(57)【要約】【課題】ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種判定を行う。ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの個体数を定量分析する。【解決手段】各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識するプライマー対を用いて被験試料をＰＣＲし、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにした。また、各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識するプライマー対を用いて被験試料をリアルタイムＰＣＲすることによりＣｔ値を得て、フジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し上記プライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を利用することによって、被験試料に存在するフジツボ幼生種の個体数の定量を行うようにした。【選択図】図１０
2010099063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（１１）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むことを特徴とするフジツボ種判定用プライマーセット。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むタテジマフジツボ（Amphibalanus amphitrite）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むシロスジフジツボ（Fitsulobalanus albicostatus）検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むドロフジツボ（Fitsulobalanus kondakovi）検出用プライマー対、
（４）配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むサラサフジツボ（Amphibalanus reticulates）検出用プライマー対、
（５）配列番号９及び１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むココポーマアカフジツボ（Megabalanus coccopoma）検出用プライマー対、
（６）配列番号１１及び１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むサンカクフジツボ（Balanus trigonus）検出用プライマー対、
（７）配列番号１３及び１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むクロフジツボ（Tetraclita japonica）検出用プライマー対、
（８）配列番号１５及び１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むイワフジツボ（Chthamalus challengeri）検出用プライマー対
（９）配列番号１７及び１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むアメリカフジツボ（Amphibalanus eburneus）及びヨーロッパフジツボ（Amphibalanus improvisus）検出用プライマー対
（１０）配列番号１９及び２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むオオアカフジツボ（Megabalanus volcano）検出用プライマー対
（１１）配列番号２１及び２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むアカフジツボ（Megabalanus rosa）検出用プライマー対
【請求項２】
前記（７）のクロフジツボ（Tetraclita japonica）検出用プライマー対に代えて、下記（１２）のクロフジツボ（Tetraclita japonica）検出用プライマー対を含む請求項１記載のフジツボ種判定用プライマーセット。
（１２）配列番号５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むクロフジツボ（Tetraclita japonica）検出用プライマー対
【請求項３】
被験試料に対し、請求項１または２に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記被験試料の遺伝子増幅の有無により前記被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定することを特徴とするフジツボ幼生の種判定方法。
【請求項４】
被験試料に対し、請求項１または２に記載のプライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、前記プライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し前記プライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより前記フジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、前記被験試料に存在する前記フジツボ幼生種の個体数の定量を行うことを特徴とするフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲとし、前記遺伝子増幅量として前記リアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値を利用することを特徴とする請求項４記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載のフジツボ幼生個体数の定量方法において、請求項１に記載のプライマーセットのうち（９）のプライマー対を除く一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、前記遺伝子増幅量をサイクリングプローブ法によりモニタリングし、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号５１で示される塩基配列からなる分子を用いることを特徴とするフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項７】
前記被験試料を分画処理してから前記ＰＣＲに供する請求項４〜６のいずれか一つに記載のフジツボ幼生個体数の定量方法。
【請求項８】
配列番号１〜２２、５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むフジツボ種判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、複数種のプランクトンが多数存在する海水域から採集した被験試料に含まれるフジツボ幼生の種を判定し、その個体数の定量を行うのに好適なフジツボ種判定用プライマーセットとこれを利用したフジツボ幼生の種判定方法及び定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フジツボは、海洋構築物や火力・原子力発電所の冷却水路系、船舶、魚網等へ付着することにより生物汚損を引き起こす代表的汚損生物として知られている。例えば、火力・原子力発電所の冷却水路系にフジツボが付着すると、流動抵抗の増大により冷却水の流量が低下し、復水器の冷却効率が低下してしまう。また、復水器管内にフジツボが付着したり、剥がれたフジツボが詰まることにより管壁の腐食が生じる。そこで、各発電所では、付着したフジツボを機械的に除去したり、フジツボの付着を抑制するための様々な防除対策が実施されている。
【０００３】
フジツボの付着を抑制する対策としては、冷却水路系や復水器管等に防汚塗料を塗布したり、あるいは塩素を注入してフジツボ幼生の付着を防ぐ手法がとられている。しかしながら、フジツボの付着時期を正確に予測することはできないことから、結果的には長期間にわたって塩素注入を継続することによりフジツボの付着を抑制しているのが現状であり、環境負荷が非常に大きいという問題がある。したがって、環境負荷を低減し、また、防除対策のコストダウンを図るためにも、フジツボが付着する直前にピンポイントで塩素注入を行うことが好ましい。そこで、フジツボの付着時期を正確に予測する技術の確立が望まれている。
【０００４】
ところで、海洋等の環境中には様々な種のフジツボが存在していることから、フジツボの付着時期を正確に予測するためには、どのような種のフジツボ幼生がどのようなタイミングで発生するのかを十分に調査する必要がある。
【０００５】
フジツボの種を幼生の段階で判定する方法としては、顕微鏡観察による手法が挙げられるが、プランクトンサンプル中に存在する複数種のフジツボ幼生から形態分類学上の差異のみを頼りにフジツボ幼生の種を判定することは極めて困難である。
【０００６】
そこで、付着期のフジツボ幼生の種を判定する技術として、特許文献１のような方法が提案されている。具体的には、海水から採集されたタテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボおよびヨーロッパフジツボを含むフジツボ種の付着期幼生（キプリス幼生）に対して、波長が４００〜４４０ｎｍの励起光を照射し、発光した波長４７５ｎｍ以上の蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに入力し、この情報をコンピュータに予め登録された種に固有の体内蛍光分布パターン認識情報と比較して、これらの蛍光分布パターンがマッチングしたフジツボ類の種を判定するようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１２４６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１記載のフジツボ幼生の種判定方法では、成長初期段階にあるノープリウス幼生期のフジツボ種の判定を行うことができない。したがって、フジツボの付着時期の予測が遅れて付着抑制対策を確実に実行できなくなる虞がある。また、蛍光パターンが類似している種が存在する結果、種の判定を高精度に行うことができないという問題も有している。さらに、キプリス幼生が死んでしまうと、励起光を照射してもキプリス幼生からの蛍光発光が生じなくなり、種の判定ができなくなることから、キプリス幼生を生きたまま種の判定に供する必要があるという煩雑さが伴う。
【０００９】
また、フジツボの付着時期を正確に予測するためには、フジツボ幼生の高精度な種判定手法と共に、その個体数を定量的に分析する手法を確立する必要がある。
【００１０】
そこで、本発明は、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期のフジツボの種を簡易且つ高精度に判定すると共に、その個体数を定量的に分析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、遺伝子解析技術からのアプローチにより各種フジツボを分子レベルで種々検討した。その結果、各種フジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列情報に基づき、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ココポーマアカフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ、オオアカフジツボをそれぞれ分子レベルで特異的に認識するプライマー対を開発することに成功し、本願発明に至った。
【００１３】
即ち、本発明のフジツボ種判定用プライマーセットは、下記（１）〜（１１）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むタテジマフジツボ検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むシロスジフジツボ検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むドロフジツボ検出用プライマー対、
（４）配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むサラサフジツボ検出用プライマー対、
（５）配列番号９及び１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むココポーマアカフジツボ検出用プライマー対、
（６）配列番号１１及び１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むサンカクフジツボ検出用プライマー対、
（７）配列番号１３及び１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むクロフジツボ検出用プライマー対、
（８）配列番号１５及び１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むイワフジツボ検出用プライマー対
（９）配列番号１７及び１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対
（１０）配列番号１９及び２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むオオアカフジツボ検出用プライマー対
（１１）配列番号２１及び２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むアカフジツボ検出用プライマー対
【００１４】
（１）のプライマー対は、タテジマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、タテジマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（１）のプライマー対によれば、タテジマフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を起こす。
【００１５】
（２）のプライマー対は、シロスジフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、シロスジフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（２）のプライマー対によれば、シロスジフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００１６】
（３）のプライマー対は、ドロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、ドロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（３）のプライマー対によれば、ドロフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００１７】
（４）のプライマー対は、サラサフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、サラサフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（４）のプライマー対によれば、サラサフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００１８】
（５）のプライマー対は、ココポーマアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、オオアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（５）のプライマー対によれば、ココポーマアカフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００１９】
（６）のプライマー対は、サンカクフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、サンカクフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（６）のプライマー対によれば、サンカクフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００２０】
（７）のプライマー対は、クロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、クロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（７）のプライマー対によれば、クロフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００２１】
（８）のプライマー対は、イワフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、イワフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（８）のプライマー対によれば、イワフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００２２】
（９）のプライマー対は、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボののミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（９）のプライマー対によれば、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００２３】
（１０）のプライマー対は、オオアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、オオアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（１０）のプライマー対によれば、オオアカフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００２４】
（１１）のプライマー対は、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、アカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、オオアカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（１１）のプライマー対によれば、アカフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。
【００２５】
ここで、本発明のプライマーセットにおいて、上記（７）のクロフジツボ検出用プライマー対に代えて、下記（１２）のクロフジツボ検出用プライマー対を用いるようにしてもよい。
