(57)【要約】【課題】従来の表面プラズモン共鳴を利用した被検物質濃度の計測方法に於いては、被検溶液の屈折率変動により、計測値が影響を受け精度が制限されていた。【解決手段】被検物質と強く結合する第１の領域と、被検物質と弱く結合する第２の領域を設けて、第１の領域の吸収スペクトルと第２の領域の吸収スペクトルと比較することで、被検物質濃度を算出する。【選択図】図３
2010107206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局在化表面プラズモン共鳴を利用して被検物質濃度を計測する方法であって、
局在化表面プラズモン共鳴が発生する第１の領域、第２の領域に対して、
前記第１の領域に前記被検物質と結合する第１の物質を固定化し、
前記第２の領域には、前記被検物質と結合する親和性が第１の物質より小さい第２の物質を固定化し、
前記第１の領域と前記第２の領域のそれぞれの局在化表面プラズモン共鳴波長の前記被検物質濃度依存性と
前記第１の領域と前記第２の領域のそれぞれの局在化表面プラズモン共鳴波長の前記被検物質を含有する被検溶液の屈折率依存性と、
前記第１の領域と、前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長と
に基づき前記被検物質の濃度を決定することを特徴とする特定物質濃度計測方法。
【請求項２】
局在化表面プラズモン共鳴を利用して被検物質濃度を計測する方法であって、
局在化表面プラズモン共鳴が発生する第１の領域、第２の領域に対して、
前記第１の領域に前記被検物質と結合する第１の物質を固定化し、
前記第２の領域には、前記被検物質と結合する親和性が前記第１の物質より小さい第２の物質を固定化し、
前記被検物質濃度が一定の際は、前記被検物質を含有する被検溶液の屈折率変化に対して前記第１の領域１と前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の変化が同一である様に、前記第１の物質と前記第２の物質の固定化量を調整し、
前記第１の領域と、前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の差に基づき前記被検物質の濃度を決定することを特徴とする特定物質濃度計測方法。
【請求項３】
局在化表面プラズモン共鳴を利用して被検物質濃度を計測する方法であって、
局在化表面プラズモン共鳴が発生する第１の領域、第２の領域に対して、
前記第１の領域に前記被検物質と結合する第１の物質を固定化し、
前記第２の領域には、前記被検物質と結合する親和性が前記第１の物質より小さい第２の物質を固定化し、
前記被検物質濃度がゼロの時の前記第１の領域と前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長が同一である様に、前記第１の抗体と前記第２の抗体の固定化量を調整し、
前記第１の領域と、前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の差に基づき前記被検物質の濃度を決定することを特徴とする特定物質濃度計測方法。
【請求項４】
前記第１の物質と前記第２の物質がモノクローナル抗体で、前記第１の領域と、前記第２の領域への固定化量が同一であることを特徴とする、請求項１〜３の前記特定物質濃度計測方法。
【請求項５】
波長がλ１の光と波長がλ２（≠λ１）の光を（重ねて）、前記第１の領域及び前記第２の領域に照射し、
前記第１の領域を透過した波長がλ１の光と波長がλ２（≠λ１）の光の強度差Ｓ１と
前記第２の領域を透過した波長がλ１の光と波長がλ２（≠λ１）の光の強度差Ｓ２とを計測し、
Ｓ１とＳ２に基づき前記第１の領域と前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の差を算出する方法で、
λ１は、前記被検物質濃度が最大時の前記第１の領域の共鳴波長と同一で、λ２は被検物質の濃度がゼロ時の前記第１の領域及び前記第２の領域の共鳴波長と同一であることを特徴とする請求項３に記載の特定物質濃度計測方法。
【請求項６】
波長がλ１の第１の略平行光を発する第１の光源と、
波長がλ２の第２の略平行光を発する第２の光源と、
前記第１の略平行光と前記第２の略平行光の光路を重ねて略平行光１２を形成し前記第１の領域に照射する光路重畳素子と、前記光路重畳素子を出射した略平行光１２のうち半分を反射するハーフミラーと、
