(57)【要約】【課題】多能性幹細胞の増殖及び分化を適切に制御できる多能性幹細胞の培養方法を提供する。【解決手段】本発明による多能性幹細胞の培養方法は、多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは、２以上の整数）しながら、多能性幹細胞を培養する第１ステップを備えている。これにより、分化を抑制しながら、多能性幹細胞が培養可能である。このとき、当該多能性幹細胞の培養方法は、前記第１ステップと組み合わせて、多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力を多能性幹細胞に加えながら、多能性幹細胞を培養する第２ステップを更に備えていることが好ましい。これにより、未分化のまま増殖された多能性幹細胞を、その後、適当な状態までその分化誘導を促進しながら培養することができる。【選択図】図１
2010193910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記多能性幹細胞の分化を抑制しながら前記多能性幹細胞を培養するステップ
を備えた
多能性幹細胞の培養方法。
【請求項２】
（ｂ）多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力を前記多能性幹細胞に加えて多能性幹細胞の分化誘導を促進しながら前記多能性幹細胞を培養するステップ
を備えた
多能性幹細胞の培養方法。
【請求項３】
請求項２に記載の多能性幹細胞の培養方法において、
前記力は、前記多能性幹細胞を一の回転軸の回りに回転して前記多能性幹細胞に遠心力を印加することにより発生される
多能性幹細胞の培養方法。
【請求項４】
（ａ）多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）して前記多能性幹細胞の分化を抑制しながら前記多能性幹細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力を前記多能性幹細胞に加えて多能性幹細胞の分化誘導を促進しながら前記多能性幹細胞を培養するステップ
とを備えた
多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは２以上の整数）しながら、前記多能性幹細胞を培養する第１培養装置と、
前記多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力を前記多能性幹細胞に加えながら、前記多能性幹細胞を培養する第２培養装置
とを備えた
多能性幹細胞の培養システム。
【請求項６】
多能性幹細胞と培地とが封入される培養容器と、
前記培養容器を、第１回転軸の回りに回転する第１回転装置と、
前記培養容器を、前記第１回転軸と平行でない第２回転軸の回りに回転する第２回転装置
とを備えた
多能性幹細胞培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載の多能性幹細胞培養装置において、
前記第１回転軸は、重力方向と実質的に平行である
多能性幹細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化多能性幹細胞の培養方法及び培養装置に関する。本発明は、特に、分化を制御しながら未分化多能性幹細胞を培養する培養方法及び培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医学においては、幹細胞移植により目的とする組織及び臓器を修復し、再生する技術の検討が進められている。多能性幹細胞は、増殖し、継代を繰り返す自己複製能力と共に、多種の成熟細胞に分化する分化能を有している。生体から取り出された多能性幹細胞を培養し、更に分化誘導をかけた上で、再度、生体内に戻すことにより、組織及び臓器を修復し、再生することができると考えられている。
【０００３】
しかし、現在では、移植された幹細胞の生着率は低い。移植された幹細胞は、生体内に存在することは可能であるが、幹細胞本来の機能を発揮するまでには至っていない。更に、幹細胞は、環境因子によって分化する方向が容易に変化するため、移植された幹細胞が目的の組織及び臓器に分化しない可能性も否定できない。
【０００４】
