(57)【要約】      （修正有）【課題】微細固体担体の分散性を良好に保ち、安定して化学発光増強作用を発揮させるように処理した化学発光増強剤を提供する。【解決手段】液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出に使用され、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光を増強するための水溶性高分子第四級アンモニウム塩、第四級スルホニウム塩又は第四級ホスホニウム塩からなる化学発光増強剤であって、酸化剤または還元剤処理により前記微細固体担体の凝集抑制処理を施したものである化学発光増強剤、該化学発光増強剤を用いた化学発光方法およびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出に使用され、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光を増強するための水溶性高分子第四級アンモニウム塩、第四級スルホニウム塩又は第四級ホスホニウム塩からなる化学発光増強剤であって、酸化剤または還元剤処理により前記微細固体担体の凝集抑制処理を施したものである化学発光増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出において、化学発光基質の酵素作用による化学発光を増強する為に用いられる化学発光増強剤に関する。
【０００２】
背景技術
微量成分を測定する分野、特に臨床診断学の分野では、免疫学の原理を応用した測定方法が利用され、固相に微細固体担体を用いた免疫測定方法が広く用いられている。その微細固体担体には赤血球、ゼラチン粒子、ラテックス粒子などがあり、それらの表面に、抗原または／および抗体を吸着させ、試験試料中の該抗原または／および抗体に対する抗体または／および抗原を免疫学的に反応させることにより定量的分析に供される。これらの微細固体担体を用いた免疫測定法は臨床診断以外の分野でも汎用されていることも周知である。
【０００３】
１，２−ジオキセタン類のような化学発光基質にアルカリフォスファターゼのような酵素を作用させて化学発光を起こさせる化学発光反応を利用した化学発光測定は、検体中の測定対象物の存在又は濃度を迅速、高感度に測定することができ、ＨＩＶ，ＨＣＶ等のウイルス、その他生体内微量成分などを測定するために広く用いられている（特表平８−５０７６９４号参照）。
【０００４】
液体媒体中で、特には水性媒体中で、ジオキセタンを有する化学発光基質の分解による化学発光に際して、消光反応が生じることは周知である。多くの試験試料は、概して生体試料であるから、これらによる試料の測定は、一般的には、水性媒体中で実施される。したがって、消光反応が、ジオキセタンを有する化学発光基質の分解によって実際に観測される化学発光を実質的に減少させることがある。特定の試験試料、例えば核酸、ウイルス抗体およびその他の蛋白質など、低レベルの検出が必要である測定法では、不可避的なバックグラウンドシグナルと合わせて、消光反応により減少した化学発光が測定法の感度を低下させるため、極めて低レベルのものを検出できないことがある。これらの消光反応を改善する為に、天然および合成分子の双方を包含している水溶性高分子の添加（米国特許第５，１４５，７７２号参照）、試験試料への各種の水溶性増強剤の添加（米国特許第４，９７８，６１４号参照）、または、水溶性重合第四級アンモニウム塩として、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）（ＴＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロライド）（ＴＢＱ）およびポリ（ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムクロライド）（ＢＤＭＱ）のような水溶性重合第四級アンモニウム塩が用いられてきた（米国特許第５，１１２，９６０号、特表平８−５０７６９４号参照）。
【０００５】
ところで、上記ＴＭＱ、ＴＢＱ及びＢＤＭＱなどの化学発光増強剤は、高分子量のポリマーであり、液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出に使用される場合、例えば免疫反応後に洗浄するために、一旦担体を物理的に凝集させると、その後に微細固体担体の分散を妨げ、被検物質の濃度に依存したジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光を阻害し、正確な測定値を得ることができないという問題が生じる場合があった。
【０００６】
発明の開示
本発明の目的は、公知の化学発光増強剤において、化学発光基質による発光反応に際して微細固体担体の分散性を良好に保ち、安定して化学発光増強作用を発揮させるように処理した化学発光増強剤を提供することである。
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、酸化作用または還元作用を有する試薬で処理した水溶性高分子第四級アンモニウム塩、スルホニウム塩または第四級ホスホニウム塩などの化学発光増強剤が、固相免疫測定法におけるシグナル検出において、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光をより安定して増強し、かつより正確な測定結果を提供することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出に使用され、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光を増強するための水溶性高分子第四級アンモニウム塩、スルホニウム塩または第四級ホスホニウム塩からなる化学発光増強剤であって、酸化剤または還元剤処理により前記微細固体担体の凝集抑制処理を施したものである化学発光増強剤、該化学発光増強剤を用いた化学発光方法およびキットを提供する。
