(57)【要約】【課題】封入された薬剤の最適な循環寿命および保持を示すリポソームを提供すること。【解決手段】少なくとも１０モル％の、非双性イオン部分に結合された負に荷電した脂質を含むリポソームは、血中において安定である。少なくとも１モル％のこのような脂質を含むリポソームは、安全に凍結に凍結され得る。本発明は、以下を含むリポソームを提供する：親水性部分および疎水性部分を有する負に荷電した脂質であって、中性の非双性イオン部分が、この脂質の親水性部分に結合している。特定の実施形態において、本発明のリポソームは、コレステロールを実質的に含まない。このリポソームは、代表的に、生物学的に活性な薬剤を含む。本発明のリポソームは、驚くべきことに、血流中での増強された循環寿命を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許出願番号６０／３９４，２７１（２００２年７月９日出願）および米国特許出願番号６０／３３１，２４８（２００１年１１月１３日出願）の利益を主張する。これらの出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、循環中にて長い寿命を有するリポソーム組成物に関する。これらのリポソームは、双性イオンを含まない負に荷電した脂質の取り込みを含む。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
リポソームは、中心の水性コアを囲む１つ以上の二重層へと配置された両親媒性脂質の水性分散物から調製される送達ビヒクルである。溶質は、内部水性区画中に閉じ込められ、それによって、血液成分との反応からこの溶質を保護し得る。閉じ込められた薬剤を標的部位に効果的に送達するために、リポソームは、封入された薬剤の最適な循環寿命および保持を示すことが所望される。
【０００４】
リポソームの薬理学的特性は、膜中に取り込まれた脂質の型を変化させることによって、変動され得る。中性（正味の荷電なし）の脂質から構成されるリポソームは、血液区画中に存在する多数のタンパク質、炭水化物および脂質成分への曝露の際に安定であるので、このようなリポソームが一般に使用される。リポソーム組成物中に負に荷電した脂質（例えば、ホスファチジルセリン）を取り込むことは、リポソームの認識および循環からのリポソームのクリアランスの増大を生じた。Ｋｉｒｂｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８０）１８６：５９１−５９８。従って、疾患部位への薬物送達は低減される。Ａｌｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：８０６１−８０７１。
【０００５】
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピンおよびホスファチジルセリンを含むリポソームの循環寿命の比較により、ホスファチジルセリンリポソームが循環から迅速に排除される一方で、カルジオリピンリポソーム、ホスファチジルグリセロールリポソームおよびホスファチジルイノシトールリポソームは、ラットにおいて減少した速度で排除されることが明らかとなった（Ｋａｏ，Ｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９８０）６９：１３３８−１３４９）。
【０００６】
特定の負に荷電したリポソームが、インビボ適用において有用性を有し得ることは知られていたが、長い循環特性を付与するためのこれらのリポソームの使用は、ごく最近認識された。Ｗ０９９／５９５４７。これらの研究により、コレステロール／ＤＰＰＣ含有リポソームへのホスファチジルグリセロールの取り込みが、血中安定性の増強を導いたことが明らかとなっている。しかし、これらの調査により、１０モル％未満のＤＭＰＧで調製されたコレステロール／ＤＰＰＣリポソームが、１０モル％より高いＤＭＰＧで調製されたコレステロール／ＤＰＰＣリポソームと比較して、増大した血中安定性特性を示す場合、脂質ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）のモル％取り込みが、キャリアの循環特性に対して影響を有したこともまた明らかとなった。脂質成分（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ））が、所望でない特性を有し、従って、これらの処方物中に含まれなかったことにも留意すべきであった。
【０００７】
さらなるビヒクル形成脂質に加えてホスファチジルグリセロールを含むリポソーム調製物は、Ｂｒｏｄｔ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（１９８９）２８：５４−５８およびＨｏｐｅら、米国特許第６，１３９，８７１号に記載される。しかし、これらの調製物において、非双性イオン性の親水性部分に連結された負に荷電した脂質（例えば、ＰＧ）は、１０モル％未満の量で存在する。同様に、ＷＯ９９／５９５４７に記載されたリポソームは、１０モル％未満のＰＧを含む。Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：５５５１−５５５９およびＡｈｌ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３２９：３７０−３８２およびＦａｒｍｅｒ，Ｍ．Ｃ．，ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１４９：１８４−２００に記載されるリポソームは、本発明のリポソームとは異なり、かなりの量のコレステロールを含む。さらに、Ａｋｈｔａｒのリポソームは、使用されるリン脂質中に含まれるアシル鎖が１８個未満の炭素原子を含むので、３８度よりも低い転移温度を示す。
【０００８】
米国特許第５，４１５，８６９号は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールを含み得るリポソーム中に含まれるタキソール処方物を記載する。これらのリポソームが、延長された循環寿命を有するという示唆は存在せず、そして３８℃より高い転移温度が好ましいということも示されない。
【０００９】
米国特許第４，７６９，２５０号は、アニオン性リン脂質および中性リン脂質（ＤＳＰＧおよびＤＳＰＣを含む）の混合物から作製された処方物を記載しているが、これらのリポソームは、４５〜５５ｎｍの寸法を有するＳＵＶである。
【００１０】
凍結および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））に起因する有害な影響を防止するために、リポソーム調製物に凍結防止剤が添加されてきた。ジサッカリド（例えば、トレハロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、マルトデキストリンおよびデキストラン）は、最も一般的に使用される凍結防止剤である（ＷＯ０１／０５３７２および米国特許第５，０７７，０５６号を参照のこと）。
【００１１】
膜結合凍結防止剤が、凍結および凍結乾燥による損傷に対する耐性をさらに改善する目的で利用されてきた。特に、１〜３個の反復単位からなるオリゴ（エチレンオキシド）リンカーを介してリポソーム膜表面に結合した糖は、凍結保護的であることが報告されている（Ｂｅｎｄａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．（１９９６）４：２１１−２２２；Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０：５３１３−５３１８；米国特許第４，９１５，９５１号）。Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒらは、末端糖基の非存在下で、オリゴエチレンオキシドリンカー自体で調製されたリポソームが、凍結に続く融合に対して保護できないことを報告した（米国特許第４，９１５，９５１号を参照のこと）。
【００１２】
リポソーム膜中にコレステロールを含めることは、静脈内投与後に薬物の放出を低減することが示されている（例えば、米国特許第４，７５６，９１０号、同第５，０７７，０５６号および同第５，２２５，２１２号；Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８０）１８６：５９１−５９８；ならびにＯｇｉｈａｒａ−Ｕｍｅｄａ，Ｉ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．（１９８９）１５：６１７を参照のこと）。一般に、コレステロールは、二重層の厚さおよび流動性を増加させるが、一方で、リポソームの膜透過性、タンパク質相互作用およびリポタンパク質不安定化を減少させる。リポソーム処方物への従来のアプローチは、かなりの量（例えば、３０〜４５モル％）のコレステロールまたは等価な膜硬直化剤（例えば、他のステロール）をリポソーム中に含めることを示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の開示）
従って、本発明は、以下を含むリポソームを提供する：親水性部分および疎水性部分を有する負に荷電した脂質であって、中性の非双性イオン部分が、この脂質の親水性部分に結合している。特定の実施形態において、本発明のリポソームは、コレステロールを実質的に含まない。このリポソームは、代表的に、生物学的に活性な薬剤を含む。本発明のリポソームは、驚くべきことに、血流中での増強された循環寿命を示す。
【００１４】
負に荷電した脂質は、代表的に、リン脂質またはスフィンゴリン脂質である。好ましくは、この脂質は、リン脂質である；すなわち、２つのアシル基が結合したグリセロールであり、ここで、第三のヒドロキシルは、リン酸に結合している。非双性イオン部分は、この負に荷電した脂質に、好ましくはリン酸基に結合している。好ましくは非双性イオン部分は中性であり、その結果、本発明において使用される脂質上の正味の負の電荷は、この脂質成分の負の電荷のみに起因する。
【００１５】
非双性イオン部分は、脂質に対して所望の親水性を付与する官能基を含み得、このような基は、アルコール、ケトン、カルボン酸、エーテルおよびアミンから選択される。好ましい非双性イオン部分は、短鎖アルコール（例えば、グリセロール）もしくは環状アルコール（例えば、イノシトール）またはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）である。
【００１６】
１実施形態において、このリポソームは、１０モル％より多い、１以上の上記の通りの凝集防止脂質（すなわち、非双性イオン部分を含む、負に荷電した脂質）；および９０モル％までの１以上の小胞形成脂質（ここで、このリポソームは、コレステロールを実質的に含まない）を含む。好ましくは、この非双性イオン部分は、短鎖アルコール（例えば、グリセロール）であるか、またはシクリトール（例えば、イノシトール）もしくはポリアルキレンオキシドである。最も好ましくは、このリポソームを構成する小胞形成脂質は、このリポソームの相転移温度が少なくとも３８℃、好ましくは少なくとも４０℃よりも高いように選択される。好ましくは、このリポソームの寸法は、８０ｎｍ〜２００ｎｍ±２５ｎｍの桁である。凍結による損傷に対する保護に関して、１モル％程度の少ない凝集防止脂質が存在し得る。
【００１７】
保存に関して、本発明のリポソームは、凍結または凍結乾燥され得、そして凍結防止剤を含み得る。用いられる凍結防止剤の量は、凍結防止剤の型および保護されるべきリポソームの特徴に依存する。当業者は、種々の凍結防止剤の型および濃度を容易に試験して、どの凍結防止剤の型および濃度が特定のリポソーム調製物について最良に作用するかを決定し得る。一般に、１００ｍＭ以上の桁の糖濃度は、最大レベルの保護を達成するに必要であることが見出されている。数モルの膜リン脂質に関して、１００ｍＭの桁のミリモル濃度レベルは、１モルのリン脂質あたり約５モルの糖に対応する。
【００１８】
本発明のリポソームは、凍結防止剤を実質的に含まなくてもよい。用語「凍結防止剤を実質的に含まない」とは、２０ｍＭ未満の凍結防止剤または１０ｍＭ未満の凍結防止剤を含む、リポソームをいう。異なる濃度の凍結防止剤が、このリポソームの内側および外側に存在する場合、外側または内側に存在する最大濃度が、これらの定義において言及される濃度であると解釈される。
【００１９】
本発明のリポソームが凍結されるべきである場合、リポソームがコレステロールを実質的に含まず、親水性ポリマー脂質結合体（特に、約１２５ダルトンよりも大きい親水性ポリマー脂質結合体）を含むことが好ましいが、必要とはされない。なぜなら、これらのリポソームは、凍結後の因子の融合および漏出に耐性であるからである。従って、リポソームが凍結されるべき場合、これらは、約１モル％〜約３０モル％の１以上の親水性ポリマー結合体化脂質および約９９モル％までの１以上の小胞形成脂質を含み、コレステロールを実質的に含まない。好ましくは、この親水性ポリマー−脂質結合体は、ＰＥＧ脂質結合体である。このリポソームはまた、凍結防止剤（例えば、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース、デキストランまたはアミノ配糖体）を含み得る。特に好ましいのはグルコースである。
