(57)【要約】      （修正有）【課題】ウイルスによる遺伝子導入は行わずに細胞が本来有する内在性の遺伝子の発現をオンにすることで細胞の脱分化反応を促進するものである。電界及び磁場刺激を神経細胞、血管細胞などの培養細胞に供給して細胞内在性遺伝子を発現させて該培養細胞を脱分化することで再生を促進させる。【解決手段】細胞脱分化方法は、脳及び脊髄に電界及び又は磁場による刺激を与えて神経細胞、血管細胞などの培養細胞に細胞内在性遺伝子を発現させて該培養細胞を脱分化することで該培養細胞を増殖させて再生を促進してなる。【選択図】図１−１
2010082400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳及び脊髄に電界及び又は磁場による刺激を与えて神経細胞、血管細胞などの培養細胞に細胞内在性遺伝子を発現させて該培養細胞を脱分化することで該培養細胞を増殖させて再生を促進してなる細胞脱分化方法。
【請求項２】
前記細胞の脱分化は、Ｓｏｘ２の発現が関与していること、及びＲｈｏＤがＲｈｏＡに拮抗することにより，アクチンストレスファイバーと接着斑の形成を阻害し，細胞分裂や細胞遊走を抑制していることを特徴とする請求項１記載の細胞脱分化方法。
【請求項３】
前記電界及び磁場刺激は、刺激強度；０．０１〜１．５テスラ、好ましくは０．４〜０．６Ｔテスラ、周波数；５Ｈｚ−３５Ｈｚ、電流密度；２０〜２００ｍＡ／ｍ２、刺激波形は正弦波またはパルス波、パルス幅；２００〜３００μ秒、かつ２００パルスを５分〜１０分間隔で３〜１０ターム（合計６００〜２０００パルス）を供給してなることを特徴とする請求項１記載の細胞脱分化方法。
【請求項４】
前記細胞が、海馬神経細胞、人もしくはラット、マウスの細胞であることを特徴とする請求項１記載の細胞脱分化方法。
【請求項５】
脳及び脊髄に刺激強度；０．０１〜１．５テスラ、好ましくは０．４〜０．６Ｔテスラ、周波数；５Ｈｚ−３５Ｈｚ、電流密度；２０〜２００ｍＡ／ｍ２、刺激波形は正弦波またはパルス波、パルス幅；２００〜３００μ秒、かつ２００パルスを５分〜１０分間隔で３〜１０ターム（合計６００〜２０００パルス）を供給してなる電界及び又は磁場生成装置を備える細胞脱分化装置。
【請求項６】
生体および細胞に電界及び又は磁場刺激を与えて脱分化を促進して中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経を再生させ、その後脊髄損傷、パーキソン病患者の下肢及び又は腕の運動誘発電位を測定して中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経の再生を評価する細胞脱分化評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、電界及び又は磁場刺激により培養細胞を脱分化させる細胞脱分化方法、細胞脱分化装置及び細胞脱分化評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】最終分化をした細胞は細胞周期のＧ０期に不可逆的に停止しており，もはや分裂しないと考えられていた．しかし最終分化をした骨格筋細胞（筋管細胞）にＳＶ４０ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子を発現させることにより，筋管細胞が再び細胞周期にはいり細胞分裂をすることが報告されている。また、ヒトの皮膚の細胞に４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，ｃ−Ｍｙｃ，Ｋｌｆ４）を導入すると、皮膚細胞の形態が変わり、ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）のように分化する能力を獲得した細胞が樹立されることが報告されている。【０００３】高頻度経頭蓋的磁気刺激（ｒＴＭＳ）は、神経損傷疾患および精神医学領域で異状の治療療法として潜在的有効性が確認されている。また海馬神経細胞では脱分化が促進され神経幹細胞が誘導されることが確認されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】本発明の目的は、ウイルスによる遺伝子導入は行わずに細胞が本来有する内在性の遺伝子の発現をオンにすることで細胞の脱分化反応を促進するものである。電界及び磁場刺激を神経細胞、血管細胞などの培養細胞に供給して細胞内在性遺伝子を発現させて該培養細胞を脱分化することで再生を促進させてなる細胞脱分化方法、細胞脱分化装置及び細胞脱分化評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】請求項１に係る細胞脱分化方法は、脳及び脊髄に電界及び又は磁場による刺激を与えて神経細胞、血管細胞などの培養細胞に細胞内在性遺伝子を発現させて該培養細胞を脱分化することで該培養細胞を増殖させて再生を促進してなる。