(57)【要約】【課題】新規GBS毒素受容体、及びその調製及び使用のための方法が提供される。【解決手段】GBS毒素受容体ポリヌクレオチド及びポリペプチド、及びそのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドを包含する、検出、スクリーニング治療方法、及び医薬組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グループBのβ−溶血性連鎖球菌毒素のための哺乳類受容体（GBS毒素受容体）又はそのポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列又は前記核酸配列に対して相補的である配列を含んで成る、少なくとも10個の長さの塩基の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記核酸配列が配列番号９を含んで成る請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記核酸配列が、配列番号１の残基61〜1542, 配列番号７の残基266〜1870及び配列番号３の残基87〜1568から成る群から選択された核酸配列に対して100％の同一性を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７の核酸配列に対して、高い緊縮条件下でハイブリダイズすることができる請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含んで成るベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを生成するための方法であって、適切な培養培地において請求項６記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項８】
哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記受容体が、配列番号２のその対応するアミノ酸配列に対して少なくとも約86％の同一性を有する請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記受容体又はフラグメントが、配列番号４又は配列番号８のアミノ酸配列のその対応する領域に対して100％の同一性を有する請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号１のヌクレオチド61〜1542，及び
ｂ）配列番号３のヌクレオチド87〜1568
から成る群から選択された核酸配列に対して、高い緊縮条件下でハイブリダイズできる核酸配列によりコードされる請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２，４及び８から成るぐんから選択されたアミノ酸配列とは、そのアミノ酸残基のわずか約20％で異なるアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記単離されたポリペプチドのアミノ酸配列が、前記群から選択されたアミノ酸配列とは、１つのアミノ酸残基により異なる請求項１２記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記異なるアミノ酸残基が、前記群から選択されたアミノ酸配列のその対応する残基の保存性置換である請求項１２記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
下記式：
AA1−AAn−AAm
[式中、AA1は、不在であるか又はMであり；
AAn は、配列番号８の０〜100個のアミノ酸、好ましくは０又は41個のアミノ酸、さらにより好ましくは残基２〜42の連続鎖であり；そして
AAmは、AA43〜AA536を含んで成る494個のアミノ酸の連続鎖であり、ここで
（１）AA43, AA47, AA51, AA52, AA57, AA58, AA65, AA66, AA72, AA85 ,AA87, AA93, AA94, AA96, AA115, AA116, AA122, AA123, AA125, AA134, AA143, AA173, AA174, AA178, AA185, AA186, AA189, AA190, AA196, AA200, AA204, AA206, AA207, AA220, AA253, AA260, AA276, AA277, AA280, AA283, AA287, AA294, AA295, AA298, AA300, AA301, AA312, AA324, AA326, AA360, AA365, AA373, AA374, AA379, AA396, AA403, AA407, AA418, AA480, AA483, AA486, AA491, AA494, AA502, AA528, AA529, AA532及びAA536の個々が、
（ａ）それぞれ、配列番号８の残基43, 47, 51, 52, 57, 58, 65, 66, 72, 85, 87, 93, 94, 96, 115, 116, 122, 123, 125, 134, 143, 173, 174, 178, 185, 186, 189, 190, 196, 200, 204, 206, 207, 220, 253, 260, 276, 277, 280, 283, 287, 294, 295, 298, 300, 301, 312, 324, 326, 360, 365, 373, 374, 379, 396, 403, 407, 418, 480, 483, 486, 491, 494, 502, 528, 529, 532及び536;
（ｂ）それぞれ、配列番号４の残基2, 6, 10, 11, 16, 17, 24, 25, 31, 44, 46, 52, 53, 55, 74, 75, 81, 82, 84, 93, 102, 132, 133, 137, 144, 145, 148, 149, 155, 159, 163, 165, 166, 179, 212, 219, 235, 236, 239, 242, 246, 253, 254, 257, 259, 260, 271, 283, 285, 319, 324, 332, 333, 338, 355, 362, 366, 377, 439, 442, 445, 450, 453, 461, 487, 488, 491及び495；又は
（ｃ）その保存性置換、
に対応するアミノ酸残基であり；
（２）AA44-AA46, AA48-AA50, AA53-AA56, AA59-AA64, AA67-AA71, AA73-AA84, AA86, AA88-AA92, AA95, AA97-AA114, AA117-AA121, AA124, AA126-AA133, AA135-AA142, AA144-AA172, AA175-AA177, AA179-AA184, AA187-AA188, AA191-AA195, AA197-AA199, AA201-AA203, AA205, AA208-AA219, AA221-AA252, AA254-AA259, AA261-AA275, AA278-AA279, AA281-AA282, AA284-AA286, AA288-AA293, AA296-AA297, AA299, AA302-AA311, AA313-AA323, AA325, AA327-AA359, AA361-AA364, AA366-AA372, AA375-AA378, AA380-AA395, AA397-AA402, AA404-AA406, AA408-AA417, AA419-AA478, AA481-AA482, AA484-AA485, AA487-AA490, AA492-AA493, AA495-AA501, AA503-AA527, AA530-AA531及びAA533-AA535の個々が、
（ａ）それぞれ、配列番号８の残基44-46, 48-50, 53-56, 59-64, 67-71, 73-84, 86, 88-92, 95, 97-114, 117-121, 124, 126-133, 135-142, 144-172, 175-177, 179-184, 187-188, 191-195, 197-199, 201-203, 205, 208-219, 221-252, 254-259, 261-275, 278-279, 281-282, 284-286, 288-293, 296-297, 299, 302-311, 313-323, 325, 327-359, 361-364, 366-372, 375-378, 380-395, 397-402, 404-406, 408-417, 419-478, 481-482, 484-485, 487-490, 492-493, 495-501, 503-527, 530-531及び533-535；又は
（ｂ）その保存性置換であり；そして
（３）AA315〜AA367の１又は複数のAAが任意には、不在である］で表されるアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを認識する抗体。
【請求項１７】
哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントに結合されるGBS毒素を含んで成る単離された複合体。
【請求項１８】
複合体の形成方法であって、
GBS毒素を結合することができる哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドと、GBS毒素とを、前記ポリペプチドへの前記GBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして
前記複合体の形成を可能にする；
ことを含んで成る方法。
【請求項１９】
GBS毒素受容体を結合する化合物の精製方法であって、
GBS毒素を結合する、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドを提供し；
前記化合物を含んで成るサンプルと前記ポリペプチドとを、前記ポリペプチドへの前記化合物の特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして
前記サンプルの残りから、結合された化合物を分離する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２０】
サンプルにおけるGBS毒素の存在又は不在を決定するための方法であって、
GBS毒素を結合することができる、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドと前記サンプルとを、前記ポリペプチドへの前記GBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして
特異的結合が生じたかどうかを決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法の実施を含んで成る、新生児における初期開始疾病の診断方法であって、前記サンプルが前記新生児から得られ、そして前記GBS毒素の存在が初期開始疾病の表示である方法。
【請求項２２】
哺乳類組織における病的血管系の検出方法であって、GBS毒素受容体の存在を検出することを含んで成る方法。
【請求項２３】
哺乳類毒素受容体へのGBS毒素の結合を阻害する化合物を同定するための方法であって、
CBS毒素を結合することができる、哺乳類GBS毒素受容体、又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドと試験化合物とを、GBS毒素を含む反応混合物において、及び前記受容体又はフラグメントへの前記GBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で一緒にし；そして
前記ポリペプチドへの前記GBS毒素の結合の、前記化合物による阻害の量を決定する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２４】
哺乳類GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合のインヒビター。
【請求項２５】
哺乳類GBS毒素受容体を特異的に結合する化合物を同定するための方法であって、
GBS毒素を結合することができる、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドと試験化合物とを、特異的結合の発生を可能にする条件下で組合して；そして
前記試験化合物と前記ポリペプチドとの間で形成される複合体を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２６】
試験キメラ化合物の細胞毒性を決定するための方法であって、
GBS毒素を結合する哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを細胞表面上で発現する細胞を、前記GBS毒素に結合された細胞毒性剤を含んで成る試験キメラ化合物に暴露し；そして
細胞毒性の微候を検出する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２７】
哺乳類GBS毒素受容体を特異的に結合する分子に共有結合された細胞毒性剤を含んで成るキメラ化合物。
【請求項２８】
GBS毒性受容体のインヒビターの同定方法であって、
試験細胞を、試験化合物の存在及び不在下で、並びに前記化合物の不在下でインキュベートされる細胞が増殖し又は移動することができる条件下でインキュベートし、GBS毒素受容体又はそのフラグメントを発現し、ここで前記試験細胞は、GBS毒素受容体活性を有し；そして
前記試験化合物の存在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動性を、前記試験化合物の不在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動性と比較し、ここで前記試験化合物の存在下での低い増殖又は移動性がGBS毒性受容体のインヒビターである試験化合物の表示である方法。
【請求項２９】
内皮細胞増殖又は移動の同定方法であって、
試験内皮細胞を、試験化合物の存在及び不在下で、並びに前記化合物の不在下で、インキュベートされる細胞が増殖し又は移動することができる条件下でインキュベートし、GBS毒素受容体又はそのフラグメントを発現し、ここで前記試験細胞は、GBS毒素受容体活性を有し；そして
前記試験化合物の存在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動性を、前記試験化合物の不在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動性に比較し、ここで前記試験化合物の存在下での低い増殖又は移動性が内皮細胞増殖又は移動のインヒビターである試験化合物の表示である方法。
【請求項３０】
病的脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理又は予防のための治療用化合物の同定方法であって、
試験細胞を、試験化合物の存在及び不在下でインキュベートし、ここで前記試験細胞は、GBS毒素受容体活性を有する、GBS毒素受容体又はそのフラグメントを発現し；そして
前記試験化合物の存在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動性を、前記試験化合物の不在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動性に比較し、ここで前記試験化合物の存在下での低い増殖又は移動性が医学的状態の処理又は予防のための候補体治療用化合物である試験化合物の表示である方法。
【請求項３１】
前記医学的状態が癌性腫瘍である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記医学的状態が再灌流損傷である請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記医学的状態が、創傷の治癒の間の瘢痕である請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記医学的状態が、ケロイドである請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記医学的状態が、慢性炎症疾患である請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
前記医学的状態が、神経損傷である請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を阻害する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）哺乳類GBS毒素受容体の最も有望なコンホメーションをシミュレートし、そして選択し；
（ｂ）ポリペプチドのエネルギー的に最も有望な立体構造を実質的に模倣する化学的に修飾された類似体を設計し；
（ｃ）前記類似体を化学的に合成し；そして
（ｄ）前記類似体の生物活性を評価する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３８】
哺乳類GBS毒素受容体に結合する化合物の同定方法であって、
（ａ）哺乳類GBS毒素受容体の最も有望なコンホメーションをシミュレートし、そして選択し；
（ｂ）ポリペプチドの最も有望な結合ドメインを推定し；
（ｃ）前記ポリペプチドとエネルギー的に最も有望な複合体を形成する化合物を設計し；
（ｄ）前記化合物を化学的に合成し；そして
（ｅ）前記化合物の生物活性を評価する；
ことを含んで成る方法。
【請求項３９】
ヒト新生児における新生児開始疾病の予防又は処理のための方法であって、ヒトGBS毒素受容体へのGBS毒素の結合のインヒビターを投与することを含んで成る方法。
【請求項４０】
哺乳類組織における病的又は低酸素症由来の内皮細胞増殖又は移動を阻害するための方法であって、前記組織における少なくとも１つの細胞の表面上に存在するGBS毒素受容体に分子を特異的に結合することを含んで成り、ここで前記分子は、
哺乳類におけるGBS毒素受容体に結合される場合、炎症性応答を誘発することができる化合物；
前記GBS毒素受容体を特異的に結合する化合物に結合された細胞毒性化合物を含んで成るキメラ化合物；
GBS毒素受容体リン酸化のインヒビター；及び
GBS毒素受容体活性のインヒビター；
から成る群から選択される方法。
【請求項４１】
GBS毒素受容体又はそのフラグメント；
GBS毒素受容体のインヒビター；及び
GBS毒素受容体を結合する化合物に結合された細胞毒性剤を含んで成るキメラ化合物から成る群から選択された、医薬的有効量の分子；及び医薬的に許容できるキャリヤー；
を含んで成る医薬成物。
【請求項４２】
GBS毒素受容体又はフラグメント；
GBS毒素受容体又はフラグメントの存在を検出するための試薬；及び
前記GBS毒素受容体又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための試薬；
から成る群から選択される成分を含んで成るキット。
【請求項４３】
人体又は動物体の処理方法への使用のためのGBS毒素受容体又はそのフラグメント；
GBS毒素受容体又はそのフラグメント；
GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合のインヒビター；
GBS毒素受容体のインヒビター；及び
GBS毒素受容体を結合する化合物に結合された細胞毒性剤を含んで成るキメラ化合物；
から成る群から選択された、人体又は動物体の処理方法への使用のための分子。
【請求項４４】
病的又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理のための医薬の製造のためへの、GBS毒性受容体のインヒビター、又はGBS毒性受容体へのGBS毒性の結合のインヒビターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GBS毒素受容体ポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する組成物及び方法を提供する。本発明は、細菌源から単離された多糖類のための受容体に関する。
【背景技術】
【０００２】
グループBのβ−溶血性連鎖球菌（Group B β-hemolytic strepts cocus）（GBS）は、偏在する微生物である。GBSが、非常に若い乳児を除いてヒトにおいて有害な感染を引き起こすことは知られていない。また“初期開始疾病”（early-onset diseases）とも呼ばれるGBS肺炎が、新生児における高い罹病率及び死亡率に関連している。
Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, TennesseeでのDr. Carl G. Hellerqvist及び共同研究者により行われた一連の研究において、多糖類GBS毒素が同定された。この毒素は、GBS肺炎の合併症における主要因子であることが決定されており、そして血管形成の阻害を通しての腫瘍の攻撃における治療剤として有用であることが見出された（アメリカ特許第5,010,062号）。
【０００３】
さらに、アメリカ特許第5,858,991号及びWO98/32453号に記載されるように、GBS毒素は、瘢痕を最少にし、そして治療を促進することによって患者における創傷治癒を促進し、そして創傷関連腫瘍進行（wound-related tumor progressions）を低める。
WO98/32452号及びWO98/ 32448号は、慢性炎症性疾患、例えばリウマチ様関節炎及び乾癬を有する患者を処理し、そして神経損傷の修復を増強するための治療剤としてのGBS毒素の使用を記載する。
