(57)【要約】【課題】試料溶液中の有害金属の総濃度を測定するための試薬及び方法を提供すること。【解決手段】水溶性ポルフィリン誘導体及び亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を含有することを特徴とする有害金属測定用試薬及び当該試薬を用いた有害金属濃度測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ポルフィリン誘導体及び亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を含有することを特徴とする有害金属測定用試薬。
【請求項２】
水溶性ポルフィリン誘導体が、次の式（１）、
【化１】
2010276567.tif 000007
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、同一又は異なって４−スルホニルフェニル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−カルボキシルフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基、Ｎ−スルホニルプロピル−３−イル基、又は４−スルホニルチエニル−２−イル基を示す）で表される水溶性ポルフィリン化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物であるか、又はビニル基を有するポルフィリン化合物とビニル系単量体をラジカル共重合させてなるポルフィリン導入ポリマーである請求項１記載の有害金属測定用試薬。
【請求項３】
亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体が、亜鉛−メタロチオネイン複合体又は亜鉛−フィトケラチン複合体である請求項１又は２記載の有害金属測定用試薬。
【請求項４】
有害金属が、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、銀、パラジウム、セレン及びニッケルからなる群から選ばれる１種以上の金属またはそのイオンである請求項１〜３のいずれか１項記載の有害金属測定用試薬。
【請求項５】
有害金属測定用試薬が、重金属毒性評価試薬である、請求項１〜４のいずれか１項記載の有害金属測定用試薬。
【請求項６】
（１）水溶性ポルフィルン誘導体、亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体、及び試料溶液を混合する工程、及び（２）工程（１）で得られた混合溶液の吸光度を測定する工程を有することを特徴とする試料溶液中の有害金属濃度の測定方法。
【請求項７】
水溶性ポルフィリン誘導体が、次の式（１）、
【化２】
2010276567.tif 000008
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、同一又は異なって４−スルホニルフェニル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−カルボキシルフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基、Ｎ−スルホニルプロピル−３−イル基、又は４−スルホニルチエニル−２−イル基を示す）で表される水溶性ポルフィリン化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物であるか、又はビニル基を有するポルフィリン化合物とビニル系単量体をラジカル共重合させてなるポルフィリン導入ポリマーである請求項６記載の測定方法。
【請求項８】
亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体が、亜鉛−メタロチオネイン複合体又は亜鉛−フィトケラチン複合体である請求項６又は７記載の測定方法。
【請求項９】
有害金属が、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、銀、パラジウム、セレン及びニッケルからなる群から選ばれる１種以上の金属またはそのイオンである請求項６〜８のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項記載の方法により測定された値を指標にすることを特徴とする、試料溶液の重金属毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中に含まれる有害金属の総濃度を測定するための試薬及び方法に関する。また、本発明は当該試料溶液の簡易な重金属毒性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重金属は、極めて微量であれば生物にとっての必須元素となっているものもあるが、過剰摂取による毒性が強く、生態系に影響を及ぼすだけでなく、ヒトの神経や腎臓、脳などの様々な部位に障害をもたらすことが知られている。一方で、重金属は現代生活で一般的に使用される様々な工業製品に不可欠であり、これらの製造から廃棄に至る過程で重金属の環境中への流出が問題となっている。
【０００３】
そのため、自然環境やヒトの健康を考慮する上で、工業排水や環境水中に含まれる重金属濃度やその毒性の程度を把握することは重要であり、各種測定方法にてこれらの把握がなされているが、未だ十分な方法とはいえない。
【０００４】
例えば、試料溶液中の各金属濃度の定量的な測定方法としては、原子吸光光度法やICP発光分光分析法あるいはICP質量分析法といった化学的な測定法が挙げられるが、この測定法は特殊な装置が必要であり、また、複数の金属が多様な化学的形態で共存する試料溶液中の総合的な有害金属濃度を測定することは難しく、また試料溶液中に金属キレート等が存在する場合では毒性が低減化される点も考慮しなければならないので、この測定結果から直ちに毒性を評価するのも難しい。
【０００５】
また、ポルフィリン化合物、ポルフィリン導入ポリマー等のポルフィリン誘導体の発色を利用した吸光度法による金属の測定法が知られている（特許文献１〜２、非特許文献１）。これらポルフィリン誘導体を用いることにより微量金属の測定を行なうことができるものの、複数の有害金属を同時に定量的に簡易に測定することや試料溶液中の有害金属による毒性の評価の指標とすることはできなかった。
【０００６】
また、メタロチオネインの一種であるフィトケラチンと、重金属を反応させ、反応溶液中の未反応のフィトケラチンをモノクローナル抗体を用いて定量する方法（特許文献３）が知られているが、この方法ではフィトケラチンが全て未反応の場合の吸光度が０．１０程度と検出の精度が非常に悪く、しかも試料溶液中の重金属濃度が１μＭ以下では重金属を正確に検出することが困難であった。
【０００７】
