(57)【要約】【課題】従来困難とされていたタンパク質の電気的シグナルの検出を可能とし、かつ対象タンパク質を高感度に検出する。【解決手段】バイオセンサ６０は、基板表面に形成されたゲート電極２２・２４と、ゲート電極２２とゲート電極２４との間の基板表面上に形成されたセンシング部２７と、センシング部２７の表面に結合された、対象タンパク質３４と特異的に相互作用するリガンド３３と、上記ゲート電極２２により上記センシング部２７と隔てられた電荷供給部と、センシング部２７においてリガンド３３と相互作用した対象タンパク質３４に由来する電荷を蓄積するｎ＋型ドープ領域１３とを備える電荷転送型センサ５０と、ｎ＋型ドープ領域１３に蓄積された電荷の量を測定するオシロスコープ４５とを備えている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象である対象タンパク質の濃度を測定するバイオセンサであって、
基板表面に形成された第１および第２ゲート電極と、
上記第１ゲート電極と上記第２ゲート電極との間の基板表面上に形成されたセンシング部と、
上記センシング部の表面に結合された、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドと、
上記第１ゲート電極により上記センシング部と隔てられた電荷供給部と、
上記ゲート電極において上記リガンドと相互作用した対象タンパク質に由来する電荷を蓄積する電荷蓄積部とを備える電荷転送型センサと、
上記電荷蓄積部に蓄積された電荷の量を測定する測定装置とを備えることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
上記測定装置は、上記対象タンパク質の電荷に加え、当該対象タンパク質に結合した電荷付与分子の電荷の量を測定することを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
上記電荷付与分子は、ＣＢＢ  Ｇ−２５０、ドデシル硫酸ナトリウム、およびカチオン性ポリマーからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサを用いた測定方法であって、
上記リガンドと上記対象タンパク質とを特異的に相互作用させる相互作用工程と、
上記相互作用工程において上記リガンドと相互作用しなかったタンパク質を除去する洗浄工程と、
上記洗浄工程の後に、電解質溶液に浸漬された上記センシング部の電荷を上記電荷蓄積部に蓄積する蓄積工程と、
上記蓄積工程の後に、上記電荷蓄積部の電位を測定する測定工程とを含むことを特徴とする測定方法。
【請求項５】
基板表面に形成された第１および第２ゲート電極と、
上記第１ゲート電極と上記第２ゲート電極との間の基板表面上に形成されたセンシング部と、
上記センシング部の表面に結合された、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドと、
上記センシング部において上記リガンドと相互作用した対象タンパク質に由来する電荷を蓄積する電荷蓄積部とを備えることを特徴とする電荷転送型センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中のタンパク質濃度を測定するためのバイオセンサ、電荷転送型センサおよび測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、濃度未知のタンパク質を定量するために様々な方法が用いられてきた。最も一般的に使用されているタンパク質の定量方法の１つは、ウエスタンブロット法である。ウエスタンブロット法とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの電気泳動により試料中のタンパク質を分離した後、当該タンパク質を電気的にメンブレンに転写し、試料中の対象タンパク質に対して特異的な抗体とメンブレン上で反応させて、対象タンパク質を検出する方法である。
【０００３】
上記ウエスタンブロット法は、使用する機器や試薬が安価であることから広く使用されてきたが、一連の実験操作に長時間を要し、かつ煩雑であることから、バイオセンサを用いたタンパク質の定量に関する研究が盛んに行われている。
【０００４】
電気的シグナルを利用して生体物質を検出するバイオセンサでは、特定の抗体に対して反応する抗原を検出できるよう設計された電界効果型トランジスタ（Field−Effect Transistor：ＦＥＴ）型バイオセンサが提案されている（特許文献１参照）。このバイオセンサでは、ドレイン電流の変化を経時的に観察して、溶液中の抗原の濃度を測定する。また、プリン、ピリミジンやヌクレオチドを検出できるよう設計されたＦＥＴ型バイオセンサも提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
現在、ＦＥＴ型バイオセンサではタンパク質に比べＤＮＡを検出するものが圧倒的に多い。これは、ＤＮＡを形成するヌクレオチドがリン酸基の負電荷をもつため、複雑な３次元立体構造のタンパク質の表面電荷よりも、電気的シグナルを検出しやすいためである。例えば、非特許文献１に記載されているＦＥＴ型バイオセンサでは、ゲート表面に結合したＤＮＡプローブに結合したほぼ全ての測定対象ＤＮＡの電荷を検出することが可能である。
【０００６】
