(57)【要約】      （修正有）【課題】保存安定性および反応性に優れた臨床診断用試薬に適用することの可能な、長期保存性に特に優れたカタラーゼを提供する。【解決手段】従来のウシ肝臓由来のカタラーゼに代替して、微生物に由来する新規なカタラーゼを提供する。４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上を示し、ｐＨ６．２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上を示す。アルカリゲネス属の微生物、特にアルカリゲネスＡＫ−２に由来することが好ましい。【選択図】図５
2010193821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有することを特徴とするカタラーゼ。
（１）サブユニットのマススペクトル法による分子量が５３４００のモノマー酵素である。
（２）至適温度が３５〜４０℃である。
（３）至適ｐＨがｐＨ７．２〜９．０である。
（４）１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上である。
（５）ｐＨ６．２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上である。
（６）酵素の持っているペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下である。
【請求項２】
Ｎ末端に配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のカタラーゼ。
【請求項３】
３７℃，８日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することを特徴とする請求項１または２に記載のカタラーゼ。
【請求項４】
３７℃，８日間の保存により７０％以上の残存活性を保持することを特徴とする請求項３に記載のカタラーゼ
【請求項５】
３７℃，１４日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することを特徴とする請求項１または２に記載のカタラーゼ。
【請求項６】
３７℃，１４日間の保存により７０％以上の残存活性を保持することを特徴とする請求項５に記載のカタラーゼ
【請求項７】
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の微生物を起源とする請求項１〜６のいずれかに記載のカタラーゼ。
【請求項８】
アルカリゲネス属の微生物が、アルカリゲネス  ＡＫ−２（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ＡＫ−２；工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号）であることを特徴とする請求項７に記載のカタラーゼ。
【請求項９】
測定対象物質が含まれているか、もしくは測定対象物質が含まれていると考えられる試料を用いて、少なくとも１種の酵素による反応を行った後、発色反応を行うことにより生体内に含まれる物質を比色測定する方法において、請求項１〜８のいずれかに記載のカタラーゼを用いて測定対象物質以外の物質が発生させる過酸化水素を分解する工程を含むことを特徴とする生体成分の測定方法。
【請求項１０】
測定対象物質が、クレアチニン、トリグリセリド、無機リン、クレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α−アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアナーゼ、リン脂質よりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項９に記載の生体成分の測定方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載のカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびペルオキシダーゼ以外の１種以上の酵素、緩衝剤および色原体を少なくとも含有されることを特徴とする生体成分測定用試薬キット。
【請求項１２】
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の微生物を、栄養培地を用いて培養し、カタラーゼ活性を有する蛋白質を採取する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のカタラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来する新規なカタラーゼに関する。具体的には、特に長期保存性に優れたカタラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）は、１分子あたり４個のプロトヘムを作用基とする四量体のヘム蛋白質で、過酸化水素を分解する下記反応を触媒する。
反応式（１）  ２Ｈ２Ｏ２  →  ２Ｈ２Ｏ＋Ｏ２
また、カタラーゼは反応式（２）で示されるペルオキシダーゼ型の活性を僅かながら持っている事も知られている。
反応式（２）    ２ＡＨ２＋Ｈ２Ｏ２  →  Ａ＋２Ｈ２Ｏ  
【０００３】
カタラーゼは動物、植物、微生物の好気的な細胞中に存在し、動物では肝臓・血球・腎臓に多く含まれ、植物では葉緑体に含まれているが、同一個体中でも臓器・組織によって酵素の多様が見られている。微生物由来のカタラーゼとして、例えば、バチラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の低温での反応性に優れたカタラーゼ（特許文献１）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属菌由来の熱安定性に優れたカタラーゼ（特許文献２）、バチラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来の高活性で安定性の優れたカタラーゼ（特許文献３）、アスペルギルス・カーボナリウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）由来の強酸性ｐＨの条件下で安定性の優れたカタラーゼ（特許文献４）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アクレモニウム・アラバメンシス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｉｓ）、サーモアスカス・オーランチアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕ）由来の耐熱性で弱アルカリ性に於ける反応性に優れたカタラーゼ（特許文献５）などが挙げられる。また、アルカリゲネス・ドゥレイア（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｌｅｙａ）、アルカリゲネス・ミクロシラ（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｉｌｌａ）由来のカタラーゼ（特許文献６）も知られている。
