(57)【要約】【課題】本発明の目的は、生物学的に有利な比のＣＬＡ異性体を含有する組成物を提供することである。生物学的に有利な比のＣＬＡ異性体を含有し、また、所望の生物学的効果を最適化するように濃縮した含量の生物活性異性体を含有する組成物の使用方法を提供することも本発明の目的である。【解決手段】ｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体が濃縮された共役リノール酸調製物を使用する組成物および方法が開示される。ｔ１０，ｃ１２対ｃ９，ｔ１１の比が約１．２：１より大きい共役リノール酸の調製物はさまざまな栄養、治療および医薬用途に望ましいことがわかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はヒトおよび動物の栄養の分野、特に共役リノール酸（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＣＬＡ）を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
共役リノール酸（ＣＬＡ）は、その栄養、治療、および薬学的特性を利用しようとする数多くの研究計画の焦点となっている。
【０００３】
リノール酸の二重結合の共役位置への転位は、高温でのニッケルまたはアルカリのような触媒による処理中、および自動酸化中に起ることが示されている。理論的には、９，１１および１０，１２オクタデカジエン酸の８つの可能な幾何異性体（ｃ９，ｃ１１；ｃ９，ｔ１１；ｔ９，ｃ１１；ｔ９，ｔ１１；ｃ１０，ｃ１２；ｃ１０，ｔ１２；ｔ１０，ｃ１２およびｔ１０，ｔ１２）が、ｃ９，ｃ１２−オクタデカジエン酸の異性化から形成される。リノール酸の異性化の一般的機構は、コーワン（非特許文献１）により記載されている。二重結合は活性化触媒との衝突の結果により分極すると考えられる。
【０００４】
その後、分極した炭素原子とその隣接炭素は回転が自由となり、その力は欠陥のある炭素原子を本質的に平坦にするようなものである。その後、該系はこれらの衝突の結果生じた力を軽減するように動いて、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ両方の異性体が形成される。ＣＬＡのある特定の異性体の形成が熱力学的に有利である。これは、共役二重結合周囲の５個の炭素原子の同一平面特性および共鳴ラジカルの空間的競合による。明らかに、ｃ９，ｔ１１またはｔ１０，ｃ１２幾何異性体のさらなる安定化から、９，１１および１０，１２異性体の比較的高い分布が得られる。
【０００５】
ガスクロマトグラフィーの進歩によって、研究者はＣＬＡのサンプルの異性体組成を正確に定量できるようになった。クリスチーら（非特許文献２）は、ＣＬＡの市販サンプルの異性体分布が次の通りであったと報じた。すなわち、８，１０（１４％）；９，１１（３０％）；１０，１２（３１％）および１１，１３（２４％）である。クリスチーらが発表した他の研究（非特許文献３）では、市販ＣＬＡ調製物の次のＣＬＡ異性体組成が報じられた。すなわち、ｔ１１，ｔ１３（０．７４％）；ｔ１０，ｔ１２（１．２３％）；ｔ９，ｔ１１（１．１８％）；ｔ８，ｔ１０（０．４６％）；ｃ１１，ｔ１３およびｔ１１，ｃ１３（２１．７％）；ｃ１０，ｔ１２およびｔ１０，ｃ１２（２９．０％）；ｃ９，ｔ１１およびｔ９，ｃ１１（２９．５％）；ｃ８，ｔ１０およびｔ８，ｃ１０（１２．３％）；ｃ１１，ｃ１３（０．９６％）；ｃ１０，ｃ１２（０．８８％）；ｃ９，ｃ１１（０．８８％）；およびｃ８，ｃ１０（０．２０％）。これらの研究にみられるように、たとえある特定の異性体の形成が有利であっても、ＣＬＡの他の異性体がアルカリ異性化ＣＬＡ調製物の組成に大きく寄与しうる。
【０００６】
１９７８年に、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の研究者は、調理した牛肉中に含まれる、突然変異誘発を阻止すると思われるある物質の正体をつきとめた。この物質はＣＬＡであることがわかった。共役不飽和を有する脂肪酸は、通常、ウシ飼料の組成物中に含まれない。しかし、ｃ９，ｔ１１オクタデカジエン酸は、ケプラー（非特許文献４）により報じられたように、嫌気性細菌Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ由来のリノール酸イソメラーゼによるリノール酸の生物水素化（ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）において、第１中間体として反芻胃で形成される。
【０００７】
ＣＬＡの個々の異性体の生物活性が推測の対象となってきた。文献は通常、生物学的に活性な異性体は、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓにより産生されるｃ９，ｔ１１異性体であると提案している（この立場をとるレビューについては、非特許文献５、非特許文献６を参照のこと）。さらに、この仮説を支持するデータはハーら（非特許文献７）の文献にもみられる。そこでは、研究者らは標識摂取研究を行い、９，１１異性体がやや優先的に摂取されて動物組織のリン脂質中に取り込まれ、１０，１２異性体はそれほどでもないことを示した。
【０００８】
ＣＬＡに関連する生物活性は多様かつ複雑である。現在、ＣＬＡの作用機序についてはほとんど知られていないが、進行中のいくつかの前臨床および臨床研究は生理学的および生化学的作用モードに新しい光をあてているようである。ＣＬＡの抗発癌性はよく文献に記載されている。ＣＬＡの投与は、ハーら（非特許文献８）が実証したようにラット乳癌形成を阻止する。ハーら（非特許文献９）は、同様な結果をマウス前胃新生物モデルにおいて報じた。ＣＬＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的ヒト黒色腫、結腸直腸癌および肺癌細胞に対する強力な細胞毒性剤としても確認されている。最近の主なレビュー記事は、個々の研究から導かれた結論を確証するものである（非特許文献１０）。
【０００９】
ＣＬＡ作用機序はまだ漠然としているが、少なくともｉｎ  ｖｉｖｏでは、免疫系のいくつかの成分が関与しうることが明らかである。特許文献１（Ｃｏｏｋら）は、ＣＬＡを含有する食物を投与することにより、Ｉ型またはＴｇＥ過敏症が介在する動物のアレルギー反応を弱める方法を開示している。また、約０．１〜１．０％の濃度のＣＬＡは白血球を保存する際の効果的なアジュバントであることが示された。
【００１０】
特許文献２（Ｃｏｏｋら）は、遊離酸または塩形態のＣＬＡの経口または非経口投与が、細胞性免疫に関連するＣＤ−４およびＣＤ−８リンパ球亜集団の増加をもたらしたことを開示した。外因性の腫瘍壊死因子による前処理から生じる副作用を、ＣＬＡを投与した動物中のＣＤ−４およびＣＤ−８細胞のレベルの上昇または維持により、間接的に軽減することができる。最後に、米国特許第５，４３０，０６６号は、免疫刺激による体重減少および食欲不振の予防におけるＣＬＡの効果を記載している。
以上述べたＣＬＡの潜在的な治療および薬学的応用とは別に、食物サプリメント（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）としてのＣＬＡの栄養的使用が非常に注目されている。ＣＬＡは、身体組成、特に脂肪および貧脂肪組織塊の分配を再指令するうえで顕著な一般的効果を発揮することが見出されている。特許文献３（Ｃｏｏｋら）は、ブタ、マウス、およびヒトに０．５％のＣＬＡを含有する食品をあたえる、ＣＬＡを食物サプリメントとして用いる方法を開示している。それぞれの動物種で、脂肪含量の有意な低下がタンパク質量の同時増加を伴なって観察された。これらの動物において、ＣＬＡ添加による食物の脂肪酸含量の増加は体重の増加をもたらさず、体内の脂肪と赤身の再分配に関連することは興味深い。関心のある他の食物現象は、飼料要求率に対するＣＬＡ補充の効果である。特許文献４（Ｃｏｏｋら）は、動物飼料（鳥類および哺乳類）へのＣＬＡの配合が飼料要求率を増加し、ＣＬＡ補充動物の体重増加をより大きくすることを示すデータを提供した。
食用動物飼育者にとって、ＣＬＡ補充の潜在的に有益な効果は明らかである。必要なことは、実際に生物学的に活性のある異性体は何であるか、またこれらの異性体を用いる適切な比はいくらかを決定することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，５８５，４００号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７４，９０１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５５４，６４６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４２８，０７２号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃ．Ｃｏｗａｎ，ＪＡＯＣＳ  ７２：４９２−９９（１９５０）
