５０Ｖ、定電流２０ｍＡ、室温の条件により行われた。
【００７５】
【表８】
2010035555.tif 000010
【００７６】
電気泳動の結果、図１９のレーン２のＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液と比較し、Ｐｃａｄ３４を固定化したウェルにタンパク質粗抽出液を接触させることで残存したタンパク質においてＣａｄＣ−ＧＦＰが濃縮・精製されたことが判る（レーン３）。このことは、ＣａｄＣ−ＧＦＰの計算から求められる分子量の位置に、タンパク質が主要バンドとして認められたことから判断される。また、ウェルの洗浄を行うことで、さらに夾雑タンパク質のバンドが減少しＣａｄＣ−ＧＦＰが濃縮・精製されたことが判る（レーン４）。一方、ウェルにＰｃａｄ３４を固定化しない場合には、洗浄によりＣａｄＣ−ＧＦＰは洗い流されたことが判る（レーン１）。この結果より、Ｐｃａｄ３４を固定化した９６穴マイクロプレート上に、タンパク質粗抽出液からＣａｄＣ−ＧＦＰを特異的に結合させることが可能であることが確認できた。よって、鉛・カドミウムセンサー素子としてＰｃａｄ  ＤＮＡとＣａｄＣ−ＧＦＰセンサータンパク質との複合体を９６穴マイクロプレート上で形成させる系を検討することとした。
【００７７】
（４）鉛・カドミウムセンサーにおけるＰｃａｄ固定化量の検討
Ｐｃａｄの３’末端にビオチンが標識されたＰｃａｄ３４−ビオチンのウェルへの結合量を確認し、センサーを構築する上での参考にした。Ｐｃａｄ３４−ビオチンの濃度が０〜５０ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し、ウェルへの固定化に使用した。ＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液は、図１６に示すように育種されたE.coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴｃａｄＣｇｆｐ）の培養液の５０ｍＬ中の細胞を４ｍＬのＴＧ（５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に懸濁し氷上にて、ＵＤ−２０１（トミー精工社）を利用して超音波破砕（発振出力３、インターバル５０％、５分間を４回）を行うことにより調製した。９９μＬのタンパク質粗抽出液と１．０  μＬの１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを混合しＰｃａｄ３４固定化ウェルに添加し、室温で２時間の振盪を行った。２時間後に余剰のタンパク質粗抽出液を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間、２回の洗浄を行った。洗浄後、ウェルに５０ｍＭ  トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）の１５０μＬを添加し蛍光測定を行った。その結果、２０ｐｍｏｌ／１００μＬまではＰｃａｄ３４の固定化量の増加に応じて、ＣａｄＣ−ＧＦＰ結合量の増加が見られた（図２０）。Ｐａｒｓの固定化の結果と同様に、蛍光強度は固定化量２０ｐｍｏｌ／１００μＬで飽和に達した。今回の試験で使用したタンパク質粗抽出液中のＣａｄＣ−ＧＦＰ量は十分であったと考えられるため、Ｐｃａｄ３４のウェル上の固定化量が１０−２０  ｐｍｏｌ／１００μＬで飽和に達したと考えられる。結論として、鉛・カドミウムセンサーを構築する上でＰｃａｄ３４を固定化に使用する濃度は２０ｐｍｏｌ／１００μＬを上限とすることにした。
【００７８】
（５）鉛・カドミウムセンサーにおけるＣａｄＣ−ＧＦＰ添加量の検討
ウェル当たり２０ｐｍｏｌのＰｃａｄ３４使用量に対し、ＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液の最適添加量の検討を行った。Ｐｃａｄ３４−ビオチンを２０ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し、ウェルに添加することで固定化した。ＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液の９９μＬと１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡの１．０μＬの混合液を調製した。次に、この混合液をＴＧ（５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール）によって混合液の全量に対する容量比が０−１００μＬ／１００μＬとなるよう希釈した。そして、この希釈試料をＰｃａｄ３４固定化ウェルに添加し蛍光測定を行った（図２１上図）。その後に室温で１時間の振盪を行った後に、余剰の希釈試料を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間の洗浄を２回行った。洗浄後にウェルに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９の１５０μＬを添加し蛍光測定を行った（図２１下図）。
【００７９】
その結果、ウェルに添加した溶液の容量比が８０〜９０μＬ／１００μＬ程度でＣａｄＣ−ＧＦＰのＰｃａｄ３４への結合量が飽和に達した。使用したタンパク質粗抽出液に関しては、容量比が８０−９０μＬ／１００μＬ以上では２０ｐｍｏｌの固定化Ｐｃａｄ３４に対してＣａｄＣ−ＧＦＰが過剰になると考えられる。つまり検出試験において、タンパク質粗抽出液が今回の容量比８０〜９０μＬ／１００μＬの濃度よりも高くなると鉛やカドミウムに対する検出感度の低下が予想されるということである。今回の試験で使用したタンパク質粗抽出液中のＣａｄＣ−ＧＦＰ濃度を目安に鉛・カドミウムセンサーの構築を行うことにした。しかしながらＡｒｓＲ−ＧＦＰの場合と同様に、ＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液も夾雑タンパク質が含まれたＥ．ｃｏｌｉ細胞破砕液であるため、正確にＣａｄＣ−ＧＦＰ濃度を算出するのが困難である。そこでｐＨ７．４におけるタンパク質粗抽出液の蛍光強度を基に簡易的にＣａｄＣ−ＧＦＰの濃度を決めることにした。
【００８０】
ＣａｄＣ−ＧＦＰとＡｒｓＲ−ＧＦＰを比較する上での大きな違いは、各タンパク質溶液が持つ蛍光強度を仮にセンサータンパク質−ＧＦＰの濃度と考えた場合に、一定量のプロモーター領域ＤＮＡ鎖に対する結合を飽和させるのに必要な量が異なる点が挙げられる。ＣａｄＣ−ＧＦＰでは、蛍光強度と液量の積がより多くなるようにタンパク質粗抽出液を添加する必要がある。これは、各センサータンパク質−ＧＦＰとプロモーター領域ＤＮＡ鎖との結合定数が異なるということや、使用しているＰｃａｄ３４の塩基数が不十分であるなどの原因が考えられる。そこで、複合体を形成させる上でのＰｃａｄの塩基数の影響と、塩濃度による影響の検討を行うことにした。
