(57)【要約】【課題】本発明は、従来の生体試料中の抗体の検出方法に比較して、感度がより向上した方法、及び該方法に用いられる試薬キットを提供することを目的とする。【解決手段】被験者から採取された生体試料中の検出対象の抗体と、ポリエチレングリコール鎖が付加され、且つ固相に結合可能にされた前記抗原に対する抗原と、固相との複合体を形成する工程；複合体を形成する前記抗体に、標識物質で標識され、且つ前記抗体に結合可能な物質を結合させ、複合体を標識する工程；及び標識された複合体を検出する工程を含む、抗体の検出方法により、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された生体試料に含まれる抗体を検出する方法であって、
生体試料中の検出対象の抗体と、ポリエチレングリコール鎖が付加され、且つ固相に結合可能にされた前記抗体に対する抗原と、固相との複合体を形成する工程；
複合体を形成する前記抗体に、標識物質で標識され、且つ前記抗体に結合可能な物質を結合させ、複合体を標識する工程；及び
標識された複合体を検出する工程；
を含む、抗体の検出方法。
【請求項２】
ポリエチレングリコール鎖が、エチレンオキシド単位を少なくとも４つ含むポリエチレングリコール鎖である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が、肝炎抗原である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
複合体形成工程が、生体試料中の検出対象の抗体と、前記抗体に対する抗原とを接触させ、抗原−抗体複合体を形成した後に、前記抗原−抗体複合体と、固相とを接触させ、抗原−抗体−固相複合体を形成する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原が、ビオチンとアビジン類との結合により固相に結合可能にされている請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体に結合可能な物質が抗ヒトＩｇＧ抗体であり、標識物質が酵素である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ポリエチレングリコール鎖が付加され、且つ固相に結合可能にされた、検出対象の抗体に対する抗原と、固相とを含む、抗体検出用試薬キット。
【請求項８】
ポリエチレングリコール鎖が、エチレンオキシド単位を少なくとも４つ含むポリエチレングリコール鎖である、請求項７記載の試薬キット。
【請求項９】
標識物質で標識され、且つ前記抗体に結合可能な物質をさらに含む、請求項７又は８に記載の試薬キット。
【請求項１０】
前記抗原が肝炎抗原である、請求項７〜９のいずれか1項に記載の試薬キット。
【請求項１１】
試薬に含まれる前記抗原の濃度が、0.3〜3μg/mlである、請求項７〜１０のいずれか1項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感度が向上した抗体の検出方法及び該方法に用いられる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の抗体を検出するための免疫学的な手法として、検出対象の抗体に対する抗原を固相に固定化し、固相上で抗原−抗体複合体を形成させた後、固定化された前記抗体を標識物質で標識し、標識された量を検出する方法が挙げられる。この際、抗原としては、合成ペプチドや遺伝子組み換え蛋白などが使用される。
【０００３】
ここで、抗原として合成ペプチドを固相に固定した場合、その分子量が小さいと、固相上のブロッキング剤等による立体障害等により、検出対象の抗体との反応性が低くなることがある。そのような場合には、合成ペプチドとBSAなどのキャリアー蛋白と結合させて複合抗原として使用したり（例えば、特開２００５−２５７７００号公報（特許文献１））、ポリリジンなどのような適当なリンカーと結合させて使用したりする（例えば、特開平６−３１９５７０号公報（特許文献２））ことで抗体との反応性を上げている。
【０００４】
また、ポリエチレングリコール鎖をタンパク質に付加することは、従来、タンパク質の修飾方法の一つとして知られている。しかし、ポリエチレングリコール鎖が付加されたタンパク質は、宿主の免疫機構に認識されにくい、すなわち抗原性が低下することが知られている（例えば、特開２００６−１６９２６３号（特許文献３））。修飾方法によっては、抗原の立体構造などが変化し、抗原性に変化が生じることが考えられる。
【特許文献１】特開２００５−２５７７００号公報
【特許文献２】特開平６−３１９５７０号公報
【特許文献３】特開２００６−１６９２６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の抗体の検出方法に比較して、感度がより向上した方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、ポリエチレングリコール鎖が付加された合成ペプチド抗原を用いてイムノアッセイを行ったところ、アッセイの感度が向上することを見出した。
