(57)【要約】【課題】  新規のヒト成長ホルモン結合タンパク質、及び前記タンパク質を用いたヒト成長ホルモンを特異的に吸着可能な吸着剤を提供すること。【解決の手段】  ヒト成長ホルモン受容体のアミノ酸配列のうち１２５番目のバリンから１３３番目のプロリンまでの領域をロイシン、グルタミン、ヒスチジン（６残基）、バリンに置換して、新規なヒト成長ホルモン結合タンパク質を調製した。また、前記タンパク質を適切な担体に結合することで、ヒト成長ホルモンを特異的に吸着する吸着剤を提供することができた。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒト成長ホルモン結合タンパク質において、１２５番目のバリンから１３３番目のプロリンまでの領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列に置換されていることを特徴とする、前記ヒト成長ホルモン結合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト成長ホルモン結合タンパク質において、配列番号２に示すアミノ酸配列に置換されている領域以外のアミノ酸のうちの１残基以上が、他のアミノ酸に置換、及び／または欠失、及び／または付加されていることを特徴とする、ヒト成長ホルモン結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヒト成長ホルモン結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、宿主へ形質転換することにより得られる、ヒト成長ホルモン結合タンパク質を発現可能な宿主。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主を用いた、ヒト成長ホルモン結合タンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載のヒト成長ホルモン結合タンパク質を担体に固定することで得られる、ヒト成長ホルモン吸着剤。
【請求項７】
請求項６に記載のヒト成長ホルモン吸着剤を用いた、ヒト成長ホルモンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な成長ホルモン結合タンパク質に関する。また本発明は、前記タンパク質をコードしたポリヌクレオチド、前記タンパク質を発現可能な宿主、前記宿主を用いた前記タンパク質の製造方法、及び前記タンパク質を担体に結合することにより得られるヒト成長ホルモン吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨＲ）は筋肉細胞や骨細胞の細胞表面にあり、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のシグナルを細胞内に伝達し、細胞の成長および分化等の生化学的プロセスの調節に関わる因子であるｈＧＨの働きを仲介するタンパク質である（非特許文献１）。ｈＧＨＲは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｘ０６５６２で開示のｈＧＨＲ前駆タンパク質のアミノ酸配列（特許文献１、配列番号３）のうちの１番目のメチオニンから１８番目のアラニンまでがシグナルペプチダーゼにより加水分解されて除かれることで得られ、ｈＧＨＲ前駆タンパク質（配列番号３）の１９番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがｈＧＨＲの１番目のアミノ酸となる。
【０００３】
ｈＧＨＲは膜貫通型のタンパク質であるが、その細胞外部分のみからなるヒト成長ホルモン結合タンパク質（ｈＧＨ結合タンパク質）は血清中に存在することが知られている（非特許文献２）。また遺伝子工学的にｈＧＨＲの細胞外部分をｈＧＨ結合タンパク質として発現させた例として、動物細胞で発現させた例（特許文献１）、大腸菌で発現させた例（非特許文献３）、昆虫細胞で発現させた例（非特許文献４）、酵母により発現させた例（特許文献２）、細胞外部分の一部を昆虫細胞で発現させた例（特許文献３）などが知られている。大腸菌を用いた発現では、アルカリフォスファターゼの分泌シグナル配列をｈＧＨ結合タンパク質に連結したタンパク質として発現後、分泌シグナル配列を大腸菌のシグナルペプチダーゼにより加水分解することで除去し得られたｈＧＨ結合タンパク質を、菌体ペリプラズム層に分泌させた例が知られている。また、より効率的にｈＧＨ結合タンパク質を得るために、菌の高密度培養により培養液あたりの菌の収率を高めたり、プロテアーゼが欠損した株を宿主として利用したりするなどの工夫も図られている。さらにｈＧＨ結合タンパク質を、大腸菌菌体内に可溶性タンパク質として発現させる方法や、封入体いわゆるインクルージョンボディーとして菌体内に発現後、変性剤による溶解、リフォールディング操作を経てｈＧＨ結合タンパク質を得る方法も知られている。
【０００４】
ｈＧＨ結合タンパク質の精製に関しては、ｈＧＨへの結合能を利用してｈＧＨ固定化ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる精製方法が知られており（非特許文献３、５及び７、特許文献１及び２）、ｈＧＨ固定化ゲルに結合させたｈＧＨ結合タンパク質は、４．５Ｍ塩化マグネシウムあるいは８Ｍ尿素を加えたトリス塩酸緩衝液で溶出されることが知られている。またゲルろ過クロマトグラフィーによる精製方法（特許文献１）や陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法（非特許文献７）も知られている。
【０００５】
ｈＧＨ結合タンパク質は野生型以外にも、アミノ酸を置換あるいは欠失により変異させた変異型のｈＧＨ結合タンパク質が作製され、その機能が調べられている。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるｈＧＨ結合タンパク質のうち７番目から２８番目のアミノ酸を欠損させても、欠損していないｈＧＨ結合タンパク質と同様のｈＧＨの結合能を有していることが知られている（非特許文献５）。
【０００６】
一方で、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるｈＧＨ結合タンパク質のうち１２５番目のバリン、１２６番目のアスパラギン酸、１２７番目のグルタミン酸、１２８番目のイソロイシン、または１３２番目のアスパラギン酸をアラニン残基に置換すると、ｈＧＨとの結合性が低下すること、また１２６番目のアスパラギン酸、１２７番目のグルタミン酸及び１３２番目のアスパラギン酸を同時にアラニン残基に置換すると、分析不可能ほどに大腸菌での生産量が少なくなることが知られている（非特許文献５）。またその他にも１３１番目のプロリンをグルタミンに置換したｈＧＨＲにはｈＧＨが結合しないことが知られている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２８７９０７９号公報