また、試料溶液の毒性の評価方法としては、水生生物やバクテリア、培養細胞といった供試生物に試料溶液を曝し、生存数や生物活性、形態を計測・観察する生物検定法（バイオアッセイ）が知られているが、供試生物の取扱いには熟練した技術や厳重な管理、大掛かりな設備を必要とするため、多様な金属を含有する試料溶液の総合的な有害金属の濃度及びその毒性を簡易に評価することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５５０７２号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６４３７０６７号公報
【特許文献３】特開平１１−１７４０５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「第２２版総合カタログ」株式会社同仁化学研究所、平成１２年１月、ｐ２６８〜２７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、試料溶液中の有害金属の総濃度を測定するための試薬及び方法を提供することを目的とする。さらには、その試料溶液中の重金属の毒性を簡易に評価するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、斯かる実情に鑑み鋭意検討の結果、水溶性ポルフィリン誘導体を含む重金属測定用試薬に、亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を含有させることによって、従来感度よく測定することができなかった種々の重金属についても感度よく測定できるようになること、更にこれら重金属は主に有害金属であったことから、試料溶液中の単数又は複数の有害金属の総濃度を測定することができることを見出した。さらに、この方法で測定された値（有害金属濃度）は、試料溶液の重金属の毒性の指標にも用いることができること、具体的には、この水溶性ポルフィリン誘導体及び亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を含有する重金属測定用試薬を用いて測定された値と、発光バクテリアを用いた一般的なバイオアッセイによる発光阻害率とに高い相関性が認められたことから、当該試薬の測定結果を、試料溶液の重金属の毒性の指標にも用いることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、水溶性ポルフィリン誘導体と亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を含有することを特徴とする有害金属測定用試薬、及び該試薬に試料溶液を混合し、その吸光度を測定することを特徴とする試料溶液中の有害金属濃度の測定方法、さらには該測定方法によって得られた値を指標にすることを特徴とする試料溶液の重金属の毒性評価方法を提供するものである。
【００１３】
本発明を詳述すると以下の通りである。
［１］水溶性ポルフィリン誘導体及び亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を含有することを特徴とする有害金属測定用試薬。
【００１４】
［２］水溶性ポルフィリン誘導体が、次の式（１）、
【００１５】
【化１】
2010276567.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、同一又は異なって４−スルホニルフェニル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−カルボキシルフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基、Ｎ−スルホニルプロピル−３−イル基、又は４−スルホニルチエニル−２−イル基を示す）で表される水溶性ポルフィリン化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物であるか、又はビニル基を有するポルフィリン化合物とビニル系単量体をラジカル共重合させてなるポルフィリン導入ポリマーである［１］記載の有害金属測定用試薬。
【００１７】
［３］亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体が、亜鉛−メタロチオネイン複合体又は亜鉛−フィトケラチン複合体である［１］又は［２］記載の有害金属測定用試薬。
【００１８】
［４］有害金属が、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、銀、パラジウム、セレン及びニッケルからなる群から選ばれる１種以上の金属またはそのイオンである［１］〜［３］のいずれかに記載の有害金属測定用試薬。
【００１９】
［５］有害金属測定用試薬が、重金属毒性評価試薬である［１］〜［４］のいずれかに記載の有害金属測定用試薬。
【００２０】
［６］（１）水溶性ポルフィリン誘導体、亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体、及び試料溶液を混合する工程、及び（２）工程（１）で得られた混合溶液の吸光度を測定する工程を有することを特徴とする試料溶液中の有害金属濃度の測定方法。
【００２１】
［７］水溶性ポルフィリン誘導体が、次の式（１）、
【００２２】
【化２】
2010276567.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、同一又は異なって４−スルホニルフェニル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−カルボキシルフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基、Ｎ−スルホニルプロピル−３−イル基、又は４−スルホニルチエニル−２−イル基を示す）で表される水溶性ポルフィリン化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物であるか、又はビニル基を有するポルフィリン化合物とビニル系単量体をラジカル共重合させてなるポルフィリン導入ポリマーである［６］記載の測定方法。
【００２４】
［８］亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体が、亜鉛−メタロチオネイン複合体又は亜鉛−フィトケラチン複合体である［６］又は［７］記載の測定方法。
【００２５】
［９］有害金属が、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、銀、パラジウム、セレン及びニッケルからなる群から選ばれる１種以上の金属またはそのイオンである［６］〜［８］のいずれかに記載の測定方法
【００２６】
