(57)【要約】      （修正有）【課題】経口投与においても豚丹毒菌およびマイコプラズマハイオニューモニエの感染防御に効果的であり、安全かつ経済的なワクチンを提供する。【解決手段】我が国で長年注射用の生ワクチン株として実績のある豚丹毒菌小金井株を経口投与型マイコプラズマワクチンのベクターとしての弱毒豚丹毒菌として選択し、本菌に相同組換えによりマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドへジン遺伝子の一部を導入し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエＰ９７アドへジンの一部を発現する豚丹毒小金井株を作出した。本株は、強毒豚丹毒菌及び強毒マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対し良好なワクチン効果を示した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口投与でワクチン効果を付与できる能力をもつ弱毒豚丹毒菌の菌体表面にマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドヘジン蛋白の一部を発現させた豚丹毒菌。
【請求項２】
弱毒豚丹毒菌が豚丹毒菌小金井株である請求項１記載の豚丹毒菌株。
【請求項３】
二重交差により宿主ＤＮＡに外来遺伝子が挿入された請求項１記載の豚丹毒菌。
【請求項４】
請求項１記載の菌株を用いたワクチン。
【請求項５】
生きた菌体を用いる請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
安定剤及び／又はアジュバントを含む請求項４〜５に記載のワクチン。
【請求項７】
請求項４〜６に記載のワクチンを経口投与し、免疫を誘導する方法。
【請求項８】
請求項４〜６に記載のワクチンを飲水もしくは飼料に混ぜて投与し、動物を免疫化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は豚丹毒・豚マイコプラズマ肺炎経口投与型マイコプラズマワクチンの発明に関する。本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエのアドヘジン蛋 白（Ｐ９７）とそのパラログ中にある反復配列を含むポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにそれらの豚マイコプラズマ肺炎感染防御用ワ クチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の大規模化する養豚産業において、豚呼吸器疾病のコントロールは経営上欠かすことのできない要素のひとつである。豚の呼吸器疾病はその研究が進むに つれて複雑であることが明らかとなってきている。すなわち、いくつかのウイルス及び細菌が複合的に働き呼吸器疾患を引き起こすことが明らかとなり、「豚の 複合呼吸器疾患」という考え方が一般化してきた。疾病のコントロールは主にワクチン及び抗生物質にて行われてきたが、近年、抗生物質の使用が制限される傾 向にあり、ワクチンの需要が高まっている。現在のワクチン投与は主に注射によるものである。前述のように呼吸器疾患に関わる病原体は多種に及ぶため、数種 のワクチンを接種する必要があり、これにより注射回数が増加し、豚に対するストレスは大きくなる一方である。この問題点を解決する手段として２つの方法が 考えられる。１つは投与方法を注射以外の方法に変えること、もう１つは複数の疾病に効果のある混合ワクチンを開発することである。
【０００３】
豚の複合呼吸器疾患の主要な病原因子の１つであるマイコプラズマ・ハイオニューモニエは、豚マイコプラズマ肺炎の起因菌であり、肥育期における豚の増体 や飼料効率に影響を与えるため経済的な損失が大きい。また、複合呼吸器疾患の引き金となる最初の病原体の１つとも考えられている。そこで、我が国ではワク チンによるコントロールが行われており、その普及率は高い。それらのワクチンはマイコプラズマ・ハイオニューモニエの菌体もしくは培養上清を不活化したも のにアジュバントとして油性アジュバントもしくはアルミニウムゲルアジュバントを添加したもので、用法・用量としてワクチン１ｍｌまたは２ｍｌを豚の筋肉 内に１回または２回接種するというものである。
【０００４】
豚丹毒は豚丹毒菌（エリシペロスリクス属菌）の感染によって起こる豚の疾病で100年以上も前から世界中の養豚地帯で発生している疾病である。経過は甚 急性で致死率も高く、慢性経過をとった場合は関節炎を惹起し、保菌豚となることがある。豚丹毒菌は人畜共通感染症であるため、屠畜時の検査で陽性となった 場合、その個体は全廃棄となり、経済損失はきわめて大きい。豚丹毒の予防にはワクチンが有効で、日本では弱毒化した菌（アクラフラビン耐性株：小金井株） で製造した生ワクチンが広く使用されている。日本国内で使用されているワクチンはすべて注射による投与であるが、諸外国では経口投与によるワクチンも市販 されている。