幹細胞移植技術を確立するためには、多能性幹細胞を培養する技術の確立が必要である。まず、多能性幹細胞を未分化で培養する技術の確立が必要である。加えて、適切な分化過程にある多能性幹細胞を移植して生着率を高めると共に、事前に適切な分化誘導を多能性幹細胞に対して行う技術の確立が必要である。
【０００５】
従来、幹細胞の増殖技術、及び分化誘導技術としては、増殖因子及び分化因子となる薬物を含有する培地で幹細胞を培養する技術が知られている。また、他の細胞と混合して幹細胞を培養する技術が知られているが、両者とも実用段階まで技術的には確立していない。更に、容器を多方向から重力を受けるように回転しながら動植物を育成する動植物育成装置が、特許公報（特公平７−８９７９８）に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、多能性幹細胞の増殖及び分化を適切に制御できる多能性幹細胞の培養方法及び培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下に、[発明を実施するための形態]で使用される番号・符号を用いて、課題を解決するための手段が説明される。これらの番号・符号は、[特許請求の範囲]の記載と[発明を実施するための形態]の記載との対応関係を明らかにするために付加されている。但し、付加された番号・符号は、[特許請求の範囲]に記載されている発明の技術的範囲の解釈に用いてはならない。
【０００８】
本発明による多能性幹細胞の培養方法は、
（ａ）多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは、２以上の整数）しながら、多能性幹細胞を培養するステップを備えている。これにより、分化を抑制しながら、多能性幹細胞が培養可能である。
【０００９】
このとき、当該多能性幹細胞の培養方法は、更に、
（ｂ）前記（ａ）ステップの後、前記多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力を多能性幹細胞に加えながら、多能性幹細胞の分化誘導を促進する培養ステップを備えていることが好ましい。これにより、（ａ）ステップにより未分化のまま培養された多能性幹細胞を、その分化を促進しながら培養することができる。これにより、適切な分化誘導が実現される。
【００１０】
このとき、多能性幹細胞に印加される力は、多能性幹細胞を一の回転軸の回りに回転し、多能性幹細胞に遠心力を印加することにより発生されることが好ましい。
【００１１】
また、既述のｎは２であることが好ましい。
【００１２】
本発明による多能性幹細胞の培養システムは、多能性幹細胞をｎ軸回転（ｎは、２以上の整数）しながら、多能性幹細胞を培養する第１培養装置（１、２１）と、多能性幹細胞に対して一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力を多能性幹細胞に加えながら、多能性幹細胞を培養する第２培養装置（１１、２１）とを備えている。
【００１３】
本発明による多能性幹細胞培養装置は、
多能性幹細胞と培地とが封入される培養容器（２、２２）と、培養容器（２）を、第１回転軸（４ａ、２５ａ）の回りに回転する第１回転装置（４、２５）と、培養容器（２）を第１回転軸（４ａ、２５ａ）と平行でない第２回転軸（６ａ、２７ａ）の回りに回転する第２回転装置（６、２７）とを備えている。
【００１４】
このとき、第１回転軸（２５ａ）は、重力方向と実質的に平行であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、多能性幹細胞の増殖及び分化を適切に制御できる多能性幹細胞の培養方法及び培養装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明による多能性幹細胞の培養方法の実施の第１形態で使用される重力分散型培養装置１を示す。
【図２】図２は、過重遠心培養装置１１を示す。
【図３】図３は、本発明による多能性幹細胞の培養方法の実施の第２形態で使用される培養装置２１を示す。
【図４】図４は、培養装置２１の動作を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、添付図面を参照しながら、本発明による多能性幹細胞の培養方法の実施
の一形態を説明する。
【００１８】
