(57)【要約】      （修正有）【課題】社会問題化しているメタボリックシンドロームの中でも、主要な症候である脂質代謝異常は高脂血症、脂肪肝、動脈硬化性疾患などを惹起しており、安全性の高い脂質低下剤を提供。【解決手段】大豆たん白質中の配列であるSer-Tyr，Val-LysおよびLys-Alaという特定のアミノ酸配列のジペプチドを大豆蛋白の分解物からの分取、或いはジペプチド合成することにより安全性の高い脂質低下剤として医療用、特定保健用食品用の有効な材料を得ることができる。【選択図】図１
2010018523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆たん白質中に認められる配列である、Ser-Tyr，Val-Lys，Lys-Alaで示されるジペプチド及びその塩から選ばれる、１種以上を有効成分とする、生体における脂質低下剤。
【請求項２】
肝臓でのトリグリセリド合成能を低下させる、請求項１の脂質低下剤。
【請求項３】
Val-Lys，Lys-Alaで示されるジペプチド及びその塩のいずれかまたは双方を有効成分とする、肝臓でのトリグリセリド合成および分泌抑制剤。
【請求項４】
Val-Lys，Lys-Alaで示されるジペプチド及びその塩のいずれかまたは双方を有効成分とする、肝臓内の脂質であるリン脂質、コレステロールエステル、遊離コレステロール、遊離脂肪酸の合成抑制剤。
【請求項５】
Ser-Tyrまたはその塩を有効成分とする、アポリポたん白質Ｂ１００分泌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆たん白質中に存在する特定の配列であって、生体における脂質低下作用有する機能性食品、医療用として有用なジペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活習慣や食生活の欧米化に伴って、肥満、高脂血症、糖尿病、高血圧などの生活習慣病が増加している。またこれらが複合したメタボリックシンドロームが社会問題化している。中でも主要な症候である脂質代謝異常は脂質の過剰な蓄積を原因とし、高脂血症、脂肪肝、動脈硬化性疾患などを惹起し、大きな問題である。脂質代謝を改善する脂質低下剤について、医薬品ではスタチン等HMG-CoA 還元酵素阻害薬（商品名：メバロチン等）が汎用されており、その他にも植物ステロールも医薬品として利用されている。また茶成分や、他の天然植物成分からの抽出物で脂質低下作用・脂質代謝改善作用を有するとして特定保健用食品として開発されたものや、現在効果が明らかとなったと報告されているものも種々見受けられる。
【０００３】
一方、大豆たん白質は栄養価の高いたん白質として大豆素材で、或いはたん白質を抽出、精製した製品が汎用されている。この大豆たん白質について、栄養効果のみでなく、種々の生理効果が近年認められており、それらの中には脂質低下効果、脂質代謝改善効果に関するものもある。さらに、大豆たん白質を酵素分解した大豆ペプチドにおいて、脂質代謝改善効果があることも報告されている。しかし、どのような特定のペプチドに効果があるのかについては明らかにされていない。
【０００４】
また一方で、蛋白質の配列からアミノ酸残基数の少ない特定のオリゴペプチドを合成して、その生理効果を確認する方法も行われている。しかし脂質低下作用を有するジペプチドは知られていない。なおペプチド合成の観点からは、アミノ酸残基数は少ないだけ合成が容易で実用性が高いといえる。ジペプチドで有効なペプチドが発見されれば、安全で実用的な脂質低下剤となることが可能である。
【０００５】
安全性が高い、食品由来のペプチドの中でジペプチドであって有効な成分の開発が望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３００１１４
【特許文献２】特開２００５−２０６５４５
【特許文献３】特開２００５−５０６３２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
