(57)【要約】      （修正有）【課題】リン酸化されたｐ２１−活性化プロテインキナーゼ（ＰＡＫ）（特にＰＡＫ４）を使用するＰＡＫ活性を調整する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法。【解決手段】哺乳類の治療組成物の効果を観察する方法は、（ｉ）治療組成物の哺乳類への投与前にその哺乳類から得た第１の生検の第１のＰＡＫリン酸化レベルを測定することと、（ｉｉ）その治療組成物の投与後にその哺乳類から得た次の生検の第２のＰＡＫリン酸化レベルを測定することを含む。この方法によれば、第１の生検と比較して次の生検のＰＡＫリン酸化がより低い水準になることは、その哺乳類についてのその治療組成物の効き目を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＫ４活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶ方法であって、
（ｉ）候補哺乳類由来の組織の試験生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫ４の比率を決定するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）の比率を、前記候補哺乳類の前記試験生検材料と同じ組織型から得られる対照生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫ４の比率と比較するステップと、
を含み、
前記試験生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫ４の比率が前記対照生検材料の前記比率より大きい場合、前記候補哺乳類は、ＰＡＫ４活性の活性調節因子による処理に適している方法。
【請求項２】
哺乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトが癌を有している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトが甲状腺癌、結直腸癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、前立腺癌および大腸癌からなる群から選択される癌を有している、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）の試験生検材料が腫瘍形成生検材料である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍形成生検材料が大腸癌を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍形成生検材料が腎細胞癌、肺腺癌、前立腺癌、管内胸部腺癌からなる群から選択される癌を含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍形成のバイオマーカ、哺乳類の生検サンプルからリン酸化されたＰＡＫを検出するためのリン酸特異的抗体およびＰＡＫ活性を調整する化合物を識別するためのスクリーニングアッセイ系としてリン酸化されたｐ２１−活性化プロテインキナーゼ（ＰＡＫ）を使用することに関する。ＰＡＫ活性を調整する化合物による処理に適した所定の集団のサブセットを決定する方法もまた、意図される。
【背景技術】
【０００２】
ｐ２１−活性化プロテインキナーゼ（ＰＡＫ）セリン／トレオニンキナーゼは、ＲｈｏファミリＧＴＰアーゼの重要なエフェクタであって、細胞形質転換の場合と同様に、細胞形態および運動性の調節に関係している。Ｃａｌｌｏｗその他著、（２００２）、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第２７７巻、第１号、５５０−５５８を参照されたい。なお、この文献は、本願明細書に引用したものとする。
【０００３】
このキナーゼ・ファミリの１つのメンバーであるＰＡＫ４は、さまざまな組織由来のヒト腫瘍株において、しばしば過剰発現する。ＰＡＫ４のアミノ酸配列は、自己リン酸化サイトをＰＡＫ４のキナーゼドメインに含む。このセリンのグルタミン酸への突然変異（Ｓ４７４Ｅ）は、キナーゼの構成的な活性化を引き起こす。ＰＡＫ４を活性化Ｃｄｃ４２とともに共発現させると、セリン４７４を標的とするリン酸特異的抗体はゴルジ膜上の活性化ＰＡＫ４を検出する。さらに、活性ＰＡＫ４（Ｓ４７４Ｅ）変異体の発現は形質転換能を有する。そして、結果としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を足場非依存性の成長に導く。キナーゼ不活性のＰＡＫ４（Ｋ３５０Ａ，Ｋ３５１Ａ）は、他方では、活性化Ｒａｓによる形質転換を効果的に阻害して、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞の足場非依存性の成長を阻害する。このように、ＰＡＫ４は腫瘍化形質転換に強く関係し、ＰＡＫ４活性がＲａｓ駆動された、足場非依存性の成長のために必要であることを示唆する。前掲のＣａｌｌｏｗその他著を参照されたい。
【０００４】
現在まで６つのヒトＰＡＫが同定されている。第１のサブファミリは、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２およびＰＡＫ３からなり、それらの触媒ドメインの中で８０−９０％の配列同一性を示す。最近同定された第２のＰＡＫサブファミリ（ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＰＡＫ６）のメンバーは、また、各々に非常に関連があるが、ＰＡＫ１−３のキナーゼドメインに、約４０−５０％の同一性しか示さない。全てのＰＡＫファミリのメンバーはｐ２１結合ドメインの存在により特徴づけられる。そして、それは活性化ＲｈｏファミリＧＴＰアーゼに結合する（Ｍａｎｓｅｒその他著、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ
３６７、４０−４６、Ｂａｇｒｏｄｉａその他著（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０、２２７３１−２２７３７、Ｋｎａｕｓその他著、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６９、２２１−２２３、Ｍａｒｔｉｎその他著、（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ． １４、１９７０〜１９７８、 Ｔｅｏその他著、（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７０、２６６９０−２６６９７、およびＡｂｏその他著、（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ． １７、６５２７−６５４０を参照のこと）。
