(57)【要約】【課題】植物ホルモンとしてエチレンを用い、カルスの誘導や有用物質の生成促進の効果が高効率でかつ安定して得られる植物組織の培養方法、該培養方法を用いた有用物質の製造方法、培養液製造装置及び培養装置の提供を目的とする。【解決手段】エチレンを含有するガスからなる微細気泡を含む培養液で植物組織を培養することを特徴とする植物組織の培養方法、及び該培養方法を用いた有用物質の製造方法。また、培養液貯留部１１と、エチレン含有ガス貯留部１２と、培養液に前記微細気泡を発生させるエチレン含有気泡発生部１３とを備える培養液製造装置１。また、培養液製造装置１と培養槽５を備える植物組織培養装置１００。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレンを含有するガスからなる微細気泡を含む培養液で植物組織を培養することを特徴とする植物組織の培養方法。
【請求項２】
前記微細気泡の平均気泡径が１０μｍ以下である、請求項１に記載の植物組織の培養方法。
【請求項３】
前記微細気泡の気泡数が前記培養液１ｍＬあたり１，０００個以上である、請求項１又は２に記載の植物組織の培養方法。
【請求項４】
植物組織の培養により有用物質を製造する方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法により植物組織を培養する工程を有する有用物質の製造方法。
【請求項５】
植物組織を培養する培養液を貯留する培養液貯留部と、エチレンを含有するガスを貯留するエチレン含有ガス貯留部と、前記培養液に前記ガスからなる微細気泡を発生させるエチレン含有気泡発生部と、を備える培養液製造装置。
【請求項６】
請求項５に記載の培養液製造装置と、該培養液製造装置から供給される培養液により植物組織を培養する培養槽とを備える植物組織培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物組織の培養方法及び有用物質の製造方法、並びに培養液製造装置及び植物組織培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
食料分野や医療分野、工業分野では、植物が生成する有用物質が広く利用されている。該有用物質を得る方法としては、天然に生育又は栽培した植物から有用物質を抽出する方法が知られている。しかし、該方法は天候等の外部環境の影響が大きいため、工業的に安定した生産量を確保することが難しい。
【０００３】
そこで、植物が生成する有用物質を工業的に安定して製造する方法として、以下に示す方法が示されている。
（１）植物内で有用物質の代謝に関わっている酵素の遺伝子を大腸菌等の宿主に導入し、該宿主を大量に培養することにより有用物質を製造する方法（特許文献１）。
（２）植物組織培養技術により大量に培養した植物細胞から有用物質を得る方法（特許文献２）。
【０００４】
方法（２）における植物組織培養では、植物の生長に必要な成分を含む培地（培養液）に、植物体の一片、細胞、器官等の植物組織を接種し、該植物組織からカルスと呼ばれる不定形細胞を誘導した後に懸濁培養を行ったり、誘導したカルスを別の器官に分化させたりすることで、植物組織を大量に培養する。これにより、植物が代謝する有用物質が高効率で得られる。
【０００５】
また、方法（２）では、無機塩類、ビタミン、糖類等を含む培地中に植物ホルモンを添加することにより、植物組織培養において植物組織からカルスを誘導したり、有用物質の生成を促進させたりする方法が示されている（特許文献３、４）。
培地中に添加する植物ホルモンの種類としては、取り扱いが容易な点から主にオーキシン類やサイトカイニン類等（以下、これらをまとめて「オーキシン類等」という。）が用いられている。さらに、植物ホルモンとしてエチレンを用いることも示されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２４５２４２号公報
【特許文献２】特許第２７５９６５６号公報
【特許文献３】特開昭６０−４７６７８号公報
【特許文献４】特許第３７２５１８９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７（２００６）：２５２−２６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
方法（１）の遺伝子工学的手法は、方法（２）に比べて宿主を短期間で大量に培養できるという利点がある。しかし、目的とする有用物質の代謝経路、反応に関与する酵素及びその遺伝子等の特定が必要であり、また方法（２）に比べて宿主から目的の有用物質を分離精製する作業が困難である。
【０００９】
一方、方法（２）の植物組織培養において、植物ホルモンとしてオーキシン類等を用いる方法は、カルス誘導や有用物質の生成促進の効果が得られる植物種が限定されており、用途に制約がある。また、植物ホルモンとしてエチレンを用いれば、前記オーキシン類等では効果が得られない植物種に対してもカルス誘導や有用物質の生成促進の効果が得られるが、エチレンを培養液中に供給する方法では、前記効果を充分にかつ安定して得ることが難しい。該問題の解決法としては、培養中にエチレンを連続的に供給し続けることが考えられるが、連続的に供給してもエチレンによる前記効果を安定して得ることは難しく、経済性にも劣る。
以上の理由から、植物ホルモンとしてエチレンを用いる植物組織の培養において、エチレンによる効果を充分にかつ安定して得る方法が望まれている。
【００１０】
本発明は、植物ホルモンとしてエチレンを用いて、カルスの誘導や有用物質の生成促進の効果が高効率でかつ安定して得られる植物組織の培養方法、及び該培養方法を用いた高い生産性でかつ安定した有用物質の製造方法、並びに培養液製造装置及び植物組織培養装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］エチレンを含有するガスからなる微細気泡を含む培養液で植物組織を培養することを特徴とする植物組織の培養方法。
［２］前記微細気泡の平均気泡径が１０μｍ以下である、［１］に記載の植物組織の培養方法。
［３］前記微細気泡の気泡数が前記培養液１ｍＬあたり１，０００個以上である、［１］又は［２］に記載の植物組織の培養方法。
［４］植物組織の培養により有用物質を製造する方法であって、［１］〜［３］のいずれかに記載の培養方法により植物組織を培養する工程を有する有用物質の製造方法。
［５］植物組織を培養する培養液を貯留する培養液貯留部と、エチレンを含有するガスを貯留するエチレン含有ガス貯留部と、前記培養液に前記ガスからなる微細気泡を発生させるエチレン含有気泡発生部と、を備える培養液製造装置。
