(57)【要約】      （修正有）【課題】フラボノイド3',5'-ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）活性を有するポリペプチド及び該ペプチドをコードする遺伝子の提供および花の色等を操作する方法の提供。【解決手段】フラボノイド3',5'-ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列、ならびにこの遺伝子配列および／またはその対応するポリペプチドを、特に花もしくはその部分または他の植物組織における色を操作するために用いる。バラまたはガーベラまたは植物学的に近縁の植物において発現される。本遺伝子配列またはその転写物の全体または部分に対応するアンチセンス分子およびセンス分子またはＲＮＡｉ誘導分子。バラ、ガーベラまたは植物学的に近縁の植物などの植物において効率的に働くプロモーター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）もしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織における核酸分子の発現が、クロマトグラフィー法による測定で、検出可能なレベルのデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を生じさせる核酸分子。
【請求項２】
F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定でデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が検出可能なレベルであることによる判定で、F3'5'Hへと翻訳されるのに十分なレベルおよび長さの転写物を生じさせる核酸分子。
【請求項３】
バラ花弁における核酸分子の発現が、外観的に検出可能な色の変化をもたらす、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
スミレ属、サルビア属、ソリア属、ラバンデュラ属およびケネディア属を含むリストより選択される植物由来の、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
スミレ属の植物に由来する、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
スミレ属ブラックパンジー品種（Viola spp. cultivar Black Pansy）に由来する、請求項5記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:10、SEQ ID
NO:12、SEQ ID NO:10に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:12に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項5または6のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11より選択されるヌクレオチド配列、SEQ ID NO:9に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、SEQ ID NO:11に対して少なくとも約40％の同一性ヌクレオチド配列、SEQ ID NO:9またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:11またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項7記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
SEQ ID NO:9に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
SEQ ID NO:11に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項8記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
サルビア属に由来する、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:14、SEQ ID
NO:16、SEQ ID NO:14に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:16に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項11記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:13に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、SEQ ID NO:15に対して少なくとも約40％の同一性ヌクレオチド配列、SEQ ID NO:13またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:15またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
SEQ ID NO:13に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項13記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
SEQ ID NO:15に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項13記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
ソリア属に由来する、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:18、およびSEQ
ID NO:18に対して少なくとも少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項16記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:17に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:17またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項17記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
SEQ ID NO:17に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項18記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
ケネディア属に由来する、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:27、およびSEQ
ID NO:27に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項20記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26に対して少なくとも少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:26またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項21記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
SEQ ID NO:26に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項22記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
ラバンデュラ属に由来する、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:32、およびSEQ
ID NO:32に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項24記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:31に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:31またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項25記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
SEQ ID NO:31に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項26記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列の、各コドンの第3のヌクレオチド位置におけるヌクレオチド
（i）A、または
（ii）T、または
（iii）AおよびT
の全体的なパーセンテージが54％またはそれ以下である、請求項1〜4のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
（i）バラ花弁組織において動作するプロモーターであって、以下のものと機能的に結合しているプロモーター、
（ii）F3'5'Hをコードする核酸分子、またはF3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードする配列に対して相補的な核酸分子であって、
バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定で、検出可能なレベルのデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を生じさせ、かつスミレ属、サルビア属、ソリア属、ラバンデュラ属およびケネディア属からなる群より選択される植物に由来する核酸分子、
を含むヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３０】
（i）バラ花弁組織において動作するプロモーターであって、以下のものと機能的に結合しているプロモーター、
（ii）F3'5'Hをコードする核酸分子、またはF3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードする配列に対して相補的な核酸分子であって、
バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定でデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が検出可能なレベルであることによる判定で、F3'5'Hへと翻訳されるのに十分なレベルおよび長さの転写物を生じさせる核酸分子、
を含むヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項３１】
バラ花弁における構築物の発現が外観的に検出可能な色の変化をもたらす、請求項29または30記載の構築物。
【請求項３２】
プロモーターがバラCHS、キクCHSおよびCaMV 35Sからなる群より選択される、請求項29〜31のいずれか一項記載の構築物。
【請求項３３】
プロモーターがSEQ ID NO:5またはその機能的等価物を含む、請求項29〜31のいずれか一項記載の構築物。
【請求項３４】
プロモーターがSEQ ID NO:30またはその機能的等価物を含む、請求項29〜31のいずれか一項記載の構築物。
【請求項３５】
核酸分子がスミレ属に由来する、請求項29〜34のいずれか一項記載の構築物。
【請求項３６】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:10、SEQ ID
NO:12、SEQ ID NO:10に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:12に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項35記載の単離された核酸分子。
【請求項３７】
SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:9に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、SEQ ID NO:11に対して少なくとも約40％の同一性ヌクレオチド配列、SEQ ID NO:9またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:11またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項36記載の単離された核酸分子。
【請求項３８】
遺伝子がSEQ ID NO:9に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項37記載の単離された核酸分子。
【請求項３９】
遺伝子がSEQ ID NO:11に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項37記載の単離された核酸分子。
【請求項４０】
サルビア種に由来する、請求項29〜34のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項４１】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:14、SEQ ID
NO:16、SEQ ID NO:14に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:16に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項40記載の単離された核酸分子。
【請求項４２】
SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:13に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、SEQ ID NO:15に対して少なくとも約40％の同一性ヌクレオチド配列、SEQ ID NO:13またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:15またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を含む、請求項41記載の単離された核酸分子。
【請求項４３】
遺伝子がSEQ ID NO:13に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項42記載の単離された核酸分子。
【請求項４４】
遺伝子がSEQ ID NO:15に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項42記載の単離された核酸分子。
【請求項４５】
遺伝子がソリア属に由来する、請求項29〜34のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項４６】
遺伝子が、SEQ ID NO:18、およびSEQ ID
NO:18に対して少なくとも少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項45記載の単離された核酸分子。
【請求項４７】
遺伝子が、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:17に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:17またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項46記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
遺伝子がSEQ ID NO:17に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項47記載の単離された核酸分子。
【請求項４９】
遺伝子がケネディア種に由来する、請求項29〜34のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項５０】
遺伝子が、SEQ ID NO:27、およびSEQ ID
NO:27に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項49記載の単離された核酸分子。
【請求項５１】
遺伝子が、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:26に対して少なくとも少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:26またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項50記載の単離された核酸分子。
【請求項５２】
遺伝子がSEQ ID NO:26に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項51記載の単離された核酸分子。
【請求項５３】
遺伝子がラバンデュラ属に由来する、請求項29〜34のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項５４】
遺伝子が、SEQ ID NO:32、およびSEQ ID
NO:32に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項53記載の単離された核酸分子。
【請求項５５】
遺伝子が、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:31に対して少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:31またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項54記載の単離された核酸分子。
【請求項５６】
遺伝子がNO:31に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項55記載の単離された核酸分子。
【請求項５７】
F3'5'Hを合成しうるトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、請求項1〜28のいずれか一項に定義された核酸配列による適した植物の細胞の安定的な形質転換を、核酸配列の結果的な発現を可能にする条件下で行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、ならびに核酸配列の発現を許容するのに十分な時間および条件の下でトランスジェニック植物を生育させること、を含む方法。
【請求項５８】
固有または既存のF3'5'H活性が低下したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、請求項1〜28のいずれか一項に定義された核酸分子によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および、必要に応じて、核酸の発現を可能にするのに十分な条件下でトランスジェニック植物を生育させること、を含む方法。
【請求項５９】
固有または既存のF3'5'H活性が低下した遺伝子組換え植物（genetically
modified plant）を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適切な変更がなされた請求項1〜28のいずれか一項に定義されたF3'5'H遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変によってF3'5'H遺伝子を改変すること、および細胞から遺伝子組換え植物を再生させること、を含む方法。
【請求項６０】
花序特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、請求項1〜28のいずれか一項に定義された核酸配列によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および核酸配列の発現を可能にするのに十分な時間および条件の下でトランスジェニック植物を生育させること、を含む方法。
【請求項６１】
花序特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適切な変更がなされた請求項1〜28のいずれか一項に定義されたF3'5'H遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変によってF3'5'H遺伝子を改変すること、および細胞から遺伝子組換え植物を再生させること、を含む方法。
【請求項６２】
請求項1〜28のいずれか一項に定義されたF3'5'Hもしくはその部分をコードする組換え遺伝子を発現しうる、またはF3'5'HをコードするmRNA分子の全体もしくは一部に対して実質的に相補的な核酸配列を有する、トランスジェニック植物を作製するための方法であって、F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子による適した植物の細胞の安定的な形質転換を、必要に応じて、単離された核酸分子の結果的な発現を可能にする条件下で行うこと、および細胞からトランスジェニック植物を再生させること、を含む方法。
【請求項６３】
請求項1〜28のいずれか一項記載の単離された核酸分子を含む、遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項６４】
請求項1〜28のいずれか一項記載の単離された核酸分子を含む、または請求項1〜28のいずれか一項記載の核酸分子の発現レベルが低下している、遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。 
【請求項６５】
請求項1〜28のいずれか一項記載の単離された核酸分子を含む、または請求項1〜28のいずれか一項記載の核酸分子の発現レベルが上昇している、遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項６６】
植物の部分が、萼片、苞葉、葉柄、花柄、子房、葯、花、実、堅果、根、茎、葉、種子より選択される、請求項63〜65のいずれか一項記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項６７】
植物が園芸用種、農業用種または観賞用種である、請求項63〜66のいずれか一項記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項６８】
植物においてF3'5'Hを発現させること、または固有のF3'5'H酵素をダウンレギュレートすることが可能な遺伝子構築物の製造における、請求項1〜28のいずれか一項に定義された単離された核酸分子の使用。
【請求項６９】
請求項1〜28のいずれか一項に定義された単離された核酸分子またはその複合体を含む、遺伝子サイレンシング構築物。
【請求項７０】
植物が、バラ、カーネーション、トルコギキョウ、ペチュニア、ユリ、パンジー、ガーベラ、キク、ゼラニウム、ツルウリクサ、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ブドウ、リンゴ、ユーホルビアまたはフクシアより選択される、請求項63〜66記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項７１】
請求項63〜67および70のいずれか一項記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞の抽出物。
【請求項７２】
香味料または食品添加物または健康製品または飲料または果汁または着色剤である、請求項71記載の抽出物。
【請求項７３】
遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞が花序の変化を呈する、請求項57〜62のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
請求項1〜28のいずれか一項に定義された核酸分子によってコードされる、単離された組換えF3'5'HまたはF3'5'H活性を有するペプチド。
【請求項７５】
組換えF3'5'HまたはF3'5'H活性を有するペプチドが、2つまたはそれ以上の異種アミノ酸配列を含む融合分子である、請求項74記載の単離された組換えF3'5'HまたはF3'5'H活性を有するペプチド。
【請求項７６】
2つまたはそれ以上の異種ヌクレオチド配列の融合物を含む、請求項1〜28のいずれか一項記載の単離された組換えF3'5'HまたはF3'5'H活性を有するペプチドの核酸分子。
【請求項７７】
請求項1〜28のいずれか一項記載のF3'5'H分子をコードする遺伝子配列をプラスミドの形態で染色体外に保有する原核生物。
【請求項７８】
請求項1〜28のいずれか一項記載のF3'5'H分子をコードする遺伝子配列をプラスミドの形態で染色体外に保有する真核生物。
【請求項７９】
遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞の製造における、請求項1〜28のいずれか一項記載の核酸分子の使用。
【請求項８０】
花または花序の変化を呈する、請求項79記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項８１】
植物においてF3'5'Hを発現させること、または固有のF3'5'H酵素をダウンレギュレートすることが可能な遺伝子構築物の製造における、請求項1〜28のいずれか一項に定義された核酸配列の使用。
【請求項８２】
F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、チョウマメに由来する核酸分子。
【請求項８３】
ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:21、およびSEQ
ID NO:21に対して少なくとも約40％の類似性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含むF3'5'Hをコードする、請求項81記載の単離された核酸分子。
【請求項８４】
SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:20に対して少なくとも少なくとも約40％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびSEQ ID NO:20またはその相補物と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項83記載の単離された核酸分子。
【請求項８５】
SEQ ID NO:20に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項84記載の単離された核酸分子。
【請求項８６】
ヌクレオチド配列の、ヌクレオチド
（i）A、または
（ii）T、または
（iii）AおよびT
の全体的なパーセンテージが55％またはそれ以下である、請求項1〜4のいずれか一項記載の単離された核酸分子。
【請求項８７】
SEQ ID NO:5またはその機能的等価物を含む、単離された核酸分子。
【請求項８８】
SEQ ID NO:30またはその機能的等価物を含む、単離された核酸分子。
【請求項８９】
F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むように改変された、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定で、検出可能なレベルのデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を生じさせ、かつペチュニア属、リンドウ属およびクリトリア属を含むリストより選択される植物に由来する核酸分子。
【請求項９０】
F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含むように改変された、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定でデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が検出可能なレベルであることによる判定で、F3'5'Hへと翻訳されるのに十分なレベルおよび長さの転写物を生じさせ、かつペチュニア、リンドウおよびチョウマメを含むリストより選択される植物に由来する核酸分子。
【請求項９１】
植物においてF3'5'Hを発現させること、または固有のF3'5'H酵素をダウンレギュレートすることが可能な遺伝子構築物の製造における、請求項89または90に定義された単離された核酸分子の使用。
【請求項９２】
遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞の製造における、請求項89または90に定義された単離された核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、フラボノイド3',5'-ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列、ならびにこの遺伝子配列および／またはその対応するポリペプチドを、特に花もしくはその部分または他の植物組織における色を操作するために用いることに関する。より詳細には、F3'5'Hは、ジヒドロケンフェロール（DHK）の代謝、ならびにジヒドロクエルセチン（DHQ）、ナリンゲニンおよびエリオジクチオールといった他の基質の代謝をモジュレートする能力を有する。さらにより詳細には、本発明は、バラまたはガーベラまたは植物学的に近縁の植物において発現された場合にF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を提供する。本発明はさらに、本遺伝子配列またはその転写物の全体または部分に対応するアンチセンス分子およびセンス分子またはRNAi誘導分子にも関する。本発明はさらに、バラ、ガーベラまたは植物学的に近縁の植物などの植物において効率的に働くプロモーターにも関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書におけるあらゆる先行技術に対する言及は、その先行技術がいずれかの国において一般的な知識の一部をなすことを承認したものでも何らかの形で示唆したものでもなく、そのようにみなされるべきでもない。
【０００３】
本明細書中に提示した参考文献の文献学的詳細は、明細書の最後に一覧として示されている。
【０００４】
花または観賞植物の産業界は、花および／または植物の新たな異なる品種を開発することに力を注いでいる。このような新たな品種を作り出すのに効率的なやり方の一つは、花の色の操作によるものである。今日入手可能な花および／または植物の商用品種のほぼすべてに関して、古典的な育種法を用いて幅広い色を生み出すことにある程度成功している。しかし、このアプローチは特定の種の遺伝子プールに限定されるという制約があり、この理由から、単一の種があらゆる色にわたる品種を備えていることは稀である。例えば、植物または花、歯および茎などの植物の部分に関して新たな色を持つ品種を開発することは、切花および観賞植物のいずれの市場にも大きな好機をもたらすと考えられる。花または観賞植物の産業界では、バラ、キク、チューリップ、ユリ、カーネーション、ガーベラ、ラン、トルコキキョウ、ベゴニア、トレニア、ゼラニウム、ペチュニア、ニーレンベルギアテンジクアオイ、アイリス、ホウセンカおよびシクラメンなどの重要な種の新たな色を持つ品種の開発に大きな関心を抱いている。さらに具体的な例は、青い色のバラまたはガーベラを切花市場に向けて開発することであろう。
【０００５】
さらに、野菜、果実および種子などの植物の部分に関して新たな色を持つ品種の開発は農業に大きな好機をもたらすと考えられる。例えば、新たな色の種子は植物に関する権利を示す標識として有用と考えられる。さらに、ベリー類または果実類（ブドウおよびリンゴを含む）およびそれらの果汁（ワインを含む）に共通するフラボノイドの改良は、このような果実および副産物の産業界に対して、価値のある様式上の特徴の変化をもたらす可能性がある。
【０００６】
花の色は主としてフラボノイド、カロテノイドおよびベタレインという3種類の色素に起因する。フラボノイドはこの3つの中でも最も多くみられ、黄から赤、さらには青までに及ぶ広い範囲の色の原因である。花の色の主な原因となるフラボノイド分子には、シアニジンのグリコシル化誘導体であるアントシアニン、およびそのメチル化誘導体であるペオニジン、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基盤とする分子、ならびにそのメチル化誘導体であるペツニジンおよびマルビジンおよびペラルゴニジンがある。アントシアニンは花弁の表皮細胞の液胞内または葉の表皮下細胞の液胞内に局在する。
【０００７】
フラボノイド色素はフェニルプロパノイド経路の二次代謝産物である。フラボノイド色素に関する生合成経路（フラボノイド経路）は明確にされており（HoltonおよびCornish、Plant
Cell 7: 1071-1083, 1995：非特許文献１；Mol et al, Trends Plant
Sci 3: 2122-7, 1998：非特許文献２；Winkel-Shirley, Plant
Physiol 126: 485-493, 2001a：非特許文献３；およびWinkel-Shirley,
Plant Physiol. 127, 1399-1404, 2001b：非特許文献４）、これは図1AおよびBに示されている。フラボノイド経路における最初の重要な基質の1つであるp-クマロイル-CoAへのフェニルアラニンの変換にはそれぞれ3つの反応および酵素が関与する。これらの酵素は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）、桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ（C4H）および4-クマラート：CoAリガーゼ（4CL）である。この経路で行われる最初の段階では、マロニル-CoA 3分子（これはアセチルCoAおよびCO2に対するアセチルCoAカルボキシラーゼ（ACC）の作用によって生じる）とp-クマロイル-CoA 1分子との縮合が起こる。この反応はカルコンシンターゼ（CHS）という酵素によって触媒される。この反応の生成物である2',4,4',6'テトラヒドロキシカルコンは通常、カルコンフラバノンイソメラーゼ（CHI）という酵素によって急速に異性化されてナリンゲニンとなる。ナリンゲニンはその後、中央の環の3位がフラバノン 3-ヒドロキシラーゼ（F3H）によってヒドロキシル化されてジヒドロケンフェロール（DHK）となる。
【０００８】
ジヒドロケンフェロール（DHK）のB環のヒドロキシル化のパターンは花弁の色の決定に重要な役割を果たす。DHKのB環は3'位、または3'位と5'位の両方でのヒドロキシル化が可能であり、これによってそれぞれジヒドロクエルセチン（DHQ）およびジヒドロミリセチン（DHM）が生じる。経路のこの部分に関与する重要な酵素はフラボノイド3'-ヒドロキシラーゼおよびフラボノイド3',5'-ヒドロキシラーゼの2つであり、これらはいずれもシトクロムP450クラスの酵素である。シトクロムP450酵素は自然界に広く存在し、その遺伝子は脊椎動物、昆虫、酵母、真菌、細菌および植物から単離され、シークエンシングが行われている。
【０００９】
フラボノイド3'-ヒドロキシラーゼ（F3'H）は、シアニジンを基にした色素をもたらすフラボノイド経路における重要な酵素であり、これらの色素は多くの植物種（例えばバラ属、ナデシコ属、ペチュニア属、ベゴニア、シクラメン、ホウセンカ、アサガオおよびキク）において赤および薄幸色の花色の原因となる。
【００１０】
フラボノイド3',5'-ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）は、デルフィニジンを基にした色素（delphinidine-based pigment）をもたらすフラボノイド経路における重要な酵素であり、これらの色素は多くの植物種（例えば、ペチュニア属、スミレ属、トルコギキョウ属、リンドウ属、ソリア属、サルビア属、クリトリア属、ケネディア属、ホタルブクロ属、ラバンデュラ属、クマツヅラ属、ツルウリクサ属、ヒエンソウ属、ナス属、シネラリア属、ブドウ属、ホザキアヤメ、マツ属、トウヒ属、フジマツ属、インゲンマメ属、スノキ属、シクラメン属、アヤメ属、テンジクアオイ属、リパリエ属（Liparieae）、ゼラニウム属、エンドウ属、レンリソウ属、ニチニチソウ属、ゼニアオイ属、ムクナ属、ソラマメ属、セントポーリア属、サルスベリ属、ボウチナ（bouchina）属、ルリマツリ属、ヒポカリプタス（Hypocalyptus）属、ツツジ（Rhododendron）属、アマ属、ナンバンアカアズキ属、フヨウ属、アジサイ属、シンビジウム属、ナツフジ属、イワオウギ属、ハギ属、アスパラガス属、アンティゴノン属、エンドウ属、フリージア属、ウツボグサ属、サンジソウ属）において紫および青の花色の原因となる。バラ、ガーベラ、キクおよびカーネーションなどの多くの植物種は、F3'5'H活性を有していないため、デルフィニジンを基にした色素を産生しない。
【００１１】
ジヒドロフラボノール（DHK、DHQ、DHM）から有色のアントシアニンが生成されるこの経路における次の段階にはジヒドロフラボノール-4-レダクターゼ（DFR）がかかわり、それによりロイコアントシアニジンの生成がもたらされる。ロイコアントシアニジンはその後、アントシアニジン、ペラルゴニジン、シアニジンおよびデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子に変換される。これらのフラボノイド分子は通常の生理的条件下では不安定であり、グリコシルトランスフェラーゼの作用による3位のグリコシル化によってアントシアニジン分子が安定化され、このためにアントシアニンの蓄積が可能となる。一般に、グリコシルトランスフェラーゼはUDP糖から糖部分を転移させるものであり、グリコシル化の位置に対しては高度な特異性を示すが、アクセプター基質に対する特異性は比較的低い（SeitzおよびHinderer、「アントシアニン（Anthocyanins）」、「植物の細胞培養および体細胞遺伝学（Cell
Culture and Somatic Cell Genetics of Plants）」中、Constabel,
F.およびVasil, I. K.(ed)、Academic Press, New York,
USA, 5: 49-76,
1988：非特許文献５）。アントシアニンは、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースおよびキシロースなどの糖との3-モノシド、3-ビオシドおよび3-トリオシドとして、さらには3,5-ジグリコシドおよび3,7-ジグリコシドとして存在しうる（StrackおよびWray、「フラボノイド―1986年以来の研究の進展（The Flavonoids - Advances in
Research since 1986）」中、Harborne, J.B.(ed)、Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993：非特許文献６）。
【００１２】
アントシアニジン分子の安定化にかかわるグリコシルトランスフェラーゼには、UDPグルコース：フラボノイド3-グルコシルトランスフェラーゼ（3GT）が含まれ、これはグルコース部分をUDPグルコースからアントシアニジン分子の3-O位に転移させてアントシアニジン3-O-グルコシドを生成させる。
【００１３】
ペチュニアおよびパンジー（特に）では、アントシアニジン3-O-グルコシドは一般に、別のグリコシルトランスフェラーゼであるUDPラムノース：アントシアニジン3-グルコシドラムノシルトランスフェラーゼ（3RT）によるグリコシル化を受け、これによってアントシアニン分子の3-O結合グルコースにラムノース基が付加されてアントシアニジン3-ルチノシドが生成されるが、これはアシル化を受けるとUDPグルコース：アントシアニジン5グルコシルトランスフェラーゼ（5GT）によってさらに修飾を受けることができる。しかし、バラ（特に）では、アントシアニジン3-O-グリコシドは一般に別のグリコシルトランスフェラーゼであるUDB：グルコースアントシアニン5グルコシルトランスフェラーゼ（5GT）によるグリコシル化を受けて、アントシアニジン3,5ジグルコシドとなる。
【００１４】
多くのアントシアニジン配糖体はポリアシル化誘導体の形態として存在する。アントシアニジン配糖体を修飾するアシル基はその構造に基づいて主に2つのクラスに分類することができる。このうち脂肪族アシル基にはマロン酸またはコハク酸が含まれ、芳香族クラスにはp-クマリン酸、コーヒー酸およびフェルラ酸を含むヒドロキシ桂皮酸類ならびにp-ヒドロキシ安息香酸などの安息香酸類などが含まれる。
【００１５】
アントシアニジングリコシドのB環の3'位および5'位でのメチル化も起こりうる。シアニジンを基とした色素のメチル化はペオニジンの生成をもたらす。デルフィニジンを基にした色素の3'位置のメチル化はペツニジンの生成をもたらすが、3'位および5'位のメチル化はマルビジンの生成をもたらす。マルビジンのメチル化は5-O位および7-O位でも起こる可能性があり、これによってカペンシニン（5-O-メチルマルビジン）および5,7-ジ-O-メチルマルビジンが生成される。
【００１６】
以上の修飾に加えて、液胞のpHならびにフラボノールおよびフラボンなどの他のフラボノイドとのコピグメンテーション（copigmentation）も花弁の色に影響を及ぼす。フラボノールおよびフラボンも芳香族アシル化を受けることが可能である（BrouillardおよびDangles、「フラボノイド―1986年以来の研究の進展（The Flavonoids - Advances in
Research since 1986）」中、Harborne, J.B.(ed)、Chapman and Hall、London, UK, 1-22, 1993：非特許文献７）。
【００１７】
顕花植物において、F3'5'H活性またはフラボノイド経路に関与する他の酵素を制御することができれば、花弁、実、葉、萼片、種子といった植物の部分の色を操作する手段が得られると考えられる。それによって単一の栽培品種の種々の色のバージョンを作出することが可能と考えられ、場合によっては単一の種により幅広い範囲の色を生じさせることが可能と考えられる。
【００１８】
ペチュニアF3'5Hをコードする2つのヌクレオチド配列（本明細書ではSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3と称する）がクローニングされている（国際特許出願番号PCT/AU92/00334：特許文献１およびHolton et al, Nature,
366: 276-279, 1993a：非特許文献８を参照）。これらの配列は、ペチュニア（国際特許出願番号PCT/AU92/00334：特許文献１（これは参照として本明細書に組み入れられる）およびHolton et al, 1993a前記：非特許文献８を参照）、タバコ（国際特許出願番号PCT/AU92/00334：特許文献１を参照、これは参照として本明細書に組み入れられる）およびカーネーション（国際特許出願番号PCT/AU96/00296：特許文献２を参照、これは参照として本明細書に組み入れられる）において、フラボノイドの3',5'ヒドロキシル化をモジュレートする効率が高かった。しかし、驚いたことに、バラでは、これらの配列を標準的な発現カセットに含めても完全な（intact）または完全長の転写物の産生はRNAまたはノーザンブロット分析によって検出可能なものとはならず、その結果、3',5'-ヒドロキシル化フラボノイドは産生されなかった。したがって、バラおよび他の重要な商用植物種において効率的に蓄積し、アントシアニンなどのフラボノイドの3',5'ヒドロキシル化をモジュレートすることができるF3'5'Hをコードする、さらなる遺伝子配列を同定することには需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際特許出願番号PCT/AU92/00334
【特許文献２】国際特許出願番号PCT/AU96/00296
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】HoltonおよびCornish、Plant Cell 7: 1071-1083, 1995
【非特許文献２】Mol et al, Trends Plant Sci 3: 2122-7, 1998
【非特許文献３】Winkel-Shirley, Plant Physiol 126: 485-493,2001a
【非特許文献４】Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127, 1399-1404,2001b
【非特許文献５】SeitzおよびHinderer、「アントシアニン（Anthocyanins）」、「植物の細胞培養および体細胞遺伝学（CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants）」中、Constabel,F.およびVasil, I. K.(ed)、AcademicPress, New York, USA, 5: 49-76, 1988
【非特許文献６】StrackおよびWray、「フラボノイド―1986年以来の研究の進展（The Flavonoids - Advances inResearch since 1986）」中、Harborne, J.B.(ed)、Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993
【非特許文献７】BrouillardおよびDangles、「フラボノイド―1986年以来の研究の進展（The Flavonoids - Advances inResearch since 1986）」中、Harborne, J.B.(ed)、Chapman and Hall、London, UK, 1-22, 1993
【非特許文献８】Holton et al, Nature, 366: 276-279, 1993a
【発明の概要】
【００２１】
本明細書の全体を通じて、文脈が別のものを要求しない限り、「含む（comprise）」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」などの変形物は、言及した要素または整数または要素もしくは整数の群を含むものの、他の要素または整数または要素もしくは整数の群を除外しないことを意味するものと解釈されるものとする。
【００２２】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列識別番号（SEQ ID NO:）によって参照する。SEQ ID NO: は、数値上は配列識別子<400>1（SEQ ID NO:1）、<400>2（SEQ ID NO:2）などに対応する。
【００２３】
F3'5'Hをコードする遺伝子配列は多数の植物種から同定され、クローニングされている。F3'5'H遺伝子配列をバラ花弁組織中で発現させると、薄層クロマトグラフィー（TLC）または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などのクロマトグラフィー法による評価で、検出可能なレベルのデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が生じる。代替的または追加的に、バラ花弁組織における遺伝子配列の発現は、F3'5'Hへと翻訳されるのに十分なレベルおよび長さの転写物を生じさせる。これは、TLCまたはHPLCなどのクロマトグラフィー法を用いて検出可能な、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子として首尾良く測定される。本発明の遺伝子配列は、例えば、デノボ発現、過剰発現、抑制、アンチセンス阻害、リボザイム活性、RNAi誘導またはメチル化誘導により、この酵素をコードする遺伝子の発現のモジュレーションを可能にする。植物における、より具体的にはバラまたはガーベラにおけるF3'5'H合成を制御することができれば、個々のアントシアニンの組成のモジュレーション、ならびにフラボノールおよびアントシアニンの相対的レベルの変更が可能となり、それによって花弁、葉、種子、萼片、実などの植物の組織および／または器官の色の操作が可能になる。
