(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍ワクチンを開発するために、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合することができる、このようなペプチドの少なくとも一つの新規なアミノ酸配列を提供する。【解決手段】特定の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連ペプチド。上記ペプチドは、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合することができる。また、腫瘍疾患の治療薬製造および腫瘍疾患治療のための上記ペプチドの使用。更に、上記ペプチドの少なくとも１つを含む医薬組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付した配列プロトコルの配列番号７７のアミノ酸配列を含み、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合することができることを特徴とする腫瘍関連ペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端又はＣ末端に１つの付加的なアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
１つのアミノ酸が欠損していることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
腫瘍疾患及び／又はアデノーマ疾患の治療薬の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の１又は２以上のペプチドの使用。
【請求項５】
疾患が、腎臓、乳房、膵臓、胃、膀胱、及び／又は精巣のがんであることを特徴とする請求項４記載のペプチドの使用。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを１又は２以上含むことを特徴とする腫瘍疾患及び／又はアデノーマ疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項７】
疾患が、腎臓、乳房、膵臓、胃、膀胱、及び／又は精巣のがんであることを特徴とする請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
さらに、アジュバントを含むことを特徴とする請求項６又は７記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗原提示細胞上に結合されたペプチドが使用されることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
白血球をラベルするために用いられることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを１又は２以上含むことを特徴とする診断試薬。
【請求項１２】
抗体を製造するための、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを１つ又は２以上含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドをコードしていることを特徴とする核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸分子又は請求項１５に記載のベクターにより遺伝子的に修飾されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを製造するための細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合することができる腫瘍関連ペプチド（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に関する。
このようなペプチドは、例えば、腫瘍関連疾患（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）の免疫療法に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞が免疫機構により排除されるとき、免疫機構の構成要素による腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：ＴＡＡ）の同定は中心的な役割を果たしている。この機構は、腫瘍細胞と正常細胞との間に、質的又は量的な違いが存在することに基づく。抗腫瘍反応を引き起こすためには、腫瘍細胞は、腫瘍を排除するのに充分な免疫反応を引き起こす抗原を発現する必要がある。
【０００３】
特に、ＣＤ８を発現している細胞傷害性Ｔリンパ球（以下、ＣＴＬという）は、腫瘍の排除に関わっている。このような細胞傷害性Ｔ細胞による免疫反応を引き起こすためには、Ｔ細胞に対して外来性のタンパク質やペプチドが提示されなければならない。抗原は、それらがＭＨＣ分子によって細胞表面に提示されたときにのみ、Ｔ細胞によりペプチド断片として認識される。これらのＭＨＣ（“主要組織適合複合体”）分子は、通常細胞内でペプチドと結合し、それらを細胞表面に輸送するペプチド受容体である。ペプチドとＭＨＣ分子とのこの複合体は、Ｔ細胞により認識される。ヒトＭＨＣ分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。
【０００４】
ＭＨＣ分子には２つのクラスがある：ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞に存在し、細胞内タンパク質の分解によって生じるペプチドを提示する。
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）にのみ存在し、エンドサイト−シスの間に取り込まれて加工される外来性タンパク質のペプチドを提示する。ペプチド／ＭＨＣクラスＩ分子複合体は、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され、ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞によって認識される。
【０００５】
細胞の免疫反応を引き起こすためには、ペプチドはＭＨＣ分子に結合しなければならない。この反応は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子とそのペプチドのアミノ酸配列に依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、一般的には８から１０残基の長さで、配列中に２つの保存された残基（「アンカー」）を含み、これらがＭＨＣ分子中に存在する相補的なくぼみ（ポケット）と結合する。
【０００６】
免疫系が腫瘍関連ペプチドに対して効果的なＣＴＬ反応を引き起こすためには、これらのペプチドは、腫瘍細胞に発現される特異的なＭＨＣクラスＩ分子に結合することができるだけでなく、特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識される必要がある。
【０００７】
腫瘍ワクチンを開発する際の主な目的は、ＣＤ８＋ＣＴＬによって認識される腫瘍関連抗原の同定と特定である。
【０００８】
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原又はそれらのエピトープは、それぞれ、酵素、受容体、転写因子等の全てのクラスのタンパク質分子でありうる。腫瘍関連抗原の別の重要なクラスは、様々な種類の腫瘍や健康な精巣組織において発現される癌精巣抗原のような、組織特異的な構造である。
【０００９】
Ｔリンパ球がタンパク質を腫瘍特異的抗原として認識するためには、そしてそれらを治療に用いるためには、以下の要件が満たされている必要がある：抗原は、腫瘍細胞によって主に発現されており、正常細胞では発現されていないか又は腫瘍におけるように、少なくとも少量が発現している必要がある。更に、特異的な抗原が一種の腫瘍中に存在するだけでなく、他の種類の腫瘍にも高濃度で存在していることが好ましい。更に、抗原のアミノ酸配列中のエピトープの存在が不可欠である。これらの腫瘍関連抗原由来のペプチドは、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれにおいてもＴ細胞反応を誘導すると考えられているためである。
