(57)【要約】  【課題】  臍帯血由来の造血幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記造血幹細胞の増殖および分化を制御する方法を提供する。  【解決手段】  超音波処理した臍帯血の液性成分を含有する培地に前記造血幹細胞を接種する。このように前記超音波処理した臍帯血の液性成分の存在下であれば、臍帯血造血幹細胞の増殖および分化を抑制できる。他方、超音波処理していない臍帯血の液性成分を含有する培地に前記造血幹細胞を接種することによって、反対に、臍帯血造血幹細胞の増殖を促進できる。このように、本発明によれば、臍帯血由来の血清を用いることで、臍帯血造血幹細胞の増殖・分化の抑制と増殖の促進とを、任意に調節可能である。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血造血幹細胞の増殖を制御する方法であって、
下記（Ｘ）工程を有することを特徴とする制御方法。
（Ｘ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する工程
【請求項２】
さらに、下記（Ｙ）工程を有する、請求項１記載の制御方法。
（Ｙ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖を促進する工程
【請求項３】
前記（Ｘ）工程において、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制した後、
前記（Ｙ）工程において、前記（Ｘ）工程により抑制した前記造血幹細胞の増殖を促進する、請求項２記載の制御方法。
【請求項４】
前記（Ｙ）工程において、前記造血幹細胞の増殖を促進した後、
前記（Ｘ）工程において、前記（Ｙ）工程により増殖した前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する、請求項２または３記載の制御方法。
【請求項５】
前記造血幹細胞および前記液性成分が、同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞および液性成分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の制御方法。
【請求項６】
前記個体が、哺乳類である、請求項５記載の制御方法。
【請求項７】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項６記載の制御方法。
【請求項８】
臍帯血造血幹細胞の製造方法であって、
請求項１から７のいずれか一項に記載の制御方法により、前記造血幹細胞の増殖を制御する工程を有することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
前記造血幹細胞を増殖させる所望の時期まで、前記造血幹細胞を、前記超音波処理した臍帯血の液性成分を含む培地で培養することにより、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記造血幹細胞を増殖させた後、前記造血幹細胞を使用する所望の時期まで、前記増殖させた造血幹細胞を、前記超音波処理した臍帯血の液性成分を含む培地で培養することにより、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する、請求項８または９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記造血幹細胞を、超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む培地で培養することにより、前記造血幹細胞の増殖を促進する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか一項に記載の臍帯血造血幹細胞の増殖の制御方法に使用するための増殖制御剤であり、
下記（ａ）の増殖抑制剤を含むことを特徴とする増殖制御剤。
（ａ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制するための増殖抑制剤
【請求項１３】
さらに、下記（ｂ）の増殖促進剤を含む、請求項１２記載の増殖制御剤。
（ｂ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖を促進するための増殖促進剤
【請求項１４】
請求項１から７のいずれか一項に記載の臍帯血造血幹細胞の増殖の制御方法に使用するための増殖制御キットであり、
下記（ａ）の増殖抑制剤を含むことを特徴とする増殖制御キット。
（ａ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制するための増殖抑制剤
【請求項１５】
さらに、下記（ｂ）の増殖促進剤を含む、請求項１４記載の増殖制御キット。
（ｂ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖を促進するための増殖促進剤
【請求項１６】
前記増殖抑制剤の液性成分と前記増殖促進剤の液性成分とが、同一個体の臍帯血由来の液性成分である、請求項１５記載の増殖制御キット。
【請求項１７】
前記液性成分と同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞の増殖を制御するためのキットである、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の増殖制御キット。
【請求項１８】
前記個体が、哺乳類である、請求項１６または１７記載の増殖制御キット。
【請求項１９】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項１８記載の増殖制御キット。
【請求項２０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の臍帯血造血幹細胞の増殖の制御方法に使用する、臍帯血造血幹細胞、超音波処理した臍帯血の液性成分および超音波処理していない臍帯血の液性成分を、同一の臍帯血から調製するための臍帯血成分調製装置であって、
臍帯血を貯留する貯留部、
赤血球を収容する赤血球収容部、
造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１および第２の血清収容部を有し、
前記貯留部は、前記赤血球収容部、前記造血幹細胞収容部、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記貯留部は、赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記赤血球収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を、導入可能であり、
前記造血幹細胞収容部は、前記貯留部において前記赤血球沈降後の上清から沈降した造血幹細胞を導入可能であり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記貯留部における前記赤血球および造血幹細胞沈降後の上清をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であることを特徴とする臍帯血成分調製装置。
【請求項２１】
請求項１から７のいずれか一項に記載の臍帯血造血幹細胞の増殖の制御方法に使用する、臍帯血造血幹細胞、超音波処理した臍帯血の液性成分および超音波処理していない臍帯血の液性成分を、同一の臍帯血から調製するための臍帯血成分調製装置であって、
臍帯血を貯留する貯留部、
造血幹細胞を含む血漿を収容する細胞含有血漿収容部、
造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１および第２の血清収容部を有し、
前記貯留部は、前記細胞含有血漿収容部と連結され、
前記細胞含有血漿収容部は、前記造血幹細胞収容部、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記貯留部は、赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記細胞含有血漿収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を含む沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を前記造血幹細胞を含む血漿として導入可能であり、
前記造血幹細胞収容部は、前記細胞含有血漿収容部において前記造血幹細胞含有血漿から沈降した造血幹細胞を導入可能であり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記細胞含有血漿収容部における前記造血幹細胞除去後の上清をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であることを特徴とする臍帯血成分調製装置。
【請求項２２】
請求項１から７のいずれか一項に記載の臍帯血造血幹細胞の増殖の制御方法に使用する、臍帯血造血幹細胞、超音波処理した臍帯血の液性成分および超音波処理していない臍帯血の液性成分を、同一の臍帯血から調製するための臍帯血成分調製装置であって、
臍帯血を貯留する貯留部、
造血幹細胞を含む血漿を収容する細胞含有血漿収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１および第２の血清収容部を有し、
前記貯留部は、前記細胞含有血漿収容部と連結され、
前記細胞含有血漿収容部は、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記貯留部は、赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記細胞含有血漿収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を含む沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を、前記造血幹細胞を含む血漿画分として導入可能であり、さらに、導入された前記血漿画分を造血幹細胞を含む沈降画分と上清画分とに分離した後、前記沈降画分を有する下領域と前記上清画分を有する上領域とを隔離可能であり、
前記細胞含有血漿収容部の下領域は、造血幹細胞の収容部となり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記細胞含有血漿収容部の上領域における前記上清画分をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清画分として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であることを特徴とする臍帯血成分調製装置。
【請求項２３】
請求項１から７のいずれか一項に記載の臍帯血造血幹細胞の増殖の制御方法に使用する、臍帯血造血幹細胞、超音波処理した臍帯血の液性成分および超音波処理していない臍帯血の液性成分を、同一の臍帯血から調製するための臍帯血成分調製装置であって、
臍帯血を貯留する第１および第２の貯留部、
赤血球を収容する赤血球収容部、
造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１、第２および第３の血清収容部を有し、
