(57)【要約】【課題】パピローマウイルスカプシド蛋白コード配列の発現方法を提供。【解決手段】細胞中におけるパピローマウイルスカプシド蛋白の発現を容易にする条件下、発現系を用いて細胞中でパピローマウイルスカプシド蛋白コード配列を発現する。別の態様では、ウイルス様−粒子（ＶＬＰｓ）、そのフラグメント、カプソメアまたは部分がパピローマウイルスカプシド蛋白から生成する。さらに、別の態様では、ウイルス様−粒子は天然の感染パピローマウイルス粒子の抗原的特徴を含む。バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞中ひとパピローマウイルス６型（ＨＰＶ−６）および１１型（ＨＰＶ−１１）のＬ１メジャーカプシド蛋白の発現方法および６型（ＨＰＶ−６）、１１型（ＨＰＶ−１１）、１６型（ＨＰＶ−１６）および１８型（ＨＰＶ−１８）ウイルス様−粒子の製造方法も得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中でパピローマウイルスカプシド蛋白の発現を容易にする条件下、パピローマウイルスカプシド蛋白コード配列を含む組換え発現ベクターで細胞を形質導入することを含む、細胞中でのパピローマウイルスのカプシド蛋白コード配列発現方法。
【請求項２】
上記組換え発現ベクターがバキュロウイルス発現系である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記カプシド蛋白コード配列がＬ１蛋白コード配列、そのフラグメントまたは部分である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記パピローマウイルスが動物およびひとパピローマウイルスからなる群から選ばれるものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記パピローマウイルスが生殖器ひとパピローマウイルス型である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記ひとパピローマウイルスが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８からなる群から選ばれるものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記ひとパピローマウイルスが、ＨＰＶ−１１である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
上記ひとパピローマウイルスが、ＨＰＶ−６である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
上記細胞が、原核細胞および真核細胞からなる群から選ばれるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
上記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
上記細胞が昆虫細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
上記形質導入段階が感染によるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
上記Ｌ１蛋白コード配列が、５個のヌクレオチドであるｍＲＮＡ分解シグナル配列ＡＵＵＵＡの突然変異または欠失したものを含むものである、請求項３記載の方法。
【請求項１４】
昆虫細胞でのパピローマウイルスのカプシド蛋白コード配列発現方法であって、
パピローマウイルスカプシド蛋白コード配列を、バキュロウイルス転移ベクター中にクローニングすること；
上記バキュロウイルス転移ベクターおよびオートグラフィカ・カリホルニカ核多面体(polyhedrosis)ウイルスゲノムＤＮＡを昆虫細胞に同時形質導入すること、
組換えバキュロウイルスを回収すること、
細胞中で上記カプシド蛋白の発現を容易にする条件下、上記組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
上記カプシド蛋白コード配列がＬ１蛋白コード配列である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
上記昆虫細胞がＳｆ−９細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
上記パピローマウイルスがひとパピローマウイルスである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−１１である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−６である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
請求項１または１４記載の方法により製造された組換えパピローマウイルスカプシド蛋白。
【請求項２２】
請求項２１記載の組換えカプシド蛋白から産生したパピローマウイルスウイルス様−粒子、そのフラグメント、カプソメアまたは部分。
【請求項２３】
天然の感染パピローマウイルス粒子の抗原的特徴に類似する、パピローマウイルスの組換えカプシド蛋白から産生したパピローマウイルスウイルス様−粒子、そのフラグメント、カプソメアまたは部分。
【請求項２４】
上記カプシド蛋白が、Ｌ１蛋白コード配列、そのフラグメントまたは部分によってコードされている、請求項２３記載のウイルス−様粒子。
【請求項２５】
上記Ｌ１蛋白コード配列がバキュロウイルス発現系を用いて、細胞中で発現されるものである、請求項２４記載のウイルス様−粒子。
【請求項２６】
上記パピローマウイルスが、ひとおよび動物パピローマウイルスからなる群から選ばれるものである、請求項２３記載のウイルス様−粒子。
【請求項２７】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８である、請求項２６記載のウイルス様−粒子。
【請求項２８】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−１１である、請求項２７記載のウイルス様−粒子。
【請求項２９】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−６である、請求項２７記載のウイルス様−粒子。
【請求項３０】
パピローマウイルス・ウイルス様−粒子、そのフラグメント、カプソメアまたは部分の製造方法であって、
パピローマウイルスカプシド蛋白配列の発現を容易にする条件下、上記カプシド蛋白コード配列を含む組換え発現ベクターを細胞に感染させ、それによって上記ウイルス様−粒子を製造することを特徴とする方法。
【請求項３１】
上記組換え発現ベクターがバキュロウイルス発現系である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
上記パピローマウイルスがひとパピローマウイルスである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−１１である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
上記ひとパピローマウイルスがＨＰＶ−６である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
上記カプシド蛋白コード配列がＬ１蛋白コード配列である、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
上記細胞が昆虫細胞である、請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
上記Ｌ１蛋白コード配列が、５個のヌクレオチドであるｍＲＮＡ分解シグナル配列ＡＵＵＵＡの突然変異または欠失したものを含むものである、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
パピローマウイルス様−粒子、そのフラグメント、カプソメアまたは部分の製造方法であって、
パピローマウイルスカプシド蛋白コード配列を、バキュロウイルス転移ベクター中にクローニングすること；
上記バキュロウイルス転移ベクターおよびオートグラフィカ・カリホルニカ核多面体(polyhedrosis)ウイルスゲノムＤＮＡを昆虫細胞に同時形質導入すること、
組換えバキュロウイルスを回収すること、および
上記蛋白の発現を容易にする条件下、上記組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させること、それによって上記ウイルス様−粒子を製造すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３０または３９記載の方法により製造されたパピローマウイルス・ウイルス様−粒子、そのフラグメント、カプソメアまたは部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は総体的にパピローマウイルス（Papillomavirus：ＰＶ）に関する。より具体的には、本発明は、バキュロウイルス発現系を用いるひとパピローマウイルス６型（ＨＰＶ−６）および１１型（ＨＰＶ−１１）カプシド蛋白コード配列の発現、ＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の製造およびＨＰＶ上のエピトープを認識する抗体の産生、ＨＰＶワクチン開発、ＨＰＶ感染の検出のための血清学的テストのためのこれらのＶＬＰｓの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パポバウイルス科は溶解性感染および良性または悪性のいずれかの腫瘍の両方を誘発する１群のＤＮＡウイルスを構成する。構造的には、全て７２カプソメアを有する裸の２０面体のビリオンであり、２本鎖環状ＤＮＡを含む。この科に含まれるウイルスは；（１）ひとおよび動物のパピローマウイルスであり、（２）マウスポリオマウイルスであり、（３）サル空胞ウイルスおよび（４）ひとウイルスＢＫおよびＪＣである。
【０００３】
ひとパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、組織−特異的方法で皮膚、生殖器、口および呼吸器の上皮に感染する。ＨＰＶによる感染は良性疾患および悪性疾患の両方の進行に密接に関連している（非特許文献１および２）。例えば、ＨＰＶ１型（ＨＰＶ−１）は足底いぼに、ＨＰＶ６型または１１型（ＨＰＶ−６またはＨＰＶ−１１）は尖圭コンジローム（肛門生殖器のいぼ）に存在し、一方、ＨＰＶ１６型または１８型（ＨＰＶ−１６または１８）は通常、頸部鱗状上皮の前悪性および悪性細胞溶解物に存在する（非特許文献３、４、５および６参照）。
【０００４】
インビトロにおけるＨＰＶの増殖の困難性は免疫学的研究のための抗原産生への別のアプローチの研究に導いた。例えば、ボネら、ＨＰＶ−６ｂＬ１ ＯＲＦのPstI-XboII制限フラグメントはＨＰＶ６尖圭コンジローム患者からの血清および対照により決定されたように免疫学的特異性を欠き（非特許文献７、８、９、１０および１１）は原核生物系における組換えカプシド蛋白コード配列を発現させ、それらを生殖管のＨＰＶ感染患者から得られた血清のウエスタン・ブロッティング分析に用いた。これらの研究から得られた結果は、変性した、すなわち、ＨＰＶカプシド蛋白の直鎖状エピトープに対する抗体がある種の感染患者の血清中に検出され得ることを示唆した。
【０００５】
ウイルス粒子全体は立体配座エピトープを目的とする抗体を含む、ひと血清中の抗体の検出に用いられてきた。多くの天然に存在するＨＰＶ誘導融解はわずかの粒子しか産生しないので、これらの研究を行うのは非常に困難であった。しかしながら、ウイルス粒子全体は、ＨＰＶ−１型−誘導足底いぼから免疫学的研究を行うのに十分な量で得られる（非特許文献１２、１３および１４）および実験的−誘導ＨＰＶ−１１型無胸腺マウス・ゼノグラフ（非特許文献１５および１６）。より具体的には、クライダーらの特許文献１は、無胸腺マウス・ゼノグラフ・モデル系を用いて実験室にて感染性ＨＰＶ−１１ビリオンの増殖方法を開示している。しかしながら、この系は生殖器ＨＰＶ感染のための血清学的試験の検討のために用いられた感染性ウイルスの相当量を産生し得るが、この系は非常に高くつき、また面倒である。さらに、この系では性器ＨＰＶ型の１種のみががこれまで増殖されており、その利用性は限定されている。さらに、この系を用いて産生された感染性ウイルスはバイオハザードを示し、従ってワクチン製剤に用いることは困難である。
【０００６】
ゾウらは、非特許文献１７において、ワクシニアウイルスＨＰＶ−１６Ｌ１／Ｌ２二重組換え発現ベクターで感染後ＣＶ−１細胞核中のＨＰＶ−１６ウイルス−様粒子の形成を報告している。しかしながら、著者らはＬ１のみを発現するベクターでＶＬＰ類を産生させることはできなかった。さらに、産生されたＶＬＰ類ははっきりした対称性を欠き、大小がさまざまであり、本発明のＨＰＶビリオン（５５ｎｍ）またはＶＬＰ類のいずれよりも小さく直径がわずか約３５−４０ｎｍである（バキュロウイルスは、直径約５０ｎｍのＨＰＶ−１１ＶＬＰ類を産生した）。
【０００７】
ミンソンの特許文献２は所望の特異性を有するモノクローナル抗体のためのハイブリドーマ培養上清のスクリーニング法を開示している。
ミンソンの方法は例えば、ひとパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）のＬ１蛋白を、マウスにおける標的抗原とし用いてこの蛋白に対する抗体の産生を挙げることができる。しかしながら、ミンソンはＬ１蛋白の発現またＨＰＶウイルス−様粒子（ＶＬＰｓ）を開示していない。
【０００８】
スクールニクらの特許文献３はパピローマウイルスに対する型−特異的抗体を溶出する、数種のパピローマウイルスの読み取り枠の初めの領域から誘導される短いペプチド配列を開示している。しかしながら、発明者らは主要な後部の読み取り枠、Ｌ１を目的とする配列は開示していない。
【０００９】
ランカスターらの特許文献４は、発明者がパピローマウイルス型−特異的エピトープをコードすると主張するパピローマウイルスＬ１カプシド蛋白読み取り枠の約３０個のポリヌクレオチド配列を開示している。しかしながら、発明者らはこの配列を認識する抗体を産生する感染動物を開示していない。そのかわり、発明者らはこの配列（１０個のアミノ酸ペプチド、すなわち、デカペプチド）のうしパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）変異型を合成し、ついで、うさぎを免疫化し、ＢＰＶ−１およびＢＰＶ−２のいずれかの誘導線維乳頭腫（fibropapilloma）組織と反応する抗血清能力を試験した。このペプチド抗血清はＢＰＶ−１組織とのみ反応し、ＢＰＶ−２組織とは反応しなかった。ついで、発明者は、このペプチドが型−特異的である抗原決定基を含み、従って、すべてのパピローマウイルスＬ１コード配列はこの遺伝子座に型−特異的エピトープを含むと結論した。この逆説を支持するデータを持たない発明者の側からは理論的な推測である。さらに、このアミノ酸配列は一般により高いオーダーの抗原的構造、すなわち、この明細書に記載された方法により製造されるような３次元構造を有する立体配座エピトープであり得ないと考えられている。