また、化学・物理現象検出装置として、電荷転送型センサ（特許文献３、特許文献４、特許文献５参照）が知られている。この電荷転送型センサは、ＦＥＴ型センサよりも高感度である（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，２３８，７５７号明細書（公開日：１９８０，１２，９）
【特許文献２】米国特許第４，７７７，０１９号明細書（公開日：１９８８，１０，１１）
【特許文献３】特開平１０−３３２４２３号公報（公開日：平成１０年（１９９８）１２月１８日）
【特許文献４】特開２００２−９８６６７号公報（公開日：平成１４年（２００２）４月５日）
【特許文献５】特開２００７−２７８７６０号公報（公開日：平成１９年（２００７）１０月２５日）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔ．ＳＡＫＡＴＡ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．４Ｂ，２００５，ｐｐ２８５４−２８５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
タンパク質を定量する従来のＦＥＴ型バイオセンサは以下の問題を有している。
【００１０】
第一に、ＤＮＡをトランジスタで定量する場合には、ヌクレオチドの有するリン酸基の負電荷とＤＮＡの電気的シグナルとが一致するが、タンパク質は各々が複雑な立体構造を有するため、アミノ酸配列から計算した電荷量と表面電荷とが一致しない。その結果、表面電荷がタンパク質量に比例せず、表面電荷からタンパク質量を正確に定量することが困難である。
【００１１】
第二に、タンパク質は高分子であり、リガンドに相互作用した対象タンパク質の全体をデバイ長内に収めることが困難である。このため、デバイ長内に収まっている電気的シグナルのポテンシャルの一部分（テーリング部分）で、タンパク質を高感度に検出しなければならない。それゆえ、タンパク質の検出が困難であるという問題が生じる。
【００１２】
従って、タンパク質の定量に用いることができ、かつ少ないタンパク質の電荷量を高感度に検出可能なバイオセンサが強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その対象は、従来よりも高感度にタンパク質を検出するバイオセンサ、電荷転送型センサおよびタンパク質濃度の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係るバイオセンサは、上記課題を解決するために、測定対象である対象タンパク質の濃度を測定するバイオセンサであって、基板表面に形成された第１および第２ゲート電極と、上記第１ゲート電極と上記第２ゲート電極との間の基板表面上に形成されたセンシング部と、上記センシング部の表面に結合された、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドと、上記第１ゲート電極により上記センシング部と隔てられた電荷供給部と、上記センシング部において上記リガンドと相互作用した対象タンパク質に由来する電荷を蓄積する電荷蓄積部とを備える電荷転送型センサと、上記電荷蓄積部に蓄積された電荷の量を測定する測定装置とを備えることを特徴としている。
【００１５】
上記の構成によれば、バイオセンサを構成する電荷転送型センサの基板表面には、第１および第２ゲート電極が形成されており、これら第１ゲート電極と第２ゲート電極との間の基板表面上にセンシング部が形成されている。上記第１ゲート電極に電圧を印加することで、第１ゲート電極下の基板表面に電荷注入制御部が形成され、上記電荷供給部からの上記センシング部への電荷の移動を制御する。
【００１６】
上記センシング部には、対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドが固定化されている。このリガンドは、センシング部の表面に結合されており、センシング部をタンパク質溶液に浸すことにより、リガンドは、当該タンパク質溶液に含まれる対象タンパク質と相互作用することが可能である。
【００１７】
さらに上記電荷転送型センサは、電荷蓄積部を備えており、センシング部においてリガンドと相互作用した対象タンパク質に由来する電荷を電荷蓄積部に蓄積する。
【００１８】
この構成により、対象タンパク質に由来する電荷を蓄積して増大することが可能となり、従来よりも高感度に対象タンパク質濃度を測定することが可能となる。
【００１９】
また、上記リガンドを備えることにより、対象タンパク質を特異的にセンシング部の表面に留めることができ、測定対象の溶液に対象タンパク質以外のタンパク質が含まれている場合でも、対象タンパク質の濃度を特異的に測定することができる。
【００２０】
上記測定装置は、上記対象タンパク質の電荷に加え、当該対象タンパク質に結合した電荷付与分子の電荷の量を測定することが好ましい。
【００２１】
上記の構成によれば、対象タンパク質そのものの電荷に加えて当該対象タンパク質に結合した電荷付与分子の電荷が電荷蓄積部に蓄積され、測定装置は、これらの電荷の量を測定する。
【００２２】
それゆえ、対象タンパク質そのものの電荷を検出する場合よりも対象タンパク質の検出感度が高まり、対象タンパク質量をより高感度に測定することができる。
【００２３】
上記電荷付与試薬は、ＣＢＢ  Ｇ−２５０、ドデシル硫酸ナトリウム、およびカチオン性ポリマーからなる群から選択されることが好ましい。
【００２４】
上記の構成により、対象タンパク質の電荷を増大することが可能となり、より高感度に対象タンパク質を検出することが可能となる。
