(57)【要約】      （修正有）【課題】精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の疾患について、ヒト染色体の増幅あるいは欠失の有無を解析しその原因を明らかにし、本疾患の判別法を提供する。【解決手段】ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域のヘミ接合体欠失を検出することにより、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群を判別する方法。好適には、当該10q24.31-10q25.1の領域の一部を含む核酸と検体核酸とのハイブリダイゼーションにより、当該染色体領域のヘミ接合体欠失に基づいて発生するシグナルを検出することにより行われる。【選択図】図１
2010035447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域のヘミ接合体欠失を検出することにより、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群を判別する、染色体欠失の検出方法。
【請求項２】
ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域のヘミ接合体欠失の検出が、当該10q24.31-10q25.1の領域の一部を含む核酸と検体核酸とのハイブリダイゼーションにより、当該10q24.31-10q25.1の領域のヘミ接合体欠失に基づいて発生するシグナルを検出することにより行われる、請求項１に記載の染色体欠失の検出方法。
【請求項３】
ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域の一部を含む核酸と検体核酸とのハイブリダイゼーションが、当該10q24.31-10q25.1の領域の一部を含む核酸が定着した基板において行われる、請求項２に記載の染色体欠失の検出方法。
【請求項４】
ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域の一部を含む核酸が、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ＰＡＣ  ＤＮＡ、又は、ＹＡＣ  ＤＮＡである、請求項２又は３に記載の染色体欠失の検出方法。
【請求項５】
ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域の一部又は全部を含む核酸を検出する手段が、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、又は、ＣＧＨ法を用いて検出する、請求項１に記載の染色体欠失の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾病を伴う染色体欠失の検出方法に関する発明であり、具体的には、特定の染色体領域のヘミ接合体欠失を検出することにより、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群を判別する方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
先天性異常症候群の患者に染色体ＤＮＡの特定領域が欠失している場合が多く観察される。現在、ゲノムの欠失領域が明らかにされている先天性異常症候群は多く知られている。ヘミ接合体欠失が原因の疾患として報告されている先天性異常症候群の例として、Williams syndrome(7q11.2)、Smith-Magenis syndrome(17p11.2)、Langer-Giedion syndrome(8q24)、Wolf-Hirschhorn syndrome(4p16.3)、Miller-Dieker syndrome(17p13.3)、Prader-Willi and Angelman syndromes(15q11-q13)、WAGR syndrome(11p13)、Cri du Chat syndrome(5p15.3)、Rubinstein-Taybi syndrome(16p13.3)、Tricho-rhino-phalangeal syndrome(8q24.1)、Potoki-Shaffer syndrome(11p11.2)、Neurofibromatosis I syndrome(17q11)、Sotos syndrome(5q35)、Craniosynostosis syndrome(7p21.1)、Kallmann type 1 syndrome(Xp22.3)、Kallmann type 2 syndrome(8p11.12)、Van der Woude syndrome(1q32-q41)、ZFHX1 B deletion syndrome(2q22)、Blepharophimosis ptosis and epicanthus inversus syndrome(3q23) 、1p36 syndrome(1p36) 、Cat eye syndrome(22q11) 、Alagille syndrome(20p11.23) 、Diamond-Blackfan syndrome(19q13.2) 、Adrenal hypoplasia congenita(Xp21.2) 、Coffin-lowry syndrome(Xp22.3)、DiGeorge syndrome(22q11) 、Russell-Silver syndrome(7p11.2) 、Duchenne Muscular Dystrophy(Xp21.2)等が知られている（特許文献１：「ゲノムDNAの定着基盤と当該基盤を用いた染色体異常並びにそれに起因する疾患の検出方法」）。なお、（    ）内の記載は、これらの症候群でヘミ接合体欠失の染色体領域を示している。
【０００３】
一方、先天性異常症候群で染色体DNAの特定領域が増幅している例がある。例えば、Down syndrome では２１番染色体がトリソミーであり、Pallister-Killian syndromeでは１２番染色体短腕がテトラソミーである。Pelizaeus Merzbacher Disease（髄鞘形成不全疾患）ではXq22領域の増幅が原因である。
