(57)【要約】【課題】  全身投与や、腹腔内投与などの幅広い投与が可能であって、高い遺伝子治療効果を発揮すると共に副作用が少なく、癌に用いた場合には癌転移の抑制にも有効な、癌などの疾患の遺伝子治療剤を提供する。【解決手段】  遺伝子治療用ウイルス；１種以上のカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を含有する層；および１種以上のアニオン性ポリマーを含有する層を含む複合体；ならびに当該複合体の製造方法であって、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、この順序で逐次混合することによって複合体を形成させる工程を含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子治療用ウイルス；１層以上のカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を含有する層（カチオン層）；および１層以上のアニオン性ポリマーを含有する層（アニオン層）を含む２層以上の被覆層を含む複合体。
【請求項２】
遺伝子治療用ウイルスがカチオン層で被覆され、かつカチオン層とアニオン層が交互に被覆している、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
カチオン層が、２種以上のカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を同時または逐次的に被覆することで形成され；および／またはアニオン層が２種以上のアニオン性ポリマーを同時または逐次的に被覆することで形成される、請求項１または２記載の複合体。
【請求項４】
カチオン性ポリマーが、正に荷電された蛋白質またはポリペプチド；正に荷電されたデンドリマー；正に荷電された合成ポリマー；正に荷電された多糖類誘導体；およびそれらの塩ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の複合体。
【請求項５】
カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体が、プロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼラチンから選択される蛋白質またはポリペプチド；ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーから選択されるデンドリマー；直鎖状またはポリ分岐型ポリエチレンイミン、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体、２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体から選択される合成ポリマー；キトサン、ジエチルアミノエチル−デキストランから選択される多糖類誘導体；ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、またはＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）から選択されるカチオン性脂質；リポフェクタミン、リポフェクチンから選択されるカチオン性脂質を含む集合体；およびそれらの塩ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の複合体。
【請求項６】
カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体が、
ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、およびプロタミンから選択される、請求項５記載の複合体。
【請求項７】
アニオン性ポリマーが、カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する多糖類またはその誘導体；負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子；カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、炭素数１〜６のアルキル基またはフェニル基で単または多置換されていてもよい）を有する高分子；ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体。
【請求項８】
アニオン性ポリマーが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸から選択される多糖類またはその誘導体；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸から選択されるポリアミノ酸；ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を５個以上有する、４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体；分子量１０００〜３００万のアクリル酸またはメタクリル酸の重合体または共重合体、ポリビニルアルコールの硫酸エステル体、またはサクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジンから選択される合成高分子；１分子当たりカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を５個以上、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、炭素数１〜６のアルキル基またはフェニル基で単または多置換されていてもよい）を有する、４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体；ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の複合体。
【請求項９】
アニオン性ポリマーが、ヒアルロン酸である、請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
遺伝子治療用ウイルスが、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、またはそれらの制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスから選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の複合体。
【請求項１１】
遺伝子治療用ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、foamy virus、Newcastle disease virus、レンチウイルス、Rabies Virus、Pox virus、もしくはmyxoma virusから選択されるＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルス、またはその制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１〜９のいずれか１項記載の複合体。
【請求項１２】
遺伝子治療用ウイルスが、変異株ウイルスまたは組換えウイルスである、請求項１〜９のいずれか１項記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１記載の複合体の製造方法であって、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、この順序で逐次混合することによって複合体を形成させる工程を含む方法。
【請求項１４】
カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を混合する工程；およびアニオン性ポリマーを混合する工程を、交互に行うことを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を２種以上同時または逐次混合し；および／またはアニオン性ポリマーを２種以上同時または逐次混合する、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法で製造された、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療用に投与されるウイルスの複合体からなる、癌などの遺伝子治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの疾患を対象とした遺伝子治療としては、様々な治療用遺伝子を組み込んだウイルスや、腫瘍細胞内で選択的に増殖するウイルスを用いた遺伝子治療が試みられ、限定的ではあるがその効果が報告されている（特許文献１〜３）。
