(57)【要約】【課題】ノイズ光を波長フィルタにより分離が難しい蛍光色素を用いるエバネッセント蛍光検出法において、高効率にノイズ光を低減させて高感度に蛍光を検出する。【解決手段】センサ部１４に液体試料Ｓ中の被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを結合させ、この蛍光標識Ｆの励起に起因して生じる信号光Ｌｆを含む光Ｌｄの量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法において、蛍光標識Ｆとして、複数の蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆから生じる蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、励起光Ｌｏの偏光方位と直交する、光Ｌｄの偏光成分Ｌｃの量を検出することにより、被検出物質Ａの量を検出する。【選択図】図１
2010038624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に少なくとも金属層が設けられてなるセンサ部とからなるセンサチップを用意し、
前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に直線偏光の励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、該蛍光標識の励起に起因して生じる信号光を含む光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質を用い、
前記励起光の偏光方位と直交する、前記光の偏光成分の量を検出することにより、前記被検出物質の量を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記直線偏光がｐ偏光であり、前記プラズモンが、表面プラズモンであることを特徴とする請求項２又は３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、
前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、
前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出することを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれに記載の検出方法に用いられる検出装置であって、
前記センサチップを収容する収容部と、
前記センサ部に前記励起光を照射する励起光源を含む励起光照射光学系と、
該励起光の照射により該センサ部上に生じた前記増強した光電場における、前記蛍光標識の励起に起因して生じる信号光を含む光から前記励起光の偏光方位と直交する偏光成分を分離して取り出す偏光分離手段と、
前記分離された偏光成分の量を検出する光検出手段とを備えたことを特徴とする検出装置。
【請求項８】
前記励起光の反射光の強度を検出する光検出器と、前記励起光源から出射された前記励起光の偏光状態を制御する偏光調整素子と、前記検出された強度に応じて、前記センサ部に入射される前記励起光のｐ偏光成分の強度が最大となるように前記偏光調整素子を操作する制御手段とを有することを特徴とする請求項７に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の被検出物質を検出する検出方法および検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
バイオ測定においては、例えば、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上に被検出物質と特異的に結合する１次抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより、１次抗体に被検出物質を特異的に結合させ、次いで、被検出物質と特異的に結合する、蛍光標識が付与された２次抗体を添加し、被検出物質と結合させることにより、１次抗体―被検出物質―２次抗体の、所謂サンドイッチを形成し、２次抗体に付与されている蛍光標識からの蛍光を検出するサンドイッチ法や、被検出物質と競合して１次抗体と特異的に結合する、蛍光標識された競合２次抗体を被検出物質と競合的に１次抗体と結合させ、１次抗体と結合した競合２次抗体からの蛍光を検出する競合法などのアッセイがなされる。
【０００４】
この際、基板上に固定された１次抗体と被検出物質を介して結合した２次抗体、あるいは直接結合した競合２次抗体のみからの蛍光を検出するために、エバネッセント光により蛍光を励起するエバネッセント蛍光法が提案されている。エバネッセンと蛍光法は、基板表面で全反射する励起光を基板裏面から入射し、基板表面に滲み出すエバネッセント波により蛍光を励起してその蛍光を検出するものである。
【０００５】
エバネッセント蛍光法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１、非特許文献１などに提案されている。表面プラズモン増強蛍光法は、プラズモン共鳴を生じさせるため、基板上に金属層を設け、基板と金属層との界面に対して基板裏面から、全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光信号を増大させてＳ／Ｎを向上させるものである。
【０００６】
同様に、エバネッセント蛍光法において、センサ部の電場を増強する効果を有するものとして、導波モードによる電場増強効果を利用する方法が非特許文献２に提案されている。この光導波モード増強蛍光分光法（OWF：Optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy)は、基板上に金属層と、誘電体などからなる光導波層とを順次形成し、基板裏面から全反射角以上の角度で励起光を入射し、この励起光の照射により光導波層に光導波モードを生じさせ、その電場増強効果によって、蛍光信号を増強させるものである。
【０００７】
また、特許文献２および非特許文献３には、表面プラズモンにより増強された電場において励起された蛍光標識からの蛍光を検出するのではなく、その蛍光が金属層に新たに表面プラズモンを誘起して生じる放射光（SPCE: Surface Plasmon-Coupled Emission)をプリズム側から取り出す方法が提案されている。
【０００８】
しかしながら、上記した信号増強方法では、検出したい蛍光信号と同時に、センサ部上にあるゴミや傷等に起因する励起光の散乱光や、センサ部表面における励起光の反射光等のノイズ光も増強されて検出されてしまう。従って、更なる高感度化、特に検出限界の向上には、ノイズ光の減少が必須課題となっている。
【特許文献１】特開平１０−３０７１４１号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００５３９７４号明細書
【非特許文献１】W.Knoll他、Analytical Chemistry 77(2005), p.2426-2431
【非特許文献２】2007年春季  応用物理学会  予稿集  Ｎo.３,P.1378
【非特許文献３】Thorsten Liebermann Wolfgang Knoll, "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy" Colloids and Surfaces A 171(2000)115-130
【非特許文献４】「蛍光分光とイメージングの手法」 pp.14-24，学会出版センタ(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
蛍光信号光とノイズ光との分離には、波長フィルタを用いる方法がよく知られているが、この方法はストークスシフトが大きい蛍光色素を使用する場合に有効な方法であり、バイオ測定では自家蛍光（吸収）を生じるサンプルを対象とすることから、ストークスシフトの小さい、長波長域において蛍光を発する蛍光色素を用いられることが多く、分離が難しい。
【００１０】
また、偏光フィルタを用いて蛍光信号光とノイズ光との分離する方法も知られている。しかしながら、蛍光信号の偏光は励起光の偏光とほぼ正の相関を持つため（非特許文献４）、この方法は、蛍光分子がブラウン運動による回転や近接する蛍光分子間のエネルギー移動を生じて偏光の解消が生じるような場合にしか適用することができない。上記エバネッセント蛍光法等の近接場光を利用する蛍光検出法においては蛍光色素がセンシング面に固定されるため、ブラウン運動による回転は生じにくく、更に検出限界が向上した場合には被検出物質自体が少なくなるため、蛍光分子が疎らになり蛍光分子間のエネルギー移動も生じにくい。非特許文献３では、表面プラズモン共鳴を利用した蛍光検出において、蛍光信号の偏光は励起光の偏光、つまりｐ偏光に強く偏っていることを確認されている。
