(57)【要約】【課題】本発明は、ＣＹＰ２Ａ６阻害剤及びＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】（＋）−カンファー、（−）−カンファー、（＋）−ボルネオール、（−）−ボルネオール、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコン、及びこれらの混合物を有効成分として含有するＣＹＰ２Ａ６阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）−カンファー、（−）−カンファー、（＋）−ボルネオール、（−）−ボルネオール、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコン、及びこれらの混合物を有効成分として含有するＣＹＰ２Ａ６阻害剤。
【請求項２】
（＋）−カンファー、（−）−カンファー、（＋）−ボルネオール、（−）−ボルネオール、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコン、及びこれらの混合物を含む精油を有効成分として含有するＣＹＰ２Ａ６阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含有する喫煙回数低減剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＣＹＰ２Ａ６阻害剤とニコチンを含む製剤。
【請求項５】
ＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質のスクリーニング方法であって、
(1)ＣＹＰ２Ａ６、サイトゾール、ＮＡＤＰＨ生成系、ニコチン、およびリン酸カリウム緩衝液を含む混合液にサンプルを加えて反応させる工程、
(2)上記(1)で得られた反応液に、内部標準物質としてトランス−４’−カルボキシコチニンエステル、及び反応停止剤を加えて反応を停止する工程、並びに
(3)上記(2)で得られた反応液を遠心分離した後、その上清をとって、ＨＰＬＣによりコチニンの生成量を定量する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＹＰ２Ａ６阻害剤及びＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は主に肝臓に含まれる酵素であり、ヒトの薬物代謝反応の約８割に関与するといわれている。ＣＹＰは脂溶性基質を酸化することで水溶性を高め、体外へ排出しやすくする役割を果たしている。
【０００３】
ＣＹＰ２Ａ６はタバコの主成分であるニコチンの主要代謝酵素であり、ニコチンを中間体であるイミニウムイオンへと代謝する。このイミニウムイオンはさらにアルデヒドオキシダーゼにより、最終生成物であるコチニンへ代謝される。喫煙者においてニコチンの代謝による消失は、集中力の欠如や不安、不眠などの離脱症状をもたらし、これらの症状を解消するため喫煙を繰り返し、ニコチン濃度を維持しようとする。
【０００４】
そこで、このＣＹＰ２Ａ６の機能に着目し、ＣＹＰ２Ａ６の発現あるいは酵素活性を抑制することで、体内でニコチンを代謝させず長く留まらせ、喫煙者の喫煙回数を減らす（喫煙回数低減）試み、あるいは発癌性物質の活性化を妨げて発癌リスクを低減させる試みが報告されている（例えば、特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、ここで提唱されているＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、抗白癬菌剤であるメトキサレン、トラニルシプロミン、プソラレン、ピロカルピン、クマリン、クロモン、エスクレチン、フェネルジン、パロキセチン、セレギリンおよびパルギリンなどであり、いずれも医師の処方箋による投与指導が必要で、日常的かつ簡便に行い得るものではない。
【０００６】
また、同文献は、天然産生物又は天然産生物の抽出物を利用したＣＹＰ２Ａ６阻害剤として、ハイペリカム（Hypericum）、チコリー（Cichorium intybus）若しくはボウガインブルラ・スペクタビリス（Bougainvllra spectabillis）などの抽出物、特にエスクレチン、エスクリンまたはエスクリン一水和物などを開示しているが、その阻害効果は満足できるものではなく、その入手も容易ではない。
【０００７】
また、特許文献２には、大豆サポニン抽出画分及び／又は甘草抽出物を有効成分とするＣＹＰ２Ａ６阻害剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−５２４５１６号公報
【特許文献２】特開２００６−１６９１８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＣＹＰ２Ａ６阻害剤及びＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、モノテルペン、特に双環性モノテルペン、具体的にはカンファー（camphor）、ボルネオール（borneol）、フェンコン（fenchone）等がＣＹＰ２Ａ６阻害活性を有することを見出した。
【００１１】