より詳細には、本発明は、以下の項目を提供する。
１．  液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出に使用され、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光を増強するための水溶性高分子第四級アンモニウム塩、第四級スルホニウム塩又は第四級ホスホニウム塩からなる化学発光増強剤であって、酸化剤または還元剤処理により前記微細固体担体の凝集抑制処理を施したものである化学発光増強剤。
２．  該増強剤が、限外ろ過法で分離される分子量において、分子量約４０万ダルトンを越える成分を実質的に含有しない上記１に記載の化学発光増強剤。
３．  該化学発光基質が、一般式
【化１】
2010032529.tif 000002
［式中、Ｒ2はＸ−オキシ基で置換されたアリール基であって、酸、塩基、塩、酵素、有機又は無機触媒及び電子供与体から選択した活性化剤でＸを除去して反応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物を形成し、その不安定な１，２−ジオキセタン化合物が電子エネルギーを放出して分解し、光と一般式
【化２】
2010032529.tif 000003
の２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸは酵素により除去される化学的に易反応性の基である。Ｒ1はアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、アリール基、及びアリール基Ｒ2と結合して１，２−ジオキセタン環にスピロ結合するところの、Ｘ−オキシ基置換の多環式アリール基を形成するアリール基から成る群から選択されたものである。またＲ3，Ｒ4はそれぞれアルキル基又はヘテロアルキル基であって、Ｒ3とＲ4が互いに結合して１，２−ジオセタン環にスピロ結合する多環式アルキレン基を形成していてもよい。］で表される基質である上記１又は２に記載の化学発光増強剤。
４．  該増強剤が、第四級アンモニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ホスホニウム塩、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる単量体から調製される、上記１〜３に記載の化学発光増強剤。
５．  該増強剤が、重合第四級アンモニウム塩、重合第四級スルホニウム塩、重合第四級ホスホニウム塩、又はそれらの共重合体である、上記１〜３に記載の化学発光増強剤。
６．  該増強剤が、ポリ[ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）]（ＢＤＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）（ＴＭＱ）、ポリ[ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムクロライド）]（ＴＢＱ）、ベンジルジメチルセチルアンモニウムクロライド（ＢＤＭＣＡＣ）、ポリメタアクリルアミドプロピレンメチルアンモニウムクロライド（ポリＭＡＰＴＡＣ）、ポリ[ビニルベンジル（トリエチルアンモニウムクロライド）]（ＴＥＱ）、ポリ[ビニルベンジル（２−ベンジルアミノ）エチルジメチルアンモニウムクロライド]（ＢＡＥＤＭ）、ポリ[ビニルベンジルジメチル（２−ヒドロキシ）エチルアンモニウムクロライド（ＤＭＥ（ＯＨ）Ｂ）、ポリ[ビニルベンジル（トリメチルホスホニウムクロライド（ＴＭ）、ポリ[ビニルベンジル（トリブチルホスホニウムクロライド）]（ＴＢ）、ポリ[ビニルベンジル（トリオクチルホスホニウムクロライド）]（ＴＯ）およびそれらの共重合体からなる群から選ばれる、上記１〜３に記載の化学発光増強剤。
７．  該固体担体が、粒子である、上記１〜６に記載の化学発光増強剤。
８．  該粒子が、磁性粒子である、上記7に記載の化学発光増強剤。
９．  酸化作用又は還元作用を有する該試薬が、過硫酸アンモニウム、亜硫酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、重クロム酸カリウムからなる群から選ばれる、上記１〜８の何れか１項に記載の化学発光増強剤。
１０．  液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫反応系における化学発光増強剤の存在下、標識体の酵素として、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ又はエステラーゼを反応させることからなる化学発光方法であって、前記化学発光増強剤が、上記１〜９に定義される化学発光増強剤である化学発光方法。
１１．  化学発光増強剤の存在下、粒子を使用する免疫測定法の化学発光方法であって、前記化学発光増強剤が、上記１〜７、９に定義される化学発光増強剤である上記１０に記載の化学発光方法。
