(57)【要約】      （修正有）【課題】アッセイのために混合される成分の容積異常を特定する制御方法を含むアッセイ装置用クローズドシステムを提供する。【解決手段】ある濃度の該対照色素を含む所定容積の該溶液を複数の容器それぞれに移送し、それぞれの容器内の対照色素の強度を測定し、所定の閾値と比較し、特定の容器において測定された強度が該所定の閾値未満である場合に流体移送異常が検出されたとする。また、測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器の平均強度値を集計算出し、該平均強度値の周りの所定の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において測定された強度が該範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体移送制御方法であって、
a)  対照色素を含む移送される溶液を用意すること、
b)  ある濃度の該対照色素を含む所定容積の該溶液を複数の容器それぞれに移送することと、
c)  それぞれの容器内の該対照色素の強度を測定することと、
d)  それぞれの容器ごとに工程c)で測定された強度を所定の閾値と比較し、特定の容器について工程c)で測定された強度が該所定の閾値未満である場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
e)  工程c)で測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器の平均強度値を集計算出することと、
f)  工程c)で測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器を対象にして該強度が工程e)で集計算出された該平均強度値の周りの所定の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において工程c)で測定された強度が該範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
g)  工程c)で測定された強度が工程f)の該所定の範囲内にあるすべての容器について適正な流体移送が行われたことを宣言することと、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記複数の容器が、マルチウェルプレートとして配置され、該マルチウェルプレートが、少なくとも8個のウェル、好ましくは少なくとも96個のウェル、より好ましくは少なくとも384個のウェル、最も好ましくは少なくとも1536個のウェルを有する、請求項１に記載の流体移送制御方法。
【請求項３】
工程d)の前記閾値が、参照溶液を用いて測定された強度値に基づいて事前に規定され、該参照溶液が、工程b)の容積および対照色素濃度を有する、請求項１または２に記載の流体移送制御方法。
【請求項４】
ある濃度のクエンチャー分子を含む所定容積の第2の溶液を前記容器に添加しかつ該クエンチャー分子が工程a)で使用された前記対照色素の強度をクエンチし、以下の追加の工程、すなわち、
h)  それぞれの容器内の前記対照色素のクエンチされた強度を測定することと、
i)  それぞれの容器ごとに工程h)で測定されたクエンチされた強度に基づいてクエンチングパラメーター値を計算し、特定の容器において該クエンチングパラメーター値の所定のクエンチング閾値基準が満たされない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
j)  工程i)で計算されたクエンチングパラメーター値が該所定のクエンチング閾値基準を満たすすべての容器の平均クエンチングパラメーター値を集計算出することと、
k)  工程i)で計算されたクエンチングパラメーター値が該所定のクエンチング閾値基準を満たすすべての容器を対象にして該クエンチングパラメーター値が工程j)で集計算出された該平均クエンチングパラメーター値の周りの所定の第2の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において工程i)で計算された該クエンチングパラメーター値が該所定の第2の範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
l)  工程i)で計算されたクエンチングパラメーター値が工程k)の該所定の第2の範囲内にあるすべての容器について適正な第2の流体移送が行われたことを宣言することと、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項５】
工程i)の前記計算されたクエンチングパラメーター値が、工程c)で測定された前記対照色素の強度と工程h)で測定された前記対照色素のクエンチされた強度との比である、請求項４に記載の流体移送制御方法。
【請求項６】
前記所定のクエンチング閾値基準が、2つの参照溶液を用いた測定に基づくものであり、第1の参照溶液が、工程b)の容積および対照色素濃度を有し、かつ第2の参照溶液が、請求項４に記載の容積およびクエンチャー分子濃度を有する、請求項４または５記載の流体移送制御方法。
【請求項７】
クエンチャー分子を含む前記所定の容積の第2の溶液を、工程g)の後かつ工程h)の前に前記容器に添加する、請求項４〜６のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項８】
クエンチャー分子を含む前記所定の容積の第2の溶液を、工程c)の前に前記容器に添加する、請求項４〜６のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項９】