また、従来、ＣＹＰ２Ａ６阻害作用のスクリーニング方法において内部標準物質としてケタミンや３−ヒドロキシコチニンが使用されていた。しかし、ケタミンは麻薬に指定されており入手が困難であり、また３−ヒドロキシコチニンは高価であるとともにコチニンの代謝産物と性質が似ているため正確な評価が困難であった。そこで、今回、入手容易なトランス−４’−カルボキシコチニンのエステル（trans-4’-carboxycotinine ester）を内部標準物質として用いることにより、従来のスクリーニング方法に比べて安価、簡便かつ正確に評価できることを見出した。これをさらに発展させて、ここに本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は次のＣＹＰ２Ａ６阻害剤、及びＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質（即ち、ニコチンの代謝阻害物質）のスクリーニング方法に関する。
【００１３】
項１．  （＋）−カンファー、（−）−カンファー、（＋）−ボルネオール、（−）−ボルネオール、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコン、及びこれらの混合物を有効成分として含有するＣＹＰ２Ａ６阻害剤。
【００１４】
項２．  （＋）−カンファー、（−）−カンファー、（＋）−ボルネオール、（−）−ボルネオール、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコン、及びこれらの混合物を含む精油を有効成分として含有するＣＹＰ２Ａ６阻害剤。
【００１５】
項３．  項１又は２に記載のＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含有する喫煙回数低減剤。
【００１６】
項４．  項１又は２に記載のＣＹＰ２Ａ６阻害剤とニコチンを含む製剤。
【００１７】
項５．  ＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質のスクリーニング方法であって、
(1)ＣＹＰ２Ａ６、サイトゾール、ＮＡＤＰＨ生成系、ニコチン、およびリン酸カリウム緩衝液を含む混合液にサンプルを加えて反応させる工程、
(2)上記(1)で得られた反応液に、内部標準物質としてトランス−４’−カルボキシコチニンエステル、及び反応停止剤を加えて反応を停止する工程、並びに
(3)上記(2)で得られた反応液を遠心分離した後、その上清をとって、ＨＰＬＣによりコチニンの生成量を定量する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の特定の双環性モノテルペンを有効成分として含有するＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、高いＣＹＰ２Ａ６阻害作用を有している。そのため、ＣＹＰ２Ａ６阻害剤を用いて、体内でのニコチンの代謝を遅らせてニコチン濃度を長時間保持して、結果的に喫煙量を減らすことができる。ＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、経口、経皮、経肺、吸入等の種々の投与形態が可能である。
【００１９】
また、本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質のスクリーニング方法は、従来の内部標準物質としてケタミンや３−ヒドロキシコチニンが使用されるスクリーニング方法に比べて、安価、簡便かつ正確に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種双環性モノテルペンのＣＹＰ２Ａ６阻害活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、モノテルペン（Ｃ１０）、さらに双環性モノテルペン、具体的には（＋）−カンファー（(+)-camphor）、（−）−カンファー（(-)-camphor）、（＋）−ボルネオール（(+)-borneol）、（−）−ボルネオール（(-)-borneol）、（＋）−フェンコン（(+)-fenchone）、（−）−フェンコン（(-)-fenchone）、これらの混合物等を有効成分として含有する。中でも、（＋）−カンファー、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコン等はＣＹＰ２Ａ６阻害活性が高いため好ましい。
【００２２】
また、これらのテルペンは種々の植物の精油成分として知られていることから、安全かつ入手が容易である。本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、上記のテルペンを含む精油をも包含する。例えば、カンファー、ボルネオール及びフェンコンは、クスノキ、ウイキョウ、竜脳樹、ラベンダー等の植物から単離することができる。
【００２３】
上記のテルペンを含む植物からの精油は、公知の方法を用いて抽出することができる。その抽出方法は、該当する植物を、そのまま抽出に供することができるが、より細かく粉砕した後、抽出に供するのが好ましい。
【００２４】
抽出溶媒としては、特に限定的ではなく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；水等を用いることができる。これらの抽出溶媒は、一種単独又は二種以上混合して用いることができる。特に、メタノール、エタノール等のアルコール類、及び酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いることが、取り扱いが容易であり、しかも優れた活性を有する抽出物を得ることができる点で好ましい。