【０００４】
しかしながら、例えば、本発明における判定の対象となる「精神遅滞を伴う多発性奇形症候群」のように、原因不明の先天性異常症候群も数多く存在する。このような状況の中、原因不明の疾患についてヒトゲノムＤＮＡを網羅的に解析し、ゲノムＤＮＡの欠失・増幅を見いだすことは極めて有用である。すなわち、疾患の原因が特定のゲノムＤＮＡにあることを特定することにより、当該疾患を的確かつ迅速に判定し、的確な対処を行うことが可能となる。また、当該疾患の原因となるゲノムの微細な構造異常の同定が可能となり、これが、将来の遺伝子レベルでの治療の可能性にもつながるものと考えられる。
【特許文献１】特開２００５−３０４４８１
【非特許文献１】アレイＣＧＨ診断活用ガイドブック、稲澤譲治・蒔田芳男・羽田明編、ｐ４０〜５０及びｐ７８〜８１、株式会社医薬ジャーナル社２００８年２月発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の疾患について、ヒト染色体の増幅あるいは欠失の有無を解析しその原因を明らかにし、本疾患の判別法を提供することを課題とする発明である。               
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群（Multiple Congenital Anomaly−Mental Retardation）のゲノム異常を効率良く解析できる手段を見出すべく検討を行った。
【０００７】
まず、２０施設の小児科専門医が多発性奇形症候群の症例登録を行い、臨床症状から判断し、既知の先天性異常症が強く疑われる症例を除いた。次に、Genome Disorder Arrayを用いた解析で、既知の微細構造異常並びにサブテロメアの構造異常が原因となる疾患を同定した。Genome Disorder Arrayを用いた解析で原因が同定できなかった疾患の中から小児科領域の臨床遺伝専門医が判断し、さらに症例を絞り、MCG Whole Genome Array-4500を用いて網羅的な解析を行った。その結果、複数の疾患で同じ領域（10q24.31-10q25.1）の遺伝子異常をヘミ接合体欠失として同定し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域（以下、単に10q24.31-10q25.1の領域等と略記することもある）のヘミ接合体欠失を検出することにより、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群を判別する、染色体欠失の検出方法（以下、本発明の検出方法ともいう）を提供する発明である。
【０００９】
ヘミ接合体欠失とは、２本一組の染色体のうち一方が欠失しているヘテロな欠失のことを意味するものである。おそらく10q24.31-10q25.1の領域のホモ接合体欠失の場合は、生存すること自体が困難であると考えられる。
【００１０】
本発明の検出方法は、10q24.31-10q25.1の領域の一部を含む核酸と検体核酸とのハイブリダイゼーションにより、当該遺伝子領域のヘミ接合体欠失に基づいて発生するシグナルを検出することにより行われることが好適である。また、この好適な態様は、典型的には、当該遺伝子領域の一部を含む核酸（以下、プローブ核酸と記載する）が定着した基板（ＤＮＡアレイ）において適切に行われる。用いられるプローブ核酸は、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosome）  ＤＮＡ、ＰＡＣ(Phage Artificial Chromosome)  ＤＮＡ、又は、ＹＡＣ(Yeast Artificial Chromosome)  ＤＮＡ等が挙げられる。プローブ核酸の好適な態様として、これらの核酸をＰＣＲ法等により無尽蔵化した遺伝子増幅産物が挙げられる。このようなプローブ核酸を用いる態様については後述する。
【００１１】
また、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＦＩＳＨ法、又は、ＣＧＨ法等を用いて、本発明の検出方法を行うことも可能である。
【００１２】
本発明の検出方法に供する検体試料としては、血液検体、特に、血漿が好適であるが、組織切片、リンパ液、喀痰、組織培養物などを用いることもできる。また、羊水、臍帯血、絨毛を検体として用いることも可能である。さらに、着床前診断として、受精卵を検体として用いることも可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、先天性異常症の染色体欠失、さらに具体的には精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の判別を行う手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［DNAアレイを用いる形態］
（１）ＤＮＡアレイ
上述したように、本発明の検出方法を行うに際しては、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ＰＡＣ  ＤＮＡ、又は、ＹＡＣ  ＤＮＡ等のプローブ核酸を搭載したＤＮＡアレイを用いることが好適である。当該アレイとして用いられる基板の素材としては、ガラス、プラスチック、メンブレン、３次元アレイ等が用いられるが、スライドガラス等のガラス基板が一般的には好ましい。ガラス等の固体基板は、ポリ-L-リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基板をコートされていることがより好ましい。
【００１５】
（２）ＷＧＡ−４５００アレイ  
極めて有力な本発明の検出方法を行う態様として、染色体を網羅的にカバーするＢＡＣ  ＤＮＡを搭載したMCG Whole Genome Array-4500（ＷＧＡ−４５００と略称することもある：非特許文献１）を用いたアレイＣＧＨ（Comparative Genomic Hybridization）法を行うことができる。ＷＧＡ−４５００は、２２種類の常染色体とＸ、Ｙ性染色体の全染色体を網羅する４５２３個のＢＡＣクローンを搭載した、平均解像度が約０．７Mbの全ゲノムアレイである。これはヒト染色体ユークロマチン領域の約１／３に及んでいる。ＷＧＡ−４５００を用いる場合、10q24.31-10q25.1の領域の一部を含むプローブ核酸の吸着量比の底が２の対数比が−０．３以下である場合を、本発明にかかわるヘミ接合体欠失の検出として認めることが通常であるが、この基準に限定されるものではない。
