(57)【要約】【課題】正確に紫外線照射による影響を評価できる、生体皮膚に近似した３次元培養皮膚モデルを開発すること。【解決手段】以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む、人為的に作製された真皮（真皮同等物）層を有する３次元培養皮膚モデル。（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層。（２）表皮角化細胞の層。（３）（１）の真皮同等物の層と、（２）の表皮角化細胞の層との間に、生着したメラノサイト。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む、人為的に作製された真皮（真皮同等物）層を有する３次元培養皮膚モデル。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層。
（２）表皮角化細胞の層。
（３）（１）の真皮同等物の層と、（２）の表皮角化細胞の層との間に、生着したメラノサイト。
【請求項２】
請求項１に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射の皮膚に対する影響を調べる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射の皮膚に対する影響に対する薬剤の影響を調べる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の皮膚モデルの製造方法であって、以下の（１）〜（３）に記載の工程を順次行う工程を含むことを特徴とする製造方法。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養して、真皮同等物の層を作製する。
（２）（１）で作製した真皮同等物の層上に、メラノサイトをコラーゲンと共に播種し、充分な時間をかけて真皮層に接着させる。
（３）（２）で作製したメラノサイトが接着した真皮同等物の層のメラノサイトが結合した側の層上に、表皮角化細胞を播種し三次元培養する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線照射に対してメラニン色素産生が亢進する新規な３次元培養皮膚モデル、およびこの３次元培養皮膚モデルを用いた紫外線照射の影響の評価方法、および紫外線照射に対する薬剤効果を調べる薬剤評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物愛護の観点から動物実験を行わずに医薬品や化粧品原料の安全性評価等の試験を行う、いわゆる動物実験代替法が盛んに研究されている。その中のひとつとして、皮膚に関する毒性や皮膚科学研究を行うための３次元培養皮膚モデルが種々開発されている。このうち、美白剤研究に用いるため、皮膚モデルの構成細胞としてメラノサイトを含む３次元皮膚モデルも開発されている。
【０００３】
しかしながら、生体皮膚から分離作成した真皮層（ＤＥＤ；Ｄｅ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  Ｄｅｒｍａｌ）の上に表皮角化細胞を重層化して作製した３次元培養皮膚モデルでは、紫外線に反応してメラニン産生が亢進するものは報告されているが（非特許文献１）、人為的に作製した真皮層を基に作られた３次元培養皮膚モデルで、且つ、紫外線照射に充分反応するモデルはこれまでに報告が無かった。
【０００４】
この大きな原因は、メラノサイトが真皮層と表皮層の境界、すなわち表皮基底層に容易には生着しないためである。即ち、コラーゲンと線維芽細胞を用いて人為的に作製した真皮（本明細書では「真皮同等物」とも表現する。）層の場合、この真皮層上にメラノサイトを播種し、更に表皮角化細胞を播種して表皮層を形成させると、メラノサイトは基底層に生着することなく表皮の重層化に伴い表皮上層に押し上げられてしまい、その機能を失ってしまう。
【０００５】
現在、商業的に作製されているメラノサイトを含む３次元皮膚モデルは、何れも真皮層は有さず、透過性膜上にメラノサイトを播種し、その上に表皮角化細胞を重層化させて表皮層を作製し培養皮膚モデルとしている。この場合、メラノサイトは透過性膜を足場としてここに生着しているためメラノサイトの機能をある程度発揮し、メラニン色素を作り出すことが可能である。しかし、これは生体の皮膚構造を再現したものとは言えず、このため、こうした皮膚モデルは特に紫外線照射に対しての反応性は再現性があまり良くないという問題があった。
【０００６】
