(57)【要約】【課題】無血清又は低血清培地条件下で効率よく哺乳類の体性幹細胞から脂肪細胞の特徴を持った細胞へ分化誘導する培地、添加剤および方法を提供すること。【解決手段】哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地は、哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤と、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含み、無血清又は低血清である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤と、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含み、無血清又は低血清である、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地。
【請求項２】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドの培地中の濃度が、０．０１μＭ〜１００μＭ、ビオチン濃度が１０μＭ〜１０ｍＭ、ビタミンＣ濃度が１０μＭ〜１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ濃度が１０μＭ〜１００ｍＭである請求項１記載の培地。
【請求項３】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドがリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
前記分化誘導剤が、イソブチルメチルキサンチン、インスリン、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン及びインドメタシンから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
前記基本培地が、ＤＭＥＭ、ＭＥＭα、ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地から成る群より選ばれる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項６】
無血清培地である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の培地。
【請求項７】
ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含む、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地添加剤。
【請求項８】
体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤をさらに含む請求項７記載の添加剤。
【請求項９】
水又は基本培地に溶解することにより請求項１ないし８のいずれか１項に記載の培地を与える組成を有する請求項７又は８記載の添加剤。
【請求項１０】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の培地中で、脂肪細胞へ分化し得る体性幹細胞を培養することを含む、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外で哺乳動物の体性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導する培地および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪細胞への分化誘導は、ヒト体性幹細胞の未分化能の確認や分化誘導した脂肪細胞でのメタボリックシンドローム関連等の研究などに利用されている。
【０００３】
ヒト体性幹細胞および脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化誘導には、動物血清（例えば、ウシ胎児血清、ヒト血清など）が用いられている。そして、動物血清は、成分構成が完全にわかっていないことに加え、血清の起源や製品等のロットにより脂肪細胞への分化誘導能力等の性能が異なることが知られている。そのため、高濃度の血清条件下で分化誘導させた脂肪細胞の品質を一定にすることが難しいという問題点がある。
【０００４】
従来、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導方法は、動物血清含有の培地にイソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリンおよびチアゾール誘導体（ロシグリタゾン、ピオグリタゾンなど）を使用する方法（非特許文献１）および、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリンおよびインドール誘導体（インドメタシンなど）を使用する方法（非特許文献２）などが報告されている。さらに、ビオチン、プロスタグランジン、パントテン酸を添加して脂肪細胞分化することが知られている。
【０００５】
ＲｈｏＡを活性化することで、脂肪細胞への分化誘導を抑制し、骨細胞への分化誘導を促進することが知られている（非特許文献３）。このＲｈｏＡの活性を誘導する物質としては、リゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が知られている。これまでに、ＲｈｏＡの活性化作用を有するＬＰＡを体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地に添加することで、脂肪分化効率を改善する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １９９５:２８１８３−７.
【非特許文献２】Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ. ２００５:１３５７−６６.
