(57)【要約】【課題】ＩＦＮ−βタンパク質の溶解度を改善し、凝集形成に対しＩＦＮ−βタンパク質を安定化し、それによってその医薬的有用性を向上する、生理学的に適合した安定剤を含有する、さらなるＩＦＮ−β医薬組成物【解決手段】安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物であって、該組成物は以下：  低イオン強度処方物中に可溶化された、実質的に単量体のインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性な改変体、を含み、ここで、該低イオン強度処方物は、該組成物のｐＨを、特定のｐＨの±０．５単位内に維持するのに十分な量の緩衝液を含む溶液であり、ここで、該特定のｐＨは、約３．０〜約５．０であり、該処方物は、約６０ｍＭよりも高くないイオン強度を有する、薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載されるような、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的に医薬組成物、より詳細には、添加される医薬賦形剤としてヒト血清アルブミンを含まないインターフェロン−βの安定化処方物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インターフェロンは、糖タンパク質のファミリーであり、細胞からのその分泌は、ウィルス、２重鎖ＲＮＡ、他のポリヌクレオチド、抗原およびマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）を含むいくつかののシグナルによって誘発される。インターフェロンは、抗ウィルス性活性、抗増殖性活性、および免疫調節活性を含む複数の生物学的活性を提示する。少なくとも３種の別のタイプのヒトインターフェロン（α、β、およびγ）が、抗ウィルス性活性および抗増殖性活性を含むいくつかの要因に基づいて識別されている。
【０００３】
インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）は、多発性硬化症（ＭＳ）を患う人のために最初に認識された有効な処置であり、再発性および弛張性ＭＳ、ならびに続発進行性ＭＳを患う患者を苦しめる発作の回数を減少することが実証されつつある。ＩＦＮ−β組成物はまたＢ型肝炎感染およびＣ型肺炎感染の処置に有用である。
【０００４】
すべてのタンパク質を基にした薬剤と同様に、治療剤としてのＩＦＮ−βの使用の際、克服すべき１つの主要な障害は、医薬処方物中のその不安定性からの生じ得る医薬的有用性の喪失である。医薬処方物中のポリペプチド活性および効力を脅かす物理的不安定性として、変性、および溶解性および不溶解性凝集体の形成が挙げられるが、一方で、化学的不安定性として、加水分解、イミド形成、酸化、ラセミ化、およびアミド分解が挙げられる。これらの変化のいくつかは、目的のタンパク質の医薬的活性の喪失または低減を導くことが公知である。他の事例において、これらの変化の正確な効果は未知であるが、結果となる分解物は、望まれない副作用の可能性のため、まだ医薬的に容認できないとみなされている。
【０００５】
医薬組成物中のポリペプチドの安定化は、試行錯誤が重要な役割となる領域のままである（非特許文献１；非特許文献２で論評される）。ポリペプチド医薬処方物に、その安定性を高めるために添加される賦形剤として、緩衝液、糖、界面活性剤、アミノ酸、ポリエチレングリコール、およびポリマーが挙げられるが、これらの化学的添加物の安定化する効果はタンパク質により変化する。
【０００６】
安定化されたＩＦＮ−β医薬処方物を調製するための主要な障害の１つとして、ＩＦＮ−β分子の乏しい溶解度がある。現在の処方物は、ＩＦＮ−βのための溶解度増加剤としてＨＳＡの使用を採用する。しかしながら、ＨＳＡの使用には短所がある。ＨＳＡは人の血液の産物であり、従って、人間被験体から採取されなければならない。危険性を低減させる工程が行なわれるが、ＨＳＡのような人の血液産物の使用は、ＨＩＶおよびＨＣＶのようなヒトウィルスの潜在的な導入が伴う。ＨＳＡの処方物への導入はまた、処方物中のＩＦＮ−βの安定性を適切に決定する能力を妨害する。これは、ＨＳＡおよびＩＦＮ−βが共にタンパク質であり、そしてＨＳＡはＩＦＮ−β安定表示アッセイのいくつかを妨害するためである。
【０００７】
さらに、ＩＦＮ−βは、医薬組成物中で調製される場合、凝集形成を提示するタンパク質であり、従って単量体の生物的に活性状態のこのタンパク質の量は、これらの組成物の
保存期間に損なわれる。医薬組成物の保存期間中ＩＦＮ−βのようなポリペプチドによる凝集形成は、そのポリペプチドの生物的活性に悪影響を及ぼし得、医薬組成物の治療的効果の損失という結果となる。さらに、ＩＦＮ−β医薬組成物が注入システムを用いて投与されたとき、凝集形成は、管、膜、またはポンプの閉塞などの他の問題を起こし得る。さらに、タンパク質の凝集化形態を含有する医薬組成物の注入は、凝集化したタンパク質に対する免疫原性反応を生じる可能性がある。
【０００８】
従って、このタンパク質の溶解度を改善し、凝集形成に対しタンパク質を安定化し、それによってその医薬的有用性を向上する、生理学的に適合した安定剤を含有する、さらなるＩＦＮ−β医薬組成物の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８５：１２９−１８８
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ（１９８８）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４２：Ｓ３−Ｓ２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
治療的活性成分およびそれらの調製に有用な方法として、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を含有する組成物が提供される。その組成物は、医薬賦形剤としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まず、低イオン強度処方物中で安定化された実質的に単量体のＩＦＮ−βを含有する安定化された医薬組成物である。その低イオン強度処方物は、特定のｐＨ（±０．５単位）（ここで、特定のｐＨは、約３．０から約５．０である）で組成物を維持するために十分な量の緩衝液を含有し、約６０ｍＭ以下のイオン強度を保持する溶液である。非イオン性等張剤（ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）が、組成物を等張にするために、医薬組成物に取り込まれる（ここで等張剤は炭水化物である）。ヒト血清アルブミンを使用しない、医薬組成物中のＩＦＮ−βの溶解度を増加させるための方法、ならびにこれらの組成物中の単量体ＩＦＮ−βの量を増加させるための方法もまた提供される。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物であって、当該組成物は以下：
低イオン強度処方物中に可溶化された、実質的に単量体のインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性な改変体、
を含み、ここで、当該低イオン強度処方物は、当該組成物のｐＨを、特定のｐＨの±０．５単位内に維持するのに十分な量の緩衝液を含む溶液であり、ここで、当該特定のｐＨは、約３．０〜約５．０であり、当該処方物は、約６０ｍＭよりも高くないイオン強度を有する、薬学的組成物。
・（項目２）
上記緩衝液が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
・（項目３）
上記緩衝液が、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する、項目２に記載の組成物。
・（項目４）
上記緩衝液が、約２ｍＭ〜約７ｍＭの濃度で存在する、項目３に記載の組成物。
・（項目５）
上記緩衝液が、約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在する、項目４に記載の組成物。
・（項目６）
上記緩衝液が、約５ｍＭの濃度で存在する、項目５に記載の組成物。
・（項目７）
上記特定のｐＨが、約３．０であり、かつ、上記緩衝液がグリシンである、項目１に記
載の組成物。
・（項目８）
上記特定のｐＨが、約４．０であり、かつ、上記緩衝液がアスパラギン酸である、項目１に記載の組成物。
・（項目９）
上記特定のｐＨが、約５．０であり、かつ、上記緩衝液がコハク酸ナトリウムである、項目１に記載の組成物。
・（項目１０）
上記特定のｐＨが、約３．０であり、かつ、上記緩衝液がグリシンである、項目６に記載の組成物。
・（項目１１）
上記特定のｐＨが、約４．０であり、かつ、上記緩衝液がアスパラギン酸である、項目６に記載の組成物。
・（項目１２）
上記特定のｐＨが、約５．０であり、かつ、上記緩衝液がコハク酸ナトリウムである、項目６に記載の組成物。
・（項目１３）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
・（項目１４）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目１に記載の組成物。
・（項目１５）
上記組成物を等張性にするのに十分な量の非イオン性等張剤をさらに含み、ここで、当該非イオン性等張剤がトレハロースである、項目１に記載の組成物。
・（項目１６）
上記トレハロースが、体積あたりの重量で約９％の濃度で存在する、項目１５に記載の組成物。
・（項目１７）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目１５に記載の組成物。
・（項目１８）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目１５に記載の組成物。
・（項目１９）
上記組成物を等張性にするのに十分な量の非イオン性等張剤をさらに含み、ここで、当該非イオン性等張剤がトレハロースである、項目１０に記載の組成物。
・（項目２０）
上記トレハロースが、体積あたりの重量で約９％の濃度で存在する、項目１９に記載の組成物。
・（項目２１）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
・（項目２２）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目１９に記載の組成物。
・（項目２３）
上記組成物を等張性にするのに十分な量の非イオン性等張剤をさらに含み、ここで、当該非イオン性等張剤がトレハロースである、項目１１に記載の組成物。
・（項目２４）
上記トレハロースが、体積あたりの重量で約９％の濃度で存在する、項目２３に記載の組成物。
・（項目２５）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目２３に記載の組成物。
・（項目２６）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目２３に記載の組成物。
・（項目２７）
上記組成物を等張性にするのに十分な量の非イオン性等張剤をさらに含み、ここで、当該非イオン性等張剤がトレハロースである、項目１２に記載の組成物。
・（項目２８）
上記トレハロースが、体積あたりの重量で約９％の濃度で存在する、項目２７に記載の組成物。
・（項目２９）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目２７に記載の組成物。
・（項目３０）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目２７に記載の組成物。
・（項目３１）
上記ＩＦＮ−βが、成熟ネイティブＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、項目１に記載の組成物。
・（項目３２）
上記ＩＦＮ−βが、組換え的に生成される、項目３１に記載の組成物。
・（項目３３）
上記ＩＦＮ−βが、グリコシル化されるか、または、グリコシル化されない、項目３２に記載の組成物。
・（項目３４）
上記ＩＦＮ−βが、グリコシル化されていないヒトＩＦＮ−β（ｈＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性なムテインである、項目３３に記載の組成物。
・（項目３５）
上記ムテインが、ｈＩＦＮ−βｓｅｒ１７である、項目３４に記載の組成物。
・（項目３６）
安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物であって、当該組成物は以下：
低イオン強度処方物中に可溶化された、実質的に単量体のインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性な改変体、
を含み、ここで、当該低イオン強度処方物は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する、グリシン、アスパラギン酸またはコハク酸ナトリウムからなる群から選択される緩衝液を含む溶液であり、当該組成物は、約３．０〜約５．０のｐＨを有し、ここで、当該処方物は、約６０ｍＭを越えないイオン強度を有する、組成物。
・（項目３７）
上記ＩＦＮ−βが、組換えヒトＩＦＮ−β（ｒｈＩＦＮ−β）、またはその生物学的に活性なムテインである、項目３６に記載の組成物。
・（項目３８）
上記ｒｈＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性なムテインが、グリコシル化されていない、項目３７に記載の組成物。
・（項目３９）
上記ムテインが、ｈＩＦＮ−βｓｅｒ１７である、項目３８に記載の組成物。
・（項目４０）
上記ｒｈＩＦＮ−βが、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目３６に記載の組成物。
・（項目４１）
上記緩衝液はグリシンであり、当該グリシンは約５ｍＭの濃度で存在し、ここで、上記組成物は約３．０のｐＨを有する、項目３６に記載の組成物。
・（項目４２）
体積あたりの重量で約９％のトレハロースをさらに含む、項目４１に記載の組成物。
・（項目４３）
上記緩衝液はアスパラギン酸であり、当該アスパラギン酸は、約５ｍＭの濃度で存在し、ここで、上記組成物は約４．０のｐＨを有する、項目３６に記載の組成物。
