(57)【要約】      （修正有）【課題】モルフォゲンおよび／またはそれらのアナログのインビボ活性を迅速に評価するための処方物およびその使用方法を提供すること。【解決手段】組織の損傷から少なくとも６時間後に、局所的欠損部位で機能的組織形態形成を誘導し得る形態形成タンパク質およびそのアナログの効力および薬物動力学を評価するための方法が開示され、この方法は、（a）非ヒト哺乳動物において局所的な許容性の欠損部位を作製する工程、（b）局所的な許容性の欠損部位を作製してから少なくとも６時間後に、候補形態形成タンパク質を非ヒト哺乳動物に全身的に投与する工程、および（c）候補形態形成タンパク質の、欠損部位で周辺組織に適合する新たな組織形成を誘導する能力を測定する工程、を包含する。【選択図】図１
2010281823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の損傷から少なくとも６時間後に、候補形態形成タンパク質の形態形成活性を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（a）非ヒト哺乳動物において局所的な許容性の欠損部位を作製する工程、
（b）該局所的な許容性の欠損部位を作製してから少なくとも６時間後に、該候補形態形成タンパク質を該非ヒト哺乳動物に全身的に投与する工程、および
（c）該候補形態形成タンパク質の、該欠損部位で周辺組織に適合する新たな組織形成を誘導する能力を測定する工程、
を包含する、方法であって、
ここで、該局所的欠損部位が、腎臓組織、肺組織、心臓組織、膵臓組織、子宮組織、卵巣組織、消化管組織、結腸組織、真皮組織、口腔粘膜組織、骨軟骨組織、軟骨組織、または甲状腺組織に存在し、そして必要に応じて、このような候補形態形成タンパク質の最適投薬量が決定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本明細書中に開示される発明は、組織特異的形態形成を誘導するための材料および方法、ならびに形態形成化合物の活性を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
真の組織モルフォゲンとして機能し得るタンパク質のクラスが、現在同定されてきている。すなわちこれらのタンパク質は、それら自身で、前駆体細胞の機能的置換組織への移動、増殖および分化を誘導し得る。このクラスのタンパク質を本明細書では、「骨形成タンパク質」または「形態形成タンパク質」または「モルフォゲン」と呼び、異所的な軟骨内性骨形態形成（endochondral bone morphogenesis）を誘導する能力により同定された骨形態形成タンパク質（BMP）のファミリーのメンバーを含む。形態形成タンパク質は一般に、増殖因子であるTGF-βスーパーファミリーのサブグループとして当該分野では分類される（Hogen（1996）Genes＆Development
10：1580-1594）。モルフォゲンファミリーのタンパク質のメンバーは以下のものが挙げられる：哺乳動物の骨形成タンパク質-1（（OP-1）、BMP-7およびショウジョウバエホモログの60Aとしても公知である）、骨形成タンパク質-2（OP-2、BMP-8としても公知である）、骨形成タンパク質-3（OP-3）、BMP-2（BMP-2AまたはCBMP-2A、およびショウジョウバエホモログのDPPとしても公知である）、BMP-3、BMP-4（BMP-2BまたはCBMP-2Bとしても公知である）、BMP-5、BMP-6およびそのマウスホモログであるVgr-1、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、GDF3（Vgr2としてもまた公知である）、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、GDF-5（CDMP-1またはMP52としてもまた公知である），GDF-6（CDMP-2としてもまた公知である）GDF-7（CDMP-3としてもまた公知である）、アフリカツメガエルホモログであるVglおよびNODAL、UNIVIN、SCREW、ADMPおよびNEURAL。
【０００３】
このファミリーのメンバーは、前駆体である「プロ-形態」から、二量体化し得、そして約97〜106アミノ酸のカルボキシ末端活性ドメインを含む成熟ポリペプチド鎖を生じることを含むプロセシングを含む共通の構造特性を共有する分泌ポリペプチド鎖をコードする。全てのメンバーがこのドメインにシステインの保存されたパターンを共有し、そしてこれらのタンパク質の活性形態は単一のファミリーのメンバーのジスルフィド結合型ホモ二量体、または2つの異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれかであり得る（例えば、非特許文献１；非特許文献２を参照のこと）。特許文献１；特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および特許文献２；非特許文献６；非特許文献７もまた参照のこと。これらの開示は、これらの骨形成タンパク質のアミノ酸配列およびDNA配列ならびに化学的特性および物理的な特性について記載する。非特許文献８；BMP
9（特許文献３、1993年1月7日公開）；DPP（非特許文献９）；およびVg-1（非特許文献１０）もまた参照のこと。
【０００４】
これらのタンパク質の形態形成活性により、これらのタンパク質は、適切な、形態形成的に許容性である環境下において組織形態形成の発生カスケードの開始および維持が可能になり、幹細胞を刺激して組織特異的様式で増殖、および分化させ、そして新しい組織形成において最高潮に達する事象の進行を誘導する。これらの形態形成活性はまた、タンパク質が、それらの分化経路から逸脱するように予め誘導された細胞の「再分化」を刺激することを可能にする。このタンパク質は、哺乳動物の疾患または損傷した組織の置換において、特に損傷組織が正常な組織または器官（例えば、気腫に起因する損傷した肺組織；硬変した腎臓または肝臓組織；心筋症および／またはアテローム血栓症もしくは心臓閉栓症の発作に起因し得るような損傷した心臓または血管組織；潰瘍の穿孔またはそれらの修復に起因する損傷した胃組織；物理的損傷、退行性疾患（例えば、アルツハイマー疾患もしくは多発性硬化症）、または発作に起因するような損傷した神経組織；疾患または機械的障害に起因し得るような損傷した象牙質および歯周組織）の機能を妨害する場合に有用である。
【０００５】
このタンパク質は、多くの非軟骨形成組織（象牙質、肝臓、腎臓、神経、うっ血肺、胃腸管組織など）の修復において有用性を有することが示されている。例えば、特許文献４（1992年9月17日公開）；特許文献５（1993年3月18日公開）；特許文献６（1994年3月31日公開）；特許文献７（1994年2月17日公開）；特許文献８（1993年3月31日公開）；特許文献９（1994年3月31日公開）を参照のこと。USSN08/404,113；08/445,467；08/432,883；08/155,343；08/260,675；08/445,468；08/461,397；08/480,528；08/402,542；08/396,930；08/751,227；（代理人参照番号
CRP 069 CP、1997年3月21日提出）（これらの開示は参考として援用される）もまた参照のこと。
【０００６】
これらの形態形成タンパク質およびこれらのアナログのインビボ活性および／または効率を評価するために改良された手段についての組成物および方法に対するニーズが残されている。異なるモルフォゲンが、所定の組織または器官において形態形成をもたらすための特異的活性が異なることが想定される。モルフォゲンのアナログ（タンパク質に基づかない候補「小分子」機能的模倣物を含む）が、インビボで所定のモルフォゲンを機能的に置換する能力について評価される必要があることもまた想定される。所定の兆候（例えば、閉栓性発作の処置）については、例えば、投与の用量および経路は、個人の全体的な健康状態、年齢および状態に依存して変化し得ることがさらに予想される。従って、形態形成タンパク質またはそれらのアナログの薬物動力学（異なる治療的適用についての、所定の個体に対する所定のモルフォゲン、および／またはアナログの投与についての用量の評価、好ましい投与時間、および好ましい投与経路を含む）を評価するためのニーズもまた残存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,011,691号明細書
【特許文献２】米国特許第5,266,683号明細書
【特許文献３】国際公開第93/00432号パンフレット
【特許文献４】国際公開第92/15323号パンフレット
【特許文献５】国際公開第93/04692号パンフレット
【特許文献６】国際公開第94/06399号パンフレット
【特許文献７】国際公開第94/03200号パンフレット
【特許文献８】国際公開第94/06449号パンフレット
【特許文献９】国際公開第94/06420号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Massague（1990）Annu．Rev．Cell Biol.6：597
【非特許文献２】Sampathら、（1990）J．Biol．Chem．265：13198
【非特許文献３】Ozkaynakら、（1990）EMBO J.9：2085-2093
【非特許文献４】Whartonら、（1991）PNAS 88：9214-9218
【非特許文献５】Ozkaynak（1992）J．Biol．Chem．267：25220-25227
【非特許文献６】Celesteら、（1991）PNAS 87：9843-9847
【非特許文献７】Lyonsら、（1989）PNAS 86：4554-4558
【非特許文献８】Wozneyら、（1998）Science 242：1528-1534
【非特許文献９】Padgettら、（1987）Nature 325：81-84
【非特許文献１０】Weeks（1987）Cell 51：861-867
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、モルフォゲンおよび／またはそれらのアナログのインビボ活性を迅速に評価するための処方物およびその使用方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
例えば、本発明は、上記目的を達成するために、以下の手段を提供する。
項目１．候補形態形成タンパク質またはそのアナログの形態形成活性を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（a）哺乳動物において局所的な許容性の欠損部位を作製する工程、
（b）該候補形態形成タンパク質またはアナログを該哺乳動物に全身的に投与する工程、および
（c）候補タンパク質またはアナログの、該欠損部位で新たな組織形成を誘導する能力を測定する工程、
を包含する、方法。
項目２．前記候補形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損部位に対して遠位の部位に投与される、項目１に記載の方法。
項目３．哺乳動物に投与するための候補形態形成タンパク質またはそのアナログの最適投薬量を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（a）哺乳動物において局所的な許容性の欠損部位を作製する工程、および
（b）該候補形態形成タンパク質またはアナログを、該哺乳動物に全身的に投与する工程、および
（c）候補タンパク質またはアナログの、該欠損部位での新たな組織形成を誘導する能力を測定する工程、
を包含する、方法。
項目４．前記タンパク質またはアナログが、前記部位に対して遠位の部位に投与される、項目３に記載の方法。
項目５．前記欠損部位が、骨格組織、肺組織、心臓組織、肝臓組織、神経組織、膵臓組織、子宮組織、または甲状腺組織において起こる、項目１または３に記載の方法。
項目６、前記欠損部位が、腎臓組織において起こる、項目１または３に記載の方法。
項目７．前記欠損部位が、歯組織または歯周組織において起こる、項目１または３に記載の方法。
項目８．前記哺乳動物が老齢である、項目１または３に記載の方法。
項目９．前記哺乳動物が、カルス形成を誘導する低減された能力を有する、項目１または３に記載の方法。
項目１０．前記哺乳動物が、骨格端への血流障害を罹患している、項目１または３に記載の方法。
項目１１．前記哺乳動物が、内因性の形態形成シグナルを誘導する低減された能力を有する、項目１または３に記載の方法。
項目１２．形態形成タンパク質またはアナログが、非経口的に投与される、項目１または３に記載の方法。
項目１３．形態形成タンパク質またはアナログが、静脈内に投与される、項目１２に記載の方法。
項目１４．前記形態形成タンパク質が、経口的に投与される、項目１または３に記載の方法。
項目１５．前記形態形成タンパク質またはアナログが、間葉前駆細胞が前記欠損部位に接触可能な時点で前記哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
項目１６．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損の作製の少なくとも６時間後に投与される、項目１、３、または４に記載の方法。
項目１７．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損が作製された少なくとも２４時間後に投与される、項目１または４に記載の方法。
項目１８．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損の作製の少なくとも７２時間後に投与される、項目１または４に記載の方法。
項目１９．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記哺乳動物に、前記欠損部位で線維症の開始後に投与される、項目１、３、または４に記載の方法。
項目２０．前記形態形成タンパク質またはアナログが、水溶液中において投与される、項目１、３、または４に記載の方法。
項目２１．前記哺乳動物が、ステロイド剤使用者である、項目８に記載の方法。
項目２２．前記哺乳動物が、老齢であるか、肥満であるか、高血圧であるか、または骨減少もしくは糖尿病を罹患している、項目８に記載の方法。
項目２３．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；BMP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vg1；Vgr-1；60Aタンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目１または３に記載の方法。
項目２４．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目１または３に記載の方法。
項目２５．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目１または３に記載の方法。
項目２６．前記形態形成タンパク質が、OP1である、項目１または３に記載の方法。
項目２７．前記形態形成タンパク質が、生理食塩水溶液中に可溶化された成熟OP1である、項目１または３に記載の方法。
項目２８．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、項目１または３に記載の方法。
項目２９．哺乳動物において非骨格性の欠損部位で新たな組織形成を誘導するための方法であって、該方法は、該哺乳動物に全身的に形態形成タンパク質を投与する工程を包含する、方法。
項目３０．前記形態形成タンパク質が、前記部位に対して遠位の部位に投与される、項目２９に記載の方法。
項目３１．哺乳動物において形態形成欠損部位でカルスの形成の質または量を増強するための方法であって、該方法は、該部位に対して遠位の部位で、形態形成タンパク質を該哺乳動物に全身的に投与する工程を包含する、方法。
項目３２．哺乳動物において局所的欠損部位で組織修復の割合を増強するための方法であって、該方法は、形態形成タンパク質を該部位に対して遠位の部位で該哺乳動物に全身的に投与する工程を包含する、方法。
項目３３．前記欠損が、肺組織、心臓組織、肝臓組織、神経組織、膵臓組織、子宮組織、または甲状腺組織において起こる、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目３４．前記欠損部位が、腎臓組織において起こる、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目３５．前記欠損部位が、歯組織または歯周組織において起こる、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目３６．前記哺乳動物が、ヒトである、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目３７．前記ヒトが、カルス形成を誘導する低減された能力を有する、項目３６に記載の方法。
項目３８．前記ヒトが、骨格端への血流障害を罹患している、項目３６に記載の方法。
項目３９．前記個体が、内因性の形態形成シグナルを誘導する減少された能力を有する、項目３６に記載の方法。
項目４０．前記形態形成タンパク質が、非経口的に投与される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目４１．前記形態形成タンパク質が、静脈内投与される、項目４０に記載の方法。
項目４２．前記形態形成タンパク質が、経口投与される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目４３．前記形態形成タンパク質が、前記個体に、間葉前駆細胞が前記欠損部位に接触可能である時点で投与される、項目２９に記載の方法。
項目４４．前記形態形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも６時間後に投与される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目４５．前記形態形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも２４時間後に投与される、項目２９または３２に記載の方法。
項目４６．前記形態形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも７２時間後に投与される、項目２９または３２に記載の方法。
項目４７．前記形態形成タンパク質が、前記哺乳動物に、前記欠損部位で線維症の開始後に投与される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目４８．前記形態形成タンパク質が、水溶液中において投与される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目４９．前記ヒトが、ステロイド剤使用者である、項目３６に記載の方法。
項目５０．前記ヒトが、老齢であるか、肥満であるか、または骨減少もしくは糖尿病を罹患している、項目３６に記載の方法。
項目５１．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；BMP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vg1；Vgr-1；60Aタンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目５２．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目５３．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目５４．前記形態形成タンパク質が、OP1である、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目５５．前記形態形成タンパク質が、生理食塩水溶液中に可溶化された成熟OP1である、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目５６．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、項目２９、３１、または３２に記載の方法。
項目５７．哺乳動物への形態形成タンパク質の全身的投与のための組成物であって、欠損部位での非骨格性の機能的置換組織の形成を誘導するのに十分な量で形態形成タンパク質を含む、組成物。
項目５８．前記組成物が、水溶液中に分散された形態形成タンパク質を含む、項目５７に記載の組成物。
項目５９．約４〜８の範囲のｐＨを有する、項目５７に記載の組成物。
項目６０．生理学的緩衝化生理食塩水を含む、項目５７に記載の組成物。
項目６１．前記形態形成タンパク質が、約0.01〜1000mg/kg体重の範囲内の濃度で提供される、項目５７に記載の組成物。
項目６２．非経口投与のための処方物を包含する、項目５７に記載の組成物。
項目６３．経口投与のために処方された、項目５７に記載の組成物。
項目６４．前記形態形成タンパク質が、生分解性の、生体適合性のミクロスフェア中に配置されている、項目５７に記載の組成物。
項目６５．形態形成タンパク質を、約0.01g/ml〜10.0g/mlの濃度範囲において含む、項目５７に記載の組成物。
項目６６．形態形成タンパク質を、約0.1g/ml〜1.0g/mlの濃度範囲において含む、項目５７に記載の組成物。
項目６７．前記形態形成タンパク質が、水性培地において該タンパク質の可溶性を増強し得る分子と結合している、項目５７に記載の組成物。
項目６８．前記形態形成タンパク質が、該タンパク質の可溶性複合体形態からなる、項目５７に記載の組成物。
項目６９．局所的な欠損部位での組織形成の割合を増強し得るとしてさらに特徴付けられる、項目５７に記載の組成物。