［６］［５］に記載の培養液製造装置と、該培養液製造装置から供給される培養液により植物組織を培養する培養槽とを備える植物組織培養装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の培養方法によれば、植物ホルモンとしてエチレンを用いて植物組織を培養することで、カルスの誘導や有用物質の生成促進の効果が高効率でかつ安定して得られる。
また、本発明の製造方法によれば、植物組織が生成する有用物質を高い生産性でかつ安定して製造できる。
また、本発明の培養液製造装置は、カルスの誘導や植物組織の有用物質の生成促進の効果に優れた培養液を製造できる。
また、本発明の培養装置は、植物組織の培養により、高い生産性で有用物質を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の培養液製造装置の実施形態の一例を示した概念図である。
【図２】本発明の培養液製造装置の他の実施形態を示した概念図である。
【図３】本発明の培養液製造装置の他の実施形態を示した概念図である。
【図４】本発明の植物組織の培養装置の実施形態の一例を示した概念図である。
【図５】実施例１及び比較例１の培養液中のエチレンを含有するガスからなる気泡の安定性を示したグラフである。
【図６】実施例２及び比較例２のヒドロキシニトリルリアーゼ生成の結果を示したグラフである。
【図７】実施例３、４及び比較例３のアントシアニン生成の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜植物組織の培養方法＞
本発明の植物組織の培養方法は、エチレンを含有するガスからなる微細気泡（以下、「エチレン含有気泡」という。）を含む培養液（以下、「培養液（Ａ）」という。）で植物組織を培養する方法である。培養液（Ａ）に含まれるエチレンは、培養する植物組織に対して植物ホルモンとして働き、カルスを誘導する効果、及び／又は有用物質の生成を促進する効果が得られる。
【００１５】
本発明における培養液（Ａ）（培地）の基質成分は、通常の植物組織の培養に用いられるものが使用でき、培養する植物組織の種類に応じて適宜選択できる。
培養液（Ａ）としては、例えば、ムラシゲ−スクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地）、リンスマイヤー−スクーグ培地（Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地）、ホワイト培地（Ｗｈｉｔｅ培地）、ガムホルグ培地（Ｇａｍｂｏｒｇ培地）、ニッチ培地（Ｎｉｔｃｈ培地）、ニッチ−ニッチ培地（Ｎｉｔｃｈ−Ｎｉｔｃｈ培地）、コーレンバッハ−シュミット培地（Ｋｏｈｌｅｎｎｂａｃｈ−Ｓｃｈｍｉｄｔ培地）、もしくはそれらの改変培地が挙げられる。
【００１６】
培養液（Ａ）には、界面活性作用を示す物質（界面活性剤）が添加されていることが好ましい。培養液（Ａ）に界面活性剤が添加されていることにより、培養液（Ａ）中で基質成分が植物組織に摂取されやすくなるとともに、エチレン含有気泡を安定して発生させやすくなるため培養液（Ａ）の製造が容易になる。また、培養液（Ａ）中におけるエチレン含有気泡の安定性も向上する。
【００１７】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等を用いることができるが、好ましくは非イオン性界面活性剤である。また、非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル及びポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレン縮合物等が挙げられる。また、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの一例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０の名でＡｔｌａｓ  Ｐｏｗｄｅｒ社から市販されている。）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられる。
これら以外にも、トライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ−５８）やノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４０）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利用可能である。
これらの界面活性剤は、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
培養液（Ａ）中の界面活性剤の含有量は、界面活性剤の種類によっても異なるが、０．００１〜５質量％であることが好ましく、０．０１〜２質量％であることがより好ましい。界面活性剤の含有量が０．００１質量％以上であれば、培養液（Ａ）中での植物組織による基質成分の摂取効率が向上するうえ、培養液（Ａ）の製造が容易になり、培養液（Ａ）でのエチレン含有気泡の安定性も向上する。また、界面活性剤の含有量が５質量％以下であれば、エチレン含有気泡を生成する際の過度な発泡を防止しやすく、コストを低減できる。
【００１９】
また、培養液（Ａ）には、植物ホルモンとしてエチレン以外の他の植物ホルモンが含まれていてもよい。
他の植物ホルモンとしては、例えば、オーキシン類、サイトカイニン類、ジベレリン類、アブジシン類、ブラシノステロイド類、ジャスモン酸、もしくはこれらの類似物質、エリシター活性を有する物質、及び増殖促進活性を有する物質が挙げられる。
エリシター活性を有する物質としては、例えば、多糖、蛋白質、ペプチド、脂質、有機酸、キチン、キトサン、ペクチン、ガラクチュロン酸、アルギン酸、グルカン、キシラン等のオリゴ糖、重金属（イオン）、ジャスモン酸及びその誘導体、カビ、酵母、細菌の破砕物等が挙げられる。
増殖促進活性を有する物質としては、例えば、ココナッツミルク、カゼイン分解物、酵母抽出物、ビタミン類、無機塩類、ペプチド性植物増殖因子等が挙げられる。
これら他の植物ホルモンは、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２０】
培養液（Ａ）におけるエチレン含有気泡のエチレン濃度は、０．１〜９９．９体積％であることが好ましく、２〜９９体積％であることがより好ましく、５〜９０体積％であることがさらに好ましい。前記エチレン濃度が０．１体積％以上であれば、エチレンによるカルスの誘導や有用物質の生成促進等の効果が得られやすい。また、前記エチレン濃度が９９．９体積％以下であれば、コストを低減できる。
