(57)【要約】【課題】持続的に血糖を制御するための組成物、および哺乳動物のインシュリン非依存性糖尿病の治療法を提供すること。【解決手段】グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびその関連ペプチドを持続的に投与することよりなる、哺乳動物のインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療法、ならびにそれらのペプチドの投与を持続させるための組成物（ここで、ＧＬＰ−１は、膵臓および腸管内で処理される間に、ＧＬＰ−１のアミノ酸７−３７を含む３１アミノ酸のペプチドに変換され、このペプチドは向インシュリン活性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をもち、すなわちホルモンであるインシュリンの合成または発現を刺激し、または刺激の原因となりうる）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病を治療するための組成物および方法に関するものである。より詳細には、本発明はグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびその誘導体の投与を持続させる組成物に関するものである。これらの組成物はインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は下記のとおりであることが知られている：
【０００３】
【化２】
2010006841.tif 000002
【０００４】
ＧＬＰ−１は、ロペツ（Ｌｏｐｅｚ，Ｌ．Ｃ．）ら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ８０：５４８５−５４８９（１９８３）；ベル（Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｉ．）ら，Ｎａｔｕｒｅ３０２：７１６−７１８（１９８３）；ハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｇ．）ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：２１７６−２１８１（１９８４）およびギグリオン（Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ，Ｍ．）ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ２７：５９９−６００（１９８４）に提示されている。
【０００５】
ＧＬＰ−１は、膵臓および腸管内で処理される間に、ＧＬＰ−１のアミノ酸７−３７を含む３１アミノ酸のペプチドに変換される。以下、このペプチドをＧＬＰ−１（７−３７）と呼ぶ。
【０００６】
このペプチドは向インシュリン活性（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をもち、すなわちホルモンであるインシュリンの合成または発現を刺激し、または刺激の原因となりうる。この向インシュリン活性のため、ＧＬＰ−１（７−３７）はインシュリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）とも呼ばれる。
【０００７】
ＧＬＰ−１（７−３７）は下記のアミノ酸配列をもつ：
【０００８】
【化３】
2010006841.tif 000003
【０００９】
ＧＬＰ−１（７−３７）、その特定の誘導体、およびそれらを哺乳動物において糖尿病の治療に用いることは、米国特許第５，１１８，６６６号（’６６６特許）および第５，１２０，７１２号（’７１２特許）明細書に示されており、これらの明細書の記載を本明細書に参考として引用する。’６６６および’７１２特許明細書に示されるＧＬＰ−１（７−３７）の誘導体には、天然の配列に存在しないアミノ酸を含むか、または１もしくは２以上のアミノ酸を欠如するポリペプチドが含まれる。’６６６および’７１２特許明細書に示される他のＧＬＰ−１（７−３７）誘導体には、特定のＣ−末端塩、エステルおよびアミドが含まれ、その場合塩類およびエステルはＯＭと定義され、そこでＭは薬剤学的に許容しうるカチオンまたは低級（Ｃl−Ｃ6）の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基であり、アミドは−ＮＲ2Ｒ3と定義され、そこでＲ2およびＲ3は同一であるか、または異なり、水素および低級（Ｃl−Ｃ6）の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基よりなる群から選ばれる。
【００１０】
トランケートしたＧＬＰ−１またはトランケートしたインシュリノトロピンとも呼ばれる、向インシュリン活性をもつ特定の他のポリペプチド、およびそれらの誘導体が、国際特許出願ＵＳ８９／０１１２１（ＷＯ９０／１１２９６）号明細書に示されている。そこでＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）およびＧＬＰ−１（７−３４）と呼ばれているポリペプチドは、それぞれ下記のアミノ酸配列をもつ：
【００１１】
【化４】
2010006841.tif 000004
【００１２】
国際特許出願ＵＳ８９／０１１２１号明細書に示されているポリペプチドの誘導体には、キャリヤー蛋白質への結合を高めるための、またはその向インシュリン効果を高めるための、本質的な効果に影響を及ぼさない（ｉｎｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）アミノ酸置換、または追加のアミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。国際特許出願ＵＳ８９／０１１２１号明細書に示されている他のインシュリノトロピン誘導体には、特定のＣ−末端塩、エステルおよびアミドが含まれ、その場合塩類およびエステルはＯＭと定義され、そこでＭは薬剤学的に許容しうるカチオンまたは低級の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基であり、アミドは−ＮＲ2Ｒ3と定義され、そこでＲ2およびＲ3は同一であるか、または異なり、水素および低級の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基よりなる群から選ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、持続的に血糖を制御するための組成物、および哺乳動物のインシュリン非依存性糖尿病の治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１形態においては本発明は、各投与後に持続性作用を伴う化合物を長期間にわたって反復投与することよりなる、インシュリン非依存性糖尿病の治療を必要とする哺乳動物におけるその治療方法において、持続性作用が哺乳動物における持続的な血糖制御を達成するために必要なものであり、化合物が下記よりなる群から選ばれる方法に関するものである：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００１５】
【化５】
2010006841.tif 000005
【００１６】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００１７】
【化６】
2010006841.tif 000006
【００１８】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００１９】
【化７】
2010006841.tif 000007
【００２０】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００２１】
【化８】
2010006841.tif 000008
【００２２】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）−（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド。
【００２３】
投与が皮下になされる方法が好ましい。
【００２４】
投与が筋肉内になされる方法も好ましい。
【００２５】
投与が経皮的になされる方法も好ましい。
【００２６】
投与が注入ポンプによりなされる方法も特に好ましい。
【００２７】
投与が経口吸入によりなされる方法も好ましい。
【００２８】
投与が鼻内吸入によりなされる方法も好ましい。
【００２９】
投与が胃腸内になされる方法も好ましい。
【００３０】
他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００３１】
【化９】
2010006841.tif 000009
【００３２】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００３３】
【化１０】
2010006841.tif 000010
【００３４】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００３５】
【化１１】
2010006841.tif 000011
【００３６】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００３７】
【化１２】
2010006841.tif 000012
【００３８】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）−（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学的
に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）持続的な血糖制御を達成するために上記化合物の作用を持続させうるポリマー。
【００３９】
ポリマーが低分子量ポリマーである組成物が特に好ましい。
【００４０】
さらにポリマーが下記よりなる群から選ばれる組成物が特に好ましい：ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、下記よりなる群から選ばれる多糖類：セルロース、セルロース誘導体、キトサン、アラビアゴム、カラヤゴム、グアーゴム、キサンタンゴム、トラガカント、アルギン酸、カラジーナン、アガロースおよびフルセララン（ｆｕｒｃｅｌｌａｒａｎｓ）、デキストラン、デンプン、デンプン誘導体、ヒアルロン酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリアンヒドリドならびにポリオルトエステル。ポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンよりなる群から選ばれるポリマーが特に好ましい。
【００４１】
他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００４２】
【化１３】
2010006841.tif 000013
【００４３】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００４４】
【化１４】
2010006841.tif 000014
【００４５】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００４６】
【化１５】
2010006841.tif 000015
【００４７】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００４８】
【化１６】
2010006841.tif 000016
【００４９】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）上記化合物の作用を持続させうる薬剤学的に許容しうる水−非混和性の油懸濁液。
【００５０】
持続的な血糖制御を達成することができる組成物が好ましい。
【００５１】
油がラッカセイ油、ゴマ油、アーモンド油、ヒマシ油、ツバキ油、綿実油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油、ベニバナ油、ヤシ油、脂肪酸エステルおよび脂肪アルコールエステルよりなる群から選ばれる組成物が特に好ましい。
【００５２】
さらに、湿潤剤、特に非イオン界面活性剤をさらに含む組成物が特に好ましい。
【００５３】
さらにまた、懸濁化剤をさらに含む組成物が特に好ましい。
【００５４】
他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００５５】
【化１７】
2010006841.tif 000017
【００５６】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００５７】
【化１８】
2010006841.tif 000018
【００５８】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００５９】
【化１９】
2010006841.tif 000019
【００６０】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００６１】
【化２０】
2010006841.tif 000020
【００６２】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）ペプチドとのコンプレックスを形成した亜鉛（ＩＩ）。
【００６３】
持続的な血糖制御作用を達成することができる組成物が好ましい。
【００６４】
持続的な血糖制御作用を達成することができる水性懸濁液である組成物が好ましい。
【００６５】
亜鉛生成物が非晶質である組成物が特に好ましい。
【００６６】
亜鉛生成物が結晶質である組成物も特に好ましい。
【００６７】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００６８】
【化２１】
2010006841.tif 000021
【００６９】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００７０】
【化２２】
2010006841.tif 000022
【００７１】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００７２】
【化２３】
2010006841.tif 000023
【００７３】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００７４】
【化２４】
2010006841.tif 000024
【００７５】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｋ（Ｉ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）よりなる群から選ばれる金属。
【００７６】
持続的な血糖制御を達成することができる組成物が好ましい。
【００７７】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００７８】
【化２５】
2010006841.tif 000025
【００７９】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００８０】
【化２６】
2010006841.tif 000026
【００８１】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００８２】
