(57)【要約】【課題】神経芽腫の悪性度および自然退縮経過を判断する手段を提供すること。【解決手段】検体において、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子の活性化または不活性化、並びにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより検体の悪性度および自然退縮経過を判定する、癌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体において、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子の活性化または不活性化、並びにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより検体の悪性度および自然退縮経過を判定する、癌の検出方法。
【請求項２】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化が、転写開始点近傍におけるＣｐＧ部位のメチル化による不活性化、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の欠失、又はＭＹＣＮによる転写抑制のいずれかによるものである、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化を、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、ＦＩＳＨ法、アレイＣＧＨ法、ＭｓＳＮｕＰ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
検体において、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子から翻訳される蛋白質の量、並びにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより検体の悪性度および自然退縮経過を判定する、癌の検出方法。
【請求項５】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子から翻訳される蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する、請求項４に記載の癌の検出方法。
【請求項６】
検体が、神経堤由来の組織である、請求項１から５の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項７】
癌が神経芽腫である、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子、あるいはＬＡＰＴＭ５遺伝子によりコードされる蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項９】
Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子、あるいはＬＡＰＴＭ５遺伝子によりコードされる蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、特に神経芽腫の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ; ＮＢ）は副腎や交感神経節に発生する腫瘍であり、神経提由来の細胞が神経芽腫の発生細胞と考えられる。神経芽腫の臨床的挙動は特徴的であることが知られている。予後良好な（ｆａｖｏｒａｂｌｅ）腫瘍の場合は、１歳未満の患者において、治療的介入をせずに、プログラムされた細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）（ＰＣＤ）がおこり腫瘍が自然に消失する（自然退縮）か、または、良性な神経節細胞腫（ｇａｎｇｌｉｏｎｅｕｒｏｍａ）（ＧＮ）へと分化成熟する。しかし、予後不良な（ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ）腫瘍の場合には、強い化学療法をおこなっても、進行した腫瘍へ発達し、結果的に死に至ってしまう例が多い（非特許文献１及び２）。一方、１歳以降に発症する神経芽腫では一般に進行していることが多く、手術や化学療法、放射線療法を組み合わせた強力な治療が必要であり、特に病期（Ｓｔａｇｅ）４の場合や癌遺伝子ＭＹＣＮが増えている場合には、造血幹細胞移植（骨髄移植や末梢血幹細胞移植など）を用いた積極的な治療がおこなわれている。しかし、ｓｔａｇｅ４の神経芽腫の場合、造血幹細胞移植を併用した積極的な治療をおこなっても５年後の生存率は３０％程度である。従って、神経芽腫発症に関連する原因遺伝子を見つけ出し、その機能を解明することで有効な検出法・治療法の開発が望まれている。
【０００３】
すなわち、神経芽腫における自然退縮の原因遺伝子を見つけ出し、その分子メカニズムを解明することで、その知見に基づいた新たな癌の検出または判定法の開発をおこなうことが望まれている。そして、その原因遺伝子の特徴を検出することにより、無駄な治療をおこなわずに済む、患者に対し適切な治療を選択することが可能になることと考えられる。
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｒｏｄｅｕｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００３，３，２０３−２１６
【非特許文献２】Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，２００２，１８４，１２７−１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経芽腫における自然退縮についての遺伝子レベルでの分子メカニズムが解明されれば、遺伝子検出技術を用いた神経芽腫の自然退縮の判定、悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能となり、さらに、メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療法の確立が可能となるはずである。具体的には、神経芽腫の自然退縮に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、神経芽腫の自然退縮の判定、悪性度の診断、進行の抑制をおこなうことが可能になる。即ち、本発明は、神経芽腫の自然退縮に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定することによって、癌の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＣＧＨ）を応用したＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＡＭＣＡ）法はゲノム上でメチル化を受けている領域を探索するためには、簡便で迅速であり、有効な方法である（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，１０，２３０７−２３１２，Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２００４，９５，５５９−５６３，Ｍｉｓａｗａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５，１０２３３−１０２４２，Ｓｕｇｉｎｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６，７４０１−７４１３，Ｔａｎａｋａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６，６４５６‐６４６８）。この手法により、神経芽腫の自然退縮に関連する遺伝子、すなわち、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子が神経芽腫においてメチル化により不活性化していることを同定することに成功した。その後の詳細な解析から、神経芽腫における自然退縮についての遺伝子レベルでの分子メカニズムにおいて、以下のようなことが明らかになった（図５f、図１６）。
【０００７】
神経芽腫腫瘍において、予後良好および不良のいずれにおいても、ＬＡＰＴＭ５はメチル化を介して、発現抑制されている。しかし、プログラムされたある時期が来ると、腫瘍細胞において、ＬＡＰＴＭ５の発現が活性化し、細胞分化あるいは細胞死へと向かい、やがて腫瘍全体は、退縮していくと考えられた。この時のＬＡＰＴＭ５の活性化には、ミトコンドリア障害などのストレス、分化誘導の刺激、脱メチルおよびＭＹＣＮの発現抑制が関与しているものと考えられた。一方で、腫瘍が退縮しない予後不良の腫瘍では、メチル化に加えて、高頻度にＬＡＰＴＭ５のコピー数の減少とＭＹＣＮ遺伝子増幅を持つため、上記のＬＡＰＴＭ５活性化に関わるプログラムされたイベントが起きたとしても、ＬＡＰＴＭ５の発現の絶対量が低下してしまっているため、細胞分化および細胞死が起こりにくくなっていることが考えられた。
【０００８】
さらに、ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死において、ＬＡＰＴＭ５の発現活性化だけでなく、その蓄積が細胞死誘導に深く関与していることが考えられた。蓄積したＬＡＰＴＭ５はリソソーム不安定性を招き、そのリソソーム不安定性により、ＬＡＰＴＭ５が相乗的に蓄積していくと考えられた。その結果、リソソーム不安定性により、カテプシンの細胞質への流出およびオートファジー経路の遮断によるユビキチン化タンパク質の蓄積が起こり、細胞死へと導かれる。このようなＬＡＰＴＭ５を介した分子メカニズムにより、神経芽腫の自然退縮が起こっているものと考えられた。