【００２１】
エチレン含有気泡中のエチレン濃度は、該エチレン含有気泡の発生に用いるエチレンを含有するガス（以下、「エチレン含有ガス」という。）中のエチレンの濃度を調整することにより調整できる。
エチレン含有ガス中のエチレン濃度の調整に使用するガスは、培養液（Ａ）による植物組織の培養に悪影響を与えないガスであればよく、例えば、窒素ガス、希ガス等の不活性ガス、酸素ガス、水素ガス、炭酸ガスが挙げられる。なかでも、培養の安定性の点から、窒素ガス、希ガス等の不活性ガスが好ましい。
【００２２】
本発明の培養方法では、培養液（Ａ）中にエチレン含有ガスを微細気泡として存在させる。これにより、培養液（Ａ）中にエチレン含有気泡を長期間留めておくことができ、エチレンによる効果が高効率でかつ安定して得られる。
本発明者等による検討により、従来のエチレンを用いた培養方法では、エチレンが水に難溶であるためにそのほとんどが気相中に放散され、エチレンの効果が充分に得られていなかったことがわかった。この問題に対しては、培養液にエチレンを連続的に通気しながら培養を行う方法が考えられたが、該方法は培養細胞へのストレス付与、及び培養液内でのエチレン濃度の不均一化等が生じるためにエチレンを効果的に用いることが難しかった。そこで本発明者等は、これらの問題は気泡径の大きな気泡（数ｍｍ〜数ｃｍ）を用いているためであると考え、エチレン含有ガスを微細気泡として用いることを試みた。これにより、培養液中にエチレンを安定して維持することができ、連続的な供給を行わなくてもエチレンによる効果を高効率でかつ安定して得られることを見い出した。
【００２３】
培養液（Ａ）中のエチレン含有気泡の平均気泡径は、１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましく、１μｍ以下であることがさらに好ましい。ただし、平均気泡径とは培養液（Ａ）中のエチレン含有気泡の気泡径の数平均を意味する。
気泡径が１０μｍ以下であれば、培養液（Ａ）中でエチレン含有気泡が上昇していく速度が小さくなるため、該気泡が培養液（Ａ）から気相中に放出されるまでの滞留時間を長くしやすく、エチレンによるカルスの誘導や有用物質の生成促進の効果が充分に得られやすい。
また、エチレン含有気泡の平均気泡径は、気泡形成の容易性から、０．０５μｍ以上であることが好ましく、０．１μｍ以上であることがより好ましい。
エチレン含有気泡の平均気泡径の測定方法としては、例えば、レーザー回折散乱法により測定するＬＳ  １３  ３２０（ベックマンコールター社製）、細孔電気抵抗法により測定するＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター社製）等が挙げられる。
【００２４】
培養液（Ａ）中のエチレン含有気泡の気泡数は、培養液（Ａ）１ｍＬあたり、１，０００個以上であることが好ましく、１０，０００個以上であることがより好ましく、５０，０００個以上であることがさらに好ましい。気泡数が培養液（Ａ）１ｍＬあたり１，０００個以上であれば、エチレンによるカルスの誘導や有用物質の生成の促進効果が得られやすく、特に１０，０００個以上であればエチレン含有気泡と植物組織の接触効率が向上して得られる効果がより高まる。
また、エチレン含有気泡の気泡数は、気泡形成の容易性から、培養液（Ａ）１ｍＬあたり、１０００万個以下であることが好ましく、１００万個以下であることがより好ましい。
エチレン含有気泡の気泡数の測定方法としては、例えば、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター社製）が挙げられる。
【００２５】
培養液（Ａ）は、該培養液（Ａ）の基質成分、及び必要に応じて界面活性剤、他の植物ホルモンを含有する培養液に、エチレン含有ガスを通気してエチレン含有気泡を発生させることにより製造できる。以下、エチレン含有ガスを通気する前の培養液を培養液（ａ）という。
培養液（ａ）にエチレン含有ガスを通気する方法としては、微細気泡を発生させることができる方法であればよく、公知の旋回流方式、加圧溶解方式、機械撹拌方式、超音波方式、膜透過方式、もしくは、これらの方式を組み合わせた方式等を用いることができる。
【００２６】
以下、培養液（Ａ）を製造する培養液製造装置の一例を示して詳細に説明する。
［培養液製造装置］  
（第１実施形態）
本実施形態の培養液製造装置１は、図１に示すように、培養液（ａ）を貯留する培養液貯留部１１と、エチレン含有ガスを貯留するエチレン含有ガス貯留部１２（以下、単に「ガス貯留部１２」という。）と、培養液（ａ）にエチレン含有ガスを通気してエチレン含有気泡を発生させるエチレン含有気泡発生部１３（以下、単に「気泡発生部１３」という。）と、培養液（Ａ）を供給する培養液供給部１４とを備えている。
また、培養液貯留部１１と気泡発生部１３とが配管２１で連結されており、ガス貯留部１２と気泡発生部１３とが配管２２で連結されており、気泡発生部１３と培養液供給部１４とが配管２３で連結されている。
【００２７】
培養液貯留部１１は、培養液（Ａ）の必要成分を有するエチレン含有気泡を含まない培養液（ａ）を貯留するものである。
培養液貯留部１１の大きさは特に限定されず、培養規模に応じて製造する培養液（Ａ）の量を考慮して任意に設定できる。また、培養液貯留部１１の形状も特に限定されない。
培養液貯留部１１の材質も特に限定されず、例えば、セラミック製、ガラス製、金属製、フッ素樹脂製の貯留槽が挙げられる。
培養液貯留部１１は１つの槽であってもよく、複数の槽の組み合わせであってもよい。
【００２８】
ガス貯留部１２は、エチレン含有ガスを貯留するものである。
ガス貯留部１２としては、エチレンを気体として貯留するものであることが好ましく、ガスボンベ等の耐圧容器が好ましい。また、ガス貯留部１２には、液体状や固体状の物質を収容し、該物質を化学的もしくは生物的に反応させることによりエチレンを発生させて貯留するような容器を用いてもよい。
【００２９】
気泡発生部１３は、培養液貯留部１１から供給される培養液（ａ）中に、ガス貯留部２４から供給されるエチレン含有ガスを通気して微細気泡化し、エチレン含有気泡を発生させるものである。
気泡発生部１３は、微細気泡を発生させることができるものであればよく、この例では、培養液を液送するポンプ１５と、旋回流を生じさせて微細気泡を発生させる気泡発生ノズル１６とを有する旋回流方式による気泡発生部である。気泡発生ノズル１６としては、例えば、特開２００６−１４２３００公報等に記載のものが挙げられる。
【００３０】