［１０］［６］〜［９］のいずれかの測定方法で測定された値を指標にすることを特徴とする、試料溶液の重金属毒性評価方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の有害金属測定用試薬及び当該試薬を用いた有害金属濃度測定方法は、試料溶液中に含まれる単数又は複数の有害金属の総濃度を簡易に測定することができると共に、測定された値を基に試料溶液中の有害金属による総合的な毒性評価の指標とすることも可能であり、排水、廃液、土壌溶出液等の重金属毒性評価に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＺｎとＴＰＰＳの錯形成によって生じた吸収スペクトルを示す図である。
【図２】ＢｉによってＭＴから解離したＺｎとＴＰＰＳが錯形成することによって生じた吸収スペクトルを示す図である。
【図３】加熱温度毎のＡ４２３の時間変化を示す図である。
【図４】Ａ４２３のｐＨ依存性を示す図である。
【図５】各ＭＴ濃度におけるＢｉ濃度に対するＡ４２３の変化を示す図である。
【図６】有害金属測定用試薬と鉛、銅、及びカドミウム溶液との反応によって生じた吸収スペクトルを示す図である。
【図７】様々な金属溶液と有害金属測定用試薬を反応させたときのＡ４２３の変化量を示す図である。
【図８】試料溶液中の１６種類の金属濃度に対するＡ４２３を示す図である。
【図９】試料溶液中の９種類の金属濃度に対するＡ４２３を示す図である。
【図１０】発光バクテリアを用いた各金属溶液の毒性評価を示す図である。
【図１１】発光阻害率とＡ４２３の関係を示す図である。
【図１２】ビスマスによってＭＴから解離したＺｎとポルフィリン導入ポリマー（ＰＰＮａ2−ＡＡｍ）との錯形成によって生じた吸収スペクトルを示す図である。
【図１３】亜鉛−フィトケラチン複合体を用いた有害金属測定用試薬と各金属溶液を反応させたときのＡ４２３の変化量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明での有害金属とは、過剰または継続的な摂取により生物に対する毒性を発揮する金属またはそのイオンであり、その特徴として特にチオール基（ＳＨ基）との高い親和性を有する金属またはそのイオンを意味する。
具体的な有害金属としては、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、銀、パラジウム、セレン及びニッケル等から選ばれる１種以上の金属またはそのイオンが挙げられる。このうち、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、パラジウム及び銀が、更に、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト及びパラジウムが、チオール基（ＳＨ基）との高い親和性を有する金属であり、本発明の測定法による測定値と毒性との相関性が高い点から、好ましい。
【００３０】
また、本発明における有害の対象の生物は、本発明に使用されるメタロチオネイン様タンパクが哺乳類から魚介類に至る動物全般、植物、酵母等の真核生物、原核生物に至るまで広く存在しており、このメタロチオネイン様タンパクに有害金属が結合すること、また後記実施例に示すように本発明の測定法にて得られた測定結果は発光バクテリアを用いたバイオアッセイの測定結果とも高い相関性を有することから、植物、動物、微生物のいずれにも限定されない。このうち、急性又は慢性の毒性が発現し易い、動物又は微生物が好ましい。また、用いるメタロチオネイン様タンパクの由来と、対象とする生物とが類縁であるのが好ましい。
具体的な対象の生物としては、ウナギ、ヒラメ、コイ、タイ、アオガイ、アマグリ、エビ、ハマグリ等の魚介類：ニワトリ、ウズラ、ダチョウ、ハト等の鳥類；ヒト、サル、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ネズミ、イヌ、ネコ、シカ、アザラシ等の哺乳類等が挙げられ、このうち、鳥類及び哺乳類、更に哺乳類を対象とするのが好ましく、特にヒトを対象とするのが、上記重金属によって急性又は慢性疾患になり易い点から、好ましい。
【００３１】
本発明で使用する水溶性ポルフィリン誘導体とは、ポルフィリン骨格を有し、水溶性で、亜鉛イオンと反応して特定波長の光の吸光度が変化するものであればよい。
上記の条件を満たすものであれば、ポルフィリン骨格の周囲に置換基を有する水溶性ポルフィリン化合物、若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物でもポリマー鎖に１個以上のポルフィリン骨格を有するポルフィリン導入ポリマーでもよい。このような水溶性ポルフィリン誘導体は、微量金属の比色試薬として公知の化合物を包含する。
例えば「第２２版総合カタログ」株式会社同仁化学研究所、平成１２年１月、ｐ２６８〜２７１に記載されている水溶性ポルフィリン化合物、若しくはその塩、またはそれらの溶媒和物やＷＯ２００４／０５５０７２号パンフレットに記載されているポルフィリン導入ポリマーが挙げられる。
【００３２】
水溶性ポルフィリン化合物としては、次の式（１）、
【００３３】
【化３】
2010276567.tif 000004
【００３４】
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、同一又は異なって４−スルホニルフェニル基、４−トリメチルアンモニウムフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、４−カルボキシルフェニル基、Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル基、Ｎ−メチルピリジニウム−３−イル基、Ｎ−スルホニルプロピル−３−イル基、又は４−スルホニルチエニル−２−イル基を示す）で表される化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物が挙げられる。
式（１）で示される化合物の好ましい塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩、硫酸塩等の無機酸付加塩、又はトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。
また、好ましい溶媒和物としては水和物等が挙げられる。
【００３５】
具体的なポルフィリン導入ポリマーとしては、ビニル基を有するポルフィリン化合物とビニル系単量体をラジカル共重合させてなるポルフィリン導入ポリマーが挙げられる。
【００３６】
ポルフィリン導入ポリマーを構成するビニル基を有するポルフィリン化合物としては、例えば、プロトポルフィリンＩＸ、プロトポルフィリンＩＸジメチルエステル、プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩、及び５，１０，１５，２０−テトラキス（４−（アリロキシ）フェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン等が挙げられ、これらのポルフィリン化合物は市販品として入手することができる。
【００３７】
