(57)【要約】【課題】共存糖の存在下においてもキシロースの代謝速度が優れた組換え酵母及び当該組換え酵母を利用したエタノールの製造方法を提供する。【解決手段】２コピー以上の細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入されるか、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入され、βグルコシダーゼ活性が0.02U/OD660=1以上である組換え酵母。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２コピー以上の細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入された組換え酵母。
【請求項２】
細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入され、βグルコシダーゼ活性が0.02U/OD660=1以上である組換え酵母。
【請求項３】
細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入され、キシロース代謝速度が2.0g/h/L以上である組換え酵母。
【請求項４】
上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項５】
上記表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、ゲノムに４コピー導入されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項６】
高次倍体の酵母を宿主として上記遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項７】
上記細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、内在する高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子の発現制御領域により発現制御されるかたちで導入されたことを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項８】
Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を宿主として上記遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれか一項記載の組換え酵母をキシロース含有培地に培養する工程と、
上記キシロース含有培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
【請求項１０】
上記キシロース含有培地は６単糖を更に含有することを特徴とする請求項９記載のエタノールの製造方法。
【請求項１１】
上記６単糖はグルコース及び/又はセロビオースであることを特徴とする請求項１０記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の遺伝子を導入した組換え酵母及び当該組換え酵母を利用したエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化を鑑みた場合、木質系バイオマスから製造されるエタノール等の石油代替資源に大きな期待が寄せられている。すなわち、木質系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。木質系バイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成されている。木質系バイオマスからエタノール等液体燃料を製造するためには、セルロースやヘミセルロースを構成単糖にまで加水分解（糖化）し、発酵によって単糖をエタノールに変換する。セルロースは主としてグルコースから構成され、ヘミセルロースは主としてアラビノースとキシロースから構成されている。したがって、木質系バイオマスを利用してエタノールを製造する際には、グルコースのみではなくキシロースも発酵の基質として有効に利用されることが望ましい。
【０００３】
ところが、エタノール製造に利用される通常の酵母は、基質として６単糖のグルコースしか利用することができない。そこで、キシロース代謝能を付与した酵母を利用してキシロースを基質として利用するといった技術が特許文献１及び２並びに非特許文献１に開示されている。しかしながら、キシロース代謝能を付与された酵母は、グルコースを基質としたエタノール発酵能を有するため、培地中にグルコースとキシロースとが含まれると、グルコース代謝が優先的に進行しキシロースの代謝遅延が発生するといった問題があった。
【０００４】
なお、非特許文献１には、キシロース及びセロオリゴ糖を発酵することができる組換え酵母を開示している。非特許文献１に開示された組換え酵母は、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子とS. cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を導入するとともに、Aspegillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子を細胞表層に提示するかたちで導入した組換え酵母である。しかし、非特許文献１に開示された組換え酵母においても、キシロースの代謝遅延を解消しておらず、上述した問題は解決されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５０９９８８号
【特許文献１】特表２００８−５０６３８３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. Katahira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 1136-1143
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、共存糖の存在下においてもキシロースの代謝速度が優れた組換え酵母及び当該組換え酵母を利用したエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、キシロース代謝関連遺伝子とともに細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子を導入した酵母において、βグルコシダーゼ活性が高ければキシロース代謝速度が向上するといった新規知見を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は以下を包含する。
（１）２コピー以上の細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入された組換え酵母。
【００１０】
（２）細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入され、βグルコシダーゼ活性が0.02U/OD660=1以上である組換え酵母。
【００１１】
（３）細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入され、キシロース代謝速度が2.0g/h/L以上である組換え酵母。
【００１２】
（４）上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする（１）乃至（３）いずれか１記載の組換え酵母。
【００１３】
（５）上記表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、ゲノムに４コピー導入されていることを特徴とする（１）乃至（３）いずれか１記載の組換え酵母。
【００１４】
（６）高次倍体の酵母を宿主として上記遺伝子を導入したことを特徴とする（１）乃至（３）いずれか１記載の組換え酵母。
【００１５】
（７）上記細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、内在する高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子の発現制御領域により発現制御されるかたちで導入されたことを特徴とする（１）乃至（３）いずれか１記載の組換え酵母。
【００１６】
（８）Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を宿主として上記遺伝子を導入したことを特徴とする（１）乃至（３）いずれか１記載の組換え酵母。
【００１７】
（９）（１）〜（８）いずれか記載の組換え酵母をキシロース含有培地に培養する工程と、上記キシロース含有培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
【００１８】
（１０）上記キシロース含有培地は６単糖を更に含有することを特徴とする（９）記載のエタノールの製造方法。
【００１９】
（１１）上記６単糖はグルコース及び/又はセロビオースであることを特徴とする（１０）記載のエタノールの製造方法。
【００２０】
