(57)【要約】      （修正有）【課題】血管新生および脈管形成の誘導に使用するための治療薬を提供する。【解決手段】治療薬は幹細胞から単離した血管新生および脈管形成誘導因子を製薬学的に許容され得る細胞治療と一緒に含む。血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増加させるために、幹細胞を暴露し、そして幹細胞と化合物を共培養することにより分泌される血管新生および脈管形成誘導因子の生産増幅法。治療に使用するために幹細胞から単離そして精製された血管新生および脈管形成誘導因子。上に説明した血管新生および脈管形成誘導因子を得る方法、その工程はヒトの間葉系幹細胞を分化前の組織から単離そして精製し、そして次いで間葉系幹細胞を培養拡大して神経学的および筋骨格治療用の道具を生産する工程を含む。組織修復に必要な所望の細胞表現型に分化し、そして生産することができる、単離され、そして必要な化合物の影響下で培養拡大した間葉系幹細胞。【選択図】図１
2010018627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生および脈管形成の誘導に使用する治療薬であって、該治療薬が幹細胞から単離された血管新生および脈管形成誘導因子を、血管新生および脈管形成を誘導するための製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含んでなる上記治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は治療薬として使用するための方法および組成物に関する。より詳細には本発明は血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の治療的生成の使用および血管新生および栄養（ｔｒｏｐｈｉｃ）因子の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
発作は米国の成人人口において３番目に多い死因であり、そして障害の主要因である。発作は脳の一部が梗塞するようになった時に起こり、大脳の血液供給の妨害から脳組織の死をもたらす。急性発作に伴う脳梗塞は急激な、しかも劇的な神経的損傷を引き起こす。他の神経性疾患も組織の死および神経的損傷をもたらす。
【０００３】
発作により影響を受けた、生存できるかもしれない脳の領域への血流を最大とするために薬理学的介入が試みられたが、臨床的効果は曖昧であった。非特許文献１では、「．．．．［脳拡張薬］が酸化窒素法により測定される脳の血流を上昇させる実験的証拠にもかかわらず、それらはヒトの一時的な虚血性の攻撃、血栓症の進行、または慢性の発作の段階でヒトの発作の症例を慎重に研究すると有益ではないことが示された。これはニコチン酸、プリスコリン（Ｐｒｏｓｃｏｌｉｎｅ）、アルコール、パパベリンおよび５％二酸化炭素の吸収にもあてはまる。．．．．．これらの方法の使用に対して、血管拡張薬は全身の血圧を下げることにより頭蓋内吻合流を低下させ、あるいは脳の正常な部分の血管を拡張することにより血管が梗塞から血液を取るので、有利というよりはむしろ有害であると示唆している」と述べている。
【０００４】
さらに心血管系の疾患は死亡率および罹病率の世界的な原因を導いている。例えば心不全の有病率は増加してきている。心不全は心臓が十分な血液を身体の様々な臓器に送ることができないことを特徴とする。現在の推定では５百万以上のアメリカ人が心不全の診断を受け、毎年ほぼ５００，０００人の新たな症例が診断され、そして年間２５０，０００人がこの疾患により死んでいる。この二十年間におけるかなりの治療的完成度にもかかわらず、心不全の発症は増え続け、流行病の比率に達し、そして開発国における主な経済的負担を表している。
【０００５】
心不全は心拍出量の障害または静脈圧の上昇から生じる明白な症状および兆候を特徴とする臨床的症候群である。さらに心不全は進行性の障害であり、これにより心臓の機能は副作用が無くても時間経過に伴い悪化し続ける。心不全により、不十分な心拍出量が生じる。
【０００６】
一般に２種類の心不全がある。右心不全は心臓の右側が静脈血を肺の循環に送ることができない。身体に液体の停滞が生じ、そして腫張および水腫が生じる。左心不全は心臓の左側が血液を全身の循環に送れないことである。次に左心室の後ろの停滞が肺に流体の蓄積を引き起こす。
【０００７】
心不全から生じる主な影響は、流体のうっ血である。心臓がポンプとして効率的でなくなると、身体は例えば血液容量を上昇させるためのホルモンおよび神経シグナルを使用することによりそれを補おうとする。
【０００８】
心不全には多数の原因がある。例えば心臓組織の疾患はもはや機能しない死んだ心筋細胞を生じる。左心室不全の進行は、部分的にこれら心筋細胞の損失の進行が原因であった。
【０００９】
心不全を処置し、そして防止する多数の方法があった。例えば幹細胞は動物モデルを対象として急性心虚血および／または梗塞または損傷における心細胞を再生するために使用されてきた。１つの特別な例では、ドナーの足の骨から単離された生きている骨髄間質細胞（ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）が培養−拡大され（ｃｕｌｔｕｒｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ）、標識され、そして次いで同系成体ラットレシピエントの心筋層に注射された。移植から４日〜１２週後に心臓を回収した後、移植部位を調査し、そして移植された間質細胞が心筋の環境で成長する可能性を示すことが分かった（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）。
【００１０】
心筋細胞は、胚様凝集物（ｅｍｂｒｙｏ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）（胚様体：ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）を介してＤ３系の多能性の胚性幹細胞（ＥＳ）からインビトロで分化することが示された。細胞は全分化期間中、全細胞パッチ−クランプ技法、形態学および遺伝子発現の類似により特徴つけられた。（Ｍａｌｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。さらに多能性のマウスＥＳ細胞は哺乳動物の心臓の主な特徴を発現する心筋細胞に分化できた（Ｍａｌｔｓｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【００１１】
幹細胞はそれらの起源（胚性、骨髄、骨格筋等）にかかわらず、すべてではないが身体の細胞型に分化する可能性を有する。幹細胞は機能的な心筋細胞にも分化することができる。すなわち心不全を処置するための幹細胞に基づく治療の開発は、既存の治療よりも多くの利点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｈａｒｒｉｓｏｎの内科学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（第９版、１９８０、第１９２６頁）
【発明の概要】
【００１３】
発明の要約
本発明に従い、血管新生および脈管形成の誘導に使用する治療薬が提供される。治療薬は幹細胞から単離された血管新生および脈管形成誘導因子を、血管新生および脈管形成を誘導するための製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含むことができる。また間質細胞を血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増すための化合物に暴露し、そして共培養することにより分泌される血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増幅させる方法も提供する。幹細胞から単離され、そして精製された治療に使用するための血管新生および脈管形成誘導因子も提供する。上に説明した血管新生および脈管形成誘導因子を得る方法を提供し、この方法は分化前の組織からヒト間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を単離し、そして精製し、そして次いで神経学的および筋骨格治療用の道具を生産するために間葉系幹細胞を培養拡大する工程を含む。組織修復に必要な所望する細胞表現型に分化し、そして生産することができる、単離され、そして必要な化合物の影響下で培養拡大された間葉系幹細胞も提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の説明
一般に本発明は血管新生および脈管形成を誘導するための細胞治療の一部として、骨髄間質細胞または他の幹細胞に由来する血管新生および脈管形成誘導因子の使用を提供する
。より詳細には本発明は、治療に使用するための間質細胞または他の幹細胞により分泌される血管新生および脈管形成誘導因子（例えば血管新生、栄養および増殖因子）の生産を増幅させる方法を提供し、この因子は投与されると血管新生または他の有益な増殖を誘導する。増幅は細胞を脳抽出物および／またはカルシウムに暴露し、そして共培養することにより起こる。
【００１５】
用語「血管新生」とは新しい、および／または発育中の血管の組織への成長が関与する組織の脈管化のプロセスと定義され、そして新脈管形成（ｎｅｏ−ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）とも呼ばれる。このプロセスは内皮細胞および平滑筋細胞の浸潤により媒介される。このプロセスは３つのうちの１つの様式で進行する：血管が既存の血管から発出し、血管のデノボ成長が前駆細胞から生じることができ（脈管形成）、かつ／または既存の小さい血管の直径が拡大することができる。
【００１６】
本明細書で使用する用語「強化する」または「強化」は、限定するわけではないが幾つかの望ましい質または量の物質を加えるかまたは増すことにより、豊富またはより豊富にすることを含むことを意味する。
【００１７】
本明細書で使用する「脳抽出物」という句は、限定するわけではないが脳細胞または脳から得られる他の類似の細胞を含むことを意味する。これらの細胞は培地で培養することができ、そして上清を脳抽出物として使用することができる。
【００１８】
本明細書で使用する用語「損傷」は、限定するわけではないが遺伝子障害、疾患および年齢により発症する障害を含む身体的または生物学的損傷を含むことを意図する。例えば患者は発作、ＣＮＳ損傷および神経変性疾患後に神経および機能的障害に罹る。
【００１９】
本明細書で使用する用語「細胞治療」は限定するわけではないが、幹細胞の治療的使用を含む。幹細胞はその子孫が種々の細胞型に特異化する分化していない母細胞である。幹細胞は限定するわけではないが、胚、骨髄、肝臓、間質、脂肪組織および当業者に知られている他の幹細胞起源を含む種々の起源を有する。これらの幹細胞はそれらが自然に発生する所望の領域に置くことができ、または当業者に知られている様式で工作することができる。すなわち限定するわけではないがトランスフェクション、削除等を含む種々の遺伝子工学的手法を介して、幹細胞はそれらの生存の見込みを上げるために、または他の所望する目的のために工作されることができる。
【００２０】
幹細胞はヒト個体に提供された時、インビボで自己再生することができ、そして系統が制限された子孫となることができ、これはさらに特異的な系統に分化し、そして拡がる。本明細書で使用する「幹細胞」はヒトの骨髄細胞を指し、そして他の細胞型の幹細胞ではない。好ましくは「幹細胞」はヒト骨髄間質細胞を指す。
【００２１】
用語「幹細胞」または「多能性」幹細胞は互換的に使用して、（１）すべての定義された造血系統における子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を生じる能力、および（２）自己−再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）により多能性造血幹細胞を含むすべての血液細胞型およびそれらの子孫において、重度な免疫抑制宿主を完全に再構成することができる幹細胞、を有する幹細胞を意味する。
【００２２】
骨髄は長骨の骨髄腔、幾つかのハヴァーズ管および海綿質すなわちスポンジ状の骨の小柱間の空間を占める柔軟組織である。骨髄には２種類ある：赤色、これは生まれたばかりのすべての骨、および成人の限定された場所（すなわち海綿質中）に見いだされ、血液細胞（すなわち増血）およびヘモグロビン（すなわち赤色）の生産に関する；および黄色、これはほとんどが脂肪細胞（すなわち黄色）および結合組織からなる。
【００２３】
全体として骨髄は造血幹細胞、赤および白血球およびそれらの前駆体、間葉系幹細胞、間質細胞およびその前駆体、ならびに「間質」と呼ばれる結合組織網を形成する繊維芽細胞、網状白血球、脂肪細胞および内皮細胞を含む細胞群を含む複雑な組織である。間質に由来する細胞は、細胞表面タンパク質および増殖因子の分泌を介して直接的な相互作用を通した造血細胞の分化を形態学的に調節し、そして骨構造の基礎および支持に関与している。
【００２４】
動物モデルを使用した実験では、骨髄が軟骨、骨および他の結合組織細胞に分化する能力を有する「前−間質（ｐｒｅ−ｓｔｒｏｍａｌ）」細胞を含むことが示唆された。（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ｎ．：骨および骨髄の骨形成幹細胞および間質系（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ）、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，２４０：２７０，１９８９）。最近の証拠では多能性間質幹細胞または間葉系幹細胞と呼ばれるこれらの細胞が、活性化で幾つかの異なる型の細胞系（すなわち骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等）を生成する能力を有することを示す。しかし間葉系幹細胞は広い種々の他の細胞（すなわち、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞等）と組織中に大変微量で存在し、そして年齢に逆行する関係で、多数の生物活性因子の影響に依存して寄せ集めの結合組織に分化することができる。
【００２５】
本発明の目的は、骨髄間質細胞、骨髄間質細胞に由来する上清、または骨髄間質細胞と他の幹細胞の相互作用から生じる分泌物を、疾患を処置するために利用することである。これらの分泌物には限定するわけではないが多数の増殖、栄養および血管新生因子を含む。本発明の方法は、処置の効果を増すこと、例えば血管新生、および存在しないまたは既存の血管から形成される血管生産を増すことにより、神経損傷または他の損傷からの回復に改善された結果を促進する。また本発明はＣＮＳ傷害または変性後の機能を向上させるために、脳の補完メカニズムを強化する手段を提供するためにも使用することができる。さらに本発明の方法および組成物は、細胞治療の効力を強化することができる。
【００２６】
損傷した細胞に分化する移植した幹細胞を介して、損傷した細胞の濃度を高め（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）かつ／または増やす（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）ことは機能を上げる。例えばこの治療が心臓で使用される時、治療は心臓の筋節（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｕｎｉｔｓ）を増すことができる。筋節の増加は心臓の機能を上げる。さらに幹細胞は栄養因子のような種々の物質の放出の原因ともなり得る。すなわち例えば栄養因子の放出は、心機能を上げ、かつ／または心不全を処置するために血管新生を誘導する（血管の数を増す）。したがって幹細胞は単に機能的な心筋細胞に分化する以外に様々なメカニズムを介して心機能を上げ、かつ／または心不全を処置するように作用する。
【００２７】
栄養因子、増殖因子および血管新生因子の生産は典型的には経費がかさむ難しい方法である。本発明の方法および組成物は、本発明の治療を単に投与することにより、純粋な栄養因子、増殖因子および他の関連因子を生産する廉価で、しかも簡単な方法を提供する。これらの因子は患者の処置に使用することができる。例えば因子はインビボおよびインビトロの両方で血管新生、脈管形成を誘導するために、および組織の機能を強化し、そして修復するために使用することができる。したがって栄養、増殖および血管新生因子を生産し、そして分泌するために、どの骨髄間質細胞が細胞工場として使用できるかを決定することが有益である。これらの因子には限定するわけではないが、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ等を含む。本発明の方法は培養条件によりこれらの因子の生産を操作することを可能とする。例えば培養条件は、細胞を培養基中で組織および／または種々のカルシウム濃度で共培養することにより操作することができる。
【００２８】
本発明は疾患を処置するための細胞治療の使用に基づく。幹細胞は異なる起源（胚、骨髄、肝臓、脂肪組織等）であるが、それらの重要な共通の特徴は、それらがすべてではないが身体の様々な細胞型に分化する可能性を有するということである。すでに述べたように、幹細胞は心筋細胞に分化できることが示された（Ｍａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；１９９４）。
