(57)【要約】      （修正有）【課題】分子認識素子が高密度に固定化されたバイオセンサを提供する。【解決手段】高密度に分子認識素子を基板に結合するために、ロイシンジッパー結合に着目した。そして、ロイシンジッパー結合を介して分子認識素子を基板に結合することにより、該分子認識素子が基板に高密度に固定化できることを見出した。そして、上記知見を基にして、分子認識素子が高密度に固定化されたバイオセンサを完成した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
該基板に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの塩基性鎖を含むペプチド
（基板固定化用ペプチド）と、
分子認識素子と、
該分子認識素子に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの酸性鎖を含むペプチド（分子認識素子固定化用ペプチド）と、を少なくとも備え、
又は、
基板と、
該基板に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの酸性鎖を含むペプチド（基板固定化用ペプチド）と、
分子認識素子と、
該分子認識素子に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの塩基性鎖を含むペプチド（分子認識素子固定化用ペプチド）と、を少なくとも備え、
前記分子認識固定化用ペプチドと前記基板固定化用ペプチドのロイシンジッパー結合により、前記分子認識素子が前記基板に固定化されていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記基板固定化用ペプチド及び前記分子認識固定化用ペプチドが、複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含むことを特徴とする請求項１のバイオセンサ。
【請求項３】
前記基板固定化用ペプチドは、複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含み、
前記分子認識固定化用ペプチドが前記基板固定化用ペプチドの複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖にロイシンジッパー結合を介して結合しており、複数の分子認識素子が一つの基板固定化用ペプチドに固定化されていることを特徴とする請求項１のバイオセンサ。
【請求項４】
前記基板固定化用ペプチド及び前記分子認識固定化用ペプチドが、複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含み、
１又は複数の分子認識素子が一つの基板固定化用ペプチドに複数のロイシンジッパー結合を介して固定化されていることを特徴とする請求項１のバイオセンサ。
【請求項５】
前記複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位が、２〜１０であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１のバイオセンサ。
【請求項６】
基板と、
該基板に直接又は間接的に結合している配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド（基板固定化用ペプチド）と、
分子認識素子と、
該分子認識素子に直接又は間接的に結合している配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド（分子認識素子固定化用ペプチド）と、を少なくとも備え、
前記分子認識固定化用ペプチドと前記基板固定化用ペプチドのロイシンジッパー結合により、前記分子認識素子が前記基板に固定化されていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項７】
前記基板固定化用ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列の単位を１〜４個含むことを特徴とする請求項６のバイオセンサ。
【請求項８】
以下の工程を含む前記分子認識素子と特異的結合能を有する相互作用物質をスクリーニングするための方法；
（１）候補相互作用物質を請求項１〜７のいずれか１に記載のバイオセンサに供給する、
（２）候補相互作用物質と分子認識素子の親和性を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子認識素子が基板に高密度に固定化されたバイオセンサに関し、特に、分子認識素子と基板の結合をロイシンジッパー結合を介して行うことを特徴とするバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは、生物の分子を認識する機構に基づき、分子や化学情報を信号特に電子信号に変換するシステムである。バイオセンサの基本要素である分子認識素子やトランスデューサー（信号変換装置）は、従来、酵素や抗体などの生体分子を電極などに固定化し、構成してきたが、選択性や安定性に乏しく、医療、環境などの分野での実用化に障害となっている。
【０００３】
一方、標的タンパク質又はペプチドを検出するには、抗体、該標的タンパク質又はペプチドと結合することが知られているタンパク質等を基板に固定化して検出することが知れている。
【０００４】
前記基板にタンパク質、ペプチドを固定化する手段として、物理吸着法が挙げられる。しかし、該物理的吸着法は、基板とタンパク質、ペプチドの結合力が弱く、固定化したタンパク質、ペプチドが不安定となる問題がある。
【０００５】
さらに、基板とタンパク質、ペプチドを静電または共有結合を介して固定化する方法が用いている。しかし、該固定化で用いられる官能基が活性部位の中または近傍にある場合、固定化によってタンパク質、ペプチドの活性が失われる欠点も生じる。
また、この方法は、タンパク質、ペプチドの適切な官能基が存在しない場合は、強固に物質を固定化することができない。
【０００６】
その他、光反応性基を利用する固定化方法や、架橋剤を利用する固定化方法が知られているが、いずれの方法も担体表面でのみ目的とする抗体やタンパク質を固定化する方法であり、三次元的に高密度に基板に固定化する方法ではなかった。
【０００７】
以上により、分子認識素子を三次元的に高密度に基板に固定化したバイオセンサの開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２７４９６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、上記問題を解決できるバイオセンサを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究し、高密度に分子認識素子を基板に結合するために、ロイシンジッパー結合に着目した。そして、本発明者は、ロイシンジッパー結合を介して分子認識素子を基板に結合することにより、該分子認識素子を高密度に基板に固定化できることを見出した。
以上により、以下の発明を完成するに至った。
「１．基板と、
該基板に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの塩基性鎖を含むペプチド（基板固定化用ペプチド）と、
分子認識素子と、