【００１１】
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、ストークスシフトが小さく波長フィルタによるノイズ光の分離が難しい蛍光色素を用いる近接場光を利用する蛍光検出法において、高効率にノイズ光を低減させて高感度検出が可能な蛍光検出方法及び装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の検出方法は、誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面に少なくとも金属層が設けられてなるセンサ部とからなるセンサチップを用意し、
前記センサ部に液体試料を接触させることにより、該センサ部上に、該液体試料中の被検出物質の量に応じた量の蛍光標識結合物質を結合させ、
前記センサ部に直線偏光の励起光を照射することにより、該センサ部上に増強した光電場を生じさせ、該増強した光電場内において前記蛍光標識結合物質の蛍光標識を励起し、該蛍光標識の励起に起因して生じる信号光を含む光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する検出方法において、
前記蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該複数の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質を用い、
前記励起光の偏光方位と直交する、前記光の偏光成分の量を検出することにより、前記被検出物質の量を検出することを特徴とするものである。
【００１３】
なお、ここで「蛍光標識結合物質」は被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する蛍光標識された結合物質であり、例えば、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と蛍光標識とから構成され、競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光標識とから構成される。
【００１４】
本明細書において、蛍光色素分子には、有機系色素及び量子ドット等の無機系色素も含まれることとする。また、前記センサ部に入射される励起光は、励起光照射光学系から出射された直後に直線偏光である励起光であってもよいし、前記センサ部に入射される直前の偏光状態が直線偏光である励起光であってもよい。
【００１５】
また、「被検出物質の量を検出する」とは被検出物質の存在の有無を含み、定量的な量のみならず、定性的な量を含むものとする。
【００１６】
ここで「光電場」とは、励起光の照射により生じるエバネッセント光もしくは近接場光に起因する電場をいうものとする。  
また、「増強した光電場を生じさせる」とは、光電場を増強させることによって、増強した光電場を形成することを意味するものであり、光電場を増強させる方法は、プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。
【００１７】
また、「前記蛍光標識結合物質の蛍光標識の励起に起因して生じる信号光の量に基づいて、前記被検出物質の量を検出する」方法としては、蛍光標識からの蛍光を直接検出するものであってもよいし、間接的に検出するものであってもよい。  
具体的には、以下の態様（１）〜（４）が挙げられる。
【００１８】
（１）前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。  
（２）前記励起光の照射により前記金属層にプラズモンを励起し、該プラズモンにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。  
（３）前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。  
（４）前記センサチップとして、前記金属層上に光導波層を備えたものを用い、前記励起光の照射により前記光導波層に光導波モードを励起し、該光導波モードにより前記増強した光電場を生じさせ、前記蛍光標識の励起に起因して生じる前記光として、該励起によって該蛍光標識から生じる蛍光が前記金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、前記誘電体プレートの前記他面から放射される放射光を検出することにより前記被検出物質の量を検出する。
【００１９】
（１）および（２）においては、前記金属層を金属膜とし、金属膜と基板との界面に基板裏面から全反射角度以上の角度でｐ偏光の励起光を入射させ、金属膜表面に表面プラズモンを励起するものであってもよいし、前記金属層を、励起光の波長よりも小さい周期の凹凸を表面に有する金属微細構造体あるいは、励起光の波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドにより構成し、励起光の照射により、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドに局在プラズモンを励起するものであってもよい。
【００２０】
本発明の検出装置は、上述の本発明の検出方法に用いられる検出装置であって、
前記センサチップを収容する収容部と、
前記センサ部に前記励起光を照射する励起光源を含む励起光照射光学系と、
該励起光の照射により該センサ部上に生じた前記増強した光電場における、前記蛍光標識の励起に起因して生じる信号光を含む光から前記励起光の偏光方位と直交する偏光成分を分離して取り出す偏光分離手段と、
前記分離された偏光成分の量を検出する光検出手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００２１】
本発明の検出装置は、更に、前記励起光の反射光の強度を検出する光検出器と、前記励起光源から出射された前記励起光の偏光状態を制御する偏光調整素子と、前記検出された強度に応じて、前記センサ部に入射される前記励起光のｐ偏光成分の強度が最大となるように前記偏光調整素子を操作する制御手段とを有することが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の検出方法および装置によれば、センサ部上に、試料に含有される被検出物質の量に応じて結合される蛍光標識結合物質の蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を、該蛍光色素分子からの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質を用いることにより、励起光の偏光方向と直交する偏光成分の蛍光信号を生じさせることができるので、検出光に含まれるノイズ光と蛍光信号とを偏光分離し、高効率にノイズ光を低減させることができる。
【００２３】
本発明によれば、これまで偏光を利用したノイズ光の分離が困難とされていた近接場光を利用する蛍光検出法において、ノイズ光の偏光分離が可能となるので、ストークスシフトが小さく波長フィルタによるノイズ光の分離が難しい蛍光色素を用いる場合にも、高効率にノイズ光を低減させ、Ｓ／Ｎのよい安定した信号を検出することができ、被検出物質の有無および／または量を精度よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
「検出方法および装置」
本発明の検出方法及び装置は、エバネッセント蛍光法等の近接場光を利用する蛍光検出において偏光分離によりノイズ光と信号光とを分離することによりＳ／Ｎを向上させて、より高感度な蛍光検出及び検出限界の向上を実現したものである。
【００２５】
「背景技術」の項目において述べたように、エバネッセント蛍光法等の近接場光を利用する蛍光検出において、蛍光標識がセンシング面に固定されるため、蛍光標識として蛍光色素分子そのものを用いる場合は、蛍光色素分子にブラウン運動による回転は生じにくく、更に検出限界が向上した場合には被検出物質自体が少なくなるため、蛍光分子間のエネルギー移動も生じにくい。そのため、励起光の蛍光信号の偏光は励起光の偏光とほぼ正の相関を持つため、これまで、偏光分離によるノイズ光と信号光との分離によりＳ／Ｎを向上させることはできなかった。
【００２６】
本発明者は、近接場光を利用する蛍光検出法において、偏光の解消機能を有する蛍光標識を用いることにより、偏光分離によりノイズ光を高効率に分離することにはじめて成功した。以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、各図において説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【００２７】