【０００５】
ＲｈｏファミリＧＴＰアーゼのエフェクタとして、ＰＡＫキナーゼは、アクチン細胞骨格を調整することによって、細胞の形態および運動性の調節において、重要な役割を果たす。Ｓｅｌｌｓその他著、（１９９７）Ｃｕｒｒ．
Ｂｉｏｌ． ７、２０２−２１０、Ｓｅｌｌｓその他著、（２０００）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５１、１４４９〜１４５７、 Ｈａｕｎｇその他著、（１９９８）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８、７１３０−７１３８、 Ｚｈｏａその他著、（１９９８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８、２１５３〜２１６３、Ｅｄｗａｒｄｓその他著、（１９９９の）Ｎａｔｕｒｅ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １、２５３−２５９、およびＫｉｏｓｓｅｓその他著、（１９９９）Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７、８３１−８４４を参照のこと。例えば、ＰＡＫ活性は、細胞運動において、病巣の癒着の収縮端での脱集合および伸長端での局在的集合に関係している（セルス著（１９９７）上記文献、Ｆｒｏｓｔその他著、（１９９８）Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３、２８１９１−２８１９８、および、Ｅｂｙその他著、（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ８、９６７−９７０を参照のこと）。繊維芽細胞単層の創傷癒合において、活性化ＰＡＫ１は、運動細胞の伸長端に急速に集合する（Ｓｅｌｌｓその他著、（２０００）上記文献を参照のこと）。さらにまた、ＰＡＫ４の過剰発現は、局所性のアクチン重合および糸状仮足の形成を誘発することが示されている（Ａｂｏその他著、（１９９８）上記文献を参照のこと）。アクチン細胞骨格におけるＰＡＫ４に依存する変化は、ＰＡＫ４キナーゼ活性およびＣｄｃ４２に依存するゴルジ膜への局在に依存している。ＰＡＫのアクチン細胞骨格を調整する能力は、キナーゼ依存性および非依存性のメカニズムによる。
【０００６】
ＰＡＫ４はＣｄｃ４２に対するエフェクタであるので、それは化学走性、細胞接着、炎症反応および自然免疫の免疫学的活性とおそらく関係している。例えば、腫瘍形成のＲａｓ駆動された足場非依存性の成長および細胞寿命の調節にＰＡＫキナーゼを関係させる証拠が増大しつつある。例えば、Ｑｉｕその他著、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ
３７４、４５７−４５９、 Ｑｉｕその他著、（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９２、１１７８１−１１７８５、 Ｑｉｕその他著、（１９９７）Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７、３４４９−３４５８、 Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒその他著、（１９９５）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５、６４４３−６４５３、Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔその他著、（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１０、２２８９〜２２９６、 Ｋｅｅｌｙその他著、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３９０、６３２−６３６、 Ｔａｎｇその他著、（１９９７）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．
１７、４４５４−４４６４、 Ｔａｎｇその他著、（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ９５、５１３９−５１４４、 Ｔａｎｇその他著、（２０００）Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５、９１０６−９１０９、Ｏｓａｄａその他著、（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０４、２２７−２３３、およびＬｉｎその他著（１９９９）Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４、２３６３３−２３６４１を参照のこと。
【０００７】
しかしながら、病気のおよび健康な哺乳類から得られる生検サンプルの腫瘍形成のためのバイオマーカとしてリン酸化されたＰＡＫ４を使用することを示唆する記載は、従来技術にない。同様に、治療を受けている哺乳類での治療組成物の効果を決定するためにＰＡＫ４リン酸特異的抗体を使用することは提案されていない。同様に、従来技術は、ＰＡＫ活性の活性調節因子として有効である化合物を同定するために、ＰＡＫ４リン酸化スクリーニングアッセイを用いることに関しては言及していない。また、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した所定の集団のサブセットを同定する手段としてＰＡＫリン酸化のレベルを検出して比較することを教示する記載は従来技術にない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の一態様では、哺乳類の治療組成物の効果を観察する方法（方法１）が、提供される。一実施形態において、上記の方法は、（ｉ）治療組成物の哺乳類への投与前にその哺乳類から得た第１の生検の第１のＰＡＫリン酸化レベルを測定することと、（ｉｉ）その治療組成物の投与後にその哺乳類から得た次の生検の第２のＰＡＫリン酸化レベルを測定することを含む。この方法によれば、第１の生検と比較して次の生検のＰＡＫリン酸化がより低い水準になることは、その哺乳類についてのその治療組成物の効き目を示す。
【０００９】