上述したように、ポリエチレングリコール鎖が付加されたタンパク質は、抗原性が低下することが知られているが、本発明者らは、予期せぬことに、ポリエチレングリコール鎖を抗原に付加することにより、生体試料中の抗体に対する反応性が向上することを見出して、本発明を完成した。
【０００７】
よって、本発明は、生体試料中の検出対象とする抗体と、ポリエチレングリコール鎖が付加され、且つ固相に結合可能にされた前記抗体に対する抗原と、固相との複合体を形成する工程；複合体を形成する前記抗体に、標識物質で標識され、且つ前記抗体に結合可能な物質を結合させ、複合体を標識する工程；及び標識された複合体を検出する工程を含む、抗体の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、より感度が高い抗体の検出方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の抗体の検出方法は、検出対象の抗体と、ポリエチレングリコール鎖が付加され、且つ固相に結合可能にされた前記抗体に対する抗原との結合に基づくイムノアッセイに基づくものである。上記の抗原と、生体試料中に含まれ得る上記の抗体とを接触させることにより得られる複合体を、固相を用いて生体試料から分離することにより、該複合体、すなわち抗原に結合した抗体を検出することができる。
【００１０】
本発明において使用される抗原は、天然から回収されたもの、組換え遺伝子工学的手法により作製されたもの、又は化学合成されたもののいずれであってもよい。抗原を天然から回収する方法、組換え遺伝子工学的手法により作製する方法及び化学合成する方法は、それ自体公知である。
例えば、抗原を化学合成する場合、固相合成法及び液相合成法のいずれを用いてもよい。また、市販のペプチド合成機を用いて合成してもよい。
なお、本発明において使用される抗原としては、肝炎抗原が好ましく、特に非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ非Ｇ型肝炎（非Ａ−Ｇ型肝炎）の抗原が好ましい。ここで、非Ａ−Ｇ型肝炎抗原は、好ましくは、配列番号１の１１〜２２位のアミノ酸配列を少なくとも含み、より好ましくは、配列番号１の１〜２２位のアミノ酸配列を少なくとも含む。
【００１１】
本発明の方法において検出対象の抗体に対する抗原に付加する「ポリエチレングリコール鎖」は、エチレンオキシド単位を少なくとも４つ含むものが好ましい。ポリエチレングリコール鎖において、エチレンオキシド単位（-(CH2-CH2-O)-）は、直接結合していてもよいし、これらのエチレンオキシド単位の間にリンカー構造が介在していてもよい。リンカー構造としては、−ＲＣＯＮＨ−基、−ＮＨＣＯＲ−基（Ｒは、炭素数１〜３のアルキレン基である）などが挙げられる。
また、該ポリエチレングリコール鎖と抗原との間にも、リンカー構造が介在していてもよい。このようなリンカー構造としては、炭素数１〜３のアルキレン基が挙げられる。
【００１２】
上記のポリエチレングリコール鎖に含まれるエチレンオキシド単位の数の上限は、用いる抗原の種類にもよるが、通常、１２であり、より好ましくは８である。
抗原に付加したエチレンオキシド単位の数は、エレクトロスプレイ/イオン化法質量分析(ESI-MS)計、例えば、Applied Biosystems社製API2000により確認できる。
【００１３】
検出対象の抗体に対する抗原への上記のポリエチレングリコール鎖の付加は、それ自体公知の方法により行うことができる。
例えば、ペプチドの化学合成反応と同じ原理を用いてポリエチレングリコール鎖を抗原に付加できる。すなわち、アミノ基又はカルボキシル基のいずれか一方を保護し、他方を活性化したポリエチレングリコール鎖を有する化合物を、ペプチド合成の際に縮合させるアミノ酸の代わりに用いて、抗原のペプチド鎖の末端に縮合させることができる。より具体的には、抗原の例えばＮ末端に、適切な保護基、例えば9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(Bz)、p-ビフェニルイソプロピルオキシカルボニルでアミノ基が保護され、かつカルボキシル基が活性化されたポリエチレングリコール鎖を有するカルボン酸誘導体、例えばFmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Boc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-11-アミノ-3,6,9-トリオキサウンデカン酸、Boc-11-アミノ-3,6,9-トリオキサウンデカン酸などを反応させ、この反応を所望の長さのポリエチレングリコール鎖が得られるまで繰り返す方法を用いることができる。