【００２５】
本発明に係る測定方法は、上記バイオセンサを用いた測定方法であって、上記リガンドと上記対象タンパク質とを特異的に相互作用させる相互作用工程と、上記相互作用工程において上記リガンドと相互作用しなかったタンパク質を除去する洗浄工程と、上記洗浄工程の後に、電解質溶液に浸漬された上記センシング部の電荷を上記電荷蓄積部に蓄積する蓄積工程と、上記蓄積工程の後に、上記電荷蓄積部の電位を測定する測定工程とを含むことを特徴としている。
【００２６】
上記測定方法により、対象タンパク質に由来する電荷を蓄積して増大することが可能となり、従来よりも高感度に対象タンパク質濃度を測定することが可能となる。
【００２７】
また、対象タンパク質を特異的にセンシング部の表面に留めることができ、測定対象の溶液に対象タンパク質以外のタンパク質が含まれている場合でも、対象タンパク質の濃度を特異的に測定することができる。
【００２８】
本発明に係る電荷転送型センサは、基板表面に形成された第１および第２ゲート電極と、上記第１ゲート電極と上記第２ゲート電極との間の基板表面上に形成されたセンシング部と、上記センシング部の表面に結合された、上記対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドと、上記センシング部において上記リガンドと相互作用した対象タンパク質に由来する電荷を蓄積する電荷蓄積部とを備えることを特徴としている。
【００２９】
それゆえ、対象タンパク質に由来する電荷を蓄積して増大することが可能となり、従来よりも高感度に対象タンパク質濃度を測定するためのセンサとして利用できる。
【００３０】
また、上記リガンドを備えることにより、対象タンパク質を特異的にセンシング部の表面に留めることができ、測定対象の溶液に対象タンパク質以外のタンパク質が含まれている場合でも、対象タンパク質の濃度を特異的に測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００３１】
以上のように、本発明に係るバイオセンサは、基板表面に形成された第１および第２ゲート電極と、上記第１ゲート電極と上記第２ゲート電極との間の基板表面上に形成されたセンシング部と、上記センシング部の表面に結合された、対象タンパク質と特異的に相互作用するリガンドと、上記第１ゲート電極により上記センシング部と隔てられた電荷供給部と、上記センシング部において上記リガンドと相互作用した対象タンパク質に由来する電荷を蓄積する電荷蓄積部とを備える電荷転送型センサと、上記電荷蓄積部に蓄積された電荷の量を測定する測定装置とを備える構成である。
【００３２】
それゆえ、従来よりも高感度に対象タンパク質濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の一実施形態に係るバイオセンサの構成および電位を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るバイオセンサの別の構成を示す概略図である。
【図３】（ａ）および（ｂ）は、ソースフォロア回路の構成を示した模式図である。
【図４】本発明に係る電荷転送型センサの電荷転送の原理を示した模式図である。
【図５】本発明に係るバイオセンサにおいて、各端子に印加される電位の大きさおよびタイミングを表したグラフである。
【図６】対象タンパク質とリガンドと電荷付与試薬とのセンシング部での反応を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の実施の一形態について、図１〜図６に基づいて説明すれば、以下のとおりである。
【００３５】
（１）バイオセンサ６０の構成
本実施形態のバイオセンサ６０の構成を図１の上段に示した。図１の上段に示すように、バイオセンサ６０は、電荷転送型センサ５０、ソースフォロア回路４０およびオシロスコープ（測定装置）４５を含んでいる。
【００３６】
電荷転送型センサ５０は、基板１０と、基板１０の表面に形成された２つのゲート電極（第１ゲート電極）２２およびゲート電極（第２ゲート電極）２４と、上記２つのゲート電極２２・２４の間の基板表面上に形成されたセンシング部２７と、参照電極２８と、液槽２９とを備えている。
【００３７】
基板１０には、ｐ型ドープ領域１５とｎ＋型ドープ領域１１・１３とが形成されている。このｎ＋型ドープ領域１１・１３はＮ型不純物が高濃度にドーピングされた領域である。ｎ＋型ドープ領域１３にソースフォロア回路４０が接続されている。このソースフォロア回路４０は、ｎ＋型ドープ領域１３に蓄積した電荷を電圧値として検出する。ソースフォロア回路４０の詳細については後述する。
【００３８】
ソースフォロア回路４０には、オシロスコープ４５が接続されており、ソースフォロア回路４０から出力された電圧値を測定する。
【００３９】
基板１０の表面には、シリコン酸化膜からなるゲート絶縁膜１９が積層されている。このゲート絶縁膜１９上に２つのゲート電極２２・２４が設けられている。センシング部２７を覆うようにシリコン窒化膜２３が積層されている。センシング部２７を覆うシリコン窒化膜２３は、センサの溶液保護を目的としており、シリコン窒化膜（Ｓｉ３Ｎ４）に限らず、Ａｌ２O３やＴａ２Ｏ５など、溶液保護作用のある膜であれば構わない。
【００４０】
シリコン窒化膜２３の上にさらにリガンド３３を固定化するための固定化層２０としてＡｕ／ＴｉＮ／Ｔｉ膜が成膜されている。固定化層２０の材質は、Ａｕ／ＴｉＮ／Ｔｉ膜に限定されず、リガンド３３を固定化するために適したものが適宜選択されればよい。