前記第１貯留部は、前記赤血球収容部、前記造血幹細胞収容部、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記第１の貯留部は、抗凝固剤および赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記赤血球収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を、導入可能であり、
前記造血幹細胞収容部は、前記貯留部において前記赤血球沈降後の上清から沈降した造血幹細胞を導入可能であり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記貯留部における前記赤血球および造血幹細胞沈降後の上清をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であり、
前記第２の貯留部は、血液凝固を促進する血液凝固促進個体を導入可能であり、
前記第３の血清収容部は、前記貯留部において血液凝固後に得られる上清画分を導入可能であることを特徴とする臍帯血成分調製装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯血由来の造血幹細胞の増殖を制御する方法およびその用途に関し、より詳細には、さらに、前記造血幹細胞の製造方法、およびそれに用いる増殖制御剤、増殖制御キットならびに臍帯血成分調製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、白血球、赤血球、血小板等の全ての血球系細胞に分化可能な自己再生能を持つ多能性幹細胞であり、骨髄液、末梢血、臍帯血中に存在する。そして、造血幹細胞を体内に移植する造血幹細胞移植は、白血病等の難治性血液疾患の治療方法として有用であることが知られている。治療には、一般に、骨髄液または末梢血の造血幹細胞が使用されているが、採取にあたってドナーに大きな負担がかかるという問題がある。これに対して、臍帯血は、出産時に副次的に得られることから、ドナーの負担が少なく、また、移植適合性に優れることからも、造血幹細胞の供給源として注目されている。
【０００３】
しかしながら、ドナーから得られる臍帯血は、骨髄液や末梢血と比較すると少量であり、移植に必要な細胞数が得られない場合がある。そこで、臍帯血由来の造血幹細胞を移植に使用するため、前記造血幹細胞を培養により増殖する方法が開発されている。具体的な方法として、増殖を促進するため、前記造血幹細胞を、間葉系幹細胞または異種動物由来の支持細胞等と共に培養する方法が報告されている（特許文献１および特許文献２）。さらに、前記造血幹細胞の培養は、例えば、所望の時期まで増殖を抑制したり、分化を抑制することが望まれる。このため、例えば、分化抑制遺伝子を組み込んだウイルスベクターを、前記造血幹細胞に導入する方法等が報告されている（特許文献３）。しかしながら、ウイルスベクターを導入する方法は、例えば、他の遺伝子発現への影響が懸念されており、安全性が不十分であるおそれがある。また、操作が煩雑であり、コストもかかるという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−６１１０６号公報
【特許文献２】特開２００７−２０２５０６号公報
【特許文献３】特開平１１−１２７８５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、臍帯血由来の造血幹細胞を培養により増殖するにあたって、優れた安全性で、前記造血幹細胞の増殖および分化を制御する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の制御方法は、臍帯血造血幹細胞の増殖を制御する方法であって、下記（Ｘ）工程を有することを特徴とする。
（Ｘ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する工程
【０００７】
本発明の製造方法は、臍帯血造血幹細胞の製造方法であって、本発明の制御方法により、前記造血幹細胞の増殖を制御する工程を有することを特徴とする。
【０００８】
本発明の増殖制御剤は、本発明の制御方法に使用するための増殖制御剤であり、下記（ａ）の増殖抑制剤であることを特徴とする。
（ａ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制するための増殖抑制剤
【０００９】
本発明の増殖制御キットは、本発明の制御方法に使用するための増殖制御キットであり、前記（ａ）の増殖抑制剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、例えば、前述のように、安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、前記臍帯血由来の液性成分を用いることで、臍帯血造血幹細胞の増殖および分化を制御できる。具体的には、超音波処理した臍帯血の液性成分を使用するのみで、前記増殖および分化を抑制できる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で増殖および分化を調節できる。特に、臍帯血の液性成分であることから、例えば、造血幹細胞と同じ個体の臍帯血由来の液性成分を使用できる。したがって、より有効な臍帯血の利用が可能であり、また、同一個体の成分を併用できることから、安全性に対する信頼性も向上できる。このように、本発明は、臍帯血造血幹細胞の増殖および分化を抑制できることから、例えば、前記造血幹細胞を目的地まで輸送する際や、増殖を行う所望の時期まで前記造血幹細胞を保存する際等に有用であり、再生医療の分野において、より一層、臍帯血造血幹細胞の有効利用を促進できる方法といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の臍帯血成分調製装置の一例の概略を示す平面図である。
【図２】図２は、本発明の他の臍帯血成分調製装置の一例の概略を示す平面図である。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の臍帯血成分調製装置の一例の概略を示す平面図である。
【図４】図４は、本発明の臍帯血成分調製装置における細胞含有血漿収容部の使用方法の一例を示す斜視図である。
【図５】図５は、本発明の臍帯血成分調製装置における、さらにその他の細胞含有血漿収容部の一例を示す平面図である。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の臍帯血成分調製装置の一例の概略を示す平面図である。
【図７】図７は、実施例１において、血清存在下で臍帯血造血幹細胞を培養した際の造血幹細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜増殖制御方法＞
本発明の制御方法は、前述のように、臍帯血造血幹細胞の増殖を制御する方法であって、下記（Ｘ）工程を有することを特徴とする。
（Ｘ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する工程
【００１３】
本発明において、前記超音波処理した臍帯血の液性成分を、以下、「処理済み液性成分」ともいう。血液は、一般に、液性成分（液性画分）と細胞成分（細胞画分）とに大別でき、前記液性成分は、例えば、血清または血漿であり、前記細胞成分は、例えば、血球成分（血球画分）であり、赤血球、白血球および血小板があげられる。本発明において、前記液性成分は、例えば、血清でもよいし、血漿でもよい。本発明においては、前記培地が前記液性成分を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記培地に含まれる臍帯血の液性成分は、例えば、さらに、前記細胞成分、血液凝固因子等の臍帯血由来の成分を含んでもよいが、好ましくは、前記細胞成分が除去された液性成分、前記血液凝固因子が除去された液性成分、前記細胞成分および前記血液凝固因子が除去された液性成分が好ましい。なお、前記細胞成分の除去および血液凝固因子の除去とは、臍帯血から完全にこれらを除去することには限定されない。前記血液凝固因子とは、例えば、フィブリノゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（II因子）等である。
【００１４】
本発明において、超音波処理する臍帯血は、特に制限されず、例えば、臍帯血そのものでもよいし、液性成分であってもよい。超音波処理前の液性成分を、以下、「処理前液性成分」ともいう。前記液性成分としては、例えば、血漿または血清があげられる。「血漿」とは、一般に、血液から前記血球を除いた液体画分であり、「血清」とは、一般に、血液から、前記血球と数種の血液凝固因子を除いた液体画分である。前記液性成分に超音波処理を施す場合、前記液性成分は、例えば、臍帯血から、前記血球成分を除いた液体画分、前記血液凝固因子を除いた液体画分、前記血球成分および前記血液凝固因子を除いた液体画分のいずれでもよいが、例えば、前記血球成分を除いた液体画分が好ましい。また、前記液性成分を超音波処理する場合、前記液性成分は、例えば、血小板を含んでもよく、前記血小板を含む血漿としては、いわゆる多血小板血漿（Platelet-Rich-Plasma）等があげられる。
【００１５】
本発明において、前記処理済み液性成分は、例えば、臍帯血そのものに超音波処理した後、液性成分を回収することにより調製してもよいし、臍帯血から液性成分を回収し、これに超音波処理して調製してもよい。また、前記臍帯血から液性成分を回収する際、例えば、血球の他に、フィブリノゲン等の血液凝固因子も除去することが好ましい。
【００１６】
本発明において、前記臍帯血の液性成分（処理済み液性成分）は、例えば、超音波処理した臍帯血血漿から得られる血清（処理済み血清）であることが好ましい。
【００１７】
本発明は、さらに、下記（Ｙ）工程を有してもよい。
（Ｙ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖を促進する工程
【００１８】
前記超音波処理していない臍帯血の液性成分を、以下、「非処理の液性成分」という。非処理の液性成分も、前述の処理済み液性成分と同様に、例えば、血漿および血清等があげられる。
【００１９】
本発明において、増殖および分化を抑制する（Ｘ）工程と、増殖を促進する（Ｙ）工程とは、例えば、いずれを先に行ってもよい。第一の形態としては、例えば、まず、前記（Ｘ）工程において、前記処理済み液性成分を用いて、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制した後、前記（Ｙ）工程において、前記非処理の液性成分を用いて、前記（Ｘ）工程により抑制した前記造血幹細胞の増殖を促進する方法があげられる。この形態によれば、所望の時期まで前記造血幹細胞の増殖ならびに分化を抑制し、所望の時期に前記造血幹細胞の増殖を開始することができる。つまり、前記造血幹細胞の増殖のＯＮ−ＯＦＦを、使用する血清を変更するのみで容易に抑制できる。
【００２０】
また、第二の形態としては、例えば、まず、前記（Ｙ）工程において、前記非処理の液性成分を用いて、前記造血幹細胞の増殖を促進した後、前記（Ｘ）工程において、前記処理済み液性成分を用いて、前記（Ｙ）工程により増殖した前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する方法があげられる。この形態によれば、増殖させた前記造血幹細胞について、所望の時期まで、さらなる増殖や分化を防止して、保存できる。
【００２１】