汎用の食品成分である大豆たん白質由来で、安全性が高く有効な医療用、特定保健食品用となるペプチド性の脂質低下剤を得ること。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題に対して大豆たん白質を酵素分解したペプチドを分画し、脂質低下・脂質代謝改善効果の高い画分の分画・精製等、鋭意研究を進め、有効ペプチドの同定および同定されたジペプチドを合成しその効果の確認を行うことにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、  （１）大豆たん白質中に認められる配列である、Ser-Tyr，Val-Lys，Lys-Alaで示されるジペプチド及びその塩から選ばれる、１種または２種以上を有効成分とする、生体における脂質低下剤であり、（２）その脂質低下剤が、肝臓でのトリグリセリド合成能を低下させるものであり、（３）Val-Lys，Lys-Alaで示されるジペプチド及びその塩のいずれかまたは双方を有効成分とする、肝臓のトリグリセリド合成および分泌抑制剤。
（４）Val-Lys，Lys-Alaで示されるジペプチド及びその塩のいずれかまたは双方を有効成分とする、肝臓内の脂質であるリン脂質、コレステロールエステル、遊離コレステロール、遊離脂肪酸の合成抑制剤。また（５）Ser-Tyrまたはその塩を有効成分とする、アポリポたん白質Ｂ１００分泌抑制剤、である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安全性が高く、摂取形態にも汎用性があり、入手の方法としても汎用の食品素材である大豆たん白質の酵素分解、またはペプチド合成と複数の方法を選択可能で実用性の高い、医療用および特定保健食品用のジペプチド性脂質低下剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の脂質低下剤としての有効成分である、３種類のジペプチド、（１）Ser-Tyr，（２）Val-Lys，（３）Lys-Alaは大豆たん白質中にある配列であり、大豆たん白質を適切な酵素で分解し、これを分画して所望のペプチドを含む画分を精製することによって得られるし、またペプチド鎖長が２と短いので通常のペプチド合成の方法によっても得られる。
【００１２】
前記３種のジペプチドについて、（１）Ser-Tyrは大豆グリシニンのＡ２サブユニットの一次構造中の６２−６３番目他に、（２）Val-Lysは２３７−２３８  番目に、（３）Lys-Alaはαサブユニット中の４５８−４５９番目他に存在している。なお大豆たん白質のアミノ酸配列については図４、図５に示す。
【００１３】
合成法によって本発明のジペプチドを得る場合には、通常のペプチド合成に用いられる化学合成法（固相法、液相法）、酵素合成法およびDNA組換え法を用いた生物学的合成方法が知られているが、いずれの方法でもよい。酵素法に関して、タンパク質分解酵素（ プロテアーゼ） の逆反応を利用した方法（Ｊ ． Ｂ ｉ ｏ ｌ ． Ｃ ｈ ｅ ｍ ．  ， ７ ０ ７ − ７ ２ ０ （ １ ９ ３ ７ ）耐熱性アミノアシルｔ − Ｒ Ｎ Ａ 合成酵素を利用する方法［特開昭５ ９ − １ ０ ６ ２ ９ ８ 号公報参照］ とかが既に知られているが、最近では、エシェリヒア属やバチルス属に属する微生物を用いた製造方法（国際公開番号 ２００４ / 0 5 8 9 6 0）が開示されている。
【００１４】
また、合成によってえられた本発明のペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換樹脂やハイポーラスポリマー樹脂を用いタクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いた通常の精製法で精製することができる。これらの脂質低下ペプチドは、散剤、錠剤等の形態でも、或いは通常の食品中に添加して飲食品の形態として摂取することが出来るし、さらに輸液や注射用剤として血中に直接投与する方法を用いることも可能である。
【００１５】
本発明の脂質低下ペプチドは、肝臓内での主要な脂質成分の過剰合成や蓄積の抑制に有効であること、また、高トリグリセリド血症の原因となる肝臓内でのTGなどの合成と分泌の抑制に有効である。また、肝臓で生合成されるVLDLの必須構成タンパク質であるアポリポタンパク質B100の細胞内代謝にはトリグリセリド、コレステロールおよびリン脂質代謝が影響するが、特にトリグリセリド合成が強く関与することが知られている。血中におけるアポリポタンパク質B100の濃度は冠状動脈疾患といった動脈硬化症の発症率と正の相関を示すため、その過剰分泌は独立した危険因子とみなされている。このアポリポたん白質の分泌を抑制することで、動脈硬化症の発症をおさえる効果が得られる。  