このような背景から、正確に紫外線照射による影響を評価できる、生体皮膚に近似した３次元培養皮膚モデルの開発が真に望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，  ２００３  ｖｏｌ．１２，  ６４−７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、コラーゲンおよび繊維芽細胞を含む真皮同等物の層を有する３次元培養皮膚モデルであって、更に構成細胞としてメラノサイトおよび表皮角化細胞を含み、照射された紫外線に反応してメラノサイトにおけるメラニン色素産生能が亢進することを特徴とする３次元培養皮膚モデルを提供すること、およびこのモデルを使って紫外線照射の影響や紫外線照射に対する薬剤の影響を調べる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記のような目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、線維芽細胞およびコラーゲンを含む真皮同等物の層を作製後、メラノサイトをコラーゲンと共に播種し、充分な時間をかけて真皮層に接着させた後に、表皮角化細胞を播種、培養して３次元培養皮膚モデルを作製することで、メラノサイトが表皮基底層に生着した培養皮膚モデルを安定的に作製できることを見出した。こうして作製した３次元皮膚モデルは、紫外線に対し良好な反応性を有している。即ち、人為的に作製された真皮層を有する３次元培養皮膚モデルの基底層にメラノサイトを生着させることに成功し、紫外線に対してメラノサイトが良好に反応してメラニンを産生することが可能な３次元培養皮膚モデルを完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本願発明の概要は以下の通りである。
［１］以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む、人為的に作製された真皮（真皮同等物）層を有する３次元培養皮膚モデル。（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層。（２）表皮角化細胞の層。（３）（１）の真皮同等物の層と、（２）の表皮角化細胞の層との間に、生着したメラノサイト。
［２］［１］に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射の皮膚に対する影響を調べる方法。
［３］［１］に記載の皮膚モデルを使用して、紫外線照射の皮膚に対する影響に対する薬剤の影響を調べる方法。
［４］［１］に記載の培養皮膚モデルの製造方法であって、以下の（１）〜（３）に記載の工程を順次行う工程を含むことを特徴とする製造方法。（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養して、真皮同等物の層を作製する。（２）（１）で作製した真皮同等物の層上に、メラノサイトをコラーゲンと共に播種し、充分な時間をかけて真皮層に接着させる。（３）（２）で作製したメラノサイトが接着した真皮同等物の層のメラノサイトが結合した側の層上に、表皮角化細胞を播種し三次元培養する。
【発明の効果】
【００１１】
上述のように本発明によって、真皮層（真皮同等物層）を有する３次元培養皮膚モデルを使用した紫外線照射の影響を調べる実験が可能となった。さらに、本発明は、この３次元培養皮膚モデルを使用して、紫外線照射に対する薬剤効果を調べる薬剤評価方法を提供することが可能となった。
【００１２】
人為的に作製した真皮層を基に作られた３次元培養皮膚モデルで紫外線照射に充分反応するモデルはこれまでに報告が無く、本発明は紫外線照射にシミや皮膚の老化などのメカニズム解明やこうした症状を改善する薬剤の開発に有用な動物代替モデルとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明を用いた実施例１における、紫外線照射４日後の皮膚組織内メラニン量の比較を示すグラフである。
【図２】本発明を用いた実施例２における、皮膚組織切片のフォンタナマッソン染色およびヘマトキシリン・エオジン染色像である。フォンタナマッソン染色像において黒く染まった部分がメラノサイトを示す。表皮形成過程およびその後も基底層にメラノサイトが生着していることが確認できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の具体的な実施の形態を説明する。
本発明の３次元培養皮膚モデルは、以下の（１）〜（３）に記載の構造を含む、人為的に作製された真皮（真皮同等物）層を有する３次元培養皮膚モデルである。
（１）コラーゲンおよび繊維芽細胞を混合したものを培養することにより得られる、真皮同等物の層。
（２）表皮角化細胞の層。
（３）（１）の真皮同等物の層と、（２）の表皮角化細胞の層との間に、生着したメラノサイト。