【０００９】
上記のように、ＬＡＰＴＭ５に対する特異抗体を作成し、免疫組織染色法による解析から、予後良好腫瘍の自然退縮を示す腫瘍変性部位において、ＬＡＰＴＭ５は活性化していることを同定した。また、予後不良神経芽腫由来の細胞株にＬＡＰＴＭ５遺伝子の転写産物または蛋白質を増加させると神経芽腫の増殖を著しく低下させ、細胞死を誘導することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明によれば、検体において、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子の活性化または不活性化、並びにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより検体の悪性度および自然退縮経過を判定する、癌の検出方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化は、転写開始点近傍におけるＣｐＧ部位のメチル化による不活性化、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の欠失、又はＭＹＣＮによる転写抑制のいずれかによるものである。
好ましくは、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化を、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、ＦＩＳＨ法、アレイＣＧＨ法、ＭｓＳＮｕＰ法、Ｂｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、又はＣＯＢＲＡ法を用いて検出する。
【００１２】
本発明によればさらに、検体において、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子から翻訳される蛋白質の量、並びにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより検体の悪性度および自然退縮経過を判定する、癌の検出方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、ＬＡＰＴＭ５遺伝子から翻訳される蛋白質の量を免疫組織化学的法により検出する。
【００１４】
好ましくは、検体は、神経堤由来の組織である。
好ましくは、癌は神経芽腫である。
【００１５】
本発明によればさらに、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子、あるいはＬＡＰＴＭ５遺伝子によりコードされる蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
本発明によればさらに、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子、あるいはＬＡＰＴＭ５遺伝子によりコードされる蛋白質を含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、神経堤由来の細胞検体における癌化、悪性度および自然退縮傾向を的確に把握することが可能となった。また、神経芽腫において、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の転写産物を導入することにより、神経芽腫の増殖を抑制し、細胞死を誘導することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（１）癌の検出方法
本発明の癌の検出方法は、検体において、Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ５（ＬＡＰＴＭ５）遺伝子の活性化または不活性化、並びにＭＹＣＮ遺伝子の増幅を検出することにより検体の悪性度および自然退縮経過を判定することを特徴とする。
【００１８】
上述したように、本検出方法は、ＬＡＰＴＭ５特異抗体を用いた神経芽腫組織における免疫組織染色法およびＬＡＰＴＭ５特異プライマーを用いた種々のメチル化状態検出法により、神経芽腫におけるＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化または活性化を検出することを特徴とする方法である。
【００１９】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化または活性化を検出する対象となる神経芽腫は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。
この検体組織細胞は、検査等の結果、副腎や交感神経節に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織、または、神経芽腫であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある神経芽腫の組織、等が主な対象となり得る。
【００２０】
本検出方法により、「検査等の結果、副腎や交感神経節に癌化が疑われる病変部が認められた場合の病変組織」におけるＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化が認められた場合には、病変組織は癌化に向かって進行しているか或るいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。
【００２１】
また、「神経芽腫であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある神経芽腫の組織」におけるＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化が認められた場合にも、癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。
【００２２】
逆にＬＡＰＴＭ５遺伝子の活性化部位が認められた場合は、その腫瘍は自然退縮に向かっている可能性があり、外科的切除以外の治療法（経過観察等）の選択も考慮に入れる必要性が示される。
【００２３】
検体として採取された神経芽腫組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡあるいはＲＮＡの調製をおこない、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００２４】
（ｉ）ＬＡＰＴＭ５遺伝子の欠失の検出
ＬＡＰＴＭ５遺伝子の欠失の検出を直接的におこなうことができる代表的な方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ＬＡＰＴＭ５遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の有無、すなわち欠失を検出することができる。
【００２５】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２６】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２７】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２８】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２９】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００３０】
また、このＬＡＰＴＭ５遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを分離して固定し、これと、ＬＡＰＴＭ５遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００３１】
（ｉｉ）ＬＡＰＴＭ５遺伝子の不活性化の検出
ＣｐＧリッチプロモーター並びにエキソン領域を密にメチル化すると転写不活性化が起こることが報告されている（Ｂｉｒｄ  ＡＰ．，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｃｅｌｌ，９９，４５１−４５４，１９９９）．癌細胞では、ＣｐＧアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域の高度メチル化（Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、癌での癌抑制遺伝子の不活性化に深く関与している（Ｅｈｒｌｉｃｈ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６６９４−６７０２，２００２）。
ＬＡＰＴＭ５遺伝子の発現量が減少していることが判明した検体細胞（癌組織に由来するプライマリー癌細胞）に対して、脱メチル化剤（５−アザデオキシシチジンなど）を作用させて、遺伝子発現量の回復を検討することができる。すなわち、検体細胞に脱メチル化剤を作用させて、ＬＡＰＴＭ５遺伝子の発現量が回復する場合には、検体細胞における遺伝子の抑制要因は、ＣｐＧアイランドのメチル化であり、検体提供者に、脱メチル化作用を有する薬剤を投与することにより、相応の抗腫瘍効果が期待される。
【００３２】
（iIII）ＬＡＰＴＭ５遺伝子の活性化の検出
