(57)【要約】【課題】ヘモグロビンＡ２のピークの分離、強いては測定結果に影響を及ぼすおそれがある、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２のピークの間に出現することのあるピークを発生させない溶血水溶液を提供すること。【解決手段】ヘモグロビン類を液体クロマトグラフィーで分離する際に用いる溶血水溶液であって、ｐHが６．９乃至１１の範囲であり、かつ、アジ化物濃度が０．０２（重量／容量％）以下である溶血水溶液により、前記課題を解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン類を液体クロマトグラフィーで分離する際に用いる溶血水溶液であって、ｐＨが６．９乃至１１の範囲であり、かつ、アジ化物濃度が０．０２（重量／容量％）以下であることを特徴とする溶血水溶液。
【請求項２】
そのｐHが６．９乃至１０．５の範囲である、請求項１の溶血水溶液。
【請求項３】
ｐＨが６．９乃至１１の範囲であり、かつ、アジ化物濃度が０．０２（重量／容量％）以下である溶血水溶液を用いて溶血した赤血球を液体クロマトグラフィーで分離することを特徴とする、ヘモグロビン類の分離方法。
【請求項４】
そのｐHが６．９乃至１０．５の範囲である溶血水溶液を用いる、請求項３のヘモグロビン類の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類を液体クロマトグラフィーで分離する際に用いる溶血水溶液、及び、それを用いたヘモグロビン類の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サラセミア症は、ヘモグロビンの生産異常が起きる遺伝子疾患である。サラセミア症の診断では、ヘモグロビンＡ２が診断の指標として用いられることがあるが、その測定は、一般的にはイオン交換クロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーによってヘモグロビンＡ２を他のヘモグロビンから分離することにより実施される。ヘモグロビン類は赤血球中に含まれるため、液体クロマトグラフィーによりヘモグロビンを分離するに当たっては、溶血水溶液を用いて事前に赤血球を溶血させる必要があり、従来は、以下に述べるような種々の溶血水溶液が使用されていた。
【０００３】
即ち、特許文献１には、蒸留水等の低張液やポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル等の界面活性剤を含む溶血水溶液が開示されている。特許文献２乃至４には、これもまた界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むｐＨ７．０のリン酸緩衝液が溶血水溶液として開示されている。
【０００４】
ところで、ヘモグロビンの分離を陽イオン交換クロマトグラフィーで実施した場合には、ヘモグロビン成分の大部分をしめるヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２の電荷の差が小さいために、両者の溶出ピークは接近したものとなる。ところが従来公知の溶血水溶液で溶血した試料を供した場合、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２のピークの間に変成ヘモグロビンに由来すると思われるピークが出現することがあり、このピークがヘモグロビンＡ２のピークの分離、強いては測定結果に影響を及ぼすおそれがあった。
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１６００４８号公報
【特許文献２】特開平１０−１０１０７号公報
【特許文献３】特開平１１−１０１０８号公報
【特許文献４】特開２０００−８８８３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明の目的は、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２のピークの間に変成ヘモグロビン由来ピークを発生させ難い溶血水溶液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
