(57)【要約】      （修正有）【課題】グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal）の子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物の特定と、当該化合物の骨疾患の予防及び治療剤としての提供。【解決手段】ステロール系化合物又は下式（２ａ）で表される化合物（１，２−ジアセチルスフィンガシン）を有効成分とする骨疾患の予防又は治療剤を使用する。2010018563.tif 000021【選択図】図１７
2010018563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2010018563.tif 000014
で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物。
【請求項２】
式（１）で表わされる化合物。
【化２】
2010018563.tif 000015
【請求項３】
式（２）
【化３】
2010018563.tif 000016
で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物。
【請求項４】
式（２a）
【化４】
2010018563.tif 000017
で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（２ａ）で表わされる化合物を提供する化合物。
【請求項５】
式（２a）
【化５】
2010018563.tif 000018
で表わされる化合物。
【請求項６】
式（１）で表される化合物、式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、式（２）で表される化合物、式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上を薬理学的に有効な量で含有することを特徴とする、骨疾患の予防又は治療剤。
【化６】
2010018563.tif 000019
【化７】
2010018563.tif 000020
【請求項７】
骨疾患が骨粗鬆症である、請求項６に記載の骨疾患の予防又は治療剤。
【請求項８】
破骨細胞形成阻害剤である、請求項６に記載の骨疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症等の骨疾患の予防や治療に有用な新規化合物と、当該化合物を有効成分とする骨疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、骨形成と骨吸収とを繰り返している。このような骨のライフ・サイクルは、概略次のとおりである。
【０００３】
即ち、軟骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞が、機能的な分業を行い、各細胞が骨の代謝を制御している。骨の代謝は、（１）軟骨内骨化による骨新生と成長、（２）骨形成と骨吸収のサイクルからなるリモデリングによる質的、量的な維持、及び（３）骨折等の損傷における骨再生の三過程に分類される。そして、骨の代謝は、種々のカルシウム代謝ホルモンやサイトカイン、各種細胞内伝達機構や転写因子等を介して、各細胞系の機能や細胞間の相互作用を調節することによって制御されている。
【０００４】
例えば、休止期にある骨の表面が刺激を受けると、破骨細胞に情報が伝達されて骨の吸収が始まる。骨が吸収されているとき、他方では、骨芽細胞による骨の修復、形成が行なわれている。このように、正常な状態にある生体においては、骨の吸収と骨の形成とが並行して行なわれて、骨は新しく生まれ変わっている。
【０００５】
ところで、近年においては、高齢者の骨粗鬆症が注目を浴びている。骨粗鬆症は、骨のリモデリングにおいて、骨の吸収が骨の形成を上回ることによって招来されるものである。従って、骨粗鬆症の予防、治療には、骨吸収を抑制するか、骨形成を促進することが必要である。
【０００６】
このような状況下、種々の骨粗鬆症治療剤や、骨粗鬆症治療効果が期待される漢方薬や食品に由来する成分が提案されている。前者としては、活性型ビタミンＤや特許文献１に記載されたリベロマイシンＡ誘導体等が挙げられる。また、後者としては、特許文献２に記載された冬虫夏草、特許文献３に記載されたエリンギや五加皮の水抽出物、特許文献４に記載された熟地黄や骨砕補の水抽出物、特許文献５に記載されたマコモタケ抽出物等が挙げられる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３５８９５号公報
【特許文献２】特開２００４−３１５４５４号公報
【特許文献３】特開２００５−３３０２８９号公報
【特許文献４】特開２００５−３３０２９０号公報
【特許文献５】特開２００６−１９３４５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献の発明者等と同様に、本発明者等も、骨粗鬆症の予防・治療効果があり、副作用の問題の少ない化合物を希求して、研究を重ねてきた。そして、学名がグリフォラ・ガルガル（Grifola gargal；和名：アンニンコウ）である茸の子実体からの抽出物が、破骨細胞形成抑制効果を示すことを見出した。しかし、骨粗鬆症等の骨疾患の予防又は治療剤としてヒトに摂取させるには、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物そのものの方が都合がよい。従って、本発明の目的は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定し、当該化合物を骨疾患の予防又は治療剤として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、グリフォラ・ガルガルの子実体中に存在する破骨細胞形成抑制効果を示す化合物を特定するために鋭意研究を重ね、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は、式（１）
