(57)【要約】【課題】目的の蛋白質をセンサー基盤に固定する際、蛋白質と基盤の結合状態を直接的に把握する方法を提供する。【解決手段】本発明の蛋白質固定化方法は、目的の固定化蛋白質１０１を、呈色物質１０２および固定化結合部位１０３を介してセンサー基板１０４上へ固定化し、呈色物質１０２の蛍光強度を測定する工程を含む。【選択図】図１
2010203870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサー基板と、
固定化蛋白質と、
固定化結合部位と、
呈色物質と、
光源と、
モノクロメータIおよびIIと、
検出器と、
を用い、
前記固定化蛋白質が呈色物質を介して固定化結合部位と融合していることを特徴とし、
（A）前記光源より出射された光を前記モノクロメータIを通過させることで２８０nｍの励起光に変換する工程、
（Ｂ）前記工程Ａにおいて変換された励起光を、前記固定化蛋白質が固定化された前記センサー基板上へ照射する工程、
（Ｃ）前記工程Ｂにおいて生じたセンサー基板からの反射光を前記モノクロメータIIにより340nmの光のみ抽出する工程、および、
（D）前記工程Cにより抽出された光を前記検出器を用いて検出する工程、
を含む、センサー基板上に固定化された蛋白質の特異結合量を定量化する蛋白質固定化方法。
【請求項２】
前記呈色物質が、タンパク質構造中の芳香族アミノ酸、特にトリプトファン（Trp）である、請求項１記載の蛋白質固定化方法。
【請求項３】
前記固定化結合部位がヒスチジン、特に６つ連結したヒスチジンであり、前記センサー基板上にNTAが担時された、請求項1及び2記載の蛋白質固定化方法。
【請求項４】
前記固定化蛋白質が、Staphylococus aureus Protein A(SpA)の全長、断片、もしくは、断片の組合せである、請求項１、２および3記載の蛋白質固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質をセンサー基板上へ固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を金などの金属基板に固定化する方法として、世の中には種々存在する。一般的な方法として、蛋白質を構成するアミノ酸の一種であるシステインを介した共有結合や、基板上に担持されたカルボキシル基を有するポリマーなどとのアミンカップリング法がある。蛋白質を構成するアミノ酸の一つであるリジンが有するアミノ基と、担体に結合させたカルボキシル基をアミノ結合させ、蛋白質を担体に固定化する方法である。また、蛋白質の特定部位を認識する蛋白質、例えば、抗体などを基板に吸着させ、目的の蛋白質を捕捉させることで固定化を行う方法がある。基板上に目的の蛋白質を固定化する方法として、基板表面にプロテインＡなどの結合剤を介して蛋白質(抗体)を固定化する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献１には、抗体のＦｃ領域に結合可能なアフィニティーリガンドを介して担体表面に一次抗体を固定化する方法が開示されている。ここで、アフィニティーリガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ等が挙げられている。
【特許文献１】特開平０７−６３７５９号公報
【特許文献２】特開平０６−２５６４００号公報（特に段落番号００７８）
【特許文献３】特開２００４−３５７７０６号公報（特に段落番号００４５および図４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１に記載の方法では、センサー基板上に固定化される目的蛋白質量を簡易的に測定できない、という問題点があった。
【０００５】
そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、センサー基板などの担体上へ固定化された目的蛋白質量を簡易的に定量する蛋白質固定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記従来の課題を解決するために、本発明の蛋白質固定化方法は、表面にNTAを有するセンサー基板と、固定化蛋白質と、固定化結合部位と、呈色物質と、光源と、モノクロメータIおよびIIと、検出器と、を用い、前記固定化蛋白質が呈色物質を介して固定化結合部位と融合していることを特徴とし、（A）前記光源より出射された光を前記モノクロメータIを通過させることで２８０nｍの励起光に変換する工程、（Ｂ）前記工程Ａにおいて変換された励起光を、前記固定化蛋白質が固定化された前記センサー基板上へ照射する工程、（Ｃ）前記工程Ｂにおいて生じたセンサー基板からの反射光を前記モノクロメータIIにより340nmの光のみ抽出する工程、および、（D）前記工程Cにより抽出された光を前記検出器を用いて検出する工程、を含む、センサー基板上に固定化された蛋白質の特異結合量を定量化する蛋白質固定化方法を提供する。
【０００７】