【００２４】
したがって、本発明の1つの面は、フラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）もしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定で、検出可能なレベルのデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を生じさせる核酸分子を提供する。
【００２５】
本発明のもう1つの面は、F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定でデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が検出可能なレベルであることによる判定で、前記F3'5'Hへと翻訳されるのに十分なレベルおよび長さの転写物を生じさせる核酸分子を対象とする。
【００２６】
本発明の単離された核酸分子は、したがって、バラ花弁におけるデルフィニジン産生による測定で、バラにおけるDHKのDHMへの変換を、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3に示されたヌクレオチド配列によってコードされるF3'5'Hよりも効率的に行えるF3'5'Hをコードする。
【００２７】
本明細書で用いる場合、効率とは、バラ細胞（またはガーベラなどの商業的に重要な植物の任意の細胞）において、F3'5'H酵素がその基質であるDHKまたはDHQをDHMに変換する能力に関する。この変換により、植物に対して、植物中に存在するフラボノイド経路の他の酵素の基質（DHM）が与えられ、その基質がさらに修飾される。この修飾には例えば、ある範囲の色の生成に寄与する種々のアントシアニンを生成するグリコシル化、アシル化、ラムノシル化および／またはメチル化が含まれうる。これにより、バラにおける3',5'-ヒドロキシル化アントシアニンの修飾が可能となる。効率は、以下より選択される1つまたは複数のパラメーターによって評価することが好都合である：完全なF3'5'H mRNAの量（ノーザンブロット分析により検出される）によって決定されるF3'5'H転写の程度；産生された翻訳産物の量によって決定されるF3'5'H mRNAの翻訳の程度；デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした色素を含むDHQまたはDHMのアントシアニン誘導体の生成（TLCまたはHPLCによって検出される）によって決定されるF3'5'H酵素活性の程度；花色に対する影響の程度。
【００２８】
驚いたことに、カーネーションおよびペチュニアにおいて機能するプロモーターおよびF3'5'H遺伝子配列のある種の組み合わせはバラでは機能しないことも明らかにされている。驚いたことに、バラの花において3',5'-ヒドロキシル化フラボノイドを生じさせたのはプロモーターおよびF3'5'H遺伝子配列の組み合わせの特定のサブセットのみであった。これらにはスミレ属、サルビア属、ラバンデュラ属およびソリア属から単離されたF3'5'H配列が含まれていた。さらに、スミレF3'5'H（またはパンジーF3'5'H））配列はバラにおいて3',5'-ヒドロキシル化フラボノイドの最も高度な蓄積を引き起こすことが明らかになった。新規プロモーターおよびF3'5'H遺伝子配列の組み合わせを、特に植物または花、実、堅果、根、茎、葉もしくは種子などの（しかし、これらには限定されない）植物の部分の色または香りまたは他の特性をモジュレートするために用いることもできる。したがって、本発明は、色特性が改変された植物品種を開発するための新たなアプローチに相当する。その他の用途には、例えば、F3'5'H形質転換植物の新規抽出物であって、香味料または食品添加物または健康製品または飲料または果汁または着色剤としての用途がある抽出物の生産が含まれる。飲料には、ワイン、蒸留酒、茶、コーヒー、ミルクおよび酪農製品が非制限的に含まれる。
【００２９】
したがって、1つの好ましい態様において、本発明は、パンジーF3'5'H、サルビアF3'5'H、ラベンダーF3'5'H、ケネディアF3'5'HもしくはソリアF3'5'Hもしくはこの酵素の機能的誘導体をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００３０】
以下のものをコードするヌクレオチド配列：パンジーF3'5'H（SEQ ID NO:9および11）、サルビアF3'5'H（SEQ ID NO:13および15）、ソリアF3'5'H（SEQ ID
NO:17）、ラベンダーF3'5'H（SEQ ID NO:31）およびケネディアF3'5'H（SEQ ID NO:26）は、括弧内に示された配列識別子によって定義される。配列識別子の概要は表1に示されている。
【００３１】
したがって、本発明のもう1つの面は、実質的にはSEQ ID
NO:9（パンジー）もしくはSEQ ID NO:11（パンジー）もしくはSEQ ID NO:13（サルビア）もしくはSEQ ID NO:15（サルビア）もしくはSEQ ID NO:17（ソリア）もしくはSEQ ID NO:31（ラベンダー）もしくはSEQ ID NO：26（ケネディア）に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11もしくはSEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:26に示された配列と少なくとも約50％の類似性を有するかもしくは低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、核酸分子を提供する。
【００３２】
好ましいF3'5'H酵素のアミノ酸配列は、SEQ ID
NO:10（パンジー）またはSEQ ID NO:12（パンジー）またはSEQ ID NO:14（サルビア）またはSEQ ID NO:16（サルビア）またはSEQ ID NO:18（ソリア）またはSEQ ID NO:32（ラベンダー）またはSEQ ID NO:27（ケネディア）に示されている。
【００３３】
本発明のさらにもう1つの面は、F3'5'Hを合成しうるトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、前記F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列による適した植物の細胞の安定的な形質転換を前記核酸配列の結果的な発現を可能にする条件下で行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、ならびに核酸配列の発現を可能にするのに十分な時間および条件の下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含む方法を提供する。この核酸配列の発現は一般に、F3'5'Hをコードするのに十分なレベルおよび長さの転写をもたらす。これは、TLCまたはHPLCなどのクロマトグラフィー法による測定でデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が検出可能なレベルであることによって首尾良く判定される。トランスジェニック植物はこれにより、固有のものでない（non-indigenous）F3'5'Hを、相当する非トランスジェニック植物で発現される量に比して高いレベルで産生すると思われる。これは一般に、植物もしくは植物の部分における、または好ましくは前記植物の花序もしくは花における、外観的に検出可能な色の変化をもたらす。
【００３４】
本発明のもう1つの面は、F3'5'H活性が低下したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、F3'5'H活性をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および必要に応じて、核酸の発現を可能にするのに十分な条件下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含む方法を考えている。
【００３５】
本発明のさらにもう1つの面は、F3'5'H活性が低下した遺伝子組換え植物（genetically modified plant）を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適切な変更がなされたF3'5'H遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変によってF3'5'H遺伝子を改変すること、および細胞から遺伝子組換え植物を再生させること、を含む方法を考えている。
【００３６】
本発明のさらにもう1つの面は、花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、本発明の核酸配列によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および核酸配列の発現を可能にするのに十分な時間および条件の下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含む方法を考えている。
【００３７】
本発明のさらにもう1つの面は、花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、本発明の核酸配列によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および核酸配列の発現を可能にするのに十分な時間および条件の下で前記トランスジェニック植物を生育させることを含む方法を考えている。
【００３８】
本発明のさらにもう1つの面は、花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適切な変更がなされたF3'5'H遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変によってF3'5'H遺伝子を改変すること、および細胞から遺伝子組換え植物を再生させることを含む方法を考えている。
【００３９】
本発明のさらにまたもう1つの面は、F3'5'Hもしくはその部分をコードする組換え遺伝子を発現しうる、またはF3'5'HをコードするmRNA分子の全体もしくは一部に対して実質的に相補的な核酸配列を有する、トランスジェニック植物を作製するための方法であって、F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子による適した植物の細胞の安定的な形質転換を、必要に応じて、前記単離された核酸配列の結果的な発現を可能にする条件下で行うこと、および細胞からトランスジェニック植物を再生させること、を含む方法にも適用される。
【００４０】
本発明のさらにもう1つの面は、本発明の核酸配列の全体もしくは部分、またはそのアンチセンス形態、および／またはその任意の相同体もしくは関連した形態を含む、すべてのトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の部分またはトランスジェニック植物の子孫、特に花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック植物にも適用される。
【００４１】
本発明のさらにまたもう1つの面は、本発明の核酸配列の全体もしくは部分、またはそのアンチセンス形態、および／またはその任意の相同体もしくは関連した形態を含む、すべてのトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の部分またはトランスジェニック植物の子孫、特に、実、液果、萼片、苞葉、葉柄、花柄、子房、葯または茎の特性といった、植物の地上部の特性の変化を呈するトランスジェニック植物にも適用される。
【００４２】
本発明のもう1つの面は、本発明の核酸配列の全体または部分を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の部分またはトランスジェニック植物の子孫からの抽出物、特に、香味料または食品添加物または健康製品または飲料または果汁または着色剤として用いられる場合のトランスジェニック植物からの抽出物を考えている。
【００４３】
本発明のさらにもう1つの面は、組換え型のF3'5'Hを対象としている。
【００４４】
本発明のもう1つの面は、植物においてF3'5'Hを発現させること、または固有のF3'5'H酵素をダウンレギュレートすることが可能な遺伝子構築物の製造における、本明細書に記載の遺伝子配列の使用を考えている。
【００４５】
本発明のさらにもう1つの面は、F3'5'Hをコードする遺伝子配列をプラスミドの形態で染色体外に保有する原核生物または真核生物を対象とする。
【００４６】
本発明のさらにもう1つの面は、実質的にはSEQ ID
NO:10もしくはSEQ ID NO:12もしくはSEQ ID
NO:14もしくはSEQ ID NO:16もしくはSEQ ID
NO:18もしくはSEQ ID NO:32もしくはSEQ ID
NO:27に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12もしくはSEQ ID NO:14もしくはSEQ ID:16もしくはSEQ ID NO:18もしくはSEQ ID NO:32もしくはSEQ ID NO:27に対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、または前記ポリペプチドの誘導体にも適用される。
【００４７】
本発明はさらに、バラおよびガーベラなどの植物または植物学的に近縁の植物において効率的に働くプロモーターも提供する。このようなプロモーターには、バラCHSプロモーター、キクCHSプロモーターおよびCaMV 35Sプロモーターが含まれる。
【００４８】
本明細書の全体を通じて用いる配列識別子の概要を表1に示している。
【００４９】
（表１）配列識別子の概要
2010193895.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】フラボノイド色素の生合成経路の概略図である。図1Aは、アントシアニンを産生するほとんどの植物におけるアントシアニジン3-グルコシドの一般的な生成を示している。この経路に関与する酵素は以下のように示されている：PAL＝フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；C4H＝ケイ皮酸4-ヒドロキシラーゼ；4CL＝4-クマリン酸：CoAリガーゼ；CHS＝カルコンシンターゼ；CHI＝カルコンフラバノンイソメラーゼ；F3H＝フラバノン3-ヒドロキシラーゼ；DFR＝ジヒドロフラボノール-4レダクターゼ；ANS＝アントシアニジンシンターゼ、3GT＝UDP-グルコース：フラボノイド3-Oグルコシルトランスフェラーゼ。他の略号には以下のものが含まれる：DHK＝ジヒドロケンフェロール、DHQ＝ジヒドロクエルセチン、DHM＝ジヒドロミリセチン。
【図１Ｂ】フラボノイド色素の生合成経路の概略図である。図1Bは、ペチュニアで起こるアントシアニンのさらなる修飾を表している。この経路に関与する酵素は以下のように示されている：3RT＝UDPラムノース：アントシアニジン3-グルコシドラムノシルトランスフェラーゼ、AR-AT＝アントシアニジン-ルチノシドアシルトランスフェラーゼ、5GT＝アントシアニン5-グルコシルトランスフェラーゼ；3' OMT＝アントシアニン3' O-メチルトランスフェラーゼ、3'5' OMT＝アントシアニン3',5' O-メチルトランスフェラーゼ。
【図２】ペチュニアOGB品種（P. hybrida cv.OGB）由来のペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンを含むプラスミドpCGP602、pCGP601およびpCGP176の概略図である。ペチュニアF3'5'H cDNAクローンを含む構築物の調製にはペチュニアF3'5'H petHf1断片を用いた。1.6kb BspHI／FspI断片の32P標識断片を花弁cDNAライブラリーのプロービングに用いた。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３】ペチュニア（P. hybrida cv. OGB）由来のペチュニアF3'5'H petHf2 cDNAクローンを含むプラスミドpCGP175の概略図である。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４】pCGP601由来のペチュニアF3'5'HpetHf1 cDNAクローンのサブクローンを含むプラスミドpCGP1303の概略図である。pCGP1303の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図５】バイナリープラスミドpCGP1452の概略図である。pCC1P485由来のAmCHS 5'：petHf1：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1452の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図６】35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子およびマルチクローニングサイトを含むバイナリープラスミドpWTT2132（DNAP）の概略図である。pWTT2132の構築は実施例4に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図７】プラスミドpCGP725の概略図である。pCUP485由来のAmCHS 5'：petHf1：petD83'遺伝子をpBluescript II(KS(+)ベクター中にクローニングした。pCGP725の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図８】バイナリープラスミドpCGP1453の概略図である。pCGP628由来のMac：petHf1：mas 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1453の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図９】バイナリープラスミドpCGP1457の概略図である。pCGP1107由来のpetD8 5'：petHf1：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1457の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１０】バイナリープラスミドpCGP1461の概略図である。pCGP497由来のshonpetFLS 5'：petHf1：petFLS 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1461の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１１】バイナリープラスミドpCGP1616の概略図である。pCGP846由来のpetRT 5'：petHf1：nos 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1616の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１２】バイナリープラスミドpCGP1523の概略図である。pCGP1619由来のmas／35S：petHf1：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1623の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１３】バイナリープラスミドpCGP1638の概略図である。pCGP1636由来のCaMV 35S：petHf1：nos 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCCIP1636の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１４】バイナリープラスミドpCGP1860の概略図である。pCGP200由来のRoseCHS 5'：petHf1：nos 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1560の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１５】バイナリープラスミドpCGP2123の概略図である。pCGP2109由来のCaMV35S：petHf2：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2123の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１６】バイナリープラスミドpCGP1988の概略図である。バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）のマルチクローニングサイトをpNEB193（New England Biolabs）由来のマルチクローニングサイトに置き換えた。pCGP1988の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１７】プラスミドpCGP2105の概略図である。プロモーター断片とターミネーター断片との間に多数の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する35S 5'：ocs 3'発現カセットがpBluescriptSK(+)ベクター骨格中にある。pCC3P2105の構築に関しては実施例4で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１８】バイナリープラスミドpCGP1307の概略図である。pCGP1106由来のpetD8 5'：GUS：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGN1548中にキメラnptII選択マーカー遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1307の構築に関しては実施例6で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図１９】バイナリープラスミドpCGP1506の概略図である。pCG1P496由来の長いpetFLS 5'：GUS：petFLS 3'遺伝子をバイナリーベクターpBIN19中にキメラnptII選択マーカー遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1506の構築に関しては実施例6で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２０】バイナリープラスミドpCGP1626の概略図である。pCGP1622由来のChrysCHS 5'：GUS：nos 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1626の構築に関しては実施例6で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２１】バイナリープラスミドpCGP1641の概略図である。pCGP1628由来のpetRT 5'：GUS：petRT 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1641の構築に関しては実施例6で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２２】バイナリープラスミドpCGP1861の概略図である。pCGP197由来のRoseCHS 5'：GUS：nos 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1861の構築に関しては実施例6で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２３】バイナリープラスミドpCGP1953の概略図である。pCGP1952由来のAmCHS 5'：GUS：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1953の構築に関しては実施例6で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２４】35S 5'：GUS：ocs 3'遺伝子をSuRB選択マーカー遺伝子との収束（convergent）配置として含むバイナリープラスミドpWTT2084（DNAP）の概略図である。pWTT2084の説明は実施例6に示されている。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２５】ブラックパンジー（Viola spp. cv Black Pansy）由来のF3'5'H BP#18 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpCGP1959の概略図である。pCGP1959の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２６】ブラックパンジー（Viola spp. cv Black Pansy）由来のF3'5'H BP#40 cDNAクローンをpBlucscript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpCGP1961の概略図である。pCGP1961の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２７】バイナリープラスミドpCGP1972の概略図である。pCGP1970由来のAmCHS 5'：BP#18：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1972の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２８】バイナリープラスミドpCGP1973の概略図である。pCGP1971由来のAmCHS 5'：BP#40：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1973の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図２９】バイナリープラスミドpCGP1967の概略図である。pCGP1965由来のCaMV 35S：BP#18：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1967の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３０】バイナリープラスミドpCGP1969概略図である。pCGP1966由来のCaMV 35S：BP#40：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1969の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３１】サルビア属（Salvia spp.）由来のF3'5'HSal#2 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpCGP1995の概略図である。pCGP1995の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３２】サルビア属由来のF3'5'H Sal#47 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpCGP1999概略図である。pCGP1999の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３３】バイナリープラスミドpCGP2121の概略図である。pCGP2116由来のAmCHS 5'：Sal#2：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2121の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３４】バイナリープラスミドpCGP2122の概略図である。2117由来のAmCHS 5'：Sal#47：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2122の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３５】バイナリープラスミドpCGP2120の概略図である。pCGP2122由来のCaMV 35S：Sal#2：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2120の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３６】バイナリープラスミドpCGP2119の概略図である。pCGP2111由来のCaMV 35S：Sal#47：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2119の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３７】ソリア属（Sollya spp.）由来のF3'5'HSoll#5 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpCGP2110の概略図である。pCGP2110の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３８】バイナリープラスミドpCGP2130の概略図である。pCGP2128由来のAmCHS 5'：Soll#5：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2130の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図３９】バイナリープラスミドpCGP2131の概略図である。pCGP2129由来のCaMV 35S：Soll#5：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2131の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４０】ケネディア属（Kennedia spp.）由来のF'3'5HKenn#31 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpCGP2231の概略図である。pCGP223I の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４１】バイナリープラスミドpCGP2256の概略図である。pCGP2242由来のAmCHS 5'. Kenn#3：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2256の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４２】バイナリープラスミドpCGP2252の概略図である。pCGP2236由来のCaMV 35S：Kenn#31：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2252の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４３】チョウマメ（Clitoric ternatea）由来の完全長F3'5'H BpeaHF2 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpBHF2Fの概略図である。pBHF2Fの説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４４】バイナリープラスミドpCGP2135の概略図である。pCGP2133由来のAmCHS 5'：BpeaHF2：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2135の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４５】バイナリープラスミドpBEBF5の概略図である。CaMV35S：BpeaHF2：nos 3'遺伝子は、pBE2113-GUS由来のGUS断片をpBHF2F由来のクリトリアF3'5'H BpeaHF2 cDNAクローンで置き換えることによって構築した。pBEBF5の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４６】バイナリープラスミドpCGP2134の概略図である。pCGP2132由来のCaMV 35S：BpeaHF2：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP2134の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４７】エゾオヤマリンドウ（Gentiana triflora）由来のF3'5'H Gen#48 cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpG48の概略図である。pC148の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４８】バイナリープラスミドpCGP1498の概略図である。pCGP1496由来のAmCHS 5'：Gen#48：petD8 3'遺伝子をバイナリーベクターpCGP1988中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1498の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している、略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図４９】バイナリープラスミドpBEGHF48の概略図である。eCaMV 35S：Gen#48：nos3'遺伝子は、pBE2113 GUS由来のGUS断片をpG48由来のリンドウF3'5'H Gen#48 cDNAクローンで置き換えることによって構築した。pBEGHF48の構築に関しては実施例7で説明している。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図５０】バイナリープラスミドpCGP1982の概略図である。pCGP1981由来のCaMV 35S：Gen#4：ocs 3'遺伝子をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）中にキメラSuRB遺伝子に対して縦列配置となるようにクローニングした。pCGP1982の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図５１】ラバンデュラ・ニル（Lavandula nil）由来のF3'5'H LBG cDNAクローンをpBluescript SK II(+)骨格中に含むプラスミドpLFH8の概略図である。pLFH8の説明は実施例7に示されている。選択した制限エンドヌクレアーゼ部位を表示している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【図５２】バイナリープラスミドpBELF8の概略図である。eCaMV35S：LBG：nos 3'遺伝子は、pBE2113-GUS由来のGUS断片をpLHF8由来のラバンデュラF3'5'H LBG cDNAクローンで置き換えることによって構築した。pBELF8の構築に関しては実施例7で説明している。略号の説明については表2および表4を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明によれば、F3'5'H活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列の同定、クローニングおよび評価が行われた。本発明の組換え遺伝子配列は、例えば、デノボ発現、過剰発現、センス抑制、アンチセンス阻害、リボザイム、ミニザイムおよびDNAザイム（DNAzyme）の活性、RNAi誘導またはメチル化誘導またはその他の転写時もしくは転写後のサイレンシング活性により、この酵素をコードする遺伝子の発現のモジュレーションを可能にする。RNAi誘導には、ヘアピン状の短い二本鎖DNAまたはRNA、および部分的に二本鎖で1つまたは2つの一本鎖ヌクレオチド突出を有するDNAまたはRNAといった遺伝分子が含まれる。植物におけるF3'5'H合成を制御することができれば、個々のアントシアニンの組成のモジュレーション、ならびにフラボノールおよびアントシアニンの相対的レベルの変更が可能となり、それによって花弁の色の操作が可能になる。さらに本発明は、植物、および花、実、種子、野菜、葉、茎などを含むその繁殖（reproductive）部分または成長（vegetative）部分にも適用される。本発明はさらに、観賞用のトランスジェニック植物または遺伝子組換え植物にも適用される。「トランスジェニック」という用語には、子孫植物、ならびに一次トランスジェニック植物からのその後の遺伝学的操作および／または交雑による植物も含まれる。
【００５２】
したがって、本発明の1つの面は、フラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）もしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定で、検出可能なレベルのデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を生じさせる核酸分子を提供する。
【００５３】
本発明のもう1つの面は、F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるその発現が、クロマトグラフィー法による測定でデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が検出可能なレベルであることによる判定で、前記F3'5'Hへと翻訳されるのに十分なレベルおよび長さの転写物を生じさせる核酸分子を対象とする。
【００５４】
本発明のさらにもう1つの面は、F3'5'HもしくはF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、バラ花弁組織における前記核酸分子の発現が、バラ花弁から単離した全RNAのノーザンブロット分析によって検出可能な完全長転写物を生じさせる核酸分子を対象にする。
【００５５】
本発明は、DHKならびにDHQに対して作用するF3'5'Hをコードする遺伝子配列の同定、クローニングおよび操作を参照することにより、本明細書において記載および例示がなされる。F3'5'H酵素はパンジー、サルビア、ソリア、ラベンダーまたはケネディアのF3'5'Hであることが好ましい。F3'5'H酵素には、F3'5'H活性またはF3'5'H様活性を有するポリペプチドまたはタンパク質も含まれるとみなすことができる。後者にはF3'5'H活性が変化した誘導体が含まれる。
【００５６】
したがって、本発明の1つの好ましい面は、F3'5'Hもしくはその機能的変異体、誘導体、部分、断片、相同体もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、以下を特徴とする核酸分子を対象とする。
（i）バラ花弁組織中のF3'5'H転写物が、クロマトグラフィー法（例えば、TLCまたはHPLC）による測定で、検出可能なデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子をバラ花弁組織中に生じさせるF3'5'Hをコードするのに十分なレベルおよびサイズである。
（ii）バラ花弁組織中のF3'5'H転写物が完全長であり、バラ花弁組織から単離した全RNAのノーザンブロット分析によって検出される。
（iii）バラ花弁組織中のF3'5'Hが、クロマトグラフィー法（例えば、TLCまたはHPLC）による測定で、検出可能なデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を生じさせる。ならびに／または
（iv）F3'5'Hがバラ花弁組織における外観上の色の変化を生じさせる。
【００５７】
デルフィニジンを基にした色素という用語には、アントシアニジン、デルフィニジン、またはグリコシル化、アシル化、メチル化もしくは他の修飾型を非制限的に含む、それらの任意の誘導体が含まれる。メチル化型のデルフィニジンには、アントシアニジン、ペツニジン（3'位がメチル化）、マルビジン（3'位および5'位がメチル化）、5-Oメチルマルビジン（5位、3'位および5'位がメチル化）、5,7-Oジメチルマルビジン（5位、7位、3'位および5'位がメチル化）が非制限的に含まれる。メチル化アントシアニジンをグリコシル化およびアシル化によって修飾することもできる。アントシアニンという用語は、グリコシル化型のそれぞれのアントシアニジンのことを記述している。
【００５８】
「核酸分子」という用語は、天然でない条件下にある遺伝子配列のことを意味する。一般にこれは、その天然の状態から単離されたこと、または天然でない環境下で合成もしくは導出されたことを意味する。より具体的には、これは、ゲノムDNA断片、組換え分子または合成分子、および異種核酸と組み合わされた核酸を含む、インビトロで形成または維持されている核酸分子を含む。これはまた、その独自のプロモーターまたは別のプロモーターに対して反対の向きにある、F3'5'Hまたはその部分をコードするゲノムDNAまたはcDNAまたはそれらの部分にも適用される。これはさらに、他の核酸配列に比して少なくとも部分的に精製された後の天然の配列にも適用される。
【００５９】
「遺伝子配列」という用語は、本明細書においてその最も一般的な意味で用いられ、F3'5'H酵素におけるアミノ酸の配列を直接的に、または相補的な一連の塩基を介して特定する任意の連続したヌクレオチド塩基を含む。このようなアミノ酸配列は、SEQ ID NO:10（パンジー）もしくはSEQ ID NO:12（パンジー）もしくはSEQ ID NO:14（サルビア）もしくはSEQ ID NO:16（サルビア）もしくはSEQ ID NO:18（ソリア）もしくはSEQ ID NO:32（ラベンダー）もしくはSEQ ID NO:27（ケネディア）に示されたような完全長F3'5'Hまたはその活性短縮型（active truncated form）であってもよく、または酵素のN末端、C末端もしくは内部の部分などの特定領域に対応してもよい。遺伝子配列をヌクレオチドの配列またはヌクレオチド配列と呼んでもよく、これには2つまたはそれ以上の配列の組換え融合物も含まれる。
【００６０】
本発明の以上の面によれば、実質的にはSEQ ID NO:9（パンジー）もしくはSEQ ID NO:11（パンジー）もしくはSEQ ID NO:13（サルビア）もしくはSEQ ID NO:15（サルビア）もしくはSEQ ID NO:17（ソリア）もしくはSEQ ID NO:31（ラベンダー）もしくはSEQ ID NO:26（ケネディア）に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11もしくはSEQ ID NQ：13もしくはSEQ
ID NO:15もしくはSEQ ID NO:17もしくはSEQ
ID NO:31もしくはSEQ ID NO:26に示された配列と少なくとも約50％の類似性を有するかもしくは低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする、核酸分子が提供される。
【００６１】
表1は配列識別子の概要を示している。
【００６２】
本発明に包含される代替的な類似度（percentage similarity）および一致度（ヌクレオチドまたはアミノ酸のレベルで）には、少なくとも約60％または少なくとも約65％または少なくとも約70％または少なくとも約75％または少なくとも約80％または少なくとも約85％または少なくとも約90％またはそれ以上（例えば、約95％または約96％または約97％または約98％または約99％など）、例えば、少なくとも約60％、61％、62％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％が含まれる。
【００６３】
1つの特に好ましい態様において、実質的にはSEQ ID
NO:9（パンジー）もしくはSEQ ID NO:11（パンジー）もしくはSEQ ID NO:13（サルビア）もしくはSEQ ID NO:15.（サルビア）もしくはSEQ ID NO:17（ソリア）もしくはSEQ ID NO:31（ラベンダー）もしくはSEQ ID NO:.26（ケネディア）に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:1（ペチュニア）もしくはSEQ ID NO:3（ペチュニア）に示された配列もしくはいずれかの相補鎖と少なくとも約50％の類似性を有するか低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がF3'5'H活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
【００６４】
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11もしくはSEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:26とハイブリダイズしうる核酸分子を明確にするためのストリンジェンシーのレベルを決定する目的に関して、本明細書における低ストリンジェンシーへの言及は、ハイブリダイゼーション条件に関しては少なくとも約0％〜少なくとも約15％v／vのホルムアミドおよび少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩、ならびに洗浄条件に関しては少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩を含有および包含する。一般に、低ストリンジェンシーは約25〜30℃から約42℃までである。温度を変更してもよく、ホルムアミドを含める代わりにおよび／または代替的なストリンジェンシー条件を得るために、より高い温度を用いることもできる。代替的なストリンジェンシー条件を必要に応じて用いてもよく、これには例えば、ハイブリダイゼーション条件に関しては少なくとも約16％v／v〜少なくとも約30％v／vのホルムアミドおよび少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩、ならびに洗浄条件に関しては少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩を含有および包含する中程度のストリンジェンシー、またはハイブリダイゼーション条件に関しては少なくとも約31％v／v〜少なくとも約50％v／vのホルムアミドおよび少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩、ならびに洗浄条件に関しては少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩を含有および包含する高ストリンジェンシーなどがある。一般に、洗浄はTm＝69.3＋0.41（G＋C）％で行われる（Marmur
and Doty, J. Mol. Biol 5: 1-9, 1962）。しかし、二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1％増える毎に1℃低下する（Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem.
