(57)【要約】      （修正有）【課題】コンパニオンアニマルに特に順応し、並びにそのプロバイオティク特性及び処理後に生存する能力で選択された、ＧＩ（哺乳類の胃腸）管の上部に存在する天然腸微生物相からの単離によって入手可能な細菌の菌株の提供、及びこれらの菌株をその使用に適した組成物の提供。【解決手段】動物でプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物胃腸管からの単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガム種の乳酸菌の菌株、および、本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガムを含む使用方法及び組成物。【選択図】図７
2010178753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られ、配列番号１で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有し且つプロバイオティク活性を有する、ビフィドバクテリア・シュードロンガムの菌株。
【請求項２】
コンパニオンアニマルの胃腸管で生存してコロニー形成する能力を有する、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
０．５％胆汁酸塩の存在下で培養したときに少なくとも３３％増殖する、請求項１又は２に記載の菌株。
【請求項４】
ｐＨ２．５において１時間後に生存能力（viability）を維持することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項５】
配列番号１で表される配列と少なくとも９６％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項６】
前記菌株がビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９９又はその突然変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項７】
前記突然変異体が、自然突然変異体、遺伝子操作された突然変異体又は誘発突然変異体である、請求項６に記載の菌株。
【請求項８】
前記コンパニオンアニマルがイヌ又はネコである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項９】
切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することよって得られ、配列番号１で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する、コンパニオンアニマルの健康を維持又は改善するための、ビフィドバクテリア・シュードロンガムの菌株。
【請求項１０】
前記菌株がコンパニオンアニマルの胃腸管で生存してコロニー形成する能力で選択されるものである、請求項９に記載の菌株。
【請求項１１】
前記菌株が、０．５％胆汁酸塩類の存在下で培養したときに少なくとも３３％増殖する、請求項９又は１０に記載の菌株。
【請求項１２】
前記菌株がｐＨ２．５において１時間後に生存能力を維持することができる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１３】
前記菌株が、配列番号１で表される配列と少なくとも９６％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有するものである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１４】
前記菌株が、ビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９９又はその突然変異体又は変異型である、請求項に９〜１３のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１５】
前記突然変異体が自然突然変異体、遺伝子操作された突然変異体又は誘発突然変異体である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１６】
コンパニオンアニマルにおける免疫系の調節、コンパニオンアニマルにおける皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、コンパニオンアニマルにおける老化の影響の改善又は低減、前記コンパニオンアニマルにおける感染中及び感染後の体重減少の予防、コンパニオンアニマルにおける胃腸の感染症の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける尿路疾患の治療又は予防あるいはこれらの組み合わせから選択される症状の処置のための、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１７】
コンパニオンアニマルにおける自己免疫疾患の治療又は予防、コンパニオンアニマルにおける炎症の治療又は予防あるいはこれらの組み合わせを含む、コンパニオンアニマルにおける免疫系の調節のための、請求項１６に記載の菌株。
【請求項１８】
コンパニオンアニマルにおけるアトピー性皮膚疾患の治療又は予防を含む、コンパニオンアニマルの皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善のための、請求項１６に記載の菌株。
【請求項１９】
コンパニオンアニマルにおける微生物生態系の改善、コンパニオンアニマルの糞便中の病原菌のレベルの低減又はこれらの組み合わせを含む、コンパニオンアニマルにおける胃腸の感染症の治療又は予防のための、請求項１６に記載の菌株。
【請求項２０】
前記病原菌が、クロストリジウム属、エシェリキア属、サルモネラ属又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の菌株。
【請求項２１】
コンパニオンアニマルにおける尿路疾患の治療又は予防のための、請求項１６に記載の菌株であって、前記尿路疾患が、尿路感染、腎臓結石又はこれらの組み合わせを含む、菌株。
【請求項２２】
前記プロバイオティク・ビフィドバクテリア・シュードロンガムが、インビトロにてシュウ酸の分解を増進する、請求項２１に記載の菌株。
【請求項２３】
前記コンパニオンアニマルにおける繊維消化が増大される、請求項９に記載の菌株。
【請求項２４】
前記コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルが低下する、請求項９に記載の菌株。
【請求項２５】
前記ストレスレベルが、エピネフィリン、ノルエピネフィリン、ドーパミン、コルチゾール、Ｃ反応性タンパク質又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるストレスホルモンのレベルを決定することによって測定される、請求項２４に記載の菌株。
【請求項２６】
前記菌株が、１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／動物／日のいずれかの量で動物に与えられる、請求項９〜２５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項２７】
前記コンパニオンアニマルがイヌ又はネコである、請求項９〜２６のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項２８】
切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管からの単離によって得られ、配列番号１で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有し且つプロバイオティク活性を有するビフィドバクテリア・シュードロンガムの菌株と、キャリアとを含む組成物。
【請求項２９】