【化２７】
2010006841.tif 000027
【００８３】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００８４】
【化２８】
2010006841.tif 000028
【００８５】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学的
に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）塩基性ポリペプチド；
であって、持続的に血糖を制御することができる水性懸濁液である組成物。
【００８６】
塩基性ポリペプチドがプロタミンである組成物が特に好ましい。
【００８７】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００８８】
【化２９】
2010006841.tif 000029
【００８９】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００９０】
【化３０】
2010006841.tif 000030
【００９１】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ―Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【００９２】
【化３１】
2010006841.tif 000031
【００９３】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有
するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【００９４】
【化３２】
2010006841.tif 000032
【００９５】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）フェノール系化合物；
であって、持続的に血糖を制御することができる水性懸濁液である組成物。
【００９６】
フェノール系化合物がフェノール、クレゾール、レゾルシンおよびメチルパラベンよりなる群から選ばれる組成物が特に好ましい。
【００９７】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００９８】
【化３３】
2010006841.tif 000033
【００９９】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１００】
【化３４】
2010006841.tif 000034
【０１０１】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【０１０２】
【化３５】
2010006841.tif 000035
【０１０３】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【０１０４】
【化３６】
2010006841.tif 000036
【０１０５】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）塩基性ポリペプチドおよびフェノール系化合物；
であって、持続的に血糖を制御することができる水性懸濁液である組成物。
【０１０６】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１０７】
【化３７】
2010006841.tif 000037
【０１０８】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１０９】
【化３８】
2010006841.tif 000038
【０１１０】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【０１１１】
【化３９】
2010006841.tif 000039
【０１１２】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有
するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【０１１３】
【化４０】
2010006841.tif 000040
【０１１４】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）塩基性ポリペプチド、フェノール系化合物および金属イオン；
であって、持続的に血糖を制御することができる水性懸濁液である組成物。
【０１１５】
塩基性ポリペプチドがプロタミンである組成物が好ましい。
【０１１６】
金属イオンが亜鉛である組成物も好ましい。
【０１１７】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１１８】
【化４１】
2010006841.tif 000041
【０１１９】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１２０】
【化４２】
2010006841.tif 000042
【０１２１】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【０１２２】
【化４３】
2010006841.tif 000043
【０１２３】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有
するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【０１２４】
【化４４】
2010006841.tif 000044
【０１２５】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）非晶質または結晶質の物質を生成する条件下で処理された上記ペプチドおよびそれらの誘導体。
【０１２６】
その条件が高剪断、塩類への暴露、またはそれらの組み合わせである組成物が好ましい。
【０１２７】
塩類が硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、塩化リチウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸アンモニウムおよび蟻酸ナトリウム、ならびにそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる組成物が特に好ましい。
【０１２８】
さらに他の形態においては本発明は、下記よりなる組成物に関するものである：
（ｉ）下記よりなる群から選ばれる化合物：
（ａ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１２９】
【化４５】
2010006841.tif 000045
【０１３０】
（ｂ）下記のアミノ酸配列を有するペプチド：
【０１３１】
【化４６】
2010006841.tif 000046
【０１３２】
式中のＸは下記よりなる群から選ばれる：
（Ａ）Ｌｙｓ、
（Ｂ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、および
（Ｃ）Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；
（ｃ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｗ−ＣＯＯＨ
式中のＷは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列であり：
【０１３３】
【化４７】
2010006841.tif 000047
【０１３４】
これらの誘導体は哺乳動物において処理された際に向インシュリン活性を有
するポリペプチド誘導体を生じる；
（ｄ）下記の一次構造よりなるポリペプチドの誘導体：
Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＣＯＯＨ
式中のＲは下記よりなる群から選ばれるアミノ酸配列である：
【０１３５】
【化４８】
2010006841.tif 000048
【０１３６】
ならびに
（ｅ）ペプチド（ａ）―（ｄ）の誘導体であって、下記よりなる群から選ばれる誘導体：
（１）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる酸付加塩；
（２）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるカルボキシレート塩；
（３）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアルカリ付加塩；
（４）該ペプチドの薬剤学的に許容しうる低級アルキルエステル；
ならびに
（５）該ペプチドの薬剤学的に許容しうるアミドであって、アミド、低級ア
ルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドよりなる群から選ばれる薬剤学
的に許容しうるアミド；
ならびに
（ｉｉ）リポソームデリバリーシステム。
【０１３７】
持続的な血糖制御を達成することができる組成物が好ましい。
【０１３８】
リポソームがリン脂質系のものである組成物が特に好ましい。
【０１３９】
リポソームが非リン脂質系のものである組成物も特に好ましい。
【０１４０】
また本発明は、本発明の組成物を長期間投与することよりなる、インシュリン非依存性糖尿病の治療を必要とする哺乳動物においてそれを治療することに関するものである。
【発明の効果】
【０１４１】
本発明によれば、持続的に血糖を制御するための組成物、および哺乳動物のインシュリン非依存性糖尿病の治療法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】４ｎｇ／ｋｇ／分のインシュリノトロピンの長期注入（７時間）がインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を伴う患者の血漿中グルコース水準に及ぼす作用を示す。
【図２】１０ｎｇ／ｋｇ／分のインシュリノトロピンの短期注入（６０分間）がＮＩＤＤＭを伴う患者の血漿中グルコース水準に及ぼす作用を示す。
【図３】２ｎｇ／ｋｇ／分および４ｎｇ／ｋｇ／分のインシュリノトロピンの長期注入（７時間）がＮＩＤＤＭを伴う患者の血漿中グルコース水準に及ぼす作用を示す。
【図４】ラットに種々の水性懸濁液（ＡＳ）中における１回量０．５ｍｇ／０．５ｍｌを皮下投与したのちのインシュリノトロピンの平均（ｎ＝３）血漿中濃度を示す。
【図５】ラットに種々の水性懸濁液（ＡＳ）中における１回量０．５ｍｇ／０．５ｍｌを皮下投与したのちのインシュリノトロピンの平均（ｎ＝３）血漿中濃度を示す。
【図６】ラットに種々の水性懸濁液（ＡＳ）中における１回量０．５ｍｇ／０．５ｍｌを皮下投与したのちのインシュリノトロピンの平均（ｎ＝３）血漿中濃度を示す。
【図７】ラットに種々の水性懸濁液（ＡＳ）中における１回量０．５ｍｇ／０．５ｍｌを皮下投与したのちのインシュリノトロピンの平均（ｎ＝３）血漿中濃度を示す。
【図８】ラットに種々の水性懸濁液（ＡＳ）中における１回量０．５ｍｇ／０．１３ｍｌを皮下投与したのちのインシュリノトロピンの平均（ｎ＝３）血漿中濃度を示す。
【図９】ラットに種々の水性懸濁液（ＡＳ）中における１回量０．５ｍｇ／０．１３ｍｌを皮下投与したのちのインシュリノトロピンの平均（ｎ＝３）血漿中濃度を示す。
【図１０】インシュリノトロピン亜鉛沈殿の薬物動態研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
持続的に血糖を制御するための組成物、および哺乳動物のインシュリン非依存性糖尿病の治療法を提供する。
ＧＬＰ−１（７−３７）およびその関連ペプチドを持続的に投与することよりなる、哺乳動物のインシュリン非依存性糖尿病の治療法が開示される。それらのペプチドの投与を持続させるための組成物も開示される。
【０１４４】
特に指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通して用いられる”誘導体”という語は、提示された一次構造を構成するポリペプチドにおいて、そのＣ−末端に１個または２個以上のＬ−アミノ酸が含まれるもの；Ｃ−末端カルボキシル基が（Ｃ1−Ｃ6）直鎖または分枝鎖アルキル基を含むエステルを形成したもの；Ｃ−末端カルボキシル基がカルボキシアミドまたは置換カルボキシアミドを形成したもの；酸性アミノ酸残基（Ａｓｐおよび／またはＧｌｕ）がエステルまたはカルボキシアミドを形成したもの；およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【０１４５】
上記ペプチドに対する相同性をもつポリペプチドであって、その相同性がそれらのポリペプチドに向インシュリン活性を付与するのに十分なものが本発明の範囲に含まれる。上記ポリペプチドの変異体であって、その変異体が本質的な効果に影響を及ぼさないアミノ酸の置換からなり、かつ向インシュリン活性をもつものも本発明の範囲に含まれる。
【０１４６】
グルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、その単離、解明、および糖尿病の治療に使用することは、米国特許第５，１１８，６６６および５，１２０，７１２号明細書に示されており、これらの特許明細書の記載全体を本明細書に参考として引用する。
【０１４７】
本発明においては、インシュリン非依存性糖尿病を伴う患者において、食事その他に際し持続的な血糖制御を達成するために、ＧＬＰ−１および関連ポリペプチドを血漿中に持続的に増加させるのが必要であることが見出された。意外にも、ＧＬＰ−１および関連ペプチドを食事時間付近で最高１時間増加させるだけではグルコース水準が適切に制御されないことが認められた。従ってＧＬＰ−１および関連ペプチドの投与には持続的なデリバリーシステムが必要とされる。この持続的なデリバリーシステムによってインシュリンの作用が増強される。
【０１４８】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して用いられる”インシュリンの作用の増強”という句には、インシュリン合成の増加、インシュリン分泌の増加、筋肉および脂肪によるグルコース取り込みの増加、ならびに肝臓によるグルコース産生の減少のうち１または２以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の各種方法により製造される。たとえばこれらのポリペプチドは自動ペプチド合成装置、たとえばアプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）４３０Ａ固相ペプチド合成装置により合成することができる。あるいは本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができ、この場合そのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が発現ベクターに作動的に結合しており、これを用いて適宜な宿主細胞を形質転換する。この形質転換された細胞を、次いでポリペプチドが発現される条件下で培養する。次いでポリペプチドを培養物から採取する。さらにまた、合成法および組換えＤＮＡ技術を併用して、本発明のアミドおよびエステル誘導体を製造し、および／または目的とするポリペプチドのフラグメントを製造し、次いでこれを当業者に周知の方法で結合させることができる。
【０１５０】