【００２９】
出願人は神経学および筋骨格治療用の価値ある道具を生産するために、分化前の組織からヒト間葉系幹細胞を単離し、そして精製し、次いで間葉系幹細胞を培養拡大する方法を開発した。そのような操作の目的は、間葉系幹細胞の数を大きく増加させ、そしてこれらの細胞を身体の正常な修復能力に方向転換かつ／または強制させるために利用することである。間葉系幹細胞は多数で回収され、そして再生および／または修復のためのインビボ成長を強化または刺激するために、後の活性化および分化等を介して種々の人工器官デバイスへの移植付着を向上させるために、組織損傷の領域に適用され、造血細胞の生産等を強化する。
【００３０】
発明者は培養で拡大され、精製された間葉系幹細胞を修復、移植等の部位に転移し、固定化し、そして活性化するための様々な手法を企図し、それらには細胞を骨格欠損の部位に注射すること、細胞を人工器官とインキューベーションすること、および人工器官を移植すること等を含む。このように分化前の細胞を単離し、精製し、そして数を大きく拡大し、そして次いで組織傷害の部位にそれらを配置することにより、またはそれらを移植前にインビトロで前処理することにより分化プロセスを能動的に制御することにより、培養拡大した未分化間葉系幹細胞を多数の神経疾患、神経損傷、代謝性骨疾患、骨格筋形成異常、軟骨欠損、靭帯および腱の損傷および他の筋骨格および結合組織障害における細胞的、分子的および遺伝的障害を解明するためのような種々の治療目的に利用することができる。
【００３１】
発明者は細胞を損傷の部位に注射することを含め、種々の多孔質セラミック媒体または担体の使用を介して、修復、移植等の部位に間葉系幹細胞または前駆細胞を転移し、固定化し、そして活性化するための種々の手順を企図する。
【００３２】
ヒト間葉系幹細胞は、変性関節疾患の患者から腰または膝の代替手術中に得られる大腿頭海綿質骨片の栓を含む多数の異なる供給源から、および将来の骨髄移植のために骨髄が回収される正常ドナーおよびガン患者から得られる吸引された骨髄から得ることができる。回収された骨髄は回収された骨髄の供給源に依存して（すなわち骨片、末梢血の存在等）、多数の異なる機械的単離法により細胞培養分離のために調製されるが、単離法に含まれる重要な工程は分化無しに間葉系幹細胞の成長を可能とするだけではなく、培養皿のプラスチックまたはガラス表面領域に間葉系幹細胞だけを直接付着させる作用物質を含む特別に調製した培地の使用であった。骨髄サンプル中に大変少量で存在する所望の間葉系幹細胞の選択的付着を可能とする培地を生産することにより、骨髄に存在する他の細胞（すなわち赤および白血球、他の分化した間葉系幹細胞等）から間葉系幹細胞を分離することが可能となった。
【００３３】
上に示したように完全な培地は、細胞培養分離のために回収された骨髄を調製するために使用した最初の回収工程の具体的な種類に依存して、多数の異なる単離法に利用することができる。海綿質骨髄の栓を利用する時、骨髄を完全な培地に加え、そしてボルテックス処理して分散物を形成し、これを次いで遠心して骨片等から骨髄細胞を分離する。次いで骨髄細胞（主に赤および白血球および大変少量の間葉系幹細胞等からなる）は骨髄細胞を含有する完全培地を、一連の１６、１８および２０ゲイジ針を備えたシリンジに通すことにより単一細胞に解離する。酵素的分離法に対して機械的分離法の使用を介して生産する利点は、機械的方法では細胞の変化がほとんど生じず、一方酵素的方法は特に培養付着
および選択的分離に必要なタンパク質結合部位、および／または該間葉系幹細胞に特異的なモノクローナル抗体の生産に必要なタンパク質部位に細胞傷害を生じ得る点であると考えられる。次いで単一細胞懸濁液（これは約５０〜１００×１０６の有核細胞からなる）が、続いて懸濁液中に見いだされる残りの細胞から間葉系幹細胞を選択的に分離し、かつ／または単離する目的で１００ｍｍの皿にまかれた。
【００３４】
ヒト間葉系幹細胞源として吸引した骨髄を利用する時、骨髄幹細胞（これは骨片をほとんど含まないか、または全く含まないが、大量の血液を含む）を完全培地に加え、そして以下にさらに詳細に記載するようにＰｅｒｃｏｌｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）勾配で分画した。Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配は、骨髄に由来する間葉系幹細胞を含む低密度血小板画分から大部分の赤血球および単核造血細胞を分離する。約３０〜５０×１０６細胞を含む血小板画分は、骨髄ドナーの年齢に依存して未確定量の血小板細胞、３０〜５０×１０６の有核細胞およびわずか約５０〜５００の間葉系幹細胞からなった。次いで低密度血小板画分は細胞付着性に基づき選択的に分離するためにペトリ皿にまいた。
【００３５】
海綿質骨または腸骨吸引物のいずれかから得た骨髄細胞（すなわち初代培養）を完全培地中で成長させ、そして以下に説明する条件に従い１〜７日間、ペトリ皿の表面に接着させた。３日目以降は細胞接着に増加が観察されなかったので、非接着細胞は元の完全培地を新しい完全媒体と交換することにより培養から除去する時期の標準的な長さとして３日を選択した。引き続く培地交換は、培養皿がコンフルエントになるまで（これには通常、１４〜２１日を要する）４日毎に行った。これは未分化ヒト間葉系幹細胞に１０３〜１０４倍の上昇を示した。
【００３６】
次いで細胞はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むトリプシンのような放出剤（０．２５％ｔｒｙｓｉｎ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（１．倍）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランアイランド、ニューヨーク州）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ’−四酢酸、シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）のような錯化剤を利用して培養皿から脱着させた。錯化剤の使用を介して生じるトリプシンに優る利点は、トリプシンには間葉系幹細胞の多数の結合タンパク質を開裂させる可能性がある点である。これらの結合タンパク質はモノクローナル抗体が生産されると想定される時の認識部位を含むので、トリプシンに対してＥＧＴＡのような錯化剤を放出剤として利用した。次いで放出剤を不活性化し、そして脱着した培養した未分化間葉系幹細胞を続いて使用するために完全培地で洗浄した。
【００３７】
特定の条件下で培養拡大した間葉系幹細胞は、多孔質のリン酸カルシウムセラミックス中で移植片としてインキューベーションした時、骨に分化する能力を有する。間葉系幹細胞が軟骨細胞に反して骨に分化することに影響を及ぼす内部因子はよく知られていないが、間葉系幹細胞の拡散チャンバーに反して多孔質のリン酸カルシウムセラミックス中で脈管により供給される増殖および栄養因子への直接的な接近性が、間葉系幹細胞の骨への分化に影響を及ぼしたと思われる。さらに脳抽出物は幹細胞がさらなる栄養因子を生産することを引き起こし、さらに幹細胞のこの効果を強化する。
【００３８】
結果として、単離され、そして培養拡大された間葉系幹細胞は特定の特異的条件下および／または特定の因子の影響下で利用されて、分化し、そして組織修復に必要な所望する細胞の表現型を生産することができる。
【００３９】
間葉系幹細胞の単回用量の投与は、Ｔ細胞と同種系の組織に、または「非−自己」組織に対して、特にＴリンパ球が間葉系幹細胞から分離された後に同種細胞に対するそれらの非応答性（すなわち寛容またはアネルジー）を保持する場合、Ｔ細胞応答を下げるか、ま
たは排除するために効果的となることができる。
【００４０】
脳抽出物と幹細胞を心筋に移植する一般法は以下の手順により行われる。幹細胞および脳抽出物を患者に投与する。投与は皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内を含む非経口、および鼻内投与ならびにくも膜下内および注入技法であることができる。
【００４１】
間葉系幹細胞の投薬用量は広い限界内で変動し、そして各々の特定の症例で個々の要件に合わせる。一般に非経口投与の場合、通常、受容体の体重１キログラムあたり約０．０１〜約５百万個の細胞を投与する。使用する細胞数は受容体の体重および状態、投与の回数または頻度、および当業者に知られている他の変数に依存する。間葉系幹細胞は組織、器官または移植する細胞に適する経路により投与することができる。それらは全身的に、すなわち非経口的に、静脈内注射により投与することができ、または骨髄のような特定の組織もしくは器官を標的とすることができる。ヒト間葉系幹細胞は細胞の皮下移植を介して、または幹細胞を結合組織、例えば筋肉に注射することにより投与することができる。
【００４２】
細胞は適当な希釈剤中に約０．０１〜約５×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁することができる。注射溶液に適する賦形剤は、緩衝化塩溶液または他の適当な賦形剤のような生物学的および生理学的に細胞および受容体と適合性があるものである。投与用の組成物は適切な殺菌性および安定性を順守する標準法に従い配合され、製造され、そして保存されるなければならない。
【００４３】
本発明はこれらに限定されることはないが、間葉系幹細胞を好ましくは骨髄から単離し、精製し、そして培養で拡大（すなわちインビトロで）して、本明細書に記載する方法で使用するために十分な数の細胞を得ることができる。骨に見いだされる新細胞を形成する多能性の芽細胞である間葉系幹細胞は通常、骨髄（１：１００，０００）および他の間葉系組織に大変低い頻度で存在する。Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ、米国特許第５，４８６，３５９号明細書を参照にされたい。間葉系幹細胞の遺伝子形質導入は、Ｇｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，５９１，６２５号明細書に開示されている。
【００４４】
特に言及しない限り、遺伝子操作はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版；コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８９）に記載されているように行う。
【００４５】
心不全における機能悪化の病因に関するメカニズムの１つが、一部は心筋細胞の進行している死によることが益々明らかになったので（Ｓａｂｂａｈ，２０００）、本発明は価値がある。この問題に対する解決は、失った細胞の代わりとなるか、または現在機能している心細胞のさらなる強化を提供する新たな心細胞で、心筋の濃度を高め（ｅｎｒｉｃｈ）かつ／または増やし、これにより欠けている心臓のポンプ機能を改善することである。
【００４６】
本発明は副作用が知られておらず、しかも処置が比較的非侵襲的であるので、すべての既存の処置よりも有利である。例えば心不全の処置は現在、主に神経体液系を妨害する薬剤の使用に基づく。さらに心臓移植ならびに心室または両心室補補助デバイスの使用を含む外科的処置が存在する。本発明により提供される利点は、疾患の主原因、すなわち筋節の損失に直接取り組むことにより心不全を処置する能力である。それ故に欠けている心臓の全体的機能に寄与する筋節に分化する幹細胞による心筋の増加（ｒｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）は新規であり、そして問題の核心をついている。他の利点には薬理学的治療の使用にしばしば伴う副作用の不存在、および心臓移植または他の臓器移植でかかる免疫拒絶
の不存在および幹細胞により生成される栄養因子を増加させる能力を含む。
【００４７】
本発明は多くの現行の外科的治療および恐らく薬理学的治療にも代わる可能性を有する。カテーテルに基づく取り組みを使用して脳抽出物と一緒に幹細胞を欠けている心臓へ送達できるようにする既存のデバイスは、このように開胸手術の必要性を排除する。さらに本発明はヒトの医学的環境および獣医学的状況の両方に応用可能である。
【００４８】
本発明の方法および組成物は、本明細書に含む実施例で例示する。具体的態様を本明細書では開示するが、それらは可能性を全て試したわけではなく、そして当業者に知られている計画および方法で変動する他の適当な計画も含むことができる。基本的には当業者に知られている任意の種々の計画、方法、構造および材料を、本発明の精神から逸脱することなく利用することができる。
【実施例】
【００４９】
方法：
分子生物学の一般法：当該技術分野で知られており、そして具体的には記載しない標準的な分子生物学技術は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン  ウィリー  アンド  サンズ（Ｊｏｎｅ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、バルチモア、メリーランド（１９８９）およびＰｅｒｂａｌ、分子クローニングの実践的手引き（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ジョン  ウィリー  アンド  サンズ、ニューヨーク（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）、サイエンティフィック  アメリカン  ブックス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ）、ニューヨーク、およびＢｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ（編集）、ゲノム分析：ア  ラボラトリーマニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ），第１〜４巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（１９９８）、および米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号明細書および引用により編入されている参考文献に説明されている方法論に従った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は一般に、ＰＣＲプロトコール：方法および応用の手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）のように行った。フローサイトメトリーと組み合わせたＩｎ−ｓｉｔｕ（Ｉｎ−ｃｅｌｌ）ＰＣＲは、特異的ＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含む細胞を検出するために使用することができる（Ｔｅｓｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８７：３８２２）。
【００５０】
免疫学の一般法：当該技術分野で知られており、そして具体的には記載しない免疫学における標準法は、  一般にＳｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ（編集）、基礎的および臨床的免疫学（Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第８版）、アップレトン  アンド  レンゲ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ）、ノルウォーク、コネチカット州（１９９４）およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編集）、細胞免疫学における選択された方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ）、ニューヨーク（１９８０）に従う。
【００５１】
治療薬の送達
本発明の細胞は個々の患者の臨床的状態、投与の部位および方法、投与計画、患者の年齢、性別、体重および医療専従者に知られている他の因子を考慮して良好な医学的プラクティスに従い投与そして投薬される。本発明の目的について製薬学的な「有効量」は、このように当該技術分野で知られているような考察に従い決定される。この量は限定するわけではないが改善された生存率またはより早い回復、あるいは当業者により適切な基準として選択されるような症状および他の兆候の改善または排除を含む改善を達成するために効果的でなければならない。
【００５２】
本発明の方法では、本発明の細胞は種々の方法で投与することができる。これは細胞として、または製薬学的に許容され得る塩として投与することができ、そして単独で、または有効成分として製薬学的に許容され得る担体、希釈剤、補助剤および補形剤と組み合わせて投与することができることに注目すべきである。細胞は経口で、皮下に、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内を含む非経口的に、および鼻内投与ならびにくも膜下および注入技術で投与することができる。細胞のインプラントも有用である。処置される患者は温血動物、そして特に人間を含む哺乳動物である。製薬学的に許容され得る担体、希釈剤、補助剤および補形剤ならびにインプラント担体は一般に、本発明の有効成分と反応しない不活性な非毒性の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化材料を称する。