なお、本願発明者らは、先の出願（特願2007-200978号）において、ホモタリック性を有する酵母を利用して、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となるといった技術を開示した。例えば、この先願で開示された酵母に細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及びキシロース代謝関連遺伝子を導入することによって、βグルコシダーゼ及びキシロース代謝能を高めることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る組換え酵母によれば、キシロースを含有する培地を用いたエタノール発酵においてキシロース代謝速度の向上を達成することができる。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用することにより、例えば木質系バイオマスを用いたエタノール発酵をより効率的に、且つ優れた生産性で実施することができる。
【００２２】
また、本発明に係るエタノールの製造方法によれば、培地に含まれるキシロースを基質とした発酵によりエタノールをより効率的に、且つ高収率で回収することができる。特に、培地にキシロース及びグルコースを含有する場合であっても、キシロース代謝速度の遅延がなく、効率よくエタノールを製造することができる。
【００２３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-180434号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明を適用してホモタリック性を有する複数の選択マーカーを有する形質転換用酵母を構築する際の工程を模式的に示す図である。
【図２】YPH500株及びOC-2T株について、培地中の糖濃度とTDH１遺伝子、TDH３遺伝子及びPDC1遺伝子の発現量との関係を測定した結果を示す特性図である。
【図３】pIHCS及びpBG211からpIBG13を構築するフローを説明する図である。
【図４】pRS404及びpBlue-BGL1からpIWBGL1を構築するフローを説明する図である。
【図５】OC-2ABGL4株、OC-2ABGL2株及びOC-2HUTについて、PNPG活性を測定した結果を示す特性図である。
【図６】OC-2ABGL4Xyl2株について共存糖の有無及び種類によるキシロース代謝量を測定した結果を示す特性図である。
【図７】OC-2ABGL4Xyl2株及びOC-2ABGL2Xyl2株について、キシロース代謝量を測定した結果を示す特性図である。
【図８】OC-2ABGL4Xyl2株について培養プロセスにおける、キシロース濃度、セロビオース濃度及びエタノール濃度を測定した結果を示す特性図である。
【図９】プラスミドpABGL-TDH3P、pABGL-PDC1P及びpABGL-HOR7Pの構成を示す図である。
【図１０】プラスミドpRS404-NotI-s.s-BGL1-3'half a-agglutinin-SphI-TRP1-NotIを作製する工程を示す図である。
【図１１】プラスミドpUC19-AscI-HOR7promoter-NotI-SalI、pUC19-AscI-PDC1promoter-NotI-SalI及びpUC19-AscI-TDH3promoter-NotI-SalIを作製する工程を示す図である。
【図１２】プラスミドpABGL-HOR7P、pABGL-PDC1P及びpABGL-TDH3Pを作製する工程を示す図である。
【図１３】形質転換酵母OC-2ATDH3PBGL2、OC-2APDC1PBGL2及びOC-2AHOR7PBGL2についてPNPG活性を測定した結果を示す特性図である。
【図１４】形質転換酵母OC-2APDC1PBGL2XYL2、OC-2AHOR7PBGL2XYL2、OC-2HUT株、２、４若しくは６コピーのアーミングBGL遺伝子を導入したTDH3PBGL2株、TDH3PBGL4株及びTDH3PBGL6株、OC-2HUT株にpIUX1X2Xkを導入したOC-2HTx2株についてPNPG活性を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
＜組換え酵母＞
本発明に係る組換え酵母は、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入されており、細胞表層に提示されたβグルコシダーゼの活性が高い（例えば0.02 U/OD660=1以上）酵母である。また、本発明に係る組換え酵母は、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及び２コピー以上のキシロース代謝関連遺伝子がゲノムに導入されており、キシロース代謝速度が高い（例えば2.0g/h/L以上）酵母である。
【００２６】
ここで、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、発現したβグルコシダーゼが細胞の表層にディスプレイされるように、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開２００６−１７４７６７号公報参照）。
【００２７】
細胞表層に提示するβグルコシダーゼをコードするβグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
【００２８】
また、キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００２９】
酵母ゲノムに導入されるキシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、ストレプトマイセスムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子等を利用することもできる。
【００３０】
上述した遺伝子を導入する際には、各遺伝子をそれぞれ2コピー以上導入するか、キシロース代謝関連遺伝子を2コピー以上導入するとともに細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子をβグルコシダーゼ活性が0.02U/OD660=1以上となるように導入する。各遺伝子をそれぞれ２コピー以上導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、複数の選抜マーカーを有する酵母のホモタリック性を利用した方法を適用することができる。
【００３１】
ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母では、HO遺伝子にコードされるエンドヌクレアーゼによる性転換がおこり、一倍体の母細胞から性の異なる娘細胞が出芽することになる。一倍体の酵母にはa細胞とα細胞という２種類の性（接合型）が存在し、a細胞どうし、α細胞どうしは接合しない。a細胞とα細胞はそれぞれaファクターとαファクターという特有の性ホルモン（フェロモン）を分泌しており、お互いが十分に近接して相手のフェロモン細胞膜上の受容体で感知すると、通常の増殖を停止し接合をはじめる。互いの方向に向かい細胞が伸長し、互いの細胞膜、続いて核が融合し、二倍体の細胞となる。したがって、ホモタリック性を有する酵母は、一倍体の母細胞から出芽した娘細胞が、当該母細胞と接合して二倍体となるといった生活環を形成している。この生活環によれば、ホモタリック性を有する一倍体の酵母は、接合型を決定するMAT遺伝子（MATａ遺伝子及びMATα遺伝子）以外は全く同一の遺伝子型を有する二倍体酵母へと変化することになる。なお、二倍体酵母は、培地中の窒素源が枯渇する等の栄養飢餓条件になると減数分裂をはじめ胞子を形成する。酵母の胞子は、子嚢という袋状構造のなかに２つのａ細胞及び２つのα細胞を有している。胞子は、栄養飢餓条件が解消されると発芽し、一倍体として再び出芽による増殖を開始する。
【００３２】
ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００３３】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００３４】
本発明に係る形質転換用酵母は、複数の選択マーカーが付与されている。具体的に、選択マーカーとしては、宿主における所定の遺伝子を不機能化することによって、所定の条件下における生育状態が他の条件下における生育状態と区別して観察される表現型を利用するものである。ここで、遺伝子の不機能化とは、当該遺伝子の欠損、当該遺伝子の転写抑制、当該遺伝子の翻訳抑制、当該遺伝子自体の変異等を意味する。なお、高次倍数体においては、全ての染色体における遺伝子が不機能化されることとなる。より具体的に、選択マーカーとしては、生育に必須な栄養成分の生合成に関与する遺伝子を不機能化させることによって付与される栄養要求性等を挙げることができる。栄養要求性としては、酵母におけるURA3遺伝子を不機能化させることで付与されるウラシル要求性、酵母におけるHIS3遺伝子を不機能化させることで付与されるヒスチジン要求性及びTRP1遺伝子を不機能化させることで付与されるトリプトファン要求性を挙げることができる。なお、不機能化させる遺伝子は、URA3遺伝子、HIS3遺伝子及びTRP1遺伝子に限定されず、例えばLeu2遺伝子、Ade2遺伝子、Lys2遺伝子等を挙げることができる。Leu2遺伝子を不機能化させることでロイシン要求性を付与することができ、Ade2遺伝子を不機能化させることでアデニン要求性を付与することができ、またLys2遺伝子を不機能化させることでリジン要求性を付与することができる。
