(57)【要約】【課題】  基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が架橋していない細胞培養基材であり、支持体との接着性が良好であり、更に、環境温度に対する疎水性と親水性の変化が敏速で、迅速に培養した細胞を培養基材表面から容易に剥離、回収できる細胞培養基材及びその製造方法を提供する。【解決手段】  下記式（１）で表すモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材。2010193743.tif 000008（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基を表し、ｎは１〜９の整数を表す。）【選択図】図1
2010193743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表すモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材。
【化１】
2010193743.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基を表し、ｎは１〜９の整数を表す。）
【請求項２】
下記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とが相互作用することにより形成された複合体と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）とを含有する細胞培養基材であって、
該細胞培養基材の細胞培養面に前記重合体（Ｂ）が露出していることを特徴とする細胞培養基材。
【化２】
2010193743.tif 000007
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基を表し、ｎは１〜９の整数を表す。）
【請求項３】
前記水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト及び水膨潤性合成雲母から選択される、水媒体（Ｗ）中で１〜１０層に層状剥離する１種以上の粘土鉱物であり、前記シリカが水分散性のコロイダルシリカである請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜１０の範囲にある請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項５】
細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記重合体（Ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー（ｂ）の重合体である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記モノマー（ｂ）が、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６記載の細胞培養基材。
【請求項８】
請求項６記載の細胞培養基材の製造方法であって、
水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を支持体に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、前記溶媒（Ｅ）を揮発させる第３工程、
前記表面（Ｓ）に前記モノマー（ｂ）の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第４工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【請求項９】
請求項６記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｗ）を支持体に塗布して、
前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する第１工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、溶媒（Ｅ）を揮発させる第２工程、
前記モノマー（ｂ）の水溶液を前記表面（Ｓ）に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第３工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項１０】
請求項６記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記モノマー（ｂ）の重合体である重合体（Ｂ）を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養の技術に関し、具体的には、培養した細胞を容易に剥離、回収できる細胞培養基材、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、主にプラスチック（例えばポリスチレン）製容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行わせるために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器を培養基材として用いた場合には、培養（増殖）した細胞が容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシ等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品により細胞を剥離する操作は工程が煩雑であるほか、雑菌やＤＮＡあるいはＲＮＡ等の不純物が混入する恐れがあった。また、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞を増殖している形状（例えばシート状）のままで取り出すことができなかったり、細胞の性質が変化してしまう問題があった。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面にポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのような下限臨界溶解温度を有するポリマーを極薄く被覆した基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーが疎水性状態を示し細胞がポリマーに接着し、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用せずに基材から細胞をシート状に剥離する技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのようなポリマーはポリスチレンのようなプラスチック表面との間に接着性が低く、水に触れると、塗布されたポリマー層が容易に剥離してしまう。このようなポリマー層を水に触れてもプラスチック表面から剥離させないためには、ポリマーを固定する必要がある。その方法の一つとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（モノマー）の溶液を細胞培養基材表面に塗布して電子線照射によるグラフト重合を行う方法がある（例えば、特許文献３参照）。
【０００５】
電子線照射によるグラフト重合は、重合と同時に、ポリマー間の架橋反応も必ず起こり、ポリマーの温度応答速度が架橋度合の進行につれ大きく低下してしまい、ポリマーを親水性にするために低温を保持する時間を長く要する問題があり、且つ、その間、細胞も低温状態に長時間晒され、ダメージを受ける問題があった。また、この方法で製造された細胞培養基材は、放射線（例えばγ線）滅菌処理を行うと、ポリマーの温度応答性が大きく低下してしまい、本来の細胞の剥離しやすさが無くなる問題があった。
【０００６】
一方、水に均一に分散した水膨潤性粘土鉱物の存在下で、水溶性有機モノマーを放射線の照射により重合させてなる高分子ヒドロゲルからなり、水溶性有機モノマーの重合体（ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのような下限臨界溶解温度を有するポリマー）と水膨潤性粘土鉱物とから構成される三次元網目構造を有する細胞培養基材が開示されている（例えば特許文献４参照）。
【０００７】
生化学分野では、細胞培養操作等の点において、細胞培養基材がプラスチック製培養ディッシュのような容器と一体化するものが求められていた。しかしながら、上記従来文献においては、このような一体化した細胞培養容器の具体的手段は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１公報
【特許文献２】特開平５−１９２１３８公報
【特許文献３】特開平５−１９２１３０公報