培養液供給部１４は、気泡発生部１３で得られたエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ）を供給するものである。
培養液供給部１４の構造は特に限定されないが、バルブ等により培養液の供給及び停止が行える構造が好ましい。
また、培養液供給部１４には、培養液（Ａ）を供給するためのポンプ等の液送機構が設けられていることが好ましい。ただし、気泡発生部１３にポンプ等の培養液の液送機構（この例ではポンプ１５）が設けられている場合等には、培養液供給部１４に液送機能が設けられていなくてもよい。
【００３１】
以下、培養液製造装置１の作用について説明する。
培養液（ａ）の組成及び量は、培養液（Ａ）による培養対象となる植物組織の種類や培養規模等に応じて適宜決定できる。
まず、ポンプ１５により、培養液貯留部１１に貯留されている培養液（ａ）が配管２１を通じて気泡発生部１３に液送され、気泡発生ノズル１６に通液される。同時に、ガス貯留部１２に貯留されているエチレン含有ガスが配管２２を通じて気泡発生部１３の気泡発生ノズル１６に供給される。エチレン含有ガスの供給機構は、加圧により気泡発生部１６に送られる機構であってもよく、減圧により気泡発生部１６内に吸引される機構であってもよい。
気泡発生ノズル１６内では、通液される培養液（ａ）により旋回流が形成されており、該旋回流により生じた渦流の中心部には、エチレンを含む気体空洞部が形成される。このエチレンを含む気体空洞部の先端部が、培養液（ａ）の旋回流によるせん断力により引きちぎられることにより、エチレンを含有する微細気泡が発生する。
得られる培養液（Ａ）中のエチレン含有気泡の平均気泡径、及び気泡数は、気泡発生ノズル１６の形状及び生じさせる旋回流の度合い、気泡発生ノズル１６に通液する培養液（ａ）の液流量、エチレン含有ガスの流量、界面活性剤の種類や添加量等を調整することにより制御できる。
気泡発生ノズル１６により発生したエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ）は、配管２３を通じて培養液供給部１４に液送され、バルブ等の操作により所定の容器等に供給される。
【００３２】
気泡発生部１３は、前述の旋回流方式には限定されず、加圧溶解方式、機械攪拌方式、超音波方式、膜透過方式を採用したものであってもよく、それらを組み合わせたものであってもよい。
例えば、膜透過方式としては、多孔質ガラス膜を有し、内部に培養液を通液できる多孔質ガラスモジュール（気泡発生部）等が挙げられる。該多孔質ガラスモジュールでは、モジュール内に通液されている培養液に対して、微細な孔を多数有する多孔質ガラス膜を介してエチレン含有ガスを通気することにより、培養液中にエチレン含有気泡を発生させることができる。
【００３３】
膜透過方式における培養液（Ａ）中のエチレン含有気泡の平均気泡径は、エチレン含有ガスを通気する孔の平均孔径、エチレン含有ガスの圧力、通液する培養液の液流量、界面活性剤の種類や添加量を調整することにより制御できる。また、気泡数は、多孔質ガラス膜の表面積（孔数）、エチレン含有ガスの通気時間、通液する培養液の液流量、界面活性剤の種類や添加量を調整することにより制御できる。
【００３４】
前記モジュールにおいて平均気泡径が１０μｍ以下のエチレン含有気泡を充分に発生させるには、エチレン含有ガスを通気する孔の平均孔径は０．０５〜１μｍであることが好ましい。
通気する際のエチレン含有ガスの圧力は、通常、膜の平均孔径や界面活性剤の添加量等に依存するが、例えば、膜の平均孔径が０．０８μｍの場合、ガス圧力は２．５〜３．５ＭＰａであることが好ましい。
培養液の液流量は、作製する培養液の量により異なるが、培養液１Ｌの場合、０．５〜１０Ｌ／分であることが好ましい。
【００３５】
（第２実施形態）
次に、本発明の培養液製造装置の他の実施形態である培養液製造装置２について図２に基づいて説明する。培養液製造装置２において、培養液製造装置１と同じ部分については同じ符号を付して説明を省略する。
培養液製造装置２は、図２に示すように、培養液貯留部１１とガス貯留部１２と気泡発生部１３と培養液供給部１４と切替弁１７とを備えており、培養液貯留部１１と気泡発生部１３とが配管２１で連結されており、ガス貯留部１２と気泡発生部１３とが配管２２で連結されており、気泡発生部１３と切替弁１７とが配管２４で連結されており、培養液貯留部１１と切替弁１７とが配管２５で連結されており、切替弁１７と培養液供給部１４とが配管２６で連結されている。
【００３６】
培養液製造装置２では、培養液（ａ）にエチレン含有ガスを通気してエチレン含有気泡を発生させる際、切替弁１７により配管２４と配管２５とを連通させ、培養液貯留部１１から液送される培養液（ａ）を、配管２１、気泡発生部１３、配管２４、配管２５を順次通過させて培養液貯留部１１に戻して循環させる。これにより、連続的にエチレン含有ガスを通気することで、エチレン含有気泡の気泡数を容易に向上させることができる。
そして、充分なエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ）が得られた後、切替弁１７を配管２４と配管２６が連通するように切り替え、培養液（Ａ）を培養液供給部１４から供給する。
【００３７】
（第３実施形態）
次に、本発明の培養液製造装置のさらに他の実施形態である培養液製造装置３について図３に基づいて説明する。培養液製造装置３において、培養液製造装置１と同じ部分については同じ符号を付して説明を省略する。
培養液製造装置３は、図３に示すように、培養液貯留部１１とガス貯留部１２と気泡発生部１３と培養液供給部１４とを備えており、培養液貯留部１１と気泡発生部１３の上流側とが配管２１で連結されており、ガス貯留部１２と気泡発生部１３とが配管２２で連結されており、気泡発生部１３の下流側と培養液貯留部１１とが配管２７で連結されており、培養液貯留部１１と培養液供給部１４とが配管２８で連結されている。
【００３８】
培養液製造装置３では、培養液貯留部１１から液送される培養液（ａ）を、配管２１、気泡発生部１３、配管２７を順次通過させて培養液貯留部１１へと戻して循環させる。これにより、連続的にエチレン含有ガスを通気することで、エチレン含有気泡の気泡数を容易に向上させることができる。そして、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ）を、配管２８を通じて培養液供給部１４に送液し、培養液供給部１４から供給する。
培養液製造装置３における培養液供給部１４は、培養液貯留部１１の底部付近の一画に連結されることが好ましい。
【００３９】
（その他の実施形態）