【００５３】
ヒトは一般に本明細書に例示するマウスまたは他の実験動物よりも長期間、処置され、その処置は疾患プロセスの長さおよび薬剤の効力に比例する長さを有する。投薬は単回投与または数日の期間にわたる多回投与であることができるが、単回投与が好ましい。
【００５４】
投薬は単回投与または数日間の多回投与であることができる。処置は一般に疾患プロセスの長さおよび薬剤の効力および処置する患者の種に比例する長さを有する。
【００５５】
本発明の細胞を非経口的に投与する時、一般に単位注射剤形（溶液、懸濁液、乳液）に配合される。注射に適する製剤には滅菌水溶液または分散剤および滅菌の注射可能な溶液または分散剤に再構成するための滅菌粉末を含む。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒質であることができる。
【００５６】
適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、および表面活性剤の使用により維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油またはピーナッツ油およびミリスチン酸イソプロピルのようなエステルのような非水性補形剤も、細胞組成物の溶媒系として使用することができる。さらに抗微生物剤、保存剤、酸化防止剤、錯化剤およびバッファーを含む組成物の安定性、殺菌性および等張性を強化する種々の添加剤を加えることができる。微生物の作用の防止は、種々の抗バクテリアおよび抗菌・カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確実にすることができる。多くの場合で、張性調整剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含むことが望ましい。注射可能な剤形の長期吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。しかし本発明に従い、任意の補形剤、希釈剤または添加剤の使用は細胞と適合しなければならない。
【００５７】
滅菌した注射可能な溶液は、本発明を実施するために利用する細胞を、所望により様々な他の成分を含む必要量の適切な溶媒に必要な量で包含することにより調製することができる。
【００５８】
本発明の薬理学的製剤は、種々の補形剤、補助剤、添加剤および希釈剤のような適合性のある担体を含む注射可能な製剤で患者に投与することができ；または本発明で利用する
細胞は、モノクローナル抗体、媒介型送達、イオン導入的、ポリマーマトリックス、リポソームおよび微小球のような緩効性の皮下インプラントまたは標的化送達系の状態で患者に非経口的に投与することができる。本発明に有用な送達系の例には：５，２２５，１８２；５，１６９，３８３；５，１６７，６１６；４，９５９，２１７；４，９２５，６７８；４，４８７，６０３；４，４８６，１９４；４，４４７，２３３；４，４４７，２２４；４，４３９，１９６；および４，４７５，１９６を含む。多くの他のそのようなインプラント送達系およびモジュールが当業者には周知である。
【００５９】
本発明で利用する細胞の薬理学的製剤は、患者に経口的に投与することができる。錠剤、懸濁液、溶液、乳液、カプセル、粉末、シロップ等の中で細胞を投与するような常法を利用することが可能である。経口的または静脈内に細胞を送達し、そして生物学的活性を保持する既知の技術が好適である。
【００６０】
１つの態様では、本発明の細胞を最初に静脈内注入により投与して血液レベルを適当なレベルにすることができる。次いで患者のレベルは経口剤形により維持されるが、患者の状態に依存して、そして上に示したように他の投与形態を使用することもできる。投与する量は処置する患者について変動し、そして１日あたり約１００ｎｇ／ｋｇの体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重で変動し、そして好ましくは１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００６１】
実施例１
骨髄間質細胞（ＭＳＣｓ）を用いた外傷性の脳損傷（ＴＢＩ）の処置は、ラットの機能的成果を改善する。組織交換は細胞移植治療の単なる代償的手段ではない。種々の増殖因子が傷害を受けた組織の修復および交換を媒介することが示されたので、ＭＳＣｓは傷害を受けた組織の処置に役割を果たす栄養的支援を提供する。ＴＢＩに由来する大脳組織抽出物に対するヒトＭＳＣｓ（ｈＭＳＣｓ）の応答を調査し、そしてＴＢＩ環境がｈＭＳＣｓの分化および増殖因子の分泌を誘導するかどうかを決定するために実験した。ｈＭＳＣｓはＴＢＩ抽出物とインビトロで培養し、そして免疫細胞化学および定量的サンドイッチ酵素−連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。結果はＴＢＩでコンディショニングしたｈＭＳＣｓが特異的な細胞性タンパク質マーカー：神経細胞核用のＮｅｕＮ（全ｈＭＳＣｓの０．２〜０．５％）、初期ニューロンの分化および神経突起の伸長用のＴｕｊ−１（６〜１０％）、星状膠細胞用のＧＦＡＰ（４〜７％）および小突起膠細胞用のＭＢＰ（３〜５％）を発現したことを示す。加えて、ＴＢＩ抽出物で処置したｈＭＳＣｓは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の分泌を時間依存的様式でアップ−レギュレーションすることにより応答する。これらのデータはＴＢＩ抽出物が、ｈＭＳＣｓが脳組織の神経形態およびタンパク質表現型を発現するようにさせていることを示している。さらにＥＬＩＳＡデータは移植したｈＭＳＣｓが、神経保護および血管新生を助長することができる多くの増殖因子の反応性分泌を介して治療的利益を提供することを示す。
【００６２】
骨髄間質細胞（ＭＳＣｓ）は外傷的損傷（ＴＢＩ）に供されたラットに静脈内から移植された時、神経機能の回復を促進する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ）。移植でＭＳＣｓは損傷を受けた組織の場所に優先的に移動し、そして幾つかの細胞が脳内因性−様細胞の表現型のタンパク質を発現する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ；Ｍａｈｍｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。幹細胞群による損傷した組織の長期交換法は、神経損傷の処置に対する簡単な取り組みであり、ＴＢＩモデルの急性および短期の治療用移植において、低レベルのＭＳＣ分化が機能的利益を提供することはないようで（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ；Ｍａｈｍｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、そして利益を提供するメカニズムは未知の
ままである。
【００６３】
ＭＳＣｓは種々のサイトカインおよび増殖因子を自然に生産し（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌａｂｏｕｙｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｖａｌｌ，２０００；Ｄｏｒｍａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、その分泌特性はそれらの微小環境によって影響を受ける（Ｄｏｒｍａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）のようなニュートロフィンは、インビボおよびインビトロの両方で損傷したＣＮＳ組織の生存を増加させる（Ｈｅｆｔｉ，１９８６；Ｋｒｏｍｅｒ，１９８７；Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ  ｅｔ
ａｌ．，１９９３；Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇａｇｅ，２０００）。前臨床実験で広く実験された増殖因子は塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ａｙ
ｅｔ  ａｌ．，１９９９）である。虚血の発生から数時間内にｂＦＧＦを静脈内に投与すると、恐らく脳梗塞の境界（周縁部）で細胞を直接的に保護することにより梗塞のサイズを低減させる（Ａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現も血管新生および神経修復を促進する（Ｐａｐａｖａｓｓｉｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＶＥＧＦによる発作の処置は、機能的成果を向上させる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ｂ）。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現は、損傷後の脳内で自然にアップ−レギュレーションされ、そしてインビトロで脳のニューロンに対して抗−アポトーシス効果を示す（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ａ）。
【００６４】
材料および方法
試薬
ハンクスのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ノックアウトＤＭＥＭ、ノックアウト血清代替、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、トリプシンおよびエチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）は、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）（グランドアイランド、ニューヨーク州）から購入した。Ｆｉｃｏｌｌはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から購入した。モノクローナル神経核抗原（ＮｅｕＮ）、ポリクローナルβ−チューブリンアイソタイプ１（Ｔｕｊ−１）、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する抗体は、ケミコン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）（テメクーラ、カリフォルニア州）から購入した。ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦ用のサンドイッチ酵素−連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のキットは、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）から得た。ＮＧＦ  ＥＬＩＳＡキットは、研究室で作成した。抗−β（２．５Ｓ、７Ｓ）ＮＧＦモノクローナル抗体、抗−β（２．５Ｓ、７Ｓ）ＮＧＦ−β−ｇａｌ、ＮＧＦ−β標準は、ロッシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インディアナポリス、イリノイ州）から購入した。特に示さない限り、試薬はシグマケミカルズ社（セントルイス、ミズーリ州）から得た。
【００６５】
初代ｈＭＳＣｓ培養
初代骨髄は３名の正常なヒトドナーの腸骨稜に由来する１５〜１６ｍｌの吸引物から得た。各吸引物はＨＢＳＳで１：１に希釈し、そして約１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌに重層した。２，５００×ｇで３０分間遠心した後、単核細胞層を界面から取り出し、そしてＨＢＳＳに懸濁した。細胞は１，０００×ｇで１０分間遠心し、そして５×１０６細胞を各１００ｍｍの組織培養皿（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ベクトン−デッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州）で完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含有する）に再懸濁した。細胞を５％ＣＯ２のフラスコ中、３７℃で３日間インキューベーションし、そして非付着細胞は培地を交換することにより除去した。培養がコンフルエントに達した時（通常は２〜３週間で）、細胞はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の０．０５重量／容量％トリプシンおよび０．０２重量／容量％ＥＤＴＡを用いて３７℃で５分間回収し、もう一度まき、そして再度２週間培養し、そして回収した。次
いで細胞を後で使用するために凍結した。これらの実験に使用した細胞は、３〜５継代で回収した。
【００６６】
外傷的に損傷した脳に由来する抽出物
実験は体重が２５０〜３５０ｇのオスのウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットで行った（ｎ＝２１）。麻酔はラットに抱水クローラル（３５ｍｇ／１００ｇ体重）を腹腔内注射することにより誘導した。直腸温度はフィードバック−調節された水加熱システムを使用して外科的手順の間、３７℃に維持した。ラットを定位枠に配置した。損傷は左皮質（同側皮質）に、直径６ｍｍのチップを有する気体ピストンで４ｍ／秒の速度および２．５ｍｍの圧縮で衝撃を与えることにより誘導した（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。対照動物には開頭術を行ったが損傷は与えなかった。ラットは術後１、４および７日に屠殺した（各時期あたりｎ＝６）。脳組織抽出物は実験および正常対照（ｎ＝３）ラットから直ちに得た。両実験ラットおよび対照ラットの左半球のセグメントを氷上に置き、そして湿潤重量をグラムで迅速に測定した。続いて組織片はＤＭＥＭ（１５０ｍｇ組織／ｍｌＤＭＥＭ）を加えることにより均一化し、そして氷上で１０分間、インキューベーションした。ホモジネートは４℃で１０，０００×ｇにて１０分間遠心した。上清を集め、そしてｈＭＳＣｓの処置のために−８０℃で保存した。
【００６７】
細胞分化
タンパク質の表現型実験は、１．０×１０６細胞を３５ｍｍ皿に播種し、そしてそれらを新鮮なノックアウトＤＭＥＭ（１０％、２０％または４０％のＴＢＩ組織抽出上清を含む２０％ノックアウト血清代替を含む）で処理することにより行った。すべての細胞を７日間インキューベーションした。免疫反応性神経−様細胞の予測は、細胞を３枚の培養皿中、１０の無作為視野（１０×対物）で、最少３つの異なる実験で計数することに基づいた。神経細胞の表現型の割合は、細胞総数から算出した。
【００６８】
二重および三重染色免疫細胞化学
ｈＭＳＣｓは、上記の異なる処理を使用して１．０×１０６の密度で３５ｍｍ皿中のガラスカバースリップ（１８×１８ｍｍ２）にまいた。ガラスカバースリップ上の細胞を免疫細胞化学に使用した。培養基の上清は、以下に記載するように定量的ＥＬＩＳＡ測定に使用した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、そして４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。非特異的結合部位は、４％正常ウマ血清、２％ウシ血清アルブミンおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１時間ブロックした。カバースリップをＰＢＳで洗浄し、そしてＴｕｊ−１、ＧＦＡＰまたはＭＢＰに対する１次抗体と１時間インキューベーションした。それらを再度ＰＢＳで洗浄し、そしてフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗−マウスまたは抗−ウサギＩｇＧ２次抗体と１時間インキューベーションした。Ｔｕｊ−１染色したｈＭＳＣカバースリップをもう一度洗浄し、そして第２の１次抗体ＮｅｕＮと一晩インキューベーションし、次いでＰＢＳで洗浄し、そしてシアニン−５．１８（Ｃｙ５）結合抗−マウスＩｇＧ２次抗体と１時間インキューベーションした。４’ｂ−ジアミジン−２−フェニルインドールジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）色素を使用して、視野の核を計数することにより細胞数を決定した。次いでカバースリップにグリセルゲル上層媒質（ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）をのせた。
【００６９】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用してｈＭＳＣｓによるＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌を、ＴＢＩおよび正常脳抽出物上清によりコンディショニングした培養の１、４および７日に測定した。簡単に説明すると、すべての試薬および作業標準は製造元により指示された通りに準備し、そして５０〜１５０μｌの標準またはアッセイ希釈溶液を９６ウェルプレートのウェル毎に加えた。ウェルは穏やかに混合し、そして室温で２〜４
