(57)【要約】【課題】目的タンパク質を高感度に検出することができるタンパク質定量システムを提供する。【解決手段】タンパク質定量システム２０は、基板表面に形成されたソース領域４およびドレイン領域５と、ソース領域４とドレイン領域５との間の基板表面上に形成されたゲート部７と、ゲート部７の基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液１２を介してゲート部７に電圧を印加する参照電極１とを備えるとともに、ゲート部７の基板表面に面する側とは反対側の面に、目的タンパク質１４と特異的に相互作用するリガンド１３が結合されているトランジスタ１０と、リガンド１３に特異的に相互作用した目的タンパク質１４に電荷付与試薬１５が結合することによって、ソース領域４とドレイン領域５との間に生じるチャネルを流れる電流を測定する電流計９とを含んでいる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象である対象タンパク質の濃度を測定する測定システムであって、
基板表面に形成されたソース領域およびドレイン領域と、
上記ソース領域と上記ドレイン領域との間の基板表面上に形成されたゲート部と、
上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して上記ゲート部に電圧を印加する参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面に、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されているトランジスタと、
上記リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間に生じるチャネルを流れる電流を測定する測定装置とを含むことを特徴とする測定システム。
【請求項２】
上記電荷付与分子は、ＣＢＢ  Ｇ−２５０、ドデシル硫酸ナトリウム、およびカチオン性ポリマーからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載の測定システム。
【請求項３】
上記ゲート部は、上記基板表面上に形成されたゲート絶縁層と、当該ゲート絶縁層に積層された、上記リガンドを固定化する固定化層とを有するものであることを特徴とする請求項１または２に記載の測定システム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定システムにおいて用いられるトランジスタであって、
上記ソース領域、上記ドレイン領域、上記ゲート部と、上記参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面にリガンドが結合されていることを特徴とするトランジスタ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定システムを用いた測定方法であって、
上記リガンドと上記対象タンパク質とを特異的に相互作用させる相互作用工程と、
上記相互作用工程において上記リガンドと相互作用しなかったタンパク質を除去する洗浄工程と、
上記洗浄工程の後に、上記リガンドと相互作用しているタンパク質に上記電荷付与分子を結合させる電荷付与工程と、
上記電荷付与工程の後に、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間を流れる電流を測定する測定工程とを含むことを特徴とする測定方法。
【請求項６】
対象タンパク質の濃度を測定する測定装置であって、
基板表面に形成されたソース領域およびドレイン領域と、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間の基板表面上に形成されたゲート部と、
上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して上記ゲート部に電圧を印加する参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面に、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されているトランジスタと、
