(57)【要約】【課題】少量の抗体で該抗体を金薄膜表面の所望の位置に固定することができ、さらに金薄膜表面に固定化された抗体の均一性の向上を図ることが可能なマイクロチップを提供すること。【解決手段】第一基板１０の一面１０ａと第二基板２０の一面２０ａとが対向して積層してなり、第一基板１０には、試料溶液が導入される導入部１１と、導入部１１に添加された試料溶液を一時塞き止める貯留部１２と、貯留部１２に一端１３ａが接続され、他端１３ｂが第一基板１０の一面１０ａに開口され、試料溶液が移送される流路１３とが形成され、第二基板２０には、流路１３の他端１３ｂに接続するように配された貫通孔２１と、第二基板２０の他面２０ｂにあって、金薄膜３２を有する検出チップ３０とが配され、貫通孔２１は、金薄膜３２の少なくとも一部に開口されていることを特徴とするマイクロチップ。【選択図】図１
2010038628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一基板の一面と第二基板の一面とが対向して積層してなり、
前記第一基板には、試料溶液が導入される導入部と、前記導入部に添加された試料溶液を一時塞き止める貯留部と、前記貯留部に一端が接続され、他端が前記第一基板の一面に開口され、前記試料溶液が移送される流路とが形成され、
前記第二基板には、前記流路の他端に接続するように配された貫通孔と、前記第二基板の他面にあって、金薄膜を有する検出チップとが配され、
前記貫通孔は、前記金薄膜の少なくとも一部に開口されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
前記導入部と前記貯留部と前記流路とからなる導入管及び該導入管に接続された前記貫通孔が複数配されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記第一基板には、前記導入部と前記貯留部との間に試料溶液を混合する混合部が更に配されていることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記混合部には、複数の前記導入部が接続されていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記混合部は、複数回屈折した混合路と該混合路間を接続する複数のバイパスとからなることを特徴とする請求項４に記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記混合部は、複数回屈曲した混合路と該混合路の内壁面に形成された複数の凸部とからなることを特徴とする請求項４に記載のマイクロチップ。
【請求項７】
前記貯留部がフィルターであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載のマイクロチップを用いて金薄膜の少なくとも一部に抗体を固定化する抗体固定化方法であって、
前記マイクロチップの導入部に抗体を導入した後、該抗体をＦ（ａｂ）化する工程、
前記流路に前記Ｆ（ａｂ）化抗体を移動させる工程、
前記流路に移動された前記Ｆ（ａｂ）化抗体を、貫通孔を介して前記金薄膜表面に移動させて固定化する工程、を有することを特徴とする抗体固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロチップに係り、より詳しくは、抗体の固定化において均一化を図ることが可能なマイクロチップと、該マイクロチップを用いた抗体の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛乳房炎は、搾乳牛の乳房内に細菌などの微生物が侵入、増殖して発症する。この牛乳房炎の原因菌に感染した搾乳牛においては、乳量および乳質の低下が観察され、重篤になるとまったく牛乳が出なくなってしまうばかりでなく、乳牛自体が死亡することもある。搾乳牛の乳房炎は，一度罹ってしまうと完治が非常に難しいため，発症のごく初期の段階での対処が特に重要になる。そのため，効率的な早期診断法の確立が強く望まれている。
従来牛乳房炎の原因となる微生物（原因菌）の探索試験として行われている培養検査は少なくとも数日の時間を要する。また、原因菌の種類によって最適な治療薬、対処法が異なるため、複数種類の菌種の中から特定の菌を迅速かつ定量的に検出可能な手法の開発が待たれていた。
【０００３】
原因菌の同定に関しては、従来から用いられてきた培養を介した同定法や染色による同定法、ＡＴＰなど細菌の代謝に係る物質を計測する方法に加え、表面プラズモン共鳴法を用いたＳＰＲ（Surface plasmon resonance）イムノ測定による細菌同定法が開発されている。特に、ＳＰＲイムノ測定は、少量の測定サンプルで感度よく、かつ迅速に測定が行えることから、現在様々な形で応用が進められている。
【０００４】
ＳＰＲイムノ測定では、測定対象物の検出に、例えば特許文献１や特許文献２に開示されているように、薄膜の表面に抗体を固定化したチップ（抗体固定化チップ）が用いられている。この抗体固定化チップは、金薄膜の上に１００ｎｍ以下のゲル層を形成し、このゲル層に抗体を固定化する方法、あるいはWholeタイプのイムノグロブリン（抗体）を主成分とする抗体液を、清浄な金薄膜表面に滴下して乾燥させるという物理吸着法により作製される。ＳＰＲイムノ測定では、全反射光の反射面である金薄膜表面において屈折率の検出感度が最も高くなるため、金薄膜表面の最近傍に抗体を固定化したチップ、すなわち物理吸着法で作製した抗体固定化チップの方が、感度の点から有利である。
【０００５】
