(57)【要約】【課題】新規な腫瘍マーカーを用いた腫瘍の検査方法を提供する。【解決手段】この方法は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を腫瘍マーカーとすることを特徴とする。この検査方法によれば、膵癌、大腸癌、乳癌、白血病等をはじめとする様々な腫瘍を同時に検査することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を腫瘍マーカーとすることを特徴とする、腫瘍の検査方法。
【請求項２】
前記腫瘍マーカーの検出に、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を用いることを特徴とする、請求項１に記載の腫瘍の検査方法。
【請求項３】
前記シアリルルイスｘ糖鎖結合分子が、抗シアリルルイスｘ抗体である、請求項２又は３に記載の腫瘍の検査方法。
【請求項４】
前記腫瘍マーカーの検出に、さらに抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を用いることを特徴とする、請求項２に記載の腫瘍の検査方法。
【請求項５】
ｈｎＲＮＰ  Ａ３発現細胞を被検試料とすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍の検査方法。
【請求項６】
腫瘍が、膵癌、大腸癌、乳癌及び白血病の少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の腫瘍の検査方法。
【請求項７】
シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる腫瘍マーカー。
【請求項８】
請求項７に記載の腫瘍マーカーを検査するための腫瘍検査用試薬又はキット。
【請求項９】
シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を含む、請求項８に記載の腫瘍検査用試薬又はキット。
【請求項１０】
抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体をさらに含む、請求項９に記載の腫瘍検査用試薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍マーカーを用いた腫瘍の検査方法に関し、より詳細には特定の核内タンパク質を腫瘍マーカーに用いた腫瘍の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質の糖鎖は、癌化に伴い変化することが知られている。表１に示すように、癌に特異的に発現する様々な糖鎖や糖タンパク質が腫瘍マーカーとして利用されている。
【０００３】
【表１】
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【０００４】
２型糖鎖の中に、糖鎖構造ＮｅｕＮＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＡｃ→Ｒのシアリルルイスｘがある。このシアリルルイスｘは、接着分子セレクチンのリガンドであることが知られている。また、肺癌、卵巣癌、膵癌、大腸癌、胆道癌等の癌になると、細胞中や血中のシアリルルイスｘ濃度が上昇することが報告されている。そのため、現在、腫瘍マーカーとしてＳＬＸ、ＣＳＬＥＸ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９等が臨床応用されている。
【０００５】
しかし、これらの腫瘍マーカーは、良性疾患でも増加することがあることから、前記診断では癌組織を特異的に検出することが難しい。ＳＬＸは、非癌疾患での偽陽性率が比較的低いといわれているが、ＳＬＸ値が高くても、正確な診断を期するために他の腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９−９）の併用、その他の生理学検査、顕微鏡での組織検査、Ｘ線画像診断、内視鏡検査等が必要である。
【０００６】
シアリルルイスｘ含有糖タンパク質として、表２に示す複数の膜タンパク質が、これまでに同定されている。しかし、癌との関連性が示唆されているタンパク質は、ＣＤ４４やＭＵＣ１等の一部に限られる。
【０００７】
【表２】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のとおり、腫瘍マーカーとしての糖タンパク質には、共通する糖鎖部分構造（糖鎖癌抗原）があることが明らかにされているが、腫瘍マーカーのタンパク質部分は、ほとんどが同定されていないのが現状である。癌細胞に特異的に発現しているシアリルルイスｘ含有糖タンパク質を同定すれば、従来よりも陽性的中率の高い癌診断法、治療効果判定法、転移予測法、予後の判定法等を提供できるものと考える。
【０００９】
そこで、本発明は、癌細胞に特異的に発現しているシアリルルイスｘ含有糖タンパク質を見つけ出し、それを腫瘍マーカーとする腫瘍の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、抗シアリルルイスｘ抗体を用いて、様々な細胞のスクリーニングを行った結果、癌細胞の核画分に複数のシアリルルイスｘ含有タンパク質があることを見出した。そのうちの２つは、２次元電気泳動とＬＣ／ＭＳ／ＭＳでｈｎＲＮＰ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ヘテロ核リボ核酸タンパク質）Ａ１及びＡ３であると同定された。これらは主要な核タンパク質として核内に発現しているタンパク質である。一方、正常ヒト細胞の核画分において、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ１及びシアリルルイスｘ含有Ａ３の有無を調べたところ、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ１の発現を確認することができたが、シアリルルイスｘ含有  ｈｎＲＮＰ  Ａ３は検出されなかった。これらの知見を総合して本発明者らは、癌細胞特異的に核内のｈｎＲＮＰ  Ａ３にシアリルルイスｘが結合することを見出して、以下の発明を完成させた。すなわち、本発明は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を腫瘍マーカーとすることを特徴とする、腫瘍の検査方法を提供する。