本発明の検出方法は、エバネッセント蛍光法等の近接場光を利用する蛍光検出法、例えば図１に示すように、誘電体プレート１１と、該プレート１１の一面に設けられた少なくとも金属層１２を含むセンサ部１４とからなるセンサチップ１０を用い、センサ部１４に液体試料Ｓを接触させることにより、該センサ部１４上に、液体試料Ｓに含有される被検出物質Ａの量に応じた量の蛍光標識結合物質ＢＦを結合させ、センサ部１４に直線偏光の励起光Ｌｏを照射することにより、センサ部１４上に増強した光電場Ｄを生じさせ、該増強した光電場Ｄ内において、蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識Ｆを励起し、蛍光標識Ｆの励起に起因して生じる信号光Ｌｆを含む光Ｌｄの量に基づいて、被検出物質Ａの量を検出する検出方法であって、蛍光標識Ｆとして、複数の蛍光色素分子ｆを、該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、励起光Ｌｏの偏光方位と直交する、光Ｌｄの偏光成分Ｌｃの量を検出することにより、被検出物質Ａの量を検出することを特徴とするものである。
【００２８】
なお、センサ部１４に、蛍光標識結合物質ＢＦを結合させた後に、液体試料Ｓ中の、センサ部１４に結合せずに滞留あるいは非特異吸着している蛍光標識結合物質ＢＦをセンサ部１４上から除去し、その後、被検出物質Ａの量を検出することが望ましい。なお、ここで、センサ部１４に結合するとは、センサ部１４に対して特異的に結合することを意味し、具体的には、蛍光標識結合物質ＢＦが特異的に結合する物質Ｂ１が固定層としてセンサ部１４に設けられており、この固定層に結合する形態が挙げられる。
【００２９】
以下に示す本発明に係る一実施形態の検出装置１〜６は、上記検出方法を実施するためのものであって、センサチップ１０を収容する収容部１３と、センサ部１４に励起光Ｌｏを照射する励起光源２１を含む励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１４上に生じる増強した光電場Ｄにおける、蛍光標識ｆの励起に起因して生じる信号光Ｌｆを含む光Ｌｄから励起光Ｌｏの偏光方位と直交する偏光成分Ｌｃを分離して取り出す偏光分離手段４０と、分離された偏光成分Ｌｃの量を検出する光検出手段３０とを備えている。
【００３０】
センサ部１４に入射される励起光Ｌｏがｐ偏光であることが好ましい場合は、励起光Ｌｏの反射光ＬＲの強度を検出する光検出器５０と、励起光源２１から出射された励起光の偏光状態を制御する偏光調整素子２３と、光検出器５０において検出された強度に応じて、センサ部１４に入射される励起光Ｌｏのｐ偏光成分の強度が最大となるように偏光調整素子２３を操作する制御手段６０とを備えた構成としてもよい（図４を参照）。
【００３１】
蛍光標識Ｆは、図２に示すように、複数の蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆからエバネッセント光ＬＥ（光電場Ｄ）により励起される蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質である。複数の蛍光色素分子ｆを含む蛍光物質Ｆを用いれば、蛍光Ｌｆ量を増加させることができ、且つ、蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により蛍光色素分子ｆが内包されていることにより、蛍光色素分子ｆが金属層１２に近接した場合に生じる金属消光を防止し、また、蛍光Ｌｆの偏光をランダム化することができる。
【００３２】
蛍光色素分子が金属層に接近しすぎた場合に生じる消光は、金属へのエネルギー移動に伴うものであり、このエネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。従って、金属層１２と蛍光色素分子ｆとの間の距離は少なくとも数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。  
従来金属消光を防止する方法としては、金属層１２上に自己組織化膜（ＳＡＭ）を形成し、さらにカルボキシメチルデキストラン(ＣＭＤ)膜を作製して金属膜と蛍光色素分子との距離を離す方法が知られている。しかしながら、金属膜上にこれらの金属消光を防止するための膜を設けるのは、センサチップ作製工程を複雑なものとし、非常に手間がかかる。一方、蛍光物質Ｆを用いれば、金属層１２と所定以上の距離を保つことができるため、上述のような金属消光防止のための膜を設けることなく、非常に簡便な方法で効果的に金属消光を防止することができる。
【００３３】
また、蛍光標識Ｆは、センサ部１４の表面に固定されるので、それ自身の回転は生じにくいが、図２に示されるように、励起光Ｌｏによりセンサ部１４の表面に生じたエバネッセント波ＬＥ（光電場Ｄ）が蛍光標識Ｆ内に入射されると、エバネッセント波ＬＥ及びその光電場Ｄにより励起され、増強された蛍光Ｌｆは、蛍光標識Ｆの誘電体１６内部で反射及び多重散乱される。また、図示されるように蛍光標識Ｆ内部に、複数存在するため蛍光色素分子ｆ間のエネルギー移動が生じ易い。従って、蛍光標識Ｆ内での反射や多重散乱、そして蛍光色素分子ｆ間でのエネルギー移動により偏光がランダム化され、励起光Ｌｏの偏光が解消される。
【００３４】
この偏光解消効果は、蛍光標識Ｆ内の蛍光色素分子ｆの密度が高ければ高いほど、更に蛍光色素分子ｆの異方性が強いほど、そして、誘電体１６の複屈折が大きいほど大きくなる。蛍光色素分子ｆの密度が高いほど蛍光色素分子の相互作用及び多重散乱の効果が大きくなり、また、蛍光色素分子ｆの異方性が強いほど、蛍光色素分子内のダイポールの誘起される方向がランダムに近接して存在することになるためより偏光のランダム化を生じる。また、誘電体１６自身の複屈折が高ければその複屈折性により偏光が乱されて偏光が解消される。上記のように、蛍光標識Ｆを標識として用いることにより、信号光となる蛍光Ｌｆの偏光をランダム化することができる。
【００３５】
信号光の偏光だけでなく、蛍光標識Ｆ内に入射したエバネッセント光ＬＥの偏光もランダム化される。しかしながら、信号光とノイズ光とが分離される前の光Ｌｄに含まれるノイズ光中において、蛍光標識Ｆ内に入射されたエバネッセント光ＬＥの割合は少なく、センサ部１４の表面の傷や、表面上にある又は表面付近に浮遊する塵、また、センサ部１４上に固定された被検出物質Ａと特異的に結合する物質Ｂ１等に起因するエバネッセント光ＬＥの散乱光成分がほとんどであることから、ノイズ光のほとんどの偏光状態は励起光Ｌｏと同じであると考えられる。
【００３６】
従って、光Ｌｄを偏光分離手段４０を介して取り出した励起光Ｌｏの偏光方向と直交する光Ｌｄの成分Ｌｃ（以下、検出光Ｌｃとする）含まれるノイズ光強度は、光Ｌｄのノイズ光強度に比して例えば５０分の１程度にまで低減される（後記実施例を参照）。
【００３７】
偏光分離手段４０を介して検出される信号光Ｌｆの強度は、ノイズ光と同様励起光Ｌｏの偏光方向と直交する成分のみになるため小さくなるが、ノイズ光と異なって信号光のほとんどの偏光がランダム化されていることから、光Ｌｄの信号光強度に比して例えば３分の１程度となる（後記実施例を参照）。検出光Ｌｃにおいて信号光強度が３分の１となっても、ノイズ光強度が５０分の１となれば、そのＳ／Ｎは1桁向上することになる。従って、Ｓ／Ｎの高い高感度検出及び検出限界の向上を実現することができる。
【００３８】
上記したように、蛍光標識Ｆは、複数の蛍光色素分子ｆを、該複数の蛍光色素分子ｆからエバネッセント光ＬＥ（光電場Ｄ）により励起される蛍光Ｌｆを透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質である（図２）。
【００３９】
誘電体１６としては、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ、エバネッセント光ＬＥ（光電場Ｄ）及び蛍光Ｌｆを透過可能なものであれば特に制限なく、ポリスチレンやＳｉＯ2などが挙げられる。偏光ランダム化の観点から、誘電体１６自身に複屈折性を有するものであることが好ましい。ポリスチレンは複屈折の大きな高分子物質として知られている。また、誘電体１６として、複屈折性を大きくするために、上記したポリスチレンやＳｉＯ2等のマトリックスに、針状結晶（炭酸ストロンチウム等）等の異方性の強い無機物質又は有機物質等を包含させたものを用いてもよい。異方性物質は、Ｓ／Ｎを大きく低下させるような散乱光を引き起こす要因とならない事が好ましいため、散乱光を生じない大きさ及び密度とすることが好ましい。
【００４０】
