(57)【要約】【課題】自己免疫疾患を治療し又は予防するために自己抗原に対する自然免疫寛容を発達させ且つ回復させることを課題とする。【解決手段】上記課題は、抗原提示細胞に対する抗体を使用して抗原提示細胞とＴ細胞を含む免疫細胞との相互作用を阻害することで解決された。該抗体にペプチドを結合させ、それによってこのようなペプチドに対する免疫応答を生じさせることができる。好ましくは、該抗体に結合するペプチドは、自己免疫に関わるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
自己免疫疾患を治療し又は予防するために自己抗原に対する自然免疫寛容を発達させ且
つ回復させることである。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞仲介疾患のインスリン依存性糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）は、大きな健康上の問題で
あり、１．５百万人以上の米国人がこれに冒されている。この自己免疫疾患は、膵臓内に
あるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞のＴ細胞仲介破壊によって生じる。インス
リンによる治療にもかかわらず、Ｔ１ＤＭが原因の死亡率は過去２０年で増加してきてい
る一方で、癌、心疾患及び脳卒中が原因の死亡率は減少してきている（Ｈｕｒｌｂｅｒｔ
外，２００１）。さらに、腎症、末梢神経障害及び網膜症を含め外因性インスリンによる
治療の合併症は非常に衰弱性である。
【０００３】
Ｔ１ＤＭはＴｈ１仲介疾患であるとみなされており、また、例えば、ＩＬ−４の全身投
与によって免疫応答をＴｈ２型に移行させる初期介入は、病気の発症を予防することがで
きる（Ｃａｍｅｒｏｎ外，１９９７）。エフェクターＴ細胞とＴｈ１とＴｈ２とのバラン
スは免疫寛容を維持する際に重要であり、そしてバランスの変化が自己免疫を生じさせ得
る。しかしながら、自己免疫疾患からの防御は、Ｔｈ２細胞の固有の特性ではない。とい
うのは、ＮＯＤマウスからのＴｈ２細胞株が疾患を転移させることも示されたからである
（Ｐａｋｋａｌａ外，１９９７）。
【０００４】
免疫系は、自己寛容を維持するために複雑な方法で進化してきた。胸腺は、Ｔ細胞の重
要な初期選択を与える。この選択は、胸腺中に存在する自己抗原に対して寛容なＴ細胞を
末梢に伝える。しかしながら、多くの組織特異的蛋白質は、寛容を誘導するのに十分なレ
ベルでは発現しない。例えば、おそらく低い親和性ではあるが、健康な被験者においてラ
ンゲルハンス島反応性Ｔ細胞が見出された（Ｌｏｈｍａｎ外，１９９６）。末梢性寛容の
うちいくつかの機構は、自己反応性Ｔ細胞を調節下で維持するために胸腺において中心的
な寛容機構を補完する。末梢性寛容の重要なメディエーターの一つが抗原提示細胞（「Ａ
ＰＣ」）である。樹状細胞（「ＤＣ」）及びマクロファージのようなＡＰＣは、他の細胞
から自己抗原を捕獲し、そしてこれらのものを自己反応性Ｔ細胞に提示して調節Ｔ細胞の
欠失、無感作及び／又は発生によってＴ細胞寛容を誘導する（Ｈｅａｔｈ  ＆  Ｃａｒｂ
ｏｎｅ，２００１）。現在の仮説は、定常状態の免疫系におけるＡＰＣのような未成熟Ａ
ＰＣが、おそらくは共刺激分子の欠損のために、Ｔ細胞を活性化するのではなくむしろ寛
容化させるというものである。Ｈａｗｉｇｅｒ外は、ＤＣ制限エンドサイト受容体である
ＤＥＣ−２０５に対する抗体を使用してＤＣの主要組織適合クラスII（「ＭＨＣ II」）
経路に抗原を向けた（Ｈａｗｉｇｅｒ外，２００１）。これらのＤＣによる抗原提示は、
ＣＤ４+Ｔ細胞の短期の急激な増殖を刺激し、その後欠失し、そして受容者は、その後の
ペプチド免疫化に対する応答の欠如によって示されるように、抗原に対して寛容になった
。対照的に、抗原ターゲティングが抗ＣＤ４０のような強力なＤＣ成熟刺激を伴ったとき
には、免疫が誘導された。
【０００５】
また、樹状細胞は、エフェクターＴ細胞の機能を抑制サイトカインを介して又は接触依
存機構によって感化させる調節Ｔ細胞を発生させることによって末梢寛容を誘導すること
もできる（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ外，２００１；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ外，２０００；Ｄｈｏｄ
ａｐｋａｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００１）。調節Ｔ細胞を誘導させるための多数の
異なるプロトコールが、一般に「部分最適」Ｔ細胞刺激の手段によって開発された。Ｔ細
胞の部分最適刺激は、共刺激の非存在下での抗原提示によって、又は炎症によって、又は
Ｔ細胞受容体若しくはその共受容体であるＣＤ４及びＣＤ８の部分的な妨害によって達成
できる。調節Ｔ細胞の表現型及びその作用機構は異質である。多くのサプレッサー細胞は
ＣＤ４+ＣＤ２５+であるが、多くの状況においてはＣＤ４+ＣＤ２５-細胞が同様に有効で
あることがますます明らかになっている。調節Ｔ細胞母集団において同定されたその他の
マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲ及びＣＤ１０３（Ｌａｆａｉｌｌｅ  ＆  Ｌａ
ｆａｉｌｌｅ，２００２）が挙げられ、そしてＣＤ８+調節Ｔ細胞も報告された（Ｄｈｏ
ｄａｐｋａｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００２）。いくつかの調節Ｔ細胞が、免疫抑制
サイトカインであるインターロイキン（「ＩＬ」）−１０を産生することが示された（Ｗ
ａｋｋａｃｈ外，２００１；Ｂａｒｒａｔ外，２００２）が、口腔寛容によって誘導され
た調節Ｔ細胞は、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０の他に、β型トラ
ンスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ−β」）の産生を特徴とした（Ｗｅｉｎｅｒ，２０
０１）。接触依存サプレッサー細胞は、ＴＧＦ−βの存在下にＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+ヒト
末梢Ｔ細胞を活性化させることによって生じた（Ｙａｍｉｇａｗａ外，２００１）。調節
Ｔ細胞の誘導は、Ｔ細胞受容体を介した刺激を必要とするが、それらの抑制効果は非抗原
特異的であるように思われる（Ｔｈｏｒｔｏｎ  ＆  Ｓｈｅｖａｃｈ，２０００）。
【０００６】
免疫調節Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて病原反応性Ｔ細胞を下方調節する際にある種
の役割を果たすことが示された。前糖尿病マウスが免疫調節Ｔ細胞を宿し、しかもそれら
の数又はそれらの機能的容量の減少が病気の進行に大きく寄与する事象であるという証拠
がある（Ｓｅｍｐｅ外，１９９４）。同時転写実験から、前糖尿病マウスからのＣＤ４+
Ｔ脾臓細胞が糖尿病誘発性細胞による免疫不全受容者への病気の転移を完全に妨げること
が示された（Ｂｏｉｔａｒｄ外，１９８９；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ＆  Ｃｏｏｋｅ，１９
９０）。また、未成熟ＤＣによる調節Ｔ細胞の誘導は、ＮＯＤマウスモデルにおける病気
の予防と相関があった（Ｈｕｇｅｓ外，２００２）。
【０００７】
ヒトでは、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）、熱ショック
蛋白質（「ＨＳＰ」）６０又は蛋白質チロシンホスファターゼ様分子（「ＩＡ−２」）及
びその他の不定β細胞抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞が説明されてきた（Ｒｏｅｐ外，
１９９０；Ａｔｋｉｎｓｏｎ外，１９９２；Ｈｏｎｅｙｍａｎ外，１９９３；Ｒｅｉｊｏ
ｎｅｎ外，２００２）。
【０００８】
ＧＡＤは、抑制性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸の生合成酵素である（Ｂａｅｋｋ
ｅｓｋｏｖ外，１９９０）。６５％の相同性を有する２種の別個のアイソホームであるＧ
ＡＤ６５及びＧＡＤ６７がクローン化された。ＧＡＤ６５はヒトでは優性のアイソホーム
であるが、ＧＡＤ６７はＮＯＤマウスにおける主要な形態であり、両者のアイソホームに
対する抗体がヒトで検出される（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９２）。ＮＯＤマウスでは、抗
ＧＡＤ抗体は、膵島炎の前又はそれと同時に且つその他のβ細胞抗原に対する抗体が現れ
る前に検出された。このタイミングは、ＧＡＤがこのモデルにおいてβ細胞の自己免疫を
開始させる一次抗原であることを示唆する（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３）。糖尿病における
ＧＡＤの重要な役割についてのさらなる証拠は、糖尿病マウスの脾臓又は膵臓から単離さ
れたＧＡＤ特異的Ｔ細胞が病気を実験未使用動物に転移させ得るという多くの研究室によ
る観察に由来する（Ｒｏｈａｎｅ外，１９９５；Ｗｅｎ外，１９９８；Ｚｅｋｚｅｒ外，
１９９８）。Ｔ１ＤＭの病因におけるＧＡＤの中心的な役割に関する議論の余地は残るも
のの、動物実験からの証拠は、この蛋白質の重要な役割を少なくとも示唆している。
【０００９】
若年期に精製ＧＡＤ６５によって胸腺内又は静脈内のいずれかで免疫化すると、ＮＯＤ