この方法は、一実施形態として、一方または双方の生検サンプルが足場非依存性の細胞発育ができる細胞を含むと推測されるものであることもまた意図する。あるいは、他の一実施形態として、第１および第２の生検サンプルのいずれも、足場非依存性の細胞発育ができる細胞を含まないことが推測される。好ましい実施形態では、生検サンプルは、組織生検サンプルである。一実施形態の当該例において、その組織は、頬粘膜組織、皮膚、毛嚢、腫瘍組織または骨髄である。また、その組織は、試験される哺乳類由来の、内臓から得られてもよい。他の実施形態では、その生検サンプルは、体液である。さらに別の実施形態では、その体液は、滑液、全新鮮血、末梢血単核細胞、冷凍全血液、新鮮な血漿、冷凍された血漿、尿または唾液である。他の一実施形態として、第１のおよび次の生検サンプルは、哺乳類の腫瘍から取り出される。
【００１０】
他の実施形態では、治療組成物は、直接または間接的に、少なくとも一つのＰＡＫのリン酸化を調整する。好ましい実施形態では、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５またはＰＡＫ６の任意の組合せのリン酸化が、測定される。他の好ましい実施形態では、ＰＡＫ４のリン酸化が、測定される。
【００１１】
一実施形態において、哺乳類に薬を投与するタイミングに関して、哺乳類から得られる第１の生検サンプルのリン酸化されたＰＡＫの第１のレベルは、治療組成物が哺乳類に投与される前に、少なくとも１日、少なくとも５日、少なくとも一週間、少なくとも二週間、少なくとも一月間測定される。
【００１２】
一実施形態において、治療組成物の投与は、治療組成物の少なくとも一回分の投与量を含む。他の実施形態では、治療組成物の投与は、治療組成物の多回投与の療法を含む。その投与量は、４時間から約１００日の期間の間に投与されてもよい。
【００１３】
他の実施形態では、その方法における哺乳類から得られる次の生検材料は、治療組成物の最終的な投与量の投与の後で採取される。さらに別の実施形態では、複数の生検材料は、治療組成物投薬療法の間、哺乳類から得られる。
【００１４】
その方法によれば、治療組成物は、哺乳類に対する投与の後で、生理的、生化学的、遺伝的、細胞的、あるいは免疫学的な哺乳類の一つ以上の特徴の変化をもたらしてもよく、または生じさせてもよい。
【００１５】
本発明の他の態様では、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶ方法（方法２）が、提供される。この方法は、候補哺乳類から得られた試験生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルを測定することを含む。一実施形態において、対照生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルより大きい試験生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルは、哺乳類がＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適していることを示す。
【００１６】
一実施形態において、対照生検材料は、候補哺乳類の試験生検材料と同じ組織型から得られる。好ましい実施形態において、対照生検材料は、候補哺乳類と同じ種の健康な哺乳類から得られる。他の実施形態では、組織型は、リンパ球細胞である。さらに別の実施形態では、組織型は、脳、心臓、肺、胸部、皮膚、腸、大腸、胃、膀胱である。さらなる態様において、哺乳類は、癌細胞を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の態様において、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶ他の方法（方法３）が提供される。この方法は、（ｉ）候補哺乳類から得られる組織の試験生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫの比率を決定することと、（ｉｉ）（ｉ）の比率を候補哺乳類の試験生検材料と同じ組織型から得られる対照生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫの比率と比較することと、を含む。好ましい実施形態では、試験生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫの比率が対照生検材料のそれより大きい場合、候補哺乳類はＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適している。
【００１８】
他の実施形態において、対照生検材料は、候補哺乳類と同じ種の健康な哺乳類から得られる。さらに別の実施形態では、候補哺乳類は、癌細胞を含む。他の実施形態では、候補哺乳類は、腫瘍を有する。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、癌を有する多数の哺乳類からＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選択する方法（方法４）を提供する。この方法は、（ｉ）候補哺乳類由来の組織から得られる腫瘍形成生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫの第１のレベルを決定すること、（ｉｉ）（ｉ）の候補哺乳類から同じ組織の非腫瘍形成生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫの第２のレベルを決定すること、および（ｉｉｉ）リン酸化されたＰＡＫの第１および第２のレベルを比較することを含む。好ましい実施形態において、ＰＡＫリン酸化のレベルが第１のレベルにおいて、第２のレベルより大きいことは、候補哺乳類がＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類であることを示す。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、哺乳類の生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルを決定する方法（方法５）を内包する。この方法は、（ｉ）生検材料をＰＡＫに特異的なリン酸特異的抗体にさらすことと、（ｉｉ）その抗体を検出することと、を含む。好ましい実施形態において、検出される抗体のレベルは、哺乳類の生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルと相関している。
【００２１】
また、本発明は、ＰＡＫ４タンパク質の配列の４７４番目の位置でリン酸化されたセリンを含むＰＡＫ４のペプチドに対して作成されるリン酸特異的抗体も意図する。一実施形態において、ＰＡＫ４ペプチドは、リン酸化されたセリンを含むアミノ酸配列（ＫＥＶＰＲＲＫＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ）を含む。
