(57)【要約】【課題】有機溶媒水溶液中の不揮発性溶質を流路内に均一に塗布する溶質塗布方法を提供する。【解決手段】溶質塗布方法は、有機溶媒水溶液に不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加するステップと、不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加した有機溶媒水溶液を、親水性流路内に導入するステップと、親水性流路内に導入された不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加した有機溶媒水溶液を乾燥させるステップと、を有し、親水性流路内に不揮発性物質を均一に塗布する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒水溶液に不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加するステップと、
前記不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加した有機溶媒水溶液を、親水性流路内に導入するステップと、
前記親水性流路内に導入された前記不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加した有機溶媒水溶液を乾燥させるステップと、を有することを特徴とする溶質塗布方法。
【請求項２】
前記有機溶媒水溶液に添加する前に、前記双極性非プロトン性溶媒を脱塩するステップをさらに有することを特徴とする請求項１記載の溶質塗布方法。
【請求項３】
前記有機溶媒水溶液は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン及びその組み合わせの何れかを主体とすることを特徴とする請求項１又は２に記載の溶質塗布方法。
【請求項４】
前記不揮発性物質は、イオン化促進剤であることを特徴する請求項１から３の何れか１項に記載の溶質塗布方法。
【請求項５】
前記不揮発性物質は、３、５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸であることを特徴する請求項１から４の何れか１項に記載の溶質塗布方法。
【請求項６】
前記双極性非プロトン性有機溶媒は、フォルムアミド及びジメチルフォルムアミドの何れかであることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の溶質塗布方法。
【請求項７】
前記親水性流路は、微細加工を施されていることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載の溶質塗布方法。
【請求項８】
前記親水性流路は、ピラーを備えることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の溶質塗布方法。
【請求項９】
前記親水性流路は、タンパク質等電点電気泳動用チップに設けられた流路であることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の溶質塗布方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機溶媒水溶液中の不揮発性溶質を流路内に塗布する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のプロテオミクス技術の飛躍的な進展は、個々人に発現しているタンパク質やペプチドを解析し、ゲノム情報からは得られない翻訳後修飾、ＲＮＡ（RiboNucleic Acid）プロセシング、タンパクプロセシング等の情報を迅速に取り出す手段を提供している。そして現在、疾患の病態解析やその治療及び予防を行おうとする、いわゆるテーラーメード医療の実現に向けた基礎的研究が活発に行われている。
【０００３】
特に、血清タンパク質の解析は個人の肉体的及び精神的負担が少ないうえに、全身をくまなく循環する血液中に含まれるタンパク質を解析することから、疾患のマーカとなりうるタンパク質及びペプチドがその中に含まれているものと期待され、精力的な研究が行われている。さらに、タンパク質の形態と量など実サンプルから得られるデータと他の診断情報とを統合して、疾患に特異的で、診断及び治療に有用な情報をマイニングする研究も盛んに行われつつある。
【０００４】
上述したような血清サンプルからタンパク質やペプチドを分離及び精製する方法としては、様々な方法が実用化されている。例えば、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析）や２次元ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Poly- Acrylamide Gel Electrophoresis ））等に代表されるタンパク質の解析方法がある。
【０００５】