マウスにおいて膵臓β細胞に対するＴ細胞を寛容化させることができ、それによって膵島
炎及び糖尿病を予防することができる（Ｔｉａｎ外，１９９６；Ｍａ外，１９９７）。ま
た、ＧＡＤに対する寛容化は、ＨＳＰ６５のようなその他の抗原に対する免疫反応の発生
を防止することもできた。ＧＡＤペプチドが寛容を誘導できることにさらなる研究が向け
られた（Ｔｉｓｃｈ外，２００１；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８
）。また、糖尿病の発症からの防御は、静脈内、皮下、経口又は経鼻経路を介したインス
リン又はＨＳＰ６５治療のいずれかによっても達成できる（Ｅｌｉａｓ外，１９９１；Ｅ
ｌｉａｓ  ＆  Ｃｏｈｅｎ，１９９４；Ｅｌｉａｓ外，１９９７；Ａｔｋｉｎｓｏｎ外，
１９９０）。抗原特異的治療は、初期に施すときには発病を防止するのに非常に有効であ
るが、ほんの２、３の試みが進行しつつある病気の制御に成功しただけである（Ｅｌｉａ
ｓ  ＆  Ｃｏｈｅｎ，１９９４；Ｔｉａｎ外，１９９６）。
【００１０】
一般的なペプチド免疫化は、抗原提示細胞が該ペプチドを免疫を誘導する段階で提示す
るかどうかを制御できず又は免疫応答を寛容に移行させ得る抗原提示細胞では制御できな
いため、免疫刺激又は免疫抑制のいずれかを生じさせ得る。
【００１１】
免疫系を損なうと糖尿病の発症を予防することができる。ＦＫ５０６、抗ＣＤ４、抗Ｃ
Ｄ８、抗ＣＴＬＡ−４などのようなＴ細胞機能を抑制するありとあらゆる一般的な薬剤が
ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を予防し又は遅らせることが示された（概説：Ａｔｋ
ｉｎｓｏｎ  ＆  Ｌｅｉｔｅｒ，１９９９）。しかしながら、これらの試薬のいずれも糖
尿病誘発性Ｔ細胞に対して特異的ではなく、また、これらの大部分は病気の発症を予防す
ることができるが、いったん病気が発症すると効果的ではない。臨床実験で試験されたシ
クロスポリンのような一般的な免疫抑制剤は、短期間では有効であった（Ｆｅｕｔｒｅｎ
外，１９８８；Ｓｋｙｌｅｒ  ＆  Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，１９９２）。しかしながら
、免疫抑制の中断は即座の再発に至り、そして腎臓障害のような副作用が長期治療を妨げ
る（Ｐａｒｖｉｎｇ外，１９９９）。
【００１２】
糖尿病における抗原特異的治療の有効性を評価するための臨床試験が開始された。ＨＳ
Ｐ６０ｐ２７７ペプチド（ＤｉａＰｅｐ２７７）は、初期の糖尿病で試験された（Ｒａｚ
外，２００１）。このペプチドによる多数の免疫化がこの病気の進行を緩やかにし、そし
てこの結果を確認し且つ拡大するための大規模な研究が開始された。ヒトインスリンのβ
鎖を不完全フロイントアジュバント、インスリンＢ９−２３の改変ペプチドリガンド及び
ＧＡＤと組み合わせて使用した臨床試験が進行中である。しかしながら、近年診断された
糖尿病を経口インスリンで治療する試験は失敗し（Ｐｏｚｚｉｌｉ外，２０００；Ｃｈａ
ｉｌｌｏｕｓ外，２０００）、そして非経口インスリン投与は非常に危険な状態にある前
糖尿病を予防することに失敗した（糖尿病予防試験１型（ＤＰＴ）研究グループ，２００
２）。失敗は、抗原の選択、抗原の投与量（Ｋｕｒｔｓ外，１９９９）、投与のタイミン
グ及び経路を含むいくつかの要因による可能性があった。また、抗原療法は、いかなるタ
イプの免疫細胞が抗原を取り込むのかを制御することができない。マウスは制御された病
原体フリーの条件下にあるが、臨床試験ではそういうわけにはいかない。細菌又はウイル
スの同時感染が存在するときには、寛容よりもむしろプライミングが生じ得る。動物では
、糖尿病は、ある種の条件下での抗原免疫化によって誘導され得た（Ｂｌａｎａ外，１９
９６；Ｂｅｌｌｍａｎｎ外，１９９８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
免疫系がいかにして自己抗原に対する寛容を維持するのかという理解が過去数十年の間
に実質的に深まってきたため、Ｔ１ＤＭを予防し又は治療するための近年の治療戦略は、
β細胞抗原に対する免疫寛容を回復させることに向けられている。近年の免疫療法の戦略
は、自己反応性Ｔ細胞を直接不活性化させること及び／又は調節能力を有するＴ細胞を誘
導することのいずれかによってβ細胞抗原に対する寛容を誘導することに向けられている
。調節Ｔ細胞の誘導は、多数の自己免疫疾患の治療のために期待できる手法であると思わ
れる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
要約
本発明は、免疫寛容を誘導することによって自己免疫疾患を治療する方法に関する。免
疫寛容は、自己抗原を抗原提示細胞に提示することによって誘導される。自己抗原は、抗
原内在化受容体を認識する抗体に結合する。自己抗原は、抗原提示細胞によって内在化さ
れ且つ該細胞上に提示されるが、これは自己反応性Ｔ細胞の抑制を生じさせる。
【００１５】
特に有用な具体例では、ここに記載される方法及び化合物は、特に、β細胞抗原、ＧＡ
Ｄ又はそれらのエピトープ、インスリン又はそのエピトープ、ＨＳＰ又はそのエピトープ
であることができる自己抗原に対する免疫寛容を誘導することによって糖尿病を治療する
ために使用される。この自己抗原は、抗原内在化受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮＲ又はＤＣ
−ＳＩＧＮＲの変異体を認識する抗体に結合する。自己抗原は、標的肝臓シヌソイド内皮
細胞又は表面上にＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現するその他の寛容化ＡＰＣに内在化される。自
己抗原は、この標的肝臓シヌソイド内皮細胞上に提示され、そして自己反応性Ｔ細胞の増
殖を抑制する。
【００１６】
別の態様では、ペプチドに結合した抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含有する抗
体／ペプチド構築物を説明する。好ましくは、このペプチドは、抗原、さらに好ましくは
自己抗原である。特に有用な具体例では、抗体／自己抗原構築物又はその部分は、抗原提
示細胞によって内在化され、そしてこの自己抗原に対する免疫寛容が達成される。場合に
よっては、毒素が本発明の抗体と混合され、そして患者に投与される。この毒素が、例え
ば腫瘍細胞に対するものである場合には、本発明の抗体は、該毒素を該腫瘍細胞に向けさ
せ、それによって該毒素の投与を該腫瘍細胞に集中させるために使用される。
【００１７】
別の態様では、自己抗原に結合した抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含有する改
変抗体を組換えによって作製するための方法を説明する。
【００１８】
また、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＴ細胞のようなＩＣＡＭ発現細胞との相
互作用を妨害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に関するものでもある。
【００１９】
別の態様では、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ウイルスが肝臓シヌソイド細胞のよ
うな肝細胞に入るのを阻害し、そしてそれらがその他の細胞に感染するのを阻害する。い
くつかの具体例では、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体をワクチンに使用するこ
とを包含する。
【００２０】
いくつかの具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はヒト化抗体であるこ
とができる。その他の具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はｓｃＦｖで
あることができる。
【００２１】
本発明のさらなる具体例は、上記のような組成物を使用した及び／又は方法を具体化
した予防技術並びに診断技術に関するものである。また、薬剤として許容できるキャリア
中に本願発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を含む組成物も提供する。
【００２２】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
自己免疫疾患の治療方法であって、
抗原提示細胞の受容体に対する抗体に結合した自己抗原を含有する抗体／自己抗原構築
物を準備し、
該抗体／自己抗原構築物を被検体に投与すること
を含む、自己免疫疾患の治療方法。
（項目２）
糖尿病の治療方法であって、
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、イン
スリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原
よりなる群から選択される自己抗原であって抗原提示細胞受容体に対する抗体に結合した
ものを含有する抗体／自己抗原構築物を準備し、
該抗体／自己抗原構築物を被検体に投与すること
を含む、糖尿病の治療方法。
（項目３）
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッ
パー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞の受容体に対する抗体を含有
する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−
ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受
容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から
選択される受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原受容体を準備することを含む、
項目１又は２に記載の方法。
（項目５）
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−
ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲよりなる群から選択される抗原内在化受容体に対する抗体
を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目６）
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）
、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳ
Ｐ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される自己抗原を含有する
抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
抗体がＤＣ−ＳＩＧＮＲ又はＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異体を認識する、項目１又は２に
記載の方法。
（項目８）
抗原提示細胞上の受容体に対する抗体をある種のペプチドに結合させてなる抗体／ペプ
チド構築物。
（項目９）
ペプチドが自己抗原である、項目８に記載の抗体／ペプチド構築物。
（項目１０）
抗体が、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群か
ら選択される抗原提示細胞上の受容体に対するものである、項目８に記載の抗体／ペプ
チド構築物。
（項目１１）
抗体が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、Ｍ
ＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型
レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対するもので
ある、項目８に記載の抗体／ペプチド構築物。
（項目１２）
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、イン
スリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及
びβ細胞抗原よりなる群から選択される、項目９に記載の抗体／ペプチド構築物。
（項目１３）
抗体に結合した毒素をさらに含む、項目８に記載の抗体／ペプチド構築物。
（項目１４）
抗体に結合した毒素が腫瘍細胞毒素に対するものである、項目１３に記載の抗体／ペ
プチド構築物。
（項目１５）
項目８に記載の抗体／ペプチド構築物及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成
物。
（項目１６）
抗原提示細胞の受容体に対する抗体を自己抗原に結合させることを含む、組換えによっ
て改変抗体を作製するための方法。
（項目１７）
自己抗原を樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群
から選択される抗原提示細胞の受容体に対する抗体に結合させる、項目１６に記載の方
法。
（項目１８）
自己抗原をＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、
ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ
型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対する抗体
に結合させる、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、イン
スリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及
びβ細胞抗原よりなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨害するＤＣ−ＳＩＧＮ
Ｒに対する抗体。
（項目２１）
項目２０に記載の抗体及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
（項目２２）
項目２０に記載の抗体を含むワクチン。
（項目２３）
ウイルスが肝細胞に入るのを阻害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体。
（項目２４）
項目２３に記載の抗体を含むワクチン。
（項目２５）
項目２３に記載の抗体及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に従う抗体／自己抗原構築物と抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞との相互作用を示す概略図である。
【図２Ａ】ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ｓｃＦｖ抗体の重鎖アミノ酸配列（配列番号１〜６）を示す図である。
【図２Ｂ】ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ｓｃＦｖ抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号７〜１２）を示す図である。
【図３】抗体ペプチド構築物産生用ベクターの一部分の概略図である。
【図４】ＩｇＧ１クローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図５】ＩｇＧ２ａクローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図６】ＩｇＧ１クローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図７】ＩｇＧ２ａクローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図８Ａ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図８Ｂ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図８Ｃ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図９Ａ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号３７〜５５）を示す図である。
【図９Ｂ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号３７〜５５）を示す図である。
【図１０】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号６３〜８２）を示す図である。
【図１１】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号４６〜２２６）を示す図である。
【図１２】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１３３〜１５４）を示す図である。
【図１３】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１６９〜１８９）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本方法は、自己免疫疾患に関わる自己抗原又は自己ペプチドに対する免疫寛容を誘導す
る。
【００２５】
免疫寛容は、本発明に従って、抗体／自己抗原構築物（本明細書においては、時として
「改変抗体」ともいう。）を被検体に投与することによって誘導される。この抗体／自己
抗原構築物は、ある種の抗体に結合した自己抗原を包含する。
【００２６】
この抗体の成分は、任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する抗体であることが
できる。当業者であれば認識するであろうが、抗原提示細胞のタイプとしては、樹状細胞
、マクロファージ、内皮細胞、クッパー細胞及びＢ細胞が挙げられる。現在知られている
受容体又は抗原提示細胞の中では、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ
、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール（Ｔｏｌｌ）受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白
質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体が挙げられ
る。特に有用な具体例では、この受容体は、ＳＴＴ抗体を内在化させるであろうものであ
る。内在化が特定の受容体で生じるかどうかは、当業者に知られた技術を使用して実験に
よって決定できる。現在抗体の内在化を与えることが知られている受容体又は抗原提示細
胞としては、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲ
が挙げられる。