項目７０．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；BMP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vg1；Vgr-1；60Aタンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目５７に記載の組成物。
項目７１．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目５７に記載の組成物。
項目７２．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目５７に記載の組成物。
項目７３．前記形態形成タンパク質がOP1である、項目５７に記載の組成物。
項目７４．前記形態形成タンパク質が、生理食塩水溶液中に可溶化された成熟OP1である、項目５７に記載の組成物。
項目７５．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、項目５７に記載の組成物。
項目７６．哺乳動物において欠損部位での骨または軟骨の形成を誘導するための方法であって、該方法は、骨形成タンパク質を全身的に該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
項目７７．前記骨形成タンパク質が、前記部位に対して遠位の部位に投与される、項目７６に記載の方法。
項目７８．哺乳動物において骨形成の欠損部位でのカルスの形成の量または質を増強するための方法であって、該方法は、骨形成タンパク質を該部位に対して遠位の部位で該哺乳動物に全身的に投与する工程を包含する、方法。
項目７９．哺乳動物において局所的欠損部位での骨または軟骨の修復の割合を増強するための方法であって、該方法は、該部位に対して遠位の部位で該哺乳動物に骨形成タンパク質を全身的に投与する工程を包含する、方法。
項目８０．前記欠損部位が骨折を規定する、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目８１．前記欠損部位が、内因性修復が不可能である容量を規定する、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目８２．前記欠損部位が、骨軟骨性の欠損を規定する、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目８３．前記哺乳動物がヒトである、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目８４．前記ヒトが、カルス形成を誘導する低減された能力を有する、項目８３に記載の方法。
項目８５．前記ヒトが、骨格端への血流障害を罹患している、項目８３に記載の方法。
項目８６．前記個体が、内因性の骨誘導性シグナルを誘導する低減された能力を有する、項目８３に記載の方法。
項目８７．骨形成タンパク質が、非経口的に投与される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目８８．前記骨形成タンパク質が、静脈内投与される、項目８７に記載の方法。
項目８９．前記骨形成タンパク質が、経口投与される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目９０．前記骨形成タンパク質が、間葉前駆細胞が前記欠損部位に接触可能な時点で、前記個体に投与される、項目７６に記載の方法。
項目９１．前記骨形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも６時間後に投与される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目９２．前記骨形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも２４時間後に投与される、項目７６または７９に記載の方法。
項目９３．前記骨形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも７２時間後に投与される、項目７６または７９に記載の方法。
項目９４．前記骨形成タンパク質が、前記欠損部位での線維症の開始後に前記哺乳動物に投与される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目９５．前記骨形成タンパク質が、水溶液中において投与される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目９６．前記ヒトが、ステロイド剤使用者である、項目８３に記載の方法。
項目９７．前記ヒトが、老齢であるか、肥満であるか、または骨減少もしくは糖尿病に罹患している、項目８３に記載の方法。
項目９８．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；BMP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vg1；Vgr-1；60Aタンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目９９．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目１００．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目１０１．前記骨形成タンパク質がOP1である、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目１０２．前記骨形成タンパク質が、生理食塩水中に可溶化された成熟OP1である、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目１０３．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、項目７６、７８、または７９に記載の方法。
項目１０４．哺乳動物への骨形成タンパク質の全身的投与のための組成物であって、骨の欠損部位での骨または軟骨の形成を誘導するのに十分な量で骨形成タンパク質を含む、組成物。
項目１０５．前記組成物が、水溶液中に分散された骨形成タンパク質を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１０６．約４〜８の範囲のｐＨを有する、項目１０４に記載の組成物。
項目１０７．生理学的緩衝化生理食塩水を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１０８．前記骨形成タンパク質が、約0.01〜1000mg/kg体重の範囲内の濃度で提供される、項目１０４に記載の組成物。
項目１０９．非経口投与のための処方物を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１１０．経口投与のために処方された、項目１０４に記載の組成物。
項目１１１．前記骨形成タンパク質が、生分解性の生体適合性のミクロスフェア中に分散されている、項目１０４に記載の組成物。
項目１１２．約0.01g/ml〜10.0g/mlの濃度範囲で骨形成タンパク質を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１１３．約0.1g/ml〜1.0g/mlの濃度範囲で骨形成タンパク質を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１１４．前記骨形成タンパク質が、該タンパク質の水性媒体での可溶性を増強し得る分子と結合している、項目１０４に記載の組成物。
項目１１５．前記骨形成タンパク質が、該タンパク質の可溶性複合体形態を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１１６．局所的な骨折部位で骨形成の割合を増強し得るとしてさらに特徴付けられる、項目１０４に記載の組成物。
項目１１７．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；BMP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vg1；Vgr-1；60Aタンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
項目１１８．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、項目１０４に記載の組成物。
項目１１９．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目１０４に記載の組成物。
項目１２０．前記骨形成タンパク質がOP1である、項目１０４に記載の組成物。
項目１２１．前記骨形成タンパク質が、生理食塩水中に可溶化された成熟OP1である、項目１０４に記載の組成物。
項目１２２．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、項目１０４に記載の組成物。
【００１１】
本明細書に開示される本発明の利点および特色と共に、これらの目的および他の目的は、以下の記載事項、図面および項目より明らかである。
（発明の要旨）
本発明は、その成熟二量体形態において単独で、または可溶性複合体の一部として全身的に投与された真の組織モルフォゲン（例えば、OP-1）が、局在化した、投与部位に対して遠位にある欠損部位で新たな再生を誘導し得るという発見に基づく。具体的には、全身的に投与されるタンパク質は、新規の機能的置換組織の処方を誘導するために十分であり、組織（骨格または整形組織、肝臓、膵臓、肺、心臓、腎臓、子宮、腸管、胃腸の
組織を含む）での局所的欠損の修復に十分である。（本明細書で使用される場合、「整形組織（orthopedic）」または「骨格」または「関節」または「軟骨形成（chondrogenic）」組織は、骨格および骨格関節組織：骨、軟骨、腱、靱帯、および滑膜組織を包含することが理解される）。形態形成タンパク質の単回の注入が、所望される生物学的効果を誘導するために十分であり、そして提供される間葉前駆体細胞が欠損部位に到達可能である場合、投与が時間反応性ではないことがさらに発見されてきた。つまり、形態形成タンパク質は、欠損の作製直後、またはある有意な時間の後（線維性組織形成の開始の後を含むがこれらに限定されない）に、局所的な許容性の欠損部位を有する個体に提供され得る。従って、機能的置換組織の組織機能の修復および／または修復もしくは再生を、欠損の作製後の有意な時間後に形態形成タンパク質を全身的に投与することによって増強する手段が、現在利用可能である。方法および処方物が外科的な介入を必要とせずに局所的な欠損の修復に使用され得；新しい置換組織形成の速度および質を、特に自発的治癒を生じる能力が減少した易感染性個体において増強し得、そして欠損部位での線維形成が始まった後であっても新しい組織形成を誘導するために使用され得る。この発見は、同時継続中の米国特許出願（代理人参照番号、CRP-124、2054/94（本願と同日に出願））に開示され、この開示は本明細書で参考として援用される。
【００１２】
本明細書中で開示されるように、局所的組織欠損の修復での所定のモルフォゲンおよびモルフォゲンアナログのインビボでの活性を効率的に評価するための方法がここに提供される。本方法は、モルフォゲンまたはアナログを、場合によっては修復を必要とする局所的組織欠損を患う動物に対して全身的に提供する工程を含む。モルフォゲンまたはアナログは、経口、静脈内または腹腔内を含む任意の全身的な手段により提供され得る。組織は、修復を必要とする任意の組織であり得、本明細書中に記載される任意の組織を含むがこれらに限定されない。さらに、本明細書において提供される方法により、好ましい形成処方物、（もしあれば、標的試薬、抗生物質、鎮痛薬などのような添加された分子の価値を含む）を容易に評価することが可能になり、そして投与経路賦形剤としての価値を付加する好ましい結合剤、溶液、および他の成分を評価することが可能になる。
【００１３】
本方法により、任意のモルフォゲン（任意の天然に存在するかまたは生合成の（例えば、遺伝子操作されたその改変体（キメラおよびムテインを含む）を含むを迅速に試験することが可能になる。
【００１４】
本方法により、所定のモルフォゲン、モルフォゲンアナログ、治療の症状および／または個体の状態についての最適な投薬ストラテジー、投与経路および／または投与時間の評価することもまた可能になる。これらのストラテジーは、欠損型、組織型、モルフォゲンおよび／またはアナログの選択、ならびに個体の状態に基づいてある程度まで変化することが予測される。例えば、老齢の個体、または血流の減少を有する固体は、健康である若年個体と比較して異なる投薬ストラテジーおよび／または投与経路を必要とし得る。これらの異なる患者群における投薬ストラテジー試験により、投与のための最適な分子および状態を決定することが可能になる。
【００１５】
本明細書において提供される方法はまた、1つ以上のインビトロアッセイによって決定されるように、モルフォゲンを機能的に擬態することにおいて有用性を有することが決定された、候補のモルフォゲンアナログの効力を評価するための信頼性のあるインビボ手段を提供する。モルフォゲンまたはモルフォゲンアナログの活性を評価するためのインビトロアッセイは、極めて多くの公共的供給源（WO93/05751（1993年4月1日公開）、およびUSSN08/432,883（1995年5月2日出願）、およびUSSN08/727,118（1996年10月8日提出）（これらの開示は本明細書において参考として援用される）を含む）において記載される。本方法はまた、もしあれば、何が所定の候補アナログの毒性レベルであり得るかを決定するための、容易な、そして信頼性のある手段を提供する。
【００１６】
本アッセイは、目的の組織における局所的欠損の生成およびモルフォゲンまたはアナログの全身的な投与を含む。1つの実施態様では、生体適合性の生分解性マトリックスが皮下部位に移殖され、そしてモルフォゲンまたはアナログは、例えば、腹腔内または静脈内に全身的に投与される。1つの実施態様では、マトリックスは、骨由来のコラーゲンマトリックスであり、活性モルフォゲンまたはアナログは、コラーゲン移殖部位における新しい軟骨および骨形成を誘導し得、これらは移殖後12日目に標準的組織学について評価され得る。別の実施態様では、許容性の局所的欠損部位は、存在する組織において作製される。
【００１７】
本明細書で意図されるように、「許容性」部位とは、修復を必要とする組織欠損部位であり、そしてこれに対して前駆体細胞が到達可能である。間葉前駆体細胞は、代表的には、最初の外傷により誘発される炎症性応答の一部として、少なくとも外傷後6〜24時間後までは欠損部位に利用可能となる。具体的には、これらの前駆体細胞（幹細胞）は、炎症応答により活性化されたケモカインおよび増殖因子により部位へ補充される。これらの補充された前駆体細胞は、欠損部位で凝縮塊を形成し、代表的にはカルスと呼ばれ、そして局所的に利用可能である特異的な組織誘導性シグナルへ応答して特定の組織型へ分化するために利用可能である。このような組織誘導性シグナルの不在下では、これらの前駆体細胞は、代表的には、ケモカインおよび増殖因子（例えば、PDGF、TGFβ、IL-1など）により線維芽細胞へ分化するように誘導される。次いで、最終分化に運命づけられた線維芽細胞は、線維性「瘢痕（scarring）」組織に特徴的な非特異的細胞外マトリックスを生成し得、そしてこれらは経時的に吸収され得る。このような瘢痕は、例えば、肺、肝臓、腎臓、および心臓組織において生じ得るような硬化性組織または組織梗塞の特徴であり得る。
【００１８】
別の実施態様では、局所的欠損部位は目的の組織（例えば、肺、心臓、膵臓、肝臓、胃腸管および神経組織）において作製される。本方法および組成物は、骨格組織のような組織（骨、軟骨、靭帯、腱および滑膜組織を含む）、および肝臓、腎臓、肺、膵臓、脾臓、子宮、心臓、甲状腺、胃腸管、神経組織、感覚器官などへの、機能の修復および／または回復のための、好ましい投与プロトコルの評価において補助することが意図される。
【００１９】
1つの好ましい実施態様においては、アッセイが最適な投与時間を評価するために使用され得る。例えば、1つの実施態様において、タンパク質または候補アナログが、外傷後の少なくとも6時間に、または外傷後の少なくとも10〜24時間で提供される。別の実施態様においては、タンパク質またはアナログは、外傷後の24〜36時間の間、および／または36〜72時間の間、および／または72〜120時間の間、および／または120〜168時間の間の任意の時間に全身的に提供される。別の実施態様においては、アッセイは、難治性治癒の条件下での組織修復の促進または誘導のための最適な投与経路、時間および用量を評価するために使用される。本明細書で使用される場合、「難治性治癒」とは、欠損の性質または個体（老齢、肥満、喫煙者、糖尿病、ステロイド使用者）の状態に起因して、例えば、欠損を修正するのに十分な新しい置換組織の自発的形成が生じない任意の欠損をいう。
【００２０】
別の局面において、本発明は、存在する組織または器官においてインビボで損失または損傷した組織を再生するためのモルフォゲンまたはモルフォゲンアナログの能力を評価するための方法を提供する。別の局面においては、本発明は、組織損傷後、またはこのような損傷の前に、正常な組織機能を維持するモルフォゲンまたはアナログの能力を評価するための方法を提供する。本明細書において開示されるように、修復方法は、塞がっているかまたは開いている損傷の両方の処置を含む。欠損の例には、組織欠損が含まれるがこれに限定されない。
【００２１】
別の局面において、本発明は、上記に記載の方法の実施するためのキットを提供する。本明細書において意図されるように、キットの1つの実施態様には、全身投与のための、コラーゲンマトリックス移殖物およびモルフォゲンおよび／またはアナログ処方物が含まれる。別の実施態様においては、キットは形態形成タンパク質またはアナログを含み、そして全身投与キャリア（例えば、液体キャリア）は同じ容器にパッケージされている。他の実施態様においては、形態形成タンパク質またはアナログは、滅菌形態で提供され、そして所定のキャリア（例えば、同じ容器内の水性緩衝液）で再構成される。
【００２２】
本発明の方法を使用して試験するための例示的な処方物には、静脈内に投与される液体処方物として、タンパク質またはアナログを提供する工程を含む。別の実施態様においては、タンパク質またはアナログは、腹腔内に液体処方物で提供される。なお別の実施態様においては、タンパク質またはアナログは、経口投与のために液体または錠剤または他の非液体形態で提供され、これらは生体適合性、生分解性、または生体腐食性の微粒子（bioerodible microsphere）、および他の送達ビヒクルに配置されて、または本明細書に記載されるような別の適切な結合剤と組み合わされて含む。別の好ましい実施態様は、投与直前に溶かされる乾燥粉末構成物を有し得る。1つの適切な処方物は、最初に液体キャリア（例えば、賦形剤を有するかまたは有しない水）中に形態形成タンパク質またはアナログを分散させ、次いで凍結乾燥することから生じる。1つの試験された処方物においては、組成物は酸性緩衝化溶液（例えば、pH4.0〜4.5、例えば、酢酸またはクエン酸緩衝液）と一緒にタンパク質を組み合わせることにより作製される溶液である。なおも別の処方物は、生理的緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS））で骨形成タンパク質を分散することにより形成される懸濁液である。
【００２３】
本明細書において意図されるように、本発明の方法における評価するために有用である形態形成タンパク質は、以下を含むがこれらに限定されない、OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-4、BMP-5、およびBMP-6。現在好ましい形態形成タンパク質は、OP-1である。本明細書で使用される場合、用語「モルフォゲン」、「骨形態形成」、「骨形態形成タンパク質」、「BMP」、「骨形成タンパク質」および「骨形成因子」は、ヒト骨形成タンパク質1（hOP-1）により代表されるタンパク質のクラスを包含する。hOP-1についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号1および2にそれぞれ提供される。記載を簡潔にするために、hOP-1は、本明細書において、代表的な形態形成タンパク質として以下に記載される。しかし、OP-1は、真の組織モルフォゲンのTGF-βのサブクラスの単なる代表であり、そしてその記載に制限されることは意図されないことが当業者により理解される。他の公知の、そして有用なタンパク質は、BMP-2、BMP-3、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11、GDF-12、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURALおよびそれらの形態形成的に活性なアミノ酸改変体を含む。1つの好ましい実施態様においては、本発明において有用であるタンパク質は、これらのタンパク質の任意の生物学的に活性な種改変体を含み、保存性アミノ酸配列改変体、縮重ヌクレオチド配列改変体によりコードされるタンパク質、および本明細書に記載され、そして本明細書に開示される形態形成タンパク質（以下を含むがこれらに限定されない、OP-1：BMP-5、BMP-6、BMP-2、BMP-4またはGDF-5、GDF-6またはGDF-7）をコードするDNA配列とハイブリダイズし得るDNA配列によりコードされる保存された7個のシステイン骨格を共有する骨形成的に活性なタンパク質を含む。別の実施態様において、有用なタンパク質は、7個の保存されたシステインドメインを共有し、そして少なくとも70％のアミノ酸配列の相同性（同一性）を本明細書中で定義されるC末端の活性ドメインの内部に共有するタンパク質を含む。別の実施態様においては、有用なタンパク質は、C末端ドメイン中に60％を超える同一性を共有するタンパク質を含む。なお別の実施態様においては、有用な骨形成タンパク質は、OPX（配列番号3）および一般配列7および8（配列番号4および5）または一般配列9および10（配列番号6および7）を含む本明細書で定義されるある1つの一般配列を有する骨形成的に活性なタンパク質として定義され得る。