しかし、ウイルスを生体内にそのまま投与しても、抗体による中和のため、導入された治療用遺伝子の発現や、ウイルスの抗腫瘍活性は大きく抑制される。特に、遺伝子治療に用いられることが多いアデノウイルスに対しては、患者が初めから抗体を持っていることも多く、その効果は大きく抑制される。また、たとえ抗体を持っていない患者であっても、複数回投与を行ううちに抗体が産生され、十分な効果が得られなくなる。
そこで、抗体による中和を回避するために、ウイルスを導入したキャリアー細胞を用いた遺伝子治療が広く研究されている。
しかし、これらのキャリアー細胞を用いる方法では、キャリアー細胞の生体内、組織内での拡散性の悪さや、キャリアー細胞から出た裸のウイルス自体が有する高い毒性のために、その効果的な投与経路は、腫瘍局所内への投与に限られていた。
一方、検出できない小さな腫瘍や、直接注射することが不可能な部位の腫瘍、あるいは転移した腫瘍組織に対しては、腹腔内や動脈・静脈内投与により広範囲の部位を標的にした治療が必要である。しかし、ウイルスは、腹腔内や静脈内に投与すると、その毒性のため副作用が生じる恐れがある。さらに、血流中への投与では、ウイルスの肝集積性のため、標的組織・細胞への十分なデリバリーがなされない。
このような理由から、キャリアー細胞を用いた系においても、その効果的な投与部位は腫瘍局所内に限定され、腹腔内や静脈内投与で高い治癒効果を示すものは報告がない。
以上のように、遺伝子治療用に用いられるウイルスは、そのままでは抗体による中和のために効果が大きく損なわれ、また副作用が強く、そのため投与経路も限定され、全身投与や腹腔内投与によって、極微小な腫瘍や、局所投与できない部位の腫瘍、あるいは転移巣を広くターゲットとすることができない。
このような問題を解決するために、ポリマーを結合させたり（非特許文献１）、カチオン性リピッドをウイルスに混ぜて抗体のブロックを防いだり（非特許文献２）する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３７３２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／４５７８３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／２３００４号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】"Modification of Adenovirus Gene Transfer Vectors With Synthetic Polymers: A Scientific Review and Technical Guide" www.moleculartherapy.org vol. 16 no. 1 Jan. 2008
【非特許文献２】"Adenovirus complexed with polyethylene glycol and cationic lipid is shielded from neutralizing antibodies in vitro" Gene Therapy (1998) 5, 995-1002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記欠点を解決すべく鋭意研究を行った結果、遺伝子治療用ウイルスを、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体およびアニオン性ポリマーと複合体を形成させると、全身投与や、腹腔内投与などの幅広い投与が可能であって、高い遺伝子治療効果を発揮すると共に副作用が少なく、癌に用いた場合には癌転移の抑制にも有効な、癌などの疾患の遺伝子治療剤が得られることを発見して、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを含む複合体に関する。本発明はまた、上記複合体の製造方法であって、遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、逐次混合することによって複合体を形成させる工程を含む方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の複合体は、抗ウイルス抗体による中和を受けにくく、また生体内での治療効果が高い。また、毒性が低いため、局所投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内、頭蓋内投与などの各種投与が可能である。また、調製・取り扱いが簡便で、保存性にも優れている。さらに、本発明の一態様においては、対象となる細胞に対するリガンドを複合体に導入することで、標的細胞への取り込みの効率や選択性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】アデノウイルスにＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図２】アデノウイルスに０．２マイクログラムのＰＥＩを加えたときに得られる複合体のゼータ電位の時間変化を示す。
【図３】アデノウイルス／ＰＥＩ複合体にＨＡ（ヒアルロン酸）を加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図４】アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ複合体にＰＥＩを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図５】アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図６】アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体にＰＥＩを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図７】アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図８】ポリマーコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を示す。
【図９】アデノウイルスにＰＲＴ（プロタミン）を加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図１０】アデノウイルス／ＰＲＴ複合体にＨＡを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図１１】アデノウイルスにスーパーフェクトを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図１２】アデノウイルス／スーパーフェクト複合体にＨＡを加えたときに得られる複合体のゼータ電位を示す。
【図１３】リガンドを持つポリアニオンでコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の複合体は、遺伝子治療用ウイルス；１層以上のカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を含有する層（カチオン層）；および１層以上のアニオン性ポリマーを含有する層（アニオン層）を含む２層以上の被覆層を含む複合体である。