・（項目４４）
体積あたりの重量で約９％のトレハロースをさらに含む、項目４３に記載の組成物。
・（項目４５）
上記緩衝液はコハク酸ナトリウムであり、当該コハク酸アトリウムは、約５ｍＭの濃度で存在し、ここで、上記組成物は約５．０のｐＨを有する、項目３６に記載の組成物。
・（項目４６）
体積あたりの重量で約９％のトレハロースをさらに含む、項目４５に記載の組成物。
・（項目４７）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目３６に記載の組成物。
・（項目４８）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目３６に記載の組成物。
・（項目４９）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目４１に記載の組成物。
・（項目５０）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目４１に記載の組成物。
・（項目５１）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目４３に記載の組成物。
・（項目５２）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目４３に記載の組成物。
・（項目５３）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目４５に記載の組成物。
・（項目５４）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目４５に記載の組成物。
・（項目５５）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目４２に記載の組成物。
・（項目５６）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目４２に記載の組成物。
・（項目５７）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目４４に記載の組成物。
・（項目５８）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目４４に記載の組成物。
・（項目５９）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目４６に記載の組成物。
・（項目６０）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目４６に記載の組成物。
・（項目６１）
安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物であって、当該組成物は以下：
低イオン強度処方物中に可溶化された、実質的に単量体のヒトインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性なムテイン、
を含み、ここで、当該低イオン強度処方物は緩衝液としてグリシンを含む溶液であり、当該緩衝液は、約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在し、当該組成物は、約３．０〜約４．０のｐＨを有し、そして、当該処方物は、約４０ｍＭを越えないイオン強度を有する、組成物。
・（項目６２）
上記ｒｈＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性なムテインが、グリコシル化されていない、項目６１に記載の組成物。
・（項目６３）
上記ムテインが、ｈＩＦＮ−βｓｅｒ１７である、項目６２に記載の組成物。
・（項目６４）
上記緩衝液が、約５ｍＭの濃度で存在し、上記ｐＨが約３．０であり、そして、上記イオン強度が、約２０ｍＭを超えない、項目６３に記載の組成物。
・（項目６５）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目６１に記載の組成物。
・（項目６６）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目６１に記載の組成物。
・（項目６７）
体積あたりの重量で約９％のトレハロースをさらに含む、項目６１に記載の組成物。
・（項目６８）
安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物であって、当該組成物は以下：
低イオン強度処方物中に可溶化された、実質的に単量体のヒトインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性なムテイン、
を含み、ここで、当該低イオン強度処方物は緩衝液としてアスパラギン酸を含む溶液であり、当該緩衝液は、約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在し、当該組成物は、約３．５〜約４．５のｐＨを有し、そして、当該処方物は、約４０ｍＭを越えないイオン強度を有する、組成物。
・（項目６９）
上記ｒｈＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性なムテインが、グリコシル化されていない、項目６８に記載の組成物。
・（項目７０）
上記ムテインが、ｈＩＦＮ−βｓｅｒ１７である、項目６９に記載の組成物。
・（項目７１）
上記緩衝液が、約５ｍＭの濃度で存在し、上記ｐＨが約４．０であり、そして、上記イオン強度が、約２０ｍＭを超えない、項目６８に記載の組成物。
・（項目７２）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目６８に記載の組成物。
・（項目７３）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目６８に記載の組成物。
・（項目７４）
体積あたりの重量で約９％のトレハロースをさらに含む、項目６８に記載の組成物。
・（項目７５）
安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物であって、当該組成物は以下：
低イオン強度処方物中に可溶化された、実質的に単量体のヒトインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性なムテイン、
を含み、ここで、当該低イオン強度処方物は緩衝液としてコハク酸ナトリウムを含む溶液であり、当該緩衝液は、約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在し、当該組成物は、約４．５〜約５．０のｐＨを有し、そして、当該処方物は、約４０ｍＭを越えないイオン強度を有する、組成物。
・（項目７６）
上記ｒｈＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性なムテインが、グリコシル化されていない、項目７５に記載の組成物。
・（項目７７）
上記ムテインが、ｈＩＦＮ−βｓｅｒ１７である、項目７６に記載の組成物。
・（項目７８）
上記緩衝液が、約５ｍＭの濃度で存在し、上記ｐＨが約５．０であり、そして、上記イオン強度が、約２０ｍＭを超えない、項目７５に記載の組成物。
・（項目７９）
上記組成物は液体形態または乾燥形態であり、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、項目７５に記載の組成物。
・（項目８０）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目７５に記載の組成物。
・（項目８１）
体積あたりの重量で約９％のトレハロースをさらに含む、項目７５に記載の組成物。
・（項目８２）
ヒト血清アルブミンの非存在下で、薬学的組成物中のインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性な改変体の溶解度を増加させる方法であって、当該方法は、当該組成物を低イオン強度処方物で調製する工程および当該ＩＦＮ−βまたはその生物
学的に活性な改変体を、当該組成物に組込む工程、を包含する方法であって、ここで、当該低イオン強度処方物は、特定のｐＨの±０．５単位の範囲内に当該組成物のｐＨを維持するのに十分な量の緩衝液を含む溶液であり、当該特定のｐＨは、約３．０〜約５．０であり、当該処方物は、約６０ｍＭを越えないイオン強度を有する、方法。
・（項目８３）
上記緩衝液が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、項目８２に記載の方法。
・（項目８４）
上記緩衝液が、約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在する、項目８３に記載の方法。
・（項目８５）
上記特定のｐＨが約３．０であり、かつ、上記緩衝液がグリシンである、項目８４に記載の方法。
・（項目８６）
上記特定のｐＨが約４．０であり、かつ、上記緩衝液がアスパラギン酸である、項目８４に記載の方法。
・（項目８７）
上記特定のｐＨが約５．０であり、かつ、上記緩衝液がコハク酸ナトリウムである、項目８４に記載の方法。
・（項目８８）
上記組成物がさらに、当該組成物を等張性にするのに十分な量の非イオン性等張剤を含み、ここで、当該非イオン性等張剤がトレハロースである、項目８２に記載の方法。
・（項目８９）
上記組成物の乾燥形態を調製する工程をさらに包含する、項目８２に記載の方法であって、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、方法。
・（項目９０）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、項目８２に記載の方法。
・（項目９１）
項目８２の方法に従って生成された薬学的組成物。
・（項目９２）
ＨＳＡ非含有薬学的組成物を調製する方法であって、当該組成物は、実質的に単量体のインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を含み、当該方法は、当該組成物を低イオン強度処方物で調製する工程、および、当該ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体を、当該組成物に組込む工程を包含する、方法であって、ここで、当該低イオン強度処方物は、特定のｐＨの±０．５単位内に当該組成物のｐＨを維持するのに十分な量の緩衝液を含む溶液であり、ここで、当該特定のｐＨは、約３．０〜約５．０であり、当該処方物は、約６０ｍＭを越えないイオン強度を有する、方法。
・（項目９３）
上記緩衝液が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、項目９２に記載の方法。
・（項目９４）
上記緩衝液が、約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在する、項目９３に記載の方法。
・（項目９５）
上記特定のｐＨが約３．０であり、かつ、上記緩衝液がグリシンである、項目９４に記載の方法。
・（項目９６）
上記特定のｐＨが約４．０であり、かつ、上記緩衝液がアスパラギン酸である、項目９４に記載の方法。
・（項目９７）
上記特定のｐＨが約５．０であり、かつ、上記緩衝液がコハク酸ナトリウムである、項
目９４に記載の方法。
・（項目９８）
上記組成物がさらに、当該組成物を等張性にするのに十分な量の非イオン性等張剤を含み、ここで、当該非イオン性等張剤がトレハロースである、項目９２に記載の方法。
・（項目９９）
上記組成物の乾燥形態を調製する工程さらに包含する、項目９２に記載の方法であって、ここで、当該乾燥形態が、凍結乾燥形態、風乾形態および噴霧乾燥形態からなる群から選択される、方法。
・（項目１００）
上記組成物が、肺吸入によって被験体に送達されるのに適切な、水溶液もしくは非水溶液、水溶性懸濁液もしくは非水溶性懸濁液、または、乾燥粉末形態である、請求９２に記載の方法。
・（項目１０１）
項目９２の方法に従って生成された薬学的組成物。
・（項目１０２）
インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を用いた治療に反応性の疾患の診断、予防または処置のための処方物であって、当該処方物が、項目１、３６、６１、６８または７５に記載の薬学的組成物を含む、処方物。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、塩化ナトリウム溶液中のＩＦＮ−β−１ｂの溶解度を示す。
【図２】図２は、低イオン強度処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの溶解度を示す。
【図３】図３は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態におけるｐＨ３．０の効果を示す。
【図４】図４は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態におけるｐＨ４．０の効果を示す。
【図５】図５は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態におけるｐＨ５．０の効果を示す。
【図６】図６は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態におけるイオン強度（０ｍＭ  ＮａＣｌ）の効果を示す。
【図７】図７は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態におけるイオン強度（５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の効果を示す。
【図８】図８は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態におけるイオン強度（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の効果を示す。
【図９】図９は、５ｍＭ  グリシン緩衝剤のみを含有するｐＨ３．０の処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態を示す。
【図１０】図１０は、図９に示す処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態における非イオン性等張剤（９％  スクロース）の効果を示す。