【特許文献４】特開２００６−２８８２５１公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】大和雅之、岡野光夫「ナノバイオテクノロジーの最前線」第６章、Ｐ．３４０−Ｐ．３４７、シーエムシー出版（２００３年出版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が架橋していない細胞培養基材であり、更に、環境温度に対する疎水性と親水性の変化が敏速で、培養した細胞を分離回収する際にトリプシン等のタンパク質加水分解酵素などを使用することなく、細胞へのダメージがなく、迅速に培養した細胞を培養基材表面から容易に剥離、回収できる細胞培養基材を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の課題は、上記の細胞培養基材を製造する方法であって、基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が架橋されることがなく、且つ電子線照射のような方法を使用することなく、該細胞培養基材をプラスチック製容器の表面に容易に接着させることができ、更に、培養される細胞の種類（接着性）に応じて、重合体（Ｂ）の長さ、密度も容易に調節することができる、簡便な装置と工程とによる製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）とを含有する細胞培養基材が各種細胞に対する良好な培養性、及び培養された細胞を、環境温度を低下させることにより容易に剥離できる特性、更に、細胞種類に応じて、その培養性と剥離性を容易に調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、下記式（１）で表すモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材。
【００１４】
【化１】
2010193743.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基を表し、ｎは１〜９の整数を表す。）
【００１５】
また、本発明は、前記式（１）で表すモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とが相互作用することにより形成された複合体と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）とを含有する細胞培養基材であって、該細胞培養基材の細胞培養面に臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が露出していることを特徴とする細胞培養基材を提供する。
【００１６】
また、本発明は、上記重合体（Ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー（ｂ）の重合体である細胞培養基材の製造方法であって、
前記水媒体（Ｗ）中の前記水膨潤性無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を支持体に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、前記溶媒（Ｅ）を揮発させる第３工程、
前記表面（Ｓ）に前記モノマー（ｂ）の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第４工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００１７】
また、本発明は、上記重合体（Ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー（ｂ）の重合体である細胞培養基材の製造方法であって、
前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｗ）を支持体に塗布して、
前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する第１工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、溶媒（Ｅ）を揮発させる第２工程、
前記モノマー（ｂ）の水溶液を前記表面（Ｓ）に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第３工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
【００１８】
更に、本発明は、重合体（Ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー（ｂ）の重合体である細胞培養基材の製造方法であって、
前記水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記モノマー（ｂ）の重合体である重合体（Ｂ）を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法を提供する。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００１９】
本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、上記重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）の構成部分が細胞の増殖を担い、ＬＣＳＴを有する重合体（Ｂ）は温度変化による細胞の剥離を担い、この二つの部分を細胞の種類に応じてそれぞれ単独に制御できることにある。例えば、培養時、培養温度（３７℃）がポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのＬＣＳＴ（３２℃）より高いため、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが水不溶（疎水性）状態になり、細胞が基材の表面で増殖するが、温度を３２℃以下に下げると（例えば２０℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが水溶性になり基材表面から水溶液へと伸展し、それに伴い細胞が基材表面から脱離しながら剥離していく。
【００２０】
重合体（Ａ）及び重合体（Ｂ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｃ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｃ）を引き離すことはできない。例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと粘土鉱物からなる三次元網目構造を有するヒドロゲル（含水率が９０％）は９５ｋＰａの引っ張り破断強度を示している（（特許文献４）特開２００６−２８８２５１公報参照）。
【００２１】
本発明の細胞培養基材は、無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）がほぼ均一な層状構造になっている複合体（Ｘ）の薄層と、該薄層の中から表面に向かって伸び出ている重合体（Ｂ）とから構成されている。
【００２２】
重合体（Ｂ）の長さ（分子量）と密度（含有量）を適宜調整することにより、複合体（Ｘ）の薄層表面が重合体（Ｂ）に完全に覆われることなく適宜露出することで、良好な細胞増殖性と細胞剥離性を維持できる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の細胞培養基材は、環境温度に対する疎水性と親水性の変化速度が速く、培養される細胞の種類（接着性）に応じて、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）の長さや密度を容易に調節することができ、培養した細胞を、薬剤（トリプシン等）を使用することなく、迅速に培養基材表面から剥離、回収できる特徴を有する。
【００２４】
また、本発明の製造方法は、基材中に含まれる下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）が架橋されることがなく（より敏速な温度応答性を維持できる）、且つ電子線照射のような方法を使用することなく、該細胞培養基材を（プラスチック製培養容器のような）支持体に容易に接着させることができ、更に、培養される細胞の種類（接着性）に応じて、重合体（Ｂ）の長さや密度も容易に調節することができ、装置と工程が簡便である特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】分散液（Ｌ５）を円形のパターン状に塗布した細胞培養基材（実施例８）の光学顕微鏡にて撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明で用いるモノマー（ａ）は、その重合体が粘土鉱物と相互作用し、重合により有機無機複合ヒドロゲルを形成できるものであれば、好適に使用できるが、中でも、（メタ）アクリル酸ポリプロピレングリコールやポリエチレングリコールエステル系モノマーが好ましく用いられ、特に好ましくは下記式（１）のモノマー（ａ）が用いられる。
【００２７】
【化２】
2010193743.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基であり、ｎは１〜９である。）
【００２８】
これらのモノマー（ａ）の使用により、細胞の初期接着性を容易に調節でき、細胞増殖性と剥離性が良好な細胞培養基材が得られる。また、この細胞培養基材をポリスチレンなどのプラスチック製基材等の支持体の表面に積層させる場合は、両者間の接着性が強く、製造が簡便にできる。
【００２９】
上記のモノマー（ａ）は、要求される力学物性や表面性質などにより、一種以上を混合して使用してもよい。また、細胞培養基材の培養性や物性に影響を及ぼさない程度に、必要に応じてその他の共重合モノマーとして、例えば、スルホン基やカルボキシル基のようなアニオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基のようなカチオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基と燐酸基とを持つ両性イオン基を有するアクリル系モノマー、カルボキシル基とアミノ基とをもつアミノ酸残基を有するアクリル系モノマー、糖残基を有するアクリル系モノマー、また、水酸基を有するアクリル系モノマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール鎖を有するアクリル系モノマー、更にポリエチレングリコールのような親水性鎖とノニルフェニル基のような疎水基を合わせ持つ両親媒性アクリル系モノマー、ポリエチレングリコールジアクリレート、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどを併用することができる。
