(57)【要約】      （修正有）【課題】標的化合物又は標的化合物の集団を含みうる試料の分析の為の方法に関する。【解決手段】該標的化合物又は標的化合物の集団のための結合性パートナーと該試料の少なくとも一部とを混合すること、該結合性パートナーは、（i）該標的化合物に特異的に結合することができるセグメント及び（ii）ポリアニオン性ポリマーセグメントを含むマクロ分子である；及び該結合性パートナーが正味の負電荷を有する分離媒体中で、該結合性パートナーを含む該試料を電気泳動により分離することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化合物又は標的化合物の集団を含みうる試料の分析の為の方法であって、
該標的化合物又は標的化合物の集団のための結合性パートナーと該試料の少なくとも一部を混合すること、該結合性パートナーは、（i）該標的化合物に特異的に結合することができるセグメント及び（ii）ポリアニオン性ポリマーセグメントを含むマクロ分子である；及び
該結合性パートナーが正味の負電荷を有する分離媒体中で、該結合性パートナーを含む該試料を電気泳動により分離すること
を含む上記方法。
【請求項２】
該標的化合物又は標的化合物の集団が、血清タンパク質の群から、特には血清イムノグロブリン、マクログロブリン及びミクログロブリンの群から、選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ポリアニオン性セグメントが、ポリアニオン性のポリ（アミノ酸）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（スルホン酸）、ポリヌクレオチド、カルボキシル化ポリサッカライド、硫酸化ポリサッカライド及びホスホリル化ポリサッカライド、並びにそれらのコポリマーの群から選ばれる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該ポリアニオン性セグメントが、アミン側基の少なくとも過半がアニオン側基へと変形されているポリリシン、アミン側基の少なくとも過半がアニオン側基へと変形されているポリアルギニン、アミン側基の少なくとも過半がアニオン側基へと変形されているポリヒスチジン、アミン側基の少なくとも過半がアニオン側基へと変形されているポリアスパラギン、アミン側基の少なくとも過半がアニオン側基へと変形されているポリグルタミン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、カルボキシアルキルセルロース、ヘパリン、硫酸化デキストラン、ヒアルロン酸、ポリスルホン酸、ポリマレイン酸及びポリアクリル酸、並びにそれらのコポリマーの群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ポリアニオン性セグメントが、アミン側基の少なくとも過半が、ポリカルボン酸又はそれらの無水物により修飾されているポリリシンの群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該ポリアニオン性ポリマーセグメントが、少なくとも２０ｋＤ、好ましくは少なくとも４０ｋＤ、より好ましくは少なくとも５０ｋＤの数平均分子量を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該標的化合物に特異的に結合することができる該セグメントが、該標的化合物に対する抗原特異性を有する抗体、又は該標的化合物に対する抗原特異性を有する、抗体の断片である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該試料の分離が、８．０〜１１．０のｐＨ、特には９．０〜１０．７のｐＨ、より特には９．５〜１０．５のｐＨを有するバッファーを用いて実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
さらに、該試料の一部が、該結合性パートナーと混合されること無く、他は同じ条件下で、電気泳動を用いて分析され、そして、該部分の分析の結果と、該結合性パートナーと混合された後に分析された部分の分析の結果とを比較する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該分析が、血清タンパク質の群から選ばれる化合物、特にはイムノグロブリン、ミクログロブリン、マクログロブリン、トランスフェリン及び、炭水化物を欠くトランスフェリンの群から選ばれる化合物、の存在を定性的に及び／又は定量的に決定することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
キャピラリー電気泳動による試料の分析における使用の為のキットであって、
ａ）（i）標的化合物に特異的に結合することができるセグメント及び（ii）ポリアニオン性ポリマーセグメントを含むマクロ分子を含む第１の容器；及び
ｂ）電気泳動による該試料の分離の為のアルカリ性バッファーを含む第２の容器；
ｃ）任意的にキャピラリー、その内壁は、該アルカリ性バッファーと接触したときに少なくとも一部が解離する酸性基を含む；及び
ｄ）任意的に、該キャピラリーを洗浄するための洗浄流体を含む第３の容器、
を含む上記キット。
【請求項１２】
該マクロ分子が、請求項３、４、５、６又は７のいずれか１項に定義されたものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
少なくとも２０ｋＤ、特には少なくとも４０ｋＤ、より特には少なくとも５０ｋＤの数平均分子量を有するポリアニオン性ポリマーセグメントを含む修飾された抗体又はその抗原結合性断片、好ましくは該セグメントが請求項３、４又は５のいずれか１項に定義されたものである修飾された抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１４】
電気泳動分析において、（i）分析されるべき試料中に存在しうる標的化合物又は標的化合物の集団に特異的に結合することができるセグメントと（ii）ポリアニオン性ポリマーセグメントとを含むマクロ分子、好ましくは請求項３、４、５、６又は７のいずれか１項に定義されたマクロ分子、を使用する方法であって、
該試料中におけるその存在が決定されるべき１以上の他の化合物と一緒に移動しうる、該マクロ分子に結合していない該標的化合物又は標的化合物の集団の実効移動度を選択的に修飾する為に上記マクロ分子を使用し、それにより該１以上の（該マクロ分子に結合した）干渉する化合物が、その存在が決定されるべき該１以上の化合物の移動ゾーンの外側に位置されたゾーンに移動する上記方法。
【請求項１５】