本発明の前、GBS毒素のための受容体は同定されたことはない。上記状態において脈管形成を受ける組織の進行性血管系における細胞上に存在するGBS毒性の受容体を信じている本発明の研究者は、本発明をもたらす一連の実験に着手した。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約：
最初に、グループBのβ溶血性連鎖球菌毒性のための新規受容体（GBS毒素受容体）が同定された。本発明の1つの観点は、GBS毒素受容体を含んで成るポリペプチド又はそのポリペプチドフラグメントを提供する。好ましい態様は、哺乳類GBS毒素受容体を包含する。また、GBS毒素受容体又はそのフラグメントを認識する抗体が提供される。本発明のポリペプチドは、中でも、病理学的又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成から生じる病状、例えば癌性腫瘍、慢性炎症性疾患、創傷治癒の間の瘢痕、ケロイド、神経及び再灌流損傷を処理するか又は予防するために使用され得る化合物のスクリーニングのために使用され得る。
【０００５】
本発明のもう１つの観点は、GBS毒素受容体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。好ましいポリヌクレオチドは、少なくとも10個の長さの塩基であり、そして哺乳類GBS毒素受容体又はそのポリヌクレオチドフラグメントをコードする核酸配列を含んで成り、又はそれをコードする核酸配列に対して相補的である。
【０００６】
本発明の第３の観点は、哺乳類毒素受容体又はそのフラグメントに結合されたGBS毒素を含んで成る複合体である。また、そのような複合体を形成する方法が提供される。この方法は、GBS毒素を結合することができる、哺乳類GBS毒素受容体又はフラグメントを含んで成るポリペプチドとGBS毒素とを、前記ポリペプチドへのGBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で接触し、そして複合体の形成を可能にすることを含んで成る。
【０００７】
本発明のさらにもう１つの観点は、GBS毒素受容体を結合する化合物を精製するための方法である。本発明は、
GBS毒素を結合する、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドを提供し；
前記化合物を含んで成るサンプルと前記ポリペプチドとを、前記ポリペプチドへの前記化合物の特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして
前記サンプルの残りから、結合された化合物を分離する；
ことを含んで成る。
【０００８】
本発明のもう1つの観点は、サンプルにおけるGBS毒素の存在又は不在を決定するための方法である。この方法は、
GBS毒素を結合することができる、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドと前記サンプルとを、前記ポリペプチドへの前記GBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ；そして
特異的結合が生じたかどうかを決定する；
ことを含んで成る。新生児から得られるサンプルにおけるGBS毒素の存在が、初期開始疾病の表示である。
【０００９】
本発明の第６の観点は、哺乳類組織における病理学的血管系の検出方法である。この方法は、GBS毒素受容体の存在を検出することを含んで成る。この方法は、脈管形成又は新生血管形成に関連する種々の医学的状態を検出し、又はモニターし、例えば癌性腫瘍の転移を検出し、又は癌に対する治療を受ける哺乳類における腫瘍の縁をモニターするために使用され得る。
【００１０】
本発明のもう1つの観点は、病的及び/又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理のための薬物候補体の同定方法を提供する。１つの態様は、哺乳類GBS毒素受容体を特異的に結合する化合物を同定するための方法である。この方法は、GBS毒素を結合することができる、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントと試験化合物とを、特異的結合の発生を可能にする条件下で一緒にし、そして試験化合物とポリペプチドとの間で形成される複合体を検出することを含んで成る。
【００１１】
もう1つの態様は、試験キメラ化合物の細胞毒性を決定するための方法である。この方法は、GBS毒素を結合する、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを、細胞表面上で発現する細胞を、前記GBS毒素に結合される細胞毒性剤を含んで成る試験キメラ化合物に暴露し；そして細胞毒性の微候を検出することを含んで成る。
【００１２】
さらに、もう1つの態様は、試験化合物の存在及び不在下で、並びに前記試験化合物の不在下でインキュベートされる細胞が増殖し、又は移動することができる条件下で、GBS毒素受容体又はそのフラグメントを発現する試験細胞をインキュベートし、そして前記試験化合物の存在及び不在下でインキュベートされる試験細胞の増殖又は移動を比較することによって、GBS毒性受容体のインヒビターを同定するための方法であり、ここで前記試験化合物の存在下での低い増殖又は移動性が、GBS毒性受容体のインヒビターである試験化合物の表示である。
【００１３】
内皮細胞増殖又は移動のインヒビターは、上記方法により同定され得、ここで試験化合物の存在下での試験細胞の低い増殖又は移動性が、内皮細胞増殖又は移動のインヒビターである試験化合物の表示である。病理学的脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理又は予防のための治療用化合物がまた上記方法により同定され得、ここで試験化合物の存在下での試験細胞の低い増殖又は移動性が、前記医学的状態の処理又は予防のための候補体治療化合物である試験化合物の表示である。
【００１４】
本発明はまた、哺乳類GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を阻害する化合物の同定方法も提供する。この方法は、
哺乳類GBS毒素受容体の最も有望なコンホメーションをシミュレートし、そして選択し；
ポリペプチドのエネルギー的に最も有望な立体構造を実質的に模倣する化学的に修飾された類似体を設計し；
前記類似体を化学的に合成し；そして
前記類似体の生物活性を評価する；
ことを含んで成る。
【００１５】
また、哺乳類GBS毒素受容体に結合する化合物を同定するための方法が提供される。この方法は、
哺乳類GBS毒素受容体の最も有望なコンホメーションをシミュレートし、そして選択し；
ポリペプチドの最も有望な結合ドメインを推定し；
前記ポリペプチドとエネルギー的に最も有望な複合体を形成する化合物を設計し；
前記化合物を化学的に合成し；そして
前記化合物の生物活性を評価する；
ことを含んで成る。
【００１６】
本発明のもう１つの観点は、ヒトGBS毒素受容体へのGBS毒素の結合のインヒビターを投与することによる、ヒト新生児における新生児開始疾病の予防又は処理のための方法である。
【００１７】
本発明のさらにもう1つの観点は、哺乳類組織における病理学的又は低酸素症由来の内皮細胞増殖又は移動性を阻害するための方法である。前記方法は、組織における少なくとも１つの細胞の表面上に存在するGBS毒素受容体に分子を特異的に結合することを含んで成り、ここで前記分子は、哺乳類におけるGBS毒素受容体に結合される場合、炎症性応答を誘発することができる化合物；前記GBS毒素受容体を特異的に結合する化合物に結合される細胞毒性化合物を含んで成るキメラ化合物；GBS毒素受容体リン酸化のインヒビター；及びGBS毒素受容体活性のインヒビターから成る群から選択される。
【００１８】
本発明はまた、人体又は動物体の処理方法に使用するために、あるいは病的低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理のための医薬の製造のために、GBS毒素受容体又はそのフラグメント、GBS毒素受容体のインヒビター、又はGBS毒素受容体へのGBS毒素の結合のインヒビターを提供する。また、GBS毒素受容体を結合する化合物に結合された細胞毒性剤を含んで成る人体又は動物体の処理方法への使用のためのキメラ化合物が提供される。
【００１９】
また、GBS毒素受容体、及び/又はGBS毒素受容体を結合する化合物に結合される細胞毒性剤を含んで成るキメラ化合物、並びに医薬的許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物が提供される。
本発明はまた、GBS毒素受容体又はフラグメント、及び/又はGBS毒性受容体又はそのポリペプチドフラグメントの存在又はGBS毒性受容体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための試薬を含んで成るキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は合理的な薬物企画の工程を示す。
【図２Ａ】図２Aは、例４に記載されるような抗体Pab55を用いて、癌性ヒト卵巣組織におけるGBS毒素受容体発現の免疫組織化学分析の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Bは、例４に記載されるような抗体Pab55を用いて、正常ヒト卵巣組織におけるGBS毒素受容体発現の免疫組織化学分析の結果を示す。
【図３Ａ】図３Aは、例４に記載されるような抗体Pab57を用いて、癌性ヒト卵巣組織におけるGBS毒素受容体発現の免疫組織化学分析の結果を示す。
【図３Ｂ】図３Bは、例４に記載されるような抗体Pab57を用いて、正常ヒト卵巣組織におけるGBS毒素受容体発現の免疫組織化学分析の結果を示す。
【図４Ａ】図４Aは、例６に記載されるような癌性組織において発現されるGBS毒素受容体へのキメラ化合物の標的化された供給を示す。
【図４Ｂ】図４Bは、例６に記載されるような癌性組織において発現されるGBS毒素受容体へのキメラ化合物の標的化された供給を示す。
【図４Ｃ】図４Cは、例６に記載されるような癌性組織において発現されるGBS毒素受容体へのキメラ化合物の標的化された供給を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義：
一般的に、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において使用される命名法、及び細胞培養、分子遺伝学及び核酸化学における実験方法、並びに下記記載されるハイブリダイゼーションは、当業界において良く知られており、そして通常、当業界において使用される。組換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のための標準技法が使用される。
【００２２】
製造業者により供給される酵素反応及び精製段階は典型的には、その製造業者の規格に従って行われる。技法及び方法は、当業界における従来の方法、及び種々の一般的な文献（一般的には、Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に従って行われる。
【００２３】
本明細書において使用される命名法、及び分析化学、有機合成化学及び下記に記載される医薬製剤における実験方法は、当業界において良く知られ、そして通常使用されるものである。標準技法が、化学合成、化学分析、医薬配合及び供給、及び患者の処理のために使用され得る。本発明の開示を通して使用される場合、次の用語は、特異ことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
【００２４】
“GBS毒素受容体”とは、グループBのβ−溶血性連鎖球菌からの毒素（GBS毒素）、例えばCM101を結合することができるタンパク質分子を意味する。GBS毒素受容体は通常、天然において、細胞の表面上に見出される。組換え膜結合及び可溶性GBS毒素受容体が、当業界において知られており、そして本明細書に記載される実験技法により生成され得る。
【００２５】
本明細書において言及される用語“単離されたポリヌクレオチド”とは、ポリヌクレオチドが、それが天然において通常結合されるのと同じ態様で天然において通常結合される染色体又は細胞と、単離されたポリヌクレオチドがもはや結合されなくなるよう操作にゆだねられているポリヌクレオチドを意味する。“単離されたポリヌクレオチド”の例は、ゲノム、組換え又は合成起源、又はそれらの組み合わせ起源のポリヌクレオチドである。
【００２６】
本明細書において言及される用語“単離されたタンパク質”とは、タンパク質が、それが天然において通常結合されるのと同じ態様で天然において通常結合される細胞と、もはや結合されないタンパク質、例えば（１）同じ源からの少なくともいくらかの他のタンパク質を有さないタンパク質、（２）異なった種からの細胞により発現されるタンパク質、（３）天然に存在しないタンパク質、及び（４）cDNA, 組換えRNA又は合成起源、又はそれらの組み合わせから生成されるタンパク質を意味する。
【００２７】
用語“ポリペプチド”は、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、フラグメント、又は類似体を言及するための一般的な用語として、本明細書に使用される。従って、天然のタンパク質、フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。
用語“天然に存在する”とは、天然に見出されることを意味する。例えば、天然に見出される生物（例えば、ウィルス）に存在し、そして実験室においてヒトにより故意に修飾されていないポリペプチド又はポリヌクレオチドが天然に存在する。
【００２８】
用語“作用可能に連結される”とは、並置を言及し、ここでそのように記載される成分は、それらの意図された態様においてそれらの機能を可能にする関係で存在する。コード配列に“操作可能に連結される”対照配列は、コード配列の発現が対照配列と適合できる条件下で達成されるような態様で連結される。
【００２９】
用語“制御配列”とは、それらが連結されるコード配列の発現をもたらすために必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なり；原核生物においては、そのような制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み；真核生物においては、そのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。用語“制御配列”は、最少でも、発現のために必要である存在するすべての成分を含むよう意図され、そしてまた、好都合である存在する追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。
【００３０】
用語“ポリヌクレオチド”とは、本明細書において言及される場合、少なくとも10個の長さの塩基のヌクレオチドのポリマー形、すなわちリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかの型のヌクレオチドの修飾形を意味する。この用語は、DNAの一本鎖及び二本鎖形を包含する。
【００３１】
本明細書において言及される用語“オリゴヌクレオチド”は、天然に存在する及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド連鎖により一緒に連結される、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは通常、200個の長さ又はそれよりも少ない塩基のポリヌクレオチドである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、最少10〜60個の長さの塩基、及び最も好ましくは、13〜35個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、プローブに関しては、一本鎖であり；但し、例えば、遺伝子変異体の構成への使用のためには、通常二本鎖である。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスのいずれかのオリゴヌクレオチドであり得る。
【００３２】
本明細書において言及される用語“天然に存在するヌクレオチド”とは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語“修飾されたヌクレオチド”とは、修飾された又は置換された糖基及び同様のものを有するヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語“オリゴヌクレオチド連鎖”とは、オリゴヌクレオチド連鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート、及び同様のものを包含する。オリゴヌクレオチドは、所望により、欠失のためのラベルを含むことができる。
【００３３】
“相補的”又は“相補体”とは、アデニンが最初の核酸配列に出現する場合、チミン又はウラシルが“相補的”配列に見出され、そして逆もまた同じであり、そしてグアニンが最初の核酸配列に出現する場合、シトシンが“相補的”配列に見出され、そして逆もまた同じであることを意味する。
【００３４】
用語“配列同一性”とは、２種の核酸配列間での塩基適合の割合、又は２種のアミノ酸配列間でのアミノ酸適合の割合、すなわち２種の配列間での同一性の程度を記載する。配列同一性が％として、例えば50％として表される場合、その％は、いくつかの他の配列に比較されるGBS毒素受容体配列からの配列の長さに対する正確な適合性の割合を示す。種々のコンピューター整列プログラムが、配列同一性を決定するために使用され得る。
【００３５】
その単純な形においては、％同一性は、２種の核酸配列間の又は２種のアミノ酸配列間の正確な適合性の数を、対照配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸の合計数により割り算することによって計算される。例えば、長さ400個のアミノ酸の配列間で300の適合性が存在する場合、それらの配列は75％の同一性を有する。ウラシル及びチミンは、リボ核酸配列とデオキシリボ核酸配列とを比較する場合、同一であると思われる。
【００３６】
ポリヌクレオチドに適用される場合、用語“実質的な同一性”とは、２種の核酸配列が、最適には、例えばプログラムBLAST（Altschulなど., J. Mol. Bio. 215: 403-410 (1990)）により整列される場合、少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％の配列同一性及び最も好ましくは、95％又はそれ以上の配列同一性を共有することを意味する。
【００３７】
コンピュ−ター整列プログラムを用いる場合、ギャップ（２種の配列のいずれかにおける）は適合性を最大にするようにされ；15個又はそれ以下の塩基のギャップ長さが通常使用され；６個又はそれ以下の塩基が好ましく；２個又はそれ以下の塩基が最も好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブとして、又は処理に用いる場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列同一性は一般的に、20の可能なオリゴヌクレオチド塩基対適合のうち17以上の標的塩基適合であり（85％）；好ましくは、10の可能な塩基対適合のうち９以上の適合であり（90％）、そして最も好ましくは、20の可能な塩基対適合のうち19以上の適合である（95％）。
【００３８】
好ましくは、それにもかかわらず、同一でない塩基は、そのアミノ酸位置で同じアミノ酸をコードする縮重コドンの一部である。他方では、同一でない塩基は好ましくは、そのアミノ酸位置のための保存性アミノ酸置換をコードする縮重コドンの一部である。
【００３９】
ポリペプチドに適用される場合、用語“実質的な同一性”とは、２個のペプチド配列が、BLASTコンピュータープログラムにより最適に整列される場合、少なくとも約80％の配列同一性、好ましくは少なくとも約86％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約95％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約99％の配列同一性（１つのアミノ酸差異を有するまで）を共有し、そして最も好ましくは、100％の同一性を共有する。ギャップ（適合される２種の配列のいずれかにおける）は、適合化の最大化において可能にされ；５又はそれ以下のギャップの長さが好ましく、そして２又はそれ以下がより好ましい。好ましくは、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
【００４０】
保存性アミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリシン、アルギニン及びヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。
【００４１】
好ましい保存性アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。
本明細書において言及される用語“高い緊縮性条件下でハイブリダイズできる”とは、お互いに対して95％以上の実質的な同一性を有する核酸配列のみがハイブリダイズするであろう条件下で、特異的に結合することができることを意味する。