【非特許文献２】Ｃｈｒｉｓｔｉｅら，ＪＡＯＣＳ  ７４（１１）：１２３１（１９９７）
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｉｅら，Ｌｉｐｉｄｓ  ３３（２）：２１７−２１（１９９８）
【非特許文献４】Ｋｅｐｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：１３５０−５４（１９６６）
【非特許文献５】Ｐ．Ｗ．Ｐａｒｏｄｉ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２７（６）：１０５５−６０（１９９７）
【非特許文献６】Ｍ．Ａ．Ｂｅｌｕｒｙ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５３（４）：８３−９（１９９５）
【非特許文献７】Ｈａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９１）
【非特許文献８】Ｈａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２：２０３５−ｓ（１９９２）
【非特許文献９】Ｈａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：１０９７（１９９０）
【非特許文献１０】Ｉｐ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｎｕｔｒ．６６（６）：１５２３ｓ（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（発明の概要）
科学的文献は、活性ＣＬＡ異性体がｃ９，ｔ１１異性体であることを示唆する。しかし、本明細書に示されるように、１０，１２対９，１１異性体の比の増加により、ＣＬＡ調製物の生物学的活性に対する格別の効果が得られる。それゆえに、本発明の目的は、生物学的に有利な比のＣＬＡ異性体を含有する組成物を提供することである。生物学的に有利な比のＣＬＡ異性体を含有し、また、所望の生物学的効果を最適化するように濃縮した含量の生物活性異性体を含有する組成物の使用方法を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するために、以下を提供する。
１．１．２：１〜３：１の範囲の比で１０，１２−共役リノール酸および９，１１−共役リノール酸を含む共役リノール酸含有組成物。
【００１５】
２．１．２：１より大きい比で１０，１２−共役リノール酸および９，１１−共役リノール酸を含むヒトの食品および動物飼料中の食物サプルメントとして使用するための共役リノール酸含有組成物。
【００１６】
３．０．０１〜１０グラム当量の１０，１２−共役リノール酸を含む脂質成分を有するビヒクルを含んでなる、ヒトまたは動物の食事用の１日分の食料。
【００１７】
４．前記脂質成分がアルキルエステルとして提供される、項目３に記載の食料。
【００１８】
５．前記脂質成分がトリグリセリドとして提供される、項目３に記載の食料。
【００１９】
６．前記脂質成分が遊離脂肪酸として提供される、項目３に記載の食料。
【００２０】
７．少なくとも５０パーセントの共役リノール酸異性体を含有する組成物であって、該共役リノール酸異性体が１．２：１より大きい比のｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体の混合物を９０パーセントを超えて含有することを特徴とする、上記組成物。
【００２１】
８．リノール酸異性体を含有する組成物であって、該リノール酸異性体が１．２：１より大きい比のｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体の混合物を９０パーセントを超えて含有することを特徴とする、上記組成物。
【００２２】
９．遊離脂肪酸共役リノール酸異性体の混合物を含んでなり、該混合物が少なくとも約８０％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有する、共役リノール酸組成物。
【００２３】
１０．前記ｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を加えた食品をさらに含む、項目９に記載の組成物。
【００２４】
１１．前記食品がヒトの消費用である、項目１０に記載の組成物。
【００２５】
１２．前記食品が動物の消費用に配合された飼料である、項目１０に記載の組成物。
【００２６】
１３．遊離脂肪酸共役リノール酸異性体の混合物を含んでなり、該混合物が少なくとも約９２％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有する、共役リノール酸組成物。
【００２７】
１４．前記ｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を加えた食品をさらに含む、項目１３に記載の組成物。
【００２８】
１５．前記食品がヒトの消費用である、項目１４に記載の組成物。
【００２９】
１６．前記食品が動物の消費用に配合された飼料である、項目１４に記載の組成物。
１７．次の構造：
【００３０】
【化１】
2010259437.tif 000002
【００３１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はヒドロキシル基およびオクタデカジエン酸からなる群から選択される）の複数のアシルグリセロール分子を含むアシルグリセロール組成物であって、位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に少なくとも約８０％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有することを特徴とする、上記組成物。
【００３２】
１８．前記アシルグリセロール組成物を加えた食品をさらに含む、項目１７に記載の組成物。
【００３３】
１９．前記食品がヒトの消費用である、項目１８に記載の組成物。
【００３４】
２０．前記食品が動物の消費用に配合された飼料である、項目１８に記載の組成物。
【００３５】
２１．次の構造：
【００３６】
【化２】
2010259437.tif 000003
【００３７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はヒドロキシル基およびオクタデカジエン酸からなる群から選択される）の複数のアシルグリセロール分子を含むアシルグリセロール組成物であって、位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に少なくとも約９２％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有することを特徴とする、上記組成物。
【００３８】
２２．前記アシルグリセロール組成物を加えた食品をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
【００３９】
２３．前記食品がヒトの消費用である、項目２２に記載の組成物。
【００４０】
２４．前記食品が動物の消費用に配合された飼料である、項目２２に記載の組成物。
【００４１】
２５．ａ）商用種子油および該種子油を処理する方法を準備し、
ｂ）該種子油を、ｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有する調製物が生成され、該調製物が少なくとも約８０％のｔ１０，ｃ１２ＣＬＡとなる条件下で処理する、
ことを含んでなる方法により調製される共役リノール酸組成物。
【００４２】
２６．前記ｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を加えた食品をさらに含む、項目２５に記載の組成物。
【００４３】
２７．前記食品が動物の消費用に配合された飼料である、項目２６に記載の組成物。
【００４４】
２８．ａ）商用種子油を準備し、
ｂ）該種子油から脂肪酸アルキルエステルの混合物を形成し、
ｃ）該脂肪酸アルキルエステルを共役化して共役脂肪酸アルキルエステルを形成し、該共役脂肪酸アルキルエステルはｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを含むことを特徴とするものであり、
