(57)【要約】【課題】培養されている観察対象物の位置、分布、及び種類の把握を容易に行うことができる観察装置を提供する。【解決手段】照明光を照射する光源１１と、照射された光を平行光に変換するコンデンサレンズ１４と、開口部１３ｓを有する開口絞り１３と、試料Ｏを載置するステージ３０と、試料Ｏを透過した光を集光する対物レンズ２１と、位相変換部及び光強度変調部を有し第１絞り部材と共役な位置に設けられ、対物レンズを通過した光を制限する位相絞り２２と、位相絞り２２を通過した光をＣＣＤカメラ３５の撮像面に導いて、位相物体の像を結像させる結像レンズ２３とを備え、開口部１３ｓは、開口絞り１３の中心に対して非対称に形成され、位相変換部は開口部１３ｓを通過し対物レンズ２１により集光された像が含まれるような円環状に形成され、光強度変調部は位相変換部の外周に設けられることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を観察対象物に照射する照明部と、
所定形状の第１光通過部を有した第１絞り部材と、
前記観察対象物の像を形成する対物レンズ系と、
前記第１絞り部材と共役な位置に設けられ、前記第１光通過部と所定倍率で相似な領域を含む形状の第２光通過部を有した第２絞り部材とを備え、
前記第１絞り部材の前記第１光通過部は、前記対物レンズ系の光軸からずれた位置に形成され、前記光軸に関して非対称な形状を有し、
前記第２絞り部材の前記第２光通過部は、光の位相の変換及び前記光の光量の調節を行って通過させる第１光変調部と、前記第１光変調部の周囲に隣接して設けられ、光の光量の調節を行って通過させる第２光変調部とを備えることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記第１絞り部材は、前記光軸を中心に回転自在に構成され、
前記第２絞り部材の前記第１光変調部は、前記第１絞り部材の回転に対応して前記第１光通過部を通過した光が前記第２絞りの第１光変調部を通過するように、前記光軸を中心に円環状に形成されることを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記第２光変調部は、前記第１光変調部の外周に前記第１光変調部を囲んで設けられることを特徴とする請求項１または２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記第１絞り部材の前記第１光通過部が円弧状に形成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の観察装置。
【請求項５】
前記対物レンズ系による結像位置に設けられた撮像面を有する撮像部を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の観察装置。
【請求項６】
光を透過させる観察物支持基材の両面に前記観察対象物を付着させて前記観察物支持基材及び前記観察対象物を通過する光により前記観察対象物を観察することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項７】
前記観察物支持基材を支持する基材支持部を備えることを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
【請求項８】
前記基材支持部は、前記光軸方向に移動可能に構成されていることを特徴とする請求項７に記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物標本等の無色透明な観察対象物（細胞等）を染色することなく生きたまま観察できる位相差顕微鏡においては、上記観察対象物を開口絞りで制限された照明光で照明し、対物レンズにより観察対象物を通過した光を集光させ、位相を変換する位相変換部及び透過する光の光量を変調する光量変調部を上記開口絞りと共役位置に備えるものが周知となっている（例えば、特許文献１を参照）。観察対象物を通過する光は、直接光と０次以外の回折光に変換され位相差が生じ、この位相差を像の明暗として可視化することによりコントラストを上げて観察対象物を観察できるようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３６６３９２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記のような位相差顕微鏡においては、細胞等の観察対象物を付着させる無色透明な膜（メンブレンとも称する）を培養液に浸し、その培養液中で膜の表裏にそれぞれ異なった種類の観察対象物を付着させて培養する場合がある。このような観察対象物を観察する場合において、上述したような位相差顕微鏡により膜の表裏に付着された観察対象物を観察すると、コントラストを上げて観察することはできるものの、無色透明であるため、観察対象物が膜の表裏のどちらに付着しているか、すなわち、膜に付着している観察対象物の位置、分布、及び種類が容易に把握できないという課題があった。
