(57)【要約】【課題】応答速度が速く、高感度な無機カチオンの定量的蛍光検出法を提供する。【解決手段】粒子径が異なる２種類の量子ドットの各表面に、検出対象無機カチオン分子を選択的に認識する分子認識部位をそれぞれ結合させて２種類の無機カチオンプローブを形成する。これら２種類の無機カチオンプローブが検出対象無機カチオン分子を介して複合体を形成して２種類の量子ドットが近接すると、当該２種類の量子ドット間にフェルスター型励起エネルギー移動が生じて蛍光スペクトルの形状が変化する。このため、２種類の量子ドットで生じる蛍光スペクトルの形状変化に基づき無機カチオンを定量的に検出することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子径が異なる２種類の量子ドットの各表面に、検出対象無機カチオン分子を選択的に認識する分子認識部位がそれぞれ結合してなる２種類の無機カチオンプローブが、前記検出対象無機カチオン分子を介して複合体を形成し、前記２種類の量子ドットが近接することにより当該２種類の量子ドット間に生じるフェルスター型励起エネルギー移動による蛍光スペクトルの形状変化に基づき無機カチオンを定量的に検出する蛍光検出法。
【請求項２】
２種類の無機カチオンプローブを液体中に分散させた分散液に、検出対象の無機カチオン分子を含む試料を添加することにより、当該無機カチオン分子と前記２種類の無機カチオンプローブが形成する１対２のサンドイッチ型複合体において生じる蛍光スペクトルの形状に基づき無機カチオンを定量的に検出することを特徴とする請求項１に記載の無機カチオンの定量的蛍光検出法。
【請求項３】
前記分子認識部位が、検出対象の無機カチオン分子と当該分子認識部位とで１対２のサンドイッチ型錯体を形成するクラウンエーテル又はアザクラウンエーテルである請求項１又は２に記載の無機カチオンの定量的蛍光検出法。
【請求項４】
検出対象無機カチオンがナトリウムイオンであり、前記分子認識部位が１２−クラウン−４−エーテルである請求項３に記載の無機カチオンの定量的蛍光検出法。
【請求項５】
検出対象無機カチオンがアンモニウムイオンであり、前記分子認識部位が１８−クラウン−６−エーテルである請求項３に記載の無機カチオンの定量的蛍光検出法。
【請求項６】
各量子ドットの表面には２種類以上の分子認識部位が結合しており、これら分子認識部位のうち少なくとも１種類はナトリウムイオンを認識することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の無機カチオンの定量的蛍光検出法。
【請求項７】
ジスルフィド基が連結したクラウンエーテルの当該ジスルフィド基を、亜鉛粉末及び塩酸を用いて還元した後、量子ドットの表面に結合させて生成した無機カチオンプローブを用いることを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の無機カチオンの定量的蛍光検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質中、特に液体中に含まれる無機カチオンの定量を可能とする蛍光検出法に関し、特には燃料電池の電解質液に含まれる微量な無機カチオンを定量できる蛍光検出法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の無機カチオンの検出法の一つに、有機色素にイオン認識部位を結合させたプローブを用いる蛍光検出があり、細胞中のイオン濃度のイメージングなどに使われている（非特許文献１参照）。また、脂溶性の高い膜にイオン認識分子と蛍光性色素を含有させたオプトードも開発されており、フローインジェクション分析に利用されている（非特許文献２参照）。さらに、最近では、イオン認識部位を表面に結合させた金属ナノ微粒子を用いた無機カチオンの検出法が開発されている（非特許文献３参照）。この方法では、金属ナノ微粒子の凝集に伴う色調変化を吸光検出器で検出することにより無機カチオンを定量的に検出できる。
一方、イオンクロマトグラフィーなどの流れ分析における無機カチオンの検出では間接吸光法や電気伝導度検出が主に用いられている。
【非特許文献１】Henryk Szmacinski and Joseph R. Lakowicz, "Sodium Green as a Potential Probe for Intracellular Sodium Imaging Based on Fluorescence Lifetime", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 250, 131-138(1997).
【非特許文献２】Hideaki Hisamoto, et al., "Theory and practice of rapid flow-through analysis based on ion-selective optode detection and its application to sodium ion determination.", Analytica Chimica Acta 396(1999), 131-141.