このような単純な物理吸着法で作製された抗体固定化チップでは、金薄膜表面と直接接触したイムノグロブリンがさまざまな方向で金薄膜に吸着し、抗原補足部位であるＦａｂ部分が金薄膜表面に吸着して抗原と接触できなかったり、あるいは、金と接触することでＦａｂ部分が変性したりし、約２０％程度しか活性を維持できないと言われている。しかしこの場合においても、イムノグロブリンは多層に吸着可能であるため、失活した抗体の上に活性を維持した他の抗体が重なって存在する。したがって、この抗体の密集度合いと、ＳＰＲ測定における金薄膜の表面最近傍の感度が高いという測定原理とが掛け合わされ、物理吸着法で作製された抗体固定化チップは、ＳＰＲイムノ測定の感度としては金薄膜の表面にゲル層などの抗体固定化層を設けた場合と遜色ない感度が得られる。
【特許文献１】特開２００５−９８７７０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２５４６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、この抗体固定化チップにおける金薄膜表面の微視的状況を調べると、ある核（抗体）に対して山のように抗体が積み重なった部分（厚さ、径が数μｍ程度の半球状）と、金薄膜表面とが露出している部分とが混在している状況である。この抗体の積み重なった部分は、まず金薄膜表面のナノレベルのラフネス、キンクなどに起因して抗体が吸着して核を形成する。そして、その核となった抗体の周辺でさらに抗体同士の吸着が進むことによって形成される。さらに、抗体を含んだ水溶液を乾燥させる際に、親水性であるタンパク質表面に水が吸着し、該水の表面張力によって抗体のタンパク間吸着が促進される。ゆえに、金薄膜上には、最終的にマイクロメートルスケールの山のような形状の抗体凝集部分が分散して配されるとともに、それ以外の形状の抗体も配され、均一性が低く抗体の配された抗体固定化チップが形成される。
【０００７】
このように抗体が不均一に固定化された抗体固定化チップでは、以下のような問題が生じる。
１：ＳＰＲイムノ測定を感度よく実施するためには、抗体の山を測定領域内（数百μｍ２オーダー）にある程度均一に分散した形で作製する必要がある。そのためには、ある程度の濃度を含む抗体液を金薄膜表面に滴下する必要があり、結果的に固定化に必要な抗体量が多量となるため、コストが高くなる。
２：抗体凝集部分である山の形成の制御が困難であるため、ＳＰＲイムノ測定に用いる抗体固定化チップの作製再現性、および抗体固定化チップ間の個体差の制御が困難である。ゆえに、ＳＰＲイムノ測定の再現性及び定量性に関しては、信頼性に欠ける虞があった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、少量の抗体で該抗体を金薄膜表面の所望の位置に固定することができ、さらに金薄膜表面に固定化された抗体の均一性の向上を図ることが可能なマイクロチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の請求項１に記載のマイクロチップは、第一基板の一面と第二基板の一面とが対向して積層してなり、前記第一基板には、試料溶液が導入される導入部と、前記導入部に添加された試料溶液を一時塞き止める貯留部と、前記貯留部に一端が接続され、他端が前記第一基板の一面に開口され、前記試料溶液が移送される流路とが形成され、前記第二基板には、前記流路の他端に接続するように配された貫通孔と、前記第二基板の他面にあって、金薄膜を有する検出チップとが配され、前記貫通孔は、前記金薄膜の少なくとも一部に開口されていることを特徴とする。
本発明の請求項２に記載のマイクロチップは、請求項１において、前記導入部と前記貯留部と前記流路とからなる導入管及び該導入管に接続された前記貫通孔が複数配されていることを特徴とする。
本発明の請求項３に記載のマイクロチップは、請求項１または２において、前記第一基板には、前記導入部と前記貯留部との間に試料溶液を混合する混合部が更に配されていることを特徴とする。
本発明の請求項４に記載のマイクロチップは、請求項３において、前記混合部には、複数の前記導入部が接続されていることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載のマイクロチップは、請求項４において、前記混合部は、複数回屈折した混合路と該混合路間を接続する複数のバイパスとからなることを特徴とする。
本発明の請求項６に記載のマイクロチップは、請求項４において、前記混合部は、複数回屈曲した混合路と該混合路の内壁面に形成された複数の凸部とからなることを特徴とする。
本発明の請求項７に記載のマイクロチップは、請求項１ないし６のいずれかにおいて、前記貯留部がフィルターであることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項８に記載の抗体固定化方法は、請求項１ないし７のいずれかに記載のマイクロチップを用いて金薄膜の少なくとも一部に抗体を固定化する抗体固定化方法であって、前記マイクロチップの導入部に抗体を導入した後、該抗体をＦ（ａｂ）化する工程、前記流路に前記Ｆ（ａｂ）化抗体を移動させる工程、前記流路に移動された前記Ｆ（ａｂ）化抗体を、貫通孔を介して前記金薄膜表面に移動させて固定化する工程、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のマイクロチップによれば、金薄膜がマイクロチップに組み込まれていることで、従来よりも少ない抗体量で所望の位置に簡便に抗体を固定化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を、図面を参照して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【００１３】