【００１１】
これまでに、ｈｎＲＮＰｓが糖タンパク質であることや、核内にシアリルルイスｘ含有タンパク質が存在することは知られていなかった。また、ｈｎＲＮＰ  Ａ１及び  Ａ２／Ｂ１は、それぞれ、表３に示すように、大腸癌及び肺癌で増加することから、診断マーカーとしての可能性が期待されている。しかし、シアリルルイスｘ糖鎖の付加したｈｎＲＮＰ  Ａ３が腫瘍マーカーとして有用であることは全く認識されていなかった。
【００１２】
【表３】
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【００１３】
また、特開２００８−１６４５１７には、メチル化アミノ酸残基に結合する抗体を用いたメチル化ｈｎＲＮＰの免疫学的分析方法によって、大腸癌、肺癌及び乳癌等の癌を検出することが記載されている。本発明の腫瘍の検査方法は、シアリルルイスｘ糖鎖が結合したｈｎＲＮＰである点で特開２００８−１６４５１７に記載の発明と相違する。しかも、腫瘍マーカーとして機能するには、ｈｎＲＮＰがｈｎＲＮＰ  Ａ３であることが必須であるところ、特開２００８−１６４５１７はすべてのｈｎＲＮＰを対象とする。
【００１４】
前記腫瘍マーカーの検出には、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を用いることが好ましい。該シアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、例えば抗シアリルルイスｘ抗体である。
【００１５】
前記腫瘍マーカーの検出には、さらに抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を用いることが好ましい。
【００１６】
前記腫瘍の検査方法は、ｈｎＲＮＰ  Ａ３発現細胞を被検試料とすることが好ましい。
【００１７】
本発明の検査方法は、例えば膵癌、大腸癌、乳癌、白血病等の診断、治療効果の判定及び予後の予測に有用である。
【００１８】
本発明は、また、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる腫瘍マーカーを提供する。
【００１９】
本発明は、また、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる腫瘍マーカーを検出するための腫瘍検査用試薬又はキットを提供する。該腫瘍検査用試薬又はキットは、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子であることが好ましい。該腫瘍検査用試薬又はキットは、さらに抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の糖タンパク質は、例えばＴ８４（大腸癌肺転移部位由来）細胞、ＨＴ−２９（大腸癌原発部位由来）細胞、ＢｘＰＣ−３（膵癌原発部位由来）細胞、Ｃａｐａｎ−１（膵癌肝転移部位由来）細胞、ＺＲ−７５−３０（乳癌腹水転移部位由来）細胞、ＴＨＰ１（急性単球性白血病細胞由来）細胞、ＫＵ８１２（慢性骨髄性白血病細胞由来骨髄芽球様）細胞等において発現する。したがって、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を腫瘍マーカーとして用いれば、膵癌、大腸癌、乳癌、白血病等を含む様々な腫瘍を同時に検査することが可能である。
【００２１】
本明細書の実施例に示すように、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ１は、正常細胞と癌細胞のどちらにも発現している。シアリルルイスｘ糖鎖のみを判定する従来の腫瘍マーカーは、ｈｎＲＮＰ  Ａ１も検出するであろうから、陽性率の低下を招くことになる。一方、本発明の腫瘍の検査方法は、シアリルルイスｘを含有するｈｎＲＮＰ  Ａ３が癌組織のみに発現することに基づく。本発明の腫瘍マーカーを用いた腫瘍の検査方法は、従来の腫瘍マーカー（例えばＳＬＸ）を用いた検査方法よりも陽性率を高くすると予想される。
【００２２】
シアリルルイスｘを糖鎖抗原とする従来の腫瘍マーカー（例えばＳＬＸ）は、細胞膜に存在するシアルルルイスｘ付加糖タンパク質や糖脂質を測定する。一方、本発明の腫瘍の検査方法は、シアルルルイスｘが付加したｈｎＲＮＰ  Ａ３という核内タンパク質を測定する。核内タンパク質を検査対象とすることは、核内タンパク質が関与する癌の悪性度の判定、治療効果の判定や転移等の予測に利用できるという点で好都合である。したがって、本発明の腫瘍の検査方法は、特に癌患者を治療した後の予後の観察に有用である。
【００２３】
シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる腫瘍マーカーは、様々な検査手法（例えばウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法）や診断キットの中に取り入れることが容易である。また、シアリルルイスｘを糖鎖抗原とするＳＬＸ、ＣＳＬＥＸ等の従来の診断法に追加することにより、これらの診断法を補完することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】抗シアリルルイスｘ抗体を用いた癌細胞（二種類の大腸癌、乳癌、二種類の膵癌、及び二種類の白血病細胞）、並びに正常細胞（乳腺上皮細胞、気管支上皮細胞、表皮角化細胞、血管内皮細胞、及び線維芽細胞）の核画分のウエスタンブロットを示す。核内タンパク質であるヒストンＨ１タンパク質の発現量が同程度の癌細胞及び正常細胞の両方において、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ１の発現が確認された。一方、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の発現は、癌細胞で明瞭に観測されたが、正常細胞では発現していないか、あっても非常に僅かであった。なお、図１の正常細胞側に現れた３箇所のＨＴ−２９バンドは、ポジティブコントロールを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明の腫瘍の検査方法の一実施の形態をより詳細に説明する。本発明の腫瘍の検査方法は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３という糖タンパク質を腫瘍マーカーとすることを特徴とする。上記糖タンパク質のベースとなるｈｎＲＮＰ  Ａ３（分子量３９ｋＤａ）には、４種類のアイソフォームが存在する。本発明の腫瘍の検査方法には、この４種のアイソフォームのいずれも対象とすることができる。