【００１０】
このように、ＴＡＡは、腫瘍ワクチン開発の出発点である。ＴＡＡの同定方法及び特定方法は、患者由来のＣＴＬの利用、又は腫瘍組織と正常組織との間に異なる転写プロファイルが生じることに基づく。
【００１１】
腫瘍組織で過剰発現された、又は、このような組織において選択的に発現された遺伝子の同定は、これらの遺伝子から翻訳された抗原の、免疫療法への利用について正確な情報を与えない。これは、Ｔ細胞反応は、ＭＨＣの提示を媒介として、抗原全体ではなく抗原のエピトープのみによって引き起こされるので、これらの抗原のいくつかのエピトープのみがこのような利用に適当であるという事実に基づく。このように、過剰発現された、又は、選択的に発現されたタンパク質からＭＨＣ分子によって提示されるこれらのペプチドを選択することは重要であり、それにより細胞傷害性Ｔリンパ球による特異的な腫瘍の認識に対する取り組みの着手点となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記観点から、本発明は、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合することができる、このようなペプチドの少なくとも一つの新規なアミノ酸配列を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、添付した配列プロトコルの配列番号１〜配列番号７９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連ペプチドであって、上記ペプチドは、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合することができるペプチドを提供することにより上記課題は達成される。
本発明の基礎をなす課題は、これにより、完全に達成される。
【００１４】
言うまでもなく、腫瘍から同定されるペプチドは、量産するため、そして以下に述べる目的に使うため、合成されてもよく又は細胞中で発現されてもよい。
【００１５】
本発明者らは、上述したペプチドを、ＭＨＣクラスＩ分子に特異的なリガンドとして腫瘍関連組織から同定することができた。これに関連して、「腫瘍関連」ペプチド（“ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ”  ｐｅｐｔｉｄｅ）の用語は、ここでは腫瘍材料から単離され、同定されたペプチドを意味する。真性（一次）腫瘍に提示されるこれらのペプチドは、腫瘍細胞中で抗原処理を受ける。
【００１６】
例えば、上記ペプチドが由来する対応する抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫反応を引き起こすため、癌の治療において特異的なリガンドを用いることができる。
【００１７】
一方では、このようなＣＴＬの誘導による免疫反応は、生体内で達成しうる。この目的のため、ペプチドは、例えば、医薬組成物の形態で、ＴＡＡに関連する腫瘍疾患に苦しむ患者に投与される。
【００１８】
他方では、ペプチドが由来する抗原を発現する腫瘍に対するＣＴＬ反応は、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で誘導しうる。この目的のため、ＣＴＬ前駆体細胞は、抗原提示細胞及びペプチドと共にインキュベートされる。これによって刺激されたＣＴＬは次いで培養され、そしてこれらの活性化されたＣＴＬが患者に投与される。
【００１９】
更なる可能性は、生体外でペプチドをＡＰＣにロード（ｌｏａｄ）しそしてこれらのロードされたＡＰＣを、腫瘍組織においてこのペプチドが由来する抗原を発現している患者に投与することである。上記ＡＰＣは生体内で次々にＣＴＬにペプチドを提示し、それらを活性化する。
【００２０】
本発明のペプチドは、診断試薬として利用することもできる。
ここでは、ペプチドは、ＣＴＬ集団中に特異的にそのペプチドに向かうＣＴＬが存在するかどうか、又は、ＣＴＬが治療により誘導されたかどうかを知るために用いることができる。
【００２１】
更に、そのペプチドに対して反応性を示すＴ細胞前駆体の増加が、そのペプチドを用いて調べられる。
【００２２】
更に、そのペプチドは、ペプチドが由来する抗原を発現する腫瘍の病気の経過を評価するマーカーとして用いることができる。
【００２３】
添付した表１に、同定されたペプチドが示されている。これらペプチドは、それが結合するそれぞれのＨＬＡタイプに従って配列されている。更に、表にはペプチドが由来するタンパク質と、そのタンパク質中のペプチドの各位置が配列されている。ここに、翻訳上の誤解を避けるためタンパク質の英語表記を残した。更に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｓｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの“Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”の遺伝子バンクに載せられているＡｃｃ番号が引用されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【００２４】
本発明者らは、２人の患者、ＲＣＣ０１とＲＣＣ１３の腎臓細胞の悪性腫瘍からペプチド（又はリガンド）を分離することができた。ここで、患者ＲＣＣ０１の腫瘍組織から６８のリガンドが単離され、患者ＲＣＣ１３の腫瘍組織から１３のリガンドが単離された。両患者において同定されたリガンドのうち２つのリガンドは、同一であった。これらは、配列番号１と３を有するペプチドであった（ｍｅｔ−プロトオンコジーン（Ｃ−Ｍｅｔ）のＹＶＤＰＶＩＴＳＩとケラチン１８のＡＬＬＮＩＫＶＫＬ）。
【００２５】
７９のリガンドが患者の腫瘍から同定され、それらのうちの３０はＨＬＡサブタイプのＨＬＡ−Ａ*０２と結合し、１３はＨＬＡ−Ａ*６８と結合し、３４はＨＬＡ−Ｂ*１８又はＨＬＡ−Ｂ*４４と結合し、２つはＨＬＡ*２４と結合した。
【００２６】
ＨＬＡ−Ａ*０２リガンドは、全て対立遺伝子特異的ペプチドモチーフを提示していた（ポジション２にロイシン／バリン、イソロイシン、アラニン又はメチオニン；Ｃ末端にロイシン／バリン、イソロイシン又はアラニン）。
【００２７】
上記リガンドの中には、多量に発現される、ほとんどの組織で等しく発現されるいわゆるハウスキーピング遺伝子に由来するものもあったが、多くは腫瘍との結合により区別された。
【００２８】
例えば、配列番号１  ＹＶＤＰＶＩＴＳＩを有するペプチドは、リガンド、特に腫瘍と結合しｍｅｔ−プロトオンコジーン（ｃ−Ｍｅｔ）（ポジション６５４−６６２）に由来するリガンドに関連する。配列番号２、２２及び２３を有するペプチドは、アディポフィリン（ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ）（ “脂肪細胞分化関連”タンパク質とも呼ばれる）に由来し、このタンパク質のポジション１２９−１３７、６２−７１及び３４９−３５８を構成し、最後の２つのペプチドはＨＬＡ−Ａ*６８が提示するペプチドの中に包含される。配列番号３を有するリガンドは、ケラチン１８由来のリガンドで、ポジション３６５−３７３に位置する。
【００２９】
上記リガンドの大部分は、ポジション２にグルタミン酸（Ｅ）を有しており、このグルタミン酸は、ＨＬＡ−Ｂ*４４サブタイプのアンカーアミノ酸である。このように、ペプチドが初期の研究で免疫原性であると証明されたタンパク質由来であることを確認できた。例えば、配列番号５を有するペプチドは、タンパク質アネキシンＩＩ（Ａｎｎｅｘｉｎ  ＩＩ）（アネキシンＩＩ中のポジション：５５−６３）に由来する。このタンパク質は、メラノーマ患者に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子に関する免疫原性であることが証明されている（Heinzel et al.,  The self peptide annexin II(208-223)presented by dendritic cells sentisizes autologous CD4+ T-lymphocytes torecognize melanoma cells, 2001,Cancer Immunol. Immunother.  49:671-678参照）。
【００３０】