「マイクロチップ」
＜第１実施形態＞
図１は、本発明の第１実施形態に係るマイクロチップ１Ａを模式的に示した図である。図１（ａ）は平面図、図１（ｂ）は、図１（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図である。
本発明の第１実施形態に係るマイクロチップ１Ａ（１）は、第一基板１０の一面１０ａと第二基板２０の一面２０ａとが対向して積層してなり、
第一基板１０には、試料溶液が導入される導入部１１と、導入部１１に添加された試料溶液を一時塞き止める貯留部１２と、貯留部１２に一端１３ａが接続され、他端１３ｂが第一基板１０の一面１０ａに開口され、試料溶液が移送される流路１３とが形成されている。また、第二基板２０には、流路１３の他端１３ｂに接続するように配された貫通孔２１と、第二基板２０の他面２０ｂにあって、金薄膜３２を有する検出チップ３０とが配されている。さらに、貫通孔２１は、金薄膜３２の少なくとも一部に開口されている。以下、それぞれについて詳細に説明する。
【００１４】
第一基板１０は、例えばＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。また、上記ポリマーのうち、熱可塑性エラストマーの特性を持つものの場合、ＵＶによるリソグラフィー以外にも、金型を用いた成型によるパターニングが可能となる。第一基板１０の大きさは、流路１３の長手方向において３５ｍｍ以上１００ｍｍ以下である。また、厚さは、例えば１ｍｍ以上８ｍｍ以下である。第一基板１０が第二基板２０と接する一面１０ａには、導入部１１と、導入部１１に添加された試料溶液を一時塞き止める貯留部１２と、貯留部１２に一端１３ａが接続された流路１３とからなる導入管１４が形成されている。
【００１５】
導入部１１は、抗体等の各種溶液が添加される部位である。その大きさは、マイクロピペットチップの先が十分入る容量であればよく、例えば流路１３の長手方向における長さが３ｍｍ程度、流路１３の短手方向における断面が０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以上２ｍｍ×２ｍｍ以下、望ましくは１ｍｍ×１ｍｍ程度である。
また、導入部１１の一端１１ａは第一基板１０の側面に開口して開口部１１ｃを形成し、その他端１１ｂは貯留部１２と連通している。なお、本発明のマイクロチップ１においては、この開口部１１ｃに嵌合するキャップ（図中、非表示）を用いることができる。
【００１６】
貯留部１２は、導入部１１に添加された複数の試料溶液が流路１３へ自由に移送されることを抑制するものである。この貯留部１２としては、図１に示すようにメニスカス構造とすることができる。この貯留部１２の大きさとしては、導入部１１と連通している部位は、導入部１１の断面と同程度あるいはそれ以上とすることができ、例えば０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以上２ｍｍ×２ｍｍ以下である。また、流路１３と連通している部位の断面は、該流路１３と同一である。貯留部１２をこのような構成とすることで、導入部１１から貯留部１２に移送された溶液が自由に流路１３へと移動することを抑制することができる。
【００１７】
流路は１３、その一端１３ａが貯留部１２と接続され、他端１３ｂ周辺で第二基板２０に設けられた貫通孔２１と連通されている。流路１３の大きさとしては、流路１３の短手方向における断面が０．３ｍｍ×０．３ｍｍ程度である。また、貯留部１２から貫通孔２１までの長さとしては、特に限定されるものではなく、金薄膜３２上の所望の位置に開口した貫通孔２１までの長さに応じて適宜調節可能である。
【００１８】
第二基板２０は、第一基板１０と同様に例えばＰＤＭＳ、ポリアクリル酸、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、シラン架橋ポリオレフィン等のポリマーが適用可能である。また、上記ポリマーのうち、熱可塑性エラストマーの特性を持つものの場合、ＵＶによるリソグラフィー以外にも、金型を用いた成型によるパターニングが可能となる。その大きさは、第一基板と同様である。この第二基板２０には貫通孔２１が配され、貫通孔２１の一端２１ａは、流路１３の他端１３ｂと連通している。また、貫通孔２１の他端２１ｂは、第二基板２０の他面２０ｂに配された検出チップ３０の金薄膜３２表面３２ａに開口している。
【００１９】
貫通孔２１は、第二基板２０の厚さ方向に形成され、第一基板１０に配された流路１３と第二基板２０の他面２０ｂに配された検出チップ３０の金薄膜３２表面３２ａとを連通するものである。貫通孔２１の大きさは、第一基板１０と第二基板２０の重なり方向における断面が０．１ｍｍ×０．３ｍｍ以上０．８ｍｍ×０．３ｍｍ以下である。貫通孔２１は、その他端２１ｂが金薄膜３２表面上であれば、所望の位置に設けることができる。
【００２０】
検出チップ３０は、金薄膜３２を有したものであり、第二基板２０から自由に取り外しができる。金薄膜３２表面に抗体が固定化された後は、第二基板２０から取り外され、各種の測定、例えばＳＰＲを利用した測定や、ＥＬＩＳＡなどに用いることができる。この際、金薄膜３２は第三基板３１上に配されて支持されていることが好ましい。第二基板２０から取り外す際に、金薄膜３２に応力が加わり、曲げなどによる損傷を抑制することができる。
【００２１】
第三基板３１としては、特に限定されるものではないが、例えばガラス、プラスチック、シリコンウェハ等を用いることができる。
検出チップ３０を例えばＳＲＰを利用した測定に用いる場合は、第三基板３０は透明性を有しているものを用いる。その際、第三基板３１は、ガラス、プラスチック等を用いることが好ましい。