【００２７】
抗体成分は、自然抗体（慣用技術を使用して単離される）又は当業者の認識範囲内にあ
る組換え方法により合成によって調製される抗体であることができる。この抗体は、例え
ば、完全にヒトの抗体、ヒト以外の抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は任意の方法（部位
特異的修飾若しくは脱免疫化）で操作された前述のタイプの抗体のうち任意のものである
ことができる。抗体は、有利には、例えばファージディスプレイ及びパニング法のような
当業者に知られた技術を使用して抗体ライブラリーから選択できる。
【００２８】
いったん選択されると、該抗体をコードする核酸は、例えば、それぞれ２００２年９月
１９日に出願された米国特許出願第１０／２５１０８５号及び２００１年１２月１０日に
出願された米国特許出願第１０／０１４０１２号（これらの開示は引用によってここに加
えるものとする）に記載された慣用のＰＣＲ及び増幅技術のような当業者に知られた技術
を使用して増幅できる。
【００２９】
この開示に従って、自己抗原を抗体に結合させて抗体／自己抗原構築物を調製する。任
意の自己抗原が使用できる。自己抗原は、天然に生じるものであることができ、そして当
業者に知られた技術を使用して単離できる。別法では、この自己抗原のアミノ酸配列が知
られている場合には、このものは既知の技術を使用して合成によって調製できる。好適な
自己抗原としては、インスリン、ＧＡＤ、Ｈｓｐ、核抗原、アセチルコリン受容体、ミエ
リン塩基性蛋白質、ミエリン希突起膠細胞糖蛋白質、プロテオリピド蛋白質、ミエリン結
合糖蛋白質、糸球体基底膜蛋白質及びチロトロピン受容体が挙げられる。特に有用な具体
例では、自己抗原は、抗原提示細胞による提示に基づき免疫寛容を誘導するものである。
【００３０】
自己抗原は、任意の好適な方法によって抗体に結合できる。一つの特定の方法を後の実
施例に示しているが、この開示は、抗体／自己抗原構築物を作製する任意の特定の方法に
限定されるものではない。
【００３１】
自己抗原に対する免疫寛容を誘導する本方法は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）を標的に
し、且つ、自己抗原を抗体によってそれらの細胞に向ける。図１は、本発明に従う抗体／
自己抗原構築物と抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞との相互作用を概略的に示している
。抗体は、標的細胞上の受容体を認識する。この抗体による自己抗原の送達に向けるため
に、これら２つのものを結合させる。本明細書はベクターのクローニングを使用すること
を記載しているが、この結合は、任意の方法によって達成され得る。抗体は、ユニークな
抗体内在化受容体のみを標的にし、そしてこれに結合し、それによって所望の細胞型への
抗原の送達を確実なものにする。
【００３２】
抗体が標的抗原内在化受容体に結合した後に、結合した自己抗原と抗体は、抗原提示細
胞内に内在化される。自己抗原は、おそらくは該細胞内の主要組織適合複合体（「ＭＨＣ
」）との自己抗原相互作用を介してＡＰＣの表面上に提示される。いったん自己抗原が共
刺激能力を有するＡＰＣの表面上で発現すると、ナイーブ自己反応性Ｔ細胞は活性化され
るようになり、そしてそれらの特異的な自己抗原を標的にし且つそれと反応し得る。ＡＰ
Ｃの表面に共刺激分子が存在しないことは、おそらくＴ細胞応答を制限させることに関わ
る。自己反応性エフェクターＴ細胞は、制限された数の抗原提示組織細胞のみを死滅させ
得る。数種の標的細胞を死滅させた後に、このエフェクター細胞は死滅する。そのときに
、自己抗原提示細胞が寛容化される。
【００３３】
本願発明の抗体／自己抗原構築物は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋
肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入若しくは病変内経路、局所又は以下に示すよう
な徐放系による注射又は注入によって投与できる。この抗体／自己抗原構築物は、好まし
くは、注入又は静脈内ボーラスによって連続的に投与される。局所的又は全身的な態様で
該抗体／自己抗原構築物を投与できる。
【００３４】
抗体／自己抗原構築物は、薬剤として許容できるキャリアとの混合物で調製できる。本
願発明の化合物の処方及び投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｎｅｃｅｓ」，Ｍａｃｋ出版社，ペンシルバニア州イーストン
，最新版に見出され得る。この医薬組成物は、静脈内に又は鼻若しくは肺を介して、好ま
しくは液体又は粉末エーロゾル（凍結乾燥された）として投与され得る。また、この組成
物は、非経口で又は皮下にも望み通りに投与され得る。全身に投与されるときに、この医
薬組成物は、滅菌されており、発熱性物質を有しておらず、しかもｐＨ、等張性及び安定
性について十分に考慮された非経口投与に許容できる溶液中にあるべきである。これらの
条件は当業者に周知である。
【００３５】
簡単に説明すると、本発明の抗体／自己抗原構築物の投与処方物は、貯蔵又は投与のた
めに、所望の純度を有する化合物と生理的に許容できるキャリア、賦形剤又は安定剤とを
混合させることによって調製される。このような材料は、使用される投与量及び濃度では
これらの賦形剤に対して非毒性であり、しかもＴＲＩＳ・ＨＣｌ、燐酸塩、クエン酸塩、
酢酸塩及びその他の有機酸塩のような緩衝液、アスコルビン酸のような酸化防止剤、ポリ
アルギニンのような低分子量（約１０残基以下）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチン
又は免疫グロブリンのような蛋白質、ポリビニルピロリジノンのような親水性重合体、グ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニンのようなアミノ酸、単糖、二糖及
びその他の炭水化物（セルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース又はデキ
ストリンを含む）、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、マンニット又はソルビットのような
糖アルコール、ナトリウムのような対イオン及び／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ
若しくはポリエチレングリコールのような非イオン界面活性剤を含むことができる。
【００３６】
生体内投与のために使用されるときに、抗体／自己抗原構築物処方物は滅菌された状態
でなければならず、そして慣用の製薬手法に従って処方され得る。これは、凍結乾燥及び
復元の前又は後に、滅菌濾過膜によって濾過することにより容易に達成される。この抗体
は、通常、凍結乾燥形態又は溶液の状態で保存されるであろう。その他の賦形剤、例えば
、胡麻油、落花生油若しくは綿実油のような天然の植物油又はオレイン酸エチルなどのよ
うな合成脂肪賦形剤が望ましいかもしれない。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などが、認め
られた製薬手法によって取り込まれ得る。
【００３７】
使用するのに好適な医薬組成物としては、１種以上の抗体／自己抗原構築物がそれらの
意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。より具体的には
、治療上有効な量とは、病気を予防し、その症状を緩和し若しくは改善させる又は治療さ
れる被検体を延命させるのに有効な抗体の量を意味する。治療上有効な量の決定は、特に
ここに与えた詳細な開示に照らせば、当業者の能力の範囲内にある。治療上有効な投与量
は、試験管内及び生体内方法を使用することによって決定できる。
【００３８】
治療に使用されるべき抗体／自己抗原構築物の有効量は、例えば、治療対象、投与経路
及び患者の状態に依存するであろう。さらに、主治医は、病気の深刻さとタイプ、体重、
性別、食事、投与の時間と経路、他の薬物療法及びその他の関連する臨床要因を含め、薬
剤の作用を改変させることが知られている様々な要因を考慮する。従って、治療専門家は
、最適な治療効果を得るために要求されるように、投与量を滴定し及び投与の経路を改変
することが必要であろう。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達す
るまで抗体／自己抗原を投与するであろう。この治療の進行は、慣用のアッセイ法によっ
て容易に監視される。
【００３９】
任意の抗体／自己抗原構築物について、その治療上有効な投与量は、最初に細胞培養ア
ッセイ法から推定できる。例えば、投与量を動物モデルに処方して細胞培養液中で決定さ
れるようなＥＣ50を含む循環濃度範囲（例えば、細胞増殖又は細胞分化を促進させ又は阻
害する試験分子の濃度）を達成することができる。このような情報を使用してヒトに有用
な投与量をさらに正確に決定することができる。
【００４０】
ここで記載した抗体／自己抗原構築物の毒性及び治療上の効果は、例えば、ＬＤ50（母
集団の５０％致死量）及びＥＤ50（母集団の５０％に治療上有効な量）を決定するための
、細胞培養基又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定できる。毒性と治療効
果との間の投与量比は治療指数であり、そしてこれはＬＤ50とＥＤ50との間の比として表
すことができる。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイ法及び