更に、タンパク質、特に腫瘍組織で過剰発現されるタンパク質由来のいくつかのペプチドも同定できた。このように、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）のフラグメント（ＥＥＩＡＦＬＫＫＬ、ポジション２２９−２３７）及びカルデスモン（Ｃａｌｄｅｓｍｏｎ）のフラグメント（ＤＥＡＡＦＬＥＲＬ、ポジション９２−１００）を同定できた。Ｙａｎｇらは、これらのタンパク質が、腎臓細胞の癌組織で過剰発現されることを開示している（Expression profiling of renalepithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery ofdiagnostic molecular markers, 2001, Am. J. Pathol.,158:1639-1651）。
【００３１】
本発明者らは更に、中でも特に、ｅｓｔ−１由来のリガンド（ＮＥＦＳＬＫＧＶＤＦ、ポジション８６−９５）、アルファ−カテニン（Ａｌｐｈａ−Ｃａｔｅｎｉｎ）由来のリガンド（ＮＥＱＤＬＧＩＱＹ、ポジション１６９−１７７）及びガレクチン２（Ｇａｌｅｃｔｉｎ  ２）由来のペプチド（ＳＥＶＫＦＴＶＴＦ、ポジション８０−８８）を同定することができた。
【００３２】
本発明者らは更に、酵素ニコチンアミド−Ｎ−メチル−トランスフェラーゼ由来のフラグメントＹＹＭＩＧＥＱＫＦ（配列番号７９）を単離した。高橋らは、この酵素が腎臓細胞癌において過剰発現されることを開示している（Gene expression profiling of clearcell renal cell carcinoma: gene identification and prognostic classification,2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98:9754-9749）。
【００３３】
驚くべきことに、本発明者らは提供者の血液中の同定されたペプチドの中の１つに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を検出することができた。このように、腫瘍に特異的なＣＴＬ反応を誘導することが可能となる。
【００３４】
本発明者らは、本研究において、２つの具体例として選択されたペプチドを用いることによって、配列番号１（ｃ−ｍｅｔ−プロトオンコジーンフラグメント又はｃ−Ｍｅｔペプチド）を有するペプチド又は配列番号２（アディポフィリンフラグメント又はアディポフィリンペプチド）を有するペプチドに特異的なＴリンパ球（ＣＴＬ）が生体内で発生することを明らかにすることができた。これらのＣＴＬは、それぞれのタンパク質を発現した、異なる患者の異なる腫瘍細胞株由来の腫瘍細胞を特異的に死滅させることができた。本発明者らはまた、上述したＣＴＬについて、例えば、予め対応するペプチドを用いてパルスされた樹状細胞が溶解されることを明らかにした。本発明者らはまた、本発明のペプチドをエピトープとして用いると、ヒトＴ細胞が試験管内で活性化されることを、これらの研究から明らかにした。本発明者らは、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）から得られ、ある種のペプチドに特異的なＣＴＬが、別の患者の同種の腫瘍細胞を死滅させることができるという点についてのみ、証明できなかった。本発明者らは更に、他種の腫瘍細胞であってもこれらのＣＴＬにより溶解することを明らかにした。
【００３５】
好ましい具体例として、配列番号１〜配列番号７９からなるペプチド及びこれらの配列の少なくとも１つのアミノ酸が、類似する化学的性質を有する他のアミノ酸によって置換されているペプチドは、免疫反応の活性化にも用いられる。
【００３６】
それぞれのＭＨＣ−サブタイプに関しては、例えば、これらのアンカーアミノ酸は類似する化学的性質を有する他のアミノ酸によって置換されていてもよい。例えば、ＭＨＣサブタイプＨＬＡ−Ａ*０２と結合するペプチドにおいて、ポジション２のロイシンは、イソロイシン、バリン又はメチオニンで置換されていても良く、逆もまた同じである。Ｃ末端のロイシンは、バリン、イソロイシン及びアラニンで置換されていても良く、これらは全て非極性側鎖を有する。
【００３７】
更に、配列番号１〜７９を有するペプチドが、Ｎ末端又はＣ末端に少なくとも１つの付加的なアミノ酸を含むものであるか、又は、配列中の少なくとも１つのアミノ酸が欠損しているものであっても用いることができる。
【００３８】
更に、配列番号１〜７９を有するペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸が化学的に修飾されているものであっても用いることができる。
【００３９】
（１又は２以上の）アミノ酸の変異は、その変異がペプチドの免疫原性に影響を与えないように、言い換えると、ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する同程度の結合能及びＴ細胞刺激能を示すように選択される。
【００４０】
本発明において、上記ペプチドは、腫瘍疾患及び／又はアデノーマ（腺種）性疾患の治療に用いることができる。
【００４１】
治療される腫瘍疾患としては、例えば、腎臓、乳房、膵臓、胃、膀胱、精巣、及び／又は、皮膚のがんがあげられる。腫瘍疾患の一覧は、単なる例示にすぎず、利用範囲を特に限定するものではない。
【００４２】
本発明者らはまた、研究により本発明のペプチドがこのような用途に適していることを明らかにした。このように、ある種のペプチドに特異的な、特異的に生成したＣＴＬによって、腫瘍細胞は効果的に、かつ選択的に死滅させられることが明らかになった。
【００４３】
腫瘍関連抗原を腫瘍のワクチンに用いるためには、その適用には一般的にいくつかの可能な形態がある。Ｔｉｇｈｅらは、抗原を、組換えタンパク質として適当なアジュバント（補助剤）又は運搬系と共に、又は、プラスミドベクター中で抗原をコードしているｃＤＮＡとして投与しうることを明らかにした（1998, Gene vaccination:plasmid DNAis more than just a blueprint, Immunol. Today 19(2):89-97）。後者の場合、免疫反応を誘導するためには、患者の体内において抗原が処理され、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示されなければならない。
【００４４】
Ｍｅｌｉｅｆらは、更なる可能性、すなわち合成ペプチドをワクチンとして用いる可能性について明らかにしている（1996,Peptide-based cancervaccines, Curr. Opin. Immunol. 8:651-657）。
【００４５】
好ましい形態として、上記ペプチドは、アジュバントを加えて、又は、それ自体で用いることができる。
【００４６】
アジュバントとしては、例えば、顆粒球マクロファージ刺激因子（granulocate-macrophage-colony-stimulating-factor）（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いることができる。
【００４７】
また、このようなアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント等のミネラルオイルのエマルジョン、サポニン又はシリコン化合物があげられる。
【００４８】
アジュバントを用いることは、上記ペプチドにより誘導される免疫反応が高められ、及び／又は、ペプチドが安定化されるため、有用である。
【００４９】
別の好ましい形態として、抗原提示細胞上（表面）に結合されたペプチドが投与される。
【００５０】
この方法は、ペプチドが免疫系、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に提示されるため、有効である。これによって、ＣＴＬは腫瘍細胞を認識でき、特異的に死滅させることができる。例えば、樹状細胞、単球又はＢリンパ球は、この目的における抗原提示細胞として適している。
【００５１】
ここで、上記細胞は、例えば、生体外でペプチドをロードされる。一方、細胞で上記ペプチドを発現させるため、ペプチドをコードしているＤＮＡ又は対応するＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクションすることもできる。
【００５２】