【００２２】
また、本発明は、ＰＡＫリン酸化を調整する化合物を同定する方法（方法６）も意図する。この方法は、（ｉ）ＰＡＫ４タンパク質の標本に、テスト化合物を添加することと、（ｉｉ）
ＰＡＫ４を標的とするリン酸特異的抗体を使用することによりＰＡＫ４のリン酸化のレベルを測定することと、（ｉｉｉ）処理済みのＰＡＫ４標本のレベルを未処理のＰＡＫ４標本のリン酸化レベルに対して比較することを備える。一実施形態において、処理済みの標本のリン酸化のレベルが未処理の標本のリン酸化レベルと異なることは、テスト化合物がＰＡＫリン酸化を調整する化合物であることを示す。好ましい実施形態では、テスト化合物は、標本のリン酸化されたＰＡＫ４のレベルを低下させるか、阻害するか、減らすかまたは、抑制する。
【００２３】
他の一実施形態として、ＰＡＫ４標本は、哺乳類由来の生検材料から単離されるＰＡＫ４タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、ＰＡＫ４標本は、遺伝子組み換えにより作成されたＰＡＫ４タンパク質を含む。
【００２４】
本発明のさらに別の態様は、ＰＡＫリン酸化を調整する化合物を同定する方法（方法７）を提供する。この方法は、（ｉ）細胞の培養物をテスト化合物にさらすことと、（ｉｉ）ＰＡＫ４を標的とするリン酸特異的抗体を用いることによりＰＡＫのリン酸化のレベルを測定することと、（ｉｉｉ）そのレベルを未処理の細胞のＰＡＫリン酸化のレベルと比較することを含む。一実施形態において、リン酸化のレベルが未処理の細胞より低いまたは高いことは、テスト化合物がＰＡＫリン酸化を調整する化合物であることを示す。好ましい実施形態において、テスト化合物は、処理済みの細胞により生成されるリン酸化されたＰＡＫのレベルを低下させるか、阻害するか、減らすかまたは、抑制する。
【００２５】
本発明のさらに別の態様は、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶ方法（方法８）である。この方法は、ＰＡＫ４タンパク質が哺乳類から得られる生検材料において、過剰発現するかどうか決定することを含む。一実施形態において、ＰＡＫ４タンパク質のレベルが同じ組織型の生検サンプルのＰＡＫ４発現の正常レベルより大きいことは、その哺乳類がＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適していることを示す。
【００２６】
他の本発明の一態様は、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶさらにもう一つの方法（方法９）を含む。この方法は、（ｉ）候補哺乳類の器官の第１の組織から得られた生検材料におけるＰＡＫ４タンパク質のレベルを測定することと、（ｉｉ）候補哺乳類のその器官の第２の組織から得られた生検材料におけるＰＡＫ４タンパク質のレベルを測定することと、（ｉｉｉ）その二つのレベルを比較することと、を含む。一実施形態において、２つの生検材料におけるＰＡＫ４タンパク質のレベルの違いは、候補哺乳類がＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適していることを示す。
【００２７】
他の方法（方法１０）として、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶ方法であって（ｉ）候補哺乳類から得られる組織由来の生検材料において、ＰＡＫ４メッセンジャーＲＮＡが過剰発現するかどうか決定することを含む方法が提供される。一実施形態において、ＰＡＫ４メッセンジャーＲＮＡのレベルが、公知の健康な哺乳類由来の同等の組織から得られる生検材料におけるＰＡＫ４メッセンジャーＲＮＡ発現の正常レベルより大きいことは、候補哺乳類がＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適したことを示す。
【００２８】
以下の実施形態は、本発明の全ての方法に適用できる。
このように、一実施形態において、哺乳類は、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ネコ、そしてイヌからなる群から選択される。好ましい実施形態では、哺乳類は、ヒトである。さらに別の実施形態では、哺乳類は、疾患を有する。他の実施形態では、疾患は、癌である。さらに別の実施形態では、癌は、甲状腺癌、結直腸癌、膵臓癌、乳癌、耳下腺癌、滑膜細胞癌、前立腺癌、喉頭癌、精巣癌、肝細胞癌、そして平滑筋肉腫からなる群から選択される。
【００２９】
同様に、本発明の方法の好ましい実施態様では、リン酸化されたＰＡＫのレベルは、ＰＡＫ４のリン酸化されたセリンに特異的なリン酸特異的抗体を用いて決定される。一実施形態において、リン酸特異的抗体は、リン酸化されたセリンを含むＰＡＫ４ペプチド（ＲＲＫＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ）に対して作成される。他の実施形態では、ＰＡＫ４−特異抗体を用いることにより全ＰＡＫ４タンパク質のレベルが決定されることは、本発明の方法に適用できる。好ましい実施形態では、ＰＡＫ４−特異抗体は、ペプチド配列（ＡＴＴＡＲＧＧＰＧＫＡＧＳＲＧＲＦＡＧＨＳＥＡ）に対して作成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
この国際出願は、２００２年１１月２７日に出願された米国の仮出願６０／４２９，３６３を基礎とする優先権を主張する。そして、その基礎出願は全体として本願明細書に引用される。
【００３１】
本発明は、試験−および対照−哺乳類の組織から得られる生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルを決定するためのリン酸特異的ＰＡＫ４抗体の新しい使用法に基づく。
【００３２】
「生検材料」は、診断目的のための生物体由来の組織の検体の除去および検査を指す。
【００３３】
本発明によれば、「組織」は、固体組織（たとえば心臓、肺、脳、肝臓、胃、膵臓または腸などの哺乳類における任意の内臓の固体組織など）であってもよい。また、「組織」は、頬粘膜組織、皮膚、毛嚢、腫瘍組織または骨髄により例示されてもよい。また、組織は、体液（例えば滑液、全新鮮血、末梢血単核細胞、冷凍全血液、新鮮な血漿、冷凍血漿、尿または唾液）であってもよい。
【００３４】
「試験生検材料」は、リン酸化されたＰＡＫのレベルが未決定である候補哺乳類から得られてもよい。
【００３５】
候補哺乳類は、疾患を有すると考えられるか、または疾患を有することが公知である哺乳類であってもよい。疾患は、癌であってもよい。例えば、候補哺乳類は、甲状腺癌、結直腸癌、膵臓癌、乳癌、耳下腺癌、滑膜細胞癌、前立腺癌、喉頭癌、精巣癌、肝細胞癌または平滑筋肉腫で罹患させられてもよい。候補哺乳類は、また、「患者」と称してもよい。かくして、本発明の「哺乳類」または「個人」は、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ネコまたはイヌであってもよい。