例えば、上記ＬＣ／ＭＳとしては、より確実な同定を行うために、サンプルにイオン化促進剤を添加し、サンプルの分析時間を短縮する技術が開示されている（例えば、特許文献１）。また、近年では複合ＭＳを利用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマロトグラフ−タンデム質量分析）の技術も普及している。このＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用したいわゆるショットガン解析は、タンパク質を網羅的に解析することができ、スループット性が非常に高く、非常に多くのタンパク質発現様態を明らかにすることができる。しかし、翻訳後修飾等、疾患関連タンパク質に多く見られるヘテロジェナイティの網羅的検出及びその定量的解析には未だ多くの問題があった。
【０００６】
他方、２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質を網羅的に解析することができ、翻訳後修飾をうけたタンパク質群の定量性に優れているが、スループット性や実験技法の習熟難度の高さ等が問題となっていた。近年、検出方法の技術進歩により再現性はかなり改善されてきているが、スループット性については未だに問題が残されたままである。
【０００７】
また、タンパク質やペプチドを分離及び精製する方法として、微細加工を施した流路内でキャピラリー等電点電気泳動を行い、分離及び精製されたタンパク質やペプチドを引き続き分離を維持した状態で質量分析することによって、タンパク質やペプチドの等電点及び分子量を同時に解析する方法も開示されている。上記の方法では、質量分析には簡便性からマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計（MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION TIME-OF-FLIGHT MASS：MALDI-TOF MS）が好適に使用される。流路内に乾燥・保持されたタンパク質やペプチドとマトリックスを混合することで、乾燥後質量分析を行う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０６−１０２２５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したタンパク質やペプチドの等電点及び分子量を同時に解析する方法では、親水性処理を施した流路が用いられることがある。しかし、微細加工を施した親水性流路に対して有機溶媒水溶液に混合した質量分析用イオン化促進剤（マトリックス）を導入する際、不揮発性溶質であるマトリックスが流路の壁面付近に偏在してしまい、観測されるイオンの強度分布にむらが生じてしまうという課題があった。そのため、シグナルの均一性を確保することが困難であるという課題があった。
【００１０】
本発明はこのような実情を鑑みてなされたものであり、上記課題を解決し、有機溶媒水溶液中の不揮発性溶質を流路内に均一に塗布する溶質塗布方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
有機溶媒水溶液に不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加するステップと、不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加した有機溶媒水溶液を、親水性流路内に導入するステップと、親水性流路内に導入された不揮発性物質と双極性非プロトン性有機溶媒とを添加した有機溶媒水溶液を乾燥させるステップと、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、有機溶媒水溶液中の不揮発性溶質を流路に均一に分布するように塗布することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本実施形態に係る本実施形態に係る溶質塗布方法を適用する流路に設けられるピラー構造の概略構成例を示す。
【図２】本実施形態に係る溶質塗布方法を適用した流路の全体写真である。
【図３】本実施形態に係る溶質塗布方法を適用した流路の拡大写真である。
【図４】本実施形態に係る溶質塗布方法を適用した流路の構成例を示す流路長手方向断面図である。
【図５】本実施形態に係る溶質塗布方法を適用して溶質を塗布した流路を流路長に渡って質量分析して得られたシグナルを示す図である。
【図６】本実施形態に関連する溶質塗布方法を適用した流路の全体写真である。
【図７】本実施形態に関連する溶質塗布方法を適用した流路の拡大写真である。
【図８】本実施形態に関連する溶質塗布方法を適用した流路の構成例を示す流路長手方向断面図である。
【図９】本実施形態に関連する溶質塗布方法を適用して溶質を塗布した流路を流路長に渡って質量分析して得られたシグナルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の実施形態の例について、図面を用いて詳細に説明する。