【００１６】
この基準を適用する場合、より具体的には、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-16H23、RP11-80B2、RP11-99N20、RP11-541N10、RP11-302K17、RP11-89G15、RP11-68M5、RP11-21N23、RP11-105N15、RP11-302K17、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-107I14、RP11-108L7、RP-11-91A6、RP11-37L21、（いずれもＢＡＣ  ＤＮＡ）が、−０．３以下である場合に、ヘミ接合体欠失の検出として認められる。
【００１７】
（３）アレイの他の態様
また、アレイに搭載するプローブ核酸を、上記のヘミ接合体欠失のパターンに合わせて絞り込むことで減少させた、ＤＮＡ-アレイを用いることもできる。ただし、当該ＤＮＡアレイには少なくとも10q24.31-10q25.1の領域の一部を含むプローブ核酸を有していることが必要である。例えば、プローブ核酸としてＢＡＣ  ＤＮＡを用いる場合、少なくとも、上記の２２種のＢＡＣ  ＤＮＡ群から選択される１種以上のＢＡＣ  ＤＮＡが固定化されていることが好適である。また、同時に、10q24.31-10q25.1領域以外に該当するＢＡＣ  ＤＮＡが１種以上固定化されていることがより好適である。
【００１８】
（４）標的核酸の無尽蔵化
ＤＮＡアレイの作成において、通常に得られるＢＡＣ  ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基板を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得ることが好適である（この遺伝子増幅工程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ  ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、RsaI、DpnI、HaeIII等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションを行う。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３’−末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ  ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００１９】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基板上にスポットする濃度は、好ましくは１０pg/μｌ〜５μg/μl、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ng/μlである。スポットする量は好ましくは１nl〜１μl、より好ましくは１０nl〜１００nlである。また、基板に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１mmであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μmである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基板あたり１０〜５００００個、より好ましくは１００〜５０００個である。それぞれのＤＮＡはSingularからQuadruplicateの範囲でスポットするが、DuplicateあるいはTriplicateにスポットすることが好ましい。
【００２０】
乾燥スポットは、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基板上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、GENESHOT（登録商標）（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２１】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基板上、好適には固体基板上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基板を製造することができる。
【００２２】
（５）ハイブリダイゼーションの態様
（ａ）二色蛍光法
ＤＮＡアレイと標識核酸を用いるハイブリダイゼーション法［ＣＧＨ（Comparative Genomic Hybridization）法］では、例えば、二色蛍光法を用いて行うことができる。
【００２３】
二色蛍光法とは、例えば１枚のＤＮＡアレイもしくは１つのハイブリダイゼーション領域に対して、２種類の異なった試料由来の標識標的核酸を用いる方法である。ここで、標識標的核酸に結合させている標識化合物はそれぞれ異なっている。正常検体由来の標的核酸を標識した標識標的核酸を調製し、患者検体由来の標的核酸にて標識した標識標的核酸を調製し、この両方を混合後、１枚のＣＧＨアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションを行うことで、吸着量比を算出する。例えば、蛍光標識がなされている場合には、その蛍光値の強度比から吸着量比を算出する。
【００２４】
（ｂ）標識