工程c)での前記対照色素の前記強度および工程h)での前記対照色素の前記クエンチされた強度を、前記対照色素のクエンチ状態と非クエンチ状態とを切り換える溶液パラメーターの調節に基づいて前記容器内で逐次的に測定する、請求項８に記載の流体移送制御方法。
【請求項１０】
前記溶液を、検出色素を含有する後続のリアルタイムPCR増幅のために工程a)〜g)に従って移送する、請求項１〜９のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項１１】
前記溶液を、検出色素を含有する後続のリアルタイムPCR増幅のために工程a)〜l)に従って移送する、請求項４〜９のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項１２】
前記対照色素および前記検出色素が蛍光色素である、請求項１０または１１記載の流体移送制御方法。
【請求項１３】
前記対照色素がオリゴヌクレオチドに結合される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項１４】
前記クエンチャー分子が第2のオリゴヌクレオチドに結合される、請求項４〜１３のいずれか１項記載の流体移送制御方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドが相補的配列を有する、請求項１３または１４記載の流体移送制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体移送制御方法に関する。より詳細には、本発明は、移送される流体中の色素の強度の測定に基づく方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アッセイの準備のために、ほとんどの場合、複数の流体試薬を混合する必要があり、かつ該アッセイの再現性のある結果を得るために、制御された容積のそれぞれの試薬およびサンプルを移送することが重要である。すべての流体移送プロセスは特定の変動を有するので、移送異常を回避することはできないが、少なくとも、許容できない異常を有する移送プロセスのアッセイの結果を無視するためにはそうした移送プロセスを検出することが可能でなければならない。
【０００３】
なかでもとくにリアルタイムPCRシステムは、サンプル材料の量、プライマー／プローブの量、さらにはリアルタイムPCRに必要とされるマスターミックスの量が定量結果にとくに影響を及ぼすので、信頼性のある比較可能な定量を行うためにすべての反応成分の正確な混合を必要とする。しかし、当然ながら、他のアッセイもまた、複数の成分を混合する装置を必要とし、かつ容積移送に関して該装置を制御することもまた、重要である。
【０００４】
こうした不確定性に対処するために、規格化技術を使用することが可能であり、定量的リアルタイムPCR（qPCR）に対して主に以下の2つの異なる規格化方法が確立されている。すなわち、
（1）サンプル材料（DNAまたはRNA）の差に関して規格化するために、レギュレートされない参照遺伝子を標的遺伝子と組み合わせて測定し、標的／参照の比を計算する（相対定量法、たとえば、LightCycler 480オペレーターズマニュアルの179頁以降を参照されたい）。
【０００５】
（2）蛍光強度差に関して規格化するために、参照色素（qPCR反応に関与しない）を添加し、すべての測定蛍光値を参照色素蛍光に対して規格化する（Applied Biosystems、ROX参照色素、米国特許第5,736,333号明細書）。
【０００６】
しかし、これらの規格化方法はいずれも、問題を呈する。規格化方法（1）は、相対定量を適用した場合にのみサンプル材料の量／質を制御でき、絶対定量を用いた場合には制御できない。さらに、この方法は、サンプル材料以外の他のPCR成分の量を制御しない。規格化方法（2）は、qPCRシステムの変動により発生する蛍光強度差に関して規格化するにすぎない。該方法は、特定の成分の量が特定の限界値未満であるときにも、制御も使用者への警告も行わない。
【０００７】
現在、アッセイ装置用の混合すべき成分の容積を制御するシステムを備えた流体移送制御システムは従来技術で知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,736,333号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】LightCycler 480オペレーターズマニュアル
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アッセイのために混合される成分の容積異常を特定する制御方法を包含するアッセイ装置用クローズドシステムを提供する。本発明に係る方法は、なかでもとくにリアルタイムPCR増幅装置に好適である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様は、流体移送制御方法である。この方法は、
a)  対照色素を含む移送される溶液を用意すること、
b)  ある濃度の該対照色素を含む所定容積の該溶液を複数の容器それぞれに移送することと、
c)  それぞれの容器内の対照色素の強度を測定することと、
d)  それぞれの容器ごとに工程c)で測定された強度を所定の閾値と比較し、特定の容器において工程c)で測定された強度が該所定の閾値未満である場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
e)  工程c)で測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器の平均強度値を集計算出することと、