このリポソームは、約−５℃まで、好ましくは、約−１０℃未満まで、そしてより好ましくは約−２０℃未満まで凍結され得る。これらは、凍結される場合、凍結乾燥され得る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
リポソームを含む組成物であって、該リポソームは、少なくとも１つの小胞形成脂質；少なくとも１モル％の凝集防止剤；および少なくとも１つの生物学的に活性な因子を含み、そしてコレステロールを実質的に含まず；ここで、該リポソームは、８０〜２００ｎｍ＋／−２５ｎｍの間の平均直径を有し；そして該リポソームは、少なくとも３８℃の転移温度（Ｔｃ）を有する、組成物。
（項目２）
前記リポソームが、少なくとも１８個の炭素原子の鎖長のアシル基を含む小胞形成脂質を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記凝集防止剤が、ＰＥＧ化両親媒性脂質またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）もしくはホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記凝集防止剤が、ＰＧまたはＰＩである、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記リポソームが、少なくとも１０モル％の前記凝集防止剤を含む、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記リポソームが、凍結防止剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目７）
低温で安定である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
凍結または凍結乾燥形態である、項目１に記載の組成物。
（項目９）
項目１に記載の組成物であって、前記リポソームが、１０モル％のＰＩまたは１０モル％のＰＧを含み、そして前記小胞形成脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリンである、組成物。
（項目１０）
前記生物学的に活性な因子が、ＦＵＤＲおよび／またはＣＰＴ１１および／またはカルボプラチンを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
生物学的因子を必要とする被験体に、該因子を投与する方法であって、該方法は、項目１に記載の組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１３）
項目１に記載の組成物を、凍結する工程または凍結乾燥する工程を包含する、リポソーム組成物を保存する方法。
（項目１４）
項目６に記載の組成物を、凍結する工程または凍結乾燥する工程を包含する、リポソーム組成物を保存する方法。
（項目１５）
項目７に記載の組成物を、凍結する工程または凍結乾燥する工程を包含する、リポソーム組成物を保存する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、９０：１０（黒丸）、８０：２０（白丸）および７０：３０（逆三角形）のモル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＧを含むダウノルビシン充填リポソームの静脈内投与後に血中に残っている、注射した脂質のパーセントを示す、グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、９０：１０（黒丸）、８０：２０（白丸）および７０：３０（逆三角形）のモル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＧを含むダウノルビシン充填リポソームの静脈内投与後に血中に残っている、注射したダウノルビシンのパーセントを示す、グラフである。
【図２】図２は、ＦＵＤＲに受動的に封入された、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０のモル比）およびＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５のモル比）のリポソームの静脈内投与後の種々の時点でのＦＵＤＲ−対−脂質の比を示す、グラフである。
【図３】図３は、ＦＵＤＲおよびイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）を共充填（ｃｏ−ｌｏａｄ）したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソームの静脈内投与後のＦＵＤＲ−対−脂質の初期の比のパーセントに対するコレステロール含有量の種々の時点での効果を示す、グラフである。このリポソームは、５モル％（黒丸）、１０モル％（白丸）、１５モル％（黒い逆三角形）および２０モル％（白い逆三角形）でコレステロールを含んでおり、そしてＤＳＰＧレベルを、２０モル％に一定に保持した。
【図４】図４は、９０：１０（黒丸）、８０：２０（白丸）および７０：３０（逆三角形）のモル比でＤＳＰＣ／ＤＰＰＧを含むリポソームの静脈内投与後に血液中に残っている、注射した脂質のパーセントを示す、グラフである。
【図５】図５は、９０：１０（黒丸）、８０：２０（白丸）および７０：３０（逆三角形）のモル比でＤＳＰＣ／ＰＩ（水素化植物）を含むリポソームの静脈内投与後に血液中に残っている注射した脂質のパーセントを示す、グラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、両方の薬物を充填した後の凍結前の、−２０℃にて２４時間凍結し、続いて室温で解凍した後の、および−７０℃にて２４時間凍結し、続いて室温で解凍した後の、ＦＵＤＲおよびイリノテカンを共充填したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０モル比）リポソームのサイズを示す、ヒストグラムである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、両方の薬物を充填した後の、凍結前の、−２０℃で２４時間凍結し、続いて室温で融解した後の、および−７０℃で２４時間凍結し、続いて室温で融解した後の、ＦＵＤＲおよびイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）を共充填したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０モル比）リポソームのＦＵＤＲ対脂質比を示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、両方の薬物を充填した後の、凍結前の、−２０℃で２４時間凍結し、続いて室温で融解した後の、および−７０℃で２４時間凍結し、続いて室温で融解した後の、ＦＵＤＲおよびイリノテカンを共充填したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソーム（８０：２０モル比）のイリノテカン対脂質比を示すヒストグラムである。
【図７】図７は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側および外側の両方に３００ｍＭのクエン酸緩衝液を含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソーム、ＤＰＰＣ／コレステロール（５５：４５モル％）からなるリポソームおよびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図８】図８は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側および外側の両方に３００ｍＭのクエン酸緩衝液を含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソーム、ＤＳＰＣ／コレステロール（５５：４５モル％）からなるリポソームおよびＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図９】図９は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側および外側の両方にＨＢＳを含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソーム、ＤＰＰＣ／コレステロール（５５：４５モル％）からなるリポソームおよびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１０】図１０は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側および外側の両方にＨＢＳを含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソーム、ＤＳＰＣ／コレステロール（５５：４５モル％）からなるリポソームおよびＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１１】図１１は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側および外側の両方にＨＢＳを含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ７５０（９５：５モル％）からなるリポソームおよびＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ７５０（９５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１２】図１２は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および後（灰色棒）の、リポソームの大きさを示すヒストグラムである。ＤＡＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１３】図１３は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および凍結の後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側にｐＨ４．０のクエン酸を含みかつ外側にＨＢＳを含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）およびからなるリポソームＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１４】図１４は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および凍結の後（灰色棒）の、リポソーム膜の内側にｐＨ４．０のクエン酸を含みかつ外側にＨＢＳを含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームおよびＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１５】図１５は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および凍結の後（灰色棒）の、封入されたグルコースを含むリポソームのサイズを示すヒストグラムである。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームおよびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１６】図１６は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および凍結の後（灰色棒）の、リポソーム中へのグルコースの封入パーセントを示すヒストグラムである。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームおよびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを試験した。
【図１７】図１７は、２４時間の凍結の前（黒色棒）および凍結の後（灰色棒）の、封入されたドキソルビシンを含むＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームのサイズを示すヒストグラムであり（左パネル）、ドキソルビシン保持パーセントを示すヒストグラムである（右パネル）。
【図１８】図１８は、充填の間のＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソーム中へのドキソルビシンの封入パーセントを、時間の関数として示すグラフである。充填を、凍結前（黒丸）および凍結後（白丸）に実施した。
【図１９】図１９は、充填の間のＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソーム中へのドキソルビシンの封入パーセントを、時間の関数として示すグラフである。充填を、凍結前（黒丸）および凍結後（白丸）に実施した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明を実施する形態）