上記のアミノ基が保護された、ポリエチレングリコール鎖を有するカルボン酸誘導体は、市販で入手可能であり、例えばPeptides International社のmini-PEG(商標)を用いることができる。
【００１４】
また、例えば、抗原中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してポリエチレングリコール鎖を抗原に付加できる。アミノ基と反応性を有する基としてはN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。
これらの反応性基を有するポリエチレングリコール鎖は、市販で入手可能である。例えば、PIERCE社のメチル-PEO4-NHSエステル、メチル-PEO8-NHSエステル、メチル-PEO12-NHSエステルなどを用いることができる。
【００１５】
上記のポリエチレングリコール鎖は、検出対象の抗体に対する抗原の抗原性を損なわない位置であれば、前記抗原のアミノ酸配列のいずれの位置に付加されてもよいが、Ｎ末端又はＣ末端に付加されることが好ましい。
【００１６】
前記抗原を固相に結合可能にする様式としては、当該技術において公知の様式を用いることができる。好ましくは、該抗原に固相結合部位を付加し、固相に該固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化し、該固相結合部位と結合物質との結合により、抗原が固相に結合可能となる。
【００１７】
上記の固相結合部位と結合物質は、本発明の方法の反応条件下で特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせは、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオンン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。
ハプテンと抗ハプテン抗体としては、例えば、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体が挙げられる。好ましくは、ビオチンとアビジン類との組み合わせである。より好ましくは、固相結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類である。固相結合部位と結合物質との組み合わせの各々の物質は、どちらを抗原又は固相に結合させてもよく、特に限定されない。なお、本明細書において「アビジン類」は、アビジン及びストレプトアビジンを含むことを意味する。
【００１８】
上記のポリエチレングリコール鎖と、固相結合部位とは、それぞれが検出対象の抗体に対する抗原に直接結合してもよいが、該抗原に結合したポリエチレングリコール鎖に固相結合部位が結合することがより好ましい。このような構造とすることにより、生体試料中の抗体が、前記抗体に対する抗原及びポリエチレングリコール鎖を介して固相に結合することができる。
【００１９】
ポリエチレングリコール鎖と固相結合部位との結合は、固相結合部位の種類に応じて、それ自体公知の方法により行うことができる。例えば、固相結合部位の末端とポリエチレングリコール鎖の末端基との間にアミド結合などを形成させる反応を行うことにより、固相結合部位とポリエチレングリコール鎖とを結合させることができる。
【００２０】
また、固相結合部位が検出対象の抗体に対する抗原と直接結合する場合に、固相結合部位を前記抗原に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、固相結合部位がビオチンを含む場合、ビオチンが有するカルボキシル基を、通常のペプチド合成に用いられる縮合剤（例えばHBTU（1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドヘキサフルオロホスファート)、カルボジイミドなど）を用いて、抗原のＮ末端のアミノ基に縮合させることができる。
また、該抗原中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを抗原に結合させることもできる。アミノ基と反応性を有する基としてはNHS基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。
【００２１】
上記の固相は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。固相の材料としては、例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。
また、固相の形状としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子などが挙げられる。粒子としては、磁性粒子、ポリスチレンラテックスのような疎水性粒子、粒子表面にアミノ基、カルボキシル基などの親水基を有する共重合ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。
【００２２】
