(57)【要約】【課題】新規のＪＮＫ阻害剤ペプチド（「ＪＮＫＩペプチド」）、ならびにそれが存在しているペプチドを所望の細胞位置に向けるために用いることができる輸送ペプチドと結合したＪＮＫペプチド阻害剤などのキメラペプチドを提供すること。【解決手段】新規のＪＮＫ阻害剤ペプチド（「ＪＮＫＩペプチド」）、ならびにそれが存在しているペプチドを所望の細胞位置に向けるために用いることができる輸送ペプチドと結合したＪＮＫペプチド阻害剤などのキメラペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、蛋白キナーゼ阻害剤に関し、より具体的には、蛋白キナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、マイトジェン活性化蛋白（ＭＡＰ）キナーゼ類のストレス活性化群の一員である。これらのキナーゼは、細胞増殖および分化の制御に、またより一般的には、環境刺激に対する細胞応答と関係付けられている。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに応答して、また細胞表面受容体の幾つかのクラスとの関係によって活性化される。これらの受容体としては、サイトカイン受容体、蛇紋受容体、および受容体チロシンキナーゼ類を挙げることができる。哺乳動物細胞において、ＪＮＫは、癌化などの生物過程に、また、環境ストレスに対する適応反応媒介に関係付けられている。また、ＪＮＫは、免疫細胞の成熟および分化などの免疫応答の変調、および免疫系によって破壊されることが確認されている細胞におけるプログラム化された細胞死をもたらすことに関連してきた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明はＪＮＫ蛋白質の効果的な阻害剤であるペプチドの発見に一部基づいている。本明細書においてＪＮＫペプチド阻害剤と称されるペプチドは、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の下流細胞増殖作用を減少させる。
【０００４】
したがって、本発明は、新規のＪＮＫ阻害剤ペプチド（「ＪＮＫＩペプチド」）、ならびにそれが存在しているペプチドを所望の細胞位置に向けるために用いることができる輸送ペプチドと結合したＪＮＫペプチド阻害剤などのキメラペプチドを含む。輸送配列は、原形質膜を通過するペプチド輸送を指示するために用いることができる。替わりに、またはそれに加えて輸送ペプチドは、核などの所望の細胞内配置にペプチドを方向づけるために用いることができる。
【０００５】
ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、Ｌ−アミノ酸のポリマーとして存在し得る。あるいは、前記ペプチドは、Ｄ−アミノ酸のポリマーとして存在し得る。
【０００６】
ＪＮＫ結合ペプチドならびにＪＮＫ結合ペプチドを特異的に認識する抗体を含む製薬組成物もまた本発明に含まれる。
【０００７】
本発明はまた、細胞におけるＪＮＫキナーゼの発現を阻害する方法も含む。
【０００８】
他の態様において、本発明は、細胞におけるＪＮＫの活性化に関連した病態生理学を処置する方法を含む。例えば、標的細胞は、例えば培養動物細胞、ヒト細胞または微生物であり得る。キメラペプチドを診断、予防または治療目的に用いるべき個人にキメラペプチドを投与することにより送達はインビボで実施できる。標的細胞は、インビボ細胞、すなわち生きている動物、またはヒトの器官または組織を構成している細胞、または生きている動物、またはヒトに見られる微生物であり得る。
【０００９】
本発明はさらに、被験体における聴力低下の予防または治療の方法を提供する。前記方法は、有毛細胞不動毛への損傷、有毛細胞アポトーシスまたはニューロンアポトーシスを防ぐ細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与することを含む。細胞透過性生物活性ペプチドは、例えばＪＮＫ阻害剤ペプチドである。細胞透過性生物活性ペプチドは、配列番号：１、２、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、または１６であることが好ましい。
【００１０】
聴力低下は、騒音外傷によって生じる。したがって、一態様において、前記ペプチドは、被験体が騒音外傷に曝露される前に投与される。他の態様において、前記ペプチドは、被験体が騒音外傷に曝露された後に投与される。騒音外傷は、例えば、少なくとも９０ｄＢ  ＳＰＬであり得る。あるいは、聴力低下は抗生物質治療によって生じる。したがって、一態様において、前記ペプチドは、被験体が抗生物質に曝露される前に投与される。他の態様において、前記ペプチドは、被験体が抗生物質に曝露された後に投与される。前記抗生物質は、例えばアミノグリコシドである。
【００１１】
聴力低下は、化学療法剤によって生じる。したがって、一態様において、前記ペプチドは、被験体が化学療法剤に曝露される前に投与される。他の態様において、前記ペプチドは、被験体が化学療法剤に曝露された後に投与される。
【００１２】
本発明は、被験体におけるニューロン死または脳の損傷を予防または治療する方法をさらに提供する。この方法は、ニューロンに対する損傷またはニューロンのアポトーシスを防ぐ細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与することを含む。細胞透過性生物活性ペプチド、例えば、ＪＮＫ阻害剤（「ＪＮＫＩ」）ペプチドである。前記細胞透過性生物活性ペプチドは、配列番号：１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または２１〜２８であることが好ましい。
【００１３】
ニューロン死または脳の損傷は、大脳虚血によって生じる。したがって、一態様において、前記ペプチドは、被験体が虚血事象を経験する前に投与される。他の態様において、前記ペプチドは、被験体が虚血事象を経験した後に投与される。虚血事象は、例えば、慢性または急性である。
【００１４】
ニューロン死または脳の損傷は、他の興奮毒性機構によって生じる。したがって、一態様において、前記ペプチドは、被験体が興奮毒性機構を経験する前に投与される。他の態様において、前記ペプチドは、被験体が興奮毒性機構を経験した後に投与される。興奮毒性機構は、例えば、低酸素性／虚血性脳損傷、外傷性脳損傷、てんかん性発作から生じるニューロン死およびアルツハイマーなどの幾つかの神経変性疾患であり得る。
【００１５】
本発明はまた、膵臓の小島細胞を膵臓細胞死が抑制されるように細胞透過性生物活性ペプチドと接触させることを含む、膵臓の小島細胞死を抑制する方法も考慮している。細胞透過性生物活性ペプチドは、例えば、ＪＮＫ−阻害剤ペプチドである。細胞透過性生物活性ペプチドは、配列番号：１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または２１〜２８であることが好ましい。前記方法は、前記細胞を、コラーゲナーゼと接触させることをさらに含み得る。
【００１６】
また、本発明は、膵臓細胞死が抑制されるように細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与することにより、被験体における膵臓の小島細胞死を抑制する方法を考慮している。細胞透過性生物活性ペプチドは、例えばＪＮＫ阻害剤ペプチドである。細胞透過性生物活性ペプチドは、配列番号：１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または２１〜２８であることが好ましい。前記方法は、前記細胞を、コラーゲナーゼと接触させることをさらに含み得る。一実施形態において、前記細胞透過性生物活性ペプチドは、被験体が炎症誘発性サイトカインに曝露される前に投与される。他の実施形態において、前記細胞透過性生物活性ペプチドは、被験体が炎症誘発性サイトカインに曝露された後に投与される。
【００１７】
幾つかの態様において、本発明のペプチドの投与は、耳介内（ｉｎｔｒａｕｒｔｉｃｕｌａｒ）、腹腔内、鼻腔内、静脈内、経口およびパッチ送達から選択されるいずれか１つの投与経路によってなされ得る。
【００１８】
本発明によって提供される利点の中でも、ＪＮＫ阻害剤ペプチドが小型であり、大量に、また高純度で容易に生産できるという利点がある。前記阻害剤ペプチドはまた、細胞内分解に抵抗性であり、免疫原生も弱い。したがって、前記ペプチドは、ＪＮＫ発現の阻害が望まれているインビトロおよびインビボの適用に十分に好適である。
【００１９】
他に定義しない限り、本明細書に用いられる専門用語および科学用語は、本発明が属する通常の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様な、または同等な方法および材料を、本発明の実践または試験に用いることができるが、下記に好適な方法および材料を記載する。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許およに他の参考文献は、それらの全体を参考として援用している。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御する。なお、材料、方法および実施例は、例示的のみであって、限定する意図はない。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかとなる。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
ニューロン細胞の損傷を確認する前に、配列番号：１〜６、１１〜１６および２３〜２６のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを含む組成物を、被験体に投与することを含んでなる、被験体におけるニューロン細胞の損傷を防ぐ方法。
・（項目２）
上記ペプチドが、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む項目１に記載の方法。
・（項目３）
上記ペプチドが、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む項目１に記載の方法。
・（項目４）
上記被験体が、異常な細胞損傷を特徴とする病態を発症する危険にある項目１に記載の方法。
・（項目５）
上記異常な細胞損傷が、興奮毒性細胞死である項目４に記載の方法。
・（項目６）
上記異常な細胞損傷が、アポトーシス細胞死である項目４に記載の方法。
・（項目７）
上記被験体が、発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、ヒト免疫不全ウィルス痴呆または自己免疫疾患を発現させる危険にある項目１に記載の方法。
・（項目８）
上記発作が、虚血性発作である項目７に記載の方法。
・（項目９）
発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、ヒト免疫不全ウィルス痴呆または自己免疫疾患を含む虚血または再灌流傷害の症状を確認する前に、被験体に投与することを含んでなる、被験体における虚血性または再灌流関連傷害を防ぐ方法。
・（項目１０）
配列番号：１〜６、１１〜１６および２３〜２６のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを、ニューロン障害を患って、またはニューロン障害発現の危険にある哺乳動物に投与することを含んでなる、上記哺乳動物におけるニューロン細胞死を防ぐ方法。
・（項目１１）
上記ペプチドが、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む項目１０に記載の方法。
・（項目１２）
上記ペプチドが、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む項目１０に記載の方法。
・（項目１３）
上記ニューロン障害が、発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、およびヒト免疫不全ウィルス痴呆よりなる群から選択される項目１０に記載の方法。
・（項目１４）
配列番号：１〜６、１１〜１６および２３〜２６のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを含む組成物を、哺乳動物に投与することを含んでなるニューロン障害を治療する方法。
・（項目１５）
上記ペプチドが、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む項目１４に記載の方法。
・（項目１６）
上記ペプチドが、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む項目１４に記載の方法。
・（項目１７）
上記ニューロン障害が、発作、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、神経ラチリスム、およびヒト免疫不全ウィルス痴呆よりなる群から選択される項目１４に記載の方法。
・（項目１８）
ニューロン細胞を、配列番号：１〜６、１１〜１６および２３〜２６のアミノ酸配列よりなる群から選択されるペプチドを含む組成物に接触させることを含んでなる、ニューロン細胞死を防ぐ方法。
・（項目１９）
上記ペプチドが、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む項目１８に記載の方法。
・（項目２０）
上記ペプチドが、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む項目１８に記載の方法。
・（項目２１）
上記細胞が、興奮毒性細胞死である項目１８に記載の方法。
・（項目２２）
上記細胞が、アポトーシス細胞死である項目１８に記載の方法。
・（項目２３）
有毛不動毛、有毛アポトーシス、またはニューロンアポトーシスに対する損傷を防ぐ細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与することを含んでなる、被験体における聴力低下を予防または治療する方法。
・（項目２４）
上記ペプチドが、配列番号：１、２、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６および２３〜２６よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む項目２３に記載の方法。
・（項目２５）
上記被験体は、騒音障害に曝露される前に上記ペプチドが投与される項目２３に記載の方法。
・（項目２６）
上記被験体は、騒音障害に曝露される前に上記ペプチドが投与される項目２４に記載の方法。
・（項目２７）
上記被験体は、騒音障害に曝露された後に上記ペプチドが投与される項目２３に記載の方法。
・（項目２８）
上記騒音傷害が、少なくとも９０ｄＢ  ＳＰＬの騒音である項目２７に記載の方法。
・（項目２９）
上記被験体が、抗生物質に曝露される前に上記ペプチドが投与される項目２３に記載の方法。
・（項目３０）
上記被験体が、抗生物質に曝露される前に上記ペプチドが投与される項目２４に記載の方法。
・（項目３１）
上記被験体が、抗生物質に曝露された後に上記ペプチドが投与される項目２３に記載の方法。
・（項目３２）
上記抗生物質が、アミノグリコシドである項目３０に記載の方法。
・（項目３３）
上記被験体は、化学療法剤に曝露される前に上記ペプチドが投与される項目２３に記載の方法。
・（項目３４）
上記被験体は、化学療法剤に曝露される前に上記ペプチドが投与される項目２４に記載の方法。
・（項目３５）
上記被験体は、化学療法剤に曝露された後に上記ペプチドが投与される項目２３に記載の方法。
・（項目３６）
細胞透過性生物活性ペプチドに細胞を接触させて、膵臓細胞死を防ぐことを含んでなる膵臓小島細胞死を防ぐ方法。
・（項目３７）
上記ペプチドが、配列番号：１、２、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６および２３〜２６よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む項目３６に記載の方法。
・（項目３８）
上記細胞を、コラーゲナーゼと接触させることをさらに含んでなる項目３６に記載の方法。
・（項目３９）
細胞透過性生物活性ペプチドを被験体に投与して膵臓細胞死を防ぐことを含んでなる、被験体における膵臓小島細胞死を防ぐ方法。
・（項目４０）
上記ペプチドが、配列番号：１、２、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６および２３〜２６よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む項目３９に記載の方法。
・（項目４１）
コラゲナーゼを投与することをさらに含んでなる項目３９に記載の方法。
・（項目４２）
上記被験体が、炎症誘発性サイトカインに曝露される前に上記ペプチドが投与される項目３９に記載の方法。
・（項目４３）
上記被験体が、炎症誘発性サイトカインに曝露された後に上記ペプチドが投与される項目３９に記載の方法。
・（項目４４）
上記投与が、耳介内（ｉｎｔｒａｕｒｔｉｃｕｌａｒ）、腹腔内、鼻腔内、静脈内、経口およびパッチ送達よりなる群から選択されるいずれか１つの投与経路により送達される項目２３に記載の方法。
・（項目４５）
上記投与が、耳介内（ｉｎｔｒａｕｒｔｉｃｕｌａｒ）、腹腔内、鼻腔内、静脈内、経口およびパッチ送達よりなる群から選択されるいずれか１つの投与経路により送達される項目３９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、示された転写因子におけるＪＢＤの保存ドメイン領域の配列を示す図である。
【図２】図２は、包括的なＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドの配列を示す図である。
【図３】図３は、完全な２８０個のアミノ酸のＪＢＤドメインに比して、ＩＢ１の最少２３個のアミノ酸長ＪＢＤドメインによるβ細胞死の抑制を示すヒストグラムである。
【図４ａ】図４は、組み換えＪＮＫ類のリン酸化に及ぼすＴＡＴ、ＴＡＴ−ＩＢ１およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの効果を示す図である。パネルＡは、インビトロの組み換えＪＮＫ類によるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１リン酸化の阻害を示している。パネルＢは、パネルＡと同様な用量応答実験を示している。
【図４ｂ】図４は、組み換えＪＮＫ類のリン酸化に及ぼすＴＡＴ、ＴＡＴ−ＩＢ１およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの効果を示す図である。パネルＢは、パネルＡと同様な用量応答実験を示している。
【図５】図５は、組み換えＪＮＫ類によるリン酸化のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ阻害を示すヒストグラムである。パネルＡは、ＭＫＫ４の存在下、インビトロの組み換えＪＮＫ類によるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１リン酸化の阻害のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ阻害を示している。パネルＢは、ＭＫＫ７による同様な用量応答実験を示している。
【図６】図６は、活性化ＴＮＫ類によるｃ−Ｊｕｎリン酸化の阻害を示す図である。
【図７】図７は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類によるＩＬ−１β誘導膵臓β−細胞死の短期抑制を示すヒストグラムである。
【図８】図８は、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類によるＩＬ−１β誘導膵臓β−細胞死の短期抑制を示すヒストグラムである。
【図９】図９は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類によるＩＬ−１β誘導膵臓β−細胞死の長期抑制を示すヒストグラムである。
【図１０】図１０は、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類による照射誘導ヒト大腸癌ＷｉＤｒ細胞死の阻害を示すヒストグラムである。
【図１１】図１１は、Ｌ−ＴＡＴ、ＴＡＴ−ＩＢ１およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類によるＪＮＫキナーゼ活性の変調を示す図である。
【図１２】図１２は、マウスにおけるＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類の予防効果を示すグラフである。パネルＡは、体重に及ぼす照射の効果を示している。パネルＢは、浮腫状態および発疹状態に及ぼす照射の効果を示している。
【図１３】図１３は、騒音誘導聴力低下に及ぼすＤ−ＪＮＫ１の予防効果を示す図である。パネルＡは、実験の概略図、パネルＢは、聴力低下のグラフ、パネルＣとＤは反対側の耳（対照）およびＤ−ＪＮＫ１を注入した耳、各々の組織学的実験を示している。