【特許文献２】特開平４−６３５９４号公報
【特許文献３】特開平６−１７２３９４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｅｌｌｓ  Ｊ．Ａ．  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ  Ａ．、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２２、３２９−３５１（１９９３）
【非特許文献２】Ｂａｕｍａｎｎ．Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、７８、１１１３−１１１８（１９９４）
【非特許文献３】Ｆｕｈ  Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５（６）、３１１１−３１１５（１９９０）
【非特許文献４】Ｏｔａ  Ｙ．ら、Ｇｅｎｅ、１０６（２）、１５９−１６４（１９９１）
【非特許文献５】Ｓｔｅｖｅｎ  Ｈ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、８８、４４９８−４５０２（１９９１）
【非特許文献６】Ｗａｌｋｅｒ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、８３、２５５４−２５６１（１９９８）
【非特許文献７】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｂ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、８２１−８２５（１９９１）
【非特許文献８】Ａｘｅｎ  Ｒ．ら、１９６７、Ｎａｔｕｒｅ、２１４、１３０２−１３０４（１９６７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ヒト成長ホルモンと結合可能な、新規のヒト成長ホルモン結合タンパク質、及び前記タンパク質を用いたヒト成長ホルモンを特異的に吸着可能な吸着剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒト成長ホルモン結合タンパク質において、１２５番目のバリンから１３３番目のプロリンまでの領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列に置換されていることを特徴とする、前記ヒト成長ホルモン結合タンパク質。
【００１１】
（２）（１）に記載のヒト成長ホルモン結合タンパク質において、配列番号２に示すアミノ酸配列に置換されている領域以外のアミノ酸のうちの１残基以上が、他のアミノ酸に置換、及び／または欠失、及び／または付加されていることを特徴とする、ヒト成長ホルモン結合タンパク質。
【００１２】
（３）（１）または（２）に記載のヒト成長ホルモン結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチド。
【００１３】
（４）（３）に記載のポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、宿主へ形質転換することにより得られる、ヒト成長ホルモン結合タンパク質を発現可能な宿主。
【００１４】
（５）（４）に記載の宿主を用いた、ヒト成長ホルモン結合タンパク質の製造方法。
【００１５】
（６）（１）または（２）に記載のヒト成長ホルモン結合タンパク質を担体に固定することで得られる、ヒト成長ホルモン吸着剤。
【００１６】
（７）（６）に記載のヒト成長ホルモン吸着剤を用いた、ヒト成長ホルモンの精製方法。
【００１７】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、前記課題を解決するために鋭意検討し得られた、ヒト成長ホルモンと結合可能な新規ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合タンパク質であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるｈＧＨ結合タンパク質のうち、１２５番目のバリンから１３３番目のプロリンまでの領域が、配列番号２に示すアミノ酸配列に置換されていることを特徴としている。なお本発明は、ｈＧＨと結合する機能を保持している限り、配列番号２に示すアミノ酸配列に置換されている領域以外の領域、すなわち配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目のフェニルアラニンから１２４番目のセリン、及び１３４番目のプロリンから２３８番目のグルタミンまでの領域のアミノ酸のうちの１残基以上が他のアミノ酸に置換、及び／または欠失、及び／または付加されたｈＧＨ結合タンパクも含む。例えば、配列番号４６（配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１２５番目のバリンから１３３番目のプロリンを配列番号２に示すアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列のＮ末端側に、メチオニンとグルタミン酸が付加した配列）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質のような、Ｎ末端側及び／またはＣ末端側に数残基のアミノ酸が付加されたタンパク質も、ｈＧＨと結合する機能を有しているため、本発明のｈＧＨ結合タンパク質に含まれる。
【００１９】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質を遺伝子工学的に製造するために用いるポリヌクレオチドは、本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドであればよい。
【００２０】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドは公知の方法により調製することが可能である。前記ポリヌクレオチド調製法の一例として、以下に示す、市販の成長ホルモンレセプターｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法による調製法があげられる。
（Ａ）配列番号１のうち１番目のフェニルアラニンから１２４番目のセリンまでのアミノ酸をコードする配列からなるポリヌクレオチドの３’末端側に配列番号２に記載のポリペプチドをコードする配列からなるポリヌクレオチドが付加した配列からなるポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドを増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅し、ｈＧＨ結合タンパク質の前半部分をコードする配列からなるポリヌクレオチドを調製する。