ポルフィリン導入ポリマーを構成するビニル系単量体としては、アクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、５−ヘキセン酸、アリルアミン、３−ブテン酸、β−メタリルアルコール、アリルアルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、１−ビニルイミダゾール、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、塩化アリル、酢酸ビニル、クロトンアミド、マレイン酸、フマル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、トランス−１，２−ジクロロエチレン、シトラコン酸、メサコン酸、アンゲリカ酸、チグリン酸、２−メチル−２−ブテン等が挙げられる。
【００３８】
好ましい水溶性ポルフィリン誘導体としては、５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリンテトラスルホン酸（以下、ＴＰＰＳと略する場合がある）や、プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩とアクリルアミドをラジカル共重合したポルフィリン導入ポリマー（以下、ＰＰＮａ2−ＡＡｍと略する場合がある）等が挙げられる。
【００３９】
ＴＰＰＳは、例えばピロールとベンズアルデヒドの脱水縮合と、ｐ−クロラニルによる酸化によって得られるテトラフェニルポルフィリンのフェニル基を、濃硫酸中でスルホン化することによって製造することができる（Ｊ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｉ．Ｃ．Ｓｃｈｒｅｉｍａｎ，Ｈ．Ｃ．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ，Ａ．Ｍ．Ｍａｒｇｕｅｒｅｔｔａｚ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，ｖｏｌ．５２，ｐ８２７−８３６）。また、市販品として入手することも可能である。ＰＰＮａ2−ＡＡｍはＷＯ２００４／０５５０７２の実施例１に記載の方法によって製造することができる。
【００４０】
本発明で使用する水溶性ポルフィリン誘導体の使用量は、試料溶液中に含まれる有害金属の量によって適宜変更することができるが、有害金属測定用試薬と試料溶液を混合した状態における水溶性ポルフィリン誘導体（但し、ポルフィリン導入ポリマーの場合はポルフィリン骨格を１つ有するモノマー単位）の濃度として、０．０１〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、更に０．１〜５００μｍｏｌ／Ｌ、特に１〜１００μｍｏｌ／Ｌであるのが、試料溶液中に含まれる有害金属濃度測定及び毒性評価の精度の点で好ましい。
【００４１】
本発明で使用する亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体は、メタロチオネイン様タンパクにあらかじめ亜鉛が結合（錯形成）しているものである。メタロチオネイン様タンパクとは、重金属処理によって発現が誘導され、構成アミノ酸に占めるシステインの割合が高いタンパク質またはペプチドである。メタロチオネイン様タンパクは、動物全般、植物、酵母等の真核生物の他、原核生物に至るまで広くその存在が確認されている。ウマの腎臓から単離された分子量６０００〜７０００のメタロチオネイン様タンパクとアミノ酸配列が類似するものは、単にメタロチオネインと呼ばれる。哺乳動物から抽出されたメタロチオネイン様タンパクの多くは、メタロチオネインに含まれる。また、植物や酵母から抽出されたメタロチオネイン様タンパクには、アミノ酸配列が（γグルタミン酸−システイン）ｎ−グリシン（ｎは２以上の整数）で一般的に表されるフィトケラチン（ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎ）がある。フィトケラチンのうちｎが２又は３のものを特にカディスチン（Ｃａｄｙｓｔｉｎ）と呼ぶ。カディスチンを含むフィトケラチンは、メタロチオネインのアミノ酸配列と遠縁であるものの、メタロチオネインの名で呼ばれることもある（Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０５：８−１０）。
【００４２】
メタロチオネイン様タンパクは、構成アミノ酸残基に占めるシステイン残基の割合が高いことが特徴である。そのため、システイン残基のＳＨ基を介して様々な金属と結合することが可能であり、生体内では、有害金属を結合することによる解毒作用や必須金属の運搬や恒常性維持等の役割を担っていると考えられている。
本発明で使用できる亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体を構成するメタロチオネイン様タンパクとしては、銅、鉛、亜鉛、ビスマス、カドミウム、水銀、コバルト、銀、パラジウム、セレン及びニッケルとの結合能を有する限りは任意のものを使用することができ、天然由来のメタロチオネイン様タンパクの他、化学合成又は遺伝子組み換え技術により作製したメタロチオネイン様タンパクの何れでもよい。
天然由来のメタロチオネイン様タンパクを入手する場合は、メタロチオネイン様タンパクを発現している魚介類〜哺乳類等の各種動物（例えば、ヒト、サル、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ハムスター、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、アザラシ等の哺乳類；ニワトリ、ウズラ等の鳥類；ウナギ、ヒラメ、コイ、タイ、アオガイ、アマグリ、エビ、ハマグリ、ウニ等の魚介類等）、酵母又は植物（例えば、マメ、トウモロコシ）の細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。
化学合成によりメタロチオネイン様タンパクを合成する場合は、Ｂｏｃ法やＦｍｏｃ法といったペプチド固相合成法等の化学合成法に従ってメタロチオネイン様タンパクを合成することができる。
遺伝子組み換え技術によりメタロチオネイン様タンパクを産生する場合は、メタロチオネイン様タンパクをコードする塩基配列を有するＤＮＡを適切な発現系に導入することによりメタロチオネイン様タンパクを製造することができる。
また、市販品として、例えばＡＬＥＸＩＳ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社、ＡｎａＳｐｅｃ社、シグマ−アルドリッチ社、コスモバイオ株式会社、又はフナコシ株式会社等から入手することも可能である。
【００４３】