特異抗体を用いた腫瘍組織切片での免疫組織染色法を行うことにより、図２aに示すようなＬＡＰＴＭ５遺伝子が陽性の腫瘍細胞が存在し、かつ細胞の脱落を伴った、腫瘍変性部位が検出された場合、その腫瘍は、自然退縮過程の途中であることが考えられる。
【００３３】
（２）細胞増殖の抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によればさらに、ＬＡＰＴＭ５遺伝子、または、該ＬＡＰＴＭ５遺伝子の発現産物である蛋白質をインビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記遺伝子又は蛋白質を含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３４】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子を取り扱う場合、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ法などにより酵素学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法によりＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、目的とする塩基配列を増幅できるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３５】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子の検出ブローブ又はプライマーの調製、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、２nd  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００３６】
ＬＡＰＴＭ５遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３７】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３８】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３９】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００４０】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００４１】
本発明の細胞増殖抑制剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００４２】
有効成分である上記遺伝子又は蛋白質を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４３】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖抑制剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４４】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４５】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：神経芽腫細胞におけるＤＮＡメチル化を介したＬＡＰＴＭ５の発現低下
ヒト1番染色体短腕（1p）上でＤＮＡメチル化を介して発現低下する神経芽腫抑制遺伝子を探索するために、２種の神経芽腫細胞株（ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞）から調製したゲノムＤＮＡを用いて、１ｐ３６  ｃｏｎｔｉｇ  ＢＡＣ‐ａｒｒａｙを用いてＢＡＭＣＡ法による解析をおこなった（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，１０，２３０７−２３１２，Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ，２００４，９５，５５９−５６３，Ｍｉｓａｗａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５，６５，１０２３３−１０２４２，Ｓｕｇｉｎｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６，７４０１−７４１３，Ｔａｎａｋａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２６，６４５６‐６４６８）。なお、対象として、ｓｔａｇｅ-1の神経芽腫検体、または正常末梢血単核球細胞（ＰＢＭＮＣｓ）から調製したMCA（Methylated CpG island amplification、Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５）産物をＣｙ５で標識した。被検サンプルとして、ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞から調製したMCA産物をＣｙ３で標識した。ＢＡＭＣＡ法によるハイブリダイゼーションの後、アレイをＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした（図６ａ）。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ４．１イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３／Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。メチル化に差がない場合にはＲａｔｉｏ値は１である。Ｒａｔｉｏ値が１．０より大きい時にメチル化の変化が認められると判定した。
【００４７】
その結果、ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞の両方で、メチル化されたＤＮＡ配列の特徴を持つ３つのＢＡＣクローン（１２７Ｊ４、３１６Ｃ６、４１８Ｂ２２）を候補として単離することが出来た（表１）。
【００４８】
これらの染色体領域には、６つの遺伝子（ＦＬＪ１０４２０、ＫＩＡＡ１９２２、ＵＳＰ４８、ＲＡＰ１ＧＡ１、ＬＡＰＴＭ５、ＭＡＴＮ１）が存在していることをヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）から確認した。これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現をＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞で適切なプライマー（表２）を用いてRT-PCRにより確認した（図６ｂ、表３）。
【００４９】
この結果、３つの遺伝子（ＫＩＡＡ１９２２、ＲＡＰ１ＧＡ１、ＬＡＰＴＭ５）は、ｓｔａｇｅ-1の神経芽腫検体（Ｓ１ ＮＢｓ）、正常副腎（Ａｄｒ）、またはＰＢＭＮＣｓと比較して、ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞の両方で発現低下していることを確認した（図６ｂ、表１）。さらに詳細なメチル化の状態を探るため、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＭＳ）-ＰＣＲを用いて、ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞におけるＲＡＰ１ＧＡ１とＬＡＰＴＭ５の転写開始部位周辺に存在するＳｍａＩ認識配列内のＣＧ部位のメチル化状態を調べた（図６ｃ、表１）。各細胞のゲノムＤＮＡ（１μｇ）をメチル化感受性制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）により反応液量４０μｌ中で２５℃、２４時間消化し、適切なプライマー（表２）を用いて増幅反応をおこなった。各ＳｍａＩ部位のメチル化状態は、ＰＣＲ産物の存在の有無により決定した。その結果、ＫＩＡＡ１９２２はメチル化を確認できなかったが、ＲＡＰ１ＧＡ１、ＬＡＰＴＭ５において、ＩＭＲ３２細胞とＧＯＴＯ細胞でメチル化を受けていることを確認した。
【００５０】
さらにこの２つの遺伝子（ＲＡＰ１ＧＡ１、ＬＡＰＴＭ５）について、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法により、様々なステージの４１種類の神経芽腫検体でのメチル化状態を調べた。ＣＯＢＲＡ法によるメチル化の検討には、ＥＺ  ＤＮＡメチレーションキット（Ｚｙｍｏ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、神経芽腫検体に由来するゲノムＤＮＡ（２μｇ）をＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ中５０℃で１晩処理をおこない、目的とするメチル化ＤＮＡを増幅するようにデザインしたプライマー（表２）を用いてＰＣＲをおこなった。得られたＰＣＲ産物をＴａｑＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）または、ＨｈａＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。ＴａｑＩとＨｈａＩはメチル化されないシトシンがＳｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾された配列は消化しないが、シトシンがメチル化された、Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで修飾されない配列を消化する性質を利用して、メチル化の頻度を調べた。その結果、ＬＡＰＴＭ５においてのみ、神経芽腫検体で高頻度にメチル化を受けていることを確認した（図６d,e）。さらにＢＡＣ４１８Ｂ２２内に存在するＳｍａＩにおけるメチル化および転写開始点近傍のＣＧ部位におけるメチル化状態をMS-PCR法およびｂｉｓｕｌｆｉｔｅ シーケンス法により解析した。その結果、ＬＡＰＴＭ５遺伝子座は、ＰＢＭＮＣｓまたはＥＢウイルスによりトランスフォームしたリンパ球細胞株（ＬＣＬ）と比較して、ＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞において高い頻度で広範囲にメチル化されていた。（図６ｆ、ｇ）。これらの結果により、神経芽腫細胞における１ｐ３５−ｐ３６上のメチル化を介した発現抑制される候補遺伝子としてＬＡＰＴＭ５に注目することを決定した。