【００３６】
「対照生検材料」は、健康な哺乳類（たとえば癌のような疾患にかかっていない哺乳類）から得られてもよい。健康な哺乳類は、候補哺乳類と同じ生物種でなければならない。したがって、ヒト癌患者由来の肝臓「試験」生検材料のＰＡＫリン酸化のレベルは、健常なヒト由来の肝臓「対照」生検材料のＰＡＫリン酸化のレベルに対して比較される。このように、一般的に、「健康な」対照生検材料は、候補哺乳類から試験生検材料が取り出される組織と同じ組織型から取り出される。
【００３７】
あるいは、「対照生検材料」は、試験生検材料が得られる病気の組織または器官の病気に罹患していない部位（例えば非腫瘍形成部位）から取り出されてもよい。この場合、対照および試験生検材料は、同じ哺乳類から得られる。対照および試験生検材料は、例えば、ＰＡＫ活性の決定の前に、同一のサイズ、重量、細胞数または量でなければならない。対照および試験生検材料の一方または両方は変更を加えられてもよい。例えば、それら両方が細胞数、サイズまたは重量において、基本的に等しいことを確実にするために、何らかの方法で切られるか、希釈されるか、または、操作されてもよい。
【００３８】
略語「ＰＡＫ」は、本発明において、用いられているように、ｐ２１−活性化プロテインキナーゼ、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５およびＰＡＫ６を指す。したがって、哺乳類の標本のこの種のＰＡＫ（特にＰＡＫ４）の異常に高いレベルを検出することが可能であることは、ＰＡＫ活性を調整する（すなわち、阻害するか、減少させるか、抑制するか、または、低下させる）化合物を同定することに役立つ。それらの化合物は、それから治療組成物に調製されてもよく、ＰＡＫ活性の下方制御を必要とする哺乳類に投与されてもよい。ＰＡＫ活性の下方制御を「必要とする」個人は、一般的に、足場非依存性の成長（下記参照）を示す多数の細胞を有する個人である。さらにまた、ＰＡＫ活性調節因子により治療された個人から直接に得られた標本のリン酸化されたＰＡＫタンパク質の検出によって、治療的な処理の径時的な有効性を観察できる。リン酸化されたＰＡＫタンパク質のレベルが上昇した個人を同定することは、ＰＡＫ活性調節因子による処理に適した可能性がある個人を同定する際に役立つ第一のステップである。
【００３９】
そのために、試験生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルが、その試験生検材料が得られた組織に関する通常のレベルより高いレベルを有する個人は、ＰＡＫ活性調節因子によって、潜在的に治療可能であるＰＡＫの異常なレベルを有することとなる。本発明の「活性調節因子」は、好ましくはＰＡＫ活性を減少させる。リン酸化されたＰＡＫ（特に活性化ＰＡＫ４）のレベルの上昇は、足場非依存性の成長を経る傾向が高まった細胞と互いによく関連する。後者の現象は、腫瘍形成および癌成長における起因性要因であると知られているメカニズムである。例えば、足場独立成長が腫瘍生検材料から得られる生細胞が半固体培地におけるコロニーを形成できることを意味することが知られている。逆にいえば、足場に依存している細胞は、この種のコロニーを形成することができない。したがって、リン酸化されたＰＡＫのレベルが正常であるとみなされるレベルより高いことは、腫瘍形成の良好なバイオマーカである。その理由は、この種の高いレベルは足場非依存性の細胞成長のインジケータであるからである。
【００４０】
したがって、発明の方法は、基底線のレベル、上昇したレベルおよび異常なレベルのＰＡＫリン酸化の検出をさまざまな診断用および治療上の目的に適用する。例えば、本発明の１つの方法は、治療組成物による処理の前後で取り出される生検サンプルにおけるＰＡＫリン酸化のレベルを比較することによって、哺乳類（例えばヒト患者）に関する治療組成物の効果を観察する。しかしながら、個人を治療する前に、個人は、好ましくは実際にこの種の治療を必要とするとして、最初に同定されなければならない。したがって、患者における内因性のＰＡＫの活性を決定することは、患者のＰＡＫ活性が抑制されることを必要とするかどうかについて決定するのを助ける。かくして、本発明は、ＰＡＫ活性の活性調節因子による処理に適した哺乳類を選ぶための方法を提供する。
【００４１】
この種の選択法は、さまざまな方法で達成されることができる。例えば、１つの方法は、候補哺乳類由来の組織から得られる試験生検材料における全ＰＡＫ４タンパク質に対する、リン酸化されたＰＡＫの比率を決定してもよい。それから、それらのレベルは、同じ組織型であるが、健康な、候補哺乳類と同じ生物種の対照哺乳類における組織型において、測定される同じ比率と比較されてもよい。１つの方法は、特定の器官および組織についての総ＰＡＫ４タンパク質に対するリン酸化されたＰＡＫの一組の「通常の」比率を得るために、多くのこの種の健康な個人を試験してもよい。したがって、患者由来の、標準より大きい比率は、その患者がＰＡＫ活性の活性調節因子による治療に適していそうであることを示す。あるいは、ＰＡＫ４に対するリン酸化されたＰＡＫの比率は、同じ患者由来の試験生検材料および対照生検材料において、比較されてもよい。
【００４２】
患者は、この文脈において、癌のような疾患と、すでに診断されてもよい。このように、本発明は、ＰＡＫ活性調節因子による治療の利益を受ける癌患者の部分集合を選ぶことを意図する。したがって、１つの方法は、患者（すなわち「候補哺乳類」）由来の腫瘍の試験生検材料におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルを、同じまたは隣接した器官または組織由来の非腫瘍形成組織から得られた対照生検材料と比較する発明の方法を用いてもよい。本発明によれば、腫瘍生検材料のＰＡＫリン酸化のレベルが、非腫瘍形成組織におけるレベルより高いことは、その癌患者がＰＡＫ活性の活性調節因子による治療に適していることを示す。
【００４３】
本発明によれば、リン酸化されたＰＡＫ（特にリン酸化されたＰＡＫ４および全ＰＡＫ４タンパク質）は、一般にＰＡＫ４およびＰＡＫ４タンパク質のリン酸化された様態を認識する抗体を使用して検出されてもよい。それから、本発明は、例えば、ＰＡＫに特異的なリン酸特異的抗体に試験生検材料を接触させることによって、哺乳類におけるリン酸化されたＰＡＫのレベルを決定する方法を提供する。抗体が容易に検出可能であるように、抗体は標識されてもよい。このように、標本においてリン酸化されたＰＡＫ４に結合する抗体の量は、試験生検材料においてリン酸化されたＰＡＫのレベルと関連がある。この種のリン酸特異的抗体は、ＰＡＫ４タンパク質のリン酸化されたセリン−４７４に対して設計されていてもよい。例えば、抗体はＰＡＫ４ペプチド配列、ＲＲＫＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ、配列番号１に対して作成されてもよい。ＰＡＫ４ペプチド配列において、セリン−４７４はリン酸塩部分（太い、下線を引かれた部分）を含む。また、リン酸化されたセリン−４７４を含む他のペプチド配列に対して作成される抗体も、本発明により意図される。
