(57)【要約】【課題】被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価する方法等を提供する。【解決手段】被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における１１種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。【選択図】図４
2010133947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ０１）〜（Ａ１１）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価することを特徴とする内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
（Ａ０１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ１１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｉ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
（ａ）マーカー物質（Ａ０３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ａ０４）はアポリポタンパク質Ｃ２又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ａ０５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ａ０６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ａ０７）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ａ０８）はβ２−ミクログロブリン又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ａ０９）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ａ１０）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ａ１１）はアポリポタンパク質Ｍ又はその修飾体である。
【請求項３】
被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価することを特徴とする内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｂ２）アポリポタンパク質Ｃ２又はその修飾体、
（Ｂ３）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ５）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ６）β２−ミクログロブリン又はその修飾体、
（Ｂ７）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｂ８）アポリポタンパク質Ｍ又はその修飾体。
【請求項４】
前記動物は、被験物質を摂取させると共に低繊維高脂肪食を摂取させた動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
【請求項５】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
【請求項６】
前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
【請求項７】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
【請求項８】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項７に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
【請求項９】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項７又は８に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、所望の内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする内臓脂肪増加抑制効果の評価用キット。
【請求項１２】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１１に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価用キット。
【請求項１３】
所望の内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内臓脂肪増加抑制効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価する内臓脂肪増加抑制効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる内臓脂肪増加抑制効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて所望も内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発症、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
また、これらの生活習慣病には内臓脂肪型肥満が大きく関与していることが明らかになりつつあり、いわゆる「メタボリック症候群」（メタボリックシンドローム、内臓脂肪症候群）に注目が集まっている。メタボリック症候群は、内臓脂肪型肥満に加えて、高血糖、高血圧、脂質異常のうちいずれか２つ以上をあわせもった状態と定義されている。内臓脂肪型肥満をベースとした複合疾患ともいえるメタボリック症候群は、動脈硬化を進行させ、心臓病や脳卒中の危険性を急激に高めることとなる。したがって、メタボリック症候群を予防・改善することが、長寿命ならびに高い生活の質を維持するために重要である。
【０００４】
メタボリック症候群を予防・改善するためには、生活習慣を改善することが効果的である。例えば、運動習慣や食生活を改善することが提唱されている。食生活に関しては、内臓脂肪の増加を抑制する効果がある食品を積極的に摂取することで、メタボリック症候群の発症を予防・改善できると考えられる。特許文献１，２には内臓脂肪を減少させる効果がある飲食品の開示がある。一方、内臓脂肪の増加抑制効果を有する物質のスクリーニング系については定かでないが、特許文献３には高コレステロールや高中性脂肪に関係するスクリーニング系についての開示がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２１４２５３号公報
【特許文献２】特開２００８−１６９１４７号公報
【特許文献３】特開２００７−６４７４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、メタボリック症候群の予防・改善するための１つの方策として、内臓脂肪の増加抑制効果を有する物質を含有する食品を摂取することが挙げられる。そのためには、物質が有する内臓脂肪の増加抑制効果の評価系や、内臓脂肪の増加抑制効果を有する物質のスクリーニング系を構築することが有用である。例えば、内臓脂肪の状態を反映するバイオマーカー（マーカー物質）を特定できれば、該バイオマーカーを指標とした種々の評価系やスクリーニング系が構築できると考えられる。
【０００７】
そこで本発明は、内臓脂肪に関連する新たなバイオマーカーを特定し、該バイオマーカーを用いて被験物質が有する内臓脂肪増加抑制果を評価する方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ０１）〜（Ａ１１）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価することを特徴とする内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
（Ａ０１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ１１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００９】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法は、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における上記マーカー物質（Ａ０１）〜（Ａ１１）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ａ０１）〜（Ａ１１）は、いずれも内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質である。本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によれば、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を容易かつ高精度に評価することができる。
【００１０】
「内臓脂肪型肥満を発症し得る動物」とは、内臓脂肪型肥満を発症するように設計された動物であって、現時点ではまだ内臓脂肪型肥満をまだ発症していない動物を指す。そして、「内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物」とは「内臓脂肪型肥満を発症している動物」又は「内臓脂肪型肥満を発症し得る動物」を指す。動物の種類としては、ラット等の飼育可能な動物のほか、ヒトも含まれるものとする。
【００１１】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約４６１０」、「約８９３０」、「約２１４００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約４６１０は概ね４６１０±０．２％、約８９３０は概ね８９３０±０．２％、約２１４００は概ね２１４００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ａ０１）、（Ａ０３）、（Ａ０４）、（Ａ０５）、（Ａ０６）、（Ａ０９）、（Ａ１０）、及び（Ａ１１）の濃度はより低値を示し、（Ａ０２）、（Ａ０７）、及び（Ａ０８）の濃度はより高値を示す。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、下記（ａ）〜（ｉ）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
（ａ）マーカー物質（Ａ０３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ａ０４）はアポリポタンパク質Ｃ２又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ａ０５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ａ０６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ａ０７）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ａ０８）はβ２−ミクログロブリン又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ａ０９）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ａ１０）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ａ１１）はアポリポタンパク質Ｍ又はその修飾体である。
【００１３】
アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ｃ２、アポリポタンパク質Ａ２、アポリポタンパク質Ｃ３、補体Ｃ３、β２−ミクログロブリン、トランスサイレチン、アポリポタンパク質Ｍはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によれば、マーカー物質（Ａ０３）〜（Ａ１１）の解析が容易である。
【００１４】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１５】
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価することを特徴とする内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｂ２）アポリポタンパク質Ｃ２又はその修飾体、
（Ｂ３）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ５）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ６）β２−ミクログロブリン又はその修飾体、
（Ｂ７）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｂ８）アポリポタンパク質Ｍ又はその修飾体。
【００１６】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法は、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価するものである。上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）に属するマーカー物質は、いずれも内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質である。本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によれば、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を容易かつ高精度に評価することができる。特に、アポリポタンパク質Ｃ１、アポリポタンパク質Ｃ２、アポリポタンパク質Ａ２、アポリポタンパク質Ｃ３、補体Ｃ３、β２−ミクログロブリン、トランスサイレチン、アポリポタンパク質Ｍはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。
【００１７】
本発明においても「内臓脂肪型肥満を発症し得る動物」とは、内臓脂肪型肥満を発症するように設計された動物であって、現時点ではまだ内臓脂肪型肥満をまだ発症していない動物を指す。そして、「内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物」とは「内臓脂肪型肥満を発症している動物」又は「内臓脂肪型肥満を発症し得る動物」を指す。動物の種類としては、ラット等の飼育可能な動物のほか、ヒトも含まれるものとする。
【００１８】
また、本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１９】
請求項４に記載の発明は、前記動物は、被験物質を摂取させると共に低繊維高脂肪食を摂取させた動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
【００２０】
本発明では、「被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物」として「被験物質を摂取させると共に低繊維高脂肪食を摂取させた動物」を採用する。すなわち本発明では、低繊維高脂肪食を摂取させることで「内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物」を設定し、当該動物に被験物質を摂取させる。本発明では、例えば食餌に被験物質や低繊維高脂肪食を含有させて動物を飼育すればよいので、内臓脂肪増加抑制効果の評価がより容易に行える。
【００２１】
請求項５に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
【００２２】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価することができる。
【００２３】
請求項６に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
【００２４】
かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価することができる。
【００２５】
請求項７に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
【００２６】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２７】
請求項８に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項７に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
【００２８】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００２９】
請求項９に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項７又は８に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法である。
【００３０】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３１】
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、所望の内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３２】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ａ０１）〜（Ａ１１）の各マーカー物質および上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、所望の内臓脂肪増加抑制効果の評価を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ａ０１）〜（Ａ１１）の各マーカー物質および上記（Ｂ１）〜（Ｂ８）に属する各マーカー物質は、いずれも内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質である。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、内臓脂肪増加抑制効果の評価を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材の場合は、内臓脂肪増加抑制効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３３】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか１項に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする内臓脂肪増加抑制効果の評価用キットである。
【００３４】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３５】
請求項１２に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１１に記載の内臓脂肪増加抑制効果の評価用キットである。
【００３６】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３７】
所望の内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１３）。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によれば、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００３９】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、内臓脂肪増加抑制効果の評価を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００４０】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】各群間で体重を比較したグラフである。
【図２】各群間で内臓脂肪の量を比較したグラフである。
【図３】各群間で皮下脂肪の量を比較したグラフである。
【図４】質量／電荷比が４６１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が５５０１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が７０５４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が８３３２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が８８３６（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】質量／電荷比が８９３１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１０】質量／電荷比が９０６５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１１】質量／電荷比が１１６４３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１２】質量／電荷比が１３７３３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１３】質量／電荷比が１３９２２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１４】質量／電荷比が２１３８３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１５】実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１６】実施例２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１７】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１８】実施例３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１９】実施例４で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図２０】実施例５で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図２１】実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２２】実施例６で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図２３】実施例７で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図２４】実施例８で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２５】実施例８で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図２６】実施例９で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００４３】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ０１）〜（Ａ１１）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価する。