【０００４】
このように、カタラーゼは自然界に非常に広く分布していながら、酵素の安定性・反応性・基質特異性などの性質が給源よって大きく異なり、産業上利用できるものは希少である。特に、臨床診断薬用途を始めとする生化学分野、分析化学の分野では、中性付近の緩衝液、特にグッド・バッファー中に希薄な濃度に溶解したときの安定性に優れること、カタラーゼが本質的に有しているペルオキシダーゼ型活性が極めて低い事が必要であり、従来ウシ肝臓由来のカタラーゼがこのような用途に適した特性を有していため、例えば、中性脂肪測定試薬やクレアチニン測定試薬において妨害物質の消去系の中に使用されて来た。
【０００５】
しかしながら、近年、牛海面脳症（ＢＳＥ）の影響で牛の臓器を原料とする蛋白製剤・酵素製剤の取り扱いに規制が発生し、また、製造においても、牛臓器の安価で安定的な入手が困難になっている。そのような事情から、微生物由来であり、かつ安定性に優れたカタラーゼへのニーズが高まってきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２４６０９２号公報
【特許文献２】特開平１０−２５７８８３号公報
【特許文献３】特開２００１−２７５６６９号公報
【特許文献４】特開平１１−４６７６０号公報
【特許文献５】特開平５−１５３９７５号公報
【特許文献６】特表２０００−５１３５７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、臨床診断薬用途を始めとする生化学分野、分析化学の分野への利用に優れた特性を有する、微生物由来のカタラーゼを安価に安定的に提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アルカリゲネス  ＡＫ−２（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ＡＫ−２）、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを用いると、分析試薬の組成中でも安定に活性を保持することができ、しかも、該カタラーゼは高純度な酵素標品を大量に調製できることが判明した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
項１．下記の理化学的性質を有することを特徴とするカタラーゼ。
（１）サブユニットのマススペクトル法による分子量が５３４００のモノマー酵素である。
（２）至適温度が３５〜４０℃である。
（３）至適ｐＨがｐＨ７.２〜９.０である。
（４）１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上である。
（５）ｐＨ６.２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上である。
（６）酵素の持っているペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下である。
項２．Ｎ末端に配列番号１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする項１に記載のカタラーゼ。
項３．３７℃，８日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することを特徴とする項１または２に記載のカタラーゼ。
項４．３７℃，８日間の保存により７０％以上の残存活性を保持することを特徴とする項３に記載のカタラーゼ
項５．３７℃，１４日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することを特徴とする項１または２に記載のカタラーゼ。
項６．３７℃，１４日間の保存により７０％以上の残存活性を保持することを特徴とする項５に記載のカタラーゼ
項７．アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の微生物を起源とする項１〜６のいずれかに記載のカタラーゼ。
項８．アルカリゲネス属の微生物が、アルカリゲネス  ＡＫ−２（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ＡＫ−２；工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号）であることを特徴とする項７に記載のカタラーゼ。
項９．測定対象物質が含まれているか、もしくは測定対象物質が含まれていると考えられる試料を用いて、少なくとも１種の酵素による反応を行った後、発色反応を行うことにより生体内に含まれる物質を比色測定する方法において、項１〜８のいずれかに記載のカタラーゼを用いて測定対象物質以外の物質が発生させる過酸化水素を分解する工程を含むことを特徴とする生体成分の測定方法。
項１０．測定対象物質が、クレアチニン、トリグリセリド、無機リン、クレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α−アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアナーゼ、リン脂質よりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする項９に記載の生体成分の測定方法。
項１１．項１〜８のいずれかに記載のカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびペルオキシダーゼ以外の１種以上の酵素、緩衝剤および色原体を少なくとも含有されることを特徴とする生体成分測定用試薬キット。
項１２．アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の微生物を、栄養培地を用いて培養し、カタラーゼ活性を有する蛋白質を採取する工程を含む、項１〜６のいずれかに記載のカタラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により長期保存性に優れた過酸化水素消去試薬が得られる。液状化試薬が主流である現在、これらのように液状で安定な試薬は非常に有用である。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、体液中の測定成分を測定するに当たり、