本発明において「標識」とは、検出可能な物質を標的核酸に対して結合させる行為であり、検出可能であれば、いかなるものも本発明にかかわる標的核酸に組み込むことができる。例えば、蛍光物質、無機化合物、タンパク質（ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)などで使用される酵素標識抗体など）、放射性同位元素、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）などを選択ことができる。
【００２５】
標識として用いられる蛍光物質は、特に限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy3, Cy5, Cy7、緑色蛍光タンパク質(GFP, Green Fluorescent Protein)、青色蛍光タンパク(BFP, Blue Fluorescent Protein)、黄色蛍光タンパク(YFP, Yellow Fluorescent Protein)、赤色蛍光タンパク(RFP, Red Fluorescent Protein)、Alexa、Acridine、DAPI、Ethidium bromide、SYBR Green、Texas Red、希土類蛍光ラベル剤 ［4,4'-bis(1",1",1",2",2",3",3"-heptafluoro-4",6"-hexanedion-6"-yl)-chlorosulfo-o-terphenyl(BHHCT)］、アクリジンオレンジ、TAMRA、ROXなどを用いることができる。
【００２６】
標識として用いられる無機化合物としては、特に限定されないが、例えば、半導体無機材料でできた量子ドットを挙げることができる。その例としては、シリカ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳｅのナノ微粒子を挙げることができる。この微粒子は、その粒径を変えることで、発する蛍光波長を変化させることが可能であり、直径２nmでは青色、直径３nmでは緑色、４nmでは黄色、５nmでは赤色となる。この様に、蛍光を検出することも可能であり、その粒子の存在を検出することもできる。例えば、粒子の存在を検出する手段として、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）を用いることができる。
【００２７】
標識としては、さらに、ジゴキシゲニン（Digoxigenin：DIG）、ビオチン等も利用することができる。ビオチンを用いる例としては、例えば、標的核酸に結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えることによる紫色の発色の利用が挙げられる。
【００２８】
さらに、非酵素的な標識も行うことができる。例えば、ULSTM array CGH Labeling Kit（Kreatech Biotechnology BV社）等も用いることができる。
【００２９】
（ｃ）標的核酸の精製
本発明において、標的核酸を検体から調製する際には、精製を行う必要がある。この場合には、後述する標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質など細胞溶解物がバックグラウンドノイズに大きな影響を与え、精製を行わなければ、核酸マイクロアレイ等を用いるハイブリダイゼーション試験の性能を著しく低下させる。
【００３０】
「精製」とは、抽出、分離、分取と同義語の意味で使用している。また、そのための手段として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を含むことができる。さらに、電気泳動法による精製も含めることができる。また、本発明では、溶媒置換も広い意味で精製と呼んでいる。
【００３１】
本発明では、標的細胞から標的核酸を調製する場合、２回の精製工程を行うこともできる。本発明では、標的細胞からの精製工程、すなわち、１回目の精製工程として、シリカやセルロース誘導体などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出などを用いることができる。この中で、トリ酢酸セルロースをケン化して調製した核酸吸着性多孔質膜をカートリッジに保持させたQuickGeneシリーズ（富士フイルム株式会社）による精製が好ましい。QuickGeneシリーズを使用することで、低価格の機械を用いて、半自動的に標的核酸を調製することができるからである。
【００３２】
さらに、もう一段の精製工程を行うこともできる。すなわち、調製した標的核酸の濃度や純度向上のための精製である。例えば、フェノール−クロロホルム抽出法や種々の沈殿法を用いた場合、その精製度は一般的にカラム法と比較して悪く、以降の工程に悪影響を及ぼしてしまう。２回目の精製法として、シリカなどの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を示す樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる方法を用いることができるが、この中で最も好適なのが、QuickGene SP kit（富士フイルム株式会社）による精製法である。
【００３３】
QucikGene SP kitの核酸吸着性多孔質膜は、シリカ系核酸吸着性多孔質膜と比較して非常に薄く、少量での核酸抽出に適しており、他の方法と比較して非常に高濃度の標的核酸を得ることができる。また、少量液量での精製が可能なエタノール沈殿法やイソプロパノール沈殿法と比較して、より高純度の標的核酸を得ることが可能であり、少量かつ高濃度の標的核酸を得るのに適した方法である。
【００３４】
［その他の検出態様］
（１）染色体検査
原因不明の精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の疾患に関してヒトゲノムの特定領域の異常が明確になれば、特に、10Mb程度の欠失を伴い10q24.31-10q25.1領域が、ヘミ接合体欠失している場合には、Ｇ分染法等の染色体検査により検出することが可能である。本発明の該当領域の染色状態の違い(10q24.31-10q25.1領域を含む染色体バンドの消失の有無)を観察することで検出することができる。
【００３５】
（２）ＦＩＳＨ法による検出