【図１４ａ】図１４ａは、抗生物質誘導聴力低下に及ぼすＤ−ＪＮＫ１の予防効果を示す図である。
【図１４ｂ】図１４ｂは、抗生物質誘導聴力低下に及ぼすＤ−ＪＮＫ１の予防効果を示す図である。
【図１５】図１５は、単離操作時、Ｄ−ＪＮＫ１処理に供された膵臓小島の回復増加を示す棒グラフである。
【図１６】図１６Ａは、ＪＮＫの活性化および作用に対する本発明のＪＮＫ阻害（ＪＮＫＩ）ペプチド類の感受性および特異性を示す図である。図１６Ａは、キナーゼアッセイにおけるＪＮＫの活性化および作用に及ぼす組み換えＪＮＫＩα１ならびにＧＳＴ−ＪｕｎおよびＧＳＴ−Ｅｌｋ１基質、各々によるＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の阻害効果を示す。図１６Ｂは、ＪＮＫの活性化および作用に対する本発明のＪＮＫ阻害（ＪＮＫＩ）ペプチド類の感受性および特異性を示す図である。図１６Ｂは、図１６Ａと同様な条件を用い、Ｌ−ＪＢＤ２０を増量させた用量応答実験におけるＪＩＰ−ＩＢ１（ＪＢＤ２０のＬ体）の２０個のアミノ酸最少ＪＮＫ阻害配列の阻害効果を示す。図１６Ｃは、ＪＮＫの活性化および作用に対する本発明のＪＮＫ阻害（ＪＮＫＩ）ペプチド類の感受性および特異性を示す図である。図１６Ｃは、種々の組み換えキナーゼ類によるキナーゼアッセイを用いてＪＮＫ活性化防止における本発明のＪＮＫＩペプチド類の特異性を示す。
【図１７】図１７Ａは、未処理ニューロン（０）における、また、１００μＭのＮＭＤＡに１０分間（１０’）または３０分間（３０’）曝露したニューロンにおけるＪＮＫのＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸エステル（「ＮＭＤＡ」）誘導活性化を示す図である。図１７Ｂは、ＮＭＤＡに対する曝露後、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のレベルおよびＪＮＫ量に及ぼす本発明のＪＮＫペプチド類の効果を示す図である。図１７Ｂにおいて、核抽出物（Ｎｕｃ１）中には、細胞質抽出物（Ｃｙｔ）中の４倍の蛋白質が入っていた。なお、使用された略号は、Ｃ：対照；Ｎ：ＮＭＤＡ；Ｌ：Ｌ−ＪＮＩ１＋ＮＭＤＡ；Ｄ：Ｄ−ＪＮＩ１＋ＮＭＤＡである。図１７Ｃは、抽出ＲＮＡを用いたリアルタイムＰＣＲによるｃ−ｆｏｓ発現の定量化を示すヒストグラムである。図１７Ｃは、アクチンに相対的なｃ−ｆｏｓ発現を示している。
【図１８】図１８は、Ｌ−ＪＮＫＩ１、Ｄ−ＪＮＫＩ１および２つの対照ペプチドの、ＴＡＴ−空き（ＪＢＤ２０なしのＴＡＴ配列のみ）およびＬ−ＪＮＫＩ−変異体（６個のアミノ酸がアラニンに変異した）によるＮＭＤＡ神経毒性および神経保護の経路を示す図とヒストグラムである。図１８Ａ〜１８Ｅは、ＮＭＤＡ処理後２４時間目のヘキスト染色ニューロンを示す一連の顕微鏡写真である。図１８Ｆは、ＬＤＨ活性として示されたＮＭＤＡ曝露（１００μＭ  ＮＭＤＡ）後１２時間目、２４時間目、４８時間目におけるニューロン死を示すヒストグラムである。
【図１９】図１９は、マウスにおける一時的虚血を示す図とヒストグラムである。図１９Ａは、閉鎖１時間前、被験体にＤ−ＪＮＫＩ１（２μＬリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中、１５．７ｎｇ）の大脳内−脳室（ｉｃｖ）注入を行った前処理の梗塞容積に及ぼす効果を示している。図１９Ｂは、閉鎖１時間前、または閉鎖３時間後、６時間後および１２時間後、被験者にＤ−ＪＮＫＩ１のｉｃｖ注入を行った場合の梗塞容積に及ぼす効果を示している。
【図２０】図２０は、閉鎖後２４時間、灌流を行った幼若ラット（Ｐ１４）における永続的病巣虚血に対するＤ−ＪＮＫＩ１による予防を示す図とヒストグラムである。図２０Ａは、対照ラット（左パネル）および閉鎖６時間後、Ｄ−ＪＮＫＩ１によって処理されたラット（右パネル）の病巣例を示す一連の図である。図２０Ｂは、閉鎖０．５時間前または閉鎖６時間後、または１２時間後にＤ−ＪＮＫＩ１の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入を行った後、半球容積の％として表された梗塞容積を示すヒストグラムである。図２０Ｃは、梗塞周囲皮質の多数のニューロンにおいてｃ−Ｊｕｎがリン酸化された、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎに対する免疫組織化学の結果を示す一連の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、活性化ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路を阻害する細胞透過性ペプチド類の発見に一部基づいている。これらのペプチド類は、本明細書においてＪＮＫ阻害剤ペプチドと称される。さらに本発明は、ＪＮＫシグナル伝達に関連する病態生理学を処置するための方法および製薬組成物を提供する。
・ＪＮＫ阻害剤ペプチド類は、種々のインスリン結合（ＩＢ）蛋白質におけるＫＪＮＫ結合ドメイン間の配列を調べることによって確認された。この配列の結果は、図１Ａ〜１Ｃに示されている。図１Ａは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−ＪｕｎおよびＡＴＦ２の間の最も高い相同性領域を示している。パネルＢは、ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤ類のアミノ酸配列を示している。ＧＦＰ−ＪＢＤ２３Ｍｕｔベクターにおいて、完全に保持された残基は、星印で示され、一方、アラニンに変化した残基は白丸で示されている。図１Ｃは、ＪＮＫ阻害剤ペプチドドメインおよび輸送ドメインを含むキメラ蛋白質のアミノ酸配列を示している。示された例において輸送ドメインは、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、ＩＢ１ポリペプチドに由来する、パネルＢおよびパネルＣにおいて、ヒト、マウス、およびラットの配列は同一である。
【００２３】
ＩＢ１［配列番号：１７］、ＩＢ２［配列番号：１８］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号：１９］およびＡＴＦ２［配列番号：２０］のＪＮＫ結合ドメイン間の配列比較により、部分的に保持されたアミノ酸８個の配列が明らかにされた（図１Ａ）。ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤ類の比較により、２つの配列間で保持性の高いアミノ酸７個およびアミノ酸３個の２つのブロックがさらに明らかにされた。これらの２つのブロックは、ＩＢ１［配列番号：１］におけるアミノ酸２３個およびＩＢ２［配列番号：２］におけるアミノ酸２１個のペプチド配列の中に含まれている。ＪＩＰ−ＩＢ１（ＪＢＤ２０（配列番号：２１）のＬ体）のアミノ酸２０個の最少ＪＮＫ阻害配列が図１Ｃに示されている。
【００２４】
本発明のＪＮＫ阻害剤ペプチド類は、ＪＮＫ活性阻害が望まれるいずれの状況においても用いることができる。これは、インビトロ適用、エクスビボおよびインビボ適用を含み得る。ＪＮＫ類およびその全てのイソ体は病理学的状態の発現および確立、または経路に関係しているため、このような病理学的状態発生を予防または阻害するためにＪＮＫペプチド類を用いることができる。これは、疾病の予防および治療ならびに治療行為に二次的な病態の予防および治療を含む。例えば、本発明のペプチド類は、例えば糖尿病、イオン化照射、免疫応答（自己免疫疾患を含めて）、虚血／再灌流損傷、心臓および心血管肥厚および幾つかの癌（例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ形質転換）の治療または予防に用いることができる。
【００２５】
前記ペプチド類はまた、活性ＪＮＫポリペプチドの存在下でその発現が増加する遺伝子発現を阻害するために用いることができる。これらの遺伝子および遺伝子産物としては、例えば、炎症誘発性サイトカイン類が挙げられる。このようなサイトカイン類は、炎症性、自己炎症性、免疫および自己免疫疾患、変性疾患、ミオパシー、心ミオパシーおよび移植片拒絶の全ての形態に見られる。
【００２６】
本明細書に記載されたＪＮＫ阻害剤ペプチド類はまた、心臓肥大および動脈硬化傷害などの動脈高血圧により誘発された、また、血管二分枝などにおける病理学的状態；放射線療法およびＵＶ光線で用いられるイオン化照射；フリーラジカル；化学療法剤などのＤＮＡ損傷薬剤；発癌性形質転換；ニューロンおよび膵臓の細胞損傷、聴力低下、虚血および再灌流；低酸素；および低体温および高体温などにおける細胞剪断ストレスに関連した効果の治療または予防にも用いることができる。
【００２７】
本発明により提供されるポリヌクレオチド類は、対応するペプチドが優先的に発現する（構成的に、または組織分化または発生の特別な段階で、もしくは疾病状態において）組織のマーカーとして、分析、特性化または治療的使用のための組み換えペプチドを発現させるために用いることができる。核酸に関する他の利用法としては、例えば、核酸のゲル電気泳動法に基づいた分析における分子量マーカーが挙げられる。
【００２８】
本明細書に開示されているＪＮＫ阻害剤ペプチド類は、表１に示されている。この表は、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの名称、ならびにその配列同定番号、長さおよびアミノ酸配列を示している。
【００２９】
【表１】
2010053136.tif 000002
（ＪＮＫ阻害剤ペプチド）
一態様において、本発明はＪＮＫ阻害剤ペプチドを提供する。用語の「ペプチド」は特定の長さを意味しない。幾つかの実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、長さがアミノ酸２８０個未満、例えば長さがアミノ酸１５０個以下、１００個以下、７５個以下、５０個以下、３５個以下、または２５個以下である。種々の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、配列番号：１〜６および２１〜２２の１つ以上のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドペプチド類はＪＮＫに結合する。他の実施形態において、前記ペプチドは、少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２またはＥｌｋ１の活性化を阻害する。
【００３０】
ＪＮＫ阻害剤ペプチドの例として、配列ＮＨ２−ＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ−ＣＯＯＨ［配列番号：１］を含む（全体をまたは部分的に）ペプチドが挙げられる。他の実施形態において、前記ペプチドは、配列ＮＨ２−ＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ−ＣＯＯＨ［配列番号：２］を含む。あるいは、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの例として、配列、配列ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ  ＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ−ＣＯＯＨ［配列番号：２１］を含む（全体をまたは部分的に）ペプチドが挙げられる。
【００３１】
ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または双方の組合わせのポリマーであり得る。例えば、種々の実施形態において、前記ペプチド類は、Ｄ−レトロ・インベルソペプチド類である。用語の「レトロ・インベルソ異性体」とは、配列方向が逆の線状ペプチドの異性体を言い、用語の「Ｄ−レトロ・インベルソ異性体」とは、配列方向が逆であり、各アミノ酸残基のキラリティーが逆の線状ペプチド異性体を言う。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、ｐ．７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、ｐ．６９２−６９３（１９９４）を参照されたい。Ｄ−鏡像異性体と逆転合成を組合わせた最終結果として、各アミド結合におけるカルボニル基とアミノ基の位置が変換されるが、各アルファ炭素における側鎖基の位置は保持される。他に特に言及しない限り、本発明のいずれの所与のＬ−アミノ酸配列も、対応する天然Ｌ−アミノ酸配列に関する配列の逆転体を合成することによりＤ−レトロ・インベルソペプチドにすることができる。
【００３２】
例えば、Ｄ−レトロ・インベルソペプチドは、配列ＮＨ２−ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ−ＣＯＯＨ［配列番号：３］または配列ＮＨ２−ＳＤＱＡＧＬＴＴＬＲＬＴＴＰＲＨＫＨＰＥＥ−ＣＯＯＨ［配列番号：４］を有する。あるいは、Ｄ−レトロ・インベルソペプチドは、配列ＮＨ２−ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦ  ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ［配列番号：２２］を含む。予想外なことに、Ｄ−レトロ・インベルソペプチドは、種々の有用なペプチドを有することが判明した。例えば、Ｄ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ、およびＤ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩペプチド類は、Ｌ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ、およびＤ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩペプチド類と同様に、効率よく細胞に入り、またＤ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ、およびＤ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩペプチド類は、対応するＬ−ペプチド類よりも安定である。さらに、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、ＪＮＫの阻害において、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢおよびＬ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩよりも約１０〜２０倍効率が低いが、それらはインビボで約５０倍安定である。さらに、Ｄ−レトロ・インベルソペプチド類は、プロテアーゼ耐性である。最後に、下記でさらに検討されているように、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢおよびＤ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩペプチド類は、インターロイキン−１で処理された細胞およびイオン化照射された細胞をアポトーシスから保護し、ＴＡＴ配列を神経系におけるペプチド処理に関与するニューロンプロテアーゼに極めて鋭敏にする６対のアミノ酸をＴＡＴ配列が含有するため、これらのペプチド類は、ニューロンの治療に有用である。例えば、各々が参照としてその全体が本明細書に組み込まれているＳｔｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．２３４３５−２３４３８（１９９２）；Ｂｒｕｇｉｄｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１４：ｐ．６８５−６９３（１９９５）を参照されたい。
【００３３】
本発明によるＪＮＫ阻害剤ペプチドは、配列ＮＨ２−Ｘｎ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／Ｔ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ［配列番号：５，および図２に示されるようにＬ−ＴＡＴ−ＩＢ、配列番号：１３の残基１７〜４２］を含む。本明細書に用いられるＸｎは、長さがゼロ残基であり得るか、または配列番号：１および２１由来の切れ目のない連なりであり得、好ましくは長さがアミノ酸１個と７個の間の連なりであり、または長さがアミノ酸１０個、２０個、３０個またはそれ以上であり得る。Ｓ／Ｔで表示された単一残基は、総配列におけるＳｅｒまたはＴｈｒであり得る。さらなる実施形態において、本発明のＪＮＫ阻害剤ペプチドは、配列ＮＨ２−Ｘｎ−Ｓ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ［配列番号：６］，および図２に示されるようにＬ−ＴＡＴ−ＩＢ、配列番号：１６の残基１７〜４２］を有するＤ−レトロ・インベルソペプチドあり得る。
【００３４】
ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、当該分野でよく知られた方法、例えば、下記で検討される化学合成、遺伝子工学的な方法によって得られるか、または製造される。例えば、所望の領域またはドメインを含むか、またはインビトロで所望の活性を媒介するＪＮＫ阻害剤ペプチドの一部に相当するペプチドを、ペプチド合成機によって合成できる。
【００３５】
ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定し、したがって、結合実験、抗体合成などの実験的操作のための基質のデザインを補助するために利用し得る親水性分析（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ米国７８：ｐ．３８２４−３８２８を参照）によって候補となるＪＮＫ阻害剤ペプチドが分析される。また、特定の構造的モチーフを推定する二次的構造分析が、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの領域を同定するために実施できる。例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：ｐ．２２２〜２２３参照されたい。当該分野で利用できるコンピュータソフトウェアプログラムを用いて操作、翻訳、二次構造の予測、親水性プロフィルおよび疎水性プロフィル、オープンリーディングフレームの予測およびプロッティングおよび配列相同性の決定が達成できる。例えば、Ｘ線結晶学（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：ｐ．７−１３を参照）；質量分析およびガスクロマトグラフィ（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９７年、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨークを参照）およびコンピュータモデリング（例えば、ＦｌｅｔｔｅｒｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ編集、１９８６年、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｉｎ：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照）などの他の構造分析法もまた使用し得る。
【００３６】
さらに本発明は、Ｌ体アミノ酸、例えば表１に示されたＬ−ペプチド類ならびにこれらの配列の相補体を有するＪＮＫ阻害剤ペプチドをコードする核酸に関する。ＪＮＫ阻害剤ペプチドをコードする好適な核酸源としては、それぞれジーンバンク受入れ番号ＡＦ０７４０９１およびＡＡＤ２０４４３として入手できるヒトＩＢ１核酸（およびそのコード化蛋白質配列）が挙げられる。他の供給源としては、ラットＩＢ１核酸が挙げられ、蛋白質配列は、それぞれジーンバンク受入れ番号ＡＦ１０８９５９およびＡＡＤ２２５４３に示されており、本明細書にその全体が参照として組み込まれている。ヒトＩＢ２核酸および蛋白質配列は、ジーンバンク受入れ番号ＡＦ２１８７７８に示されており、また、本明細書にその全体が参照として組み込まれている。
【００３７】
ＪＮＫ阻害剤ペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知のいずれの方法（例えば、前記配列の３’末端および５’未満にハイブリダイゼーションできる合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅および／または所与の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を用いたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからのクローニングによって）によっても得ることができる。
