(57)【要約】【課題】組み換え枯草菌を用いた効率のよいタンパク質又はポリペプチドの製造方法の提供。【解決手段】異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌を用いてタンパク質又はポリペプチドを製造する方法であって、宿主枯草菌のRocGの発現量を調節することを特徴とするタンパク質又はポリペプチドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌を用いてタンパク質又はポリペプチドを製造する方法であって、宿主枯草菌のRocGの発現量を調節することを特徴とするタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
RocGを転写誘導することによりその発現量を調節する請求項1記載の製造方法。
【請求項３】
RocGの転写誘導が、枯草菌遺伝子rocGをそのゲノム上から欠失させた枯草菌変異株MGB874株を、Pspacプロモーターを連結したrocG遺伝子で形質転換し、当該形質転換体をイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの存在下に培養することにより行われる請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
組換え枯草菌が、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合したものである請求項１〜３のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項５】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである請求項４又は５記載の製造方法。
【請求項７】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
タンパク質又はポリペプチドがセルラーゼである請求項１〜７のいずれか1項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。
【０００３】
近年、枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約4100種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、271個の遺伝子が成育に必須であることが指摘されている（非特許文献１）。また、枯草菌等の胞子形成初期に関わる遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁或いは細胞膜中のテイコ酸へのD-アラニン付加に関わる遺伝子、更にはサーファクチンの生合成或いは分泌に関わる遺伝子を単独に欠失又は不活性化した菌株が構築されている（特許文献１〜８参照）。
また、本出願人は、枯草菌に由来する遺伝子破壊株を網羅的に解析し、枯草菌ゲノムの大量域を欠失させ、各種酵素の生産性に優れた変異株を見出すことに成功している（特許文献９）。
【０００４】
しかしながら、限定された生産培地と安定な培養条件が用いられる工業的生産においては、タンパク質又はポリペプチドの生産にとって必要或いは不必要な遺伝子が存在すると考えられ、更なる研究が求められている。
【０００５】
一方、RocGは、アルギニン分解経路の最下流に存在し、グルタミン酸をアンモニアと2-オキソグルタル酸に分解するという異化性のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する他、グルタミン酸合成酵素GltABの発現を抑制するという機能を有し(非特許文献２)、TCA回路及びグルタミン酸合成経路を複雑に制御する重要なタンパクであることが知られている（図２参照）。
しかしながら、斯かるRocGがタンパク質やポリペプチドの生産性に関与するという報告は全くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭58-190390号公報
【特許文献２】特開昭61-1381号公報
【特許文献３】国際公開第89/04866号パンフレット
【特許文献４】特表平11-509096号公報
【特許文献５】特許第3210315号公報
【特許文献６】特表2001-527401号公報
【特許文献７】特表2002−520017号公報
【特許文献８】特表2001−503641号公報
【特許文献９】特開2007-130013号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
【非特許文献２】B. R. Belitsky, A. L. Sonenshein, J Bacteriol 179, 1035 (Feb, 1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、組み換え枯草菌を用いた効率のよいタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）を野生株とし、そのゲノムの合計874kbpを削除して作製された枯草菌変異株MGB874株（特許文献９）を用いてタンパク質又はポリペプチドの生産性を検討したところ、MGB874株からグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子rocGを欠失させたR-533株ではセルラーゼの生産性が大幅に低下したが、当該rocG遺伝子の発現を穏やかに誘導した場合にセルラーゼの生産性が、MGB874株を用いて製造した場合と比較して有意に向上することを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の１）〜８）に係るものである。
１）異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌を用いてタンパク質又はポリペプチドを製造する方法であって、宿主枯草菌のRocGの発現量を調節することを特徴とするタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
２）RocGを転写誘導することによりその発現量を調節する上記1）の製造方法。
３）RocGの転写誘導が、枯草菌遺伝子rocGをそのゲノム上から欠失させた枯草菌変異株MGB874株を、Pspacプロモーターを連結したrocG遺伝子で形質転換し、当該形質転換体をイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの存在下に培養することにより行われる上記２）の製造方法。
４）組換え枯草菌が、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域を結合したものである上記１）〜３）の製造方法。
５）転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した上記４）の製造方法。
６）分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである上記４）又は５）の製造方法。
７）転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜659の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと70％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である上記５）の製造方法。