数Ｍｂ以下の微細なゲノム異常であればＦＩＳＨ法[蛍光in situ ハイブリダイゼーション（FISH: Fluorescence in situ hybridization）:Yasui,K., Imoto,I., Fukuda,Y., Pimkhaokham,A., Yang,Z.Q., Naruto,T., Shimada,Y., Nakamura,Y., and Inazawa,J: Identification of target genes within an amplicon at 14q12-q13 in esophageal squamous cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer, 32, 112-118, 2001]、等により、核酸のハイブリダイゼーションによるシグナルを基に検出することが可能となる。この場合、10q24.31-10q25.1領域のＦＩＳＨプローブを作成し、患者由来の染色体とハイブリダイゼーションを行い、シグナル数の減少を観察することで、ヘミ接合体欠失を検出することが可能である。
【００３６】
（３）サザンブロット法
サザンブロット法を用いる場合、検体から得られるゲノムＤＮＡを制限酵素消化し、それをゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜上に固定し、これと、標識した10q24.32-q25.1領域のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行い検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。ヘミ接合体欠失の場合、正常由来の検体から得られる検出量（バンドの濃さ）に対し、患者由来の検体から得られる検出量が少ないことと共に、異なるバンドの出現が認められることにより、判定することができる。
【００３７】
（４）ノーザンブロット法
ノーザンブロット法は、検体から得られる全ＲＮＡを電気泳動に供し、サザンブロッティング法と同様の操作で膜上に固定し、これと、標識した10q24.32-q25.1領域のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行い検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。正常由来の検体から得られる検出量（バンドの濃さ）に対し、患者由来の検体から得られる検出量が少ない場合、10q24.32-q25.1領域のヘミ接合体欠失として判定することができる場合がある。
【００３８】
（５）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、検体ＤＮＡの10q24.32-q25.1領域の転写産物に対応するプライマーを少なくとも１種類準備し逆転写反応を行い、次に、遺伝子の増幅工程を行い、当該増幅産物の生成の有無や生成量から検出する方法である。正常由来ＤＮＡの増幅産物量に対し、患者由来ＤＮＡからの増幅産物量が少ないことで、ヘミ接合体欠失として判定できる場合がある。
【００３９】
本発明に関する遺伝子異常の同定に至るまでのスキームを図１に示す。また、当該同定のさらに具体的な内容は、実施例として開示する。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明について、実施例により、さらに具体的に説明する。
（Ａ）MCG Whole Genome Array-4500
上述したように、本発明の検出方法を行うに際して、ヒト染色体の10q24.31-10q25.1の領域のヘミ接合体欠失が、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群に関連していることを見出すために用いた検出手段は、MCG Whole Genome Array-4500である。この検出基板については公知（非特許文献１）であるが、念のために、ここにその製造過程を簡単に説明する。
【００４１】
The National Center for Biotechnology Information (NCBI)及びUniversity of California, Santa Cruz のゲノムデータベースウエブサイト並びに選択されたＤＮＡのBLAST検索の結果から、ヒトゲノムのユークロマチン領域に存在する４５２３種類のＢＡＣ／ＰＡＣクローンを選択した。
【００４２】
選択したＢＡＣ  ＤＮＡ及びＰＡＣ  ＤＮＡを調製した後、その各々をDpnI、RsaI、HaeIIIで消化し、その後アダプター合成オリゴヌクレオチドとのライゲーションを行った。次に、アダプターの配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを２回行った。このプロセスを無尽蔵化といい、得られたＤＮＡを無尽蔵化ＤＮＡと定義する。無尽蔵化ＤＮＡをインクジェットタイプのスポッター（GENESHOT（登録商標）、日本ガイシ株式会社、名古屋）を使用してDuplicateでアレイ上にスポットして、所望の高密度ＣＧＨアレイを作製した（MCG Whole Genome Array-4500）。
【００４３】
（Ｂ）ヒト染色体における該当領域の特定
（１）精神遅滞を伴う多発性奇形症候群患者２名の臨床像
本実施例において、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群に対応するヒト染色体の領域を特定するための検体提供者２名［精神遅滞を伴う新規先天性異常症患児２名（ケース１と２）］の臨床像について、可能な範囲で開示する。
【００４４】
ケース１（男児）は、出生時の体重２８３０ｇで、出産時の仮死はなく、４歳０ヶ月での診断結果は重度精神遅滞、大頭症（＋2SD）、外斜視、顔貌異常であった。詳細は頭頚部・顔面では頭蓋で軽度の巨大頭蓋、前頭突出があり、眼球で重度の内斜視があり、鼻では前向き鼻孔及び鞍鼻があった。成長発達・神経症状では重度の精神発達遅滞が見られ、首のすわり（定頚）は５ヶ月、定坐は２４ヶ月、独歩と発語はなく、神経症状としての痙攣発作は認められていない。自閉傾向は重度で、筋緊張は低下している。
【００４５】
