(57)【要約】【課題】  フルクタンを含有する原料（特に、フルクタンを高含有するニンニク、ラッキョウを含む原料）を、加熱処理や酵素処理を行うことなく直接乳酸発酵し、高機能化された発酵生成物（発酵食品）を提供することを課題とする。【解決手段】  フルクタン資化能を有する乳酸菌ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６菌株（ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３)、もしくは、フルクタン資化能を有する前記Ｓ５０６菌株からの変異体菌株、もしくは、前記Ｓ５０６菌株と同一の菌学的性質を有するラクトバシラス・プランタルムからの分離菌株、を用いて、；フルクタンを含有する原料を乳酸発酵させ、得られた免疫賦活作用を有する発酵生成物、および、前記発酵生成物を含有してなる発酵食品、を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクタン資化能を有する乳酸菌ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６菌株（ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３)、もしくは、フルクタン資化能を有する前記Ｓ５０６菌株からの変異体菌株、もしくは、前記Ｓ５０６菌株と同一の菌学的性質を有するラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）からの分離菌株、を用いて、；フルクタンを含有する原料を乳酸発酵させ、得られた発酵生成物。
【請求項２】
前記フルクタンを含有する原料が、ニンニク、ラッキョウ、チコリ、キクイモ、ダリア、ヤーコン、ゴボウ、から選ばれる１以上の植物を含むものである、請求項１に記載の発酵生成物。
【請求項３】
前記フルクタンを含有する原料が、ニンニクを含むものである、請求項１に記載の発酵生成物。
【請求項４】
前記発酵生成物が免疫賦活作用を有するものである、請求項１〜３のいずれかに記載の発酵生成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の発酵生成物を含有してなることを特徴とする、発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクタン資化能を有する特定の乳酸菌株を用いて、フルクタンを含有する原料を乳酸発酵させ、得られた発酵生成物に関し、詳しくは免疫賦活作用を有する発酵生成物に関する。
また、本発明は、前記発酵生成物を含有してなることを特徴とする、免疫賦活作用を有する発酵食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は糖源の資化能力の高い細菌でブドウ糖、単糖を資化して乳酸発酵を行うが、一般的には難消化性多糖であるフルクタンは発酵できない。
フルクタンは、ニンニクやラッキョウなどに特に多く含有される難消化性多糖であり、その乾物あたりの含有量はニンニクでは約８０％、ラッキョウで約７０％である。
そこで、ニンニクやラッキョウに付加価値を高めるために、高含有されるフルクタンを直接発酵しようと（特にニンニクを）試みてきたが、成功した事例はない。
【０００３】
特にニンニクについては、その有効利用が期待されており、様々な発酵を利用する開発がされている。例えば、ぶどう酒の製造過程で少量のニンニクを添加して発酵させた例（特許文献１）や少量のニンニクに多量の糖を添加して発酵させた例（特許文献２）がある。
また、ニンニクの内在性酵素を加熱失活した後‘麹菌’で発酵する例（特許文献３）やニンニクを加熱処理して破砕した後に、乳酸発酵とプロピオン酸発酵を行う例（特許文献４）、がある。
しかし、これらの例はいずれも、ニンニクに高含有される‘フルクタン’を、‘加熱処理や酵素処理を行うことなく、直接発酵する技術’ではない。
【０００４】
なお、ニンニクやラッキョウの生理機能については、有機イオウ化合物やサポニンについての有効性は数多く報告されているのに対して、大部分を占めるフルクタンについての報告は少ない。
そこで、これらに含有されるフルクタンを発酵して、高機能化させる技術や有効利用の技術の開発が期待されていた。特に、顕著な高機能化が期待される‘乳酸発酵食品’への応用が期待されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭４８‐５２９９５号公報
【特許文献２】特開昭５３‐２６３６１号公報
【特許文献３】特開２００２−１５４９８１号公報
【特許文献４】特開２００６−９４８５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決し、フルクタンを含有する原料（特に、フルクタンを高含有するニンニク、ラッキョウを含む原料）を、‘加熱処理や酵素処理を行うことなく直接乳酸発酵し’、‘高機能化された’発酵生成物（発酵食品）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、フルクタン資化能を有する特定の乳酸菌株を分離して用いることによって、フルクタンを含有する原料（特に、フルクタンを高含有するニンニク、ラッキョウを含む原料）に対して、含有されるフルクタンを‘加熱処理や酵素処理を行うことなく直接乳酸発酵する’ことが、可能となることを見出した。