ｄ）該共役脂肪酸アルキルエステルを溶媒中に希釈して溶液を形成し、
ｅ）該溶液からｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを沈降させ、
ｆ）該ｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを鹸化してｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を生成する、
ことを含んでなる方法により調製される共役リノール酸組成物。
【００４５】
２９．前記ｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を加えた食品をさらに含む、項目２８に記載の組成物。
【００４６】
３０．前記食品が動物の消費用に配合された飼料である、項目２９に記載の組成物。
【００４７】
３１．共役リノール酸のアルキルエステルの混合物を含んでなり、該混合物が少なくとも約８０％のｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを含有する、食物サプルメント用および動物飼料用の共役リノール酸組成物。
【００４８】
３２．前記ｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを加えた食品をさらに含む、項目３１に記載の共役リノール酸組成物。
【００４９】
３３．共役リノール酸のアルキルエステルの混合物を含んでなり、該混合物が少なくとも約９２％のｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを含有する、食物サプルメント用および動物飼料用の共役リノール酸組成物。
【００５０】
３４．前記ｔ１０，ｃ１２アルキルエステルを加えた食品をさらに含む、項目３３に記載の共役リノール酸組成物。
したがって、ある実施形態では、本発明は、１０，１２−リノール酸および９，１１−リノール酸、最も好ましくはｔ１０，ｃ１２共役リノール酸およびｃ９，ｔ１１共役リノール酸を１．２：１以上の比で、最も好ましくは約１．２：１〜３：１の範囲で含有する共役リノール酸組成物を提供する。他の実施形態では、提供される共役リノール酸組成物は、ヒトまたは動物の食事のための１日分の食料の一部でありうる。１日分の食料（ｄａｉｌｙ  ｒａｔｉｏｎ）は液体成分を有するビヒクルを含んでなる。液体成分は、０．０１〜１０グラム当量の１０，１２共役リノール酸、好ましくはｔ１０，ｃ１２共役リノール酸を含有するか、これから構成される。あるいは、他の実施形態では、本発明は、リノール酸異性体を含有する組成物を提供し、該異性体は、９０％より多いｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ異性体の混合物を含有することを特徴とする。ある実施形態では、該異性体は、ｔ１０，ｃ１２のほうを優先して約１．２：１より大きい比で存在する。
他の実施形態では、本発明は、共役リノール酸異性体を少なくとも５０％含有する共役リノール酸組成物も提供する。ＣＬＡ異性体は、ｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体の混合物を９０％以上含有することに特徴がある。好ましくは、これらの異性体の比は、ｔ１０，ｃ１２のほうを優先して約１．２：１より大きい。
他の実施形態では、本発明は、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡを濃縮した他の組成物および調製物をさらに提供する。ある実施形態においてｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは少なくとも約８０％の純度であり、他の実施形態ではｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは少なくとも約９０％の純度であり、そしてさらに他の実施形態ではｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは少なくとも約９２％の純度である。
他の実施形態では、本発明は、動物およびヒトに供給するためのｃ９，ｔ１１
ＣＬＡを濃縮した組成物を提供する。ある実施形態では、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ対ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの比が約１．４：１〜３．０：１である。他の実施形態では、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ対ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの比は約１．８：１〜２．２：１である。さらに他の実施形態では、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ対ｔ１０，ｃ１２ＣＬＡの比は約２．０：１である。
上記の組成物をアシルグリセリドまたはアルキルエステルに組み入れることができる。ある実施形態では、アシルグリセロール組成物は下記構造の複数のアシルグリセロール分子を含み、
【００５１】
【化３】
2010259437.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はヒドロキシル基およびオクタデカジエン酸からなる群から選択され、該組成物は位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に少なくとも約８０％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有することを特徴とする。他の実施形態では、アシルグリセロール組成物は、位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３  に少なくとも約９０％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有することを特徴とする。さらに他の実施形態では、アシルグリセロール組成物は、位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に少なくとも約９２％のｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を含有することを特徴とする。他の実施形態においては、ｃ９，ｔ１１濃縮ＣＬＡは、上に記載した比および百分率にしたがって、アシルグリセロールの位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に組み入れることもできる。
さらなる実施形態では、濃縮ｔ１０，ｃ１２組成物および濃縮ｃ９，ｔ１１組成物を、動物飼料またはヒト消費用の食料を含めた食品中に配合することができるし、または賦形剤もしくは経口送達ビヒクルを用いて製剤化してもよい。
他の実施形態では、本発明の組成物は多種多様な栄養、治療および薬理学上の用途がある。ｃ９，ｔ１１を含有する組成物は成長、飼料効率および体重増加速度を高めるために使用される。従って、ある実施形態では、動物およびｃ９，ｔ１１  ＣＬＡを濃縮した組成物が提供される。ある実施形態では、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ対ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの比が約１．４：１〜３．０：１である。他の実施形態では、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ対ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの比が約１．８：１〜２．２：１である。さらに他の実施形態では、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ対ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの比が約２．０：１である。他の実施形態では、濃縮ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ組成物は、約４０〜６０％のｃ９，ｔ１１  ＣＬＡおよび約２０〜３０％のｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡを含有する。