医学的疾患の診断の為の、特にはガンマグロブリン血症、パラプロテイン血症、肝臓の病、アルコール依存症、タンパク尿症を含む腎臓の病気から選択される医学的疾患の診断の為の、請求項１１若しくは１２に記載されたキット、又は請求項１３に定義された修飾された抗体若しくはその抗原結合性断片、ここで該診断は、体液試料の電気泳動分離の分析を含み、該分析が該キット又は修飾された抗体若しくはその抗原結合性断片を使用することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動による試料の分析の為の方法であって、該試料中に存在しうる標的化合物又は標的化合物の集団のための結合性パートナーを使用する上記方法に関する。本発明はさらに、電気泳動分析における使用の為のキット、修飾された抗体又はその断片、及び該キット又は修飾された抗体若しくはそれらの断片の特定の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動は、何十年もの間、生物学的化合物、例えばタンパク質など、を含む試料を含む、種々の試料を分析する為のよく確立された方法である。
【０００３】
長年にわたり、よく確立された方法が開発されてきた。例えば、一連の特徴的なバンドの血清タンパク質、一般にはγ、β、α−１及び２並びにアルブミンと呼ばれる、の電気泳動による分離が、当技術分野の当業者によく知られており、そして、幅広い参考資料、例えばハンドブック‘Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ'  ｂｙ  Ｄａｖｉｄ  Ｆ．Ｋｅｒｅｎ，２００３，Ａｒｎｏｌｄ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ’など、においてよく記載されている。
【０００４】
一般に知られている方法は、特定の化合物が、特定の結合性パートナー、例えばその化合物に対する抗体など、との複合体化に付される技術を使用することを含む。そのような技術は、電気泳動分離に先立ち該試料から該化合物を除去する為に（抗体が結合性パートナーとして用いられる場合、典型的にはイムノサブトラクションと言われる）又は電気泳動の間のその化合物の電気泳動実効移動度を修飾する為に（抗体が結合性パートナーとして用いられる場合、免疫置換と呼ばれる）用いられうる。
【０００５】
該結合性パートナーと複合体を形成する標的化合物は、同定されるべき化合物、例えばモノクローナルγグロブリン血症（gammopathy）についての指標でありうるモノクローナルイムノグロブリン、でありうる。該結合性パートナーが抗体である場合、この方法はイムノタイピングと言われうる。
【０００６】
代わりに、該標的化合物は、妨害因子、すなわち、例えば関心のある分析物と一緒に移動することにより又は他の方法ではその存在をマスクすることにより、その存在が決定されるべき他の化合物についての試料の分析を潜在的に妨害する因子、例えばトランスフェリンの炭水化物欠損アイソフォームと非常に近接して移動し及びそれ故に過剰アルコール消費についての診断マーカーとしてのそれらの使用を妨害しうるγ−グロブリン、でありうる。
【０００７】
キャピラリー電気泳動は、特定の形の電気泳動であり、キャピラリーが該電気泳動を実施する為に用いられる。キャピラリー電気泳動は、利点、例えば短い分析時間及び高い分解能など、を提供する。その存在が決定されるべき化合物（すなわち分析物）を含む試料のキャピラリー電気泳動分析の為の方法であって、該分析物についての結合性パートナーとして抗体を使用する上記方法が、国際公開第９５／２０１６０号パンフレットに記載されている。該方法は、
（ａ）該試料の第１部分を、キャピラリー電気泳動により構成成分分析物部分へと分離すること、及び該部分の検出すること；
（ｂ）該試料の第２部分を、予め定められた候補分析物への少なくとも１つの特異的結合性パートナーと混合すること、該特異的結合性パートナーは該候補分析物の電気泳動移動度と異なる電気泳動移動度を有し、それ故に、形成された得られた複合体に、結合しなかった分析物と異なる電気泳動移動度を授ける；
（ｃ）該第２部分を、キャピラリー電気泳動により構成成分部分へと分離すること、及び該部分を検出すること；及び
（ｄ）工程（ｃ）の該分離された構成成分部分と工程（ａ）の該分離された構成成分部分とを比較すること
を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特異的結合性パートナーとして、好ましくは、無水物、例えば無水コハク酸など、により化学的に修飾された抗体が、アルカリ性のｐＨで負の、追加的なカルボン酸官能基を該抗体に備える為に用いられる。実施例において記載された分析の条件下において（ｐＨ  １０）、該修飾された抗体の全体の負電荷はそれ故に、修飾されていない抗体と比較して、増加される。しかしながら、国際公開第９５／２０１６０号パンフレットの図１に示されたとおり、該修飾された抗体はなお、ヒトイムノグロブリン（ＩｇＧ）と接近して移動し、及び特には、該修飾された抗体とＩｇＧとの複合体が、複合体化していないＩｇＧから十分に分離されない。１以上の血清タンパク質の存在について分析されるべき現実の生物学的試料（例えば、血液血清、尿、脳脊髄流体）において、該試料中の該修飾された抗体の電気泳動の移動及び特には抗体とイムノグロブリンとの複合体の電気泳動の移動は、それらが、血清タンパク質（それについて該試料が分析されるべきである）、例えば他のイムノグロブリン、トランスフェリン、アルブミン又はビス−アルブミン、と一緒に移動しうるようなものだろう。
【０００９】
米国特許出願公開第２００５／０１６４３０２号明細書は、生物学的試料の成分を分離し及び該分析されるべき生物学的試料中に存在しうるモノクローナルタンパク質のタイピングを許す免疫置換を実施する代替的方法を提案する。該方法が、該試料のタンパク質についての移動プロファイルに相当するゾーンの外側での、特には該グロブリン移動ゾーンの外側での、置換を許すことが言及されている。これは、特定の方法において該結合性パートナー（抗体）を修飾することにより達成されると述べられている。示された該特定の修飾は、抗体のトリカルボン酸無水物による修飾及びメリト酸による修飾である。実施例から、該修飾された抗体が、免疫置換が起こることにおける効果を有することが明白であるが、該試料の該修飾された抗体又は該試料の修飾された抗体とイムノグロブリンとの複合体が、該試料中の他のタンパク質から十分に分離されないことも明白である。特に、いくつかの電気泳動図、例えば米国特許出願公開第２００５／０１６４３０２号明細書の図２ｅ、４ｂ、５ａ、９ａ及び９ｂ、は、該試料のアルブミンと該イムノグロブリンとの間を移動するアルブミン及びありうる他のタンパク質との重なりを示唆する。