ハーフミラーを反射した略平行光１２を反射して前記第２の領域に照射するミラーと、
前記第１の領域を透過した略平行光１２のうち前記第１の略平行光の成分を透過し前記第２の略平行光の成分を反射する第１の分光フィルターと、
前記第２の領域を透過した略平行光１２のうち前記第１の略平行光の成分を透過し前記第２の略平行光の成分を反射する第２の分光フィルターと、
前記第１の分光フィルターを透過した前記第１の略平行光の成分を検出する第１の光センサと、
前記第１の分光フィルターを反射した前記第２の略平行光の成分を検出する第２の光センサと、
前記第２の分光フィルターを透過した前記第１の略平行光の成分を検出する第３の光センサと、
前記第２の分光フィルターを反射した前記第２の略平行光の成分を検出する第４の光センサと、
前記第１の光センサの出力信号と前記第２の光センサの出力信号との差信号Ｓ１を発生する第１の差分器と、
前記第３の光センサの出力信号と前記第４の光センサの出力信号との差信号Ｓ２を発生する第２の差分器と、
Ｓ１とＳ２に基づき前記第１の領域と前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の差を算出するコンピューターと
を備えたことを特徴とする、請求項５に記載の特定物質濃度計測方法を用いる特定物質濃度計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属に光を照射することで発生する表面プラズモン共鳴を利用して、特定物質の濃度を計測する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン共鳴を利用した計測技術の一例としては、伝播型と呼ばれるものがある。これは、三角プリズムの一面に金属の薄膜を形成してこの金属薄膜を介して被検試料に接触させている。そして、プリズムの別の面から金属膜の被検試料に接触しない面に光を照射している。この光が金属薄膜に入射する角度が特定の値になると、表面プラズモン共鳴が発生する。表面プラズモン共鳴が発生する時の、光が金属薄膜に入射する角度（共鳴角度）は、金属薄膜から約１００ｎｍ以内の領域にある被検試料の屈折率に依存する。また、この金属薄膜上に抗体を固定化しておくと、被検試料中の抗原と抗体が結合することで、金属薄膜近傍（約１００ｎｍ以内の領域）の屈折率が変化する。従って、共鳴角度を計測することで、被検試料中の抗原濃度を算出できる。
【０００３】
一方、別な一例としては、局在型と呼ばれるものがあり、金属微粒子や、誘電体微粒子に金属がコーティングされた微細構造体に光を照射すると発生する局在化表面プラズモン共鳴を利用した方法である。局在化表面プラズモン共鳴が発生する波長は、金属微粒子や微細構造体周辺（球形金属微粒子の場合は、その半径程度）の領域にある被検試料の屈折率に依存する。この金属、微粒子や微細構造体上に抗体を固定化しておくと、被検試料中の抗原と抗体が結合することで、金属微粒子や微細構造体周辺の屈折率が変化する。従って、金属微粒子や微細構造体の透過光や反射光を分光して吸収スペクトルを観測し、共鳴波長を計測することで、被検試料中の抗原濃度を算出できる。
【０００４】
この局在化表面プラズモン共鳴を利用した方法としは、基板上の複数領域に微細構造体を形成し、領域毎の局在化表面プラズモン共鳴を観測し、その共鳴波長より濃度を算出する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。ここでは、ある領域に形成された微細構造体には生体分子と結合する抗体等が固定化され、この領域（信号領域）は生体分子の濃度を反映した共鳴波長を示す。別な領域に形成された微細構造体には生体分子とは結合反応が起こらない処理が施され参照領域としている。信号領域と参照領域共鳴波長を同時に観測し、これらの差より生体分子の濃度を算出している。また、信号領域を設けない場合は、生体分子と反応させる前後の信号領域の共鳴波長の差から算出する。同様に、生体分子と反応させる前後での信号領域の共鳴波長の差から算出する方法は、特許文献２にも開示されている。
【特許文献１】特許第3528800号公報（図1）
【特許文献２】特開2007-71667号公報（図2）
【特許文献３】特開平０５−２８８６７２号公報