該分子認識素子に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの酸性鎖を含むペプチド（分子認識素子固定化用ペプチド）と、を少なくとも備え、
又は、
基板と、
該基板に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの酸性鎖を含むペプチド（基板固定化用ペプチド）と、
分子認識素子と、
該分子認識素子に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの塩基性鎖を含むペプチド（分子認識素子固定化用ペプチド）と、を少なくとも備え、
前記分子認識固定化用ペプチドと前記基板固定化用ペプチドのロイシンジッパー結合により、前記分子認識素子が前記基板に固定化されていることを特徴とするバイオセンサ。
２．前記基板固定化用ペプチド及び前記分子認識固定化用ペプチドが、複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含むことを特徴とする前項１のバイオセンサ。
３．前記基板固定化用ペプチドは、複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含み、
前記分子認識固定化用ペプチドが前記基板固定化用ペプチドの複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖にロイシンジッパー結合を介して結合しており、複数の分子認識素子が一つの基板固定化用ペプチドに固定化されていることを特徴とする前項１のバイオセンサ。
４．前記基板固定化用ペプチド及び前記分子認識固定化用ペプチドが、複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含み、
１又は複数の分子認識素子が一つの基板固定化用ペプチドに複数のロイシンジッパー結合を介して固定化されていることを特徴とする前項１のバイオセンサ。
５．前記複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位が、２〜１０であることを特徴とする前項２〜４のいずれか１のバイオセンサ。
６．基板と、
該基板に直接又は間接的に結合している配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド（基板固定化用ペプチド）と、
分子認識素子と、
該分子認識素子に直接又は間接的に結合している配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチド（分子認識素子固定化用ペプチド）と、を少なくとも備え、
前記分子認識固定化用ペプチドと前記基板固定化用ペプチドのロイシンジッパー結合により、前記分子認識素子が前記基板に固定化されていることを特徴とするバイオセンサ。
７．前記基板固定化用ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列の単位を１〜４個含むことを特徴とする前項６のバイオセンサ。
８．以下の工程を含む前記分子認識素子と特異的結合能を有する相互作用物質をスクリーニングするための方法；
（１）候補相互作用物質を前項１〜７のいずれか１に記載のバイオセンサに供給する、
（２）候補相互作用物質と分子認識素子の親和性を測定する。」
【発明の効果】
【００１１】
本発明では、分子認識素子が高密度に固定化された基板を有するバイオセンサの提供を可能とした。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（バイオセンサ用分子認識素子）
本発明の「分子認識素子」は、測定物質を認識する認識部位を少なくとも有する。
さらに、分子認識素子は、複数の認識部位を有することが好ましい。
なお、複数の認識部位は、各々測定物質の別個の領域を認識することが好ましい。
分子認識素子が１つの測定物質の２箇所以上の異なる領域を認識する場合には、１箇所を認識する場合と比較して、測定物質の結合能を向上させることができる（参照：K. Yokoyama et al., Proceedings of the Second International and the Seventeenth American Peptide Symposium, Ed. M. Lebl and R. A. Houghten, American Peptide Society, 2001, 202-203）。
さらに、複数の認識部位は、各々異なる測定物質を認識することもできる。これにより、本発明のバイオセンサは、異なる測定物質を同時に測定可能となる。
【００１３】
上記バイオセンサ用分子認識素子の創製方法として、測定物質に対して親和性を有するポリペプチドのスクリーニング方法が利用できる。例えば、ファージディスプレイ法、ペプチドシンセサイザーによるペプチド合成法、コンビナトリアルペプチドライブラリー方法、光を用いたパラレル合成法、部位特異的結合ペプチドの利用、相互作用する部位を検索してこれを利用する方法が挙げられる。しかしながら、本発明に用いることができるバイオセンサ用分子認識素子の創製方法は特に限定されず、目的とするアミノ酸配列を効率的に合成できる手法であれば良い。
【００１４】
また、分子中に複数個の認識部位を有する分子認識素子は、各認識部位をリンカーとなるペプチドで結合することで形成が可能である。なお、リンカーの配列及び鎖長は、コンピュータによるシミュレーションから得られる配列、既知のリンカー配列、相互作用をするタンパク質の結合部位周囲の配列を用いたものが挙げられるが、複数の結合ペプチド間を適度な物理的空間を保持していればよく、特に限定されない。
【００１５】
（ロイシンジッパー）
ロイシンジッパー（leucine zipper）は、真核生物の転写因子で見られるDNA結合ドメイン構造で、特異的なDNA配列と相互作用することが知られている。構造上、αへリックスを有する部位が存在し、DNA結合ドメイン内のαへリックスがDNAのmajor groove(主溝)内に配置されてDNAの原子との間で特異的水素結合やvan der Waals力によって相互作用している。
ロイシンジッパーは酵母の転写因子で発見され、７アミノ酸残基ごとに疎水性のアミノ酸のロイシン（leucine）が出現する構造を有する。これらロイシンに変異を入れた研究において、ロイシンは二量体形成に必須であることが後に明らかとなった。これら構造を有する二つの異なるペプチド鎖からなるヘテロ二量体は結合力が非常に高いことが知られている。
【００１６】
（ロイシンジッパー鎖）
ロイシンジッパー鎖には、数個のアミノ酸残基ごとに現われるロイシン（Ｌ）の間に、主として酸性アミノ酸が存在し全体的に負の電荷を示す酸性鎖と、主として塩基性アミノ酸が存在し全体的に正の電荷を示す塩基性鎖がある。また、前記酸性鎖と前記塩基性鎖が結合してヘテロダイマーを形成する（ロイシンジッパー結合）。
【００１７】
本発明で好適に使用されるロイシンジッパー塩基性又は酸性鎖の配列は以下の通りであるが、特に限定されない。
LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYRTRYGPLGAGPGAGSGAA（配列番号１）
LEIRAAALRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNEVSQYETRYGPL（配列番号２）