体液中に含まれる妨害物質に、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素およびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む試薬を作用させて、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から生成した過酸化水素を消去した後、
次いで体液中の測定成分に、該測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む試薬を作用させて、
体液中の測定成分から妨害物質を生成させ、
該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から過酸化水素を生成させ、
該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中の測定成分の測定法において、
各分析試薬の組成中で安定に活性を維持することができる。
【００１２】
また、本発明は、
体液中に含まれる妨害物質に作用して過酸化水素を生成する酵素または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素およびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含有する第１試薬、および、
体液中の測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素、ペルオキシダーゼおよび色原体を含有する第２試薬
からなる体液中の測定成分測定試薬で安定に活性を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明におけるカタラーゼの温度反応性を示す図である。
【図２】本発明におけるカタラーゼのｐＨ反応性を示す図である。
【図３】本発明におけるカタラーゼの熱安定性（１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．０、３０分処理後の残存活性）を示す図である。
【図４】本発明におけるカタラーゼのｐＨ安定性（１０ｍＭ  緩衝液、２５℃、１７時間処理後の残存活性）を示す図である。
【図５】本発明における微生物由来カタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼ（液状品）との安定性比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のカタラーゼの特性
本発明の製法により得られたカタラーゼ活性を有する蛋白質は、以下のような性質を有することを特徴とする。
（１）マススペクトル法による分子量が５３４００のモノマー酵素である。
（２）至適温度が３５〜４０℃である。
（３）至適ｐＨがｐＨ７.２〜９.０である。
（４）１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上である。
（５）ｐＨ６.２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上である。
（６）酵素の持っているペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下である。
【００１５】
本発明におけるカタラーゼは、熱安定性に特に優れている。具体的には、３７℃，８日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することが好ましく、７０％以上の残存活性を保持することがより好ましい。また、３７℃，１４日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することが好ましく、３７℃，１４日間の保存により７０％以上の残存活性を保持することがより好ましい。
【００１６】
本発明におけるカタラーゼは、該カタラーゼに有するペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下であることを特徴とする。より好ましくは３×１０−８％以下、更に好ましくは２×１０−８％以下である。
【００１７】
さらには、本発明におけるカタラーゼは、Ｈ２Ｏ２に対するＫｍ値が約５．５ｍＭであることが好ましい。比活性は、約３５，０００Ｕ／ｍｇ−蛋白質以上であることが好ましい。また、Ｎ末アミノ酸配列は配列番号１に示されるような、”Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−”の配列を有することが特に好ましい。
【００１８】
本発明のカタラーゼの由来・製造方法
本発明に用いるカタラーゼは、微生物に由来することを特徴とする。微生物の種類は特に限定されるものではないが、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などが挙げられる。なかでも、アルカリゲネス属の微生物が好ましい。
【００１９】
具体的には、例えばアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを培養し、該培養物から精製することにより得られる。このような方法としては、特に限定されるものではないが、例えば特開昭６３−２０７３８４号公報に記載される方法がある。カタラーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素物、その他必要な栄養素を適量含有するものを、合成培地、天然培地のいずれかであっても使用できる。培養は通常、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行い、培養温度は２０〜４０℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で行う。培養期間は１〜５日で生育し、菌体内にカタラーゼが生産蓄積される。
【００２０】
本発明に使用するカタラーゼの精製は、例えば以下の様にして行うことができる。菌体からの抽出法として、超音波破砕、ガラスビーズなどを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理が挙げられる。さらに抽出液については、硫安などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノメチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。このようにして得られたカタラーゼは通常、比活性１６ｋＵ／Ａ２８０以上で得ることができる。