（１２）配列番号５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むクロフジツボ検出用プライマー対
【００２６】
（１２）のプライマー対は、クロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識する。即ち、クロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列のみを認識し、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しない。したがって、（７）のプライマー対によれば、クロフジツボの遺伝子と特異的にＰＣＲを起こす。また、ＰＣＲにおけるプライマーダイマーの発生を抑えることができる。
【００２７】
次に、本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、被験試料に対し、上記（１）〜（１１）、または上記（１）〜（６）及び（８）〜（１２）のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにしている。
【００２８】
例えば、被験試料にタテジマフジツボ幼生が存在している場合には、上記（１）のプライマー対がタテジマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列を特異的に認識し、ＰＣＲによりタテジマフジツボ幼生の遺伝子の増幅が生じる。一方、被験試料にタテジマフジツボ幼生が含まれていない場合には、上記（１）のプライマー対によって認識される遺伝子が存在しないので、遺伝子増幅は生じない。したがって、遺伝子増幅の有無を検出することにより、被験試料に存在しているフジツボ幼生の種がタテジマフジツボであるか否かを判定することができる。つまり、遺伝子増幅の有無を検出することによって、被験試料に存在しているフジツボ幼生種がＰＣＲに使用したプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種であるか否かがわかるので、これによりフジツボ幼生の種を判定できる。
【００２９】
次に、本発明のフジツボ幼生個体数の定量分析方法は、被験試料に対し、上記（１）〜（１１）、または上記（１）〜（６）及び（８）〜（１２）のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種（ＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種）の個体数の定量を行うようにしている。
【００３０】
例えば、上記（１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、被験試料に存在するタテジマフジツボ幼生個体数に対応して遺伝子が増幅する。したがって、タテジマフジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、上記（１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりタテジマフジツボ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いることで、被験試料の遺伝子増幅量から被験試料に存在するタテジマフジツボ幼生個体数を定量することができる。つまり、ＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数を定量することができる。
【００３１】
ここで、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲとし、遺伝子増幅量としてリアルタイムＰＣＲにより得られるＣｔ値を利用することが好ましい。
【００３２】
また、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、上記（１）〜（１１）のプライマー対のうち（９）のプライマー対を除く一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をサイクリングプローブ法によりモニタリングし、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号５１で示される塩基配列からなる分子を用いることが好ましい。
【００３３】
さらに、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法において、被験試料を分画処理してからＰＣＲに供することが好ましい。
【００３４】
次に、本発明のフジツボ種判定用キットは、配列番号１〜２２、５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００３５】
例えば、配列番号１または２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーをプローブとして含む場合、このプローブがタテジマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して結合（ハイブリダイズ）する。したがって、本発明のフジツボ種判定用キットにより、被験試料に存在するフジツボ幼生の種がタテジマフジツボであるか否かを判定することができる。つまり、プローブとのハイブリッドの形成の有無によって、被験試料に存在しているフジツボ幼生種がプローブとして使用したプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種であるか否かがわかるので、これによりフジツボ幼生の種を判定できる。
【発明の効果】
【００３６】
請求項１記載のフジツボ種判定用プライマーセットによれば、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ココポーマアカフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ、オオアカフジツボまたはアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、このプライマーセットをＰＣＲに供することで、この特定領域の遺伝子断片のみを増幅することができる。
【００３７】
請求項２記載のフジツボ種判定用プライマーセットによれば、配列番号５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むクロフジツボ（Tetraclita japonica）検出用プライマー対によってクロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができるので、ＰＣＲ時のプライマーダイマーの生成を抑えることができる。
【００３８】
請求項３記載のフジツボ幼生種判定方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、ＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種を特異的に検出して、フジツボ幼生の種を判定することができる。
【００３９】
請求項４記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、ＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種のみを特異的に検出して定量することができる。
【００４０】
請求項５記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、被験試料に複数種のプランクトンが多数存在している場合であっても、リアルタイムＰＣＲに使用するプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種のみを特異的に検出して定量することができる。しかも、請求項１に記載のフジツボ種判定用プライマーセットにより増幅されるＤＮＡ断片長は３００ｂｐ以内に収まることから、リアルタイムＰＣＲを行うためのＤＮＡ断片長として好適な長さとなり、リアルタイムＰＣＲによるＣｔ値の測定を精度良く行うことが可能になる。
【００４１】
請求項６記載のフジツボ幼生個体数の定量方法によれば、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号５１で示される塩基配列からなる分子を用いているので、サイクリングプローブがＰＣＲにより増幅されたフジツボのＤＮＡの特定領域とハイブリッドを形成する。したがって、対象となるフジツボ幼生種のみを精度良く定量することが可能となる。
【００４２】
請求項７に記載のフジツボ幼生個体数の定量分析方法によれば、被験試料が予め分画処理されてからＰＣＲに供されるので、例えば、初期ノープリウス幼生期にあるフジツボ幼生と、後期ノープリウス幼生期及びキプリス幼生期にあるフジツボ幼生とを分画して定量することにより定量精度を高めることが可能となる。
【００４３】
請求項８記載のフジツボ種判別用キットによれば、配列番号１〜２２、５４及び５５記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも一つのプライマーをプローブとして含んでいるので、プローブとして含まれるプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ種について、そのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識することができ、被験試料に存在するフジツボ幼生種の種判定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】各種フジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域の塩基配列を示す図である。
【図２】アカフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図３】ココポーマアカフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図４】タテジマフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図５】サンカクフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図６】サラサフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図７】イワフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図８】ヨーロッパフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図９】クロフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図１０】各種フジツボ幼生の個体数とＣｔ値との関係を示す図である。
【図１１】アカフジツボ幼生だけを含むサンプルのリアルタイムＰＣＲの結果と、アカフジツボ幼生と野外採集混合プランクトンを含むサンプルのリアルタイムＰＣＲの結果とを示す図である。
【図１２】アカフジツボ幼生だけを含むサンプルについて３５サイクルでＰＣＲを行った結果と、アカフジツボ幼生と野外採集混合プランクトンを含むサンプルについて３５サイクルでＰＣＲを行った結果とを示す図である。
【図１３】アカフジツボ幼生だけを含むサンプルについて２５サイクルでＰＣＲを行った結果と、アカフジツボ幼生と野外採集混合プランクトンを含むサンプルについて２５サイクルでＰＣＲを行った結果とを示す図である。
【図１４】発生段階の異なるアカフジツボ幼生のリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図１５】サイクリングプローブ法によりリアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図１６】アカフジツボ幼生の個体数と蛍光強度との関係について検討した結果を示す図である。
【図１７】ＤＮＡチップの実施の一例を示す図である。
【図１８】サイクリングプローブ法の原理を示す図である。
【図１９】ＰＣＲ後の蛍光写真を示す図である。
【図２０】オオアカフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２１】オオアカフジツボ幼生の個体数とＣｔ値との関係を示す図である。
【図２２】実海域から採集したサンプルの各種フジツボ種の幼生の個体数の季節間変動を示す図である。
【図２３】配列番号５４及び５５に記載のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてクロフジツボ鋳型ＤＮＡまたは野外採集混合プランクトンとＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図２４】クロフジツボ成体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５４及び５５に記載のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを２５サイクルおこなうことにより得られた産物のアガロース電気泳動像を示す図である。
【図２５】配列番号５４及び５５に記載のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてクロフジツボ幼生の個体数とＣｔ値との関係を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００４６】
本発明のフジツボ種判定用プライマーセットは、下記（１）〜（１１）のうち少なくとも一組のプライマー対を含むものである。
【００４７】
（１）タテジマフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号２７で示されるタテジマフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、４８〜１１１番目の６４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００４８】
（２）シロスジフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号２９で示されるシロスジフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、４７〜１５６番目の１１０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００４９】
（３）ドロフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号４４で示されるドロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３２〜２８６番目の２５５ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５０】
（４）サラサフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号２８で示されるサラサフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３４〜１５３番目の１２０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５１】
（５）ココポーマアカフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号３８で示されるココポーマアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、４２〜１４４番目の１０３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５２】
（６）サンカクフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号３０で示されるサンカクフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、４６〜１３８番目の９３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５３】
（７）クロフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号３４で示されるクロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、４９〜１４８番目の１００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５４】
（８）イワフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号３３で示されるイワフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３５〜１５８番目の１２４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５５】
（９）アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号２６で示されるアメリカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３０〜１４５番目の１１６ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。また、このプライマー対により、配列番号４３で示されるヨーロッパフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、３０〜１４５番目の１１６ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５６】
（１０）オオアカフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号１９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号５０で示されるオオアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、１６〜２２３番目の２０８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５７】
（１１）アカフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号２２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号２３で示されるアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、５４〜１４４番目の９１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５８】
ここで、上記（７）のクロフジツボ検出用プライマー対に代えて、下記（１２）のクロフジツボ検出用プライマー対を用いるようにしてもよい。