本発明者らは、研究によって、樹状細胞（ＤＣ）が、特異的なペプチドをロードできること、そして、これらのペプチドをロードされた樹状細胞がペプチドに特異的なＣＴＬを活性化することを見いだした。このことは、免疫系が、各ペプチドを発現する腫瘍を標的とするＣＴＬを生成するように刺激されうることを意味する。
【００５３】
上記ペプチドを載せている抗原提示細胞は、そのまま用いることもでき、又は、使用に先立って熱ショックタンパク質ｇｐ９６を用いて活性化することもできる。この熱ショックタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ分子や、Ｂ７のような共刺激分子の発現を誘導し、更にサイトカインの生産を刺激する。このため、免疫反応の誘導は、すべてにおいて高められる。
【００５４】
別の好ましい形態として、上記ペプチドは、白血球、特にＴリンパ球をラベルするために用いられる。
【００５５】
この使用方法の利点として、上記ペプチドを用いると、ＣＴＬ群において上記ペプチドに特異的なＣＴＬを検出することができることである。
【００５６】
上記ペプチドはまた、腫瘍疾患の治療経過を評価するためのマーカーとして用いることもできる。
【００５７】
上記ペプチドは、他の免疫処置や治療における治療のモニターするために用いることもできる。ここで、上記ペプチドは、治療に用いることができるだけでなく、診断においても用いることができる。
【００５８】
更なる具体例として、上記ペプチドは、抗体を生成するために用いられる。
【００５９】
一般的にポリクローナル抗体は、ペプチドの注入により動物を免疫処置し、次いで免疫グロブリンを精製することにより得ることができる。
【００６０】
モノクローナル抗体は、例えば、Methods Enzymol.(1986), 121, Hybridomatechnology and monoclonal antibodiesに記載されているような一般的手順により生成する。
【００６１】
更に、本発明は、ペプチドを１又は２以上含む医薬組成物に関する。
【００６２】
この組成物は、例えば、非経口的に、例えば、皮下、皮内又は筋内に適用することができ、又は、経口投与することもできる。この場合、上記ペプチドは、薬学的に利用可能なキャリアー、好ましくは水性キャリアーに溶解又は懸濁される。上記組成物は更に、添加物、例えば、緩衝液、バインダー、希釈液等を含んでいても良い。
【００６３】
上記ペプチドは、免疫刺激物質、例えば、サイトカインと共に投与することもできる。このような性質の組成物に用いることができる多くの添加剤についての記述があり、例えば、A. Kibbe, Handbook ofPharmaceutical Excipients, 3.ed,2000,American Pharmaceutical Association andpharmaceutical pressに記載されている。
【００６４】
上記組成物は、腫瘍疾患及び／又はアデノーマ性疾患の防止、予防及び／又は治療に用いることができる。
【００６５】
配列番号１〜７９を有するペプチドを少なくとも１つ含む上記医薬組成物は、それぞれのペプチド又は抗原が関連する腫瘍疾患の患者に投与される。それゆえ、腫瘍特異的免疫反応が腫瘍特異的ＣＴＬを基にして誘導される。
【００６６】
上記医薬組成物中に存在する１又は２以上のペプチドの量としては、治療学的に効果がある量である。これに関して、上記組成物に含まれるペプチドは、少なくとも２つの異なるＨＬＡタイプに結合することができる。
【００６７】
本発明は更に、配列番号１〜７９のペプチドをコードしている核酸分子に関する。
【００６８】
上記核酸分子は、ＤＮＡ−又はＲＮＡ−分子を意味し、がんの免疫治療にも用いることができる。これにより、核酸分子により発現したペプチドは、そのペプチドを発現する腫瘍細胞に対する免疫反応を誘導する。
【００６９】
本発明において、上記核酸分子は、ベクター中に供給されてもよい。
【００７０】
本発明は更に、配列番号１〜７９のペプチドを生産するように、上記核酸分子により遺伝子的に修飾されている細胞に関する。
【００７１】
この目的のため、上記細胞は、上記ペプチドをコードしているＤＮＡ又は対応するＲＮＡを用いてトランスフェクションされ、それにより細胞上にペプチドを発現する。この目的のため、例えば、樹状細胞、単球又はＢリンパ球が、抗原提示細胞として好適である。
【００７２】
上述した特性や以下に説明する特性は、明記された例の組み合わせにおいて用いることができるだけでなく、他の組み合わせ又は本発明の範囲を逸脱することなく、それら自体でも使用することができることは、言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
本発明の具体例が以下に図示し、説明されている。
【００７４】
【図１】ケラチン１８に特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の検出を示す。
【図２ａ】ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に特異的な、試験管系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＣＴＬ反応の誘導を示す。
【図２ｂ】ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に特異的な、試験管系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＣＴＬ反応の誘導を示す。
【図２ｃ】アディポフィリン（ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ）ペプチド（配列番号２）に特異的な、試験管系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＣＴＬ反応の誘導を示す。
【図２ｄ】アディポフィリン（ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ）ペプチド（配列番号２）に特異的な、試験管系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＣＴＬ反応の誘導を示す。
【図３ａ】ｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞株の抗原特異的溶解を示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されるＣＴＬにより媒介される溶解を示す。
【図３ｂ】ｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞株の抗原特異的溶解を示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されるＣＴＬにより媒介される溶解を示す。
【図３ｃ】ｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞株の抗原特異的溶解を示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されるＣＴＬにより媒介される溶解を示す。
【図３ｄ】ｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞株の抗原特異的溶解を示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されるＣＴＬにより媒介される溶解を示す。
【図３ｅ】ｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞株の抗原特異的溶解を示す。アディポフィリンペプチド（配列番号２）に誘導されるＣＴＬにより媒介される溶解を示す。
【図３ｆ】ｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞株の抗原特異的溶解を示す。アディポフィリンペプチド（配列番号２）に誘導されるＣＴＬにより媒介される溶解を示す。
【図４ａ】誘導されたＣＴＬに媒介される５１Ｃｒでラベルした腫瘍細胞とラベルしていないパルスされたＴ２細胞を用いた溶解阻害アッセイを示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されたＣＴＬに媒介されている。