さらに、本発明者らにより実施された試験において、修飾されていない抗体（ＩｇＧ）及びベンゼントリカルボン酸無水物により修飾された抗体（ＩｇＧ）の、ｐＨ１０でのバッファー（３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）及びＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）を含む）中における移動時間、該修飾された抗体は、アルブミンの移動時間と似た移動時間（最大の先端の時間（peak top time））を有することが発見された。これは該修飾された抗体が、血液血清試料中のアルブミンからベースライン分離されないだろうことを示唆する。さらに、これは、血清試料中の該修飾された抗体とイムノグロブリンとの複合体が、イムノグロブリンの移動時間とアルブミンの移動時間との間の移動時間を有しうることの示唆である。すなわち、該複合体は、そのようなバッファーを用いる電気泳動分析において、他のタンパク質、例えばα−バンド血清タンパク質、と少なくとも部分的に、一緒に移動しそうだろう。すなわち、特には複雑な試料、例えば血液血清又は他の生物学的試料など、の分離において、該複合体の望ましくない一緒の移動を回避することの挑戦が残っている。
【００１０】
関心のある１以上の化合物、例えば１以上の血清タンパク質など、の存在について、試料、特には１以上の血清タンパク質を含みうる体液の試料、を分析する為の新規方法であって、特定の標的化合物に結合することができる結合性パートナー、例えば抗体又はその断片など、を使用し、それは存在が決定されるべき化合物（分析物）又は該試料の該分析を邪魔しうる化合物でありうる上記方法を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
特に、該試料の任意成分からの該結合性パートナーのベースライン分離（baseline  separation）、及び好ましくは該結合性パートナーと該標的化合物との複合体のベースライン分離、又は少なくとも存在が決定されるべき任意タンパク質のベースライン分離を許す方法を提供することが本発明の目的である。
【００１２】
本発明に従い満たされる１以上の他の目的が、明細書及び／又は請求項から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、電気泳動分析方法における特定の方法において、修飾された結合性パートナーを用いることが可能であることを発見した。
【００１４】
従って、本発明は、標的化合物又は標的化合物の集団を含みうる試料の分析の為の方法に関し、該方法は、
該標的化合物又は標的化合物の集団のための結合性パートナーと、該試料の少なくとも一部を混合すること、該結合性パートナーは、（i）該標的化合物に特異的に結合することができるセグメント及び（ii）ポリアニオン性ポリマーセグメントを含むマクロ分子である；及び
該結合性パートナーが負電荷を有する分離媒体中で、該結合性パートナーを含む該試料を電気泳動により分離すること
を含む。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、該試料の一部は、該結合性パートナーと一緒にされた後（通常は電気泳動を開始する前に混合される）に分析され、そして、該試料の他の部分は、該結合性パートナーと混合され又は他の方法で一緒にされること無く、その他は同じ条件下で、電気泳動を用いて分析される。その後、両部分の分析の結果が、関心のある該分析物が存在するかどうかを確かめる為に比較されうる。
【００１６】
該試料がキャピラリー電気泳動を用いて分離されるところの本発明に従う方法により、良い結果が達成された。
【００１７】
さらに、本発明は、キャピラリー電気泳動による試料の分析における使用のためのキットに関し、該キットは、
ａ）（i）標的化合物に特異的に結合することができるセグメント及び（ii）ポリアニオン性ポリマーセグメントを含むマクロ分子を含む第１の容器；及び
ｂ）キャピラリー電気泳動による該試料の分離の為のアルカリ性バッファーを含む第２の容器；
ｃ）任意的に、キャピラリー電気泳動を実施する為のキャピラリー又は該電気泳動が実施されうるところのチャネルを含むマイクロ流体デバイス；及び
ｄ）任意的に、該キャピラリーを洗浄するための洗浄流体を含む容器
を含む。
【００１８】
本発明はさらに、ポリアニオン性セグメントを含む修飾された抗体又はその抗原結合性断片に関し、該ポリアニオン性ポリマーセグメントは、少なくとも２０ｋＤ、特には少なくとも４０ｋＤ、より特には少なくとも５０ｋＤの数平均分子量を有する。
【００１９】
本発明はさらに、電気泳動分析におけるマクロ分子の使用方法に関し、該マクロ分子が、（i）分析されるべき試料中に存在しうる標的化合物又は標的化合物の集団に特異的に結合することができるセグメントと（ii）該試料中におけるその存在が決定されるべき１以上の他の化合物と一緒に移動しうる、該マクロ分子に結合していない該標的化合物又は標的化合物の集団の実効移動度を選択的に修飾する為のポリアニオン性セグメントとを含む上記方法に関し、それにより該１以上の干渉する化合物（該マクロ分子に結合している）が、その存在が決定されるべき該１以上の化合物の移動ゾーンの外側に位置されたゾーンに移動する。
【００２０】
語「又は（若しくは）」は、本明細書において用いられるときに、他に明示されない限り、「及び／又は（若しくは）」を意味する。
【００２１】
単数で表される語は、本明細書において用いられるときに、他に明示されない限り、少なくとも１つの当該語を意味する。
【００２２】
単数で名詞を言及するとき（例えば、化合物、添加物など）、複数形が包含されることが意味される。
【００２３】
本明細書においてｐＨを言及するとき、他に明示されない限り、ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ａｒｇｅｎｔｈａｌ参照電極を伴うＩｎＬａｂ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏオープン注入電極及び温度センサーを有するＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＳｅｖｅｎＥａｓｙメーターにより測定されたときのｐＨであって、２０℃での、４．００、７．００及び１０．００の参照ｐＨによる３点キャリブレーション曲線により校正された上記ｐＨが意味される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は特に、しかし排他的にではなく、複雑な試料、例えば血液血清、尿、脳脊髄流体又は他の体液など、の中の種々の分析物の決定を、電気泳動図からのそれらの選択的な除去により許す。