本発明において、制御目的とする造血幹細胞は、臍帯血由来であり、増殖を制御するための血清も臍帯血由来である。このため、本発明においては、例えば、同一個体由来の臍帯血造血幹細胞と臍帯血液性成分とを使用できる。具体的には、同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞と処理済み液性成分とを用いて、増殖および分化を抑制でき、さらに、同一個体の臍帯血由来の非処理の液性成分を用いて、増殖を促進することもできる。このため、臍帯血成分のうち、造血幹細胞だけでなく、その増殖を制御するために液性成分をも使用でき、臍帯血をより一層有効に利用できる。
【００２２】
前記個体としては、特に制限されないが、例えば、ヒトや、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く、霊長類等の哺乳類等があげられる。
【００２３】
本発明において、造血幹細胞の調製方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用でき、以下に一例を示すが、これには制限されない。まず、臍帯血中の赤血球を沈降させて、上清画分を回収する。臍帯血は、胎盤および臍帯に含まれる血液であって、通常、病院において、娩出時および娩出後に胎盤および臍帯から、抗凝固剤を含む採血バッグ内に採取される。前記抗凝固剤を含む臍帯血に、赤血球を分離するための、赤血球沈降剤を添加する。前記赤血球沈降剤としては、例えば、ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｅｔｈｙｌ  Ｓｔａｒｃｈ）等があげられる。前記赤血球沈降剤の添加量は、特に制限されないが、例えば、１〜５０ｍｇ／ｍＬとなるように臍帯血に添加することが好ましい。前記赤血球沈降剤を添加した臍帯血を静置することによって、赤血球を含む画分と、造血幹細胞を含む上清画分とに分離される。分離の条件は、特に制限されないが、例えば、温度が、１５〜２５℃である。なお、例えば、前記臍帯血が予め前記赤血球沈降剤を含む場合、前記赤血球沈降剤は添加しなくてもよい（以下、同様）。
【００２４】
つぎに、前記上清画分を遠心分離して、造血幹細胞を含む沈降画分と、液体画分（上清画分）とに分離する。遠心分離の条件は、特に制限されないが、例えば、遠心加速度１０７８０〜４３１２０ｍ／ｓ２（１１００〜４４００×ｇ）、温度２〜３７℃、時間４〜３０分である。なお、前述のように、本発明では、同一個体由来の造血幹細胞と液性画分とを使用することが好ましい。このため、遠心分離後の前記液体画分は、後述するように、前記液性成分の調製に使用することが好ましい。前記遠心分離後の前記液体画分は、例えば、血漿を含む画分（血漿画分）でもよいし、血清を含む画分（血清画分）でもよい。また、前記遠心分離後の前記液体画分は、例えば、前述のように、さらに、血小板を含んでもよい。前述のように、前記液性成分は、例えば、血小板を含む液性成分から調製してもよいことから、前記沈降画分を回収する際、例えば、遠心分離後の前記液体画分に血小板が含まれるような条件で遠心分離してもよい。この条件は、特に制限されず、例えば、従来公知の多血小板血漿の回収方法に従って行うことができ、具体的には、例えば、遠心加速度２９４０〜１１７６０ｍ／ｓ２（３００〜１２００×ｇ）、温度１〜２０℃、時間３〜６分である。
【００２５】
続いて、前記沈降画分から、造血幹細胞の純化を行う。具体的には、まず、前記沈降画分に抗ＣＤ３４抗体を固定化した磁気ビーズを添加し、造血幹細胞のＣＤ３４と前記磁気ビーズの抗ＣＤ３４抗体とを反応させる。この抗原抗体反応を介して、前記磁気ビーズに前記造血幹細胞を結合させる。続いて、前記磁気ビーズを添加した沈降画分を磁気カラムにアプライし、磁気によって、前記磁気ビーズを前記カラム内にトラップし、前記沈降画分中の不要成分を除去する。このようにして、純化した造血幹細胞を調製できる。
【００２６】
本発明において、臍帯血由来の処理済み液性成分の調製方法は、特に制限されない。なお、本発明においては、同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞と液性成分とを使用することが好ましいため、以下に、一例として、前述した造血幹細胞の調製とあわせて液性成分を調製する方法を説明する。
【００２７】
まず、前述のようにして、造血幹細胞を含む沈降画分と、液体画分（上清画分）とに分離する。前記液体画分は、例えば、前述のように、前記血漿画分でもよいし、血清画分であってもよい。そして、前記液体画分に超音波処理を施す。超音波処理の方法としては、特に制限されないが、例えば、以下のような方法があげられる。超音波処理の条件は、特に制限されないが、例えば、その対象物に対する超音波を音圧計にて測定したとき、５ｍＶ以上の音圧が得られる条件下、周波数を、例えば、２８〜１００ｋＨｚ、超音波発生装置からの距離を、例えば、５〜３０ｃｍ、処理時間を、例えば、５分間〜６０分間、好ましくは１０分間〜３０分間として、超音波処理を行う。また、本発明において、超音波は、例えば、通常の超音波発生装置を用いて発生させることができる。このようにして、前記処理済み液性成分が得られる。
【００２８】
また、前記液体画分が、例えば、フィブリノゲン等の血液凝固因子を含む場合、例えば、さらに、前記液体画分から、前記血液凝固因子を除去し、前記除去後の液体画分を、前記処理済み液性成分とすることもできる。具体的には、前記液体画分が、例えば、前記血液凝固因子を含む血漿画分である場合、前記血液凝固因子を除去して、血清を回収し、これを前記処理済み液性画分として使用することが好ましい。前記血液凝固因子の除去は、例えば、超音波処理の前に行ってもよいし、超音波処理の後に行ってもよい。前記血液凝固因子の除去方法としては、特に制限されないが、例えば、フィブリノゲン等の血液凝固因子を変性させ、不溶性画分として除去する方法があげられる。具体例としては、例えば、フィブリノゲンの変性によりフィブリンを形成させて、不溶性画分として除去する方法があげられる。前記変性方法は、特に制限されないが、例えば、熱変性があげられ、具体的には、前記液体画分に加熱処理を施す方法があげられる。加熱条件は、特に制限されないが、例えば、加熱温度は、５０〜６０℃が好ましく、加熱時間は、１０〜１２０分が好ましく、より好ましくは３０〜６０分である。前記不溶性画分の除去は、例えば、加熱処理後の液体画分を、静置、遠心またはフィルターろ過等することによって行える。そして、例えば、静置後の上清画分、遠心後の上清画分、または、フィルターろ過後のろ液を回収することで、前記処理済み液性成分が得られる。なお、静置、遠心またはフィルターろ過等の条件は、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。また、前記液体画分から血液凝固因子を除去する方法としては、この他に、例えば、前記液体画分に対する、塩化カルシウム、トロンビン等の凝固因子の添加等、血液凝固系の活性化機構を利用した方法があげられる。具体的な条件については、何ら制限されず、従来公知の条件が採用できる。
【００２９】
他方、前記非処理の液性成分は、前記超音波処理を行わない以外は、例えば、前述と同様にして調製できる。
【００３０】
本発明において、前記（Ｘ）工程、すなわち、造血幹細胞の増殖および分化を抑制する工程は、前述のように、前記超音波処理した液性成分血清を含む培地に前記造血幹細胞を接種することで行える。以下に、具体例として、前記処理済み液性成分が処理済み血清である一例を示す。なお、本発明は、これには制限されず、例えば、血清以外の処理済み液性成分についても、同様に使用できる。
【００３１】
前記培地としては、前記処理済み血清を含有すればよく、その他の構成や条件は、何ら制限されない。前記培地としては、例えば、臍帯血の造血幹細胞の培養に使用可能な培地があげられ、具体例としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｘ−ＶＩＶＯ培地、ＳＴＥＭ−ＬＩＮＥ培地等が使用できる。前記培地における前記処理済み血清の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜２０ｖ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜１０ｖ／ｖ％であり、より好ましくは２．５〜１０ｖ／ｖ％である。前記培地１ｍＬあたりの造血幹細胞数は、例えば、１０００〜１０万個である。前記培地は、さらに、添加物を含んでもよく、前記添加物としては、例えば、サイトカイン、抗生物質、塩類、ビタミン等があげられる。
【００３２】
前記処理済み血清を含む培地に接種した前記造血幹細胞は、例えば、造血幹細胞を増殖させる際の一般的な培養条件下におくことができる。本発明によれば、前述のように、前記培地は処理済み血清を含有するため、培養によっても、その増殖および分化を抑制することができる。前記培養時の温度としては、例えば、３７℃である。また、前記造血幹細胞は、同じ培地に、例えば、１〜７日程度置くことができ、好ましくは、１〜７日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましい。このように培地の取り換えによって、例えば、１〜７日の間、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制し、さらに、後述する増殖の促進によって、増殖を開始させることもできる。新しい培地への取換え方法は、何ら制限されないが、例えば、前述のように、所定時間ごとに培地交換する方法、新たな培地を連続的または断続的に供給する方法等があげられる。後者の場合、例えば、あわせて、古い培地の一部を連続的または断続的に廃棄することが好ましい。
【００３３】
本発明において、前記（Ｙ）工程、すなわち、造血幹細胞の増殖を促進する工程は、前述のように、前記超音波処理していない血清を含む培地に前記造血幹細胞を接種することで行える。以下に、その具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。
【００３４】
前記培地としては、前記処理済み血清に代えて前記非処理の血清を含有する以外は、前述と同様の培地が使用できる。前記培地における前記非処理の血清の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜２０ｖ／ｖ％であり、好ましくは０．１〜１０ｖ／ｖ％であり、より好ましくは２．５〜１０ｖ／ｖ％である。前記培地１ｍＬあたりの造血幹細胞数は、例えば、１０００〜１０万個である。前記培地は、さらに、前述と同様の添加物を含んでもよく、特に制限されず、前述と同様である。
【００３５】
前記非処理の血清を含む培地に接種した前記造血幹細胞は、例えば、造血幹細胞を増殖させる際の一般的な培養条件下におくことができる。前記培養時の温度としては、例えば、３７℃である。また、前記造血幹細胞は、同じ培地に、例えば、１〜７日程度置くことができ、好ましくは、１〜７日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましい。前記非処理の血清を含む培地で前記造血幹細胞を培養すれば、例えば、７日間の培養により、初期接種数と比べて、細胞数を約２〜１０倍に増加させることができる。
【００３６】
本発明において前記（Ｙ）工程を、例えば、増殖および分化を抑制する前記（Ｘ）工程の後に行う場合、すなわち、所望の時期まで増殖および分化を抑制し、所望の時期から増殖を促進させる場合には、前記処理済み血清を含む培地から、前記非処理の血清を含む培地に、交換すればよい。一方、前記（Ｙ）工程を、例えば、増殖および分化を抑制する前記（Ｘ）工程の前に行う場合、すなわち、造血幹細胞を増殖させ、増殖した造血幹細胞について、所望の時期まで、分化とさらなる増殖とを抑制する場合には、前記非処理の血清を含む培地から、前記処理済み血清を含む培地に、交換すればよい。なお、前記（Ｘ）工程と前記（Ｙ）工程とを繰り返す際には、前述のように、目的に応じて培地を置き換えればよい。