本明細書中で使用される場合、「リポソーム」は、水相を封入する１つ以上の同心に整列された脂質二重層から構成される小胞を意味する。これらの小胞の形成は、二重層構造をとり得るかまたは二重層構造に取り込まれ得る両親媒性脂質である「小胞形成脂質」の存在を必要とする。これとしては、単独でまたは別の脂質と組み合わせた場合、二重層を形成し得るような脂質が挙げられる。両親媒性脂質は、二重膜の内部の疎水性領域と接触するその疎水性部分および膜の外側の極性表面に向いたその極性頭部部を有することによって脂質二重層に組み込まれる。ほとんどのリン脂質は、小胞形成脂質の前者の型に属するのに対して、コレステロールは、後者の型の代表である。
【００２２】
本発明のリポソームまたは脂質キャリアに組込まれ得る適切な小胞形成脂質は、種々の両親媒性脂質（代表的には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のようなリン脂質およびスフィンゴミエリンのようなスフィンゴリピドを含む）から選択され得る。本明細書中において、脂質について用語「嵩高い」または「構造的」は、リポソームの構造に寄与する小胞形成脂質を意味する。
【００２３】
本発明に従って調製されたリポソームは、小胞を調製するために使用される従来の技術によって調製され得る。これらの技術としては、エーテル注入法（Ｄｅａｍｅｒら、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）３０８：２５０）、界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４５５：３２２）、凍結融解法（Ｐｉｃｋら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９８１）２１２：１８６）、逆相エバポレーション法（Ｓｚｏｋａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８０）６０１：５５９−５７１）、超音波処理法（Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９６９）８：３４４）、エタノール注入法（Ｋｒｅｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７７）１６：３９３２）、押し出し法（Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８５）８１２：５５−６５）、およびフレンチプレス法（Ｂａｒｅｎｈｏｌｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９７９）９９：２１０）が挙げられる。これらのプロセスは、組み合わせて使用され得るかまたは改変され得る。小さな単層小胞（ＳＵＶ）は、超音波処理法、エタノール注入法およびフレンチプレス法によって調製され得る。好ましくは、多層小胞（ＭＬＶ）は、逆相エバポレーション法によって、または水を脂質フィルムに単に添加した後、機械的攪拌により分散することによって調製される（Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ｌ９６５）１３：２３８−２５２）。
【００２４】
本発明の実施において使用され得る特に適切なリポソーム調製物は、大きな単層小胞（ＬＵＶ）である。ＬＵＶは、エーテル注入法、界面活性剤法、凍結融解法、逆相エバポレーション法、フレンチプレス法または押し出し法のいずれかによって調製され得る。好ましくは、ＬＵＶは、押し出し法に従って調製される、押し出し法は、まず、クロロホルム中で、脂質を所望のモル比を得るように合わせる工程を包含する。脂質マーカーは、必要に応じて、脂質調製物に添加され得る。得られた混合物は、窒素ガス流下で乾燥され、溶媒が実質的に除去されるまで真空ポンプ中に配置される。次いで、サンプルを、適切な緩衝液または治療剤の混合物中で水和する。次いで、混合物は、押し出し装置を通され、規定の平均サイズのリポソームが得られる。平均リポソームサイズは、例えば、ＮＩＣＯＭＰＴＭ  ３７０サブミクロン粒径測定器を使用して６３２．８ｎｍの波長で準弾性光散乱によって決定され得る。
【００２５】
「実質的にコレステロールを含まない」リポソームは、リポソームの相転移特性を有意に変化させるのに十分ではない量のコレステロール（代表的には、２０モル％未満のコレステロール）を含み得る。２０モル％以上のコレステロールは、相転移が生じる温度の範囲を広くする。相転移は、より高いコレステロールレベルでは消失する。好ましくは、コレステロールを実質的に有さないリポソームは、約１５モル％以下のコレステロール、より好ましくは約１０モル％以下のコレステロールを有し、より好ましくは、約５モル％以下のコレステロールまたは約２モル％以下のコレステロールまたは１モル％以下のコレステロールを有する。また、「コレステロール非含有」リポソームを調製する場合、コレステロールは、存在しなくても添加されなくてもよい。
【００２６】
用語「生理的ｐＨで負に荷電した脂質」または「負に荷電した脂質」は、生理的ｐＨで１つ以上の負電荷を有する小胞形成脂質をいう。本発明での使用のための適切な負に荷電した脂質は、リン脂質またはスフィンゴリン脂質であり得る。非双性イオン部分を含む負に荷電した脂質は、５〜９５モル％で、より好ましくは１０〜５０モル％で、そして最も好ましくは１５〜３０モル％で、リポソームに組込まれ得る。「非双性イオン部分」は、生理的ｐＨで反対の電荷を有さないが、親水性である部分をいう。
【００２７】
本発明で使用される脂質における正味の負電荷は、単に負に荷電した脂質上（例えば、リン酸基上）の電荷の存在から生じ得るか、またはさらなる負電荷は、非双性イオン部分上に存在する１つ以上の負に荷電した基の存在に起因し得る。好ましくは、正味の負電荷は、単に脂質上の１つ以上の負に荷電した基の存在から生じ、この場合において、非双性イオン部分は、中性基である。好ましくは、非双性イオン部分は、２〜６の炭素原子を含む。
【００２８】
適切な非双性イオン部分は、ヘッド基に親水性特性を付与する電子吸引性官能基を含む。このような官能基は、アルコール、酸、ケトン、エステル、エーテル、アミド、およびアルデヒドからなる群から選択され得る。サッカリドもまた、このことについて使用され得る。
【００２９】
モノサッカリドとしては、アラビノース、フコース、ガラクトース、グルコース、リキソース、マンノース、リボースおよびキシロースが挙げられる。ジサッカリドとしては、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、ゲンチオビオース、およびマルトースが挙げられる。リポソームの循環からのクリアランスの増加が、細胞表面へのリポソームの結合から生じ得るので、細胞レセプターに結合しないモノサッカリドおよびジサッカリドが、好ましい。
【００３０】
非双性イオン部分が、生理的ｐＨで中性であるように選択される場合、イオン化不可能基（例えば、アルコール、ケトン、エステル、エーテル、アミドおよびアルデヒド）の組込みが選択される。
【００３１】
本発明の１つの実施形態において、非双性イオン部分は、短鎖アルコールであり、好ましいアルコールは、２つ以上のヒドロキシル基を含む。アルコールは、グリセロールが一例である直鎖ポリオールであり得、グリセロール分子の末端ヒドロキシル基を介してリン脂質のリン酸に結合して、得られた分子は、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と呼ばれる。好ましくは、ホスファチジルグリセロールの脂肪酸鎖は、独立して、カプロイル（６：０）、オクタノイル（８：０）、カプリル（１０：０）、ラウロイル（１２：０）、ミリストイル（１４：０）、パルミトイル（１６：０）、ステアロイル（１８：０）、アラキドイル（２０：０）、ベヘノイル（２２：０）、リグノセロイル（ｌｉｎｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）（２４：０）またはフィタノイルであり、これらは、シス配座またはトランス配座のこれらの脂肪酸鎖の不飽和バージョン（例えば、オレオイル（１８：１）、リノレオイル（１８：２）、アラキドノイル（２０：４）、およびドコサヘキサエノイル（２２：６））を含む。１４〜１８炭素原子の２つのアシル鎖を有するリン脂質が、好ましい。いずれにせよ、１つの実施形態において、負に荷電した脂質の疎水性置換基の性質は、リポソームの相転移温度が、約３８℃より高く、好ましくは約４０℃より高いというような性質である。
【００３２】
別の実施形態において、非双性イオン部分は、環構造であり、好ましくは、シクリトールである。このような化合物は、分子に所望の水溶性を付与する種々の基で誘導体化され得る。好ましくは、シクリトールは、リン酸基を介してリン脂質に結合されたイノシトールであり、得られた化合物は、ホスファチジルイノシトールである。好ましくは、ホスファチジルイノシトールの脂肪酸鎖は、独立に選択され、それは、上記の通りである。
【００３３】
別の実施形態では、非双性イオン部分は、「親水性ポリマー−脂質結合体」を形成するポリマーであり得る。これは、その極性頭部部分で親水性ポリマーに共有結合された小胞形成脂質をいい、そしてポリマーに付着させるために、極性頭部部分に反応性官能基を有する脂質から代表的には形成される。適切な反応性官能基は、例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、またはホルミルである。この脂質は、このような結合体において使用することについて当該分野で記載される任意の脂質であり得る（例えば、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびセラミド）。好ましくは、この脂質は、種々の不飽和度の長さ約６個〜約２４個の間の炭素原子を含む２つのアシル鎖を有するリン脂質（例えば、ＰＣ、ＰＥ、ＰＡまたはＰＩ）である。結合体における脂質は、例えば、ＰＥであり得、好ましくは、ジステアロイル形態である。ポリマーは、リポソームの均一な表面範囲を生じる十分な可撓性で、ポリマー鎖を、リポソーム表面から効果的に伸長することを可能にする、水における溶解度により特徴付けられる生体適合性ポリマーである。好ましくは、ポリマーは、ポリアルキルエーテル（ポリメチレングリコール、ポリヒドロキシプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリアクリル酸、およびそれらのコポリマー、ならびに米国特許第５，０１３，５５６号および第５，３９５，６１９号に開示されたものを含む）である。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。結合体は、放出可能な脂質ポリマー結合（例えば、ペプチド結合、エステル結合、またはジスルフィド結合）を含むように調製され得る。結合体はまた、標的化リガンドを含み得る。結合体の混合物は、本発明において使用するためのリポソームに取り込まれ得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＰＥＧ結合体化脂質」は、ポリマーがＰＥＧである、上記に規定した親水性ポリマー−脂質結合体をいう。
【００３５】
親水性ポリマー−脂質結合体または他の非双性イオン含有負荷電脂質は、一旦所望の生体分布が達成されれば、ＬＵＶキャリア表面を露出するように選択的な生理条件下で開裂され得る放出可能な脂質−ポリマー結合（例えば、ペプチド結合、エステル結合、またはジスルフィド結合）を含むように調製され得る。例えば、米国特許第６，０４３，０９４号、またはＫｉｒｐｏｔｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９６）３８８：１１５−１８８において開示される。
【００３６】
親水性ポリマー−脂質結合体はまた、特定の細胞にリポソームを指向させるために、ポリマーの遊離末端に付着された標的化リガンドを含み得る。標的化リガンドの結合体化を可能にするポリエチレングリコールの誘導体は、例えば、メトキシ（ヒドラジド）ポリエチレングリコールおよびビス（ヒドラジド）ポリエチレングリコールである。
【００３７】
負荷電脂質は、天然供給源から得られ得るか、または化学合成され得る。脂質の頭部基に化合物を共有結合するための方法は、当該分野で周知であり、そして脂質頭部基の末端部の官能基を、付着される部分上の官能基と反応させることを包含する。非双性イオン親水性部分の化学的付着のために適切な負荷電脂質は、反応性化学基で終結する極性頭部基を有する脂質（例えば、ホスフェート、アミン）を含む。特に適切な脂質の例は、反応性アミノ基を含むので、ホスファチジルエタノールアミンである。ホスファチジルエタノールアミン誘導体を調製するための方法は、Ａｈｌ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９７）１３２９：３７０−３８２に記載されている。既に非双性イオン部分を含む天然供給源から得られた負荷電脂質の例としては、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルイノシトール（これらはそれぞれ、卵、植物供給源から得られる）が挙げられる。