【００４１】
ゲート電極２２とゲート電極２４との間におけるゲート絶縁膜１９、シリコン窒化膜２３および固定化層２０の積層をセンシング部２７と称している。なお、シリコン窒化膜２３に直接リガンド３３を固定化できるのであれば、固定化層２０は必ずしも必要ではない。
【００４２】
リガンド３３は、対象タンパク質３４と特異的に相互作用することにより、対象タンパク質３４を捕捉し、その結果、対象タンパク質３４をセンシング部２７の表面に留める。リガンド３３には、抗体、人工抗体、ペプチド、タンパク質、アプタマーなど、またはこれらの組み合わせが利用できる。
【００４３】
リガンド３３は、固定化層２０のシリコン窒化膜２３と接する側とは反対側の表面（リガンド結合面）に結合されている。換言すれば、リガンド３３は、センシング部２７の基板表面に面する側とは反対側の表面であるリガンド結合面に結合されている。固定化層２０のリガンド結合面は、電解質溶液３２と直接接している。
【００４４】
バイオセンサ６０は、リガンド３３に特異的に結合した対象タンパク質３４に、電荷付与試薬３５を結合させることにより、対象タンパク質３４の検出感度を高めるものである。リガンド３３を用いずに、溶液中に離散する対象タンパク質３４の濃度を測定することも可能であるが、リガンド３３および電荷付与試薬３５を用いることにより、対象タンパク質３４の濃度をより高感度に測定することができる。電荷付与試薬３５として、例えば、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を用いることができる。電荷付与試薬３５の詳細については後述する。
【００４５】
リガンド３３を固定化層２０に固定化する方法として、リガンド３３を固定化層２０に直接吸着させる物理吸着法、固定化層２０上にＡｕまたはＰｔなどを塗布してリガンド３３と化学結合させる化学結合法、ポリマーを用いてリガンド３３を包括する包括法などが利用できる。リガンド３３を固定化層２０に固定化する場合に用いるリガンド３３を含む溶液の濃度は、例えば５μｇ／ｍＬである。リガンド溶液の濃度範囲は、１〜２０μｇ／ｍＬが望ましく、更に５μｇ／ｍＬであることが望ましい。
【００４６】
参照電極２８は、電解質溶液３２を介してセンシング部２７に一定の電圧を印加するための電極である。この参照電極２８には上記電圧を供給する電源が接続されている。
【００４７】
液槽２９は、電解質溶液３２を溜めるためのものであり、その底部はセンシング部２７である。それゆえ、液槽２９は、センシング部２７の表面に電解質溶液３２を留めるための壁部であると言える。
【００４８】
タンパク質濃度測定時には、液槽２９に電解質溶液３２を充填し、センシング部２７の上部に備えられた参照電極２８により一定の電位を印加する。基板１０のｎ＋型ドープ領域１１、ゲート電極２２およびゲート電極２４はそれぞれＩＤ（Ｉｎｐｕｔ  Ｄｉｏｄｅ）、ＩＣＧ（Ｉｎｐｕｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｇａｔｅ）およびＴＧ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｇａｔｅ）とも呼ばれる。これらはパルスジェネレータ（電圧供給装置）（不図示）に接続されており、このパルスジェネレータは、後述する所定の様式でｎ＋型ドープ領域１１、ゲート電極２２およびゲート電極２４に電圧を印加する。
【００４９】
その結果、基板１０のｎ＋型ドープ領域１１が電荷供給部として機能し、ゲート電極２２が電荷注入制御部として、２つのゲート電極２２・２４の間の基板表面がセンシング部２７として、ゲート電極２４が障壁部として、ｎ＋型ドープ領域１３が電荷蓄積部（以下、ＦＤ（Ｆｌｏａｔｉｎｇ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）部と称する）として機能する。
【００５０】
電荷供給部は、外部の電源から電荷を受け入れる。電荷注入制御部は、電荷供給部からセンシング部へ移動する電荷の量を調整する。センシング部は、電解質溶液３２に含まれる電荷（特に、リガンド３３に結合した対象タンパク質３４の電荷および電荷付与試薬の電荷）を検出する。ＦＤ部（電荷蓄積部）は、センシング部から電荷を受け入れ、当該電荷を蓄積する。それゆえ、センシング部２７においてリガンド３３と相互作用した対象タンパク質３４に由来する電荷は、ＦＤ部に蓄積される。
【００５１】
図１の下段には、ｎ＋型ドープ領域１１（電荷供給部）、ゲート電極２２（電荷注入制御部）、センシング部２７、ゲート電極２４（障壁部）およびｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）における電位の相対関係を、符号１〜５をそれぞれ付して模式的に示している。また、ｎ＋型ドープ領域１３に蓄積した電荷を符号６を付して示している。例えば、ゲート電極２４における電位（符号４で示す）は、他の部位における電位よりも低く、ｎ＋型ドープ領域１３における電位（符号５で示す）は、センシング部２７における電位（符号３で示す）よりも高い。センシング部２７の電荷をｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）に転送して蓄積することで、従来よりも高感度にタンパク質濃度を測定することが可能である。
【００５２】