【００３７】
＜製造方法＞
つぎに、本発明の製造方法は、前述のように、臍帯血造血幹細胞の製造方法であって、本発明の制御方法により、臍帯血造血幹細胞の増殖を制御する工程を有することを特徴とする。
【００３８】
本発明は、造血幹細胞の増殖および分化の抑制に、本発明の制御方法を使用することが特徴であり、その他の条件や構成は何ら制限されない。なお、特に示さない限り、本発明の制御方法と同様に行うことができる。
【００３９】
本発明の製造方法は、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する抑制工程として、前記（Ｘ）工程を有し、さらに、前記造血幹細胞の増殖を促進する促進工程を有することが好ましい。前記促進工程は、例えば、血液の液性成分を含む培地に臍帯血造血幹細胞を接種して前記造血幹細胞の増殖を促進する工程であり、好ましくは、前記本発明の制御方法における前記（Ｙ）工程である。
（Ｘ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する工程
（Ｙ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む培地で前記造血幹細胞を培養することにより、前記造血幹細胞の増殖を促進する工程
【００４０】
本発明において、前記促進工程で使用する培地は、特に制限されないが、例えば、液性成分を含む培地が好ましい。前記培地の液性成分としては、特に制限されず、例えば、ヒト臍帯血血清、ウシ胎児血清、ヒト末梢血血清等があげられる。前記液性成分は、例えば、超音波処理していない液性成分が好ましく、より好ましくは、前述の（Ｙ）工程のように、超音波処理していない臍帯血の液性成分であり、特に、造血幹細胞と同じ臍帯血由来の非処理の液性成分が好ましい。
【００４１】
本発明において、前記抑制工程と、前記増殖を促進する工程とは、前記本発明の制御方法と同様に、いずれを先に行ってもよい。第一の形態としては、例えば、まず、造血幹細胞を増殖させる所望の時期まで、前記造血幹細胞を、前記処理済み液性成分を含む培地に接種し、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制し、前記所望の時期に、前記造血幹細胞の増殖を開始する方法があげられる。また、第二の形態としては、例えば、まず、前記造血幹細胞を増殖した後、前記造血幹細胞を使用する所望の時期まで、前記増殖した造血幹細胞を、処理済み液性成分を含む培地に接種し、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制する方法があげられる。なお、増殖および分化の抑制と、増殖の促進は、例えば、前述の本発明の制御方法と同様に、例えば、前記処理済み液性成分を含む培地と、前記非処理の液性成分を含む培地とを、制御の目的に応じて置き換えることで切り替え可能である。
【００４２】
本発明においては、前述の制御方法と同様に、例えば、同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞と液性成分とを使用することが好ましく、具体的には、同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞と処理済み液性成分とを用いて、増殖および分化を抑制し、さらに、同一個体の臍帯血由来の非処理の液性成分を用いて、増殖を促進することが好ましい。前記個体としては、特に制限されないが、例えば、ヒトや、ヒトを除く哺乳類等があげられる。
【００４３】
＜増殖制御剤＞
本発明の増殖制御剤は、本発明の制御方法に使用するための増殖制御剤であり、下記（ａ）の増殖抑制剤を含むことを特徴とする。
（ａ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制するための増殖抑制剤
【００４４】
本発明の増殖制御剤は、前記超音波処理した臍帯血血清を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の増殖制御剤は、例えば、本発明の臍帯血造血幹細胞の製造方法にも使用できる。
【００４５】
本発明の増殖制御剤は、さらに、下記（ｂ）の増殖促進剤を含んでもよい。なお、前記（ａ）の増殖抑制剤と、前記（ｂ）の増殖促進剤とは、抑制と促進という逆の作用を示すことから、例えば、別個に独立した剤として、増殖制御剤に含まれている。
（ｂ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む、造血幹細胞の増殖を促進するための増殖促進剤
【００４６】
本発明の増殖制御剤において、前記増殖抑制剤の液性成分と前記増殖促進剤の液性成分とが、同一個体の臍帯血由来の液性成分であることが好ましい。なお、本発明の増殖制御剤において、前記増殖抑制剤における処理済み液性成分と、前記増殖促進剤における非処理の液性成分は、特に示さない限り、前述と同様である。
【００４７】
＜増殖制御キット＞
本発明の増殖制御キットは、本発明の制御方法に使用するための増殖制御キットであり、下記（ａ）の増殖抑制剤を含むことを特徴とする。
（ａ）超音波処理した臍帯血の液性成分を含む、前記造血幹細胞の増殖および分化を抑制するための増殖抑制剤
【００４８】
本発明の増殖制御キットは、前記増殖抑制剤を含んでいればよく、前記増殖抑制剤は、前記本発明の増殖制御剤と同様である。本発明の増殖制御キットは、例えば、本発明の臍帯血造血幹細胞の製造方法にも使用できる。
【００４９】
本発明の増殖制御キットは、例えば、さらに、下記（ｂ）の増殖促進剤を含んでもよい。前記増殖促進剤を含むことによって、臍帯血造血幹細胞の増殖の促進と、増殖および分化の抑制とを容易に行うことができる。前記増殖促進剤は、前記本発明の増殖制御剤と同様である。
（ｂ）超音波処理していない臍帯血の液性成分を含む、造血幹細胞の増殖を促進するための増殖促進剤
【００５０】
本発明の増殖制御キットにおいて、前記増殖抑制剤と前記増殖促進剤とは、相反する目的で使用することから、別個の容器に収容されていることが好ましい。
【００５１】
＜臍帯血成分調製装置＞
本発明の臍帯血成分調製装置は、本発明の制御方法または本発明の製造方法に使用する、臍帯血造血幹細胞、超音波処理した臍帯血の液性成分および超音波処理していない臍帯血の液性成分を、同一の臍帯血から調製するための臍帯血成分調製装置である。本発明の臍帯血成分調製装置によれば、制御目的の臍帯血造血幹細胞、増殖および分化を抑制するための液性成分、ならびに、増殖を促進するための液性成分を、この装置１つで調製可能である。本発明の第１〜第４の臍帯血成分調製装置を以下に示す。
【００５２】
本発明の第１の臍帯血成分調製装置は、
臍帯血を貯留する貯留部、
赤血球を収容する赤血球収容部、
造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１および第２の血清収容部を有し、
前記貯留部は、前記赤血球収容部、前記造血幹細胞収容部、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記貯留部は、赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記赤血球収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を、導入可能であり、
前記造血幹細胞収容部は、前記貯留部において前記赤血球沈降後の上清から沈降した造血幹細胞を導入可能であり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記貯留部における前記赤血球および造血幹細胞沈降後の上清をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であることを特徴とする。
【００５３】
本発明の第２の臍帯血成分調製装置は、
臍帯血を貯留する貯留部、
造血幹細胞を含む血漿を収容する細胞含有血漿収容部、
造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１および第２の血清収容部を有し、
前記貯留部は、前記細胞含有血漿収容部と連結され、
前記細胞含有血漿収容部は、前記造血幹細胞収容部、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記貯留部は、赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記細胞含有血漿収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を含む沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を前記造血幹細胞を含む血漿として導入可能であり、
前記造血幹細胞収容部は、前記細胞含有血漿収容部において前記造血幹細胞含有血漿から沈降した造血幹細胞を導入可能であり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記細胞含有血漿収容部における前記造血幹細胞除去後の上清をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であることを特徴とする。
【００５４】
本発明の第３の臍帯血成分調製装置は、
臍帯血を貯留する貯留部、
造血幹細胞を含む血漿を収容する細胞含有血漿収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１および第２の血清収容部を有し、
前記貯留部は、前記細胞含有血漿収容部と連結され、
前記細胞含有血漿収容部は、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記貯留部は、赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記細胞含有血漿収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を含む沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を、前記造血幹細胞を含む血漿画分として導入可能であり、さらに、導入された前記血漿画分を造血幹細胞を含む沈降画分と上清画分とに分離した後、前記沈降画分を有する下領域と前記上清画分を有する上領域とを隔離可能であり、
前記細胞含有血漿収容部の下領域は、造血幹細胞の収容部となり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記細胞含有血漿収容部の上領域における前記上清画分をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清画分として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であることを特徴とする。
【００５５】
本発明の第４の臍帯血成分調製装置は、
臍帯血を貯留する第１および第２の貯留部、
赤血球を収容する赤血球収容部、
造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部、
血漿を収容する第１および第２の血漿収容部、および
血清を収容する第１、第２および第３の血清収容部を有し、