【非特許文献３】Binil Itty Ipe, et al., "Functionalized Gold Nanoparticles as Phosphorescent Nanomaterials and Sensors.", J.AM.CHEM.SOC.2006, 128, 1907-1913.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
有機色素にイオン認識部位を結合させたプローブは、特に水中でのイオン種との結合に伴い蛍光強度が大きく変化する系を構築することが困難である。このことは、生体試料中の高濃度なナトリウムイオンやカリウムイオンの濃度分布を解析する際には問題とならないが、ｐｐｍ以下の微量濃度の無機カチオンの検出を難しくしている。
【０００４】
オプトードは蛍光強度の変化が現れるまでに時間を要するため、イオンクロマトグラフィー分析や電気泳動分析のような分離分析との組み合わせが難しく、単一の試料しか検出できないという問題がある。
表面にイオン認識部位を結合させた金属ナノ微粒子を用いた無機カチオンの検出法は、吸光検出器を用いるために検出感度がさほど高くない。流れ分析で使われている電気伝導度検出や間接吸光法は選択性がほとんどなく、また本質的にバックグラウンドノイズが高い手法であるため、高い検出感度が得られない。
【０００５】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、応答速度が速く、特に液体中の無機カチオンを高感度に検出できる定量的蛍光検出法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために成された本発明に係る無機カチオンの定量的蛍光検出法は、粒子径が異なる２種類の量子ドットの各表面に、検出対象無機カチオン分子を選択的に認識する分子認識部位がそれぞれ結合してなる２種類の無機カチオンプローブが、前記検出対象無機カチオン分子を介して複合体を形成し、前記２種類の量子ドットが近接することにより当該２種類の量子ドット間に生じるフェルスター型励起エネルギー移動による蛍光スペクトルの形状変化に基づき無機カチオンを定量的に検出するものである。
【０００７】
本発明の無機カチオンの定量的蛍光検出法では、２種類の無機カチオンプローブを液体中に分散させた分散液に、検出対象の無機カチオン分子を含む試料を添加することにより、当該無機カチオン分子と前記２種類の無機カチオンプローブが形成する１対２のサンドイッチ型複合体において生じる蛍光スペクトルの形状に基づき無機カチオンを定量的に検出する。
【０００８】
分子認識部位としては、検出対象の無機カチオン分子と当該分子認識部位とで１対２のサンドイッチ型錯体を形成するクラウンエーテル又はアザクラウンエーテルを用いることができる。クラウンエーテルは、ナトリウムイオンやカリウムイオン等、特定の無機カチオンに対応する空孔を有し、この空孔に無機カチオンを取り込んで錯体（図１参照）を形成する。このとき、粒子径が異なる２つの量子ドットの各表面に結合した分子認識部位と無機カチオン分子とが錯体を形成すると、粒子径が異なる２個の量子ドットが近接（凝集）するため、発光の際に前記２個の量子ドット間でフェルスター型のエネルギー移動が起こり、２種類の量子ドットの蛍光強度比が大きく変化する。粒子径が異なる２個の量子ドットからなる凝集体の量は無機カチオンの濃度に大きく依存するため、蛍光スペクトルの形状から試料の定量が可能となる。
【０００９】
本発明に係る無機カチオンの定量的蛍光検出法では、検出対象無機カチオン分子がナトリウムイオンであるときは、分子認識部位として１２−クラウン−４−エーテルを用いることができる。
また、検出対象無機カチオン分子がアンモニウムイオンであるときは、分子認識部位として１８−クラウン−６−エーテルを用いることができる。
さらに、粒子径が異なる２種類の量子ドットの各表面に２種類以上の分子認識部位を結合させれば、２種類の無機カチオン分子を同時に蛍光検出することができる。この場合、２種類以上の分子認識部位のうちの一つを、例えばナトリウムイオンを選択的に認識するクラウンエーテルとすると良い。
【発明の効果】
【００１０】
量子ドットは、その粒子径により発光波長が大きく変化することが最大の特徴である。また、広帯域に光吸収を示し、単一波長での励起が可能になることから、粒子径の異なる、即ち、発光波長の異なる複数の量子ドットを用いて同時に複数の発光を得ることができる。さらに、量子ドットは、既存の有機色素に比して蛍光寿命が長く、量子収量も高いため、強い発光強度を示す。また、光退色もしない。このため、本発明に係る無機カチオンの定量的蛍光検出法は、非常に高感度でかつ選択的な無機カチオン分子の分析システムの構築に適している。
【００１１】
しかも、無機カチオン分子とクラウンエーテル又はアザクラウンエーテルとのサンドイッチ型１：２錯体の形成は十分に速く進行するため、分子認識部位としてクラウンエーテル又はアザクラウンエーテルを用いることにより応答速度の速い無機カチオンの定量的蛍光検出法を実現できる。
【００１２】
さらに、量子ドットの発光域が狭いことを利用すれば、２種類以上のサイズの量子ドットからの発光スペクトルを容易に分離することができる。したがって、複数種の無機カチオンを同時に検出することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を、分子認識部位としてクラウンエーテルを用いた無機カチオンの定量的蛍光検出法を例に挙げて説明する。
【００１４】