時間インキューベーションした。各ウェルを吸引し、そして洗浄し、このプロセスを３回繰り返した。最後の洗浄後、残るいかなるバッファーもウェルを吸引、またはデカントすることにより除去し、そして２００μｌの種々の増殖因子結合物を各ウェルに加えた。次いでプレートを室温で２〜４時間インキューベーションした。吸引および洗浄を繰り返した。２００μｌの基質溶液を各ウェルに加え、そして室温で１５〜３０分間インキューベーションした。５０μｌの停止溶液を加え、そして穏やかに混合した。各ウェルの光学密度は、４５０〜６２０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、３０分以内に決定した。
【００７０】
統計分析
スチューデントｔ検定を使用して刺激したサンプルとそれらの各対照との間の形態学的差異を評価した。時間応答の有意さは、分散の繰り返し測定分析により評価した（ＡＮＯＶＡ）。ＥＬＩＳＡデータは種々の増殖因子濃度の対数  対  光学密度の対数をプロットすることにより直線化し、そして最も合う直線を回帰分析により決定した。各標準、対照およびサンプルについて二重の読み取りの平均を作成し、そしてゼロ標準光学密度の平均を引いた。すべての値は平均±ＳＤで表す。ｐ＜０．０５を統計的に有意と考えた。
【００７１】
結果
ｈＭＳＣｓの神経様細胞への形態的分化
位相差顕微鏡は、１０％ＦＢＳを補充した完全ＤＭＥＭ中で培養した繊維芽細胞様ｈＭＳＣｓの正常形態を示す。７日間の暴露後、２０％ノックアウト血清代替を含むノックアウトＤＥＭＥ中、いくらかの屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ）細胞が短い突起を表した。わずかな細胞（全細胞〜２〜３％、表１）が、正常脳組織抽出上清で培養したｈＭＳＣｓ中でニューロン様細胞の形態を表した。しかし正常脳抽出物が誘導するｈＭＳＣｓ増殖（１．５６×１０４±０．２×１０４／ｍｌ）は、２０％ノックアウト血清代替を含むノックアウトＤＭＥＭ中で培養したｈＭＳＣｓ（１．２４×１０４±０．５×１０４／ｍｌ）に匹敵した（ｐ＜０．０５）。多様な形態であるが、しかし典型的には長い分枝突起（突起長＞１０μｍ）および成長円錐様末端構造を持つ屈折性細胞（全細胞の〜１３〜３０％のニューロン様細胞、表）、および小さく、そして多極突起（ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を持つ星状細胞が２０％〜４０％ＴＢＩ抽出上清中で培養したｈＭＳＣｓ中に検出された。ＴＢＩ（１．０８×１０４±０．３×１０４／ｍｌ）抽出物カルチャー中の全細胞数に関しては減少する傾向があったが、これは統計的に有意には至らなかった。種々の濃度のＴＢＩ組織抽出物のすべてが、ｈＭＳＣｓを形態学的に似ている神経様細胞に誘導した。
【００７２】
ｈＭＳＣｓによる神経マーカーの発現
２０％ノックアウト血清代替を含むノックアウトＤＭＥＭおよび１０％、２０％または４０％のＴＢＩ脳組織抽出物カルチャーを含む中で７日後、ｈＭＳＣｓを免疫細胞蛍光法のために処理した。このｈＭＳＣｓのＤＡＰＩ（核の同定には紫青色）、ＦＩＴＣ（緑色）での二重標識、またはＣＹ５（赤色）の三重標識により、骨髄起源の細胞がニューロン（ＮｅｕＮ、Ｔｕｊ−１）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）および小突起膠細胞（ＭＢＰ）の神経特異的マーカーを発現するかどうかの決定が可能となった。細胞核はＤＡＰＩにより染色された。免疫反応性について染色したカルチャーでは、０．２〜０．５％のｈＭＳＣｓがＮｅｕＮタンパク質を発現し、そして６〜１０％のｈＭＳＣｓがＴｕｊ−１表現型により標識された。ＮｅｕＮおよびＴｕｊ−１免疫反応性は同じ細胞に同時に局在した（ピンク色）。４〜７％のｈＭＳＣｓ由来細胞がＧＦＡＰ免疫反応性を発現した。３〜５％のｈＭＳＣｓ由来細胞がＭＢＰ免疫反応性を発現した。調査した種々の濃度のＴＢＩ抽出物のすべてが、ｈＭＳＣｓが神経の表現型の免疫反応性を発現することを誘導した。
【００７３】
ＴＢＩ組織抽出物上清で処置したｈＭＳＣｓによる増殖因子の分泌
２０％ノックアウト血清代替培地を含むノックアウトＤＭＥＭおよび２０％のＴＢＩ抽出物上清を含む中で１、４および７日後、ｈＭＳＣｓにより分泌される増殖因子を図１に示す。正常脳およびＴＢＩ組織抽出物は、インビトロでｈＭＳＣｓのＢＤＮＦ（図１ａ）、ＮＧＦ（図１ｂ）、ｂＦＧＦ（図１ｃ）、ＶＥＧＦ（図１ｄ）およびＨＧＦ（図１ｅ）の分泌に影響を与えた。正常脳組織抽出物は培地単独の対照と比較して、インビトロですべての検出される増殖因子について分泌を増加した。各実験群で、ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＨＧＦ分泌は、ＴＢＩ抽出物によるコンディショニングで１日から７日を通して増加した。ＶＥＧＦ分泌は正常脳およびＴＢＩ後の脳の群で同様であった。ＶＥＧＦ分泌は１日のカルチャー中よりも４日および７日間のカルチャー中で一貫して大きかった。ｂＦＧＦ分泌のプロフィールは、他の栄養因子とは異なった。１日の期間のカルチャー中でｂＦＧＦの分泌値は、他の増加因子とは異なり、４日および７日の値を越えるか、または等しかった。これらのデータはＴＢＩがインビトロでｈＭＳＣｓによるＮＧＦおよびＢＤＮＦの分泌を促進することを表し、そしてすべてのニューロトロフィンおよび試験した増殖因子が、血清代用培地中のｈＭＳＣｓに比べて正常脳中でのｈＭＳＣｓ分泌に有意な上昇を示した。
【００７４】
考察
ＴＢＩ抽出物で処置したヒト骨髄間質細胞は、形態学的に神経様細胞に分化し、そして大脳実質細胞の表現型のタンパク質を発現することができる。ｈＭＳＣｓはＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦを分泌し、そして分泌レベルはカルチャー中のＴＢＩ抽出物への暴露時期およびＴＢＩ組織が抽出された時期の両方に依存する。
【００７５】
データはｈＭＳＣｓがインビトロでＴＢＩ組織抽出物に暴露されることにより、形態学的に神経様細胞の亜群に似るように仕向けられ得ることを示す。処置したｈＭＳＣｓはＮｅｕＮ（神経に）、Ｔｕｊ−１（初期分化および神経突起の伸長に）、ＧＦＡＰ（星状膠細胞に）およびＭＢＰ（小突起膠細胞に）のような特異的な脳タンパク質マーカーも発現する。すなわちｈＭＳＣｓは多くの細胞系統に分化できる。研究ではＭＳＣｓが試薬（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によりカルチャー中で、および損傷したＣＮＳ中で（Ａｚｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋｏｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｃｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｈｅｎ
ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ；Ｍａｈｍｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ニューロン様細胞へ分化させられ得ることが報告された。このデータは初めて、幾らかのｈＭＳＣｓがＴＢＩ組織抽出物を含む特異的な微小環境内にインビトロで置かれた時、脳実質細胞の形態学的ならびに表現型的特徴の推定により応答することを示す。治療用の移植で、これらの細胞はＴＢＩ傷害脳における細胞代替物の供給源を提供することができる。
【００７６】
骨髄間質細胞は正常な造血に必要である。ＭＳＣｓにより分泌される造血を媒介する多数の可溶性因子が特徴付けられた（Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍａｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍａｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＭＳＣｓはＩＬ−６、−７、−８、−１１、−１２、−１４、−１５およびＦｌｔ−３リガンドを生産し、そして定常状態レベルのＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＳＣＦを誘導する。しかしこれらの因子単独ではＴＢＩのＭＳＣ処置の治療的利益の基になるメカニズムを提供しないようである。他の未だに未知の間質因子の存在が仮定された。ここに提示する実験において、定量的なＥＬＩＳＡデータは、ＴＢＩ組織抽出物で処置したｈＭＳＣが培養時期ならびにＴＢＩ組織抽出物が得られた時期の両方に依存する様式でＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦを同時に分泌することを示している。ＢＤＮＦの静脈内投与により、ラットにおけるＴＢＩ後の損傷容量は減少し、そして脳損傷におけるＢＤＮＦの神経保護的役割を支持する（Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ  ｅ
ｔ  ａｌ．，１９９３；Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＮＧＦ注射後、またはＮＧＦ−生産繊維芽細胞を介して、およびＮＧＦトランスジェニックマウスの神経保護的能力は、実験的な脳損傷の異なるパラダイムを証明した（Ｈｅｆｔｉ，１９８６；Ｋｒｏｍｅｒ，１９８７；Ｃａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｇａｇｅ，２０００）。ｂＦＧＦの静脈内投与はラット、マウスおよびネコを対象とした局所脳虚血のモデルにおいて、梗塞容量を減少させた（Ｓｕｇｉｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。血管新生の強力なプロモーターであるＶＥＧＦも、軸索伸長、神経細胞生存およびシュワン細胞増殖を刺激する（Ｓｏｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。挫骨神経の挫壊損傷後のＶＥＧＦ増加は、ＶＥＧＦが神経再生に役割を果たしていることを示唆する（Ｓｏｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋａｎｊｅ，２００１）。ラットの実験的発作をＶＥＧＦで処置すると、機能欠損が有意に減少する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ｂ）。ｈＭＳＣｓはＨＧＦを構成的に生産し（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、そしてＨＧＦは組織修復に重要な分子である（Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。したがってこの知見はｈＭＳＣｓが正常な脳およびＴＢＩ環境に感受性であり、そして多くの因子の生産を有意に増加することにより応答することを強く示す。外傷的に損傷した神経組織に移植したＭＳＣｓの生存を仮定すると（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ；Ｍａｈｍｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、傷つけられた組織の局所レベルでのＭＳＣｓによる神経保護および血管新生因子の連続的および微小環境的応答分泌は、ＭＳＣ移植により提供される機能的利益における鍵である。
【００７７】
データは成熟（ａｄｕｌｔ）ＭＳＣｓが誘導されて、それらの間葉系拘束を克服し、そして種々の神経性疾患を処置するために豊富かつ接近可能な脳細胞的および分子的リザーバーを構成することができる。この結果は移植されたＭＳＣｓがＴＢＩ後の機能的利益を提供することを示す（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ；Ｍａｈｍｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。特にＭＳＣｓは患者自身の腸骨稜に由来する少量の骨髄から容易に得、そして培養で拡大することができる。したがってＭＳＣｓは移植用の自家細胞の容易に入手可能かつ補充可能な供給源を提供する。損傷した組織中のこれらの細胞は、損傷した能の修復および可塑性のために活力のある増殖因子の連続的供給源を提供する。
【００７８】
図１は、ＴＢＩ組織抽出物上清で処置したｈＭＳＣｓからＢＤＮＦ（図１Ａ）、ＮＧＦ（図１Ｂ）、ｂＦＧＦ（図１Ｃ）、ＶＥＧＦ（図１Ｄ）およびＨＧＦ（図１Ｅ）の成長因子の分泌を示す。この分泌はＥＬＩＳＡで定量した。正常な能組織抽出物は、培地単独の対照に比べてインビトロで検出されたすべての増殖因子の分泌を増加させた。各実験群においてＴＢＩ抽出物でのコンディショニングで１日から７日にＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＨＧＦ分泌が増加した。ＶＥＧＦ分泌は正常脳およびＴＢＩ後の脳群については同様であった。ＶＥＧＦ分泌は４日および７日間のカルチャー中で、１日目のカルチャー中よりも一貫して大きかった。ｂＦＧＦ分泌に関するプロフィールは他の栄養因子とは異なった。１日目のカルチャー中、ｂＦＧＦ分泌値は他の増殖因子とは対照的に、４日および７日の分泌値を越えるか、またはそれに等しかった。
【００７９】
実施例２
方法：
ラットを一時的な中大脳動脈閉塞に供し、そして発作から１日後に３×１０６ｈＭＳＣをＩＶ注射した。機能的な成果を発作前および１、７および１４日後に測定した。混合リンパ球反応および細胞傷害性Ｔリンパ球の発生は、ｈＭＳＣの免疫拒絶を測定した。ヒト細胞核に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ１２８１）を使用してｈＭＳＣを同定し、そして神経の表現型を測定した。ＥＬＩＳＡはｈＭＳＣ−処置または未処置ラットに由来する脳組織中のニュートロフィンレベルを分析した。ブロモデオキシウリジン注射を使用して新たに形成された細胞を同定した。結果：機能の有意な回復が虚血の対照ラットに比
べてｈＭＳＣで処置したラットに１４日で見いだされた。わずか（１〜５％）なｈＭＳＣが脳実質細胞の表現型のタンパク質を発現した。脳由来神経栄養因子および神経成長因子は有意に増加し、そしてアポトーシス細胞は虚血境界領域で有意に減少し；ブロモデオキシウリジン反応性細胞がｈＭＳＣで処置したラットの虚血性半球の脳室下領域でより有意により多く検出された。ｈＭＳＣは細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導なしにリンパ球の増殖を誘導した。
【００８０】
結論：
ラットの発作のｈＭＳＣ処置から生じる神経学的利益は、虚血組織中の増殖因子の増加、損傷の半影領域のアポトーシスの減少、および脳室下領域中の内因性細胞の増殖からもたらされ得る。
【００８１】
骨髄間質細胞（ＭＳＣ；間葉系幹および前駆細胞とも呼ばれる）は多能性であり、しかもインビトロおよびインビボで組織の修復を補助することができる。ＭＳＣは通常、骨、軟骨および間葉系細胞で生じ、そしてＭＳＣは筋細胞、肝臓細胞、グリア細胞およびニューロンに分化できる。ＭＳＣは血液脳関門を通過し、そして前脳および小脳全体に移動することができる。メスの虚血性ラットに全身的に注入されたオスに由来する骨髄細胞は、虚血性皮質に優先的に移動する。照射されたメスのマウスに投与されたオスのマウスの骨髄細胞は数日から数週間にわたり脳に入り、そしてミクログリアおよび星状膠細胞に分化する。
【００８２】
発作後の成果を改善した神経保護薬はなかった。ラットにおける心筋虚血および心疾患のためのヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）の治療的利益は、組織の置き換えおよび血管新生および脈管形成の誘導からもたらされると思われる。ＭＳＣは多数の増殖因子およびサイトカインを分泌し、これらは通常、造血前駆体が増殖し、そして分化することを支持する。骨髄はＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む数種の血管新生増殖因子を分泌する種々の原始細胞を含む。このようにＭＳＣは神経性疾患を処置するための価値ある治療に発展することができる。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のラットモデルでは、齧歯類ＭＳＣで処置した時、有意な機能的回復が証明された。
材料および方法。
【００８３】