【特許文献４】特開平０９−２５７６９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、局在化表面プラズモン共鳴における共鳴波長は、微粒子等の周辺の屈折率に影響を受けるので、微粒子上に固定された抗体と被検物質との結合反応だけに依存するわけではない。なぜなら、微粒子等の周辺の屈折率は、被検物質を含有している、血液、尿、唾液、汗等の溶液の屈折率にも影響されるからである。即ち、被検物質の濃度が一定でも、他の成分の濃度が変化することで溶液の屈折率が変化すると、共鳴波長が変化するので、被検物質の濃度が変化したかのように見えてしまう。これは、被検物質に対する特異性が低下し、計測精度が劣化することを意味する。特許文献１、２には、この様な溶液の屈折率変動による特異性低下の影響や、対策が開示されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、局在化表面プラズモン共鳴を利用して被検物質濃度を計測する方法であって、
局在化表面プラズモン共鳴が発生する第１の領域、第２の領域に対して、
前記第１の領域に前記被検物質と結合する第１の物質を固定化し、
前記第２の領域には、前記被検物質と結合する親和性が第１の物質より小さい第２の物質を固定化し、
前記第１の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の前記被検物質濃度依存性と
前記第１の領域と前記第２の領域のそれぞれの局在化表面プラズモン共鳴波長の前記被検物質を含有する被検溶液の屈折率依存性と、
前記第１の領域と、前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長と
に基づき前記被検物質の濃度を決定する特定物質濃度計測方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、濃度を計測する特定物質（被検物質）を含有する溶液の屈折率変化を補償でき、特異性を確保できる。
【０００８】
特に、被検物質が、血液、尿、唾液、汗等の体液中に存在する疾患マーカーやホルモン等の場合は有効である。この理由を以下に述べる。
【０００９】
体液中ではこれらの被検物質の濃度は極めて低い（１０-15〜１０-8Ｍ）。これに比べると、共存物質であるアルブミンやグロブリンの血液中の濃度は遥かに高い（１０-3Ｍ程度）。従って、血液の屈折率への寄与する度合いもアルブミンやグロブリンの方が遥かに高い。アルブミンやグロブリンの濃度は、個体間で倍程度のバラツキがあり、これが個体間での血液の屈折率バラツキをもたらす。タンパク質も場合、濃度＝１[mg/dl]変化させると屈折率＝１．９×１０-6程度変化する。例えばアルブミンの場合、血液中の濃度は２０００[mg/dl]程度の個体差が存在する。従って、屈折率は４×１０-3程度は個体間で変動する。微粒子が金、銀の球形微粒子の場合、屈折率が1変化すると１００ｎｍ程度共鳴波長がシフトので、個体間で共鳴波長は０．４ｎｍ程度で変動する。一方、被検溶液の１０-13Ｍ程度の濃度変化による共鳴波長シフトは、１０-4nm程度であり、個体間の被検溶液の屈折率変動の方が大きい。さらに、血液中には、糖分、塩分等が屈折率に影響を及ぼす。
【００１０】
本発明は、被検物質の濃度が低く、かつ共存物質の濃度変化が大きくこれに伴う溶液の屈折率変化が大きい場合に特に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施の形態１）
本発明の特定物質計測方法の第１の形態を図１〜５を用いて説明する。
【００１２】
図１は、局在化表面プラズモン共鳴が発生する第１の領域を示す。図１において、１は透明なガラス等の基板、２は金、銀等の金属微粒子（粒径＝数nm〜１００ｎｍ程度）で基板上に固定化されている。３は金属微粒子２上に固定化された第１の抗体である。４は第１の抗体と結合する抗原を示す。
【００１３】
図２は、局在化表面プラズモン共鳴が発生する第２の領域を示す。図２において、１、２、４は図１の１、２、４と同一の物をである。５は、抗原４と結合する親和性が第１の抗体よりも低い第２の抗体２を示す。
【００１４】