（２）バイオセンサ６０の別の構成
バイオセンサ６０が備える電荷転送型センサの別の構成を、図２を参照しつつ説明する。図２は、電荷転送型センサ７０の構成を示す概略図である。図２に示すように、電荷転送型センサ７０は、電荷転送型センサ５０の構成に加えて、ｎ＋型ドープ領域１４およびゲート電極（第３ゲート電極）２６を備えている。ｎ＋型ドープ領域１４はＲＤ（Ｒｅｓｅｔ  Ｄｉｏｄｅ）端子に接続されており、ゲート電極２６はＲＧ端子に接続されている。ＲＤ端子およびＲＧ端子はパルスジェネレータ（不図示）に接続されており、このパルスジェネレータは、後述する所定の様式でｎ＋型ドープ領域１４およびゲート電極２６に電圧を印加する。その他の構成は、電荷転送型センサ５０の構成と同様である。
【００５３】
この電荷転送型センサ７０は、３つのゲート電極２２、２４、２６が基板表面に形成されている。ゲート電極２２、２４に加えてゲート電極２６を形成することで、ｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）に蓄積される電荷を一定（任意の電圧値）にすることができる。
【００５４】
電荷転送型センサ７０においても、ｎ＋型ドープ領域１１が電荷供給部として機能し、ゲート電極２２が電荷注入制御部として、２つのゲート電極２２・２４の間の基板表面がセンシング部２７として、ゲート電極２４が障壁部として、ｎ＋型ドープ領域１３がＦＤ部として機能する。
【００５５】
（３）ソースフォロア回路４０の構成
本実施形態のバイオセンサ６０においては、ＦＤ部であるｎ＋型ドープ領域１３にソースフォロア回路４０が連結されている。ソースフォロア回路４０を含む電荷転送型センサの基本的な構成を図３（ａ）および図３（ｂ）に示す。図３（ａ）は、電荷転送型センサ５０に接続されたソースフォロア回路４０の構成を示す概略図である。図３（ｂ）は、電荷転送型センサ７０に接続されたソースフォロア回路４０の構成を示す概略図である。
【００５６】
ｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）に蓄積された電荷は、ソースフォロア回路４０において、そのゲート電圧として印加され、電圧値（ＶＯＵＴ値）として検出される。すなわち、ソースフォロア回路４０の出力値であるＶＯＵＴ値を測定することにより、ｎ＋型ドープ領域１３に蓄積した電荷の量を測定することができる。
【００５７】
ＶＯＵＴ端子は、オシロスコープ４５に接続されており、このオシロスコープ４５によってＶＯＵＴ値を測定する。このオシロスコープ４５は、ＦＤ部に蓄積された電荷の量を測定する測定装置であると見なすことができる。ただし、測定装置はオシロスコープに限定されるものではない。
【００５８】
なお、ソースフォロア回路は、入力インピーダンスが高く出力インピーダンスが低いという特徴がある。理想的にはソースフォロア回路の入出力特性がＶｏｕｔ＝Ｖｉｎとなり、入力に入れた電圧が減衰することなく出力されるので、本発明においてバッファ回路として使用した。
【００５９】
（４）ＦＤ部における電荷蓄積の原理
対象タンパク質３４および電荷付与試薬３５に由来する電荷の蓄積方法を図４および図５を参照しつつ説明する。図４は、電荷転送型センサ７０においてＦＤ部に電荷が蓄積する原理を説明するための図である。図５は、バイオセンサ６０において、各端子に印加される電位の大きさおよびタイミングを表したグラフである。
【００６０】
まず、センシング部２７のリガンド結合面に結合されたリガンド３３に対象タンパク質３４を特異的に結合させた後、その対象タンパク質３４に電荷付与試薬３５を結合させる。その結果、対象タンパク質３４の電荷および当該対象タンパク質３４に結合した電荷付与試薬３５の電荷によって、センシング部２７の電荷容量が変化する（Ｓ０段階）。
【００６１】
次に、Ｓ１およびＳ２段階では、ＲＧ端子の電位（ゲート電極２６の電位）が上昇するとともに、ＲＤ端子の電位（ｎ＋型ドープ領域１４の電位）とｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）の電位とが等しくなる。
【００６２】
なお、電荷転送型センサ５０・７０（図１、２）において、ＩＣＧ端子の電位は常に一定である。ＲＧ端子およびＲＤ端子を備えていない電荷転送型センサ５０においては、電荷供給部（ＩＤ端子）の電位を上げることによって、電荷注入調節部（ＩＣＧ端子）によりすりきられた電荷がセンシング部２７に残され、続いてこの残された電荷をＦＤ部へ蓄積する。
【００６３】
Ｓ３およびＳ４段階では、ｎ＋型ドープ領域１１に電荷が蓄積してＩＤの電位が低下し、センシング部２７とＩＤ端子の電位（ｎ＋型ドープ領域１１の電位）とが等しくなる。
【００６４】
Ｓ５およびＳ６段階では、センシング部２７に電荷が注入されている状態になる。
【００６５】
Ｓ７およびＳ８段階では、ＴＧ端子の電位（ゲート電極２４の電位）が上昇し、センシング部２７の電荷がｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）へ移動する。
【００６６】
Ｓ９段階では、センシング部２７に注入されていた電荷がｎ＋型ドープ領域１３（ＦＤ部）に全て移動された状態になる。Ｓ０段階からＳ９段階によりＦＤ部に蓄積された電荷は、ソースフォロア回路４０において、そのゲート電圧として印加され、電圧値（ＶＯＵＴ値）として検出される。Ｓ９段階におけるソースフォロア回路４０のＶＯＵＴ値とＳ３段階におけるソースフォロア回路４０のＶＯＵＴ値とを比較することで対象タンパク質３４および電荷付与試薬３５に由来する電荷を測定する。