動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための所定の範囲の投与量を処方する際
に使用できる。このような分子の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く有しな
いＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。この投与量は、使用される剤形及び使用される
投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の
医師によって患者の状態を考慮して選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ外，「Ｔｈｅ  Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第１
章，１頁，１９７５を参照）。
【００４１】
投与量及び投与間隔を個々に調節して細胞増殖若しくは細胞分化を促進させ若しくは阻
害するのに十分な抗体／自己抗原構築物の血漿レベル又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を与え
ることができる。このＭＥＣは、それぞれの抗体／自己抗原構築物に対して変化するであ
ろうが、説明したアッセイ法を使用した試験管内データから推定できる。ＭＥＣを達成す
るのに必要な投与量は、個々の特性及び投与経路に依存するであろう。しかしながら、Ｈ
ＰＬＣアッセイ法又はバイオアッセイ法を使用して血漿濃度を決定することができる。
【００４２】
また、投与間隔もＭＥＣ値を使用して決定することができる。抗体／自己抗原構築物分
子は、その時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、もっとも好ましくは５０〜９
０％にわたってＭＥＣ以上の血漿レベルを維持する方式を使用して投与されるべきである
。
【００４３】
局所投与又は選択的摂取の場合には、抗体／自己抗原構築物の有効な局所濃度は、血漿
濃度とは関連がない。
【００４４】
典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまで
の範囲又はそれ以上であることができる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する
投与量に到達するまで抗体／自己抗原構築物を投与するであろう。この治療の進行は、慣
用のアッセイ法によって容易に監視される。
【００４５】
病気のタイプ及び深刻さに応じて、抗体／自己抗原構築物の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜
約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ま
しくは約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇが、例えば１回以上の別個の投与によるか又は連続
注入によるかに関わらず、患者への投与の候補となる初期投与量であり得る。数日又はそ
れ以上にわたる繰り返し投与については、状態に応じて、治療は、病状の所望の抑制が生
じ又は患者の状態の所望の改善が達成されるまで繰り返される。しかしながら、その他の
用法・用量も有用であり得る。
【００４６】
特に有用な具体例では、本願発明の方法は、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産
生β細胞に対する免疫慣用を誘導することによって糖尿病を治療するために使用できる。
これらの細胞の自己抗原は、所望の抗原内在化受容体を認識する抗体に結合する。本発明
において使用するのに好適な自己抗原は、β細胞抗原、インスリンのエピトープ又はエピ
トープに相当するペプチド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）及び熱ショ
ック蛋白質（「ＨＳＰ」）である。インスリン、ＧＡＤ及びＨＳＰからのエピトープを覆
う一組のペプチドを抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に結合させることによって、Ｔ１ＤＭに関わ
る全ての主要な抗原に対する慣用を誘導することができる。その他の自己抗原は、当業者
であれば周知・慣用であり、発見・使用できる。
【００４７】
抗原内在化受容体は、分化したＡＰＣ上に提示される。この方法について、選択される
抗原内在化受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（樹状細胞特異的細胞間付着分子３−接着性非イ
ンテグリン関連受容体：dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-
grabbingnonintegrin related receptor）である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、肝臓常駐抗原
提示細胞である肝臓シヌソイド内皮細胞（「ＬＳＥＣ」）によって発現される（Ｐｏｈｌ
ｍａｎｎ外，２００１）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、受容体結合蛋白質を内在化させ且つ抗原
提示を促進させる病原体内在化受容体ファミリーに属する（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外
，２００２）。ＬＳＥＣによる抗原の提示が抗原特異的慣用を生じさせることが示された
（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。未成熟の免疫寛容状態から活性化状態に成熟し得るその
他の樹状細胞型とは対照的に、肝臓シヌソイド細胞は、活性化抗原提示細胞に発達するよ
うに誘導され得ない（2Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するホモ
ログであるヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ（Ｌ−ＳＩＧＮとも呼ばれる）は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対
してアミノ酸レベルで７７％の同一性を示し、そして内在化受容体に対する特有のドメイ
ンを有する（Ｂａｓｈｉｒｏｖａ外，２００１；Ｓｏｉｌｌｅｕｘ外，２０００）。ＤＣ
−ＳＩＧＮＲは、ＬＳＥＣ上で高発現し、且つ、リンパ節マクロファージ様細胞の亜母集
団でも見出されるが、ＤＣによっては発現しない。
【００４８】
本発明の目的上、用語「ＤＣ−ＳＩＧＮＲ」及び「Ｌ−ＳＩＧＮ」は区別なく使用する
。
【００４９】
Ｃ型レクチンマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）は、近年、ＤＣ特異的受容体として
同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣのトランス内皮移行を仲介するが、これは、一過性
のＤＣ−Ｔ細胞相互作用を開始させることによって一次免疫応答を可能にする（3Ｇｅｉ
ｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２０００；2Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２０００）。また、ＤＣ
−ＳＩＧＮは、炭水化物構造を介して病原体を認識する内在化抗原受容体としても作用す
る。ＤＣ−Ｔ細胞のクラスター形成及びＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割のほか
に、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣの感染及びその後のＴ細胞へのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ
ＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）及びデングウイルスのようなウイルス、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyl
ori）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiellapneumonae）及びミコバクテリア・ツ
ベルクロシス（Mycobacteriatuberculosis）のような細菌、カンジダ・アルビカンス（C
andida albicans）のような酵母並びにリーシュマニア・ピファノイ（Leishmaniapifano
i）及びシストソーマ・マンソニ（Schistosomamansoni）のような寄生虫の伝達に関わる
主要な受容体である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲのネズミホモログであるｍＳＩＧＮＲＩは、迅速
に内在化され且つプロセシングためのリソソームを標的とする抗体を捕捉する（Ｇｅｉｊ
ｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。アミノ酸配列に基づけば、ネズミｍＳＩＧＮＲ１は、ヒ
トＤＣ−ＳＩＧＮＲ、実際にはヒトＤＣ−ＳＩＧＮに相同的であり、そのため動物モデリ
ング研究に有用である。
【００５０】
いくつかの具体例では、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞
とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を調節、即ち抑制し又は高める。一具体例では、抗ＤＣ
−ＳＩＧＮＲ抗体は、ＬＳＥＣのような抗原提示細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲ受容体
部位に結合し、そしてＬＳＥＣとＴ細胞との間の相互作用を阻害する。より具体的には、
ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体と
の付着を妨害することによってＬＳＥＣとＴ細胞との付着を減少させる。
【００５１】
ここで使用するときに、「ＩＣＡＭ受容体」とは、ＩＣＡＭ−２受容体とＩＣＡＭ−３
受容体の両方、特にＩＣＡＭ−３受容体を意味する。
【００５２】
いくつかの具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮに
は結合しない。
【００５３】
その他の具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ウイルスが肝臓シヌ
ソイド細胞のような肝臓細胞に入るのをブロックし、しかもウイルスが他の細胞に感染す
るのをブロックする。
【００５４】
Ｔ細胞の抗原提示細胞への付着の妨害により、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用は
、抗原提示細胞−Ｔ細胞クラスター形成、Ｔ細胞活性化及び抗原提示細胞とＴ細胞との間
の接触に依存するその他の相互作用に影響を与えるであろう。これらのその他の相互作用
としては、抗原提示細胞とＴ細胞との細胞対細胞の直接接触又はかなりの接近が挙げられ
る。
【００５５】
その他の具体例では、本発明の抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、自己抗原ペプチドのような
ペプチドに結合する。これらのペプチドは、ベクターを抗体フラグメントにグラフトさせ
ること及び結合したベクター／抗体をクローン化させること又は化学的に結合させること
を含め、任意の好適な方法によって抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に結合できる。ベクターを結
合させる方法、クローン化の方法又は化学的に結合させる方法は当業者に周知である。
【００５６】
次いで、これらのペプチド、好ましくは自己抗原は、結合した抗体と共に、ＬＳＥＣに
内在化される。ＬＳＥＣは、ＭＨＣII、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような抗原提示に必要な
表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅ外，１９９６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ外，１９８６）。ナ
イーブＣＤ４+Ｔ細胞に調節表現型を誘導させる（Ｋｎｏｌｌ外，１９９９）ことに加え
て、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによってＣＤ８+Ｔ細胞に寛容を誘導し
得る（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。ＬＳＥＣは、ＭＨＣの下方調節及びエンドソームプ
ロセシングの妨害によってＴＮＦ−α及び内毒素として刺激に応答する（2Ｋｎｏｌｌ外
，１９９９）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官に移動しない。
【００５７】
この内在化は、ＭＨＣ相互作用を介して仲介されるＬＳＥＣに対する表面への自己抗原
ペプチドの提示を促進させる。いったん自己抗原が共刺激能力を有するＬＳＥＣの表面上
で発現すると、ナイーブ自己反応性Ｔ細胞は活性化された状態になり得る。これらのＴ細
胞は、結合した自己抗原を標的にし且つそれと反応する。エフェクターＴ細胞は、少数の
ＬＳＥＣを死滅させ、そして共刺激分子がなければ死滅する。ＬＳＥＣによるこの自己抗
原提示は、抗原特異的寛容を生じさせる。
【００５８】
肝臓は、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのような多数の免疫寛容メディエーター並びに免疫
寛容の発達を助成する分化ＡＰＣを有するユニークな微環境を有する（1Ｋｎｏｌｌｅ及
びＧｅｒｋｅｎ，２０００）。肝臓の免疫寛容特性は、同種肝移植物がＭＨＣ障壁にわた
って受け入れられ得るという知見によって裏付けられる（Ｃａｌｎｅ，１９６９）。さら
に、門脈を介した抗原の適用は、おそらく抗原の全身適用よりも寛容に至る（Ｋａｍｅｉ
外，１９９０）。肝臓を介した排出は、口腔免疫寛容誘導にとって不可欠であることが報
告されている（Ｙａｎｇ外，１９９４）。肝血管を通過する血液は、まずクッパー細胞及
びＬＳＥＣと接触する。肝臓シヌソイドを通る血流は遅いため、肝臓シヌソイド細胞集団
と通過する白血球との接触が可能となる。ＬＳＥＣは、ＭＨＣII、ＣＤ８０及びＣＤ８６
のような抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅ外，１９９６；Ｒｕｂｉｎｓｔ
ｅｉｎ外，１９８６）。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に調節表現型を誘導する（3Ｋｎｏｌｌｅ
外，１９９９）ことに加えて、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによってＣＤ
８+Ｔ細胞に寛容を誘導し得る（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚ外（
Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚ外，２００２）は、Ｔｈ１、ＩＦＮ−γ産生ＴＣＲ形質転換細胞をマ
ウスに注射すると、静脈内蛋白質免疫化後に、肝臓内でこれらの細胞によるＩＦＮ−γ産
生の抑制及びＴｈ２細胞の促進を生じることを立証した。未成熟な寛容段階から免疫を開
始させる成熟段階に分化し得るプロフェッショナル骨髄性ＡＰＣとは対照的に、ＬＳＥＣ
は、ＭＨＣの下方調節及びエンドソームプロセッシングの妨害によってＴＮＦ−α及び内
毒素として刺激に応答する（2Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓
からリンパ器官に移動しない。ＬＳＥＣは、寛容の誘導に特化した唯一のＡＰＣではない
可能性がある。Ｐｕｇｌｉｅｓｅ外は、近年、内因的に発現する自己抗原を提示すること
によって寛容を誘導した脾臓ＤＣの小さなサブセットを同定した（Ｐｕｇｌｉｅｓｅ外，
２００１）。全体的に、ＬＳＥＣは、寛容を誘導する目的でβ細胞抗原を提示するのに有
利な細胞型であると思われる。
【００５９】
好ましい態様及び具体例を含め、本方法の実施は、次の実施例から容易に理解されるで
あろう。これらの実施例は、単なる例示であり、決して限定するように解釈すべきではな
い。
【実施例】
【００６０】
例１：抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体の取得
ファージディスプレイ技術を使用して、ｍＳＩＧＮＲ１を認識する単鎖抗体（ｓｃＦｖ
）のパネルを同定した。ｓｃＦｖは、リンカーによって結合した可変軽鎖及び重鎖領域を
含有する。それらの短い長さはこれらの抗体フラグメントを抗原結合のために非常に好適
にし、また受容体に対する結合能力は保存されている。ウサギを組換えｍＳＩＧＮＲ１で
免疫化し、そして国際公開第ＷＯ０２／４６４３６Ａ２号パンフレット（２００２年６月
１３日発行）に記載されるファージディスプレイ用ベクターｐＲＬ４を使用してｓｃＦｖ
抗体ライブラリーを構築した。この特許文献の開示は引用によってここに加えるものとす
る。この系における抗体フラグメントは、ファージの遺伝子IIIコート蛋白質上に提示さ
れる。ｍＳＩＧＮＲ１を認識する抗体を、組換えｍＳＩＧＮＲ１上での４ラウンドの固相
パニングによって単離した。６種の異なる抗体を同定した。これら６種の抗体のアミノ酸
配列を図２Ａ及びＢに与えている（それぞれ、配列番号１〜６及び７〜１２）。全ての抗
体は固相ＥＬＩＳＡでｍＳＩＧＮＲ１を認識し、そしてヒトＤＣ−ＳＩＧＮのネズミホモ
ログであるｍＤＣ−ＳＩＧＮとの交差反応は全く観察されなかった。これらの抗体をＨＡ
及びＨＩＳ6でエピトープ標識した。ｍＳＩＧＮＲ１とＤＣ−ＳＩＧＮＨＩＳの両方を３
Ｔ３ＥＢＮＡ細胞によって産生させ、そしてニッケルカラムで精製した。
【００６１】
例２：細胞表面受容体への結合に基づき内在化される抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体の同定
ｍＳＩＧＮＲ１を発現する細胞株のスクリーニング
ウサギマクロファージ細胞株のパネル（Ｐ３８８Ｄ１、１−１３．３５、ＷＥＨＩ−３
及びＪ７７４）を標準的な方法によるＲＴ−ＰＣＲによってｍＳＩＧＮＲ１の発現に対し
てスクリーニングする。プライマーをｍＳＩＧＮＲ１のＧｅｎｂａｎｋ配列に基づきデザ
インし、これらのものをマウス器官のＲＴ−ＰＣＲで使用する。ｍＲＮＡレベルでｍＳＩ
ＧＮＲ１を発現する細胞株を同定し、そして表面発現をＦＡＣＳ分析によって確認する。
５×１０5個の細胞を、１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中で１μｇの抗
ｍＳＩＧＮＲ１抗体と共に氷上で１５分間、抗体の内在化を可能としない条件でインキュ