他の実施形態では、濃縮ｃ９，ｔ１１調製物は飼料要求率、成長または体重増加速度が高まるように動物に投与される。ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡを含有する組成物はヒトおよび他の動物の体脂肪を減少させるために用いることができる。したがって、ある実施形態では、動物およびｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡ組成物が提供される。ある実施形態では、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡが少なくとも約８０％の純度であり、他の実施形態ではｔ１０，ｃ１２が少なくとも９０％の純度であり、そしてさらに他の実施形態では、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡが少なくとも９２％の純度である。さらに他の実施形態では、ｔ１０，ｃ１２調製物は、体脂肪を減少させるためにヒトを含む動物に投与される。かかる組成物の他の用途としては、動物の筋量の増加；動物のアレルギー反応の軽減；動物の免疫刺激による体重減少の予防；動物のＣＤ−４およびＣＤ−８細胞数の増加；動物の骨のミネラル含量の増加；動物の骨格異常の予防；および動物血液中のコレステロール量の低減が挙げられる。
他の実施形態では、本発明は、限定されるものでないが、ヒマワリ油、サフラワー油、大豆油およびコーン油を含む商用種子油用のｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡを調製する方法を提供する。ある実施形態では、商用種子油および種子油の処理方法が提供される。他の実施形態では、該種子油が、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡを含有する調製物が製造されるような条件下で処理される。ある実施形態では、該ＣＬＡは少なくとも約８０％  ｔ１０，ｃ１２であり、他の実施形態では、該ＣＬＡは少なくとも約９０％  ｔ１０，ｃ１２であり、そしてさらに他の実施形態では、該ＣＬＡは少なくとも約９２％  ｔ１０，ｃ１２である。他の実施形態では、アルキルエステルの混合物が商用種子油から形成される。さらに他の実施形態では、その後、該アルキルエステルが共役化される。ある実施形態では、該共役アルキルエステルを溶媒で希釈し、そして温度を少なくとも約−５６℃〜−５７℃に下げて沈降させる。他の実施形態では、温度を約−３０℃に下げて、該調製物から飽和脂肪酸を除去する。さらに他の実施形態では、尿素分画化により飽和脂肪酸を除去する。他の実施形態では、本発明は、上記した方法により製造されたｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ＣＬＡ１０，１２および９，１１異性体の比と雄ブタの背脂肪（ｂａｃｋ  ｆａｔ）減少％を比較する３つ別々の研究の対数回帰分析のプロットである。
【図２】図２は、雄ブタの飼料中のＣＬＡの１０，１２異性体の全百分率と背脂肪減少％を比較する３つの別々の研究の線形回帰分析のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書で用いる「共役リノール酸」または「ＣＬＡ」は、あらゆる共役リノール酸またはオクタデカジエン遊離脂肪酸を意昧する。この用語は、分子の任意の位置に２つの共役した炭素−炭素二重結合を有するリノール酸の全ての位置異性体および幾何異性体を包含しかつそれらを示すものである。ＣＬＡは、通常のリノール酸が炭素原子９および１２に二重結合を有する点で通常のリノール酸と異なる。ＣＬＡの例は、次の位置異性体のｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体（「Ｅ／Ｚ異性体」）を含む：２，４−オクタデカジエン酸、４，６‐オクタデカジエン酸、６，８‐オクタデカジエン酸、７，９‐オクタデカジエン酸、８，１０‐オクタデカジエン酸、９，１１‐オクタデカジエン酸および１０，１２‐オクタデカジエン酸、１１，１３‐オクタデカジエン酸。本明細書で用いる「ＣＬＡ」は、天然源から得られる単一の異性体、２以上の選択した異性体の混合物、および非選択の異性体混合物、ならびに合成および半合成ＣＬＡを包含する。
本明細書で用いるＣＬＡの「トリグリセリド」は、トリグリセリド骨格の３つの位置のいずれかまたは全部にＣＬＡを含むものである。したがって、ＣＬＡを含むトリグリセリドはＣＬＡの位置異性体および幾何異性体のどれを含んでいてもよい。
本明細書で用いるＣＬＡの「エステル」は、生理学的に許容される天然アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール）を含むがそれらに限定されないアルコールまたは他の化学基にエステル結合を介して結合されたＣＬＡの任意のおよび全ての位置および幾何異性体を含むものである。したがって、ＣＬＡのエステルまたはエステル化ＣＬＡは、ＣＬＡの位置および幾何異性体のどれを含んでいてもよい。
ＣＬＡの「非天然異性体」は、限定されるものでないが、ｃ１１，ｔ１３；ｔ１１，ｃ１３；ｔ１１，ｔ１３；ｃ１１．ｃ１３；ｃ８，ｔ１０；ｔ８，ｃ１０；ｔ８，ｔ１０；ｃ８，ｃ１０；およびオクタデカジエン酸のｔｒａｎｓ‐ｔｒａｎｓ異性体を含み、オクタデカジエン酸のｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体を含まないものである。「非天然異性体」は、これらの異性体がＣＬＡをアルカリ異性化で合成するときに通常少量生成されるので、ＣＬＡの「マイナー異性体」とも呼ばれる。
「調理済食品（ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、ヒト消費用にプレパックした食品を意味する。
本明細書で用いる「ｃ」はｃｉｓ配向の化学結合をさし、「ｔ」はｔｒａｎｓ配向の化学結合をさす。ＣＬＡの位置異性体が「ｃ」または「ｔ」なしに記述されるときは、該記述は全ての４つの可能な異性体を含む。例えば、１０，１２オクタデカジエン酸は、ｃ１０，ｔ１２；ｔ１０，ｃ１２；ｔ１０，ｔ１２；およびｃ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸を包含するが、ｔ１０，ｃ１２オクタデカジエン酸もしくはＣＬＡは単一の異性体のみを意味する。
本明細書で用いる「油（ｏｉｌ）」なる用語は、長鎖脂肪酸（ＣＬＡを含む）または他の長鎖炭化水素基を含有する自由流動性の液体を意味する。長鎖脂肪酸は限定するものでないが、ＣＬＡの各種の異性体を含む。
本明細書で用いる「生理学的に許容される担体」は、油性医薬品とともに常用される任意の担体または賦形剤を意昧する。このような担体また賦形剤は、限定するものでないが、油、デンプン、スクロースおよびラクトースを含む。
本明細書で用いる「経口送達ビヒクル」は、限定するものでないが、カプセル、ピル、錠剤およびシロップを含む経口的に医薬品を送達する手段を意味する。本明細書で用いる「食品」は、ヒト、非反芻動物または反芻動物による消費に適した食料または飼料を意味する。「食品」は調理されてパックされた食品（例えば、マヨネーズ、サラダドレシング、パン、もしくはチーズ食品）または動物飼料（例えば、押出してペレット化した動物飼料もしくは粗粒の混合飼料）であってよい。ＣＬＡの様々な用途は特許および科学文献に十分に記載されている。これらの用途は２つの一般的なカテゴリーに大別される。第１のカテゴリーは、ＣＬＡの食物サプリメントとしての栄養上の使用である。第２のカテゴリーは、治療および薬理学上の使用である。
本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，５５４，６４６号（Ｃｏｏｋら）は、動物の体脂肪を減らすためにＣＬＡを使用することを開示している。この方法では、体重の減少を引き起こすのに十分なＣＬＡの安全かつ有効な量を動物に与える。０．５％のＣＬＡを含有する食餌を与えられたマウスは、給餌が終わった時点で、０．５％のコーン油を含有する食餌を与えられた対照マウスの脂肪含量より有意に低い全脂肪含量を示した。体脂肪を減らすために投与されるべきＣＬＡの正確な量は、動物、使用するＣＬＡの形態、および投与経路に左右される。その量は、一般的に約０．００１ｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ（動物の体重）の範囲にある。医薬量は、一般的にヒト食物の約１，０００ｐｐｍ〜約１０，０００ｐｐｍのＣＬＡの範囲にある。しかし、ＣＬＡは比較的無毒であるので、使用量の上限は特に決まっていない。この用途や他の用途のためのＣＬＡは、様々な形態で調製することができる。それらには、製薬上の希釈剤と組合せたＣＬＡの無毒性ナトリウムまたはカリウム塩および活性エステルが含まれる。ＣＬＡは、動物飼料またはヒトに供する食品に、ＣＬＡが動物またはヒトの食料の約０．０１〜２．０重量％もしくはそれ以上を占めるように、直接添加することもできる。該特許は、動物食餌へのＣＬＡの補充が、動物中の体タンパク質を保持しかつ動物の筋タンパク質を増加するのに役立つことも開示した。
