(57)【要約】    【課題】大腸菌群の測定において、特に牛乳や豆乳など乳化構造を基本とする試料では、従来の技術では長時間を要するなどの問題があった。これに対し、大腸菌群を迅速に、また簡易に測定する方法を提供することを課題とする。    【解決手段】試料を、大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質共存下培養して、該培養後試料中の微生物を蛍光染色法で測定する。これにより、従来法による測定よりも短時間で、また簡易に大腸菌群を測定できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を、大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質共存下培養し、該培養後試料中の微生物を蛍光染色法で測定することを特徴とする大腸菌群の測定方法。
【請求項２】
試料が豆乳または牛乳である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質が胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩、ラウリル硫酸塩、ブリリアントグリーン、クリスタルバイオレットおよびメチレンブルーからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１または２いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌群を迅速に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の食品中の大腸菌群の有無を、製品出荷前に迅速に確認することは重要である。大腸菌群の検出方法としては乳糖ブイヨン法、ＢＧＬＢ培地法、デオキシコレート寒天培地法などが知られている（非特許文献１）。 しかし一般的に実施されている培養法では、検出するまでに作業時間を除いても２０〜４８時間かかるという問題があった。
【０００３】
微生物を迅速かつ容易に計測する方法として、ＡＴＰ法が知られている（非特許文献２）。ＡＴＰ法はホタルルシフェラーゼ反応を用い、微生物に含まれるＡＴＰを発光させる反応を利用した細菌計測法であるが、概ね１０００ＣＦＵ/ｍｌ以上の細菌数でないと検出されない場合が多い。しかも微生物の種類によりＡＴＰ量が１０倍以上異なる場合があり、目的の細菌の種類毎に菌数と発光量の相関関係を調べ、検量線を作成する必要が生じる場合もある。加えて豆乳のようなタンパク質が多い食品では、食品由来のＡＴＰを完全に消去する事ができず、そのためにブランクの発光量が上昇し、検出感度が更に悪くなる弊害も危惧される。
【０００４】
食品中の大腸菌群を、大腸菌群以外の微生物の増殖を阻害して、大腸菌群のカタラーゼ活性を利用して測定する方法も提案されている（特許文献１）。しかし牛乳など、測定試料中にカタラーゼ活性を有するものの場合は、計測目的の微生物由来のカタラーゼの活性を選択的に測定するために、培養後試料のｐＨを１０以上１１．５以下に厳密に調整する必要があることや、予め培養後試料に窒素ガスなどの不活性ガスを通気して溶存酸素を２ｐｐｍ以下にしなければならないなど、非常に煩雑な操作が必須である。
【０００５】
さらに牛乳中の細菌数を蛍光染色法で自動計測する方法も提案されている（特許文献２及び非特許文献３）。しかし単に蛍光染色法を適用するだけでは、牛乳など乳化状態を基本とするサンプルや、濁りが多いサンプルの場合はブランクの数値が高くなり、感度が落ちるという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１５９６５０号公報
【特許文献２】特開２００６−０９４８４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本薬学会編、「衛生試験法・注解 ２０００」、２０００年版 第１刷、金原出版株式会社、ｐ６９〜７０
【非特許文献２】「食品微生物の簡易迅速測定法はここまで変わった！」、株式会社サイエンスフォーラム、ｐ１４５〜１４９（2002年11月30日）