（Ｂ）配列番号１のうち１３６番目のプロリンから２３８番目のグルタミンまでのアミノ酸をコードする配列からなるポリヌクレオチドの５’末端側に配列番号２に記載のポリペプチドをコードする配列からなるポリヌクレオチドが付加した配列からなるポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドを増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅し、（Ａ）と重複する配列とｈＧＨ結合タンパク質の後半部分をコードする配列からなるポリヌクレオチドを調製する。
（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）で調製したポリヌクレオチドを混合したものを鋳型として、（Ａ）で調製したポリヌクレオチドの５’末端側を含むプライマーと、（Ｂ）で調製したポリヌクレオチドの３’末端側を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法で増幅し、本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを調製する。
なお、前記調製方法において（Ｃ）で調製したポリヌクレオチドを鋳型に、アミノ酸の置換、及び／または欠失、及び／または付加するように設計したプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅を行なう、またはエラープローンＰＣＲ法にて増幅を行なうことで、１残基以上のアミノ酸の置換、及び／または欠失、及び／または付加された、ｈＧＨ結合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００２１】
前記ポリヌクレオチド調製法の別の例としては、本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドの全長を網羅するように、例えば２０塩基から５０塩基程度の塩基からなるプライマーセットを設計後、前記プライマーセットを用いてＰＣＲ法にて人工的に前記ポリヌクレオチドを調製する方法があげられる。なお、当該調製法において、前記ポリヌクレオチド配列を設計する際は、形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して設計したほうが、宿主を用いた効率的なタンパク質発現ができる点で好ましい。また、アミノ酸の置換、及び／または欠失、及び／または付加するように設計したプライマーセットを用いれば、１残基以上のアミノ酸の置換、及び／または欠失、及び／または付加された、ｈＧＨ結合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを調製することもできる。
【００２２】
前記方法により得られた本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドは、通常の遺伝子工学の分野で使用される相応のベクター系に導入することで種々の宿主で本発明のｈＧＨ結合タンパク質を発現することができる。宿主としては細菌、酵母、カビ、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞が例示できるが、取扱い易さ、培養の容易性、高密度培養の可否、更には遺伝子操作における宿主／ベクター系が整備されている点で、細菌、特に大腸菌に代表されるエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌が好ましい。形質転換に用いる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）としては、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）といった株が例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドは、制限酵素を用いて適切なプラスミドに挿入することで前記ポリヌクレオチドを有するプラスミドを調製後、宿主（例えば、大腸菌ＪＭ１０９やＨＢ１０１）へ形質転換することで本発明のｈＧＨ結合タンパク質を発現可能な宿主を調製することができる。本発明のｈＧＨ結合タンパク質を発現させるためのプラスミドとして、例えばｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｕ１３８７２）、ｐＳＴＶ２８（商品名、タカラバイオ社製）、ｐＳＴＶ２９（商品名、タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（商品名、メルク社製）、ｐＲＳＦ−１ｂ（商品名、メルク社製）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）（商品名、メルク社製）が例示できる。本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを前記プラスミドに挿入する際は、前記ポリヌクレオチドのフレームシフトが生じないようにプラスミド内のマルチクローニングサイトに挿入すればよい。なお、挿入したポリヌクレオチドの５’末端側、または３’末端側に適切なアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドが付加されるように設計されたプラスミドを用いることで、本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列に付加配列をもった配列からなるポリヌクレオチドを作製することもできる。一例として、プラスミドｐＥＴ−２６ｂ（＋）（商品名、メルク社製）の制限酵素ＮｄｅＩサイトを利用することで、本発明のｈＧＨ結合タンパク質のＮ末端側にメチオニン（さらに、任意のアミノ酸を付加してもよい）が付加したタンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを調製することができる。別の例として、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｕ１３８７２）の制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを利用することで、本発明のｈＧＨ結合タンパク質のＮ末端側にメチオニンとグルタミン酸（さらに、任意のアミノ酸を付加してもよい）が付加したタンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを調製することができる。
【００２４】