１２．  化学発光増強剤の存在下、磁性粒子を使用する免疫測定法の化学発光方法であって、前記化学発光増強剤が、上記１〜６、８、９に定義される化学発光増強剤である上記１０又は１１に記載の化学発光方法。
１３．  液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫反応法における検出系に使用され、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光に基づく検出試薬キットであって、ジオキセタンを有する化学発光基質、及び上記１〜９のいずれか１項に記載の増強剤を含んでなるキット。
１４．  粒子を使用する免疫測定法の試薬キットであって、ジオキセタンを有する化学発光基質、及び上記１〜９のいずれか１項に記載の増強剤を含んでなる上記１３に記載のキット。
１５．  磁性粒子を使用する免疫測定法の試薬キットであって、ジオキセタンを有する化学発光基質、及び上記１〜９のいずれか１項に記載の増強剤を含んでなる上記１３又は１４に記載のキット。
【０００９】
該増強剤の好ましい態様としては、限外ろ過法で分離される分子量において、分子量約４０万ダルトンを越える成分を実質的に含有しない該化学発光増強剤である。
【００１０】
発明を実施するための最良の形態
上記の通り、本発明の化学発光増強剤は、水溶性高分子第四級アンモニウム塩、スルホニウム塩または第四級ホスホニウム塩などを、酸化作用または還元作用を有する試薬で処理したものであり、下記一般式（Ｉ）で示される。
【００１１】
【化３】
2010032529.tif 000004
【００１２】
一般式［I］中、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、それぞれ、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状非置換アルキル基、（例えばメチル基、エチル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基またはヘキシル基等）、１個またはそれ以上のヒドロキシル基、アルコキシ基（例えばメトキシ基、エトキシ基、ベンジルオキシ基またはポリオキシエチルエトキシ基）、アリールオキシ基（例えばフェノキシ基）、アミノ基、置換アミノ基（例えばメチルアミノ基）、アミド基（例えばアセトアミド基）またはウレイド基（例えばフェニルウレイド基）で置換された１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状アルキル基、フルオロアルカン基、フルオロアリール基（例えばヘプタフルオロブチル基）、３〜１２個の環炭素原子を有する非置換モノシクロアルキル基（例えばシクロヘキシル基またはシクロオクチル基）、１個以上のアルキル基、アルコキシ基または縮合ベンゾ基で置換された３〜１２個の環炭素原子を有する置換モノシクロアルキル基（例えばメトキシシクロヘキシル基または１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基）、それぞれが５〜１２個の炭素原子を有する２個以上の縮合環を有する、非置換であるか１個以上のアルキル基、アルコキシ基またはアリール基で置換されたポリシクロアルキル基（例えば１−アダマンチル基または３−フェニル−１−アダマンチル基）、非置換であるか１個以上のアルキル基、アリール基、フッ素またはヒドロキシル基で置換された、少なくとも１個の環および全部で６〜２０個の炭素原子を有するアリール基、アルカリール基またはアラルキル基（例えばフェニル基、ナフチル基、ペンタフルオロフェニル基、エチルフェニル基、ベンジル基、ヒドロキシベンジル基、フェニルベンジル基またはデヒドロアビエチル基）であってもよく、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7のうち少なくとも２個は、それらが結合している第四級原子とともに、飽和または不飽和の、３〜５個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子を有し、かつベンゼン環が縮合していてもよい窒素、リンまたは硫黄を含有する非置換であるか、または置換された環（例えば１−ピリジニウム、１−（３−アルキル）イミダゾリウム、１−（３−アラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、アルキルモルホリニウム、アルキルピペリジニウム、Ｎ−アシルピペリジニウム、ピペリジノ、アシルピペリジノ、ベンゾオキサゾリウム、ベンズチアゾリウムまたはベンズアミダゾリウム）を形成し得る基を意味する。
【００１３】
一般式［I］中の記号Ｙは、単独に、または合わさって、ハロゲンイオン、すなわちフッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、硫酸イオン、アルキルスルホン酸イオン（例えばメチルスルホン酸イオン）、アリールスルホン酸イオン（例えばｐ−トルエンスルホン酸イオン）、置換アリールスルホン酸イオン（例えばアニリノナフチレンスルホン酸イオンと各種の異性体）、ジフェニルアントラセンスルホン酸イオン、過塩素酸イオン、アルカン酸イオン（例えば酢酸イオン）、アリールカルボン酸イオン（例えばフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体）、ベンゼン複素環式アリールカルボン酸イオン（例えば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボン酸イオン）のような部分を包含できる対イオンを表す。ｐ−テレフタル酸イオンなどの有機ジアニオン類もＹによって表されてよい。