【００３８】
本発明のリポソームは、周囲環境における温度の上昇に感受性であるように調製され得る。このようなリポソームの温度感受性は、（高体温の臨床手順におけるように）熱されたか、または（炎症におけるように）身体の残りの部分よりも固有に高い温度である標的部位でのリポソームの内部水性腔内に捕捉された化合物の放出、および／または脂質二重奏と結合した化合物の放出を可能にする。温度依存様式で化合物の放出を可能にするリポソームは、「温度感受性リポソーム」と呼ばれ、そして低レベルのコレステロールを含有する。本発明のリポソームは、高体温の範囲で（例えば、約３８℃から約４５℃の範囲）でのゲル−液体結晶転移温度を有する脂質を含む。約３８℃から約４５℃の相転移温度を有するリン脂質が好ましく、そしてアシル基が飽和されているリン脂質がより好ましい。特に好ましいリン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。
【００３９】
本発明の温度感受性リポソームは、比較的水溶性の界面活性剤（例えば、リゾ脂質（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ））を、主に比較的水溶性の分子で構成される二重層（例えば、二鎖リン脂質（例えば、ＤＰＰＣ））に組み込み得る。主要脂質成分のゲル相における界面活性剤の組み込みは、主要脂質のゲル−液結晶相転移温度に加熱された場合に、得られたリポソームからの内容物の放出を増強する。好ましい界面活性剤は、リゾ脂質であり、そして特に好ましい界面活性剤は、モノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）である。適切な界面活性剤は、二重層の主要脂質と適合性であり、そして液体が液相へ融解する場合に脱着する界面活性剤である。リン脂質二重層における使用のためのさらなる適切な界面活性剤としては、パルミトイルアルコール、ステアロイルアルコール、モノパルミチン酸パルミトイル、モノパルミチン酸ステアロイル、モノパルミチン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、およびモノアシル化脂質（例えば、スフィンゴシンおよびスフィンガミン（ｓｐｈｉｎｇａｍｉｎｅ））が挙げられる。
【００４０】
本発明のリポソームはまた、液晶転移温度が４５℃より高くなるように調製され得る。この場合、リポソームを構成する小胞形成脂質は、ＰＣまたはＰＥのようなリン脂質である。好ましいリン脂質は、ＰＣである。罹患脂質を選択する際、これらの脂質のアシル鎖の長さが４つ以上のメチレン基だけ異なる場合、相分離が起こり得るので注意されるべきである。好ましくは、脂質は、２つの飽和脂肪酸を有する（これらのアシル鎖は、以下からなる群から独立して選択される：ステアロイル（１８：０）、ノナデカノイル（１９：０）、アラキドイル（２０：０）、ヘンイコサノイル（ｈｅｎｉｅｃｏｓａｎｏｙｌ）（２１：０）、ベヘノイル（２２：０）、トリコサノイル（２３：０）、リングセロイル（ｌｉｎｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）（２４：０）およびセロトイル（ｃｅｒｏｔｏｙｌ）（２６：０））。好ましくは、少なくとも１つ（おとびより好ましくは両方）のアシル鎖が１８：０、またはそれより長い。
【００４１】
本発明の実施形態は、感熱性の適用について有用である相転移温度より高い相転移温度（例えば、約４５℃以上）を有するコレステロールを実質的に含まないリポソームを使用し得、これは、２００１年１１月１５日に公開されたＰＣＴ／ＣＡ０１／００６５５（本明細書中に参考として援用される）に記載されるような増強された薬物保持を示す。このようなリポソームは、１８より多い炭素原子の少なくとも１つのアシル鎖を有する少なくとも６０ｍｏｌ％のリン脂質を有するコレステロールを含まないリポソームを含む。
【００４２】
本発明の実施形態は、コレステロールを実質的に含まないリポソームを使用し得、約２００ｍＭ未満の内部負荷緩衝濃度で、ｐＨ勾配負荷技術に従って負荷される場合、試薬の増加した全身保持を提供する。このようなリポソームは、２００１年１１月１３日に出願されたＵ．Ｓ．６０／３３１，２４９（本明細書中に参考として援用される）に記載される。コステロールを含まないリポソームにおいて乏しい全身保持を示す試薬は、本実施形態に従ってより安定に保持され得る。
【００４３】
本発明の実施形態は、注射によって投与される場合、内部緩衝液の浸透圧が、リポソームが存在する媒体の浸透圧に近くなるように選択される場合、封入された治療剤の増加した全身保持を示すコレステロールを含まないリポソームを使用し得る。このようなリポソームは、２００１年１１月１３日に出願されたＵ．Ｓ．６０／３３１，２４９（本明細書中に参考として援用される）に記載される。従って、この実施形態は、コレステロールを含まないリポソームおよびリポソーム内部緩衝液が媒体の溶質浸透圧に適合するコレステロールを含まないリポソームを含む注入媒体を含む低溶質の使用を含む。
【００４４】
本発明の実施形態は、患者に適用され得る温度（例えば、約４５℃以下）で不安定化する「感熱性」リポソームを使用し得、２００１年１２月１４日に出願されたＵ．Ｓ．６０／３３９，４０５（本明細書中に参考として援用される）に記載されたものを含む。従って、本実施形態は、被験体に、活性剤を含む感熱性リポソームを投与することによって被験体の目的の部位に試薬を送達するための方法の使用を含み得るか、またはその使用から生じ得、目的の部位へのリポソームの局在化についての延長した時間可能にし、続いてリポソーム含量の放出を引き起こす目的の部位で恒温動物の処置を施す。
【００４５】
本発明の実施形態はまた、脂質に結合体化した親水性部分を含むコレステロールを含まないリポソームを使用し得る。このようなリポソームは、凍結後の試薬の融合および漏出、引き続くに耐性であり、そして２００１年１１月１３日に出願されたＵ．Ｓ．６０／３３１，２４８（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００４６】
本発明の１つの局面において、コレステロールを含まないリポソームが提供され、ここで、負に荷電した脂質は、１０ｍｏｌ％より多くリポソーム中に取り込まれる。本発明のこの局面において、非双性イオン性の部分は、好ましくは、グリセロールのような単鎖アルコールである。最も好ましくは、本発明の本実施形態ににおけるリポソームを構成する小胞形成脂質は、リポソームの相転移温度が約４０℃より高くなるように選択される。本発明のこの局面についての全ての他の好ましい性質および条件は、一般的に上記に記載される通りである。
【００４７】
リポソームの循環寿命の測定は、当該分野で公知の手段によって行われ得る。これらの手段としては、試験動物への静脈内投与および血液レベルのモニタリングを含む、以下の実施例において記載される方法が挙げられる。この測定は、静脈内投与のために意図されるリポソームについて、静脈内投与に適切なビヒクルまたは希釈剤中でリポソームまたは脂質キャリアを処方し、この処方物を投与し、そして血液レベルをモニタリングすることによって、行われ得る。この測定は、罹患した動物モデルへの投与後の構成成分（例えば、リポソームまたは脂質キャリア中に存在する放射標識）の量を測定することによって行われ得る。
【００４８】
本発明の実施形態は、コレステロールを含まないリポソームを使用し得る。このコレステロールを含まないリポソームは、脂質に結合体化された親水性部分の組み込みを介して、コレステロール含有脂質と同等に挙動するように選択されるかまたはそのように作製される（例えば、Ｕ．Ｓ．６０／３３９，４０４（２００１年１２月１４日出願）（これは、本明細書中で参考として援用される）に開示される）。本発明のこのような実施形態は、試験形式（この形式は、被験体の体温に対してわずかに体温上昇である相転移温度を有する、コレステロールを含まないリポソームの循環寿命と、同等のコレステロール含有リポソームの循環寿命との比較に基づく）を使用して、リポソームを調製する方法または選択する方法の使用を包含し得るかまたはその使用に起因する。このように選択されたリポソーム組成物は、リポソーム安定性および薬物保持特性の増強を可能にする。
【００４９】
本発明のリポソームは、送達薬物に有用であり、従って生物学的に活性な因子を含むように処方される。
【００５０】
多様な因子が、本発明のリポソームに封入され得る。本発明のリポソームはまた、封入された因子と共に凍結され得るか、あるいはこの因子は、凍結に続いて封入され得る。用語「因子」は、治療適用および診断適用において使用され得る化学的部分をいう。本明細書中で使用される場合、用語「治療剤」および「薬物」は、治療において使用される化学的部分をいい、リポソームベースの薬物送達が望ましい。本発明のリポソームは、治療剤（例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤および抗菌剤）で封入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗菌剤」および「抗ウイルス剤」は、微生物およびウイルスの、成長、増殖および生存のそれぞれに関する効果を有する化学部分をいう。抗菌剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、アンピシリン、ペニシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、バンコマイシン、ならびにフロキサシン（ｆｌｏｘａｃｉｎ）およびフロキサシン誘導体（シクロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、ノルフロキサシン（ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、ガトリフロキサシン（ｇａｔｒｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、レボフロキサシン（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキフロキサシン（ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ）およびトロバフロキサシン（ｔｒｏｖａｆｌｏｘａｃｉｎ））。抗ウイルス剤としては、ＡＺＴが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「抗腫瘍剤」は、新生細胞または腫瘍の、成長、増殖、侵襲性または生存に関する効果を有する化学部分をいう。抗腫瘍治療剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗物質薬、細胞傷害性抗生物質および種々の植物アルカロイドならびにそれらの誘導体が挙げられる。
【００５１】
薬剤は、当該分野において公知の受動的充填技術により本発明のリポソームの内側に封入され得る。リポソーム中に治療剤を封入する受動的方法は、リポソームの合成の間に薬剤を包埋する工程を包含する。この方法において、この薬剤は、捕捉された水性空間内に会合または包埋された膜であり得る。これは、Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６５）１２：２３８により記載される受動的捕捉方法を含み、ここで、目的の薬剤を含む水相は、反応容器の壁に沈着した、乾燥した小胞形成脂質の層と接触される。機械的手段による撹拌の際、脂質の膨張が生じ、そして多層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＬＶ）が形成される。押出しを用いて、ＭＬＶが、超音波処理後に、大単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶ）または小単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＵＶ）に変換され得る。用いられ得る受動的充填の別の方法としては、Ｄｅａｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９に記載される方法が挙げられる。この方法は、エーテル中に小胞形成脂質を溶解する工程を包含し、そして最初にエーテルをエバポレートして表面に薄層を形成する（その後、この薄層が、封入される水相と接触される）代わりに、このエーテル溶液が直接この水相に注入され、そしてその後エーテルがエバポレートされ、これにより、封入された薬剤を有するリポソームが得られる。使用され得るさらなる方法は、Ｓｚｏｋａら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９７８）７５：４１９４により記載される逆相エバポレーション（ＲＥＶ）法であり得、この方法において、水不溶性有機溶媒中の脂質の溶液が、水性キャリア相に乳化され、そして引き続き、有機溶媒が減圧下で除去される。
【００５２】