【００５１】
さらに、１０種類の神経芽腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＫＰ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＫＰ−Ｎ−ＲＴ、ＭＰ−Ｎ−ＭＳ、ＣＨＰ１３４、ＳＪ−Ｎ−ＣＧ、ＩＭＲ３２、ＧＯＴＯ）において、ＬＡＰＴＭ５の遺伝子発現レベル、メチル化頻度、およびコピー数を調べるために、定量的RT-PCR，ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ シーケンス法、ＣＧＨ-アレイ法、およびＦＩＳＨ解析を行った。（図１ａ、図６ｈ、図７, 表４）。その結果、すべての細胞株において、ＭＹＣＮの増幅またはＬＡＰＴＭ５のコピー数の低下の有無に関わらず、メチル化およびＬＡＰＴＭ５の発現低下を検出した。
【００５２】
次に、神経芽腫腫瘍検体（ｓｔａｇｅ-１、-２、-３、-４Ｓ、-４ａ）において、ＬＡＰＴＭ５の発現レベルおよびメチル化頻度を調べるために、定量的RT-PCR法およびＭｓ−ＳＮＵＰＥ法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  Ｍ．Ｌ．＆  Ｌｉａｎｇ  Ｇ，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，２００７，２，１９３１−１９３６）を行った（図１ｂ、図８）。結果として、ＰＢＭＮＣｓと比較して、すべての神経芽腫腫瘍で予後の状態に関係なく、ｍＲＮＡの量とメチル化の状態は逆相関であることが判明した（図１ｂ）。
【００５３】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法には、ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理したＤＮＡを用いて、２つのＣＧ部位を含むゲノム領域を適切なプライマー（図８ｂ、表２）を用いてＰＣＲにより増幅、その増幅産物をアガロースゲル電気泳動により増幅産物を精製した。この精製した増幅産物を用い各部位のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー（表２）を用いてメチル化解析をおこなった。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ産物は１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認し、得られるシグナルは、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）の平均化により定量した（図８ｂ）。メチル化の評価は、［Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｃ／（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｃ＋ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｔ）］に従い、２つのＣＧ部位の結果に基づいて算出した。
【００５４】
またこのときのｍＲＮＡの定量は、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ（ｑRT-PCR）、ＡＢＩ−７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定をおこなった。コントロールとしてｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ-３-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を用い、各サンプルはＧＡＰＤＨの量に基づいて標準化をおこなった。各プライマーの配列は表２に示す。
【００５５】
さらに、７１の神経芽腫検体において、ＬＡＰＴＭ５に対する特異抗体を用いた免疫組織染色法による解析の結果、陽性である血球系細胞および副腎髄質細胞と比較して、Ｓｔｇａｅｎｉ関係なく、全ての神経芽腫の癌細胞でＬＡＰＴＭ５のタンパク質発現量が低下していることを確認した（図１ｃ）。興味深いことに、ＬＡＰＴＭ５の発現は、予後良好な検体中に含まれる分化傾向を示す細胞や完全に分化成熟したＧＮ中に含まれる分化細胞において、高い発現を認めた（図１ｃ）。また、分化成熟したＧＮにおいては、神経芽腫と比較して、メチル化頻度が低下していることを同定した（図１ｄ、e）。このことから、ＬＡＰＴＭ５はすべての神経芽腫において、メチル化を介して発現低下していることが強く示唆された。
【００５６】
実施例２：腫瘍変性部位におけるＬＡＰＴＭ５の活性化およびＬＡＰＴＭ５の強制発現によるカスパーゼ非依存的な細胞死の誘導
特異抗体を用いた免疫組織染色解析の結果、ＬＡＰＴＭ５の発現は、腫瘍変性部位（タイプ１；分化傾向を示す細胞群の脱落部位、タイプ２；未分化腫瘍細胞群の脱落部位）に存在する変性細胞において、活性化していることを同定した（図２a）。ＬＡＰＴＭ５陽性の変性部位は、臨床的に発見された予後不良な腫瘍に比べて（１７例中１例、５．９％）、マススクリーニングで発見された予後良好な腫瘍において（５４例中４２例、７７．８％）、高頻度に出現していた（ｐ＜０．００００１）（表３）。しかも、臨床的に発見されたＬＡＰＴＭ５陽性の腫瘍変性部位をもつ１例の検体では、病理学的にＧＮへの分化成熟過程であり、予後良好群に含まれることが考えられた。これらのように、ＬＡＰＴＭ５は、神経芽腫の自然退縮における腫瘍変性に密接に関係すること明らかになった。そして、この遺伝子産物は神経芽腫細胞の細胞死に関与することが推測された。なお、神経芽腫の変性部位において、高発現していることが知られているＨ−ｒａｓ遺伝子は、ＬＡＰＴＭ５陽性の同じ変性部位において、共発現していることを確認した（図９）。
【００５７】
次に、ＬＡＰＴＭ５の発現は神経芽腫細胞の細胞死に関与するかを調べるため、アデノウイルスを介した発現システムを用いて神経芽腫細胞株に強制発現させたときの影響を調べた。細胞死と生存率のアッセイは、細胞を２４ウエルプレート上に撒き、選択したＭＯＩｓ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＰＦＵ／cell）でインフェクションさせた。インフェクションの２または４日後、死滅した細胞数はトリパンブルー排他法により決定した。また、ｐａｎ‐カスパーゼ阻害剤、ｚＶＡＤ-ｆｍｌは１００μＭの濃度で使用した。また、各実験において最低２００細胞はカウントした。生存細胞数は水溶性テトラゾリウム塩比色分析アッセイ（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ-８;同仁化学）を用いて評価した。
【００５８】
その結果、ＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞においてＬＡＰＴＭ５蛋白質の強い発現は高濃度でのインフェクション後４日目に検出され（図２ｂ）、その細胞の生存率はアデノウイルス−ＬＡＰＴＭ５（Ａｄ−ＬＡＰＴＭ５）をインフェクションした両方の細胞株で濃度依存的に減少していることが明らかになった（図２ｃ）。さらに、高濃度インフェクションの４日後に、アデノウイルス−ＬａｃＺ（Ａｄ−ＬａｃＺ）インフェクションと比較して、Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５インフェクションにおいて死滅細胞の著しい増加を確認した（図２ｄ）。また、各細胞株において、細胞死は、カスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ−ｆｍｋを用いた処理で阻害されることはないことを確認した（図２ｄ）。また、他の神経芽腫細胞株または他の癌種由来細胞株を用いた場合でも同じような結果を得ることができた（図１５）。
【００５９】
これらの結果は、ＬＡＰＴＭ５の過剰発現は、神経芽腫細胞においてカスパーゼ非依存性な細胞死を誘導できることを示唆している。