より好ましくは、固相は、磁性粒子である。
磁性粒子は、磁性を有する材料を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材として例えばＦｅ2Ｏ3及び／又はＦｅ3Ｏ4、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。磁性粒子の表面へのタンパク質などの結合を目的として、基材の表面をポリマーなどで被覆したものなどがより好ましい。
【００２３】
上記の結合物質を固相に固定化する方法は、当該技術において公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。
結合物質がアビジン類である場合、例えば、物理的吸着によりアビジンを固相に直接固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した固相にアビジン類を結合させる方法により、アビジン類を固相に固定化することができる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を固相に固定化することも可能である。
また、アビジン類を結合させた固相は、例えばＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから購入することもできる。
【００２４】
本発明の方法では、生体試料中に含まれ得る抗体と、上記の抗原と、固相との複合体を形成させる。該複合体を形成させるには、抗体と抗原及び抗原と固相が結合するように、それぞれを接触さればよい。すなわち、抗体と抗原と固相を混合することで、複合体を形成させることができる。
生体試料と、抗原と、固相との接触順序は特に限定されず、生体試料と抗原とを混合した後に固相を加えてもよく、抗原と固相とを混合してから生体試料に加えてもよく、生体試料と固相とを混合した後に抗原を加えてもよい。また、生体試料と、抗原と、固相とを同時に接触させてもよい。抗原と抗体との反応が進行しやすいと考えられる点で、生体試料と抗原とを混合した後に固相を加える、すなわち、抗体と抗原とが複合体を形成した後に、該複合体中の抗原が固相に結合するのが好ましい。
【００２５】
上記の生体試料は、検査しようとする対象のヒトから採取された試料であり、全血、血清、血漿などの血液試料を含む。
【００２６】
本発明の方法において、検出対象の抗体に対する抗原は、用いる抗原の種類にもよるが、生体試料中に含まれ得る抗体に対して過剰量で反応させることが好ましい。より具体的には、反応における前記抗原の濃度は、0.1〜10μg/mlが挙げられ、0.3〜3μg/mlが好ましく、0.5〜2μg/mlが特に好ましい。
【００２７】
本発明の方法は、通常のイムノアッセイの反応条件下で行うことができる。このような条件とは、好ましくは、ｐＨ６〜10、30〜45℃の温度である。
また、生体試料と抗原と固相とをそれぞれ接触させる時間は、特に限定されないが、通常、1〜5分である。
【００２８】
上記のようにして、固相に結合した抗原−抗体複合体は、固相を回収することにより、生体試料から分離できる。分離と同時に洗浄を行って、複合体を形成していない抗原及び抗体を除去することが好ましい。洗浄は、当該技術において公知の洗浄液を用いて行うことができる。
【００２９】
上記のようにして生体試料から分離された抗原に結合した抗体の検出は、標識物質で標識され、且つ該抗体に結合可能な物質を用いて検出を行う。すなわち、抗原を介して固相に結合した抗体を、標識物質で標識され、且つ抗体に結合可能な物質を用いて標識する。そして、標識された抗体を検出すればよい。
抗体に結合可能な物質は、ヒト型抗体に結合し得る物質であり、ヒト型抗体に対する抗体を用いることが好ましい。ヒト型抗体に対する抗体は、抗体のフラグメント及びその誘導体も含む。具体例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）2フラグメント、及びｓＦｖフラグメント等が挙げられる。抗体のクラスはＩｇＧ、ＩｇＭなどを含み得るが、これらに限定されない。
【００３０】
上記の標識物質は、通常のイムノアッセイにおいて用い得る標識物質であれば特に限定されず、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。
【００３１】
上記の標識物質の測定は、当該技術において公知の方法に従って行うことができ、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。
例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を用いて発色又は発光反応を行うことにより、標識物質を測定できる。例えば、酵素がアルカリホスファターゼである場合、基質としては、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発色基質を用いることができる。