用いられ得る受動捕捉の他の方法は、リポソームを連続的な脱水および再水和の処理、または凍結および解凍に供する工程を包含する。この技術は、Ｋｉｒｂｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）９７９〜９８４により開示される。また、Ｓｈｅｗら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８５）８１６：１〜８は、超音波処理により調製されたリポソームが、水溶液中で、封入される溶質と混合され、そしてこの混合物が、回転フラスコ中、窒素下で乾燥される方法を記載する。再水和の際、有意な画分の溶質が封入されている大きなリポソームが生成される。
【００５３】
薬剤は、能動的封入方法を用いて封入され得る。能動的充填は、リポソームが形成された後での治療薬剤の取り込みを誘導するための、リポソーム膜を通る膜内外勾配の使用を包含する。これは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｈ＋、および／またはプロトン化窒素部分を含む１以上のイオンの勾配を包含し得る。本発明に従って用いられ得る能動的充填技術としては、ｐＨ勾配充填、電荷誘引、およびこの薬物に結合し得る薬剤による薬物シャトリングが挙げられる。
【００５４】
リポソームは、ｐＨ勾配充填技術に従って充填され得る。この技術に従って、選択されたｐＨの水相を封入するリポソームが形成される。水和したリポソームは、封入される薬物または他の薬剤上の電荷を除去または最小にするために選択された、異なるｐＨの水性環境中に配置される。一旦、この薬物がこのリポソームの内側に移動したら、この内部のｐＨは、荷電した薬物状態をもたらし、このことは、この薬物が脂質二重層を透過することを防止し、それにより、この薬物をこのリポソーム内に封入する。
【００５５】
ｐＨ勾配を作製するために、元の外部媒体は、異なる濃度のプロトンを有する新たな外部媒体によって置換される。外部媒体の置換は、種々の技術によって（例えば、脂質小胞調製物を、（以下の実施例に記載したような）新たな媒体で平衡化したゲル濾過カラム（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム）に通過させることによって、または遠心分離技術、透析技術もしくは関連の技術によって）達成され得る。内部媒体は、外部媒体に対して酸性または塩基性のいずれであってもよい。
【００５６】
ｐＨ勾配の確立後、ｐＨ勾配充填可能薬剤は、この混合物に添加され、そしてこのリポソーム中へのこの薬物の封入が、上記の通りに生じる。
【００５７】
ｐＨ勾配を用いた充填は、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，６１６，３４１号、同第５，７３６，１５５号および同第５，７８５，９８７号に記載される方法に従って実施され得る。
【００５８】
ｐＨ勾配充填を用いて充填され得る治療薬剤は、中性形態のイオン化可能部分が、この薬物がこのリポソーム膜を横切ることを可能にし、そして荷電した形態へのこの部分の変換が、この薬物がこのリポソーム内に封入されたままであることを引き起こすように、１以上のイオン化可能部分を含み得る。イオン化可能部分は、アミン基、カルボン酸基およびヒドロキシル基を含み得るが、これらに限定されない。酸性内部に応答して充填される薬剤は、酸性環境に応答して荷電されるイオン化可能部分を含み得るのに対して、塩基性内部に応答して充填される薬物は、塩基性環境に応答して荷電される部分を含む。塩基性内部の場合、カルボン酸基またはヒドロキシル基を含むがこれらに限定されない、イオン化可能部分が利用され得る。酸性内部の場合、１級アミン基、２級アミン基および３級アミン基を含むがこれらに限定されない、イオン化可能部分が用いられ得る。好ましくは、ｐＨ勾配充填可能な薬剤は治療薬剤であり、そして最も好ましくは抗腫瘍性薬剤、抗微生物薬剤または抗ウイルス薬剤である。ｐＨ勾配充填法によってリポソーム中に充填され得、それゆえ、本発明において使用され得る治療薬剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アントラサイクリン抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトザントロン、エピルビシン、アクラルビシンおよびイダルビシン）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、マイトマイシン、ブレオマイシンおよびダクチノマイシン）；ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ））；プリン誘導体（例えば、６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン）；プリン誘導体およびピリミジン誘導体（例えば、５−フルオロウラシル）；カンプトテシン（例えば、トポテカン、イリノテカン、ルートテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンおよび１０−ヒドロキシカンプトテシン）；シタラビン（例えば、シトシンアラビノシド）；抗微生物剤（例えば、シプロフロキサシンおよびそれらの塩）。本発明は、現在入手可能な薬物に限定るべきでないが、未だ開発も市販もされておらずかつ膜内外ｐＨ勾配を用いて充填され得る他の薬物まで拡大される。
【００５９】
リポソームに亘るｐＨ勾配を達成し、そして維持するために種々の方法が、使用され得る。これは、そのリポソームが膜に入り込みそしてプロトンと交換で膜を横切ってイオンを輸送し得るイオン透過担体の使用を含み得る（例えば、米国特許第５，８３７，２８２号を参照のこと）。そのリポソーム膜を横切ってプロトンを輸送し、それによって、ｐＨ勾配を設定し得るリポソームの内側に封入された緩衝剤がまた、利用され得る（例えば、米国特許第５，８３７，２８２号を参照のこと）。これらの緩衝剤は、脱プロトン化しているときは中性であり、かつプロトン化したときは荷電している、イオン化可能部分を含む。この緩衝剤の中性の脱プロトン化形態（これは、プロトン化形態と平衡状態にある）は、リポソーム膜を横断することができ、従って、そのリポソームの内部にプロトンを残し、それによって、内部のｐＨを上昇させる。このような緩衝剤の例としては、塩化アンモニウムメチル、硫酸メチルアンモニウム、硫酸エチレンジアンモニウム（米国特許第５，７８５，９８７を参照のこと）および硫酸アンモニウムが挙げられる。塩基性の内部ｐＨを達成し得る内部に充填された緩衝剤がまた、利用され得る。この場合において、この緩衝剤の中性形態が、プロトン化されて、その結果、プロトンが、リポソーム内部から輸送されて、塩基性の内部を達成する。このような緩衝剤の例は、酢酸カルシウムである（米国特許第５，９３９，０９６号を参照のこと）。
【００６０】
電荷誘引法は、治療剤を能動的に充填するために使用され得る。薬物充填のための電荷誘引機構は、１以上の荷電した種について濃度勾配を生成することによって、膜を横切る膜貫通電位を生成することを含む。従って、イオン化したときに負に荷電した薬物について、膜貫通電位が、外側の電位に対して正である内側の電位を有する膜を横切って生じる。正に荷電した薬物について、反対の膜貫通電位が使用される。
【００６１】
１つの実施形態において、調製に続いて、そのリポソームは、０℃より低い温度に供され、その結果、凍結状態で存在する。このリポソームは、以下によって凍結され得る：液体窒素への浸漬、ドライアイス、−２０℃の従来型フリーザーまたは−８０℃もしくは−７０℃の従来型フリーザー。代替的実施例において、そのリポソームは、液体窒素中に凍結され得、その後、フリーザー内に浸漬させる。リポソームは、それらが使用されるまで長期期間におよんで凍結状態で安定に貯蔵され得る。凍結後に、このリポソームは、０℃より高い温度に供することによってさらなる使用のために解凍され得る。
【００６２】
このリポソームは、０℃より低い温度に供される前に、封入された薬剤を含む。これは、上述の能動的充填技術および受動的充填技術を使用して、薬剤を予め形成されたリポソームにロードすることに関連する。このカプセルされた薬剤が治療薬である場合に、この解凍されたリポソームは、リポソーム封入薬剤を投与するための既知の手順に従って、治療において直接的に使用され得る。
【００６３】
このリポソームには、凍結の後に、薬剤が能動的に充填され得る。これにより、凍結リポソームが非封入形態で薬物製造業者に提供されることが、可能になる。その製造業者は、その後、そのリポソームに、薬剤を能動的に充填し得る。好ましい能動的充填方法は、上記のｐＨ勾配充填法である。リポソームは、膜を通るｐＨ勾配を伴って凍結され得るか、またはこの勾配は、凍結後に生成され得る。
【００６４】
この勾配が凍結後に生成される場合、外部緩衝液は、異なるプロトン濃度を有する新しい外部媒体により交換および置換され得る。この外部ｐＨはまた、酸または塩基の添加によって調整され得る。この外部媒体の置換は、種々の技術によって達成され得、例えば、（以下の実施例において示されるように）新しい媒体ゲルで平衡化されたゲル濾過カラム（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム）に脂質小胞調製物を通すことによってか、または遠心分離技術、透析技術、もしくは関連技術によって、達成され得る。内部媒体は、この外部媒体に対して酸性または塩基性のいずれであってもよい。
【００６５】
本発明のリポソームはまた、１回より多くの凍結および解凍のサイクルに供され得る。
【００６６】
凍結後、そのリポソーム調製物は、そのリポソームが中に浸漬されている水性溶媒を除去することによって、脱水され得る。このリポソームは、好ましくは、標準的な凍結乾燥装置または等価な装置を使用して脱水される。すなわち、このリポソームは、好ましくは、減圧下で脱水される。使用前に、この乾燥リポソーム調製物は、そのリポソームが懸濁される適切な溶媒を添加することによって、再構成され得る。好ましくは、このリポソーム調製物は、減圧を導入することによって脱水される。減圧を適用するための手段としては、真空ポンプまたは等価な装置の使用が挙げられる。この脱水プロセスは、好ましくは、室温ではなく、低下した温度にて実行される。一旦このリポソームが脱水されると、このリポソームは、使用されるまで長期間にわたって保存され得る。
【００６７】
本明細書における用語「低温安定な（ｃｒｙｏｓｔａｂｌｅ）」とは、いくつかの望ましくない効果のうちの１つを引き起こすに十分である約０℃未満の温度に本リポソーム組成物を曝露した際に生じるこれらの望ましくない効果のうちのいずれか１つに対して実質的に抵抗性である、リポソームを指す。望ましくない効果としては、そのリポソームの凝集および／または融合に起因する、リポソームサイズの増加、そのリポソーム調製物のサイズ分布もしくは濁度の増加、ならびに封入された薬剤の損失が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、望ましくない副作用は、０℃未満の温度、−５℃未満の温度、なおより代表的には−１０℃未満の温度で生じる。
【００６８】
リポソームが低温安定であるか否かは、例えば、そのリポソームを０℃未満の温度に曝露することに関連する望ましくない効果を測定することによって、評価され得る。０℃未満の温度に供した前と後でのそのリポソームのサイズ変化を測定することは、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して下記のように実行され得る。このリポソームの融合はまた、蛍光共鳴エネルギー転移を含む他の手段によっても、測定され得る。このことは、励起されたプローブと第２のプローブとの近接に起因する、その励起されたプローブから第２のプローブへのエネルギー転移の測定を包含する。凍結後の封入された薬剤の放出の測定は、以下に開示されるように実行され得る。封入された薬剤は、上記の能動的充填法または受動的充填法を使用して、このリポソーム中に組込まれ得る。捕捉された薬剤の漏出は、凍結前および凍結後に捕捉された薬剤の量を測定することによって、測定され得る。その薬剤は、放射性標識剤の場合にはシンチレーション計数によって、または定量のために検出可能な吸光度を含む薬剤の場合には分光法によって、定量され得る。あるいは、その薬剤は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、原子吸光技術および関連技術によって、定量され得る。
【００６９】
リポソーム調製物もまた、凍結損傷の巨視的証拠（例えば、巨視的粒子の存在）について、および非凍結コントロールサンプルと比較した懸濁物の透明度または濁度について、視覚的に検査され得る。濁度は、６５０ｎｍに設定した分光光度計を使用して、測定され得る。このリポソームはまた、大きな粒子、凝集物、またはそのリポソームが低温安定ではないことを示し得る他の変化について、遠心分離によって試験され得る。遠心分離後、その遠心管は、肉眼で観察され得るその管の底にある粒子の存在について、観察される。
【００７０】
このリポソームを０℃未満の温度に曝露することに関係する望ましくない効果は、コレステロールを含む等価なリポソーム処方物と比較され得る。
【００７１】
