(57)【要約】      （修正有）【課題】長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物と、これを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供する。【解決手段】骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ５（ＩＦＩＴＭ５）遺伝子領域の一部又は全部、あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されている、骨形成能が欠損した実験動物。【選択図】図５
2010099049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体では有されるべきＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ５  （以下ＩＦＩＴＭ５と記す。）遺伝子領域の一部又は全部あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されていることを特徴とする実験動物。
【請求項２】
請求項１に記載の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする実験動物。
【請求項３】
請求項１に記載の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の両方が改変されたホモ接合体であることを特徴とする実験動物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の実験動物において、前記遺伝子改変を全身に及ぼさせてあることを特徴とする実験動物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の実験動物において、前記遺伝子改変を特定の部位のみに生じさせてあることを特徴とする実験動物。
【請求項６】
骨形成能が欠損した実験動物であって、請求項１から５のいずれかに記載の実験動物の子孫であることを特徴とする実験動物。
【請求項７】
請求項６に記載の実験動物において、請求項１から５のいずれかに記載の実験動物同士の交配によるものであることを特徴とする実験動物。
【請求項８】
請求項６に記載の実験動物において、請求項１から５のいずれかに記載の実験動物と同士と前記遺伝子改変が存在しない実験動物との交配によるものであることを特徴とする実験動物。
【請求項９】
物質の骨疾患改善能を評価する方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物とに被験物質を投与し、
両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする骨疾患改善能の評価方法。
【請求項１０】
物質の骨疾患改善能を評価する方法であって、請求項１から８のいずれかに記載の実験動物に被験物質を投与したものと投与しないものとを作り、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする骨疾患改善能の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成能が欠損した実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、骨形成不全症、骨軟化症、くる病、骨減少症、骨粗鬆症、骨硬化症、大理石病、鎖骨頭蓋異形成症、等の骨疾患に関する基礎的研究、骨疾患の治療薬の開発等に使用するための適当なモデル動物は存在しなかった。そのため、たとえば骨粗鬆症に関しては、卵巣摘出動物が主に使用されている。また、骨粗鬆症モデル動物として小胞体ストレスセンサーＯＡＳＩＳ遺伝子欠損マウス（特許文献１）が存在するが、この遺伝子は骨芽細胞以外の細胞でも発現しているため、骨組織以外への影響が考えられ骨組織のみの正確な解析は困難であった。
【０００３】
骨芽細胞の分化に重要な役割を果たす転写因子Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２のノックアウトマウスは、軟骨形成および骨形成に重大な影響を及ぼすが、胎生致死（非特許文献１）のためモデル動物として使用することはできない。また、骨芽細胞特異的で骨芽細胞の分化に重要なもう一つの転写因子Ｏｓｔｒｉｘのノックアウトマウスは骨量が少なく、特に鎖骨が未発達であるが、誕生後数十分内に呼吸障害で死に至るため（非特許文献２）モデル動物として使用できない。
【０００４】
また、骨芽細胞特異的で、かつ骨芽細胞の分化成熟の後期過程である石灰化期で発現量が増加するタンパク質としてオステオカルシンが知られている。しかしながら、オステオカルシン遺伝子ノックアウトマウスは骨量が増加することから、オステオカルシンは過剰な骨形成を抑制する機能を有することが報告されている（非特許文献３）。これまで骨芽細胞に特異的でかつ骨形成の促進に関与する遺伝子またはタンパク質は見出されていなかった。したがって、骨芽細胞に特異的でかつ骨形成を促進する遺伝子を改変した骨疾患モデル動物は存在しない。
【特許文献１】PCT/JP2006/319628
【非特許文献１】Komori, T. et al. Target disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 89: 755-764 (1997)
【非特許文献２】Nakashima, K. e al., The novel zinc finger-containing transcription factor Osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108: 17-29 (2002)