前記呈色物質は、タンパク質構造中の芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（Trp）といったアミノ酸であり、これらアミノ酸は、およそ280nmの励起光に対して、約350nmの蛍光発光を示す。これらの中でも、Trpが特に強いUV蛍光発光を示す。さらに、疎水領域において、これら物質の蛍光強度が増強される性質を利用して、疎水性となる金属を材料としたセンサー基板上で蛍光強度が増強される特徴を有する、蛋白質固定化方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、目的の固定化蛋白質を、呈色物質および固定化結合部位を介してセンサー基板上へ固定化する際、その固定化度合いを蛍光強度により定量する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下において、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１０】
以下に、例えば、呈色物質１０２としてトリプトファン(Trp)、固定化結合部位１０３として6つのヒスチジン(6xHis)、固定化蛋白質として、Staphylococcus aureus Protein A (SpA)のD領域として、作製および呈色評価について記載する。
【００１１】
遺伝子配列(プラスミド)の作製
固定化蛋白質発現プラスミドの作製(6xHisの融合)
図２に、大腸菌を用いて固定化蛋白質１０１を作製するため、発現プラスミドベクター２０１を示す。発現プラスミドベクター２０１は、環状を成し、その一部に、固定化蛋白質１０１の遺伝子を導入することのできる、マルチクローニングサイト(MCS)２０２を有する。MCS２０２は制限酵素サイト２０３を有し、制限酵素を用いて、固定化蛋白質１０１の遺伝子をMCS２０２内の任意の箇所に導入することができる。発現プラスミドベクター２０１として、例えば、pETベクター（Novagen Inc.）を使用する。特に、固定化蛋白質１０１のアミノ基末端（N末端）に6xHisを融合できるpET15b(+)と、固定化蛋白質１０１のカルボキシル基末端（C末端）に6xHisタグを融合できるpET22b(+)を用いる。
【００１２】
SpAのD領域遺伝子の設計・作製(Trpの融合)
固定化蛋白質１０１として、Staphylococus aureus Protein A(SpA)のD領域を用いる。前述のpETベクターへ導入するために、固定化蛋白質１０１の遺伝子配列のN末端側およびC末端側に、制限酵素サイト２０３を付加する。また、呈色物質１０２となるTrpの遺伝子を任意に付加する。
【００１３】
例えば、C末端側に6xHisを導入する(pET22b(+)を利用する)場合、5'末にNdeIサイト、3'末にNotIサイトが付加されるように、プライマーを設計する。さらに、Trpの遺伝子である、UGGが、例えば、3'末のD領域遺伝子とNotIサイトの間に位置するようにプライマーを設計する。具体的な一例として、5'末側としては、5'-atcatatggccgatgcgcaacaaaataa-3'（配列番号１）、 3'末側としては、5'-gagagagcggccgcccatttcggtgcttgagattcgtttaattttttagct-3' （配列番号２）という配列をもつプライマーを用いることで可能である。
【００１４】
これらプライマーを用い、SpAのD領域遺伝子をPCRによって各断片を増幅する。PCRによる増幅後、.2.0%アガロースゲルによる電気泳動を行い、SpAのD領域遺伝子に相当するバンドを切り出し・精製する。さらに、獲得したSpAのD領域遺伝子を制限酵素であるNdeIおよびNotIで処理し、2.0%アガロースゲルにて電気泳動を行い、SpAのD領域遺伝子に相当するバンドを切り出し・精製する。これらにより、制限酵素サイト２０３(NdeIサイトおよびNotIサイト)、およびTrpが付加されたSpAのD領域遺伝子断片の作製が可能となる。
【００１５】
作製したSpAのD領域遺伝子断片をpET22b(+)ベクターのMCS２０２に導入し、大腸菌DH10B株にエレクトロポレーション法（Micro Pulser、BioRad）により形質転換する。この際、pET22b(+)ベクターおよそ0.2ugに対して大腸菌DH10B株42uLを混合し、1mmGapのキュベットを用いて、エレクトロポレーション(Eco1、1.8kV)を行う。
【００１６】
LBプレート培地（100uL/mLアンピシリン）上にて大腸菌コロニーを育成すると共に、ブルーホワイトセレクションを実施し、pET22b(+)ベクターが大腸菌に形質導入されたコロニーのみを抽出する。形質導入されたコロニーをピペットマンチップの先などで回収し、およそ５〜１０ｍLのLB培地(100uL/mLアンピシリン)中にいれ、揺動（３７度、２３０rpm）にて一晩大腸菌を増殖する。増殖した大腸菌は、遠心により回収し、miniprep（QIAGEN）による精製を行うことで、SpAのD領域発現プラスミドベクター２０１を獲得する。
【００１７】
蛋白質の作成
蛋白質発現用E.coliへの形質転換
まず、SpAのD領域発現プラスミドベクター２０１(およそ０．２ug)と蛋白質発現用大腸菌BL21(DE3)pLysS株（４２uL）を混合し、1mmGapのキュベットを用いて、エレクトロポレーション(Eco1にて、1.8kVのパルスを印加)を行うことにより形質導入し、LBプレート培地（100uL/mLアンピシリン、25ug/mLクロランフェニコール）上にて大腸菌コロニーを獲得する。
【００１８】
