(57)【要約】【課題】  低ｐＨで蛍光強度が増大する新規高分子化合物及び該新規高分子化合物を有する蛍光プローブを提供すること。【解決手段】  疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、前記高分子化合物の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、前記高分子化合物の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物。
【請求項２】
疎水環境感受性蛍光色素と、ポリアミノ酸と、を有する高分子化合物であって、前記ポリアミノ酸の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸であることを特徴とする請求項２に記載の高分子化合物。
【請求項４】
前記疎水環境感受性蛍光色素が、ソルバトフルオロクロミック色素であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の高分子化合物。
【請求項５】
前記ソルバトフルオロクロミック色素が、アニリノナフタレン、ナイルレッド、ダンシル、ニトロベンゾオキサジアゾール、ピレンまたはそれらの誘導体のいずれかであること、を特徴とする請求項４に記載の高分子化合物。
【請求項６】
生体の病変部位を検出するための蛍光プローブであって、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の高分子化合物を有することを特徴とする蛍光プローブ。
【請求項７】
疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、
ｐＨ７．４において前記高分子化合物の二次構造がヘリックスである確率が、ｐＨ５．５においてヘリックスである確率よりも高いことを特徴とする高分子化合物。
【請求項８】
疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、
前記高分子化合物の二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化する結果、
ｐＨが５．５における前記高分子化合物の蛍光強度が、
ｐＨが７．４における前記高分子化合物の蛍光強度よりも大きいこと、を特徴とする高分子化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規高分子化合物及び該新規高分子化合物を有する蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍や炎症などの病変部位を検出することは、生物学、医学、とりわけ臨床検査分野及び体内画像診断領域において、極めて重要な課題である。このような検出を高感度かつ高精度で行うために、病変部位を特異的に高感度に検出する分子プローブが求められている。
【０００３】
一方、腫瘍や炎症などの病変部位と、正常組織との環境の相違点として、ｐＨが挙げられる。すなわち、腫瘍や炎症部位（ｐＨ５〜６程度）では正常組織（ｐＨ７．４程度）に比べて低いｐＨを示すことが知られている。また、悪性度の高い腫瘍の一部では、ｐＨ５．５程度まで低下しているものも知られている。そこで、ｐＨ応答性のある化合物が腫瘍や炎症などを検出することのできる分子プローブの候補として期待されている。
【０００４】
ｐＨ応答性のある化合物として、特許文献１には、ｐＨ応答性のある蛍光色素をｐＨ応答性のないポリマーに結合させた蛍光性高分子インジケーターが開示されている。また、特許文献１では、このインジケーターの周辺環境を高ｐＨ環境から低ｐＨ環境へと変化させていくと、低ｐＨ領域（ｐＨ５付近）で蛍光強度が小さくなることが示されている。
【０００５】
特許文献２では、増粘剤、安定剤として用いられるポリカルボン酸の定量分析などを行うための蛍光標識化ポリカルボン酸として、アニリノナフタレンで蛍光標識したポリカルボン酸が開示されている。この蛍光標識化ポリカルボン酸を用いると、周辺環境が高ｐＨから低ｐＨへと変化することにより、ポリカルボン酸同士が会合するため、会合体の内側に疎水性の高い領域が形成され、そこにアニリノナフタレンが取り込まれて蛍光発光が起こると考えられる。
【０００６】
さらに、特許文献３では、膜蛋白質の抽出手段などに用いることができる両親媒性重合体として、ポリグルタミン酸を有する第１の側鎖とアニリノナフタレンを有する第２の側鎖を有するポリマーが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平２−２５１３８号公報
【特許文献２】特開２００１−２７８９１４号公報
【特許文献３】特許第２８８４０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載のインジケーターは、ｐＨが下がることによって蛍光強度が小さくなる。そのため、このインジケーターを低ｐＨ部位の検出に用いようとすると、ｐＨが低いことに起因する蛍光強度の減少とインジケーターの喪失あるいはインジケーターと夾雑物の相互作用などに起因する蛍光強度の減少とを区別することが困難である。したがって、低ｐＨ部位を正確に検出しづらいという問題があると考えられる。
【０００９】
また、特許文献２の蛍光標識化ポリカルボン酸では、主に会合によって疎水性の高い領域が形成されるため、低ｐＨ領域に応答性があるものの、十分な蛍光強度が得られないという問題があると考えられる。さらに、特許文献２の蛍光標識化ポリカルボン酸は、ビニルポリマーを骨格としており、生体内での代謝、排泄の観点から、生体内利用には限界がある。
【００１０】
また、特許文献３に記載の両親媒性重合体は、ｐＨ８〜９で最大蛍光波長が変化するため、悪性度の高い腫瘍（ｐＨ５．５程度）と正常部位（ｐＨ７．４程度）とを区別することはできないと考えられる。
【００１１】