【図１１】図１１は、図９に示す処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態における非イオン性等張剤（９％  トレハロース）の効果を示す。
【図１２】図１２は、４０℃で８週間の保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する、凍結乾燥された処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ分光度により測定された。
【図１３】図１３は、４０℃で８週間の保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する凍結乾燥された処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの主要ピ−クのパーセントを示す。主要ピークのパーセントは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により測定された。
【図１４】図１４は、５℃または３０℃で９ヶ月の保存後の、９％トレハロースを含有する凍結乾燥された処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ分光法により測定された。
【図１５】図１５は、５℃または３０℃で９ヶ月の保存後の、９％トレハロースを含有する凍結乾燥された処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの主要ピ−クのパーセントを示す。主要ピークのパーセントは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により測定された。
【図１６】図１６は、３０℃で９週間の保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する液体処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ吸光度により測定された。
【図１７】図１７は、３０℃で８週間の保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する液体処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの主要ピークのパーセントを示す。主要ピークのパーセントは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により測定された。
【図１８】図１８は、５℃でバイアル中に９ヶ月保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する液体処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ分光法により測定された。
【図１９】図１９は、５℃でバイアル中に９ヶ月保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する液体処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの主要ピークのパーセントを示す。主要ピークのパーセントは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により測定された。
【図２０】図２０は、３０℃で９週間の保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する液体処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ分光法により測定された。
【図２１】図２１は、４０℃で８週間の保存後の、９％トレハロースまたは９％スクロースを含有する凍結乾燥された液体処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ分光法により測定された。
【図２２】図２２は、５℃で６ヶ月保存した、５％のマンニトールを含有する液体処方物中の初期ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のパーセントを示す。濃度は、ＵＶ分光法により測定された。
【図２３】図２３は、５℃で６ヶ月保存した、５％のマンニトールを含有する液体処方物中のＩＦＮ−β−１ｂの主要ピークのパーセントを示す。主要ピークのパーセントは、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）を含有する安定化された医薬組成物およびそれらを調製するための方法に関する。これらの組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の不存在下で調製され、従ってこの医薬賦形剤を含まない。本明細書中においては、そのような組成物は、「ＨＳＡ非含有」ＩＦＮ−β医薬組成物という。本組成物は、低イオン強度処方物中に可溶化される、実質的に単量体のＩＦＮ−βを含有する。「低イオン強度」処方物とは、医薬組成物のｐＨを特定のｐＨの±０．５単位の範囲内に維持するために十分な量で緩衝液を含有し、そして約６０ｍＭ以下のイオン強度を有する溶液を意味する。「イオン強度」とは、溶液に適用されるような標準の化学的定義を意味し、ここで、溶液のイオン強度は１／２Σｃｉｚｉ２（ここでｃは濃度であり、そしてｚは電荷である）に相当する。緩衝液は、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ〜約２５ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、さらにより好ましくは約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、よりさらに好ましくは約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で、低イオン強度処方物中に存在する。従って、いくつかの実施形態において、低イオン強度処方物は、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、約２ｍＭ〜約７ｍＭ，約２ｍＭ〜約５ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭの濃度で緩衝液を含有する。ＩＦＮ−βが可溶化される低イオン強度処方物を調製するために使用され得る適切な緩衝液として、グリシン、アスパラギン酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、グルタミン酸、ヒスチジン、イミダゾール、およびリン酸塩、好ましくは、グリシン、アスパラギン酸およびコハク酸ナトリウム、より好ましくはグリシンおよびアスパラギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、低イオン強度処方物は、約６０ｍＭ以下、より好ましくは約４０ｍＭ以下、さらにより好ましくは約２０ｍＭ以下のイオン強度を保有する。いくつかの実施形態において、処方物のイオン強度は緩衝液の濃度によってのみ決定され、従って処方物は、そのイオン強度に寄与する、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、アンモニウム塩などのような、さらなるイオン種を有しない。
【００１３】
約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で緩衝液を含む溶液である、低イオン強度処方物の使用は、使用される特定の緩衝液に依存して、約３．０〜約５．０、好ましくは約３．０〜約４．５、より好ましくは約３．０〜約４．０、さらにより好ましくは約３．５〜約４．０、最も好ましくは約４．０のｐＨを有する、安定化された
ＩＦＮ−β医薬組成物の調製を提供する。従って、緩衝液がグリシンである場合、組成物のｐＨは、約３．０〜約３．５、好ましくは約３．０である。緩衝液がアスパラギン酸である場合、組成物のｐＨは、約３．５〜約４．５、好ましくは約４．０である。緩衝液がコハク酸ナトリウムである場合、組成物のｐＨは、約４．５〜約５．０、好ましくは約５．０である。
【００１４】
本発明のＩＦＮ−β医薬組成物のｐＨを約ｐＨ３．０〜約ｐＨ５．０の範囲内に維持することにより、これらの組成物中のＩＦＮ−βの溶解度を、ヒト血清アルブミンを使用しない場合に一般に起こり得るよりも、増加させることが可能となる。さらに、本明細書にて定義されるような低イオン強度処方物に、ＩＦＮ−βを取り込むことにより、実質的に単量体のＩＦＮ−βを含有する医薬組成物を調製することが可能となる。「実質的に単量体の」とは、組成物中に存在するＩＦＮ−βの大部分（重量で）が、凝集形態よりむしろ単量体形態であることを意味する。「凝集」とは、溶解したままであり得るか、もしくは溶液から沈殿し得る多量体（ダイマー、トリマーなど）の形成を生じる、ポリペプチド分子間の物理的相互作用を意味する。ＩＦＮ−βポリペプチドの単量体形態は溶解したままであり、そしてそれ故に、低イオン強度処方物または本発明の医薬組成物中において「可溶化」されると言われる。本発明のＨＳＡ非含有組成物中の単量体の形態でのＩＦＮ−βのパーセント（重量で）は８０％以上で変動し得る。従って、本発明は、凝集化形態と対比して、少なくとも約８０％の単量体形態のＩＦＮ−β、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上の単量体形態のＩＦＮ−βを含有する、ＨＳＡ非含有のＩＦＮ−β医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態において、ＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β医薬組成物は、組成物を体液と等張とするために十分な量の非イオン性等張剤をさらに含有する。その組成物は、当業者に一般的に公知の多数の非イオン性等張改変剤（ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ  ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いて等張にされ得る。これらは、代表的には、様々な分類（例えば、ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）の炭水化物である。グルコース、マンノース、アラビノースおよびリボースのようなアルドースとして分類される単糖類、ならびにフルクトース、ソルボース、およびキシルロースのようなケトースとして分類される単糖類が、本発明において非イオン性等張剤として使用され得る。スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースのような二糖類もまた使用され得る。さらに、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールのようなアルジトール（非環式のポリヒドロキシアルコール）は、本発明において有用な非イオン性等張剤である。最も好ましい非イオン性等張剤は、トレハロース、スクロース、およびマンニトール、またはそれらの組み合わせである。この非イオン性等張剤は、処方物を体液と等張とするために十分な量で添加される。ＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β医薬組成物に取り込まれる場合、非イオン性等張剤は、使用される薬剤に依存して、約１％〜約１０％の濃度で存在する。従って、１つの実施形態では、非イオン性等張剤は、体積当たりの重量で約８％〜約１０％、好ましくは約９％濃度のトレハロースまたはスクロースであり、好ましくはこの濃度のトレハロースである。別の実施形態において、非イオン性等張剤は、体積あたりの重量で約４％〜約６％、好ましくは約５％の濃度のマンニトールである。他の実施形態において、非イオン性等張剤は、トレハロースおよびマンニトールの組み合わせ、またはスクロースおよびマンニトールの組み合わせ（ここでトレハロースおよびスクロースは、体積当たりの重量で約１％の濃度で存在し、マンニトールは、体積当たりの重量で約３％〜約５％、好ましくは体積あたりの重量で約４．６％の濃度で存在する）である。
【００１６】
本発明のＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β医薬組成物は、液体組成物およびその乾燥した形態を
包含する。本発明の目的のために、医薬組成物または処方物に関する用語「液体」は、用語「水性」を含むことが意味され、凍結されている液体処方物を含む。「乾燥した形態」とは、フリーズドライ（すなわち、凍結乾燥；例えば、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｏｌｌｉ（１９８４）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３８：４８−５９を参照のこと）、噴霧乾燥（Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９１）、Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第５版；Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ、Ｅｓｓｅｚ、Ｕ．Ｋ．）、４９１−６７６頁；Ｂｒｏａｄｈｅａｄら（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．１８：１１６９−１２０６；およびＭｕｍｅｎｔｈａｌｅｒら（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１２−２０を参照のこと）、あるいは風乾（ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＣｒｏｗｅ（１９８８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５：４５９−４７０；およびＲｏｓｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４：４７−５３）のいずれかによって乾燥されている、液体医薬組成物または処方物を意味する。ＩＦＮ−β医薬処方物に関する用語「凍結乾燥する」は、複数のバイアル（それぞれはその中に本発明のインターフェロン処方物の単位用量を含む）の減圧下での急速な凍結乾燥をいうことを意味する。上記の凍結乾燥を実施する凍結乾燥器は市販され、当業者によって容易に操作可能である。本発明の１つの実施形態において、液体組成物は、乾燥凍結された組成物として調製される。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、本発明のＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β医薬組成物は、肺送達、ならびに肺吸入を介して調製物を被験体に投与するために適した形態で調製され得る。「肺吸入」とは、被験体が口腔を介して吸入するにつれて、医薬組成物が、送達デバイスから被験体の口腔へエアロゾルまたは、他の適切な調製物中で組成物を送達することにより、肺へ直接投与されることを意味する。「エアロゾル」とは、気流（ｆｌｏｗｉｎｇ