【００１６】
本発明ジペプチドを飲食用組成物として利用する実施形態は、上記ジペプチドの一種以上を、１ 回の摂取量として好ましくは、０．０１ｍｇから１０ｇ、より好ましくは１００ｍｇから１０００ｍｇ添加して製造される。本発明のジペプチドは、取り扱いが容易で安定な固体ないし粉末であり、水への溶解性もよい。また、胃腸管からの吸収もよい。したがって、食品への添加の時期、及び方法に特別の制限はなく、粉末状、溶液状、懸濁液状等として、食品製造の原料段階、中間工程、最終工程に、食品分野で慣用の方法で添加することが可能である。
【００１７】
本発明のジペプチドを含有する飲食用組成物を、一時的、断続的、継続的または日常的に摂取することにより、肝臓でのＴＧ合成阻害と分泌を抑制し、例えば血清ＴＧ低下の効果を得ることが可能である。飲食品の形態としては、固形状、半流動状、流動状などを挙げることができる。固形状食品としては、ビスケット状、シート状、タブレットやカプセルなどの錠剤、顆粒粉末などの形態の一般食品および健康食品が挙げられる。半流動状食品としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状などの、また、流動状食品としては、ジュース、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤などの形態の一般食品および健康食品が挙げられる。飲食物を栄養ドリンクや調味料として、本発明のジペプチドを継続して摂取することにより、血清ＴＧ上昇を抑制することも可能である。
【００１８】
本発明ジペプチドを医薬組成物として利用する実施形態は、本発明のジペプチドを、上記飲食用組成物と同様の量で投与する。本発明の医薬組成物は、患者の肝臓でのＴＧ合成阻害と分泌を抑制し、その結果血清中のＴＧを低下させるために、高ＴＧ症状の患者に一時的に投与してもよい。本発明の医薬組成物の有効成分は天然物由来であることから、継続して安全に使用することもできる。
【００１９】
本発明の医薬組成物により治療および／ または予防することができる疾患の例は、高ＴＧ血漿などである。医薬組成物の形態は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ等の経口投与剤が好ましい。非経口投与用の製剤としては、経管栄養等静脈、動脈、皮下、筋肉を通して投与するため、あるいは鼻腔から吸入するための、無菌の液剤が挙げられる。液剤は、用時溶解できる乾燥固体であってもよい。また経静脈の注射用製剤は有効成分のジペプチドを生理食塩水に溶解し、通常の無菌操作により注射用製剤とか輸液に製造することができる。
【００２０】
以下、本発明を具体的に説明する。まず実験材料および細胞の培養に関して記載する。
【００２１】
（実験に使用した培養細胞および試薬）
HepG2細胞は大日本住友製薬株式会社（大阪）から購入した。牛血清アルブミン（BSA, 無脂肪酸）、Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DME培地）はSigma Aldrich社（St. Louis, MO, USA）から購入した。牛胎児血清（FCS）およびペニシリン、ストレプトマイシンはMP Biomedicals, Inc.（Ohio, USA）から購入した。トリプシンはDifco Laboratories（Detroit, MI, USA）から購入した。細胞培養ディッシュおよび他の培養器具はNunc社（Roskilde, Denmark）の製品を用いた。[14C]酢酸はAmersham, Inc.（Buckinghamshire, England）から購入した。シリカゲル70プレートは和光純薬工業株式会社（大阪）から購入した。BCA（bicinchoninic acid）Protein Assay ReagentはPierce Biotechnology, Inc.（Rockford, IL, USA）から購入した。シンチゾールEx-Hは株式会社同仁化学研究所（熊本）から購入した。