【００８１】
（６）鉛・カドミウムセンサー構築におけるＰｃａｄ塩基数及び塩濃度の検討
Ｐｃａｄの塩基数の違いによる影響を調べるために、新たに二本鎖ＤＮＡを設計した。これはS. aureusが持つｐＩ２５８上のｃａｄＣの転写開始地点から上流のプロモーター共通配列の−１０塩基付近のＣａｄＣ結合配列を含むＰｃａｄ３４の塩基配列に、さらに−３５付近のＣａｄＣ結合配列を加えたものである。新たに作成した二本鎖ＤＮＡを調製するために、表９に示すＰｃａｄ５０−Ｓ−３−Ｂ（配列番号５にＰｃａｄ５０−Ｓの配列を示す）とＰｃａｄ５０−Ａ（配列番号６）を等量混合し、プロモーター配列の３’末端にビオチンが標識された二本鎖オリゴヌクレオチド、Ｐｃａｄ５０−ビオチンを形成させた。次に、Ｐｃａｄ３４−ビオチンとＰｃａｄ５０−ビオチンを２０ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し固定化に用いた。
【００８２】
【表９】
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【００８３】
ＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液は、３００ｍＬの培養液中の細胞を４ｍＬのＴＧ２（２００ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に懸濁し氷上にて、ＵＤ−２０１（トミー精工社）を利用して超音波破砕（発振出力３、インターバル５０％、５分間を４回）を行うことで調製した。７．５μＬのタンパク質粗抽出液と０．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、９２μＬの超純水を混合し１００μＬとした時の蛍光強度は６５．３±０．６であった。この混合液をＰｃａｄ３４及びＰｃａｄ５０固定化ウェルに添加し、室温で２時間の振盪を行った。２時間後にウェル中の混合液を除去し、２００μＬのＰＢ−Ｔ（表６）により５秒間、１回の洗浄を行った。洗浄後、ウェルに１５０μＬの蛍光測定用緩衝液を添加し蛍光測定を行った。その結果、蛍光強度はＰｃａｄ３４固定化ウェルでは２．１０、Ｐｃａｄ５０固定化ウェルでは２．０６の値を示した。もう一箇所のＣａｄＣ結合配列を増やしたＰｃａｄ５０を固定化してもＣａｄＣ−ＧＦＰの結合量に変化は認められなかった。
【００８４】
次に、複合体を形成させる上での塩濃度による影響についての検討を行った。複合体を形成させる反応時に塩化ナトリウムを添加し、塩濃度の調整を行った。マイクロプレートのウェルには、Ｐｃａｄ５０−ビオチンを２０ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し固定化した。鉛検出試験においては、Ｐｃａｄ−ＣａｄＣ−ＧＦＰ複合体形成における塩濃度による影響を調べるため、まず試料とタンパク質粗抽出液の混合液を表１０に示す組成で調製した。この場合に塩化ナトリウム添加条件では、酢酸鉛（II）溶液：４Ｍ塩化ナトリウムが９９：１（ｖ／ｖ）となる。その後、これまでの検出試験と同様に一連の操作を行い、蛍光強度の測定を行った。
【００８５】
【表１０】
2010035555.tif 000012
【００８６】
塩化ナトリウム非添加、及び塩化ナトリウム添加のいずれの条件においてもＰｂ（II）濃度の増加に伴い蛍光強度の減少が認められた（図２２）。しかしながら、塩化ナトリウム添加条件ではＰｂ（II）濃度０μｇ／Ｌにおける蛍光強度が大幅に増加した。さらに、鉛を添加した場合との蛍光強度の差も顕著に増加し、Ｐｂ（II）濃度１００μｇ／Ｌにおいては、０μｇ／Ｌと比較し蛍光強度が約３０％にまで減少した。この結果から、ＣａｄＣ−ＧＦＰとＰｃａｄの結合には塩濃度が大きく影響していることが明らかとなったため、鉛とカドミウム検出試験では塩濃度を４０ｍＭに調整して行うことが効果的であると判断される。
【００８７】
（７）鉛及びカドミウム検出における標準曲線
これまでの試験で得られたインキュベーション条件にて鉛及びカドミウムの検出試験を行った。マイクロプレートのウェルには、Ｐｃａｄ５０−ビオチンを２０ｐｍｏｌ／１００μＬとなるよう調製し固定化した。試料として０から１００μｇ／Ｌの既知濃度のＰｂ（II）あるいはＣｄ（II）溶液の３７６μＬと４ＭのＮａＣｌの４．０μＬを混合した。さらに、試料のｐＨを一定にするために１Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の２０．０μＬを緩衝液として加え、試料の全量を４００μＬとした。この前処理後の試料の９２μＬとＣａｄＣ−ＧＦＰを含むタンパク質粗抽出液の７．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡの０．５μＬを混合し、これまでの検出試験と同様に一連の操作を行い、蛍光強度の測定を行った。
【００８８】
その結果、Ｐｂ（II）、Ｃｄ（II）の濃度増加に相関した蛍光強度の減少が認められた（図２３）。０μｇ／Ｌと比較し、Ｐｂ（II）では１０μｇ／Ｌ、Ｃｄ（II）では５μｇ／Ｌの濃度で蛍光強度に有意差が認められた。Ｃｄ（II）の検出下限について、さらに詳細な試験を行った結果、１μｇ／Ｌであることが判明した。一方、いずれの重金属においても７５μｇ／Ｌ以上で蛍光強度の減少が見られなくなることが明らかとなった。
【００８９】
世界保健機構が勧告する飲料水の基準値は、Ｐｂ（II）が１０μｇ／Ｌ、Ｃｄ（II）が３μｇ／Ｌである。したがって、開発した鉛・カドミウムセンサーは、基準値にある鉛、そして基準値以下のカドミウムをそれぞれ検出可能であることが示された。また、データには示さないが、センサーは１、１０、１００μＭのＣａ（II）、Ｍｇ（II）、Ｆｅ（II）、Ｍｎ（II）、Ｆｅ（III）、Ａｓ（III）に対する交差応答性をほとんど示さないことが明らかとなった。
【００９０】
［比較例；ＦＲＥＴ法］
ＤＮＡとタンパク質の相互作用を介した複合体分子の高次構造の変化を検出するために、蛍光共鳴エネルギー移動 (Fluorescence Resonance Energy Transfer; ＦＲＥＴ)を利用した系の開発を試みた。ＦＲＥＴとは、ドナーとなるエネルギー供与体からアクセプターとなるエネルギー受容体へ励起エネルギーが移動する現象である。励起状態にあるドナーの近くにアクセプターが存在すると、ドナーからの発光が起こらないうちにその励起エネルギーがアクセプターを励起させ、その発光を検出することができる。距離が近いほどＦＲＥＴは起きやすいため、分子間の相互作用や分子の構造変化を検出する手段として用いられている。
【００９１】
（１）組み換えタンパク質の発現とその抽出ならびに発現の確認