そこで本発明は上記問題に鑑み、ｐＨ５．５程度の環境に置かれたときの方がｐＨ７．４程度の環境に置かれたときに比べて、蛍光強度が増大し、かつ高い蛍光強度を発生する新規高分子化合物及び該新規高分子化合物を有する蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、前記高分子化合物の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物である。
【００１３】
また、本発明の第二は、疎水環境感受性蛍光色素と、ポリアミノ酸と、を有する高分子化合物であって、前記ポリアミノ酸の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物である。
【００１４】
また、本発明の第三は疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、ｐＨ７．４において前記高分子化合物の二次構造がヘリックスである確率が、ｐＨ５．５においてヘリックスである確率よりも高いことを特徴とする高分子化合物である。
【００１５】
また、本発明の第四は、疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、前記高分子化合物の二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化する結果、ｐＨが５．５における前記高分子化合物の蛍光強度が、ｐＨが７．４における前記高分子化合物の蛍光強度よりも大きいこと、を特徴とする高分子化合物である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の高分子化合物及び蛍光プローブは、悪性度の高い腫瘍部位（ｐＨ５．５程度）の正確な検出に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（ａ）本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ１ならびにアニリノナフタレンスルホン酸の１０％血清含有ＰＢＳ中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ、（ｂ）本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ１ならびにアニリノナフタレンスルホン酸の水中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ
【図２】本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＮＲの水中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ
【図３】本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ−Ｇｅｌの水中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ
【図４】本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ１、アニリノナフタレンスルホン酸、ならびにＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６７のＰＢＳ中における蛍光強度の血清濃度依存性を示すグラフ
【図５】（ａ）本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ２、３の水中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ、（ｂ）本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ４の水中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ、（ｃ）本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮ５、６の水中における蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフ
【図６】本発明の高分子化合物の一例であるＰＧＡ−ＡＮの水中における中性−酸性領域の蛍光強度比を示すグラフ
【図７】様々な色素の、ＤＭＦ中とＰＢＳ中における蛍光強度の比を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を実施するための最良の形態について以下に説明する。
【００１９】
本発明は、疎水環境感受性蛍光色素を有する高分子化合物であって、前記高分子化合物の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物である。
【００２０】
ここで、「高分子化合物」とは、ポリアミノ酸、糖鎖などの天然高分子や合成高分子などを有する化合物を意味する。なお本発明の高分子化合物は重量平均分子量（Ｍｗ）が１０００以上である化合物、と定義する。また、前記高分子化合物は、前記高分子化合物の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がるものであればどのようなものでもよい。なお、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化することを以下「ヘリックス転移」という。
【００２１】
また、別の本発明は、疎水環境感受性蛍光色素と、ポリアミノ酸と、を有する高分子化合物であって、前記ポリアミノ酸の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がること、を特徴とする高分子化合物である。
【００２２】