【００２２】
（HepG2細胞の培養方法）
細胞は10 mlのDME培地を用いて、100×20 mm細胞培養dishで培養した。継代培養には10% FCS、ペニシリン（100 IU/ml）およびストレプトマイシン（100 μg/ml）を含むDME培地を用いた。細胞培養は、37℃、95%空気、5%二酸化炭素の条件下で行い、3日ごとに新しい培地と交換した。細胞がコンフルエントな状態になると以下の方法で継代培養した。ディッシュ内の培地を全て除き、細胞をPBS（phosphate buffered saline）で素早く洗浄した後、適当量の0.3%トリプシン液（0.03% EDTAを含む）を加えて37℃で2分間インキュベートした。その後、10% FCSを含むDME培地を適当量添加してトリプシンの反応を停止させ、細胞をよく懸濁した。懸濁液を190×gで3分間遠心分離し、細胞を回収した。細胞は1/3に分けた後、10% FCSを含むDME培地を用いて、実験に供せる細胞数になるまで培養した。  細胞数はサイトメーターを用いて計測した。実験を開始する前に、細胞（5×105個/dish）を3.5 cm dishにまき、1dish当たり2 ml DME培地（10% FCS含む）を用いて培養した。細胞がコンフルエントな状態になったとき、PBSで洗浄し、0.5 mMオレイン酸を含む1% BSA-DME培地で24時間前培養した。前培養後、試験培地に交換し、同時に放射性脂質前駆体である[14C]酢酸を18.5kBq添加し、24時間培養を行った。これらの細胞と培地を回収し、分析に供した。
【００２３】
（培地調整方法および試験に用いたジペプチド濃度）
基本培地としてDME培地を用いた。前培養の培地は0.5 mMのオレイン酸を1% BSA複合体として添加した。なお、オレイン酸-BSA複合体は、超音波発生器（Sonifier 250, Branson Ultrasonic Co., Danbury, CT, USA）を用いてマイクロチップリミットで15分間超音波処理し調製した。試験培地においては、対照群は1% BSA-DME培地を用い、試験群は1% BSA-DME培地に５mg/mlとなるように各ジペプチドを添加した。これらの培地を0.45 μmフィルター（DISMIC-25cs Cellulose Acetate 0.45μm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd, 東京）でろ過滅菌し用いた。
【００２４】
（脂質の測定方法）
以下の方法により細胞内で合成されたトリグリセリド（以下TGと略す）含量および細胞外に分泌されたTG含量、さらにTG以外の細胞内で合成された脂質含量および細胞外に分泌された脂質含量を測定した。尚、TG以外に測定した脂質は以下の５種類である。ＰＬ：リン脂質、ＣＥ：コレステロールエステル、ＦＣ：遊離コレステロール、ＤＧ：ジグリセリド、ＦＦＡ：遊離脂肪酸
【００２５】
（分析試料の調整方法）
以下の方法により細胞内に合成された脂質を抽出した。また、細胞外に分泌された脂質含量の測定には、細胞培養液を用いた。
Yotsumotoらの報告（Planta Med. 63(2):141-5, 1997.）に準じて、[14C]酢酸（Amersham, Inc.（Buckinghamshire, England）製）を用いて行った。即ち、HepG2細胞は1% BSA-DME培地で24時間前培養した後、各試験培地に交換した。試験培地には[14C]酢酸を18.5kBq添加し、24時間培養した後に細胞と培地に分離した。さらに細胞は、PBSで洗浄され、2mlのPBSを加えてセルスクレーパーを用いて回収した。回収した細胞と培地は分析に供するまで-35℃で凍結保存した。
回収した細胞は融解後、超音波発生器を用いて破砕し、細胞ホモジネートを調製した。タンパク質はBCA Protein Assay Reagentを用いて定量した（Smith PK等  Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150(1): 76-85, 1985.）。
【００２６】