上記リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間に生じるチャネルを流れる電流の変化を測定する測定部とを備えることを特徴とする測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中のタンパク質濃度を測定するための測定システム、測定装置、トランジスタおよび測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、濃度未知のタンパク質を定量するために様々な方法が用いられてきた。最も一般的に使用されているタンパク質の定量方法の１つは、ウエスタンブロット法である。ウエスタンブロット法とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの電気泳動により試料中のタンパク質を分離した後、当該タンパク質を電気的にメンブレンに転写し、試料中の目的タンパク質に対して特異的な抗体とメンブレン上で反応させて、目的タンパク質を検出する方法である。
【０００３】
上記ウエスタンブロット法は、使用する機器や試薬が安価であることから広く使用されてきたが、一連の実験操作に長時間を要し、かつ煩雑であることから、トランジスタを用いたタンパク質の定量に関する研究が盛んに行われている。
【０００４】
電気的シグナルを利用して生体物質を検出するトランジスタとして、特定の抗体に対して反応する抗原を検出できるよう設計された電界効果トランジスタが提案されている（特許文献１参照）。また、プリン、ピリミジン、およびヌクレオチドを検出できるよう設計された電界効果トランジスタも提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
現在知られている生体物質を検出するトランジスタでは、ＤＮＡを検出するもの（非特許文献１参照）が圧倒的に多く、タンパク質を検出するものはまだ少ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，２３８，７５７号明細書（公開日：１９８０，１２，９）
【特許文献２】米国特許第４，７７７，０１９号明細書（公開日：１９８８，１０，１１）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．４Ｂ，２００５，ｐｐ２８５４−２８５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質を定量する従来のトランジスタは以下の問題を有している。
【０００９】
第一に、ＤＮＡをトランジスタで定量する場合には、ヌクレオチドの有するリン酸基の負電荷とＤＮＡの電気的シグナルとが一致するが、タンパク質は各々が複雑な立体構造を有するため、アミノ酸配列から計算した電荷量と表面電荷とが一致しない。その結果、表面電荷がタンパク質量に比例せず、表面電荷からタンパク質量を正確に定量することが困難である。
【００１０】
第二に、タンパク質は高分子であり、リガンドに結合・吸着した目的タンパク質の全体をデバイ長内に収めることが困難である。このため、デバイ長内に収まっている電気的シグナルのポテンシャルの一部分（テーリング部分）で、タンパク質を高感度に検出しなければならない。それゆえ、タンパク質の検出が困難であるという問題が生じる。
【００１１】
従って、タンパク質の定量に用いることができ、かつ少ないタンパク質の電荷量を高感度に検出可能な測定装置が強く望まれていた。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりも高感度にタンパク質を検出する測定装置（トランジスタ）および測定システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る測定システムは、上記課題を解決するために、測定対象である対象タンパク質の濃度を測定する測定システムであって、基板表面に形成されたソース領域およびドレイン領域と、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間の基板表面上に形成されたゲート部と、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して上記ゲート部に電圧を印加する参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面に、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されているトランジスタと、上記リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間に生じるチャネルを流れる電流を測定する測定装置とを含むことを特徴としている。
【００１４】
上記の構成によれば、測定システムを構成するトランジスタは、ソース領域、ドレイン領域、ゲート部および参照電極を備えている。参照電極は、ゲート部の基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して当該ゲート部に電圧を印加する。このゲート部には、基板表面に面する側とは反対側の面に、対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されている。この構成により、対象タンパク質のみをゲート部の表面に留めることが可能となる。