【００１４】
さらに記号ｎは、そのようなポリ（ビニルベンジル第四級塩）の分子量が、固有粘度またはＬＡＬＬＳ法を用いて測定して約５００〜約５００，０００（平均分子量）、好ましくは約２０，０００〜約７０，０００の範囲にわたる数を表す。Ｍが窒素であるこれらの重合体、関連共重合体および関連出発材料を調製する方法は、G.D.Jonesら：Journal of Polymer Science、第２５巻２０１ページ（１９５８年）、米国特許第２，７８０，６０４号、第３，１７８，３９６号、第３，７７０，４３９号、４，３０８，３３５号、第４，３４０，５２２号、第４，４２４，３２６号、およびドイツ国公開特許第２，４４７，６１１号公報に開示されている。記号Ｍは、リンまたは硫黄でもよく、ここで、対応するホスホニウムまたはスルホニウム重合体は先行技術に記載されている（米国特許第３，２３６，８２０号および第３，０６５，２７２号参照）。
【００１５】
一般式［I］で示される構造を有する化学発光増強剤としては、ポリ［ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）］（ＢＤＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）（ＴＭＱ）、ポリ［ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムクロライド）］（ＴＢＱ）、ベンジルジメチルセチルアンモニウムクロライド（ＢＤＭＣＡＣ）、ポリメタアクリルアミドプロピレンメチルアンモニウムクロライド（ポリＭＡＰＴＡＣ）、ポリ［ビニルベンジル（トリエチルアンモニウムクロライド）］（ＴＥＱ）、ポリ［ビニルベンジル（２−ベンジルアミノ）エチルジメチルアンモニウムクロライド］（ＢＡＥＤＭ）、ポリ［ビニルベンジルジメチル（２−ヒドロキシ）エチルアンモニウムクロライド（ＤＭＥ（ＯＨ）Ｂ）、ポリ［ビニルベンジル（トリメチルホスホニウムクロライド）］（ＴＭ）、ポリ［ビニルベンジル（トリブチルホスホニウムクロライド）］（ＴＢ）及びポリ［ビニルベンジル（トリオクチルホスホニウムクロライド）］（ＴＯ）並びにそれらの共重合体から選択されるものが好適である。
【００１６】
本発明において特に好ましい、一般式［Ｉ］の化学発光増強剤は、ポリ[ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）]（ＢＤＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）（ＴＭＱ）、ポリ[ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムクロライド）]（ＴＢＱ）、ポリ[ビニルベンジル（トリエチルアンモニウムクロライド）]（ＴＥＱ）、ポリ[ビニルベンジル（トリメチルホスホニウムクロライド（ＴＭ）、ポリ[ビニルベンジル（トリブチルホスホニウムクロライド）]（ＴＢ）及びポリ[ビニルベンジル（トリオクチルホスホニウムクロライド）]（ＴＯ）並びにそれらの共重合体から選択されるものであり、さらに好ましくは、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）（ＴＭＱ）、ポリ[ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムクロライド）]（ＴＢＱ）及びポリ[ビニルベンジル（ベンジルメチルアンモニウムクロライド）]（ＢＤＭＱ）、ポリ[ビニルベンジル（トリエチルアンモニウムクロライド）]（ＴＥＱ）、並びにそれらの共重合体から選択されるものであり、最も好ましくは、ポリ[ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムクロライド）]（ＴＢＱ）又はポリ[ビニルベンジル（ベンジルメチルアンモニウムクロライド）]（ＢＤＭＱ）である。
【００１７】
下記一般式［II］に記載するように、２個以上の異なるオニウム側鎖を有する共重合体も、ここに述べた本発明で利用できる。記号Ｙ、Ｍ’、Ｒ5’、Ｒ6’およびＲ7’は、Ｙ、Ｍ、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7として前記で説明したものと同様である。記号ｙおよびｚは、共重合体を構成する個々の単量体のモル分率を表す。したがって、記号ｙおよびｚの合計は常に１に等しく、個別的には０．０１から０．９９まで変動してよい。好適な部分として、Ｍは窒素またはリンであり、Ｒ5〜Ｒ7は、それぞれ独立して、１〜２０個の炭素原子を有する、非置換であるか、ヒドロキシル基、アミノ基、アミド基またはウレイド基で更に置換されたアルキル基、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基（例えばアダマンタン基）、アラルキル基またはアリール基であるか、あるいは併せて、Ｍ原子とのスピロ結合を介して複素環式の（場合により他の窒素、硫黄または酸素のヘテロ原子を含む芳香族、脂肪族もしくは混合の）オニウム基を形成する。
【００１８】
【化４】
2010032529.tif 000005
【００１９】