【化１】
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で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物に関する。
【００１１】
また、本発明は、式（２）
【化２】
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で表わされる化合物又はその薬理学的に許容される塩、あるいは加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物に関する。
【００１２】
本発明は、前記式（１）で表される化合物、前記式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって前記式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、前記式（２）で表される化合物、前記式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって前記式（２）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上を薬理的に有効な量で含有することを特徴とする、骨疾患の予防又は治療剤に関する。
【００１３】
前記骨疾患としては、骨粗鬆症が挙げられる。また、前記有効成分は、破骨細胞形成阻害剤として使用されることが好ましい。
【００１４】
なお、式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩、式（２）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩は、新規な化合物である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、安全性が高く、骨粗鬆症等の骨疾患の予防及び治療に有効な骨疾患の予防又は治療剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係る前記式（１）で表わされる化合物は、ステロール系化合物である。式（１）において、
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は、その個所の炭素原子に酸素原子が結合していることを意味する。従って、式（１）で表わされる化合物は、下記式１ａで表わされる化合物であるか、又は、下記式１ｂで表される化合物である。すなわち、エポキシ基を一つと、エーテル結合を二つ有する化合物である。
【００１７】
【化３】
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【００１８】
【化４】
2010018563.tif 000007
【００１９】
本発明に係る前記式（２）で表わされる化合物は、１，２−ジアセチルスフィンガシン（１，２−ｄｉａｃｅｔｙｌｓｐｈｉｎｇａｓｉｎｅ）である。
【００２０】
前記式（１）で表わされる化合物や前記式（２）で表わされる化合物は、化学構造上、異性体を有することがある。本発明において、「式（１）で表わされる化合物」、「式（２）で表わされる化合物」とは、化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体及び異性体混合物を包含する。
【００２１】
本発明に係る前記式（２）で表わされる化合物には、２位の炭素原子に結合しているアセチルイミノ基と、３位の炭素原子に結合している水酸基とが、式（２ａ）
【化５】
2010018563.tif 000008
の立体配置を有する化合物が包含される。
【００２２】
また、前記式（１）で表わされる化合物や前記式（２）で表わされる化合物に結晶多形が存在する場合、本発明においては、結晶形は限定されず、いずれかの単一結晶形であっても、それらの混合物であってもよい。
【００２３】
これらの化合物の薬学的に許容される塩とは、例えば、前記式（１）及び（２）において、水酸基の水素が、ナトリウム、カリウム、カルシウム等で置換されてアルカリ又はアルカリ土類金属塩となっているものやアンモニウム基で置換されてアンモニウム塩となっているもの、塩酸、硫酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、グリシン等のアミノ酸が付加した付加塩をいう。しかし、これらに限定されず、薬学的に許容されるものであれば、いずれであってもよい。
【００２４】
「加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物」、「加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物」とは、前記式（１）及び（２）中の水酸基が、保護基で保護されている、換言すれば、当該水酸基中の水素原子が、何らかの基によって置換されており、加水分解されると水酸基となる化合物をいう。このような「保護基で保護されている水酸基」の例としては、メトキシメチルエーテル基、テトラヒドロピラニルエーテル基、ターシャリーブチルエーテル基、アリルエーテル基、安息香酸エステル基、アセテート基（アセチルオキシ基）、ホルメート基、クロトネート基、ｐ−フェニル安息香酸エステル基、トリメチルアセチルオキシ基、ターシャリーブチルジメチルシリルオキシ基、ターシャリーブチルジフェニルシリルオキシ基、トリチルオキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００２５】