【００１５】
そして、測定装置は、リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって生じるチャネルに流れるドレイン電流（ソース領域とドレイン領域との間を流れる電流）を測定する。
【００１６】
電荷付与試薬を対象タンパク質に結合させることで、当該対象タンパク質が少量であっても、電荷を増大させることで、対象タンパク質濃度に応じたドレイン電流を測定することが可能となる。それゆえ、対象タンパク質を従来よりも高感度に検出できる。
【００１７】
なお、電荷付与試薬が有する電荷は、正の電荷であってもよいし、負の電荷であってもよい。
【００１８】
上記電荷付与分子は、ＣＢＢ  Ｇ−２５０、ドデシル硫酸ナトリウム、およびカチオン性ポリマーからなる群から選択されるものであることが好ましい。
【００１９】
上記の構成により、対象タンパク質の電荷を増大することが可能となり、従来よりも高感度に対象タンパク質を検出することが可能となる。
【００２０】
上記ゲート部は、上記基板表面上に形成されたゲート絶縁層と、当該ゲート絶縁層に積層された、上記リガンドを固定化する固定化層とを有するものであることが好ましい。
【００２１】
上記の構成により、リガンドをゲート部に固定化することが容易となる。
【００２２】
また、上記測定システムにおいて用いられるトランジスタであって、上記ソース領域、上記ドレイン領域、上記ゲート部と、上記参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面にリガンドが結合されているトランジスタも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２３】
本発明に係る測定方法は、上記測定システムを用いた測定方法であって、上記リガンドと上記対象タンパク質とを相互作用させる相互作用工程と、上記相互作用工程において上記リガンドと相互作用しなかったタンパク質を除去する洗浄工程と、上記洗浄工程の後に、上記リガンドと相互作用しているタンパク質に上記電荷付与分子を結合させる電荷付与工程と、上記電荷付与工程の後に、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間を流れる電流を測定する測定工程とを含むことを特徴としている。
【００２４】
上記方法によれば、ゲート絶縁層上に特異的に目的タンパク質を留めておくことが可能となり、該目的タンパク質に電荷付与試薬を結合させることにより、タンパク質の電荷を増大させ、従来よりも高感度に目的タンパク質を検出することが可能となる。
【００２５】
本発明に係る測定装置は、対象タンパク質の濃度を測定する測定装置であって、基板表面に形成されたソース領域およびドレイン領域と、上記ソースと上記ドレインとの間の基板表面上に形成されたゲート部と、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して上記ゲート部に電圧を印加する参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面に、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されているトランジスタと、上記リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間に生じるチャネルを流れる電流の変化を測定する測定部とを備えることを特徴としている。
【００２６】
上記の構成によれば、測定装置は、ソース領域、ドレイン領域、ゲート部および参照電極を備えるトランジスタを備えている。トランジスタに備えられた参照電極は、ゲート部の基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して当該ゲート部に電圧を印加する。このゲート部には、基板表面に面する側とは反対側の面に、対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されている。この構成により、対象タンパク質を特異的にゲート部の表面に留めることが可能となる。
【００２７】
そして、測定装置は、リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって生じるチャネルに流れるドレイン電流を測定する。
【００２８】
電荷付与試薬を対象タンパク質に結合させることで、当該対象タンパク質が少量であっても、電荷を増大させることで、対象タンパク質濃度に応じたドレイン電流を測定することが可能となる。それゆえ、対象タンパク質を従来よりも高感度に検出できる。