図３は、第１の領域と第２の領域に光を照射し局在化表面プラズモン共鳴を発生させ、その吸収スペクトルを観測する計測系を示す。図において、１は図１，２で示した基板である。６は透明なカバーガラスで、７で示すスペーサと基板１とで形成される空間に被検溶液を保持する。この空間を被検溶液保持空間１８として示している。８は図１に示した第１の領域で、９は図２に示した第２の領域で、１で示した基板は共通である。１０はハロゲンランプと光学系からなる光源で、矢印で示す略平行光を発する。１１は、音響光学フィルターで、光源からの略平行光の中から特定波長の成分を抽出する。音響光学フィルター１１は、供給される信号の周波数で、抽出する波長を制御できる。１２はハーフミラーで、音響光学フィルター１１で抽出された特定波長の略平行光の半分を透過し第１の領域に照射する。そして、残りの半分を反射する。１３は全反射ミラーで、ハーフミラー１２で反射された略平行光を反射して第２の領域に照射する。１４は第１の光センサで第１の領域の透過光を検出し，１５は第２の光センサで第２の領域の透過光を検出する。１６は、駆動器で、音響光学フィルター１１に任意の周波数の信号を供給する。１７はコンピューターで、駆動器１６へ音響光学フィルター１１に供給する周波数を指示することで、第１の領域１と第２の領域へ照射する略平行光の波長を制御する。
【００１５】
この図３の計測系の動作例図４〜５を用いて説明する。コンピューター１７が駆動器１６を制御し、音響光学フィルター１７が抽出する波長を３７０ｎｍから６７０ｎｍまで掃引する。この際の第１の光センサ１４の出力信号は、第１の領域の透過光強度に相当し、第２の光センサ１５の出力信号は第２の領域の透過光強度に相当する。抗原４の濃度がゼロの被検溶液を被検溶液保持空間１８に保持したときの、第１の領域の吸収スペクトルを図４の太実線に示し、第２の領域の吸収スペクトルを図４の細実線に示す。図４において、横軸は音響光学フィルター１１を駆動する周波数で第１、２の領域に照射するλに相当し、縦軸は第１，２の光センサの出力信号で第１、２の領域の透過光強度に相当する。微粒子２が球形で金の場合、透過光強度が最小値を示す波長即ち共鳴波長は５２０nm付近に表れ、微粒子２が球形で銀の場合、共鳴波長は４００nm付近に表れる。
【００１６】
被検溶液中の抗原４の濃度が増加すると、第１の抗体を結合する抗原４の数が増加し、微粒子２の周辺の屈折率が増加する。これに伴い第１の領域の吸収スペクトルの共鳴波長は長波長側へシフトする（図４の太点線）。一方、第２の抗体と結合する抗原４の数は、第１の抗体と結合する抗原の数よりも少ないので、第２の領域の吸収スペクトルの共鳴波長の長波長側へのシフトは、第１の領域の共鳴波長の長波長側へシフトと比べて小さい。この様子を図５の実線に示す。図５では、横軸は抗原の濃度を、縦軸は第１、２の領域の共鳴波長を示す。第１の領域の共鳴波長を太実線に示し、第２の領域の共鳴波長を細実線に示している。ここで、第２の抗体の抗原４に対する親和性がゼロの場合は、第２の領域の共鳴波長は実質的に長波長側へシフトしない。即ち、図５において細実線の傾きがゼロになる。この関係を以下の（式１，２）に示す。
【００１７】
Δλ１ag＝ｋ１ΔCag   （式１）
Δλ２ag＝ｋ２ΔCag   （式２）
ここで、
Δλ１ag：抗原濃度のみが変化した時の第１の領域の共鳴波長のシフト
Δλ１ag：抗原濃度のみが変化した時の第２の領域の共鳴波長のシフト
ΔCab  ：抗原濃度変化
ｋ１    ：第１の抗体の親和性に比例する定数
ｋ2    :第２の抗体の親和性に比例する定数
次に、被検溶液中の抗原４の濃度が一定の場合を示す。抗原４の濃度が一定の場合、被検溶液の屈折率が一定である限りは、第１の領域と第２の領域の吸収スペクトルは変化しない。ところが、抗原４の濃度が一定であっても、抗原４以外の成分の濃度変動により、被検溶液の屈折率が変化すると、第１の領域と第２の領域の吸収スペクトルは変化する。この様子を図５の点線及び一点鎖線に示す。図５では、第１の領域の共鳴波長を太点線及び太一点鎖線に示し、第２の領域の共鳴波長を細点線及び細一点鎖線に示している。被検溶液の屈折率が大きくなるに伴い、実線から点線に、更に、一点鎖線へと長波長側へ平行移動する。この関係を以下の（式３，４）に示す。
【００１８】
Δλ１ｓ＝l１Δｎｓ          （式３）
Δλ２ｓ＝l２Δｎｓ          （式４）
ここで、
Δλ１ｓ：被検溶液の屈折率のみが変化した時の第１の領域の共鳴波長のシフト
Δλ２ｓ：被検溶液の屈折率のみが変化した時の第２の領域の共鳴波長のシフト
Δｎｓ  ：被検溶液の屈折率変化
l１      ：第１の抗体の屈折率と固定化量に依存する定数
l２      :第２の抗体の屈折率と固定化量に依存する定数