本発明のロイシンジッパー塩基性又は酸性鎖を含むペプチドは、上記配列からなるペプチド又は該ペプチドにさらにリンカー配列を含むペプチドである。
【００１８】
また、本発明のバイオセンサで使用するロイシンジッパー塩基性又は酸性鎖の配列は、上記配列に限定されない。本発明のバイオセンサで使用するロイシンジッパー塩基性又は酸性鎖の配列は、上記いずれかに記載のペプチド（配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列）と９０％以上の相同性を有しかつ該ペプチドと実質的同質のロイシンジッパー結合能を持つペプチド又は、上記いずれかに記載のペプチドに対して、１〜５個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しておりかつ実質的同質のロイシンジッパー結合能を持つペプチドも含める。
【００１９】
「配列番号１又は２に記載のペプチドと実質的に同質のロイシンジッパー結合能」とは、配列番号１又は２に記載のペプチドのロイシンジッパー結合能を奏することを意味し、その程度が該ペプチドのロイシンジッパー結合能と比較して強くても弱くてもよい。
【００２０】
「配列相同性」とは、通常、アミノ酸配列の全体で70％以上、好ましくは80％、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上であることが適当である。
【００２１】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列相同性を有するペプチドとして、例えば、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において、例えば1〜15個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらにより好ましくは1個〜3個、またさらに好ましくは1個〜2個、最も好ましくは1個のアミノ酸の変異、例えば欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表されるペプチドが例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと実質的に同質のロイシンジッパー結合能を有するものである限り特に制限されない。
さらに、好ましくは、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドのロイシン（Ｌ）以外のアミノ酸を置換する。
【００２２】
基板固定化用ペプチドとは、基板に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖を含むペプチドである。加えて、基板固定化用ペプチドは、複数、好ましくは２〜１０、３〜７のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含むことが好ましい（参照：図２）。
【００２３】
また、分子認識素子固定化用ペプチドとは、分子認識素子に直接又は間接的に結合しているロイシンジッパーの酸性鎖又は塩基性鎖を含むペプチドである。さらに、分子認識素子固定化用ペプチドは、複数、好ましくは２〜１０、３〜７のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖の単位を含むものでもよい。
【００２４】
（測定物質）
本発明の「測定物質」は、分子認識素子に特異的に認識されるものであれば特に限定されない。例えば、生体分子を含む有機分子および無機分子がある。
具体的には、環境汚染物質（例えば、農薬、殺虫剤、毒等）、治療的分子（例えば、低分子量薬）、生体分子｛例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖、ホルモン、サイトカイン、膜抗原、受容体（例えば、神経細胞の、ホルモンの、栄養素の、または細胞表面の受容体）｝、前記生体分子のリガンド又はその断片、全細胞（原核細胞、真核細胞を含み、哺乳類の腫瘍細胞を含む）、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等）、並びに胞子であってよい。特に好ましい測定物質は、生体中の病変部位で特定的に発現する微量タンパク質、特にヒト疾患腸管関連因子であるTNFα、IL-12、IL-6、血管内皮増殖因子（VEGF）等である。
【００２５】
（候補相互作用物質）
本発明の相互作用物質は、分子認識素子となんらかの相互作用をもたらす物質を意味する。相互作用とは、分子認識素子に対して、共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力等による結合を意味するが、特に限定されない。具体的な相互作用としては、分子認識素子の作用に対しアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、インヒビター、プロモーターになるような物質等を意味する。
また、上記作用の結果生じることによる、分子認識素子との結合反応、新たな物質の合成反応、分解反応も含まれる。
なお、候補相互作用物質は、相互作用物質の候補であり、本発明のバイオセンサを用いたスクリーニングにより相互作用物質であるかどうかが決定される。
【００２６】
（本発明のバイオセンサの構造）
本発明は、分子認識素子がロイシンジッパー結合を介して基板に結合されていることを特徴とするバイオセンサに関する（図１参照）。
さらに、本発明のバイオセンサは、複数の分子認識素子（１つのロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖を持つ）が一つの基板固定化用ペプチド（複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖を持つ）にロイシンジッパー結合を介して固定化されていることを特徴とするバイオセンサに関する（図２参照）。
また、本発明のバイオセンサは、１又は複数の分子認識素子（複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖を持つ）が一つの基板固定化用ペプチド（複数のロイシンジッパーの塩基性鎖又は酸性鎖を持つ）に複数のロイシンジッパー結合を介して固定化されていることを特徴とするバイオセンサに関する。
本発明のバイオセンサは、上記構成により、分子認識素子を高密度に基板に固定化可能であり、さらに測定物質を特異的かつ高感度で検出可能である。
特に、本発明のロイシンジッパー結合を利用したバイオセンサは、分子認識素子の配向性を向上させることができる。
さらに、本発明のロイシンジッパー結合を利用したバイオセンサは、複数の分子認識素子を基板の特定領域のみに固定化させることができる。これにより、本発明のバイオセンサは、異なる種類の分子認識素子を１つの基板に高密度に固定化することができる。
【００２７】
本発明のバイオセンサの「基板」は、基板固定化用ペプチドを直接的に固定する場合には、金や白金などの貴金属、カーボン、セラミックスなどの導電性の材料（例、電極等）及び／又は磁気性の材料（例、磁石、電磁石、コイル）であり、目的の反応のみを高感度に検出し、他の反応の影響を受けにくい材料ならなんでもよい。
また、基板固定化用ペプチドを間接的に基板に固定する場合には、ガラス、シリコン、プラスチック、ＰＭＭＡ、シリコン樹脂等が挙げられる。合成樹脂など絶縁性のある材料であり、任意の厚さで形成され、基板固定化用ペプチドを固定した導電性及び／又は磁気性材料の担体を安定的に固定化できる材料ならなんでもよい。