【００２９】
なお、電荷付与試薬が有する電荷は、正の電荷であってもよいし、負の電荷であってもよい。
【発明の効果】
【００３０】
以上のように、本発明に係るタンパク質定量システムは、基板表面に形成されたソース領域およびドレイン領域と、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間の基板表面上に形成されたゲート部と、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して上記ゲート部に電圧を印加する参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面に、対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されているトランジスタと、上記リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによって、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間に生じるチャネルを流れる電流を測定する測定装置とを含む構成である。
【００３１】
それゆえ、対象タンパク質を従来よりも高感度に検出できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態に係るタンパク質定量システムの構成を示す図である。
【図２】目的タンパク質とリガンドと電荷付与試薬とのゲート部での反応を示す図である。
【図３】（ａ）は本発明の一実施例に係るタンパク質定量システムの構成を示す図であり、（ｂ）はタンパク質定量の原理を説明するためのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の実施の一形態について図１〜図３に基づいて説明すれば、以下のとおりである。本実施形態のタンパク質定量システム２０は、検出および測定対象である目的タンパク質（対象タンパク質、ターゲットタンパク質）１４を定量する定量システムである。後述するように、タンパク質定量システム２０では、トランジスタ１０のゲート部７に結合したリガンド１３に特異的に結合した目的タンパク質１４を電荷付与試薬１５で処理し、目的タンパク質１４に電荷付与試薬１５が結合することによって増減するドレイン電流を測定することにより、目的タンパク質１４を高感度に検出および定量する。
【００３４】
（１）タンパク質定量システム２０の構成
本実施形態のタンパク質定量システム２０の構成を図１に示した。図１に示すように、タンパク質定量システム２０は、タンパク質センサ（バイオセンサ）としてのトランジスタ１０、一定の電圧を供給する固定電源８、電流計（電流測定装置）９および供給する電圧を変更できる可変電源１６を含んでいる。
【００３５】
トランジスタ１０は、基本的には電界効果トランジスタ（Field−Effect Transistor：ＦＥＴ）であり、参照電極１、基板６の表面に形成されたソース領域４およびドレイン領域５、ソース領域４とドレイン領域５との間の基板表面上に形成されたゲート部７および液槽１１を備えている。
【００３６】
参照電極１は、ゲート部７の基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液１２を介してゲート部７に電圧を印加する。この参照電極１は、可変電源１６の陽極に接続されており、液槽１１に溜められている電解質溶液１２に、参照電極１の先端部が挿入されている。なお、可変電源１６の陰極は接地されている。
【００３７】
ソース領域４およびドレイン領域５は、Ｎ型不純物が高濃度にドープされた領域であり、基板６はＰ型不純物が高濃度にドープされたシリコン基板である。そして、ソース領域４とドレイン領域５とは、ゲート部７によって分離されている。すなわち、トランジスタ１０は、Ｎチャネル・デプレッション型のイオン感応性電界効果トランジスタ（Ion Sensitive Field−Effect Transistor：ＩＳＦＥＴ）をその基本構造として有している。ソース領域４およびドレイン領域５には、それぞれソース電極およびドレイン電極が接続されているが、これらの電極は図１には図示していない。なお、トランジスタ１０は、Ｐチャネル型のＭＯＳトランジスタをその基本構造として有していてもよい。
【００３８】
ゲート部７は、基板表面上に形成されたゲート絶縁層３を有している。ゲート絶縁層３は、例えば、シリコン酸化膜である。
【００３９】