本発明の複合体の一態様では、遺伝子治療用ウイルスが、カチオン層で被覆され、更にアニオン層で被覆されている（２層複合体）。また別の態様の複合体では、遺伝子治療用ウイルスが、カチオン層で被覆され、更にアニオン層で被覆され、更にまたカチオン層で被覆されている（３層複合体）。このように、遺伝子治療用ウイルスがカチオン層で被覆され、かつアニオン層とカチオン層が交互に被覆している２層以上の被覆層を含む複合体を好ましく挙げることができる。このような複合体として、例えば、遺伝子治療用ウイルスが、カチオン層およびアニオン層の順で被覆された２層複合体、この２層複合体が更にまたカチオン層で被覆された３層複合体、この３層複合体が更にまたアニオン層で被覆された４層複合体、この４層複合体が更にまたカチオン層で被覆された５層複合体、この５層複合体が更にまたアニオン層で被覆された６層複合体、この６層複合体が更にまたカチオン層で被覆された７層複合体などが挙げられる。培養細胞への感染率が高まる点から２層以上の被覆層を含む複合体が好ましく、インビボにおける細胞への感染率が高まる点から３層以上の被覆層を含む複合体が好ましい。また、層の数の上限は特に制限されないが、複合体の作製効率が高まる点から、１９層以下、特に１４層以下、とりわけ１１層以下が好ましい。
ここで、上記のカチオン層またはアニオン層では、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体やアニオン性ポリマーが１または２種以上含有されるが、２種以上含有されるときは、これらを同時に被覆してもよく、または逐次的に被覆してもよい。例えば、遺伝子治療用ウイルスを、ＲＧＤペプチドを導入したＲＧＤ−ポリエチレンイミンで被覆した後、ポリエチレンイミンで被覆し、それからヒアルロン酸で被覆することができる。
また、上記のカチオン層またはアニオン層が存在する場合、各層に含有されるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、およびアニオン性ポリマーの種類は、同一である必要はなく、異なる種類のポリマーやカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、あるいはその組み合わせを、各層ごとに変更して含有させていくことも可能である。
さらに、上記の層は、遺伝子治療用ウイルスまたは多層複合体の表面を全部または一部被覆していてもよいが、細胞への感染率が高まる点から、表面を全部被覆するのが好ましい。もっとも、標的細胞に対して特異的接着能を有するもの、例えばＲＧＤなどを導入したアニオン性ポリマーやカチオン性ポリマーは表面を一部被覆しても、当該標的細胞への高い感染率が得られる。
本複合体中で遺伝子治療用ウイルスは、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とイオン結合による複合体を形成しており、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とアニオン性ポリマーもまたイオン結合している。これらは、後の調製方法に関する説明において述べる調製時の混合の回数、混合比、混合順序等によって、表面がカチオン性の複合体、表面がアニオン性の複合体、さらには表面電荷がほぼ中性の複合体のいずれでもあることができる。
【００１０】
（遺伝子治療用ウイルス）
本発明の複合体においては、遺伝子治療用ウイルスとは、遺伝子治療に用いることができるウイルスを意味する。このようなウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、foamy virus、Newcastle disease virus、レンチウイルス、Rabies Virus、Pox virus、myxoma virus等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、あるいはそれらの制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスなどを挙げることができ、治療対象とする動物種・疾患に応じて適宜選ぶことができる。例えば、ヒトの遺伝子治療を目的とする場合には、アデノウイルスまたはその制限増殖型腫瘍溶解性ウイルスなど、ヒトに安全に使用することができるウイルスを適宜用いることができる。また、変異株ウイルスや治療用遺伝子を導入した組換えウイルスも用いることができる。
【００１１】
（ウイルスに導入する遺伝子）
上記の遺伝子治療用ウイルスに導入しえる治療用遺伝子は、遺伝子治療の対象である疾患に応じて適宜選択することができる。例えば、癌疾患を遺伝子治療の対象とする場合には、ｐ５３、チミヂンキナーゼ、及びＧＭ−ＣＳＦなどの遺伝子を上記ウイルスに導入することができる。また、筋ジストロフィーの疾患を遺伝子治療の対象にする場合は、ジストロフィンなどの遺伝子を上記ウイルスに導入することができる。
ウイルスの種類、導入する遺伝子の種類、遺伝子導入の方法は、ウイルス、導入する遺伝子の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、WO/1995/012660に記載されたようなｐ５３遺伝子を導入したアデノウイルス、例えば、Nature Medicine, 1, 938-943 (1995)に記載されたような腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスなどを挙げることができる。
【００１２】
（カチオンポリマー）
本発明の複合体に用いることができるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体のうちカチオン性ポリマーとしては、正に荷電された分子量が１０００〜３００万程度の天然由来または合成高分子であって、溶液中でウイルスと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができる。このような官能基としては、例えば置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）、イミノ基、イミダゾリル基、グアニジノ基などの有機アミノ基を挙げることができる。このようなカチオン性ポリマーとしては、例えば、正に荷電された蛋白質やポリペプチド；正に荷電されたデンドリマー；正に荷電された合成ポリマー；および正に荷電された多糖類誘導体、およびそれらの塩、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１３】
本発明の複合体にカチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された蛋白質、正に荷電されたポリペプチドの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。このような蛋白質、ポリペプチドとしては、具体的にはプロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼラチンなどのタンパク質およびポリペプチドを例示することができ、また、正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸もまた例示することができる。このような正に荷電されたアミノ酸残基を含むポリアミノ酸としては、具体的にはポリ−Ｌ−リジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンなどを例示することができる。これらの蛋白質、およびポリペプチドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００１４】
カチオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する正に荷電されたデンドリマーとは、分岐した分子鎖の末端または内部に、置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）、イミノ基、イミダゾリル基、グアニジノ基などの有機アミノ基を有するデンドリマーであり、その分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度である。デンドリマーとしては、具体的にはポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどを例示することができる。また、デンドリマーの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００１５】