なお、「ｐＨが低下する」とは、本発明の高分子化合物の周囲のｐＨがアルカリ性から酸性の向きへと変化することを意味する。
【００２３】
また、後述する本発明のメカニズムに基づいて理論的に考察すると、本発明の高分子化合物は、ｐＨ５．５においてヘリックス構造をとる確率がｐＨ７．４でヘリックス構造をとる確率より大きければよい。ただし、その確率の差は有意な（化合物群として観察した場合に検出可能な）ものでなければならない。たとえば、ｐＨ５．５においてヘリックス構造をとる確率がｘ％であってｐＨ７．４でヘリックス構造をとる確率がｙ％である場合、ｘがｙよりも５以上大きければ、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化しているといってよい。
【００２４】
本発明の高分子化合物がヘリックス構造やランダムコイル構造をとっていることを確認するためには、当該技術分野で知られている様々な手法、例えば円偏光二色性（ＣＤ；Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）測定、赤外線吸収スペクトル測定、蛍光測定、核磁気共鳴（ＮＭＲ；Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スペクトル分析法、中性子散乱、質量スペクトル分析法などを用いる。例えば、紫外部のＣＤスペクトルの測定により、αヘリックス構造、β構造、ランダムコイル構造の存在や含率を評価できる。具体的には、ポリアミノ酸溶液のＣＤスペクトルでは、αヘリックス構造は２０８ｎｍと２２２ｎｍに負の極大、１９２ｎｍに正の極大を示し、ランダムコイル構造では２００ｎｍ近傍のみに負の極大を示すため、ＣＤスペクトルから二次構造の解析が可能である。
【００２５】
別の手法として、ポリアミノ酸の赤外線吸収スペクトルでは、波数が１５００〜１７００ｃｍ−１の範囲にペプチド結合の吸収帯が存在しており、１６００〜１７００ｃｍ−１のアミドＩ、１５００〜１５５０ｃｍ−１のアミドＩＩの振動帯が二次構造評価に用いられる。αヘリックス構造では１６５０ｃｍ−１と１５４６ｃｍ−１に、ランダムコイル構造では１６５５ｃｍ−１と１５３５ｃｍ−１に吸収帯が存在する。これらの吸収を観察する事で、二次構造の解析が可能である。ＣＤスペクトル測定はポリアミノ酸溶液を使用するが、赤外線吸収スペクトル測定では、粉末やフィルム状のサンプルの測定も可能である。
【００２６】
ここで「高分子化合物が疎水環境感受性蛍光色素を有する」とは、高分子化合物の有する基の一部が疎水環境感受性蛍光色素によって置換されていることを意味する。なお、本発明において、疎水環境感受性蛍光色素とは、血清や水などの媒体中で、当該色素の周囲が親水環境から疎水環境へと変化したとき、蛍光強度が増大する色素、と定義する。また、本発明の疎水環境感受性蛍光色素は、色素自身の運動性が高い状態から低い状態へと変化したときに、蛍光強度が増大するものが望ましい。
【００２７】
ここで、「高分子化合物がポリアミノ酸を有する」とは、当該高分子化合物がポリアミノ酸またはポリアミノ酸誘導体のうちいずれかを含むことを意味する。なお、本発明においてポリアミノ酸とは、１０個以上のアミノ酸がペプチド結合によって連なった化合物と定義する。そして、ポリアミノ酸誘導体とは、ポリアミノ酸の一部あるいは該ポリアミノ酸の有する基の一部が置換された高分子化合物と定義する。
【００２８】
例えば、ポリアミノ酸誘導体としては、ヒドロキシアルキルアミノ基、スルホアルキルアミノ基、あるいはステアロイル基を側鎖に持つポリグルタミン酸やポリアスパラギン酸、カルボキシル基を部分修飾されたポリリジンなどが挙げられる。また、ポリアミノ酸誘導体の主鎖基本骨格の繰り返し単位は、アミノ酸以外のモノマーからなる高分子との共重合体であってもよい。共重合体である場合には、ブロックコポリマー、ランダムコポリマーあるいはグラフトコポリマーであってもよい。
【００２９】
本発明の高分子化合物を用いて悪性度の低い腫瘍や炎症部位等も含めて（正常でない部位を）数多く検出しようとした場合、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化するｐＨは、５．７以上とすることが好ましく、６．０以上とすることがさらに好ましい。一方、本発明において、正常部位中の若干ｐＨの低下した領域がノイズとして検出されないようにするという観点からは、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化するｐＨは、６．９未満とすることが好ましく、６．５未満とすることがより好ましい。
【００３０】
（ｐＨ変化検出のメカニズム）
本発明の高分子化合物を用いたｐＨ変化の検出は、当該高分子化合物が検体中に存在する検出対象（たとえば、ｐＨ５．５程度の低ｐＨ部位）に近づくことによって、高分子化合物の周囲のｐＨが低下し、前記高分子化合物から発せられる蛍光強度が大きくなることを利用して行われる。より具体的には次のようなメカニズムを利用して行う。
【００３１】
まず、本発明の高分子化合物が検出対象に近づくと、当該高分子化合物の周囲のｐＨが低下する。このｐＨ低下によって前記高分子化合物の二次構造の変化（ヘリックス転移）、さらには、前記高分子化合物同士の会合や凝集が起こるため、少なくとも一部の疎水環境感受性蛍光色素の周囲に疎水環境が形成され、さらに色素自身の運動性が低下する。それにより、色素から発せられる蛍光強度が大きくなる。つまり、ｐＨ低下を蛍光強度の増加として検出することができる。また、本発明の高分子化合物は、ヘリックス転移に伴う会合や凝集によって見かけの分子量が増加し、拡散速度が低下するため、低ｐＨ領域に留まりやすくなる。
【００３２】
