(57)【要約】【課題】腫瘍血管新生の進行を阻害する薬物を提供すること。【解決手段】治療上有効量の、動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を変化させる薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の血管形成を変化させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量の、動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を変化させる薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の血管形成を変化させる方法。
【請求項２】
動脈特異的細胞表面分子が動脈特異的なリガンド又はレセプターであり、かつ静脈特異的細胞表面分子が静脈特異的なレセプター又はリガンドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血管形成が阻害され、かつ薬物が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドと静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとの結合又は相互作用を妨げる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
血管形成が増強され、かつ薬物が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドとその静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとの結合又は相互作用を増強する、請求項３記載の方法。
【請求項６】
薬物が、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドのアンタゴニスト又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターのアンタゴニストである、請求項３記載の方法。
【請求項７】
動脈特異的ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつ静脈特異的ＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
（ａ）薬物、及び
（ｂ）動脈特異的細胞表面分子を結合する成分
を含有した複合体を、（ｂ）成分が動脈特異的細胞表面分子を結合するのに適した条件下で哺乳動物に投与し、それにより該薬物を動脈に送達する工程を含む、哺乳動物の動脈に薬物を選択的に送達する方法。
【請求項９】
動脈特異的細胞表面分子がリガンド又はレセプターである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
薬物が抗血管形成剤であり、かつ（ｂ）成分が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドに特異的な抗体、又は動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドのレセプターである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
動脈特異的ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
薬物が抗血管形成剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
薬物が血管形成剤である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
薬物がアテローム性動脈硬化班の形成を阻害する、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）薬物、及び
（ｂ）静脈特異的細胞表面分子を結合する成分
を含有した複合体を、（ｂ）成分が静脈特異的細胞表面分子を結合するのに適した条件下で哺乳動物に投与し、それにより該薬物を静脈に送達する工程を含む、哺乳動物の静脈に薬物を選択的に送達する方法。
【請求項１７】
静脈特異的細胞表面分子がレセプター又はリガンドである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
静脈特異的細胞表面分子が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
薬物が抗血管形成剤であり、かつ（ｂ）成分が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターに特異的な抗体、又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターのリガンドである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
静脈特異的ＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
薬物が抗血管形成剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
薬物が血管形成剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
動脈細胞で検出可能に発現されるが、静脈細胞では検出可能に発現されない指示遺伝子を有してなるトランスジェニックマウス。
【請求項２４】
指示遺伝子が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド遺伝子に挿入された、請求項２３記載のマウス。
【請求項２５】
遺伝子型がＥｐｈｒｉｎＢ２+/- のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子が全ての動脈を標識するが、静脈を標識しない挿入物を含有してなる、トランスジェニックマウス。
【請求項２７】
遺伝子型がＥｐｈｒｉｎＢ２taulacZ/+ のトランスジェニックマウス。
【請求項２８】
指示遺伝子の発現の検出に適した物質でマウスのセクションを染色する工程を含む、１以上のＥｐｈｒｉｎＢ２対立遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスにおける動脈細胞の同定方法。
【請求項２９】
静脈内皮細胞で発現されるが、動脈内皮細胞では発現されない指示遺伝子を有してなるトランスジェニックマウス。
【請求項３０】
指示遺伝子が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター遺伝子に挿入されている、請求項２９記載のマウス。
【請求項３１】
静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター遺伝子がＥｐｈＢ４をコードする、請求項３０記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３２】
遺伝子型がＥｐｈＢ４+/- のトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
指示遺伝子の発現の検出に適した物質でマウスのセクションを染色する工程を含む、１以上のＥｐｈＢ４対立遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスにおける静脈細胞の同定方法。
【請求項３４】
動脈で特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスに薬物を投与する工程、薬物の作用を観察する工程、及び適切な対照マウスで呈示されたものと作用を比較する工程を含む、動脈の増殖に対する薬物の作用の試験方法。
【請求項３５】
静脈で特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスに薬物を投与する工程、薬物の作用を観察する工程、及び適切な対照マウスで呈示されたものと作用を比較する工程を含む、静脈の増殖に対する薬物の作用の試験方法。
【請求項３６】
ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する分子であって、標識に結合されている分子に組織試料を接触させる工程、及び標識を検出する工程を含み、ここで該標識が細胞で検出されれば、該細胞は動脈細胞である、哺乳動物由来の組織試料中の動脈細胞の同定方法。
【請求項３７】
分子が抗体である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＥｐｈＢ４に結合する分子であって、標識に結合されている分子に組織試料を接触させる工程、及び標識を検出する工程を含み、ここで該標識が細胞で検出されれば、該細胞は静脈内皮細胞である、組織試料中の静脈内皮細胞の同定方法。
【請求項３９】
分子が抗体である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ＥｐｈｒｉｎＢ２を結合する部分に結合された物質を含有した複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の動脈へ物質を導入する方法。
【請求項４１】
ＥｐｈＢ４を結合する部分に結合された物質を含有した複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の静脈へ物質を導入する方法。
【請求項４２】
動脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有した可溶性ポリペプチド、又は静脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有した可溶性ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における血管の発生を変化させる方法。
【請求項４３】
動脈特異的細胞表面タンパク質がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面タンパク質がＥｐｈファミリーレセプターである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）（１）動脈細胞特異的表面分子、
（２）静脈細胞特異的表面分子、及び
（３）（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用に適した条件下で、（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用を阻害する能力の評価対象の薬物
を混合する工程、
（ｂ）（１）の分子と（２）の分子とが相互作用する度合いを決定する工程、並びに
（ｃ）（ｂ）で決定した度合いを、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が、評価対象の薬物の非存在下で、かつ（１）の分子と（２）の分子との相互作用に適した同じ条件下で発生する度合いと比較する工程
を含み、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が薬物の非存在下よりも薬物の存在下の方が度合いが小さい場合、薬物が（１）の動脈細胞特異的分子と（２）の静脈細胞特異的分子との相互作用を阻害するものである、動脈細胞特異的表面分子と静脈細胞特異的表面分子との相互作用を阻害する薬物の同定方法。
【請求項４６】
動脈細胞特異的表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈細胞特異的表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）（１）動脈細胞特異的表面分子、
（２）静脈細胞特異的表面分子、及び
（３）（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用に適した条件下で、（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用を阻害する能力の評価対象の薬物
を混合する工程、
（ｂ）（１）の分子と（２）の分子とが相互作用する度合いを決定する工程、並びに
（ｃ）（ｂ）で決定した度合いを、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が評価対象の薬物の非存在下で、かつ（１）の分子と（２）の分子との相互作用に適した同じ条件下で発生する度合いと比較する工程
を含み、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が薬物の非存在下よりも薬物の存在下の方が度合いが大きい場合、薬物が（１）の動脈細胞特異的分子と（２）の静脈細胞特異的分子との相互作用を増強するものである、動脈細胞特異的表面分子と静脈細胞特異的表面分子との相互作用を増強する薬物の同定方法。
【請求項４９】
動脈細胞特異的表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈細胞特異的表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
動脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、分離した細胞と、動脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質とを接触させる工程、及び該物質を結合した細胞と物質を結合しなかった細胞とを分離する工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５２】
動脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、該細胞と、動脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質であって、固体の支持体に結合されている物質とを接触させる工程、物質に結合しない細胞を除去する工程、並びに固体の支持体から動脈内皮細胞を放出させる工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５３】
静脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、分離した細胞と、静脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質とを接触させる工程、及び該物質を結合した細胞と物質を結合しなかった細胞とを分離する工程を含む、静脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５４】
静脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、組織試料の細胞と、静脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質であって、固体の支持体に結合されている物質とを接触させる工程、物質に結合しない細胞を除去する工程、並びに固体の支持体から静脈内皮細胞を放出させる工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法。
【請求項５５】
単離された動脈内皮細胞。
【請求項５６】
単離された静脈内皮細胞。
【請求項５７】
単離された動脈細胞に１以上の薬物を添加する工程、及び作用について細胞を観察する工程を含む、動脈に対する１以上の薬物の作用の評価方法。
【請求項５８】
細胞が内皮細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
単離された静脈内皮細胞に１以上の薬物を添加する工程、及び作用について細胞を観察する工程を含む、静脈に対する１以上の薬物の作用の評価方法。
【請求項６０】
動脈内皮細胞由来の細胞株。
【請求項６１】
静脈内皮細胞由来の細胞株。
【請求項６２】
動脈で検出可能に産生されるが、静脈で検出可能に産生されないタンパク質を産生する細胞株。
【請求項６３】
静脈で検出可能に産生されるが、動脈で検出可能に産生されないタンパク質を産生する細胞株。
【請求項６４】
単離された動脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー。
【請求項６５】
単離された静脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー。
【請求項６６】
示差的な発現についての試験対象の遺伝子に指示挿入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作製する工程、及び指示挿入遺伝子の発現を観察する工程を含み、静脈内皮細胞及び動脈内皮細胞での指示挿入遺伝子の発現の違いが、示差的な発現を示す遺伝子を表すものである、動脈内皮細胞に比べて静脈内皮細胞において示差的な発現を示す遺伝子の同定方法。
【請求項６７】
単離された動脈内皮細胞を遺伝学的に変化させる工程、及び変化させた細胞を哺乳動物に導入する工程を含む、哺乳動物における動脈の改変方法。
【請求項６８】
単離された静脈内皮細胞を遺伝学的に変化させる工程、及び変化させた細胞を哺乳動物に導入する工程を含む、哺乳動物における静脈の改変方法。