さらに、ペクチン酸リアーゼ（ＰｅｌＢ）、アルカリフォスファターゼ、β−ラクタマーゼといったタンパク質の分泌シグナル配列に、直接、または１残基以上のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド配列を付加した、本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを宿主に形質転換することで、ｈＧＨ結合タンパク質、または本発明のｈＧＨ結合タンパク質に、挿入した１残基以上のアミノ酸残基が付加したタンパク質を、宿主のペリプラズム画分に分泌させることもできる。例えば、本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを、プラスミドｐＥＴ−２６ｂ（＋）（商品名、メルク社製）のマルチクローニングサイト上の制限酵素ＭｓｃＩサイト、あるいは制限酵素ＭｓｃＩサイトとマルチクローニングサイト上のもう一つ別の制限酵素サイトの間にフレームシフトが生じないように挿入することで、ＰｅｌＢシグナル配列を連結した本発明のｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを調製することができる。
【００２５】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質は、前記タンパク質をコードした配列からなるポリヌクレオチドを挿入した発現用プラスミドを宿主へ形質転換し、形質転換した宿主を培養・増殖後、さらに適当な誘導剤を培地に加えて遺伝子発現を誘導しながら培養を行ない、培養した菌を集菌後、凍結融解、リゾチーム消化処理、超音波処理あるいはそれらの組み合わせにより菌を破砕することで得られる。分泌シグナルを用いた宿主／ベクター系の場合は、可溶性画分にｈＧＨ結合活性を有した分子として本発明のｈＧＨ結合タンパク質を得ることができる。例えば、ｈＧＨ結合タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドと、プラスミドｐＥＴ−２６（＋）中にあるＰｅｌＢ分泌シグナル配列をコードする配列からなるポリヌクレオチドとをタンパク質翻訳時にフレームシフトが生じないように連結したプラスミドを調製し、前記プラスミドを大腸菌に形質転換後、遺伝子発現の誘導剤であるイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含んだ培地で培養することで、発現が誘導され、ＰｅｌＢ分泌シグナル配列がシグナルペプチダーゼにより加水分解されて除かれたｈＧＨ結合タンパク質が、大腸菌菌体のペリプラズム層に生産され、菌の破砕により可溶性画分にｈＧＨ結合タンパク質が得られる。
【００２６】
一方、分泌シグナルを用いない宿主／ベクター系では、ｈＧＨ結合活性が不活性な分子として不溶性画分に本発明のｈＧＨ結合タンパク質を得ることができる。分泌シグナルを用いない宿主／ベクター系で得られた不溶性かつ不活性なｈＧＨ結合タンパク質は、公知の技術を用いて溶解やリフォールディングを行なうことで活性化させればよく、例えば、還元剤を加えた変性剤溶液に溶解したのち、還元剤および変性剤が適度に希釈された（好ましくは２０倍以上、より好ましくは３０倍以上に希釈された）溶液中でｈＧＨ結合タンパク質をリフォールディングさせればよい。より具体的には、還元剤を加えた変性剤溶液として、３から８Ｍ濃度の尿素または２から６Ｍ濃度の塩酸グアニジンを含んだｐＨ  ７．５から８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液（トリス塩酸緩衝液）からなる変性剤溶液に、還元剤としてジチオスレイトールを例えば１０ｍＭになるように加えた溶液をあげることができる。変性剤として尿素を用いる場合には、尿素の分解物により生じる反応で起こるタンパク質のアミノ基の修飾を防ぐ目的で、リジンあるいはリジン塩酸塩を１０から１００ｍＭ程度加えることが好ましい。前記手法はｈＧＨをリガンドに用いた担体への結合を利用したアフィニティークロマトグラフィーにおいて、ｈＧＨに結合したｈＧＨ結合タンパク質を遊離させる緩衝液に尿素を用いる場合にも応用できる。還元剤を加えた変性剤溶液に溶解したｈＧＨ結合タンパク質の希釈には、例えば２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型グルタチオン、３ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだトリス塩酸緩衝液を用いればよい。なお、トリス塩酸緩衝液のｐＨは７．５から８．５にすればよい。また、可溶化及びリフォールディングの方法には前記の例以外にもさまざまな方法が公知であるため、状況に応じて適宜最適な方法を選択すればよい。
【００２７】
遺伝子工学的手法により得られた、本発明のｈＧＨ結合タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレート担体への結合を利用したアフィニティークロマトグラフィー、ｈＧＨをリガンドに用いた担体への結合を利用したアフィニティークロマトグラフィー、またはそれらのクロマトグラフィーを組み合わせることによって精製することができる。
【００２８】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質は不溶性の担体に吸着あるいは結合させることができ、目的に応じた材質、形状の基材に固定することで、ｈＧＨの定量、結合性の評価、分離／精製に用いることができる。
【００２９】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質を固定化する担体としては、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、あるいはセルロース系ポリマー、アガロース系ポリマー、デキストリン系ポリマー、キチン系ポリマー、またあるいは磁性粒子が例示できる。基材の形状としてはゲル状、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空糸膜状、繊維状など特に制限はない。
【００３０】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質を担体に固定するためには、担体表面に活性基を含有させ、それを利用して本発明のｈＧＨ結合タンパク質を固定化する方法や、本発明のｈＧＨ結合タンパク質を予め化学修飾して活性基を導入し、それを利用して官能基を含有する基材に固定化する方法などがあげられる。活性基としては、ホルミル基、エポキシ基、２，２，２−トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、スクシンイミド基、イソシアナート基、メルカプト基、ピリジルジスルフィド基、イミダゾリルカルバミン酸基などがあげられ、前記活性基を利用してｈＧＨ結合タンパク質を共有結合により固定化することができる。また、例えば臭化シアン法（非特許文献８）により、イミドカルボネート構造を導入して活性化した担体にｈＧＨ結合タンパク質を固定化することもできる。