ＣＬＡの他の栄養的使用が、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，４２８，０７２号（Ｃｏｏｋら）に開示されている。該特許には、安全かつ有効な量のＣＬＡを動物に与えることにより、動物の体重増加および飼料効率が増加することが示される。０．５％のＣＬＡを補充した食餌を与えたヒヨコの群は、たとえＣＬＡを与えたヒヨコの飼料消費が少なくとも、０．５％のリノール酸を与えた対照ヒヨコと同等の体重増加を示した。さらに、０．５％のＣＬＡを与えた後に内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）を注射したヒヨコは体重増加を示したが、対照食餌を与えたヒヨコは体重が減少するか、ごく僅かしか体重が増加しなかった。同様な結果は、０．５％のＣＬＡを含有する食餌を与えたラットおよび０．５％または１％のＣＬＡを与えたウサギにも見られた。食餌に供給されるまたは含まれるＣＬＡの量に対するガイドラインは米国特許第５，５５４，６４６号に開示された量と同一である。
ＣＬＡは実際にヒトの体重を減少させるために使用しうることも研究により実証されている。ノルウエーでアーリング・トーム（Ｅｒｌｉｎｇ  Ｔｈｏｍ）が１９９７年に実施した二重盲検法では、２０人の健康人の食事に３ｇのＣＬＡ混合物または３ｇのプラシーボを補充した。ＣＬＡを与えた群は体重および体脂肪率の両方の減少を経験したが、プラシーボを与えた群は体重および体脂肪率の増加を経験した。ＰＣＴ公開ＷＯ  ９７／４６２３０は、体脂肪および／または体重の既存レベルを維持する方法を開示している。
該特許のクレームは、ＣＬＡが合計３人により消費されるという逸話的で管理されていない研究を当てにしたものである。
ＣＬＡ使用に関する他の特許は、免疫応答におけるＣＬＡの役割に焦点をおいている。本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，５８５，４００号（Ｃｏｏｋら）は、ＣＬＡを含有する食物の投与によりＩ型またはＴｇＥ過敏症の介在する動物のアレルギー反応を軽減する方法を開示している。該特許は、白血球数を保持するために、約０．１〜１．０％の濃度のＣＬＡを投与することも開示している。該特許に開示された研究は、モルモット（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ）気管アレルギーモデルを採用した。モルモットに０．２５％のＣＬＡまたは対照食餌を２週間与え、その後、高度免疫感作（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）のために２および３週目に卵白アルブミンで免疫した。潅流モデル系を使って、ＣＬＡを与えることがアレルゲン誘起気管収縮になんらかの影響を与えるかどうかを確認した。該潅流系では、ＣＬＡを与えたモルモットからの気管は、対照食餌を与えたモルモットの気管より安定していた。アレルゲンをモルモット気管上に注入すると、ＣＬＡを与えた動物の組織ではより少ない気管収縮が観察された。対照動物と比較してＣＬＡを与えた動物の白血球数は増えており、対照動物の白血球数が２．４ｘ１０６＋／−０．３であるのに対して、ＣＬＡを与えた動物の白血球数は３．５ｘ１０６  ＋／−０．６であった。
成長を促進しかつ免疫刺激（例えば内毒素曝露）および異化ホルモン（例えば、ＩＬ−１）の有害作用による食欲不振と体重減少を予防するためのＣＬＡの使用が、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，４３０，０６６号（Ｃｏｏｋら）に開示された。０．５％ＣＬＡの食餌を与え、その後内毒素注入によりチャレンジしたヒヨコは、体重増加を示したが、対照食餌を与えたヒヨコは内毒素の曝露後に体重が増加しなかった。同様な結果が、０．５％ＣＬＡを含有する食餌を与えたラットにおいて、０．５％コーン油の対照食餌を与えた動物と比較して得られた。開示された調製物と用量範囲は、米国特許第５，５５４，６４６号に開示されたものと同一である。
動物に安全かつ有効な量のＣＬＡを投与することからなる、ＣＤ−４およびＣＤ−８細胞レベルを維持または上昇させ、そして腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の産生または外因的投与によりまたはウイルスにより引き起こされる動物に対する有害作用を防止もしくは軽減するための動物の治療方法が、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，６７４，９０１号（Ｃｏｏｋら）に開示された。マウスに対照食餌または０．５％ＣＬＡを与え、その後ＴＮＦの注射でチャレンジした。ＣＬＡを与えたマウスは対照マウスより体重減少が少なかった。同様に、０．５％ＣＬＡ食餌を与え、その後、生弱毒化鶏痘ウイルスの羽弁（ｗｉｎｇ  ｗｅｂ）注射でチャレンジしたヒヨコは、対照食餌を与えたヒヨコより体重増加が大きかった。０．５％ＣＬＡ食餌を与えたヒヨコは、対照食餌を与えたヒヨコと比較して顕著にＣＤ−４およびＣＤ−８細胞の％が増加していた。
本明細書に参照により組み入れられる欧州特許出願７７９，０３３  Ａｌ（Ｌｉｅｖｅｎｓｅら）は、血中脂質プロフィールを改善するためのＣＬＡの使用を開示している。簡単に説明すると、ハムスターにトリグリセリドに組込まれたＣＬＡを含有する食餌を、脂肪スプレッド（ｆａｔ  ｓｐｒｅａｄ）の形態にして食餌全カロリーの１．５％の比率で与えた。ＣＬＡを与えたハムスターは総コレステロールの減少、ＨＤＬコレステロールの減少、およびＬＤＬコレステロールの減少を示した。
本明細書にその両方が参照により組み入れられるＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／０５３１８（Ｃｏｏｋら）およびＷＯ  ９８／０５３１９（Ｃｏｏｋら）において報じられたように、ＣＬＡは骨沈着に影響することも実証されている。０．１８７５％、０．３７５％、または０．７５％のＣＬＡを含有する食餌を与えたヒヨコは、その食餌にＣＬＡの含まれないヒヨコと比較すると、骨格異常の大幅な減少を示した。さらに、０．５％ＣＬＡを含有する食餌を与えたヒヨコは骨ミネラル含量の増加を示した。
他の特許はＣＬＡの様々な製剤を記載している。欧州特許出願ＥＰ７７９０３３  Ａｌは、（重量で）０．０５〜２０％の共役リノール酸残油を含有する食用脂肪スプレッドを開示している。そこでは、９５．３％のリノール酸含量を有する遊離脂肪酸の市販混合物を、エチレングリコール中でＮａＯＨによるアルカリ異性化にかけた。遊離脂肪酸を、１０部のパーム油およびリパーゼと混合することによりトリグリセリドに組み入れた。混合物を４８時間、４５℃で攪拌し、リパーゼと遊離脂肪酸を除去した。この組成物７０部と、２９部の水、０．５部の乳清タンパク質粉末、０．１部の塩、および少量の香料とクエン酸（４．５のｐＨを得るため）を混合し、加工して脂肪スプレッドを作った。
本明細書に参照により組み入れられるＰＣＴ公開ＷＯ  ９７／４６１１８（Ｃｏｏｋら）には、ＣＬＡの安全かつ有効な量を含有する他の食品が開示されている。そこには、直径約０．３３〜０．５ミクロンの乳化脂肪粒子を含有するヒトへの非経口投与用の液体栄養食品が開示されている。該エマルジョンは０．５ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇのＣＬＡまたは食品脂質基準で０．３％〜１００％のＣＬＡまたは１００カロリーの食物当り０．０３ｇ〜０．３ｇのＣＬＡを含有する。この出願は、同様な量のＣＬＡを、２．６６ｇのタンパク質、５．４６ｇの脂肪、１０．１ｇの炭水化物、１３３ｇの水、およびＲＤＡ量のビタミンとミネラルとともに含有するベビー用配合物を開示している。高タンパク質、ビタミンおよびミネラルのサプリメントとして有用な、低残留液状腸内栄養製品の他の例が開示されている。このサプリメントはＣＬＡを、製品重量で０．０５％〜約５％、または存在脂質の０．３％〜約１００％、または１００カロリー当たり約０．０３〜０．３ｇのＣＬＡで含有する。さらに、１４０カロリーの代表的配合物は、７．５ｍｇの卵白固体、０．１ｇのＣＬＡ、２７．３ｇのスクロースまたは加水分解トウモロコシデンプンのような炭水化物、１．９ｇの水、およびＲＤＡ量のビタミンとミネラルを含有する。