【非特許文献３】Ducy, P. et al., Increased bone formation in osteocalcin-deficient mice. Nature 382: 448-452 (1996)
【非特許文献４】Hanagata, N. et al., Phenotype and expression pattern of osteoblast-like cells cultured on polystyrene and hydroxyapatite with pre-adsorbed type-I collagen. Journal of Biomedical Materials Research Part A 83(2): 362-371 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような背景から、長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物とこれを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明１の実験動物は、  骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ５  （以下ＩＦＩＴＭ５と記す。）遺伝子領域の一部又は全部あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されていることを特徴とする。
発明２は、発明１の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする。
【０００７】
発明３は、発明１の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の両方が改変されたホモ接合体であることを特徴とする。
【０００８】
発明４は、発明１から３のいずれかの実験動物において、前記遺伝子改変を全身に及ぼさせてあることを特徴とする。
【０００９】
発明５は、発明１から３のいずれかの実験動物において、前記遺伝子改変を特定の部位のみに生じさせてあることを特徴とする。
【００１０】
発明６は、骨形成能が欠損した実験動物であって、発明１から５のいずれかの実験動物の子孫であることを特徴とする。
【００１１】
発明７は、発明６の実験動物において、発明１から５のいずれかの実験動物同士の交配によるものであることを特徴とする。
【００１２】
発明８は、発明６の実験動物において、発明１から５のいずれかの実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物との交配によるものであることを特徴とする。
【００１３】
発明９の骨疾患改善能の評価方法は、発明１から８のいずれかの実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物とに被験物質を投与し、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする。
【００１４】
発明１０の骨疾患改善能の評価方法は、発明１から８のいずれかの実験動物に被験物質を投与したものと投与しないものとを作り、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする。
【００１５】
発明者は、ＩＦＩＴＭ５が骨形成に関与することをｉｎ  ｖｉｔｒｏで見出し（非特許文献４、Ｔａｂｌｅ  １）、さらにこの遺伝子の機能について調べ、以下に記載する事実を得た。
図１ａに示すようにマウス骨芽細胞を適当な培地で培養すると骨芽細胞が成熟し石灰化により骨結節を形成する。骨芽細胞が石灰化する時期にはオステオカルシン遺伝子（Ｂｇｌａｐ１／２）の発現が誘導されることが知られているが、ＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現はＢｇｌａｐ２と同様に石灰化期に発現が誘導された。ＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現誘導とともにタンパク質レベルでも発現量が増加していることを確認した。
また、骨形成促進因子であるＢＭＰ−２を添加すると骨結節の増加に伴いＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量も増加し、一方、骨形成抑制因子であるインターロイキン１（ＩＬ−１）を添加すると骨結節の減少に伴いＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量も減少した（図１ｂ，  ｃ）。
これらのことから、ＩＦＩＴＭ５は骨形成に関与することが示唆された。
【００１６】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子はＩＦＩＴＭファミリーのメンバーとして知られている。ＩＦＩＴＭファミリーはマウスでは少なくとも５つの機能的なメンバー（ＩＦＩＴＭ１，  ＩＦＩＴＭ２，  ＩＦＩＴＭ３，  ＩＦＩＴＭ５，  ＩＦＩＴＭ６）が知られているが、骨結節の増減と正の相関があるのはＩＦＩＴＭ５だけである（図１ｄ）。
【００１７】
１６．５日目のマウス胚のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現組織を調べたところ、図２に示すように腰椎、胸椎、口蓋骨、蝶骨、下顎骨、頭蓋骨、上顎骨、鼻骨、大腿骨、脛骨、指骨など軟骨内骨化および膜性骨化の両骨組織で発現が認められ、他の組織での発現は認められなかった。また、骨組織においては、軟骨細胞では発現せず、特に骨膜の周囲に位置する骨芽細胞、海綿骨周囲に位置する骨芽細胞において顕著に発現していた。これらのことから、ＩＦＩＴＭ５遺伝子は骨芽細胞でのみ発現する骨芽細胞特異的遺伝子であるといえる。