【００２５】
あるいは、関心のある分析物又は分析物群と一緒に移動しうるか又は該分析物又は分析物群の存在をマスクしうる、該試料中の標的化合物の移動を選択的に修飾することにより、干渉の減少された水準を有する分析が実施されうる。
【００２６】
本発明に従い用いられる結合性パートナーは、種々の標的化合物の移動度を（該標的化合物との複合体化又は他の結合により）修飾する為に用いられることができ、その結果、該結合性パートナーにより結合された該標的化合物及び該結合していない結合性パートナーの両方が、電気泳動分離プロセスにおいて１以上の分析物から十分に離れて移動して、該分析物又は分析物群からのベースライン分離を許すことが意図される。
【００２７】
特に、驚くべきことに、本発明に従い、血清イムノグロブリン画分の移動度と十分に異なる、好ましくはまた血清タンパク質のβ画分とも十分に異なる、より好ましくはまた血清タンパク質のα１画分及びα２画分とも十分に異なる、特にはまたアルブミン画分とも十分に異なる及びより特にはビス−アルブミン画分とも十分に異なる電気泳動移動度（少なくともアルカリ性のｐＨで、特には９超のｐＨで）を有するポリアニオン性ポリマーセグメントを含む結合性パートナーを用いて、該画分又は画分群の、該試料中に存在しうる標的化合物に結合していない該結合性パートナー及び該試料中に存在しうる標的化合物（例えばイムノグロブリンなど）と結合した該結合性パートナーの両方からの、少なくともアルカリ性ｐＨ、例えば８〜１１のｐＨなど、でのベースライン分離を許すことが可能であることが発見された。
【００２８】
さらに、本発明は、比較的低い濃度での該結合性パートナーの使用を許すことができ、一方で、電気泳動分離プロセスにおいて、本質的に全ての該標的化合物又はそれらの少なくとも実質的に一部の移動時間を変化させることにおいてなお有効であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】タンパク質バンドがどのように分離されたかを示すグラフである。
【図２】ポリ−Ｌ−グルタミン酸（３９０ｋｇ／ｍｏｌ）修飾された抗体を添加された試料が、どのように分離されたかを示すグラフである。
【図３】ポリ−Ｌ−グルタミン酸（２２５０ｋｇ／ｍｏｌ）修飾された抗体を添加された試料が、どのように分離されたかを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
原理上、任意の形の電気泳動が用いられうる。特に、ゾーン電気泳動により良い結果が得られた。
【００３１】
原理上、本発明に従う方法はプレート上又は同様物上で（慣用のフラットゲル電気泳動におけるように）実施されうるが、好ましくは、該電気泳動はチャネルにおいて実施される。特に好ましい実施態様において、該チャネルはキャピラリーであり、この場合、該電気泳動技術は一般に、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）と言われる。特定の実施態様において、電気泳動は、マイクロ流体デバイス又は同様物のチャネルにおいて実施されてよく、この技術はしばしば、「チップ上のＣＥ（CE on a chip）」と当技術分野において言われる。ＣＥについてのより多くの情報が、Ｓａｍ  Ｌｉによる総説「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」及び  Ｌａｒｒｙ  Ｋｒｉｃｋａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２，ｐ３７−４５，２００６、並びにそこで引用された参考文献中に見られうる。
【００３２】
該チャネル（キャピラリー）の内壁は、特に、酸性基を含んでよく、このうち、少なくとも一部が、アルカリ性バッファーとの接触のときに解離し、その結果、該分離の間、電気浸透流を利用することができる。キャピラリー電気泳動を用いる本発明の特に好ましい実施態様において、該電気浸透流は、該キャピラリーの入口側から、該キャピラリーの出口側に向けられ、それにより出口電極と同じ電荷の符号（負電荷）を有する試料成分（例えばタンパク質など）も検出器に向かって引っ張られ、及びすなわち検出される。適当な物質は、一般的に当技術分野において知られている。そのような酸性基を含む非常に好ましい物質は、シリカ、特には溶融シリカ、である。
【００３３】
該結合性パートナーは、１以上の標的化合物と結合することができるセグメント（結合性セグメント）及びポリアニオン性ポリマーセグメントを含む。典型的には、該結合性パートナーは、合成のマクロ分子である。とはいえ、該マクロ分子は、生物学的起源又は合成の起源である１以上の結合性セグメント及び／又は１以上のポリアニオン性ポリマーセグメントを含みうる。原理上、該結合性セグメントは、特定の標的化合物（例えば特異的モノクローナルイムノグロブリン）又は特定の標的化合物の集団（例えばＩｇＧ集団）に特異的に結合することができる任意の天然又は合成のセグメントでありうる。
【００３４】
特に、該結合性セグメントは、抗体又は該抗体の抗原結合性断片でありうる。該抗体又はその断片は、市販入手可能であってよく又は免疫付与技術により調製されてよく、この技術は、当技術分野において一般に知られている。抗体又はその断片は、特に、該標的化合物が抗原性化合物であるときに用いられうるが、それ自体が抗原性でない化合物に対する抗体を、例えば抗原性であるマクロ分子により該化合物（一般的にはハプテンと言われる）を固定することにより、作ることも可能である。そのような技術もまた一般に知られている。該結合性セグメントは、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はそれらの断片でありうる。意図される適用に依存して、ポリクローナル抗体が好まれる。なぜなら、それは、密接に関連した複数の標的化合物の移動の修飾を許しうるからである。
【００３５】
他方、モノクローナル抗体は、高い選択性を有する特定の標的化合物を標的とすることにとって有利でありうる。結合性セグメントとして用いられる抗体は原理上、任意の種類の抗体でありうる。例えば、それは、哺乳類のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってよく、又は他の哺乳類の抗体であってよく、例えば普通でない哺乳類抗体、例えばラクダ科動物のシングルドメイン又はＶＨＨ抗体など、又は鳥類抗体、例えばＩｇＹなど、でありうる。
【００３６】
上記に示されるとおり、抗体の抗原結合性断片を用いることも可能である。そのような断片は、それ自体当技術分野において知られる方法において、抗体の酵素分解により産生されうる。