まず、本発明の定量的蛍光検出法のステップを説明する。
１）粒子径が異なる２種類の量子ドットの表面に検出対象となる無機カチオン分子の認識部位であるクラウンエーテルを結合させて２種類の無機カチオンプローブを生成する。
２）これら２種類の無機カチオンプローブをほぼ同量ずつ液体中に分散させて分散液を調製する。
３）前記分散液に測定対象の無機カチオンを含む試料を滴定する。
４）分散液に所定の励起光を照射したときの蛍光スペクトルを測定する。
【００１５】
図１は、２種類の無機カチオンプローブの例を示している。具体的には、無機カチオンプローブ１０は、量子ドット１０Ｌの表面に複数のクラウンエーテル１１（図１では、2-(ヒドロキシメチル)−12-クラウン-4-エーテル)が結合して成る。一方、無機カチオンプローブ１２は、量子ドット１０Ｌよりも粒子径が小さい量子ドット１０Ｓの表面に複数のクラウンエーテル１１が結合して成る。
【００１６】
なお、図１では各量子ドット１０Ｌ，１０Ｓの表面に４個のクラウンエーテル１１が結合しているが、これは例示に過ぎない。２種類の量子ドットの各表面に同数のクラウンエーテルが結合している必要はなく、また、同じ種類の量子ドットであっても各表面に結合するクラウンエーテルの数が同じである必要はない。
【００１７】
クラウンエーテルは、特定の無機カチオンに対応する空孔を有し、この空孔に無機カチオンを取り込んで１対２のサンドイッチ型錯体を形成する。従って、２種類の無機カチオンプローブ１０，１２を含む分散液に試料を滴定すると、当該試料中に無機カチオンが含まれる場合には、当該無機カチオン分子と２個の無機カチオンプローブとで複合体が形成される。
【００１８】
このとき、無機カチオンプローブ１０，１２の組み合わせにより３形態の複合体（（１）２個の無機カチオンプローブ１０と無機カチオン、（２）２個の無機カチオンプローブ１２と無機カチオン、（３）無機カチオンプローブ１０，１２と無機カチオン）が形成される。
図１に示すように、種類が異なる無機カチオンプローブ１０，１２と無機カチオン１４（図１ではナトリウムイオン）からなる複合体が形成されると、粒子径が異なる、即ち発光波長が異なる量子ドットが接近（凝集）するため、量子効果により短波長側から長波長側の量子ドットにエネルギーが移動し(フェルスター型励起エネルギー移動)、蛍光スペクトル形状が変化する。このエネルギー移動は接近した量子ドットの数、即ち、無機カチオン濃度に依存することから、蛍光スペクトルの形状に基づき液体中の無機カチオン濃度を検出することができる。
【００１９】
本発明に適用可能な量子ドットは、エネルギードナーとなる粒子径の小さな量子ドットの蛍光スペクトルと、エネルギーアクセプターとなる粒子径の大きな量子ドットの吸収スペクトルに重なりを有する組み合わせであれば良く、以下の式で与えられるＲ０（臨界エネルギー移動距離）が、複合体を形成したときの量子ドット間の距離よりも大きくなるような組み合わせであれば良い。なお、式中、Ｋpは配向因子、ＱＤはドナーの発光量子収率、ＮＡはアボガドロ数、ｎｄは分散液の屈折率、Ｉはドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なり積分を表す。
【数１】
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【００２０】
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
実施例１は、本発明をナトリウムイオンの定量的蛍光検出法に適用した例である。
（ナトリウムイオンプローブの調製）
ナトリウムイオンプローブの調製法を図２を参照しながら説明する。
2-(ヒドロキシメチル)−12-クラウン-4-エーテル（2-(hydroxymethyl)-12-crown-4-ether）を22.6 mmol、リポ酸（lipoic acid）を22.6mmol をジクロロエタン (CH2Cl2)15 mL に溶解し、氷浴中、窒素雰囲気下で15分間撹拌する。そして、ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexyl carbodiimide、DCC）22.6mmol、 4-ジメチルアミノピリジン（4-dimethylaminopyridine、DMAP）2.27mmolのジクロロエタン溶液 (15 mL) を加え、氷浴中、窒素雰囲気下でさらに15分間撹拌する。得られた反応混合液を室温に戻した後、窒素雰囲気下で７時間撹拌する。反応混合液に酢酸エチルを加えて冷却し、生じる白色沈殿を濾過した後、濾液を分液漏斗で水、酢酸、水の順に洗浄する。洗浄した濾液の溶媒を減圧留去・真空乾燥し、シリカゲルカラム  (クロロホルム：酢酸エチル＝３：１) で精製すると、目的生成物１が収量3.82g (9.69mmol)、収率43%で得られる。
生成物１を1H-NMR、及び高速原子衝撃質量分析（FAB-MS）により同定した結果は次の通りである。
・NMR (CDCl3); δ 1.48 (2H, m), 1.67 (4H, m), 1.91 (1H, m), 2.34 (2H, t), 2.45 (1H, m), 3.13 (2H, m), 3.57 (2H, t), 3.70 (12H, m), 3.83 (2H, t), 4.11 (2H, m).
・FAB-MS; [M] 394.2, Calcd. for C17H30O6S2: 394.2, [M+H]+ 395.3, Calcd. for C17H31O6S2: 395.2.