前記第１貯留部は、前記赤血球収容部、前記造血幹細胞収容部、第１および第２の血漿収容部とそれぞれ連結され、
前記第１の血漿収容部は前記第１の血清収容部と連結し、
前記第２の血漿収容部は前記第２の血清収容部と連結し、
前記第１の貯留部は、抗凝固剤および赤血球沈降剤を導入可能であり、
前記赤血球収容部は、前記貯留部において臍帯血から沈降した赤血球を、導入可能であり、
前記造血幹細胞収容部は、前記貯留部において前記赤血球沈降後の上清から沈降した造血幹細胞を導入可能であり、
前記第１の血漿収容部および第２の血漿収容部は、前記貯留部における前記赤血球および造血幹細胞沈降後の上清をそれぞれ導入可能であり、
前記第１の血漿収容部は、導入された前記上清への超音波処理およびフィブリン形成処理が可能であり、
前記第１の血清収容部は、前記第１の血漿収容部において前記超音波処理およびフィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理した血清として導入可能であり、
前記第２の血漿収容部は、導入された前記上清へのフィブリン形成処理が可能であり、
前記第２の血清収容部は、前記第２の血漿収容部において前記フィブリン形成処理後の前記上清から得られる沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を超音波処理していない血清として導入可能であり、
前記第２の貯留部は、前記第３の血清収容部と連結し、
前記第２の貯留部は、血液凝固を促進する血液凝固促進個体を導入可能であり、
前記第３の血清収容部は、前記第２の貯留部において血液凝固後に得られる上清画分を導入可能であることを特徴とする。
【００５６】
本発明において、前記貯留部および各種収容部は、それぞれ気密状態で連結されていることが好ましい。これによって、例えば、本発明の装置の内部を無菌状態に維持することが可能となり、例えば、臍帯血の導入以後、一連の操作を外気に触れることなく行うことができる。また、気密状態で連結することにより、例えば、液密状態も維持可能である。
【００５７】
前記貯留部および各種収容部は、例えば、可撓性材料から形成されていることが好ましい。前記可撓性材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリブチレンテレフタレート等のポリオレフィン；軟質ポリ塩化ビニル等のポリ塩化ビニル；ポリビニルアルコール；エチレン−酢酸ビニル共重合樹脂；シリコン;ポリウレタン；ナイロン等の樹脂があげられる。また、本発明の臍帯血成分調製装置は、例えば、衛生面から滅菌処理が可能であることが好ましく、また、後述するように、前記各血漿収容部は、例えば、前記フィブリン形成処理として加熱処理を施す場合がある。このため、前記可撓性材料としては、耐熱性を兼ねることが好ましい。
【００５８】
第１の血漿収容部および第２の血漿収容部における前記フィブリン形成処理としては、特に制限されないが、例えば、前記血漿収容部への加熱処理や、前記血漿収容部への血液凝固用試薬の導入処理があげられる。前者の場合、各血漿収容部は、例えば、導入された前記上清への加熱処理が可能であり、後者の場合、例えば、前記血液凝固用試薬が導入可能であればよい。前記血液凝固用試薬は、例えば、予め、各血漿収容部に収容されてもよいし、使用時に外部より導入されてもよい。なお、本発明の第１および第２の血漿収容部における前記フィブリン形成処理は、例えば、加熱処理であることが好ましい。
【００５９】
前記貯留部および各種収容部の形態は、特に制限されないが、取り扱い性に優れることから、例えば、バッグが好ましい。前記バッグは、例えば、可撓性樹脂製のシート２枚を重ね合わせ、その周囲の縁部（シール部）を接着することで形成できる。接着の形態は、特に制限されず、例えば、熱融着、高周波融着等の融着でもよいし、接着剤等による接着等があげられる。
【００６０】
前記貯留部および各種収容部の大きさは、特に制限されない。前記貯留部の容量は、例えば、５０〜４００ｍＬが好ましく、前記貯留部内に導入する臍帯血の量は、例えば、前記貯留部の容量の４０〜８０体積％が好ましい。前記各種収容部の容量は、例えば、前記貯留部に導入可能な臍帯血量に応じて適宜決定でき、２５〜２００ｍＬが好ましく、また、前記貯留部の容量の３０〜７０体積％が好ましい。前記貯留部および各種収容部は、例えば、内部に空気が含有されてもよいが、可能な限り含有量が少ないことが好ましい。前記第４の臍帯血成分調製装置において、第１の貯留部の容量は、例えば、前述と同様であり、第２の貯留部は、例えば、１０〜８０体積％が好ましく、導入する臍帯血の量は、例えば、第２の貯留部の容量の４０〜８０体積％が好ましい。
【００６１】
前記貯留部および各種収容部は、例えば、チューブで連結されていることが好ましい。前記チューブは、例えば、可撓性材料から形成されていることが好ましい。また、後述するように、チューブの流路を閉鎖した状態で、臍帯血成分調製装置から造血幹細胞収容部１２、第１の血清収容部１３ｂおよび第２の血清収容部１４ｂを取り外すことが好ましい。このため、前記チューブは、例えば、加熱溶融等により溶断可能な材質で形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリブチレンテレフタレート等のポリオレフィン；軟質ポリ塩化ビニル等のポリ塩化ビニル；ポリビニルアルコール；エチレン−酢酸ビニル共重合樹脂；シリコン;ポリウレタン；ナイロン等があげられる。また、本発明の臍帯血成分調製装置は、例えば、適宜、チューブの流路を閉塞および開通可能な部材を有することが好ましい。前記部材としては、例えば、クランプ、クレンメ等の挟持部材があげられる。前記挟持部材で、各チューブを適宜挟むことによって、前記貯留部と各種収容部との間や、各種収容部間の流路を切り替えることができる。また、前記流路の開閉を行う前記部材としては、この他に、例えば、バルブ等も使用できる。前記バルブは、例えば、チューブの途中に配置してもよいし、後述するようなチューブ間の分岐部に備えてもよい。また、後述するような分岐コネクタがバルブを兼ねてもよい。
【００６２】
前記第１および第３の臍帯血成分調製装置において、前記貯留部は、例えば、患者から直接臍帯血を導入する場合、さらに抗凝固剤を含んでもよいし、前記抗凝固剤を導入可能であってもよい。後者の場合、例えば、前記貯留部に臍帯血を導入する前に、前記抗凝固剤を前記貯留部内に導入することが好ましい。前記抗凝固剤としては、特に制限されないが、例えば、ＣＰＤ液（Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＡＣＤ−Ａ液（Ａｃｉｄ−Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等があげられる。前記抗凝固剤の量は、特に制限されず、例えば、前記貯留部の体積や、前記貯留部に導入する臍帯血の体積等に応じて決定できる。前記抗凝固剤の添加量は、例えば、導入する臍帯血に対して、３０〜１００体積％であることが好ましい。また、第４の臍帯血成分調製装置においては、前記第１の貯留部が、前述のように抗凝固剤を導入可能であり、第２の貯留部は、抗凝固剤の導入は不要である。
【００６３】
第１〜第３の臍帯血成分調製装置において、前記貯留部は、例えば、予め赤血球沈降剤が収容されてもよいし、赤血球沈降剤を外部から導入してもよい。また、前記貯留部は、例えば、赤血球沈降剤を含む臍帯血を導入する場合、赤血球沈降剤を収容または導入しなくてもよい。
【００６４】
本発明の臍帯血成分調製装置は、例えば、ヒトの臍帯血だけでなく、げっ歯類、家畜類、霊長類等の哺乳類の臍帯血からの成分調製にも使用できる。
【００６５】
（第１の実施形態）
つぎに、本発明の第１の臍帯血成分調製装置の一例について、図１を用いて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。
【００６６】
図１は、本実施形態における臍帯血成分調製装置の概略を示す平面図である。臍帯血成分調製装置１は、臍帯血を貯留する貯留部１０、赤血球を収容する赤血球収容部１１、造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部１２、血漿を収容する第１の血漿収容部１３ａおよび第２の血漿収容部１４ａ、および、血清を収容する第１の血清収容部１３ｂおよび第２の血清収容部１４ｂを有する。同図の貯留部１０および各収容部１１〜１４ｂにおいて、点線の内部は、各種成分を収容可能な空間であり、点線と外枠の実線との間が、シール部である。貯留部１０は、２つの導入口１５ａ、１５ｂと２つの導出口１６ｃ、１６ｆとを備える。貯留部１０の左側の導入口１５ａは、臍帯血の導入口であり且つチューブ１８ａの一端が連結されており、チューブ１８ａの他端は、臍帯血バッグとの接続部９であり、例えば、穿刺針等が連結可能であり、使用時まで、キャップ等でカバーされている。貯留部１０の右側の導入口１５ｂは、赤血球沈降剤の導入口であり且つチューブ１８ｂの一端が連結されており、チューブ１８ｂの他端は、赤血球沈降剤の収容器との接続部９であり、使用時まで、キャップ等でカバーされている。また、貯留部１０の下方の導出口１６ｃは、臍帯血から沈降した赤血球および造血幹細胞の導出口であり且つチューブ１８ｃの一端が連結され、上方の導出口１６ｆは、赤血球と造血幹細胞とを除去した後の血漿の導出口であり且つチューブ１８ｆの一端が連結されている。赤血球収容部１１は、臍帯血から沈降した赤血球の導入口１５ｄを有し、導入口１５ｄは、チューブ１８ｄの一端が連結されており、造血幹細胞収容部１２は、臍帯血から沈降した造血幹細胞の導入口１５ｅを有し、導入口１５ｅは、チューブ１８ｅの一端が連結されている。貯留部１０に連結されたチューブ１８ｃと、赤血球収容部１１に連結されたチューブ１８ｄと、造血幹細胞収容部１２に連結されたチューブ１８ｅとは、それぞれの他端が分岐コネクタ１９を介して連通されている。第１の血漿収容部１３ａは、赤血球と造血幹細胞とを除去した後の血漿の導入口１５ｇと、血清の導出口１６ｉとを有し、導入口１５ｇには、チューブ１８ｇの一端が連結され、導出口１６ｉには、チューブ１８ｉの一端が連結されている。他方、第２の血漿収容部１４ａも同様に、赤血球と造血幹細胞とを除去した後の血漿の導入口１５ｈと、血清の導出口１６ｋとを有し、導入口１５ｈには、チューブ１８ｈの一端が連結され、導出口１６ｋには、チューブ１８ｋの一端が連結されている。貯留部１０に連結されたチューブ１８ｆと、第１の血漿収容部１３ａに連結されたチューブ１８ｇと、第２の血漿収容部１４ａに連結されたチューブ１８ｈは、それぞれの他端が、分岐コネクタ１９を介して連通されている。さらに、第１の血清収容部１３ｂは、血清の導入口１５ｉを有し、導入口１５ｉは、第１の血漿収容部１３ａに連結されたチューブ１８ｉの他端が連結されている。また、第２の血清収容部１４ｂは、血清の導入口１５ｋを有し、導入口１５ｋは、第２の血漿収容部１４ａに連結されたチューブ１８ｋの他端が連結されている。
【００６７】
臍帯血成分調製装置１は、例えば、チューブを挟むクランプ等の挟持部材を備えることが好ましい（図示せず）。前記挟持部材は、例えば、貯留部１０と各種収容部１１、１２、１３ａ、１４ａとを連結するチューブ、および、血漿収容部１３ａ、１４ａと血清収容部１３ｂ、１４ｂとを連結するチューブに、備えられることが好ましい。これによって、所望の流路に切り替え可能である。
【００６８】
第１の血漿収容部１３ａと第１の血清収容部１３ｂとの間（例えば、チューブ１８ｉ）、第２の血漿収容部１４ａと第２の血清収容部１４ｂとの間（例えば、チューブ１８ｋ）には、例えば、残存する赤血球等を除去するためのフィルターが介在してもよい。また、第２の血漿収容部１４ａに連結されるチューブ１８ｈにフィルターが介在してもよい。