上記の方法で入手したメタロチオネイン様タンパクには、金属の結合していないメタロチオネイン（アポメタロチオネイン）様タンパクの他、亜鉛等の金属が結合しているものがあり、結合している金属の組成は生物種、組織、重金属の曝露状態、合成条件、発現条件によって異なる。アポメタロチオネイン様タンパクは、中性又はアルカリ性溶液に溶解し亜鉛源を添加することにより、本発明で使用できる亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体とすることができる。亜鉛が結合しているメタロチオネイン様タンパクは、そのまま亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体として本発明に使用できる。亜鉛以外の金属が結合しているメタロチオネイン様タンパクは、酸性溶液に溶解して金属を解離させてアポメタロチオネイン様タンパクとした後、タンパク質の単離・精製法を適宜組み合わせて単離し、亜鉛源を与えることにより、本発明で使用できる亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体とすることができる。亜鉛源としては、塩化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、硫酸亜鉛等の水溶性無機塩や酢酸亜鉛、乳酸亜鉛、サリチル酸亜鉛等の水溶性有機亜鉛等が使用できる。
【００４４】
亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体に結合している亜鉛の数は、メタロチオネイン様タンパク１分子に対して、１個以上結合しているものであればよく、更に３個以上、特に６個以上結合していることが好ましい。
【００４５】
亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体の使用量は、試料溶液中に含まれる有害金属の量によって適宜変更することができるが、有害金属測定用試薬と試料溶液を混合した状態における亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体の濃度として、０．０１〜１００μＭ、特に０．１〜１０μＭであることが好ましい。
有害金属測定用試薬と試料溶液を混合した状態における亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体が上記の濃度で含まれていれば、亜鉛が結合していないメタロチオネイン様タンパクが共存してもよいが、全メタロチオネイン様タンパクのモル濃度に占める亜鉛−メタロチオネイン様タンパクのモル濃度の割合は、１％以上、さらには１０％以上であることが好ましい。
【００４６】
本発明で使用することができる亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体としては、メタロチオネインと亜鉛とが結合した亜鉛−メタロチオネイン複合体又はフィトケラチンと亜鉛とが結合した亜鉛−フィトケラチン複合体が好ましい。
【００４７】
本発明の有害金属測定用試薬は、水溶性ポルフィリン誘導体と亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体（場合によっては水溶性ポルフィリン誘導体と、亜鉛と、メタロチオネイン様タンパク）と、適宜他の任意成分とを、混合したものでも、それぞれが別々のキット形式になったものでもよい。
【００４８】
本発明の有害金属測定用試薬には水溶性ポルフィリン誘導体、亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体、及び水、この他、本発明の効果を損なわない範囲で、通常溶液中の重金属イオンの測定に使用される任意成分を加えることができる。このような任意成分としては、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリスヒドロキシメチル−メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、酢酸、リン酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等が挙げられ、３−モルホリノプロパンスルホン酸が好ましい。
【００４９】
本発明の有害金属の測定方法は、上記水溶性ポルフィリン誘導体、上記亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体及び試料溶液を混合する工程；当該混合して得られた混合液の吸光度を測定する工程を含むものである。
そして、試料溶液中に含まれる単数又は複数の有害金属によって亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体から亜鉛が遊離し、この遊離した亜鉛が水溶性ポルフィリン誘導体と錯体を形成し、この形成によって水溶性ポルフィリン誘導体の吸収波長に変化が生じて特定の範囲の吸光波長となり、この吸光度変化を測定することによって、試料溶液中の有害金属の総濃度を測定することができる。
【００５０】
本発明の有害金属測定用試薬を使用して有害金属を測定する際のｐＨは、５〜１１であることが好ましく、より好ましくは６〜９、高感度となる点から、最も好ましくは７〜９である。
有害金属測定用試薬と試料溶液との混合液のｐＨがこの範囲外である場合は、この範囲になるように当該混合液のｐＨをｐＨ調整剤で調整するのが好ましい。
その際、添加されるｐＨ調整剤の濃度は、有害金属測定用試薬と試料溶液との混合液に対して、１〜１０００ｍＭ、特に５〜５００ｍＭであることが好ましい。
本発明の有害金属測定用試薬を使用して有害金属を測定する際、有害金属測定用試薬と試料溶液の混合液を加熱処理することが、迅速で高感度な測定となる点から好ましい。
このときの加熱温度は、２０〜９０℃、特に６０〜８０℃であるのが好ましい。また、加熱時間は、１〜１２０分、更に５〜９０分、特に３０〜７０分であるのが好ましい。
また、吸光度計による測定における吸光波長は、使用する水溶性ポルフィリンが亜鉛と結合することによって起こる吸光度変化を検出できる波長であれば特に制限はないが、３５０〜７００ｎｍが好ましく、より好ましくは４００〜５００ｎｍ、更に好ましくは４００〜４５０ｎｍ、最も好ましくは４１５〜４３５ｎｍである。
【００５１】
本発明の有害金属の総濃度は、有害金属の標準溶液を基準として算出することができ、また、後記実施例から明らかなように９種の有害金属の総濃度と試料溶液の測定値（Ａ４２３）とに高い相関性が認められたことから、例えば後記実施例８のような場合であれば、試料溶液の測定値（吸光度）から以下の式（１）によって算出することもできる。
有害金属の総濃度（μＭ）＝（吸光度）／（０．２±０．０５）      式（１）
【００５２】
本発明の測定方法にて対象とする試料は、海水、水道水、河川水、排水、廃液、土壌溶出液等の環境試料が好ましいが、特に限定されず、畜肉、農林水産物、飲料等の食品試料や、ヒト又は動物の血液、唾液等の体液等の生体試料であってもよい。
対象とする試料は、そのまま試料溶液としてもよいし、適宜濃縮したり純水等で希釈したりして試料溶液としてもよい。試料溶液中の有害金属濃度が、本発明の有害金属測定用試薬を用いた測定方法で測定できる範囲よりも高い場合は、該試料溶液を純水等で希釈し、その希釈液を試料溶液として同様な測定を行えばよい。その場合は、得られた吸光度を希釈倍率によって割り返すことにより、希釈前の試料溶液を用いたときの吸光度に換算することができる。