【００４４】
同様に、ペプチド配列、ＡＴＴＡＲＧＧＰＧＫＡＧＳＲＧＲＦＡＧＨＳＥＡ、配列番号２は、ＰＡＫ４に特有であり、この特定の配列を認識し、結合する抗体を生産するために用いてもよい。よって、ＰＡＫ４タンパク質をそれ自体で検出するための配列番号２に対して作成される抗体は、本発明により意図される。
【００４５】
他の抗体も、本発明により想定される。例えば、ＰＡＫ５およびＰＡＫ６に対する抗体が、ＰＡＫ４−特異抗体と無関係にまたは結合して設計されてもよく、用いられてもよい。したがって、ＰＡＫ４、ＰＡＫ５および／またはＰＡＫ６の全体に対するリン酸化されたＰＡＫのさまざまな比率を、決定できる。本発明の抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたは特異的な組換え型単鎖分子であってもよい。抗体が検出可能であるように、本発明の抗体も標識されてもよい。例えば、抗体は、一旦抗体がその標的に結合したときに、抗体の検出を促進するように、酵素、蛍光体、または発色基に接合または架橋されてもよい。あるいは、１つの方法は、ＰＡＫ−特異抗体と結合する同じように標識された二次抗体を使用してもよい。それにより、結合した抗体の検出を容易にすることができる。
【００４６】
この種の抗体を用いて、ＰＡＫ活性を調整する検査化合物を求めてスクリーニングすることが可能である。本発明は、例えば、テスト化合物を投与する前後で単離されたおよび／または精製されたＰＡＫ４のリン酸化のレベルを測定することによって、ＰＡＫリン酸化を調整する化合物を同定する方法を意図する。単離または精製されたＰＡＫ４は、溶解された細胞から得られてもよく、または遺伝子組み換えにより作成されてもよい。テスト化合物も、細胞全体に投与し、次にこの細胞をリン酸特異的ＰＡＫ抗体によってテストして、細胞のＰＡＫ活性についてのテスト化合物の効果を決定してもよい。一旦ＰＡＫ活性を調整するとして同定されると、テスト化合物は、生体内、生体外、および試験管内で哺乳類に投与するための治療組成物に調製されてもよい。
【００４７】
治療組成物による治療の前に、試験生検材料は、特定の組織におけるＰＡＫリン酸化のレベルを決めるために、標的にされた哺乳類から取り出されてもよい。このように、試験生検材料は、治療組成物による治療の前に、例えば、１、５、７、１４または３０日取り出されてもよい。複数の試験生検材料を、その時間の間、同じ組織から取り出して、「平均」ＰＡＫリン酸化レベルを決定し、かつそれらのレベルの彷徨変異の可能性を明らかにしてもよい。上記の時間の後、それから、哺乳類は、例えば毎日、毎週または毎月治療組成物が投与される特定の投薬療法を施されてもよい。治療組成物は、少なくとも一つの投与量、または少なくとも２つの投与量、または最低５つの投与量、または少なくとも１０の投与量であって、最高で少なくとも５５か５６の投与量の治療組成物において、投与されてもよい。その投与量は、４時間から約１００日の期間の間に投与されてもよい。投与量は、２４時間、２日または２８日の期間にわたって投与されてもよい。あるいは、２つの投与量は、２４時間ごとに投与されてもよく、あるいは約１２時間ごとに投与されてもよい。治療されている哺乳類の個々の必要を満足させるために、治療組成物の投与が変化してもよいことは、当業者により理解される。例えば、典型的な投薬療法では、多数の日数、たとえば約２８日、約５６日などの間、患者は、１日につき２つの投与量の治療組成物を投与される。他の投薬療法において、治療組成物は、１日につき一回、１週当たり二回、あるいは１週当たり一回投与される。
【００４８】
投薬療法を終えた後で、他の、次の生検材料は、かつて「試験」生検材料を提供した生検材料と同じ組織から取り出される。それから、この次の生検材料におけるＰＡＫリン酸化のレベルは、発明の方法に従って決定され、そして治療の前に決定されたそれらのレベルと比較される。従って、哺乳類についての治療組成物の効果は、治療後のＰＡＫリン酸化のレベルの減少によって、あるいは哺乳類の生理的、生化学的、遺伝子的、免疫学的態様の変化を同定することによって、同定されてもよい。また、生検材料は、投薬療法の間、採取されてもよく、そして治療が進行中である間、哺乳類についての治療組成物の有効性を判定するために用いてもよい。
【実施例】
【００４９】
下記の実施例は、実例を示すが、本発明を制限しないことを目的とする。それらは使われる可能性のあるものの中で典型的であるが、当業者に知られている他の方法が用いられてもよい。
【００５０】
＜実施例Ｉ＞ 抗体
全ＰＡＫ４タンパク質（＃９３３）に対するウサギポリクローナル抗体はペプチドＡＴＴＡＲＧＧＰＧＫＡＧＳＲＧＲＦＡＧＨＳＥＡ（配列番号２）に対して作成された。そして、このペプチドはＰＡＫ４タンパク質のアミノ酸１２２−１４４を表す。リン酸特異的抗ＰＡＫ４ポリクローナル・ウサギ抗体＃１０８は、セリン−４７４がリン酸化されるよう（ＣＲＲＫｐＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ）（配列番号１）合成されたＫＬＨ結合リン酸化ペプチドに対して作成された。配列番号１の配列（ＲＲＫＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ）は、ＰＡＫ４タンパク質配列の領域３７１−３８５にわたる。リン酸特異的ＰＡＫ４ポリクローナル＃１０８血清は、プロテインＡアフィニティーカラムで更に精製された。リン酸化されたセリン４７４に対する特異性を確認するために、リン酸化されたＰＡＫ４のためのプロテインＡ精製された血清の特異性が、ＰＡＫ４ペプチドの抗原ペプチドＣＲＲＫｐＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ（配列番号１）、非リン酸化ＣＲＲＫＳＬＶＧＴＰＹＷＭＡＰＥ（配列番号３）（すなわちペプチド「＃７０４」）、そしてリン酸化されたトレオニン−４７８（ＣＲＲＫＳＬＶＧｐＴＰＹＷＭＡＰＥ）（配列番号４）（すなわちペプチド「＃６８１」）の種類のＰＡＫ４ペプチドに対して試験することにより確認された。非リン酸化ペプチドと交差反応するとわかった任意の抗体は、プロテインＡにより精製された血清をウルトラリンク−ヨードアセチル・カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、アメリカ合衆国）に結合させたペプチド＃６８１を通すことにより除去された。