【００１５】
本実施形態に係る溶質塗布方法として、微細加工を施した親水性流路に不揮発性溶質であるマトリックスを塗布する方法を例に挙げて説明する。尚、以下では、微細加工を施した親水性流路流路を有する例としてタンパク質等電点電気泳動分離チップを挙げて説明するが、これに限定されるものではない。
【００１６】
（流路）
図１は、本実施形態に係る溶質塗布方法を適用する流路に設けられたピラー構造の概略構成例を示す。本実施形態に係る溶質塗布方法を適用するタンパク質等電点電気泳動分離チップは、例えば、縦２ｍｍ、横３５ｍｍの流路を備えている。図１に示すように、流路の内部には、例えば、縦１２．５μｍ、横３．７５μｍ、高さ１０μｍのピラー１０が等間隔に埋め込まれている。ピラーと該ピラーの平行方向又は垂直方向に隣接するピラーとの中心間距離は１２．５μｍである。尚、ここではピラー構造について具体的な数字を挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、流路の大きさ等に基づいて適宜変更可能である。
【００１７】
また、タンパク質等電点電気泳動分離チップの流路内壁面及びピラー１０の壁面には、線形ポリアクリルアミドをコートしている。これにより、流路は親水性を保つと同時に等電点電気泳動時の電気浸透流を抑えることができる。
【００１８】
上述したような流路に対して質量分析用イオン化促進剤、すなわちマトリックスを塗布して流路内に分離されたタンパク質やペプチドの分子量を計測する。この際、流路の特定の場所からのイオンは特定の等電点を示すものであるから、イオンの観測はそのイオンの分子種の等電点を同時に観測することに他ならない。つまり、流路に対して観測されるイオンを連続的に表示すると、仮想的な２次元マップが得られる。
【００１９】
マトリックスを流路に導入する際は、上述したように同時に等電点の情報を得ることが前提になっているので、分子種が電気泳動による移動の結果存在していた流路の特定の位置からずれるようなマトリックスの導入手法は好ましくない。マトリックス導入前の流路に存在するサンプルである分離タンパク質・ペプチドの状態は一様ではないが、一般的には分離タンパク質・ペプチドは凍結乾燥された状態で流路に存在している。
【００２０】
（サンプル分離方法）
以下に、サンプルであるタンパク質・ペプチドを流路内で分離する方法について具体的な例を挙げて説明するが、これに限定されるものではない。
【００２１】
まず、サンプルとなるタンパク質やペプチドの混合溶液をキャピラリー電気泳動用ゲル溶液と混合し、さらにキャリアアンフォライト（ｐＨ３〜１０）と混合する。この際、等電点電気泳動をモニタするために、蛍光ラベルされた各種マーカを同時に混入させてもよい。こうして調合された等電点電気泳動用タンパク質・ペプチド溶液を、タンパク質等電点電気泳動用チップの親水性処理を施した微細加工流路に導入する。この際、あらかじめタンパク質等電点電気泳動用チップには、例えばポジジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のフタをしておき、流路外に等電点電気泳動用タンパク質・ペプチド溶液が漏れないようにする。
【００２２】
電気泳動に適用する電極としては、例えば、プラス電極液として１０ｍＭ燐酸水溶液、マイナス電極液として５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を使用する。両極に３０００Ｖの電圧を１０〜１２分間印加し、温度をペルチエ素子により１０℃に維持する。電圧印加後、直ちに温度を−３０℃に下げ、流路内の溶液を凍結させる。凍結後、ＰＤＭＳ製のフタを取り外し、減圧して揮発性成分を蒸発する。これにより、不揮発性のタンパク質・ペプチドは等電点分離が達成された流路の特定の位置に凍結乾燥の状態で保持され、常温に戻しても、静かに取り扱えば分離されたタンパク質・ペプチドが移動、拡散、混合することはない。
【００２３】
（マトリックス導入）
上述したような方法で分離されたタンパク質・ペプチドを保持している親水性微細加工流路に、イオン化促進剤であるマトリックスを含有する有機溶媒水溶液を導入する。本実施形態では、マトリックスを含有する有機溶媒水溶液であるマトリックス溶液に、さらに双極性・非プロトン性有機溶媒を０．５〜５％(ｖ／ｖ)、より好ましくは１〜２％(ｖ／ｖ)となるように添加する。
【００２４】
双極性・非プロトン性有機溶媒としては、例えば、ジメチルフォルムアミドやフォルムアミドを適用することができる。特に、フォルムアミドは比較的揮発性が低いため、マトリックス溶液が十分に分散してから揮発するので、好適である。しかし、双極性・非プロトン性有機溶媒はこれに限定されるものではない。また、有機溶媒水溶液の有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン又はその組み合わせ等を主体として適用することができるが、これに限定されるものではない。また、イオン化促進剤であるマトリックスとしては、例えば、３、５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸等を適用することができるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