【０００５】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、培養されている観察対象物の位置、分布、及び種類の把握を容易に行うことができる観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的を達成するため、本発明に係る観察装置は、光を観察対象物に照射する照明部と、所定形状の第１光通過部を有した第１絞り部材と、前記観察対象物の像を形成する対物レンズ系と、前記第１絞り部材と共役な位置に設けられ、前記第１光通過部と所定倍率で相似な領域を含む形状の第２光通過部を有した第２絞り部材とを備え、前記第１絞り部材の前記第１光通過部は、前記対物レンズ系の光軸からずれた位置に形成され、前記光軸に関して非対称な形状を有し、前記第２絞り部材の前記第２光通過部は、光の位相の変換及び前記光の光量の調節を行って通過させる第１光変調部と、前記第１光変調部の周囲に隣接して設けられ、光の光量の調節を行って通過させる第２光変調部とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る観察装置によれば、培養されている細胞の位置、分布、及び種類を、像のコントラストの違いによって、容易に把握することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明に係る観察装置の一例である位相差顕微鏡の概略構成図である。
【図２】上記観察装置における開口絞りの正面図である。
【図３】上記観察装置における位相絞りの正面図であり、（ａ）は、位相変換部の内側に光強度変調部を有する場合、（ｂ）は位相変換部の内側に光強度変換部を有しない場合を示す図である。
【図４】（ａ）は、コンデンサレンズを通過した平行光が試料を照射する様子を示した図、（ｂ）は、上記試料が画像表示装置に表示された様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下で本発明に係る位相差顕微鏡１について、図面を参照しながら説明する。この位相差顕微鏡１は、培養液中においてメンブレンと称する孔部を有する膜の表裏にそれぞれ異なった種類の位相物体（細胞等）が付着され、このメンブレンに付着された位相物体を観察する装置である。位相差顕微鏡１は、無色透明な位相物体についても染色することなく観察できる装置であり、図１に示すように、照明光学系１０、観察光学系２０、ＣＣＤカメラ３５、画像処理ユニット４０、及び画像表示装置４５を備えて構成されている。照明光学系１０と観察光学系２０の間にはステージ３０が設けられ、メンブレンに付着した細胞等の位相物体である試料Ｏをステージ３０に載置させた状態で観察できるようになっている。なお、位相差顕微鏡１では、いわゆるケーラー照明を採用しており、照明光学系１０から試料Ｏに対してその面を均一に照明する構成となっている。
【００１０】
照明光学系１０は、光源側から順に、光源１１と、コレクタレンズ１２と、開口絞り１３と、コンデンサレンズ１４とを備えて構成されている。ステージ３０及び試料Ｏには、コンデンサレンズ１４から射出された平行光が照明されるようになっている。観察光学系２０は、光源側から順に、対物レンズ２１と、位相絞り２２と、結像レンズ２３とを備えて構成されている。光源１１としては、例えば、ハロゲンランプや高圧水銀ランプを用いることができる。光源１１からは発散光が照射されあらゆる方向に光を照射しているが、図１においては、後に詳述する開口絞り１３の開口部１３ｓを通過する光のみを表現しており、それ以外の光については省略している。
【００１１】
光源１１から射出された照明光は、コレクタレンズ１２により集光され、コレクタレンズ１２により集光された光は、円形状の開口絞り１３によって制限される。開口絞り１３は、その中心がコレクタレンズ１２の光軸Ａと一致する位置、及びコンデンサレンズ１４の前側焦点位置に設けられている。開口絞り１３を通過した光は、コンデンサレンズ１４を透過し、コンデンサレンズ１４を透過した光は平行光としてステージ３０に載置された試料Ｏに照射されるようになっている。なお、ステージ３０は、試料移動装置３２により光軸Ａの方向に移動可能となっている。
【００１２】