本発明によるポリペプチドの誘導体は、当業者に周知の方法により製造される。たとえば本発明のポリペプチドのＣ−末端アルキルエステル誘導体は、目的とする（Ｃ1−Ｃ6）アルカノールと目的とするポリペプチドを、触媒酸、たとえばＨＣｌの存在下で反応させることにより製造される。このアルキルエステル形成に適した反応条件には、約５０℃の反応温度および約１−約３時間の反応時間が含まれる。同様にポリペプチド内にＡｓｐおよび／またはＧｌｕ残基の（Ｃ1−Ｃ6）アルキルエステルを含む本発明のポリペプチドの誘導体を、こうして製造することができる。
【０１５１】
本発明のポリペプチドのカルボキシアミド誘導体も当業者に周知の固相ペプチド合成法により製造される。たとえば下記を参照されたい：Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．）ら，パース・ケム出版社，１９８４。
【０１５２】
上記の代わりに、または上記と組み合わせて、塩基性アミノ酸残基を異なる塩基性アミノ酸残基と、または酸性もしくは中性アミノ酸残基と交換するか、あるいは酸性アミノ酸残基を異なる酸性アミノ酸残基と、または塩基性もしくは中性アミノ酸残基と交換するか、あるいは中性アミノ酸残基を異なる中性アミノ酸残基と、または酸性もしくは塩基性アミノ酸残基と交換することにより、そのポリペプチドに対するＤＮＡコード配列を修飾することによって本発明のポリペプチドの誘導体を製造しうる。このようなポリペプチドの一次配列の変化は、誘導体の直接合成によっても達成しうる。それらの方法は当業者に周知である。もちろん、本発明を実施する際に有用であるためには、これらの誘導体は向インシュリン作用を達成しなければならない。
【０１５３】
本発明によるポリペプチド誘導体の向インシュリン活性は下記により測定される。
【０１５４】
正常なラットの膵臓組織からランゲルハンス島をランシー（Ｌａｎｃｙ，Ｐ．Ｅ）ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１６：３５−３９（１９６７）の方法の変法により摘出する。この方法においては、膵臓組織のコラーゲナーゼ消化物をフィコール濃度勾配（ハンクの平衡塩類溶液中２７％、２３％、２０．５％および１１％、ｐＨ７．４）において分離する。ランゲルハンス島を２０．５％／１１％界面から採取し、洗浄し、立体顕微鏡下に外分泌組織および他の組織を手作業で取り除く。１０％ウシ胎仔血清を補充され、かつ１１ｍＭグルコースを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃および９５％空気／５％ＣＯ2にお
いて、ランゲルハンス島を一夜インキュベートする。次いで１０％ウシ胎仔血清を補充され、かつ５．６ｍＭグルコースを含有するＲＰＭＩ１６４０培地にランゲルハンス島を移す。３７℃および９５％空気／５％ＣＯ2において６０分間、ランゲルハンス島をインキ
ュベートする。１０％ウシ胎仔血清を補充され、かつ１６．７ｍＭグルコースを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中において、検査すべきポリペプチド誘導体を１ｎＭおよび１０ｎＭ濃度に調製する。次いで８−１０個の摘出されたランゲルハンス島を、９６ウェルのミクロタイター皿内の全容量２５０μｌポリペプチド誘導体含有培地に移す。ランゲルハンス島をポリペプチド誘導体の存在下で３７℃および９５％空気／５％ＣＯ2において９０
分間インキュベートする。次いでランゲルハンス島を含まない培地のアリコートを採取し、その１００μｌをインシュリンの存在量につき、ラジオイムノアッセイ法により、イクエート・インシュリンＲＩＡキット（Ｅｑｕａｔｅ  ＩｎｓｕｌｉｎＲＩＡＫｉｔ）（
バイナックス社、メイン州ポートランド）を用いてアッセイする。
【０１５５】
成人発症糖尿病の治療に有効な用量は、本発明のポリペプチド誘導体をたとえば静脈内、筋肉内または皮下に投与する場合、１日当たり約１ｐｇ／ｋｇ−１，０００μｇ／ｋｇであろう。食事中および食間での静脈注入のための好ましい用量範囲は、１００ｋｇの患者を基準として約４−１０ｎｇ／ｋｇ／分または約０．６−１．４μｇ／ｋｇ／日である。ただしこの範囲外の用量も可能であり、本発明の範囲に含まれることを認識すべきである。適切な用量は処方する医師が決定し、治療される症状の程度、および投与される誘導体により達成される反応、ならびに患者の年齢、体重、性別および病歴に応じて決定されるであろう。
【０１５６】
持続投与は皮下、筋肉内もしくは経皮的手段により、経口吸入、鼻内吸入により、胃腸内に、または注入ポンプを用いて行うことができる。
【０１５７】
ＧＬＰ−１および関連ペプチドの持続投与は、各種の水溶性ポリマー中における溶液としての配合物によっても達成しうる。これらのポリマーは一般に低分子量（＜１５ｋＤａ）のポリマーである。限定ではないこれらの低分子量ポリマーの例には、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。これより高い分子量のポリマーも使用しうる。限定ではない、より高い分子量のポリマーの例には、多糖類、たとえばセルロース、セルロース誘導体、キトサン、アラビアゴム、カラヤゴム、グアーゴム、キサンタンゴム、トラガカント、アルギン酸、カラジーナン、アガロースおよびフルセラランが含まれる。後者の場合、インビボで酵素により、または加水分解により分解されるポリマー、たとえばデキストラン；デンプンおよびその誘導体、ヒアルロン酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリアンヒドリドおよびポリオルトエステルが好ましい。低分子量ポリマーまたは生物分解性ポリマーを用いることにより、高分子量の生物非分解性ポリマーに伴う組織蓄積が避けられる。配合物は一般に約１ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１または関連ペプチドを含有し、濃度はポリマーに依存するが、一般に最高で５０ｃｐｓの粘度に達する濃度であり、かつ適切な緩衝剤、張性調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）および防腐剤を含有しうる。ラットおよびヒトにおけるインビボデータは、たとえば測定可能な血中インシュリノトロピン水準を最高で２４時間達成しうることを証明する。これに対し、たとえばリン酸緩衝食塩液中に配合されたインシュリノトロピンは急激に（約１５分）ピーク血漿中水準に達し、わずか４時間を越えると血漿中水準は検出限界未満にまで低下する。時間に対する血漿中濃度のプロットは、たとえば注射部位からのインシュリノトロピン吸収がポリマーの存在下では著しく減少したことを示唆する。
【０１５８】
ＧＬＰ−１および関連ペプチドは、薬剤学的に許容しうる油に懸濁された粒子として配合されてもよい。好ましい油はトリグリセリドである。これらの油の限定ではない例には、ラッカセイ油、ゴマ油、アーモンド油、ヒマシ油、ツバキ油、綿実油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油、ベニバナ油およびヤシ油が含まれる。油が水と非混和性であり、かつペプチドに対する貧溶媒である限り、他の群の油、たとえば脂肪酸のエステルおよび脂肪アルコールのエステルも許容される。配合物は適切な防腐剤、湿潤剤および懸濁化剤をも含有しうる。たとえば配合物中のインシュリノトロピンの重量％は、０．０１−１０％である。ラットにおけるインビボデータは、たとえば測定可能な血中インシュリノトロピン水準を最高で２４時間達成しうることを証明する。これに対し、たとえばリン酸緩衝食塩液中に配合されたインシュリノトロピンは急激に（約１５分）ピーク血漿中水準に達し、わずか４時間を越えると血漿中水準は検出限界未満にまで低下する。時間に対する血漿中濃度のプロットは、たとえば注射部位からのインシュリノトロピン吸収が油懸濁液中では著しく減少したことを示唆する。
【０１５９】
ＧＬＰ−１および関連ペプチドは、金属イオン、好ましくは塩の形のものと組み合わせることにより、低溶解性投与形態のものとして配合されてもよい。この組み合わせにより、非晶質または結晶質である組成物が得られる。好ましいイオンは亜鉛（ＩＩ）である。Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｋ（Ｉ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）を含めた他の金属イオンも使用しうる。
【０１６０】
他の形態の持続投与には、多重ラメラまたは単一ラメラのリポソームが含まれ、その製法は当業者に周知である。リポソームは多重ラメラまたは単一ラメラのいずれも、リン脂質系または非リン脂質系のいずれであってもよい。
【０１６１】
他の形態の持続投与は、沈殿剤、たとえばフェノール系化合物もしくは塩基性ポリペプチドまたは金属イオンもしくは塩類を用いて、および／または高剪断力を用いて形成された、インシュリノトロピン沈殿または凝集物の水性懸濁液である。２種以上の沈殿剤を同時に用いることができる。沈殿は結晶質または非晶質のいずれであってもよい。
【０１６２】
インシュリノトロピン結晶は、水中における薬物溶液からｐＨ勾配（高から低へ、または低から高へ）および／または温度勾配および／または塩類を用いて溶解度を低下させることにより得られる。塩類には、クエン酸アンモニウム、リン酸ナトリウムまたはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウムまたはアンモニウム、酢酸ナトリウムまたはアンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸アンモニウム、蟻酸ナトリウム、および薬物の溶解度を低下させうる他のいずれかの塩類が含まれる。結晶化のために用いられる塩類が薬剤学的に許容しうるものでない場合、結晶化が完了したのち母液を薬剤学的に許容しうる媒質と交換することができる。目的とする薬物動態プロフィルを達成するためにさらに薬物溶解度を低下させる必要がある場合、結晶を金属イオン、たとえば亜鉛もしくはカルシウム、および／またはフェノール系化合物で処理することができる。この処理は、単にこれらの添加物を結晶懸濁液に添加することにより実施しうる。
【０１６３】
インシュリノトロピン沈殿または凝集物の溶解度は生理的条件下で１μｇ／ｍＬ以下から５００μｇ／ｍＬにまで及びうる。ラットにおけるインビボデータは、これらの配合物が測定可能な血中インシュリノトロピン水準をたとえば少なくとも３０時間達成しうることを証明する。
【０１６４】
上記の配合物に用いられる水性媒質は、注射に使用しうるいずれかの種類の緩衝剤系、または純水であってもよい。最終配合物のｐＨは、配合物が注射可能である限りいかなる値であってもよい。プロタミンをいずれかの塩の形（たとえば硫酸塩、塩化物など）で、またはプロタミン塩基として添加することができる。配合物の調製のために使用しうる成分の濃度範囲の例は下記のとおりである：フェノール（０．５−５．０ｍｇ／ｍｌ）、ｍ−クレゾール（０．５−５．５ｍｇ／ｍｌ）、プロタミン（０．０２−１．０ｍｇ／ｍｌ）、亜鉛（０．１０−６、亜鉛／インシュリノトロピン、モル比）、塩化ナトリウム（最高１００ｍｇ／ｍｌ）およびリン酸緩衝液（５−５００ｍＭ）。
【０１６５】
他のフェノール系または非フェノール系化合物も使用しうる。それらの化合物の限定ではない例には、レゾルシン、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロクレゾール、クレゾール、ベンズアルデヒド、カテコール、ピロガロール、ハイドロキノン、没食子酸ｎ−プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンが含まれる。塩基性ポリペプチドの限定ではない例は、ポリリシン、ポリアルギニンなどである。従って、本明細書において「塩基性ポリペプチド」とは、プロタミン、ポリリシンまたはポリアルギニンの塩基性と実質的に同等か、またはそれ以上の塩基性を有するポリペプチドをいう。
【実施例】
【０１６６】
以上、本発明を一般的に述べたが、以下に個々の例につき述べる。これらの例は本発明を限定するためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲の記載によって定められると解すべきである。
【０１６７】
（実施例１）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ１の調製
１０ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４ｍｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）をフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。フラスコを満たすのに十分なＰＢＳ（適量）を添加した。２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。両フラスコの内容物を、ガラス注射器により０．２２μのフィルター（蛋白質結合が低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過することにより混和した。溶液Ａ１はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１６８】
溶液Ｂ１の調製
８ｍｇの硫酸プロタミンおよび４４ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。適量のＰＢＳを添加して、硫酸プロタミンおよびフェノールを溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合が低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ１はプロタミン塩基０．６ｍｇ／ｍｌおよびフェノール４．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１６９】
水性懸濁液１
１．５ｍｌの溶液Ａ１を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ１をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間緩和に撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液１はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．３ｍｇ／ｍｌ、およびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１７０】
（実施例２）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２の調製
１０ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。両フラスコの内容物を、ガラス注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過することにより混和した。溶液Ａ２はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１７１】
溶液Ｂ２の調製
２ｍｇの硫酸プロタミンおよび４４ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。適量のＰＢＳをフラスコに添加して、硫酸プロタミンおよびフェノールを溶解した。この溶液を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ２はプロタミン塩基０．１５ｍｇ／ｍｌおよびフェノール４．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１７２】