前記式（１）で表わされる化合物は、ステロール類の合成方法を参考にして、また、前記式（２）で表わされる化合物は、例えばスフィンゴシンの合成方法を参考にして、有機合成をすることができる。
【００２６】
また、前記式（１）で表わされる化合物や前記式（２ａ）で表わされる化合物は、グリフォラ・ガルガルやカワリハラタケの子実体から抽出によって単離することができる。ここで、グリフォラ・ガルガルは、南米原産のグリフォラ属の茸であり、近年、菌床栽培も可能となったものである。グリフォラ・ガルガルの子実体を得るための菌床栽培方法は、例えば特開２００７−２０５６０に開示されている。また、カワリハラタケは、ハラタケ属の茸である。
【００２７】
前記式（１）で表わされる化合物や前記式（２ａ）で表わされる化合物をグリフォラ・ガルガルの子実体から抽出する場合には、例えば、子実体乾燥物をヘキサン等の有機溶媒や水に入れ、可溶性成分を抽出した後、適切な条件下でカラム・クロマトグラフィーを繰り返せばよい。
【００２８】
本発明に係る骨疾患の予防又は治療剤の有効成分は、式（１）で表される化合物、式（１）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、式（２）で表される化合物、式（２）で表わされる化合物の薬理学的に許容される塩、及び加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物からなる群から選択される一種以上である。
【００２９】
本発明に係る骨疾患の予防又は治療剤の有効成分は、少なくとも破骨細胞の形成を抑制する作用を示す。従って、本発明の骨疾患の予防又は治療剤が有効な疾患には、破骨細胞の過剰な形成や機能亢進を伴なって骨量が減少する内因性疾患と、骨折等の外因性疾患とが包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗鬆症、破骨細胞腫、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折等が挙げられる。
【００３０】
本発明に係る骨疾患の予防又は治療剤の剤型、投与方法、投与量等は、使用目的や有効成分の物性を考慮して、適宜決定することができる。剤型の例としては、経口投与を目的として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等が、また、非経口投与を目的として、注射剤、吸入剤、座剤、経皮吸収剤等が挙げられる。有効成分と共に使用される添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶剤等が挙げられる。
【００３１】
投与量は、予防であるか治療であるか、疾患の状態、剤型、投与方法、患者の年齢や体重等の諸条件によって異なるが、成人に経口投与する場合であって、式（１）で表わされる化合物、その薬学的に許容される塩、加水分解によって式（１）で表わされる化合物を提供する化合物、式（２）で表わされる化合物、その薬学的に許容される塩、又は加水分解によって式（２）で表わされる化合物を提供する化合物のいずれの場合も、通常は０．１乃至２００μｇ／体重１ｋｇ/日、好ましくは０．２乃至５０μｇ／体重１ｋｇ/日である。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【００３３】
（実施例１）グリフォラ・ガルガルの子実体からの有効成分の抽出、同定
（１）有効成分の有無の判定方法
抽出液や分画液中の有効成分による活性及び細胞毒性の測定は、次のようにして行なった。
【００３４】
（１−１）共存培養法による細胞の培養
マウス（♀、５乃至７週齢）の脛骨及び大腿骨から採取し、培養した骨髄細胞１．３×１０８個と、頭蓋骨から採取し、培養した骨芽細胞様間質細胞１．０×１０６個とを、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（Minimum Essential Medium α- Medium）７．２ｍｌに懸濁させた。これを、４８穴の破骨細胞活性アッセイ用基質プレートに、１５０μｌ／ウェルで分注した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：２０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し（被験試料１００ｍｇ／ｍｌ）、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（希釈系列の作製）５０μｌ／ウェルとを加え、全量２５０μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて７日間培養した。なお、培養３日目には、各ウェル中の上澄み液１００μｌを除去し、代わりに、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液（濃度：４０ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウェルと、被験試料を培養開始前に使用したものの２倍の濃度で含有する被験試料の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液５０μｌ／ウェルとを添加した。
【００３５】
（１−２）ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定
上記のように、骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞とを、活性ビタミンＤ３の存在下で共存培養を行なうと、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）を有する破骨様多核細胞（破骨細胞）に分化する。この細胞は、ＴＲＡＰ染色液で染色される。この染色された細胞の数を計測することにより、破骨細胞の形成が抑制されたか否かが分かる。