これらの基質による発光又は発色を、ルミノメータ又は分光光度計により測定できる。
【００３２】
本発明は、ポリエチレングリコール鎖が付加され、且つ固相に結合可能にされた検出対象の抗体に対する抗原と、固相とを含む、抗体の検出用試薬キットも提供する。
上記の抗原と、固相とは、同じ試薬に含まれていてもよいし、異なる試薬に含まれていてもよい。なお、上記抗原と固相が、同じ試薬に含まれている場合は、上記抗原と固相とは、予め結合した状態で試薬中に含まれていても良い。より好ましくは、抗原と固相とは別々の試薬に含まれている。
【００３３】
上記の試薬キットは、上記の標識物質で標識され、且つ生体試料中の抗体に結合可能な物質をさらに含むことが好ましい。該物質は、上記の抗原及び固相とは別の試薬に含まれることが好ましい。
【００３４】
本発明の試薬キットに含まれる各試薬は、液体であってもよいし、用時に水などを加えて用いるための固体であってもよい。
【００３５】
液体の形態の試薬は、適切な溶媒中に、少なくとも上記の各成分を溶解したものであればよい。適切な溶媒としては、水、ｐＨ６〜10の緩衝液などが挙げられる。該緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）などを用いることができる。該緩衝液は、界面活性剤、保存剤、血清タンパク質などの公知の添加剤を含んでいてもよい。
【００３６】
上記の固体の形態の試薬は、上記の成分が溶解された適切な溶媒を、凍結乾燥などに付すことにより得ることができる。
【００３７】
本発明の試薬キットに含まれる抗原の量は、生体試料中に含まれ得る抗体と抗原が反応する際に、生体試料中に含まれ得る抗体に対して過剰量となるような量であればよい。すなわち、抗体と抗原が反応する際の濃度が、0.1〜10μg/mlが挙げられ、0.3〜3μg/mlが好ましく、0.5〜2μg/mlが特に好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されることを意図しない。
＜ビオチンが結合し、エチレンオキシド単位を４つ含むポリエチレングリコール鎖が付加された非Ａ−Ｇ型肝炎抗原の製造＞
配列番号１の1〜22位のアミノ酸配列を有する非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を、Fmoc固相法により、ペプチド合成機Model 433A(Applied Biosystems社製)を製造業者の使用説明に従って用いて合成した。具体的には、次のとおりである。
上記のペプチド合成機の取扱説明書に従って、市販のFmoc-フェニルアラニン-Wang樹脂を反応槽に分取し、合成すべきポリペプチドのC末端の第1アミノ酸Fmoc-セリンと、縮合剤としてHBTU（1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドヘキサフルオロホスファート)、添加剤としてHOBt（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、溶媒としてNMP（N-メチル-2-ピロリドン）をそれぞれ反応槽に加えて反応させた。得られた樹脂−ジペプチドに、２０重量％ピペリジンを含むDMFを添加し、Fmoc基を除去後、第2アミノ酸Fmoc-プロリンを上記と同様に反応させた。これを繰り返し、C末端から順次1〜22番目までのFmoc-アミノ酸を反応させて、非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を得た。
【００３９】
次に、アミノ酸の代わりに、Fmoc-mini-PEG（Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；Peptides International社製）を用いて同様の反応を2回繰り返して、非Ａ−Ｇ型肝炎抗原のＮ末端にmini-PEGを2分子結合させた。
【００４０】
さらに、ビオチンと、上記の縮合剤、添加剤及び溶媒を加えて反応させることにより、ビオチン−２×mini-PEG−抗原が、N末端からこの順序で結合したビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を得た。
なお、ビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原の樹脂からの切断及び精製は、樹脂に結合しているビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を、脱保護液（87.5容量％トリフルオロ酢酸、5容量％チオアニソール、2.5容量％エタンジオール、5容量％m-クレゾール）中で室温にて2時間攪拌して該抗原を樹脂から切り出し、ＯＤＳカラムによる逆相クロマトグラフィーにより、0.1重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液の直線的濃度勾配で溶出することにより行った。
【００４１】