【００２６】
シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の被検試料は、生体由来でｈｎＲＮＰ  Ａ３発現細胞が含まれるものならば特に制限されない。被検試料の具体例としては、臓器、組織、細胞等の生体組織の細胞、血液、血球、血漿、血清、髄液、関節液、腹水、糞便、尿等が挙げられる。これらの検体から常法（例えば実施例に記載の方法）に基づいて核タンパク質を抽出する。被検試料は、好ましくは、組織または細胞から抽出された核タンパク質である。
【００２７】
上記腫瘍マーカーを使用した腫瘍の検査方法の具体例は、被検試料をシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させて、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる複合体を形成させ、次いで、該複合体を検出することからなる。
【００２８】
シアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、シアリルルイスｘ糖鎖に特異的に結合する分子のすべてが含まれる。その例としては、抗シアリルルイスｘ抗体やレクチンが挙げられ、好ましくは抗シアリルルイスｘ抗体である。
【００２９】
抗シアリルルイスｘ抗体は、常法に基づいて、ウサギ、ラット、マウス等の動物にシアリルルイスｘ糖鎖又はそれを含む物質を免疫してポリクローナル抗体を作製する方法、また、常法に基づいて、例えばシアリルルイスｘ糖鎖又はそれを含む物質で予め免疫された抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて得られる自律増殖能を持ったハイブリドーマが産出するモノクローナル抗体でもよい。さらに、抗原結合活性を有する限り、組換え抗体やこれらの抗体のフラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ領域等）でもよい。抗体フラグメントは、抗体をタンパク質分解酵素で分解し、精製することにより得られる。本発明の方法には、これらの抗体を一種単独に用いてもよく、あるいは二種以上を組み合わせて用いてもよい。また、抗シアリルルイスｘ抗体は、市販されているものを制限なく使用可能である。
【００３０】
また、前記レクチンの候補としては、イヌエンジュレクチンＭＡＭ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ｍｉｔｏｇｅｎ；Ｓｉａα２−３Ｇａｌを認識する）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ；Ｆｕｃα１−２，３，６を認識する）、小麦胚芽レクチンＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；シアル酸を認識する）等が挙げられる。
【００３１】
腫瘍マーカーの検出を容易にするため、予めシアリルルイスｘ糖鎖結合分子を標識しておくことが好ましい。シアリルルイスｘ結合分子の標識物質としては、検出方法に基づいて、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位体、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ユーロピウム、ナフチルアミン等の蛍光物質、ルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光物質、フェノール、ナフトール、アントラセン等の紫外線吸収物質、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等の酵素、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシルのスピンラベル化剤、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド等が使用可能である。
【００３２】
標識したシアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、シグナルの検出に利用できる物質、例えばジゴキシン、ジゴキシゲニン、ビオチン、ペニシリン、トリニトロフェニル、ジニトロフェニルのようなハプテン、ペプチド、レクチン等を結合させたものでもよい。例えば、ＬＡＢ法、ＡＢＣ法及びＬＳＡＢ法では、ビオチンを結合した抗体（ビオチン化抗体）を被検試料と反応させ、さらに酵素等で標識したアビジンやストレプトプトアビジンを前記ビオチン化抗体と反応させることにより、検出感度を増加させることができる。
【００３３】
前記シアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、複合体の検出方法に基づいて、適宜、担体に固定化してもよい。固定化担体の材質には、金属、ガラス、セラミックス、シリコーン、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等の合成高分子が挙げられる。担体の形状は、多孔性粒子、ビーズ、チューブ、ファイバー、プレート等が挙げられる。
【００３４】
上記で形成されたシアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる複合体を検出するには、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、凝集法、免疫沈降法等の免疫学的測定法を使用することができる。その測定原理も、サンドイッチ法、競合法等が取り得る。以下のその具体例を示す。
【００３５】
（電気泳動−ウエスタンブロット−免疫染色）
