(57)【要約】【課題】試料の拡散が最小限に抑えられ、その結果、生体試料などの複雑なマトリックスから目的物質を分離可能な高理論段数を有する高分離性能の液体クロマトグラフィーチップを提供すること。【解決手段】曲線流路部における圧力損失を均一にする機能を有する手段を備えることを特徴とする、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップ、及び、曲線流路部における流路抵抗を均一にする機能を有する手段を備えることを特徴とする、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップ、該液体クロマトグラフィー用チップを含むマイクロチップ、及び、マイクロ化学分析システム。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
曲線流路部における圧力損失を均一にする機能を有する手段を備えることを特徴とする、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップ。
【請求項２】
曲線流路部における流路抵抗を均一にする機能を有する手段を備えることを特徴とする、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップ。
【請求項３】
低拡散型曲線流路を備えた、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
【請求項４】
曲線流路におけるピラー間の流路幅が曲線部の内側から外側に向かって漸次広がる構造を有する、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
【請求項５】
曲線流路に沿ったピラーの大きさが内側から外側に向かって漸次小さくなる構造を有する、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
【請求項６】
曲線流路の深さが内側から外側に向かって漸次深くなる構造を有する、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載の液体クロマトグラフィー用チップを含む、マイクロチップ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項記載の液体クロマトグラフィー用チップを含む、マイクロ化学分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ化学分析システムにおける圧力損失が均一である構造を有する曲線流路部を有する液体クロマトグラフィーによる分離手段を提供する。具体的には、マイクロシステムの流路内に半導体微細加工技術を用いて、高理論段数を得ることが出来るような圧力損失が均一である曲線流路部を有する液体クロマトグラフィー（マイクロ）チップ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体微細加工技術と生物工学技術の発展により、マイクロ化学分析システムの研究が盛んに行われている。このようなシステムの代表例であるDNAチップは病態診断などにおいて広く利用されるに至っている。分離分析においても、電気泳動による分離と、蛍光検出や質量分析検出を組み合わせた定性・定量分析が報告されている。これらのチップを用いた分析法は、微量のサンプルで高感度検出が可能であると共に、高速分析も可能である。また、生体分子の分離分析をマイクロチップ上において行う場合、前処理技術や誘導体化反応技術などを含めた分析の全ての過程をマイクロチップ上で行うことができるという利点がある。さらに、使用する試薬量及び廃液の少量化をもたらすことから、環境負荷への軽減にもつながる。このように、微量生体分子の分離・定量の技術として、マイクロ化学分析システムの利用は有効であると考えられる。
【０００３】
しかしながら、低分子化合物を対象としたマイクロ化学チップは、現在も汎用されるには至っていない。その理由の一つとして、従来のマイクロ化学チップにおける分離技術が電気泳動法もしくは電気クロマトグラフィー法であったため、分析対象が限られていたことが挙げられる。一方で、液体クロマトグラフィーは、電気泳動と並ぶ分離手段の一つであり、低分子化合物の分析において広く用いられていることからも分かるように、その開発は分析対象を広げることを可能とするが、マイクロ化学チップにおける液体クロマトグラフィーの報告は非常に少ない。
【０００４】