細胞および培地の脂質は、Bligh and Dyer法（Bligh EG等 Can J Biochem Physiol.  37(8): 911-7, 1959）に従い抽出純化した。細胞ホモジネートおよび培地の一定量を共栓付き試験管に取り、クロロホルム：メタノール（1：2）を4.5 ml加えよく撹拌し、クロロホルムを1.5 ml添加した後37℃で1時間加温した。その後、最終的にクロロホルム：メタノール：水（1：1：0.8）の混合液となるように水を加え、1,750×gで15分間遠心した。下層のクロロホルムを回収し、窒素ガスで濃縮した後、一定量の石油エーテルに溶解し、脂質分析に供した。
【００２７】
（TG含量の測定方法）
細胞内で合成されたTG含量および細胞外（培地中）に分泌されたTG含量は、上記で調整された各脂質抽出液を用いて液体シンチレーションカウンターで測定した。
脂質抽出液の一定量をバイアルに取り、有機溶媒を蒸発させ、液体シンチレーション用カクテル（シンチゾールEx-H）で溶解した。その放射能活性を液体シンチレーションカウンター（WALLAC 1440TM, Pharmacia, Finland）でカウントし、これをトータルカウントとした。
【００２８】
TG以外の細胞内外で合成された脂質の測定に関して、
細胞内で合成された脂質含量および細胞外（培地中）に分泌された脂質含量は、上記で調整された脂質抽出液を用い、薄層クロマトグラフィー法で分画して測定した。（thin layer chromatography, TLC）法（Yanagita T等  Biochim Biophys Acta. 919(1): 64-70, 1987  およびCha JY等  Biosci Biotechnol Biochem. 62(3): 508-13, 1998.）  
尚、TG以外に測定した脂質は以下の５種類である。ＰＬ：リン脂質、ＣＥ：コレステロールエステル、ＦＣ：遊離コレステロール、ＤＧ：ジグリセリド、ＦＦＡ：遊離脂肪酸
TLCには市販のシリカゲル70プレートを用い、展開溶媒として石油エーテル：ジエチルエーテル：酢酸（82：18：1, v/v/v）を用いた。展開終了後、プレートをラップフィルムで包み、イメージングプレートの露光面とプレートが合わさるようにカセット内に入れ、数時間密着露光を行った。その後、バイオイメージングアナライザ（BAS1000, 富士写真フィルム, 神奈川）を用いて放射能活性を測定した。得られた各バンドの面積比と、トータルカウントから放射能活性を算出した。
実験で得たデータはDuncan’s multiple range test（Biometrics. 11(1): 1-42, 1955.）を用いて多重検定を行った。
【００２９】
〔アポリポたん白質分泌量の測定方法〕
本発明におけるアポリポたん白質の測定は、以下の方法に従って測定した。
ヒト肝臓由来のHepG2細胞系でのアポリポタンパク質B100の定量は、Total Human Apolipoprotein B ELISA assay（ALerCHEK, inc., Maine, USA）を用いたELISA法によって測定した。実験で得たデータはDuncan’s multiple range testを用いて多重検定を行った
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を記載するが、この発明の技術思想がこれらの例示によって限定さ
れるものではない。
【００３１】
ペプチドの調製
通常のペプチド固相合成法により大豆たん白質中に存在するペプチドの内、Ala-Leu、Ala-Tyr、Ala-Val、Lys-Ala、Ser-Tyr、Val-Lysの６つのジペプチドを合成し、その生理効果を確認した。
【００３２】
〔細胞内のTG合成および細胞外（培地中）へのTG分泌に及ぼす影響を調べた〕
既に記載した方法により試料を調整し、細胞内外のTG含量を測定することで、大豆ペプチドから単離同定されたジペプチドの細胞内外のTG合成に及ぼす影響に関して、合成されたペプチドを用いて検討した。
結果を図１、図２に示す。
【００３３】
図１に示すように24時間培養後の[14C]酢酸からの細胞TG合成量は、ペプチド無添加群と比較して、Lys-Alaで50%、Ser-Tyrで25%、Val-Lysで44%の有意な低下が認められた。一方、図２から明らかになように、細胞内で[14C]酢酸を取り込み、培地中へ分泌されたTG量は、Lys-Alaで37%、Ser-Tyrで39%、Val-Lysでは52%の有意な低下が認められた。