【非特許文献３】Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ. ２００４:４８３−９５.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、哺乳類の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導には、血清を含んだ分化誘導培地が使用されている。本発明は、無血清又は低血清培地条件下で効率よく哺乳類の体性幹細胞から脂肪細胞の特徴を持った細胞へ分化誘導する培地、添加剤および方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、従来から脂肪細胞の分化誘導に使用されている誘導剤（イソメチルキサンチン、インスリン、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、インドメタシンなど）に内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、カルボキシル基転移酵素の補酵素で知られているビタミンのビオチン、抗酸化作用を有するビタミンのビタミンＣ（アスコルビン酸またはアスコルビン酸２リン酸）および緩衝剤として使用される有機化合物のＨＥＰＥＳを培地に配合することにより無血清培地条件下で効果的に哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞へ分化させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、哺乳動物細胞培養用基本培地と、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤と、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含み、無血清又は低血清である、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地を提供する。また、本発明は、ビオチンと、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、ビタミンＣと、ＨＥＰＥＳとを含む、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導培地添加剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の培地中で、脂肪細胞へ分化し得る体性幹細胞を培養することを含む、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地および培地添加剤は、体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導する際に、従来の分化誘導培地に添加されていた血清を用いない条件下、すなわち、無血清条件下で体性幹細胞を脂肪細胞へ効果的に分化させることを可能にする。さらに、血清を用いることにより発生していた血清の起源、ロットによる分化効率などへの影響を解決することができる。その結果、安定した品質の分化誘導された脂肪細胞を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び比較例１〜３で得られた、各培地中でヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。
【図２】実施例１及び比較例１〜３で得られた、（Ａ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞から分泌されたアディポネクチン量の変化を示したグラフ、（Ｂ）オイルレッドＯで染色された脂肪量の変化を示したグラフ（縦軸は、波長492nmでの吸光度を細胞数で序した値）である。
【図３】実施例１及び比較例１〜３で得られた、（Ａ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞のＰＰＡＲ−γ遺伝子および（Ｂ）アディポネクチン遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）変化を示したグラフである。
【図４】実施例２、比較例４〜８で得られた、各培地中でヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。
【図５】実施例３、比較例９〜１１で得られた、各培地中でヒト脂肪由来多能性幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。
【図６】実施例４、比較例１２〜１４で得られた、各培地中でヒト脂肪前駆細胞から脂肪細胞へ分化誘導した細胞をオイルレッドＯ染色した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、「体性幹細胞」とは、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、繊維芽細胞、肝臓細胞など生体内の各器官を形成する１種類以上の組織細胞に分化転換することができる細胞を意味する。そして、「体性幹細胞」は、何種類かの異なった機能を持つ細胞に分化する能力を有する幹細胞および前駆細胞のうち、胚性幹細胞を除く細胞であり、誘導多機能幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞などを含む。
【００１３】
本発明の培地中で脂肪細胞へ分化誘導可能な細胞としては、哺乳動物の体性幹細胞（上記の通り脂肪細胞の前駆細胞を包含する）であれば何ら限定されず、好ましい例として、脂肪組織由来幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、線維芽細胞等由来の間葉系間幹細胞の体性幹細胞を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明の培地には、ＲｈｏＡ活性効果を有する内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドが必須成分として含まれる。ここで、Ｅｄｇファミリーレセプターは、その遺伝子配列の相同性が高いＧタンパク質共役型のレセプターの一群であり、現在までにヒト、マウス、ヒツジなどの哺乳類でＥｄｇ−１からＥｄｇ−８までが同定されている。これらのうち、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４及びＥｄｇ−７はＬＰＡレセプターとして機能し、Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６及びＥｄｇ−８はＳ１Ｐレセプターとして機能することが知られている。また、「レセプターに対するリガンド」とは、該レセプターと特異的に結合する物質であり、生体内に存在する天然のリガンドのみならず、アゴニストやアンタゴニストとして知られる天然又は合成された他の化合物をも包含する。
【００１５】
Ｅｄｇファミリーレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「Ｅｄｇリガンド」と呼ぶことがある）としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩などのアゴニストからなる群より選択される１又は複数種の化合物が好ましい。
【００１６】