【００１０】
パピローマウイルス感染に関する別の問題は別の治療的および予防的様式の必要性である。このような様式の１つは最近ほとんど研究されていないパピローマウイルスワクチンであろう。１９４４年に、ビバーシュタインが患者のいぼから誘導した自原性ワクチンで尖圭コンジローム患者を処置した（非特許文献１８）。その後、パウエルらは、尖圭コンジロームの処置のための自原性いぼワクチンの現在典型的に用いられている製造技術を開発した（非特許文献１９）。自原性ワクチンの効果を評価するために、たった１つの２重盲検プラセボー対照研究がおこなわれた（非特許文献２０）。著者らは、自原性ワクチン治療は尖圭コンジロームの治療には効果がなかったと結論づけたが、この解釈は誤っているかもしれない。被検患者の数が有効な反対の結論を引き出すことを妨げた。いずれにしても、自原性ワクチンには、ここに述べたように、いくつかの不利な点がある。第１に、ワクチンを製造するために患者に比較的大きないぼがある（２ｇ〜５ｇ）ことが必要である。第２に、実験者が、処置患者が来るたびに実験装置を用い、専門家としての意見を求められる。すなわち、ワクチン製造は非常に高価につき、かつうんざりするものであり、比較的小さないぼの場合は不可能である。
【００１１】
不幸にして、ウイルス増殖の伝統的な方法は未だパピローマウイルスの研究には採用することができず、また既述のように別の方法もまた、免疫学的研究のための有効量の感染ビリオンを製造することができない。無胸腺系マウスにおけるＨＰＶ−１１のインビボ増殖は、非常に高価であり、労働集約的であり、現在はＨＰＶ−１１に限定されているところから、かなり実用的でない。従って、免疫学的研究およびワクチン製造に使用するためのＨＰＶカプシドのエピトープの別の製造方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】アメリカ合衆国特許出願５，０７１，７５７
【特許文献２】アメリカ合衆国特許第５，０４５，４４７号
【特許文献３】アメリカ合衆国特許第４，７７７，２３９号
【特許文献４】アメリカ合衆国特許第５，０５７，４１１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ライヒマンら、パピローマウイルス、１１９１−１２００頁（１９９０年）
【非特許文献２】マンデルら、感染病の原理と操作３版、ニューヨーク州、ニューヨーク、チャーチル・リビングストーン
【非特許文献３】クラムら、「ひとパピローマウイルス感染および頸部新形成：新考察」インターナショナル・ジャーナル・オブ・ガイネコロジカル・パトロジー３巻３７６−３８８頁（１９８４年）
【非特許文献４】ズール・ホーセン、生殖器パピローマウイルス感染８３−９０頁（１９８５年）
【非特許文献５】リグビーら、ウイルスおよび癌、ケンブリッジ（イギリス）
【非特許文献６】コーツキィら、「生殖器ひとパピローマウイルス感染の疫学」エピデミオロジー改訂版１０巻１２２−１６３頁（１９８８年）
【非特許文献７】ＵＣＬＡシンポジウム・モルキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー新訂版１２４巻７７−８０頁（１９９０年）
【非特許文献８】ジェニソンら、エシェリヒア・コリ−発現融解蛋白を用いることによるひとパピローマウイルス６ｂ型の免疫活性抗原の同定（ジャーナル・オブ・ビロロジー６２巻２１１５−２１２３頁（１９８８年））
【非特許文献９】リーら、コンジロームにおけるひとパピローマウイルス６ｂＬ１型読み取り枠蛋白およびひと血清における対応する抗体（ジャーナル・オブ・ビロロジー６１巻２６８４−２６９０頁（１９８７年））
【非特許文献１０】スティールら、ひとパピローマウイルス１型の分裂または非分裂エピトープに対するひと血清の体液試験（ビロロジー１７４巻３８８−３９８頁（１９９０年））
【非特許文献１１】ストライクら、ひとパピローマウイルス６ｂ型の完全なＬ１およびＬ２読み取り枠を含む７個のＤＮＡセグメントのエシェリヒア・コリにおける発現および共通抗原(commom antigen)の位置（ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７０巻５４３−５５５頁（１９８９年））
【非特許文献１２】キーンツラーら、ひと足底いぼにおけるひとパピローマウイルス１型（ＨＰＶ−１）の体液および細胞媒介免疫性、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー１０８巻６５−６７２頁（１９８３年）
【非特許文献１３】フィッツァーら、ひとパピローマウイルス１型（ＨＰＶ−１）感染の血清疫学的研究（インターナショナル・ジャーナル・オブ・カンサー２１巻１６１−１６５頁（１９７８年））
【非特許文献１４】スティールら、ひとパピローマウイルスの分裂および非分裂エピトープに対するひと血清の体液検定（ビロロジー１７４巻３８８−３９８頁（１９９０年））
【非特許文献１５】クライダーら、感染性ひとパピローマウイルス１１型のインビボにおける実験室的生産、（ジャーナル・オブ・ビロロジー６１巻５９０−５９３頁（１９８７年））
【非特許文献１６】クライダーら、尖圭コンジロームからパピローマウイルスによるひと子宮頸部のインビボにおける形態学的変化（ネイチャー３１７巻６３９−６４１頁（１９８５年））
【非特許文献１７】ゾウら、上皮細胞におけるワクシニア組換えＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２ＯＲＦの発現はＨＰＶビリオン−様粒子の組立てのために十分である（ビロロジー１８５巻２５１−２５７頁（１９９２年））
【非特許文献１８】ビバーシュタイン、いぼの免疫治療、Ａrch. Ｄermatol Ｓyphilol５０巻１２−２２頁（１９４４年）
【非特許文献１９】パウエルら、自原性ワクチンによる尖圭コンジロームの処置、サザン・メディカル・ジャーナル６３巻２０２−２０５頁（１９７０年）
【非特許文献２０】マリソンら、尖圭コンジロームの自原性ワクチン治療：２重盲検対照研究、Ｂr．Ｊ．Ｖener．Ｄis.５８巻６２−６５頁（１９８２年）
【発明の概要】
【００１４】
本発明は１９９３年３月９日に出願された現在係属中のアメリカ合衆国特許出願番号０８／０２８，５１７号および１９９４年３月７日に出願された現在係属中のアメリカ合衆国特許出願（番号未通知）の１部継続出願である。
アメリカ合衆国政府は国立保健研究所(National Institute of Health)からの公共保健助成金(Public Health Service Awards)であるＡＩ−８２５０９、ＡＩ−３５１５９およびＣＡ−１１１９８に応じて本発明に一定の権利を有し得る。
【００１５】
発明の要約
本発明は細胞中のパピローマウイルス（ＰＶ）のカプシド蛋白コード配列の発現方法に関するものであり、この方法は、細胞中で蛋白を容易に発現させる条件下でパピローマウイルスカプシド蛋白コード配列を含む発現ベクターでの細胞の形質転換を含む。
本発明の別の態様は、パピローマウイルスカプシド蛋白から生成されたウイルス−様粒子類（ＶＬＰｓ）、フラグメント類、カプソメア類、またはそれらの部分を提供するものである。この発明において、ウイルス−様粒子は天然の感染性パピローマウイルス粒子に類似する抗原的特徴を含むことが判明した。
【００１６】
本発明のより好ましい具体例において、バキュロウイルス発現系を用いて、Ｓｆ−９昆虫細胞において、ひとパピローマウイルス６型（ＨＰＶ−６）および１１型（ＨＰＶ−１１）のＬ１カプシド蛋白コード配列の発現方法を提供する。ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１コード配列は当分野における標準的技術を用いてバキュロウイルス形質転換ベクター中にクローニングされた。得られたバキュロウイルス形質転換ベクターは、組換えバキュロウイルス（Ａｃ６Ｌ１またはＡｃ１１Ｌ１）を生成するオートグラファ・カリホルニカ（Autographa californica）核多面体ウイルス(ＡｃＮＰＶ)でＳｆ−９昆虫細胞に同時形質転換され、組換えバキュロウイルスを回収した。その後、細胞中に蛋白を容易に発現させ得る条件下、Ｓｆ−９昆虫細胞はＡｃ６Ｌ１またはＡｃ１１Ｌ１のいずれかに感染させた。Ｌ１蛋白がウイルス−様粒子（ＶＬＰｓ）を生成することが判明した。ＶＬＰｓは、Ａｃ１１Ｌ１組換えバキュロウイルスで感染させたＳｆ−９細胞から得られたネガチィブ−染色スクロースバンドの画分の電子顕微鏡により同定された。さらに、ＶＬＰｓは、うさぎ抗血清により明らかにされたように天然のＨＰＶ−１１ビリオンに類似する免疫学的および形態学的特徴を有することが判明した。
【００１７】
本発明によるウイルス−様粒子類は診断法に用いることができ、ＨＰＶ細胞レセプターの同定および特徴化に１役果たし、またワクチン開発（治療および予防の両方）に用い得る。ＨＰＶ−１１およびＨＰＶ−６の産生のためにこの明細書に記載の本発明の方法は、同様の他の動物および／またはひとパピローマウイルスからの免疫学的試薬の製造のために用いることができる。さらに、本発明により産生されたＶＬＰｓはパピローマウイルスの免疫学的研究を実施し、パピローマウイルスに対するワクチンを開発するための豊富な試剤を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Fig.１Ａは、野生型ＡｃＮＰＶおよび組換えＡｃ１１Ｌ１−感染Ｓｆ−９細ライゼートのクーマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。Fig.１Ｂは、ＨＰＶＬ１共通エピトープに特異的なうさぎポリクローナル抗血清で確認された、野生型ＡｃＮＰＶおよびＡｃ１１Ｌ１感染ＳＦ−９細胞ライゼートのウエスタンブロットを示す。
【図２】Fig.２は、Ａｃ１１Ｌ１−感染ＳＦ−９細胞からのスクロース密度遠心分離により回収されたＨＰＶ−１１ウイルス−様粒子の電子顕微鏡写真を示す。示されたＶＬＰｓは直径約５２ｎｍであり（拡大基準による測定）、２０面体対称を有しており、天然−生成パピローマウイルスの形態学的特徴に関して公開された観測に一致している。
【図３】Fig.３は、組換えＬ１とのうさぎ抗血清免疫反応性のウエスタンブロッティングおよびイムノドットブロッティングの比較を示す。Ａ図において、組換えＬ１昆虫細胞ライゼートは変性条件下でウエスタン・ブロッティングされた。Ｂ図において、非−組換え（＋）または組換えＬ１（Ｌ１）昆虫細胞ライゼートを非−変性条件下で染色膜においた。Ａ列はＨＰＶＬ１共通エピトープに特異的なうさぎポリクローナル抗血清で確認された。Ｂ列はＨＰＶＬ１のアミノ末端アミノ酸配列に特異的なうさぎポリクローナル抗血清で確認された。Ｃ列はうさぎポリクローナル全ウイルス粒子抗血清で確認された。
【図４】Fig.４は、組換えＬ１昆虫細胞ライゼートを用いたウエスタンブロッティング試験を示す。Ａ〜Ｘ列は用いられた種々の１次抗体に対応する（Ａ列およびＢ列は免疫前および免疫後うさぎ抗−全ウイルス粒子抗血清変性Ｌ１共通エピトープと反応させた；Ｃ列は免疫後うさぎ抗−変性Ｌ１共通エピトープ抗血清と反応させた；Ｄ〜Ｏ列は尖圭コンジローム患者抗血清と反応させた。Ｐ〜Ｘ列は対照血清と反応させた）。
【図５】Fig.５は、昆虫細胞ライゼートを用いるイムノドットブロッティング試験を示す。列のアルファベットは用いられた種々の１次抗体に対応し、それはFig.４の記載と同様である。
【図６】Fig.６は、ＨＰＶ−６Ｌ１組換えバキュロウイルス（Ａｃ６Ｌ１）の構築および発現により産生された、ＨＰＶ６型ＶＬＰｓの電子顕微鏡写真を示す。
【図７】Fig.７は、ＨＰＶ−１６Ｌ１組換えバキュロウイルス（Ａｃ１６Ｌ１）の構築および発現により産生された、ＨＰＶ１６型ＶＬＰｓの電子顕微鏡写真を示す。
【図８】Fig.８は、ＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰｓに対する尖圭コンジローム患者の血清反応性を示す。
【図９】Fig.９は、ＨＰＶ−１１ビリオンとＨＰＶ−１１ＶＬＰｓに対する血清反応性間の相関関係を示す。
【図１０】Fig.１０（a）は、ＨＰＶ−１１Ｌ１（レーン２）およびＨＰＶ−１６Ｌ１（レーン３）蛋白のウエスタンブロッティングを示す（左図）。分子量対照マーカーは左端であり、矢印はＨＰＶ−１１およびＨＰＶ−１６組換えＬ１蛋白の大体の位置を示す。Fig.１０（b）は、レーン１：ＡｃＮＰＶ（野生型バキュロウイルス−感染試料）；レーン２：Ａｃ１１Ｌ１（組換えＡｃ１１Ｌ１−感染試料）；レーン３：Ａｃ６Ｌ１（組換えＡｃ６Ｌ１−感染試料）のイムノドットブロッティングを示す（右図）。
【図１１】Fig.１１は、Ａｃ１１Ｌ１−感染Ｓｆ−９細胞培養上清中の組換えＨＰＶ−１１Ｌ１のＳＤＳＰａｇｅおよびウエスタンイムノブロッティング検出を示す（Ａ図：ＳＤＳ page（クーマシー染色）；Ｂ図：ウエスタンブロッティング、ＰＶＬ１共通抗原血清を使用；レーン１：非−組換えＡｃＮＰＶ−感染細胞培養上清からの高速ペレット；レーン２：Ａｃ１１Ｌ１−感染Ｓｆ−９細胞培養上清からの高速ペレット；分子量マーカー（Ｍr）は左端；右端の矢印は５５ｋＤ Ｍr組換えＬ１の位置を示す）。
【図１２】Fig.１２は、粗−およびＣsＣl−精製ＶＬＰ調製物（Ａ−Ａｃ１１Ｌ１−感染Ｓｆ−９細胞無含有培養上精からペレット化されたＶＬＰｓ；Ｂ−ＣsＣl−精製ＶＬＰｓ；線分＝５０ｎｍ）の電子顕微鏡分析を示す。
【図１３】Fig.１３は、精製組換えＶＬＰｓおよびＨＰＶ−１１全ビリオン（レーン１：免疫前血清；レーン２：免疫後血清；Ａ−うさぎＲ−３６６、精製ＨＰＶ−１１全ビリオンで免疫化；Ｂ−うさぎＲ−３９９、ＨＰＶ−１１ＶＬＰｓで免疫化；抗原：ＶＬＰ（ＨＰＶ−１１Ｌ１ウイルス−様粒子）；ＷＶＰ（ＨＰＶ−１１全ウイルス粒子））のイムノドットブロッティング分析を示す。
【図１４】Fig.１４は、異種移植(xenograft)幾何平均直径（ＧＭＤ）のドットプロット分析を示す。
【図１５】Fig.１５は、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８精製ＶＬＰ調製物（レーンＡ、ＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰｓ；レーンＢ、ＨＰＶ−１６Ｌ１ＶＬＰｓ；レーンＣ、ＨＰＶ−１８Ｌ１ＶＬＰｓ）のウエスタンブロッティング免疫試験を示す。
【図１６】Fig.１６（Ａ〜Ｃ）は、ＨＰＶ−１１、１６および１８型に由来する塩化セシウム−精製ＶＬＰｓの電子顕微鏡写真を示す。ＶＬＰｓは明細書に記載と同様にして精製され、２％リンタングステン酸でネガティブ−染色された。Ａ）ＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰｓ；Ｂ）ＨＰＶ−１６Ｌ１ＶＬＰｓ；Ｃ）ＨＰＶ−１８Ｌ１ＶＬＰｓ；線分は１００ｎｍに対応する。