なお、本発明の培養液製造装置は、前述の培養液製造装置１〜３に限定されるものではない。例えば、培養液貯留部を、培養液（ａ）の溶媒成分（水等に、必要に応じて界面活性剤を添加した成分）を貯留する溶媒貯留部と、溶質成分（栄養成分）を収容する溶質収容部とに分け、前記溶媒貯留部を気泡発生部１３の上流側、前記溶質収容部を気泡発生部１３の下流側に配置したものであってもよい。このような配置とすれば、気泡発生部１３において培養液（ａ）の溶質成分による汚れや詰まり等が生じ難くなるため、装置のメンテナンス頻度を低減できる。
また、気泡発生部１３の下流側に、培養液（Ａ）の生物汚染（コンタミネーション）を抑制する殺菌部を設けてもよい。
【００４０】
［培養方法］
本発明の培養方法は、以上説明した培養液（Ａ）を用いて植物組織を培養する方法である。
本発明の培養方法に用いる植物組織は、エチレンによってカルスの誘導及び／又は有用物質の生成の促進が可能な植物種の組織であればよく、例えば、色素、酵素等の有機化合物等の有用物質を生成する植物、並びにこれに類する蘚苔類、地衣類、菌類、藻類、微細藻類、海草、海藻等の淡水性及び海水性の植物組織が挙げられる。
また、植物組織は、植物組織の一片、細胞、器官、培養細胞、プロトプラスト等、種々の形態で使用できる。ただし、本発明の培養方法は、前記形態の植物組織の培養に限るものではない。
【００４１】
適切な濃度のエチレンによりカルスの誘導が促進される植物組織の具体例としては、例えば、酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを生成するアーモンド（Ｐｒｕｎｅｓ  ａｍｙｇｄｕｌｃｉｓ）、Ｉｎｄｏｌｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ類を生成するニチニチ草（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）等が挙げられる。
エチレンにより有用物質の生成が促進される植物組織の具体例としては、例えば、色素であるアントシアニンを生成するイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄｓ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）；Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ等のＴａｘｏｉｄ化合物を生成するイチイ科イチイ属植物（例えばＴａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ）；Ｉｎｄｏｌｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ類を生成するニチニチ草（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）；酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを生成するアーモンド（Ｐｒｕｎｅｓ  ａｍｙｇｄｕｌｃｉｓ）等が挙げられる。
【００４２】
本発明の培養方法は、培養液（Ａ）を用いる以外は通常の植物組織の培養方法を用いることができる。
培養温度は、培養する植物組織の種類によっても異なるが、植物組織の培養で通常用いられる培養温度は１０〜４０℃であり、２０〜３７℃であることが好ましい。
また、本発明の培養方法では、必要に応じて、培養液（Ａ）に酸素ガス、水素ガス、炭酸ガス等を供給しながら培養を行ってもよい。
【００４３】
植物組織の培養における培養液（Ａ）のｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）は、培養する植物組織に応じて適宜条件を選択できる。培養液（Ａ）のｐＨは、エチレン含有気泡を発生させる前の培養液（ａ）のｐＨを予め調整しておいてもよく、エチレン含有気泡を発生させた後に培養液（Ａ）のｐＨを調整してもよい。培養液（Ａ）のＤＯは、エチレン含有気泡を発生させるエチレン含有ガスに予め所定の濃度で酸素を含有させておいてもよく、培養中に酸素ガスを別途供給するようにしてもよい。
【００４４】
また、培養中の光照射量、攪拌、振とう等の条件についても、培養する植物組織に応じて適宜条件を選択でき、通常の植物組織の培養に比べて特別な条件を設定する必要はない。本発明における培養液（Ａ）では、植物組織の培養に通常採用される条件で攪拌又は振とうを行っても、エチレン含有気泡の安定性はほとんど低下しないため、エチレンによる効果を安定して充分に得ることが可能である。
また、本発明の培養は、植物組織の種類や培養規模に応じて、回分式、半回分式、半連続式、連続式等の方式を適宜用いることができる。
【００４５】
以上説明した本発明の培養方法は、水に難溶な気体であるエチレンを培養液に供給する方法であるにも関わらず、エチレンを含むガスからなる微細気泡とすることによって該微細気泡を培養液（Ａ）中に長期間留めることができる。そのため、培養液（Ａ）からエチレンが気相中に放散することが抑制されることでエチレン濃度を長期間維持することができ、カルスの誘導や有用物質の生成促進の効果が高効率でかつ安定して得られる。また、本発明の培養方法は、培養中にエチレンを連続的に供給し続ける必要がないため、経済性にも優れている。
【００４６】
［植物組織培養装置］
本発明の植物組織の培養は、例えば、以下に示す植物組織培養装置により行うことができる。
本実施形態の植物組織培養装置１００（以下、単に「培養装置１００」という。）は、図４に示すように、培養液（Ａ）を製造する前述の培養液製造装置１と、培養液（Ａ）を殺菌する殺菌装置４と、培養液（Ａ）により植物組織を培養する培養槽５とを備えている。また、培養装置１００では、培養液製造装置１の培養液供給部１４と殺菌装置４とが配管２９で連結されており、殺菌装置４と培養槽５とが配管３０で連結されている。
培養槽５における配管３０の接続位置は、特に限定されるものではないが、培養槽５の底部付近とすることが好ましい。このような位置に配管３０を接続することにより、培養液（Ａ）をより緩やかに培養槽５に供給することができ、培養液（Ａ）中におけるエチレン含有気泡の滞留時間が向上し、エチレンによる効果が得られやすくなる。
【００４７】
殺菌装置４は、培養液（Ａ）の生物汚染（コンタミネーション）を抑制するために、培養液（Ａ）の殺菌を行う装置である。殺菌装置４は、培養液（Ａ）を殺菌して生物汚染を抑制できるものであればよく、紫外線、放射線、光触媒、金属触媒、放電、プラズマ、オゾン、フィルター等を利用している公知の殺菌装置が使用できる。
【００４８】