【００５３】
本発明の測定用試薬を用いた測定方法は、植物、動物及び微生物に広く存在するメタロチオネイン様タンパクを亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体として用い、試料溶液中の有害金属がこれに結合して亜鉛を遊離させることから、供試生物を用いた毒性評価に類似すると考えられ、しかも試料溶液中の有害金属が低濃度でも精度よく検出することが可能であり、その測定結果はバイオアッセイの測定結果とも高い相関関係を有する。
従って、本発明の測定用試薬及びこれを用いた測定方法は、重金属毒性評価試薬及びこれを用いた重金属毒性評価方法として使用することができる。
そして、本発明の重金属毒性評価方法は、本発明の測定用試薬により測定された値（吸光度）を指標として簡易に生物に対する重金属の毒性の評価を行うことができ、しかも、溶液中に金属キレート等が存在し、重金属の毒性が低減した場合でもこれに対応した毒性の評価を行うこともできる。また、大掛かりな測定装置や設備を必要とせず、供試生物を用いなくともよい。
具体的には、本発明の測定方法で測定された値（有害金属濃度）が、一般的に急性又は慢性毒性とされるような基準値よりも高ければ、毒性が強いと評価でき、一方低ければ毒性が弱い又はないと評価できる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１  水溶性ポルフィリンと遊離亜鉛との反応
亜鉛−メタロチオネイン様タンパク複合体として、市販品のウサギ肝臓由来の亜鉛−メタロチオネイン複合体（ＡＬＥＸＩＳ  ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ社製）（以下、ＭＴと略する場合がある）を使用した。この亜鉛−メタロチオネイン複合体は、メタロチオネイン１分子あたり亜鉛が平均約６．１個結合したものであった。
水溶性ポルフィリン誘導体であるＴＰＰＳ、及びｐＨ調整剤であるＭＯＰＳは、株式会社同仁化学研究所から入手した。
亜鉛（Ｚｎ）溶液は、１０００ｍｇ/Ｌの原子吸光用亜鉛標準液（関東化学株式会社製）を超純水で希釈して調製した。
【００５６】
（ＴＰＰＳ＋Ｚｎ）溶液として、ＴＰＰＳを２．５μＭ、Ｚｎを１．２８μＭ、及びＭＯＰＳを５０ｍＭ含む溶液（ｐＨ７．２）を調製した。
また、ブランクとして、ＴＰＰＳを２．５μＭ、及びＭＯＰＳを５０ｍＭ含む溶液（ｐＨ７．２）を調製した。
それぞれの溶液を７５℃で５分加熱後、ブランクに対する吸収スペクトルを測定した。得られた吸収スペクトルを図１に示す。ＴＰＰＳとＺｎの錯形成によって、４２３ｎｍに吸収ピークが生じた。
【００５７】
次に、（ＴＰＰＳ＋ＭＴ）溶液として、Ｚｎの代わりにＭＴを０．２１μＭ含む溶液を調製した。ＭＴ１分子には６．１個のＺｎが結合しているため、この溶液にも１．２８μＭのＺｎが含まれていることになる。
しかしながら、この溶液の加熱処理後に得られた吸収スペクトルは、４２３ｎｍにピークを示さなかった（図１）。これは、ＭＴがＺｎと強く結合しているため、ＭＴからＺｎが遊離せずＴＰＰＳと錯体を形成しなかったことを示している。このように、ＴＰＰＳはＭＴに結合していない遊離なＺｎとのみ錯形成し、４２３ｎｍの吸光度変化を生じることが示された。
【００５８】
実施例２  ビスマスによってＭＴから遊離したＺｎの検出
原子吸光用ビスマス（Ｂｉ）標準液（関東化学株式会社製）を超純水で希釈してＢｉ溶液を調製した。
ＴＰＰＳを２．５μＭ、ＭＴを０．２１μＭ、Ｂｉを０〜１μＭ、及びＭＯＰＳを５０ｍＭ含む溶液（ｐＨ７．２）（ＭＴあり）を７５℃で５分加熱後、実施例１と同じブランクに対する吸収スペクトルを測定した（図２ａ）。Ｂｉ濃度に応じて４２３ｎｍの吸光度が増加した。また、そのスペクトルの形状は実施例１で示したＺｎとＴＰＰＳの錯形成によって生じたスペクトル形状と一致した。
ところが、同様な測定をＭＴ未添加の溶液（ＭＴなし）で行った場合は、吸収スペクトルの変化は観察されなかった（図２ｂ）。
このことから、ＢｉはＭＴのＳＨ基との親和性が強く、ＢｉがＭＴに結合することによってＭＴからＺｎが遊離し、その遊離したＺｎとＴＰＰＳが錯体を形成し吸収スペクトルの変化が生じたことが示された。
【００５９】
実施例３  反応条件の検討
反応温度：ＴＰＰＳを２．５μＭ、ＭＴを０．２１μＭ、Ｂｉを１μＭ、及びＭＯＰＳを５０ｍＭ含む溶液（ｐＨ７．２）を調製した。Ｂｉを含まない同じ組成の溶液をブランクとして調製した。
これら溶液を、様々な温度（３０，４５，６０，７５，９０℃）で加熱したときのブランクに対する４２３ｎｍの吸光度（Ａ４２３）の時間変化（５，１５，３０，６０，１２０分）を測定した（図３）。加熱温度が３０℃のとき、Ａ４２３は緩やかに上昇し、１２０分後で０．１となった。加熱温度の上昇に伴いＡ４２３の増加率も上昇し、加熱温度７５℃では６０分で０．３に達し、その後はほぼ一定の値を保った。加熱温度が９０℃のときは、３０分で最大値に達した後、急速に減少した。これらの結果から、加熱処理によって迅速で高感度な測定が可能になることが示された。また、９０℃以上の高温で長時間加熱するとＡ４２３は減少し、感度が低下することがわかった。以下の実施例では、加熱温度及び時間は、７５℃及び６０分とした。
測定ｐＨ：ＴＰＰＳを２．５μＭ、ＭＴを０．２１μＭ、Ｂｉを１μＭ、及び各ｐＨ調整剤を５０ｍＭ含む様々なｐＨ（３．９〜１０．１）の溶液を調製した。ｐＨ調整剤として、ｐＨ３．９には酢酸、ｐＨ５．５及び６．１にはＭＥＳ、ｐＨ７．２にはＭＯＰＳ、７．９及び９．１にはＴＡＰＳ、１０．１にはＣＡＰＳを用いた。
各ｐＨでの加熱処理後のＡ４２３の値を図４に示す。Ａ４２３はｐＨ４付近から上昇し、８付近で最大となり、それ以上では単調に減少した。このことから、ｐＨは５〜１１の間が望ましいことが示された。以下の実施例では、溶液のｐＨはＭＯＰＳを用いて７．２とした。
ＭＴ濃度：ＴＰＰＳを２．５μＭ、ＭＴを０．０７〜０．３５μＭ（０．０７，０．１４，０．２１，０．２８，０．３５μＭ）、Ｂｉを０〜２．５μＭ（０，０．５，１，１．５，２，２．５μＭ）、及び５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）を含む溶液を調製し、加熱処理後のＡ４２３を測定した（図５）。Ａ４２３は、Ｂｉ濃度に応じてほぼ直線的に増加し、やがて飽和して一定値を保った。ＭＴ濃度が増すにつれて、飽和に達するのに要するＢｉ濃度も増加した。これは、ＭＴに結合していたＺｎがＢｉ濃度に応じて解離し、すべてのＺｎが解離するとＡ４２３が変化しなくなることを示している。
また、Ａ４２３の増加率はＭＴ濃度に依存しなかった。すなわちＭＴ濃度は、遊離Ｚｎの検出感度には影響せず、測定可能な範囲の上限を規定していた。