【００２２】
得られた生成物１(0.25mmol) にメタノール(15mL)を加え、氷浴中で亜鉛粉末を118mg加えて攪拌し、濃塩酸0.7mLを徐々に加える。65分間攪拌した後、亜鉛粉末を濾別し、ベンゼンを15mL加える。反応液を水、重炭酸アンモニウム、水の順で洗浄した後、モレキュラーシーブで水分を除去する。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥すると目的生成物２が収量53mg(0.13 mmol)、収率53%で得られた。生成物２を1H-NMR及び高速原子衝撃質量分析（FAB-MS）により同定した結果は次の通りである。
・NMR (CDCl3); δ 1.35 (2H, m), 1.55-1.63 (6H, m), 1.89 (2H, m), 2.35 (2H, t), 2.70 (2H, m), 2.92 (1H, m), 3.59 (1H, q), 3.70-3.75 (12H, m), 3.83 (2H, q), 4.12 (2H, m).
・FAB-MS; [M] 394.2, Calcd. for C17H30O6S2: 394.2, [M+H]+ 395.3, Calcd. for C17H31O6S2: 395.2.
【００２３】
生成物２（10mg）をメタノール（10ml）に溶解し、pHが１０以上となるように水酸化テトラメチルアンモニウムを加える。カドミウムセレン／硫化亜鉛（CdSe / ZnS）のコアシェル型量子ドット (直径2.1nm、2.4nm)のトルエン分散液（１mg/ml）を10ml加え、65℃で一晩還流する。その後、溶媒を減圧留去して、目的生成物３であるナトリウムイオンプローブを得る。具体的には、量子ドットの直径が2.1nmのナトリウムイオンプローブ (以下、「12-C-4 QDs-2.1」とする)が収量16.4 mgで得られ、量子ドットの直径が2.4nmのナトリウムイオンプローブ (以下、「12-C-4 QDs-2.4」とする) が収量16.7mgで得られた。
【００２４】
（ナトリウムイオンプローブの蛍光特性）
0.5%アセトン水溶液に対し12-C-4 QDs-2.1および12-C-4 QDs-2.4をそれぞれ0.2μMとなるように分散させて分散液を生成し、この分散液にナトリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトルを図３に示す。図３に示すように、蛍光スペクトルには12-C-4 QDs-2.1および12-C-4 QDs-2.4に起因する2つのピークが観測され、ナトリウムイオン濃度が増加するにつれて、短波長側のピーク強度が徐々に減少し、長波長側のピーク強度が徐々に増加することがわかった。このようなナトリウムイオン濃度に応じた蛍光スペクトルの形状の変化から、蛍光スペクトル変化に基づくナトリウムイオン濃度の検出が可能となった。
【００２５】
ナトリウムイオン濃度を横軸に、短波長側と長波長側のピーク強度の比（I551/I517）を縦軸にとってプロットしたところ、図４のような関係が得られた。ナトリウムイオン濃度が0μMから0.5μMの領域では、当該濃度と共にI551/I517が増加する傾向を示し、0.5μMよりも高濃度の領域ではI551 / I517がほぼ一定となることがわかった（図４にはナトリウムイオン濃度が0μMから0.5μMの領域のみ示す）。また、ナトリウムイオン濃度が0μMから0.5μMの濃度領域では、ナトリウムイオン濃度に対するI551/I517は良好な直線関係を示しており、得られた検量線からナトリウムイオンの定量が可能であることが確認された。
【００２６】
以上の結果より、スペクトルのピーク強度比から定量が可能であることが示された。蛍光強度比による定量は、単一波長の蛍光強度による定量に比べて、励起光強度のふらつき等、外的な因子に左右され難く、より高い精度が得られるため、12-C-4 QDs-2.1 / 12-C-4 QDs-2.4は有用な蛍光プローブである。なお、この系におけるナトリウムイオン濃度の検出限界は0.1μM (2ppb) 程度であることがわかった。
【００２７】
ナトリウムイオンプローブに適用可能な量子ドットは、以下の式で与えられるＲ０（臨界エネルギー移動距離）が、ナトリウムイオンプローブがナトリウムイオンを介したサンドイッチ型の複合体を形成したときの量子ドット間の距離（2.6nm）よりも大きくなるような組み合わせであればよい。たとえば、直径2.1nmと2.4nmの量子ドットでは、Ｒ０はおよそ６nmとなるため、エネルギー移動が十分に起こり得、イオンの認識に伴う蛍光スペクトルの形状変化を観測できる。
【数１】
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（式中、Ｋpは配向因子、ＱＤはドナーの発光量子収率、ＮＡはアボガドロ数、ｎｄは分散液の屈折率、Ｉはドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なり積分を表す。）
【００２８】
(イオン選択性）
