(57)【要約】【課題】簡便に、比較的短い分析時間で、しかもバックグラウンドノイズを小さくして高い感度で生化学物質等の分析を可能とする定量分析方法を得る。【解決手段】被検出物質を含む被検液が供給される流路８と、該流路８の途中に設けられた貯留部１６と、前記主流路８において前記貯留部１６よりも下流側に設けられた検出部１８とを備える検出用カートリッジ１を用いた定量分析方法であって、前記貯留部１６において、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と前記被検出物質の会合体を濃縮する工程と、前記会合体に結合されている前記金属ナノ粒子を溶解し、金属イオン溶液を得る工程と、前記金属イオン溶液を前記検出部１８に搬送する工程と、前記検出部１８において、前記金属イオン濃度を測定し、金属イオン濃度に応じた前記被検出物質濃度を定量する工程とを備える、定量分析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質を含む被検液が供給される主流路と、該主流路の途中に設けられた貯留部と、
前記主流路において前記貯留部よりも下流側に設けられた検出部とを備える検出用カート
リッジを用いた定量分析方法であって、
前記貯留部において、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅまたはＡｇを主成分とする金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と前記被検出物質の会合体を濃縮する工程と、
前記会合体に結合されている前記金属ナノ粒子を溶解し、金属イオン溶液を得る工程と、
前記金属イオン溶液を前記検出部に搬送する工程と、
前記検出部において、前記金属イオン濃度を測定し、金属イオン濃度に応じた前記被検出物質濃度を定量する工程とを備える、定量分析方法。
【請求項２】
前記貯留部に、前記被検出物質に対して特異的に結合する特異的結合分子が予め固定されており、
前記被検出物質を含む被検液を貯留部に導入することにより、前記被検出物質と前記特異的結合分子とが会合し、前記貯留部において、前記被検出物質が濃縮され、
前記金属ナノ粒子で標識された前記分子認識試薬が前記貯留部に導入されることにより、金属ナノ粒子で標識された前記分子認識試薬と前記被検出物質との会合体が、前記貯留部に濃縮貯留される、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項３】
前記貯留部に多孔体が予め配置されており、
前記濃縮貯留に際し、前記被検出物質を含む被検液と、前記金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と、前記被検出物質に対して特異的に結合する特異的結合分子が固定されたビーズとを混合することにより得られた凝集物を含む懸濁液を前記主流路を通じて前記貯留部に導入し、金属ナノ粒子で標識された前記分子認識試薬と前記被検出物質の会合体を含む凝集物を前記貯留部において濃縮貯留する、請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項４】
前記金属ナノ粒子を溶解し、金属イオン溶液を得る工程が、溶離液として酸を加える工程を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の定量分析方法。
【請求項５】
前記ビーズとして、ポリマー粒子を用いる、請求項３に記載の定量分析方法。
【請求項６】
前記ビーズとして、少なくとも最表面の一部が、金属からなる粒子を用いる、請求項３または５に記載の定量分析方法。
【請求項７】
前記検出部に、前記金属イオンを検出するための電気化学的電極が配置されており、金属イオン濃度の定量に際し、前記電気化学的電極上へ電気化学的に金属を析出させた後、電位を掃引しつつ電流を測定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の定量分析方法。
【請求項８】
前記金属ナノ粒子が溶解された金属イオン溶液に硫化物イオンを加えることにより生じる非水溶性の硫化物塩が分散した懸濁液を前記検出部において光学的に検出することにより、前記金属イオン濃度を定量する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイを利用し、抗原、抗体、アレルゲン、菌体、ウイルス、薬物、ＤＮＡ付加体など様々な生化学的物質等を定量するのに用いられる定量分析方法に関し、より詳細には、微量の被検液が流される流路を有する検出用カートリッジを用いた定量分析方法、試薬及び検出用カートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、様々なアレルゲンや生化学的物質を定量するに際し、これらの生化学的物質をより高い感度で定量することが強く求められている。例えば、数十ｆｇ／ｍＬ〜数百ｐｇ／ｍＬのような非常に低濃度の被検液から被検出物質を測定する場合、次のようにするのが常套手段である。すなわち、先ず、被検液から被検出物質を固相抽出処理し、濃縮物を得る。次にこの濃縮物を、液体クロマトグラフィー装置または電気泳動装置に供給し定量する方法、あるいはこの濃縮物を用いてＥＬＩＳＡ法で定量する方法などが用いられている。しかしながら、これらの方法では固相抽出処理等の濃縮するための前処理に時間がかかり、全分析時間として数時間から数日と非常に長い時間を要した。
【０００３】
他方、次々と発見されるバイオマーカーの展開医療における実用化のためには、被検出物質を高感度かつ迅速にその場で定量分析することが求められてきている。このようなニーズに応えるために、イムノクロマト法や比色法を利用した簡易定量検査チップが開発されている。しかしながら、この種の簡易定量検査チップの感度は、０．１ｎｇ／ｍＬ程度が限界であった。すなわち、より微量の被検出物質を高精度に測定することはできなかった。
【０００４】
下記の特許文献１には、土壌からの水溶出液中の重金属のような微量成分を携帯可能なカートリッジ式検出装置を用いて高感度に検出する装置及び方法が開示されている。特許文献１に記載のカートリッジ式検出装置では、内部に流路が形成されている検出用カートリッジが用いられる。この検出用カートリッジ内において、流路の途中に貯留部が設けられており、貯留部より下流側に検出部が設けられている。被検液中の被検出物質を貯留部において貯留し、貯留部で一旦濃縮する。しかる後、濃縮された被検出物質を再度溶離液を用いて溶出させ、検出部に供給する。検出部において、改めて溶出された被検出物質の濃縮液に含まれる金属イオン濃度を測定することにより、土壌からの水溶出液中の重金属などの微量成分を１ｐｐｂ程度の高感度で検出することが可能とされている。
【０００５】
なお、特許文献１では、貯留部において、抗原または抗体が固定された構成についても言及されており、標識酵素による還元物質を検出部で測定してもよい旨が記載されている。これは、従来のＥＬＩＳＡ法と同様の方法を実現するための構成である。
【０００６】
他方、下記の特許文献２には、例えば生物試料などの試料中の金属でラベルされた化学種の金属を可溶性の電気化学的に活性な錯体とし、該錯体を溶解し、錯イオンを電気化学的に測定し、金属ラベルされた化学種の存在または量を測定する方法が開示されている。特許文献２の実施例４では、ポリスチレン基板上に流路及び電極を有する検出部等が構成された装置が用いられている。ラテックスラベルされた抗体と銀ラベルされた抗体と抗原とを混合し、得られた混合物溶液を流路に供給し、流路の途中に設けたフィルタ領域に設けられたフィルタに導いている。このフィルタにおいて、ラテックスラベルされた抗体−分析物−銀ラベルされた抗体錯体が捕捉される。また、未結合の銀ラベルされた抗体がフィルタを通過する。次に、捕捉された化学種を洗浄し、残存する未結合の銀ラベルされた抗体を除き、捕捉された化学種を錯化剤を添加して錯イオン化する。このようにして得られた錯イオンの濃度が検出部により検出されている。ここでは、上記フィルタに化学種を捕捉させるに際し、上記混合物溶液をフィルタの面方向に供給している。