【図１７】Fig.１７は、同種および異種ＶＬＰｓ調製物での免疫後ＶＬＰうさぎ抗血清の免疫反応性を示す。抗原：ＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰs、白い棒；ＨＰＶ−１６Ｌ１ＶＬＰｓ、点斜線の棒；ＨＰＶ−１８Ｌ１ＶＬＰｓ、黒色斜線。抗血清：Ａ）抗−ＰＶＬ１共通抗原(common antigen)うさぎ抗血清；Ｂ）ＨＰＶ−１１全ビリオンうさぎ抗血清；Ｃ、Ｄ）ＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰｓで免疫化した２わのうさぎから；Ｅ、Ｆ）ＨＰＶ−１６Ｌ１ＶＬＰｓで免疫化した２わのうさぎ；Ｇ、Ｈ）ＨＰＶ−１８Ｌ１ＶＬＰｓで免疫化した２わのうさぎから。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞中で蛋白を容易に発現させる条件下バキュロウイルス発現系を用いて、細胞中でのパピローマウイルスカプシド蛋白コード配列の発現方法に関するものである。本発明の別の態様では、ウイルス−様粒子類（ＶＬＰｓ）、フラグメント類、カプソメア類、またはそれらの部分パピローマウイルスカプシド蛋白から生成されることが判明した。さらに、ウイルス−様粒子は天然の感染性パピローマウイルス粒子に類似する抗原的特徴を含むことが判明した。
【００２０】
ここに用いる「ウイルス−様粒子類（ＶＬＰｓ）」とは、パピローマウイルスカプシド蛋白から生成され、天然の感染性パピローマウイルス粒子に類似する抗原的特徴を含む、ウイルス−様粒子類（ＶＬＰｓ）、フラグメント類、カプソメア類、またはそれらの部分である。ここに用いる「抗原的特徴」とは、（１）ＶＬＰｓまたは感染性ウイルスのいずれかで免疫化された動物および／またはひと中に産生される抗血清によって確認される、野生型（同じＨＰＶ型の天然感染性ウイルス粒子）と交差反応するウイルス−様粒子の能力；および／または（２）同種ウイルスに感染していることが判明している患者からのひと血清中の抗体を認識または検出し得る能力をいう。
【００２１】
この明細書における「Ｌ１蛋白コード配列」または「Ｌ１カプシド蛋白コード配列」または「Ｌ１コード配列」とは、パピローマウイルス中のＬ１蛋白をコードする読み取り枠をいう。発現されると、Ｌ１蛋白コード配列は、天然パピローマウイルスビリオンに類似する免疫学的および形態学的特徴を有する蛋白、または蛋白複合体、または凝集体を産生する。本発明において用いられるＬ１コード配列はパピローマウイルスゲノムＤＮＡから分離または精製されるか、標準的な遺伝子工学技術によって合成され得る。
【００２２】
この明細書における、用語「形質転換すること」とは、細胞中にウイルス、プラスミドまたはベクターを導入するためのなんらかの手段をいう。この手段の例は、感染、りん酸カルシウム沈澱およびエレクトロポレーションを含む。
より好ましい具体例において、バキュロウイルス発現系を用いて、Ｓｆ−９昆虫細胞における、ひとパピローマウイルス１１型（ＨＰＶ−１１）およびひとパピローマウイルス６型（ＨＰＶ−６）のＬ１カプシド蛋白のコード配列の発現方法を提供するものである。これらのＨＰＶ型のカプシド蛋白コード配列は説明のためにのみ用いられ、いかなる動物またはひとパピローマウイルス型のいかなるＬ１カプシド蛋白コード配列も本発明の所期の範囲から逸脱することなく用いられ得ると理解されねばならない。このようなＨＰＶ型には、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５（ギスマンら、カンサー・セルズ５巻２７５頁（１９８７年）、ここに引用してこの明細書の記載とする）；およびバウスネルらのＰＣＴ公開ＷＯ９２／１６６３６号中に開示されたＨＰＶ型（引用してこの明細書の記載とする）を含む。
【００２３】
本発明の方法に用いられる好ましい発現系はバキュロウイルス発現系であるが、いかなる他の発現系も採用し得る。ただし、その系がＬ１蛋白コード配列を発現し得ることが条件である。この系の例には、アデノウイルス、ＳＶ４０、エシェリヒア・コリ、１９９３年３月９日ＣＨＯ細胞、ワクシニア・ウイルス、昆虫ウイルス、酵母、バクテリオファージ・ウイルスまたは修飾ウイルス、ＤＮＡプラスミド、ベクターなどを含む原核および／または真核細胞系が含まれるがこれに限定されるものはない。Ｌ１コード配列の発現のための宿主細胞は用いられる発現系により変化する。適当な宿主細胞には、以下に限定されるものではないが、細菌（原核生物）、酵母などの微生物、哺乳動物細胞（真核生物）および昆虫細胞が含まれる。バキュロウイルス発現系を用いるときは、Ｓｆ−９またはＳｆ−２１などの昆虫細胞が好ましい。
【００２４】
本発明の別の態様では、Ｌ１蛋白が、パピローマウイルスカプシド蛋白から産生されるウイルス−様粒子類（ＶＬＰｓ）、フラグメント類、カプソメア類、またはそれらの部分を生成することが判明したことである。ウイルス−様粒子は天然の感染性パピローマウイルス粒子に類似する抗原的特徴を含むことが判明した。より具体的には、これらのＶＬＰｓは、生殖器のＨＰＶ−感染患者から得られた血清中に存在する抗体によって特異的に認識される抗原決定基を含む。例えば、ウエスタンブロッティングおよびイムノドットブロッティング試験法によって帰結される、変性または非変性カプシドエピトープのいずれかに対する抗血清とのＶＬＰ−含有昆虫細胞抽出物の反応は、天然ＨＰＶ−１１感染性ビリオン中に存在する立体配座エピトープがまた、本発明のバキュロウイルス−産生ＨＰＶ−１１ＶＬＰｓ上にも存在することを示唆する。バイオプシーによって証明された尖圭コンジロームの患者から得られたひと血清を用いるイムノドットブロッティング試験法は、ボネら（尖圭コンジロームのひと中の特異的抗体を検出するためのＥＬＩＳＡにおけるひとパピローマウイルス１１型の利用、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７２巻１３４３−１３４７頁（１９９１年）、ここに引用してこの明細書の記載とする）に記載のＨＰＶ−１１全ウイルス粒子によるＥＬＩＳＡ試験で既に得られている結果と密接な相関関係を有する。
【００２５】
天然ＨＰＶ−１１ビリオンに対するこれらの形態学的および免疫学的類似性はバキュロウイルス系で産生された組換えＶＬＰｓが、生殖器ＨＰＶ感染およびあらゆるパピローマウイルスの血清−疫学および病原研究だけでなく、ワクチン開発にも有用であることを示唆している。すなわち、Ｌ１は自己−組立て(self assembly)のための固有の能力を有している。すなわち、他のパピローマウイルス蛋白は、バキュロウイルス系中でのＶＬＰ生成に必要ではない。これは、すべての型のパピローマウイルスのＶＬＰｓはここに記載の方法によって製造され得るという主張を支持する。
【００２６】
本発明のＶＬＰｓはＨＰＶによる感染に対する防御が必要な患者に抗体、すなわち、ワクチンを産生させるために、またはすでに存在するＨＰＶ感染に対する免疫応答をを高めるために使用することができる。本発明のＶＬＰｓは診断に有用な抗血清を得るための動物種に投与することができる。ポリクローナル抗体に加えて、モノクローナル抗体をコーラーおよびミルスタインの方法、またはそれらの修正方法を用いて、脾臓、または抗体−産生クローン、すなわち、ハイブリドーマを得るために注射された動物からの他の抗体産生細胞を不死化することによって得られ得る。
【００２７】
得られた抗体は、頸部バイオプシーまたはパパニコラウ・スミアのＨＰＶ感染の診断およびひとまたは他の対象における疾患の程度の判断のために用いることができる。特に、本発明の抗体を用いる診断は病状の進展の観察を可能にする。この抗体はウイルスを検出するための、および感染または腫瘍の制御を目的とする抗ウイルス性または他の治療試剤による治療の進行を観察するための血清の分析に使用することができる。この抗体はまた種(species)の変化を考慮した受動的治療としても用い得る。
【００２８】
本発明のＶＬＰｓは、ＨＰＶ感染の疑いのある患者の血清中のＨＰＶに対する抗体の存在を検出ための、または抗−ＨＰＶワクチンで処置されている患者の血清の測定のための免疫測定に使用され得る。
本発明のＶＬＰｓは、宿主に直接投与して、中和する抗体の生成を誘導し（ボネら、１９９２、前掲；およびローズら、印刷中、前掲、ここに引用してこの明細書の記載とする）、ＨＰＶに対する防御的免疫を授けるか、患者が既に感染しているならば、患者自身の免疫応答を強化することができる。すべての適用のために、ＶＬＰｓは免疫原性形態で投与される。所望により、ＶＬＰｓは、免疫原性供与担体物質と結合させることができるが、その物質は好ましくは免疫原的に中性であることが望ましい。所望の用途により、本発明のＶＬＰｓは、型特異的または広範囲のワクチンおよび診断剤として役立つ能力を有する。
【００２９】
ワクチンとして投与されるべきＶＬＰｓは、防御されるべき患者へのそのような投与のための通常用いられる方法および／または将来の方法に従って製剤化することができ、また通常用いられるアジュバントと混合することができる。発現されたペプチドは、サブユニット・ワクチン製剤（多価であってもよい）における免疫原として用いることができる。多価ワクチン製剤は種々のＨＰＶｓからの１種の異なるＬ１蛋白をエンコードする各ＶＬＰｓを含むことができる。生成物は、異種の蛋白を発現するベクター／宿主系からワクチン製剤化の目的で精製され得る。精製されたＶＬＰｓは適当な濃度に調整され、適当なアジュバントとともに製剤化され、包装される。適当なアジュバントは、以下に限定されるものではないが：鉱物性ゲル、例えば、水酸化アルミニウム；界面活性剤、例えば、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール類；ポリアニオン類；ペプチド類；オイル・エマルジョン；および非常に有効なひとアジュバント類、例えば、ＢＣＧ（バシル・カルメット−ゲラン）およびコルネバクテリウム・パルブムである。免疫原はリポソーム中に組み込むことができ、またポリサッカライド類および／または他のワクチン製剤用のポリマー類に結合させることができる。多くの方法が上記のワクチン製剤の投与のために用いられ得；以下に限定されるものではないが、これらには、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内経路がある。もしそれらが、診断剤として直接用いられるときは、通常用いられる方法により精製され、用途に従って包装される。もしそれらが診断目的の抗体を産生させるために用いられるときは、適当な抗血清を調製するために、都合のよい実験動物を用いることができる。適当な宿主にはマウス、ラット、うさぎ、モルモット、またはひつじなどのさらに大きな哺乳動物を用いることができる。抗体は処置されるべき動物に適合するかぎり、治療的に用い得る。適切な種の特徴を有するモノクローナル抗体が、この用途には好ましい。
下記の実施例は本発明をさらに具体的に説明するものである。
【実施例】
【００３０】
実施例Ｉ
方法
１．ＨＰＶ−１１ウイルスＤＮＡ及びpＶＬ１１Ｌ１バキュロウイルストランスファーベクター構築
ＨＰＶ−１１ゲノムＤＮＡは、ローズ等、「エクスプレッション・オブ・ザ・フル−レングス・プロダクツ・オブ・ジ・ＨＰＶ−６b・アンド・ＨＰＶ−１１Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・バイ・リコンビナント・バキュロウイルス，アンド・アンチゲニック・コンパリゾンス・ウィズ・ＨＰＶ−１１・ホール・ウイルス・パーティクルス」1990、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ ７１巻、2725−2729頁（これを引用して明細書記載の一部とする）により開示されたように実験的に誘導された無胸腺マウス異種移植片から精製した。Ｌ１コード配列は、それぞれ５'および３'末端でＢglIIおよびＥcoＲＩ制限酵素部位を導入するよう設計されたプライマーを用い、精製ゲノムＤＮＡのＲＣＲ増幅によりクローンした。順向及び逆プライマー配列は、それぞれ、５'−ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＣ−３'（配列番号：１）及び５'−ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ−３'（配列番号：２）であった。（下線した）制限部位は、プライマー指定突然変異導入法により、推定Ｌ１開始コドンの近位、および推定Ｌ１停止コドンから約３０ヌクレオチド下流に導入した。増幅は、５００ngの各プライマーおよび２単位のＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（アンプリタク、パーキン−エルマー・シータス・コーポレーション、ノーウォーク、ＣＴ）を用い、実質的にボネズ等「アンティボディー−メディエイテッド・ニュートラリゼイション・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１（ＨＰＶ−１１）・インフェクション・イン・ザ・ヌード・マウス：デテクション・オブ・ＨＰＶ−１１ mＲＮＡs・バイ・ザ・ポリメラーゼ・チェイン・レアクション」1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス、１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されたように実施した。増幅後、ＰＣＲ生成物はＢglIIおよびＥcoＲＩにより設計した。全ＨＰＶ−１１Ｌ１読み取り枠（ＯＲＦ）を含んだ１５３９塩基対（bp）切断生成物は、ローズ等、「エクスプレッション・オブ・ザ・フル−レングス・プロダクツ・オブ・ザ・ＨＰＶ−６b・アンド・ＨＰＶ−１１ Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・バイ・リコンビナント・バキュロウイルス，アンド・アンチゲニック・コンパリゾンス・ウィズ・ＨＰＶ−１１・ホウル・ウイルス・パーティクルス」1990、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７１巻、2725−2729頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるようにアガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてバキュロウイルストランスファーベクター、pＶＬ−1392（Ｍ.Ｄ.サマーズ、テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシティー、カレッジ・ステイション、ＴＸ）の対応する部位にクローンした。得られる構築物、pＶＬ１１Ｌ１は、サマーズ等の方法、ア・マニュアル・オブ・メソーズ・フォー・バキュロウイルス・ベクタース・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロセデュアズ，1987、テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシティー、カレッジ・ステイション、テキサス（この開示を引用して明細書記載の一部とする）に従ってオー���グラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡcＮＰＶ）ゲノムＤＮＡによりＳf−９細胞を同時形質導入するのに用いた。組換えバキュロウイルスを吸蔵（occlusion)−ネガティブ（occ-）プラクの視覚試験と選択により回収し、そしてサマーズ等の方法、ア・マニュアル・オブ・メソーズ・フォー・バキュロウイルス・ベクタース・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロセデュアズ，1987、テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシティー、カレッジ・ステイション、テキサス（この開示を引用して明細書記載の一部とする）に従ってさらに２回のプラク精製に付した。分離したウイルスストックからの蛋白発現をウエスタンブロットにより測定した。