12-C-4 QDs-2.1 / 12-C-4 QDs-2.4のイオン選択性を確認するために、分散液にカリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル形状を調べた。0.5%アセトン水溶液に対し12-C-4 QDs-2.1および12-C-4 QDs-2.4をそれぞれ0.2μMとなるように分散し、カリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトルを図５に示す。ナトリウムイオンの場合と同様に、蛍光スペクトルには12-C-4 QDs-2.1および12-C-4 QDs-2.4に起因する2つのピークが観測された。しかし、ナトリウムイオンの場合とは異なり、カリウムイオン濃度を増加しても、長波長側、短波長側のピーク強度はいずれもあまり変化しないことがわかった。また、カリウムイオン濃度に対して短波長側と長波長側のピーク強度の比（I552/I517）をプロットしたところ、カリウムイオンの濃度に依らずほぼ一定の値を示すことが確認された（図６）。
【００２９】
すなわち、12-C-4 QDs-2.1 / 12-C-4 QDs-2.4混合分散系においては、添加するカリウムイオンの濃度を変化させてもスペクトル形状は変化せず、カリウムイオンの添加により12-C-4 QDs-2.1/12-C-4 QDs-2.4間のエネルギー移動は起こらないことが明らかとなった。これは、量子ドット表面に結合した12-クラウン-4-エーテルはナトリウムイオンに対する選択係数がカリウムイオンに対する選択係数よりも十分に大きく、12-C-4 QDs-2.1 / 12-C-4 QDs-2.4の混合分散液ではカリウムイオンを介した１：２錯体を形成しないことに起因するものと考えられる。したがって、12-C-4 QDs-2.1 / 12-C-4 QDs-2.4はナトリウムイオン選択的な蛍光プローブであることが確認された。
【実施例２】
【００３０】
実施例２は、本発明をアンモニウムイオンの定量的蛍光検出法に適用した例である。
（アンモニウムイオンプローブの調製）
アンモニウムイオンプローブの調製法を図７を参照しながら説明する。
2-(ヒドロキシメチル)−18-クラウン-6-エーテル（2-(hydroxymethyl)-18-crown-6-ether）7.19mmolおよびリポ酸（lipoic acid）7.29mmol をジクロロメタン (12mL) に溶解し、氷浴中、窒素雰囲気下で10分間撹拌する。そして、DCC (7.15mmol)，DMAP (0.715mmol) のジクロロメタン溶液 (12 mL) を加え、氷浴中、窒素雰囲気下で15分間撹拌する。室温に戻した後、窒素雰囲気下で7.5 時間撹拌する。得られた反応混合物に酢酸エチルを加えて冷却し、生じる白色沈殿を濾過した後、濾液を濃縮し、分液漏斗で水、酢酸、水の順に洗浄する。溶媒を減圧留去し、真空乾燥して得られる生成物をシリカゲルカラム（クロロホルム：酢酸エチル＝２：１→クロロホルム：メタノール＝２０：１→クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製すると生成物４が収量0.82g、収率24%で得られる。
生成物４を1H-NMR及び高速原子衝撃質量分析（FAB-MS）により同定した結果は次の通りである。
・NMR (CDCl3); δ 1.47-1.66 (6H, m), 1.93 (1H, m), 2.34 (2H, t), 2.45 (1H, m), 3.13 (2H, m), 3.55-3.79 (24H, m), 4.12 (1H, m), 4.21 (1H, m).
・FAB-MS; [M] 482.3, Calcd. for C21H38O8S2: 482, [M+H]+ 483.3, Calcd. for C21H39O8S2: 483.
【００３１】
得られた生成物４(0.23mmol) に重炭酸ナトリウム水溶液 (0.25mol/l) を10mL加えて、氷浴中で水素化ホウ素ナトリウム (0.99 mmol) を徐々に加え、2時間撹拌する。冷塩酸を滴下して水層のpHを約１にしてからベンゼン10mLを加えて目的物を溶媒抽出し、油層の水分をモレキュラーシーブで除去する。溶媒を減圧留去すると目的生成物５が収量81 mg (0.17 mmol)、収率74%で得られる。
【００３２】
生成物５（9〜12mg）をメタノール（10mL）に溶解し、pHが10以上となるように水酸化テトラメチルアンモニウムを加える。カドミウムセレン／硫化亜鉛（CdSe / ZnS）のコアシェル型量子ドット (直径2.1nm、2.4nm)のトルエン分散液（1mg/ml）を10ml加え、65℃で一晩還流する。その後、溶媒を減圧留去して、目的生成物６であるアンモニアプローブを得る（図７参照）。具体的には、量子ドットの直径が2.1nmのアンモニウムイオンプローブ (以下、「18-C-6 QDs-2.1」とする)は収量11mgで得られ、量子ドットの直径が2.4nmのアンモニウムイオンプローブ (以下、「18-C-6 QDs-2.4」とする)は収量6.0mgで得られた。
【００３３】
（アンモニウムイオンプローブの蛍光特性）
0.5%アセトンおよび10mMのKClを含む水溶液に対し18-C-6 QDs-2.1および18-C-6 QDs-2.4をそれぞれ0.2μMとなるように分散し、アンモニウムイオンを添加したときの蛍光スペクトルを図８に示す。図８に示すように、蛍光スペクトルには12-C-4 QDs-2.1および12-C-4 QDs-2.4に起因する2つのピークが観測され、アンモニウムイオン濃度が増加するにつれて、短波長側のピーク強度は徐々に減少し、長波長側のピーク強度は徐々に増加することがわかった。