【００２４】
本明細書において意図されるように、本発明の方法は、モルフォゲンアナログ（例えば、モルフォゲン媒介性生物学的効果を誘導し得る任意の候補化合物）の形態形成特性の評価について有用である。モルフォゲンアナログは、リガンド-モルフォゲンレセプター結合相互作用におけるモルフォゲン、およびネイティブな状態下でのリガンド-モルフォゲンレセプター結合により通常は刺激される下流の効果を誘導することによって形態形成の生物学的効果を誘導し得る機能的模倣物を置換し得るホモログおよびリガンドのアナログを含む。
【００２５】
本発明のアナログを同定する方法の結果として、本発明は、治療グレードのモルフォゲンアナログを同定し、そして生成する手段を提供する。本発明はさらに候補モルフォゲンアナログの誘導体を同定し、そして生成することを提供し、ここでは、最初に同定されたアナログの任意の所望されない特性（例えば、インビボ毒性、または保存における品質低下の傾向）が軽減される。
【００２６】
なお別の実施態様は、モルフォゲンまたはアナログの適切な用量の決定および／または形態生成の進行において有用なアッセイ方法を意図する。
【００２７】
本発明の任意の処置方法において、「形態形成タンパク質またはアナログの投与」とは、単独または他の分子との組み合わせのいずれかでタンパク質またはそのアナログを投与することを言う。例えば、モルフォゲンの成熟形態は、その前駆体である「プロ」ドメイン（これらはタンパク質の溶解性を増強することが公知である）と関連して提供され得る。本明細書で使用される場合、形態形成タンパク質の「可溶形態」とは、形態形成タンパク質プロドメインの一部または全てと複合体化した二量体種を意味することが理解される。例えば、形態形成タンパク質の可溶性複合体形態の詳細な記載については、WO94/03600（1994年2月18日公開）および／またはJonesら、（1994）Growth Factors 11：215-225を参照のこと。タンパク質可溶性を増強することが公知である他の有用な分子は、カゼインおよび他のミルクの成分ならびに様々な血清タンパク質を含む。
【００２８】
本発明の前述および他の目的、特性および利点は、本発明の以下の詳細な説明よりさらに明瞭にされる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、全身性OP-1により誘導される骨形成活性を示すグラフである。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、骨形成活性に対するOP-1投与のタイミングの効果を示すグラフである。ウシのコラーゲンキャリア（25mg）を筋肉内および皮下部位に移殖し、そしてコラーゲン移殖後１日目、３日目、５日目、７日目または９日目にOP-1を尾部静脈を介して投与した（一回の注射あたり1500ug）。骨形成活性を、OP-1投与後12日目に、組織学、アルカリホスファターゼおよびカルシウム含有量により決定した。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、全身性に投与されたOP-1により誘導された骨形成活性に対する動物の年齢の効果を示す。ウシのコラーゲンキャリア（25mg）を皮下部位および筋肉内に移殖した。OP-1を尾部静脈を介して投与した（キャリア移殖の24時間後、単回注射として2500ug）。骨形成活性を、OP-1移殖後12日目に、アルカリホスファターゼ活性（図３Ａ）およびカルシウム含有量（図3Ｂ）、および移殖物に対して行った組織学により決定した。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、全身性に投与されたOP-1により誘導された骨形成活性に対する動物の年齢の効果を示す。ウシのコラーゲンキャリア（25mg）を皮下部位および筋肉内に移殖した。OP-1を尾部静脈を介して投与した（キャリア移殖の24時間後、単回注射として2500ug）。骨形成活性を、OP-1移殖後12日目に、アルカリホスファターゼ活性（図３Ａ）およびカルシウム含有量（図3Ｂ）、および移殖物に対して行った組織学により決定した。
【図４】図４は、ヒトOP-1のｃ-末端の７個のシステイン領域に対する様々なモルフォゲンの相同性のパーセントを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な説明）
形態形成タンパク質およびそのアナログの効力および／または薬物動力学特性を評価するためのアッセイ方法が、ここで発見された。この方法は、局所的な許容性の欠損部位を有する動物における形態形成タンパク質またはそのアナログを全身的に投与する工程、および欠損部位において機能的置換組織の形成を誘導するために、アッセイの条件下で投与されるタンパク質またはアナログの能力を評価する工程を包含する。本方法は、外因性マトリックス物質を含むことを必要とせず、または欠損部位にタンパク質またはアナログを直接提供することを必要としない。局所的許容性欠損部位は、動物（例えば、ラット）において筋肉内または皮下部位でのマトリックス物質を移殖することにより容易に生成され得る。1つの実施態様において、物質は鉱質を除去され、脱タンパク質化（deproteinated）されたコラーゲンマトリックスである。別の実施態様においては、マトリックスは、任意の他の生体適合性で、生分解性で、生物学的な不活性な足場物質であり、好ましくは多孔性でありそして実質的に無細胞である。なお別の実施態様では、許容性の局所的欠損部位は現存する組織において生成される。例えば、骨折は骨において誘導され得、そして断裂または軟骨の欠損は軟骨で誘導され得る。同様な機械的または毒物誘導性欠損は、少し例を挙げると、肺、心臓、肝臓、膵臓、子宮および他の組織において誘導され得る。
【００３１】
欠損はまた、異なる患者群を代表する標準的な良好に特徴付けられた動物モデルにおいて、異なる治療状態におけるモルフォゲンまたはアナログの効力および／または薬物動力学を評価するための手段として作製され得る。例示的な患者群は、以下を含むがこれらに制限されない：若年、老齢、糖尿病、高血圧、肥満、免疫無防備状態の（immune comprised）動物など。
【００３２】
以下では、本方法において有用である適切な形態形成タンパク質およびアナログおよび処方物、本発明の組成物およびアッセイならびにそれらの投与および適用についての方法の詳細な記載；ならびに多くの非限定的な例は、1）本明細書に記載される形態形成タンパク質、アナログ、処方物、方法およびアッセイの適切さを例示し；そして 2）異なる組織での効力について、様々な欠損の修復について、および異なる患者群における効力および／または薬物動力学の測定について、候補のタンパク質およびアナログ、処方物を試験するためのアッセイの提供の詳細な記載である。
【００３３】
請求される発明の主題をより明解かつ簡潔に記載するために、以下の定義が、明細書および添付の項目の範囲で使用される特定の用語の意味についての指導を提供することを意図される。
【００３４】
本明細書中に具体化されるように、「正常組織機能を維持している」という表現は、傷害または優先的もしくは先天的な欠損に起因して損失した組織機能の回復（regain）または回復（restore）ならびに傷害からの損傷の危険にある組織を保護することの両方を意味する。組織機能を回復することは、新しい組織の再生および／または生存する分化した組織の細胞を刺激して老化細胞の場合におけるようにそれらの表現形の発現を続けることを含み得る。「抑圧された組織機能」レベルとは、組織傷害または疾患の結果として、欠乏まで減少した組織機能をいう。本明細書で使用される場合、組織または器官「の生存性を増強する」という表現は、組織の壊死および／または線維症（特に、免疫応答媒介組織の壊死および／または線維症）の結果として減少したかまたは損失した組織または器官の機能の低減および／または除去からの保護を意味する。「軽減する」とは、所望されない組織の破壊の低減および／または排除からの保護を意味する。「移殖された」生存組織は、例えば、移殖され、単離された前駆体または幹細胞の場合のように組織移殖片および細胞移殖物の両方を含み、これは、単独で、または一時的な足場と結合させて移殖され得る。組織は、自己または同種異型の組織および／または、例えば、人工マトリックスの存在下での肝細胞を培養することにより生成される合成組織であり得る。「形態形成的に許容性の環境」とは、形態形成が生じる組織を生じさせ得る環境を意味することが理解される。最後に、「症状を軽減する補因子」とは、本発明の治療剤と一緒に投与され得る1つ以上の医薬について言い、そしてこれらは、代表的には組織負傷および／または組織機能損失に関連する1つ以上の症状を軽減するか、または和らげる。例示的な補因子は、抗生物質、消毒剤、非ステロイド性抗炎症剤などを含む。
【００３５】
「欠損（defect）」または「欠損部位（defect site）」または「欠損位置（部位）（defect locus）」とは、本明細書で意図されるように、修復を必要とする組織または器官での任意の構造的破壊を規定し得る。全身的に投与される形態形成タンパク質は、間葉前駆体細胞（幹細胞）の補充、増殖および分化の割合を増強し得る。このような組織欠損の修復は、利用可能または接触可能な間葉前駆体細胞の存在に依存する。
【００３６】
「修復」とは、哺乳動物において機能の再生および／または欠損を機能的に補正するために十分である新たな組織の形成を意味することが意図される。しかし、修復は、完全な治癒のプロセス、または、その欠損前の生理学的/構造的/機能的（mechanical）状態に欠損を再生させることにおいて100％有効である処置を意味せず、またはそうである場合もない。
【００３７】
形態形成タンパク質に加えて、様々な全身性因子、ホルモン、酵素、酵素インヒビターおよび／または化学誘引物質/送化性因子、治療的組成物、抗生物質、または他の生物活性剤もまた、本発明における使用のための処方物内に含まれ得る。従って、様々な公知の増殖因子（例えば、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF-α、およびTGF-β）もまた本明細書に記載される形態形成処方物と組み合わされ、そして全身的に投与され得る。
【００３８】
「モルフォゲン」、「形態形成タンパク質」、「骨形成タンパク質」、または「骨形態形成タンパク質」は、一般に、新規の器官特異的組織形成を達成する形態形成事象の完全なカスケードを誘導し得るタンパク質を意味することが理解される。本明細書中の他の場所に記載されるように、このタンパク質のクラスは、ヒト骨形成タンパク質（hOP1）によって代表される。本発明の実施において有用な他の骨形成タンパク質には、OP1、OP2、OP3、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、DPP、Vgl、Vgr-1、60Aタンパク質、GDF-1、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、BMP10、BMP11、BMP12、BMP13、BMP15、UNIVIN、NODAL、SCREW、ADMP、NEURALの骨形成的な活性形態、およびそのアミノ酸配列改変体が含まれる。１つの現在好ましい実施態様において、骨形成タンパク質には、以下のいずれか１つが含まれる：OP1、OP2、OP3、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、ならびにそのアミノ酸配列改変体およびホモログ（そのホモログ種を含む）。ヒトOP-1、BMP2および関連タンパク質の保存された７つのシステインドメインを規定する、Ｃ末端102〜106アミノ酸と少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が特に好ましい。本発明の特定の好ましい実施態様は、骨形成タンパク質であるOP-1、およびＣ末端の７つのシステインドメインにおいてOP-1と60％より大きいアミノ酸配列同一性を共有するタンパク質を含む。特定の他の好ましい実施態様は、生理学的生理食塩溶液に可溶化される成熟OP-1を含む。本明細書中の他の場所にさらに記載されるように、本願の発明を用いる使用に適切なタンパク質は、ReddiおよびSampathにより記載される当該分野に認識されるバイオアッセイを使用して、日常的な実験の手段によって同定され得る。有用な形態形成タンパク質の詳細な記載は、以下に提供される。
【００３９】
一般に、用語「アナログ」は、所定の物質の機能的等価物であり、そしてこの物質の代用物（治療代用物として含む）であり得ることが理解される。アナログはまた、構造的等価物であり得る。本明細書中に使用される場合、「モルフォゲンアナログ」は、モルフォゲン（例えば、OP-1）によって誘導および／または媒介される生物学的効果を模倣する物質である。このような模倣特性を有する任意の物質は、その化学的または生化学的性質に関わりなく、本明細書中のモルフォゲンアナログとして使用され得る。本明細書中で考慮されるようなモルフォゲンアナログは、生存システムによって、または化学的もしくは生化学的合成技術を介して産生される、簡単または複合の物質であり得る。これは、天然に存在する物質であり得るか、または新規の物質であり得、例えば、合理的な薬物設計の原理に従って調製される。これは、レセプター相互作用に関連する溶媒に露出されたモルフォゲン表面エピトープに構造的に類似した物質、モルフォゲン応答性細胞の表面上に提示されるモルフォゲンレセプターを他に刺激する物質、または細胞膜等価性物質もしくは他に細胞内作用性分子（これは、モルフォゲン応答性細胞のシグナル伝達機構の細胞内成分と相互作用し、それによってモルフォゲン特異的生物学的効果を刺激する）であり得る。このような細胞内作用性モルフォゲンアナログは、本明細書中で「下流形態形成インデューサー」ともいわれる。本明細書中で使用されるモルフォゲンアナログは、「模倣物（mimic）」または「模倣物（mimetic）」として好ましくあり得る。
【００４０】
別の実施態様において、本発明において使用されるモルフォゲンアナログは、候補化合物、またはモルフォゲンレセプターのアゴニストとして作用する薬剤を含む。レセプターの「アゴニスト」は、レセプターに結合する化合物、およびこのような化合物のために、このような結合は、レセプターへのモルフォゲンの結合に類似した機能的結果を有する化合物を意味する。すなわち、レセプターとの相互作用における化合物は、モルフォゲンと同じか、または実質的に類似した膜貫通および／または細胞内効果を産生する。従って、モルフォゲンレセプターのアゴニストはレセプターに結合し、そしてこのような結合は、モルフォゲン結合と同じかまたはこれに類似した機能的結果（例えば、形態形成の誘導）を有する。アゴニストの活性または潜在力は、天然のモルフォゲンのものよりも低くあり得（この場合、アゴニストは「部分的アゴニスト」といわれる）、または天然のリガンドのものと等しいかもしくはこれよりも高くあり得る（この場合、アゴニストは「完全アゴニスト」といわれる）。従って、例えば、モルフォゲンレセプターへの結合および活性化におけるモルフォゲンの活性を模倣し得る小ペプチドまたは他の分子が、モルフォゲン等価物として使用され得る。好ましくはアゴニストは完全なアゴニストであるが、部分的なモルフォゲンレセプターアゴニストもまた有利に使用され得る。このようなアゴニストを同定する方法は、本明細書中で開示されており、そしてこれは、モルフォゲン媒介性応答（例えば、後腎間葉分化の誘導、軟骨内の骨形成の誘導など）を誘導する化合物のアッセイを包含する。このようなアゴニストは、モルフォゲン「模倣物（mimic）」、「模倣物（mimetic）」、または「アナログ」ともいわれ得る。
【００４１】
また、例示的な目的であって、これに限定されないが、本発明において有用な別の型のモルフォゲンアナログは、米国特許第5,132,405号、同第5,091,513号、および同第5,258,498号に示される（これらの教示は、本明細書中に参考として援用される）ような、生合成抗体結合部位（BABS）技術の原理の賢明な適用を用いて調製され得る。BABSアナログ構築物は、抗体から調製され得、好ましくはモルフォゲン細胞表面レセプターに特異的に結合するハイブリドーマ細胞によって産生される。あるいは、BABS分析は、モルフォゲン生物学的活性をブロックする抗体の抗原結合部位と特異的に反応性である抗イディオタイプ抗体から調製され得る。Vukicevicら（1994）Biochem．Biophys．Res．Comm．198：693-700は、OP-1特異的モノクローナル抗体の調製を教示する。当業者は、このような抗体が、本発明のBABSアナログが調製され得る抗イディオタイプの抗体の日常的な調製において免疫原として使用され得ることを理解する。
【００４２】
再度、本明細書中に例示の目的で示されるがこれに限定されない、構造的に異なるクラスのモルフォゲンアナログは、Tuerkら（1990）Science 249：505-510，Famulokら（1992）Angew．Chem．Intl．Ed．Engl．31：979-988、およびBockら（1992）Nature
355：564-556（各教示は本明細書中に参考として援用される）に示されるような直接的な分子進化の原理の適用によって調製され得る。この直接的な分子進化プロセスは、核酸分子（代表的には、タンパク質のような選択されたリガンドに高い親和性で結合するRNA）の単離を含む。このような核酸分子は、当該分野で「アプタマー」といわれる。所望のアプタマーは、最初に核酸分子のランダムプールに存在し、そしてリガンド結合核酸のPCRに基づく増幅の代わりに、いくつかのラウンドのリガンド親和性に基づくクロマトグラフィーを行うことによって単離される。Bockら（1992）上記は、動物におけるインビボ使用に適切な、血液凝固促進因子、トロンビンを特異的に阻害するアプタマーの調製を示した。本明細書中で考慮されるように、このようなアプタマーは、モルフォゲン由来であり得る。
【００４３】
なお別の構造的に異なるクラスのモルフォゲンアナログは、ランダムペプチドライブラリー（Scottら（1990）Science 249：386-390）または有機もしくは無機の化合物の組み合わせ合成されたランダムライブラリー（Needelsら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA
90：10700-10704；Ohlmeyerら（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：10922-10926）の適切なメンバーを選択することによって調製され得る。当業者は、上記および他の関連技術が、生物学的に産生されるのスクリーニング物質の長期確立された原理とあわせて、モルフォゲンアナログ活性についてスクリーニングするための広いアレイの候補物質を提供することを理解する。当業者によって理解されるように、このようなライブラリースクリーニングの産物は、モルフォゲンレセプター結合のためのリガンドとして、OP-1または別のモルフォゲンを模倣し得る。あるいは、産物は、１つ以上の細胞内相互作用を介してモルフォゲン特異的生物学的効果を誘導し得る。従って、天然の供給源または一般的に操作されたOP-1または他のモルフォゲンアナログ、モルフォゲンレセプターアナログまたは生物学的機能的模倣物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖質、脂質、アミノ酸、核酸、糖、脂肪酸、ステロイド、または上記の化合物のいずれか１つの誘導体を含み得る。これは、真核生物細胞または原核生物細胞の代謝の中間体もしくは最終産物であり得る。あるいは、アナログは、生物学的な応答性変更因子または毒素であり得る。最終的に、アナログは、内因性モルフォゲンの発現を誘導するのにコンピテントな（誘導し得る）分子であり得る。
【００４４】
本明細書中で使用される「結合剤」は、本明細書中に規定されるような形態形成タンパク質とともに混合される場合、インビトロでタンパク質の生物学的活性を実質的に破壊することなく、処方物の所望の生物学的特性を増強させる、任意の生物学的に適合可能な物質を意味する。結合剤は、経口投与が所望される場合、有用性を有することが意図される。とりわけ好ましい結合剤の他の特性は、デバイスに以下を与える能力である：柔軟性、成形のしやすさ、および／または適応性に優れる。さらに、特定の好ましい実施態様において、結合剤は、低い割合で存在する場合、上記の特徴および利点を達成し得る。
【００４５】
本明細書中で有用であることが意図されるこれらの結合剤には、当該分野において理解される懸濁剤、粘性剤、および乳化剤が含まれるが、これらに限定されない。特に、当該分野において理解される薬剤、例えば、セルロースガム誘導体、アルギン酸ナトリウム、および粉ゼラチンが使用され得る。より詳細には、セルロース誘導体剤（例えば、アルキルセルロース）が好ましく、これには、少し列挙すると、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびヒドロキシアルキルセルロースが含まれる。現在、カルボキシメチルセルロース（そのナトリウム塩を含む）が最も好ましい。他の有用な結合剤には、デキストラン、マンニトール、白色パラフィン、ゴマ油、およびその混合物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中上記の技術に関して、当業者は、単に日常的な経験および従来の技術を使用して、上記に同定された結合剤の適切な等価物を同定し得る。