本発明の化学発光増強剤が使用される化学発光反応自体は公知である。化学発光反応を行うための酵素としては、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ又はエステラーゼを挙げることができ、好ましい例としては、酸フォスファターゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びエステラーゼを挙げることができる。最も好ましくは、アルカリフォスファターゼである。これらの酵素は動物、植物又は細菌などから公知の方法で精製することができ、また市販もされている。市販品も好ましく用いることができる。これらの酵素は遊離の状態であってもよく、また、抗原、抗体又はハプテン等の他の物質に結合された状態にあってもよい。
【００２０】
ここで用いられる化学発光反応の基質としては、下記一般式［III］で表されるジオキセタン誘導体を挙げることができる。
【００２１】
【化５】
2010032529.tif 000006
［式中、Ｒ2はＸ−オキシ基で置換されたアリール基であって、Ｘは酸、塩基、塩、酵素、有機又は無機触媒及び電子供与体から選択した活性化剤でＸを除去して反応を誘発すると不安定なオキシド中間体の１，２−ジオキセタン化合物を形成し、その不安定な１，２−ジオキセタン化合物が電子エネルギーを放出して分解し、光と２個のカルボニル含有化合物とを生成し、またＸは酵素により除去される化学的に易反応性の基であり、Ｒ1はアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、アリール基、及びアリール基Ｒ2と結合して１，２−ジオキセタン環にスピロ結合するところの、Ｘ−オキシ基置換の多環式アリール基を形成するアリール基から成る群から選択されたものであり、またＲ3とＲ4はそれぞれアルキル基またはヘテロアルキル基であって、Ｒ3とＲ4が互いに結合して１，２−ジオセタン環にスピロ結合する多環式アルキレン基を形成していてもよい。］
【００２２】
一般式［III］式中、Ｒ1がＲ2と結合していないときは、このＲ1は前記したようにアルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基またはアリール基であり、好ましくは、１〜８個の炭素原子を有する低級のアルキル基またはアルコキシ基である。Ｒ1はまた、６〜２０個の炭素原子を有するアリール基、アリールオキシ基またはアリールシリルオキシ基であってもよい。Ｒ1がアリール基であるＲ2と結合して１，２−ジオキセタン環にスピロ結合する多環式アリール基を形成する場合、その多環式アリール基は炭素数３０までのものであることが好ましい。この場合の多環式アリール基はキサンテニル基のように、炭素原子に代わって酸素原子を含むものであってもよく、スピロ結合多環式アリール基が、同基のＣ９位で１，２−ジオキセタン環にスピロ結合するフルオレニル又はキサンテニルが好ましい。
【００２３】
Ｒ2は、Ｘ−オキシ基（ＯＸ基）で置換されたアリール基であり、アリール基を含む基はフエニル基、ビフエニル基、結合フエニル基または他のアリール基で、６〜３０個の炭素原子を含み、且つ他の置換体を含んでいてもよい。Ｘは、安定なジオキセタン構造を分解して化学発光（シグナル）を生じさせるために、ジオキセタンから活性化剤により除去される基である。ＯＸ基はヒドロキシ基、アルキルシリルオキシ基、アリールシリルオキシ基、無機オキシ酸塩（特にリン酸塩または硫酸塩）、ピラノシド酸素、アリールカルボキシルエステルまたはアルキルカルボキシルエステル基から選択するのが好ましい。また、ＯＸ基がヒドロキシ基である場合、同基の水素原子はカリウムｔ−ブトキシドのような有機塩基あるいは水酸化カリウムのような無機塩基と易反応性であって、塩基により分解させて化学発光を生じさせることができる。活性化剤が、免疫測定用またはＤＮＡプローブ検出用に、標識として通常良く用いられる酵素である場合には、該酵素と易反応性のＸを有するＯＸ基を適宜、選択すればよい。例えば、免疫測定用またはＤＮＡプローブ検出において、比色基質又は蛍光基質により検出させるものとして、汎用されているアルカリホスファターゼ、β−ガラクシドダーゼ、アリールまたはアセチルコリンエステラーゼなどである場合、ＯＸ基としてリン酸塩、ピラノシド酸素または酢酸エステル基を選択することができる。
【００２４】
Ｒ3またはＲ4はそれぞれアルキル基またはヘテロアルキル基であり、また互に結合して環状構造を形成し、多環式アルキレン基としていてもよい。多環式アルキレン基は６〜３０個の炭素原子を含み、また異種原子（窒素、酸素、硫黄又はリン）を含んでいてもよい。好ましい多環式アルキレン基はアダマンチル基である。Ｒ3、Ｒ4はジオキセタン構造に対し安定性をもたらし、安定性を損なう置換基でない限り、置換基を有していてもよい。
【００２５】
以上のような、ジオキセタン構造を有する化合物の中で、好適な化学発光基質は、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ[３．３．１3.7]デカン〕―４−イル）フェニルリン酸、特にその２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）と、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ[３．３．１3.7]デカン〕―４−イル）フェニルリン酸およびその２ナトリウム塩（ＣＳＰＤ）である（米国特許第４，９６２，１６２号、特許２５５２４１３号参照）。
【００２６】