【００３８】
１つ以上のＪＮＫ阻害剤ペプチドの組み換え発現のためには、前記ペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部を含有する核酸を適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたペプチドをコードする配列の転写および翻訳のために必要な要素を含有するベクター）内へ挿入できる。幾つかの実施形態において、調節要素は、非相同である（すなわち、生来の遺伝子プロモーターではない）。あるいは、また、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルが、遺伝子および／またはそれらのフランキング領域に関する生来のプロモーターによって供給され得る。
【００３９】
ペプチドをコードする配列（単数または複数）を発現させるために、種々の宿主−ベクター系が利用できる。これらには、限定はしないが：（ｉ）ワクシニアウィルス、アデノウィルスなどに感染している哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウィルスなどに感染している昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含有する酵母、または（ｉｖ）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡによって形質転換した細菌が挙げられる。利用される宿主−ベクター系に依って、多数の転写要素および翻訳要素のうちのいずれか１つが使用できる。
【００４０】
発現ベクター内のプロモーター／エンハンサー配列には、本発明で提供される植物、動物、昆虫または真菌の調節配列が利用できる。例えばプロモーター／エンハンサー要素は、酵母および他の真菌（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）から使用できる。代替としてまたは、それに加えて、それらには、動物転写制御領域、例えば、（ｉ）膵臓のβ−細胞内で活性なインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ３１５：ｐ．１１５−１２２を参照）；（ｉｉ）リンパ球内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４年、Ｃｅｌｌ３８：ｐ．６４７−６５８を参照）；（ｉｉｉ）肝臓内で活性なアルブミン（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒｔら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １：ｐ．２６８−２７６を参照）；（ｉｖ）脳の乏突起膠細胞内で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域；および（ｖ）視床下部内で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Ｍａｓｏｎら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：ｐ．１３７２−１３７８を参照）などが挙げられる。
【００４１】
発現ベクターまたはそれらの誘導体としては、例えばヒトウィルスまたは動物ウィルス（例えば、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルス）；昆虫ウィルス（例えば、バキュロウィルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）；プラスミドベクターおよびコスミドベクターが挙げられる。
【００４２】
所望の特定の様式で目的の被験体の挿入配列の発現を変調させるか、または前記配列によってコードされる発現ペプチドを修飾、または処理する宿主細胞が選択できる。また、選択された宿主系において、ある一定の誘発物質の存在下で、ある一定のプロモーターの発現を増強でき、したがって、遺伝子工学ペプチドの発現制御を助けることができる。さらに、種々の宿主細胞が発現ペプチドの翻訳処理および翻訳後処理ならびに修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）に関する特徴および特定の機構を有している。したがって、外来ペプチドの所望の修飾および処理の達成を確実にするために、適切な細胞系または宿主系が選択できる。例えば、非グリコシル化コアペプチドを製造するために、細菌系内におけるペプチド発現が使用でき、一方、哺乳動物細胞内における発現によって、非相同ペプチドの「生来の」グリコシル化が確実になる。
【００４３】
また、本発明には、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの誘導体、断片、相同体、アナログおよび変異体ならびにこれらのペプチドをコードする核酸が含まれる。本明細書に提供される核酸、誘導体、断片およびアナログは、少なくとも６つの（連続的な）核酸の配列であり、また、特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さを有する配列として規定される。本明細書に提供される核酸、誘導体、断片およびアナログは、少なくとも４つの（連続的な）アミノ酸であり、エピトープの特異的な認識を可能にするのに十分な長さの配列として規定される。
【００４４】
前記断片の長さは、ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたは同一物をコードする核酸が誘導される、対応する完全長核酸またはポリペプチドの長さ未満である。前記誘導体またはアナログが修飾された核酸またはアミノ酸を含有する場合、その誘導体またはアナログは、完全長であっても、完全長以外であってもよい。ＪＮＫ阻害剤ペプチドの誘導体またはアナログとしては、例えば、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列上で、または当該分野に公知のコンピュータ相同性プログラムにより整列がなされた整列配列と比較した場合、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％またはさらに９９％の同一性で前記ペプチドと実質的に相同である領域を含む分子が挙げられる。例えば、その中に省略時パラメータを使用した配列分析ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、５３７０５ウィスコンシン州マジソン、大学大通り１７１０）を用いて配列同一性を測定できる。
【００４５】
参照配列に対して同一性が１００％未満であるポリペプチド配列の場合、非同一性の位置は、参照配列の保存的置換であることが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。保存的置換としては、典型的に、以下の基：グリシンとアラニン；バリン、イソロイシンとロイシン；アスパラギン酸とグルタミン酸；アスパラギンとグルタミン；セリンとトレオニン；リジンとアルギニン；およびフェニルアラニンとチロシン内の置換が挙げられる。したがって、本発明には、対応する親配列と、例えば配列において、機能において、および抗原性または他の機能において、相同性を残存させているような変異配列を有するペプチドが含まれる。このような変異は、例えば、保存的アミノ酸変化、例えば概して同様な分子の性質を有するアミノ酸との間の変化を伴う変異であり得る。例えば、脂肪族基、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン内の交換は、保存的の考えることができる。時には、これらのうちの１つとグリシンとの置換は、保存的と考えることができる。他の保存的交換としては、脂肪族基のアスパラギン酸塩とグルタミン酸塩内；アミド基のアスパラギンとグルタミン内；ヒドロキシル基のセリンとトレオニン内；芳香族基のフェニルアラニン、チロシンとトリプトファン内；塩基性基のリジン、アルギニンとヒスチジン内；および硫黄含有基のメチオニンとシステイン内での交換が挙げられる。時には、メチオニン基とロイシン基内の置換も保存的と考えることができる。好ましい保存的置換基は、アスパラギン酸塩−グルタミン酸塩；アスパラギン−グルタミン、バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；およびリジン−アルギニンである。
【００４６】
特定のポリペプチドが規定された長さの参照ポリペプチドに対して特定の同一性パーセントを有していると言われる場合、その同一性パーセントは、参照ペプチドに関連する。したがって、アミノ酸１００個の長さの参照ポリペプチドに５０％同一であるペプチドは、参照ポリペプチドのアミノ酸５０個の長さの部分に完全に同一であるアミノ酸５０個のポリペプチドであり得る。また、それは参照ポリペプチドの全体の長さの５０％同一である、アミノ酸１００個の長さのポリペプチドでもあり得る。もちろん、他のポリペプチドが同じ基準に合致するであろう。
【００４７】
本発明はまた、開示されたポリヌクレオチドまたはペプチドの対立変異体、すなわち、前記ポリヌクレオチドによってコードされるものに同一の、相同の、または関連するペプチドをもコードする単離ポリヌクレオチドの天然の代替形態も包含する。あるいは、突然変異誘発法により、または直接的合成により非天然の変異体を製造し得る。
【００４８】
開示されたポリヌクレオチドおよびペプチドの種相同体もまた、本発明によって提供される。「変異体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、それの本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを言う。一般に変異体は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、全体的に非常に類似しており、また、多くの領域で同一である。変異体は、コード領域、非コード領域または双方における変更を含み得る。
【００４９】
幾つかの実施形態において、変更配列は、全体のアミノ酸配列が長くなる一方で、蛋白質が輸送性を保持するような挿入を含む。さらに、変更配列は、全体のアミノ酸配列を短くする一方、蛋白質が輸送性を保持するランダムな、またはデザインされた内部欠失を含み得る。
【００５０】
前記変更配列はさらに、または代替としてＪＮＫ阻害剤ペプチドが誘導されるポリペプチドまたはペプチドをコードする天然のポリヌクレオチドの適切な鎖により、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うポリヌクレオチドによってコードされ得る。前記変異ペプチドは、本明細書に記載したアッセイを用いて、ＪＮＫ結合およびＪＮＫ媒介活性の変調に関して試験することができる。「ストリンジェントな条件」は、配列依存性であり、異なった状況においては異なってくる。一般に「ストリンジェントな条件」は、特定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列に関する熱融解点（ＴＭ）よりも約５℃低く選択できる。ＴＭは、標的配列の５０％が完全マッチプローブにハイブリダイゼーションを行う温度（特定のイオン強度およびｐＨにおいて）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７における塩濃度が少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃である条件となる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーには他の要因（他にもあるが、中でも塩基組成および相補鎖のサイズなど）が影響し得るため、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチの程度、パラメータの組合わせが、いずれか１つの絶対的基準よりも重要である。
【００５１】
高ストリンジェンシーとしては、例えば、以下を挙げることができる：ステップ１：６ＸＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中、ＤＮＡ含有フィルタを６５℃で８時間から一晩、前処理する。ステップ２：上記の前ハイブリダイゼーション混合液中、６５℃で４８時間、フィルタのハイブリダイゼーションを行い、それに、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加する。ステップ３：２Ｘ  ＳＳＣ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間フィルタを洗浄する。この後、０．１Ｘ  ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。ステップ４：フィルタのオートラジオグラフィを行う。使用し得る他の高ストリンジェントな条件は、当該分野によく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、１９９３年、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００５２】
中程度にストリンジェントな条件としては、以下を挙げることができる：：ステップ１：６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、ＤＮＡ含有フィルタを５５℃で６時間前処理する。ステップ２：５〜２０Ｘ  １０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した。同一溶液中、５５℃で１８〜２０時間、フィルタのハイブリダイゼーションを行う。ステップ３：２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間フィルタを洗浄し、次に１Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、６０℃で３０分間、２回洗浄する。ステップ４：フィルタをブロット乾燥し、オートラジオグラフィに曝露する。使用し得る他の中程度のストリンジェントな条件は、当該分野によく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、１９９３年、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００５３】
低ストリンジェンシーとしては以下を挙げることができる：ステップ１：３５％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＰＶＰ、０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ、１％  ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、ＤＮＡ含有フィルタを４０℃で６時間前処理する。ステップ２：０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）硫酸デキストランおよび５〜２０Ｘ  １０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同一溶液中、４０℃で１８〜２０時間、フィルタのハイブリダイゼーションを行う。ステップ３：２Ｘ  ＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、５５℃で１．５時間フィルタを洗浄する。洗浄液を新鮮な溶液と取替え、６０℃でさらに１．５時間温置する。ステップ４：フィルタをブロット乾燥し、オートラジオグラフィに曝露する。必要ならば、フィルタを３回目に６５〜６８℃で洗浄し、フィルムに再曝露する。使用し得る他の低ストリンジェントな条件は、当該分野によく知られている（例えば、種交差ハイブリダイゼーションに使用されるような）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、１９９３年、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００５４】
（ＪＮＫ阻害剤ドメインおよび輸送ドメインを含むキメラペプチド）
他の態様において、本発明は、第１および第２のドメインを含むキメラペプチドを提供する。第１のドメインは、輸送配列を含み、一方、第２のドメインは、共有結合、例えば、ペプチド結合により第１のドメインに結合しているＪＮＫ阻害剤配列を含む。第１および第２のドメインは、ペプチド内いずれの順序においても生じ得、前記ペプチドは、各ドメインの１個以上を含み得る。
【００５５】
輸送配列は、それが存在するペプチドを所望の細胞目的へ方向づけるアミノ酸の何らかの配列である。したがって、輸送配列は、前記ペプチドを、原形質膜を越えて、例えば、細胞の外から、原形質膜を通って細胞質内へ方向づけることができる。あるいはまたは、それに加えて、輸送配列は、前記ペプチドを細胞内の所望の場所、例えば、核、リボソーム、ＥＲ、リソソーム、ペルオキシソームへ方向づけることができる。
【００５６】
幾つかの実施形態において、輸送ペプチドは、公知の膜転座配列から誘導される。例えば、輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴ蛋白質の配列を含み得る。この蛋白質は、例えば、米国特許第５，８０４，６０４号および米国特許第５，６７４，９８０号に記載されており、各々参照として本明細書に組み込まれている。ＪＮＫ阻害剤ペプチドは、ＴＡＴ蛋白質を構成する全８６個のアミノ酸の幾つか、または全てと結合している。例えば、細胞内への取り込み、場合によっては細胞の核内への取り込みを表す８６個以下のアミノ酸を有するＴＡＴ蛋白質の機能的に有効な断片または部分を用いることができる。例えば、参照として本明細書にその全体が組み込まれているＶｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｍ．、２７２（２５）：ｐ．１６０１０−１７（１９９７）を参照されたい。一実施形態において、前記断片は、ＴＡＴ残基４８〜５７、例えば、ＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ［配列番号：７］または包括的ＴＡＴ配列ＮＨ２−Ｘｎ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ［配列番号：９］を含有するペプチドを含む。細胞内への進入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドを公知の方法を用いてさらに規定できる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８６：ｐ．７３９７−７４０１（１９８９）を参照されたい。
【００５７】
ＴＡＴ配列は、ＪＮＫ阻害剤配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合し得る。ＴＡＴとＪＮＫ阻害剤ペプチドとの間に２つのプロリン残基のかなめが加わって完全融合ペプチドが創製される。例えば、Ｌ−アミノ酸融合ペプチドは、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド［配列番号：１１］、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド［配列番号：１２］または包括的Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド［配列番号：１３］であり得る。あるいは、Ｌ−アミノ酸融合ペプチドは、Ｌ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩ１ペプチド［配列番号：２１］または包括的Ｌ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩペプチド［配列番号：２５］であり得る。Ｄレトロ逆ー融合ペプチドは、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド［配列番号：１４］、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド［配列番号：１５］または包括的Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド［配列番号：１６］であり得る。あるいは、Ｄレトロ・インベルソ融合ペプチドは、Ｄ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩ１ペプチド［配列番号：２２］または包括的Ｌ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩペプチド［配列番号：２６］であり得る。ＴＡＴペプチドは、配列、ＮＨ２−Ｘｎ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ［配列番号：１０］を有するＤレトロ−」逆融合ペプチドであり得る。配列番号：５〜６、９〜１０、１３、１６および２５〜２６において、「Ｘ」残基の数は、示されたものに限定されず、アミノ酸残基のゼロを含む任意の数に等しいことがあり得、上記のように変化し得る。