以上の事実からＩＦＩＴＭ５は骨形成に関与し、かつ骨芽細胞に特異的であることが示唆されたため、これを利用して新たな実験動物のこの遺伝子改変動物の作製に至った。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＩＦＩＴＭ５遺伝子改変非ヒト動物およびその一部により、これまで不明であった骨形成の分子機構解明のための有用なモデルとして、また、ＩＦＩＴＭ５が様々な骨疾患にどのように関与するかを調べる有用なモデルとして役立つ。      
本発明の骨疾患改善評価方法によると、骨芽細胞に作用して骨疾患を治療しうる薬剤の開発、および骨疾患の診断方法の開発に貢献することができる。
また、動脈硬化や乳癌でも骨形成に類似した石灰化現象が認められ、骨芽細胞あるいは骨芽細胞に類似した細胞の関与が報告されている。ＩＦＩＴＭ５遺伝子改変非ヒト動物あるいはＩＦＩＴＭ５遺伝子改変非ヒト動物の一部は、これらの疾患による石灰化機序、治療薬、診断薬および診断方法の開発への利用も期待できる。
さらに、ＩＦＩＴＭ５の一塩基多型（ＳＮＰ）や変異を有する動物の表現型の解析により骨疾患の診断が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子を欠損したノックアウトマウスの作製
本発明における遺伝子改変とは、内因性のＩＦＩＴＭ５遺伝子の塩基配列のうち、１塩基以上に置換、欠失、挿入の操作を行うこと（ノックアウト）、あるいは外因性のＩＦＩＴＭ５遺伝子を染色体上に導入する操作を行うこと（トランスジェニック）である。前者では、ＩＦＩＴＭ５遺伝子の機能的欠損を引き起こし、後者ではＩＦＩＴＭ５遺伝子の機能的亢進を引き起こす。
【００２０】
これらの操作が加えられた改変動物は、ＩＦＩＴＭ５遺伝子の対立遺伝子の片方のみに操作が加えられたヘテロ接合体、および両方に操作が加えられたホモ接合体、およびそれらの出生前の胎仔も含まれる。
【００２１】
前記遺伝子の改変は、ノックアウトの場合、内因性のＩＦＩＴＭ５遺伝子の少なくとも一部を欠損させる変異を導入し、機能的欠損を有するように操作する。マウスＩＦＩＴＭ５のゲノムＤＮＡはＢａｃ  ｃｌｏｎｅなどから単離することができる。トランスジェニックの場合は、外因性のＩＦＩＴＭ５遺伝子を用いるが、ヒトの疾患モデルのためにはヒトのＩＦＩＴＭ５遺伝子を使用することが望ましい。ヒトＩＦＩＴＭ５遺伝子の塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿００１０２５２９５、ＢＣ１５０５６２、ＢＣ１５０５６３などで公表されており、公知の手法により単離可能である。
【００２２】
現在まで、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ニワトリでＩＦＩＴＭ５の存在が知られているが、ハムスター、ウサギ、モルモット、ネコ、サル等の実験動物、およびヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜などでも同様にＩＦＩＴＭ５類似遺伝子の存在が確認されているのでこれらを利用することも可能である。
【００２３】
本発明のノックアウト動物は公知の方法で作製することができる。
ノックアウト動物を作製するためにはＩＦＩＴＭ５のターゲティングベクターを設計し構築する。ＩＦＩＴＭ５遺伝子のターゲティングベクターは当該遺伝子の全部あるいは一部を喪失あるいは破壊させ、機能を失わせるか、あるいは機能を低下させるものである。ここで機能とは、骨形成あるいは石灰化に関する機能のことを言う。
ターゲティングベクターとしては、ＩＦＩＴＭ５遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して相同組換えを起こすように設計されたＩＦＩＴＭ５遺伝子に相同な２つのポリヌクレオチド、および選択マーカーを含むことが好ましい。ＩＦＩＴＭ５遺伝子に相同な２本のポリヌクレオチドは相同領域が長いほど良く、また長さは０．５〜２０Ｋｂ、好ましくは１〜１０Ｋｂである。
【００２４】
本発明で用いられるターゲティングベクターの選択マーカーはポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーあるいは両方を含むことができる。ポジティブ選択マーカーとしては例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などがあり、ネガティブ選択マーカーとしては例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などを使用することができる。
ターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、大腸菌などの形質転換を行う細胞中で自己複製できるものであれば良い。たとえば、ｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が使用できる。
【００２５】
本発明のターゲティングベクターは公知の方法により構築できる。すなわち、ＩＦＩＴＭ５に相同な２本のポリヌクレオチドおよび選択マーカーをベクターに挿入することにより構築できる。
構築したターゲティングベクターを用いて相同組換えを行う。相同組換えはＥＳ細胞を用いることが望ましい。ＥＳ細胞はＴＴ２細胞が多く使用されるが、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞などを使用しても良い。
ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、エレクロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム法などがあり、いずれの方法でも良い。