ＺｎｔＲタンパク質の発現用大腸菌形質転換株をＡｍｐとＣｍを添加した培地５ｍＬで３７℃、一晩培養し、その後ＡｍｐとＣｍを添加した培地２５０ｍＬに植菌し３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００が０．６−０．８に達したときにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside；ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭになるように無菌的に加え３７℃で３時間、培養した。この培養液を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離して集菌し上清を捨てた後、凍結融解（−８０℃で３０分間凍結させ室温で３０分間融解する）を３回行い、適量のトリスバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ジチオスレイトール）に再懸濁して室温で１０分間インキュベートした。４℃、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心してＺｎｔＲタンパク質粗抽出液を得た後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって展開してＺｎｔＲタンパク質の発現確認を行った。
【００９２】
ＡｒｓＲタンパク質の発現用大腸菌形質転換株をＡｍｐとＣｍを添加した培地５ｍＬで３７℃、一晩培養し、その後Ａｍｐを添加したＬＢ培地２５０ｍＬに植菌した。これを３７℃でＯＤ６００が０．８になるまで振とう培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように無菌的に加え、３７℃で３時間、培養した。この培養液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心して集菌し上清を捨てた後、３０ｍＬのトリスバッファーＡに再懸濁し、超音波破砕を行うことでＡｒｓＲタンパク質粗抽出液を得た。このＡｒｓＲタンパク質粗抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開することでＡｒｓＲタンパク質の発現の確認を行った。タンパク質とＤＮＡを分離するために、ＤＮａｓｅＩ処理を行った。ＤＮａｓｅＩ処理はＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ(TaKaRa社) を用い、方法は製品のプロトコールに従って行った。
【００９３】
ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現はＡｒｓＲタンパク質の発現と同様にして行った。ただし、培地にはＡｍｐのみを添加した。
【００９４】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥのゲル、電気泳動バッファー、サンプルバッファーの組成を表１１、表１２、表１３にそれぞれ示す。タンパク質溶液とサンプルバッファーを２０μＬずつ混合して４０μＬとし、沸騰水中で５分間ボイルしたものをゲルに添加し電気泳動を行った。分子量マーカーはPrestained Protein Marker, Broad Range (Bio Labs社) を使用した。泳動後のゲルは、４０％（ｖ／ｖ）メタノール−１０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液に０．２％（ｗ／ｖ）のクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を溶かした染色液に浸漬させて、３０分間ゆるやかに振とうさせて染色した。脱色は２０％（ｖ／ｖ）メタノール−５％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液（脱色液）に浸してゆるやかに振とうさせた。ゲルが脱色されタンパク質のバンドが鮮明になるまで新しい脱色液に取り替えての脱色を繰り返した。
【００９５】
【表１１】
2010035555.tif 000013
【００９６】
【表１２】
2010035555.tif 000014
【００９７】
【表１３】
2010035555.tif 000015
【００９８】
（２）ＺｎｔＲとＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の精製
全ての精製のステップは低温室（６〜８℃）にて行った。ＺｎｔＲあるいはＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の粗抽出液に対し硫酸アンモニウム沈殿を行い、その後、脱塩のためのゲルろ過を行った。硫酸アンモニウムは乳棒と乳鉢で細かくすりつぶした。その後、スターラーで撹拌しながら、０％→１０％→２０％→３０％→４０％→４５％となるよう粗抽出液に添加しそれぞれのステップにおいて完全に溶解させた。４５％濃度に到達した後、一晩、スターラーで撹拌した。その後、４℃、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心し上清を捨て、粗抽出液の１／１０量のトリスバッファーＡを沈殿に加え完全に溶解させた。ゲルろ過はＰＤ−１０ Desalting column（GE Healthcare社）を用い、方法は付属のプロトコールに従い行った。この時、カラム平衡化に使用したバッファーと溶出バッファーにはトリスバッファーＡを用いた。
【００９９】
その後、ＺｎｔＲタンパク質の精製においてはアフィニティークロマトグラフィーを、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の精製においてはアフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを行った。アフィニティークロマトグラフィーではＨｉ  Ｐｒｅｐ  １６／１０  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＦＦ（GE Healthcare社）、イオン交換クロマトグラフィーではＨｉ  Ｔｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（GE Healthcare社）を用いた。方法はそれぞれのプロトコールに従い行った。それぞれの精製条件については表１４、表１５に示す。
【０１００】
【表１４】
2010035555.tif 000016
【０１０１】
【表１５】
2010035555.tif 000017
【０１０２】
精製後のＺｎｔＲタンパク質の定量は、Bradford法（クーマシーブリリアントブルー染色後に５９５ｎｍの吸光度（Ａ５９５）を測定）により行った。吸光度測定にはSmart SpecTMPlusSpectrophotometer（Bio Rad社製）を用いた。精製後のＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の定量は、Ａ２８０を測定することにより行った。同時にＧＦＰの蛍光測定（５１８ｎｍ）も行った。蛍光測定にはＦ−２５００形分光蛍光光度計（日立社製）を用いた。