【図４ｂ】誘導されたＣＴＬに媒介される５１Ｃｒでラベルした腫瘍細胞とラベルしていないパルスされたＴ２細胞を用いた溶解阻害アッセイを示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されたＣＴＬに媒介されている。
【図４ｃ】誘導されたＣＴＬに媒介される５１Ｃｒでラベルした腫瘍細胞とラベルしていないパルスされたＴ２細胞を用いた溶解阻害アッセイを示す。アディポフィリンペプチド（配列番号２）に誘導されたＣＴＬに媒介されている。
【図５ａ】誘導されたＣＴＬに媒介される、腫瘍ＲＮＡを用いてトランスフェクションされた自己由来の樹状細胞の溶解を示す。ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されたＣＴＬにより媒介されている。
【図５ｂ】誘導されたＣＴＬに媒介される、腫瘍ＲＮＡを用いてトランスフェクションされた自己由来の樹状細胞の溶解を示す。アディポフィリンペプチド（配列番号２）に誘導されたＣＴＬにより媒介されている。
【図６】試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で誘導されたアディポフィリン特異的自己由来ＣＴＬが、慢性白血病患者の自己由来腫瘍細胞を認識するが、自己由来樹状細胞又はＢ細胞を認識しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
実施例１
１．１  患者サンプル
組織学的に確認された腎臓細胞の悪性腫瘍を有する患者のサンプルは、ティュービンゲン大学の泌尿器科から入手した。患者はいずれも術前治療を受けていない。患者番号１（以下、ＲＣＣ０１と記す）は、以下のＨＬＡ型を有していた：ＨＬＡ−Ａ*０２  Ａ*６８  Ｂ*１８  Ｂ*４４；患者番号２（以下、ＲＣＣ１３と記す）：ＨＬＡ−Ａ*０２  Ａ*２４  Ｂ*０７  Ｂ*４０。
【００７６】
１．２  ＭＨＣクラスＩ分子結合ペプチドの単離
ショック冷凍（ｓｈｏｃｋ−ｆｒｏｚｅｎ）した腫瘍サンプルは、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．らの記載「新規Ｔ細胞−非依存アプローチによる、腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定(Identification of tumor-associated MHC-class I ligands by a novel Tcell-independent approach)」2000,European Journal ofImmunology,30:2216-2225に従い処理した。ペプチドは、クラスＩＨＬＡに特異的なモノクローナル抗体Ｗ６／３２、又は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なモノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて標準的な手順により単離された。これらの抗体の生産方法と使用方法は、Barnstable, C.J.らの「グループＡ赤血球、ＨＬＡおよび他のヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の生産−遺伝的解析のための新規ツール(Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes,HLA andother human cell surface antigens-New tools for genetic analysis.)」1978,Cell,14:9-20、及び、Parham, P.及びBrodsky F.M.の「ＢＢ７．２の部分精製および特性。ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８の変異体に対する特異性を持つ細胞傷害性モノクローナル抗体(Partial purification and some properties of BB7.2.A cytotoxicmonoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28)」1981,Hum.Immunol.,3:277-299による。
【００７７】
１．３  質量分析
患者ＲＣＣ０１の腫瘍組織由来のペプチドは、逆相ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴ−ｓｙｓｔｅｍ，  μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ  ２．１／１９，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により分離され、フラクションはｎａｎｏＥＳＩ  ＭＳを用いて分析された。これに際し、手順はＳｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．等の報告に記載されている方法で実施した（Identification of tumor-associatedMHC-class I ligand by a novel T cell-independent approach, 2000,EuropeanJournal of Immunology, 30:2216-2225）。
【００７８】
患者ＲＣＣ１３の腫瘍組織由来のペプチドは、上述したオンラインのキャピュラリーＬＣ−ＭＳに少し変更を加えて同定した。１００ μｌ量のサンプルを注入し、３００μｍ*５ｍｍ  Ｃ１８カラム（ＬＣ−ｐａｃｋｉｎｇ）で脱塩し、予め濃縮した。気密性１００μｌシリンジ（１７１０  ＲＮＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を備えたシリンジポンプ（ＰＨＤ  ２０００，  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，  Ｉｎｃ．）は、溶媒とサンプルを２μｌ／分で流した。ペプチドの分離のため、予め濃縮するためのカラムは、７５μｍ×２５０ｍｍ  Ｃ１８（ＬＣパッキング）カラムに一列で切り替えた。その後ＴＥＥピース（ＺＴ１Ｃ，  Ｖａｌｃｏ）及び３００μｍ×１５０ｍｍ  Ｃ１８カラムのプレカラムを用いて、流速１２μｌ／分を約３００ｎｌ／分に減少して、７０分間のＢ液濃度２５％−６０％の二液グラジエントを実施した。
【００７９】
ブランクランを常時実施して、確実に本系に残余ペプチドを含めないようにした。オンライン断片化を上述のように実施して、断片スペクトルを手動で解析した。データベースサーチ（ＮＣＢＩｎｒ，  ＥＳＴ）は、ＭＡＳＣＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を用いて行った。
【００８０】
１．４  患者ＲＣＣ０１の腫瘍組織の７７のＭＨＣクラスＩリガンドの同定
添付した表１に、ＨＬＡ−Ａ*０２、ＨＬＡ−Ａ*６８、ＨＬＡ−Ｂ*１８、又は、ＨＬＡ−Ｂ*４４に結合したリガンドを示した。ＨＬＡ−Ａ*０２に結合したペプチドは、対立遺伝子に特異的なペプチドモチーフを示した：ポジション２がロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン又はメチオニンで、Ｃ末端がロイシン、バリン、イソロイシン又はアラニンである。多くのリガンドは、いわゆるハウスキーピングタンパク質由来であるが、腫瘍関連グループと報告されているタンパク質由来のリガンドも検出された。
【００８１】
ＨＬＡ−Ａ*６８リガンドは、アンカーアミノ酸であるポジション２のスレオニン、イソロイシン、バリン、アラニン又はロイシンと、Ｃ末端のアルギニン又はリジンによって同定された。これは、ＨＬＡ−Ａ*６８０１サブタイプを示す。アディポフィリン由来の別の２つのリガンド、すなわちＭＴＳＡＬＰＥＩＱＫ及びＭＡＧＤＩＹＳＶＦＲが、ＨＬＡ−Ａ*６８が提示するペプチド中に発見された。更に腫瘍関連サイクリンＤ１由来のＥＴＩＰＬＴＡＥＫＬが見つかった。ペプチドＴＩＶＮＩＬＴＮＲは、アネキシンＩ（Ａｎｎｅｘｉｎ  ＩＩ）由来であり、このタンパク質はメラノーマ患者のＭＨＣクラスＩＩと関連する免疫原であることが分かっている（Heinzel et al., The self peptideannexin II(208-223) presented by dendritic cells sentisizes autologous CD4+T-lymphocytes to recognize melanoma cells, 2001,Cancer Immunol. Immunother.49:671-678参照）。更に、リガンドは、ＨＬＡ−Ｂ*４４サブタイプのアンカーアミノ酸であるグルタミン酸をポジション２に有していた。ＨＬＡ−Ｂ*１８のペプチドモチーフは知られていないので、これらの２つのＨＬＡ−Ｂ分子間の区別は不可能であった。