（１２）クロフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号５４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号３４で示されるクロフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、１４５〜２４５番目の１０１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００５９】
また、上記（１１）のアカフジツボ検出用プライマー対に代えて、下記（１３）のアカフジツボ検出用プライマー対を用いるようにしてもよい。
（１３）アカフジツボ検出用プライマー対
このプライマー対は、配列番号５６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、配列番号５７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーとからなるものである。このプライマー対により、配列番号２３で示されるアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、５４〜１３７番目の８４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。
【００６０】
尚、各プライマーの塩基配列は、配列番号１〜２２、５４〜５７で示される塩基配列に限定されるものではなく、プライマーの一端または両端が延長されたプライマーであって、対応するフジツボ種の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域の塩基配列と相補的な配列を有して特異的に認識するプライマーも包含される。但し、プライマー長は、１８〜４０塩基とすることが好ましい。プライマー長を４０塩基超とすると、非特異的なアニーリングが起こり易くなり、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。また、短すぎても、目的のＤＮＡ断片の増幅が検出できなくなる虞がある。
【００６１】
本発明のプライマーセットの各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いて合成してもよい。
【００６２】
次に、本発明のフジツボ幼生の種判定方法について説明する。
【００６３】
本発明のフジツボ幼生の種判定方法は、被験試料に対し、上記のプライマー対のうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、被験試料の遺伝子増幅の有無により被験試料に存在しているフジツボ幼生の種を判定するようにしている。
【００６４】
被験試料としては、フジツボ幼生を１個体以上含有する可能性のあるあらゆる種類の試料が包含される。例えば、複数種のプランクトンを多数含有している海水等の環境サンプルは勿論のこと、人工飼育水槽の飼育水等も被験試料とすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
被験試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、被験試料中のプランクトンをエタノールに浸漬して固定することが好ましい。この処理により、被験試料中のプランクトンに含まれる酵素等が失活してＤＮＡが分解等を起こすことがなくなり、被験試料の長期保存が可能となると共に、ＰＣＲに悪影響を及ぼす虞のある塩分の析出を防ぐことができる。エタノール固定後は、室温（２０℃程度）で保存してもよいが、１５℃程度で保存することが好適であり、１０℃程度で保存することがより好適であり、５℃程度で保存することがさらに好適である。低温保存することで、プランクトンに含まれる酵素の活性を確実に抑えることができ、ＤＮＡの分解を防止することができる。エタノールに固定した被験試料は、例えばエッペンドルフチューブなどのチューブに入れて乾燥させる。エタノールは揮発しやすいので、乾燥を素早く行うことができる。尚、エタノール以外の揮発性有機物、例えば、メタノール、プロパノール、ブタノール、ベンゼン、トルエン等を用いても同様の効果を発揮する。
【００６６】
但し、被験試料中のプランクトンをエタノール等に浸漬して固定する処理は本発明においては必須処理ではない。即ち、滅菌水等で被験試料中のプランクトンを十分に洗浄して塩分を除いた後、風乾等を行うようにしても良いし、ＤＮＡが分解しない程度に熱をかけて乾燥を行うようにしても良い。
【００６７】
ここで、被験試料に対しＤＮＡ抽出処理を施すようにしてもよい。この場合、プランクトン等に含まれる有機物等によるＰＣＲへの悪影響を防いで、より確実にフジツボ幼生の種の判別を行うことが可能になる。ＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知あるいは新規の方法を適宜用いることができる。
【００６８】
ＰＣＲは、被験試料中のＤＮＡを鋳型として、上記プライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いて行われる。ＰＣＲ条件としては、当該技術分野において公知あるいは新規の条件を適宜用いることができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼアドバンテージ２（クローンテック社）を用いたＰＣＲが挙げられるが、これに限られるものではない。ＰＣＲを行うことにより、被験試料中にフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。より詳細には、使用したプライマー対に対応するフジツボ種のミトコンドリアＤＮＡ上にコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が被験試料中に含まれている場合には、遺伝子増幅が起こり、増幅産物が得られる。
【００６９】
ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、非検出対象成分（鋳型ＤＮＡ、プライマー等）と検出対象成分である増幅産物とを分離した状態で蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量から判断して特定し、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行うことができる。しかしながら、この方法に限定されるものではなく、当該技術分野において公知あるいは新規の他の方法を用いることもできる。増幅産物が検出された場合には、ＰＣＲに使用したプライマー対によって認識される遺伝子を有するフジツボ種が被験試料に存在していることになる。したがって、ＰＣＲに使用したプライマーに応じて、被験試料に存在しているフジツボ種を判定することができる。
【００７０】
ここで、本発明のフジツボ幼生種の判定方法は、上記プライマーセットのうちの一組のプライマー対毎にＰＣＲを行って、被験試料に存在するフジツボ幼生の種判定を行うようにしてもよいが、上記プライマーセットのうち複数組のプライマー対を被験試料に投入してＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡの分子量の差異から、被験試料に存在するフジツボ幼生の種判定を行うようにしてもよい。
【００７１】
次に、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法について説明する。本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットのうちの一組以上のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲにおける遺伝子増幅量に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対しこのプライマー対を用いてＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数と遺伝子増幅量との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種の個体数の定量を行うようにしている。以下に、リアルタイムＰＣＲを利用した場合の実施形態について、詳細に説明する。
【００７２】
リアルタイムＰＣＲを利用した本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、被験試料に対し、上記プライマーセットのうちの一組のプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより得られるＣｔ値に基づき、このプライマー対に認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種の個体数が既知の複数の試料のそれぞれに対し、このプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生種の個体数とＣｔ値との関係を調べて予め作成された検量線を用いて、被験試料に存在するフジツボ幼生種（リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー対により認識される遺伝子を有するフジツボ幼生種）の個体数の定量を行うようにしている。
【００７３】
即ち、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、フジツボ種毎にフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を作成する。そして、この検量線を利用して、被験試料のＣｔ値から、被験試料に含まれるフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしている。
【００７４】
このように、フジツボ種毎にフジツボ幼生個体数とＣｔ値との関係を示す検量線を予め作成しておくことで、被験試料に対し、上記プライマーセットのうち一組のプライマー対毎にリアルタイムＰＣＲを行うことにより、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ココポーマアカフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ、オオアカフジツボ、さらにはアカフジツボの幼生個体数の定量分析を行うことができる。そして、被験試料に上記フジツボ種の幼生が存在していない場合には、フジツボ幼生の個体数が０という結果が得られるので、被験試料に存在しているフジツボ幼生種の判定と個体数の定量とを同時に実施できることになる。
【００７５】
ここで、本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法は、本発明のフジツボ幼生種判定方法を行った後に実施するようにしてもよい。例えば、上記プライマーセットのうちの複数組のプライマー対を用いて被験試料に存在するフジツボ幼生種を絞り込んだ後に、被験試料に存在するフジツボ幼生種に対応するプライマー対を用いて幼生個体数の定量分析を実施することで、定量分析を無駄なく効率的に実施することができる。また、フジツボ種の判定と定量を同時に行うようにしてもよい。例えば、上記プライマーセットのうちの複数組のプライマー対を用いて被験試料に存在するフジツボ幼生種を絞り込む際に、電気泳動法を利用して遺伝子増幅の有無をバンドの発現の有無により確認すると共に、バンドの位置からフジツボ幼生種を検出し、さらに遺伝子増幅量をバンドの濃淡から判断し、予め作成されたバンドの濃淡と幼生個体数との関係を示す検量線から、フジツボ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【００７６】
尚、リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。この手法を用いることで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。即ち、段階希釈した濃度既知の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡを標準試料としてＰＣＲを行い、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値を測定する。この結果に基づいて、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ濃度を横軸にプロットし、検量線を作成する。つまり、この検量線が、試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度とＣｔ値との関係を表す。したがって、濃度未知の被験試料のＣｔ値をリアルタイムＰＣＲにより測定することで、被験試料の特定の塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡの濃度を決定することができる。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置により行うことができる。また、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、蛍光試薬を用いた蛍光モニター法により行われる。例えば、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレータ）をＰＣＲ反応系に添加し、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）にインターカレータを結合させ、励起光を照射することにより蛍光発光を生じさせて、蛍光強度を検出することによりＤＮＡ増幅量のモニタリングを行う、所謂インターカレータ法を用いることができる。尚、インターカレータ法に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法などを適宜採用することもできる。
【００７８】
ここで、ＤＮＡ増幅量のモニタリングは、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号５１で示される塩基配列からなる分子を用いたサイクリングプローブ法により実施するのが特に好ましい。
【００７９】
サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号５１で示される塩基配列からなる分子を用いることで、このプローブが、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ココポーマアカフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、アカフジツボ及びオオアカフジツボの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析領域のうち、上記（１）〜（８）、（１０）、（１１）、及び（１３）のプライマー対によるＤＮＡ増幅部位中の特定領域を特異的に認識する。したがって、被験試料にタテジマフジツボ、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ココポーマアカフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、アカフジツボまたはオオアカフジツボが含まれている場合には、サイクリングプローブが、ＰＣＲにより増幅されたこれらフジツボのＤＮＡの特定領域とハイブリッドを形成する。尚、上記（９）によるアメリカフジツボとヨーロッパフジツボのＤＮＡ増幅部位、及び上記（１２）によるクロフジツボのＤＮＡ増幅部位については、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として配列番号５１で示される塩基配列からなる分子を用いても認識しないが、これらのＤＮＡ増幅部位に基づき、サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子として使用可能な分子の設計が可能である。また、インターカレータ法やＴａｑＭａｎプローブ法などによる検出を行っても良い。
【００８０】
サイクリングプローブには、ＲＮＡ部（配列番号５１に示される塩基配列においては、３番目のＡがＲＮＡである）を挟んで５’端に蛍光物質が結合し、３’端にこの蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）が標識されている。サイクリングプローブは、インタクトな状態にある場合には、クエンチャーの作用により強い蛍光を発することは無い。しかし、増幅ＤＮＡの相補的な配列とハイブリッドを形成した後にＲＮＡ切断酵素であるＲＮａｓｅＨを作用させると、サイクリングプローブがＲＮＡ部で切断され、クエンチャーが作用しなくなって強い蛍光を発するようになる。したがって、この蛍光強度を測定することで、仮に被験試料に存在するプランクトン等の遺伝子がＰＣＲによって増幅されてしまうケースが生じたとしても、目的のフジツボ幼生種の遺伝子増幅のみを選択的に検出することが可能となり、目的のフジツボ幼生個体数の定量を確実且つ精度良く行うことができる。尚、蛍光物質及び消光物質については、リアルタイムＰＣＲ装置で検出可能なものを適宜選択することができる。
【００８１】
尚、リアルタイムＰＣＲにおけるＣｔ値とは、蛍光標識されたＰＣＲ産物量が指数関数的なＤＮＡ増幅期の中で一定量となるときの値、即ち、一定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲサイクル数を表している。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、初期には指数関数的に起こり、１次関数的な増幅を経て、最終的にはプラトーに達する。指数関数的なＤＮＡ増幅期における一定ＰＣＲ産物量に達するＰＣＲサイクル数と初期鋳型ＤＮＡ量には高い相関がある。したがって、初期鋳型ＤＮＡ量、つまり、試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度とＣｔ値との相関を調べることで、Ｃｔ値から試料の特定の塩基配列をもつＤＮＡの濃度を推定する為の検量線を作成することができる。また、ＤＮＡの増幅曲線を二回微分して最大値を算出し、この最大値に達するまでのサイクル数、つまり、ＰＣＲ産物量の増幅がバックグラウンド値から指数関数的に変化する時点のサイクル数を検出し、これをＣｔ値とするようにしてもよい。
【００８２】
本発明のフジツボ幼生個体数の定量方法に用いる検量線は、フジツボ幼生個体数が既知の複数の試料それぞれに対し、このフジツボ幼生が有する遺伝子を認識するプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことによりフジツボ幼生個体数とＣｔ値の関係を調べて予め作成される。
【００８３】
試料の処理方法に関しては、上記と同様、試料からは塩分が含まれる海水や飼育水等をできるだけ除き、試料中のフジツボ幼生をエタノールに浸漬して固定し、乾燥させることが好ましい。
【００８４】
試料のＤＮＡ抽出処理方法としては、当該技術分野において公知または新規の方法を適宜用いることができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社）によるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出方法を用いることが好適である。この場合には、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、フジツボ幼生の定量をより正確に実施することができる。