本発明では、上に記載したそれぞれの用途に対して、１０，１２異性体または９，１１異性体のいずれかを濃縮した調製物を用いることが好ましい。９，１１異性体の濃縮調製物は、マトレヤ社（Ｍａｔｒｅｙａ，Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）から市販されている。ｔ１０，ｃ１２異性体を濃縮したＣＬＡ調製物は、分取規模のガスクロマトグラフィーによりまたは実施例４に示される沈降法により調製することが好ましい。
本発明者らは、最近の大方の科学的見解に反して、特に活性のあるＣＬＡ異性体が、実際にはＣＬＡのｔ１０，ｃ１２異性体であることを見出した。本発明では、ヒト食品サプリメントおよび動物飼料に添加される１０，１２対９，１１異性体の比、最も好ましくはｔ１０，ｃ１２対ｃ９，ｔ１１異性体の比は、所望の栄養、治療および薬理学的効果を提供するようにコントロールされる。用いる１０，１２対９，１１異性体の比、最も好ましくはｔ１０，ｃ１２対ｃ９，ｔ１１異性体の比は、約１．２：１より大きく、最も好ましくは約１．２：１〜３：１の間にある。ＣＬＡは毒性が無いので、１０，１２対９，１１異性体の比の上限は重要でない。しかし、３：１の比の閾値を超えても、付加的効果は比較的小さいと予想される；しかし濃縮１０，１２  ＣＬＡの送達はその最大観測効果を超えるレベルで有効であろう。
本発明の組成物は、ｔ１０，ｃ１２異性体の濃縮調製物を、９，１１異性体の濃縮調製物またはアリカリ異性化により生成された通常のＣＬＡ調製物と組合わせて製剤化することが好ましい。それぞれの事例で、１０，１２対９，１１異性体の所望の比を達成するように、１０，１２異性体の濃縮調製物を加える。様々なＣＬＡ調製物の異性体組成は、当業界で公知のガスクロマトグラフィーにより確めることが好ましい。
あるいはまた、１０，１２異性体は、１日分の食料として、０．０１〜１０ｇ当量の１０，１２異性体、最も好ましくは０．０１〜１０ｇ当量のｔ１０，ｃ１２異性体を含有するまたはそれから構成される脂質成分を含むビヒクルで与えることができる。グラム当量は、存在する他の異性体に関係なく、与えられる１０，１２異性体の全量が０．０１〜１０ｇであることを意味する。存在する１０，１２異性体の量は、約１．２：１より大きい１０，１２対９，１１比をもたらす量でありうる。１０，１２異性体が１日分の食料の部分として与えられる場合は、その摂取は、一回で行われても、または一日を通じて消費される飼料もしくは様々な食品中の一連の摂取量として行われてもよい。
本発明の組成物は、商業販売用のバルク製品の形態をとることもできる。バルクＣＬＡ製品は、少なくとも５０％の共役リノール酸異性体を含有するかまたはそれから構成される。該リノール酸異性体は、９０％以上のｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体の混合物を含有することを特徴とする。好ましくは、これらの異性体は、ｔ１０，ｃ１２のほうを多くして約１．２：１より大きい比、最も好ましくは、約１．２：１〜３：１の範囲で提供される。このバルク製品は、動物飼料、ヒトの食物サプリメント、およびヒトの食品のような栄養製品中に希釈することができる。これらの製品は、９０％以上のｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１異性体の混合物を含むことを特徴とするリノール酸異性体を含有するまたはそれから構成される組成物であろう。好ましくは、これらの異性体は、ｔ１０，ｃ１２のほうを多くして約１．２：１より大きい比で、最も好ましくは、約１．２：１〜３：１の範囲で提供される。
本発明の組成物は各種の用途を有するであろう。これらの用途としては、動物の体脂肪の減少、動物の筋量の増加、動物の飼料効率の増加、ヒトの体重の減少、動物のアレルギー反応の軽減、動物の免疫刺激による体重減少の予防、動物のＣＤ−４およびＣＤ−８細胞数の増加、動物の骨のミネラル含量の増加、動物の骨格異常の予防、および動物の血中コレステロール量の減少が含まれる。それぞれの事例で、用語「動物」はヒトを含む全ての哺乳類を含む。それぞれの用途に用いられる１０，１２異性体、最も好ましくはｔ１０，ｃ１２異性体の好ましい用量および比は、上に記載したものと同じである。
本発明の好ましい実施形態では、体重または脂肪を減少させるためにｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの安全で有効な栄養または治療量を（ヒトを含む）動物に経口投与する。ある実施形態では、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡが少なくとも約８０％の純度であり、他の実施形態では、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡが少なくとも約９０％の純度であり、さらに他の実施形態では、ｔ１０，ｃ１２ＣＬＡが少なくとも約９２％の純度である。ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは、肥満および非肥満のヒトに投与することができる。ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは無毒で、自然に存在する食品成分であり、薬剤ではないので、ＣＬＡは通常の食物の一部として消費することができ、肥満でない人たちの毎日の栄養の一部として利用される。栄養的に有効な量は、精製した形でまたは食品サプリメントとして摂取したときに、適切な栄養を損なったり妨害することなく体重または脂肪の減少をもたらすｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡ量である。したがって、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡの栄養的に有効な量の投与により、食品摂取の減少に伴う感覚遮断（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）なしに体重低下が達成される。ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは、わずかな臨床肥満から顕著な臨床肥満をもつヒトを治療するためにも使うことができる。臨床肥満のヒトを治療するときは、治療有効量のｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡが投与される。治療有効量は、臨床的に肥満した人の体重または体脂肪を減少させる量である。本発明では、１日に約０．１〜１５ｇのＣＬＡを投与し、好ましくは１日に約０．１〜５ｇを投与し、最も好ましくは、１日に約１．８ｇを投与する。一般的に、栄養的または治療的に有効でありさえすれば、投与するＣＬＡの量は重要ではない。
栄養的または治療的に有効と認められるＣＬＡの量は、４週間またはそれ以上にわたって投与したときに、測定可能な体重または脂肪低下をもたらす量である。
体重、基礎代謝、運動、および食事の他の側面などのパラメーターの個人間の差異により、有効性にいくらかの変動があると考えられる。個人は、最初の２週間は、好ましくは１．８ｇ用量で始めるべきで、その後、もし体重低下が起らなければ、徐々にＣＬＡ用量を増やして１日当り約１０〜１５ｇに達するまでにする。
本発明は、ＣＬＡ異性体濃縮調製物の誘導体の使用も考えている。例えば、ＣＬＡは遊離であっても、エステル結合を介して結合していても、実施例５に記載のように異性体濃縮ＣＬＡトリグリセリドを含有する油の形態で提供されてもよい。これらの実施形態では、トリグリセリドは部分的にまたは全体的にグリセロール骨格に結合された異性体濃縮ＣＬＡを含むことができる。異性体濃縮ＣＬＡは、実施例に記載のように、メチルエステルまたはエチルエステルとして提供することもできる。さらに、異性体濃縮ＣＬＡは、カリウムまたはナトリウム塩のように無毒の塩の形態（例えば、ｐＨ約８〜９で化学当量の遊離酸と水酸化アルカリを反応させることにより形成される塩）であってもよい。
ある好ましい実施形態では、投与は経口で行われる。異性体濃縮ＣＬＡは、デンプン、スクロースまたはラクトースのような適切な担体を用いて、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、溶液、液体、スラリー、懸濁液および乳濁液に製剤化することができる。異性体濃縮ＣＬＡは、水溶液、油性溶液、上に述べた他の形態のどれかで提供することができる。本発明の錠剤またはカプセル剤は、約６．０〜７．０のｐＨで溶解する腸溶コーティングでコートしてもよい。小腸で溶解するが胃では溶解しない適切な腸溶コーティングは、酢酸フタル酸セルロースである。ある好ましい製剤では、異性体濃縮ＣＬＡが軟ゼラチンカプセル剤として提供される。異性体濃縮ＣＬＡは、限定するものでないが、静脈内、筋内、動脈内、延髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸手段を含む多数の他の経路によっても提供される。製剤化および投与の技術のさらなる詳細は、「レミントンの製薬科学」（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見出すことができる。