【００３５】
複数の選択マーカーを付与するには、先ず、単独の選択マーカーを有する酵母を準備する。なお、当該酵母は、上述したようにホモタリック性を有するものである。このような単独の選択マーカーを有するホモタリックな酵母としては、例えばApplied and Environmental microbiology, May 2005, p. 2789-2792に開示されたSaccharomyces cerevisiae OC-2T株を使用することができる。このSaccharomyces cerevisiae OC-2T株は、ワイン酵母として知られているSaccharomyces cerevisiae OC-2株における一対のTRP1遺伝子を欠失させた株であり、トリプトファン栄養要求性を選択マーカーとして付与されたホモタリックな酵母である。また、同報に開示されたSaccharomyces cerevisiae OC-2U株を使用することもできる。このSaccharomyces cerevisiae OC-2U株は、Saccharomyces cerevisiae OC-2株における一対のURA3遺伝子を欠失させた株であり、ウラシル栄養要求性を選択マーカーとして付与されたホモタリックな酵母である。
【００３６】
次に、以下のようにして２つ目の選択マーカーを導入する。２つ目の選択マーカーとして、例えば、異なる栄養成分についての栄養要求性を付与する場合、当該栄養成分の生合成に関与する遺伝子を全ての染色体から欠失させる。一例として、ウラシル栄養要求性を付与されたホモタリックな酵母（OC-2U株）に対して、２つ目の選択マーカーとしてヒスチジン栄養要求性を付与する方法を図１に模式的に示す。先ず、宿主のHIS3遺伝子を欠損させるためのDNA断片を準備する。このDNA断片は、宿主におけるHIS3遺伝子の上流領域、URA3遺伝子及び宿主におけるHIS3遺伝子の下流領域をこの順で連結した構造を有している。次に、このDNA断片をウラシル栄養要求性を付与されたホモタリックな酵母に導入すると、図１（ａ）に示すように、導入したDNA断片に含まれる上流領域及び下流領域において宿主の染色体との間で相同組換えが生じる。DNA断片が染色体に導入されると、URA3遺伝子が発現することでウラシル要求性が消失することとなる。このため、DNA断片で形質転換された酵母は、ウラシル非含有培地において生育することができ、ウラシル要求性の消失を指標として同定することができる。このとき、DNA断片で形質転換された酵母の染色体構造は図１（ｂ）に示すように、一方の染色体におけるHIS3遺伝子に置き換わるようにしてURA3遺伝子が挿入されることとなる。他方の染色体におけるHIS3遺伝子は残存しており、この段階における酵母は栄養要求性を示さない。
【００３７】
次に、導入されたURA3遺伝子が脱落した株を選抜する。これは、5-フルオロオロト酸（5-FOAと称す）を含む培地で、ウラシル要求性酵母を培養することでポジティブに選択することができる。すなわち、ウラシルの生合成系を有する酵母を5-FOA存在下で培養すると、5-FOAを基質としてウラシルアナログが合成されることになり、ウラシルの生合成系を有する酵母は致死となる。よって、5-FOAを含む培地で、ウラシル要求性酵母を培養して生育した株は、URA3遺伝子が染色体から脱落したものとして同定できる。URA3遺伝子が染色体から脱落した酵母の染色体構造は、図１（ｃ）に示すように、一方の染色体におけるHIS3遺伝子のみが欠失したものとなる。
【００３８】
次に、図１（ｃ）に示した染色体構成を有する酵母を胞子形成培地において培養し、減数分裂を経て胞子を形成させる。胞子形成培地としては、特に限定されず、従来公知の組成の培地を使用することができる。次に、例えばマイクロマニュピレーター等の機器を利用して、培地から胞子（子嚢）を分離する。分離した子嚢には、図１（ｃ）に示した一対の染色体のうちいずれか一方の染色体を含む胞子（一倍体）が２個と、他方の染色体を含む胞子（一倍体）が２個含まれることとなる。次に、胞子を発芽培地において培養することで、個々の胞子を栄養増殖の生活環で増殖する。このとき、ホモタリック性を有する酵母では、一倍体の母細胞から出芽した娘細胞が、当該母細胞と接合して二倍体となるといった生活環を示すため、接合型を決定するMAT遺伝子（MATａ遺伝子及びMATα遺伝子）以外は全く同一の遺伝子型を有する二倍体酵母へと変化する。したがって、図１（ｃ）に示した染色体構成を有するホモタリックな酵母を、胞子形成の後に発芽させることによって、図１（ｄ）に示すような染色体構成を有する２種類の酵母を取得することができる。一方の２倍体酵母はウラシル栄養要求性のみを示し、他方の２倍体酵母はウラシル栄養要求性に加えてヒスチジン栄養要求性が付与されものとなる。よって、ウラシル及びヒスチジン含有培地で生育するが、ウラシル及びヒスチジン非含有培地で生育しない株として、２つ目の選択マーカーとしてヒスチジン栄養要求性が付与されたホモタリックな酵母を作製することができる。
【００３９】
なお、上述した手法を繰り返すことによって、３つ目の選択マーカーを付与できることは説明するまでもないことである。すなわち、上述した手法を採用することで、ホモタリック性を有する酵母に複数の選択マーカーを順次付与することができる。上述した手法は、ホモタリック性といった特徴的な生活環及びURA3遺伝子の脱落といった現象を効果的に利用した方法である。なお、上述の説明においては、HIS3遺伝子を欠失させるためのDNA断片にURA3遺伝子を利用し、当該URA3遺伝子の脱落を判別するために5-FOAを利用する系を説明したが、欠失対象の遺伝子はHIS3遺伝子に限定されないが、マーカーリサイクル用マーカーはURA3遺伝子が好ましい。これはウラシル要求性株を選択的に取得する事を可能とする5-FOAを利用しているためである。なお、上述したHIS3遺伝子を欠失させるためのDNA断片は、マーカーリサイクル法に利用する目的でRinji Akadaらの論文（Yeast，Volume 23，Issue 5， Pages 399-405）にも開示されている。
【００４０】
以上の説明から、複数の選抜マーカーを有する酵母のホモタリック性を利用することで、上述した細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子やキシロース代謝関連遺伝子を2コピー以上導入できることが理解される。なお、上述した細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、必ずしも2コピー以上導入する必要はなく、細胞表層に提示されたβグルコシダーゼの活性が0.02U/OD660=1以上、又はキシロース代謝速度が2.0g/h/L以上となるように導入されても良い。すなわち、酵母の宿主に導入された細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子が高発現するのであれば、当該βグルコシダーゼの活性を0.02U/OD660=1以上又はキシロース代謝速度が2.0g/h/L以上に制御することができる。例えば、細胞提示型βグルコシダーゼ遺伝子のプロモーターを高発現型プロモーターとすることで、当該βグルコシダーゼの活性を0.02U/OD660=1以上又はキシロース代謝速度が2.0g/h/L以上とすることができる。プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００４１】
すなわち、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、その発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに、ホモタリック性を有する酵母のゲノムに導入してもよい。または、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子は、ホモタリック性を有する酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。特に、ホモタリック性を有する酵母における高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子のプロモーターを含む発現制御領域の下流に、すなわち、当該発現制御領域により発現制御されるように細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子を導入することが好ましい。HOR7遺伝子の発現制御領域により細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子の発現を制御した場合には、より高いβグルコシダーゼ活性を達成することができる。
【００４２】