（式１，２，３，４）をまとめると以下の（式５，６）が得られる
Δλ１＝Δλ１ag ＋Δλ１ｓ＝ｋ１Δcag＋l１Δｎｓ （式５）
Δλ２＝Δλ２ag ＋Δλ２ｓ＝ｋ２Δcag＋l２Δｎｓ （式６）
ここで、
Δλ１：第１の領域の共鳴波長のシフト
Δλ２：第２の領域の共鳴波長のシフト
（式５，６）に示すように、共鳴波長のシフトは抗原の濃度変化と、被検溶液の屈折率変化に依存する。被検溶液が体液の場合、被検物質である抗原の濃度が未知であるだけでなく、屈折率も未知である。従って、第１の領域の共鳴波長のシフト（Δλ１）のみを観測した場合、（式５）から明らかな様に、Δcagを特定することができない。ところが、さらに第２の領域の共鳴波長のシフト（Δλ２）を観測し（式６）を得ると、（式５、６）の連立方程式から、Δcagを特定できる。なお、第１、２の領域の共鳴波長λ１、λ２は以下の（式７，８）で表現される。
【００１９】
λ１＝λ（０）１＋Δλ１     （式７）
λ２＝λ（０）２＋Δλ２     （式８）
ここで、
λ１：第１の領域の共鳴波長
λ２：第２の領域の共鳴波長
λ（０）１：被検物質濃度＝０かつ被検溶液の屈折率が最低の時の第１の領域の共鳴波長
λ（０）２：被検物質濃度＝０かつ被検溶液の屈折率が最低の時の第２の領域の共鳴波長
次に、（式５、６）の連立方程式から、Δcagを特定するために必要な、ｋ１とｋ２及びｌ１とｌ２を決定する方法を説明する。まず、被検物質である抗原濃度が様々である被検溶液を作成する。なお、この抗原濃度の範囲は、体液などの被検溶液が示す濃度範囲であれば十分である。例えば、疾患マーカーやホルモンであれば、濃度は極めて低い（１０-15Ｍ〜１０-8Ｍ）範囲で十分である。この範囲であれば、屈折率変化は１０-7程度なので、屈折率変化は実質的に無視できる。抗原濃度が様々である被検溶液で、第１、２の領域の吸収スペクトルを観測して図５に相当するグラフを作成し、ｋ１、ｋ２を決定する。また、抗原濃度＝０で様々な屈折率の被検溶液で、第１、２の領域の吸収スペクトルを観測して図５に相当するグラフを作成し共鳴波長の屈折率依存性を求め、ｌ１、ｌ２を決定する。なお、抗原濃度＝０で様々な屈折率の被検溶液を作成するには、例えば、アルブミンやグロブリンを利用すると良い。タンパク質も場合、濃度＝１[mg/dl]変化させると屈折率＝１．９×１０-6程度変化するので、濃度を０〜１００００[mg/dl]の被検溶液を作成すると屈折率を１．９×１０-2程度変化させれるので、純水で作成すると、屈折率＝１．３３３（純水の屈折率）〜１．３５２の間で制御できる。上記の方法で、あらかじめｋ１とｋ２及びｌ１とｌ２を確認できる。なお、この値は、同一条件で製造された第１、２の領域であれば、すべて同一と見なせる。従って、同一条件で製造された第１、２の領域を有するセンサデバイスの中から、必要数をサンプリングして、上記計測を実施して、ｋ１とｋ２及びｌ１とｌ２を確認する。
【００２０】
被検溶液の抗原濃度は以下の様に算出する。まず、抗原濃度＝０で、屈折率が最低の被検溶液を準備する。例えば、被検溶液が体液の場合は生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline, PBS）等の生化学用の緩衝液を準備し、被検溶液の屈折率が生理食塩水よりも低い可能性があれば、純水を準備する。そして、準備した生理食塩水等を被検溶液保持空間１８に保持した状態で第１、２の領域の吸収スペクトルを観測し、この時の共鳴波長λ（０）１、λ（０）２を記録する。そして、被検溶液に入れ替え、第１、２の領域の吸収スペクトルを観測し、共鳴波長λ１、λ２を得る。そして、共鳴波長のシフト即ちΔλ１とΔλ２を（式）７より求め、（式５，６）よりΔcagを算出する。ここで、最初に計測した溶液の抗原濃度＝０であったので、Δcagが被検溶液中の抗原濃度である。
【００２１】
以上のように、本発明の特定物質計測方法によると、濃度を計測する特定物質（被検物質）を含有する溶液の屈折率変化を補償できる。特に、被検物質の濃度が低く、かつ共存物質の濃度変化が大きくこれに伴う溶液の屈折率変化が大きい場合に有効である。さらに、本実施の形態の場合、抗原濃度＝０で、屈折率が最低の生理食塩水等で、λ（０）１及びλ（０）１を確認してから、被検溶液に対するλ１及びλ２を計測し、Δλ１及びΔλ２を決定してΔcagを算出しているので、共鳴波長の計測値の絶対値変動の影響を低減できる。即ち、音響光学フィルターの抽出波長の絶対値の日差変動等の影響を回避でき、高精度化に有利である。