蛍光色素分子ｆとしては、特に制限なく、有機系色素及び量子ドット等の無機系色素も含まれる。バイオ測定の用途では自家蛍光（吸収）を生じるサンプルを対象とすることから、ストークスシフトの小さい、長波長域において蛍光を発する蛍光色素/蛍光色素分子を用いることが好ましい。赤外励起可能な蛍光色素としては、林原生物化学研究所  ＮＫ−５２９(励起波長〜６４０ｎｍ)、ＮＫ−１８３６(励起波長〜６５０ｎｍ)、ＮＫ−２０１４(励起波長〜７８０ｎｍ)、Dyomics社製  ＤＹ−７８５−Ｌ (励起波長〜７６０ｎｍ)、ＤＹ−７８５−Ｌ (励起波長〜７７０ｎｍ)、等が挙げられる。
【００４１】
蛍光標識Ｆの粒径は特に制限ないが、蛍光量およびセンサ部上への最密充填密度の観点および、表面プラズモンの擾乱の観点から７０ｎｍ〜９００ｎｍのものがさらに好ましく、１３０ｎｍ〜５００ｎｍのものが特に好ましい。本明細書において、蛍光標識Ｆの粒径は、略球状の粒子の場合にはその直径であり、球状でない粒子の場合にはその最大幅と最小幅との平均の長さで定義するものとする。
【００４２】
蛍光標識（蛍光物質）Ｆは、ポリスチレン等の誘電体粒子に上記した蛍光色素を含浸させることにより作製してもよいし、所望の波長で励起可能なものであれば、市販の蛍光ビーズを利用してもよい。例えば、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製ＬＤ光源(品番ＤＬ−３１４７−１６０Ｆ、ＤＬ−３３５７−１６５、波長６５５ｎｍ)等を用いる場合は、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製蛍光ビーズ(品番ＦＣ０３Ｆ／８６３２)、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、 蛍光波長６９０ｎｍ)、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製蛍光ビーズ（品番Ｆ８８０７、直径２００ｎｍ、 励起波長６６０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ）、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製ＬＤ光源（品番ＤＬ−３１４８−０２３、ＤＬ−３０３８−０１１、波長６３５ｎｍ）等を用いる場合は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製蛍光ビーズ（品番Ｆ８８１６、直径１０００ｎｍ、励起波長６２５ｎｍ、蛍光波長６４５ｎｍ）等の市販の蛍光ビーズを使用することができる。上記に例示した蛍光ビーズの粒子表面はカルボキシル基にて修飾されているので、２次抗体をアミンカップリングにて結合させることができる。
【００４３】
蛍光標識結合物質ＢＦは、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する蛍光標識された結合物質であり、図１で示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と特異的に結合する結合物質と上述の蛍光物質Ｆとから構成されるものであり、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合する結合物質と蛍光物質Ｆとから構成されるものである。より具体的には、センサチップ１０として、センサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１の結合物質Ｂ１が固定層として固定されたものを用いた場合、サンドイッチ法では、蛍光標識結合物質ＢＦとして、被検出物質Ａと特異的に結合する第２の結合物質Ｂ２と、この結合物質Ｂ２が修飾された蛍光物質Ｆとからなるものを用い、競合法では、蛍光標識結合物質として、被検出物質Ａと競合して第１の結合物質と特異的に結合する第３の結合物質と、この結合物質が修飾された蛍光物質Ｆとからなるものを用いる。被検出物質Ａが抗原である場合、第１の結合物質Ｂ１として所謂１次抗体を用い、蛍光標識結合物質として所謂標識２次抗体を用いればよい。
【００４４】
本発明の検出方法は、励起光の照射によりセンサ部上に増強した光電場を生じさせ、その増強した光電場において蛍光標識が励起されることによって生じる光を検出するものであるが、光電場を増強させる方法は、表面プラズモン共鳴あるいは局在プラズモン共鳴によるものであってもよいし、光導波モードの励起によるものであってもよい。また、蛍光標識から生じる蛍光を直接検出してもよいし、間接的に検出してもよい。具体的な態様については、以下の各実施形態で説明する。
【００４５】
＜第１の実施形態＞
第１実施形態の検出方法および装置について図１を参照して説明する。図１は第１の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
【００４６】
本実施形態の本蛍光検出方法では、誘電体プレート１１およびその一面の所定領域に少なくとも金属層１２として金属膜が設けられてなるセンサ部１４を備えたセンサチップ１０を用い、このセンサチップ１０上に液体試料Ｓを保持する試料保持部（収容部）１３が備えられ、センサチップ１０と液体試料を保持可能な収容部１３による箱状の試料セルを用いている。  
金属膜１２は、所定領域に開口を有するマスクをプレート１１の一表面に形成し、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光として６５５ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。なおここで、「主成分」は、含量９０質量％以上の成分と定義する。
【００４７】
誘電体プレート１１の構成材料としては、励起光Ｌｏに対して透光性を有するものであれば特に制限なく、ガラス等が好ましい。本明細書において、透光性を有するとは、所定の波長の光に対する透過率が８０％以上であることと定義する。
【００４８】
蛍光検出装置１は、センサチップ１０を収容する収容部１３と、収容部１３に収容されたセンサチップ１０の誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に直線偏光の励起光Ｌｏを全反射角以上の入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の他面側から入射させる励起光照射光学系２０と、励起光Ｌｏの照射によりセンサ部１２上に生じた、増強した光電場Ｄにおける、蛍光標識Ｆの励起に起因して生じる信号光を含む光Ｌｄから励起光Ｌｏの偏光方位と直交する偏光成分Ｌｃを分離して取り出す偏光分離手段４０と、偏光成分Ｌｃを検出する光検出手段３０とを備えている。
【００４９】
本実施形態では、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにｐ偏光で誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して入射させる。励起光照射光学系２０は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる励起光源２１と、励起光Ｌｏを直線偏光（ｐ偏光）とする偏光調整素子２３と、誘電体プレート１１に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するように誘電体プレート１１内に励起光Ｌｏを導光するものである。
【００５０】
偏光調整素子２３は、ｐ偏光のみを取り出す偏光子である。プリズム２２の構成材料としては特に制限なく、ガラスやポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等が好ましい。  
なお、本実施形態ではプリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。励起光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面１０ａで励起光Ｌｏが全反射角以上で、かつ金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間には必要に応じて導光部材を配置してもよい。また、プリズム２２と誘電体プレート１１とが一体的に形成されていてもよい。
【００５１】
収容部１３は、センサチップ１０を収容する際に、センサチップのセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出手段３０で蛍光が検出できるよう構成されている。収容部１３の構成材料としては、励起光Ｌｏ及び信号光（蛍光）Ｌｆに対して透光性を有するものであれば特に制限されず、ガラス等が挙げられる。収容部１３中のセル（センサチップ１０）は交換可能である。
【００５２】