なお、細胞表層にβグルコシダーゼを提示する酵母は、いわゆるアーミング酵母である。アーミング酵母とは、細胞表層局在タンパク質と種々の機能性タンパク質（酵素・抗原・抗体・レポータータンパク質など）やペプチドを融合させ、細胞表層にディスプレイさせることにより、通常の酵母では有していない新しい機能を有する、あるいは元来有している機能を増強した酵母細胞のことをいう。また、細胞表層とは、細胞膜・細胞壁ならびにその間の空間であるペリプラズムのことであり、これらの層を利用し上記の様な要件を満たす酵母細胞をアーミング酵母という。すなわち、細胞表層にβグルコシダーゼを提示する酵母は、アーミング酵母の創製について詳述された公開特許公報（特開平11-290078、ＷＯ02/085935）に基づいて創製することができる。
【００４３】
一方、上述したキシロース代謝関連遺伝子については、2コピー以上の各遺伝子が酵母ゲノムに発現可能に組み込まれていればよい。すなわち、キシロース代謝関連遺伝子の発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに導入すればよい。キシロース代謝関連遺伝子のプロモーターとしては、上記で列挙した各種プロモーターを適宜使用することができる。
【００４４】
また、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及びキシロース代謝関連遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００４５】
ここで、ホモタリック性を有する酵母に対して細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及びキシロース代謝関連遺伝子を導入する際には、まずいずれか一方の遺伝子を有する発現ベクターを、酵母に付与された複数の選択マーカーのうち１つを利用して導入する。利用する選択マーカーが栄養要求性である場合には、発現ベクターに目的遺伝子とともに栄養要求性を消失させる遺伝子を導入し、栄養要求性の消失を指標として株を選択することができる。また、その後、当該株の子嚢を分離し、一倍体の胞子を発芽培地で培養する。これにより、ホモタリック性を有する酵母では、一倍体の母細胞から出芽した娘細胞が、当該母細胞と接合して二倍体となるといった生活環を示すため、接合型を決定するMAT遺伝子（MATａ遺伝子及びMATα遺伝子）以外は全く同一の遺伝子型を有する二倍体酵母へと変化する。これにより目的遺伝子は、全ての染色体に導入されることとなるため、一回の形質転換によって多コピーで染色体に導入されることとなる。これに対して、ヘテロタリックな酵母を使用した場合には、一回の形質転換によって目的遺伝子を１コピーしか導入できない。
【００４６】
次に、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及びキシロース代謝関連遺伝子のうちいずれか他方の遺伝子を有する発現ベクターを、酵母に付与された複数の選択マーカーのうち、先の処理で使用したものを除く選択マーカーを利用して導入する。これにより、上述したメカニズムと同様にして、当該他方の遺伝子についても、一回の形質転換によって多コピーで染色体に導入することができる。
【００４７】
このように、複数の選択マーカーが導入されたホモタリック性を有する酵母を利用することによって、簡便な手法によって選択マーカーの数に応じて複数の目的遺伝子を導入することができる。したがって、選択マーカーが残存していれば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及びキシロース代謝関連遺伝子をさらに導入することができ、これら遺伝子の更なる高発現を達成することができる。
【００４８】
以上のように作製された組換え酵母は、細胞表層に提示されたβグルコシダーゼを有し、優れたβグルコシダーゼ活性を示し、優れたキシロース代謝速度を示すこととなる。ここで、βグルコシダーゼ活性は、β-グルコシダーゼがPNPGを基質としてp-nitrophenolとD-glucoseを生成するので、生成したp-nitrophenol量に基づいて定義することができる（PNPG活性）。なお、所定の条件で１分間に１マイクロモルのp-nitrophenolを生成する酵素量を１Uと定義し、OD660nmで測定される細胞濃度を所与の値（例えばOD660=1）として酵素量あたりの活性値（U/OD660=1）を測定することができる。また、キシロース代謝速度は、培地中のキシロース量を例えばHPLC等により定量し、キシロース消費量と培養時間とから算出することができる。
【００４９】
＜エタノール製造＞
以上で説明した組換え酵母を利用することで、キシロース等の糖を基質としたエタノール発酵を行うことができる。特に、上述した組換え酵母は、キシロースを基質とした発酵におけるキシロース代謝速度か非常に向上しているため、キシロースを構成糖として含有する木質系バイオマスを利用したエタノール製造に好適である。
【００５０】
木質系バイオマスを用いたエタノールの製造するためには、まず、セルロースやヘミセルロースを構成単糖にまで加水分解（糖化）する。なお、糖化に先立って、木質系バイオマスに対して従来公知の前処理を施しても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、木質系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。
【００５１】
次に、木質系バイオマスを糖化してセルロースやヘミセルロースを構成する単糖を収集する。糖化方法としては、特に限定されず従来公知の手法をなんら限定されることなく利用することができる。糖化方法としては、例えば、希硫酸又は濃硫酸を利用する硫酸法、セルラーゼやヘミセルラーゼを利用する酵素法等を挙げることができる。糖化処理により、木質系バイオマスを構成する成分に由来する単糖を得ることができるが、単糖以外の二糖及びオリゴ糖を同時に収集してもよい。すなわち、単糖以外の二糖及びオリゴ糖を積極的に除去する必要はない。
【００５２】
次に、上述した組換え酵母を用いてエタノール発酵を行う。エタノール発酵に際しては、上述した組換え酵母を至適条件下で培養することが好ましい。上記組換え酵母の培養条件としては、例えば、温度を25〜35℃とし、pHを４〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。
【００５３】
特に、このエタノール発酵では上述した組換え酵母を使用しているため、培地に含まれるキシロースの代謝速度が向上することとなる。これに対して、S. Katahira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 1136-1143に開示された組換え酵母においては、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子及びキシロース代謝関連遺伝子が1コピーずつしか導入されていなため、キシロースの代謝速度は低いままである。
【００５４】
また、上述した組換え酵母は、グルコース糖のキシロース以外の糖成分（共存糖）が含まれた培地において特にキシロース代謝速度が向上したものとなっている。木質系バイオマスに由来する糖成分は、上述したようにキシロース及びキシロース以外のグルコースなどの共存糖が多く含まれる。したがって、上述した組換え酵母は、木質系バイオマスからエタノールを高効率で製造する際に特に有効であるといえる。
【００５５】
次に、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株にウラシル要求性を付与したSaccharomyces cerevisiae OC-2U株（Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996)）を宿主として、２つ目の選択マーカーとして更にヒスチジン要求性を付与した（図１（ａ）〜（ｄ）参照）。
【００５７】
先ず、AkadaらYeast 2006 23:399-405に記載のHIS3破壊DNA断片(PCR fragment that consisted of a URA3 marker attached to a 40 base repeated-generating sequence franked by the HIS3 targeteing sequence at both ends.)を作製し、OC-2U株をFrozen EZ transformation kitII：Zymo Research社により、形質転換を行い、SDプレートで生育するコロニーを分離した。SD培地は、ウラシル要求性株は生育できず、ウラシル要求性が消失した株が生育可能なプレート、すなわち、HIS3破壊DNA断片に含まれるURA3遺伝子の発現に起因するウラシル要求性の消失を指標として、形質転換体を選抜した。
【００５８】
次に、得られたコロニーをSDプレートにてシングルコロニーにした後、YPD液体培地で３０℃１日培養を行い、培養液0.2mlをFOAプレートに撒いた。ここで、FOAプレートの組成は、Bacto yeast nitrogen baseを0.67%、グルコースを2%、ウラシルを50μg/ml、及び5-FOAを0.1%である。このFOAプレートで生育したコロニーは、導入された遺伝子断片に含まれるURA3遺伝子が脱落し、OC-2U株本来のウラシル要求性が回復した株である。
【００５９】