【０００７】
他方、下記の特許文献３には、Ａｕナノ粒子に結合した生物学的物質をイムノアッセイにより定量する方法が開示されている。競合法を用い、Ａｕナノ粒子で標識された未反応の生物学的物質におけるＡｕナノ粒子をＡｕイオンとし、該Ａｕイオン濃度を電気化学的に測定することにより、定量が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４０５３０８１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／１２１７９２号公報
【特許文献３】ＷＯ２００２／００１１７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に開示されているカートリッジ式検出装置では、上記のように、被検出物質を酵素で標識し、標識酵素による還元物質を測定することにより、被検出物質が定量され得ると述べられている。しかしながら、酵素を利用したこのような増幅方法を用いた場合、酵素による反応が温度により影響を受けやすくまた、保管履歴により酵素の活性が変化しやすい。従って、測定温度のばらつきや保管履歴のばらつき等により、被検出物質を高精度に測定することはできなかった。
【００１０】
特許文献２に記載の分析方法では、Ａｇに錯化剤を添加し、Ａｇ錯体を形成し、最終的にＡｇ錯イオン濃度を計測している。Ａｇ錯イオンは、Ａｇイオンに比べて電気活性が高いため、バックグラウンドノイズが高くなるという問題がある。すなわち、ＳＮ比が低下し、感度を高めることができない。加えて、上記フィルタ領域においては、ストリップ状のフィルタの上面に該上面の面方向に混合物溶液が供給されるため、未反応成分や夾雑物が電極に付着し、それによってもＳＮ比が低下するという問題がある。
【００１１】
また、特許文献３に記載のイムノアッセイでは、コロイド金属粒子として、Ａｕを用い、酸によりＡｕナノ粒子を溶解し、Ａｕイオンを計測しているが、Ａｕイオン濃度の計測では、高感度に定量を行うことができない。
【００１２】
本発明の目的は、上述した従来技術の現状に鑑み、微量な被検出物質をより一層高い感度で、かつ比較的短い時間で定量することができ、しかも、測定温度の影響や保管履歴による影響を受け難い、定量分析方法、試薬及び検出用カートリッジを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、上記課題を達成するために、被検出物質を含む被検液が供給される流路と、該流路の途中に設けられた貯留部と、前記主流路において前記貯留部よりも下流側に設けられた検出部とを備える検出用カートリッジを用いた定量分析方法であって、前記貯留部において、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅまたはＡｇを主成分とする金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と前記被検出物質の会合体とを濃縮する工程と、前記会合体に含まれる前記金属ナノ粒子を溶解し、金属イオン溶液を得る工程と、前記金属イオン溶液を前記検出部に搬送する工程と、前記検出部において、前記金属イオン濃度を測定し、金属イオン濃度に応じた前記被検出物質濃度を定量する工程とを備える、定量分析方法が提供される。
【００１４】
本発明において、上記貯留部は、イムノアッセイに代表される分子特異的結合反応を短時間化するため並びに前記イムノアッセイに代表される分子特異的結合反応を通じて会合体に含まれる金属ナノ粒子の濃縮及び洗浄を行うための足場を与えるものである。
【００１５】
分子特異的結合反応を短時間化することができるのは、イムノアッセイに代表される分子特異的結合反応が拡散律速であり、反応場がカートリッジの貯留部内においてマイクロ空間に限定されていて拡散距離が短いことによる。拡散律速反応においては、反応が飽和するまでに要する時間は、反応空間の距離の自乗に反比例する。例えば、４ミリのウェルと４０μｍの空間とでは、凡そ一万倍反応が早くなる。
【００１６】
上記貯留部において、表面積が大きな多孔質上に被検出物質と分子認識試薬との会合体が濃縮される。更に、濃縮された会合体中の分子認識試薬を標識している金属ナノ粒子を溶解することにより、金属イオン溶液が得られる。この金属イオン溶液は、会合体が濃縮されたものである効果と、ひとつの金属ナノ粒子から数千数万のイオンを生じる効果とによって、もとの被検液中の被検出物質の濃度に比べて、１００倍〜１００００倍の濃度に変換された金属イオン溶液を与える。したがって、極低濃度の被検出物質濃度であっても、貯留部で濃縮された標識金属ナノ粒子由来の高濃度に変換された金属イオンが検出部において定量される。検出部で測定された金属イオン濃度は、被検液中の被検出物質の濃度に比例している。この金属イオン濃度を被検出物質の濃度に換算することにより、被検出物質を定量することができる。
【００１７】
本発明のある特定の局面では、前記貯留部に、前記被検出物質に対して特異的に結合する特異的結合分子が予め固定されており、前記被検出物質を含む被検液を貯留部に導入することにより、前記被検出物質を前記特異的結合分子が会合し、前記貯留部において、前記被検出物質が濃縮され、前記金属ナノ粒子で標識された前記分子認識試薬が前記貯留部に導入されることにより、金属ナノ粒子で標識された前記分子認識試薬と前記被検出物質との会合体が、前記貯留部に濃縮貯留される工程が含まれる。この場合には、貯留部に上記特異的結合分子が予め固定されているので、被検出物質を含む被検液が貯留部に導入されると、被検出物質と特異的結合分子の会合体が貯留部に固定されることになる。従って、貯留部において、被検出物質が確実に濃縮される。従って、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬を貯留部に導入すれば、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と上記被検出物質との会合体が貯留部に濃縮され、かつ貯留される。
【００１８】
本発明の定量分析方法の他の特定の局面では、前記貯留部に多孔体が予め配置されており、前記濃縮貯留に際し、前記被検出物質を含む被検液と、前記金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と、前記被検出物質に対して特異的に結合する特異的結合分子が固定されたビーズ等を混合することにより得られた凝集物を含む懸濁液を前記主流路を通じて前記貯留部に導入し、金属ナノ粒子で標識された前記分子認識試薬と前記被検出物質の会合体を含む凝集物を前記貯留部において濃縮貯留する工程とが含まれる。この場合には、被検出物質を含む被検液と、上記金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と、上記特異的結合分子が固定されたビーズとの混合物が懸濁液として貯留部に導かれるので、懸濁液中において各成分が速やかに拡散し、拡散律速である反応が早く簡潔することとなる。よって、分析時間をより一層短縮することができる。
【００１９】
本発明に係る定量分析方法のさらに他の局面では、前記濃縮貯留後に、前記貯留部に洗浄液を導く工程がさらに備えられる。洗浄液の貯留部への導入により洗浄を行うことで、上記会合体に取り込まれていない未反応の分子認識試薬を除き、かつ、後続の金属イオンの検出において検出を邪魔する夾雑物を貯留部から容易に除去することができる。それによって、測定のバックグラウンドを下げることができ、有効な検出シグナルとノイズの比であるＳ／Ｎ比を高めることができる。