Ｅｄｇファミリーレセプターに対するアゴニストとは、Ｅｄｇファミリーと結合してＬＰＡ同様に作用する物質であり、例えば、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）、ジヒドロスフィンゴシン１リン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、スフィンゴシルホスホリルコリン、アルキルＬＰＡアナログ、ＦＴＹ７２０などが挙げられる。
【００１７】
ＬＰＡとは、下記の一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＰＯ４Ｈ２                    （Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１０〜３０のアルキル基、炭素数１０〜３０のアルケニル基又は炭素数１０〜３０のアシル基である）
で表される化合物である。なお、上記の式（Ｉ）のＲ基についてのアシル基の炭素数は、カルボニル基の炭素数を含まない。
【００１８】
ＬＰＡの塩としては、従来公知の塩を用いることができ、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。ＬＰＡ又はＬＰＡの塩としては、例えば１−オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩、ＬＰＡカリウム塩などが挙げられる。
【００１９】
Ｅｄｇリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００２０】
本発明の培地には、カルボキシル基転移酵素（ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の補酵素として働くとして知られているビタミンのビオチンが含まれる。ビオチンは、糖代謝に関与するピルビン酸カルボキシラーゼ、脂肪酸代謝に関与するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼやプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼなどの補酵素として体内で重要な役割を果たすことが知られている。
【００２１】
本発明の培地には、水溶性ビタミンとして知られているビタミンＣが含まれている。ビタミンＣは、アミノ酸の生合成に利用されるほか、副腎からのホルモンの分泌、脂肪酸をミトコンドリアに運ぶための担体であるL-カルニチンの合成、結合組織でコラーゲンを生成など、体内で進行するヒドロキシル化反応に重要な役割を果たすことが知られている。ビタミンＣは、アスコルビン酸またはアスコルビン酸２リン酸でよく、これらの混合物でもよい。
【００２２】
本発明の培地には、緩衝液に用いられる有機化合物である２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれる。ＨＥＰＥＳは、ｐＫａが７．５５（２０℃）で、およそｐＨ ６．８-８．２の範囲で緩衝作用を持つころが知られている。
【００２３】
本培地中のＥｄｇリガンドであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩の濃度は、０．０１〜１００μＭが好ましく、 ０．１〜１０μＭがさらに好ましい。ビオチンおよびその塩の濃度は、０．０１〜１０ｍＭが好ましく、０.１〜５ｍＭがさらに好ましい。ビタミンＣおよびその塩の濃度は、０．０１〜１０ｍＭが好ましく、０.１〜５ｍＭがさらに好ましい。ＨＥＰＥＳの濃度は、０.０１〜１００ｍＭが好ましく、０.１〜５０ｍＭがさらに好ましい。
【００２４】
本発明の培地は、哺乳動物の体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤を含む。体性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導剤自体は公知であり、本発明においても公知の分化誘導剤を好ましく用いることができる。公知の分化誘導剤の好ましい例として、イソブチルメチルキサンチン；インスリン；デキサメタゾン；ロシグリタゾン及びピオグリタゾン等のチアゾール誘導体；及びインドメタシン等のインドール誘導体が挙げられる。これらの分化誘導剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００２５】
培地中の分化誘導剤の濃度は、用いる分化誘導剤の種類や細胞の種類等に応じて適宜設定されるが、通常、イソブチルメチルキサンチンは、１０〜１０００μM程度、好ましくは、２５０〜７５０μM程度である。インスリンは、０．１〜１０μM程度、好ましくは、０．５〜２．５μM程度である。デキサメタゾンは、０．１〜１０μM程度、好ましくは、０．５〜２．５μM程度である。チアゾール誘導体は、０．１〜１０μM程度、好ましくは、０．５〜５μM程度である。インドール誘導体は、１０〜５００μM程度、好ましくは、５０〜２００μM程度である。
【００２６】
本発明の培地は、上記した４種類の必須成分および上記分化誘導物質を含むことを除き、公知の哺乳動物細胞用培地と同様でよい。従って、公知の基本培地に、上記した４種類の必須成分および従来から脂肪細胞への分化誘導に使用されている分化誘導剤を添加することにより、本発明の培地を得ることができる。
【００２７】
本発明の培地に用いることができる、好ましい公知の無血清基本培地としては、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれもこの分野において周知の培地である。
【００２８】
本発明の培地は、さらに、哺乳動物細胞用培地に含ませることが周知である種々の添加剤を含んでいてもよい。このような周知の添加剤として、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類、及び炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。
【００２９】
アミノ酸類としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンを挙げることができる。
【００３０】
無機塩類としては、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（III）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及び硫酸亜鉛を挙げることができる。
【００３１】
ビタミン類としては、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ及びビタミンＰを挙げることができる。
【００３２】