【００４６】
本明細書中で使用される「湿潤剤」または「キャリア」は、骨形成タンパク質のインビボ生物学的活性で妨害されない場合、任意の生物学的に適合性の水性溶液を意味する。現在好ましい湿潤剤またはキャリア剤には、個体に液体形態で投与され得るように、溶液中でタンパク質を可溶性化またはそうでなければ懸濁させ得る水性溶液が含まれる。現在好ましいキャリアには、生理学的生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、酢酸緩衝化溶液（pH4.5）などが含まれるが、これらに限定されない。等価物は、日常的な実験および従来の技術を超える技術を使用することなく当業者によって同定され得る。
【００４７】
例示的な組織：
いくつかの例示的な組織、ならびに本明細書中に記載される方法および組成物によって処置可能な、ならびにこの開示によって可能な、ならびにこの開示によって可能な評価可能なアッセイにおいて有用な、種々の欠損の病因論を以下に列挙する。援用は、いかなる場合も制限されることが意図されないことが、当業者によって理解される。本明細書中に援用される組織に加えて、他の組織（膵臓、子宮、卵巣、胃腸管、結腸、小腸、皮膚、および歯周組織を含むが、これらに限定されない）が、本明細書中に記載される方法および組成物によって処置され得る。
【００４８】
心臓組織：
成人の哺乳動物心筋は、非常に制限された増殖力および再生力を有する。結果として、例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、身体的外傷（例えば、自動車事故）、または感染に起因する心筋の損傷または喪失が、代表的に永続的およびしばしば進行的な心機能の喪失を生じる。
【００４９】
本発明の方法および組成物から利益を受け得る被検体には、心筋の喪失または損傷の危険性にあるか、またはこれに苦しむ個体が含まれる。このような被検体には、既に心筋梗塞、心臓への身体的外傷（例えば、自動車事故）に罹患している被検体、または既にうっ血性心不全に罹患している被検体、ならびに心筋梗塞またはうっ血性心不全に罹患していることが合理的に予期される被検体のような、心筋組織の欠失で既に苦しんでいる被検体が含まれる。
【００５０】
方法および組成物は、新規かつ機能的な哺乳動物心筋を生じるために、喪失または損傷した哺乳動物心筋の部位での前駆体幹細胞の増殖および／または分化のプロセスを誘導し、それによって、全体的または部分的に喪失または損傷を回復または再生させる。処置はまた、慢性的に悪化した哺乳動物心筋（例えば、うっ血性心不全または慢性筋障害に起因する）を修正するために使用され得る。１つの実施態様において、既に１つ以上の心筋梗塞に罹患している被検体は、瘢痕組織を除去するための手術を受け得、そしてモルフォゲンまたはアナログが全身的に投与され、心臓組織形態形成を誘導し得る。
【００５１】
神経組織：
心臓組織のように、哺乳動物の神経組織は、制限された増殖力および再生力を有する。モルフォゲンまたはアナログは、神経経路に対する損傷において、またはこのような損傷を見越して、神経経路を維持するために充分な時間および濃度で、創傷経路の修復またはそれに対するさらなる障害の阻害を含み、本発明の方法および組成物において使用され得る。
【００５２】
特に、モルフォゲンおよびアナログは、神経自体におけるギャップを埋める離れた距離にわたって、または神経とシナプス後細胞との間での、横断したもしくは損傷した神経線維（神経）修復再生のニューロンプロセス（特に軸策）を含む損傷した経路を修復するために使用され得る。特に、本明細書中に記載のモルフォゲンおよびアナログは、保護的な髄鞘の脈管形成および再形成を含む、完全な軸策神経再生を刺激し得る。これらはまた、中枢神経系における（例えば、損傷もしくは剥離した網膜、または視神経の他の損傷の修復における）機能的な置換神経経路を形成し得る。
【００５３】
モルフォゲンまたはアナログはまた、死の危険性にあるニューロン細胞の生存を増強し、それによって神経経路に対する損傷を予防、制限、または阻害するに有用である。非有糸分裂性ニューロンは、神経障害またはニューロンもしくはグリア細胞の他の細胞性機能障害（細胞死を含む）、続いて細胞またはその周辺組織の化学的もしくは機械的外傷の結果として、死の危険性にある。化学的外傷は、鉛、エタノール、アンモニア、ホルムアルデヒド、および多くの他の有機溶媒、ならびにタバコの煙および麻酔剤における毒素を含む、公知の毒性剤から生じ得る。グルタミン酸のような興奮性のアミノ酸もまた、神経細胞死の病因において役割を果たし得る（Freeseら（1990）Brain Res．521：254-264を参照のこと）。ニューロン細胞死はまた、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、およびパーキンソン病、筋萎縮外側硬化、および多発性硬化症を含む多数の神経変性疾患における重要な起因因子であると考えられる。これらの神経障害は、肝臓の脳障害、感染性脳障害、毒性脳障害、自己免疫脳障害、栄養上の脳障害または虚血性脳障害を生じる代謝性であり得る。さらに、エタノール、および多数の他の毒素もまた、神経変性疾患における重要な起因因子として同定されている。
【００５４】
本明細書中に記載されるモルフォゲンおよびアナログもまた、身体の免疫/炎症応答に関連する神経経路を緩和する神経保護効果を提供するために有用である。このような応答は、例えば、虚血または低酸素症に続く、ニューロンもしくはグリア細胞への血流を阻害することによって、または神経もしくは周辺物質への他の外傷によって、（例えば、自己免疫機能障害、新生物外傷、感染、化学的外傷または機械的外傷、疾患によって引き起こされる）神経組織に対する外傷に続く。塞栓性脳卒中におけるように、例えば、低酸素症または虚血性再灌流から生じる主な損傷、続く神経血液供給の閉塞は、免疫学的に関連することが考えられている。さらに、少なくとも多数の主な脳腫瘍に関連する損傷部分もまた、免疫学的に関連することが明らかである。例えば、脳室内または間接的に、経口投与によって哺乳動物に全身的にモルフォゲンを提供することが、神経損傷に対する免疫学的に関連した応答を緩和および／または阻害するために使用され得る。損傷が、手術または他の進入性の臨床的な処置の間に誘導される場合、モルフォゲンまたは薬剤は、危険性にある神経組織への神経保護効果を提供するために損傷の誘導の前に提供され得る。
【００５５】
さらに別の局面において、本明細書中に記載される本発明は、モルフォゲンおよび分化したニューロンの増殖および維持を支持し得るアナログの有効性および／または薬物動態学を評価するための方法を提供し、これは、表現型を発現することを継続させるためにニューロンを誘導する工程を包含する。この活性は、機能の喪失が、細胞性代謝性機能および細胞の減少または喪失によって引き起こされる神経組織障害の処置において使用され得る。なぜなら、老化または鎮静期が老化細胞において生じ、そしてアルツハイマー病において顕著であることが考えられるからである。非経口または経口投与によって全身的にモルフォゲンを提供することによって、これらの細胞を刺激して、細胞性代謝性機能障害の効果を有意に阻害および／または逆にし、それによって危険な状態にある神経経路を維持する表現型の発現を継続させる。
【００５６】
本発明はまた、モルフォゲン、アナログ、および機械的な力によって引き起こされる中枢神経系に対する外傷障害を処置することにおいて、それらの薬物動態学の評価に使用され得る。外傷は、哺乳動物の頭、首、または脊柱の任意の位置またはその付属物との外来の物体の外傷性接触から生じ得るような、傷、切開、挫傷、刺し傷、圧迫などから選択される組織発作を含み得る。外傷性損傷の他の形態は、不適切な体液蓄積による哺乳動物CNS組織の収縮または圧迫から生じ得る（例えば、正常な脳脊髄または硝子体液産生、回転もしくは容量制御、硬膜下もしくは脳内血腫もしくは浮腫の遮断または機能不全）。同様に、外傷性の収縮または圧迫は、転移性または原発腫瘍のような、異常な組織の塊の存在から生じ得る。
【００５７】
肝臓：
身体におけるほとんどの他の器官とは異なって、肝臓は、肝組織障害または細胞死の後の規定された再生能力を有する。詳細には、肝細胞が胎児および出生後肝増殖の後、活性に増殖しない場合、正常な静止肝細胞が細胞死または肝組織の喪失に応答して分化する。しかし、組織損傷が広範および／または慢性である場合、永久的な組織障害が生じ得、期間の生存および機能的な能力を減少させる。永久的な肝組織の損傷は、代表的に、広範な壊死および／または線維形成または瘢痕（硬変）によって特徴付けられる。非修復性損傷の別の供給源は、肝臓新生物および転移性のガンから生じる。
【００５８】
いずれの肝細胞塊が充分に減少するか、またはそれらの機能が充分に障害された場合、肝不全が起こる。肝不全の病因は、代謝性（例えば、変化したビリルビン代謝または脂肪酸貯蔵）、感染性（例えば、ウイルス性肝炎肝臓分裂縮瞳（schistomiasis）、梅毒、または回虫症によって誘導される）、毒性（例えば、エタノール、アンモニア、フェノール、および他の環境毒素、脂肪酸、薬物、および／またはそれらの代謝物によって誘導される）、自己免疫、虚血、または栄養性（例えば、アルコール性肝疾患はまた、重篤度、しばしば本質的な凝血因子の産生の減少に起因する生命を脅かす出血によって特徴付けられる）であり得る。肝不全はまた、肝臓の脳障害として広く特徴付けられ、そして腎不全黄疸、肺の合併症に関連付けられる神経学的な機能不全、ならびにホルモンの不均衡に関連した宿主の障害を誘導し得る。
【００５９】
胃腸管
本発明の方法および組成物は、特に、潰瘍の危険性にある個体での、モルフォゲンおよびアナログの、裂創からの胃腸管の管腔裏打ちの保護を評価するために有用である。詳細には、本明細書中に記載されるモルフォゲンおよびアナログは、潰瘍性疾患に正常に関連する炎症を阻害して、瘢痕組織形成を阻害して、ならびに潰瘍組織の修復および再生を誘導して、上皮細胞の増殖を制限する効力について評価され得る。
【００６０】
１つの局面において、本発明は、完全なGI路管腔ライニングを維持するに充分な、最適な治療的有効量のモルフォゲンタンパク質またはアナログを評価するための組成物および方法を特徴とし、これは、全てもしくは一部のGI路管腔ライニングに対する、またはこのような障害の予測における、障害における哺乳動物への全身投与の工程、および潰瘍組織の修復を評価する工程、および／またはそれに対する損傷の阻害を包含する。
【００６１】
本発明の１つの好ましい実施態様において、アッセイのために作成された潰瘍、および／または本発明に従って処置可能な潰瘍には、局所的な回腸炎を引き起こす回腸において見られるもの、潰瘍性結腸炎、局所的腸炎（クローン病）、直腸炎および他の形態の炎症性腸疾患（IBD）、胃、小腸、十二指腸、および食道に見られる胃潰瘍；および口腔に見られる潰瘍を引き起こす結腸において見られるもの、を含む。本明細書中に記載される組成物および方法は、化学治療または放射線治療によって引き起こされる粘膜障害の処置において特に有用である。
【００６２】
肺：
種々の肺の病気は、気道炎症（慢性気管支炎、肺気腫、突発性線維症および喘息を含む）によって特徴付けられる。別の型の肺関連炎症障害は、一般化された広く広がった急性炎症性応答（例えば、成人呼吸困難症候群）によって特徴付けられる炎症疾患である。炎症性応答に関連した別の機能不全は、高酸素症（例えば、致死的な高濃度のO2（95〜100％O2）の延長した暴露）によって引き起こされる障害に対する応答においてモニターされるものである。同様に、以下に記載されるような組織への血流の減少（および、従って、組織への酸素の減少または欠如）もまた、炎症性応答を刺激する主な組織障害を誘導し得る。
【００６３】
本発明のアッセイは、これらおよび他の肺組織障害の供給源に起因する、回復肺組織機能および／または組織喪失における、モルフォゲンおよびアナログの効果ならびに/または薬物動態学を評価し得る。
【００６４】
本発明の処方物および方法の作製および使用のための手段、ならびにそれらの性質および有用性に関連する他の物質局面（本発明の請求の範囲を作製および使用する方法を含む）は、現在、本発明の調製に意図される最高の形態を構成する以下からさらに理解される。本発明は、このような例示的な研究またはこれらの実施例における特定の詳細に限定されないことが理解される。
【００６５】
Ｉ．タンパク質考察
Ａ．骨形態形成タンパク質の生化学的、構造的、および機能的性質
その成熟の天然形態において、天然に由来する形態形成タンパク質は、SDS-PAGEによって決定されるように約30〜36kDaの見かけの分子量を代表的に有するグリコシル化ダイマーである。還元される場合、30kDaタンパク質は、約16kDaおよび18kDaの見かけの分子量を有する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットになる。還元状態において、タンパク質は検出可能な骨形成活性を有さない。非グリコシル化タンパク質（これはまた、骨形成活性を有する）は、約27kDaの見かけの分子量を有する。還元されると、27kDaタンパク質は、約14kDa〜16kDaの分子量を有する２つの非グリコシル化ポリペプチド鎖になる。代表的には、天然に存在する骨形成タンパク質は、前駆体として翻訳され、これは代表的には約30残基よりも小さいＮ末端シグナルペプチド配列、続いて、切断されて成熟Ｃ末端ドメインを産生する「プロ」ドメインを有する。シグナルペプチドは、Von
Heijne（1986）Nucleic Acids Research 14：4683-4691の方法を使用して所定の配列において推定され得る切断部位で、迅速に、翻訳に基づいて切断される。プロドメインは、代表的には、完全なプロセスされた成熟Ｃ末端ドメインよりも約３倍大きい。
【００６６】
１対のポリペプチド鎖を含むモルフォゲンは、折りたたまれると、得られた二量体のタンパク質に充分な構造を適用し、モルフォゲンに特異的なレセプターを提示する細胞および組織における形態形成応答を惹起する。すなわち、モルフォゲンは、一般的に、形態形成的に許容性の環境（前駆体細胞の増殖刺激；前駆体細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；および分化細胞の増殖および維持の支持）において、全ての以下の生物学的機能を誘導する。「前駆体」細胞は、ゲノムレパートリーおよび形態形成が誘導される許容される（許容性の）環境の特異的な組織に依存して、１つ以上の特異的型の分化細胞に分化する能力のある中立細胞である。モルフォゲンはさらに、表現型および／または組織機能の老化または静止関連喪失の開始を遅延または移動させ得る。モルフォゲンはなおさらに、分化細胞の表現型の発現（代謝および／またはその機能（例えば、分泌）的特性の発現を含む）を刺激し得る。さらに、モルフォゲンは、適切な環境条件下で、関連細胞の再分化を誘導し得る。上記のように、少なくとも象牙質、心臓、肺、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、卵巣、膵臓、神経、膵臓、または胃腸管組織の増殖および／または分化を誘導するならびに/またはこれらの組織の任意の増殖、維持および／または機能的特性を支持するモルフォゲンは、本明細書中で特に目的である。
【００６７】
本明細書中で有用な形態形成タンパク質には、任意の既知の天然に存在するネイティブなタンパク質（天然に存在するもしくは生合成により生成した、対立遺伝子の、系統発生の対応物および他のその変異体（例えば「ムテイン」あるいは「変異体タンパク質」を含む））ならびに、一般的な形態形成ファミリーのタンパク質の新しい、生物学的に活性なメンバーが含まれる。
【００６８】
特に有用な配列には、DPP（Drosophilaより）、Vgl（Xenopusより）、Vgr-1（マウスより）のＣ末端の96あるいは102アミノ酸配列、OPlおよびOP2タンパク質、タンパク質（米国特許第5，011，691号およびOppermannらを参照のこと）ならびに、BMP2、BMP3、BMP4（W088/00205、米国特許第5，013，649号およびW091/18098）、BMP5およびBMP6（W090/11366、PCT/US90/01630を参照のこと）、BMP8およびBMP9といわれるタンパク質を含む配列が含まれる。本発明の実施において有用な他のタンパク質にはOP1、OP2、OP3、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、GDF-5、GDF-6、GDF-7、DPP、Vgl、Vgr-1、60Aタンパク質の活性形態、GDF-1、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、BMP10、BMP11、BMP13、BMP15、UNIVIN、NODAL、SCREW、ADMPまたはNURALおよびそのアミノ酸配列変異体が含まれる。１つの現在好ましい実施様態において、形態形成タンパク質には次のうちいずれか一つが含まれる：OPl、OP2、OP3、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、およびそれらのアミノ酸配列変異体およびホモログ、これらの配列ならびに（その種ホモログを含む）を含む。
【００６９】
化学的および物理学的特性を開示する刊行物には以下が含まれる：OP-1およびOP-2：米国特許5，011，691、米国特許5，266，683、Ozkaynakら（1990）EMBO J.9：2085-2093；OP-3：W094/l0203（PCT
US93/l0520）；BMP2、BMP3、BMP4：W088/00205，Wozneyら（1988）Science 242：1528-1534）；BMP5およびBMP6：Celesteら（1991）PNAS
87：9843-9847；Vgr-1：Lyonsら（1989）PNAS 86：4554-4558；DPP：Padgettら（1987）Nature 325：81-84；Vg-1：Weeks（1987）Cell
51：861-867；BMP-9：W095/33830（PCT/US95/07084）；BMP10：W094/26893（PCT/US94/05290）；BMP-11：W094/26892（PCT/US94/05288）；BMP12：W095/16035（PCT/US94/14030）；BMP-13：W095/16035（PCT/US94/14030）；GDF-1：W092/00382（PCT/US91/04096）およびLeeら（1991）PNAS
88：4250-4254；GDF-8：W094/21681（PCT/US94/03019）；GDF-9：W094/15966（PCT/US94/00685）；GDF-lO：W095/10539（PCT/US94/11440）；GDF-11：W096/01845（PCT/US95/08543）；BMP-15：W096/36710（PCT/US96/06540）；MPl21：W096/O1316（PCT/EP95/02552）；GDF-5（CDMP-1，MP52）：W094/15949（PCT/US94/00657）およびW096/14335（PCT/US94/12814）およびW093/16099（PCT/EP93/0035O）およびStormら（1994）、Nature
368：639-643；GDF-6（CDMP-2，BMP13）：W095/01801（PCT/US94/07762）およびW096/l4335およびW095/l0635（PCT/US94/14030）；GDF-7（CDMP-3，BMP12）：W095/l0802（PCT/US94/07799）およびW095/l0635（PCT/US94/14030）；BMP-3b：Takaoら（1996）、Biochem．Biophys．Res．Comm.219：656-662；GDF-3：W094/15965；60A：Blasterら（1993）、Cell
73：687-702およびGenBank登録番号Ll2032。他の実施様態において、有用なタンパク質には生物学的に活性な生合成構築物（新規の生合成タンパク質および二つもしくはそれ以上の既知の骨原生タンパク質からの配列を使用して設計されたキメラのタンパク質を含む）が含まれる。米国特許第5，011，691号に開示した生合成構築物（例えば、COP-1、COP-3、COP4、COP-5、COP-7およびCOP-16）もまた参照のこと、およびこの開示は本明細書中に参考として援用される。
【００７０】
ある好ましい実施様態において、本明細書中で有用な形態形成タンパク質には、そのアミノ酸配列が前述の天然に存在するタンパク質から選択された参照形態形成タンパク質と少なくとも70%のアミノ酸配列相同生あるいは「類似性」および好ましくは80%の相同性あるいは類似性を共有する配列を含むタンパク質が含まれる。好ましくは参照タンパク質はヒトOP-1である、そしてその参照配列は形態形成的に活性形態のヒトOP-1中に存在するＣ-末端７システインドメイン、（配列番号２の残基330〜431である。他の既知の形質形成タンパク質もまた参照配列として使用し得ることが認められる。１つの実施様態において、参照アミノ酸配列と機能的に等価と考えられる候補アミノ酸配列は、Alignプログラム（DNAstar，Inc.）のようなコンピュータープログラムにより都合よく実行される、Needlemanら（1970）J.Mol.Biol.48：443-453の方法を使用して整列化され得る。候補配列中の内部のギャップとアミノ酸挿入は、定義された関連性（候補と参照配列との間で、あるレベルのアミノ酸配列の相同性あるいは同一性として習慣的に表される。）を計算する目的で無視される。
【００７１】