46: 83, 1974）。ホルムアミドはこれらのハイブリダイゼーション条件においては任意である。したがって、特に好ましいストリンジェンシーのレベルは以下のように定義される。低ストリンジェンシーは6×SSC緩衝液、1.0％w／v SDSで25〜42℃である。中程度のストリンジェンシーは2×SSC緩衝液、1.0％w／v SDSで温度が20℃〜65℃の範囲である。高ストリンジェンシーは0.1×SSC緩衝液、0.1％w／v SDSで温度が少なくとも65℃である。
【００６５】
本発明のもう1つの面は、実質的にはSEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12またはSflQ ID NO、14もしくはSEQ ID NO:16もしくはSEQ ID NO:18もしくはSEQ ID NO:32もしくはSEQ ID NO:27に記載のアミノ酸配列もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００６６】
本明細書で用いる類似性という用語には、比較する配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸のレベルでの厳密な同一性が含まれる。ヌクレオチドレベルでの同一性がない場合、類似性には、異なってはいるものの構造的、機能的、生化学的および／またはコンフォメーション的なレベルでは互いに関連がある複数のアミノ酸が生じるような配列間の違いが含まれる。アミノ酸レベルでの同一性がない場合には、類似性には、それでも構造的、機能的、生化学的および／またはコンフォメーション的なレベルでは互いに関連がある複数のアミノ酸が含まれる。1つの特に好ましい態様において、ヌクレオチドおよび配列の比較は類似性ではなく同一性のレベルで行われる。
【００６７】
2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係を説明するために用いられる用語には、「参照配列」「比較域（comparison window）」「配列類似性」「配列同一性」「配列類似度（percentage
of sequence similarity）」「配列一致度（percentage of sequence
identity）」「実質的に類似している」および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、長さが、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基の、少なくとも12モノマー単位、しかししばしば15モノマー単位から18モノマー単位まで、多くの場合は少なくとも25モノマー単位またはそれ以上、例えば30モノマー単位である。2つのポリヌクレオチドはそれぞれ（1）2つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、および（2）2つのポリヌクレオチド間で大きく異なる配列を含みうるため、2つの（またはそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、2つのポリヌクレオチドの配列を「比較域」にわたって比較して、配列類似性のある局所領域を同定および比較することによって行われる。「比較域」とは、参照配列と比較される、典型的には12個の連続した残基の概念的セグメントを意味する。比較域は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して約20％またはそれ未満の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。比較域のアラインメントを行うための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer
Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA中のGAP、BESTEIT、PASTAおよびTFASTA）のコンピュータでの実行により、または目視検査および選択した種々の任意の方法によって生成された最良のアラインメント（すなわち、比較域にわたって最も高いパーセント相同性が得られるもの）によって行うことができる。BLASTファミリーのプログラム、例えばAltschulら（Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）によって開示されたものを参照してもよい。配列解析に関する詳細な考察は、Ausubelら（「分子生物学における最新プロトコール（Current
Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons
Inc. 1994-1998, 第15章、1998）の第19.3項に記載されている。
【００６８】
本明細書で用いる「配列類似性」および「配列同一性」という用語は、配列が、比較域にわたり、個々のヌクレオチドまたはアミノ酸のレベルで同一または機能的もしくは構造的に類似している程度のことを指す。このため、「配列一致度」は例えば、2つの最適にアラインメントされた配列を比較域にわたって比較すること、両方の配列に同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、 Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が存在する位置の数を決定して合致した位置の数を得ること、合致した位置の数を比較域における位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除算すること、およびその結果に100を掛けて配列一致度を得ることによって求められる。本発明の目的に関して、「配列同一性」は、DNASISコンピュータプログラム（ウィンドウズ用バージョン2,5；Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco,
California, USAから販売）を、ソフトウェアに添付の参照マニュアルで用いられている標準的なデフォルト値で用いることによって算出される「合致率」を意味することが理解されるであろう。同様の注釈は配列類似性に関しても適用される。
【００６９】
本発明の核酸分子を、F3'5'Hをコードするもののバラ花弁組織において検出可能な完全な転写物を生じさせないか、または発現された場合にTLCもしくはHPLCなどのクロマトグラフィー法による測定で、検出可能なデルフィニジンもしくはデルフィニジンを基にした分子を生じさせない核酸分子と比較して、全体的なAT含有率（またはGC含有率）が低い、または誘導体化の前には低かったということによってさらに特徴付けることもできる。さらに、コドンの3番目の位置におけるAまたはTのパーセンテージも他のF4'5'H酵素より低い。本明細書におけるクロマトグラフィー法への言及には関連した手順が含まれる。「関連した」とは、技術的に関連のある手順または同様の結果が得られる手順のことを意味する。関連した手順の例には、他の形態のクロマトグラフィー（例えば、ガスクロマトグラフィー）が含まれる。
【００７０】
さらに、バラ組織では十分に発現しないヌクレオチド配列を、全体的なAT率を低下させること、または少なくともコドンの第3の位置におけるAT率のレベルを低下させることなどの点で改変することもできる。このような場合、バラ組織における発現は上昇する。
【００７１】
本明細書で考えている核酸配列には、増幅反応のための遺伝子プローブとして、または植物における対応する遺伝子の発現を調節しうるアンチセンス分子もしくはセンス分子として有用なオリゴヌクレオチドも含まれる。センス分子には、ヘアピン構築物、短い二本鎖DNAおよびRNA、ならびに部分的に二本鎖で1つまたは2つの一本鎖ヌクレオチド突出を有するDNAおよびRNAが含まれる。本明細書で用いるアンチセンス分子には、そのプロモーターまたは別のプロモーターに対して反対の向きにある、ゲノム性またはcDNA性の構造遺伝子またはその部分を含む遺伝子構築物も含まれうる。これには相同遺伝子配列も含まれうる。アンチセンス分子またはセンス分子を、F3'5'H活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の末端部分もしくは内部の部分に対して、または以上の組み合わせに対して、遺伝子の発現が低下または消失するように向かわせることもできる。
【００７２】
本発明のこの面に関して、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18, 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55などの5〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:26に示されたヌクレオチド配列を有する分子の1つの部分または領域に対して実質的な類似性を有するオリゴヌクレオチドが提供される。この文脈における実質的な類似性または相補性とは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに関する低ストリンジェンシー条件、代替的および好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、ならびに代替的および最も好ましくは高ストリンジェンシー条件の下で、ハイブリダイズ可能な類似性のことを意味する（Sambrook et al,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular
Cloning：Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989）。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、種々の源からのF3'5'H遺伝子配列に対するスクリーニングにおいて、またはトランスジェニック植物における導入した遺伝子配列のモニタリングのために有用である。好ましいオリゴヌクレオチドは、保存されているF3'5'H遺伝子配列、またはある植物属、植物種および／または植物品種において保存されている配列を対象とする。
【００７３】
本発明の1つの面において、オリゴヌクレオチドはF3'5'H遺伝子配列の5'末端または3'末端に対応する。便宜上、5'末端を本明細書では、実質的には構造的遺伝子の開始コドンから遺伝子の中央部分までの領域を定めたものとみなし、3'末端を本明細書では、遺伝子の中央部分から構造遺伝子の終止コドンまでの領域を定めたものとみなす。このため、オリゴヌクレオチドまたはプローブが、5'末端もしくは3'末端と、または5'末端および3'末端の両方に共通する領域とハイブリダイズしうることは明らかである。本発明はこのようなすべてのプローブに対して適用される。
【００７４】
1つの態様において、F3'5'Hまたはその種々の機能的誘導体をコードする核酸配列は、内因性F3'5'Hのレベルを低下させるため（例えば、共抑制またはアンチセンスを介した抑制による）もしくはRNAiを含む他の転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）過程のレベルを低下させるために用いられる、または代替的には、この酵素またはその種々の誘導体もしくは部分をコードする核酸配列は、F3'5'Hのレベルを低下させるセンスまたはアンチセンスの向きで用いられる。二本鎖またはヘアピンループを有する構築物のように部分的に一本鎖のセンス鎖はPTGS応答を誘導するのに特に有用である。さらにもう1つの選択肢として、リボザイム、ミニザイムまたはDNAザイムを、標的核酸配列を不活性化するために用いることも可能と考えられる。
【００７５】
さらにもう1つの態様は、ポリペプチド材料への翻訳を低下させるための転写後抑制を包む。さらにまたもう1つの態様は、メチル化を特異的に誘導または除去することを含む。
【００７６】
本明細書におけるF3'5'H活性の改変という言及は、正常な内因性または既存の活性レベルに比べて、最大で30％、またはより好ましくは30〜50％、またはさらにより好ましくは50〜75％、またはなおより好ましくは75％またはそれ以上の活性の上昇または低下に関する。このような上昇または低下は、F3'5'H酵素活性のモジュレーションと呼ぶことができる。一般に、モジュレーションは、F3'5'H遺伝子配列の転写または翻訳のレベルで行われる。
【００７７】
本発明の核酸は、リボ核酸でもデオキシリボ核酸でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよく、線状分子でも共有結合によって閉環した環状分子であってもよい。核酸分子はcDNAであることが好ましい。本発明はまた、低ストリンジェンシー条件下、好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、本発明の核酸分子、特に、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:26に示されたヌクレオチド配列、またはその一部もしくはその領域とハイブリダイズする他の核酸配列にも適用される。その最も好ましい態様において、本発明は、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11もしくはSEQ ID NO:13もしくはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID NO:26に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子、または、SEQ ID
NO:9もしくはSEQ ID NO:11もしくはSEQ ID
NO:13もしくはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID
NO:17もしくはSEQ ID NO:31もしくはSEQ ID
NO:26に示された配列の少なくとも1つもしくは複数の領域と、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルで少なくとも40％、より好ましくは少なくとも45％、さらにより好ましくは少なくとも55％、なおより好ましくは少なくとも65％〜70％、さらになおより好ましくは85％を上回る類似性を有する分子であって、核酸がF3'5'H活性を有する酵素をコードする、またはそれをコードする配列に対して相補的であるような分子にも適用される。しかし、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、以上に提示したパーセンテージを下回る類似性しか有せず、それでもなおF3'5'H活性をコードする場合があり、このような分子は、配列が保存された領域を有する場合、本発明の範囲にやはり含まれうることには注意が必要である。本発明はさらに、以上に想定した核酸分子、特にSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:13またはSEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:26に示されたものの一部分と、低ストリンジェンシー条件下、好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうる、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブにも適用される。この部分は遺伝子の5'末端または3'末端に対応することが好ましい。便宜上、5'末端を本明細書では、実質的には構造的遺伝子の開始コドンから遺伝子の中央部分までの領域を定めたものとみなし、3'末端を本明細書では、遺伝子の中央部分から構造遺伝子の終止コドンまでの領域を定めたものとみなす。このため、オリゴヌクレオチドまたはプローブが、5'末端もしくは3'末端と、または5'末端および3'末端の両方に共通する領域とハイブリダイズしうることは明らかである。本発明はこのようなすべてのプローブに対して適用される。
【００７８】
遺伝子という用語は、その最も広い意味で用いられ、これには遺伝子のエクソンに対応するcDNAが含まれる。したがって、本明細書における遺伝子への言及には、以下のものが含まれると解釈される。
（i）転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域ならびに／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、5'非翻訳配列、および3'非翻訳配列）を含む古典的なゲノム遺伝子；または
（ii）遺伝子のコード領域（すなわち、エクソン）ならびに5'非翻訳配列および3'非翻訳配列に対応するmRNAまたはcDNA。
【００７９】
遺伝子という用語はまた、発現産物のすべてまたは一部をコードする合成分子または融合分子を説明するためにも用いられる。特定の態様において、核酸分子および遺伝子という用語は、互換的に用いることができる。
【００８０】
核酸またはその相補的な形態は、完全長の酵素をコードしてもその一部または誘導体をコードしてもよい。「誘導体」とは、天然に存在する酵素に対して任意の単一または複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加され、しかもF3'5'H活性を保っているものをを意味する。この点に関して、核酸にはF3'5'Hをコードする天然に存在するヌクレオチド配列が含まれ、または核酸が前記天然に存在する配列に対して単一または複数のヌクレオチド置換、欠失、および／または付加を含んでもよい。また、本発明の核酸またはその相補的な形態が、活性または不活性であれ、F3'5'Hの「一部」をコードしてもよく、このような核酸分子は、オリゴヌクレオチドプローブとして、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして、さまざまな変異誘発法において、またはアンチセンス分子を作製するために有用な可能性がある。
【００８１】
本明細書における核酸分子、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「一部」に対する言及は、好ましくは、適宜、少なくとも約10個の連続したヌクレオチドまたは5個の連続したアミノ酸を含む分子に関する。
【００８２】
本発明のF3'5'Hのアミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入物が含まれる。挿入性のアミノ酸配列バリアントは、1つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク質における既定の部位に導入されたものであるが、得られた産物に適したスクリーニングを行えば、ランダム挿入も同じく可能である。欠失バリアントは、配列から1つまたは複数のアミノ酸が除去されていることを特徴とする。置換性のアミノ酸バリアントは、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたバリアントである。典型的な置換は、表3に従って行われるものである。
【００８３】
（表３）アミノ酸の置換に適した残基
2010193895.tif 000003
【００８４】
F3'5'Hがアミノ酸置換によって誘導体化される場合、そのアミノ酸は一般に、疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の嵩高性などの点で類似した特性を有する他のアミノ酸によって置換される。アミノ酸の置換は、典型的には単一の残基の置換である。アミノ酸挿入は通常、約1〜10アミノ酸のオーダーで行われ、欠失は約1〜 20残基の範囲であると考えられる。好ましくは、欠失または挿入は、隣接する対において行われ、すなわち2つの残基の欠失または2つの残基の挿入が行われる。
【００８５】
以上に言及したアミノ酸バリアントは、固相ペプチド合成（Merrifield、J. Am. Client. Soc. 85: 21-9, 1964）などのような当技術分野で周知のペプチド合成法、または組換えDNA操作により、容易に作製することができる。既知の配列または部分的に既知の配列を有するDNA中の既定の部位に置換変異を作製するための技法は周知であり、例えば、M13変異誘発法が含まれる。置換、挿入または欠失バリアントとして現れる種々のタンパク質を作製するためのDNA配列の操作は、例えばSambrookら（1989, 前記）に簡便に記載されている。
【００８６】
本発明のF3'5'H酵素の組換え型または合成型の変異体および誘導体のその他の例には、糖質、脂質および／またはタンパク質もしくはポリペプチドなどの、酵素に付随する任意の分子の単一もしくは複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。
【００８７】
「類似体」または「誘導体」という用語は、F3'5'Hの任意の機能的化学同等物および上記の任意のアミノ酸誘導体にも適用される。便宜上、本明細書におけるF3'5'Hへの言及には、その任意の機能的変異体、誘導体、一部、断片、相同体または類似体への言及が含まれる。
【００８８】
本発明は、最も簡便であり、しかも現在に至るまで好ましい材料の源であることから、パンジー、サルビア、ソリアまたはラベンダーまたはケネディアに由来する核酸配列を用いて例示される。しかし、当業者は、他の植物またはある種の微生物などの任意のさまざまな源から類似の配列を単離しうることを直ちに理解すると考えられる。F3'5'Hを直接的または間接的にコードするそのような核酸配列はすべて、その源にかかわらず本発明に含まれる。F3'5'Hをコードする遺伝子の他の源には、ブドウ属、ホザキアヤメ、マツ属、トウヒ属、フジマツ属、インゲンマメ属、スノキ属、シクラメン属、アヤメ属、テンジクアオイ属、リパリエ属、ゼラニウム属、エンドウ属、レンリソウ属、クリトリア属、ニチニチソウ属、ゼニアオイ属、ムクナ属、ソラマメ属、セントポーリア属、サルスベリ属、ボウチナ属、ルリマツリ属、ヒポカリプタス属、ツツジ属、アマ属、ナンバンアカアズキ属、フヨウ属、アジサイ属、シンビジウム属、ナツフジ属、イワオウギ属、ハギ属、アスパラガス属、アンティゴノン属、エンドウ属、ウツボグサ属、サンジソウ属などが非制限的に含まれる。
【００８９】
本発明によれば、F3'5'Hをコードする核酸配列をいずれかの向きでトランスジェニック植物に導入して発現させ、それにより、適した基質を（植物細胞内で合成される場合には）最終的にDHMに変換するための手段、または内因性もしくは既存のF3'5'H活性を低下もしくは消失させることによって代謝産物のそのような変換を阻害するための代替的な手段のいずれかを得ることができる。これらの3'5'-ヒドロキシル化基質の生成はその後、デルフィニジンを基にした色素へと変換され、それが花弁の色を改変し、青色の生成に寄与する可能性がある。植物における核酸配列の発現は、構成的、誘導的または発達型のいずれであってもよく、組織特異性であってもよい。「発現」という用語は、その最も広い意味において用いられ、RNAの産生、またはRNAおよびタンパク質の両方の産生が含まれる。これは核酸分子の部分的発現にも適用される。
【００９０】
本発明のこの面によれば、F3'5'Hを合成しうるトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、前記F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列による適した植物の細胞の安定的な形質転換を前記核酸配列の結果的な発現を可能にする条件下で行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、ならびに核酸配列の発現を可能にするのに十分な時間および条件の下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含む方法を提供する。トランスジェニック植物はこれにより、固有のものでないF3'5'Hを、相当する非トランスジェニック植物で発現される量に比して高いレベルで産生する可能性がある。
【００９１】
本発明のもう1つの面は、固有または既存のフラボノイド3',5'H活性が低下したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、F3'5'H活性をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および必要に応じて、核酸の発現を可能にするのに十分な条件下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含む方法を考えている。
【００９２】
本発明のさらにもう1つの面は、固有または既存のフラボノイド3',5'H活性が低下したトランスジェニック植物を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適切な変更がなされたF3'5'H遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変によってF3'5'H遺伝子を改変すること、および細胞から遺伝子組換え植物を再生させること、を含む方法を考えている。
【００９３】
本明細書で用いる「固有の（indigenous）」酵素とは、特定の細胞にとって本来の、またはそこで本来発現されるもののことである。「固有でない（non-indigenous）」酵素は、その細胞にとって本来のものではなく、植物細胞への遺伝材料の導入によって、例えば導入遺伝子によって発現されるものである。「内因性」酵素は細胞によって産生される酵素のことであるが、これはその細胞にとって固有であっても固有でなくてもよい。
【００９４】
1つの好ましい態様において、本発明は、花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、本発明の核酸配列によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および核酸配列の発現を可能にするのに十分な時間および条件の下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含む方法を考えている。
【００９５】
または、前記方法は、本発明の核酸配列またはその相補配列によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および固有または既存のF3'5'Hの活性のレベルを改変するのに十分な時間および条件の下で前記トランスジェニック植物を生育させること、を含みうる。改変されたレベルは相当する非トランスジェニック植物における固有または既存のF3'5'H活性を下回ることが好ましい。本発明を限定することは意図しないが、作用様式に関する1つの理論は、固有のF3'5'H活性の低下には導入された核酸配列またはその相補配列の発現が必要であるというものである。しかし、導入された遺伝子配列またはその相補物の発現が、所望の効果、すなわち花または花序の特性の変化を呈する顕花植物を得るために必要でなくてもよい。
【００９６】
1つの関連した態様において、本発明は、花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック顕花植物を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適切な変更がなされたフラボノイド3'5'-ヒドロキシラーゼ遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変によってF3'5'H遺伝子を改変すること、および細胞から遺伝子組換え植物を再生させることを含む方法を考えている。
【００９７】
好ましくは、改変された花または花序には、レシピエント植物の遺伝子型および生理的状態に応じて、青色または紫色または赤色の花またはその他の色といった異なる色合いの生成が含まれる。
【００９８】
したがって、本発明は、F3'5'Hもしくはその部分をコードする組換え遺伝子を発現しうる、またはF3'5'HをコードするmRNA分子の全体もしくは一部に対して実質的に相補的な核酸配列を有する、トランスジェニック植物を作製するための方法であって、F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子による適した植物の細胞の安定的な形質転換を、必要に応じて、前記単離された核酸配列の結果的な発現を可能にする条件下で行うこと、および細胞からトランスジェニック植物を再生させること、を含む方法にも適用される。適した植物とは、DHKを産生して、所望の色の発生に必要な適切な生理的特性を有することが可能な植物のことを意味する。
【００９９】
当業者は、標的植物に本来存在する酵素の発現を増加または減少させて、異なる色合いの青、紫または赤といった異なる色合いの色を得るというような、本発明の方法に適用可能な変法を直ちに認識すると思われる。
【０１００】
したがって、本発明は、本発明の核酸配列の全体もしくは部分、またはそのアンチセンス形態および／またはその任意の相同体もしくは関連する形態を含む、すべてのトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の部分またはトランスジェニック植物の子孫、特に花または花序の特性の変化を呈するトランスジェニック植物にも適用される。トランスジェニック植物が、F3'5'Hをコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む導入された核酸分子を含んでもよい。一般に、核酸は植物ゲノムに安定的に導入されると考えられるが、本発明は、植物細胞内で複製可能なDNAウイルスまたはRNAウイルスなどの自律複製性のある核酸配列中へのF3'5'Hヌクレオチド配列の導入にも適用される。本発明はまた、このようなトランスジェニック植物の種子にも適用される。このような種子は、特に着色している場合、植物にとって固有の標識として有用である。アグロバクテリウムを介した形質転換、微粒子銃法を非制限的に含む、植物細胞に遺伝物質を導入するための任意かつすべての方法が本発明に含まれる。
【０１０１】
本発明のもう1つの面は、本発明の核酸配列の全体または部分を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の部分またはトランスジェニック植物の子孫からの抽出物、特に、香味料または食品添加物または健康製品または飲料または果汁または着色剤として用いられる場合のトランスジェニック植物からの抽出物を考えている。
【０１０２】
本発明によって想定される植物の部分には、花、実、野菜、堅果、根、茎、葉または種子が非制限的に含まれる。
【０１０３】
本発明の抽出物は、化学的抽出または熱抽出または濾過または圧搾または粉砕を非制限的に含む、さまざまななやり方で、植物または植物の部分またはそれ由来の細胞から得ることができる。
【０１０４】
植物、植物の部分またはそれ由来の細胞または抽出物は、さまざまなやり方で利用することができる。香味料の（例えば、食物エキス）、食品添加物（例えば、安定化剤、着色剤）、健康製品（例えば、抗酸化剤、錠剤）、飲料（例えば、ワイン、蒸留酒、茶）または果汁（例えば、果物果汁）または着色剤（例えば、食品着色剤、布地着色剤、染料、絵の具、染髪剤）。
【０１０５】
本発明のさらにもう1つの面は、組換え型のF3'5'Hを対象としている。組換え型のこの酵素は、例えばより活性の高い酵素といった研究のための材料の源になると考えられ、有色化合物の生成のためのインビトロシステムの開発にも有用な可能性がある。
【０１０６】
本発明のさらにまたもう1つの面は、植物においてF3'5'Hを発現させること、または固有のF3'5'H酵素をダウンレギュレートすることが可能な遺伝子構築物の製造における、本明細書に記載の遺伝子配列の使用を考えている。
【０１０７】
遺伝子構築物という用語は、本明細書の全体を通じて、「融合分子」「組換え分子」「組換えヌクレオチド配列」とい用語と互換的に用いられる。遺伝子構築物は、シグナルタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸分子を含んでもよく、または2つもしくはそれ以上のタンパク質をコードする多数のオープンリーディングフレームを含んでもよい。これは、オープンリーディングフレームの1つまたは複数と機能的に結合したプロモーターを含んでもよい。
【０１０８】
本発明のもう1つの面は、プラスミド形態として染色体外でF3'5'Hをコードする遺伝子配列を有する、原核生物または真核生物を対象とする。
【０１０９】
本発明はさらに、実質的にはSEQ ID NO:10もしくはSEQ
ID NO:12もしくはSEQ ID NO:14もしくはSEQ
ID NO:16もしくはSEQ ID NO:18もしくはSEQ
ID NO:32またはSEQ ID NO:27に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12もしくはSEQ ID NO:14もしくはSEQ ID NO:16もしくはSEQ ID NO:18もしくはSEQ ID NO:32もしくはSEQ ID NO:27に対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチド、または前記ポリペプチドの誘導体にも適用される。
【０１１０】