これらの添加剤を哺乳動物細胞用の培地に添加すること自体は公知であり、各添加剤の添加量も公知の培地と同様でよく、また、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。例えば、アミノ酸類の添加量は、通常、各アミノ酸毎に５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌ程度であり、無機塩類の添加量は、通常、０ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ程度、好ましくは、０．０１ｍｇ／Ｌ〜７ｇ／Ｌ程度であり、ビタミン類の添加量は、各ビタミン毎に０．０１ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度、好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ程度である。
【００３３】
他の添加剤としては、（１）繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子、（２）ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン及びカナマイシン等の抗生物質、（３）グルコース、ガラクトース、フルクトース及びスクロース等の炭素源、（４）マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル及びケイ素等の微量金属）、（５） ２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及びＮ-アセチルシステイン等の抗酸化剤、並びにアデノシン ５‘−一りん酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン及びラクトフェリン等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の添加量も従来と同様でよく、また、各添加剤の目的に応じ、ルーチンな試験により適宜設定することもできる。通常、０．００１ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、特に０．１〜３ｇ／Ｌ程度である。
【００３４】
本発明の培地は、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含むことができ、通常、複数の添加剤を組み合わせて含む。
【００３５】
なお、これらの他の添加剤のうち、プロゲステロンは、培地に添加した場合に脂肪細胞内の油滴量を増強する効果を発揮するので好ましい。プロゲステロンの場合、培地中の好ましい濃度は、２０ｎＭ〜２００ｎＭ程度である。
【００３６】
本発明の培地は、無血清又は低血清であり、無血清が好ましい。なお、ここで「低血清」は、血清を含むがその含有量が５重量％以下、好ましくは１重量％の培地を意味する。
【００３７】
本発明の培地中での哺乳動物体細胞の培養自体は、従来と同様な方法で行なうことができ、通常、３０〜３７℃の温度、及び５％ＣＯ２環境下、及び５〜２１％Ｏ２環境下で行なわれる。また、分化誘導に必要な培養時間は、用いる分化誘導剤や細胞の種類等により適宜設定され、また、細胞の様子を観察しながら適宜選択することができるが、通常、１０日〜２８日程度である。
【００３８】
本発明は、上記した本発明の培地を構成するための添加剤をも提供する。従って、本発明の添加剤は、上記したＥｄｇリガンド、ビオチン、ビタミンＣ及びＨＥＰＥＳを含む。また、これらにさらに上記分化誘導剤を含むものであってもよい。さらに、上記した各種添加剤の１種又は複数種を含んでいてもよい。さらに、基本培地の成分を含ませ、水に溶解するだけで、本発明の培地を与えるものとすることもできる。本発明の添加剤は、水又は基本培地に溶解することにより、上記した本発明の培地を与える組成を有するものが簡便で好ましい。この場合には、添加剤に含まれる各種成分の配合比率は、培地における各成分の含有量の比率と同じになる。なお、基本培地としては、従来から哺乳動物細胞の培養に用いられている、上記した各種培地が挙げられる。
【００３９】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、各例に記載されている濃度は、培地中の終濃度である。また、用いたリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、いずれも１−オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウムであった。
【実施例】
【００４０】
実施例１、比較例１〜３    無血清条件下でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化誘導１
ＨＥＰＥＳ含有（濃度２５ｍＭ）のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して無血清コントロール培地（比較例１）を製造した。
【００４１】
ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地を製造した。
【００４２】
上記脂肪細胞分化誘導培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して、本発明の無血清分化誘導培地（以下、無血清分化培地、実施例１）を製造した。
【００４３】
ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭ及び前記脂肪細胞分化誘導培地のそれぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例２）および従来分化培地（比較例３）を製造した。
【００４４】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（株名：正常ヒト間葉系幹細胞（Ｃｒｙｏ ｈＭＳＣ）、入手先：ＬＯＮＺＡ）を３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように４８穴培養プレートの培養容器に播種し、これらの培地を３〜４日ごとに新しい各培地に交換して、３７℃、５％ＣＯ２で７〜２１日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。
【００４５】