【００８５】
また、特にキプリス幼生においては、クチクラの殻（甲皮）の堅さがサンプルにより異なる場合があり、これが原因で試料のＤＮＡ抽出効率が低下する場合がある。そこで、試料からＤＮＡを抽出する前に、クチクラの殻の破砕処理を行うことが好適である。例えば、エタノールを除いて乾燥させた試料の入ったエッペンドルフチューブにジルコニアボール（直径２〜３ｍｍ）を数個（例えば、３〜５個）入れて、強く震盪することで組織を破砕した後、上記のＤＮＡ抽出処理に供することが好適である。
【００８６】
ここで、フジツボ幼生は、Ｉ期ノープリウス幼生として孵化後すぐにＩＩ期ノープリウスとなり、その後は、海水中の植物プランクトンを餌として取り込んで成長する。そしてＶＩ期ノープリウス幼生を経て摂餌をしない付着期のキプリス幼生となる。成長に伴い、個体サイズ、細胞数が増加するため、標的となる１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することになる。したがって、幼生の個体数が同じであっても、リアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値が幼生の発生段階で異なってくる。
【００８７】
本願発明者の実験によると、フジツボのキプリス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数は初期（Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数の５倍であることが確認されている。この値はキプリス幼生と初期ノープリウス幼生の体積差を反映している。
【００８８】
したがって、検量線を作成する際に使用する試料としては、幼生の各個体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数がほぼ一定である試料を用いることが好ましい。この場合には、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数が試料中の幼生個体数を正確に反映するので、幼生個体数に対する正確なＣｔ値を得ることができる。例えば、キプリス幼生のみが含まれている試料を用いれば、キプリス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができるし、初期ノープリウス幼生のみが含まれている試料を用いれば、初期ノープリウス幼生の個体数に対応する正確なＣｔ値を得ることができる。
【００８９】
また、幼生個体数が既知の複数の試料は、上記とは別の方法でも得ることができる。即ち、成体試料等から鋳型ＤＮＡを抽出し、これを幼生個体数と同等の遺伝子コピー数となるように段階希釈することによって、幼生個体数が既知の複数の試料を得るようにしてもよい。
【００９０】
アカフジツボ幼生から作成された検量線の例を図１４に示す。このように、初期ノープリウス幼生の個体数に対応する検量線と、キプリス幼生の個体数に対応する検量線とを作成することで、被験試料をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれているフジツボ幼生の個体数を初期ノープリウス幼生個体数の総量として、あるいはキプリス幼生個体数とキプリス幼生の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数とほぼ同数の遺伝子コピー数を有するＶＩ期ノープリウス幼生個体数との総量として換算することができる。換言すれば、被験試料に含まれているフジツボ幼生の総個体数の最大値が初期ノープリウス幼生個体数の総量として換算した場合の値（β）であり、アカフジツボ幼生の総個体数の最小値がキプリス幼生個体数及びＶＩ期ノープリウス幼生個体数の総量として換算した場合の値（α）である。つまり、この検量線を用いることで、被験試料のＣｔ値から、被験試料に含まれているアカフジツボ幼生の総個体数Ｘがα≦Ｘ≦βであると推定することができる。
【００９１】
尚、被験試料の種類や処理方法に関しては、上記と同様である。但し、ＤＮＡ抽出処理方法に関しては、検量線作成時と同様の方法を採用することが定量値のばらつきを抑える上で好ましい。また、被験試料に対して行うリアルタイムＰＣＲ条件は検量線作成時のリアルタイムＰＣＲ条件と同様とする。
【００９２】
ここで、被験試料を分画処理してからリアルタイムＰＣＲに供することにより、精度の高い定量分析を実施することが可能となる。即ち、フジツボ幼生は成長段階に応じてその体積が異なるため、例えば、被験試料を篩にかけて、篩を通過した体積の小さいフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているフジツボの幼生個体数を初期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているフジツボの初期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。また、篩を通過しなかった体積の大きいフジツボ幼生を含む分画成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、分画成分に含まれているフジツボ幼生の個体数をキプリス幼生個体数とＶＩ期ノープリウス幼生個体数の総量として換算することで、被験試料に含まれているフジツボのキプリス幼生とＶＩ期ノープリウス幼生の真の個体数により近い値を得ることができる。したがって、どの成長段階にあるフジツボ幼生が被験試料中にどの程度存在するのかをより具体的に明らかにすることが可能となる。尚、分画方法は篩によるものには限定されず、例えば遠心分離処理を用いてもよい。また、分画処理により、例えば初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生のみを被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれている初期(Ｉ期及びＩＩ期）ノープリウス幼生の個体数を高精度に定量することも可能であるし、ＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生を被験試料から分離した成分をリアルタイムＰＣＲして得られるＣｔ値から、被験試料に含まれているＶＩ期ノープリウス幼生及びキプリス幼生の個体数を高精度に定量することも可能である。
【００９３】
本発明のフジツボ幼生の定量方法により、実海域でのフジツボの付着時期を予測することが可能になる。即ち、Ｃｔ値から換算される幼生個体数の発生段階による相違は最大でも５倍である。これは、実海域での幼生出現ピーク時の個体数増加に比べれば小さい値であり、付着時期予測には大きな問題点とはならないと考えられる。これまでに実海域でフジツボ幼生の個体数変動と付着時期を詳細に調査した報告、例えば、志津川湾におけるフジツボ幼生および付着板の調査（電力中央研究所報告Ｖ０５０３３）や、柳井・三隅火力発電所前面海域での付着板を用いた調査（中国電力  技研時報１０１、ｐ７５−８３）によると、フジツボ種がアカフジツボの場合、付着盛期は１ヶ月以内に集中し、この期間内に急激に付着個体が増加すると報告されている。また、飼育実験からフジツボの幼生は、孵化後１〜２週間で付着期幼生になり、基盤に付着すると考えられる。したがって、付着期前の比較的短期間に幼生の出現ピークがあり、その際の幼生数の増加率は５倍という値に比較して圧倒的に大きな値、例えば、３日〜１週間毎に被験試料をサンプリングした場合、サンプリング量にもよるが、数十倍〜数百倍、あるいはそれ以上の増加率となることが予想される。よって、本発明の定量方法によりフジツボ幼生個体数の定量分析を定期的（例えば、３日〜１週間毎）に行うことで、実海域でのフジツボの付着時期を確実に予測することが可能になる。
【００９４】
次に、本発明のフジツボ種判定用キットについて説明する。
【００９５】
本発明のフジツボ種判定用キットは、配列番号１〜２２、５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーをプローブとして含むものである。
【００９６】
即ち、配列番号１〜２２、５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうち一つのプライマーのみをプローブとして含むことによって、このプライマーによって認識される遺伝子を有するフジツボ種のみを検出するキットとすることができる。また、配列番号１〜２２、５４及び５５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうち２つ以上のプライマー（但し、異なるプライマー対由来の２つ以上のプライマー）をプローブとして含むことによって、２種以上のフジツボを検出するキットとすることができる。
【００９７】
本発明のフジツボ種判定用キットの一例として、図１７に示すＤＮＡチップが挙げられる。このＤＮＡチップ１は、基板２と、基板２の表面に形成されたスポット３と、スポット３内に固定されたＤＮＡプローブ４により構成される。
【００９８】
基板２としては、ガラス基板、シリコンウエハー、ナイロン膜、セルロース膜等を適宜用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
スポット３には、ＤＮＡプローブ４が等量ずつ固定される。ＤＮＡプローブ４は、配列番号１〜２２、５４及び５５のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーである。例えば、スポット３にはそれぞれ異なるフジツボ種を検出するプライマーをプローブとして固定しておく。
【０１００】
ＤＮＡチップ１を用いて、フジツボ幼生の種判定を行う。被験試料はＤＮＡ抽出処理後、ＤＮＡを一本鎖に調製し、蛍光剤や発色剤を添加して１本鎖ＤＮＡを蛍光標識する。そして、これをＤＮＡチップ１のスポット３に滴下し、ＤＮＡプローブ４と結合（ハイブリダイズ）させる。未結合の一本鎖ＤＮＡは洗い流し、スポット３の蛍光強度を検出することにより、蛍光発光が生じたスポットを特定することで、被験試料中のフジツボ幼生の検出を行うことができる。
【０１０１】
尚、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【０１０２】
例えば、上述の実施形態では、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化したリアルタイムＰＣＲ装置を用いてフジツボ幼生個体数の定量分析を行う場合について詳細に説明したが、ＰＣＲ装置やヒートブロックを利用して遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅量を例えばモニタリングすることによって、フジツボ幼生個体数の定量を行うことも可能である。具体的には、フジツボ幼生個体数が既知の試料を複数用意し、この試料に一定サイクルでＰＣＲ装置またはヒートブロックを用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅量をモニタリングし、フジツボ幼生個体数と遺伝子増幅量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、実海域から採集した試料を同条件でＰＣＲして遺伝子増幅量をモニタリングし、検量線を利用して試料中のフジツボ幼生個体数の定量を行うようにしてもよい。
【０１０３】
遺伝子増幅量のモニタリング方法としては、公知あるいは新規の方法を各種用いることができる。例えば、分光光度計によりＰＣＲ後の溶液のＤＮＡ濃度を測定することで遺伝子増幅量をモニタリングするようにしてもよいし、電気泳動や色素によるＤＮＡ染色を利用した定量方法を用いることもできる。ＤＮＡを染色する色素としては、核酸のＡＴに特異性があり、ＤＮＡ量の測定に一般的に使用されている色素であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、サイクリングプローブ法を用いてもよく、サイクリングプローブの蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｘはサイクリングプローブの核酸）を用い、消光物質としてEclipseを用いることで、紫外光を照射することにより赤色の強い蛍光強度を得ることができ好ましいが、これに限定されるものではない。また、蛍光物質としてＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンを用い、消光物質としてEclipseを用いたサイクリングプローブ法のように、可視光領域において強い蛍光発光を生じる場合には、目的とするフジツボ幼生の増幅ＤＮＡのみを、蛍光物質を励起するための励起光を照射するだけで目視で検出することが可能となるので、フジツボ幼生の有無およびおおよその量を目視で容易に検出することができる。
【実施例】
【０１０４】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１０５】
（実施例１）
各種フジツボ成体の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータベース化を行い、このデータベースに基づいて各種フジツボに特異的な塩基配列を特定し、プライマーを設計した。データベース化に供したフジツボ種を表１に示す。アカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ココポーマアカフジツボは採集後に室内でアルテミア、珪藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）などを餌として与えて飼育されたものを９９．５％エタノール（和光純薬製）に浸して固定し、実験に使用するまで４℃で保存した。なお、エタノール浸漬前は、数日間餌を与えずアルテミア由来のＤＮＡの影響を排除した。その他のフジツボは採集直後に９９．５％エタノールに浸漬し４℃で保存した。尚、オオアカフジツボは伊豆半島にて採集したものを使用した。
【０１０６】
【表１】
2010099063.tif 000003
【０１０７】
大型のフジツボ成体であるアカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、クロフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ココポーマアカフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、オニフジツボ、オオアカフジツボ、Cryptolepas rhachianechi、ミミエボシ、スジエボシは、解剖後、軟体部、可能であれば筋肉組織の小片（２〜３ｍｍ角）を清浄なメスを用いて切り出し、インビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットにより総ＤＮＡの抽出を行った。具体的には、上述のエタノール浸漬保存したフジツボ成体からエタノールを除いた後、これを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、５０μＬのリシスバッファー（インビトロジェン製）を加えてプラスチックペッスルですり潰し、さらに３００μＬのリシスバッファーを加えて６５℃で１０分間処理した。次に、ＤＮＡ沈澱用バッファー（インビトロジェン製、名称Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１５０μＬを加えて強く混合撹拌処理（ｖｏｌｔｅｘ）し、さらにクロロホルム（和光純薬製）５００μＬを加えた後、１３８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノール１ｍＬを加え撹拌混合して０℃に３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール（和光純薬製）５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られた沈澱（ＤＮＡ）を風乾後、５０μＬのＴＥバッファー（インビトロジェン製）に溶解した。抽出用組織が小さい場合は適宜溶解バッファー量を減らした。また小型のフジツボであるイワフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ムツアナフジツボ、ハナフジツボ、Semibalanus balanoides、Elminius modestus、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、また、上記大型のフジツボ成体に属するタテジマフジツボの中でも小型の個体に関しては、１個体の軟体部全体をそのまま同様の方法で抽出に供した。
【０１０８】
ＴＥバッファーに溶解したＤＮＡの濃度を分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ  Ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社）により測定した結果、ほとんどのサンプルで５μｇ以上のＤＮＡが得られていることが確認されたが、イワフジツボなど非常に小型のフジツボにおいては１個体から得られるＤＮＡ量が少なかった。ＤＮＡ濃度の測定結果に基づいて、２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度としたＴＥバッファー溶液を調整し、これをＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして供した。
【０１０９】
次に、上記操作により得られた総ＤＮＡを鋳型として、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。プライマーには、フジツボミトコンドリアの１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対するプライマーとして文献１〜４で報告されているものを用いた。
（文献１:  R.A.Begum,T.Yamaguchi and S.Watabe(2004).Molecular phylogeny of thoracican barnacles based on the mitochondrial 12S and 16S rRNA genes.Sessile organisms,21,47-54.
文献２:  T.D.Kocher, W.K.Thomas, A.Meyer, S.V.Edwards, S.Paabo, F.X.Villablansca and A.C.Wilson(1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6196-6200.
文献３:  O.Mokady, S.Rozenblatt, D.Graur and Y.Loya(1994). Coral-host specificity of red sea Lithophaga bivalves: interspecific and intraspecific variation in 12S mitochondrial ribosomal RNA.Mol.Mar.Biol.Biotech.,3,158-164. 