水性懸濁液２
１．５ｍｌの溶液Ａ２を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液２はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．０７５ｍｇ／ｍｌ、およびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１７３】
（実施例３）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ３の調製
２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ３を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ３はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１７４】
溶液Ｂ３の調製
８ｍｇの硫酸プロタミン、４４ｍｇのフェノールおよび３２３ｍｇのグリセリンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。適量のＰＢＳをフラスコに添加して、硫酸プロタミン、フェノールおよびグリセリンを溶解した。この溶液を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ３はプロタミン塩基０．６ｍｇ／ｍｌ、フェノール４．４ｍｇ／ｍｌ、およびグリセリン３２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１７５】
水性懸濁液３
１．５ｍｌの溶液Ａ３を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ３をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液３はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．３ｍｇ／ｍｌ、フェノール２．２ｍｇ／ｍｌ、およびグリセリン１６ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１７６】
（実施例４）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ４の調製
２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ４を、注射器により０．２２μのフィルター（ミリポア、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）−ＧＶ）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ４はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１７７】
溶液Ｂ４の調製
８ｍｇの硫酸プロタミンおよび５２ｍｇのｍ−クレゾールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。適量のＰＢＳをフラスコに添加して、硫酸プロタミンおよびｍ−クレゾールを溶解した。この溶液を注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ４はプロタミン塩基０．６ｍｇ／ｍｌおよびｍ−クレゾール５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１７８】
水性懸濁液４
１．５ｍｌの溶液Ａ４を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ４をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、結晶を形成させた。水性懸濁液４はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．３ｍｇ／ｍｌ、およびｍ−クレゾール２．５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１７９】
（実施例５）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ５の調製
５０ｍｇのインシュリノトロピンを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ５を、注射器により０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ５はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１８０】
フェノール原液の調製
０．４４ｇのフェノールを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約９５ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。得られた溶液（フェノール４．４ｍｇ／ｍｌ）を溶液Ｂ５の調製に用いた。
【０１８１】
溶液Ｂ５の調製
２５ｍｌのフェノール原液を０．２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過することにより、溶液Ｂ５を調製した。溶液Ｂ５はフェノール４．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１８２】
水性懸濁液５
１．２５ｍｌの溶液Ａ５を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．２５ｍｌの溶液Ｂ５をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液５はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１８３】
（実施例６）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ６の調製
５０ｍｇのインシュリノトロピンを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ６を、注射器により０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ６はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１８４】
フェノール原液の調製
０．４４ｇのフェノールを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約９５ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。得られた溶液（フェノール４．４ｍｇ／ｍｌ）を溶液Ｂ６の調製に用いた。
【０１８５】
溶液Ｂ６の調製
下記により溶液Ｂ６を調製した。１．２５ｍｇの硫酸プロタミンを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２０ｍｌのフェノール原液をフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。適量のフェノール原液をフラスコに添加した。溶液Ｂ６を０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ６はフェノール４．４ｍｇ／ｍｌおよびプロタミン塩基０．０３８ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１８６】
水性懸濁液６
１．２５ｍｌの溶液Ａ６を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．２５ｍｌの溶液Ｂ６をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液６はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌ、フェノール２．２ｍｇ／ｍｌ、およびプロタミン塩基０．０１９ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１８７】
（実施例７）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ７の調製
５０ｍｇのインシュリノトロピンを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ７を、注射器により０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ７はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１８８】
フェノール原液の調製
０．４４ｇのフェノールを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約９５ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。得られた溶液（フェノール４．４ｍｇ／ｍｌ）を溶液Ｂ７の調製に用いた。
【０１８９】
溶液Ｂ７の調製
溶液Ｂ７を下記により調製した。２．５ｍｇの硫酸プロタミンを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２０ｍｌのフェノール原液をフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。適量のフェノール原液をフラスコに添加した。溶液Ｂ７を０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ７はフェノール４．４ｍｇ／ｍｌおよびプロタミン塩基０．０７５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１９０】
水性懸濁液７
１．２５ｍｌの溶液Ａ７を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．２５ｍｌの溶液Ｂ７をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液７はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌ、フェノール２．２ｍｇ／ｍｌ、およびプロタミン塩基０．０３８ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１９１】
（実施例８）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ１２の調製
２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を分散、溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ１２を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ１２はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１９２】
溶液Ｂ１２
溶液Ｂ１２を下記により調製した。２０ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ１２を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ１２はフェノール２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０１９３】
水性懸濁液１２
４ｍｌの溶液Ａ１２を１０ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に４ｍｌの溶液Ｂ１２をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液１２はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびフェノール１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１９４】
（実施例９）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ１５の調製
２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢ）をフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢをフラスコに添加した。溶液Ａ１５を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ１５はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。
【０１９５】
溶液Ｂ１５の調製
溶液Ｂ１５を下記により調製した。８ｍｇの硫酸プロタミンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢをフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。適量のＰＢをフラスコに添加した。溶液Ｂ１５を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ１５はプロタミン塩基０．６ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。
【０１９６】
水性懸濁液１５
３ｍｌの溶液Ａ１５を１０ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に３ｍｌの溶液Ｂ１５をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して懸濁液を形成させた。水性懸濁液１５はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびプロタミン塩基０．３ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０１９７】
（実施例１０）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ１６の調製
２０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢをフラスコに添加した。溶液Ａ１６を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ１６はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。
【０１９８】
溶液Ｂ１６の調製
溶液Ｂ１６を下記により調製した。４４ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢをフラスコに添加した。溶液Ｂ１６を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ１６はフェノール４．４ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。
【０１９９】
水性懸濁液１６