脂肪細胞は、オイルレッドＯにて細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。さらに、オイルレッドＯ染色した細胞をイソプロパノールで抽出し、細胞に蓄積された脂肪量を吸光光度計にて測定した(波長492nm)。そして、分化誘導４日目〜７日目、１１日目〜１４日目、１８日目〜２１日目の３日間で細胞から分泌されたアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）量をアディポネクチン測定キット（富士レビオ社製）で確認した。さらに、ＰＰＡＲ−γおよびアディポネクチンのｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは、ＰＰＲＡ−γ：フォワード（ggtttcagaaatgccttgcag（配列番号１））、リバース（tcgcctttgctttggtcag（配列番号２））、アディポネクチン：フォワード（ccctcccgatatcaaaaagact（配列番号３））、リバース（tcagaaacaggcacacaactca（配列番号４））、ＧＡＰＤＨ：フォワード（aacagcctcaagatcatcagc（配列番号５））、リバース（ggatgatgttctggagagcc（配列番号６））を使用した。
【００４６】
結果を、図１〜図３に示す。図１〜図３より、従来の血清含有分化誘導培地と同様に、本発明の無血清培地でヒト骨髄由来間葉系幹細胞が脂肪細胞に効率良く分化誘導されたことが確認された。
【００４７】
実施例２、比較例４〜７    無血清条件下でのヒト骨髄由来間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化誘導２
【００４８】
実施例１と同様に、ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地を製造した。この脂肪細胞分化誘導基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、０．５ｍＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加した、本発明の無血清分化培地（実施例２）を製造した。一方、比較のため、ＬＰＡのみを添加しない培地（比較例４）、ビタミンＣのみを添加しない培地（比較例５）、ビオチンのみを添加しない培地（比較例６）及びプロゲステロンのみを添加しない培地（比較例７）も調製した。
【００４９】
ＨＥＰＥＳ不含のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地２を製造した。この脂肪細胞分化誘導基本培地２に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して、無血清分化培地２を製造した（比較例８）。
【００５０】
実施例１と同様、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように４８穴培養プレートのウェルに播種し、これらの培地を３〜４日ごとに新しい各培地に交換して、３７℃、５％ＣＯ２で２１日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。
【００５１】
脂肪細胞は、実施例１と同様、オイルレッドＯにて細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。
【００５２】
結果を図４に示す。図４に示されるように、実施例２及び比較例７の培地中で培養した場合に比べ、比較例４〜６及び比較例８の培地中で培養した場合には、脂肪細胞内の脂肪油滴量が明らかに少なかった。このことより、ＬＰＡ、ビタミンＣ、ビオチン、ＨＥＰＥＳは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化誘導に必要な物質であるが、プロゲステロンは分化誘導に必須ではないことが確認された。
【００５３】
実施例３、比較例９〜１１    無血清条件下でのヒト脂肪由来多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導
【００５４】
実施例１と同様にＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して無血清コントロール培地（比較例９）を製造した。
【００５５】
実施例１と同様、ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭに最終濃度が５００μＭのＩＢＭＸ、１μＭのデキサメダゾン、１μＭのインスリン、１μＭのロシグリタゾンを添加した脂肪細胞分化誘導培地を製造した。この脂肪細胞分化誘導基本培地に５μＭのＬＰＡ、１ｍＭのビタミンＣ、１００μＭのビオチンおよび４１．５ｎＭのプロゲステロンを添加して、無血清分化培地を製造した（実施例３）。
【００５６】
ＨＥＰＥＳ含有のＤＭＥＭおよび上記脂肪細胞分化誘導培地のそれぞれに１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して、従来培地（比較例１０）および従来分化培地（比較例１１）を製造した。
【００５７】
ヒト脂肪由来多能性幹細胞（株名：ｈＭＡＤＳ細胞、入手先：ステムセルサイエンス株式会社）を３００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように４８穴培養プレートのウェルに播種し、これらの培地を３〜４日ごとに新しい各培地に交換して、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養することにより、脂肪細胞への分化誘導を行った。
【００５８】
脂肪細胞は、実施例１と同様、オイルレッドＯにて細胞内に蓄積した脂肪滴を染色して確認した。
【００５９】
結果を図５に示す。図５に示されるように、比較例８（無血清コントロール培地）及び比較例９（従来培地）では、脂肪細胞は誘導されなかった。一方、実施例３の培地で培養した場合には、比較例１０の培地（血清を含む従来分化培地）中で培養した場合と同程度に多くの脂肪細胞が効率よく分化した。
【００６０】
実施例４、比較例１２〜１４    無血清条件下でのヒト脂肪細胞前駆細胞から脂肪細胞への分化誘導
【００６１】
ヒト脂肪由来多能性幹細胞を、ヒト脂肪前駆細胞（株名：正常ヒト前駆脂肪細胞−臓器脂肪組織由来（Ｃｒｙｏ  ＨＰＲＡＤ−ＶＩＣＥ）、入手先：ＬＯＮＺＡ）に代えたことを除き、実施例３及び比較例９〜１１と同じ操作を行った（それぞれ、実施例４、比較例１２〜１４）。
【００６２】
結果を図６に示す。図６に示されるように、比較例１２（無血清コントロール培地）及び比較例１３（従来培地）では、脂肪細胞は誘導されなかった。一方、実施例４の培地で培養した場合には、比較例１４の培地（血清を含む従来分化培地）中で培養した場合と同程度に多くの脂肪細胞が効率よく分化した。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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