「組換えポリペプチド」とは、人為的な介入によって直接的もしくは間接的に細胞に導入されたヌクレオチド配列、または親細胞、近縁細胞もしくは前駆細胞に導入されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのことを意味する。また、組換えポリペプチドを無細胞系のインビトロ転写系を用いて合成することもできる。「組換えポリペプチド」という用語には、単離されたポリペプチド、または細胞もしくは細胞調製物に存在する場合が含まれる。これはまた、前記ポリペプチドを産生する細胞から再生した植物または植物の部分であってもよい。
【０１１１】
「ポリペプチド」には、ペプチドまたはタンパク質が含まれ、これは「酵素」という用語に含まれる。
【０１１２】
また、組換えポリペプチドが、2つまたはそれ以上の異種アミノ酸配列を含む融合分子であってもよい。
【０１１３】
以下の非制限的な実施例により、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１１４】
実施例1
一般的な方法
一般に、以下の方法は、Sambrookら（1989,前記）またはSambrook and Russell、「分子クローニング：実験マニュアル第3版（Molecular Cloning: Laboratory Manual 3rd edition）」、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001または「植物分子生物学マニュアル（Plant Molecular Biology Manual」（第2版）、Gelvin and Schilporoot（eds）, Kiuwec Academic Pablisher, Netherlands, 1994または「植物分子生物学ラブファクス（Plant Molecular Biology Labfax）」、Croy（ed）、Bios scientific Publishers, Oxford, UK,
1993に記載された通りに行った。
【０１１５】
クローニングベクターpBluescriptおよびPCR
scriptはStratagene, USAから入手した。pCR7
2.1はInvitrogen, USAから入手した。
【０１１６】
大腸菌の形質転換
用いた大腸菌の菌株は以下の通りである。
DH5α
supE44,Δ(lacZYA-ArgF)U169, (φ80lacZΔM15), hsdR17(rK−, mK+）, recA1, endA1, gyrA96,
thi-1, relA1, deoR (Hanahan, J. Mol. Riol. 166: 5-7, 1983)
XL1-Blue
supE44、hsdR17(rK−,
mK＋), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1,
lac−, [F'proAB、lacq,
lacZΔM15, Tn10(tetR)] (Bullock et al, Blotechniques 5: 3-6, 1987)
BL21-CodonPlus-RIL株
ompT hsdS(Rb-mB-)dcm+Tetr gal endA Hte[argU ileY leuW Camr)
M15大腸菌は大腸菌K12に由来し、表現型Nals,
Strs, Rifs, Thi−, Ara＋, Gal＋, Mtl−, F−, RecA＋, Uvr＋, Lon＋を有する。
【０１１７】
大腸菌株の形質転換は、Inone et al.（Gene
96: 23-28, 1990）の方法に従って行った。
【０１１８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の菌株および形質転換
用いた無害化アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株はAGL0である（Lazo et al. Bio/technology 9: 963-967, 1991）。
【０１１９】
5μgのプラスミドDNAを、50mLのLB培養液（Sambrook
et al, 1989,前記）に接種することによって調製した100μLのコンピテントAGL0細胞に添加し、振盪しながら28℃で16時間インキュベートすることにより、プラスミドDNAをアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株に導入した。続いて細胞をペレット化し、0.5mLの85％（v／v）100mM CaCl2／15％（v／v）グリセロール中に再懸濁した。このDNA-アグロバクテリウム混合物を液体N2中での2分間のインキュベーションによって凍結した後に、37℃での5分間のインキュベーションによって解凍させた。続いてこのDNA／細菌混合物を氷上にさらに10分置いた。続いて細胞を1mLのLB培養液（Sambrook
et al, 1989前記）と混合し、振盪しながら28℃で16時間インキュベートした。プラスミドを有するA.ツメファシエンス細胞を、50μg／mLテトラサイクリンまたは100μg／mLゲンタマイシンなどの適切な抗生物質を含むLB寒天平板上で選択した。A.ツメファシエンス内部のプラスミドの確認は、抗生物質耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼマッピングによって行った。
【０１２０】
DNAの連結
DNAの連結は、Amersham Ligation KitまたはPromega Ligation Kitを製造元により推奨されている手順に従って用いて行った。
【０１２１】
DNA断片の単離および精製
断片は一般に、1％（w／v）アガロースゲルで単離し、QIAEX II Gel Extraction kit（Qiagen）またはBresaclean Kit（Bresatec, Australia）を、製造元により推奨されている手順に従って用いて精製した。
【０１２２】
制限エンドヌクレアーゼによる消化後の突出末端の修復
5'突出末端はDNAポリメラーゼ（クレノウ断片）を標準的なプロトコール（Sambrook et al, 1989 前記）に従って用いて修復した。3'突出末端はT4 DNAポリメラーゼを標準的なプロトコール（Sambrook et al, 1989
前記）に従って用いて修復した。
【０１２３】
核酸からのホスホリル基の除去
再環状化を防ぐ目的でクローニングベクターからホスホリル基を除去するために、一般的にはエビアルカリホスファターゼ（SAP）（USB）を製造元の推奨に従って用いた。
【０１２４】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
別に特記する場合を除き、プラスミドDNAをテンプレートとして用いるPCR条件は、2ngのプラスミドDNA、100ngの各プライマー、2μLの10mM
dNTP混合物、5μLの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、0.5μLのTaq DNAポリメラーゼを合計50μLの容積中に含むものを用いることを含む。サイクル条件は、94℃ 5分間の最初の変性段階に続き、94℃ 20sec、50℃ 30secおよび72℃ 1分間を35サイクル行い、72℃
10分間の最終処理後に4℃で保存することから構成される。
【０１２５】
PCRはPerkin Elmer GeneAmp PCR
System 9600で行った。
【０１２６】
DNAプローブの32P標識
DNA断片（50〜100ng）を、Gigaprimeキット（Geneworks）を用いて50μCiの[α-32P]-dCTPにより放射標識した。取り込まれなかった[α-32P]-dCTPを、Sephadex G-50（Fine）カラムまたはMicrobiospin P-30 Trisクロマトグラフィーカラム（BioRad）に対するクロマトグラフィーによって除去した。
【０１２７】
プラスミドの単離
個々のコロニーを、適切な抗生物質選択（例えば100μg／mLアンピシリンまたは10〜50μg／mLテトラサイクリンなど）を用いてLB培養液（Sambrook et al., 1989,前記）に接種し、この液体培養物を振盪しながら37℃（大腸菌の場合）または29℃（A.ツメファシエンスの場合）でほぼ16時間インキュベートすることにより、挿入断片に関して分析した。プラスミドDNAを、アルカリ溶解手順（Sambrook et al, 1989,前記）を用いて、またはWizardPluz
SVミニプレップDNA精製システム（Promega）もしくはQiagen Plasmid Mini Kit（Qiagen）を用いて精製した。挿入断片の存在を確認したところで、より多くの量のプラスミドDNAを、一晩した培養物50mLから、アルカリ溶解手順（Sarnbrook et al, 1989,前記）またはQIAfilter
Plasmid Midiキット（Qiagen）を製造元により推奨されている条件に従って用いて調製した。
【０１２８】
DNA配列解析
DNAシークエンシングは、Applied Biosytems社のPRISM（商標）Ready Reaction Dye Primer Cycle
Sequencing Kitを用いて行った。製造元により提供されたプロトコールに従った。サイクルシークエンシング反応は、Perkin Elmer PCR装置（GeneAmp PCR System 9600）を用いて行った。シークエンシングの実行は一般に、The Walter and Eliza Hall Institute of Medical ResearchのAustralian Genome Research Facility（Melbourne,
Australia）により、または施設内で自動373A DNAシークエンサー（Applied Biosystems）を用いて行った。
【０１２９】
配列はMacVector（商標）アプリケーション（バージョン6.5.3）（Oxford Molecular Ltd., Oxford, England）を用いて解析した。
【０１３０】
Genbank、SWISS-PROTおよびEMBLデータベースに対する相同性検索は、FASTAおよびTFASTAプログラム（Pearson and Lipman, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85(8): 24442448, 1988）またはBLASTプログラム（Altschul et al, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990）を用いて行った。配列類似度は、LALIGNプログラム（Huang and Miller, Adv. Appl.
Math. 12: 373-381, 1991）またはClustaIWプログラム（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994）を、MacVectorアプリケーション（Oxford Molecular Ltd.,
England）の内部でデフォールトの設定を用いて得た。
【０１３１】
複数の配列アラインメントを、ClustalW（Thompson
et al, 1994,前記）をデフォールトの設定で用いて作成した。
【０１３２】
実施例2
植物の形質転換
ペチュニア（Petunia hybrida）の形質転換（Sw63×Skr4）
Holton et al.（1993a,前記）に記載された通り、当技術分野で周知の任意の他の方法による。
【０１３３】
バラ（Rosa hybrida）の形質転換
米国特許出願第542,841号（PCT/US91/04412）もしくはRobinson and Firoozabady（Scientia
Horticulturae, 55: 83-99, 1993）もしくはRout et al.（Scientia Horticulturac, 81: 201-238, 1999）もしくはMerchant et al.（Molecular Breeding 4:
187-94, 1998）に記載された通り、または当技術分野で周知の任意の他の方法による。
【０１３４】
バラの切り枝は一般にVan Wyk and Son Flower Supply, Victoriaから入手した。
【０１３５】
カーネーション（Dianthus caryophyllus）の形質転換
国際特許出願番号PCT/US92/02612（カーネーションの形質転換）。国際特許出願番号PCT/AU96/00296（紫色のカーネーション）、Lu et al.（Bio/Technoiogy 9: 864-868, 1991）、Robinson
and Firoozabady（1993,前記）に記載された通り、または当技術分野で周知の任意の他の方法による。
【０１３６】
Dianthus caryophyllus cv. Kortina ChanelまたはMonte Lisaの切り枝はVan Wyk and Son Flower
Supply, Victoriaから入手した。
【０１３７】
実施例3
トランスジェニック体の分析
色のコード化
観察された色の記載にはRoyal Horticultural SocietyのColor Chart（Kew, UK）を用いた。これは観察された色の表現型を記載するための代替的な手段となる。しかし、指定された数は知覚された色の目安に過ぎないものと解釈すべきであり、得られる可能性のある色を限定するものと見なすべきではない。
【０１３８】
クロマトグラフィー分析
薄層クロマトグラフィー（TLC）および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析は一般に、Brugliera et al（Plant J. 5, 81-92, 1994）に記載された通りに行った。
【０１３９】
アントシアニジンの抽出
HPLC分析の前に、アントシアニジンまたはフラボノールのコアからグリコシル部分を除去するために、花弁および雄蕊の抽出物中に存在するアントシアニン分子およびフラボノール分子の酸加水分解を行った。花の抽出物に存在する化合物の同定を補助するためにアントシアニジンおよびフラボノールの標準物質を用いた。
【０１４０】
反応混合物中のアントシアニジンを、10分間で50％Bから60％Bにし、続いて60％Bに10分間保ち、最後に5分間で60％Bから100％にするという勾配条件を用いる（ここで溶媒AはTFA：H2O（5：995）からなり、溶媒Bはアセトニトリル：TFA：H2O（500：5：495）からなる）勾配溶出により、HPLCによって分析した。逆相クロマトグラフィー分離のためにはAsahi Pac ODP-50カートリッジカラム（250mm×内径4.6mm）を用いた。流速は1mL／分とし、温度は40℃とした。アントシアニジン化合物の検出はShimadzu SPD-M6A三次元検出装置を400〜650nmで用いて行った。
【０１４１】
アントシアニジンのピークは、既知の標準物質、すなわちデルフィニジン、またはデルフィニジンを基にした分子であるペツニジン、マルビジン、シアニジンおよびペオニジンを参照することによって同定した。
【０１４２】
花の発達段階
ペチュニア
ペチュニア（Petunia hybrida cv. Skr4×Sw63）の花を、以下のように定義される発達段階で採取した。
ステージ1：色が付いていない閉じたつぼみ
ステージ2：有色の閉じたつぼみ
ステージ3：花冠が現れつつある有色のつぼみ
ステージ4：葯が保たれている（裂開前の）有色の開いた花
ステージ5：すべての葯が裂開した完全に開いた花
【０１４３】
TLC分析またはHPLC分析に関しては、色素蓄積が最大の段階であるステージ4の花から花弁を採取した。
【０１４４】
ノーザンブロット分析に関しては、フラボノイド経路遺伝子の発現が最大の段階であるステージ2〜3の花から花弁を採取した。
【０１４５】
カーネーション
カーネーションの花を、以下のように定義される発達段階で採取した。
ステージ1：閉じたつぼみ。花弁は認められない
ステージ2：花芽が開きつつある：花弁の先端が認められる
ステージ3：すべての花弁の先端が露出する。「絵筆（Paint-brush）期」
ステージ4：外側の花弁が茎に対して45°の角度となる
ステージ5：花が完全に開く
【０１４６】
TLC分析またはHPLC分析に関しては、色素蓄積が最大の段階であるステージ4の花から花弁を採取した。
【０１４７】
ノーザンブロット分析に関しては、フラボノイド経路遺伝子の発現が最大の段階であるステージ2〜3の花から花弁を採取した。
【０１４８】
バラ
バラの花の発達段階は以下のように定義される。
ステージ1：色が付いていない堅く閉じたつぼみ
ステージ2：有色の堅く閉じたつぼみ
ステージ3：有色の閉じたつぼみ；萼片がちょうど開こうとしている
ステージ4：花芽が開こうとしている。花弁は濃く着色している。萼片は分離している
ステージ5：萼片は完全に広がる。いくつかは弯曲している。花弁は濃く着色し、広がっている
【０１４９】
TLC分析またはHPLC分析に関しては、色素蓄積が最大の段階であるステージ4の花から花弁を採取した。
【０１５０】
ノーザンブロット分析に関しては、フラボノイド経路遺伝子の発現が最大の段階であるステージ3〜4の花から花弁を採取した（Tanaka et al, Plant Cell
Physiol, 36(6): 1023-1031, 1995）。
【０１５１】
分光光度測定によるアントシアニン／フラボノールの測定
約200mgの新鮮な花弁組織を2mLのメタノール／1％（v／v）HClに添加し、4℃で約16時間インキュベートした。続いて1：20希釈物（例えば50μLを1000μLにする）を作製し、350nmおよび530nmでの吸光度を記録した。
【０１５２】
続いて、フラボノールおよびアントシアニンのおおまかな量（nmole／gram）を以下の式を用いて算出した。
アントシアニンの含有量
2010193895.tif 000004
フラボノールの含有量
2010193895.tif 000005
【０１５３】
ノーザン／RNAブロット分析
RNAを単離し、予想される転写物の量およびサイズを推定することにより、導入した遺伝子の転写をモニタリングした。花弁における特定の転写物の定常レベルのモニタリングにはノーザンブロット分析を用いた。転写物が完全または完全長であるかを、用いた遺伝子から予想される推定サイズに基づいて判定した。一般に、cDNAをコード配列として用いた場合には、予想される転写物のサイズはcDNA＋融合プロモーター断片の5'非翻訳成分＋融合ターミネーター断片の3'非翻訳配列であると考えられる。cDNA領域がポリアデニル化部位と推定される部位を含み、ターミネーター領域がポリアデニル化部位を含む場合には、2つの転写物が検出されると考えられる。その1つは、cDNA配列内部のポリアデニル化部位のすぐ下流で起こったポリアデニル化に相当するサイズであると考えられる。第2の転写物はより大型で、ターミネーター断片内部のポリアデニル化部位の後にポリアデニル化が起こった転写物に相当すると考えられる。
【０１５４】
Plant RNAeasyキット（QIAGEN）を製造元により推奨されている手順に従って用いて、花弁または葉から全RNAを単離した。バラ試料に関しては1％（w／v）PVPを抽出バッファーに添加した。
【０１５５】
RNA試料（5μg）を、40mMモルホリノプロパンスルホン酸（pH 7.0）、5mM酢酸ナトリウム、0.1mM EDTA（pH 8.0）を含むランニングバッファーを用いて、2.2Mホルムアミド／1.2％w／vアガロースゲル中で電気泳動した。RNAを臭化エチジウムで染色し、UV光の下で可視化した。リボソームRNAは一般に、RNAが細胞内または細胞外のリボヌクレアーゼによる分解を受けなかったことを確認する際に目安として用いた。製造元による記載の通りにRNAをHybond-Nメンブランフィルター（Amersham）に移行させて処理した。
【０１５６】
RNAゲルには、放射標識プローブの完全性の指標として、および予想される転写物のサイズの目安として対照試料を含めた。petHf1およびperHf2遺伝子に関する対照には、ペチュニアOGB花弁（ステージ3〜4）から、またはpetHf1転写物を蓄積することが以前に示されているトランスジェニックカーネーションの花から単離したRNAを含めた。他のF35H遺伝子に関する対照には一般に、F3'5'H配列を単離したものと同じ種の花弁から単離したRNAを含めた。
【０１５７】
RNAブロットを32P標識断片によりプロービングした。メンブランフィルターのプレハイブリダイゼーション（42℃で1時間）およびハイブリダイゼーション（42℃で16時間）は50％v／vホルムアミド、1M NaCl、1％w／v SDS、10％w／v硫酸デキストラン中で行った。メンブランフィルターの洗浄は一般に、2×SSC、1％w／v SDSにより65℃で1〜2時間行った後に、0.2×SSC、1％w／v SDSにより65℃で0.5〜1時間行った。メンブランフィルターは一般に、Kodak XARフィルムに対して増感スクリーンを用いて-70℃で16〜72時間露出させた。
【０１５８】
実施例4
キメラのペチュニアF3'5'H遺伝子のバラへの導入
序論で述べたように、アントシアニジン分子のB環のヒドロキシル化のパターンは花弁の色の決定に重要な役割を果たしている。ジペチュニアなどの植物におけるヒドロフラボノールDHMの生成は、紫色／青色のデルフィニジンを基にした色素の生成をもたらす。F3'5'H活性の欠如は、バラ属、ガーベラ属、キンギョソウ属、ナデシコ属およびキク属などの多くの植物種に青色の花がないことと相関付けられている。
【０１５９】
変異型ペチュニア系統（Holton et al, 1993a, 前記および国際特許出願番号PCT/AU92/00334）、タバコの花（国際特許出願番号PCT/AU92100334）およびカーネーションの花（国際特許出願番号PCT/AU96/00296）において、デルフィニジンを基にした色素を産生させることが成功していることに基づき、同様のキメラのペチュニアF3'5'H遺伝子を、デルフィニジンを基にした新規色素を産生させるため、および花の色を改変するためにバラに導入した。
【０１６０】
キメラのペチュニアF3'5'H遺伝子構築物の調製
構築物の調製に用いたプロモーター、ターミネーターおよびコード断片ならびにそれぞれの略号を表4に列挙した。
【０１６１】
（表４）構築物の調製に用いたものの略号
2010193895.tif 000006
2010193895.tif 000007
2010193895.tif 000008
【０１６２】
デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子をバラ花弁において産生させるために、ペチュニアF3'5'H
cDNA断片ならびに種々のプロモーターおよびターミネーター断片を利用して、さまざまなバイナリーベクター構築物を調製した。これらのキメラのペチュニアF3'5'H遺伝子はカーネーションおよびペチュニアにおいて奏功し、検出可能な完全なF3'5'H転写物（ノーザンブロット分析による検出で）と、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子色素の生成とをもたらした。表5にペチュニアF3'5'H cDNA断片を含むバイナリーベクター構築物をまとめた。
【０１６３】
（表５）バラの形質転換に用いたバイナリーベクター構築物に含まれるキメラのペチュニアF3'5'H遺伝子発現カセットの概要（略号の説明については表4を参照のこと）
2010193895.tif 000009
【０１６４】
ペチュニアF3'5'H cDNAクローン（petHf1およびpetHf2）の単離
ペチュニアF3'5'HのcDNAクローン（petHf1およびpetHf2、それぞれpCGP602（図2）およびpCGP175（図3）に含まれる）（それぞれSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3）の単離および特性決定に関しては、国際特許出願番号PCT/AU92/00334およびHolton et al.（1993, 前記）に記載されている。
【０１６５】
プラスミドpCGP601（図2）、pCGP602（図2）、pCGP176（図2）は、ペチュニアpetHf1 F3'5'H cDNAクローンの相同体を含む。プラスミドpCGP601は、52bpの5'非翻訳配列を含むペチュニアF3'5'H petHf1相同体を含む。プラスミドpCGP602は、125bpの5'非翻訳配列を含むペチュニアF3'5'H petHf1相同体を含む（SEQ ID NO:1）。プラスミドpCGP176（Holton et al., 1993a前記に記載）は、pCGP602中のペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンに加えて27bpの5'非翻訳配列およびさらに約127bpの3'非翻訳配列を含むペチュニアF3'5'H petHf1相同体を含む。
【０１６６】
pCGP1303（pUC19骨格中にpetHf1がある）の構築
プラスミドpCGP601（上記）（図2）中に含まれるペチュニアF3'5'H cDNAクローンは、52bpの5'非翻訳配列、および16bpのポリA尾部を含む141bpの3'非翻訳配列を含んでいた。このプラスミドpCGP601（図2）をまず制限エンドヌクレアーゼBspHIを用いた消化によって線状化した。その両端を修復し、制限エンドヌクレアーゼBspHIで消化してペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンを遊離させた。BspHI認識配列は、翻訳開始コドンと推定されるもの、および終止コドンの2bp下流から始まるFspI認識配列を含む。ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンを含む1.6kb断片を精製し、pUC19（New England Biolabs）の修復EcoRI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1303と命名した（図4）。
【０１６７】
pCG627（pBluescript骨格中に短いpetHf1がある）の構築
プラスミドpCGP176（Holton et al,,
1993a, 前記）（図2）を制限エンドヌクレアーゼSpeIおよびEcoRIで消化した。続いて両端を修復し、再び連結させた。この結果得られたプラスミドはpCGP627と命名され、cDNAクローンの5'末端でpBluescriptベクターのマルチクローニングサイトから制限エンドヌクレアーゼ部位PstI、BamHIおよびSmaIが除去されている点を除き、pCGP176中のものと同一のcDNAクローンを含んでいた。
【０１６８】
バイナリーベクターpCGP1452（AmCHS 5’：petHf1：petD8 3'）
プラスミドpCGP1452（図5）は、キンギョソウカルコンシンターゼ遺伝子（CHS）（Sommer and Saedler, 1986, 前記）由来のプロモーター断片の制御下にあってペチュニアリン脂質輸送タンパク質（PLTP）遺伝子（Holton, 1992, 前記）由来のターミネーター断片（petD8 3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。キメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNA Plant Technologies, USA＝DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB遺伝子に対して縦列配置にある。
【０１６９】
バイナリーpCGP1452の調製における中間体
バイナリーベクターpWTT2132
バイナリーベクタープラスミドpWTT2132（DNAP）（図6）は、35S 5'プロモーター配列（Franck
et al, 1980, 前記）がタバコのSuRB遺伝子座由来のアセト乳酸シンターゼ（ALS）遺伝子（Lee et al, 1988, 前記）に対するコード領域およびターミネーター配列と連結されたものから構成されるキメラ遺伝子を含む。ペチュニアクロロフィルa／b結合タンパク質遺伝子（Cab 22遺伝子）（Harpster et al, MGG, 212: 182190, 1988）由来の約60bpの5'非翻訳リーダー配列が、35S 5'プロモーター断片とSuRB配列との間に含められている。
【０１７０】
pCGP725（pBluescript中にAmCHS
5'：petHf1：petD8 3'がある）の構築
キンギョソウCHS（AmCHS 5'）プロモーターの制御下にあってペチュニアPLTPターミネーター（petD8 3'）プロモーターを有する、キメラのペチュニアF3'5'H遺伝子を、pCGP602（Holton
et al, 1993a, 前記）由来の1.6kbのBclI／FspIペチュニアF3'5'H（petHf1）断片（図2）を、翻訳開始部位に対して5'側にある1.2kbのキンギョソウCHS遺伝子断片（Sommer and Saedler, 1986, 前記）と、推定される終止コドンに対して3'側にあるpCGP13ΔBam（Holton,
1992, 前記）由来の0.7kbのSmaI／XhoI PLTP断片（petD8 3'）との間にクローニングすることによって構築した。pBluescript II KS（Stratagene、USA）骨格のベクター中にある、この結果得られたプラスミドをpCGP725と命名した（図7）。
【０１７１】
pCGP485およびpCG1452（AmCHS
5'：petHf1：petD8 3'バイナリーベクター）の構築
pCGP725（図7）由来のキメラのF3'5'H遺伝子を、nptII選択マーカー遺伝子カセットを含むバイナリーベクターpCGN1547（McBride and Summerfelt, Plant
Molecular Biology 14: 269-276, 1990）中にクローニングして、pCGP485を作製した。pCGP485を制限エンドヌクレアーゼPstIで消化して、AmCHS 5'：petHf1：petD8
3'カセットを含む3.5kb断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した3.5kb断片をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）のSmaI末端と連結した。断片が35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1452と命名した（図5）。
【０１７２】
pCGP1452による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1452（図5）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０１７３】
バイナリーベクターpCGP1453（Mac：petHf1：mas 3'）
プラスミドpCGP1453（図8）は、Macプロモーター（Comai et al, 1990, 前記）の制御下にあってアグロバクテリウムのマンノピンシンターゼ遺伝子由来のターミネーター断片（mar 3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。キメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０１７４】
プラスミドpCGP628（国際特許出願番号PCT/AU94/00265に記載）を制限エンドヌクレアーゼPstIで消化して、Mac：petHf1：mas 3'遺伝子を含む3.9kb断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片をpWTT2132（DNAP）のSmaI末端と連結した。Mac：petHf1：mas 3'遺伝子が35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNA の制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1453と命名した（図8）。
【０１７５】
pCGP1453による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1453（図8）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０１７６】
バイナリーベクターpCGP1457（petD8 5'：petHf1：pet D8 3'）
プラスミドpCGP1457（図9）は、ペチュニアPLTP遺伝子由来のプロモーター断片（petD8 5'）の制御下にあってペチュニアPLTP遺伝子由来のターミネーター断片（petD8 3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。キメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SURD遺伝子に対して縦列配置にある。
【０１７７】
バイナリーベクターpCGP1457の調製における中間体
ペチュニアD8ゲノムクローンの単離
λ2001におけるP. hybrida cv. OGB（Old
Glory Blue）ゲノムライブラリーの調製
Holton, 1992（前記）に記載された通りにゲノムDNAのSau3Aによる部分消化を用いて、ペチュニア（Petunia hybrida cv.