ａｉｒ）または他の生理学的に許容可能なガス流中の固体粒子または液体粒子の懸濁液を意味する。タンパク質組成物を含有する粒子が、以下に規定されるような、医薬組成物の乾燥粉末形態について記載されるものに一致するサイズ範囲で送達される限り、他の適切な調製物として、霧、蒸気、または噴霧調製物が挙げられるが、これらに限定されない。肺吸入はまた、当業者に公知の他の適切な方法により達成され得る。これらは、適切なデバイス、または他のこのような方法を使用する液体点滴注入法を含み得る。肺吸入は、被験体の肺の肺胞中に、吸入されたタンパク質組成物の沈降を生じる。一度沈降すると、タンパク質は、肺胞上皮層および毛細血管上皮層を横断し、続く全身分配のための血流へ、受動的または能動的に吸収され得る。
【００１８】
ＩＦＮ−βのようなポリペプチドまたはタンパク質の肺投与は、吸入の間、送達デバイスから被験体の口腔への生物学的活性物質の分配を要求する。本発明の目的のため、ＩＦＮ−βまたはその改変体を含有するＨＳＡ非含有医薬組成物は、使用される送達デバイスに依存して、医薬組成物の水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液形態、または固体もしくは乾燥粉末形態から得られる、エアロゾルまたは他の適切な調製物の吸入を介して、投与される。そのような送達デバイスは、当該分野において周知であり、これらとしては、噴霧器、定量吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ−ｄｏｓｅ  ｉｎｈａｌｅｒ）、および乾燥粉末吸入器、または水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液として、または固体もしくは乾燥粉末形態として医薬組成物の分配を可能にする任意の他の適切な送達機構が挙げられるが、これらに限定されない。肺送達に適した医薬組成物の文脈で使用される場合、これらの用語は、次の意図される意味を有する。「水性」とは、混合物中において水が優先物質である混合物を含む、水を用いて調製される組成物、水を含有する組成物、または水中に溶解した組成物を意味する。優先物質は、混合物の他の物質よりも多くの量で存在する。「非水性」とは、水以外の物質または、混合物中において水が優先物質でない混合物を用いて調製されるか、それらを含有するか、あるいはそれらの中に溶解した、組成物を意味する。「溶液」とは、固体、液体、気体、またはそれらの相互の組み合わせであり得る、２種以上の物質の均一な調製物を意味する。「懸濁液」とは、１つ以上の不溶性物質が、
別の優先物質中に均一に分散されるような、物質の混合物を意味する。
【００１９】
本発明の目的として、用語「固体」および「乾燥粉末」は、肺送達に適するＨＳＡ非含有医薬組成物に関して、交換可能に使用される。医薬組成物の「固体」または「乾燥粉末」形態とは、約１０重量％を下回る、一般的に約５重量％を下回る、および好ましくは約３重量％を下回る含水率を有する、細かく粉砕された粉末に乾燥される組成物を意味する。この乾燥粉末形態の組成物は、ＩＦＮ−βまたはその改変体を含有する粒子からなる。好ましい粒子サイズは、約１０．０μｍ平均直径より小さく、より好ましくは約７．０μｍ平均直径より小さく、さらにより好ましくは約６．０μｍ平均直径、さらにより好ましくは０．１〜５．０μｍ平均直径の範囲で、最も好ましくは約１．０〜約５．０μｍ平均直径の範囲内である。
【００２０】
従って、肺送達が意図されるＩＦＮ−βまたはその改変体を含有するＨＳＡ非有含液体医薬組成物は、送達デバイス内で液体溶液または懸濁液として使用され得るか、あるいは当該分野で周知の凍結乾燥または噴霧乾燥技術を使用して乾燥粉末形態に最初に加工され得るかのいずれかである。液体溶液または懸濁液が送達デバイスで使用される場合、噴霧器、定量吸入器、または他の適切な送達デバイスは、単一用量または多数の分割用量で、肺吸入によって、乾燥粉末形態について上記で述べたのと同じ粒子サイズ範囲を有する小滴として、医薬的に有効な量の組成物を被験体の肺に送達する。「医薬的に有効な量」とはＩＦＮ−βに対して応答性の疾患または状態の処置、予防、または診断において有用である量を意味する。組成物の液体溶液または懸濁液は、それらが、本発明のＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β組成物の識別できる特性を損わない限り、当業者に公知の生理学的に適切な安定化剤、賦形剤、粘度調整剤、充填剤、界面活性剤、またはそれらの組み合わせと共に使用され得る。
【００２１】
液体医薬処方物が、肺送達での使用前に凍結乾燥される場合、凍結乾燥された組成物は、上記に述べた所望のサイズ範囲内の粒子からなる、細かく粉砕された乾燥粉末を得るために、製粉される。液体医薬組成物の乾燥粉末形態を得るために、噴霧乾燥が使用される場合、このプロセスは、上記に述べた所望のサイズ範囲内の粒子からなる、実質的に無定形の細かく粉砕された乾燥粉末を生じる条件下で行なわれる。同様に、開始医薬組成物がすでに凍結乾燥された形態である場合、組成物は、肺吸入に適したエアロゾルまたは他の調製物として、続く調製のための乾燥粉末形態を得るために製粉され得る。開始医薬組成物が噴霧乾燥形態である場合、組成物は、すでに、肺投与に従って、水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液または乾燥粉末形態として分配するための適切な粒子サイズを有する乾燥粉末形態であるように、好ましくは調製されている。医薬組成物の乾燥粉末形態を調製する方法については、例えばＷＯ９６／３２１４９、ＷＯ９７／４１８３３、ＷＯ９８／２９０９６、および米国特許第５，９７６，５７４号、同第５，９８５，２４８号、および同第６，００１，３３６号を参照のこと（本明細書中に参考として援用される）。
【００２２】
次いで、得られた乾燥粉末形態の組成物は、適切な送達デバイス内に配置され、続いて、肺吸入を介して被検体に送達されるエアロゾルまたは他の適切な調製物に調製される。この乾燥粉末形態の薬学的組成物は、水性または非水性の溶液または懸濁液として調製および調剤され、用量が計量される吸入器、または他の適切な送達デバイスが用いられる。薬学的有効量の乾燥粉末形態の組成物が、エアロゾルまたは肺吸入に適する他の調製物として投与される。この送達デバイス内に配置された乾燥粉末形態の組成物の量は、被検体への吸入による薬学的有効量の組成物の送達を可能にするのに十分である。従って、この送達デバイスに配置される乾燥粉末形態の量は、乾燥粉末形態の組成物の貯蔵および送達の間の、このデバイスへの可能性の有る損失を補う。送達デバイス内でのこの乾燥粉末形態の配置の後で、上記の適切な大きさの粒子が、エアロゾルの推進剤中に懸濁される。次いで、加圧された非水性懸濁液が、吸入の間に、この送達デバイスから被検体の気道へと
放出される。この送達デバイスは、肺吸入によって、単回または複数回の細分された投与で、被検体の肺に薬学的有効量の組成物を送達する。エアロゾル推進剤は、本発明の目的に用いられる任意の慣用の物質（例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロ−フルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロメタン、ジクロロジフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラ−フルオロエタン、またはこれらの組み合わせを含む））であり得る。エアロゾルが分配されている送達デバイスの壁へのタンパク質含有乾燥粉末の粘着を低減するために、界面活性剤がこの薬学的組成物に添加され得る。この意図される使用に適する界面活性剤としては、ソルビタン三オレイン酸、大豆レシチン、およびオレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。非水性懸濁液としての乾燥粉末形態のタンパク質含有組成物の肺送達に適するデバイスは、市販されている。そのようなデバイスの例としては、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ用量計量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）およびＩｎｔａｌ吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ，Ｃｏｒｐ.、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）が挙げ
られる。米国特許第５，５２２，３７８号、同第５，７７５，３２０号、同第５，９３４，２７２号、および同第５，９６０，７９２号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるエアロゾル送達デバイスもまた参照のこと。
【００２３】
固体形態または粉末形態のＨＳＡ非含有ＩＦＮ−βの薬学的組成物が、乾燥粉末形態で送達される場合、好ましくは、乾燥粉末吸入器または他の適切な送達デバイスが用いられる。好ましくは、乾燥粉末形態の薬学的組成物は、慣用的な様式で、流れる空気または他の生理学的に受容可能な気体の流れの中への分配による乾燥粉末エアロゾルとして調製される。本明細書中の方法に従う使用に適する市販の乾燥粉末吸入器の例としては、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＶｅｎｔｏｌｉｎ  Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（Ｇｌａｘｏ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）が挙げられる。ＷＯ  ９３／００９５１、ＷＯ  ９６／０９０８５、ＷＯ  ９６／３２１５２、および米国特許第５，４５８，１３５号、同第５，７８５，０４９号、および同第５，９９３，７８３号（本明細書中に参考として援用される）に記載される乾燥粉末送達デバイスもまた参照のこと。
【００２４】
ＩＦＮ−βまたは生物学的に活性なその改変体を含みＨＳＡ非含有乾燥粉末形態の薬学的組成物が、水溶液にもどされ得、続いて、噴霧器、用量計量吸入器、または他の適切な送達デバイスを用いて、水溶液エアロゾルとして送達される。噴霧器の場合、流体レザバ内に保持される水溶液が、水性スプレーへと変換され、任意の所定の時間での被検体への送達について、そのほんの一部のみがその噴霧器に残存する。残ったスプレーの残水は、この噴霧器の流体レザバ内に戻り、ここでそれは、再び水性スプレーへとエアロゾル化する。このプロセスは、この流体レザバが完全に分配されるか、またはこのエアロゾル化スプレーが終了するまで繰り返される。そのような噴霧器は、市販されており、そして例えば、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、ＣＯ）が挙げられる。ＷＯ  ９３／００９５１に記載される噴霧器および米国特許第５，５４４，６４６号に記載されるエアロゾル化水性処方物を送達するためのデバイス（これらは本明細書中に参考として援用される）も参照のこと。
【００２５】
本発明のＨＳＡ非含有ＩＦＮ−βの薬学的組成物は、「安定化」組成物である。「安定化されること」により、これらの組成物が、貯蔵の間、ＩＮＦ−βポリペプチドが実質的にモノマー形態で維持されることが意図され、従って、このポリペプチドの治療有効性が、凝集形成に起因して損なわれることはない。「貯蔵の間」により、一旦調製された液体の薬学的組成物または処方物が、直ぐには被験体に投与されないことが意図される。むし
ろ、調製後にそれは、液体形態、凍結形態、後で液体状態にもどすかまたは被験体への投与に適する他の形態への再構築のための乾燥形態で、貯蔵のためにパッケージングされる。この安定性は、安定化剤および可溶化剤としてＨＳＡを使用せずに達成される。好ましくは、本発明の組成物は、液体形態での貯蔵安定性、再構築を伴わない投与の容易さ、および予め充填された既時使用のシリンジ中の処方物を供給するか、またはその処方物が細菌発育阻止剤と適合する場合、複数回投与調製物として供給する能力を有する簡便さを最大限利用するように、直接それらの液体形態で貯蔵される。本発明の安定化された、ＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β組成物は、２〜８℃で貯蔵される場合、少なくとも約６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、より好ましくは少なくとも２０ヶ月、なおより好ましくは約２２ヶ月、最も好ましくは少なくとも約２４ヶ月の貯蔵寿命を有する。
【００２６】
本発明のＨＳＡ非含有ＩＦＮ−βの薬学的組成物の安定性をモニターする方法は、当該分野において利用可能であり、本明細書中に開示される実施例に記載される方法を含む。従って、本発明の液体の薬学的組成物の貯蔵の間のＩＦＮ−β凝集体形成は、溶液中の可溶性ＩＦＮ−βの変化を経時的に測定することによって、容易に測定され得る。溶液中の可溶性ポリペプチドの量は、ＩＦＮ−βの検出に適合する多数の分析的アッセイによって定量され得る。そのようなアッセイとしては、例えば、以下の実施例に記載されるような逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣおよびＵＶ吸収分光法が挙げられる。液体処方物中での貯蔵の間の可溶性凝集体および不溶性凝集体の両方の定量は、例えば、可溶性凝集体として存在する可溶性ポリペプチドの部分と、凝集せずに生物学的に活性な分子の形態で存在する部分との間を区別するための、以下の実施例に示されるような分析的超遠心を用いて達成され得る。