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された合成ポリマーは、上記のような、溶液中でウイルスと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する合成ポリマーであって、分子量が好ましくは１０００〜３００万である合成ポリマーである。合成ポリマーとしては具体的には、ポリエチレンイミン（直鎖状ポリエチレンイミン、またはポリ分岐型ポリエチレンイミンを含む）、２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体、２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体、およびそれらの塩などを例示することができる。合成ポリマーの一例であるポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。また、ポリエチレンイミンの塩として、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
【００１６】
カチオン性ポリマーとして用いることができる正に荷電された多糖類誘導体は、溶液中でウイルスと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する、分子量が、好ましくは１０００〜３００万であり、より好ましくは５０００〜５０００００である多糖類誘導体である。このような多糖類としては、具体的にはキトサン、上記のような官能基を導入したデキストラン誘導体、およびそれらの塩などを例示することができる。これらのうちキトサンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度である。キトサンの塩としては、塩酸塩、酢酸塩などを例示することができる。また、デキストラン誘導体の分子量は、好ましくは３０００〜１００万である。このようなデキストラン誘導体としては、具体的にはジエチルアミノエチル−デキストランなどを例示することができる。
【００１７】
上記のカチオン性ポリマーは、従来正に荷電していないものにアミノ基などの官能基を導入し、正に荷電するようにしたものでも良い。また、通常は正に荷電されていないものであっても、複合体形成時に正に荷電されるものであれば使用可能であり、また、必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。
【００１８】
本発明の複合体に用いることができるカチオン性脂質（カチオン性コレステロール誘導体を含む）としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、またはＤＯＴＭＡ（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１９】
また、カチオン性脂質を含む集合体としては、上記カチオン性脂質（たとえばＤＯＳＰＡ）と、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、コレステロールなどの中性物質を混合したものを使用することができる。カチオン性脂質を含む集合体としては、例えばリポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、リポフェクチン（上記ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥの1：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）、またはこれらの混合物などを好ましく挙げることができる。
【００２０】
本発明の複合体においては、カチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン；プロタミン；HelΔ１；ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどのデンドリマー；キトサン；２−ジメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体；２−トリメチルアミノエチルメタクリレートの重合体または共重合体などを好ましく用いることができ、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、キトサン、およびプロタミン、なかでもポリエチレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、およびプロタミンを特に好ましく用いることができる。また、カチオン性脂質もしくはそれを含む集合体としては、リポフェクタミン（上記ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム）を好ましくは用いることができる。
【００２１】
（アニオン性ポリマー）
本発明の複合体において使用するアニオン性ポリマーとしては、分子中にアニオン性基を含む、負に荷電された、分子量が５００〜４００万程度の天然由来または合成高分子であって、水中でポリカチオンと複合体を形成できる官能基を１分子中に複数、好ましくは５個以上有する高分子を使用することができる。このような官能基としては、例えばカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩を挙げることができる。このようなアニオン性ポリマーとしては、両イオン性ポリマーも含まれる。
【００２２】
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、より具体的には、カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する多糖類またはその誘導体；負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子；カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を有する高分子；ならびにそれらの組み合わせを用いることができる。
【００２３】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる上記のような官能基を有する多糖類またはその誘導体としては、好ましくはグルコサミノグリカンを用いることができる。このようなグルコサミノグリカンの分子量は、好ましくは１０００〜４００万、より好ましくは４０００〜３００万である。このようなグルコサミノグリカンとして、具体的には例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、およびそれらの塩などを例示することができる。なかでもヒアルロン酸を好ましく用いることができる。ヒアルロン酸は、その塩または負に荷電した誘導体としても用いることができる。その分子量は、５，０００以上であればよいが、１０，０００以上が好ましく、１０万〜３００万がより好ましい。ヒアルロン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。また、ヒアルロン酸の誘導体としては、例えば、ヒアルロン酸にポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体またはその一部などを導入することによって得られるものが挙げられ、スペルミン、スペルミジン等を導入し、プラスに荷電した部分を持つ両イオン性の誘導体も含まれる。
【００２４】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができる、負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を含むポリアミノ酸とは、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩などの基を側鎖として有するアミノ酸残基を含む、好ましくは５００〜１００万の分子量を有するポリアミノ酸である。このようなポリアミノ酸としては、具体的にはポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などを例示することができる。また、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。