OGB）DNAからのゲノムDNAライブラリーをベクターλ2001（Kant et al., Gene 32: 217-224, 1984）中に構築した。ペチュニアD8遺伝子に関するOGBゲノムライブラリーのスクリーニングはHolton, 1992, 前記に記載されている。
【０１７８】
D8ゲノムクローンOGB2.6の単離
D8. Oligo #2
2010193895.tif 000010
（SEQ ID NO:6）に相当する非変異型ゲノムクローンを見いだす目的でPCRを行い、Oligo #4
2010193895.tif 000011
（SEQ ID NO:7）を、OGBゲノムライブラリーの一次スクリーニングによって単離したクローンからのファージ懸濁液の4μLを用いて、D8遺伝子断片をイントロン領域全体にわたって増幅するために用いた。反応は1×Amplification Buffer（Cetus）、0.2μM dNTP混合物、1μg未満のテンプレートDNA、50pmoleの各プライマーおよび0.25μLのTaqポリメラーゼ（5単位／μL-Cetus）を含む合計50μLの容積中で行った。反応混合物を30μLの鉱油で覆い、Gene Machine（Innovonics）を用いて温度サイクル処理を行った。反応は以下の条件を用いて30サイクル行った。94℃ 1分間、55℃ 50秒間、72℃
2分間。各PCR反応物の4分の1を、TAEランニングバッファーを用いてアガロースゲルに通した。
【０１７９】
3つのクローン、λOGB-2.4、λOGB-2.5およびλOGB-2.6からは約1kbの断片が得られたが、変異型クローンλOGB-3.2（Holton, 1992, 前記に記載）からは1.25kbの産物が得られた。λOGB-2.6クローンを以降の分析のために選択した。
【０１８０】
pCGP382
ゲノムクローンλOGB-2.6は、D8 cDNAとハイブリダイズする単一の3.9kb XbaI断片を含んでいた。このXbaI断片を単離、精製してpBluescriptII KS-（Stratagene, USA）のXbaI末端と連結した。このクローンの制限マッピングにより、3'末端から350bpの箇所に内部PstI部位が示された。しかし、pCGP13中の「変異型」ゲノムクローンは、コード領域の開始「ATG」と推定される箇所（その3'末端から約1.5kbのところ）に内部PstIを有しており、この2つのクローンでPstI部位の位置が異なることからλOGB-2.6のXbaI断片はD8の全ゲノム配列は含まないことが示唆された。PstIで消化したλOGB-2.6 DNAに対してサザンブロット法を行ったところ、2.7kbの断片がD8 cDNAとハイブリダイズすることが判明した。制限エンドヌクレアーゼマッピングにより、この断片が3' コード領域および隣接配列を含むことが確認された。
【０１８１】
D8の全ゲノム配列を含む断片を得るために、さまざまなクローニング工程を試みた。λOGB-2.6の2.7kbのPstI断片を精製し、pBluescriptII KS-（Stratagene, USA）のPstI末端と連結した。この結果得られたクローンをXbaIで消化して350bpのPstI／XbaI断片を取り出した。この断片をλOGB-2.6由来の3.9kbのXbaI断片により置換してプラスミドpCGP382を作製した。
【０１８２】
制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびNcoIで消化して、pCGP382中のD8 2.6遺伝子由来のプロモーター領域を含む3.2kb断片を遊離させた。この断片を精製し、pJB1（Bodean, 「Bronze-2および他のトウモロコシアントシアニン遺伝子の分子的および遺伝的な調節（Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize
anthocyanin genes）」、学位論文、Stanford University, USA, 1994）の4.8kb NcoI／HindIII断片と連結して、petD8 5'：GUS：nos 3'カセットを含むpCGP1101を作製した。
【０１８３】
制限エンドヌクレアーゼBspHIおよびBamHIで消化して、プラスミドpCGP602（Holton et al, 1993a, 前記）（SEQ ID NO:1）（図2）から1.6kbのペチュニアF3'5'H petHf1断片を遊離させた。この断片を精製し、pCGP1101の6.2kbのNcoI／BamHI断片と連結して、petD8 5'：petHf1：nos
3'発現カセットを含むpCGP1102を作製した。
【０１８４】
0.75kbのBamHI petD8 3'断片（Holton, 1992, 前記）をプラスミドpCGP13ΔBamHIから精製し、pCGP1102のBamHI／bglII末端と連結して、petD8 5'：petHf1：petD8
3'発現カセットを含むプラスミドpCGP1107を作製した。
【０１８５】
このプラスミドpCGP1107を制限エンドヌクレアーゼXbaIで消化して線状化し、突出末端を修復した上で、制限エンドヌクレアーゼPstIで消化して、petD8 5'：petHf1：petD8 3'発現カセットを含む5.3kb断片を遊離させた。この断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）のSmaI／PstI末端と連結した。petD8
5'：petHf1：petD8 3'遺伝子が、35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体からから単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1457と命名した（図9）。
【０１８６】
pCGP1457による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1457（図9）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０１８７】
バイナリーベクターpCGP1461（短いpetFLS
5'：petHf1：patFLS 3'）
プラスミドpCGP1461（図10）は、ペチュニアフラボノールシンターゼ（FLS）遺伝子由来のプロモーター断片（短いpetFLS 5'）の制御下にあってペチュニアFLS遺伝子由来のターミネーター断片（petFLS 3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。このキメラのペチュニアF3'5'H遺伝子は、バイナリーベクターpWTT2132（図6）の35S 5'：SuRB遺伝子に対して縦列配置にある。
【０１８８】
バイナリーベクターpCGP1461の調製における中間体
ペチュニアFLS遺伝子の単離
P. hybrida cv. Th7ゲノムライブラリーの調製
ペチュニア（P. hybrida cv. Th7）のゲノムライブラリーを、Sambrookら（1959, 前記）に従い、ゲノムDNAのSau3A部分消化を用いて調製した。部分的に消化されたDNAをEMBL-3λベクター（Stratagene,
USA）中にクローニングした。
【０１８９】
Th7ゲノムDNAライブラリーを、ペチュニアFLS cDNAクローン（Holton et al, Plant J. 4:
1003-1010, 1993b）の32P標識断片により、高ストリンジェンシー条件を用いてスクリーニングした。
【０１９０】
2つのゲノムクローン（FLS2およびFLS3）を以降の分析のために選択したところ、これらはペチュニアFLSコード領域の開始メチオニンと推定されるものの上流にある配列を含むが、FLS2の方がFLS3よりも長いプロモーター領域を含むことが明らかになった。
【０１９１】
pCGP486
ゲノムクローンFLS2を制限エンドヌクレアーゼXhoIで消化して、6kb断片を遊離させた。短いペチュニアFLS遺伝子を含む断片を精製し、pBluescript SK（Stratagene, USA）のXhoI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP486と命名した。
【０１９２】
pCGP487
ゲノムクローンFLS3を制限エンドヌクレアーゼXhoIで消化して、9kb断片を遊離させた。ペチュニアFLS遺伝子を含む断片を精製し、pBluescript SK（Stratagene, USA）のXhoI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP487と命名した。
【０１９３】
pCGP717
制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびPstIで消化して、プラスミドpCGP487から、翻訳開始部位と推定されるものの上流にある2.2kbのペチュニアFLSプロモーター断片を遊離させた。生じた断片を精製し、pBluescriptII
KS+（Stratagene, USA）のXhoI／PstI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP717と命名した。
【０１９４】
pCGP716
制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびSacIで消化して、プラスミドpCGP487から、翻訳終止部位と推定されるものの下流にある0.95kbのペチュニアFLSターミネーター断片を遊離させた。生じた断片を精製し、pBluescriptII
KS+（Stratagene, USA）のHindIII／SacI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP716と命名した。
【０１９５】
pCGP493（短いpetFLS 5'：petFLS
3'発現カセット）の構築
短いペチュニアFLSプロモーター断片を含む1.8kb断片を、プラスミドpCGP717をテンプレートとして用い、T3プライマー（Stratagene, USA）およびFLS-Ncoプライマー
2010193895.tif 000012
（SEQ ID NO:19）を用いるPCRによって増幅した。PCR産物を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびClaI消化し、精製した断片をpCGP716のXhoI／ClaI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP493と命名した。
【０１９６】
pCGP497（短いpetFLS 5'：petHf1：petFLS 3'発現カセット）の構築
制限エンドヌクレアーゼBspHIおよびFspIで消化して、プラスミドpCGP627（上記）からペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを遊離させた。このBspHI認識配列は翻訳開始コドンと推定されるものを含み、FspI認識配列は終止コドンの2bp下流から始まる。生じたペチュニアF3'5'H petHf1断片を精製し、プラスミドpCGP493のClaI（修復末端）／NcoI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP497と命名した。
【０１９７】
pCGP1461（短いpetFLS 3'：petHf1：petFLS 3'バイナリーベクター）
プラスミドpCGP497を、制限エンドヌクレアーゼSacIで消化して線状化した。突出末端を修復し、制限エンドヌクレアーゼKpnIで消化して、短いpetFLS 5'：petHf1：petFLS 3'遺伝子発現カセットを含む4.35kb断片を遊離させた。生じた断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）のPstI（末端は修復）／KpnI末端と連結した。断片がpWTT2132の35S 5'、SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1461と命名した（図10）。
【０１９８】
pCGP1461による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1461（図10）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０１９９】
バイナリーベクターpCGP1616（petRT 5'：petHf1：nos 3'）
プラスミドpCGP1616（図11）は、ペチュニア（P. hybrida）3RT遺伝子（Brugliera,
1994, 前記）由来のプロモーター断片（paRT 5'）の制御下にあってアグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子（Depicker et al., 1982, 前記）由来のターミネーター断片（nos
3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。このキメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB遺伝子に対して縦列配置にある。
【０２００】
バイナリーベクターpCGP1616の調製における中間体
ペチュニア3RT遺伝子の単離
EMBL3におけるP. hybrida cv. Th7ゲノムDNAライブラリーの構築
ペチュニア（Petunia hybrida cv. Th7）ゲノムライブラリーを、Sambrook et al, 1989, 前記に従って、ゲノムDNAのSau3A部分消化を用いて調製した。部分的に消化されたDNAをEMBL-3λベクター（Stratagene, USA）中にクローニングした。ペチュニア3RT遺伝子に関するTh7ゲノムライブラリーのスクリーニングは、Brugliera, 1994, 前記に記載された通りに行った。
【０２０１】
制限エンドヌクレアーゼPstIおよびBamHIで消化して、プラスミドpCGP84G（described in I3rugliera, 1994, 前記）から、petRT 5'：petHf1：nos
3'カセットを含む3kb断片を遊離させた。精製した断片をpWTT2132（DNAP）（図6）のPstI／BamHI末端と連結した。断片がpWTT2132の35S 5'、SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1616と命名した（図11）。
【０２０２】
pCGP1616による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1616（図11）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２０３】
バイナリーベクターpCGP1623（mas／35S：petHf1：ocs 3'）
プラスミドpCGP1623（図12）は、アグロバクテリウムのマンノピンシンターゼ遺伝子のプロモーター（mar）由来の増強配列を備えたカリフラワーモザイクウイルス35S遺伝子由来のプロモーター断片（35S 5'）およびアグロバクテリウムのオクトピンシンターゼ遺伝子由来のターミネーター断片（ocs 3'）からなる、pRIWI101（Janssen and Gardner, 1989, 前記）中に含まれる発現カセットの制御下にあるキメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。このキメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB遺伝子に対して縦列配置にある。
【０２０４】
バイナリーベクターpCGP1623の調製における中間体
制限エンドヌクレアーゼBspHIおよびSmaIで消化して、プラスミドpCGP1303（図4）中に含まれるペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンの約1.6kbの断片を遊離させた。このペチュニアF3'5'H petHf1断片を精製し、pKIWI101（Janssen and Gardner, 1989, 前記）の約4.9kbのNcoI／EcoRI（修復末端）断片と連結して、プラスミドpCGP1619を作製した。
【０２０５】
制限エンドヌクレアーゼXhoIによるプラスミドpCGP1619の部分消化により、mas／35S：petHf1：oct 3'発現カセットを含む4.9kb断片を遊離させた。この断片を精製し、pWTT2132（DNAP）（図6）のSalI末端と連結した。断片が35S 5' SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1623と命名した（図12）。
【０２０６】
pCGP1623による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1623（図12）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２０７】
バイナリーベクターpCGP1638（35S 5'：petHf1：ocs 3'）
プラスミドpCGP1638（図13）は、CaMV 35Sプロモーター（35S 5'）の制御下にあってオクトピンシンターゼターミネーター（ocs 3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。ペチュニアクロロフィルa／b結合タンパク質遺伝子（Cab 22遺伝子）（Harpster et al, 1988, 前記）由来の約60bpの非翻訳リーダー配列が、CaMV 35Sプロモーター断片とペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンとの間に含まれている。このキメラのペチュニアF3'5'HカセットはバイナリーベクターpWTT2132（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２０８】
バイナリーベクターpCGP1638の調製における中間体
pCGP1273の構築物
バイナリーベクターpJI3499（Jones et al,
Transgenic Research 1: 285-297, 1992）由来の35S 5'：GUS：ocs 3'遺伝子を含む約3kbのHindIII／HpaI断片を、プラスミドpBluescript KS II(+)（Stratagene, USA）のHindIII／SmaI末端にサブクローニングすることにより、プラスミドpCGP1273を構築した。
【０２０９】
pCGP1634の構築
続いて、pCGP1273由来の35S 5'：GUS：ocs 3'遺伝子を含む約3kbのHindIII／BamHI断片を単離し、クローニングベクターpUC19（New England Biolabs）のHindIII／BamHI末端と連結してプラスミドpCGP1634を作製した。
【０２１０】
pCGP1636の構築
pCGP1634を制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびXbaIで消化することによってプラスミドpCGP1634からGUS断片を除去し、35S 5'プロモーター断片、ocs 3'ターミネーター断片およびpUC19ベクター骨格を含む約3.7kbの断片を精製した。
【０２１１】
制限エンドヌクレアーゼBspIIIおよびXbaIで消化して、pCGP1303（図4）からペチュニアF3'5'H
petHf1 cDNAクローンを遊離させた。この結果得られた約1.6kbの断片を精製し、pCGP1634由来の約3.7kbのNcoI／XbaI断片と連結した。このペチュニアF3'5'H petHf1断片がが正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られた35S 5'：petHf1：ocs 3'遺伝子を含むプラスミドをpCGP1636と命名した。
【０２１２】
pCGP1638の構築
制限エンドヌクレアーゼPstIおよびEcoRIでpCGP1636を消化して、プラスミドpCGP1636から35S 5'：petHf1：ocs 3'遺伝子を遊離させた。末端を修復し、約2.6kbの断片を精製して、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）のSam末端と連結した。この35S
5'：petHf1：ocs 3'遺伝子が35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1638と命名した（図13）。
【０２１３】
pCGP1638による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1638（図13）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２１４】
バイナリーベクターpCGP1860（RoseCHS 5'：petHf1：nos 3'）
プラスミドpCGP1860（図14）は、バラのカルコンシンターゼ遺伝子由来のプロモーター断片（Rose CHS 5'）の制御下にあってアグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子由来のターミネーター断片（nos 3'）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf1）遺伝子を含む。このキメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２１５】
バイナリーベクターpCGP1860の調製における中間体
バラCHSプロモーターの単離
カーディナル種バラ（Rosa cv. Kardinal）の若葉から単離したゲノムDNAから、バラのゲノムDNAライブラリーを調製した。
【０２１６】
カーディナル種バラのゲノムDNAライブラリーを、プラスミドpCGP634に含まれるバラCHS cDNAクローンの32P標識断片によってスクリーニングした。ペチュニアCHS cDNA断片（pCGP701に含まれるクローン1F11、Brugliera et al, 1994, 前記）をプローブとして用いる、カーディナル種バラの花弁から単離したRNAより調製した花弁cDNAライブラリー（Tanaka et al, 1995, 前記）のスクリーニングにより、バラCHS
cDNAクローンを単離した。その条件はTanaka et al, 1995（前記）に記載されている。
【０２１７】
バラのゲノムクローン（roseCHS20λ）を以降の分析のために選択したところ、これはバラCHSコード領域の開始メチオニンと推定されるものの上流にある約6.4kbの配列を含むことが判明した。
【０２１８】
翻訳開始部位から上流の約6.4kbの断片を、pBluescript
KS(-)（Statagene）中にクローニングし、このプラスミドをpCGP1114と命名した。
【０２１９】
プラスミドpCGP1114を制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびEcoRVで消化して2.7〜3.0kbの断片を遊離させ、これを精製して、pUC19（New England Biolabs）のHindIII／SmaI末端と連結した。バラCHSプロモーター断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1116と命名した。バラCHSプロモーター断片のDNA配列を、pCGP1116をテンプレートとして用いて決定した（SEQ ID NO:5）。
【０２２０】
pCGP197（pUC18骨格中にRoseCHS
5' GUS：nos 3'がある）の構築
制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびAsp718で消化して、プラスミドpCGP1116から、バラカルコンシンターゼプロモーター（RoseCHS 5'）を含む約3.0kbの断片を遊離させた。この断片を精製し、ベクター骨格、β-グルクロニダーゼ（GUS）およびnos 3'断片を含むpJB1（Bodeau, 1994, 前記）由来のHindIII／Asp718断片と連結した。がバラCHSプロモーター断片がGUSコード配列の上流に正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP197と命名した。
【０２２１】
pCGP200（pUC18骨格中にRoseCHS
5'：petHf1：nos 3'がある）の構築
制限エンドヌクレアーゼBspHIおよびSacIで消化して、プラスミドpCGP1303（上記）（図4）から、ペチュニアF3'5'H（petHf1）断片を含む1.8kb断片を遊離させた。このペチュニアF3'5'H petHf1断片を精製し、pCGP197のNcoI／SacI末端と連結した。ペチュニアF3'5'H petHf1断片がバラCHSプロモーターとnos 3'断片との間に正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP200と命名した。
【０２２２】
pCGP1860（バイナリーベクター中にRoseCHS 5'：petHf1：nos 3がある）の構築
制限エンドヌクレアーゼBglIIで消化して、プラスミドpCGP200から、RoseCHS 5'：petHf1：nor
3'カセットを含む約4.9kbの断片を遊離させた。断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）のBamHI末端と連結した。断片がpWTT2132の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1860と命名した（図13）。
【０２２３】
pCGP1860による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1560（図14）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２２４】
バイナリーベクターpCGP2123（CaMV 35S：petHf2：ocs 3'）
プラスミドpCGP2123（図15）は、CaMV 35Sプロモーターの制御下にあってアグロバクテリウムのオクトピンシンターゼ遺伝子のターミネーター断片（ocs 3）を有する、キメラのペチュニアF3'5'H（petHf2）遺伝子を含む。このキメラのペチュニアF3'5'Hカセットは、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２２５】
バイナリーベクターpCGP2123の調製における中間体
pCGP1988（バイナリーベクターpWTT2132の誘導体）の構築
バイナリーベクターpCGP1988（図16）は、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）を基にしているが、pNEB193（New England Biulabs）由来のマルチクローニングサイトを含む。プラスミドpNEB193をまず制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化して線状化した。突出末端を修復し、制限エンドヌクレアーゼPstIで消化してマルチクローニング断片を遊離させた。断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）のSalI（末端は修復）／PstI末端と連結した。マルチクローニング断片がpWTT2132に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1988と命名した（図16）。
【０２２６】
pCGP2000（pBluescript中にCaMV 35Sプロモーター断片がある）の構築
プラスミドpCGP2000は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター断片をpBluescript SK（Stratagen；USA）骨格中に含む中間体プラスミドである。制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびPstIで消化して、pKIWI101（Janssen and Gardner, 1989, 前記）由来のCaMV 35Sプロモーター断片を遊離させた。生じた約0.35kbの断片を精製し、ベクターpBluescript SKのXbaI／PstI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。 このプラスミドをpCGP2000と命名した。
【０２２７】
pCGP2105（pBluescript中にCaMV 35S 5'およびocs 3'断片がある）の構築
プラスミドpCGP2105（図17）は、CaMV 35Sプロモーター断片を、アグロバクテリウムのオクトピンシンターゼ遺伝子由来のターミネーター断片（ocs 3'）とともに含んでおり、これはいずれもpKIWI101（Janssen and Gardner, 1989, 前記）に由来する。
【０２２８】
プラスミドpKIWI101をまず制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化した後に、突出末端を修復し、最後に制限エンドヌクレアーゼXhoIで消化して1.6kb断片を遊離させることにより、pKIWI101（Janssen and Gardner, 1989, 前記）からocs 3'断片を単離した。この断片を次にpCGP2000のHindIII／XhoI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP2105と命名した（図17）。
【０２２９】
pCGP2109（pBluescript中にCaMV 35S：petHf2：ocs
3'遺伝子がある）の構築
プラスミドpCGP2109は、CaMV 35S：petHf2：ocs 3'発現遺伝子カセットをpBluescript骨格中に含んでいた。
【０２３０】
制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびSspIで消化して、pCGP175（Holton et al, 1993a, 前記）から、1.8kbのペチュニアF3'5'H petHf2 cDNAクローンを遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片をpCGP2105（上記）（図17）のPstI（末端は修復）／EcoRV末端と連結した 。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP2109と命名した。
【０２３１】
pCGP2123（CaMV 35S：petHf2：ocs 3'バイナリーベクター）の構築
制限エンドヌクレアーゼAsp718およびXbaIで消化して、pCGP2109からCaMV 35S：pctHf2：ocs 3'カセットを遊離させた。突出末端を修復し、この結果得られたCaMV 35S：petHf2：ocs 3'遺伝子を含む約3.7kbの断片を精製し、バイナリーベクターpCGP1988（図16）のAsp718修復末端と連結した。CaMV 35S：petHf2：ocs
3'遺伝子が35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP2123と命名した（図15）。
【０２３２】
pCGP2123による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2123（図15）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２３３】
実施例5
トランスジェニックバラの分析
実施例4に記載した実験で作製したトランスジェニックバラを開花するまで生育させた。花を収集し、花弁の色をRoyal Horticultural Society Colour Charts（RHSCC）を用いてコード化した。アントシアニンを抽出し、TLCおよび／またはHPLC分析によって、アントシアニジン（特にデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の存在）に関して分析した。花弁組織から全RNAも単離し、ペチュニアF3'5'H導入遺伝子、内因性バラCHS遺伝子およびSuRB導入遺伝子の転写物を検出する目的でノーザンブロット分析を用いた。このトランスジェニック分析の結果を表6にまとめた。
【０２３４】
250種を上回るトランスジェニックのカーディナル種バラを作製したが（表6）、色の変化した花を生じたものは皆無であった。TLCおよび／またはHPLC分析では、デルフィニジンおよびデルフィニジンを基にした分子性の色素の蓄積はいずれも検出されず、このことから効率的なF3'5'H活性が存在しないことが裏づけられた。続いて行った、これらのトランスジェニックバラの花弁組織から単離した全RNAに関するノーザン分析でも、検出可能な完全なペチュニアF3'5'H（petHf1またはpetHf2）転写物が認められないか、いくつかの場合に（脚注参照）分解された転写物が認められたのみであった。選択マーカー遺伝子（SuRB）または内因性バラCHS cDNAプローブを用いて同じ膜のハイブリダイゼーションを行ったところ、不連続的なハイブリダイズ性転写物が認められ、このことから単離した全RNAは分解されていないことが示された。SuRB導入遺伝子の転写物の検出により、これらのバラがトランスジェニック性であることが確かめられた。
【０２３５】
（表６）種々のペチュニアF3'5'H（petHf1またはpetHf2）遺伝子発現カセットからのT-DNAによる形質転換を行ったバラ花弁のトランスジェニック分析の結果
2010193895.tif 000013
EVENT＝発生した独立なトランスジェニックイベントの数
DEL＝花弁においてデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が（TLCまたはHPLCにより）検出されたトランスジェニックイベントの数／分析したイベントの総数
RNA＝バラ花弁から単離した全RNA中にノーザンブロット分析により完全なF3'5'H（petHf1またはpetHf2）転写物が検出されたトランスジェニックイベントの数／分析したイベントの総数
1＝分析した34件中5件で分解した転写物が検出された
2＝分析した13件中8件で分解した転写物が検出された
3＝分析した12件中8件で分解した転写物が検出された
【０２３６】
記載したT-DNAによる形質転換を行ったトランスジェニックバラ花弁で完全なペチュニアF3'5'H（petHf1またはpetHf2）転写物が全く検出されなかったという事実（表6）により、さまざまな可能性が示唆された。
【０２３７】
1．単離したRNAが分解された。RNAを臭化エチジウムで染色してUV光の下で可視化しているため、これは該当しない。単離したRNAの質の指標として、視認しうる完全なリボソームRNAバンドを用いた。さらに、内因性バラCHS遺伝子およびSuRB導入遺伝子の完全長転写物が検出されたことにより、RNA標本は分解されなかったことが裏づけられた。
【０２３８】
2．評価したキメラのF3'5'H遺伝子の転写が開始されなかった。ノーザン分析によってF3'5'H転写物が検出されなかったため、分析した発現カセットの一部ではこの可能性がある。しかし、カーネーションおよびペチュニアなどの他の植物では、ペチュニアF3'5'H発現カセットのすべてが機能的である（すなわち、完全な転写物を生じ、デルフィニジンを基にした色素を生じさせる）ことが証明されている。
【０２３９】
3．ペチュニアF3'5'H petHf1およびpetHf2のmRNAはバラにおいて不安定である。いくつかのイベントの花弁から単離した全RNA中に、分解されたペチュニアF3'5'H転写物がノーザン分析によって検出されているため、これも可能性がある。しかし、ペチュニアpetHf1およびpetHf2のmRNAは、カーネーションおよびペチュニアなどの他の植物では安定なことが証明されている。このような不安定性は、mRNA代謝回転をもたらす異常な翻訳、バラ細胞において本来的に不安定な配列の何らかの特徴、1つまたは複数の他の何らかの要因に起因する可能性がある。
【０２４０】
このため、バラ花弁における遺伝子の発現を効率的に推進させると考えられる適したプロモーター断片を見いだすこと、ならびにバラ花弁に蓄積して機能的なF3'5'H活性およびデルフィニジンを基にした色素の生成をもたらすと考えられる適したF3'5'H配列を見いだすことに対しては需要があった。
【０２４１】
実施例6
バラにおけるプロモーターの評価
GUS遺伝子発現カセットの開発
プロモーター断片およびターミネーター断片の評価をGUSレポーター遺伝子を用いて行った。このため、バラの花における効率的な転写開始をもたらす発現カセットを同定する試みとして、数多くのプロモーターをβ-グルクロニダーゼレポーター遺伝子（GUS）（Jefferson et al, 1987, 前記）と連結して、バラに導入した。
【０２４２】
評価したプロモーター断片およびターミネーター断片の概要を表7に示した。
【０２４３】
（表７）バラにおいて評価したキメラのGUS遺伝子発現カセットの一覧表
2010193895.tif 000014
【０２４４】
バイナリーベクターpCGP1307（petD8 5'：GUS：petD8 3'）