【００３１】
２．Ｓf−９細胞での組換えＬ１発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット検定
感染Ｓf−９細胞培養を１５０cm２組織培養フラスコ中で生育させて分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットアッセイ用に調製した。非組換え又は組換えＬ１−感染細胞をパスツールピペットで再懸濁することにより収集し、同数の野生型又は組換えＬ１−感染細胞を４℃、５００×gで１０分間遠心分離した。上清を除き、細胞ペレットを水に移し、直ちに１mlの溶解緩衝液（３０mＭトリス、pＨ７.６；１０mＭ ＭgＣl２；１mＭ ＣaＣl２；１mＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）；ロイペプチン（１０μg／ml）；１％ＮＰ−４０）に再懸濁し、室温で１５分間、間欠的に撹拌しながら放置した。４℃、５００×gで２分間遠心後、上清に含まれるＮＰ４０可溶性フラクションを取り、ラームリ、「クリベイジ・オブ・ストラクチュラル・プロテインズ・デューリング・ジ・アセンブリィ・オブ・ザ・ヘッド・オブ・ザ・バクテリオファージ・Ｔ４」1970、ネイチャー、２７７巻、６８０−６８５頁（その開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、２Ｘラームリ試料緩衝液で１：１に希釈し、９５℃に３分間加熱した。（核物質を含む）ＮＰ４０不溶性ペレットを冷ＰＢＳ（１mＭ ＰＭＳＦ：１０μg／ml  ロイペプチン）で一回洗浄し、１Ｘラームリ緩衝液中で煮沸、撹拌することにより溶解した。ローズ等、「エクスプレッション・オブ・ザ・フル−レングス・プロダクツ・オブ・ジ・ＨＰＶ−６b・アンド・ＨＰＶ−１１ Ｌ２・オープン・リーディング・フレイムズ・バイ・リコンビナント・バキュロウイルス，アンド・アンチゲニック・コンパリゾンス・ウィズ・ＨＰＶ−１１・ホウル・ウイルス・パーティクルス」1990，ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７１巻、2725−2729頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、試料を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、次いでクーマシィブルー染色（Ｆig.１、パネルＡ）又はイモビロン−Ｐ膜（ミリポア・コーポレイション、ニュー・ベッドフォード、ＭＡ）へのブロッティング（Ｆig.１、パネルＢ）を行った。
【００３２】
３．非組換え及び組換えＬ１ストック溶液の調製
これらのアッセイは、ＡcＮＰＶ又はＡc１１Ｌ１感染昆虫細胞のいずれかの抽出物から調製した澄明化（高速）上清ストック溶液の希釈液を用いて実施した。細胞当り１０プラク形成単位のほぼ多重感染でＡcＮＰＶ又はＡc１１Ｌ１のいずれかで感染したＳf−９細胞の浮遊培養物（１００ml）を２７℃で７２時間インキュベートした。次いで培養物を４℃、１,０００×gで１０分間遠心し、細胞ペレットを２０ml均一化緩衝液（１Ｍ ＮaＣlを含む溶解緩衝液）に再懸濁し、氷上にダンスホモゲナイザーで５０ストロークで均一化した。均一化物を冷却３０mlねじ込み口金コレックス試験管に移し、４℃、３,０００×gで１０分間、遠心した。次いで低速上清フラクションを清澄な管に移し、４℃、１００,０００×gで３０分間、遠心した。高速上清フラクションの全部蛋白濃縮物をストシェック、メソーズ・イン・エンザイモロジィ，１８２巻、５４頁、アカデミック・プレス・インコーポレーテッド、ニューヨークの「クアンチティション・オブ・プロテインズ」,1990（この開示を引用して明細書記載の一部とする）の方法に従って２８０nmでスペクトル光度測定吸収により測定し、新鮮な均一化緩衝液（蛋白濃度はほぼ３０mg／mlに等しい）で平衡に調整した。グリセロールを１０％(v／v)まで加えてストック溶液はアリコートして−２０℃で貯えた。
【００３３】
４．ウエスタンブロットおよびイムノドットブロットアッセイ
ウエスタンブロットおよびイムノドットブロットアッセイを用いてウサギ抗血清およびヒト血清の線状および配座エピトープ抗体特異性を測定した。ウエスタンブロットアッセイ（Ｆig.３、パネルＡおよびＦig.４）は、ラームリ、「クリーベイジ・オブ・ストラクチャル・プロテインズ・デューリング・ジ・アセンブリィ・オブ・ザ・ヘッド・オブ・ザ・バクテリオファージ・Ｔ４」1990、ネイチャー，２７７巻、６８０−６８５頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように蛋白変性試薬を含む１×ラムリ試料緩衝液で１：１００に希釈した２μl（約６０μg全蛋白）の組換えＬ１ストック溶液を用いて実施し、９５℃まで３分間、加熱した。変性試料を単−１００mm幅広試料ウエルに乗せ、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、イモビロン−Ｐ膜にブロットした。２％ＢＳＡ溶液（キークガード・アンド・ペリィ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド、ゲイサースバーグ、ＭＤ）で３７℃で２時間ブロックしたのち、それぞれ約２.５μg全蛋白を含む２４.４mm幅の細片にスライスした。次いで細片を抗血清でプローブした（Ｆig.３、パネルＡおよびＦig.４）。
【００３４】
イムノドットブロットアッセイ用に、非組換えまたは組換えＬ１ストック溶液を冷ＰＢＳ（１mＭ ＣaＣl２）で１：１,０００に希釈し、１００μlアリコート（約３.０μg全蛋白を含む）をイモビロン−Ｐ膜上にドットした。組換えＬ１の天然の（native）コンフォーメイションを保存するために、イムノドットブロット試料調製物から蛋白変性試薬を除いた。ブロッキング、一次および２次抗体希釈溶液、洗浄並びに用いた基質は、ストライク等、「エクスプレッション・イン・エシェリキア・コリ・オブ・セブン・ＤＮＡ・セグメンツ・コンプライジング・ザ・コンプリート・Ｌ１・アンド・Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ６b・アンド・ザ・ロケイション・オブ・ザ（コモン・アンチゲン）」1989，ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載される通りである。一次抗体インキュベーションは４℃で一晩実施し、二次抗体インキュベーションは室温で９０分間行った。イムノドットブロット用に、基質溶液を除く全ての溶液は、ＣaＣl２を１mＭ含有した。一次抗希釈は、ウサギに関しては１：２,０００でヒト血清に関しては１：１,０００であった。特異的に結合した抗体は、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（キークガード・アンド・ペティ・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド）を用い、それぞれ１：２,０００および１：５,０００の希釈液で用いたアフィニティ精製抗ウサギ（キークガード・アンド・ペティ・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド、ゲイサースバーグ、ＭＤ）または抗ヒト（ＴＡＧＯイムノダイアグノスティクス、バーリンゲノム、ＣＡ）ＩgＧ−アルカリフォスファターゼ抱合体で検出した。イムノドットブロット反応は、非組換えおよび組換えＬ１ドット強度の視覚比較により評価した。反応は、組換えＬ１ドットの色強度が同一細片上に存在する非組換えコントロールの色強度より大であれば陽性とした。
【００３５】
５．抗血清
用いた変性Ｌ１抗血清は、ストライク等、「エクスプレッション・イン・エシェリキア・コリ・オブ・セブン・ＤＮＡ・セグメンツ・コンプライジング・ザ・コンプリート・Ｌ１・アンド・Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ６ｂ・アンド・ザ・ロケーション・オブ・ザ（コモン・アンチゲン）」1989，ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により抗pＥＸ４８０として既に記載されている。本抗血清は、スタンレイ等、「コンストラクション・オブ・ア・ニュー・ファミリィ・オブ・ハイ・エフィシエンシィ・バクテリアル・エクスプレッション・ベクターズ：アイデンティフィケーション・オブ・cＤＮＡクローンズ・コーディング・フォー・ヒューマン・リバー・プロテインズ」1984，ＥＭＢＯ.ジャーナル，３巻、1429−1434頁及びストローク等、「エクスプレッション・イン・エシェリキア・コリ・オブ・セブン・ＤＮＡ・セグメンツ・コンプライジング・ザ・コンプリート・Ｌ１・アンド・Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ６ｂ・アンド・ザ・ロケーション・オブ・ザ（コモン・アンチゲン）」1989，ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁（これらの開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、ベータガラクトシダーゼのＣ末端に融合したＨＰＶ−６bＬ１読み取り枠の中央部分から誘導された１６０アミノ酸配列を含むゲル精製細菌発現融合蛋白によるウサギ免疫により得た。本配列は、ストライク等、「エクスプレッション・イン・エシェリキア・コリ・オブ・セブン・ＤＮＡ・セグメンツ・コンプライジング・ザ・コンプリート・ＬＩ・アンド・Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ６b・アンド・ザ・ロケーション・オブ・ザ（コモン・アンチゲル）」1989，ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ、７０巻、５４３−５５５頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるようにパピローマウイルスＬ１共通抗原を含む。用いたウサギ全ウイルス粒子抗血清は、ボネズ等、「アンティボディ−メディエイテッド・ニュートラリゼーション・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１（ＨＰＶ−１１）・インフェクション・イン・ザ・ヌード・マウス：デテクション・オブ・ＨＰＶ−１１ mＲＮＡs・バイ・ザ・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション」1992，ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載される通りであり、ボネズ等、「アンティボディ−メディエイテッド・ニュートラリゼーション・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１（ＨＰＶ−１１）・インフェクション・イン・ザ・ヌード・マウス：デテクション・オブ・ＨＰＶ−１１ mＲＮＡs・バイ・ザ・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション」1992，ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス、１６５巻、３７６−３８０頁及びクライダー等、「ラボラトリィ・プロダ��ション・イン・ビボ・オブ・インフェクティアス・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１」1989，ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６１巻、５９０−５９３頁（これらの開示を引用して明細書記載の一部とする）に従って無胸腺マウス包皮異種移植片から得た精製非変性ＨＰＶ−１１ビリオンによるウサギの免疫により生成した。患者血清はバイオプシー証明尖圭コンジロームの個人から得た。ボネズ等、「ユーズ・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ・イン・アン・エサイザ・ツー・デテクト・スペシフィック・アンチボディーズ・イン・ヒューマンズ・ワズ・コンディロマタ・アクミナタ」1991，ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−1347頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるようにＨＰＶ−１１全ウイルス粒子基礎ＥＬＩＳＡにより既に陽性と判っており、ＶＬＰに対して向けられた抗体を検出する能力を最大にするのに用いた。コントロール血清は終生性的接触のない修道尼から得た。これらの血清は、ボネズ等、「ユーズ・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ・イン・アン・エライザ・ツー・デテクト・スペシフィック・アンチボディーズ・イン・ヒューマンズ・ウィズ・コンディロマタ・アクミナタ」1991、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−1347頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、ＨＰＶ−１１粒子基礎ＥＬＩＳＡにより測定された通り、ＨＰＶ−１１抗体に対して陰性であった。
【００３６】
６．ＨＶＰ−１１Ｌ１ウイルス様粒子の生成及び精製