【００６７】
また、Ｓ１段階からＳ９段階を繰り返すことで、電荷をＦＤ部に累積させて対象タンパク質３４の検出感度を向上させることが可能である。
【００６８】
（５）対象タンパク質濃度の定量方法
次に、電荷転送型センサ５０・７０を用いた場合のタンパク質濃度を定量する方法について説明する。なお、ここでは、リガンド３３に特異的に対象タンパク質３４を結合させ、当該対象タンパク質３４に電荷付与試薬３５を結合させた後の工程から説明を始める。
【００６９】
電荷転送型センサ５０・７０において、参照電極２８、ＩＤ、ＩＣＧ、ＴＧ、ＲＧ、ＲＤ、ＶＤＤ、およびＶＬＮの各端子に加えられた電位によって、それぞれ電位の異なる電荷供給部、電荷注入制御部、センシング部、障壁部、およびＦＤ部が形成される。
【００７０】
測定対象となる試料に含まれる対象タンパク質３４の濃度を測定するために、まず、参照電極２８に一定の電圧を印加し、パルスジェネレータに接続した各端子（ＩＤ、ＩＣＧ、ＴＧ、ＲＧ、ＲＤ、ＶＤＤ、およびＶＬＮ）にそれぞれ電圧を加える。
【００７１】
少なくとも３つの異なる既知濃度のタンパク質溶液を用いて、参照電極２８に所定の電圧（ＶＲＥ値）を印加した場合のソースフォロア回路４０のＶＯＵＴ値を、既知濃度の対象タンパク質３４を含むタンパク質溶液のそれぞれについて測定する。各端子に加える電圧の一例を図５に示した。一例として、ＶＲＥ＝１．０２０Ｖの時点のＶＯＵＴを記録することができる。上記ＶＯＵＴ値に対して上記タンパク質溶液のタンパク質濃度をプロットすることにより検量線を作成する。
【００７２】
その後、濃度未知の対象タンパク質３４を含む試料の上記ＶＲＥ値におけるＶＯＵＴ値を、ソースフォロア回路４０を用いて測定し、該ＶＯＵＴ値を上記検量線に当てはめることで、上記試料中の対象タンパク質３４の濃度を算出する。
【００７３】
（６）対象タンパク質３４の電荷付与試薬３５による処理方法
次に、リガンド３３に対象タンパク質３４を特異的に結合させ、結合した対象タンパク質３４を電荷付与試薬３５で処理する方法について図６を用いて説明する。
【００７４】
まず、リガンド３３と対象タンパク質３４以外の物質との非特異的吸着を防止するために、リガンド３３を固定化層２０上に固定化後、固定化層２０の表面およびリガンド３３をブロッキング剤を用いてブロッキングする。ブロッキング剤としては、例えば、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液が挙げられる。ブロッキング処理により、リガンド３３に特異的に結合した目的タンパク質１４のみを検出することができる。
【００７５】
次に、リガンド３３と対象タンパク質３４とを結合させる。すなわち、リガンド３３上に対象タンパク質３４を含む溶液を滴下し、リガンド３３と結合させる。対象タンパク質３４は、生体組織から採取したものであってもよいし、クロマトグラフィーなどの精製方法を用いて精製したものであってもよく、対象タンパク質３４の調整方法は特に限定されない。
【００７６】
リガンド３３と対象タンパク質３４との反応時間は、リガンド３３および対象タンパク質３４が分解および／または変性しない範囲で、リガンド３３および対象タンパク質３４の濃度などによって決定されればよく、例えば、１〜３時間である。抗原抗体反応は数分〜３時間でよく、更に５分〜１時間が望ましい。本実施例では１０分で行った。
【００７７】
その後、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）などの適当な洗浄用緩衝液を用いて、リガンド３３に結合しなかった対象タンパク質３４を洗い流す。
【００７８】
次に、固定化層２０上に電荷付与試薬３５を滴下し、所定時間放置することにより、リガンド３３に特異的に結合した対象タンパク質３４に電荷付与試薬３５を結合させる。電荷付与試薬３５と対象タンパク質３４との反応時間は、電荷付与試薬３５の種類に応じて適宜設定されればよい。電荷付与試薬３５として、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を用いる場合には、上記反応時間は、例えば５分間である。
【００７９】
電荷付与試薬３５として、ＣＢＢ  Ｇ−２５０の他に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびカチオン性ポリマー（正電荷を有するポリマー）などを用いることができる。これらのうち、ＣＢＢ  Ｇ−２５０が特に好ましい。
【００８０】
電荷付与試薬３５として、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を使用した場合は、対象タンパク質３４の高次構造や複合体構造を維持しながら対象タンパク質３４全体に負電荷を与えることが出来る。このため、対象タンパク質３４は、従来の方法で分離困難な高分子、または膜タンパク質などでもよい。
【００８１】
電荷付与試薬３５として、ＳＤＳを使用する場合は、ＳＤＳの結合は対象タンパク質３４の変性を伴うため、ＳＤＳと対象タンパク質３４との反応時間を短くするなど変性による抗原抗体反応への影響をできるだけ小さくすることが好ましい。
【００８２】
電荷付与試薬３５として、カチオン性ポリマーを用いる場合には、当該カチオン性ポリマーを対象タンパク質３４の表面に限定的に化学結合させる。この場合に利用できるタンパク質の修飾方法の一例が特開平６−１８４１９０に開示されている。