【００２２】
金薄膜３２は、その表面３２ａに抗体のチオール基が共有結合によって固定化され、ＳＰＲやＥＬＩＳＡなどの各種の測定に用いられる。
【００２３】
検出チップ３０をＳＰＲに利用する際は、エバネッセント波の染みだしが必要であるため、金薄膜３２の厚さは２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下が好ましい。更に、金薄膜３２表面３２ａは平坦であるほうがよく、表面ラフネスは例えば５ｎｍ以下である。
【００２４】
本実施形態のマイクロチップ１Ａによれば、少量の抗体量で、金薄膜３２表面３２ａの所望の位置に抗体を均一に固定化することができる。また、マイクロチップ１に検出チップ３０が組み込まれているため、簡便に金薄膜３２表面３２ａに抗体を固定し、抗体固定化チップを得ることができる。
【００２５】
＜第２実施形態＞
図２は、本発明の第２実施形態に係るマイクロチップ１Ｂを模式的に示した図である。図２（ａ）は平面図、図２（ｂ）は、図２（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｂが第１実施形態のマイクロチップ１Ａと異なる点は、導入部１１と貯留部１２と流路１３とからなる導入管１４及び貫通孔２１が複数配された点である。
【００２６】
本実施形態のマイクロチップ１Ｂによれば、導入管１４及び貫通孔２１を複数配することで、異なる種類の抗体を同時に金薄膜３２表面３２ａの所望の位置に簡便に固定化することが可能となり、抗体アレイを簡便に作製することができる。このようにして得られた検出チップは、その表面に複数の抗体が配されていることから、特に、感染症の原因菌の特定などの際に有効である。
【００２７】
＜第３実施形態＞
図３は、本発明の第２実施形態に係るマイクロチップ１Ｃ（１）を模式的に示した図である。図３（ａ）は、平面図、図３（ｂ）は、図３（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｃが第１実施形態のマイクロチップ１Ａと異なる点は、導入部１１と貯留部１２との間に、混合部１５が配されており、導入部１１と混合部１５とは第二流路１６により連通している点である。
【００２８】
混合部１５は、導入部１１に添加された各種溶液を混合・反応させる部位である。混合部１５の大きさとしては、流路１３（第一流路１３）の短手方向における断面が０．５ｍｍ×０．５ｍｍ以上５ｍｍ×５ｍｍ以下が望ましく、より望ましくは１ｍｍ×１ｍｍ程度である。また、第一流路１３の長手方向における長さは、例えば１０ｍｍ以上２０ｍｍ以下が望ましい。混合部１５の形状は、図３では方形で示しているが特にこの形状に限定されるものではなく、例えば第一流路１３と連通した側の面が曲面となるようなお椀形とすることで、混合部１５に添加された溶液を効率よく混和することができる。
混合部１５を別途設けることで、導入部１１から混合部１５へと溶液を移送する工程を要するため、該混合部１５における反応時間などを制御することが容易となる。
【００２９】
第二流路１６としては、該第二流路１６の短手方向における断面が０．１ｍｍ×０．１ｍｍ以上０．８ｍｍ×０．８ｍｍ以下が望ましく、より望ましくは０．３ｍｍ×０．３ｍｍ程度である。また、第二流路１６の導入部１１から混合部１５までの長さは、例えば５ｍｍ以上３０ｍｍ以下が望ましく、より望ましくは１０ｍｍ程度である。
【００３０】
本実施形態のマイクロチップ１Ｃによれば、混合部１５を別途設けることで、導入部１１から混合部１５へと溶液を移送する工程を要するため、該混合部１５における反応時間などを制御することが容易となる。なお、本実施形態においても、第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様に、導入部１１と第二流路１６と混合部１５と貯留部１２と第一流路１３とからなる導入管１４及び該導入管１４と連通した貫通孔２１とを複数設けることもできる。上述した第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様な効果が得られる。
【００３１】
＜第４実施形態＞
図４は、本発明の第３実施形態に係るマイクロチップ１Ｄ（１）を模式的に示した図である。図４（ａ）は、平面図、図４（ｂ）は、図４（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｄが第３実施形態のマイクロチップ１Ｃと異なる点は、一つの混合部１５に複数の導入部１１Ａ，１１Ｂが連通している点である。
【００３２】
このように複数の導入部１１Ａ，１１Ｂを設けることで、異なる種類の溶液、例えば、抗体を含んだ溶液と、例えば該抗体を処理する溶液（抗体処理溶液）とを各導入部１１Ａ，１１Ｂへ添加し、混合部１５で混合させて反応させることが可能となる。したがって、反応時間の制御が容易になると共に、各導入部１１Ａ，１１Ｂに添加した溶液を同時に混合部へと移送することができるので、導入部１１Ａ，１１Ｂの溶液を混合部１５へと移送する際の工程を、第３実施形態のマイクロチップ１Ｃよりも簡略化することができる。
なお、図４では導入部を２つ設けた例を示しているが、３つ以上の導入部を設けたものであってもよい。また、第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様に、導入部１１Ａ，１１Ｂと第二流路１６と混合部１５と貯留部１２と第一流路１３とからなる導入管１４及び該導入管１４と連通した貫通孔２１とを複数設けることもできる。上述した第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様な効果が得られる。
【００３３】
＜第５実施形態＞