組換えＶＬＰは、一連の低及び高速遠心段階により、Ａc１１Ｌ１感染Ｓf−９細胞浮遊培養物の細胞フリー培養上清から直接精製した。感染Ｓf−９細胞は２００ml浮遊培養物から低速（1,000×g）でペレット化し、細胞フリー上清を４℃で高速（100,000×g）で９０分間、再び遠心した。高速ペレットを緩衝液Ａ（５０mＭ トリス、pＨ８.０；１Ｍ ＮaＣl；１０mＭ ＭgＣl２；１０mＭ ＣaＣl２；２mＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）；１０μg／mlロイペプチン）に再び懸濁し、５.２g固体ＣsＣlを加え、新鮮な緩衝液Ａ（０.４g／ml最終濃度）で全量１３mlに調整した。遠心（100,000×g、２２時間、１０℃）後、得られた単一バンドを取り、１２mlの新鮮な緩衝液Ａ（Ｃ×Ｃlなし）で希釈し、再び遠心し（100,000×g、９０分、４℃）精製ＶＬＰをペレット化した。ショ糖濃度勾配遠心により精製したＶＬＰは、２％中性緩衝化リンタングステン酸で染色後、電子顕微鏡により同定した（Ｆig.２、６及び７）。
【００３７】
実施例II
Ｓf−９細胞での組換えＨＰＶ−１１Ｌ１蛋白の発現及び免疫検定
組換えウイルスＡc１１Ｌ１を感染させた昆虫細胞からの全Ｓf−細胞蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ａc１１Ｌ１感染細胞中クーマシーブルー染色により見られる新規な５５kＤ蛋白を証明した（Ｆig.１Ａ、レーン３）。Ｆig.１（Ａ及びＢ）を引用すると、Ｆig.１Ａは、野生型ＡcＮＰＶ及び組換えＡc１１Ｌ１感染Ｓf−９細胞溶解質のクーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示し、Ｆig.１Ｂは、ＨＰＶＬ１共通エピトープに特異的なウサギポリクローナル抗血清でプローブした野生型ＡcＮＰＶ及び組換えＡc１１Ｌ１感染Ｓf−９細胞溶解質のウエスタンブロットを示す。非組換え（レーン１、２）及び組換えＬ１−感染（レーン３、４）Ｓf−９細胞溶解質は不溶性（レーン１、３）及び可溶性（レーン２、４）フラクションに分画され、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に付した。分子対照（Ｍｒ）マーカー左に示し、右の矢印は、組換えＬ１（約５５kＤ Ｍr）の特定位置を示す。本蛋白は、野生型ＡcＮＰＶに存在せず、ストライク等、「エクスプレッション・イン・エシェリキア・コリ・オブ・セブン・ＤＮＡセグメンツ・コンプライジング・ザ・コンプリート・Ｌ１・アンド・Ｌ２・オープン・リーディング・フレームス・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ６b・アンド・ザ・ロケイション・オブ・ザ(コモン・アンチゲン)」1989、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁（この開示を引用して明細書開示の一部とする）により記載されるように、線状ＨＰＶＬ１共通抗原に対して調製されたウサギ抗血清に免疫反応性である蛋白と共に移動する。低いＭrＬ１−免疫反応性バンドも検出され、全長Ｌ１生成物の崩壊から誘導されうる（Ｆig.１Ｂ、レーン３及び４）。本システムに生成されるＬ１の主な蛋白はＮＰ４０不溶性フラクション中に見られたが、約２５−３０％はＮＰ４０可溶性フラクションに存在した（Ｆig.１Ｂ、レーン４）。最大Ｌ１蓄積は感染後、何時間も生じた。
【００３８】
実施例III
ＶＬＰの電子顕微鏡視覚化
ショ糖バンドＶＬＰの染色されない調製品の電子顕微鏡写真（Ｆig.２、６及び７）は異なるＶＬＰを示した。Ｆig.２はショ糖密度勾配の５０−６０％界面に存在したＨＰＶ−１１カプシド様粒子を示す。Ｆig.６はバキュロウイルスシステムでのＨＰＶ−６bＬ１コード配列の発現の結果生じるＨＰＶ型６b（ＨＰＶ−６b）カプシド様粒子を示し、それは同様の方法で厳密に精製された。Ｆig.７は、この方法もＨＰＶ−１６Ｌ１コード配列の発現による、ＨＰＶ型１６（ＨＰＶ−１６）ＶＬＰの生成に適していることを示す。Ｆig.１２及び１６は、ＶＬＰが塩化セシウム濃度勾配遠心によっても精製できることを示す。Ｆig.２におけるＶＬＰの直接測定により測定された粒子直径は、約５２nmであった。本測定は、クルグ等「ストラクチャー・オブ・ウイルシズ・オブ・ザ・パピローマ−ポリオマ・タイプＩ：ヒューマン・ワァート・ウイルス」1965、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジィ，１１巻、４０３−４２３頁（この開示を引用して明細書の一部とする）により記載されるように、分離されたパピローマウイルスビリオンの直径と一致する。
【００３９】
実施例IV
ＨＰＶ−１１ＶＬＰ−含有昆虫細胞抽出物のウサギ抗血清との免疫反応性
組換えＬ１蛋白の免疫学的性質は、天然又は変性Ｌ１蛋白エピトープと反応するウサギ抗血清を用いて研究した。共通パピローマウイルス抗原に対して向けられたウサギ抗血清pＥＸ４８０は、ウエスタンブロットアッセイで変性組換えＬ１とよく反応したが、非変性条件下、抗原をブロッティング膜上に置くイムノアッセイの型であるイムノブロットによる同一抗原調製物と反応しなかった（Ｆig.３、比較細片Ａ）。抗pＥＸ４８０により発現される反応性のパターンと対象的に、ＨＰＶ−１１全ウイルス粒子を作ったウサギポリクローナル抗血清は、ウエスタンブロットにより組換えＬ１と反応しなかったが、イムノブロットアッセイでは組換えＬ１と強く反応した（Ｆig.３、比較細片Ｃ）。本反応性は、天然非組換えコントロール調製物に対する免疫後血清での反応性の欠除により証明されるように特異的であった（Ｆig.３、パネルＢ、細片Ｃ）。ウサギ抗血清pＥＸ２１５はこれらのイムノアッセイに含まれ、二つの型のイムノアッセイで存在するＬ１の相対量の比較を可能にした。両様式でのＰＥＸ２１５抗血清の組換えＬ１との免疫反応性の程度は概ね等しく（Ｆig.３、細片Ｂ）、Ｌ１の量がほぼ等しいことを示す。さらに、本抗血清が両様式でＬ１と反応しうるという観察記録は、pＥＸ２１５抗血清により確認される線状免疫反応性Ｌ１Ｎ末端エピトープ（複数もあり）が高い状態のＬ１コンフォーメーションの採用により弱められないことを示唆する。
【００４０】
実施例V
ＶＬＰ含有昆虫細胞抽出物のヒト血清との免疫反応性
線状ウイルス配座エピトープに対し向けられたヒト血清中の抗体の有病率を測定するため、バイオプシ−プローブ尖圭コンジロームの個人から得た血清を、抗原としてＶＬＰを用いるウエスタンブロット及びイムノドットブロットアッセイで評価した。患者の又はコントロールの血清は、いずれもウエスタンブロットにより変性組換えＬ１と免疫反応性でなかった（Ｆig.４、細片Ｄ−Ｏ(患者)及びＰ−Ｘ(コントロール)）。逆に、１２患者の血清中１１（Ｆig.５、細片Ｈを除き、細片Ｄ−Ｏは陽性と読み取れた）及び９コントロール血清中Ｏ（Ｆig.５、細片Ｐ−Ｘ）がイムノドットブロットにより組換えＬ１と免疫反応性で、高度に統計的に有意差があった（Ｐ＝７×１０−５；フィッシャーの正確試験）。この結果は、ボネズ等「ユース・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ・イン・アン・エライザ・トゥ・デテクト・スペシフィック・アンチボディーズ・イン・ヒューマンズ・ウィズ・コンディロマタ・アクミナタ」1991、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−1347頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、ＨＰＶ−１１粒子基礎ＥＬＩＳＡで同一血清を用いて既に得られた結果とよく一致する。
【００４１】
実施例VI
ＥＬＩＳＡ試験
ＣsＣl精製ＶＬＰを分光測定器（Ａ２８０）により定量し、冷ＰＢＳ中８ng／μlの濃度に希釈した。ＰＢＳ又は希釈ＶＬＰ溶液（８００ng全蛋白）のいずれかのアリコート（１００μl）をウエルに入れ、プレートを４℃で一夜放置した。プレートを１％ＢＳＡ溶液により、室温で２時間ブロックし、次いで抗血清を、二回、１：１００の希釈で添加した。一次抗血清は室温で９０分間、反応させた。プレートを４回洗浄し、二次抗体（ヒツジ抗ヒトＩgＧアルカリホスファターゼ結合体)を加え(ＴＡＧＯ、１：５０００）てプレートを室温で９０分間、放置した。基質を各プレートに加えて４０５nmの吸収を読み取った。各実験に関するＶＬＰ吸収からＰＢＳを引くことにより特異的吸収を計算し、平均吸収値を得た。
ＶＬＰを用いて得た結果（Ｆig.８）は、抗原（５０％）としてＨＰＶ−１１全蛋白粒子を用いた（ＲＲＰ患者からの）同一血清のＥＬＩＳＡ試験で既に報告された結果と同じであった。これまでの全ウイルス粒子基礎ＥＬＩＳＡからの結果との良好な相関関係はＦig.９（ｒ２＝０.７５）に示される。
【００４２】
実施例VII
ウエスタンブロット及びイムノドットブロット
Ｓf−９浮遊培養物（１００ml）は、ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により既に記載されるように、ＡcＮＰＶ（非組換えコントロール）、Ａc１１Ｌ１又はＡc１６Ｌ１組換えバキュロウイルスのいずれかで感染させ、２７℃で７２時間インキュベートした。図面１１に関して、ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁、及びローズ等、1990、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７１巻、2725−2729頁（これらの開示を引用して明細書記載の一部とする）により既に記載されるように試料を調製し、電気泳動に付し、イムノブロットした。ＶＬＰは、電子顕微鏡により証明されるように（データは示さず）、両試料調製品に存在した。全試料蛋白濃度は分光測光器（Ａ２８０）によって使用する前に平衡化した。
【００４３】
図面１０(ａ)に関して、試料（２０μg全蛋白／レーン）を、ボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により既に記載されるように、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、一晩ウエスタンブロットした。ニトロセルロースブロットを、クリステンセン等、1991、ウイルス・リサーチ，２１巻、１６９−１７９頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように１：１０００の希釈で用い、ウサギ抗血清Ｒ５−４０９でプローブした。Ｆig.１０(ａ)（左パネル）に示すように、組換えＨＰＶ−１１Ｌ１（レーン２）及び組換えＨＰＶ−１６ＬＩ（レーン３）蛋白を、抗パピローマウイルスＬ１共通エピトープ抗血清Ｒ５−４０９により、ほぼ等量検出した。ＨＰＶ−１６Ｌ１蛋白の予報されたアミノ酸配列は、ＨＰＶ−１１Ｌ１蛋白の予報された配列よりも５アミノ酸長く、これは組換えＨＰＶ−１６Ｌ１蛋白により示されるやや低速度の移動と一致する。
【００４４】
図面１０(ｂ)に関して、試料は希釈し（ＰＢＳでなされる２倍系列希釈）、２５μg（底部）の全蛋白濃度で開始し、２５ng（最上部）の全蛋白濃度で終る非変性条件下にニトロセルロースに適用した。ウサキ抗血清Ｒ−３６６を１：１０００の希釈で用いた。右パネル（即ち、イムノブロット）で、全ウイルス粒子抗血清は、１０００倍希釈範囲にわたり自生（native）組換えＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰ調製品を検出した。しかしながら、この同一過免疫ウサギ抗血清は、ウエスタンブロットによる分析用に用いたもの（２０μg）よりも高濃度の抗原（２５μg）でさえ、自生組換えＨＰＶ−１６Ｌ１ＶＬＰ調製品に免疫反応性でなかった。
過免疫ウサギ自生ＨＰＶ−１１ビリオン中和抗血清は自生ＨＰＶ−１６Ｌ１蛋白と交差反応せず、本抗血清により認識されるＨＰＶ−１１カプシドの配座エピトープ（複数もあり）がＨＰＶ−１６ＶＬＰ調製品に存在する配座エピトープと免疫学的に異なることを示唆した。
【００４５】
実施例VIII
ウエスタンイムノブロットアッセイ
ＶＬＰをＡc１１Ｌ１感染Ｓf−９細胞浮遊培養（２００ml）の上清媒体中に検出し、これから直接精製した。細胞を低速度（１０００×g）でペレット化し、次いで細胞フリー上清を高速度（100,000×g）で遠心した。細胞を低速度遠心（１０００×g）で除き、「ひと・パピローマウイルス・タイプ１１（ＨＰＶ−１１）ウイルス−ライク・パーティクルス（ＶＬＰ）インジュース・ザ・フォーメーション・オブ・ニュートラライジング・アンチボディ」（発表のために提出たれた）1993、においてローズ等に既に記載されるように（この開示を引用して明細書記載の一部とする）ＶＬＰを培養上清から調製した。パネルＡはクーマシーブルーで染色した１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルである。パネルＢは、ストライク等、1989、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、１：１０００の希釈で用いた、ＨＰＶ共通抗原に特異的なウサギ抗血清でプローブした、全く同じに負荷したゲルのウエスタンイムノブロットである。非組換え又は組換えＬ１−感染Ｓf−９細胞培養上清から得た高速度ペレットの試験は、組換えＬ１感染上清フラクションでのＶＬＰの存在を示した。再び懸濁した組換えＬ１高速度ペレットは、ボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）に既に記載されるように、平衡密度勾配遠心により精製した。この方法によりえられた単一バンドを無菌１８標準針で取り、新鮮な緩衝液Ａ（５０mＭ トリス、pＨ８.０；１Ｍ ＮaＣl；１０mＭ ＭgＣl２；１０mＭ ＣaＣl２；２mＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）；１０μg／mlロイペプチン）で１２mlの容量に希釈し、４℃で100,000×gで９０分間、再び遠心した。０.５mlの新鮮な緩衝液Ａ（５０％グリセロール）にペレットを再懸濁後、試料の蛋白の電子顕微鏡分析は、２％リンタングステン酸で染色されず、無傷のＨＰＶ ＶＬＰの存在を確認した（Ｆig.１２）。
【００４６】