前記菌株が、コンパニオンアニマルの胃腸管で生存してコロニー形成する能力で選択されるものである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記菌株が０．５％胆汁酸塩の存在下で培養したときに少なくとも３３％増殖する、請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ｐＨ２．５において１時間後に生存率を維持することができる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記菌株が、配列番号１で表される配列と少なくとも９６％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有するものである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記菌株がビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９９又はその突然変異体である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記突然変異体が、自然突然変異体、遺伝子操作された突然変異体又は誘発突然変異体である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記コンパニオンアニマルがイヌ又はネコである、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、コンパニオンアニマル用フード、好ましくはキャットフード又はドッグフードである、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物が湿式アニマルフード又は乾燥アニマルフードである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、粗挽き、噛み物（chew）、ビスケット、コンパニオンアニマル用フードサプリメント、肉汁、乳製品、カプセル、錠剤又は丸剤の形態である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
約１．０Ｅ＋０４ＣＦＵ／ｇ〜約１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／ｇの乳酸菌を少なくとも０．００１％含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ビフィドバクテリア・シュードロンガム菌が、生存細胞、非生存細胞（non-viable cell）又はそれらの構成する活性画分の形態である、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティク微生物の分野、より具体的にはイヌ科動物のプロバイオティク乳酸菌及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の胃腸（ＧＩ）管を病原菌によるコロニー形成から保護する防衛機構は非常に複雑である。ほとんどの哺乳類のＧＩ管は、天然微生物相、及び侵襲性病原性微生物によってコロニー形成される。健康な個体では、これらの競争する微生物相は平衡状態にある。腸内微生物相の平衡の変更は、ヒト並びにネコ、イヌ及びウサギを包含するコンパニオンアニマルのようなその他の哺乳類種のいずれでも、多数のＧＩ疾患を引き起こす又は防止する場合がある。コンパニオンアニマルの健康は、その給餌及びＧＩの健康と密接に関係し、そしてこれらの動物における腸内微生物相の平衡は、より健康なペットにつながる場合がある。
【０００３】
腸内微小生物相の数及び組成は、年齢及び食事によって変わる場合があるが、安定となる傾向がある。胃液酸性度、胆汁、腸蠕動及び局所免疫は、ヒト及び種々のその他の哺乳類の小腸内の細菌叢の調節において重要と考えられる要因である。ペットＧＩ疾患は、イヌ科動物及びネコ科動物に見られるものを含めて、細菌の過成長及び病原菌による腸毒素の生産と関係づけられることが多い。これらの要因は、腸内微生物相の平衡を撹乱し、炎症及び異常免疫反応を促進することができる。
【０００４】
過去数年の間に、いくつかの有用な細菌の株及びそのプロバイオティク剤としての使用の可能性を強調するための研究が開始された。プロバイオティクス菌は、ＧＩ管内の天然微生物相の保全及び促進、並びに異常免疫反応に対する通常制御の強化によって哺乳類の健康を促進する細菌（生存又は死滅のいずれか）の製剤類、タンパク質類又は炭水化物類のようなそれらの構成成分、又は細菌発酵素の精製部分と考えられる。プロバイオティク細菌は、処置しようとする個体の種又は当該種に密接に関係する種から誘導したときにより有効であると考える者もいる。したがって、コンパニオンアニマルから誘導したプロバイオティク菌株をコンパニオンアニマルに使用する必要があり、これはヒトから誘導したものと異なる。
【０００５】
ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０１／９０３１１は、プロバイオティク活性を有するネコ及びイヌから入手した糞便試料から単離したプロバイオティク微生物を開示している。ただし、これらの細菌は糞便試料から得られたもので、ＧＩ管の上部に存在する天然腸微生物相の一部を形成しなくてもよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
結果として、コンパニオンアニマルに特に順応し、並びにそのプロバイオティク特性及び処理後に生存する能力で選択された、ＧＩ管の上部に存在する天然腸微生物相からの単離によって入手可能な細菌の菌株を提供する必要、及びこれらの菌株をその使用に適した組成物に組み込む必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、動物でプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物胃腸管からの単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガム種の乳酸菌の菌株が提供される。
【０００８】
好ましい実施形態において、当該乳酸菌株は、配列番号１と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓスペーサー領域ＤＮＡ配列を有するビフィドバクテリア・シュードロンガムである。
【０００９】
さらに好ましい実施形態において、乳酸菌株はビフィドバクテリア・シュードロンガムＡＨＣ７（ＮＣＩＭＢ４１１９９）である。
【００１０】
さらに、本発明は、ペットの健康の維持及び改善のための、切除及び洗浄されたイヌ科動物胃腸管からの単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌の使用、及び当該乳酸菌を含む組成物の提供に関する。
【００１１】
本発明のこれら及びその他の特徴、態様、及び利点は、本開示を読むことにより当業者に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（配列）
配列番号１−ビフィドバクテリア・シュードロンガムＡＨＣ７（ＮＣＩＭＢ４１１９９）からの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサ−ヌクレオチド配列。
【００１３】
配列番号２−１６ｓ−２３ｓＤＮＡ配列分析用プライマー配列。
【００１４】
（細菌寄託番号）
下の表は、本発明の実施例であるビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株を示す。当該細菌株は、英国アバディーン（Aberdeen）ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・フード・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria）（ＮＣＩＭＢ））に寄託される。
【表１】
2010178753.tif 000003
【００１５】
本明細書のすべての重量、測定値及びレベルは、特に指定のない限り、組成物全体に関して２５℃で測定される。
【００１６】
指示がない限り、本明細書で言及される組成物のすべてのパーセンテージは重量％であり、すべての比率は重量比である。
【００１７】
指示がない限り、分子量は全て、重量平均分子量である。
【００１８】
特に指示のない限り、本文内で参照される全ての文献の内容は、その全てを本明細書に参考として組み込む。
【００１９】
実際に測定した値の特定の例を提示する場合を除いて、本明細書で言及される数値は、「約」という言葉で修飾されていると考えるべきである。
【００２０】