ｈＭＳＣ調製およびインビトロでの増殖キネティクス。インビトロでのｈＭＳＣの細胞増殖キネティクスおよび拡大を調査するために、骨髄吸引物を局所麻酔下で３名の健康なヒトドナーの後部腸骨稜の穿刺により得た。骨髄検体の単核細胞（１人あたり１５〜１６ｍＬ）をＦｉｃｏｌｌ密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、［密度、１．０７３］、ファルマシア、カリフォルニア州）で分離した。ｈＭＳＣカルチャーの単離および樹立は、Ｄｉｇｉｒｏｌａｍｏ  ｅｔ  ａｌ．により記載されているように行った。簡単に説明すると、単核細胞を１×１０６細胞／７５ｃｍ２組織培養フラスコの密度で、２０ｍＬの低−グルコースダルベッコ改良イーグル培地（ギブコ−ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州）にまき、そして２０％のウシ胎児血清（ギブコ−ＢＲＬ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ミリモル／リットルのＬ−グルタミンを補充した。７２時間のインキューベーション後、非付着細胞をカルチャーから除去し、そして新たな培養基をフラスコに加えた。細胞増殖および細胞収量を評価するために、プラスチックに付着したｈＭＳＣを１４日（９０％の集密度）およびその後７日毎に分けた。有核骨髄細胞はサイトメーターを使用して計数して移植に十分な細胞数を確保した。３×１０６ｈＭＳＣ用量を各ラットに注射した。５継代目から回収し、そしてさらに２０％のノックアウト血清代用培地（ギブコ−ＢＲＬ）を含むノックアウトダルベッコ改良イーグル培地（無血清；ギブコ−ＢＲＬ）で培養したｈＭＳＣを、ＥＬＩＳＡ測定に使用した（ｎ＝６）。ｈＭＳＣによる脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経増殖因子（ＮＧＦ）の分泌は、無血清ダルベッコ改良イーグル培地中で１、４および７日
に測定した。
【００８４】
インビトロでのラット脾臓細胞とｈＭＳＣとの間の混合リンパ球反応。抗原が誘導するリンパ球の増殖を研究するために、健康なラットまたは２週間前に３×１０６ｈＭＳＣを注射したラットに由来する２×１０５の脾臓細胞を３連で、照射（２０Ｇｙ）ｈＭＳＣ有り、または無しで９６時間、１０：１の応答物（脾臓細胞）−対−刺激物（ｈＭＳＣ）比で培養した。混合細胞は３Ｈ−チミジン（０．２５μＣｉ／ウェル）で１６時間、パルスをかけた。ｈＭＳＣによる脾臓リンパ球増殖の誘導は、複製している脾臓細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。カルチャーを自動化細胞回収機で回収し、そして３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションにより測定した。
【００８５】
挿入式
インビトロでのｈＭＳＣに対するラット細胞傷害性Ｔリンパ球応答
Ｔリンパ球は移植片−対−宿主の致死的医原性疾患のイニシエーターとして関わっている。したがってヒトの移植片−対−ラット宿主Ｔ細胞応答を、５１Ｃｒアッセイを使用して測定して溶解効果（ｌｙｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を決定する。健康なラットの脾臓細胞または２週間前に３×１０６のｈＭＳＣを注射したラットの脾臓細胞を、照射ｈＭＳＣと５日間、１０：１の応答物（脾臓細胞）−対−刺激物（ｈＭＳＣ）比で培養した。インキューベーション期間の終わりに、生きている細胞をカルチャーから回収し、そして５１Ｃｒ−標識ｈＭＳＣに対する細胞傷害性について８時間の５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。
【００８６】
動物ＭＣＡＯモデル
成体のオスウィスターラット（体重２７０〜３００ｇ）を、チャールズリバーブリーデング社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入した。ラットは最初に３．５％ハロタンで麻酔をかけ、そしてフェイスマスクを使用して１．０％〜２．０％のハロタン（７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２中）で維持した。直腸温度はフィードバック調節温水システムを使用して、外科的手順の間を通して３７℃に維持した。一過性のＭＣＡＯは、研究室で改良した血管内脈管閉塞（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の方法を使用して誘導した。右頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を露出した。動物の体重により決定した長さの４−０のモノフィラメントナイロン糸（１８．５〜１９．５ｍｍ）を、その先端付近を焼炎加熱することにより丸くし、これを外頸動脈から内頸動脈の管腔へＭＣＡの起点で遮断されるまで進めた。ＭＣＡＯから２時間後、ハロタンで動物に再度麻酔をかけ、そして縫合糸をその先端が外頸動脈の管腔からとり除かれるまで引っ張ることにより再潅流を行った。
【００８７】
実験群。
群１。
ニュートロフィンを測定するために、ラットは処置無しで（ｎ＝３）ＭＣＡＯに供するか、または発作から１日後に１ｍＬの全液体用量中に３×１０６ＭＳＣ（ｎ＝３）または３×１０６肝臓繊維芽細胞（ｎ＝３）を尾の静脈に注射した。肝臓繊維芽細胞の実験は「対照」として限定され、ここで繊維芽細胞は対照細胞の宿主ラットに対する予期せぬ免疫応答を回避するために同種のウィスターラットから集めた。ラットはＭＣＡＯから７日後にニュートロフィンの測定のために屠殺した。３匹の健康なラットも対照個体として使用した。
【００８８】
群２。
ラットは３×１０６ｈＭＳＣ（ｎ＝９）または３×１０６ラット肝臓繊維芽細胞（ｎ＝９；対照）を１日目に注射するＭＣＡＯに、あるいは細胞ドナー無しのＭＣＡＯ単独（ｎ
＝１０；対照）に供した。ラットは細胞の形態を測定するためにＭＣＡＯから１４日後に屠殺した。ＭＣＡＯは上衣および上衣下領域（脳室領域／脳室下領域［ＶＺ／ＳＶＺ］とも呼ばれる）中の内因性の神経幹細胞および前駆細胞の増殖を誘導するので、群２の１７匹のラットは細胞増殖を確認するために、ドナー細胞のＩＶ注射有り、または無しでＭＣＡＯ後から１４日間、連続して毎日、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、新たに合成されたＤＮＡを標識するチミジン類似体［５０ｍｇ／ｋｇ］；シグマ、セントルイス）の腹腔内注射を受けた。対照としてさらに２匹の健康な動物に５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵの腹腔内注射を毎日、１４日間、死ぬ前まで与えた。
【００８９】
行動試験。
すべての動物はＭＣＡＯ前、およびＭＣＡＯから１、７および１４日後に、実験群に対して知らされていない調査者による行動試験を受けた。前肢体性感覚不均斉を測定するために、小さい接着剤付きペーパードット（１１３．１ｍｍ２）を両側の触覚の刺激物として使用し、そしてホームケージ中、１日に５回の実験について各前肢の手首の橈側面に適用した。ラットの刺激物への接触および除去の時期を記録した。個々の実験は少なくとも５分間の間隔をあけた。動物は手術前に３日間、接着−除去ドット試験に慣らされた。いったんラットが１０秒以内にドットを除去できれば、ラットをＭＣＡＯに供した。改良した神経学的重症度の採点（ｍＮＳＳ）を使用して、神経的機能の様々な観点を等級分けした。ｍＮＳＳは運動（筋肉状態および異常な運動）、感覚（視覚、触覚および自己刺激感応性）および反射試験の複合である。
【００９０】
【表１】
2010018627.tif 000003
【００９１】
改良した神経学的重症度の採点試験
虚血脳から抽出物の調製：
ＭＣＡＯから７日後、群１のラットにハロタンで麻酔をかけ；脳を摘出し、そして虚血性半球を氷上で切開した。次いでサンプルを−８０℃に保存した。続いて各組織サンプルを１ｇ／ｍＬのホモジネートバッファー中で均一化した。ホモジネートを４℃で１０分間遠心し（１０，０００ｇ）、そして上清を分泌を測定するために集めた。
【００９２】
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した増殖因子の分泌の測定
ＢＤＮＦ  ＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、ミネソタ州）から得、そしてＥＬＩＳＡは製造元の指示に従い調製した。ＥＬＩＳＡ溶液はＮＧＦについて作成した。抗−β（２．５Ｓ、７Ｓ）ＮＧＦモノクローナル抗体、抗−β（２．５Ｓ、７Ｓ）ＮＧＦ−β−ゲルおよびＮＧＦ−β標準は、ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ（インディアナポリス、インディアナ州）から購入した。簡単に説明すると、虚血性組織から集めた上清またはｈＭＳＣからの無血清培養基を、１００−〜２００−μＬの３連サンプルに分割した。ＢＤＮＦおよびＮＧＦに対するモノクローナル抗体は、製造元の使用説明に従い使用した。続いて各１次抗体に対する２次特異的ポリクローナル抗体を加えた。発色基質とのインキューベーション期間の後、増殖因子の量に比例して発色し、そしてマイクロプレートリーダー（４５０〜６２０ｎｍ）を使用して測定する。
【００９３】
組織学的、免疫組織化学的およびアポトーシス評価。
スライドの調製
ＭＣＡＯから１４日後まで生かした群２のラットを、形態学的分析に使用した。その時点で、ラットにケタミン（４４〜８０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇを腹腔内に）で麻酔をかけ、そしてヘパリンを加えたリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、続いてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを管系に経心臓的に潅流した。脳はＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに２日間浸し、そして次に脳組織を７つの等しい間隔（２ｍｍ）の皮質塊に切断した。組織を処理し、そして各塊から１００μｍ厚の自由に流動するビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）皮質スライド（１つの塊あたり５個のビブラトームスライド）を切断した。すべての残りの脳塊はパラフィンに包埋し、そして連続して隣接する６μｍ厚のスライドを切断した。
【００９４】
梗塞容量の測定
７個の塊から各皮質パラフィンスライドの１つ（６μｍ厚）をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）で染色した。７個の脳スライドはＧｌｏｂａｌ  Ｌａｂ  Ｉｍａｇｅ分析システム（データ  トランスレーション（Ｄａｔａ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、マルボロ、マサチューセッツ州）を使用して追跡した。間接的な損傷領域（ここで同側半球の完全な領域を反対側半球の領域から引く）を算出した。損傷容量は反対側半球と比較した損傷容量の割合として提示する。
【００９５】
免疫組織化学染色。
正常血清でブロッキングした後、すべてのビブラトームスライドはＰＢＳ中で１：１００に希釈したヒト核に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ１２８１；ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、テメキューラ、カリフォルニア州）で４℃にて３日間処理した。マウスＩｇＧに対するフルオレセインイソチオシアネート−結合ウサギ抗体（希釈、１：１００、ダコパッツ、カリフォルニア州）との順次インキューベーション後、２次抗体をｍＡｂ１２８１に対する１次抗体に結合させた。ｈＭＳＣに由来する細胞は形態学的基準およびドナー細胞に存在するが実質細胞には存在しないｍＡｂ１２８１での免疫組織化学的染色を使用して同定した。同じ細胞中でｍＡｂ１２８１および細胞型に特異的なマーカーの、細胞性同時局在を視覚化するために、二重染色を虚血中心部が中央にある連続参照ビブラトームスライド（１００μｍ）に使用した（ブレグマで座標を取る−１．０、１．０ｍｍ）。各皮質スライドを第１の１次抗体、ｍＡｂ１２８１で上記のように処理し、そして次にシアニン−５．１８に結合した細胞型に特異的な第２の１次抗体（カルビオケム（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州）で４℃にて３日間処理した：神経核抗原（神経核用のＮｅｕＮ［希釈、１：２００］；ケミコン）、微小管−結合タンパク質２（神経樹状突起用のＭＡＰ−２［希釈、１：２００］；シグマ）、グリア繊維酸性タンパク質（星状細胞用のＧＦＡＰ［希釈、１：１０００］；ＤＡＫＯ、カルピンテリア、カリフォルニア
州）およびｖＷＦ（内皮細胞用［希釈、１：４００］；ＤＡＫＯ）。各動物に関する陰性対照スライドは、免疫組織化学染色については１次抗体を省略した点を除き同一の調製を受けた。
【００９６】
レーザー走査共焦点顕微鏡。
皮質のビブラトームスライドは、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡（バイオ−ラッド、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に乗せたバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のＭＳＣ１０２４（アルゴンおよびクリプトン）レーザー走査共焦点撮像システムで分析した。免疫蛍光標識スライドには、スライド上の緑（フルオレセインイソチオシアネート）および赤（シアニン−５．１８）フルオロクロムを４８８ｎｍおよび６４７ｎｍのレーザービームにより励起し、そして発光を５２２ｎｍおよび６７０ｎｍの発光フィルターを通す光電子倍増管を用いて順次獲得した。ｍＡｂ１２８１陽性細胞の総数は、全７個の塊に由来する各塊について５枚の連続スライド（１００μｍ厚）を、細胞計数用のＸＹＺステージエンコーダーを使用することにより測定した。２６  次いで全前脳のｍＡｂ１２８１−陽性細胞の総数は、すべての７個の塊からｍＡｂ１２８１−陽性細胞数を合わせることにより算出した。動物あたり全部で５００個のｍＡｂ１２８１−陽性細胞を計数して、細胞型に特異的なマーカー（ＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、ｖＷＦおよびＧＦＡＰ）と同時に局在するｍＡｂ１２８１−陽性細胞の割合を二重染色により得た。
【００９７】
アポトーシス細胞染色。
ブレグマ−１．０に位置する上記の参照塊に由来する５枚の皮質パラフィンスライド（６μｍ厚；２５−μｍ間隔）、１．０ｍｍをアポトーシス細胞分析に使用した。これらのスライドはｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス細胞検出のために、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが媒介するｄＵＴＰ−ビオチンニックエンド−ラベリング（ＴＵＮＥＬ）法により染色された（ＡｐｏｐＴａｇ  キット；オンコール（Ｏｎｃｏｒ）、ゲチスバーグ、メリーランド州）。ＰＢＳ中のＨ２Ｏ２で内因性のペルオキシダーゼ活性を消した後、スライドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの中に置いた。抗−ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼをスライドに加え、そしてペルオキシダーゼを３，３’−ジアミノベンジジンで検出した。ＴＵＮＥＬ染色後、スライドをメイヤー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリンでカウンター染色した。陰性対照スライドは各塊から行った。ＴＵＮＥＬ調製物では、暗く茶色いアポトーシス体（＞２）を含む細胞のみをアポトーシス細胞とした。
【００９８】
図２は、右半球を３つのサブ領域（虚血中心部、虚血境界領域およびＶＺ／ＳＶＺ）に分割したラット脳の前交連のレベルで同定された標準的な皮質区画を表す。外因性のｈＭＳＣ（ｍＡｂ１２８１）で、同側および反対側半球のこれらの領域の細胞型陽性細胞（ＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰおよびｖＷＦ）、およびアポトーシス細胞（ＴＵＮＥＬ−陽性細胞）について測定した。日常的なＨ−Ｅ染色の組織的特徴を使用して３つの領域を同定した：虚血損傷の虚血中心部（エオシン好性バックグラウンドの拡散蒼白）および内側（神経網の空胞化または海綿状）および外側境界領域（海綿状から全体的に完全な組織［ほとんどの細胞が完全であった；しかし散乱した損傷および死んだ細胞も観察できた］）、ならびに細胞の形状および染色能における改変。図２は処置に対する応答を分析するために、右半球を３つのサブ領域（虚血中心部［ＩＣ］、虚血境界領域［ＩＢＺ］；および脳室領域／脳室下領域［ＶＺ／ＳＶＺ］）および８つの場（１、ＩＣ中の皮質；２、ＩＣ中の線条；３−４、ＩＢＺ中の皮質；５−６、ＩＢＺ中の線条；および７−８、ＶＺ／ＳＶＺ中の線条）に分割したラット脳の前交連のレベルで同定された標準的な皮質区画を示す。
【００９９】
統計分析
すべての測定は盲検的に行った。行動の採点（接着−除去ドット試験およびｍＮＳＳ）
は正常について評価した。反復測定分析を行って行動の採点に及ぼす処置の効果を試験した。分析は０．１の有意さレベルで処置−時間の相互関係について試験することから始まり；全体の処置効果についての試験は、０．０５の有意さレベルで相互関係が検出されない場合に行った。０．１の有意さレベルでの処置−時間の相互関係または０．０５の有意さレベルでの全体的処置効果が存在するならば、各時点で各々の行動の採点に及ぼす処置効果のサブグループ分析を有意さレベル０．０５で行った。あるいはサブグループ分析は予備的と考えた。損傷容量および細胞数という意味で、スチューデントｔ検定を使用して対照群と処置群との間の差異を評価した。ＥＬＩＳＡデータはＢＤＮＦおよびＮＧＦ濃度の対数  対  光学密度の対数をプロットすることにより直線化し、そして回帰分析により最も合った直線を決定した。各標準、対照およびサンプルについて二連の読み取りの平均を作成し、そしてゼロ標準の光学密度の平均を引いた。処置および対照群の間の差異を試験するために、平均（ＳＤ）およびｐ値を提示する。