【００５８】
輸送配列は、ＴＡＴ配列に存在する単独（すなわち連続的）アミノ酸配列であり得る。あるいは、輸送配列は、ＴＡＴ蛋白質内に存在するが、天然の蛋白質においては、他のアミノ酸配列によって分離されている２つ以上のアミノ酸配列であり得る。本明細書に用いられるＴＡＴ蛋白質は、天然のＴＡＴ蛋白質またはその機能的に等価な蛋白質またはその機能的に等価な断片（ペプチド類）のアミノ酸配列と同じ天然のアミノ酸配列を含む。このような機能的に等価な蛋白質または機能的に等価な断片は、天然のＴＡＴ蛋白質の細胞内および細胞の核内への取り込み活性と実質的に同様な活性を有する。ＴＡＴ蛋白質は、天然供給源から得ることができるか、または遺伝子工学法または化学合成を用いて製造できる。
【００５９】
天然のＨＩＶＴＡＴ蛋白質のアミノ酸配列は、例えば、天然のＴＡＴ蛋白質に存在する少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失および／または置換によって修飾でき、修飾ＴＡＴ蛋白質（本明細書ではＴＡＴ蛋白質とも称される）を作製できる。安定性を増加または減少させた修飾ＴＡＴ蛋白質またはＴＡＴペプチドアナログを、公知の方法を用いて製造できる。幾つかの実施形態において、ＴＡＴ蛋白質またはＴＡＴペプチドは、その天然のＴＡＴ蛋白質またはＴＡＴペプチドのアミノ酸配列と同一ではないが、相当に類似したアミノ酸配列を含む。また、コレステロールまたは他の脂質誘導体をＴＡＴ蛋白質に付加することができ、膜溶解性の増加した修飾ＴＡＴを製造することができる。
【００６０】
ＴＡＴ−ＪＮＫ阻害剤ペプチドの分子内局在化を調整するためにＴＡＴ蛋白質の変異体をデザインすることができる。外因的に加えられる場合、このような変異体は、細胞に進入するＴＡＴの能力が保持される（すなわち変異ＴＡＴ蛋白質またはＴＡＴペプチドの細胞内への取り込みが天然のＨＩＶ  ＴＡＴのそれと相当に類似している）ようにデザインされる。例えば、核の局在化に重要であると考えられる塩基性領域の変更（例えば、ＤａｎｇおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：ｐ．１８０１９−１８０２３（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：ｐ．１１８１−１１８７（１９８９）；Ｒｕｂｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：ｐ．１−８（１９８９）を参照）は、ＴＡＴの、したがってＪＮＫ阻害剤ペプチドの細胞質の位置づけまたは部分的な細胞質の位置づけをもたらし得る。あるいは、ＴＡＴおよびＪＮＫ阻害剤ペプチドの細胞質またはいずれかの他の区画に保持してＴＡＴおよびＪＮＫ阻害剤ペプチドの取り込みを調節するために、細胞質の、または他のいずれかの成分または区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、グルーム器官、リソソーム小胞）結合に関する配列をＴＡＴに導入することができる。
【００６１】
輸送ペプチドの他の供給源としては、例えばＶＰ２２（例えば、国際公開第９７／０５２６５号；ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：ｐ．２２３−２３３（１９９７）に記載されている）または、非ウィルス蛋白質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８９：ｐ．１０６９１−１０６９５（１９９２））が挙げられる。
【００６２】
ＪＮＫ阻害剤配列および輸送配列は、当該分野で公知の好適な様式で化学的カップリングによって結合させることができる。公知の多くの化学架橋法は、非特異的である。すなわち、それらは、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子上の特定の部位にカップリング箇所を指定しない。その結果、非特異的架橋剤の使用によって、機能的部位が攻撃されるか、または活性部位がブロックされ得、共役蛋白質は、生物学的に不活性にされる。
【００６３】
カップリング特異性を増大させる１つの方法は、１つ、または双方のポリペプチドにほんの１回または少数回見られる官能基に対する直接化学的カップリングを架橋させることである。例えば、多くの蛋白質において、チオール基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは、ほんの少数回見出される。また、例えば、あるポリペプチドがリジン残基を含有しない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、そのポリペプチドのアミノ末端に選択的となる。カップリング特異性を増加させるためのこの方法の利用に好結果をもたらすためには、分子の生物学的活性の損失なしで変化し得る分子の領域にポリペプチドが好適に希少で、反応性の残基を有することが必要である。
【００６４】
システイン残基は、架橋反応におけるそれらの寄与が、それ以外では生物学的活性を妨げる可能性のあるポリペプチド配列の部分に見出される場合、置換できる。システイン残基が置換される場合、典型的には、ポリペプチドの折りたたみにおいて生じ得る変化を最小化することが望ましい。ポリペプチドの折りたたみにおける変化は、前記置換が化学的に、および立体的にシステインに類似している場合に最小化される。これらの理由で、システインの置換体としてはセリンが好ましい。下記の例に示されるように、システイン残基は、架橋目的でポリペプチドのアミノ酸配列内へ導入できる。システイン残基を導入する場合、アミノ末端またはカルボキシ末端における、またはその近くでの導入が好ましい。目的の被験体のポリペプチドが化学合成によって製造されようと、組み換えＤＮＡの発現によって製造されようと、このようなアミノ酸配列の修飾のために、従来の方法が利用できる。
【００６５】
２つの構成要素のカップリングは、カップリング剤または共役化剤によって達成できる。利用できる幾つかの分子間架橋試薬がある。例えば、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４年、ｐ．３９−４３を参照されたい。これらの試薬の中には、例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｊ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（双方とも、スルフヒドリル基に対して特異性が高く非可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６個から１１個の炭素メチレン架橋を有する他のこのような試薬（スルフヒドリル基に対して比較的特異性がある）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ基およびチロシン基と非可逆的結合を形成する）がある。この目的に有用な他の架橋試薬としては：Ｐ，Ｐ’−ジフルオロ−ｍ、ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基およびフェノール性基と非可逆的結合を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネートまたはアゾフェノール−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（幾つかの異なった側鎖と反応する）およびジスジアゾベンジジン（主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００６６】
架橋試薬は、ホモ二官能性であり得る。すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有し得る。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、２つのマレイミド官能基を含有し、緩和な条件下（ｐＨ６．５〜７．７）で、スルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって結合している。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの非可逆的架橋に有用である。
【００６７】
また架橋試薬は、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なった官能基、例えば、アミン反応性基とチオール反応性基を有し、遊離アミンおよびチオールの各々を有する２つの蛋白質に架橋する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）およびＭＢＳの延長鎖類縁体である４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミド（「ＳＭＰＢ」）である。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール反応性のマレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００６８】
架橋試薬は、水に低溶解性であることが多い。その水溶性を高めるために、架橋試薬に、スルホネート基などの親水性部分を付加できる。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性のために修飾された架橋試薬の例である。
【００６９】
多くの架橋試薬は、細胞条件下では本質的に非開裂性の共役体を生成させる。しかしながら、幾つかの架橋試薬は、細胞条件下で開裂性であるジスルフィドなどの共有結合を含有する。例えば、トラウト試薬、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（「ＤＳＰ」）および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（「ＳＰＤＰ」）は、周知の開裂性架橋剤である。開裂性架橋試薬の使用により、標的細胞内への送達後、カーゴ部分が輸送ポリペプチドから分離することが可能となる。直接的ジスルフィド結合もまた有用である。
【００７０】
上記に検討したものも含めて多数の架橋試薬が商品として入手できる。それらの使用に関する詳しい説明書は商品の供給元から容易に入手できる。蛋白質架橋および共役体調製についての一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【００７１】
化学的架橋は、スペーサーアームの使用を含む。スペーサーアームは、分子内屈曲性を提供するか、または共役部分間の分子間距離を調節し、それによって、生物学的活性を保存する助けとなり得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．社、イリノイ州ロックフォード、カタログ番号２１６５１Ｈ）におけるような架橋試薬の部分であり得る。
【００７２】
あるいは、公知の好適な宿主細胞に便宜よく発現できる輸送配列と、ＪＮＫ阻害剤配列を含む融合ペプチドとしてキメラペプチドを製造できる。本明細書に記載される融合ペプチドは、上記の標準的な組み換えＤＮＡ法に類似した方法で、またはそれらから容易に改造できる方法で形成でき、また利用できる。
【００７３】
（ＪＮＫ阻害剤ペプチドに特異的な抗体の製造）
ＪＮＫ阻害剤ペプチドを含むキメラペプチドなどのＪＮＫ阻害剤ペプチド（例えば、表１に示されたアミノ酸配列を含むペプチド）ならびにそれらのペプチドまたは誘導体、断片、アナログまたは相同体は、これらのペプチド成分に免疫特異的に結合する抗体を生成するために免疫原として利用し得る。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル鎖、モノクローナル鎖、キメラ鎖、単独鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリが挙げられる。特定の実施形態において、ヒトペプチドに対する抗体が開示されている。他の特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの断片が抗体生産用の免疫原として使用される。ＪＮＫ阻害剤ペプチド、またはその誘導体、断片、アナログまたは相同体に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生産のために、当該分野で公知の種々の操作を使用できる。
【００７４】
ポリクローナル抗体生産のために、種々の宿主動物を、天然ペプチドまたはその合成変異体または前記のものの誘導体の注入により免疫化し得る。免疫学的応答を増大させるために、種々のアジュバントを使用でき、限定はしないが、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル類（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性化物質（例えば、レソレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油性エマルジョン、ジニトロフェノールなど）およびカルメット・ゲラン杆菌およびコリネバクテリウムパルブムなどのヒトアジュバントが挙げられる。
【００７５】
ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその誘導体、断片、アナログまたは相同体に向けられたモノクローナル抗体の調製には、連続的な細胞系培養による抗体分子の製造を提供する任意の方法を利用し得る。このような方法として、限定はしないが、ハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：ｐ．４９５−４９７を参照）；トリオーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ４：ｐ．７２を参照）およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５年、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社、ｐ．７７−９６を参照）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用でき、ヒトハイブリドーマの利用に（Ｃｏｔｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８０：ｐ．２０２６−２０３０を参照）により、またはインビトロでのエプスタイン−バーウイルスによるヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５年、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社、ｐ．７７−９６を参照）により製造できる。
【００７６】
本発明によれば、ＪＮＫ阻害剤ペプチドに特異的な一本鎖抗体製造のための方法を改造できる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。また、ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその誘導体、断片、アナログまたは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で効率的な同定を可能にするためのＦａｂ発現ライブラリ構築（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：ｐ．１２７５−１２８１を参照）用に方法論を改造することができる。非ヒト抗体は、当該分野で周知の方法によって「ヒト化」することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。ＪＮＫ阻害剤ペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体断片は、例えば、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生産されたＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋還元により生成したＦａｂ断片；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤による抗体分子の処理により生成したＦａｂ断片および（ｉｖ）Ｆｖ断片などの当該分野に公知の方法により生産できる。
【００７７】
一実施形態において、所望の特異性を有する抗体スクリーニングの方法論として、限定はしないが、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で公知の他の免疫学的に媒介された方法が挙げられる。特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの特定のドメインに特異的な抗体の選択は、そのようなドメインを有するＪＮＫ阻害剤ペプチドの断片に結合するハイブリドーマの生成によって促進される。ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその誘導体、断片、アナログまたは相同体のうちのドメインに特異的な抗体もまた、本明細書に提供される。
【００７８】
抗ＪＮＫ阻害剤ペプチド抗体は、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの局在化および／または定量化に関する当該分野に公知の方法において使用できる（例えば、適当な生理学的サンプル内のペプチド濃度の測定における使用に、診断法における使用に、ペプチドの画像化における使用になど）。所与の実施形態において、抗体誘導結合ドメインを含有する、ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその誘導体、断片、アナログまたは相同体に対する抗体は、製薬上有効化合物（以後、「治療薬」）として利用される。
【００７９】
（障害の治療法または予防法）
（望ましくないＪＮＫ活性に関連した障害）
また、本発明には、被験者におけるＪＮＫ活性化剤に伴う細胞増殖性障害を、被験者に生物学的に活性な治療用化合物（以後、「治療薬」）を投与することにより治療する方法も含まれる。
【００８０】
用語の「細胞増殖性障害」とは、周囲組織とは形態学的におよび機能的にしばしば異なっているように見える悪性ならびに非悪性の細胞集団を意味する。例えば、ＪＮＫの活性化がしばしば示されてきた種々の器官系、例えば、肺、乳房、リンパ球、胃腸管および尿生殖器管の悪性腫瘍ならびに多くの大腸癌、腎細胞上皮悪性腫瘍、前立腺癌、肺の非小細胞上皮悪性腫瘍、小腸癌および食道癌などの悪性腫瘍も含む腺癌の治療に、本法は有用であり得る。ＪＮＫの活性化を明らかに必要とするＢｃｒ−Ａｂ１発癌性形質転換による癌もまた含まれる。
【００８１】
本法はまた、乾癬、尋常天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性心疾患、透析後症候群、白血病、リウマチ様関節炎、後天性免疫不全症候群、血管炎、敗血症性ショックおよび他のタイプの急性炎症、および脂質性組織球増殖症などの非悪性または免疫学的に関連した細胞増殖性疾患の治療にも有用である。特に好ましいのは、免疫病理学的疾患である。本質的に、病因学的にＪＮＫキナーゼ活性に関連しているいずれの疾患も治療に対して感受性があると考えられよう。
【００８２】
（聴力低下）
また、本発明には有毛不動毛への損傷、有毛アポトーシス、またはニューロンアポトーシスを防ぐ治療薬、すなわち細胞透過性の生物活性ペプチドを被験者に投与することにより、聴力低下を予防または治療する方法も含まれる。前記治療薬は、配列番号：１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８のペプチドであることが好ましい。
【００８３】
大きな騒音への曝露は、コルチ器官損傷により、騒音誘導聴力低下（ＮＩＨＬ）を生じさせる。ＮＩＨＬ損傷は、騒音レベルと曝露時間の双方に依存する。修復機構がコルチ器官を回復させることができる場合、聴力低下は一時的（ＴＴＳ）であり得る。しかし、有毛細胞またはニューロンが死滅すると、それは永続的（ＰＴＳ）となる。騒音傷害に対し構造的に相関するものに２つのタイプがある。すなわち、（１）修復でき、ＴＴＳおよび回復の原因であるシナプス、および有毛細胞不動毛の軽度の損傷および（２）修復できず、ＰＴＳの原因である有毛細胞およびニューロンのアポトーシスを誘導する重篤な損傷。
【００８４】
前記治療薬は、騒音傷害、抗生剤または化学療法剤に対する曝露前に被験者に投与される。あるいは、前記治療薬は、騒音傷害、抗生剤または化学療法剤に対する曝露後に被験者に投与される。
【００８５】
騒音傷害は、コルチ器官に損傷を起こすのに十分な騒音である。例えば、騒音傷害は、少なくとも７０ｄＢ  ＳＰＬ、少なくとも９０ｄＢ  ＳＰＬ、または少なくとも１００ｄＢ  ＳＰＬ、少なくとも１２０ｄＢ  ＳＰＬ、または少なくとも１３０ｄＢ  ＳＰＬである。