文献４:  S.R.Palumbi(1996). Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Molecular Systematics,ed. D.M.Hillis, C.Mortiz and B.K.Mable, Sinauer Associates, Sunderland, pp.205-248.）
【０１１０】
表２と配列番号５２及び５３に使用したプライマーの配列を示す。なお、これらのプライマーは、合成（シグマジェノシス）により得られたものであり、ＰＣＲに供するまで５０ｐｍｏｌ／μＬのストック溶液（シグマジェノシス製）中に−２０℃で保存した。使用前にストック溶液を純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）で５倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μＬとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは、上記の操作により抽出した総ＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑポリメラーゼとしてジーンタック（ニッポンジーン）またはアドバンテージ２（クローンテック）を用いて行った。なお、鋳型ＤＮＡは２０ｎｇ／μＬに調製した溶液を２μＬ（４０ｎｇ）、各プライマー溶液１μＬ（１０ｐｍｏｌ）を２０μＬの反応液に加えた。反応にはタカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）を用い、反応液の調製はそれぞれのＴａｑポリメラーゼに添付された方法に従った。具体的には、ジーンタックに関しては、滅菌水１３．２０μＬ、１０ｘＰＣＲバッファー（１０ｘＧｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物１．６０μＬ、ジーンタックポリメラーゼ０．２０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。クローンテックアドバンテージ２に関しては、滅菌水１４．２０μＬ、１０ｘＰＣＲ  ＳＡバッファー（１０ｘＧｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）２．００μＬ、５０×ｄＮＴＰ混合物０．４０μＬ、５０×ポリメラーゼ  ｍｉｘ０．４０μＬ、プライマーはそれぞれ０．５０μＬ、鋳型ＤＮＡは２．０μＬとした。なお、アドバンテージ２においては、添付された２種類の反応バッファーのうち良好な結果が得られたＳＡバッファーを使用した。
【０１１１】
【表２】
2010099063.tif 000004
【０１１２】
まず、グラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の推定を行った。グラジエントＰＣＲでのアニーリング温度は、４５．０℃〜６５．０℃の１２段階に設定した。９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）で１分間保ったあと、熱変性９６℃（ジーンタック）または９５℃（アドバンテージ２）３０秒間、各温度でのアニーリング３０秒間、伸長反応７２℃（ジーンタック）または６８℃（アドバンテージ２）３０秒間という反応を３５サイクル繰り返す条件で行った。反応産物はサイズマーカーとともに２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により特定領域の増幅の有無を確認した。
【０１１３】
その結果、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲにおいては、ニッポンジーンのジーンタックを用いた場合、アニーリング温度は５３℃が最適であり、クローンテックのアドバンテージ２を用いた場合は５４℃が最適ではあったが、４５．０℃〜６５．０℃のアニーリング温度範囲であれば、安定してＰＣＲすることが可能であった。なお、増幅されたＤＮＡ断片はいずれのフジツボにおいても約３５０ｂｐの長さであった。
【０１１４】
アガロース電気泳動にて増幅を確認したＰＣＲ産物からエタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、その一部を塩基配列決定に供した。ＰＣＲ産物に９９．５％エタノール５０μＬ、３Ｍの酢酸ナトリウム（和光純薬製）２μＬ、１２５ｍＭのＥＤＴＡ（和光純薬製）２μＬを加え、撹拌混合して１５分間室温で静置した後、１３８００ｇで２０分間遠心分離処理した。沈澱はさらに７０μＬの７０％エタノールで洗浄し、得られた沈澱を乾燥後、６μＬの純水（脱塩蒸留水、無菌、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリー、和光純薬）に溶解した。回収されたＰＣＲ産物（鋳型ＤＮＡ）１μＬと配列番号１に記載された塩基配列からなるプライマーを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）により、サイクルシーケンス反応を行った。反応は、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃４分間を２５サイクル行い、終了後、再度エタノール沈澱を行った。得られた乾燥標品にＨｉＤｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）２０μＬを加え、９５℃で２分間の反応後、サンプルをＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０に供してシーケンシングを行った。また、塩基配列のデータはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて解析した。
【０１１５】
各種フジツボ総ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５２及び配列番号５３に記載された塩基配列からなるプライマーを用いて得られた１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片のシーケンシングの結果について、塩基配列を配列表の配列番号２３〜５０に示す。なお、解析領域は、得られたＤＮＡ断片のうち、全てのサンプルで塩基配列が決定できた領域である２９７ｂｐ〜３０５ｂｐの範囲とした。また、配列表の配列番号２３〜５０に示す塩基配列は、それぞれの種において最も出現頻度の高かった塩基配列である。
【０１１６】
また、図１に、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、サンカクフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、クロフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、カメノテ、エボシガイの塩基配列のシーケンシング結果を示す。図１において、「：」はアカフジツボと同じ塩基であることを表し、「−」は塩基配列が欠損している部分を表している。図１に示すように、便宜上、比較するＤＮＡ断片の塩基に１から３１１まで番号をつけた。このなかで、種間で変異の大きい領域とほとんど変異のみられない領域があったが、特に５５番付近、７０番付近、１３０番付近、１７２番付近、２２２番付近などは変異の大きな領域であった。
【０１１７】
なお、同一の鋳型ＤＮＡから１２Ｓ ｒＲＮＡ用プライマーを用いてジーンタック、アドバンテージ２の２種類のＴａｑポリメラーゼにより増幅した場合、得られた塩基配列データは全く同じであった。
【０１１８】
次に、配列表の配列番号２３〜５０の塩基配列について、種間で変位の大きい領域に基づき、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ココポーマアカフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、イワフジツボ、アメリカフジツボ、ヨーロッパフジツボ、オオアカフジツボ、アカフジツボについて、特異的な塩基配列領域の特定を行ったところ、リアルタイムＰＣＲにおいて高精度に測定できると考えられている３００ｂｐ以下のＤＮＡ断片を挿むプライマー結合部位を選定することができた。各プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１〜２０、５６及び５７に示す。これらのプライマーを合成（シグマジェノシス）し、以下の実験に供した。
【０１１９】
（１）アカフジツボ検出用プライマー対の特異性
まず、合成したプライマーのうち、配列番号５６及び５７のアカフジツボ検出用プライマー対について、上記方法により得られたアカフジツボ成体並びにタテジマフジツボ成体の鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、このプライマー対の有効性とＰＣＲの最適条件について検討した。ＰＣＲは基本的には上述の方法に従い、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＤｉｃｅ（ＴＰ６００）のグラジエント機能を利用して最適アニーリング温度の検討を行なった。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（３％アガロース）後にＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（インビトロジェン）によるＤＮＡバンドの可視化により検出した。ＰＣＲにおけるサイクル数は３０サイクルとした。なお、タテジマフジツボは日本の沿岸に広く生息するフジツボであるとともに、実験室内での飼育法が確立していることから、アカフジツボの対照種として実験に用いた
アニーリング温度の検討を行った結果、５９℃でもっとも増幅効率が高かったため、この温度でのＰＣＲを行なうこととした。ＰＣＲの結果、アカフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とした場合は、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した場合、１００ｂｐ以下の低分子領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号５６及び５７のアカフジツボ検出用プライマー対により増幅した８４ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、アカフジツボＤＮＡとタテジマフジツボＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡを用いた場合にも、アカフジツボＤＮＡの量由来のシングルバンドが観察された。
以上の結果から、配列番号５６及び５７のアカフジツボ検出用プライマー対はアカフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２０】
（２）タテジマフジツボ検出用プライマー対の特異性
タテジマフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号１及び２のタテジマフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐ以下の低分子領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号１及び２のタテジマフジツボ検出用プライマー対により増幅した６４ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がタテジマフジツボと比較的似ていると考えられるPlatylepas、Semibalanus、シロスジフジツボ、ドロフジツボ、サラサフジツボ、ヨーロッパフジツボ及びアメリカフジツボ（但し、Platylepas、Semibalanus、シロスジフジツボ及びサラサフジツボについては２個体分）について、鋳型ＤＮＡに配列番号１及び２のタテジマフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号１及び２のタテジマフジツボ検出用プライマー対はタテジマフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２１】
（３）シロスジフジツボ検出用プライマー対の特異性
シロスジフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号３及び４のシロスジフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐより上の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号３及び４のシロスジフジツボ検出用プライマー対により増幅した１１０ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がシロスジフジツボと比較的似ていると考えられるミネフジツボ、タテジマフジツボ、ドロフジツボ、ヨーロッパフジツボ、アメリカフジツボ、イワフジツボ及びサラサフジツボ（但し、ミネフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ及びサラサフジツボについては２個体分）について、鋳型ＤＮＡに配列番号３及び４のシロスジフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号３及び４のシロスジフジツボ検出用プライマー対はシロスジフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２２】
（４）ドロフジツボ検出用プライマー対の特異性
ドロフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号５及び６のドロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、２００ｂｐより上の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号５及び６のドロフジツボ検出用プライマー対により増幅した２５５ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がドロフジツボと比較的似ていると考えられるチシマフジツボ、ココポーマアカフジツボ、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ、アメリカフジツボ、ヨーロッパフジツボ及びイワフジツボ（但し、チシマフジツボ、ココポーマアカフジツボ、タテジマフジツボ、シロスジフジツボ及びイワフジツボについては２個体分）について、鋳型ＤＮＡに配列番号５及び６のドロフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号５及び６のドロフジツボ検出用プライマー対はドロフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２３】
（５）サラサフジツボ検出用プライマー対の特異性
サラサフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号７及び８のサラサフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐより上の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号７及び８のサラサフジツボ検出用プライマー対により増幅した１２０ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がサラサフジツボと比較的似ていると考えられるカメノテ、ヨーロッパフジツボ、サンカクフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ、アカフジツボ及びケハダカイメンフジツボ（但し、カメノテ及びヨーロッパフジツボについては２個体分）について、鋳型ＤＮＡに配列番号７及び８のサラサフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号７及び８のサラサフジツボ検出用プライマー対はサラサフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２４】
（６）ココポーマアカフジツボ検出用プライマー対の特異性
ココポーマアカフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号９及び１０のシロスジフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐ付近の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号９及び１０のココポーマアカフジツボ検出用プライマー対により増幅した１０３ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がココポーマアカフジツボと比較的似ていると考えられるアカフジツボ、イワフジツボ、カメノテ、クロフジツボ及びサンカクフジツボ各２個体分について、鋳型ＤＮＡに配列番号９及び１０のココポーマアカフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号９及び１０のココポーマアカフジツボ検出用プライマー対はオオアカフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２５】