【０００６】請求項２に係る細胞脱分化方法は、前記細胞の脱分化が、Ｓｏｘ２の発現が関与していること、及びＲｈｏＤがＲｈｏＡに拮抗することにより，アクチンストレスファイバーと接着斑の形成を阻害し，細胞分裂や細胞遊走を抑制していることを特徴とする。【０００７】請求項３に係る細胞脱分化方法は、前記電界及び磁場刺激が、刺激強度；０．０１〜１．５テスラ、好ましくは０．４〜０．６Ｔテスラ、周波数；５Ｈｚ−３５Ｈｚ、電流密度；２０〜２００ｍＡ／ｍ２、刺激波形は正弦波またはパルス波、パルス幅；２００〜３００μ秒、かつ２００パルスを５分〜１０分間隔で３〜１０ターム（合計６００〜２０００パルス）を供給してなることを特徴とする。【０００８】請求項４に係る細胞脱分化方法は、前記細胞が、海馬神経細胞、人もしくはラット、マウスの細胞であることを特徴とする。【０００９】請求項５に係る細胞脱分化装置は、脳及び脊髄に刺激強度；０．０１〜１．５テスラ、好ましくは０．４〜０．６Ｔテスラ、周波数；５Ｈｚ−３５Ｈｚ、電流密度；２０〜２００ｍＡ／ｍ２、刺激波形は正弦波またはパルス波、パルス幅；２００〜３００μ秒、かつ２００パルスを５分〜１０分間隔で３〜１０ターム（合計６００〜２０００パルス）を供給してなる電界及び又は磁場生成装置を備える。【００１０】請求項５に係る細胞脱分化評価方法は、生体および細胞に電界及び又は磁場刺激を与えて脱分化を促進して中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経を再生させ、その後脊髄損傷、パーキソン病患者の下肢及び又は腕の運動誘発電位を測定して中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経の再生を評価する。
【発明の効果】
【００１１】ウイルスによる遺伝子導入は行わずに細胞が本来有する内在性の遺伝子の発現をオンにすることで細胞の脱分化反応を促進することができる。
電界及び又は磁場刺激を神経細胞、血管細胞などの培養細胞に供給して細胞内在性遺伝子を発現させて該培養細胞を脱分化することで再生を促進させることができる。
脳及び脊髄に電界及び又は磁場刺激を与えて細胞を脱分化させることで神経幹細胞を増殖させることにより中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経を再生させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】本発明によれば、ウイルスなどによる遺伝子導入なしに分化した細胞をＥＳ細胞様に変化させることができる。電界及び又は磁場刺激が細胞の核に作用しＥＳ様性質を発現するのに必要な遺伝子群を発現させていると考えられる。本発明の実験によりＳｏｘ２の発現が関与していることと、ＲｈｏＤがＲｈｏＡに拮抗することにより，アクチンストレスファイバーと接着斑の形成を阻害し，細胞分裂や細胞遊走を抑制していることが考えられる（図２−４）。
【実施例１】
【００１３】以下、添付図面を参照して本発明の実施例を詳述する。
電界及び磁場生成コイル１０は、内径：１０ｍｍ〜５０ｍｍ、外形：６０ｍｍ〜２５０ｍｍ、厚さ：１０ｍｍ〜２０ｍｍの鉄製中空円形体からなり、コードで電源に接続される。コイル１０は、ラット１２の脳の上１１ｃｍに載置する。コイル１０は、コイルの中心で間隔２３８μｓのｂｉｐｈａｓｉｃパルスと最大１．２５Ｔ（最大渦電流＝５．５Ａ／ｍ２）を生じる。コイル１０は日本光電製ＳＭＮ−１２００を使用した。【００１４】ラットの脳に刺激強度；０．０１〜１．５テスラ、好ましくは０．４〜０．６Ｔテスラ、周波数；７Ｈｚから３５Ｈｚ電流密度；２０〜２００ｍＡ／ｍ２、刺激波形は正弦波またはパルス波、パルス幅；２００〜３００μ秒、かつ２００パルスを５分〜１０分間隔で３〜１０ターム（合計６００〜２０００パルス）で曝露した（図１−１）。その後、解剖を行い凍結切片およびパラフィン切片を作製し、免疫組織化学的方法を用いて病理学的に解析した。【００１５】その結果、曝露群において以下の結果が得られた。
正常ラットの脳に曝露を施行したところ、７Ｈｚから３５Ｈｚにおいて海馬領域で神経幹細胞様の細胞が増殖していた。【００１６】図１−２（ａ）；生理食塩水投与、非刺激群、図１−２（ｂ）；生理食塩水投与、磁気刺激群
海馬ＣＡ３領域の顆粒細胞および錐体細胞層を比較した。損傷ラットの脳に曝露を施行したところ、７Ｈｚから３５Ｈｚにおいて海馬領域でグリア細胞の細胞が増殖していた。【００１７】図１−３（ａ）；ＭＰＴＰ投与、非刺激群、図１−３（ｂ）；ＭＰＴＰ投与、磁気刺激群