ＩＦＩＴＭ５遺伝子がターゲティングされているかどうかは、たとえばターゲティングベクターの外側のゲノムＤＮＡ領域上、およびターゲティングベクター配列のうち薬剤耐性遺伝子上などから設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより確認できる。また、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識するプローブを設計し、ＩＦＩＴＭ５遺伝子を含むゲノムを適当な制限酵素で処理することにより得られるゲノム断片と、上記のプローブをハイブリダイズするサザンブロットによっても確認できる。
【００２６】
相同組換えされたＥＳ細胞は、８細胞期胚あるいは胚盤胞の胚内にマイクロマニピュレーション法、凝集法などの方法により移植する。８細胞期胚あるいは胚盤胞の胚は、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧなどのホルモン剤により過排卵処理した雌動物と雄動物を交配させることにより得ることが出来る。
ＥＳ細胞を移植されたキメラ胚は動物、好ましくは偽妊娠動物（去勢した雄動物と交配した雌動物）の子宮に移入する。キメラ胚を移入された動物はキメラ動物を出産する。キメラ動物は体色や被毛色など公知の方法により確認できる。
キメラ動物を成熟するまで飼育し、雄のキメラ動物と野生型の雌動物と交配させる。誕生した動物の体色、被毛色などによりＥＳ細胞がキメラ動物の生殖系列に導入されたことを確認することができる。胚内に移植された相同組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入されたＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損動物はヘテロ接合体動物である。
このヘテロ接合体の雄動物とヘテロ接合体の雌動物を交配させることによりＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。ホモ接合体動物の確認は、たとえば尻尾などから染色体ＤＮＡを抽出しＰＣＲ等により行うことができる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、ＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現が調節されている。
マウスの場合、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスはＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現が抑制され、骨量が野生型に比べて減少しているが、野生型マウスと同じ飼育条件下でも発生、繁殖、寿命には欠陥が生じない。
【００２７】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子改変非ヒト動物あるいはその一部による骨疾患改善物質の探索方法
骨疾患改善物質の評価方法であって、（ａ）本発明の非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、（ｂ）前記被験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量を調べ、被験物質を投与あるいは接触させていない対照の非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量と比較し、（ｃ）（ｂ）の結果に基づいて被験物質を選択する骨疾患の改善物質を評価することを特徴とする骨疾患改善物質の探索方法を提供する。
【００２８】
ここで、非ヒト動物の一部とは、組織または細胞などである。また、投与は経口投与と非経口投与であり、非経口投与としては、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは骨、骨髄への局所投与等が挙げられる。表現型とは、体長、体重等、および骨量、骨密度、骨強度など、骨組織形態計測に利用されている指標である。骨形成関連マーカー物質とはアルカリフォスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、オステオポンチン、オステオカルシン、骨シアロタンパク質など、骨形成に関連して生成される物質である。
【００２９】
本発明の探索方法の対象となる被験物質は特に限定されるものではない。たとえば、アミノ酸、タンパク質、核酸、多糖、合成物質、天然物質などを挙げることができる。これらの被験物質は単独でも組み合わせても良い。
このようにして選択された被験物質はＩＦＩＴＭ５遺伝子あるいはＩＦＩＴＭ５タンパク質に障害のある骨疾患の改善薬として有効である。
【００３０】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子あるいはＩＦＩＴＭ５タンパク質を測定することによる骨疾患改善物質の探索方法
骨疾患改善物質の評価方法であって、（ａ）非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、（ｂ）非験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部のＩＦＩＴＭ５遺伝子あるいはＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現量を調べ、非験物質を投与あるいは接触させていない非ヒト動物あるいはその一部のＩＦＩＴＭ５遺伝子あるいはＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現量と比較し、（ｃ）（ｂ）の結果に基づいて被験物質の骨疾患改善能を評価することを特徴とする骨疾患改善物質を探索する方法を提供する。
ＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではく、例えばＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
【００３１】
ＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではなく、例えばウエスタンブロッティング法などが挙げられる。