【００２０】
また、本発明の定量分析方法のさらに別の特定の局面では、前記会合体に結合されている前記金属ナノ粒子を溶解し、金属イオン溶液を得る工程が、溶離液として酸を加える工程を含む。この場合には、酸を導入することにより、会合体に取り込まれている金属ナノ粒子を速やかに溶解し、被検出物質の濃度に応じた金属イオンを溶出し、金属イオン溶液として検出部に速やかに搬送することができる。
【００２１】
本発明に係る定量分析方法のさらに別の特定の局面では、上記ビーズとして、ポリマー粒子が用いられる。ポリマー粒子として、上記貯留部に固定されている多孔体の網目よりも大きいポリマー粒子を用いたり、あるいは１つのポリマー粒子が複数の特異的結合分子を介して被検出物質並びに金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬とネットワークを形成したりすることにより、濾過可能な会合体もしくは凝集体を与えることができる。すなわち、上記のようにポリマー粒子を用いることにより、濾過を効率良く行うことができる。
【００２２】
もっとも、本発明においては、上記ビーズとして、少なくとも最表面が金属である粒子を用いてもよい。この場合には、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬以外にも、金属成分が測定系中に存在することとなるため、同じ貯留部を用いた場合において、より大きなシグナル増幅率を得ることができる。貯留部に、上記金属ナノ粒子よりも表面積が大きな、最表面が金属である粒子を用いた場合は、より大きな信号増幅率を得ることができる。最表面が金属である粒子の金属種は、金属ナノ粒子を構成する金属種と必ずしも同じでなくてもよい。還元電位が近くとも、検出部でアノーディック  ストリッピング  ボルタンメトリのような方法を用いることにより、それぞれを定量できる。
【００２３】
本発明に係る定量分析方法のさらに他の特定の局面では、上記金属ナノ粒子として、カドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、または銀（Ａｇ）からなる金属ナノ粒子が用いられる。ナノスケールのＣｄＳｅ、ＣｄＴｅやＡｇは、酸により速やかに溶解し、カドミウムイオン（Ｃｄ２＋）及び銀イオン（Ａｇ＋）を与える。カドミウムイオン及び銀イオンは、比較的容易にかつ速やかに定量することができる。
【００２４】
本発明に係る定量分析方法のさらに別の特定の局面では、前記検出部に、前記金属イオンを検出するための電気化学的電極が配置されており、金属イオン濃度の検出に際し、前記電気化学的電極上へ電気化学的に金属を析出させ、ついで、電位を掃引してストリッピング電流を測定する。このような電気化学的電極を含む検出部の場合には、嵩張る光学系が必要ないため、測定装置の小型化を進めることができる。また、電気化学的電極は、三極式、四極式または二極式のいずれであってもよいが、アノードに金属を析出させた状態で洗浄することにより、夾雑物の影響を低減することができる。また、電位を掃引しつつ電流を測定するため、電流のピーク位置により夾雑イオン種のシグナルと目的の金属イオンのシグナルとを区別することができる。従って、有意の測定シグナルとノイズの比であるＳ／Ｎ比をより一層高めることができる。
【００２５】
本発明に係る定量分析方法のさらに別の特定の局面では、前記金属ナノ粒子が溶解された金属イオン溶液に硫化物イオンを加えることにより生じる非水溶性の硫化物塩の懸濁液を前記検出部において光学的に検出することにより、前記金属イオン濃度を定量する方法が用いられる。この場合には、光学的手段により、非接触で金属イオン濃度を容易にかつ速やかに定量することができる。従って、周知の吸光度測定法、反射光測定法あるいは光導波路を利用した測定法などを適用することにより、金属イオン濃度を速やかにかつ高精度に検出することができる。特に、カドミウムイオンや銀イオンのような重金属イオンの場合には、ローソン試薬やラヴェッソン試薬のような硫化剤を硫化イオンとして加え、非水溶性の硫化物塩として析出させて懸濁液とすることにより、光学的手法により、容易に金属イオン濃度を測定することができ好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る定量分析方法では、カートリッジ内において、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と被検出物質との免疫反応を通じて被検出物質の濃度に応じた標識物質の濃縮が速やかに行われ、標識物質である金属ナノ粒子が溶出された金属イオン溶液中の金属イオン濃度が被検液中の被検出物質濃度と相関しており、しかも被検出物質に対して高濃度に変換された金属イオンが検出部でのシグナル検出を速やかにかつ非常に高い感度で可能にしている。すなわち、１０ｐｇ／ｍＬ程度の高感度な定量分析を、例えば２０分以内のような比較的短時間で完了することが可能となる。
【００２７】
しかも、本発明の定量分析方法では、酵素反応を利用した増幅等を用いておらず、用いる金属ナノ粒子により増幅倍率が明確であるため、測定温度による影響が少なく、また、分析試薬等の保管履歴による影響も受け難い。従って、測定の信頼性を高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（ａ）は、本発明の一実施形態の検出用カートリッジの外観を示す斜視図及び（ｂ）はカートリッジ本体内に構成されている流路と、貯留部及び検出部の関係を示す模式的斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態において、検出用カートリッジ内に構成されている流路と、第１の貯留部、検出部等の関係を模式的に示す正面断面図である。
【図３】本発明の一実施形態の検出用カートリッジの分解斜視図である。
【図４】本発明の他の実施形態に係る検出用カートリッジの構造を説明するための分解斜視図である。
【図５】本発明の他の実施形態に係る検出用カートリッジにおける流路接続切り換え機構を説明するための模式図である。
【図６】本発明のさらに他の実施形態に係る検出用カートリッジにおける流路接続切り換え機構を説明するための模式図である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、本発明のさらに別の実施形態における検出用カートリッジの流路接続切り換え機構を説明するための各模式図である。
【図８】本発明の実施例１における電流密度測定結果を示す図である。
【図９】ＣｄＳｅナノ粒子を用いた実施例１の場合と、Ａｇナノ粒子を用いた実施例２の測定結果を示す図である。
【図１０】Ａｇナノ粒子を用いた実施例２及びＡｕナノ粒子を用いた比較例における被検出物質測定結果を示す図である。
【図１１】実施例３において、硝酸濃度を変化させた場合のＡｇのナノ粒子が溶解して生成したＡｇイオン由来のピーク電流値と硝酸濃度との関係を示す図である。
【図１２】実施例４における被検出物質測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の具体的な実施形態を説明しつつ、本発明の詳細を明らかにする。
【００３０】
本発明の定量分析方法では、流路と、流路の途中に設けられた貯留部と、流路において貯留部よりを下流側に設けられた検出部とを備える定量分析用カートリッジを用いる。そして、少なくとも、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と被検出物質との会合体が貯留部において濃縮貯留される工程と、上記会合体に含まれる金属ナノ粒子を溶解し、金属イオン溶液として検出部に搬送する工程とを備える。