図５は、本発明の第５実施形態に係るマイクロチップ１Ｅを模式的に示した図である。図５（ａ）は平面図、図５（ｂ）は、図５（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図、図５（ｃ）は、図５（ａ）におけるαの拡大図である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｅが第３実施形態のマイクロチップ１Ｃと異なる点は、混合部１５は、複数回屈折した混合路５５と該混合路５５間を接続する複数のバイパス５６とからなる点である。
【００３４】
混合路５５は、第一流路１３に対して４５°で屈曲していることが好ましい。混合路５５の第一流路１３の短手方向における断面は、例えば１００μｍ×１００μｍ以上４００μｍ×４００μｍ以下である。
【００３５】
バイパス５６は、屈曲した混合路５５間を連通するものであり、長さの異なる複数の流路から構成されている。また、それぞれのバイパス５６は直線状で、かつ互いに略並行に配されている。バイパス５６の第一流路１３の短手方向における断面は、混合路５５よりも小さく、混合路５５の１／５〜１／６程度が好ましい。例えば、混合路５５の幅が２７μｍ程度であった場合、各バイパス５６の幅は５μｍ程度が好ましい。バイパス５６の幅が太すぎた場合、あるいは、バイパス５６の幅が狭くなると、導入部１１Ａ，１１Ｂに添加された溶液間の混合が起こり難くなる。
なお、混合路５５とバイパス５６との深さ（第一基板１０の厚さ方向における高さ）は同一であることが好ましい。
【００３６】
本実施形態によれば、溶液が混合部１５（混合路５５）の壁面との表面張力により該壁面を沿って進行する際に、長さの異なるバイパス５６を多数配したことによって、各導入部１１Ａ，１１Ｂに添加された試料溶液の混合が促進され、少ない液量で該試料溶液を混合することができる。なお、本実施形態においても、第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様に、導入部１１と第二流路１６と混合部１５と貯留部１２と第一流路１３とからなる導入管１４及び該導入管１４と連通した貫通孔２１とを複数設けることもできる。上述した第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様な効果が得られる。
【００３７】
＜第６実施形態＞
図６は、本発明の第６実施形態に係るマイクロチップ１Ｆを模式的に示した図である。図６（ａ）は平面図、図６（ｂ）は、図６（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｆが第３実施形態のマイクロチップ１Ｃと異なる点は、混合層１５は、複数回屈曲した混合路６５と該混合路６５の内壁面６５ａに形成された複数の凸部６６とからなる点である。
【００３８】
混合路６５は、複数回の屈曲部位Ｃを有した流路であり、例えばその短手方向における断面は、２００μｍ×５００μｍ以上５００μｍ×５００μｍ以下である。混合路６５の内壁６５ａにおいて、該屈曲部位Ｃの外側には、複数の凸部６６が配されている。
【００３９】
凸部６６としては、導入部１１Ａ，１１Ｂに添加された試料液滴が、混合路６５中で混合されればその形状は特に限定されるものではないが、その表面が曲面であれば液滴中に含まれる複数種の液を効率的に混合させることができるため、好ましい。また凸部６６の大きさとしては、混合路６５を流れる液滴の流動性を著しく減少させない程度で、かつ、液滴中に含まれる複数種の液を効率的に混合させることができれば特に限定されるものではないが、例えば混合路６５の内壁６５ａからの高さが、例えば１００μｍ以上２５０μｍ以下である。
【００４０】
本実施形態によれば、導入部１１Ａ，１１Ｂに添加された試料溶液からなる液滴が、混合路６５の内壁６５ａに形成された凸部６６に当たりながら該混合路６５を流れることで、液滴の中での２液の混合が促進される。そのため、少ない液量であっても、溶液間の混合を促進することができる。なお、本実施形態においても、第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様に、導入部１１と第二流路１６と混合部１５と貯留部１２と第一流路１３とからなる導入管１４及び該導入管１４と連通した貫通孔２１とを複数設けることもできる。上述した第２実施形態のマイクロチップ１Ｂと同様な効果が得られる。
【００４１】
＜第７実施形態＞
図７は、本発明の第７実施形態係るマイクロチップ１Ｇを模式的に示した図である。図７（ａ）は平面図、図７（ｂ）は、図７（ａ）におけるＬ−Ｌ断面図である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｇが第１実施形態のマイクロチップ１Ａと異なる点は、貯留部１２としてフィルター７２を用いている点である。
【００４２】
フィルター７２としては、導入部１１に添加された試料溶液が自由に流路１３に流れ出ないようにするものであれば得に限定されるものではないが、例えば、分子量に応じた分画フィルターなどを用いることができる。
なお、第一実施形態のマイクロチップ１Ａに限らず、上述した第２実施形態〜第６実施形態のマイクロチップにおいても、貯留部１２としてフィルター７２を用いることが可能である。
【００４３】
「抗体固定化チップの抗体固定化方法」
＜第１実施形態のマイクロチップ１Ａを用いた際の作製方法＞
次に、本発明の第１実施形態に係るマイクロチップ１Ａを用いた抗体固定化方法について説明する。
まず、導入部１１にＦ（ａｂ´）２抗体溶液を所定量、添加する。導入部１１に添加された抗体溶液は、貯留部１２に移送され該貯留部１２で一時的に保持される。
【００４４】