固定化層２は、目的タンパク質１４と特異的に相互作用（結合または吸着）するリガンド１３を固定化するための層であり、シリコン窒化膜（Ｓｉ３Ｎ４）の層である。シリコン窒化膜は溶液に対する保護作用が強いため、シリコン酸化膜を溶液から保護する目的がある。固定化層２は、リガンド１３を固定化しやすいようにＡｕ、Ｐｔ、またはポリマーを含んでいてもよい。
【００４０】
リガンド１３は、固定化層２の、ゲート絶縁層３と接する側とは反対側の表面（リガンド結合面）に結合されている。換言すれば、リガンド１３は、ゲート部７の基板表面に面する側とは反対側の面に結合されている。固定化層２のリガンド結合面は、電解質溶液１２と直接接している。
【００４１】
リガンド１３は、目的タンパク質１４と特異的に相互作用することにより、目的タンパク質１４を捕捉する。リガンド１３には、抗体、人工抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマーなど、またはこれらの組み合わせが利用できる。
【００４２】
リガンド１３を固定化層２に固定化する方法として、リガンド１３を固定化層２に直接吸着させる物理吸着法、固定化層２上にＡｕまたはＰｔなどを塗布してリガンド１３と化学結合させる化学結合法、ポリマーを用いてリガンド１３を包括する包括法などが利用できる。リガンド１３を固定化層２に固定化する場合に用いるリガンド１３を含む溶液の濃度は、例えば５μｇ／ｍＬである。リガンド溶液の濃度範囲は、１〜２０μｇ／ｍＬが望ましく、更に５μｇ／ｍＬであることが望ましい。
【００４３】
電流計９は、参照電極１から電圧を印加したときに、ソース領域４からドレイン領域５に流れるドレイン電流を測定する。参照電極１から電圧を印加するとソース領域４からドレイン領域５に印加電圧に応じたドレイン電流が流れ、電流計９により該ドレイン電流が検出される。特に、電流計９は、リガンド１３に特異的に相互作用した目的タンパク質１４に電荷付与試薬１５が結合することによって生じるドレイン電流を測定する。
【００４４】
（２）リガンドへの目的タンパク質の結合および電荷付与試薬による処理
次に、リガンド１３に目的タンパク質１４を特異的に結合させ、結合した目的タンパク質１４を電荷付与試薬１５で処理する方法について説明する。図２は、目的タンパク質１４とリガンド１３と電荷付与試薬（電荷付与分子）１５とのゲート部７での反応を示す図である。
【００４５】
図２に示すように、まず、固定化層２に対する目的タンパク質１４および／または目的タンパク質１４以外の物質との非特異的吸着を防止するために、リガンド１３を固定化層２上に固定化後、固定化層２の表面をブロッキング剤でブロッキングする。ブロッキング剤としては、例えば、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液が挙げられる。ブロッキング処理により、リガンド１３に特異的に結合した目的タンパク質１４のみを検出することができる。
【００４６】
次に、リガンド１３と目的タンパク質１４とを結合させる。すなわち、リガンド１３上に目的タンパク質１４を含む溶液を滴下し、リガンド１３と結合させる。目的タンパク質１４は、生体組織から採取したものであってもよいし、クロマトグラフィーなどの精製方法を用いて精製したものであってもよく、目的タンパク質１４の調整方法は特に限定されない。
【００４７】
リガンド１３と目的タンパク質１４との反応時間は、リガンド１３および目的タンパク質１４が分解および／または変性しない範囲で、リガンド１３および目的タンパク質１４の濃度などによって決定されればよく、例えば、１〜３時間である。抗原抗体反応は数分〜３時間でよく、更に５分〜１時間が望ましい。本実施例では１０分で行った。
【００４８】
その後、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）などの適当な洗浄用緩衝液を用いて、リガンド１３に結合しなかった目的タンパク質１４を洗い流す。
【００４９】
次に、固定化層２上に電荷付与試薬１５を滴下し、所定時間放置することにより、リガンド１３に特異的に結合した目的タンパク質１４に電荷付与試薬１５を結合させる。電荷付与試薬１５と目的タンパク質１４との反応時間は、電荷付与試薬１５の種類に応じて適宜設定されればよい。電荷付与試薬１５として、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を用いる場合には、上記反応時間は、例えば５分間である。
【００５０】
電荷付与試薬１５として、ＣＢＢ  Ｇ−２５０の他に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびカチオン性ポリマー（正電荷を有するポリマー）などを用いることができる。これらのうち、ＣＢＢ  Ｇ−２５０が特に好ましい。
【００５１】