【請求項６９】
動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を変化させる治療上有効量の薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の腫瘍における血管新生を変化させる方法。
【請求項７０】
血管新生が阻害され、かつ薬物が動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を妨げる、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における血管形成の阻害方法。
【請求項７４】
ａ）動脈内皮細胞を単離する工程、
ｂ）単離された細胞からｃＤＮＡを作製する工程、
ｃ）ｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程、
ｄ）単離された動脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリープローブ、及び単離された静脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリープローブを用いてＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ライブラリーをスクリーニングする工程、並びに
ｅ）単離された動脈内皮細胞から作製されたプローブへの示差的なハイブリダイゼーションにより動脈特異的遺伝子を含むクローンを同定する工程
からなる、動脈特異的遺伝子を含むクローンの同定方法。
【請求項７５】
ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインに結合する抗体。
【請求項７６】
ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を変化させる薬物、動脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有した可溶性ポリペプチド、又は静脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有した可溶性ポリペプチド、およびそれらを使用する方法に関する。
【０００２】
関連出願
本件出願は、１９９８年５月２２日に出願された米国特許出願第０９／０８３，５４６号（放棄された）の一部継続出願である、１９９８年５月２８日に出願された米国特許出願第０９／０８５，８２０号の一部継続出願である。本件出願は、１９９８年４月１３日に出願された米国特許暫定出願第６０／０８１，７５７号の利益も主張している。これらの出願のそれぞれの教示は、参照により、全て本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管形成のプロセスは、発生と疾患の両方に必須のものである。循環系は、胚形成の間に発生する最初の器官系であり、発育中の胎児を育てるのに必要なものである。冠状動脈疾患等の循環系の疾患は、現代社会における罹患率及び死亡率の主な原因となっている。従って、血管の増殖を修復し、取り替え、そして促進することは、臨床研究と薬学の発展の主要な目標である。逆に、発生中の腫瘍へ新しい毛細管網状構造が内生増殖することは、癌の進行にとって最も重要なことである。従って、腫瘍血管新生のこの進行を阻害する薬物の開発は、同じ程度に重要な治療目的である。どのようにして動脈と静脈がその性質の異なる独自性を獲得しているのかという問題にはほとんど関心が払われていなかった。事実、多くの人々は、動脈と静脈との間の解剖学的かつ機能的な違いは、血圧、酸素添加及び剪断力等の生理学的な影響を反映しているだけであると決めてかかってきた。どのようにして動脈と静脈がそれぞれの独自性を獲得しているのかというさらなる知識は、研究と臨床環境の両方において貴重なものであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、腫瘍血管新生の進行を阻害する薬物を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
即ち、本発明は、
〔１〕治療上有効量の、動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を変化させる薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の血管形成を変化させる方法、
〔２〕動脈特異的細胞表面分子が動脈特異的なリガンド又はレセプターであり、かつ静脈特異的細胞表面分子が静脈特異的なレセプター又はリガンドである、〔１〕記載の方法、
〔３〕動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、〔１〕記載の方法、
〔４〕血管形成が阻害され、かつ薬物が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドと静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとの結合又は相互作用を妨げる、〔３〕記載の方法、
〔５〕血管形成が増強され、かつ薬物が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドとその静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとの結合又は相互作用を増強する、〔３〕記載の方法、
〔６〕薬物が、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドのアンタゴニスト又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターのアンタゴニストである、〔３〕記載の方法、
〔７〕動脈特異的ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつ静脈特異的ＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、〔３〕記載の方法、
〔８〕（ａ）薬物、及び
（ｂ）動脈特異的細胞表面分子を結合する成分
を含有した複合体を、（ｂ）成分が動脈特異的細胞表面分子を結合するのに適した条件下で哺乳動物に投与し、それにより該薬物を動脈に送達する工程を含む、哺乳動物の動脈に薬物を選択的に送達する方法、
〔９〕動脈特異的細胞表面分子がリガンド又はレセプターである、〔８〕記載の方法、
〔１０〕動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドである、〔８〕記載の方法、
〔１１〕薬物が抗血管形成剤であり、かつ（ｂ）成分が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドに特異的な抗体、又は動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドのレセプターである、〔１０〕記載の方法、
〔１２〕動脈特異的ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２である、〔１０〕記載の方法、
〔１３〕薬物が抗血管形成剤である、〔１２〕記載の方法、
〔１４〕薬物が血管形成剤である、〔１２〕記載の方法、
〔１５〕薬物がアテローム性動脈硬化班の形成を阻害する、〔１２〕記載の方法、
〔１６〕（ａ）薬物、及び
（ｂ）静脈特異的細胞表面分子を結合する成分
を含有した複合体を、（ｂ）成分が静脈特異的細胞表面分子を結合するのに適した条件下で哺乳動物に投与し、それにより該薬物を静脈に送達する工程を含む、哺乳動物の静脈に薬物を選択的に送達する方法、
〔１７〕静脈特異的細胞表面分子がレセプター又はリガンドである、〔１６〕記載の方法、
〔１８〕静脈特異的細胞表面分子が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターである、〔１６〕記載の方法、
〔１９〕薬物が抗血管形成剤であり、かつ（ｂ）成分が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターに特異的な抗体、又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターのリガンドである、〔１８〕記載の方法、
〔２０〕静脈特異的ＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、〔１８〕記載の方法、
〔２１〕薬物が抗血管形成剤である、〔２０〕記載の方法、
〔２２〕薬物が血管形成剤である、〔２０〕記載の方法、
〔２３〕動脈細胞で検出可能に発現されるが、静脈細胞では検出可能に発現されない指示遺伝子を有してなるトランスジェニックマウス、
〔２４〕指示遺伝子が動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド遺伝子に挿入された、〔２３〕記載のマウス、
〔２５〕遺伝子型がＥｐｈｒｉｎＢ２+/- のトランスジェニックマウス、
〔２６〕ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子が全ての動脈を標識するが、静脈を標識しない挿入物を含有してなる、トランスジェニックマウス、
〔２７〕遺伝子型がＥｐｈｒｉｎＢ２taulacZ/+ のトランスジェニックマウス、
〔２８〕指示遺伝子の発現の検出に適した物質でマウスのセクションを染色する工程を含む、１以上のＥｐｈｒｉｎＢ２対立遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスにおける動脈細胞の同定方法、
〔２９〕静脈内皮細胞で発現されるが、動脈内皮細胞では発現されない指示遺伝子を有してなるトランスジェニックマウス、
〔３０〕指示遺伝子が静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター遺伝子に挿入されている、〔２９〕記載のマウス、
〔３１〕静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター遺伝子がＥｐｈＢ４をコードする、〔３０〕記載のトランスジェニックマウス、
〔３２〕遺伝子型がＥｐｈＢ４+/- のトランスジェニックマウス、
〔３３〕指示遺伝子の発現の検出に適した物質でマウスのセクションを染色する工程を含む、１以上のＥｐｈＢ４対立遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスにおける静脈細胞の同定方法、
〔３４〕動脈で特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスに薬物を投与する工程、薬物の作用を観察する工程、及び適切な対照マウスで呈示されたものと作用を比較する工程を含む、動脈の増殖に対する薬物の作用の試験方法、
〔３５〕静脈で特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウスに薬物を投与する工程、薬物の作用を観察する工程、及び適切な対照マウスで呈示されたものと作用を比較する工程を含む、静脈の増殖に対する薬物の作用の試験方法、
〔３６〕ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する分子であって、標識に結合されている分子に組織試料を接触させる工程、及び標識を検出する工程を含み、ここで該標識が細胞で検出されれば、該細胞は動脈細胞である、哺乳動物由来の組織試料中の動脈細胞の同定方法、
〔３７〕分子が抗体である、〔３６〕記載の方法、
〔３８〕ＥｐｈＢ４に結合する分子であって、標識に結合されている分子に組織試料を接触させる工程、及び標識を検出する工程を含み、ここで該標識が細胞で検出されれば、該細胞は静脈内皮細胞である、組織試料中の静脈内皮細胞の同定方法、
〔３９〕分子が抗体である、〔３８〕記載の方法、
〔４０〕ＥｐｈｒｉｎＢ２を結合する部分に結合された物質を含有した複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の動脈へ物質を導入する方法、
〔４１〕ＥｐｈＢ４を結合する部分に結合された物質を含有した複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の静脈へ物質を導入する方法、
〔４２〕動脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有した可溶性ポリペプチド、又は静脈特異的細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含有した可溶性ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における血管の発生を変化させる方法、
〔４３〕動脈特異的細胞表面タンパク質がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面タンパク質がＥｐｈファミリーレセプターである、〔４２〕記載の方法、
〔４４〕ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、〔４３〕記載の方法、
〔４５〕（ａ）（１）動脈細胞特異的表面分子、
（２）静脈細胞特異的表面分子、及び
（３）（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用に適した条件下で、（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用を阻害する能力の評価対象の薬物
を混合する工程、
（ｂ）（１）の分子と（２）の分子とが相互作用する度合いを決定する工程、並びに
（ｃ）（ｂ）で決定した度合いを、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が、評価対象の薬物の非存在下で、かつ（１）の分子と（２）の分子との相互作用に適した同じ条件下で発生する度合いと比較する工程
を含み、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が薬物の非存在下よりも薬物の存在下の方が度合いが小さい場合、薬物が（１）の動脈細胞特異的分子と（２）の静脈細胞特異的分子との相互作用を阻害するものである、動脈細胞特異的表面分子と静脈細胞特異的表面分子との相互作用を阻害する薬物の同定方法、
〔４６〕動脈細胞特異的表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈細胞特異的表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、〔４５〕記載の方法、
〔４７〕ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、〔４６〕記載の方法、
〔４８〕（ａ）（１）動脈細胞特異的表面分子、
（２）静脈細胞特異的表面分子、及び
（３）（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用に適した条件下で、（１）の分子と（２）の分子との間の相互作用を阻害する能力の評価対象の薬物
を混合する工程、
（ｂ）（１）の分子と（２）の分子とが相互作用する度合いを決定する工程、並びに
（ｃ）（ｂ）で決定した度合いを、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が評価対象の薬物の非存在下で、かつ（１）の分子と（２）の分子との相互作用に適した同じ条件下で発生する度合いと比較する工程
を含み、（１）の分子と（２）の分子との相互作用が薬物の非存在下よりも薬物の存在下の方が度合いが大きい場合、薬物が（１）の動脈細胞特異的分子と（２）の静脈細胞特異的分子との相互作用を増強するものである、動脈細胞特異的表面分子と静脈細胞特異的表面分子との相互作用を増強する薬物の同定方法、
〔４９〕動脈細胞特異的表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈細胞特異的表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、〔４８〕記載の方法、
〔５０〕ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、〔４９〕記載の方法、
〔５１〕動脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、分離した細胞と、動脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質とを接触させる工程、及び該物質を結合した細胞と物質を結合しなかった細胞とを分離する工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法、
〔５２〕動脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、該細胞と、動脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質であって、固体の支持体に結合されている物質とを接触させる工程、物質に結合しない細胞を除去する工程、並びに固体の支持体から動脈内皮細胞を放出させる工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法、