【００５１】
ウエスタンブロット分析のために、プロテインＡ精製された（セリン４７４をリン酸化した）リン酸特異的抗ＰＡＫ４血清は、１／４０００希釈溶液にて使用された。免疫蛍光法実験のために、プロテインＡ精製されたリン酸特異的抗ＰＡＫ４抗体は、ペプチド＃６８１および＃７０４によって、あらかじめ吸収された。免疫組織化学のために使用するＰＡＫ４抗体の希釈溶液は、以下の通りである。＃１０８については、１／２５０〜１／１００の希釈度の範囲が、ＩＨＣ方法のためには好ましかった。＃９３３については、ＡＢＣ染色法のためには１／２００と同じ程度の希釈度が用いられた一方で、ベクター・レッド方法のために希釈度の範囲が１／５０に変えられた。
【００５２】
＜実施例ＩＩ＞ ウサギ一次抗体に対するＩＨＣプロトコル
ミクロトームは、４−５ミクロンで組織切片を切るために用いた。本発明において、使用する組織型の例については下記の表１を参照のこと。上記切片は、水浴に浮べられて、スライド上へ拾い上げられた。パラフィン切片を含んでいるスライドは、キシレン、アルコールを使用して脱パラフィン化されて、再水和されて、それから蒸気による標的回復法により処理した（ＤＡＫＯ試薬＃Ｓ１７００）。免疫組織化学的実験は、ＤＡＫＯにより開発された手順および試薬によりＤＡＫＯ自動染色機上で実行された。詳細には、スライドは、ブロックされ（ブロッキング剤は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ
ＡＢＣ−ＡＰキットに含まれていた）、リンスされ、一次抗体がアプライされ、室温で４５分間暖められた、スライドが再びリンスされた。それから、ビオチン化された二次抗体（５μｌ／ｍｌに希釈されている、Ｖｅｃｔｏｒ
抗ウサギ二次抗体（ＢＡ−１００）は、スライド上の組織にアプライされた。上記スライドは、それから室温で３０分間インキューベートされ、リンスされ、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ−ＡＰ（ＡＫ−５０００）試薬がアプライされた。Ｖｅｃｔｏｒ
Ｒｅｄ（ＳＫ−５１００）が、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ−ＡＰ（ＡＫ−５０００）のための基質として使われた。対照抗体（ＣＤ３１）は、ＤＡＫＯ（Ｍ０８２３マウス・モノクローナル）から得られ、それらの条件に従って、１：８０の希釈度で用いて、標本組織の品質および完全性を保証するために使用した。
【００５３】
＜実施例ＩＩＩ＞ ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ法
（ｉ）スライド調製
１． ４ｕｍ組織切片を切って帯電したスライド上へ載せる。本発明において、使用する組織型の実施例として下記の表１を参照のこと。２０分間６０℃乾燥炉にスライドを置く。あるいは、スライドは、必要に応じて終夜空気乾燥されてもよい。
【００５４】
２． スライドをラベルして、ラック中に置く。
【００５５】
３． スライドを脱パラフィン化して、再水和する（キシレンを３交換（１０分）し、その後、３Ｘ １００％のエチルアルコール、２Ｘ
９５％のエタノールにより処理（合計１０分）し、蒸留水によって、リンスする）。
【００５６】
４． 内因性のペルオキシダーゼを阻害する。すなわち、５分間３％の過酸化水素中にスライドを静置する。
【００５７】
５． 蒸留水中でスライドをリンスする。
【００５８】
６． 前処理：必要に応じて前処理を実行する。可能な前処理として、１０ｍＭのクエン酸塩バッファｐＨ ６．０またはＥＤＴＡバッファ（ｐＨ
８．０）中の加熱されたスライドをプロテアーゼまたは他の酵素により消化することを含む点に注意されたい。蒸留水への移動の前に、熱処理済みのスライドを徐々に（バッファ中で２０分間）冷却させる。スライドを乾燥させない。
【００５９】
７． 内因性のビオチン阻害：例えばＤＡＫＯキットのＶｅｃｔｏｒを使用して、必要に応じてビオチン阻害法を実行する。あるいは以下の方法を使用する。
２００ｍｌの蒸留水を７５ｍｌの鶏卵代用品に加える。
鶏卵混合物の中で１５分、スライドを浸漬して、２回、蒸留水の中でリンスする。
１５分の間スライドを脱脂乳に浸漬する。
２回、蒸留水の中でリンスする。
スライドをＰＢＳＴ（ツイーンを加えたＰＢＳバッファ）へ移す。
【００６０】
８． ＰＢＳＴを３交換して洗う、しかしながら、一部の抗体はツイーン−２０に適した点に注意する。この場合、ツイーン−２０はＰＢＳバッファに加えられてはならない。
【００６１】
（ｉｉ）抗体の適用
１． はじめに、１％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳにより、マウス一次抗体（すなわち、リン酸特異的ＰＡＫ４抗体または全ＰＡＫ４抗体）を希釈する。精製されたモノクローナル抗体にとって、１−５μｇ／ｍｌの範囲の濃度は、通常最適である。しかしながら、有効濃度は、滴定により決定されなければならない。適当な量（たとえば約１００ｕｌ）の希釈された一次抗体を組織にアプライする、組織全体をおおう。
【００６２】
２． 室温で４０分間または４℃で終夜、湿室の中でスライドをインキューベートする。一方、二次抗体および三次試薬（例えば、モノクローナルのマウス・一次抗体およびＶｅｃｔｏｒ
Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ用に１：３００に希釈されたＶｅｃｔｏｒ ビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）を調製する。一般的に、二次抗体は、一次抗体が作られたのと同じ生物種を標的にする。
【００６３】
３． ＰＢＳＴ溶液を３交換してスライドを洗う。
【００６４】
４． ビオチン化された二次抗体をアプライして、湿室の中で室温にて３０分間インキューベートする。
【００６５】
５． 上記のようにＰＢＳＴを３交換してスライドを洗う。
【００６６】
６． スライドに三次試薬（ＡＢＣ）をアプライして、湿室の中で室温にて２５分間インキューベートする。
【００６７】
７． インキュベーションの間、２つのスライドラック容器を１７５ｍｌの０．０５Ｍのトリス緩衝液で満たして、予熱するために３７℃水槽の中で静置する。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の冷凍部分標本を解凍する。
【００６８】
８． 最低１０分間、ＰＢＳＴを３交換して洗う。
【００６９】
９． 予熱された０．０５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ ７．８−８．０）の中でスライドをリンスする。