また、本発明者は、得られた発酵生成物が、‘免疫賦活作用を有すること’（高機能化されたこと）を見出した。
本発明者は、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、請求項１に係る本発明は、フルクタン資化能を有する乳酸菌ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６菌株（ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３)、もしくは、フルクタン資化能を有する前記Ｓ５０６菌株からの変異体菌株、もしくは、前記Ｓ５０６菌株と同一の菌学的性質を有するラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）からの分離菌株、を用いて、；フルクタンを含有する原料を乳酸発酵させ、得られた発酵生成物、に関するものである。
請求項２に係る本発明は、前記フルクタンを含有する原料が、ニンニク、ラッキョウ、チコリ、キクイモ、ダリア、ヤーコン、ゴボウ、から選ばれる１以上の植物を含むものである、請求項１に記載の発酵生成物、に関するものである。
請求項３に係る本発明は、前記フルクタンを含有する原料が、ニンニクを含むものである、請求項１に記載の発酵生成物、に関するものである。
請求項４に係る本発明は、前記発酵生成物が免疫賦活作用を有するものである、請求項１〜３のいずれかに記載の発酵生成物、に関するものである。
請求項５に係る本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の発酵生成物を含有してなることを特徴とする、発酵食品、に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に用いる乳酸菌株は、グルコースまたは単糖類の存在を必要とせず、フルクタンのみを糖質源として効率よく乳酸発酵することができるため、フルクタンを含有する原料（特にフルクタンを高含有するニンニク、ラッキョウを含む原料）を、加熱処理や酵素処理を行うことなく直接乳酸発酵することによって、‘免疫賦活作用を有するようになった（高機能化された）’発酵生成物、を提供することを可能にする。
本発明は、前記発酵生成物を含んでなる、免疫賦活作用を有する発酵食品を提供することを可能とする。
また、本発明は、前記発酵生成物を含んでなる、免疫賦活作用剤を提供することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】調製例１で得られたＳ５０６株のフルクタン資化能を示す図である。
【図２】実施例２における生ニンニク発酵をＴＬＣにて確認した結果を示す図である。
【図３】実施例３におけるマクロファージのＮＯ産生能試験結果を示す図である。
【図４】実施例４におけるマクロファージのＩＬ‐１２産生能試験結果を示す図である。
【図５】実施例５におけるマクロファージの異物貪食能試験結果を示す図である。
【図６】実施例６におけるマウスパイエル板細胞からのＩＦＮ−γ産生促進試験結果を示す図である。
【図７】実施例６におけるマウスパイエル板細胞からのＩｇＡ産生促進試験結果を示す図である。
【図８】実施例７におけるマウス好中球増殖促進作用試験結果を示す図である。
【図９】実施例８におけるヒト唾液中ＩｇＡ分泌促進作用試験結果を示す図である。
【図１０】実施例９におけるヒト好中球異物貪食能活性化試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、フルクタン資化能を有する特定の乳酸菌株を用いて、フルクタンを含有する原料（特には、フルクタンを高含有するニンニクを含有する原料）を乳酸発酵させ、得られた発酵生成物に関し、詳しくは、免疫賦活作用を有する発酵生成物に関する。
また、本発明は、前記発酵生成物を含有してなることを特徴とする、免疫賦活作用を有する発酵食品に関する。
【００１２】
フルクタンは、フルクトースを主な構成糖とする多糖の総称で、水溶性の食物繊維であり、難消化性である。
本発明において、フルクタンを含有する原料とは、フルクタンを含有するものであれば、如何なるものも用いることができるが、フルクタンを高含有するものを用いることが好ましい。具体的には、ニンニク、ラッキョウ、チコリ、キクイモ、ダリア、ヤーコン、ゴボウ、から選ばれる１以上の植物を含むものであることが好適である。
特には、ニンニク、ラッキョウから選ばれる１以上の植物を含むもの、さらには、ニンニクを含むものであることがさらに好適である。
なお、ニンニク、ラッキョウなどのネギ属には、水への溶解性（特に冷水への溶解性）に優れた‘非イヌリン型’のフルクタンが含有され、本発明の原料に用いるのに好ましい。
【００１３】
前記植物としては、ニンニクとしては可食部である鱗茎部、ラッキョウとしては可食部である鱗茎部、チコリとしては可食部である根、キクイモとしては可食部である塊茎部、ダリアとしては根部、ヤーコンとしては塊茎部、ゴボウとしては可食部である根を用いることができる。