次に、ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死において、オートファジーの特徴を有するかを調べた。まず、ＬＡＰＴＭ５誘導細胞死により死滅している神経芽腫細胞の細胞質にＬＣ３蛋白質がどのように局在しているのかを調査するため、神経芽腫細胞（ＧＯＴＯ細胞）へＧＦＰ-ＬＣ３発現ベクターをトランスフェクションし、３週間、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ存在下で培養し、ＧＦＰ−ＬＣ３安定発現株を樹立した。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い推奨プロトコールに従って実験をおこなった。ＧＦＰ−ＬＣ３安定発現するＧＯＴＯ細胞において、Ａｄ−ＬＡＰＴＭ５のインフェクションにより細胞死が誘導されたとき、Ａｄ−ＬａｃＺをインフェクションした細胞と比較して、細胞質内にＧＦＰ-ＬＣ３の点状な局在が顕著に増加していることを見出した（ｐ＝０．００３、図２e）。さらに、ウエスタンブロット解析により、Ａｄ‐ＬＡＰＴＭ５をインフェクションしたＧＦＰ−ＬＣ３安定発現するＧＯＴＯ細胞でＬＣ３−ＩＩ型の存在を検出した（図２f）。また、電子顕微鏡解析ではＡｄ−ＬａｃＺをインフェクションした細胞と比較して、Ａｄ−ＬＡＰＴＭ５をインフェクションしたほとんどのＧＯＴＯ細胞で細胞質においてオートファジー関連小胞の存在を確認した（図２g）。さらに、一部の死細胞において、細胞質の空砲化および核の虎斑状模様といったネクローシスの特徴を示す細胞が認められた（図１４）。
【００６０】
これらの結果は、ＬＡＰＴＭ５の強制発現は、神経芽腫細胞株において、オートファジー小胞の出現を伴ったネクローシス様細胞死を誘導することが出来ることを示唆する。
【００６１】
実施例３：ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死におけるリソソーム膜透過化（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＬＭＰ）の誘導およびオートファジー経路の遮断について
ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死における、オートファジー小胞の出現の意義を検討するために、オートファジー小胞形成を抑制する薬剤（ウォルトマニン）またはsiRNA導入によるＡＴＧ５遺伝子（オートファジー関連遺伝子）発現抑制の効果を検討した（図３a）。その結果、オートファジーを阻害してもＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死は抑制されなかった。この結果は、ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死におけるオートファジー小胞の出現は、オートファジー自体の活性化ではなく、未成熟なオートファジー小胞の蓄積に起因することが示唆された。さらに、ウエスタンブロット解析および蛍光染色法により、ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死の際に、オートファジーによるタンパク分解を受けると考えられているｐ６２/ＳＱＳＴＭ１およびユビキチン化タンパク質の蓄積を認めた（図３b,c、図８）。その際、細胞死を起こした一部の細胞において、ｐ６２/ＳＱＳＴＭ１およびユビキチン化タンパク質が共局在し、封入体を形成していた。また、過去の報告どおり、ｐ６２/ＳＱＳＴＭ１とＧＦＰ−ＬＣ３との共局在も確認された（図３b）。さらに、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）不溶性分画において、ユビキチン化タンパク質量が増加していることがウエスタンブトッティングにより確認されたので、このユビキチン化タンパク質は封入体を形成して蓄積していることが強く示唆された（図８ｂ）。これらの結果は、ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死の際に出現するオートファジー小胞は、オートファジー経路の遮断による未成熟なオートファジー小胞およびユビキチン化タンパク質の蓄積を示唆していることが分かった。
【００６２】
一方、ＬＡＰＴＭ５は膜タンパク質であり、リソソームに局在することが知られている。実際にアデノウイルス感染１日後、強制発現されたＬＡＰＴＭ５は、ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｂｅであるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＬＴＲ）と点状に共局在を示した（図３d）。しかしながら、感染４日後において、ＬＡＰＴＭ５の蓄積と相関して、ＬＴＲの点状な染色パターンはしばしば消失していることを同定した（図３d）。このようなＬＴＲ染色パターンの変化は、ＬＭＰに起因しており、リソソームの不安定化・崩壊を示している。このＬＭＰの観察は、ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死の増加に伴って、認められた（Ａｄ−ＬａｃＺ細胞と比較して、ＧＯＴＯ細胞において２．７倍、ｐ＝０．０００７とＩＭＲ３２細胞において５．４倍、ｐ＝０．０１０８、図１１）。さらに、ＬＭＰの他のマーカーであるアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色の減少もＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死に伴って、起こっていることを確認した（図３e、図１１）。また、一部の死細胞において、リソソームでの加水分解酵素カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）のリソソームから細胞質ゾルへの放出および中間体フォームの増加を確認した（図３ｃ、d、図１１）。これらの結果は、ＬＡＰＴＭ５の強制発現は、ＬＭＰを介したリソソームの不安定化・崩壊を伴うリソソーム性細胞死を誘導することが示唆された。従って、ＬＡＰＴＭ５により誘導されるＬＭＰがオートファジー経路の遮断を招いていることが推測された。実際に、ＧＦＰ−ＬＣ３安定発現するＧＯＴＯ細胞において、ＬＭＰ誘導剤であるｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ（ＣＰＸ）（ＬＫＴ  ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）処理したとき、ＬＡＰＴＭ５誘導リソソーム細胞死と同様の、ＬＣ３−ＩＩ型の検出とｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白質の蓄積を見出した（図１２）。さらに、これらのiｎ  ｖｉｔｒｏでの観察と一致するように、免疫組織染色法においてもまた、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１、ユビキチン化タンパク質およびカテプシンＤの発現増加が観察された（図３f）。また、一部の細胞において、ユビキチン化陽性封入体の形成を認めた。これらの結果は、LAPTM5の発現は、LMPを介したリソソームの不安定化を伴ったリソソーム性細胞死を誘導することを示唆している。同時に、LAPTM5により誘導されたリソソーム不安定性は、未成熟なオートファジー小胞およびユビキチン化タンパク質の蓄積を導いていることが考えられた。
【００６３】
実施例４：プロテアソームまたはリソソーム分解経路の遮断によるLAPTM5の蓄積と細胞死誘導
ＧＯＴＯ細胞において、アデノウイルスにより強制発現させたＬＡＰＴＭ５は蓄積しているように観察された。従って、ＬＡＰＴＭ５はプロテアソームまたはリソソーム系のタンパク分解を受けるかどうか、またこのＬＡＰＴＭ５の蓄積が細胞死に重要かどうかを調べた。Ａｄ−ＬＡＰＴＭ５によるインフェクション１日後、プロテアソーム阻害剤（ＡＬＬＮまたはＭＧ１３２）またはリソソーム阻害剤（Ｂａｉｌｏｍｙｃｉｎ  Ａ１またはＮＨ４Ｃｌ）により、さらに１日間処理を行った。その後、細胞を回収し、サンプルを調整しウエスタンブロット解析を行った。その結果、発現されたＬＡＰＴＭ５は、タンパク分解阻害剤処理により、顕著に蓄積していることが明らかになった（図４a）。さらに、この蓄積はＬＡＰＴＭ５抗体を用いた蛍光染色によっても確認された（図４ｂ）。また、ＬＡＰＴＭ５の蓄積に伴って、死細胞の頻度が有意に増加していた（図４ｃ）。これらのことは、ＬＡＰＴＭ５は、プロテアソームおよびリソソーム系によるタンパク分解を受けていること、そして、ＬＡＰＴＭ５の蓄積が細胞死誘導に深く関与することが考えられた。次に、このＬＡＰＴＭ５の蓄積が細胞死誘導に必須かどうかを検討するために、ＬＡＰＴＭ５に対するsiRNAのトランスフェクションの影響を検討した。その結果、ＬＡＰＴＭ５に対するsiRNAのトランスフェクションした細胞において、Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  Ａ１またはＡＬＬＮ処理によるＬＡＰＴＭ５の蓄積は、顕著に抑制されることをウエスタンブロッティング解析により確認した（図４ｄ）。また、このとき、ＬＡＰＴＭ５の蓄積による細胞死の頻度が、有意に低下することが分かった（図４e）。以上より、ＬＡＰＴＭ５の蓄積は細胞死誘導に深く関与しており、ＬＡＰＴＭ５発現抑制は、その細胞死を抑制することが出来ることを示唆している。
【００６４】
実施例５：ミトコンドリア障害または酸化ストレスによるＬＡＰＴＭ５の活性化とＭＹＣＮによる転写抑制