異性体濃縮ＣＬＡは、様々な調理食品および飲料のサプリメントとしても提供することができる。本出願において、調理食品は、異性体濃縮ＣＬＡが添加された天然の、加工された、食事用または非食事用食品を意味する。異性体濃縮ＣＬＡは、遊離脂肪酸の形で、または異性体濃縮ＣＬＡの部分的または全体的トリグリセリドを含有する油として加えることができる。それゆえに、異性体濃縮ＣＬＡは、限定するものでないが、飲料、ダイエットバー（ｄｉｅｔ  ｂａｒ）、サプリメント、調理冷凍食品、キャンディ、スナック製品（例えばチップ）、調理肉製品、ミルク、チーズ、ヨーグルトおよび他の脂肪または油を含有する食品を含む様々な調理食品に直接添加することができる。
ＣＬＡはまた、酸化を受けやすい。したがって、ヒトに使用する異性体濃縮ＣＬＡは、レシチン、トコフェロール、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテートのような適切な抗酸化剤またはローズマリー抽出物のようなスパイス抽出物とともにパッケージすることが望ましい。
現在、ほとんどのＣＬＡはアルカリ異性化プロセスにより製造される。ヒマワリ油、オオマツヨイグサ（ｅｖｅｎｉｎｇ  ｐｒｉｍｒｏｓｅ）油またはサフラワー油のようなリノール酸含量の高い油を、不活性な窒素環境のもとで水酸化カリウムおよびプロピレングリコールのような溶媒を用いて約１８０℃で約２．５時間反応させる。反応生成物を酸性化し、酸性水で数回洗浄し、最後は真空下で乾燥する。アルカリ異性化によるＣＬＡの実験室規模製造の完全な記述については、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，５５４，６４６号を参照すること。ＣＬＡは、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第４，１６４，５０５号に記載の連続流アルカリ異性化プロセスによっても製造することができる。これらのプロセスから得られる反応生成物は、ＣＬＡ、リノール酸および原料油中に存在する他の脂肪酸の混合物である。
一般的に、ヒマワリ油のアルカリ異性化から誘導されるＣＬＡの量は、全遊離脂肪酸生成物の約６０％であり、ほぼ等量のｃ９，ｔ１１およびｔ１０，ｃ１２異性体を含有する。
主にｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１  ＣＬＡからなる調製物を製造する他の方法は、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第５，６７４，９０１号に開示されている。この方法では、リノール酸を含有する油を微生物Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓとともにインキュベートする。Ｂ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓはリノール酸をｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１  ＣＬＡに転化するΔ１２−ｃｉｓ，Δ１１−イソメラーゼを含有する。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
飼料中のＣＬＡ含量と雄ブタの背脂肪量の関係を調べる３つの異なる研究が実施されている。アイオワ州立大学（Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で行われ、中西部動物科学会議（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｍｅｅｔｉｎｇ）で報じられた１つの研究では、シールら（Ｒ．Ｌ．Ｔｈｉｅｌら）は、ＣＬＡをあたえたブタは背脂肪が減少したことを報じた。簡単に説明すると、平均初期体重２６．３ｋｇの５匹の同腹仔去勢雄ブタを無作為に個々の囲い（ｐｅｎ）に割当てて８回の反復実験を行った、。ブタに、平均９３日間給餌し、屠殺時の平均体重は１１６ｋｇであった。０．５％のＣＬＡを与えた群は、背脂肪が１０．３％減少した。最初発表されなかったが、この食餌で用いられたＣＬＡは、ＣＬＡの１０，１２対９，１１異性体比は１．０５：１であった。
カンサス州立大学（Ｋａｎｓａｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の研究者により実施され、中西部動物科学会議（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ）で報じられた他の研究では、平均初期体重８３ポンドの３６匹の雑種去勢雄ブタに、０．５０％のＣＬＡを含有する食餌を与えた。平均最終体重は約２３０ポンドであった。ＣＬＡを含有する食餌を与えた雄ブタは背脂肪が７．２％減少した。この実験で用いられたＣＬＡでは、ＣＬＡの１０，１２対９，１１異性体比は０．４８７：１であった。
未発表の他の研究では、初期体重２６ｋｇの２４匹の去勢雄ブタに０．４８％のＣＬＡを含有する食餌または対照食餌を与えた。雄ブタに給餌して最終体重を１１８ｋｇとした。ＣＬＡを与えた雄ブタは背脂肪が１３．７％減少した。この実験におけるＣＬＡの１０，１２対９，１１異性体比は１．１６：１であった。
これらの研究のそれぞれで用いたＣＬＡの１０，１２対９，１１異性体比を背脂肪減少百分率に対してプロットし、対数回帰により分析した。結果を図１に示す。これらの結果は、ＣＬＡの１０，１２対９，１１異性体比が増加すると背脂肪の減少百分率も増加することを示す。したがって、約１．２：１より大きい１０，１２対９，１１の異性体比を含有するＣＬＡの調製物が望ましい。
食餌中の１０，１２異性体の総量も背脂肪蓄積に影響しうる。食餌中の１０，１２異性体の百分率を背脂肪減少百分率に対してプロットし、線形回帰により分析した。結果を図２に示す。これらの結果は、食餌中の１０，１２異性体の総量が増加すると背脂肪が減少することを示す。見られる効果は異性対比の効果ほど大きくはない。しかし、これらの結果は異性体比の結果と一致すると考えられる。頼みにした研究は異性体間で差異を生じなかった。存在する９，１１および他の異性体の量および比が、食餌の１０，１２の百分率の増加に関係するなんらかの影響をマスクした可能性がある。１０，１２異性体を濃縮したＣＬＡの調製物を用いる場合には、その結果が異性体比の結果に匹敵しうることが予期される。
（実施例２）
科学文献は、ＣＬＡの生物学的活性異性体は確認されていないか、またはｃ９，ｔ１１ＣＬＡが生物学的活性異性体であることを示す。実施例１の結果に基いて、本発明者らは、ｔ１０，ｃ１２異性体が活性異性体であると考える。それ故に、異なる異性体比と量のＣＬＡ異性体の食餌をマウスに与えることの効果を試験して、ｔ１０，ｃ１２異性体が生物学的活性のある異性体であること、そして所望の生物学的効果をもたらすようにｔ１０，ｃ１２対ｃ９，ｔ１１比を操作しうることを実証した。
試験は、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した８４匹のＩＣＲマウスで実施した。食餌は、基礎食餌、砂糖、コーン油および共役リノール酸の１つ異性体または異性体混合物を用いてブレンドした。各処理は、２つの囲い（ｐｅｎ）に入れたそれぞれ３匹のマウスから成っていた。マウスに食餌と水を自由に与えた。食餌消費を毎日モニタリングし、ベッドを変えたとき１日おきにマウスの体重を測定した。食餌を与えて３週間後に、マウスをＣＯ２  で安楽死させ、最終体重を測定した。その後マウスを剖検し、脂肪パッドの重量を測定した。マウスの総体脂肪も分析した。マウスを凍結乾燥し、摩砕した。２重サンプルの近位分析（ｐｒｏｘｉｍａｔｅａｎａｌｙｓｉｓ）（エーテル抽出、灰分、キェルダール、および水分）により分析した。結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2010259437.tif 000005
【００５６】