【００１５】
本発明の３次元培養皮膚モデルは、例えば以下の方法により作製することが出来る。
まず線維芽細胞およびコラーゲンを含む真皮同等物をトランスウェルなどの支持膜体のある培養基の中に作製する。線維芽細胞は市販されている凍結ヒト線維芽細胞をフラスコで拡大培養し回収したものが好適に用いることができる。コラーゲンは、市販のウシ由来タイプＩコラーゲン（高研、Ｃｏｄｅ：Ｉ−ＰＣ）などが好適に用いることが出来るがこの限りではない。
【００１６】
コラーゲンと線維芽細胞を混合したものを一定期間培養すると、コラーゲンが収縮し、真皮同等物が形成される。しかる後に、真皮層の上にメラノサイトを播種する。メラノサイトは、市販の凍結ヒトメラノサイトをフラスコで拡大培養し回収したものが好適に用いることができる。
【００１７】
このとき、メラノサイトを真皮同等物上に効率よく接着させるために、メラノサイトの懸濁液にコラーゲンを加え、メラノサイトを播種した後、充分な時間をかけて培養する。  この工程の培養時間はメラノサイトが接着されるに充分な時間であれば特に限定されないが、８時間以上が好ましく、さらには２４時間以上が好ましい。ただし培養時間が長すぎるとこの時点でメラノサイトの色素産生が亢進してしまうため、１２０時間を越えることは好ましくなく、可能であれば７２時間以下が好ましい。メラノサイトが接着したことを確認する方法は、特に限定されないが、例えば、作製した組織切片をフォンタナマッソン染色することによりメラノサイトが黒く染まることで確認できる。
メラノサイトを接着させた後、表皮角化細胞を播種し、更に培養する。表皮角化細胞は、市販の凍結ヒト表皮角化細胞をフラスコで拡大培養し回収したものを好適に用いることができる。ここから更に一定期間培養した後、上面を空気に暴露した状態にし、更に培養を行い表皮重層化および角質形成をさせ本発明の３次元培養皮膚モデルを完成させる。
【００１８】
更に、本発明では、上記の３次元培養皮膚モデルを用いて紫外線照射の皮膚に対する影響を調べることが出来る。
また、これを応用して紫外線照射に対する薬剤の効果、すなわち、紫外線照射の皮膚に対する影響に対する薬剤の影響を調べ、薬剤評価を行うことが出来る。例えば一定期間、本発明の３次元培養皮膚モデルの上面への紫外線照射と薬剤の添加を繰り返し、その後、皮膚組織内のメラニン量を測定することにより薬剤の評価を行うことが出来る。
【００１９】
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
１．３次元培養皮膚モデルの作製
（１）培養皮膚支持体コラーゲンゲル（真皮同等物）の作製：
コラーゲンゲル作製方法はベルらの方法（Ｂｅｌｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  第７６巻、第１２７４項、１９７９）に準じて行った。オルガノジェネシス社から購入したヒト繊維芽細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛血清含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地（ＳＩＧＭＡ製）にて培養し、サブコンフレントに達した後、同培地にて細胞を回収し、繊維芽細胞懸濁液を得た。４℃において、９容量のコラーゲン溶液（オルガノジェネシス社製）に１容量の１０倍濃度のＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）培地（ギブコ社製）を加え、重曹をｐＨが中性付近になるまで攪拌しながら加えた。さらに１０％（ｖ／ｖ）量の牛血清を加えた後、上記繊維芽細胞懸濁液を最終細胞濃度が２．５×１０４  個／ｍｌになるようゆっくり加え、良く攪拌した。
【００２１】
上記のようにして得られた混合溶液を６穴プレートに入ったトランスウェル（コースター社製）の内側に３ｍｌずつ加え、室温（１８℃から２８℃の範囲の温度）にて１５分間静置してゲル化させた。上記コラーゲンゲルに１０％（ｖ／ｖ）牛血清含有ＤＭＥＭ培地を静かに添加して、３７℃、１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２  条件下で５〜７日間培養し、繊維芽細胞の作用によってコラーゲンゲルを収縮させた後、培養皮膚の支持体に供した。
【００２２】
（２）メラノサイト播種：
メラノサイトはクラボウ社から購入したメラノサイト（Ｃｏｄｅ：ＮＨＥＭ−ＭＰ）を、メラノサイト増殖培地（クラボウ、Ｃｏｄｅ：ＫＭ−６３５０）で培養し、サブコンフルエントに達した時点で同培地にて回収し、メラノサイト懸濁液を得た。このメラノサイト懸濁液を最終細胞濃度が４．０〜５．０×１０５／ｍｌになるよう、また、最終コラーゲン添加量が１／６量（ｖ／ｖ）になるよう、コラーゲンと培地を添加し調製した。