本発明で用いられる微細固体担体としては、動物赤血球、ゼラチン粒子、ラテックス粒子、磁性粒子などが挙げられる。ここで言うゼラチン粒子とは、ゼラチンに、水溶性多糖類、メタリン酸ナトリウム及びアルデヒド架橋剤などよりなる粒子を指し（特開平５−３０６１１３号、特公昭６３−４８０２１号参照）、ラテックス粒子とは、有機高分子であるポリスチレン、アクリル樹脂などの合成樹脂よりなる粒子を指し、市販もされている。市販品も好ましく用いることができる。
【００２７】
本発明において用いられる微細固体担体には、核が有機高分子で表面が酸化鉄系のフェライト被覆層を有する磁性粒子を帯びるように加工したものも含まれる。磁性粒子は磁力を利用して効率良くＢ／Ｆ分離ができる（特許第３１９２１４９号、特許第２９７９４１４号参照）。特に好適に用いられる磁性粒子としては、例えば、マグネタイトを核としてシランを被覆した粒子（特開昭５５−１４１６７０号、特開昭５０−１２２９９７号参照）、磁性金属酸化物を核としてシランを被覆した粒子（特開昭６０−１５６４号参照）、有機高分子化合物を核として、酸化鉄系のフェライト被覆層を有した磁性粒子（特許２９７９４１４号参照）、さらに、有機高分子化合物を核とした磁性粒子の表面にゼラチンを有する粒子などが挙げられる（特許３１９２１４９号参照）。
【００２８】
特にこれらに限定しないが、前記の微細固体担体は、各測定の目的や測定キットの構成により、適切な担体が選択され、固相免疫測定法において使用する担体であれば、該化学発光増強剤により、発明の効果を発揮する。
【００２９】
本発明に係る化学発光増強剤は、酸化作用または還元作用を有する試薬を用いた処理によって調製され得る。ここで用いられる酸化剤または還元剤としては過硫酸アンモニウム、過ヨウ素酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、重クロム酸カリウムなどがあげられる。特に好ましい酸化剤または還元剤としては、過硫酸アンモニウム、亜硫酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム及びメタ過ヨウ素酸ナトリウムを挙げることができ、さらに好ましくは、亜硫酸ナトリウム及び次亜塩素酸ナトリウムを挙げることができる。
【００３０】
本発明に係る化学発光増強剤を調製するに際しては、既知の方法により製造された前記一般式［I］または［II］の化学発光増強剤または市販品の該化学発光増強剤が、前記の酸化剤または還元剤により適切な条件下で処理される。処理条件としては、該化学発光増強剤の有する化学種、分子量、濃度等を考慮することにより、酸化剤又は還元剤の試薬濃度、反応時間、反応温度、使用する溶媒系等が適切に選択され得る。特に限定するものではないが、例えば、化学発光増強剤が数ｇ〜数１００ｇ程度の量である場合、水性溶液中において、５mM亜硫酸ナトリウムでは室温にて１時間、あるいは０．１％次亜塩素酸ナトリウムでは室温にて２時間、あるいは１mM過硫酸アンモニウム及び１mMメタ過ヨウ素酸ナトリウムでは６０℃にて２時間、あるいは１５％過酸化水素では室温にて１７時間、あるいは１mM過マンガン酸カリウム及び１mM重クロム酸カリウムでは８０℃で２時間の処理により、本願発明に係る化学発光増強剤を得ることができる。なお、亜硫酸ナトリウムは条件により酸化作用又は還元作用を示すことが知られている。
【００３１】
下記の実施例をもって例示するように、本発明の化学発光増強剤は次亜塩素酸ナトリウム処理後に、約１４０００以下の分子量をカットする透析膜を用いて精製することが望ましい。また、未処理の化学発光増強剤の多くは、分子量３０万カットの限外ろ過フィルターを通過しえないが、一方で、本発明の化学発光増強剤は通過しえるようになることが判明している。さらに、酸化・還元の条件によっては、フィルターの透過率が低い化学発光増強剤であっても、透析液の条件を変更することにより、本発明の化学発光増強剤の透過率が向上することを見出している。
【００３２】
下記の実施例をもって例示するように、本発明の化学発光増強剤を微細固体担体、すなわち例えば磁性粒子の分散系に添加すると、未処理の化学発光増強剤の添加と比較して、分散性が改善されていることが判明した。このような微細固体担体の良好な分散性が、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光（シグナル）の増強・安定化をもたらすものと考えられる。
【００３３】
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。尚、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１−１  未処理と酸化還元処理ＴＢＱの化学発光測定に与える影響
ＴＢＱ溶液（３５．２mg/ml）２mlに、２mM亜硫酸ナトリウム溶液、０．０１５％（有効塩素濃度）次亜塩素酸ナトリウム溶液、２mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液又は２mM過硫酸アンモニウム溶液を２ml加え、混合後、６０℃にて４時間処理した。これら処理ＴＢＱを透析膜（分子量カット１２０００〜１４０００、三光純薬社製）に分注後ＭｉｌｌｉＱ水（超純水）を外液として透析を行い、処理ＴＢＱとした。次に０．８mg/mlの未処理ＴＢＱ又は処理ＴＢＱを含有した０．４mg/mlＡＭＰＰＤ液（０．２Ｍジエタノールアミン（ＤＥＡ）、１mM塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、０．０５％アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）  pH１０．０）を調製した（基質液）。０．０１５％アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）結合磁性粒子を反応容器に２００μl分注し、磁石を接して粒子を集磁させ上清を除き洗浄した。この反応容器に、前記の基質液２００μlを加えて混合し、３７℃で５分間反応させた後、フォトンカウンター（浜松フォトニクス社製）で発光（シグナル）をカウントし、２秒間の積算値を求めた。上記の磁性粒子と基質による反応を５回行った。この結果を表１に示す。未処理ＴＢＱと比較し、いずれの処理条件においても、処理ＴＢＱ添加群はシグナルが増加し、同時再現性（ＣＶ値）も向上した。