「アミノ酸配列相同性」は本明細書中において、アミノ酸配列の同一性および類似性をともに含むと理解される。相同な配列は同一のおよび／または類似のアミノ酸残基を共有するが、ここで類似の残基は整列化した参照配列中の対応アミノ酸残基の保存的置換もしくは「許容される点変異」である。従って、参照配列と70%のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、任意の70%の整列化した残基は参照配列中の対応残基と同一であるか、あるいはこれの保存的置換のいずれか一つである。ある特に好ましい形態形成ポリペプチド鎖は、ヒトOP-1の好ましい参照配列のＣ末端７システインドメインと少なくとも60%のアミノ酸配列同一性、なおより好ましくは、少なくともそれとの65%アミノ酸配列同一性を共有する。
【００７２】
有意なアミノ酸変化は、形態形成活性を保持する、参照配列から作られ得る。例えば、GDF-1タンパク質配列が本明細書中に記載されるhOP-1配列とただ約50%のアミノ酸同一性のみを共有する場合、GDF-1配列はhOP-1配列と70%以上のアミノ酸配列相同性を共有するが、ここで「相同性」は上記に定義したとおりである。さらにGDF-1は、OP-1（配列番号２）の残基372および373に対応する２つの残基間で、４つのアミノ酸挿入（Gly-Gly-Pro-Pro）を含む。同様にBMP-3は、hOP-1（配列番号２）の残基385および386に対応する２つの残基間に挿入された「外」残基、バリンを有する。また、BMP-2およびBMP-4は、ともに、OP-1（配列番号２）の残基389に対応する「欠損（missing）」アミノ酸残基である。参照配列からのこれらの「逸脱（deviation）」はどれも生物学的活性を妨害しないようである。
【００７３】
当該者に理解されるように、相同性配列なあるいは機能的に等価な配列には、保存的システイン骨格内（これらのシステインの直線配列を変化させるアミノ酸挿入あるいは欠損を含む。）システイン残基の機能的に等価な配列が含まれるが、しかしこの配列は、生物学的活性に必要であり得るような鎖内あるいは鎖間のジスルフィド結合を形成する能力を含む二量体タンパク質の折り畳み構造中において、それらの関係を本質的に損なわない。例えば、天然に存在するモルフォゲンは、（１つの残基BMP2の）少なくとも１つの内部欠損もしくは（４つの残基GDF-1の）挿入が存在するが、生物学的な活性を抑制しないと記述されている。機能的に等価な配列は、さらに１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基が、参照配列の対応残基この相異が組織の形態形成活性を破壊しない場合、例えばヒトOP-1のＣ末端７システインドメイン（本明細書中で保存的７システイン骨格とも言及される）と異なる部位を含む。
【００７４】
本明細書に使用されるように、「保存的置換」は、対応する参照残基（例えば、類似のサイズ、形、電荷、化学的性質（共有結合性結合もしくは水素結合を形成する能力を含む）などを有するもの）と物理的にあるいは機能的に類似した残基である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoffら（1978）、5 Atlas of Protein Sequence and Structure，補意3，第22章（354-352頁），Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.20007において許容される点変異について規定される基準を満たすものである。保存的置換の例には、１つのアミノ酸から類似の性質を有する他のアミノ酸への置換が含まれ、例えば、以下のグループ内での置換が周知である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リシン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的変異体（variant）」あるいは「保存的変異（variation）」はまた、得られた置換したポリペプチド鎖に対して結合特異性を有する抗体もまた、非置換あるいは親ポリペプチド鎖に結合特異性（例えば、「交差反応」「免疫反応」）を有する場合、所定のポリペプチド鎖中の非置換の親アミノ酸の代わりに、置換したアミノ酸の使用を含む。
【００７５】
他の好ましい実施様態において、本発明に有用な形態形成タンパク質のファミリーおよびそのメンバーは、一般的なアミノ酸配列によって規定される。例えば、以下に開示した一般配列７（配列番号４）および一般配列８（配列番号５）は、現在までに同定された好ましいタンパク質ファミリーメンバーの間で共有されている相同性に適応する、（少なくともOP-1、OP-2、OP-3、CBMP-2A、CBMP-2B、BMP-3、60A、DPP、Vg1、BMP-5、BMP-6、Vgr-1およびGDF-1を含む）。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、上に要約されるように、本明細書中および／または当該分野において記述されている。一般配列は、６および７システイン骨格（それぞれ一般配列７および８）により規定されたＣ末端ドメイン中のこれらの配列により共有されるアミノ酸同一性、並びにこの配列内の可変の位置についての代替的な残基の両方を含む。一般配列は、分子間あるいは分子内ジスルフィド結合が、折り畳まれた３次構造のタンパク質に影響を及ぼし得るある特定のアミノ酸を形成および含み得る場合、適切なシステイン骨格を提供する。さらに、一般配列は、36位（一般配列７）あるいは41位（一般配列８）で付加的なシステインを許容し、それによりOP-2およびOP-3の生物学的に活性な配列を含む。
【００７６】
【化１】
2010281823.tif 000003
ここで各Xaaは、独立して、以下で定義された１つあるいはそれ以上の特異的なアミノ酸のグループから選択される：残基（Res.）は「残基（residue）」の意味であり、残基2でのXaa＝（TyrまたはLys）；残基3でのXaa＝（ValまたはIle）；残基4でのXaa＝（Ser、AspまたはGlu）；残基6でのXaa＝（Arg、Gln、Ser、LysまたはAla）；残基7でのXaa＝（AspまたはGlu）；残基8でのXaa＝（Leu、ValまたはIle）；残基11でのXaa＝（Gln、Leu、Asp、His、AsnまたはSer）；残基12でのXaa＝（Asp、Arg、AsnまたはGlu）；残基13でのXaa＝（TrpまたはSer）；残基14でのXaa＝（IleまたはVal）；残基15でのXaa＝（IleまたはVal）；残基16でのXaa（AlaまたはSer）；残基18でのXaa＝（Glu、Gln、Leu、Lys、ProまたはArg）；残基19でのXaa＝（GlyまたはSer）；残基20でのXaa＝（TyrまたはPhe）；残基21でのXaa＝（Ala、Ser、Asp、Met、His、Gln、LeuまたはGly）；残基23でのXaa＝（Tyr、AsnまたはPhe）；残基26でのXaa＝（Glu、His、Tyr、Asp、Gln、AlaまたはSer）；残基28でのXaa＝（Glu、Lys、Asp、GlnまたはAla）；残基30でのXaa＝（Ala、Ser、Pro、Gln、IleまたはAsn）；残基31でのXaa＝（Phe、LeuまたはTyr）；残基33でのXaa＝（Leu、ValまたはMet）；残基34でのXaa＝（Asn、Asp、Ala、ThrまたはPro）；残基35でのXaa＝（Ser、Asp、Glu、Leu、AlaまたはLys）；残基36でのXaa＝（Tyr、Cys、His、SerまたはIle）；残基37でのXaa＝（Met、Phe、GlyまたはLeu）；残基38でのXaa＝（Asn、SerまたはLys）；残基39でのXaa＝（Ala、Ser、GlyまたはPro）；残基40でのXaa＝（Thr、LeuまたはSer）；残基44でのXaa＝（Ile、ValまたはThr）；残基45でのXaa＝（Val、Leu、Metまたはlle）；残基46でのXaa＝（GlnまたはArg）；残基47でのXaa＝（Thr、AlaまたはSer）；残基48でのXaa＝（LeuまたはIle）；残基49でのXaa＝（ValまたはMet）；残基50でのXaa＝（His、AsnまたはArg）；残基51でのXaa＝（Phe、Leu、Asn、Ser、AlaまたはVal）；残基52でのXaa＝（Ile、Met、Asn、Ala、Val、GlyまたはLeu）；残基53でのXaa＝（Asn、Lys、Ala、Glu、GlyまたはPhe）；残基54でのXaa＝（Pro、SerまたはVal）；残基55でのXaa＝（Glu、Asp、Asn、Gly、Val、ProまたはLys）；残基56でのXaa＝（Thr、Ala、Val、Lys、Asp、Tyr、Ser、Gly、IleまたはHis）；残基57でのXaa＝（Val、AlaまたはIle）；残基58でのXaa＝（ProまたはAsp）；残基59でのXaa＝（Lys、LeuまたはGlu）；残基60でのXaa＝（Pro、ValまたはAla）；残基63でのXaa＝（AlaまたはVal）；残基65でのXaa＝（Thr、AlaまたはGlu）；残基66でのXaa＝（Gln、Lys、ArgまたはGlu）；残基67でのXaa＝（Leu、MetまたはVal）；残基68でのXaa＝（Asn、Ser、AspまたはGly）；残基69でのXaa＝（Ala、ProまたはSer）；残基70でのXaa＝（Ile、Thr、ValまたはLeu）；残基71でのXaa＝（Ser、AlaまたはPro）；残基72でのXaa＝（Val、Leu、MetまたはIle）；残基74でのXaa＝（TyrまたはPhe）；残基75でのXaa＝（Phe、Tyr、LeuまたはHis）；残基76でのXaa＝（Asp、AsnまたはLeu）；残基77でのXaa＝（Asp、Glu、Asn、ArgまたはSer）；残基78でのXaa＝（Ser、Gln、Asn、TyrまたはAsp）；残基79でのXaa＝（Ser、Asn、Asp、GluまたはLys）；残基80でのXaa＝（Asn、ThrまたはLys）；残基82でのXaa＝（Ile、ValまたはAsn）；残基84でのXaa＝（LysまたはArg）；残基85でのXaa＝（Lys、Asn、Gln、His、ArgまたはVal）；残基86でのXaa＝（Tyr、GluまたはHis）；残基87でのXaa＝（Arg、Gln、GluまたはPro）；残基88でのXaa＝（Asn、Glu、TrpまたはAsp）；残基90でのXaa＝（Val、Thr、AlaまたはIle）；残基92でのXaa＝（Arg、Lys、Val、Asp、GlnまたはGlu）；残基93でのXaa＝（Ala、Gly、GluまたはSer）；残基95でのXaa＝（GlyまたはAla）および残基97でのXaa＝（HisまたはArg）。
【００７７】
一般配列８（配列番号５）は全ての一般配列７を含み、そして加えて、Ｎ末端に次の５アミノ酸配列（配列番号８）を含む：
【００７８】
【化２】
2010281823.tif 000004
従って、残基７で開始し、一般配列８中の各「Xaa」は、一般配列７について規定された特定のアミノ酸であるが、一般配列７について記述された各残基番号は、一般配列８の５つでずれていることが異なる。従って、一般配列７の「残基2でのXaa＝（TyrまたはLys）」は、一般配列８において、残基7でのXaaを言及する。一般配列８中において、残基2でのXaa＝（Lys、Arg、AlaまたはGln）；残基3でのXaa＝（Lys、ArgまたはMet）；残基4でのXaa＝（His、ArgまたはGln）；および残基5でのXaa＝（Glu、Ser、His、Gly、Arg、Pro、ThrまたはTyr）である。
【００７９】
他の実施様態において、有用な形態形成タンパク質には、以下のように定義された、一般配列９および10により規定されたものが含まれる。
【００８０】
詳細には、一般的配列９および10は、次のタンパク質構成のアミノ酸配列である：ヒトOP-1、ヒトOP-2、ヒトOP-3、ヒトBMP-2、ヒトBMP-3、ヒトBMP-4、ヒトBMP-5、ヒトBMP-6、ヒトBMP-8、ヒトBMP-9、ヒトBMP1O、ヒトBMP-11、Drosophila
60A、Xenopus Vg-1、ウニUNIVIN、ヒトCDMP-1（マウスGDF-5）、ヒトCDMP-2（マウスGDF-6、ヒトBMP-13）、ヒトCDMP-3（マウスGDF-7、ヒトBMP-12）、マウスGDF-3、ヒトGDF-1、マウスGDF-1、ニワトリDORSALIN、dpp、Drosophila
SCREW、マウスNODAL、マウスGDF-8、ヒトGDF-8、マウスGDF-9、マウスGDF-lO、ヒトGDF-ll、マウスGDF-ll、ヒトBMP-15、およびラットBMP3b。一般配列７のように、一般配列９はＣ末端６システイン骨格を提供し、そして一般配列８のように、一般配列10は７システイン骨格を提供する。
【００８１】
【化３】
2010281823.tif 000005
ここで、各Xaaは独立して、以下に規定された１つあるいはそれ以上の特異的なアミノ酸配列のグループから選択される。：残基（Res.）は「残基（residue）」を意味し、残基1でのXaa＝（Phe、LeuまたはGlu）；残基2でのXaa＝（Tyr、Phe、His、Arg、Thr、Lys、Gln、ValまたはGlu）；残基3でのXaa＝（Val、Ile、LeuまたはAsp）；残基4でのXaa＝（Ser、Asp、Glu、AsnまたはPhe）；残基5でのXaa＝（PheまたはGlu）；残基6でのXaa＝（Arg、Gln、Lys、Ser、Glu、AlaまたはAsn）；残基7でのXaa＝（Asp、Glu、Leu、AlaまたはGln）；残基8でのXaa＝（Leu、Val、Met、IleまたはPhe）；残基9でのXaa＝（Gly、HisまたはLys）；残基10でのXaa＝（TrpまたはMet）；残基11でのXaa＝（Gln、Leu、His、Glu、Asn、Asp、SerまたはGly）；残基12でのXaa＝（Asp、Asn、Ser、Lys、Arg、GluまたはHls）；残基13でのXaa＝（TrpまたはSer）；残基14でのXaa＝（IleまたはVal）；残基15でのXaa＝（lleまたはVal）；残基16でのXaa＝（Ala、Ser、TyrまたはTrp）；残基18でのXaa＝（Glu、Lys、Gln、Met、Pro、Leu、Arg、HisまたはLys）；残基19でのXaa＝（Gly、Glu、Asp、Lys、Ser、Gln、ArgまたはPhe）；残基20でのXaa＝（TyrまたはPhe）；残基21でのXaa＝（Ala、Ser、Gly、Met、Gln、His、Glu、Asp、Leu、Asn、LysまたはThr）；残基22でのXaa＝（AlaまたはPro）；残基23でのXaa＝（Tyr、Phe、Asn、AlaまたはArg）；残基24でのXaa＝（Tyr、His、Glu、PheまたはArg）；残基26でのXaa＝（Glu、Asp、Ala、Ser、Tyr、His、Lys、Arg、GlnまたはGly）；残基28でのXaa＝（Glu、Asp、Leu、Val、Lys、Gly、Thr、AlaまたはGln）；残基30でのXaa＝（Ala、Ser、Ile、Asn、Pro、Glu、Asp、Phe、GlnまたはLen）；残基31でのXaa＝（Phe、Tyr、Leu、Asn、GlyまたはArg）；残基32でのXaa＝（Pro、Ser、AlaまたはVal）；残基33でのXaa＝（Leu、Met、Glu、PheまたはVal）；残基34でのXaa＝（Asn、Asp、Thr、Gly、Ala、Arg、LeuまたはPro）；残基35でのXaa＝（Ser、Ala、Glu、Asp、Thr、Leu、Lys、GlnまたはHis）；残基36でのXaa＝（Tyr、His、Cys、Ile、Arg、Asp、Asn、Lys、Ser、GluまたはGly）；残基37でのXaa＝（Met、Leu、Phe、Val、GlyまたはTyr）；残基38でのXaa＝（Asn、Glu、Thr、Pro、Lys、His、Gly、Met、ValまたはArg）；残基39でのXaa＝（Ala、Ser、Gly、ProまたはPhe）；残基40でのXaa＝（Thr、Ser、Leu、Pro、HisまたはMet）；残基41でのXaa＝（Asn、Lys、Val、ThrまたはGln）；残基42でのXaa＝（His、TyrまたはLys）；残基43でのXaa＝（Ala、Thr、LeuまたはTyr）；残基44でのXaa＝（Ile、Thr、Val、Phe、Tyr、MetまたはPro）；残基45でのXaa＝（Val、Leu、Met、IleまたはHis）；残基46でのXaa＝（Gln、ArgまたはThr）；残基47でのXaa＝（Thr、Ser、Ala、AsnまたはHis）；残基48でのXaa＝（Leu、Asnまたはlle）；残基49でのXaa＝（Val、Met、Leu、Proまたはlle）；残基50でのXaa＝（His、Asn、Arg、Lys、TyrまたはGln）；残基51でのXaa＝（Phe、Leu、Ser、Asn、Met、Ala、Arg、Glu、GlyまたはGln）；残基52でのXaa＝（Ile、Met、Leu、Val、Lys、Gln、AlaまたはTyr）；残基53でのXaa＝（Asn、Phe、Lys、Glu、Asp、Ala、Gln、Gly、LeuまたはVal）；残基54でのXaa＝（Pro、Asn、Ser、ValまたはAsp）；残基55でのXaa＝（Glu、Asp、Asn、Lys、Arg、Ser、Gly、Thr、Gln、ProまたはHis）；残基56でのXaa＝（Thr、His、Tyr、Ala、Ile、Lys、Asp、Ser、GlyまたはArg）；残基57でのXaa＝（Val、Ile、Thr、Ala、LeuまたはSer）；残基58でのXaa＝（Pro、Gly、Ser、AspまたはAla）；残基59でのXaa＝（Lys、Leu、Pro、Ala、Ser、Glu、ArgまたはGly）；残基60でのXaa＝（Pro、Ala、Val、ThrまたはSer）；残基61でのXaa＝（Cys、ValまたはSer）；残基63でのXaa＝��Ala、ValまたはThr）；残基65でのXaa＝（Thr、Ala、Glu、Val、Gly、AspまたはTyr）；残基66でのXaa＝（Gln、Lys、Glu、ArgまたはVal）；残基67でのXaa＝（Leu、Met、ThrまたはTyr）；残基68でのXaa＝（Asn、Ser、Gly、Thr、Asp、Glu、LysまたはVal）；残基69でのXaa＝（Ala、Pro、GlyまたはSer）；残基70でのXaa＝（Ile、Thr、LeuまたはVal）；残基71でのXaa＝（Ser、Pro、Ala、Thr、AsnまたはGly）；残基2でのXaa＝（Val、Ile、LeuまたはMet）；残基74でのXaa＝（Tyr、Phe、Arg、Thr、TyrまたはMet）；残基75でのXaa＝（Phe、Tyr、His、Leu、Ile、Lys、GlnまたはVal）；残基76でのXaa＝（Asp、Leu、AsnまたはGlu）；残基77でのXaa＝（Asp、Ser、Arg、Asn、Glu、Ala、Lys、GlyまたはPro）；残基78でのXaa＝（Ser、Asn、Asp、Tyr、Ala、Gly、Gln、Met、Glu、AsnまたはLys）；残基79でのXaa＝（Ser、Asn、Glu、Asp、Val、Lys、Gly、GlnまたはArg）；残基80でのXaa＝（Asn、Lys、Thr、Pro、Val、Ile、Arg、SerまたはGln）；残基81でのXaa＝（Val、Ile、ThrまたはAla）；残基82でのXaa＝（Ile、Asn、Val、Leu、Tyr、AspまたはAla）；残基83でのXaa＝（Leu、Tyr、Lysまたはlle）；残基84でのXaa＝（Lys、Arg、Asn、Tyr、Phe、Thr、GluまたはGly）；残基85でのXaa＝（Lys、Arg、His、Gln、Asn、GluまたはVal）；残基86でのXaa＝（Tyr、His、GluまたはIle）；残基87でのXaa＝（Arg、Glu、Gln、ProまたはLys）；残基88でのXaa＝（Asn、Asp、Ala、Glu、GlyまたはLys）；残基89でのXaa＝（MetまたはAla）；残基90でのXaa＝（Val、Ile、Ala、Thr、SerまたはLys）；残基91でのXaa＝（ValまたはAla）；残基92でのXaa＝（Arg、Lys、Gln、Asp、Glu、Val、Ala、SerまたはThr）；残基93でのXaa＝（Ala、Ser、Glu、Gly、ArgまたはThr）；残基95でのXaa＝（Gly、AlaまたはThr）；残基97でのXaa＝（His、Arg、Gly、LeuまたはSer）。さらに、rBMP3bおよびmGDF-1Oの残基53の後にIleがあり；CDF-1の残基54の後にＴがあり；BMP3の残基54の後にＶがあり；BMP-8およびD
or salinの残基78の後にＧがあり；hGDF-1の残基37の後にPro、Gly、Gly、Proがある。
【００８２】
一般配列10（配列番号７）は、全ての一般配列９（配列番号６）を含み、さらにそのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む。
【００８３】
【化４】
2010281823.tif 000006
従って、残基６で開始し、一般配列10の各「Xaa」は、一般配列９について規定された特定のアミノ酸であるが、一般配列９について記述された各残基番号は、一般配列10の５つでずれていることが異なる。従って、一般配列９の「残基1でのXaa＝（Tyr、Phe、His、Arg、Thr、Lys、Gln、ValまたはGlu）」は、一般配列10の残基6でのXaaを言及する。一般配列10では、残基2でのXaa＝（Lys、Arg、Gln、Ser、His、Glu、AlaまたはCys）；残基3でのXaa＝（Lys、Arg、Met、Lys、Thr、Leu、TyrまたはAla）；残基4でのXaa＝（His、Gln、Arg、Lys、Thr、Leu、Val、ProまたはTyr）；および残基5でのXaa＝（Gln、Thr、His、Arg、Pro、Ser、Ala、Gln、Asn、Tyr、Lys、AspまたはLeu）。
【００８４】
上述のとおり、本発明において有用な、ある現在好ましい骨形態形成ポリペプチド配列は、好ましい参照配列のhOP-1を規定するアミノ酸配列と60%以上の同一性、好ましくは65%以上の同一性を有する。これらの特に好ましい配列は、OP-1およびOP-2タンパク質（Drosophila