【０００５】
我々は、下地らにより開発された無毒化豚丹毒菌ＹＳ-１株に、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの感染初期に働く豚気管繊毛への付着に重要な菌体側の 抗原蛋白分子量９７キロダルトンの蛋白、Ｐ９７アドへジン遺伝子を豚丹毒菌の菌体表面に存在する感染防御関連蛋白質ＳｐａＡ.１の遺伝子内部に挿入し、 Ｐ９７アドへジン蛋白を菌体表面に発現する豚丹毒菌ＹＳ-１９株を作出した。さらに、我々は豚丹毒菌ＹＳ-１９株を豚に鼻腔内投与し、豚丹毒菌およびマイ コプラズマ・ハイオニューモニエの攻撃に対し良好なワクチン効果を示すことを確認した（例えば特許文献１〜３を参照。）。我々は注射以外の投与方法でかつ 複数の疾病にワクチン効果を発揮する有望なワクチン候補株である豚丹毒菌ＹＳ-１９株の発明に成功した。しかし、本株の投与経路は鼻腔内であり、ワクチン 投与の際は個体一頭一頭を保定する必要があった。この投与方法は労働力を削減したいという生産者の要求を満足し得なかった。
【０００６】
現在、我が国では各メーカーより多種類の豚マイコプラズマ肺炎用ワクチンが市販されている。ワクチン用抗原としてはマイコプラズマ菌体を使用したものが一 般的で一部に培養上清を用いた製品が見られるが、すべて不活化した抗原を使用している。また、免疫賦活を目的としたアジュバントを加えてあるのが一般的 で、そのアジュバントには各製品で工夫が見られるが、投与法は注射による筋肉内投与であり、全身性の免疫は誘導するが、局所の免疫は誘導できない。
【０００７】
豚丹毒菌のワクチンは、生ワクチンと不活化ワクチンの２種類があり、どちらもその効果は高く評価されている。我が国における生ワクチンは、長い間シード ロットとして管理された豚丹毒菌小金井株を用いたもので、その安全性も高い。豚丹毒菌の被害は主として全身性の菱形疹を伴った菌血症による突然死であるた め、そのワクチン効果の主体は全身性の免疫である。
【０００８】
養豚業においては、抗生物質使用を控える傾向にあり、代わって豚疾病のコントロールにはワクチンによる対応が増えてきている。豚は生涯多くの病原体に暴露 されることから、それらの病原体が撲滅できない限り数多くのワクチンを接種されることになる。ワクチン注射は豚にとって大きなストレスとなり時には増体に も影響する。そこで、経口投与によるワクチネーションの可能性を検討した。日本での豚丹毒菌生ワクチンは注射により投与されているが、アメリカでは飲水投 与等による経口投与が実施されている（例えば特許文献４を参照。）。ただし、両者のワクチン株の性状は異なるため、日本で経口投与用のワクチンは市販され ていない。我々は既に開発済みの豚丹毒菌ＹＳ-１９株の経口投与用ワクチンの可能性を検討したが、本株は安全性を高めるために高度に弱毒化してある株で あったため、経口投与ではワクチン効果を付与できなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第２９９２９８０号公報
【特許文献２】特許第３７９３８８９号公報
【特許文献３】特開２００６−３１１８２４号公報
【特許文献４】特表２００４−５０１９７９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, Ｊａｎｕａｒｙ １９９９, Ｐ２７８-２８２, Ｖｏｌ. ６５, Ｎｏ.１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って本発明の課題は、ワクチン投与による豚のストレスを軽減するため、経口投与によって豚丹毒菌およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエの発症を防御する安全かつ効果的なワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
我々は、既に豚丹毒菌のＳｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ (ＳｐａＡ.１)の遺伝子をクローニングし、本遺伝子内部に外来遺伝子を挿入し、キメラ遺伝子を作製、そのキメラ遺伝子を豚丹毒菌に導入し、外来抗原を発 現する豚丹毒菌を発明している。今回さらにキメラ遺伝子導入の効率の向上と安定化を目的とした方法を開発し、経口投与型ワクチンの開発に応用した。
通常、グラム陽性菌の形質転換には、大腸菌とその菌とで複製が可能なシャトルプラスミドにクローニング後、その目的の菌株に導入して形質転換を行う。しかしながら、形質転換法が確立されていない豚丹毒菌を遺伝学的に改変することは極めて困難である。
【００１３】