プラスミドpCGP1307（図18）は、プロモーターの制御下にあってペチュニアPLTP遺伝子由来のターミネーター断片（それぞれpetD8 5'およびpetD8 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。このキメラのGUSレポーター遺伝子カセットは、バイナリーベクターpCGN1548（McBrideおよびSunimerfelt, 1990, 前記）のmas 5'：nptII：mas 3'選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２４５】
バイナリーベクターpCGP1307の調製における中間体
pCGP1101（実施例4参照）由来のnos 3'断片を0.75kbのpetD8
3'断片（Holton, 1992, 前記）に置き換えて、petD8
5'：GUS：petD8 3'発現カセットを含むプラスミドpCGP1106を作製した。。
【０２４６】
制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびPstIで消化して、プラスミドpCGP1106から、petD8 5'：GUS：petD8 3'発現カセットを含む5.3kb断片を遊離させた。この断片を精製し、バイナリーベクターpCGN1548（McBride and Summerfelt, 1990, 前記）のHindIII／PstI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1307と命名した（図18）。
【０２４７】
pCGP1307による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1307（図18）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２４８】
バイナリーベクターpCGP1506（長いpetFLS
5'：GUS：petPLS 3'）
プラスミドpCGP1506（図19）は、プロモーター断片の制御下にあってペチュニアフラボノールシンターゼ遺伝子由来のターミネーター断片（それぞれpetFLS 5'およびpetFLS 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。このキメラのGUSレポーター遺伝子カセットは、バイナリーベクターpBIN19（Bevan、Nucleic
Acids Res 12: 8711-8721, 1984）のnos 5'：nptII：nc's 3'選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２４９】
バイナリーベクターpCGP1506の調製における中間体
制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびPstIで消化して、プラスミドpCGP486（実施例4に記載）から、翻訳開始部位と推定されるものの上流にある4kbの長いペチュニアFLSプロモーター断片を遊離させた。生じた断片を精製し、pBluescript II KS+（Stratagene, USA）のXhoI／PstI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP715と命名した。
【０２５０】
pCGP494（長いpetFLS 5'：petFLS
3'発現カセット）の構築
長いペチュニアFLSプロモーター断片を含む4.0kb断片を、テンプレートとしてのプラスミドpCGP715ならびにT3プライマー（Stratagene,
USA）およびFLS-Ncoプライマー
2010193895.tif 000015
（SEQ ID NO:19）を用いるPCRによって増幅した。PCR産物を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびClaIで消化し、精製した断片をpCGP716（実施例4に記載）のXhoI／ClaI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP494と命名した。
【０２５１】
pCGP496（長いpetFLS 5'：GUS：petFLS 3'発現カセット）の構築
制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびSmaIで消化して、プラスミドpJB1（Bodeau, 1994, 前記）からGUSコード配列を遊離させた。生じたGUS断片を精製し、プラスミドpCGP494のClaI（修復末端）／NcoI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP496と命名した。
【０２５２】
pCGP1506（長いpetFLS 5'：GUS：petFLS 3'バイナリーベクター）の構築
プラスミドpCGP496をまず制限エンドヌクレアーゼXhoIで消化して線状化した。突出末端を部分的に修復し（修復反応にはdTTPおよびdCTPのみを使用）、制限エンドヌクレアーゼSacIで消化して、長いpetFLS 5'：GUS：petFLS 3'遺伝子発現カセットを含む6.7kb断片を遊離させた。生じた断片を精製し、バイナリーベクターpBIN19のBamHI（修復反応にdGTPおよびdATPを用いて部分的に修復）／SacI末端と連結した。断片がnos 5'：nptII：nos 3'選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、カナマイシン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1506と命名した（図19）。
【０２５３】
pCGP1506による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1506（図19）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２５４】
バイナリーベクターpCGP1626（chrysCHS
5'：GUS：petRT 3'）
プラスミドpCGP1626（図20）は、キクのカルコンシンターゼ遺伝子由来のプロモーター断片（chrysCHS 5'）の制御下にあってペチュニアの3RT遺伝子（Brugliera, 1994, 前記）由来のターミネーター断片（petRT 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。このキメラGUSレポーター遺伝子カセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２５５】
バイナリーベクターpCGP1626の調製における中間体
キクCHSプロモーターの単離
キクHero品種（chrysanthemum cv Hero）の若葉材料から単離したゲノムDNAから、キクのゲノムDNAライブラリーを調製した。
【０２５６】
キクのゲノムDNAライブラリーを、高ストリンジェンシー条件を用いて、キクCHS cDNAクローン（SEQ ID NO:28）（プラスミドpCGP856中に含まれる）の32P標識断片によってスクリーニングした。プラスミドpCGP856は、キクDark Pink Pom Pom品種（chrysanthemum cv. Dark Pink Pom Pom）から単離したRNAより調製された花弁cDNAライブラリーから単離した、1.5kbのCHS cDNAクローンを含む。
【０２５７】
1つのゲノムクローン（CHS5）を以降の分析のためにさらに選択したところ、これはキクCHSコード領域の開始メチオニンと推定されるものの上流にある約3kbの配列を含むことが明らかになった。
【０２５８】
制限エンドヌクレアーゼHindIIIによるゲノムクローンCHS5の消化により、4kb断片を遊離させた。キクCHSプロモーターを含む断片を精製し、pBluescript SK（Stratagene, USA）のHindIII末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1316と命名した。
【０２５９】
翻訳開始部位と推定されるものの上流にある2.6kbのキクCHSプロモーター断片を、テンプレートとしてのpCGP1316ならびにプライマー「chrysanCHSATG」
2010193895.tif 000016
（SEQ ID NO:8）およびM13逆方向プライマー（Stratagene, USA）を用いるPCRによって増幅した。プライマー「chrysanCHSATG」は、クローニングを容易にするためにNcoI制限エンドヌクレアーゼ認識配列を翻訳開始点と推定される箇所に組み入れた。このPCR断片を精製し、pBluescript KS（Holton and Graham、Nuc. Acids Res. 19: 11-6,
1990）のEcoRV（dT尾部を有する）末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1620と命名した。pCGP1620に含まれるキクCHSプロモーター断片のヌクレオチド配列はSEQ ID NO:30として示している。
【０２６０】
pCGP1622（pUC骨格中にchrysCHS
5'：GUS：nos 3'がある）の構築
制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびPstIで消化して、プラスミドpCGP1620から、キクCHSプロモーターを含む約2.5kbの断片を遊離させた。この断片を精製し、骨格ベクターならびにGUS断片およびnos 3'断片を含むpJB1（Bodeau,
1994, 前記）の4.8kb NcoI／PstI断片と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1622と命名した。
【０２６１】
pCGP1626（バイナリーベクター中にchysCHS 5'：GUS：nos 3'がある）の構築
制限エンドヌクレアーゼPstIおよびBamHIで消化して、プラスミドpCGP1622から、chrysCHS 5'：GUS：nos 3'カセットを含む約4.6kbの断片を遊離させた。この断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）のPstI／BamHI末端と連結した。カセットが35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1626と命名した（図20）。
【０２６２】
pCGP1626による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1626（図20）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２６３】
バイナリーベクターpCGP1641（petRT 5'：GUS：petRT 3'）
プラスミドpCGP1641（図21）は、3RT翻訳開始コドンと推定されるものから上流の1.1kbにわたるペチュニアSRTプロモーター（petRT 5'）の制御下にあって、3RT終止コドンから下流の2.5kbにわたるペチュニア3RTターミネーター（petRT 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。このキメラのGUSカセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２６４】
バイナリーベクターpCGP1641の調製における中間体
ペチュニア3RT遺伝子の単離
ペチュニア（P. hybrida）のRt遺伝子座に対応するペチュニア3RT遺伝子の単離は、Brugliera, 1994, 前記に記載されている。
【０２６５】
pCGP1625（CaMV 35S：GUS：pet RT 3'カセット）の構築
中間体プラスミドpCGP1625は、pUC骨格中にCaMV 35S：GUS：petRT
3'カセットを含む。制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびSacIで消化して、プラスミドpCGP1610（Brugliera, 1994, 前記に記載）から、petRTターミネーター配列を含む2.5kb断片を遊離させた。この断片を精製し、ベクター骨格ならびにCaMV 35Sプロモーター断片およびGUS断片を含むpJB1（Bodeau, 1994, 前記）のBamHI／SacI 4.9kb断片と連結した。ペチュニア3RTターミネーター断片がGUS断片の下流に正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1625と命名した。
【０２６６】
pCGP1628（petRT 5'：GUS：petRT 3'カセット）の構築
制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびPstIで消化して、プラスミドpCGP1611（Brugliera, 1994, 前記に記載）から1.1kbのpetRTプロモーター断片を遊離させた。精製した断片を、ベクター骨格ならびにGUS断片およびpetRT 3'断片を含むpCGP1625の7kb断片のNcoI／PstI末端と連結した。petRTプロモーター断片がGUS断片の上流に正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1628と命名した。
【０２６７】
pCGP1641（petRT 5' GUS：petRT 3'バイナリーベクター）の構築
制限エンドヌクレアーゼPstIで消化して、pCGP1628から、petRT 5'：GUS：peERT
3'カセットを含む5.4kb断片を遊離させた。この断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）のPstI末端と連結した。断片が35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1641と命名した（図21）。
【０２６８】
pCGP1641による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1641（図21）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２６９】
バイナリーベクターpCGP1861（RoseCHS 5'：GUS：nos 3'）
プラスミドpCGP1861（図22）は、ペチュニア（P. hybrida）のCHS遺伝子のプロモーター断片（RoseCHS 5'）の制御下にあってアグロバクテリウムのnos遺伝子由来のターミネーター断片（nos 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。このキメラのGUSレポーター遺伝子カセットは、バイナリーベクターpWTT2132（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２７０】
制限エンドヌクレアーゼBglIIで消化して、pCGP197（実施例4に記載）から、RoseCHS 5'：GUS：nos 3'カセットを含む約5kbの断片を遊離させた。この断片を精製し、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）のBamHI末端と連結した。断片が35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1861と命名した（図22）。
【０２７１】
pCGP1861による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1861（図22）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２７２】
バイナリーベクターpCGP1953（AmCHS 5'：GUS：petD8 3'）
プラスミドpCGP1953（図23）は、キンギョソウのCHS遺伝子由来のプロモーター断片（AmCHS 5'）の制御下にあってペチュニアPLTPターミネーター（petD8 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。このキメラのGUSレポーター遺伝子カセットは、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２７３】
バイナリーベクターpCGP1953の調製における中間体
プラスミドpJB1（Bodeau, 1994, 前記）を制限エンドヌクレアーゼNcoIによって線状化した。突出末端を修復し、BamHIで消化して1.8kbのGUS断片を遊離させた。このGUS断片を精製し、pBlueseript骨格ベクターならびにAmCHS 5'断片およびpetDB 3'断片を含むpCGP726（実施例4に記載）の5kbのXbaI（末端は修復）／BamHI断片と連結した。GUS断片がAmCHS
5'断片とpetD8 3'断片との間に正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1952と命名した。
【０２７４】
制限エンドヌクレアーゼEagIおよびPstIで消化して、プラスミドpCGP1952から、AmCHS 5'：GUS：petD8 3'発現カセットを含む3.8kb断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片を、Asp718で消化したpWTT2132バイナリーベクター（図6）の修復末端と連結した。断片が35S P：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置に正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。このプラスミドをpCGP1953と命名した（図23）。
【０２７５】
pCGP1953による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1953（図23）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２７６】
バイナリーベクターpWTT2084（35S 5'：GUS：ocs 3'）
プラスミドpWTT2084（DNAP）（図24）は、CaMV 35Sプロモーター（35S
5'）の制御下にあってオクトピンシンターゼターミネーター（ocs 3'）を有する、キメラのGUS遺伝子を含む。ペチュニアクロロフィルa／b結合タンパク質遺伝子（Cab 22遺伝子）（Harpster et al, 1988, 前記）由来の約60bpの5'非翻訳リーダー配列が、CaMV 35Sプロモーター断片とGUSクローンとの間に含まれている。このキメラのGUSカセットは、バイナリーベクターpWTT2084の35S 5'：SuRE選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２７７】
pWTT2084による植物の形質転換
バイナリーベクタープラスミドpWTT2084（図24）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラに導入した。
【０２７８】
GUS発現カセットによる形質転換を行ったバラのトランスジェニック分析
種々のGUS発現カセットのT-DNAによる形質転換を行った、発達段階3〜4のトランスジェニック性カーディナル種バラの花弁から単離した全RNAに対してノーザンブロット分析を行った。ノーザンブロットハイブリダイゼーションによる検出で、蓄積性の転写物がみられない場合もあれば、約1,8kbという予想されるサイズの完全な完全長転写物が検出された場合もあった。バラ花弁に蓄積するGUS転写物の相対レベルを記録した（表8参照）。
【０２７９】
（表８）GUS構築物を含むトランスジェニック性カーディナル種バラの花（つぼみの開いた段階）に対するノーザン分析の概要
2010193895.tif 000017
- ＝転写物が検出されず
+〜+++++ ＝ノーザンブロット分析によって検出された完全長GUS転写物の相対レベル（低〜高）
【０２８０】
以上の結果によれば（表8）、CaMV 35Sプロモーター（35S 5'）およびバラCHSプロモーター（RoseCHS 5'）は、バラ花弁における転写を相対的に高いレベルで推進させるように思われる。キクCHSプロモーター（chrysCHS 5'）も高い転写物レベルをもたらすが、CaMV 35SプロモーターまたはバラCHSプロモーターを用いて得られるほどには高くないように思われる。驚いたことに、キンギョソウ（snapdragon）CHS（AmCHS
5'）、ペチュニア3RT（petRT 5'）、ペチュニアFLS（petFLS 5'）およびペチュニアPLTP（petD8 5'）プロモーターは、これらのプロモーターを組み入れた発現カセットを用いてもGUS転写物が検出されなかったことから、バラ花弁では機能しないように思われる。しかし、これらと同一のプロモーターをpetHf1遺伝子および／またはGUS遺伝子と融合させたものは、カーネーションおよびペチュニアで十分に機能して相対的に高い完全長転写物レベルをもたらし、petHf1遺伝子に関しては、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子性の色素の生成がもたらされることがこれまでに証明されている。GUS遺伝子と融合させたキンギョソウCHSプロモーター（AmCHS 5'）を用いて得られた結果は、他の2つの種（バラおよびキク）由来の相同遺伝子からのプロモーター領域がバラにおいて比較的良好に機能するという点でさらに驚くべきものであった。キンギョソウCHSプロモーターもペチュニアF3'5'H（petHf1）との併用で新たな紫色カーネーションFlorigene Moondustを作製することに成功している（国際特許出願番号PCT/AU96/00296を参照）。
【０２８１】
GUS遺伝子と融合させたプロモーター断片およびターミネーター断片の評価からも、ペチュニアP3'5'H配列をCaMV 35S、バラCHSおよびキクCHSプロモーター（これらはバラでは機能しない）と連結したものを含む構築物はバラにおいて完全なペチュニアF3'5'H petHf1およびpetHf2転写物を生じさせなかったため（表6参照）、ペチュニアF3'5'H petHf1およびpetHf2配列はバラでは不安定であることを示唆するさらなる証拠が得られた。
【０２８２】
実施例7
ペチュニア以外の種からのF3'5'H配列の単離
ペチュニアF3'5'H配列がカーネーション、ペチュニアおよびタバコなどの種々の植物において機能し、最終的にはデルフィニジンを基にした色素の生成をもたらすことはすでに証明されているため、これらの配列がバラでも機能的であると仮定したことは妥当であった。酵素活性が種の背景によって異なる可能性があることは仮定しており、実際にペチュニアF3'5'Hを導入した所定の種の品種間ではそうであった。しかし、完全長の組換えペチュニアF3'5'H
mRNAが蓄積しないことは予想されていなかった。ペチュニアF3'5'Hヌクレオチド配列（petHf1およびpetHf2）の分析からは、不安定性およびその後の分解をもたらす可能性のある配列（Johnson et al, 「転写に関する展望（A look beyond
transcription）」中、ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallic,
eds；1998）も、イントロン：エクソンスプライス部位（Brendel
et al, 「転写に関する展望（A look beyond transcription）」中、ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallic, eds；1998）も、今日までに科学文献に記載されたいかなる自己触媒性または分解誘発性の配列（「転写に関する展望（A look beyond transcription）」中、ASPP, USA,
Bailey-Serres and Gallic, eds；1998）も認められなかった。この驚くべき結果により、ペチュニアF3'5'H配列を不安定化させる、バラに特異的な因子が存在することが示唆された。
【０２８３】
ペチュニアF3'5'H配列がなぜバラでは不安定であるがカーネーション、ペチュニアまたはタバコでは安定であるかが不明なため、何らかのF3'5'H配列がバラで安定であるか否かを判定し、続いて、バラにおける安定なF3'5'H転写物の合成およびF3'5'H活性をもたらし、最終的にはデルフィニジンを基にした色素を生成させて花の色の変化をもたらすF3'5'H配列を同定するための取り組みとして、ある範囲にわたるファミリーから数多くのF3'5'H配列を単離した。
【０２８４】
花弁cDNAライブラリーの構築
表9に記載したさまざまな種の植物の、つぼみの時期から花が開いた時期までの花弁から単離したRNAから花弁cDNAライブラリーを調製した。バラ（Rosa hybrida）はバラ科バラ目バラ亜綱に分類されるため、デルフィニジンを基にした色素を産生し、すなわち機能的なF3'5'Hを含み、バラ亜綱に属する種を選択した。ペチュニア（Petunia
hybrida）はナス科ナス目キク亜綱に分類されるため、デルフィニジンを基にした色素を産生したキク亜綱由来の種も選択した。
【０２８５】
（表９）花弁cDNAライブラリーの調製のために全RNAを単離した花の一覧
2010193895.tif 000018
2003年8月時点でNational Center for
Biotechnology Information（NCBI）のウェブサイトからTaxonomy browser（TaxBrowser）によって入手した情報。
【０２８６】
別に記載する場合を除き、Tuqen and Griffith（BioTechniques 4: 11-15, 1986）の方法を用いて、紫色／青色の花弁組織から全RNAを単離した。oligotex-dT（商標）（Qiagen）を用いて、またはoligo-dTセルロースクロマトグラフィー（Aviv and Lacier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 14-8, 1972）を3サイクル行うことにより、全RNAからポリ(A)＋RNAを選択した。
【０２８７】
一般的には、λZAPII／Gigapack II
Cloningキット（Stratagene, USA）（Short
et al., Nucl. Acids Res. 16: 7583-7600, 1988）を、花弁から単離したポリ(A)＋RNAの5μg前後をテンプレートとして用いて定方向性花弁cDNAライブラリーをλZAPII中に構築するために用いた。得られた組換え体の総数は一般に1×105〜1×106個の範囲であった。
【０２８８】
XL1-Blue MRF'細胞にトランスフェクトした後に、パッケージングしたcDNA混合物を直径15cmのプレート当たり50,000pfu前後でプレーティングした。プレートを37℃で8時間インキュベートし、ファージを100mM NaCl、8mM MgSO4、50mM Tris-HC1 pH8.0、0.01％（w／v）ゼラチン（ファージ保存バッファー（PSB））中で溶解させた（Sambrook et al, 1989, 前記）。クロロホルムを添加し、ファージを増幅ライブラリーとして4℃で保存した。
【０２８９】
一般的には、XL1-Blue MRF'細胞にトランスフェクトした後に、100,000pfu前後の増幅ライブラリーを、NZYプレート（Sanibrook et al, 1989, 前記）上に直径15cmのプレート当たり50,000pfu前後の密度でプレーティングし、37℃で8時間インキュベートした。4℃で一晩インキュベートした後に、2つずつのリフトをColony／Plaque
Screen（商標）フィルター（DuPont）上に採取し、製造元による推奨の通りに処理した。
【０２９０】
プラスミドの単離
ヘルパーファージR408（Stratagene, USA）を用い、製造元によって記載された方法を用いて、増幅したλZAPIIまたはλZAP cDNAライブラリーからのcDNA挿入断片を含むpBluescriptファージミドを切り出した。
【０２９１】
花弁cDNAライブラリーのスクリーニング
ハイブリダイゼーションの前に、2つずつのプラークリフトを、予備洗浄液（50mM Tris-HCl pH7.5、1M NaCl、1mM EDTA、0.1％（w／v）サルコシン）中にて65℃で30分間洗浄し；その後、0.4M水酸化ナトリウム中にて65℃で30分間洗浄し；その後、0.2M Tris-HC1 pH 8.0、0.1×SSC、0.1％（w／v）SDS中にて65℃で30分間洗浄して、最後に2×SSC、1.0％（w／v）SDS中ですすぎ洗いした。
【０２９２】
花弁cDNAライブラリー由来の膜上のリフトを、ペチュニアF3'5'H
petHf1 cDNAクローン（Holton et al., 1993a, 前記）を含むpCGP602（図2）（SEQ ID
NO:1）由来の1,6kb BspHI／FspI断片の32P標識断片とハイブリダイズさせた。
【０２９３】
ハイブリダイゼーション条件には、10％v／vホルムアミド、1M NaCl、10％w／v硫酸デキストラン、1％w／v SDS中、42℃での少なくとも1時間のプレハイブリダイゼーションの段階を含めた。続いて、32P標識断片（それぞれ1×106cpm／mL）をハイブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを42℃でさらに16時間続けた上で、フィルターを2×SSC、1％w／v SDS中にて42℃で1時間×2回洗浄し、Kodak XARフィルムに対して増感スクリーンを用いて-70℃で16時間露出させた。
【０２９４】
強くハイブリダイズしたプラークを摘出してPSB（Sambrook
et al., 1989, 前記）に入れ、cDNAライブラリーの初回スクリーニングに関して記載した通りのプレーティング条件およびハイブリダイゼーション条件を用いて、精製プラークを単離するために再びスクリーニングを行った。λZAPIIまたはλZAPバクテリオファージベクター中に含まれているプラスミドを取り出し、cDNA挿入断片の3'末端および5'末端から配列データを得た。ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンに対する配列類似性に基づき、新たなF3'5'H
cDNAクローンを同定した。
【０２９５】
単離されたcDNAクローンに対して、表10に記載した通りにプラスミド指定暗号を付した。
【０２９６】
（表１０）様々な種から単離された、F3'5'H cDNAクローンのプラスミド番号および配列番号
2010193895.tif 000019
【０２９７】
スミレ（パンジー）F3'5'H構築物
スミレ属（パンジー）の花弁からのF3'5'H cDNAクローンの単離
スミレ属ブラックパンジー品種の若蕾の花弁から上記の通りに全RNAおよびポリ(A)＋ RNAを単離した。上記の通りに、λZAPII Gigapack II Cloningキット（Stratagene,
USA）を用いて花弁cDNAライブラリーを構築してスクリーニングを行った。ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローン（SEQ ID NO:1）との配列類似性により、2種類の完全長パンジーF3'5'H cDNAクローン（pCGP1959中のBP#18（SEQ
ID NO:9）（図25）およびpCGP1961中のBP#40（SEQ ID NO:11）（図26））が同定された。BP#18およびBP#40はヌクレオチドレベルで82％の同一性を有していた。パンジーF3'5'Hクローン（BP#18およびBP#40）とペチュニアF3'5'Hとのヌクレオチド配列の比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローンに対しては60％前後の同一性、ペチュニアF3'5'H petHf2クローンに対しては62％の同一性が示された。
【０２９８】
バイナリーベクターpCGP1972およびpCGP1973（AmCHS 5'：BP#18またはBP#40：petD8 3'）
プラスミドpCGP1972（図27）およびpCGP1973（図28）は、パンジーF3'5'H
cDNAクローン（それぞれBP#18およびBP#40）を、キンギョソウ（snapdragon）CHSプロモーター断片（AmCHS 5'）とペチュニアPLTPターミネーター断片（petD8 3'）との間に含む。このキメラのF3'5'H遺伝子は、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にある。
【０２９９】
pCGP725（実施例4に記載）（図7）中のペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを、pCGP725を制限エンドヌクレアーゼBamHIでまず消化することによって除去した。末端を修復し、線状化されたプラスミドをさらに制限エンドヌクレアーゼXbaIで消化した。AmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片を有するベクターを含む約4.9kbの断片を精製し、pCGP1959またはpCGP1961由来のパンジーF3'5'H BP#18またはBP#40 cDNAクローンを含む約1.6kbのKpnI（末端は修復）／XbaI断片とそれぞれ連結して、pCGP1970およびpCGP1971をそれぞれ作製した。続いて、制限エンドヌクレアーゼNotIでまず消化することにより、AmCHS 5'：パンジーF3'5'H：petD8 3'カセットをpCGP1970またはpCGP1971から単離した。線状化されたプラスミドの末端を修復し、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化してキメラのF3'5'H遺伝子を遊離させた。精製した断片を続いてバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）のAsp718（修復末端）と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをそれぞれpCGP1972（図27）およびpCGP1973（図28）と命名した。
【０３００】
pCGP1972および1973によるカーネーションおよびペチュニアの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1972（図27）およびpCGP1973（図28）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーネーションKortina Chanel品種およびMonte Lisa品種ならびにペチュニアSkr4×Sw63品種に別個に導入した。
【０３０１】
バイナリーベクターpCGP1967およびpCGP1969（CaMV 35S：パンジーF3'5'H：ocs
3'）
バイナリーベクターpCGP1967（図29）およびpCGP1969（図30）は、バイナリーベクターpWIT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にあるキメラのCaMV 35S：パンジーF3'5'H：ocs
3'遺伝子を含む。
【０３０２】
バイナリーベクターpCGP1967およびpCGP1969の調製における中間体
プラスミドpCGP1959（図25）およびpCGP1961（図26）を、制限エンドヌクレアーゼKpnIで消化してまず線状化した。KpnI突出末端を修復し、制限エンドヌクレアーゼFstIで消化してパンジーF3'5'H cDNAクローンBP#l8およびBP#40を遊離させた。生じた約4.6kbの断片をpKIWI101（Janssen
and Gardner, 1989, 前記）の約5.9kbのEcoRI（修復末端）／PstI断片と連結した。各断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをそれぞれpCGP1965およびpCGP1966と命名した。
【０３０３】
プラスミドpCGP1965およびpCGP1966を制限エンドヌクレアーゼXhoIによってまず消化した。この結果得られた断片を制限エンドヌクレアーゼXbaIでさらに消化した。突出末端を修復し、CaMV 35S：パンジーF3'5'H：ocs
3'キメラ遺伝子を含む3.6kb断片を単離して、pWTT2132（図6）のAsp718修復末端と連結した。各断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをそれぞれpCGP1967（図29）およびpCGP1969（図30）と命名した。
【０３０４】
pCGP1967およびpCGP1969によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1967（図29）およびpCGP1969（図31）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーディナル種バラおよびSoft Promise種バラに導入した。バイナリーベクタープラスミドpCGP1969（図31）に含まれるT-DNAも、Pamela種およびMedeo種のバラにアグロバクテリウムを介した形質転換によって導入した。