【００８３】
その後、対象タンパク質３４に結合せずに遊離した状態の電荷付与試薬３５を、０．１×ＰＢＳなどで洗浄することにより取り除く。
【００８４】
最後に、ゲート電極上に参照電極を浸すように測定溶液である電解質溶液３２（例えば、０．１×ＰＢＳ）を注入する。その後、上述したようにＳ０からＳ９段階を実行してソースフォロア回路４０によって、ＦＤ部に累積した電荷を測定し、その測定値（ＶＯＵＴ値）を用いて対象タンパク質３４の量を算出する。
【００８５】
以上のように、バイオセンサ６０におけるタンパク質定量方法は、リガンド３３と対象タンパク質３４とを特異的に相互作用させる相互作用工程と、相互作用工程においてリガンド３３と相互作用しなかったタンパク質を除去する洗浄工程と、洗浄工程の後に、電解質溶液３２に浸漬されたセンシング部２７の電荷をＦＤ部に蓄積する蓄積工程と、上記蓄積工程の後に、上記ＦＤ部の電位を測定する測定工程とを含んでいる。
【００８６】
さらに、バイオセンサ６０におけるタンパク質定量方法は、センシング部２７のリガンド３３と相互作用した対象タンパク質３４に電荷付与試薬３５を結合させる電荷付与工程を含んでいることが好ましい。
【００８７】
（７）コントロールについて
ＣＢＢ  Ｇ−２５０は、リガンド３３およびブロッキング剤にも結合する。検量線を作成するために用いるリガンド３３と濃度未知のタンパク質溶液のタンパク質濃度を測定するために用いるリガンド３３とは、基本的に同じものであるため、バックグラウンドを除くためのコントロールをとる必要は必ずしもない。
【００８８】
電荷転送型センサ５０（または電荷転送型センサ７０）のドリフトの影響やノイズを除くためにコントロールをとる場合には、１つの対象タンパク質３４の濃度を測定するために２つの電荷転送型センサ５０（または電荷転送型センサ７０）を利用する。一方の電荷転送型センサ５０では、リガンド３３の固定、ブロッキング、抗原抗体反応、および電荷付与試薬３５による処理を行い、他方の電荷転送型センサ５０では、ブロッキング、抗原抗体反応、および電荷付与試薬３５による処理を行う。後者は、ノイズを含んだ測定値であるため、これをバックグラウンドとして、前者の測定値から後者の測定値を差し引き、タンパク質量のための測定値として用いる。
【００８９】
（８）電荷付与試薬の効果
本発明では対象タンパク質３４の電荷量を大きくするために、電気泳動の一種であるＢＮ−ＰＡＧＥに用いられているＣＢＢ  Ｇ−２５０を電荷付与試薬３５の一例として利用している。一般的に、タンパク質の電気泳動を行う場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥが用いられる。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、電荷の小さいタンパク質にＳＤＳの負電荷を与えることで、ゲル中を泳動しやすくし、分離を行う。しかし、このＳＤＳはタンパク質の高次構造や複合体構造を壊しながら結合するため、タンパク質本来の形に基づいた分離が行えない。
【００９１】
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥは、泳動バッファ条件を検討することでタンパク質自体に電荷を与え、タンパク質本来の形のまま分離する。しかし、塩基性等電点をもつタンパク質や表面電荷の少ないタンパク質では泳動に十分な電荷をもつことが出来ず、正確な分離をも困難とする。
【００９２】
一方、ＢＮ−ＰＡＧＥは、ＳＤＳの代わりにＣＢＢ  Ｇ−２５０という色素を用いることで全体的に負電荷を帯びた状態でタンパク質を泳動させ分離する。このＣＢＢ  Ｇ−２５０は、タンパク質の高次構造や複合体構造を維持したまま、タンパク質全体に負電荷を与えることが出来るため、泳動が容易でタンパク質本来の形に基づいた分離が行える。このため、分離困難な高分子や膜タンパク質への応用も可能となる。
【００９３】
また、電気泳動によるタンパク質の検出は、タンパク質の大きさ毎に分離するというものである。このことよりサンプル溶液中に同じ大きさのタンパク質が含まれている可能性が懸念される場合など、ターゲットタンパク質だという確証を得るには、電気泳動後にウェスタンブロッティングを行って抗体による特異的反応を検出する必要がある。これらの作業は数時間に及ぶものであり、また手間のかかるものである。
【００９４】
バイオセンサ６０を用いれば、従来の電気泳動法に比べ、動作が速く煩雑な作業を必要とせずに、少ないタンパク質の電荷量を高感度に検出することができる。
【００９５】
また、電荷転送型センサ５０は、高集積化が可能で簡易に製造できるため、産業上利用することが容易である。
【００９６】
〔実験結果例〕
本発明に係るバイオセンサ６０を用いてタンパク質濃度測定のための検量線を作成した実験結果の一例について説明する。
【００９７】
本実施例では、リガンド３３として抗アディポネクチン抗体（Anti Adiponectin [Acrp30],Human,(Mouse)、RSD）を用い、対象タンパク質３４としてアディポネクチンを用いた。市販のアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ）（Acrp30/Adiponectin,CF,Human、RSD）を０、２５、６２．５μｇ／ｍＬに２．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を用いて希釈することにより３種類のタンパク質溶液を調整した。