用語“縮重コドン”とは、遺伝子コードに従って所望するアミノ酸をコードするヌクレオチドコドントリプレットのいずれかを意味する。コドンは、宿主生物、例えばE.コリにおける既知の好ましいコドン使用法に基づいて選択され得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語“ポリペプチドフラグメント”は、アミノ酸末端及び/又はカルボキシ−末端欠失を有するが、しかし残るアミノ酸が、例えば完全な長さのDNA配列から推定される天然に存在する配列におけるその対応する位置と同一であるポリペプチドを言及する。フラグメントは典型的には、少なくとも３個の長さのアミノ酸、好ましくは５〜10個の長さのアミノ酸、より好ましくは10〜50個の長さのアミノ酸、さらにより好ましくは50個よりも多くの長さのアミノ酸であり、そしてGBS毒素受容体の少なくとも１つの細胞外ドメインを含んでなる。
【００４３】
最も好ましくは、フラグメントは、GBS毒素受容体の完全な細胞外ドメインを含んで成り、そして好ましくはまた、細胞、脂質膜、リポソーム、ミセル又は他の親油性構造体の表面上に、機能的立体化学コンホメーションでポリペプチドフラグメントを維持するのに十分であるトランスメンブラン及び細胞内ドメインの一部を含んで成る。
【００４４】
用語“免疫学的に活性”とは、抗原性質を有するか、又はGBS毒素受容体を特異的に結合することができる抗体により特異的に結合され得ることを意味する。物質は、それが、特定の抗原を認識し、そして結合するであろう抗体の生成を促進することが当業界において知られている条件下で、動物に投与される場合、モノクローナル又はポリクローナル抗体を生成することができる場合、抗原性質を有する。
【００４５】
“異種ポリペプチド”は、特定細胞により通常生成されるポリペプチドとは異なるポリペプチドである。例えば、GBS毒素受容体ポリペプチド又はそのフラグメントを通常生成しない細胞において、組換え的に生成される、GBS毒素受容体ポリペプチド又はそのフラグメントが、異種ポリペプチドである。GBS毒素受容体ポリペプチド又はそのフラグメントに連結される第２ポリペプチドはまた、それが天然においてGBS毒素受容体ポリペプチドに連結されなければ、異種ポリペプチドである。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語“ラベル”又は“ラベルされた”とは、例えば、放射性ラベルされるアミノ酸の組み込み、又は標識されたアビジン（例えば、光学的又は比色方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）により検出され得るビオチニル成分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組み込みを言及する。ポリペプチド及び糖タンパク質をラベリングする種々の方法は、当業界において知られており、そして使用され得る。
【００４７】
ポリペプチドのためのラベルの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体（例えば、3H, 14C, 35S, 125I, 131I）、蛍光ラベル（例えば、FITC, ローダミン、ランタニドリン）、酵素ラベル（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセンス、ビオチニル基、ニ次レポーターにより認識される予定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの態様においては、ラベルは、可能性ある立体的障害を低めるための種々の長さのスペーサーアームにより結合される。
【００４８】
用語“化合物”とは、本明細書において使用される場合、好ましくは、ペプチド、ペプチド擬似体、有機又は他の化学分子を意味し、そしてまた、核酸分子又はその化学的誘導体を言及する。化合物は、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドと相互作用することができ、又はそれらであり得る。
単数形“ａ”“an”及び“the”は、特にことわらない限り、複数表示を包含する。
本明細書に記載される核酸及びアミノ酸の配列が、下記表１に要約される。
【００４９】
【表１】
2010099072.tif 000002
【００５０】
本明細書に提供される標題は、論議される一般的な話題を記載し、そして他のセクションにおいて論議される情報を除くものではない。ときおり、情報、方法、組成物及び他の観点が、本発明の１よりも多くの態様に適用でき、そしてそのように組み合わされ得る。
【００５１】
序説：
GBS毒性は、病理学的、低酸素症由来及び発生学的脈管形成又は新生血管形成を受ける組織に結合する。本発明者は、本明細書に記載される少なくとも２種の哺乳類GBS毒素受容体を同定した。例１及び２は、いくつかのGBS毒素受容体のクローニング及び特徴化を記載する。本発明者は、７種のトランスメンブランドメインを有する内在性タンパク質としてGBS毒性受容体を分類した。推定されるセグメントが表７に示される。
【００５２】
タンパク質は、cAMP−依存性キナーゼ、タンパク質キナーゼC（PKC）及びカゼインキナーゼII（CK2）によるリン酸化のためのいくつかの推定上の部位を有する。典型的には、そのような内在性タンパク質は、分子（例えば、リガンド又は細胞外メッセンジャー）の結合に基づいて、上記で論じられたようなリン酸化部位でのリン酸化を促進するコンホメーション変化を受ける。それらの部位でのタンパク質のリン酸化は、シグナルトランスダクションカスケードを引き起こし、これがしばしば、結合分子に暴露された細胞の増殖又は他の核応答をもたらす。
【００５３】
脈管形成又は新生血管形成は、内皮細胞の増殖及び移動を包含する。例４及び５においてより詳細に論じられるように、GBS毒素受容体発現、病理学的、低酸素症由来及び発生学的脈管形成又は新生血管形成を包含する医学的状態と相互関係している。GBS毒素受容体ポリペプチドは、種々の目的、例えばGBS毒素受容体により介在される内皮細胞増殖及び/又は移動を阻害することができる化合物のスクリーニングのために、及び毒素受容体を発現する細胞に結合し、そして破壊することができる細胞毒素キメラ化合物のスクリーニングのために使用され得る。GBS毒素受容体ポリヌクレオチドは、種々の目的、例えばGBS毒素受容体をコードするメッセンジャーRNAの翻訳を阻止することができるアンチセンスポリヌクレオチドの企画のために使用され得る。
【００５４】
ポリヌクレオチド：
本発明の1つの観点は、GBS毒性受容体又はそれに由来するグラグメントをコードする核酸配列をコードするか又はそれに対して相補的である、少なくとも10個の長さの塩基の単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、GBS毒素受容体は、哺乳類GBS毒素受容体、より好ましくは羊、ウシ又はネコGBS毒素受容体、及び最も好ましくは、ヒトGBS毒素受容体である。単離されたポリヌクレオチドは、天然に存在しても又は天然に存在しなくても良い。
【００５５】
単離されたポリヌクレオチドは、DNA配列、又はあらゆるTがUにより置換されているRNA配列を含んで成る。％同一性の決定のためには、TはUと同等であると見なされる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、羊、ウシ、ネコ又はヒトGNS毒素受容体の対立遺伝子を包含し、そして他の哺乳類のGBS毒素受容体の対立遺伝子を包含することができる。それらのポリヌクレオチドは、下記にさらに記載されるように、配列番号1, 3, 7, 9及び11に由来するポリヌクレオチドを用いて単離され得る。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びフラグメントは、非特異的核酸への検出できる結合の適切な量を減じる、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドは、少なくとも20の連続したポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１又は３の少なくとも30の連続したヌクレオチドを含んで成る核酸配列を有する核酸分子、及びより好ましくは、配列番号1, 3, 7, 9又は11、又は配列番号1, 3, 7, 9又は11の相補体の核酸配列に、高い緊縮条件下でハイブリダイズすることができる。
【００５７】
そのようなポリヌクレオチドは、選択的な緊縮性のハイブリダイゼーションを行うために使用さえ得、そして特に、GBS毒素受容体mRNAの翻訳をブロックするためにアンチセンス分子として、GBS毒素受容体をコードする天然に存在する核酸（例３を参照のこと）を単離するために、サンプルにおけるGBS毒素受容体の存在又は不在を決定するためのポリメラーゼ鎖反応（PCR）による核酸の増幅の実施のために有用である。
【００５８】
高い緊縮条件で、次のヌクレオチドの核酸配列を含んで成る核酸配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるポリヌクレオチドが特に好ましい：配列番号７のヌクレオチド266〜1870（開始コドンを包含するヒトGBS毒素受容体の推定上の完全な長さのコード領域）、配列番号１のヌクレオチド61〜1542（開始コドンを含まないヒトGBS毒素受容体の部分的コード領域）、配列番号１のヌクレオチド58〜1542（開始コドンを包含するヒトGBS毒素受容体の部分的コード領域）、配列番号３のヌクレオチド87〜1568（開始コドンを含まない羊GBS毒素受容体のコード領域）、配列番号３のヌクレオチド84〜1568（開始コドンを含む羊GBS毒素受容体のコード領域）、又はそれらの相補的核酸配列。
【００５９】
ポリヌクレオチドは、配列番号1, 3又は７の対応する領域の核酸配列、又は配列番号1, 3又は７の対応する領域の補体に対して、約85％〜100％、好ましくは約87％以上、より好ましくは約95%以上、及び最も好ましくは約99％〜100％の同一性を有することができる。配列番号７のヌクレオチド266〜1870、又は配列番号3, 9又は11のヌクレオチド87〜1568の核酸配列、又はそれらの相補的核酸配列を含んで成るポリヌクレチドが特に好ましい。
【００６０】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、GBS毒素受容体のフラグメントのアミノ酸配列に対して、約85％〜100％、より好ましくは86％以上、さらにより好ましくは95％以上、及び最も好ましくは99％〜100％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、又はその核酸配列に対して相補的な核酸配列を含んで成る。好ましくは、フラグメントは、GBS毒素を結合する。好ましいフラグメントは、配列番号２の残基１〜495のすべて又は一部、又は配列番号８の残基１〜536のすべて又は一部を含んで成る。配列番号４の残基１〜495、配列番号２の残基１〜495、又は配列番号８の残基１〜536のアミノ酸配列に対して100％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るポリヌクレオチドが特に好ましい。
【００６１】
天然に存在するGBS毒素受容体をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法により、そのような受容体を生成する異なった種からの種々の組織源及び細胞培養物、例えば腫瘍内皮からの細胞、リウマチ様関節炎における滑膜組織、又は灌流損傷又は傷つけられた組織における血流から取られるか又はそれから制限された低酸素症組織から単離され得る。
【００６２】
そのようなポリヌクレオチドは、プローブを用いてのハイブリダイゼーション又はオリゴヌクレオチドを用いてのポリメラーゼ鎖反応により、及び当業界において知られている他の分子生物学的技法を行うことにより単離され得る。そのようなプローブ及びオリゴヌクレオチドは典型的には、配列番号1, 3, 7, 9又は11、好ましくは配列番号1, 3又は７の配列の種々の領域を含んで成り、又は配列番号2, 4, 8, 10又は12、好ましくは配列番号2, 4又は8の配列の種々の領域をコードする。
【００６３】
種々の生物のGBS毒素受容体をコードする遺伝子をクローニングするために有用なポリヌクレオチドは、相同タンパク質のアミノ酸配列を比較することによって決定され得る（表４を参照のこと）。例えば、保存された領域は、ハイブリダイゼーション又は核酸増幅、すなわち下記及び例３においてさらに論じられる技法のためのプローブとして使用されるオリゴヌクレオチド又は変性オリゴヌクレオチドの合成のために標的化され得る。
【００６４】
緊縮性は、選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために変更され得、それにより、お互いに対して95％以下の同一性を有する核酸配列がハイブリダイズするであろう。それらの条件は、当業界において知られており、そして本明細書において論じられ、そして例が提供される。一般的に、本発明及び興味ある核酸配列のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びフラグメント間の核酸配列同一性は、少なくとも約85％であり、そしてより典型的には、好ましくは少なくとも約90％, 95％、99％，及び100％の上昇する同一性を有する。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、当業界において知られているような高い緊縮条件及び対応するハイブリダイゼーション条件下でプローブとして使用され得る。小さなポリヌクレオチド、例えば200個の塩基又はそれよりも少ない長さの塩基のポリヌクレオチドはしばしば、オリゴヌクレオチドとして当業界において言及される。同じか又は関連する核酸配列を検出するためにプローブとしてポリヌクレオチドを用いるための技法は、当業界において良く知られている。例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Sambrookなど., 特にチャプター11を参照のこと。
【００６６】
通常、プローブは、10〜200個の長さの塩基であるポリヌクレオチドから製造され得る。好ましくは、プローブは、10〜60個の長さのヌクレオチド及び最も好ましくは12〜40個の長さのヌクレオチドのポリヌクレオチドから製造され得る。特定のプローブは、Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988)) の方法を用い、そして比較される配列の同一性の程度を示す、核酸相同性コンピュータープログラム、例えばFASTAを用いて得られる結果に基づいて企画され得る。
【００６７】
プローブのサイズは、それがハイブリダイズされるであろう遺伝子の領域に依存する。プローブのサイズは、所望しない核酸配列に対する相同性の程度が上昇するにつれて、上昇する。10〜50個の長さのヌクレオチド、好ましくは50個以上のヌクレオチド、さらにより好ましくは100個以上のヌクレオチドのプローブが使用され得、そして最も好ましくは、GBS毒素受容体の完全なコード領域から製造されたプローブが使用されるであろう。誤った陽性の数を減じるためには、好ましくは２種のプローブが、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で両プローブに結合するクローンを同定するために使用される。オリゴヌクレオチドは、製造業者により提供される規格に従って、Applied BioSystems オリゴヌクレオチド合成機上で合成され得る。
【００６８】
典型的には、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、従来のハイブリダイゼーション方法に従って行われる。プラークリフトをスクリーニングするための典型的なハイブリダイゼーション条件（Benton and Davis (1978) Science 196: 180） は、次の通りであり得る：50％のホルムアミド、５×SSC（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）又はSSPE（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、EDTA）、１〜５×Denhardt溶液、0.1〜１％のSDS、100〜200μgの剪断された異種DNA又はtRNA, ０〜10％の硫酸デキストラン、１×105〜１×107cpm/mlの変性プローブ（約１×108cpm/μgの比活性を有する）、及び42℃で約６〜36時間のインキュベーション。
【００６９】
プレハイブリダイゼーション条件は実質的に同一であるが、但しプローブは含まれず、そしてインキュベーション時間は典型的には、減じられる。洗浄条件は典型的には、１〜３×SSC、0.1〜１％のSDS、42〜70％であり、そして約５〜30分での洗浄溶液の交換を伴う。同起源の細菌配列、例えば対立遺伝子配列が、この態様で得られる。高い緊縮性のハイブリダイゼーション条件のためには、種々のパラメーターが、ハイブリダイゼーションの緊縮性を高めるために、例えばラベルされたプローブとのインキュベーションの温度を高めることによって変更され得る。好ましくは、実験企画におけるより高い柔軟性のためには、プローブはより低い温度、例えば室温でハイブリダイズされ得、そして次に、緊縮性が洗浄溶液の塩濃度を変更することによって変性され得る。
【００７０】
高い緊縮性のためには、42℃よりも高いか又は等しい洗浄温度、例えば３×SSCよりも低い塩濃度、例えば0.1×SSCを有する洗浄緩衝液における68℃が使用され得る。多くの場合、TMACLが、特に、非特異的結合を低めるためにG−C塩基対に富んでいるポリヌクレオチドのために使用され得る。より低い緊縮性洗浄が、低い同一性を有するポリヌクレオチド、又は60個よりも少ない塩基対であるポリヌクレオチドをハイブリダイズするために使用され得る。低い緊縮性のためには、42℃よりも低いか又は等しい温度が、２×SSCよりも高いか又は等しい塩濃度を有する洗浄緩衝液において使用され得る。
【００７１】
本発明は、標的核酸の増幅のための方法、例えばポリメラーゼ鎖反応（“PCR”）技法を包含する。PCR技法は、お互い間隔をあけられて存在し、そして本明細書に示される遺伝子配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、種々の生物のゲノムにおける関連する配列を同定し、そして疑わしいサンプルにおけるヌクレオチド配列を検出するために適用され得る。プライマーは、二本鎖のDNA分子の対抗する鎖に対して相補的であり、そして典型的には、約50〜450個のヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチド（通常、2000個以下のヌクレオチド）により分離される。
【００７２】
この方法は、特定オリゴヌクレオチドプライマーの調製、続いて、標的DNA変性、プライマー結合、及びプライマー空間に基づいて予測される長さのDNAフラグメントを得るためにDNAポリメラーゼによる延長の反復されたサイクルを必要とする。１つのプライマーから生成される延長生成物は、他のプライマーのための追加の標的配列として作用する。標的配列の増幅の程度は、実施されるサイクルの数により制御され、そして単純な式2n（ここで、ｎはサイクルの数である）により理論的に計算される。
【００７３】
サイクル当たりの平均効率が約65％〜85％の範囲である場合、25のサイクルが標的配列の0.3〜4.8×106個のコピーを生成する。PCR方法は多くの出版物、例えばSaikiなど., Science (1985) 230: 1350-1354; Saikiなど., Nature (1986) 324: 163-166; 及びScharfなど., Science (1986) 233: 1076-1078に記載される。また、アメリカ特許第4,683,194号；第4,683,195号；及び第4,683,202号（引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００７４】
PCR増幅のための追加の方法は、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification ed. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protecols; A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. and Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications I: 17; 及びPCR, eds. McPherson, Quirkes, and Tsylor, IRL Press, Oxford (それらはすべては、引用により本明細書中に組み込まれる)に記載される。
【００７５】
さらにもう1つの態様においては、アンチセンスポリヌクレオチドが、医学的状態、例えば病理学的及び/又は低酸素症由来の脈管形成を処理し又は妨げるために哺乳類に投与され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、既知のオリゴヌクレオチド合成方法のいずれかにより合成され得る。そのような方法は一般的に、たとえばWinnacker, From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology, VCH Verlagsgesellschaft mbH (H., Ibelgaufts trans. 1987) に記載されている。
【００７６】
オリゴヌクレオチド合成のいずれかの既知方法が、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製に使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、市販の自動核酸合成機のいずれかを用いることによって、最も都合良く調製される。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを調製するために利用できる装置、すなわちApplied Biosystems 380B DNA Synthesizerは、シアノエチルホスホラミジット化学を利用する。mRNA転写体のいずれかの部分とハイブリダイズできるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に既知のオリゴヌクレオチド合成方法により調製され得る。