本発明による多能性幹細胞の培養方法の実施の第１形態では、まず、多能性幹細胞が、生体から取り出される。例えば、ラットの多能性幹細胞を取り出す場合、下記方法により多能性幹細胞が取り出される。まず、ラット大腿骨から骨髄細胞が取り出される。取り出された骨髄細胞は、牛胎児血清を含む培地に懸濁される。骨髄細胞が懸濁された培地は、遠心分離法により脂肪成分と細胞沈査とに分離される。得られた細胞沈査は、密度勾配遠心法によって低密度分画と高密度分画とに分離される。その低密度分画から多能性幹細胞がフローサイトメトリにより分離される。
【００１９】
続いて、取り出された多能性幹細胞が、図１に示されている重力分散型培養装置１により、２軸回転されながら培養される。重力分散型培養装置１は、培養容器２、本体３、モータ４、外側フレーム５、モーター６、及び内側フレーム７を含む。培養容器２には、多能性幹細胞と培地とが封入される。本体３は、基部３ａと脚３ｂ、３ｃを含む。基部３ａには、脚３ｂ、３ｃが接続されている。脚３ｂには、モータ４が設けられている。モータ４には、外側フレーム５が接続されている。モータ４は、回転軸４ａの回りに外側フレーム５を回転する。外側フレーム５には、モータ６が設けられている。モータ６には、内側フレーム７が接続されている。モータ６は、回転軸６ａの回りに内側フレーム７を回転する。回転軸６ａは、回転軸４ａと概ね直交する。内側フレーム７には、培養容器２が接続されている。培養容器２は、回転軸４ａと回転軸６ａとの交点の近傍にある。培養容器２は、内側フレーム７と同体に回転する。外側フレーム５と内側フレーム７とがそれぞれ回転されると、培養容器２は、２軸回転することになる。
【００２０】
多能性幹細胞が２軸回転されながら培養されると、多能性幹細胞にかかる重力は３次元的に分散され、多能性幹細胞は、分化が抑えられた状態で増殖する。
【００２１】
多能性幹細胞が充分に増殖された後、増殖された多能性幹細胞は、図２に示されている過重遠心培養装置１１によって培養される。過重遠心培養装置１１は、培養容器１２、本体１３、モータ１４、及びロータ１５を含む。培養容器１２には、重力分散型培養装置１により培養された多能性幹細胞と培地とが封入される。培養容器１２に封入される培地は、所望の分化を誘導する各種因子を含む。例えば、骨及び軟骨への分化を誘導する場合、骨及び軟骨への分化を誘導するデキサメタソン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）及びＴＧＦ−βが、培地に混入される。本体１３には、モータ１４が設けられる。モータ１４は、ロータ１５を回転軸１５ａの回りに回転する。回転軸１５ａは、重力方向に実質的に平行である。ロータ１５には、培養容器１２が固定される。
【００２２】
ロータ１５が回転すると、培養容器１２には遠心力が印加され、これにより培養容器１２に封入された多能性幹細胞に、多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向であり、且つ、重力よりも大きい力が印加される。ロータ１５が回転すると、培養容器１２には、重力方向と垂直な水平方向に遠心力Ｆ１が印加される。培養容器１２に封入された多能性幹細胞には、遠心力Ｆ１と重力Ｆ２との合力Ｆ３が作用する。その合力Ｆ３は、多能性幹細胞に対して一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい。このとき、回転軸１５ａが重力方向に実質的に平行であることにより、合力Ｆ３の多能性幹細胞に対する相対方向と、合力Ｆ３の大きさとが、概ね一定に保たれる。これは、分化を促進する上で好ましい。また、培養容器１２の細胞培養面は、合力Ｆ３に対して垂直に設置することが好ましい。
【００２３】
相対方向が一定であり、且つ、重力よりも大きい力が印加された状態で多能性幹細胞が培養されると、多能性幹細胞の分化が促進される。多能性幹細胞は、所望の状態まで分化され、分化誘導細胞に成長する。分化誘導細胞は、生体細胞移植に使用される。
【００２４】
実施の第１形態では、多能性幹細胞が２軸回転されながら培養され、多能性幹細胞の分化を抑制しながら多能性幹細胞を培養することができる。更に、多能性幹細胞が充分に培養された後、重力よりも大きい力が一定の方向に印加された状態で多能性幹細胞が培養され、多能性幹細胞の分化が促進される。これにより、実施の第１形態では、多能性幹細胞の増殖及び分化が適切に制御可能である。