蛍光（信号光）Ｌｆは、収容部１３のプリズム２２と反対側の面側（図示上方）から、光検出手段３０により検出する。光検出手段３０により検出される検出光Ｌｃは、収容部１３から検出される光Ｌｄから偏光分離手段４０により、励起光Ｌｏの偏光方向と直交する偏光成分、すなわちｓ偏光成分を取り出したものである。偏光分離手段４０は、偏光調整手段２３とクロスニコル状態に配される偏光フィルタである。また、光検出手段３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等の光検出器を適宜用いることができ、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。また、光検出手段３０は、検出条件に応じて偏光フィルタ以外のフィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。
【００５３】
以下に、蛍光検出装置１を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。  
ここでは、一例として、試料Ｓに含まれる被測定物質として抗原Ａを検出する場合について説明する。
【００５４】
センサチップ１０として、センサチップ１０の金属膜１２上に、抗原Ａと特異的に結合する第１の結合物質として１次抗体Ｂ１が固定層として修飾されているものを用意する。  
まず、収容部１３中に検査対象である液体試料Ｓを流し、センサチップ１０の金属膜１２上に試料Ｓを接触させる。次いで同様に抗原Ａと特異的に結合する第２の結合物質である２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとからなる蛍光標識結合物質（標識２次抗体）ＢＦを含む溶液を流す。この場合、金属膜１２に表面修飾される１次抗体Ｂ１と蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２として、被検出物質である抗原Ａに対して互いに別の部位に結合するものを用いる。蛍光標識Ｆは、誘電体粒子中に蛍光色素分子ｆを内包する蛍光物質Ｆである。
【００５５】
試料Ｓ中に抗原Ａが存在すれば、１次抗体Ｂ１に抗原Ａが特異的に結合し、さらに抗原Ａに蛍光標識結合物質ＢＦの２次抗体Ｂ２が結合して、１次抗体Ｂ１−抗原Ａ−２次抗体Ｂ２結合体（以下、サンドイッチ結合体という。）が形成される。
【００５６】
その後、サンドイッチ結合体と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦを分離するため、緩衝液を流し、未反応の蛍光標識結合物質を排除する。
【００５７】
被検出物質（抗原Ａ）への標識のタイミングは特に制限されず、被検出物質（抗原Ａ）を第１の結合物質（１次抗体Ｂ１）に結合させる前に、予め試料に蛍光標識Ｆを添加しておいてもよい。
【００５８】
その後、センサチップ１０の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光Ｌｏの入射により金属層１２上に生じている光電場（エバネッセント波ＬＥに起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。
【００５９】
光検出手段３０によりこの蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができるが、既に述べたように、光検出手段３０の配される収容部１３のプリズム２２と反対側の面に存在する光Ｌｄには、信号光である蛍光Ｌｆだけでなく、センサ部１４上の傷や塵、１次抗体Ｂ１等に起因する散乱光等のノイズ光が含まれる。一方、本実施形態では、上記したように、信号光とノイズ光とでは偏光状態が異なるため、偏光分離手段４０を介して光検出手段３０により検出光Ｌｃを検出することにより、ノイズ光を高効率にカットしたＳ／Ｎの高い蛍光検出を行うことができる。
【００６０】
また、センサ部１４上にサンドイッチ結合物を形成させ、サンドイッチ結合物と、未反応の蛍光標識結合物質ＢＦとを分離する工程は、センサチップ１０を検出装置１の収容部１３にセットする前に行ってもよいし、セット後に行ってもよい。
【００６１】
上記実施形態の検出方法および装置によれば、センサ部１４上に、試料Ｓに含有される被検出物質Ａの量に応じて結合される蛍光標識結合物質ＢＦの蛍光標識として、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用いることにより、励起光Ｌｏの偏光方向と直交する偏光成分の蛍光信号Ｌｆを生じさせることができるので、光Ｌｄに含まれるノイズ光と蛍光信号とを偏光分離し、高効率にノイズ光を低減させることができる。
【００６２】
本発明によれば、これまで偏光を利用したノイズ光の分離が困難とされていた近接場光を利用する蛍光検出法において、ノイズ光の偏光分離が可能となるので、ストークスシフトが小さく波長フィルタによるノイズ光の分離が難しい蛍光色素ｆを用いる場合にも、高効率にノイズ光を低減させ、Ｓ／Ｎのよい安定した信号を検出することができ、被検出物質Ａの有無および／または量を精度よく検出することができる。
【００６３】
＜第１の実施形態の設計変更例＞
上述の各実施形態においては励起光Ｌｏとして、界面に所定の角度θで入射する平行光を入射するものとしたが、励起光としては、図３に模式的に示すような、角度θを中心に角度幅Δθを持つファンビーム（集束光）を用いてもよい。ファンビームの場合、プリズム１２２とプリズム上の金属膜１１２との界面に対して、角度θ―Δθ／２〜θ＋Δθ／２の範囲の入射角度で入射することになり、この角度範囲内に共鳴角があれば、金属膜１１２に表面プラズモンを励起することができる。金属膜上への試料供給の前後において、金属膜上の媒質の屈折率が変化し、そのために表面プラズモンが生じる共鳴角が変化する。上述の実施形態のように平行光を励起光として用いる場合、共鳴角が変化するたびに平行光の入射角度を調整する必要がある。しかし、図３に示すような、界面に入射する入射角度に幅を持たせたファンビームを用いることにより、入射角度の調整をすることなく、共鳴角の変化に対応することができる。なお、ファンビームは入射角度による強度変化が少ないフラットな分布を持つものであることがより好ましい。
【００６４】
また、誘電体プリズム２２や誘電体プレート１１として、例えば複屈折性の大きな樹脂製のものを用いた場合等は、励起光Ｌｏが誘電体プリズム２２に入射してから金属膜２０に到達するまでに、ｐ偏光およびｓ偏光の間に位相差δが生じて、例えば右回り楕円偏光状態に変化することがある。
【００６５】
このとき、励起光Ｌｉのうちｐ偏光成分は表面プラズモン励起に寄与できるが、偏光状態の回転により生じたｓ偏光成分は表面プラズモンを励起することができない。すなわち、表面プラズモンを励起することができる励起光量が実質的に減少するという問題が生じることになる。
【００６６】
このような場合は、図４に示される検出装置２のように、励起光Ｌｏの反射光ＬＲの強度を検出する光検出器５０と、光検出器５０において検出された強度に応じて、センサ部１４に入射される励起光Ｌｏのｐ偏光成分の強度が最大となるように偏光調整素子２３を操作する制御手段６０とを備えた構成とすることにより、金属膜１２に到達する励起光の変更状態をｐ偏光のみを持つ直線偏光とし、励起光量の減少を防ぐことができる。
【００６７】
検出装置２では、あらかじめ励起光Ｌｏの偏光状態を上記の位相差と逆の位相差を持つ左回り楕円偏光状態にしてから、励起光Ｌｏを誘電体プリズム２２に入射する。例えば、誘電体プリズム２２による複屈折の影響により、上記のように誘電体プリズム２２内で位相差δの右回り楕円偏光状態となってしまう場合には、誘電体プリズム２２に入射される前に、あらかじめ励起光Ｌｏの偏光状態を位相差−δの左回り楕円偏光状態になるように調整する。このように誘電体プリズム６内で生じる位相差δをあらかじめ与えておいた位相差−δによって相殺することで、励起光Ｌｏの上記界面２０ａに到達した際の偏光状態をｐ偏光のみを持つ直線偏光状態とすることにより、励起光のエネルギーを表面プラズモンの励起に有効に利用することが可能となる。
【００６８】
この場合、偏光調整素子２３は、例えばλ／２板及びλ／４板からなるものであり、λ／２板によって偏光軸の傾きを調整し、λ／４板によって偏光状態の広がり具合を調整する。なお、偏光調整素子２３は、これらに制限されるものではなく、ポッケルスセル等を用いてもよい。
【００６９】
偏光子Ｈは、反射光ＬＲの特定偏光成分を抽出することができれば、特に制限されず偏光プリズムおよび偏光板等を用いることできる。
【００７０】
自動偏光調整機構６０は、光検出器５０からの検出信号に応じて、金属膜１２に入射される際に励起光Ｌｏのｐ偏光の強度が最大となるように、誘電体プリズム２２に入射される前の励起光Ｌｏの偏光状態を調整するため偏光調整素子２３を操作するものである。自動偏光調整機構６０は、パーソナルコンピューター（ＰＣ）等を含む。
【００７１】