試料Ｏを透過した照明光は、試料内部を直進する直接光（図１における実線を参照）と、位相物体である試料Ｏにより回折し直接光に対して位相がずれた０次以外の直接光に対して曲がって進行する回折光とに分かれる。この回折現象は屈折率に違いのある部位で発生するため、当該回折光は位相物体と培養液との境界部分、位相物体の内部構造等、位相物体の形状情報を含んでいる。上記直接光及び回折光は対物レンズ２１を透過するが、直接光は対物レンズ２１により集光され、回折光は対物レンズ２１により平行光となり光軸Ａに対して平行な方向に射出される。上記直接光は、後に詳述する位相絞り２２の位相変換部２２ａに集光され、その位相がずれるようになっている（後に詳述）。なお、位相変換部２２ａとしては、例えば位相が１／４波長だけ進むようにずれる位相板を用いることができる。
【００１３】
位相絞り２２は、円形に構成されその中心が光軸Ａと一致する位置、及び開口絞り１３と共役な位置に設けられている。試料Ｏによって回折された回折光は、対物レンズ２１にて上記光軸Ａに対して平行な平行光に変換された後に位相絞り２２の位相変換部２２ａ以外の部分を透過する。そして、上記直接光と回折光は、結像レンズ２３により結像されてＣＣＤカメラ３５の撮像面上で干渉する。これにより、撮像面上には試料Ｏの拡大像Ｉが形成されて、ＣＣＤカメラ３５により撮像されることになる。
【００１４】
拡大像Ｉでは、位相が進んだ直接光と位相が進んでいない回折光が干渉して弱め合う。これに対して、位相物体が無い部分では回折光が生じないため直接光の明るさの背景となる。これにより、試料Ｏの位相差を像の明暗として観察でき、試料Ｏの屈折力差や厚み等により生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変換して像の明暗として可視化することで試料Ｏの像を観察することができるようになる。
【００１５】
なお、本実施形態における位相差顕微鏡１では、ＣＣＤカメラ３５に画像処理ユニット４０が電気的に接続されており、ＣＣＤカメラ３５は、上記拡大像Ｉを光電変換して画像信号を生成し、この画像信号を画像処理ユニット４０に出力する。画像処理ユニット４０は、当該画像信号に基づいて拡大像Ｉの画像を所定ビットのデジタル画像に変換し、拡大像Ｉの反対画像（デジタル画像）を生成することが可能となっている。生成された拡大像Ｉの反対画像は、モニターである画像表示装置４５に出力表示され、これにより、試料Ｏを観察することが可能になる。
【００１６】
ところで、本実施形態における位相差顕微鏡１では、図１及び図２に示すように、開口絞り１３の形状がその中心に対して非対称となっており、図２に示すように、開口部１３ｓが、半径が開口絞り１３の半径の半分程度、弧の長さがその円周の１／４程度となっている円弧状に形成されている。従って、コレクタレンズ１２により集光された光のうち上記円弧状に形成された開口部１３ｓに照射されたもののみがコンデンサレンズ１４に透過されるため、試料Ｏには、光軸Ａに対して平行でない傾いた光（以下、斜め照明と称する）が照射されることになる。
【００１７】
また、位相絞り２２は、図３（ａ）に示すように、位相変換部２２ａと、光強度変調部２２ｂと、無変調部２２ｃとを備えて構成されている。位相変換部２２ａ及び光強度変調部２２ｂは、円環状に形成されており、光強度変調部２２ｂは、位相変換部２２ａの外周に設けられている。位相変換部２２ａは、上述した入射光の位相を変化させる機能のほか、入射光の光量を低減させる機能を有しており、光強度変調部２２ｂは、上記光量を低減させる機能のみを有している。無変調部２２ｃは、位相を変化させる機能も光量を低減させる機能も有していない。なお、上述したように、位相変換部２２ａ及び光強度変調部２２ｂは共に光量を低減させ光の透過を制限しているが、その透過率は位相変換部２２ａが光強度変調部２２ｂよりも低くなっている。例えば、位相変換部２２ａを透過する光の透過率は２０％、光強度変調部２２ｂを透過する光の透過率は５０％となっている。
【００１８】
なお、位相絞り２２における位相変換部２２ａが形成されている位置と開口絞り１３における開口部１３ｓが形成されている位置の上記光軸Ａからの距離は等しくなっており、図３（ａ）に示すように、開口部１３ｓの光軸Ａに関して対称な位置２２ｓが位相変換部２２ａに含まれるようになっている。このため、図１に示すように、開口絞り１３の開口部１３ｓを通過した光のうち試料内部を直進する直進光は位相変換部２２ａを透過し、また試料Ｏにより曲がって進む回折光は、位相変換部２２ａを透過せず、回折角度の小さい回折光は光強度変調部２２ｂを透過し、回折角度の大きい回折光は無変調部２２ｃを透過する。
【００１９】