これらの結果より、以後の実施例では、特に断りがない限り５μＭのＴＰＰＳ、０．４２μＭのＭＴ、１００ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）を含む溶液を本発明の有害金属測定用試薬として使用することとした。そして、この有害金属測定用試薬と試料溶液を体積比１：１で混合し、７５℃で６０分加熱した後、試料溶液に水を用いた場合をブランクとしてＡ４２３を測定することで、試料溶液中の有害金属濃度を求めた。なお、混合後の溶液中のＴＰＰＳ、ＭＴ、及びＭＯＰＳの濃度は、２．５μＭ、０．２１μＭ、及び５０ｍＭとなる。
【００６０】
実施例４  有害金属測定用試薬と鉛、銅、カドミウム溶液との反応
鉛（Ｐｂ）、銅（Ｃｕ）、及びカドミウム（Ｃｄ）の原子吸光用標準液（いずれも１０００ｍｇ／Ｌ、関東化学株式会社製）を超純水で希釈して１μＭのＰｂ、Ｃｕ、及びＣｄ溶液を調製して試料溶液とした。有害金属測定用試薬０．２ｍＬと試料溶液０．２ｍＬを混合し、加熱後、吸収スペクトルを測定した。比較として、ＭＴ以外の成分は同じでＭＴを含まない測定用試薬を用意し、同様に吸収スペクトルを測定した。得られた吸収スペクトルを図６に示す。
試料溶液がＰｂを含む場合（図６ａ）、ＭＴを含まない測定用試薬（ＴＰＰＳ）においては、４６５ｎｍ付近に吸収ピークが観察された。これはＴＰＰＳとＰｂが錯体を形成したことを示しており、このことは公知である。一方、本発明の有害金属測定用試薬（ＴＰＰＳ／ＭＴ）を用いたときは、４６５ｎｍ付近に吸収ピークは観察されず、４２３ｎｍに吸収ピークが観察された。すなわちＰｂは、ＴＰＰＳに結合せずＭＴと結合し、それによってＭＴから解離したＺｎとＴＰＰＳが錯体を形成することが示された。
試料溶液がＣｕの場合（図６ｂ）、ＭＴを含まない測定用試薬（ＴＰＰＳ）においては、４０９ｎｍ付近に吸収ピークが観察された。これはＴＰＰＳとＣｕが錯体を形成したことを示しており、ＴＰＰＳがＣｕと強固に結合することは公知である。一方、本発明の有害金属測定用試薬（ＴＰＰＳ／ＭＴ）を用いたときは、４２３ｎｍに吸収ピークが観察された。すなわちＣｕは、ＴＰＰＳに結合せずＭＴと結合し、それによってＭＴから解離したＺｎとＴＰＰＳが錯体を形成することが示された。
試料溶液がＣｄの場合（図６ｃ）、ＭＴを含まない測定用試薬（ＴＰＰＳ）においては、４３４ｎｍ付近に吸収ピークが観察された。これはＴＰＰＳとＣｄが錯体を形成したことを示しており、このことは公知である。一方、本発明の有害金属測定用試薬（ＴＰＰＳ／ＭＴ）を用いたときは、４３４ｎｍ付近に吸収ピークは観察されず、４２３ｎｍに吸収ピークが観察された。すなわちＣｄは、ＴＰＰＳと結合せず、ＭＴに結合し、それによってＭＴから解離したＺｎとＴＰＰＳが錯体を形成することが示された。
本発明の有害金属測定用試薬において、上述のとおり、Ｂｉ、Ｐｂ、Ｃｕ及びＣｄともに、同じ波長でそれらの濃度を測定できることが示された。
【００６１】
実施例５  有害金属測定用試薬と様々な金属溶液との反応
銀（Ａｇ）、ヒ素（Ａｓ）、ホウ素（Ｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、カルシウム（Ｃａ）、カドミウム（Ｃｄ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、水銀（Ｈｇ）、ランタン（Ｌａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、鉛（Ｐｂ）、セレン（Ｓｅ）、スズ（Ｓｎ）、タリウム（Ｔｌ）、タングステン（Ｗ）、及び亜鉛（Ｚｎ）の原子吸光用標準液（いずれも１０００ｍｇ／Ｌ、関東化学株式会社製）を超純水で希釈して１μＭの各金属類溶液を調製した。塩化クロム、二クロム酸カリウム、塩化アルミニウム（いずれも和光純薬工業（株）製）、及び塩化鉄（シグマ−アルドリッチ社製）の水溶液を超純水で希釈して１μＭのＣｒ（ＩＩＩ）、Ｃｒ（ＶＩ）、Ａｌ、Ｆｅ溶液を調製した。
有害金属測定用試薬０．２ｍＬとこれらの１μＭの金属類溶液０．２ｍＬを混合し、加熱処理した後、Ａ４２３を測定した。比較として、ＭＴ以外の成分は同じで、ＭＴを含まない測定用試薬を調製し、同様にＡ４２３を測定した。
図７に、各金属類溶液を測定したときのＡ４２３を示す。ＭＴを含まない測定用試薬を用いた場合、Ａ４２３に有意な変化が認められたのはＺｎのみであった（図７ａ）。これは、Ａ４２３の変化は、ＺｎとＴＰＰＳの錯形成のみによって生じることを示している。一方、本発明の有害金属測定用試薬を用いた場合、Ｃｕ、Ｐｂ，Ｚｎ，Ｂｉ，Ｃｄ，Ｈｇ，Ｐｄ，Ｃｏ，Ａｇ、Ｓｅ，又はＮｉ溶液、特にＣｕ、Ｐｂ，Ｚｎ，Ｂｉ，Ｃｄ，Ｈｇ，Ｐｄ，Ｃｏ，又はＡｇ溶液を用いたときにＡ４２３の有意な増加が認められた（図７ｂ）。これらの金属はＭＴに結合し、それによってＭＴから解離したＺｎとＴＰＰＳが錯体を形成することが示された。このような金属は、ＳＨ基との親和性が強く、生体内において酵素等のＳＨ基に結合してその機能を失活させる作用機序で毒性を発揮する能力を有していることを示している。本発明の有害金属測定用試薬を用いたＡ４２３の測定によって、このような金属が試料溶液中に含まれていることを簡易に知ることができた。
【００６２】
実施例６  有害金属測定用試薬と金属混合溶液の反応
１６種類の金属が様々な濃度で混合する試料溶液を表１に示すようにＮｏ．１〜１５として調製した（表１）。これらの試料溶液と有害金属測定用試薬を反応させてＡ４２３を測定した。
Ｎｏ．１〜１５の各試料溶液中に実際に含まれる１６種の金属の総濃度を算出し、これを横軸とし、またＡ４２３（吸光度）を縦軸とし、その関係を図８に示す。一方、同じ各試料溶液中に実際に含まれるＣｕ、Ｐｂ，Ｚｎ，Ｂｉ，Ｃｄ，Ｈｇ，Ｎｉ，Ｃｏ及びＡｇの９種の金属の総濃度を算出し、これを横軸とし、Ａ４２３（吸光度）を縦軸とし、その関係を図９に示す。この９種は、実施例５でＳＨ基との親和性が強いとされたものである。
図８に示すように、１６種の金属の総濃度とＡ４２３の間にはおおよその相関は見られるものの、その相関は弱く、相関係数は０．７０７であった。これに対し、図９に示すように、特定の９種の金属の総濃度で算出した場合、Ａ４２３は、９種の金属の総濃度にほぼ比例して増加し、相関係数は０．９３３と良好な相関を示した。
このことから、試料溶液に含まれる金属をＳＨ基との親和性が強い有害な金属と想定すれば、ＳＨ基との親和性が強い有害な金属の総濃度とＡ４２３の測定値との間に高い相関関係が認められ、その比例係数が０．２２であった。
よって、未知の試料溶液を、本発明の有害金属測定用試薬を用いて反応させて、波長４２３ｎｍで測定すれば、得られたＡ４２３（測定値）を０．２２で除することで、有害金属の総濃度を算出することができることが明らかになった。
【００６３】
【表１】
2010276567.tif 000005
【００６４】
実施例７  各金属溶液のバイオアッセイとの比較