【０１０３】
（３）ゲルシフト法 (Electrophoresis Mobility Shift Assay; ＥＭＳＡ)
ＥＭＳＡに用いた蛍光標識オリゴヌクレオチド鎖を表１６に示した（配列番号７にzntA-Pr-Sの配列を、配列番号８にzntA-Pr-Aの配列を示す）。なお、蛍光非標識のオリゴヌクレオチドは蛍光標識オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のもの作製した。また、プロモーターＤＮＡとＺｎｔＲタンパク質の結合反応組成を表１７に示す。２本鎖ＤＮＡとする際は、相補的な２本の１本鎖ＤＮＡ（１００μＭ）を等量ずつＰＣＲチューブにて混合し、９５℃で１分間の熱処理を行った。熱処理の後は室温で１時間以上放置して２本鎖（５０μＭ）の形成を促した。プロモーターＤＮＡとＺｎｔＲタンパク質との結合を促すために反応液を調製後、３７℃で３０分間のインキュベートを行った。反応液は表１８に示すＮａｔｉｖｅ-ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを加えて４０μＬとした。その後、表１９に示した組成で作製したアクリルアミドゲルと表２０に示すＴＢＥバッファーを使用しＮａｔｉｖｅ-ＰＡＧＥを行った。
【０１０４】
【表１６】
2010035555.tif 000018
【０１０５】
【表１７】
2010035555.tif 000019
【０１０６】
【表１８】
2010035555.tif 000020
【０１０７】
【表１９】
2010035555.tif 000021
【０１０８】
【表２０】
2010035555.tif 000022
【０１０９】
ＥＭＳＡにおける蛍光標識ＤＮＡの検出は暗条件下においてＬＥＤ光源ビジレイズ（ＡＴＴＯ社、ＡＥ−６９３５Ｂ（青色光源）、ＡＥ−６９３５ＧＬ（緑色光源））を照射したゲルをデジタルカメラにより撮影することで行った。
【０１１０】
（４）鉛化合物の検出試験
用いたプロモーターＤＮＡはＥＭＳＡで用いたものと同様に両末端にＦＩＴＣとＴＡＭＲＡを標識した２本鎖ＤＮＡである。プロモーターＤＮＡはあらかじめＦＩＴＣとＴＡＭＲＡで標識した１本鎖ＤＮＡプローブを混合しＥＭＳＡにおいて用いた方法により処理することで２本鎖ＤＮＡを形成させた。重金属は、酢酸鉛（II）；Ｐｂ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２（以降Ｐｂと表記）と硫酸亜鉛；ＺｎＳＯ４（以降Ｚｎと表記）をそれぞれ１０ｎＭの濃度で調製した。比較対象として塩化ナトリウム；ＮａＣｌ（以降Ｎａと表記）、カルシウムイオン；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（以降Ｃａと表記）をそれぞれ１０ｎＭ濃度で調製した。試料は１ｎＭ  Ｐｂ、１ｎＭ  Ｚｎ、１ｎＭ  Ｎａ、１ｎＭ  Ｃａ、そしてＥＤＴＡを加えないトリスバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭジチオスレイトール）を加えたものの５条件を検討した。表２１に示す組成で反応液を調製し暗条件下、３７℃で３０分間のインキュベートを行った。その後、反応溶液にＥＤＴＡを加えないトリスバッファーＡを１ｍＬ加えて混合した後に表２２に示す条件にて蛍光測定を行った。
【０１１１】
【表２１】
2010035555.tif 000023
【０１１２】
【表２２】
2010035555.tif 000024
【０１１３】
（５）ヒ素化合物の検出試験
ＡｒｓＲタンパク質を融合させた、ｐＡｃＧＦＰ１プラスミド由来のＧＦＰは励起波長４７５ｎｍ、蛍光波長５０５ｎｍの緑色蛍光を発する蛍光タンパク質である。３つの異なる蛍光標識ＤＮＡプローブを、それぞれＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質、亜ヒ酸ナトリウム；ＮａＡｓＯ２（以降、Ａｓと表記）と混合することで反応溶液を調製した。用いた３つの蛍光標識ＤＮＡプローブを表２３に示した。３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍの励起光を検討した結果、Ａｓ非添加時とＡｓ添加時にＴＡＭＲＡとＧＦＰの蛍光強度のピークに変化が生じた３５０ｎｍと３６０ｎｍの波長を用いた。励起波長と蛍光開始波長、蛍光終了波長を除く蛍光測定条件は表２２に示す条件にて行った。全てのインキュベートは遮光条件下にて行った。表２３に示すプライマー「ParsR-S3-5-TAMRA」と「Ec arsR prm ext prm」を組み合わせたＰＣＲによりＡｒｓＲタンパク質が結合する、ゲノムＤＮＡ上のプロモーター領域を中心とした３５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した（以下、ＰａｒｓＲ-３５０プローブＤＮＡと表記する）（配列番号９にParsR-S3の配列を、配列番号１０にEc arsR prm ext prmの配列を、配列番号１１にR773-50-Sの配列を、配列番号１２にR773-50-Aの配列を示す）。
【０１１４】
【表２３】
2010035555.tif 000025
【０１１５】
表２３に示すプライマー、ParsR-S3-5-TAMRAとEc arsR prm ext prmを組み合わせたＰＣＲによりＡｒｓＲタンパク質が結合する、ゲノムＤＮＡ上のプロモーター領域を中心とした３５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される（以降、ＰａｒｓＲ-３５０プローブＤＮＡと表記）。ＰａｒｓＲ-３５０プローブＤＮＡを用いた検出試験における反応組成を表２４に示した。検出は表２４に示す手順で行った後、反応溶液１ｍＬの蛍光スペクトルを測定した。蛍光の検出は４００−６５０ｎｍについて、２回ずつ行った。
【０１１６】
【表２４】
2010035555.tif 000026
【０１１７】
表２３に示す、ParsR-50-S-5-TAMRAとParsR-50-Aにより形成される２本鎖ＤＮＡはＡｒｓＲタンパク質が結合する、ゲノムＤＮＡ上のプロモーターＤＮＡの５０ｂｐの塩基配列からなる（以下、ＰａｒｓＲ−５０プローブＤＮＡと表記）。
また、表２３に示す、R773-50-S-5-TAMRAとR773-50-Aにより形成される２本鎖ＤＮＡはＡｒｓＲタンパク質が結合する、Ｒ−７７３プラスミドＤＮＡ上のプロモーターＤＮＡの５０ｂｐの塩基配列からなる（以下、Ｒ７７３−５０プローブＤＮＡと表記）。これら２つ蛍光標識ＤＮＡプローブは、８０℃でインキュベートした後、室温でインキュベートし２本鎖ＤＮＡを形成させた。
【０１１８】
ＰａｒｓＲ−５０プローブＤＮＡあるいはＲ７７３−５０プローブＤＮＡを用いた検出試験における反応組成と検出手順を表２５に示した。蛍光の検出は４８０〜６５０ｎｍについて、３回ずつ行った。