【００３７】
これらの抗体又はそれらの断片のうち、ＩｇＧ又はその抗原結合性断片が特に、結合性セグメントとして有用である。ＩｇＧ又はそれらに由来する抗原結合性断片は、本発明における使用にとって適当な結合性パートナーを得るために、特によく修飾されうると考えられる。
【００３８】
結合性セグメントを提供する為に用いられうる他の分子は、タンパク質結合性分子の群から、例えばプロテインＡ、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチン、レセプター（例えば細胞膜で又は細胞質中に見られるようなもの）、並びに関心のある結合性標的との特異的親和性を有する他の分子の群から、選ばれうる。
【００３９】
ポリアニオン性ポリマーは、（該ポリマーが少なくとも概念上形成される）モノマー単位の少なくとも実質的な部分が、（十分に高いｐＨの）水性液体中でイオン化可能である少なくとも１つの基を含み、その結果、該ポリマーは負に荷電する。該ポリマーは合成又は天然のものでありうる。
【００４０】
一般に、該ポリアニオン性ポリマーセグメントは、該結合性パートナーが用いられることが意図されるｐＨ付近の又はそれより低いｐＫａ、好ましくは少なくとも２ｐＨ単位低いｐＫａ、を有する複数の酸性基を含み、その結果該電気泳動分離において用いられた場合、該基の少なくとも大多数が解離される（本明細書において、語「アニオン基」は、ポリアニオン性ポリマーの酸性基のイオン化していない形及びイオン化した形の両方について用いられうる；ポリアニオン性ポリマーの酸性基を言及する場合に、この語が、解離していない酸、共役塩基及びそれらの塩を包含する為に意味されるように）。該ポリアニオン性セグメントが、７以下のｐＫａを有する複数の酸性基を含むことが、特に好ましい。原理上、モノマー単位の一部は、イオン化可能基を含む必要はないが、モノマー集団の５０〜１００％、特には７５〜１００％、より特には９０〜１００％が、イオン化可能であってアルカリ性ｐＨでアニオン基を形成する以上の基を含むことが好ましい。
【００４１】
ポリアニオン性ポリマーセグメントのイオン化した基の例は、カルボキシレート官能基、サルフェート官能基、スルホネート官能基、ホスフェート官能基及びホスホネート官能基を含む。
【００４２】
好ましい実施態様において、該ポリアニオン性セグメントは、ポリアニオン性のポリ（アミノ酸）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（スルホン酸）、ポリヌクレオチド、カルボキシル化ポリサッカライド、硫酸化ポリサッカライド及びホスホリル化ポリサッカライド、それらのコポリマーを含む、の群から選ばれる。
【００４３】
良い結果が、ポリ（アミノ酸）により実現された。該ポリ（アミノ酸）は通常は、複数の酸性側基を有する。これらの側基は、カルボン酸側基を有する天然アミノ酸、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸など、の側基、又は他の酸性基、例えばヒドロキシル基（チロシン中にあるものなど、約１０のｐＫａを有する）であってよい。本発明の特定の実施態様において、ポリアニオン性ポリマーセグメントは、ポリ（アミノ酸）セグメントであり、このうち複数のアミン側基（例えば複数のリシンアミノ酸残基）が、誘導体化されて酸性基を形成する。これを達成する為に、そのような官能基が、ポリ酸又はその無水物、例えばジカルボン酸、トリカルボン酸又は、３超のカルボン酸官能基を有するカルボン酸、と反応されうる。特に、該アミン側基は、コハク酸、メリト酸、ベンゼントリカルボン酸、スルホン酸、リン酸、又はこれらのいずれかの無水物により誘導体化されうる。そのようなポリ（アミノ酸）は、市販で購入されることができ、又は、例えば上記言及された先行技術文献中の、それ自体既知の方法で誘導体化されうる。
【００４４】
特に好ましいポリ（アミノ酸）セグメントは、複数のリシン残基を含むポリ（アミノ酸）セグメントであって、該複数のリシン残基のうち、アミン側基の少なくとも過半が、好ましくはカルボキシル化により、例えばスクシニル化により、アニオン側基へと変形されている上記セグメントであり、特には該アミン側基の９０〜１００％、又は優先的には９８〜１００％が、アニオン側基へと変形されているポリリシンである。そのようなセグメントを含む結合性パートナーは、試料が、血清タンパク質の存在について分析される方法における使用にとって特に有利であると分かった。
【００４５】
さらに好ましい実施態様において、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸を含むポリアニオン性セグメントが提供される。
【００４６】
さらなる実施態様において、該アニオン性セグメントは、ポリアルギニン、ポリアスパラギン、ポリグルタミン又はポリヒスチジンのセグメントであって、アミン側基の少なくとも過半（好ましくは９０〜１００％）が、好ましくはコハク酸又は他のポリカルボン酸又はそれらの無水物との反応により、アニオン側基へと変形されている上記セグメントを含む。
【００４７】
アニオン性ポリサッカライドセグメントは特に、カルボキシアルキルセルロース、例えばカルボキシメチルセルロースなど；ヘパリン；硫酸化デキストラン；ヒアルロン酸及び同様物の群から選ばれうる。
【００４８】
適当なポリスルホン酸はポリ（４−スチレンスルホン酸）である。
【００４９】
適当なポリカルボン酸は、ポリマレイン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びポリフマル酸、それらのコポリマーを含む、の群から選ばれうる。適当なコポリマーは、例えば、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）コポリマーである。
【００５０】
ポリマーの平均サイズ（分子量）は、特にはそれの意図される使用に依存して、広い範囲内で選ばれうる。標的化合物と該結合性パートナーとの複合体の実効移動度は、ポリアニオン性セグメント分子質量が（該セグメントの、同様の質量対荷電の割合で）増加するにつれて増加しうる（すなわち、より負になる）。すなわち、該ポリアニオン性ポリマーセグメントの平均分子量を選択することにより、該標的化合物−結合性パートナー複合体の所望の移動度が、微調整されうることが意図される。
【００５１】
本明細書において用いられるときに、（平均）分子量は、マトリックス支援光散乱スペクトロメトリー（ＭＡＬＬＳ）又は粘度（もし市販で入手されたポリマーが、該結合性パートナーを調製するために用いられるならば、供給者により特定される）に基づく（平均）分子量であり、又は分析超遠心（ＡＵＣ）により決定されたときの（平均）分子量である。