加えて、適した形態の例としては、箔、ワイヤー、ウェハ、チップ等であるが、特に限定されない。
【００２８】
また、基板固定化用ペプチドを基板に固定化する方法としては、自己組織化単分子層(SAMs)を利用した方法がある。SAMsは有機分子を金表面へ均一に導入することが可能であることから、生体分子を一定の配向性を保持しながら固定化することが可能であり、側鎖に様々な置換基を持った高分子を用いることができるため、表面特性の制御や機能性の付与も容易であることが知られている。
また、共有結合で分子を固定化できるため、担体から固定化した分子の脱離も少なく、操作も簡便でコスト面にも優れることから、固定化担体への分子認識素子の固定化法として有用であると考える。さらに、プラズマ重合法を用いた固定化法（WO 01/33227 A1）が挙げられる。
【００２９】
（分子認識素子の創製）
本発明の分子認識素子の創製方法は従来公知の方法を利用することができる。例えば、測定物質がタンパク質である場合を例に示す。
測定物質の表面に出ていると推定されるアミノ酸配列を１又は２以上を選択する。該選択したアミノ酸配列は、好ましくは１０〜４０、１５〜３５、２０〜３０アミノ酸数が好ましい。次に、該選択したアミノ酸配列を固相合成法等で合成する。合成したペプチドを適当な担体に固定して、ファージディスプレイ法等によって、該選択したアミノ酸配列を特異的に認識するアミノ酸配列を選抜する。次に、選抜したアミノ酸配列を固相合成法等で合成し、分子認識素子とする。なお、選抜したアミノ酸配列が２箇所以上なら、各選抜したアミノ酸配列をペプチド（好適には、グリシン等のアミノ酸）リンカー等で結合して分子認識素子とすることができる。
また、ペプチドの製造方法を以下により詳しく記載する。
【００３０】
ペプチドの製造は、遺伝子工学的手法、化学合成、および無細胞タンパク質合成により実施できる。ペプチドは、製造された後に、さらに精製して用いることができる。
ペプチドの製造は、該ペプチドをコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的な遺伝子工学的手法（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社；ウルマー（Ulmer, K.M.）、「サイエンス（Science）」、1983年、第219巻、p. 666-671；エールリッヒ（Ehrlich, H.A.）編、「PCRテクノロジー，DNA増幅の原理と応用」、1989年、ストックトンプレス）により実施できる。
【００３１】
ペプチドの製造はまた、一般的な化学合成法により製造できる。ペプチドの化学合成方法として、例えば、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、アジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、N−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等）法、およびウッドワード法等を例示できる。
【００３２】
ペプチドの精製および／または分離は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび透析法等の公知の方法を例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作製し、該抗体により特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーが推奨される。
【００３３】
（本発明のバイオセンサを用いたスクリーニング）
本発明のバイオセンサを用いた分子認識素子と特異的結合能を有する相互作用物質をスクリーニングする方法を以下に示す。しかしながら、本発明のスクリーニング方法は以下に限定されない。
（１）候補相互作用物質を本発明のバイオセンサの基板上に添加する。
（２）候補相互作用物質と分子認識素子の親和性を測定する。
なお、上記親和性の測定方法は、候補相互作用物質と分子認識素子の親和性を測定できる方法であれば特に限定されないが、例えば、表面プラズモン共鳴法、蛍光物質標識法、抗体利用法等が挙げられる。好ましくは表面プラズモン共鳴法である。
【００３４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を具体的に説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００３５】
（基板固定化用ペプチドの作製）
以下の方法で、基板固定化用ペプチド及び基板固定化用リンカーを作製した。なお、該基板固定化用ペプチドと基板間には該基板固定化用リンカーを挿入した。
【００３６】
（基板固定化用リンカーのDNA断片の作製）
N末端から9残基に複数のシステイン残基を含むペプチド鎖（基板固定化用リンカー）をコードするDNA断片は、各塩基配列を混合した溶液において、Applied Biosystems社製GeneAmp PCR System 9700を用いてPCRを行った。
PCRの条件は、「温度条件：98℃ 10秒→98℃ 5秒、57℃ 10秒、72℃ 10秒（5サイクル）→98℃ 5秒、65℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」である。
得られたPCR産物は、2%アガロース（Agarose X, 和光純薬）を用いて電気泳動によって確認した（参照：図３）。
【００３７】
次に、上記得られたPCR産物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて処理した。その後、得られたDNA溶液は制限酵素BglII（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した。消化反応後、1/10量の3.0M Sodium acetate (pH 5.2)を添加した後、2倍量の99.5% Ethanolを添加し、15000rpm、4℃、10分間遠心分離（TOMY社 MX-300、ローター：AR015-24）をおこなった後、上清を除き、500μlの70% Ethanol溶液を加えた。その後、15000rpm、4℃、5分間遠心分離（TOMY社 MX-300、ローター：AR015-24）をおこなった後、真空乾燥し、ここに10μlのTE溶液（pH7.6）を滴下したものを基板固定化用リンカーのDNA断片として得た。
【００３８】
（ロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片の作製）
ロイシンジッパー断片は、C末端にリンカー配列を付加したものを用いた。アミノ酸配列は、LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYRTRYGPLGAGPGAGSGAA（配列番号１）にリンカー配列（GPGSG：配列番号４）を加えたものである。
【００３９】
上記アミノ酸配列は、以下のようにして作製した。
下記1)から8)の配列を有する1本鎖DNAを合成し、以下の条件でPCRをおこなった。
1)TTTCAAGAGCTGTATTCTCTTGTTCGAGGAATGCAGCCTCAATTTCTAATCCAGGCGCTGAGCCAGC（配列番号５）