次に、FOAプレートで生育したコロニーをYPDプレートで３０℃１日、前培養した。その後に、胞子形成培地であるShermanプレートに接種し、２５℃で３日間培養を行い、胞子形成を確認した。そして、株式会社ナリシゲ社製のマイクロマニュピレーターを用いて胞子分離を行った。
【００６０】
得られた子嚢には、胞子が３個ないし４個含まれていた。OC-2U株は、本来、酵母の性を変換するHO遺伝子を有するホモタリック性を有するため、減数分裂後１倍体の胞子が栄養細胞化に伴い２倍体化する。このため、形質転換株の４胞子のうち２胞子については、URA3遺伝子が抜け落ちHIS３遺伝子が破壊され、ウラシル要求性が回復したため、ウラシル要求性、ヒスチジン要求性を併せ持つ株として分離した。残りの２個については、正常なHIS３遺伝子をもつためウラシル要求性のみをもつ株となる。
【００６１】
そこで、得られた４胞子をSDプレート、SDプレート+ウラシル（20mg/L）、SDプレート+ヒスチジン（20mg/L）、SDプレート+ウラシル+ヒスチジンの４種のプレートにてそれぞれ培養を行った。その結果、SD+ウラシル+ヒスチジンプレートでのみ生育する菌株を単離することに成功した。すなわち、ウラシル要求性に加えて、ヒスチジン要求性を付与されたSaccharomyces cerevisiae OC-2U株を作製することに成功した。本実施例で作製したウラシル要求性及びヒスチジン要求性を合わせもつホモタリックな酵母をSaccharomyces cerevisiae OC-2HU株と命名した。
【００６２】
〔実施例２〕
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株に由来する菌株が物質生産における生産性に優れることを検証した。すなわち、異種遺伝子を形質転換により導入して高い物質生産性を目的とした場合、高発現プロモーターを活用する必要がある。プロモーターには、恒常性プロモーター、誘導性プロモーターがあるが、いずれのプロモーターを使用する場合でも高生産性を目的とする場合には、高糖濃度でのプロモーター発現量の高いものを選択する必要がある。そこで、YPH500株（実験室酵母）、OC-2T株（Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996)）について、酵母の遺伝子組換え技術において一般的に使用されるTDH1プロモーター、TDH3プロモーター及びPDC1プロモーターのプロモーター活性を、それぞれのプロモーターによって転写される遺伝子の発現量を比較することで検討した。
【００６３】
先ず、YPH500株及びOC-2T株について、グルコース量２％或いは１０％の２水準でYPD液体培養（しんとう）を行った。得られた培養菌体をサンプリングしRoche製、1ststrand cDNA synthesis kit for RT-PCRを用いてcDNAを調整し、以下のプライマーによりTDH1遺伝子、TDH3遺伝子及びPDC1遺伝子の発現量を、Roche Light cycler 330を用いて定量PCRを行った。使用したプライマー配列を表１に示す。
【００６４】
【表１】
2010035556.tif 000003
【００６５】
また、図２(a)にYPH500株、図２(b)にOC-2T株のグルコース濃度の違いによるTDH1遺伝子、TDH3遺伝子及びPDC1遺伝子の発現量を示した。実験室酵母であるYPH500株はグルコース濃度を２％から１０％へ上昇させた場合、実験に供したTDH3遺伝子及びPDC1遺伝子については、全て発現量が下がる傾向を示した。これに対して、OC-2T株では、逆にグルコース濃度を２％から１０％へ上昇させるとTDH1遺伝子、TDH3遺伝子及びPDC1遺伝子の全てにおいて発現量が増大する傾向を示した。この結果からは、YPH500株が本来、実験室酵母としてきて使用されてきたため、通常の２％グルコース含有YPD培地では、十分な性能は発揮できる株が選択されてきたのに対して、OC-2株は、従来日本国内のワイン醸造等に使用されてきた酵母であるため糖濃度が高い培地で、菌株の性能を発揮しやすくなっている事をサポートしているものと考えられる。
【００６６】
以上の結果及び考察からすると、実施例１で作製したOC-2HU株は、物質の生産性に優れるため実用酵母として有益であるといえる。
【００６７】
〔実施例３〕
本実施例では、実施例１で作製したOC-2HU株の胞子形成率を確認した。なお胞子形成率が０．１％以上である場合には、後述の実施例で説明するように、マイクロマニュピレーターを用いて子嚢を分離する作業を行いやすいため好ましい。実施例１で作製したOC-2HU株をグルコース２％含有するYPDプレートにて画線し、３０℃で１日培養した後、胞子形成培地であるShermanプレートに培養菌体を移し、２５℃で3〜４日間培養し顕微鏡にて胞子形成を確認した。OC-2HU株の胞子形成率を表２に示した。なお、胞子形成率は以下の式に従って算出した。
胞子形成率＝（胞子数）×１００/（計測細胞数）
【００６８】
【表２】
2010035556.tif 000004
【００６９】
本実施例の結果から、実施例１で作製したOC-2HU株は、培養開始から２日目程度でマイクロマニュピレーターを用いた子嚢分離を行えることが明らかとなった。
【００７０】
〔実施例４〕
本実施例では、実施例１で作製したSaccharomyces cerevisiae OC-2HU株を宿主として、３つ目の選択マーカーとして更にトリプトファン要求性を付与した。本例では、トリプトファン要求性を付与するため、以下に示すプライマーを用いてTRP１破壊断片を作製し、OC-2HUT（トリプルマーカー）株を作製した。
【００７１】
【表３】
2010035556.tif 000005
【００７２】
具体的には、TRP1-998及びTRP1-28rを用いて1stPCRを行い、TRP1-URA3及びTRP1-40rを用いて2ndPCRを行い、そして、1stPCRで増幅したDNA断片及び2ndPCRで増幅したDNA断片を鋳型とし、TRP1-998及びTRP1-40rを用いてannealing PCRを行ってTRP1破壊断片を取得した。1stPCRでは、鋳型としてOC-2T株（Saitoら、Journal of Ferment. Bioeng.81:98-103 (1996)）のゲノムDNAを使用した。2nedPCRでは、URA3遺伝子を有するStratagene社製のpRS406を鋳型として使用した。1stPCR及び2ndPCRにおける温度条件は、94℃で5分間維持した後、94℃で20秒間、50℃で30秒間及び68℃で1分間を１サイクルとして30サイクル行った後、68℃で2分間維持する条件とした。annealing PCRにおける温度条件は、94℃で5分間維持した後、94℃で20秒間、50℃で30秒間及び68℃で2分間を１サイクルとして35サイクル行った後、68℃で2分間維持する条件とした。
【００７３】
annealing PCRの結果として得られたTRP1破壊断片は、URA3遺伝子を含み、その両末端に相同組換え領域を付加した構成となっている。TRP1破壊断片を導入した組換え酵母を5-FOAを含む培地で培養すると、URA3遺伝子が脱落することとなる。
【００７４】
得られたTRP1破壊断片を実施例１に示したOC-2HU株（ヒスチジン要求性及びウラシル要求性酵母）を宿主として、実施例１に示した方法と同様にして形質転換を行い、ウラシル要求性を相補する株を単離した。次に、得られた株を、5-FOAを含有するプレート（以下、FOAプレート）に適当量塗抹し、その後、出現したコロニーを単離した。FOAプレートはウラシル要求性株をポジティブセレクションできるため、単離されたコロニーに含まれる株は、形質転換されたTRP1破壊断片からURA3遺伝子が脱落した株であると考えられる。
【００７５】
さらに、胞子形成培地であるShermanプレートにおいて胞子形成を行い、胞子形成を確認した後、顕微鏡下にてマイクロマニュピレータを用いて胞子分離を行った。得られた四胞子は、染色体上にTRP1破壊断片をホモに有する株と正常なTRP1遺伝子をホモに有する株が２：２となる。このため、SDプレートを用いてｍトリプトファン要求性株を分離すれば、トリプトファン要求性、ヒスチジン要求性及びウラシル要求性を併せ持つトリプルマーカー株を取得することができる。
【００７６】
なお、得られた胞子は、SDプレート、SDプレート+ウラシル、SDプレート+ヒスチジン、SDプレート+トリプトファン、SDプレート+ウラシル+ヒスチジン、SDプレート+ウラシル+トリプトファン、SDプレート+トリプトファン+ヒスチジン、SDプレート+ウラシル+ヒスチジン＋トリプトファンの８種のプレートにてそれぞれ培養を行った。その結果、SD+ウラシル+ヒスチジン＋トリプトファンプレートでのみ生育する菌株を単離することに成功した。すなわち、ウラシル要求性及びヒスチジン要求性に加えて、トリプトファン要求性を付与されたSaccharomyces cerevisiae OC-2HU株を作製することに成功した。本実施例で作製したウラシル要求性、ヒスチジン要求性及びトリプトファン要求性を合わせもつホモタリックな酵母をSaccharomyces cerevisiae OC-2HUT株と命名した。
【００７７】
〔実施例５〕
本実施例では、実施例４で作製したOC-2HUT株を形質転換用酵母として用い、目的遺伝子として表層提示型BGL遺伝子を４コピー導入した。