【００３４】
〔TG以外の細胞脂質合成および細胞外への分泌に及ぼす影響〕
既に記載した方法（［００２３］、「００２５」）により試料を調整し、TG以外の細胞内で合成された脂質含量および細胞外に分泌された脂質含量を測定し、大豆ペプチドから単離同定されたジペプチドが細胞内外の脂質合成に与え得る影響に関して、合成したジペプチドを用いて検討した。
結果を次に表示する
【００３５】
【表１】
2010018523.tif 000003
【００３６】
【表２】
2010018523.tif 000004
【００３７】
表１より、脂質合成に関しては、まずLys-Ala、Ser-Tyr、Val-Lysにより、リン脂質、遊離脂肪酸の合成を有意に抑制した。さらに、Lys-Alaはジグリセリド、Ser-Tyrはコレステロールエステルの合成も顕著に抑制した。また、Ala-Valは遊離脂肪酸の合成を有意に低下した。脂質の培地中への分泌に関しては、表２よりLys-Ala、Ser-Tyr、Val-Lysは、遊離脂肪酸の分泌を有意に抑制した。さらに、Lys-Alaはコレステロールエステル、Ser-Tyrは遊離コレステロールおよびコレステロールエステルの分泌を顕著に抑制した。しかしながら、Ala-Leu、Ala-Tyr、Ala-Valはリン脂質の分泌が上昇した。
【００３８】
〔アポリポタンパク質B100分泌に及ぼす影響〕
既に記載した方法により試料を調整し、大豆ペプチドから単離同定されたジペプチドが肝臓細胞からのアポリポたん白質分泌与え得る影響に関して、合成したジペプチドを用いて検討した。  結果を図3に示す。
【００３９】
図３から明らかなように、ジペプチドSer-Tyrは、ペプチド無添加群と比較して35%と顕著にアポリポ蛋白質１００の分泌量を低下させた。
【００４０】
〔補足実験〕大豆たん白の酵素分解と分画によるペプチドの調製と同定
以下、本発明の実施形態をジペプチドの調製法、同定、効果について、さらに詳細に説明する。
【００４１】
先ず大豆たん白の酵素分解について述べる。原料となる大豆蛋白は安価に手に入る材料として、豆乳、濃縮大豆蛋白、あるいは分離大豆蛋白、脱脂大豆、大豆ホエー蛋白などを使用し得るが、その中で分離大豆蛋白が好ましい。酵素反応液中の大豆たん白濃度は通常１〜３０重量％程度で行えばよく、好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは８〜１２重量％が適当である。
【００４２】
用いる蛋白分解酵素（プロテアーゼ）は、その起源は特に問われず、具体的には、セリンプロテアーゼ（動物由来のトリプシン、キモトリプシン、微生物由来のズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ等）、チオールプロテアーゼ（植物由来のパパイン、フィシン、ブロメライン等）、カルボキシプロテアーゼ（動物由来のペプシン等）を用いることができる。更に、具体的にはアスペルギルス・オリゼ起源の「プロチンＦＮ」（大和化成(株)製）、ストレプトマイセス・グリセウス起源の「アクチナーゼ」（科研製薬(株)製）、バチルス・リケホルミス由来の「アルカラーゼ」（Novozymes Japan Ltd.製）やバチルス・ズブチルス由来の「プロチン」（大和化成(株)製）等を例示できる。また、「プロテアーゼＳ」（天野製薬(株)製）や「サーモライシン」（大和化成(株)製）などを使用するこことができる。これらの酵素から単独あるいは複数組み合わせて酵素分解することが出来る。
【００４３】
〔実験１〕大豆蛋白質からジペプチドの単離同定
（１）大豆ペプチド（SCP-LD3）の製造
分離大豆たん白質（不二製油（株）製、「ニューフジプロ−Ｆ」）30kgをpH7.0の９％水溶液とし、蛋白分解酵素（天野製薬（株）製、「プロチンＡＹ」）1.2kgを作用させ60℃で５時間加水分解（15％TCA可溶率85％）した後、８５℃で３０分間、加熱失活し、次に不溶物を遠心分離機除去し、上澄み液を０．４５ミクロン（キュノー（株）製）のフィルターでろ過しスプレードライで乾燥させ、ペプチド粉末  SCP-LD3  １８ｋｇを得た。