以下の記載で、略語ＣＦＵ（「コロニー形成単位」）は、当該技術分野で一般に理解されるように、寒天平板上での微生物学的計数によって明らかになった細菌細胞の数を指す。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「その突然変異体」は、参照された菌株の１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサ−ポリヌクレオチド配列と少なくとも９３％の相同性、好ましくは少なくとも９６％の相同性、より好ましくは９８％の相同性を有するが、そうでなければ細菌ゲノム内の他のＤＮＡ配列にＤＮＡ突然変異を含む、誘導された細菌株を包含する。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「ＤＮＡ突然変異」は、親配列と少なくとも５０％の相同性を維持しながら親ヌクレオチド又はアミノ酸配列に導入された遺伝子修飾を包含する、欠失、挿入、転換、及び当業者に既知のその他のＤＮＡ修飾を包含する少なくとも１つの塩基変化を含む自然突然変異又は誘発突然変異を包含する。好ましくは、ＤＮＡ突然変異又は突然変異類を含む配列は、親配列と又少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より一層好ましくは８５％の相同性を有する。本明細書で使用するとき、配列「相同性」は、当業者に既知の標準的な技法を用いて決定することができる。例えば、相同性は、ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で公的に入手可能なオンライン（on-line）相同性アルゴリズム「ブラスト（ＢＬＡＳＴ）」プログラムを用いて決定してもよい。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「遺伝子修飾」は、前記生物のゲノムへの挿入によって又は当業者に既知であるようにプラスミドＤＮＡ若しくはバクテリオファージを包含するベクターによって、外因性及び／又は内因性ＤＮＡ配列を生物のゲノムに導入することを包含し、前記ＤＮＡ配列が少なくとも２つのデオキシリボ核酸塩基を有する長さである。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「コンパニオンアニマル」は家畜を意味する。好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、飼われているイヌ科動物、ネコ科動物、ウサギ、フェレット、馬、牛、又は同様なものを意味する。より好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、飼われているイヌ科動物又はネコ科動物を意味する。
【００２５】
（ビフィドバクテリア・シュードロンガム（Bifidobacteria pseudolongum）菌株）
本発明の第一の態様は、動物においてプロバイオティク活性を有する、切除及び洗浄されたイヌ科動物胃腸管からの単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガム種の菌株を含む。プロバイオティクス菌は、微生物（生存又は死滅のいずれか）、加工された微生物の組成物、タンパク質又は炭水化物のようなその構成成分、又は宿主に有益に影響する微生物発酵素の精製された画分である。汎用のプロバイオティク細菌は、生存細胞の形態である。ただし、プロバイオティク細菌によって表される有益要因を含有する死滅した培養物又は組成物のような非生存細胞にまで拡大することができる。これは、熱的に死滅した微生物、又はｐＨ変化に晒されるか又は圧力を受けることよって死滅した微生物を包含してもよい。本発明の目的においては、「プロバイオティクス菌」は、別個に示されていない場合には、発酵中に本発明の微生物類によって生み出される代謝産物類を包含することが更に意図される。これらの代謝産物は、発酵の媒質から放出されることがあるか、又は微生物の体内に保存されることがある。本明細書で使用するとき、「プロバイオティクス菌」は、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌性抽出物、細菌性発酵素上清、及びこれらの組み合わせも包含し、これらは治療用量で与えられたときに宿主動物に対して有益な働きをする。
【００２６】
切除及び洗浄された哺乳類のＧＩ管からの直接の単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガムの菌株は、生存細菌細胞の供給後にＧＩ管に付着すること、及び生存、非生存又は画分の形態で動物に供給されたときに非常に免疫調節的でもあることが見出された。理論に束縛されるものではないが、切除及び洗浄されたＧＩ管からの単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガムは、腸粘膜組織と密接に関連すると考えられる。さらに理論に束縛されるものではないが、これにより、そのプロバイオティク作用を生じる代替宿主反応を発生する本発明のプロバイオティク・ビフィドバクテリア・シュードロンガムが得られると考えられる。切除及び洗浄されたＧＩ管からの単離によって入手できるプロバイオティク細菌は、粘膜上皮との直接相互作用によって宿主の免疫系を、及び宿主の免疫細胞を調節できることが見出された。この免疫調節は、プロバイオティク細菌に関連する従来の作用機構、即ち栄養素の閉鎖及び競争による病原体の腸への付着の防止と共に、プロバイオティク生物として非常に効果的な本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガムを生じる。
【００２７】
切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から単離によって入手できる、本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガムは、当業者に既知の阻害領域又は細菌増殖阻害アッセイによって測定したときに、多数の病原菌菌株／種に対して生体外抗菌活性を有する。理論に束縛されるものではないが、この生体外抗菌活性は、動物、好ましくはイヌ科動物及びネコ科動物のようなコンパニオンアニマルにおける生体内の潜在的プロバイオティク活性を示すと考えられる。本発明の乳酸菌は、好ましくはネズミチフス菌、単球症リステリア、リステリア・イノキュア又は大腸菌、より好ましくはこれらの菌株の組み合わせ、より一層好ましくはこれらの菌株のすべてに対してインビトロにて抗菌活性を有する。
【００２８】
理論に束縛されるものではないが、本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌の抗菌活性は、本明細書のビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌による多数の異なる作用の結果であってもよい。糞便試料から単離された細菌の数種類の菌株が、経口摂取の後、病原体生物の閉鎖による腸粘膜への付着を防止することによってＧＩ管でそのプロバイオティク効果を示すことが当該技術分野において過去に示唆された。これは、細菌のコロニーが腸内でコロニー形成するために、「生きた」又は生存細菌細胞の経口摂取を必要とする。ただし、切除及び洗浄されたイヌ科動物のＧＩ管から単離によって入手できる本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガムは、生存形態で与えられた場合に閉鎖によるいくらかのプロバイオティク効果を示すと同時に、病原微生物の成長を阻害する、病原微生物を殺す、及び／又は宿主動物の免疫能力を改変する物質又は物質類の生体外での発酵中に生産による生存又は非生存のいずれかの形態で実質的なプロバイオティク効果を供出（deliver）してもよい。本発明の細菌は生存若しくは非生存培養物又は精製発酵製品として与えられることができ、なお宿主に有益な治療効果を供出することから、この形態のプロバイオティク活性が望ましい。
【００２９】
好ましくは、本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガムはＧＩ管を通過した後に生存能力を維持することができる。これは、細菌の生きた培養物を経口摂取するため、並びに食道及び胃を通過した後に腸及び内臓でコロニー形成が起こるために望ましい。本発明の乳酸菌による腸及び内臓のコロニー形成は、長期間のプロバイオティク効果を宿主に供出するために望ましい。非生存細胞又はその精製単離物の経口投与は一時的な効果を誘発するが、細菌が生存可能でないため、成長すること、及び原位置（in situ）で継続的にプロバイオティク効果を供出することができない。結果として、これは、健康効果を維持するために宿主への定期的な投与を必要とする場合がある。対照的に、胃の通過に生存可能な形態で生存することができ、その後腸粘膜に付着し腸粘膜上で増殖することによってコロニー形成することができる生存細胞は、原位置（in situ）で継続的にプロバイオティク効果を供出できる。
【００３０】