【００３１】
なお、主流路とは、被検出物質を含む被検液を流し、定量する一連の分析方法を実現する流路すなわち分析用流路を意味する。主流路と表現しているのは、後述の変形例で示す廃液流路と区別するためであることを指摘しておく。
【００３２】
前記貯留部は、イムノアッセイに代表される分子特異的結合反応を短時間化すると同時に、濃縮、洗浄を行う足場を与える。拡散律速である分子特異的結合反応の反応場がマイクロ空間とされていることにより、反応平衡にいたる時間が短時間化される。また、前記貯留部に配置される表面が大きな多孔質上に前記被検出物質と前記分子認識試薬の会合体が濃縮される。前記貯留部で濃縮、洗浄された前記被検出物質と前記分子認識試薬の結合体に含まれる金属ナノ粒子は、酸などの適宜の溶離液の導入により、溶解して、金属イオン溶液を与える。金属イオンは、元となったひとつの金属ナノ粒子に対し、数千から数万の金属イオンとなるため、被検液中の被検出物質の濃度に比べて１００倍〜１００００倍の濃度になる。溶出された金属イオンは、検出部に搬送されて定量される。被検液中の被検出物質の濃度が極低濃度であっても、被検液中の被検出物質の濃度に比例する高濃度に変換された金属イオンを検出部で測定するため、検出部での金属イオン濃度の定量は容易になる。
【００３３】
測定された金属イオン濃度は、被検出物質の濃度に換算される。このようにして、煩雑で数時間かかっていた濃縮及び分析を比較的短時間で、例えば２０分以内で完了することができる。また、信号の増幅に酵素を用いていないため、測定温度の影響や保管履歴の影響を受け難い。本発明において、「検出」なる用語は、被検出物質の濃度に応じた金属イオン濃度を定量するための情報を収集することを広く意味する。また、被検液とは、検出対象である被検出物質を含む可能性がある限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料［例えば、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、腹水、涙液、汗、膿、喀痰、または咽頭拭い液）若しくは排泄物（例えば、尿、糞便）、臓器、組織、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体］、あるいは、環境由来の試料（例えば、河川水、湖沼水、若しくは海水、又は土壌）、食品粉砕物、燃焼残渣および、これらからの抽出物を挙げることができる。
【００３４】
検出用カートリッジにおける流路は、被検液、マスキング剤、洗浄液、溶離液等の種々の試薬の流れを確保し、液体を移送及び／又は貯蔵することができる限り、その形状、長さ、大きさ、数等は特に限定されず、例えば、数十μｍ〜数ｍｍのオーダーの幅を有し、数十μｍ〜数百μｍの深さを有する溝により形成されていることが適しており、例えば、流路の断面積は１００μｍ２〜１ｍｍ２程度である。
【００３５】
本発明において用いられる金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬は、分子認識部分と、リンカー部分と、金属ナノ粒子とを有する。
【００３６】
前記分子認識部分は、免疫学的検定法（イムノアッセイ）に用いられる抗体が好適に用いられる。特に、モノクローナル抗体は特異性が高いものも多く優れている。前記分子認識部分は、抗体に限られるものではなく、糖鎖、レクチン、セレクチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペブチド核酸、アプタマー、抗体断片Ｆａｂ、抗体認識部位Ｆｖ、クラウンエーテル等の分子特異的結合能をもつ分子認識試薬を用いることができる。
【００３７】
前記リンカー部分は、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、ビオチン−アビジンコンジュゲート、これらの誘導体、改変体からなる一群より選ばれる少なくとも一種を挙げることができる。
【００３８】
標識に用いられる前記金属ナノ粒子としては、直径３ｎｍ〜３０ｎｍのカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）ナノ粒子、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）ナノ粒子、銀（Ａｇ）ナノ粒子が好適に用いられる。この範囲より小さいナノ粒子は安定に存在し難い。また、ナノ粒子が大きすぎると、沈降し、抗体試薬の標識としては不適となることがある。
【００３９】
本発明において、上記貯留部は被検液に含まれる被検出物質と、金属ナノ粒子で標識された上記分子認識試薬とを会合させ、生成された会合体を濃縮し、保持する機能を有する。一方、会合体に取り込まれていない金属ナノ粒子を含む夾雑物を包含する分散媒、マスキング剤、または洗浄液などは貯留部を通過する。貯留部は、上記会合体を生成する反応場を増大し、かつ被検出物質を貯留／保持するために濃縮物を担持する担持手段を含むことが好ましい。
【００４０】
従って、好ましくは、貯留部に担持手段として、多孔性材料もしくはメッシュ状物または微細加工表面を有する材料が好適に用いられる。多孔性材料やメッシュ状物は表面積が大きいため、特許文献２に記載のようなフィルタやメンブレンフィルタに比べ、多くの反応場を提供することができ、かつ上記会合体をより多く担持することができる。なお、多孔性材料は、材料自体が多数の孔を有するものに限らず、微粒子が凝集し、粒子間に大きくの孔が形成されているものをも含むものとする。
【００４１】
上記担持手段を構成する材料は、上記多孔性材料もしくはメッシュ状物が好ましいが、より具体的には、スポンジ、織布、不織布、充填された微粒子、繊維、焼結体、モノリシック多孔質体のいずれかの様態、または、それらの組み合わせからなる様態をとる。微細加工表面としては、ナノインプリンティング法やスプレーデポジショニング法による構造表面が好適に用いられる。担持手段を構成する素材としては、例えば、セラミック、ガラス、合成繊維、植物繊維、動物性繊維、合成樹脂、セルロース系材料、金属なども用いてもよい。また、基材の表面に、被検出物質に対して化学反応を行う又は特異的結合能を有する分子や官能基で処理したものを用いてもよい。
【００４２】
前記金属ナノ粒子標識された分子認識試薬から金属イオンを溶出する方法としては、酸を加える方法がとられる。ここで適当な酸としては、０．５〜３Ｎの硝酸が好適に使用できる。塩酸及び硫酸は、難水溶性の塩化物及び硫化物を生じるので望ましくない。
【００４３】
溶出された金属イオンは、検出部へと輸送され、定量される。検出機構は、特に限定されることなく、被検出物質を検出することができる方法を実現し得る機構の全てを利用することができる。方法としては、電気化学分析法、光学分析法、他の原理を利用した分析が挙げられる。機構としては、特に限定されず、例えば、電気化学分析のための電極及び電流・電圧を印加又は読取る手段等、光学的分析法における光学セル、光源及び分光器等、又はその一部が、検出用カートリッジにおける検出区画を構成して搭載される。
【００４４】
本発明の検出方法において用いられる電気化学分析法について、より具体的に記載するならば、例えば、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）、クーロアンペロメトリー（ＣＡ）、クーロクロノメトリー（ＣＣ）、サイクリックボルタメトリー（ＣＶ）、又はアノーディック  ストリッピング  ボルタンメトリー（ＡＳＶ）などを挙げることができる。電極構成は、三極式、四極式、二極式のいずれの方法も採用しうるが、精度と使い勝手との兼ね合いを考慮すると、三極式が望ましい。
【００４５】
なお、本発明においては、上記検出部は貯留部よりも下流側に配置されているが、貯留部の下流側に連ねられて設けられ、両者が一体化されていてもよい。