【００８６】
抗生物質としては、例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、ジクロキサシリンおよびオキサシリンなどのペニシリン類；セファレキシン（ケフレックス）、セファクロル（セクロール）およびセフィキシム（スプラックス）などのセファロスポリン類；トブラマイシンおよびストレプトマイシンなどのアミノグリコシド；エリスロマイシン、アジスロマイシン（ジスロマックス）およびクラリスロマイシンなどのマクロライド類；トリメトプリン−サルファメトキサゾールなどのスルホンアミド類、またはテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサイクリン類が挙げられる。
【００８７】
（ニューロン障害）
また、本発明には、ニューロンへの損傷またはニューロンのアポトーシスを防ぐ細胞透過性生物活性ペプチドの組成物を、細胞または被験者に投与することにより、ニューロン細胞死に関連した障害を治療または予防する方法も含まれる。前記組成物は、例えば、配列番号：１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または２１〜２６のペプチドである。
【００８８】
前記組成物は、ニューロン細胞の興奮毒性、または酸化的ストレス誘導の死滅を防ぐ働きをすることが好ましい。ニューロン細胞は、中枢または末梢の神経系由来の任意の細胞、例えば、ニューロン、神経突起、または樹状突起である。前記細胞は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで接触させる。被験者は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。
【００８９】
ニューロン死は、当該分野に公知の方法で測定される。例えば、細胞死は、顕微鏡で、または、カルセイン−ａｍ（分子プローブ）などの化学的指標を用いて測定される。
【００９０】
興奮毒性は、発作における神経細胞死の基礎をなす主要機構であり、無酸素および外傷性脳損傷は、興奮毒性である。興奮毒性は、向イオン性グルタメート受容体、特にＮ−メチル−Ｄ−アスパルテートのサブタイプの受容体の過度の活性化が引き金となり、それによって、細胞死を引き起こすＣａ２＋の急速な流入に至る。例えば、Ｄｉｒｎａｇｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：ｐ．３９１−９７（１９９９）；Ｚｉｐｆｅｌら、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、１７：ｐ．８５７−６９（２０００）を参照されたい。
【００９１】
前記方法は、種々のニューロン障害の症状を軽減するために有用である。ニューロン障害は、急性または慢性である。ニューロン障害としては、てんかん性発作から生じるシェミック発作、大脳虚血、低酸素／虚血脳損傷、外傷性脳損傷、ニューロン死などの興奮毒性事象に関連するもの、およびアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびハンチントン病などの幾つかの神経変性疾患に関連するニューロン死が挙げられる。
【００９２】
大脳虚血におけるニューロン死は、興奮毒性機構に関連している。大脳虚血（例えば、全体的大脳虚血、および焦点大脳虚血）は、発作、頭部傷害、または心臓停止に依る。全体的大脳虚血は、心臓停止または両側頚動脈閉塞から生じる。
【００９３】
焦点大脳虚血は、大脳動脈閉塞後の大脳の血流減少から生じる。焦点大脳虚血は、エネルギー消耗興奮毒性および梗塞周囲の脱分極などの事象の複雑な病因的カスケードならびにアポトーシスおよび炎症の双方を含むより遅延化した機構によるニューロンの壊死的死滅をもたらす。焦点大脳虚血はさらに、血栓性または塞栓性焦点虚血に分けられる。血栓性発作は、脳内に形成された血塊により大脳動脈が遮断される時に生じる。塞栓性発作もまた、血塊化動脈により生じるが、塞栓性発作では、血塊が脳自体以外のどこかで形成される。
【００９４】
本明細書に記載された方法は、本明細書に記載されたものなどのニューロン障害の１つ以上の症状の重症度の低下または軽減をもたらす。ニューロン障害は、典型的には標準的な方法論を用いて医師により診断され、および、またはモニターされる。
【００９５】
実施例に記載されているように、本発明のＪＮＫＩペプチドは、高レベルのニューロン保護を提供し、さらにＪＮＫＩペプチドが虚血発現の６〜１２時間後に投与された場合でもその保護レベルは高いままであることが示された。虚血後９時間までに投与された種々の化合物で３０〜５０％のニューロン保護が証明されている（例えば、それぞれが本明細書に参照としてその全体が組み込まれているＦｉｎｋら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．、１８：ｐ．１０７１−７６（１９９８）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、１３：ｐ．８２１−２４（２００２）を参照されたい）が、本発明のＪＮＫＩペプチドは、下記の実施例に記載されているように、虚血事象１２時間後に投与された場合に保護を提供することが示された。
【００９６】
虚血性発作などの興奮毒性事象を経験しているか、または経験した多くの患者は、興奮毒性事象の３時間後から６時間後以内に医療援助を求める。細胞死機構の活性化には興奮毒性事象後、数時間かかり得るため、虚血性事象において生じる損傷などの興奮毒性損傷を治療、または予防するために利用できる時間の長さは重要である。したがって、治療薬は、興奮毒性事象を経験する前に、被験体に投与することができる。あるいは、治療薬は、興奮毒性事象を被験体が経験した後に投与することができる。
【００９７】
（膵臓小島細胞死の抑制）
また、被験者に生物活性治療薬を投与すること、細胞、または被験者に細胞死または細胞損傷を防ぐ生物活性ペプチドを含有する組成物（治療薬）を投与することにより、細胞損傷または細胞死の防止または酸化的−ストレス誘導細胞死（例えば、アポトーシス細胞死）などの異常な細胞損傷を防ぐ方法も含まれる。前記細胞は、例えば、膵細胞である。前記治療薬は、配列番号：１、２、３、４、５、６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または２１〜２６のペプチドであることが好ましい。場合によっては、前記細胞または被験者は、コラゲナーゼもまた投与される。
【００９８】
前記ペプチドは、被験者が、インターロイキンなどの炎症誘発性サイトカインに曝露される前または後にも投与される。
【００９９】
前記被験者は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタであり得る。
【０１００】
（製薬組成物）
前記治療薬としては、例えば：（ｉ）ＪＮＫ阻害剤ペプチドおよびその誘導体、断片、アナログおよび相同体のいずれか１つ以上；（ｉｉ）ＪＮＫ阻害剤ペプチドに向けられた抗体；（ｉｉｉ）ＪＮＫ阻害剤ペプチドおよびその誘導体、断片、アナログおよび相同体をコードする核酸；（ｉｖ）ＪＮＫ阻害剤ペプチドをコードする配列に対するアンチセンス核酸および（ｖ）モジュレーター（すなわち、阻害剤、アゴニストおよびアンタゴニスト）が挙げられる。
【０１０１】
用語の「治療上有効な」とは、例えば、使用される阻害剤ペプチド量が、ＪＮＫ関連疾患」を改善するために十分な量であることを意味する。
【０１０２】
治療としては、ＪＮＫキナーゼ活性を調整する試薬の投与が挙げられる。用語の「調整する」には、ＪＮＫが過剰発現する場合のＪＮＫ発現の抑制が挙げられる。また、それには、細胞内の天然のｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２結合部位およびＮＦＡＴ４結合部位の競合的阻害剤として、例えば、配列番号：１〜６および２１〜２２ならびに配列番号：１１〜１６および２３〜２６のいずれか１つ以上のペプチドを用いることによるｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２またはＮＦＡＴ４のリン酸化抑制も挙げられる。したがって、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２またはＮＦＡＴ４から構成される転写因子のヘテロおよびホモ複合体およびそれらの例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体などの関連パートナーの抑制も挙げられる。細胞増殖障害が、ＪＮＫの過剰発現に関連している場合、このような抑制的ＪＮＫ阻害剤ペプチドが細胞に導入できる。幾つかの例では、「調整する」には、例えば、ＪＮＫに対するＩＢペプチドの結合を妨げるＩＢペプチド特異的抗体の使用によりＪＮＫ発現を増加させ、したがって、ＩＢ関連ペプチドによるＪＮＫ阻害の防止を挙げることができる。本発明のＪＮＫ阻害剤、ペプチド、融合ペプチドおよび核酸は製薬組成物中に製剤化することができる。これらの組成物は、上記物質の１つに加えて、製薬上許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、または当業者に周知の他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性でなければならず、また有効成分の有効性を妨害してはならない。担体または他の物質の精確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、耳介内（ｉｎｔｒａｕｒｔｉｃｕｌａｒ）、またはパッチ経路に依存し得る。
【０１０３】
経口投与用の製薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤または液剤の形態であり得る。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。液体の製薬組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理的食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含み得る。
【０１０４】
静脈内、皮膚または皮下注射または疾患部位における注射では、前記有効成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ，等張性および安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液の形態となる。関連の当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸化リンゲル注射などの等張媒体を用いて、好適な溶液を調製することができる。必要ならば、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含み得る。
【０１０５】
個人に投与すべきものが、本発明によるポリペプチドであろうと、ペプチドであろうと、または核酸分子、他の製薬上有用な化合物であろうと、個人に利益を示すのに十分な「予防上有効な量」または「治療上有効な量」（場合によっては予防を治療と考えることができるが）の投与であることが好ましい。投与される実際の量、および投与の割合および経過は、治療されているものの性質および重症度に依る。治療処方、例えば、投与量などについての決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の病態、送達部位、投与方法および開業医に公知の他の因子を考慮に入れる。上記に挙げた方法およびプロトコルの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ｐＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編集）、１９８０年に見ることができる。
【０１０６】
あるいは、抗体または細胞に特異的なリガンドなどのターゲッティングシステムの使用により、ある一定のタイプの細胞に対して、より特異的に有効剤を送達するために、ターゲッティング療法が使用できる。種々の理由で、例えば、薬剤が許容できないような毒性である場合、または、そうでなければ、非常に高い投与量が必要となる場合、または、そうでなければ、標的細胞に進入できないと考えられる場合、ターゲッティングが望ましい。
【０１０７】
これらの薬剤を直接投与する替わりに、例えば、ウィルスベクターにおける細胞内に導入されたコード遺伝子の発現により、それらを、標的細胞内に産生し得る（ＶＤＥＰＴ法の変法−下記を参照）。ベクターは、治療されるべき特定の細胞をターゲットにし得るか、またはベクターは、標的細胞によって多かれ少なかれ選択的にスイッチが入れられる調節要素を含有し得る。
【０１０８】
あるいは、前記薬剤は、治療されるべき細胞内で産生されるか、または治療されるべき細胞をターゲットにする活性化剤によって活性体へ変換するために、前駆体において投与され得る。このタイプの方法は、時にＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られており、前者は、細胞特異的抗体に対する共役により、前記細胞への活性化剤のターゲッティングを伴い、後者は、ウィルスベクターにおけるコードＤＮＡの発現により、ベクターにおける活性化剤、例えば、ＪＮＫ阻害剤ペプチドの産生を伴う（例えば、欧州特許出願公開第４１５７３１号および国際公開第９０／０７９３６号を参照）。
【０１０９】
本発明のある特定の実施形態において、遺伝子療法により、活性化ＪＮＫシグナル伝達経路を調整するために、ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸が投与される。より特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその機能的誘導体をコードする１つの核酸または複数の核酸が、遺伝子療法により投与される。遺伝子療法とは、特定の核酸を被験体に投与することにより実施される療法を言う。本発明のこの実施形態において、前記核酸はそのコードペプチド（単数または複数）を生産し、次にこれが、疾患または障害の調整機能により治療的効果を行使することに役立つ。当該分野内で利用できる遺伝子療法に関するいずれの方法論も、本発明の実施において使用できる。例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３年、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：ｐ．４８８−５０５を参照されたい。
【０１１０】
好ましい実施形態において、前記治療薬は、ＩＢ−関連ペプチド、ＪＢＤ２０関連ペプチドまたはそれらの断片、誘導体またはアナログのいずれか１つ以上を、好適な宿主内に発現させる発現ベクターの部分である核酸を含む。ある特定の実施形態において、このような核酸は、ＪＮＫ阻害剤ペプチドのコード領域（単数または複数）と操作可能に連結しているプロモーターを有する。前記プロモーターは、誘導的、または構成的および場合によっては、組織特異的であり得る。他の特定の実施形態において、ゲノム内の所望の部位で相同的組み換えを促す領域によってコード配列（および他の所望の配列）がフランキングされ、したがって、核酸の染色体内発現を提供している核酸分子が用いられる。ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８０：ｐ．８９３２−８９３５を参照されたい。
【０１１１】
患者内への治療的核酸の送達は、直接的（すなわち、患者は、核酸、または核酸含有ベクターに直接曝露される）、または間接的（すなわち、細胞が先ずインビトロで核酸により形質転換し、次に患者に移植される）のいずれかであり得る。これらの２つの方法は、各々、インビボ遺伝子療法またはエクスビボ遺伝子療法として知られている。本発明のある特定の実施形態において、核酸はインビボで直接投与され、発現してコード産物を生産する。これは、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、これを細胞内となるような様式で投与すること（例えば、不完全または弱毒化レトロウィルスベクターまたは他のウィルスベクターを用いた感染により、米国特許第４，９８０，２８６号を参照）；裸のＤＮＡの直接注射；微粒子銃（例えば，「Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（登録商標）」；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）；脂質による核酸のコーティング；関連した細胞表面受容体／移入物質を用いて；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内へカプセル化して；核に進入することが知られているペプチドにこれを結合させて投与することにより；または目的の被験体の受容体を特異的に発現する細胞タイプを「ターゲットにする」ために使用できる受容体媒介エンドサイトーシスに前配置したリガンドに結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：ｐ．４４２９−４４３２を参照）など、当該分野に公知の多数の方法のいずれかにより達成できる。
【０１１２】
本発明の実施における遺伝子療法への追加のアプローチには、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウィルス感染などの方法による、インビトロ組織培養における細胞内への遺伝子伝達が含まれる。一般に、前記伝達法として、細胞への選択的マーカーの同時伝達が挙げられる。次に伝達された遺伝子を取り込み、発現しているそれらの細胞の単離を促進するような選択圧（例えば、抗生物質耐性）下にそれらの細胞を置く。次にそれらの細胞を患者に送達する。ある特定の実施形態において、生じた組み換え細胞のインビボ投与の前に、例えば、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、目的の被験体の核酸配列を含有するウィルスまたはバクテリオファージによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子伝達、微小細胞媒介遺伝子伝達、スフェロプラスト融合んどの当該分野で公知のいずれかの方法、およびレシピエント細胞の必要な発育上の、および生理的機能が前記伝達によって撹乱されないことが保証される同様な方法論によって、前記核酸を細胞内に導入する。例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ、１９９３年、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：ｐ．５９９−６１８を参照されたい。前記核酸が前記細胞によって発現可能であるように、選択された方法は、細胞への安定な核酸伝達を提供しなければならない。好ましくは、伝達された核酸は遺伝可能であり、後代細胞によって発現可能である。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態において、生じた組み換え細胞は、例えば、上皮細胞の注入（例えば、皮下に）、患者への皮膚移植片として組み換え皮膚細胞の適用、および組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または始原細胞）の静脈注入などの当該分野で公知の種々の方法により、患者に送達できる。使用のために想定される細胞の総量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定できる。
【０１１４】
遺伝子療法を目的として核酸を導入できる細胞としては、任意の利用できる所望の細胞タイプが含まれ、異種、異種遺伝子、同型遺伝子または自己遺伝子であり得る。細胞タイプとしては、限定はしないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞および血液細胞などの分化細胞または種々の幹細胞または始原細胞、特に胎芽心筋細胞、肝幹細胞（国際特許公開第９４／０８５９８号）、ニューロン幹細胞（ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ７１：ｐ．９７３−９８５）、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる造血幹細胞または始原細胞が挙げられる。好ましい実施形態において、遺伝子療法に利用される細胞は、患者の自己由来のものである。
【０１１５】
（免疫アッセイ）