したがって、本発明の乳酸菌はｐＨ２．５の培地で１時間の懸濁後に生存能力を維持することが好ましい。本明細書で使用するとき、「生存能力を維持する」は、当業者に既知の平板計数法を用いて、最初に試験培地に懸濁された細菌の少なくとも２５％が生存可能であることを意味する。好ましくは、「生存能力を維持する」は、最初に懸濁された細菌の少なくとも５０％が生存可能であることを意味する低ｐＨへの暴露は、これが動物での経口摂取後の生体内での胃及び腸での胃液への暴露を模倣することから、本発明の乳酸菌は、低ｐＨへの暴露後に生存能力を維持することが望ましい。
【００３１】
さらに、本発明の乳酸菌は、少なくとも０．５％のブタ胆汁酸塩類が存在するときに少なくとも３３％増殖することが好ましい。本明細書で使用するときの増殖は、実施例３にさらに詳細に記載されている。より好ましくは、本発明の細菌は、少なくとも１％のブタ胆汁酸塩類が存在するときに少なくとも３３％増殖する。理論に束縛されるものではないが、少なくとも０．５％のブタ胆汁酸塩類の存在下で増殖できる本発明の乳酸菌は、腸内に存在する条件で生存できると考えられる。これは、腸の条件を模倣する培地へのブタ胆汁の添加の結果であると考えられる。
【００３２】
さらに、本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌は、インビトロで腸被毛細胞に有意な付着を有することが好ましい。本明細書で使用するとき、「有意な付着」は、インビトロで被毛細胞とコインキュベートされた乳酸菌の総数の少なくとも４％が被毛細胞に付着することを意味する。より好ましくは、コインキュベートされた細菌細胞の少なくとも６％がインビトロで被毛細胞に付着する。理論に束縛されるものではないが、インビトロでの腸上皮細胞付着は、生体内での動物のＧＩ管への乳酸菌のコロニー形成能力を示すと考えられる。
【００３３】
１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、異なる細菌の種及び菌株を同定するために使用できる細菌ゲノムのＤＮＡ配列として当業者に既知である。この遺伝子間ポリヌクレオチド配列は、下の実施例４に詳述する方法によって決定できる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、ビフィドバクテリア・シュードロンガムの菌株は、配列番号１によるポリヌクレオチド配列と少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９９％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、本発明による乳酸菌の菌株は、配列番号１による１６ｓ−２３ｓポリヌクレオチド配列を有する。より一層好ましくは、本発明による乳酸菌の菌株は、ビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株ＮＣＩＭＢ４１１９９（ＡＨＣ７）、又はその突然変異体である。
【００３５】
切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管からの単離によって入手できるビフィドバクテリア・シュードロンガム属の乳酸菌の菌株を、動物、好ましくはコンパニオンアニマル又はヒトにおいて経口摂取後にプロバイオティク効果を供出するために使用することができる。このプロバイオティク効果は一般に動物の全体的健康を維持及び改善する。病気の症状の治療的軽減、又は予防による病気の防止のいずれかにおいて利益となる、動物の健康及び生理機能の非限定的な要素としては、炎症疾患、免疫不全、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、癌（特に胃腸及び免疫機構の癌）、下痢性疾患、抗生物質に関連する下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、アミロイドーシス、リウマチ様関節炎、関節炎、関節可動域、真性糖尿病、インシュリン抵抗性、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、歯周病、泌尿生殖器疾患、外科関連の外傷、手術誘発性（surgical-induced）転移性疾患、敗血症、体重減少、重量増加、過剰な脂肪組織蓄積、拒食症、発熱の抑制（fever control）、悪液質、創傷治癒、潰瘍、腸バリア感染症、アレルギー、ぜんそく、呼吸器疾患、循環器疾患、冠状動脈性心疾患、貧血、血液凝固システムの疾患、腎臓の疾患、中枢神経系の疾患、肝臓疾患、虚血、栄養疾患、骨粗鬆症、内分泌腺疾患、及び表皮の疾患が挙げられる。好ましいのは、下痢の治療又は予防を包含する胃腸管の処置；免疫機構の調整、好ましくは自己免疫疾患及び炎症の治療又は予防；皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善、好ましくはアトピー性皮膚疾患の治療又は予防；精神的認知及び活動レベルを包含する老化の影響の改善又は減少；及び感染中及び感染後の体重減少の予防である。
【００３６】
上に開示された疾患の治療は、当業者に既知の技法を用いて測定されてもよい。例えば、自己免疫疾患及び炎症を包含する炎症疾患は、リンパ球幼若化現象、ナチュラルキラー細胞活性、ワクチンに対する抗体反応、遅延型過敏症、及びこれらの組み合わせのような生体内免疫機能試験を使用して検出及び監視されてもよい。このような方法を本明細書で簡単に記載するが、当業者には周知である。
【００３７】
１．リンパ球幼若化現象：このアッセイは、試験及び対照動物の新鮮全血から単離したリンパ球の種々のマイトジェンに対する増殖性反応を測定するもので、全体的なＴ細胞及びＢ細胞機能の指標である。簡単に述べると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、当業者に既知のフィコール・ハイパック（Ficoll-Hypaque）密度遠心分離法によって全血から単離する。単離したＰＢＭＣを、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＰＲＭＩ１６４０細胞培地中で２回洗浄する。洗浄した細胞を、ＰＲＭＩ１６４０に再懸濁し、計数し、細胞密度を適切に調節する。２×１０５の細胞を、ある範囲のレベル（０．１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ）の種々のマイトジェン（そのいくつかの例として、ポークウィードマイトジェン（ギブコ（Gibco））、フィトヘマグルチニン（ギブコ（Gibco））及びコンコナバリン（conconavalin）Ａ（シグマ（Sigma））が挙げられる）に、３７℃及び５％ＣＯ２で１０％ウシ胎児血清（シグマ（Sigma））と共に三重反復にて７２時間暴露する。５４時間で、細胞を１μＣｉ３Ｈ−チミジンで標識し、７２時間で当該細胞を採取し、トップカウント（TopCount）ＮＸＴでシンチレーションカウントを読み取る。
【００３８】
２．ナチュラルキラー細胞活性：ＵＳ６，３１０，０９０に記載されているように、このアッセイは、試験及び対照動物の新鮮全血から単離したナチュラルキラー細胞のインビトロエフェクタ−活性を測定する。ナチュラルキラー細胞は、哺乳類の先天免疫機能の一構成成分である。イヌ科動物甲状腺癌細胞を、ＮＫ細胞の細胞毒活性の測定において標的細胞として使用した。この細胞株は、イヌ科動物ＮＫ細胞によって殺されやすいことが過去に明らかにされた。標的細胞は、Ｔ７５フラスコ内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補足した最少必須培地（ＭＥＭ；シグマケミカル社（Sigma Chem.Co.）（米ミズーリ州セントルイス））２０ｍＬで培養した。融合したとき、標的細胞はトリプシン処理され、３回洗浄され、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）中で５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに再懸濁される。三重反復した標的細胞の１００μＬアリコートを、９６穴Ｕ底プレート（コスター（Costar）（米マサチューセッツ州ケンブリッジ））にピペットで移し、８時間インキュベートして細胞を付着させる。フィコール・ハイパック（Ficoll-Hypaque）分離（上述の通り）によって単離したリンパ球（エフェクタ細胞；１００μＬ）を、続いて、標的細胞に添加し、１０：１のエフェクタ／標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を与えた。３７℃で１０時間のインキュベート後、５μｇの３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を含有する基質２０μＬを添加した。当該混合物を、３７℃で４時間インキュベートし、その後、未代謝のＭＴＴを吸引によって除去した。ホルマザン結晶を、２００μＬの９５％エタノールを添加することによって溶解した。光学的密度を、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで測定した。ＮＫ細胞固有の溶解のパーセンテージを次のように計算した：