【００２７】
本発明の安定化された薬学的組成物は、ＩＦＮ−βおよびその改変体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ＩＦＮ−β」とは、ＩＦＮ−βまたはその改変体をいい、しばしば、ＩＦＮ−β様ポリペプチドとして示される。天然に存在し得る（例えば、ＩＦＮ−βの遺伝子座に生じる対立遺伝子改変体）か、または組換え産生され得るヒトＩＦＮ−β改変体は、ネイティブの成熟ＩＦＮ−β配列と同じであるか、類似するか、または実質的に類似するアミノ酸配列を有する。ＩＦＮ−βのフラグメントまたはＩＦＮ−βの活性を保持するＩＦＮ−βの短縮された形態もまた包含される。ＩＦＮ−βの生物学的に活性なフラグメントまたは短縮された形態は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、全長ＩＦＮ−βアミノ酸配列からアミノ酸残基を除去することによって作製される。ＩＦＮ−βポリペプチドは、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよい。なぜなら、グリコシル化されているＩＦＮ−βおよびグリコシル化されていないＩＦＮ−βの両方が定性的に類似する特異的活性を示し、従って、グリコシル部分が、ＩＦＮ−βの生物学的活性に関連せず、そして寄与しないことが文献に報告されているからである。
【００２８】
本明細書中に包含されるＩＦＮ−β改変体は、ネイティブな成熟ＩＦＮ−β配列のムテインを含む。ここで、生物学的活性に必須でない１つ以上のシステイン残基は、分子間架橋または不正確な分子間ジスルフィド結合形成のいずれかに関する部位を除去するように、故意に欠失しているか、または他のアミノ酸と置換されている。この型のＩＦＮ−β改変体としては、ネイティブな成熟アミノ酸配列のアミノ酸１７で見出されるシステイント置換されている、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、トレオニン、またはメチオニンを含む改変体が挙げられる。システインに対するセリンおよびトレオニンの化学的類似に起因して、これらは、より好ましい置換である。セリン置換が、最も好ましい。１つの実施形態において、ネイティブの成熟配列のアミノ酸１７に見出されるシステインが、セリンで置換されている。システイン１７はまた、当該分野において公知の方法（例えば、米国特許第４，５８８，５８４号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）を
用いて欠失されて、ネイティブの成熟ＩＦＮ−βよりも１アミノ酸短い成熟ＩＦＮ−βムテインを生じ得る。例えば、米国特許第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；および同第４，５８８，５８５号も参照のこと。従って、例えば、それらの治療的有用性を改善する１以上の変異を有するＩＦＮ−β改変体もまた、本発明により、包含される。
【００２９】
当業者は、ＩＦＮ−βをコードするヌクレオチド配列への変異により、そしてこの変異にＩＦＮ−βアミノ酸配列の変化を誘導することにより、このインターフェロンの生物学的活性を変化することなく、さらなる変化が導入され得ることを理解する。従って、ネイティブな成熟ＩＦＮ−βのアミノ酸配列と異なる配列を有するＩＦＮ−β改変体をコードする単離された核酸分子は、１以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失がコードされるＩＦＮ−β内に導入されるように、本明細書中に開示される対応するヌクレオチド配列中に１以上のアミノ酸ヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入することによって作製され得る。変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって導入され得る。そのようなＩＦＮ−β改変体もまた、本発明により包含される。
【００３０】
例えば、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の予測される、好ましくは本質的でないアミノ酸残基でなされ得る。「本質的でない」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変化することなく野生型配列のＩＦＮ−βから変化され得る残基であり、一方で、「本質的な」アミノ酸残基とは、生物学的活性に必要とされる残基である。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、１アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。そのような置換は、保存されたアミノ酸残基についても、保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基についてもなされない。
【００３１】
あるいは、改変体ＩＦＮ−βヌクレオチド配列は、ＩＦＮ−βコード配列の全てまたはその一部にそって不規則に変異を導入することによって（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）作製され得、得られた変異体は、活性を保持する変異体を同定するためにＩＦＮ−βの生物学的活性についてスクリーニングされ得る。変異誘発の後で、コードされるタンパク質が、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性が、本明細書中に記載される標準的なアッセイ技術を用いて決定され得る。
【００３２】
ＩＦＮ−βの生物学的に活性な改変体は、ネイティブの成熟ＩＦＮ−βのアミノ酸配列（比較の基礎としての役割を果たす）に対して、一般的に、少なくとも８０％、より好ましくは約９０％〜約９５％以上、そして最も好ましくは約９６％〜約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。改変体の特定の連続するアミノ酸配列のセグメントが整列され、そして参照の分子のアミノ酸配列と比較される場合に参照としての役割を果たす場合に、「配列同一性」によって、同じアミノ酸残基が改変体ポリペプチド、およびポリペプチド分子内に見出される。
【００３３】
配列同一性決定の目的のための２つの配列の最適なアラインメントの目的のために、この改変体のアミノ酸配列の連続セグメントは、参照分子のアミノ酸配列に対して付加され
たアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較のために用いられる連続セグメントは、少なくとも２０の連続するアミノ酸残基を含む。ギャップの包含に関連する、改変体のアミノ酸配列における増加する配列同一性のための修正は、ギャップペナルティーを割り当てることによってなされ得る。配列アラインメントの方法は、当該分野において周知である。
【００３４】
従って、任意の２つの配列間でのパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの１つの好ましい非限定の例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４．１１−７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（これは、ＧＣＧアラインメントソフトウェアパッケージの一部である）において使用される。Ａ  ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティーは、アミノ酸配列を比較する場合の、ＡＬＩＧＮプログラムに用いられ得る。２つの配列の比較に用いるための数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定の例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：５８７３−５８７７のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７で修正される）である。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴアミノ酸配列検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワードレングス（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝３）を用いて実施されて、目的のポリペプチドに類似するアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップの挿入されたアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴ（ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように使用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが用いられて、分子間の離れた関係を検出する統合された検索が実施され得る。Ａｌｔｓｃｈｌら（１９９７）（前出）を参照のこと。ＢＬＡＳＴプログラム、ギャップドＢＬＡＳＴプログラムまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、デフォルトパラメーターが用いられ得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。ＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより入手可能）におけるプログラム（例えば、ＧＡＰプログラム（このプログラムのデフォルトパラメーターが使用される））もまた参照のこと。
【００３５】
アミノ酸配列同一性のパーセンテージを考慮する場合、いくつかのアミノ酸残基位置は、タンパク質機能の特性に影響しない保存的アミノ酸置換の結果として、異なり得る。これらの例において、配列同一性パーセントは、保存的に置換されたアミノ酸の類似性を説明するように上方に調整され得る。そのような調整は、当該分野において周知である。例えば、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００３６】
本発明により包含される生物学的に活性なＩＦＮ−β改変体はまた、例えば、ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）またはアルブミンと共有結合しているＩＦＮ−βポリペプチドを含む。これらの共有結合ハイブリッドＩＦＮ−β分子は、特定の所望の薬学的特性（例えば、患者に投与された後の血清の延長された半減期）を保有する。ＰＥＧ−ＩＦＮ付加
物を作製するための方法は、ＩＦＮ−βと反応する活性化化合物を作製するためのモノメトキシポルエチレングリコールの化学的改変を包含する。ＰＥＧ−連結ポリペプチドを作製および使用するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．９：２４９−３０４に記載される。アルブミン融合ポリペプチドを作製するための方法は、目的のポリペプチド（例えば、ＩＦＮ−β）のコード配列と、アルブミンとの融合を包含し、それらは、米国特許第５，８７６，９６９号（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００３７】
本発明により包含されるＩＦＮ−βの生物学的に活性な改変体は、ＩＦＮ−β活性（特に、ＩＦＮ−βレセプターに結合する能力）を保持するべきである。いくつかの実施形態において、このＩＦＮ−β改変体は、アミノ酸配列が図１または図２に示されるポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％以上を保持する。活性が、図１または図２に示されるポリペプチドの活性と比較して増加しているＩＦＮ−β改変体もまた包含される。ＩＦＮ−β改変体の生物学的活性は、当該分野において公知の方法により測定され得る。そのようなアッセイの例は、Ｆｅｌｌｏｕｓら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：３０８２−３０８６；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９（２）：４９０−４９６；Ｍａｒｋら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−５６６６；Ｂｒａｎｃａら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：２２１−２２３；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：５８２−５８６；Ｈｅｒｂｅｒｍａｎら、（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：２２１−２２３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１９）：１１３０１−１１３０４；および本明細書中に記載されるＩＦＮ−βの潜在能力アッセイ（実施例２を参照のこと）に見出され得る。
【００３８】
本発明のＩＦＮ−βの処方物は、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトを含むがこれらに限定されない、任意の動物種に由来し得る。好ましくは、ＩＦＮ−βは、処方物が哺乳動物ＩＦＮ−β障害の処置において使用される場合には哺乳動物種由来であり得、より好ましくは、このような障害についての処置を受ける哺乳動物と同じ種の哺乳動物由来であり得る。従って、処置を受ける哺乳動物がヒトである場合、好ましくは、被験体は、実質的にモノマーのヒトＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体を含むＨＳＡ非含有薬学的組成物を投与される。
【００３９】