本発明のペプチドおよび抗体は、ＪＮＫまたはＪＮＫ阻害剤ペプチドの異常濃度を特徴とする種々の病態、疾患および障害を検出、予測、診断またはモニターするため、または、それらの治療をモニターするため、アッセイ（例えば、免疫アッセイ）に利用できる。「異常濃度」とは、身体の冒されていない部分からの、またはその疾患を有さない被験者からの類似サンプルに存在する濃度に対してあるサンプル中の増加した、または減少した濃度を意味する。免疫アッセイは、患者由来のサンプルを、免疫特異的結合から生じ得るような条件下で抗体と接触させ、引き続き抗体による何らかの免疫特異的結合量を検出または測定することを含む方法によって実施できる。ある特定の実施形態において、ＪＮＫまたはＪＮＫ阻害剤ペプチドの存在に関して、患者の組織サンプルまたは血清サンプルを分析するために、ＪＮＫ阻害剤ペプチドに特異的な抗体が使用でき、ここでＪＮＫまたはＪＮＫ阻害剤ペプチドの異常濃度は、疾病状態を示している。利用し得る免疫アッセイとしては、限定はしないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈澱アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、蛍光免疫アッセイ、補体固定アッセイ、免疫ラジオメータアッセイ、および蛋白−Ａ免疫アッセイなどの方法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。
【０１１６】
（キット）
本発明はさらに、抗ＪＮＫ阻害剤ペプチド抗体および場合によっては、その抗体に対する標識結合パートナーを含有する１つ以上の容器を含む診断または治療に使用するキットを提供する。前記抗体に組み込まれる前記標識として、限定はしないが、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、比色部分または放射活性部分を挙げることができる。他の特定の実施形態において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドをコードするか、もしくはＪＮＫ阻害剤ペプチドに相補的な修飾または未修飾核酸および場合によっては、前記核酸に対する標識結合パートナーを含有する１つ以上の容器からなる診断使用のためのキットもまた、提供される。ある特定の代替実施形態において、１つ以上の容器において、前記キットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０年、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、カリフォルニア州サンディエゴを参照）、リガーゼ連鎖反応、環状プローブ反応など、または当該分野に公知の他の方法のための増幅プライマーとして作用することのできる１対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、各々、長さが６〜３０ヌクレオチド）を含み得る。前記キットは、場合によっては、診断薬、標準品またはアッセイにおける対照として使用するために、予め決められた量の精製ＪＮＫ阻害剤ペプチドまたはその核酸をさらに含み得る。
【０１１７】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって、範囲を限定されることはない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の説明およびそれに伴う図から、当業者に明らかとなろう。このような修飾は添付の請求項の範囲に入る。
【０１１８】
種々の刊行物が、本明細書に引用されているが、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用されている。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１：ＪＮＫ阻害剤ペプチドの同定）
ＪＮＫとの効率的な相互作用にとって重要なアミノ酸配列を、公知のＪＢＤ間の配列整列によって同定した。ＩＢ１［配列番号：１７］、ＩＢ２［配列番号：１８］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号：１９］およびＡＴＦ２［配列番号：２０］のＪＢＤ間の配列比較により、弱く保存された８個のアミノ酸配列が定められた（図１Ａ）。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤは、ＪＮＫ結合においてｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２の約１００倍効率的であるために（Ｄｉｃｋｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：ｐ．６９３（１９９７））、最大の結合を与える上で、ＩＢ１とＩＢ２間の保存された残基が重要であるに違いないと推論された。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤ間の比較により、２つの配列間で保存性の高い７個のアミノ酸と３個のアミノ酸の２つのブロックが定められた。これらの２つのブロックは、ＩＢ１における２３個のアミノ酸［配列番号：１］およびＩＢ２における２１個のアミノ酸［配列番号：２］のペプチド配列内に含まれている。これらの配列は図１Ｂに示されており、ＩＢ２配列におけるダッシュは、保存された残基を整列させるための配列における間隙を示している。
【０１２０】
本発明のＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫＩ）ペプチドは、本明細書においてＪＢＤ２０と称されるＪＩＰ−１／ＩＢ１の２０個のアミノ酸のＪＮＫ結合モチーフを、例えば１０個のアミノ酸のＨＩＶ−ＴＡＴ４８〜５７輸送体配列などの輸送蛋白質と結合させることに得られた。
【０１２１】
（実施例２：ＪＮＫ阻害剤融合蛋白質の調製）
ＪＮＫ阻害剤融合蛋白質は、ＪＢＤ２３のＣ末端、またはＩＢ２（ＪＢＤ２１）由来の２１個のアミノ酸配列、または、ＪＢＤ２０のアミノ酸配列のＣ末端と、ＨＩＶ−ＴＡＴ４８〜５７由来のＮ末端の１０個のアミノ酸長担体ペプチド（Ｖｉｒｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：ｐ．１６０１０（１９９７））とを、２つのプロリン残基からなるスペーサーによって共有結合させることによって合成した。このスペーサーは、最大の屈曲性を可能にするため、また、不必要な二次構造の変化を防ぐために用いられた。図１Ｃに示されるように、これらの調製物は、各々Ｌ−ＴＡＴ［配列番号：７］、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１［配列番号：１１］、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ２［配列番号：１２］およびＬ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩ１［配列番号：２１］と称された。全てのＤ−レトロ・インベルソペプチドのＴＡＴ融合蛋白質もまた合成され、各々Ｄ−ＴＡＴ［配列番号：８］、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１［配列番号：１４］およびＤ−ＴＡＴ−ＪＮＫＩ１［配列番号：２２］と称された。全てのＤおよびＬペプチド類は、古典的なＦ−モック合成によって製造され、さらに質量分析によって分析された。これらを最終的にＨＰＬＣによって精製した。プロリンスペーサーの効果を測定するために、２つのプロリンを有する、および有さない２つのタイプのＴＡＴペプチドを製造した。２つのプロリンの添加により、ＴＡＴペプチドの細胞内への進入または局在化は変化しないようであった。
【０１２２】
保存アミノ酸残基を示す包括的ペプチドは、図２に示してある。Ｘは、任意のアミノ酸を示す。所与のペプチドのＸの数は、示されたものに限定されず、変わり得る（すなわち、Ｘはアミノ酸残基のゼロを含む任意の数を示し得る）。包括的配列のより詳細については上記を参照されたい。
【０１２３】
（実施例３：ＪＢＤ２３によるβ細胞死の抑制）
次に、ＪＮＫ生物学的活性に及ぼすＩＢ１の２３個のアミノ酸長ＪＢＤ配列の効果を試験した。２３個のアミノ酸配列を緑色蛍光蛋白質にＮ末端結合させ（ＧＦＰ−ＪＢＤ２３構築体）、ＩＬ−１βによって誘導された膵臓β細胞のアポートシスに及ぼすこの構築体の効果を評価した。図３を参照されたい。このアポートシス様式は、ＪＢＤ１〜２８０によるトランスフェクションによって妨げられることが以前示されていたが、一方、ＥＲＫ１／２の特異的阻害剤またはｐ３８によっては防止されなかった。上記のＡｍｍｅｎｄｒｕｐらを参照されたい。
【０１２４】
２３個のアミノ酸配列（ＪＢＤ２３；図１Ｂ）および完全保存領域において変異した（ＪＢＤ２３ｍｕｔ）に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ＥｃｏＲＩおよび緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＳａｌＩ部位内へ直接挿入した。１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００単位／ｍＬペニシリンおよび２ｍＭグルタミンを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地でインスリン産生βＴＣ−３細胞を培養した。インスリン産生βＴＣ−３細胞を表示されたベクター類によって移入し、細胞培養培地にＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＩＬ−１βの添加４８時間後に、倒立蛍光顕微鏡を用いてアポトーシス細胞数をカウントした。特徴的な細胞質の「ブレビングアウト」によって正常な細胞から識別されたアポトーシス細胞を２日後にカウントした。
【０１２５】
図３に示されているように、ＧＦＰは、対照として用いられた緑色蛍光蛋白質発現ベクターであり；ＪＢＤ２３は、ＩＢ１のＪＢＤ由来の２３個のアミノ酸配列に結合したキメラＧＦＰを発現するベクターであり；ＪＢＤ２３Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ２３と同じベクターであるが、図１Ｂに示されるように、４つの保存残基において変換したＪＢＤを有しており；ＪＢＤ２８０は、完全ＪＢＤ（アミノ酸１〜２８０）に結合したＧＦＰベクターである。ＧＦＰ−ＪＢＤ２３発現構築体は、ＩＬ−１β誘導の膵臓β−細胞アポトーシスを完全ＪＢＤ１〜２８０と同様に効率よく防いだ（図３、ＪＢＤ２８０／ＩＬ−１と比較してのＪＢＤ２３／ＩＬ−１）。追加対照として、完全に保存されたＩＢ１残基において変異した配列は、アポトーシスを防ぐ能力が大きく低下した（図３、ＪＢＤ２３Ｍｕｔ／ＩＬ−１）。
【０１２６】
（実施例４：ＴＡＴ−ＩＢ１およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドの細胞移入）
ＴＡＴ、ＴＡＴ−ＩＢ１およびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド類（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド類」）のＬおよびＤ鏡像異性体の細胞進入能力を評価した。
【０１２７】
Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ２、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類［配列番号：各々７、８、１１、１２および１４］をフルオレセインに共役させたグリシン残基のＮ末端付加により標識化した。標識ペプチド類（１μＭ）を、βＴＣ−３細胞培養液に加え、これを実施例３に記載したとおり維持した。予め決められた時点で細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノール−アセトン（１：１）中で５分間固定してから、蛍光顕微鏡下で検査した。蛍光標識ＢＳＡ（１μＭ、１２モル／モルＢＳＡ）を対照として用いた。上記の蛍光標識ペプチドは全て、一旦培地に加えられると効率よく迅速に（５分以内に）細胞に進入した結果が示された。逆に蛍光標識ウシ血清アルブミン（１μＭ  ＢＳＡ、１２モルフルオレセイン／モルＢＳＡ）は、細胞に進入しなかった。
【０１２８】
経時的試験により、Ｌ−エナンチオペプチドに関する蛍光シグナル強度は、２４時間後に７０％減少したことが示された。４８時間目には、シグナルは殆どから全く存在しなかった。これとは対照的に、Ｄ−ＴＡＴおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、細胞内で極めて安定であった。これら全てのＤ−レトロ・インベルソペプチド類からの蛍光シグナルは、１週間後でもまだ極めて強く、処理２週目でわずかに減少しただけであった。
【０１２９】
（実施例５：  ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１リン酸化のインビトロ阻害）
ＪＮＫの標的転写因子のＪＮＫ媒介リン酸化に及ぼす前記ペプチドの効果をインビトロで調べた。転写および翻訳ウサギ網状赤血球ライゼートキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、組換え非活性ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３を製造し、基質としてｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１を単独で、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させた固相キナーゼアッセイに用いた。Ｌ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１またはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド（０〜２５μＭ）を、反応緩衝液（２０ｍＭトリスアセテート、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ｐ−グリセロホスフェート、１ｍＭジチオトレイトール）中、組換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３キナーゼと２０分間混合した。次に１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５μＣｉ３３Ｐ−γーｄＡＴＰおよび１μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）か、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（アミノ酸１〜９６）か、またはＧＳＴ−ＥＬＫ１（アミノ酸３０７〜４２８）の添加により、キナーゼ反応を開始した。ＧＳＴ融合蛋白質は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラジョーラ）から購入した。また、１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズも、前記混合物に加えた。次に反応産物を、変性１０％ポリアクリルアミドゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを乾燥し、引き続きＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。ＴＡＴ−ＩＢペプチドの２．５μＭという低用量で、ＪＮＫ類によるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥｌｋ１リン酸化のほぼ完全な阻害が見られた。しかし、顕著な例外は、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ阻害欠如であった。全体的に見て、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、それらの標的転写因子のＪＮＫファミリーリン酸化の阻害において、ＴＡＴ−ＩＢ２よりもわずかに優れているようであった（図４Ａを参照）。
【０１３０】
組換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３により、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜７３）リン酸化を阻害するＤ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの能力（０〜２５０μＭ用量試験）を上記のとおり分析した。全体的に見て、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ媒介リン酸化を減少させたが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１より約１０〜２０倍低い効率のレベルであった（図４Ｂを参照）。
【０１３１】
（実施例６：  活性化ＪＮＫ類によるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害）
ストレスの多い刺激により活性化したＪＮＫ類に及ぼすＬ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴＩＢ１、またはＬ−ＴＡＴＩＢ２ペプチドの効果をＵＶ光照射Ｈｅｌａ細胞またはＩＬ−１β処理βＴＣ細胞のＪＮＫ類を減弱させるＧＳＴ−Ｊｕｎを用いて評価した。βＴＣ細胞は上記のとおり培養した。Ｈｅｌａ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００単位／ｍＬペニシリンおよび２ｍＭグルタミンを補足したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞抽出調製物と用いる１時間前に、βＴＣ細胞は上記のとおりＩＬ−１βによって活性化し、一方、Ｈｅｌａ細胞は、ＵＶ−光（２０Ｊ／ｍ２）によって活性化した。溶解緩衝液（２０ｍＭトリスアセテート、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ｐ−グリセロホスフェート、１ｍＭジチオトレイトール）中、細胞培養物をこすり取って、対照物、ＵＶ光照射ＨｅＬａ細胞およびＩＬ−１β処理βＴＣ−３細胞から細胞抽出物を調製した。ＳＳ−３４ベックマンローター中１５，０００で５分間の遠心分離により、砕片を除去した。１００μｇの抽出物を室温で１時間、１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）および１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に温置した。こすりおとし、緩衝液で４回洗浄後、Ｌ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴＩＢ１、またはＬ−ＴＡＴＩＢ２ペプチド（２５μＭ）で補足した同一の緩衝液中に、前記ビーズを２０分間再懸濁した。次に１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５μＣｉ３３Ｐ−γーｄＡＴＰの添加により、キナーゼ反応を開始し、３０℃で３０分間温置した。次に反応産物を、変性１０％ポリアクリルアミドゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを乾燥し、引き続きＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。これらの実験において、ＴＡＴ−ＩＢペプチド類は、活性化ＪＮＫ類によるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を効率よく防いだ（図６を参照）。
【０１３２】
（実施例７：  ＴＡＴ−ＩＢペプチド類によるｃ−ＪＵＮリン酸化のインビボ阻害）
前記細胞透過性ペプチド類が、インビボでＪＮＫシグナル伝達を妨害し得るかどうかを判定するために、非相同性ＧＡＬ４系を用いた。上記のとおり培養したＨｅＬａ細胞にＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに結合させたｃ−Ｊｕｎの活性化ドメイン（アミノ酸１〜８９）を含むＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構築体（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）と共に、５ｘＧＡＬ−ＬＵＣリポーターベクターの同時トランスフェクションを行った。ＪＵＮＫの活性化は、直接上流のキナーゼ、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７を発現するベクター類の同時トランスフェクションにより達成した（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：ｐ．１５７３（１９９９）を参照）。簡略に述べると、ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造元の説明書に従って用い、３．５ｃｍ皿に３ｘ１０５の細胞にプラスミドのトランスフェクションを行った。ＧＡＬ−Ｊｕｎに関する実験では、１μｇのリポータープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）および０．５μｇのＭＫＫ４かまたはＭＫＫ７の発現プラスミドと共に、２０ｎｇのプラスミドのトランスフェクションを行った。トランスフェクション３時間後、細胞培地を交換し、Ｌ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴＩＢ１、またはＬ−ＴＡＴＩＢ２ペプチド（１μＭ）を加えた。１６時間後、蛋白質含量を標準化してから、Ｐｒｏｍｅｇａの「二重リポーターシステム」を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図５に示されるように、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７に媒介されたＪＮＫの活性化後、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチド双方の添加により、ｃ−Ｊｕｎの活性化が妨害された。ＨｅＬａ細胞はＪＮＫ１異性体とＪＮＫ２異性体の双方を発現するが、ＪＮＫ３異性体は、発現しないため、細胞にＪＮＫ３のトランスフェクションを行った。やはり２つのＴＡＴ−ＩＢペプチド類は、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２媒介活性化を阻害した。