本発明はまた、本発明のリポソームを哺乳動物に投与する方法、および障害（例えば、癌）に罹患している哺乳動物または障害（例えば、癌）に対して感受性である哺乳動物または障害（例えば、癌）に罹患している疑いがある哺乳動物を処置する方法を包含する。本発明の組成物の医学的使用の例としては、癌の処置、心血管疾患（例えば、高血圧、心律動異常、および再狭窄）の処置、細菌感染の処置、真菌感染の処置、または寄生生物感染の処置、本発明の組成物をワクチンとして使用することを介する疾患の処置および／もしくは予防、炎症の処置、または自己免疫疾患の処置が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明は、被験体にリポソームを投与する方法を包含し、この方法は、本発明のリポソームを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。処置方法または投与方法は、一般的には、その障害またはその症状を改善するに十分である投与量にて本発明の薬学的組成物を投与する工程を包含することが理解される。
【００７２】
ヒトの病気を処置するために、有資格医師は、用量、スケジュール、および投与経路に関して本発明の組成物がどのように利用されるべきかを、確立されたプロトコルを使用して決定することが予期され得る。そのような適用はまた、本発明の送達ビヒクル組成物において封入された活性薬剤が被験体の健常組織に対して減少した毒性を示すのであれば、用量増大を利用し得る。
【００７３】
本発明のリポソームを含む薬学的組成物は、標準的技術に従って調製され、そしてこの薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。一般に、通常の生理食塩水が、この薬学的に受容可能なキャリアとして使用される。他の適切なキャリアとしては、例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロースなどが挙げられ、安定性増加のための糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）が挙げられる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。生じる水溶液は、使用のために包装され得るか、または無菌条件下で濾過され凍結乾燥され得る。その凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水溶液と合わされる。この組成物は、生理的条件に近づけるために必要である薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど））を含み得る。さらに、このリポソーム懸濁物は、保存の際に脂質をフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から保護する、脂質保護剤を含み得る。親油性フリーラジカルクエンチャー（例えば、αトコフェロールおよび水溶性鉄特異的キレーター（例えば、フェリオキサミン）が、適切である。  
【００７４】
この薬学的処方物中のリポソーム濃度は、広範に、すなわち、約０．０５重量％未満から、通常は、少なくとも約２重量％〜５重量％から、１０重量％〜３０重量％程度まで変化し得、選択される特定の投与様式に従って、主に流体容積、粘度などによって選択される。例えば、その濃度は、処置に関連する流体負荷を低下させるために増加され得る。あるいは、刺激性脂質から構成されたリポソームは、投与部位の炎症を弱めるために、低濃度に希釈され得る。診断のために、投与されるリポソームの量は、使用される特定の標識、診断される疾患状態、および臨床家の判断に依存する。
【００７５】
好ましくは、その薬学的組成物は、非経口投与、すなわち、動脈内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与されるか、あるいはエアロゾルを介して投与される。エアロゾル投与法は、鼻内投与および肺投与を包含する。より好ましくは、この薬学的組成物は、ボーラス注入によって、静脈内投与または腹腔内投与される。例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；およびＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号を参照のこと。この使用に適する特定の処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）に見出される。
【００７６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明を限定するために提供されない。
【実施例】
【００７７】
（調製物Ａ）
（大きな単膜リポソームの調製方法）
脂質を、クロロホルム溶液中に溶解し、その後、窒素ガス流下で乾燥し、真空ポンプ中に配置して溶媒除去した。微量レベルの放射性脂質３Ｈ−ＣＨＥまたは１４Ｃ−ＣＨＥを添加して、処方プロセスの間および静脈内投与後の脂質を定量した。生じた脂質フィルムを、高真空下に最低限２時間は配置した。この脂質フィルムを示した溶液中で脱水して、単膜リポソーム（ＭＬＶ）を形成した。生じた調製物を、押出し装置（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いて、積み重ねたポリカーボネートフィルターに１０回通して押出して、８０ｎｍと１５０ｎｍとの間の平均リポソームサイズを達成した。全リポソーム構成脂質を、モル％で報告する。
【００７８】
（調製物Ｂ）
（薬物充填の定量方法）
薬物充填開始後の種々の時点で、アリコートを取り出し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを通して、遊離薬物を封入された薬物から分離した。脂質レベルを、液体シンチレーション計数によって測定した。使用する場合、溶出物中に存在する放射標識ダウノルビシン（３Ｈ−ダウノルビシン）レベルおよびＦＵＤＲ（３Ｈ−ＦＵＤＲ）レベルを、液体シンチレーション計数によって測定した。イリノテカンレベルを、遊離薬物の標準曲線に対して、３７０ｎｍでの吸光度によって測定した。特定の容積の溶出物に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して、イリノテカン含有リポソームを可溶化した。界面活性剤を添加した後、その混合物を１００℃まで加熱し、そして吸光度測定前に室温まで冷却させた。
【００７９】
（実施例１）
（ＤＳＰＣリポソームの血中安定性は、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）含量の増加にともなって増加する）
種々のレベルのホスファチジルグリセロール（ＰＧ）がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を多量脂質成分として含むリポソームの血中残留時間を延長しそしてそのリポソームの薬物保持特性を増加する能力を、調査した。ＤＳＰＣリポソームを、種々のレベルのジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）を用いて調製し、封入ＣｕＳＯ４に応じたダウノルビシンを充填した。その血漿中脂質レベルおよび薬物濃度を、マウスに投与した後に測定した。
【００８０】
１０モル％、２０モル％および３０モル％のＤＳＰＧを含むＤＳＰＣリポソームを、上記方法に記載されたようにして、クロロホルム中にＤＳＰＣを溶解し、クロロホルム／メタノール／水（１６：８：１  ｖ／ｖ）中にＤＳＰＧ脂質を溶解し、そしてこれらの調製物を、放射性マーカー１４Ｃ−ＣＨＥと、モル比９０：１０、８０：２０および７０：３０で合わせることによって、調製した。脂質フィルムを真空下に一晩置いて、すべての残留溶媒を除去し、その後、１５０ｍＭ  ＣｕＳＯ４、２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７．４）中で再水和した。その後、手持ち型のタンジェンシャルフロー透析カラムを使用して、これらのリポソームの緩衝液を生理食塩水に交換して、外部の銅を除去し、さらに３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＳＨＥ緩衝液）（ｐＨ７．４）に交換した。
【００８１】
これらのＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソーム中へのダウノルビシン（微量レベルの３Ｈ−ダウノルビシンを含む）の取り込みを、これらのリポソームを薬物とともに、薬物対脂質重量比０．１にてインキュベートすることによって、確立した。上記の方法において記載されたようにスピンカラム分析によって測定した完全な薬物充填を、６０℃にてこの溶液をインキュベートした後に達成した。手持ち型タンジェンシャルフローカラムを使用して、その外部緩衝液を生理食塩水に交換した。得られたダウノルビシン充填ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソームを、脂質用量１００ｍｇ／ｋｇおよび薬物用量１０ｍｇ／ｋｇにて、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１時点あたり３匹のマウス）に注射した。望ましい時点にて、心臓穿刺によって血液を収集し、ＥＤＴＡコートした微小容器中に配置した。それらのサンプルを遠心分離し、血漿を注意深く別のチューブに移した。脂質および薬物の回収を、二重標識シンチレーション計数によってモニターした。データの点は、平均結果±標準偏差（ＳＤ）を示す。
【００８２】
これらの結果は、リポソームの最適な血液耐性が、２０モル％のＤＳＰＧの取り込みによって達成されたことを実証する（図１Ａ）。対照的に、Ｍｅｈｔａらは、ＷＯ９９／５９５４７において、１５モル％未満のＤＭＰＧで調製したＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームが、２０モル％のＤＭＰＧで調製したリポソームと比較して、延長された血中半減期を示したことを報告した。これらの以前の研究におけるリポソームは、本発明において使用される相転移温度よりも低い相転移温度を有するバルク脂質（ＤＰＰＣ）および安定化脂質としてのコレステロール（Ｃｈｏｌ）を利用した。従って、これらの結果は、ホスファチジルグリセロール含有リポソームを形成する脂質成分の性質が、キャリアの血漿安定性特性に影響を与え得ることを実証する。
【００８３】
以前に、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）および脂質（例えば、ＧＭ１）で調製したリポソームが、リポソームの循環寿命を延長させる能力を有することが実証されている。これらの結果は、ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が、血漿安定性のためには必要とされず、そして非双性イオン部分（例えば、頭部（ｈｅａｄ）基に結合したグリセロール）が、リポソームに長い循環特性を生じさせ得ることを示している。理論により束縛されることを望まないが、ＰＧ頭部基上のヒドロキシル基の存在は、リポソームを取り囲む水和シェルを作製する、外部媒体中の水分子との水素結合を促進し得る。
【００８４】
図１Ｂに示される結果は、ダウノルビシンの血漿血中レベルがまた、ＤＳＰＧのレベルの増加と共に増加することを示す。従って、このデータは、血液区画からのリポソームの排除を減少させることに加えて、ＤＳＰＧ含有リポソームが、インビボでの優れた薬物保持特性を示すことを実証する。
【００８５】
（実施例２）
（５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ）の保持は、コレステロールを含まないＰＧ含有リポソーム中に封入される場合に最適である）
受動的に内包された５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦＵＤＲ）のインビボでの保持に対する、リポソーム処方物中のコレステロール（Ｃｈｏｌ）の取り込みの影響を試験し、そしてホスファチジルグリセロールを含むリポソーム中に封入されたＦＵＤＲの保持特性と比較した。これを、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５モル比）およびＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０モル比）からなるリポソーム中にＦＵＤＲを受動的に内包し、そしてマウスへの処方物の投与後に薬物対脂質の比率を比較して実施した。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームを、これらの研究についてのコントロールとして選択した。なぜなら、この処方物は、コレステロールの安定化効果に一部起因して、薬物を最適に保持するその能力に起因して当該分野で歴史的に利用されているからである。ＤＳＰＧを、２０モル％にてＤＳＰＣリポソーム中に取り込んだ。なぜなら、このレベルのＰＧは、実施例１において実証されるように、リポソームに最適な循環寿命を付与することが見出されているからである。
【００８６】