【００７０】
１０． ＤＡＢの溶液の中でスライドを静置して、８分間インキューベートする。
【００７１】
１１． スライドを２回蒸留水で洗う。
【００７２】
１２． Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンの中で２５−３０秒間、スライドを対比染色剤で着色する。
【００７３】
１３． すきとおるまで水の中でスライドをリンスする。
【００７４】
１４． ブルーヘマトキシリン（０．５％の濃度で溶解されたアンモニア水）の中で、スライドを約３０秒間静置する。水を３交換して洗う。
【００７５】
１５． ９５％エタノールで二回、１００％エタノールで３回、スライドを脱水し、キシレンで３回洗浄してきれいにする。
【００７６】
１６． キシレン適合性の封入剤およびガラス製のカバーグラスまたはテープを用いて、カバーグラスをかぶせる。
【００７７】
＜実施例ＩＶ＞ 免疫蛍光法
カバーグラスは、２４穴組織培養トレイの中で静置されて、ウェルあたり２ｘ１０の４乗細胞の密度で接種された。細胞は、ヒトＰＡＫ４クローンの発現を促進する哺乳類の発現ベクターによって、翌日トランスフェクションされた。上記培地はトランスフェクション後６時間で交換され、細胞は４８時間成長させられた。カバーグラスは、ＰＢＳによって、丁寧に洗われて、それから冷たい４％のパラホルムアルデヒドで固定した。固定細胞は、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の標準溶液を使用して可溶化され、洗われて、１％のウシ血清アルブミン、ペプチド＃６８２（リン酸特異的Ｓ４７４）を標的とするＰｒｏｔｅｉｎ
Ａ精製されたウサギ血清を含むＰＢＳで希釈されている一次抗体とともにインキューベートされ、脱塩され、使用前にリン酸特異的Ｓ４７４に対する特異性をウエスタンブロット分析法により確認される。ＨＡ−７抗体（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）は、外因性ＰＡＫ４を検出するために用いられた。発現したＰＡＫ４は、ＨＡ−７抗体により認識されるエピトープタグをそのＮ末端に融合した形で備える。上記カバーグラスは、ＰＢＳによって、丁寧に洗われて、室温の暗所で２時間、Ｈｏｅｃｈｓｔ番号３３３４２（ビス−ベンズイミド、Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）１μｇ／ｍｌと一緒に、ローダミン結合ヤギα−ウサギ二次抗体（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． アメリカ合衆国）とともに、またはＦＩＴＣ結合ヤギα−マウス−フルオレセインイソチオシアネート（「ＦＩＴＣ」）抗体（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． アメリカ合衆国）とともに、インキューベートされた。上記カバーグラスは洗われて、Ｆｌｕｏｒｏｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
Ｃｏｒｐ．、アメリカ合衆国）に載置されて、終夜乾燥させられた。画像は、ＳＰＯＴ ＲＴカメラを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡上のＮｉｋｏｎ ｏｉｌ
ｅｍｅｒｓｉｏｎ ４０ ｘ／１．３０対物レンズを使用して得られた。
【００７８】
【表１】
2010281830.tif 000002
【００７９】
【表２】
2010281830.tif 000003
【００８０】
＜実施例Ｖ＞ 結果
大腸癌腫のリン酸特異的抗体（＃１０８）についての上記データは特に有益である（６人の患者由来の６つのデータは、腫瘍では、顕著な核周囲の染色を示したが、遠位にある良性の組織では染色を示さなかった）。染色がベクター・レッドの基質（赤紫色／赤色の沈澱を引き起こす）を使用して検出された点に注意されたい。この結果は、ＰＡＫ４が大腸癌細胞において、特に活性が高く、同じ患者由来の良性の大腸組織では活性が高くないことを強く示唆する。また、リン酸化されたＰＡＫ４の染色は、腎細胞癌、肺腺癌、前立腺癌、管内胸部腺癌および卵巣腺癌において、観察された。
【００８１】
腫瘍において、リン酸特異的ＰＡＫ４抗体による濃い染色は、結腸腺癌において、同定された（一方、遠位にある良性の組織は、リン酸−ＰＡＫ４染色を示さなかった）。０−３の尺度について、「０」は染色されないことを示し、「１」は弱い染色を示し、「２」は適度な染色を示し、「３」は濃い染色を示す。腺腫性上皮には適度に陽性なものもわずかにあったが、大部分の通常の上皮はリン酸化されたＰＡＫ４に対して「１」の染色しか示さなかった。前立腺癌は、適度な染色（「２」）を示した。
【００８２】
良性の組織において、リン酸化されたＰＡＫ４に対する最も顕著な染色は、脂肪細胞、心臓筋細胞、皮脂腺および時折貪食細胞において、確認された。さらなる陽性の細胞および組織型は、毛嚢、良性の前立腺上皮、乳房上皮および尿路上皮を含んでいた。リン酸化されたＰＡＫ４に対して負の細胞型は、肺細胞、卵母細胞、繊維芽細胞、脳の神経膠細胞、皮質神経細胞、腎糸球体、集合管以外の尿細管上皮、卵母細胞、卵巣基質および卵巣胚上皮を含んでいた。
【００８３】
時折、好中球および好酸球性は、陽性を示した。あまり顕著ではない陽性は、腎臓集合管、厚いヘンレ係蹄、肥満細胞および良性の結腸上皮において、同定された。弱い染色（「1」）は、気道上皮、卵巣顆粒膜細胞、卵胞膜細胞、エクリン腺、前立腺基質、内皮の病巣および脈管平滑筋において同定された。扁平上皮のいくつかの標本は、基底層において染色された。リンパ球も、時折染色を示した。
【００８４】
よって、特定の組織における標準を越えるリン酸化されたＰＡＫ４のレベルは、組織の細胞の完全性および状態を決定するのに役立つバイオマーカである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】高度潜在腺癌を有する絨毛腺腫患者のＰＡＫ４リン酸化に対して着色されるヒト組織切片を示す図である。図１（ａ）は、大腸上皮内癌／高度異形成を示し、図１（ｂ）は、アデノーマから遠く離れている良性上皮を示し、図１（ｃ）は、ヘマトキシリン−エオジン染色法を示す。
【図２】転移性段階ＩＩＩの腺癌の組織由来のＰＡＫ４リン酸化に対して染色されるヒト患者の切片を示す図である。図２（ａ）は、大腸上皮内癌／高度異形成を示し、図２（ｂ）は、アデノーマから遠く離れている良性上皮を示し、図２（ｃ）は、ヘマトキシリン−エオジン染色法を示す。
【図１】
2010281830.tif 000004
【図２】
2010281830.tif 000005
【配列表】
2010281830000001.app