【００１４】
フルクタンを含有する原料としては、例えば、上記植物を粉砕、細断、擂潰したもの、；粉砕、細断、擂潰した後で水溶性成分を抽出した上清、；などを用いることができる。
例えば、ニンニクを用いる場合、生のニンニクを粉砕、細断、擂潰したもの、；生のニンニクの絞り汁、；加熱したニンニクを粉砕、細断、擂潰したもの、；加熱したニンニクの搾り汁などを用いることができる。
【００１５】
本発明の発酵生成物は、前記フルクタンを含有する原料を、「フルクタン資化能を有する乳酸菌であるラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６菌株（ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３)」、もしくは、「フルクタン資化能を有する前記Ｓ５０６菌株からの変異体菌株」、もしくは、「前記Ｓ５０６菌株と同一の菌学的性質を有するラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）からの分離菌株」、を用いて乳酸発酵させ、得られるものである。
なお、本発明では、上記菌株以外の通常の乳酸菌（通常のラクトバシラス・プランタルム〔Lactobacillus plantarum〕を含む）を用いた場合、フルクタンを、全くもしくは十分に資化することができないため、フルクタンを含有する原料、特にフルクタンを高含有するニンニクを含む原料、を乳酸発酵させて、免疫賦活作用を有する発酵生成物を得ることができない。
【００１６】
本発明に用いるラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６菌株は、平成２０年９月２日付で、「受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ-６４３」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されている菌株であり、「フルクタン資化能を有する」以外は、ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）とほぼ同一の菌学的性質を有する菌株である。
また、本発明では、前記Ｓ５０６菌株からの変異体菌株であり、フルクタン資化能を有するものも用いることができる。
さらに本発明では、ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）から分離した分離株であって、前記Ｓ５０６菌株と同一の菌学的性質を有するものも、用いることができる。当該分離株の菌学的性質として、下記の調製例１に記載の‘形態的特徴’、‘各種糖類の資化性’が同一のもの、好ましくはこれらの性質に加えて配列表１に示す‘１６ＳｒＤＮＡの塩基配列’が同一のもの、を用いることができる。
【００１７】
乳酸発酵は、上記原料に含有されるフルクタンが、十分フルクトースに分解されるまで行う。
具体的には、嫌気条件にて行い、温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃で行うことが望ましい。
ｐＨは３．０〜７．０、好ましくは４．０〜５．５、特には５．０付近で行うことが望ましい。なお、ｐＨの調整は、例えば滅菌したカキガラ等を加えて、緩衝作用を持たせることで、発酵の進行によって酸性に傾かないようにすることで、上記ｐＨの範囲を維持することができる。
発酵時間としては、上記原料に含有されるフルクタンが、十分フルクトースに分解されるまで行えばよいが、例えば、７〜２１日行うことによって、発酵させることができる。
【００１８】
上記のように乳酸発酵を行うことによって、本発明の発酵生成物を得ることができる。
本発明の発酵生成物は、十分な量の乳酸菌を含む発酵生成物として得ることができる。
具体的には、本発明の発酵生成物が液体状のものである場合、１０８〜１０１２／ｍｌの乳酸菌を含有するものとして得ることができる。
【００１９】
得られる発酵生成物の形状としては、用いる原料の状態や形状によるが、液体状のもの、；粉砕、細断、擂潰した状態のもの、；ペースト状のもの、；原料の原型を留めたもの、；が得られる。
なお、これらを、粉砕や乾燥などの処理を行うことで、乾燥粉末とすることもできる。
【００２０】
ここで、免疫賦活作用とは、自然免疫と獲得免疫の両方についての、機能を向上させる作用を指す。
本発明の発酵生成物は、「免疫賦活作用」を有するものであり、自然免疫と獲得免疫の両方の機能を向上させる作用を有するものであるが、特に自然免疫に関しての免疫賦活作用に有効である。
なお、‘自然免疫’とは、マクロファージ等の炎症細胞系の細胞により、生体防御機能を担うシステムである。例えば、風邪などのウイルスの侵入、切り傷などの傷口からの細菌の侵入、がん細胞などの異物を発見・除去など体が最初に防御するための免疫システムである。また、‘獲得免疫’とは、いろいろな抗原に感染することで身につく免疫系で、おもに抗体による免疫システムである。
【００２１】