【０１００】
結果。
インビトロでのｈＭＳＣの増殖動力学
３名の健康なヒトドナーからの骨髄由来ｈＭＳＣを、培養拡大により試験した。初代培養では、ｈＭＳＣは形態学的に均一な繊維芽様細胞群に成長した。通常７日の間隔でその後の継代中、ｈＭＳＣは密に詰められた螺旋状細胞の一巻として成長した。５週目の終わりに（４継代）、ｈＭＳＣは５．４から６．６×１０７細胞の間の範囲になった（表２）。
【０１０１】
【表２】
2010018627.tif 000004
【０１０２】
インビトロでラット脾臓細胞とｈＭＳＣとの間の混合リンパ球反応および細胞傷害性Ｔリンパ球応答は、非刺激脾臓細胞に比べてｈＭＳＣが健康なラット脾臓細胞の増殖を有意に増加させた（刺激指数＝１８．８）（図２Ａ）。ｈＭＳＣを注射したラットに由来する脾臓細胞の増殖も、インビトロでｈＭＳＣを用いて再刺激した後に増加した（刺激指数＝１５．６）；しかしこれらの細胞の増殖応答は健康なラットの脾臓細胞中と有意に異なら
なかった。これらのデータはｈＭＳＣがラット脾臓リンパ球に１次増殖応答を誘導でき、ｈＭＳＣのラットへの投与は２次的なインビトロ増殖応答についてリンパ球をインビボで感作できないことを示す。
【０１０３】
図８Ａはラット脾臓細胞とヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）との間の混合リンパ球反応を示す；２×１０５の健康なラット脾臓細胞（Ｎ−Ｓｐｌ）または２週間前にｈＭＳＣでＩＶ処置したラットからの脾臓細胞（Ｔ−Ｓｐｌ）を３連で、照射した（２０Ｇｙ）ｈＭＳＣを含んで、または含まずに９６時間、１０：１の応答物：刺激物比で培養した。カルチャーは３Ｈ−チミジン（０．２５μＣｉ／ウェル）で１６時間パルスをかけ、そして自動化細胞回収機で回収した。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションにより測定した。ｈＭＳＣ−処置と未処置ラットから得た脾臓細胞の間に差異は観察されなかった。ＳＩ＝刺激指数。（Ｂ）ラット脾臓細胞（１×１０７）は、１×１０６照射（２０Ｇｙ）ｈＭＳＣと５日間培養した。インキューベーション期間の終わりに、生きている細胞をカルチャーから回収し、そして５１Ｃｒ−標識ｈＭＳＣに対する細胞傷害性について、８時間の５１Ｃｒ−放出アッセイにてエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で試験した。ラット脾臓細胞はｈＭＳＣに応答する細胞傷害性Ｔリンパ球を生じなかった。すべての値は平均±ＳＤとして表す。図８Ｂは、刺激物（ｈＭＳＣ）と共に、または無しでインキューベーションした健康なラット脾臓細胞による＜４％の標的細胞（ｈＭＳＣ）の溶解（ｌｙｓｉｓ）を示す。同様に、ｈＭＳＣの投与によりインビボで脾臓細胞をプライムし、続いて培養中５日間、ｈＭＳＣを用いた再刺激では、それらに細胞傷害性を誘発することはできず、ｈＭＳＣがラットの脾臓細胞に細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導できないことを示す。
【０１０４】
神経学的機能試験。
発作から１４日後に、接着−除去ドット試験（ｐ＜０．０５；図３Ａ）およびｍＮＳＳ試験（ｐ＜０．０５；図３Ｂを参照にされたい）により示された機能的回復は、ＭＣＡＯのみに供された対照ラットおよび３×１０６ラット肝臓繊維芽細胞を注射したラットに比べて、ＭＣＡＯから１日後に３×１０６ｈＭＳＣを注射したラットで見いだされた。
【０１０５】
図３は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）前後の行動的機能試験の結果を示す（Ａ：接着−除去ドット試験；改良された神経学的重症度の採点［ｍＮＳＳ］試験）。ラットを２時間のＭＣＡＯのみ（ｎ＝１０）に供するか、または培養したヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）（ｎ＝９）またはラット肝臓繊維芽細胞（ＬＣ；ｎ＝９）をＭＣＡＯの１日後に注射した。有意な機能的回復は、対照個体と比較してｈＭＳＣで処置したラットで検出された。白丸＝ＭＣＡＯ；黒丸＝＋ＬＣ；三角＝＋ｈＭＳＣ。
【０１０６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ定量
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、ＢＤＮＦ（９６９±１９８ｐｇ／ｍＬ対４３４±５９ｐｇ／ｍＬおよび４９８±７６ｐｇ／ｍＬ）およびＮＧＦ（１，２２７±１１１ｐｇ／ｍＬ対８３４±１２３ｐｇ／ｍＬおよび９８０±５５ｐｇ／ｍＬ）の分泌レベルは、細胞処置無しでＭＣＡＯのみから７日後の動物およびラット肝臓繊維芽細胞で処置したラットに比べて、ｈＭＳＣ処置ラットの虚血半球で増加した（ｐ＜０．０５）。インビトロのデータは、ｈＭＳＣがＢＤＮＦおよびＮＧＦを時間依存的様式で分泌することを示す。ＢＤＮＦおよびＮＧＦにおける有意な上昇は、１日に比べて４および７日の培養で無血清培地中に検出された（表３）。
【０１０７】
【表３】
2010018627.tif 000005
【０１０８】
形態学的分析。
２時間のＭＣＡＯに供したラットに、虚血から１日後に３×１０６ｈＭＳＣを注入し、そして形態学的分析のためにＭＣＡＯから１４日後に屠殺した。Ｈ−Ｅで染色した皮質スライド内に、暗く、そして赤いニューロンがｈＭＳＣ注射を含む、または含まないＭＣＡＯに供したすべてのラットの虚血中心部で観察された。虚血傷害の容量における有意な減少は、ＭＣＡＯのみ（３６．３％±１０．５％）に供した対照ラット、またはＭＣＡＯから１４日後にラットの肝臓繊維芽細胞を注射したラット（３４．６％±９．１％）に比べて、ｈＭＳＣ−処置ラット（損傷容量、３３．３％±７．６％）で検出されなかった。
【０１０９】
脳組織内で、ｈＭＳＣに由来する細胞はヒト特異的抗体ｍＡｂ１２８１により同定される丸から卵形の核を特徴とした。ｈＭＳＣ（１２４×１０３±４６×１０３；３×１０６ｈＭＳＣの４％）が生き残り、そして受容マウスの虚血性傷害脳全体に分布した。ｍＡｂ１２８１反応性細胞は皮質および線条を含む同側半球の多くの領域で観察されたが、最も
多くのｍＡｂ１２８１で標識されたｈＭＳＣ（全１２４×１０３±４６×１０３の６０％）が虚血境界領域に位置した。数個の細胞が反対側半球でも観察された（９×１０３±２×１０３；３×１０６ｈＭＳＣの０．３％）。
【０１１０】
二重染色免疫組織化学では、使用した神経マーカーに反応性のｍＡｂ１２８１陽性細胞はほとんど無いことが明らかになった。ＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰおよびｖＷＦを発現するｍＡｂ１２８１標識ｈＭＳＣの割合は、１％、１％。５％および２％であった。レーザー走査共焦点顕微鏡画像は、ヒトの核ｍＡｂ１２８１（ｈＭＳＣ同定については緑）とＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰまたはｖＷＦ（細胞型特異的マーカーについては赤）に対して特異的なモノクローナル抗体の受容体ラット脳中での同時局在化を示した（図４、ａからｈ）。ほとんどのｍＡｂ１２８１陽性細胞は管の回りを取り囲むが、実質に局在する細胞はほとんどない。
【０１１１】
図９はラット脳中の外因性ヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）および内因性脳細胞の形態学的特徴を示す顕微鏡写真である。二重免疫蛍光染色を使用して、ｍＡｂ１２８１（ヒト核に特異的なモノクローナル抗体）−反応性細胞が脳の傷害を受けた領域に存在した。レーザー走査共焦点顕微鏡画像は、ｍＡｂ１２８１（ｈＭＳＣ［ａ、ｃ、ｄ、ｆ−ｈ］については緑）、神経核抗原（ＮｅｕＮ）（ｂ、ｃ）、微小管−結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）（ｅ、ｆ）、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（ｇ）およびｖＷＦ（ｈ）（細胞型特異的マーカーについては赤）を受容体ラット脳内に示した。尺度の棒＝５０μｍ。
【０１１２】
ＴＵＮＥＬ（図７、ａ、ｃおよびｄ）、およびＨ−Ｅ染色（図７ｂを参照にされたい）を使用して、典型的な焦げ茶色の丸い、または卵形のアポトーシス体を持つアポトーシス細胞を虚血境界領域で計数した。参照皮質の６μｍ厚切片内で測定されたアポトーシス細胞数は、ＭＣＡＯのみから１４日後の動物または肝臓繊維芽細胞で処置した虚血性ラットと比較して、ｈＭＳＣ処置ラットの虚血境界領域で減少した（３８．５±３．４対８２．６±３．８または７６．４±６．８；ｐ＜０．０５）。
【０１１３】
図７は、アポトーシス細胞（ａ：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが媒介するｄＵＴＰ−ビオチンニックエンドラベリング［ＴＵＮＥＬ］−陽性細胞［矢印］；ｂ：ヘマトキシリン−エオシン［Ｈ＆Ｅ］染色）が、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のみの後に虚血境界領域に存在することを示す。減少したアポトーシス細胞（ｄ：青−ヘマトキシリン−カウンター染色細胞のより多い生存；矢頭）は、肝臓繊維芽細胞を注射したラット（ｃ）に比べてヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）を注射したラットで検出された。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；新たに合成されたＤＮＡのマーカー）−陽性細胞（矢印）は、健康な脳の脳室領域／脳室下領域（ＶＺ／ＳＶＺ）にはほとんど存在しなかった（ｅ）。増加したＢｒｄＵ−陽性細胞は、ＭＣＡＯのみに供したラット（ｆ）および肝臓繊維芽細胞を注射したラット（ｇ）の同側半球のＶＺ／ＳＶＺに検出された。ＢｒｄＵ−陽性細胞の有意な増加は、肝臓細胞処置を含むか、または含まないＭＣＡＯに供したラットに比べて、ｈＭＳＣ（ｈ）で処置したラットのＶＺ／ＳＶＺで検出された。尺度の棒＝１５μｍ。
【０１１４】
ＢｒｄＵ−陽性細胞はＶＺ／ＳＶＺにほとんど存在しなかった（図７、ｅからｈを参照にされたい）。有意により多くのＢｒｄＵ−反応性細胞が、ＭＣＡＯのみに供したラット（図７ｆ）または肝臓繊維芽細胞で処置したラット（図７ｇを参照にされたい）よりも
ｈＭＳＣ処置を含むＭＣＡＯに供されたラットの同側半球のＶＺ／ＳＶＺで検出された（図７ｈを参照にされたい）。ブレグマ−１．０  １．０ｍｍに位置する標準参照切片から５枚の皮質パラフィンスライド（６μｍ厚；２５μｍ間隔）を、ＢｒｄＵ反応性細胞分析に使用した。ｈＭＳＣ処置を含むＭＣＡＯに供されたラットのＶＺ／ＳＶＺ中のスライドあたりＢｒｄＵ−陽性細胞の数（９５．３±２４．１）は、ＭＣＡＯのみに供したラット
（２７．５±１８．５）または肝臓繊維芽細胞で処置した虚血ラットのＶＺ／ＳＶＺ（３７．８±１１．２）よりも有意に高かった。発作から１４日後、ｈＭＳＣ処置を含むＭＣＡＯに供したラットは、ＭＣＡＯのみに供したラットまたは肝臓繊維芽細胞で処置したラットよりも、スライドあたり多数のＢｒｄＵ陽性細胞が、ＮｅｕＮ（２．５±０．４対０．５±０．６または０．６±０．４；ｐ＜０．０５）およびＧＦＡＰ（４．４±２．３対１．４±１．１または１．７±０．５；ｐ＜０．０５）を発現した。
【０１１５】
考察。
発作から１日後のｈＭＳＣのＩＶ注射は、ＭＣＡＯのみに供したラットまたは肝臓繊維芽細胞を注射したラットに比べて、体性感覚採点およびｍＮＳＳに従い機能的成果を有意に改善した。この利点はラットにおいて、発作後に傷害を受けた実質細胞の修復を促進できるニュートロフィンを含む増殖因子の生産に影響を及ぼし、虚血境界領域のアポトーシスを減少し、そしてＶＺ／ＳＶＺ中の内因性神経幹および前駆細胞の増殖および分化を強化することができる。
【０１１６】
神経移植片は脳傷害に伴う機能的欠損を逆転した。本発明のヒト移植片−対−ラット宿主データは、照射した動物７に永久的なＭＣＡＯおよび非照射動物にＭＣＡＯを一時的に２時間発生させた後の損傷部位に対して、ＩＶ移植した自家骨髄細胞の優先的ホーミングを示す他の研究からの知見と一致する。形態学的分析では、ｈＭＳＣが虚血性傷害を受けたラット脳に選択的に移動する能力を有することを示す。ｈＭＳＣは生き残り、そして分散した幾つかが実質脳細胞のタンパク質マーカーを発現する。
【０１１７】
ｈＭＳＣは失ったニューロンを交換する能力を有することができるが、治療的利益を提供するメカニズムは多面的であるらしい。データでは発作から１日後の３×１０６ｈＭＳＣの注射が、投与から７および１４日後の未処置ラットに比べて（ｐ＜０．０１）、体性感覚採点およびｍＮＳＳに従う機能的成果を改善することを示す。しかしｈＭＳＣのわずか１％、５％および２％がすぐに完全な細胞分化および組織へ一体化される神経、星状膠および内皮細胞タンパク質を発現するだけである。したがってより短期的利益のメディエーターは、ｈＭＳＣが虚血境界領域中に残るニューロンの機能的回復を促進し、そしてアポトーシスを減らす多数の増殖因子で傷害を受けた組織を補充することであるらしい。ＭＳＣは虚血性の傷害を受けたニューロンの可塑性を促進し、またはグリア細胞がニュートロフィン（例えばＢＤＮＦおよびＮＧＦ）を分泌することを刺激することに直接関与することができる。ｈＭＳＣと宿主脳との相互作用はｈＭＳＣおよび実質細胞が豊富な栄養因子を生産することを導くことができ、これが損傷の結果として失った機能の回復に貢献する。３０，３１この研究においてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの分泌レベルは、細胞処置無しのＭＣＡＯのみから７日後の動物、および肝臓細胞処置を行ったラットに比べて、ｈＭＳＣ−処置ラットの虚血半球で有意に上昇したことが示される。虚血脳におけるＢＤＮＦおよびＮＧＦの存在を測定したが、他の増殖因子（血管新生因子ＶＥＧＦ３２およびＨＧＦ３３のような）が、血管新生を増すことにより少なくとも部分的に機能回復を改善できる可能性は排除されなかった。血管新生は発作からの改善された神経的回復と関連する。
【０１１８】
ＭＳＣは低分子「工場」として行動する。これらの細胞は多くのサイトカインおよび栄養因子を生産する。それらはまた長期間にわたりこれらの因子を分泌し、そして単回のボーラス投与ではない。ＭＳＣは造血に役割を果たすことが知られている多くのサイトカインを発現し、そしてまた骨髄微小環境自体の細胞に影響を及ぼすオートクリン、パラクリンおよびジャクスタクリン因子も供給する。大脳組織中のＭＳＣはこれらの因子を発現しているらしく、そして機能の回復を迅速かつ効率的に促進することがこれらサイトカインおよび栄養因子が脳組織に及ぼす効果である。これらの細胞は異なるイオン的微小環境下（例えばカルシウム）で培養した時、増殖因子の発現を調整することによりイオン的微小
環境の信号（ｃｕｅ）に応答する。これは損傷した組織中の細胞が組織の必要性に滴定された（ｔｉｔｒａｔｅｄ）栄養および増殖因子を発現することを示唆している。脳での発作のＭＳＣを用いた処置では、特異的因子の単回の局在化注射とは明らかに対照的に、種々の栄養因子およびサイトカインが解剖学的に分布され、組織感受性で、しかも一時的に進行する様式で生産される。
【０１１９】
神経幹細胞はＶＺ／ＳＶＺ内に存在し、そしてこれらの細胞は発達している脳内でそれらの運命に移行する。健康な成人の脳では、前脳のニューロン生産の欠如は適切なニューロン前駆細胞の欠如に影響せずに、むしろ有糸分裂後の栄養および移動サポートの持続的（ｔｏｎｉｃ）阻害および／または欠如に影響する。この実験はＢｒｄＵ反応性細胞は、ＭＣＡＯのみに比べてｈＭＳＣ処置を含むＭＣＡＯ後のＶＺ／ＳＶＺで増加し、ＩＶ注射したｈＭＳＣは内因性の脳細胞が増殖し、そして虚血傷害を受けた脳の修復への参加を刺激することを示唆する。これらの知見はラット由来のＭＳＣのＩＶ投与を使用して得た結果と一致する。
【０１２０】
ｈＭＳＣのラット中へのＩＶ移植は、インビトロで混合リンパ球反応により測定した時、ラットをｈＭＳＣに対して感作しない。同様に健康なラットまたはｈＭＳＣを注射したラットの脾臓細胞はｈＭＳＣに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答、外来臓器／細胞移植の拒絶に関わる機能的免疫応答を生じることができない。これらのデータはラットによるｈＭＳＣの免疫学的拒絶が発作の処置としてｈＭＳＣを試験することと関係しないことを示唆する。潜在的に、そしてより重要なことは、ラット脾臓が注射したｈＭＳＣに対する感度をほとんど示さないか、または感度が無いことである。ｈＭＳＣが強力な免疫応答を誘導できないことは、主要組織適合性遺伝子複合体（クラスＩおよびクラスＩＩ）および同時刺激（ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）分子の発現が無いか、またはほとんど無いために、これら細胞の弱い免疫原性と関連している可能性がある。さらにｈＭＳＣは異種移植の拒絶に関与する免疫応答の発生をダウンレギュレートする可溶性メディエーターも分泌することができる。これらのデータは、ＭＳＣの同種細胞−付着群の免疫原性を調査するさらなる実験を要求する。