（１）アーミングBGL２コピー導入株の作製
先ず、実施例４で作製したOC-2HUT株に、以下のようにして構築したアーミングBGL-DNAであるpIBG13(HIS3マーカー)を制限酵素NdeIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)により形質転換を行った。選択プレートはSD+トリプトファン+ウラシルプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートを用いて分離し、擬陽性株を排除した。
【００７８】
次に、得られたコロニーをYPDプレートにて３０℃で１日培養を行った後、胞子形成培地（sherman）に菌体を塗り、25℃でプレート培養を行い、培養３日目に胞子形成を確認し、ナリシゲ製マイクロマニュピレーターを用いて子嚢に含まれる４胞子を分離した。これにより、２コピーpIBG13が導入された株と、pIBG13が脱落した株が２：２に分離することになる。そこで、得られた胞子をSD培地にて３０℃２日間培養し、ヒスチジン要求性が消失した株を同定した。得られた株は、pIBG13が２コピー導入された株でありOC-2ABGL２と命名した。
【００７９】
なお、pIBG13は、図３に示すように、pIHCS（Yasuya Fujitaら"Direct and Efficient Production of Ethanol from Cellulosic Material with a Yeast Strain Displaying Cellulolytic Enzymes" Appl Environ Microbiol. 2002 October; 68(10): 5136-5141参照）とpBG211（Murai, Tら"Assimilation of cellooligosaccharides by a cell surface-engineered yeast expressing β-glucosidase and carboxymethylcellulase from Aspergillus aculeatusAspergillus aculeatus." Appl. Environ. Microbiol. 1998 64:4857-4861参照）とから構築した。具体的には、pBG211を鋳型として以下の一対のプライマーセットを用いたPCRによってNcoI/XhoIサイトを両末端に持つBGL1断片（2.5kbp）を増幅した。
5′-GATCTCCATGGCTGATGAACTGGCGTTCTCTCCTCCTTTC-3′（配列番号７）
5′-TGGCGCTCGAGCCTTGCACCTTCGGGAGCGCCGCGTGAAG-3′（配列番号８）
増幅したBGL1断片は、NcoI/XhoIで処理した。また、pIHCSをNcoI/XhoIで処理し、NcoI/XhoI処理後のBGL1断片とライゲーションすることによってpIBG13を構築した。
【００８０】
（２）アーミングBGL４コピー導入株の作製
上記（１）で作製したOC-2ABGL2を用いて、以下のようにして構築したpIWBGL1(TRP1マーカー)を制限酵素Bst1107Iで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社）により形質転換を行った。選択プレートはSD+ウラシルプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートに分離し、擬陽性株を排除した。
【００８１】
次に、得られたコロニーをYPDプレートにて３０℃で１日培養を行った後、胞子形成培地であるshermanプレートに菌体を塗り、25℃でプレート培養を行い、培養３日目に胞子形成を確認し、ナリシゲ製マイクロマニュピレータを用いて子嚢に含まれる４胞子を分離した。そして、得られた胞子をSD培地にて３０℃２日間培養し、トリプトファン要求性が消失した株を同定した。同定した株は、２コピーのpIBG13と２コピーのpIWBGL1が導入され、合計でゲノムへ４コピーのアーミングBGL遺伝子断片が導入された株であり、OC-2ABGL4と命名した。
【００８２】
なお、pIWBGL1は、図４に示すように、pRS404（ATCC Number: 87515）及びpIBG13から構築した。pIWBGL1を構築する際には、先ず、pRS404をNotIで処理した後にアルカリフォスファターゼ処理を行った。そして、pIBG13をNotI処理することによってGAPDH promoter-BGL1 gene-3'half of a-agglutinin geneを切り出し、NotI処理及びアルカリフォスファターゼ処理後のpRS404とライゲーションした。これによりpIWBGL1を構築した。
【００８３】
（３）アーミングBGL４コピー及びキシロース代謝関連遺伝子２コピー導入株の作製
上記（２）で作製したOC-2ABGL4を用いて、pIUX1X2Xk(URA3マーカー)を制限酵素NcoIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社）により形質転換を行った。選択プレートはSDプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートに分離し、擬陽性株を排除した。なお、pIUX1X2Xkについては、S. Katahira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 1136-1143に開示されており、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子がそれぞれGAPDHプロモーターの制御下に発現可能に導入されたプラスミドである。
【００８４】
次に、得られたコロニーをYPDプレートにて３０℃で１日培養を行った後、胞子形成培地であるshermanプレートに菌体を塗り、25℃でプレート培養を行い、培養３日目に胞子形成を確認し、ナリシゲ製マイクロマニュピレーターを用いて子嚢に含まれる４胞子を分離した。そして、得られた胞子をSD培地にて３０℃２日間培養し、ウラシル要求性が消失した株を同定した。同定した株は、２コピーのpIBG13と２コピーのpIWBGL1と２コピーのpIUX1X2Xkとが導入され、合計でゲノムへ４コピーのアーミングBGL遺伝子断片及び２コピーのキシロース代謝関連遺伝子が導入された株であり、OC-2ABGL4Xyl2と命名した。
【００８５】
なお、上述した方法に準じて、上記（１）で作製したOC-2ABGL2に対してキシロース代謝関連遺伝子を２コピー導入した株を作製した（OC-2ABGL2Xyl2）。
【００８６】
（４）p-ニトロフェニル-β-D-グルコシド（PNPG）活性の測定
次に、上記（１）で作製したOC-2ABGL2及び上記（２）で作製したOC-2ABGL4における、BGL遺伝子産物であるβ-グルコシダーゼ活性を評価した。具体的には、β-グルコシダーゼがPNPGを基質としてp-nitrophenolとD-glucoseを生成するので、p-nitrophenol量を測定（PNPG活性）して評価した。なお、下記の条件で１分間に１マイクロモルのp-nitrophenolを生成する酵素量を１Uと定義した。
【００８７】
測定に使用する試薬は下記の通りである。
・0.1M 酢酸緩衝液 pH5.0（25℃）
・20mM PNPG水溶液（603ｍｇのPNPGを100ｍｌの蒸留水に溶解）
・0.2M Na2CO3溶液（21.2gの無水炭酸ナトリウムを蒸留水に溶解）
【００８８】
測定の手順は、先ず試験管に反応混液（1.0mlの0.1M酢酸緩衝液及び0.5mlのPNPG水溶液）を調整し、37℃で約５分間予備加温した。次に、希釈した培養液を0.5ml加え、反応を開始した。次に、37℃で正確に15分間反応させた後、Na2CO3溶液2mlを加え、反応を停止した。次に、反応液における400nm吸光度を測定した。盲検は反応液を37℃で15分間放置後、Na2CO3溶液2mlを加えて混和し、次いで酵素溶液0.5ｍｌを加えて調整した。
【００８９】
なお、本実施例では希釈した培養液として以下を調製した。すなわち、先ず、YPD培地でOD660＝20となるよう培養組成を調整し、セロビオース５％、イーストエキス１％及びペプトン２％添加した培地に上記（１）で作製したOC-2ABGL2若しくは上記（２）で作製したOC-2ABGL4を接種し全量２０mlとし、30℃、60rpmの条件でしんとう培養を行った。培養開始１日目及び２日目に培地を１ml採取し、これを５０倍に希釈して本実験に供した。結果を図５に示した。
【００９０】
図５から明らかなように、アーミングBGL遺伝子が導入されていない親株（OC-2HUT株）については、PNPG活性が検出されていないのに対して、アーミングBGL遺伝子数の増加に伴い、PNPG活性は顕著に向上した。
【００９１】
〔実施例６〕
本実施例では、実施例５（３）で作製したOC-2ABGL4Xyl2株について、共存糖の違いによるキシロース代謝速度への影響を評価した。先ず、YP培地をベースに、(1)グルコース9%+キシロース6%、(2)セロビオース9%+キシロース6%、及び(3)キシロース6%を含有する３種類の培地を作製した。これら３種類の培地に対してOC-2ABGL4Xyl2株をそれぞれ接種し、30℃、60rpmの条件でしんとう培養を行った。