【０１１９】
【表２５】
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【０１２０】
（６）ＺｎｔＲタンパク質発現用大腸菌株の育種の結果
ＺｎｔＲタンパク質発現用大腸菌株の育種にはｐＥＴ３ａベクターを用いた。以前報告した組み換えＺｎｔＲタンパク質にはＮ末端にＨｉｓタグが付いていたため、Ｈｉｓタグを介した重金属との結合の可能性が否定できなかったため、Ｈｉｓタグの付いていないＺｎｔＲタンパク質を発現する大腸菌株を再度、育種した。まず、図２７に示すｐＥＴ１６ｚｎｔＲを保持するＪＭ１０９株を、Ａｍｐを加えたＬＢ培地１００ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。翌日、菌体を回収した後にプラスミド抽出を行った。得られたプラスミド溶液を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いて一晩、反応を行った。制限酵素反応液をアガロースゲル電気泳動により展開し、目的とするｚｎｔＲ遺伝子断片のバンドを切り出し精製した。これをインサートＤＮＡとしｐＥＴ３ａベクターと１６℃で一晩のインキュベートを行うことによりライゲーションを行った。ライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。形質転換の後に選んだ５つコロニーをａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅとし、それぞれＡｍｐを加えたＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。次に、それぞれの培養液を用いてプラスミド抽出を行った後にＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間の制限酵素反応を行った。アガロースゲル電気泳動を行い、インサートの有無を確認した結果、ｂとｃから抽出したプラスミドにてインサートが認められた。シーケンスの結果、ｃのサンプルが目的のｐＥＴ３ｚｎｔＲであることが確認できたため、本プラスミドによりＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。これらの過程を経て、ＺｎｔＲタンパク質発現用大腸菌株を育種した（図２７）。
【０１２１】
（７）ＺｎｔＲタンパク質の発現と精製の結果
ＺｎｔＲタンパク質発現用大腸菌をＡｍｐとＣｍを加えたＬＢ培地５ｍＬで３７℃にて一晩振とう培養し、種菌とした。ＡｍｐとＣｍを加えたＬＢ培地５ｍＬを新たに２つ用意し、それぞれに種菌を植菌し培養の途中で１つにＩＰＴＧを添加した。得られた培養液から１０，０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体をトリスバッファーＡに懸濁させ、超音波破砕機により菌体を破砕した。その後、１２，０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した。これを、ＺｎｔＲタンパク質粗抽出液として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＺｎｔＲタンパク質の発現を確認した。この結果、ＩＰＴＧを添加した方にのみ、ＺｎｔＲタンパク質と見られるバンドが確認出来たため（図２８の矢印の位置）、ＺｎｔＲタンパク質の精製のために培地を２５０ｍＬにスケールアップして培養を行うこととした。５ｍＬの培養スケールの時と同様にして回収した菌体にトリスバッファーＡを加えて溶解し超音波により破砕した。その後、遠心チューブに移し、１２，０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離を行い、デカンテーションによって上清を回収した。これをＺｎｔＲタンパク質粗抽出液とする。
【０１２２】
精製の初発過程として硫酸アンモニウム沈殿を行った。その後、脱塩のためにゲルろ過を行い続けてヘパリンカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行った。その際、約５ｍＬずつ４０フラクションを回収した。各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光値をそれぞれ測定した結果、いくつかの吸光値のピークが得られた。しかしながら、これらのピークを形成するフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、図２８の矢印で示される位置にバンドが確認されなかった。ＺｎｔＲタンパク質は芳香族アミノ酸を含有しておらず、そのため２８０ｎｍの光吸収を示さないことが推察された。そのため、４０フラクションについてＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質染色を行い、５９５ｎｍにおける吸光値をそれぞれ測定した（図２９）。フラクション５までに認められたピークは非吸着画分と考えられたためフラクション５以降で認められたピークを形成するフラクション９〜１５をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した。
【０１２３】
フラクション１０−１３において、矢印の箇所にＺｎｔＲタンパク質と考えられるバンドを確認することができた（図３０、矢印の位置）。そこで、フラクション１０−１３をまとめて限外ろ過により濃縮し、Bradford法にてタンパク質定量を行った後、脱塩のためにゲルろ過を行った。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＺｎｔＲタンパク質の確認を行った（図３１）。その結果、矢印の箇所にＺｎｔＲタンパク質と見られるバンドが確認出来たため、このＺｎｔＲタンパク質部分精製液を用いて以後の実験を行った。
【０１２４】
（８）ＺｎｔＲタンパク質部分精製液を用いたＥＭＳＡの結果
部分精製したＺｎｔＲタンパク質の定量を行った結果、０．５３ｍｇ／ｍＬであった。ＺｎｔＲタンパク質と各蛍光色素を標識したＤＮＡからなるプローブＤＮＡを用いてＥＭＳＡを行った。電気泳動用ゲルにロードした各試料の一覧を表２６に示す。ＦＩＴＣ標識したプローブＤＮＡを用いた場合には、ＦＩＴＣ標識の場合には青色励起光を照射しＳＣＦ５１５フィルター（ATTO社製）を通して、ＴＡＭＲＡ標識の場合には緑色励起光を照射しＲ−６０フィルター（ATTO社製）を通してそれぞれ撮影を行った（図３２）。レーン１で認められるバンドは１本鎖ＤＮＡ、レーン２と６で認められるバンドは２本鎖ＤＮＡのバンドと考えられる。ＺｎｔＲタンパク質部分精製液を添加した試料ではさらに上にＺｎｔＲタンパク質とプローブＤＮＡの複合体のバンドと考えられるバンドのシフトが認められ、加えたタンパク質の液量の増加に伴いシフトしたバンドの量的増加が認められた。また、ＦＩＴＣあるいはＴＡＭＲＡで標識したプローブＤＮＡは緑色あるいは赤色の蛍光として検出可能であった。これらの結果から、調製した組み換えＺｎｔＲタンパク質と用いたプローブＤＮＡは特異的に結合し複合体を形成することが明らかとなった。