【０１３３】
（実施例８：  ＴＡＴ−ＩＢペプチド類によるＩＬ−１β誘導膵臓β細胞死の抑制）
ＩＬ−１βによって誘導された膵臓β細胞アポトーシス促進に及ぼすＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類の効果を調べた。βＴＣ−３細胞培養液を１μＭのＬ−ＴＡＴＩＢ１ペプチドか、またはＬ−ＴＡＴＩＢ２ペプチドのいずれかと共に３０分間温置し、その後１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βと共に温置した。ペプチド（１μＭ）の２回目の添加を２４時間後に行った。ＩＬ−１βとの温置２日後、ヨウ化プロピジウム（赤い染色細胞と死滅細胞）およびヘキスト３３３４２（青い染色細胞ともとのままの細胞膜を有する細胞）の核染色を用いて、アポトーシス細胞をカウントした。図５に示されるように、ＩＬ−１β存在下、２日間培養したβＴＣ−３細胞のＩＬ−１β誘導アポトーシスは、ＴＡＴ−ＩＢペプチド類の添加によって阻害された。
【０１３４】
ペプチド類とＩＬ−１βとの細胞の温置を１２日間維持したことを除いては上記のとおり、βＴＣ−３細胞処理によるＩＬ−１β誘導細胞死の長期阻害を試験した。追加ペプチド類（１μＭ）は毎日加え、追加ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）は２日おきに加えた。これらの条件におけるアポトーシスに対してＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、強力な保護を提供する。まとめると、これらの実験によりＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類は、細胞死に関するＪＮＫシグナル伝達作用を防ぐことのできる生物学的活性分子であることが確証される。
【０１３５】
（実施例９：全Ｄ−レトロ・インベルソペプチド類の合成）
本発明のペプチド類は、自然的プロテオリシスを防ぐため、逆に合成された、全Ｄ−アミノ酸ペプチド（すなわち全Ｄ−レトロ・インベルソペプチド）であり得る。本発明の全Ｄ−レトロ・インベルソペプチドは、天然ペプチドと同様の官能性を有するペプチドを提供するが、このペプチドにおいて構成要素のアミノ酸の側鎖基は、天然ペプチド配列に相当するが、プロテアーゼ耐性骨格を保持すると考えられる。
【０１３６】
本発明のレトロ・インベルソペプチドは、レトロ・インベルソペプチドアナログにおけるアミノ酸配列が、モデルとして働く選択ペプチドのアミノ酸配列と全く逆であるように、ペプチド鎖内にアミノ酸を付加することにより、Ｄ−アミノ酸を用いて合成されたアナログである。例えば、天然のＴＡＴ蛋白質（Ｌ−アミノ酸から形成）が配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号：７］を有する場合、このペプチドのレトロ・インベルソペプチドアナログ（Ｄ−アミノ酸から形成）は配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ［配列番号：８］を有すると考えられる。レトロ・インベルソペプチドを形成するためにＤ−アミノ酸の鎖を合成する操作は当該分野に公知である。例えば、Ｊａｍｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、ｐ．７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、ｐ．６９２−６９３（１９９４）；Ｇｕｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９、ｐ．２０３０−２０３９（１９９６）を参照されたい。具体的に言うとレトロペプチドは、古典的なＦ−モック合成により製造し、さらに、質量分析によって分析した。それらは最終的にＨＰＬＣによって精製した。
【０１３７】
天然ペプチドでの固有の問題は、天然のプロテアーゼおよび固有の免疫原生による分解であるため、本発明のヘテロ二価化合物またはヘテロ多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ・インベルソ異性体」を含んで調製されることになる。したがって、自然的プロテオリシスからペプチドを保護することは、半減期の延長および活発に前記ペプチドを破壊することに向けられた免疫応答の程度を低下させることの双方により、特定のヘテロ二価化合物またはヘテロ多価化合物の有効性を増加させるはずである。
【０１３８】
（実施例１０：全Ｄレトロ・インベルソＩＢペプチド類の長期生物学的活性）
実施例５に示されるように、天然プロテアーゼによる分解からのＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド保護により、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢレトロ・インベルソ含有ペプチド共役体では、天然のＬ−アミノ酸アナログに較べた場合、長期の生物学的活性が予測される。
【０１３９】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１β誘導膵臓β細胞死の抑制を分析した。図１０に示されるように、表示されたペプチド類（１μＭ）を１回添加したβＴＣ−３細胞を上記のとおり３０分間温置し、次にＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。次にＩＬ−１βと共に２日間温置後、ヨウ化プロピジウムおよびヘキスト３３３４２染色を用いて、アポトーシス細胞をカウントした。各実験につき、最低１０００個の細胞をカウントした。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が示されており、ｎ＝５である。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様な程度までＩＬ−１誘導アポトーシスを減少させた（図５と図１０を比較されたい）。
【０１４０】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１β誘導細胞死の長期抑制もまた分析した。表示されたペプチド類（１μＭ）を１回添加したβＴＣ−３細胞を上記のとおり３０分間温置し、次にＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、続いて２日おきにサイトカインを添加した。次にＩＬ−１βと共に１５日間温置後、ヨウ化プロピジウムおよびヘキスト３３３４２核染色を用いて、アポトーシス細胞をカウントした。Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの１回の添加によっては、長期保護が与えられないことに注意されたい。各実験につき、最低１０００個の細胞をカウントした。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が示されており、ｎ＝５である。結果は図９に示されている。Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ではなく、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１が長期（１５日）保護を与えることができた。
【０１４１】
（実施例１１：ＴＡＴ−ＩＢペプチド類による照射誘導膵臓β細胞死の抑制）
ＪＮＫは、イオン化照射によっても活性化される。照射誘導ＪＮＫ損傷に対してＴＡＴ−ＩＢペプチド類が保護を提供するかどうかを測定するために、図１０に示されるように、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１またはＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド（照射３０分前に１μＭを添加）の存在下または不在下で、「ＷｉＤｒ」細胞を照射した（３０Ｇｙ）。対照細胞（ＣＴＲＬ）は照射しなかった。４８時間後、上記のとおりＰＩおよびヘキスト３３３４２染色により細胞を分析した。ｎ＝３でＳＥＭは示されている。このヒト大腸癌細胞系において、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの双方とも照射誘導アポトーシスを防ぐことができた。
【０１４２】
（実施例１２：イオン化放射に対するＴＡＴ−ＩＢペプチド類による放射線保護）
ＴＡＴ−ＩＢペプチド類の放射線保護効果を測定するために、フィリップス  ＲＴ  ２５０  Ｒ線により、０．７４Ｇｙ／分の線量比でＣ５７Ｂ１／６マウス（２〜３月齢）を照射した（１７ｍＡ、０．５ｍｍ  Ｃｕフィルタ）。照射３０分前に、マウスにＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類（１ｍＭ溶液／３０μｌ）を腹腔内注射した。簡略に述べると、マウスを以下のとおり照射した：マウスを小型のプラスチックボックスに入れ、頭部をボックスの外に出した。照射器の下に仰向けにマウスを置き、頭部を正しい位置に維持するために、マウスの頚部を小型プラスチックトンネル内に固定した。身体は鉛で保護した。照射前マウスは、標準的なマウスペレット食餌を給餌したが、照射後は、半流動食を毎日取り換えて与えた。
【０１４３】
次にＰａｒｋｉｎｓら（Ｐａｒｋｉｎｓら、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１：ｐ．１６５−１７３、１９８３年）によって開発された評点システムに従って、２人の独立した観察者により唇粘膜の反応を評点づけしたが、そこでは、紅斑の状態ならびに浮腫、剥離および滲出、の存在を評価した。なお、マウスの紅斑／浮腫状態の各記録前に、それらの体重を測った。
【０１４４】
図１２Ａ：照射後のマウスの体重を示した。値は、１００に設定したマウスの最初の体重に対して報告されたもの。ＣＴＲＬ：３０μｌの生理食塩水を注射された対照マウス。各報告値に関してｎ＝２であり、Ｓ，Ｄ，は示されている。Ｘ値は日数である。
【０１４５】
図１２Ｂは、照射後の紅斑／浮腫評点を示している。図１２Ａと同じマウスの下方唇の浮腫および紅斑状態を定量化した。各報告値に関してｎ＝２であり、Ｘ値は日数である。
【０１４６】
これらの実験結果は、ＴＡＴ−ＩＢペプチド類が、イオン化放射に伴う体重減少および紅斑／浮腫を防止し得ることを示している。
【０１４７】
（実施例１３：Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド類によるＪＮＫ転写因子の抑制）
示されるようにＡＰ−１二重標識プローブ（５’−ＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡ−３’、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで１時間処理した、または未処理のＨｅＬａ細胞核抽出物を用いて、ゲル遅延化アッセイを実施した。ＴＡＴペプチドおよびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドを、ＴＮＦ−αの３０分前に添加した。特異的ＡＰ−１ＤＮＡ複合体を有するゲルの部分だけ（未標識の特異的および非特異的競合体による競合実験によって証明された）が示されている。Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＴＮＦ−αの存在下でＡＰ−１ＤＮＡ結合複合体の形成を減少させる（図１１を参照）。
【０１４８】
（実施例１４：騒音誘導聴力低下に対するＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類による保護）
図１３、パネルＡに示されるように、モルモットの右内耳内へＤ−ＪＮＫＩ（１μＭ、１μｌ／時間）の溶液を注入し、一方、左耳には、生理食塩水のみを注入した。次にモルモットを騒音傷害（１２０ｄｂ、３０分）に曝露し、３日後にに聴力感受性（図１３、パネルＢ）ならびに内耳の組織学的検査（図１３、パネルＣおよびＤ）を実施した。図１３に示されるように、組織学的検査から判断されるように線毛構造の多くが消失した未処理の耳とは対照的に、ＪＮＫＩで処理した耳では、線毛構造が騒音誘導破壊から完全に保護されている。さらに、Ｄ−ＪＮＫＩで処理した耳の騒音に対する感受性は、保存されているようである（図１３、パネルＢ）。
【０１４９】
（実施例１５：抗生物質誘導聴力低下に対するＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類による保護）
Ｄ  ＪＮＫＩの存在／不在下で、ニワトリの内耳をストレプトマイシンにより処理した。次にアポトーシスを検出（緑色核）するために、ＴＵＮＥＬ実験を実施した。図１４に示されるように、Ｄ−ＪＮＫＩはストレプトマイシン誘導アポトーシスから内耳を完全に保護する。しがって、Ｄ−ＪＮＫＩは抗生物質療法によって被る聴力低下状態の防止に有用である。
【０１５０】
（実施例１６：炎症誘発性サイトカイン類に誘導された膵臓小島破壊に対するＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類による保護）
膵臓小島細胞を、インターロイキン１Ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）に曝露する前にＤ−ＪＮＫＩ（１ｍＭを１時間）で処理した。図１５に示されるように、Ｄ−ＪＮＫＩで処理された小島はＩＬ−１Ｂ誘導破壊に抵抗する。このことは、Ｄ−ＪＮＫＩによる処理が移植された小島の保存を助けることを示している。
【０１５１】
（実施例１７：Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチド類による膵臓小島細胞の回復増加）
小島細胞単離時、コラゲナーゼと共にＤ−ＪＮＫＩを添加した。これは乳酸デヒドロゲナーゼの増加を測定すると、３日後、培養液中の小島収量の増加をもたらした。図１５を参照されたい。
【０１５２】
（実施例１８：ＪＮＫ活性化およびＪＮＫ関連作用に及ぼすＪＮＫペプチド類の効果試験に用いられる一般的方法）
（一般的ニューロン培養）
２日齢のラットの脳から皮質小片を切開し、２００単位のパパリンと共に、３４℃で３０分間温置した。次に、１００μｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジンで予め被覆した皿上に約１ｘ１０６細胞／皿の密度でニューロンを入れた。０．５ｍグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補足したＢ２７／ニューロベーサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地を用いて前記細胞を培養した。
【０１５３】
（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイ）
培地内に放出されたＬＤＨ量を、サイトトックス（Ｃｙｔｏｔｏｘ）９６非放射性細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【０１５４】
（ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ減弱およびキナーゼアッセイ）
：リシス緩衝液（２０ｍＭトリスアセテート、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％トリトン×−１００、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ｐ−グリセロホスフェート、１ｍＭジチオトレイトール）中に細胞をこすりとって細胞抽出液を調製した。２５μｇのサンプルを、１μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）および１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に、室温で１時間温置した。前記ビーズを４回洗浄し、上記のリシス緩衝液に再懸濁した。次いで組み換えＪＮＫＩα１およびＧＳＴ融合蛋白質類（例えば、ＧＳＴ−ＪｕｎおよびＧＳＴ−Ｅｌｋ１融合蛋白質）、カゼインおよびヒストン（Ｓｉｇｍａ）よりなる群から選択された０．５μｇの基質を用いて、インビトロキナーゼアッセイを実施した。５μＣｉ３３Ｐ−ＡＴＰの存在下、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびおよび１０μＭ  ＡＴＰによって反応を開始させ、摂氏３０度で３０分間温置した。反応産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ゲルを乾燥してから、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。
【０１５５】
（ウェスタンブロット）
リシス緩衝液（上記）中に細胞をこすりとって、総蛋白抽出物を得、前記蛋白質を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。次に前記の分離蛋白質をフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に移した。本明細書に記載したウェスタンブロットにおいて使用した抗体は、Ａｌｅｘｉｓから入手した。
【０１５６】
（細胞質からの核の分離）
ウェスタンブロット分析用に核を単離するために（図１７Ｂを参照）、ニューロンをリシス緩衝液中に１５分間溶解してから、サンプルを４℃で１０分間、３００ｇで遠心分離した。核ペレットをリシス緩衝液中で再構成してから音波処理した。
【０１５７】
（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ライトサイクラー器具（Ｒｏｃｈｅ）上で特異的プライマーを用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ法により抽出されたＲＮＡ類の量と品質を統一するために、ハウスキーピングアクチン転写物を用いた。本明細書に参照としてその全体が組み込まれているＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２：ｐ．１５６−５９（１９８７）を参照されたい。用いられたプライマー類の配列は以下のとおりである：
ｃＦｏｓ  正：５’−ＧＣＴＧＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧ−３’
逆：５’−ＣＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＧＡＡＡＣＡ−３’
アクチン  正：５’−ＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡＡ−３’
逆：５’−ＡＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＡ−５’
（Ｐ−ｃ−ｊｕｎ免疫組織化学）
本明細書に用いられるＰ−ｃ−ｊｕｎは、ｃ−ｊｕｎのリン酸化形態を言う。Ｐ−ｃ−ｊｕｎは、ウサギポリクローナル抗体（ＰＢＳ中５００ｘ）によってターゲットにされた。生じた抗体複合体を、３，３−ジアミノベンジジンを基質として用いて視覚化した。
【０１５８】
（成体マウスにおける一時的虚血）