マイクロ化学チップにおける液体クロマトグラフィーの報告例としては、従来のカラムクロマトグラフィーと同様にチップ流路内に固定相となる粒子を充填する方法がある（非特許文献１）。しかし、粒子充填による方法は、充填方法が複雑で長時間を要する上、分離性能に優れた充填状態を再現することが難しい。さらに流路長（カラム長）が増加するに従って、微粒子の均一な充填が飛躍的に困難になるので、カラム長を増すことによる分離性能の向上を図り難い。他の例として、チップの流路内に液相反応で一体型（モノリス）多孔体を合成する方法がある（特許文献１）。粒子を充填する必要がなく、分離媒体の作製は容易であるものの、化学反応により分離媒体を作製することから、その再現性は良くない。  
【０００５】
これらの技術の問題点を克服した方法として、マイクロチップ上の微小流路をμmオーダー以下で製作し、その壁面を修飾することにより分離媒体をマイクロチップ内に形成させるピラー構造を有した液体クロマトグラフィーチップが報告されている（非特許文献2）。このチップは、上位のものに較べて、より均一な分離媒体を形成可能であり、試料の拡散が抑制された高分離能を有する分離媒体である。
【０００６】
一方、マイクロ化学分析システムにおける流路を用いた分離分析の代表例である電気泳動において、分離流路を長くするほど高い分離性能が得られることが知られている。チップ内で流路長を長く取るためには、直線の流路だけでは十分な長さを得ることが出来ない。このため、曲線の流路が必要となるが、直線部と同じ径の曲線流路では、目的成分の拡散が起こってしまう。この曲線流路由来の分離性能の低下は、流路幅が広くなるほどその影響が大きくなることが知られている。そこで、このような拡散を防ぐ目的で、曲線部の流路を細める構造を有する電気泳動チップが報告されている（非特許文献３）。同様に、電気泳動における曲線部における拡散を防ぐ目的で、低拡散型曲線が報告されている（非特許文献４，５，６）。更に、湾曲部の径方向内側領域に配置されるピラーの密度が湾曲部の径方向外側領域に配置されるピラーの密度よりも高いことを特徴とする、ピラーを備えたクロマトグラフィ用カラムが報告されている（特許文献２）が、該特許公報には具体的な実験データは何等開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2002-311008号公報
【特許文献２】特開2008-298619号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yin H, Killeen K, Brennen R, Sobek D, Werlich M, van de Goor T.  Microfluidic chip for peptide analysis with an integrated HPLC column, sample enrichment column, and nanoelectrospray tip. Anal. Chem. (2005) 77, 527-533.
【非特許文献２】De Malsche W, Eghbali H, Clicq D, Vangelooven J, Gardeniers H, Desmet G. Pressure-driven reverse-phase liquid chromatography separations in ordered nonporous pillar array columns. Anal. Chem. (2007) 79, 5915-5926.
【非特許文献３】Paegel BM, Hutt LD, Simpson PC, Mathies RA. Turn geometry for minimizing band broadening in microfabricated capillary electrophoresis channels. Anal. Chem. (2000) 72, 3030-3037.
【非特許文献４】Mellors JS, Gorbounov V, Ramsey RS, J. M. Ramsey JM. Fully Integrated Glass Microfluidic Device for Performing High-Efficiency Capillary Electrophoresis and Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. (2008) 80, 6881-6887.
【非特許文献５】Dutta D, Leighton DT. A Low Dispersion Geometry for Microchip Separation Devices. Anal. Chem. (2002) 74, 1007-1016.