８）タンパク質又はポリペプチドがセルラーゼである上記１）〜７）の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、目的タンパク質又はポリペプチドを高生産で効率よく製造することができ、有用タンパク質、特にセルラーゼの工業的生産が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【図２】RocGの役割を模式的に示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における枯草菌変異株MGB874株とは、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）を野生株とし、そのゲノムの大量域、すなわちprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域、yeeK-yesX領域、pdp-rocR領域、ycxB-sipU領域、SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK)領域、sbo-ywhH領域、yybP-yyaJ領域及びyncM-fosB領域を欠失させたものである（前記特許文献９）。表１に示した当該欠失領域は、同表に示す一対のオリゴヌクレオチド・セットにより挟み込まれる領域として言い換えることができる。
【００１４】
【表１】
2010193760.tif 000002
【００１５】
本発明のタンパク質又はポリペプチドの製造方法においては、宿主枯草菌のRocGの発現量の調節が行われるが、ここで、RocGとは、アルギニン分解経路の最下流に存在し、グルタミン酸をアンモニアと2-オキソグルタル酸に分解するという異化性のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する他、転写因子GltCと相互作用することで、グルタミン酸合成酵素GltABの発現を抑制するという機能を有しており(前記非特許文献２)、細胞の主要な代謝経路であるTCA回路およびグルタミン酸合成経路を複雑に制御する重要なタンパクである。
【００１６】
RocGの発現量の調節は、例えばRocGを転写誘導することにより行われる。
転写誘導は、所定の物質の存在を条件として下流に位置する遺伝子の発現を亢進する機能を有するプロモーター、すなわち転写誘導型プロモーターを連結したrocG遺伝子で宿主枯草菌株を形質転換し、これを発現誘導物質の存在下に培養することにより行われる。
斯かる転写誘導型プロモーターとしては、例えばlacプロモーター、Pspacプロモーター、ザイロース誘導プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、ECFシグマ因子特異的プロモーター（J. Helmann and C. Moran Jr.,"Bacillus subtilis and its closest relatives." ASM Press, 2002, pp289-312）、Ｍｇ及びＣｕの２成分によって誘導されるプロモーター等を挙げることができるが、このうち、lacオペロンのリプレッサーであるlaclによって制御されるPspacプロモーター（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 439-443.(1984)）が好ましい。
Pspacプロモーターの発現誘導物質としては、例えばメチルβ−Ｄ−ガラクトシド、メチル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、ｎ−プロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、イソプロピルβ−Ｄ−ガラクトシド、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、ｎ−ブチルβ−Ｄ−ガラクトシド、ｎ−ブチル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、ベンジルβ−Ｄ−ガラクトシド、ベンジル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、２−フェニルエチルβ−Ｄ−ガラクトシド、２−フェニルエチル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−アミノフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−アミノフェニル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、Ｏ−ニトロフェニル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェニル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、Ｄ−フコース、ガラクトース、６−フルオロ−６−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、メリビオース及びチオアロラクトース等が挙げられるが、このうちイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）が好ましい。
【００１７】
具体的には、例えば、枯草菌遺伝子rocGをそのゲノム上から欠失させた枯草菌変異株MGB874株（R-533株）を、Pspacプロモーターを連結したrocG遺伝子を含有するプラスミドpAPNC-rocGを用いて形質転換することによって、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）によりRocGの発現制御が可能な株（R-716株）を構築し、これを宿主として用いることにより行われる。
【００１８】
rocG遺伝子をMGB874株のゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えば図１に示す以下の方法を適用することができる。本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象領域の上流に隣接する約0.1〜3kb断片（上流断片と称する）と、薬剤耐性遺伝子マーカーを含む断片、同じく下流に隣接する約0.1〜3kb断片（下流断片と称する）が連結したDNA断片である。
【００１９】
例えば、薬剤耐性遺伝子マーカーとしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、後記表３に示すrocG-FW1とrocG/Cm-R、及びrocG/Cm-FとrocG-RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のrocG遺伝子の上流に隣接する断片（Ａ）及び下流に隣接する1.0kbp断片（B）をそれぞれ調製する。さらに、表１に示したCmFW及びCmRVのプライマーセットを用いて、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール耐性遺伝子(C)を増幅する。
【００２０】
次に、得られた（A）（B）（C）の３断片を混合して鋳型とし、rocG-FW2とrocG-RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、３断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得る（図１参照）。
このDNA断片を用いて、コンピテント法によりMGB874株の形質転換を行い、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離する。
【００２１】
形質転換体のゲノムDNAを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲにより、rocG遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換され、目的とする遺伝子が欠失されていることを確認することができる。ゲノムＤＮＡの抽出は、斉藤と三浦（Saito & Miura）の方法[Saito & Miura Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)]、あるいは、市販のゲノムＤＮＡ抽出キット、例えば、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.）を用いて行うことができる。