【００３２】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子あるいはＩＦＩＴＭ５タンパク質を測定することによる骨疾患の診断方法
被験者あるいは被験動物から組織を採取し、ＩＦＩＴＭ５遺伝子あるいはＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現量を測定することにより骨形成能あるいは骨疾患の診断を行う方法を提供する。
ＩＦＩＴＭ５遺伝子およびＩＦＩＴＭ５タンパク質の測定方法は特に限定されるものではなく、前記の例と同様な方法で測定することができる。
【実施例１】
【００３３】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトＥＳ細胞の作製
ＩＦＩＴＭ５遺伝子のゲノムＤＮＡのクローンは、市販のＢａｃ  ｃｌｏｎ  （ＩＤ：  ＲＰ２３−３８８Ｎ１３）から得た。ターゲティングベクターはＮｅｏカセットを含むベクターの両側にＢａｃ  ｃｌｏｎｅから切り出したゲノムをＳｈｏｒｔ  ａｒｍ、Ｌｏｎｇ  ａｒｍとしてクローニングした。さらにネガティブセレクションマーカーとしてＤＴＡ（ジフテリア毒素）を挿入し、コンストラクトとして（ｓｈｏｒｔ−Ｎｅｏ−ｌｏｎｇ−ＤＴＡ）を作製した（図３）。
次に、ターゲティングベクターより直鎖状にしたＤＮＡをエレクトロポレーションにより４−７ｘ１０７個のＥＳ細胞に導入した。Ｇ４１８により１週間選択をおこなった後、生き残ったコロニーを数百個ピックアップした。ピックアップしたＥＳ細胞はさらに１週間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法を用いて相同組換えクローンをスクリーニングした。ここで得た陽性クローンをさらに５‘側、３’側に設計した２組のプローブを用いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクターの相同組換え体を確認した（図４）。
【実施例２】
【００３４】
ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスの作製
実施例１で作製されたＩＦＩＴＭ５遺伝子が破壊されたＥＳ細胞をマイクロインジェクションにより交配後３．５日目のＣ５７ＢＬ６の胚盤胞に移入し、偽妊娠マウスの子宮に移した。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ６マウスと交配し、生殖系列にＩＦＩＴＭ５遺伝子の破壊が導入されたヘテロ接合マウスを得た。さらに、これらのヘテロ接合マウス同士を交配させることにより本発明のＩＦＩＴＭ５遺伝子がノックアウトされた遺伝子改変動物を得た。
本発明におけるＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスは野生型マウスと同じ飼育条件で生育できた。
【実施例３】
【００３５】
実施例２で得たマウスの表現型
実施例２で得たＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスは、野生型マウスに比べ体長が小さく、かつ前肢および後肢とも発達不全であった（図５ａ）。また、本発明におけるＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスは、軟骨形成には異常は認められなかったが、脛骨および尺骨が湾曲していた（図５ｂ，  ｃ）。さらに、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは、上顎骨および下顎骨の骨化が認められず、頭蓋骨も野生型に比べ薄かった（図５ｄ）。
【実施例４】
【００３６】
実施例２で得た本発明マウスの骨構造
野生型マウスおよび実施例２で得たＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスから脛骨を摘出し、μ−ＣＴにより二次海綿骨部位の立体構造を調べた（図６ａ）。さらにこの画像から骨形態計測のパラメーターをＴＲＩ／３Ｄ−ＢＯＮ（ラトックシステムエンジニアリング）により求めた（図６ｂ，ｃ）。二次海綿骨の骨組織に対する割合（ＢＶ／ＴＶ）および二次海綿骨の骨密度（Ｔｒ．ＢＭＤ）はＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスで低かった。
これは、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは骨量が野生型に比べて低下していることを示している。ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは海綿骨数（Ｔｂ．Ｎ）は野生型と変わらないが、海綿骨幅（Ｔｂ．Ｔｈ）が低いことから、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは野生型マウスに比べ海綿骨が薄いことがわかる。また、皮質骨の骨密度（Ｃｏｒ．ＢＭＤ）および皮質骨量（Ｃｏｒ．ＢＭＣ）はＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスが野生型マウスに比べ顕著に低く、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスは皮質骨量の重大な低下を引き起こすことがわかる。
さらに、図７に示すようにＩＦＩＴＭ遺伝子欠損マウスの二次海綿骨では、骨粗鬆症の指標であるＶ＊ｍ．ｓｐａｃ（大きい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい）は野生型に比べ大きく、Ｖ＊ｔｒ．（小さい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい）は野生型に比べて小さいことから、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは骨粗鬆症の度合いが大きいことを示していた。