ベートする。１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄した後に、結
合した抗ｍＳＩＧＮＲ１をビオチニル化抗ＨＡ（ロシュ）、次いでＰＥ結合ストレプタビ
ジン（ベクトン・ディキンソン）によって検出し、そして細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕ
ｒ（ベクトン・ディキンソン）を使用して分析する。別法として、内在化を、肝臓シヌソ
イド内皮細胞のようなｍＳＩＧＮＲ１を発現することが知られている一次細胞で決定する
。また、ＬＳＥＣ上でのｍＳＩＧＮＲ１の発現も上記のようなＦＡＣＳによって確認でき
るが、ただし、反応当たり１×１０5個の細胞のみを添加する。
【００６２】
内在化の測定
いったんｍＳＩＧＮＲ１発現細胞株又は一次細胞型を同定したら、抗体パネルの内在化
をＦＡＣＳ分析によって評価する。内在化がｍＳＩＧＮＲ１の結合に基づくことを示すた
めに、ＪＡＷＳ１マウス樹状細胞のようなｍＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞株を含める。
ビオチニル化抗ＨＡ抗体、次いでＰＥ結合ストレプタビジンを使用したそのままの浸透化
細胞についての抗ｍＳＩＧＮＲ１検出を抗ＤＥＣ−２０５抗体について記載されるように
比較する（Ｍａｈｎｋｅ外，２０００）。細胞株について１．５×１０6個細胞又は一次
細胞について３×１０5個細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ
中で３μｇのｍＳＩＧＮＲ１と共に２０分間にわたって４℃でインキュベートして内在化
なしで抗体を表面に結合させる。結合しなかった抗体を４℃の１％ＢＳＡを含有するＰＢ
Ｓで２回洗浄することによって除去する。それぞれの試料を３つに分ける。３分の１を４
％パラホルムアルデヒドで固定し、そして上記のように表面抗体を検出する。その他の３
分の２を固定する前に３７℃で３０分間さらにインキュベートして内在化を可能にする。
２分の１を抗ＨＡ及びストレプタビジンで直接検出し、残り２分の１を、０．１％（ｖ／
ｗ）サポニン（シグマ・オールドリッチ）を含有するＰＢＳで細胞をインキュベートする
ことによって浸透化させる。内在化された抗体の量を、固定された細胞中の平均の蛍光度
を固定され且つ浸透化された細胞で記録されたものから差し引くことによって算出する。
３０分以内に最も高い内在化パーセンテージを有する抗体を、ペプチドを抗体に結合させ
るさらなる研究のために選択する。既存の無関係のウサギｓｃＦｖをネガティブコントロ
ールとして使用し、近年ｍＳＩＧＮＲ１に結合することが示された市販のＥＲ−ＴＲ９抗
体（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）をポジティブコントロールとして使用する
。また、ＥＲ−ＴＲ９のＦａｂフラグメントもパパイン消化によって作製し、そして内在
化について試験して二量体化が内在化の要件ではないことを確認する。所望ならば、この
ｓｃＦｖをＦａｂ'２又はＩｇＧに変換することができる。
【００６３】
別の具体例では、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーを、Ｊａｍｅｓ  Ｄ．Ｍａｒｋｓのグル
ープによって説明されるように、抗体を内在化させるためにパニングする（Ｐｏｕｌ外，
２０００）。この具体例のために好適な方法を以下に概説する。
【００６４】
ｍＳＩＧＮＲ１ファージライブラリーからの内在化抗体の選択
ｍＳＩＧＮＲ１を発現させるために上記のように同定された５×１０6個の細胞を、ｍ
ＳＩＧＮＲ１ライブラリーからの１×１０12コロニー形成単位のファージであってそれら
の表面上で３遺伝子蛋白質に融合した抗体フラグメントを提示するものと１．５時間にわ
たって４℃でインキュベートして内在化なしにファージを結合させる。ファージの結合後
に、これらの細胞を燐酸緩衝生理食塩水で５回洗浄して非特異的に結合した又は弱く結合
したファージを除去する。次いで、表面に結合したファージのエンドサイトーシスを可能
にする一方で、細胞内でのファージの分解を回避するように、細胞を１５分間にわたって
３７℃でインキュベートする。細胞の表面に結合したファージを除去するために、細胞を
低ｐＨグリシン緩衝液で３回洗浄することによってストリップする。次いで、細胞をトリ
プシン処理し、そしてＰＢＳで洗浄してから高ｐＨトリエチルアミンで溶解させる。ファ
ージを含有する細胞溶解物を使用してＥ．ｃｏｌｉに感染させて次の選択ラウンド用のフ
ァージを調製する。３ラウンドの選択の全てを実行する。細胞表面に結合したファージの
力価（最初の低ｐＨグリシン洗浄で見出される）及び細胞内から回収されるファージの数
をそれぞれのラウンドについて監視する。エンドサイトーシスを受けたファージの数の増
加は、内在化するファージ抗体の選択がうまくいったことを示す。
【００６５】
内在化されたｓｃＦｖ抗体フラグメントのいずれもｍＳＩＧＮＲ１に結合するのかどう
かを決定するために、ラウンド３からの５００個のクローンを自動Ｑｐｉｘ（ジェネティ
クス）システムを使用して選択し、そしてＨｉＧｒｏｗシェーカー（ジーン・マシーン）
で一晩ＳＢ培地入りの９６ウェルディッシュ中で生長させる。次の日に、ディッシュをス
ピンダウンし、そして上澄み液を自動Ｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｒｅｅｄｏｍ  ２００（Ｔｅｃ
ａｎ）システムを使用する固相ｍＳＩＧＮＲ１  ＥＬＩＳＡで試験する。９６ウェルＥＬ
ＩＳＡプレートを１μｇのｍＳＩＧＮＲ／ｍＬ  ＰＢＳで一晩４℃でコートする。翌日に
、プレートを１％ＢＳＡでブロックし、次いで０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳ
で３回洗浄する。コントロールのプレートを１％のＢＳＡでコートする。抗体を含有する
上澄み液をｍＳＩＧＮＲ１又はＢＳＡ単独のウェルに１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中０
．０５〜５μｇ／ｍＬの濃度で添加する。シェーカー上で室温で２時間振盪後に、プレー
トを０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄する。結合したｓｃＦｖの検出
のために、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５マウスの腹水，ストラテジック・バイオソルーション
ズ，デラウェア）を１％のＢＳＡを有するＰＢＳでの１：１０００希釈で添加する。シェ
ーカー上で室温で２時間振盪後に、プレートを再度洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ結
合抗マウスＩｇＧ（シグマ）を２時間にわたって添加する。３回以上洗浄した後に、結合
した抗体をＳｉｇｍａ  １０４（登録商標）基質を使用して検出する。これらのプレート
をＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用してＯＤ405で
様々な時点で読む。
【００６６】
ＥＬＩＳＡにおいて正のシグナルを与えるクローンを制限酵素消化パターンによって特
徴付ける。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ社製ミニプレップキットを使用して単離する。２μｇの
ＤＮＡを５ＵのＥｃｏＲIIで２時間にわたって３７℃で消化し、次いでこれらの試料を４
％のＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルに流す。パターンを比較し、そして配列を少量（約１
００〜３００μｇ）で精製する。ｓｃＦｖを細菌の細胞周辺腔に適切にアセンブルし、そ
して分泌させる。ｓｃＦｖは、上澄み液又は細胞周辺腔のいずれかから単離できる。クロ
ーンを４リットルのＳＢ中で０．８のＯＤ600にまで生長させ、そして１ｍＭのイソプロ
ピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３〜４時間にわたって３０℃で誘
導させて最適な量のｓｃＦｖを産生させる。細胞周辺腔から単鎖抗体を単離するために、
細胞ペレットを、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ（ロシュ）プロテアーゼ阻害剤が添加され
た冷却ＰＢＳに再懸濁し、そしてソニックス製Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ  ＶＣ７５０を使用
して超音波処理する。次いで、細胞の破片をペレットにし、そして上澄み液をＡｋｔａ  
ＦＰＬＣ（ファルマシア）を使用してＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムに適用する。抗
体をイミダゾールで溶出させる。この方法は、一般に、約１００〜３００μｇの精製抗体
／リットルを生じさせる。内毒素をＳａｒｔｏｒｉｕｓＱ１５フィルターにより濾過する
ことによって除去する。これは、一般的に、ＬＡＬ試験（バイオ・ホイッタカーから購入
できるアッセイ法）によって決定されるときに１０Ｕ／ｍＬ以下の内毒素を含有する抗体
調製物を生じさせる。抗体を上記のように内在化について並びに固相ＥＬＩＳＡで組換え
ｍＳＩＧＮＲ１への結合について再度分析する。３０分以内に最も高い内在化パーセンテ
ージ及び固相ＥＬＩＳＡにおいて良好なシグナル（１μｇ／ｍＬで１時間後に＞１０Ｄ）
を有する抗体を選択してペプチド−抗体構築物を作製する。
【００６７】
例３：ＧＡＤペプチドの抗体への結合