〔５３〕静脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、分離した細胞と、静脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質とを接触させる工程、及び該物質を結合した細胞と物質を結合しなかった細胞とを分離する工程を含む、静脈内皮細胞の単離方法、
〔５４〕静脈内皮細胞を含有した組織試料の細胞を分離する工程、組織試料の細胞と、静脈内皮細胞で特異的に発現される細胞表面タンパク質に結合する物質であって、固体の支持体に結合されている物質とを接触させる工程、物質に結合しない細胞を除去する工程、並びに固体の支持体から静脈内皮細胞を放出させる工程を含む、動脈内皮細胞の単離方法、
〔５５〕単離された動脈内皮細胞、
〔５６〕単離された静脈内皮細胞、
〔５７〕単離された動脈細胞に１以上の薬物を添加する工程、及び作用について細胞を観察する工程を含む、動脈に対する１以上の薬物の作用の評価方法、
〔５８〕細胞が内皮細胞である、〔５７〕記載の方法、
〔５９〕単離された静脈内皮細胞に１以上の薬物を添加する工程、及び作用について細胞を観察する工程を含む、静脈に対する１以上の薬物の作用の評価方法、
〔６０〕動脈内皮細胞由来の細胞株、
〔６１〕静脈内皮細胞由来の細胞株、
〔６２〕動脈で検出可能に産生されるが、静脈で検出可能に産生されないタンパク質を産生する細胞株、
〔６３〕静脈で検出可能に産生されるが、動脈で検出可能に産生されないタンパク質を産生する細胞株、
〔６４〕単離された動脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー、
〔６５〕単離された静脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリー、
〔６６〕示差的な発現についての試験対象の遺伝子に指示挿入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作製する工程、及び指示挿入遺伝子の発現を観察する工程を含み、静脈内皮細胞及び動脈内皮細胞での指示挿入遺伝子の発現の違いが、示差的な発現を示す遺伝子を表すものである、動脈内皮細胞に比べて静脈内皮細胞において示差的な発現を示す遺伝子の同定方法、
〔６７〕単離された動脈内皮細胞を遺伝学的に変化させる工程、及び変化させた細胞を哺乳動物に導入する工程を含む、哺乳動物における動脈の改変方法、
〔６８〕単離された静脈内皮細胞を遺伝学的に変化させる工程、及び変化させた細胞を哺乳動物に導入する工程を含む、哺乳動物における静脈の改変方法、
〔６９〕動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を変化させる治療上有効量の薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の腫瘍における血管新生を変化させる方法、
〔７０〕血管新生が阻害され、かつ薬物が動脈特異的細胞表面分子と静脈特異的細胞表面分子との結合又は相互作用を妨げる、〔６９〕記載の方法、
〔７１〕動脈特異的細胞表面分子がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドであり、かつ静脈特異的細胞表面分子がＥｐｈファミリーレセプターである、〔７０〕記載の方法、
〔７２〕ＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドがＥｐｈｒｉｎＢ２であり、かつＥｐｈファミリーレセプターがＥｐｈＢ４である、〔７１〕記載の方法、
〔７３〕ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する薬物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物における血管形成の阻害方法、
〔７４〕ａ）動脈内皮細胞を単離する工程、
ｂ）単離された細胞からｃＤＮＡを作製する工程、
ｃ）ｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する工程、
ｄ）単離された動脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリープローブ、及び単離された静脈内皮細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリープローブを用いてＤＮＡハイブリダイゼーションにより、ライブラリーをスクリーニングする工程、並びに
ｅ）単離された動脈内皮細胞から作製されたプローブへの示差的なハイブリダイゼーションにより動脈特異的遺伝子を含むクローンを同定する工程
からなる、動脈特異的遺伝子を含むクローンの同定方法、
〔７５〕ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインに結合する抗体、
〔７６〕ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに結合する抗体
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、腫瘍血管新生の進行を阻害する薬物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ  １Ａは、Ｅｘｏｎ−１構造を示すＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の野生型遺伝子座の図である。黒塗りのボックスは、５’非翻訳領域を示す。網目がついたボックスはＡＴＧで開始し、シグナル配列を含む。Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｘ＝ＸｂａＩ；Ｎ＝ＮｃｏＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ。  Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｂは、ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子を破壊するのに使用されるターゲティングベクターの図である。  Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｃは、変異ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子座を示す概略説明図である。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ  ２は、ハムスター抗−ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２ハイブリドーマ上清の存在下でのＧＰＩ−ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２へのＥｐｈＢ２Ｆｃの結合活性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の要約
本発明は、動脈細胞（動脈内皮細胞）のタンパク質発現であって、かつ静脈細胞では生じないタンパク質発現に基づき、動脈細胞（動脈内皮細胞を含む）と静脈細胞とを区別する方法、並びに研究及び臨床環境に有用なものを含み、２つの細胞型の間で発現が異なることに基づく、広く多様な工程、方法及び物質の組成物に関する。本明細書に記載されているように、動脈内皮細胞（動脈）と静脈内皮細胞（静脈）との間に分子的な違いがあり、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞は、特に各細胞型を同定し、分離し、標的にし、操作し、又は他の状態に進行させる（他から分離される）ことに使用できる分子マーカーを産することが示されている。結果として、動脈と静脈は、今では互いに区別することができ、動脈と静脈を構成する細胞型を、個々に又は別々に、研究、診断及び治療目的のために、他の遺伝分子学的な違い又は機能的な違いについて評価して標的にし、操作し、又は他の状態に進行することができる。
【０００９】
本発明は、動脈細胞を静脈細胞と区別し分離する方法、さらに詳しくは、動脈内皮細胞を静脈内皮細胞とそれぞれの分子マーカーに基づいて区別し分離する方法；薬物又は薬剤を動脈又は静脈に選択的にターゲティングし或いは送達する方法；動脈特異的な又は静脈特異的な分子マーカーの機能若しくはそれらの間の相互作用を変化させる（増強又は阻害する、ここで、「阻害する」とは、部分的又は完全に阻害することを含む）方法（従って、効果を増強又は阻害することで、かかる機能又は相互作用が動脈内皮細胞又は静脈内皮細胞に生じる）；並びに動脈細胞（より詳しくは、動脈内皮細胞）又は静脈細胞（より詳しくは、静脈内皮細胞）に選択的に作用する薬物についてスクリーニングする方法に関する。
【００１０】
本発明は、動脈細胞分子マーカー又は静脈細胞分子マーカーをコードする遺伝子が、物理的に又は機能的に改変されたトランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、及び特に動脈又は静脈のいずれかを明視化し、改変された分子マーカーの機能を評価し、そしてその機能に影響を与える（増強又は阻害する）薬物を同定するための「指示マウス（indicator mice) 」としてのそれらの使用にも関する。さらに、動脈細胞特異的マーカー又は静脈細胞特異的マーカーを結合する抗体；動脈細胞特異的マーカー又は静脈細胞特異的マーカーをそれぞれ含有し、発現することによって動脈又は静脈を標的とするウイルス又は他のベクター；さらなる動脈特異的又は静脈特異的遺伝子についてスクリーニング対象のライブラリーを調製するのに有用なｃＤＮＡ、並びに単離された動脈内皮細胞由来、静脈内皮細胞由来、又は本発明のトランスジェニック動物（例えば、マウス）由来の不死化細胞株に関する。
【００１１】
動脈細胞又は静脈細胞に対する分子マーカーは、これらの細胞型のうちの一方で発現され、他方で発現されないあらゆる遺伝子産物（タンパク質又はＲＮＡ又はその組み合わせ）である。かかるマーカーは、動脈内皮細胞特異的（動脈特異的）な又は静脈内皮細胞特異的（静脈特異的）な産物又はタンパク質であり得る。特定の態様においては、これらは、それぞれ動脈内皮細胞特異的（動脈特異的）リガンド及び静脈内皮細胞特異的（静脈特異的レセプターと呼ばれ得る。かかる分子マーカーは、動脈又は静脈内皮細胞に加えて細胞型で発現され得るが、動脈及び静脈内皮細胞の両方で発現されない。分子マーカーには、例えば、ｍＲＮＡ、リガンド−レセプター対のメンバー、及び接着タンパク質、転写因子又は両方の細胞型で発現されない抗原等の他のタンパク質が含まれ得る。一つの態様において、前記分子マーカーは、動脈又は静脈に作用する増殖因子に対するレセプターである膜レセプターである。他の態様において、前記分子マーカーは、動脈又は静脈内皮細胞で発現されるが、両方では発現されない内皮細胞表面リガンド−レセプター対のメンバーである。例えば、本明細書で詳細に記載しているように、Ｅｐｈｒｉｎファミリーのリガンドのメンバー及びそのレセプターであるＥｐｈファミリーのレセプターのメンバーは、それぞれ動脈内皮細胞及び静脈内皮細胞に対する分子マーカーであり、２つの細胞型を区別するのに有用なものである。動脈内皮細胞で発現されるが、静脈内皮細胞では発現されない任意のＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドと、動脈内皮細胞特異的リガンドを結合する静脈内皮細胞特異的Ｅｐｈファミリーレセプターとを使用して、動脈と静脈とを区別することができる。
【００１２】
一つの態様において、本発明は、動脈内皮細胞がＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドを発現し、静脈内皮細胞が動脈内皮細胞で発現されるＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドのレセプターであるＥｐｈファミリーレセプターを発現するという知見；動脈細胞（動脈）と静脈細胞（静脈）とを区別又は分離する方法；薬物又は薬剤を動脈又は静脈に選択的に標的にし送達する方法；Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド同種Ｅｐｈファミリーレセプター対のメンバーの少なくとも一つと該方法に有用な薬物の活性を変化する（増加、低減又は延長する）等により、腫瘍における血管新生を含む血管形成を増強又は阻害する方法；並びに動脈又は静脈に選択的に作用する薬物についてスクリーニングする方法に関連している。
【００１３】
さらに、動脈に印を付けるが静脈に印を付けない、ｔａｕ−ｌａｃＺ（ｔｌａｃＺ）挿入物を含むＥｐｈｒｉｎＢ２ノックアウトマウス、又はレポーター構築物（例えば、ｌａｃＺ又はアルカリホスファターゼ遺伝子）をＥｐｈＢ４遺伝子座に含むＥｐｈＢ４ノックアウトマウス等の、Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドをコードする改変遺伝子又はＥｐｈファミリーレセプターをコードする改変遺伝子を有する、トランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、これらのマウスを「指示マウス」として使用して血管形成プロセス（例えば、腫瘍血管新生及び虚血関連心臓新生血管形成）を明確にし、可視化する、又はインビボで動脈又は静脈における血管形成的な又は抗血管形成的な作用について薬物をスクリーニングする方法；並びにトランスジェニックマウス由来の、不死化細胞等の細胞に関連する。本発明は、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーレセプターを結合する抗体（例えば、ＥｐｒｈｉｎＢ２を結合する抗体）；静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプターを結合する抗体（例えば、ＥｐｈＢ４を結合する抗体）；Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又はＥｐｈファミリーレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）をそれぞれコードするＤＮＡを含み、発現することにより、脈管特異的遺伝子治療について動脈又は静脈を標的にするウイルス又は他のベクター；追加の動脈特異的又は静脈特異的遺伝子についてスクリーニング対象のライブラリーを調製するのに有用なｃＤＮＡ（その遺伝子産物は、順番に、動脈特異的又は静脈特異的薬物標的となりうる）、及び単離された動脈もしくは静脈内皮細胞、それら由来の不死化細胞株、又はこれらの細胞から形成された人工血管の移植により、ダメージを受けた動脈又は静脈を修復又は取り替える方法にも関連する。
【００１４】
本明細書に記載され、当業者に公知であるように、Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンドは２つのサブクラス（ＥｐｈｒｉｎＡとＥｐｈｒｉｎＢ）に分類され、Ｅｐｈファミリーレセプターは２つのグループ（ＥｐｈＡとＥｐｈＢ）に分類される。また、公知のように、各サブクラス又はグループ内で、個々のメンバーはアラビア数字で示される。本発明は、具体的にＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４に関して明細書に記載されている。しかしながら、同様の動脈特異的な及び静脈特異的な発現を示す他のＥｐｈｒｉｎファミリーリガンド−Ｅｐｈファミリーレセプター対とそれらの使用も本発明の対象である。同様の動脈特異的及び静脈特異的対は、当業者に公知の方法によって同定することができる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されるように、動脈及び静脈は、胚発生の初期段階から遺伝学的に区別され、動脈と静脈との間の相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）相互作用が正しい脈管形成に必須であることが示されている。この知見は、胚脈管構造の基礎個体発生解剖学についてのわれわれの考え方を劇的に変えるだけでなく、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とを物理的かつ機能的に区別するための手段をも提供する。結果として、２つの細胞型を互いに分離する手段；他の動脈特異的又は静脈特異的遺伝子を同定する手段；動脈又は静脈に対する薬物又は他の薬剤の選択的な作用を評価し、かくして、動脈特異的又は静脈特異的であるものを同定する手段；並びにそれぞれの細胞型に物質を選択的に送達又は標的とする手段も利用できる。さらに、本明細書に記載された研究は、脈管形成及び血管形成を調節（増強又は阻害）する或いは制御を可能にし、必要とあれば、動脈特異的又は静脈特異的な方法でそのようにすること可能にしている。
【００１６】
実施例に記載されているように、神経系及び血管系に存在する細胞膜関連リガンドをコードする遺伝子は成体マウスにおいて動脈内皮細胞で発現され、静脈内皮細胞では発現されないことが示されている。さらに、該リガンドのレセプターをコードする遺伝子は、静脈内皮細胞で発現されるが、動脈細胞では発現されないことが示されている。従って、初め、動脈内皮細胞で見られるマーカー（動脈特異的マーカー）と静脈内皮細胞（静脈特異的）マーカーが利用可能であり、血管形成機構のさらなる研究や理解；動脈又は静脈に対する処置又は治療の選択的ターゲティング（動脈をターゲティングするが逆に静脈をターゲティングしない）並びに動脈及び／又は静脈の形成、増殖及び生存の選択的調節（増強又は阻害）等の様々な目的のために動脈と静脈を区別することを可能にしている。