前記担体の例としては、ＡＦ−Ｆｏｒｍｙｌ−６５０Ｍ（商品名）、ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ（商品名）、ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（商品名、以上東ソー社製）、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（商品名）、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（商品名）、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（商品名、以上ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ（ＧＦ−２０００）Ｓｕｐｐｏｒｔ（商品名、ピアス社製）といった予め活性基が導入された市販の樹脂をあげることができる。担体へ固定する際は、ｈＧＨ結合タンパク質が実質的な機能を失わない条件で行なうことが好ましく、ｐＨが４から１０、より好ましくは６から８の緩衝液で、かつ前記緩衝液成分が活性基と反応しない組成であることが好ましい。反応温度はｈＧＨ結合タンパク質を溶かした緩衝液が凍結しない温度から４０℃の間、より好ましくは４から２５℃が望ましく、反応時間は数分間から数日間の間で最適な条件を探ればよい。なお、前述した予め活性基が導入された市販の樹脂を使用する場合は、それぞれの樹脂の使用法に則った、適切な条件でｈＧＨ結合タンパク質を固定化すればよい。
【００３１】
また共有結合によらず、リガンドを介して本発明のｈＧＨ結合タンパク質を担体に固定化することもできる。例えば、ニッケルイオンやコバルトイオンなどの金属イオンに配位結合できる３座あるいは４座の配位子からなる金属錯塩（キレート）を固定化した担体の金属イオンに対して、本発明のｈＧＨ結合タンパク質を配位結合させた担体をつくることができる。前記担体の例としては、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、メルク社製）、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）や、予めニッケルイオンがキレートされているＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（５０）（商品名、キアゲン社製）、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓ（商品名、キアゲン社製）があげられる。
【００３２】
また本発明のｈＧＨ結合タンパク質をビオチンの誘導体で化学修飾し、ビオチンがアビジンやストレプトアビジンと結合する原理を利用してビオチン修飾した本発明のｈＧＨ結合タンパク質と結合した担体も例示できる。例えば（＋）−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルで本発明のｈＧＨ結合タンパク質を化学修飾し、前記ビオチン修飾されたｈＧＨ結合タンパク質を、ストレプトアビジンが固定された担体に固定化すればよい。ストレプトアビジンが固定された担体には、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（商品名、シグマ・アルドリッチ社製）やＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（商品名、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）が例示できる。
【００３３】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質を固定した担体へのｈＧＨの吸着は、例えばｐＨが６から８、より好ましくは７から７．５の緩衝液で平衡化した担体にｈＧＨ溶液を導入することで、ｈＧＨを吸着させればよい。用いる緩衝液は、リン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液が例示できるが、これに限定されるものではない。なお、ｈＧＨ結合タンパク質を共有結合していない担体の場合は、ｈＧＨ結合タンパク質を担体から解離しない緩衝液であれば特に制限はない。また、緩衝液には塩類や界面活性剤を添加してもよく、ｈＧＨとｈＧＨ結合タンパク質との結合または解離への影響や、固定したｈＧＨ結合タンパク質と担体との結合または解離への影響を実験的に調べた上で使用すればよい。前記緩衝液の一例として、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（ＰＢＳ）、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）といった界面活性剤を０．０１から０．１％含んだＰＢＳあるいはＴＢＳがあげられる。なお、ニッケルイオンをキレートした担体に固定したｈＧＨ結合タンパク質の場合は、１０から１００ｍＭ、好ましくは３０から６０ｍＭのイミダゾールを緩衝液に加えることで非特異的な結合を抑制できる。
【００３４】
本発明のｈＧＨ結合タンパク質に吸着したｈＧＨは、例えば８Ｍ尿素を加えた緩衝液で溶出できる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明のヒト成長ホルモン結合タンパク質は、ヒト成長ホルモンと結合可能な新規のタンパク質である。また、本発明のタンパク質を適切な担体に固定することで、ヒト成長ホルモンを特異的に分離可能な吸着剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】成熟型ヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨＲ）と本発明のヒト成長ホルモン結合タンパク質（ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６））の一次構造の模式図。
【図２】実施例１及び２で調製したプラスミドの模式図。
【図３】本発明のヒト成長ホルモン結合タンパク質（ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６））のエンザイムイムノアッセイの結果。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３８】
実施例１  プラスミドｐＥＴ―ｈＧＨｂｐ２５８の作製
配列番号３に示したヒト成長タンパク質受容体（ｈＧＨＲ）のアミノ酸配列のうち１９番目のフェニルアラニンから２７６番目のフェニルアラニンまでをコードした配列番号４のポリヌクレオチドを調製した。
（１）以下の試薬組成及び反応条件にてＰＣＲ反応を行なった。
【００３９】
（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
０．０１ｕｎｉｔ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ社製）
各５．２ｎＭ  配列番号５から１０に示したプライマー