【００６９】
各収容部は、例えば、開口可能な導出口１７を有してもよい。導出口１７は、例えば、臍帯血の各種成分を分離する際には、同図に示すように、開口が閉塞されていることが好ましい。そして、各収容部に収容された各種成分を外部に導出する際、前記閉塞部を取り外すことで、開口した導出部１７から内部の成分を導出することができる。また、閉塞された導出部１７に、例えば、採取針を差し込み、前記採取針を介して、内部の成分を導出することもできる。
【００７０】
本実施形態の臍帯血成分調製装置１を用いて、臍帯血から造血幹細胞、超音波処理した血清（処理済み血清）および超音波処理していない血清（非処理の血清）を調製する方法を、一例をあげて説明する。なお、具体的な処理条件は、特に示さない限り、前述と同様に設定できる。
【００７１】
まず、臍帯血を準備する。ヒト臍帯血の場合、例えば、血液バッグに収容された状態で入手できる。前記血液バックに収容されたヒト臍帯血は、通常、抗凝固剤を含んでいる。この血液バッグに、貯留部１０に連結されたチューブ１８ａの一端を接続し、臍帯血を貯留部１０に導入する。チューブ１８ａ先端の接続部９には、例えば、採血針を装着し、前記採血針を前記血液バッグに挿入することで、臍帯血を貯留部１０に導入してもよい。ここで、貯留部１０内の臍帯血が、下部の導出口１６ｃからチューブ１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、赤血球収容部１１および造血幹細胞収容部１２に流れこまないように、チューブ１８ｃの流路を貯留部１０近傍でクランプにより閉鎖していることが好ましい。また、貯留部１０に臍帯血を導入した後、臍帯血導入用のチューブ１８ａは、例えば、先端にキャップをかぶせてもよいし、シーラー等を用いて所望の部位で溶断してもよい。なお、患者から、直接、チューブ１８ａ先端に装着した採血針を介して、直接、貯留部１０に臍帯血を回収してもよい。このように、患者から臍帯血を直接貯留部１０に回収する場合、貯留部１０は、例えば、内部に、予め抗凝固剤が収容されていてもよい。また、例えば、臍帯血の導入前に、貯留部１０に連結されたチューブ１８ｂを通じて、貯留部１０に抗凝固剤が導入されてもよい。
【００７２】
続いて、貯留部１０に連結されたチューブ１８ｂを通じて、貯留部１０内に赤血球沈降剤を導入し、臍帯血と前記赤血球沈降剤とを混合した後、貯留部１０を静置する。そして、貯留部１０内で、前記臍帯血が赤血球画分と上清画分とに分離した後、貯留部１０下部のチューブ１８ｃと１８ｄとを介して、沈降した赤血球画分を赤血球収容部１１に導入する。この際、造血幹細胞収容部１２への赤血球画分の導入を防止するため、造血幹細胞収容部１２に連結したチューブ１８ｅの流路を分岐コネクタ１９近傍でクランプにより閉鎖してから、クランプによるチューブ１８ｃの流路の閉鎖を解除することが好ましい。これによって、貯留部１０から赤血球収容部１１の流路が連通され、赤血球画分を赤血球収容部１１に導入できる。なお、赤血球画分を赤血球収容部１１に導入した後は、再度、チューブ１８ｃの流路を貯留部１０近傍でクランプにより閉塞することが好ましい。
【００７３】
このようにして、赤血球画分を導出した後、貯留部１０を遠心分離機にかけ、造血幹細胞を含む沈降画分と血漿を含む上清画分とに分離する。この際、遠心分離の条件は、前述のとおりである。
【００７４】
そして、貯留部１０の下部のチューブ１８ｃと１８ｅとを介して、沈降した造血幹細胞画分を造血幹細胞収容部１２に導入する。この際、赤血球収容部１１への造血幹細胞画分の導入を防止するため、赤血球収容部１１に連結したチューブ１８ｄの流路を分岐コネクタ１９近傍でクランプにより閉鎖してから、クランプによるチューブ１８ｃの流路の閉鎖を解除することが好ましい。なお、造血幹細胞画分を造血幹細胞収容部１２に導入した後は、再度、チューブ１８ｃの流路を貯留部１０近傍でクランプにより閉塞することが好ましい。また、シーラー等を用いて、チューブ１８ｃや導入口１５ｅを、所望の部位で溶断してもよい。これによって、臍帯血成分調整装置１から、造血幹細胞画分を収容した、密閉状態の造血幹細胞収容バッグが得られる。前記バッグ内の造血幹細胞は、例えば、導出口１７の閉塞部を切り離したり、閉塞した導出口１７に採取針を突き刺すことによって、内部から取り出すことができる。
【００７５】
他方、貯留部１０に残存する血漿画分を、チューブ１８ｆ、１８ｇ、１８ｈを介して、第１の血漿収容部１３ａと第２の血漿収容部１４ａとに分注する。第１の血漿収容部１３ａおよび第２の血漿収容部１４ａに、順次、血漿画分を導入する際、例えば、第２の血漿収容部１４ａに連結したチューブ１８ｈの流路を分岐コネクタ１９近傍で閉塞して、第１の血漿収容部１３ａに血漿画分を導入し、続いて、第１の血漿収容部１３ａに連結したチューブ１８ｇの流路を分岐コネクタ１９近傍で閉塞した後、クランプによるチューブ１８ｈの流路の閉塞を解除して、第２の血漿収容部１４ａに血漿画分を導入することが好ましい。
【００７６】
つぎに、第１の血漿収容部１３ａに超音波処理を施す。超音波処理は、例えば、浴槽内の液体に前記血漿収容部と振動子とを浸漬し、前記振動子から超音波を出力することで行うことができる。引き続き、第１の血漿収容部１３ａに加熱処理を施す。加熱処理によって、前記血漿画分においてフィブリノゲンからフィブリンが形成される。前記加熱処理は、例えば、浴槽内の加熱した液体に第１の血漿収容部１３ａを浸漬することで行うことができる。そして、加熱処理後の第１の血漿収容部１３ａを遠心分離機にかけ、形成されたフィブリンや血小板等を含む沈降画分と血清を含む上清画分とに分離する。この上清画分を、第１の血漿収容部１３ａと第１の血清収容部１３ｂとを連結するチューブ１８ｉを介して、第１の血清収容部１３ｂに導入する。このようにして、超音波処理した血清を回収できる。第１の血漿収容部１３ａ内の上清画分を第１の血清収容部１３ｂに導入する際、沈降画分の混入を防ぐことが好ましい。この場合、例えば、上清画分と沈降画分との境界を、第１の血漿収容部１３ａの外部からクランプ等で挟むことによって、分離する方法があげられる。
【００７７】
他方、第２の血漿収容部１４ａに、超音波処理を施さないことと、血小板を除去すること以外は、同様にして加熱処理を施す。第２の血漿収容部１４ａの加熱処理は、例えば、第１の血漿収容部１３ａの加熱処理と同時に行ってもよい。続いて、加熱処理後の前記第２の血漿収容部１４ａを遠心分離機にかけ、形成されたフィブリノゲンや血小板等を含む沈降画分と血清を含む上清画分とに分離する。この上清画分を、第２の血漿収容部１４ａと第２の血清収容部１４ｂとを連結するチューブ１８ｋを介して、第２の血清収容部１４ｂに導入する。このようにして、超音波処理していない血清を回収できる。
【００７８】
第１の血清収容部１３ｂおよび第２の血清収容部１４ｂは、例えば、シーラー等を用いて、チューブ１８ｉまたは導入口１５ｉ、および、チューブ１８ｋまたは導入口１５ｋを、所望の部位で溶断してもよい。これによって、臍帯血成分調製装置１から、処理済み血清を収容した密閉状態の血清収容バッグ、および、非処理の血清を収容した密閉状態の血清収容バッグが得られる。前記バッグ内の血清は、例えば、導出口１７の閉塞部を切り離したり、閉塞した導出口１７に採取針を突き刺すことによって、内部から取り出すことができる。
【００７９】
このようにして得られた造血幹細胞が収容された造血幹細胞バッグ、処理済み血清が収容された血清バッグ、および、非処理の血清が収容された血清バッグは、例えば、使用時まで、冷凍保存等で保存することができる。また、冷凍保存する際には、造血幹細胞収容部１２、第１の血清収容部１３ｂおよび第２の血清収容部１４ｂに目的成分をそれぞれ収容した後、例えば、連結されたいずれかのチューブを介して凍結保護剤を内部に導入してから、前記チューブを溶断してもよい。
【００８０】
また、本発明の実施形態において、前述のように、血漿からフィブリノゲンを除去して血清を回収する際、前記加熱処理に代えて、血液凝固系の活性化機構を利用することも可能である。この場合、前述のように、第１の血漿収容部１３ａに超音波処理を施した後、第１の血漿収容部１３ａに、さらに、血液凝固用試薬を添加することが好ましい。前記血液凝固用試薬とは、例えば、前述のような、トロンビン等の凝固因子等があげられ、前記臍帯血が抗凝固剤を含む場合、前記血液凝固用試薬は、例えば、さらに、塩化カルシウム等の中和剤を含むことが好ましい。このように血液凝固用試薬を添加することによって、血漿においてフィブリノゲンからフィブリンが形成されるため、その後は、前述と同様に遠心分離を行えばよい。なお、前記血液凝固用試薬は、例えば、トロンビン等の凝固因子と中和剤とを同時に前記血漿に添加してもよいし、前記中和剤を添加した後に前記凝固因子を添加してもよい。このような形態では、第１の血漿収容部１３ａは、前記血液凝固用試薬の導入口を有することが好ましい。前記導入口は、例えば、チューブの一端が連結されており、前記チューブの他端は、前記血液凝固用試薬の収容部との接続部であり、使用時までキャップ等でカバーされていることが好ましい。また、第２の血漿収容部１４ａも同様に、加熱処理に代えて、前記血液凝固用試薬を添加することが好ましい。また、第２の血漿収容部１４ａも同様に、前記血液凝固用試薬の導入口を有することが好ましい。前記導入口は、例えば、チューブの一端が連結されており、前記チューブの他端は、前記血液凝固用試薬の収容部との接続部であり、使用時までキャップ等でカバーされていることが好ましい。
【００８１】
（第２の実施形態）
つぎに、本発明の第２の臍帯血成分調製装置の一例について、図２を用いて説明する。同図において、図１と同様の部位には同じ符号を付している。また、特に示さない限りは、前記第１の臍帯血調製装置と同様である。なお、特に示さない限り、本発明は、これらには制限されない。
【００８２】
図２は、本実施形態における臍帯血成分調製装置の概略を示す平面図である。臍帯血成分調製装置２は、臍帯血を貯留する貯留部１０、赤血球除去後の造血幹細胞含有血漿を収容する細胞含有血漿収容部２０、造血幹細胞を収容する造血幹細胞収容部１２、血漿を収容する第１の血漿収容部１３ａおよび第２の血漿収容部１４ａ、および、血清を収容する第１の血清収容部１３ｂおよび第２の血清収容部１４ｂを有する。貯留部１０は、２つの導入口１５ａ、１５ｂと導出口１６ｆとを備える。貯留部１０の左側の導入口１５ａは、臍帯血の導入口であり且つチューブ１８ａの一端が連結されており、チューブ１８ａの他端は、臍帯血バッグとの接続部９である。貯留部１０の右側の導入口１５ｂは、赤血球沈降剤の導入口であり且つチューブ１８ｂの一端が連結されており、チューブ１８ｂの他端は、赤血球沈降剤の収容器との接続部９である。また、貯留部１０の上方の導出口１６ｆは、赤血球を除去した後の造血幹細胞を含む血漿の導出口であり且つチューブ２１ａの一端が連結されている。細胞含有血漿収容部２０は、導入口２５ｂと導出口２６ｃとを備える。上部の導入口２５ｂは、造血幹細胞を含む血漿の導入口であり且つチューブ２１ｂの一端が連結されている。細胞含有血漿収容部２０に連結されたチューブ２１ｂの他端は、貯留部１０に連結されたチューブ２１ａの他端ならびにチューブ２１ｄの一端と、分岐コネクタ１９を介して連結されている。チューブ２１ｄの他端は、第１および第２の血漿収容部１３ａ、１４ａに連結されたチューブ１８ｇ、１８ｈの一端と、分岐コネクタ１９を介して連結されている。
【００８３】