そして、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件を満たすように励起光Ｌｏを入射して、金属膜１２内に表面プラズモンを励起させるように界面での反射角を変えながら、偏光子Ｈを通して反射光ＬＲを光検出器５０でモニタリングし、その反射光ＬＲの角度スペクトルを求めて、スペクトル中に現れる吸収ピーク（暗線）から、金属膜１２に接している試料Ｓの屈折率あるいはその変化等の物性を測定する。このとき、光検出器５０は、反射光ＬＲのｓ偏光成分を偏光子Ｈで抽出しながら、その検出信号を自動偏光調整機構６０にフィードバックし、また、自動偏光調整機構６０はこのｓ偏光の強度が最小となるように偏光調整素子２３を操作して励起光Ｌｏの偏光状態を調整する。なお暗線測定時は、偏光子を取り除くか反射光ＬＲのｐ偏光成分のみが透過するように調整する。
【００７２】
上記の方法では、励起光Ｌｏが金属膜１２に反射され、反射光ＬＲが誘電体プリズム２２内を伝搬するときにも、誘電体プリズム２２による複屈折の影響を受けるが、これは励起光Ｌｏの照射点を調整して、反射光ＬＲが反射して誘電体プリズム２２内を伝搬する距離を極力短くすることによって回避できる。
【００７３】
上記した自動偏光調整機構を備えた構成は、以下に示す第３〜第５実施形態にも適用可能である。いずれの場合も第１実施形態と同様に、励起光の反射光ＬＲの偏光成分を検出して自動偏光調整機構により励起光Ｌｏの偏光状態を補正するものであるので、第３〜第５実施形態に適用した実施形態については説明を省略する。
【００７４】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態である検出方法および装置について図５を参照して説明する。図５は第２の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、局在プラズモン共鳴により光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。なお、以下においては、第１実施形態と同じ構成要素には同じ参照符号を付してある。
【００７５】
図５に示す蛍光検出装置３は、用いられるセンサチップ１０’と、励起光照射光学系２０’とが上述の第１の実施形態の蛍光検出装置１とは異なる。
【００７６】
センサチップ１０’は誘電体プレート１１上に設けられる金属層１２’として、励起光の照射を受けて、所謂局在プラズモンを生じる、表面に励起光Ｌｏの波長よりも小さい凹凸構造を有する金属微細構造体、あるいは、励起光Ｌｏの波長よりも小さいサイズの複数の金属ナノロッドを備えている。このような局在プラズモンを生じさせる金属層１２’を備えた場合には、励起光を金属層１２’と誘電体プレート１１との界面に全反射するように入射させる必要はなく、ここでは、励起光照射光学系２０’は、誘電体プレート１１上方から励起光Ｌｏを照射するよう構成されている。
【００７７】
励起光照射光学系２０’は、励起光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、励起光Ｌｏを直線偏光（ｐ偏光）とする偏光調整素子２３と、励起光Ｌｏを反射してセンサチップ１０’へ導光するハーフミラー２３とを備えている。ハーフミラー２３は、励起光Ｌｏを反射し、蛍光Ｌｆを透過するものである。
【００７８】
センサチップ１０’の具体例を図６Ａ〜図６Ｃに斜視図で示し説明する。  
図６Ａに示すセンサチップ１０Ａは、誘電体プレート１１と、該プレート１１の所定領域上にアレイ状に固着された複数の金属粒子７３ａからなる金属微細構造体７３で構成されている。金属粒子７３ａの配列パターンは適宜設計できるが、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属粒子７３ａの平均的な径及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００７９】
図６Ｂに示すセンサチップ１０Ｂは、誘電体プレート１１と、該プレートの上の所定領域に設けられた、金属細線７４ａが格子状にパターン形成された金属パターン層からなる金属微細構造体７４で構成されている。金属パターン層のパターンは適宜設計でき、略規則的であることが好ましい。かかる構成では、金属細線７４ａの平均的な線幅及びピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００８０】
図６Ｃに示すセンサチップ１０Ｃは特開２００７−１７１００３号公報に記載のような、Ａｌなどの金属７６の陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に成長させた複数のマッシュルーム状の金属７５ａからなる金属微細構造体７５により構成されている。ここでは金属酸化物体７７が誘電体プレートに相当する。この金属微細構造体７５は、金属体（Ａｌ等）の一部を陽極酸化して金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３等）とし、陽極酸化の過程で形成される金属酸化物体７７の複数の微細孔７７ａ内に各々金属７５ａをメッキ等により成長させて得ることができる。  
図６Ｃに示す例では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が粒子状であり、サンプルプレート表面から見れば、金属微粒子が配列されたような構造になっている。かかる構成では、マッシュルーム状の金属７５ａの頭部が凸部であり、その平均的な径およびピッチが励起光Ｌｏの波長よりも小さく設計される。
【００８１】
なお、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じる金属層１２’としては、その他、特開２００６−３２２０６７号公報、特開２００６-２５０９２４号公報などに記載の金属体を陽極酸化して得られる微細構造体を利用した種々の形態の金属微細構造体を用いることができる。
【００８２】
さらには、局在プラズモンを生じさせる金属層は、表面が粗面化された金属膜により構成されていてもよい。粗面化方法としては、酸化還元等を利用した電気化学的な方法等が挙げられる。また、金属層を、サンプルプレート上に配置された複数の金属ナノロッドにより構成してもよい。金属ナノロッドのサイズは、短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さを励起光の波長よりも小さいサイズとする。金属ナノロッドについては、例えば特開２００７-１３９６１２号公報に記載されている。
【００８３】
なお、金属層１２’として用いられる、金属微細構造体あるいは金属ナノロッドとしては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００８４】
蛍光検出装置３を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。  
センサチップを用意し、抗原―抗体反応をさせる工程は、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。以下の実施形態において同様とする。  
センサチップ１０’を収容部１３にセットした状態で、センサチップ１０’の誘電体プレート１１の所定領域に向けて励起光照射光学系２０‘により励起光Ｌｏを照射する。光源２１から出射された励起光Ｌｏはハーフミラー２３により反射されてセンサチップ１０’の試料接触面上に入射される。この励起光Ｌｏの照射により、金属層１２’の表面で局在プラズモンが励起される。励起光Ｌｏの入射により金属層１２’上に生じている光電場（近接場光に起因する電場）が、この局在プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２’表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、局在プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出手段３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００８５】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、偏光分離手段４０を介して、励起光Ｌｏの偏光方向と直交する偏光成分の検出光Ｌｃを検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００８６】
＜第３の実施形態＞
第３の実施形態の検出方法および装置について図７を参照して説明する。図７は第３の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、表面プラズモン共鳴により電場を増強させ、増強された電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
【００８７】