溶血水溶液には、通常、アジ化ナトリウム等のアジ化物が防腐剤（抗菌剤）として０．０５〜０．１０（重量／容量％）程度含まれているが、本発明者らがヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２のピークの間に出現する変成ヘモグロビン由来ピークの発生原因について鋭意検討したところ、当該ピークがこのアジ化物によって引き起こされている可能性のあることを知見した。溶血後の血液試料は血液そのものと比較した場合、不安定で、徐々に変成が進行する。臨床的なヘモグロビン類の分離測定の際に数分から１０時間程度に渡って溶血後の試料が室温条件におかれることがあるが、そのような場合には当該ピークの発生が顕著になると予想される。そして本発明者らは、前記知見に基づき、アジ化物の濃度と溶血水溶液のｐＨの組合せを一定の範囲に制御することによってかかるピークを発生し難くすることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ヘモグロビン類を液体クロマトグラフィーで分離する際に用いる溶血水溶液であって、ｐＨが６．９乃至１１の範囲、好ましくはｐHが６．９乃至１０．５の範囲であり、かつ、アジ化物濃度が０．０２（重量／容量％）以下であることを特徴とする溶血水溶液である。また本発明は、ｐＨが６．９乃至１１の範囲、好ましくはｐH６．９乃至１０．５の範囲であり、かつ、アジ化物濃度が０．０２（重量／容量％）以下である溶血水溶液を用いて溶血した赤血球を液体クロマトグラフィーで分離することを特徴とする、ヘモグロビン類の分離方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、溶血水溶液に防腐剤として添加されているアジ化物の濃度と溶血水溶液のｐＨの組合せを一定の範囲に制御したことによって、室温条件下に１０時間程度溶血後の試料が室温条件におかれた場合であっても、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２のピークの間に変成ヘモグロビン由来ピークを出現させ難い溶血水溶液を提供することが可能となる。
【００１０】
具体的には、実施例に示したようにアジ化ナトリウム濃度を０．０２％以下とし、そのｐＨを７．５乃至９．５とした場合、室温条件に９時間おいた場合にも、陽イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分離に影響を与える変成ヘモグロビン由来ピークの発生を防止できる。
【００１１】
本発明では、アジ化ナトリウムに代表されるアジ化物の添加量を０．０２％以下と、通常の添加濃度よりも低くしているが、本発明者らの知見では、本発明に従って製造した溶血水溶液を室温下で約１年放置しても、バクテリア等の繁殖は観察されなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、液体クロマトグラフィー、特に陽イオン交換クロマトグラフィーで分離されるべき血液試料を溶血させる溶血水溶液である。本発明の溶血水溶液に含まれるアジ化物とは、アジ化ナトリウムやアジ化リチウムといった、防腐目的で従来から使用されている既知のアジ化物である。本発明の溶血水溶液は、そのｐＨが６．９乃至１１の範囲、好ましくはｐH６．９乃至１０．５の範囲であり、かつ、アジ化物濃度が０．０２（重量／容量％）以下であれば特に制限はない。特に好ましくは、そのｐＨは７．５乃至９．５である。ｐＨをこの範囲に制御するために、本発明の溶血水溶液は適当な緩衝材を含むことができる。また本発明の溶血水溶液は、例えば、溶血後のヘモグロビンを安定させる保存剤としてのＥＤＴＡ塩や、可溶化剤としての非イオン性界面活性剤等を含んでいても良い。当該ＥＤＴＡ塩としては、例えばエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸三カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸四カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸三ナトリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸四ナトリウムが好適なものとして例示できる。また当該非イオン性界面活性剤としては、例えば、しょ糖脂肪酸エステル類、脂肪酸アルカノールアミド類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類等の非イオン性界面活性剤が好適なものとして例示できる。
【００１３】
このような本発明の溶血水溶液を用いて溶血した赤血球を液体クロマトグラフィー、特に陽イオン交換クロマトグラフィーで分離する方法について、以下、説明する。液体クロマトグラフィーに供する血液試料は、既知の抗凝固剤を封入した採血管等を用いて採取される。既知の抗凝固剤としては、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸二カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸三カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸三ナトリウム、フッ化ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどが例示できる。
【００１４】