本発明に包含される、ＩＦＮ−βポリペプチドおよびＩＦＮ−β改変体ポリペプチドの非制限的な例は、以下に示される：Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６〜３２０；Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８７：４１１〜４１６；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１〜７４１；Ｓｔｒｅｕｌｉら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２８４８〜２８５２；ＥＰ０２８０３３Ｂ１、およびＥＰ１０９７４８Ｂ１。また、米国特許第４，５１８，５８４号；同第４，５６９，９０８号；同第４，５８８，５８５号；同第４，７３８，８４４号；同第４，７５３，７９５号；同第４，７６９，２３３号；同第４，７９３，９９５号；同第４，９１４，０３３号；同第４，９５９，３１４号；同第５，５４５，７２３号；および同第５，８１４，４８５号を参照のこと。これらの開示は、本明細書中で参考として援用される。これらの引用はまた、生物学的活性を失わずに変更され得るＩＦＮ−βポリペプチドの残基および領域に関する手引きを提供する。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、安定化された薬学的処方物内のＩＦＮ−βは、成熟ネイティブのＩＦＮ−βポリペプチドである。別の実施形態において、これらの処方物中のＩＦＮ−βは、成熟ネイティブ配列のアミノ酸１７で見出されるシステインが上記のよ
うにセリンと置換された、成熟ＩＦＮ−βポリペプチドである。しかし、本発明は、安定化された薬学的処方物内のＩＦＮ−βが、本明細書中の他の箇所に記載されるような任意の生物学的に活性なＩＦＮ−βポリペプチドまたは改変体である、他の実施形態を包含する。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態において、ＩＦＮ−βは、組換え生成される。「組換え生成されたＩＦＮ−β」によって、成熟ネイティブＩＦＮ−βに匹敵する生物学的活性を有するＩＦＮ−β、および組換えＤＮＡ技術によって調製されたＩＦＮ−βが意図される。ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することによって生成され得る。宿主細胞は、ヌクレオチド配列を転写して所望のタンパク質を生成し得る細胞であり、そして原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）であり得る。ＩＦＮ−βの組換え生成の例は、Ｍａｎｔｅｉら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１２８；Ｏｈｎｏら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：９６７；Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６、ならびに米国特許第４，４６２，９４０号、同第５，７０２，６９９号、および同第５，８１４，４８５号に提供され、これらは本明細書中で参考として援用される。ヒトインターフェロン遺伝子は、組換えＤＮＡ（「ｒＤＮＡ」）技術を用いてクローン化されており、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現されている（Ｎａｇｏｌａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６；Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ  ２８７：４１１；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：７３１；Ｓｔｒｅｕｌｉら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２８４８）。あるいは、ＩＦＮ−βは、当該分野で公知の方法に従って、目的のＩＦＮ−βタンパク質を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物によって生成され得る。
【００４２】
ネイティブなインターフェロン−β様性質を示すタンパク質またはポリペプチドはまた、ポリ−Ａ−リッチな１２ＳメッセンジャーＲＮＡをウイルス誘導されたヒト細胞から抽出する工程、ｍＲＮＡをテンプレートとして使用して２本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、ｃＤＮＡを適切なクローニングベクター中に導入する工程、適切な微生物をこのベクターで形質転換する工程、微生物を収集する工程、およびそれからインターフェロン−βを抽出する工程による、ｒＤＮＡ技術を用いて生成され得る。例えば、欧州特許出願第２８０３３号（１９８１年５月６日公開）；同第３２１３４号（１９８１年７月１５日公開）；および同第３４３０７号（１９８１年８月２６日公開）を参照のこと（これらは、ｒＤＮＡ技術を用いるインターフェロン−βを生成するための種々の方法を記載する）。
【００４３】
あるいは、ＩＦＮ−βは、ペプチド分野の当業者に公知の任意のいくつかの技術によって、化学的に合成され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｌｉら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２２１６〜２２２０、ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、ならびにＢａｒａｎｅｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８０）Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，（編）ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８０）３〜２５４頁，固相ペプチド合成技術を考察；ならびにＢｏｄａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）ならびにＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｎｈｏｆｅｒ（編）（１９８０）Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），古典的な溶液合成を考察。ＩＦＮ−βはまた、同時に複数のペプチドを合成
する方法によって化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１〜５１３５；および米国特許第４，６３１，２１１号を参照のこと。
【００４４】
本発明の安定化されたＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β薬学的組成物の調製における使用のために組換え生成されたＩＦＮ−βは、回収され得、そして当業者に公知の任意の方法を用いて精製され得る。このような方法としては、本明細書中で参考として援用される、米国特許第４，４６２，９４０号および同第５，７０２，６９９号に開示される方法が挙げられる。これらの方法は、可溶化剤として使用されるＳＤＳの非存在下で凝集を形成する傾向がある、純粋な形態のＩＦＮ−βを回収する。さらに、これらの方法は、タンパク質の生物学的性質に不利に影響し得る高いｐＨ条件にタンパク質を曝露し、そして精製の間に、タンパク質を可溶化するために使用される残留量のＳＤＳを含む組成物を生じ得る。従って、ＩＦＮ−βは、これらの方法を用いて得られ得るが、好ましくは、以下に開示される改善された方法によって回収および精製される：２０００年１０月２７日に出願され、そして米国出願第６０／２４３，９６５号を割り当てられた「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ」という表題の同時係属中の仮出願、および２００１年４月９日に出願され、そして米国特許出願第６０／２８２，６０７号を割り当てられた「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ」という表題の同時係属中の仮出願、および本明細書と同時に出願され、そして米国出願番号＿＿を割り当てられた「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ」という表題の仮出願；これらの内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００４５】
ＩＦＮ−βについての２つの改善された精製方法および回収方法は、これらの同時係属中および同時に出願された明細書中に開示される。第１のこれらの精製方法および回収方法は、実質的に精製されたＩＦＮ−βを、脂肪族アルコールのようなアルコールで沈殿させる工程、および沈殿したＩＦＮ−βを、塩酸グアニジンに溶解する工程を包含する。次いで、得られた溶液は、適切な緩衝液で希釈されてタンパク質を再生する。第２のこれらの精製方法および回収方法は、沈殿工程を省く。この様式において、実質的に精製されたＩＦＮ−βを含むサンプルは、塩酸グアニジンと混合されて、可溶性の変性されたＩＦＮ−βを含む溶液を形成し；次いで、この溶液は、適切な緩衝液で希釈されてタンパク質を再生する。次いで、両方の方法において、復元されたＩＦＮ−βを含む溶液は、薬学的目的のために使用される緩衝液中にダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）されるか、または透析される。本発明のＨＳＡ非含有薬学的組成物を調製するために使用される場合、精製された復元ＩＦＮ−βタンパク質は、以下の実施例８に記載されるような本発明の低イオン強度の処方物にダイアフィルトレーションされるか、または透析される。
【００４６】
本発明に包含される組成物は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−β程の少なさ、および約２０．０ｍｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−β程の多さを有し得る（重量／容量）。種々の実施形態において、ＩＦＮ−βは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１５ｍｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約８．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０７５ｍｇ／ｍｌ〜約６．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１７５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．２２５ｍｇ／ｍｌ〜約０．３ｍｇ／ｍｌ、および約０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明の処方物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」によって、治療成分の保存、投与、およびまたは治癒
効果を容易にするために当該分野において従来使用されているキャリアが意図される。キャリアはまた、ＩＦＮ−βの任意の望ましくない副作用を低減し得る。適切なキャリアは、安定であるべきである（すなわち、処方物中の他の成分と作用し得ない）。処置のために用いられる投薬量および濃度では、レシピエントにおいて、有意な局所的な有害効果または全身性の有害効果は生成されるべきではない。このようなキャリアは、一般に当該分野において公知である。本発明のための適切なキャリアとしては、従来使用されている大きい安定な高分子（例えば、ゼラチン、コラーゲン、多糖類、単糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、不揮発油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）がある。緩速放出（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）キャリア（例えば、ヒアルロン酸）もまた、適切であり得る。特にＰｒｉｓｅｌｌら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕ．８５：５１〜５６、および米国特許第５，１６６，３３１号を参照のこと。
【００４８】
この薬学的組成物は、本明細書中で開示された低イオン強度の処方物を用いて得られた増強された溶解性を越えたタンパク質の可溶性に貢献する、可溶化剤または溶解性増強剤をさらに含み得る。グアニジニウム基を含む化合物（最も好ましくは、アルギニン）は、ＩＦＮ−βに対する適切な溶解性増強剤である。このような溶解性増強剤の例としては、アミノ酸アルギニン、およびＩＦＮ−βの可溶性を増強する能力を維持するアルギニンのアミノ酸アナログが挙げられる。このようなアナログとしては、アルギニンを含むジペプチドおよびトリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる適切な可溶化剤は、米国特許第４，８１６，４４０号；同第４，８９４，３３０号；同第５，００４，６０５号；同第５，１８３，７４６号；同第５，６４３，５６６号；およびＷａｎｇら（１９８０）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｓｓｏｃ．３４：４５２〜４６２（これらは、本明細書中で参考として援用される）で考察される。
【００４９】
上記で開示される薬剤に加えて、他の安定化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、またはその塩の１つ（例えば、二ナトリウムＥＤＴＡ）は、液体の薬学的組成物の安定性をさらに増強するために添加され得る。ＥＤＴＡは、多くの酸化反応を触媒することが公知である金属イオンのスカベンジャーとして作用し、従って、さらなる安定化剤を提供する。他の適切な安定化剤としては、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビトールエステル（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０））；ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７）；ポリオキシエチレンアルコール（例えば、Ｂｒｉｊ  ３５）；シメチコン；ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ４００）；リゾホスファチジルコリン；ならびにポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む）が挙げられる。界面活性剤による薬剤の標準的な安定化は、例えば、Ｌｅｖｉｎｅら（１９９１）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０〜１６５に記載され、これは本明細書中で参考として援用される。