【００２１】
本発明のカタラーゼの用途
本発明のカタラーゼは、種々の生体内物質を酵素反応により定量する際に有用である。その測定原理としては、特に限定されるものではないが、測定対象物質が含まれているか、もしくは測定対象物質が含まれていると考えられる試料を用いて、少なくとも１種の酵素による反応を行った後、発色反応を行うことにより生体内に含まれる物質を比色測定する方法において、一般的には、測定対象成分以外の生体内成分に由来する過酸化水素をカタラーゼで分解することにより、対象成分の正確な定量を実現するために用いられる。このような原理を用いた、本発明の生体成分測定用試薬キットは、本発明のカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびペルオキシダーゼ以外の１種以上の酵素、緩衝剤および色原体を少なくとも含有する。
このようなカタラーゼの利用法は、いわゆる「消去系」として当技術分野で汎用される方法であり、種々の公知技術が存在する。さらにその具体的な態様を以下に例示する。
【００２２】
［トリグリセリドの測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中のトリグリセリドを測定するに当たり、体液中に含まれるグリセリンにグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、グリセリンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グルセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、トリグリセリドからグリセリンを生成させ、グリセリンからグリセロール−３−リン酸を生成させ、グリセロール−３−リン酸から過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のトリグリセリド測定法である。
【００２３】
上記方法に使用する試薬としては、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グルセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のトリグリセリド測定試薬がある。
【００２４】
［クレアチニンの測定］
また、本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する別な実施態様は、体液中のクレアチニンを測定するに当たり、体液中に含まれるクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、クレアチンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のクレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、クレアチニンからクレアチンを生成させ、クレアチンからザルコシンを生成させ、ザルコシンから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のクレアチニンの測定法である。
【００２５】
上記方法に使用する試薬としては、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびクレアチニンアミジノヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のクレアチニンの測定試薬がある。
【００２６】
［コレステロールエステルの測定］
さらに、本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中のコレステロールエステルを測定するに当たり、体液中に含まれるコレステロールにコレステロールオキシダーゼ、およびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、コレステロールから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のコレステロールエステルにリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、コレステロールエステルからコレステロールを生成させ、コレステロールから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のコレステロールエステルの測定法である。
【００２７】
上記方法に使用する試薬としては、コレステロールにコレステロールオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のコレステロールエステルの測定試薬がある。
【００２８】
［リン脂質の測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する別な実施態様は、体液中のリン脂質を測定するに当たり、体液中に含まれるコリンにコリンオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、コリンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のリン脂質にホスフォリパーゼ  Ｄ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、リン脂質からコリンを生成させ、コリンから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のリン脂質の測定法である。
【００２９】
上記方法に使用する試薬としては、コリンオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびホスフォリパーゼ  Ｄ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のリン脂質の測定試薬がある。
【００３０】
［無機リンの測定］