各４ｎＭ  配列番号１１から１８に示したプライマー
各３．２ｎＭ  配列番号１９から２６に示したプライマー
各２．４ｎＭ  配列番号２７から３４に示したプライマー
各２ｎＭ  配列番号３５から３８に示したプライマー
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・５０
秒間のＰＣＲ反応を７サイクル実施した。
（２）配列番号３９と４０に示したプライマーをそれぞれ１０μＭ含んだ水溶液２μＬをＰＣＲ反応後の（１）の反応液に添加後、さらに９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・５０秒間のＰＣＲ反応を３０サイクル行なった。
（３）ＰＣＲ反応後の（２）の反応液をアガロースゲル電気泳動で泳動後、目的産物に相当する０．８ｋｂｐのバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（４）精製したＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｔｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、消化後のＤＮＡがペクチン酸リアーゼ（ＰｅｌＢ）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに連結されるようにプラスミドｐＥＴ−２６（＋）の制限酵素ＭｓｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（商品名、タカラバイオ社製）を用いてライゲーションしてプラスミドを調製後、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。
（５）形質転換したＪＭ１０９を培養後、集菌し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  Ｉ，Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（商品名、オメガ  バイオテク社製）を用いてプラスミドｐＥＴ―ｈＧＨｂｐ２５８（サイズは６．１ｋｂｐ、図２）を得た。
【００４０】
実施例２  組替え大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）の作製
実施例１で得られたプラスミドｐＥＴ―ｈＧＨｂｐ２５８（図２）から、以下の方法で組替え大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を作製した。
（１）プラスミドｐＥＴ−ｈＧＨｂｐ２５８（図２）を鋳型にして、配列番号４１と４２に示したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ない、サイズが０．３８ｋｂｐのＤＮＡを得た後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで二重消化することでインサートＤＮＡ（ＤＮＡ−１）を得た。
（２）プラスミドｐＥＴ−ｈＧＨｂｐ２５８（図２）を鋳型にして、配列番号４３と４４に示したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行ない、サイズが０．３５ｋｂｐのＤＮＡを得た後、制限酵素ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化することでインサートＤＮＡ（ＤＮＡ−２）を得た。
（３）得られたインサートＤＮＡ（ＤＮＡ−１とＤＮＡ−２）をプラスミドｐＴｒｃ９９ＡのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲーションしたプラスミドを作製し、前記プラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１へ形質転換した。
（４）形質転換したＨＢ１０１を培養後、集菌し、プラスミドｐＴｒｃ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）（サイズは４．８ｋｂｐ、図２）を調製した。
（５）プラスミドｐＴｒｃ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）（図２）を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化して得られた０．７ｋｂｐのＤＮＡを、プラスミドｐＲＳＦ−１ｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにライゲーションして環化させた。前記プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）へ形質転換することで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を得た。
【００４１】
当該方法で得られた、プラスミドｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）（図２）に挿入されているｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）の塩基配列を分析した結果、塩基配列は配列番号４５に示す配列であった。また、前記塩基配列から翻訳されるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合タンパク質であるｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）のアミノ酸配列を配列番号４６に示した。なお、配列番号４６は配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１２５番目のバリンから１３３番目のプロリンを配列番号２に示すアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列のＮ末端側に、メチオニンとグルタミン酸が付加した配列と同一である。
【００４２】
実施例３  ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）タンパク質の調製  
実施例２で得られた大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）より、以下の方法でｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）タンパク質を調製した。
（１）大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を、１５μｇ／ｍＬカナマイシン、１％  ＹＥＡＳＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ、１．６％トリプトン、０．５％塩化ナトリウムを含んだ培地（２×ＹＴ／Ｋｍ培地）に菌濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．６になるように植菌後、３７℃で培養した。