【００１７】
さらに、実施例にある研究は、動脈と静脈との間の相互のシグナル伝達が管形態形成（動脈と静脈の発生／形成）に非常に重要であることを示す。記載されているように、マウスにおけるリガンドをコードする遺伝子の欠失は、動脈と静脈の両方の血管の正確な発生を妨げた。リガンドは、動脈に存在する（が、静脈に存在しない）ため、静脈欠損の発生は、静脈が管形態発生について動脈からのシグナルを必要としている証拠である。逆に、動脈は変異マウスでも欠損しているため、リガンドは、静脈にシグナル伝達する役割に加えて、動脈細胞自身に機能を有する。動脈内皮細胞に存在するリガンドが膜貫通構造であるという事実を考慮すると、静脈からの相互のシグナルを受けとり、そのシグナルを動脈細胞に変換するように機能するようである。
【００１８】
特に、Ｅｐｈファミリーレセプター相互作用タンパク質のＥｐｈｒｉｎファミリーのメンバーであるリガンド（膜貫通リガンドのＥｐｈファミリー）は、動脈内皮細胞で発現されるが、静脈内皮細胞で発現されないことが示されている。従って、今ではＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドとレセプター型プロテインチロシンキナーゼのＥｐｈファミリーのメンバーであるそのレセプターの存在又は非存在に基づいて、動脈と静脈とを区別又は標的にすることが可能である。本明細書に記載されているように、動脈内皮細胞は、ＥｐｈｒｉｎＢ２を発現することが示され、静脈内皮細胞はＥｐｈｒｉｎＢ２レセプターであるＥｐｈＢ４を発現するこが示されている。ＥｐｈｒｉｎＢ２は静脈内皮細胞で発現されず、ＥｐｈＢ４は動脈内皮細胞で発現されないので、２つ細胞型を同定又は区別することができる手段、及びそれにより、動脈内皮細胞と静脈動脈細胞が、例えば、お互いに分離され得、選択的にターゲティングされ又は選択的な様式（例えば、他方を排除して一方の細胞型に作用する薬物又は薬剤により）で作用され得る方法を提供する。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２に又はその細胞外ドメインに結合する抗体は、蛍光標識したり、細胞の混合物に結合させることができ、次いで、これらを蛍光活性化セルソーティングに供して混合物から動脈の細胞を選択する。
【００１９】
本明細書、特に実施例に記載した研究は、ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４に関連している。しかしながら、いかなるＥｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈファミリー由来のリガンド−レセプター対、いかなる他のリガンド−レセプター対又は１つの細胞型で産生され、もう１つでは産生されないいかなる遺伝子産物（例えば、Ｅｐｈｒｉｎリガンドは動脈内皮細胞で発現されるが、静脈内皮細胞では発現されず、Ｅｐｈレセプターは静脈内皮細胞で発現されるが、動脈内皮細胞で発現されない）をも使用して、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とを区別又は同定し、従って、選択的に作用することができる。
【００２０】
ｅｐｈｒｉｎ（リガンド）には２つの構造型があり、それは配列関係に基づいてさらに分類することができ、機能的には優先的な結合に基づき、それらが２つの類似のレセプターサブグループを示す。構造的には、２つの型のｅｐｈｒｉｎがある：グリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合で膜固定されたものと膜貫通ドメインを経て固定されたもの。慣習的には、リガンドが、ＥｐｈＡレセプターに優先的に結合するＧＰＩ結合タンパク質であるＥｐｈｒｉｎ−Ａサブクラス、と通常、ＥｐｈＢレセプターに優先的に結合する膜貫通タンパク質であるｅｐｈｒｉｎＢサブクラスとに分類される。
【００２１】
Ｅｐｈファミリーレセプターは、エリトロポエチン産生ヒト肝細胞性癌細胞株での発現について名付けられたレセプター、Ｅｐｈに関連するレセプター型プロテインチロシンキナーゼのファミリーである。それらはその細胞外ドメイン配列との関連及びｅｐｈｒｉｎＡタンパク質又はｅｐｈｒｉｎＢタンパク質に優先的に結合する能力に基づいて２つのサブグループに分類される。ｅｐｈｒｉｎＡタンパク質と優先的に相互作用するレセプターはＥｐｈＡレセプターであり、ｅｐｈｒｉｎＢタンパク質と優先的に相互作用するレセプターはＥｐｈＢレセプターである。
【００２２】
本明細書で使用されているように、ＥｐｈｒｉｎとＥｐｈという用語は、それぞれリガンドとレセプターを示すように使用されている。それらは、様々な動物（例えば、哺乳動物／非哺乳動物、ヒトを含む脊椎動物／非脊椎動物）由来ものであり得る。当該分野の名称は急速に変わってきており、本明細書で使用される用語は、Ｅｐｈノーメンクラッチャー・コミッティー（Eph Nomenclature Committee) による研究の結果として提案されているものであり、これはウェブサイトhttp://www.eph-nomenclature.com.で以前から使用されている名称に加えて、アクセスすることができる。便宜上、ｅｐｈレセプターとそのそれぞれのリガンドを表に挙げる。
【００２３】
【表１】
2010053134.tif 000002
【００２４】
本明細書に記載された研究は、下記に論じられる多くのリサーチ及び臨床適用がある。
【００２５】
本明細書で用いられるように、トランスジェニックマウスは、ヒトの操作により、いくつか又は全てのその有核細胞のゲノムに取り込まれた、該マウス又は少なくとも１種のその祖先に導入されている遺伝子改変を有するものである。トランスジェニックマウスは、例えば、妊娠マウス卵へのＤＮＡの導入又は胚性幹細胞へのＤＮＡの導入によりもたらされる。
【００２６】
本発明の１つの態様は、その特定の遺伝子型のため、静脈細胞にのみ又は動脈細胞にのみにおいて、例えば、ＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーションにより、蛍光により、酵素活性の検出により、又は抗体結合と、結合した抗体の検出系とによる遺伝子産物の検出により、そのＲＮＡ転写物又はポリペプチド遺伝子産物が検出されうる遺伝子を発現するトランスジェニックマウスである。
【００２７】
本発明の特定の態様は、遺伝子型ＥｐｈｒｉｎＢ２+/- のトランスジェニックマウスであり、ここで、「マイナス」対立遺伝子は、天然由来の対立遺伝子が、欠失、改変又は指示遺伝子の挿入を有しうる変異対立遺伝子を含む変異対立遺伝子で置換された対立遺伝子を示す。かかる「マイナス」対立遺伝子は、野生型、改変又は非リガンド機能を有するＥｐｈｒｉｎＢ２リガンドをコードしうる。遺伝子型ＥｐｈｒｉｎＢ２+/tlacZ のマウスは、実施例１に記載されるように生産されており、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とが発生の初期段階から遺伝学的に異なること及び血管の２つのタイプ間に、正しい毛細血管床形成に必要な相互の相互作用が生じることを示すのに用いられた。同じ表現型のトランスジェニックマウスは、当業者に公知の他の方法により生産されうる。かかる方法は、例として、ＥｐｈｒｉｎＢ２を用いて下記に示されるが、他のいかなる静脈又は動脈特異的遺伝子に対しても用いられうる。
【００２８】
例えば、前記ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子に挿入、欠失又は１以上の点変異を保持したベクターも産生できる。ＥｐｈｒｉｎＢ２トランスジーンは、ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、米国特許第４，８７３，１９１号明細書（１９８９）の方法により妊娠卵にトランスジーンを導入すること又は胚性幹（ＥＳ）細胞にトランスジーンを導入すること〔例えば、キャペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２、１９８９〕又は他の方法により、突然変異を起こしたＥｐｈｒｉｎＢ２対立遺伝子を保持したベクターを介してゲノムに導入され得る。
【００２９】
トランスジェニックノックアウトマウスを構築するのに用いられるＤＮＡの挿入は、そのなかに、その宿主細胞にＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏなどのその存在がただちに試験され得る遺伝子、を有しうる。それは、ＥｐｈｒｉｎＢ２+/- 指示マウス（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２プロモーターの制御下に、マウスにより内因的に発現しないいかなる遺伝子でもありうる指示遺伝子を発現しうるＥｐｈｒｉｎＢ２+/taulacz の利点である。特に有利な指示遺伝子は、ＥｐｈｒｉｎＢ２発現の検出をしやすくするものであり、恐らく、例えば、その固有の吸光性質、発色産物を生じる基質に作用するその能力又はそれ自体が検出可能である指示物又は色素に結合する能力によって、検出可能な遺伝子産物の生産により、野生型対立遺伝子に生じるものであろう。
【００３０】
さらに、別法は、例えば、酵母の（ｌｏｘＰ部位に作用する）Ｃｒｅ又は（ＦＲＴ部位に作用する）ＦＬＰ１などの部位特異的レコンビナーゼにより、静脈又は動脈において特異的に発現した遺伝子（すなわち、静脈特異的又は動脈特異的遺伝子）の条件付けノックアウト又は組織特異的ノックアウトを産生するのに利用できる。
【００３１】
バクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系は、ＥＳ細胞及びトランスジェニックマウスの両方におけるｌｏｘＰ部位特異的組換えを媒介することができる。部位特異的レコンビナーゼＣｒｅは、予め確立された細胞系において、又は発生のある段階でも用いられうる。例えば、Ｔ細胞からＤＮＡポリメラーゼβ遺伝子セグメントを欠失させた、グ（Ｇｕ，Ｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６、１９９４を参照のこと；Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えが、マウス前頭部における細胞に限定されたツァィエン（Ｔｓｉｅｎ，Ｊ．Ｚ．）ら、Ｃｅｌｌ  ８７：１３１７−１３２６、１９９６も参照のこと）。ついで、これらの細胞における変異の影響を解析する。
【００３２】
Ｃｒｅレコンビナーゼは、３４ｂｐのｌｏｘＰ認識配列〔ザウワー（Ｓａｕｅｒ，Ｂ）及びヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５１６６−５１７０、１９８８〕間の組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、〔「フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）」遺伝子をつくる〕目的の遺伝子の１以上のエキソンに隣接するように相同組換えにより胚性幹細胞のゲノムに挿入される。前記挿入が、遺伝子の正常発現を妨害しないことが非常に重要である。フロックス遺伝子についてマウス同型接合体は、慣用の技術により、これらの胚性幹細胞から産生され、組織型又は細胞型特異的転写プロモーターの制御下に、Ｃｒｅトランスジーンを保持する第２世代マウスと交配させる。フロックス遺伝子について同型であり、Ｃｒｅトランスジーンを保持する子孫において、Ｃｒｅ遺伝子関連プロモーターが活性なこれらの細胞型においてのみ、フロックス遺伝子はＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えにより欠失されるであろう。
【００３３】
静脈特異的又は動脈特異的遺伝子における変異により引き起こされた表現型を模擬する効果を有するように作用するタンパク質をコードした遺伝子も、静脈特異的又は動脈特異的遺伝子におけるノックアウトと同様の効果を達成するのに用いられうる。
【００３４】
レセプターへのリガンドの結合を妨げるか、又はかかる結合の機能重要性を妨げ、それにより静脈又は動脈特異的遺伝子ノックアウト（例えば、ドミナントネガティブ変異体）の表現型を複製する産物をコードする遺伝子における変異がノックアウトへの別法として用いられうる。変異遺伝子は、その機能が阻害されるべきものである組織特異的遺伝子産物に依存して、静脈又は動脈において発現させるべき組織特異的プロモーターの制御下に置かれうる。
【００３５】
さらに、誘導に際して、遺伝子機能の阻害効果を研究することができるように、動脈特異的又は静脈特異的遺伝子の１以上のドミナントネガティブ対立遺伝子が誘導可能なプロモーターの制御下に置かれうる。ドミナントネガティブ変異体は、変異導入及びトランスジェニックマウスを作製する方法により単離又は構築されうる。
【００３６】
所望の変異体又は野生型対立遺伝子を同定するための試験又は他の対立遺伝子を同定するための試験は、適切なプライマーを用いて、単離ゲノムＤＮＡでのＰＣＲ、又は適切なハイブリダイゼーションプローブを用いたサザンブロット、これらの手法の組み合わせ、又は他の方法により行なわれうる。
【００３７】
本明細書の実施例に記載された指示マウスの使用に加えて、動脈細胞にしるしづけすることができる指示遺伝子を有するマウスの使用の１つは、動脈の増殖における薬物の作用を試験する方法である。前記方法は、動脈に特異的に発現される遺伝子に挿入された指示遺伝子を有するマウス（例えば、胚、新生児、未成熟個体、成体、任意の祖先における創傷箇所、腫瘍、虚血病変又は動静脈形成異常）に薬物を投与すること、及び指示遺伝子を有し、該薬物で処理されてないが同一の条件下に維持された適切な対照マウスにおける作用に比較して、動脈の増殖における該薬物の作用を観察することを含みうる。静脈細胞をしるしづけする指示遺伝子を有する指示マウスにおいて、類似の試験を行なってもよい。前記薬物の作用は、例えば、増殖を促進すること、増殖を阻害すること又は異常増殖を促進することでありうる。薬物の投与は、当業者に公知のいかなる適切な経路でもあり得る。
【００３８】
動脈細胞に特異的に発現する遺伝子に挿入された指示遺伝子を有する指示マウスは、血管の増殖及び発生におけるその作用を試験するべきものである遺伝子における変異を保持する他の株のマウスと交配させ、動脈細胞に特異的な変異の作用の容易な可視化を可能にする。前記記載のものに類似した試験において、薬物の作用は、この交配の型から生じたマウスにおいて、例えば、変異の作用が、該薬物により軽減されうるかどうかを見るために、評価されうる。同様に、静脈細胞に特異的に発現する遺伝子に挿入された指示遺伝子を有する指示マウスが、静脈の増殖におけるその作用が評価対象である変異を有するマウスと交配するのに用いられ得、得られたハイブリッドは静脈の増殖の研究に用いられる。
【００３９】
本明細書に記載された研究の結果、細胞表面の動脈特異的又は静脈特異的遺伝子産物の存在を利用することにより、動脈内皮細胞（動脈）及び静脈内皮細胞（静脈）の間を区別することができる。動脈内皮細胞と静脈内皮細胞とは、例えば、哺乳動物組織試料から動脈又は静脈組織を除くこと、物質に結合していない細胞から該物質に結合した細胞を分離することを容易にするある性質又は特性（例えば、標識又はタグを与える分子、又は動脈特異的細胞表面タンパク質及び他の型の分子の両方に親和性を有する分子）を有する物質に細胞を適切な条件下に結合させうる細胞を解離することにより、他の組織型の細胞からそれぞれ単離することができる。細胞の分離は、結合した物質の性質を利用することができる。例えば、前記物質は、動脈内皮細胞に特異的なタンパク質（又は該タンパク質の十分な抗原性部分）に対して生じさせ、かつフルオロクロム、ビオチン又は他の標識で標識した抗体（抗血清、ポリクローナル又はモノクローナル）でありうる。前記物質に結合した細胞の分離は、蛍光標識について蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、ビオチン標識についてストレプトアビジンアフィニティーカラム、他のアフィニティーに基づく分離法又は、例えば、抗体結合磁気ビーズ又は固体支持体によりなされうる。本明細書において用いられる、細胞に関する「単離」とは、細胞が、開始群と比較して、ある細胞型が富化された群となるように他の細胞型から分離されることを示し、１つの細胞型を１００％含む群の場合に限定されない。
【００４０】
他の分離手段が、動脈又は静脈特異的タンパク質をコードする遺伝子における指示挿入物を産する血管細胞に関し利用され得、指示遺伝子産物又は融合タンパク質の部分の性質は、指示挿入物によりコードされる。例えば、緑色蛍光タンパク質部分又は青色蛍光タンパク質部分を有する動脈又は静脈特異的融合タンパク質を産生する細胞は、セルソーターにより非蛍光細胞から分離されうる。動脈又は静脈特異的タンパク質部分と指示タンパク質又は結合活性もしくは酵素活性を有する部分とを有する融合タンパク質を産生する細胞は、融合タンパク質が蛍光物質、例えば、β−ガラクトシダーゼ又はβ−ラクタマーゼの基質に結合する能力あるいは細胞における蛍光産物を産生する能力により検出されうる。
【００４１】