【０１２１】
データはＩＶ投与したｈＭＳＣが発作から２週間後に神経学的機能の回復を促進することを示す。ｈＭＳＣは選択的に大脳虚血領域に入る。ｈＭＳＣと虚血脳との間の相互関係はニューロトロフィンの分泌を強化し、これが虚血境界領域におけるニューロンのアポトーシスを減少させ、そして虚血脳中の比較的完全なＳＶＺからの細胞増殖を促進することができる。しかしＳＶＺから始まる細胞が虚血脳に移動し、一体化されるかどうかは決定されなかった。ＣＮＳでは神経損傷の効果的処置が、大脳循環のリモデリングを含む内因性の補償機能の活性化を要求することができ、その正確なメカニズムは不明である。ＭＳＣが誘起する神経欠損の減少の元にあるメカニズムの解明ならびに長期の治療的利益の証明により、ｈＭＳＣが発作、そして恐らくは広い多数のヒトの神経学的障害の強力な分子および細胞治療を提供することができる。
【０１２２】
実施例３
神経損傷の処置：前臨床プロトコール
ＭＳＣが発作後の機能的回復を促進するという仮定の調査において、出願人は前臨床細胞治療プロトコールを実施するための様々な選択に直面した。中でも取り組むべき問題は、何時そして何処に細胞を移植するかということである。関心は修復治療であるので、虚血損傷のサイズが効果的な修復治療により改変しないと仮定して、出願人は最初に動物を発作から１日以上後に処置することを選んだ。３１，３２この時期は臨床的に合理的である。欠損が発作から１日持続する場合、この出来事は発作と分類され、そして一過性の虚血性攻撃とは分類されない。１日で患者は安定し、そして神経欠損の重症度を容易に評価することができる。
【０１２３】
最も直接的な細胞の脳への配置経路は、外科的移植を介する。細胞は損傷内に、健康な非虚血性組織内に、または境界領域内に配置されるべきであるか？脳の観察を引き出して、特に発生状態における損傷の境界領域を考慮して、初期の実験で出願人は境界組織内にナイーブな全骨髄細胞を配置することを選んだ。３２すなわち細胞はドナーのラットから抽出し、そして外科的および定位的に皮質下および皮質組織内の虚血損傷の境界領域に移植した。３１−３３試験すべき主な仮定は、これらの細胞が機能的回復を促進するかであり、そのような神経学的および機能的試験を動物で行った。完全な神経学的調査（表１）を行った。この調査、改良された神経学的重症度の採点（ｍＮＳＳ）は、運動指数、感覚反射および筋肉状態を提供する。３４−３８加えて出願人は体性感覚試験を使用し、この試験は足の平から粘着性のタブの除去３９、およびラットが加速して踏み車を持続する時間を測定する運動協調性試験４０を含んだ。測定は発作前およびその後７および１４日に行った。３１動物を１４日に屠殺し、そして移植した細胞を組織学により大脳組織で探した。この組織学的分析で扱う１つの疑問は、ＭＳＣが脳の実質細胞に分化するかどうかであった。同様な実験を中大脳動脈の塞栓性閉塞に供したマウスで行い、そしてドナーマウスからのナイーブな全骨髄細胞の脳内移植で処理した。機能的測定は移植から２８日後に行った。注目すべきかつ迅速な機能的回復は、これらの細胞を虚血損傷の境界内に配置した後にあった。パーキンソン様損傷を１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンで誘導したマウスの線条へのＭＳＣの実質内移植の同様な実験では、運動機能の有意な回復が示された。４２同様にＭＳＣを脊髄の挫傷に隣接して移植し、そして有意な機能的利益が明らかであった。
【０１２４】
これら実験の変動により、ＭＳＣと脳由来神経成長因子のような栄養因子の同時投与が機能的回復を促進し、そしてこれら細胞の増殖因子中での前培養が機能的利益ならびに脳細胞表現型タンパク質を発現する細胞数の増加を助長することが示された。カルチャー中の細胞の脳の環境への順化は、インビトロからインビボへの移行を容易にすると思われる。多くの移植された骨髄細胞が虚血脳中でアポトーシスを受けた。したがって出願人は骨髄細胞をＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＤＬ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ）、カスパーゼインヒビターと同時投与した。この仮定は確認された；アポトーシス細胞の数は有意に減少し、そして運動協調性試験で測定した機能は利益の増加を示した。このように細胞治療でも併用療法が所望の成果を改善することができる。
【０１２５】
類似の治療的介入が、外傷性脳損傷、脊髄損傷およびパーキンソン病の動物モデルで効果的であった：すべての３つのモデルで、ＭＳＣの外科的移植により神経学的欠損の有意な減少があった。治療的利益は移植から数日以内で明らかになった。しかしわずか１〜３％の細胞が実質細胞の表現型のタンパク質を発現しただけであった。そのようなタンパク質を発現する細胞の比率は前培養で増加させることができたが、移植された細胞数は中大脳動脈の閉塞後に梗塞した半球脳組織の量に比べてわずかである（大体４０％）。閉塞から１４日後、約５０，０００個の細胞（ＳＥ１８０００）、すなわち移植した４００，０００個の１２．５％が生存し；少ない割合が神経タンパク質を発現し、少なすぎて梗塞組織を交換できない。
【０１２６】
これらの細胞の脳への直接移植の成功は、侵襲性が低い血管経路の投与を試験する実験を促した。ラットを中大脳動脈の閉塞に供し、そして虚血損傷がある半球に対して同側の頸動脈に細胞注入のためのカニューレを挿入した。約２百万個のＭＳＣを発作から１日後に注射した。一連の神経学的試験は処置の前後で行った。組織学的分析では少量の細胞が実質細胞の表現型のタンパク質を発現することが示された。しかし有意な機能的利益が明らかであった。出願人は外傷性脳損傷を処置するためにＭＳＣ投与の動脈経路の可能性も試験した。頸動脈経路を介して投与した時、細胞は脳に入ったが、恐らく投与経路が内部頸動脈の連結を要し、外傷性脳損傷を悪化させる低潅流を負わせるので、機能的利益は無
かった。
【０１２７】
次に出願人は、より臨床的に直接関連する静脈内の投与経路の可能性を調査した。この取り組みは頸動脈または直接的な組織注射よりも明らかに侵襲性が低く、そして悪影響も少ない。静脈経路は多回および長期の細胞処置にも利用が可能である。
【０１２８】
他では静脈内に注射された細胞が脳へ入って行く道を見いだすことが示された。しかし発作または外傷のような損傷内で、静脈内注射した細胞が虚血損傷の部位に選択的に移動し、そして機能的利益を促進することを示す研究はなかった。したがって出願人はこの仮説を中大脳動脈の閉鎖に供したラットで試験した。発作から１日以上後、１〜３百万個のＭＳＣを尾静脈に注射した。出願人は一連の神経学的成果の測定（表１）を行った。発作から１日後に細胞を投与した動物は、発作から１４日後に屠殺し（図１）、そして発作から７日後に処置した動物は３５日に屠殺した。以前の実験のように、新たな細胞の生成を示すために細胞をブロモデオキシウリジン（新たに合成されたＤＮＡのマーカー）で標識した。またオスのラットからのＭＳＣをメスの動物に注射し、そして細胞をＹ染色体に対するｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより同定した。処置した動物は処置により有意な機能的改善が示された（図２）。改善された機能の促進における細胞型の特異性について試験するために、細胞の対照群も使用した。死んだＭＳＣおよび肝臓および肺の繊維芽細胞（非実質細胞対照として）は治療的利益を示さず、そしてリン酸緩衝化生理食塩水対照よりも良くなかった。このように静脈内経路は発作および外傷後に有意な機能的改善を提供する。これは発作から７日後に開始する処置にもあてはまり、そして機能的利益はオスおよびメスのラットで同様であった。
【０１２９】
ヒトの試験条件により詳細に似せるために、ラットＭＳＣではなくヒトの骨髄間質細胞をドナー細胞群として使用する。ヒト細胞は局所麻酔下で健康なドナーの後部腸骨稜の穿刺により抽出した。骨髄抽出物（１５〜１６ｍＬ）の単核細胞を分離した。３百万個のヒトＭＳＣ用量を各ラットに閉塞または外傷性脳損傷から１日後に静脈内注射した。強力な機能的改善が発作および外傷後の両方で見いだされた。ヒト細胞はドナーから簡単に得た。それらは容易に大変多数に拡大することができ、そして抗体をフローサイトメトリーまたは磁気細胞ソーティングによる分離のために利用することができる。ヒトＭＳＣは癌および多発性硬化症の患者を処置するために使用されてきた。すなわちヒトにおける安全性のデータは入手可能である。
【０１３０】
出願人はいかなる免疫拒絶の兆候も観察しなかった（公開していない考察）。未処置ラットおよびヒトＭＳＣで処置した動物の脾臓を摘出し、そしてヒトＭＳＣと培養した。ヒトＭＳＣを注射したラットに由来する脾臓細胞の増殖は、これらの細胞でインビトロにて再刺激した後に増加した；しかし増殖応答は未処置ラットに由来する脾臓細胞の応答と有意に異ならなかった。すなわちヒトＭＳＣはラット脾臓リンパ球に１次的増殖応答を誘導することができるが、これらの細胞のラットへの投与はインビトロでの２次的な増殖応答についてインビボでリンパ球を感作しない。Ｔリンパ球は移植片−対−宿主疾患のイニシエーターとして関与する。したがってヒト移植片に対するラット宿主Ｔ細胞の応答は、溶解効果を評価するための標準的なクロム−５１アッセイで測定した。ヒトＭＳＣはラット脾臓細胞に細胞傷害性−Ｔ−リンパ球応答を誘導しなかった。出願人は齧歯類とヒトがＭＳＣ処置に対して異なって応答し得る可能性を排除できない。しかし別の可能性は、ユニバーサル細胞、同種細胞および自己ではない細胞を患者を処置するために使用することができるということである。明らかにヒトにおいてより多くのデータが、この仮定を試験するために必要である。初期の臨床的応用は自家移植を必要とするだろう。
【０１３１】
これらの細胞をどのように損傷の部位に標的とさせるか、およびそれらがどのように利益を提供するかを含め、取り組まなければならない多くの問題がある。細胞はどのように
して行くべき場所を知るのか？どのメカニズムがこれらの細胞を損傷部位に特異的に標的させるのか？しかし最も興味深い問題は細胞が脳に及ぼす効果、およびこれらの効果がどのように治療的利益に翻訳されるのかである。
【０１３２】
大脳損傷部位へのＭＳＣの標的化
静脈内注射された細胞はどこへ行くのか？最初に、注射された細胞を、それらが組織中で同定できるようにするために印を付けなければならない。ＭＳＣは種々の標識に反応性の抗体により同定することができる。ＭＳＣはブロモデオキシウリジンで標識することができる；オスに由来する細胞をメスの動物に注射し、そしてｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＹ染色体を同定することができる；あるいはヒト細胞をラットに注射し、そしてヒト抗原に対する抗体を使用することができる。静脈内に注射された細胞は肝臓、腎臓、脾臓および骨髄内に見いだされた。しかし最も確認されたＭＳＣはこれらの器官内で微血管を囲み、実質に局在する細胞はほとんど無い。大変わずかな細胞（処置から１４〜３５日後に、３百万個の注射されたＭＳＣの１．５〜３．０％）が脳組織の実質に検出された。損傷した脳では、発作後または外的損傷後であろうとも、ほとんどの細胞が損傷の領域を標的とした。例えば発作後、８０％より多くの細胞が影響を受けた半球内にあり、これら細胞のほとんどが損傷の回りの領域内に集まった。多くの細胞が血管に隣接またはその中にも存在した。細胞はどのようにして損傷した組織を標的とし、そしてこれら細胞の微小脈管への局在化は重要なのか？
【０１３３】
損傷の部位へのＭＳＣのホーミングは、炎症細胞の損傷組織への応答の記憶である。好中球および単球は、損傷および炎症組織を脈管性および細胞性分子シグナリングの調和した因果的連鎖により標的とする。炎症細胞および脈管上に発現される接着分子およびそれらのレセプターが細胞を損傷組織へと導き、そしてこれらの細胞を脈管境界を渡して、通常は血液脳関門を通して輸送する。これらの標的化および接着分子はケモカインと協調して働く。したがって出願人は接着分子および誘引剤が作用し、そしてＭＳＣを脳に標的させるかどうかを試験した。出願人は、透過性の膜により分けられた２つのチャンバーの間の細胞移動に関するアッセイであるＢｏｙｄｅｎチャンバーを使用した。ＭＳＣは移動媒質（５％ウシ血清アルブミンを含むＩｓｃｏｖｅの改良ダルベッコ培地）中、５×１０５細胞／ｍＬに調整された。５０・Ｌの細胞懸濁液を各上部ウェルに加えた。底面に移動したＭＳＣの数を５個の視野（０．１２ｍｍ２面積）で計数した。虚血脳組織は誘引タンパク質１およびマクロファージ炎症タンパク質１のような走化性タンパク質を発現するので、出願人はこれらの物質を下のチャンバーに配置して、用量依存的な移動の増加を提供した。同様の応答が細胞間接着分子１のような接着分子を下のチャンバーに配置した時に見いだされた。移動の上昇は付着分子に対する抗体またはケモカインを下のチャンバーに加えた時に効果的に遮断された。外的損傷または発作に供した脳由来の組織が下のチャンバーに配置された時、細胞の移動は有意に増加した。これらの知見は細胞がどのように炎症細胞様の同定を仮定し、そしてそれらがどのように損傷した組織を特異的に標的とすることを「知る」かという洞察を提供する。このようにパーキンソン病および多発性硬化症のような神経変性的プロセスを含め、炎症応答を有する任意の損傷は、ＭＳＣを傷つけられた組織に導くことができる。損傷の程度による指針の依存性も、細胞の「効果的」な用量の滴定状態を提供する。損傷および相伴う炎症応答が重症なほど、その部位に向けられる細胞数が多くなる。
【０１３４】
作用のメカニズム
細胞がどのように脳に影響を及ぼし、そしてそれにより損傷および病理的プロセスから機能的回復が促進されるのか？脳細胞になることによりＭＳＣが大脳組織に与える利益の可能性の見込は無いようである。静脈内注射および多くても数十万を数える実質内細胞数で、たとえそれらが脳細胞になっても、数立方ミリメートル強の組織容量を交換するための大変少量の細胞が存在するだけである。多くの場合で利益は処置から２、３日に検出さ
れる。多くてもわずかな比率の細胞が実質細胞の表現型のタンパク質を発現する。これらタンパク質の発現は真の分化およびニューロンまたはグリア−細胞機能を示さない。そのような短期間の後、さらに分化した細胞が組織に真に一体化され、そして機能を向上させる複雑な結合を形成する見込みはほとんどない。このようにＭＳＣがそれらの有益な効果を促進することによるメカニズムとしての組織代替はありそうにもない。この利益についてより合理的な説明は、ＭＳＣが脳の内因性の回復効果を活性化するように大脳組織を誘導するということである。ＭＳＣは反応を始め、そして脳と相互作用して回復的、そして恐らくは再生的メカニズムを活性化することができる。
【０１３５】
ＭＳＣは低分子工場として行動し、多くの種々のサイトカインおよび栄養因子を生産する。大脳組織中または損傷した脳の微小脈管中のＭＳＣはこれら因子を発現するらしく、そして栄養因子が脳組織に及ぼす効果は、機能の回復を迅速かつ効果的に促進するメカニズムである。出願人は多くの他の栄養および増殖因子の中でも、ＭＳＣが肝細胞増殖因子、ＶＥＧＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を生産することを示した。この様々な因子、そして特定の増殖因子の単一の一丸（ｂｕｌｌｅｔ）ではないことが、有益な効果を助長する。大変重要な観察は、ＭＳＣを異なるイオン的微小環境下で培養した時に、増殖因子の発現を調整することにより信号に応答するということである。この知見は損傷した組織中の細胞が組織の必要性に合った栄養因子および増殖因子を発現することを示唆している。異なる環境がこれら因子の分泌に影響を及ぼす。すなわち組織損傷の程度および対応するイオン的な環境の混乱（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が栄養因子の分泌を記録するのだろう。出願人はこの仮説をいくつかの実験条件下で試験した。発作または損傷により傷つけられた脳から抽出した組織中でＭＳＣを培養すると、栄養因子の分泌は有意に増加する。損傷した脳に対するＭＳＣの応答分泌は、傷を受けた脳から組織が抽出される時期に従い異なる。これらの実験はＭＳＣで処置した脳内の成長因子の発現の測定において、一歩前進ととらえられた。出願人は定量的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、これは免疫標識法により脳中の増殖因子の発現を測定する。栄養因子の発現は、発作または外傷に供された未処置動物よりも、ＭＳＣ処置動物で有意に大きかった。
【０１３６】
ＭＳＣが選択的に損傷した脳に入り、そして増殖および栄養因子を組織フィードバックループで分泌するとすれば、これらの因子は脳をどのように改変して治療的利益を促進するのだろうか？操作上の仮説は治療的利益が脳の可塑性に関係する１組の出来事により誘導される；このプロセスは限定するわけではないが血管新生、神経細胞新生（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、シナプス形成（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、樹状突起の分枝、および組織の境界領域中で戦略的に重要な組織中のアポトーシスの減少を含む。
【０１３７】