（２）菌濁度がおよそ１．２になったところで、濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、誘導培養を４時間行なった。得られた培養液の菌濁度は５．２であった。
（３）（２）の培養液０．５Ｌを氷冷後に遠心分離して集菌した。集めた菌を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）５０ｍＬに懸濁した後、遠心分離して集菌することで菌を洗浄した。前記洗浄操作を再度行ない、菌を前記緩衝液に懸濁（菌濁度がＯ．Ｄ．６００でおよそ６９）させた後、菌を超音波破砕し、遠心分離により不溶性画分を得た。
（４）得られた不溶性画分は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．５）を含んだ１４ｍＬのＰＢＳに懸濁したのち、さらに２ｍＬの８Ｍグアニジン塩酸を加えて不溶性画分を懸濁した。前記懸濁液は、６Ｍグアニジン塩酸を含んだＰＢＳ（６Ｍ  Ｇｄｎ／ＰＢＳ）に溶解後、遠心分離して沈殿を除去することで、ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）溶液１４．６ｍＬを得た。
【００４３】
当該方法で得られたｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）溶液のタンパク質濃度をγ―グロブリンを標準タンパクとしたプロテインアッセイキットＩ（商品名、バイオラッド社製）を用いて比色定量した結果、タンパク質濃度は６．４ｍｇ／ｍＬであった。
【００４４】
実施例４  ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）のエンザイムイムノアッセイ
実施例３で調製したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）タンパク質について、以下の方法でエンザイムイムノアッセイを行なった。
（１）９６穴イムノプレートに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で調製した１０μｇ／ｍＬ  ｈＧＨを１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、４℃で一晩インキュベートしてｈＧＨを吸着させた。
（２）１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）（ＴＢＳ）に０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）を加えた緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した。
（３）１％ウシ血清アルブミンを含んだＴＢＳ−Ｔ（ブロッキング緩衝液）、２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、３０℃で２時間インキュベートすることでブロッキングした。
（４）ブロッキング後のイムノプレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄したのち、ブロッキング緩衝液で希釈したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）（実施例３で調製）を、１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３０℃で１時間インキュベートした。
（５）ＴＢＳ−Ｔで洗浄することでＢ／Ｆ分離をしたのち、０．５μｇ／ｍＬマウス抗ｈＧＨレセプター抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて３０℃で１時間インキュベートした。
（６）ＴＢＳ−Ｔで洗浄することでＢ／Ｆ分離をしたのち、ブロッキング緩衝液で適度に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて３０℃で１時間インキュベートした。
（７）ＴＢＳ−Ｔで洗浄することでＢ／Ｆ分離をしたのち、イムノプレートのＨＲＰ活性を、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて測定した。基質溶液の１／２容量の１Ｍリン酸を加えて反応を停止させたのち、反応生成物の４５０ｎｍの吸光度を測定して、イムノプレート上のｈＧＨへのｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）の吸着を調べた。
【００４５】
ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）のエンザイムイムノアッセイの結果を図３に示す。ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）の濃度に依存して、イムノプレート上のｈＧＨと結合していることが示された。
【００４６】
実施例５  ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）結合キレート樹脂の調製
実施例３で調製したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）タンパク質を、下記の方法でキレート樹脂に固定した。
（１）予めニッケルイオンを結合し、６Ｍグアニジン塩酸と２０ｍＭイミダゾールを含んだＰＢＳ−Ｔ（平衡化緩衝液１）で平衡化した、樹脂容量０．５ｍＬのＨｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、メルク社製）をカラムに充填した。
（２）実施例３で調製したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）溶液に、１／５０容量の１Ｍイミダゾールと１／１００容量の１０％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）を混合した溶液を（１）のカラムにロードした。
（３）１ｍＬの平衡化緩衝液１で洗浄後、２ｍＬの５０ｍＭイミダゾールを含んだＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
（４）カラムを素通りした画分及びカラム洗浄画分に含まれるｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を、実施例４に記載のエンザイムイムノアッセイで定量した。
【００４７】