１４Ｃ−ＣＨＥで標識したＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ脂質薄層およびＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ脂質薄層を、実施例１に記載されるように調製し、そして微量レベルの３Ｈ−ＦＵＤＲを含むＨＢＳ（ｐＨ７．４）中のＦＵＤＲからなる溶液中で水和した。押出し後、リポソームを、接線流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）透析の使用によって通常の生理食塩水へと緩衝液交換した。ＦＵＤＲ充填したリポソームを、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１時点当たり３匹のマウス）に、２０μｍｏｌｅ／ｋｇのＦＵＤＲ用量で投与し、得られた脂質用量は２００μｍｏｌｅ／ｋｇであった。示された時点において、血液を、心臓穿刺によって収集し、ＥＤＴＡコーティングした微量容器（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）中に配置した。サンプルを遠心分離し、そして血漿を別のチューブへ注意深く移した。脂質回収および血漿薬物濃度を、液体シンチレーション計数によって決定した。データ点は、３点からの平均＋／−ＳＤである。
【００８７】
図２の結果は、ＦＵＤＲが、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５モル比）処方物と比較して、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０モル比）処方物において最適に保持されたことを実証する。これらの結果は、コレステロールの代わりに安定化脂質としてＰＧが使用される場合に、増強されたＦＵＤＲ保持が実現されることを示唆する。
【００８８】
（実施例３）
（コレステロール含量の減少は、イリノテカンを含むＰＧ含有リポソーム中のＦＵＤＲの増大した保持を生じる）
ＰＧ含有リポソーム中に受動的に内包され、その後イリノテカンを充填されたＦＵＤＲの保持に対するコレステロールの影響を、２種の封入薬物を含む処方物中のＦＵＤＲの保持に対するコレステロールの影響を試験するために、調査した。本発明者らは、インビボでの２種の薬物の相乗的相互作用が、これら２種の薬物の放出速度が匹敵する場合に、最適に生じることを以前に実証している。薬物の保持は、パラメータ（例えば、構成要素の脂質のアシル鎖長、コレステロール含量およびリポソームの内部区画の浸透圧）を制御することによって、調節され得る。これらの研究を、両方の薬物の協調した放出を達成する最終目的で、コレステロールが二重充填されたリポソーム中の１種の薬物の放出速度を調節する能力を調査するために実施した。受動的に内包されたＦＵＤＲの保持に対する漸増レベルのコレステロールの影響を決定するために、ＤＳＰＧ含有リポソームを、５モル％、１０モル％、１５モル％および２０モル％のコレステロールで調製し、そして血漿の薬物対脂質比率を、マウスへの静脈内投与後に測定した。上記の実施例のように、ＰＧを、２０モル％にてリポソーム中に取り込んだ。なぜなら、このレベルのＰＧは、ＤＳＰＣリポソームに対して長期循環特性を最適に付与することが見出されているからである。
【００８９】
５モル％、１０モル％、１５モル％および２０モル％で取り込まれたコレステロール、ならびに２０モル％で一定に維持されたＰＧと共に、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＧからなる脂質薄層を、ＤＳＰＣおよびコレステロールをクロロホルム中に溶解させ、そしてＤＳＰＧをクロロホルム／メタノール／水中に溶解させ、そしてこれらの調製物を適切なモル比で合わせることによって、実施例１に記載されるように調製した。溶媒の除去後、脂質薄層を、クロロホルム中に再溶解させ、そして再び乾燥し、その後、２５ｍｇ／ｍＬのＦＵＤＲを微量レベルの３Ｈ−ＦＵＤＲと共に含む、２５０ｍＭのＣｕＳＯ４からなる溶液中に水和した。押出し後、リポソームを、３００ｍＭスクロース、２０  ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中に、手持ち式接線流透析カラムを使用して、緩衝液交換した。緩衝液交換後、これらのサンプルを、０．１：１の薬物対脂質モル比にて５０℃でイリノテカンと共に充填し、そして手持ち式接線流透析カラムを使用して、ＨＢＳ（ｐＨ７．４）へと交換した。得られた二重充填リポソームを、脂質３４０μｍｏｌｅ／ｋｇ、ＦＵＤＲ３４μｍｏｌｅ／ｋｇおよびイリノテカン３４μｍｏｌｅ／ｋｇにて、Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与した。血液を、示された時点にて心臓穿刺によって回収し、そしてＥＤＴＡコーティングした微量容器中に配置した；３匹のマウスを各時点について使用した（上記実施例のように、データ点は、平均＋／−ＳＤである）。これらのサンプルを遠心分離し、そして血漿を、別のチューブに注意深く移した。脂質濃度およびＦＵＤＲ濃度を、液体シンチレーション計数によって決定し、イリノテカン濃度を、ＨＰＬＣ分析によって決定した。
【００９０】
図３の結果は、２０モル％のＤＳＰＧを含むＤＳＰＣリポソーム中のコレステロール含量が増加するにつれて、最初のＦＵＤＲ対脂質比％に付随する減少が存在することを実証する。従って、これらの結果は、コレステロールが、第二の薬物を充填されたＰＧ含有リポソームからの薬物放出反応速度論を制御するために使用され得ることを実証する。
【００９１】
（実施例４）
（リポソームの血中安定性は、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の取り込みによって増強され得る）
これらの脂質がまた、ＤＳＰＧについて観察された特性と同様の長期循環特性をこれらのリポソームに付与するか否かを決定するために、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含むＤＳＰＣリポソームの血漿残留時間を試験した。ＤＳＰＧおよびＤＰＰＧは共に、グリセロール頭部基を含むが、ＤＳＰＧのアシル鎖が、１８個の飽和炭素原子を有し、一方でＤＰＰＧのアシル鎖が、１６個の飽和炭素原子のみを含む点で異なる。ＰＧおよびＰＩは、これらが共に親水性中性部分によって遮蔽された、負に荷電したリン酸基を含む点で、共通の化学的特徴を共有する。
【００９２】
１０モル％、２０モル％および３０モル％のＤＰＰＧを含むＤＰＰＧリポソームを、実施例１に示されるように調製した（但し、ＤＰＰＧ脂質を、クロロホルム／メタノール（９４：６  ｖ／ｖ）に溶解させ、そして３Ｈ−ＣＨＥを脂質標識として使用した）。得られた脂質薄層を、ＨＢＳ（ｐＨ７．４）で水和し、そして押出し後、これらのリポソームを、１００ｍｇ／ｋｇの脂質用量でＢａｌｂ／ｃマウス（１つの時点当たり３匹のマウス）に注射した。示された時点において、血液を心臓穿刺によって収集し、そしてＥＤＴＡコーティングした微量容器中に配置した。これらのサンプルを遠心分離し、そして血漿を別のチューブに注意深く移した。脂質の回収を、液体シンチレーション計数によってモニタリングし、そしてこれらのデータ点は、平均結果＋／−ＳＤを示す。
【００９３】
ＤＳＰＣ／ＰＩリポソームを、クロロホルム中にＤＳＰＣ脂質を溶解させ、そして水素化植物ＰＩをクロロホルム／メタノール／水（８：４：１  ｖ／ｖ）中に溶解させることによって調製した。次いで、これらの脂質を、９０：１０、８０：２０および７０：３０のＤＳＰＣ対ＰＩモル比で、適切な量の３Ｈ−ＣＨＥと一緒に合わせた。温度を、溶媒がほとんどなくなるまで７０℃で維持しながら、Ｎ２ガス流の下で、クロロホルムを除去した。得られた脂質薄層を、減圧下におき、大部分の溶媒を除去した。これらの薄層を、メタノールを含むクロロホルムの溶液中に再溶解し、その後、上記のように溶媒を除去した。これらの脂質薄層を減圧ポンプ下に一晩おいて、残りの溶媒を除去し、その後、ＨＢＳ（ｐＨ７．４）中で再水和した。押出し後、得られたＬＵＶを、１００ｍｇ／ｋｇの脂質用量でＢａｌｂ／ｃマウス（１つの時点当たり３匹のマウス）に注射した。示された時点において、血液を心臓穿刺によって収集し、そしてＥＤＴＡコーティングした微量容器中に配置した。これらのサンプルを遠心分離し、そして血漿を別のチューブに注意深く移した。脂質の回収を、液体シンチレーション計数によってモニタリングし、そしてこれらのデータ点は、平均結果＋／−標準偏差を示す。
【００９４】
図４に要約される結果は、ＤＰＰＧ脂質が、ＤＳＰＣリポソームに長期循環特性を付与することを示す。このように、２つのメチレン基の除去によってＰＧ脂質のアシル鎖成分の長さを減少させることは、これらの脂質がリポソームに長期循環特性を付与する能力に実質的に影響を与えないようである。
【００９５】
図５に示される結果は、ＰＧ含有リポソームと同様に、ＰＩで調製した処方物が、延長した循環寿命を示すことを実証する。従って、ＰＩのイノシトール頭部基は、ＰＧのグリセロール頭部基と同じ様式で、リポソームの血漿安定性を増強するように作用するようである。
【００９６】
（実施例５）
（低レベルのコレステロールを含むホスファチジルグリセロールリポソームは、凍結の有害な影響に対向する）
リポソーム調製物は、これらの組成物が特定の使用のためのものであるように、延長した化学的安定性特性および物理的安定性特性を示すことが好ましい。これは、しばしば、不安定な薬物および／または脂質成分の分解を回避するために、凍結または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））生成物形式の使用を必要とする。凍結防止剤を使用しない場合、リポソームは、一般に、解凍／再水和プロセスの間に、機械的破断、凝集および融合しやすい。ＦＵＤＲおよびイリノテカンで同時充填され、そして２０モル％未満のコレステロールで調製されたホスファチジルグリセロール含有リポソームが、凍結の有害な影響に対して耐性であるか否かを試験するために、ＤＳＰＣリポソームを、０モル％、５モル％、１０モル％、１５モル％および２０モル％のコレステロールで調製し、そして−２０℃および−７０℃の温度に供した。リポソームサイズを、薬物の充填および凍結後の解凍によって誘導されるリポソーム凝集の程度を測定するために、凍結の前後および薬物充填の前後に測定した。
【００９７】
０〜２０モル％のコレステロール、ＤＳＰＧおよびＤＳＰＣ、ならびに微量レベルの１４Ｃ−ＣＨＥを有する脂質薄層を、これらの方法に記載されるように調製した。これらの脂質薄層を、１００ｍＭのＦＵＤＲを微量レベルの３Ｈ−ＦＵＤＲと共に含む２５０ｍＭのＣｕＳＯ４で再水和した。押出し後、これらのリポソームを、生理食塩水で緩衝液交換し、次いで、手持ち型接線流カラムを使用して、３００ｍＭのスクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＳＨＥ緩衝液）（ｐＨ７．４）へと緩衝液交換した。次いで、このサンプルを、３００ｍＭのスクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）へと交換して、外部緩衝液中のいずれのＥＤＴＡをも除去した。０．１：１の薬物対脂質モル比で、５分間にわたって５０℃で薬物と共にリポソームをインキュベートすることによって、これらのリポソームにイリノテカンを充填した。遊離の薬物を接線流を使用するＨＳＢへの緩衝液交換によってサンプルから除去した。ＮＩＣＯＭＰ粒子寸法測定器を使用して、薬物充填の前後に、サンプルの寸法を測定した。凍結研究について、これらのサンプルを、２４時間にわたって−２０℃および−７０℃で凍結した。凍結後、これらのサンプルを室温まで解凍し、次いでサンプルのアリコートを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムに流し込み、次いで遠心分離した。スピンカラム溶出液についての薬物対脂質のモル比を、液体シンチレーション計数を使用して生成して、脂質および５−ＦＵＤＲの濃度を決定し、そして標準曲線に対する３７０ｎｍでの吸収を決定して、イリノテカン濃度を決定した。溶出したリポソームの粒子寸法決定もまた、準弾性光散乱を使用して決定した。リポソームサイズ測定値についての標準偏差値は、凍結前のリポソームについて２４％〜３４％の範囲であり、−２０℃での凍結後では３１％〜６１％の範囲であり、そして−７０℃での凍結後では３２％〜４７％の範囲であった。全てのχ二乗値は、１未満であった。
【００９８】
図６Ａに要約される結果は、ＦＵＤＲおよびイリノテカンを同時封入されたリポソームが、リポソームサイズが、凍結前後に実質的に変化しなかったという観察によって証明されるように、−７０℃での凍結の後に最適な安定性を示すことを示す。−２０℃および−７０℃での凍結の前後の、二重充填リポソームにおけるＦＵＤＲおよびイリノテカンの保持の試験により、ＦＵＤＲが、凍結／解凍プロセスを通じて十分保持されることが明らかとなった（図６Ｂ）。同様の知見が、−２０℃および−７０℃での凍結の前後に、イリノテカンの保持について観察された（図６Ｃ）。累積的に、これらの結果は、安定化脂質（例えば、ホスファチジルグリセロール）が、凍結防止剤の存在を必要とせずに、凍結の有害な影響に対してリポソームを保護するために使用され得ることを実証する。
【００９９】
（実施例６  ｐＨ勾配の非存在下で調製された、コレステロールを含まないリポソームは凍結後の凝集に耐える）