【００４４】
（２）大豆ペプチド（SCP-LD3）からジペプチドの単離同定
上記で得られたSCP-LD3 ５kgを20%に調整後、疎水性樹脂HP-21（三菱化成）を積めたカラム（直径30cm×高さ90cm）に通液して疎水度の強いペプチドを吸着除去後、親水性に富むペプチドを含む未吸着画分を回収し粉末乾燥させ２ｋｇを得た。
【００４５】
（３）このペプチド粉末１ｇを30% アセトニトリル（CH3CN）＋0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）溶解し、Bio-Rad Superdex Peptide HR10/30カラム（1.0×30cm）でゲルろ過し、４画分に分画して、ジペプチドに富む４番目の画分を集めて凍結乾燥し、Ｆ４画分を得た。この操作を数回行い、最終１００ｍｇ程度のＦ４画分を得た。
【００４６】
（ゲル濾過条件）
カラム：Bio-Rad Superdex Peptide HR10/30カラム（1.0×30cm）
溶出液：溶離液30% CH3CN/0.1%TFA、
流速：0.3ml/min、
検出：波長220nm、
カラム温度：35℃
【００４７】
（４）このＦ４画分を１０ｍｇ程度、ODSオープンカラムクロマトグラフィー（20×60 mm）に供し、0%CH3CN/0.1%TFA画分、20%CH3CN/0.1%TFA画分、50%CH3CN/0.1%TFA画分の３画分に分画した。  HepG2細胞において脂質代謝の変動を調べたところ、0%CH3CN/0.1%TFA画分が最も活性が強いことが分かった。
【００４８】
（ＯＤＳカラムでの分画条件）
カラム：ODSオープンカラムクロマトグラフィー（20×60 mm）
溶出液：0%CH3CN/0.1%TFA、20%CH3CN/0.1%TFA、50%CH3CN/0.1%TFA溶離液
流速：流速0.3ml/min
検出：220nm
カラム温度：（35℃）
【００４９】
（５）0%CH3CN/0.1%TFA画分からの単離同定
活性が最も高かった0%CH3CN/0.1%TFA画分を逆相高速液体クロマトグラフィー（COSMOSIL 5C18-AR-IIカラム（4.6×250 mm）、流速0.3ml/min、検出波長220nm、カラム温度35℃）で分画し、12ピークを分取した。次に、5C18-AR-IIカラムで得られた各ピークをさらにRP-HPLC（COSMOSIL 5C18-AR-300カラム（4.6×250 mm）、流速0.3ml/min、検出波長220nm、カラム温度35℃）により再分取した。各ピークのアミノ酸配列は、アミノ酸配列は，自動エドマン分解により，Shimadzu PPSQ-21 Protein Sequencerを用いて決定した。
その結果、Ala-Leu、Ala-Tyr、Ala-Val、Lys-Ala、Ser-Tyr、Val-Lys、Leu-Valであることが確認された。
以下に条件を記す。
カラム；COSMOSIL 5C18-AR-IIカラム（4.6×250 mm）
溶出液：
流速：流速0.3ml/min
検出：220nm
カラム温度：（35℃）
【産業上の利用可能性】
【００５０】
一般に食されている大豆蛋白質の中に配列を有するジペプチドでにより、安全に生体の脂質代謝（脂質合成、脂質吸収）を抑制することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】大豆ペプチド由来のジペプチドが肝臓細胞の脂質合成量に及ぼす影響異なるシンボル間で有意差あり  Ｐ＜０．０５
【図２】大豆ペプチド由来のジペプチドが肝臓細胞からのTG分泌量に及ぼす影響異なるシンボル間で有意差あり  Ｐ＜０．０５
【図３】大豆ペプチド由来のジペプチドがHepG2肝臓細胞のアポリポタンパク質B100分泌に及ぼす影響異なるシンボル間で有意差あり  Ｐ＜０．０５
【図４】大豆グリシニンのサブユニットのアミノ酸配列
【図５】大豆β−コングリシニンのサブユニットのアミノ酸配列
【図１】
2010018523.tif 000005
【図２】
2010018523.tif 000006
【図３】
2010018523.tif 000007
【図４】
2010018523.tif 000008
【図５】
2010018523.tif 000009