培養槽５には、培養液（Ａ）を攪拌する攪拌装置５１と、培養液（Ａ）に酸素を供給する散気部材５２と、必要に応じて培養液（Ａ）の各種項目を検知するセンサー５３とが設けられている。
培養槽５の形状及び大きさは特に限定されず、培養規模に応じて適宜決定できる。例えば、培養槽５の形状を水路形状や平板浅型形状とすることにより、水耕栽培のような形で植物を栽培（培養）する場合に適用することも可能である。
また、培養槽５の材質は特に限定されず、セラミック製、ガラス製、金属製、フッ素樹脂製が好ましい。
【００４９】
攪拌装置５１は、培養液（Ａ）を撹拌することにより、植物組織（細胞）と、エチレン及び基質成分との接触効率を向上させる役割を果たす。攪拌装置５１の羽根５１ａは、攪拌によって植物組織と培養液（Ａ）との接触効率を向上させることができるものであればよく、この例では２枚羽根型である。
【００５０】
散気部材５２は、酸素ガス、水素ガス、炭酸ガス等の所望のガスを培養液（Ａ）に供給する役割を果たす。
散気部材５２としては、例えば、培養槽５に供給するガス（酸素ガスもしくは酸素濃度を高めたガス等）を送るためのブロワ（図示せず）等に接続されており、該ガスがフィルター等の除菌部材を介して供給される形態が挙げられる。
散気部材５２の形状は、気泡径を小さくして酸素溶解効率を向上させやすい点から、多孔質板等の形状が好ましい。
また、散気部材５２の材質は特に限定されず、セラミック製、ガラス製、金属製、フッ素樹脂製等のものを用いることが好ましい。
【００５１】
センサー５３は、ｐＨ、ＤＯ、酸化還元電位（ＯＲＰ）、液温、細胞量、エチレン濃度、有用物質量（代謝物質量）等、各々の培養対象及び目的に応じた項目を検知できるものが挙げられる。
また、培養槽５にセンサー５３を設ける場合には、その測定値に応じて培養に最適な条件をフィードバック制御できる制御装置を併設することが好ましい。
【００５２】
以上説明した培養装置１００では、培養液製造装置１で製造された培養液（Ａ）が、配管２９を通じて殺菌装置４に液送されて殺菌され、培養槽５に供給される。次いで、培養液（Ａ）に植物組織を接種し、攪拌装置５１により攪拌し、散気装置５２により酸素を供給し、センサー５３により各種項目を検知しながら培養を行う。
【００５３】
なお、本発明の植物組織培養装置は、前述の培養装置１００には限定されない。例えば、培養液製造装置１の代わりに、培養液製造装置２、３を備えた装置であってもよく、それ以外の培養液製造装置を備えた装置であってもよい。
また、培養装置１００では通気撹拌型の培養槽５を示したが、培養を行う植物組織の種類や培養規模に応じて通気型、エアリフト型、気泡塔型、回転ドラム型等の一般的に用いられている培養槽を適宜用いることができる。また、培養槽５内の圧力を高めることで、培養液（Ａ）中のエチレンや酸素の溶存濃度を高める機構を有していてもよい。
【００５４】
また、培養する植物組織によっては散気部材５２を有さない装置であってもよく、例えば、培養液製造装置１と同様の装置を用いて、培養液（Ａ）と同じ組成でかつ酸素を含むガスからなる微細気泡を含む培養液を製造し、該培養液を培養槽５に供給する培養装置であってもよい。
その他、攪拌装置５１を有さない装置であってもよく、例えば、培養槽５の内側、もしくは外側表面に振動部材等を配置して、培養槽５自体を振動させることにより培養液（Ａ）の撹拌を行う装置であってもよい。また、センサーを用いない培養装置であってもよい。
さらに、本発明の培養装置は、回分式、半回分式、半連続式、連続式等、いずれの方式を採用したものであってもよい。
【００５５】
＜有用物質の製造方法＞
本発明の有用物質の製造方法は、植物組織が生成する有用物質を製造する方法であって、前述の培養方法により植物組織を培養する工程を含む。
本発明の製造方法により製造する有用物質としては、例えば、色素であるアントシアニンを生成するイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄｓ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）；Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ等のＴａｘｏｉｄ化合物を生産するイチイ科イチイ属植物（例えばＴａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ）；Ｉｎｄｏｌｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ類を生産するニチニチ草（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）；酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを生成するアーモンド（Ｐｒｕｎｅｓ  ａｍｙｇｄｕｌｃｉｓ）等が挙げられる。
【００５６】
植物組織の培養工程については、前述の培養方法において説明した通りである。
培養により増殖させた植物組織から有用物質を回収する方法については特に限定されず、従来の回収方法の中から、対象となる植物組織及び有用物質の種類に応じて適した方法を使用できる。
【００５７】
以上説明した本発明の有用物質の製造方法は、培養中に培養液（Ａ）内にエチレン含有気泡を長期間維持できるため、培養液（Ａ）中のエチレン濃度を高く維持することができ、エチレンによって有用物質の生成が促進され、高い生産性で安定して目的の有用物質を製造できる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。なお、本実施例においては特に明記しない限り「％」は「質量％」を意味する。
＜エチレン含有気泡の安定性＞  
エチレン含有気泡を含む培養液を製造し、該培養液中におけるエチレン含有気泡の安定性を評価した。
［実施例１］
培養液製造装置は、気泡発生部１３として、多孔質ガラス膜（平均孔径０．０８μｍ、ＳＰＧテクノ社製）を用いた膜透過方式を採用した気泡発生部を有する図３の培養液製造装置３（以下、「製造装置３Ａ」という。）を用いた。
また、培養液は、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地に界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を０．２％添加した培養液（ａ１）を用い、液温は２５℃に設定した。
製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ１）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、該気泡発生部において培養液（ａ１）中に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ１）を製造した。