ｔ１０，ｃ１２，が存在しないとき、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡのみを与えたマウスは成長の線形増加（１６％）を示した。ｔ１０，ｃ１２異性体については逆が真であり、成長が１０％減少した。結果として、ｃ９，ｔ１１はまた０．２％：０％の比で消費率を８％増加した。これらのデータは、食餌のｔ１０，ｃ１２異性体の量の増加は体脂肪の減少を引起こすことも示す。食餌にＣＬＡを含まない対照マウスと比較すると、ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡのみを与えたマウスは体脂肪が減少しかつ成長が低下した。対照的に、ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡのみを与えたマウスは、成長、体重増加率および飼料要求率の増加を示した。マウスにｔ１０，ｃ１２およびｃ９，ｔ１１の両ＣＬＡを与えたときは、ｔ１０，ｃ１２を増加するとともに体脂肪が減少した。成長、飼料要求率を改善し、脂肪を減少させる最適飼料は約２：１のｃ９，ｔ１１：ｔ１０，ｃ１２である。これらのデータは、異なるＣＬＡ異性体が異なる生物学的作用を有することを示す。
（実施例３）
１０，１２異性体を濃縮したＣＬＡの調製物を、分取規模ガスクロマトグラフィーにより調製した。得られた生成物をガスクロマトグラフィーにより分析した。ＣＬＡ異性体を同定するためのガスクロマトグラフィー法の最近の記載については、Ｃｈｒｉｓｔｌｅら，ＪＡＯＣＳ７４（１１）：１２３１（１９９７）、Ｃｈｒｉｓｔｌｅら，ＬｌＰｌｄＳ３３（２）：２１７−２１（１９９８）、Ｓｅｈａｔら，Ｌｉｐｉｄｓ  ３３（２）：２１７−２１（１９９８）、およびＭａｒｃｅｌ  Ｓ．Ｆ．Ｌｉｅ  Ｋｅｎ  ＪｉｅおよびＪ．
Ｍｕｓｔａｆａ，Ｌｉｐｉｄｓ  ３２（１０）：１０１９−３４（１９９７）を参照されたい。上記の参考文献は、本明細書に参照により組み入れられる。ガスクロマトグラフィー条件は次の通りであった。
システム：  パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）自動システム
注射器：    スプリットレス（Ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）、２４０℃
検出器：    炎イオン化検出器（Ｆｌａｍｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、２８０℃
担体：      ヘリウム
カラム：    ＷＣＯＴ溶融シリカ０．２５ｍｍ  Ｘ  １００Ｍ、ＦＡＭＥ用ＣＰ−ＳＬ８８、ＤＦ  ０．２
オーブンプログラム：    ８０℃（０分）から２２０℃へ毎分１０℃で上昇し、２２０℃で１０分間保持
全ての結果は相対ピーク面積百分率として表す。分析結果は次の通りであった。
【００５７】
【表２】
2010259437.tif 000006
【００５８】
（実施例４）
ｔ１０，ｃ１２  ＣＬＡは代りの方法で大量に生産することができる。完全精製ヒマワリ油（サフラワー油に置換可能）を原料に使う。油に触媒として１％のナトリウムエチラートを含有する過剰の純粋エタノールを加えることにより、エチルエステルを形成させる。該混合物を攪拌しながら６０℃で３０分間加熱し、そして分離させる。下層を抜き去り、上層を微酸性水で洗浄し、そして真空下で乾燥する。
その後、エチルエステル混合物を、１６０℃および１０−２ｍｂａｒの圧力で分子蒸留により精製し、残査を廃棄する。共役化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、０．５〜１％のエタノールおよび０．５〜１％のカリウムエチラートをエチルエステルに加え、該混合物を１２０℃で１時間攪拌して実施する。この反応は、希クエン酸を加えて停止させる。その後、油を洗浄し乾燥する。
その後、共役エチルエステルをアセトンに希釈し、−３０℃に冷却し、濾過してほとんどの飽和脂肪酸を除去する。その後、濾液をさらに−５６〜−５７℃に冷却して、ｔ１０，ｃ１２エチルエステルを沈降させる。エチルエステルは、わずかに暖めて減圧にすることで沈降物からアセトンを除去することによって得られる。こうして得られるｔ１０，ｃ１２エチルエステルは、少なくとも約９０％の純度である。より高い純度が所望であれば、共役化の前にさらに飽和脂肪をエチルエステルから除去する。これは尿素分画化により達成することができる。得られる精製生成物は、最終の沈降後に少なくとも約９７％のｔ１０，ｃ１２となる。
遊離脂肪酸は、エチルエステルから鹸化（ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とその後の中和によって得られる。鹸化するために、溶解度を改良するためのエタノールを含有する水の１０％量およびＮａＯＨの１００％過剰量をアルキルエステルに加えて、石鹸を形成させる。この反応は７０℃で実施する。その後、石鹸を水で希釈し、よく攪拌しながらＨＣｌを加えて全混合物を酸性にする。遊離脂肪酸が分離して上層を形成し、これを希クエン酸で洗浄し、最終的に乾燥する。その結果得られたものを上に記載のとおリガスクロマトグラフィーで分析した。尿素分画を用いた結果は次のとおりであった。
【００５９】
【表３】
2010259437.tif 000007
【００６０】
尿素分画なしの結果は次の通りであった。
【００６１】
【表４】
2010259437.tif 000008
【００６２】
（実施例５）
ＣＬＡのトリアシルグリセロールは直接エステル化により調製することができる。固定したＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼ（１．２５ｇ）をグリセロール（１．２２ｇ．１３．３ｍｍｏｌ）および異性体（ｔ１０，ｃ１２またはｃ９，ｔ１１のいずれか）を濃縮したＣＬＡ（遊離脂肪酸として、分子量２８０．３ｇ／ｍｏｌ；１１．６ｇ，４１．５ｍｍｏｌ）の混合物に加える。この混合物を、磁気攪拌器ホットプレート上、６５℃、０．０１〜０．５Ｔｏｒｒの連続真空下で穏かに攪拌する。反応進行中に生成する揮発性の水を、連続的に液体窒素冷却トラップ中に凝縮させる。４８時間後、反応を停止し、ｎ−ヘキサンを加え、酵素を濾過して分離除去する。（必要に応じて）有機層を、炭酸ナトリウムのアルカリ性水溶液で処理して、過剰の遊離脂肪酸を除去する。（適宜に無水硫酸マグネシウム上で乾燥した後）有機溶媒をロータリーエバポレーターで真空除去し、その後、高真空処理して実質的に純粋な生成物を微黄色の油として得る。化学量諭量の脂肪酸を用いるときは、標準化した水酸化ナトリウムによる滴定を応用して、粗反応生成物の遊離脂肪酸含量（エステル基のモル数に基づいて１％未満の遊離脂肪酸含量で、これは最低で９７％のトリグリセリド含量に等しい、少なくとも９９％の組込みに相当する）を定量する。粗生成物を直接、ＨＰＬＣへ導入し、ｎ−ヘキサン中の１０％ジエチルエーテルで溶出させて、１００％純度のトリグリセリドを無色の油として得る。
反応の進行をモニタリングしかつ反応中の各グリセリドの組成についてさらに詳細を知る目的で、反応の進行につれて定期的にサンプルを採取する。それらをＨＮＭＲ分光分析計で分析すると、反応進行中のモノ−、ジ−およびトリアシルグリセロールの組成について推察することができる。
（実施例６）
本実施例は、共役サフラワーＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）の大規模バッチ製造を記載する。サフラワー共役ＦＡＭＥの製造は、２工程、すなわちメタノリシスおよび共役化に分けることができる。メタノリシスの場合は、６，０００ｋｇのサフラワー油を密閉反応器に入れた。反応器を大気圧で窒素によりパージし、１１５０リットルのメタノールおよび１６０ｋｇのＮａＯＣＨ３  （３０％溶液）を加えた。混合物を６５℃に攪拌しながら加熱し、そして６５℃で２時間反応させた。生成した下層をデカントして除き、反応器を窒素ガスでパージした。その後、攪拌しながら１０００リットルの水（４０〜５０℃、５０ｋｇのクエン酸一水和物を溶解しておいた）を加えた。その層を分離させ（約６０分間）、下層をデカントし、その間窒素ガスで反応器をパージする。生じたサフラワーＦＡＭＥ生成物を８０℃で真空下で１時間乾燥する。得られたサフラワーＦＡＭＥ生成物は上に記載したごとく共役化し、ｔ１０，ｃ１２またはｃ９，ｔ１１のいずれかのＣＬＡについて濃縮することができる。
【００６３】
（発明の効果）
生物学的に有利な比のＣＬＡ異性体を含有する組成物が提供された。生物学的に有利な比のＣＬＡ異性体を含有し、また、所望の生物学的効果を最適化するように濃縮した含量の生物活性異性体を含有する組成物の使用方法もまた提供された。
【図１】
2010259437.tif 000009
【図２】
2010259437.tif 000010