被検試料中のシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を、電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動）で分離し、ウエスタンブロット法により、あるいはＨＰＬＣ、ゲル濾過、分子量分画等で分離し、ドットブロット法によりニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜に転写する。次いで、アルブミンやスキムミルクでブロッキング処理をする。そして、標識した抗シアリルルイスｘ抗体との反応性を調べることで、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の存在を調べる。適宜、染色された部分を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析等で詳細に同定する。
【００３６】
（ＥＬＩＳＡ−免疫染色）
被検試料を上記担体に接触させて吸着させる。スキムミルク、アルブミン等のブロッキング剤を担体に吸着させてブロッキングする。次いで、酵素で標識済みの抗シアリルルイスｘ抗体を反応させ、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−抗シアリルルイスｘ抗体からなる複合体を形成させた後、洗浄する。シアリルルイスｘ糖鎖結合分子が標識されていない場合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識済みの二次抗体を作用させる。酵素の基質（発色、発光色素等）を添加して、酵素反応物を検出する。適宜、染色された部分を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析等で詳細に同定する。
【００３７】
本発明の腫瘍の検査方法は、前記シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３に対して、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子、及び、ｈｎＲＮＰ  Ａ３と結合する抗体を反応させるものでもよい。それには、まず、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を被検試料と反応させ、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体からなる複合体を得る。次に、該複合体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子とを反応させ、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体からなる複合体を得る。該複合体を、ＨＰＬＣ、電気泳動、ゲル濾過、分子量分画等で分離して、検出する。この場合、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を上記したような標識手段で標識しておく。
【００３８】
上記方法は、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体及びシアリルルイスｘ糖鎖結合分子の反応順序を逆転させてもよい。すなわち、被検試料をシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させ、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる複合体を得る。次に、該複合体と抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体とを反応させ、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体からなる複合体を得る。この場合、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を適宜の手段で予め標識化しておく。その標識物質は、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子で例示したものと同様である。
【００３９】
シアリルルイスｘ糖鎖結合分子には、前記した抗シアリルルイスｘ抗体等前記したものを使用する。抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体は、ｈｎＲＮＰ  Ａ３に特異的に結合する抗体であれば特に限定されない。抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体には、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３のシアリルルイスｘにシアリルルイス結合タンパク質が結合したｈｎＲＮＰ  Ａ３を認識しなくなるようなもの、シアリルルイスｘの付加の有無にかかわらず認識するものも含まれる。抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体は、市販されているものを制限なく使用できる。
【００４０】
抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体又はシアリルルイスｘ糖鎖結合分子は、複合体の検出方法に基づいて、適宜、前記した担体に固定化してもよい。
【００４１】
上記で形成されたシアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３−からなる複合体を検出するには、ウエスタンブロット、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、凝集法、免疫沈降法等の免疫学的測定法を使用することができる。その測定原理も、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等が取り得る。シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の二価抗原としての性質を活用するので、サンドイッチ法が有利である。
【００４２】
（免疫沈降−ウエスタンブロット−免疫染色）
被検試料を抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体と反応させ、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる複合体を形成させる。複合体をプロテインＡセファロースビーズ等に付着させ、遠心分離で沈殿を回収する。沈殿物から複合体を適当な方法（ＳＤＳ等）で抽出する。得られた複合体を電気泳動にかけ、膜に転写する。膜をブロッキングした後、標識したシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させ、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−シアリルルイスｘ糖鎖結合分子からなる複合体を形成させる。その後、前記複合体を標識化物質に基づいてシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を検出する。