【００３０】
本発明に用いる無機材料（Ｃ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。
【００３１】
本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。
【００３２】
本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜１０であることが好ましく、０．０３〜５がより好ましく、０．０５〜３が特に好ましい。質量比（（Ｃ）／（Ａ））がこの範囲であると、粘土鉱物またはシリカと重合体（Ａ）との複合構造（例えば粘土鉱物が主成分として構成したシェル（殻）部分と重合体（Ａ）が主成分として構成したコア（内部）部分からなるコアシェル構造、粘土鉱物と重合体（Ａ）が均一に複合した均一構造など）の設計が容易であり、得られる塗膜の表面特性（例えば親疎水性度合いや細胞培養性）や塗膜物性が良好であり、均一な塗膜が得られ、支持体との接着性が良好で、脆さも無く好ましい。
【００３３】
また、本発明の細胞培養基材において、基材全体に対する重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％であることが好ましく、０．０１〜３０質量％であることがより好ましく、1〜２０質量％であることが特に好ましい。
【００３４】
重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％であると、培養基材の細胞接着性と増殖性及び温度低下時の剥離性が良好であり、培養基材の表面平滑性もよく、また、プラスチック製基材の表面に積層するときの塗布性や基材表面との接着性がよく、好ましい。
【００３５】
本発明で用いられる下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature：以下ＬＣＳＴと略記する）を有する重合体（Ｂ）は、分子内にＬＣＳＴを示す部分を有するものであれば、好適に使用できるが、中でもＮ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー（ｂ）の重合体であることが好ましい。このようなモノマー（ｂ）の例としては、Ｎ−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−エチル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチル(メタ)アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−(メタ)アクリロイルピペリディン、Ｎ−(メタ)アクリロイルピロリディンがあげられる。
【００３６】
上記これらのモノマー単独で用いてもよく、必要に応じて複数のモノマーを混合して用いてもよい。更に、上記モノマー（ｂ）とそれ以外の水溶性有機モノマーまたは有機溶媒可溶性有機モノマーとの共重合体も、得られた重合体が親水性及び疎水性の両方を示すものであれば使用することが出来る。
【００３７】
上記の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）とは、この温度以上になると、該ポリマーが水中で不溶となり（疎水性を示す）、この温度以下になると、水溶性になる（親水性を示す）温度のことである。例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのＬＣＳＴは３２℃である。
【００３８】
次いで、本発明の製造方法について説明する。
本発明の細胞培養基材は、下記三つの方法で製造することができる。
即ち、第一の製造方法としては、前記水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、前記溶媒（Ｅ）を揮発させる第３工程、
前記表面（Ｓ）に前記モノマー（ｂ）の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第４工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００３９】
この製造方法に用いられるモノマー（ａ）と無機材料（Ｃ）及びモノマー（ｂ）は、前記細胞培養基材の説明で述べたのと同じものを使用できるので、省略する。
【００４０】
本発明の製造方法に用いる水媒体（Ｗ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体分散液が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、アミノ酸類、細胞、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。
【００４１】
本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。
【００４２】
触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。
【００４３】
一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。
【００４４】
前記光重合開始剤は非水溶性のものである。ここで言う非水溶性とは、重合開始剤の水に対する溶解量が０．５質量％以下であることを意味する。非水溶性の重合開始剤を使用することにより、開始剤がより粘土鉱物の近傍に存在しやすく、粘土鉱物近傍からの開始反応点が多くなり、得られる重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の粒径分布が狭く、分散液（Ｌ）の安定性が高く、好ましい。
【００４５】
前記光重合開始剤を水媒体（Ｗ）と相溶する溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記水媒体（Ｗ）中に添加することが好ましい。この方法によって光重合開始剤がより均一に分散でき、より粒径の揃った複合体（Ｘ）が得られる。
【００４６】
光重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液中における光重合開始剤（Ｄ）と溶媒（Ｅ）の質量比（Ｄ）／（Ｅ）は、０．００１〜０．１であることが好ましく、０．０１〜０．０５が更に好ましい。０．００１以上であると、紫外線の照射によるラジカルの発生量が十分に得られるため好適に重合反応を進行させることができ、０．１以下であれば、開始剤による発色や、臭気を実質的に生じることがなく、またコストの低減が可能である。
【００４７】
光重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の添加量が、モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）、重合開始剤（Ｄ）及び溶媒（Ｅ）の総質量に対し、０．１質量％〜５質量％であることが好ましく、０．２質量％〜２質量％であることが更に好ましい。該分散量が０．１質量％以上であると、重合が十分に開始され、５質量％未満であると、複合体（Ｘ）中の重合開始剤の増加による臭気の発生、更には一旦分散された光重合開始剤が再び凝集する等の問題を低減でき、均一な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を得ることができるため好ましい。
【００４８】
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を使用することにより、第４工程では、モノマー（ｂ）の水溶液を塗布した時に、開始剤の溶出が無く、粘土鉱物またはシリカ近傍からの開始反応点が多くなり、得られる重合体（Ｂ）と無機材料（Ｃ）間の相互作用がより強くなり、好ましい。
【００４９】
無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（２）又は式（３）で表される範囲であることが本発明の細胞培養基材製造の最大の特徴である。無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）が上記範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。
【００５０】
本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。
【００５１】
本製造方法の第２工程における、前記分散液（Ｌ）の支持体への塗布方法は、公知慣用の方法でよい。例えば、分散液を支持体に流延させる方法や、バーコーターやスピンコーターによるコーター法、または噴霧などのスプレー法、模様のあるゴム版に分散液をつけてから支持体に転写する方法、また支持体に塗布しない部分を予め遮蔽して塗布後遮蔽部分を取り除くパターン状塗布や、インクジェットプリンター方式による分散液の塗布方法が挙げられる。
【００５２】