【００７７】
いずれの長さのオリゴヌクレオチドでも本発明の実施において使用され得るが、12個よりも短い配列は標的GBS毒素受容体mRNAへのハイブリダイゼーションにおいては低い特異性であり、そして酵素消化により一層容易に破壊され得る。従って、12又はそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが好ましい。18〜21個のヌクレオチドの配列は、標的細胞による低められた摂取のために、GBS毒素受容体翻訳の阻害においては、幾分低い有効性を有する。
【００７８】
従って、12〜21個のヌクレオチドのオリゴマー、特に12〜18個のヌクレオチドのオリゴマーが、本発明の実施において最も好ましい。GBS毒素受容体mRNA転写体のいずれかの部分に相補的であり、そしてその部分にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは、原則的に、転写体の翻訳の阻害のために効果的であり、そして本明細書に記載される効果を誘発することができる。翻訳は、阻害コドンでのその近くでの部位でmRNAを阻止することによって、最も効果的に阻害される。従って、GBS毒素受容体mRNA転写体の5’側領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００７９】
ハイブリダイゼーションを妨げる二次又は三次構造は、この領域においては、最少である。さらに、開始部位から3’側方向に離れ過ぎている配列は、“読み合わせ（read-through）”現像のために、mRNA転写体のハイブリダイゼーションにおいて、ほとんど効果的ではなく、それによりリボソームは、メッセンジャーの翻訳を可能にするために、アンチセンス/センス重複体を解くことが推定される（例えば、Shakin, J. Biochemistry 261, 16018 (1986) を参照のこと）。
【００８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、タンパク質合成のためのATG開始コドンでの又は近くでの部位に向けられる。開始コドンを包含するGBS毒素受容体mRNAの一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。GBS毒素受容体転写の5’側領域、特に開始コドンを包含する領域に対して相補的なアンチセンスオリゴマーが好ましいが、有用なアンチセンスオリゴマーはmRNA転写体の翻訳された部分に見出される配列に対して相補的なそれらのアンチセンスオリゴマーに限定されないが、しかしまた、5’及び3’側未翻訳領域に含まれるか、又はその領域中に延長するヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドも包含する。
【００８１】
アンチセンスヌクレオチド又はアンチセンス発現構造体は、GBS毒素受容体の不適切な発現が内皮細胞の過増殖をもたらすので、病理学的又は低酸素症由来の脈管形成及び新生血管形成と関連する疾病を処理し、又は予防するために使用され得る。
１つの態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、線状形で存在することができる。もう１つの態様においては、ポリヌクレオチドは、プラスミドの一部として環状形で存在することができる。
【００８２】
さらにもう１つの態様においては、プローブ又はPCRプライマーは、種々の位置で異なった縮重コドンを含むポリヌクレオチド種のグループを含んで成り、前記ポリヌクレオチドは、GBS毒素受容体を完全に又は部分的にコードする配列をコードするか、又はその配列に対して相補的であるかである。そのようなポリヌクレオチドは、羊又はヒトGBS毒素受容体、例えば他の生物のGBS毒素受容体のアミノ酸配列に対して少なくとも約85％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列するために有用である。典型的には、そのようなポリヌクレオチドは、一定の位置で核酸残基の特定の組み合わせを組み込むよう合成機をプログラミングすることによって、上記のようにして化学的に合成される。典型的な名称が表２に示されている。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
ポリペプチド：
本発明のもう１つの観点は、（１）完全な長さのGBS毒素受容体タンパク質又は天然に存在するその対立遺伝子変異体、（２）配列番号2, 4, 8, 10又は12のアミノ酸配列の少なくとも３個のアミノ酸のフラグメント、並びに（３）配列番号2, 4又は8の対応する領域のアミノ酸配列に対して約80％〜100％の範囲でのアミノ酸同一性を有するGBS毒素受容体タンパク質、ポリペプチド、又はポリペプチドフラグメントを含んで成るポリペプチドを提供する。配列番号2, 4, 8, 10又は12のアミノ酸配列の好ましいフラグメントは、少なくとも5, 6, 7, 8又は９個のアミノ酸長であり、そして免疫的に反応性であり、すなわち免疫原生である。
【００８５】
少なくとも25個の長さのアミノ酸のフラグメント、及び配列番号２の残基181〜419又は配列番号４の残基１〜240のアミノ酸配列を含んで成るフラグメントが、より好ましい。GBS毒素を結合することができるフラグメントが最も好ましい。好ましくは、GBS毒素受容体のタンパク質、ポリペプチド、又はフラグメントは、配列番号2, 4又は８の対応する領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも86％、より好ましくは少なくとも約95％、さらにより好ましくは少なくとも約99％の同一性〜１つのアミノ酸差異まで、そして最も好ましくは100％の同一性を有する。
【００８６】
好ましいポリペプチドは、配列番号２の残基181〜419又は配列番号４の残基１〜495のアミノ酸配列に対して、少なくとも約89％、より好ましくは少なくとも約95％、さらにより好ましくは少なくとも約99％の同一性〜１つのアミノ酸差異まで、及び最も好ましくは100％の同一性を有する。好ましくは、完全な長さのGBS毒素受容体タンパク質は、配列番号２の残基１〜495、配列番号４の残基１〜495、又は配列番号８の残基１〜536、又はそれらの対立遺伝子変異体のアミノ酸配列を含んで成る。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、GBS毒素受容体タンパク質、ポリペプチドフラグメントの他のアミノ酸を含むことができる。そのようなポリペプチドは典型的には、上記のように、GBS毒素受容体に由来する第２のポリペプチドに連結される異種ポリペプチドを含んで成る。好ましくは、追加のアミノ酸は、GBS毒素受容体タンパク質、ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントのアミノ末端又はカルボキシ末端に共有結合される。
【００８８】
GBS毒素受容体のフラグメント又は類似体は、当業者により調製され得る。フラグメント又は類似体の好ましいアミノ−及びカルボキシ−末端は、機能的ドメインの境界近くで存在する。例えば、そのような機能的ドメインは、GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合に基づいて、炎症応答の誘発の性質を付与するドメインを含む。GBS毒素は、GBS毒素受容体を発現する内皮細胞のC3による結合及びオプソニン作用化を仲介する。そのようなドメインは、GBS毒素のための結合部位を、完全に又は部分的に、又はGBS毒素受容体構造及び/又は機能のために必須のドメインを含んで成る。
【００８９】
好ましくは、コンピューター処理される比較方法が、既知の構造及び/又は機能の他のタンパク質において存在する配列型又は予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用される。既知の立体構造に折りたたむタンパク質配列を同定するための方法は知られている（Bowieなど. (1991) Science 253: 164）。
【００９０】
コンピューター処理される予測方法、例えばPC/GENEにおける“Soap”プログラムにより提供されるような水療法プロフィールが、推定上の構造及び機能的ドメインを同定するために使用され得る。Klein, Kanehisa and Delise, Biochim Biophys Acta (1985) 815: 468-476の方法を用いて、本発明者は、推定される７種のトランスメンブランセグメントを有する内在性タンパク質として、羊GBS毒素受容体、すなわちSP55を分類した。そのようなタンパク質はまた、“７−spanner”として、当業界において知られている。予測されるセグメントは下記表３に示される。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
★：周囲配列の疎水性に一体性配列（integral requience）の疎水性を関連させる。高い疎水性数を有する一体性配列は、おそらく、トランスメンブランドメインの一部である。
種々の生物におけるGBS毒素受容体のコンピューター処理されたアミノ酸配列の整列は、好ましいフラグメントの調製にさらなる案内を提供する。例えば、ヒトGBS毒素受容体（HP59）の残基42〜536（配列番号８残基42〜536）及び羊GBS毒素受容体（SP55）のアミノ酸配列を比較する表４を参照のこと。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
従って、前述の例は、当業者がGBS毒素受容体配列における構造及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフ及び構造コンホメーションを認識できることを示す。
【００９５】
１つの種類の好ましい態様は、機能ドメイン境界近くのアミノ酸位置に応答するアミノ−及び/又はカルボキシ−末端を有するフラグメントであるが、他のフラグメントも調製され得る。そのようなフラグメントのアミノ−及びカルボキシ−末端の選択は、実施者の選択しだいであり、そして実験的な考慮、例えば構成の容易さ、タンパク質分解に対する安定性、熱安定性、免疫学的反応性、アミノ−又はカルボキシル−末端残基修飾又は他の考慮に基づいて行われるであろう。
【００９６】
ポリペプチドフラグメントは通常、少なくとも９個のアミノ酸を含み、そしていずれかのアミノ酸を含むことができ、但し、ペプチドフラグメントは、配列番号2, 4又は８のその対応するフラグメントに対して少なくとも約80％同一である。ヒトGBS毒素受容体は、羊GBS毒素受容体に比較して、N−末端上に41個の追加のアミノ酸を有する（配列番号４及び８を比較する）。類似体は、それらの41個のN−末端アミノ酸のいくつか又はすべての付加又は欠失を含むことができる。例えば、精製及び/又は抗体認識のために有用なN−末端及びC−末端付加がまた、企画され得る。
【００９７】
例としては、ヒスチジン標識、FLAG（フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グアニン）エピトープ、融合パートナー、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及び同様のものを列挙することができる。保存されていないアミノ酸の欠失がまた企画され、但しGBS毒素受容体の構造的統合及び/又は結合性質は実質的に妥協されない。
【００９８】
類似体はまた、アミノ酸置換、好ましくは保存性置換を包含することができる。種々の種間で、ほとんど共有される同一性をを有さない領域における保存性及び/又は非保存性置換がまた好ましい。例えば、GBC毒素受容体の変異体は、配列番号４の残基2, 6, 10, 11, 16, 17, 24, 25, 31, 44, 46, 52, 53, 55, 74, 75, 81, 82, 84, 93, 102, 132, 133, 137, 144, 145, 148, 149, 155, 159, 163, 165, 166, 179, 212, 219, 235, 236, 239, 242, 246, 253, 254, 257, 259, 260, 271, 283, 285, 319, 324, 332, 333, 338, 355, 362, 366, 377, 439, 442, 445, 450, 453, 461, 487, 488, 491及び495に対応するアミノ酸の保存性及び/又は非保存性置換を含んで成る。
【００９９】
好ましくは、置換は、配列番号４又は８のその対応する位置に存在するアミノ酸である。例えば、表４における整列プロットを参照すれば、配列番号４の位置152に対応するアミノ酸は、アルギニン（R）、グルタミン（Q）、又はR又はQの保存性又は非保存性置換であり、そして好ましくは、R又はQである。そのような領域は、表４に示されるようなアミノ酸配列の整列プロットにより同定され得る。
【０１００】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低め、（２）酸化に対する感受性を低め、（３）GBS毒素に対する結合親和性を変え、そして（４）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与し、又は変性するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々の突然変異、例えば、単一の又は複数のアミノ酸置換を包含することができる。
【０１０１】
保存性アミノ酸置換は一般的に、親配列の構造的特徴を実質的に変えるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを破壊し、ジスルフィド結合を破壊し、又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向を有すべきではない）。当業界において認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles, (1984) Creighton (ed.), W.H. Freeman and Company, New York; Introduction to Protein Structure, (1991), C. Branden and J. Tooze, Garland Publishing, New York, NY;及びThornton et al. (1991) Nature 354; 105 (引用により本明細書に組み込まれる) に記載される。
【０１０２】
保存性置換は、“類似する特徴を有するアミノ酸によるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換”である。（McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms, Fifth Edition, 1994, Sybil P. Parker, Edition in Chief）。天然に存在するアミノ酸の構造及び特徴は、当業界において長く知られている（Biochemistry, Second Edition, Albert L. Lehninger, 1975, P. 71-76）。例えば、それらの疎水性R基により類似するアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンである。
【０１０３】
アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、それらの脂肪族R基により類似する。フェニルアラニン及びトリプトファンは、それらの芳香族R基により類似する。グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンは、それらの荷電されていない極性R基により類似する。グリシン及びアラニンは、それらの小さなサイズにより類似する。セリン及びトレオニンは、それらのR基におけるヒドロキシルにより類似する。アスパラギン及びグルタミンは、わずか１つのメチル基により異なる。
【０１０４】
同様に、アスパラギン酸及びグルタミン酸は、わずか１つのメチル基により異なり、そしてそれらはそれらの酸性R基により類似する。リシン、アルギニン及びヒスチジンは、それらの塩基性R基により類似する。さらに、リシン及びアルギニンは、それらのR基における脂肪族鎖の末端上のアミノ酸により類似する。チロシン及びフェニルアラニンは、それらの芳香族基により類似する。当業界において通常行われているアミノ酸置換は、ロイシン又はイソロイシンによるバリン、グリシンによるアラニン、トレオニンによるセリン、グルタミンによるアスパラギン、グルタミン酸によるアスパラギン、アルギニンによるリシン、及びフェニルアラニンによるチロシンの置換を包含し、そして逆もまた同じである。
【０１０５】
典型的には、当業者は一般的に、種々のGBS毒素受容体間に保存されるアミノ酸の変更を制限するが、しかし保存性置換が適度に行われ得る。例えば、表４は、当業者が、表４に示されるGBS毒素受容体間に保存される、配列番号４の残基1, 3-5, 7-9, 12-15, 18-23, 26-30, 32-43, 45, 47-51, 54, 56-73, 76-80, 83, 85-92, 94-101, 103-131, 134-136, 138-143, 146-147, 150-154, 156-158, 160-162, 164, 167-178, 180-211, 213-218, 220-234, 237-238, 240-241, 243-245, 247-252, 255-256, 258, 261-270, 272-282, 284, 286-318, 320-323, 325-331, 334-337, 339-354, 356-361, 363-365, 367-376, 378-438, 440-441, 443-444, 446-449, 451-452, 454-460, 462-486, 489-490, 及び492-494に対応するアミノ酸による置換、特に非保存性置換を回避することを案内する。
【０１０６】
表５及び６並びに表７及び８は、予測されるアミド化、N−糖化、cAMP−リン酸化、CK2−リン酸化、ミリスチル化（不飽和脂肪酸分子の付加）及びPKC−リン酸化部位（Omega1.1配列分析プログラム）を整合する、それぞれHP59（表５及び表６）及びSP55（表７及び表８）内の配列を記載する。それらの表に含まれる情報は、当業界がGBS毒素受容体変異体及びフラグメントを企画する案内を提供する。例えば、ポリペプチド変異体を企画する場合、当業者は、それらの領域のいくつか又はすべてにおける置換の回避を決定することができる。例えば、免疫原性ポリペプチドフラグメント以外のポリペプチドフラグメントを企画する場合、当業者はそれらの領域のいくつか又はすべてを含むよう決定することができる。
【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
【表７】
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【０１１０】
【表８】
2010099072.tif 000009
【０１１１】
前述から、好ましいポリペプチドは、下記式：
AA1−AAn−AAm
[式中、AA1は、不在であるか又はMであり；
AAn は、配列番号８の０〜100個のアミノ酸、好ましくは０又は41個のアミノ酸、さらにより好ましくは残基２〜42の連続鎖であり；そして
AAmは、AA43〜AA536を含んで成る494個のアミノ酸の連続鎖であり、ここで
【０１１２】
（１）AA43, AA47, AA51, AA52, AA57, AA58, AA65, AA66, AA72, AA85 ,AA87, AA93, AA94, AA96, AA115, AA116, AA122, AA123, AA125, AA134, AA143, AA173, AA174, AA178, AA185, AA186, AA189, AA190, AA196, AA200, AA204, AA206, AA207, AA220, AA253, AA260, AA276, AA277, AA280, AA283, AA287, AA294, AA295, AA298, AA300, AA301, AA312, AA324, AA326, AA360, AA365, AA373, AA374, AA379, AA396, AA403, AA407, AA418, AA480, AA483, AA486, AA491, AA494, AA502, AA528, AA529, AA532及びAA536の個々が、必須アミノ酸又は修飾されたアミノ酸であり、そして好ましくは、
【０１１３】
（ａ）それぞれ、配列番号８の残基43, 47, 51, 52, 57, 58, 65, 66, 72, 85, 87, 93, 94, 96, 115, 116, 122, 123, 125, 134, 143, 173, 174, 178, 185, 186, 189, 190, 196, 200, 204, 206, 207, 220, 253, 260, 276, 277, 280, 283, 287, 294, 295, 298, 300, 301, 312, 324, 326, 360, 365, 373, 374, 379, 396, 403, 407, 418, 480, 483, 486, 491, 494, 502, 528, 529, 532及び536;
【０１１４】