例えば、生体内の腫瘍や炎症などの酸性部位を検出したい場合、高分子化合物としては、疎水環境感受性蛍光色素と、ポリグルタミン酸とを有する高分子化合物を好適に用いることができる。ポリグルタミン酸は、生理的ｐＨ領域（ｐＨ７．４程度）ではランダムコイル状態で水溶性であるが、低ｐＨ領域ではヘリックス転移（コンフォメーションの変化）を起こし、ヘリックス構造へと変化する。そして、さらに低いｐＨになると水に不溶になる。すなわち、生理的ｐＨ領域で疎水環境感受性蛍光色素は多数の水分子と接触する親水環境におかれる上、色素自身が高い運動性を持つ結果、当該色素からの蛍光強度は低く抑えられる。一方、低ｐＨ領域ではポリグルタミン酸がヘリックス構造をとり、さらにヘリックス同士の会合や凝集が起こる。その結果、疎水環境感受性蛍光色素はヘリックス構造内部や会合体内部などに形成される疎水環境に置かれ、さらに、色素自身の運動が束縛される結果、蛍光強度が増加し、ｐＨ低下を検出可能となる。つまり、腫瘍や炎症部位（ｐＨ５〜６）では、正常部位（ｐＨ７．４程度）に比べて蛍光強度が大きくなるので、腫瘍や炎症部位などの病変部位を蛍光強度の増大として検出可能である。
【００３３】
なお、「疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がる」ことは、当該技術分野で知られている様々な手法、例えば蛍光測定、核磁気共鳴スペクトル分析法などの手法で確かめる事ができる。蛍光測定では、まず、対象となる疎水環境感受性蛍光色素を様々な極性の溶媒、例えば、水、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール、クロロホルム、ヘキサンなどに溶解させ、それぞれの蛍光変化の溶媒依存性を観察する。例えば、疎水環境感受性蛍光色素がアニリノナフタレンである場合、ヘキサンのような疎水性溶媒中では蛍光波長が短波長側にシフトして蛍光強度が増大し、水のような親水性溶媒中では蛍光波長が長波長側にシフトして蛍光強度が減少することが観察できる。
【００３４】
次に、疎水環境感受性蛍光色素が結合したポリアミノ酸の蛍光強度の測定を行う。ここで得られた蛍光強度とあらかじめ測定された蛍光強度の変化の溶媒依存性から、ポリアミノ酸に結合している疎水環境感受性蛍光色素の周囲の親水性、疎水性を評価する事ができる。例えば、アニリノナフタレンが結合したポリアミノ酸の蛍光強度が増加している場合、アニリノナフタレンの周囲の疎水性が上がっていることを示し、蛍光強度が減少している場合、アニリノナフタレン周囲の疎水性が下がっていることを示す。またＮＭＲスペクトル分析法では、該色素の運動性の低下に伴うＮＭＲ信号ピークのブロードニングを観察する事で、該色素の周囲の疎水性を評価する事ができる。すなわち、該色素周囲の疎水性が上がると、疎水性相互作用により互いに集まり、色素の運動性が低下するため、該色素からのＮＭＲ信号のピークはよりブロードになる。
【００３５】
また、本発明の高分子化合物としては、検体中において、前記高分子化合物の周囲がｐＨ７．４程度のときに比べてｐＨ５．５程度のときの方が蛍光強度が大きくなるものを用いることができる。なお、検体として例えば、血清、水などが挙げられる。
【００３６】
以上を踏まえた上で、本発明の高分子化合物の好適な実施形態について説明する。
【００３７】
（ポリアミノ酸）
本発明の高分子化合物がポリアミノ酸を有する場合、ポリアミノ酸は、周囲のｐＨが低下した場合、ｐＨが５．５以上７．４未満で二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化するものであることが好ましい。したがって、ポリアミノ酸は、周囲のｐＨが５．５以上７．４未満のときに疎水基に、ｐＨが７．４以上のときに親水基になるような基を有することが好ましい。このような基の例として、カルボキシル基が挙げられる。また、アミノ基、グアニジノ基、フェニル基、イミダゾール基、リン酸基、チオール基、スルホン基などの解離基を含んでいても良い。これらの基は、高分子化合物の周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がるように、種類及び含率を適宜選択することができる。
【００３８】
ポリアミノ酸としては、これらの基のいずれかを有する、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、リシンのホモポリマーを含むことが好ましく、特にはグルタミン酸のホモポリマー、アスパラギン酸のホモポリマーを含むものが好ましい。なお、ポリアミノ酸は上記のホモポリマーを複数含んでいてもよい。また、ポリアミノ酸は、周囲のｐＨが低下した場合に、ｐＨが５．５以上７．４未満の範囲で、二次構造がランダムコイルからヘリックスへと変化し、前記疎水環境感受性蛍光色素の周囲の疎水性が上がるものであればよい。したがって、グルタミン酸、リシン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシンなどを構成要素とするランダムポリマー、ブロックコポリマー、グラフトポリマーなどでもよい。
【００３９】
さらに、ポリアミノ酸は、ｐＨが変化することで二次構造が変化するものが好ましく、その数平均重合度が２０〜１０００であることが、水溶性かつ低粘性という点から好ましい。数平均重合度が２０未満の場合、ポリアミノ酸の二次構造変化が生じにくくなると同時に色素の周囲に疎水環境が形成されにくくなると考えられる。
【００４０】
さらに、本発明の高分子化合物および蛍光プローブを生体内で利用する場合は、生体内に存在する酵素により分解可能で、生体に対する毒性がなく、抗原性がないものが好ましい。この観点から、ポリアミノ酸として特に好ましいのは、生体適合性がよく、ｐＨ５．５以上７．４未満の範囲でヘリックス転移を起こす、重合度１６３〜４３４の範囲にあるポリグルタミン酸である。
【００４１】
以上で挙げたアミノ酸は生分解性の点から通常はＬ体が好ましいが、Ｄ体またはＬ体とＤ体の混合物でもよく、非天然アミノ酸でもよい。また、血中における化合物の半減期を延長する目的で、非天然アミノ酸もしくはＤ体アミノ酸残基を積極的に高分子化合物に導入することも可能である。