【００２２】
なお、本実施の形態では、被検物質と結合する物質として抗体で説明したが他の物質でも同様の効果が得られる。
【００２３】
（実施の形態２）
本発明の特定物質計測方法の別な形態について説明する。
【００２４】
本実施の形態は、実施の形態１で利用した抗原濃度＝０で、屈折率が最低の生理食塩水等を利用しない場合である。
【００２５】
被検溶液を被検溶液保持空間１８に保持した状態で第１、２の領域の吸収スペクトルを観測し、この時の共鳴波長λ１、λ２を得る。ここで、（式７）−（式８）を計算すると、次の（式９）が得られる。
【００２６】
λ１−λ２＝λ（０）１−λ（０）２＋Δλ１−Δλ２
＝λ（０）１−λ（０）２＋（ｋ１−ｋ２）Δcag＋（l１−ｌ２）Δｎ      ｓ  （式９）
ここで、λ（０）１−λ（０）２は、同一条件で製造された第１、２の領域であれば、すべて同一と見なせる。従って、同一条件で製造された第１、２の領域を有するセンサデバイスの中から、必要数をサンプリングして、屈折率が最低の生理食塩水を用いて、λ（０）１−λ（０）２をあらかじめ計測しておくことで既知となる。さらに、微粒子２への第１の抗体の固定化量と第２の抗体の固定化量を調整すると、被検溶液の屈折率変化に対して、第１の領域と第２の領域の共鳴波長の変化を同一にすることができる。即ちl１＝l２を満足させることができる。この場合、第１、２の領域の共鳴波長を観測して得られたλ１−λ２より、（式９）を用いてΔcagを算出できる。
【００２７】
次に、上記の抗体の固定化量の調整について説明する。
【００２８】
微粒子２が金、銀等の金属微粒子の場合は、抗体を純水に溶解させ抗体水溶液を作成し、この抗体水溶液に微粒子を混入することで、微粒子上に抗体を固定化することができる。この抗体水溶液の抗体濃度を調整することで、微粒子への固定化量を制御できる。即ち、抗体濃度を増加すると、固定化量を増加できる。様々な量の抗体を固定化して、第１、２の領域を形成し、抗原濃度＝０で様々な屈折率の被検溶液で、吸収スペクトルを観測して、l１、l２の抗体水溶液濃度依存性を求める。そして、l１＝l２を満足させる抗体濃度を決定する。なお、微粒子への抗体の固定化量が増加すると、l１とl２は低下する。なぜなら、微粒子の周囲を抗体が覆う量が増加するのに伴い、抗体の屈折率の寄与度合いが被検溶液の屈折率の寄与度合いよりも大きくなるからである。
【００２９】
さらに、上記の方法で、l１＝l２を満足させた第１、２の領域を用いて、実施の形態１と同様の方法で、ｋ１とｋ２を決定する。なお、実施の形態１と同様に、この値は、同一条件で製造された第１、２の領域であれば、すべて同一と見なせる。従って、同一条件で製造された第１、２の領域を有するセンサデバイスの中から、必要数をサンプリングして、上記計測を実施して、ｋ１とｋ２及びｌ１＝ｌ２を確認する。
【００３０】
上記のように、l１＝l２を満足させ、λ（０）１−λ（０）２及びｋ１、ｋ２が既知のセンサデバイスでは、被検溶液を被検溶液保持空間１８に保持した状態で第１、２の領域の吸収スペクトルを観測し、この時の共鳴波長λ１とλ２を求め、（式９）よりΔcagを算出する。ここで、λ（０）１−λ（０）２は、溶液の抗原濃度＝０で有る時の共鳴波長の差なので、Δcagが被検溶液中の抗原濃度である。
【００３１】
以上のように、本発明の特定物質計測方法によると、濃度を計測する特定物質（被検物質）を含有する溶液の屈折率変化を補償できる。更に、実施の形態１のように、抗原濃度＝０で、屈折率が最低の生理食塩水等で計測する必要がなく、簡易性にも優れている。また、本実施の形態の場合、被検溶液に対するλ１及びλ２を計測し、λ１−λ２を決定して（式９）よりΔcagを算出しているので、共鳴波長の計測値の絶対値変動の影響を低減できる。即ち、音響光学フィルターの抽出波長の絶対値の日差変動等の影響を回避でき、高精度化に有利である。
【００３２】
（実施の形態３）
本発明の特定物質計測方法の別な形態を図６〜７を用いて説明する。
【００３３】
本実施の形態は、抗原濃度＝０の時の、第１、２の領域の共鳴波長が同一の場合である。これは、実施の形態２で示したλ（０）１−λ（０）２＝０の場合に相当する。