細胞が接着や増殖しない支持体（例えばコロナ放電処理をしていないポリスチレン）表面に、分散液（Ｌ）をパターン状に塗布することにより、塗布部分間の間隔が十分狭い場合、細胞が未塗布部分を乗り越えて増殖し、最終的に支持体表面全体に渡って細胞を培養することができ、更に、培養した細胞層が支持体との間の接着点が少なく、剥離がより容易に起き、好ましい。塗布部分境界と境界間の間隔（未塗布部分の幅）が３００μｍ以下であることが好ましい、２００μｍ以下は更に好ましい、１００μｍ以下は最も好ましい。３００μｍ以下であれば、細胞がこの未塗布幅を十分超え、増殖することができ、良好な細胞層を培養することができる。
【００５３】
乾燥方法も、分散液（Ｌ）中の揮発成分が揮発し、複合体（Ｘ）の薄層ができれば、任意の方法でよい。例えば、室温自然乾燥、室温の風や加熱または熱風による乾燥、遠赤外線乾燥などがあげられる。或いは分散液をスピンコーターで回転しながら熱風を当てたり加熱したりする方法も挙げられる。
【００５４】
本製造方法の第３工程における、非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）への塗布や溶媒（Ｅ）の揮発方法は、第２工程に準じて公知慣用の方法を用いてよい。
【００５５】
前記表面（Ｓ）に塗布された前記溶液（Ｄ＋Ｅ）が複合体（Ｘ）の薄層中へ浸透し、溶媒（Ｅ）の揮発により、開始剤が複合体（Ｘ）の薄層全体に均一に存在する状態になる。非水溶性の重合開始剤（Ｄ）としては、前記の光重合開始剤に準じたものを使用することができる。非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を使用することにより、第４工程での、モノマー（ｂ）の水溶液塗布時に、開始剤の溶出が少なく、粘土鉱物またはシリカ近傍からの開始反応点が多くなり、得られる重合体（Ｂ）と無機材料（Ｃ）間の相互作用がより強くなり、好ましい。
【００５６】
非水溶性重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液中における重合開始剤（Ｄ）と溶媒（Ｅ）の質量比（Ｄ）／（Ｅ）は、０．００１〜０．１であることが好ましく、０．０１〜０．０５が更に好ましい。０．００１以上であると、紫外線の照射によるラジカルの発生量が十分に得られるため好適に重合反応を進行させることができ、０．１以下であれば、開始剤による発色や、臭気を実質的に生じることがなく、またコストの低減が可能である。
【００５７】
本発明の溶媒（Ｅ）としては、光重合開始剤（Ｄ）または非水溶性重合開始剤（Ｄ）を溶解できる水溶性の溶剤、または光重合開始剤（Ｄ）と非水溶性重合開始剤（Ｄ）を溶解し且つＨＬＢ（親水疎水バランス）値が８以上のアクリル系モノマー（ａ’）を用いることができる。ここのＨＬＢ値はデービス式（「界面活性剤−物性・応用・化学生態学」、北原文雄ら編、講談社、１９７９、ｐ２４−２７）に従って求められた値である。例えば、トリプロピレングリコールジアクリレートのようなポリプロピレングリコールジアクリレート類、ポリエチレングリコールジアクリレート類、ペンタプロピレングリコールアクリレートのようなポリプロピレングリコールアクリレート類、ポリエチレングリコールアクリレート類、メトキシエチルアクリレート、メトキシトリエチレングリコールアクリレートのようなメキシポリエチレングリコールアクリレート類、ノニルフェノキシポリエチレングリコ−ルアクリレート類、ジメチルアクリルアミドのようなＮ置換アクリルアミド類、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、などが挙げられる。溶媒（Ｅ）としてのアクリル系モノマーのＨＬＢ値が８以上であると、水媒体（Ｗ）への溶解性または分散性に優れるため好ましい。これらのアクリル系モノマーは、一種以上を混合して用いることができる。
【００５８】
また、本発明の溶媒（Ｅ）としては、光重合開始剤（Ｄ）と非水溶性重合開始剤（Ｄ）を溶解でき、且つ一定以上の水溶性を有する溶剤を用いることができる。ここで言う水溶性を有する溶剤とは、水１００ｇに対し５０ｇ以上溶解できる溶剤であることが好ましい。水への溶解性が５０ｇ以上であると、非水溶性の重合開始剤（Ｄ）の水媒体（Ｗ）への分散性が良く、得られる複合体（Ｘ）の粒径が揃いやすくなり、分散液（Ｌ）の安定性が高く好ましい。
【００５９】
例えば、水溶性溶剤としては、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドなどのアミド類、メタノール、エタノール、２−プロパノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランなどが挙げられる。これらの溶剤を混合して用いても良い
本製造方法の第４工程における、前記表面（Ｓ）への前記モノマー（ｂ）の水溶液の塗布も第２工程に準じて公知慣用の方法を用いてよい。
【００６０】
モノマー（ｂ）の水溶液におけるモノマー（ｂ）の濃度は、１〜２０質量％が好ましく、５〜１８質量％であることが更に好ましい。１質量％以上であれば、長さ十分な重合体（Ｂ）が得られ、細胞剥離性が維持でき、また、２０質量％以下であれば、十分な細胞増殖性が維持でき、性能のよい細胞培養基材を製造できる。
【００６１】
前記表面（Ｓ）に塗布されたモノマー（ｂ）が複合体（Ｘ）の薄層中へ浸透し、紫外線の照射により重合される。この製造方法で得た細胞培養基材の表面は、モノマー（ｂ）の重合体（重合体（Ｂ））が一層完全に覆っているものではなく、重合体（Ｂ）が複合体（Ｘ）の薄層の中から伸び出て、該薄層の表面も適宜露出しているような構造になっている。重合体（Ｂ）は、複合体（Ｘ）の薄層中から表面までイオン結合や水素結合などにより粘土鉱物に結合しており、物理的な力や水中でもその結合が切れることなく、安定な構造になっている。また、培養される細胞の種類に応じて、該重合体（Ｂ）の長さ（分子量）や密度（複合体（Ｘ）の薄層中での含有量）を、モノマー（ｂ）の水溶液濃度や塗布量で適宜調整することができる。
【００６２】
本工程に用いられる光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さやモノマー（ｂ）の重合と同時に架橋を起こさせない観点から紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。
【００６３】
上記第一の製造方法は、モノマー（ａ）と無機材料（Ｃ）の比率を調整することにより、細胞の増殖速度を幅広く調整することができ、また、モノマー（ｂ）の種類や濃度、塗布量を調整することにより、温度変化による細胞の剥離速度を制御できるという特徴を有する。
【００６４】
本発明の第二の製造方法としては、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｗ）を支持体に塗布して、前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する第１工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、溶媒（Ｅ）を揮発させる第２工程、
前記モノマー（ｂ）の水溶液を前記表面（Ｓ）に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第３工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
【００６５】
本製造方法の塗布方法、紫外線、重合開始剤（Ｄ）及びモノマー（ｂ）の濃度は、全て第１の製造方法に準ずる。この製造方法の第１工程は、反応液から直接複合体（Ｘ）の薄層を製造するため、水媒体（Ｗ）中の無機材料（Ｃ）の濃度が式（２）又は式（３）で表される範囲になる必要はない。この製造方法で得た細胞培養基材の表面構造は、第１の製造方法で得たものとほぼ同じである。
【００６６】
本発明の第三の製造方法としては、水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記重合体（Ｂ）を添加し、均一に混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法である。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００６７】
本製造方法における重合体（Ｂ）は、その１０質量％水溶液の粘度が２０〜２０００ｍＰａ・ｓ（山一電機株式会社製DIGITAL VISCOMATE  MODEL  VM-100A粘度計使用）のものであることが好ましく、１００〜１０００ｍＰａ・ｓの方が更に好ましく、２００〜８００ｍＰａ・ｓのポリマーの方が最も好ましい。２０ｍＰａ・ｓ以上であれば、十分な細胞剥離性が維持でき、また、１０００ｍＰａ・ｓ以下であれば、十分な細胞増殖性が維持でき、性能のよい細胞培養基材を製造できる。
【００６８】
また、本製造方法における重合体（Ｂ）は、その重量平均分子量Ｍｗが1×１０４〜２×１０７であることが好ましく、1×１０５〜５×１０６であることが更に好ましい。1×１０４以上であれば、十分な細胞剥離性が維持でき、また、２×１０７以下であれば、十分な細胞増殖性が維持でき、性能のよい細胞培養基材を製造できる。
【００６９】
この製造方法で得た細胞培養基材の表面は、重合体（Ｂ）が一層覆っているものではなく、複合体（Ｘ）の薄層の中から重合体（Ｂ）が伸び出て、該薄層の表面も適宜露出しているような構造になっている。重合体（Ｂ）は、複合体（Ｘ）の薄層中から表面までイオン結合や水素結合などにより粘土鉱物またはシリカに結合しており、物理的な力や水中でもその結合が切れることなく、安定な構造になっている。また、培養される細胞の種類に応じて、重合体（Ｂ）の長さ（分子量）や含有量を適宜調整することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００７１】