予後良好ＮＢ腫瘍の退縮におけるＮＢ細胞の変性には、何が引き金になっているのかは、明らかになっていない。図３に示すように、パーキンソン病などの神経変性疾患で見られるようなユビキチン陽性の封入体が、in vivoでもin vitroにおいても、ＬＡＰＴＭ５関連変性細胞で認められた。このことは、ＮＢ腫瘍退縮と神経変性疾患での細胞変性において、共通のメカニズムの存在が考えられた。ミトコンドリア障害と酸化ストレスは、神経変性疾患でのニューロンの変性に深く関与していることが知られているので、これらのストレスが、ＮＢ細胞株でのLAPTM5の発現活性化に関与するかどうかを検討した。ミトコンドリア障害を誘導するMPP+（1-methyl-4-phenylpridinium）または酸化ストレス１種であるＨ２Ｏ２により、GOTO細胞が処理されたとき、濃度依存的な細胞死の頻度の増加に伴い、ＬＡＰＴＭ５の発現が活性化することが分かった（図5a）。また、興味深いことに処理に伴い、ＭＹＣＮの発現は、低下することが分かった（図5b）。さらに、MYCN遺伝子増幅を持つ予後不良なNB腫瘍検体でのLAPTM5 mRNAレベルは、それを持たない検体に比べて、メチル化頻度に関わらず、低くなっていることが分かった（P=0.0005）（図5c）。MYCNタンパク質は、様々な標的遺伝子の転写を活性するだけでなく、抑制することができることが知られている。したがって、増幅により活性化したＭＹＣＮタンパク質は、ストレスにより誘導されるＬＡＰＴＭ５の転写活性化を抑制していると考えた。そこで、ＣｈＩＰ assayにより、LAPTM5遺伝子転写開始点近傍にMYCNが直接結合するかどうかを調べた。その結果、ＬＡＰＴＭ５遺伝子のイントロン１内のＭＹＣＮ結合配列候補を含む領域に結合していることが分かった（図5d）。一方で、ＩＭＲ３２細胞株は、レチノイン酸処理により、神経細胞に分化することが知られている。その際にＬＡＰＴＭ５の発現の活性化とＭＹＣＮの発現抑制が認められた（図１３）。
【００６５】
以上のことから、ミトコンドリア障害または酸化ストレスに限らず、分化誘導の刺激はＬＡＰＴＭ５の発現活性化に深く関与しており、ＭＹＣＮは直接的にその発現上昇を抑制している可能性が示唆された。従って、予後不良ＮＢ検体では、ＬＡＰＴＭ５の欠失とＭＹＣＮ増幅による発現抑制により、恒常的に不活性化されており、細胞増殖能が維持され続けていることが推測された。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
【表２】
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【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４】
2010099039.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】神経芽腫細胞株と腫瘍におけるＬＡＰＴＭ５遺伝子のメチル化と発現の解析（ａ）神経芽腫細胞株におけるＬＡＰＴＭ５のメチル化頻度およびｍＲＮＡレベル。ＭＹＣＮの増幅またはＬＡＰＴＭ５遺伝子のアレルの消失が有り（+）、無し（-）の神経芽腫細胞株におけるＬＡＰＴＭ５  ｍＲＮＡレベルは、リアルタイム定量RT-PCR解析により測定し、ドットとして示す。ＬＡＰＴＭ５  ｍＲＮＡのレベルはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルを用いて標準化した。転写開始点近傍の１７個のＣＧ部位におけるメチル化頻度は、（ｂ）ＬＡＰＴＭ５遺伝子の転写開始部位Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  シークエンス法により測定し（補足図１ｈ）、各々の平均値をメチル化頻度（％）として、棒グラフで示す。（ｂ）病期の異なる神経芽腫検体におけるＬＡＰＴＭ５のメチル化頻度およびｍＲＮＡレベル。ＬＡＰＴＭ５  ｍＲＮＡのレベルはリアルタイム定量RT-PCRにより測定し、ドットで示す；２つのＣＧ部位（ＣＧ-ＩまたはＣＧ-ＩＩ）におけるメチル化頻度は、Ｍｓ-ＳＮｕＰＥにより測定し、それぞれダークグレイ（ＣＧ-Ｉ）またはライトグレイ（ＣＧ-ＩＩ）バーで占めす。ｎは検体数を示す。垂直線は、標準偏差を示す。（ｃ）神経芽腫腫瘍検体の切片を用いた免疫組織染色による、ＬＡＰＴＭ５の発現解析。上段：腫瘍切片内に含まれる血球系細胞、副腎部位、および予後良好腫瘍（stage-1）、ＭＹＣＮ増幅を持つ予後不良腫瘍の癌細胞におけるＬＡＰＴＭ５の染色像を示す。矢印は、副腎髄質細胞を示す。下段：予後良好腫瘍検体またはＧＮ検体内に含まれる分化細胞におけるＬＡＰＴＭ５の染色像およびヘマトキシレンーエオジン染色像を示す。スケールバーは、５０umを示す。（ｄ）ＧＮにおけるメチル化頻度。上段：２つのＣＧ部位（ＣＧ-ＩまたはＣＧ-ＩＩ）におけるメチル化頻度は、Ｍｓ-ＳＮｕＰＥにより測定し、それぞれダークグレイ（ＣＧ-Ｉ）またはライトグレイ（ＣＧ-ＩＩ）バーで占めす。下段：神経芽腫とＧＮにおけるメチル化頻度の比較。各々のＣＧ部位におけるメチル化頻度の平均値をバーで示す。ｎは検体数を示す。垂直線は、標準偏差を示す。（e）神経芽腫とＧＮにおけるメチル化頻度の比較。ＬＡＰＴＭ５の転写開始部位周辺のＣＧ部位におけるｂｉｓｕｌｆｉｔｅシーケンシングの典型的な結果。メチル化状態はホワイト（非メチル化）またはブラック（メチル化）サークルで示す。矢印は転写開始部位を示す。
【図２】予後良好腫瘍検体内に含まれる変性細胞におけるＬＡＰＴＭ５の活性化と神経芽腫細胞株へのＬＡＰＴＭ５強制発現による細胞死の誘導（ａ）Ｓｔａｇｅ−１腫瘍検体切片内の変性部位におけるＬＡＰＴＭ５の免疫組織染色像。連続切片は、ヘマトキシレンーエオジン染色（左）またはＬＡＰＴＭ５抗体（右）により染色をした。上段：分化傾向を示す細胞がまとまって脱落している変性部位（タイプー１変性部位）における染色像を示す。下段：未分化細胞がまとまって脱落している変性部位（タイプー２変性部位）における染色像を示す。矢印で囲まれた領域は、典型的なタイプー２変性部位を示す。（ｂ）アデノウイルスをインフェクションしたＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞のウエスタンブロッティング解析。２４ウエルプレートに撒いたＧＯＴＯ細胞（５ｘ１０4細胞／ウエル）またはＩＭＲ３２細胞（２ｘ１０4細胞／ウエル）はＬａｃＺ（Ａｄ-ＬａｃＺ）またはＬＡＰＴＭ５（Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５）アデノウイルスをＧＯＴＯ細胞には１０ＭＯＩ、ＩＭＲ３２細胞には４ＭＯＩでインフェクションをおこなった；インフェクション後２日目と４日目の全細胞抽出液（３０μｇ）は１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで泳動し、ＬＡＰＴＭ５またはβ-アクチン（蛋白質量の内部標準）に対する抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。結果は、独立した実験を２回おこなった代表を示す。（ｃ）アデノウイルスをインフェクションしたＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞の生存率。（ｂ）と同条件で撒いた細胞に前記したＭＯＩでＡｄ-ＬａｃＺまたはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５でインフェクションをおこなった。インフェクションの４日後、生存している細胞の割合を水溶性テトラゾリウム塩比色分析アッセイにより決定した。垂直線は２回の実験の標準偏差を示す。Ｎｏ  ｉｎｆ；インフェクションをおこなっていないコントロール。（ｄ）アデノウイルスをインフェクションしたＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞の死滅細胞の頻度。（ｂ）と同条件で撒いた細胞に前記したＭＯＩでＡｄ-ＬａｃＺまたはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５でインフェクションをおこない、また、各細胞株でｐａｎ‐カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ-ｆｍｋの処理未処理をおこなった。死滅細胞はインフェクション後２日目と４日目にトリパンブルー排他法を用いて測定し、割合を示した。垂直線は２回の実験で標準偏差を示す。（e）ＧＦＰ-ＬＣ３の細胞内局在。２４ウエルプレートに撒いたＧＯＴＯ細胞（５ｘ１０4細胞／ウエル）はＬａｃＺ（Ａｄ-ＬａｃＺ）またはＬＡＰＴＭ５（Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５）アデノウイルスをＧＯＴＯ細胞には１０ＭＯＩでインフェクションをおこなった。４日後,細胞を固定し、蛍光顕微鏡にて典型的な画像を取得した。下段；GFP-LC3の局在がドット状になっている細胞の頻度を％で示す。（ｆ）ウエスタンブロッティングによるＧＦＰ-ＬＣ３ＩＩ型の検出。ＧＦＰ-ＬＣ３を安定的に発現しているＧＯＴＯ細胞へ１０ＭＯＩの条件でＡｄ-ＬａｃＺまたはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５をインフェクションさせた。そして、４日後、全細胞抽出液（３０μｇ）は１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで泳動し、ＧＦＰまたは分離した膜上でβ-アクチン（蛋白質量の内部標準）に対する抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。矢印はＧＦＰ-ＬＣ３のＩ型と���Ｉ型を示す。（ｇ）Ａｄ-ＬａｃＺ（左）またはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５（中央および右）をインフェクションしたＧＯＴＯ細胞における電子顕微鏡観察像。インフェクションから４日後の代表的な電子顕微鏡像を示す。（右）イメージは（中央）における長方形で囲んだ領域の拡大を示し、オートファジー小胞の数の蓄積を示す。アローヘッドはオートファジー小胞を示す。