培養液（Ａ１）の作成直後に培養液（Ａ１）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径及び気泡数をＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（検出限界０．４μｍ、ベックマンコールター社製）で測定したところ、平均気泡径は１．０μｍ、気泡数（測定気泡径：０．４〜２μｍ）は培養液（Ａ１）１ｍＬあたり約５７，０００個であった。
【００５９】
［比較例１］
実施例１の前記培養液（ａ１）に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを、内径５ｍｍのチューブ管を用いて１０分間通気して培養液（Ｂ１）を製造した。
培養液（Ｂ１）の作成直後に培養液（Ｂ１）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径及び気泡数をＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（ベックマンコールター製）で測定したところ、平均気泡径は約５１μｍ、培養液（Ｂ１）１ｍＬあたりの気泡数（測定気泡径：２〜８０μｍ）は、約３００個であった。通気時に生成する気泡径が数ｍｍ〜数ｃｍの気泡は、すぐに浮上して気相中に放散されてしまい、測定できなかった。
【００６０】
［評価方法］
実施例１及び比較例１で得られたエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ１）、（Ｂ１）について、１時間、３時間、２４時間、及び７２時間静置したときの、培養液（Ａ１）、（Ｂ１）がそれぞれ含有するエチレン濃度をガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１８Ａ、島津製作所製、カラム：Ｐｏｒａｐａｃｋ  Ｑ（Ｍｅｓｈ６０／８０）、測定温度７５℃）により測定した。その結果を図５に示す。
【００６１】
図５に示すように、実施例１の培養液（Ａ１）では、７２時間経過後においてもエチレン濃度が５ｍｇ／Ｌに維持されており、エチレンを含有する微細気泡を用いることで培養液（Ａ１）中にエチレンが長時間保持された。
一方、比較例１の培養液（Ｂ１）は、２４時間後にはすでにエチレン濃度がほぼ０ｍｇ／Ｌとなっており、７２時間後には培養液（Ｂ１）中のエチレン含有気泡が全て空気中に放散していた。
【００６２】
＜ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）の製造＞
アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄｕｌｃｉｓ）の培養細胞を用いたヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）の生成試験を行った。
［実施例２］
接種するアーモンド細胞は、アーモンドの種を７０％エタノール溶液、及び５％ＮａＣｌＯ溶液（Ｔｗｅｅｎ８０を０．２％添加）を用いて殺菌し、蒸留水で３回洗浄した後、細かく切断した組織片を、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｍｇ／Ｌ）、ベンジルアミノプリン（１ｍｇ／Ｌ））を用いて振とう培養（２５℃、１２０ｒｐｍ、暗条件）を行い、誘導したカルス細胞を用いた。
また、培養液は、ＧａｍｂｏｒｇＢ５培地に、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｍｇ／Ｌ）、ベンジルアミノプリン（１ｍｇ／Ｌ）、及びＴｗｅｅｎ８０（０．２％）を添加し、孔径０．２μｍのフィルター（２５ＣＳ０２０ＡＳ、アドバンテック東洋社製）でろ過した培養液（ａ２）を用いた。
実施例１と同じ製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ２）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、気泡発生部において培養液（ａ２）に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ２）を製造した。
培養液（Ａ２）中のエチレン含有気泡の平均気泡径及び気泡数を前記Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３により測定したところ、平均気泡径は０．９μｍ、気泡数（測定気泡径：０．４〜２μｍ）は培養液（Ａ２）１ｍＬあたり約５５，０００個であった。
次いで、培養液（Ａ２）の２００ｍＬに前記カルス細胞を接種し、２５℃、暗条件下において、７日間の振とう培養（１２０ｒｐｍ）を行った。
【００６３】
［比較例２］
実施例２の前記培養液（ａ２）にエチレン含有ガスを通気させずにそのまま用いた以外は、実施例２と同様にして前記カルス細胞の振とう培養を行った。
【００６４】
［評価方法］
ＨＮＬの生成量を、以下の方法によりＨＮＬ酵素活性を測定することにより評価した。
培養前（カルス細胞の接種直後）と培養後の各培養液について、カルス細胞を乳鉢ですり潰して蒸留水５０ｍＬを添加し、その上層水を２回遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上澄水をサンプル水とした。次に、０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（７ｍＬ、ｐＨ５．５）に基質としてＤＬ−マンデロトリル（０．９３１μＬ）を添加した溶液を調製し、該溶液３ｍＬに前記サンプル液（１０μＬ）を添加し、基質が分解されることにより生成するベンズアルデヒドによる吸光度変化（２０℃）を波長２４９．６ｎｍで３０秒間測定した。ＨＮＬ活性は、前記測定における反応初速度から算出した。培養前のカルス細胞についての結果を図６（Ａ）、培養後（７日後）のカルス細胞についての結果を図６（Ｂ）に示す。
【００６５】
図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、実施例２の培養液（Ａ２）のカルス細胞では、培養後のＨＮＬ活性が０．３（Ｕ／ｇ−ｆｒｅｓｈ  ｃｅｌｌ）であった。これは、培養液（Ａ２）が微細なエチレン含有気泡を含んでいることによって、ＨＮＬの生成が促進されたためである。
一方、比較例２のカルス細胞では、７日間の培養後においてもカルス細胞のＨＮＬ活性は確認できず、ＨＮＬの生成は促進されなかった。
【００６６】