60Aタンパク質を含む）の対立遺伝子および系統発生の対応物変異体を含む。従って、ある特に好ましい実施様態において、有用なタンパク質には本明細書中で、「OPX」（配列番号３）のように言及される一般のアミノ酸配列内のポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質が含まれ、これは７システイン骨格を規定し、そしてOP-1およびOP-2のいくつかの同定された変異体間の相同性を提供する。本明細書中に記述したように、所定の位置での各Xaaは、独立的して、マウスあるいはヒトのOP-1またはOP-2のＣ末配列における対応位置で生じる残基から選択される。
【００８５】
【化５】
2010281823.tif 000007
ここで、残基2でのXaa＝（LysまたはArg）；残基3でのXaa＝（LysまたはArg）；残基11でのXaa＝（ArgまたはGln）；残基16でのXaa＝（GlnまたはLeu）；残基19でのXaa＝（IleまたはVal）；残基23でのXaa＝（GluまたはGln）；残基26でのXaa＝（AlaまたはSer）；残基35でのXaa＝（AlaまたはSer）；残基39でのXaa＝（AsnまたはAsp）；残基41でのXaa＝（TyrまたはCys）；残基50でのXaa＝（ValまたはLeu）；残基52でのXaa＝（SerまたはThr）；残基56でのXaa＝（PheまたはLeu）；残基57でのXaa＝（IleまたはMet）；残基58でのXaa＝（AsnまたはLys）；残基60でのXaa＝（Glu、AspまたはAsn）；残基61でのXaa＝（Thr、AlaまたはVal）；残基65でのXaa＝（ProまたはAla）；残基71でのXaa＝（GlnまたはLys）；残基73でのXaa＝（AsnまたはSer）；残基75でのXaa＝（IleまたはThr）；残基80でのXaa＝（PheまたはTyr）；残基82でのXaa＝（AspまたはSer）；残基84でのXaa＝（SerまたはAsn）；残基89でのXaa＝（LysまたはArg）；残基91でのXaa＝（TyrまたはHis）；および残基97でのXaa＝（ArgまたはLys）。
【００８６】
なお他の好ましい実施様態において、有用な形態形成活性タンパク質は、低、中程度または高ストリンジェントのハイブリダイゼーション状件下で、参照形態形成配列（例えば、OP-1、OP-2、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、60A、GDF5、GDF6、GDF7などの保存的７システインドメインを規定するＣ末端配列）をコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズする核酸によりコードされる配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を持つ。本明細書に使用される場合、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、既知の技術40%ホルムアミド、5×SSPE、5×デンハルト溶液、および0.1%SDS中で37℃での一晩、ならびに0.1×SSPE、0.1%SDS中50℃での洗浄）に従うハイブリダイゼーションとして規定される。標準的なストリンジェントな条件は、市販の標準の分子クローニングの教示において良く特徴付けられる。例えば、Molecular
Cloning A Laboratory Manual第二版、Sambrook、FritschおよびManiatis編（Cold Spring Harbor
Laboratory Press：1989）；DNA Cloning一巻および二巻（D.N.Glover編、1985）；Oligonucleotide
Synthesis（M.J.Gait編、1984）：Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hames & S.J.Higgins編集、1984）；およびB.Perbal、A
Practical Guide To Molecular Cloning（1984）。
【００８７】
本明細書中で意図される形態形成タンパク質は、インタクトあるいは短縮型のゲノムあるいはcDNAから、または原核生物あるいは真核生物の宿主細胞中の合成DNAから発現し得る。二量体タンパク質は培養培地から単離され得、および／または生物学的に活性な組成物を形成するためにインビトロで再折たたみおよび二量体化され得る。ヘテロ二量体は、インビトロで、個々の異なるポリペプチド鎖を組み合せることにより形成され得る。あるいは、ヘテロ二量体は、個々の異なるポリペプチド鎖をコードする核酸を同時発現することにより、単一細胞内で形成され得る。例えば、いくつかの例示的な組換えへテロ二量体タンパク質生成プロトコールについては、WO93/09229あるいは米国特許第5，411，941号を参照のこと。現在好ましい宿主細胞には、E.coliを含む原核生物、または、酵母あるいはSaccharomycesあるいは哺乳類細胞（例えば、CHO、COSあるいはBSC細胞）を含む真核生物が含まれるがこれらに限定されない。当業者は、他の宿主細胞が有利に使用され得ることを理解する。形態形成活性について生成、使用および試験方法を含む本発明の実施に有用であるタンパク質の詳細な記述は、米国特許第5,266,683号、同第5,011,691号、および／または米国特許第5,585,237号を含む多数の刊行物。（これらの開示は本明細書中に参考として採用される）、ならびに本明細書中に援用される刊行物（任意の米国特許を含む）（この開示は、本明細書中に参考として援用される。）
本明細書中上述される二量体タンパク質種は、本明細書において「成熟」形態形成タンパク質として言及される。これらのタンパク質の可溶性形態はまた、二量体種を一部あるいは全ての少なくとも1つ、および好ましくは２つの形態形成タンパク質プロドメインペプチドと複合体化することにより作られ得る。あるいは、形態形成はタンパク質の可溶性複合体形態は、例えば1994年2月18日に公開されたWO94/03600に記載されたプロトコールを使用して細胞培養培地から単離され得る（以下を参照のこと）。
【００８８】
モルフォゲンの他の可溶性形態は、これらのタンパク質の非切断プロ形態の二量体、並びに、二量体の片方のサブユニットはタンパク質の非切断のプロ形態であり、他方のサブユニットがタンパク質の成熟形態（その短縮形態、好ましくは切断プロドメインペプチドと非共有結合した形態を含む）を含む「ヘミ二量体」を含む。
【００８９】
公開された出願WO94/03600に記述のように、その教示は本明細書中に参考として採用されるが、有用なプロドメインは全長プロ領域、およびその様々な短縮形態、特にプロドメインポリペプチド内のタンパク質分解性のArg-Xaa-Xaa-Arg切断部位で切断される短縮形態を含む。例えば、OP1中に可能性のあるプロ配列は、残基30〜292（全長型）；48〜292；および158〜292、および配列番号２の全てにより規定された配列を含む。可溶性OP1複合体の安定性は、プロ領域が残基48〜292短縮形態（ここで残基30〜47は他のモルフォゲンのＮ末端部分と配列相同性を示し、現在では全てのモルフォゲンの複合体安定性を増強するにあたり特に有用性を有すると考えられている）のような短縮形態ではなく全長型を含む場合、最も増強される。従って、現在好ましいプロドメインは、少なくともＮ末端フラグメント（例えば、天然に存在するモルフォゲンプロドメイン、もしくは天然に存在するペプチドの特性を増強する溶解性および／または安定性を保持するその生合成変異体）を含むペプチドを含む。
【００９０】
当業者に理解されるように、プロ領域をコードする有用な配列は、既知のモルフォゲンをコードする遺伝子配列から得られ得る。あるいは、キメラのプロ領域は、１つ以上の既知のモルフォゲンの配列はから構築され得る。なお他の選択肢は、１つ以上の既知のプロ領域配列の合成配列変異体を造る方法である。
【００９１】
変性剤なしに実施される単一の３工程クロマトグラフィーのプロトコールを使用して、可溶性モルフォゲン複合体は、馴化培地から単離され得る。プロトコールには、培地（あるいは体液）をアフィニティーカラムでの泳動、続いてイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含む。以下に記述するアフィニティーカラムはZn-IMACカラムである。別のプロトコールもまた有用性があると想定され、イムノアフィニティーカラム（標準的な製法を使用して作られ、そして、例えば、所定のモルフォゲンプロドメインに特異的な抗体（例えば、タンパク質Ａ抱合型のセファロースカラムと複合体化された）を使用する）を含む。イムノアフィニティーカラムを開発するためのプロトコールは当該分野でよく記述されている（例えば、Guide
to Protein Purification，M.Deutscher編，Academic Press，San Diego，1990，特にそのVII節およびXI節を参考のこと）。
【００９２】
モルフォゲンは、組換えタンパク質を発現し得る任意の適した宿主細胞おいて発現され得る。例えば、当該分野で記述されるように、（例えば、国際出願US90/05903（WO91/05802）を参照のこと）哺乳動物（CHO、チャイニーズハムスター卵巣）細胞が使用され得る。CHO細胞は0.5%FBSを含む馴化培地が、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を使用して最初に精製される。馴化培地からの可溶性モルフォゲン複合体は、Zn-IMAC樹脂に非常に選択的に結合し、そして高濃度のイミダゾール（50mMイミダゾール、pH8.0）が結合複合体が効果的に溶出されることが必要である。Zn-IMAC工程によりフロースルー中に溶出する夾雑血清タンパク質のバルク、および35mMイミダゾール洗浄画分から可溶性モルフォゲンを分離する。Zn-IMAC精製可溶性モルフォゲンは、次に、20mM
NaPO4（pH7.0）（50mM NaClを含む）で平衡化したS-セファロースカチオン交換カラムに適用される。このS-セファロース工程は続くゲル濾過工程の調製における可溶性複合体をさらに精製および濃縮するのに貢献する。タンパク質は、TBS中で平衡化したセファクリル
S-200HRカラムに適用された。実質的に同じプロトコールを使用して、可溶性モルフォゲンはまた、１つまたはそれ以上の体液（血清、脳脊髄液、または腹水を含む）から単離され得る。
【００９３】
細胞培養培地から単離された可溶性複合体は、標準タンパク質分子量と比較して110kDaの見かけの分子量で溶出する。タンパク質の同一性は、Ｎ末端の配列決定により確認され得る。最終混合物の純度は、還元15%ポリアクリルアミドゲル中の適切な画分を通過させることにより確認され得る。
【００９４】
培養培地あるいは体液から可溶性タンパク質を精製する代替案として、可溶性複合体は、精製したプロドメインおよび成熟した二量体種から構成され得る。首尾良く複合体形成は、ジスルフィド結合に影響を及ぼさずに、これらの分子のこの折り畳み構造を緩和するのに十分な変性条件下で、成分の結合を必要とするようである。好ましくは変性条件は、小胞体の環境を模倣し、その結果、切断プロドメインが、緩和した折り畳み条件下で成熟した二量体種に結合する機会を有する。次いで、溶液中の変性剤の濃度を、好ましくは工程ごとに減少させ、その結果、プロドメインと二量体との結合を維持する間、二量体およびプロ領域を適切に再折り畳みさせる。有用な変性剤は、pH4〜10好ましくはpH6〜8の緩衝溶液中、4〜6M尿素あるいはグアニジン塩酸塩（GuHCl）を含む。次いで、可溶性複合体は、0.1〜2M未満の尿素あるいはGuHCl、好ましくは1〜2M尿素のGuHClの最終変性剤濃度を有する溶液中に、制御された透析あるいは希釈により形成され、次いでこれは好ましくは生理緩衝液中に希釈され得る。タンパク質精製／再生手順および考案は、当該分野でよく記述されており、そして適切な再生プロトコールを開発するための詳細は、当業者によって容易に決定され得る。これについての１つの有用なテキストは、Guide
to Protein Purification，M.Deutscher編，Academic Press，San Diego，1990、特にＶ節である。複合体形成はまた、１つまたはそれ以上のシャペロンタンパク質の付加により助けられ得る。複合体の安定性もまた、アルギニンのような正電荷のアミノ酸の存在により増強される。
【００９５】
II．処方と送達の案
一般的な案
本発明の実施に有用な組成物は、日常の方法を使用して処方され得る。要求される全ては、投与当りのモルフォゲンタンパク質の所望の最終濃度の決定である。有用な処方、方法論は、凍結乾燥タンパク質あるいはアナログの可溶化を含む。有用なタンパク質あるいはアナログの可溶化溶液は、エタノール、尿素、生理学的および／または酸性緩衝液、生理食塩水、ならびにアセトニトリル／トリフルオロ酢酸溶液、などを含む。例えば、米国特許第5,266,683号を参照のこと。所望される最終濃度のタンパク質またはアナログは、タンパク質あるいはアナログの特異的活性、ならびに型、容積および／または欠損の解剖学的位置に依存する。１つの好ましい実施様態において、有用なタンパク質およびアナログは、標準のラットバイオアッセイにおいて測定される1.0〜2.0ng分子/25mgマトリックス、あるいは0.5〜1.0ngタンパク質/25mgマトリックスの特異的活性を形成する最大骨格の半分を有するものである。より低い特異的活性を有するタンパク質もまた、異なる組織モルフォゲンアッセイにおいて特異的活性を有するモルフォゲンとして有利に使用され得る。加えて、所望されるタンパク質の最終濃度は、年齢、性別および／またはレシピエントの全般的な健康に依存し得る。全てのこれらの案は、本発明により可能となったアッセイを用いて評価および最適化され得る。
【００９６】
有用なモルフォゲンタンパク質あるいはアナログの用量の投与範囲は、0.1〜1000mg/kg体重を含み、好ましくは1〜100mg/kgの範囲を含むことが意図される。本明細書中下記に記されるように、タンパク質あるいはアナログは単一のボーラスとして、あるいは経時的に投与される複数の用量として、全身に投与され得る。液体投与の有用な濃度は、約0.5〜5000mlの範囲を含む。投与の至適化は、日常的な実験法を超えない程度に要求され、そしてこれは当業者の技術レベル内である。成熟したタンパク質（例えば、OP1、20mg）を21日間継続して正常に生育しているラットに毎日投与する場合、明白な形態形成タンパク質を誘導性病理学的障害を生じないことに留意すべきである。さらに、正常な新生マウスに10日間毎日注射するモルフォゲン（例えば、OP1）の10mgの全身の注射は、いかなる全体の異常をも起さない。毒性レベルの候補アナログは、治療的に有用な用量を決定するために本発明によって容易に決定され得る。
【００９７】
タンパク質またはアナログは、全身投与に適切な任意の手段（例えば、i.v.または腹膜内によって非経口的に、または経口的に）によって個体に提供され得る。液体処方物は、好ましくは水性の、生理学的に受容可能な溶液の一部を構成し、その結果、所望のタンパク質またはアナログの標的部位への送達に加え、溶液は、細胞または被験体の電解質および／または容量バランスに他の点では悪影響を与えない。適切な、水性媒体は、通常の生理食塩水（例えば、9.85%
NaCl、O.15M，pH 7〜7.4）を含むが、これに限定されない。薬剤を含むそのような水溶液は、例えば、0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）または0.1%HCl中のアセトニトリル含有50%エタノールまたは等価な溶媒中に、凍結乾燥したタンパク質を溶解するか、またはタンパク質を分散させることにより作製され得る。例えば、次に、１０容量のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（さらに０．１％〜０．２％のヒト血清アルブミン（HSA）を含み得る）に、結果として生じる溶液の１容量を添加する。結果として生じる溶液は、好ましくは、広範にボルテックスをかける。あるいは、凍結乾燥したタンパク質またはアナログを、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）またはその等価物に溶解し得る。
【００９８】
タンパク質またはアナログが非経口的に（例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、眼窩内に、眼に、脳室内に、頭蓋内に、嚢内に、脊椎内に、槽内に、腹腔内に、頬に、直腸に、膣に、鼻腔内に、またはエアロゾル投与により提供される場合、タンパク質は好ましくは水溶液の一部を構成する。現在、モルフォゲンの静脈内投与に好ましいのは、PBSまたは酢酸ナトリウム緩衝液である。タンパク質またはアナログは、タンパク質またはアナログの単回用量またはボラースの定期的な注入として投与され得るか、あるいは外部（例えば、i.v.バッグ）または内部（例えば、生体侵食性移植片、または移植された、モルフォゲン／アナログ産生細胞のコロニー）のリザーバーから静脈内または腹腔内投与によってより連続的になされ得る。
【００９９】
非経口的投与に有用な溶液は、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Gennaro，A.編），Mack Pub.，1990に記載される。
【０１００】
あるいは、本明細書において記載される形態形成タンパク質またはアナログは、経口的に投与され得る。治療法としてのタンパク質の経口投与は、一般的に行われない。なぜなら、ほとんどのタンパク質は、血流に吸収され得る前に、哺乳動物の消化系における消化酵素または酸によって容易に分解されるからである。しかし、本明細書において記載される形態形成タンパク質は、代表的には、酸安定性およびプロテアーゼ耐性である（例えば、米国特許第4,968,590号を参照のこと）。さらに、少なくとも１つのモルフォゲンであるOP1は、乳腺分泌物、初乳および５７日目の乳汁において同定されている。さらに、乳腺分泌物から精製されたOP1は、形態形成的に活性であり、また血流中で検出される。経口摂取される乳汁を介する、母性投与は、TGFβスーパーファミリータンパク質の天然の送達経路であり得る。Letterioら（（1994），Science
264：1936-1938）は、TGFβがマウス乳汁に存在すること、および放射性標識化TGFβは、哺乳する子供の胃腸粘膜によって吸収されることを報告する。標識された経口摂取されたTGFβは、子供の体細胞（肺、心臓および肝臓を含む）においてインタクトな形態で迅速に出現する。これらの知見、ならびに以下の実施例に開示される知見は、経口および非経口投与は、形態形成タンパク質を個体に全身的に投与するために実行可能な手段であることを示す。さらに、本明細書において記載される特定の形態形成タンパク質の成熟形態は、代表的には、あまり可溶性ではないが、乳汁（および乳腺分泌物および初乳）において見出されるタンパク質の形態は、容易に可溶性であり、これはおそらく、成熟二量体の種が、インタクト配列のプロドメインの一部または全部と会合することによるか、および／あるいは１つ以上の乳汁成分と会合することによる。例えば、WO
93/05751、1993年4月1日公開、および米国特許出願第08/278，730号を参照のこと。これらの開示を、本明細書において参考として引用する。従って、本明細書において提供される化合物はまた、インビトロまたはインビボにおいて化合物の可溶性を増強し得る分子と会合し得る。
【０１０１】
溶解度を増強し得、そして経口投与に特に有用な別の分子は、カゼインである。例えば、０．２％カゼインの添加は、成熟な活性形態のOP1の溶解度を８０％増加させる。乳汁において見出される他の成物および／または種々の血清タンパク質はまた、有用であり得る。
【０１０２】
あるいは、または加えて、経口投与された形態形成タンパク質またはアナログは胃腸系を介して輸送されるのが許容され得る送達ビヒクルの一部として処方され得る。一つの例として、タンパク質は、生物学的に侵食性のマイクロスフェア（特に、そのポリマーが胃腸粘液と管壁細胞との一過的な相互作用を可能にする十分な接着特性を有し、そして粘膜の吸収性上皮およびパイアー斑のリンパ系組織を覆う小胞関連上皮を横切り得る）の一部として処方され得る。有用なポリマーとして、ポリスチレン、ポリ乳酸および／またはポリグリコリドおよび／またはポリシアノアクリレートポリマーならびにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。そして、有用なポリマーは、形態形成タンパク質を腸管の内層を横切り、循環系へ輸送するために使用され得る。マイクロスフェアは以下およびMathlowitzら（1996） Nature 386：410-414に記載され、また有用であると考慮される。フマル酸とセバシン酸とのポリ無水物コポリマー「ポリ（FA：SA）」（例えば、相反転ナノカプセル化によって作製される20：80マイクロスフェア（直径0.1〜10mm）中に処方される）は、光学顕微鏡で測定した場合、両方の膜を一時間程度の短時間で横切る。さらに他の有用なマイクロスフェアは、ポリ（フマル酸無水物）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）のポリマーブレンドを含む。
【０１０３】
形態形成タンパク質またはアナログは、標準的な相反転プロトコールによって、容易にマイクロカプセル化され得る。例えば、形態形成タンパク質は、希釈ポリマー溶液（すなわち、塩化メチレン中に１〜４％（w/v））で添加され、次に溶媒と非溶媒との比が1：100で、攪拌しない非溶媒浴（石油エーテル）中に迅速に注がれ、ナノおよびマイクロスフェア（直径0.1〜5.0μm）を自発的に形成させる。
【０１０４】