【００５２】
該ポリアニオン性ポリマーセグメントの（ＡＵＣにより決定可能である）数平均分子量は、少なくとも１ｋｇ／ｍｏｌ、少なくとも１０ｋｇ／ｍｏｌ又は少なくとも２０ｋｇ／ｍｏｌでありうる。好ましくは、該数平均分子量は、少なくとも４０ｋｇ／ｍｏｌ、より好ましくは少なくとも５０ｋｇ／ｍｏｌ又は少なくとも７５ｋｇ／ｍｏｌである。
【００５３】
上限は、該結合性パートナーの溶解度／分散性により主として定められる。さらに、該ポリマーセグメントが大きくなればなるほど、その粘度はより高くなる傾向にある。すなわち、通常、選ばれる該ポリマーセグメントは、該結合性パートナーを含む該試料の粘度が取り扱うのになお容易であるように、平均分子量を有する。当業者は、適当な上限粘度及び分子量をどのように決定するかを知っているであろう。一般に、数平均分子量は、１００００ｋｇ／ｍｏｌ以下だけであり、好ましくは５０００ｋｇ／ｍｏｌ以下であり、特には１０００ｋｇ／ｍｏｌ以下であり、より特には７５０ｋｇ／ｍｏｌ以下であろう。
【００５４】
該試料は好ましくは、生物学的試料、特には体液を含む試料、より特には血液血漿、血液血清、リンパ流体、尿又は脳脊髄流体から選ばれる体液を含む試料である。
【００５５】
該分析物は原理上、電気泳動により分離されうる任意の分析物（動電学的クロマトグラフィーにより分離可能な任意の分析物を含む）でありうる。特に、該分析物は、生体分子から、より特にはタンパク質及び他のペプチドから選ばれうる。該分析物は、該標的化合物であってよく、又は該結合性パートナーの不在下において該標的化合物と一緒に移動しそうである化合物であってよい。特に、該分析物は、疾患、例えばガンマグロブリン血症（gammapthies）、パラプロテイン血症、肝臓の病及びアルコール依存症から選択される疾患など、についてのマーカーであってよい。
【００５６】
分析物の好ましい例は、血清タンパク質、特にはイムノグロブリン；トランスフェリン；アルブミン；ビス−アルブミン；ミクログロブリン、例えばβ−２ミクログロブリンなど；及びマクログロブリン、これはイムノグロブリン、例えばＩｇＭなど、又は他のマクログロブリン、例えばα−２マクログロブリンなど、でありうる、の群から選ばれる血清タンパク質である。
【００５７】
分離条件は、例えば特定の分析物の分析についての上記記載の先行技術文献における、それ自体既知の方法に基づきうる。また、電気泳動のためのバッファー溶液は、種々の分析物について、市販入手可能である。
【００５８】
一般に、該ポリアニオン性ポリマーセグメントの（平均）ｐＫａとほぼ同じ又はそれより高いｐＨを有するバッファー溶液を用いることが有利であり、その結果、該酸性官能基の少なくとも過半がイオン化されて、アニオン基を形成する。特に、該試料の分離は、アルカリ性のｐＨ、特には、ｐＨ８．０〜１１．０の範囲のｐＨ、より特にはｐＨ９．０〜１０．７の範囲のｐＨ、さらにより特には９．５〜１０．５のｐＨを有する溶液を用いて実施されうる。好ましくは、該溶液はｐＨバッファーを含む。そのようなバッファーは一般に、少なくとも１つの酸と少なくとも１つの塩基（該酸の共役塩基でありうる）との組み合わせであり、該溶液のｐＨ付近のｐＫａを有する（一般に、該ｐＫａは、ｐＨ±１ｐＨ単位の範囲のｐＫａ、好ましくはｐＨ±０．５ｐＨ単位のｐＫａである）。
【００５９】
バッファー溶液を提供する為に用いられうる酸／塩基の例は、生物学的バッファーとして知られる、ボレート、ホスフェート及びカーボネートのバッファー、バッファーを提供する為のアミノ酸及び両性イオン化合物に基づくバッファーである。生物学的バッファーの為の酸／塩基の例は、ビス−ＴＲＩＳ（２−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＤＡ（Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ（２−［２−アセトアミノ[−２−アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ビス−ＴＲＩＳ  ＰＲＯＰＡＮＥ（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパン］）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（２−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチルアミノ］エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ'−（２−エタンスルホン）酸）、ＤＩＰＳＯ（３−Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−Ｎ−モルホリノブタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３［Ｎ−トリス−ヒドロキシメチル−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（２−アミノ−２−［ヒドロキシメチル］−１，３−プロパンジオール）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ'−［２−ヒドロキシプロパンスルホン］酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス［２−ヒドロキシプロパンスルホン］酸）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ'−［３−プロパンスルホン］酸）、ＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルグリシン）、ＧＬＹ−ＧＬＹ（ジグリシン）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ'−［４−ブタンスルホン］酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−４−アミノブタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシー１−プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プパノール）、
ＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸）及びＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）を含む。