ＶＥＧＦおよび塩基性繊維芽細胞増殖因子は、有力な血管新生剤である。出願人はＭＳＣまたはＭＳＣの上清が血管新生の誘導に及ぼす効果を試験した。測定はヒト脳の内皮細胞に関するアッセイで行い、ここでＭＳＣからの上清が管の迅速な形成を誘導することが示され、構造的および血管新生プロセスを反映している。インビボで使用したアッセイは古典的な無血管角膜アッセイであった。外科的切開で角膜にポケットを作成し、そしてＭＳＣ上清またはＭＳＣ自体をコートしたコラーゲンオブラードをポケットに挿入した。対照条件は外科的切開およびコラーゲンオブラード単独またはＶＥＧＦのポケットへの直接的配置からなった。出願人は迅速かつ強固な血管新生を、ＭＳＣ上清を乗せたオブラードで処理した角膜で観察した。角膜切開に直接配置した細胞のほとんどが部位から拡散したが、血管新生は明らかであった。対照動物には血管新生はなかった（図２）。血管新生の誘導は、ＶＥＧＦの直接使用よりはＭＳＣ上清でより強固であり、これは上清が血管新生因子の高度に効果的な供給源であることを示唆している。脳組織のＭＳＣ処置による血管新生誘導の予備実験も、新規血管形成の増加を示唆する（報告していない観察）。血管新生の誘導は機能の促進に直接翻訳されないが、出願人は以前に発作から１日以上後のＶＥ
ＧＦでの発作の処置が機能的回復を有意に改善し、そして血管新生を増加することを示した。
【０１３８】
ＭＳＣによる神経細胞新生の誘導も、発作後の機能的改善に貢献することができる。神経細胞新生の重要な部位は、脳側室に隣接する領域−脳室下領域である。神経細胞新生は齧歯類の脳の嗅球および歯状回にも見いだされる。発作のような大脳損傷は、脳の特定領域内のニューロンの生産を増幅する。特に発作後長期における機能的修復は、新規脳細胞の生産に関連し得る。これらの細胞の生産を促進するメカニズムは、回復を改善することができる。出願人はＭＳＣでの発作の処置が神経細胞新生の誘導に及ぼす効果を試験した。細胞数の有意な増加は、発作後の脳室下領域で測定された。多くのこれらの細胞はＴＵＪ−１のような特異的分子マーカーの発現により示されるような、新たに形成された前駆様細胞のマーカーを有した。同側半球内の大脳組織も幹細胞マーカーであるネスチンの発現の大きな増加を示し、大脳組織の前駆体または発生状態への活性化を示す。ＭＳＣを移植した大脳組織の組織学的分析も、虚血組織内の神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）ロゼットの存在を示した。これら神経細胞のロゼットは、発生中の脳で見いだされるものに類似する。これらの細胞系の大脳組織への移動は、脳室領域から発出する星状膠細胞様の放出により導かれることができ、これも発生中の脳内の出来事に似ている。このように骨髄細胞の存在は、脳室領域内の１次供給源から新規細胞の、および脈絡叢の損傷した脳への迅速な誘導および移動を促進するように思われる。これらの細胞は機能的修復に貢献することができるが、神経細胞新生の誘導およびこれらの細胞の機能回復への移行の関係は、直接試験されなかった。
【０１３９】
ＭＳＣにより生産される増殖および栄養因子は、損傷したおよび虚血脳におけるシナプス形成に影響を与え、そして樹状分枝を増加させることができる。発作のＭＳＣによる処置が樹状分枝に及ぼす直接的効果は、さらなる実験が待たれることろである。予備実験で出願人は、発作後の虚血性損傷の境界領域内にシナプスタンパク質であるシナプトフィシンの発現増加を示した。
【０１４０】
グリオーシスは神経損傷後の軸索伸長および分枝の障害になり得る。トランスフォーミング増殖因子・タンパク質は創傷治癒に主に重要であり、そして皮膚および心筋における瘢痕の抑制、および胎児で観察される瘢痕が無い創傷修復に関わってきた。ＭＳＣはこの増殖因子を生産するので、治療的利益は瘢痕の減少および続くシナプス形成および樹状分枝の改善からももたらされ得る。
【０１４１】
サイトカインおよび増殖および栄養因子に加えて、ＭＳＣは骨芽細胞に特異的なファクター２および骨形成タンパク質１のような骨形成に関係する因子を発現する。ＭＳＣはまた神経細胞−接着分子ニューロピリンおよびＮＧＦおよびＢＤＮＦを含む神経栄養因子も発現する。最近の研究は、骨形成タンパク質、ソニック  ヘジホック（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｅｈｏｇ）、副甲状腺ホルモンおよび繊維芽増殖因子８は、中胚葉および神経外胚葉経路を修飾することにより、胚性細胞の分化中に調節の役割を有することが示された。ＭＳＣによる損傷脳中のこのサイトカインカスケードの分泌が機能的利益に貢献するかどうかを、慎重な考察およびさらなる実験で実証する。
【０１４２】
損傷周辺領域は、アポトーシス細胞死に高度に感受性である。アポトーシスは発作または脳の外傷後数カ月間持続する。回復に及ぼす効果は未知である。出願人はＭＳＣを用いた発作および脳外傷の処置がこの領域内のアポトーシスを有意に減少させることを示した。この効果は損傷した脳内のＮＧＦのような増殖因子の生産により媒介されることができる。出願人はこの領域内のアポトーシスの選択的減少は、大脳の再配線（ｒｅｗｉｒｉｎｇ）を支持することができると推測する。
【０１４３】
脳のリモデリング、神経細胞新生および神経保護的メカニズムが損傷後に機能的改善を喚起するメカニズムは不確定であり、そして重要な研究課題である。ＭＳＣを用いた処置により増幅されるこれらすべての出来事が、実際に発作および外傷後の改善された成果に貢献するのかどうかは現在調査中である。
【０１４４】
この時点で、神経学的機能の回復を促進する特異的な出来事を単離することはできない。しかし出願人は機能の回復を促進するプロセスが組織の１つの修飾ではなく（例えば神経細胞新生）、恐らくは機能を改善するために、相乗的様式でなくても組合わさって貢献する出来事である血管新生、神経細胞新生、シナプス形成、ならびに瘢痕およびアポトーシスの境界での減少の混交された組み合わせであろうと推測する。この仮説を試験し、そして改善された神経学的機能に貢献する特異的因子の同定はやりがいがあるが、出願人は神経細胞新生に影響を及ぼさずに血管新生を減少するために、境界領域内でアポトーシスを選択的に増加させる能力に限界がある。
【０１４５】
損傷した大脳組織は多くの方法で個体発生を繰り返す。発作または損傷後、大脳組織は発生のより早い段階に戻り、このようにして侵入するＭＳＣからのサイトカインおよび栄養および増殖因子による刺激に対して高度に応答性となる。ＭＳＣは恐らく準発生的（ｑｕａｓｉｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）大脳組織内の構造および血管新生、脈管形成、神経発生および樹状分枝を含む再生的変化を刺激する。ＭＳＣの初期状態よりは種々の刺激物および増殖因子に対して高度に感受性の組織の初期状態は、主に治療的応用を促進する。ＭＳＣは大脳リモデリングを刺激するために、個体発生性大脳組織により必要とされる資源を単に提供できるだけである。出願人は他の細胞またはサイトカインおよび増殖因子を調和のとれた因果的連鎖で滴定して注入することにより、傷つけられた脳細胞を刺激して反応させ、そして機能を回復させることができる可能性を排除しない。同様に出願人はＭＳＣの亜集団が幹様または前駆様であり、そして損傷した組織と相乗的に反応する可能性も排除することができない。しかし出願人は、少なくとも出願人が見る機能的利益の時間規模では、脳内のＭＳＣは組織とは置き換わらず、そしてそれらは機能するニューロンおよび支持的な星状膠細胞に分化しないという自信がある。主な利益は損傷をリモデルし、そして補償するための損傷した組織の活性化により得られる。図３はＭＳＣが回収され、そして損傷した大脳組織を処置するために使用することができるこのプロセスの現在の解釈を具体的に説明する。
【０１４６】
患者への移植
この細胞治療の形態が発作の患者に使用できる前に、明らかに安全性の問題に取り組まなければならない。骨髄移植は癌処置では普通の手順であり、そして多発性硬化症における併用療法としても使用されてきたが、発作における安全性に関するフェイズＩ実験が認められている。今日まで発作を生じたほぼ２０００匹の動物に関する実験で、出願人は治療のいかなる副作用または腫瘍形成の兆候も検出しなかった。患者は彼ら自身の細胞、ＨＬＡが合った細胞またはユニバーサル−ドナー群で処置されるべきか？これまでの前臨床データは、ドナー細胞による処置が可能であることを示唆している。しかし前臨床およびフェイズＩ臨床試験はこの問題に取り組むために行なわなければならない。この再考を説明する前臨床および基本的試験は、ＭＳＣでの発作の処置が現実的かつ高度に効果的な回復的治療を提供することができることを示す。すなわち臨床試験は実証される。
【０１４７】
本出願を通して、米国特許を含む種々の刊行物が著者および年号および特許番号により引用されている。刊行物に関する完全な引用を以下に掲載する。これら刊行物および特許の開示は、本発明の技術分野の状況をより完全に説明するために全部、引用により本明細書に編入する。
【０１４８】
本発明を具体的に説明する様式で記載してきたが、使用した用語術は限定ではなく言葉
の説明的性質を持つことを意図していると理解される。
【０１４９】
明らかに本発明の多くの修飾および変更が上記の教示に照らして可能である。したがって記載した本発明の範囲内で、本発明は具体的に記載した以外に実施できると理解される。
【０１５０】
【表４】
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【０１５１】
ＴＢＩ組織抽出物で処置したｈＭＳＣｓを、ノックアウト血清代替および正常脳抽出物を含むノックアウトＤＭＥＭと比べる。★Ｐ＜０．０１
【０１５２】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【０１５３】
１．血管新生および脈管形成の誘導に使用する治療薬であって、該治療薬が幹細胞から単離された血管新生および脈管形成誘導因子を、血管新生および脈管形成を誘導するための製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含んでなる上記治療薬。
【０１５４】
２．上記血管新生および脈管形成誘導因子が血管新生、栄養および増殖因子から本質的になる群から選択される１．に記載の治療薬。
【０１５５】
３．上記細胞治療薬が間葉系幹細胞、間質細胞およびその前駆体、繊維芽細胞、網状赤血球、脂肪細胞および内皮細胞から本質的になる群から選択される幹細胞である、１．に記載の治療薬。
【０１５６】
４．血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増すために、間質細胞を分化誘導化合物に暴露し、そして共培養することにより、間質細胞から分泌される血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増幅させる方法。
【０１５７】
５．上記方法が血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増すために、間質細胞を分化誘導化合物に暴露し、そして共培養することを含み、該分化誘導化合物が脳抽出物およびカルシウムから本質的になる群から選択される、４．に記載の方法。
【０１５８】
６．治療として使用するために幹細胞から単離され、そして精製された血管新生および脈管形成誘導因子。
【０１５９】
７．血管新生および脈管形成を誘導する処置が必要な患者に投与した時、血管新生および脈管形成を誘導する、６．に記載の血管新生および脈管形成誘導因子。
【０１６０】
８．上記血管新生および脈管形成誘導因子が、所望の因子の生産を増すために分化誘導化合物に暴露され、そして共培養された時、幹細胞により分泌される因子である６．に記載の血管新生および脈管形成誘導因子。
【０１６１】
９．上記分化誘導化合物が脳抽出物およびカルシウムから本質的になる群から選択される、８．に記載の血管新生および脈管形成誘導因子。
【０１６２】
１０．上記脳抽出物が脳細胞、脳から得られる細胞および培地で培養された間質細胞からの上清から本質的になる群から選択される、９．に記載の血管新生および脈管形成誘導因子。
【０１６３】
１１．６．に記載の血管新生および脈管形成誘導因子を得る方法であって：
分化前の組織からヒト間葉系幹細胞を単離し、そして精製し；そして
神経学的および筋骨格治療用の道具を生産するために間葉系幹細胞を培養拡大する、
工程を含んでなる上記方法。
【０１６４】
１２．幹細胞が組織修復に必要な所望する細胞表現型に分化し、そして生産することができる、単離され、そして分化を誘導する化合物の影響下で培養拡大された間葉系幹細胞。
【０１６５】
１３．上記の分化を誘導する化合物が脳抽出物およびカルシウムから本質的になる群から選択される、１２．に記載の幹細胞。
【０１６６】
１４．上記の脳抽出物が脳細胞、脳から得られる細胞および培地で培養された間質細胞からの上清から本質的になる群から選択される、１３．に記載の幹細胞。
【０１６７】
１５．細胞の修復能力の方向転換に使用するための１２．に記載の幹細胞。
【０１６８】
１６．幹細胞から単離した血管新生および脈管形成誘導因子を製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含んでなる治療薬を投与することによる、治療が必要な患者の血管新生および脈管形成を誘導するための治療であって、治療薬が患者に血管新生および脈管形成を誘導する上記治療。
【０１６９】
１７．上記投与工程が、皮下、非経口的、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、くも膜下内、および注入技術を介することから本質的になる群から選択される様式で治療薬を投与することを含む、１６．に記載の治療。
【０１７０】
１８．幹細胞から単離した血管新生および脈管形成誘導因子を製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含んでなる治療薬を投与することによる組織修復を誘導する方法であって、治療薬が組織修復を誘導する上記方法。
【０１７１】
１９．上記投与工程が、皮下、非経口的、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、くも膜下内、および注入技術を介することから本質的になる群から選択される様式で治療薬を投与することを含む、１８．に記載の方法。
【０１７２】
２０．細胞の機能の増大に使用するための治療薬であって、該治療薬が幹細胞から単離された細胞機能の増強因子を、細胞の機能を増大するための製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含んでなる上記治療薬。
【０１７３】
【表５】
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【０１７４】
【表６】
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【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
【表８】
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【０１７７】
本発明の他の利点は容易に評価され、それは前述の詳細な説明を参照にして添付の図面と一緒に考える時、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１ＡからＥはＢＤＮＦ（図１Ａ）、ＮＧＦ（図１Ｂ）、ｂＦＧＦ（図１Ｃ）、ＶＥＧＦ（図１Ｄ）およびＨＧＦ（図１Ｅ）の増殖因子の分泌を示す写真である。
【図２】図２ＡおよびＢは中大脳動脈の閉塞そして静脈内ＭＳＣでの処置有り、または処置無しの前後のラットにおける行動機能試験の結果を表すグラフである。
【図３】図３ＡおよびＢはＭＳＣ分泌がインビボで血管新生を誘導するかどうかを試験するためのラット角膜の新生血管形成モデルの使用を示す写真であり、図３Ａは模擬−手術した角膜には新生血管形成の根拠はないことを示し、そして図３Ｂは角膜ポケット内に挿入されたコラーゲン水中に配置されたＭＳＣ上清を示し、ここでは強固な角膜の新生血管形成が明らかである。
【図４】本発明を支持するために行った実験の具体的説明を示し、ここでは骨髄が動物から抽出され、そしてＭＳＣが分離され、そして３〜５継代まで培養され、ＭＳＣが神経損傷の動物に注射され、そして細胞は損傷組織に選択的に移動し、そして損傷の境界領域に局在し、次いでＭＳＣが、ＭＳＣ、実質細胞分泌および増殖および栄養因子により媒介される一連の修復的出来事を活性化し、これが神経学的機能を改善する。
【図５】図５は８つの右半球を３つのサブ領域および８つの場に分割する、ラット脳の前交連のレベルで同定された標準的な皮質切片を示す。
【図６】図６ＡおよびＢは中大脳動脈閉塞の前後の、行動的機能試験の結果を示すグラフである。
【図７】図７はアポトーシス細胞（図７ａ−ｄ）およびＢｒｄＵ−陽性細胞（図７ｅ−ｈ）を示す。
【図８】図８ＡおよびＢは、脾臓細胞とｈＭＳＣとの間の混合リンパ球反応を示すグラフである。
【図９】図９はラット脳における外因性ヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）および内因性脳細胞の形態学的特徴を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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