【非特許文献３】Milk Science, Vol.55,No.1, p.31-36(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、大腸菌群の検出において、従来の技術では長時間を要するなどの問題があったことに対し、大腸菌群を迅速に、また簡易に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するために、本発明者は鋭意検討をおこなった。そして、試料を、大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質の共存下培養した後、該培養後試料中の微生物を蛍光染色法で測定することで、課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は
（１）試料を、大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質共存下培養し、該培養後試料中の微生物を蛍光染色法で測定することを特徴とする大腸菌群の測定方法。
（２）試料が豆乳または牛乳である、（１）記載の方法。
（３）大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質が胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩、ラウリル硫酸塩、ブリリアントグリーン、クリスタルバイオレットおよびメチレンブルーからなる群から選ばれる１種以上である、（１）または（２）いずれか１つに記載の方法。
に関するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、試料中の大腸菌群を迅速に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における試料は特に限定されないが、食品が好適であり、特に豆乳や牛乳を好ましく適用することができる。試料は液体、固体状の試料のいずれでも適用することができる。液体状の試料を殺菌処理した蒸留水で希釈して用いてもよく、固体状の試料の場合は、殺菌処理した蒸留水に溶解または分散させたものを用いる。
【００１２】
本発明の大腸菌群の測定方法の実施形態について説明する。まず、適宜希釈等した試料に大腸菌群以外の微生物の生育抑制物質を添加する。本発明で用いられる生育抑制物質は、大腸菌群に比べ大腸菌群以外の微生物の生育をより抑制するものであればよく、例えば胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸、デオキシコール酸塩（例えば、ナトリウム塩）、ラウリル硫酸塩（例えば、ナトリウム塩）、ブリリアントグリーン、クリスタルバイオレットまたはメチレンブルーが好ましく用いられる。
【００１３】
これらは、いずれか１種を用いてもよく２種以上を併用してもよい。これらの生育抑制物質を１種または２種以上使用することにより、例えば、ブドウ球菌（スタフィロコッカス）、各種乳酸菌、ミクロコッカス、バチルス、ストレプトコッカス等の増殖を効果的に阻害することができる。上記の生育抑制物質の中でも、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩、ブリリアントグリーンがより好ましい。２種以上の生育抑制物質を併用する場合、特に好ましい組み合わせは胆汁末とブリリアントグリーンの組み合わせ、デオキシコール酸塩とブリリアントグリーンの組み合わせ、胆汁酸塩とブリリアントグリーンの組み合わせである。更に大腸菌群以外の微生物の生育抑制を上げるために抗生物質（例えば、マクロライド系抗生物質、リンコマイシン、グリンダマイシン、バシトラシン）などを加えても良い。
【００１４】
生育抑制物質の添加量は、試料中の大腸菌群以外の微生物の生育を抑制し、本発明を実施できる程度であればよい。上記に挙げた生育抑制物質の適切な添加量としては、胆汁末では０．０５〜５重量％、胆汁酸塩では０．０５〜５重量％、デオキシコール酸では０．０５〜５重量％、デオキシコール酸塩では０．０５〜５重量％、ラウリル硫酸塩では０．００１〜０．５重量％、ブリリアントグリーンでは０．０００１〜０．５重量％、クリスタルバイオレットでは０．０００１〜０．５重量％、メチレンブルーでは０．０００１〜０．５重量％が適当である。２種以上の生育抑制物質を試料に添加する場合は、各生育抑制物質を単独で使用したときに得られる効力と同等となるように設定するのが好ましい。なお、大腸菌群以外の微生物の生育を抑制する成分を含む既存の培地、たとえば牛胆汁末とブリリアントグリーンを含むＢＧＬＢ（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｂｉｌｅ  Ｂｒｏｔｈ）培地なども使用することができる。