【００２５】
なお、本実施の形態では、分化を抑制しながら多能性幹細胞が培養されるとき、その多能性幹細胞は２軸回転されているが、多能性幹細胞が２軸よりも多い回転軸の回りに多軸回転された状態で多能性幹細胞が培養されることも可能である。多軸回転された状態で多能性幹細胞が培養された場合でも、２軸回転の場合と同様に、多能性幹細胞にかかる重力は３次元的に分散され、多能性幹細胞は分化が抑えられた状態で増殖する。
【００２６】
本発明による多能性幹細胞の培養方法の実施の第２形態では、図１の重力分散型培養装置１と、図２の過重遠心培養装置１１との代わりに、図３に示された培養装置２１が使用される。
【００２７】
培養装置２１は、培養容器２２、本体２３、支柱２４、モータ２５、外側フレーム２６、モータ２７、及び内側フレーム２８を含む。培養容器２２には、多能性幹細胞と培地とが封入される。本体２３には、支柱２４が接続される。支柱２４は、外側フレーム２６を支持する。本体２３には、更にモータ２５が設けられる。モータ２５は、回転軸２５ａの回りに外側フレーム２６を回転する。回転軸２５ａは、重力方向と平行な方向である。外側フレーム２６には、モータ２７が接続されている。モータ２７は、内側フレーム２８を回転軸２７ａの回りに回転する。内側フレーム２８には培養容器２２が、同体に接続されている。このような構成を有する培養装置２１は、重力分散型培養装置１と過重遠心培養装置１１との両方の機能を有する。
【００２８】
実施の第２形態では、以下のようにして多能性幹細胞が培養される。
【００２９】
まず、実施の第１形態と同様にして、生体から多能性幹細胞が取り出される。取り出された多能性幹細胞は、培地と共に、培養容器２２に封入される。
【００３０】
続いて、培養容器２２を２軸回転しながら多能性幹細胞が培養される。即ち、モータ２５が外側フレーム２６を回転し、且つ、モータ２７が内側フレーム２８を回転した状態で、培養容器２２の中で多能性幹細胞が培養される。モータ２５が外側フレーム２６を回転し、且つ、モータ２７が内側フレーム２８を回転すると、培養容器２２は２軸回転する。培養容器２２が２軸回転されると、多能性幹細胞にかかる重力は３次元的に分散され、多能性幹細胞は、分化が抑えられた状態で増殖する。
【００３１】
多能性幹細胞が充分に増殖された後、培養容器２２に封入された培地が、所望の分化を誘導する各種の分化因子を含む培地に交換される。
【００３２】
続いて、多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい力が多能性幹細胞に印加された状態で、多能性幹細胞が培養される。より詳細には、図４に示されているように、外側フレーム２６が、回転軸２５ａのまわりに回転され、内側フレーム２８は、外側フレーム２６に対して一定の角度をなすように固定された状態で、多能性幹細胞の培養が行われる。このとき、モータ２７は、内側フレーム２８を回転しない。これにより、培養容器２２は一軸回転され、培養容器２２には、遠心力Ｆ１が印加される。培養容器２２に封入された多能性幹細胞には、遠心力Ｆ１と重力Ｆ２との合力Ｆ３が作用する。その合力Ｆ３は、多能性幹細胞に対して相対的に一定の方向を向き、且つ、重力よりも大きい。
【００３３】
既述のように、重力よりも大きい力が一定の方向に印加された状態で多能性幹細胞が培養されると、多能性幹細胞の分化が促進される。多能性幹細胞は、所望の状態まで分化され、分化誘導細胞に成長する。分化誘導細胞は、生体細胞移植に使用される。
【００３４】
実施の第２形態でも、実施の第１形態と同様に、多能性幹細胞の増殖及び分化が適切に制御される。更に実施の第２形態は、実施の第１形態よりも培養に必要な装置が削減されている点で好ましい。
【符号の説明】
【００３５】
１：重力分散型培養装置
２：培養容器
３：本体
４：モータ
５：外側フレーム
６：モーター
７：内側フレーム
１１：過重遠心培養装置
１２：培養容器
１３：本体
１４：モータ
１５：ロータ
２１：培養装置
２２：培養容器
２３：本体
２４：支柱
２５：モータ
２６：外側フレーム
２７：モータ
２８：内側フレーム
【図１】
2010193910.tif 000003
【図２】
2010193910.tif 000004
【図３】
2010193910.tif 000005
【図４】
2010193910.tif 000006