重金属毒性を評価する方法として発光バクテリア（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）を用いたバイオアッセイ法が知られている。これは、発光バクテリアの呼吸等の代謝レベルと発光強度が密接に関係しているため、試料溶液を暴露したときの発光強度の減少率（発光阻害率）を指標にすることを特徴とする試料溶液の毒性評価方法である。各金属混合溶液を発光バクテリアに曝露したときの発光阻害率を以下の方法で調べた。
発光バクテリアの凍結乾燥粉末は、日立化成工業(株)製のＭｅｔａｌキットとして購入した。発光バクテリア凍結乾燥粉末を２％のＮａＣｌ溶液に懸濁し、毒性評価用発光バクテリア懸濁液を調製した。試料溶液として、０〜５０μＭのＡｇ、Ａｌ，Ｂｉ，Ｃａ，Ｃｄ，Ｃｏ，Ｃｒ（ＩＩＩ），Ｃｒ（ＶＩ），Ｃｕ，Ｆｅ，Ｈｇ，Ｍｇ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｐｂ，及びＺｎ溶液（いずれも２％ＮａＣｌを含む、購入先は上記実施例と同じ）を用意した。発光バクテリア懸濁液５０μＬと試料溶液５０μＬを混合して２５℃で１５分間静置した後、蛍光分光光度計を用いて４９０ｎｍの発光強度（ＢＬ）を測定した。このとき、蛍光分光光度計の測定モードは発光測定用に設定した。試料溶液に２％ＮａＣｌ溶液を用いた場合をコントロールとして同様に発光強度（ＢＬｃ）を測定した。発光阻害率を（ＢＬｃ−ＢＬ）／ＢＬｃとして算出した。試料溶液中の金属濃度に対する発光阻害率を図１０に示す。試料溶液としてＡｇ，Ｂｉ，Ｃｄ，Ｃｏ，Ｃｕ，Ｆｅ，Ｈｇ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｐｂ，及びＺｎを用いたとき、濃度依存的な発光阻害が観察された。毒性が認められたこれらの金属は、図７に示したように、本発明の有害金属測定用試薬のＡ４２３を増加させる９種の金属と重複していた。
【００６５】
実施例８  金属混合溶液のバイオアッセイとの比較
ＬＢ寒天培地に播種して培養した発光バクテリアのコロニーを回収し、２％ＮａＣｌ溶液に懸濁させ、遠心と２％ＮａＣｌ溶液による洗浄を２回繰り返し、発光バクテリア懸濁液を得た。このバクテリア懸濁液０．２ｍＬを、５０ｍＭのＭＯＰＳと２％のＮａＣｌの混合溶液（ｐＨ７．２）４．８ｍＬに添加して毒性評価用発光バクテリア懸濁液とした。試料溶液として、表２に示したように、４種類の金属を様々な濃度で混合した金属混合溶液（Ｎｏ．１〜１８）を用意した。また、これらの金属混合溶液に４０μＭのＥＤＴＡを添加した試料溶液（Ｎｏ．１９〜３６）も用意した。毒性評価用発光バクテリア懸濁液を０．１ｍＬ、４％ＮａＣｌを０．０５ｍＬ、及び試料溶液を０．０５ｍＬ混合して２５℃で１５分間静置した後、実施例７と同様に発光阻害率を測定した。一方で、同じ試料溶液を超純水で５０倍希釈した溶液と本発明の有害金属測定用試薬を混合し、加熱処理後、Ａ４２３を測定した。各試料溶液について得られたＡ４２３に対する発光阻害率を表２及び図１１に示す。
ＥＤＴＡを含まない試料溶液（Ｎｏ．１〜１８）を用いたとき、発光阻害率は３２〜７９％の間であった。対応するＡ４２３は０．１３〜０．７４であり正の相関を示した。ＥＤＴＡを含む試料溶液（Ｎｏ．１９〜３６）を用いた場合は、全体的に発光阻害率は低下し４〜５２％であった。金属組成（絶対量）は同じであってもＥＤＴＡの添加により毒性が軽減されることを示している。これらの試料溶液に対応するＡ４２３も全体的に低い値となり、−０．０９〜０．５３であった。このように、溶液中の毒性が軽減されると、溶液中の重金属の絶対量が同じであっても、吸光度も低下した。
その結果、全体として、発光阻害率とＡ４２３の間には相関係数０．８１０の正の相関が認められ、発光阻害率の大きさ、すなわち毒性の強さに応じてＡ４２３が変化することが見出された。全体のプロットにフィットさせた回帰直線から、例えば、Ａ４２３が０．４７以上であれば発光阻害率５０％以上に相当する強い毒性である、といった評価を行うなど、本発明の有害金属測定用試薬を用いて得たＡ４２３を毒性の指標として用いられることが見出された。
【００６６】
【表２】
2010276567.tif 000006
【００６７】
実施例９  ＢｉによってＭＴから遊離したＺｎのポルフィリン導入ポリマーによる検出
ＷＯ２００４／０５５０７２号パンフレットの実施例１記載の方法に従い、プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩とアクリルアミドをラジカル共重合したポルフィリン導入ポリマー（ＰＰＮａ2−ＡＡｍ）を合成した。ＰＰＮａ2−ＡＡｍを１．３ｗｔ％（プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム塩として５７μＭに相当）、ＭＴを０．２１μＭ、Ｂｉを０〜１μＭ、及びＭＯＰＳを２５ｍＭ含む溶液（ｐＨ７．２）を用意した。ブランクとして、ＰＰＮａ2−ＡＡｍを１．３ｗｔ％と２５ｍＭのＭＯＰＳを含む溶液（ｐＨ７．２）を用意した。各々、７５℃で６０分加熱後、ブランクに対する吸収スペクトルを測定した（図１２ａ）。Ｂｉ濃度に応じて吸収スペクトルが変化し、吸収極大ピークの位置は４１５ｎｍであった。同様な測定をＭＴ未添加で行った場合は、吸収スペクトルの変化は観察されなかった（図１２b）。ＴＰＰＳの代わりにＰＰＮａ2−ＡＡｍを用いても、ＢｉのＭＴへの結合によって解離したＺｎを吸光度の変化によって検出できることが示された。
【００６８】
実施例１０  亜鉛−フィトケラチン複合体を用いた有害金属測定用試薬と金属溶液との反応
メタロチオネイン様タンパクとして、市販のフィトケラチン（ＡｎａＳｐｅｃ社製）を使用した。このフィトケラチン（以下、ＰＣと略する場合がある）のアミノ酸配列は、γグルタミン酸−システイン−γグルタミン酸−システイン−グリシンである。ＴＰＰＳを５μＭ、ＰＣを６μＭ、Ｚｎを３μＭ、及びＭＯＰＳを１００ｍＭ含む溶液（ｐＨ７．２）を調製し、ＴＰＰＳ及びＺｎ−ＰＣ複合体を含む本発明の有害金属測定用試薬とした。この試薬中のＰＣは、ＰＣ１分子あたり亜鉛が１個結合したものを含み、その濃度は２．１μＭであった。全ＰＣのモル濃度に占める亜鉛が結合したＰＣの割合は３５％であった。Ｃａ、Ｃｄ、Ｍｇ、及びＰｂの原子吸光用標準液（いずれも１０００ｍｇ／Ｌ、関東化学株式会社製）を超純水で希釈して１μＭの各金属溶液を調製した。有害金属測定用試薬０．２ｍＬとこれらの１μＭの金属溶液０．２ｍＬを混合し、加熱処理した後、Ａ４２３を測定した。図１３に、各金属溶液を用いたときのＡ４２３を示す。Ｃｄ及びＰｂ溶液を用いたときＡ４２３の有意な増加が認められた。これらの金属はＰＣに結合し、それによってＰＣから解離したＺｎとＴＰＰＳが錯体を形成することが示された。一方、Ｃａ及びＭｇ溶液を用いたときはＡ４２３の明確な増加は観察されなかった。本発明の有害金属測定用試薬としてＰＣに亜鉛を結合させたものを用いた場合でも、ＳＨ基との親和性が強い有害金属を検出できることが示された。
【図１】
2010276567.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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