比細胞毒性（％）＝１００×｛１−［（標的細胞及びエフェクタ細胞のＯＤ−エフェクタ細胞のＯＤ）／（標的細胞のＯＤ）］｝
３．ワクチンに対する抗体反応：被験体は、プロバイオティク又は対照の供給の少なくとも１２週間後に複数（５まで）のワクチンを投与される。ワクチンは、新規ワクチンと冗長ワクチンとの組み合わせであってもよい。使用してもよいワクチン配列の非限定例としては、フォートドッジアニマルヘルス（Fort Dodge Animal Health）によって調製されたワクチンの混合物が挙げられる。本明細書での使用に好適なワクチンの非限定例としては、イヌジステンパー、アデノウイルス、コロナウイルス、パラインフルエンザ、及びパルボウイルスが挙げられる。被験体のワクチン履歴が、使用するワクチンを決定する。投与されたワクチンに対する特異的な抗体を３週間血液中で測定し、対照及びプロバイオティク供給群の反応の長さ及び強さを比較する。
【００３９】
４．遅延型過敏症：免疫系の状態を測定する生体内、非侵襲法。この試験は、ポリクローナルマイトジェン・フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と羊赤血球細胞多価ワクチン、ヒスタミン（１００μＬの０．０２７５ｇ／Ｌヒスタミンホスフェート；グリーア（Greer）、米ノースカロライナ州レノア（Lenoir）、又はＰＢＳ（１００μＬのホスフェート緩衝生理食塩水、８．５ｇ／Ｌ；シグマ（Sigma））との組み合わせの皮内注射を含む。抗原に対する免疫反応は、注射後０、２４、４８及び７２時間の時間間隔で、キャリパーを用いて皮下脂肪厚として記録される。皮下脂肪厚の増進は、本発明の細菌での処置によって低減されるべき過敏症反応がより大きいことを示す。
【００４０】
本発明のビフィズス菌の影響を調べるその他の方法は、ＵＳ６，１３３，３２３及びＵＳ６，３１０，０９０に記載されている。
【００４１】
さらに、年齢の影響の改善が、体脂肪量、除脂肪体重及び骨塩量を包含する体組成を測定するためのデュアルＸ線吸光光度法（dual x-ray absorptometry）又はＣＴスキャンを用いて決定されてもよい。同様に、この方法は、感染後の被験体の重量損失又は骨密度のような解剖学的変化の決定に使用されてもよい。
【００４２】
本発明のビフィズス菌は、コンパニオンアニマルのストレスレベル低下のための方法にも使用されてもよい。エピネフィリン、ノルエピネフィリン、ドーパミン、コルチゾール及びＣ反応性タンパク質を包含する血中ストレスホルモンのレベルを、ストレスレベル及びその低減又は維持を調べるために測定してもよい。これらのホルモンは、ストレスのバイオマーカーとして認識されており、当業者に既知の技法を用いて容易に測定できる。
【００４３】
さらに、アトピー性皮膚疾患を包含するコンパニオンアニマルの皮膚及び／又は被毛系の健康の維持又は改善は、２名の訓練を受けた個人によって実施される皮膚及び被毛測定を用いて測定されてもよい。このような測定で調査される判定基準の例：
ａ）脱毛指数：脱毛指数は、標準化されたブラッシングセッションの間に生じた毛を回収することによって各被験体に割り当てられる。毛は保持及び計量され、対照及び被験体を比較する。
ｂ）主観的皮膚／被毛測定：訓練された官能試験員が、脱毛、光沢、フケ、均一性、柔軟性及び密度を測定することによって皮膚及び被毛状態を主観的に測定する。
ｃ）皮膚機能測定：皮膚のバリヤ機能を、アセトン浸漬したガーゼで皮膚表面を拭くことによって測定してもよい。この技法は、単細胞層及び関連する角質層の脂質画分を除去することによって皮膚バリヤを有効に撹乱する。バリヤ撹乱（disruption）は、経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）の増進及び損傷部位の発赤の度合いを当業者に既知の方法を用いて測定することによって定量化される。発赤（紅斑）評点を、過去に記載されたカメラ及び照明装置を用いて得る。皮膚の保護及び治癒特性を測定するため、ＴＥＷＬ指数及び発赤評点を、撹乱の直前及び直後、並びに５及び２４時間のエンドポイントで得る。
【００４４】
コンパニオンアニマルにおける下痢を包含する胃腸の感染症の治療又は予防は、便評点を用いて測定してもよい。便評点は、次のガイドラインに従って一日一回記録してもよく、本発明による細菌の供給の前後に対照群及び試験群を比較する。
【００４５】
評点：５非常に乾燥している
この便は、硬く、表面に付着しない。便は、押したときに転がる。便を持ち上げたときにくぼみが生じない。便が、１つの完全な単一体でなく、個別の便の組となって排泄されることが多い。便が、回収後に元の形状を維持する。
【００４６】
評点：４硬い（理想的な便）
この便は、硬く、形が良く、円筒形である。この便は、持ち上げたときに容易に崩れない。この便は、表面及び手袋上に残留物を残す場合がある。この便は、１つの単一体として排泄されることが多い。この便は、回収後にもとの形状を維持する。
【００４７】
評点：３柔らかく、形がある
この便は、柔らかいが明確な形がある。この便は、容易に崩れ、表面及び手袋上に明らかに残留物を残す。便が、回収後に元の形状を失うことが多い。この便は、別の評点と共に存在することが多いが、全便試料を含むことができる。
【００４８】
評点：２柔らかく、形がない
この便は、柔らかく、円筒形を持たない。「２」に関連することが多い形状は「牛肉のパテ」形である。この便は、回収時にもとの形状を失い、表面及び手袋上に明らかに残留物を残す。この便評点は、別の評点と共に存在することが多いが、全便試料を含むことができる。この便試料は数インチ（５〜１５センチ）の領域にわたって広がる場合がある。
【００４９】
評点：１液体
この便評点は、必ず液体に似ており、粒子状物質が存在してもしなくてもよい。この便は、１つの完全な単一体でなく、堆積物の組で排泄されることが多い。この便試料は粘液と共に存在することが多い。この便試料は回収が非常に困難であり、表面及び手袋の上に残留物が必ず残される。この便試料は数インチ（５〜１５センチ）の領域にわたって広がる場合がある。
【００５０】
加えて、便中の血液、便中の異物、又は便中の粘液を包含するその他の観測結果も記録される。
【００５１】
さらに、コンパニオンアニマルの胃腸の感染症の治療は、コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善を含んでもよい。コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善は、好ましくは、コンパニオンアニマルの糞便中の病原菌のレベル低下を含む。コンパニオンアニマルの糞便に存在する病原菌のレベルは、当業者に既知の標準平板計数法を用いて数えてもよい。より好ましくは、病原菌は、クロストリジウム属(Clostridia)、エシェリキア属(Escherichia)、サルモネラ属(Salmonella)、バクテロイド類及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。好適な病原菌の菌株の非限定例としては、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ディフィシレ、大腸菌、ネズミチフス菌、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５２】
本発明の細菌の使用方法は、哺乳類、好ましくはコンパニオンアニマルの尿路の予防的又は治療的処置も包含してもよい。尿路処置の非限定例としては、尿路感染の治療又は予防、腎疾患の治療又は予防、膀胱感染の治療又は予防等が挙げられる。理論に束縛されるものではないが、本発明のビフィズス菌は、インビトロで実証されたように、シュウ酸の分解能力の結果として、これらの疾病の防止に有用であると考えられる。シュウ酸は、腎臓、膀胱及びその他の尿路感染につながる不溶性沈殿を形成することができる尿代謝の副生成物である。シュウ酸を分解すること、及びしたがって尿路内でのその沈殿及び蓄積を潜在的に防止することによって、本発明の細菌は尿路の感染及びその他の疾患を治療及び予防してもよい。シュウ酸分解は、ベーリンガー・マンハイム／Ｒ−バイオファーム（Boehringer Mannheim/R-Biopharm）より市販されているシュウ酸試験キットカタログ番号７５５６９９を用いてインビトロで測定してもよい。
【００５３】