（ｂ）それぞれ、配列番号４の残基2, 6, 10, 11, 16, 17, 24, 25, 31, 44, 46, 52, 53, 55, 74, 75, 81, 82, 84, 93, 102, 132, 133, 137, 144, 145, 148, 149, 155, 159, 163, 165, 166, 179, 212, 219, 235, 236, 239, 242, 246, 253, 254, 257, 259, 260, 271, 283, 285, 319, 324, 332, 333, 338, 355, 362, 366, 377, 439, 442, 445, 450, 453, 461, 487, 488, 491及び495；又は
（ｃ）その保存性置換、
に対応するアミノ酸残基であり；
【０１１５】
（２）AA44-AA46, AA48-AA50, AA53-AA56, AA59-AA64, AA67-AA71, AA73-AA84, AA86, AA88-AA92, AA95, AA97-AA114, AA117-AA121, AA124, AA126-AA133, AA135-AA142, AA144-AA172, AA175-AA177, AA179-AA184, AA187-AA188, AA191-AA195, AA197-AA199, AA201-AA203, AA205, AA208-AA219, AA221-AA252, AA254-AA259, AA261-AA275, AA278-AA279, AA281-AA282, AA284-AA286, AA288-AA293, AA296-AA297, AA299, AA302-AA311, AA313-AA323, AA325, AA327-AA359, AA361-AA364, AA366-AA372, AA375-AA378, AA380-AA395, AA397-AA402, AA404-AA406, AA408-AA417, AA419-AA478, AA481-AA482, AA484-AA485, AA487-AA490, AA492-AA493, AA495-AA501, AA503-AA527, AA530-AA531及びAA533-AA535の個々が、
【０１１６】
（ａ）それぞれ、配列番号８の残基44-46, 48-50, 53-56, 59-64, 67-71, 73-84, 86, 88-92, 95, 97-114, 117-121, 124, 126-133, 135-142, 144-172, 175-177, 179-184, 187-188, 191-195, 197-199, 201-203, 205, 208-219, 221-252, 254-259, 261-275, 278-279, 281-282, 284-286, 288-293, 296-297, 299, 302-311, 313-323, 325, 327-359, 361-364, 366-372, 375-378, 380-395, 397-402, 404-406, 408-417, 419-478, 481-482, 484-485, 487-490, 492-493, 495-501, 503-527, 530-531及び533-535；又は
（ｂ）その保存性置換であり；そして
（３）AA315〜AA367の１又は複数のAAが任意には、不在である］で表されるアミノ酸配列を含んで成る。
【０１１７】
好ましいポリペプチドは、配列番号４、配列番号８のアミノ酸配列、又は羊GBS毒素受容体（配列番号４）とヒトGBS毒素受容体（配列番号８）との間に保存されない特定の残基でのみその配列とは異なるアミノ酸配列を含んで成る。それらの変化の中で、最も好ましい変化は、配列番号11によりコードされるポリペプチドをもたらすそれらの変化である。さらにより好ましい変化は、配列番号４のアミノ酸配列のその対応する位置におけるそれらのアミノ酸である。アミノ酸残基のわずか約20％で、配列番号２，４又は８とは異なるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドが特に好ましく、そしてわずか約10％、５％、１％と好ましいさが増し、そして１〜ゼロのアミノ酸差異が最も好ましい。
【０１１８】
変化に関する特定のアミノ酸の標的化の他に、GBS毒素受容体の類似体は、アメリカ特許第5,605,793号；第5,830,721号；第5,811,238号；第5,837,458号；第5,093,257号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,571,698号；及び第5,837,500号（それらは引用により本明細書に組み込まれる）に一部記載されるように、異なった種からの遺伝子の原核生物又は真核生物における活性選択、例えば、ファージ表示、指図された進化、DNAシャフリングを包含する技法により調製され得る。
本明細書に記載されるヒト及び羊GBS毒素受容体のいずれかの変異体又はフラグメントは、その変異体又はフラグメントがGBS毒素を結合することができるかどうかを決定することによって、必要な活性について試験され得る。
【０１１９】
それらのポリペプチドは、薬物発現及び精製において有用な試薬を提供し、そして好ましくは、細胞、例えばトランスフェクトされた安定細胞の表面上で発現される場合、種々のインビトロアッセイにおいて使用され得る。例えば、アッセイ、例えば結合アッセイが、試験化合物、例えば多糖類及び他の化合物を、GBS毒素受容体を結合するそれらの能力についてスクリーンするために使用され得る。アッセイは、GBS毒素受容体へのGBS毒素結合を阻止する可能性ある薬物候補体を同定することができる。そのような薬物は、ヒト新生児における初期開始疾病の予防及び/又は処理のために有用である。いくつかのポリペプチドは、GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を、競争的に阻害するために使用され得る。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは、GBS毒素、GBS毒素キメラ化合物、及びGBS毒素受容体を結合できる他の多糖類又は化合物を親和性精製するために使用され得る。
前記ポリペプチドはまた、GBS毒素受容体を発現する細胞への供給のための細胞毒性剤を標的化する方法を開発するためにも使用され得る。例えば、細胞毒性剤は、増殖性腫瘍の新生血管形成への選択的供給のためGBS毒素受容体を供給する分子に結合され得る。そのような供給システムは、ほとんどの化学療法において遭遇する悪い全身性副作用を最少にしながら、増殖性腫瘍に対して非常に集中され、局在化された攻撃を可能にするであろう。
【０１２１】
１つの態様においては、細胞毒性剤は、Hellerqvistなど., Ang’ogenesis: Molecular Biology, Clinical Aspects, Edited by M.E. Maragoudakis など., Plenum Press, New York 1994, P. 265-269に記載されるように、GBS毒性受容体への結合に基づいて、炎症応答を誘発するGBS毒素であり得る。類似する様態で、GBS毒素受容体を発現する細胞への治療剤の選択的供給は、腫瘍、リウマチ様関節炎、又は神経損傷を処理し、又は創傷治療を促進するために都合良く使用され得る。
【０１２２】
本発明のポリペプチドはまた、改良された治療性質、例えば低酸素症により誘発された新生血管形成又は脈管形成を阻害する改良された能力を有するGBS毒素擬似体をスクリーンし、そして/又は企画するためにも使用され得る。そのような擬似体は、低酸素症により誘発された新生血管形成又は脈管形成に起因する状態、例えば腫瘍増殖、創傷治療の間の瘢痕、神経損傷の修復の間のグリオーシス、再灌流損傷、再狭窄、リウマチ様関節炎、乾癬、脈管形成により特徴づけられる他の慢性炎症疾患、等の処理及び予防において有用である。治療性質は、生物学的安定性、GBS毒性受容体のための親和性、補体結合活性、抗原性の低下、等を増強することによって改良され得る。
【０１２３】
本発明のポリペプチドはまた、種々の治療及び研究目的のための抗体を生成するためにも使用さえ得る。本発明のポリペプチドは、ウサギ、マウス、ヤギ、ニワトリ、又はそのような免疫化に敏感な、当業界において知られている他の動物を免疫化するために使用され得る。モノクローナル抗体は一般的に、好ましいが、しかしポリクローナル抗体もまた、使用され得、そしてGBS毒素受容体へのGBS毒素受容体抗体の結合検出が可能である。
【０１２４】
非ヒト、例えばネズミモノクローナル抗体の生成は良く知られている（例えば、Harlowなど., Antibodies A Lavoratory Manual, Cold Spring Harbor Press, PP. 139-240, 1989 (引用により本明細書に組み込まれる)を参照のこと）。ヒト受容体又は結合ドメインポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体を生成することは困難であるので、ヒト分子を実質的に生成するためには、組換え技法により、非ヒトモノクローナル抗体、例えばF(ab’)2 又は超可変領域、又はネズミモノクローナル抗体の抗原結合領域を、ヒト不変領域（Fc）又は骨格領域に移行することが所望される。
【０１２５】
そのような方法は、一般的に知られており、そして例えばアメリカ特許第4,816,397号及び第4,946,778号、及びEP公開第173,495号及び第239,400号に記載されている。他方では、WO90/14430号に概略される一般的プロトコールに従って、ヒトB細胞からDNAライブラリーをスクリーニングし、そして次にクローニングし、そして所望する特異性の抗体（又は結合フラグメント）をコードする配列を増幅することによって、受容体タンパク質を特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗体又はその一部をコードするDNA配列を単離することができる。
【０１２６】
通常、抗体を生成するために使用されるポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばその一次アミノ酸配列に基づいて、ポリペプチドの二次及び三次構造を予測するコンピュータープログラムにより同定される推定上の細胞ドメインから企画される、完全な長さの受容体又は受容体フラグメントである。抗原性ペプチドを企画するためのもう１つの方法は、特定の一次アミノ酸配列内の疎水性の高い点を予測するコンピュータープログラムを利用する。
【０１２７】
例えば、PC/GENEにおける“抗原”プログラムを通して、Happ and Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 3824-3829の方法を用いて、本発明者は、下記表９に示される、高い親水性の３種の領域を同定し、そしてGBS毒素受容体に対する抗体の調製に使用される抗原ペプチドを企画する結果を使用した（例４を参照のこと）。
【０１２８】
【表９】
2010099072.tif 000010
【０１２９】
損なわれていないGBS毒素受容体の種々の部分を認識する抗体は、受容体の構造及び機能をさらに調べるために使用さえ得る。本発明のポリペプチドは、次の種々の形のGBS毒素受容体（但し、それらだけには限定されない）を認識する抗体を生ぜしめることができる：細胞表面上に発現される損なわれていないGBS毒素受容体、修飾されたGBS毒素受容体又は修飾されていないGBS毒素受容体、及び細胞成分から精製されたGBS毒素受容体、又は細胞溶解物に含まれるGBS毒素受容体。GBS毒素受容体は、種差異、及び種々の細胞型におけるGBS毒素受容体発現レベルを研究するために使用され得る。
【０１３０】
細胞外ドメインの一部又はすべてを認識する抗体は、腫瘍増殖及び転移のモニターのために、慢性炎症性状態、例えばリウマチ様関節炎又は乾癬の検出又は同定のために、及び低酸素症由来の脈管形成、例えば再狭窄により生じる他の医学的状態の検出のために、診断薬として特に有用である。
【０１３１】
典型的には、そのような抗体は、次の種々の標準研究及び診断技法（但し、それらだけには、限定されない）に使用され得る：ウェスターンブロット、免疫沈殿法は、ELISA, ラジオイムノアッセイ（RIA）、BIACOR（商標）、酸素−結合されたイムノアッセイ（ELA）、免疫蛍光法、蛍光活性化された細胞ソーティング（FACS）及びインビボ診断イメージングシステム、例えば磁気共鳴イメージング（MRI）、核磁気共鳴（NMR）、コンピューター処理された軸断層撮影法（CAT）スキャン、及び陽電子射出断層撮影法（PET）、等。
【０１３２】
さらに、GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を阻止する抗体は、新生児における初期開始疾病の処理又は予防のために使用され得る。そのような抗体は、GBS毒素受容体上のGBS毒素結合部位を直接的に又は間接的に阻止することができる。
１つの態様においては、GBS毒素受容体タンパク質は、天然に存在し、そして当業界において知られている次のタンパク質精製技法により細胞抽出物から単離され得る：イオン交換カラムクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、逆相HPLC、又はGBS毒素受容体を認識する抗体を用いる親和性クロマトグラフィー。
【０１３３】
他方では、単離されたタンパク質及びポリペプチドは、好ましくは哺乳類細胞及び/又は細菌、昆虫又は酵母細胞における発現のために適切な発現ベクターにおけるプロモーターを含む適切な制御配列と操作的に関連して、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて発現される。
【０１３４】
通常、GBS毒素受容体ポリヌクレオチド又はそのフラグメントは、哺乳類システムにおいて発現され得る。そのような発現は通常、哺乳類RNAポリメラーゼを結合することができ、そしてmRNAへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流での（3’側）転写を開始せしめることができるいずれかのDNA配列である哺乳類プロモーターに依存するであろう。通常、プロモーターは、コード配列の5’末端に最も近く配置される転写開始領域を有するであろう。この転写開始領域は典型的には、RNAポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。
【０１３５】
哺乳類細胞における複製のための適切なベクターは、当業界において、知られており、そしてウィルスレプリコン、又は宿主ゲノム中へのPAK65をコードする配列の組み込みを確保する配列を含むことができる。例えば、適切なベクターは、SV40，レトロウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノウィルスに由来するそれらのベクターを包含することができる。
【０１３６】
例えば、適切なベクターは、ワクシニアウィルスに由来するベクターである。この場合、異種DNAがワクシニアゲノム中に挿入される。ワクシニアウィルスゲノム中への外来性DNAの挿入のための技法は、当業界において知られており、そして例えば、相同組換えを利用する。異種DNAの挿入は一般的に、天然においては必須ではない遺伝子、例えば選択マーカーもまた提供するチミジンキナーゼ遺伝子（tk）中にである。組換えウィルスの構成を非常に促進するプラスミドシャトルベクターはこれまで記載されている（例えば、Mackettなど. (1984); Chakrabartiなど. (1985); Mess (1987) を参照のこと）。次に、異種ポリペプチドの発現は、生存組換えワクシニアウィルスにより免疫化された細胞又は個人において生じる。
【０１３７】
そのような適切な哺乳類発現ベクターは通常、哺乳類細胞における発現を促進できる１又は複数の真核生物転写単位を含む。その転写は、外来性DNAの転写を仲介するために少なくとも１つのプロモーター要素から構成される。
【０１３８】
哺乳類細胞のために適切なプロモーターは、当業界において知られており、そしてウィルスプロモーター、例えばSV40（Subramani など., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981）、サイトメガロウィルス（CMV）（Boshartなど., Cell 41: 521-530, 1985）、ラウス肉腫ウィルス（RSV）、アデノウィルス（ADV）（Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-139, 1982）、及びウシ乳頭腫ウィルス（BPV）からのプロモーター、並びに細胞プロモーター、例えばマウスメタロチオネイン−１プロモーター（アメリカ特許第4,579，821号）、マウスVKプロモーター（Bergmanなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7041-7045, 1993; Grantなど., Nuc. Acids Res. 15: 5496, 1987）、及びマウスVHプロモーター（Lohなど., Cell 33:85-93, 1983）を包含する。
【０１３９】
本明細書に記載されるプロモーター要素を組み合わされるエンハンサー要素（エンハンサー）の任意の存在は典型的には、発現レベルを高めるであろう。エンハンサーは，内因性の又は異種プロモーターに連結される場合、転写を1000倍まで刺激することができるいずれかの調節DNA配列であり、そして合成は通常のmRNAの開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが転写部位から上流又は下流に、正常な又はフリッピング配向で、又はプロモーターから1000個よりも多くのヌクレオチドにより離れた距離で、配置される場合も活性的である（Maniatis など. (1987) Science 236: 1237; Alverts など. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2nd ed.）。
【０１４０】
ウィルス由来のエンハンサー要素は、それらが典型的には広い宿主範囲を有するので、特に有用であり得る。哺乳類細胞において有用な例は、SV40初期遺伝子エンハンサーの長い末端反復体（Dijkemaなど（1985）EMBO J. 4: 761）、及びラウス肉腫ウィルス（Gormanなど. (19826) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777）、又はヒトサイトメガロウィルス（Boshartなど. (1985) Cell 41: 521）に由来するエンハンサー/プロモーター、マウスμエンハンサー（Gillies, Cell 33: 717-728, 1983）を包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは、調節でき、そしてインデューサー、例えばホルモン又は金属イオンの存在下でのみ活性的に成る（Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis など. (1987) Science 236: 1237)。
【０１４１】
さらに、転写単位はまた、GBS毒素受容体コード配列に操作可能的に連結される、終結配列及びポリアデニル化シグナルからも構成され得る。ポリアデニル化シグナルは、SV40からの初期又は後期ポリアデニル化シグナル（Kaufman and Sharp）、アデノウィルス 5E1B 領域及びヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターからのポリアデニル化シグナル（DeNoto など., Nac. Acid Res. 9: 3719-3730, 1981）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１４２】
遺伝子の増幅を引き起こす配列はまた、選択マーカーをコードする配列と同様に、所望される。哺乳類細胞からの選択マーカーは、当業界において知られており、そして例えば、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR増幅剤としてメトトレキセートと一緒に）、アミノグリコシルホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アデノシンデアミナーゼ及び抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子を包含する。
【０１４３】
GBS毒素受容体又はそのフラグメントは、細胞の表面上で発現され得、又は可溶性又は分泌された形で発現され得る。細胞の表面上での発現は、例えば所望する受容体フラグメント及び少なくとも１つのトランスメンブランドメインをコードする核酸配列に操作可能的に連結される分泌リーダーを含むことによって達成される。
【０１４４】
前記分泌リーダーは、GBS毒素受容体遺伝子によりコードされるものであり、又は当業界において通常使用される異種リーダー配列、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）pho1＋酸ホスファターゼのリーダー配列（Braspenningなど., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 245: 166-71）、ヒトインターロイキン−２（IL−２）遺伝子のリーダー配列（Sasada など., Cell Struct. Funct. (1988) 13: 129-141）である。可溶性又は分泌された形での発現は、例えば、トランスメンブランドメインをコードする核酸配列を遺伝子構造体から排除することによって達成され得る。多くの場合、溶解性及び/又は分泌は、融合パートナー、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラクトシダーゼ及び選択された宿主細胞において容易に発現される他の遺伝子の使用により達成される。