（７）サンカクフジツボ検出用プライマー対の特異性
サンカクフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号１１及び１２のサンカクフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐ以下の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号１１及び１２のサンカクフジツボ検出用プライマー対により増幅した９３ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がサンカクフジツボと比較的似ていると考えられるアカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、ヨーロッパフジツボ、タテジマフジツボ、イワフジツボ及びサラサフジツボ各２個体分について、鋳型ＤＮＡに配列番号１１及び１２のサンカクフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号１１及び１２のサンカクフジツボ検出用プライマー対はサンカクフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２６】
（８）クロフジツボ検出用プライマー対の特異性
クロフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐ付近の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対により増幅した１００ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がクロフジツボと比較的似ていると考えられるココポーマアカフジツボ、アカフジツボ、イワフジツボ、カメノテ、サンカクフジツボ及びムツアナヒラフジツボ（但し、アカフジツボ、イワフジツボ、カメノテ、サンカクフジツボ及びムツアナヒラフジツボについては２個体分）について、鋳型ＤＮＡに配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対はクロフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２７】
（９）イワフジツボ検出用プライマーの特異性
イワフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号１５及び１６のイワフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐより上の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号１５及び１６のイワフジツボ検出用プライマー対により増幅した１２４ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がイワフジツボと比較的似ていると考えられるミネフジツボ、クロフジツボ、ヨーロッパフジツボ、タテジマフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ及びサラサフジツボ（但し、ヨーロッパフジツボ、タテジマフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ及びサラサフジツボについては２個体分）について、鋳型ＤＮＡに配列番号１５及び１６のイワフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号１５及び１６のイワフジツボ検出用プライマー対はイワフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２８】
（１０）アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対の特異性
ヨーロッパフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号１７及び１８のアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐより上の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号１７及び１８のアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対により増幅した１１６ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボと比較的似ていると考えられるアカフジツボ、クロフジツボ、タテジマフジツボ、オオアカフジツボ、サンカクフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボについて、鋳型ＤＮＡに配列番号１７及び１８のアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号１７及び１８のアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対はアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１２９】
（１１）オオアカフジツボ検出用プライマーの特異性
オオアカフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、（１）と同様の条件で配列番号１９及び２０のオオアカフジツボ検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った結果、２００ｂｐより上の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号１９及び２０のオオアカフジツボ検出用プライマーにより増幅した２０８ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がオオアカフジツボと比較的似ていると考えられるココポーマアカフジツボ、アカフジツボ、タテジマフジツボ、ミネフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、サンカクフジツボ、クロフジツボ、チシマフジツボ、さらには混合プランクトンについて、鋳型ＤＮＡに配列番号１９び２０のオオアカフジツボ検出用プライマーを加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されなかった。
以上の結果から、配列番号１９及び２０のオオアカフジツボ検出用プライマーはオオアカフジツボのミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１３０】
（実施例２）
本発明のプライマー対を用いた定量分析について検討した。
【０１３１】
まず、アカフジツボ成体から調製したＤＮＡを鋳型とし、これを０．２〜２０ｎｇ／μＬ（反応液の最終濃度）の範囲で濃度調整し、配列番号５６及び５７のアカフジツボ検出用プライマー対を用いて実施例１と同様の条件でＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲのサイクル数は３５サイクルとした。その結果、鋳型ＤＮＡの濃度によるバンドの濃淡は確認できなかった。そこで、ＰＣＲのサイクル数を２５サイクルとしたところ、１〜１０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。結果を図２に示す。また、アカフジツボＤＮＡとタテジマフジツボＤＮＡを混合した鋳型ＤＮＡを用いた場合にも、アカフジツボＤＮＡの濃度に依存したＰＣＲ産物量（バンドの濃淡）が観察された。このように、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるフジツボ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、フジツボ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【０１３２】
また、ココポーマアカフジツボ、タテジマフジツボ、サンカクフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、ヨーロッパフジツボ、クロフジツボ、オオアカフジツボについて、上記と同様の実験を行った。その結果、ＰＣＲのサイクル数は３５サイクルとした場合には、アカフジツボの場合と同様、鋳型ＤＮＡの濃度によるバンドの濃淡は確認できなかった。これに対し、ＰＣＲのサイクル数を２５サイクルとしたところ、バンドの濃淡が確認された。即ち、図３に示すココポーマアカフジツボの実験結果からは１〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認され、図４に示すタテジマフジツボの実験結果からは２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認され、図５に示すサンカクフジツボの実験結果からは２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認され、図６に示すサラサフジツボの実験結果からは０．４〜１０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認され、図７に示すイワフジツボの実験結果からは０．４〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認され、図８に示すヨーロッパフジツボの実験結果からは０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認され、図９に示すクロフジツボの実験結果からは２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。また、図２０に示すオオアカフジツボの実験結果からは、０．２〜２０ｎｇ／μＬの範囲でバンドの濃淡が確認された。
【０１３３】
このように、図３〜図９、図２０に示す結果においても、鋳型ＤＮＡの濃度に応じてバンドに濃淡が生じることが確認されたことから、被験試料に含まれるフジツボ幼生に含まれるＤＮＡに起因するバンドの濃淡に応じて、フジツボ幼生の個体数の定量分析が可能であると考えられた。
【０１３４】
（実施例３）
フジツボ幼生から総ＤＮＡを抽出するための条件について、タテジマフジツボのノープリウス幼生を用いて検討を行った。
【０１３５】
タテジマフジツボノープリウス幼生のエタノールへの固定を行った。即ち、実験室内でタテジマフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生をその日のうちに回収して海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加えて、タテジマフジツボノープリウス幼生固定溶液を調製した。この溶液は４℃で保存した。
【０１３６】
次に、以下（１）〜（３）に示すＤＮＡ抽出処理について検討した。（１）のＤＮＡ抽出処理は、タテジマフジツボノープリウス幼生を０、２５、５０、１００個体を含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ３個ずつ用意して行った。（２）のＤＮＡ抽出処理は、タテジマフジツボノープリウス幼生を０、１、１０、１００個体を含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ４個ずつ用意して行った。（３）のＤＮＡ抽出処理は、タテジマフジツボノープリウス幼生を０、１、１０、１００個体含むエッペンドルフチューブ（すべてエタノールを乾燥させたもの）をそれぞれ５個ずつ用意して行った。
【０１３７】
（１）インビトロジェン社のＥａｓｙ−ＤＮＡキットを用い、このキットに添付されたマニュアルに従ってＤＮＡ抽出を行った。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に５０μＬのリシスバッファーを加えてプラスチックペッスルですり潰し、さらに３００μＬのリシスバッファーを加えて６５℃で１０分間処理した。次にＤＮＡ沈澱用バッファー１５０μＬを加えて強く撹拌混合処理し、さらにクロロホルム５００μＬを加えた後、１３８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノールを１ｍＬを加え撹拌混合処理し、０℃で３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理した後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られたＤＮＡ沈澱は、風乾させた後に５０μＬのＴＥバッファーに溶解した。
【０１３８】
（２）乾燥させたサンプルの入った１．５ｍＬエッペンドルフチューブに２４０μＬのＴＥバッファー、１５μＬのリシスバッファー、７．５μＬのＤＮＡ沈澱用バッファー、３．７５μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｒａｄｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ，  ５ｍｇ／ｍｌ）を加えて６０℃で一定時間（１、２または２４時間）インキュベートし、その後２２５μＬのリシスバッファー、９０μＬのＤＮＡ沈澱用バッファーを加えて強く撹拌混合処理をし、さらに５６２．５μＬのクロロホルムを加えて強く撹拌混合処理をし、１３８００ｇで１５分間遠心分離処理してＤＮＡの含まれる水層を別のチューブに移した。これに氷冷した９９．５％エタノールを７５０μＬ加え撹拌混合処理し、０℃で３０分間静置してＤＮＡを沈澱させ、遠心分離処理した後エタノールを除き、さらに氷冷８０％エタノール５００μＬを加えて沈澱させた。最終的に得られたＤＮＡ沈澱は、風乾させた後に５０μＬのＴＥバッファーに溶解した。
【０１３９】
（３）キアゲン社のＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出を行った。基本的にはこのキットに添付されたマニュアルに従って抽出した。即ち、ＤＮＡ抽出用試料に１８０μＬの抽出用バッファー（ＡＴＬ  ｂｕｆｆｅｒ）と２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋとを加えて撹拌混合処理した後、５５℃で一定時間（１、２または２４時間）インキュベートした（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理）。さらに２００μＬのバッファー（ＡＬ）を加えて撹拌混合処理した後、７０℃で１０分間インキュベートした。次に、２００μＬの９９．５％エタノールを加えて撹拌混合処理した後、２ｍＬのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＴｕｂｅにセットしたＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに処理サンプルを供した。このチューブを１分間遠心分離処理して素通り画分を除いた後、Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎのシリカゲル膜フィルターに吸着したＤＮＡをＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１およびＡＷ２で洗浄し、最終的には１００μＬの溶出バッファー（Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＥ）によりＤＮＡを溶出し、回収した。
【０１４０】
ＤＮＡ抽出処理後の試料をリアルタイムＰＣＲによる定量的解析に供して、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値を測定することにより、試料間のＤＮＡ抽出ばらつきを評価した。リアルタイムＰＣＲによる定量的解析は、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたインターカレータ法により行った。反応液は、純水９．５μＬ、プライマーＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｆ（１０μＭ）、ＲＴＭｒ１２Ｓ−Ｒ（１０μＭ）それぞれ０．５μＬ（最終濃度０．２μＭ）、鋳型ＤＮＡを２μＬ、そしてＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ｘ２）を１２．５μＬを混合して調製した。装置はＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｉｅｄ社）を使用して、９５℃で初期変性した後、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返し、最後に融解曲線確認のための反応（６０℃−９５℃）を実施した。そして反応後、各試料のＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値を測定した。
【０１４１】