本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガムは、繊維消化の改善を含むコンパニオンアニマルの健康の改善又は維持のための方法に使用されてもよい。繊維消化の改善は、それが前記プロバイオティク細菌、加えて有益な内因性微生物相（これはいくらかの潜在的病原菌の抑制を助ける）の増殖を促進することから望ましい。加えて、コロニー発酵から生じる毒性代謝物及び有害酵素の量の減少が、ヒトで記録された（トモマツ、Ｈ．（Tomomatsu,H.）、「オリゴ糖の健康影響」（Health effects of oligosaccharides）、（１９９４年）、フードテクノロジー（Food Technol）、４８、６１〜６５）。繊維消化は、希釈糞便試料を用いた接種の代わりに各実験で問題の細菌株の純粋培養物を使用する点を除いて、ビッカーズ（Vickers）ら（２００１年）の「選択されたフラクトオリゴ糖及びその他の繊維基質のイヌ科動物結腸微生物相による発酵の比較」（Comparison of fermentation of selected fructooligosaccharides and othe rfiber substrates by canine colonic microflora）、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．６１（４）、６０９〜６１５に記載されている方法を用いて決定してもよい。
【００５４】
本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌の使用方法は、一般に当該動物による経口摂取を伴う。経口摂取は、通常の食事摂取の一部として、又はそれへのサプリメントとして行われてもよい。経口摂取は、一般的に少なくとも１ヶ月に１回、好ましくは１週間に１回、より好ましくは１日に１回行う。本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌は、動物、好ましくはコンパニオンアニマルの健康を維持又は改善するために治療的に有効な量で当該コンパニオンアニマルに投与されてもよい。本明細書で使用するとき、用語「治療的に有効な量」は、乳酸菌に関して、処置が必要な宿主動物に所望の影響又は効果を提供するのに十分であって、さらに毒性、刺激作用、又はアレルギー応答のような悪影響を回避するのに十分低く、本発明の方式で用いた場合、合理的な利点／リスクの比に相応する、細菌の量を意味する。特定の「治療的に有効な量」とは、処置されている特定の状態と同じ因子、使用者の物理的状態、処置の期間、併用している療法（もしあれば）の性質、用いられる特定の投薬形態、使用されるキャリア、投薬形態の溶解性、及び特定の投与レジメンによって変化する。
【００５５】
好ましくは、乳酸菌は、１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１４ＣＦＵ／日、より好ましくは１．０Ｅ＋０６〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／日の用量でコンパニオンアニマルに投与される。組成物は、切除及び洗浄されたイヌ科動物ＧＩ管から単離によって入手可能な１．０Ｅ＋０４〜１．０Ｅ＋１２ＣＦＵ／ｇのビフィドバクテリア・シュードロンガムを、好ましくは少なくとも０．００１％含有してもよい。ビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌は、生存可能な形態で、又は死滅細胞として、又は本発明の乳酸菌の発酵生成物の留出物、単離物若しくはその他の画分又はこれらのいかなる組み合わせでも動物に投与されることができる。
【００５６】
好ましくは、ビフィドバクテリア・シュードロンガム細菌、又はその精製若しくは単離された画分が、動物の健康の維持又は改善を意図する組成物の調製に使用される。上記のように、組成物は通常の食事摂取の一部又はサプリメントであってもよい。組成物が通常の食事摂取の一部である場合、当該組成物はビスケット又は粗挽き(kibble)のような乾燥アニマルフード、加工穀類フード、湿式アニマルフード、ヨーグルト、肉汁(gravy)、噛み物(chew)、おやつ等であってもよい。
【００５７】
このような組成物は、さらに構成成分を含んでもよい。他の構成成分は、本明細書で使用される組成物に含めるのに有益であるが、本発明の目的には任意である。例えば、フード組成物は好ましくは、栄養的にバランスが取れている。１つの実施形態では、フード組成物は、乾燥物質基準で、フード組成物の約２０重量％〜約５０重量％の粗タンパク質、好ましくは約２２重量％〜約４０重量％の粗タンパク質を含んでもよい。粗タンパク質材料は、少なくとも約１５重量％のタンパク質分を有するいかなる材料であってもよく、その非限定例としては、大豆、綿実、及びピーナッツのような植物性タンパク質、並びにカゼイン、アルブミン、及び食肉組織のような動物性タンパク質が挙げられる。本明細書で有用な食肉組織の非限定例としては、新鮮食肉、並びに魚粉、鶏肉粉、肉粉、骨粉等のような乾燥又は精製粉餌が挙げられる。その他の種類の好適な粗タンパク質供給源としては、小麦グルテン又はトウモロコシグルテン、及びイーストのような微生物供給源から抽出したタンパク質が挙げられる。
【００５８】
さらに、フード組成物は、乾燥物質基準で、フード組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、好ましくは約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。さらに、本発明の乳酸菌を含むフード組成物は、約４％〜約２５％の全食物繊維も含んでもよい。組成物は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９９／５１１０８に記載されているような複数のデンプン供給源も含んでもよい。
【００５９】
本発明の組成物は、炭水化物源をさらに含んでよい。米、トウモロコシ、ミロ、サトウモロコシ、大麦、アルファルファ、小麦などのようなグレイン又はシリアルが、供給源の例である。さらに、組成物は、乾燥ホエイ及び他の乳製品副産物のような他の物質も含有してよい。
【００６０】
本発明の細菌を含む組成物は、プレバイオティクも含んでもよい。「プレバイオティク」は、ペットの腸細菌叢によって発酵され、したがって病原菌存在時のペットの胃腸管内における乳酸菌の増殖及び発達を促進する、物質又は化合物を包含する。この発酵の結果は、結腸内での脂肪酸類、特に短鎖脂肪酸類の放出である。これは、結腸内におけるｐＨ値を低下する効果がある。好適なプレバイオティク類の非限定例としては、イヌリンのようなオリゴ糖並びにフラクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、キシロオリゴ糖類として一般に知られるその加水分解生成物又はデンプンのオリゴ誘導体が挙げられる。プレバイオティク類は、いかなる好適な形態で提供されてもよい。例えば、プレバイオティクは、繊維を含有する植物材料の形態で提供されてもよい。好適な植物材料としては、アスパラガス類、アーティチョーク類、タマネギ類、小麦又はチコリー、又はこれらの植物材料の残留物類が挙げられる。あるいは、プレバイオティク繊維はイヌリン抽出物として提供されてもよく、例えばチコリーからの抽出物が好適である。好適なイヌリン抽出物は、ベルギー国ティルルモン（Tirlemont 3300,Belgium）のオラフティ社（Orafti SA）から「ラフティリン」（Raftiline）の商標で入手されてもよい。例えば、イヌリンは、約９０〜約９４重量％のイヌリン、約４重量％までのグルコース及びフルクトース、並びに約４〜９重量％のスクロースを含有する微小白色粉末であるラティフリン（Raftiline）（ｇ）ＳＴとして提供されてもよい。あるいは、繊維は、ベルギー国ティルルモン（Tirlemont 3300,Belgium）のオラフティ社（Orafti SA）から「ラフティロース」（Raftilose）の商標で得られるようなフラクトオリゴ糖の形態であってもよい。例えば、イヌリンはラフティロース（Raftilose）（ｇ）Ｐ９５の形態で提供されてもよい。そうでなければ、フラクトオリゴ糖はイヌリンの加水分解によって、酵素法によって、又は微生物類の使用によって、得られてもよい。
【００６１】
焼成又はその他の好適なプロセスを使用してもよいが、乾燥ペットフードにとって好適なプロセスは、押出し調理である。押出し調理されるとき、乾燥ペットフードは通常粗挽きの形態で提供される。プレバイオティクが使用される場合、当該プレバイオティクは加工の前に乾燥ペットフードの他の成分と混合されてもよい。好適なプロセスは、欧州特許出願第０８５０５６９号に記載されている。プロバイオティク微生物が使用される場合、当該生物は、乾燥ペットフードの上にコーティングされるか又は中に充填されるのが最善である。好適なプロセスは、欧州特許公報番号ＥＰ０８６２８６３に記載されている。