３ｍｌの溶液Ａ１６を１０ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に３ｍｌの溶液Ｂ１６をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液１６はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２００】
（実施例１１）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
水性懸濁液１７
１０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢをフラスコに添加した。フラスコの内容物を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中へ濾過した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液１７はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌをＰＢ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２０１】
（実施例１２）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
水性懸濁液１８
１０ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。フラスコの内容物を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中へ濾過した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間緩和に撹拌して（泡またはバブルが確実に生じないようにする）、懸濁液を形成させた。水性懸濁液１８はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２０２】
（実施例１３）
インシュリノトロピン（０．２ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２２の調製
溶液Ａ２２を下記により調製した。２ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ２２を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２２はインシュリノトロピン０．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２０３】
溶液Ｂ２２の調製
溶液Ｂ２２を下記により調製した。４４ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ２２を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ２２はフェノール４．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２０４】
水性懸濁液２２
１．５ｍｌの溶液Ａ２２を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２２をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液２２はインシュリノトロピン０．２ｍｇ／ｍｌおよびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２０５】
（実施例１４）
インシュリノトロピン（０．２ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２３の調製
溶液Ａ２３を下記により調製した。２ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ２３を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２３はインシュリノトロピン０．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２０６】
溶液Ｂ２３の調製
溶液Ｂ２３を下記により調製した。８．８ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ２３を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ２３はフェノール０．８８ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２０７】
水性懸濁液２３
１．５ｍｌの溶液Ａ２３を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２３をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液２３はインシュリノトロピン０．２ｍｇ／ｍｌおよびフェノール０．４４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２０８】
（実施例１５）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２４の調製
溶液Ａ２４を下記により調製した。１０ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ２４を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２４はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２０９】
溶液Ｂ２４の調製
溶液Ｂ２４を下記により調製した。８ｍｇの硫酸プロタミンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ２４を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ２４はプロタミン塩基０．６ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１０】
水性懸濁液２４
１．５ｍｌの溶液Ａ２４を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２４をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液２４はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびプロ夕ミン塩基０．３ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２１１】
（実施例１６）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２５の調製
溶液Ａ２５を下記により調製した。１０ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ２５を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２５はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１２】
溶液Ｂ２５の調製
溶液Ｂ２５を下記により調製した。５３ｍｇのｍ−クレゾールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してｍ−クレゾールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ２５を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ２５はｍ−クレゾール５．３ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１３】
水性懸濁液２５
１．５ｍｌの溶液Ａ２５を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２５をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液２５はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびｍ−クレゾール２．５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２１４】
（実施例１７）
インシュリノトロピン（０．５ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２９の調製
溶液Ａ２９を下記により調製した。２５ｍｇのインシュリノトロピンを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２０ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ２９を、注射器により０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２９はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１５】
溶液Ｂ２９の調製
溶液Ｂ２９を下記により調製した。５０ｍｇのフェノールを５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ２９を０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ２９はフェノール１．０ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１６】
水性懸濁液２９
１．５ｍｌの溶液Ａ２９を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２９をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液２９はインシュリノトロピン０．５ｍｇ／ｍｌおよびフェノール０．５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２１７】
（実施例１８）
インシュリノトロピン（１ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ３１の調製
１０ｍｇのインシュリノトロピンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して、薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ３１を、注射器により０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ３１はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１８】
溶液Ｂ３１の調製
溶液Ｂ３１を下記により調製した。５０ｍｇのフェノールを５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ３１を０．２２μのフィルターを通して５０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ３１はフェノール１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２１９】
水性懸濁液３１
１．５ｍｌの溶液Ａ３１を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ３１をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１６時間撹拌して、懸濁液を形成させた。水性懸濁液３１はインシュリノトロピン１ｍｇ／ｍｌおよびフェノール０．５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２２０】
（実施例１９）
インシュリノトロピン（４ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ５１の調製
２２．２ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。５ｍｌのＰＢＳをバイアルにピペット注入して、薬物を溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ５１はインシュリノトロピン４．４４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２２１】
溶液Ｂ５１の調製
１１０ｍｇのフェノールおよび３０ｍｇの硫酸プロタミンを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールおよび硫酸プロタミンを溶解した。フラスコにマークの位置までＰＢＳを充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ５１はフェノール２２ｍｇ／ｍｌおよびプロタミン塩基４．５ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２２２】
水性懸濁液５１
３ｍｌの溶液Ａ５１および０．３３ｍｌの溶液Ｂ５１を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を緩和に振盪して、確実に均質に混合した。バイアルを周囲温度に１６時間静置した。水性懸濁液５１はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．４４ｍｇ／ｍｌ、およびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２２３】
（実施例２０）
インシュリノトロピン（４ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ５２の調製
２２．２ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。５ｍｌのＰＢＳをバイアルにピペット注入して、薬物を溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ５２はインシュリノトロピン４．４４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２２４】
溶液Ｂ５２の調製
１１０ｍｇのフェノールおよび１５．６ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４ｍｌの注射用水をフラスコに添加してフェノールおよび酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ５２はフェノール２２ｍｇ／ｍｌおよび酢酸亜鉛・２水和物７．８ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２２５】
水性懸濁液５２
３ｍｌの溶液Ａ５２および０．３３ｍｌの溶液Ｂ５２を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を緩和に振盪して、確実に均質に混合した。バイアルを周囲温度に１６時間静置した。水性懸濁液５２はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、およびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２２６】
（実施例２１）