（実施例１）
この実施例は第一の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）０．６ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite  XLG（Rockwood  Additives Ltd.社製）０．３ｇ、水媒体（Ｗ）として水２０ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。
【００７２】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｅ）として、２−プロパノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（２）を調製した。
【００７３】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（２）を５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。
この反応系のＲａ＝０．５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝１．４８（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．６１
【００７４】
［複合体（Ｘ）の薄層の調製（第２工程）］
直径５０ｍｍのポリスチレン製シャーレ（アドバンテック東洋株式会社製、ＰＤ−５０Ｋ）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を入れ、スピンコーターを用いて２０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、複合体（Ｘ）の薄層を調製した。
【００７５】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の塗布（第３工程）］
前記溶液（２）をシャーレに入れ、スピンコーターにより２０００回転で薄く塗布して、室温で５分間静置してエタノールを揮発させ、重合開始剤（Ｄ）を複合体（Ｘ）の薄層表面に塗布した。
【００７６】
［細胞培養基材の作製（第４工程）］
１０質量％のＮ―イソプロピルアクリルアミド（モノマー（ｂ）、株式会社興人製）水溶液２ｍｌをシャーレに入れ、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を６０秒照射して、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを重合させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材１を得た。
【００７７】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材１に、ＣＳ-Ｃ complete medium（Cell Systems社製培地）を適量入れ、正常ヒト真皮線維芽細胞を播種して（播種濃度は１．２×１０４個／ｃｍ２）、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を吸い取り、４℃の培地を入れ、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。（表１、細胞の剥離回収率＝９３％、所要時間は１８分であった）。
【００７８】
（実施例２）
この実施例は第一の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
第４工程のモノマー（ｂ）として、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドの１７質量％の水溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして細胞培養基材２を作製した。
【００７９】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。（表１、細胞の剥離回収率＝９８％、所要時間は１０分であった）。
【００８０】
上記実施例１、２より、モノマー（ｂ）の濃度を増加させることにより、細胞剥離性の増加が見られた。
【００８１】
（実施例３）
この実施例は第二の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）１．２８ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite  XLG（Rockwood  Additives Ltd.社製）０．２４ｇ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、を均一に混合して反応溶液（３）を調製した。
【００８２】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
実施例１と同様な溶液（２）を用いた。
【００８３】
［複合体（Ｘ）の薄層調製（第１工程）］
上記反応溶液（３）全量に、溶液（２）を５０μｌ入れ、均一に分散させた後、直径５０ｍｍのポリスチレン製シャーレ（アドバンテック東洋株式会社製、ＰＤ−５０Ｋ）に入れ、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布した後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射して、複合体（Ｘ）の薄層を調製した。
【００８４】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の塗布（第２工程）］
前記溶液（２）をシャーレに入れ、スピンコーターにより２０００回転で薄く塗布して、室温で５分間静置してエタノールを揮発させ、重合開始剤（Ｄ）を塗布した。
【００８５】
［細胞培養基材の作製（第３工程）］
１５質量％のＮ―イソプロピルアクリルアミド（モノマー（ｂ）、株式会社興人製）水溶液２ｍｌをシャーレに入れ、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を６０秒照射して、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを重合させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥して、細胞培養基材３を得た。
【００８６】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材３に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝１００％、所要時間は１２分であった）。
【００８７】
（実施例４）
この実施例は第二の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
第３工程のモノマー（ｂ）として、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドの３質量％の水溶液を用いたこと以外は、実施例３と同様にして細胞培養基材４を作製した。
【００８８】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材４に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝７８％、所要時間は３０分であった）。
【００８９】
上記実施例３、４より、モノマー（ｂ）の濃度を変化させることにより、細胞剥離性の変化が見られた。
【００９０】
（実施例５）
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）０．３２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite  XLG（Rockwood  Additives Ltd.社製）０．０８ｇ、界面活性剤として２０重量％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液１００μｌ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、を均一に混合して反応溶液（５）を調製した。
【００９１】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
実施例１と同様な溶液（２）を用いた。
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（５）全量に、溶液（２）を３０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ５）を作製した。
【００９２】
この反応系のＲａ＝０．２５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．７９（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．３９
【００９３】
［重合体（Ｂ）水溶液の調製］