既に記載されているように、組換えＶＬＰはＨＰＶ−１１全ウイルス粒子に向けられた抗体に免疫反応性であった。（ロース等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁参照、この開示を引用して明細書記載の一部とする。）本研究で、出願人は精製ＶＬＰでウサギを免疫し、全ビリオンによる免疫反応性について後免疫血清を試験した。ニュージランド白ウサギを、完全フロインドアジュバント中、精製ＶＬＰ（〜２０μg蛋白）の１：１エマルジョンで２部位で筋肉内に免疫した（部位当り０.２５ml）。３０日後、完全フロインドアジュバントで調製したＶＬＰエマルジョンにより増加し、免疫血清を１４日後、収集した。血清を、ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）に既に記載されるように、ドットブロットイムノアッセイで自生ＨＰＶ−１１ピリオン又は組換えＶＬＰのいずれかと反応させた。抗ＶＬＰ抗体と全ビリオンとの免疫交差反応は、図面１３に示されるように、ＶＬＰが免疫原性であり、感染性ＨＰＶ−１１ビリオンの抗原性プロフィルを正確に増殖しているようであることを示す。図面１３に関連して、非変性精製試料調製品をローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように、セルロースに適用した。
【００４７】
実施例IX
中和活性
感染ＨＰＶ−１１ハーシェイウイルス懸濁液の調製品（ジョン・クライダー、デパートメント・オブ・パソロジィ・アンド・マイクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ、ザ・ミルトンＳ．ハーシェイ・メディカル・センター、ハーシェイ、ＰＡにより最初に提供された）はボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されている。４つの平行実験において、４５０μlの感染ウイルス懸濁液（バッチ４／９０）を、５０μl（１：１０最終希釈）の前免疫抗ＨＰＶ−１１血清（グループ１）、後免疫抗ＨＰＶ−１１血清（グループ２）、前免疫抗ＶＬＰ血清（グループ３）又は後免疫抗ＶＬＰ血清）グループ４）のいずれかと３７℃で１時間インキュベートした。グループ１と２は、ボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス、１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により既に記載されている中和コントロールであり、グループ３と４は試験グループであった。慣用の環状切除のために切除されているヒト包皮の調製品もボネズ等、1991、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−1347（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されている。包皮を１×１mm四角に切り、用いる各包皮からの小数の断片を手早く凍結し貯えた。残っている断片を４つのグループに等分し、各グループをインキュベーション期間の終りで、４つのウイルス懸濁液−血清混合物の一つに添加した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。各実験グループについて、１包皮断片を、ＢＡＬＢ／cバックグラウンドの３匹の雌同腹仔合致４〜６週令無胸腺nu／nuマウス（タコニック・ファームス、ジャーマンタウン、ＮＹ）の各腎臓の腎ノウの下に置いた。実験を異なる包皮を用いて異なる日に繰り反した。従って、各実験グループについて、全１２移植片を移植した。動物は、移植の１２週後に犠牲に付し、この時点で移植片を取り出し処理した。（ボネズ等、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁参照、この開示を引用して明細書記載の一部とする）図面１４に関して、移植片は、ここに記載されるように分析用に調製し、(１)前−および(２)後−免疫ウサギＨＰＶ−１１全ウイルス粒子血清または(３)前−および(４)後−免疫ウサギＨＰＶ−１１Ｌ１ウイルス様粒子血清のいずれかで前処理したウイルス溶解質を感染させた。黒丸は第一増殖実験に相当し、中空の丸は第二増殖実験に相当する。水平棒は平均ＧＭＤを示す。移植片大きさ比較用に、幾何学的平均直径（ＧＭＤ）は、回収した移植片の長さ、幅および高さの積の立方根を取ることにより計算した。
【００４８】
安楽死の時点で、−移植片を中和コントロール前−および後−免疫抗ＨＰＶ−１１処理グループの各々から除いた。従って、これらのグループの各々で分析に利用しうる移植片の数は１１であった（Ｆig.１４）。前−および後−免疫コントロールグループの移植片の中央〔範囲〕ＧＭＤ（mm）はそれぞれ２.９〔１.０、４.９〕および１.３〔１.０、２.６〕であった。差、１.６mmは統計的に有意（Ｐ＝０.００４、マン−ホイットニィＵ試験）であった。全１２の移植した移植片は、前−および後−免疫抗ＶＬＰ抗体処理グループのいずれでも分析に利用できた（Ｆig.４）。移植片の中央〔範囲〕ＧＭＤ（mm）は、それぞれ２.３〔１.３、４.２〕および１.０〔１.０、１.８〕であった。大きさの差、１.３mmは統計的に有意（ｐ<１０−４）であった。第一と第二実験との間の移植片の大きさの差は、前−免疫グループでは統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０.６２）が、後−免疫グループでは有意（Ｐ＝０.００７）であった。従って、出願人は、各増殖実験での前−および後−免疫抗ＶＬＰ抗体処理グループ間の移植片の差を比較した。両者は統計的に有意（第一および第二増殖についてそれぞれＰ＝０.００２およびＰ＝０.０４）であった。
【００４９】
実施例X
ウイルスＤＮＡの起原
ＨＰＶ−１１ゲノムＤＮＡの起原（ボネズ等、1991、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−1347頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）およびＡc１１Ｌ１組換えバキュロウイルスの構築（ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）は記載されている。ＨＰＶ−１６ゲノム配列をＣＩＮIII病巣から回収し、標準的クローニング方法を用いてＡc１６Ｌ１バキュロウイルスを構築した（チェスターズおよびマックカンス、未発表データ）。ＨＰＶ−１８ＬＩ配列をポリメラーゼ連鎖反応によりＨＰＶ−１８原型（Ｈ.ツール・ハアゼンにより提供）から増幅し、Ａc１１Ｌ１の構築（ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）に用いたのと同じ操作によりＡc１８Ｌ１バキュロウイルスを構築するのに用いた。
【００５０】
実施例XI
組換えＶＬＰの精製
組換えＶＬＰを、ローズ等、1993、「ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１（ＨＰＶ−１１）・ウイルス−ライク・パーティクルス(ＶＬＰs)・インデュース・ザ・フォーメーション・オブ・ニュートラライゼーション・アンチボディズ・アンド・デデクト・ジエニタル・ＨＰＶ−スペシフィック・アンチボディズ・イン・ヒューマン・セラ」印刷中、（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されるように精製した。精製ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、またはＨＰＶ−１８ＶＬＰを含む単一バンドを注射器によりＣsＣl密度勾配から取り、緩衝液Ａ（リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)；１mＭ ＭgＣl２；１mＭ ＣaＣl２；１mＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)）で１２mlに希釈し、４℃で100,000×gで９０分間沈殿させた。ペレットを５０％グリセロールを含む緩衝液Ａ２００μlに再懸濁し、スペクトル光度測定法（２８０nm）により定量し、２０℃で貯えた。組換えＬ１蛋白は、既に記載されている（ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６７巻、1936−1944頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）ようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットイムノアッセイにより分析した。５μgの精製ＨＰＶ−１１、−１６または−１８ＶＬＰを含む試料を、既に記載されている（ストライク等、1989、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）ように、電気泳動に付し、ブロットし、そして抗パピローマウイルスＬ１（抗−ＰＶＬ１）共通抗原ウサギ抗血清でプローブした。ＨＰＶ−１１、−１６および−１８Ｌ１開いた読み枠（ＯＲＦ）の予報されたコード容量は、それぞれ５０１アミノ酸（ダートマン等、1986、バイロロジィ，１５１巻、１２４−１３０頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）、５０５アミノ酸（シードーフ等、1985、バイロロジィ，１４５巻、１８１−１８５頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）および５０７アミノ酸（コール等、1987、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジィ，１９３巻、５９９−６０８頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）であり、予期された大きさ（〜５５kＤ Ｍr）のＬ１−免疫反応性バンドがウエスタンブロットイムノアッセイにより試験した３つの試料調製物の各々に現れた（Ｆig.１５）。低分子量Ｌ１免疫反応性蛋白が、ＣsＣl精製ＶＬＰ調製物のウエスタンブロットイムノアッセイによっても検出され（Ｆig.１５）、これらの蛋白の相対量はその後の分析で変化した（データ示さず）ように、全長Ｌ１蛋白の崩壊生成物であるらしい。しかしながら、各試料での主な〜５５kＤ ＭrＬ１免疫反応性バンドは、それらの可動性またはそれらの相対量のいずれも変化しなかった（データ示さず）。精製試料の電子顕微鏡（２％リンタングステン酸により染色しない）は、ＨＰＶ−１１（Ｆig.１６Ａ）、ＨＰＶ−１６（Ｆig.１６Ｂ）およびＨＰＶ−１８（Ｆig.１６Ｃ）ＶＬＰ調製物でＶＬＰ形成を確認した。
【００５１】
実施例XII
ウサギＶＬＰ免疫血清の調製およびＥＬＩＳＡの条件
ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８Ｌ１  ＶＬＰウサギ免疫血清は、２匹のニュージーランド白ウサギを、既に記載された方法（ボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁、ローズ等、1993、ジャーナル・オブ・バイロロジィ、これらの開示を引用して明細書記載の一部とする）を用いて、各ＶＬＰ調製物で２部位で筋肉内に免疫化することにより調製した（即ち、６匹のウサギを免疫化した）。ウサギ抗ＰＶＬ１共通抗原（ストライク等、1989、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７０巻、５４３−５５５頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）、ＨＰＶ−１１全ビリオン（ボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）並びにＨＰＶ−１１、−１６および−１８ＶＬＰ抗血清を３つの組換えＶＬＰ調製物に対するＥＬＩＳＡで試験した（Ｆig.１７）。本ＥＬＩＳＡに関して、精製ＶＬＰをＰＢＳ中１０ng／μlの濃度に希釈し、約１μgの抗原中またはＰＢＳのみを含むアリコートを交互系列の９６−ウエルＥＬＩＳＡプレートに分与した。アッセイの条件は、試験前に、遮断溶液中に希釈（２％v／v）した非組換え（ＡcＮＰＶ）バキュロウイルス感染Ｓf−９細胞溶解質で一次抗血清を前吸収した以外は、正確に既に記載された（ローズ等、1993、「ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１(ＨＰＶ−１１)・ウイルス−ライク・パーティクルス（ＶＬＰs）・インデュース・ザ・フォーメーション・オブ・ニュートラライジング・アンチボディズ・アンド・ディテクト・ジェニタルＨＰＶ−スペシフィック・アンチボディズ・イン・ヒューマン・セラ」、印刷中、この開示を引用して明細書記載の一部とする）通りであった。全抗血清を、１：1000から１：128,000までの範囲の希釈で、数多くの場合に、２回試験した。Ｆig.１７に示される全てのウサギ抗ＶＬＰ抗血清についての吸収値は、これらの抗血清の１：１６,０００の最適希釈で得た。抗ＰＶＬ１共通抗原およびＨＰＶ−１１全ビリオンウサギ抗血清の吸収値は低希釈（１：１,０００）で得た。特異的吸収値は各２回について実験値（抗原含有ウエル）からコントロール値（ＰＶＳウエル）を引くことにより決定し、平均（４０５nm）吸収値を決定した。
【００５２】
実施例XIII
ＶＬＰ  ＥＬＩＳＡ
ＶＬＰをＥＬＩＳＡイムノアッセイで試験して、患者血清中、特異抗体を検出する能力を評価し、結果をＨＰＶ−１１全ビリオンエンザイムイムノアッセイで同一血清を用いて既に得られた結果（ボネズ等、1993、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジィ，３９巻、３４０−３４４頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）と比較した。抗原をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈して既知の全ビリオンＥＬＩＳＡで用いた量のそれ（ボネズ等、1993、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジィ，３９巻、３４０−３４４頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）に等しい量とし、抗原溶液または抗原のないＰＢＳのいずれかを交互系列の９６ウエルプレートにアリコートした。４℃で１６時間コーチング後、これらの溶液を吸収して、ウエルを室温で２時間、希釈／遮断溶液（カークガード・アンド・ペリィ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド、ガイサーズバーグ、ＭＤ）でブロックした。ＨＰＶ−１１全ウイルス粒子ＥＬＩＳＡ（ボネズ等、1993、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジィ，３９巻、３４０−３４４頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）により予め試験した５９人のヒト血清（４３患者、１６コントロール）の全てを希釈／遮断溶液中に１：１００希釈し、１００μlアリコートをＰＢＳのみで、または抗原溶液で処理したウエルに加えた（血清試料当り２回）。プレートを室温で９０分間インキュベートし、次いで４回洗浄した（洗浄溶液、カークガード・アンド・ペリィ・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド、ガイサーズバーグ、ＭＤ）。抗ヒトＩgＧアルカリホスファターゼ接合体（１００μlアリコート、１：５０００希釈、タゴ、バーリンゲーム、ＣＡ）を各ウエルに加えてプレートを室温で９０分間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（ジエタノールアミン緩衝液中ｐ−ニトロフェニルリン酸）で発達させた各血清試料の４０５nmでの特異吸収は、各２回、抗原含有ウエルから得た値から、ＰＢＳ処理ウエルから得た値を引くことにより計算して、平均増殖差を計算した。本明細書中のどこかで検討した全ビリオンＥＬＩＳＡで、４２名の患者血清（および２０名コントロール血清）を処理のコースの間のカプシド抗体濃度の変化について分析した（ボネズ等、1993、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジィ，３９巻、３４０−３４４頁、この開示を引用して明細書記載の一部とする）。本ＥＬＩＳＡ研究で試験した全ての血清は、これまでの研究に加えて収集された。次いでこれまでの研究で分析された患者血清の一つを、処理結果に関連するがイムノアッセイの結果には関連しない理由で除去した。しかしながら、この血清の吸収値は利用しうるので、血清は本アッセイに含め、これによって本ＥＬＩＳＡ研究で分析した患者血清の数は４３に増加した。分析したコントロール血清の数は、アッセイに関係する理論的考慮の結果、２０から１６に減じた。