‘自然免疫’として、具体的には、マクロファージ細胞の活性向上に関する「マクロファージ細胞のＮＯ産生促進作用（マクロファージ細胞の活性化作用）」、「マクロファージ細胞ＩＬ‐１２産生促進作用」、「マクロファージ細胞貪食能活性化」、を有するものである。なお、マクロファージ細胞のＮＯ産生促進作用は、自然免疫強化の指標と一つとなるものである
また、病原微生物などを貪食・殺菌して排除する機能をもつ顆粒球（９０％以上を好中球が占める）の活性向上に関する「好中球増殖促進作用」、を有するものである。なお、抗癌剤のシクロフォスファミドは副作用として免疫低下作用（血中の好中球の減少）が知られているが、本発明の発酵生成物は、シクロフォスファミド投与をした場合においても、血中の好中球の減少を抑制することが可能となる。
【００２２】
‘獲得免疫’として、具体的には、腸管免疫バリアに関する「唾液中ＩｇＡ分泌促進作用」、を有するものであり、さらに「パイエル板細胞からのＩＦＮ−γ及びＩｇＡ産生促進作用」を有するものである。
なお、「パイエル板細胞からのＩＦＮ−γ産生促進作用」は、獲得免疫だけでなく自然免疫についても促進させる作用を有するものである。
【００２３】
本発明では、上記発酵生成物をそのまま発酵食品とすることもできるが、他の原料を含有させた発酵食品とすることもできる。例えば、オタネニンジン、ショウガ、オリーブ、クローブ、ガラナ、などの原料を含有させることができる。
そして、本発明では、具体的には、錠剤状またはカプセル状の健康食品、飲料、お菓子類などの発酵食品を得ることができる。
なお、上記発酵生成物は、乾燥重量換算に換算した場合、０．１％以上含有させることが望ましい。
【００２４】
なお、本発明では、上記発酵生成物を有効成分として含有する、「免疫賦活剤」を得ることもできる。
剤の形態としては、粉末状、液状、シロップ状、カプセルに充填した形態、賦型剤等と混和して得られる錠剤、丸剤、顆粒剤などを挙げることができる。
【００２５】
上記「発酵食品」および「剤」の摂取量としては、含有される発酵生成物の発酵乾燥重量あたり０．１〜２．０ｇ／１回を、１〜２回／１日摂取することで、免疫賦活作用を得ることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００２７】
調製例１〔ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６菌株（ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３)の分離と選抜〕
（１）ニンニクフルクタン発酵能を有する乳酸菌の分離
まず、糖質源としてニンニク由来のフルクタンを用い、種々の植物由来の食品についてフルクタンを分解する乳酸菌のスクリーニングを試みた。
その結果、ニンニクと同属である‘ラッキョウの塩漬け’がニンニクフルクタンを発酵することを認めたため、その乳酸菌の分離を試みた。
菌の分離には普遍的で栄養豊富なＬＢプレートや乳酸菌用のＢＣＰ添加プレート寒天培地、ＴＹＧプレートを用い、塩漬けラッキョウから乳酸菌の分離を行った。
塩漬けラッキョウからは、乳酸桿菌や乳酸球菌の他、ピチアやハンヌセラ等と推定される酵母類が検出された。更に選抜を行うため、ニンニク搾り汁のみを栄養源とした培地を最も選択性の高いものとし、独自にイーストエキスやタンパク質分解処理したニンニク搾り汁、トリプトン等を僅かに混ぜたニンニクフルクタン培地、糖源をフルクトースにしたＴＹＧプレートなどを作製し、ニンニクフルクタン発酵に適した乳酸菌を選抜した。
その結果、ひとつの乳酸菌がニンニク搾り汁のみを栄養源とした培地で、栄養豊富な培地に引けをとらない、良好な生育を示した。これは、偏性嫌気性の有機酸産生菌で無芽胞、直径１〜２ｍｍの淵のはっきりしたコロニーを形成し、運動性なし、桿菌もしくは連鎖球菌・双球菌（または短桿菌）であった。更にクローニングを行って安定形質分離株（Ｓ５０６株）を手に入れた。
【００２８】
（２）フルクタン資化能の確認
Ｓ５０６株のフルクタン資化能を以下の方法で、確認した。結果を図１に示す。
高フルクタン含有ニンニクエキス粉末２０ｇに水１５０ｍｌを加えて３０℃で培養した。発酵スターターとしてニンニク生搾り培地にて培養したＳ５０６株菌体液１００μlを添加し（試料ｐ１−１）、２日間培養を行った（試料ｐ１−２）。
その後、さらに２日間（計４日間）培養を行うか（試料ｐ１−３）、もしくは、約１ｇのカキガラ粉末を添加した後さらに２日間（計４日間）培養を行った（試料ｐ１−４）。
これらの試料をＴＬＣにて分離して、フルクタンの分解の程度を確認した。ＴＬＣの展開溶媒は酢酸エチル、酢酸、メタノール、水からなる組成を用いた。展開後、薄層を乾燥させ、アニス試薬により呈色させ、各スポットを確認した。結果を図１に示す。なお図１は、左から右方向に展開した図である。
【００２９】
その結果、２日間の培養で、若干のフルクタンの分解が確認された（試料ｐ１−２）。なお、２日経過後にカキガラ粉末を添加せずに培養を行ったものでは、４日後でも２日経過後の試料と同程度のフルクタンしか分解されていなかった（試料ｐ１−３）。
そして、２日経過後にカキガラ粉末を添加したものでは、３日経過後にＳ５０６株発酵物は、生菌数も１０９／ｍｌを超えるまでに増殖し、４日経過後にはフルクタンが‘殆ど分解した’（試料ｐ１−４）。