【００５０】
本発明の薬学的に有効な量の安定な液体ＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β処方物、または本発明の薬学的に有効な量の再構成された安定な凍結乾燥されたＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β薬学的処方物が、被験体に投与される。「薬学的に有効な量」によって、疾患または状態の処置、予防、または診断において有用な量が意図される。投与の代表的な経路としては、経口投与、鼻送達（ｎａｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、肺送達、および非経口投与（経皮、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、および腹腔内の注射または注入を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。１つのこのような実施形態において、注射による投与は、好ましくは皮下注射である。本発明の注射可能な形態の組成物としては、溶液、懸濁物および乳濁物が挙げられるが、これらに限定されない。代表的に、治療有効量のＩＦＮ−βは、組
成物の約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０５μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、なおより好ましくは約０．５μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇを含む。
【００５１】
１つの実施形態において、実質的にモノマーのＩＦＮ−βを含む安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物は、単位投薬量で処方され、そして注射可能な形態または注入可能な形態（例えば、溶液、懸濁物、または乳濁物）であり得る。さらに、これは、乾燥された形態（例えば、凍結乾燥粉末）で凍結されるかまたは調製されて保存され得、これは、経口経路の投与または非経口経路の投与を含む任意の種々の方法による投与の前に、液体溶液、懸濁物、または乳濁物に再構成され得る。この安定化された薬学的組成物は、膜ろ過によって滅菌され得、そして単位投薬容器または複数回投薬（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）容器（例えば、密封されたバイアルまたはアンプル）中に保存される。当該分野において一般に公知の薬学的組成物を処方するためのさらなる方法は、本明細書中で開示される薬学的組成物の保存安定性をさらに増強するために使用され得るが、但し、これらは、本明細書中で開示されるような安定化剤の有益な効果に不利に影響しない。薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤などの処方および選択の徹底的な考察は、本明細書中で参考として援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）（１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）中に見出され得る。
【００５２】
β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）またはその改変体（例えば、ｈＩＦＮ−βｓｅｒ１７といわれるヒトＩＦＮ−β（ｈＩＦＮ−β）のムテイン）を含む本発明の薬学的組成物の有効量を含む処方物は、このポリペプチドを用いる治療に応答する、臨床学的適用の診断、予防、および処置（局所または全身）において有用である。このような臨床的適用としては、例えば、以下が挙げられる：中枢神経系（ＣＮＳ）、脳、および／または脊髄の障害または疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、レーヴィ体痴呆、多発性硬化症、癲癇、小脳性運動失調、進行性核上麻痺、筋萎縮性側索硬化症、情動障害、不安障害、強迫性障害、人格障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、ツレット症候群、テイ−サックス、ニーマン−ピック、および精神分裂病を含む）；脳血管障害（例えば、脳もしくは脊髄における発作）から、髄膜炎およびＨＩＶを含むＣＮＳ感染から、脳および脊髄の腫瘍から、またはプリオン疾患からの神経損傷；自己免疫疾患（後天性免疫不全、慢性関節リウマチ、乾癬、クローン病、シェーグレン症候群、筋萎縮性側索硬化症、および狼瘡を含む）；ならびに癌（乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌および結腸癌を含む）。ヒトまたは動物へのＩＦＮ−βまたはそのムテインの投与は、経口、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、鼻腔内で送達され得るか、あるいは医師によって適切と判断される場合、肺送達によって送達され得る。
【００５３】
本発明は、ヒト血清アルブミンの非存在下で、薬学的組成物においてインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）またはその生物学的に活性な改変体の可溶性を増加するための方法を提供する。この方法は、本明細書中の別の箇所で開示されるような低イオン強度処方物を用いて組成物を調製する工程（その結果、この組成物のｐＨは、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ５．０で維持される）、およびＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体を組成物中に組み込む工程を包含する。１つの実施形態において、低イオン強度の処方物は、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で緩衝液としてグリシン、アスパラギン酸、またはコハク酸ナトリウムを含む。この組成物は、本明細書中の別の箇所で開示される、組成物を体液と等張にするのに十分な量の非イオン性等張剤をさらに含み得る。１つの実施形態において、非イオン性等張剤は、トレハトース、スクロース、マンニトール、および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに、この組成物のｐＨを、約ｐＨ３．０とｐＨ５．０との間、好ましくはｐＨ４．０に維持することによって、ＩＦＮ−βの大部分をモノマーの状態に維持することが可能である。従って、本発明
はまた、実質的にモノマーのＩＦＮ−βを含む安定化されたＨＳＡ非含有薬学的組成物を調製するための方法を提供する。
【実施例】
【００５４】
以下の実施例は、例示の目的で与えられ、限定としてではない。
【００５５】
（実験）
本発明は、ＩＦＮ−β−１ｂの溶解特性および安定特性のより深い理解によってなされた。ＨＳＡ非含有ＩＦＮ−β−１ｂの処方物の好ましい特徴は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ５．０のｐＨ範囲、および非常に低イオン強度の条件である。このｐＨ範囲内の非常に低イオン強度条件の利用は、より高い単量体ＩＦＮ−β−１ｂ含有量およびより低い凝集ＩＦＮ−β−１ｂ種含有量を生じる。これらの条件は、処方物におけるＨＳＡの使用なしに従来では成し得なかったＩＦＮ−β−１ｂの可溶性および安定性を提供する。これらはまた、単量体ＩＦＮ−β−１ｂの最大含有量を有する処方物を提供する。
【００５６】
これらの実験における使用のためのＩＦＮ−β−１ｂは、本質的に米国特許第４，４６２，９４０号および／または同第４，８１６，４００号に記載される精製の最初のいくつかの工程において記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産される。すなわち、形質転換した細菌を使用してＩＦＮ−βを生産し；宿主細胞を濃縮し、そしてＩＦＮ−β−１ｂバルク原料を獲得するためにそれらの細胞壁を破壊した。
【００５７】
このようして獲得されたＩＦＮ−β−１ｂバルク原料は、ｐＨ５．５で５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。以下に記載される可溶性および安定性の測定のための開始原料を作製するために、＞ｐＨ１１の１．５ｍＭの水酸化ナトリウムで平衡化されたＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通してこの原料を処理することによって、ＩＦＮ−β−１ｂバルク原料からＳＤＳを除去した。Ｇ−２５カラムからのプールを回収した後、そのプールの約１／１０に等しい容量の１Ｍ  グリシン（ｐＨ３）を高速に攪拌しながら添加し、このプールを約ｐＨ３に調製した。原料を、可溶性および安定性の測定における以降の使用のために、４℃で保存するか、または凍結した。
【００５８】
（実施例１：ＩＦＮ−β−１ｂの可溶性の決定）
ＩＦＮ−β−１ｂの可溶性を理解するために、広範な種々のｐＨ、緩衝液型、およびイオン強度の条件の下で最初の実験を行った。ＩＦＮ−β−１ｂの溶液（１００ｍＭグリシン溶液（ｐＨ３．０）中の約０．８ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ−β−１ｂ）を、表１の緩衝液に対して透析した。結果を図１に示す。これらの結果は、ＩＦＮ−β−１ｂの可溶性がｐＨおよびイオン強度に依存することを示す。ｐＨ３．０でのＩＦＮ−β−１ｂは、２００ｍＭまでのあらゆる濃度の塩化ナトリウムで可溶性のままであった。ｐＨ４．０の処方物については、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭに達する場合、ＩＦＮ−β−１ｂはより低い可溶性になる。ｐＨ５．０の処方物については、ＩＦＮ−β−１ｂは、その処方物が１００ｍＭのみの塩化ナトリウムを含む場合、より低い可溶性になる。まとめると、これらのデータは、ＩＦＮ−β−１ｂはｐＨ３．０の処方物において最も可溶性であり、ｐＨ４．０の処方物においてはより低い可溶性であり、そしてｐＨ５．０では最も低い可溶性であることを示す。これらのデータはまた、処方物のイオン強度を（塩化ナトリウム濃度の増加によって）増加させることもまたＩＦＮ−β−１ｂの可溶性を低下させることを示す。
【００５９】
上記の実験はＩＦＮ−β−１ｂの可溶性について好ましい条件を決定し得たが、この実験は任意の所定の条件における可溶性の限度を定めるものではなかった。ＩＦＮ−β−１ｂの可溶性の限度を決定するために、その後の実験を行った。ＩＦＮ−β−１ｂを最大とするために、低イオン強度の処方物（すなわち、５ｍＭの緩衝液および塩化ナトリウムの
ような塩を含まない）を使用した。透析後、所定の処方物における可溶性の限度を決定するために、ＩＦＮ−β−１ｂを濃縮した。これらの実験の結果を図２に示す。ｐＨ３．０およびｐＨ４．０の処方物は、最も高い可溶性であり、少なくとも１６ｍｇ／ｍｌの可溶性を示す。ｐＨ５の処方物は、約８ｍｇ／ｍｌまで可溶性であった。ｐＨ５．０以上の処方物は、約０．２ｍｇ／ｍｌまでのみ可溶性であった。これらの結果は、ここでも、ｐＨがＩＦＮ−β−１ｂの可溶性に対して有力な効果を有することを示す。ｐＨ３．０およびおＨ４．０の低イオン強度の処方物は、ｐＨ５．０よりも高い可溶性である。ｐＨ５．０以上では、ＩＦＮ−β−１ｂは低イオン強度の処方物において本質的に不溶性である。
【００６０】
【表１】
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（実施例２：分析超遠心分離の実験）
可溶性実験は、溶液中にどのくらい多くのＩＦＮ−β−１ｂが存在するかを決定し得るが、タンパク質の凝集状態を決定するためには他の技術が必要とされる。タンパク質が所定の処方物において単量体であるかどうかを決定すること、および二量体、三量体などのようなより高次の形態で（存在する場合は）どのくらい多くのタンパク質が存在するかを決定することは、重要である。分析超遠心分離は、タンパク質の凝集状態を解明するための最も有力な技術の１つである（ＬｉｕおよびＳｈｉｒｅ（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．
Ｓｃｉ．８８：１２３７−１２４１を参照のこと）。分析超遠心分離を使用して、いくつかのＩＦＮ−β−１ｂ処方物の単量体含有量の特性を表すために、３つの実験を行った。これらの分析超遠心分離実験をそれぞれ、ＩＦＮ−β−１ｂの異なる調製物を用いて行った。この場合、各々の実験は、共通の処方物（５ｍＭ  グリシン（ｐＨ３．０））を包含した。しかし、これらの共通の処方物の各々は、バーセント単量体において微妙に変動した（図３では８９．８％；図６では９４．２％；図９では８６．３％）。これらのＩＦＮ−β−１ｂ処方物を調製するために使用された回収手順および精製手順は、ＩＦＮ−β−１ｂ分子のいくらかの凝集（これは本来、主として共有結合性）を生じる。従って、各実験について、５ｍＭ  グリシン（ｐＨ３．０）の処方物は、各実験の開始時の処方物中の凝集量のベースラインとして役立つ。
【００６１】