動脈内皮細胞の単離及び静脈内皮細胞の単離は、培地中におけるこれらの細胞型の試験に関して、種々の薬物、増殖因子、リガンド、サイトカイン、Ｅｐｈ及びＥｐｈｒｉｎファミリーのレセプターやリガンドのメンバー、細胞表面タンパク質に結合する分子、又は動脈及び静脈の増殖と発生において作用をもたらしうる他の分子の作用を評価することを可能にする。１以上のこれらの物質を、培地に添加することができ、これらの添加物の作用を（例えば、増殖速度又は生存性の測定、酵素アッセイ、細胞表面成分の存在についてのアッセイ、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質などの高分子への標識前駆体の取り込みなどにより）評価しうる。
【００４２】
単離された動脈内皮細胞又は単離された静脈内皮細胞は、人工増殖培地において維持され得、不死化細胞株は、培地において細胞を効率よく形質転換することが知られているいくつかのウイルスの１つを用いた（例えば、レトロウイルス、ｖ−ｍｙｃ又はＳＶ４０  Ｔ抗原などの不死化オンコジーンの導入による）感染により、かかる単離細胞型それぞれから生産（すなわち「形質転換」）されうる。前記ウイルスは、感染性の種特異性（例えば、マウス細胞に対するネズミエコトロピックウイルス；ヒト細胞に対する両種性又は偽型ウイルス）に関して選択されうる。ウイルスによる形質転換の別法として、細胞は、１以上の増殖因子を含む培地で細胞を増殖させることにより、培地で維持されうる。
【００４３】
静脈細胞又は動脈細胞のいずれか由来の不死化細胞株は、これらの組織のそれぞれにおいて盛んに発現した遺伝子の研究を容易にするためのｃＤＮＡライブラリーの創出に用いられうる。さらに、かかる細胞株を用いて、細胞において発現したタンパク質を、例えば、馴化増殖培地又は細胞自体からタンパク質を精製することにより単離及び同定しうる。
【００４４】
動脈又は静脈起源の不死化細胞株を用いることの１つの別法として、非動脈もしくは非静脈起源（例えば、他の組織由来の内皮細胞、又は繊維芽細胞）の細胞又は細胞株を、（１以上の非内因的に発現した遺伝子の導入により）遺伝学的に改変して、動脈特異的又は静脈特異的細胞表面タンパク質を発現させることができ、レセプター−リガンド相互作用を妨害する物質を検出及び同定する方法に使用されうる。
【００４５】
細胞株への１以上の遺伝子の導入は、１以上の遺伝子の挿入を有するように構築されたベクターを用いて、形質転換、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン又はリポソームによりなされうる。アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、補遺４０までの補遺を含む、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９章、Ｆａｌｌ、１９９７、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。また、細胞株における発現対象の１以上の遺伝子の導入は、ウイルス感染、例えば、レトロウイルスにより達成されうる。レトロウイルス遺伝子転移は、全細胞群に遺伝子をうまく導入するのに用いられており、それによりクローン変異に関連する問題を取り除く。
【００４６】
静脈及び動脈細胞を区別し単離する能力は、広範種々の目的に対する広範種々の応用を可能にする。次に、動脈及び静脈に対する、例えば、薬物、診断薬などの種々の薬剤及び環境／食餌性因子の作用を評価し、観察された作用が、両方の細胞の型に共通であるか一方の細胞型に特異的であるかを決定することができる。
【００４７】
例えば、血管形成及び抗血管形成因子又は薬物が、同等に動脈及び静脈細胞に作用することは、もはや仮定できない。本研究により可能にされた、これらの組織のこれらの細胞型の単離は、動脈又は静脈特異性について、これらの血管形成及び抗血管形成因子を試験することを可能にし、これは、これらの薬物のより選択的な臨床適用を提供するであろう。それは、不死化動脈又は静脈内皮細胞株の高処理量スクリーニングなどによる新規な動脈又は静脈選択的薬物の発見をも可能にするであろう。また、既存の薬物は、ターゲティングデバイス（例えば、リポソーム又はウイルス表面にタンパク質もしくはその細胞外ドメイン部分を有するウイルス賦形剤）として、本明細書に記載のタンパク質を用いることにより、動脈又は静脈にも選択的に標的化し、薬物（例えば、化学結合剤）を一方の型の静脈又は他方に送達する。例えば、動脈特異的薬剤を用いて、動脈の側副枝増殖を促進し、冠状動脈閉塞又は虚血病変を回避しうる。
【００４８】
動脈及び静脈における選択的作用〔血管形成性又は抗血管形成性、血管緊張（ｖａｓｏｔｅｎｓｉｏｎ）に作用する又はアテローム性動脈硬化型斑の形成を阻害する〕について薬剤をスクリーニングする多くのアプローチがある。例えば、化合物又は分子の高処理量スクリーニングは、動脈もしくは静脈に選択的に又はある場合にはその両方に作用する薬剤又は薬物を同定することが行なわれうる。動脈又は静脈細胞におけるそれらの作用に関して評価対象の試験薬剤は、合成により作製された、組換え技術により作製された、又は天然供給源から単離されたいかなる化学物質（エレメント、分子、化合物）でもあり得る。例えば、試験薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、糖類、ホルモン類又はアンチセンス核酸分子などの核酸分子でありうる。また、試験薬剤は、例えばライブラリーに集められた、小分子又はコンビナトリアル・ケミストリーにより作製されたより複雑な分子でありうる。これらのライブラリーは、例えば、アルコール類、ハロゲン化アルキル類、アミン類、アミド類、エステル類、アルデヒド類、エーテル類及び他のクラスの有機化合物を含有しうる。また、試験薬剤は、溶解物又は細胞−−細菌、動物もしくは植物−−の増殖培地から単離された天然産物又は遺伝子工学産物であり得、あるいは細胞溶解物もしくは増殖培地自体でありうる。試験系に対する試験化合物の提示は、特に最初のスクリーニングステップにおいて、単離された型又は化合物の混合物のいずれかでありうる。
【００４９】
スクリーニングされる化合物又は分子（集合的に、薬剤又は薬物という）は、血管形成、抗血管形成活性、抗プラーク活性もしくは血管作用性を有することが既に公知であるもの、又は作用が未知であるものでありうる。公知の作用を有するこれらの薬剤の場合、スクリーニングは、動脈内皮細胞又は静脈内皮細胞に選択的に作用するこれらの薬物を同定するのに有用であろう。未知の作用を有するこれらの薬剤の場合、スクリーニングは、血管形成、抗血管形成活性、抗プラーク活性もしくは血管作用性を有する薬物を新規に同定すること、及びそれらが作用する細胞型（動脈、静脈）を確立するのに有用である。例えば、動脈又は静脈起源の不死化細胞株は、化合物のライブラリーをスクリーニングして、動脈又は静脈特異的薬物作用を有する薬物を同定するのに用いられうる。
【００５０】
１つの態様において、アッセイを行ない、不死化細胞への標識リガンド−Ｆｃ融合タンパク質又はレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の結合の阻害により、ＥｐｈＢ４レセプターへのＥｐｈｒｉｎＢ２の結合などのそのＥｐｈレセプターへのＥｐｈｒｉｎリガンドの結合又はその逆を特異的に阻害する薬物をスクリーニングしうる。一方、かかるライブラリーをスクリーニングし、不死化細胞への標識リガンド−Ｆｃ融合タンパク質又はレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の結合の増強により、そのＥｐｈレセプターへのＥｐｈｒｉｎリガンドの結合を増強するメンバーを同定しうる。ついで、このスクリーニングにより同定された薬物を動物モデル（例えば、癌、動静脈形成異常又は冠状動脈疾患のモデル）で試験して、それらのイン・ビボ活性を評価しうる。
【００５１】
動脈特異的細胞表面分子（例えば、動脈内皮細胞特異的表面分子）と静脈特異的細胞表面分子（例えば、静脈内皮細胞特異的表面分子）との相互作用を阻害する薬物は、例えば、動脈内皮細胞特異的表面分子及び静脈内皮細胞特異的表面分子を、細胞特異的分子間の相互作用に適した条件下で、該細胞特異的分子間の相互作用の阻害能力の評価対象薬物と混合する方法で同定しうる。細胞特異的分子は、両者が懸濁物中のインタクト細胞（例えば、単離された動脈もしくは静脈内皮細胞、これら由来の不死化細胞、又は動脈もしくは静脈特異的細胞表面分子を発現するように改変された細胞）に見出されるように、本アッセイにおいて用いられてもよい；一方の細胞型は個体支持体に固定され、他方の細胞型に特異的な他の分子は可溶型で適切な溶液中に存在する；あるいは、他方の細胞型に特異的な分子は、細胞特異的分子の相互作用を可能にする溶液中において遊離していることが見出されるが、一方の細胞型に特異的な分子は固体支持体に固定される。他の変法は、２つの異なる細胞特異的分子間の相互作用の簡便な評価を可能にしうる。
【００５２】
本アッセイのさらなるステップにおいて、前記薬物の存在下に、及び別の試験（対照）において、薬物の非存在下に、細胞特異的分子が相互作用する度合いを決定する。細胞特異的分子の相互作用が評価対象薬物の存在下及び非存在下に生じる度合いを比較する。細胞特異的分子の相互作用が生じる度合いが、薬物の非存在下よりも薬物の存在下のほうが、より少ない場合、該薬物は、動脈内皮細胞特異的分子と静脈内皮細胞特異的分子との相互作用を阻害するものである。細胞特異的分子の相互作用が生じる度合いが、薬物の非存在下よりも薬物の存在下のほうが、より多い場合、該薬物が、動脈内皮細胞特異的分子と静脈内皮細胞特異的分子との相互作用を増強するものである。
【００５３】
２つの細胞表面分子、動脈に特異的な一方のものと静脈に特異的な他方のものとの相互作用（例えば、リガンドとそれを認識するレセプターとの結合；接着タンパク質間の相互作用；細胞表面タンパク質と細胞表面の炭水化物部分との間の相互作用）を妨害する物質を同定するアッセイの１つの態様において、細胞表面分子（例えば、静脈由来細胞株又はＥｐｈレセプターを発現するように遺伝子操作された他の細胞などのＥｐｈレセプターを発現する細胞）を、標識リガンド（例えば、ｅｐｈｒｉｎリガンド、その可溶性部分、又は細胞外ドメインとＩｇＧのＦｃドメインとの融合物などの可溶性融合タンパク質）か又は標識リガンドプラス試験化合物もしくは試験化合物群かのいずれかと接触させる。細胞に結合している標識リガンドの量を決定する。前記試験化合物（群）と接触させた試料における標識のより少ない量（ここで、該標識は、例えば、放射活性アイソトープ、蛍光又は発色性標識でありうる）は、該試験化合物（群）が結合を妨害することの指標である。リガンド（例えば、Ｅｐｈｒｉｎリガンド又はその可溶型）を発現する細胞を用いる相互アッセイを用いて、レセプター又はその可溶性部分の結合を妨害する物質を試験しうる。
【００５４】
動脈特異的及び静脈特異的細胞表面タンパク質間の相互作用を妨害する物質を同定するアッセイは、固体支持体と結合した、試験化合物と競合しない成分（例えば、細胞、融合タンパク質及び結合活性を有する部分を含む精製タンパク質）を用いて行なわれ得る。固体支持体は、いかなる適切な固相；ビーズ、プレートの壁もしくは他の適切な表面（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）などのマトリックス；カラム孔ガラス（ＣＰＧ）又はウェル中などの溶液内に沈めることができるピンでもありうる。固体支持体への細胞又は精製タンパク質の結合は、直接又は１以上のリンカー分子を介するものでありうる。
【００５５】
哺乳動物からの動脈特異的又は静脈特異的タンパク質を発現する遺伝子の単離に際して、該遺伝子は、組換えタンパク質又は融合タンパク質の生産のための発現系に取り込まれ、その後、単離及びイン・ビトロでの該タンパク質の試験が行なわれうる。また、単離又は精製タンパク質は、タンパク質に特異的に結合する薬剤のデザインを可能にするさらなる構造的研究に用いられ得、該タンパク質のレセプター又はリガンド活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる。
【００５６】
１つの態様において、単離又は精製動脈特異的もしくは静脈特異的タンパク質は、化学架橋又は単離もしくは精製タンパク質に対して生じさせた抗体を介するものなどの標準技術により、適したアフィニティーマトリックスに固定化し、固体支持体に結合させうる。前記マトリックスを、カラム又は他の適切な容器に充填することができ、タンパク質への該化合物の結合に適した条件下に、試験対象の１以上の化合物（例えば、混合物）と接触させる。例えば、化合物含有溶液は、マトリックスを介して流れるようになされうる。前記マトリックスは、適切な洗浄緩衝液を用いて洗浄して、非結合化合物及び非特異的結合化合物を除くことができる。結合したままの化合物は、適切な溶離緩衝液により、遊離されうる。例えば、溶離緩衝液のイオン強度又はｐＨにおける変化は、化合物の遊離を導きうる。一方、溶離緩衝液は、遊離成分又は化合物の結合を破壊するようにデザインされた成分（例えば、適切な１以上のリガンドもしくはレセプター、あるいは結合を破壊しうるか又はタンパク質への試験化合物の結合を競合的に阻害しうるそのアナログ）を含有しうる。
【００５７】
本法の他の態様に用いるために、天然に見出されるようなタンパク質において存在しない第２の部分に連結した動脈特異的もしくは静脈特異的タンパク質の全部又は一部を含有した融合タンパク質を調製しうる。この目的のために適した融合タンパク質としては、第２の部分がアフィニティーリガンド（例えば、酵素、抗原、エピトープ）を含有するものが挙げられる。融合タンパク質は、動脈もしくは静脈細胞に特異的に発現される遺伝子又はその一部を、アフィニティーリガンドをコードする適切な発現ベクターに挿入することにより産生されうる。発現ベクターは、発現に適した宿主細胞に導入されうる。宿主細胞を破砕し、アフィニティーマトリックスへの融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分の結合に十分な条件下に、該細胞材料とアフィニティーマトリックスとを接触させることにより、融合タンパク質を含む細胞材料を適切なアフィニティーマトリックスに結合しうる。
【００５８】
本態様の１つの概念において、融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分をマトリックスに結合するに十分な条件下に、融合タンパク質を適切なアフィニティーマトリックスに固定化し得、結合した融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への化合物の結合に適した条件下に、融合タンパク質を試験対象の１以上の化合物（例えば、混合物）に接触させうる。ついで、結合融合タンパク質を有するアフィニティーマトリックスを適切な洗浄緩衝液で洗浄し、特異的に結合した化合物の結合を顕著に破壊することなく、非結合化合物及び非特異的結合化合物を除去しうる。結合したままの化合物を、それに結合した融合タンパク質を有するアフィニティーマトリックスと適切な溶離緩衝液（化合物溶離緩衝液）とを接触させることにより遊離しうる。この概念において、化合物溶離緩衝液は、アフィニティーマトリックスにより融合タンパク質を保持することを可能にするように調製され得るが、融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への試験された化合物の結合を妨害するように調製されうる。例えば、溶離緩衝液のイオン強度又はｐＨにおける変化は、化合物の遊離を導き、あるいは該溶離緩衝液が、遊離成分又は融合タンパク質のレセプターもしくはリガンドタンパク質部分への化合物の結合を破壊するようにデザインされた成分（例えば、１以上のリガンドもしくはレセプター又は融合タンパク質のレセプターもしくはリガンドタンパク質部分への化合物の結合を破壊しうるそのアナログ）を含有しうる。
【００５９】
固定化は、適宜、融合タンパク質を化合物に接触させる前、同時に又は後に行いうる。試験される化合物、選択される親和性マトリックス及び溶離緩衝液の組成などの要因によって方法の種々の変更が可能である。例えば、洗浄工程の後、化合物が結合した融合タンパク質を、適当な溶離緩衝液（マトリックス溶離緩衝液）により親和性マトリックスから溶離することができる。融合タンパク質が、トロンビン切断部位などの切断可能なリンカーを有する場合、親和性リガンドからの切断により、化合物が結合した融合タンパク質の一部分が放出されうる。結合した化合物は、次いで、抽出などの適当な方法により融合タンパク質又はその切断産物から放出されうる。
【００６０】
該方法により一種以上の化合物を同時に試験しうる。化合物の混合物を試験する場合、先述の方法により選択される化合物を、（適宜）分離し、適当な方法（例えば、ＰＣＲ、シークエンシング、クロマトグラフィー）により同定しうる。コンビナトリアル・ケミストリーによる合成又はその他の方法により製造される化合物（例えば有機化合物、ペプチド、核酸）のラージ・コンビナトリアル・ライブラリー（Large combinatorial library ）を試験しうる（例えば、Ohlmeyer, M.H.J.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-110926 (1993)  及びDeWitt, S.H.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993) これらは標識化合物に関する；又、Rutter, W.J.ら、米国特許第5,010,175 号公報； Huebner, V.D.ら、米国特許第5,182,366 号公報；及び Geysen,H.M.、米国特許第4,833,092 号公報参照のこと）。本発明の方法によってコンビナトリアル・ライブラリーから選択された化合物が特有の標識を有する場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。化合物が標識を有しない場合、例えば、クロマトグラフィーによる分離、続いて構造を確認するための質量分光測光分析を、該方法によって選択された個々の化合物を同定するのに使用することができる。