【００８２】
１．５  患者ＲＣＣ１３の腫瘍組織のＭＨＣクラスＩリガンド
患者ＲＣＣ１３の腫瘍組織にも、患者ＲＣＣ０１において確認された同じリガンドが同定された、プロトオンコジーン（ｃ−Ｍｅｔ）とケラチン１８由来のリガンドと同じリガンドが確認された：配列番号１と３を有するペプチドである。更に、この腫瘍組織からは、別のリガンドが得られ、ニコチンアミド−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）に由来するリガンドが確認された；この遺伝子は、全ての腎臓悪性腫瘍の９５％以上において過剰発現される。更に、その他のリガンドのいくつかは、ＲＣＣ０１のペプチドのレパートリーと共通している。
【００８３】
１．６  正常ＣＤ８＋Ｔ細胞レパートリー中のケラチン１８特異的Ｔ細胞の検出
健康な患者由来の末梢血単核細胞を、アディポフィリン−、ケラチン１８−又はｍｅｔ−プロトオンコジーン（ｃ−Ｍｅｔ）ペプチドと共に折り畳まれたＨＬＡ−Ａ*０２０１四量体で染色した：四量体の生成のため、組換えＨＬＡ−Ａ*０２０１分子は、試験管内（インビトロ）でＳＶＡＳＴＩＴＧＶ（配列番号２、アディポフィリン），ＡＬＬＮＩＫＶＫＬ（配列番号３、ケラチン１８）又はＹＶＤＰＶＩＴＳＩ（配列番号１、ｍｅｔ−プロトオンコジーン、ｃ−Ｍｅｔ）と共に折り畳まれ、ゲルろ過により精製され、単量体を連結するためにビオチン化され、ストレプトアビジンと混合された。
【００８４】
健康な２２の個体のうち４個体において、予想外に、ケラチン１８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な個体群が見られた。ダブル染色の結果を、図１にドットプロットで示す。中段にケラチン１８で染色した結果を示す。ＣＤ８＋陽性Ｔ細胞の０．０２〜０．２％がケラチン１８特異的であった。ドットプロットの下段から分かるように、ケラチン１８四量体の結合は特異的であった。
【００８５】
実施例２
腫瘍細胞による配列番号１（ＹＶＤＰＶＩＴＳＩ）（ｃ−Ｍｅｔオンコジーンのペプチド断片）及び配列番号２（アディポフィリンのペプチド断片）のペプチドの提示、及び、ＣＴＬによるそれらの認識について分析するため、ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１のペプチド）に特異的なＣＴＬとアディポフィリンペプチド（配列番号２のペプチド）に特異的なＣＴＬが、試験管内で誘導された。この操作において、健康なＨＬＡ−Ａ*０２陽性ドナー由来の樹状細胞（ＤＣ）が用いられた。
【００８６】
２．１  ＤＣの生成
末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）は、テュービンゲン大学の血液バンクの健康なボランティアの軟膜層(buffy coat)の調製物から得られたヘパリン化された血液を、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、密度勾配遠心分離することにより単離された。細胞は、ＲＰ１０培地（ＲＰＭＩ  １６４０、熱で不活化したウシ胎児の血清１０％と抗生物質を添加した）を使用した６穴のプレート（Ｆａｌｃｏｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に植えられた（１穴あたり１×１０７細胞／３ｍｌ）。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベーションしたあと、非粘着性の細胞を除去し、以下のサイトカインを添加したＲＰ１０培地で粘着性の血液の単球を培養した：ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｌｅｕｋｏｍａｘ，  Ｎｏｖａｒｔｉｓ；  １００ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン  ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １０００  ＩＵ／ｍｌ）及びＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １０ｎｇ／ｍｌ）。
【００８７】
２．２  ペプチド合成
典型的な、２つのＨＬＡ−Ａ*０２結合ペプチド（上述したように同定されたｃ−Ｍｅｔ  （配列番号１、ＹＶＤＰＶＩＴＳＩ）又はアディポフィリン（配列番号２，ＳＶＡＳＴＩＴＧＶ））は、標準Ｆ−ｍｏｃ試薬を用いてペプチド合成機（４３２Ａ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成され、逆相ＨＰＬＣと質量分析により分析された。この方法で、同定されたペプチドの充分量を得ることができる。
【００８８】
２．３  ＨＬＡ−Ａ*０２により限定される合成ペプチドを用いた抗原特異的ＣＴＬ反応の誘導
ＣＴＬ誘導のため、ステップ２．１で得られたＤＣ（５×１０５）を、ステップ２．２で得られた配列番号１又は配列番号２のペプチド各５０μｌ／ｍｌと共に２時間パルスし、洗浄し、自己由来の２．５×１０６のＰＢＭＮＣとＲＰ１０培地中でインキュベートした。
【００８９】
７日間培養した後、細胞を、ペプチドと共にパルス刺激された自己由来のＰＢＭＮＣにより再刺激した。その過程において、１ｎｇ／ｍｌのヒト組換えインターロイキンＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１、３、５日に添加した。それにより誘導されたＣＴＬの細胞溶解活性は、最終の再刺激の後５日目に標準５１Ｃｒ放出アッセイ（以下の項目２．４を参照：ＣＴＬアッセイ）により分析した。
【００９０】
２．４  ＣＴＬアッセイ
ＣＴＬアッセイにおいて、腫瘍細胞、異なる細胞株のペプチド−パルス細胞及び自己由来のＤＣが標的細胞として用いられた。ペプチド−パルス細胞は、５０μｇ／ｍｌのペプチド（配列番号１又は配列番号２）と共に２時間パルスされた。全ての標的細胞は、ＲＰ１０培地（ＲＰＭＩ  １６４０、熱で不活化したウシ胎児の血清１０％と抗生物質を添加した）中で〔５１Ｃｒ〕クロム酸ナトリウムを用いて、１時間の間３７℃でラベルされた。その後、１穴あたり１０４の細胞を９６穴の丸底プレートに移した。最終体積が２００μｌとなるようにＣＴＬの数を変化させて加えて、４時間３７℃でインキュベートした。アッセイの終わりに、上澄み（１穴あたり５０μｌ）を採取して、ベータ−プレートカウンターで数えた。特異的な溶解の割合は、次のように計算した：１００×（（実験に基づく放出数）−（自然放出数））／（（最大放出数）−（自然放出数））。自然放出数及び最大放出数は、それぞれ培地又は２％Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ−１００いずれかの存在下で決定した。
【００９１】
２．５  ＣＴＬ誘導の結果
ａ）  ペプチド−パルスＤＣに対するＣＴＬ細胞傷害活性
図２には、Ｔ２−又はＤＣ−細胞に対する誘導されたＣＴＬ（項目２．３参照）の細胞傷害活性に関する５１Ｃｒ放出アッセイの結果を示す。Ｔ２−細胞株はＨＬＡ−Ａ*０２陽性で、ＴＡＰ（抗原処理に関連する輸送体）欠損である；（ＴＡＰペプチド輸送体は、タンパク質性のペプチド断片を細胞質ゾルから小胞体に輸送し、そこでそれらはＭＨＣ分子と結合する）。
【００９２】
図２の２ａ及び２ｂに、配列番号１のペプチドにより誘導されたＣＴＬのＴ２−又はＤＣ−細胞に対する細胞傷害活性を示す。どちらの細胞型も、配列番号１の（ｃ−Ｍｅｔ）ペプチド（黒く塗られた四角）、又は、関係のないペプチド（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（＝“Ｓｖ”；ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ；配列番号８０）又はＨＩＶ（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ；Ｐｏｌ．ＨＩＶ−１逆転写酵素ペプチド、ポジション４７６−４８４；配列番号８１）と共に予めパルスされている。図２ｃ及び２ｄに、配列番号２のペプチドにより誘導されたＣＴＬのＴ２−又はＤＣ−細胞に対する細胞傷害活性を示す。Ｔ２−又はＤＣ−細胞どちらの細胞型も、配列番号２のアディポフィリンペプチドと共に予めパルスされている。