（Ａ０１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５５００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７０５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１１６００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ０９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ１１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２１４００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４４】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中で特異的に検出されるものである。なお、（Ａ０１）、（Ａ０３）、（Ａ０４）、（Ａ０５）、（Ａ０６）、（Ａ０９）、（Ａ１０）、及び（Ａ１１）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、内臓脂肪が増加した状態でより高値を示すものであるので、被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより低値を示す。一方、（Ａ０２）、（Ａ０７）、及び（Ａ０８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、内臓脂肪が増加した状態でより低値を示すものであるので、被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有する場合には、当該被験物質を投与した動物においてより高値を示す。
【００４５】
ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ａ０３）はアポリポタンパク質Ｃ１、マーカー物質（Ａ０４）はアポリポタンパク質Ｃ２、マーカー物質（Ａ０５）はアポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ０６）はアポリポタンパク質Ｃ３、マーカー物質（Ａ０７）は補体Ｃ３ａ（ｄｅｓ−Ａｒｇ）、マーカー物質（Ａ０８）はβ２−ミクログロブリン、マーカー物質（Ａ０９）はトランスサイレチン、マーカー物質（Ａ１０）はトランスサイレチン、マーカー物質（Ａ１１）はアポリポタンパク質Ｍ、と同定される。すなわち、ある実施形態では、下記（ａ）〜（ｉ）の少なくとも１つを満たす。
（ａ）マーカー物質（Ａ０３）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（ｂ）マーカー物質（Ａ０４）はアポリポタンパク質Ｃ２又はその修飾体である、
（ｃ）マーカー物質（Ａ０５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（ｄ）マーカー物質（Ａ０６）はアポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体である、
（ｅ）マーカー物質（Ａ０７）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（ｆ）マーカー物質（Ａ０８）はβ２−ミクログロブリン又はその修飾体である、
（ｇ）マーカー物質（Ａ０９）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｈ）マーカー物質（Ａ１０）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（ｉ）マーカー物質（Ａ１１）はアポリポタンパク質Ｍ又はその修飾体である。
【００４６】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法の他の様相では、被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中における下記（Ｂ１）〜（Ｂ８）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果を評価する。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｂ２）アポリポタンパク質Ｃ２又はその修飾体、
（Ｂ３）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）アポリポタンパク質Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ５）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ６）β２−ミクログロブリン又はその修飾体、
（Ｂ７）トランスサイレチン又はその修飾体、
（Ｂ８）アポリポタンパク質Ｍ又はその修飾体。
【００４７】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００４８】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００４９】
例えば、アポリポタンパク質Ｃ１（配列番号１）のＮ末端側２アミノ酸残基（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損したタンパク質断片（配列番号２）は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。
【００５０】
例えば、補体Ｃ３のタンパク質断片である補体Ｃ３ａ ｄｅｓ Ａｒｇ（配列番号６）は「補体Ｃ３又はその修飾体」に含まれる。
【００５１】
トランスサイレチン（配列番号８）については、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。例えば、トランスサイレチンのＣｙｓ残基にシステインが付加した「システイニル化トランスサイレチン」や、グルタチオンが付加した「グルタチオン化トランスサイレチン」は、「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。さらに、トランスサイレチンは４個のサブユニットからなる複合体タンパク質であるので、当該サブユニットは「トランスサイレチン又はその修飾体」に含まれる。
【００５２】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法では、（Ａ０１）〜（Ａ１１）の各マーカー物質ならびに（Ｂ１）〜（Ｂ８）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００５３】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法では「被験物質を投与された内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物」を用いる。好ましい実施形態では、当該動物として「被験物質を摂取させると共に低繊維高脂肪食を摂取させた動物」を用いる。例えば、動物に被験物質と低繊維高脂肪食とを同時摂取させた動物を用いればよい。低繊維高脂肪食は、例えば、低繊維飼料に数％〜数十％の動物性脂肪を混合することにより調製することができる。他の実施形態としては、内臓脂肪型肥満を発症する自然発症モデル動物や遺伝子操作モデル動物を用いることも考えられる。例えば、当該自然発症モデル動物や遺伝子操作モデル動物に被験物質を投与し、体液中における各マーカー物質の濃度を指標とすればよい。
【００５４】
「内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００５５】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法では、動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を基準値と比較する。当該基準値としては特に限定はなく、目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、「被験物質を摂取させると共に低繊維高脂肪食を摂取させた動物」を採用する場合には、低繊維高脂肪食のみを摂取させた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いることができる。低繊維高脂肪食のみを摂取させた動物は、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物のモデルとなり、その体液中のマーカー物質濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を摂取させると共に低繊維高脂肪食を摂取させた動物（例えば同時摂取）における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００５６】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、通常食を摂取させた動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、
（１）通常食を摂取（正常値）、
（２）低繊維高脂肪食を摂取（異常値）、
（３）被験物質と低繊維高脂肪食とを同時摂取、
の３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００５７】
さらに、基準値として、内臓脂肪増加抑制効果を有する既知物質と低繊維高脂肪食とを同時摂取させた動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、
（４）上記既知物質と低繊維高脂肪食とを同時摂取させる群、
を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００５８】
内臓脂肪型肥満を発症する自然発症モデル動物や遺伝子操作モデル動物を用いる場合には、上記（２）の代わりに「内臓脂肪増加抑制効果を有さない既知物質を摂取させる群」、上記（３）の代わりに「被験物質を摂取させる群」を設定すればよい。
【００５９】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００６０】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法における被験物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００６１】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６２】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６３】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６４】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６５】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００６７】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００６８】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００６９】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００７０】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００７１】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７２】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７３】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法によって被験物質を評価し、所望の内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７４】