【００２２】
斯くして得られたR-533株から、RocGを転写誘導可能な株（R-716株；(R-533 aprE::Pspac-rocG spec)が構築される。以下に、転写誘導型プロモーターとしてIPTGで発現制御が可能なPspacプロモーターを用いてrocG遺伝子を発現誘導する場合を例に挙げて説明する。
まず、形質転換に使用するプラスミドDNAを構築する目的で、枯草菌ゲノムを鋳型として後記表４に示すプライマーrocG.f.SalIおよびrocG.f.SacIを用いて、制限酵素サイトSalＩ/SacＩを両端に含むrocG遺伝子断片をPCRによって増幅する。さらに、増幅した遺伝子断片をIPTGで発現制御が可能なPspacプロモーター（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 439-443.(1984)）を含むプラスミドpAPNC213(Microbiology 148, 3539-3552)のSalＩ/SacＩサイトに挿入することで形質転換用プラスミドpAPNC-rocGを構築する。pAPNC-rocGは枯草菌168株由来aprE遺伝子の内部にPspacプロモーターと連結したrocG遺伝子(Psapc-rocG)およびスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されており、形質転換によってゲノム上のaprEサイトにPspac-rocG遺伝子を挿入することが可能なプラスミドである。表４に示すプライマーrocG.f.1〜rocG.f.3およびrocG.r.1を用いてシーケンシングを行い、変異なくプラスミドが構築されたことを確認した後、コンピテント法によりR-533株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離する。さらに得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってaprE遺伝子部位にPspac-rocG遺伝子およスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されたことを確認する。以上のようにしてIPTGによりrocG遺伝子の発現制御が可能な株（R-716株）を構築できる。
【００２３】
斯くして得られた枯草変異株（R-716株）を宿主とし、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、当該タンパク質又はポリペプチドを製造するための組換え枯草菌とし、これをIPTGのような発現誘導物質の存在下に培養することによって、RocGの転写誘導下に目的のタンパク質又はポリペプチドの製造が行われる。
ここで、組換え枯草菌は、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によってR-716株細胞に取り込ませることによって作製できる。また、当該異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むDNA断片に枯草菌ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、R-716株ゲノムに直接組み込むことによっても組換え枯草菌を得ることができる。
【００２４】
目的の異種タンパク質又はポリペプチドは特に限定されず、洗浄剤用、食品用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、より好ましくはセルラーゼが挙げられる。
【００２５】
セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）
中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ、又は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。
【００２６】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、又は配列番号５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。
【００２７】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼ、或いは当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００２８】
尚、本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、また、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２９】
宿主枯草菌に導入される上記異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するDNA、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。また此処で言うストリンジェントな条件とは、例えば[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件等が挙げられる。例えば、6XSSC(1XSSCの組成：0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、ｐH7.0)、0.5％SDS、5Xデンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００３０】
培養は、形質転換された菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて行なうことができる。IPTGの添加は、培養開始時若しくは培養初期において行われ、タンパク質又はポリペプチドの生産性の点から、4μM〜15μMの範囲で行うことが好ましく、6μM〜10μMの範囲で行うのがより好ましい。
培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取し、適宜精製することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドを得ることができる。
斯くして、後記実施例に示すように、本発明の方法によれば、枯草菌変異株MGB874株を宿主として製造した場合と比較して、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が有意に向上される。
【００３１】
以下に、本発明の方法に用いられる組換え微生物の構築方法と及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼの製造方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００３３】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００３４】
さらに、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００３５】
枯草菌の形質転換はコンピテントセル法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）にて行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００３６】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００３７】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）のによって行った。組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、LB培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）、2xL-マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物）を用いた。