【００２３】
収縮したコラーゲンゲルの培地を抜き取った後に、このメラノサイト懸濁液を８０μｌ／ウェルづつ真皮層同等物の上に添加した。この後、再び１０％（ｖ／ｖ）牛血清含有ＤＭＥＭ培地とメラノサイト増殖培地の等量混合培地を加え、１日間培養しメラノサイトを充分接着させた。
【００２４】
（３）表皮角化細胞播種：
表皮角化細胞の播種、培養はベルらの方法（Ｐａｒｅｎｔｅａｕ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  第４５巻、第２４５項、１９９１）に従い行った。すなわち、オルガノジェネシス社から購入したヒト表皮角化細胞をＣａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ  Ｆ１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ）＝３：１を基礎とするＥｐｉｄｅｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  用培地（東洋紡績製）に懸濁し、支持体であるコラーゲンゲルの上に同細胞懸濁液を細胞が０．５×１０５〜１×１０５  個／ｃｍ２  になるように添加した。次いで、同培地を静かに添加し、３７℃、１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２  条件下で３〜５日間培養し、表皮角化細胞を充分伸展させた。次に、Ｃａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ  Ｆ１２＝１：１を基礎とするＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  用培地（東洋紡績製）を、真皮層が培養液下で、かつ表皮角化細胞が空気中に出るよう添加した（空気暴露培養）。この空気暴露培養を６ないし７日間行い、表皮層、角質層を形成させ３次元培養皮膚モデルを作製し実験に供した。
【００２５】
２．紫外線照射実験
（１）紫外線照射
上記方法にて作製した３次元培養皮膚モデルに紫外線照射装置（ＤＮＡ−ＦＩＸ、アトー社）を使って、紫外線（ＵＶＢ）（波長３１２ｎｍ）を照射した。照射量は、５０ｍＪ／ｃｍ２とし、４日間連続で計４回を照射した。対照群は、紫外線は照射しないで照射群と同様の操作を行った。
【００２６】
（２）メラニン定量
４回目の紫外線照射から２４時間後、メラニン色素を含む中央部分の皮膚組織を直径１２ｍｍの大きさで切り取った。切り取った皮膚組織を３００μｌの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中でホモジナイズし、３７℃で一晩インキュベートした後、メタノール：クロロホルム（１：２）の混合液を１００μｌ添加し激しく攪拌した。これを遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ社  ＣＦ  １６ＲＸ  型）を用いて１１０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を９６ウェルプレートに１００μｌ分取し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。同様に処理したメラニン標準液についても測定し、検量線を描いてサンプルのメラニン量を求めた。
【００２７】
４日間のＵＶＢ照射により、肉眼観察において非照射群に対して黒色化が強くなる傾向が見られた。メラニン量を測定した結果、ＵＶＢ照射では、非照射群に対し、有意にメラニン産生量が増加していた。
【実施例２】
【００２８】
実施例１と同様の方法で作製した３次元培養皮膚モデルについて、空気暴露培養開始から３、７および１４日目に皮膚組織をホルマリン固定、パラフィン包埋し、常法通りに組織切片を作製した。作製した組織切片についてヘマトキシリンエオジン染色およびフォンタナマッソン染色を施し、表皮形成過程におけるメラノサイトの所在を観察した。
【００２９】
その結果、空気暴露培養後の表皮形成過程において終始メラノサイトは表皮基底層に存在しており、基底層への生着が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は紫外線照射にシミや皮膚の老化などのメカニズム解明やこうした症状を改善する薬剤の開発に有用な動物代替モデルとなる。
【図１】
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【図２】
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