抗体としては、特に限定されるものではなく、測定対象物に応じて適宜変更できるが、例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒト、マウス、ラット、ラビットなどのＩｇＧが好適に用いられる。なお、測定対象物によっては、ＩｇＥ、やＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤを用いても良い。
Ｆ（ａｂ´）２抗体は、従来公知の方法で調整したものであってもよいし、購入したものを用いても良い。
また、抗体の濃度は例えば、ＰＢＳＴなどで適宜濃度調節されるが、一般的に用いられている０．１ｍｇ／ｍｌで用いることが望ましい。
抗体の添加量としては、５μｌ程度で充分である。
このように、従来では５μｇ〜７μｇ程度使用していた抗体の量が、本発明のマイクロチップを用いれば、抗体の使用量が０．５μｇ程度で充分となるため、抗体固定化チップを作製する際に抗体に要するコストを大幅に削減することができる。
【００４５】
続いて、導入部１１に抗体処理溶液を添加する。抗体処理溶液は、抗体のジスルフィド結合を還元するＤＴＴなどを含有した緩衝液で、例えば水にＤＴＴとＥＤＴＡとＨＥＰＥＳとを混合したものである。導入部１１に添加された抗体処理溶液は貯留部１２に移送され、貯留部１２で抗体溶液と混合される。
【００４６】
次に、抗体のジスルフィド結合を還元し、Ｆ（ａｂ´）２をＦａｂ化する。この反応の際、室温にてシェイカー等で混和することが好ましい。反応時間に関しては、適宜調節されるが、通常６０分間行えば十分である。その後、例えば×２０００Ｇで遠心することで、Ｆａｂ化された抗体は貯留部１２から流路１３へと移送され、貫通孔２１を介して抗体が金薄膜３２表面３２ａに到達する。
遠心する際は、例えば図７に示すように、マイクロチップ１を遠心管８１に設置することが好ましい。図８は、遠心分離機８０にマイクロチップ１を設置した一例を模式的に示した図である。図８（ａ）は上面図、図８（ｂ）は、図８（ａ）において矢印方向から見た図である。なお、図８（ｂ）においては、遠心管８１及び遠心管８１中に配されたマイクロチップ１のみを図示している。図８に示すように、マイクロチップ１を遠心分離機８０に配置して遠心を行うことで、抗体を含んだ溶液が流路１３や貫通孔２１に付着する量を最小限として金薄膜３２の表面３２ａに移送できる。
【００４７】
金薄膜３２の表面３２ａに到達した抗体のチオール基は、金と共有結合することで金薄膜３２の表面３２ａに固定化される。そのため、抗体同士の凝集が生じる前に金薄膜３２の表面３２ａに抗体の固定化が終了する。この際、チオール基は抗体の抗原補足部とは反対側の末端近傍にあるため、金薄膜３２表面３２ａに固定化されたＦａｂの抗原補足部は、金薄膜３２に固定化されない部分、すなわち、抗原を捕捉しやすい方向に存在するようになる。
【００４８】
本発明のマイクロチップ１Ａを用いた抗体固体化方法によれば、所望の位置に少量の抗体量で金薄膜表面に抗体を固定化することが可能となる。特に、抗体は高価であるため、コストの低減が図れる。また、従来のように乾燥による抗体と金薄膜との物理的吸着ではなく、抗体のチオール基を共有結合により金薄膜と固定化するので、従来のように抗体液を乾燥させる際の表面張力の影響が無く、また、抗体同士の凝集が起こりがたい。ゆえに、金薄膜表面に固体化された抗体の均一性の向上が図れる。
また、遠心により抗体を金薄膜表面の所望の位置に固定化することができるので、従来の様にスポッター等を必要とせず、簡便に抗体を固定化することができる。
【００４９】
＜第２実施形態のマイクロチップ１Ｂを用いた際の抗体固定化方法＞
次に、第２実施形態のマイクロチップ１Ｂを用いた抗体固定化方法について説明する。本実施形態のマイクロチップ１Ｂを用いた際には、各導入部１１に異なる抗体溶液を添加すること以外は、第１実施形態のマイクロチップ１Ａを用いた際と同様である。
本実施形態のマイクロチップ１Ｂを用いることで、複数種の抗体を同時に金薄膜３２表面３２ａに固定化することができ、簡便に抗体アレイを作製することができる。
【００５０】
＜第３実施形態のマイクロチップ１Ｃを用いた際の抗体固定化方法＞
次に、第３実施形態のマイクロチップ１Ｃを用いた抗体固定化方法について説明する。
まず、導入部１１に抗体溶液を添加し、遠心により第二流路１６を介して混合部１５へ抗体溶液を移す。遠心に関しては、例えば５００Ｇにて１分から３分遠心することで導入部１１から第二流路１６を介して混合部１５及び貯留部１２へと抗体溶液を移送することができる。
【００５１】
続いて、導入部１１に抗体処理溶液を添加し、遠心しながら該抗体処理溶液を混合部１５及び貯留部１２へと移送させていく。遠心に関しては、例えば５００Ｇにて１０分間行えば十分である。
【００５２】
その後、混合部１５と貯留部１２にて抗体溶液と抗体処理溶液とを室温で６０分間反応させ、抗体のジスルフィド結合を還元し、Ｆ（ａｂ´）２をＦａｂ化させる。その際、第１実施形態と同様にシェイカーを用いて混和することが好ましい。その後、例えば×２０００Ｇで遠心することで、Ｆａｂ抗体は混合部１５及び貯留部１２から第一流路１３へと移送され、貫通孔２１を介してＦａｂ抗体が金薄膜３２表面３２ａに到達する。金薄膜３２表面３２ａに達した抗体は、第１実施形態の際と同様に共有結合により金薄膜３２に固定化され、該抗体が固定化された検出チップ３０（抗体固定化チップ）が作製される。
【００５３】
本実施形態のマイクロチップ１Ｃを用いることで、抗体と抗体処理溶液との添加、及び抗体の処理が個別に行われるので、確実に抗体をＦａｂ化することができ、より効率的に金薄膜３２表面３２ａに抗体を固定化することができる。
【００５４】