【００９２】
そして、培養液に含まれるキシロース濃度を、培養開始から２４時間の間、経時的に測定した。キシロース濃度は、HPLCで測定した。その測定結果を図６に示した。
【００９３】
図６に示すように、OC-2ABGL4Xyl2株のキシロース代謝量は、培地にキシロースのみ含有する場合には1.83%にすぎなかった。これに対して、培地にキシロースに加えてグルコースやセロビオースといった共存糖が含まれている場合には、キシロース代謝量がそれぞれ4.34%及び4.92%まで向上していた。なお、ここでキシロース代謝量とは、培養開始時において培地に含まれるキシロース濃度から、培養開始24時間において培地に含まれるキシロース濃度を引いた値（％）として示している。
【００９４】
この結果から、実施例３で作製したOC-2ABGL4Xyl2株は、特に共存糖が存在する場合にキシロース代謝速度がより向上するといった特徴を有していることが明らかとなった。さらに、共存糖としては、グルコースよりもセロビオースの方がキシロース代謝速度の観点でより好ましいことが明らかとなった。
【００９５】
〔実施例７〕
本実施例では、実施例５（３）で作製したOC-2ABGL4Xyl0032株及びOC-2ABGL2Xyl2株を用いて、BGL遺伝子のコピー数の違いによるキシロース代謝速度への影響を評価した。先ず、先ず、YP培地をベースに、セロビオース9%+キシロース6%を含有する培地を作製した。この培地に対してOC-2ABGL4Xyl2株又はOC-2ABGL2Xyl2株を接種し、30℃、60rpmの条件でしんとう培養を行った。
【００９６】
そして、培養液に含まれるキシロース濃度を、培養開始から24時間の間、経時的に測定した。キシロース濃度は、実施例４と同様にして測定した。その測定結果を図７に示した。
【００９７】
図７に示すように、OC-2ABGL2Xyl2株では培養開始24時間後のキシロース代謝量が3.38%であったのに対して、OC-2ABGL4Xyl2株では培養開始24時間後のキシロース代謝量が4.92%であった。なお、ここでキシロース代謝量とは、培養開始時において培地に含まれるキシロース濃度から、培養開始24時間において培地に含まれるキシロース濃度を引いた値（％）として示している。
【００９８】
この結果から、表面提示型BGL遺伝子を４コピー導入した場合には、表面提示型BGL遺伝子を２コピー導入した株と比較して、キシロース代謝速度が約５割以上向上することが明らかとなった。
【００９９】
〔実施例８〕
本実施例では、実施例５（３）で作製したOC-2ABGL4Xyl2株を用いてキシロース代謝速度を評価した。先ず、先ず、YP培地をベースに、セロビオース9%+キシロース6%を含有する培地を作製した。この培地に対してOC-2ABGL4Xyl2株を接種し、30℃、120rpmの条件でしんとう培養を行った。
【０１００】
そして、培養液に含まれるキシロース濃度、セロビオース濃度及びエタノール濃度を、培養開始から24時間の間、経時的に測定した。キシロース濃度は、実施例４と同様にして測定した。セロビオース濃度はHPLCで測定した。エタノール濃度は、酵素センサー（王子計測機器株式会社製、型番BF4）を使用して測定した。その測定結果を図８に示した。
【０１０１】
図８に示すように、OC-2ABGL4Xyl2株は、培養開始24時間以内にセロビオース8.2%及びキシロース5%をほぼ完全に代謝し、5.8％のエタノールを生成することができた。なお、図８に示した結果からOC-2ABGL4Xyl2株のキシロース代謝速度は2.0g/h/Lであることが明らかとなった。この結果から、OC-2ABGL4Xyl2株を使用することによって、木質系バイオマスを用いたエタノール製造においてキシロースを有効に利用してエタノールを効率よく製造できることが明らかとなった。
【０１０２】
〔実施例９〕
本実施例では、β-グルコシダーゼ活性をより向上させるべく、BGL遺伝子の発現を制御する発現制御領域について検討した。具体的に、本実施例では、実施例４で作製したOC-2HUT株に内在するグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）又は高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）の発現制御領域の下流にアーミングBGL遺伝子を導入し、β-グルコシダーゼ活性を検討した。
【０１０３】
先ず、TDH3遺伝子の発現制御領域の下流にアーミングBGL遺伝子を導入するためのプラスミドpABGL-TDH3P、PDC1遺伝子の発現制御領域の下流にアーミングBGL遺伝子を導入するためのプラスミドpABGL-PDC1P及びHOR7遺伝子の発現制御領域の下流にアーミングBGL遺伝子を導入するためのプラスミドpABGL-HOR7Pを構築した（図９参照）。使用したプライマーを下記表４に示す。
【０１０４】
【表４】
2010035556.tif 000006
【０１０５】
先ず、図３に示したプラスミドpIBG13を鋳型とし、プライマー（１）及び（２）を用いたPCRを行った。得られたPCR断片を制限酵素BssHIIで処理した。そして、得られたDNA断片と、制限酵素BssHIIで処理したStratagene社製のpRS403とをライゲーションし、プラスミドpRS404-NotI-s.s-BGL1-3'half a-agglutinin-SphIを作製した。また、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（３）及び（４）を用いたPCRを行い、得られたPCR断片を制限酵素SphIで処理した。そして、得られたDNA断片と、制限酵素SphIで処理したプラスミドpRS404-NotI-s.s-BGL1-3'half a-agglutinin-SphIとをライゲーションし、プラスミドpRS404-NotI-s.s-BGL1-3'half a-agglutinin-SphI-TRP1-NotIを作製した（図１０）。
【０１０６】
一方、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（５）及び（８）を用いたPCRによりHOR7プロモーター領域を含むDNA断片を増幅した。また、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（６）及び（９）を用いたPCRによりPDC1プロモーター領域を含むDNA断片を増幅した。さらに、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（７）及び（１０）を用いたPCRによりTDH3プロモーター領域を含むDNA断片を増幅した。これらHOR7プロモーター領域を含むDNA断片、PDC1プロモーター領域を含むDNA断片及びTDH3プロモーター領域を含むDNA断片をそれぞれ、制限酵素EcoRI及びSalIにて処理した。そして、得られた３種類のDNA断片と、制限酵素EcoRI及びSalIにて処理したpUC19とをライゲーションし、３種類のプラスミドpUC19-AscI-HOR7promoter-NotI-SalI、pUC19-AscI-PDC1promoter-NotI-SalI及びpUC19-AscI-TDH3promoter-NotI-SalIを作製した（図１１）。
【０１０７】
次に、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（１１）及び（１４）を用いたPCRによりHOR7遺伝子のコーディング領域の一部を含むDNA断片を増幅した。また、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（１２）及び（１５）を用いたPCRによりPDC1遺伝子のコーディング領域の一部を含むDNA断片を増幅した。さらに、S. cerevisiaeのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー（１３）及び（１６）を用いたPCRによりTDH3遺伝子のコーディング領域の一部を含むDNA断片を増幅した。これら３種類のDNA断片をそれぞれ制限酵素NotI及びSalIにて処理した。そして、得られたHOR7遺伝子のコーディング領域の一部を含むDNA断片（NotI-SalI断片）と、制限酵素NotI及びSalIにて処理したプラスミドpUC19-AscI-HOR7promoter-NotI-SalIをライゲーションし、プラスミドpUC19-AscI-HOR7promoter-NotI-truncated-AscIを作製した。また、得られたPDC1遺伝子のコーディング領域の一部を含むDNA断片（NotI-SalI断片）と、制限酵素NotI及びSalIにて処理したプラスミドpUC19-AscI-PDC1promoter-NotI-SalIをライゲーションし、プラスミドpUC19-AscI-PDC1promoter-NotI-truncated-AscIを作製した。さらに、得られたTDH3遺伝子のコーディング領域の一部を含むDNA断片（NotI-SalI断片）と、制限酵素NotI及びSalIにて処理したプラスミドpUC19-AscI-TDH3promoter-NotI-SalIをライゲーションし、プラスミドpUC19-AscI-TDH3promoter-NotI-truncated-AscIを作製した（図１１）。