【０３０５】
サルビアF3'5'H構築物
サルビア属の花弁からのF3'5'H cDNAクローンの単離
サルビア属（種苗場から購入）の若い蕾の花弁から上記の通りに全RNAおよびポリ(A)＋RNAを単離した。λZAPII／Gigapack II Cloningキット（Stratagene, USA）を用いて花弁cDNAライブラリーを構築した。ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンとの類似性により、2種類の完全長サルビアF3'5'H cDNAクローン（pCGP1995中のSal#2（SEQ ID NO:13）（図31）およびpCGP1999中のSal#47（SEQ ID NO:15）（図32））を選択した。Sal#2およびSal#47はヌクレオチドレベルで95％の同一性を有していた。サルビアF3'5'Hクローン（Sal#2およびSal#47）とペチュニアF3'5'Hとのヌクレオチド配列の比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:1）に対しては57％前後の同一性、ペチュニアF3'5'H petHf2クローン（SEQ ID NO:3）に対しては58％の同一性が示された。
【０３０６】
バイナリーベクターpCGP2121およびpCGP2122
（AmCHS 5'：サルビアF3'5'H#2または#47：petD8 3'）
プラスミドpCGP2121（図33）およびpCGP2122（図34）は、サルビアF3'5'H
cDNAクローン（それぞれSal#2およびSal#47）を、キンギョソウCHSプロモーター断片（AmCHS 5'）とペチュニアPTLPターミネーター断片（petD8 3'）との間に、バイナリーベクターpWTT2132（DNAP）（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置となるように含む。
【０３０７】
pCGP725（実施例4に記載）（図7）中のペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを、pCGP725を制限エンドヌクレアーゼBamHIでまず消化することによって除去した。末端を修復し、線状化されたプラスミドをさらに制限エンドヌクレアーゼXbaIで消化した。AmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片を有するベクターを含む4.9kb断片を精製し、サルビアF3'5'H#2を含むpCGP1995（図31）由来の約1.6kbのXhoI／BamHI（末端は修復）断片、またはサルビアF3'5'H#47を含むpCGP1999（図32）由来のXhoI／EcoRI（末端は修復）断片とそれぞれ連結して、それぞれpCGP2116およびpCGP2117を作製した。
【０３０８】
制限エンドヌクレアーゼNotIでまず消化することにより、AmCHS
5'：サルビアF3'5'H：petD8 3'カセットをpCGP2116またはpCGP2117から単離した。線状化されたプラスミドの末端を修復し、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化してキメラのF3'5'H遺伝子カセットを遊離させた。続いて約3.6kbの精製断片をバイナリーベクターpCGP1988（図16）（実施例4に記載）のAsp718修復末端と連結した。各断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをそれぞれpCGP2121（図33）およびpCGP2122（図34）と命名した。
【０３０９】
pCGP2121およびpCGP2122によるカーネーションおよびペチュニアの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2121（図33）およびpCGP2122（図34）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーネーションKortina Chanel品種およびMonte Lisa品種ならびにペチュニアSkr4×Sw63品種に別個に導入した。
【０３１０】
バイナリーベクターpCGP2120およびpCGP2119（CaMV 35S：サルビアF3'5'H：ocs
3'）
バイナリーベクターpCGP2120（図35）およびpCGP2119（図36）は、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'
SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置にあるキメラのCaMV 35S：サルビアF3'5'H：ocs 3'遺伝子カセットを含む。
【０３１１】
バイナリーベクターpCGP2120およびpCGP2119の調製における中間体
プラスミドpCGP1995（図31）およびpCGP1999（図32）を、制限エンドヌクレアーゼXhoIで消化してまず線状化した。XhoI突出末端を修復した後に、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化してサルビアF3'5'H cDNAクローンSal#2またはSal#47を遊離させた。pCGP1995の場合にはEcoRIによる部分消化を行った。約1.7kdの断片をpCGP2105（図17）のClaI（修復末端）／EcoRI末端と連結した。各断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをそれぞれpCGP2122およびpCGP2111と命名した。
【０３１２】
プラスミドpCGP2112およびpCGP2111を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびXbaIで消化した。この結果得られた突出末端を修復し、CaMV 35S：サルビアF3'5'H：ocs
3'キメラ遺伝子を含む約3.6kbの断片を単離して、バイナリーベクターpCGP1988（実施例4に記載）のAsp718修復末端と連結した。各断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをそれぞれpCGP2120（図35）およびpCGP2119（図36）と命名した。
【０３１３】
pCGP2120およびpCGP2119によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2120（図35）およびpCGP2119（図36）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーディナル種バラに導入した。
【０３１４】
ソリアF3'5'H構築物
ソリア属の花弁からのF3'5'H cDNAクローンの単離
ソリア属（種苗場から購入）の若い蕾の花弁から上記の通りに全RNAおよびポリ(A)＋RNAを単離した。λZAPII／Gigapack II Cloningキット（Stratagene, USA）を用いて花弁cDNAライブラリーを構築した。ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンとの類似性により、1種類の完全長ソリアF3'5'H cDNAクローン（pCGP2110中のSoll#5（SEQ ID NO:13）（図37））を同定した。ソリアF3'5'HクローンとペチュニアF3'5'Hとのヌクレオチド配列の比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:1）に対しては48％前後の同一性、ペチュニアF3'5'H petHf2クローン（SEQ ID NO:3）に対しては52％の同一性が示された。
【０３１５】
バイナリーベクターpCGP2130（AmCHS 5'：ソリアF3'5'H：petD8 3'）
プラスミドpCGP2130（図38）は、ソリアF3'5'H Soll#5cDNAクローンを、キンギョソウCHSプロモーター断片（AmCHS 5'）とペチュニアPLTPターミネーター断片（petD8 3'）との間に、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置となるように含む。
【０３１６】
pCGP725（実施例4に記載）（図7）中のペチュニアF3t5'H（petHf1）cDNAクローンを、pCGP725をまず制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIで消化することによって除去した。末端を修復し、AmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片を有するベクターを含む約4.9kbの断片を精製して、ソリアF3'5'H cDNAクローンを含むpCGP2110の約1.6kbのAsp718／PstI断片の修復末端と連結してpCGP2128を作製した。ソリアF3'5'H断片がAmCHS 5'断片およびpetDB 3'断片に対して縦列配置に正しく挿入されたことは制限エンドヌクレアーゼマッピングによって確かめた。
【０３１７】
続いて、制限エンドヌクレアーゼNotIでまず消化することにより、AmCHS 5'：ソリアF3'5'H：petD8
3'遺伝子カセットをpCGP2128から単離した。線状化されたプラスミドの末端を修復した上で、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化してキメラのF3'5'H遺伝子を遊離させた。続いて約3.5kbの精製断片をバイナリーベクターpCGP1988（実施例4に記載）（図16）のAsp718（修復末端）と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2130と命名した（図38）。
【０３１８】
pCGP2130によるカーネーションおよびペチュニアの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2130（図38）に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、カーネーションKortina
Chanel品種およびMonte Lisa品種ならびにペチュニアSkr4×Sw63品種に別個に導入した。
【０３１９】
バイナリーベクターpCGP2131（CaMV 35S：ソリアF3'5'H：ocs 3'）
バイナリーベクターpCGP2131（図39）は、キメラのCaMV 35S：ソリアF3'5'H：ocs
3'遺伝子を、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置で含む。
【０３２０】
バイナリーベクターpCGP2131の調製における中間体
プラスミドpCGP2110を、制限エンドヌクレアーゼAsp718で消化してまず線状化した。突出末端を修復した後に、制限エンドヌクレアーゼPstIで消化してソリアF3'5'H cDNAクローンを遊離させた。約1,7kbの断片をpCGP2105（図17）のEcoRV／PstI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、によって確かめた。アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2129と命名した。
【０３２１】
制限エンドヌクレアーゼAsp718およびXbaIで消化して、CaMV 35S：ソリアF3'5'H：ocs
3'キメラ遺伝子を含む3.6kb断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片をバイナリーベクターpCGP1958（図16）のAsp718修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2131と命名した（図39）。
【０３２２】
pCGP2131によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2131（図39）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーディナル種バラに導入した。
【０３２３】
ケネディアF3'5'H構築物
ケネディア属の花弁からのF3'5'H cDNAクローンの単離
ケネディア属（種苗場から購入）の若い蕾の花弁から上記の通りに全RNAおよびポリ(A)＋RNAを単離した。λZAPII／Gigapack II Cloningキット（Stratagene, USA）を用いて花弁cDNAライブラリーを構築した。ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンとの類似性により、1種類の完全長ケネディアF3'5'H cDNAクローン（pCGP2231中のKenn#31（SEQ ID NO:26）（図40））を同定した。ケネディアF3'5'HクローンとペチュニアF3'5'Hとのヌクレオチド配列の比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:1）に対しては60％前後の同一性、ペチュニアF3'5'H petHf2クローン（SEQ ID NO:3）に対しては60％の同一性が示された。
【０３２４】
バイナリーベクターpCGP2256（AmCHS 5'：ケネディアF3'5'H：petD8 3'）
プラスミドpCGP2256（図41）は、ケネディアF3'5'H Kenn#31 cDNAクローンを、キンギョソウCHSプロモーター断片（AmCHS 5'）とペチュニアPLTPターミネーター断片（petD8 3'）との間に、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置となるように含む。
【０３２５】
pCGP725（実施例4に記載）（図7）中のペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを、pCGP725をまず制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIで消化することによって除去した。末端を修復し、AmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片を有するベクターを含む約4.9kbの断片を精製して、ケネディアF3'5'H cDNAクローンを含むpCGP2231の約1.8kbのXhoI／BamHI断片の修復末端と連結してpCGP2242を作製した。ケネディアF3'5'H断片がAmCHS 5'断片およびpetDB 3'断片に対して縦列配置に正しく挿入されたことは制限エンドヌクレアーゼマッピングによって確かめた。
【０３２６】
続いて、制限エンドヌクレアーゼNotIおよびEcoRIでまず消化することにより、AmCHS 5'：ケネディアF3'5'H：petD8 3'遺伝子カセットをpCGP2242から単離した。線状化されたプラスミドの末端を修復した上で、約3.7kbの精製断片をバイナリーベクターpCGP1988（実施例4に記載）（図16）のAsp718修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2256と命名した（図41）。
【０３２７】
pCGP2256によるペチュニアの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2256（図41）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってペチュニアSkr4×Sw63品種に導入した。
【０３２８】
バイナリーベクターpCGP2252（CaMV 35S：ケネディアF3'5'H：ocs 3'）
バイナリーベクターpCGP2252（図42）は、キメラのCaMV 35S：ケネディアF3'5'H：ocs 3'遺伝子を、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S' 5：SuRB選択マーカーカセットに対して縦列配置で含む。
【０３２９】
バイナリーベクターpCGP2252の調製における中間体
プラスミドpCGP2231を、制限エンドヌクレアーゼXhoIで消化してまず線状化した。突出末端を修復した後に、制限エンドヌクレアーゼPstIで消化してケネディアF3'5'H cDNAクローンを遊離させた。約1.7kbの断片をpCGP2105（図17）のClaI（修復末端）／FstI末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2236と命名した。
【０３３０】
制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびNotIで消化して、プラスミドpCGP2236から、CaMV 35S：ケネディアF3'5'H：ocs 3'キメラ遺伝子カセットを含む3.6kb断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片を、バイナリーベクターpCGP1988（図16）のAsp718修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2252と命名した（図42）。
【０３３１】
pCGP2252によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2252（図42）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーディナル種バラに導入した。
【０３３２】
チョウマメF3'5'H構築物
クリトリア（チョウマメ）の花弁からのF3'5'H cDNAの単離
チョウマメ花弁cDNAライブラリーの構築
クリトリアの青色品種（チョウマメ、種子はOsaka Botanical Gardenによって寄贈された）を大阪の圃場で生育させた。新鮮な色付きの花弁から開花前の時期に上記の通りに全RNAを単離した。Oligotex（Takara）を製造元の推奨に従って用いて、ポリA+ RNAを調製した。定方向λZAP cDNA合成キット（Stratagcne, USA）を製造元のプロトコールに従って用いて、ポリA+ RNAからチョウマメの花弁cDNAライブラリーを構築した。
【０３３３】
F3'5'H cDNAクローンに関するチョウマメcDNAライブラリーのスクリーニング
以前の記載の通りに（Tanaka et al,、Plant
Cell Physiol. 37: 7117-6, 1996）、DIG標識ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンを用いてチョウマメ花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。ペチュニアF3'5H petHf1に対して高い配列類似性を示した2種類のcDNAクローンを同定した。最も長いcDNAクローンを含むプラスミドをpBHF2と命名し、そのcDNAクローンの配列を決定した。チョウマメF3'5'HクローンおよびペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:2）の推定されるアミノ酸配列のアラインメントにより、チョウマメF3'5'H
cDNA（pBHF2中に含まれる）は完全長cDNAではなく、開始コドンと推定されるものの最初の2塩基を欠くことが判明した。この2つの塩基を、以前の記載の通りに（Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol. 41: 495-502, 2000）、PCRおよび合成プライマー
2010193895.tif 000020
［SEQ ID NO:25］を用いて、BamHI制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにcDNAクローンに付加した。この結果得られた断片を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびPstIで消化し、その後に約200bpのDNA断片を回収した。このDNA断片をBamHI／EcoRIで消化したpBHF2の3.3kb断片と連結してpBHF2Fを得た（図43）。PCR中に生じた誤りを除くためにDNA配列を確認した
（SEQ ID NO:20）。
【０３３４】
チョウマメF3'5'Hクローンのヌクレオチド配列（SEQ
ID NO:20）とペチュニアF3'5'Hのそれとの比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:1）に対しては59％前後の同一性、ペチュニアF3'5'H petHf2クローン（SEQ ID NO:3）に対しては62％の同一性が示された。
【０３３５】
バイナリーベクターpCGP2135（AmCHS 5'：チョウマメF3'5'H：petD8 3'）
プラスミドpCGP2135（図44）は、チョウマメF3'5'H cDNAクローンを、キンギョソウCHSプロモーター断片（AmCHS 5'）およびペチュニアPLTPターミネーター断片（petD8 3'）との間に、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置で含む。
【０３３６】
pCGP725（実施例4に記載）（図7）中のペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを、pCGP725を制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIでまず消化することによって除去した。末端を修復し、AmCHS 5'およびpetD8 3'断片を有するベクターを含む約4.9kbの断片を精製して、チョウマメF3'5'H cDNAクローンを含むpBHF2F（図43）由来の約1.6kbのXhoI／BamHI断片の修復末端と連結してpCGP2133を作製した。チョウマメF3'5'H断片がAmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片に対して縦列配置に正しく挿入されたことは、制限エンドヌクレアーゼマッピングによって確かめた。
【０３３７】
続いて、制限エンドヌクレアーゼNotIでまず消化することにより、AmCHS 5'：チョウマメF3'5'H：petD8 3'カセットをpCGP2133から単離した。線状化されたプラスミドの末端を修復した上で、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化してキメラのF3'5'H遺伝子を遊離させた。約3.6kbの精製断片をバイナリーベクターpCGP1988（実施例4に記載）（図16）のAsp718修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2135と命名した（図44）。
【０３３８】
pCGP2135によるカーネーションおよびペチュニアの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2135（図44）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、カーネーションKortina
Chanel品種およびMonte Lisa品種ならびにペチュニアSkr4×Sw63品種に導入した。
【０３３９】
バイナリーベクターpBEBF5（eCaMV 35S：チョウマメF3'5'H：nos 3'）
バイナリーベクターpBE2113-GUSは、pB1121バイナリーベクター（Mitsuhara et al, 1996, 前記）中の強化型CaMV 35Sプロモーターとnosターミネーターとの間にGUSコード領域を含む。このプラスミドpBE2113-GUSを制限エンドヌクレアーゼSacIで消化した。突出末端を修復した後に、SalIリンカーと連結してpBE2113-GUSを得た。pBHF2F由来の1.8kb BamHI-XhoI断片をBamHI-SalIで消化したpBE2113-GUSと連結してpBEBF5を作製した（図45）。
【０３４０】
pBEBF5によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpBEBF5（図45）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラLavande品種（Rose hybrida cultivar Lavande）に導入した。
【０３４１】
バイナリーベクターpCGP2134（CaMV 35S：チョウマメF3'5'H：ocs 3'）
バイナリーベクターpCGP2134（図46）は、キメラのCaMV 35S：チョウマメF3'5'H：ocs 3'遺伝子カセットを、バイナリーベクターpCGP1988（図16）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置で含む。
【０３４２】
バイナリーベクターpCGP2134の調製における中間体
プラスミドpBHF2F（図43）を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHIで消化して、チョウマメF3'5'H cDNAクローンを遊離させた。突出末端を修復し、約1.7kbの断片をpCGP2105（実施例4に記載）（図17）のPstI（修復末端）／EcoRV末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2132と命名した。
【０３４３】
制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびXbaIで消化して、CaMV 35S：チョウマメF3'5'H：ocs 3'キメラ遺伝子カセットを含む約3.6kbの断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片をバイナリーベクターpCGP1988（実施例4に記載）（図16）のAsp718修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP2134と命名した（図46）。
【０３４４】
pCGP2134によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP2134（図46）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーディナル種バラに導入した。
【０３４５】
リンドウF3'5'H構築物
エゾオヤマリンドウ（リンドウ）の花弁からのF3'5'H cDNAクローンの単離
リンドウ花弁cDNAライブラリーの構築およびスクリーニング
F3'5'HをコードするリンドウcDNAの単離は以前に記載されており（Tanaka et al, 1996, 前記）、これはプラスミドpG48内部に含まれている（図47）。プラスミドpG48（図47）中に含まれるリンドウF3'5'Hクローン（Gen#48）のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:22）とペチュニアF3'5'Hのそれとの比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:1）に対しては61％前後の同一性、ペチュニアF3'5'H petHf2クローン（SEQ ID NO:3）に対しては64％の同一性が示された。
【０３４６】
バイナリーベクターpCGP1498（AmCHS 5'：リンドウF3'5'H：petD8 3'）
プラスミドpCGP1498（図48）は、リンドウF3'5'H（Gen#48）cDNAクローンを、キンギョソウCHSプロモーター断片（AmCHS 5'）およびペチュニアPLTPターミネーター断片（petE'S 3'）との間に、バイナリーベクターpWTT2132（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置で含む。
【０３４７】
pCGP725（実施例4に記載）（図7）中のペチュニアF3'5'H（petHf1）cDNAクローンを、pCGP725を制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびBamHIでまず消化することによって除去した。末端を修復し、AmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片を有するベクターを含む約4.9kbの断片を精製して、リンドウF3'5'H cDNAクローンを含むpG48（図47）由来の約1.7kbのXhoI／BamHI断片と連結してpCGP1496を作製した。リンドウF3'5'H断片がAmCHS 5'断片およびpetD8 3'断片に対して縦列配置に正しく挿入されたことは、制限エンドヌクレアーゼマッピングによって確かめた。
【０３４８】
続いて、制限エンドヌクレアーゼNotIでまず消化することにより、AmCHS 5'：リンドウF3'5'H：petD8
3'カセットをpCGP1496から単離した。線状化されたプラスミドの突出末端を修復した上で、制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化してキメラのF3'5'H遺伝子を遊離させた。続いて約3.6kbの精製断片をバイナリーベクターpWTT2132（図6）のAsp718修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1498と命名した（図48）。
【０３４９】
pCGP1498によるカーネーションおよびペチュニアの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1498（図48）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、カーネーションKortina
Chanel品種およびMonte Lisa品種ならびにペチュニアSkr4×Sw63品種に導入した。
【０３５０】
バイナリーベクターpBEGHF48（eCaMV 35S：リンドウF3'5'H：nos 3'）
制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXhoIによるプラスミドpG48の消化によって、リンドウF3'5'H cDNAクローンを遊離させた。この結果得られた約1.7kbのDNA断片を単離し、BamHI／SalIで消化したpBE2113-GUS（Mitsuhara et al., 1996, 前記）と連結してpBEGHF48を作製した（図49）。
【０３５１】
pBEGHF48によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpBEGHF48（図49）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラLavande品種に導入した。
【０３５２】
バイナリーpCGP1982（CaMV 35S：リンドウF3'5'H：ocs 3'）
バイナリーベクターpCGP1982（図50）は、キメラのCaMV 35S：リンドウF3'5'H：ocs
3'遺伝子カセットを、バイナリーベクターpWTT2132（図6）の35S 5'：SuRB選択マーカー遺伝子カセットに対して縦列配置で含む。
【０３５３】
バイナリーベクターpCGP1982の調製における中間体
プラスミドpG48（図47）を制限エンドヌクレアーゼAsp718で消化して線状化した。突出末端を修復した後に、制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化してリンドウF3'5'H cDNAクローン（Gen#48）を遊離させた。この約1.7kbの断片を、pKIWI101（Janssen
and Gardner, 1989, 前記）の5.95kb EcoRI（修復末端）／BamHI断片と連結した。断片が正しく挿入されたことは、アンピシリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1981と命名した。
【０３５４】
制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびXbaIでプラスミドpCGP1981を消化して、CaMV 35S：リンドウF3'5'H：ocs 3'キメラ遺伝子カセットを含む約3.6kbの断片を遊離させた。突出末端を修復し、精製した断片を、Asp718で消化したバイナリーベクターpWTT2132の修復末端と連結した。断片が正しく挿入されたことは、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離したプラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確かめた。この結果得られたプラスミドをpCGP1982と命名した（図50）。
【０３５５】
pCGP1982によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpCGP1982（図50）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってカーディナル種バラに導入した。
【０３５６】
ラベンダーF3'5'H構築物
ラバンデュラ・ニル（ラベンダー）の花弁からのF3'5'H cDNAクローンの単離
ラベンダー花弁cDNAライブラリーの構築
紫色種のラバンデュラ・ニルの切花を花屋から購入した。新鮮な色付きの花弁から上記の通りに全RNAを単離した。Oligotex（Takara）を製造元の推奨に従って用いて、ポリA+ RNAを調製した。定方向λZAP cDNA合成キット（Stratagcne, USA）を製造元のプロトコールに従って用いて、ポリA+ RNAからラベンダーの花弁cDNAライブラリーを構築した。
【０３５７】
F3'5'H cDNAクローンに関するラベンダーcDNAライブラリーのスクリーニング
以前の記載の通りに（Tanaka et al, 前記）、DIG標識ペチュニアF3'5'H petHf1 cDNAクローンを用いてラベンダー花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。ペチュニアF3'5H petHf1に対して高い配列類似性を示した1種類のcDNAクローン（LBG）を同定し、そのプラスミドをpBLHF8と命名した（図51）。ラベンダーF3'5'H（LBG）cDNAクローンのヌクレオチド配列はSEQ ID NO:31として指定された。
【０３５８】
ラベンダーF3'5'Hクローンのヌクレオチド配列とペチュニアF3'5'H
cDNAクローンのそれとの比較により、ペチュニアF3'5'H petHf1クローン（SEQ ID NO:1）に対しては59％前後の同一性、ペチュニアpetHf2クローン（SEQ ID NO:3）に対しては60％の同一性が示された。
【０３５９】
バイナリーベクターpBELF8（eCaMV 35S：ラベンダーF3'5'H：nos 3'）
pLHF8プラスミド（図51）を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXhoIで消化して約1.8kbのDNA断片を遊離させた。続いて、pLHF8由来のこの約1.8kbの精製断片を、BamHI-SalIで消化したプラスミドpBE2113-GUS（上記）の末端と連結してpBELF8を作製した（図52）。
【０３６０】
pBELF8によるバラの形質転換
バイナリーベクタープラスミドpBELF8（図52）中に含まれるT-DNAを、アグロバクテリウムを介した形質転換によってバラLavande品種に導入した。
【０３６１】
実施例8
トランスジェニックカーネーション、ペチュニアおよびバラの分析
実施例7に記載した実験で作製したトランスジェニック植物を開花するまで生育させた。花を収集し、花弁の色をRoyal Horticultural Society Colour Charts（RHSCC）を用いてコード化した。アントシアニンを抽出し、分光光度分析、TLCおよび／またはHPLC分析によってアントシアニジンに関して分析した。適切な花発達段階にある花弁組織から全RNAも単離し、ノーザンブロット分析を用いてF3'5'H導入遺伝子を検出した。このトランスジェニック分析の結果を表11、12および13にまとめた。
【０３６２】
カーネーション
実施例7に記載したF3'5'H遺伝子を、カーネーション花弁におけるデルフィニジンを基にした色素の産生をもたらす能力に関して評価した。形質転換実験には2つのカーネーション品種、Kortina Chanel（ICC）およびMonte Lisa（ML）を用いた。カーネーション品種Kortina Chanelは、シアニジンを基にしたアントシアニンが通常蓄積するピンク色の花を生じる。この品種はしたがってカーネーションF3'H活性およびDFR活性を含み、導入されたF3'5'Hは基質に関してこれらと競合する必要があると考えられる。カーネーション品種Monte
Lisaは、ペラルゴニジンを基にしたアントシアニンが通常蓄積する赤レンガ色の花を生じる。この品種は完全に機能的なF3'H活性を持たず、DHKに対して作用しうるDFRを含むと考えられており、このため、導入されたF3'5'Hは基質に関して内因性DFRと競合する必要があるのみであると考えられる。
【０３６３】