【非特許文献６】Molho JI, Herr AE, Mosier BP, Santiago JG, Kenny TW, Brennen RA, Gordon GB, Mohammadi B. Optimization of turn geometries for microchip electrophoresis. Anal. Chem. (2001) 73, 1350-1360.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、ピラー構造を備えた液体クロマトグラフィーチップにおいて、従来の電気泳動チップと較べて非常に狭い２μm程度という流路幅を有するにも拘らず、極めて予想外なことに、曲線部において試料の拡散が起こってしまうことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決すべく研究の結果、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィーチップの曲線流路部における流路抵抗を均一にし、該曲線流路部における圧力損失を均一にすることにより、試料の拡散を最小限に抑制することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
［１］曲線流路部における圧力損失を均一にする機能を有する手段を備えることを特徴とする、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップ。
［２］曲線流路部における流路抵抗を均一にする機能を有する手段を備えることを特徴とする、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップ。
［３］低拡散型曲線流路を備えた、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
［４］曲線流路におけるピラー間の流路幅が曲線部の内側から外側に向かって漸次広がる構造を有する、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
［５］曲線流路に沿ったピラーの大きさが内側から外側に向かって漸次小さくなる構造を有する、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
［６］曲線流路の深さが内側から外側に向かって漸次深くなる構造を有する、請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィー用チップ。
［７］請求項１〜６のいずれか一項記載の液体クロマトグラフィー用チップを含む、マイクロチップ。
［８］請求項１〜６のいずれか一項記載の液体クロマトグラフィー用チップを含む、マイクロ化学分析システム。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の液体クロマトグラフィー用チップを使用することにより、試料の拡散が最小限に抑えられ、その結果、生体試料などの複雑なマトリックスから目的物質を分離可能な高理論段数を有する高分離性能のクロマトグラフィーにより、試料の分離を行なうことができる。
更に、本発明を利用することによって、チップ上に分離用の流路のみならず、前処理用の流路や反応用の流路も形成し、前処理、分離および反応を１台のマイクロチップ上で実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明液体クロマトグラフィー用チップの低拡散型曲線流路の一例を示す（右側）。
【図２】本発明液体クロマトグラフィー用チップの曲線流路においてピラー間の流路幅を変えた構造の一例を示す。
【図３】本発明液体クロマトグラフィー用チップの曲線流路においてピラーの形状（大きさ）を変えた構造の一例を示す。
【図４】本発明液体クロマトグラフィー用チップの曲線流路の深さ（h）を変えた構造の一例を示す。
【図５】バンド状のクマリン色素（C525）溶液を円弧型流路（A）および低拡散型曲線流路（B）に流し、それらが通過する様子を0.5秒ごとの静止画像として捕らえたものである。
【図６】液体クロマトグラフィー用チップにおける逆相分離を行った時の低拡散型曲線と円弧型曲線の理論段数を示す。
【図７】低拡散型曲線流路を有する本発明の液体クロマトグラフィー用チップによる誘導体化アミノ酸の分離の様子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の液体クロマトグラフィー用チップは、例えば、特許文献１及び非特許文献２に記載された、当業者に公知の任意の従来方法に準じて作製することが出来る。
【００１５】
チップに使用する板状部材としては、例えば各種ガラス、石英、及びＳｉ基板等が用いられ、それらの厚みは例えば０．２〜５ｍｍ程度が好ましい。この板状部材に、フォトリソグラフィ及びドライエッチング等の当業者に公知の任意の方法により流路パターン及びピラー構造等を形成する。
【００１６】
通常、本発明のチップにおいて、板状部材の厚さ：0.1〜1ｍｍ、一辺：5〜50ｍｍ、流路幅：50〜1000μｍ、流路深さ：10〜100μｍである。分離流路の長さは全体で1〜250ｍｍとすることができ、約4〜40ｍｍ毎に曲線部分が設けられている。又、ピラーの構造・形状は当業者が適宜設計することが出来、例えば、一辺：１〜100μｍ、ピラー間の幅：0.1〜5μｍとすることができる。