【００４２】
さらに本発明の高分子化合物に、抗体、断片化抗体、レセプター結合分子などを結合させてもよい。この場合、ターゲットをより特異的に検出することが可能となる。
【００４３】
以上に挙げたポリアミノ酸は多数市販されており、当業者が適宜のものを容易に入手し利用できる。なお、ポリアミノ酸は、逐次的なペプチド液相合成法あるいはペプチド固相合成法、またはＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）法などにより容易に合成することが可能である。
【００４４】
（疎水環境感受性蛍光色素）
本発明において疎水環境感受性蛍光色素とは、先に定義したものである。なお、本発明における疎水環境感受性蛍光色素はｐＨ応答性を有しないものであることが好ましい。なぜなら、本発明の高分子化合物の有するポリアミノ酸がｐＨ応答性を有しているため、疎水環境感受性蛍光色素がｐＨ応答性を有してしまうと、本発明の高分子化合物が所望のｐＨ範囲で応答性を示すようにするための調整が難しくなるからである。さらに、本発明の高分子化合物を蛍光プローブとして生体内で用い、かつ生体外から蛍光を観察する場合、疎水環境感受性蛍光色素はその吸収波長および発光波長が近赤外領域にあるものを選択することが望ましい。一方、本発明の高分子化合物を蛍光プローブとして生体内で用い、生体内観察あるいは観察対象を生体外に取り出して観察を行う場合は、紫外可視光領域に吸収、発光波長を有する疎水環境感受性蛍光色素でも良い。
【００４５】
（ソルバトフルオロクロミック色素）
疎水環境感受性蛍光色素の中で、蛍光強度が顕著に増大するものとしてソルバトフルオロクロミック色素が知られている。実施例で後述するように、本発明においてソルバトフルオロクロミック色素は、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）中の蛍光強度がＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の蛍光強度に対して２０倍以上の色素、と定義する。
【００４６】
なお、ソルバトフルオロクロミック色素としては、例えば、アニリノナフタレン、ナイルレッド、ダンシル（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸）、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）、ピレンまたはそれらの誘導体が挙げられる。これらの中では、下記の式（１）で示されるアニリノナフタレン誘導体、もしくは式（２）で示されるナイルレッド誘導体が好ましい。その中でも、アニリノナフチルマレイミドやヒドロキシル基修飾ナイルレッド（ＤＥＡＨＢ：９−Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｈ−ｂｅｎｚ［ａ］ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ−５−ｏｎｅ）を用いることが特に好ましい。なお、式（１）および式（２）中のＲはマレイミド基、ヒドロキシル基などの結合活性基を示す。
【００４７】
【化１】
2010053354.tif 000002
【００４８】
【化２】
2010053354.tif 000003
【００４９】
（疎水環境感受性蛍光色素の結合）
疎水環境感受性蛍光色素は、疎水環境感受性蛍光色素が結合していない高分子化合物の有する基の一部に、従来周知のカップリング反応によって結合させることができる。例えば、前記基がカルボキシル基の場合は、カルボキシル基と反応性を示すアミノ基、チオール基あるいはヒドロキシル基などを有する色素をカップリングさせることができる。前記基がアミノ基の場合には、アミノ基と反応性を示すカルボキシル基、スルホン酸基、ヒドロキシスクシンイミド基、アルデヒド基、チオール基、イソチオシアネート基、グリシジル基などを有する色素をカップリングさせることができる。前記基がヒドロキシル基やチオール基の場合には、それらの基と反応性を示すカルボキシル基、スルホン酸基、ハロゲン、ジスルヒド、マレイミド基などを有する色素をカップリングさせることができる。
【００５０】
また、高分子化合物と疎水環境感受性蛍光色素との結合は直接結合に限らず、適宜スペーサー分子を介して結合していてもよい。スペーサー分子としてはアルカンジチオール、アルカンジアミンなどの二官能性短鎖アルカン、二官能性オリゴエチレンオキシド鎖や酸無水物を利用できる。一般的には、スペーサー分子の末端の基を前記高分子化合物の有する基と、スペーサー分子のもう一方の末端の基を色素の有する基とそれぞれ結合させればよい。前記高分子化合物と疎水環境感受性蛍光色素間の結合や、スペーサー分子の種類は上記のものに限定されることはなく、種々の利用可能な結合方法及びスペーサーから当業者が適宜選択できることは言うまでもない。なお、本発明の高分子化合物は、生体内で利用する場合、水溶性であることが好ましいため、前記式（１）、（２）の疎水環境感受性蛍光色素は、高分子化合物全体の重合度に対して０．０００５〜０．０３の割合で導入されていることが好ましい。
【００５１】
（末端残基）
前記高分子化合物の末端に結合する残基は、ｐＨ変化の検出性能を妨げないものであればどのようなものでもよい。例えば、当該高分子化合物を合成するときに用いる重合開始剤やキャップ剤などによって決まる基が結合していてもよい。なお、高分子化合物がポリアミノ酸を有する場合、ポリアミノ酸のＮ末端については、例えば、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＣＯＣＨ３などが考えられる。そして、Ｃ末端については、例えば、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ２）ｚＣＨ３（ただし、Ｚは２乃至５の正整数）などが考えられる。
【００５２】