第１の実験は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態に対するｐＨの効果を測定した。ｐＨ３．０の処方物（溶液を緩衝化するために５ｍＭグリシンのみを含む）、ｐＨ４．０の処方物（溶液を緩衝化するために５ｍＭアスパラギン酸のみを含む）、ｐＨ５．０の処方物（溶液を緩衝化するために５ｍＭコハク酸ナトリウムのみを含む）を分析した。結果を図３、図４および図５に示す。これらのプロフィールにおける主要なピークは分子量約２０ｋＤａに対応し、これはＩＦＮ−β−１ｂの分子量（１９．８７８ｋＤａ）に非常に近い。従って、この主要なピークはＩＦＮ−β−１ｂの単量体である。より大きな種（二量体、三量体など）は、より高い沈降分離の係数に対応する。これらの結果は、ＩＦＮ−β−１ｂがｐＨ３．０およびｐＨ４．０で主として（約９０％）単量体であるが、ｐＨ５．０のこの分子は凝集を開始してより高次の種となり、そして約７５％のみが単量体であることを示す。これらの結果は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態がｐＨで変化し得ること、ならびにこのＩＦＮ−β−１ｂ単量体がｐＨ３．０およびｐＨ４．０のような低ｐＨ条件を好むことを示す。
【００６２】
第２の実験は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態に対するイオン強度の効果を調査した。処方物のイオン強度を、ｐＨ３．０の処方物（５ｍＭグリシンで緩衝化された）において、０ｍＭ、５０ｍＭおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを添加することによって増加させた。結果を図６、図７および図８に示す。塩化ナトリウムを全く添加しなかった処方物（図６）については、ＩＦＮ−β−１ｂの単量体形態は、総ＩＦＮ−β−１ｂの約９４％（すなわち、９４％のメインピーク）を含む。処方物に５０ｍＭの塩化ナトリウムを添加する場合、単量体含有量は約７６％に低下し（図７）、そして処方物中に１５０ｍＭの塩化ナトリウムを有すると、単量体は１０％未満に低下する（図８）。これらの結果は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態がイオン強度に強く影響されること、およびＩＦＮ−β−１ｂ単量体が低イオン強度条件を好むこと示す。
【００６３】
注入可能な薬学的処方物の望ましい特徴は、その処方物が体液と等張性であるべきであることである。イオン性物質（例えば、塩化ナトリウム）および非イオン性物質（例えば、糖のスクロースおよびトレハロース）を使用して、体液に等張性の処方物を作製し得る。先の分析超遠心分離実験は、等張性ではない（５ｍＭの緩衝剤のみを含む）か、またはイオン性強張力剤として塩化ナトリウムを含むかのいずれかである処方物を試験した。第３の実験は、ＩＦＮ−β−１ｂの凝集状態に対する、非イオン性の強張力化剤の効果を試験した。この実験において、ｐＨ３．０の３つの処方物（５ｍＭグリシンで緩衝化された）を調製した。１つはグリシン緩衝化剤のみを含み、２つ目を９％スクロースで強張力化し、そして３つ目を９％トレハロースで強張力化した。分析遠心分離の結果を図９、図１０および図１１に示す。緩衝剤のみを有する処方物の単量体含有量（図９）は、約８６％である。強張力化剤としてスクロース（図１０）またはトレハロース（図１１）のいずれかを添加する場合、単量体含有量は約８９％である。これらの結果は、スクロースおよびトレハロースのような非イオン性強張力化剤がＩＦＮ−β−１ｂ分子の凝集を促進しないことを示す。
【００６４】
（実施例３：加速温度条件下での凍結乾燥されたＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物の安定性）
ｐＨ３．０（緩衝剤として５ｍＭグリシン）のＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物およびｐＨ４．０（緩衝剤として５ｍＭアスパラギン酸）のＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物を、９％のトレハロース（ｐＨ３．０およびｐＨ４．０）または９％のスクロース（ｐＨ４．０）のいずれかを含んで、凍結乾燥した。次いで凍結乾燥された処方物を４０℃で保存し、そしてそれらの安定性を８週間にわたって測定した。スクロースおよびトレハロースは、凍結乾燥される処方物において使用される代表的な安定化剤である。再構築される処方物が体液に等張性であるように、９％のレベルのこれらの試薬を使用する。処方物のイオン強度を、従ってＩＦＮ−β−１ｂの凝集量を最低限にするために、緩衝剤量を最低レベルに保った。従って、全ての緩衝剤は５ｍＭの濃度であった。
【００６５】
タンパク質の薬学的生産物についての代表的な保存条件は、しばしば５℃である。しかし、加速温度条件はしばしば、特定の処方物の分解速度を増加させてより短期間の時間で信頼性のある安定性データを収集し得る、処方物の研究において使用される。この実験において、４０℃を使用してＨＳＡ非含有処方物においてＩＦＮ−β−１ｂの強制的な分解を企図した。濃度測定および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析の結果を、図１２および図１３に示す。これらの結果は、上昇した温度でさえも、これらのＩＦＮ−β−１ｂ処方物が８週間の研究に渡って検出可能な変化を全く示さないことを示す。
【００６６】
（実施例４：実時間保存条件下での、トレハロースを含む凍結乾燥されたＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物の安定性）
タンパク質医薬の代表的な保存条件は５℃であるが、生産物に室温（２５℃〜３０℃）での安定性をもたらすことが望ましい。この実験において、９％のトレハロース（５ｍＭグリシン（ｐＨ３）または５ｍＭアスパラギン酸（ｐＨ４））を含む処方物を凍結乾燥した。再構成される処方物が体液と等張性であるように、９％トレハロースの濃度を使用した。処方物を５℃および３０℃で保存し、そしてそれらの安定性を９ヶ月にわたって測定した。濃度測定および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析の結果を、図１４および図１５に示す。これらの結果は、３０℃でさえも、これらのＩＦＮ−β−１ｂ処方物が９ヶ月の研究に渡って検出可能な変化を全く示さないことを示す。
【００６７】
（実施例５：加速温度条件下での液体のＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物の安定性）
ｐＨ３．０およびｐＨ４．０でのＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物の安定性をまた、溶液状態において試験した。処方物の組成は、実施例３において概説されたものと同じ（９％のトレハロース（ｐＨ３．０およびｐＨ４．０）または９％のスクロース（ｐＨ４．０））であった。ここでもまた、処方物のイオン強度を、従ってＩＦＮ−β−１ｂの凝集量を最低限にするために、緩衝剤量を最低レベル（５ｍＭ）に保った。液体処方物を３０℃で保存し、そしてそれらの安定性を９週間に渡って測定した。液体のタンパク質処方物についての代表的な保存条件は、５℃である。従って、３０℃の保存は、ＩＦＮ−β−１ｂの分解速度を増加させるために設計される加速温度条件を示唆する。図１６（濃度測定）および図１７（逆相ＨＰＬＣ分析）に示される結果は、９週間の研究に渡って処方物において検出可能な変化が全くないこと示す。これらの結果は、これらの条件下でのこれら処方物において、ＩＦＮ−β−１ｂが研究の経過に渡って安定であることを示す。
【００６８】
（実施例６：実時間保存条件下での、液体のＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物の安定性）
この実験において、９％のトレハロース（５ｍＭグリシン（ｐＨ３）もしくは５ｍＭアスパラギン酸（ｐＨ４））を含む液体処方物、または９％のスクロース（５ｍＭグリシン
（ｐＨ３）もしくは５ｍＭアスパラギン酸（ｐＨ４））を含む液体処方物を、５℃の実時間保存条件下で試験した。処方物をバイアルに充填し、それらの安定性を９ヶ月に渡って測定した。濃度測定および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析の結果を、それぞれ図１８および図１９に示す。これらの結果は、これらの処方物においてＩＦＮ−β−１ｂが９ヶ月のこの研究の間、安定であることを示す。
【００６９】
（実施例７：トレハロースは、ＩＦＮ−β−１ｂの処方物のための非イオン性強張力化剤としてスクロースよりも好ましい）
この実験において、９％のトレハロース（５ｍＭグリシン（ｐＨ３）もしくは５ｍＭアスパラギン酸（ｐＨ４））を含む処方物、または９％のスクロース（５ｍＭグリシン（ｐＨ３）もしくは５ｍＭアスパラギン酸（ｐＨ４））を含む処方物を調製し、そして液体としてバイアルに充填し、そして同じ処方物のバイアルを凍結乾燥した。これらの安定性を、しばしば所定のタンパク質の処方物の安定性の順位の予測となる、加速温度条件下で測定した。液体処方物を３０℃で９週間保存し、そして凍結乾燥処方物を４０℃で８週間保存した。濃度測定の結果を図２０（液体）および図２１（凍結乾燥物）に示す。これらの結果は、スクロースを含むｐＨ３の処方物が濃度の明白な増加を示すことを示す。この濃度の明白な増加は、低ｐＨでのスクロースの加水分解による、還元された糖の形成に起因して、このことが処方物の非酵素性の褐色化（すなわち、メイラード反応）を生じる。トレハロースは加水分解にさらに高い耐性であり、従ってトレハロースはこれらの処方物においてスクロース以上に好ましい（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６１：６７９−６８２を参照のこと）。
【００７０】
（実施例８：グアニジン塩酸沈殿を使用する、ＳＤＳの除去およびＩＦＮ−β−１ｂの処方）
精製したＩＦＮ−β−１ｂ（０．４％ＳＤＳ、５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５中での１．９１ｍｇ／ｍｌを１Ｌ）を５℃で保存した。保存の間、いくらかのＳＤＳが沈殿する。この原料（４７７．５ｍｇ）の２５０ｍｌを、２２９ｇのグアニジン塩酸と混合し（６Ｍ、総容量４００ｍｌ）、そして電磁攪拌棒を使用して室温で１５分間攪拌した。次いで、この６Ｍグアニジン塩酸／タンパク質の溶液をＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）Ｐ  Ｃａｐｓｕｌｅ（孔径０．４５μｍ）を使用して濾過して、沈殿したＳＤＳを除去した。２８０ｎｍのＵＶによって決定したそのタンパク質濃度は、１．０２ｍｇ／ｍｌだった。このタンパク質収量は４０６ｍｇまたは８５％だった。
【００７１】
４００ｍｌのグアニジン塩酸処理した原料を、２つのＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）０．１ｃｍ２  １０ｋＤポリスルフォン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を備えるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｌａｂｓｃａｌｅ（登録商標）ＴＦＦダイアフィルトレーションシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を利用して濃縮した。濃縮工程後の容量は、濃縮後収量３８１ｍｇまたは９３％に対して、１０．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３７ｍｌだった。
【００７２】
移送ピペットを使用して、１０ｍｌ（１０３ｍｇ）の濃縮塩酸グアニジン／タンパク質の溶液を、５９０ｍｌの５ｍＭグリシン（ｐＨ３．２）溶液に徐々に添加した。この緩衝液を、電磁攪拌棒を使用して高速攪拌して；タンパク質をボルテックスに直接添加した。６Ｍ塩酸グアニジン／タンパク質の溶液の６０倍（６０×）希釈は、０．１７ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ塩酸グアニジン／タンパク質の溶液を生じた。この溶液６００ｍｌを、２つのＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＩＩ、１０ｋＤ、０．１ｍ２のポリスルフォン膜を装着した５００ｍｌ規模のダイアフィルトレーションユニットに移し換えた。この溶液を、最初にタンパク質濃度０．２３ｍｇ／ｍｌになるまで約４００ｍＬに濃縮し、それから９倍容量（３．６Ｌ）の５ｍＭグリシン（ｐＨ３．２）に対してダイアフィルトレーションした。最終タンパク質濃度０．２３ｍｇ／ｍｌに関しては、最終的なダイアフィルトレーショ
ン産物（４０２ｍｌ）を２８０ｎｍのＵＶによって測定し、ダイアフィルトレーション工程に関しては、９２．４６ｍｇまたは９０％の収量であり、そして精製プロセスに関しては、総収量７２％の可溶性タンパク質であった。
【００７３】
（実施例９：強張力剤としてマンニトールを含む、液体のＩＦＮ−β−１ｂのＨＳＡ非含有処方物の安定性）
この実験において、５ｍＭアスパラギン酸、５％マンニトールを含む液体処方物を、５℃の実時間保存条件の下で試験した。３つの別々の調製物（図中のＰｒｅｐＡ、ＰｒｅｐＢおよびＰｒｅｐＣと称される）を、ＨＡＳ非含有のＩＦＮ−β−１ｂの単一ロットから調製し、そしてバイアルに充填した。それらのバイアルを５℃で保存し、そしてその処方物の安定性を６ヶ月に渡って測定した。濃度測定および逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の分析の結果を、それぞれ図２２および図２３に示す。結果は、６ヶ月間の研究に渡って、これらのＩＦＮ−β−１ｂ処方物中には検出可能な変化が全く発生しなかったことを実証する。
【００７４】
本明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、本明細書において、各個別の刊行物または特許出願が具体的および個別に参考として援用されることが示されるのと同じ範囲に、参考として援用される。明細書の文書中の小見出しは、短にその文書の簡単な概説のために含まれ、いかなる方法によっても、その文書の内容に対して限定するようには意図されない。
【００７５】
前述の発明は、理解の明確さを目的として例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、特定の変更および改変が、本発明の範囲内で実施され得ることは、明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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