臍帯血成分調製装置２は、例えば、チューブを挟むクランプ等の挟持部材を備えることが好ましい（図示せず）。前記挟持部材は、例えば、貯留部１０と細胞含有血漿収容部２０とを連結するチューブ２１ａ、チューブ２１ｄ、細胞含有血漿収容部２０と造血幹細胞収容部１２とを連結するチューブ２１ｃ、分岐コネクタ１９から血漿収容部１３ａ、１３ｂに連結されたチューブ１８ｇ、１８ｈ、血漿収容部１３ａ、１４ａと血清収容部１３ｂ、１４ｂとを連結するチューブ１８ｉ、１８ｋ等に、前述のような挟持部材が備えられることが好ましい。
【００８４】
本実施形態の臍帯血成分調製装置２を用いて、臍帯血から造血幹細胞、処理済み血清および非処理の血清を調製する方法を、一例をあげて説明する。なお、具体的な処理条件は、特に示さない限り、前述と同様に設定できる。
【００８５】
前述と同様に、貯留部１０内の臍帯血を赤血球画分と上清画分とに分離させた後、貯留部１０上部のチューブ２１ａと２１ｂとを介して、前記上清画分を細胞含有血漿収容部２０に導入する。前記上清画分は、造血幹細胞を含む血漿画分である。この際、前記上清画分の各血漿収容部１３ａ、１４ａへの導入を防止するため、チューブ２１ｄの流路を、チューブ２１ｂに連結する分岐コネクタ１９近傍でクランプにより閉鎖することが好ましい。また、細胞含有血漿収容部２０に導入した前記上清画分が、造血幹細胞収容部１２に導出されることを防ぐため、チューブ２１ｃの流路を導出口２６ｃ近傍でクランプにより閉塞することが好ましい。
【００８６】
次に、細胞含有血漿収容部２０を遠心分離機にかけ、造血幹細胞を含む沈降画分と血漿を含む上清画分とに分離する。この際、遠心分離の条件は、前述のように、血小板が上清画分に含まれるような条件とすることが好ましい。
【００８７】
そして、細胞含有血漿収容部２０の下部のチューブ２１ｃを介して、造血幹細胞を含む沈降画分を造血幹細胞収容部１２に導入する。造血幹細胞の導入後、細胞含有血漿収容部２０と造血幹細胞収容部１２とを連結するチューブ２１ｃの流路をクランプによって閉塞することが好ましい。
【００８８】
他方、細胞含有血漿収容部２０に残存する血漿画分を、チューブ２１ｂ、２１ｄ、１８ｇ、１８ｈを介して、第１の血漿収容部１３ａと第２の血漿収容部１４ａとに分注する。この際、血漿画分が貯留部１０に導出されることを防ぐため、貯留部１０に連結されたチューブ２１ａの流路をクランプによって分岐コネクタ１９近傍で閉塞することが好ましい。そして、分注した血漿を前述と同様に処理して血清を調製する。
【００８９】
（第３の実施形態）
つぎに、本発明の第３の臍帯血成分調製装置の一例について、図３を用いて説明する。同図において、図１および図２と同様の部位には同じ符号を付している。また、特に示さない限りは、前記第１および第２の臍帯血成分調製装置と同様である。なお、特に示さない限り、本発明は、これらには制限されない。
【００９０】
図３は、本実施形態における臍帯血成分調製装置の概略を示す平面図である。臍帯血成分調製装置３は、図２における細胞含有血漿収容部２０と造血幹細胞収容部１２とに代えて、隔離可能な細胞含有血漿収容部３０を備える以外は、前述の第２の臍帯血成分調製装置と同様である。細胞含有血漿収容部３０は、貯留部１０において臍帯血から沈降した赤血球を含む沈降画分と上清画分のうち、前記上清画分を、前記造血幹細胞を含む血漿画分として導入可能である。そして、細胞含有血漿収容部３０は、さらに、導入された前記血漿画分をが造血幹細胞を含む沈降画分と上清画分とに分離した後、前記沈降画分を有する下領域３０ｂと前記上清画分を有する上領域３０ａとを隔離可能である。
【００９１】
細胞含有血漿収容部３０に、赤血球除去後の造血幹細胞を含む血漿を導入した後、細胞含有血漿収容部３０を遠心分離機にかけ、造血幹細胞を含む沈降画分と血漿を含む上清画分とに分離させる。分離後、沈降画分を有する下領域３０ｂと上清画分を含む上領域３０ａとの境界を、把持部材によって、細胞含有血漿収容部３０の外部から挟み、前記両領域を隔離する。具体的には、例えば、図４に示すように、細胞含有血漿収容部３０の上領域３０ａと下領域３０ｂとの境界Ｘをクランプ４０で挟む。
【００９２】
そして、上領域３０ａに収容された上清画分を血漿収容部１３ａ、１４ａに導出し、前述と同様にして血清を調製する。他方、上清画分を導出した後の細胞含有血漿収容部３０（下領域３０ｂ）は、造血幹細胞の収容部となる。
【００９３】
第３の臍帯血成分調製装置３において、細胞含有血漿収容部としては、例えば、図５に示す細胞含有血漿収容部５０であってもよい。同図に示すように、細胞含有血漿収容部５０は、沈降する赤血球が下領域５０ｂに移動し易いように、上領域５０ａの下部がテーパー状となっている。
【００９４】
（第４の実施形態）
つぎに、本発明の第４の臍帯血成分調製装置について説明する。本発明の第４の臍帯血成分調製装置は、例えば、血液凝固剤を含まない未凝固の臍帯血を導入して、各種成分を調製する際に使用する装置である。前記血液凝固剤を含まない未凝固の臍帯血とは、通常、患者から直接導入される臍帯血である。本実施形態の臍帯血成分調製装置によれば、前述の臍帯血幹細胞、処理済み血清および非処理の血清の他に、さらに、血液凝固を促進する血液凝固促進個体により血小板が活性化された血清を得ることができる。
【００９５】
本発明の第４の臍帯血成分調製装置の一例について、図６を用いて説明する。同図において、図１〜図５と同様の部位には同じ符号を付している。また、特に示さない限りは、前記第１〜第３の臍帯血成分調製装置と同様である。なお、特に示さない限り、本発明は、これらには制限されない。
【００９６】
図６は、本実施形態における臍帯血成分調製装置の概略を示す平面図である。臍帯血成分調製装置６は、前記第１の実施形態を例示する図１の臍帯血成分調製装置について、さらに、臍帯血を貯留する第２の貯留部６０および第３の血清収容部６１ｂを有する。なお、図１における貯留部１０は、本実施形態において、第１の貯留部に該当する。第１の貯留部１０は、特に示さない限り、前記第１の実施形態における貯留部と同様であり、第１の貯留部１０からチューブ等を介して連結される各種収容部も、特に示さない限り、図１に例示する前記第１の実施形態と同様である。第１の貯留部１０は、血液凝固用試薬ならびに赤血球沈降剤を導入可能であり、臍帯血の導入口１５ａを有し、導入口１５ａには、チューブ６８ａの一端が連結されている。第２の貯留部６０は、血液凝固を促進させる血液凝固促進個体（血液凝固促進剤）が収容可能であり、導入口６５ａおよび導出口６６ａを備える。第２の貯留部６０の左側の導入口６５ａは、臍帯血の導入口であり、チューブ６８ｂの一端が連結されている。そして、第１の貯留部１０に連結されたチューブ６８ａおよび第２の貯留部６０に連結されたチューブ６８ｂは、分岐コネクタ１９を介して、それぞれチューブ６８ｃに連結されている。チューブ６８ｃの他端は、臍帯血を採取するための穿刺針等が連結可能な接続部９である。第２の貯留部６０の右側の導出口６６ａは、血液凝固後の血清を導出する導出口であり、チューブ６８ｄが連結されている。また、第３の血清収容部６１ｂは、導入口６５ｂを備え、導入口６５ｂには、第２の貯留部６０に連結されたチューブ６８ｄの他端が連結されている。
【００９７】
本実施形態の臍帯血成分調製装置は、後述するように、第２の貯留部において、前記血液凝固促進個体が臍帯血に接触することにより、血液凝固のカスケード系が作用して、血液の凝固ならびに血小板活性化による増殖因子の放出が起こる。このため、前記第２の貯留部６０において、血液凝固の上清には、血小板を活性化させていない場合と比較して、より多くの増殖因子が含まれることとなる。
【００９８】
前記血液凝固促進個体としては、特に制限されないが、例えば、特許第３７８８４７９等に記載されているものが使用できる。前記血液凝固促進個体の形状は、例えば、粒状、顆粒状、塊状であることが好ましく、また、略球状であることが好ましい。前記血液凝固促進個体の大きさは、特に制限されないが、例えば、直径が、１〜１０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは３〜５ｍｍである。前記血液凝固促進個体は、例えば、多孔質構造であってもよい。このように多孔質構造の血液凝固促進個体の単位体積あたりの表面積を大きく設計でき、効率良く血小板等の活性化を行うことができる。
【００９９】
前記血液凝固促進個体の材質としては、特に制限されないが、例えば、その表面が、二酸化ケイ素を含む層から形成されていることが好ましい。前記二酸化ケイ素としては、例えば、ガラス、シリカ、珪藻土、カオリン等があげられる。さらに、前記血液凝固促進個体は、例えば、その芯体が、例えば、磁性物質を含んでもよい。このように血液凝固促進個体が磁性物質を含む場合、例えば、前記血液凝固促進個体が収容された前記第２の貯留部に磁界を作用させることで、臍帯血の攪拌を行うことができ、血小板等の迅速な活性化が可能となる。
【０１００】
前記第２の貯留部における前記血液凝固促進個体の量は、特に制限されないが、例えば、前記貯留部に導入可能な臍帯血の量に応じて適宜決定できる。具体例としては、前記血液凝固促進個体の総表面積を、例えば、臍帯血体積に対して、０．１〜２５ｍｍ２／ｍＬに設定することが好ましい。
【０１０１】
本実施形態の臍帯血成分調製装置６を用いて、臍帯血成分を調製する方法を、一例をあげて説明する。なお、具体的な処理条件は、特に示さない限り、前述と同様に設定できる。
【０１０２】
まず、チューブ６８ｃの接続部９に穿刺針を装着し、その先端を臍帯に挿入し、チューブ６８ｃ内に臍帯血を導入する。そして、チューブ６８ａおよび６８ｂを介して、第１の貯留部１０および第２の貯留部６０にそれぞれ臍帯血を導入する。臍帯血の導入順序は、特に制限されず、各貯留部に同時に導入してもよいし、順次導入してもよい。後者の場合、例えば、まず、第１の貯留部１０に連結したチューブ６８ａの流路を分岐コネクタ１９近傍で閉塞しておき、第２の貯留部６０への臍帯血の導入を行った後、第２の貯留部６０に連結したチューブ６８ｂの流路を分岐コネクタ１９近傍で閉塞してから、前記チューブ６８ａの閉塞を解除して、第１の貯留部１０に臍帯血を導入することができる。第１の貯留部１０と第２の貯留部６０のそれぞれに臍帯血を導入した後、両貯留部間のチューブ６８ａおよび６８ｂを溶断してもよい。
【０１０３】
第１の貯留部１０には、例えば、前述のように予め抗凝固剤が収容されてもよいし、臍帯血の導入前に抗凝固剤が導入されてもよい。抗凝固剤を備えた第１の貯留部１０に臍帯血が導入された後は、例えば、第１の実施形態と同様に処理を行うことで、前述した、造血幹細胞、処理済み血清および非処理の血清を得ることができる。なお、第１の貯留部１０に連結される各種収容部は、例えば、第１の実施形態に代えて、第２または第３の実施形態と同様であってもよい。
【０１０４】
他方、第２の貯留部６０には、例えば、前述のように前記血液凝固促進個体が予め収容されてもよいし、臍帯血の導入前に前記血液凝固促進個体が導入されてもよい。前記血液凝固促進個体を備えた第２の貯留部６０に臍帯血が導入されると、前記臍帯血について血液凝固（フィブリン形成）が生じるとともに、血小板の活性化がおきる。この活性化によって、非活性化の場合よりも、多く増殖因子が放出される。そして、血液凝固が生じた後、第２の貯留部６０を遠心分離機にかけ、フィブリンや血小板等を含む沈降画分と上清画分とに分離する。この上清画分を、第２の貯留部６０と第３の血清収容部６１ｂとを連結するチューブ６８ｄを介して、第３の血清収容部６１ｂに導入する。このようにして、増殖因子をより多く含む血清を回収できる。また、本実施形態によれば、第２の貯留部６０は、抗凝固剤を含まないことから、例えば、塩化カルシウム等の中和剤が含まれていない血清が得られる。
【０１０５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
【実施例】
【０１０６】
［実施例１］