f)  工程c)で測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器を対象にして該強度が工程e)で集計算出された該平均強度値の周りの所定の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において工程c)で測定された強度が該範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
g)  工程c)で測定された強度が工程f)の該所定の範囲内にあるすべての容器について適正な流体移送が行われたことを宣言することと、
を含む。
【００１２】
「溶液」とは、容器内で後続の反応に供するために容器内に移送する必要のあるあらゆる種類の液体成分に対する一般用語として本明細書全体を通じて用いられるものであり、該反応は、該容器に追加成分の添加を要するものであってもよい。したがって、本発明に係る方法は、該反応の前に行う必要のあるそれぞれの移送工程に適用可能である。2つ以上の溶液を1つの反応容器に移送する場合、それぞれの該溶液を異なる識別色素と混合することが可能である。他の選択肢として、それぞれの溶液は、同一の色素を有することが可能であり、そしてそれぞれの工程後の強度の変化を移送制御に使用することができる。
【００１３】
本発明全体を通じて、対照色素は、移送制御用として使用される。対照色素の存在は、使用される色素に応じて好適な装置を用いて、たとえば、光学色素に対してはPMTもしくはCCDチップを用いてまたは放射性色素の場合にはシンチレーションカウンターを用いて、測定することができる。
【００１４】
測定強度は、ソフトウェアモジュールにより処理され、該ソフトウェアモジュールは、計算値を特定の閾値（たとえば、最小の蛍光、平均値からの偏差の範囲）と比較する。ソフトウェアモジュールは、(a)特定の容器が移送制御検査で不合格になったことを使用者に警告するか（「ソフトクロージング（soft closing）」）または(b)移送制御が不合格になった容器の結果計算を禁止するか（「ハードクロージング（hard closing）」）のいずれかの出力信号を発生する。さらに、移送異常が検出された容器のさらなる処理を回避するためにソフトウェアモジュールを使用することが可能である。
【００１５】
本発明の利点は、特定の用途に必要とされるすべての成分の移送容積の正確性を自動で独立に検査することである。とくに、自動液体操作システム（ピペッティングロボット）を反応装置に使用した場合、目測による手動制御をプロセスに適用することはできない。さらに、小容積用途（全反応容積<3μl）での移送プロセス制御は、（サブ）マイクロリットル容積の液体操作が確度および再現性に関してきわめて重要であるので、とくに適合する。
【００１６】
本発明の他の態様は、リアルタイムPCR増幅ワークフローにおける流体移送制御方法である。この方法は、
i)  対照色素を含む移送される溶液を用意すること、
ii)  ある濃度の該対照色素を含む所定容積の該溶液を複数の容器それぞれに移送することと、
iii)  それぞれの容器内の対照色素の強度を測定することと、
iv)  それぞれの容器ごとに工程iii)で測定された強度を所定の閾値と比較し、特定の容器において工程iii)で測定された強度が該閾値未満である場合に流体移送異常を検出することと、
v)  該複数の容器内でリアルタイムPCR増幅を行い、工程iv)で流体移送異常が検出された容器内で行われたリアルタイムPCR増幅の結果にそれに応じてマークを付すことと、
を含む。
【００１７】
他の選択肢として、本発明に係るリアルタイムPCR増幅ワークフローにおける流体移送制御方法は、工程v)の代わりに以下の工程、すなわち
v')  工程iv)で流体移送異常が検出されなかった容器内でリアルタイムPCR増幅を行うこと
を用いて実施することも可能である。
【００１８】
リアルタイムPCR増幅は複数の成分を必要とするので、それぞれの成分は、移送制御用として同一もしくは異なる色素を含有しうる。リアルタイムPCR反応を開始する前、リアルタイムPCR機器を用いてそれぞれの色素の強度を測定する。たとえば、1つの対照色素はqPCRマスターミックス中に含有され、第2の対照色素はサンプル材料中に含有され、そして第3の対照色素はプライマー／プローブ混合物中に含有される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る方法を実行するソフトウェアのスクリーンショットであり、複数の容器の移送制御結果を示している。
【図２】本発明に係る方法のPCR実施形態を実行するソフトウェアのスクリーンショットであり、複数の容器のPCR増幅曲線の出力を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一態様は、流体移送制御方法である。この方法は、
a)  対照色素を含む移送される溶液を用意すること、
b)  ある濃度の該対照色素を含む所定容積の該溶液を複数の容器それぞれに移送することと、
c)  それぞれの容器内の対照色素の強度を測定することと、
d)  それぞれの容器ごとに工程c)で測定された強度を所定の閾値と比較し、特定の容器において工程c)で測定された強度が該所定の閾値未満である場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
e)  工程c)で測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器の平均強度値を集計算出することと、
f)  工程c)で測定された強度が該所定の閾値以上であるすべての容器を対象にして該強度が工程e)で集計算出された該平均強度値の周りの所定の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において工程c)で測定された強度が該範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