このような血液試料に対し、前述した溶血水溶液を加え、試料中の赤血球を溶血させる。溶血水溶液の添加は、血液試料に対して一定割合の溶血水溶液を添加するようにすれば良い。例えば血液試料１に対して４０の割合で溶血水溶液を添加することが提示できる。また血液試料に溶血水溶液を添加する際の温度条件等については、例えば室温条件が例示できる。更に、溶血水溶液を添加する際の具体的な操作については、例えば添加後１０秒程度、緩やかに撹拌する等を例示することができる。
【００１５】
溶血後の試料（溶血試料）を供する液体クロマトグラフィー装置は、例えば定流量ポンプ、サンプル注入器（インジェクタ）、カラム、検出器等を備えた装置であるが、より正確な分離を行うためには、脱気装置、グラジエント制御可能なポンプ、ミキサ、サンプル注入器（インジェクタ）、カラムオーブン、検出器を備えた装置であることが好ましい。
【００１６】
前記した好ましい構成の液体クロマトグラフィー装置では、例えば２種類の溶出液（ＡとＢ；ＢはＡよりもヘモグロビンの溶出力を強くする）を用い、これらを定流量ポンプによって混合して分離カラムに供することでリニアグラジエント法又はステップグラジエント法によって経時的に溶出液の溶出力を高めることができる。この方法では、ヘモグロビンをカラムの充填剤表面で電荷の差により、多種の成分に分離することができる。例えば３種類の溶出液を用い、これらを順次切り替えるステップグラジエント法を実施しても良い。なお、前記した溶出力を強める方法としては、溶出液中のイオン濃度を高くする方法、溶出液のｐＨを高くする方法が知られている。
【実施例】
【００１７】
液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析装置として、陽イオン交換クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を分離する自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３Ｇ８（商品名、東ソー（株）製）を用い、本発明の溶血水溶液の効果を調査した。前記装置の分離カラムは、スルホン基をイオン交換基としてもつ非多孔性イオン交換樹脂が充填されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ８  β−Ｔｈａｌ．  ＨＳｉ（商品名、東ソー（株）製）であり、溶出液は、Ｇ８  β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎｏ．１、Ｇ８  β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎｏ．２及び  Ｇ８  β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎｏ．３  （Ｎｏ．１からＮｏ．３の順番でヘモグロビンの溶出力が高くなっている）で構成されるＧ８  β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（商品名、東ソー（株）製）である。なおこの装置は、脱気装置、ポンプ、カラム恒温槽、検出器を有する装置である。
【００１８】
実施例１
インフォームドコンセントを得て採取したヒトの血液に対し、ＥＤＴＡ・２Ｋ、ＥＤＴＡ・４Ｎ及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを純水に溶解した溶血水溶液Ａ（ｐＨ７．０６）を血液１に対して４０の割合で加え、１０秒間攪拌して溶血した溶血試料を、０時間から２０時間に渡って３０℃で保存した。この保存の間に溶血試料の一部を前記装置に供してヘモグロビンＡ２を分離し、その割合（％）を測定した。結果を図１に白丸で示す。
【００１９】
０時間におけるヘモグロビンＡ２（％）を１００％とし、各測定でのヘモグロビンＡ２の回収率を算出したところ、前記条件で２０時間放置しても、９７％の回収率が達成された。実施例１の結果からは、溶血水溶液の保存性を考慮しないのであれば、アジ化物を一切含めないことが最良であることが分かる。
【００２０】
実施例２
アジ化ナトリウムを０．０２％（重量／容量％）となるように溶血水溶液Ａに加え、この溶液を用いて実施例１と同様の操作を実施した。結果を図１に白三角で示す。６時間後の回収率は９５％、２０時間後の回収率は９２％であり、サラセミア症のヘモグロビンＡ２の測定では±１０％の差は陽性率に影響しないと考えられることから、十分な正確性が得られていることが分かる。
【００２１】
比較例１
アジ化ナトリウムを０．０５％となるように溶血水溶液Ａに加えた以外は実施例１と同様の操作を実施したところ、１０時間程度で回収率は９０％を下回り、２０時間後には８０％程度の回収率となった（図１における白四角）。またアジ化ナトリウムを０．１％となるように溶血水溶液の原液に加えた場合も、１０時間程度で回収率は９０％を下回り、２０時間後には７０％をも下回る回収率となった（図１における白ひし形）。
【００２２】
実施例３