また、本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中の無機リンを測定するに当たり、体液中に含まれるヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、ヒポキンチンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中の無機リンにイノシンおよびプリンヌクレオチドフォスフォリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、無機リンからヒポキサンチンを生成させ、ヒポキサンチンから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中の無機リンの測定法である。
【００３１】
上記方法に使用する試薬としては、キサンチンオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびイノシンおよびプリンヌクレオチドフォフォリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中の無機リンの測定試薬がある。
【００３２】
［ＧＰＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する別な実施態様は、体液中のＧＰＴを測定するに当たり、体液中に含まれるピルビン酸にピルビン酸オキシダーゼ、およびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、ピルビン酸から生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のＧＰＴにＬ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、ＧＰＴからピルビン酸を生成させ、ピルビン酸から過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のＧＰＴの測定法である。
【００３３】
上記方法に使用する試薬としては、ピルビン酸オキシダーゼ、およびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびＬ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなるＧＰＴの測定試薬がある。
【００３４】
［αアミラーゼの測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中のα−アミラーゼを測定するに当たり、体液中のグルコースにグルコースオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、グルコースから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のα−アミラーゼにアミラーゼ基質、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、α−アミラーゼからグルコースを生成させ、グルコースから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のα−アミラーゼ測定法である。
【００３５】
上記方法に使用する試薬としては、グルコースオキシダーゼおよびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを含む第１試薬およびα−アミラーゼ基質、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のα−アミラーゼ測定試薬がある。基質としては、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘプタオースなどのオリゴ糖やそれらの非還元末端修飾オリゴ糖などがある。
【００３６】
本発明における試料としては、尿、血清、唾液、膵液などの体液がある。また、分析対象物としては、その試料中に対象物以外の物質に起因して過酸化水素を発生するものを含有するものであれば、何でも適用可能である。例えばクレアチニン、トリグリセリド、無機リンが代表的であるが、他にクレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α−アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアナーゼ、リン脂質などを挙げることができる。
【００３７】
本発明に用いる妨害物質に作用して過酸化水素を生成する酵素としては、例えばコレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼなどがある。
【００３８】
本発明において妨害物質に由来する物質とは、妨害物質に酵素または基質および他の物質を作用させて生成する物質であって、該物質は該物質に作用する酵素によって過酸化水素を生成するものである。例えばグリセロール−３−リン酸、ザルコシン、キサンチンなどが挙げられる。
【００３９】
本発明において妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素としては、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、グリセロールオキシダーゼなどがあり、過酸化水素を発生する酸化酵素であれば、いかなる起源のものでも良い。
【００４０】
本発明に使用する測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素としては、グリロキナーゼ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホスフォリパーゼＤ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、プリンヌクレオチドフォスフォリラーゼなどが挙げられる。
【００４１】
本発明に使用するペルオキシダーゼとしては、西洋ワサビをはじめとする植物や各種微生物由来のものがある。
【００４２】
本発明に使用する色原体としては、過酸化水素により分光学的に吸収の変化を生じさせるものであればいかなるものでもよい。ペルオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体、４−アミノアンチピリンとフェノール誘導体、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンとアニリン誘導体または４−アミノアンチピリン単独、アニリン誘導体単独、フェノール誘導体単独が考えられる。アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−スルホプロピル−３，５−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジンなどがある。フェノール誘導体としては、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，３，４−トリクロロフェノールなどがある。