2)CCTGGTTCTGTACTGACTCACTATATTCTCGAGCCGCTGGACCTCTTGTTCTAGCTCGGCAACTTCCG（配列番号６）
3)CTGCCCCTGACCCGGCTCCAGGGCCAGCACCCAGAGGCCCGTA（配列番号７）
4)TGAGTCAGTACAGAACCAGGTACGGGCCTCTGGG（配列番号８）
5)CAAGAGAATACAGCTCTTGAAACGGAAGTTGCCGAG（配列番号９）
6)CCGGGTCAGGGGCAGCTGGCCCAGGTTCCGGG（配列番号１０）
7)GAAGATCTGCTGGCTCAGCGCCT（配列番号１１）
8)CCGGAATTCCGCGGATCCCCCGGAACCTGGGC（配列番号１２）
なお、上記配列番号５〜１０のDNA断片を鋳型として使用した。また、配列番号１１、１２のDNA断片は両末端の配列とした。
【００４０】
PCRの条件は、「98℃ 10秒→98℃ 5秒、57℃ 10秒、72℃ 10秒（5サイクル）→98℃ 5秒、65℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」である。
得られたPCR産物は、2%アガロース（Agarose X, 和光純薬）を用いて電気泳動によって確認した（参照：図４）。
さらに、得られたPCR産物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて処理した。その後、得られたDNA溶液は制限酵素BglII（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した。反応後、1/10量の3.0M Sodium acetate (pH 5.2)を添加した後、2倍量の99.5% Ethanolを添加し、15000rpm、4℃、10分間遠心分離（TOMY社 MX-300、ローター：AR015-24）をおこなった後、上清を除き、500μlの70% Ethanol溶液を加えた。その後、15000rpm、4℃、5分間遠心分離（TOMY社 MX-300、ローター：AR015-24）をおこなった後、真空乾燥し、ここに10μlのTE溶液（pH7.6）を滴下したものを基板固定化用ペプチドのDNA断片として得た。
【００４１】
（プラスミドベクターの制限酵素処理）
本発明では、タンパク質大量発現系プラスミドベクター  pGEX-6P-1（GEヘルスケア）を用いた。まず、プラスミドベクターを制限酵素BamHI（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した後、ここに1/10量の3.0M Sodium acetate (pH 5.2)を添加し、さらに2倍量の99.5% Ethanolを添加した後、15000rpm、4℃で10分間、遠心分離（TOMY社 MX-300、ローター：AR015-24）をおこなった。
その後、上清を除き、ここに500μlの70% Ethanol溶液を加えた。さらに、15000rpm、4℃で5分間遠心分離（TOMY社 MX-300、ローター：AR015-24）をおこなった後、真空乾燥して10μlのTE溶液（pH7.6）を滴下したものを用いた。
【００４２】
なお、１個のロイシンジッパー鎖をコードするペプチドのＤＮＡ断片の作製の場合は、N末端から9残基に複数のシステイン残基を含むペプチド鎖（基板固定化用リンカー）の配列を有するプラスミドベクターを制限酵素で消化し、ここで配列番号１のアミノ酸をコードするDNA断片を１コピーのみ有するクローンを選択した。この結果、「（基板固定化用リンカー配列）―（配列番号１）」の構造を有するクローンを得た。
２個のロイシンジッパー鎖をコードするペプチドのＤＮＡ断片の作製の場合は、基板固定化用リンカー配列に配列番号１をコードするDNA断片を有するクローンを制限酵素で消化し、ここで配列番号１をさらに１コピー追加したクローンを選択した。この結果、「（基板固定化用リンカー配列）―（配列番号１）―（配列番号１）」構造を有するクローンを得た。
３個のロイシンジッパー鎖をコードするペプチドのＤＮＡ断片の作製の場合は、基板固定化用リンカー配列に配列番号１を２つ直列に持つクローンを制限酵素で消化し、ここで配列番号１をさらに１コピー追加したクローンを選択した。この結果、「（基板固定化用リンカー配列）―（配列番号１）―（配列番号１）―（配列番号１）」構造を有するクローンを得た。
４個のロイシンジッパー鎖をコードするペプチドのＤＮＡ断片の作製の場合は、基板固定化用リンカー配列に配列番号１を３つ直列に持つクローンを制限酵素で消化し、ここで配列番号１をさらに１コピー追加したクローンを選択した。この結果、「（基板固定化用リンカー配列）―（配列番号１）―（配列番号１）―（配列番号１）―（配列番号１）」構造を有するクローンを得た。
【００４３】
（タンパク質大量発現用ベクターの作製）
（１）：基板固定化用リンカー
制限酵素BamHIおよびEcoRIで消化したベクターは、まず、基板固定化用リンカーDNA断片とDNAリガーゼ（宝酒造、Takara Ligation Kit Ver.2）を用い、16℃で15分間反応した。その後、大腸菌コンピテントセル（JM109）を50μl添加し、氷上で10分間静置した後、42℃にて30秒間ヒートショックを与え、直後に氷上にて2分間静置した。
その後、SOC培地(20g bacto tryptone, 5g bacto yeast extract, 10ml 1M NaCl, 2.5ml 1M KCl/1L)を450μl添加し、37℃で10分間浸透培養した溶液を、100μg/ml アンピシリン含有LB培地(10g polypeptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g bacto agar/1L)に播種して1晩37℃で培養した。
【００４４】
目的のDNA断片が正しく挿入されたか確認するために、得られたコロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの条件は、「温度条件：98℃ 30秒→98℃ 3秒、50℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ ３分→4℃」であった。
その後得られたPCR産物は2%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認した（参照：図５）。
【００４５】
（２）：１つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片
ベクターに目的のDNA断片が挿入されたクローンは、10mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）含有LB培地で培養し、アルカリ法を用いてプラスミドを回収・精製した。
精製したプラスミドDNA断片は制限酵素BamHI（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて精製した。
本ベクターは、あらかじめ制限酵素BglIIおよびEcoRIで消化しておいたロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片とDNAリガーゼ（宝酒造、Takara Ligation Kit Ver.2）を用いて、16℃で15分間反応した。その後反応液は大腸菌コンピテントセル（JM109）50μlと混合し、氷上で15分間静置した後、42℃にて30秒間ヒートショックを与え、直後に氷上にて2分間静置した。