電荷付与試薬１５として、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を使用した場合は、目的タンパク質１４の高次構造や複合体構造を維持しながら目的タンパク質１４全体に負電荷を与えることが出来る。このため、目的タンパク質１４は、従来の方法で分離困難な高分子、または膜タンパク質などでもよい。
【００５２】
電荷付与試薬１５として、ＳＤＳを使用する場合は、ＳＤＳの結合は目的タンパク質１４の変性を伴うため、ＳＤＳと目的タンパク質１４との反応時間を短くするなど変性による抗原抗体反応への影響をできるだけ小さくすることが好ましい。
【００５３】
電荷付与試薬１５として、カチオン性ポリマーを用いる場合には、当該カチオン性ポリマーを目的タンパク質１４の表面に限定的に化学結合させる。この場合に利用できるタンパク質の修飾方法の一例が特開平６−１８４１９０に開示されている。
【００５４】
その後、目的タンパク質１４に結合せずに遊離した状態の電荷付与試薬１５を、０．１×ＰＢＳなどで洗浄することにより取り除く。
【００５５】
最後に、液槽１１に測定溶液である電解質溶液１２（例えば、０．１×ＰＢＳ）を注入する。
【００５６】
（３）目的タンパク質濃度を定量する原理
トランジスタ１０において、参照電極１による電圧負荷によってソース領域４からドレイン領域５にドレイン電流が流れる。このとき、リガンド１３に特異的に結合した目的タンパク質１４に、電荷を有する電荷付与試薬１５が結合することにより、ソース領域４からドレイン領域５に流れるドレイン電流が増加する。電荷付与試薬１５は、目的タンパク質１４に非特異的に結合するため、リガンド１３に特異的に結合した目的タンパク質１４の量が増えるのに伴いドレイン電流が増加する。このようにタンパク質定量システム２０では、リガンド１３に特異的に結合した目的タンパク質１４の量をドレイン電流の増加量として検出する。このドレイン電流の変化は、Ｖｇ−Ｉｄ特性を測定することで測定すればよい。
【００５７】
測定対象となる試料に含まれる目的タンパク質１４の濃度を測定するために、まず、参照電極１に印加される電圧（すなわち、可変電源１６の電圧）を変化させながら、少なくとも３つの異なる既知濃度のタンパク質溶液を用いて、所定のＩｄ値（ドレイン電流）が得られるＶｇ値（ゲート電圧）を、既知濃度のタンパク質溶液のそれぞれについて測定する。参照電極１の電圧変化は、例えば、−３〜＋３Ｖで挿引すればよい。そして、上記Ｖｇ値に対してタンパク質濃度をプロットすることにより検量線を作成する。
【００５８】
その後、目的タンパク質１４を含む試料の上記Ｉｄ値におけるＶｇ値を電流計９を用いて検出し、該Ｖｇ値を上記検量線に当てはめることで、上記試料中の目的タンパク質１４の濃度を算出する。
【００５９】
なお、可変電源１６の電圧を一定にした状態で、３つの異なる既知濃度のタンパク質溶液を用いた場合のＩｄ値（ドレイン電流）をそれぞれ測定し、Ｉｄ値に対してタンパク質濃度をプロットすることにより検量線を作成してもよい。
【００６０】
いずれにせよ、リガンド１３に特異的に相互作用した目的タンパク質１４に電荷付与試薬１５が結合することによるドレイン電流の増加を測定できればよい。
【００６１】
以上のように、タンパク質定量システム２０におけるタンパク質定量方法は、リガンド１３と目的タンパク質１４とを特異的に相互作用させる相互作用工程と、相互作用工程においてリガンド１３と相互作用しなかったタンパク質を除去する洗浄工程と、洗浄工程の後に、リガンド１３と相互作用している目的タンパク質１４に電荷付与試薬１５を結合させる電荷付与工程と、電荷付与工程の後に、ドレイン電流を測定する測定工程とを含んでいる。
【００６２】
（４）コントロールについて
ＣＢＢ  Ｇ−２５０は、リガンド１３およびブロッキング剤にも結合する。検量線を作成するために用いるリガンド１３と濃度未知のタンパク質溶液のタンパク質濃度を測定するために用いるリガンド１３とは、基本的に同じものであるため、バックグラウンドを除くためのコントロールをとる必要は必ずしもない。
【００６３】
トランジスタ１０のドリフトの影響やノイズを除くためにコントロールをとる場合には、１つの目的タンパク質１４の濃度を測定するために２つのトランジスタ１０を利用する。一方のトランジスタ１０では、リガンド１３の固定、ブロッキング、抗原抗体反応、および電荷付与試薬１５による処理を行い、他方のトランジスタ１０では、ブロッキング、抗原抗体反応、および電荷付与試薬１５による処理を行う。後者は、ノイズを含んだ測定値であるため、これをバックグラウンドとして、前者の測定値から後者の測定値を差し引き、タンパク質量のための測定値として用いる。
【００６４】
（５）タンパク質定量システム２０の効果