【００４３】
本発明では、まず、体液中の測定成分を測定するに当たり、体液中に含まれる妨害物質に、該妨害物質に作用して過酸化水素を生成する酵素およびアルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼを作用させて、または該妨害物質から他の物質を誘導し、該物質に作用して過酸化水素を生成する酵素および該カタラーゼを作用させて、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から生成した過酸化水素を消去する。次いで、体液中の測定成分に、該測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む試薬を作用させて、体液中の測定成分から妨害物質を生成させ、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定する。
【００４４】
過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定する方法としては、生成したキノン色素の測定に、通常５４０〜６５０ｎｍの波長の吸光度測定で行う。測定法としては、エンド法もしくはレート法で行う。
【００４５】
本発明の測定試薬は通常、２試薬系から成り、色原体が４−アミノアンチピリンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾリルノンヒドラジン等とアニリン誘導体またはフェノール誘導体から構成されている場合、その内の１種、好ましくはアニリン誘導体またはフェノール誘導体は、必ず第２試薬に含まれなければならないが、他の１種は第１試薬または第２試薬のどちらかに含まれていても良い。
【００４６】
本発明において２試薬系の場合には、第１試薬および第２試薬には前記成分に加えてペルオキシダーゼ、緩衝液および必要により測定成分に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼ以外の酵素、これらの酵素の基質、界面活性剤、安定化剤、各種妨害物質等を含んでいても良い。ペルオキシダーゼは第１、第２試薬どちらに含まれても良いが、好ましくは第１試薬の方が良い。
【００４７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
カタラーゼの活性測定法
実施例中、カタラーゼの活性測定は、寺西らの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８，１２１３（１９７４））を改良して以下のようにして行なった。
【００４８】
まず、試験管に０．２５ｍｌの基質溶液（１６ｍＭ  Ｈ２Ｏ２となるように１０ｍＭ  リン酸緩衝液；ｐＨ７．０で希釈したもの）を取り、２５℃で約５分間予備加温する。次いで酵素溶液０．２５ｍｌを加え反応を開始し、２５℃で正確に５分間反応させた後、チタン溶液（１ｇの酸化チタンと１０ｇの硫酸カリウムを１５０ｍｌの濃硫酸に溶解し、１８０〜２２０℃で２〜３時間加温した後、蒸留水で１．５Ｌに希釈したもの）２．５ｍｌを加えて反応を停止する。この反応停止液の４１０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。一方、盲検は酵素液の代わりに酵素希釈液（０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液；ｐＨ７．４）を添加し、上記と同様の方法にて吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より分解された過酸化水素量を算出し、カタラーゼ活性を算出した。上記条件で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
【００４９】
【数１】
2010193821.tif 000003
【００５０】
カタラーゼの有するペルオキシダーゼ様活性の測定方法
また、カタラーゼの有するペルオキシダーゼ様活性の測定は、以下の方法により実施した。蒸留水１４ｍｌ、５％  ピロガロール水溶液２ｍｌ、０．１４７Ｍ  過酸化水素水１ｍｌ及び１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍｌを加え、酵素反応を開始した。２０秒間反応を行った後、２Ｎ  硫酸水溶液１ｍｌを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍｌにて５回抽出した。抽出液を合わせた後、全量１００ｍｌとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、盲検は蒸留水１４ｍｌ、５％  ピロガロール水溶液２ｍｌ、０．１４７Ｍ  過酸化水素水１ｍｌ及び１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を順次混合した後、２Ｎ  硫酸水溶液１ｍｌを加えて混和し、酵素液次いでサンプル溶液１ｍｌを加えて調製する。この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出した。上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
【００５１】
【数２】
2010193821.tif 000004
【実施例１】
【００５２】
アルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号株からのカタラーゼの精製
アルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号株を、をＬＢ（１％  ポリペプトン，０．５％  酵母エキス，１％  ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）寒天培地にて培養した後、滅菌した５０ｍｌの種培地（１．６％  ポリペプトン，０．２％  酵母エキス，０．５％，肉エキス，０．２２％  リン酸１カリウム，０．５８％  リン酸２カリウム，０．１％  硫酸マグネシウム，４．４％  塩化コリン）に一白金耳を植菌し、３０℃で２４時間培養をした。次に、この培養液を滅菌した本生産培地（１．６％  ポリペプトン，０．２％  酵母エキス，２．５％，肉エキス，０．２２％  リン酸１カリウム，０．５８％  リン酸２カリウム，０．１％  硫酸マグネシウム，４．４％  塩化コリン，０．０８％  アデカノール）に全量植菌して、３０℃にて３０〜４０時間通気・攪拌培養し、カタラーゼ活性の生産量の増加が停止した時点で培養を終了し、遠心分離により菌体を回収した。この時の生産性は約４，０００Ｕ／ｍｌ−ｂであった。回収された菌体は５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、以後の精製に供した。