（４）の定量値をカラムにロードしたｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）の量から差し引くことで、ニッケルイオンを結合したＨｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎに結合した量を算出した結果、２．２ｍｇのｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）がキレート樹脂に結合していることがわかった。
【００４８】
実施例６  ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）結合キレート樹脂へのｈＧＨの吸着と溶出
実施例５で調製したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）結合キレート樹脂を用いて、ｈＧＨの吸着と溶出を行なった。
（１）実施例５で調製したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）結合キレート樹脂を充填したカラムに５０ｍＭイミダゾールを含んだＰＢＳ−Ｔ（平衡化緩衝液２）で調製したｈＧＨ（０．５ｍｇ）をロードした。
（２）１．５ｍＬの平衡化緩衝液２、次いで１ｍＬのＰＢＳで前記カラムを洗浄後、８Ｍ尿素を含んだＰＢＳでｈＧＨを溶出させた。
【００４９】
樹脂を素通りした画分および洗浄画分中のｈＧＨの総和（非吸着画分）をプロテインアッセイキットＩ（商品名、バイオラッド社製）で比色定量した結果、非吸着画分はロード量の９５％を含んでいた。すなわち５％が吸着したと算出された。
【００５０】
ｈＧＨを溶出させた後の樹脂は、１．５ｍＬのＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）を含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍＬでｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を溶出させた。ゲル濃度１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した結果、１．５ｍＬの２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）を含んだ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出された画分にｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）に相当するタンパク質バンドを確認した。
【００５１】
実施例７  ｈＧＨの定量
実施例５で調製したｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）結合キレート樹脂に吸着したｈＧＨを以下の方法で定量した。
（１）９６穴イムノプレートに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で調製した５μｇ／ｍＬ  マウス抗ｈＧＨ抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、４℃で一晩インキュベートしてｈＧＨを吸着させた。
（２）１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）（ＴＢＳ）に０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）を加えた緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、１％ウシ血清アルブミンを含んだＴＢＳ−Ｔ（ブロッキング緩衝液）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、３０℃で２時間インキュベートすることでブロッキングした。
（３）ブロッキング後のイムノプレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄したのち、ブロッキング緩衝液で希釈した実施例６で得た画分を、１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、３０℃で１時間インキュベートした。
（４）ＴＢＳ−Ｔで洗浄することでＢ／Ｆ分離をしたのち、０．６μｇ／ｍＬビオチン標識ウサギ抗ｈＧＨ抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて３０℃で１時間インキュベートした
（５）ＴＢＳ−Ｔで洗浄することでＢ／Ｆ分離をしたのち、ブロッキング緩衝液で適度に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンを１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて３０℃で１時間インキュベートした。
（６）ＴＢＳ−Ｔで洗浄することでＢ／Ｆ分離をしたのち、イムノプレートのＨＲＰ活性を、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。基質溶液の１／２容量の１Ｍリン酸を加えて反応を停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
結果、実施例６で８Ｍ尿素を含んだＰＢＳで溶出された画分は、ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）結合キレート樹脂にロードしたｈＧＨ量の４．２％を含んでいた。
【００５３】
比較例１  ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を結合していないキレート樹脂へのｈＧＨの吸着
ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を含まない溶液で実施例５と同様に調製した樹脂を用いて、実施例６と同様の操作を行ない、樹脂を素通りした画分および洗浄画分中のｈＧＨを、プロテインアッセイキットＩを用いて比色定量した結果、ロード量のほぼ１００％を含んでいた。
【００５４】
比較例２  ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を結合していないキレート樹脂からのｈＧＨの溶出
ｈＧＨｂｐ２３８ｍ９（Ｈ６）を含まない溶液で実施例５と同様に調製した樹脂を用いて、実施例６と同様の操作を行ない、８Ｍ尿素を含んだＰＢＳで溶出された画分を実施例７と同様に分析した結果、ロード量の０．５％を含んでいた。実施例５から７、比較例１及び２の結果をまとめたものを表１に示す。
【００５５】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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