【００４６】
また、検出部において、被検出物質の濃度に応じた金属イオン濃度が検出されるが、この場合検出手段は、カートリッジ内またはカートリッジ上に設けられる必要は必ずしもない。もっとも、検出手段の少なくとも一部がカートリッジ内またはカートリッジ上に存在する場合には、小型化を進めることができる。
【００４７】
また、検出手段の一部のみがカートリッジに設けられてもよい。例えば、光学式検出手段を用いる場合、カートリッジ内あるいはカートリッジ上に光学セルが検出部の一部として配置され、光学セルを透過してきた光を受光する受光手段を含む測定部分が、カートリッジ外の測定装置内に設けられてもよい。
【００４８】
好ましくは、検出手段を構成する部材の内、濃縮カラムのように再生し難い部材や、測定前に煩雑な再生処理を要する部材、例えば電気化学的電極などはカートリッジ側に設けられることが好ましい。また、電気化学的電極分析に用いられる電極は、測定前に研磨したりしなければならないため、１回毎に、あるいは一定分析回数毎に廃棄されるカートリッジ側に設けられることが望ましい。
【００４９】
他方、光学セルは、測定前に簡易な洗浄作業により再度使用することができるので、カートリッジ内に配置されてもよい。
【００５０】
より具体的には、検出手段として電気化学的分析手段を用いる場合には、例えば、カートリッジ内の検出部に、作用電極、対極及び参照電極などの電極を配置し、処理ユニット内に、電流または電圧を印加もしくは読み取る手段を設ければよい。光学分析手段を用いる場合には、カートリッジ内に光学セルを設け、カートリッジ外に光源や受光手段を設ければよい。
【００５１】
上記検出部における検出手段としての１つの好ましい態様は、溶出された金属イオンを含む可能性のある上記貯留部から溶出液と、金属イオンを含まない溶離液とを用い、電気化学的応答を対比する分析手段が挙げられる。
【００５２】
また、別の好ましい検出手段としては、硫化物イオンを加えて生じる抵触懸濁物の濃度を光学的に検出手段が挙げられる。Ｃｄイオン及びＡｇイオンは、非水溶性硫化物イオンとして、水溶液中に析出分散し、溶液を懸濁するとともに、特有の色を呈する。これを光学的手段により容易に測定することができる。透過光による吸光度を測定する方法を用いてもよく、反射光を利用する測定方法を用いてもよく、光導波路を用いた測定方法などのど様々な光学的測定方法を用いることができる。
【００５３】
上記カートリッジと、カートリッジ外の測定装置との間で、液体を輸送する必要がある場合には、カートリッジの表面に液体供給及び液体排出用の複数のポートを設ければよい。複数のポートは、被検液または試薬等を導入または排出するために用いられるものであり、大きさ及び位置は特に限定されない。例えば、複数のポートは、貯留部の上流側において被検液を供給するため、貯留部と検出機構との間に、検出に用いられる溶液や洗浄液を供給するために、検出部の下流側などの適宜の位置に配置することができる。ポートの選択及び切り換えは、電磁バルブ等を用いた適宜のバルブ機構を用いて行えばよい。
【００５４】
次に、本発明で用いられるカートリッジの具体的な構造例を、図面を参照しつつ説明する。
【００５５】
図１（ａ）は本発明の一実施形態に係る検出用カートリッジの外観を示す斜視図であり、（ｂ）はカートリッジ内に形成されている流路、及び貯留部の関係を示す模式的斜視図であり、図２はカートリッジ内に設けられている流路及び貯留部並びに検出部の関係を示す模式図である。また、図３は、本実施形態の検出用カートリッジの内部構造を示す分解斜視図である。
【００５６】
図１に示すように、本実施形態の検出用カートリッジ１は、下方から第１〜第３のプレート１１〜１３を積層してなるカートリッジ本体２を有する。プレート１１〜１３は、例えば合成樹脂により形成される。各プレート１１〜１３は、典型的には３５ｍｍ×５０ｍｍの矩形の平面形状を有し、１枚のプレートの厚みは１ｍｍ程度とされる。図１（ａ）では省略されているが、図３に示すように、第１〜第３のプレート１１〜１３は、粘着シート１４，１５を介して積層されている。従って、カートリッジ本体２は、約４ｍｍ程度の厚みを有する。
【００５７】
図３においては、図示を容易とするために、また理解を容易とするために、第１のプレート１１及び粘着シート１４の向きと、残りの第２，第３のプレート１２，１３及び粘着シート１５の向きを代えて図示している。
【００５８】
カートリッジ本体２の下面には、第１〜第５のポート３〜７が形成されている。第１〜第５のポート３〜７は、カートリッジ本体２内に設けられている流路８に接続されている。流路８は、第１のプレート１１，１２間及び第２のプレート１２及び第３のプレート１３間のいずれかの内面に形成された溝及び／または第２のプレート１２に設けられた貫通溝により形成されている。また、流路８は、第１の流路部分９と第２の流路部分１０とを有する。第１の流路部分９は、第１，第２のポート３，４を接続している。第１の流路部分９の途中に貯留部１６が設けられている。また、第２の流路部分１０は、第３のポート５〜第５のポート７を接続している。第２の流路部分１０の途中には検出部１８が設けられている。
【００５９】
また、第２の流路部分１０の下流側は図２には示されていない部分において、廃液貯留部１９に接続されている。廃液貯留部１９は、図３に示すように、第１のプレート１１の上面において上方に向かって開いた凹部１９ａ、第２のプレート１２に設けられた大きな開口部１９ｂ及び第３のプレート１３の下面において下方に向かって開いた凹部１９ｃが組合わさって形成されている。
【００６０】
他方、貯留部１６は、第１のプレート１１の上面において上方に向かって開いた凹部１６ａと、第２のプレート１２に設けられた放射状の開口部１６ｂとが積層されて形成されている。なお、第１のプレート１１には、上記貯留部１６に繋がるように前述した第２のポート４が形成されている。貯留部１６内には、図２においては略図的に示すように、濃縮担持手段としての濃縮担持体２１が収納されている。濃縮担持体２１は、前述の適宜の担持材料により形成されている。
【００６１】
この場合、図２に示されているように、流路９が上下方向に延びる部分おいて、貯留部１６が設けられているため、貯留部１６内の濃縮担持体２１には、上方から被検液が供給され、流路を流れる液体は濃縮担持体２１を上下方向に通過する。従って、濃縮担持体２１が、前述した多孔性材料もしくはメッシュ状物等からなる場合、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と被検液中の被検出物質の会合体を生成する際の反応場を増大させることができる。前述した特許文献２では、ストリップ状フィルタの面方向に被検液が供給されるため、反応場が少ないのに対し、本実施形態では、濃縮担持体２１を上下方向に通過するように被検液が供給されるため、反応場を著しく増大させることができる。従って、それによっても、検出感度を高めることが可能とされている。
【００６２】
本実施形態では、貯留部１６に、流路から被検液が供給される。この貯留部１６において、金属ナノ粒子で標識された分子認識試薬と被検液中の被検出物質の会合体が生成し、濃縮される。この場合、流路に、上記被検液と上記分子認識試薬と適宜の液状媒体とを含む混合液を供給し、貯留部１６に導いてもよく、あるいは、貯留部にまず被検液を供給し、しかる後分子認識試薬を貯留部１６に導いてもよい。貯留部１６において、上記分子認識試薬と被検出物質の会合体が濃縮される。
【００６３】
他方、検出部１８においては、化学電極としては、参照電極Ｒ、作用電極Ｗ及び対極Ｃが配置されている。ここでは、対極Ｃと、参照電極Ｒとの間の電圧及び作用電極Ｗと対極Ｃとの間の電圧に基づいて、金属イオンの析出と電位掃引アンペロメトリが行われ、金属イオン濃度が測定される。すなわち、貯留部１６で会合体に取り込まれている金属ナノ粒子を、流路に金属ナノ粒子を溶解する溶離液を流し、会合体中の金属ナノ粒子を溶解することにより、金属イオン溶液が貯留部１６から下流側に排出される。この金属イオン溶液中の金属イオン濃度が検出部１８において検出される。