【００３４】
また、アンモニウムイオン濃度に対して短波長側と長波長側のピーク強度の比（I560/I521）をプロットしたところ、図９のような関係が得られた。図９に示すように、アンモニウムイオン濃度が0μMから1μMの領域ではI551/I517は急峻な増加を示し、それ以上の濃度では緩やかな増加傾向を示した。また、図９には示していないが、20μM以上の濃度でほぼ一定となることがわかった。急峻な増加傾向を示す濃度領域（0μM〜1μM）では、I551/I517は良好な直線関係を示しており、得られた検量線よりアンモニウムイオンの定量が可能であることが確認された。この系におけるアンモニウムイオン濃度の検出限界は0.6μM (11ppb) 程度であることがわかった。
【００３５】
なお、調製した量子ドット混合分散液には、十分過剰量のカリウムイオンが含まれているにもかかわらず、低濃度のアンモニウムイオンに対して、エネルギー移動に基づく蛍光スペクトル変化が観測されたことから、18-C-6 QDs-2.1/18-C-6 QDs-2.4はアンモニウムイオン選択的な蛍光プローブであることが確認された。
【実施例３】
【００３６】
実施例３は、本発明をアンモニウムイオンの定量的蛍光検出法に適用した別の例である。
（アンモニウムイオンプローブの調製）
実施例２のアンモニウムイオンプローブの調製の最終段階における、反応液中に量子ドットを添加する方法を次のように変更して、量子ドットの表面にクラウンエーテル基を導入した。
即ち、生成物５（9〜12mg）をメタノール（10mL）に溶解し、pHが10以上となるように水酸化テトラメチルアンモニウムを加える。カドミウムセレン／硫化亜鉛のコアシェル型量子ドット（トルエン分散液1 mg/mL）を10mL加え、65℃で一晩還流する。このとき、量子ドットの分散溶媒であるトルエンを減圧留去してから、反応液に量子ドットを加える。反応後、溶媒を減圧留去して、目的生成物６であるアンモニウムイオンプローブを得る。直径2.1nmの量子ドットのアンモニウムイオンプローブ (以下「18-C-6 mod-QDs-2.1」とする)は収量11 mgで、直径2.4nmの量子ドットのアンモニウムイオンプローブ (以下「18-C-6 mod-QDs-2.4」とする)は収量6.0mgで得られた。
【００３７】
（アンモニウムイオンプローブの蛍光特性）
0.5%アセトンおよび10mMのKClを含む水溶液に対し18-C-6 mod-QDs-2.1および18-C-6 mod-QDs-2.4をそれぞれ0.1μMとなるように分散し、アンモニウムイオンを添加したときの蛍光スペクトルを図１０に示す。図１０に示すように、蛍光スペクトルには18-C-6 mod-QDs-2.1および18-C-6 mod-QDs-2.4に起因する2つのピークが観測され、アンモニウムイオン濃度が増加するにつれて、長波長側のピーク強度が徐々に増加することがわかった。短波長側のピーク強度は、アンモニウムイオン濃度が変化してもほとんど変化しなかった。
【００３８】
アンモニウムイオン濃度に対して短波長側と長波長側のピーク強度の比（I550/I518）をプロットしたところ、図１１のような関係が得られた。アンモニウムイオン濃度が0μMから20μMの領域ではI550/I518は緩やかな増加を示し、それ以上の濃度では比較的急峻な増加傾向を示すことがわかった。アンモニウムイオン濃度の対数に対して、I550/I518は良好な直線関係を示しており、得られた検量線よりアンモニウムイオンの定量が可能であることが確認された。また、実施例２に比べて、応答する濃度範囲が大きくなることが確認された。つまり、量子ドット表面へのクラウンエーテルの導入法を変更することにより、アンモニウムイオンの定量範囲を調節できることがわかった。
【実施例４】
【００３９】
実施例４は、本発明をカリウムイオンの定量的蛍光検出法に適用した例である。
(カリウムイオンプローブの調製）
カリウムイオンプローブの調製法を図１２を参照しながら説明する。
2-(ヒドロキシメチル)-15-クラウン-5-エーテル（2-(hydroxymethyl)-15-crown-5-ether,15-C-5）19.0mmol(4.75g)、リポ酸（lipoic acid）19.0mmol(3.91 g)をジクロロエタン(CH2Cl2)15mLに溶解し、氷浴中、窒素雰囲気下で15分撹拌する。
そして、DCC 19.0mmol(3.91 g)、 DMAP 1.92mmol(0.235g)のジクロロエタン溶液（15 mL）を加え、氷浴中、窒素雰囲気下でさらに15分間撹拌する。
得られた反応混合液の氷浴を外し、ゆっくりと室温に戻した後、窒素雰囲気下で6時間撹拌する。このとき、反応混合液には白色固体が生じる。
【００４０】
反応混合物に酢酸エチルを加えて冷却すると、白色沈殿がさらに生じる。この白色沈殿を吸引濾過し、過剰な溶媒を減圧留去した後、黄色透明な濾液を分液漏斗で水、１Ｍ酢酸、水の順に洗浄する。さらに濾液の溶媒を減圧留去・真空乾燥して黄色でオイル状の生成物を得た。この生成物をシリカゲルカラム  (クロロホルム：酢酸エチル＝２：１）で精製すると、目的生成物７が収量: 4.56 g (10.4 mmol)、収率:55%で得られた。また、この生成物７の薄層クロマトグラフィ（TLC：クロロホルム /酢酸エチル(3/1 v/v))の Rf値は 0.26であった。