これらのことから、Ｓ５０６株がフルクタンを資化することが確認された。そして、特に、酸性に傾かない条件にて、フルクタンを資化することが示された。
【００３０】
（３）Ｓ５０６株の同定
・形態的性質
本菌株をＭＲＳ寒天培地に植菌し、３０℃で４８時間嫌気培養した後、生育した菌体を形態観察した。その結果、細胞形態は桿菌(０．７〜０．８×１．５〜２．０μｍ)であり、グラム染色では陽性を示した。コロニー色調は乳白色であった。
また、本菌株は、偏性嫌気性の有機酸産生菌で無芽胞、直径１〜２ｍｍの淵のはっきりしたコロニーを形成し、運動性はなかった。
・塩基配列
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列約１５００ｂｐを決定し（配列表１参照）、その配列を用いて塩基配列データベースに対して相同性検索を行った。また、相同性検索の結果から推定される近縁菌群の基準株由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを取得して検体の１６Ｓ ｒＤＮＡを含めた分子系統解析を行い、検体の帰属分類群を決定した。
その結果、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はL. pentosus、L. plantarum、L. paraplantarumに相同率９９％以上の高い相同性を示した。国際塩基配列データベースに対する相同性検索においても、Ｓ５０６株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列はL. pentosus、L. plantarumに対して高い相同性を示した。これらのことからＳ５０６株は、L. pentosus、L. plantarum等に非常に近縁であると考えられた。
そこで上記の種を中心に、Lactbacillus基準株由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを取得し、分子系統樹を作成した。分子系統解析の結果、Ｓ５０６株は、L. plantarum、L. pentosus と同一の系統枝を形成した。
・各種糖の資化性試験
各種糖の資化性試験には細菌検査同定用キットＡＰＩ５０ＣＨＬ（bioMeriux社製）を用いた。培地としてＭＲＳ寒天、培養温度は３０℃、培養期間は２４時間、嫌気培養の条件で行った。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2010193841.tif 000002
【００３２】
その結果、Ｓ５０６株は、アラビノース、リボース、ガラクトースおよびフルクトースなどを発酵し、グリセロールやキシロースなどは発酵しなかった。
また、Ｓ５０６株は１５℃での生育性を示した。これらの性質はL. pentosus、L. plantarumの内、‘L. plantarumの性状と一致する’ものであった。
また、グリセロール、Ｄ−キシロースおよびズルシトールを資化しない点において、L.  pentosusと異なった。
【００３３】
よって、上記１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を用いた系統解析結果と各種糖の資化性試験の結果から、Ｓ５０６株は、「Lactobacillus plantarumに属する‘新規の乳酸菌株’」であると同定された。
本菌は、フルクタンを資化する点で特徴的な乳酸菌であり、フルクタン含有原料の発酵菌として非常に有用である。
本発明の乳酸菌株であるラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）Ｓ５０６株は、平成２０年９月２日付で、「受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ-６４３」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されている。
【００３４】
調製例２〔菌体の調製〕
Lactobacillus plantarum Ｓ５０６株（ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３）をニンニクフルクタン培地で３０℃にて３日培養した。
ニンニクフルクタン培地の組成は表２に示す通りである。なお、ニンニクフルクタンは、ニンニクを加熱処理した後にエキスを抽出し、ＥｔＯＨ沈殿により精製し調製した。
【００３５】
得られた菌体を、グルコースをフルクトースに変更した少量のＴＹＧ培地(ＴＹＦ培地)に植菌し３０℃にて一晩培養した。この培養液をさらにＴＹＦ培地に植菌し３０℃にて８時間培養した。こうして得られた培養液中から菌体（沈殿物）を回収して生理食塩水で洗浄し、ニンニクの‘発酵スターター’とした。
【００３６】
【表２】
2010193841.tif 000003
【００３７】
実施例１〔ニンニクの発酵〕
ニンニク１ｋｇに水を加えて８０℃で１時間加熱した。上清を捨て、ニンニクに新たに水約７００ｍｌ加えて、ホモジナイズした。
得られた液から遠心分離などにより不溶物を取り除き、得られた液を‘ニンニク煮沸上清’とした。