【００９３】
５１Ｃｒの放出により証明される特異的な溶解を、図２ａ−２ｄのグラフに、同様に図３−５のＣＴＬ溶解のグラフに、標的細胞（溶解する５１Ｃｒでラベルされた細胞）に対するエフェクター細胞（ＣＴＬ）の細胞の割合を変化させて示す。
【００９４】
図２ａ−２ｄに示されるように、抗原特異的な細胞殺傷能が、ＣＴＬ細胞株（この細胞株は２週間ごとの再刺激で生成されたものである）について証明された。配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチド（図２ａ及び２ｂ）又は配列番号２のアディポフィリンペプチド（図２ｃ及び２ｄ）を与えられた細胞のみがＣＴＬの増加により溶解した（図２ａ−２ｄ中の黒塗り四角の曲線参照）；一方、関係のないペプチドとパルス処理したコントロール細胞は、溶解しなかった（塗りつぶされていない四角で示す曲線）。これゆえ、溶解活性の特異性が証明された。
【００９５】
ｂ）  腫瘍細胞株に対するＣＴＬ細胞傷害活性
次いで、再び標準的な腫瘍５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチド又は配列番号２のアディポフィリンペプチドに特異的なＣＴＬが、細胞内でｃ−Ｍｅｔ−プロトオンコジーン又はアディポフィリンを発現している腫瘍細胞を認識し、溶解するかどうかを調べた。
【００９６】
その実験において、以下に示す５１ＣｒでラベルされたＨＬＡ−Ａ*０２陽性細胞株が用いられた：ＨＣＴ１６６（大腸がん；Ｇ．Ｐａｗｅｌｅｃ教授（テュービンゲン、ドイツ）から入手）、Ａ  ４９８、ＭＺ  １２５７及びＭＺ  １７７４（腎臓細胞がん、Ａ．  Ｋｎｕｔｈ教授（フランクフルト、ドイツ）から入手）、ＭＣＦ−７（乳がん；ＡＴＣＣ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）、Ｍｅｌ  １４７９（悪性メラノーマ；Ｇ．Ｐａｗｅｌｅｃ教授（テュービンゲン、ドイツ）から入手）、Ｕ  ２６６（多発性骨髄腫；Ｇ．Ｐａｗｅｌｅｃ教授（テュービンゲン、ドイツ）から入手）。これらの細胞株は、標的構造（ターゲット）としてｃ−Ｍｅｔ−プロトオンコジーン及びアディポフィリンを発現する。
【００９７】
この実験において、ＣＥＢＶ（エプスタイン・バールウイルス）で不死化したＢ細胞株Ｃｒｏｆｔ、ＨＬＡ−Ａ*０１陽性（Ｏ．Ｊ．Ｆｉｎｎ（ピッツバーグ、米国）から入手、）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣がん；ＨＬＡ−Ａ*０３陽性；Ｏ．Ｊ．Ｆｉｎｎ（ピッツバーグ、米国）から入手）、がネガティブコントロールとして用いられた。Ｋ  ５６２細胞（例えば、the German Collection of MikroOrganism and Cell Cultures DSMZから入手可能；ＡＣＣ  １０）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の活性を決定するために用いられた。この細胞株は、これらのキラー細胞に対する感受性が高いためである。
【００９８】
すべての細胞株は、ＲＰ１０培地（ＲＰＭＩ  １６４０、熱で不活化したウシ胎児の血清１０％と抗生物質を添加した）中で培養された。
【００９９】
上述した腫瘍細胞株と誘導されたＣＴＬを用いて、上述した方法により５１Ｃｒ放出アッセイ（項目２．４．参照）を行った。
【０１００】
図３ａ−３ｆに、これらのＣＴＬアッセイの結果を示す。図３ａ−３ｄにおいては、配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチドを用いて誘導されたＣＴＬが用いられ、図３ｅ−３ｆにおいては、配列番号２のアディポフィリンペプチドを用いて誘導されたＣＴＬが用いられた。
【０１０１】
図３ａ−３ｆに示されるように、配列番号１を有するｃ−Ｍｅｔペプチドに特異的なＣＴＬ（図３ａ−３ｄ）又は配列番号２を有するアディポフィリンペプチドに特異的なＣＴＬ（図３ｅ及び３ｆ）は、ＨＬＡ−Ａ*０２及びｃ−Ｍｅｔ又はアディポフィリンの両方を発現している腫瘍細胞を効果的に溶解した（図３ａは細胞株ＨＣＴ  １１６、図３ｂは細胞株Ａ  ４９８、図３ｃは細胞株ＭＺ  １２５７及びＭＥＬ  １４７９、図３ｄは細胞株ＭＣＦ−７及びＵ  ２６６；図３ｅは細胞株Ａ  ４９４、Ｕ  ２６６及びＭＣＦ−７、図３ｆは細胞株ＭＺ  １７７４、Ｍｅｌ  １４７９及びＭＺ  １２５７）。特異的溶解は、項目２．４に記載したように、５１Ｃｒ放出により測定した。配列番号１のペプチドにより誘導されたＣＴＬによっても、配列番号２のペプチドにより誘導されたＣＴＬによっても、コントロールの細胞株ＳＫ−ＯＶ−３（ＨＬＡ−Ａ*０２陰性）の溶解はなかった。このように、ターゲット細胞を効果的に溶解するためには、ＨＬＡ−Ａ*０２分子と共に腫瘍細胞に両ペプチドが提示される必要があることが明らかとなった。更に、ＣＴＬの抗原特異性及びＭＨＣ制限がこの方法により明らかになった。
【０１０２】
配列番号１を有するペプチドにより試験管内で誘導されたＣＴＬ細胞は、Ｋ５６２細胞株（図３ａ、３ｂ及び３ｄ参照）を認識せず、細胞傷害活性はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によっては媒介されないことを示した。
【０１０３】
ｃ）阻害アッセイ
試験管内で誘導されたＣＴＬの抗原特異性とＭＨＣ制限を更に確かめるため、５１Ｃｒでラベルしていない（“ｃｏｌｄ”）阻害細胞株を用いて阻害アッセイを行った。
【０１０４】
ペプチド−パルス細胞株の能力は、腫瘍細胞の溶解を阻害することで分析した（競合アッセイ）。このため、過剰量の阻害剤（過剰量のラベルしていないパルス細胞）が用いられた。阻害剤（ペプチド−パルス細胞）の標的細胞（腫瘍細胞）に対する比率は、２０：１であった。阻害細胞株はラベルされていないので、阻害細胞株が溶解するときには５１Ｃｒは放出されなかった。
【０１０５】
細胞株Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ*０２；ＴＡＰ欠損；項目２．５．ａ）参照）が阻害剤として用いられた。アッセイの前に、この細胞株Ｔ２は関連するペプチド（配列番号１又は２）又は関係のないペプチド（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（＝Ｓｖ）、配列番号８０）それぞれを用いてパルスされた。
【０１０６】
これらの試験結果を図４ａ−４ｃに示す。それによれば、図４ａ及び４ｂでは、ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）に誘導されたＣＴＬが用いられ、図４ｃでは、アディポフィリンペプチド（配列番号２）に誘導されたＣＴＬが用いられた。
【０１０７】
図４ａ及び４ｂにおいて、５１Ｃｒでラベルした細胞株Ｕ  ２６６及びＡ  ４９８の溶解は、阻害剤細胞株無しでテストした（黒く塗られた四角の曲線参照）；関係のないペプチド（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（＝Ｓｖ）、配列番号８０；ネガティブコントロール、塗りつぶされた三角）と共にパルスした阻害剤細胞株Ｔ２を用いた溶解；配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチドと共にパルスした阻害細胞株Ｔ２を用いた溶解（塗りつぶされていない菱形の曲線）。
【０１０８】
阻害剤細胞の存在なしで、ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解が証明された（図４ａ−ｄにおいて黒く塗られた四角の曲線をそれぞれ参照）。更に、図４ａ及び４ｂに示されるように、阻害剤標的が配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチドを用いてパルスされていれば（塗りつぶされていない菱形の曲線それぞれ参照）、過剰量の阻害剤を用いた場合には標的腫瘍細胞は溶解しなかった（そして５１Ｃｒが放出されなかった）。ＣＴＬ活性は、過剰量のラベルされていないＴ細胞に向けられ、それゆえこれらの細胞が溶解し、腫瘍細胞は溶解しなかった。関係のないペプチド（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（＝Ｓｖ）、配列番号８０）を用いてパルスしたＴ２細胞は、ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を阻害しなかったので、放出された５１Ｃｒが測定された（図４ａ及び４ｂの黒塗り三角の曲線参照）。