【００６２】
ウエットフードについては、米国特許第４，７８１，９３９号及び第５，１３２，１３７号に記載されているプロセスを使用して、模造食肉製品を製造してもよい。ぶつ切り型の製品を製造するその他の手順、例えばスチームオーブン内での調理も使用してもよい。あるいは、塊型の製品を、好適な食肉材料の乳化による食肉乳濁液の製造、好適なゲル化剤の添加、及び缶類又はその他の容器類への充填前の当該食肉乳濁液の加熱によって製造してもよい。典型的なウエットフード組成物は、約５％〜約１５％のタンパク質、約１％〜約１０％の脂肪、及び約１％〜約７％の繊維を含んでもよい。ウエットフード組成物に使用してもよい非限定的成分としては、鶏肉、七面鳥、牛肉、白身魚、鶏肉スープ、七面鳥スープ、牛肉スープ、鶏レバー、発酵用米、コーングリッツ、魚粉、卵、ビートパルプ、塩化物、亜麻粉、子羊肉、牛肉副生成物、鶏肉副生成物及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６３】
別の実施形態では、ビスケット、噛み物（chew）、及びその他のおやつのようなサプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約２０重量％〜約６０重量％のタンパク質、又は約２２重量％〜約４０重量％のタンパク質を含んでもよい。別の例としては、サプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約５重量％〜約３５重量％の脂肪、又は約１０重量％〜約３０重量％の脂肪を含んでもよい。イヌ科動物又はネコ科動物による使用を意図されたフード及びサプリメント組成物は、一般的に当該技術分野において既知である。
【００６４】
ペットフードは、長鎖脂肪酸類及び亜鉛のようなその他の活性剤を含有してもよい。好適な長鎖脂肪酸類としては、α−リノール酸、γ−リノレン酸、リノレン酸、エイコサペンタン酸、及びドコサヘキサン酸が挙げられる。魚油は、エイコサペンタン酸及びドコサヘキサン酸の好適な供給源である。
【００６５】
ルリチシャ油、クロスグリ種子油及びマツヨイグサ油は、γリノレン酸の好適な供給源である。ベニバナ油類、ヒマワリ油類、コーン油類及び大豆油類は、リノール酸の好適な供給源である。これらの油類は、上で参照されたコーティング基材にも使用してもよい。亜鉛は、種々の好適な形態、例えば硫酸亜鉛又は酸化亜鉛として提供されてもよい。さらにペットフードに一般的に使用される多数の成分が脂肪酸類及び亜鉛の供給源である。プレバイオティクの供給源としてのチコリーと、大豆油のようなリノール酸リッチ油との組み合わせは、予想外の効果を提供することが観察され、相乗効果が示唆された。
【００６６】
組成物が肉汁の形態である場合、組成物は好ましくは少なくとも１０％の肉汁、又はブイヨンを含み、その非限定例としては野菜入り牛肉、鶏肉又はハムブイヨンが挙げられる。典型的な肉汁組成物は、約０．５％〜約５％の粗タンパク質、約２％〜約５％の粗脂肪、及び約１％〜約５％の繊維を含んでもよい。
【００６７】
本明細書での使用に好適なサプリメントのさらなる非限定例としては、粉末、油懸濁液、乳ベースの懸濁液チーズ、及び丸剤又はカプセルが挙げられる。組成物が丸剤の形態である場合、該丸剤を固体の加圧された形態に維持するために好適な結合剤が必要である。好適な結合剤の非限定例としては、キサンタンガム、ペクチン類、レシチン類、アルギネート類及びその他の当業者に既知のもののような天然ガム類が挙げられる。組成物がカプセルの形態の場合、組成物は好ましくは当業者に既知の技術を用いて封入される。好適な封入材料の非限定例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルギネート類、及びゼラチンが挙げられる。ヨーグルトベースの組成物は、約１％〜約５％のタンパク質、約１０％〜約２０％の炭水化物、約１％〜約５％の繊維、約１％〜約５％の脂肪及び約５０％〜約９０％の乳のような液体キャリアを含んでもよい。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、及びいかなる方式においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００６９】
実施例１：イヌ科動物ＧＩ管からのビフィドバクテリア・シュードロンガム菌の単離
イヌ科動物の腸試料は、安楽死に着手することを承認した所有者のために地元の獣医師立会いのもとで複数の健常犬から入手した。すべての動物は健康で罹患していなかった。各イヌの結腸、中結腸（mid-colon）、盲腸及び回腸を切開し、粘膜を暴露した。
【００７０】
粘膜組織の攪拌（１分間攪拌）に続いて、及び組織の機械的均質化に続いて、上清を除去した。各上清を、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）又はＭＲＳ＋０．０５％システイン＋ムピロシンの上に接種した。これらを、アネロカルト・ガスパック（Anerocult GasPak）システムを用いて、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートした。プレートから単離したコロニーを、ＭＲＳ又はＲＣＡのいずれかに再画線し、再び同じ条件で嫌気的に生育した。単一菌株を精製するため、単離したコロニーをさらに４回再画線した。コロニーのモルホロジー（morphology）及び微視的外観を測定した。好適な単離物を、グラム反応及びカタラーゼ活性について試験した。ＡＰＩ試験（ＡＰＩ  ５０ＣＨＬ、バイオメリックス（BioMerieux）を用いてグラム陽性、カタラ−ゼ陰性菌の同定を行った。培養した細胞は、０．０５Ｍリン酸塩緩衝剤（ｐＨ６．５）及びシステイン−ＨＣｌ（５００ｍｇ／Ｌ）を用いて２回洗浄した後、音波処理した。遠心分離により細胞片を除去した。上清をＮａＦ（６ｍｇ／ｍＬ）及びヨード酢酸Ｎａ（１０ｍｇ／ｍＬ）で、３７℃で３０分間インキュベートした。ヒドロキシルアミンＨＣｌ（ｐＨ６．５）で室温で１０分間インキュベートすることによって反応を停止した。ＨＣｌ（４Ｍ）、ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ（０．１Ｍ  ＨＣｌ中５％（重量／体積））及びフルクトース−６−ホスフェート（Ｎａ塩）を添加した後、発色を観察した。フルクトース−６−ホスフェートからのアセチルホスフェートの生成が、そのヒドロキシメートの第二鉄キレートによって生じる赤みがかった色によって証拠付けられた。
【００７１】
切除及び洗浄されたイヌ科動物ＧＩ管から５８の乳酸菌菌株を単離し、そのうち６株がビフィズス菌属であり、及び１株がＢ．シュードロンガム菌株であることが見出された。
【００７２】
実施例２：抗菌活性のスクリーニング
単離したビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株を、ＴＰＹブイヨン内で嫌気的にインキュベートした。各培養物２μＬをＴＰＹ寒天平板上に滴下し、嫌気的に一晩インキュベートした。ネズミチフス菌、単球症リステリア、リステリア・イノキュア及び大腸菌０１５７Ｈ４５を一晩前生育し、１００μＬを溶融寒天に接種した（１体積％）。この指標培養物を、接種したＭＲＳ又はＴＰＹプレートの表面に注いだ。一晩インキュベートした後、プロバイオティクコロニー周辺の阻害領域を測定した。すべての実験は、別に３度、反復した。さらに、緩衝剤の２％βグリセロホスフェートを寒天に組み込むことで、観察された病原体阻害に対する酸生産の寄与をインビトロで測定することが可能になる。
【００７３】
図１、２、３及び４に示すデータは、切除及び洗浄されたイヌ科動物ＧＩ管から得られる本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株がインビトロで抗菌活性を持ち、潜在的プロバイオティク活性が示されることをはっきり実証する。
【００７４】
実施例３：生存性及びコロニー形成のインビトロ測定
（ｐＨ許容度）
細菌細胞を、一晩培養物から採取し、ホスフェート緩衝剤（ｐＨ６．５）で２回洗浄し、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２．５に調節したＴＰＹブイヨンに再懸濁した。細胞を３７℃で嫌気的にインキュベートし、その生存性を、０、３０、６０、１２０、２４０及び３６０分の間隔で当業者に既知の平板計数法を用いて測定した。
【００７５】
図５は、９菌株はｐＨ２．５に１時間を越えて耐えず、４９菌株はｐＨ２．５に１時間を越えて耐えたことをはっきり実証している。表２は、このデータを菌株別にまとめている。
【表２】