【００６４】
なお、図３に示すように、第１〜第３のプレート１１〜１３は、粘着シート１４，１５を介して貼り合わされ、積層されている。粘着シート１４，１５は、上述した廃液貯留部１９などを形成するため貫通孔を有する。また流路を接続するための複数の小さな貫通孔も有する。
【００６５】
上記作用電極Ｗとしては、例えば、３．５ｍｍ×８．４ｍｍ×０．５ｍｍ程度の板状のカーボン電極を好適に用いることができる。対極Ｃ及び参照電極Ｒについても同様の寸法の板状の電極を用いることができ、対極Ｃは作用電極Ｗと同様に板状のカーボン電極を用いて作製することができる。また、参照電極Ｒについては、金属イオン種によって適宜最適なものが選ばれる。例えば、金属イオン種がカドミウムイオンの場合には、参照電極にアルミナ基材上に銀ペーストが塗布された電極を用いることができる。金属イオン種が銀イオンの場合には、金基財にフェロセンを固定した電極を用いることができる。
【００６６】
もっとも、上記化学電極の寸法及び構造については特に限定されず、第１のプレート１１上に適宜の電極材料を印刷することにより形成されてもよい。
【００６７】
本実施形態では、プレート１１の上面と化学電極の表面とが面一となるように、第１のプレート１１の上面に凹部が形成され、該凹部を埋めるように電極材料が充填されている。
【００６８】
従って、参照電極Ｒ、作用電極Ｗ及び対極Ｃの上面と、第１のプレート１１の上面とは面一とされている。よって、第１のプレート１１と第２のプレート１２とを隙間を生じさせることなく容易に積層することができる。
【００６９】
なお、粘着シート１４には、上記参照電極Ｒ、作用電極Ｗ及び対極Ｃを露出させるための貫通孔１４ａ〜１４ｃがそれぞれ形成されている。
【００７０】
これらの貫通孔１４ａ〜１４ｃを通して液体が参照電極Ｒ、作用電極Ｗ及び対極Ｃに接触されることになる。
【００７１】
上記第１〜第５のポート３〜７の内、第１のポート３は、被検液や溶離液などを導入するためのポートであり、第１のプレート１１に貫通孔として形成されている。なお、第２のプレート１２においては、特に図示はしていないが、参照電極Ｒを活性化するための活性化液としての電解質溶液が貯留された電解質溶液室を設けてもよい。このような電解質溶液を上記第２の流路部分１０に接続し、第２の流路部分に供給することにより、上記参照電極Ｒの活性化を容易に行うことができる。
【００７２】
上記カートリッジにおける検出手段としては、化学電極を用いることが望ましい。より望ましくは、上記実施形態のように、カートリッジ本体２内に、化学電極としての参照電極Ｒ、作用電極Ｗなどが配置された検出区画が備えられていることが望ましい。化学電極を用いることにより検出手段の小型化を進めることができ、それによってカートリッジ全体の小型化を進めることができる。
【００７３】
上記検出用カートリッジ１におけるカートリッジ本体２の構造は、上記貯留部及び検出部と、これらを接続する流路が形成される限り、図１〜図３に図示の構造に限定されるものではない。
【００７４】
図４は、本発明の他の実施形態に係る検出用カートリッジを説明するための分解斜視図である。検出用カートリッジ５１では、２枚のプレート５２，５３を接着剤等を用いて貼り合わすことにより構成されている。すなわち、プレート５２，５３を貼り合わせることによりカートリッジ本体が構成されている。
【００７５】
なお、プレート５２，５３は、接着剤による貼り合わせに限らず、拡散接合、陽極接合、レーザー接合等の適宜の接合方法によって貼り合わすことができる。
【００７６】
プレート５２の下面に破線で示す多孔形状の凹部が設けられており、該蛇行形状の凹部により第１の流路部分９が形成されている。また、プレート５２には、第１〜第４のポート３〜６を構成するための各貫通孔が形成されている。なお、図２の第５のポート７は記載されていない。
【００７７】
プレート５３の上面には、上記第１の流路部分９が形成される部分に、プレート５２の下面に設けられた蛇行形状の凹部と重ねられ合う蛇行形状の凹部が設けられている。プレート５２，５３の蛇行形状の凹部が合体し、第１の流路部分９が形成される。また、プレート５３の上面には、濃縮担持体２１を含む凹部からなる第１の貯留部１６が設けられている。第１の流路部分９の一端は第１のポート３に、他端は第２のポート４に接続されている。
【００７８】
また、プレート５３の上面には、第２の流路部分１０が形成されており、第２の流路部分１０の途中に、凹部からなる第２の貯留部１７が設けられている。また、第２の貯留部１７の下流側に、検出部１８が設けられている。検出部１８は、第１の実施形態と同様に構成されている。
【００７９】
図５は、図１及び図４に示した検出用カートリッジに用いられる流路接続切り換え機構を説明するための模式図である。
【００８０】
図１及び図４では、第１の流路部分９の下流側端部が第２のポート４に接続されており、第２の流路部分１０の上流側端部が第３のポート５に接続されている。この第２のポート４と第３のポート５との間の流路を接続する切り換え機構としては、例えば図５に示す流路切り換え装置を用いる構造が挙げられる。ここでは、カートリッジ本体２の外部に流路切り換え装置として三方コック３１が用意される。
【００８１】
三方コック３１は、第１〜第３のポート３１ａ〜３１ｃを有する公知の三方コックである。流路３２が第２のポート４と三方コック３１とに接続されており、流路３３が三方コックと３１と第３のポート５とを接続している。
【００８２】
図５に示す状態では、第１のポート３１ａが流路３２に接続されており、第２，第３のポート３１ｂ，３１ｃは流路３３に接続されていない。従って、第１の流路部分９から第２のポート４を経て流路３２に流れ込んできた液体は、第１のポート３１ａから三方コック３１内を通過し、第２のポート３１ｂまたは３１ｃから排出される。従って、第１の流路部分９から流れてきた残液を廃棄することができ、未反応の試薬等が第２の流路部分１０に至ることはない。よって、この状態で第１のポート３１ａから洗浄液として緩衝液などを流し、濃縮担持体２１及び第１の流路部分９を洗浄する。洗浄液も、三方コック３１のポート３１ｂまたは３１ｃから洗浄液を排出することができる。
【００８３】
次に、測定に際しては、三方コック３１を回転し、流路３２にポート３１ｂを、流路３３にポート３１ｃを接続する。その状態で溶出液を第１のポート３１ａから注入し、金属ナノ粒子が溶解している溶出液を流路３２、三方コック３１及び流路３３を介して第２の流路部分１０に導き、検出部１８で検出する。このように、三方コック３１のような流路接続切り換え機構をカートリッジ本体２の外部に設けることにより、上記検出用カートリッジ１を用いて定量を行うことができる。
【００８４】
また、図６は、本発明のさらに他の実施形態に係る検出用カートリッジにおける流路接続切り換え機構を説明するための模式図である。この流路接続切り換え機構は、カートリッジ本体２内に構成することができる。本実施形態では、カートリッジ本体２内において、第１の流路部分９と第２の流路部分１０とが接続部Ｘにおいて接続されている。すなわち、第１の流路部分９の下流端が接続部Ｘに至っている。また、接続部Ｘと第２のポート４との間に廃液流路４１が接続されている。
【００８５】
言い換えれば、図２に示した構成において、第１の流路部分９の下流端に接続部Ｘを設け、接続部Ｘと第１のポート４との間を廃液流路４１とした構成に相当する。第２の流路部分１０の上流端は、上記のように接続部Ｘに接続されているため、図２に示す構造における第３のポート５は省略されることとなる。他方、第２の流路部分１０の途中には検出部１８が設けられており、下流端側にポート６が設けられており、図２のポート７は省略されている。ポート６は外部に開いている。