インフォームドコンセントを得て採取したヒトの血液に対し、アジ化ナトリウムを０．０２％（重量／容量％）、ＥＤＴＡ・２Ｋ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを含む溶血水溶液Ｂ（ｐＨ７．２６）を血液１に対して４０の割合で加え、１０秒間攪拌して溶血した溶血試料を、０時間から１２時間に渡って３０℃で保存した。この保存の間に溶血試料の一部を前記装置に供してヘモグロビンＡ２を分離し、その割合（％）を測定した。結果を図２に黒四角で示す。
【００２３】
０時間におけるヘモグロビンＡ２（％）を１００％とし、各測定でのヘモグロビンＡ２の回収率を算出したところ、前記条件で１２時間放置しても、９６％の回収率が達成され、アジ化物の濃度とｐＨの組合せを一定の範囲に制御することにより、高いヘモグロビンＡ２の回収率を実現できることが分かる。
【００２４】
実施例４
インフォームドコンセントを得て採取したヒトの血液に対し、アジ化ナトリウムを０．０２％（重量／容量％）、ＥＤＴＡ・２Ｋ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを含む溶血水溶液Ｃ（ｐＨ９．２１）を血液１に対して４０の割合で加え、１０秒間攪拌して溶血した溶血試料を、０時間から１２時間に渡って３０℃で保存した。この保存の間に溶血試料の一部を前記装置に供してヘモグロビンＡ２を分離し、その割合（％）を測定した。結果を図２に黒三角で示す。
【００２５】
０時間におけるヘモグロビンＡ２（％）を１００％とし、各測定でのヘモグロビンＡ２の回収率を算出したところ、前記条件で１２時間放置しても、１００％の回収率が達成され、アジ化物の濃度とｐＨの組合せを一定の範囲に制御することにより、高いヘモグロビンＡ２の回収率を実現できることが分かる。
【００２６】
実施例５
インフォームドコンセントを得て採取したヒトの血液に対し、アジ化ナトリウムを０．０２％（重量／容量％）、ＥＤＴＡ・２Ｋ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを含む溶血水溶液Ｄ（ｐＨ１０．２４）を血液１に対して４０の割合で加え、１０秒間攪拌して溶血した溶血試料を、０時間から１２時間に渡って３０℃で保存した。この保存の間に溶血試料の一部を前記装置に供してヘモグロビンＡ２を分離し、その割合（％）を測定した。結果を図２に白丸で示す。
【００２７】
０時間におけるヘモグロビンＡ２（％）を１００％とし、各測定でのヘモグロビンＡ２の回収率を算出したところ、前記条件で１２時間放置しても、１０２％の回収率が達成され、アジ化物の濃度とｐＨの組合せを一定の範囲に制御することにより、高いヘモグロビンＡ２の回収率を実現できることが分かる。
【００２８】
実施例６
インフォームドコンセントを得て採取したヒトの血液に対し、アジ化ナトリウムを０．０２％（重量／容量％）、ＥＤＴＡ・２Ｋ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを含む溶血水溶液（ｐＨ６．５又はｐＨ１０．６７）を血液１に対して４０の割合で加え、１０秒間攪拌して溶血した溶血試料を、０時間から１２時間に渡って３０℃で保存した。この保存の間に溶血試料の一部を前記装置に供してヘモグロビンＡ２を分離し、その割合（％）を測定した。結果を図２にそれぞれ白三角又は白四角で示す。
【００２９】
０時間におけるヘモグロビンＡ２（％）を１００％とし、各測定でのヘモグロビンＡ２の回収率を算出したところ、前記条件で１２時間放置すると、それぞれ８６％又は１０７％の回収率であった。
【００３０】
本例では、ヘモグロビンＡ０とヘモグロビンＡ２のピークとの間には変成ヘモグロビンに由来すると思われるピークは出現しなかったものの、ヘモグロビンＦのピークが実施例４の場合と比較して広がる傾向が観察された。この結果から、溶血水溶液のｐＨが１０．５を超えても、ヘモグロビンＡ２の分離は良好であるが、他のヘモグロビンの分離が影響を受けるため、溶血水溶液はそのｐＨを６．９乃至１０．５とすることが特に好ましいことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、実施例１、実施例２、比較例１の各結果を示す図である。縦軸はグリコヘモグロビンＡ２の回収率（ＨｂＡ２回収率（％））を、縦軸はインキュベート時間（Ｈｒ）をそれぞれ示す。
【００３２】
実施例１の結果は丸、実施例２の結果は三角、比較例１の結果は四角又はひし形で示している。
【図２】図２は、実施例３乃至６の各結果を示す図である。縦軸はグリコヘモグロビンＡ２の回収率（ＨｂＡ２回収率（％））を、縦軸はインキュベート時間（Ｈｒ）をそれぞれ示す。
【００３３】
実施例３の結果は黒四角、実施例４の結果は黒三角、実施例５の結果は白丸そして実施例６の結果は白三角または白四角で示している。
【図１】
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【図２】
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