【図３】ＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死におけるＬＭＰの発生とオートファジー経路の遮断（a）LAPTM5誘導性細胞死におけるATG5ノックダウンおよびワートマンニン処理による細胞生存率の影響。９６ウエルプレートに撒いたＧＯＴＯ細胞（１ｘ１０4細胞／ウエル）は、ATG5siRNA またはControl siRNAをトランスフェクションされた。翌日、ＬａｃＺ（Ａｄ-ＬａｃＺ）またはＬＡＰＴＭ５（Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５）アデノウイルスをＧＯＴＯ細胞には１０ＭＯＩでインフェクションをおこなった。また、アデノウイルス感染と同時にワートマンニン処理を行った。生存している細胞の割合を水溶性テトラゾリウム塩比色分析アッセイにより決定した。垂直線は２回の実験の標準偏差を示す。下段；ATG5 siRNAによるATG5発現低下をウエスタンブロットで確認された。（ｂ）ＬＡＰＴＭ５をインフェクションしたＧＯＴＯ細胞におけるｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白質、ユビキチン化タンパク質およびカテプシンＤの発現はウエスタンブロッティングにより解析した。図２ｂで示されたサンプルについて、SDS-PAGEを行い、各々の交代を用いてウエスタンブロット解析を行った。カテプシンＤについて、矢印は、各々のフォームを示す。星印は未知のフォームを示す。結果は２回の結果の代表を示す。この結果は２回の独立した実験の代表を示す。（ｃ）ＬＡＰＴＭ５をインフェクションしたＧＯＴＯ細胞におけるｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白質とユビキチン化タンパク質またはＧＦＰ−ＬＣ３蛋白質の蓄積と共局在は免疫蛍光により明らかにした。ＧＯＴＯ細胞（５ｘ１０4細胞／ウエル）を２４ウエルプレートに撒き、１０ＭＯＩの条件でＡｄ-ＬＡＰＴＭ５をインフェクションさせた。インフェクションの４日後、細胞を固定化、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１抗体を用いて反応し、Ｔｅｘａｓ-Ｒｅｄ二次抗体により可視化した。イメージは代表的なものを示す；ＤＡＰＩは対比染色。(d)ＧＯＴＯ細胞におけるＬＡＰＴＭ５蛋白質の局在とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＬＴＲ）染色の代表的なイメージ。ＧＯＴＯ細胞（１ｘ１０4細胞／ウエル）を２４ウエルプレートに撒き、１０ＭＯＩの条件でアデノウイルス（Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５）を用いてインフェクションさせた。インフェクションの１日後または４日後、細胞はＬＴＲを用いて染色し、２度洗浄し固定化、ＬＡＰＴＭ５抗体で反応した後、ＦＩＴＣ複合２次抗体を用いて可視化した。ＤＡＰＩは対比染色。矢印はＬＭＰの特徴を持つ細胞を示す。(e)インフェクションしたＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ細胞のアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色。インフェクションの４日後、インフェクションした細胞はＡＯを用いて染色しＰＢＳで２回洗浄した。染色の強度はＦＬ３のチャンネルを用いてフローサイトメトリーにより測定した；ＡＯ蛍光ではない細胞とインフェクションした細胞の＞９８％含んでいる範囲で開閉した。ＡＯ蛍光の極端な減少は、ＬＭＰがＡｄ-ＬＡＰＴＭ５をインフェクションしたＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ細胞それぞれで生じている。下のグラフはＡＯ蛍光の減少の割合を示す。垂直線は２つの分離した実験の標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５。（ｆ）カテプシンＤ，ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１、ユビキチン化タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織染色。連続切片は、各��の抗体で反応した。上段は、非変性部位における染色像を示し、下段は、変性部位にける代表的な染色像を示す。
【図４】プロテアソームまたはリソソーム分解経路の遮断によるLAPTM5の蓄積と細胞死誘導(a) ＧＯＴＯ細胞（5ｘ104細胞／ウエル）を２４ウエルプレートに撒き、Ａｄ-ＬａｃＺまたはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５で感染された。１日後、プロテアソーム阻害剤（ALLNまたはMG132）またはリソソーム分解阻害剤（BafilimycinA1またはALLN）により、処理された。そして１日後、細胞を回収し、サンプルを調整し、ウエスタンブロット解析を行った。調整したサンプルについて、SDS-PAGEを行い、各々の抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。(b) 蛍光免疫染色によるＬＡＰＴＭ５の蓄積。（a）のように細胞は処理され、固定し、ＬＡＰＴＭ５抗体を用いて免疫反応をおこない、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ複合２次抗体を用いて可視化した。(ｃ) LAPTM5蓄積に伴う細胞死の頻度の増加。（a）のように細胞は処理されたときの死滅した細胞は、トリパンブルー排他法を用いて測定した。垂直線は２度の実験の標準偏差を示す。(ｄ) LAPTM５ siRNA処理によるLAPTM5発現抑制。ＣｏｎｔｒｏｌまたはＬＡＰＴＭ５に対するsiRNAでトランスフェクションしたあと、（a）のように細胞は処理され、サンプルは調整された。ＬＡＰＴＭ５抗体を用いてウエスタンブロット解析された。
【図５】ＭＰＰ+またはH2O2処理によるLAPTM5の発現誘導とMYCNによるその発現抑制（ａ）GOTO細胞は、ＭＰＰ+（1または2 mM）で２４時間、またはH2O2（100または200 uM）で４８時間処理された。処理後、死滅した細胞は、トリパンブルー排他法を用いて測定した。また、ＬＡＰＴＭ５の発現レベルは、定量的RT-PCRにより解析された。垂直線は２度の実験の標準偏差を示す。（ｂ）ＭＹＣＮの発現レベルは、ウエスタンブロットで解析された。調整したサンプルについて、SDS-PAGEを行い、各々の抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。（ｃ）ＭＹＣＮ増幅をもつ腫瘍検体と持たない検体におけるＬＡＰＴＭ５のメチル化頻度と発現量の比較ＬＡＰＴＭ５  ｍＲＮＡのレベルはリアルタイム定量RT-PCRにより測定し、ドットで示す；２つのＣＧ部位（ＣＧ-ＩまたはＣＧ-ＩＩ）におけるメチル化頻度は、Ｍｓ-ＳＮｕＰＥにより測定し、それぞれダークグレイ（ＣＧ-Ｉ）またはライトグレイ（ＣＧ-ＩＩ）バーで占めす。ｎは検体数を示す。垂直線は、標準偏差を示す。（ｄ）ＭＹＣＮ抗体を用いたクロマチン免疫沈降法（ChIP assay）。上段は、ＬＡＰＴＭ５遺伝子転写開始点近傍のマップと５種のプライマーの位置を示す。下段左は、ＩＭＲ３２細胞におけるChIP−ＰＣＲの結果を示す。各々のプライマーおよびＭＤＭ２遺伝子のプライマーをもちいて、ＰＣＲを行い、その産物はアガロースゲルにて分離された。下段右は、神経芽腫細胞株におけるＲｅｇｉｏｎ−４のChIP−ＰＣＲの結果を示す。ＭＹＣＮ増幅をもつＩＭＲ３２，ＧＯＴＯ，ＳＪ−Ｎ−ＣＧ細胞および増幅を持たないＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるChIP−ＰＣＲは、定量的ＰＣＲにて行った。グラフは、MYCN enrichment = (値 MYCN-ChIPの値 - IgG-ChIPの値) / inputの値で計算し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞での値を１．０としたときの相対値を示す。（e）予後不良神経芽腫におけるＬＡＰＴＭ５不活性化の生物学的意義についてのモデル