この場合、実施の形態１で示した図５は、図６の様になる。図６の縦軸、横軸、実線、点線、一点鎖線等の表記は図５と同一なものを示す。ただし、図６では、抗原濃度＝０では、太線と細線が交わっている。
【００３４】
この様にすると、共鳴波長を決定するための波長の掃引範囲を狭めることができる。なぜなら、波長掃引範囲は、被検溶液中の抗原濃度＝０でかつ被検溶液の屈折率が最低の時の共鳴波長から、被検溶液中の抗原濃度が最大で、かつ被検溶液の屈折率が最大の時の共鳴波長までで、十分であるからである。即ち、波長掃引範囲は濃度の最大変動幅と、被検溶液の屈折率の最大変動幅の合計で決まる。一方、実施の形態１の様に、抗原濃度＝０の時の、第１、２の領域の共鳴波長が異なる場合は、この差の分だけ掃引範囲を拡大する必要がある。波長の掃引範囲を狭めることができれば、音響光学フィルター１１での波長の掃引時間を短縮できるので、計測の迅速化を実現できる。一方、掃引時間を一定にした場合、波長の掃引速度を低下することができ、共鳴波長を求める際の分解能を向上させれる。共鳴波長の分解能を向上させることは、濃度の算出精度を向上させることを意味する。
【００３５】
次に、抗原濃度＝０の時の、第１、２の領域の共鳴波長を同一にする方法について述べる。球形の微粒子に抗体を固定化した時の、模式図を図６に示す。図６において、実効吸着層厚さは、抗体の物理的な寸法と抗体の数で決まる仮想的な数値である。ここで、第１の抗体と第２の抗体がモノクローナル抗体であれば、その物理的な寸法は、実質的に同一とみなせるので、実効吸着層厚さは、微粒子に固定化される抗体の数即ち、固定化量で決定される。また、共鳴波長は、実効吸着層厚さと抗体の屈折率によって決定される。ここでも、抗体がモノクローナル抗体であれば、その屈折率は、実質的に同一とみなせる。従って、第１の抗体と第２の抗体がモノクローナル抗体であれば、固定化量を同一にすると、共鳴波長を同一にすることができる。これにより、自動的に抗体の屈折率と固定化量に依存する定数であるl１とl２も、同一になる、即ちｌ１＝ｌ２を満足させることができる。
【００３６】
本実施の形態は、被検物質への親和性が異なる抗体であっても、モノクローナル抗体であれば、物理的な寸法が実質的に同一かつ屈折率が実質的に同一である条件を満足しているという特性を利用している。さらに、本来なら結合しない物質との結合（非特異結合）する能力もモノクローナル抗体であれば同一であるので、この非特異結合の影響も補償することができる。
【００３７】
以上の様に、本実施の形態の様に、第１の抗体及び第２の抗体として、モノクローナル抗体を用いて微粒子に同一量固定化することで、第１及び第２の領域の共鳴波長を同一にしかつｌ１＝ｌ２を満足させることができる。これによって、計測の迅速化や、濃度算出の高精度化を実現できる。
【００３８】
（実施の形態４）
本発明の特定物質計測方法の別な形態を図８〜１０を用いて説明する。本実施の形態は実施の形態３を実現する装置に関するもので、第１及び第２の領域の共鳴波長が同一でかつｌ１＝ｌ２の場合である。
【００３９】
図８において、１，６，７，８，９，１２，１３、１８は、図３の、１，６，７，８，９，１２，１３、１８と同一である。
１９は波長がλ１の第１の略平行光を発する第１の光源、２０は波長がλ２の第２の略平行光を発する第２の光源、２１は第１の略平行光と第２の略平行光の光路を重ねて略平行光１２を形成し第１の領域に照射する光路重畳素子、２２は第１の領域８を透過した略平行光１２のうち第１の略平行光の成分を透過し第２の略平行光の成分を反射する第１の分光フィルター、２３は第２の領域９を透過した略平行光１２のうち第１の略平行光の成分を透過し第２の略平行光の成分を反射する第２の分光フィルター、２４は第１の分光フィルター２２を透過した第１の略平行光の成分を検出する第１の光センサと、２５は第１の分光フィルター２２を反射した第２の略平行光の成分を検出する第２の光センサと、２６は第２の分光フィルター２３を透過した第１の略平行光の成分を検出する第３の光センサ、
２７は第２の分光フィルター２３を反射した第２の略平行光の成分を検出する第４の光センサ、
２８は前記第１の光センサ２４の出力信号と前記第２の光センサ２５の出力信号との差信号Ｓ１を発生する第１の差分器、２９は第３の光センサ２６の出力信号と第４の光センサ２７の出力信号との差信号Ｓ２を発生する第２の差分器、３０はＳ１とＳ２に基づき前記第１の領域と前記第２の領域の局在化表面プラズモン共鳴波長の差を算出するコンピューターである。第１の光源１９及び第２の光源２０は、第１の領域及び第２の領域に照射する波長がλ１、λ２の光の強度が同一に成るように、発光強度を調整している。