g)  工程c)で測定された強度が工程f)の該所定の範囲内にあるすべての容器について適正な流体移送が行われたことを宣言することと、
を含む。
【００２１】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、該複数の容器は、マルチウェルプレートとして配置され、マルチウェルプレートは、少なくとも8個のウェル、好ましくは少なくとも96個のウェル、より好ましくは少なくとも384個のウェル、最も好ましくは少なくとも1536個のウェルを有する。
【００２２】
当業者であればわかるであろうが、他の選択肢として、保持ラック内に個別容器を配置することも同様に本発明に好適である。当然ながら、マルチウェルプレートのウェルのいくつかを空の状態で放置してこれらの複数の容器のそれぞれが流体移送を受けないようにすることが本発明全体を通じて可能である。
【００２３】
本発明に係るさらに他の好ましい流体移送制御方法では、工程d)の該閾値は、参照溶液を用いて測定された強度値に基づいて事前に規定される。ただし、該参照溶液は、工程b)の容積および対照色素濃度を有する。
【００２４】
溶液がまったく入っていないために強度がまったく観測されない容器さらには所定の容積のごく一部分だけを受け取った容器を検出するために、該閾値を第1の移送制御用として用いる。適当な閾値を見いだすために、所定の流体移送プロセスの容積および色素濃度を有する溶液を用いて参照測定を行い、測定された強度を閾値として使用することができることが好ましい。
【００２５】
他の選択肢として、空の容器のバックグラウンド強度を用いて所定の閾値を規定することが可能である。たとえば、閾値をバックグラウンド強度の3倍と規定することが可能である。
【００２６】
わずかな移送変動は許容されうるので、測定強度の特定の偏差たとえば約10%の偏差を許容することがより好ましい。この例では、10%の移送異常は依然として許容される。測定強度に依存して「移送制御合格」または「移送制御不合格」として容器にフラグが立てられる。
【００２７】
この第1の移送制御に加えて、容器間の偏差を評価するために第2の移送制御が行われる。なぜなら、該偏差は、該容器の意味のある比較に関して問題を引き起こすからである。該第2のピペッティング制御は、第1のピペッティング制御に合格したすべての容器の平均強度値の周りの所定の範囲に基づく。測定強度に依存して「範囲制御合格」または「範囲制御不合格」として容器にフラグが立てられるであろう。
【００２８】
この第2のピペッティング制御は、本方法のそれぞれの使用間で移送される溶液の変動が大きい状況下ではとくに重要である。移送される溶液のこうした変動は、本方法の後続の適用間の容積のずれまたは対照色素濃度のシフトに起因しうる。そのような状況下では、本方法のそれぞれの使用に適用される平均値に意味のある閾値を設定することはできない。
【００２９】
したがって、本発明は、比較可能な容器を特定すべくそれぞれの実験ごとに平均強度値が決定されるので他の所定の閾値を必要とすることなく実際の移送実験のみに基づいて自動ピペッティング制御を行う可能性を提供する。
【００３０】
第1の移送制御と組み合わせて、規定量からかけはなれた移送容積を有する容器は、平均強度値の決定に使用されないことが保証される。なぜなら、こうした容器は、第2の制御の値を大幅にゆがめるからである。
【００３１】
主として、平均強度値の周りのそのような範囲を使用するのに好適な2つの異なる実施形態が存在する。
【００３２】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法は、工程f)の該所定の範囲が工程e)で集計算出された該平均強度値の周りに対称に存在する方法である。
【００３３】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法は、工程f)の該所定の範囲が工程e)で集計算出された該平均強度値の周りに非対称に存在する方法である。
【００３４】
これらの2つの実施形態は、許容される変動の異なる状況を反映している。より小さいおよびより大きい移送容積への変化が同じように重要である状況下では、対称な範囲が使用され、該範囲の幅は許容される移送変動に基づいて事前に決定される。たとえばより大きい容積への変動が重要でない状況下では、より小さい容積に対して小さい部分範囲およびより大きい容積に対してより大きい部分範囲を有する非対称な範囲を使用することが好ましい。
【００３５】
2つ以上の溶液をそれぞれの容器内に移送する必要がある場合、他の溶液に対しても本発明の範囲内で制御を使用することが可能である。一実施形態では、他の溶液もまた対照色素と混合されるであろう。本発明全体を通じて、溶液が逐次的に容器に添加される場合かつそれぞれの溶液の添加後に強度が測定される場合、それぞれの溶液に対して同一の対照色素を使用することが可能である。したがって、この実施形態での移送制御は、特定の溶液を添加した後の対照色素の強度増加に基づく。他の選択肢として、それぞれの溶液を異なる対照色素と混合することが可能である。ただし、該色素は、スペクトルにより識別可能なものにする。したがって、この実施形態では、すべての色素の強度を独立に測定できるので、溶液は、すべてを一度にまたは逐次的に容器に添加可能である。
【００３６】
2つの溶液を容器に添加する必要がある場合、本発明に係る好ましい方法では、第1の溶液に対して対照色素を使用し、第2の溶液に対してクエンチャー分子を使用する。この構成は、1種の色素だけを用いて2つの移送制御を確立でき、そのことにより強度を測定する装置は、2種の色素を必要とする構成と比較してそれほど複雑でなくてすむという利点を有する。