【００２５】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体とは、ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を複数、好ましくは５個以上有する、５００以上、好ましくは２，０００以上、より好ましくは４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体またはその塩である。カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体は、その塩または負に荷電した誘導体としても用いることができる。これらの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。このようなＰＥＧ誘導体としては、具体的にはJ. Biomater. Sci. Polymer Edn. Vol. 14, pp 515-531 (2003)に記載されたＰＥＧ誘導体を例示することができる。
【００２６】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する合成高分子とは、１分子当たり複数、好ましくは５個以上の、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を有する重合体または共重合体であって、好ましくは５００〜４００万の分子量を有する重合体または共重合体である。このような重合体または共重合体としては、具体的には分子量１０００〜３００万のアクリル酸またはメタクリル酸の重合体または共重合体、あるいはポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ−Ｌ−リジンなどを例示することができる。また、カルボキシル基、−Ｏ−ＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。
【００２７】
本発明の複合体においてアニオン性ポリマーとして用いることができるカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を有する高分子とは、１分子当たりカルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基、およびこれらの塩から選択される官能基を複数、好ましくは５個以上、ならびに置換されていてもよいアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を有する、５００以上、好ましくは２，０００以上、より好ましくは４，０００〜４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体などの高分子である。カルボキシル基、−ＯＳＯ3Ｈ基、−ＳＯ3Ｈ基、リン酸基の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。また、アミノ基もしくはアンモニウム基の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩などを挙げることができる。
このような高分子としては、好ましくは、カルボキシル側鎖とその当量以下のアミノ基もしくはアンモニウム基またはその塩（これらの基は、例えば炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基などで単または多置換されていてもよい）を持つＰＥＧ誘導体を挙げることができ、具体的にはMacromol. Biosci. Vol. 2, pp 251-256 (2002)に記載されている方法で調製することができるＰＥＧ誘導体や、アセトアミド基を部分的に加水分解したヒアルロン酸、一部のカルボキシル基にヒドラジンを導入したヒアルロン酸などを例示することができる。
【００２８】
本発明の複合体において用いることができるアニオン性ポリマーは、従来負に荷電していないものにカルボキシル基などの官能基を導入し、負に荷電するようにしたものでも良い。通常は負に荷電されていないものであっても、複合体形成時に負に荷電されるものであれば使用可能であり、また必要により糖鎖、オリゴペプチド、抗体などで更に修飾されていてもよい。
【００２９】
本発明の複合体においては、アニオン性ポリマーとしては、ヒアルロン酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体、ポリアクリル酸などのアニオン性ポリマーまたはそれらの塩を好ましく用いることができ、ヒアルロン酸、カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体またはそれらの塩、なかでもヒアルロン酸を特に好ましく用いることができる。
【００３０】
また、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、あるいはアニオン性ポリマーとして、標的細胞に対して特異的接着能を有するものを用いることにより、標的細胞に特異的に治療用遺伝子の導入を行うことが可能である。例えばアニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸を用いる場合、ヒアルロン酸と特異的に結合するＣＤ４４などの細胞表面分子を有する細胞を標的とすることができる。また、ＲＧＤペプチドを導入したアニオン性ポリマーやカチオン性ポリマー、好ましくはＲＧＤペプチドを導入したＰＥＧ誘導体やポリエチレンイミンを用いることにより、多くの種類の腫瘍細胞を標的とすることができ、またガラクトース側鎖を導入したカチオン性ポリマーやアニオン性ポリマーを用いることにより肝細胞または肝由来の細胞を標的とすることができる。
【００３１】
（カチオンポリマーとアニオンポリマーの好ましい組み合わせ）
本発明の複合体において、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と、アニオン性ポリマーの組み合わせとしては、ポリエチレンイミンとヒアルロン酸；プロタミンとヒアルロン酸；カチオン性デンドリマーとヒアルロン酸；ポリエチレンイミンとカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗ混合体リポソーム））とヒアルロン酸；ＤＯＳＰＡを含む集合体（例えばリポフェクタミン）とカルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体を好ましく挙げることができる。
【００３２】
（ウイルスとカチオンポリマーの比率）
本発明複合体において使用するウイルスと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体の混合比は、ウイルスの種類、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体の種類、製造工程におけるどのステップで加えるかに応じて適宜選択することができるが、ウイルス１×１０8pfuに対して、好ましくは０．００１〜５００μg、より好ましくは０．０１〜５０μg、特に好ましくは０．１〜５μgのカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を混合することができる。例えばウイルスとしてアデノウイルスを用い、カチオン性ポリマーとしてポリエチレンイミンを用いる場合、アデノウイルス１×１０8pfuに対して、各ステップで加えるポリエチレンイミンの量は、好ましくは０．００１〜５００μg、より好ましくは０．０１〜５０μg、特に好ましくは０．１〜５μgである。
【００３３】
（ウイルスとアニオン性ポリマーの比率）
本発明複合体において使用するウイルスと、アニオン性ポリマーの混合比は、ウイルスの種類、アニオン性ポリマーの種類、製造工程におけるどのステップで加えるかに応じて適宜選択することができるが、ウイルス１×１０8pfuに対して、好ましくは０．００５〜２０００μg、より好ましくは０．０５〜２００μg、特に好ましくは０．５〜２０μgのアニオン性ポリマーを混合することができる。例えばウイルスとしてアデノウイルスを用い、アニオン性ポリマーとしてヒアルロン酸を用いる場合、アデノウイルス１×１０8pfuに対して、各ステップで加えるヒアルロン酸の量は、好ましくは０．００５〜２０００μg、より好ましくは０．０５〜２００μg、特に好ましくは０．５〜２０μgである。
【００３４】
本発明の複合体に含まれるウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーの好ましい混合比は、上述のとおりであるが、ウイルスの種類、量、対象となる疾患、病体によって最適な条件は変動するため、配合比は、当業者が適宜決定することができる。