【０１０８】
最後に、図１０に示したプラスミドpRS404-NotI-s.s-BGL1-3'half a-agglutinin-SphI-TRP1-NotIをNotIで処理し、BGL遺伝子、3'half a-agglutinin及びTRP1遺伝子を含むDNA断片（NotI断片）を切り出した。そして、得られたDNA断片と、制限酵素NotIで処理した３種類のプラスミドpUC19-AscI-HOR7promoter-NotI-truncated-AscI、pUC19-AscI-PDC1promoter-NotI-truncated-AscI及びpUC19-AscI-TDH3promoter-NotI-truncated-AscIとをライゲーションし、プラスミドpABGL-HOR7P、pABGL-PDC1P及びpABGL-TDH3Pを作製した（図１２）。これらプラスミドpABGL-HOR7P、pABGL-PDC1P及びpABGL-TDH3Pは、制限酵素AscIで処理することで、細胞表層提示型β-グルコシダーゼ遺伝子及び選択マーカーであるTRP1遺伝子を、染色体への相同組換え領域を含むDNA断片として切り出すことができる。
【０１０９】
なお、これらプラスミドpABGL-HOR7P、pABGL-PDC1P及びpABGL-TDH3Pには、所望の領域に相同組換えを生じるように一対のDNA断片がそれぞれ含まれている。詳細には、プラスミドpABGL-TDH3Pには、TDH3遺伝子の上流に位置する約300bpの領域（配列番号９）及びTDH3遺伝子のコーディング領域に含まれる約300bpの領域（配列番号１０）が含まれている。プラスミドpABGL-PDC1Pには、PDC1遺伝子の上流に位置する約300bpの領域（配列番号１１）及びPDC1遺伝子のコーディング領域に含まれる約300bpの領域（配列番号１２）が含まれている。同様に、プラスミドpABGL-HOR7Pには、HOR7遺伝子の上流に位置する約300bpの領域（配列番号１３）及びHOR7遺伝子のコーディング領域に含まれる約300bpの領域（配列番号１４）が含まれている。
【０１１０】
以上のように構築したこれらプラスミドpABGL-HOR7P、pABGL-PDC1P及びpABGL-TDH3Pを用いて、実施例４で作製したOC-2HUT株に形質転換した。先ず、各プラスミドを制限酵素AscIで処理した後、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)により形質転換を行った。選択プレートはSD+ヒスチジン+ウラシルプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートを用いて分離し、擬陽性株を排除した。
【０１１１】
次に、得られたコロニーをYPDプレートにて３０℃で２日培養を行った後、胞子形成培地（sherman）に菌体を塗り、25℃でプレート培養を行い、培養３日目に胞子形成を確認し、ナリシゲ製マイクロマニュピレーターを用いて子嚢に含まれる４胞子を分離した。これにより、２コピーの上記プラスミドが導入された株と、pIBG13が脱落した株が２：２に分離することになる。そこで、得られた胞子をSD培地にて３０℃２日間培養し、トリプトファン要求性が消失した株を同定した。２コピーのプラスミドpABGL-TDH3Pが導入された株をOC-2ATDH37PBGL2と命名し、２コピーのプラスミドpABGL-PDC1Pが導入された株をOC-2APDC1PBGL2と命名し、２コピーのプラスミドpABGL-HOR7Pが導入された株をOC-2AHOR7PBGL2と命名した。
【０１１２】
得られた３種の形質転換酵母OC-2ATDH37PBGL2、OC-2APDC1PBGL2及びOC-2AHOR7PBGL2について、実施例５（４）に記載した方法に準じてPNPG活性を測定した。その結果を図１３に示した。図１３から分かるように、全ての形質転換酵母において、導入したアーミングBGL遺伝子に起因するβ-グルコシダーゼ活性を確認することができた。特に、OC-2AHOR7PBGL2においては、他の形質転換酵母と比較して優れたβ-グルコシダーゼ活性を示すことが分かった。この結果から、HOR7遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入することが、β-グルコシダーゼ活性を向上させる点で非常に優れていることが判明した。
【０１１３】
〔実施例１０〕
本実施例では、実施例９で作製した形質転換酵母OC-2APDC1PBGL2及びOC-2AHOR7PBGL2に、実施例５（３）で使用したpIUX1X2Xkを用いて、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子をGAPDHプロモーターの制御下に発現可能に導入した。なお、pIUX1X2Xkについては、S. Katahira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 1136-1143に開示されており、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子がそれぞれGAPDHプロモーターの制御下に発現可能に導入されたプラスミドである。
【０１１４】
先ず、pIUX1X2Xk(URA3マーカー)を制限酵素PstIで線状化したプラスミドにより、Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社）を用いて形質転換を行った。選択プレートはSD(G)＋ヒスチジンプレートを用いた。形質転換により得られたコロニーを同じプレートに分離し、擬陽性株を排除した。
【０１１５】
次に、実施例５（３）に記載された方法に準じて時と同様に、実施例９で作製した形質転換酵母OC-2APDC1PBGL2及びOC-2AHOR7PBGL2に２コピーのpIUX1X2Xkが導入された形質転換酵母をそれぞれOC-2APDC1PBGL2XYL2及びOC-2AHOR7PBGL2XYL2と命名した。
【０１１６】
得られた２種の形質転換酵母OC-2APDC1PBGL2XYL2及びOC-2AHOR7PBGL2XYL2について、実施例５（４）に記載した方法に準じてPNPG活性を測定した。その結果を図１４及び表５に示した。なお、図１４には、比較のため、OC-2HUT株、OC-2HUT株に２、４若しくは６コピーのアーミングBGL遺伝子を導入したTDH3PBGL2株、TDH3PBGL4株及びTDH3PBGL6株、OC-2HUT株にpIUX1X2Xkを導入したOC-2HTx2株について測定したPNPG活性も併せて示した。
【０１１７】
【表５】
2010035556.tif 000007
【０１１８】
図１４から分かるように、HOR7遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入した株においては、アーミングBGL遺伝子を６コピー導入した株よりも優れたβ-グルコシダーゼ活性を示した。また、表５から分かるように、PDC1遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入するとともにキシロース代謝関連遺伝子を導入した株においては、PDC1遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入し株と同等のβ-グルコシダーゼ活性を示した。これに対して、HOR7遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入するとともにキシロース代謝関連遺伝子を導入した株においては、HOR7遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入した株と比較して更に優れたβ-グルコシダーゼ活性を示した。この結果から、詳細なメカニズムは不明ではあるが、HOR7遺伝子の発現制御領域により発現制御されるようにアーミングBGL遺伝子を導入するとともにキシロース代謝関連遺伝子を導入した株では、予測の範囲を超える優れたβ-グルコシダーゼ活性を示すことが分かった。
【０１１９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2010035556.tif 000008
【図２】
2010035556.tif 000009
【図３】
2010035556.tif 000010
【図４】
2010035556.tif 000011
【図５】
2010035556.tif 000012
【図６】
2010035556.tif 000013
【図７】
2010035556.tif 000014
【図８】
2010035556.tif 000015
【図９】
2010035556.tif 000016
【図１０】
2010035556.tif 000017
【図１１】
2010035556.tif 000018
【図１２】
2010035556.tif 000019
【図１３】
2010035556.tif 000020
【図１４】
2010035556.tif 000021
【配列表】
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