【００３７】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法は、ある濃度のクエンチャー分子を含む所定容積の第2の溶液を容器に添加しかつ該クエンチャー分子が工程a)で使用された該対照色素の強度をクエンチする方法である。該方法は、以下の追加の工程、すなわち、
h)  それぞれの容器内の対照色素のクエンチされた強度を測定することと、
i)  それぞれの容器ごとに工程h)で測定されたクエンチされた強度に基づいてクエンチングパラメーター値を計算し、特定の容器において該クエンチングパラメーター値の所定のクエンチング閾値基準が満たされない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
j)  工程i)で計算されたクエンチングパラメーター値が該所定のクエンチング閾値基準を満たすすべての容器の平均クエンチングパラメーター値を集計算出することと、
k)  工程i)で計算されたクエンチングパラメーター値が該所定のクエンチング閾値基準を満たすすべての容器を対象にして該クエンチングパラメーター値が工程j)で集計算出された該平均クエンチングパラメーター値の周りの所定の第2の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において工程i)で計算された該クエンチングパラメーター値が該所定の第2の範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
l)  工程i)で計算されたクエンチングパラメーター値が工程k)の該所定の第2の範囲内にあるすべての容器について適正な第2の流体移送が行われたことを宣言することと、
を含む。
【００３８】
この実施形態では、第2の流体移送制御もまた、2つの制御工程すなわち以上に記載の「移送制御」および「範囲制御」に基づく。工程h)〜l)は工程a)〜g)の後であるので、本発明の範囲内で可能な2つの異なる実施形態が存在する。
【００３９】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、工程h)〜l)は、工程d)で流体移送異常が検出されなかった容器でのみ行われる。
【００４０】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、工程h)〜l)は、適正な流体移送が行われたことが工程g)で宣言された容器でのみ行われる。
【００４１】
本発明に係る方法の用途に応じて、第1の流体移送の一方または両方の移送制御に合格した場合にのみ第2の流体移送を行うことが好ましいこともある。一方、特定数の容器でのみワークフローを停止するよりも不合格になった容器でさえも全ワークフローを行うことがより理にかなっている場合、それぞれの異常を有するものについては容器に少なくともフラグを立てる。
【００４２】
第2の流体移送の第1の移送制御では、所定のクエンチング閾値基準と比較するためにクエンチングパラメーター値を計算する。クエンチングパラメーターは、工程h)で測定されたクエンチされた強度に基づくものであり、主として、そのようなクエンチングパラメーターの2つの主要な実施形態が存在する。すなわち、該パラメーターは、測定されたクエンチされた強度そのものであるか、または該パラメーターは、対照色素強度およびクエンチされた強度を用いて集計算出された比である。
【００４３】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、それぞれの容器ごとのクエンチングパラメーター値は、工程h)で測定された対照色素のクエンチされた強度である。
【００４４】
本発明に係るより好ましい流体移送制御方法では、工程h)で測定された対照色素のクエンチされた強度が所定のクエンチ閾値以上の場合に特定の容器における流体移送異常が工程i)において検出されることとする。
【００４５】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、工程i)の該計算されたクエンチングパラメーター値は、工程c)で測定された対照色素の強度と工程h)で測定された対照色素のクエンチされた強度との比である。
【００４６】
本発明に係る他のより好ましい流体移送制御方法では、該比が所定のクエンチ閾値比未満であるかまたはそれ以上の場合に、特定の容器における流体移送異常が工程i)において検出されることとする。
【００４７】
第2の溶液の移送異常は、容器内の少量のクエンチャー分子に相当するので、測定されたクエンチされた強度は、予想よりも高いであろう。したがって、ピペッティング異常の場合、工程c)で測定された対照色素の強度を工程h)で測定された対照色素のクエンチされた強度で割り算した比は、所定のクエンチ閾値比未満であろう。一方、工程h)で測定された対照色素のクエンチされた強度を工程c)で測定された対照色素の強度で割り算した比は、ピペッティング異常を検出するには所定のクエンチ閾値比よりも大きくなければならない。
【００４８】
第1の流体移送の閾値および範囲に関連して論述したように、所定のクエンチング閾値基準もまた、参照溶液を用いた測定に基づくものであり、当然ながら、この実施形態では2つの参照溶液が必要とされる。
【００４９】
この場合も、空の容器の強度およびクエンチャー分子を有していない容器の強度を用いて同様に該所定のクエンチング閾値基準を実験的に規定することが可能である。