【００４１】
この目的生成物７について、1H-NMRにより同定を行った。得られたNMRスペクトルを図１３に示す。図１３から、目的生成物７が得られたものといえるが、薄層クロマトグラフィにおけるスポットが２点以上あったため、さらにシリカゲルカラム  (クロロホルム：メタノール：酢酸＝１２０：４：５) で精製した。この結果、得られた目的生成物７は最終収量:4.17g(9.51mmol)、最終収率:50%であった。
【００４２】
得られた生成物７（162mg、0.37mmol) にメタノールを15mL加えて溶解させ、氷浴中で亜鉛粉末を180mg加えて撹拌し、濃塩酸１mLを徐々に加える。45分間撹拌した後、亜鉛粉末を濾別し、ベンゼンを12 mL加える。反応液を分液漏斗を用いて水、重炭酸アンモニウム、水の順で洗浄した後、モレキュラーシーブで乾燥させる。そして、吸引濾過し、溶媒を減圧留去した後、真空乾燥することにより、目的生成物８が収量:107 mg(0.24 mmol)、収率:66%で得られた。
【００４３】
得られた生成物８(13mg)を12mLのメタノールに溶解し、pHが１０以上となるように水酸化テトラメチルアンモニウムを加える。カドミウムセレン／硫化亜鉛（CdSe/ZnS）のコアシェル型量子ドット (以下、直径2.1の量子ドットを「QDs-2.1」、直径2.4nmの量子ドットを「QDs-2.4」とする) を10mg加え、65℃で一晩還流する。
そして、室温に戻してさらに一晩静置した。このとき、生成物は反応溶媒に溶解していたが、減圧留去するとメタノールに溶けなくなった。
その後、溶媒を減圧留去し、ヘキサンで洗浄した。これにより、目的生成物９であるカリウムイオンプローブが得られる。具体的には、量子ドットの直径が2.1nmのカリウムイオンプローブ（以下、「15-C-5 QDs-2.1」とする）が収量7mgで得られ、量子ドットの直径が2.4nmのカリウムイオンプローブ（以下「15-C-5 QDs-2.4」とする）が収量6.3mgで得られた。
【００４４】
なお、15-C-5 QDs-2.1および15-C-5 QDs-2.4はいずれも水への溶解性が小さいが、15-C-5 QDs-2.1はアセトン／メタノール混合溶媒に、15-C-5 QDs-2.4はアセトンに良好に分散した。この分散液を水に滴下することで、両カリウムイオンプローブの水分散液を調製できた。さらに、混合溶媒に分散したカリウムイオンプローブは長期間の保存が可能であり、水分散液を再現良く調製することが可能となった。
【００４５】
（カリウムイオンプローブの蛍光特性）
0.5%アセトンを含む脱イオン水に対し、15-C-5 QDs-2.1および15-C-5 QDs-2.4をそれぞれ0.3μMとなるように分散させて混合分散液を作成し、この混合分散液にカリウムイオン（過塩素酸カリウム）を0.1μM〜315μM添加した。このときの蛍光スペクトルを図１４に示す。図１４に示すように、蛍光スペクトルには15-C-5 QDs-2.1および15-C-5 QDs-2.4に起因する明確な2つのピークが観測された。また、カリウムイオン濃度が増加するにつれて，全体的にピーク強度が減少した。これは、今回得られたカリウムイオンプローブの水への溶解性が小さく凝集しやすいことが主な原因と考えられる。
【００４６】
また、短波長側のピーク強度 (I523) と長波長側のピーク強度 (I555) の比(I555/I523)をカリウムイオン濃度に対してプロットしたところ、図１５および図１６のような関係が得られた。図１５および図１６に示すように、カリウムイオン濃度が0μMから20μMの領域では、当該濃度と共にI555/I523が増加する傾向を示し、20μMよりも高濃度の領域ではI555/I523がほぼ一定となることがわかった。したがって、カリウムイオン濃度が0μMから20μMの領域では、カリウムイオンは15-C-5と１：２錯体を形成していることが示唆された。
ただし、今回の測定では、同じ試料について測定直後に再度スペクトル測定をするとスペクトル形状が変化するなど，再現性が十分でなかった。ピペッティングによる撹拌の後、一定の時間で測定するなどして条件をそろえることが必要である。また、より均一な分散液を得るためにも水への溶解性を上げることが必要であると考えられる。
【００４７】
次に、15-C-5 QDs-2.1と15-C-5 QDs-2.4の混合分散液におけるイオン選択性を確認するために、ナトリウムイオン（過塩素酸ナトリウム）を0.1μM〜20μM添加したときの蛍光スペクトルを測定した。その結果を図１７に示す。また、得られた蛍光スペクトルの短波長側のピーク強度 (I523) と長波長側のピーク強度 (I557) の比(I555/I523)をナトリウムイオン濃度に対してプロットしたところ図１８のような関係が得られた。
【００４８】
カリウムイオンを添加したときとは異なり、ナトリウムイオン濃度が大きくなるにつれて2つのピーク強度はどちらも同じように減少した。ピーク強度比にばらつきが見られたが、ナトリウムイオン濃度の増加に対して大きな変化は認められなかった。したがって、15-C-5 QDs-2.1/15-C-5 QDs-2.4はカリウムイオンに選択的な蛍光プローブであることが確認された。
【００４９】