【００６０】
例えば、血清タンパク質の分析の為に、特に、ｐＨ９．０〜１０．７の範囲のｐＨを有するバッファー溶液が用いられうる。バッファー及び説明書を含む適当なキット、例えばＣＥ−Ｓｕｒｅ  ＳＰＥキット（Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇａｔｅｓｈｅａｄ、英国）から、１９９０年代半ばから入手可能である）、が市販入手可能である。さらに、米国特許出願第２００２／０１６２７４４号明細書（これは少なくとも１つの血清タンパク質、特にはアルブミン、と相互作用し、そして、その電気泳動移動度を修飾する添加物を記載する）において、ｐＨ１０のアルカリ性バッファー溶液が記載されている。同様に、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７４２（２０００），７９−８９において記載されるように、血清トランスフェリンシアロフォームの分離が、例えば、８〜９の範囲のｐＨで、ボレート及びジアミノブタンを含むバッファー溶液中で、実施されうる。
【００６１】
本発明は、以下の実施例により今説明されるであろう。
実施例
【実施例１】
【００６２】
実施例１  ポリ（アミノ酸）により修飾された抗体を用いる免疫置換ＣＥ
【００６３】
結合性パートナーの調製
【００６４】
流体Ａ：抗体（ヒツジ抗ヒトＩｇＧκ、８ｍｇ／ｍｌ）が、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、９００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、中へ一晩透析された。５００μｌのこの抗体溶液が反応ごとに用いられた。
流体Ｂ：１０ｍｇのポリ（アミノ酸）が、２５０μｌの１００ｍＭのリン酸ナトリウム、９００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中に溶解された。
流体Ｃ：１０ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド  ナトリウム塩）が、４０μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中に溶解された。
流体Ｄ：１０ｍｇのＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロライド）が、４０μｌの１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、中に溶解された。
【００６５】
流体Ａ、Ｂ，Ｃ及びＤが一緒にされ、そして、ボルテックスにより反応混合物を形成する為に混合された。該混合物中の該試薬は、室温（約２０℃）で一晩反応することが許され、同時に、回転器上で回転混合され、それにより、ポリ（アミノ酸）が共有結合された抗体、すなわち該修飾された抗体又は結合性パートナーを形成した。
【００６６】
その後、該反応混合物が、１００ｋｇ／ｍｏｌの排除分子量（molecular  weight  cut-off）の透析チュービングを用いて、５０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．１、に対して透析された。
【００６７】
その後、該修飾された抗体は、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｇｅｌ吸収剤（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、カリフォルニア州、米国）中に該修飾されれた抗体を含む透析チュービングを置くことにより濃厚にされた。
【００６８】
該濃厚にする工程の後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．１、の溶液が、最大で５００μｌの体積で、該抗体溶液に添加された。
【００６９】
免疫置換ＣＥのための試料調製
【００７０】
２μｌのヒト血液血清が、９８μｌのＣＥバッファー溶液に添加された。該バッファーは、水の中の２００ｍＭのＣＡＰＳ、６６ｍＭのＴＡＰＳ、ｐＨ９．７、であり、そして混合された。その後、２０μｌの修飾された抗体溶液が添加された。混合後、該試料は、ＣＥによる分離のために用意された。
【００７１】
免疫置換電気泳動
【００７２】
ＣＥ系の構造は以下のとおりであった：
装置：ＰｒｉｎＣＥ  ＣＥＣ  ７６０，ＤＡｘ  ３Ｄ  ８．１  ソフトウェア
キャピラリー：溶融シリカ（内部コーティングなし）
検出器へのキャピラリー長：２３ｃｍ
総キャピラリー長：３０ｃｍ
キャピラリー内部直径：５０μｍ
【００７３】
試料は、圧力注入（２５ｍｂａｒ、６秒）を用いて注入され、そして、分離の為に、１３ｋＶが適用された。温度は２５℃であった。
【００７４】
さらに、血清試料が調製され、そして、該修飾された抗体が添加されたことを除き、同じ方法で分離された。
【００７５】
実施例１Ａ：ポリリシンスクシニル化修飾された抗体
【００７６】
ヒツジ抗ヒトＩｇＧが、上記に記載されたとおり、ポリ−Ｌ−リシンスクシネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログナンバーＰ３５１３、Ｍｗ＞５００００ｇ／ｍｏｌ、ポリ−Ｌ−リシン粘度に基づくＭｗ、ＭＡＬＬＳによっても測定された）により修飾された。
【００７７】
該血清試料が、ヒト血清標準対照試料、すなわち健康なヒトからの試料であった。
【００７８】
図１は、どのようにタンパク質バンドが分離されたかを示す。上のグラフは、ヒトイムノグロブリンへの結合性パートナー（修飾された抗体）が添加された試料のものであり、下のグラフは、結合性パートナー無しの試料のものである。図１において示されるとおり、該結合性パートナーは、血清中のイムノグロブリンに結合することにおいて有効であり、且つ、該結合性パートナーそれ自身又は結合性パートナーとヒトイムノグロブリンとの複合体のいずれもが該血清タンパク質バンドの内で又は近くで移動しなかった。該分離は、４分後（最後のバンド（アルブミン）が検出器を過ぎて十分に移動した後約４５秒で）に停止され、そのときに、該複合体又は複合体化していない結合性パートナーのいずれもが、該検出器をまだ過ぎて移動していなかった。これは、本発明に従う結合性パートナーが、血清タンパク質の分析における使用にとって特に適当であることを説明する。
【００７９】
実施例１Ｂ  ポリ−Ｌ−グルタミン酸修飾された抗体
【００８０】