【０１４５】
GBS毒素受容体をコードするベクターは、適切な哺乳類宿主細胞の形質転換のために使用され得る。形質転換は、アメリカ特許第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号及び第4,959,455号（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）により例示されるように、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入し、例えばウィルスにポリヌクレオチドをパッケージングし、そしてウィルスにより宿主細胞をトランスダクトするためのいずれかの既知方法により、又は当業者において知られているトランスフェクション方法により行われる。
【０１４６】
使用される形質転換方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。哺乳類細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入の方法は、当業界において知られており、そしてデキストラン−介在性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、及び核中へのDNAの直接的なマイクロインジェクションを包含する。
【０１４７】
発現のための宿主として利用できる哺乳類細胞系は、当業界において知られており、そしてAmerican Type Culture Collection (ATCC) から入手できる多くの不滅化された細胞系、例えば次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、Hela細胞、子供のハムスターの腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、NIE−115（Lilesなど., J. Biol. Chem. 261: 5307-5313, 1986）、PC12ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Hep  G2）、及び多くの他の細胞系、例えば昆虫由来の細胞系IF9及びIF21。
【０１４８】
特に好ましい細胞系は、組換えGBS毒素受容体構造体を構成的に発現するそれらの細胞系、例えば形質転換された細胞の特徴を結果的に生成する細胞系、及びより好ましくは、GBS毒素受容体又はフラグメントを、細胞表面上で発現する細胞系である。ECV細胞（内皮細胞系として科学文献に本来言及されている膀胱癌細胞系）、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、ウシ、羊及びヒト副腎髄質内皮細胞が特に好ましい。
【０１４９】
組換えGBS毒素受容体又はそのフラグメントは、適切な培養培地において、及び適切な細胞培養条件下で、前記受容体又はフラグメントを発現する宿主細胞を培養することによって生成され得る。培養培地及び条件は、特定の宿主細胞系の必要条件に依存して変化し、そして当業界において良く知られている。典型的には、細胞は、固定された量のCO2を、通常５〜10％で含む細胞培養インキュベーターにおいて、37℃で培養される。
【０１５０】
もう１つの態様においては、ポリペプチドフラグメントは、当業界において良く知られている技法、例えば固相ペプチド合成（Stewartなど., Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco (1963); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2148-2154 (1963)）により、化学的に合成され得る。それらの及び他のペプチド合成方法はまた、アメリカ特許第3,862,925号、第3,842,067号、第3,972,859号及び第4,105,602号によっても例示される。
【０１５１】
前記合成は、手動合成技法を使用することができ、又は例えば、Applied BioSystems 430A又は431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) を、その製造業者により供給される説明マニュアルに従って、自動的に使用することができる。本発明の類似体化合物を合成する間に構成される中間体は、それら自体新規で且つ有用な化合物であり、そして従って、本発明の範囲内であることは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【０１５２】
天然に存在するアミノ酸のみから成るポリペプチドの他に、ペプチド擬似体もまた、供給される。ペプチド類似体は通常、鋳型ペプチドの性質に類似する性質を有する非ペプチド薬物として医薬産業において使用される。それらのタイプの非ペプチド化合物は、“ペプチド擬似体”と命名され（Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15: 29; Veber and Freidinger (1985) TINS（登録商標） P. 392; 及びEvansなど. (1987) J. Med. Chem. 30: 1229 (それらは引用により本明細書に組み込まれる)）、そして通常、コンピューター処理された分子モデリングの助けにより生成される。
【０１５３】
治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチド擬似体は、同等の治療又は予防効果を生成するために使用され得る。一般的に、ペプチド擬似体は典型的なポリペプチド（すなわち、生化学性質又は薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、しかし当業界において知られており、そしてさらに、次の文献に記載される方法により、−CH2NH−，−CH2S−，−CH2−CH2−，−CH＝CH−（シス及びトランス）、−COCH2−，−CH(OH)CH2−及び−CH2SO−から成る群から選択された結合により任意に置換された１又は複数のペプチド連鎖を有する：
【０１５４】
Spatola, A.F. in “Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, “B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983); Vol. 1. Issue 3, “Peptide Backbone Modifications” (一般的再考)；Morley, I.S., Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468 (一般的再考)；Hudson, D. など., Int J Pept Prot Res (1979) 14: 177-185 (−CH2NH−, CH2CH2−)；Spatola, A.F. など., Life Sci (1986) 38: 1243-1249 (−CH2−S)；
【０１５５】
Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (−CH−CH−，シス及びトランスAlmquist, R.G. など., J. Med Chem (1980) 23: 1392-1398 (−COCH2−)；Jennings-White, C. など., Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533 (−COCH2−)；Szelke. M. など., European Appln. EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (−CH(OH)CH2−)；Holladay，M.W. など., Tetrahedron Lett (1983) 24: 4401-4404 (−C(OH)CH2−)；及びHruby, V. J., Life Sci (1982) 31: 189-199 (−CH2−S−) (それらの個々は引用により本明細書に組み込まれる)。
【０１５６】
特に好ましい非ペプチド連鎖は、−CH2NHである。そのようなペプチド擬似体は、ポリペプチド態様よりも次のような有意な利点を有することができる：より経済的な生成、高い化学的安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収性、効能、効力、等）、変更された特異性（例えば、広範囲の生物学的活性）、低められた抗原性及び他の性質。
【０１５７】
ペプチド擬似体のラベリングは通常、定量構造−活性データ及び/又は分子モデリングにより予測される、ペプチド擬似体上の非干渉位置への、直接的に、又はスペーサー（例えば、アミド基）を通しての１又は複数のラベルの共有結合を包含する。そのような非干渉位置は一般的に、GBS毒素との直接的な接触を形成しない（例えば、GBS毒素受容体のGBS毒素結合ドメインにおける接触点ではない）位置である。ペプチド擬似体の誘導体化（例えば、ラベリング）は、ペプチド擬似体の所望する生物学的又は薬理学的活性を実質的に妨害すべきではない。
【０１５８】
同じタイプのD−アミノ酸によるコンセンサス配列の１又は複数のアミノ酸の組織学的置換（L−リシンの代わりにD−リシン）は、より安定したペプチドを生成するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサスを含んで成る強制されたペプチドは、当業界において知られている方法（Rizo and Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (引用により本明細書に組み込まれる)）、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィド橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって生成され得る。
【０１５９】
本発明はまた、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントに結合されるGBS毒素を含んで成る複合体も提供する。好ましくは、前記複合体は、GBS毒素を結合することができる、上記GBS毒素受容体ポリペプチドに結合されるGBS毒素を含んで成る。典型的には、複合体は、GBS毒素と、そのようなポリペプチドとを、そのポリペプチドへの前記GBS毒素の特異的結合にする条件下で接触することによって形成される。GBS毒素はラベルされても又はラベルされなくても良い。ポリペプチドは、細胞の表面上に存在し、又はウェルに又はビーズ上に同定され得、又はポリペプチドは溶液に存在することができる。
【０１６０】
検出方法：
本発明のさらにもう１つの観点は、病理学的及び/又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる種々の医学的状態を検出し又はモニターするための方法を提供する。例としては、新生児における初期開始疾病、及び腫瘍を包含する癌の進行を列挙することができるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６１】
初期開始疾病は、患者におけるGBS毒素の存在又は不在を検出することによって診断され得る。１つの検出方法は、GBS毒素受容体又はそのフラグメントとの間での複合体の形成に対する疑わしいサンプルの効果を決定する競争をアッセイである。例えば、前記方法は、対照GBS毒素とGBS毒素受容体ポリペプチドとを、GBS毒素を含むと思われるサンプルの存在及び不在下で、及びポリペプチドへのGBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で接触し、そして疑わしいサンプルの存在下で達成される複合体形成の量と、疑わしいサンプルの不在下で達成される複合体形成の量とを比較することを含んで成る。
【０１６２】
好ましくは、対照毒素は、実質的に精製され、そして既知の濃度のものである。好ましくは、対照GBS毒素はさらに、ラベルを含んで成る。適切なラベルは、放射性同位体、発色団、蛍光団、ビオチン、アビジン及び当業者により使用される他のラベルを包含するが、但しそれらだけには限定されない。もう１つの方法は、対照GBS毒素との競争によってよりもむしろ、疑わしいサンプルに存在するGBS毒素とGBS毒素受容体ポリペプチドとの間での複合体形成を直接的に測定する。
【０１６３】
病理学的血管形成は、腫瘍の領域におけるGBS毒素受容体の存在又は不在を検出することによって、哺乳類組織において検出され得、そしてGBS毒素受容体の存在は、病理学的血管形成の存在の表示である。前記方法は、腫瘍増殖又は転移をモニターするために使用され得る。１つの検出方法は、GBS毒素受容体、好ましくはGBS毒素受容体の細胞ドメインに特異的に結合する分子、例えば抗体の使用を包含する。典型的には、前記方法は、癌性腫瘍を有する哺乳類における哺乳類組織に、GBS毒素受容体を認識する抗体を投与し、そして前記抗体の特異的結合を検出することを含んで成る。典型的には、前記抗体は、ラベルされた抗体である。好ましくは、観察は定量的であり、そして視覚によることができる。
【０１６４】
手術の間、腫瘍の縁は、当業界において知られており、そして上記に記載される多くのイメージング技法のいずれかにより可視化され得る。腫瘍のイメージングは、腫瘍の病理学的血管形成上でのGBS毒素受容体へのラベルされた抗体又は他の分子の結合を検出することによってもたらされる。このタイプの手術は、その手術を行いながら、外科医はイメージングスクリーン上で腫瘍を間接的に見るので、虚像の手術としても知られている。
【０１６５】
薬物発見：
本発明の第４の観点は、低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理のための薬物候補体を同定するための、本発明のポリペプチドを用いての方法を提供する。好ましい化合物は、GBS毒素受容体へのGBS毒素結合の競争インヒビターであり、又はGBS毒素受容体活性を阻害する。シグナルトランスダクション経路における第１のリン酸化段階を阻害する化合物が特に好ましい。
【０１６６】
化学物は、当業界において通常知られている次の種々のランダム薬物企画方法により生成され得る：結合化学（アメリカ特許第5,646,285号；第5,639,603号）、ペプチドライブラリー（アメリカ特許第5,591,646号；第5,367,053；第5,747,334号）、ファージ表示（アメリカ特許第5,403,484号；第5,223,409号）、SELEX（商標） (アメリカ特許第5,773,598号；第5,763,595号；第5,763,566号)、及び結合炭水化物化学（Hirschmann など., J. Med. Chem. (1996) 39: 2441-2448; Hirschmann など., J. Med. Chem. (1998) 41: 1382-1391; Sofia MJ. Mol. Divers (1998) 3: 75-94; アメリカ特許第5,780,603号；第5,756,712号）。
【０１６７】
他のアプローチは、次の技法を用いて、改良された治療性質を有する、GBS毒素擬似体又はGBS毒素受容体擬似体を生成するための合理的薬物企画である：X−線結晶学、核磁気共鳴（NMR）相関スペクトル（アメリカ特許第5,698,401号）、コンピューター助力された分子モデリング（アメリカ特許第5,579,250号；第5,612,895号；第5,680,331号；Cooperなど., J. Comput.-Aided Mol. Design, 3: 253-259 (1989); Brentなど., J. Comput. -Aided Mol. Design 2:311-310 (1988), 及び当業界において知られている他の合理的薬物企画方法。
【０１６８】
図１は、本発明の合理的薬物企画方法のいくつかにおける主要段階のいくつかの広い概観を提供する。例えば、合理的薬物企画への１つのアプローチは、相同に基づくモデリングによりタンパク質における活性部位を同定するために、コンピュータープログラム、例えばINS（登録商標）IGHT II (Bisoym Technologies, 10065 Barnes Canyon Road, San Diego, Californiaから入手できる)を包含する。
【０１６９】
この方法は、構造が良く知られている類似するタンパク質を用いることによって、タンパク質のモデリングを促進する。二次元データベース比較のための市販のソフトウェアを含む調査アルゴリズムは、Day Light Information Systems, Inc., Irvine, California 92714, 及びMolecular Design Limited, 2132 Foralton Drive, San Leandro, California 94577から入手できる。
【０１７０】
１つの態様においては、化合物はGBS毒素受容体を結合し、そしてGBS毒素受容体へのGBS毒素の結合に類似する態様で炎症性応答を誘発することができる。そのような化合物は、例えば腫瘍の進行性血管形成に対する炎症性応答を標的にするために薬物として使用され得る。
【０１７１】
もう１つの態様においては、前記化合物は、炎症性応答の誘発を伴って又はそれを伴わないで、好ましくは炎症性応答の誘発を伴わないで、GBS毒素受容体を結合することができる。1つの態様においては、化合物は、細胞毒性剤による処理のために病理学的新生血管形成を標的化するビークルとして使用され得る。例えば、細胞毒性剤は、キメラ薬物を形成するために化合物に化学的に結合され得る。そのようなキメラ薬物は、腫瘍、リウマチ様関節炎、創傷治癒、脊髄損傷、及び低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる他の状態の処理に使用され得る。もう１つの態様においては、前記化合物は、GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を競争的に阻害するために、直接的に使用され得る。そのような化合物は、新生児における初期開始疾病の処理に使用され得る。
【０１７２】
第３の態様においては、前記化合物は、GBS毒素を結合することができ、そして新生児における初期開始疾病の処理に使用され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、GBS毒素を結合する変異体ペプチドGBS毒素受容体ポリペプチドの合成及び同定のために、ランダム突然変異誘発、例えばファージ表示又は酵母２−ハイブリッドシステムにおいて発現され得る。
【０１７３】
他方では、本発明の固定された又は可溶性のGBS毒素受容体フラグメントは、GBS毒素受容体結合について、結合ペプチド及び結合化学ライブラリー、及び非ランダム組換え及び合成ペプチド；並びに他の化合物（例えば、非ペプチド分子）をスクリーンするために使用され得る。次に、GBS毒素又はGBS毒素受容体を結合する化合物はさらに、脈管形成又は新生血管形成を包含する医学的状態の処理のための薬物候補体を固定するために、上記活性のいずれかについて機能的アッセイにより特徴づけられ得る。
【０１７４】
GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を阻害する化合物は、試験化合物と、GBS毒素を結合できる、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントとを、そのGBS毒素受容体又はフラグメントへのGBS毒素の特異的結合を可能にする条件下で組合し、そしてGBS毒素受容体又はフラグメントへのGBS毒素の結合の前記化合物による阻害の量を決定することによって同定され得る。
【０１７５】
好ましい態様においては、GBS毒素受容体又はフラグメントは、細胞により、好ましくは細胞表面上に発現される。前記細胞は、試験化合物の存在又は不在下で、ラベルされたGBS毒素と接触される。次に、GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合の変化が決定される。他方では、GBS毒素はラベルされず、そしてGBS毒素を認識する抗体が代わりにラベルされる。そのラベルされた抗体は、GBS毒素受容体又はフラグメントに結合するGBS毒素の化合物による阻害を測定するために使用される。もう1つの態様においては、GBS毒素受容体又はフラグメントは、細胞に結合されておらず、しかし代わりに、マトリックス、例えばマイクロタイタープレートのウェル又はビーズに結合される。
【０１７６】
追加の安定固体支持体は、ラテックス、ポリスチレンビーズ（Interfacial Dynamics Corp. Portland, Oreg.）、磁気粒子（Advanced Magnetics, Cambridge, Mass.）及びナイロンボール（Hendryなど., J. Immunological Meth., 35: 285-296, 1980）を包含する。前記受容体又はフラグメントは、受容体フラグメントを結合する、マトリックスに結合される抗体を通して、直接的に又は間接的にマトリックスに結合され得る。第３の観点においては、GBS毒素受容体又はフラグメントは可溶性であり、そして前記受容体又はフラグメントを認識する抗体により免疫沈殿され得る。
【０１７７】
哺乳類GBS毒素受容体を結合する化合物を同定するための好ましい方法は、（１）試験化合物とGBS毒素受容体又はそのフラグメントとを、特異的結合の発生を可能にする条件下で組合し、そして（２）前記試験化合物とGBS毒素受容体又はフラグメントとの間に形成される複合体を検出する段階を含んで成る。好ましい方法は、GBS毒素受容体又はフラグメントへの結合について競争する試験化合物の能力を決定する競争アッセイである。そのようなアッセイにおいては、GBS毒素は、試験化合物の存在又は不在下で、GBS毒素受容体又はフラグメントと共に組み合わされる。