【実施例５】
【００３７】
実施例２で得た誕生後２日目のＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離し、５６００細胞／ｃｍ２の濃度でカルチャーディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ，  １００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、２ｍｍｏｌ／ｌのβーグリセロリン酸を含む培地で培養した。培養後４０日目以降で野生型マウスから単離した骨芽細胞は石灰化による骨結節が認められたが、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは石灰化はわずかしか起こらなかった（図８a）。さらに、細胞からＲＮＡを抽出後、逆転写によりｃＤＮＡを合成し、５’−ｃａｇｃｔｃｃｔｇｇｇａｇｔｔａｃａｇｃ−３’および５’−ａａｇｔｇｇｇｇａａａｇｇｇａｃａａａ−３’のプライマーを用いてＰＣＲによってＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量を求めた。その結果、野生型マウスでは培養後期にＩＦＩＴＭ５遺伝子の顕著な発現増加が認められたのに対し、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは発現が認められなかった（図８b）。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。
【実施例６】
【００３８】
実施例２で得た誕生後２日目のＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離し、前記した培地にて５０日間培養した。培養後４０日目以降で野生型マウスから単離した骨芽細胞は石灰化による骨結節が認められたが、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは石灰化がわずかしか観察されなかった。培養４０日目の培養細胞からｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を用いて抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った後に、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にタンパク質を転写した。メンブレンは３％Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（０．０５Ｔｅｅｎ−２０を含むＰＢＳに溶解）を用いて、室温で１ｈｒブロッキングを行い、メンブレンを一次抗体としてＩＦＩＴＭ５タンパク質のＮ末端に対するポリクロナル抗体（Ｎ末端側ｐｅｐｔｉｄｅ  配列：ＴＳＹＰＲＥＤＰＲＡＰＳＳＲＣ）を４℃で一晩インキュベートした。その後、０．０５％  Ｔｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでメンブンレンを３回洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２  ｏｆ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  （ＺＹＭＥＤ）を加え、室温で１時間あるいは４℃で一晩インキュベートした。このメンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｍｉｌｉｍｕｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて反応させ、ＩＦＩＴＭ５タンパク質を検出した。その結果、ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスではＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現が認められず、野生型マウスでは顕著に発現していた（図８c）。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのＩＦＩＴＭ５タンパク質の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。
【実施例７】
【００３９】
実施例２で得た誕生後７日目のマウスの大腿部からＫａｗａｍｏｔｏ法（詳しくは下記参考文献参照）によりクライオセクションを調整した。このクライオセクションをメタノールで固定後、ヘマトキシリンとエオシンで染色し（ＨＥ染色）、エタノールで脱水処理を行った。この大腿部切片からレーザーマイクロダイセクションで骨芽細胞を切り出し、ＲＮＡを回収、ｃＤＮＡを合成後、前記のプライマーセットでＰＣＲを行いＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量を調べた。ＩＦＩＴＭ５遺伝子欠損マウスでは遺伝子の発現は認められないが、野生型マウスではＩＦＩＴＭ５遺伝子が発現していた（図９）。
このような方法により、回収した組織からＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量を計測することができ、組織の骨形成能および骨疾患の診断を行うことができる。また、非ヒト動物に被験物質を投与し、投与してない対照の非ヒト動物とＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量を測定することにより骨疾患改善物質の探索を行うことができる。これらの診断および探索は、実施例６によるＩＦＩＴＭ５タンパク質の測定によって行ってもよい。