【００３８】
実施例１  菌株の構築
（１）R-169株（MGB874ΔaprE::spec）の構築
aprE欠失用DNA断片の増幅は、まず、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したaprE-FW1とaprE/Sp-R、及びaprE/Sp-FとaprE-RVの各プライマーセットを用いてゲノム上のaprE遺伝子の上流に隣接する1.0kbp断片（A）、及び下流に隣接する1.0kbp断片（B）をそれぞれ調製し、さらに、表１に示したspf及びsprのプライマーセットを用いてプラスミドpDG1727（Gene, 167, 335, (1995)）のスペクチノマイシン耐性遺伝子(C)を増幅した。得られた（A）（B）（C）の３断片を混合して鋳型とし、aprE-FW2とaprE-RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、３断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た（図１参照）。このDNA断片を用いて、コンピテント法によりMGB874株(Biotech. Appl. Biochem. 46:169-178 2007)(DNA research 15, 73-81 2008)の形質転換を行い、スペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってaprE遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換され、目的とする遺伝子が欠失されていることを確認した。以上のようにしてaprE欠失株（R-169株）を作製した。
【００３９】
（２）R-533株（MGB874ΔrocG::cat）の構築
R-169株を構築した手法と同様の手法にて行った。まず、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表３に示したrocG-FW1とrocG/Cm-R、及びrocG/Cm-FとrocG-RVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のrocG遺伝子の上流に隣接する1.0kbp断片（A）、及び下流に隣接する1.0kbp断片（B）をそれぞれ調製し、さらに、表１に示したCmFW及びCmRVのプライマーセットを用いて、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール耐性遺伝子(C)を増幅した。次に、得られた（A）（B）（C）の３断片を混合して鋳型とし、rocG-FW2とrocG-RV2のプライマーを用いてPCRを行ない、３断片を（A）-（C）-（B）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のDNA断片を得た（図１参照）。このDNA断片を用いて、コンピテント法によりMGB874株の形質転換を行い、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってrocG遺伝子がクロランフェニコール耐性遺伝子と置換され、目的とする遺伝子が欠失されていることを確認した。以上のようにしてrocG欠失株（R-533株）を作製した。
【００４０】
（３）R-716株(R-533 aprE::Pspac-rocG spec)株の構築
まず、形質転換に使用するプラスミドDNAを構築する目的で、枯草菌ゲノムを鋳型として表４に示すプライマーrocG.f.SalIおよびrocG.f.SacIを用いて、制限酵素サイトSalＩ/SacＩを両端に含むrocG遺伝子断片をPCRによって増幅した。さらに、増幅した遺伝子断片をIPTG（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside）で発現制御が可能なPspacプロモーター（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 439-443.(1984)）を含むプラスミドpAPNC213(Microbiology 148, 3539-3552)のSalＩ/SacＩサイトに挿入することで形質転換用プラスミドpAPNC-rocGを構築した。pAPNC-rocGは枯草菌168株由来aprE遺伝子の内部にPspacプロモーターと連結したrocG遺伝子(Psapc-rocG)およびスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されており、形質転換によってゲノム上のaprEサイトにPspac-rocG遺伝子を挿入することが可能なプラスミドである。表４に示すプライマーrocG.f.1〜rocG.f.3およびrocG.r.1を用いてシーケンシングを行い、変異なくプラスミドが構築されたことを確認した後、コンピテント法によりR-533株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（0.5μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってaprE遺伝子部位にPspac-rocG遺伝子およスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されたことを確認した。以上のようにしてIPTGによりrocGの発現制御が可能な株（R-716株）を構築した。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
【表４】
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【００４４】
実施例２（各変異株のタンパク質生産性評価）
実施例１にて得られたR-169株、R-533株、R-716株のタンパク質生産性評価は、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼの生産性を指標として行った。
アルカリセルラーゼの生産性評価に関しては、まず、実施例１にて得られたR-169株、R-533株、R-716株に、Bacillus属細菌 KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）をコードするDNA断片（3.1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5mLのLB培地で30℃で15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6ｍLを30ｍLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。R-716株の生産性評価の際にはrocGを転写誘導する目的でIPTGを適宜、培養開始時に添加した。また、培養は測定誤差を考慮して各々３回ずつ行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとし、生産性比較はMGB874株の生産性を100%とする相対値により比較した（表５）。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
R-533株の生産性評価結果から、RocGの欠失は顕著な生産性の低下を引き起こす一方で、R-716株においてIPTGを4μMから15μM加えrocGを緩やかに発現した場合にMGB874株よりも高い生産性を発揮した。なお、R-169株の生産性がMGB874株と同等であることから、R-716株を構築する際に生じたaprE遺伝子の欠失は生産性増加に影響がないと判断できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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