本発明では目的タンパク質１４の電荷量を大きくするために、電気泳動の一種であるＢＮ−ＰＡＧＥに用いられているＣＢＢ  Ｇ−２５０を電荷付与試薬１５の一例として利用している。一般的に、タンパク質の電気泳動を行う場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥが用いられる。
【００６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、電荷の小さいタンパク質にＳＤＳの負電荷を与えることで、ゲル中を泳動しやすくし、分離を行う。しかし、このＳＤＳはタンパク質の高次構造や複合体構造を壊しながら結合するため、タンパク質本来の形に基づいた分離が行えない。
【００６６】
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥは、泳動バッファ条件を検討することでタンパク質自体に電荷を与え、タンパク質本来の形のまま分離する。しかし、塩基性等電点をもつタンパク質や表面電荷の少ないタンパク質では泳動に十分な電荷をもつことが出来ず、正確な分離をも困難とする。
【００６７】
一方、ＢＮ−ＰＡＧＥは、ＳＤＳの代わりにＣＢＢ  Ｇ−２５０という色素を用いることで全体的に負電荷を帯びた状態でタンパク質を泳動させ分離する。このＣＢＢ  Ｇ−２５０は、タンパク質の高次構造や複合体構造を維持したまま、タンパク質全体に負電荷を与えることが出来るため、泳動が容易でタンパク質本来の形に基づいた分離が行える。このため、分離困難な高分子や膜タンパク質への応用も可能となる。
【００６８】
また、電気泳動によるタンパク質の検出は、タンパク質の大きさ毎に分離するというものである。このことよりサンプル溶液中に同じ大きさのタンパク質が含まれている可能性が懸念される場合など、ターゲットタンパク質だという確証を得るには、電気泳動後にウェスタンブロッティングを行って抗体による特異的反応を検出する必要がある。これらの作業は数時間に及ぶものであり、また手間のかかるものである。
【００６９】
タンパク質定量システム２０を用いれば、従来の電気泳動法に比べ、動作が速く煩雑な作業を必要とせずに、少ないタンパク質の電荷量を高感度に検出することができる。
【００７０】
また、トランジスタ１０は、高集積化が可能で簡易に製造できるため、産業上利用することが容易である。
【００７１】
〔実験結果例〕
タンパク質定量システム２０を用いてタンパク質濃度測定のための検量線を作成した実験結果の一例について説明する。図３（ａ）は本発明の一実施例に係るタンパク質定量システム２０の構成を示す図であり、図３（ｂ）はタンパク質定量システム２０におけるタンパク質定量の原理を説明するためのグラフである。
【００７２】
本実施例では、リガンド１３として抗アディポネクチン抗体（Anti Adiponectin [Acrp30],Human,(Mouse)、RSD）を用い、目的タンパク質１４としてアディポネクチンを用いた。市販のアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ）（Acrp30/Adiponectin,CF,Human、RSD）を０、２５、６２．５μｇ／ｍＬに２．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を用いて希釈することにより３種類のタンパク質溶液を調整した。
【００７３】
また、本実施例では、プロトン感応膜（Ｓｉ３Ｎ４）を固定化層２として有するトランジスタ１０を用いた。このトランジスタ１０は、図３（ａ）に示すように、Ｎチャネル・デプレッション型のＣＭＯＳ−ＩＳＦＥＴを基本構造として有するものであり、ソース領域４とドレイン領域５とを架橋するＮ型領域が基板表面に形成されている。このＮ型領域はＮ型不純物が高濃度にドーピングされた領域であり、その表面にゲート部７が形成されている。また、基板６はＮ型シリコンであり、ソース領域４およびドレイン領域５の周囲にはＰウェルが形成されている。
【００７４】
まず、トランジスタ１０を３つ用意し、それぞれ、図２に示すように固定化層２上に抗アディポネクチン抗体を物理吸着法で固定化した。用いた抗体溶液は、２．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／２．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  １ｍＬに抗体５００μgを溶解し、５００μｇ／ｍＬの抗体溶液とし、さらに５μg／ｍＬへ希釈したものを使用した。固定化層２上に抗アディポネクチン抗体溶液を滴下した後、１時間静置した。
【００７５】
固定化後、０．１×ＰＢＳを用いて固定化層２の表面を洗浄し、固定化層２に結合していない抗体を取り除いた。
【００７６】