【００５０】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、該所定のクエンチング閾値基準は、2つの参照溶液を用いた測定に基づくものであり、第1の参照溶液は、工程b)の容積および対照色素濃度を有し、かつ第2の参照溶液は、該第2の溶液の流体移送で使用される容積およびクエンチャー分子濃度を有する。
【００５１】
該第2の範囲に関しても同様に、その設定には2つの異なる実施形態が存在し、第1の範囲に関する以上の論述がこの場合にもあてはまる。
【００５２】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、工程k)の該所定の第2の範囲は、工程j)の該平均クエンチングパラメーター値の周りに対称に存在し、かつ該第2の範囲の幅は、許容される移送変動に基づいて事前に規定される。
【００５３】
本発明に係るさらに他の好ましい流体移送制御方法では、工程k)の該所定の第2の範囲は、工程j)の該平均クエンチングパラメーター値の周りに非対称に存在し、かつ該非対称の第2の範囲は、より小さいまたはより大きい移送容積への異なる許容される移送変動に基づいて事前に規定される。
【００５４】
本発明に係る方法の一連の異なる工程に関して、第2の溶液を添加するための2つの異なる選択肢が存在する。
【００５５】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、クエンチャー分子を含む該所定の容積の第2の溶液は、工程g)の後かつ工程h)の前に容器に添加される。
【００５６】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、クエンチャー分子を含む該所定の容積の第2の溶液は、工程c)の前に容器に添加される。
【００５７】
したがって、第1の選択肢では、すなわち、第1の流体移送の制御が終了した後で第2の溶液を添加する場合、対照色素の強度の測定は、クエンチャー分子の存在前に行われる。
【００５８】
第2の選択肢では、いずれの流体移送制御を行う前からも両方の溶液が混合されるので、両方の制御測定で対照色素およびクエンチャー分子が容器内に存在する。本発明に係る方法のこの構成は、該容器内で対照色素のクエンチングのオンとオフの切換えをすることができる場合に可能である。
【００５９】
本発明に係るより好ましい流体移送制御方法では、工程c)での対照色素の該強度および工程h)での対照色素の該クエンチされた強度は、対照色素のクエンチ状態と非クエンチ状態とを切り換える溶液パラメーターの調節に基づいて容器内で逐次的に測定する。
【００６０】
クエンチャー分子が対照色素の強度をクエンチできるように、クエンチャー分子は、対照色素のごく近傍に存在する必要があるので、クエンチャー分子は、対照色素に結合する親和性を有していなければならない。したがって、対照色素へのクエンチャー分子の結合を回避するためには、容器の溶液中で該親和性に打ち勝つことが可能でなければならない。クエンチャー分子と対照色素との間の相互作用の種類に応じて、該相互作用を回避する手順については、当業者であればわかるであろう。
【００６１】
本発明に係る他のより好ましい流体移送制御方法では、該溶液パラメーターは溶液温度である。
【００６２】
本発明に係るさらに他のより好ましい流体移送制御方法では、該溶液パラメーターは、溶液のモル濃度または溶液のpHである。
【００６３】
以上に挙げたクエンチャー分子と対照色素との親和性に加えて、対照色素の発光およびクエンチャー分子の吸光度をスペクトル的に互いに調節することが重要である。発光スペクトルと吸光度スペクトルとのオーバーラップが十分に徹底していない場合、クエンチングは不十分になるであろう。
【００６４】
本発明に係るさらに他の好ましい流体移送制御方法では、該クエンチャー分子および該対照色素は、対照色素の強度が効果的に該クエンチャー分子によりクエンチされるようにスペクトル的に調節される。
【００６５】
一方、対照色素の発光スペクトルの一部分のみをクエンチする吸光度スペクトルを有するクエンチャー分子を使用することが可能であり、その結果対照色素強度およびクエンチされた強度の測定は、クエンチャー分子の吸光度スペクトルに対応する周波数スペクトル内でのみ行われる。
【００６６】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、該対照色素は蛍光色素である。
【００６７】
本発明の範囲を限定するものではないが、本発明に係る方法は、なかでもとくにリアルタイムPCR増幅の準備のための流体移送プロセスに好適である。そのようなリアルタイムPCRでは、複数の成分、すなわち、増幅されるサンプル、ポリメラーゼとヌクレオチドとを含むマスターミックス、さらにはプライマーとプローブとを含む検出ミックスが混合される。本発明に係る好適な流体移送プロトコルの一例では、対照色素を含むマスターミックスが検出ミックスと混合され、かつ該混合物が第1の流体移送制御を行う容器に移送される。その後、クエンチャー分子を含むサンプルが第2の流体移送制御を行う該容器に添加される。他の選択肢として、当然ながら、対照色素を含むサンプルとクエンチャー分子を含むマスターミックスとを使用することが可能である。さらに、検出ミックスに添加された第2の対照色素を用いることによりマスターミックスと検出ミックスとの混合を制御することが可能である。
【００６８】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、該溶液は、検出色素を含有する後続のリアルタイムPCR増幅のために工程a)〜g)に従って移送される。
【００６９】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、該溶液は、検出色素を含有する後続のリアルタイムPCR増幅のために工程a)〜l)に従って移送される。
【００７０】