2010178753.tif 000004
【００７６】
（胆汁抵抗）
細菌株ブタ胆汁（シグマ（Sigma））を補足したＴＰＹ寒天上に、０．５％、１％及び５％（重量／体積）にて画線した。プレートを嫌気性条件下で３７℃でインキュベートし、増殖を２４時間後に記録した。増殖は、経験を積んだ観測者によって対照プレートと比較され、コロニーの増殖は次のように記述される：
陰性（０）−増殖なし；
＋（１）−濁った不透明な増殖（＜３３％  胆汁０％の対照プレート）
＋＋（２）−明確に増殖しているが対照ほど良好ではない（＞３３％であるが＜６６％）
＋＋＋（３）−対照に等しい増殖（＞６６％）。
【００７７】
胆汁酸塩類の存在時にコロニーの成長を対照と比較した後、増殖記述子を０、１、２又は３（それぞれ−；＋；＋＋、＋＋＋）の数値で与え、続いてパーセンテージで表す。この場合、３は１００％を表す。
【００７８】
図６は、本発明のビフィズス菌が胆汁酸塩類への抵抗があり、０．５％胆汁酸塩類に暴露したときに少なくとも３３％のレベルで増殖及びコロニー形成できることをはっきり実証している。
【００７９】
（腸上皮細胞への付着）
ヒト上皮細胞系ＨＴ−２９を使用して、選択した菌株の付着特性を測定した。上皮細胞を、７５ｃｍ２組織培養フラスコ内で、３７℃、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気にて、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン及びフンギソンを含有するダルベッコの最少必須培地（Dulbecco’s Minimal Essential Media）（ＤＭＥＭ）中で単層として慣例的に培養した。実験の目的で、上皮細胞を、６穴培養プレート（ザルスタット（Sarstedt））に１穴当たり５×１０５セル／ｍＬ（全体積３ｍＬ）のレベルで接種した。７日間のインキュベーションで分化させた後、上皮単層を１０％ＦＣＳを含有する抗生物質フリーの培地で洗浄した。抗生物質フリーＤＭＥＭプラス／中の細菌懸濁液を、各穴に添加し、細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの後、単層をＰＢＳで３回洗浄した。上皮細胞を、脱イオンＨ２Ｏに溶解し、付着細菌の数を当業者に既知の平板計数法を用いて数えた。接着は、最初に接種した細菌の数のパーセンテージとして表した。
【００８０】
図７からわかるように、ビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株は、少なくとも４％のレベルでＨＴ−２９腸上皮細胞に付着したＮＣＩＭＢ４１１９９の付着数未満でＮＣＩＭＢに付着した。
【００８１】
実施例４：１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレオチド配列
ビフィドバクテリア・シュードロンガムのコロニーを寒天平板から取り出し、ＩＸ  ＰＣＲ緩衝剤に再懸濁し、９６℃で５分間加熱し、−７０℃で５〜１０分間凍結し、解凍し、及びアリコートをＰＣＲエッペンドルフ管に添加した。ＰＣＲは遺伝子間スペーサ−（ＩＧＳ）プライマーを用いて実施し、ＩＧＳ  Ｌ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ−３’及びＩＧＳ  Ｒ：５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡ−３’であった。サイクル条件は、９６℃で１分（１サイクル）、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で３０秒（２８サイクル）であった。ＰＣＲ反応は、５μLのＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝剤（バイオライン（Bioline）、英国）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ロッシュ（Roche）、英国）、０．４μＭ  ＩＧＳ  Ｌ及びＲプライマー（１５０ｎｇ／５０μＬ）（ＭＷＧバイオテック（MWG Biotech）、ドイツ）並びにバイオライン（Bioline）タック（Taq)ポリメラーゼ（０．６ユニット）を含有した。ＰＣＲ反応は、ハイベイド（Hybaid）サーモサイクラーで実施した。ＰＣＲ生成物（８μL）を、分子量マーカー（ΦＸ １７４Ｈａｅ  ＩＩＩ、プロメガ（Promega））とともに、ＴＡＥ中２％アガロースＥｔＢｒ染色ゲル上に流し、そのＩＧＳプロファイルを調べた。上と同じプライマーを用いて、２つのイヌ科動物ビフィドバクテリア・シュードロンガム菌株について、当業者に既知の方法を用いて遺伝子間スペーサ−（ＩＧＳ）ＤＮＡを配列決定した。
【００８２】
配列決定に続いて、４つの付着菌株で得られた配列を、他の付着細菌１６ｓ−２３ｓ配列との相同性について、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なオンライン（on-line）配列データベース「ブラスト」（BLAST）と比較した。ビフィドバクテリア・シュードロンガムＡＴＣＣ２５８６５はＡＨＣ  ７に最も一致し、９２％の相同性評点を有する。ただし、これらの菌株類の間には数点の差異が存在する。
【００８３】
実施例５：例組成物の例
実施例１〜４は、本発明のプロバイオティク・ビフィドバクテリア・シュードロンガムを含む乾燥粗挽き組成物の例である。
【表３】
2010178753.tif 000005
【００８４】
実施例５〜７は、本発明のプロバイオティクス・ビフィドバクテリア・シュードロンガムを含むウェットペットフード組成物の例である。
【表４】
2010178753.tif 000006
【００８５】
実施例８〜１０は、本発明のプロバイオティクス・ビフィドバクテリア・シュードロンガムを含むヨーグルトサプリメント組成物の例である。
【表５】
2010178753.tif 000007
【００８６】
本発明の特定の実施形態を例示し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】実施例２に説明した方法による本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌によるインビトロでのネズミチフス菌の増殖阻害を実証する。
【図２】実施例２に説明した方法による本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌によるインビトロでの単球症リステリアの増殖阻害を実証する。
【図３】実施例２に説明した方法による本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌によるインビトロでのリステリア・イノキュアの増殖阻害を実証する。
【図４】実施例２に説明した方法による本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌によるインビトロでの大腸菌０１５７Ｈ４５の増殖阻害を実証する。
【図５】実施例３に説明した方法による本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌によるインビトロでの酸安定性を実証する。
【図６】０．５％、１％及び５％ブタ胆汁酸塩類の存在時における本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌の増殖特性を実証する。
【図７】本発明のビフィドバクテリア・シュードロンガム菌のインビトロでのＨＴ−２９腸上皮細胞への付着能力を実証する。
【図１】
2010178753.tif 000008
【図２】
2010178753.tif 000009
【図３】
2010178753.tif 000010
【図４】
2010178753.tif 000011
【図５】
2010178753.tif 000012
【図６】
2010178753.tif 000013
【図７】
2010178753.tif 000014
【配列表】
2010178753000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月16日(2010.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切除及び洗浄されたイヌ科動物の胃腸管から単離することによって得られ、配列番号１
で表される配列と少なくとも９３％の相同性を有する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間ポリヌクレ
オチド配列を有し且つプロバイオティク活性を有する、ビフィドバクテリア・シュードロ
ンガムの菌株。