【００１５】
次に、生育抑制物質共存下で試料を培養して、培養後試料を得る。培養条件は大腸菌群の生育に適した条件とすることが必要である。具体的には、培養温度は、３５〜３７℃が好ましい。培養時間は、長いほど大腸菌群の数が増え測定感度が向上するが、迅速に測定を行うためには短くすべきである。例えば、適宜希釈等した試料の培養直前の初発大腸菌群が約１００ＣＦＵ／ｍｌの場合、培養時間を４時間以上とすれば、菌数を１０６ＣＦＵ／ｍｌ程度とすることができるので、良好な測定結果を得ることができる。
【００１６】
そして得られた培養後試料中の微生物を蛍光染色法で測定する。
蛍光染色法では、試料液をろ過して微生物を細孔径が０．２〜０．４μｍのメンブレンフィルター上に捕捉する。そしてフィルター上に捕集された微生物を蛍光染色剤で染色し、顕微鏡等で観察する。
【００１７】
豆乳や牛乳など、乳化状態を基本とする試料の場合、試料に含まれるエマルジョン粒子などの成分はフィルターろ過を行う際に、フィルター細孔をふさいでろ過を阻害したり、また試料に含まれるタンパク質などに蛍光色素が結合し、微生物と同様に観察されるため区別が難しく、操作の上で妨害要因となる。そのために、エマルジョン粒子などを細分化し０．４μｍ以下、少なくとも０．２μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以下にして微生物をろ過することが必要になってくる。さらに試料には、蛍光染色試薬と反応しやすい成分も含まれている場合があり、観察する場合、微生物との区別が非常に難しく、熟練を要する。これらの成分も０．２μｍ以下に細分化することで、微生物との区別が可能になり、より正確に測定することが出来る。
【００１８】
本発明ではエマルジョン粒子などを細分化あるいは溶解する方法として、ホモジナイズ、超音波やｐＨ変化など各種物理化学手法が適用できるが、界面活性剤を用いた方法が最も有効に適用できる。とりわけ、アミド系非イオン界面活性剤は安定して、ろ過が可能で、反応処理後の液も安定して透明な液に処理され、かつ計測を阻害するような物質がなくなり、微粒子化するための界面活性剤として有効である。アミド系非イオン界面活性剤は、脂肪酸アルカノールアミド型非イオン性界面活性剤として、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミド、アミゾール、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウリン酸モノイソプロパノールアミドなどが例示される。液中濃度として、好ましくは０.０１〜５重量％を使用すると良い。
【００１９】
またアミド系イオン界面活性剤と反応した後に放置していると、成分によっては脂肪酸がカルシウムと再結合し、カルシウムを核として再凝集し、半透明に変化する場合がある。この場合は、カルシウムをキレートするキレート剤を添加することで、反応後も透明を維持することができる。キレート剤としてメタリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、オルソリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸系（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、アミノエチルエチレングルコール（ＧＥＤＴＡ）等があり、試料内の微生物に影響を与えない濃度として０．０１〜３重量％を添加すると良い。
【００２０】
たとえば豆乳や牛乳のようにタンパク質が多く含まれる試料では、計測するための微生物とともにタンパク質がフィルター上を覆う場合があり、ろ過性の低下や蛍光染色を行うとタンパク質に蛍光試薬が残存して発光する場合がある。そのため、さらに酵素などでタンパク質を分解する手段を用いることも有効である。分解することでより精度良く測定することが可能である。タンパク分解酵素としては、ペプシン、トリプシン 、キモトリプシン、パパインの他、微生物起源のプロテイナーゼ等が例示できる。酵素剤の種類にもよるが、ろ過性が改良され、フィルター上に残存するタンパク質による測定阻害が改良される濃度を決定すればよい。好ましくは、試料1ｍｌ当たり、０．０２Unit〜５Unitを使用すると良い。