本発明の内臓脂肪増加抑制効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、内臓脂肪増加抑制効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７５】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００７６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
４週齢のＳＤラットを１群当たり６〜８匹用意した。第１群のラットには、通常食としてＣＥ−２（日本クレア社）を摂取させた。第２群のラットには、低繊維高脂肪食（低繊維飼料に３０％牛脂混餌）を摂取させた。第３群には、前記低繊維高脂肪食と内臓脂肪増加抑制効果を有する既知素材との混合飼料を摂取させた。第４群には、通常飼料と内臓脂肪増加抑制効果を有する既知素材との混合飼料を摂取させた。各飼料は自由摂取とし、３週間（２１日）飼育した。飼育終了後、各ラットの体重、体重当たりの内臓脂肪の量（腸間膜、腎、精巣周囲）、体重当たりの皮下脂肪の量（肩甲骨、腰下肢周囲）を測定し、４群比較した。さらに、各ラットから全血を採取して血漿を調製した。
【００７８】
図１に体重の測定結果、図２に内臓脂肪の測定結果、図３に皮下脂肪の測定結果を示す。図１〜３において、記号＊は第１群に対する有意差、記号＃は第２群に対する有意差を示し、「＊」「＃」は５％有意、「＊＊」「＃＃」は１％有意、「＊＊＊」「＃＃＃」は０．１％有意を意味する。まず図１に示すように、第１群と第４群（通常飼料群）に対して、第２群と第３群の方が有意に体重が多かった。また、第３群と第４群との間では有意差はなかった。すなわち、上記既知飼料による体重への影響は見られなかった。また図２に示すように、第１群と第４群（通常飼料群）に対して、第２群と第３群の方が有意に内臓脂肪の量が多かった。さらに、第２群に対して第３群の方が有意に内臓脂肪の量が少なかった。これにより、上記既知飼料による内臓脂肪抑制効果が裏付けられた。なお図３に示すように、皮下脂肪についても内臓脂肪と同様の傾向を示した。以上より、本動物実験の妥当性が裏付けられた。なお、本実験では３週間（２１日）という短期間で飼育を終了しており、飼育終了時における第２群のラットは発症初期の内臓脂肪型肥満の状態であったと考えられる。
【００７９】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
各血漿試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８０】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として１１個の候補ピークを選抜した。
【００８１】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）上記既知物質の効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．１）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８２】
３．マーカー物質（Ａ０１）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４６１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図５以降も同じ）。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７５０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０１８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１４であった。
【００８３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４６１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０１））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０１）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４６１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００８４】
４．マーカー物質（Ａ０２）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が５５０１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８３３、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４であった。
【００８５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５５００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０２））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０２）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５５００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００８６】
５．マーカー物質（Ａ０３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７０５５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７５０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２９、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１８であった。
【００８７】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７０５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０３））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０３）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７０５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００８８】
６．マーカー物質（Ａ０４）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が８３３３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８４、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０６０であった。
【００８９】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８３３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０４））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０４）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８３３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００９０】
７．マーカー物質（Ａ０５）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８３３７（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８０２、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００４、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０９０であった。
【００９１】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０５））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０５）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００９２】
８．マーカー物質（Ａ０６）の特定
画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が８９３１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８４、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００００１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００１であった。
【００９３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８９３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０６））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０６）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８９３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００９４】
９．マーカー物質（Ａ０７）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が９０６５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１０に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７１４、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４６、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０１８であった。
【００９５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０７））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０７）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００９６】
１０．マーカー物質（Ａ０８）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１１６４３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７２９、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０３３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０９０であった。
【００９７】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１１６００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０８））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０８）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１１６００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【００９８】