【００３６】
ＴＲＡＰ染色液は、次のようにして調製した。先ず、５０ｍＭの酒石酸ナトリウムと０．１Ｍの酢酸ナトリウムとを含むＴＲＡＰ緩衝液（ｐＨ＝５．０）を調製した。次に、用時調製で、１．５ｍｇのナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩を、１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させた。これにＴＲＡＰ緩衝液１５ｍｌを加え、次に、９ｍｇのファスト・レッド・バイオレットＬＢ塩を加えて溶解させた。
【００３７】
染色は、次のようにして行なった。ウェル中の培養液を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いで、１０％ホルマリン（＝３．７％ホルムアルデヒド）含有ＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ／ウェルで加え、１０分間放置し、細胞をウェルに固定させた。その後、エタノールを０．５ｍｌ／ウェルで加え、１分間放置した。乾燥後、ウェルにＴＲＡＰ染色液０．３ｍｌ／ウェルを加え、室温で３０分間インキュベートさせた。ウェルを蒸留水０．５ｍｌ／ウェルで洗浄し、その後乾燥させた。
【００３８】
顕微鏡下において、ウェル当たりの、ＴＲＡＰ染色液によって染色された核を２個以上有する多核細胞（ＴＲＡＰ陽性多核細胞）の数を数えた。これが、ウェル当たりの破骨細胞数である。
【００３９】
細胞を培養する際に、被験試料をＤＭＳＯに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００４０】
コントロールのウェル中の細胞数を１００として、被験試料を添加したウェル中の細胞数の割合を算出した。値が小さいほど、破骨細胞形成抑制効果が高い。
【００４１】
なお、図１に、コントロールのウェルの顕微鏡写真を、図２に破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真を示す。
【００４２】
（１−３）ＭＴＴアッセイ法による細胞生存率の測定
ＭＴＴとは、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミドを指す。この化合物は、水溶性であり、水溶液は黄色を示すが、脱水素酵素によって、ＭＴＴとＮＡＤＨとの間で酸化還元反応が生じると、ＭＴＴが還元されて青色のフォルマゾンとなる。この脱水素酵素は、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素であるので、細胞の健康状態の指標となる。即ち、細胞が元気であれば、酵素活性が高く、フォルマゾンが多く生成されるが、細胞が死んでしまうと、フォルマゾンは生成されない。よって、波長５７０ｎｍにおける吸光度測定によって、生成されたフォルマゾンの量、ひいては細胞の生存率を計測することができる。
【００４３】
ＭＴＴ溶液は、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するＰＢＳ溶液である。共存培養後、培養液を除去せず、１２５μｌ／ウェルの量でＭＴＴ溶液を加えた。次いで、炭酸ガスインキュベータを用い、３７℃、炭酸ガス濃度５％にて２時間インキュベートした。培養液を除去し、１００μｌ／ウェルの量でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。フォルマゾンをよく溶解させた後、波長５７０ｎｍにおいてＤＭＳＯ溶液の吸光度を測定した。
【００４４】
細胞を培養する際に、被験試料をＤＭＳＯに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭで希釈したもの（５０μｌ）の代わりに、１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（５０μｌ）を添加したものを用意し、同様に処理した。これがコントロールである。
【００４５】
コントロールの吸光度を１００として、被験試料を添加した場合の吸光度の割合を算出した。値が小さいほど、細胞生存率又は細胞活性が低く、それは、被験試料の細胞毒性が強いことを示している。
【００４６】
（２）原料
菌床栽培において、種菌の植え付けから約１２０日後にグリフォラ・ガルガル子実体を収穫した。これに、４５℃の温風を一昼夜、その後７０℃の温風を１時間あて、乾燥させた。このようにして温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体を、原料として用いた。
【００４７】
（３）有効成分の抽出
抽出方法の概略は、図３乃至図６に示すとおりである。具体的には、次のようにして有効成分を抽出した。
【００４８】
（３−１）へキサン抽出
温風乾燥されたグリフォラ・ガルガル子実体８．７８ｋｇを粉砕した。ヘキサン５０ｌに入れ、室温にて放置した。濾過により、へキサン溶液と残渣とに分けた。
【００４９】
（３−２）酢酸エチル抽出
残渣に酢酸エチル５０ｌを加え、室温にて放置した。濾過により、酢酸エチル溶液と残渣とに分けた。酢酸エチル溶液には、１０１．５ｇの固形分（酢酸エチル可溶画分）が含まれていた。
【００５０】
（３−３）フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー
（３−２）で得られた酢酸エチル溶液（固形分量で９０．１ｇに相当する量）を、フラッシュ・カラム・クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｎ；関東化学社製；充填剤重量：３５０ｇ；φ４ｃｍ×６０ｃｍ）に３回に分けて供し、有効成分をカラムに保持させた。次いで、溶出液として、ヘキサン／酢酸エチル（９：１（容量））混液５００ｍｌ、塩化メチレン５００ｍｌ、塩化メチレン／アセトン（８：２（容量））混液５００ｍｌ、アセトン５００ｍｌ及び１００％エタノール１，０００ｍｌをこの順で流した。
【００５１】
溶出液を２０ｍｌずつ分取し、各々につき、（１−１）及び（１−２）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。
【００５２】
この測定結果を踏まえ、溶出液を２８の群（順に、３ＧＡ−ＥＡ−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−２８）にまとめた。これら２８の群のそれぞれを被験試料として用い、（１−１）、（１−２）及び（１−３）に記載の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定とＭＴＴアッセイを行った。破骨細胞形成阻害活性が確認されたのは、３ＧＡ−ＥＡ−１１乃至３ＧＡ−ＥＡ−２７であった。
【００５３】
（３−４）Ｓｅｐ  ｐａｋによる前処理と逆相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー
（３−３）に記載の処理によって得られた画分３ＧＡ−ＥＡ−１７（固形分量で３５９．１ｍｇに相当する量）をＳｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、有効成分を保持させた。１００％メタノール、９５％メタノールを順次流した。その後、カートリッジに保持されたもの（吸着物）を、塩化メチレン、続いて酢酸エチルで溶出させた。塩化メチレン溶出液と酢酸エチル溶出液とを合わせた。その固形分量は２９６．４ｍｇであった。これを３ＧＡ−ＥＡ−１７−１と名付けた。
【００５４】
３ＧＡ−ＥＡ−１７−１（固形分量で２７４．０ｍｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続されたＯＤＳカラム（和光純薬工業製；Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ  ５Ｃ１８）に通し、有効成分を保持させた。９５％メタノールで溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１７−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１７−２１の画分を得た。
【００５５】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１７−１、５乃至７、９乃至１６、１８及び１９に有効成分が濃縮されていた。３ＧＡ−ＥＡ−１７−１３につき、メタノールを留去し、固形分（以下、「化合物１」という）１１．１ｍｇを得た。
【００５６】
（３−５）Ｓｅｐ  ｐａｋによる前処理、逆相カラムによる高性能液体クロマトグラフィー、及び再結晶
（３−３）に記載の処理によって得られた画分３ＧＡ−ＥＡ−１８（固形分量で３．５８９２ｇに相当する量）を、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、有効成分を保持させた。９５％メタノール、９０％メタノールを順次流した。その後、カートリッジに保持されたもの（吸着物）を、塩化メチレン、続いて酢酸エチルで溶出させた。塩化メチレン溶出液と酢酸エチル溶出液とを合わせた。その固形分量は、２．７３５２ｇであった。これを３ＧＡ−ＥＡ−１８−４と名付けた。
【００５７】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４（固形分量で２．６６９１ｇに相当する量）を、高性能液体クロマトグラフ装置に接続されたＯＤＳカラム（３０Ｃ−ＵＧ−１５／３０）に通し、有効成分を保持させた。９０％メタノールで溶出を行い、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−１乃至３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−５７の画分を得た。
【００５８】
各画分を用い、前記の方法で、ＴＲＡＰ染色法による破骨細胞形成数の測定を行った。その結果、３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−２乃至７、１３乃至２８、３５、及び４１乃至５５に有効成分が濃縮されていた。３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−２８を、さらに精製することとした。
【００５９】
３ＧＡ−ＥＡ−１８−４−２８（固形分量で３４．４ｍｇに相当する量）を、Ｓｅｐ  Ｐａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  カートリッジ（ウォーターズ社製；ＯＤＳ）に通し、有効成分を保持させた。クロロホルム／メタノール（９７：３（容量））混液での溶出を行った。その後、カートリッジに保持されたもの（吸着物）を、塩化メチレン、続いて酢酸エチルで溶出させた。塩化メチレン溶出液と酢酸エチル溶出液とを合わせた。その固形分量は、２８．３ｍｇであった。
【００６０】
得られた固形分を、エーテル／ヘキサンで再結晶させたところ、２．６ｍｇの結晶（以下、「化合物２」という）が得られた。
【００６１】
（４）有効成分の同定
（４−１）化合物１