＜アントシアニン（赤色色素）の製造＞
バラ（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄｓ）の培養細胞を用いたアントシアニン（赤色色素）の生成試験を行った。
［実施例３］
接種するバラ細胞には、バラの花びらから採取した組織片を、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地）を用いて振とう培養（２５℃、１２０ｒｐｍ、暗条件）を行い、カルス培養して得られた変異株を用いた。
また、培養液は、ＭＳ培地にＴｗｅｅｎ８０を０．２質量％添加し、孔径０．０８μｍのフィルター（トラックエッチ・ニュークリポア、ワットマン社製）でろ過した培養液（ａ３）を用いた。
培養液製造装置は、気泡発生部１３として、マイクロバブル発生装置（ＢＴ−５０、有限会社バブルタンク製）を用いた旋回流方式を採用した気泡発生部を有する図３の培養液製造装置３（以下、「製造装置３Ｂ」という。）を用いた。
製造装置３Ｂを用い、気泡発生部１６であるマイクロバブル発生装置中に培養液（ａ３）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ３）を製造した。
培養液（Ａ３）の作成直後に培養液（Ａ３）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径及び気泡数を前記Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３により測定したところ、平均気泡径は１０μｍ、気泡数（測定気泡径：２〜８０μｍ）は培養液（Ａ３）１ｍＬあたり約３，２００個であった。
次いで、培養液（Ａ３）の２００ｍＬに前記変異株を接種し、２５℃、暗条件下において、３日間、振とう培養（１２０ｒｐｍ）を行った。
【００６７】
［実施例４］
実施例１と同じ製造装置３Ａを用い、該製造装置３Ａにおいて、気泡発生部内部に培養液（ａ３）を循環（液流量１．３Ｌ／分）させ、該気泡発生部において培養液（ａ３）に、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスを３．５ＭＰａの圧力で多孔質ガラス膜を介して１０分間通気し、エチレン含有気泡を含む培養液（Ａ４）を製造した。
培養液（Ａ４）の作成直後に培養液（Ａ４）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径及び気泡数を前記Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３により測定したところ、平均気泡径は１．０μｍ、気泡数（測定気泡径：０．４〜２μｍ）は培養液（Ａ４）１ｍＬあたり約５２，０００個であった。
次いで、培養液（Ａ４）の２００ｍＬに前記変異株を接種し、２５℃、暗条件下において、３日間、振とう培養（１２０ｒｐｍ）を行った。
【００６８】
［比較例３］
実施例３の前記培養液（ａ３）に対し、窒素で希釈したエチレン濃度５．０体積％のエチレン含有ガスをガラス製散気フィルター（ガラスボールフィルターＧ４、木下理化工業社製）によりバブリングして培養液（Ｂ２）を得た。
培養液（Ｂ２）の作成直後に培養液（Ｂ２）中に残存するエチレン含有気泡の平均気泡径及び気泡数を前記Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３により測定したところ、平均気泡径は４８μｍ、気泡数（測定気泡径：２〜８０μｍ）は培養液（Ｂ２）１ｍＬあたり約７００個であった。通気時に生成する気泡径が数ｍｍ〜数ｃｍの気泡は、すぐに浮上して気相中に放散されてしまい、測定できなかった。
次いで、培養液（Ｂ２）の２００ｍＬに前記変異株を接種し、２５℃、暗条件下において、３日間、振とう培養（１２０ｒｐｍ）を行った。
【００６９】
［評価方法］
アントシアニン濃度は、培養前（変異株の接種直後）と培養後の各培養液について、培養液にＨＣｌ−メタノール溶液を加えて振とうすることにより色素を抽出し、該色素を含む懸濁液を０．４５μｍのディスミックフィルター（２５ＣＳ０４５ＡＳ、アドバンテック東洋社製）でろ過した後、波長５３０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
培養前の各培養液のアントシアニン濃度を図７（Ａ）、培養後（３日後）の各培養液のアントシアニン濃度を図７（Ｂ）に示す。
【００７０】
図７に示すように、平均気泡径が１０μｍのエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ３）を用いた実施例３のアントシアニン濃度は、培養前が０．２ｇ／Ｌであるのに対して培養後には０．７ｇ／Ｌまで増加しており、アントシアニンの生成量が増加していた。同様に、平均気泡径が１．０μｍのエチレン含有気泡を含む培養液（Ａ４）を用いた実施例４のアントシアニン濃度は、培養前が０．２ｇ／Ｌであるのに対して培養後には１．１ｇ／Ｌまで増大しており、アントシアニンの生成量が増加していた。これは、培養液（Ａ３）及び（Ａ４）が微細なエチレン含有気泡を含んでいることによって、アントシアニンの生成が促進されたためである。
また、実施例３と実施例４の比較から、エチレン含有気泡の平均気泡径が小さいほど、アントシアニンの生成の促進効果が大きいことがわかった。これは、平均気泡径が小さいほど培養液中でエチレン含有気泡が維持されやすく、エチレンによる効果が得られやすいためである。
【００７１】
一方、平均気泡径が４８μｍのエチレン含有気泡を発生させた培養液（Ｂ２）を用いた比較例３のアントシアニン濃度は、培養前が０．２ｇ／Ｌであるのに対して培養後は０．４ｇ／Ｌとあまり増加しておらず、アントシアニンの生成の促進効果が低かった。
以上の結果より、本発明の製造方法によれば、植物組織の培養において有用物質の生成が促進され、高い生産性で目的の有用物質が製造できることが示された。
【符号の説明】
【００７２】
１、２、３  培養液製造装置  ４  殺菌装置    ５  培養槽  １１  培養液貯留部  １２  エチレン含有ガス貯留部  １３  エチレン含有気泡発生部  １４  培養液供給部  １５  ポンプ  １６  気泡発生ノズル  １７  切替弁  ２１、２２、２３、２４、２７、２８、２９、３０  配管  ５１  撹拌装置  ５１ａ  羽根  ５２  散気部材  ５３  センサー  １００  植物組織培養装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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