（好ましい高分子化合物の例）
本発明の高分子化合物の特に好ましい実施形態の例として、下記の一般式（３）と（４）に示されるものが挙げられる。下記例はそれぞれ、ポリグルタミン酸にアニリノナフチルマレイミド、ヒドロキシル基修飾ナイルレッドを導入したものである。なお、数平均重合度（ｍ＋ｎ）は５０〜１０００の範囲にあり、色素修飾率ｎ／（ｍ＋ｎ）は０．０００５〜０．０３の範囲にある。
【００５３】
【化３】
2010053354.tif 000004
【００５４】
【化４】
2010053354.tif 000005
【００５５】
（ハイドロゲル化）
本発明の高分子化合物は、分子間架橋によりハイドロゲル化したものであってもよい。具体的には、多官能性の架橋剤を用いて、当該高分子化合物が有する疎水環境感受性蛍光色素以外の基同士を結合することでハイドロゲル化することができる。この結合は、上述の、高分子化合物と疎水環境感受性蛍光色素との結合方法と同様にして実施することができる。架橋剤としてはジアミン化合物、ジオール化合物、ジグリシジルエーテルなどが用いられる。また、実施例にて後述するが、公知の方法にしたがって本発明の高分子化合物をナノサイズのハイドロゲル粒子に成形してもよい。例えば、逆ミセルをナノサイズの反応場として利用した成形方法により、ナノサイズのハイドロゲル粒子が得られることが知られている。架橋反応や架橋剤の種類は上記のものに限定されることはなく、種々の利用可能な架橋反応及び架橋剤から当業者が適宜選択できる。本発明の高分子化合物のナノゲル粒子は、タンパク質などの夾雑物と色素の接触を抑制し、かつＥＰＲ効果による高い腫瘍滞留性を実現できるｐＨ応答性蛍光プローブとしての応用が期待できる。
【００５６】
（本発明の高分子化合物の用途）
本発明の高分子化合物の好適な用途は、疾病に関連した異常なｐＨ変化を検出する蛍光プローブである。より具体的には、炎症や腫瘍の部位（ｐＨ５〜６程度）におけるｐＨ低下の蛍光センシングを可能とする蛍光プローブである。より好ましくは、悪性度の高い腫瘍部位（ｐＨ５．５程度）における、ｐＨ低下の蛍光センシングを可能とする蛍光プローブである。もっとも、本発明のプローブの適用対象はこれらの疾患に限定されることはない。
【００５７】
さらに、本発明の高分子化合物は、細胞内輸送やタンパク分解機構を理解するための、蛍光プローブとして有用である。具体的には、細胞内エンドソーム内の酸性環境を検出し、エンドサイトーシスを追跡することが可能とする蛍光プローブである。このようなプローブは、細胞生物学分野における応用が期待できる。
【実施例】
【００５８】
本発明の高分子化合物の一例として、ポリグルタミン酸を用いる例示化合物ならびに調製方法を以下の実施例に示した。従って、これらの方法を参照することで、さらに出発原料、反応試薬、反応条件などを適宜修飾ないし改変することにより、所望の蛍光プローブを容易に調製可能である。なお、本発明の高分子化合物の製造方法は下記実施例に記載された方法に限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１）
（高分子化合物の合成）
（実施例１−１）
（ポリ−Ｌ−グルタミン酸のスクシンイミド化）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＧＡ；Ｍｗ４１０００、ペプチド研究所）のナトリウム塩１ｇを１００ｍＬの蒸留水に溶解させ、塩酸を滴下しながら撹拌し、脱塩ＰＧＡを析出させた。得られた脱塩ＰＧＡはアセトンで十分に洗浄し、エーテル洗浄後、真空乾燥させた。次に、洗浄、乾燥したＰＧＡ（１５０ｍｇ）を、１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；１３．５ｍｇ）と、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；２２．２ｍｇ）を加えた後、一晩室温にて振とうした。仕込み比において、全ＣＯＯＨに対して１０％スクシンイミド化させている。反応後、未反応のＥＤＣ、ＮＨＳおよびＥＤＣの反応後生成物である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）尿素を除去するために無水アセトンを用いて再沈させた。その後、遠心分離を行い、デカンテーションによってさらに２回洗浄してから、へキサン洗浄、エーテル置換し、減圧乾燥することでスクシンイミド化ＰＧＡを得た。
【００６０】
（実施例１−２）
（スクシンイミド化ＰＧＡへのアニリノナフチルマレイミドの修飾）
上記実施例１−１に従って調製したスクシンイミド化ＰＧＡ（１５０ｍｇ）を、無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた。その溶液にＮ−（１−アニリノナフチル−４−）−マレイミド（アニリノナフチルマレイミド：ＡＮＭ）（２１ｍｇ）と６−アミノ−１−ヘキサンチオール（１１ｍｇ）を混合し、一晩撹拌したＤＭＳＯ溶液１．５ｍＬを加え、遮光下室温で一晩攪拌した。反応溶液を、アセトンを用いて再沈させ、デカンテーションによってさらに２回洗浄してから、へキサン洗浄、エーテル置換後、減圧乾燥することでアニリノナフチルマレイミド修飾ＰＧＡ（ＰＧＡ−ＡＮ１）１３６ｍｇを得た（収率９０％）。得られたＰＧＡ−ＡＮ１のアニリノナフチル（ＡＮ）基の吸光度（３５０ｎｍ）測定より、ＰＧＡの全ＣＯＯＨに対するＡＮ基の修飾率（ｎ／ｎ＋ｍ）は０．００６であることが確認された。得られたＰＧＡ−ＡＮ１の構造式を式３に示す。式中、ｍは３１６、ｎは１．９であった。
【００６１】
同様にして、（実施例１−１）に従って調製した分子量の異なるスクシンイミド化ＰＧＡに対してもアニリノナフチルマレイミドの修飾を行った（ＰＧＡ−ＡＮ２ならびにＰＧＡ−ＡＮ３）。また、アニリノナフチルマレイミド量を約５倍の量を導入した系も行った（ＰＧＡ−ＡＮ４）。さらに、６−アミノ−１−ヘキサンチオールの替わりに１１−アミノ−１−ウンデカンチオールを用いる系も行った（ＰＧＡ−ＡＮ５ならびにＰＧＡ−ＡＮ６）。表１に合成したＰＧＡ−ＡＮ１〜６の分子量、重合度、ＡＮ修飾率、リンカーアルキル鎖長を示した。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