【００４０】
本実施の形態では、λ１は、被検物質濃度が最大時かつ被検溶液の屈折率が最大時の第１の領域の共鳴波長と同一で、λ２は被検物質の濃度がゼロ時かつ被検溶液の屈折率が最小時の第１の領域及び第２の領域の共鳴波長と同一である。これを図９に示す。図９において、横軸が波長で、縦軸が第１の領域及び第２の領域の透過光強度を示す。図９の実線が被検物質の濃度がゼロ時の第１の領域の吸収スペクトルを示す。被検物質の濃度が増加するのに伴って、吸収スペクトルは点線や一点鎖線に示すように長波長側へシフトする。この一点鎖線が、被検物質濃度が最大時の第１の領域の吸収スペクトルを示す。この様に設定することで、ダイナミックレンジを最大化することができる。この理由を以下に述べる。
【００４１】
図８に示す、本実施の形態では、異なる２つの波長の光に対する透過光強度の差から共鳴波長を算出している。即ち、第１の領域８の透過光強度の差に相当する第１の差分器２７の出力信号Ｓ１から第１の領域の共鳴波長を、第２の領域９の透過光強度の差に相当する第２の差分器２８の出力信号Ｓ２から第２の領域の共鳴波長を算出している。これら、第１、２の差分器２７，２８の出力信号Ｓ１、Ｓ２を縦軸に、共鳴波長を横軸にとると図１０の様になる。被検溶液保持空間１８に、生理食塩水等の被検物質の濃度がゼロかつ屈折率が最小の溶液を保持すると、Ｓ１とＳ２は最小値を示す。また、被検溶液保持空間１８に被検物質濃度が最大かつ屈折率が最大の溶液を保持すると、Ｓ１は最大値を示す。この様に設定することで、Ｓ１とＳ２より共鳴波長を一意的決定できる領域（図１０において両矢印で示す）を最大化でき、ダイナミックレンジを最大化できる。Ｓ１は図６の太線に相当し、Ｓ２は図の６の細線に相当しコンピューター３０で、Ｓ１とＳ２より被検物質濃度を算出する。
【００４２】
また、本実施の形態では、第１、２の光源として半導体レーザのような小型で堅牢な光源を利用でき、装置全体の小型化が図れ、かつ信頼性も向上させることができる。
【００４３】
以上の様に、本実施の形態によれば、ダイナミックレンジの最大化と、小型、高信頼性を実現できる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明にかかる特定物質濃度計測方法及び装置は、濃度を計測する特定物質（被検物質）を含有する溶液の屈折率変化を補償でき、精度を確保できる。
【００４５】
特に、被検物質が、血液、尿、唾液、汗等の体液中に存在する疾患マーカーやホルモン等の場合は、被検物質の濃度が低く、かつ共存物質の濃度変化が大きくこれに伴う溶液の屈折率変化が大きいので有効である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施の形態１，２，３、４の第１の領域の構成図
【図２】本発明の実施の形態１，２，３、４の第２の領域の構成図
【図３】本発明の実施の形態１の全体の構成図
【図４】本発明の実施の形態１の信号図
【図５】本発明の実施の形態１の信号図
【図６】本発明の実施の形態３の信号図
【図７】本発明の実施の形態３の説明図
【図８】本発明の実施の形態３の全体の構成図
【図９】本発明の実施の形態３の信号図
【図１０】本発明の実施の形態３の信号図
【符号の説明】
【００４７】
１    基板
２    微粒子
３    第１の抗体
４    抗原
５    第２の抗体
６    カバーガラス
７    スペーサ
８    第１の領域
９    第２の領域
１０  光源
１１  音響光学フィルター
１２  ハーフミラー
１３  全反射ミラー
１４  第１の光センサ
１５  第２の光センサ
１６  駆動器
１７  コンピューター
１８  被検溶液保持空間
１９  第１の光源
２０  第２の光源
２１  光路重畳素子
２２  第１の分光フィルター
２３  第２の分光フィルター
２４  第１の光センサ
２５  第２の光センサ
２６  第３の光センサ
２７  第４の光センサ
２８  第１の差分器
２９  第２の差分器
３０  コンピューター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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