【００１７】
該チップには、試料を分離する分離流路、試料注入路、試料排出路、及び、試料検出部等を備えて成ることも可能である。又、１つのチップに分離流路が複数形成されていてもよい。
【００１８】
分離流路は、例えば、シリル化剤などで化学修飾することにより、逆相系、イオン交換系（陽イオンまたは陰イオン）、順相系の分離媒体を作製させることができる。シリル化剤としては、例えばオクタデシルシリル化剤およびトリメチルシリル化剤、アミノプロピルトリメトキシシランが好ましく、オクタデシルシリル化剤としては、例えばオクタデシルジメチル−Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノシラン、トリメチルシリル化剤としては、例えば1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルシランを用いることができる。
【００１９】
試料注入部及び試料排出路は、分離流路と同じチップ内に作製する。注入時における拡散を最小限にするようなマイクロバルブを用いたもの、分離用流路に交差して試料導入用流路が設けられたクロスインジェクション方式の流路であっても良い。
【００２０】
本発明のチップにおいて、分離されたサンプルの検出は、例えば、光源からの光を分析流路に入射させ、分析流路内での蛍光を検出器で検出するもの、流路に電極を挿入して電気化学変化量を測定するもの、流路からの溶液を質量分析計に導き測定するもの等、当業者に公知の任意の手段を用いることができる。
【００２１】
更に、本発明のマイクロチップは、上記の液体クロマトグラフィー用チップに加えて、当業者に公知の任意の他の構成要素、例えば、試料の前処理及び誘導体化反応用の構造を適宜備えたものである。又、本発明の液体クロマトグラフィー用チップを含むマイクロ化学分析システムは、種々の疾患診断用等の、生化学、薬学、及び医学分野等において様々な目的で使用することが可能である。
【００２２】
本発明の液体クロマトグラフィー用チップの主な特徴は、曲線流路部における圧力損失又は流路抵抗を均一にする機能を有する手段を備えていることである。その結果、特に曲線流路における試料の拡散を最小限に抑えることが出来る。従って、このような機能を有する手段である限り、その構造に特に制限はない。
【００２３】
このような曲線流路部における圧力損失又は流路抵抗を均一にする機能を有する手段の代表的な例として、以下の４つの態様をあげることが出来る。
【００２４】
a. 低拡散型曲線流路（曲線部流路全体の構造を変えたもの）
上記手段が、曲線部の前後に設計された流路幅（黒い部分）を細める部分が、細い曲線流路において生じる内側と外側との流路長さの差及び試料分布の変化を補正するための構造（図１右側）を有する。流路幅が細くなる部分において、ターンの内側に流入した試料の方が外側の試料と比較して長い距離を通過する構造とすることで、低拡散曲線構造全体としては、内側と外側を流れる液体がそれぞれ通過する距離がほぼ等しくなっている。それと同時に、細い曲線流路において生じる試料バンド形状の歪曲と、流路幅が細くなる部分において生じる歪曲とが、互いに逆向きで相殺されるような構造になっている。
【００２５】
b. 曲線流路のピラー間の流路幅を変えた構造
上記手段が、曲線部の内側から外側に向かって、ピラー間の流路幅が漸次広がった構造（図２）を有する。この構造において、ピラー間の幅（Wi）は下の式で表される。尚、ピラー間の流路幅の拡大の程度は、該曲線流路部における流路抵抗又は圧力損失が均一になるように、分離する試料、使用する溶媒、及び、その他の液体クロマトグラフィーの条件等に従い、当業者が適宜設定することが出来る。
【００２６】
【数１】
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【００２７】
c. 曲線流路のピラーの形状（大きさ）を変えた構造
b.と同じ原理であるが、上記手段がピラー間の流路幅を一定にしたまま、ピラーの形状（大きさ、例えば、放射線方向に沿った幅）が内側から外側に向かって漸次小さくなる構造（図３）を有する。尚、ピラーの形状（大きさの変化の程度は、該曲線流路部における流路抵抗又は圧力損失が均一になるように、分離する試料、使用する溶媒、及び、その他の液体クロマトグラフィーの条件等に従い、当業者が適宜設定することが出来る。
【００２８】
d. 曲線流路の深さを変えた構造
b.と同じ原理であるが、ピラー間の流路幅、ピラーの形状（大きさ）を一定にしたまま、曲線流路の深さを変えた構造（図４）を有する。曲線部の内側から外側に向かって、ピラー間の流路深さ（h）を漸次深くした構造。ピラー間の流路深さは、下の式で表される。但し、wはピラー間の流路幅である。尚、ピラー間の流路深さの変化の程度は、該曲線流路部における流路抵抗又は圧力損失が均一になるように、分離する試料、使用する溶媒、及び、その他の液体クロマトグラフィーの条件等に従い、当業者が適宜設定することが出来る。