‘ニンニク煮沸上清’に、調製例２で得られたL. plantarum Ｓ５０６株の菌体を発酵スターターとして加え、３０℃にて培養し発酵させた。
培養の際には、少量の培養液を取りｐＨの経時変化を測定し、ｐＨが５．０付近になるように滅菌したカキガラを加えてｐＨを調整した。１４日後、培養を終了し、発酵液（発酵生成物）を得た。
発酵の進行はＴＬＣを用いてフルクタンが資化されてフルクトースに分解されていることにより確認し、フルクトースの生成量及び乳酸菌数が十分に得られた時点で発酵を終了した。
このようにして得られた発酵液（発酵生成物）を１００℃１５分間の加熱処理を行い、さらに凍結乾燥させ、‘発酵ニンニク粉末’を得た。
【００３８】
実施例２〔生ニンニクの発酵〕
生のニンニクをホモジナイズし、ろ過した。さらに滅菌フィルターに通すことで滅菌し、発酵の基質とした。
得られた‘ニンニク生搾り液’に、調製例２で得られたL. plantarum Ｓ５０６株の菌体を発酵スターターとして加え、３０℃にて培養し発酵させた。
培養の際には、少量の培養液を取りｐＨの経時変化を測定し、ｐＨが５．０付近になるように滅菌したカキガラを加えてｐＨを調整した。１４日後、培養を終了し、発酵液（発酵生成物）を得た。
発酵の進行はＴＬＣを用いてフルクタンが資化されてフルクトースに分解されていることにより確認した。ＴＬＣは調製例１に記載と同様の方法により行った。図２に発酵の進行を確認したＴＬＣの結果を示す。なお、図２は、左から右方向に展開した図である。
【００３９】
その結果、生ニンニク発酵前に存在したフルクタン（原点付近のスポット）は、生ニンニクの発酵後にはほとんど消費され、フルクトースの生成が確認された。
【００４０】
実施例３〔発酵ニンニクのマクロファージ細胞ＮＯ産生促進作用〕
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株を用い、ＮＯ産生を指標としたマクロファージ活性化能の測定を行った。ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ‐１６４０培地にて継代培養したものを用いた。培養は３日ないし４日毎に０．５〜１×１０５cells／ｍｌで植え継いだ。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
まず、前培養したＲＡＷ２６４．７細胞を８×１０５cells／ｍｌに細胞数を調整し、得られた細胞懸濁液を１００μlずつ９６穴平底プレートの各ウェルに加えた。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移して、細胞がウェルの底に接着して伸展したまで３時間培養を行った。試験試料として、実施例１で得られた発酵ニンニク粉末を‘発酵ニンニク’として用い、細胞培養液中で終濃度が１００μｇ／ｍｌなるように添加したものを最高容量として用いた。さらに、濃度を下げた５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌの容量について試験した。
比較対照として未発酵のニンニク煮沸上清を‘未発酵ニンニク’とし、細胞培養液中で終濃度が１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌになるように調整し用いた。また、陽性対照物として‘リポ多糖’(Pantoea agglomeransより精製したＬＰＳ)を終濃度１００ｎｇ／ｍｌの容量で用いた。
調整した各試験液を１００μlずつ対応したウェルに添加し、プレートシェイカーを用いて１０秒間攪拌した後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移し、２０時間培養を行った。培養終了後、各ウェルから培養上清５０μlずつを別の９６穴平底プレートに移した。調整したGriess試薬を各ウェル当たり５０μlずつ加え、１０分間室温でインキュベートし、５５０ｎｍの波長でプレートリーダーにより吸光度を測定した。
図３に発酵ニンニク、未発酵ニンニク及びＬＰＳの各濃度における、マクロファージからのＮＯ産生能を調べた結果を示した。
【００４１】
その結果、図３が示すように、発酵ニンニクは濃度依存的にＮＯ産生が強まり、未発酵ニンニクはいずれの濃度においてもＮＯ産生は認められなかった。即ち、発酵によりＮＯ産生能が付与されたことがわかる。
【００４２】
実施例４〔発酵ニンニクのマクロファージ細胞ＩＬ‐１２産生促進作用〕
マウスマクロファージＪ７７４．１細胞株を用い、ＩＬ‐１２産生を指標としたマクロファージ活性化能の測定を行った。Ｊ７７４．１細胞は１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地にて継代培養したものを用いた。培養は３日毎に０．５〜１×１０７cells／ｍｌで植え継いだ。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