【００５３】
ＯＤ値として示される、１６コントロール血清の中央〔範囲〕血清反応性（seroreactivity）は、４３名の患者血清についての０.０２４〔−０.０６３、０.５１２〕に比べて０.００５〔−０.０２９、０.０２５〕で、統計的に有意差（Ｐ＝０.０１；マン−ホワイトニィＵ試験）があった。カットフとしてのコントロールグループでの高いＯＤ値を用いると、アッセイの感受性は４９％（Ｐ＝２×１０４；フィシャーの正確試験）であった。従って、ＨＰＶ−１１ＥＬＩＳＡは、コンジューム刺針による患者とコントロールとを識別することができた。さらに、全血清を含む場合、またはＨＰＶ−１１ＶＬＰ  ＥＬＩＳＡで陽性の２１血清のみを考慮した場合（ｒ＝０.８７；Ｐ<１０−６）、ＨＰＶ−１１ＶＰ  ＬＥＬＩＳＡおよびＨＰＶ−１１ビリオンＥＬＩＳＡによる試料血清反応性の間には、すぐれた相関があった（パーソンの生成物モーメントｒ＝０.８７；ｐ<１０６）。
【００５４】
結果
免疫学的観察は、組換えＬ１が自生のコンフォーメーションをとることを示唆する。変性Ｌ１共通抗体を作るウサギ抗血清は、変性組換えＬ１とのみ免疫反応性であった（すなわち、ウエスタンブロットによる）が、一方、未変性全ウイルス粒子を作るウサギ抗血清は、未変性組換えＬ１とのみ反応した（すなわち、イムノドットブロットによる）。さらに、ホネズ等、「ユーズ・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ・イン・アン・エライザ・トゥ・デテクト・スペシフィック・アンチボディーズ・イン・ヒューマンズ・ウィズ・コンディロマタ・アキュミナタ」，1991、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−1347頁、によるＥＬＩＳＡでＨＰＶ−１１ビリオンと反応性であった尖圭コンジロームの患者からのヒト血清も、未変性ＨＰＶ−１１組換えＬ１と反応した（Ｆig.４、８および９）。従って、本発明のＶＬＰの配座エピトープは自生のＨＰＶ−１１ビリオンに存在するものと類似であるように見え、そしてそれらは自然感染の間にヒト免疫系により認識される。パピローマウイルス血清学の幾つかの研究は、配座エピトープ抗体特異性がパピローマウイルス感染の良好な指標であることを示す（ボネズ等、「ユーズ・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ・イン・アン・エライザ・トゥ・デテクト・スペシフィック・アンチボディーズ・イン・ヒューマンズ・ウィズ・コンジィロマタ・アクミナタ」，1991、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７２巻、1343−14347頁；ボネズ等、「エボリューション・オブ・ジ・アンチボディーズ・レスポンス・トゥ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１(ＨＰＶ−１１)・イン・ペイシェンツ・ウィズ・コンジローマ・アクミナツム・アコーディング・トゥ・トリートメント・レスポンス」，1991、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジィ，1991、印刷中；ボネズ等；「アンチボディーメディエイテッド・ニュートラリゼイション・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１(ＨＰＶ−１１)・インフェクション・イン・ザ・ヌード・マウス：デテクション・オブ・ＨＰＶ−１１mＲＮＡs・バイ・ザ・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション」，1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス、１６５巻、３７６−３８０頁；クリステンセン等、「デテクション・オブ・ヒューマン・セルム・アンチボディーズ・ザット・ニュートラライズ・インフェクティアス・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ」，1992、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７３巻、1261−1267頁；キーンズラー等、「ヒューモラル・アンド・セル−メディエイテッド・イムニティ・ツー・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１(ＨＰＶ−１)・イン・ヒューマン・ウォーツ」，1983、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ダーマトロジィ，１０８巻、６６５−６７２頁；およびスティール等、「ヒューモラル・アッセイズ・オブ・ヒューマン・セラ・トゥ・ディスラップド・アンド・ノンディスラップド・エピトープス・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１」，1990、バイロロジィ，１７４巻、３８８−３９８頁、これらの開示を引用して明���書記載の一部とする）。これらの特異性はウイルス発生学で有意な役割を演ずることもできる。例えば、全ＨＰＶ−１１粒子に向けられたウサギ抗血清は、ＨＰＶ−１１感染性を中和する（ボネズ等、「アンチボディー−メディエイテッド・ニュートラリゼイション・オブ・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１(ＨＰＶ−１１)・インフェクション・イン・ザ・ヌード・マウス：デテクション・オブ・ＨＰＶ−１１ mＲＮＡs・バイ・ザ・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション」，1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁；およびクリステンセン等、「アンチボディー−メディエイテッド・ニュートラリゼイション・イン・ビボ・オブ・インフェクティアス・パピローマウイルス」，1990、ジャーナル・オブ・バイロロジィ，６４巻、3151−3156頁）。さらに、クリステンセン等、「デテクション・オブ・ヒューマン・セルム・アンチボディーズ・ザット・ニュートラライズ・インフェクティアス・ヒューマン・パピローマウイルス・タイプ１１・ビリオンズ」，1992、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ，７３巻、1261−1267頁は、ヒト血清を用い、抗全ＨＰＶ−１１ビリオン抗体と血清中和活性との相関を報告した。本発明の組換えＬＩＶＬＰを有するそのような抗体は、診断および機能の重要性を有することができる。
【００５５】
組換えバキュロウイルスの構築を考慮した場合、発明者が構築した初期の組換えバキュロウイルスのあるものは、正しいＬ１コード配列を有したが、検出可能程度のＬ１蛋白を生成していなかった。このことは発明者にＨＰＶ−１１および幾つかの他のＨＰＶＬ１コード配列の３'未翻訳部分を検査させることとなった。ペンタヌクレオチドmＲＮＡ崩壊シグナル配列、ＡＵＵＵＡ、（ショー Ｇ．およびケイメン Ｒ．、「ア・コンサーブドＡＵ・シーケンス・フロム・ザ３'・アントランスレイテッド・レジオン・オブ・ＧＭ−ＣＳＦmＲＮＡメディエイツ・セレクティブmＲＮＡ・デテクション」、セル，1986，４６巻、６５９−６７頁；コールＭＤ．およびマンゴＳＥ．、「シス−アクティング・デターミナンツ・オブ・c−myc mＲＮＡ・スタビリティ」，1990、エンザイム，４４巻、１６７−８０頁；シューＡＢ．等、「ツー・ディスティンクト・デスタビライジング・エレメンツ・イン・ザ・ｃ−ｆｏｓ・メッセージ・トリガー・デアニレイション・アズ・ア・ファースト・ステップ・イン・ラピットmＲＮＡデケイ」、ジーンズ・アンド・デベロップメント，1991，５巻、２２１−３１頁；サバント−ボンセイルＳ．およびクリーブランドＤＷ．、「エビデンス・フォア・インスタビリティ・オブ・mＲＮＡs・コンテイニングＡＵＵＵＡ・モチーフス・メディエイテッド・スルー・トランスレイション−デペンデント・アセンブリィ・オブａ：２０ｓデグラディション・コンプレックス」、ジーンズ・アンド・デベロップメント，1992，６巻、1927−３７頁、これらの開示を引用して明細書記載の一部とする）はＨＰＶ−１１Ｌ１コード配列の停止コドンの３０ヌクレオチドにあること、さらに、検査した他のＨＰＶ型が同様にＬ１停止コドンの近くにＡＵＵＵＡ配列を有することが測定された。もこの配列を除くか、または変異を導入すれば、Ｌ１蛋白の発現濃度を増加できるであろう。従って、クローンのための制限酵素部位を取り込むだけでなく、Ｌ１停止コドンから３０ヌクレオチド下流のＡＵＵＵＡペンタヌクレオチドをも変異するＨＰＶ−１１ゲノムＤＮＡからのＬ１コード配列を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。本クローンのスケールアップは非常に高濃度のＬ１蛋白を生成した。ＢＥＶＳシステムを用いる報告は、細胞培養の３００−５００mg／リットルの範囲で組換え蛋白生成の濃度を与えた。本発明においては、組換えＬ１蛋白生成の程が非常に高く、約６００−８００mg／リットルで、多分、３'未翻訳部分のＬ１崩壊シグナル配列の除去による。
【００５６】
これらの結果は、同様の実験条件下、ＨＰＶ−１１ＶＬＰで免疫したウサギからの後免疫血清が、ＨＰＶ−１１全ビリオンで免疫したウサギから得た血清と同じように有効にヒト組織のＨＰＶ−１１感染をブロックできることを示す。各前免疫血清では観察できなかった遮断は、初期のウイルス遺伝子発現の不存在と関連した。従って、その効果は、典型的なウイルス中和、すなわちウイルス侵入または脱カプシド化（decapsidation）と一致した（ジモック，1993、ニュートラリゼイション・オブ・アニマル・ウイルシス、ヘルリン：シュピングラー−ファーラク、この開示を引用して明細書記載の一部とする）。
ウイルス遺伝子発現の分析によるＨＰＶ−１１中和の確認を得るために、全移植片は、ボネズ等、1992、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディジージス，１６５巻、３７６−３８０頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）に既に記載されるように、ＨＰＶ−１１Ｅ１＾Ｅ４スプライスmＲＮＡ転写物の存在について分析した（データ示さず）。Ｅ１＾Ｅ４mＲＮＡを、前または後免疫ＶＬＰ血清で前処理したグループからの移植片の１０／１２（８３％）および０／１２（０％）に検出した。それぞれ（ｐ<１０−４）。同様に、前または後免疫抗全ビリオン血清で前処理したコントロールグループについて、Ｅ１＾Ｅ４mＲＮＡは８／１１（７３％）および０／１１（０％）移植片に検出した、それぞれ（Ｐ＝１０−３）。これらの結果は、後免疫ＶＬＰ血清によるウイルス接種物の処理は移植片生育およびウイルス遺伝子発現の顕著な阻害と関連すること、免疫中和と一致する効果を示す。すなわち、組換えＶＬＰは、感染ウイルスによる免疫によって得た反応に類似する中和反応を大きく誘発できる。
【００５７】
ゾー等、1991、バイロロジィ，１８５巻、２５１−２５７頁（この開示を引用して明細書記載の一部とする）により記載されたＨＰＶ１６Ｌ１−Ｌ２ ＶＬＰは、大きさが、変化しやすく、ＨＰＶビリオン（５０−５５）またはバキュロウイルス生成ＨＰＶ１１ＶＬＰ（５０−５５nm；ローズ等、印刷中、この開示を引用して明細書記載の一部とする）よりも小さかった（直径３５−４０nm）。これらの形態学的特性は、本発明において記載されるＶＬＰのものと全く異なる。さらに、本発明の方法を用い、ＨＰＶ Ｌ１蛋白のみが、その生物物理学的特性と抗原性質が天然のＨＰＶビリオンのものを密接に反映する粒子の形成に十分なものである。
【００５８】