【００２９】
【数２】
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【００３０】
以下、参考例及び実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに何ら限定されるものではない。
【００３１】
（低拡散型流路を用いた参考例）
１．保持が起こらない条件における低拡散型流路の評価
まず、内部にピラー構造を有するチップを以下のように作製し、試料の保持が起こらない条件において低拡散型流路の評価を行なった。
【００３２】
即ち、ピラー構造を有する液体クロマトグラフィー用チップは、フォトレジスト塗布、分離流路のパターニング（露光、現像）、Siエッチング、レジスト除去、フォトレジスト塗布、インジェクションホールパターニング、Siエッチング、レジスト除去、表面酸化、陽極接合のプロセスで作製した。板状部材の厚さ  0.5 ｍｍ、一辺 20 ｍｍ、流路幅 400 μｍ、流路深さ25 μｍである。ピラーは1辺が3μmの正方形、ピラーの間隔は2μmとした。
【００３３】
このチップに、バンド状のクマリン色素（C525）溶液を円弧型流路（A）及び低拡散型曲線流路（B）に流し、それらが通過する様子を0.5秒ごとの静止画像として捕らえた（図５）。一番左の図は、流路全体に色素溶液を満たした時のものである。その結果、円弧型流路（A）ではターンの内側と外側で距離差が存在するために蛍光バンドの形状が大きく変化するのに対して、低拡散型曲線流路（B）ではターン前後でほとんどバンドの形状に変化が見られなかった。この結果から、流路内部にピラー構造を有する場合に低拡散型曲線流路により、試料の拡散が抑えられることが示された。
【実施例１】
【００３４】
２．逆相分離を行った時の低拡散型曲線の評価
次に、上記の円弧型流路（A）及び低拡散型曲線流路（B）を有する液体クロマトグラフィー用チップのピラー表面を、水酸化ナトリウム溶液で活性化後、dimethyloctadecylchlorosilane乾燥トルエン溶液と室温24時間反応させることで、表面修飾を行い、逆相分離用の液体クロマトグラフィー用チップを作製し、逆相分離条件下における比較を行なった。尚、試料注入部から数えて奇数回目の曲線部分に入る直前において検出した。
その結果、クマリン色素を分離した時の理論段数（図６）は、明らかに、低拡散型曲線流路（B）（本発明の液体クロマトグラフィー用チップ）が円弧型曲線流路（A）に較べて高い値であることが確認された。
【実施例２】
【００３５】
３．低拡散型曲線流路を有するピラー型液体クロマトグラフィー用チップによる誘導体化アミノ酸の分離
低拡散型曲線流路を有する本発明の液体クロマトグラフィー用チップを用いて、予め4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F)にて蛍光誘導体化したアミノ酸標準溶液を分離した。その結果、得られたクロマトグラムを示す（図７）。検出はそれぞれ、試料注入部から数えて、１つ目のターンが始まる直前(A)、３つ目のターンが始まる直前(B)、及び、５つ目のターンが始まる直前(C)にて行った。その結果、最初のターンに入るまでの短い直線の分離流路のみでは、７種類の蛍光物質は４本のピークにしか分離されなかった（Ａ）。これに対して、分離能が向上し（Ｂ）、更に一往復分長くなることで７本のピークとして検出されるようになった（Ｃ）。これらの結果は、本発明の液体クロマトグラフィー用チップを用いることで低分子化合物等の高性能分離が可能であることを示している。尚、図７における各ピークは以下の通りである。
1, NBD-OH; 2, NBD-Pro; 3, NBD-Val; 4, NBD-e-amino-n-caproic acid; 5, NBD-Ile; 6, NBD-Leu; 7, NBD-Phe.
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の液体クロマトグラフィー用チップは、従来の分離媒体を超える分離性能を持つことから、高感度な検出系と組み合わせることにより、低分子やタンパク質の網羅的解析だけでなく、未知の微量生体成分の発見などに有効である。従って、生化学、薬学、医学分野における基礎研究の基盤技術と成り得るだけでなく、種々の疾患診断のためのマイクロ化学分析システム開発にも貢献でき、社会的効果も大きいといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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