（表１１）F3'5'H遺伝子発現カセット（AmCHS 5'：F3'5'H：petD8 3'）を含むT-DNAによる形質転換を行ったカーネーションからの花弁のトランスジェニック分析の結果
2010193895.tif 000021
F3'5'H＝T-DNA上に含まれるF3'5'H配列
pCGP＝形質転換実験に用いたバイナリーベクターのプラスミドpCGP番号
cv.＝品種
KC＝カーネーションKortina Chanel品種（シアニジン系統）
ML＝カーネーションMonte Lisa品種（ペラルゴニジン系統）
#tg＝作製したトランスジェニック体の総数
TLC+＝デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が花弁において検出された（TLCにより判定）個々のイベントの数／分析した個々のイベントの総数
HPLC+＝デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が花弁において検出された（HPLCにより判定）個々のイベントの数／分析した個々のイベントの総数
Highest％del＝トランスジェニックイベントの集団に関する、花弁におけるデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の検出率の最大値
Av％del＝トランスジェニックイベントの集団に関する、花弁におけるデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の検出率の平均値
Northern＝花弁から単離した全RNA中に特定の完全なF3'5'H転写物がノーザンブロット分析によって検出された個々のイベントの数／分析したイベントの総数
nd＝実施せず
【０３６４】
これらの結果は、評価したF3'5'H配列のすべて（ペチュニアpetHf1、ペチュニアpetHf2、サルビアSal#2、サルビアSal#47、ソリアSol#5、チョウマメBpeaHF2、パンジーBR#18、パンジーBP#40およびリンドウGen#48）が、カーネーションにおいて安定であり、カーネーションの花におけるデルフィニジンを基にした新規色素の生成をもたらすことを示唆している。トランスジェニックカーネーションの花弁から単離したRNA中に、各F3'5'Hの完全な転写物がノーザンブロット分析によって検出された。
【０３６５】
ペチュニア
実施例7に記載したF3'5'H遺伝子を、ペチュニア花弁におけるデルフィニジンを基にした色素の産生をもたらす能力に関して評価した。形質転換実験には、Hf1およびHf2に関して劣性ホモ接合性であるペチュニアF1雑種Skr4×Sw63を用いた。Skr4×Sw63はHf1およびHf2に関して劣性ホモ接合であるが、これらの変異は内因性F3'5'Hの産生を完全に阻止するわけではなく（米国特許第5,349,125号を参照）、低レベルのマルビジンが産生されて花弁を薄いライラック色にする。マルビジンは、3',5'-ヒドロキシル化色素、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子のメチル化誘導体である（図1Aおよび1B）。分光光学分析を、トランスジェニックペチュニアの花の花弁に蓄積するアントシアニンの総量の指標として用いた。アントシアニンレベルの上昇および／または検出された色の変化を、評価対象であるF3'5'H遺伝子の有効性の目安として用いた。
【０３６６】
（表１２）F3'5'H遺伝子発現カセット（AmCHS 5'：F3'5'H：petD8 3'）を含むT-DNAによる形質転換を行ったペチュニアSkr4×SW63品種の花弁のトランスジェニック分析の結果
2010193895.tif 000022
F3'5'H＝F3'5'H＝T-DNA上に含まれるF3'5'H配列
pCGP＝形質転換実験に用いたバイナリーベクターのプラスミドpCGP番号
#tg＝作製したトランスジェニック体の総数
TLC+＝マルビジンが花で検出された（Skr4×SW63バックグラウンドを上回るレベルで）（TLCにより判定）個々のイベントの数／分析した個々のイベントの総数
Col＝対照と比較して花色が変化した花が生じた個々のイベントの数／分析した個々のイベントの総数
↑A／c＝粗抽出物の分光光学分析による測定で花弁におけるアントシアニンレベルが上昇していた個々のイベントの数／分析した個々のイベントの数（μmole／g単位）
Best＝個々のイベントの花からの粗抽出物の分光光学分析による測定でのアントシアニン量の最大値（μmole／g単位）
Av＝分析したトランスジェニック花の集団内の花からの粗抽出物の分光光学分析による測定で検出されたアントシアニン量の平均値（μmole／g単位）
Northern＝花弁から単離した全RNA中に特定の完全なF3'5'H転写物がノーザンブロット分析によって検出された個々のイベントの数／分析したイベントの総数
Best color＝そのトランスジェニック集団に関して記録された最も劇的な色の変化
nd＝実施せず
na＝該当せず
【０３６７】
Skr4×SW63へのF3'5'H遺伝子発現カセットの導入により、薄いライラック色から紫色への劇的な花色の変化がもたらされ、この際、花弁におけるマルビジンの産生が劇的に増加した。
【０３６８】
これらの結果は、検討したF3'5'H配列のすべて（ペチュニアpetHf1、ペチュニアpetHf2、サルビアSal#2、サルビアSal#47、ソリアSol#5、チョウマメBpeaHF2、パンジーBR#18、パンジーBP#40およびリンドウGen#48、ケネディアKenn#31）が、ペチュニアにおいて安定であり、Skr4×SW63ペチュニア系統におけるHf1またはHf2の変異を代償してマルビジン蓄積レベルの劇的な上昇をもたらし、それに伴って色の変化が生じたことを示唆している。
【０３６９】
バラ
実施例7に記載したF3'5'H遺伝子を、バラ花弁におけるデルフィニジンを基にした色素の産生をもたらす能力に関して評価した。3つのバラ品種、カーディナル（Kard）、Soft Promise（SP）またはLavande（Lav）を選択し、形質転換実験に用いた。バラのカーディナル品種は、シアニジンを基にしたアントシアニンが通常蓄積する赤色の花を生じる。この品種はしたがってバラF3'H活性およびDFR活性を含み、導入されたF3'5'Hは基質に関してこれらと競合する必要があると考えられる。バラ品種Lavandeは、シアニジンを基にしたアントシアニンが通常蓄積する薄いピンク色の花を生じる。この品種はしたがって機能的なバラF3'H活性およびDFR活性を含み、導入されたF3'5'Hは基質に関してこれらと競合する必要があると考えられる。バラ品種Soft
Promiseは、ペラルゴニジンが通常蓄積するアンズ色の花を生じる。この品種は完全に機能的なF3'H活性を持たず、DHKに対して作用しうるDFRを含むと考えられており、このため、導入されたF3'5'Hは基質に関して内因性DFRと競合する必要があるのみであると考えられる。
【０３７０】
（表１３）F3'5'H遺伝子発現カセット（CaMV 35S：F3'5'H：ocs 3'）を含むT-DNAによる形質転換を行ったバラからの花弁のトランスジェニック分析の結果
2010193895.tif 000023
F3'5'H＝T-DNA上に含まれるF3'5'H配列
プラスミド＝形質転換実験に用いたバイナリーベクターのプラスミドpCGP番号
Cult＝バラ（Rosa hybrida）の品種
Kard＝カーディナル
SP＝Soft Promise
Lav＝Lavande
#tg＝作製したトランスジェニック体の総数
TLC+＝デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が花弁において検出された（TLCにより判定）個々のイベントの数／分析した個々のイベントの総数
HPLC+＝デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子が花弁において検出された（HPLCにより判定）個々のイベント／分析した個々のイベントの総数
Northern＝花弁から単離した全RNA中に特定の完全なF3'5'H転写物がノーザンブロット分析によって検出された個々のイベントの数／分析したイベントの総数
nd＝実施せず
【０３７１】
これらの結果は、驚いたことに、評価したF3'5'H配列のすべて（ペチュニアpetHf1、ペチュニアpetHf2、サルビアSal#2、サルビアSal#47、ソリアSol#5、チョウマメBpeaHF2、パンジーBR#18、パンジーBP#40、リンドウGen#48、ケネディアKenn#31およびラベンダーLBG）が、バラにおいて機能的であるとは限らないことを示唆している。実際に、クリトリア（チョウマメ）、エゾオヤマリンドウ（リンドウ）およびペチュニアハイブリダ（ペチュニア）から単離した導入F3'5'H配列の転写物は、バラ花弁に蓄積しなかった。バラ花弁に蓄積したのは、パンジー、サルビア、ケネディア、ソリアおよびラベンダー由来の完全長F3'5'H転写物のみであった。しかし、ケネディアF3'5'H転写物はバラ花弁に蓄積したものの、酵素の蓄積が生じないか、産生された酵素が機能的でないかもしくは内因性バラF3'HおよびDFRと競合してデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子性の色素を産生させることができないかのいずれかであった。評価したF3'5'H配列のうち、バラ花弁におけるデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子に基づく色素の産生をもたらしたのは、サルビア属（Sal#2およびSal#47）、スミレ属（BP#18およびBP#40）、ソリア属（Soll#5）およびラバンデュラ・ニル（LBG）からのcDNAクローンに由来するF3'5'H配列のみであった。バラ花弁で産生されたデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の相対的なパーセンテージに基づくと、パンジー由来のF3'5'H配列（BP#18およびBP#40）は、評価したもののうち、バラ花弁においてデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子を産生させる点で最も有効であることが示された。
【０３７２】
バラMedeo品種およびPamela品種へのスミレ属F3'5'H配列の導入
序論に述べた通り、他のフラボノイドとのコピグメンテーション、アントシアニジン分子のさらなる修飾、および液胞のpHは、アントシアニンによって生じる色に影響を及ぼす。このため、フラボノールレベルが相対的に高く液胞pHが相対的に高いバラ品種を選択することにより、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子性の色素が産生された際に、より青さの強い花色が生じると考えられる。
【０３７３】
バラ品種Medeoは一般に、クリーム色ないし薄いアンズ色の花（RUSCC l58C〜159A）を生じる。Medeo種バラの花弁に蓄積するアントシアニジンおよびフラボノールのHPLC分析により、花弁には高レベルのフラボノール（2.32mg／gケンフェロール、0.03mg／gクエルセチン）が蓄積し、アントシアニンの蓄積レベルは極めて低い（0.004mg／gシアニジン、0.004mg／9ペラルゴニジン）ことが明らかになった。Medeoの花弁の推定pHは4.6前後である。
【０３７４】
バラ品種Pamelaは、白色ないし非常に薄いピンク色の花を生じる。これも同様にアントシアニンの蓄積レベルは低く、フラボノールの蓄積レベルは相対的に高い。
【０３７５】
パンジーF3'5'HクローンBP#40を組み入れた構築物pCGP1969（図30）中に含まれるT-DNAもバラ品種MedeoおよびPamelaに導入したところ、これらのバラでは90％を上回るデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の産生が起こり、劇的な色の変化および新たな色の花がもたらされた。トランスジェニックMedeo種の花における最も劇的な色の変化は、RHSCC 70b、70c、80c、186bの紫／スミレ色へのものであった。トランスジェニックPamela種の花における最も劇的な色の変化は、RHSCC 71；60c、71a、80bの紫／スミレ色へのものであった。
【０３７６】
以上の結論として、ペチュニアおよびカーネーションにおける機能性が証明されている遺伝子配列をバラに導入した場合に、予想外の2つの所見が明らかになった。
【０３７７】
第1に、カーネーションにおいて新たな色の生成を引き起こし、ペチュニアにおける機能的酵素の合成をもたらすことも証明されているペチュニアF3'5'H petHf1（およびpetHf2）配列は、バラ花弁において（ノーザンブロット分析によって検出可能な）完全長（または完全な）転写物の蓄積をもたらさなかった。実際には、完全長または完全な転写物の蓄積がみられないか、または検出された転写物が分解されているか、もしくはRNAブロット上に低MWの多様なハイブリダイズ性RNAの存在を示す低MW（または高速移動性）のスメアとして認められるかのいずれかであった。このため、バラに蓄積して機能的酵素をもたらすと考えられるF3'5'H配列を見いだす目的で、さまざまなF3'5'H配列を単離した。この場合も、どの配列がバラ花弁における活性酵素をもたらすかは不明であった。単離したF3'5'H配列のすべてをカーネーションおよび／またはペチュニアにおける機能性に関して検討したところ、そのすべてが完全な転写物の蓄積および機能的F3'5'H活性の生成をもたらした。しかし、完全な完全長転写物の蓄積を引き起こしたのは、パンジー（BP#18およびBP#40）、サルビア（Sal#2およびSal#47）、ソリア（Soll#5）、ケネディア（Kenn#31）およびラベンダー（LBG）由来のF3'5'H配列のみであり、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の合成による評価で、バラにおける機能的酵素の生成を引き起こした、パンジー（BP#18およびBP#40）、サルビア（Sal#2およびSal#47）、ソリア（Soll#5）およびラベンダー（LBG）由来のもののみであった。
【０３７８】
第2に、どのプロモーターがバラにおいて有効であるかは不明であった。検討されてカーネーションおよびペチュニアの花において機能的であることが証明されたプロモーターカセットは、バラ花弁において検出可能な転写物の蓄積をもたらさなかった。バラで検討したプロモーターのうち、バラ花弁において完全で検出可能なGUSまたはnptIIまたはSuRB転写物の蓄積をもたらしたのは、CaMV 35S、RoseCHS 5'、ChrysCHS
5'、mas 5'およびnos 5'プロモーターのみであった。
【０３７９】
表14は、ペチュニア、カーネーションおよびバラのさまざまな種に由来するF3'5'H配列を評価した際に得られた結果の概要を示している。
【０３８０】
（表１４）ペチュニア、カーネーションおよびバラにおけるF3'5'H配列の有効性の概要
2010193895.tif 000024
nd＝実施せず
Mal＝TLCによって分析した際に花弁において検出されたマルビジン
Del＝TLCまたはHPLCによって分析した際に花弁において検出されたデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子
＋＝あり
−＝なし
【０３８１】
実施例9
バラ以外の種におけるパンジーF3'5'H配列の使用
ガーベラ
以上の諸実施例から、パンジーF3'5'H配列BP#18およびBP#40がバラおよびカーネーションにおいて機能的なF3'5'H活性を生じさせ、xデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の高レベルの産生をもたらすことが明らかになった。
【０３８２】
ガーベラにおけるパンジーF3'5'H配列の機能性を検証するために、キメラのCaMV 35S：パンジーBP#40 F3'5'H：ocs 3'遺伝子発現カセットを含むバイナリー構築物pCGP1969（実施例8に記載）（図30）由来のT-DNAをアグロバクテリウムを介した形質転換によってガーベラ品種Boogieに導入した。
【０３８３】
これまでに生じた6件のイベントのうち、1つ（#23407）が、対照の花の色（RHSCC 38a、38c）と比較して劇的な色の変化（RHSCC 70c）を伴う花を生じた。
【０３８４】
トランスジェニックガーベラの花弁の色の変化は、TLCにより検出したデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子と相関していた。
【０３８５】
その他の種
デルフィニジンを基にした色素を通常産生せず、フラボノイド3'5'ヒドロキシラーゼを含まない植物においてデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子性の色素を産生させるためには、F3'5'H遺伝子（例えば、キメラのスミレ属および／またはサルビア属および／またはソリア属および／またはラバンデュラ属および／またはケネディア属のF3'5'H遺伝子など、ただしこれらには限定されない）を含む構築物を、デルフィニジンを基にした色素を通常産生しない種に導入する。このような植物には、カーネーション、キク、ガーベラ、ラン、ユーホルビア、ベゴニアおよびリンゴが非制限的に含まれうる。
【０３８６】
実施例10
ペチュニア、カーネーションおよびバラで評価したF3'5'Hの特徴
真核生物における遺伝子調節は、簡潔に言うと、ある所定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の近位および遠位の一定範囲の配列と相互作用するさまざまな因子によって促進される。1つまたは複数の形質の作製を目的とする、植物への導入のための発現カセットの操作は、真核生物全般における、さらに選ばれたケースでは特に植物における遺伝子調節の理解に基づく。必須な要素には、典型的には（排他的ではない）転写開始点の上流または5'側に位置する、一連の転写調節配列が含まれる。このような因子は一般的にはエンハンサーおよびプロモーターとして記載され、後者は転写開始点の近位にある。転写開始点のすぐ下流または3'側には転写されるDNAの可変領域があり、これは5'非翻訳領域（5'utr）と呼ばれ、転写物の安定性および翻訳効率に役割を果たす。このような配列は発現カセットに導入される場合にはしばしばキメラであり、コード配列および／または所定のプロモーター配列に隣接して天然に存在する配列に由来することもある。コード配列（時にはイントロンにより分断されている）は5'utrの3'側に位置し、転写物（mRNA）の安定性および翻訳効率にとって重要な3'utrがその後に続く。コード領域の末端の3'側および3'utr自体の3'側にある配列はターミネーター配列と呼ばれる。発現カセットはこれらのすべての要素によって構成される。プロモーター間または他の因子間の直接的な比較を行うためには、発現カセットの残りの要素の均一性を保つことが重要である。それ故に、種々のF3'5'H配列の有効性を比較する際に、操作したmRNAの不安定性およびそれに続く自己分解、ならびにその結果としてのトリヒドロキシル化産物（デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の誘導体）をもたらす配列をF3'5'Hをコードする領域に限局させ、発現カセット中の他の因子、例えば5'utrおよび／または3'utr配列などには及ばないようにすることが可能であった。
【０３８７】
バラの花から単離した全RNA中に検出された完全長転写物を生じさせ、最終的にはデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の生成をもたらした複数のF3'5'H配列のモチーフまたは類似性を同定する取り組みにおいて、ある範囲にわたるパラメーター間の比較を行った。これらには、核酸レベルおよびアミノ酸レベルでの配列同一性、配列アラインメント、分類学的な分類、配列中に存在するAまたはTヌクレオチドの比率、第3の位置にAまたはTがあるコドンの比率などが含まれる。
【０３８８】
分類学的な分類
F3'5'H配列を単離した各々の種の分類学的検討を行った（表15）。亜綱の分類と、F3'5'H配列がバラにおいて完全な転写物、およびそれに続くデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の産生を生じさせたか否かとの間には明らかな関連性はないように思われた。
【０３８９】
（表１５）F3'5'H配列を単離した種の分類学的な分類、および、配列の使用がRNAブロット分析により検出可能な完全な転写物をバラ花弁中に生じさせたか否か
2010193895.tif 000025
完全な転写物＝トランスジェニックバラの花弁から単離した全RNA中にノーザンブロット分析により完全長F3'5'H mRNAが検出された
【０３９０】
F3'5'Hヌクレオチド配列の比較
評価した各F3'5'H配列の間のヌクレオチド配列同一性を、MacVector（商標）バージョン6.5.3アプリケーションプログラム（Oxford Molecular Ltd., England）内部のClustalWプログラム（Thompson et al, 1994, 前記）を用いて決定した（表16）。バラ花弁から単離したRNA中に完全な完全長転写物を生じさせたF3'5'H配列と生じさせなかったものとの間に明らかな違いはなかった。
【０３９１】
（表１６）さまざまな種から単離したF3'5'Hのヌクレオチド配列間の核酸配列一致度
2010193895.tif 000026
バラ花弁から単離したRNA中に完全な転写物が検出されたF3'5'H配列には下線を付し、イタリック体とした。
【０３９２】
翻訳されたF3'5'Hヌクレオチド配列の比較
評価した各F3'5'H配列の間の、翻訳されたヌクレオチド配列の同一性および類似性も、MacVector（商標）バージョン6.5.3アプリケーションプログラム（Oxford Molecular Ltd., England）内部のClustalWプログラム（Thompson et al, 1994, 前記）を用いて決定した（表17）。バラ花弁から単離したRNA中に完全な完全長転写物が検出されたF3'5'H配列と検出されなかったものとの間に明らかな違いはなかった。
【０３９３】
（表１７）さまざまな種から単離したF3'5'H配列間のアミノ酸配列の一致度および類似度（括弧内）
2010193895.tif 000027
バラ花弁から単離したRNA中に完全な転写物が検出されたF3'5'H配列には下線を付し、イタリック体とした。
【０３９４】
F3'5'H DNA配列におけるヌクレオチドAまたはTの比率
コドンの選択が翻訳およびmRNA分解の速度に影響を及ぼすことを示唆するある程度の証拠が得られている。ある種のコドンが用いられる頻度は別のものよりも低く、これはアイソアクセプターtRNAの存在量と関係している可能性がある。大腸菌および酵母において、稀なコドンに対応するトランスファーRNAの存在量は、好まれるコドンに対応するtRNAよりも少ない（van Hoof and Green、Plant Molecular Biology,
35: 383-387, 1997）。コドン使用頻度を改変して遺伝子をより「植物のように」する例には、細菌B.t.毒素遺伝子（Diehn et al, Genet Engin, 18: 83-99, 1996に総説がある）およびクラゲgfp遺伝子（Hasetbff et al, Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 94: 2122-2127, 1997）がある。しかし、van Hoof arid Green（1997）（前記）がコメントしているように、B.t.遺伝子中の稀なコドンを排除した影響としてGC含有率が高まり、それによってAUリッチ配列が排除されており、これはイントロンおよびポリアデニル化部位の不適切な認識ならびに不安定性決定因子の除去の原因となる可能性がある。クラゲgfp遺伝子におけるコドン使用頻度の改変も潜在性イントロンの除去を引き起こしている（Haseloff
et al, 1996, 前記）。コドン使用頻度および不安定性エレメントの影響を検討した研究は一般に、異なる界に属する種から（すなわち、細菌、酵母、動物、植物を対比して）単離した遺伝子間の差異に限定されている。植物界の内部での差異は双子葉植物および単子葉植物の間で観察されている。トランスジェニック植物に関する研究により、双子葉植物での遺伝子発現を推進させるために用いたプロモーター断片を単子葉植物に用いた場合には同程度には有効でない可能性が示唆されている（Galun and Breiman、「トランスジェニック植物（Transgenic
Plants）」、Imperial College Press, London, England, 1997を参照されたい）。トウモロコシ（単子葉）DFR cDNAをガーベラ（双子葉）DFR cDNAと比較したところ、ペチュニア（双子葉）におけるDFR導入遺伝子のメチル化および最終的な発現の違いが検出された（Elomea et
al, 「分子遺伝学および一般的遺伝学（Molecular and General Genetics）」、248: 649-656, 1995）。その結論は、ガーベラDFR cDNAがAT含有率が高く（CC含有率が低く）、ペチュニアのゲノム構成に対してより「適合性」があるために、それが外来遺伝子として認識されてメチル化によるサイレンシングを受けることを妨げるというものであった（バラはカーネーションおよびペチュニアとともに双子葉植物であり、検討したF3'5'H遺伝子はすべて双子葉植物から単離した）。これらの事項は、分解および安定性の機序が詳細には解明されておらず、植物界と他の界との間、および植物界の内部には差異があると思われることを例示する上で役立つ。
【０３９５】
評価したF3'5'H cDNAにおけるAおよびTの含有率に関して、バラから単離されている4種類のフラボノイド経路遺伝子（F3'H、DFR、CHS、FLS）とともに検討した（表18）。各コドン（オープンリーディングフレーム内部）の3番目の位置も検討し、第3の位置にAまたはTがあるコドンの比率を算出した（表18）。
【０３９６】
（表１８）単離したF3'5'H配列におけるAまたはTジヌクレオチドの比率、およびF3'5'Hがバラ花弁中にノーザンブロット分析により検出される完全長転写物を生じさせたか否かに関する概要
2010193895.tif 000028
％AT＝核酸配列中にAまたはTがあるヌクレオチドのパーセンテージ
％A or T in 3rd＝第3の位置にAまたはTがあるコドンのパーセンテージ
RNA＝バラ花弁から単離した全RNA中にノーザンブロット分析により完全長mRNA転写物が検出されたか否か
Del＝バラ花弁中にデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子がTLCまたはHPLCによって検出されたか否か
あり*＝ラベンダーF3'5'H発現カセットによる形質転換を行ったトランスジェニックバラのノーザンブロット分析は行わなかったが、デルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子がバラ花弁中に検出されたため、完全長転写物が産生されたと推定しうる
バラF3'H（国際特許出願番号PCT/AU97/00124に記載）
バラDFR（Tanaka et al., 1995, 前記）
バラFLS（GenBankアクセッション番号AB038247）
バラCHS（GenBankアクセッション番号AB038246）
【０３９７】
フラボノイド経路酵素をコードする4種類のバラ配列（上記）のAT含有率は47〜56％の範囲にあった。一般に、バラ花弁中に完全な転写物を生じさせたF3'5'H配列のAT含有率は48〜54％の範囲にあった。しかし、バラ花弁に蓄積する完全な転写物を生じさせなかったF3'5'H配列では一般にAT含有率はより高く、57〜61％の範囲であった。このため、バラに導入されたF3'5'H遺伝子のAT含有率は、完全な転写物がバラ花弁に蓄積してF3'5'Hおよびデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の産生をもたらすか否かに関する一つの要因である可能性がある。
【０３９８】
フラボノイド経路酵素をコードする4種類のバラ配列の各コドンの第3の位置にあるヌクレオチド塩基は一般に、コドンの34〜46％でAまたはTであった。一般に、バラ花弁中に完全な転写物を生じさせたF3'5'H配列はコドンの33〜54％で各コドンの第3の位置にAまたはTを含んでいた。しかし、バラ花弁に蓄積する完全な転写物を生じさせなかったF3'5'H配列は一般に、コドンの53〜66％で各コドンの第3の位置にAまたはTを含んでいた。このため、バラに導入されたF3'5'H遺伝子の第3の位置にAまたはTを有するコドンの比率もまた、完全な転写物がバラ花弁に蓄積してF3'5'Hおよびデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の産生をもたらすか否かにおける一つの要因である可能性がある。
【０３９９】
ペチュニアpetHf1、ペチュニアpetHf2、クリトリア（チョウマメ）BpeaHF2またはエゾオヤマリンドウ（リンドウ）Gen#48などの（ただしこれらには限定されない）、バラにおいて完全な転写物を生じさせなかったF3'5'H DNA配列におけるヌクレオチドAおよび／またはTの全体的な含有率を、バラ遺伝子で認められるものにより合致するレベルへと改変することにより、完全な転写物が蓄積してF3'5'H転写物の効率的な翻訳を引き起こし、それによってバラ花弁におけるデルフィニジンまたはデルフィニジンを基にした分子の蓄積が引き起こされる可能性がある。アミノ酸配列を変化させずにDNA配列のAT含有率を改変する手法の一つは、各コドンの第3の位置の縮重性を標的にすることである。
【０４００】
当業者は、本明細書に記載した本発明に対して、具体的に記載したもの以外に変更および修正を行えることを理解していると考えられる。本発明にはこのようなあらゆる変更および修正が含まれ、それらもその精神および範囲に含まれることが理解される必要がある。本発明はまた、本明細書において個別的または一括的に言及または指摘されたすべての段階、特徴、組成物および化合物、ならびに任意の2つまたはそれ以上の前記の段階または特徴の任意およびすべての組み合わせも含む。
【０４０１】
（表２）図2〜52に用いた略号の説明
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【０４０２】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月10日(2010.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:30、およびSEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:30に対して少なくとも約90％の同一性を有する、またはSEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:30もしくはその相補物と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチド配列から選択されるカルコンシンターゼプロモーターを定義するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子がバラ（SEQ ID NO:5）およびキク（SEQ ID NO:30）より選択される植物由来の、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
スミレ属、ソリア属およびラバンデュラ属より選択される植物由来の、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27およびSEQ ID NO:32から選択されるフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼ（F3'5'H）をコードする核酸分子、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26またはSEQ ID NO:31に対して少なくとも約90％の同一性を有する配列を含む核酸分子、ならびにSEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26もしくはSEQ ID NO:31またはその相補物と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしうる核酸分子と機能的に結合している請求項1または2または3記載の単離された核酸分子であって、バラ花弁組織におけるF3'5'H核酸分子の発現が、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラフィー法による測定で、検出可能なレベルのデルフィニジンを生じさせる、核酸分子。
【請求項５】
F3'5'Hを合成する遺伝子組換え植物（genetically modified plant）を作製するための方法であって、請求項4に定義された核酸配列によって植物の細胞の安定的な形質転換を、核酸配列の発現を可能にする条件下で行うこと、細胞から遺伝子組換え植物を再生させること、ならびに核酸配列の発現を許容するのに十分な時間および条件の下で遺伝子組換え植物を生育させること、を含む方法。
【請求項６】
固有または既存のF3'5'H活性が低下した遺伝子組換え植物を作製するための方法であって、請求項4に定義された核酸分子によって適した植物の細胞の安定的な形質転換を行うこと、細胞からトランスジェニック植物を再生させること、および、必要に応じて、核酸の発現を可能にするのに十分な条件下で遺伝子組換え植物を生育させること、を含む方法。
【請求項７】
請求項1〜4のいずれか一項記載の単離された核酸分子を含む、遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項８】
請求項1〜4のいずれか一項記載の単離された核酸分子を含む、または請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸分子の発現レベルが遺伝子非組換え植物における発現レベルと比較して変化している、遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項９】
植物の部分が、萼片、苞葉、葉柄、花柄、子房、葯、花、実、堅果、根、茎、葉、および種子からなる群より選択される、請求項7または8記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項１０】
植物が、バラ、カーネーション、トルコギキョウ、ペチュニア、ユリ、パンジー、ガーベラ、キク、ゼラニウム、ツルウリクサ、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ブドウ、リンゴ、ユーホルビアまたはフクシアからなる群より選択される、請求項7または8または9記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項１１】
植物がバラである、請求項10記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項１２】
遺伝子組換え植物の作製における、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離された核酸分子の使用。
【請求項１３】
植物においてF3'5'Hを発現させることもしくは固有のF3'5'H酵素をダウンレギュレートすること、または植物において固有のF3'5'H酵素のレベルを改変することが可能な遺伝子構築物の製造における、請求項1〜4のいずれか一項に定義された単離された核酸分子の使用。
【請求項１４】
請求項1〜4のいずれか一項に定義された単離された核酸分子を含み、デノボ発現、過剰発現、センス抑制、アンチセンス阻害、リボザイム、ミニザイムおよびDNAザイムの活性、RNAi誘導またはメチル化誘導のいずれかの機能を有する核酸分子。
【請求項１５】
請求項7〜11のいずれか一項記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞の抽出物。
【請求項１６】
請求項4記載の核酸分子をプラスミドの形態で染色体外に保有する真核生物。
【請求項１７】
請求項1または2または3のいずれか一項記載の核酸分子をプラスミドの形態で染色体外に保有する真核生物。
【請求項１８】
遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞の製造における、請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸分子の使用。
【請求項１９】
花または花序の変化を呈する、請求項7記載の遺伝子組換え植物またはその部分またはそれ由来の細胞。
【請求項２０】
F3'5'Hをコードする遺伝材料の同定における、請求項4記載の核酸分子の使用。
【請求項２１】
F3'5'Hをコードする遺伝材料の増幅とクローニングにおける、請求項4記載の核酸分子の使用。
【請求項２２】
CHSを定義する遺伝材料の同定における、請求項1または2または3記載の核酸分子の使用。
【請求項２３】
CHSを定義する遺伝材料の増幅とクローニングにおける、請求項1または2または3記載の核酸分子の使用。