【００６１】
動脈又は静脈に対して選択的に作用する薬物を同定するのに有用なインビボアッセイも利用可能である。それは、本明細書に記載されているようなトランスジェニック動物を用いて行われ、それにより血管形成のプロセスを可視化することが可能になる。例えば、動脈はすべてマーキングするが静脈はしないｔａｕ−ｌａｃＺ挿入物などのマーカーを含有するＥｐｈｒｉｎＢ２ノックアウトマウスを、種々のインビボアッセイに使用することができる。使用しうる他のマーカー遺伝子は、例えば、アルカリホスファターゼ、ブルー蛍光タンパク質又はグリーン蛍光タンパク質を発現する遺伝子である。マウス又はそれが含有する標的対立形質を、静脈とは独立して、動脈における腫瘍血管形成及び虚血関連性心臓新生血管形成などの血管形成のプロセスを研究するのに使用しうる。例えば、腫瘍細胞を指示マウスに移植することができ、腫瘍内での動脈血管増殖をｌａｃＺ染色により可視化することができる。あるいは、標的対立形質を有するマウスを、血管変性又は新生血管形成などの別の状態のマウスモデルと交雑させて、可視化することができる。該プロセスの動脈特異的局面を、ｌａｃＺ染色により視覚的にモニターすることができる。このタイプのインジケーターも、薬物の血管形成作用又は抗血管形成作用を評価するのに使用することができる。
【００６２】
動脈内皮細胞（動脈）により特異的に産生されるが他の細胞型によっては産生されない遺伝子産物は、薬物、診断薬剤、タグ用標識、組織学的染色、又は他の物質の、動脈への特異的ターゲティングを可能にする。同様に、静脈内皮細胞（静脈）により特異的に産生されるが他の細胞型によっては検出可能に産生されないと同定された遺伝子産物は、薬物、診断薬剤、タグ用標識、組織学的染色、又は他の物質の、静脈への特異的ターゲティング及び送達を可能にする。ターゲティングビヒクル、標的薬剤及び方法の以下の記載は、動脈内皮細胞により産生されるが静脈細胞によっては産生されない遺伝子産物の例としてＥｐｈｒｉｎＢ２を、静脈内皮細胞により産生されるが動脈細胞によっては産生されない遺伝子産物の例としてＥｐｈＢ４を用いて示される。しかしながら、この記載は、これらの組織の型を同定するのに使用しうる他の動脈特異的遺伝子産物及び静脈特異的遺伝子産物に対しても充分に等しくあてはまる。
【００６３】
動脈におけるＥｐｈｒｉｎＢ２及び静脈におけるＥｐｈ４の示差的発現は、薬物、診断薬剤、画像形成剤（imaging agent ）、又は他の物質の動脈若しくは静脈の細胞への特異的ターゲティングを可能にする。ターゲティングビヒクルは、かかる物質の送達に使用することができる。ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈ４に特異的に結合するターゲティングビヒクルは、動脈又は静脈のそれぞれの細胞に送達される物質に結合しうる。該結合は、一以上の共有結合を介して、又は高親和性の非共有結合により形成されうる。ターゲティングビヒクルは、例えば、抗体、又は高い特異性でＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈ４のいずれかに結合する他の化合物でありうる。別の例は、Ｅｐｈ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する水溶性のポリぺプチド、又は該細胞外ドメインの充分な部分（若しくは、ＥｐｈｒｉｎＢ２への特異的な結合を可能にするに充分類似するコンフォメーションを与えるアミノ酸配列を有するポリペプチド）であり、それらは、動脈内のＥｐｈｒｉｎＢ２に物質を送達するためのターゲティングビヒクルとして使用しうる。同様に、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する可溶性のポリぺプチド、又は該細胞外ドメインの充分な抗原性部分（若しくは、Ｅｐｈ４への特異的な結合を可能にするに充分類似するコンフォメーションを与えるアミノ酸配列を有するポリペプチド）は、静脈内のＥｐｈ４に物質を標的化するのに使用しうる。
【００６４】
動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又は静脈特異的Ｅｐｈレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）に特異的なターゲティングビヒクルは、インビボ（例えば、治療的及び診断的）適用を有する。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２に特異的に結合する抗体は、動脈に標的化される薬物（例えば、抗プラーク剤などの治療剤）に結合しうる。あるいは、ＥｐｈＢ４に特異的に結合する抗体は、薬物を静脈に標的化するのに使用しうる。インビボで検出（例えば、標識）しうる物質（例えば、放射活性物質）も、動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）に特異的に結合するターゲティングビヒクルに結合することができ、コンジュゲートは、動脈を同定するための標識剤として使用しうる。同様に、検出可能な標識は、静脈特異的Ｅｐｈレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）に特異的に結合するターゲティングビヒクルに結合して静脈を同定することができる。
【００６５】
ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に特異的なターゲティングビヒクルには、さらにインビトロ適用が見出されている。例えば、ＥｐｈＢ４に特異的に結合する抗体（ポリクローナル又はモノクローナル調製物）などのＥｐｈＢ４特異的ターゲティングビヒクルを、組織試料（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）のための染色剤として使用することができる物質に結合することができ、試料中の静脈の同定法が提供される。同様に、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を、動脈の同定において使用することができる。例えば、腫瘍由来又は小児若しくは成人における動静脈形成異常由来としての生検組織試料において、ＥｐｈｒｉｎＢ２若しくはＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外ドメインに対する抗体を、動脈組織を同定するため、及び静脈組織と区別するために使用することができる。
【００６６】
形成異常で、痛みを伴うか又は美容的に望ましくない静脈を処理するため、それらに対して作用する薬剤（例えば、抗血管形成因子）を、静脈への局所投与のためにＥｐｈＢ４特異的ビヒクルに結合させることができる。例えば、抗血管形成因子を拡張蛇行静脈内に注射することができる。
【００６７】
動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）のいずれかに指向する標的薬剤も、動脈と静脈の両方に対する作用を生み出すことが望まれる場合に使用しうる。例えば、抗血管形成薬剤と、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥｐｈＢ４のいずれか又は両方に対するターゲティングビヒクルとを含有する標的薬剤の限定された量を、腫瘍形成の部位又は望ましくない新生血管形成の部位などの、血管の増殖を阻害することが望まれる血管形成の部位に、並びに血管の増殖及び確立を増強するために血管新生の増加が望まれる領域に局所的に投与することができる。
【００６８】
動脈特異的Ｅｐｈｒｉｎファミリーリガンド（例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２）又は静脈特異的Ｅｐｈファミリーレセプター（例えば、ＥｐｈＢ４）のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する物質を、血管形成剤又は抗血管形成剤として使用することができる。これらの分子を標的化する薬物は、動脈及び静脈の血管形成に選択的に作用する。例えば、ＥｐｈｒｉｎＢ２又はＥｐｈＢ４に対するモノクロナール抗体は、動脈特異的若しくは静脈特異的な血管形成又は抗血管形成剤として役立ちうる。ＥｐｈｒｉｎＢ２機能を妨害する薬物（例えば、ブロッキング抗体）を治療の抗血管形成法において使用することができる。ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ ／ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ 変異マウスにより示される表現型から結論づけられるように、ＥｐｈｒｉｎＢ２のアンタゴニスト又はＥｐｈＢ４のアンタゴニストは、血管形成を阻害する。ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の両方のアゴニストである薬剤は、血管形成を促進する。
【００６９】
別の例において、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合したＥｐｈｒｉｎファミリーリガンドの細胞外ドメイン又はＥｐｈファミリーレセプターの細胞外ドメインを含有する可溶性アゴニストを作製することができる。例えば、膜タンパク質の細胞外ドメインがヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合した、ＥｐｈＢ４又はＥｐｈｒｉｎＢ２のハイブリッドタンパク質を使用することができる（Wang, H.U.及びD.J.Anderson, Neuron 18:383-396(1997)）。方法の例については、クラスター形成したＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１／Ｆｃ融合タンパク質に対する細胞の応答に関する実験に関するStein, E. ら、Genes and Dev. 12:667-678(1998)を参照のこと。これらのハイブリッド分子の抗ヒトＦｃ抗体とのクラスター形成は、可溶性アゴニスト：Ｅｐｈレセプターに対するＥｐｈｒｉｎ由来「リガンド体（ligand-bodies ）」を生じ、逆に、Ｅｐｈｒｉｎに対するＥｐｈ由来「レセプター体」を生じる。これらのハイブリッド分子の非クラスター形成形態をアンタゴニストとして使用することができる。
【００７０】
単離された動脈内皮細胞及び単離された静脈内皮細胞のさらなる適用は、単離された細胞の遺伝的改変、及びこれらの細胞の、該細胞が単離された宿主哺乳動物への、又は該細胞が適当な種類の血管に取り込まれうる別の適合可能な宿主内への投与、好ましくは静脈内投与である。このようにして、動脈又は静脈に現れる遺伝的欠損の影響は改善されうる。循環する内皮細胞前駆体は、新生血管形成の部位に移動し、かつ血管に取り込まれうるということが示されている（Asahara ら、Science 275:964-967 (1997)）。
【００７１】
遺伝子（例えば、変化させた内在性遺伝子、又は由来は異なる生物体から単離した遺伝子）の細胞への導入は、いくつかの公知の技術のいずれか、例えば、両種性レトロウイルスによるものなどのようなベクター介在性遺伝子輸送、リン酸カルシウム、又はリポソーム融合によっても行いうる。
【００７２】
宿主哺乳動物において動脈又は静脈に作用を有することを意図した遺伝子を、単離された動脈細胞又は単離された静脈細胞に、目的の遺伝子をコードする核酸配列を一種以上含有するウイルスベクターの使用により輸送することができる。一般に、該核酸配列は、ウイルスベクターのゲノムに組み込まれている。インビトロでは、該遺伝子をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを細胞と接触させることができ、感染が起こりうる。次いで、細胞を、例えば、インビトロでの動脈又は静脈細胞の増殖に対する該遺伝子の作用を研究するために実験的に使用することができ、あるいは該細胞を治療的使用のために患者に移植することができる。遺伝子の導入又は置換により変化する細胞は、患者から得られる生物学的試料中に存在し、かつ疾患の治療において使用することができ、あるいは、細胞培養物から得られ、かつインビボ及びインビトロ系における動脈及び静脈の発生経路を詳細に分析するのに使用できる。
【００７３】
目的の遺伝子をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターとの接触後、処理された動脈又は静脈細胞を、当業者に知られた方法に従って患者に戻すか、又は再投与することができる。かかる治療方法は、エクスビボ治療と呼ばれる場合がある。エクスビボ遺伝子治療は、例えば、Kasid ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:473 (1990) ； Rosenbergら、New Engl. J. Med. 323:570 (1990)； Williams ら、 Nature 310476 (1984) ；Dickら、Cell 42:71 (1985) ； Keller ら、 Nature 318:149 (1985)；及びAndersonら、米国特許第5,399,346 号公報（1994）に記載されている。
【００７４】
一般に、治療的及び実験的に使用されうるウイルスベクターが当該技術分野において知られている。例としては、Srivastava, A.、米国特許第5,252,479 号公報（1993）； Anderson, W.F. ら、米国特許第5,399,34６号公報（1994）；Ausubel ら、"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc.(1998) に記載されたベクターが挙げられる。核酸の細胞への送達のための適切なウイルスベクターとしては、例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）及びコロナウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、ニワトリ白血病−肉腫、哺乳類Ｃ型、Ｂ型ウイルス、レンチウイルス（Coffin, J.M., "Retroviridae: The Viruses and Their Replication", In: Fundamental Viology、第３版、B.N. Fields ら編、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, (1996) ）が挙げられる。感染力のメカニズムは、ウイルスベクター及び標的細胞によって異なる。例えば、ＨｅＬａ細胞のアデノウイルス感染力は、ウイルス表面レセプターへの結合、続いてレセプター媒介性エンドサイトーシス及び染色体外複製によって生じる（Horwitz, M.S.,"Adenoviruses" In: Fundamental Virology 、第３版、B.N. Fields ら編、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, (1996) ）。
【００７５】
本発明を、何ら限定することを意図しない以下の実施例により説明する。
【実施例】
【００７６】
実施例
実験方法
以下の実験方法を、以下の実施例において使用した。
【００７７】
ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の標的破壊。マウスＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子のＡＴＧから開始する２００塩基対プローブ（Bennett, B.D. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1866-1870 (1995) ）を、１２９ＳＶＪゲノムライブラリー（Stratagene）をスクリーニングするのに使用した。いくつかのオーバーラップクローンの解析により、シグナル配列を含む第一エキソンがＡＴＧの１３１塩基対後方で終結することが明らかになった。さらに、ファージ解析及びライブラリースクリーニングにより、ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の残部は第一エキソンから少なくとも７塩基対下流に位置することが明らかになった。ターゲティングベクター（Ｆｉｇ．１Ｂ）を構築するため、その３’末端がＡＴＧで終結する３ｋｂのＸｂａＩ−ＮｃｏＩ断片を５’アームとして使用した。５．３ｋｂのＴａｕ−ｌａｃＺコーディング配列（Mombaerts, P. ら、 Cell 87:675-686 (1996) ）をＡＴＧ後方にインフレームで融合した。ＰＧＫｎｅｏ遺伝子（Ma, Q.ら、Neuron 20:469-482 (1998)）を用いて、第一エキソンの３’側の２．８ｋｂのイントロン配列を置き換えた。最後に、３．２ｋｂ下流ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を３’アームとして使用した。正常な（６ｋｂ）及び標的（９ｋｂ）遺伝子座は、１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩゲノム断片でプロービングするとＨｉｎｄＩＩＩ消化により区別される。エレクトロポレーション、選別及びＡＢ−１  ＥＳ細胞の胚盤胞注入を、ＦＩＡＵ選別を省いたこと以外は、本質的に、Ma, Q.ら（Neuron 20:469-482 (1998)）に記載のようにして行なった。Ｇ４１８選別を介するＥＳ細胞ターゲティング効率は、１８クローンのうち１クローンであった。ヘテロ接合性雄におけるＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子座（Ｆｉｇ．１Ｃ）の生殖系列伝達は、１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩプローブを用い、成体マウスのテイルＤＮＡのサザンブロッティングにより確認された。続く遺伝子型分類（genotyping）を、ゲノムＰＣＲにより行なった。Ｎｅｏに対するプライマーは、