（実施例１−３）
（スクシンイミド化ＰＧＡへの９−Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｈ−ｂｅｎｚ［ａ］ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ−５−ｏｎｅの修飾）
上記実施例１−１に従って調製したスクシンイミド化ＰＧＡ（１５０ｍｇ）を、無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させ、その溶液にナイルレッド誘導体９−Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｈ−ｂｅｎｚ［ａ］ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ−５−ｏｎｅ（ＤＥＡＨＢ）２０ｍｇを混合し、遮光下室温で一晩攪拌した。反応溶液を、アセトンに再沈させ、デカンテーションによってさらに２回洗浄してから、へキサン洗浄、エーテル置換後、減圧乾燥することでＤＥＡＨＢ修飾ＰＧＡ（ＰＧＡ−ＮＲ）１１６ｍｇを得た（収率７６％）。得られたＰＧＡ−ＮＲのＤＥＡＨＢ基の吸光度（６００ｎｍ）測定より、ＰＧＡの全ＣＯＯＨに対するＤＥＡＨＢ基の修飾率は０．００２であることが確認された。得られたＰＧＡ−ＮＲの構造式を式４に示す。式中、ｍは３１７、ｎは０．６であった。
【００６４】
（実施例１−４）
（ハイドロゲル粒子の作製）
ＰＧＡ−ＡＮ１  １０ｍｇを蒸留水１ｍＬに溶解させ、その溶液に架橋剤としてエチレングリコールグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）０．１ｍＬを添加した。これに直ちに、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム（ＡＯＴ）の０．０５Ｍのｎ−ヘキサン溶液を２００ｍＬ添加し、超音波照射後、室温で５日間撹拌した。次いで、エバポレーターにて溶媒を除去した後、一晩真空乾燥させた。アセトン／メタノール（９／１）で３回洗浄し、エーテル置換後、真空乾燥させＰＧＡ−ＡＮ１のハイドロゲル粒子ＰＧＡ−ＡＮ−Ｇｅｌを得た。得られたＰＧＡ−ＡＮ−Ｇｅｌを水に分散後、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した。動的光散乱（ＤＬＳ）測定により、直径約１００ｎｍの粒子が形成されていることを確認した。
【００６５】
（実施例２）
（高分子化合物の評価）
（実施例２−１）
（ＰＧＡ−ＡＮの水中における蛍光強度のｐＨ依存性測定）
ＰＧＡ−ＡＮ１水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを石英セルに入れ、室温で蛍光測定を行った。ｐＨの調整には６ＮのＨＣｌと６ＮのＮａＯＨを用いた。励起波長は３５０ｎｍ、蛍光強度は４４０〜４７０ｎｍに出現する最大蛍光波長の値を測定した。ＰＧＡ−ＡＮ１水溶液のｐＨを変化させたときの蛍光強度変化を図１（ｂ）中に黒丸で示す。ｐＨを下げるにつれて、蛍光強度の増加が観察された。一方、ｐＨ７以上では蛍光強度は変化しなかった。また、ｐＨ３以下においてプローブの沈殿が見られた。ｐＨ４における蛍光強度はｐＨ７．４の時と比較して約１０倍増加した。図１（ｂ）の中に、比較例として、色素単独、すなわちアニリノナフタレンスルホン酸の水中における蛍光強度のｐＨ依存性を測定した結果をプロットした。図１（ｂ）から明らかなように、蛍光強度のｐＨ依存性は観測されなかった。以上の結果より、疎水環境感受性蛍光色素であるアニリノナフチル基をポリグルタミン酸の有する基に導入した蛍光プローブＰＧＡ−ＡＮ１はｐＨ７．４未満において蛍光強度が増加するため、生理的ｐＨ７．４からのｐＨ低下を検出できるプローブとして利用できることがわかった。
【００６６】
同様にして、蛍光プローブＰＧＡ−ＡＮ２〜６についても蛍光強度のｐＨ依存性測定を行った。ＰＧＡ−ＡＮ２、３の結果を図５（ａ）に、ＰＧＡ−ＡＮ４の結果を図５（ｂ）に、ＰＧＡ−ＡＮ５、６の結果を図５（ｃ）に示す。いずれにおいても、ｐＨが下がるにつれて、蛍光強度の増大が観察された。図６には、ＰＧＡ−ＡＮ１〜６の水中におけるｐＨ７とｐＨ５での蛍光強度比、ならびにｐＨ７とｐＨ４での蛍光強度比を示した。図６から、ＰＧＡ−ＡＮ４、５、６に比べ、ＰＧＡ−ＡＮ１、２、３は高い蛍光強度比を示すことがわかった。分子量、ＡＮ修飾率、ＰＧＡ骨格とＡＮ基の間のアルキルリンカーの長さなどが酸性領域における二次構造の変化に影響していることが考えられる。
【００６７】
（実施例２−２）
（ＰＧＡ−ＮＲの水中における蛍光強度のｐＨ依存性測定）
実施例２−１と同様にして、ＰＧＡ−ＮＲ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光測定を行った。励起波長は５５０ｎｍで、蛍光強度は６００〜６６０ｎｍに出現する最大蛍光波長の値を測定した。ＰＧＡ−ＮＲ水溶液のｐＨを変化させたときの蛍光強度変化を図２に示す。ｐＨを下げるにつれて、蛍光強度の増加が観察された。一方ｐＨ７以上では蛍光強度は変化しなかった。また、ｐＨ４における蛍光強度はｐＨ７．４と比較して約２．４倍に増加した。なお、ＤＥＡＨＢは水に不溶であったため、色素単独の蛍光測定は行えなかった。以上の結果より、ソルバトフルオロクロミック色素であるナイルレッド誘導体をポリグルタミン酸の有する基に導入した高分子化合物ＰＧＡ−ＮＲは、ｐＨ７．４未満において蛍光強度が増加するため、生理的ｐＨ７．４からのｐＨ低下を検出できる蛍光プローブとして利用できることがわかった。また、ＰＧＡ−ＡＮに比べ、励起波長ならびに蛍光波長がより長波長側（５５０ｎｍ以上）であり、細胞や生体組織中における蛍光プローブとしての利用性が高いことがわかった。