その後、SOC培地を450μl添加し、37℃で20分間浸透培養した溶液を、100μg/ml アンピシリン含有LB培地に播種して1晩37℃で培養した。
【００４６】
目的のDNA断片が正しく挿入されたか確認するために、得られたコロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの条件は、「温度条件：98℃ 30秒→98℃ 3秒、50℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」であった。
その後得られたPCR産物は2%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認した（参照：図６）。
【００４７】
（３）：２つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片
ベクターにロイシンジッパーをコードするDNA断片が２分子挿入されたクローンは、10mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）含有LB培地で培養し、アルカリ法を用いてプラスミドを回収・精製した。
精製したプラスミドDNA断片は制限酵素BamHI（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて精製した。
本ベクターは、あらかじめ制限酵素BglIIおよびEcoRIで消化しておいた２つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片とDNAリガーゼ（宝酒造、Takara Ligation Kit Ver.2）を用いて、16℃で15分間反応した。
その後反応液は大腸菌コンピテントセル（JM109）50μlと混合し、氷上で15分間静置した後、42℃にて30秒間ヒートショックを与え、直後に氷上にて2分間静置した。その後、SOC培地を450μl添加し、37℃で20分間浸透培養した溶液を、100μg/ml アンピシリン含有LB培地に播種して1晩37℃で培養した。
【００４８】
目的のDNA断片が正しく挿入されたか確認するために、得られたコロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの条件は、「温度条件：98℃ 30秒→98℃ 3秒、50℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」であった。その後得られたPCR産物は2%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認した（参照：図７）。
【００４９】
（４）：３つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片
ベクターにロイシンジッパーをコードするDNA断片が３分子挿入されたクローンは、10mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）含有LB培地で培養し、アルカリ法を用いてプラスミドを回収・精製した。
精製したプラスミドDNA断片は制限酵素BamHI（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて精製した。
本ベクターは、あらかじめ制限酵素BglIIおよびEcoRIで消化しておいた３つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片とDNAリガーゼ（宝酒造、Takara Ligation Kit Ver.2）を用いて、16℃で15分間反応した。
その後、反応液は大腸菌コンピテントセル（JM109）50μlと混合し、氷上で15分間静置した後、42℃にて30秒間ヒートショックを与え、直後に氷上にて2分間静置した。その後、SOC培地を450μl添加し、37℃で20分間浸透培養した溶液を、100μg/ml アンピシリン含有LB培地に播種して1晩37℃で培養した。
【００５０】
目的のDNA断片が正しく挿入されたか確認するために、得られたコロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの条件は、「温度条件：98℃ 30秒→98℃ 3秒、50℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」であった。
その後得られたPCR産物は2%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認した（参照：図８）。
【００５１】
（５）：４つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片
ベクターにロイシンジッパーをコードするDNA断片が４分子挿入されたクローンは、10mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）含有LB培地で培養し、アルカリ法を用いてプラスミドを回収・精製した。
精製したプラスミドDNA断片は制限酵素BamHI（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて消化した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて精製した。
本ベクターは、あらかじめ制限酵素BglIIおよびEcoRIで消化しておいた４つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片とDNAリガーゼ（宝酒造、Takara Ligation Kit Ver.2）を用いて、16℃で15分間反応した。
その後反応液は大腸菌コンピテントセル（JM109）50μlと混合し、氷上で15分間静置した後、42℃にて30秒間ヒートショックを与え、直後に氷上にて2分間静置した。その後、SOC培地を450μl添加し、37℃で20分間浸透培養した溶液を、100μg/ml アンピシリン含有LB培地に播種して1晩37℃で培養した。
【００５２】
目的のDNA断片が正しく挿入されたか確認するために、得られたコロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの条件は、「温度条件：98℃ 30秒→98℃ 3秒、50℃ 10秒、72℃ 10秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」であった。その後得られたPCR産物は2%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認した（参照：図９）。
【００５３】
上記結果により、N末端に基板固定化用リンカー配列を有し、１〜４のロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片が導入されたタンパク質大量発現ベクターを取得することができた。
【００５４】
（N末端に基板固定化用リンカー配列を有し、１〜４のロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドの作製）
上記得られたプラスミドは大腸菌BL21株に以下の操作をおこない形質転換した。