【００３５】
（本発明の複合体の製造方法）
本発明の複合体は、上述した遺伝子治療用ウイルス；カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、この順序で逐次混合することによって複合体を形成させる工程によって調製することができる。カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体を混合する工程；およびアニオン性ポリマーを混合する工程は、それぞれ、必要に応じて交互に行うことができる。例えば、遺伝子治療用ウイルスを、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と混合して、１層の複合体を得、次にアニオン性ポリマーと混合して２層である本発明の複合体を得る。更に、この２層の複合体をカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と混合して、３層の複合体を得、更にまたアニオン性ポリマーと混合して、４層の複合体を得ることができる。更に、この４層の複合体をカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体と混合して、５層の複合体を得、更にまたアニオン性ポリマーと混合して、６層の複合体を得ることもできる。
ここで、これらの混合する工程では、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体やアニオン性ポリマーを、１または２種以上混合するが、２種以上を混合するときは、同時に混合させてもよく、または逐次混合させてもよい。例えば、遺伝子治療用ウイルスを、ＲＧＤペプチドを導入したＲＧＤ−ポリエチレンイミンと混合した後、ポリエチレンイミンと混合し、それからヒアルロン酸と混合することができる。
また、このような混合する工程を繰り返す場合、加えるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、およびアニオン性ポリマーの種類は、同一である必要はなく、異なる種類のポリマーやカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、あるいはその組み合わせを、ステップごとに変更して加えていくことも可能である。
さらに、加えるカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体、およびアニオン性ポリマーの量は、その添加によってウイルス、または事前に調製したウイルス複合体の電荷が逆転する程度の量が好ましい。ただし、最後に加えるものに関してはこの限りではない。具体的には、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体；およびアニオン性ポリマーを、各ステップごとに上記の量加えることによって、調製することができる。
【００３６】
このような方法で調製した複合体中、ウイルスは、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とイオン結合による複合体を形成しており、またカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質もしくはそれを含む集合体とアニオン性ポリマーもまたイオン結合している。これらは、混合の回数、混合比、混合順序等によって、表面がカチオン性の複合体、表面がアニオン性の複合体、さらには表面電荷がほぼ中性の複合体のいずれであることもできる。
【００３７】
（本発明の複合体の使用）
このようにして調製した本発明の複合体は、ヒトや動物に対する各種の遺伝子治療、免疫治療、あるいは各遺伝子を導入した実験動物や細胞の作成に利用することができる。
【００３８】
本発明の複合体の適用量は、投与経路、投与部位、疾患の種類、導入するウイルスの種類によって異なるが、例えばアデノウイルスを用いた場合、腹腔内投与では、含まれるウイルス量で、例えば１０８〜１０１２pfu／個体とすることができる。単純ヘルペスウイルスを用いた場合は、例えば、１×１０４〜５×１０５pfu／個体を皮下の腫瘍内に、あるいは乳癌腫瘍塊などに投与することが出来る。投与経路としては、腫瘍局所内、腹腔内、肝動脈内、静脈内、頭蓋内などが例示される。例えば、ｐ５３遺伝子を導入したアデノウイルスや腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを用いた場合は、腫瘍局所内、腹腔内、肝動脈内、静脈内、頭蓋内に投与することが出来る。
また本発明の複合体を、遺伝子導入細胞の作成に用いる場合には、ウイルス量に換算して１〜８０００pfuの複合体を、細胞１個当たりに適用することができる。
【００３９】
なお、本発明に使用するウイルスは、対象とする動物種・疾患によって、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスなどから、効果のあるものを自由に選ぶことができる。
【００４０】
本発明を、下記の例により更に具体的に説明する。なお、これらの例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４１】
（試薬及び材料）
ポリエチレンイミン（以降、ＰＥＩと記載する）はPolyscience社製の Polyethyleneimine “Max”（塩酸塩；Ｍｗ＝４００００）を用いた。ＲＧＤ付加ＰＥＩは、Polyplus-transfection社のjetPEITM-RGDを用いた。ヒアルロン酸（以降、ＨＡと記載する）は、ナカライテスク株式会社の「微生物由来」のヒアルロン酸（分子量：１００万）を用いた。プロタミン（以降、ＰＲＴと記載する）は、和光純薬の硫酸プロタミン（サケ製）を用いた。カチオン性デンドリマー（ポリアミドアミンデンドリマー）であるスーパーフェクトは、QIAGEN社製のものを用いた。使用したワイルドタイプのヒトアデノウィルス（Ｖ型）は、Microbix社から入手した。ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)、および、腫瘍溶解性ウィルス（ADE3-IAI.3B）は、これをもとに、特許文献１と同じ方法で作成した。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス(AD-GM-CSF)は、AD-GFPと同様の方法で、ＧＦＰ遺伝子の代わりにマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を挿入して作成した。
また、ゼータ電位は、５％グルコース溶液中の顕濁液０．８ｍｌを用いて、MALVERN Zetasizer Nano ZS.によって測定を行った。
これらは、特にことわらない限り以降の例においても同じである。
【００４２】
（例１）
アデノウイルスにＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００４３】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、所定量のＰＥＩを加えて良く撹拌し、その直後のゼータ電位を測定した。
【００４４】
［結果］
結果を図１に示す。
【００４５】
ウイルスのゼータ電位は、ＰＥＩを加えることによって次第に上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００４６】
（例２）
アデノウイルスにＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位の時間変化を測定した。
【００４７】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、その直後からゼータ電位を経時的に測定した。
【００４８】
［結果］
結果を図２に示す。
【００４９】
ウイルスのゼータ電位は、ＰＥＩを加えた直後に正の値を示したが、その後さらにゆっくりと上昇し、約２０分でほぼ一定の値になった。
【００５０】
（例３）
アデノウイルス／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００５１】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００５２】