【０１２５】
【表２６】
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【０１２６】
ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡを標識したプローブＤＮＡを用いたＥＭＳＡにおいて、電気泳動用ゲルにロードした各試料の一覧を表２７、実験結果を図３３にそれぞれ示す。ゲルはＦＩＴＣを励起する青色励起光を照射しオレンジ色のフィルムを介して撮影された。１種類の蛍光で標識されたプローブＤＮＡを用いたＥＭＳＡの結果と同様にＺｎｔＲタンパク質部分精製液を添加した試料ではＺｎｔＲタンパク質とプローブＤＮＡの複合体と考えられる、上方にシフトしたバンドが認められた。レーン１においてＦＩＴＣで標識した一本鎖ＤＮＡのバンドにおいて緑色の蛍光が認められるが一方、レーン２のＴＡＭＲＡで標識した一本鎖ＤＮＡでは赤色蛍光がほとんど確認できなかった。しかしながら、ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡの両方を標識したプローブＤＮＡ由来のバンドにおいては、ＦＩＴＣの緑色とＴＡＭＲＡ赤色の中間色のピンク色の蛍光が認められた。この結果より、ＦＩＴＣの発する緑色蛍光によりＴＡＭＲＡが励起され赤色蛍光を発していること、すなわちプローブＤＮＡ上のＦＩＴＣからＴＡＭＲＡへとＦＲＥＴが生じていることが確認された。
【０１２７】
【表２７】
2010035555.tif 000029
【０１２８】
（９）ＺｎｔＲタンパク質部分精製液と蛍光標識プローブＤＮＡを用いた鉛化合物の検出結果
ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡで２重標識したプローブＤＮＡとＺｎｔＲタンパク質部分精製液を混合した反応液の蛍光スペクトルを測定した結果、ＰｂあるいはＺｎの添加によりバッファーを添加したコントロールと比較し全体的に蛍光スペクトルが上方にシフトしただけであった。金属イオンであるＮａ、ＣａにおいてもＰｂとＺｎのときと同様の結果となった（図３４）。
【０１２９】
予想された蛍光スペクトルの変化は、ＰｂあるいはＺｎが存在する場合にはＦＩＴＣの５１８ｎｍのピークが増加しＴＡＭＲＡの５８０ｎｍのピークが減少するというものであった。また、Ｎａ、Ｃａ、コントロールにおいては、ＦＩＴＣの５１８ｎｍのピークとＴＡＭＲＡの５８０ｎｍのピークにおける比率に変化がないことが期待された。しかし、ＦＩＴＣの蛍光ピーク（５１８ｎｍ）とＴＡＭＲＡの蛍光ピーク（５８０ｎｍ）の比率において、バッファーを加えたコントロールとＰｂあるいはＺｎを加えたものを比較した場合に変化が生じなかった。
【０１３０】
本試験において、ＦＩＴＣの蛍光ピークとＴＡＭＲＡの蛍光ピークの比率に変化が生じなかった原因としては、ＦＲＥＴを起こす際、ＺｎｔＲ−プロモーターＤＮＡ複合体の高次構造変化に伴う蛍光物質間の距離の変化が小さい点が推察される。また、試験を行う際に試料中に加えた蛍光標識プローブＤＮＡやＺｎｔＲタンパク質の量がＦＲＥＴを生じさせるための添加量として適切でなかった可能性も考えられる。
【０１３１】
（１０）ＡｒｓＲタンパク質発現用大腸菌株の育種結果
ＦＲＥＴを介したＡｓ検出系を構築するためにヒ素に対するセンサータンパク質であるＡｒｓＲタンパク質を組み換えタンパク質として調製することとした。組み換えＡｒｓＲタンパク質を調製することができれば図２６に示す原理で、かつＡｒｓＲをＧＦＰとの融合タンパク質という形でなくとも直接的に蛍光物質で標識可能であると考えられる。表２８に示すａｒｓＲ遺伝子断片増幅用プライマーＥ．ｃｏｌｉＡｒｓＲ−Ｓ及びＥ．ｃｏｉｌＡｒｓＲ−Ａを大腸菌Ｋ１２株のＤＮＡシークエンスデータを基にして設計した（配列番号１３に大腸菌ＡｒｓＲ−Ｓの配列を、配列番号１４に大腸菌ＡｒｓＲ−Ａの配列を示す）。大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマー大腸菌  ＡｒｓＲ−Ｓ及び大腸菌  ＡｒｓＲ-Ａを用いてａｒｓＲ遺伝子を、Ｐｆｘ５０TMＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。電気泳動にて増幅を確認した後、ＰＣＲ反応液にTaKaRa LA TaqTM with GC Bufferを加えて３’末端へのｄＡＴＰの付加反応を行った。この反応液を精製し、ＴＡクローニングベクター、ｐＧＥＭ−Ｔ  ベクターとライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した（図３５）。形質転換株よりｐＧＥＭａｒｓＲを抽出しＸｈｏＩとＮｄｅＩで消化して電気泳動によって挿入断片の確認を行った。ｐＧＥＭａｒｓＲとｐＥＴ１６ｂをそれぞれＸｈｏＩとＮｄｅＩで処理し、ｐＧＥＭａｒｓＲに関しては電気泳動後に目的とするａｒｓＲ遺伝子断片（約３６０ｂｐ）のバンドを切り出して精製した。また、ｐＥＴ１６ｂは反応液をそのまま精製してａｒｓＲ遺伝子断片とライゲーションした。ライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。ａｒｓＲ遺伝子のｐＥＴ１６ｂへの挿入の確認は形質転換株よりプラスミドを抽出し、ＸｈｏＩとＮｄｅＩで処理した後電気泳動にてａｒｓＲ遺伝子断片のバンドを確認することで行った。ｐＥＴ１６ａｒｓＲ上のａｒｓＲ遺伝子のシークエンスを行いＧｅｎ  Ｂａｎｋデータベースの大腸菌  Ｋ１２株ＤＮＡシークエンスデータと比較することで、クローニングしたａｒｓＲ遺伝子に変異がないことを確認した。しかし、ｐＥＴ１６ａｒｓＲから発現するＡｒｓＲタンパク質にはＨｉｓタグが付いており、Ｈｉｓタグを介して重金属と結合してしまう可能性が考えられたため、Ｈｉｓタグを持たないｐＥＴ３ａベクターにａｒｓＲ遺伝子断片を連結し直すことにした。ｐＥＴ１６ａｒｓＲとｐＥＴ３ａベクターをそれぞれＢａｍＨＩとＮｄｅＩで処理し、ｐＥＴ１６ａｒｓＲに関しては電気泳動後に目的とするａｒｓＲ遺伝子断片のバンドを切り出して精製した。ａｒｓＲ遺伝子断片をｐＥＴ３ａベクターと連結させ、ｐＥＴ３ａｒｓＲを作製した。上記と同様にしてシークエンスを行い、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋの大腸菌  Ｋ１２株ＤＮＡシークエンスデータと比較することでｐＥＴ３ａｒｓＲ上のａｒｓＲ遺伝子に、変異がないことを確認した。次にｐＥＴ３ａｒｓＲのプラスミド溶液を用いてタンパク質発現用株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、ＡｒｓＲタンパク質発現用大腸菌株を育種した（図３５）。