【００２１】
フィルター上に捕集された微生物を蛍光染色する方法としては、微生物が付着したフィルターに４’，６ージアミジノ―２―フェニルインドール二塩酸塩、プロピュームイオダイド、６ーカルボキシフルオレセインジアセテート、４ーメチルウンベリフェリルーβーＤーガラクトシド等の試薬を接触させる。４’，６ージアミジノー２ーフェニルインドール二塩酸塩では、生死細胞の核酸と結合し、励起波長３５９ｎｍにより４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞を発色させる。プロピデュームイオダイドでは、死細胞の核酸と結合し励起波長５３５ｎｍにより６１７ｎｍの蛍光波長を発し死細胞のみを発色させる。
【００２２】
生菌だけが有しているエステラーゼと反応するものや呼吸活性を検知できる試薬を用いて生菌だけを染色するもの、細胞膜を透過しないために細胞膜が損傷を受けて死んだ場合に、そこから透過してＤＮＡなどの核酸と結合して染色することで死菌だけを染色するもの、同様にＤＮＡなどの核酸と結合するもので、細胞膜を透過する性質であるため、生菌と死菌の両方を染色するもの、特定の微生物だけが代謝する特定微生物由来物質と反応することや特定の微生物とのみ反応する蛍光ラベルを有した抗体やマイクロファージで特定の微生物のみを染色するもの、などがあり、目的により選択して使用することができる。 
【００２３】
微生物の計測はフィルター上に捕集された微生物を蛍光顕微鏡で観察することでされるが、微生物自動計測装置、すなわち光源、光源から発せられた励起光波長を取り出す分光フィルター、励起光によって励起された微生物が有する蛍光のみを取り出す蛍光分光フィルター、受光部、光電変換素子、微生物判断手段・判断方法をプログラミングされたマイコン等で構成される装置により自動計測・解析が可能であり、パナソニックエコシステムズ社製「バイオプローラ」が好適に例示される。
【００２４】
以上のように、牛乳や豆乳など、比較的賞味期限が短く、調製後できるだけ速やかに出荷する必要がある製品であり、蛋白質を含有し、また、乳化状態を基本とするような組成物において、本発明の適用により、従来にない簡易な操作で、従来よりも短時間で大腸菌群の有無を判定できるようになった。
【実施例】
【００２５】
次に実施例をあげて本発明の実施様態を具体的に説明する。
実施例１
ＢＧＬＢ培地（日本製薬社製）８０ｇを水１Ｌに溶解して、１００℃、１０分間滅菌したものを調製した。豆乳（不二製油製、固形分５重量％）５ｍｌに、上記液体培地を５ｍｌ混合した（混合液中の各最終濃度は、胆汁末１重量％、ブリリアントグリーン６.６ppm）。当該混合液にエシェリチア コリ（Escherichia coli NBRC3301）及びバチルスサブチリス（Bacillus subtilis NBRC 3023）をそれぞれ１００ＣＦＵ／ｍｌになるように添加して、３５℃で培養した。経時的に上記培養液をサンプリングした。サンプリングした試料１ｍｌにキレート剤（ヘキサメタリン酸1重量％水溶液）１００μｌを添加し、よく混合攪拌した。次にこの混合溶液から１００μｌを採取し、界面活性剤（川研ファインケミカル株式会社製アミゾール0.5重量％溶液）８００μｌ添加し混合、引き続き酵素液（Sigma社Protease from Bacillus licheniformis P4860を蒸留水で10倍希釈したもの）１ｍｌを加え、５５℃、５分間処理した。
【００２６】
この処理液全量を専用ろ過ファネル（ＦＪ−ＶＫＦ０３キット：パナソニックエコシステムズ社製）で吸引ろ過した。さらに３ｍｌの生理食塩水を用いてフィルター洗浄（吸引ろ過）を行なった。次に、蛍光染色試薬（プロピュームイオダイド：ＦＪ−ＶＫＲ０１：パナソニックエコシステムズ社製）を１００μｌフィルター上に添加し、１分間放置後、吸引ろ過を行い、さらに生理食塩水１００μｌでフィルター洗浄（吸引ろ過）した。そしてこのフィルター上の微生物をパナソニックエコシステムズ社製「バイオプローラ」で細菌数を評価した。
培養４時間で細菌数の上昇が確認され、エシェリチア コリが検出された。（同時にデソキシコレート寒天培養を実施した結果から、生育した細菌はエシェリチア コリと判断された）
【００２７】
実施例２および実施例３