上述したようなマトリックス溶液を親水性微細加工流路内に導入すると、親水性微細加工流路内へのマトリックス溶液の導入直後においては主体を占める揮発性の高い有機溶媒成分が速やかに乾燥することにより、マトリックス、水分及び双極性・非プロトン性有機溶媒の濃度が上昇する。
【００２６】
次に、マトリックス溶液中の水分が蒸発するが、水分蒸発とともにマトリックス溶液は双極性・非プロトン性有機溶媒が主体の溶液となる。ここで、双極性・非プロトン性有機溶媒が主体の溶液の特性に由来する効果のため、上記マトリックス溶液は流路壁に偏在することなく流路底面に均一な分布を示し、このためマトリックスも均一な分布となる。最終的に、マトリックス溶液中の双極性・非プロトン性有機溶媒が揮発し、マトリックスが流路底面に均一に分布した状態が得られ、これを質量分析することにより、シグナルの安定性を向上させること及びシグナル強度の増大を実現できる。
【００２７】
尚、双極性・非プロトン性溶媒をあらかじめよく脱塩しておくことにより、シグナルの複雑化を抑制することができる。双極性・非プロトン性溶媒の脱塩方法としては、適切なイオン交換樹脂の使用や電気によるイオン除去などが利用できる。双極性・非プロトン性溶媒をあらかじめよく脱塩することにより、双極性・非プロトン性有機溶媒にしばしば混入しているイオン、特に陽イオン体であるナトリウム、カリウムイオンなどの質量分析時の夾雑にともなうシグナルの複雑化と、それに伴うイオン強度の低下を実質的に問題のないレベルにまで抑えることができる。
【実施例】
【００２８】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は、かかる実施例により何ら限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
本実施例では、タンパク質等電点電気泳動用チップ表面上に親水性微細加工された流路に対して双極性・非プロトン性有機溶媒であるフォルムアミドを含有するマトリックス溶液を導入した例について説明する。
【００３０】
＜マトリックス溶液の調合＞
本実施例では、イオン化促進剤であるマトリックスとして、シナピン酸（3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシケイ皮酸）を使用した。このマトリックスを含有するマトリックス溶液は、０．０５％ＴＦＡ、７０％アセトニトリル水溶液を調合し、これにシナピン酸を４．５ｍｇ/ｍＬとなるように溶解し、されにフォルムアミドを２％(ｖ／ｖ)となるように添加して調合した。ここで、本実施例では、マトリックス溶液に、以下に示す質量既知のペプチドを混入した。尚、上記質量既知のペプチドは、双極性・非プロトン性有機溶媒を含んでいなかった。
【００３１】
Bradykinin, m/z=756.4, 9 pmol/uL
【００３２】
＜マトリックス溶液の微細加工流路への導入・乾燥＞
上述したように調合したマトリックス溶液の親水性微細加工流路への導入・乾燥は、市販のディスペンサー装置（SuperΣCM-v2、武蔵エンジニアリング（株）製）を使用した。等電点電気泳動用チップをディスペンサー装置に設置されているホットプレート上に固定し、温度を常に８０℃に保つように設定した。
【００３３】
次に、上述した方法でシナピン酸の塗布を行ったタンパク質等電点電気泳動用チップの流路を観察した。図２は、本実施例においてマトリックス塗布を行った流路の全体写真を示す。図３は、本実施例においてマトリックス塗布を行った流路の拡大写真を示す。図４は、本実施形態に係る溶質塗布方法を適用した流路の構成例を示す流路長手方向断面図である。図２〜図４に示すように、マトリックスは流路全体にわたって満遍なく分布していた。主に、マトリックスがピラー１０の底の周囲に分布している様子が見られた。また、流路内には全体的にまだらな模様がほとんど観測されなかった。
【００３４】
また、上述したようにシナピン酸の塗布を行ったタンパク質等電点電気泳動用チップをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass）にかけ、マトリックスに含まれるペプチドのイオンを流路全長に渡って測定した。イオンの測定結果を図５に示す。尚、便宜上、流路を７１の区画に分けて区画ごとに測定を行った。また、各区画に得られたシグナル強度を流路全体にわたって観察できるように測定後各区画のデータを合成した。具体的には、各区画で得られたスペクトルを手前から奥へ順番に配列し、区画間での強度が比較できるようにＸ軸を区画ごとにずらして表示している。
【００３５】