【００４３】
（ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）−免疫染色）
抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を上記担体に固定する。次に、スキムミルク、アルブミン等のブロッキング剤で担体をブロッキングする。抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を固定した担体に被検試料を添加し、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる複合体を形成させる。洗浄後、酵素標識済みのシアリルルイスｘ糖鎖結合分子と反応させ、抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−シアリルルイスｘ糖鎖結合分子からなる複合体を形成させた後、洗浄する。シアリルルイスｘ糖鎖結合分子が標識されていない場合は、酵素標識済みの二次抗体を作用させる。酵素の基質（発色、発光色素等）を添加して、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を含有する酵素反応物を検出する。上記操作は、担体への固体化を抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体に替えてシアリルルイスｘ糖鎖結合分子にしてもよい。
【００４４】
シアリルルイスｘ糖鎖結合分子−シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３−抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体からなる複合体を定量するには、当業分野で公知の方法を用いることができる。例えば、予め濃度既知のシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を含む標準液について、標識物質量（測定値）とｈｎＲＮＰ  Ａ３濃度との関係を表す検量線を作成しておくことにより、被検試料中のシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３を定量することができる。
【００４５】
前記方法で、被検試料と抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子との複合体、又は、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の量で腫瘍の有無を判定する基準の一例を、以下に説明する。
【００４６】
例えば、被検試料と抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体との複合体の量を求める。この複合体は、ｈｎＲＮＰ  Ａ３の総量を意味する。ｈｎＲＮＰ  Ａ３複合体に対するシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３複合体の割合が有意に高くなっていれば、ｈｎＲＮＰ  Ａ３へのシアリルルイスｘ糖鎖の付加が進んでいることを意味し、腫瘍が発生していると判断される。同様に、ｈｎＲＮＰ  Ａ３の総量に対するシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の割合が高くなっていれば、腫瘍が発生していると判断される。
【００４７】
被検試料と抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体との複合体（すなわち、ｈｎＲＮＰ  Ａ３の総量）と、被検試料と抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子との複合体の量（すなわち、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の量）は、別々に測定してもよいし、同時に測定してもよい。
【００４８】
別法として、予め、健常者の被検試料（以下、対照試料）を用いて、対照試料と抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体とシアリルルイスｘ糖鎖結合分子の複合体とシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３の量を求めておく。実際の被検試料の値を、対照試料のものと比較する。被検試料の測定値が対照試料の値と比べて有意に高ければ、腫瘍が発生していると判断される。
【００４９】
本発明は、また、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる腫瘍マーカーを提供する。この腫瘍マーカーは、癌の発生する臓器の検索やこの腫瘍マーカーを検出するための診断マーカーのスクリーニング等の研究に有用である。
【００５０】
本発明は、また、シアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３からなる腫瘍マーカーを検査するための腫瘍検査用試薬又はキットを提供する。試薬は、腫瘍マーカーを検査することができるあらゆるものを含む。具体的には、腫瘍検査用試薬又はキットは、シアリルルイスｘ糖鎖結合分子を含む。該キットは、さらに抗ｈｎＲＮＰ  Ａ３抗体を含むことが好ましい。これらのキットによれば、腫瘍の検査工程を簡略化できるため、大量の検体を短時間に検査することができる。
【００５１】
上記腫瘍検査用試薬又はキットには、この分野で公知の試薬を含めることができる。その例としては、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、安定化剤、防腐剤等が挙げられる。
【実施例】
【００５２】
〔実施例１〕