損傷した海馬ＣＡ３錐体細胞と顆粒細胞と磁気刺激後の再生した海馬ＣＡ３錐体細胞と顆粒細胞【００１８】図１−４（ａ）；ＭＰＴＰ投与、非刺激群、図１−４（ｂ）；ＭＰＴＰ投与、磁気刺激群
損傷ラットにおける海馬神経細胞でのグリア細胞のＧＦＡＰによる染色画像
磁気刺激群でＧＦＡＰの染色が増加していることからアストロサイトが活性化していた。【００１９】図１−５；損傷ラットでの磁気刺激による海馬神経細胞の増減
磁気刺激群では非刺激群に比べて３５％位損傷細胞が少なかった。【００２０】図１−６；ＨＥ染色による海馬神経細胞の再生画像
海馬ＣＡ３神経細胞層での比較、非刺激群では損傷細胞が明らかに多く、磁気刺激群では正常細胞が多い。【００２１】また、ミクログリアは減少していた。これより、曝露により海馬領域に存在すると言われている神経幹細胞様の細胞が誘導されたと考えられる。脱分化反応が促進した結果と考えられる。この結果からＥＳ細胞様変化に必要なＳｏｘ２遺伝子が増加していたと考えられる。
【実施例２】
【００２２】電界及び又は磁場生成コイル１０は、内径：１０ｍｍ〜５０ｍｍ、外形：６０ｍｍ〜２５０ｍｍ、厚さ：１０ｍｍ〜２０ｍｍの鉄製中空円形体からなり、コードで電源に接続される。コイル１０は、コイルの中心で間隔２３８μｓのｂｉｐｈａｓｉｃパルスと最大１．２５Ｔ（最大渦電流＝５．５Ａ／ｍ２）を生じる。コイル１０は日本光電製ＳＭＮ−１２００を使用した。コイル１０上には、アクリル板１４を介して細胞培養皿１６が載置される。細胞培養皿１６は、コイル１０から１１ｍｍの距離に置かれた（図２−１）。【００２３】細胞は、刺激強度；０．０１〜１．５テスラ、好ましくは０．４〜０．６Ｔテスラ、周波数；７Ｈｚから３５Ｈｚ、電流密度；２０〜２００ｍＡ／ｍ２、刺激波形は正弦波またはパルス波、パルス幅；２００〜３００μ秒、かつ２００パルスを５分〜１０分間隔で３〜１０ターム（合計６００〜２０００パルス）で曝露した。【００２４】その後細胞固定を行い、細胞内のＪＮＫ／ＳＡＰＫリン酸化反応を同定する抗体と蛍光色素を用いて蛍光免疫染色を行った。さらに、サンプルをＮｉｋｏｎ共焦点レーザー顕微鏡で観察し、画像解析した。ＨＥＫ２９３細胞に曝露を施行したところ、７Ｈｚから３５Ｈｚにおいて細胞内のＪＮＫ／ＳＡＰＫリン酸化反応とＭＡＰＫリン酸化反応が促進されていた。【００２５】図２−２；ＨＥＫ２９３細胞における磁気刺激後の核近傍のストレス応答性酵素のリン酸化の変化
図の左から非刺激群、７Ｈｚ磁気刺激群、２５Ｈｚ磁気刺激群
７Ｈｚ磁気刺激群で最もリン酸化反応が顕著に見られた。細胞核の近傍で染色が顕著にみられた。【００２６】コントロール２５％、７ＨｚｒＴＭＳ６２．５％、２５ＨｚｒＴＭＳ１４．８％【００２７】図２−３；ＨＥＫ２９３細胞におけるストレス応答性酵素のリン酸化の変化領域の比較
非磁気刺激群では２５％、２５Ｈｚ磁気刺激群では１５％、７Ｈｚ磁気刺激群では６３％とリン酸化領域が最も多い。
ＲｈｏＡによる蛍光染色の結果ではアクチンストレスファイバーと接着斑の形成を阻害し，細胞分裂や細胞遊走を抑制していると考えられる。
また、曝露実験においてはＳｏｘ２遺伝子が有意に増加しているというデータが得られた。【００２８】本実施例では、ＨＥＫ２９３細胞にｒＴＭＳを与えることにリン酸化反応が促進もしくは抑制される効果を調査解析した。培養細胞は１日に８秒（＝６００パルス）間に２５パルス／秒列を受けた。パルス列は、１０〜１５分間隔で行なわれた。シャムなコントロールネズミは刺激の間、同じノイズにさらされた。【００２９】統計分析はソフトウェアパッケージ（ＧＢスタットｖｅｒｓｉｏｎ６．０、Ｄｙｎａｍｉｃマイクロシステムズ、シルバースプリング、ＭＤ）で実行された。統計的な重要性は、グループ間で繰り返し測定（グループ及び日数）のため相違の双方分析（ＡＮＯＶＡ）を使用することで決定された。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−テストは、各日でＭＰＴＰかｒＴＭＳ処理されたグループの間の統計分析に使用された。承認時に、ポストｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｎｅｗ−ｍａｎ−Ｋｅｕｌｓｔテストが使用された。０．０５未満の確率水準が、統計的に重要であると考えられる。イメージは、ＩＰ  Ｌａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍソフトウェアを使用することで分析した。有限要素法（ＦＥＭ）を使用してＴＭＳの分布を計算して求めた。【００３０】哺乳類の中枢神経系では、損傷後の神経軸索の再生がきわめて困難であり、これが現在脊髄損傷による後遺症で多くの人が不自由を極めている現況である。そこで、新生仔から成体にいたるマウスを用いて海馬神経細胞での神経幹細胞の増殖を詳細に観察した。その結果、新生仔では神経幹細胞が増殖し、細胞の脱分化が促進されることを見出した。【００３１】最終分化をした骨格筋細胞（筋管細胞）にＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子を発現させることにより，筋管細胞が再び細胞周期にはいり細胞分裂をする。すなわち最終分化細胞も可塑性をもち，脱分化をする。