【００８６】
使用に際しては、ポート６を閉じた状態で、第１のポート３から被検液及び試薬を導入する。濃縮担持体２１において会合体が濃縮される。余剰の液体が廃液流路４１を介して第２のポート４から排出される。ポート６が閉じられているため、第２の流路部分１０においては空気の抜け道がないため、第２の流路部分１０に液体は浸入しない。
【００８７】
次に、第１のポート３から洗浄液を導入し、同じく洗浄後の洗浄液が第２のポート４から排出される。
【００８８】
洗浄終了後、第１の流路部分９、第２の流路部分１０及び廃液流路４１の全体が空気で占められることになる。
【００８９】
次に、第２のポート４を閉塞し、ポート６を開放する。この状態で、第１のポート３から溶出液を導入する。その結果、会合体に含まれている金属ナノ粒子が溶解し、金属ナノイオンを含む溶液が第２の流路部分１０に流入し、検出部１８によりイオン濃度を定量することができる。この場合、第２のポート４が閉塞されているので、溶液は選択的に第２の流路部分１０に流れることになる。
【００９０】
図７（ａ）及び（ｂ）は、本発明のさらに他の実施形態の検出用カートリッジにおける各流路接続切り換え機構を説明するための模式図である。
【００９１】
図７（ａ）では、図６の場合と同様に、接続部分Ｘにおいて、第１の流路部分９、第２の流路部分１０及び廃液流路４１が接続されている。異なるところは、第２の流路部分１０において、検出部１８よりも上流側にあって、接続部Ｘよりも下流側に流路を開閉するバルブ４２が設けられていることにある。そして、第２の流路部分１０の流動抵抗に比べて、廃液流路４１における流体の流動抵抗が大きくなるように、流動抵抗増大部４１ａが廃液流路４１に設けられていることにある。
【００９２】
バルブ４２を閉じた状態で、第１のポート３から被検液及び試薬を導入し、免疫会合体を濃縮担持体２１で濃縮する。残液は、バルブ４２が閉じられているので、第２のポート４から排出される。洗浄に際しても、同様に第１のポート３から洗浄液を導入し、第２のポート４から排出する。この場合も、バルブ４２は閉じられているので、洗浄液は第２の流路部分１０のバルブ４２よりも下流側には至らない。
【００９３】
定量に際しては、バルブ４２を開状態とすればよい。その状態で、溶出液を第１のポート３から導入する。第２の流路部分１０の流動抵抗が、廃液流路４１における流動抵抗よりも低くされているため、金属ナノイオンを溶解した溶出液は、廃液流路４１には至らず、バルブ４２を介して第２の流路部分１０に至る。従って、金属ナノイオン濃度を検出部１８で測定することができる。
【００９４】
なお、図７（ｂ）に示すように、バルブ４２は、検出部１８の下流側において第２の流路部分１０に設けられていてもよい。
【００９５】
本発明の被検出物質の検出方法は、各種アレルゲン、例えば、卵黄、卵白、牛乳、落花生、エビ、カニ、魚、貝、大豆、マンゴーなどの食品、塵ダニ、羽毛、花粉、真菌、細菌、ゴキブリ、犬又は猫の毛が挙げられる。その他、内分泌撹乱物質、農薬、ＩｇＥもしくはＩｇＧ等の免疫グロブリン、ヒスタミン、遺伝子（ＲＮＡ）、ストレスマーカー、各種タンパク質、人または動物の血液、血液成分、尿、唾液もしくは体液に含まれる抗原もしくは抗体、特定疾患を示す成分、アスベスト、血中薬物またはその他の抗体により検知可能な物質の検出に用いることができる。
【００９６】
次に、本発明の検出用カートリッジを用いて、被検出物質を測定する具体的な実施例をより具体的に説明する。
【００９７】
（実施例１）
まず、分析ターゲットとして、Ｃ反応性タンパク質（以下、ＣＲＰと表記する）を選定し、サンドイッチアッセイ可能な２種の抗体、すなわち、第１の抗ＣＲＰＩｇＧと、第２の抗ＣＲＰＩｇＧを用意した。第２の抗ＣＲＰＩｇＧには、アダプターとしてのプロティンＧを介してＣｄＳｅナノ粒子を結合し、ＣｄＳｅナノ粒子標識抗体試薬とした。
【００９８】
第１の抗ＣＲＰＩｇＧは、ニトロセルロースメンブレンに物理感作させ、アルブミンでブロッキングしたのち乾燥させ、直径４ミリのディスク形状に打ち抜いて、ＣＲＰに対する濃縮担持体とした。
【００９９】
次いで、図１に示したプレート１１〜１３を用意し、貯留部に上記濃縮担持体をセットした。さらに、検出部については前述した実施形態に従って、化学電極を配置した。
【０１００】
第１〜第３のプレート１１〜１３としては、５０ｍｍ×３５ｍｍ×厚み１ｍｍのポリメチルメタクリルプレートからなる樹脂プレートを用い、２０μｍの厚みの両面粘着テープを粘着シート１４，１５として用いた。
【０１０１】
上記のようにして得られた検出用カートリッジ１を用い、ＣＲＰ濃度１μｇ／ｍＬの標準試料を用意し、１０ｐｇ／ｍＬ、５０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬの各濃度の試料溶液を作製し、検出用カートリッジ１を用いて検量線を作成した。１つの試料溶液についての分析手順は以下の通りとした。
【０１０２】
まず、第１のポート３から１ｍＬの試料溶液をマイクロシリンジを用いて流路８の第１の流路部分９に導入し、貯留部１６に導いた。
【０１０３】
次に、カートリッジ本体を測定装置にセットし、マイクロコンピューターで制御された送液システムにより、以下の洗浄液、抗体試薬及び洗浄液（２回目）、及び溶出液を前記貯留部に順次導いた。すなわち、まず、ポート３から第１の流路部分９を介して貯留部１６に、洗浄液としてリン酸緩衝液を４ｍＬ、１ｍＬ／ｍｉｎ．の速度で導入した。次に、抗体試薬を、第１のポート３から、１．０ｍＬ、２００μＬ／ｍｉｎ．の流速で貯留部１６に導いた。しかる後、洗浄液としてのリン酸緩衝液を、第１のポート３から、２ｍＬ、１ｍＬ／ｍｉｎ．の速度で、貯留部１６に導き、次に、標識溶液を第１のポート３から、０．２ｍＬ及び５０μＬ／ｍｉｎ．の流速で貯留部１６に導いた。
【０１０４】
次に、溶出された金属イオンが溶解している可能性がある溶出液を検査部に送液した。検査部において、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）により、測定を行った。掃引速度は５ｍＶ／秒とし、２００ｍＶから７００ｍＶまで掃引し、電流値を測定した。結果を図８に示す。図８において、横軸は掃引電位であり、縦軸は、電流値である。−０．８Ｖから−０．６Ｖ近傍のハッチングしてある部分の面積が、標識由来の金属イオンの検出量である。夾雑イオン種は異なる電位にピークがあるので、目的の金属イオン種と明瞭に区別できる。参照電極に用いたＡｇ／ＡｇＣｌ由来の銀の小さなピークが０Ｖ近傍にあるが、これとも区別できる。従って、上記リニアスイープボルタンメトリーを用いることにより、被検出物質の濃度を高精度に検出し得ることがわかる。
【０１０５】
（銀ナノ粒子を用いた実施例２）
上記ＣｄＳｅ粒子を用いた実施例１と同様にして、ただし、ＣｄＳｅナノ粒子に代えてＡｇナノ粒子を用い、上記実施例１と同様にして検出物質の濃度の検出を試みた。結果を図９に示す。図９においては、比較を容易とするために、上記ＣｄＳｅナノ粒子を用いた実施例１の場合の結果も併せて示す。図９から明らかなように、Ａｇナノ粒子を用いた場合の方が、ＣｄＳｅナノ粒子を用いた場合よりも被検出物質濃度を高感度に検出し得ることが分かる。なお、実施例１でみられた参照電極に用いたＡｇ／ＡｇＣｌ由来の銀の小さなピークは、Ａｇナノ粒子由来の信号のバックグランドとして補正に用いる。
【０１０６】
（比較例）
比較のために、Ａｇ粒子に代えて、Ａｕ粒子を用いたことを除いては上記実施例２と同様にして被検出物質濃度の測定を行った。図１０は、上記実施例２及び比較例においてリニアスイープボルタンメトリーにより測定した結果を示す。図１０から明らかなように、Ａｇナノ粒子を用いた場合、電流のピーク値はＡｕイオンを用いた比較例の場合に比べて著しく高くなることが分かる。