１１．マーカー物質（Ａ０９）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７３３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７０３、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４６、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０５５であった。
【００９９】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ０９））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ０９）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【０１００】
１２．マーカー物質（Ａ１０）の特定
画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３９２２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７５５、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２０、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０４２であった。
【０１０１】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３９００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ１０））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ１０）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３９００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【０１０２】
１３．マーカー物質（Ａ１１）の特定
画分４（有機溶媒）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２１３８４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７５０、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０１１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０８３であった。
【０１０３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ１１））が、内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物に特異的な物質であり、内臓脂肪の状態を反映するマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を投与した内臓脂肪型肥満を発症している又は発症し得る動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ１１）の濃度を指標として、被験物質が有する内臓脂肪増加抑制効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２１４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、内臓脂肪増加抑制効果を有すると評価することができる。
【０１０４】
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ａ０１）〜（Ａ１１）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、内臓脂肪型肥満を診断できる可能性も示唆された。
【実施例２】
【０１０５】
マーカー物質（Ａ０３）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（５ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ラット標準血清（ケミコン社）１．５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収した。回収した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０３）の質量／電荷比（平均値：７０５４）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１０６】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１５）。図１５中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．０ｋＤａのバンド（図１５の矢印ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６の矢印）。
【０１０７】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．０ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも５個のピークが検出され、それらの精密質量は「１２９３．６６」、「１０５２．４９」、「１２７９．６２」、「７８１．４５」、及び「１１３８．５４」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１０〜１４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報のラットアポリポタンパク質Ｃ１（成熟型）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【０１０８】
【表１】
2010133947.tif 000003
【０１０９】
ここで、ヒト、マウス等において、アポリポタンパク質Ｃ１のＮ末端側２アミノ酸残基が欠損したものが見出されている。全長のラットアポリポタンパク質Ｃ１（配列番号１）の質量が７１８７Ｄａであり、一方、Ｎ末端側２アミノ酸残基（Ａｌａ−Ｐｒｏ）が欠損したラットアポリポタンパク質Ｃ１の断片（配列番号２）の質量が７０１９Ｄａであることから、マーカー物質（Ａ０３）はアポリポタンパク質Ｃ１の断片（配列番号２）と最終的に同定された。
【実施例３】
【０１１０】
マーカー物質（Ａ０４）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ （５ｍＬ）（ＧＥヘルスケア社）を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）にて平衡化した。ラット標準血清（ケミコン社）１ｍＬを５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）で１０倍に希釈した後、Ｍｉｌｌｅｘ０．４５μＬでろ過し、平衡化した前記カラムに添加した。５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１２ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）／２００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）でカラムを順次洗浄した後、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、２８０ｎｍの吸光度の高い画分を回収した（約１ｍＬ）。回収した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０４）の質量／電荷比（平均値：８３３３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１１】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１７）。図１７中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．３ｋＤａのバンド（図１７の矢印ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０４）の質量／電荷比（平均値：８３３３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１８の矢印）。
【０１１２】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．３ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも７個のピークが検出され、それらの精密質量は「９５０．４９」、「１０５５．５４」、「１３２４．７４」、「１９６４．９８」、「９２８．４６」、「２２６１．１８」、及び「２４４７．２６」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１５〜２１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。既報のラットアポリポタンパク質Ｃ２のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１１３】
【表２】
2010133947.tif 000004
【実施例４】
【０１１４】
マーカー物質（Ａ０５）の精製と同定
実施例２で行ったカラム非吸着画分に対するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で、マーカー物質（Ａ０５）の質量／電荷比（平均値：８８３７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１５】
実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約８．８ｋＤａのバンド（図１５の矢印ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１９）。
【０１１６】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．８ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１２６．５４」、「８６０．５０」、及び「１２７０．６３」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２２〜２４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。既報のラットアポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１１７】
【表３】
2010133947.tif 000005
【実施例５】
【０１１８】
マーカー物質（Ａ０６）の精製と同定
実施例３で行ったカラム非吸着画分に対するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で、マーカー物質（Ａ０６）の質量／電荷比（平均値：８９３１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１９】
実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約８．９ｋＤａのバンド（図１７の矢印ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２０）。