ケース２（男児）は、出生時の体重２４５８ｇで、Atrial septal defect（心房中隔欠損）、ＶＳＤ(Ventricular septal defect：心室中隔欠損)及びＰＤＡ(Patent ductus arteriosus：動脈管開存症)の心臓血管外科領域の疾患を認めた。３歳８ヶ月での診断結果は、口唇口蓋裂、難聴（100ｄＢ）、小眼球症、短い指、特異的顔貌（濃い眉毛、幅広い鼻根、内眼角贅皮、幅広い鼻）、第5指単一屈曲線、反張姿勢が特徴であった。詳細には頭頚部・顔面では眼域での両眼隔離、内眼角贅皮、及び右目の小眼球があり、鼻では扁平な鼻背、前向き鼻孔、及び、軽微の鞍鼻が認められた。口域では口唇口蓋裂があり、躯幹では外陰部で停留睾丸があり、四肢では手指で小指短小・内彎が認められた。成長発達・神経症状では重度の精神発達遅滞が見られ〔発達指数（DQ）が20〜30〕、定坐はできなかった。神経症状としての痙攣発作は認められない。筋緊張は低下していた。
【００４６】
（２）ＤＮＡアレイを用いた解析［実施例１］
（ａ）Genome Disorder Arrayでの解析結果
Genome Disorder Arrayは、ヒトゲノムＤＮＡが、先天性異常症疾患で欠失または増幅する領域のゲノムＤＮＡ（ＢＡＣクローン）が定着している基板である。
【００４７】
Genome Disorder Arrayを用いた解析ではWilliams syndrome、Smith-Magenis syndrome、Down syndrome、Langer-Giedion syndrome、Wolf-Hirschhorn syndrome、Miller-Dieker syndrome、Prader Willi and Angelman syndrome、WAGR症候群、Cri du Chat syndrome、Pallister-Killian syndrome、Rubinstein-Taybi syndrome、Tricho-rhino-phalangeal syndrome、Potoki-Shaffer syndrome、Neurofibromatosis I syndrome、Sotos syndrome、Craniosynostosis syndrome、Kallmann type2 syndrome、Kallmann type1 syndrome、Van der Woude syndrome、ZFHX1 B deletion syndrome、Blepharoph imosis and epicanthus syndrome、1p36症候群、Cat eye syndrome、Alagille syndrome、Diamond-Blackfan syndrome、Adrenal hypoplasia congenita syndrome、Steroid sulfatase syndrome、Digeorge syndrome、Russell-Silver syndrome、Duchenne Muscular Dystrophy、Pelizaeus Merzbacher Disease、及びサブテロメア異常疾患を検出することが可能である。
【００４８】
ケース1及び２の精神遅滞を伴う新規多発性奇形症群患児２名からＤＮＡを抽出し、Genome Disorder Arrayを用いたアレイＣＧＨ法での解析を常法に従い行ったが、その限りでは、ゲノム構造異常は検出されなかった。
【００４９】
（ｂ）MCG Whole Genome Array-4500を用いた解析
再び、ケース１及び２の患者の血液からＤＮＡを調製し、上記の要領にて製造される、MCG Whole Genome Array-4500を用いたアレイＣＧＨ法によるゲノム構造異常に関する解析を、下記の要領にて行なった。
【００５０】
ケース1及び２の精神遅滞を伴う新規多発性奇形症候群患児２名に由来するＤＮＡをBioPrime DNA labeling System (米国Invitrogen社)を用いてCy３-標識し、健常者由来のＤＮＡをCy５-標識した。両ＤＮＡを各々５０μl、それにCot-1 ＤＮＡ  (米国Invitrogen社)を２５０μl、３M NaOAc (米国Sigma社)を３５μl、１００％エタノールを８７５μl加え、−８０℃で１０分間冷やし、４℃で１５０００rpmの遠心分離を３０分間行なった。
【００５１】
一方、MCG Whole Genome Array-4500を沸騰した滅菌水中に２分間入れ、その後、７０％、８５％、１００％の冷エタノールに２分間ずつ浸して脱水し、乾燥させ、４２℃に保温した。ハイブリマスターHS-300（アロカ株式会社、東京）に上記処理を行なったMCG Whole Genome Array-4500をセットし、プレハイブリダイゼーション液（MM４０μl、yeast tRNA６μl、２０％SDS１２μl）を滴下し、１０分間４２℃でプレハイブリダイゼーションを行なった。その後、上記ＤＮＡを溶解したハイブリダイゼーション液（MM８０μl 、yeast tRNA１２μl 、２０％SDS２４μl）を滴下し、４２℃で４８〜７２時間のハイブリダイゼーションを行なった。MMとはMaster Mixの意味で、ホルムアミド５ｍｌ、硫酸デキストラン１ｇ、20×SSC １ｍｌを混合し、蒸留水を加えて７ｍｌにメスアップして十分に溶解した溶液である。
【００５２】
その後、アレイの洗浄は５０℃に保温した２×SSCを用いて１分間、さらに同条件で１０分間、５０℃に保温した５０％ホルムアミド／２×SSC(ｐＨ７．０)を用いて１０分間、４２℃に保温した１×SSCを用いて１０分間行なった。その後、十分に乾燥させ、GenePix4000B(米国Amersham Biosciences社)を用いてマイクロアレイを５３２nmレーザー光によりCy3蛍光を、６３５nmレーザー光によりCy5蛍光をスキャンした。Cy3蛍光とCy５蛍光はエネルギーが大きく異なるために全スポットから得られる値をCy3とCy5で同じ値になるように補正し、次に、各スポットでのCy3/Cy5の値（ratio）を求めた。これをLog変換しLog２(ratio)を求め、その値を縦軸に、横軸にはヒト１０番染色体(Chromosome10)の位置をMｂ単位の値で表示した（図２：縦軸はLog２(ratio)の値を、横軸は１０番染色体の短腕の先端から長腕の末端に至るまでの約144Mbの中の位置を表示した）。なお、図２は、図２Ａ（ケース１に関する）と図２Ｂ（ケース２に関する）で構成されている。