オスＩＣＲ−ＣＤ１マウス（約６週齢で体重は約１８〜３７ｇの範囲）（Ｈａｒｌａｎ社）を用い、通常の頚動脈から１本のフィラメントを内部の頚動脈内へ導入し、前記フィラメントを動脈循環内へ進入させ、そのことにより、中央大脳動脈を閉塞させることによって、虚血を引き起こした。例えば、それぞれ参照として本明細書にその全体が組み込まれている、Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：ｐ．１８８３−８５（１９９４）；Ｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）９４：ｐ．２００７−１２（１９９７）を参照されたい。虚血時を通し、また再灌流１０分後まで頭蓋骨に固定したプローブを有するレーザー−ドップラー流量計によって、局所大脳血流を測定した。直腸温度を測定し、３７℃に維持した。再灌流４８時間後にマウスを殺処理した。連続低温槽切片２０μＭ厚を、Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａプログラムを装備したコンピュータ顕微鏡システム（Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）を用いて追跡し、Ｎｅｕｒｏｅｘｐｌｏｒｅｒプログラムによって、虚血領域および脳全体容積を算出した（盲検）３匹の追加マウスにおいて、動脈カテーテルによって、収縮期血圧と拡張期血圧を、Ｄ−ＪＮＫＩ注入１０分前から３０分後まで測定した。これらの血圧測定により、前記注入が血圧に影響を与えないことが示された（すなわち、１０％未満の変化）。全ての実験は、Ｓｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｏｆｆｉｃｅの指針に従った。
【０１５９】
（幼若（Ｐ１４）ラットにおける永続的焦点虚血）
嗅覚枝との接合部における起点に対して閉じている位置で、中央大脳動脈を電気凝固することにより、中央大脳動脈閉塞を得た。体重が約２７〜３５ｇの範囲のラット（Ｗｉｓｔａｒより）を中央大脳動脈閉塞２４時間後に殺処理した。前記ラットは、抱水クロラールの過剰用量を用いて殺処理し、Ｚａｍｂｏｎｉ固定剤によって左脳室を灌流した。前記脳を灌流に用いたものと同じ溶液中で２時間固定してから、前記脳を寒冷保護のため、３０％スクロース中に一晩浸潤させた。各虚血領域の輪郭を、コンピュータ顕微鏡システムによって描いた（染色した）。虚血傷害および脳全体の面積を、クレシルバイオレットで染色した５０μｍ連続低温槽切片から、Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａプログラムを用いて追跡し、各々の容積を上記のとおりＮｅｕｒｏｅｘｐｌｏｒｅｒプログラムを用いてを算出した。
【０１６０】
統計：双方の虚血モデル（すなわち、一時的および永続的）のデータは、Ｇａｕｓｓｉａｎ基準に合わせるために対数変換した。データは、概括ＡＮＯＶＡ（双方のモデルでｐ＜０．０００１）に続いて片側不対ｔ検定によって分析した。
【０１６１】
（実施例１９：  ＪＮＫ作用に対するＪＮＫＩペプチド類の感受性および特異性）
これらの実験に用いられるＪＮＫＩ１ペプチド類は、直接競合的機構により、ｃ−Ｊｕｎおよび他の基質に対するＪＮＫのアクセスを妨げることを目的としている。各々が参照としてその全体が本明細書に組み込まれているＢｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０：ｐ．７７−８２（２００１）；Ｂａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：ｐ．１０９８７−９７（２００２）を参照されたい。
【０１６２】
ＪＮＫの活性化と作用に及ぼすＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の阻害効果を、上記実施例１８に記載したとおり、キナーゼアッセイを用いて試験した。これらの実験結果は、図１６Ａ〜１６Ｃに示されている。ＪＮＫの活性化と作用に及ぼすＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の阻害効果は、ＪＮＫ１α１を用い、公知のＪＮＫ標的、ｃ−ＪｕｎおよびＥｌｋ１のインビトロリン酸化を防ぐそれらの能力によって示される（図１６を参照）。本明細書に用いられる用語の「Ｐ−Ｊｕｎ」および「Ｐ−Ｅｌｋ１」とは、それぞれＧＳＴ−ＪｕｎおよびＧＳＴ−Ｅｌｋ１基質の放射標識（すなわち、３３Ｐ−ＡＴＰによるリン酸化形態）を言う。Ｌ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の阻害効果を試験するために用いられたものと同様な条件を用い、また減量したＬ−ＪＢＤ２０を用いた用量応答実験におけるＪＩＰ−ＩＢ１のアミノ酸２０個の最少ＪＮＫ阻害配列（ＪＢＤ２０のＬ体（配列番号：２１））の阻害効果を、図１６Ｂは証明している。Ｌ−ＪＢＤ２０ペプチド（配列番号：２１）単独で（すなわち、ＴＡＴ配列なしで）ＪＮＫ作用を阻害し得ることを、図１６Ｂは示している。またＪＢＤ２０は、ＡＴＦ２、ＩＲＳ−１、ＭＡＤＤ、ｂｃｌ−ｘ１などの他のＪＮＫ標的を阻害することも示された。これらの場合の各々で、ＩＣ５０は、約１μＭであった（データは示していない）。これらの実験において、ＴＡＴ配列は、ＪＢＤ２０に結合されなかった。なぜならば、５０μＭ超の濃度では、ＴＡＴ配列は、抽出液中の蛋白質の非特異的沈殿を引き起こすからである。５０μＭ以下の濃度では、ＴＡＴは、ＪＢＤ２０ペプチド類の阻害特性に影響を与えない。
【０１６３】
ＪＮＫ活性化の阻害におけるＪＮＫＩペプチド類の特異性を測定するために、インビトロ実験を実施した。特に、４０種の異なるキナーゼ類の各々の基質に対する活性に及ぼすこれらのペプチド類（１０μＭペプチド、１０μＭ  ＡＴＰ）の効果を試験した。これらの実験に使用された基質の完全リストは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｐｓｔａｔｅ．ｃｏｍ／ｉｍｇ／ｐｄｆ／ＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒ．ｐｄｆで見ることができる。予想通り、ＪＮＫＩペプチド類は、全てがＪＮＫ−結合ドメインを含んでいるＪＮＫ類ならびにＭＫＫ４およびＭＫＫ７キナーゼに影響を与えた。前記ペプチド類（Ｌ−ＪＮＫＩ１体およびＤ−ＪＮＫＩ１体の双方）は、他の全てのキナーゼ類の活性を妨害することは全くなかった。追加実験により、５００μＭのＪＢＤ２０ペプチド類は６つの特定のキナーゼ類：ＥＲＫ２、ｐ３８、ｐＫＣ、ｐ３４、ｃａＫ、およびｐＫＡの活性を妨害しないことが示された（図１６Ｃ）。これらのキナーゼ類に対する基質は、ＥＲＫ２：ＥＲＫ１；ｐ３８：ＡＴＦ２；ｐ３４、ｐＫＣ、ｐＫＡ：ヒストン；およびｃａＫ；カゼインである。この特異性レベルは、Ｊｕｎ−Ｎ−末端キナーゼの他の小型化学的阻害剤で達成されたものよりはるかに高く、このことから、本発明のＪＮＫＩペプチド類の極めて高い選択性が証明される。Ｊｕｎ−Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の他の小型化学的阻害剤の検討に関しては、参照としてその全体が組み込まれているＢｅｎｎｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）、９８：ｐ．１３６８１−８６（２００１）を参照されたい。
【０１６４】
（実施例２０：ＮＭＤＡ−処理皮質ニューロン内部のＪＮＫ標的に及ぼすＪＮＫＩペプチド類の効果）
ニューロン内部の種々のＪＮＫ標的に及ぼすＪＮＫＩペプチド類の効果を分析するために、一連の実験を実施した。培養液内のＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）で処理した皮質ニューロンにおけるＪＮＫ活性化は、上記の方法を用いて、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎを用いる減弱ＪＮＫについてのキナーゼアッセイによって予測した（例えば、各々が参照として本明細書にその全体が組み込まれているＫｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：ｐ．１３９０−１３９５（１９９８）；Ｃｏｆｆｅｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：ｐ．７６０２−７６１３（２０００）を参照）。これらの実験結果は、図１７〜１８に示されている。
【０１６５】
図１７Ａは、未処理ニューロン（「０」）、１００μＭ  ＮＭＤＡへの曝露１０分後（１０’）、または１００μＭ  ＮＭＤＡへの曝露３０分後のＪＮＫ活性を示している。図１７Ｃの右の２つのレーンは、ＪＮＫ活性化がＤ−ＪＮＫＩ１によって本質的に変化しなかったことを証明している。ＪＮＫ活性の増加は、ＮＭＤＡ処理の３０分後に最大（すなわち２．２倍）となった（図１７Ａ）。ＪＮＫ活性のこの増加は、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の増加という形となる（図１７Ｂ）。細胞透過性ペプチド類のＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の添加によって、１００μＭ  ＮＭＤＡへの曝露５時間後、ＪＮＫ活性が、正常レベルであるにもかかわらず、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎの増加が完全に防止されることが示された。Ｌ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の添加によって、Ｐ−ｃ−Ｊｕｎの濃度は、対照中のＰ−ｃ−Ｊｕｎの濃度以下にさえなった。
【０１６６】
Ｅｌｋ１転写因子を介したＪＮＫの影響下でのｃ−ｆｏｓ遺伝子のＮＭＤＡ誘導転写もまた、Ｌ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の添加によって、完全に防止された（図１７Ｃ）。ｃ−ｆｏｓ発現は、上記実施例１８に記載された方法を用いて抽出されたＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）によって定量化した。図１７Ｃにおけるデータは、アクチンと相対的なｃ−ｆｏｓ発現として示されて（ｎ＝４）。ＪＮＫに媒介されたＴＣＦ／Ｅｌｋ−１リン酸化を介したｃ−ｆｏｓ発現誘導の説明に関しては、参照として本明細書にその全体が組み込まれているＣａｖｉｇｅｌｌｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４：ｐ．５９５７−５９６４（１９９５）を参照されたい。
【０１６７】
経時的なＮＭＤＡ神経毒性およびＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１による神経保護ならびに２つの対照ペプチド、ＴＡＴ−空（すなわちＴＡＴ配列単独で、ＪＢＤ２０配列なし）およびＬ−ＪＮＫＩ１ｍｕｔ（Ｂｏｎｎｙら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：ｐ．７７−８２（２００１）に記載されているとおり、アラニンに変異した６個のアミノ酸を有する）を、参照としてその全体を本明細書に組み込んである。図１８の顕微鏡写真は、処理２４時間後におけるヘキスト染色ニューロンを示している。Ｌ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１ペプチドの添加により、ＮＭＤＡの興奮毒性作用に対して（図１８）、またはカイニン酸の興奮毒性作用に対して（データは示していないが）ニューロンは、完全に保護されたが、対照ペプチドの添加に神経保護効果はなかった。処理１２時間後、Ｌ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１ペプチド双方とも、ニューロン死を防ぐことが示されたが、一方、ＴＡＴ−空ペプチド類には効果がなかった（図１８）。
【０１６８】
図１８に見られるように、本発明の細胞透過性ペプチド類のＤ体、すなわちＤ−ＪＮＫＩ１は、１００μＭ  ＮＭＤＡへの曝露後、長時間、すなわち、１２時間、２４時間および４８時間の間のニューロンの保護において、より優れていた。これらの顕微鏡写真は、対照培養液と、Ｄ−ＪＮＫＩ１およびＮＭＤＡで処理している培養液とが同等であることから、処理２４時間後においてＤ−ＪＮＫＩ１が依然として全体的な神経保護を提供したことを示している。ＪＮＫＩ１のＬ体は、処理２４時間後において、もはやニューロンの保護をしなかったのは、ペプチドのＬ体が一般に分解をより受け易いためと思われる。ＴＡＴ−空ペプチド類は、いかなる条件下でも、細胞死に影響を与えなかった。ペトリ皿培地中のＬＤＨ活性によって示されるように、図１８のヒストグラムは、１００μＭ  ＮＭＤＡへの曝露１２時間後、２４時間後および４８時間後におけるニューロン死の程度を示している。吸光度値を総ＬＤＨに関する平均吸光度で割ることにより、ＬＤＨ濃度を表す吸光度値は、％ニューロン死の値に変換されている。総ＬＤＨに関する平均吸光度は、培地プラス溶解ニューロンから得られた。
【０１６９】
（実施例２１：細胞透過性ＪＮＫＩペプチド類のインビボ送達）
インビボ適用における細胞透過性ペプチド類の使用可能性を試験するために、ＦＩＴＣで標識したＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１を用いて、脳内へ浸透するそれらの能力を評価した。生物学的活性蛋白質のマウスへのインビボ送達についての検討に関しては、参照として本明細書にその全体が組み込まれているＳｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５：ｐ．１５６９〜７２（１９９９）を参照されたい。これらの実験により、ＦＩＴＣで標識したＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の双方とも、成体マウスおよび種々の年齢のラットの血液−脳関門を通過でき、ニューロン内へ浸透できることが示された。ＦＩＴＣで標識したＬ−ＪＮＫＩ１およびＤ−ＪＮＫＩ１の双方とも、、腹腔内注射の１時間以内にニューロン内へ浸透することができた。（データは示していない）。
【０１７０】
（実施例２２：一時的および永続的焦点大脳虚血に対するＪＮＫＩペプチド類による神経保護）
マウスにおける軽度虚血のモデルにおいて、左中央大脳動脈を３０分間閉塞させ、続いて４８時間の灌流を行った。対照媒体処理群は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみの注射を受けた。対照媒体処理群では、この閉塞は、重篤なピクノーゼ細胞を含有する顕著な梗塞を系統的に引き起こし、これらは主に全ての脳の皮質および層に見られ、脳のうち７つで、これらの細胞が海馬においても見られた。対照媒体処理群において、それらの被験体における平均梗塞容積は６７．４ｍｍ３であった（ｎ＝１２）。
【０１７１】
有効性および治療の「治療的ウィンドー」（すなわち、本発明のペプチド類による治療が有効性を保つ傷害後の時間枠）を評価するために、被験体を、Ｄ−ＪＮＫＩ１（２μＬのＰＢＳ中１５．７ｎｇ）の大脳内−脳室（ｉｃｖ）注射により処理した。図１９Ａは生じる梗塞の典型的な例を示すクレシルバイオレット染色切片を示している（棒線、１ｍｍ）。図１９Ｂは、中央大脳動脈閉塞前（−１時間）または後（＋３、６または１２時間）の種々の時点におけるＤ−ＪＮＫＩ１のｉｃｖ注射後の梗塞容積を示している。図１９Ｂにおいて、星印は、結果が、統計的に対照と異なっている（ｔ−検定で示された）ことを示している。
【０１７２】
中央大脳動脈閉塞１時間前のＤ−ＪＮＫＩ１のｉｃｖ注射による前処理によって、灌流４８時間前後に測定した梗塞容積は８８％、７．８ｍｍ３の容積に著しく減少した（図１９Ａ〜１９Ｂ）。閉塞３時間後に注射された被験体に関する平均梗塞容積は、５．８ｍｍ３に減少し（未処理マウスに較べて９１％の減少）、閉塞６時間後に注射された被験体に関する平均梗塞容積は、４．８ｍｍ３に減少（未処理マウスに較べて９３％の減少）したため、中央大脳動脈閉塞の３時間後または６時間後におけるＤ−ＪＮＫＩ１ペプチド投与は、依然として保護的効能があった。これとは対照的に中央大脳動脈閉塞１２時間後におけるＤ−ＪＮＫＩ１ペプチド注射は、それほど目だって保護的ではなかった。再灌流後の完全虚血の達成は、全マウスにおいて、左中央大脳動脈領域における局所大脳血流のモニタリングにより確認した。
【０１７３】
また幼若（Ｐ１４）ラットにおける永続的焦点虚血に対するＤ−ＪＮＫＩの保護能力も評価した。中央大脳動脈の永続的閉塞実施によるＰ１４ラットの大脳皮質における虚血区域により、頭頂側頭骨皮質に限定された広い変性区域が誘導された。Ｐ１４ラットの脳容積は変化し得るため、傷害は、大脳半球容積のパーセンテージとして表された。Ｄ−ＪＮＫＩ１は、約３４０μｇに相当する１１ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内注射された。Ｄ−ＪＮＫＩ１は、中央大脳動脈閉塞の３０分前、または閉塞６時間後または１２時間後に投与された。ラットは閉塞２４時間後に固定した。これらの各時点で（すなわち、−３０分、＋６時間または＋１２時間での投与）、Ｄ−ＪＮＫＩ１は、対照ラットに較べて統計的に大きな有意の梗塞容積の減少をもたらした（図２０Ａ〜２０Ｂ）。閉塞３０分前でのＤ−ＪＮＫＩ１投与により、６８％の梗塞容積減少に至ったが、閉塞６時間後および閉塞１２時間後のペプチド投与では、それぞれ、７８％と４９％の梗塞容積減少に至った。
【０１７４】
永続的虚血を有する仔ラットの脳における主要なＪＮＫ標的であるｃ−Ｊｕｎ転写因子の活性化を測定するために、免疫組織化学分析を実施した。梗塞周囲の皮質における多くのニューロン内で、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化は明白であった（図５Ｃ、ｂａｒ＝２００μＭ）。これとは対照的にＤ−ＪＮＫＩ１ペプチドで処理した脳内では、梗塞周囲皮質は陰性であり、梗塞領域の境界における陽性ニューロンが少数検出されただけであった。
【０１７５】
（実施例２２：ＪＮＫＩペプチド類の副作用の可能性についての行動的評価）
一般に、他の神経保護的化合物の高い毒性により、それらの臨床的使用は厳しく制限されてきた（参照としてその全体が組み込まれているＧｌａｄｓｔｏｎｅら、Ｓｔｒｏｋｅ、３３：ｐ．２１２３−３６（２００２）を参照）。種々の用量のＤ−ＪＮＫＩ１およびＭＫ−８０１の治療用量（１ｍｇ／Ｋｇ、標準的治療用量）の可能的副作用の基準として、水平な回転棒上で自身を保持するマウスの能力を用いた。特にＤ−ＪＮＫＩ１のｉ．ｐ．注射（１１ｍｇ／ｋｇおよび１１０ｍｇ／ｋｇ）およびｉｃｖ注射（１５．７ｎｇまたは１５７ｎｇのＤ−ＪＮＫＩ１を含有する２μｌ）双方の３時間後、２４時間後、６日後および１２日後に回転棒試験を用いて、マウスの運動機能を評価した。この評価操作時にＭＫ−８０１（１ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射剤を対照化合物として用いた。
【０１７６】
対照間の変化性を減少させるために、実験日の前日と実験日の朝、マウスを訓練した。訓練および試験双方の時間は、対照マウスと注射マウスで同一であった。注射直前および注射１日後、６日後、および１２日後に各マウスの運動機能を検査した。４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで一様に加速」するようにプログラムされた回転棒上にマウスを置いた。試験した各マウスに関して落下までの潜伏時間を記録した。回転棒法を用いたこの評価の結果は、落下までの潜伏時間（秒で測定）中央値として表２に示している。
【０１７７】
【表２】
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表２に見られるように、ｉ．ｐ．とｉｃｖ双方のＤ−ＪＮＫＩ１の用量（すなわち、９０神経保護を提供した２．８μｌ／ｋｇ用量と１０倍の高用量の双方）によって、運動整合は損なわれないことが判明した。これとは対照的に、ＭＫ−８０１では、マウスが回転輪の上に乗ることができず、運動整合の著しい減損に至り、（例えば、表２；Ｄａｗｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９２：３４４：３５０（２００１））（他の神経保護剤に関して同様の結果を記述している）、また、ＭＫ−８０１の１０倍高用量により、全マウスが死亡した。低用量ＭＫ−８０１の副作用は、２４時間後、本質的には消失することがわかった。Ｄ−ＪＮＫＩ１による処理６日後、および１５日後、運動整合減損の徴候は見られず、回転棒評点は、対照マウスよりも良好で再現性があった。
【０１７８】
（同等物）
本発明の特定な実施形態の前述の詳細な説明から、独自の細胞透過性生物活性ペプチド類が説明されたことは明白である。特定の実施形態が、本明細書に詳細に開示されたが、これは例示のみを目的とした例としてなされたのであって、以下の添付請求項の範囲に関する限定を意図してはいない。特に本発明に対して種々の置換、変更および修飾が、請求項によって規定された本発明の精神と範囲から逸脱することなくなされ得ることが、本発明者によって考慮されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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