参考文献：Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol. Cytol. 66(2): 123-143 (2003)
【実施例８】
【００４０】
ＩＦＩＴＭ５と相互作用するタンパク質群をプルダウン法で得た後、質量分析計により同定した結果、女性ホルモンであるエストラジオールの合成に関与する酵素ＨＳＤ１７Ｂ１２およびＨＳＤ１７Ｂ７、さらに免疫抑制剤ＦＫ５０６と結合するＦＫＢＰ１１が得られた（図１０）。骨粗鬆症の主要な原因として、閉経後に卵巣等から骨組織に供給されるエストラジオール濃度の低下が報告されている。ＩＦＩＴＭ５はエストラジオール合成に関与する酵素と結合していることから骨粗鬆症との関連が示唆され、ＩＦＩＴＭ５遺伝子改変動物は骨粗鬆症の発症機序および治療薬の開発に寄与することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】マウス骨芽細胞の培養におけるＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現挙動を示す。（ａ）は、分化培地で培養したマウス骨芽細胞は培養が進むと徐々に成熟し石灰化による骨結節を形成する（上図の赤い部分、アリザリンレッドでカルシウムを染色）。この培養でＩＦＩＴＭ５遺伝子は石灰化度が大きくなると発現量も増加する（下図）。Ｂｇｌａｐ２（オステオカルシン遺伝子）は石灰化に連動して発現量が増加することが知られているが、ＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現挙動はＢｇｌａｐ２と類似している。この培養でＩＦＩＴＭ５のタンパク質生成量にＩＦＩＴＭ５抗体を用いたウェスタンブロットで調べると石灰化度が大きくなるほどＩＦＩＴＭ５タンパク質量も増加する。（ｂ）は、分化培地に骨形成促進因子であるＢＭＰ−２を添加すると石灰化による骨結節の形成が促進される（上図）。この培養においてＢＭＰ−２の添加量が大きくなり骨結節の形成が促進されるとＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量も連動して大きくなる（下図）（ｃ）は、分化培地に骨形成抑制因子であるＩＬ−１を添加すると石灰化による骨結節の形成が抑制される（上図）。この培養においてＩＬ−１の添加量が大きくなり骨結節の形成が抑制されるとＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現量も連動して小さくなる（下図）（ｄ）は、図１（ａ）の培養において培養２日目（石灰化してない時期）と培養２１日目（石灰化している時期）でのＩＦＩＴＭメンバーの遺伝子発現量を調べると、ＩＦＩＴＭ５遺伝子のみが石灰化している時期で発現量が増加している。
【図２】マウス１６．５日目の胚でのＩＦＩＴＭ５遺伝子発現組織をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで調べた結果を示す。胚の断面におけるａ１〜ａ７がＩＦＩＴＭ５発現部位。枠内のａ１〜ａ７はそれぞれの部位を拡大した図。さらに枠内ａ１〜ａ７の矢頭を拡大した図がａ１−１〜ａ７−１。青く染色されている部位がＩＦＩＴＭ５発現部位。ｂ１，  ｂ２は１６．５日目の胚の後肢。ｃ１は指骨。
【図３】実施例１のＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウス作製のためのターゲティングベクターを示す模式図。作製したターゲティングベクターはｓｈｏｒｔ−Ｎｅｏ−ｌｏｎｇ−ＤＴＡ構造をもつコンストラクトである。
【図４】実施例１のＳｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  結果を示す写真。エレクトロポレーションにより陽性であると判断された９クローンのＥＳ細胞でサザンブロットを行った。レーン１は野生型。レーン３以外の８クローンが相同組換え体のクローンであることが確認できる。
【図５】実施例3の生後２日目のＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウス（ＩＦＩＴＭ５−／−）と正常マウス（ＷＴ）の比較写真。（ａ）は、生後２日目のＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウスと野生型マウス。ノックアウトマウスは体長が小さく、さらに四肢も短い。野生型マウスとは外見が顕著に異なる。（ｂ）は、ＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウスでは脛骨およびひ骨の変形が観察される。（ｃ）は、ＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウスではとう骨および尺骨の変形が観察される。（ｄ）は、上顎、下顎および頭蓋骨のｖｏｎ  ＫｏｓｓａとＨＥ染色。茶色く染まっている領域が骨化していることを示している。ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスでは、上顎、下顎の骨化が観察されない。また、頭蓋骨は野生型マウスに比べて薄い。
【図６】実施例4の生後２日目のＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウス（ＩＦＩＴＭ５−／−）と正常マウス（ＷＴ）の脛骨二次海綿骨の比較写真。（ａ）は、μ−ＣＴで解析した脛骨二次海綿骨の立体構造。野生型に比べてＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスは皮質骨が薄い。（ｂ）は、海綿骨に関するパラメーター。ＢＶ／ＴＶは骨組織全体の体積に対する骨体積の割合、ＢＭＤは骨密度を表す。両パラメーターともＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウスは野生型マウスよりも低い。Ｔｂ．Ｔｈは海綿骨幅、Ｔｂ．Ｎは海綿骨数を表す。（ｃ）は、皮質骨に関するパラメーター。ＢＭＤは骨中の石灰化密度、ＢＭＣは皮質骨総量。いずれもＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスは野生型に比べ低い。