【００３５】
【表１】
2010032529.tif 000007
【００３６】
実施例１−２  未処理と酸化還元処理ＴＢＱの粒子分散に与える影響
０．８mg/ml未処理ＴＢＱ又は処理ＴＢＱを含む０．１Ｍ  ＤＥＡ溶液（pH１０．０）を調製した。０．０３％磁性粒子を反応容器に１００μl分注し、磁石を接して粒子を集磁させ上清を除いた。前記ＴＢＱを含むＤＥＡ溶液２００μlを加えて３０秒攪拌した。攪拌後１５秒後にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製マイクロピペット）で液上面から１５０μlを吸引し、分光光度計用セルに分注し、１０秒後に分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＵＶ−１２００）で濁度（ＯＤ５００）を測定した。この結果を表２に示す。処理ＴＢＱは未処理ＴＢＱにくらべて、濁度が高く、粒子の分散は向上した。
【００３７】
【表２】
2010032529.tif 000008
【００３８】
実施例２−１  未処理と酸化還元処理ＴＢＱの化学発光測定に与える影響
３５．２mg/mlＴＢＱ溶液２mlに、有効塩素濃度として０．００５％、０．０５％又は０．５％次亜塩素酸ナトリウムを含む溶液を２ml加え、混合後、２５℃にて２４時間放置した。次に、透析膜（分子量カット１２０００〜１４０００、三光純薬社製）に分注後ＭｉｌｌｉＱ水を外液として透析を行い、処理ＴＢＱとした。０．８mg/mlの未処理ＴＢＱ又は処理ＴＢＱを含有した０．２mg/mlＡＭＰＰＤ液（０．１Ｍ  ＤＥＡ、１mM  ＭｇＣｌ2、０．０５％  ＮａＮ3、pH１０．０）を調製した（基質液）。次に０．０１５％  ＡＬＰ結合磁性粒子を反応容器に２００μl分注し、磁石を接して粒子を集磁させ上清を除き洗浄した。前記の基質液２００μlを加えて混合し、３７℃で５分間反応させた後、フォトンカウンター（浜松フォトニクス社製）で発光（シグナル）をカウントし、２秒間の積算値を求めた。この結果を表３に示す。未処理ＴＢＱと比較し、いずれの処理条件においても、処理ＴＢＱ添加群はシグナルが増加し、同時再現性（ＣＶ値）も向上した。
【００３９】
【表３】
2010032529.tif 000009
【００４０】
実施例２−２
未処理と酸化還元処理ＴＢＱの粒子分散に与える影響
実施例２−１に記した方法により処理ＴＢＱを得た。０．８mg/ml未処理ＴＢＱ又は処理ＴＢＱを含む０．１Ｍ  ＤＥＡ溶液（pH１０．０）を調製した。０．０３％磁性粒子を反応容器に１００μl分注し、磁石を接して粒子を集磁させ上清を除いた。前記ＴＢＱを含むＤＥＡ溶液２００μlを加えて３０秒攪拌した。攪拌後１５秒後にピペットマンで液上面から１５０μlを吸引し、分光光度計用セルに分注し、１０秒後に分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＵＶ−１２００）で濁度（ＯＤ５００）を測定した。この結果を表４に示す。各処理ＴＢＱは未処理ＴＢＱに比べて濁度が高く、粒子の分散は向上した。
【００４１】
【表４】
2010032529.tif 000010
【００４２】
実施例３  未処理と酸化還元処理ＴＢＱの限外ろ過フィルターの透過率
０．１Ｍ又は１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で未処理と各処理ＴＢＱを１mg/ml以下に希釈した。この溶液を分子量３０万カットの限外ろ過フィルター（ミリポア社製）で限外ろ過し、ろ液の吸光度（ＯＤ２６８）を測定し、透過率を算出した。その結果を表５に示す。未処理ＴＢＱと比較し、各処理ＴＢＱのフィルター透過率は上昇した。更に、０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶液では低い透過率であった０．００５％次亜塩素酸ナトリウム処理ＴＢＱは１Ｍ  ＮａＣｌ溶液に溶解した場合、フィルター透過率は向上した。
【００４３】
【表５】
2010032529.tif 000011
【００４４】
実施例４  未処理と酸化還元処理ＴＢＱの化学発光免疫測定に与える影響（１）