【０１０７】
（好ましい硝酸濃度についての実施例３）
上記実施例１及び実施例２において、金属ナノ粒子をイオン化する際の溶出液として硝酸を用いていたが、硝酸濃度の好ましい範囲につき検討した。粒径２０ｎｍのＡｇナノ粒子を、０．０１Ｎ〜５Ｎの硝酸にて溶解し、１０μｍのＡｇイオン溶液を調製した。リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）により５０ｍＶ／秒の挿入速度で、−０．５Ｖから０．８Ｖまで挿引し、電流値を測定した。その結果からピーク電流値と硝酸濃度との関係を求めた。結果を図１１に示す。
【０１０８】
図１１から明らかなように、硝酸濃度が０．５Ｎ〜３Ｎであれば、より好ましくは１Ｎ〜２Ｎの範囲であれば、Ａｇイオンを高い感度で測定し得ることが分かる。なお、硝酸濃度が５Ｎの場合には、参照電極の銀塩化銀部分が変色し、電流が安定せず測定を行うことはできなかった。
【０１０９】
（実施例４）
被検出物質として、心疾患マーカーである脳性ナトリウム利尿ペプチド（以下、ＢＮＰと表記する）を選定し、一次抗体として、ＢＮＰを認識する抗ＢＮＰ抗体を、二次抗体として、抗ＢＮＰ抗体とＢＮＰの複合体を認識する抗Ｆａｂ２４Ｃ５／ＢＮＰ抗体を用いて、以下の手順で検出を行った。
【０１１０】
（１）水溶性銀ナノ粒子の作製
疎水性銀ナノ粒子（大研化学社製）１５ｍｇを８００μＬのエタノールに分散させた。ここにエタノールに溶解させたＮ−〔（Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル〕−Ｌ−プロリン（シグマアルドリッチ社製）２５ｍｇを加え、ＮａＯＨ水溶液を加え、分散液を調製した。
【０１１１】
ピンチコックされたキャピラリー流路（ピンチコック幅自動調整装置）を備える高圧液体反応装置であるＡＫＩＣＯ社製「ＨＰＢ−４５０」を用い、圧力３５ＭＰａ、流速２．６ｍＬ／分の速度で分散液を通液した。全量の処理に要した時間は、約１０分間であった。この処理により、疎水性銀ナノ粒子の表面修飾剤が置換され、水溶性銀ナノ粒子が生成された。通液後の分散液をクロロホルム洗浄した後、限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、「Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４」）及びセファデックスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、「ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ」）を用いて精製と濃縮を行い、精製した水溶液性銀ナノ粒子を得た。
【０１１２】
得られた銀ナノ粒子は、水に分散し、橙色の分散液を与える。動的光散乱法による粒径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製、「ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎａｎｏ−ＺＳ」）を用いて粒子径分布を測定した結果、ピーク粒子径は３．６ｎｍであった。
【０１１３】
（２）水溶性銀ナノ粒子標識抗体の調製
上記の銀ナノ粒子水溶液を、同体積の１００ｍＭシステイン溶液に、１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリング剤（いずれもＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）共存のもとで、４℃、１時間混合した。Ｎａｐ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて遊離アミノ酸を除去した後、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣカップリング剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、銀ナノ粒子に二次抗体を結合させ、４℃で２時間超音波分離させた。生成物をセファデックスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製後、限外濾過後（ＮＭＷＬ  １００ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、銀ナノ粒子表面に抗ＢＮＰ抗体が結合した水溶性銀ナノ粒子標識抗体試薬を作製した。
【０１１４】
（３）ラテックス抗体試薬の作製
平均粒径０．０８７μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス希釈用緩衝液９容を添加してラテックスを希釈し、１．０％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液とした。一次抗体を抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作用の抗体液とした。１．０％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液６００μＬを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、これに抗体液１２００μＬを素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を３．０ｍＬ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液を４．０ｍＬ添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を１．８ｍＬ添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行った。これにさらにブロッキング用緩衝液を１．８ｍＬ添加し、ラテックス抗体試薬とした。
【０１１５】
（４）水溶性銀ナノ粒子標識抗体を使用した分析例
ＢＮＰ濃度２μｇ／ｍＬの標準試料を用意し、０．０１ｐｇ／ｍＬ、０．１ｐｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬの各濃度の試料溶液を作製した。これらの標準試料溶液それぞれ１ｍＬに、（３）のラテックス抗体試薬２０μＬを加え攪拌した。ここに（２）の水溶性銀ナノ粒子標識抗体試薬３０μＬを加え、さらに攪拌した。この溶液を図１の検出用カートリッジに導入した。以下の操作は、実施例２と同様にしてピーク面積の測定を行った。結果を図１２に示す。
【０１１６】
図１２から明らかなように、実施例１と同様にリニアスイープボルタンメトリーを用いることにより被検出物の濃度を高精度に検出し得ることが分かる。
【符号の説明】
【０１１７】
１…検出用カートリッジ
２…カートリッジ本体
３〜７…第１〜第５のポート
８…主流路
９…第１の流路部分
１０…第２の流路部分
１１〜１３…第１〜第３のプレート
１４…粘着シート
１４ａ〜１４ｃ…貫通孔
１５…粘着シート
１６，１７…第１，第２の貯留部
１６ａ…凹部
１６ｂ…開口部
１８…検出部
１９…廃液貯留部
１９ａ…凹部
１９ｂ…開口部
１９ｃ…凹部
２１…濃縮担持体
３１ａ〜３１ｃ…第１〜第３のポート
３２，３３…流路
４１…廃液流路
４１ａ…流動抵抗増大部
４２…バルブ
５１…検出用カートリッジ
５２，５３…プレート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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