【図６】ＤＮＡメチル化による発現抑制される候補遺伝子の探索（ａ）ＢＡＭＣＡの概略図。ＤＮＡ断片は、神経芽腫細胞株（緑）とリファレンス（赤）からＭＣＡ方法により作製し、それぞれＣｙ３またはＣｙ５で標識をおこない、１ｐ３６コンティグアレイ上で共ハイブリダイゼーションをおこなった。（ｂ）RT-PCR解析による候補遺伝子のスクリーニング。ＧＡＰＤＨ遺伝子は内部標準として用いた。Ａｄｒ、正常副腎；Ｓ１  ＮＢｓ、５つのｓｔａｇｅ‐１神経芽腫腫瘍からのサンプル。（ｃ）３つのＢＡＣ（１２７Ｊ４、３１６Ｃ６、４１８Ｂ２２）の遺伝的地図と各遺伝子のおける転写開始部位周辺のＳｍａＩ部位とメチル化特異的（ＭＳ）-ＰＣＲ解析の結果。ブラックボックスまたはバーは遺伝子またはＣｐＧアイランドを示す。開始部位についての矢印は転写方向を示す。ＭＳ-ＰＣＲでのブラックとホワイトサークルは、ＰＣＲ産物の有（メチル化）と無（非メチル化）を示す。グレイボックスにより示した領域は、各リファレンス（ＬＡＰＴＭ５についてはＰＢＭＮＣｓまたはＲＡＰ１ＧＡ１についてはｓｔａｇｅ‐１神経芽腫腫瘍）と比較したＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ細胞におけるメチル化頻度を示す。（ｄ）神経芽腫細胞株とＲＡＰ１ＧＡ１のための初代腫瘍におけるＣＯＢＲＡとRT-PCR解析の代表的なイメージ。（c）でのＲＡＰ１ＧＡ１の領域におけるｂｉｓｕｌｆｉｔｅ-ＰＣＲ産物はＨｈａＩを用いて消化した。矢印はメチル化している場合に確認できるバンドを示す。（ｅ）ＬＡＰＴＭ５のための神経芽腫検体におけるＣＯＢＲＡの代表的なイメージ。（c）でのＬＡＰＴＭ５の２つの領域におけるｂｉｓｕｌｆｉｔｅ-ＰＣＲ産物はＨｉｎｆＩ（ｒｅｇｉｏｎ‐１）とＴａｑＩ（ｒｅｇｉｏｎ‐２）を用いて消化した。矢印はメチル化している場合に確認できるバンドを示す。（ｆ）ＰＢＭＮＣｓとＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞を含む２つの神経芽腫細胞株でのＬＡＰＴＭ５を含んでいるＢＡＣクローン４１８Ｂ２２内のＳｍａＩ部位のメチル化状態。１６プライマーセットは２００−２，０００塩基対の距離範囲において、少なくとも２つのＳｍａＩ部位を含んでいるゲノミック領域でＰＣＲのために合成した。ＳｍａＩで消化したゲノミック断片を鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。ブラックとホワイトサークルはＰＣＲ産物のメチル化の有無を示す。そのグレイボックスの領域（プライマー１２-１６を含んでいる）は、ＬＡＰＴＭ５遺伝子座の神経芽腫特異的メチル化領域を示す。（ｇ）ＬＡＰＴＭ５遺伝子の転写開始部位周辺のＣＧ部位におけるメチル化状態。開始点の１ｋｂ以内の全３２ＣＧ部位は（ｃ）で示す２つのプライマーセット（ｒｅｇｉｏｎ‐Ｉとｒｅｇｉｏｎ‐ＩＩ）を用いて解析した。矢印は開始部位の転写方向を示す。２つのＳｍａＩ部位を示すアローヘッドは（ｃ）で示した。ＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ３２細胞は両方で広範囲にメチル化されており、ＰＢＭＮＣｓとＥＢＶでトランスフォームしたリンパ球細胞株（ＬＣＬ）は、ほとんどメチル化されていなかった。（h）神経芽腫細胞株におけるbisulfite sequencingによるメチル化解析。（ｃ）で示す２つのプライマーセット、ｒｅｇｉｏｎ‐Ｉ、を用いて１７個のＣＧ  ｓｉｔｅにおけるbisulfite sequencingを行った。各々のメチル化��度を白（０−２５％）、薄い灰色（２６−５０％）、濃い灰色（５１−７５％）、および黒（７６-１００％）で示す。
【図７】神経芽腫細胞株におけるＤＮＡコピー数変化の解析アレイＣＧＨにより、神経芽腫細胞株における１ｐ消失の頻度を明らかにした。１ｐに位置する４３ＢＡＣを含む任意のＢＡＣをスポットしたＭＣＧ  Ｃａｎｃｅｒａｒｒａｙ-８００を用いて、１０神経芽腫細胞株を解析した。横向きの赤（ＭＹＣＮが増幅していない４つの神経芽腫細胞株）または青（ＭＹＣＮが増幅している神経芽腫細胞株）バーは、各ＢＡＣ上の消失頻度を示す。ＬＡＰＴＭ５遺伝子座を含み１ｐ上の大きい範囲消失は、ＭＹＣＮが増幅した神経芽腫細胞株において高頻度に検出した。
【図８】Ｍｓ-ＳＮｕＰＥ解析によるメチル化解析（ａ）ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ‐ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ‐ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ）解析に用いたプライマーの位置。Ｒｅｇｉｏｎ‐Ｉ（補足図１ｃに示す）のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ‐ＰＣＲ産物はゲル精製をおこなった。矢印はプライマー伸長実験に用いた各プライマーの位置を示す。ＣＧ部位がメチル化または非メチル化されているときは、それぞれ、ＣまたはＴが付加される。（ｂ）ＣＧ-ＩＩについてのＭｓ-ＳＮｕＰＥ解析の代表的なイメージ。精製したｂｉｓｕｌｆｉｔｅ‐ＰＣＲ産物（２５ｎｇ）、プライマー、そしてラジオアイソトープでラベルしたＣまたはＴは、プライマー伸長のために反応させた；産物は精製後、ＰＡＧＥにより泳動した。各ＣＧ部位のメチル化値は、メチル化したＣ／（メチル化したＣ+非メチル化Ｔ）ｘ１００、により算出した。腫瘍サンプル番号、Ｔ８３０、Ｔ１０５２、Ｔ３３４は、図２ｂと２ｃでのＧＮ１、ＧＮ２、ＧＮ３を反映する。
【図９】Ｓｔａｇｅ‐４Ｓ神経芽腫腫瘍内の腫瘍変性範囲についてＬＡＰＴＭ５またはＨ-rasで染色した免疫化学染色の代表的なイメージ（左）ヘマトキシリン-エオジン（ＨＥ）；（中央）ＬＡＰＴＭ５抗体；（右）H-ras抗体による代表的な染色像
【図１０】Ａｄ−ＬａｃＺまたはＡｄ−ＬＡＰＴＭ５により感染されたＧＯＴＯ細胞におけるｐ６２/ＳＱＳＴＭ１およびユビキチン化タンパク質の蓄積インフェクションの４日後、細胞は固定化し、ｐ６２/ＳＱＳＴＭ１抗体を用いて免疫反応をおこない、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ複合２次抗体を用いて可視化した。細胞抽出物は、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸｎにて調整された。ＴｒｉｔｏｎＸ不溶性画分は、２％ＳＤＳにて溶解した。ＴｒｉｔｏｎＸ可溶性または不溶性画分は、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、各々の抗体でウエスタンブロット解析を行った。
【図１１】ＬＡＰＴＭ５誘導細胞死におけるリソソームの膜透過化（ＬＭＰ）（ａ）ＬＴＲ染色の点状パターンの消失を持つ細胞の頻度。Ａｄ-ＬａｃＺまたはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５インフェクションの１日後または４日後、点状パターンの消失を持つ細胞の頻度を算出した。上段は、代表的な像を示す。全細胞の割合として記録した。図は両細胞株における細胞の割合を示す。垂直線は３回の独立した実験の標準偏差を示す。＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０５．Ｎｏ  ｉｎｆ；インフェクションしていないサンプルを示す。（ｂ）インフェクションしたＧＯＴＯ細胞とＩＭＲ細胞のアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色のＦＡＣＳ解析例。（ｃ）リソソームから細胞質へのカテプシンＤ（ＣＴＳＤ）の流出。図はＣＴＳＤ蛋白質の局在を示す。インフェクションの４日後、細胞は固定化し、ＣＴＳＤ抗体を用いて免疫反応をおこない、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ複合２次抗体を用いて可視化した。矢印は細胞質へＣＴＳＤが放出した細胞を示す。
【図１２】ＬＭＰを誘導する薬剤の処理によるＧＦＰ-ＬＣ３  ＩＩ型蛋白質の検出とｐ６２／ＳＱＳＴＭ１蛋白質の蓄積ＧＦＰ-ＬＣ３を安定して発現しているＧＯＴＯ細胞（１ｘ１０6細胞／ウエル）は、６ウエルプレートに撒き、ＬＭＰ誘導のために、Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘｉｃａｎ（ＣＰＸ）（１００または３００μｇ／ｍｌ）またはその溶媒（０．１Ｎ塩酸）で処理した。処理した細胞からの全細胞抽出液はＳＤＳ-ＰＡＧＥにより泳動し、各蛋白質に対する抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。
【図１３】In vitro分化誘導に伴うＬＡＰＴＭ５の発現活性化（ａ）ＩＭＲ３２細胞における分化誘導した際の細胞形態変化。細胞はレチノイン酸（ＲＡ）１０uMで１４日間処理された。写真は位相差顕微鏡像を示す。（ｂ）ＲＡ処理０、６、１４日後のＭＹＣＮの発現は、ウエスタンブロットにて解析された。（ｃ）ＲＡ処理０、６、１４日後のＬＡＰＴＭ５の発現レベルは、定量的RT-PCRにより解析された。
【図１４】Ａｄ−ＬＡＰＴＭ５で感染されたＧＯＴＯ細胞におけるネクローシスを示す電子顕微鏡像。細胞質の空砲化および核の虎斑状模様が認められる。
【図１５】神経芽腫細胞以外の癌種由来細胞株におけるＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死（ａ）８３０５Ｃ（甲状腺未分化癌；２ｘ１０4細胞／ウエル）、ＳａｏＳ２（骨肉腫；２ｘ１０4細胞／ウエル）は、２４ウェルプレートに撒き、ＬａｃＺ（Ａｄ-ＬａｃＺ）またはＬＡＰＴＭ５（Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５）を１０ＭＯＩの条件でインフェクションさせた。死滅した細胞は、トリパンブルー排他法を用いて、インフェクション２日後と４日後で測定した。垂直線は２度の実験の標準偏差を示す。（ｂ）Ａｄ-ＬＡＰＴＭ５をインフェクションした８３０５Ｃ細胞またはＳａＯＳ２細胞において、ＧＦＰ-ＬＣ３  ＩＩ型の検出、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１の蓄積、ＣＴＳＤ活性型の増加を示す。２４ウエルプレートに撒いたＧＦＰ-ＬＣ３を安定に発現している８３０５Ｃ細胞またはＳａＯＳ２細胞（各２ｘ１０4細胞／ウエル）は１０ＭＯＩの条件でＡｄ-ＬａｃＺまたはＡｄ-ＬＡＰＴＭ５で感染し、４日後、サンプルは調整され、各々の抗体をもちいてウエスタンブロット解析を行った。
【図１６】ＮＢ腫瘍の退縮の際のＬＡＰＴＭ５誘導性細胞死における分子メカニズムの仮説図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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