ヒト大腸癌上皮由来Ｔ８４細胞株からの核タンパク質の抽出を、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，１９８９，１７，６４１９に記載の方法に準じて以下のように行った。ヒト大腸癌上皮由来Ｔ８４細胞株（ＡＴＣＣより入手）の凍結細胞を氷上で融解させ、抽出液Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を３００μＬ加え、ピペッティングにより懸濁した。氷上で１５分間インキュベートした後、１８．７５μｌの１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を加え、１０秒間ｖｏｌｔｅｘミキサーにより撹拌した。４℃、５００×ｇで３分間遠心した後、上清を細胞質由来タンパク質として回収した。再び、ペレットに３００μＬの抽出液Ａを加え、ピペッティングにより懸濁した後、４℃、５００×ｇで１分間遠心し、上清を回収した。この操作を２回繰り返した。
【００５３】
ペレットに２００μｌの抽出液Ｂ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９，４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ピペッティングにより懸濁した。４℃で１５分間ｖｏｌｔｅｘミキサーにより撹拌した後、４℃、１５，０００×ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を核タンパク質として回収した。
【００５４】
抽出した核タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、エレクトロブロッティング法によりＰＶＤＦ膜に核タンパク質を転写した。転写されたタンパク質を、蛍光色素Ｃｙ５を用いて標識した後、蛍光イメージアナライザー（製品名Ｔｙｐｈｏｏｎ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。また、核タンパク質に含まれるシアリルルイスｘのキャリアタンパク質を、マウス抗シアリルルイスｘモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、登録商標）を用いたウエスタンブロット法で検出した。なお、二次抗体には、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ、登録商標）を用いた。核タンパク質画分のウエスタンブロッティングの結果、３５ｋＤａ近傍及び４２ｋＤａ近傍にシアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ）由来の明瞭なシグナルが検出された。
【００５５】
ヒト大腸癌上皮由来Ｔ８４細胞株の場合と同様に、以下の癌細胞：
ヒト膵癌由来ＢｘＰＣ−３細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６８７）、
ヒト膵癌由来Ｃａｐａｎ−１細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ−７９）、
ヒト大腸癌由来ＨＴ−２９細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ−３８）、
ヒト乳癌由来ＺＲ−７５−３０細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５０４）、
急性単球性白血病細胞由来ＴＨＰ１細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−２０２）、及び、
慢性骨髄性白血病細胞由来骨髄芽球様ＫＵ８１２細胞株（ＪＣＲＢ０１０４）
の核タンパク質画分についても、ウエスタンブロッティング解析を実施した。表４に癌細胞の特徴を示し、そして図１にウエスタンブロットの結果を示す。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
さらに、以下の正常ヒト細胞：
ヒト乳腺上皮細胞（三光純薬（株）より入手）、
ヒト気管支上皮細胞（三光純薬（株）より入手）、
ヒト表皮角化細胞（三光純薬（株）より入手）、
ヒト血管内皮細胞（三光純薬（株）より入手）、及び
ヒト正常２倍体線維芽細胞ＴIG−１−２０（ＪＣＲＢ０５０１）
の核タンパク質画分を用いて、ウエスタンブロッティング解析を実施した。その結果もまた図１に示す。
【００５８】
図１に示すとおり、抗シアリルルイスｘ抗体を用いて癌細胞及び正常ヒト細胞の核画分のシアリルルイスｘ含有タンパク質の発現を調べた結果、癌細胞及び正常細胞に共通するシアリルルイスｘ含有タンパク質と、癌細胞特異的シアリルルイスｘ含有タンパク質が存在した。これとは別に２Ｄ電気泳動とＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った結果、上記の共通する糖タンパク質はシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ１であり、上記の癌特異的糖タンパク質はシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３であることが判明した。また、核に一定量存在するヒストンタンパク質について癌細胞と正常細胞との発現の違いを見たが、差は見られなかった。
【００５９】
以上のことから、同じｈｎＲＮＰファミリーでもシアリルルイスｘの転移と癌化の関係に違いがあり、癌特異的糖タンパク質であるシアリルルイスｘ含有ｈｎＲＮＰ  Ａ３は、腫瘍マーカーとしての利用が充分に可能であることが明らかとなった。
【符号の説明】
【００６０】
Ａｎｔｉ−Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：抗シアリルルイスｘ抗体
Ａｎｔｉ−Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ：抗ヒストンＨ１抗体
ＨＴ−２９：ヒト大腸癌原発部位由来
Ｔ８４：ヒト大腸癌肺転移部位由来
ＺＲ−７５−３０：ヒト乳癌腹水転移部位由来
Ｃａｐａｎ−１：ヒト膵癌肝転移部位由来
ＢｘＰＣ−３：ヒト膵癌原発部位由来
ＴＨＰ１：ヒト急性単球性白血病細胞由来細胞株由来
ＫＵ８１２：ヒト慢性骨髄性白血病細胞由来
【図１】
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