［結果］
結果を図３に示す。
【００５３】
ウイルス／ＰＥＩ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００５４】
（例４）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ複合体にＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００５５】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、所定量のＰＥＩを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００５６】
［結果］
結果を図４に示す。
【００５７】
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ複合体のゼータ電位は、ＰＥＩを加えることによって再び上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００５８】
（例５）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００５９】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００６０】
［結果］
結果を図５に示す。
【００６１】
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００６２】
（例６）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体にＰＥＩを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００６３】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、１０マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、所定量のＰＥＩを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００６４】
［結果］
結果を図６に示す。
【００６５】
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体のゼータ電位は、ＰＥＩを加えることによって再び上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００６６】
（例７）
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００６７】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．２マイクログラムのＰＥＩを加えて良く撹拌し、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、２マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００６８】
［結果］
結果を図７に示す。
【００６９】
アデノウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００７０】
（例８）
ポリマーコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を調べた。
【００７１】
［操作手順］
［１］ウイルスおよびその複合体を加える１日前に、２４穴マルチプレートにＡ５４９細胞（JCRB Cell Bank から入手）をまき（５００００個／ウェル）、１晩インキュベートした（温度：３７℃；湿度９９％；培地：FCS10%を含むRPMI培地）。
［２］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を用いて、例３〜７と同じ方法で、ポリマーとの複合体を調製した。
［３］半数のウェルに、予めヒト免疫グロブリン点滴液（日本製薬株式会社から入手；タイター：×６０００）を２００マイクロリットル加えた。
［４］［２］で調製した複合体をウェルに加えた（添加量：２×１０８pfu/ウェル）。
［５］３７℃、５％ＣＯ２−９５％  ａｉｒ下で８日間インキュベートした。
［６］細胞を経日的に蛍光顕微鏡観察し、感染した細胞の数を数えた。
【００７２】
［結果］
結果を図８に示す。
【００７３】
アデノウイルスとＰＥＩとＨＡからなる複合体は、抗体存在下において、もとのウイルス単体と比べてはるかに高い感染能力を示した。
【００７４】
（例９）
腫瘍溶解性ウイルスとＰＥＩとＨＡからなる複合体の腹腔内注射によるOVHM細胞移植マウスに対する治癒効果を調べた。
【００７５】
［操作手順］
［１］腫瘍溶解性ウィルス（ADE3-IAI.3B）を５％ぶどう糖水溶液に５×１０９pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を５ミリリットルとり、８３．３マイクログラムのＰＥＩを加えて３０分放置後、８３３マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、４１７マイクログラムのＰＥＩを加え、３０分放置後１３９０マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後２７８マイクログラムのＰＥＩを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体を調製した。さらに、同様に調製したものに、最後のＰＥＩ添加３０分放置後、１３９０マイクログラムのＨＡを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体を調製した。
［２］例８の［１］と同様の手法で用意したOVHM細胞（Jpn. J. Cancer Res. 80, 459-463 (1989)に記載された「ＯＶ２９４４−ＨＭ−１」）をマウス一匹あたり１０６個の割合で、３週間前に１０１０pfuのAD-GSFで予め免疫処置した雌の(C57BL/6×C3/He)F1マウス（入手先：日本クレア）の腹腔内に投与した（例数：１３）。
［３］細胞投与から５日目、および９日目に［１］で調製した腫瘍溶解性ウイルス（ADE3-IAI.3B）複合体をそれぞれマウスの腹腔内に、ウイルス量に換算してマウス一匹あたり２．５×１０１０pfuずつ投与し、生存日数を調べた。また、コントロール群には、複合体を投与せず、比較群には、複合体を形成していない裸のウイルス、ADE3-IAI.3Bを一匹あたり２．５×１０１０pfuずつ投与した。
【００７６】
［結果］
何も投与していないコントロール群では全て腫瘍移植後２１日以内に死亡した（例数：3）。また、ポリマーを加えていない裸のウイルスを同量腹腔内に投与した比較群のマウスは、４匹中一匹は投与５秒後にショック症状を呈し、数分で死亡し、残り３匹は３１日以内に死亡した。一方、腫瘍溶解ウイルス複合体を腹腔内投与したマウスは、腹水がたまることもなく７０日以上経っても生存していた（例数：各３）。
【００７７】
（例１０）
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだウイルスとＰＥＩとＨＡからなる複合体の腹腔内注射によるOVHM細胞移植マウスに対する治癒効果を調べた。
【００７８】
［操作手順］
［１］ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだヒトアデノウイルス（AD-GM-CSF）を５％ぶどう糖水溶液に５×１０９pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を５ミリリットルとり、４１．７マイクログラムのＰＥＩを加えて３０分放置後、４１７マイクログラムのＨＡを加え、３０分放置後、４１７マイクログラムのＰＥＩを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ複合体を調製した。さらに、同様に調製したものに、最後のＰＥＩ添加３０分放置後、２０８５マイクログラムのＨＡを加え、ウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ複合体を調製した。