ヒツジ抗ヒトＩｇＧが、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈカタログナンバーＰ４８８６、分子量５００００〜１０００００ｇ／ｍｏｌ、６４０００ｇ／ｍｏｌ平均、粘度に基づく決定及びＭＡＬＬＳによる決定）により、上記に記載されたとおりに修飾された。
【００８１】
その後、ポリ−Ｌ−グルタミン酸修飾された抗体が添加された（上記のとおり）、異常γ−バンド水準を有するヒト血液血清試料（いわゆる異常対照試料）及び、修飾された抗体がそこに添加されていない試料が、ＣＥにより（上記のとおり）分離された。該修飾された抗体が、該γ−バンド中の該異常ヒトイムノグロブリンをほぼ完全に除去するのに有効であることが分かった。最後の血清タンパク質バンド（アルブミン）は、３分１５秒以内で完全に移動した。４分後、該分離が停止され、そのときに、修飾された抗体又はそれらとヒトイムノグロブリンとの複合体は、まだ検出されなかった。
【００８２】
実施例１Ｃ  ポリ−γグルタミン酸修飾された抗体
【００８３】
ヒツジ抗ヒトＩｇＧが、ポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＧＡ）（Ｎａｔｔｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、モントリオール、カナダ）（３９０ｋｇ／ｍｏｌ又は２２５０ｋｇ／ｍｏｌの分子量を有する）により、修飾反応当たり５ｍｇのポリ（アミノ酸）を用いて、上記に記載されたとおりに、修飾された。
【００８４】
該修飾された抗体のそれぞれが、上記に記載されたとおり、血清対照試料に添加された。結果が図２（３９０ｋｇ／ｍｏｌ）及び図３（２２５０ｋｇ／ｍｏｌ）に示される。点線は、該修飾された抗体により処理された試料を表し、実線は修飾された抗体が添加されていない試料を表す。それぞれの試験において、該修飾された抗体は、該γバンドからヒトイムノグロブリンを除去するのに有効であること及び該免疫置換されたヒトイムノグロブリン並びに該修飾された抗体は、該最後の血清タンパク質バンド（アルブミン）の後に移動することが分かる。
【実施例２】
【００８５】
実施例２  カルボキシル化ポリサッカライドにより修飾された抗体を用いた免疫置換ＣＥ
【００８６】
結合性パートナーの調製
【００８７】
ポリアニオン性ポリマー（この場合２つの異なるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））の量が以下の通りに変動した条件で、実施例１に記載されたのと同じプロトコールが用いられた。
【００８８】
ＣＭＣナトリウム塩（平均Ｍｗ９００００ｇ／ｍｏｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号４１９２７３）の、２、５又は１０ｍｇが、ヒツジ抗ヒトＩｇＧを修飾する為に用いられた。
【００８９】
ＣＭＣナトリウム塩（平均Ｍｗ２５００００ｇ／ｍｏｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号４１９３０３）の、２、４又は６ｍｇが用いられた。
【００９０】
免疫置換ＣＥの為の試料調製
【００９１】
ヒト異常対照血清試料が、上記に記載されたとおり、結合性パートナーの有り又は無しで、調製された。
【００９２】
免疫置換電気泳動
【００９３】
ＣＥ分離が、上記に記載されたとおりに実施された。ＣＭＣのいずれのタイプにより修飾された結合性パートナーも、該血清試料中のイムノグロブリンに結合することにおいて及び該結合性パートナーに結合した該イムノグロブリンが最後の血清タンパク質バンド（アルブミン）の後に移動することを引き起こすことにおいて有効であることが分かった。９００００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＣＭＣを含む（ヒトイムノグロブリンと複合体化した）該結合性パートナーが、２５００００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するＣＭＣを含む該結合性パートナー（ヒトイムノグロブリンと複合体化した）よりも、最後の血清タンパク質バンドにより近く移動すること、とはいえ、結合性パートナーの両方のタイプについて、該結合性パートナー（複合体）とアルブミンとの間のベースライン分離が実行可能であることが分かった。
【００９４】
さらに、結合性パートナー（複合体）とアルブミンとの間の分解能が、４、５、６又は１０ｍｇのＣＭＣにより得られた結合性パートナーについてのときのほうが、２ｍｇだけのＣＭＣを添加することにより得られた結合性パートナーについてのときよりも、より高かった。
【実施例３】
【００９５】
実施例３  スルホン酸カルボン酸コポリマーにより修飾された抗体を用いた免疫置換ＣＥ
【００９６】
結合性パートナーの調製
【００９７】
２つのポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）コポリマー（ＰＳＳＡ−ＭＡ）が、抗ヒト抗体を修飾する為に用いられた。該ＰＳＳＡ−ＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた）は、両方とも約２００００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有した。１のＰＳＳＡ−ＭＡは、１：１のスチレンスルホン酸対マレイン酸のモル比を有し（Ａｌｄｒｉｃｈカタログナンバー４３４５５８）、他方は、３：１のスチレンスルホン酸対マレイン酸のモル比を有した（Ａｌｄｒｉｃｈカタログナンバー４３４５６６）。
【００９８】
該量が、１０ｍｇの代わりに、１５ｍｇ又は２０ｍｇであることを条件として、実施例１において記載されたのと同じプロトコールが用いられた。
【００９９】
免疫置換ＣＥの試料調製
【０１００】
ヒト異常対照血清試料が、上記に記載されたとおり、結合性パートナーの有り又は無しで、調製された。
【０１０１】
免疫置換電気泳動
【０１０２】
ＣＥ分離が、上記に記載されたとおりに実施された。
【０１０３】
いずれのタイプのＰＳＳＡ−ＭＡにより修飾された結合性パートナーも、該血清試料中のイムノグロブリンに結合することにおいて、及び該結合性パートナーに結合したイムノグロブリンが、最後の血清タンパク質バンド（アルブミン）の後に移動することを引き起こすことにおいて、有効であることが分かった。
【図１】
2010107509.tif 000002
【図２】
2010107509.tif 000003
【図３】
2010107509.tif 000004
【外国語明細書】
2010107509000001.pdf
2010107509000002.pdf
2010107509000003.pdf
2010107509000004.pdf