【０１７８】
試験化合物の存在又は不在下でのGBS毒素の低められた特異的結合が、哺乳類GBS毒素受容体を結合する試験化合物の能力の表示である。もう1つの方法は、対照化合物とGBS毒素受容体又はフラグメントとを、前記試験化合物と同じ条件下で組合し、そして試験化合物又は対照化合物とGBS毒素受容体又はそのフラグメントとの間での複合体形成の量を比較することを含んで成る。好ましくは、前記試験化合物及び/又は対照化合物はラベルされる。試験化合物は、多くの種類の化合物、例えば小有機分子（例えば、結合化学のために使用され、そしてそれにより使用されるそれらのもの）、多糖類、ポリペプチド、RNA、抗体及び一本鎖抗体のいずれかであり得る。
【０１７９】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、細胞により、好ましくは細胞の表面上に、及び好ましくはトランスフェクトされた安定細胞により発現される。そのようなシステムは、細胞毒性剤を含んで成るキメラ化合物の有効性を試験するために特に有用である。前記化合物の細胞毒性活性は、細胞表面上でGBS毒素受容体を発現する細胞を、試験キメラ化合物に暴露し、そして細胞毒性の徴候を検出することによって決定され得る。
【０１８０】
細胞の生存率染色により、アポプトシスを検出することにより（例えば、破壊されたDNAに結合する、DNAラダーアッセイ又はTUNEL（商標）染色による）、細胞中へのトリチウム化されたチミジン組み込みを測定することにより、及びキナーゼ−依存性リン酸化を定量化することにより（ホスホ抗体又は種々のホスホイメージング技法を用いて）、そのような徴候を検出することができる。
【０１８１】
もう１つの態様においては、本発明は、GBS毒素受容体のインヒビターを同定するための方法を提供する。この方法は、試験化合物の存在及び不在下で試験細胞をインキュベートすることを含んで成る。前記試験細胞は、GBS毒素受容体活性を有する、GBS毒素受容体又はそのフラグメント（例えば、フラグメントを発現しない同じ細胞型の対照細胞に対して、発現性細胞の増殖又は移動を高めるフラグメント）を発現する。前記試験細胞は、前記試験化合物の不在下でインキュベートされる細胞が増殖し、又は移動することができる条件下でインキュベートされる。
【０１８２】
GBS毒素受容体又はフラグメントを発現しない対照細胞は、GBS毒素受容体又はフラグメントを発現する細胞によりも低く増殖し又は移動する。試験化合物の存在又は不在下でインキュベートする試験細胞の増殖又は移動性（また、移動度としても本明細書において言及される）が比較される。試験化合物の不在下でよりも、試験化合物の存在下での低い増殖又は移動性が、GBS毒素受容体のインヒビターである試験化合物の表示である。好ましくは、試験化合物がGBS毒素受容体を特異的に阻害するかどうかを決定するための対照として、試験化合物の存在及び不在下での対照細胞の増殖又は移動性がまた、比較される。
【０１８３】
試験化合物の存在又は不在下でインキュベートされた対照細胞の増殖又は移動性における差異の不在下においては、試験化合物に暴露されていない試験細胞に対して、試験化合物が暴露された試験細胞における低められた増殖又は移動性が、GBS毒素受容体の特定的阻害の表示である。前記方法の対照部分が、その方法の試験部分と同時に行われる必用はないことは、明らかであろう。例えば、対照細胞は、試験化合物と共に試験細胞をインキュベートする前、試験化合物の細胞効果を決定するために一群の試験化合物と共にインキュベートされ得る。運動性又は移動性は、培養皿上の細胞の運動を検出することによって決定され得る。
【０１８４】
増殖は、多くの手段、例えばトリチウム化されたチミジン組み込み、細胞計数、アポプトシスアッセイ及び生存性アッセイ（但し、それらだけには限定されない）で検出され得る。好ましい細胞は、GBS毒素受容体によりトランスフェクトされた細胞、好ましくは、GBS毒素受容体によりトランスフェクトされた内皮細胞、さらにより好ましくは、血管内皮細胞又は微小血管内皮細胞を包含する。GBS毒素受容体を発現する一次細胞、例えば細胞培養において、集密性で、わずか８又は９回、継代された内皮細胞が又好ましい。
【０１８５】
好ましい種類の試験化合物は、より特異的なGBS毒素受容体インヒビターを増殖するための開始点として使用され得る、キナーゼインヒビター、好ましくはcAMP−依存性キナーゼインヒビター、PKCインヒビター、及びCK2インヒビターを包含する。もう1つの種類の化合物は、GBS毒素受容体に対して特異的な抗体を包含する。単鎖抗体、好ましくは、GBS毒素受容体上の種々のエピトープを認識する単鎖抗体の収集物が特に好ましい。GBS毒素受容体リガンドの結合部位に対して特異的な二価抗体は、それらがニ量体化に基づいて、シグナルトランスダクションカスケードを誘発できるので、ほとんど好ましくはない。
【０１８６】
本発明のもう1つの態様は、脈管形成の必須成分である、内皮細胞増殖又は移動のインヒビターを同定する方法である。前記方法は基本的には、前述の段階を含んで成り、そして内皮細胞を使用する。
本発明のさらにもう1つの態様は、病理学的又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成により特徴づけられる医学的状態の処理又は予防のための治療化合物の同定方法である。前記方法は基本的には、上記段階を含んで成り、そして影響される組織のためのモデルとして作用する、医学的状態又は細胞により影響された哺乳類に由来する組織からの細胞を使用する。
【０１８７】
哺乳類GBS毒素受容体へのGBS毒素の結合を阻害する化合物を企画するための好ましい方法は、（１）哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントの最も有望なコンホメーションをシミュレートし、そして選択し；（２）GBS毒素受容体又はそのフラグメントのエネルギー的に最も有望な立体構造を実質的に模倣する化学的に修飾された類似体を企画し；（３）前記類似体を化学的に合成し；そして（４）前記類似体の生物活性を評価することを含んで成る。好ましくは、段階（ａ）及び（ｂ）は、コンピュータープログラムの助けにより行われる。
【０１８８】
哺乳類ＧＢＳ毒素受容体に結合する化合物を企画するための好ましい方法は、（１）GBS毒素受容体又はそのフラグメントの最も有望なコンホメーションをシミュレートし、そして選択し；（２）受容体又はフラグメントの最も有望な結合ドメインを推定し；（３）前記受容体又はフラグメントとエネルギー的に最も有望な複合体を形成する化合物を企画し；（４）前記化合物を化学的に合成し；そして（５）前記化合物の生物活性を評価することを含んで成る。好ましくは、段階（ａ）−（ｂ）は、コンピュータープログラムの助けにより行われる。
【０１８９】
上記スクリーニングアッセイに使用するための好ましいポリペプチドは、GBS毒素受容体活性を有する、配列番号２又は４のアミノ酸配列又はそのフラグメントと、少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約95％、及び最も好ましくは約99％以上の同一性を共有するポリペプチドである。GBS毒素受容体活性を有する配列番号２, ４又は８のアミノ酸配列又はそのフラグメントを有するポリペプチドが最も好ましい。
【０１９０】
精製方法：
本発明のもう1つの観点は、GBS毒素受容体を結合する化合物、例えばGBS毒素受容体に対して特異的な天然のリガンド、他の多糖類又は抗体の精製方法である。前記方法は、GBS毒素を結合する、哺乳類GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドを供給し、前記ポリペプチドと、前記化合物を含んで成るサンプルとを、前記ポリペプチドへの前記化合物の特異的結合を可能にする条件下で接触せしめ、そして前記サンプルの残りから結合された化合物を分離することを含んで成る。前記ポリペプチドは可溶性であるが、しかし好ましくは、基質、例えばビーズ、膜又は細胞表面、好ましくはトランスフェクトされた安定細胞上に固定される。
【０１９１】
GBS毒素結合を妨害する、GBS毒素受容体ポリペプチド及び抗体が、ヒト又は動物身体の処理方法に使用され得る。例えば、GBS毒素結合のインヒビターは、GBS毒素受容体へのGBS毒素結合を包含する医学的状態、例えば新生児における初期開始疾病を処理し、又は予防するために患者に投与され得る。
【０１９２】
GBS毒素受容体を結合し、そして/又は阻害するGBS毒素擬似体又は他の化合物（それらのいくつかは、本発明の薬物発現アッセイにより同定され得る）は、ヒト又は動物身体の処理の方法に使用され得、又は病理学的及び/又は低酸素症由来の脈管形成を包含する多くの医学的状態、例えば癌性腫瘍、慢性炎症性疾病、創傷治癒中の瘢痕又は神経損傷の修復のいずれかの処理又は予防のための医学の製造のために使用され得る。
【０１９３】
好ましい態様においては、そのような化合物は、GBS毒素受容体を結合し、そしてGBS毒素のように、炎症性応答を引き起こすことによって、その治療効果を発揮する。好ましくは、そのような化合物は、補体C3を結合するために利用できるように表示されるスルフヒドリル、ヒドロキシル又はアミノ基を含んで成る。
もう１つの好ましい態様においては、前記化合物は、GBS毒素活性のインヒビターである。好ましいインヒビターは、キナーゼインヒビター、GBS毒素受容体に対して特異的な単鎖抗体、及びGBS毒素受容体核酸配列、例えば配列番号1, 3又は７の配列に対して、高い緊縮条件で特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１９４】
もう1つの好ましい態様においては、前記化合物は、炎症性応答を誘発しないで、その治療効果を発揮する。化合物は、GBS毒素受容体を発現する細胞付近の組織、例えば脈管形成を受ける腫瘍に細胞毒性剤を供給するために使用され得る。好ましくは、化合物は、細胞毒性剤に共有結合され、そしてリポソーム、ミセル又は他の親油性薬物を封入する構造体の外部表面上で、細胞毒性剤と非共有的に結合され得る。
【０１９５】
好ましい細胞毒性剤は、例えば当業界において通常使用される抗腫瘍剤、例えばメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド及び他のアルキル化剤、メトトレキセート及び他の葉酸アンタゴニスト、６−メルカプトプリン及び他のプリンアンタゴニスト、５−フルオロウラシル及び他のピリミジンアンタゴニスト、シタラビン、オビンブラスチン、ビンクスチン及び他のビンカ、エトポシド及び他のポドフィロトキシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトマイシン及び他の抗生物質、カルムスチン、ロムスチン及び他のニトロスレア、シスプラチン、インターフェロン、アスパラギナーゼ、タモキシフェン、フルタミド及びタキソールを包含する。
【０１９６】
他の好ましい生物剤は、特定の腫瘍プロモーター又はサプレッサー遺伝子、例えばP53及びTGF遺伝子ファミリー、シグナルトランスダクションタンパク質ファミリーメンバー、例えばras及びmyc, 及び増殖因子受容体キナーゼ、例えばflt2及びflk1, tai1, tai2及びニューロホリン、及び腫瘍性疾病及び病理学的脈管形成により誘発される他の疾病に関する他の遺伝子に由来するセンス及び/又はアンチセンスRNA又はDNAを包含する。
【０１９７】
もう１つの態様においては、GBS毒素受容体ポリペプチド又はそのフラグメントは、影響される組織（例えば、腫瘍組織）に存在するGBS毒素受容体の刺激の量を低め、それにより、影響される組織の細胞の増殖及び移動性に導く細胞応答を低めるために，デコイとして、対象に投与され得る。好ましくは、GBS毒素受容体ポリペプチド又はフラグメントは、可溶性形、さらにより好ましくはトランスメンブランドメインを伴わないで投与される。
【０１９８】
医薬組成物：
インビボでの生物利用性、安定性及び薬物動力学の他の重要なパラメーターに関する所望する特徴を有する、GBS毒素結合のために必須のドメインを含んで成る本発明のポリペプチドは、GBS毒素結合が所望されない医学的状態、例えば新生児における初期開始疾病のためのGBS毒素結合の競争インヒビターとして使用され得る。適切なポリペプチドは、配列番号２又は４の部分的又は完全な配列に応答するアミノ酸配列を有するフラグメント又はその類似体を包含することができる。
【０１９９】
GBS毒素受容体を結合し、そして/又は炎症性応答を誘発することが、本発明のポリペプチドを用いてのアッセイにより決定され、そして所望する薬物動力学特徴を有する化合物は、GBS毒素結合が治療的であり得る医学的状態、例えば病理学的又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成又は新生血管形成を包含する医学的状態に関する処理薬として使用され得る。
【０２００】
本発明の医薬組成物は、種々の機能、例えば薬物濃度の調節、溶解性の調節、化学的安定化、粘度の調節、吸収性増強、pHの調節、及び同様のものを提供する種々の成分を含むことができる医薬的に許容できるキャリヤーを包含する。例えば、水溶性製剤においては、医薬組成物は好ましくは、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、又は他の有機酸塩を、好ましくは約７〜８のpHで含む。他の成分は、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、親水性ポリマー、例えば単糖類、二糖類及び他の炭水化物、例えばセルロース又はその誘導体、デキストリン、キレート化剤、例えばEDTA及び医薬科学、例えばRemington’s Pharmaceutical Science, Lates edition (Mack Publishinng Company, Easton, PA)において良く知られている同様の成分を包含する。
【０２０１】
活性化合物、例えばGBS毒素受容体ポリペプチド、擬似体又は類似体、又は特定用途のためのGBS毒素擬似体又は類似体の有効量は、いくつかの要因、例えばポリペプチド、擬似体又は類似体の化学的性質、処理される障害、投与の方法及び同様のものに依存する。好ましくは、有効量は、細胞表面上の標的GBS毒素受容体で、約0.001〜100μM、より好ましくは10μM以下の濃度のポリペプチド又は擬似体を付与し、そして１μM以下が最も好ましい。
【０２０２】
活性化合物は、種々の形で哺乳類宿主に投与され得、すなわちそれらは、投与の選択された経路、例えば経口又は非経口に依存して、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、硬質キャンディー、粉末、スプレー、エリキシル、シロップ、注射用又は点眼用溶液及び同様のものの形で、種々の医薬的許容できる不活性キャリヤーと共に組み合わされ得る。これに関する非経口投与は、次の経路による投与を包含する：静脈内、筋肉内、皮下、眼内、滑膜内、上皮を通して（例えば、経皮を通して、眼、舌下及び頬）、局部性（例えば、眼、皮膚、眼内レンズ、直腸、吸入剤及びエアロゾルを通しての鼻からの吸入）、及び直腸を通しての全身性投与。
【０２０３】
活性化合物は、例えば不活性希釈剤又は同化できる食用キャリヤーと共に経口投与され得、それは硬質又は軟質シェルゼラチンカプセルに封入され、錠剤に圧縮され、又は食品と共に直接的に導入され得る。経口治療投与に関しては、活性化合物は、賦形剤と共に導入され、そして摂取できる錠剤、頬用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート及び同様のものの形で使用され得る。そのような組成物及び調製物は、少なくとも0.1％の活性化合物を含むべきである。
【０２０４】
もちろん組成物及び調製物中のその％は変化し、そして便利には、単位の重量の約２％〜約６％であり得る。そのような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適切な容量が得られるであろうような量である。本発明の好ましい組成物又は調製物は、経口投与単位形が約１〜1000mgの活性化合物を含むように調製される。
【０２０５】
錠剤、トローチ、ピル、カプセル及び同様のものはまた、次のものを含むことができる：結合剤、例えばポリビニルビロリドン、トラガカントガム、アカシア、スクロース、コーンスターチ又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム及び炭酸カルシウム；砕解剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモスターチ、タピオカスターチ、一定の複合シリケート、アルギン酸及び同様のもの；滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、タルク及びステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばスクロース、ラクトース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、冬縁油又はチェリーフレーバー。
【０２０６】
類似型の固体組成物はまた、軟質及び硬質−充填されたゼラチンカプセルにおける充填剤として使用され；これに関する好ましい材料はまた、ラクトース又は乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコールを包含する。用量単位型がカプセルである場合、それは、上記型の材料の他に、液体キャリヤーを含むことができる。種々の他の材料が、被膜として、又は他方では、用量単位の物理形を変性するために存在することができる。例えば、錠剤、ピル又はカプセルは、シェラック、糖又は両者により被覆され得る。
【０２０７】
シロップ又はエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、風味剤、例えばチェリー又はオレンジフレーバー、乳化剤及び/又は懸濁剤、及び希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、並びにそれらの種々の組み合わせを含むことができる。もちろん、いずれかの用量単位形の調製に使用される材料は、医薬的に純粋であり、そして使用される量で実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、持効性製剤及び配合物に組み込まれ得る。
【０２０８】
活性化合物はまた、非経口、又は腹腔内投与もされ得る。非経口投与のためには、ゴマ油又はピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールにおける溶液が使用され得、そしてその対応する水溶性、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩の無菌水溶液がこれまでに列挙されている。そのような水溶液は、必用なら、適切に緩衝化され、そして液体希釈剤がまず、十分な塩溶液又はグルコースにより等張性にされる。遊離塩基又は薬理学的に許容できる塩として活性化合物の溶液が、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースにより適切に混合される。
【０２０９】
懸濁液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油においても調製され得る。貯蔵及び使用の通常の条件下で、それらの製剤は、微生物の増殖を妨げるために、保存剤を含む。それらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内注入目的のために、特に適切である。これに関しては、使用される無菌水性媒体は、当業者に良く知られている標準の技法により、すべて容易に得られる。
【０２１０】
注射使用のために適切な医薬形は、無菌注射溶液又は分散液の即座の調製のために無菌水溶液又は分散液及び無菌粉末を包含する。すべての場合、その形は無菌性であるべきであり、そして容易な注射可能性が存在する程度まで流体であるべきである。それは製造及び貯蔵の条件下で安定すべきであり、そして微生物、例えば細菌及び菌類の汚染性作用に対して保存されるべきである。キャリヤーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール及び同様のもの）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。
【０２１１】
正しい流動性は、例えば被膜、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必用とされる粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の殺菌剤及び抗真菌剤、例えばペラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール及び同様のもによりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能組成物の延長された吸収性は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされ得る。
【０２１２】
無菌注射用溶液は、上記に列挙された種々の他の成分と共に適切な溶媒に、必要とされる量で、活性化合物を導入し、必用なら、続いて濾過殺菌することにより調製される。一般的には、分散液は、基本分散媒体及び上記に列挙されるそれらの成分からの必要とされる他の成分を含む無菌ビークル中に殺菌された活性成分を導入することにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分、及び前もって無菌濾過されたその溶液からのいずれかの追加の所望する成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥方法である。