5'-AAGATGGATTGCACGCAGGTTCTC- 3' （配列番号：１）及び
5'-CCTGATGCTCTTCGTCCAGATCAT- 3' （配列番号：２）である。置き換えたイントロンの断片に対するプライマーは、
5'-AGGACGGAGGACGTTGCCACTAAC- 3' （配列番号：３）及び
5'-ACCACCAGTTCCGACGCGAAGGGA- 3' （配列番号：４）である。
【００７８】
ＬａｃＺ、ＰＥＣＡＭ−１及び組織学的染色。胚嚢及び卵黄嚢を、Ｅ７．５とＥ１０．０との間で取り出し、冷却した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定し、ＰＢＳで２回リンスし、Ｘ−ｇａｌ緩衝液（ＰＢＳ中、１．３ｍｇ／ｍｌのフェロシアン化カリウム、１ｍｇ／ｍｌのフェリシアン化カリウム、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、及び１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］、ｐＨ７．２）中で１時間から一晩３７℃で染色した。ＬａｃＺで染色した胚を後固定し、写真撮影し、又はＰＢＳ中の１５％スクロース及び７．５％ゼラチンに包埋した後クリオスタット上で薄切した。抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（クローンＭＥＣ１３．３、Pharmingen）による全体（whole mount ）又は切片染色のための方法は、本質的に、Maら（Neuron 20:469-482 (1998)；Fongら、 Nature 376:66-70 (1995)）に記載のようにして行なった。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体をすべてのＰＥＣＡＭ−１染色に使用した。ＬａｃＺで染色した卵黄嚢をゼラチン中で薄切した後、標準的な方法によってヘマトキシリン対比染色に供した。
【００７９】
インサイチューハイブリダイゼーション。凍結切片でのインサイチューハイブリダイゼーションを、先に記載（Birrenら Development 119:597-610 (1993) ）のようにして行なった。全体インサイチューハイブリダイゼーションは、Wilkinson, D.G. （Whole-mount in situ hybridization of vertebrate embryos. pp.75-83 In: In Situ Hybridization: A Practical Approach (ed. D.G. Wilkinson) IRL Press, Oxford: 75-83 (1992)）によるプロトコルに従った。ＥｐｈＢ２／Ｎｕｋ及びＥｐｈＢ４／Ｍｙｋ−１のｃＤＮＡを含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Stratagene）を、Wang, H.U.及びAnderson, D.J.（Neuron 18:383-396(1997) ）に記載のようにして作製した。
【００８０】
実施例１：マウスにおけるＥｐｈｒｉｎＢ２の標的変異誘発
ＥｐｈｒｉｎＢ２遺伝子の標的破壊を、胚幹細胞における相同組換えにより行なった。ターゲティング計画は、シグナル配列を除去すること及びフレーム内のＴａｕ−ｌａｃＺ指示遺伝子と開始コドンとをインフレームで融合することを含んだ。ヘテロ接合性（ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ/+ ）胚におけるβ−ガラクトシダーゼの発現パターンは、内在性遺伝子について先に報告されたものと見分けがつかない（Bennett, B.D. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1866-1870 (1995)；Bergemann, A.D. ら、Mol. Cell. Bio. 1995:4921-4929 (1995) ；Wang, H.U. and Anderson, D.J. Neuron 18:383-396 (1997)）。菱脳及び体節(somites) において顕著な発現が検出されたが、早くもＥ８．２５で、より低レベルが大動脈及び心臓において観察された。卵黄嚢における発現は、まずＥ８．５で検出された。ヘテロ接合性動物は、表現型としては正常のようであった。ヘテロ接合性胚において、増殖遅滞がＥ１０で明白であり、Ｅ１１あたりで１００％の浸透度で致死が生じた。内在性ＥｐｈｒｉｎＢ２  ｍＲＮＡの発現は、インサイチューハイブリダイゼーションによって検出されず、これは、変異がヌルであることを示す。体節極性(somite polarity) 、菱脳分割(segmentation)、及び神経冠移動の体節性パターン化（ここで、ＥｐｈｒｉｎＢ２及び関連リガンドは、以前に、Xu, W.ら、Development 121:4005-4016 (1995)；Wang, H.U. and Anderson, D.J. Neuron 18:383-396 (1997)；Krull, C.E. ら、 Curr. Biol. 7:571-580 (1997) ；Smith, A. ら、 Curr. Biol. 7:561-570 (1997) に暗示されている）は、ヘテロ接合性変異胚において、肉眼的には正常のようであった。
【００８１】
実施例２：動脈及び静脈におけるＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４の相互発現パターン
死につつある変異胚において観察された肥大(enlarged)心臓は、血管系におけるＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ の発現の詳細な検査を促した。発現は、動脈においては一貫して観察されたが、静脈においては観察されなかった。例えば、卵黄嚢においては、卵黄動脈にはつながっているが卵黄静脈にはつながっていない後血管(posterior vessels) は、該遺伝子を発現し、それはＬａｃＺ染色により検出された。幹(trunk) において、標識は、背側大動脈、卵黄動脈、臍動脈、及びその尿嚢脈管叢において検出されたが、臍静脈、前主静脈及び総主静脈（臍静脈は抗ＰＥＣＡＭ−１抗体で標識される）においては検出されなかった。頭部において、標識は、内頸動脈の分枝においては見られたが、前主静脈の分枝においてはみられなかった。ＥｐｈｒｉｎＢ２  ｃＤＮＡプローブとのインサイーチューハイブリダイゼーションにより、動脈におけるｔａｕ−ｌａｃＺの選択発現は、内在性遺伝子の発現パターンを正確に反映することが確認された。ＥｐｈｒｉｎＢ２のレセプターである４種のＥｐｈＢファミリー遺伝子並びにＥｐｈ  Ａ４／Ｓｅｋ１（Gale, N.W.ら、 Neuron 17:9-19 (1996)）の発現の検査により、動脈でなく、卵黄嚢の前部における卵黄静脈及びその分枝を含む静脈におけるＥｐｈＢ４の相補発現が明らかになった。
【００８２】
実施例３：脈管形成は、ＥｐｈｒｉｎＢ２変異胚において正常に起こる
幹における主要な血管の形成は、９個の体節胚のｌａｃＺ及びＰＥＣＡＭ−１の二重染色により検査されたように、ＥｐｈｒｉｎＢ２の欠如により影響されなかった。ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｌａｃＺの発現は背側大動脈及び卵黄動脈において見られたが、臍主静脈及び後主静脈においてはみられなかった。血管壁にいくらか拡張及びしわ（wrinkling ）が観察されたが、例えば、背側大動脈、卵黄動脈、後主静脈及び臍静脈が形成された。同様に、背側大動脈から発生した体節間(intersomitic)血管がこの段階で形成された。Ｅ８．５とＥ９．０との間で、初期の心内膜が、変異体においてわずかに乱れた(perturb) ようであったが、顕著な組織破壊がＥ１０で明らかであった。変異卵黄嚢及び胚の両方において、標準的にはＥ９．５までに赤血球が完全に発生し、循環した。
【００８３】
実施例４：ＥｐｈｒｉｎＢ２発現により明らかにされた卵黄嚢動脈及び卵黄嚢静脈の広範なインターカレーション。
卵黄嚢において、卵黄動脈及びその毛細血管網は後部を占有し、そして卵黄静脈及びその毛細血管網は前部を占有する。始原性毛細血管叢が形成されているが、再構築がまだ生じていない段階であるＥ８．５では、ヘテロ接合性胚におけるＥｐｈｒｉｎＢ２−ｔａｕｌａｃＺの非対称発現が前部と後部との間の界面で明白であった。明らかに、静脈の血管から明瞭に分離したより大きな分枝した幹へのβ−ガラクトシダーゼ+ 動脈性毛細血管のホモタイプの再構築は、Ｅ９．０とＥ９．５との間で明白であった。この段階では、レセプターＥｐｈＢ４の発現は、卵黄静脈上で明白に観察されたが、動脈では観察されなかった。従って、動脈性及び静脈性の内皮毛細血管は、脈管形成の後と血管形成の前では既に分子的に異なる。
【００８４】
卵黄嚢毛細血管叢の模範的な図（Carlson, B.M Patten's Foundations of Embryology (1981)）は、動脈性毛細血管床と静脈性毛細血管床との間に非重複境界領域を示すが、ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｔａｕｌａｃＺの発現は、以前には認識されていなかった、卵黄嚢の前後範囲全体にわたる動脈と静脈との間の広範なインターカレーションの検出を可能にした；これは、ヘテロ接合体において観察されたが、ホモ接合体においては観察されなかった。ちなみにＰＥＣＡＭ及びβ−ガラクトシダーゼに対する二重標識により、動脈と静脈との間の境界が、より大きな血管嵌合を橋渡しする微小血管伸展物間で生じることが明らかになった。
【００８５】
実施例５：ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ ／ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ 胚の卵黄嚢における中断された血管形成。
卵黄嚢血管形成における欠損は、Ｅ９．０までに出現し、そしてＥ９．５では明白であった。β−ガラクトシダーゼ染色によって示されるように動脈血管、及びＰＥＣＡＭ染色によって示されるように嚢の前部の静脈血管の両方について、毛細管叢段階で再構築が明かにブロックされた。従って、ＥｐｈｒｉｎＢ２リガンド遺伝子の破壊は、ＥｐｈＢ４レセプター発現静脈性細胞における非自立性欠損、及び動脈自身における自立性欠損の両方を引き起こした。
【００８６】
この欠損は、卵黄嚢の前後範囲にわたる動脈及び静脈の両方向の増殖をインターカレートし得ないことによって達成された。その結果、嚢の中間点でのＥｐｒｈｉｎＢ２発現区域と非発現区域との間に境界が出現した。（しかし、ｌａｃＺ発現の小さな斑点が前部静脈性叢内で時折観察された。このことは、幾つかの動脈内皮細胞が、静脈性毛細血管に取り込まれたかもしれないことを示唆する。）これらの観察は、より大きな血管への毛細血管叢の再構築とこれらの血管のインターカレート増殖との間の密接な関係を暗示する。しかし、胚由来の脈管構造の卵黄嚢への進入の点で存在する、大きなβ−ガラクトシダーゼ+ 卵黄動脈ならびに卵黄静脈は、変異体において混乱していないようであった。このことは、変異が始原性幹脈管構造の形成に影響しないという観察と一致する。また、卵黄嚢表現型は、内因性血管形成の破壊に起因し、そして胚由来血管の内殖の不全から派生するものではないことが論じられる。
【００８７】
卵黄嚢の切片の組織学的染色（ヘマトキシリン）により、Ｅ１０及びＥ１０．５で内皮血管と密接に会合した伸長した支持細胞（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｃｅｌｌ）（間葉細胞又は周皮細胞）の集積が示された。変異卵黄嚢において、これらの支持細胞はより丸く見えた。このことは、それらの分化における欠損を示唆する。さらに、ヘテロ接合性卵黄嚢とは対照的に、異なる直径の血管がＥ９．５で出現し始め、そして血管の直径はＥ１０．５の間に増大し、毛細血管の直径は、比較的均一であるようであり、そして変異体の年齢に伴って増大しなかった。Ｅ１０．５で、血管の融合が支持細胞による被包を伴うことなく生じたかのように、動脈は膨張してみえる。変異体の毛細血管はまた、基底内皮層から離層し得なかった。
【００８８】
実施例６：変異体胚の頭部における、内部頸動脈分枝の不在及び静脈性毛細血管の欠損した血管形成。
卵黄嚢の表現型に類似して、頭部の毛細血管床は、変異体において膨張しているようであり、そして始原叢段階で明かに停止した。β−ガラクトシダーゼに対する染色により、内部頸動脈の最前分枝(anterior-most bracnch) が変異体において発生し得なかったことが示された。したがって、卵黄嚢の場合とは異なり、奇形の毛細血管床は、完全に静脈性起始であるにちがいない。しかしながら、前部の主静脈の前部分枝が形成された。わずかに拡大したが、総合すると、これらのデータは、頭部において、動脈性毛細血管との正常な相互作用が妨げられる場合には、静脈性血管形成はブロックされることを示す。頭部及び卵黄嚢において観察される血管形成欠損は、心臓欠損から派生する結果ではなさそうである（下記参照）。なぜなら、それらはＥ９．０で始まることが観察されており、そして胚性血液循環は通常Ｅ９．５まで正常であるようだからである。
【００８９】
実施例７：心内膜細胞間のＥｐｈｒｉｎＢ２依存性シグナル伝達は、心筋の小柱(trabeculae)形成に必要とされる。
野生型心臓におけるリガンド及びレセプターの発現の検査は、ＥｐｈｒｉｎＢ２（ｌａｃＺ染色によって検出される）及びＥｐｈＢ４（インサイチューハイブリダイゼーションによって検出される）の両方の心房での発現を示した。リガンド及びレセプターの両方の発現をまた、心室において心筋の小柱状伸展物（  ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を裏打ちする内皮細胞にて検出した。二重標識実験は、リガンド及びレセプターが、異なるが部分的に重複する細胞群によって発現されることを示唆したが、この方法の解像度では、この重複が、同一細胞による同時発現又は異なる細胞の密接な会合のどちらを反映するのかを区別することができない。いずれにせよ、ＥｐｈｒｉｎＢ２及びＥｐｈＢ４は、心臓外の脈管構造とは異なり、心臓の相補的な動脈性（心室性）及び静脈性（心房性）の区画を規定しない。
【００９０】
心臓欠損は、Ｅ９．５で始まり、そしてＥ１０では形態学及び全体量のＰＥＣＡＭ−１染色両方により変異体胚において明かであった。ＥｐｈｒｉｎＢ２発現心内膜細胞の鎖（ｓｔｒａｎｄ）は依然として観察されたが、切片は心筋の小柱状伸展物の非存在を示した。従って、リガンドコード遺伝子の変異は、ニューレグリン-1遺伝子における変異の作用と同様に、心内膜細胞において非自律的欠損を引き起こした（Meyer, D. 及びBirchmeier, C, Nature 378:386 〜390 (1995)）。しかし逆説的に、この場合には、ＥｐｈＢ４レセプターは、ニューレグリン−１レセプターｅｒｂＢ２及びｅｒｂＢ４の場合と同様に（Lee ら、Nature 378:394〜398 (1995)；Gassmannら、Nature 378:390〜394(1995) ）、心筋細胞には発現されず、内心膜細胞において発現される。Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂファミリーリガンド（Ｅｐｈ  Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＡ４）に対する任意の他のレセプターの発現を、この組織において検出した。このことは、心臓において、内皮細胞間のリガンド−レセプター相互作用が、続いて平滑筋細胞との相互作用に影響しうることを示唆する。
【００９１】
実施例８：Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２は、神経管の血管新生に必要とされる。
ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ ／ＥｐｈｒｉｎＢ２tlacZ 胚において、神経管への毛細血管内殖は生じなかった。代わりに、ＥｐｈｒｉｎＢ２発現内皮細胞は、発生している脊髄の外部表面と会合したままであった。全内皮ＰＥＣＡＭ−１及びＥｐｈＢ４発現に対するβ−ガラクトシダーゼの比較は、この初期の段階（Ｅ９〜Ｅ１０）では、ＣＮＳにおいてＥｐｈＢ４を発現する別の静脈性毛細血管網の証拠を提供しなかった。むしろ、異なるＥｐｈｒｉｎＢ２レセプターであるＥｐｈ  Ｂ２の発現が、以前に報告されたHenkemeyerら、Oncogene 9:1001-1014 (1994) のように神経管において観察された。ここで、肉眼では形態学的欠損又はパターンの欠損は検出され得なかった。この場合には、それゆえ、変異は、レセプター発現細胞において非自律的な表現型を引き起こさず、むしろリガンド発現細胞における自律的な作用のみを引き起こすようである。
【００９２】
実施例９：ＥｐｈｒｉｎＢ２は成体組織においては動脈特異的である。
ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２が、動脈特異的様式で成体組織において発現されるかどうかを決定するために、我々は、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２taulacZ ／＋ヘテロ接合性マウスにおいてβ−ガラクトシダーゼに対する組織化学的染色を行った。全内皮マーカーであるＰＥＣＡＭ−１に対する抗体染色を、非動脈血管（すなわち、静脈）を明らかにするために、同一又は隣接した切片において行った。Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２は、動脈特異的様式で、心臓、脚部筋、腎臓、肝臓及び脂肪を含む組織において、成体マウス全体で発現される。発現を、大動脈、細動脈及び最も小さい直径の毛細血管を含む、あらゆる直径の血管において検出した。以前には、定義による毛細血管は、動脈及び静脈同一性のいずれをも有さないと考えられていた。これらの結果は、これが事実ではなく、そして動脈同一性が毛細血管床にまで拡張されることを示す。
【００９３】
成体動脈の切片を、全内皮マーカーとしてＰＥＣＡＭ−１に対する抗体を用いて、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）に対する組織化学的染色によって二重標識し、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ｔａｕｌａｃＺ発現を明らかにした。ｌａｃＺ（Ｘ−ｇａｌによる青色）染色は、ｅｐｈｒｉｎＢ２の背部大動脈における発現、下大静脈における非発現、足骨に隣り合う大腿動脈における発現、大腿静脈における非発現及び冠状動脈の心外膜動脈における発現、冠状静脈における非発現を明らかにした。
【００９４】
他の切片の同様の染色は、腎臓細動脈、肝臓細動脈及び小筋肉細動脈、ならびに動脈性毛細血管におけるＥｐｈｒｉｎＢ２の存在を明らかにした。腎臓細静脈、肝臓静脈及び小筋肉静脈は、ｌａｃＺネガティブであったが、ＰＥＣＡＭ−１ポジティブであった。
【００９５】
腸の脂肪を、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）について染色し、そしてＰＥＣＡＭ−１で標識して、静脈性血管ならびに動脈性血管を明らかにした。ＥｐｈｒｉｎＢ２は、細動脈及び動脈性毛細血管により細静脈において発現されるが、ＰＥＣＡＭ−１ポジティブ細静脈において発現されない。さらなる切片は、ＥｐｈｒｉｎＢ２が、ＰＥＣＡＭ−１ポジティブ非動脈性毛細血管によって包囲される動脈性毛細血管によって発現される。
【００９６】
実施例１０：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２は、腫瘍血管新生の間に発現される。
腫瘍血管は、後毛細血管（ｐｏｓｔ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｅｎｕｌｅ）の細静脈から発生すると考えられていた。ＥｐｈｒｉｎＢ２が腫瘍血管新生の間に発現されるかどうかという問題に取り組むために、ルイス肺ガンを、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２taulacZ ／＋ヘテロ接合性雌の背部領域に皮下移植した。１週間後、腫瘍を取り出し、そして全体量でのβ−ガラクトシダーゼ組織化学のために処理した。結果は、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２が腫瘍血管によって実際に発現されることを明らかに示す。このことを、β−ガラクトシダーゼ及びＰＥＣＡＭ−１に対する、このような腫瘍全体の切片の二重染色によって確認した。
【００９７】
腫瘍毛細血管によるＥｐｈｒｉｎＢ２発現。ルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞を、ＥｐｈｒｉｎＢ２−ｔａｕｌａｃＺヘテロ接合性雌の背部領域に皮下移植した。１週間後、染色のために腫瘍を取り出した。ＥｐｈｒｉｎＢ２ポジティブ動脈性毛細血管を、末梢の腫瘍組織において観察した。ＰＥＣＡＭ−１での二重標識は、動脈性毛細血管においてＥｐｈｒｉｎＢ２  ｌａｃＺ（青色に染色）及びＰＥＣＡＭ−１（茶色に染色）のシグナルを共存（ｃｏｌｏｃａｒｉｚｅ）させ、そしてＰＥＣＡＭ−１のみにより標識された非動脈性毛細血管を示す。
【００９８】
実施例１１：動脈特異的遺伝子を含有するクローンのスクリーニング
使用したスクリーニング手順の要旨を付録Ｉに提供する。手短には、内皮細胞を、ＰＥＣＡＭ−１に対する抗体（磁気ビーズ又はＦＡＣＳ）でのポジティブ選択を用いて、分離した胚の卵黄嚢、卵黄動脈又は卵黄静脈から単離した。ｃＤＮＡを、単一の細胞又は少数（約２００）の細胞の溶解物から合成し、そしてＰＣＲによって増幅した。ｃＤＮＡが、動脈又は静脈の内皮細胞に由来することを確認するために、各々の細胞プレップから合成したｃＤＮＡを、サザンブロットさせ、そして一連のプローブ（チューブリン（遍在して発現される）全内皮プローブＦｌｋｌ及びＦｌｔｌ、及び動脈特異的プローブｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２）を用いて４つ組でハイブリダイズさせた。Ｆｌｋｌ、Ｆｌｔｌ及びｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２配列を含むｃＤＮＡを動脈性とみなし、一方、全内皮マーカーを含有するが、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２を含有しないｃＤＮＡを静脈性と見なした。従って、この手順におけるｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２プローブの使用は、合成されたｃＤＮＡの動脈特性対静脈特性を確認するために必須であった。
【００９９】
これらのｃＤＮＡからさらなる動脈特異的遺伝子を単離するために、それらをλファージベクターにクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。次いで、これらのライブラリーに由来するプラークを、単一の細胞又は細胞のプールから作製した動脈又は静脈に特異的なｃＤＮＡプローブを用いて２つ組のフィルターリフトにおいてスクリーニングした。動脈プローブ対静脈プローブに対して特質的なハイブリダイゼーションを示したプラークを単離し、そして挿入物を、Ｔ３〜Ｔ７プライマーを用いて増幅し、そしてｃＤＮＡサザンブロッティングによって再分析した。２つの異なる組の動脈−静脈の内皮細胞ｃＤＮＡプローブ（卵黄の動脈−静脈細胞及び単一の卵黄嚢の動脈及び静脈内皮細胞）をサザンブロットに使用した。ほとんどのクローンが、動脈細胞において強く発現され、そして静脈細胞によって弱く、又は検出し得ないほどに発現された。最初のスクリーニングは、さらなる動脈特異的遺伝子を単離するために設計された。１２の候補の動脈特異的クローンを、単一細胞プローブを用いて単離し、一方、１つのクローンを、プールしたプローブを用いて単離した。インビボでのこれらの遺伝子の動脈特異的発現を、インサイチューハイブリダイゼーション実験によって確認し得る。これらのような方法は、動脈内皮細胞又は静脈特異的細胞に適用され得る。
【０１００】
これらのデータは、単一の内皮細胞から新規の動脈又は静脈に特異的な遺伝子を単離することが可能であることを示す。このような血管型限定遺伝子は、動脈内皮細胞と静脈内皮細胞との間の生理学的差異に対する見識を提供し得る。本明細書中に記載されるような方法は、また、動脈及び静脈に特異的な疾患（例えば、動脈高血圧症、アテローム性動脈硬化症、深部静脈血栓、及び所定の型の静脈形成異常）の病因に関連する遺伝子を同定し得る。それらはまた、循環器系のヒト遺伝子障害に関する候補遺伝子を提供しうる。次いで、このような遺伝子の遺伝子産物は、新規の薬物標的として働き得る。
【０１０１】
付録Ｉ：新規の動脈又は静脈に特異的な遺伝子を単離するための、単一細胞ＰＣＲ、３’ｃＤＮＡライブラリー構築及び示差的スクリーニング手順
１．形態学的判断基準に基づく、Ｅ１２．５〜Ｅ１４．５の卵黄嚢からの卵黄動脈及び卵黄静脈の解体。
２．３７℃にて４５分間の、コラゲナーゼ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）中での卵黄嚢の解離。
３．以下の方法の内の１つにより、単一又は少数群の内皮細胞（ＥＳ）を単離する。
ａ）一次抗体としてＰＥＣＡＭ−１を使用する、磁気ビーズに基づく分離。
ｂ）ＰＥＣＡＭ−１−ＦＩＴＣ一次抗体を使用する、ＦＡＣＳ精製。
ｃ）内皮細胞同定のためのｔｉｅ２−ＧＦＰトランスジェニックマウスに由来するＧＦＰ蛍光、続く微細管マウスピペッティング。
４．６５℃にて１分間、ＰＣＲチューブ中で単一細胞を溶解させる。
５．室温で１〜２分間維持し、オリゴＴをＲＮＡにアニールさせる。
６．３７℃にて１５分間の、ＡＭＶ及びＭＭＬＶ酵素を用いた逆転写。
７．３７℃にて１５分間の、末端転移酵素及びｄＡＴＰを用いたポリＡ尾部付加。
８．ＰＣＲ反応設定：
１００μｌ反応、５倍の通常レベルのｄＮＴＰ混合物、高濃度のＴａｑ。
対称な増幅のために、３’末端の２４（Ｔ）を有する単一のＰＣＲプライマーを使用する。
９．各々の細胞プレップに対して増幅したｃＤＮＡにおける、内皮特異的及び動脈／静脈特異的な３’プローブを用いたｃＤＮＡサザンブロッティング。
１０．適切なプローブに対して強いシグナルを生じる少数の良好な細胞を選択する。アガロース上で５００ｂｐ〜２ｋｂのｃＤＮＡを単離する。
１１．ｃＤＮＡを沈殿させ、そして定量する。
１２．λＺＡＰＩＩ（Stratagene;LaJolla, CA）ファージアームにｃＤＮＡライブラリーを連結する。
１３．非常に低い密度：１０００ｐｆｕ／プレートでライブラリーをプレーティングする。２つ組のフィルターリフトを取得する。
１４．卵黄動脈細胞及び卵黄静脈細胞から作製したプローブを用いて２つ組のフィルターをスクリーニングする。
１５．示差的に発現したファージクローンを選出する。卵黄動脈細胞及び卵黄静脈細胞から作製したプローブでプロービングすることによる、ファージ挿入物の逆（ｃＤＮＡ）サザンブロット確認。
１６．ｃＤＮＡフラグメントの発現パターンを調査するためのインサイチューハイブリダイゼーション。
【０１０２】
実施例１２：ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の産生
細菌において発現されたｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２のフラグメントに対するポリクローナルウサギ抗体が以前に報告されたが、このような抗体は、細胞表面上の天然の形態のタンパク質とは典型的には反応性ではなく、それゆえ、細胞選別、機能的阻害及び薬物標的化を含む多くの適用には有用ではない。より望ましい結合特性を有する抗体を産生するために、我々は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に連結した形態としてのｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２の細胞外ドメインを発現させた。ハムスターをこれらの細胞で免疫化し、ハイブリドーマをマウス骨髄腫細胞との融合によって調製し、そして上清をｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩを発現するＣＯＳ細胞上でスクリーニングした。
【０１０３】
クローン＃６Ｅ３は、生存するＣＯＳ細胞上のｅｐｈｒｉｎＢ２に良好に結合した。ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩ  ＣＯＳ細胞株は、プールされたＧ４１８選択細胞群であり、細胞の３０％がｅｐｈｒｉｎＢ２に対してポジティブである。対照（非トランスフェクション）ＣＯＳ細胞は、同じ抗体で染色した場合にはネガティブであった。
【０１０４】
実施例１３：数種の抗ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２抗体は、ＥｐｈＢ２−ｅｐｈｒｉｎＢ２結合相互作用をブロックする
抗体がまたブロック機能を有する（すなわち、ｅｐｈｒｉｎＢ−２のそのレセプターへのｅｐｈｒｉｎＢ２の結合を阻害する）場合、それらは強力な抗血管形成剤として使用され得る。このような機能（抗体を阻害する）を同定するアッセイを実証するために、我々は、可溶性ＥｐｈＢ２−Ｆｃ融合タンパク質へのＧＰＩ−ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（ＣＯＳ細胞において発現される）の結合を減少させる能力について、１２のハムスター抗ＥｐｈｒｉｎＢ２ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。結合を、125 Ｉ−標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体によって検出した。細胞と種々の上清とのプレインキュベーションにより、これらの上清の全てが、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩに結合する抗体を含むとしても、大多数の抗体が引き続くレセプター−リガンド結合に対してブロック作用を有さないことが示された（対照を１００％として）。抗体の１つは、ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＧＰＩ  ＣＯＳ細胞へのＥｐｈＢ２−Ｆｃ結合において４０％減少を生じた（Ｆｉｇｕｒｅ２）。
【０１０５】
均等物
本発明は、その好ましい実施態様に関して、特に示され、記載されているが、添付の請求の範囲で規定されている本発明の意図や範疇から外れることなく、形式や詳細において種々の変更が本明細書で行われてもよいことが当業者によって理解されるだろう。当業者であれば、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に詳細に記載された発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるだろう。そのような均等物が、特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【図１】
2010053134.tif 000003
【図２】
2010053134.tif 000004
【配列表】
2010053134000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月29日(2009.12.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物、及び
ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する抗体
を含んでなる、哺乳動物において薬物を動脈に選択的に送達するための製剤。
【請求項２】
哺乳動物における動脈特異的疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１記載の製剤の使用。
【請求項３】
薬物が抗血管形成剤である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
薬物が血管形成剤である、請求項２記載の使用。
【請求項５】
薬物がアテローム性動脈硬化斑の形成を阻害する、請求項２記載の使用。
【請求項６】
ＥｐｈｒｉｎＢ２に結合する抗体に連結された物質を含む複合体を含んでなる、哺乳動物中の動脈に物質を送達するための製剤。
【請求項７】
ＥｐｈＢ４に結合する抗体に連結された物質を含む複合体を含んでなる、哺乳動物中の静脈に物質を送達するための製剤。
【請求項８】
ＥｐｈｒｉｎＢ２とＥｐｈＢ４の結合又は相互作用を変化させる抗体を含んでなる、腫瘍における血管形成を変化させることによって哺乳動物中の腫瘍を治療するための製剤。
【請求項９】
哺乳動物における血管形成を変化させるための医薬の製造における、ＥｐｈｒｉｎＢ２またはＥｐｈＢ４に結合する抗体の使用。
【請求項１０】
該抗体がＥｐｈｒｉｎＢ２またはＥｐｈＢ４のアンタゴニストであり、該医薬が血管形成を阻害するためのものである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
該抗体がＥｐｈｒｉｎＢ２またはＥｐｈＢ４に対するモノクローナル抗体である、請求項１０記載の使用。