＜第４実施形態のマイクロチップ１Ｄを用いた際の抗体固定化方法＞
次に、第４実施形態のマイクロチップ１Ｄを用いた抗体固定化方法について説明する。本実施形態のマイクロチップを用いた際は、導入部１１Ａに抗体溶液、導入部１１Ｂに抗体処理溶液を添加し、遠心により混合部１５及び貯留部１２に両者を移し、該混合部１５及び貯留部１２にて反応させて抗体をＦａｂ化する。反応及びその後の工程については、第３実施形態のマイクロチップ１Ｃを用いた際と同様である。
【００５５】
本実施形態のマイクロチップ１Ｄを用いることで、個別に溶液を添加し、遠心により両者を混合部で混合させることができる。したがって、抗体と抗体処理溶液との添加、及び抗体の処理が個別に行われるので、確実に抗体をＦａｂ化することができ、より効率的に金薄膜表面に抗体を固定化することができる。さらに、１回の遠心で混合部１５及び貯留部１２に各溶液を移送できることから、遠心の回数が減り、抗体固定化チップの操作を簡略化することができる。
【００５６】
＜第５実施形態のマイクロチップ１Ｅを用いた際の抗体固定化方法＞
次に、第５実施形態のマイクロチップ１Ｅを用いた抗体固定化方法について説明する。まず、導入部１１Ａ，１１Ｂにそれぞれ抗体溶液と抗体処理溶液とを添加し、遠心により第二流路１６を介して混合部１５（第一混合路５１）へ抗体溶液と抗体処理溶液とを移す。遠心に関しては、例えば５００Ｇにて１分から３分遠心することで各導入部１１Ａ，１１Ｂから第二流路１６を介して混合部１５へと抗体溶液及び抗体処理溶液を移送することができる。混合部１５へ到達した抗体溶液と抗体処理溶液とは、混合路５５とバイパス５６との壁面に沿って表面張力により進行する際に混合され、貯留部１２へと移送される。この際、室温で６０分間静置させて反応させ、抗体のジスルフィド結合を還元し、Ｆ（ａｂ´）２をＦａｂ化させる。その後、例えば×２０００Ｇで遠心することで、Ｆａｂ抗体は混合部１５及び貯留部１２から第一流路１３へと移送され、貫通孔２１を介して抗体が金薄膜３２表面３２ａに到達する。金薄膜３２表面３２ａに達した抗体は、第１実施形態の際と同様に共有結合により金薄膜３２に固定化され、該抗体が固定化された検出チップ３０が作製される。
【００５７】
本実施形態のマイクロチップ１Ｅを用いることで、少ない液量で抗体を金薄膜３２表面３２ａに固定できることから、使用する抗体量が低減され、抗体固定化チップの作製に要するコストの削減を図ることができる。
【００５８】
＜第６実施形態のマイクロチップ１Ｆを用いた際の抗体固定化方法＞
次に、第６実施形態のマイクロチップ１Ｆを用いた抗体固定化方法について説明する。まず、導入部１１ａ，１１ｂにそれぞれ抗体溶液と抗体処理溶液とを添加し、遠心により第二流路１６を介して混合部１５（混合路６５）へ抗体溶液と抗体処理溶液とを移す。遠心に関しては、例えば５００Ｇにて１分から３分遠心することで導入部１１から第二流路１６を介して混合部１５（混合路６５）へと抗体溶液及び抗体処理溶液を移送することができる。混合部１５へ到達した抗体溶液と抗体処理溶液とは液滴を形成し、混合路６５の屈曲部位Ｃの内壁６５ａに形成された凸部６６に当たりながら混合路６５を流れることで、該液滴の中での２液の混合が促進され、貯留部１２へと移送される。この際、室温で６０分間静置させて反応させ、抗体のジスルフィド結合を還元し、Ｆ（ａｂ´）２をＦａｂ化させる。その後、例えば×２０００Ｇで遠心することで、Ｆａｂ抗体は混合部１５及び貯留部１２から第一流路１３へと移送され、貫通孔２１を介して抗体が金薄膜３２表面３２ａに到達する。金薄膜３２表面３２ａに達した抗体は、第１実施形態の際と同様に共有結合により金薄膜３２に固定化され、該抗体が固定化された検出チップ３０が作製される。
【００５９】
本実施形態のマイクロチップ１Ｅを用いることで、少ない液量で抗体を金薄膜３２表面３２ａに固定できることから、使用する抗体量が低減され、抗体固定化チップの作製に要するコストの削減を図ることができる。
【００６０】
＜第７実施形態のマイクロチップ１Ｇを用いた際の抗体固定化方法＞
次に、第７実施形態のマイクロチップ１Ｇを用いた抗体固定化方法について説明する。本実施形態のマイクロチップ１Ｇには貯留部１２としてフィルター７２が配されているため、第１実施形態で抗体溶液及び抗体処理溶液を流路１３に移送する際の遠心を、×２０００Ｇとすることで、同様に作製することができる。
貯留部１２としてフィルター７２が配されたマイクロチップ１Ｇを用いることで、ジスルフィド結合が還元されていない未反応な抗体Ｆ（ａｂ´）が金薄膜表面に到達し、抗体同士の凝集等が生じることをより確実に抑制できる。ゆえに、金薄膜３２表面３２ａに固定化された抗体を、より一層均一に固定化することができる。
【実施例】
【００６１】
＜マイクロチップの作製＞
図９に示す第３実施形態のマイクロチップ１Ｃを作製した。但し、貯留部１２としてはフィルター７２を用いた。
導入部１１、混合部１５、第一流路１３及び第二流路１６が配された第一基板１０をインジェクション成形により作製した。また、同様にＰＤＭＳを用い、貫通孔２１が配された第二基板２０をインジェクション成形により作製した。
その後、第一基板１０及び第二基板２０の表面をプラズマ処理し、所定の位置にフィルター７２を配し、第一基板１０の一面１０ａと第二基板２０の一面２０ａとを対向させて貼り合わせ、マイクロチップ１とした。その後、ガラス基板３１上に金薄膜３２を配して検出チップ３０を作製し、プラズマ表面処理を行った。次に、金薄膜３２の表面３２ａが貫通孔２１と重なるように、この検出チップ３０を第二基板２０の他面２０ｂに押し付け装着し、図９に示すマイクロチップを得た。
【００６２】
＜抗体の固定化＞