形態形成タンパク質およびアナログは、当然のことながら、単独でか、または本明細書において記載される状態の処置に有益であることが公知の他の分子と組み合わせて、全身的に投与され得る。従って、他の実施態様において、本発明は、形態形成タンパク質またはアナログが新規の組織形成を促進するか、または増強する他の薬剤と組み合わせられている薬学的組成物を評価するためのアッセイを提供する。そのような組成物の各々において、形態形成剤と分裂促進剤との比率は、文献に開示されるように、そして本発明の方法を使用する簡単な実験を通じて決定されるように、その活性に基づき調整され得、単回単位投薬量において、各化合物の治療的有効投薬量を提供する。そのような組成物中の形態形成剤および分裂促進剤は、各々、好ましくは、組成物の乾燥重量の少なくとも約１％、およびより好ましくは５％または１０％より多くを構成する。しかし、組成物は、上記に記載されるように、そして一般的にRemington's Pharmaceutical Sciences（Gennaro，A.編），Mack Pub.，1990に記載されるように、他の薬学的キャリアおよび活性薬剤を含む。従って、形態形成剤および分裂促進剤は、各々薬学的組成物の最終重量の小画分を構成し得る。
【０１０５】
形態形成処方物は、移植前に標準的な手順を用いて容易に滅菌され得る。例えば、タンパク質は、簡便に濾過滅菌（例えば、0.22ミクロンフィルターを使用して）され得る。あるいは、エチレンオキシドのような化学薬品を使用し得る。キャリア物質、湿潤剤および／または結合剤は、化学薬品、熱または電離放射線に曝露することにより、滅菌され得る。さらに、形態形成処方物は、電離放射線（例えば、γ線放射または電子ビーム放射）への曝露によって、10-6の無菌保証レベルまで、最終的に滅菌され得る。有用な用量範囲は、約0.5〜4.0メガラド、好ましくは2.0〜3.5メガラドの範囲内を含む。例えば、WO
96/40297（1996年12月19日公開）を参照のこと。
【０１０６】
本発明の実施は、以下の実施例から、なおより十分に理解される。以下の実施例は、本明細書において説明のためにのみ表され、そしていかなる方法においても、本発明を制限するように解釈されるべきではない。
【０１０７】
ＩＶ．バイオアッセイ
Ａ．骨形態形成活性のバイオアッセイ：軟骨内骨形成および関連する特性
SampathおよびReddi（Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1983） 80：6591-6595）ならびに米国特許第4,968,590号（これらの開示は本明細書において参考として引用する）に記載される当該分野で認識されている骨誘導のバイオアッセイは、所定のデバイスまたは処方物の効力を確立するために使用され得る。手短に言えば、アッセイは、試験サンプルをエーテル麻酔下のレシピエントラットにおける皮下部位に沈着させる工程からなる。垂直方向の切開（1cm）を、滅菌条件下で胸部領域にわたる皮膚において作製し、ブラントジセクションによりポケットを調製する。特定の状況において、約２５mgの試験サンプルを、ポケット内部に深く移植し、そして切開を金属皮膚クリップで閉鎖する。異所性の部位（heterotropic
site）は、同所性部位の使用から生じる可能性のある不明確性なしに、骨誘導の研究を可能にする。移植片はまた、筋肉内に提供され得、デバイスを接近可能な前駆細胞のより近くに接触して配置する。代表的な筋肉内移植片は、両脚の骨格筋中に作製される。
【０１０８】
異所性部位で生じる一連の細胞反応は、複雑である。軟骨内骨形成の多段階カスケードは、以下を含む：フィブリンおよびフィブロネクチンの移植マトリクスへの結合、細胞の走化性、線維芽細胞の増殖、軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、血管の侵入、骨形成、リモデリングおよび骨髄分化。
【０１０９】
成功した移植片は、制御された進行を、タンパク質に誘導される軟骨内骨発生の以下を含む段階を通じて示す：（１）１日目の、多形核白血球による一過性浸潤；（２）２日目および３日目の、間葉細胞の移動および増殖；（３）５日目および６日目の、軟骨細胞の出現；（４）７日目の、軟骨マトリクス形成；（５）８日目の、軟骨の石灰化；（６）９日目および１０日目の、血管の侵入、骨芽細胞の出現、および新骨の形成；（７）１２日目〜１８日目の、骨芽細胞および骨リモデリングの出現；ならびに（８）２１日目の、小骨における造血骨髄分化。
【０１１０】
組織学的切片化および染色は、移植片の骨形成の程度を決定するために、好ましい。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン（hemotoxylin）／エオシンを用いる染色は、最終的な軟骨内骨の発生を、明らかに実証する。１２日目のバイオアッセイは、骨誘導活性が試験サンプルと関連するのか否かを決定するのに十分である。
【０１１１】
さらにアルカリホスファターゼ活性および／または全カルシウム含量は、骨形成の生化学的マーカーとして使用され得る。アルカリホスファターゼ酵素活性は、切り出された試験物質のホモジナイゼーション後に、分光光度的に測定され得る。インビボにおける９〜１０日の活性のピークは、その後ゆっくりと減少する。組織学的に骨発生を示さないサンプルは、これらのアッセイ条件下でアルカリホスファターゼ活性を全く示さないであろう。このアッセイは、試験サンプルがラットから取り出された後に非常に迅速に骨形成を定量するためおよび推定値を取得するために有用である。アルカリホスファターゼ活性レベルおよび組織学的評価によって測定される結果は、「骨形成単位」として表され得る。１骨形成単位は、１２日目の、最大骨形成活性の半値に必要なタンパク質量を表す。さらに、用量曲線を、種々の濃度のタンパク質をアッセイすることにより、精製スキームの各段階でのインビボ骨誘導活性について構築し得る。従って、当業者は、日常的な実験のみを用いて代表的な用量曲線を構築し得る。
【０１１２】
全カルシウム含量を、例えば、冷 0.15M NaCl，3mM NaHCO3，pH9.0中でのホモジナイゼーション、および沈殿物の酸可溶性画分のカルシウム含有量の測定後に、決定し得る。
[実施例]
【０１１３】
Ｂ．
[実施例1]
このアッセイは、全身投与された形態形成タンパク質が、局所的欠損部位で骨形成を誘導する能力について、実証する。局所的で、許容性の部位は、マトリクス単独（ウシの鉱物質除去、タンパク質除去した骨コラーゲン）をラットの皮下または筋肉内部位に移植することにより、作製された。皮下部位に単独で移植された場合、骨コラーゲンは、局所的炎症を起こし、そして移動する間葉幹細胞（例えば、局所的に与えられた場合に新骨形成を誘導する骨誘導シグナルに対し、応答し得る前駆細胞）により、迅速に囲まれるようになる。単独のままの場合、誘導された炎症応答は、時間の経過により消滅し得る、移植部位での線維性組織形成をもたらす。本実施例において、緩衝液単独、可溶性OP-1、または成熟OP-1は、形態形成タンパク質が移植位置で新骨形成を誘導する能力を評価するために、全身的に投与された。
【０１１４】
ロング−エバンス（Long-Evans）ラットを、各々４つの骨コラーゲン移植に供した：上記のように（25mgマトリクス／移植片）、２つを皮下に（胸部の左側、右側）および２つを筋肉内に（各後脚の筋肉に１つ）。可溶性OP-1（0.5mg、PBS緩衝液中の成熟等価物）、またはmOP-1（酢酸緩衝液中に0.5mg）を移植後0時間後、8時間後、24時間後、48時間後および72時間後に尾静脈を介して静脈内（i.v.）に投与した。12日目に動物を屠殺し、組織学的および生化学的マーカーによって新骨形成を試験した。移植の日を０日目と考えた。４匹のラットの４つの群の各々を以下の様に試験した：
【０１１５】
【化６】
2010281823.tif 000008
[実施例2]
この実施例は、全身的に提供されたタンパク質が全身投与後に局所的欠損部位に標的化する能力を評価するプロトコールを提供する。
【０１１６】
この実施例において、投与されたタンパク質の血清中レベルを、標準的なプロトコール（ウエスタンブロット、Elisa、および／または放射性ヨウ素化）によって、注入後、0分、5分および30分で、評価する。
【０１１７】
詳細には、mOP-1（500μlの酢酸ナトリウム中に2.5mg成熟）を、コラーゲン移植の２４時間後、尾静脈を介して、i.v.投与する。適切なコントロールは緩衝液のみを含む。OP-1投与の5分後および30分後に動物を屠殺する。移植片を、８M尿素含有界面活性剤緩衝液で抽出し、そして移植片中のOP-1の存在をElisaおよびウエスタンブロット分析によって試験する。第２のプロトコールにおいて、ヨウ素化されたOP-1を提供し、そして放射性タンパク質を、投与後５分および３０分で、移植部位で測定する。
【０１１８】
全身投与されたOP-1がコラーゲン移植片中で利用可能か否か決定するために、ヨウ素化OP-1を、コラーゲン移植の２４時間後に投与した。次に、移植片を標識化OP-1の投与後、5分、15分および60分で収集した。隣接する皮下の筋膜および大腿骨格組織をコントロールとして収集した。抽出組織のタンパク質のSDS-PAGEオートラジオグラフィー分析は、ヨウ素化されたOP-1の一部は、５分で収集したコラーゲン移植片において検出可能であったが、15分または60分で収集した移植片では検出不可能であったことを実証した。コントロールサンプルは、検出可能なレベルの標識化OP-1を、いずれの時間間隔においても含まなかった。以前の薬物動態学的な研究は、静脈内投与されたOP-1の約0.5％が、1分以内に循環内で利用可能であり、そして約15分〜30分の半減期で循環から除去されることを示した。iv投与の5分後に検出可能なOP-1の部分は、軟骨内骨の分化の誘発に十分であるようである。
【０１１９】
試験は、ウシ骨由来の不溶性Ｉ型コラーゲンがラットの尾の腱、ウシアキレス腱およびＩＶ型コラーゲンを富化したマトリゲル（matrigel）から得られる他の不溶性コラーゲンより優れていることを示した。ヒドロキシアパタイトはまた、キャリアとしては、あまり有効ではなかった。コラーゲン移植片を用いない外科的創傷部位は、骨形成の徴候を示さなかった。このことは、コラーゲン移植片が全身投与によるOP-1シグナルに応答するための間葉細胞の局所的な補充に必要である、ということを示している。
【０１２０】
[実施例3]
この実施例は、全身的に投与された形態形成タンパク質の単回用量が投与部位から離れた局所的な許容性欠損部位での新規組織形成の誘導に適格である（誘導にコンピテントである（誘導し得る））こと、および治療的効果は、時間に対して感受性ではない、ということを実証する。詳細には、24時間または48時間または72時間での単回ボーラスとして投与される形態形成タンパク質は、ラットのバイオアッセイにおいて、複数回の注入において見られるのと匹敵するレベルで、新骨形成を誘導する。
【０１２１】
これらの研究において、OP-1は、全身的に、単回濃度（実施例１に示すように、500μl中に500μgを、コラーゲンマトリクス移植後の0時間、6時間、24時間、48時間および72時間に5回の注入で与える、または任意の所定の時間で500μgのOP-1の単回投与で与える）で投与された。コントロール群（注入なしおよび緩衝液注入）は、コラーゲン移植部位（s.c.またはi.m.）で骨形成を誘導しなかったが、12日後に試験した場合、成熟OP-1を注入した群は、軟骨内骨を誘導した。
【０１２２】
ロング−エバンス（６週齢）を、上記に詳述したように、皮下および筋肉内移植に供した。移植片はウシコラーゲンマトリクス（約25mg）のみからなり、ラットの両側の皮下部位、そして両脚の骨格筋に移植された。ラットあたり、４つの移植がなされ、１群あたり４匹のラットを用いた。コラーゲン移植またはOP-1投与の日を０日および０時間と考えた。
【０１２３】
この実施例は、単回用量が哺乳動物において新骨形成に影響を与える能力、そして用量は欠損が形成されてから長時間後に投与され得ることを実証する。詳細には、全身的に投与された形態形成タンパク質は、線維性組織形成のオンセットまたは開始後に提供される場合でも、有効である。
【０１２４】
外傷の72時間後までに、局所欠損部位の微小環境は、正常化および安定化した。詳細には、微小血管は修復され、手術または外傷によって誘発された全ての炎症応答は安定化し、そして線維芽細胞は、今やその部位に存在し、そして細胞外マトリクス瘢痕組織の積層を開始し得る。従って、形態形成タンパク質の不存在下において、移植後の７２時間までに、試験移植片の微小環境は、無防備状態の（compromised）個体（例えば、年齢、疾患（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）、手術または他の治療的手順（例えば、ステロイド）に関連して使用される治療法によって、新骨仮骨の形成能力が損なわれた個体）の難治性治癒部位の環境を今や実質的に模倣する。欠損が作製されてから実質的に後の時点で投与される場合、全身的に投与される形態形成タンパク質が新骨形成を誘導する能力は、難治性治癒に罹患した患者の処置について、ポジティブな関連を有する。
【０１２５】
OP-1（2.5mg/ラット）によって誘導される骨形成は、OP-1がコラーゲン移植の２４または７２時間後に投与される場合に最大であった。骨形成における約３０％の減少が、移植６時間後にOP-1が投与される場合に、観察された。図2はこれらの結果を示す。各場合において、OP-1は、示された時点で投与され、そして骨形成は、OP-1投与の12日後に測定された。移植後１２０時間より後の時点では、OP-1は、骨を誘導しなかった。このことは、コラーゲンは既に線維芽細胞系統に拘束され得ており、従ってOP-1に対し非応答性であり得ることを示唆する。
【０１２６】
[実施例4]
この実施例は、骨形成が、全身的に投与された形態形成タンパク質の用量に依存することを実証している。詳細には、このアッセイにおいて、mOP-1（酢酸緩衝液500μl中に0.05mg、0.5mg、2.5mg）および可溶性OP-1（PBS中の0.05mg、0.5mg、2.5mgの成熟等価物）を（コラーゲン移植の２４時間後に）尾静脈を介してi.v.投与した。適切なコントロールは、緩衝液（酢酸ナトリウム）のみを含む。動物をOP-1投与後12日目に屠殺し、そして組織学、アルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含量によって、新骨形成について試験した。ロング−エバンス（4〜5週齢）を、上記に詳述のとおり、皮下および筋肉内移植に供した。１ラットにつき4つの移植、1群につき4匹のラットを用いた。OP-1投与の日を、０日目および０時間と考えた。
【０１２７】
結果。コントロール群（緩衝液注入）は、コラーゲン移植部位（s.c.またはi.v.）において骨形成を誘導しなかったが、成熟OP-1を注入された群は、１２〜１４日後に試験した場合、軟骨内骨を誘導した。複数の注入を受けた群によって示された骨形成活性は、実施例１において観察されたものと匹敵する。単回投与を受けた群において観察された骨形成活性の量は、OP-1の投薬と直接的に関連した；最大の活性は高濃度のOP-1（2.5mg）で観察され、そして実施例１で観察されるものに匹敵する骨形成活性を示した。
【０１２８】
コラーゲン移植の24時間後でOP-1の単回投与を受けた群において、全てのものは骨形成を示し、高用量群（2.5mg）は、複数注入を受けた群と匹敵する骨形成を示し；低濃度（50μgまたは500μg）の群はそれぞれ移植片の50％または60％の軟骨内骨形成を示した。複数または単回高用量投与を受けた群由来の全ての移植片は、互いに匹敵する骨を形成したので、全身投与によって形成される骨の量は、投薬レジメに依存しない。ラットのバイオアッセイに基づき、単回用量全身投与によりラットにおいて骨形成をもたらすための現在好ましい用量範囲は、１ラットあたり約0.5mg〜2.5mgの範囲、または体重１ｋｇあたり１mg〜50mgもしくは５mg〜25mgである。個体の処置に好ましい投薬量の決定は日常的な実験によって決定され得ることが理解される。
【０１２９】
関連する実験において、移植後24時間で投与される単回用量（１ラットあたり2.5mg OP-1）を、3日、5日、7日、9日、11日、14日、21日、28日および60日に評価し、新骨（仮骨）形成の速度および質を決定した。OP-1投与の3日後、5日後、7日後、9日後、11日後、14日後、21日後および28日後および60日後に動物を屠殺し、そして生化学的アッセイおよび組織学によって新骨形成を試験した。データは、1週間までの良好な骨形成、そして骨形成が局所的に提供されたタンパク質の同一の生物学に従うこと（すなわち、本当の骨形成を明示する拘束段階を介する保存された進行；間葉前駆細胞の補充、軟骨細胞の増殖、マトリックス沈着、骨芽細胞の補充および増殖；リモデリング、および骨髄形成を含む）を示す。
【０１３０】
異なる実験において、局所的な異所性部位で、全身的に投与された形態形成タンパク質がコラーゲンキャリアを単独で移植し、新骨形成を開始する潜在能力である。各々約25mgのウシ骨由来の不溶性Ｉ型コラーゲンを、６〜８週齢のロング−エバンス雄性ラットの皮下（胸部領域の左側および右側）部位および筋肉内（左および右の大腿骨格筋）部位に移植した。１群あたり、4匹のラットが使用された。OP-1（500μl）を、１ラットあたり0.05mg、0.5mg、1.25mg、および2.5mgの濃度で、尾静脈を介して静脈内に与えた。コラーゲン移植片とともに緩衝液を受けた群、およびニセの移植片とともに全身性OP-1を受けた群をコントロールとして使用した。骨形成活性を、組織学、アルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含有量によって、OP-1投与後１２日目に決定した。
【０１３１】
図1は、OP-1投与後12日目に収集した移植片をアルカリホスファターゼ活性、カルシウム含有量、および組織学的試験によって測定した場合、静脈内に投与されたOP-1が、用量依存様式で新骨形成を誘導することを示す。最大の骨形成活性は、1ラットあたり2.5mgのOP-1の用量が使用された場合に観察された。１ラットあたり0.05mgのOP-1が使用された場合、最大活性の約３０％が観察された。１度の注入において与えられる2.5mgのOP-1の単回投与（移植後２４時間）は、移植後0時間後、8時間後、24時間後、48時間後および72時間後に投与される５回の注入が生成した匹敵する骨形成活性に匹敵する骨形成形成活性を生成した。重要なことに、最大の骨形成をもたらすために全身的に投与されるOP-1量は、局所的に骨を誘導するためにコラーゲン/OP-1デバイスを使用する場合に骨形成を誘導するために必要な量より約１０００倍高い。筋肉内部位のコラーゲン移植片は、皮下部位での移植片よりも良好に作用するようである。なぜなら、応答する細胞および血管成分は、筋肉内部位では容易に利用可能であるからである。
【０１３２】
[実施例5]
以下の実施例は、骨形成の比較測定のためのプロトコルを提供する。ここで、タンパク質は、任意の全身経路（すなわち、i.v.、腹腔内、または経口投与）により提供される。OP-1の液体溶液を、以下のとおり、すべての投与経路に使用した。
【０１３３】
静脈内および腹腔内：500μg（成熟等価物）用量を、コラーゲン移植の０時間後、６時間後、24時間後、48時間後および72時間後に投与した（500μl容量中）。経口投与：可溶性の成熟OP-1を24時間、１〜２mlに2.5mgの単回用量として投与した。i.v.および経口投与に関し、mOP-1は、i.v.投与用の酢酸ナトリウム緩衝液、および経口投与用のPBS中0.1％カゼインで摂取される。OP-1は、0.1％カゼインに完全に可溶である。OP-1投与の日を０日目とし、移植物を12日目に採取する。次いで、コラーゲン移植物において骨形成を引き起こした全身OP-1を、アルカリホスファターゼの比活性、カルシウム含量、および組織学に基づいて評価する。
【０１３４】
別の経口投与プロトコル：2.5mgタンパク質（成熟OP-1）を、希釈塩化メチレンに可溶化し、そしてポリマー溶液（すなわち、FA：SA、20：80）に閉じ込め、そして転相によりカプセル化した。
【０１３５】
結果：３つすべての経路が、試験移植物部位で骨形成を引き起こすことが予測される。この方法論は、好ましい投薬量をアッセイする手段、および所望の投与経路用の処方物を提供する。
【０１３６】
組織化学的および生化学的分析は、全身に投与されたOP-1により、局所のコラーゲン移植物において引き起こされた骨形成が、局所のOP-1/コラーゲン移植物により引き起こされるものと同様な、細胞事象のカスケードを受けることを示す。
【０１３７】
[実施例6]
本実施例は、全身に投与された他の形態形成タンパク質の、局所的な骨形成を引き起こす能力を立証する。上記のプロトコルを使用して、組換えBMP-2、CDMP-1およびCDMP-2を評価した。アッセイにおいて、OP-1、BMP-2（1.25mgにて）ならびにCDMP-1およびCDMP-2（2.5mgにて）を、コラーゲン移植の24時間後、全身性に投与した（尾静脈、500μl）。タンパク質投与の日を、０日目として、移植物を12日目に採取した。
【０１３８】
[実施例7]
本実施例は、異所性部位のコラーゲン移植物における骨形成に対する、動物の年齢の効果、および成体ラットにおける治癒を加速または改善する、全身性に投与された形態形成タンパク質の能力を評価する。代表的には、若齢ラットは、老齢ラットより早期に治癒する。例えば、毛髪様骨折を若齢ラット（例えば、１ヶ月齢）に誘導した場合、仮骨形成が１週間までに見られ得、そして完全な治癒が３週間までに生じる。対照的に、成体ラット（24ヶ月齢）において、形成には２週間かかり、そして完全な治癒には６〜12週間を必要とする。
【０１３９】
１ヶ月齢、３ヶ月齢、６ヶ月齢、12ヶ月齢、および24ヶ月齢のLong-EvansまたはFisherラットを、上記のような皮下および筋肉内移植に供した。移植物は、ウシコラーゲン性マトリクス（約25mg）のみからなる。ラット１匹あたり４つの移植物を製作し、１群あたり４匹とした。成熟OP-1を、酢酸緩衝液中500μlあたり500μgで、０時間目、６時間目、24時間目、48時間目、および72時間目に投与した。OP-1投与の日を０日目とする。動物を、以下の日数範囲内で選択した時点で評価した：３日目、５日目、７日目、９日目、11日目、14日目、21日目、28日目、および60日目。