【０１３２】
【表２８】
2010035555.tif 000030
【０１３３】
（１１）組み換えＡｒｓＲタンパク質の発現と確認
ＡｒｓＲタンパク質発現用大腸菌株を培養後に超音波破砕することでＡｒｓＲタンパク質粗抽出液を得た。このＡｒｓＲタンパク質粗抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開することでＡｒｓＲタンパク質の発現の確認を行った。しかし、ＩＰＴＧの添加の有無に関わらずＡｒｓＲタンパク質のバンドが予測された位置（約１３ｋＤａ）にバンドが確認できなかった。ＩＰＴＧ添加時のタンパク質粗抽出液ではゲルの上部にバンドが密集しているため、ＡｒｓＲタンパク質とＤＮＡが結合している可能性が考えられた。そこでタンパク質と結合したＤＮＡを除去する目的でタンパク質粗抽出液をＤＮａｓｅＩ処理し、その後、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＡｒｓＲタンパク質のバンドの確認を行った。しかしながら、ＩＰＴＧの添加の有無により予測される位置のバンドに差異は見られなかった。原因を特定していないが、組み換えＡｒｓＲタンパク質を調製するには至らなかった。そこで、ＡｒｓＲをＧＦＰとの融合タンパク質という形で調製することにより蛍光標識することにした。
【０１３４】
（１２）ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質発現用大腸菌株の育種の結果
ａｒｓＲ遺伝子断片のクローニングのために表２９に示す、ａｒｓＲ遺伝子増幅用プライマーＥｃ-ａｒｓＲ-ｐＡｃＧＦＰ-Ｓ（配列番号１５）及びＥｃ-ａｒｓＲ-ｐＡｃＧＦＰ-Ａ（配列番号１６）を大腸菌Ｋ１２株のＤＮＡシークエンスデータを基にして設計した。また、それぞれのプライマーにはクローニングの際に必要となる制限酵素サイトを付けた。まず、大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＥｃ-ａｒｓＲ-ｐＡｃＧＦＰ-Ｓ及びＥｃ-ａｒｓＲ-ｐＡｃＧＦＰ-Ａを用いてａｒｓＲ遺伝子断片をＰＣＲで増幅した（図３６）。電気泳動にて増幅を確認した後のａｒｓＲ遺伝子断片とｐＡｃＧＦＰ１ベクターをそれぞれＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで処理し、ｐＡｃＧＦＰ１に関しては電気泳動後に目的とするベクター部位（約３．３ｋｂ）のバンドを切り出して精製した。また、ａｒｓＲ遺伝子断片は反応液をそのまま精製した。両ＤＮＡ断片をライゲーションし、得られたｐＡｃＧＦＰａｒｓＲで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。ａｒｓＲ遺伝子の挿入の確認は形質転換株よりｐＡｃＧＦＰａｒｓＲを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動にてａｒｓＲ遺伝子断片（約３６０ｂｐ）のバンドを確認することで行った。ｐＡｃＧＦＰａｒｓＲ上のシークエンスを行い、Gen Bankの大腸菌Ｋ１２株のａｒｓＲのＤＮＡシークエンスデータとの比較によりｐＡｃＧＦＰａｒｓＲ上のａｒｓＲ遺伝子に変異がないことを確認した。
【０１３５】
【表２９】
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【０１３６】
（１３）ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現と確認
ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質発現用大腸菌株を培養し菌体を破砕することでＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質粗抽出液を得た。このＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質粗抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開することでＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現の確認を行った。その結果、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の予測される位置（約４７ｋＤａ）にバンドが確認された（図３７の矢印の位置）。しかしながら、発現量が低いため目的タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにて部分精製し、夾雑タンパク質に対する比率を高めることとした。
【０１３７】
（１４）ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の精製結果
ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質粗抽出液に対して硫酸アンモニウム沈殿を行いバッファーに再溶解後、ゲルろ過による脱塩を行った。その後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行い回収した４０本のフラクションのＡ２８０とＧＦＰの蛍光（５２０ｎｍ）を測定した。その結果、フラクション１９と２０を中心にＡ２８０と蛍光値のピークが認められ（図３８）、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質は主としてこれらのフラクションに存在することが明らかとなった。フラクション１９と２０についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を確認したところ、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質と考えられるバンドが確認できた（図３９、矢印の位置）。
【０１３８】
しかしながら、目的タンパク質以外にも夾雑タンパク質が依然として認められたため更に精製度を高めるために、これらのフラクションを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。その後、回収した４０本のフラクションのＡ２８０と蛍光強度（４２０ｎｍ）を測定した。その結果、フラクション１９〜２１を中心にＡ２８０のピークが認められ、蛍光値は主としてフラクション２０と２１が高い値を示した（図４０）。ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質は主としてフラクション２０と２１に存在することが明らかとなった。フラクション２０と２１についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにてタンパク質を分離したところＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質と考えられるバンドが確認できた（図４１、矢印の位置）。イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことによって、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質以外の夾雑タンパク質を大幅に除くことができた。