【００２５】
上記した方法によって抽出物を得た後、必要に応じ、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。本発明では、得られた抽出液をそのままＣＹＰ２Ａ６阻害剤として用いることが可能であるが、活性が低い場合もあるため、適宜濃縮又は溶媒を留去して、エキス状や粉末状として用いることもできる。
【００２６】
本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、ＣＹＰ２Ａ６の発現あるいは酵素活性を抑制することで、体内でニコチンを代謝させず長く留まらせ、喫煙者の喫煙回数を減らす働きを有する。そのため、喫煙回数低減剤として有用である。
【００２７】
ＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、従来慣用されている方法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の剤に製剤化することができる。製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分及び配合量を適宜選択して常法により製剤化される。
【００２８】
本発明の製剤を投与する場合、その投与形態は特に限定されず、通常用いられる方法であればよく、例えば、経口、経皮、経肺、吸入、局所、直腸等のいずれでもよい。好適には、チューインガム、点鼻スプレー、口内スプレー、うがい薬、経皮パッチ等の形態が例示される。特に、経皮スキンパッチの形態、ネブライザー等によるエアゾール投与、ディフューザーによる空間への噴霧等で用いることが好適である。
【００２９】
本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、ニコチンとともに用いて、体内でニコチンを代謝させず長く留まらせ、喫煙者の喫煙衝動をより低減することができる。例えば、公知のニコチン製剤（例えば、チューインガム、点鼻スプレー、口内スプレー、うがい薬、経皮パッチ等）とともに上記のＣＹＰ２Ａ６阻害剤の製剤を併用することができる。また、製剤中にＣＹＰ２Ａ６阻害剤とニコチンを含有していても良い。
【００３０】
喫煙者の喫煙回数を低減させるため、フィルター付タバコのフィルターに本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含有させることもできる。また、喫煙ルームなどにおいて、ディフューザーを用いて空間への噴霧することも可能である。
【００３１】
また、本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害活性物質（即ち、ニコチンの代謝阻害物質）のスクリーニング方法は、
(1)ＣＹＰ２Ａ６、サイトゾール、ＮＡＤＰＨ生成系、ニコチン、およびリン酸カリウム緩衝液を含む混合液にサンプルを加えて、サンプル濃度の異なる複数の反応液を調製して反応させる工程、
(2)上記(1)で得られた反応液に、内部標準物質としてトランス−４’−カルボキシコチニンエステル、及び反応停止剤を加えて反応を停止する工程、並びに
(3)上記(2)で得られた反応液を遠心分離した後、その上清をとって、ＨＰＬＣによりコチニンの生成量を定量する工程、
を含む。
【００３２】
このスクリーニング方法によれば、工程(1)の反応では、ＣＹＰ２Ａ６としては例えばバキュロウイルス組換えＣＹＰ２Ａ６、サイトゾールとしては例えばプールドヒト肝サイトゾール等が用いられ、ＮＡＤＰＨ生成系としては例えば0.5mM NADP+、5mM G-6-P、0.5 units/mL G-6-P DH等の系が用いられる。ニコチンは商業的に入手容易なものを用いることができ、例えば東京化成工業（株）、関東化学（株）、Fluka社、SIGMA社、ALDRICH社等の製品を用いることができる。リン酸カリウム緩衝液はpH7.0〜8.0（特に7.4）とすることができる。サンプルを溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（DMSO）が挙げられる。複数の反応液におけるサンプル濃度は、ＣＹＰ２Ａ６の阻害活性の程度により適宜選択することができる。反応は、通常約37℃で30〜120分間で行うことができる。
【００３３】
工程(2)では、内部標準物質であるトランス−４’−カルボキシコチニンエステル（特にメチルエステル）を用いることを特徴とする。また、反応停止剤としては、酵素の反応を停止し得る試薬であり、通常、アセトニトリル／メタノール混合溶液、アセトン等が用いられる。なお、上記の内部標準物質は、入手容易なトランス−４’−カルボキシコチニンをジアゾメタンと反応させるなどして、メチルエステルに変換して調製される。なお、トランス−４’−カルボキシコチニンは商業的に入手容易なものを用いることができ、例えば東京化成工業（株）、ALDRICH社等の製品を用いることができる。
【００３４】