モノマー（ｂ）としてＮ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．７ｇ、水１０ｇ、溶液（２）１４０μｌ、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約１０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの水溶液（５）を調製した。この溶液に更に水を５ｇ添加し、均一に混合した後、DIGITAL VISCOMATE粘度計（MODEL  VM-100A、山一電機株式会社製）を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は３６８ｍＰａ・ｓであった。測定時の溶液温度は２４．２℃であった。
【００９４】
また、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  Ｓｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）で測定した結果、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０６であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤ  ＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。
【００９５】
［細胞培養基材の作製（第２工程）］
分散液（Ｌ５）全量に、上記ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの水溶液（５）を1．０ｇ（固形分０．１ｇ）入れ、均一に混合した後、６０ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時乾燥して、細胞培養基材５を得た。
【００９６】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材５に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝１００％、所要時間７分であった）。
【００９７】
（実施例６）
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
第２工程のポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの水溶液（５）を０．７ｇ用いたこと以外は、実施例５と同様にして細胞培養基材６を作製した。
【００９８】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材６に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝１００％、所要時間１５分であった）。
【００９９】
上記実施例５、６より、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミド水溶液の添加量を変化させることにより、細胞剥離性（剥離時間）の変化が見られた。
（実施例７）
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
［重合体（Ｂ）水溶液の調製］
モノマー（ｂ）としてＮ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）０．５７ｇ、水１００ｇ、を混合し、真空脱気により水溶液中の酸素を十分除去した後、開始剤として０．１ｇのＫ２Ｓ２Ｏ８（ペルオキソ二硫酸カリウム、和光純薬工業株式会社製）、触媒として８０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（花王株式会社製）を添加して、２０℃、２０時間静置して、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの水溶液（６）を得た。この水溶液を５０℃に加熱し、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドを沈殿させて、更に５０℃の超純水で洗浄した後、８０℃、６時間乾燥させて、固体状のポリＮ―イソプロピルアクリルアミドを作製した。
【０１００】
Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  Ｓｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）を用いて、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの分子量を測定した結果、重量平均分子量Ｍｗは６．０×１０４であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤ  ＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。
【０１０１】
［細胞培養基材の作製（第２工程）］
実施例５の分散液（Ｌ５）全量に、上記固体状のポリＮ―イソプロピルアクリルアミドを０．1ｇ入れ、均一に混合した後、６０ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時乾燥して、細胞培養基材７を得た。
【０１０２】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材７に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝７９％、所要時間２９分であった）。
【０１０３】
上記実施例５、７より、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの添加量（０．１ｇ）が同じく、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの分子量を変化させることにより、細胞剥離性（剥離時間）の変化が見られた。
【０１０４】
（実施例８）
この実施例は第三の製造方法でパターン状の細胞培養基材を製造する例である。
実施例５の分散液（Ｌ５）全量に、実施例５のポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの水溶液（５）を０．１ｇ入れ、均一に混合した後、単ノズルパルスインクジェクター（クラスターテクノロジー(株)製）を用いて、厚さ１ｍｍのポリスチレン板に、直径３０μｍ、間隔が約２０μｍになるように、円形（点）状に塗布した。次いで、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間加熱処理させ、滅菌水によりこのポリスチレン板を洗浄した後、滅菌袋中でポリスチレン板を４０℃、５時間乾燥して、細胞培養基材８を得た。
【０１０５】
この基材８を光学顕微鏡で観察したところ、ポリスチレン板の上に直径が約３６μｍの点が一面に形成されているパターンが観察された。点と点の間隔は約２１μｍであった（写真１参照）。
【０１０６】
［Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞（マウス腫瘍線維芽細胞）の培養］
上記得られた細胞培養基材８を６０ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、Doulbecco's modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ）培地（ＦＢＳを１０％添加）（日水製薬株式会社製）を適量入れ、Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞を播種して（播種濃度は１．０×１０４個／ｃｍ２）、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。４６時間増殖させた細胞を顕微鏡で確認したところ、塗布部分がほぼ全面に細胞に覆われていることが観察された。次いで３７℃の培地を４℃の培地に交換し、数分静置したところ、細胞が細胞培養基材８から剥離したことが観察された。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。（表１、細胞の剥離回収率＝９８％、所要時間は９分であった）。
【０１０７】
一方、上記ポリスチレン板を用いて、同様にＢａｌｂ３Ｔ３細胞を培養したところ、細胞は殆ど増殖しなかった。この結果から、このポリスチレン板は播種した細胞を培養することができない基材であることが分かる。
【０１０８】
上記実施例８より、少量のポリＮ―イソプロピルアクリルアミドを添加した分散液（Ｌ５）を点のパターン状に塗布することにより、全面に塗布した細胞培養基材５と同じように塗布面及び未塗布面全体に渡って細胞を培養することができ、更に、ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの添加量が少量でも、優れた細胞剥離性を示したことが理解できる。
【０１０９】
（実施例９）
この実施例は第三の製造方法で細胞培養基材を製造する例である。
［モノマー（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応溶液の調製］
モノマー（ａ）としてポリオキシプロピレンモノアクリレート「ブレンマＡＰ−４００」（日本油脂株式会社製）０．９１ｇ、シリカとしてスノーテックス２０（２０重量％のコロイダルシリカ水溶液、日産化学工業株式会社製）０．４ｇ（固形分０．０８ｇ）、界面活性剤として２０重量％のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製１００μｌ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇ、を均一に混合して反応溶液（９）を調製した。
【０１１０】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