同様の方法を用いて、カーンバウアーらは、抗ＢＰＶ−１ＶＬＰ抗体によるインビトロのマウスＣ１２７細胞のＢＰＶ−１−媒介形質導入の阻害を報告している（カーンボウアら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスィズＵＳＡ８９巻１２１８０−１２１８４頁（１９９２年）、ここに引用することによって、この開示を明細書の記載とする）。その系で得られた結果は本発明で開示された結果を支持するものであり、その結果において、発明者らは生殖器のＨＰＶおよびその正常な標的組織を用いて中和を証明している。ＢＰＶ−１／Ｃ１２７細胞試験と無胸腺マウス雄牛仔牛皮膚異種移植系からの結果の一致は、先の開示として報告され（ギムら、インターナショナル・ジャーナル・カンサー４９巻２８５−２８９頁（１９９３年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）、ＢＰＶ−１／Ｃ１２７マウス腺維芽細胞系は非−産生であり、従って、中和はインビトロでの形質導入物の不存在からのみ推論し得る。さらに、ＢＰＶ−１は自然にはマウスに感染しないし、Ｃ１２７細胞に入り得るメカニズムは天然の感染過程に関与しているメカニズムとは異なっているかもしれない。反対に、今回の研究で用いられた無胸腺マウスモデルはクライダーら（ネイチャー３１７巻６３９−６４１頁（１９８５年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）によりすでに報告された、天然の標的組織の生殖器ＨＰＶによる感染によるものであり、感染した移植片はインビボで維持され、感染移植片の形態学的および組織学的変換は感染性ビリオンの産生を伴う（クライダーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６１巻５９０−５９３頁（１９８７年）参照、その開示をここに引用して明細書の記載とする）。ボネら、ジャーナル・オブ・インフェクティアス・ディスイージーズ１６５巻３７６−３８０頁（１９９２年）；クリステンセンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６４巻３１５１−３１５６頁（１９９０年）；クリステンセンら、ウィルス・リサーチ２１巻１６９−１７９頁（１９９１年）；クリステンセンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６４巻５６７８−５６８１頁（１９９０年）；およびクリステンセンら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７３巻１２６１−１２６７頁（１９９２年）による既報の抗体媒介移植片成長阻害、その開示をここに引用して明細書の記載とする。ウイルス性遺伝子発現の阻害の免疫細胞化学的および分子生物学的証拠は、ボネら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７２巻１３４３−１３４７頁（１９９１年）；およびボネら、インターナショナル・インフェクティアス・ディスイージーズ１６５巻３７６−３８０頁（１９９２年）によりすでに報告されたように十分に実証されており、その開示をここに引用して明細書の記載とする。したがって、無胸腺マウス系でなされた観察は、自然感染で生じる事象をより正確に反映し得る。
【００５９】
ＨＰＶ−１１に対する抗体の中和は、クリステンセンら（ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７３巻１２６１−１２６７頁（１９９２年）（その開示を引用して明細書の記載とする）による既報のように尖圭コンジロームを有するひとにおいて確認されているが、がそれらの生物学的意義は不明である。もし、中和がインビボにおけるパピローマウイルス感染に対する防御免疫学的エフェクターメカニズムであることを証明するならば、ついで、組換ＶＬＰｓでの免疫化は感染の危険がある人達に防御免疫を授け得る。発明者らの結果はＨＰＶ−１１ ＶＬＰ抗体の中和活性の重要性はＨＰＶ−１１感染性ビリオンに特異的な抗体の重要性と同様であることを示唆している。従って、ＶＬＰｓは良好なワクチンの候補であると思われる。しかしながら、異なるＨＰＶ−型類間でのカプシド立体配座的決定基の交差反応程度は未だ未知であり、既報のギスマンら（ビロロジー７６巻５６９−５８０頁（１９７７年）；グロスら、Ｏngogenic Ｖiruses，Pergamon版ニュヨーク(１９８３年)；ヘージェンシーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６７巻３１５−３２２頁（１９９３年）；ホーリーら（「パピローマウイルス属およびそれらの複製」Ｂ．Ｎ．フィールドおよびＤ．Ｍ．ナイプ編５８章１６２５−１６５０頁）、ビロロジー第２版２巻Ｒaven版ニュヨーク（１９９０年）カーンバウアーら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスィズＵＳＡ８９巻１２１８０−１２１８４頁（１９９２年）；クライダーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６１巻５９０−５９３頁（１９８７年）；クライダーら、ネイチャー３１７巻６３９−６４１頁（１９８５年）；およびオースら、ジャーナル・オブ・ビロロジー２４巻１０８−１２０頁（１９７７年）（その開示をここに引用してこの明細書の記載とする）に記載のように、それは低いのかもしれない。生殖器ＨＰＶ疾患の防御のための免疫源としての使用のための組換ＶＬＰｓの可能性の十分な特徴付けは他の生殖器のＨＰＶ型類から誘導されるＶＬＰｓに関連するさらなる検討が必要である。異種生殖器のＨＰＶ ＶＬＰｓがＨＰＶ感染を中和し得るかどうかを決定することが、特に重要である。
【００６０】
Ｆig.１７に関して、ＨＰＶ全ウイルス粒子（Ｂ）およびＨＰＶ−１１ ＶＬＰ抗血清（Ｃ、Ｄ）はＨＰＶ−１１ ＶＬＰｓと強く反応したが、これらの抗血清のいずれもＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８調製物とは反応しなかった。同様に、ＨＰＶ−１６（Ｅ、Ｆ）およびＨＰＶ−１８（Ｇ、Ｈ）Ｌ１ ＶＬＰうさぎ抗血清は体軸をなす (homotypic)ＶＬＰｓとのみ反応した。これらの反応の特異性は前吸着実験において立証され、その中で、各うさぎＶＬＰ抗血清の免疫反応性は体軸をなしている（homotypic）が異型（heterotypic）でないＶＬＰsによる前吸着により放棄された（データは示さず）。抗ＰＶＬ１コモンアンティジェン抗血清はウエスタンイムノブロッティングによる組換Ｌ１蛋白と十分反応する（Ｆig．１５）が、これはＥＬＩＳＡにおいて、天然のＶＬＰ調製物とわずかに反応するのみである（Ｆig．１７）。この結果はこの抗血清によって普通に認識されるエピトープはＥＬＩＳＡ試験法の条件下で遮蔽されており、この試験法で試験されたＬ１蛋白は明らかに非−変性であることを示唆している。
【００６１】
本発明はＨＰＶ−１１、−１６および−１８のＬ１ ＶＬＰエピトープは明らかに抗原的であることを示している。Ｌ２カプシド蛋白はこれらのＶＬＰ調製物中には存在しないが、ＨＰＶ類型間で観察された違いはまた、ビリオンにもあてはまる可能性がある。Ｌ２はＨＰＶ粒子の総蛋白含有量の約１０％であり（ドアバーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６１巻２７９３−２７９９頁（１９８７年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）、粒子内における正確な位置は決定されていない（ベーカーら、バイオフィジカル・ジャーナル６０巻１４４５−１４５６頁（１９９１年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）が、最近の研究はＤＮＡカプシド封入のためにそれが必要であり、ズーら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７４巻７６３−７６８頁（１９９３年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）ＨＰＶ−１６ Ｌ２アミノ酸配列の比較的維持されるアミノ末端部分における大部分の存在が、非特異的ＤＮＡ結合を成立させる（ズーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６８巻６１９−６２５頁（１９９４年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）ことを示唆している。Ｌ２アミノ酸配列の残りはパピローマウイルス間で非常に種々雑多である（ダノスら、ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・デルマトロジー８３巻７−１１頁（１９９０年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）が、Ｌ２−特異的抗体が完全なビリオンと反応するかどうかは明らかでない（コムリーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６０巻８１３−８１６頁（１９８６年）；ヘーガンシーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６７巻３１５−３２２頁（１９９３年）、その開示をここに引用して明細書の記載とする）。すなわち、Ｌ２蛋白は本研究の結果を実質的に変えるとは思えない。
【００６２】
過去の研究は種々のＨＰＶ型が血清学の技術を用いてお互いに区別し得ることを示している。例えば、足底いぼビリオンと反応する抗体は、通常の平板な肛門性器のまたは喉頭いぼのいずれかの患者の血清よりも、通常、足底いぼの患者の血清により多く見られる（ピフィスターおよびスル・ホーセンら、インターナショナル・ジャーナル・カンサー２１巻１６１−１６５頁（１９７８年）；キーンズラーら、ブリテッシュ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー１０８巻６６５−６７２頁（１９８３年）；およびビアクら、ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロジー３２巻１８−２１頁（１９９０年）、ここに引用してこの明細書の記載とする）。アニシモバら（１９９０年）もまたＨＰＶ−１およびＨＰＶ−２が抗原的に区別されることを、電子顕微鏡によって直接示している。しかしながら、他のＨＰＶ型もまた抗原的関係があるようである。例えば、公示されているＨＰＶ−６感染の患者からの血清中のＨＰＶ−１１ビリオンを特異的に認識する抗体の検出はすでに報告されている（ボネら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー７２巻１３４３−１３４７頁（１９９１年）；およびボネら、ビロロジー１８８巻３８４−３８７頁（１９９２年）；ここに引用してこの明細書の記載とする）。ほとんどのＨＰＶ型からのＨＰＶビリオンの入手ができないことから、ＶＬＰｓが、現在では、ＨＰＶ類間の抗原親近性を調べるための利用し得る最も良い材料である。ＨＰＶ型類間の抗原的相違はＬ１コード配列内の遺伝的多様性に反映しているようである。チャンらはパピローマウイルスＬ１アミノ酸配列の限られた範囲内での遺伝的相違に基づいたパピローマウイルスの系統発生的樹木を作成した（チャンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー６６巻５７１４−５７２５頁（１９９２年）、ここに引用してこの明細書の記載とする）。かれらの研究はＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１間の比較的近い進化論的関係を示し、これはＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１カプシド間の潜在的交差反応性に一致する。他方、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８は、それらのＬ１配列において非常に異なっており、お互いに、またはＨＰＶ−１１とほとんど抗原的交差反応性がないものと思われる。これらの推論は本発明の結果と一致する。
【００６３】
ＨＰＶカプシド抗原性変化の生物学的関連性は不明であるが、カプシド蛋白の相違はパピローマウイルス組織特異性で説明できる。パピローマウイルスの多様性から組換えＶＬＰｓの利用が推定的宿主および組織特異的分子レセプターの同定に有効かもしれない。さらに、ＶＬＰｓはＨＰＶ類の抗原的特徴の輪郭的説明およびこれらのウイルスに対する免疫応答の研究の実行に有用であることを証明し得る。
本発明の理解を明確にするために、ある程度詳細に具体例および実施例により記載したが、特許請求の範囲内において、ある程度の変更および修正は行われ得ることは自明のことである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年3月5日(2010.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ひとパピローマウイルス由来のＬ１カプシド蛋白をコードするポリヌクレオチドであって、これから転写されるｍＲＮＡの３'未翻訳部分がＡＵＵＵＡ配列を含まない、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ひとパピローマウイルス由来のＬ１カプシド蛋白をコードするポリヌクレオチドであって、これから転写されるｍＲＮＡの３'未翻訳部分が、Ｌ１停止コドンの近くにＡＵＵＵＡ配列を含まない、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｍＲＮＡが、Ｌ１コード配列の停止コドンの３０ヌクレオチド以内にＡＵＵＵＡ配列を含まない、請求項１または請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または請求項２記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
バキュロウイルス発現ベクターである、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４または請求項５記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
昆虫細胞である、請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
ひとパピローマウイルス・ウイルス−様粒子またはカプソメアを産生する方法であって、請求項６または請求項７記載の宿主細胞を培養する段階、およびこれから該ウイルス−様粒子またはカプソメアを得る段階を含む、方法。
【請求項９】
ウイルス−様粒子またはカプソメアが、同種の天然の感染性ビリオンまたはそのカプソメアの大きさと等しい大きさであり、該ウイルス−様粒子またはカプソメアが、同種のパピローマウイルスに感染した患者から得られた血清中に存在する抗体によって認識されるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス−様粒子またはカプソメアが精製されている、請求項８または請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ひとパピローマウイルスに対するワクチンを産生する方法であって、請求項８〜１０のいずれかによってひとパピローマウイルス・ウイルス−様粒子またはカプソメアを得る段階、およびそれをアジュバントと組み合わせる段階を含む、方法。
【請求項１２】
ひとパピローマウイルス・ウイルス−様粒子の組み合わせ物を産生する方法であって、請求項８〜１０のいずれかの方法によってＬ１カプシド蛋白を含むひとパピローマウイルス・ウイルス−様粒子を産生する段階、および１またはそれ以上の異なるひとパピローマウイルス由来のＬ１蛋白を含む１またはそれ以上のウイルス−様粒子を組み合わせる段階を含む、方法。
【請求項１３】
ひとパピローマウイルスに対する多価ワクチンを産生する方法であって、請求項１２によってひとパピローマウイルス・ウイルス−様粒子の組み合わせ物を得る段階、およびそれをアジュバントと組み合わせる段階を含む方法。