３５．２mg/mlＴＢＱ溶液２mlに２Ｍ亜硫酸ナトリウム溶液を２ml加え、混合後、６０℃にて４時間処理した。次にこれを透析膜（分子量カット１２０００〜１４０００、三光純薬社製）に分注後ＭｉｌｌｉＱ水を外液として透析を行い、処理ＴＢＱとした。０．８mg/mlの未処理ＴＢＱ又は処理ＴＢＱを含有した０．２mg/mlＡＭＰＰＤ液（０．１Ｍ  ＤＥＡ、１mM  ＭｇＣｌ2、０．０５％  ＮａＮ3、pH１０．０）を調製した（基質液）。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）  ０、１０、１００、８００及び２０００ng/mlを含む試験試料をＢＳＡ溶液で２０倍希釈した。０．０３％抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子５０μlを入れた反応容器中に各測定試料を各々２０μl添加・混合し、３７℃で８分間反応させた。この後、反応容器に磁石を接して粒子を集磁させ上清を除き洗浄した。０．１μg/ml  ＡＬＰ結合抗ＡＦＰ抗体溶液を５０μl添加・混合し、３７℃で８分間反応させた。反応後この反応容器に磁石を接して粒子を集磁させ上清を除き洗浄した。この粒子に前記基質液を２００μl添加・混合した。３７℃で４分間反応させた後、フォトンカウンター（浜松フォトニクス社製）で発光（シグナル）をカウントし、２秒間の積算値を求めた。その結果を表６に示す。未処理ＴＢＱと比較し、亜硫酸ナトリウム処理ＴＢＱの同時再現性（ＣＶ値）は向上した。
【００４５】
【表６】
2010032529.tif 000012
【００４６】
実施例５  未処理と酸化還元処理ＴＢＱの化学発光免疫測定に与える影響（２）
３５．２mg/mlＴＢＱ溶液３００mlに１Ｍ亜硫酸ナトリウム−ＨＣｌ溶液（pH６．０）を１５ml加え、混合後、２５℃にて２４時間処理した。次にこれを透析膜（分子量カット１２０００−１４０００、三光純薬社製）に分注後、ＭｉｌｌｉＱ水を外液として透析を行い、処理ＴＢＱとした。０．８mg/mlの未処理ＴＢＱ又は処理ＴＢＱを含有した０．２mg/mlＡＭＰＰＤ液（０．１Ｍ  ＤＥＡ、１mM  ＭｇＣｌ2、０．０５％ ＮａＮ3、pH１０．０）を調整した（基質液）。
【００４７】
前記実施例４と同様に試験試料としてαフェトプロテインを用いて、免疫測定を行い発光（シグナル）をカウントして測定を行った。その結果を表７に示す。未処理ＴＢＱと比較し、亜硫酸ナトリウム処理ＴＢＱ同時再現性（ＣＶ値）は向上した。
【００４８】
【表７】
2010032529.tif 000013
【００４９】
実施例６  未処理と酸化還元処理ＢＤＭＱの化学発光免疫測定に与える影響
ＢＤＭＱ溶液（２５．４mg/ml）１０mlに１Ｍ亜硫酸ナトリウム−ＨＣｌ溶液（pH６．０）を０．５ml加え、混合後、２５℃にて２４時間処理した。次にこれを透析膜（分子量カット１２０００−１４０００、三光純薬社製）に分注後、ＭｉｌｌｉＱ水を外液として透析を行い、処理ＢＤＭＱとした。
【００５０】
次に０．４mg/mlの未処理ＢＤＭＱ又は処理ＢＤＭＱを含有した０．２mg/mlＡＭＰＰＤ液（０．１Ｍジエタノールアミン（ＤＥＡ）、１mM  塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０５％  アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）pH１０．０）を調製した（基質液）。
【００５１】
αフェトプロテイン（ＡＦＰ）０，１０，１００，８００および２０００ng/mlを含む試験試料をＢＳＡ溶液で１０倍希釈した。０．０１５％抗ＡＦＰ抗体結合磁性粒子２５０μlを入れた反応容器中に各測定試料を各々２０μl添加・混合し、３７℃で１０分間反応させた。この後、反応容器に磁石を接して粒子を集磁させ上清を除き洗浄した。０．１μg/ml  ＡＬＰ結合抗ＡＦＰ抗体溶液を２５０μl添加・混合し、３７℃で１０分間反応させた。反応後、この反応容器に磁石を接して粒子を集磁させ上清を除き洗浄した。この粒子に前記基質液を２００μl添加・混合した。３７℃で５分間反応させた後、フォトンカウンター（浜松フォトニクス社製）で発光（シグナル）をカウントし、２秒間の積算値を求めた。その結果を表８示す。未処理ＢＤＭＱと比較し、亜硫酸ナトリウム処理処理ＢＤＭＱの同時再現性（ＣＶ値）は向上した。
【００５２】
【表８】
2010032529.tif 000014
【００５３】
実施例７  未処理と酸化還元処理ＢＤＭＱの粒子分散に与える影響
ＢＤＭＱ溶液（２５．４mg/ml）１０mlに１Ｍ亜硫酸ナトリウム−ＨＣｌ溶液（pH６．０）を０．５ml加え、混合後、２５℃にて２４時間処理した。次にこれを透析膜（分子量カット１２０００−１４０００、三光純薬社製）に分注後、ＭｉｌｌｉＱ水を外液として透析を行い、処理ＢＤＭＱとした。
【００５４】
次に０．４mg/ml未処理ＢＤＭＱ又は処理ＢＤＭＱを含む０．１Ｍ  ＤＥＡ（pH１０．０）を調製した。０．０３％磁性粒子を反応容器に１００μl分注し、磁石を接して粒子を集磁させ上清を除いた。前記ＢＤＭＱを含むＤＥＡ溶液２００μlを加えて３０秒攪拌した。攪拌後、１５秒後にピペットマンで液上面から１５０μlを吸引し、分光光度計用セルに分注し、１０秒後に分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＵＶ−１２００）で濁度（ＯＤ５００）を測定した。この結果を表９に示す。処理ＢＤＭＱは未処理ＢＤＭＱに比べて、濁度は高く、粒子の分散性は向上した。
【００５５】
【表９】
2010032529.tif 000015
【００５６】
発明の効果
上記のように、酸化剤または還元剤処理により、液体媒体中に分散可能な微細固体担体に固定化される抗原または／および抗体を用いる固相免疫測定法におけるシグナル検出に使用され、従来の化学発光増強剤と比較して該微細固体担体の分散性を改善し、ジオキセタンを有する化学発光基質の酵素反応による発光の増強作用の優れた化学発光増強剤、該化学発光増強剤を用いた化学発光方法及びキットが提供された。また、本発明の化学発光増強剤を用いると測定値の同時再現性が向上し、より正確な定量が可能になる。