【００６８】
（実施例２−３）
（ＰＧＡ−ＡＮ−Ｇｅｌの水中における蛍光強度のｐＨ依存性測定）
実施例２−１と同様にして、ＰＧＡ−ＡＮ−Ｇｅｌ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光測定を行った。励起波長は３５０ｎｍ、蛍光強度は４４０〜４７０ｎｍに出現する最大蛍光波長の値を測定した。ＰＧＡ−ＡＮ−Ｇｅｌ水溶液のｐＨを変化させたときの蛍光強度変化を図３に示す。ｐＨを下げるにつれて、蛍光強度の増加が観察された。ｐＨ３における蛍光強度はｐＨ７．４と比較して約１．６倍に増加した。以上の結果より、ＰＧＡ−ＡＮをナノサイズでハイドロゲル化した蛍光プローブは、ハイドロゲル化していない蛍光プローブと同様に、生理的ｐＨ７．４からのｐＨ低下を検出できる蛍光プローブとして利用できることがわかった。
【００６９】
（実施例２−４）
（ＰＧＡ−ＡＮ１の１０％血清中における蛍光強度のｐＨ依存性測定）
実施例２−１と同様にして、ＰＧＡ−ＡＮ１の１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有リン酸緩衝生理水（ＰＢＳ）（プローブ濃度１ｍｇ／ｍＬ）における蛍光測定を行った。励起波長は３５０ｎｍで、蛍光強度は４４０〜４７０ｎｍに出現する最大蛍光波長の値を測定した。ＰＧＡ−ＡＮ１溶液のｐＨを変化させたときの蛍光強度変化を図１（ａ）中に黒丸で示す。ｐＨを下げるにつれて、蛍光強度の増加が観察された。一方ｐＨ７以上では蛍光強度は変化しなかった。ｐＨ４．６以下においてプローブの沈殿が見られた。ｐＨ５における蛍光強度はｐＨ７と比較して約４倍増加した。図１（ａ）中に、比較例として、色素単独、すなわちアニリノナフタレンスルホン酸の蛍光強度のｐＨ依存性を白丸でプロットした。図１（ａ）から明らかなように、蛍光強度のｐＨ依存性は観測されなかった。以上の結果より、ソルバトフルオロクロミック色素であるアニリノナフチル基をポリグルタミン酸側鎖に導入した高分子化合物ＰＧＡ−ＡＮ１は１０％血清中においてもｐＨ応答機能を維持する蛍光プローブとして用いることができることが示された。
【００７０】
（実施例２−５）
（ＰＧＡ−ＡＮ１の蛍光強度の血清濃度依存性評価）
ＰＧＡ−ＡＮ１と血清タンパクとの相互作用を、ＰＧＡ−ＡＮ１の蛍光強度の血清濃度依存性を測定することで評価した。低分子プローブとして、色素単独、すなわちアニリノナフタレンスルホン酸を比較のため用いた。さらに、低分子ｐＨ応答性プローブとして、酸性化されるとｐＨ依存的に蛍光強度が上昇するＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６７（インビトロジェン社製；励起波長３７３ｎｍ、蛍光波長４２５ｎｍ）を比較のために用いた。各プローブ溶液を０、１０、１００％ＦＣＳのＰＢＳ溶液に添加し、十分混合した後、蛍光強度を測定した。図４には、それぞれ無血清ＰＢＳ溶液中の蛍光強度で規格化された蛍光強度とＦＣＳ濃度の関係をプロットした。低分子プローブでは血清濃度の増加に伴い、蛍光強度が上昇した。これはプローブが血清タンパクと疎水性相互作用などにより結合し、その結果、蛍光強度が増加したものと思われる。一方、ＰＧＡ−ＡＮ１では１００％ＦＣＳ中においても著しい蛍光強度の変化は見られなかったことから、骨格のＰＧＡが色素と血清タンパクとの相互作用を抑制していることが示された。以上の結果より、本発明の蛍光プローブにおいて、骨格のポリペプチドは、ｐＨ応答性ならびに色素−タンパク質間相互作用の抑制という２つの役割を有することが示された。
【００７１】
（実施例３−１）
（本発明におけるソルバトフルオロクロミック色素の定義）
アニリノナフタレン誘導体である、アニリノナフタレンスルホン酸マグネシウム（ＡＮＳ）、アニリノナフチルマレイミド（ＡＮＭ）、及びナイルレッド誘導体である、ナイルレッド（ＮＲ）、９−Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−５Ｈ−ｂｅｎｚ［ａ］ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ−５−ｏｎｅ（ＮＲＯＨ）、及びＣｙ５、Ｃｙ５．５、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６７（ＬＳ）の７種の蛍光色素をＤＭＦあるいはＰＢＳに溶解させ、それらの蛍光強度を測定した。全ての色素は、０．３〜１ｍＭのＤＭＳＯ溶液をストック溶液とし、これをＰＢＳまたはＤＭＦで１０００倍希釈することで測定サンプルとした。サンプル濃度はＡＮＳは３μＭ、ＡＮＭ、ＮＲ、ＮＲＯＨ，Ｃｙ５、ＬＳは１μＭ、Ｃｙ５．５は０．６μＭとした。各色素における、励起波長ｅｘ／蛍光波長ｅｍＤＭＦ，ｅｍＰＢＳは、ＡＮＳ（ｅｘ３５０／ｅｍ４６８，ｅｍ５２０）、ＡＮＭ（ｅｘ３５０／ｅｍ４５６，ｅｍ５２０）、ＮＲ（ｅｘ５５０／ｅｍ６２２，ｅｍ６６０）、ＮＲＯＨ（ｅｘ５５０／ｅｍ６１６，ｅｍ６５９）、Ｃｙ５（ｅｘ６５０／ｅｍ６７７，ｅｍ６６５）、Ｃｙ５．５（ｅｘ６７８／ｅｍ７１０，ｅｍ６９０）、ＬＳ（ｅｘ３７３／ｅｍ４３９，ｅｍ４２９）とした。なお、ｅｍＤＭＦはＤＭＦ中の色素の蛍光波長、ｅｍＰＢＳはＰＢＳ中の色素の蛍光波長を表す。また、以上の励起波長、蛍光波長の値の単位は全てｎｍである。結果を図７に示す。図から明らかなように、本発明のソルバトフルオロクロミック色素は、ＤＭＦ中の蛍光強度がＰＢＳ中の蛍光強度に対して２０倍以上の色素であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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