電磁波刺激を与えて細胞の脱分化を促進して幹細胞状態にする機構は細胞のもつ時計を逆回しにする脱分化と考えられる。【００３２】脳及び脊髄、血管に電界及び又は磁場刺激を与えて細胞の脱分化を促進して幹細胞状態にすることで中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経を再生させ、その後脊髄損傷、パーキソン病患者の下肢及び又は腕の運動誘発電位を測定して中枢神経系損傷疾患及び傷害を回復又は神経の再生を評価することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】パーキンソン病、脊髄損傷、など中枢神経系損傷疾患において回復又は神経を再生させる。
またアレルギー疾患において炎症反応を抑制する因子を発現させることで炎症を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１−１】磁気刺激方法を示す概略図
【図１−２（ａ）】、
【図１−２（ｂ）】正常ラットにおける磁気刺激の海馬神経細胞図
【図１−３（ａ）】、
【図１−３（ｂ）】損傷ラットにおける磁気刺激の海馬神経細胞図
【図１−４（ａ）】、
【図１−４（ｂ）】損傷ラットにおける海馬神経細胞でのグリア細胞のＧＦＡＰによる染色画像図
【図１−５】損傷ラットにおける磁気刺激の海馬神経細胞の増減を示す図
【図１−６（ａ）】、
【図１−６（ｂ）】ＨＥ染色による海馬神経細胞の再生画像図
【図２−１】電磁波刺激装置の概略図
【図２−２】ＨＥＫ２９３細胞における磁気刺激後の核近傍のストレス応答性酵素のリン酸化の変化を示す図
【図２−３】ＨＥＫ２９３細胞におけるストレス応答性酵素のリン酸化の変化領域の比較図
【図２−４】電磁波刺激による細胞内在性遺伝子発現のモデル図
【符号の説明】
【００３５】１０；コイル
１２；ラット
１４；アクリル板
１６；細胞皿
2010082400.tif 000003
2010082400.tif 000004
2010082400.tif 000005
2010082400.tif 000006
2010082400.tif 000007
2010082400.tif 000008
2010082400.tif 000009
2010082400.tif 000010
2010082400.tif 000011
2010082400.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月29日(2008.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【図１−１】磁気刺激方法を示す概略図
【図１−２】正常ラットにおける磁気刺激の海馬神経細胞図
【図１−３】損傷ラットにおける磁気刺激の海馬神経細胞図
【図１−４】損傷ラットにおける海馬神経細胞でのグリア細胞のＧＦＡＰによる染色画像図
【図１−５】損傷ラットにおける磁気刺激の海馬神経細胞の増減を示す図
【図１−６】ＨＥ染色による海馬神経細胞の再生画像図
【図２−１】電磁波刺激装置の概略図
【図２−２】ＨＥＫ２９３細胞における磁気刺激後の核近傍のストレス応答性酵素のリン酸化の変化を示す図
【図２−３】ＨＥＫ２９３細胞におけるストレス応答性酵素のリン酸化の変化領域の比較図
【図２−４】電磁波刺激による細胞内在性遺伝子発現のモデル図
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
2010082400.tif 000013
【図１−２】
2010082400.tif 000014
【図１−３】
2010082400.tif 000015
【図１−４】
2010082400.tif 000016
【図１−５】
2010082400.tif 000017
【図１−６】
2010082400.tif 000018
【図２−１】
2010082400.tif 000019
【図２−３】
2010082400.tif 000020
【図２−２】
2010082400.tif 000021
【図２−４】
2010082400.tif 000022