【０１２０】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．９ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は「２２６２．００」及び「９６８．５３」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２５，２６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ３」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。既報のラットアポリポタンパク質Ｃ３のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【０１２１】
【表４】
2010133947.tif 000006
【実施例６】
【０１２２】
マーカー物質（Ａ０７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ラット標準血清（ケミコン社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて４℃で２０分間変性処理した。変性処理したサンプルを１２，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加し、非吸着画分を回収した。回収した画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０７）の質量／電荷比（平均値：９０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２３】
弱陽イオン交換樹脂ＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦ １ｍＬ（ＧＥヘルスケア社）を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）にて平衡化した。上記の回収画分３ｍＬと１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）２．３ｍＬを混合し、０．４５μＬのフィルターでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、５ＣＶの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ＣＶの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５ＣＶの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）／１５０ｍＭ ＮａＣｌで順次洗浄し、５ＣＶの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）／１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。溶出画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０７）の質量／電荷比（平均値：９０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２４】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図２１）。図２１中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約９．１ｋＤａのバンド（図２１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０７）の質量／電荷比（平均値：９０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２２の矢印）。
【０１２５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約９．１ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は「１１４８．４３」、「１４３８．３８」、及び「８３８．３４」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２７〜２９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「補体Ｃ３ａ（ｄｅｓ−Ａｒｇ）」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第５表に示す。既報のラット補体Ｃ３ａ（ｄｅｓ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１２６】
【表５】
2010133947.tif 000007
【実施例７】
【０１２７】
マーカー物質（Ａ０８）の精製と同定
実施例２で行ったカラム非吸着画分に対するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で、マーカー物質（Ａ０８）の質量／電荷比（平均値：１１６４２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２８】
実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約１１．６ｋＤａのバンド（図１５の矢印ｃ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２３）。
【０１２９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１１．６ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも５個のピークが検出され、それらの精密質量は「１０９１．５９」、「３４４５．４８」、「１４９６．７３」、「２８２２．１７」、及び「７７７．３９」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号３０〜３４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「β２−マクログロブリン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第６表に示す。既報のラットβ２−マクログロブリンのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【０１３０】
【表６】
2010133947.tif 000008
【実施例８】
【０１３１】
マーカー物質（Ａ０８）と（Ａ０９）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（５ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ラット標準血清（ケミコン社）１．５ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５ＣＶの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ＣＶの５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、及び５ＣＶの５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で順次洗浄した後、３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸で溶出し、溶出画分を回収した。
【０１３２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図２４）。図２４中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１３．７ｋＤａ付近のバンド（図２４の矢印ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ０８）と（Ａ０９）の質量／電荷比（平均値：１３７３３，１３９２２）と同等の質量／電荷比を含むピークを確認した（図２５の矢印）。
【０１３３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１３．７ｋＤａ付近のバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも７個のピークが検出され、それらの精密質量は「１３５２．４１」、「１５８７．５２」、「２４３９．８３」、「３１２５．１２」、「８７１．３０」、「２５１６．８８」、及び「２５９６．９６」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号３５〜４１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第７表に示す。既報のラットトランスサイレチンのアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【０１３４】
【表７】
2010133947.tif 000009
【０１３５】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。マーカー物質（Ａ０８）、（Ａ０９）の各電荷／質量比（平均値：１３７３３，１３９２２）から、マーカー物質（Ａ０８）は「システイニル化トランスサイレチン」、マーカー物質（Ａ０９）は「グルタチオン化トランスサイレチン」とそれぞれ同定された。
【実施例９】
【０１３６】
マーカー物質（Ａ１１）の精製と同定
実施例８で行ったカラム非吸着画分に対するＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で、マーカー物質（Ａ１１）の質量／電荷比（平均値：２１３８３）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１３７】
実施例８で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された約２１．４ｋＤａのバンド（図２４の矢印ｂ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ１１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２６）。
【０１３８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２１．４ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は「１２６２．４９」、「１６５４．６１」、「９３８．３０」、「８２５．３５」、「２６３５．８６」、及び「８０３．３７」、と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４２〜４７で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｍ」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第８表に示す。既報のラットアポリポタンパク質Ｍのアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【０１３９】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図１５】
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【図１７】
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【図２１】
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【図２４】
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【配列表】
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