＜ビオチンが結合した非Ａ−Ｇ型肝炎抗原の製造＞
上記と同様にして、配列番号１の1〜22位のアミノ酸配列を有する非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を合成した。
この抗原に、ビオチンと、上記の縮合剤、添加剤及び溶媒を加えて反応させることにより、ビオチンが結合したビオチン付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を得た。
樹脂からの切り出し及び精製は、上記と同様にして行った。
【００４２】
実施例１
肝炎患者の血液試料(全血) 10μlに、1μg/mlのビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を含む第1試薬（0.1M TEA、0.1% BSA 、pH7.6）120μlを加えて混合し、42℃にて2.25分間インキュベートした。
次に、固相としてストレプトアビジン磁性粒子を含む第2試薬(平均粒子径2μm、粒子濃度 0.5%、20mM MES、0.1% BSA、pH6.5) 30μlを加えて混合し、42℃にて1.5分間インキュベートした。
磁気分離を行って、固相に結合した抗原−抗体複合体を分離した。
洗浄液(0.01M MES、pH 6.5、0.1％アジ化ナトリウム) 100〜700μlを加えて撹拌し、磁気分離を行った。この洗浄操作を、3回繰り返した。
【００４３】
次いで、標識物質で標識されたヒト型抗体に結合し得る物質として、アルカリホスファターゼ(ALP)標識抗ヒトIgG抗体を含む第3試薬（4.55ng/ml；100mM MES、1mM 塩化マグネシウム、0.1mM ZnCl2、0.15M NaCl、pH6.5）100μlを加えて混合し、42℃にて2.75分間インキュベートした。上記と同様の洗浄操作を3回行った。
【００４４】
ここに、100mM MES、3mM 塩化マグネシウム六水塩、pH6.5からなる希釈液50μlを加えて混合し、さらに、ALPに対する基質として、発光基質液(CDP-Star、Applied Biosystems社製) 100μlを加えて撹拌し、42℃にて5分間反応させ、ルミノメータで発光強度を測定した。
得られた発光強度のカウントを、表1及び2に示す。
【００４５】
比較例１
実施例１において、ビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原の代わりに、ビオチン付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原を用いて、実施例１と同じ手順を繰り返して、発光強度を測定した。得られた発光強度のカウントを、表1及び2に示す。
【００４６】
【表１】
2010122002.tif 000002
【００４７】
【表２】
2010122002.tif 000003
【００４８】
これらの結果から、ポリエチレングリコール鎖が付加された抗原を用いた場合は、ポリエチレングリコール鎖が付加されていない抗原を用いた場合に比較して、非Ａ−Ｇ型肝炎陽性検体を用いた場合に、発光強度が約1.5〜17倍に増加した。この感度の増加は、非Ａ−Ｇ型肝炎陰性検体を用いた場合には見られなかった。
【００４９】
実施例２
実施例１で用いた第1試薬において、ビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原の濃度が異なる第１試薬（A）、第１試薬（B）、第１試薬（C）、第１試薬（D）及び第１試薬（E）を調製した。それぞれの試薬に含まれる、ビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原の濃度を以下に示す。
第１試薬（A）：  0.1μg/ml
第１試薬（B）：  0.3μg/ml
第１試薬（C）：  1μg/ml
第１試薬（D）：  3μg/ml
第１試薬（E）：  10μg/ml
なお、第１試薬（C）は実施例１で用いた第１試薬と同一の試薬である。
【００５０】
第１試薬（A）〜（E）を用い、実施例１と同様の操作で、５つの非Ａ−Ｇ型肝炎陽性検体の発光強度のカウントを測定した。表３に、第１試薬（C）で得られた発光強度のカウントを１００％とし、各試薬で得られた発光強度のカウントの割合を示す。また、各試薬で得られた発光強度のカウントの割合の平均値を示すグラフを、図１に示す。
【００５１】
【表３】
2010122002.tif 000004
【００５２】
表３及び図１から明らかなように、第１試薬に含まれるビオチン−PEG付加非Ａ−Ｇ型肝炎抗原は、0.1〜10μg/mlの濃度で使用可能であるが、0.3〜3μg/mlが好ましいことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】第１試薬（A）〜（E）を用いて得られた、発光強度のカウントの割合の平均値を示すグラフである。
【図１】
2010122002.tif 000005
【配列表】
2010122002000001.app