インシュリノトロピン（４ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
フェノール溶液の調製
２４４ｍｇのフェノールを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約９０ｍｌの注射用水をフラスコに添加してフェノールを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液のｐＨを５％ＮａＯＨ溶液によりｐＨ９．０に調整した。このフェノール溶液はフェノール２．４４ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。ｐＨ９．０。
【０２２７】
溶液Ａ７１の調製
２２．２ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。５ｍｌのフェノール溶液をバイアルにピペット注入して、薬物を溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ７１はインシュリノトロピン４．４４ｍｇ／ｍｌおよびフェノール２．４４ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２２８】
溶液Ｂ７１の調製
１１６ｍｇの硫酸プロタミンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ７１はプロタミン塩基８．７ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２２９】
溶液Ｃ７１の調製
１５６ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物および１．６３２ｇのＮａＣｌを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物およびＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｃ７１は酢酸亜鉛・２水和物１５．６ｍｇ／ｍｌおよびＮａＣｌ１６３．２ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２３０】
水性懸濁液７１
３ｍｌの溶液Ａ７１、０．１６５ｍｌの溶液Ｂ７１、および０．１６５ｍｌの溶液Ｃ７１を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を緩和に振盪して、確実に均質に混合した。バイアルを周囲温度に１６時間静置した。水性懸濁液７１はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．４３５ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ８．１６ｍｇ／ｍｌ、およびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２３１】
（実施例２２）
インシュリノトロピン（４ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
ｍ−クレゾール溶液の調製
２４４ｍｇのｍ−クレゾールを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約９０ｍｌの注射用水をフラスコに添加してｍ−クレゾールを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液のｐＨを５％ＮａＯＨ溶液によりｐＨ９．０に調整した。このｍ−クレゾール溶液はｍ−クレゾール２．４４ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。ｐＨ９．０。
【０２３２】
溶液Ａ１００の調製
２２．２ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。５／ｍｌのｍ−クレゾール溶液をバイアルにピペット注入して、薬物を溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ１００はインシュリノトロピン４．４４ｍｇ／ｍｌおよびｍ−クレゾール２．４４ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２３３】
溶液Ｂ１００の調製
１１６ｍｇの硫酸プロタミンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ１００はプロタミン塩基８．７ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２３４】
溶液Ｃ１００の調製
１５６ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物および１．６３２ｇのＮａＣｌを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物およびＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｃ１００は酢酸亜鉛・２水和物１５．６ｍｇ／ｍｌおよびＮａＣｌ１６３．２ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２３５】
水性懸濁液１００
３ｍｌの溶液Ａ１００、０．１６５ｍｌの溶液Ｂ１００、および０．１６５ｍｌの溶液Ｃ１００を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を緩和に振盪して、確実に均質に混合した。バイアルを周囲温度に１６時間静置した。水性懸濁液１００はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．４３５ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ８．１６ｍｇ／ｍｌ、およびｍ−クレゾール２．２ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２３６】
（実施例２３）
インシュリノトロピン（４ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ６８の調製
２２．２ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。５ｍｌのＰＢＳをバイアルにピペット注入して、薬物を溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ６８はインシュリノトロピン４．４４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２３７】
溶液Ｂ６８の調製
１１６ｍｇの硫酸プロタミンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ６８はプロタミン塩基８．７ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２３８】
溶液Ｃ６８の調製
１５６ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物および４４０ｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物およびフェノールを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｃ６８は酢酸亜鉛・２水和物１５．６ｍｇ／ｍｌおよびフェノール４４ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２３９】
水性懸濁液６８
３ｍｌの溶液Ａ６８、０．１６５ｍｌの溶液Ｂ６８および０．１６５ｍｌの溶液Ｃ６８を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を緩和に振盪して、確実に均質に混合した。バイアルを周囲温度に１６時間静置した。水性懸濁液６８はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．４３５ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、およびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２４０】
（実施例２４）
インシュリノトロピン（４ｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ６７の調製
２２．２ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。５ｍｌのＰＢＳをバイアルにピペット注入して、薬物を溶解した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ６７はインシュリノトロピン４．４４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２４１】
溶液Ｂ６７の調製
１１６ｍｇの硫酸プロタミンを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して硫酸プロタミンを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｂ６７はプロタミン塩基８．７ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２４２】
溶液Ｃ６７の調製
１５６ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物および４４０ｇのｍ−クレゾールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物およびｍ−クレゾールを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して１０／ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ｃ６７は酢酸亜鉛・２水和物１５．６ｍｇ／ｍｌおよびｍ−クレゾール４４ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２４３】
水性懸濁液６７
３ｍｌの溶液Ａ６７、０．１６５ｍｌの溶液Ｂ６７および０．１６５ｍｌの溶液Ｃ６７を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を緩和に振盪して、確実に均質に混合した。バイアルを周囲温度に１６時間静置した。水性懸濁液６７はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、プロタミン塩基０．４３５ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、およびｍ−クレゾール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２４４】
（実施例２５）
溶液Ａ３９の調製
６７．６ｍｇのインシュリノトロピンをガラスバイアル中へ秤量した。約２２ｍｌの注射用水をバイアルに添加してインシュリノトロピンを溶解した。バイアル内容物のｐＨをＮａＯＨにより９．６に調整して、透明な溶液となした。注射用水をバイアルに添加して、最終薬物濃度を２．５ｍｇ／ｍｌとなした。
【０２４５】
溶液Ｂ３９の調製
３８６．８ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ３９は酢酸亜鉛・２水和物３．９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２４６】
溶液Ｃ３９の調製
１．０９５ｇのフェノールを５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌの注射用水をフラスコに添加してフェノールを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｃ３９はフェノール２１．９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２４７】
溶液Ｄ３９の調製
２．２５ｇのＮａＣｌを２５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約２０ｍｌの溶液Ｃ３９をフラスコに添加してＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで溶液Ｃ３９を充填した。溶液Ｄ３９はＮａＣｌ９％（ｗ／ｖ）およびフェノール２１．９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２４８】
水性懸濁液３９
すべての溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。９ｍｌの溶液Ａ３９を１０ｍｌの試料バイアルに移した。緩和に撹拌しながら１ｍｌの溶液Ｂ３９をバイアルに添加した。直ちに沈澱が生じた。ｐＨは７．０と測定された。バイアルを周囲温度に約１８時間静置した。４ｍｌの試料を別個の１０ｍｌのバイアルに移し、０．４４ｍｌの溶液Ｄ３９をバイアルに添加した。試料を５分間緩和に撹拌し、次いで周囲温度に一夜静置した。
【０２４９】
水性懸濁液３９はインシュリノトロピン２ｍｇ／ｍｌ、フェノール２．２ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ ０．９％、および酢酸亜鉛０．３９ｍｇ／ｍｌを含有していた。この懸濁液を
ラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２５０】
（実施例２６）
溶液Ａ５３の調製
３２．５ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。６ｍｌの注射用水をバイアルに添加した。バイアル内容物のｐＨを１％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨにより９．６に調整して、透明な溶液となした。適量の注射用水を添加して、薬物濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとなした。
【０２５１】
溶液Ｂ５３の調製
３９０ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ５３は酢酸亜鉛・２水和物７．８ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２５２】
水性懸濁液５３
すべての溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。２．４ｍｌの溶液Ａ５３を３．５ｍｌのバイアルに移した。緩和に撹拌しながら３００μｌの溶液Ｂ５３をバイアルに添加した。添加後、直ちに複屈折性沈殿が生じた。ｐＨは６．８と測定された。バイアルを周囲温度に２０時間静置したのち、７．５μｌのｍ−クレゾールを沈降した懸濁液の上清に直接に添加した。次いで懸濁液を緩和に撹拌して、ｍ−クレゾールを溶解した。３００μｌの９％ＮａＣｌ溶液を撹拌下に懸濁液に添加した。水性懸濁液５３はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ０．９％、酢酸亜鉛０．７８ｍｇ／ｍｌ、およびｍ−クレゾール２．５ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２５３】
（実施例２７）
溶液Ａ５４の調製