プラスミド（1μl）を50μlの大腸菌コンピテントセル（BL21）に氷上で混合し、15分間静置した。その後42℃にて30秒間ヒートショックを与え、直後に氷上にて2分間静置した。さらに、400μl のSOC培地を添加し、37℃で20分間浸透培養した溶液を、アンピシリン含有（終濃度100μg/ml）LB培地に播種して1晩37℃で培養した。
【００５５】
目的のプラスミドが正しく導入されたクローンか確認するために、コロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの条件は、「温度条件：98℃ 30秒→98℃ 3秒、50℃ 10秒、72℃ 30秒（25サイクル）→72℃ 3分→4℃」である。
その後得られたPCR産物は1%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認し、プラスミドが正しく導入されたクローンを用いて実験をおこなった。なお、図１０〜１３にコロニーPCRをおこなった結果を示す。
【００５６】
大腸菌BL21株は10mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）を含むLB培地を用いて1晩37℃で前培養した。その後、100〜200mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）を含むLB培地で本培養した後、分光光度計を用いて吸光度が1（λ=660nm）になるまで37℃で培養した。
吸光度が1になった後、終濃度が1mMになるようにIPTGを添加して2〜3時間室温にて振とう培養を継続した。培養終了後、大腸菌は遠心分離器（TOMY社 MX-300）を用いて沈殿し、ダルベッコPBS（和光純薬）で2回洗浄した。
その後、沈殿物はPBSにComplete Mini（Roche社）を添加した溶液を用いて2mlエッペンドルフ試験管に回収し、超音波細胞破砕装置（BIORUPTOR、コスモバイオ社）を用いて30秒間ON、30秒間OFFの条件で10〜15分間処理した。超音波細胞破砕した溶液は、15000rpm、4℃で20分遠心分離した後、上清を0.22μmフィルター（ミリポア社）処理して、Glutathione Sepharose 4Bカラム（GEヘルスケア社）に添加した。またカラムは担体の5倍量以上のTE（pH7.6）溶液で洗浄した後、PreScission Protease（GEヘルスケア社）を添加して、4℃で1晩静置した。さらに、Protease処理したカラムにTE(pH7.6)またはダルベッコPBSを添加して適量回収して目的とするペプチド鎖（N末端に基板固定化用リンカー配列を有し、１〜４のロイシンジッパー鎖を含む基板固定化用ペプチド）を得た。
【実施例２】
【００５７】
（分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子が結合したペプチド鎖の作製）
分子認識素子として、測定物質であるEGFレセプター分子を特異的に認識する配列（ENFSGGCVAGYMRTPDGRCKPTFYQ：配列番号３）を使用した。
また、分子認識素子固定化用ぺプチドとして、配列番号２（LEIRAAALRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNEVSQYETRYGPL）に記載の配列を使用した。加えて、前記分子認識素子と分子認識素子固定化用ぺプチド間には、リンカー配列（GPGSG：配列番号４）を挿入した。
分子認識素子固定用ペプチドとロイシンジッパー鎖が結合したペプチド鎖の作製の詳細は、以下の通りである。
【００５８】
下記1)から8)の配列を有する1本鎖DNAを合成し、下記に記載の条件でPCRをおこなった。
下記の配列有する1本鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれ1pmol/μlになるように調整し、50μlの反応系に1μlずつ滴下した。
1)CGCCGGAGTGCGGCAGCCCGAATCTCGAG（配列番号１３）
2)CTGCCGCACTCCGGCGTCGAAATACTGCGCTG（配列番号１４）
3)CGGCAACCCTGGTTCTCAGCGCAGTATTTCGA（配列番号１５）
4)AGAACCAGGGTTGCCGAACTTAGGCAGAGGG（配列番号１６）
5)ATTCCGTAGTCTTTGTACCCTCTGCCTAAGTT（配列番号１７）
6)TACAAAGACTACGGAATGAGGTTTCACAATATG（配列番号１８）
7)CCGTACCGAGTTTCATATTGTGAAACCTC（配列番号１９）
8)AAACTCGGTACGGGCCCCTTGGACCTGGCTCTGGA（配列番号２０）
9)CCTCCGCTAAAATTCTCTCCAGAGCCAGGTCCAAGGGGC（配列番号２１）
10)GAGAATTTTAGCGGAGGCTGTGTAGCAGGGTATAT（配列番号２２）
11)ACCATCGGGTGTTCGCATATACCCTGCTACACAG（配列番号２３）
12)GCGAACACCCGATGGTAGATGCAAACCGACCTTTTATCAA（配列番号２４）
さらに、下記の配列を有する1本鎖オリゴヌクレオチドをそれぞれ10pmol/μlになるように調整し、50μlの反応系に1μlずつ滴下した。
13)CGGGATCCCTCGAGATTCGGG（配列番号２５）
14)GGAATTCTTGATAAAAGGTCGGTTTGCATCT（配列番号２６）
なお、上記配列番号１３〜２４のDNA断片を鋳型として使用した。また、配列番号２５、２６のDNA断片は両末端の配列とした。
【００５９】
以下の条件によりPCRを行った。
温度条件：98℃ 30秒→98℃ 10秒、57℃ 10秒、72℃ 10秒（30サイクル）→72℃ 10分→4℃
上記PCRで得られたPCR産物は、2.5% LMPアガロース（Promega社）を用いて電気泳動によって確認した（図１４）。
さらに、得られたPCR産物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて処理した。その後、得られたDNA溶液を制限酵素BamHI（宝酒造）およびEcoRI（Roche社）を用いて30℃で3時間消化反応した。反応後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega社)を用いて処理した。得られたDNA断片は、あらかじめ制限酵素BamHIおよびEcoRIで消化しておいたタンパク質大量発現ベクターpGEX-6P-1とDNAリガーゼ（宝酒造、Takara Ligation Kit Ver.2）を用いて、4℃で1晩反応した後、反応液を大腸菌ECOS BL21コンピテントセル（和光純薬）50μlと混合し、1秒間ボルテックスを用いて混合し、氷上で5分間静置した。その後、42℃にて45秒間ヒートショックを与え、さらに1秒間ボルテックスして100μg/ml アンピシリン含有LB培地に播種して1晩37℃で培養した。
【００６０】
目的のDNA断片が正しく挿入されたか確認するために、得られたコロニーを選択して以下の条件でPCRをおこなった。この際、プライマーは、pGEX sequencing primer ForwardおよびReverse（GEヘルスケア社）を用いた。PCRの熱サイクル条件は、温度条件：98℃ 30秒→98℃ 10秒、65℃ 10秒、72℃ 20秒（35サイクル）→72℃ 10分→4℃であった。その後得られたPCR産物は2%アガロースゲル電気泳動（Agarose X、和光純薬）にて挿入断片の鎖長を確認した（図１５）。