実施例１と同様に、ＢＧＬＢ培地を含む豆乳にサイトロバクター フロインディー（Citrobacter freundii ATCC 12681）及びバチルスサブチリス（Bacillus subtilis NBRC 3023）をそれぞれ１００ＣＦＵ／ｍｌになるように添加し（実施例２）、またはクレブシエラ ニューモニア（Klebsiella pneumonia NBRC 14950）及びバチルスサブチリス（Bacillus subtilis NBRC 3023）をそれぞれ１００ＣＦＵ／ｍｌになるように添加し（実施例３）３５℃で培養した。経時的に上記培養液をサンプリングした。以下実施例１と同様に行って、細菌数の計測を実施した。培養４時間で細菌数の上昇が確認され、サイトロバクター フロインディーまたはクレブシエラ ニューモニアがそれぞれ検出された。（同時にデソキシコレート寒天培養を実施した結果から、生育した細菌はサイトロバクター フロインディーまたはクレブシエラ ニューモニアと判断された）
【００２８】
実施例４
豆乳（不二製油製、固形分５重量％）５ｍｌに、デオキシコール酸ナトリウム溶液5ｍｌ（和光純薬株式会社：２ｇを１００ｍｌに溶解し、１００℃、１０分間滅菌したもの）を混合した（混合液中のデオキシコール酸ナトリウム最終濃度は１重量％）。当該混合液にエシェリチア コリ（Escherichia coli NBRC3301）及びバチルスサブチリス（Bacillus subtilis NBRC 3023）をそれぞれ１００ＣＦＵ／ｍｌになるように添加して、３５℃で培養した。経時的に上記培養液をサンプリングした。以下実施例１と同様に行って、細菌数の計測を実施した。培養４時間で細菌数の上昇が確認され、エシェリチア コリが検出された。
【００２９】
実施例５
ＢＧＬＢ培地（日本製薬社製）８０ｇを水１Ｌに溶解して、１００℃、１０分間滅菌したものを調製した。牛乳（明治乳業社製、無脂乳固形分５重量％）５ｍｌに、上記液体培地を５ｍｌ混合した。（混合液中の各最終濃度は、胆汁末１重量％、ブリリアントグリーン６.６ppm）  当該混合液にエシェリチア コリ（Escherichia coli NBRC3301）及びバチルスサブチリス（Bacillus subtilis NBRC 3023）をそれぞれ１００ＣＦＵ／ｍｌになるように添加して、３５℃で培養した。経時的に上記培養液をサンプリングした。培養４時間で細菌数の上昇が確認され、エシェリチア コリが検出された。
【００３０】
比較例１
実施例１と同様に、ＢＧＬＢ培地（日本製薬社製）８０ｇを水１Ｌに溶解して、１００℃、１０分間滅菌したものを調製した。豆乳（不二製油製、固形分５重量％）５ｍｌに、上記液体培地を５ｍＬ混合した。（混合液中の各最終濃度は、胆汁末１重量％、ブリリアントグリーン６.６ppm）  当該混合液にエシェリチア コリ（Escherichia coli NBRC3301）及びバチルスサブチリス（Bacillus subtilis NBRC 3023）をそれぞれ１００ＣＦＵ／ｍｌになるように添加して、３５℃で培養した。
【００３１】
経時的に上記培養液をサンプリングし、ＡＴＰ量の測定を評価した。サンプリングした試料１００μｌにＡＴＰ消去剤１００μｌを添加し、さらに８００μｌの希釈液を添加し混合攪拌を行い、室温で３０分放置させた。次に、反応液１００μｌを採取して、これにＡＴＰ抽出試薬１００μｌを添加した後、混合攪拌、さらに発光試薬１００μｌを添加してルミテスターK-210（キッコーマン社製）で発光量の経時変化を測定した。１分間に200カウント以上発光量が上昇する場合を陽性と判定し、１分間のカウント上昇が50未満を陰性とした。
培養６時間で陽性と判定された。
【００３２】
考察
比較例１のように、従来法では６時間培養しなければ大腸菌群の有無を判定することはできなかったが、本発明の方法によれば、実施例のように４時間程度の培養で判定を行うことができる。初発の菌数によって、判定可能となるまでの培養時間は異なると思われるが、本発明の適用により、概ね、従来法の２／３程度の培養時間により判定が可能になると思われる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により、大腸菌群の測定が、従来の技術では長時間を要するなどの問題があったことに対し、迅速に、また簡易に測定することができるようになり、特に食品業界における大腸菌群の測定の簡略化に大きく寄与するものである。