３２．５ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。６ｍｌの注射用水をバイアルに添加した。バイアル内容物のｐＨを１％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨにより９．６に調整して、透明な溶液となした。適量の注射用水を添加して、薬物濃度を５．０ｍｇ／ｍｌとなした。
【０２５４】
溶液Ｂ５４の調製
３９０ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ５４は酢酸亜鉛・２水和物７．８ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２５５】
溶液Ｃ５４の調製
１．１ｇのフェノールおよび４．５ｇのＮａＣｌを５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌの注射用水を添加した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｃ５４はフェノール２２ｍｇ／ｍｌおよびＮａＣｌ９０ｍｇ／ｍｌを含有していた。
【０２５６】
水性懸濁液５４
すべての溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。２．４ｍｌの溶液Ａ５４を３．５ｍｌのバイアルに移した。撹拌しながら３００μｌの溶液Ｂ５４をバイアルに添加した。添加後、直ちに複屈折性沈殿が生じた。ｐＨは６．８と測定された。試料を周囲温度に２０時間静置した。３００μｌの溶液Ｃ５４を緩和な撹拌下に添加した。水性懸濁液５４はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、フェノール２．２ｍｇ／ｍｌ、およびＮａＣｌ９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２５７】
（実施例２８）
溶液Ａ５７の調製
１５ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。３ｍｌの注射用水をバイアルに添加した。バイアル内容物のｐＨを５％ＮａＯＨにより９．９に調整して、薬物を完全に溶解した。溶液Ａ５７はインシュリノトロピン５．０ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２５８】
溶液Ｂ５７の調製
７８０ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ５７は酢酸亜鉛・２水和物７．８ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２５９】
溶液Ｃ５７の調製
２.２ｇのフェノールおよび９ｇのＮａＣｌを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した
。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して、フェノールおよびＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｃ５７はフェノール２２ｍｇ／ｍｌおよびＮａＣｌ  ９０ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２６０】
水性懸濁液５７
２.４ｍｌの溶液Ａ５７を３．５ｍｌのバイアルに移した。３００μｌの溶液Ｂ５７を
添加する際、溶液を緩和に撹拌した。溶液Ｂ５７の添加後、直ちに沈殿が生じた。ｐＨを測定して７．１であることが認められた。試料を周囲温度に２４時間静置した。３００μｌの溶液Ｃ５７を緩和な撹拌下に添加した。水性懸濁液５７はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、フェノール２．２ｍｇ／ｍｌ、およびＮａＣｌ９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２６１】
（実施例２９）
溶液Ａ６４の調製
５３．３ｍｇのインシュリノトロピンを３０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。１１ｍｌの注射用水を添加したのち、バイアル内容物のｐＨを５％ＮａＯＨ（ｗ／ｖ）により８．３に調整して、インシュリノトロピンを溶解した。溶液をなお確実に透明な状態に維持するために、希ＨＣｌによりｐＨを６．０に調整した。適量の注射用水を添加して、薬物濃度を４．４ｍｇ／ｍｌとなした。溶液Ａ６４を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して３．５ｍｌの試料バイアル中へ濾過した。濾過した溶液１．８ｍｌを別個の無菌３．５ｍｌの試料バイアルに移し、バイアルを周囲温度に３日間静置して結晶化させた。
【０２６２】
溶液Ｂ６４の調製
７８０ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を５０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約４０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ６４は酢酸亜鉛・２水和物１５．６ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２６３】
溶液Ｃ６４の調製
１８ｇのＮａＣｌを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加してＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｃ６４はＮａＣｌ  １８０ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２６４】
水性懸濁液６４
溶液Ａ６４の結晶化が完了したのち、１００μｌの溶液Ｂ６４を１．８ｍｌの結晶懸濁液に徐々に撹拌しながら添加した。次いで試料を周囲温度に３日間静置した。１００μ１の溶液Ｃ６４を結晶懸濁液に緩和な撹拌下で添加した。希ＮａＯＨにより懸濁液のｐＨをｐＨ７．３に調整した。ｐＨ調整した結晶懸濁液に５．０μのｍ-クレゾールを直接に添
加した。水性懸濁液６４はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７８ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ  ９ｍｇ／ｍｌ、およびｍ-クレゾール２．５ｍｇ／ｍｌを注
射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２６５】
（実施例３０）
溶液Ａ６９の調製
１ｇのＮａＣｌを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加してＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ａ６９はＮａＣｌ  １％（ｗ／ｖ）を注射用水中に含有していた。
【０２６６】
溶液Ｂ６９の調製
３９０ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ６９は酢酸亜鉛・２水和物３．９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２６７】
エマルジョンＣ６９の調製
２.５ｍｌの濾過した（０．２２μ、蛋白質結合の低いもの）無菌ｍ−クレゾールを１
００ｍｌのメスフラスコ中へ移した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填し、音波処理して均質な懸濁液を調製した。エマルジョンＣ６９はｍ−クレゾール２５ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２６８】
水性懸濁液６９
３５．７４ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。７ｍｌの溶液Ａ６９を添加した。バイアル内容物のｐＨを９．２に調整して、薬物を溶解した。希ＨＣｌにより溶液のｐＨを６．５に再調整した。適量の注射用水を添加して、薬物濃度を４．４ｍｇ／ｍｌとなした。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。溶液を周囲温度に６日間静置し、その間にインシュリノトロピンが結晶化した。１．５ｍｌの結晶懸濁液を別個のバイアルに移した。１６７μｌの溶液Ｂ６９を緩和な撹拌下に添加した。試料を周囲温度に１日間静置した。１６７μｌのエマルジョンＣ６９を、沈降した懸濁液の上清に添加した。試料を撹拌して、ｍ−クレゾールを溶解した。水性懸濁液６９はインシュリノトロピン３．６ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛０．３６ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ  ８．１７ｍｇ／ｍｌ、およびｍ−クレゾール２．２８ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２６９】
（実施例３１）
溶液Ａｌ０１の調製
１０ｇの酢酸ナトリウムを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸ナトリウムを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ａ２００は酢酸ナトリウム１００ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２７０】
水性懸濁液１０１
４４．４ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのガラスバイアル中へ秤量した。８ｍｌの注射用水をフラスコに添加した。バイアル内容物のｐＨを９．３に調整して、透明な溶液を得た。１ｍｌの溶液Ａ２００をインシュリノトロピン溶液に添加した。次いでｐＨを６．５に調整した。この溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。濾過した溶液を周囲温度に３日間静置して結晶化させた。水性懸濁液１０１はインシュリノトロピン４．９ｍｇ／ｍｌ、酢酸ナトリウム１１．１ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２７１】
（実施例３２）
溶液Ａ８２の調製
９ｇのＮａＣｌを１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加してＮａＣｌを溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ａ８２はＮａＣｌ９％（ｗ／ｖ）を注射用水中に含有していた。
【０２７２】
溶液Ｂ８２の調製
７８９ｍｇの酢酸亜鉛・２水和物を１００ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８０ｍｌの注射用水をフラスコに添加して酢酸亜鉛・２水和物を溶解した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填した。溶液Ｂ８２は酢酸亜鉛・２水和物７．８９ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２７３】
エマルジョンＣ８２の調製
２.５ｍｌの濾過した（０．２２μ、蛋白質結合の低いもの）無菌ｍ−クレゾールを１
００ｍｌのメスフラスコ中へ移した。フラスコにマークの位置まで注射用水を充填し、音波処理して均質な懸濁液を調製した。エマルジョンＣ８２はｍ−クレゾール２５ｍｇ／ｍｌを注射用水中に含有していた。
【０２７４】
水性懸濁液８２
すべての溶液を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。４５．３４ｍｇのインシュリノトロピンを１０ｍｌのバイアルに添加し、これに８ｍｌの水を添加した。５％ＮａＯＨによりｐＨを９．３に調整した。１ｍｌの溶液Ａ８２をバイアルに添加したのち、希ＨＣｌにより溶液のｐＨを６．５５に調整した。この溶液（インシュリノトロピン５ｍｇ／ｍｌ）を０．２２μのフィルター（蛋白質結合の低いもの）を通して濾過した。８１μｌの水性懸濁液１０１（実施例３１参照）を、濾過した無菌インシュリノトロピン溶液に添加し、試料を振盪することにより分散させた。次いで試料を周囲温度に７２時間静置して、結晶懸濁液を調製した。２．４ｍｌの懸濁液を３．５ｍｌのバイアルに移した。３００μｌの溶液Ｂ８２を緩和な撹拌下にバイアルに添加した。バイアル内容物のｐＨを希ＮａＯＨにより７．３に調整した。３００μ１のエマルジョンＣ８２を、沈降した懸濁液の上清に添加した。水性懸濁液８２はインシュリノトロピン４ｍｇ／ｍｌ、酢酸亜鉛・２水和物０．７９ｍｇ／ｍｌ、ｍ−クレゾール２．５ｍｇ／ｍｌ、およびＮａＣｌ  ０．９％を注射用水中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２７５】
（実施例３３）
ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（ｌｍｇ／ｍｌ）懸濁液
溶液Ａ２６の調製
溶液Ａ２６を下記により調製した。１０ｍｇのＧＬＰ−１（７−３６）アミドを５ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約３ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加して薬物を溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ａ２６を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２６はＧＬＰ−１（７−３６）２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２７６】
溶液Ｂ２６の調製
溶液Ｂ２６を下記により調製した。４４ｍｇのフェノールを１０ｍｌのメスフラスコ中へ秤量した。約８ｍｌのＰＢＳをフラスコに添加してフェノールを溶解した。適量のＰＢＳをフラスコに添加した。溶液Ｂ２６を０．２２μのフィルターを通して１０ｍｌのガラスバイアル中へ濾過した。溶液Ａ２６はフェノール４．４ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。
【０２７７】
水性懸濁液２６
１．５ｍｌの溶液Ａ２６を３．５ｍｌのタイプ１ガラスバイアル中ヘピペット注入した。バイアルの内容物を磁気撹拌し、その間に１．５ｍｌの溶液Ｂ２６をバイアル中ヘピペット注入した。バイアルに栓をし、アルミニウムシェルでシールした。バイアル内容物を１８時間緩和に撹拌して（泡またはバブルが確実に生じないようにする）懸濁液を形成させた。水性懸濁液２６はＧＬＰ−１（７−３６）アミドｌｍｇ／ｍｌおよびフェノール２．２ｍｇ／ｍｌをＰＢＳ中に含有していた。この懸濁液をラットにおいてインビボ薬物動態研究に用いた。
【０２７８】
（実施例３４）
本発明の１形態においては、溶解度の低い形態のＧＬＰ−１（７−３７）が下記により製造される。ｐＨ７−８．５の緩衝液中２−１５ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１（７−３７）を金属イオン塩の溶液と混和して、１−８ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１（７−３７）を亜鉛：ＧＬＰ−１（７−３７）のモル比約１：１−２７０：１で含有する溶液を得る。重い沈澱が生成し、これを室温で一夜放置する。金属イオン溶液中におけるＧＬＰ−１（７−３７）の溶解度は、用いる金属に応じて異なる。次いで、金属を含有しない溶剤、たとえばＰＢＳまたは水中のＧＬＰ−１（７−３７）ペレットの溶解度を測定して、亜鉛、コバルトおよびニッケルイオンが溶解度の低い形態のＧＬＰ−１（７−３７）を形成することが示される。