【０１３９】
（１５）ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質と蛍光標識プローブＤＮＡを用いたＡｓの検出試験
図２６に示す原理により、ヒ素化合物（Ａｓ）の存在がＦＲＥＴを介して蛍光スペクトルに変化をもたらすか否かの検討を行った。ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質の部分精製液とＴＡＭＲＡで標識したＰａｒｓＲ−３５０を混合しＡｓ存在下そして非存在下において励起光３５０ｎｍと３６０ｎｍにて蛍光スペクトルを測定した結果を図４２に示す。いずれの励起光においても、５８０ｎｍ近辺のＴＡＭＲＡの蛍光ピークにおいてわずかながらＡｓ非添加時よりも添加時に蛍光強度の減少が認められた。また、５１０ｎｍ近辺のＧＦＰの蛍光ピークにおいては、わずかながらＡｓ非添加時よりも添加時にピークの増加が認められた。この傾向は、図２６で示す検出原理から予測される蛍光スペクトルの変化と一致する。つまり、Ａｓ非添加時にはタンパク質とＤＮＡの複合体形成によりＴＡＭＲＡとＧＦＰの距離が短くなりＧＦＰの蛍光がＴＡＭＲＡの励起光として吸収され易くなった結果ＴＡＭＲＡの蛍光が増加し、逆にＡｓ添加時にはタンパク質とＤＮＡの解離によりＴＡＭＲＡとＧＦＰの距離が離れＴＡＭＲＡにより吸収されるＧＦＰの蛍光の割合が減少した結果ＧＦＰの蛍光が増加したと考えられる。しかしながら、ＴＡＭＲＡとＧＦＰの蛍光強度の比率においてＡｓ添加による顕著な変化が認められなかったため、ＤＮＡ鎖の長さを３５０ｂｐから５０ｂｐへと短くした、ＰａｒｓＲ−５０あるいはＲ７７３−５０プローブＤＮＡを用いてＡｓの検出試験を行った。その結果、いずれの励起光そしてプローブＤＮＡにおいても、Ａｓ添加によりＰａｒｓＲ−３５０プローブＤＮＡを使用した場合と同様のスペクトル変化が認められた（図４３、図４４）。また、５８０ｎｍ近辺のＴＡＭＲＡの蛍光においてはＡｓ添加によりＰａｒｓＲ−３５０プローブＤＮＡを使用した場合より減少が見られた。しかしながら、いずれのプローブＤＮＡにおいてもＧＦＰの蛍光強度においてはＡｓ添加により増加傾向は認められなかった。ＰａｒｓＲ−５０とＲ７７３−５０プローブＤＮＡ間の比較においては、ＴＡＭＲＡの蛍光においてはＡｓ添加によりＰａｒｓＲ−５０プローブＤＮＡを使用した場合が、より減少幅が大きかった。
【０１４０】
３つの異なるプローブＤＮＡを用いたヒ素検出試験の結果、プローブＤＮＡ鎖長を５０ｂｐに設定し、かつゲノム上のヒ素応答型プロモーターの塩基配列を選択することで、Ａｓ添加においてＴＡＭＲＡの蛍光強度の微弱な変化を生じさせることが明らかとなった。プローブＤＮＡの鎖長や塩基配列を変化させたが期待したＦＲＥＴを介した蛍光スペクトルの変化をもたらすことはできなかった。
【０１４１】
（１６）まとめ
調製した２つの組み換えタンパク質、ＺｎｔＲあるいはＡｒｓＲ−ＧＦＰを用いたＰｂあるいはＡｓの検出試験の結果をそれぞれ以下に要約した。
プロモーターＤＮＡをＦＩＴＣとＴＡＭＲＡで２重標識した、プローブＤＮＡとＺｎｔＲタンパク質を用いた試験においてはＰｂの添加によりＦＩＴＣとＴＡＭＲＡの蛍光強度の比率において変化は認められなかった。ゲルシフト法による解析結果から、調製したＺｎｔＲタンパク質とプローブＤＮＡはＺｎｔＲ−プロモーターＤＮＡ複合体を形成することが確認された。したがって、形成された複合体の、Ｐｂ添加による高次構造変化がＦＲＥＴにおけるエネルギー移動の変化を引き起こすには小さ過ぎた可能性が考えられる。ＺｎｔＲ−プロモーターＤＮＡ複合体の高次構造の変化を、ＦＲＥＴを介して外部提示するのは困難であった。
【０１４２】
一方、Ａｓ検出のために野生型のＡｒｓＲタンパク質を大腸菌株にて発現させることは困難であった。このため、ＡｒｓＲ−ＧＦＰ融合タンパク質として発現させたところ、ＡｒｓＲタンパク質をＧＦＰにより蛍光修飾することが可能となった。プロモーターＤＮＡにＴＡＭＲＡによる蛍光修飾を入れることで、Ａｓ添加により引き起こされるタンパク質−ＤＮＡ複合体からのＤＮＡ分子の解離を、ＦＲＥＴにより蛍光スペクトルの変化として外部提示できるか否かを確認した。その結果、Ａｓ添加によりＧＦＰとＴＡＭＲＡの蛍光強度の比率において、わずかながら変化が認められた。また、３つの異なるプローブＤＮＡを用いた試験結果から、プローブＤＮＡの鎖長や塩基配列の違いによりＡｓの添加による蛍光強度の変動幅がわずかながら変化することが明らかとなった。ＴＡＭＲＡの蛍光強度が最も大きく変化した試験で用いたプローブＤＮＡは株ゲノムＤＮＡ上のヒ素応答型プロモーターＤＮＡ５０ｂｐにＴＡＭＲＡを修飾した、ＰａｒｓＲ−５０であった。
【０１４３】
Ａｓの検出試験において蛍光強度の変化が微弱であった原因として、相互作用するタンパク質とＤＮＡの両分子が試験時にいずれも溶液状態であった点が挙げられる。分子が溶液中を自由に運動するために分子の結合・解離の状態の如何に関係なく、バックグラウンドのＦＲＥＴが少なからず生じていた可能性が考えられる。したがって、蛍光強度の変化をより顕著にするために、プローブＤＮＡを基材表面に修飾する形で固定化するといった方策が挙げられる。プローブＤＮＡを固定化することでヒ素添加によるＦＲＥＴが著しく減少すれば、マイクロプレートを用いたアッセイ系等への応用も可能となり将来的なハイスループットＡｓ検出系への発展も期待される。しかし、プローブＤＮＡを固定化しない本法では結局、実用レベルのＦＲＥＴの変化すなわち蛍光スペクトルの変化は生じなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明によれば、微生物由来のセンサータンパク質を用い、簡便かつ迅速に被検試料中の分析物を検出及び測定することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３８】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図５】
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【図６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４１】
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【配列表】
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