【００５３】
その結果、ケース１の患者では１０番染色体の10q24.32-q25.1に２．１Mbのヘミ接合体欠失が検出され、ケース２の患者では10q24.31-q25.1領域に最小で３．２Mbのヘミ接合体欠失が検出された。これらの欠失領域に認められたＢＡＣ  ＤＮＡは前者ではRP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-16H23、RP11-80B2、RP11-99N20、RP11-541N10、RP11-302K17、RP11-89G15、RP11-68M5であり、後者ではRP11-107I14、RP11-108L7、RP11-91A6、RP11-37L21、RP11-68M5、RP11-21N23、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-16H23、RP11-80B2、RP11-541N10、RP11-302K17、RP11-89G15、RP11-68M5、RP11-105N15、RP11-302K17、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12であった。ケース１とケース２を比較すると、RP11-551E2、RP11-416N2、RP11-18I14、RP11-30H12、RP11-16H23、RP11-80B2、RP11-541N10、RP11-302K17、RP11-89G15、RP11-21N23、RP11-99N20のＢＡＣ  ＤＮＡは両者で共通の領域に存在する。図３に、ケース１と２で見いだされたヘミ接合体欠失領域のマップを示した。
【００５４】
上記の実施例１により、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群は、10q24.32-q25.1におけるヘミ接合体欠失により判別可能であることが明らかになった。また、少なくとも、MCG Whole Genome Array-4500を用いて検出を行うことにより、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の判別が可能であることが明らかになった。
【００５５】
これらの結果により、10q24.32-q25.1におけるヘミ接合体欠失を検出可能な手段を講ずることによって、本発明の検出方法を行うことが可能であることが確かなものとなった。これは、例えば、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、又は、ＣＧＨ法等の、既知の遺伝子の解析方法において、当該遺伝子欠失変異を検出ターゲットとした常法に従い、10q24.32-q25.1におけるヘミ接合体欠失を検出して、精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の判別を行うことが可能であることを意味するものである。
【００５６】
以下に、MCG Whole Genome Array-4500以外の遺伝子検出基板を用いたＣＧＨ法による解析（実施例２）と、ＦＩＳＨ法による解析（実施例３）を例示するが、これらの手法により本発明の範囲が限定されるものではない。すなわち、本発明は、検出感度が上記遺伝子欠失変異を特定することが可能な限り、例えば、検体の遺伝子と10q24.32-q25.1に相当する核酸（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、ＰＡＣ  ＤＮＡ、又は、ＹＡＣ  ＤＮＡ等）とのハイブリダイゼーションによるシグナルの検出手法（ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、又は、ＣＧＨ法等）、あるいは、Ｇ分染法等の染色体検査等のハイブリダイゼーション以外の現象を検出原理とする手法により、広く行うことが可能である。
【００５７】
［実施例２］  Agilent 244Kオリゴアレイ（米国Agilent社）での解析
ケース１及びケース２の患者から調製したＤＮＡ（各々0.2μｇ）を用いて、アジレント社のオリゴaCGHマイクロアレイ244KタイプによるＣＧＨ法での解析を行った。244Kタイプのアレイはヒトゲノムの２３６０００以上のコード領域および非コード領域をカバーしており、ヒトゲノムの網羅的解析が可能である。プローブの平均分解能は６．４Kbである。解析の概要は次の通りでAgilent社のプロトコルに従って行った。
【００５８】
ケース１及びケース２の患者及び健常者に由来するＤＮＡ各々２．０μgを、各々２種類の制限酵素（AluIとRsaI）で消化し、Exo-Klenow fragmentを用いたニックトランスレーション法により、健常者由来のＤＮＡは蛍光色素Cy5を用いて、患者に由来するＤＮＡは蛍光色素Cy3を用いて標識した。標識したＤＮＡは、Microcon YM-30 filter unit（ミリポア社）を用いて精製した。
【００５９】
Cy3及びCy5で標識したＤＮＡを１５８μl 、１．０mg/ml Human Cot1 ＤＮＡを５０μl 、１０×Blocking Agent ５２μl 、２×Hybridization buffer ２６０μlを９５℃に加熱後、３７℃まで冷却した。この溶液４９０μlをAgilent 244Kオリゴヌクレオチドアレイを固定したガスケットスライド上にのせて、金具で固定して６５℃で４０時間ハイブリダイゼーションを行った。アレイのWashingは、室温のBuffer １液中で５分間、さらに３７℃に保ったBuffer ２液中で攪拌しながら1分間行った。本アレイを十分に乾燥させ、GenePix4000B(米国Amersham Biosciences社)を用いて、マイクロアレイを５３２nmレーザー光によりCy3蛍光を、６３５nmレーザー光によりCy5蛍光を、スキャンした。Cy3蛍光とCy５蛍光はエネルギーが大きく異なるために全スポットから得られる値をCy3とCy5で同じ値になるように補正し、次に、各スポットでのCy3/Cy5の値（Ratio）及びLog２(ratio)を求めた。