(３−４)で得た化合物１をＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。結果を図７及び表１に示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  ４６５．２９６１（Δ−２．６ｍｍｕ）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋より、化合物１の分子量は４４２であり、分子式はＣ２８Ｈ４２Ｏ４であることが分かった。
【００６２】
【表１】
2010018563.tif 000009
【００６３】
また、(３−４)で得た化合物１をＣＤＣｌ３に溶解させ、異核多重結合連結度（Ｈｅｔｅｒｏ−ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ（ＨＭＢＣ）スペクトルを得た。結果を図８乃至１０に示す。得られたデータより、化合物１の化学構造は、図１１に示すとおりであると推定された。
【００６４】
化合物１における水酸基の位置を特定するため、化合物１の水酸基をｐ−ブロモ安息香酸エステル化した化合物を調製し、ＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル（ＪＯＥＬ）社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。その１Ｈ−ＮＭＲを、化合物１の１Ｈ−ＮＭＲと共に、図１２に示す。この結果から、化合物１の水酸基の位置が３位であることが確認された。即ち、化合物１の化学構造は、前記式（１）で示されることが確認された。
【００６５】
(３−４)で得た化合物１について、常法により、ＩＲスペクトル、旋光度及び融点を求めた。結果を表２に示す
【００６６】
【表２】
2010018563.tif 000010
【００６７】
（４−２）化合物２
(３−５)で得た化合物２をＣＤＣｌ３に溶解させ、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーターと、ジョエル社製ラムダ５００ＦＴ  １３Ｃ−ＮＭＲスペクトロメーターに供した。結果を図１３及び表３に示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ  ｍ／ｚ  ４０８．３０６３（Δ−２．０ｍｍｕ）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋より、化合物２の分子量は３８５であり、分子式はＣ２２Ｈ４３ＮＯ４であることが分かった。
【００６８】
【表３】
2010018563.tif 000011
【００６９】
また、(３−５)で得た化合物２をＣＤＣｌ３に溶解させ、異核多重結合連結度（ＨＭＢＣ）スペクトルを得た。結果を図１４に示す。得られたデータより、化合物２の化学構造は、図１５に示すとおりであると推定された。
【００７０】
化合物２におけるアセチルイミノ基と水酸基の立体配置を特定するため、ジヒドロセラミドの酢酸塩と化合物２の酢酸塩について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び旋光度を測定した。結果を図１６に示す。この結果から、アセチルイミノ基はＳ体、水酸基はＲ体であること確認された。即ち、化合物２の化学構造は、図１５に示すとおり（前記式（２ａ））であることが確認された。
【００７１】
(３−５)で得た化合物２について、常法により、ＩＲスペクトル、旋光度及び融点を求めた。結果を表４に示す
【００７２】
【表４】
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【００７３】
（実施例２）イン・ビトロにおける破骨細胞の形成抑制に有効な濃度の決定
実施例１の（１−１）に記載した共存培養法において、ウェルあたり、化合物１（前記式（１）の化合物）については、０．０９８μｇ、０．１９５μｇ、０．３９μｇ、０．７８μｇ、１．５６μｇをＤＭＳＯに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液で希釈して５０μｌとしてものを、化合物２（前記式（２ａ）の化合物）については、０．３９μｇ、０．７８μｇ、１．５６μｇ、３．１２５μｇ、６．２５μｇをＤＭＳＯに溶解し、それを１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ溶液で希釈して５０μｌとしてものを用いた。ウェル中の培養液の量は２５０μｌであるから、培養液中の濃度では、化合物１は０．３９μｇ／ｍｌ、０．７８μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、及び６．２５μｇ／ｍｌの、化合物２は１．５６μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、及び２５μｇ／ｍｌの濃度であった。
【００７４】
共存培養終了後、実施例１の（１−２）に記載したＴＲＡＰ染色法と、（１−３）に記載したＭＴＴアッセイ法を行なった。
【００７５】
コントロールは、共存培養法において、被験試料を含まない１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭを、５０μｌ／ウェルの量で用いた。
【００７６】
被験試料（各濃度につき）、コントロール共に、２点ずつ実験を行なった。被験試料を用いた場合のデータを、コントロールの平均値で除した値を図１７（化合物１）及び図１８（化合物２）に示す。
【００７７】
化合物１に関し、１．５６μｇ／ｍｌとは、３．５×１０−６Ｍに相当し、化合物２に関し、２５μｇ／ｍｌとは、６．５×１０−５Ｍに相当する。化合物１は、共存培養法で培地中の被験試料濃度３．５×１０−６Ｍで、細胞毒性は殆ど示さず、破骨細胞形成数は約５０％まで抑制した。また、化合物２を培地中の被験試料濃度６．５×１０−５Ｍで用いた場合には、細胞毒性は殆ど示さず、破骨細胞形成数は約３０％であった。
【００７８】