ｐ９７遺伝子断片の豚丹毒菌染色体上への挿入は、ｐ９７遺伝子断片を豚丹毒菌のｓｐａＡ.１遺伝子の中央部に挟むようにして設計したキメラ遺伝子をエレク トロポレーション法などにより菌体内へ遺伝子を導入後、染色体上のｓｐａＡ.１遺伝子とプラスミド上のｓｐａＡ.１遺伝子との相同組換えにより行われる。 その遺伝的組換えが一ヶ所で起こる場合をシングルクロスオーバー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）、それが同時に二ヶ所で起こる場合をダブルクロスオーバー（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）という。遺伝子組換え菌をワクチンとして使用する場合、遺伝学的に安定していることが求められるが、外来遺伝子の挿入がシングルクロ スオーバーの場合、遺伝学的に不安定であり、薬剤耐性の選択圧をかけないで培養すると、すなわち抗生物質を培地に添加しないと、元の株に戻る可能性がある。また、抗生物質耐性遺伝子を含めてプラスミド上の遺伝子が丸ごと染色体上に残るため、遺伝子組換えワクチンとして不適である。従って、遺伝子組換えワ クチンの開発には、ダブルクロスオーバーにより抗生物質耐性遺伝子やベクター由来遺伝子部分を含まず、目的とする遺伝子（ｐ９７遺伝子）のみを導入した遺 伝学的に安定した組換え菌を作製しなければならない。しかしながら、形質転換により遺伝子を導入後、シングルクロスオーバーで相同性組換えが起こる確率は 極めて低く、さらに、ダブルクロスオーバーで相同性組換えが起こる確率はより低い。そのため、ダブルクロスオーバーで相同性組換えが起こったクローンを選択するのは極めて困難である (非特許文献１を参照。) 。
【００１４】
本発明では、相同性組換えが起こる確率を上げるため、ｐ９７遺伝子断片を挟んでいる豚丹毒菌ｓｐａＡ.１遺伝子の上流約１０００ｋｂ、下流７００ｋｂの未知の遺伝子領域を新たにクローニングし、遺伝子導入のための新たな組換えプラスミドを作製し、実験に使用した。
宿主になる豚丹毒菌には我が国で長年注射用の生ワクチン株として実績のある豚丹毒菌小金井株の経口投与によるワクチン効果を確認し、これを経口投与型マ イコプラズマワクチンのベクターとしての弱毒豚丹毒菌として選択した。本菌に前述した相同組換えによりマイコプラズマ・ハイオニューモニエのＰ９７アドへ ジン遺伝子の一部を導入し、マイコプラズマ・ハイオニューモニエＰ９７アドへジンの一部を発現する豚丹毒小金井株を作出した。本株のワクチン効果を豚における感染及び発症防御試験で確認したところ、強毒豚丹毒菌、強毒マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対し良好なワクチン効果を認めた。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、豚マイコプラズマ肺炎と豚丹毒の感染防御用ワクチンとして利用できる生ワクチンが提供される。該生ワクチンは、通常の豚丹毒菌と同様の 条件で大量に生産することができ、また、これを成分とするワクチンは、安全性が高く、マイコプラズマ全菌体を使用したワクチンよりも安価となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】豚丹毒菌小金井株の遺伝子にマイコプラズマ・ハイオニューモニエP97アドへジンの一部を挿入した遺伝子配列
【図２】図１のつづき
【図３】シャトルプラスミドのコンストラクト
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１７】
（実施例１）遺伝子導入プラスミドの構築
ＳｐａＡ.１の両端をクローニングした方法：<ＢＲ> ＳｐａＡ.１は免疫原性が強い。そのため、豚丹毒菌の遺伝子ライブラリーの中から豚丹毒感染耐過豚の血清と反応するファージクローンを選択し、さらに、それらの中からｓｐａＡ.１遺伝子及び、ｓｐａＡ.１遺伝子の上下流領域を含むファージミドクローンｐＥＲ３を選択した。これはｐＢＫ-ＣＭＶベク ター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に約４３００ｂｐのインサートが挿入されたクローンである。この遺伝子の中央にあるＥｃｏＲＩサイト断片と、ＥｃｏＲＩサイ トが付加するようにＰＣＲで増幅したマイコプラズマＰ９７蛋白遺伝子の断片とを置換する予定であったが、ベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の ３'側にＥｃｏＲＩ切断サイトがあるため、その操作ができないことが分った。そこで、ベクター側のＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩ切断サイトを含む ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴの配列を除去する形で変異を入れ、そのプラスミドにＥｃｏＲＩサイトが付加するようにＰＣＲで増幅したマイコプラズマ Ｐ９７蛋白遺伝子の断片を挿入した。全体のシークエンスは図１及び図２に示した。
【００１８】
豚丹毒に形質転換する際のプラスミドのコンストラクト：