図７に示す放射光検出装置４は、第１の実施形態の蛍光検出装置と光検出器の配置が異なる。本放射光検出装置４においては、光検出手段３０が、増強された電場において励起された蛍光が、金属層１２に新たに表面プラズモンを誘起することによって誘電体プレート１１の金属層形成面と反対の面側（図示下方側）から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光Ｌｐを検出するように配置されている。
【００８８】
放射光検出装置４を用いた本実施形態の放射光検出方法について説明する。  
センサチップ１０を収容部１３にセットした状態で、第１実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜上１２の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。励起光Ｌｏの入射により金属層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この表面プラズモンにより増強され、金属層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、表面プラズモンによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。本実施形態では、金属膜１２上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出手段３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識結合物質ＢＦと結合した被検出物質Ａの有無および／または量を検出することができる。
【００８９】
放射光Ｌｐは蛍光が金属膜の特定の波数の表面プラズモンと結合する際に生じるものであり、蛍光の波長に応じてその結合する波数は定まり、その波数に応じて放射光の出射角度が定まる。通常励起光Ｌｏの波長と蛍光の波長とは異なることから、蛍光により励起される表面プラズモンは、励起光Ｌｏにより生じた表面プラズモンとは異なる波数のものとなり、励起光Ｌｏの入射角度とは異なる角度で放射光Ｌｐは放射される。
【００９０】
誘電体プレート１１の金属層形成面と反対側の面には、上記放射光Ｌｐとノイズ光が含まれる光Ｌｄが存在する。本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、偏光分離手段４０を介して、光Ｌｄの、励起光Ｌｏの偏光方向と直交する偏光成分の検出光Ｌｃを検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９１】
さらに、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができる。したがって、例えば血液における光吸収をほぼ無視することができ、血液を遠心分離し赤血球などの着色成分を除去したり、血球フィルタを通して血清あるいは血漿状態にしたりするという前処理を行うことなく測定が可能となる。
【００９２】
＜第４の実施形態＞
第４の実施形態の検出方法および装置について図８を参照して説明する。図８は第４の実施形態の検出装置の概略構成を示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光を検出する蛍光検出方法および装置である。
【００９３】
図８に示す蛍光検出装置５の構成は、第１の実施形態の蛍光検出装置の構成と同じであるが、用いられるセンサチップが異なり、このセンサチップの違いにより、光電場増強のメカニズムが異なる。
【００９４】
センサチップ１０”は金属層１２ａ上に光導波層１２ｂを備えている。光導波層１２ｂの層厚は、特に制限されることはなく、光導波モードが誘起されるように、励起光Ｌｏの波長、入射角度および光導波層１２ｂの屈折率等を考慮して定めることができる。例えば、上記と同様に励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、光導波層１２ｂとして１層のシリコン酸化膜からなるものを用いる場合には、５００〜６００ｎｍ程度が好ましい。なお、光導波層１２ｂは、１層以上の誘電体等の光導波材料からなる内部光導波層を含む積層構造であってもよく、この積層構造は、金属層側から順に内部光導波層および内部金属層の交互積層構造であることが好ましい。
【００９５】
蛍光検出装置５を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。  
センサチップ１０”を収容部１３にセットした状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起される。励起光の入射により光導波層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この光導波モードにより増強され、光導波層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、光導波モードによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光検出手段３０によって、この蛍光Ｌｆを検出することにより、蛍光標識結合物質と結合した被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【００９６】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、偏光分離手段４０を介して、励起光Ｌｏの偏光方向と直交する偏光成分の検出光Ｌｃを検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００９７】
さらに、光導波モードの励起により生じる光増強電場分布は、表面プラズモンにより生じる光増強電場分布と比較して表面からの距離に伴う電場減衰の程度が緩やかであることから、蛍光標識として、複数の蛍光色素分子を内包する径の大きな蛍光物質を用いた場合、表面プラズモンによる光電場増強を用いるよりも大きな蛍光量増加効果を得ることができる。
【００９８】
＜第５の実施形態＞
第５の実施形態の検出方法および装置について図９を参照して説明する。図９は第５の実施形態の検出装置の概略構成示す全体図である。本実施形態の検出方法および装置は、金属層上に光導波層を備えたセンサチップを用い、励起光の照射により光導波層に光導波モードを励起し、光導波モードにより光電場を増強させ、増強された光電場において励起された蛍光が金属層に新たにプラズモンを誘起することにより、誘電体プレートの金属層形成面と反対の面側から放射される、新たに誘起されたプラズモンからの放射光を検出する放射光検出方法および装置である。
【００９９】
図９に示す本実施形態の放射光検出装置６は、第３の実施形態の放射光検出装置と同様の構成であり、本実施形態の検出方法において用いられるセンサチップは第４の実施形態の蛍光検出方法で用いられるセンサチップと同様である。
【０１００】
放射光検出装置６を用いた本実施形態の蛍光検出方法について説明する。
【０１０１】
センサチップ１０”を収容部１３にセットした状態で、第１の実施形態と同様に、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏを照射する。励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属層１２ａとの界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属層１２ａ上にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波が光導波層１２ｂの光導波モードと結合し、光導波モードが励起される。励起光の入射により光導波層上に生じている光電場（エバネッセント波に起因する電場）が、この光導波モードにより増強され、光導波層上に光電場増強領域Ｄが形成される。電場増強領域Ｄ、特に金属膜１２表面近傍においては、蛍光標識Ｆが励起されて（実質的にはその蛍光物質中の蛍光色素分子ｆが励起されて）蛍光Ｌｆが発生する。このとき、光導波モードによる光電場増強の効果により蛍光は増強されたものとなる。光導波層１２ｂ上で生じたこの蛍光Ｌｆが、金属膜１２に表面プラズモンを新たに誘起し、この表面プラズモンによりセンサチップ１０の金属膜形成面と反対側から特定の角度で放射光Ｌｐが射出される。光検出手段３０によって、この放射光Ｌｐを検出することにより、蛍光標識Ｆが標識された被検出物質の有無および／または量を検出することができる。
【０１０２】