工程(3)では、工程(2)で反応停止された反応液を、通常4〜10℃、1000〜3000rpmで10〜30分間遠心分離して、その上清をサンプリングしてＨＰＬＣでコチニンの生成量を定量する。ＨＰＬＣの分析条件は適宜設定することができるが、例えば、ＯＤＳカラムを用い、移動相としてアセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液を用い、流速を0.1〜1.5mL/min、カラム温度を30〜40℃に設定することができる。コチニンの検出には、例えば260nmのUV波長が用いられる。コチニンの絶対検量線を作成して、コチニンの生成量を算出できる。阻害活性は、各サンプルの50%阻害濃度（IC50値）を求めることにより評価される。
【００３５】
このスクリーニング方法によれば、内部標準物質としてケタミンや３−ヒドロキシコチニンが使用される従来のスクリーニング方法に比べて、安価、簡便かつ正確に評価できるという顕著な効果が発揮される。
【実施例】
【００３６】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［HPLC分析条件］
L-column ODS (4.6 x 150 mm、CERI製)を用い、移動相を10%アセトニトリル/25mMリン酸ナトリウム緩衝液、フローレート（Flow rate）を1.0mL/min、カラム温度を40℃とした。検出には260nm のUV波長を用いた。コチニンの生成量はコチニンの絶対検量線を作成し、それより算出した。阻害の評価はそれぞれの50%阻害濃度であるIC50値を求めることにより行った。
［内部標準物質の調製法］
トランス−４’−カルボキシコチニン（trans-4’-carboxycotinine）(東京化成工業株式会社)30 mgをアセトン20mＬに溶解し、ジアゾメタンを2mＬ加え室温で20分間、反応させた。反応後、溶媒を留去し、メチルエステル体であるトランス−４’−カルボキシコチニン  メチルエステル（trans-4’-carboxycotinine methyl ester）39 mgを得た。
【００３７】
実施例１（HPLCを用いたニコチン代謝分析法）
（＋）−カンファー、（−）−カンファー、（＋）−ボルネオール、（−）−ボルネオール、（＋）−フェンコン、（−）−フェンコンの６種の双環性モノテルペンをサンプルとして用いて、以下のニコチン代謝分析を行った。
【００３８】
5μLのバキュロウイルス組換えCYP2A6（20nmol/mL、BD社製）、15μLのプールドヒト肝サイトゾール(0.3 mg/mＬ、BD社製)、52.5μLのNADPH生成系(0.5mM NADP+、5mM G-6-P、0.5 units/mL G-6-P DH)、10μLのニコチン(50mM)、および50mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.4) を混合し、全量を250μLとした。この混合液を37℃で30分間反応した。阻害剤であるモノテルペンはDMSOに溶解させ、全量250μLの反応系で200, 100, 50, 25 μMになるように調製した。
【００３９】
反応後、内部標準物質として25μLのトランス−４’−カルボキシコチニン  メチルエステル (25μM) および反応停止剤としてアセトニトリル/メタノール（１：１、ｖ/ｖ）混合溶液250μLを加えた。反応停止後、4℃、3,000rpm、で20分間遠心分離した後、上清をとり、HPLCによりコチニンの生成量を定量した。その結果を図１に示す。
【００４０】
図１より、すべての双環性モノテルペンにおいて阻害活性を示した。特に、(+)-カンファー、(+)-フェンコン、(-)-フェンコンにおいて最も強い阻害効果を示し、いずれもIC50値は22 μMであった。また、阻害効果ではアルコール体よりもケトン体の方が、阻害効果が高い傾向にあることが示唆された。
【００４１】
実施例２（製剤例）
実施例１で分析を行ったカンファー及びフェンコンを用いて、下記製造例１〜５の製剤を調製できる。
【００４２】
製剤例１（パッチ製剤付着性ゲル）
【００４３】
【表１】
2010173973.tif 000002
【００４４】
製剤例２（パッチ製剤付着性ゲル）
【００４５】
【表２】
2010173973.tif 000003
【００４６】
製剤例３（スプレー製剤）
【００４７】
【表３】
2010173973.tif 000004
【００４８】
製剤例４（スプレー製剤）
【００４９】
【表４】
2010173973.tif 000005
【００５０】
製剤例５（チューインガム製剤）
下記の組成物Ａを調製する。
【００５１】
【表５】
2010173973.tif 000006
【００５２】
上記の組成物Ａを、下記のガムベース及び香料と混合してチューインガムを製造する。
【００５３】
【表６】
2010173973.tif 000007
【００５４】
製剤例６（パッチ製剤付着性ゲル）
【００５５】
【表７】
2010173973.tif 000008
【００５６】
製剤例７（パッチ製剤付着性ゲル）
【００５７】
【表８】
2010173973.tif 000009
【００５８】
製剤例８（スプレー製剤）
【００５９】
【表９】
2010173973.tif 000010
【００６０】
製剤例９（スプレー製剤）
【００６１】
【表１０】
2010173973.tif 000011
【００６２】
製剤例１０（チューインガム製剤）
下記の組成物Ｂを調製する。
【００６３】
【表１１】
2010173973.tif 000012
【００６４】
上記の組成物Ｂを、下記のガムベース及び香料と混合してチューインガムを製造する。
【００６５】
【表１２】
2010173973.tif 000013
【図１】
2010173973.tif 000014