上記の配列を持つインサートを、グラム陽性菌と大腸菌とのシャトルベクターであるｐＧＡ１４を以下に示す制限酵素サイトで切断し、ｓｐａＡ.１遺伝子に挟 まれた形のｐ９７遺伝子を挿入した。これをエレクトロポーレーションにより豚丹毒菌に導入し、ｓｐａＡ.１遺伝子上下流領域が、導入した遺伝子とダブルク ロスオーバーにより置き換わった株を選択した。
構造を図3に示す。
【００１９】
（実施例２）外来遺伝子導入豚丹毒菌のスクリーニング
得られた形質転換体の菌体表面へのマイコプラズマ抗原の発現を確認する目的で、培養菌体をナイロンメンブランにドットブロットし、抗ＳｐａＡ抗体と抗 Ｐ９７抗体を感作し、陽性を示したクローンを選択した。その結果、約９０クローンの形質転換体より４個の陽性クローンＥｒＭｈ-ＫｏＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを選択した。
【００２０】
（実施例３）マウスを用いたスクリーニング
ＥｒＭｈＫｏ-Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤそれぞれの培養菌液（１０８ＣＦＵ/ｍｌ）を０．１ｍｌ宛て４週齢ｄｄｙマウスの内股部皮下に接種し、マウスの生死と関節炎の有無を観察した。豚丹毒菌強毒株のマウスのＬＤ１００は１０３であり、毒性が復帰すればマウスが死亡する。毒性が復帰せず、免疫原性を保持しているクローンの指標として、マウス関節炎の発症率を採用した。
【００２１】
これらのクローンのマウス関節炎発症率を比較したところ、その発症率はクローンにより異なっていた(表１)。親株である小金井株と同様の発症率を示す豚丹毒菌ＥｒＭｈＫｏ-Ｄを豚試験用に選択した。
【００２２】
【表１】
2010193759.tif 000002
【００２３】
（実施例４）経口投与型マイコプラズマワクチンのワクチン効果
１）豚マイコプラズマ肺炎に対する効果
約１０日齢のＳＰＦ豚１１頭をワクチン群６頭、対照群５頭の２群にわけ、ワクチン群にはＥｒＭｈＫｏ-Ｄ株を対照群には豚丹毒菌小金井株をそれぞれ1頭当たり１０１０個、 抗生物質不含の代用乳と混合し、５日間投与した。最終投与より２週後、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ培養液と感染肺乳剤の混合液を鼻腔内に３日間連 続で投与した。投与より４週後剖検し、肺病変形成率を比較した。その結果、攻撃後の飼育期間中、両群において発咳、くしゃみ等の呼吸器症状や発熱は認めな かった。しかし、剖検時に両群の肺病変を比較すると、表２に示すように、ワクチン群の肺病変形成率は対照群と比較して有意に低く、ＥｒＭｈ-Ｄ株を経口投 与された豚はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ強毒株の攻撃に対し、良好な肺病変形成抑制効果を示すことが確認された。
【００２４】
【表２】
2010193759.tif 000003
【００２５】
２）豚丹毒菌に対する効果
約１０日齢のＳＰＦ豚１１頭をワクチン群５頭、対照群２頭の２群にわけ、ワクチン群にはＥｒＭｈＫｏ-Ｄ株を対照群には豚丹毒菌小金井株をそれぞれ１頭当たり１０１０個、抗生物質不含の代用乳と混合し、５日間投与した。最終投与より２週後、強毒藤沢株５.０×１０４を 皮内投与した。攻撃後、臨床症状及び菱形疹の発現の状態を観察した。表３に示すように、対照群は攻撃翌日より元気消失し、体温の上昇を認めた。また、菱形 疹は全身に転移し、豚Ｎｏ.２６は６日目に死亡、豚Ｎｏ.２７は６日目に横臥し、回復傾向を認めなかったため、安楽死させた。一方、ワクチン群は発熱、元 気消失などの臨床症状を認めず、菱形疹も接種部位のみで転移せず、良好なワクチン効果を認めた。
【００２６】
【表３】
2010193759.tif 000004
【受託番号】
【００２７】
寄託者が付した識別のための表示              受領番号
ＥｎＭｈＫｏ−Ｄ                        ＦＥＲＭ−ＡＰ−２１７５９
【配列表フリーテキスト】
【００２８】
1235460550531_3.htm
【図１】
2010193759.tif 000005
【図２】
2010193759.tif 000006
【図３】
2010193759.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月5日(2010.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010193759000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月15日(2010.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
寄託者が付した識別のための表示              受託番号
ＥｎＭｈＫｏ−Ｄ                        ＦＥＲＭ−ＢＰ−１１１７０