【０２７９】
【表１】
2010006841.tif 000049
【０２８０】
注釈：それぞれの場合、５ｍＭの金属イオン溶液１００μ１を５ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１（７−３７）１００μ１に添加し、混合し、一夜放置した。不溶性ペレットを遠心分離により除去した。金属イオン溶液中に残留するＧＬＰ−１（７−３７）の濃度を測定した。ペレットをリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に再懸濁し、音波処理し、一夜放置した。再び不溶性物質をペレット化し、ＧＬＰ−１（７−３７）の濃度を測定した。
【０２８１】
（実施例３５）
ｐＨ７−８．５の緩衝液中のＧＬＰ−１（７−３７）の溶液を特定の組み合わせの塩類および低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合することによって、微結晶質形態のＧＬＰ−１（７−３７）が得られる。表２に微結晶質形態のＧＬＰ−１（７−３７）を形成する特定の７組の条件を記載する。
【０２８２】
【表２】
2010006841.tif 000050
【０２８３】
注釈：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.１）中の５ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１（７−３７）
原液に試薬を１：１で添加した。液滴を観察し、結晶質または非晶質の形態の不溶性ＧＬＰ−１（７−３７）の存否を採点した。一般に低分子量ＰＥＧは結晶質形態を助成すると思われる。Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであり、ＨＥＰＥＳはＮ−２−（ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸である。
【０２８４】
（実施例３６）
微結晶形態および高収率を得るためには、特定の組み合わせのＧＬＰ−１（７−３７）およびＰＥＧの濃度が必要である。表３は非晶質ではなく微結晶質の形態の薬物を生成する特定の組み合わせのＰＥＧ６００およびＧＬＰ−１（７−３７）の濃度を示す。不溶性形態のＧＬＰ−１（７−３７）の収率も示される。
【０２８５】
【表３】
2010006841.tif 000051
【０２８６】
注釈：ＧＬＰ−１（７−３７）の微結晶が下記により生成する。Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中の２０ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１（７−３７）溶液、Ｈ2Ｏ中の６０％ポリエチレン
グリコール６００（ＰＥＧ６００）、およびＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）を混和して、最終濃度１５−３０％のＰＥＧおよび３−１０ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１を得る。一夜放置したのち、ＧＬＰ−１（７−３７）の微結晶が溶液中に５０−８５％の収率で生成する。
【０２８７】
（実施例３７）
この実験は、予め形成されたＧＬＰ−１（７−３７）の微結晶を各種金属イオンで処理して溶解度の低い微結晶形態を形成することによる、他の形態の本発明を例示する。実施例２２の記載に従って８ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１（７−３７）および２２．５％ＰＥＧにおいて製造された微結晶ＧＬＰ−１（７−３７）は、純粋な凍結乾燥ＧＬＰ−１（７−３７）に等しい溶解度をもつ。長時間作用形ドラッグデリバリーのために望まれる低溶解度という特性を付与するために、これらの予め形成された微結晶を金属塩の溶液で、金属：ＧＬＰ−１（７−３７）の比率１：１−２６０：１において、室温で一夜処理することができる。過剰の金属塩を遠心分離／洗浄処理により除去した。表４は処理剤として数種の２価カチオン金属塩を用いた結果を示す。
【０２８８】
【表４】
2010006841.tif 000052
【０２８９】
注釈：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中の８ｍｇ／ｍｌのＩＳＴにＨ2Ｏ中の２２．５
％ＰＥＧ６００を添加したものから、ＧＬＰ−１（７−３７）結晶を生長させる。添加する処理剤溶液はすべて１０ｍＭ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ５．２）またはＮａ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）中の１００ｍＭ  ２価金属イオン塩である。
【０２９０】
（実施例３８）
本明細書に記載した方法により、酢酸亜鉛を用いて非晶質および微結晶質両方の低溶解度配合物を調製した。ラット（各配合物につき３匹の動物）に皮下注射を行い、ＧＬＰ−１（７−３７）の血漿中水準を２４時間にわたってラジオイムノアッセイ法により測定した。図８は、対照の可溶性ＧＬＰ−１（７−３７）皮下注射と比較して、血漿中における薬物の持続性が延長したことを示す。
【０２９１】
（実施例３９）
４５％  ｗ／ｖ  ポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ）
１ｍｇ／ｍｌ  インシュリノトロピン
２０ｍＭ  リン酸緩衝液
十分量の無菌注射用水（ＳＷＦＩ）
ＳＷＦＩを用いて５０％  ｗ／ｗ  ＰＥＧ溶液を調製した。無水の二塩基性リン酸ナトリウム（２６．８５ｍｇ／ｍｌ）および一塩基性リン酸ナトリウム・１水和物（１．４１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、別個に２００ｍＭリン酸緩衝液を調製した。必要に応じ水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて緩衝液のｐＨをｐＨ８となした。インシュリノトロピンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製するのに適した量のインシュリノトロピンを十分量の緩衝液に溶解した。適切な重量のＰＥＧ溶液をこのインシュリノトロピン溶液に添加し、かつ溶液を目的容量となすのに十分な量のＳＷＦＩを用いた。次いでこの最終溶液を０．２μのフィルターで無菌的に濾過し、無菌的にバイアルに充填した。この溶液（０．５ｍｌ）をラットに皮下注射し、ＲＩＡアッセイ法により血漿中インシュリノトロピン水準を追跡した。
【０２９２】
（実施例４０）
１．３２％  ｗ／ｖ  ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）
１ｍｇ／ｍｌ  インシュリノトロピン
２０ｍＭ  リン酸緩衝液
１００ｍＭ  塩化ナトリウム
十分量の無菌注射用水（ＳＷＦＩ）
ＳＷＦＩを用いて２％  ｗ／ｗ  ヒドロキシエチルセルロース溶液を調製した。無水の二塩基性リン酸ナトリウム（２６．８５ｍｇ／ｍｌ）および一塩基性リン酸ナトリウム・１水和物（１．４１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、別個に２００ｍＭリン酸緩衝液を調製した。必要に応じ水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて緩衝液のｐＨをｐＨ８となした。インシュリノトロピンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製するのに適した量のインシュリノトロピンおよび塩化ナトリウムを十分量の緩衝液に溶解した。適切な重量のＨＥＣ溶液をこのインシュリノトロピン溶液に添加−し、かつ溶液を目的容量となすのに十分な量のＳＷＦＩを用いた。次いでこの最終溶液を０．２μのフィルターで無菌的に濾過し、無菌的にバイアルに充填した。この溶液（０．５ｍｌ）をラットに皮下注射し、ＲＩＡアッセイ法により血漿中インシュリノトロピン水準を追跡した。
【０２９３】
（実施例４１）
１８％  ｗ／ｖ  プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ１２７
１ｍｇ／ｍｌ  インシュリノトロピン
２０ｍＭ  リン酸緩衝液
十分量の無菌注射用水（ＳＷＦＩ）
ＳＷＦＩを用いて２０％  ｗ／ｗ  プルロニックＦ１２７溶液を調製した。ポリマーを溶解するために氷浴を備えたポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、プローブホモジナイザー）を用いた。無水の二塩基性リン酸ナトリウム（２６．８５ｍｇ／ｍｌ）および一塩基性リン酸ナトリウム・１水和物（１．４１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、別個に２００ｍＭリン酸緩衝液を調製した。必要に応じ水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて緩衝液のｐＨをｐＨ８となした。インシュリノトロピンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製するのに適した量のインシュリノトロピンを十分量の緩衝液に溶解した。適切な重量のプルロニック溶液をこのインシュリノトロピン溶液に添加し、かつ溶液を目的容量となすのに十分な量のＳＷＦＩを用いた。次いでこの最終溶液を０．２μのフィルターで無菌的に濾過し、無菌的にバイアルに充填した。この溶液（０．５ｍｌ）をラットに皮下注射し、ＲＩＡアッセイ法により血漿中インシュリノトロピン水準を追跡した。
【０２９４】
（実施例４２）
ラッカセイ油懸濁液（ボールミル処理）
１ｍｇ／ｍｌ  インシュリノトロピン
１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０
ツイーン８０を１％の量でラッカセイ油に添加した。この溶液を０．２μのフィルターで無菌的に濾過した。次いで固体インシュリノトロピンをこの油に懸濁した。セズバリ・アトリッター（Ｓｚｅｓｖａｒｉ  Ａｔｔｒｉｔｏｒ）を用いて４０ｒｐｍで１８時間ボールミル処理することにより（冷水ジャケット）、粒度を低下させた。次いでこの懸濁液をバイアルに充填した。この懸濁液（０．５ｍｌ）をラットに皮下注射し、ＲＩＡアッセイ法により血漿中インシュリノトロピン水準を追跡した。
【０２９５】
（実施例４３）
２２．６％  ｗ／ｖ  デキストラン
１ｍｇ／ｍｌ  インシュリノトロピン
２０ｍＭ  リン酸緩衝液
十分量の無菌注射用水（ＳＷＦＩ）
ＳＷＦＩを用いて５０％  ｗ／ｗ  デキストラン溶液を調製した。無水の二塩基性リン酸ナトリウム（２６．８５ｍｇ／ｍｌ）および一塩基性リン酸ナトリウム・１水和物（１．４１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、別個に２００ｍＭリン酸緩衝液を調製した。必要に応じ水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて緩衝液のｐＨをｐＨ８となした。インシュリノトロピンの５．０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製するのに適した量のインシュリノトロピンを十分量の緩衝液に溶解した。適切な重量のデキストラン溶液をこのインシュリノトロピン溶液に添加し、かつ溶液を目的容量となすのに十分な量のＳＷＦＩを用いた。次いでこの最終溶液を０．２μのフィルターで無菌的に濾過し、無菌的にバイアルに充填した。この溶液（０．５ｍｌ）をラットに皮下注射し、ＲＩＡアッセイ法により血漿中インシュリノトロピン水を追跡した。
【０２９６】
（実施例４４）
インシュリノトロピンをリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、エタノールおよびｍ−クレゾールの混合物から結晶化した。ガラスバイアル中にＰＢＳを用いて均質なインシュリノトロピンのスラリー（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製し、大容量（スラリーの９倍）のエタノールをバイアルに添加し、その間にバイアル内容物を磁気撹拌した。インシュリノトロピンの極めて微細な非晶質粒子が生成した。得られるｍ−クレゾール濃度が１％（ｖ／ｖ）となるようにｍ−クレゾールを添加した。溶剤が蒸発するのを防止するためにバイアルに蓋をした。この結晶化混合物を室温に数日間保存した。非晶質粒子から針状結晶板が生長した。結晶の長さは５０−２００μｍであり、幅は２−４μｍである。
【０２９７】
（実施例４５）
インシュリノトロピン（１−４ｍｇ／ｍｌ）を、８より高いｐＨ値の１％硫酸ナトリウム（または酢酸ナトリウム、または塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウム）溶液に溶解し、溶液のｐＨをｄ−ＨＣｌにより６．０−７．５に低下させた。この透明な溶液を周囲温度に静置した。数日後に、結晶化条件に応じて針状または板状の結晶が得られた。
【０２９８】
（実施例４６）
０．１−０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ８．５−９．５の５０ｍＭグリシン緩衝液に、ＧＬＰ−１（７−３７）を１−５ｍｇ／ｍｌに溶解した。亜鉛塩（酢酸塩または塩化物）の溶液を添加して、亜鉛：ＧＬＰ−１（７−３７）のモル比０．５：１−１．５：１を得た。ＧＬＰ−１（７−３７）の結晶を室温で一夜生長させ、７０−９７％の収率を得た。
【０２９９】
（実施例４７）
ＧＬＰ−１（７−３７）結晶は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８−９．５）に１０−２０ｍｇ／ｍｌで溶解したペプチドを用いる蒸気拡散法により生長させることができる。このペプチド溶液を、０．５−２．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する同一緩衝液と１：１で混合し、次いで密閉系内で未希釈緩衝液（すなわち０．５−２.５Ｍ  ＮａＣｌを含有するＴｒ
ｉｓ）に対して平衡化した。
【０３００】
（配列表）
2010006841.tif 000053
2010006841.tif 000054
2010006841.tif 000055
2010006841.tif 000056
2010006841.tif 000057
2010006841.tif 000058
2010006841.tif 000059
【図１】
2010006841.tif 000060
【図２】
2010006841.tif 000061
【図３】
2010006841.tif 000062
【図４】
2010006841.tif 000063
【図５】
2010006841.tif 000064
【図６】
2010006841.tif 000065
【図７】
2010006841.tif 000066
【図８】
2010006841.tif 000067
【図９】
2010006841.tif 000068
【図１０】
2010006841.tif 000069