【００６１】
（分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子が結合したペプチド鎖の大量発現）
分子認識素子固定用ペプチドとロイシンジッパー鎖が結合したペプチド鎖の配列を有する大腸菌BL21株クローンは30mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）を含むLB培地を用いて1晩37℃で前培養した。この培養液を5ml、新たに調整した35mlのアンピシリン（終濃度100μg/ml）を含むLB培地で本培養した後、分光光度計を用いて吸光度が1（λ=660nm）になるまで37℃で培養した。吸光度が1になった後、終濃度が1mMになるようにIPTGを添加して3時間室温にて振とう培養を継続した。培養終了後、大腸菌は遠心分離器（TOMY社 MX-300）を用いて沈殿し、ダルベッコPBS（和光純薬）で2回洗浄した。その後、沈殿物はPBSにComplete Mini（Roche社）を添加した溶液を用いて2mlエッペンドルフ試験管に回収し、超音波細胞破砕装置（BIORUPTOR、コスモバイオ社）を用いて30秒間ON、30秒間OFFの条件で15分間処理した。超音波細胞破砕した溶液は、15000rpm、4℃で20分遠心分離した後、上清を0.22μmフィルター（ミリポア社）処理して、Glutathione Sepharose 4Bカラム（GEヘルスケア社）に添加した。カラムは担体の5倍量以上のTE（pH7.6）溶液で洗浄した後、ここにPreScission Protease（GEヘルスケア社）を添加して、4℃で1晩静置し、TE(pH7.6)を添加して回収したものを用いた。精製後のペプチド鎖をSDS-PAGE法を用いて確認した。
【実施例３】
【００６２】
（基板固定化用ペプチドの基板への固定及び分子認識素子による測定物質の結合確認）
精製した分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子が結合したペプチド鎖が、SPR装置（Biacore3000）を用いてEGFレセプターを検出できるか確認した。詳細は、以下の通りである。
【００６３】
使用したセンサーチップはSIA kit Au（Biacore社）を用いた。分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子が結合したペプチド鎖は末端にロイシンジッパーの配列を有しているため、予め基板固定化用ペプチドが固定化されたSPRチップに固定化した。
分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子が結合したペプチド鎖をダルベッコPBS溶液を用いて希釈し、5μl/minで10分間送流したときのSPRシグナルの変化量を測定した。
【００６４】
上記測定結果を図１６に示す。
センサー表面は測定毎に１分間50 mM NaOH溶液を送流して、シグナルの値から固定化の有無を確認した。１〜４のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチドに、EGFレセプター認識ペプチドはそれぞれ、2408.0RU（図１６のＡ：１個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）、3382.7RU（図１６のＢ：２個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）、3189.8RU（図１６のＣ：３個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）、3085.2RU（図１６のＤ：４個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）結合した。
【００６５】
（EGFレセプター細胞外ドメインの検出）
EGFレセプターを認識する分子認識素子と分子認識素子固定用ペプチドが結合したペプチド鎖を基板固定化用ペプチドを介して（ロイシンジッパー結合）SPRチップに固定化した。該SPRチップに、50ng/μlのEGFレセプター細胞外ドメイン（R&D Systems社）を流速5μl/minで10分間送流したときのSPRシグナルの変化量を測定した。
【００６６】
上記結果を図１７に示す。この結果から分子認識ペプチドが１〜４分子結合していると考えられた固定化担体を用いた場合、それぞれ653.8 RU（図１７のＡ：１個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）、716.6 RU（図１７のＢ：２個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）、723.1 RU（図１７のＣ：３個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）、836.1RU（図１７のＤ：４個のロイシンジッパー鎖を有する基板固定化用ペプチド）となり、結合可能な分子の個数が多いほどシグナルが高い結果が得られた。
また、分子認識素子を固定化したSPRチップにBSAを流速5μl/minで10分間送流したとき（図１８のＸ：ＢＳＡ送流開始点、Ｙ：ＢＳＡ送流終了点）は優位なシグナルの変化は観察されなかった（参照：図１８）。
これらの結果から、EGFレセプター分子認識素子は特異的に検出でき、さらに、分子認識ペプチドの固定化量の違いにより、より高感度な測定が実現できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の実施態様のバイオセンサ
【図２】本発明の別の実施態様のバイオセンサ
【図３】基板固定化用リンカーのDNA断片の電気泳動
【図４】ロイシンジッパー鎖をコードするDNA断片の電気泳動
【図５】基板固定化用リンカーのDNA断片の電気泳動
【図６】１つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片の電気泳動
【図７】２つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片の電気泳動
【図８】３つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片の電気泳動
【図９】４つのロイシンジッパー鎖をコードする基板固定化用ペプチドのDNA断片の電気泳動
【図１０】コロニーPCRをおこなった結果
【図１１】コロニーPCRをおこなった結果
【図１２】コロニーPCRをおこなった結果
【図１３】コロニーPCRをおこなった結果
【図１４】分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子が結合したペプチド鎖をコードするDNA断片
【図１５】分子認識素子固定用ペプチドと分子認識素子をベクターに導入したクローン選択のためのコロニーPCRの結果
【図１６】EGFレセプターの検出
【図１７】EGFレセプター細胞外ドメインの検出
【図１８】BSAの検出
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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