前培養したＪ７７４．１細胞を１×１０５cells／ｍｌに細胞数を調整し、得られた細胞懸濁液を８００μlずつ４８穴平底プレートの各ウェルに加えた。試料として、‘発酵ニンニク’（実施例１で得られた発酵ニンニク粉末）、‘未発酵ニンニク’（未発酵のニンニク煮沸上清）、‘フルクタン’をそれぞれ終濃度１０μg／ｍｌになるように添加し、さらに各ウェルに終濃度１μｇ／ｍｌになるようにＬＰＳを添加した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移して、２４時間培養を行った。培養終了後、各ウェルから培養上清を採取しＥＬＩＳＡ法によりＩＬ‐１２を測定した。
図４に発酵ニンニク、未発酵ニンニク及びフルクタンのマクロファージからのＩＬ‐１２産生能を調べた結果を示した。
【００４３】
その結果、未発酵ニンニク及びフルクタンには、ＩＬ‐１２産生は認められないが、発酵ニンニクはＩＬ‐１２産生能が上昇していた。
【００４４】
実施例５〔発酵ニンニクのマウスマクロファージ細胞貪食能活性化〕
本実施例に使用したマクロファージ細胞は、１週間予備飼育したＩＣＲマウス雄性７〜８週齢（日本ＳＬＣより購入）より調整した。
即ち、マウスを断頭屠殺し、腹部に冷ＰＢＳを５ｍｌ注入した後、約３分間腹部をマッサージし細胞を浮遊させ、注入したＰＢＳを回収し遠心分離した。得られた細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に１×１０６cells／ｍｌになるように懸濁し、３５ｍｍのディッシュに１ｍｌずつ播いた。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移して１．５時間培養した後、‘ＬＰＳ’、‘発酵ニンニク’（実施例１で得られた発酵ニンニク粉末）、‘未発酵ニンニク’（未発酵のニンニク煮沸上清）の各試料を添加した。ＬＰＳは終濃度が２μg／ｍｌになるように調整し、発酵ニンニク、未発酵ニンニクはそれぞれ終濃度が２００μg／ｍｌになるように調整した。
各試料を添加後、３０分間３７℃の５％ＣＯ２でインキュベートした。その後、培地を除きＰＢＳで２回洗浄した。新たに１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、酵母由来Zymosanを終濃度が２００μg／ｍｌになるように添加し、３７℃の５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。培養終了後、洗浄することにより未反応のZymosan及び培地を除き、メイ・ギムザ染色にて塗抹を作製し、検鏡により貪食率を測定した。貪食率は全細胞数中のZymosanを１個以上貪食した細胞数の割合で算出した。
図５にＬＰＳ、発酵ニンニク及び未発酵ニンニクのマクロファージの貪食能活性化試験の結果を示した。
【００４５】
その結果、未発酵ニンニクでは貪食能は変化せず、発酵ニンニクはＬＰＳより強い貪食能活性化作用を示し、対照群と比較して有意（ｐ＜０．０１）に高い値が得られた。
【００４６】
実施例６〔発酵ニンニクのマウスパイエル板細胞からのＩＦＮ−γ及びＩｇＡ産生促進作用〕
実験動物として１週間予備飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス雌性７〜８週齢（日本ＳＬＣより購入）を用いた。マウスを屠殺し、小腸を摘出しパイエル板をＲＰＭＩ‐１６４０培地に採取した。採取したパイエル板を押しほぐし、得られた細胞懸濁液をナイロンメッシュに通過させ、さらにＲＰＭＩ‐１６４０培地にて洗浄した。細胞を５％若しくは１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＭＩ‐１６４０培地に再懸濁させ、パイエル板細胞を得た。
得られたパイエル板細胞を上記の培地で１×１０６cells／ｍｌに調整し、９６穴平底プレートに播いた。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに移し、３時間培養した後、実施例５と同様の各試料を添加した。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにて培養し、培養３日目の培養上清を用いてＩＦＮ−γを、７日目の培養上清を用いてＩｇＡをそれぞれＥＬＩＳＡ法により測定した。
図６及び図７に、ＬＰＳ、発酵ニンニク及び未発酵ニンニクによるパイエル板細胞からのＩＦＮ−γ及びＩｇＡ産生促進試験の結果をそれぞれ示す。
【００４７】
その結果、ＩＦＮ−γ産生では、対照群及び未発酵ニンニクはＩＦＮ−γがわずかに産生されたのに対し、ＬＰＳ及び発酵ニンニクは対照群と比較して有意（ｐ＜０．０１）に高い値を示した。ＩｇＡでは、ＬＰＳ及び未発酵ニンニクは対照群と比較して有意（ｐ＜０．０５）に高い値を示し、発酵ニンニクではさらに高い値（対照群、ＬＰＳ及び未発酵ニンニクと比較してｐ＜０．０１）を示した。
【００４８】
実施例７〔発酵ニンニクのマウス好中球増殖促進作用〕
実験動物として１週間予備飼育したＢＡＬＢ／ｃマウス雌性７週齢（日本ＳＬＣより購入）を用いた。
‘発酵ニンニク’（実施例１に記載の発酵ニンニク粉末）を調整し、マウスに２ｇ／ｋｇになるように１日１回、９日間胃ゾンデにて経口投与した（Ｃ群）。対照群、比較対照群として発酵ニンニクの代わりに‘生理食塩水’を経口投与した（Ａ群及びＢ群）。