【０１４０】
結果：全身性に投与した形態形成タンパク質は、コントロールと比較して、より老齢のラットにおいて、より早期の仮骨および骨形成を生じた。データは、成体または骨治癒の能力が減少したかもしくは難治性治癒を経験した任意の個体における骨修復を増強するための手段としての全身投与の有用性を示す。このような個体は、前駆体細胞を欠いているか、血管分布が乏しいか、誘導シグナルが減少しているか、などのいずれかのために、骨折を修復する能力が減少しているかまたは遅延している。
【０１４１】
OP-1の効果と、モルフォゲンファミリーの関連するメンバーとの比較により、12日目の移植物について実施したカルシウム含量および組織学によって測定されるように、OP-1が、全身投与の際に骨形成を誘導することにおいて、BMP-2、CDMP-1（GDF-5）、およびCDMP-2（GDF-6）より強力であることが示される。全身性にOP-1を与えられた動物における局所的コラーゲン移植物部位での骨形成に対する効果は、年齢に無関係であった。結果を図3Aおよび3Bに示す。図3Bに示されるように、カルシウム含量により決定されるように、骨再造形および鉱化作用の速度がいくらか遅延した。
【０１４２】
[実施例8]
本実施例は、当該分野において認められたイヌモデルの重大なサイズの尺骨分節性欠損において骨形成を誘導する、全身性に投与された骨形成タンパク質の能力を示す。重大なサイズの骨欠損は自然治癒し得ず、そして代表的には再生しない組織において、新規な組織形成許容位置を誘導する、形態形成タンパク質の能力を示す。簡潔には、周知の骨修復および再造形特徴のため、認可された犬舎により供給された成体雄性雑種犬を使用する。動物は好ましくは少なくとも２歳であり、そして40〜50ポンドの体重であり、均一なサイズおよび体重の動物を選択して骨幾何学および負荷の変動を限定するよう特別の注意を払った。両側の2.5cm尺骨分節性欠損を、標準的な外科手順を使用して個々のイヌに作製する。すべての右側の欠損を無処置のまま残し、すべての左側の欠損には、例えば、１ｇのコラーゲンマトリクスあたり2.5mgのrhOP-1の比で、ウシ骨Ｉ型コラーゲンマトリクスと混合した組換えヒト形態形成タンパク質-1（rhOP-1）を使用して、標準的な形態形成タンパク質デバイスを与える。成熟または可溶性の形態形成タンパク質を、0.5mg〜５mg（500〜1，000ml）の用量範囲で投与し、手術後少なくとも24時間、48時間、もしくは72時間で、単回のボーラスとして、または上記のような５回の別個の一連の注射として投与する。コントロール群には、形態形成タンパク質を全身性に投与されない、模擬移植物；および単回の試験欠損を受け、標準的なデバイスもしくは全身性に投与されたタンパク質のいずれかで処置された動物が含まれる。１週おきにＸ線写真を撮影して治癒の進行を調べそして０〜６の等級に格付けする。屠殺時、すべての尺骨をひとかたまりに摘出し、そして手による触診で十分に治癒したものを、ねじれについて機械により試験する。次いで、セグメントを組織応答、骨構造および再造形、ならびに新骨形成および治癒の質および量についての組織学により評価する。全身的に投与された形態形成タンパク質は、尺骨欠損を修復するに十分な骨形成を誘導することが予測される。
【０１４３】
[実施例9]
標準的な動物肺線維症モデルが以下に提供され、これは、損傷を受けた肺組織を修復する、全身的に投与されたモルフォゲンの能力を示すために使用され得る。本実施例は、本質的に、Hastonら（1996）Cancer Research 56：2596-2601；Weinbachら（1996）Cancer
Research 56：5659-5665；Harrisonら（1988）J.Pharmacol.Exp.Thr．247：1052-1058に記載された方法に従う。
【０１４４】
肺線維症は、ブレオマイシン（BLM）（実質的な骨髄毒性を欠く高度に有用な抗腫瘍剤）により引き起こされる傷害に対する肺の潜在的に致死的な慢性応答である。この障害の特質は、肺機能を弱める、肺胞壁における細胞外マトリクスタンパク質（特に、コラーゲン）の増大した沈着によって特徴付けられる。
【０１４５】
アッセイにおいて、肺損傷は、市販の実験用マウスにおいて、BLM注射（代表的には、100mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、または500mg/kg）で誘導される。この薬剤は、腹腔内もしくは皮下注射により、または移植ポンプにより投与され得る。好ましくは、線維症易発症発現型（例えば、肺線維症に特徴的である組織学的な損傷および増大した肺OH-プロリン（praline）含量）を有するC57BL/6Jマウス系統が利用される（Jackson
Laboratoryies）。線維症抵抗性表現型系統（例えば、C3hf/kam）がコントロールとして使用され得る。
【０１４６】
実施例において、緩衝液単独、成熟モルフォゲン、または可溶性複合体形態が、以下の１以上のプロトコルにおいて投与される：
Ａ．単回ボーラス（0.05mg、0.5mg、1.0mg、または2.5mg/500ml）を、500μl容量でBLM注射の０時間後、６時間後、12時間後、24時間後、48時間後、または72時間後に投与。
【０１４７】
Ｂ．合計0.05mg、0.5mg、1.0mg、または2.5mgまでの複数回注射を、500μl容量で０時間後、６時間後、24時間後、48時間後、および72時間後に投与。
【０１４８】
動物を、８週目、10週目、または12週目に、または亢進した呼吸数により示される呼吸窮迫時に頸椎脱臼により屠殺する。次いで、標準的な方法論を使用する組織学およびOH-プロリン含量によって肺を評価する。
【０１４９】
結果は、形態形成タンパク質の非存在下で、線維症が、適度な用量のBLM（累積用量、300mg/kgもしくは400mg/kg）によって誘導されることを示すと予測される。対照的に、全身性に投与されたモルフォゲンで処置されたマウスは、線維症の線維性病巣の実質的な減少もしくは皆無が示され、これらのマウスはより高いip接種用量のBLMに耐性である。
【０１５０】
[実施例10]
心筋は再生し得ないので、心筋梗塞は瘢痕により治癒する。このアッセイは、新たな収縮性組織を再生しそして機能を実質的に回復する、全身性に投与したモルフォゲンの能力を示す。このアッセイは、Murryら（1996）J.Clin.Invest 98（11）：2512-2523のプロトコルに従う。
【０１５１】
成体近交ラットの心臓を標準的な凍結−融解方法論により傷害する。具体的には、液体窒素で予め冷却した１cm直径のアルミニウム棒を、左前心室と直接接触させて15秒間置く。凍結−融解は、直径約１cmで心筋中に約２mm拡がる、凝固壊死の円盤状領域を再現可能に引き起こす。モルフォゲンまたは生理食塩水緩衝液単独を、傷害後ｔ＝０時間、６時間、24時間、48時間、および72時間に投与する。モルフォゲンは、実施例10に記載のとおり、単回のボーラスとして、または複数回の注射により投与され得る。１週までに、多核化筋管が修復中の組織に明らかである。２週目に、衛星幹細胞が明らかである。７週までにβ-MHC発現が検出される。
【０１５２】
１週目、２週目、および７週目に、心筋組織形成が組織学および標準的な生化学的マーカーアッセイ（β-MHC発現の証拠を含む）により評価される。
【０１５３】
[実施例11]
毒素誘導性組織損傷後の再生中の肝臓組織におけるモルフォゲン発現
毒性因子誘導性の損傷した組織後の肝臓組織修復には、肝細胞前駆体細胞の増殖および分化が含まれる。この組織修復は、胚発生の間に生じる組織形態形成カスケード（Faustoら（1989）Lab．Investigation 60：4-13）を明らかに模倣する。下記の実施例に示されるように、全身性に投与されたモルフォゲンは、ガラクトサミンまたは四塩化炭素（CCl4）誘導性肝臓損傷後の肝臓組織再生を増強し得る。実験を、本質的に、Kuhlmannら（1980）Virchows
Arch 387：47-57（この開示を本明細書中に参考として援用する）に記載のとおり実施する。
【０１５４】
０日目に、ガラクトサミン-HCl 0.75g/kg体重。モルフォゲンを本実験において投与し、雄性ラットに、全身性（例えば、以下のプロトコルに従うi.v.：毒素注射後６時間後、12時間後、24時間後、または48時間後に、500μg緩衝液（酢酸もしくはPBS）中0.5mg、1.0mg、または2.5mgのmOP-1）の単回の腹腔内注射を提供した。動物を、３日目、５日目、12日目、20日目に屠殺して、組織学によって評価する。
【０１５５】
[実施例12]
モルフォゲン誘導性肝臓再生
本実施例は、部分的な肝切除後の新たな肝臓組織を再生する、全身性に投与したモルフォゲンの能力を示す。
【０１５６】
肝細胞は、組織損失後に補償性の増殖を受ける顕著な能力を有するが、肝臓の修復特性は胚形態形成とは有意に異なる。具体的には、部分的な肝切除（ここで、肝臓葉が部分的にもしくは完全に除去される）後、残りのインタクトな葉は、迅速に増殖し、そして制限された分化を受ける、インタクトな葉の分化した肝細胞の能力に起因して重量が二倍になる。しかし、摘出された葉自体は再生しない。以下の実施例は、部分的な肝切除後の損失肝組織を再生する、モルフォゲンの能力（摘出した組織葉の再生を含む）を示す。下記のプロトコルは、例えば、Higginsら（1931）Arch．Pathol．12：136-202およびBraunら（1989）PNAS 86：1558-1562（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）により記載される、標準的な部分的肝切除プロトコルについてのバリエーションである。
【０１５７】
成長中のラットまたは老齢ラットを、ケタミンを用いて麻酔する。２つの肝臓葉（左および右）を切り出す（葉の約1/3）。標準的な外科手順を使用して傷を閉じる。モルフォゲン（例えば、精製した組換えヒトOP-1、成熟形態）を、全身性に静脈内（i.e.）またはp.（腹腔内）投与する。OP-1（成熟または可溶）を、手術後12、24、48、または72時間に、500μl緩衝液（酢酸またはPBS）中0.5mg、1.0mg、または2.5mgのタンパク質で、注射する。プラセボサンプルは、モルフォゲンを含まない注射緩衝液である。手術後、ラットに通常の食餌を食べさせ、そして水道水を飲ませる。
【０１５８】
12日後、ラットを屠殺し、そして肝臓再生を視覚的に観察する。OP-1を注射した群は、完全な肝臓組織再生（摘出された葉組織の再編成を含む）を示し、そして肝臓にいかなる切断の実質的痕跡を示さない。対照的に、PBSのみが注射されたコントロール群では、摘出された葉組織は実質的に再生されない。代表的にはこのサンプルに元の切開が残っている。
【０１５９】
本実施例のバリエーションにおいて、手術後の３〜10日の間にわたる一連の注射として、モルフォゲンを投与する。
【０１６０】
[実施例13]
口腔粘膜炎（mucositis）のモルフォゲン処置
口腔粘膜炎には、例えば、放射線療法または化学療法の結果としての口潰瘍が含まれる。潰瘍性粘膜炎の経過は、破壊期および治癒期に分けられ得る。口腔上皮の基底層の細胞は、迅速に分裂するので、化学療法の抗有糸分裂誘発効果および毒性効果に感受性である。その結果、萎縮性変化が生じ、次いで潰瘍が続く。これが破壊期を構成する。潰瘍形成後、治癒期の間に病変がゆっくりと溶解する。
【０１６１】
下記の実施例は、ハムスターモデルにおいて、口腔粘膜を口腔粘膜炎から保護することにおける、全身性に投与されたモルフォゲンの効力（潰瘍の阻害および潰瘍組織の再生の増強の両方）を示す。全身投与は、局所的に塗布されたモルフォゲンを欠損位置に維持することに関連する問題を消去する。
【０１６２】
プロトコルの詳細は、Sonisら（1990）Oral Surg．Oral Med．Oral Phathol 69：437-443（本開示を本明細書中に参考として援用する）に見出され得る。
【０１６３】
簡潔には、ゴールデンシリアンハムスター（６〜８週齢、Charles River Laboratories，Wilmington，MA）を試験群：プラセボ（例えば、生理食塩水）コントロール、ならびにモルフォゲン低用量群（100ng）およびモルフォゲン高用量群（１μg）（それぞれ、群２および群３）に分類する。さらなる群が、モルフォゲン注射の数（単回ボーラス対複数回投与）を調整し得る。各群は同数の動物を含む。０日目に始め、５日目まで続けて、モルフォゲンが全身性に（成熟形態）（経口、またはip、またはi.v.；（尾静脈））投与される。３日目、すべての群で粘膜炎誘導手順を始める。３日目（60mg/kg）および５日目（40mg/kg）に、５-フルオロウラシルを腹腔内に注射する。７日目、右頬窩粘膜を、目盛り付き18ゲージ針を用いて表面で刺激する。無処置動物では、重篤な潰瘍性粘膜炎が、10日目までに少なくとも80％の動物に誘導される。
【０１６４】
12日目、各群２匹の動物を、組織学的研究のために屠殺する。標準的な解剖および組織学的手順を用いて、右頬窩粘膜および基礎の結合組織を切り出して、10％ホルマリン中で固定する。標本をパラフィンにマウントして、組織学的検査のために調製する。次いで、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そしてハムスターの組織学が専門の３人の口腔病理学者により盲検し、標準的な粘膜炎パネルに対して、標本に関する知識なしにスコア付けする。萎縮の広がり、細胞浸潤、結合組織崩壊、潰瘍の程度、および上皮形成を評価する。
【０１６５】
組織学に基づいて、投与されたモルフォゲンは、用量依存的に病変形成を有意に阻害する。対照的に、組織中の黒っぽい領域により示される重大な組織壊死、および組織の明るい球状領域により示される潰瘍が、無処置の窩に明らかである。モルフォゲン処置組織は、壊死がなく、そして潰瘍もほとんどないか全くない、健常な組織を示す。高用量の単回投与は、複数回の注射投与と実質的に同程度に効果的であると考えられる。
【０１６６】
本発明の方法は、危険にある個体が、ガン治療レジメンと同時に予防的にこのタンパク質を摂取することを可能にし、モルフォゲンが、最初の口腔粘膜炎欠損が生じる時点にその系に存在することを可能にする。
【０１６７】
[実施例14]
十二指腸潰瘍形成のモルフォゲン処置
以下の実施例は、十二指腸潰瘍の処置における、全身性に投与するモルフォゲンの効力を立証するためのラットモデルを提供する。プロトコルの詳細な説明は、Pilanら（1985）Digestive Diseases and Sciences 30：240-246（本開示は、本明細書中に参考として援用される）に提供される。簡潔には、Sprague-Dawley雌性ラット（例えば、Charles
River Laboratories、150〜200ｇ）に、十二指腸潰瘍発生因子システアミン-HClを、体重100グラム（gm）あたり25〜28ミリグラム（mg）の用量にて、同日に３回胃管栄養法により経口的に与える。さらに、コルチソルを、各ラットに皮下で、体重100gmに対して５mgコルチソルの単回用量にて投与して、システアミン-HClの投与に起因して死亡率を減少させる。
【０１６８】
システアミン-HClの投与３日後、穿通性および足穿孔性十二指腸潰瘍を有するラットを、標準的な側腹切開により同定し、そしてコントロール群およびモルフォゲン処置群に無作為に分ける。
【０１６９】
群１のラット（すべて潰瘍を有する）には、モルフォゲンを与えず、生理食塩水のみで処置する。群２のラット（これもまたそれぞれが潰瘍を有する）に、体重100mgあたり50〜100ngのモルフォゲンを、i.v.（k.l静脈）投与またはi.p.もしくは経口投与により与える。群３のラット（全てが潰瘍を有する）に、体重100mgあたり200〜500ngのモルフォゲンを与える。処置はまた、実施例10に記載のように、単回のボーラスまたは一連の複数回の注射であり得る。動物を21日目に屠殺し、そして潰瘍を測定し組織学的切片を採集する。
【０１７０】
モルフォゲン処置動物からの十二指腸切片の組織学は、優勢で密な肉芽組織および部分的もしくは完全な上皮再形成を有する治癒した潰瘍を示す。このことは、モルフォゲンの経口投与が、GI管の潰瘍の治癒を有意に加速し得ることを立証する。さらに、潰瘍の前もしくは同時のモルフォゲンでの処置もまた、潰瘍形成を阻害する。
【０１７１】
[実施例15]
網膜障害のモルフォゲン処置
全身性に投与したモルフォゲンはまた、網膜障害を処置するため、特に、黄斑変性および円孔の処置に使用され得る。ここで、治癒が促進されそして視力が有意に改善されると予想される。処置はまた、網膜円孔、涙、および剥離の処置に使用され得る。これらの障害は、視力の喪失により特徴付けられる。
【０１７２】
モルフォゲンで処置される眼は、完全な、手術前および手術後の眼検査を受ける。この眼検査には、視力検査、眼内圧測定、細隙灯生体顕微鏡検査、および双眼間接検眼鏡検査を含む。外科ストラテジーは、当該分野において公知のように、正確な硝子体網膜の解剖学に依存する。一般に、すべての硝子体切除は、標準的な手順を用いて、標準的な３点機器使用で実施する。硝子体切除はモルフォゲン投与の前に行う。
【０１７３】
硝子体切除後、実施例10に概説したプロトコルまたはそのバリエーションに従って、モルフォゲンを全身性（ip.、iv）に投与する。１週間目、２週間目、７週間目に動物を屠殺し、組織学により評価する。全身性に投与されたモルフォゲンは、局所注射によりモルフォゲンを提供する必要を消去し、そして少なくとも局所的に提供されたタンパク質と同程度に、網膜の再付着および損失網膜組織の再生を促進すると予期される。さらに、モルフォゲンの全身投与は、線維性血管性組織の再増殖を阻害し、そして新血管新生を阻害するはずである。
【０１７４】
モルフォゲンは、同様に、黄斑円孔を処置するために投与され得る。このような処置は、視覚の改善および円孔の縁の厚さが減少することによる治癒を提供すると期待される。
【０１７５】
[実施例16]
本実施例は、当該分野において認知された動物モデル（イヌ）を使用して、骨軟骨もしくは軟骨の欠損を治癒する、全身性に投与された骨形成タンパク質の能力を立証する。具体的には、標準的なイヌ骨軟骨栓子（plug）欠損モデルを用いる研究を、下記のように実施する。簡潔には、標準的な外科手順および認可された犬舎から供給された動物を使用して、直径が５mmで肋軟骨下骨に６mm拡がる全層性欠損を、４匹の成体雑種犬の両側の大腿骨内側顆に作製する。左側欠損に標準的な骨形成デバイスを与え、そして右側欠損を無処置のままにする。全身性投与アッセイを、模擬移植物を含む、適切なコントロールを伴って、上記実施例８における重大な部位欠損についてのように実施する。すなわち、手術の少なくとも24時間後、48時間後、もしくは72時間後に単回ボーラスとして投与されるまたは複数回の別個の注射で投与される、有用な投与量の範囲を評価する（0.5mg〜５mg）。
【０１７６】
治癒を評価するためのＸ線写真を含むルーチンのプロトコルを使用して、骨軟骨および軟骨治癒をおおまかで組織学的に評価する。手術後12週目に、バルビツレートの静脈内過剰投与により各動物を屠殺する。右および左の両方の遠位大腿骨をひとかたまりに採取し、そして大まかな格付けおよび顕微鏡写真撮影が完了するまで冷却生理食塩水中に維持する。標本を４％パラホルムアルデヒド固定液中に置き、同一性を証明する必要なすべてのもので標識し、そして評価するまで４℃で貯蔵する。
【０１７７】
組織学的評価のために、個々の標本を、４％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬することにより固定し、そして標準的な手順を使用して評価する。さらに、ルーチンの手順を使用して、コラーゲン型および組織組成の割合を特徴付けるため、組織型決定分析を実施する。（マトリクス中のグリコサミノグリカン含量を示すために）サフラニンＯおよびファストグリーン染色液で染色した非脱石灰化切片（各標本から１つ）もまた使用し得た。
【０１７８】
全身性に投与した骨形成タンパク質で処置した、骨軟骨および／または軟骨の欠損は、骨および／または軟骨の再生を立証すると予想される。なぜなら、その症例が、標準的な骨形成デバイスで処置した欠損と比較した場合、適切な軟骨細胞および軟骨表現型（機能的修復性の関節軟骨形成を含む）を含み得るからである。
【０１７９】
【表１−１】
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【０１８０】
【表１−２】
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【０１８１】
【表１−３】
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【０１８２】
【表１−４】
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【０１８３】
【表１−５】
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【０１８４】
【表１−６】
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【０１８５】
【表１−７】
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【０１８６】
【表１−８】
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【０１８７】
【表１−９】
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【０１８８】
【表１−１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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