その結果、上記（３）のＤＮＡ抽出処理を行った場合に試料間のＣｔ値ばらつきが最も少ないことが明らかとなった。また、上記（１）のＤＮＡ抽出処理を行った場合よりも上記（２）のＤＮＡ抽出処理を行った場合の方が試料間のＣｔ値ばらつきを抑えることができた。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加した後のインキュベート時間を１、２および２４時間とした場合でもＣｔ値はほとんど同じであった。
【０１４２】
したがって、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔによるシリカゲル膜を利用したＤＮＡ抽出処理を採用することが好適であることがわかった。また、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加した後のインキュベート時間を１時間として処理時間の低減を図れることがわかった。
【０１４３】
また、タテジマフジツボ幼生をエッペンドルフチューブに収容し、乾燥後、ジルコニアボール（直径２ｍｍまたは３ｍｍ）を数個（３〜５個）加えて、強く震盪することで幼生を破砕し、その後、上記（３）のＤＮＡ抽出をしたところ、試料間のＣｔ値ばらつきをさらに抑えて、定量の再現性及び精度を向上できることが明らかとなった。この破砕処理を行うことで、クチクラの殻が硬いためにＤＮＡ抽出ばらつきが出やすいキプリス幼生についても、ＤＮＡ抽出ばらつきを抑えて、定量の再現性及び精度を向上することができることが明らかとなった。
【０１４４】
また、融解曲線を確認した結果、温度ピークがすべて単一であった。したがって、目的の増幅産物（６４ｂｐのＤＮＡ断片）のみが得られ、その定量が行われたことが明らかとなった。
【０１４５】
尚、上記（１）及び（２）のＤＮＡ抽出処理を行った場合には、上記（３）のＤＮＡ抽出処理を行った場合と比較して試料間のＣｔ値ばらつきが若干大きくなったものの、これらのＤＮＡ抽出方法を否定するものではなく、試料のすり潰し操作や、ＤＮＡ沈殿の回収操作の試料間ばらつきを抑えることで、また、上記の破砕処理をＤＮＡ抽出処理前に実施することで、上記（３）のＤＮＡ抽出処理を行った場合と同程度のＣｔ値ばらつきを達成することができると考えられる。
【０１４６】
尚、アカフジツボ幼生についても上記と同様の実験を行ったところ、タテジマフジツボ幼生で得られた結果と同様の結果が得られた。
【０１４７】
ここで、シロスジフジツボ幼生、ドロフジツボ幼生、サラサフジツボ幼生、ココポーマアカフジツボ幼生、オオアカフジツボ幼生、サンカクフジツボ幼生、クロフジツボ幼生、イワフジツボ幼生、アメリカフジツボ幼生及びヨーロッパフジツボ幼生を構成する成分は、タテジマフジツボ幼生及びアカフジツボ幼生を構成する成分とほぼ同等であることから、上記実験結果は、シロスジフジツボ幼生、ドロフジツボ幼生、サラサフジツボ幼生、オオアカフジツボ幼生、サンカクフジツボ幼生、クロフジツボ幼生、イワフジツボ幼生、アメリカフジツボ幼生及びヨーロッパフジツボ幼生についても成立するものと考えられる。
【０１４８】
（実施例４）
ココポーマアカフジツボ幼生、タテジマフジツボ幼生、アメリカフジツボ幼生、サンカクフジツボ幼生、アカフジツボ幼生について、リアルタイムＰＣＲによる定量性について評価した。
【０１４９】
実験室内でアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、タテジマフジツボ、アメリカフジツボ及びサンカクフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生を数時間以内に回収（ほとんどがＩＩ期ノープリウス）し、海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加えて、それぞれのノープリウス幼生をエタノールに固定してノープリウス幼生固定溶液を調製し、これを４℃で保存した。ノープリウス幼生固定溶液は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、それぞれ１、２、５、１０、２０、５０および１００個体の幼生を収容するようにした。ＤＮＡ抽出処理は実施例３（３）と同様の処理とした。最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例２に示したリアルタイムＰＣＲに供した。即ち、１、２、５、１０、２０、５０および１００個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１および２個体相当の幼生が含まれることになる。
【０１５０】
尚、リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは、アカフジツボについては配列番号５６及び５７に示すアカフジツボ検出用プライマー対とし、ココポーマアカフジツボについては配列番号９及び１０に示すココポーマアカフジツボ検出用プライマー対とし、タテジマフジツボについては配列番号１及び２に示すタテジマフジツボ検出用プライマー対とし、アメリカフジツボについては配列番号１７及び１８に示すアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対とし、サンカクフジツボについては配列番号１１及び１２に示すサンカクフジツボ検出用プライマー対とした。
【０１５１】
アカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、タテジマフジツボ、アメリカフジツボ及びサンカクフジツボのノープリウス幼生のリアルタイムＰＣＲの結果を図１０に示す。上記の通り、リアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．４、１および２個体相当と非常に少ない幼生個体数であったにも関わらず、幼生個体数の対数とＣｔ値との間に高い相関性が認められることが確認された。即ち、フジツボのノープリウス幼生がＤＮＡ抽出液１００ｍＬ中に１個体以上存在する場合、本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもってフジツボ幼生の個体数の分析が可能であることがわかった。つまり、フジツボのノープリウス幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の定量分析ができると考えられた。
【０１５２】
また、上記と同様の実験を配列番号１９及び２０に示すオオアカフジツボ検出用プライマー対を用いてオオアカフジツボ幼生について実施した。結果を図２１に示す。この結果から、アカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、タテジマフジツボ、アメリカフジツボ及びサンカクフジツボのノープリウス幼生のリアルタイムＰＣＲの結果と同様、オオアカフジツボ幼生についても、本発明のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、高い定量性をもってフジツボ幼生の個体数の分析が可能であることがわかった。つまり、フジツボのノープリウス幼生の個体数が未知のサンプルにおいても、リアルタイムＰＣＲを実施し、そのＣｔ値を測定することで、正確な幼生個体数の定量分析ができると考えられた。
【０１５３】
次に、複数のプランクトンが混在している被験試料を用いて、フジツボ幼生を特異的に検出・定量できるか確認した。
【０１５４】
プランクトンは以下のようにして得た。即ち、２００６年９月５日および１０月１１日に東京湾内でプランクトンネット（ノルパック、口径５０ｃｍ）を用いて約８ｍの鉛直曳きによりプランクトンサンプルの採集を行った。これにより約１６００Ｌ分の海水中のプランクトンが採集されたことになる。採集したプランクトンは実験室に持ち帰った後、１００μｍ（１３ＸＸ）と１ｍｍ（２０ＧＧ）の目開きのメッシュを用いてフジツボ幼生が含まれる画分を得た。つまり、フジツボ幼生は、１ｍｍのメッシュを素通りし、１００μｍのメッシュでトラップされるので、１ｍｍ以上の大型プランクトンはあらかじめ除去して解析に供した。得られたプランクトンサンプルは海水を除いた後、９９．５％エタノールを加えて固定し、４℃で保存した。
【０１５５】
尚、９月〜１０月にかけては、東京湾内でアカフジツボ幼生、ヨーロッパフジツボ幼生、タテジマフジツボ幼生、サラサフジツボ幼生、ココポーマアカフジツボ幼生、サンカクフジツボ幼生、イワフジツボ幼生、クロフジツボ幼生、アメリカフジツボ幼生が採集されることは無いため、採集したプランクトンサンプルにこれらのフジツボ幼生が含まれることは無い。
【０１５６】
次に、得られたプランクトンサンプルを固定したエタノールを２０等分してチューブに収容した。つまり、１チューブあたり８０Ｌ分の海水から採集された混合プランクトンを含むことになる。そして、それぞれのチューブにアカフジツボノープリウス幼生を１、２、５、１０、２０、５０または１００個体加えたものをＤＮＡ抽出用サンプルとした。尚、１本のチューブに含まれる混合プランクトンを沈澱させた時の体積は約２００μＬであり、これはアカフジツボノープリウス幼生約１２５００個体分に相当する。すなわち、解析したサンプルにはアカフジツボノープリウス幼生の１２５〜１２５００倍の体積のプランクトンが含まれていることになる。アカフジツボノープリウス幼生のみのサンプルと同様に、それぞれの混合プランクトンを含むサンプルをＤＮＡ抽出処理し、リアルタイムＰＣＲを行った。ＤＮＡ抽出処理は実施例３（３）と同様の処理とし、最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例３に示したリアルタイムＰＣＲに供した。
【０１５７】
結果を図１１に示す。●はアカフジツボノープリウス幼生だけを含むサンプルの結果（図１０と同じ）であり、□はアカフジツボノープリウス幼生と野外採集混合プランクトンを含むサンプルの結果である。また、図１１におけるＣｔ値は異なる３バッチのサンプルから得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。野外採集プランクトンサンプル（アカフジツボ幼生は含有しない）を体積比で標的アカフジツボ幼生の１０２〜１０４倍量以上含んでいても、アカフジツボ幼生の定量性には影響を与えないことが判明した。さらに、別の時期にも海域で採集したプランクトンサンプルを用いて実験を行ったが、アカフジツボ幼生の定量には影響を及ぼさないことが確認された。
【０１５８】
尚、野外採集プランクトンサンプルのみをＤＮＡ抽出処理し、リアルタイムＰＣＲに供した結果、Ｃｔ値が３６．９、３４．０３、３６．４７、３６．６となり、アカフジツボ幼生が０個体の試料の場合と同じ結果が得られた。つまり、野外採集プランクトンサンプルは、アカフジツボ幼生の定量には何ら影響を及ぼすことがないことがこの点からも明らかである。
【０１５９】
次に、混合プランクトンのチューブにアカフジツボノープリウス幼生を１００個体加えたものをＤＮＡ抽出用サンプルとし、これを実施例３（３）と同様のＤＮＡ抽出処理した後に実施例１（１）と同様の方法でＰＣＲした結果を図１２に示す。但し、ＰＣＲのサイクル数は３５サイクルとした。また、プライマーには、アメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボ検出用プライマー対（配列番号１７及び１８）と、タテジマフジツボ検出用プライマー対（配列番号１及び２）と、サラサフジツボ検出用プライマー対（配列番号７及び８）と、ココポーマアカフジツボ検出用プライマー対（配列番号９及び１０）と、サンカクフジツボ検出用プライマー対（配列番号１１及び１２）と、イワフジツボ検出用プライマー対（配列番号１５及び１６）と、クロフジツボ検出用プライマー対（配列番号１３及び１４）と、アカフジツボ検出用プライマー対（配列番号５６及び５７）を使用した。
【０１６０】
尚、図１２において上図（ａ）は混合プランクトン試料をＰＣＲした場合の電気泳動結果を示す図であり、下図（ｂ）が混合プランクトンにアカフジツボノープリウス幼生を１００個体加えた試料をＰＣＲした場合の電気泳動結果を示す図である。図１２に示される結果から、ＰＣＲのサイクル数を３５サイクルとした場合には、試料中に存在し得ないヨーロッパフジツボやタテジマフジツボのバンドが検出され、フジツボ種の判定精度が低下することが判明した。
【０１６１】
そこで、同様の実験をＰＣＲのサイクル数を２５サイクルとして実施した。結果を図１３に示す。図１３に示す結果から、試料中に存在し得るアカフジツボ幼生のみを検出できることが判明した。したがって、ＰＣＲのサイクル数は３５サイクル未満とすることが好ましく、ＰＣＲのサイクル数を２５サイクルとすることがさらに好ましいことが明らかとなった。
【０１６２】
（実施例５）
フジツボ幼生は、Ｉ期ノープリウス幼生として孵化後すぐにＩＩ期ノープリウスとなり、その後は、海水中の植物プランクトンを餌として取り込んで成長する。そしてＶＩ期ノープリウス幼生を経て摂餌をしない付着期のキプリス幼生となる。成長に伴い、サイズ、細胞数が増加するため、標的となる１２Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１個体当たりのコピー数も増加することになる。したがって、幼生個体数が同じであってもリアルタイムＰＣＲの結果示されるＣｔ値も幼生の発生段階で異なってくる。そこで、幼生の最終段階であるアカフジツボキプリス幼生を用いて、アカフジツボノープリウス幼生と同様の実験を行なった。
【０１６３】
実験室内でアカフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生の一部を、珪藻Chaetoceros gracilisを餌として与え、キプリス幼生まで飼育し、ノープリウス幼生と同様に海水をできるだけ除いた後、99.5％エタノールを十分量加えて固定し、4℃で保存した。エタノールで固定した後、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに１、２、５、１０、２０および５０個体のキプリス幼生を収容し、ノープリウス幼生と同様に、ＤＮＡ抽出処理し、リアルタイムＰＣＲを行った。ＤＮＡ抽出処理は実施例３（３）と同様の処理とし、最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、実施例３に示したリアルタイムＰＣＲに供した。
【０１６４】
結果を図１４に示す。図１４において、●は初期ノープリウス幼生の結果（図１０と同じ）であり、△はキプリス幼生の結果である。また、図１４におけるＣｔ値は異なる３バッチの幼生から得られた鋳型ＤＮＡを用いた３回の実験の平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示している。この結果から、キプリス幼生１個体に対応するＣｔ値は、初期ノープリウス幼生約５個体分に対応することが判明した。例えば図１４においてＣｔ値が２０の場合の個体数をみてみると、キプリス幼生では約４個体、初期ノープリウス幼生では約２０個体に相当することが読み取れる。すなわち、キプリス幼生と初期ノープリウス幼生の標的鋳型ＤＮＡの量比は、およそ５：１であると考えられる。これらの幼生のサイズを体積換算すると、ＩＩ期ノープリウス幼生からキプリス幼生で約５〜１０倍になることが推定される（R. Kado and R. Hirano (1994). Larval development of two Japanese megabalanine barnacles, Megabalanus volcano (Pilsbry) and Megabalanus rosa (Pilsbry) (Cirripedia, Balanidae), reared in the lanoratory. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 175, 17-41.に記載された実測値から推定。）。このことから、この５：１という値はおおよそフジツボ幼生の体積を反映していると考えられる。また、それぞれの幼生のグラフでの直線の傾きはほぼ同じであることから、幼生の個体数によらず正確な定量が可能であると考えられる。
【０１６５】
以上の結果から、実際に野外採集プランクトンサンプルに含まれるフジツボ幼生の個体数を、キプリス幼生に換算した値として、または初期ノープリウス幼生に換算した値として算出できることが明らかとなった。また、本実施例により、Ｃｔ値から換算される幼生個体数の発生段階による相違が最大でも５倍程度であることが明らかとなった。付着期前の比較的短期間（１ヶ月以内）に幼生の出現ピークがあることと、その際の幼生数の増加率は、５倍という値に比較して圧倒的に大きな値になることとを勘案すると、今回開発されたリアルタイムＰＣＲによるフジツボ幼生の定量的検出は、実海域での付着時期予測に十分適用可能と考えられる。
【０１６６】
（実施例６）
フジツボ幼生の個体数の定量精度をさらに向上させるための検討を行った。
【０１６７】
本願発明者等は、タテジマフジツボ検出用プライマー対（配列番号１及び２）で増幅されるＤＮＡ、シロスジフジツボ検出用プライマー対（配列番号３及び４）で増幅されるＤＮＡ、ドロフジツボ検出用プライマー対（配列番号５及び６）で増幅されるＤＮＡ、サラサフジツボ検出用プライマー対（配列番号７及び８）で増幅されるＤＮＡ、ココポーマアカフジツボ検出用プライマー対（配列番号９及び１０）で増幅されるＤＮＡ、サンカクフジツボ検出用プライマー対（配列番号１１及び１２）で増幅されるＤＮＡ、クロフジツボ検出用プライマー対（配列番号１３及び１４）で増幅されるＤＮＡ、イワフジツボ検出用プライマー対（配列番号１５及び１６）で増幅されるＤＮＡ、オオアカフジツボ検出用プライマー対（配列番号１９及び２０）で増幅されるＤＮＡ、アカフジツボ検出用プライマー対（配列番号５６及び５７）で増幅されるＤＮＡについて、塩基配列について鋭意検討した結果、共通の塩基配列ＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＧＴを有していることを見出した。また、アカフジツボ検出用プライマー対（配列番号２１及び２２）で増幅されるＤＮＡについても、この塩基配列を有していることを見出した。