【０１０９】
配列番号２のアディポフィリンペプチドを用いて誘導されたＣＴＬを用いた場合も、同様の結果が示された。
【０１１０】
アディポフィリンにより誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性のＭＨＣ制限と抗原特異性は、ＨＬＡ−Ａ*０２特異的モノクローナル抗体を用いて，ラベルしていない（“ｃｏｌｄ”）阻害剤を用いた阻害アッセイによって確認された：この実験結果を図４ｃに示す。ＨＬＡ−Ａ*０２特異的抗体（モノクローナル抗体ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ、Ｓ．Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ、ティュービンゲンから入手）を添加したとき、Ａ  ４９８腫瘍細胞はブロックされ、そのためそれらは添加したＣＴＬによって溶解されず、５１Ｃｒは放出されなかった（図４ｃの塗られた三角印の曲線参照）。コントロールとしてＨＬＡ−Ａ*０２をブロックしない非特異的抗体（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  Ｍａｕｓ  ＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ；図４ｃの塗られた四角の曲線参照）が用いられた。これらの阻害アッセイにおいて、細胞は、９６穴のプレート上に播種する前に、１０μｇ／ｍｌの抗体と共に３０分間インキュベートされた。
【０１１１】
更に、関係のないペプチドＳｕｒｖｉｖｉｎ（配列番号８０）（Ｔ２／ＳＶ）を用いてパルスされたＴ２競合細胞株は、ＣＴＬに誘導される腫瘍細胞株Ａ  ４９８の溶解を阻害できないが（図４ｃの黒く塗られた丸の曲線参照）、配列番号２のアディポフィリンペプチドを用いてパルスされたＣＴＬＴ２阻害細胞株（Ｔ２／ＡＤ）は腫瘍細胞株の溶解を阻害することができ、このため−後者を言い換えると−５１Ｃｒの放出は観察されなかった（図４ｃのｘ印の曲線参照）。
【０１１２】
ｄ）  トランスフェクションされたＤＣの特異的溶解
次の実験では、自己セッティング(autologous setting) ＣＴＬ細胞傷害活性について分析した。そこでは、ＣＴＬ誘導のために用いられた（項目２．２．参照）のと同じＰＢＭＮＣから生成した自己由来のＤＣが標的細胞として用いられた。ＣＴＬアッセイに先立って、ＤＣは、腫瘍細胞株から予め単離されたＲＮＡ又はコントロールＲＮＡに相当するＲＮＡ（試験管内で転写されたＥＧＦＰ−ＲＮＡ、強化緑色蛍光タンパク質ＲＮＡ；プラスミド：ｐＳＰ６４  Ｐｏｌｙ（Ａ）  ＥＧＦＰＩＩ、Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ、アントワープ、ベルギーより入手）を用いてエレクトロポレートされた。腫瘍細胞の全ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて、製造者の手順に従って単離された。ＲＮＡ量と純度は、分光学的手法により決定し、等分して−８０℃で貯蔵した。
【０１１３】
６日目のエレクトロポレーションに先立って、未成熟なＤＣは血清を含まないＸ−ＶＩＶＯ  ２０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、米国）で２回洗浄され、最終濃度２×１０７細胞／ｍｌに再懸濁された。次いで、細胞懸濁液２００μｌを総量１０μｇのＲＮＡと混合し、４ｍｍキュベット中でＥａｓｙｊｅｃｔ  ＰｌｕｓＴＭ（Ｐｅｇｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ、ドイツ）を用いてエレクトロポレーションした（パラメーター：３００Ｖ、１５０μＦ、１５４０Ω、パルス時間２３１ｍｓ）。エレクトロポレーションの後、細胞はすぐにＲＰ１０培地に移され、インキュベーターに戻された。８０％以上の細胞が、エレクトロポレーション後に生存していることが分かった。
【０１１４】
これらの試験結果を図５ａ及び５ｂに示す。図５ａにおいては、配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチドで誘導されたＣＴＬが用いられ、図５ｂにおいては、配列番号２のアディポフィリンペプチドで誘導されたＣＴＬが用いられた。
【０１１５】
ｃ−Ｍｅｔペプチド（配列番号１）で誘導されたＣＴＬ（項目２．４．参照）を用いたＣＴＬアッセイを行った後、ｃ−Ｍｅｔペプチド発現腫瘍細胞株（Ａ  ４９８及びＭＣＦ−７）のＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＤＣの特異的溶解が証明された（図５ａ中の黒く塗られたシンボルの曲線参照）。ｃ−Ｍｅｔペプチド非発現腫瘍細胞株ＣｒｏｆｔのＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＤＣは、溶解しなかった（塗りつぶしていない菱形の曲線参照）。
【０１１６】
配列番号２のアディポフィリンペプチドによって誘導されたＣＴＬは、アディポフィリン発現腫瘍細胞株Ａ  ４９８（図５ｂの黒く塗られた三角の曲線参照）のＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＤＣを溶解した。更に、アディポフィリンペプチド配列番号２と共にパルスされたＤＣは、溶解した（図５ｂの黒塗り菱形の曲線参照）。一方、コントロール（ＥＧＦＰ）ＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＤＣは、溶解しなかった（図５ｂの塗りつぶしていない三角の曲線参照）。
【０１１７】
このように、配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチド又は配列番号２のアディポフィリンペプチド陽性腫瘍細胞のＲＮＡを用いてＤＣをトランスフェクションした後、同定されたペプチド、すなわち配列番号１のｃ−Ｍｅｔペプチド又は配列番号２のアディポフィリンペプチドは処理され、提示されたことが証明された。
【０１１８】
ｅ）  慢性リンパ性白血病患者におけるアディポフィリン特異的ＣＴＬの誘導
更なる研究において、ＨＬＡ−Ａ*０２０１陽性の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者のＰＢＭＮＣからＣＴＬが生じ、これは配列番号２のアディポフィリンペプチドに特異的であった。この患者は、フルダラビンで治療後、症状が軽減した。更に、この患者由来のＣＬＬ細胞及びＤＣが、５１Ｃｒでラベルされる標的としてアッセイで用いられた。このアッセイでは、ペプチドに誘導されるＣＴＬにより５１Ｃｒの放出が媒介される。
【０１１９】
図６に示すように、ペプチドに誘導されるＣＴＬは、自己由来のＣＬＬ細胞（“ＣＬＬ  ｃｅｌｌｓ”）と同様に、配列番号２のアディポフィリンペプチドと共にパルスされたこの患者由来のＤＣ（“ＤＣ＋ＡＤ”）を効果的に溶解した。一方、関係のないペプチド配列番号８０のＳｕｒｖｉｖｉｎを用いてパルスしたＤＣ（“ＤＣ＋ＳＶ”）は、溶解しなかった。悪性でないＢ細胞及び細胞株Ｋ  ５６２も、ＣＴＬによって溶解しなかった。
【０１２０】
ＣＴＬ反応の特異性は、配列番号２のアディポフィリンペプチド又は関係ないペプチド配列番号８０のＳｕｒｖｉｖｉｎと共にパルスされた細胞株Ｔ２（上記参照）を阻害細胞として用いた標的阻害アッセイによって更に確認された。配列番号２のアディポフィリンペプチドによって誘導されたＣＴＬは、対応する配列番号２のペプチドと共にパルスされた過剰量の阻害剤細胞株を溶解し、そのため、５１Ｃｒでラベルされた腫瘍細胞はこの場合には溶解されなかった（図６中の塗りつぶされていない四角の曲線参照）。
【０１２１】
結論として、本発明者らは、同定されたペプチドが、多くの（腫瘍）疾患の免疫療法の分野において、将来有望な物質であることを示した。
【表１】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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