実施例１と同様な溶液（２）を用いた。
【０１１１】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（７）全量に、溶液（２）を３０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し淡い乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ９）を作製した。
【０１１２】
この反応系のＲａ＝０．０９、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．７９（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．１７
【０１１３】
［細胞培養基材の作製（第２工程）］
分散液（Ｌ９）全量に、実施例５のポリＮ―イソプロピルアクリルアミド水溶液（５）を０．７ｇ入れ、均一に混合した後、６０ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを乾燥して、細胞培養基材（９）を得た。
【０１１４】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材９に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、増殖した細胞を自然剥離させ、剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝９５％、所要時間１０分であった）。
【０１１５】
（実施例１０）
放射線滅菌処理した細胞培養基材の性能を示す例である。
［細胞培養基材の放射線滅菌処理］
実施例６の細胞培養基材６に、吸収線量が１０ｋＧｙになるように、γ線を照射した（照射処理は日本照射サービス株式会社にて行った）。
【０１１６】
比較として、市販の細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材ＵｐＣｅｌｌ（６ｃｍディッシュ、株式会社セルシード製）を用いて、同様にしてγ線照射を施した。
【０１１７】
［正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の培養］
上記γ線処理を施した細胞培養基材６に、10%FBSを含有するHu-media-EB2培地（Cell Systems社製）を適量入れ、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を播種して（播種濃度は１．２×１０４個／ｃｍ２）、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を吸い取り、４℃の培地を入れ、一定時間静置させ、増殖した細胞を自然剥離させた。剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。（表１、細胞の剥離回収率＝９６％、所要時間は１３分であった）。
【０１１８】
一方、実施例６の細胞培養基材６をそのまま用いて（放射線処理せず）、同様にして正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を培養して、自然剥離を行ったところ、細胞の剥離回収率は９５％、所要時間は１４であった。更に、上記γ線処理を施した市販のＵｐＣｅｌｌを用いて、同様にして正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を培養して、自然剥離を行ったところ、細胞の剥離回収率は３０％、所要時間は４０分であった。
【０１１９】
一方、放射線未処理のＵｐＣｅｌｌを用いて、同様にして正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を培養して、自然剥離を行ったところ、細胞の剥離回収率は１００％、所要時間は１５分であった。
【０１２０】
上記実施例（１０）より、細胞培養基材６に放射線滅菌処理を施しても、細胞の培養・剥性に影響を及ぼさないことが分かる。一方、市販のＵｐＣｅｌｌの場合、放射線滅菌処理を施すことにより、細胞の剥製性が大きく低下することが理解できる。
【０１２１】
（比較例１）
重合体（Ｂ）を含有しない細胞培養基材
［細胞培養基材の作製］
実施例１の分散液（Ｌ１）を、６０ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを乾燥して、細胞培養基材（１′）を得た。
【０１２２】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材１′に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞を培養した後、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、増殖した細胞を自然剥離させ、剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。（表１、細胞の剥離回収率＝１０％、所要時間は３０分であった）。該細胞培養基材の細胞増殖性は、細胞培養基材１とほぼ同じであった。
【０１２３】
この比較例から、重合体（Ｂ）を含まない場合、細胞の増殖性は変わらないが、剥離性は大きく低下したことが理解できる。
【０１２４】
（比較例２）
重合体（Ｂ）を過剰に含有した細胞培養基材
［細胞培養基材の作製］
実施例１の分散液（Ｌ１）に、実施例５のポリＮ―イソプロピルアクリルアミド水溶液（５）を６．３ｇ入れ（ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの全固形分に対する含有量は４１質量％である）、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを乾燥して、細胞培養基材（２′）を得た。
【０１２５】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記得られた細胞培養基材２′に、実施例１と同様にして、正常ヒト真皮線維芽細胞の培養を行った。しかし、播種した細胞が死滅し、増殖は全く見られなかった。
【０１２６】
この比較例から、重合体（Ｂ）を過剰に含有すると、細胞の増殖が阻害され、細胞培養ができなくなることが理解できる。
【０１２７】
（比較例３）
無機材料（Ｃ）の濃度が式（３）の範囲を超えた例である。
［モノマー（ａ）、水膨潤性無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応液の調製］
モノマー（ａ）としてアクリル酸２メトキシエチル（東亞合成株式会社製）１．３２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite  XLG（Rockwood  Additives Ltd.社製）０．２５ｇ、非水溶性の重合開始剤（ｄ１）として溶液（２）２５μｌ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇを均一に混合して反応液（３′）を調製した。
【０１２８】
上記反応液（３′）をマグネチックスターラーで攪拌しながら、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射したところ、反応液（３′）全体がゲル化した。このゲルを大量の水に入れても溶解や分散せずゲルのままであった。
【０１２９】
この反応系のＲａ＝０．１９、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝２．４２％＞０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．３４
この比較例から、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）が式（３）の範囲を超えると、反応液全体がゲル化してしまい、複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られず、（第一、第三の製造方法の）シャーレへのコーティングによる細胞培養基材の製造ができないことが理解できる。
【０１３０】
（比較例４）
ポリＮ―イソプロピルアクリルアミドと無機材料（Ｃ）から構成した三次元網目構造を有するヒドロゲルからなる細胞培養基材の製造例である。
［モノマー、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｗ）を含む反応液の調製］
モノマーとしてＮ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．１３ｇ、無機材料（Ｃ）としてLaponite  XLG（Rockwood  Additives Ltd.社製）０．４ｇ、水媒体（Ｗ）として水１０ｇを均一に混合して反応液（４′）を調製した。
【０１３１】
［重合開始剤（ｄ1）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｅ）として、ポリオキシプロピレンモノアクリレート「ブレンマＡＰ−４００」（日本油脂株式会社製）９８ｇ、重合開始剤（ｄ１）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）２ｇを、均一に混合して溶液（３）を調製した。
【０１３２】
［ヒドロゲルからなる細胞培養基材の調製］