(実施例３) グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物の摂取による骨芽細胞と破骨細胞のマーカーの血清又は尿中濃度の変動
８名の被験者の血液及び尿を採取し、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、骨型アルカリホスファターゼ（以上、血清中）及びデオキシピリジノリン（尿中）を、以下の方法で定量した。
【００７９】
（ＧＯＴ及びＧＰＴ）  日本臨床化学会標準法により、定量した。
【００８０】
（骨型ＡＬＰ）  血清中骨型アルカリホスファターゼ測定用キットを用い、マイクロプレートを用いたＥＩＡ法の原理に基づき、骨型ＡＬＰを測定した。このキットでは、マイクロプレートのウェルにマウス抗骨型ＡＬＰモノクローナル抗体が固相化されている。このモノクローナル抗体に骨型ＡＬＰを結合させた後、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、結合された骨型ＡＬＰによって酵素反応を生じさせ、酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノールの発色を測定した。骨型ＡＬＰ濃度は、検量線から求めた。
【００８１】
（ＤＰＤ）  尿中デオキシピリジノリン測定用キットを用い、マイクロプレートを用いた競合法ＥＩＡ法の原理に基づき、ＤＰＤを測定した。このキットでは、マイクロプレートのウェルにマウス抗ＤＰＤモノクローナル抗体が固相化されている。このモノクローナル抗体に、検体中のＤＰＤとアルカリホスファターゼ標識ＤＰＤとを競合的に結合させ、洗浄後、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を添加し、結合されたアルカリホスファターゼ標識ＤＰＤによって酵素反応を生じさせ、酵素反応の生成物であるｐ−ニトロフェノールの発色を測定した。ＤＰＤ濃度は、検量線から求めた。
【００８２】
次いで、各被験者に、実施例１（２）に記載したグリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物を、１０ｇ／日の量で２週間、経口摂取させた。摂取終了後、８名の被験者の血液及び尿を採取し、ＧＯＴ、ＧＰＴ、骨型アルカリファターゼ（以上、血清中）及びデオキシピリジノリン（尿中）を定量した。なお、グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物１０ｇ中の有効成分（式（１）の化合物１＋式（２ａ）の化合物２）量は、約５０乃至１００μｇ程度である。
【００８３】
結果を表５に示す。表５から明らかなように、本発明の骨疾患の予防又は治療剤の有効成分２種類を含有するグリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物の摂取により、骨芽細胞の活性が増強され、また、破骨細胞の活性が低下した。
【００８４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行なった、コントロールのウェルの顕微鏡写真である。
【図２】共存培養後にＴＲＡＰ染色を行なった、破骨細胞の形成が抑制されたウェルの顕微鏡写真である。
【図３】グリフォラ・ガルガル子実体温風乾燥物からの、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順を示す図である。
【図４】図３に示した手順の後に行われた、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順を示す図である。
【図５】図３に示した手順の後に行われた、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順を示す図である。
【図６】図５に示した手順の後に行われた、破骨細胞形成抑制活性を示す成分の抽出手順を示す図である。
【図７】有効成分である化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図８】有効成分である化合物１のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。
【図９】有効成分である化合物１のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。
【図１０】有効成分である化合物１のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。
【図１１】化合物１の化学構造式を示す図である。
【図１２】化合物１及びそのｐ−ブロモ安息香酸エステルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１３】有効成分である化合物２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１４】有効成分である化合物２のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。
【図１５】化合物２の化学構造式を示す図である。
【図１６】ジヒドロセラミドの酢酸塩と化合物２の酢酸塩の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７】化合物１の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図１８】化合物２の、イン・ビトロにおける破骨細胞形成抑制活性（破骨細胞形成数）と細胞毒性（ＭＴＴ活性）とを示す棒グラフである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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