【００５３】
回収した菌体からの精製は、以下の通りに実施した。上記菌体懸濁液をダイノミル破砕し、遠心分離により上清液を回収した。選られた粗酵素抽出液にポリエチレンイミン溶液を添加して除核酸処理を行ない遠心分離して上清液を回収した。得られた上清液を硫安分画した後、セファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）ゲル濾過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィーにより精製し、２回目の硫安分画、２回目のセファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）ゲル濾過を実施して、精製酵素標品を得た。該方法により得られたカタラーゼ標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示し、この時の比活性は約１８，０００Ｕ／Ａ２８０であった。また、得られたカタラーゼ標品は同一サブユニットから構成される四量体であり、サブユニットの分子量をマススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析）にて測定したところ、５３４００であった。
【実施例２】
【００５４】
実施例１で得られたカタラーゼの酵素特性の取得
先に記載したカタラーゼ活性の測定方法を用いて、実施例１で得られたカタラーゼの至適温度（図１）と、ｐＨ反応性（図２）を定法により調べた。
また、実施例１で得られたカタラーゼの熱安定性（図３）は、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液，（ｐＨ７．０）にて２００Ｕ／ｍｌに希釈した精製酵素溶液を各温度で３０分処理した後に、その残存活性を測定することにより調べた。同様に、ｐＨ安定性（図４）は、各ｐＨの１０ｍＭ緩衝液にて２５℃，２００Ｕ／ｍｌに希釈した精製酵素溶液を１７時間処理した後の残存活性を測定することにより調べた。
カタラーゼの至適温度は、上記試験において相対活性が９５％以上である温度範囲として定義でき、図１においては少なくとも３５〜４０℃の範囲であれば至適であると判断できる。
カタラーゼの至適ｐＨは、上記試験において相対活性が９５％以上であるｐＨ範囲として定義でき、図２においては少なくともｐＨ７.２〜９.０の範囲であれば至適であると判断できる。
カタラーゼの熱安定性については、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液，（ｐＨ７．０）にて２００Ｕ／ｍｌに希釈した精製酵素溶液を各温度で３０分処理した後の残存活性が９５％以上である温度範囲として定義でき、図３においては、４０℃では９５％以上であるが４５℃では９５％を下回るため、少なくとも４０℃以下では良好な熱安定性を示すと判断できる。
カタラーゼのｐＨ安定性については、各ｐＨの１０ｍＭ緩衝液にて２５℃，２００Ｕ／ｍｌに希釈した精製酵素溶液を１７時間処理した後の残存活性が９０％以上である温度範囲として定義でき、図４においては、測定した各ｐＨにおいて９０％以上であるため、少なくともｐＨ６．２〜８．９では良好なｐＨ安定性を示すと判断できる。
【実施例３】
【００５５】
実施例１で得られたカタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼの保存安定性の比較
アルカリゲネス  ＡＫ−２、工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号  第４１０５号由来のカタラーゼ（以下、ＣＡＯ−５１９と示す。）と、従来から常用されてきた牛の肝臓由来のカタラーゼ（東洋紡績製：ＣＡＯ−５０９）の液状安定性を３７℃保存にて比較した。図５に示すように、牛肝臓由来のカタラーゼは８日間保存において、その残存活性が４６％まで低下していたが、ＣＡＯ−５１９においては、約８０％の活性が維持されており、液状の保存安定性において、明らかな優位性が認められた。さらに、牛肝臓由来のカタラーゼは１４日間保存において、その残存活性が３９％まで低下していたが、ＣＡＯ−５１９においては、約７８％の活性が維持されていた。
【００５６】
【表１】
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【実施例４】
【００５７】
実施例１で得られたカタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼのペルオキシダーゼ型活性の比較
先に記載したカタラーゼ（ＣＡＯ）とペルオキシダーゼ（ＰＥＯ）の活性測定方法を用いて、実施例１で得られたカタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼのペルオキシダーゼ様活性の存在比を比較した。表２に示す通り、実施例１で得られたカタラーゼのペルオキシダーゼ様活性は、汎用されてきた牛肝臓由来のカタラーゼと比べて、１／３以下の割合であった。酵素の持っているペルオキシダーゼ活性をカタラーゼ活性で割った値は、牛肝臓由来カタラーゼが４．８×１０−１０であったのに対し、実施例１で得られたカタラーゼは１．５×１０−１０であり、４×１０−１０(４×１０−８％）を下回った。本発明におけるカタラーゼは、体外診断薬の検出系で使用されるペルオキシダーゼ本来の反応に対する影響をより低減するものであり、牛肝臓由来のカタラーゼよりも体外診断薬用途に相応しいものであると考えられる。
【００５８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
現在、体外臨床診断薬は、その大半が溶液状態で製品化・流通・保存されており、本発明のカタラーゼは、保存安定性・反応性に優れた体外診断薬を提供するうえで特に有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2010193821.tif 000011
【配列表】
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