０．１ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ´）２（Ｓｉｇｍａ社製：Ｉ９８８５  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｇｏａｔ）１０μｌを導入部１１へピペッティングにより添加し、×１０００Ｇで１分間遠心し、抗体溶液を混合部１５へと移動させた。その後、使用直前にＡｒパージした抗体処理溶液（６．２５ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）３０μｌを導入部１１にピペッティングし、室温にて、×５００ｇで１０分間遠心し、抗体反応溶液を混合部１５へ移しながら抗体と反応させた。その後、マイクロチップ１を備えた遠心管をシェイカーにのせ、室温にて６０分反応させた。次に、室温にて×５０００Ｇで２分間遠心し、抗体溶液をフィルター７２を通過させ、第一流路１３及び貫通孔２１を経て金薄膜３２表面３２ａに抗体を移動させ、固定化した。
なお、別途同様に調整した抗体を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分子量を確認した。その結果を図１０に示す。レーン（１）はマーカー、レーン（２）は上記で使用したＦ（ａｂ´）２抗体、レーン（３）は本発明のマイクロチップ１Ｃで調整した抗体である。図１０に示すように、本発明のマイクロチップ１Ｃで調整した抗体は、Ｆ（ａｂ´）２抗体の半分程度の分子量となっており、Ｆａｂ化されていることが確認された。
【００６３】
＜ＳＰＲ測定＞
作製した抗体固定化チップ（検出チップ３０）をマイクロチップから取り外し、プロテインフリーの緩衝液（Protein-Free T20（TBS）Blocking Buffer）で室温にて２時間、ブロッキングを行った。その後、この抗体固定化チップを用いてＳＰＲにより抗原抗体反応を測定した。抗原としては、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製：Ｉ４５０６）とｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製：Ｒ２００４）を用いた。ＳＰＲ測定に際して、表面プラズモン共鳴角の測定は、HandySPR（NTT-AT社製）を用いて行った。抗体固定化チップは、マッチングオイルを介してＳＰＲ装置に取り付け、０．１ｍｇ／ｍｌのＨｕｍａｎ  ＩｇＧを含む０．１Ｍのリン酸緩衝溶液（ｐＨ８）を５０μＬ滴下し、ＳＰＲ角を観察した。その結果を、図１１に示す。図１１（ａ）は、抗原としてｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧを用いたものの結果であり、図１１（ｂ）は、抗原としてＨｕｍａｎ  ＩｇＧを用いたものの結果である。
図１１より、抗原であるＨｕｍａｎ  ＩｇＧに反応を示したことが観察され、本発明のマイクロチップによれば、少ない抗体量で抗体固定化チップを作製できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、ＳＰＲやＥＬＩＳＡに用いる抗体固定化チップに適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の第１実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図２】本発明の第２実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図３】本発明の第３実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図４】本発明の第４実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図５】本発明の第５実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図６】本発明の第６実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図７】本発明の第７実施形態に係るマイクロチップを模式的に示した図である。
【図８】遠心分離機にマイクロチップを設置した際の一例を模式的に示した図である。
【図９】実施例のマイクロチップを模式的に示した断面図である。
【図１０】抗体を電気泳動した際の画像である。
【図１１】ＳＰＲの測定結果を示した図である。
【符号の説明】
【００６６】
１（１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ）  マイクロチップ、１０  第一基板、１１  導入部、１２  貯留部、１３  流路（第一流路）、１４  導入管、１５  混合部、１６  第二流路、２０  第二基板、２１  貫通孔、３０  検出チップ、３１  第三基板、３２  金薄膜、５５  第一混合路、５６  第二混合路、６５  第三混合路、６６  凸部、７２  フィルター、８０  遠心分離機、８１  遠心管  Ｃ  屈曲部位。
【図１】
2010038628.tif 000003
【図２】
2010038628.tif 000004
【図３】
2010038628.tif 000005
【図４】
2010038628.tif 000006
【図５】
2010038628.tif 000007
【図６】
2010038628.tif 000008
【図７】
2010038628.tif 000009
【図８】
2010038628.tif 000010
【図９】
2010038628.tif 000011
【図１０】
2010038628.tif 000012
【図１１】
2010038628.tif 000013