【００９８】
また、本実施例では、電荷転送型センサ７０を用いている。
【００９９】
＜リガンドの固定＞
まず、電荷転送型センサ７０を３つ用意し、それぞれ、図６に示すようにＳｉ３Ｎ４膜である固定化層２０上にリガンド３３として抗アディポネクチン抗体を物理吸着法で固定化した。用いた抗体溶液は、２．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／２．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  １ｍＬに抗体５００μgを溶解し、５００μｇ／ｍＬの抗体溶液とし、さらに５μg／ｍＬへ希釈したものを使用した。Ｓｉ３Ｎ４膜上に抗アディポネクチン抗体溶液を滴下した後、１時間静置した。
【０１００】
固定化後、０．１×ＰＢＳを用いてＳｉ３Ｎ４膜の表面を洗浄し、Ｓｉ３Ｎ４膜に結合していない抗体を取り除いた。
【０１０１】
次に、１０％ＢＳＡを含む０．１×ＰＢＳをＳｉ３Ｎ４膜上に滴下し、１時間静置してブロッキングした。ブロッキング後、０．１×ＰＢＳを用いて洗浄し、遊離のＢＳＡを取り除いた。
【０１０２】
＜対象タンパク質への電荷付与試薬の付加＞
次に、希釈した各濃度の抗体溶液を、抗アディポネクチン抗体を固定化した３つの電荷転送型センサ７０のＳｉ３Ｎ４膜にそれぞれ滴下し、１０分間静置することにより抗原抗体反応を行った。０．１×ＰＢＳを用いて洗浄して遊離の抗体を除去した後、電荷付与試薬３５としてＣＢＢ  Ｇ−２５０溶液を滴下し、５分間静置した。この処理によりアディポネクチンにＣＢＢ  Ｇ−２５０を結合させた。ＣＢＢ  Ｇ−２５０溶液は、PROTEIN ASSAY Bradford、BIO-RADを希釈せずに使用した。
【０１０３】
次に、０．１×ＰＢＳで洗浄し、遊離のＣＢＢ  Ｇ−２５０を取り除き、測定溶液（０．１×ＰＢＳ）を液槽２９に注入し、参照電極２８を測定溶液に浸した。
【０１０４】
このようにセッティングした各電荷転送型センサ７０について、ＶＯＵＴおよびＲＥを除く各端子をパルスジェネレータDG2020A(日本テクトロニクス株式会社製)に接続し、波形（ＶＯＵＴ値）を検出するためにＶＯＵＴ端子をオシロスコープ４５（TDS3034B(日本テクトロニクス株式会社製)）に接続し、ＲＥ端子を直流安定化電源R6142A(Takeda Riken)へと接続し、ＶＲＥ＝１．０２０ＶのときのＶＯＵＴを測定値として記録した。
【０１０５】
その結果、抗アディポネクチン抗体濃度が０、２５、６２．５μg／ｍＬの順にＶＯＵＴ値は、それぞれ１．４７０、１．４２０、１．３２０ｍＶであった。この結果を用いて、最小自乗法により検量線を作成した。各抗アディポネクチン抗体濃度に対応する３点は、ほぼ一直線上にのっており、抗体の定量が精度高く行われたことを示している。
【０１０６】
（変更例）
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０７】
例えば、電荷転送型センサ５０・７０をＰチャネル型のトランジスタとして実現していてもよい。
【０１０８】
また、バイオセンサ６０に電荷転送型センサ５０・７０を複数設け、各電荷転送型センサ５０・７０のＦＤ部に蓄積した電荷の量を測定してもよい。
【０１０９】
なお、本発明は、以下のようにも表現できる。
【０１１０】
すなわち、本発明は、センシング部の電荷を電荷蓄積（ＦＤ）部へ蓄積させ、該ＦＤ部に蓄積された電荷に基づく出力信号から化学・物理量を特定する化学・物理現象検出方法であって、該ＦＤ部の電位変化を電界効果型トランジスタ（Ｆｉｅｌｄ−Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ：ＦＥＴ）で検出することを特徴とする電荷転送型のセンサであって、前記化学・物理量が、タンパク質濃度であることを特徴とするバイオセンサである。
【０１１１】
上記バイオセンサは、上記センシング部が、検出しようとするタンパク質（ターゲットタンパク質）に特異的に反応あるいは吸着するリガンドから形成されていることが好ましい。
【０１１２】
上記バイオセンサは、上記リガンドとターゲットタンパク質を特異的に反応あるいは吸着させた後、ＣＢＢ  Ｇ−２５０を結合させ、ＣＢＢ  Ｇ−２５０の電荷によって変化したＦＤ部の電位変化を検出するバイオセンサであることが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明のタンパク質定量システムを使用すれば、簡便、かつ高感度にタンパク質を定量することが可能となる。このため、ライフサイエンス分野、医学分野などの研究や検査におけるタンパク質の定量に好適に使用できる。
【符号の説明】
【０１１４】
１    電荷供給部
１０  基板
１３  ｎ＋型ドープ領域（電荷蓄積部）
２２  ゲート電極（第１ゲート電極）
２４  ゲート電極（第２ゲート電極）
２７  センシング部
３３  リガンド
３４  対象タンパク質
３５  電荷付与試薬（電荷付与分子）
４０  ソースフォロア回路
４５  オシロスコープ（測定装置）
５０  電荷転送型センサ
６０  バイオセンサ
７０  電荷転送型センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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