上記反応溶液（４′）全量に、溶液（３）を５０μｌ入れ、超音波分散機で均一に分散させた後、６０ｍｍポリスチレン製シャーレ（６０ｍｍ／Ｎｏｎ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ、旭テクノグラス株式会社製）に入れ、スピンコーターを用いて２０００回転でシャーレの表面に薄く塗布し、シャーレの周りを氷で冷やしながら、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドを重合させて、ヒドロゲルの薄層を作製した。
【０１３３】
次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄したところ、該ヒドロゲルの薄層がシャーレから剥離してしまい、シャーレにヒドロゲルの薄層が積層した細胞培養基材が得られなかった。
【０１３４】
上記洗浄中で剥離したヒドロゲルの薄層をそのままシャーレ中で乾燥し、細胞培養に供した。
【０１３５】
［正常ヒト真皮線維芽細胞の培養］
上記乾燥したヒドロゲルの薄層をシャーレに入れ、ＣＳ-Ｃ complete medium（Cell Systems社製培地）を適量入れ、正常ヒト真皮線維芽細胞を播種して（播種濃度は１．２×１０４個／ｃｍ２）、５％二酸化炭素中、３７℃で培養を行った。細胞が十分増殖したのを確認して、その（３７℃の）培地を４℃の培地に交換し、増殖した細胞を自然剥離させ、剥離した細胞部分の面積と剥離前に増殖した細胞の総面積との比を求めた。またこの剥離にかかった時間を記録した。（表１、細胞の剥離回収率＝７０％、所要時間は３０分であった）。
【０１３６】
この比較例から、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と粘土鉱物との三次元網目構造を有するヒドロゲルからなる細胞培養基材は、プラスチックなどの支持体との接着性が弱く、支持体と一体化した細胞培養基材の作製はできなかったことが理解できる。
【０１３７】
【表１】
2010193743.tif 000005
（注）（１）細胞Ｆ：正常ヒト真皮線維芽細胞
（２）細胞Ｔ：マウス腫瘍線維芽細胞(Balb3T3)
（３）細胞Ｈ：正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞
【０１３８】
（注）（１）細胞Ｆ：正常ヒト真皮線維芽細胞
（２）細胞Ｔ：マウス腫瘍線維芽細胞(Balb3T3)
（３）細胞Ｈ：正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞
【０１３９】
上記実施例及び比較例から、本発明の細胞培養基材は、他の材質の支持体との間、良好な接着性を有し、優れた細胞培養と剥離機能を有している。
また、この細胞培養基材は、酸素を除去することなく極短時間で、容易に製造できることが明らかであった。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明の細胞培養基材は、再生医療分野で、コロニー状細胞群や２次元のシート状細胞、３次元の立体細胞増殖物の調製に利用できる。
【図１】
2010193743.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月19日(2009.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有し、
前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜１０の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％である細胞培養基材。
【化１】
2010193743.tif 000010
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基を表し、ｎは１〜９の整数を表す。）
【請求項２】
下記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とが相互作用することにより形成された複合体と、
下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）とを含有し、
前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜１０の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％である細胞培養基材であって、
該細胞培養基材の細胞培養面に前記重合体（Ｂ）が露出していることを特徴とする細胞培養基材。
【化２】
2010193743.tif 000011
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は水素原子または炭素原子数１〜２のアルキル基を表し、ｎは１〜９の整数を表す。）
【請求項３】
前記水膨潤性粘土鉱物が、水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリロナイト、水膨潤性サポナイト及び水膨潤性合成雲母から選択される、水媒体（Ｗ）中で１〜１０層に層状剥離する１種以上の粘土鉱物であり、前記シリカが水分散性のコロイダルシリカである請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記重合体（Ｂ）が、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びＮ,Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種のモノマー（ｂ）の重合体である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記モノマー（ｂ）が、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項４記載の細胞培養基材。
【請求項６】
請求項４記載の細胞培養基材の製造方法であって、
水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を支持体に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、前記溶媒（Ｅ）を揮発させる第３工程、
前記表面（Ｓ）に前記モノマー（ｂ）の水溶液を塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第４工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【請求項７】
請求項４記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｗ）を支持体に塗布して、
前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する第１工程、
非水溶性の重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｅ）に溶解させた溶液を前記複合体（Ｘ）の薄層の表面（Ｓ）に塗布し、溶媒（Ｅ）を揮発させる第２工程、
前記モノマー（ｂ）の水溶液を前記表面（Ｓ）に塗布した後、紫外線の照射により前記モノマー（ｂ）を重合させる第３工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項８】
請求項４記載の細胞培養基材の製造方法であって、
前記水媒体（Ｗ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（２）又は式（３）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｗ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）に、前記モノマー（ｂ）の重合体である重合体（Ｂ）を添加し、混合して、支持体に塗布した後、乾燥させる第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
式（２）    Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（３）    Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｗ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
即ち、本発明は、下記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有し、
前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜１０の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％である細胞培養基材を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、本発明は、前記式（１）で表されるモノマー（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とが相互作用することにより形成された複合体と、
下限臨界溶解温度を有する重合体（Ｂ）とを含有し、
前記重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０１〜１０の範囲にあり、
細胞培養基材全体に対する前記重合体（Ｂ）の含有率が０．０００１質量％〜４０質量％である細胞培養基材であって、
該細胞培養基材の細胞培養面に前記重合体（Ｂ）が露出していることを特徴とする細胞培養基材を提供する。