その結果を図４に示すが、縦軸は「- Log２(ratio)」の値を横軸はケース１では１０番染色体の102.3Mb（Mb:メガベースの略称；詳細には102,368,279base）から106.9Mb（詳細には106,961,455base）までの4.59Mb（詳細には4,593,176base）の染色体の位置を示した。ケース２では横軸が１０番染色体の98.6Mb（詳細には98,668,221base）から110Mb（詳細には110,576,455base）までの11.9Mb（詳細には11,908,234base）の染色体の位置を示した。また、図４の左端には１０番染色体短腕と長腕の図とAgilent244Kオリゴアレイで解析した１０番染色体全体のCGH解析の図を示した。グレイの線及び点線はその右隣に記載した遺伝子の１０番染色体上の位置を示している。なお、図４は、図４Ａ（ケース１に関する）と図４Ｂ（ケース２に関する）で構成されている。
【００６０】
得られた結果は実施例１（ｂ）の結果と同様であり、欠失サイズを詳細に評価し得た。ケース１の患者では１０番染色体の10q24.32-q25.1にヘミ接合体欠失が検出され、欠失のサイズは２．1Mbであった。ケース２の患者では10q24.31-q25.1領域にヘミ接合体欠失が検出され、欠失のサイズは３．３Mbであった。図５に、ケース１と２で見いだされたヘミ接合体欠失領域のマップを示した。
【００６１】
［実施例３］  ＦＩＳＨ法による解析
精神遅滞を伴う多発性奇形症候群患者染色体中に10q24.31-10q25.1領域のヘミ接合体欠失があることを、ＦＩＳＨ法を用いて確認した。まず、本患者２名の血液よりリンパ球を調製し、メタフェーズ染色体を作製した。即ち、ヒトリンパ球を１２．５μｇ／ｍｌのPhytohemagglutininと共に3日間培養し、さらに、0.025μｇ／ｍｌのコルセミドを添加し数時間培養した後、上清を除き、0.075M KCl低張液を加え、３０分間静置した。続いて、上清を除いた後、カルノア液で固定を行い、スライドガラス上に染色体を展開しメタフェーズ染色体を作製した。
【００６２】
ヘミ接合体欠失領域（10q24.33）に含まれるＢＡＣ  ＤＮＡ（RP11-416N2）を、ニックトランスレーションキットを用いて１６℃でovernight反応し、 Digoxigenin-11-dUTPを取り込ませた。同様に、コントロールとして患者染色体中で欠失していない10q21.2領域に含まれるＢＡＣ  ＤＮＡ（RP11-357A18）を同様に反応させ、Biotin-16-dUTPを取り込ませた。次に、両標識ＢＡＣ  ＤＮＡを７５℃、１０分間加温し、氷冷後、メタフェーズ染色体上でハイブリダイゼーションを３７℃、overnight行った。 ハイブリダイゼーションをしなかったフリーの標識ＢＡＣ  ＤＮＡの洗浄は５０％ホルムアミド/2xSSC(pH7.0)を用いて３７℃で１５分、続いて2xSSCを用いて室温で１５分間、さらに、1xSSCを用いて室温で１５分間行った。次に、蛍光標識を行うために、０．０２mg/ml Avidin-FITC及び１．２μｇ／ｍｌ Anti-Digoxigenin-rhodamineを加えてメタフェーズ染色体上で、３７℃で１時間反応させた。次に、4xSSCを用いて室温で１０分間、さらに０．０５％ Triton-X-100を含む4xSSCを用いて室温で１０分間、4xSSCを用いて室温で１０分間洗浄を行った。メタフェーズスライドは遠心分離により乾燥させた後、１２５ng/ml 4’,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI)を1滴たらし、カバーグラスを載せ、顕微鏡観察を行い、顕微鏡写真を撮影した。その結果、コントロールのRP11-357A18のＢＡＣ  ＤＮＡは2例共１０番染色体長腕の二本の染色体を緑色蛍光で染色したが、欠失領域の10q24.33に含まれるRP11-416N2のＢＡＣ  ＤＮＡは１０番染色体長腕の一本の染色体だけを赤色蛍光で染色した（図６）。これはケース１及び２の患者で10q24.33の領域がヘミ接合体欠失していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の2例について染色体の同じ領域（10q24-10q25）のヘミ接合体欠失が原因である事を見いだした。その結果、染色体の10q24-10q25領域の異常の有無を検査する事により精神遅滞を伴う多発性奇形症候群の疾患を確定診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】精神遅滞を伴う多発性奇形症候群のゲノム異常を同定するスキームを例示した図面である。
【図２Ａ】本実施例のケース１(Case 1)の場合のMCG Whole Genome Array-4500を用いたアレイCGH解析での蛍光強度比を指標とした結果を示した写真である。
【図２Ｂ】本実施例のケース２(Case 2)の場合のMCG Whole Genome Array-4500を用いたアレイCGH解析での蛍光強度比を指標とした結果を示した写真である。
【図３】本実施例のMCG Whole Genome Array-4500を用いた解析結果のゲノム異常領域のマッピングを示した写真である。
【図４Ａ】本実施例のケース１(Case 1)の場合のAgilent244Kオリゴアレイを用いた解析での蛍光強度比を指標とした結果を示した写真である。
【図４Ｂ】本実施例のケース２(Case ２)の場合のAgilent244Kオリゴアレイを用いた解析での蛍光強度比を指標とした結果を示した写真である。
【図５】本実施例のAgilent244Kオリゴアレイでの解析結果のゲノム異常領域のマッピングを示した写真である。
【図６】本実施例の正常ヒトリンパ球の染色体標本を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いて染色体の欠失を解析した結果を示す写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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