図５に本実施例によりマトリックスを塗布したタンパク質等電点電気泳動用チップを流路長に渡って質量分析にかけて得られたシグナルを示す。図示するように、シグナル強度が流路長に渡ってあまり変動していないことが観察された。また、このデータを得るために使用したレーザーパワーは５０あった。尚、図５に示す縦軸メモリ単位は１０の７乗である。
【００３６】
（比較例１）
イオン化促進剤であるマトリックスとして、シナピン酸（3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシケイ皮酸）を使用した。このマトリックス溶液として、０．１％TritonX45、０．０５％ＴＦＡ、７０％アセトニトリル水溶液を調合し、これにシナピン酸を４．５ｍｇ/ｍＬとなるように溶解した。ここで、上記マトリックス溶液に、以下に示す質量既知のペプチドを混入した。尚、上記質量既知のペプチドは、双極性・非プロトン性有機溶媒を含んでいなかった。
【００３７】
Bradykinin, m/z=756.4, 9 pmol/uL
【００３８】
＜マトリックス溶液の微細加工流路への導入・乾燥＞
上述したように調合したマトリックス溶液の親水性微細加工への導入・乾燥は、市販のディスペンサー装置（SuperΣCM-v2、武蔵エンジニアリング（株）製）を使用した。等電点電気泳動用チップをディスペンサー装置に設置されているホットプレート上に固定し、温度を常に８０℃に保つように設定した。
【００３９】
次に、上述した方法でシナピン酸の塗布を行ったタンパク質等電点電気泳動用チップの流路を観察した。図６は、マトリックス塗布を行った流路の全体写真を示す。図７は、マトリックス塗布を行った流路の拡大写真を示す。図８は、流路の構成例を示す流路長手方向断面図である。図６〜図８に示すように、マトリックスは、主に流路の上端及び下端にある壁面周辺に分布していた。また、マトリックスの結晶の厚みも不規則であり、流路内に全体的にまだらな模様が観察された。つまり、上記実施例１の流路に比べ、マトリックスの偏在が多いことが観察された。
【００４０】
また、上述したようにシナピン酸の塗布を行ったタンパク質等電点電気泳動用チップをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass）にかけ、マトリックスに含まれるペプチドのイオンを流路全長に渡って測定した。イオンの測定結果を図９に示す。尚、便宜上、流路を７１の区画に分けて区画ごとに測定を行った。また、各区画に得られたシグナル強度を流路全体にわたって観察できるように測定後各区画のデータを合成した。具体的には、各区画で得られたスペクトルを手前から奥へ順番に配列し、区画間での強度が比較できるようにＸ軸を区画ごとにずらして表示している。
【００４１】
図９にマトリックスを塗布したタンパク質等電点電気泳動用チップを流路長に渡って質量分析にかけて得られたシグナルを示す。図示するように、シグナル強度が流路長に渡って変動していることが観察された。また、このデータを得るために使用したレーザーパワーは６５であり、上記図５に示す実施例１でデータを得るために必要なレーザーパワー５０に比べて、強いレーザーパワー必要であった。尚、図９に示す縦軸メモリ単位は１０の６乗である。
【００４２】
また、上記図９に比較して、上記図５に示すシグナル強度が流路長に渡ってあまり変動していないことが観察された。また、実施例１でデータを得るために使用したレーザーパワーは５０であり、図９に示した比較例１による場合に必要なレーザーパワー６５に比べて弱いレーザーパワーで十分なシグナル強度を得ることが可能となった。ここで、レーザーパワーを低く設定できると、観測対象の分解頻度をより低く抑えることが可能である。さらに、レーザーパワーを低く設定できることで、スペクトルの分解能を高くすることが可能であるため、本実施形態のマトリックス塗布方法は質量分析を行う際の実用上のメリットに優れている。
【００４３】
本実施形態により、不揮発性溶質を含有する有機溶媒溶液に双極性・非プロトン性有機溶媒を添加することで、不揮発性溶質を含有する有機溶媒溶液を流路に導入した際に生じる不揮発性溶質の偏在を抑制することが可能となり、流路に不揮発性溶質を均一に塗布することが可能となる。
【００４４】
また、流路に不揮発性溶質を均一に塗布することが可能となることから、流路に分離保持されたタンパク質やペプチドの質量分析を行う際に、イオン強度の安定性を向上させ且つイオン強度を増大させることが可能となる。
【００４５】
以上好適な実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上述した溶質塗布方法に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であるということは言うまでもない。
【符号の説明】
【００４６】
１０    ピラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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