リアルタイムPCRの準備時に流体移送制御のために本発明に係る方法を適用する場合、PCR増幅のオンラインモニタリングに必要とされる検出色素の発光スペクトルが対照色素による影響を受けないことを考慮に入れることが重要である。
【００７１】
本発明に係るより好ましい流体移送制御方法では、該対照色素を、該検出色素からスペクトル的に分離する。
【００７２】
本発明に係る他のより好ましい流体移送制御方法では、該対照色素および該検出色素は蛍光色素である。
【００７３】
本発明の範囲を限定するものではないが、本発明に係る方法の好ましい実施形態は、対照色素さらにはクエンチャー分子の両方におけるアフィニティータグとしてのオリゴヌクレオチドに基づく。
【００７４】
本発明に係る好ましい流体移送制御方法では、該対照色素は、オリゴヌクレオチドに結合される。
【００７５】
本発明に係る他の好ましい流体移送制御方法では、該クエンチャー分子は、第2のオリゴヌクレオチドに結合される。
【００７６】
対照色素に結合されるオリゴヌクレオチドとクエンチャー分子に結合されるオリゴヌクレオチドとが互いに親和性を有することが望ましい場合、それらの配列は、少なくとも部分的に相補的でなければならない。
【００７７】
本発明に係るより好ましい流体移送制御方法では、該オリゴヌクレオチドおよび該第2のオリゴヌクレオチドは相補的配列を有する。
【００７８】
アフィニティータグとしてオリゴヌクレオチドを使用すれば、オリゴヌクレオチドと第2のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの融解温度以上またはそれ未満に溶液温度をそれぞれ上昇または低下させることにより対照色素のクエンチングのオンとオフの切換えを容易に行うことが可能であるというさらなる利点が得られる。
【００７９】
本発明の他の態様は、リアルタイムPCR増幅ワークフローにおける流体移送制御方法である。この方法は、
i)  対照色素を含む移送される溶液を用意すること、
ii)  ある濃度の該対照色素を含む所定容積の該溶液を複数の容器それぞれに移送することと、
iii)  それぞれの容器内の対照色素の強度を測定することと、
iv)  それぞれの容器ごとに工程iii)で測定された強度を所定の閾値と比較し、特定の容器において工程iii)で測定された強度が該閾値未満である場合には流体移送異常が検出されるとすること、および
v)  該複数の容器内でリアルタイムPCR増幅を行い、工程iv)で流体移送異常が検出された容器内で行われたリアルタイムPCR増幅の結果にそれに応じてマークを付すことと、
を含む。
【００８０】
本発明に係るリアルタイムPCR増幅ワークフローにおける流体移送制御方法の他の実施形態では、工程v)は、
v')  工程iv)で流体移送異常が検出されなかった容器内でリアルタイムPCR増幅を行うこと
により置き換えられる。
【００８１】
本発明に係るリアルタイムPCR増幅ワークフローにおける好ましい流体移送制御方法は、ある濃度のクエンチャー分子を含む所定容積の第2の溶液が工程v)の前に容器に添加されかつ該クエンチャー分子が工程i)で使用された該対照色素の強度をクエンチする方法であって、該方法は、工程v)の前に行われる追加の工程、すなわち、
A)  それぞれの容器内の対照色素のクエンチされた強度を測定することと、
B)  それぞれの容器ごとに工程A)で測定されたクエンチされた強度に基づいてクエンチングパラメーター値を計算し、特定の容器において該クエンチングパラメーター値の所定のクエンチング閾値基準が満たされない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
C)  工程B)で計算されたクエンチングパラメーター値が該所定のクエンチング閾値基準を満たすすべての容器の平均クエンチングパラメーター値を集計算出することと、
D)  工程B)で計算されたクエンチングパラメーター値が該所定のクエンチング閾値基準を満たすすべての容器を対象にして該クエンチングパラメーター値が工程C)で集計算出された該平均クエンチングパラメーター値の周りの所定の第2の範囲内にあるかを検証し、特定の容器において工程B)で測定された該クエンチングパラメーター値が該所定の第2の範囲内にない場合に流体移送異常が検出されたとすることと、
E)  工程B)で測定されたクエンチングパラメーター値が工程D)の該所定の第2の範囲内にあるすべての容器について適正な第2の流体移送が行われたことを宣言することと、
を含む。
【実施例１】
【００８２】
ピペッティング制御成分を含有するマスターミックスおよび標的DNAミックスの準備
A)  ヒトcDNA由来のGAPDH遺伝子のリアルタイムPCR用の2フォールドマスターミックスを以下の成分を含有させて準備した。 
・  1μMの配列番号1および2で示されるヒトGAPDHプライマー
・  800nMのヒトGAPDH UPLプローブ（Universal Probe Library, Probe #60, Roche Applied Science社, カタログ番号04 688 589 001）
・ RealTime ready DNA Master, Probes（Roche Applied Science社）のPCR成分を使用した。マスターミックスは、長波長蛍光染料（JA286, Roche Applied Science社; 励起極大686nm、発光極大703nm）で5'末端に末端標識された配列番号3で示される4μMのオリゴヌクレオチドを含有する。 
B)  リアルタイム増幅用の2フォールド標的DNAミックスを以下の成分を含有させて準備した。 
・  1ngのヒトcDNA（qPCR Human Reference cDNA, Clontech社, カタログ番号639654）