【図７】実施例4のＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウス（ＩＦＩＴＭ５−／−  ）と正常マウス（ＷＴ）の脛骨二次海綿骨の骨粗鬆度を示すグラフ。  骨密度の指標となるパラメーター。Ｖ＊ｍ．ｓｐａｃは大きい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きいく、Ｖ＊ｔｒ．は小さい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい。
【図８】実施例5および実施例６の  ＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウスと野生型マウスから単離した骨芽細胞の石灰化能とＩＦＩＴＭ５遺伝子およびタンパク質の発現を示す写真。（ａ）は、ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から単離した骨芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養における石灰化（骨結節形成）をアリザリンレッドで検出。ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べて骨結節が少ない。（ｂ）は、ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から単離した骨芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養における石灰化期のＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現をＰＣＲによって検出。（ｃ）は、ＩＦＩＴＭ５遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から単離した骨芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養における石灰化期のＩＦＩＴＭ５タンパク質をウエスタンブロッティングにより検出。
【図９】実施例7のＩＦＩＴＭ５ノックアウトマウスと野生型マウス大腿骨から単離した骨芽細胞のＩＦＩＴＭ５遺伝子発現を示す写真。  大腿骨切片からレーザーマイクロダイセクションにより石灰化部位を切り出す。上左図の黄色の線で囲われた部分の石灰化部位を切り出す。上右図は切り出した後の切片。下図はＰＣＲによる切り出した石灰化部位のＩＦＩＴＭ５遺伝子の発現。
【図１０】実施例8のＩＦＩＴＭ５と相互作用するタンパク質の探索とIFITM5タンパク質がHSD17B7、HSD17B12、FKBP11と相互作用することを示したウェスタンブロット写真。  （ａ）は、Ｆｌａｇ−ＩＦＩＴＭ５をマウス骨芽細胞で強制発現させ、得られたタンパク質溶液をＦｌａｇ抗体で免疫沈降しプルダウンを行った。レーン  １は細胞から回収した全タンパク質、レーン  ２は免疫沈降後の上澄み液（ＩＦＩＴＭ５と相互作用していないタンパク質）、レーン  ３は免疫沈降により回収されたタンパク質（ＩＦＩＴＭ５と相互作用しているタンパク質）。レーン３に用いたタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析計でタンパク質を同定し、ＩＦＩＴＭ５と相互作用しているタンパク質としてＦＢＢＰ１１、ＨＳＤ１７Ｂ１２、ＨＳＤ１７Ｂ７の３種類のタンパク質を得た。（ｂ）は、前記図１０（ａ）で同定された３種類のタンパク質がＩＦＩＴＭ５と相互作用していることを確認するため、Ｆｌａｇを連結したこれら３種類のタンパク質とＩＦＩＴＭ５を細胞内で強制発現し、Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降した。その結果、ＦＢＢＰ１１、ＨＳＤ１７Ｂ１２、ＨＳＤ１７Ｂ７の３種類のタンパク質にはＩＦＩＴＭ５が相互作用していることを確認した。ＦＦＢＰ１１は免疫抑制剤と結合するレセプタータンパク質であり、ＨＳＤ１７Ｂ１２およびＨＳＤ１７Ｂ７はエストラジオール合成に関与する酵素である。
【図１】
2010099049.tif 000003
【図２】
2010099049.tif 000004
【図３】
2010099049.tif 000005
【図４】
2010099049.tif 000006
【図５】
2010099049.tif 000007
【図６】
2010099049.tif 000008
【図７】
2010099049.tif 000009
【図８】
2010099049.tif 000010
【図９】
2010099049.tif 000011
【図１０】
2010099049.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月28日(2008.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010099049.tif 000013
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2010099049.tif 000014
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2010099049.tif 000015
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2010099049.tif 000016
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2010099049.tif 000017