以上のような開口絞り１３及び位相絞り２２を備えた位相差顕微鏡１において、図４に示すようなメンブレン１００に付着した透明の位相物体（細胞）である試料Ｏ１及びＯ２の観察方法について説明する。メンブレン１００としては、例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製の厚さが数ミクロン程度のものを使用することができる。なお、試料Ｏ１と試料Ｏ２は異なった種類の位相物体であり、試料Ｏ１はメンブレン１００のコンデンサレンズ１４側の面、試料Ｏ２はメンブレン１００の対物レンズ２１側の面に付着している。まず、上記メンブレン１００が培養容器（不図示）の内部の培養液（不図示）に浸されている状態で、培養容器をステージ３０に載置する。そして、試料移動装置３２によりステージ３０の位置を調節した後、光源１１により照明光を照射させる。照明光を照射すると、コレクタレンズ１２により上記照明光が集光され、開口絞り１３により上記照明光が制限される。
【００２０】
図４（ａ）に示すように、開口絞り１３の開口部１３ｓを通過した光のみがコンデンサレンズ１４により、メンブレン１００の表面に対して傾いた平行光である斜め照明となり、メンブレン１００及びメンブレン１００に付着された試料Ｏ１及びＯ２に照射される。試料Ｏ１及びＯ２に上記斜め照明が照射されると、図４（ｂ）に示すような、試料Ｏ１及びＯ２の画像が画像表示装置４５に表示される。図４の例のように、メンブレン１００に対して左側から右側への斜め照明が照射されたときは、メンブレン１００のコンデンサレンズ１４側に付着している試料Ｏ１は右側に、メンブレン１００の対物レンズ２１側に付着している試料Ｏ２は左側に、影がついた画像が表示される。なお、上述したように、位相変換部２２ａ及び光強度変調部２２ｂが環状に設けられていることにより、開口絞り１３を回転させてメンブレン１００、試料Ｏ１及びＯ２に照射される斜め照明の入射方向を変えることができるため、上記画像として表示される影の位置を変えることができるようになっている。
【００２１】
上記のように、メンブレン１００に付着した試料Ｏ１及びＯ２に対して斜め照明を照射することにより、試料Ｏ１の画像と試料Ｏ２の画像につく影の位置が互いに異なって見えるようになるため、画像のコントラストを上げることができるとともに、試料がコンデンサレンズ１４側に付着しているか、それとも対物レンズ２１側に付着しているかを容易に把握することが可能となる。また、上述したように、コンデンサレンズ１４側（光源側）に付着する位相物体とその反対側に付着する位相物体とは種類が異なるため、どのような種類の位相物体がどの程度培養されているか（数、分布等）についても容易に把握することができる。
【００２２】
以上、本実施形態における位相差顕微鏡１では、開口絞り１３の開口部１３ｓの形状を円周の１／４程度の円弧状にすることにより試料Ｏに斜め照明を照射する例について説明したが、開口部の形状はこれに限定されるものではなく、中心に対して非対称とすれば同様の効果を得ることができる。
【００２３】
また、本実施形態における位相差顕微鏡１では、位相絞り２２の形状が、図３（ａ）に示すように、位相変換部２２ａを円環状に設けその外周に光強度変調部２２ｂが設けられている例について説明したが、これに限定されるものではなく、例えば、図３（ｂ）に示すように、位相変換部２２ａの外周及び内周に光強度変調部２２ｂを設けるようにしてもよい。また、位相変換部２２ａ及び光強度変調部２２ｂそのものの形状についても、円環状でなければならないわけではなく、対物レンズを透過した光を受光できればどのような形状にしてもよい。
【００２４】
なお、上記では、本発明に係る観察装置を位相差顕微鏡１に適用させた例について説明したが、本発明の適用対象は位相差顕微鏡に限定されることなく、他の種類の観察装置にも本発明を適用することが可能である。
【符号の説明】
【００２５】
Ｏ      試料（観察対象物）
１      位相差顕微鏡（観察装置）        １１      光源（照明部）
１３      開口絞り（第１絞り部材）
１３ｓ    開口部（第１光透過部）          
２１      対物レンズ（対物レンズ系）
２２      位相絞り（第２絞り部材）        ２２ａ    位相変換部（第１光変調部）
２２ｂ    光強度変調部（第２光変調部）    ２３      結像レンズ（結像光学系）
３０      ステージ（基材支持部）          ３５      ＣＣＤカメラ（撮像部）
１００    メンブレン（観察物支持基材）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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