投与開始３日目に調整した‘シクロフォスファミド’を比較対照群（Ｂ群）及び発酵ニンニク投与群（Ｃ群）に１００ｍｇ／ｋｇになるように腹腔内投与して、免疫を低下させた。発酵ニンニク投与開始８〜１０日目に尾静脈から採血し、メイ・ギムザ染色にて塗沫を作製し血液像を検鏡により好中球数を測定した。
図８に、シクロフォスファミドによる免疫低下マウスに対する、発酵ニンニクによる好中球増殖促進作用試験の結果を示す。
【００４９】
その結果、投与開始８日目では対照群（Ａ群）と比較して、比較対照群（Ｂ群）及び発酵ニンニク投与群（Ｃ群）は有意（ｐ＜０．０１）に減少していたが、９日目と１０日目では、発酵ニンニク投与群（Ｃ群）は対照群（Ａ群）と有意差はなくなり、一方、比較対照群（Ｂ群）は有意（ｐ＜０．０１）に低いままであった。
このことから、発酵ニンニクにより、好中球の増殖が促進されたことがわかる。
【００５０】
実施例８〔発酵ニンニクのヒト唾液中ＩｇＡ分泌促進作用〕
数名のボランティアに、‘発酵ニンニク’（実施例１で得られた発酵ニンニク粉末）０．７５ｇを１日１回自由に５週間摂取してもらい、２週間摂取中止した。
摂取前、摂取開始から５週間、及び、摂取中止から２週間（実験開始から７週間）の唾液をコットンに含ませ回収し、遠心分離することで唾液ＩｇＡ測定試料とし、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
図９に発酵ニンニクのヒト唾液中ＩｇＡ分泌促進作用試験の結果を示す。
【００５１】
その結果、摂取前と比較して、５週間の摂取で有意（Ｐ＜０．０５）にＩｇＡの分泌が上昇していた。また、摂取中止してから２週間で、ＩｇＡの分泌が低下していた。
【００５２】
実施例９〔発酵ニンニクのヒト好中球の異物貪食能活性化〕
実施例８と同様にボランティアに‘発酵ニンニク’（実施例１で得られた発酵ニンニク粉末）を摂取してもらった。５週間の摂取後、２週間摂取中止し、再び２週間摂取してもらった。
摂取開始から５週間、摂取中止から２週間（実験開始から７週間）、摂取再開から１週間（実験開始から８週間）、及び、摂取再開から２週間（実験開始から９週間）の末梢血を採血し、ザイモサン２ｍｇ／ｍｌと等量混合し２６℃で３０分反応させ、ザイモサンを貪食させた。反応後、メイ・ギムザ染色にて塗末を作製し、ザイモサン貪食率を検鏡により測定した。
図１０に発酵ニンニクのヒト好中球の異物貪食能活性化試験の結果を示す。
【００５３】
その結果、５週間の摂取で高かった貪食率は、摂取中止後２週間（実験開始７週間）で有意（Ｐ＜０．０５）に低下するが、摂取を再開することで再び上昇することが示された。
【００５４】
実施例１０〔ラッキョウの発酵〕
ラッキョウを少量のＮａＣｌを含む水に漬け込み、２週間程度抽出した。得られた液を透析して塩分を取り除いた。このようにして得られた透析液を煮沸することにより殺菌し、ここに調製例２で得られたL. plantarum Ｓ５０６株の菌体を発酵スターターとして加え、３０℃にて培養し発酵させた。
培養の際には、少量の培養液を取りｐＨの経時変化を測定し、ｐＨが５．０付近になるように滅菌したカキガラを加えてｐＨを調整した。１週間後、ｐＨが４．０付近になったとき培養を終了し、発酵液（発酵生成物）を得た。
このときの乳酸菌数は約１０９／ｍｌであった。
【００５５】
実施例１１〔チコリ、キクイモからのフルクタンの発酵〕
チコリ、または、キクイモからフルクタンを、粉砕し水で抽出することで調製し、調製例２で得られたL. plantarum Ｓ５０６株の菌体を発酵スターターとして加え、３０℃にて培養し発酵させた。
培養の際には、少量の培養液を取りｐＨの経時変化を測定し、ｐＨが５．０付近になるように滅菌したカキガラを加えてｐＨを調整した。１４日後、培養を終了し、チコリからのフルクタンの発酵液（発酵生成物）とキクイモからのフルクタンの発酵液（発酵生成物）を得た。
フルクタンの発酵を、ＴＬＣを用いてフルクタンが資化されてフルクトースに分解されていることにより確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明において、見出された乳酸菌株は、フルクタン含有食品に対して高機能化を図るために有用な技術を提供することを可能とする。
本発明におけるフルクタンを含有する原料からの乳酸発酵生成物を含有する発酵食品は、免疫賦活作用を有する健康食品として実施可能であり、食品産業に利用することができる。
また、本発明におけるフルクタンを含有する原料からの乳酸発酵生成物を有効成分とする免疫賦活剤は、医薬分野に利用することができる。
【受託番号】
【００５７】
ＮＩＴＥ  ＢＰ‐６４３
【図３】
2010193841.tif 000004
【図４】
2010193841.tif 000005
【図５】
2010193841.tif 000006
【図６】
2010193841.tif 000007
【図７】
2010193841.tif 000008
【図８】
2010193841.tif 000009
【図９】
2010193841.tif 000010
【図１０】
2010193841.tif 000011
【図１】
2010193841.tif 000012
【図２】
2010193841.tif 000013
【配列表】
2010193841000001.app