脂質をクロロホルム中で調製し、その後窒素ガスの流れにおいて乾燥させ、減圧ポンプ内に一晩置いた。次いで、これらのサンプルを、３００ｍＭシトレート緩衝液（ｐＨ４．０）またはＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）（ｐＨ７．４）で水和し、そして押出装置（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）（８０ｎｍポリカーボネートフィルタおよび１００ｎｍポリカーボネートフィルタを有する）に、１０回通した。平均リポソームサイズを、ＮＩＣＯＭＰ  ３７０サブミクロン粒子寸法測定器を６３２．８ｎｍの波長で用いて、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定した。リポソームを、２４時間、液体窒素（−１９６℃）中で凍結させ、室温で解凍してＮＩＣＯＭＰ粒子寸法測定器を用いる平均リポソームサイズの決定に供した。
【０１００】
図７は、３００ｍＭシトレート中で水和したＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソーム（コレステロールを含まないリポソーム）のサイズが、凍結の前後でサイズの実質的な変化を示さなかったことを示す。対照的に、ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ（５５：４５モル％）リポソームおよびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）リポソームはまた、３００ｍＭシトレート中で水和され、凍結後に約１０倍、サイズが増加した。同じ傾向が、図８に例示されるように、シトレート中で水和されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソーム、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ（５５：４５モル％）リポソームおよびＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）リポソームによって示された。
【０１０１】
ＨＢＳ中で水和したＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソームのサイズはまた、図９において示されるように、凍結後に実質的なサイズ変化を示さなかった。対照的に、ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ（５５：４５モル％）リポソームおよびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）リポソームはまた、ＨＢＳ中で水和され、凍結後に実質的なサイズ変化を示した（また図９）。
【０１０２】
図１０は、ＨＢＳ中で水和したＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソームのサイズは凍結後に変化しなかったが、一方、ＨＢＳで水和し、かつＤＳＰＣ／コレステロール（５５：４５モル％）およびＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームはまた、図９と同じ傾向であったことを示す。
【０１０３】
図１１は、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ７５０（９５：５モル％）およびＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ７５０（９５：５モル％）からなり、かつＨＢＳ中で水和されたリポソームもまた、凍結後にサイズ変化しないことを示し、従って、低分子量の親水性ポリマーもまた、コレステロールを含まない系における、凍結に起因するリポソームの凝集に対して保護することを実証する。
【０１０４】
図１２は、ＤＡＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなり、かつＨＢＳ中で水和されたリポソームもまた、凍結後に実質的なサイズ変化をしなかったことを示し、従って、アシル鎖長の増加は、凍結安定特性に影響しないことを実証する。
【０１０５】
（実施例７  コレステロールを含まない、ｐＨ勾配ＰＥＧ化リポソームは凍結後の凝集を防ぐ）
ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）およびＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームを、押出およびサイズ決定の後にＨＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムを通してｐＨ勾配を生じさせたことを除いて、実施例７の方法（水和緩衝液としてシトレートを使用する）に従って調製した。得られたリポソームを、２４時間、液体窒素（−１９６℃）中で凍結させ、室温で解凍し、その後、平均リポソームサイズの第２の決定に供した。
【０１０６】
図１３は、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）ｐＨ勾配リポソームのサイズが、凍結後に実質的なサイズ変化を示さなかったことを示す。対照的に、ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）ｐＨ勾配リポソームはまた、３００ｍＭシトレート中で水和され、凍結後に約３倍、サイズが大きくなった。同様に、図１４に例示されるように、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるｐＨ勾配リポソームは、凍結後のサイズ変化を実証しなかったが、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームは実証した。
【０１０７】
（実施例８  封入されたグルコースを含む、コレステロールを含まないリポソームおよびコレステロール含有リポソームの凍結安定性）
リポソームを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭグルコース（ｐＨ７．４）の溶液中で水和を実施したこと（１４Ｃ−グルコースの追跡を伴う）を除いて、実施例７に従って調製した。得られた（受動的に封入されたグルコースを含む）リポソームのサイズをはかり、次いでＨＢＳ中、１０ｍＬ  Ｇ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムに通して外部の媒体からグルコールを除去した。グルコース内包の割合を、液体シンチレーション計数によって測定した。リポソームを、−１９６℃で凍結させ、室温で解凍して、その後ＱＥＬＳ分析を使用するサイズの決定に供した。封入したグルコースの割合を、凍結後に、ＨＢＳで平衡化した１ｍＬ  Ｇ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘスピンカラムにリポソームを通し、その後の溶離液のシンチレーション計数によって測定した。
【０１０８】
図１５は、内包されたグルコースを含むＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソームが、凍結によって誘導される凝集に対して耐性であることを示す。他方、ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）は、凍結工程後にサイズが増加する。慣用的な方法は、リポソームの内表面および外表面の両方において凍結保護剤の存在を必要とする。これらの結果は、リポソームの内側における凍結保護剤の存在が、凍結／解凍の保護にとって十分であることを示す。
【０１０９】
凍結前後のグルコース封入の割合を、図１６に示す。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームは、凍結後にグルコースの損失を示さなかった。対照的に、凍結後のグルコースの漏出は、ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（５０：４５：５モル％）からなるリポソームで生じた。
【０１１０】
（実施例９  封入ドキソルビシンを含む、コレステロールを含まないリポソームの凍結安定性）
膜貫通型のｐＨ勾配を有するリポソームを、実施例８のように調製した。ドキソルビシンを、０．２：１のドキソルビシン：脂質の比率でリポソーム混合物に添加し、そしてＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームのために３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、この混合物を、ＨＢＳで平衡化した１ｍＬ  Ｇ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘスピンカラムに通した。溶離液の脂質濃度を、液体シンチレーション計数によって測定した。ドキソルビシンレベルの測定のために、この溶離液の規定容積を、１００μＬに調整し、その後、９００μＬの１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、リポソーム膜を溶解した。このサンプルを、外観上濁るまで加熱し、そしてＡｂｓ４８０を室温で平衡化後に測定した。ドキソルビシンの濃度を、検量線を調製することによって計算した。
【０１１１】
ドキソルビシン封入リポソームを、ＨＢＳ（ｐＨ７．４）中で１０  ｍＬ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムに通し、外部緩衝液をＨＢＳで交換した。脂質およびドキソルビシンのレベルを、上記の通り決定した。リポソームを、−１９６℃で２４時間凍結させ、室温で解凍し、その後ＱＥＬＳ分析を行って、リポソームの新たなサイズを決定した。次にリポソームを、ＨＢＳで平衡化したＧ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘスピンカラムに通し、脂質およびドキソルビシンの濃度を、上記の通り決定した。
【０１１２】
図１７に示されるように、ドキソルビシンを封入したＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソームは、凍結後にサイズを増加しなかった。ドキソルビシンはまた、凍結後にこの処方物中に維持された。
【０１１３】
（実施例１０  凍結後に薬物を充填した、凍結安定性の、コレステロールを含まないリポソーム）
リポソームを実施例６のとおり調製し、−１９６℃で２４時間凍結した。サンプルのサブセットに、凍結前にドキソルビシンを充填（「新たな充填（ｌｏａｄｅｄ  ｆｒｅｓｈ））し、別のサブセットは凍結後に充填した。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）の充填を、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームに対して３７℃で２時間および６０℃で１５分間、実施した。ドキソルビシン封入の割合の決定を、実施例１０のように実施した。コレステロール含有リポソームは、凝集が原因で充填できなかった。ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームには、３７℃でのインキュベーションによって充填したが、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）からなるリポソームには、６０℃でのインキュベーションによって充填した。
【０１１４】
図１８および１９は、凍結の前後に充填されたＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）リポソームおよびＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームが、同様の充填プロフィールを提示することを示す。
【０１１５】
これらの結果は、コレステロールを含まないリポソームが、凍結後に薬剤を能動的に充填され得ることを実証する。これは、凍結されたリポソームが、薬剤を充填した後に、封入されていない形状で提供されることを可能にする。
【０１１６】
多くの改変が、前述の系に対して、それらの基本的教示から逸脱することなくなされ得る。本発明は、１つ以上の特定の実施形態を参照することによってかなり詳細に記載されているものの、当業者は、変更が本明細書中に詳細に開示される実施形態に対してなされ得、これらの実施形態および改良がなお、添付の特許請求の範囲に記載されるような、本発明の範囲および精神の範囲内であることを認識する。本明細書中に引用される、全ての特許出願または特許書類は、このような特許出願または書類の各々が参考として本明細書中に、特定にかつ個々に援用されるかのように、本明細書中に参考として援用される。
【０１１７】
上記の刊行物または書類の引用は、前述の全てが関連する従来技術であるという承認として意図されも、これらの刊行物または書類の内容またはその日時に関していかなる承認も構成しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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