【０１６８】
本願発明者等は、この塩基配列部を利用することにより、これらフジツボ種のＤＮＡのみを選択的に蛍光標識し、仮にこれらのフジツボ種以外の生物がＰＣＲにより増幅するケースが生じたとしても、その影響を排除できると考えた。
【０１６９】
そこで、この塩基配列部を利用したサイクリングプローブ法について検討した。
【０１７０】
まず、サイクリングプローブを設計した。サイクリングプローブのＤＮＡ−ＲＮＡ結合分子は、配列番号５１で示される塩基配列からなる分子とし、３番目のアデニンをＲＮＡとし、３’端には蛍光物質（ＲＯＸ：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）を標識し、５’端には消光物質（Eclipse）を標識して合成（タカラバイオ）した。このサイクリングプローブは、インタクトな状態では励起光を照射しても殆ど蛍光発光が起こらない。尚、サイクリングプローブ法の原理について、図１８に示す。
【０１７１】
次に、ＤＮＡの増幅量をサイクリングプローブ法によりモニタリングしながらリアルタイムＰＣＲを行った。尚、サイクリングプローブ法は、定法にしたがい、増幅ＤＮＡとサイクリングプローブとのハイブリッドを形成させた後、ＲＮａｓｅＨを添加してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド部を切断し、励起光を照射して蛍光発光させた。試料のサイクリングプローブ濃度は１０ｐｍｏｌとした。
【０１７２】
試料は以下のようにして調製した。実験室内でアカフジツボ成体から孵出したノープリウス幼生を数時間以内に回収（ほとんどがＩＩ期ノープリウス）し、海水をできるだけ除いた後、９９．５％エタノールを十分量加えて、それぞれのノープリウス幼生をエタノールに固定してノープリウス幼生固定溶液を調製し、これを４℃で保存した。ノープリウス幼生固定溶液は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、それぞれ１、１０および１００個体の幼生を収容するようにした。ＤＮＡ抽出処理は実施例３（３）と同様の処理とした。最終的に得られた１００μＬのＤＮＡ溶液から２μＬを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲに供した。１、１０および１００個体の幼生から抽出されたＤＮＡを鋳型としたリアルタイムＰＣＲのそれぞれの反応液には最終的には、０．０２、０．２および２個体相当の幼生が含まれることになる。また、アカフジツボ幼生数が同じで、混合プランクトンを含む試料を調製し、比較試料とした。
【０１７３】
リアルタイムＰＣＲの結果を図１５に示す。アカフジツボ幼生のみが含まれる試料と、アカフジツボ幼生及び混合プランクトンを含む比較試料の双方とも、アカフジツボ幼生個体数とＣｔ値とに十分な相関関係が見られ、且つ、双方の試料の相関関係に殆ど差異が現れないことが確認された。この結果から、上記サイクリングプローブを利用した方法により、十分な定量性をもってフジツボ幼生の個体数の定量分析が可能であることが明らかとなった。
【０１７４】
次に、アカフジツボ幼生個体数に対する蛍光強度について、ＰＣＲサイクル数及びサイクリングプローブ濃度の好適な条件について検討した。
【０１７５】
以下Ａ〜Ｆの試料を実験に供した。尚、これらの試料は、図１５の結果を得るためにリアルタイムＰＣＲに供した試料及び比較試料と同様の方法により調製した。
Ａ：アカフジツボ幼生１個体
Ｂ：アカフジツボ幼生１個体＋混合プランクトン
Ｃ：アカフジツボ幼生１０個体
Ｄ：アカフジツボ幼生１０個体＋混合プランクトン
Ｅ：アカフジツボ幼生１００個体
Ｆ：アカフジツボ幼生１００個体＋混合プランクトン
【０１７６】
ＰＣＲサイクル数は、３０サイクル及び２８サイクルの２条件とした。サイクリングプローブ濃度は１０ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌの２条件とした。ＰＣＲ後の蛍光写真を図１９に示す。図１９において、（ａ）が３０サイクルの結果を示し、（ｂ）が２８サイクルの結果を示す。
【０１７７】
図１９に示される結果から、ＰＣＲ３０サイクルでサイクリングプローブ濃度５ｐｍｏｌの条件では、蛍光強度に十分な差異が見られなかったが、他の条件ではアカフジツボ幼生個体数に応じた蛍光強度が得られ、特に、ＰＣＲ２８サイクルでサイクリングプローブ濃度１０ｐｍｏｌの条件の場合には、図１６に示すように、アカフジツボ幼生個体数に応じた十分な蛍光強度が得られた。
【０１７８】
以上の結果から、サイクリングプローブ濃度とＰＣＲサイクル数を最適な条件とすることで、非常に高い精度でフジツボ幼生の個体数を定量分析できることが明らかとなった。また、サイクリングプローブを用いることで、リアルタイムＰＣＲ装置を用いなくても一定サイクルの遺伝子増幅後の蛍光強度により幼生の定量が可能であることが示された。つまり、一定サイクルのＰＣＲを行った後に遺伝子増幅量をモニタリングすることで、フジツボ幼生の個体数を定量分析できることが明らかとなった。
【０１７９】
（実施例７）
実海域から被験試料を採集し、本発明のプライマーセットの有効性を確認した。
【０１８０】
伊勢湾にて採水した１０００Ｌの海水からプランクトンネット（目合い１００μｍ、口径３０ｃｍ、ポンプ採水）により採集したサンプル（１Ｌ、エタノール固定）を用いた。サンプルは２００８年７月〜２００９年８月にかけて毎月１回採集した。サンプルは実験を行うまで４〜１０℃で保存し、その後、目合い１００μｍのプランクトンネットと遠心機を用いて５０ｍＬ程度に濃縮後、２等分して、解析サンプルとストックサンプルとした。解析サンプルは遠心後に上清のエタノールをできるだけ除去した後３等分し、各々のエタノール量を１０ｍＬとなるように１００％エタノールで調製した。３等分したサンプルはそれぞれエッペンチューブに１ｍＬずつ分注し、１０等分してからＤＮＡ抽出に供した。但し、この作業はプランクトン量に応じて適宜変更し、プランクトン量が多い場合には２０等分したものから１０個を選択するようにした。
【０１８１】
サンプルからの総ＤＮＡの抽出には、富士フイルム社製の簡易核酸抽出システムQuick Gene Mini80とQuick Gene ＤＮＡ tissue kit Sを用いた。エッペンチューブを遠心後、ピペットを用いてエタノールをできるだけ除去した後に遠心減圧乾燥器で１５分間処理することによりサンプルを乾燥させ、マニュアルに従って抽出した。但し、Proteinase  Kの処理時間は１時間、最終的にＤＮＡを回収する溶出バッファー（１０ｍＭ Tris-HCl ／１ｍＭ EDTA）量は１００μＬとした。抽出したＤＮＡは4℃で保存し、１０等分したＤＮＡ抽出液からそれぞれ５μＬずつ採取してまとめた後、よく攪拌した後に２μＬを取り出し鋳型ＤＮＡとした。
【０１８２】
抽出した鋳型ＤＮＡは、以下の（１）〜（１０）及び（１３）のプライマー対を用いてリアルタイムＰＣＲに供した。また、アカフジツボについては、配列番号５６及び５７に示すアカフジツボ検出用プライマー対とは別に、配列番号２１及び２２に示すプライマー対を新たに設計し、本実施例においてその有効性を確認した。
（１）配列番号１及び２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むタテジマフジツボ（Amphibalanus amphitrite）検出用プライマー対、
（２）配列番号３及び４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むシロスジフジツボ（Fitsulobalanus albicostatus）検出用プライマー対、
（３）配列番号５及び６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むドロフジツボ（Fitsulobalanus kondakovi）検出用プライマー対、
（４）配列番号７及び８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むサラサフジツボ（Amphibalanus reticulates）検出用プライマー対、
（５）配列番号９及び１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むココポーマアカフジツボ（Megabalanus coccopoma）検出用プライマー対、
（６）配列番号１１及び１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むサンカクフジツボ（Balanus trigonus）検出用プライマー対、
（７）配列番号１３及び１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むクロフジツボ（Tetraclita japonica）検出用プライマー対、
（８）配列番号１５及び１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むイワフジツボ（Chthamalus challengeri）検出用プライマー対
（９）配列番号１７及び１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むアメリカフジツボ（Amphibalanus eburneus）及びヨーロッパフジツボ（Amphibalanus improvisus）検出用プライマー対
（１０）配列番号１９及び２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むオオアカフジツボ（Megabalanus volcano）検出用プライマー対
（１３）配列番号５６及び５７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むアカフジツボ（Megabalanus rosa）検出用プライマー対
【０１８３】
リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ（登録商標）Premix Ex Taq (Takara Bio)およびSmart Cycler（登録商標）II System (Takara Bio)を用いた。９５℃を３０秒のＰＣＲを１サイクル、９５℃を５秒、６０℃を２０秒のＰＣＲを４０サイクル繰り返す条件下で反応を行った後、融解曲線分析を行った。各反応液は総量２５μＬとし、各種フジツボの検量線を作成するため、添加する鋳型ＤＮＡの量を成体由来ＤＮＡを用いて０．２５、０．５、２．５、５、１０、２５及び５０ｎｇの間で変化させた。加えて、幼生が採集できたものについては、幼生の個体数を１、２、１０、５０個体と変化させてリアルタイムＰＣＲに供した。反応後、それぞれのフジツボの検量線を作成すると共に、供試サンプルのＣｔ値を測定して幼生個体数の推定を行った。尚、推定幼生個体数は３等分したサンプル各々のＣｔ値を用いた平均Ｃｔ値から、サンプル中の該当幼生のＤＮＡ量に換算し、ノープリウス幼生２期の数として算出した。
【０１８４】
算出したそれぞれのフジツボ幼生数の季節変化を表３及び図２２に示す。フジツボ類の出現ピークは６〜８月と９〜１１月の２回であり、後者が卓越していた。主要なフジツボ類はアメリカフジツボ及びヨーロッパフジツボであり、次いでタテジマフジツボであり、いずれも６〜８月と１０月〜１１月に出現ピークを示すことが確認された。その他、サンカクフジツボ、アカフジツボ、イワフジツボなどが検出されたが、著しい季節変動を示した種は存在しなかった。
【０１８５】
【表３】
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【０１８６】
また、アカフジツボについては、配列番号２１及び２２に示すアカフジツボ検出用プライマー対を用いた場合と、配列番号５４及び５５に示すプライマー対を用いた場合とで幼生個体数の定量性に大きな差異は見られなかったことから、配列番号２１及び２２に示すアカフジツボ検出用プライマー対についてもその有効性を確認することができた。
【０１８７】
以上、本発明のプライマーセットの有効性を確認することができた。
【０１８８】
（実施例８）
配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行うことで、プライマーダイマーが生成する可能性が懸念された。そこで、クロフジツボ検出用プライマー対について、さらに検討を行った。
【０１８９】
具体的には、アカフジツボ、キタアメリカフジツボ、ミネフジツボ、サンカクフジツボ、アメリカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボ、シロスジフジツボ、チシマフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、イワフジツボ、ムツアナヒラフジツボ、オオアカフジツボ、ココポーマアカフジツボ、カメノテ、エボシガイ、ハナフジツボ、ヨーロッパフジツボ、ドロフジツボ、コウダカキクフジツボ、キタイワフジツボ、オニフジツボ、ミミエボシ、スジエボシ、Semibalanus balanoides、 Elminius modestus、Cryptolepas rhachianechi、さらには実海域に一般的に存在しているプランクトンの遺伝子を認識しないと考えられる配列番号５４及び５５に示す新規クロフジツボ検出用プライマー対を設計した。
【０１９０】
次に、配列番号５４及び５５に示す新規クロフジツボ検出用プライマー対の特異性を実施例１と同様の方法で検討した。実施例１の（１）と同様の条件で配列番号５４及び５５に示す新規クロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、１００ｂｐ付近の領域にシングルバンドが確認できた。これは、配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対により増幅した１０１ｂｐのＤＮＡ断片であると考えられた。
また、ミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列がクロフジツボと比較的似ていると考えられるココポーマフジツボ、アカフジツボ、ケハダカイメンフジツボ、サンカクフジツボ、ムツアナフジツボ、カメノテについて、鋳型ＤＮＡに配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対を加えてＰＣＲを行った結果、いずれにおいてもバンドは検出されず、プライマーダイマーの生成は全く起こっていないことが明らかとなった。
以上の結果から、配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対はクロフジツボミトコンドリアＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を特異的に認識して増幅すると考えられた。
【０１９１】
さらに、混合プランクトンを認識しないかどうか確認を行った。結果を図２３に示す。図２３において、Ａはクロフジツボ成体から抽出した鋳型ＤＮＡに対し配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果を示し、Ｂは東京湾にて採集した混合プランクトンに対し配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果を示し、Ｃは志津川湾にて採集した混合プランクトンに対し配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対を用いてＰＣＲを行った結果を示している。図２３に示される結果からも明らかなように、配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対は、混合プランクトンサンプルを全く認識することなく、クロフジツボの鋳型ＤＮＡのみと特異的に反応することが確認できた。
【０１９２】
また、配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対を用いた定量分析について検討するため、実施例２と同様の方法で実験を行った。その結果、図２４に示すように、０．２〜４ｎｇ／μＬにおいてバンドの濃淡を確認することができ、幼生の定量分析が十分に可能であると考えられた。
【０１９３】
そこで、配列番号５４及び５５のクロフジツボ検出用プライマー対を用いた場合と、配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対を用いた場合とについて、実施例４と同様の方法でリアルタイムＰＣＲによる定量性について評価した。
【０１９４】
結果を図２５に示す。図２５に示される結果から、新規プライマー対（図２５中の◆）を用いることで、配列番号１３及び１４のクロフジツボ検出用プライマー対（図２５中の■）を用いる場合よりもプライマーダイマーの生成を抑えられる可能性が示唆された。
【０１９５】
以上より、配列番号５４及び５５に記載のクロフジツボ検出用の新規プライマー対の有効性が確認された。
【符号の説明】
【０１９６】
１  ＤＮＡチップ
４  ＤＮＡプローブ
【図１】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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