なお、本願発明者は、亜鉛および濃塩酸を用いた生成物７のジスルフィド基の還元反応に先立ち、Chun-Yen Chen らの報告(Chem.Commun. 2006, 263-265)に基づき水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を用いたジスルフィド基の還元反応を行っている。この報告は、粒子径が異なる２種類の量子ドットに2-(ヒドロキシメチル)-15-クラウン-5-エーテルを結合してなるプローブを用いた、カリウムイオンの蛍光検出法について報告したものである。
【００５０】
しかし、本願発明者が水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を用いて生成物７のジスルフィド基の還元反応を行ったところ、未反応の原料が多く残存したことから、水素化ホウ素により反応が妨害されていることが予想された。そこで、亜鉛および濃塩酸によるジスルフィド基の還元について検討を行った。この結果、副生成物が少なく品質の良い目的生成物８が得られた。以上より、水素化ホウ素ナトリウムに比べて亜鉛および濃塩酸はジスルフィド基の還元剤として有効であることが分かった。
【００５１】
また、上記実施例ではいずれも１個の量子ドットに１種類のクラウンエーテルを結合して無機カチオンプローブを形成したが、１個の量子ドットに２種類以上のクラウンエーテルを結合させるようにしても良い。このような無機カチオンプローブを用いれば、同時に２種類以上の無機カチオン分子の定量的蛍光検出が可能となる。
この場合、検出対象の無機カチオンの一つがナトリウムイオンであるときは、水素化ホウ素ナトリウムではなく亜鉛および濃塩酸をジスルフィド基の還元剤として用いる。これは、還元剤として水素化ホウ素ナトリウムを用いると、還元反応の際にナトリウムイオンとクラウンエーテルとの間で錯体が形成されてしまうからである。この点でも、水素化ホウ素ナトリウムに比べて亜鉛および濃塩酸はジスルフィド基の還元剤として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の無機カチオンプローブと検出対象無機カチオンとが形成する複合体の模式図。
【図２】本発明の実施例１に係るナトリウムイオンプローブを生じる化学反応を示す図。
【図３】ナトリウムイオンプローブを含む分散液にナトリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル。
【図４】ナトリウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【図５】ナトリウムイオンプローブを含む分散液にカリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル。
【図６】カリウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【図７】本発明の実施例２に係るアンモニウムイオンプローブを生じる化学反応を示す図。
【図８】アンモニウムイオンプローブを含む分散液にナトリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル。
【図９】アンモニウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【図１０】本発明の実施例３に係るアンモニウムイオンプローブを含む分散液にアンモニウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル。
【図１１】アンモニウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【図１２】本発明の実施例４に係るカリウムイオンプローブを生じる化学反応を示す図。
【図１３】得られた生成物のNMRスペクトル。
【図１４】カリウムイオンプローブを含む分散液にカリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル。
【図１５】カリウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【図１６】カリウムイオン濃度が0μMから20μMの領域におけるカリウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【図１７】カリウムイオンプローブを含む分散液にナトリウムイオンを添加したときの蛍光スペクトル。
【図１８】ナトリウムイオン濃度と短波長側と長波長側のピーク強度の比との関係を示す図。
【符号の説明】
【００５３】
１０,１２…無機カチオンプローブ
１０Ｌ，１０Ｓ…量子ドット
１４…無機カチオン分子
【図１】
2010038804.tif 000005
【図２】
2010038804.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010038804.tif 000009
【図６】
2010038804.tif 000010
【図７】
2010038804.tif 000011
【図８】
2010038804.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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