臍帯血から血清を調製し、臍帯血造血幹細胞の増殖および分化への影響を確認した。
【０１０７】
（１）造血幹細胞および血清の調製
抗凝固剤としてＣＰＤ液を含む臍帯血８０ｍＬを遠沈管に入れ、赤血球沈降剤としてＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｅｔｈｙｌ  Ｓｔａｒｃｈ）を１２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように添加した。これを、室温に６０分間静置して上清画分のみを採取し、これを遠心分離（３９２０ｍ／ｓ２(４００×ｇ)、５分間）して、上清画分と沈降画分とを得た。前記上清画分が多血小板血漿画分であり、前記沈降画分が有核細胞画分である。
【０１０８】
前記多血小板血漿画分のうち３０ｍＬを容量５０ｍＬの遠沈管に入れ、これを遠心分離（２２８３４ｍ／ｓ２(２３３０×ｇ)、４℃、１０分間）して、上清画分を得た。前記上清画分を５６℃で３０分間加熱した後、遠心分離（２２８３４ｍ／ｓ２(２３３０×ｇ)、４℃、１０分間）し、フィブリンを除去して非超音波処理の血清を調製した。これを、以下、臍帯血血清（−）という。他方、前記多血小板血漿画分のうち３０ｍＬを５×１０ｃｍの大きさのＰＶＣ製バッグに入れ、超音波処理した後、同様の条件で加熱処理と遠心分離処理とを行い、超音波処理した血清を調製した。これを、以下、臍帯血血清（＋）という。前記超音波処理は、通常の超音波発生装置を用い、その対象物に対する超音波を音圧計にて測定したとき、５ｍＶ以上の音圧が得られる条件下、周波数４５ｋＨｚで、超音波発生装置から１５ｃｍの距離で３０分間超音波処理を行った。
【０１０９】
前記有核細胞画分について、以下の処理を行い、造血幹細胞の純化を行った。まず、前記有核細胞画分０．３ｍＬに、ＣＤ３４抗体を固定化した磁気ビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を５０μＬとなるように添加し、４℃で３０分間静置した。そして、これを磁気カラム（商品名ＭＳカラム、ミルテニーバイオテク社製）にアプライし、前記有核細胞画分から造血幹細胞を回収した。回収した造血幹細胞の純度を、蛍光色素で標識化したＣＤ３４抗体（ベックマン・コールター社製）を用いて、フローサイトメトリー法により確認したところ、約７０％であった。
【０１１０】
なお、臍帯血血清（＋）および臍帯血血清（−）は、それぞれ、３人の臍帯血（Ａ、Ｂ、Ｃ）からそれぞれ調製し、臍帯血造血幹細胞は、そのうちの１人（Ａ）から調製した。
【０１１１】
（２）造血幹細胞の培養
血清として、前記Ａ、ＢおよびＣの前記臍帯血血清（−）または前記臍帯血血清（＋）を使用し、下記組成の培地を調製した。そして、各血清添加培地を使用して、回収した前記Ｂの前記造血幹細胞を１ウェルあたり１×１０４細胞になるように播種し、３７℃で７日間培養した。
【０１１２】
【表１】
2010193879.tif 000003
【０１１３】
（３）細胞数の測定
培養後、回収した細胞を、前記標識化ＣＤ３４抗体を用いて、フローサイトメトリー法により解析し、１ウェルあたりの総細胞数、造血幹細胞数および総細胞中の造血幹細胞の割合を算出した。
【０１１４】
（比較例１）
前記造血幹細胞の培養において、血清としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、造血幹細胞の培養、細胞数の算出を行った。
【０１１５】
（比較例２）
前記造血幹細胞の培養において、血清として末梢血血清を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、造血幹細胞の培養、細胞数の算出を行った。前記末梢血血清は、以下のようにして調製した。まず、成人男性の末梢血２０ｍＬを、ガラスビーズ（ビーズ径４ｍｍ、ブライト標識工業社製）２個を含む遠沈管に入れた。前記遠沈管を、室温で２０分間振とう後、遠心分離（２２０５０ｍ／ｓ２、４℃、１０分間）して、上清を採取した。前記上清が血漿画分である。この上清を、５６℃で３０分間熱処理後、孔径０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）を用いてろ過し、末梢血血清を調製した。
【０１１６】
図７のグラフに、実施例１、比較例１および２について、１ウェルあたりの総細胞数、造血幹細胞数の測定結果を示す。同図のグラフにおいて、縦軸は、培養後の１ウェルあたりの細胞数（×１０４個）であり、各バーは、左から順に、ＦＢＳを使用した比較例１、末梢血血清を使用した比較例２、前記Ａ〜Ｃの臍帯血血清（−）を使用した実施例１、前記Ａ〜Ｃの臍帯血血清（＋）を使用した実施例１の結果である。前記バー全体は、総細胞数を示し、そのうち黒塗り部分は、造血幹細胞数を示す。
【０１１７】
図７に示すように、臍帯血血清（−）を用いた実施例１では、ＦＢＳを用いた比較例１および末梢血血清を用いた比較例２と同様に、造血幹細胞の増殖が確認された。この結果から、臍帯血血清（−）によれば、臍帯血造血幹細胞の増殖を促進できるといえる。一方、臍帯血血清（＋）を用いた実施例１では、比較例１および比較例２と比べて、総細胞数が顕著に低い結果となった。具体的には、臍帯血血清（＋）を用いた実施例１では、総細胞数が０．１６５×１０４〜１．０×１０４個であり、比較例１の総細胞数７×１０４個に対して、２．４〜２１．４％に抑制され、また、比較例２の総細胞数８．５×１０４個に対して、１．９〜１７．６％に抑制された。この結果から、臍帯血血清（＋）によれば、臍帯血造血幹細胞の増殖を抑制できるといえる。さらに、臍帯血血清（＋）を用いた実施例１では、総細胞数における造血幹細胞の割合が、８５〜８８％であり、総細胞数において未分化細胞が占める割合が高いことを示す。この結果から、臍帯血血清（＋）によれば、さらに、造血幹細胞の分化も抑制できるといえる。そして、以上の結果から、臍帯血血清（＋）によれば、増殖・分化の抑制が可能であり、臍帯血血清（−）によれば、増殖の促進が可能であるため、これらを適宜組み合せることで、造血幹細胞の増殖を所望に応じて制御することができる。特に、同一の臍帯血から、増殖目的の造血幹細胞と、制御剤となる臍帯血血清（＋）および臍帯血血清（−）とを調製できるため、適合性や安全性にも優れ、従来廃棄されていた臍帯血の有効利用も可能となる。なお、臍帯血血清（＋）を間葉系幹細胞の培養に使用した場合、反対に増殖は促進される結果となった。このことから、臍帯血血清（＋）は、臍帯血幹細胞の増殖・分化を特異的に抑制できると解される。
【０１１８】
［実施例２］
前記実施例１と同様にして、一人の臍帯血から造血幹細胞、臍帯血血清（＋）および臍帯血血清（−）を調製した。そして、前記各血清を添加した下記培地を用いて、前記造血幹細胞を１ウェルあたり５×１０３細胞になるように播種し、３７℃で１４日間培養した。前記培地における臍帯血血清（＋）の濃度は、５、１０ｖ／ｖ％とし、臍帯血血清（−）の濃度は０．１２５、０．２５、０．５、１、２．５ｖ／ｖ％とした。また、コントロールとして、いずれの血清も含まない培地を用いて、同様に培養を行った。そして、実施例１と同様にして、培養後に回収した細胞を、フローサイトメトリー法により解析し、１ウェルあたりの造血幹細胞数を算出した。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
下記表に、臍帯血血清（＋）または臍帯血血清（−）を添加した培地を使用した際における造血幹細胞の増加率を示す。血清無添加で１４日間培養した際の造血幹細胞数を「１００％」とした相対値を、前記増加率とした。
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
前記表に示すように、超音波処理した臍帯血血清（＋）を５〜１０ｖ／ｖ％の範囲で含有する培地で培養することによって、幹細胞の増加率を抑制できた。他方、超音波処理していない臍帯血血清（−）を０．１２５〜２．５ｖ／ｖ％の範囲で含有する培地で培養することによって、幹細胞の増加率を増加できた。
【０１２３】
［実施例３］
前記実施例１と同様にして、一人の臍帯血から造血幹細胞、臍帯血血清（＋）および臍帯血血清（−）を調製した。そして、臍帯血血清（−）を０．５ｖ／ｖ％の濃度で含む前記実施例２の培地を用いて、前記造血幹細胞を１ウェルあたり５×１０３細胞になるように播種し、３７℃で１４日間培養した。そして、前記臍帯血血清（−）を０．５ｖ／ｖ％の濃度で含む培地を、培養１４日目に、前記臍帯血血清（＋）を１０ｖ／ｖ％の濃度で含む前記実施例２の培地に置換し、さらに、培養を行った。そして、実施例１と同様にして、所定の培養時間（０、７、１４、２１日）に回収した細胞を、フローサイトメトリー法により解析し、１ウェルあたりの造血幹細胞数を算出した。コントロールとして、培養１４日目に、前記臍帯血血清（＋）を１０ｖ／ｖ％の濃度で含む前記培地に置換することなく、培養開始時の血清のみを使用して、同様の血清濃度の条件で培養を行い、造血幹細胞数を算出した。
【０１２４】
下記表に、造血幹細胞の増加率を示す。培養開始時（０日目）の造血幹細胞数を「１」とした相対値（倍率）を、前記増加率とした。
【０１２５】
【表４】
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【０１２６】
前記表に示すように、臍帯血血清（−）を０．５ｖ／ｖ％の濃度で含有する培地で培養した造血幹細胞を、培養１４日目に臍帯血血清（＋）を１０ｖ／ｖ％の濃度で含有する培地に置換することによって、造血幹細胞の増加は抑制された。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
このように、本発明によれば、例えば、前述のように安全性に問題があるウイルスベクターを使用することなく、前記臍帯血由来の血清を用いることで、臍帯血造血幹細胞の増殖および分化を制御できる。具体的には、臍帯血血清を使用するのみで、前記抑制を行うことができる。このため、非常に安全性に優れ、簡便な操作で増殖および分化の調節を行うことが可能である。特に、臍帯血由来の血清であることから、例えば、同一個体の臍帯血由来の造血幹細胞と血清とを使用できる。したがって、より有効な臍帯血の利用が可能であり、また、同一個体の成分を併用できることから、安全性に対する信頼性も向上できる。このように、本発明によれば造血幹細胞の増殖および分化を抑制できることから、例えば、前記造血幹細胞を目的地まで輸送する際や、増殖を行う所望の時期まで前記造血幹細胞を保存する際等に有用であり、再生医療の分野において、より一層臍帯血造血幹細胞の有効利用を促進できる方法といえる。
【符号の説明】
【０１２８】
１、２、３    臍帯血成分調製装置
９    接続部
１０  貯留部
１１  赤血球収容部
１２、３０  造血幹細胞収容部
１３ａ  第１の血漿収容部
１３ｂ  第１の血清収容部
１４ａ  第２の血漿収容部
１４ｂ  第２の血清収容部
１５ａ、１５ｂ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｇ、１５ｈ、１５ｉ、１５ｋ、２５ｂ、６５ａ、６５ｂ  導入口
１６ｃ、１６ｆ、１６ｉ、１６ｋ、１７、２６ｃ、６６ａ  導出口
１８ａ〜１８ｋ、２１ａ〜２１ｄ、６８ａ〜６８ｄ  チューブ
１９  分岐コネクタ
２０、３０、５０  細胞含有血漿収容部
３０ａ  上領域
３０ｂ  下領域
４０  クランプ
６０  第２の貯留部
６１ｂ  第３の血清収容部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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