本実施形態においても、第１実施形態と同様に、複数の蛍光色素分子ｆを、蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過する誘電体１６により包含してなる蛍光物質Ｆを用い、偏光分離手段４０を介して、励起光Ｌｏの偏光方向と直交する偏光成分の検出光Ｌｃを検出するので、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【０１０３】
また、本実施形態では、センサ表面で生じる蛍光に起因する光をセンサ裏面側から検出するので、蛍光Ｌｆが光吸収の大きい溶媒を通過する距離を数十ｎｍ程度と削減することができ、第３の実施形態と同様の効果を得ることができる。  
さらに、光導波モードの励起による電場増強を用いていることから、第４の実施形態と同様に蛍光量増加効果を得ることができる。
【０１０４】
蛍光標識として、図１０に示すように、さらに、誘電体１６の表面に蛍光を透過する厚みの金属皮膜１９が設けられたものを（Ｆ’）用いてもよい。金属被膜１９は、誘電体１６の全表面を覆うものであってもよいし、全表面を覆うものでなく、一部表面が露出するように設けられたものであってもよい。金属被膜１９の材料としては、上述の金属層と同様の金属材料を用いることができる。
【０１０５】
蛍光物質の表面に金属被膜１９を備えた場合、センサチップ１０、１０’の金属層１２、１２’に発生した表面プラズモンあるいは局在プラズモンが蛍光物質Ｆ’の金属被膜１９のウィスパリング・ギャラリー・モードにカップリングし、蛍光物質Ｆ’内の蛍光色素分子ｆをさらに高効率に励起できる。なお、ウィスパリング・ギャラリー・モードとは、ここで用いられるφ５３００ｎｍ以下程度の蛍光物質のような微小球の球表面に局在し、周回する電磁波モードである。
【０１０６】
蛍光物質への金属被膜方法の一例を挙げる。  
まず、前述手順により消光防止性蛍光物質を作製し、その表面にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（エポミン、日本触媒社）を修飾する。  
次に、粒子表面のＰＥＩに粒径１５ｎｍのＰｄナノ粒子(平均粒径１９ｎｍ、徳力本社)を吸着させる。  
Ｐｄナノ粒子が吸着したポリスチレン粒子を無電解金メッキ液(ＨＡｕＣｌ４、小島化学薬品社)に浸漬させることで、Ｐｄナノ粒子を触媒とする無電界メッキを利用して、ポリスチレン粒子表面に金膜を作製する。
【実施例】
【０１０７】
本発明に係る実施例について説明する。  
（実施例１）
蛍光標識として、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製蛍光粒子(品番ＦＣ０３Ｆ／８６３２)、直径５１０ｎｍ、励起波長６６０ｎｍ、 蛍光波長６９０ｎｍ)を用意し、アミンカップリングにより粒子表面に抗ｈＣＧモノクロナール抗体からなる２次抗体を結合させて標識２次抗体（蛍光標識結合物質）を調製した。
【０１０８】
次に、表面に２次抗体とはエピトープの異なる抗ｈＣＧモノクロナール抗体からなる１次抗体が固定層として固定されてなる金膜を備えた、試料セルを用意した。生理食塩水（ＮａＣｌ、150ｍＭ（mmol/L）含有）中に、標識２次抗体、及び被検出物質としてｈＣＧを含む試料液を用意し、試料セルに試料液を流し、抗原―抗体反応により、固定層にサンドイッチ結合体を形成させ、緩衝液により未反応の標識２次抗体を洗い流した。
【０１０９】
次に、図１に示される検出装置と同様の構成の検出装置に試料セルをセットし、レーザ光からｐ偏光のみを取り出した励起光を、誘電体プリズムを用いて金膜に対して、全反射可能となるように入射させて、試料セル内の蛍光物質において蛍光を励起し、試料セルの誘電体プリズムと反対側の面から信号光（蛍光）及び散乱光（ノイズ光）の測定を行った。
【０１１０】
光源には、ＳｔｏｃｋｅｒＹａｌｅ社製ＬＤ光源(品番ＤＬ−３１４７−１６０Ｆ、ＤＬ−３３５７−１６５、波長６５５ｎｍ)を用い、散乱光（〜６５５ｎｍ）と信号光（〜６９０ｎｍ）との分離および測定には波長選択フィルターを用い、いずれの場合においても偏光分離手段により、ｐ偏光成分及びｓ偏光成分をそれぞれ取りだして富士フイルム株式会社製ＬＡＳ-１０００ｐｌｕｓにより検出してその強度を比較した。
【０１１１】
その結果、信号光（蛍光）は、ｐ偏光成分対ｓ偏光成分の強度比は２：１であり、散乱光（ノイズ光）のｐ偏光成分対ｓ偏光成分の強度比は５０：１となった。ｓ偏光成分を検出することにより、信号光強度としては３分の１となるが、散乱光成分は５０分の１となる。従って、蛍光標識としてポリスチレンにより蛍光色素分子を内包してなる蛍光物質Ｆを用い、ｓ偏光成分を検出することにより、ノイズ光の割合を約１桁程度低減させてＳ／Ｎの高い高感度検出が可能なことが確認された。
【０１１２】
また、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓにより撮影（露光時間１秒）した、信号光の各偏光成分のパターンを図１１Ａと図１１Ｂに、同じくＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓにより撮影（露光時間０．０１秒）した、散乱光の各偏光成分のパターンを図１２Ａと図１２Ｂに示す。図１２Ａにおいて、中央部やや左上のハッチングの施してある部分は強度が強すぎてサチュレートしている部分である。図１１、図１２からも、Ｓ／Ｎの向上を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の表面プラズモンセンサは、バイオセンサ等として好ましく利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明の第１実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図２】誘電体により複数の蛍光色素分子を包含してなる蛍光標識の断面及び蛍光標識内の光の多重反射の様子を示す模式図
【図３】励起光照射光学系の設計変更例を示す図
【図４】偏光調整素子及びその制御手段を備えた第1実施形態の設計変更例を示す図
【図５】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置を示す概略構成図
【図６Ａ】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図６Ｂ】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図６Ｃ】本発明の第２実施形態による蛍光検出装置に用いられるセンサチップのセンサ部を示す概略構成図
【図７】本発明の第３実施形態による検出装置を示す概略構成図
【図８】本発明の第４実施形態による検出装置を示す概略構成図
【図９】本発明の第５実施形態による検出装置を示す概略構成図
【図１０】金属被膜を有する蛍光物質を示す模式図
【図１１Ａ】実施例１の信号光のｐ偏光成分の強度パターン
【図１１Ｂ】実施例１の信号光のｓ偏光成分の強度パターン
【図１２Ａ】実施例１の散乱光のｐ偏光成分の強度パターン
【図１２Ｂ】実施例１の散乱光のｓ偏光成分の強度パターン
【符号の説明】
【０１１５】
１、２、３、４、５、６    検出装置
１０、１０’、１０”    センサチップ
１１    誘電体プレート
１２    金属層（金属膜）
１２’    金属層（金属微細構造体）
１６    誘電体
１９    金属被膜
２０、２０’    励起光照射光学系
２１    励起光源
２３    偏光調整素子
３０    光検出手段
４０    偏光分離手段
５０    光検出器
Ａ    抗原（被検出物質）
Ｂ１    １次抗体（第１の結合物質）
Ｂ２    ２次抗体（第２の結合物質）
ＢＦ    標識２次抗体（蛍光標識結合物質）
Ｆ    蛍光物質（蛍光標識）
ｆ    蛍光色素分子
Ｌｏ    励起光
Ｌｆ    蛍光
Ｌｐ    放射光
Ｌｄ    信号光を含む光
Ｌｃ    励起光の偏光方位と直交する、信号光を含む光の偏光成分（検出光）
ＬＲ    励起光の反射光
【図１】
2010038624.tif 000003
【図２】
2010038624.tif 000004
【図３】
2010038624.tif 000005
【図４】
2010038624.tif 000006
【図５】
2010038624.tif 000007
【図６Ａ】
2010038624.tif 000008
【図６Ｂ】
2010038624.tif 000009
【図６Ｃ】
2010038624.tif 000010
【図７】
2010038624.tif 000011
【図８】
2010038624.tif 000012
【図９】
2010038624.tif 000013
【図１０】
2010038624.tif 000014
【図１１Ａ】
2010038624.tif 000015
【図１１Ｂ】
2010038624.tif 000016
【図１２Ａ】
2010038624.tif 000017
【図１２Ｂ】
2010038624.tif 000018