得られたコロニーを50mlの2YT培地（アンピシリン100ug/ml、クロランフェニコール25ug/ml）で一晩、37oCで振とう培養し、大腸菌BL21(DE3)pLysS株を増幅する。500mlの2YT培地（アンピシリン100  ug/ml）に5mlの増幅したBL21(DE3)pLysS株を加え、37oCで1.5時間振とう培養後、最終濃度が1mMになるようにIPTGを加え、さらに6時間培養することで、BL21(DE3)pLysS株を十分に増幅する。
【００１９】
蛋白質精製
遠心により、増幅したBL21(DE3)pLysS株を回収し、40mlの最終濃度5mMイミダゾールを含む1xPBS(pH7.4)（ソニケーソンバッファー）に再懸濁し、ソニケーションにより菌体を超音波破砕する。遠心により不溶分画を除き、さらに0.22umのフィルターに通す。0.5mlのベットボリュームのNiビーズ(GE healthcare)を充填したカラムに2回通した後、ソニケーションバッファーで5回洗浄する。最終濃度300mMイミダゾールを含む1xPBS(pH7.4)を用いて、各1mlで4フラクション溶出する。O.D.280の吸光度から蛋白質溶出フラクションを同定する。O.D.280の吸光度、また、蛋白質の分子量及びTrp / Tyrの個数から算出したモル分子吸光係数から、SpAのD領域蛋白質について500mlの培養で10mgの蛋白質が獲得できる。蛋白質の精製度合いを検証するために、16%アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを行うことで、高純度に精製できていることが確認できる。
【００２０】
上記の操作により、6xHisおよびTrpが融合されたSpAのD領域蛋白質を作製することが可能である。
【００２１】
蛋白質のセンサー基板上への固定化
センサー基板への固定化
センサー基板１０４として、例えば、Sensor Chip NTA（GE healthcare）を用いる。まず、溶液A（10mM HEPES、150mM NaCl、50uM EDTA、0.005%tween 20(pH7.4)）を作製し、溶液Aに濃度が100nMとなるようにSpAのD領域蛋白質を調製した溶液Bを作製する。次に、センサー基板１０４上のNTA(nitrilotriacetic acid)を、溶液C（500uM NiCl2 in溶液A）により活性化した後、溶液Bを添加することで、SpAのD領域蛋白質に融合されている6xHisとNTAがNi2+を介したキレート作用により結合する。その後、溶液Aによりセンサー基板１０４上を洗浄することで、非結合の蛋白質を洗い流す。
【００２２】
センサー基板１０４上への固定化は、上述のキレート作用に限らず、センサー基板１０４上に固定化した抗His抗体を用いて、SpAのD領域蛋白質に融合されている6xHisを捕捉することでも可能である。
【００２３】
（実施例１）
呈色評価（蛍光強度の測定）
図３、４および５を用いて、以下に説明する。
【００２４】
前述溶液A中に、Trpを融合したSpAのD領域蛋白質を固定化したセンサー基板１０４を溶液A４０４中に整地する。センサー基板１０４上方斜め45度方向から、光源４０１より、励起光４０３を出射する。光源４０１は、水銀ランプもしくはキセノンランプを使用する。モノクロメータA４０２を用いて、光源４０１より出射された励起光４０３から２８０nmのみを分光し、その分光光をセンサー基板１０４上へ照射する。センサー基板１０４上から反射した反射光４０５を、直上に設置した検出器４０７を用いて検出する。その際、モノクロメータB４０６を通すことにより、反射光４０５から３５０nm付近の光のみを分光し、検出する。検出器４０７として、光電管、光電子増倍管やフォトカウンターを使用する。検出時のS/N比を向上するため、暗室４０８内にて行うことが望ましい。
【００２５】
図５に、検出された反射光４０５強度の結果を示す。比較として、6xHisおよびTrpが融合されていないSpAのD領域蛋白質をセンサー基板上に固定化したときの結果を同時に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上示したように本発明によれば、固定化蛋白質を、固定化部位を介してセンサー基板上へ固定化する際、その固定化度合いを蛍光強度により定量することが可能となり、目的の蛋白質をセンサー基盤に固定する際、蛋白質と基盤の結合状態を直接的に把握する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の免疫測定方法における実施の形態を示す図
【図２】本発明の免疫測定方法における実施の形態を示す図
【図３】本発明の免疫測定方法における測定フローを示す図
【図４】本発明の実施例における測定装置を示す図
【図５】本発明の一実験例の結果を示す図
【符号の説明】
【００２８】
１０１  固定化蛋白質
１０２  呈色物質
１０３  固定化結合部位
１０４  センサー基板
２０１  発現プラスミドベクター
２０２  マルチクローニングサイト（MCS）
２０３  制限酵素サイト
４０１  光源
４０２  モノクロメータA
４０３  励起光
４０４  溶液A
４０５  反射光
４０６  モノクロメータB
４０７  検出器
４０８  暗室
【図１】
2010203870.tif 000003
【図２】
2010203870.tif 000004
【図３】
2010203870.tif 000005
【図４】
2010203870.tif 000006
【図５】
2010203870.tif 000007
【配列表】
2010203870000001.app