【０２１３】
局部投与のためには、上記非経口溶液に類似する無菌希釈水溶液（通常、約0.1％〜５％の濃度）が、眼への点眼用投与のために適切な容器において調製される。本発明の化合物は、哺乳類に、単独で又は医薬的に許容できるビークルと組合して投与され得る。上記で示したように、活性成分及びキャリヤーの相対的割合は、化合物の溶解性及び化学的性質、投与の選択された経路、選択される特定の化合物、及び処理下での特定の患者の生理学的特徴により決定される。
【０２１４】
キット：
本発明のさらにもう１つの観点は、上記の方法のいづれかを実施することに使用するためのキットである。好ましい態様は、GBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成るキットである。好ましくは、受容体又はフラグメントは固定される。好ましいキットは、GBS毒素受容体に結合する化合物を同定するために使用され得、そしてGBS毒素受容体を発現する少なくとも1つの細胞を含んで成る。
【０２１５】
もう１つの態様は、GBS毒素受容体の発現を検出するための試薬を含んで成る、腫瘍増殖又は転移をモニターするためのキットである。そのような試薬の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：GBS毒素受容体核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブ及びGBS毒素受容体に結合する化合物、例えばGBS毒素受容体を特異的に認識する抗体、GBS毒素、GBS毒素擬似体、又は上記スクリーニング方法により同定される他の化合物。
【０２１６】
第３の態様は、化合物を結合するGBS毒素受容体又はそのフラグメントを含んで成る、GBS毒素受容体を結合する化合物を精製するためのキットである。好ましい化合物は、GBS毒素、GBS毒素擬似体、GBS毒素受容体を特異的に結合する抗体、及び上記スクリーニング方法により同定される他の化合物を包含する。
追加のキットは、検出のために必要とされる追加の試薬、参照標準、使用のための説明及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。適切な参照標準は、正の対照、負の対照、そのような対照の写真、そのような対照の表化され又はグラフ化されたデータ、及び同様のものを包含する。キットはさらに、上記方法を実施するための説明書、好ましくは印刷された説明書を含んで成る。
【実施例】
【０２１７】
例１．羊GBS毒素受容体のクローニング
羊肺内皮細胞の一次培養
生後７週目の羊からの一次肺組織の小片を、10mMのHEPES緩衝液（Life Technology）、１％のペニシリン/ストレプトマイシン及び0.1％のゲンタマイシンを含むハンクス液（HBSS）において、小さく断片化し、そして37℃で、羊の肺の完全培地（Life Technology）において培養する。１週間の培養の後、羊の肺内皮細胞のクローンを、Cobblestone形態学により同定し、そして24−ウェル組織培養プレート（Falcon）中に、クローニング環を用いて収穫する。
【０２１８】
細胞が集密性である場合、それらはパンクレアチンにより分離され、そして60mmの組織培養ペトリ皿又はT−25組織培養フラスコ（Falcon）に移す。それらが再び集密性に成ると、それらを分離し、そして少数の100mmの組織培養プレート（Falcon）中で培養する。個々の分離は、１つの継代であると見なされる。同じ方法を、十分な細胞（約108個）がmRNAの単離のために得られるまで、反復する。
mRNAの単離及びcDNAライブラリーの構成
ポリ (A)+RNA を、9.2×107個の羊の肺内皮細胞（継代８及び９）から、標準方法（Pharmacia）により単離する。合計16μgのポリ (A)+RNA を許容できる量で得、2.5μgのmRNAを用いて、cDNAライブラリーを構成する。ポリ (A)+RNA を、オリゴ（dT）−感作し（NotI制限部位により）、そして二本鎖cDNAに転換する。BstXI/EcoRI アダプターの付加の後、cDNAを、pCDNA3.1(＋)（Invitrogen）のBestXI及びNotI部位中に一方向性的にクローン化する。E.コリTop10F’ (Invitrogen) を、増幅のための宿主株として使用する。
【０２１９】
5.38×106個の一次クローンは、生成される許容できる数である。ライブラリーを、アンピシリン（100μg/ml）を含む50の大きなLB寒天プレート上に細胞をプレートすることによって増幅する。プレートを削り取り、そしてアリコートし、その結果、個々のアリコートは10個のプレートを表す。DNAを、Qiagen Max カラム（Qiogen）により精製する。
【０２２０】
GBS毒素受容体をコードする遺伝子についてのcDNAライブラリーのスクリーニング
GBS毒素受容体遺伝子をコードする遺伝子についてcDNAライブラリーをスクリーンするために、ユニーク比色法を使用する。cDNAライブラリーの個々のプレートからのプラスミドDNA5μgを用いて、COS7細胞をトランスフェクトする。そのトランスフェクトされた細胞を、過渡的発現のために、４〜８個の96−ウェル組織培養プレート（Falcon）において培養する。個々のウェルは、DMEM培養（Life Technology）において、約20,000個のトランスフェクトされた細胞を含む。pCDNA3.1(＋) によりトランスフェクトされたCOS7細胞を、対照として使用する。３日間の発現の後、培地を注意して除去する。個々のウェルを、Mg2+及びCa2+を含むHPSS緩衝液（洗浄緩衝液）（Life Technology）により３度すすぐ。
【０２２１】
次に、細胞を、ビオチニル化された毒素（50μl/ウェル；１〜1.5μg/ml）と共に、室温で１時間インキュベートする。１時間のインキュベーションの後、ビオチニル化された毒素を捨て、そしてウェルを洗浄緩衝液により３度すすぐ。細胞をストレプタビシン−β−gal溶液と共にインキュベートし、そして個々のウェルを洗浄緩衝液により３度すすぐ。次に、細胞を、PNPG（50μl/ウェル；基質緩衝液において1mg/ml）と共に37℃でインキュベートする。405nmでの吸光度を、それぞれ１及び20時間で、ELISA読み取り機により測定する。最高のODを付与する細胞を収穫する。プラスミドDNAを、Hirt抽出により単離する。プラスミドDNAを、次のトランスフェクション（富化）のために十分なDNAを有するよう、E.コリにおいて増幅する。
【０２２２】
富化をこの比色法により８回行う。個々のウェル中に単離される、トランスフェクトされた細胞の数は、最後の少数の富化において徐々に低められ、そして集密性になり、そして３日間の発現の後、バックグラウンドを低めるために、トランスフェクトされていない細胞を個々のウェルに添加し、ウェル当たり合計数20,000個の細胞を付与する。最後の富化で、個々のウェルは、わずか１〜10個のトランスフェクトされた細胞を有する。最高のODを付与する細胞を収穫する。DNAを単離し、そしてE.コリにおいて増幅する。
多くの単離されたクローンを、この比色法により個々にアッセイする。CM101に対してより高い結合性を示すクローンを配列決定する。
【０２２３】
配列分析
2.1kbの挿入体を有する、クローンpFU102のDNA配列分析は、部分的内在性糖タンパク質をコードする配列を示した。N−末端配列を、5’RACE方法（Life Technology）により得、そして完全な長さの遺伝子をSP55として命名する。三連結は、SP55の全コード領域を含む、CD55を生成した。
【０２２４】
SP55のためのmRNAは、55KDaの予測される質量を有する、495個のアミノ酸のタンパク質をコードする2844個のヌクレオチドを有する。Kleinなど. (Kleinなど., Biochim. Biophys. Acta, 815: 468-476 (1985)) の方法による分析は、７個のトランスメンブランセグメントを有する内在性タンパク質としてSP55を分類する。SP55は、N−グリコシル化部位及びキナーゼリン酸化部位を有する。
【０２２５】
SP55のSwiss−Prot調査は、既知のヒトタンパク質に対していずれの高い相同性も示さなかった。しかしながら、SP55は、ヒト、ウサギ、マウス及びラットからの腎ナトリウム−依存性リン酸輸送体に対していくらかの同一性（約30％）を有する。さらに、SP55は、C. エレガンスからの推定タンパク質（HYP50及びHYP63）に対していくらかの同一性（約30〜39％）を有する。
【０２２６】
例２．ヒトGBS毒素受容体のクローニング
羊GBS毒素受容体配列は、HYP50に対して約37％の同一性及びHYP63に対して約33％の同一性を共有する（それらの２種の推定タンパク質はC.エレガンスからである）。配列番号２のアミノ酸残基180〜186及び443〜449に対応する領域においては、７個のアミノ酸範囲内の５個のアミノ酸が、３種のタンパク質間で絶対的に保存される。
【０２２７】
第１の縮重オリゴヌクレオチド、すなわち
CMR3−S：5’−CGGGATCCCGCCNGCNATGCAYRSHRTSTGG−3’（配列番号５）を、180−186領域におけるSP55，HYP50及びHYP63のアミノ酸配列をコードするすべての可能なコドンを含むよう企画した。第２の縮重オリゴヌクレオチド、すなわちCMR4−AS2: 5’−GGAATTCCDGGDGCRATKTCNARRTRRTT−3’ (配列番号６)を、443−449領域におけるSP55，HYP50及びHYP63のアミノ酸配列をコードするすべての可能なコドンの相補的配列を含むよう企画した。
【０２２８】
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を、鋳型として、それらのオリゴヌクレオチド及びヒト胚の肺cDNAライブラリーを用いて行った。この反応は、配列番号３の核酸配列の一部を包含する、約400bpのサイズの３種のオーバーラッピングする配列を生成した。次に、それらの配列をプローブとして用い、本明細書において言及される遺伝子の残り及びHP59（配列番号７）をクローン化した。
【０２２９】
例３．GBS毒素受容体に対する抗体の調製
ウサギを、表10に示される合成ペプチドにより免疫化する。0.01Mのリン酸緩衝液中、ペプチド及びKLHの１mg/ml溶液を調製する。第１の免疫化のために、注入の前、十分に乳化された、200μgのペプチド＋KLH（200μl）及び等体積のフロイント完全アジュバントを、ウサギの首及び肩の回りの背面上の３〜４点に注射する。２週後、第２の免疫化（追加免疫化）を、同じ濃度の免疫原（但しフロイント不完全アジュバントにより乳化されている）で付与する。追加免疫を身体の同じ領域に供給する。さらに２週後、血液を採血し、そしてKLHを伴わないでペプチドに対する応答についてELISAによりアッセイする。必要なら、さらなる追加免疫を付与し、抗体力価を改良する。
【０２３０】
【表１０】
2010099072.tif 000011
【０２３１】
ペプチドp55は、GBS毒素受容体の細胞外ドメインのフラグメントである。ペプチドp57aは、GBS毒素受容体の細胞内ドメインのフラグメントである。それらのペプチドにより免疫化された動物は、それぞれ、ポリクローナル抗体Pab55及びPab57を生成する。
【０２３２】
例４．腫瘍細胞におけるGBS毒素受容体発現の検出
この例は、GBS毒素受容体が腫瘍細胞において検出され得ることを示す。免疫組織化学を、ウサギポリクローナル抗体Pab55及びPab57を用いて、正常又は腫瘍起源の一対のヒト及びマウス組織に対して行う。
マウス及びヒト腫瘍組織を、10％中性ホルマリンに固定する。次に組織を脱水し、パラフィンい包埋し、そして10〜20×８ミクロンの切片を、免疫組織化学染色のために切断する。
【０２３３】
免疫組織化学分析を、自動Ventana Immunohistochemical Stainer (Ventana, Tucson, Arizona)により、製造業者のプロトコールに従って行う。切片をキシレンによりパラフィンを除去する。次に、用意された切片を、30％水性メタノールにおいて調製された１％過酸化水素により、室温で20分間、処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制する。次に、スライドをPBSにより洗浄し、PBS中、５％BSA及び５％ヤギ血清により阻止し、再び洗浄し、そして次に、適切に希釈された（1：100）抗体と共に37℃で30分間インキュベートする。
【０２３４】
ホースラディッシュペルオキシダーゼによりラベルされたヤギ抗−ウサギIgGを、第２抗体として使用する。可視化のために、切片をDAB/H2O2と共にインキュベートする。切片を、最終的に、銅エンハンサー（Ventana）と共に４分間インキュベートし、洗浄し、ヘマトキシリンにより対比染色し、そしてトルエンを含まない固定媒体に固定する。写真資料調査を行い、そして像を後で再考及び分析のために貯蔵する。その結果は表11及び表12に要約される。番号はガラススライドを示す。
【０２３５】
【表１１】
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【０２３６】
【表１２】
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【０２３７】
Pab55抗体は、ヒト卵巣癌組織切片における血管の裏側の細胞を染色するが、しかしそのような染色は正常ヒト卵巣組織の細胞には明白ではない（それぞれ、図２A及び２Bを参照のこと）。類似する結果を、Pab57抗体により得る（図３A及び３Bを参照のこと）。上記表及び図２A−３Bに示されるように、抗体は、腫瘍組織に特異的に結合されるGBS毒素受容体フラグメントに対して生じるが、しかし正常組織に関しては、生ぜず、このことは、GBS毒素受容体が、正常細胞ではなく、腫瘍細胞において発現されることを示唆する。
【０２３８】
例５．リウマチ様関節炎により影響されたマウスにおけるGBS毒素受容体発現の検出
この例は、GBS毒素受容体がリウマチ様関節炎（RA）のための哺乳類モデルからの細胞において検出され得ることを示す。コラーゲン誘発された関節炎を有するマウスを、CM101又はキャリヤーにより処理した。CM101は、炎症性損傷及び阻害されたパンヌス形成を示した。CM101により処理されたマウス＃15、及び２匹の対照マウス（CM101により処理されていない）を、免疫組織化学のために殺した。
【０２３９】
【表１３】
2010099072.tif 000014
【０２４０】
上記に示されるように、Pab55及びPab57は、パンヌスにおける病理学的新生血管形成に特異的に結合し、このことは、GBS毒素受容体がリウマチ様関節炎により影響されたマウスにおいて発現されることを示唆する。CM101の結合は、関節炎のマウスの関節の成長プレートにおける正常な新生血管形成には観察されなかった。
【０２４１】
例６．GBS毒素受容体を発現する組織へのキメラ化合物の標的化された供給
この例は、GBS毒素を発現する組織へのキメラ化合物の標的化された供給を示す。そのキメラ化合物は、CM101−ビオチン接合体である。Madison 肺腫瘍（MLT）を有するマウスに、ビオチニル化されたCM101を静脈（i.v.）注入する。
【０２４２】
CM101は、多糖CM101の還元末端でビオチンヒドラゾンを形成するために、ヒドラジニル化されたビオチンにより反応されている。手短には、25μgの凍結乾燥されたCM101を、100mMの酢酸ナトリウム及び0.02％のアジ化ナトリウムでのラベリング緩衝液250μlに溶解する。水性メタ−過ヨウ素酸塩（30mMでの125μl）を添加し、そして酸化を、室温で30分間、暗室において進行せしめ。
【０２４３】
反応を、溶液に80mMのNa2SO3を添加することによって停止する。得られるアルデヒドを、室温で１時間インキュベートし、５mMのNHS−LC−ビオチン（MW556.58）125μlと反応せしめ、ビオチニル化されたCM101を形成する。過剰のビオチンを、１ｌのPBSに対して４℃で４度、透析することによって除去する。生成物を、Ultrahydrogel 1000 HPLC上でのゲル濾過により精製し、凍結乾燥し、そして使用まで−70℃で貯蔵する。
【０２４４】
組織を、CM101による注入の５分後に回収し、そして免疫組織化学にゆだねる。腫瘍及び正常マウス組織切片を、両マウス抗−CM101mAb（7A3）、続いて第２のmAb−HRP接合体（図４Bにおいては、MLT  CM101−Biot. 5’＋McAbとして言及される）、又はHRP（図４Aにおいては、MLT CM101−Biot.5’＋Strep. HRPとして言及される）により接合されたアビジン（ビオチンを特異的に結合する）によりCM101について分析する。
【０２４５】
図４A−４Cは、同じ腫瘍から採取された異なった切片を示し、そして図のほぼ中央に同じ血管の縦に伸びる外観を包含する。図４Aにおける黒い染色は、血管の内側の細胞におけるビオチン成分の局在化を示す。同様に、図４Bは、血管の内側の細胞におけるCM101成分の局在化を示す。図４Cは、CM101に暴露されなかった負の対照である。この分析は、７A３及びアビジンが腫瘍組織における同じ血管に結合することを明白に示す。従って、ビオチンは、GBS毒素受容体を結合する化合物（CM101）とのその物理的結合により腫瘍組織の血管に供給された。
【０２４６】
それらの研究は、キメラ化合物が病理学的及び/又は低酸素症由来の脈管形成又は新生血管形成を受ける組織に供給され得ることを示す。キメラ化合物の一部として、細胞毒性分子は、そのような組織、例えば腫瘍組織に向けられ得る。細胞毒性分子は、GBS毒素受容体を結合する分子、例えばGBS毒素に向けられ得る。他方では、GBS毒素受容体を結合する分子がビオチンに結合され得、そして細胞毒性分子がアビジンに結合され得る。
【０２４７】
例７．GBS毒素受容体を発現する細胞のGBS−毒素−依存性細胞毒性に対する増強された感受性
この例は、対照細胞に対して、GBS毒素受容体によりトランスフェクトされた細胞のGBS−毒素−依存性細胞毒性に対する増強された感受性を示す。特定の理論に結びつけられないが、本発明者は、補体が細胞上のGBS毒素受容体に結合されるGBS毒素を結合し、それにより、白血球細胞（WBC）により殺害するための細胞を標的化すると信じている。
【０２４８】
ヒト膀胱癌細胞（ECV細胞）を、ヒトGBS毒素受容体遺伝子により安定してトランスフェクトする。得られる細胞系はECV711である。細胞は、V23として言及されるようなベクターのみにより安定してトランスフェクトされる。ECV711及びV23を、5,000個の細胞/ウェルで、96−ウェルプレートに接種する。
【０２４９】
白血球細胞を、次のようにして健康なヒトドナーから採取する。血液を標準の静脈切開方法により、ヘパリンを添加された管（30U/ml）中に集め、そして2000rpmで20分間、遠心分離する。その界面を新しい管に注意して移し、そして培地（RPMI−1640）による遠心分離により２度洗浄する。細胞を、５％ウシ胎児血清（FBS）及びインターフェロン−γ（IFN）により100U/mlで補充されたRPMI−1640に再懸濁し、そして37℃で、５％CO2のインキュベーターにおいて一晩インキュベートする。次に、細胞を、５％FBSを有する新鮮な培地に再懸濁する。
【０２５０】
WBC調製物の5,000個の細胞を、トランスフェクトされた細胞を含む個々のウェルに添加する。CM101を、適合するヒトドナーからのヒト血清と共に、ウェルに添加し、１μg/mlの最終濃度にする。細胞を37℃で６時間インキュベートする。
【０２５１】
細胞毒性を、Promega’s CytoTox 96 Non-Radioactive Assay キット（Nachlas など. (1960) Anal. Biochem 1, 317; Korzeniewski など. (1983) J. Jmmunol. Methods 64, 313; Decker など., J. Immunol. Methods 115, 61; Brander など. (1993) Eur, J. Immunology 23, 3217; Behl など. (1994) Cell 77, 817; Lappalainen など. (1994) Pharm. Research 11, 1127; Allen など. (1994) Promega Notes 45, 7; Sinensky など. (1995) Taxicol. Letters 75, 02; Moravec (1994) Promega Notes 45, 11）を用いて乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を測定することによってアッセイする。％細胞毒性を、製造業者が推薦する説明書に従って計算する。その結果は表14に示される。
【０２５２】
【表１４】
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【０２５３】
CM101なしでインキュベートされた細胞に比較して、ECV711細胞がCM101、WBC及びヒト血清（C3の源）と共にインキュベートされる場合、39％の細胞毒性の上昇が存在する。ベクター、V23のみによりトランスフェクトされた対照細胞は、細胞毒性におけるCM101依存性上昇を示さない。
本明細書におけるすべての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が引用により組み込まれていることを、特異的且つ個々に示されているのと同じ程度に引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は現在、十分に記載されて来たが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
2010099072000001.app
【外国語明細書】
2010099072000001.pdf