次に、１０％ＢＳＡを含む０．１×ＰＢＳを固定化層２上に滴下し、１時間静置してブロッキングした。ブロッキング後、０．１×ＰＢＳを用いて洗浄し、遊離のＢＳＡを取り除いた。
【００７７】
＜目的タンパク質への電荷付与試薬の付加＞
次に、希釈した各濃度の抗体溶液を、リガンド１３を固定化した３つのトランジスタ１０の固定化層２にそれぞれ滴下し、１０分間静置することにより抗原抗体反応を行った。０．１×ＰＢＳを用いて洗浄して遊離の抗体を除去した後、電荷付与試薬としてＣＢＢ  Ｇ−２５０溶液を滴下し、５分間静置した。この処理によりアディポネクチンにＣＢＢ  Ｇ−２５０を結合させた。ＣＢＢ  Ｇ−２５０溶液は、PROTEIN ASSAY Bradford、BIO-RADを希釈せずに使用した。
【００７８】
次に、０．１×ＰＢＳで洗浄し、遊離のＣＢＢ  Ｇ−２５０を取り除き、測定溶液（０．１×ＰＢＳ）を液槽１１に充填した。
【００７９】
このようにセッティングした各トランジスタ１０について、電流計９として半導体パラメータアナライザ（4155A SEMICONDUCTOR PARAMETER ANALYZER、hp、および16442A TEST FIXTURE、hp）を用いてＶｇ−Ｉｄ特性を測定した。半導体パラメータアナライザに各測定値（ゲート電極Ｖｇは‐３〜＋３Ｖで挿引し、ソースとウェルコンタクトは接地、ドレイン電圧＋５０ｍＶ、基板電位＋１Ｖ）を入力し、図３（ｂ）に示すように、Ｉｄ＝３μＡの時のＶｇを測定値として記録した。
【００８０】
その結果、抗アディポネクチン抗体濃度が０、２５、６２．５μg／ｍＬの順にＶｇは、それぞれ９７０、９６０、９４０ｍＶであった。この結果を用いて、最小自乗法により検量線を作成した。各抗アディポネクチン抗体濃度に対応する３点は、ほぼ一直線上にのっており、抗体の定量が精度高く行われたことを示している。
【００８１】
（変更例）
なお、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８２】
例えば、トランジスタ１０と電流計９とを一体として形成し、タンパク質定量装置として実現してもよい。また、可変電源１６および固定電源８を上記タンパク質定量装置に組み込んでもよい。
【００８３】
すなわち、本発明は、測定対象である対象タンパク質の濃度を測定する測定装置であって、基板表面に形成されたソース領域およびドレイン領域と、上記ソースと上記ドレインとの間の基板表面上に形成されたゲート部と、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側に存在する電解質溶液を介して上記ゲート部に電圧を印加する参照電極とを備えるとともに、上記ゲート部の上記基板表面に面する側とは反対側の面に、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが結合されているトランジスタと、上記リガンドに特異的に相互作用した対象タンパク質に電荷付与分子が結合することによる、上記ソース領域と上記ドレイン領域との間を流れる電流の変化を測定する測定部とを備える測定装置であると表現することもできる。
【００８４】
なお、本発明は、以下のようにも表現できる。
【００８５】
すなわち、本発明は、検出しようとするタンパク質（ターゲットタンパク質）に特異的に反応あるいは吸着するリガンドがゲート表面に導入されていることを特徴とするソース、ゲートおよびドレイン電極を有するＦＥＴ型のセンサである。
【００８６】
上記センサは、前記リガンドとターゲットタンパク質とを特異的に反応あるいは吸着させた後、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を結合させ、ＣＢＢ  Ｇ−２５０の電荷によって変化したチャネルのドレイン電流を検出するバイオセンサであることが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のタンパク質定量システムを使用すれば、簡便、かつ高感度にタンパク質を定量することが可能となる。このため、ライフサイエンス分野、医学分野などの研究や検査におけるタンパク質の定量に好適に使用できる。
【符号の説明】
【００８８】
１  ゲート電極
２  固定化層
３  ゲート絶縁層
４  ソース領域
５  ドレイン領域
７  ゲート部
６  基板
９  電流計
１２  電解質溶液
１３  リガンド
１４  目的タンパク質（対象タンパク質）
１５  電荷付与試薬（電荷付与分子）
２０  タンパク質定量システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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