・  非蛍光クエンチャー（Dabsyl, Roche Applied Science社、国際公開第2007/059816号パンフレット）で3'末端に末端標識された配列番号4で示される4μMのオリゴヌクレオチド。
【００８３】
配列番号3および4で示される2種のオリゴヌクレオチドは相補的である。
【実施例２】
【００８４】
さまざまな量のマスターミックスおよび標的DNAミックスを含有するマルチウェルリアルタイムPCRプレートの準備
Nanodrop Express液体操作ロボット（Innovadyne, Part Nos. 12043 (Fluidics Module)および11245 (Stage Module)）を用いてマスターミックスと標的DNAミックスとの8つの異なる組合せを1536ウェルリアルタイムPCRプレート（Roche Applied Science社）中に充填した。
【表１】
2010243497.tif 000002
【００８５】
それぞれの組合せを1536ウェルプレートの96箇所に充填した。これは技術的反復試験を意味する。
【実施例３】
【００８６】
ピペッティング制御測定工程を含むリアルタイムPCR
分析ソフトウェアを備えたLightCycler 1536装置（Roche Applied Science社）を用いてリアルタイム増幅およびピペッティング制御測定を行った。ソフトウェアをプログラミング言語Microsoft .Net C#で書いた。
【００８７】
以下のプロトコルに従って、ピペッティング制御測定を行った後で増幅を行った。
【００８８】
A)  ピペッティング制御測定：
フィルターの組合せ618（励起）／660（発光）を用いて2回の単一取得を行った。
【表２】
2010243497.tif 000003
【００８９】
B)  リアルタイムPCR：
フィルターの組合せ465（励起）／510（発光）を用いてリアルタイム増幅を行った。
【表３】
2010243497.tif 000004
【実施例４】
【００９０】
個別リアルタイムPCR反応ウェルに対する流体移送状態計算
55℃におけるそれぞれのウェルの蛍光強度をソフトウェアの設定ファイルに保存された所定の最小蛍光閾値と比較した。1536ウェルリアルタイムPCRプレートの空のウェルの自己蛍光を分析することにより所定の閾値を実験的に決定した。空のウェルの最大測定値よりも有意に大きく閾値を設定した。プロトタイプソフトウェアにより定義された５蛍光単位に合わせて閾値を設定した。
【００９１】
その閾値未満の蛍光値を有するすべてのプレート位置を流体移送異常状態「M不合格」（マスターミックス流体移送不合格）に設定した。組合せ4および8（実施例2の表を参照されたい）のサンプルでの結果を図1に示す。
【００９２】
その蛍光閾値を超えるすべてのプレート位置に対して、55℃における蛍光を37℃における蛍光で割り算した比を計算した。計算比をソフトウェアの設定ファイルに保存された所定の最小比閾値と比較した。1536ウェルリアルタイムPCRプレートの空のウェルの比およびクエンチャーオリゴヌクレオチド（配列番号4）を含有しないウェルの比を分析することにより所定の比閾値を実験的に決定した。クエンチャーオリゴヌクレオチドを含有しないウェルの最大測定比値よりも有意に大きく比閾値を設定した。比閾値を1.5に設定した。
【００９３】
その最小比閾値未満の比を有するすべてのプレート位置を流体移送異常状態「S不合格」（構成不合格すなわち標的DNA流体移送不合格）に設定した。組合せ6および7（実施例2の表を参照されたい）のサンプルでの結果を図1に示す。
【００９４】
その最小比閾値以上のすべてのプレート位置に対して、平均比値を計算し、ソフトウェアの設定ファイルに保存された所定の比範囲と比較する。流体移送変動のPCR性能を比較することにより所定の比範囲を実験的に決定し平均比値の周りに非対称に設定した。平均比値よりも100%大きくかつ平均比値よりも50%小さく許容範囲を設定した。
【００９５】
その範囲外の比を有するすべてのプレート位置を流体移送異常状態「S不合格」（構成不合格すなわち標的DNA流体移送不合格）に設定した。
【００９６】
所定の最小蛍光閾値を超え、所定の最小比閾値を超え、かつ所定の比範囲内にある蛍光値を有するすべてのプレート位置を流体移送状態「合格」に設定した。組合せ1、2、3、および5のサンプルでの結果を図1に示す。
【実施例５】
【００９７】
リアルタイムPCR結果と組み合わせた流体移送制御結果の表示
流体移送制御の状態をリアルタイムPCRの結果の表内に表示する（図1）。使用者は、ソーティングおよびフィルタリングにより、特定の流体移送制御状態を選択し、有効なリアルタイムPCR反応と無効な反応とを識別することを可能にする。図1からわかるように、流体移送制御状態「合格」と表示されたサンプルでは、ポジティブコール（positive call）および有効Cp値も表示される。流体移送制御状態「不合格」（M不合格またはS不合格）と表示されたサンプルでは、マスターミックスと標的DNAミックスとの組合せの意図された構成に基づいてネガティブコール（negative call）が表示されCp値が表示されない。
【００９８】
結果の表を、リアルタイム増幅曲線と組み合わせる（図2）。図2からわかるように、流体移送制御状態「合格」と表示されたサンプルでは、陽性増幅曲線が表示される。流体移送制御状態「不合格」（M不合格またはS不合格）と表示されたサンプルでは、マスターミックスと標的DNAミックスとの組合せの意図された構成に基づいて陰性増殖曲線が表示される。
【図１】
2010243497.tif 000005
【図２】
2010243497.tif 000006
【配列表】
2010243497000001.app
【外国語明細書】
2010243497000001.pdf