［２］例８の［１］と同様の手法で用意したOVHM細胞（Jpn. J. Cancer Res. 80, 459-463 (1989)に記載された「ＯＶ２９４４−ＨＭ−１」）を、マウス一匹あたり１０６個の割合で、雌の(C57BL/6×C3/He)F1マウス（入手先：日本クレア）の腹腔内に投与した（例数：９）。
［３］細胞投与から５日目、および６日目に［１］で調製したＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つウイルスの複合体をそれぞれマウスの腹腔内に、ウイルス量に換算してマウス一匹あたり２．５×１０１０pfuずつ投与し、生存日数を調べた。コントロール群には、複合体を投与しなかった（例数：３）。
【００７９】
［結果］
何も投与していないコントロール群では腫瘍移植後２９日以内で死亡した（例数：３）。一方ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つウイルス複合体を腹腔内投与したマウスは、腹水がたまることもなく７０日以上経っても生存していた（例数：各３）。
【００８０】
（例１１）
アデノウイルスにＰＲＴを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
［操作手順］
例１で用いたのと同じＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス(AD-GFP)を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、所定量のＰＲＴを加えて良く撹拌し、その直後のゼータ電位を測定した。
【００８１】
［結果］
結果を図９に示す。
【００８２】
ウイルスのゼータ電位は、ＰＲＴを加えることによって次第に上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００８３】
（例１２）
アデノウイルス／ＰＲＴ複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００８４】
［操作手順］
例１で用いたのと同じＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、１．５マイクログラムのＰＲＴを加えて良く撹拌し、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００８５】
［結果］
結果を図１０に示す。
【００８６】
ウイルス／ＰＲＴ複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００８７】
（例１３）
アデノウイルスにカチオン性デンドリマーのスーパーフェクトを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００８８】
［操作手順］
ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、所定量のスーパーフェクトを加えて良く撹拌し、その直後のゼータ電位を測定した。
【００８９】
［結果］
結果を図１１に示す。
【００９０】
ウイルスのゼータ電位は、スーパーフェクトを加えることによって次第に上昇し、プラスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００９１】
（例１４）
アデノウイルス／スーパーフェクト複合体にＨＡを加えたときの、得られる複合体のゼータ電位を測定した。
【００９２】
［操作手順］
例１で用いたのと同じＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を５％ぶどう糖水溶液に１．５×１０８pfu/mlの濃度で懸濁させた。この液を８００マイクロリットルとり、０．５マイクログラムのスーパーフェクトを加えて良く撹拌し、３０分放置後、所定量のＨＡを加え、その直後のゼータ電位を測定した。
【００９３】
［結果］
結果を図１２に示す。
【００９４】
ウイルス／スーパーフェクト複合体のゼータ電位は、ＨＡを加えることによって再び低下し、マイナスの表面電荷を持つ複合体が得られた。
【００９５】
（例１５）
リガンドを結合させたポリマーでコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を調べた。
【００９６】
［操作手順］
［１］ウイルスおよびその複合体を加える１日前に、２４穴マルチプレートにＡ５４９細胞（JCRB Cell Bank から入手）をまき（５００００個／ウエル）、１晩インキュベートした（温度：３７℃；湿度９９％；培地：FCS10%を含むRPMI培地）。
［２］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP）を用いて、例１と同じ方法で、ＰＥＩとの複合体を調製した。また、例１１と同じ方法で、ＰＲＴとの複合体を調製した。
［３］得られた複合体に、ＲＧＤ側鎖を持つアニオン性ＰＥＧ誘導体であるＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｓｕｃ（Biomedicine & Pharmacotherapy 62 (2008) 448に記載した方法で合成した）を加え（添加量：１０マイクログラム）、ＲＧＤを担持したウイルス複合体を調製した。
［４］半数のウェルに、予めヒト免疫グロブリン点滴液（日本製薬株式会社から入手；タイター：×６０００）を２００マイクロリットル加えた。
［５］［３］で調製した複合体をウェルに加えた（添加量：１×１０８pfu／ウェル）。
［６］３７℃、５％ＣＯ2−９５％  ａｉｒ下で２日間インキュベートした。
［７］細胞を経日的に蛍光顕微鏡観察し（測定条件：ブルーフィルター励起）、感染した細胞の数を数えた。
【００９７】
［結果］
ヒト抗体存在下での感染細胞数に関する結果を図１３に示す。
【００９８】
アデノウイルスとＰＥＩとＲＧＤ側鎖を持つＰＥＧ誘導体からなる複合体は、抗体存在下においても、もとのウイルス単体と比べてはるかに高い感染能力を示した。また、アデノウイルスとＰＲＴとＲＧＤ側鎖を持つＰＥＧ誘導体からなる複合体も、抗体存在下においても、もとのウイルス単体と比べて有意に高い感染能力を示した。
【００９９】
（例１６）
ＲＧＤ側鎖を持つＰＥＩを用いてポリマーコーティングしたウイルス複合体の抗体存在下での細胞への感染力を調べた。
【０１００】
［操作手順］
［１］ウイルスおよびその複合体を加える１日前に、２４穴マルチプレートにＡ５４９細胞（JCRB Cell Bank から入手）をまき（５００００個／ウエル）、１晩インキュベートした（温度：３７℃；湿度９９％；培地：FCS10%を含むRPMI培地）。
［２］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだヒトアデノウィルス（AD-GFP)を用いて、例６、７と同じ方法で、ポリマーとの複合体を調製した。ただし、最後に加えるＰＥＩの代わりに、jetPEITM-RGDを３．６マイクロリットル加え、ＲＧＤリガンドを持つウイルス複合体、すなわちウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＲＧＤ−ＰＥＩ複合体（５層複合体）とウイルス／ＰＥＩ／ＨＡ／ＰＥＩ／ＨＡ／ＲＧＤ−ＰＥＩ／ＨＡ複合体（６層複合体）をそれぞれ調製した。
［３］半数のウェルに、予めヒト免疫グロブリン点滴液（日本製薬株式会社から入手；タイター：×６０００）を２００マイクロリットル加えた。
［４］［２］で調製した複合体をウェルに加えた（添加量：２×１０８pfu/ウェル）。
［５］３７℃、５％ＣＯ２−９５％  ａｉｒ下で８日間インキュベートした。
［６］細胞を経日的に蛍光顕微鏡観察し、感染した細胞の数を数えた。
【０１０１】
［結果］
アデノウイルスとＰＥＩとＨＡとＲＧＤ−ＰＥＩからなる複合体は、抗体存在下において、もとのウイルス単体と比べてはるかに高い感染能力を示し、上記５層複合体では４０％、上記６層複合体では３０％の細胞が感染した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図８】
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