ベクター及びクローニング戦略
最良の細菌産生ｓｃＦｖの同定後に、ほ乳類発現系への転換を行う。ほ乳類での発現は
、好適なペプチドの二次修飾及び内毒素フリー産生を可能にする。図３に示されるような
互換性のある制限部位を有するベクター（例えば、米国特許第６３５５２４５号に記載さ
れるもの。この開示は、引用によってここに加えるものとする。）を使用する。ｐＲＬ４
（上で説明した）内にある対象の抗体からのＤＮＡをＳｆｉで切断し、そしてＣＭＶプロ
モーターとほ乳類抗体リーダー配列とを含むＡｐｅｘ  ３Ｐベクターに挿入する。対象の
ペプチドをコードするヌクレオチドを挿入するために、制限部位を抗体配列内には含まれ
ない利用可能な部位（ＭＣＳ＝ＮａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、
ＥｃｏＲＶ、ＢＳＡＢＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｒＢＩ、Ｘｈｏ、ＰｂｖＩＯＩ、
ＳｐｈＩ、ＮｓｉＩ、ＸｂａＩ）から選択する。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチ
ドをそれぞれの末端に好適な制限部位を有するＯｐｅｒｏｎによって合成し、そしてＴ４
ＤＮＡリガーゼを使用して挿入する。得られた構築物は、ｓｃＦｖ、その後の選択された
制限酵素によって決定されるスペーサー、その後のペプチド及びＨＩＳタグを含むであろ
う（図３）。配列を標準的な技術を使用して確認してから抗体産生用の３９３ＥＢＮＡ細
胞にＤＮＡをトランスフェクトする。
【００６８】
ペプチドの選択
既知の糖尿病自己抗原であるインスリン、ｈｓｐ並びにＧＡＤ６５及び６７のペプチド
のいずれもここに説明する方法で使用できることを理解すべきであるが、次の実験につい
ては、ＧＡＤを該ペプチドとして選択する。ＧＡＤ反応性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおい
て検出される第１の自己反応性Ｔ細胞であり（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３；Ｋａｕｆｍａｎ
外，１９９３）、且つ、病気のプロセスに重要であることが示されている。さらに、ヒト
及びネズミのＧＡＤは、９５％の相同性がある。脾臓ＮＯＤ  Ｔ細胞によって認識される
エピトープが広く特徴付けられており（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３；Ｔｉｓｃｈ外，１
９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）、多くの免疫優性ペプチドがＮＯＤマウスとＴ１Ｄ
Ｍの患者において類似し、そしてこれは試験管内Ｔ細胞アッセイにおいて区別なく使用さ
れてきた（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）。ＮＯＤマウスにおける初期の免疫応答は、Ｇ
ＡＤ６５のカルボキシ末端領域内の所定の領域（ペプチド５０９〜５２８、ペプチド５２
４〜５４３）に対して向けられる（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）。また、より後期のＴ
細胞応答は、２００〜３００の間の他の領域並びに他の自己抗原にも向けられる。初期Ｃ
Ｄ４  ＧＡＤ６５  Ｔ細胞エピトープのペプチド５２４〜５４３（ＳＲＬＳＫＶＡＰＶＩ
ＫＡＲＭＭＥＹＧＧＴ（配列番号１３）、マウス及びヒトで同一の配列）の一つ並びによ
り後期に生じるネズミＧＡＤ６５エピトープのペプチド２４７−２６６（ＮＭＹＡＭＬＩ
ＡＲＹＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ（配列番号１４）、ヒトとマウスとで１アミノ酸の相違：下
線）及びペプチド２９０−３０９（ＡＬＧＩＧＴＤＳＶＩＬＩＫＣＤＥＲＧＫ（配列番号
１５）、マウスとヒトで同一の配列）の２つをこの実験でペプチドとして使用するために
選択する。３種のエピトープの全てがＮＯＤの脾臓細胞内で自発的な増殖応答を誘導し得
る。さらに、ペプチド２４７〜２６６及びペプチド２９０〜３０９によるペプチド免疫化
は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発病を遅延させることが示された（Ｍａ外，１９９７
；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）。ＣＤ４Ｔ細胞エピトープのほ
かに、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対する寛容も重要であることが報告されている（Ｑｕｉ
ｎｎ外，２００１；Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ外，２０００）。ネガティブコントロールとして
、抗体構築物を鶏卵リゾチームペプチド１１６〜１２４（ＫＧＴＤＶＱＡＷＩ）（配列番
号１６）で作製する。次いで、試験管内研究において最も効果的なこれらのものからのペ
プチドを抗体構築物と様々な組み合わせで結合させ、そしてＮＯＤ糖尿病モデルで試験す
る。
【００６９】
例４：抗体−ペプチド構築物の作製及び精製
Ｔ細胞実験のために、ほぼ３００μｇのそれぞれの抗体構築物をＥＢＮＡ２９３ヒト胚
性腎細胞内で産生させる。細胞を１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン及び２５０Ｕ／ｍ
ＬのＧ４１８（シグマ）を有するＤＭＥＭ中で増殖させる。Ｔ１７５フラスコ中の細胞に
Ｑｉａｇｅｎ製Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ試薬を使用して該メーカーの指示に従いＤＮＡをトラ
ンスフェクトする。３日後に培地を血清を有しない培地に交換する。４日目及び８日目に
上澄み液を集め、細胞の破片を遠心分離によって除去し、そして透明な上澄み液をＡｋｔ
ａ−ＦＰＬＣを使用してＮｉ−カラム上に充填する。抗体をイミダゾールで溶出させ、Ｐ
ＢＳに透析し、そして正確な寸法を１μｇをＳＤＳゲルに流すことによって確認する。
【００７０】
例５：ペプチド提示を生じさせるＬＳＥＣによる抗体−ペプチド構築物の内在化及びＴ細
胞に及ぼすこの提示の影響
肝臓シヌソイド細胞を試験管内でペプチド−抗体構築物でターゲティングし、そしてこ
れらの細胞が若いＮＯＤ又はバルブ／ｃマウス由来のＴ細胞に表現型の変化を誘導し得る
かどうかを決定する。
【００７１】
ネズミシヌソイド内皮細胞の単離
肝臓シヌソイド内皮細胞を生後３週間のＮＯＤ又は生後４〜６週間のバルブ／ｃマウス
から単離する。Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌによって記載されるように（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏ
ｍｍｅｌ及びＢｏｅｌｓｔｅｒｌｉ，１９９５）、まずカルシウムをキレート化し且つ細
胞−細胞接触を緩和するためのＥＧＴＡで門脈灌流し、その後細胞間マトリックスを分解
させるための０．０５％コラゲナーゼＡハンクス緩衝液で灌流することによって細胞を得
る。この灌流された肝臓をマウスから取り出し、そして角度付きの鉗子で穏やかに作業す
る。得られた粗細胞懸濁液を一連の金属シーブ（３０、５０、８０メッシュ）を通して濾
過して大きな組織断片を除去する。シヌソイド細胞をメトリザミド勾配に基づく密度勾配
遠心分離（１．０８９ｇ／ｃｍ3）によって実質組織細胞から分離し、その後２回の洗浄
工程を実施して細胞の破片を除去する（3Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。この時点で、ク
ッパー細胞と肝臓シヌソイド細胞との混合物が得られる。ＦＡＣＳ実験についてはこれで
十分である。というのは、クッパー細胞は、クッパー細胞を認識する一方で肝臓シヌソイ
ド細胞を認識しないＦ４／８０抗体を使用して肝臓シヌソイド内皮細胞から区別できるか
らである。しかしながら、Ｔ細胞及びペプチドとの同時培養実験については、クッパー細
胞をＰＥ結合Ｆ４／８０（ＢＤファルミンゲン）、次いでＭｉｌｔｅｎｙｉ製抗ＰＥマイ
クロビーズで標識し、そしてメーカーの指示に従いＭＡＣＳカラム及びセパレーターを使
用してこの標識細胞を磁気選別することによってクッパー細胞を除去する。残りの細胞集
団を、１０％のウシ胎仔血清及び２％のグルタミンが添加されたダルベッコ製改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）入りの９６ウェル組織培養プレート上に接種する。細胞集団の純度を
、抗ｍＳＩＧＮＲ１及び抗Ｆ４／８０を使用した表面マーカーに対するＦＡＣＳ染色によ
る単離後３日目に調査する。ｍＳＩＧＮＲ１はクッパー細胞上には存在しない（1Ｇｅｉ
ｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。９０％の純度が実験を続行するのに十分であるとみな
される。実験当たり２個のマウスの肝臓を使用し、予期される収量は約２×１０7個の細
胞である（Ｋｎｏｏｋ及びＳｌｅｙｓｔｅｒ，１９７６，マウスについて推定される収量
）。
【００７２】
Ｔ細胞表現型アッセイ
Ｔ細胞アッセイは、ペプチド−抗体構築物が肝臓シヌソイド内皮細胞によるペプチドの
提示を生じさせるかどうか及びペプチドの提示がＴ細胞の表現型の変化を誘導し得るかど
うかを証明する。肝臓シヌソイド内皮細胞を平底マイクロタイタープレート内で１×１０
5細胞／ウェルの密度で培養する。シヌソイド細胞を３日間にわたって保持した後に、Ｃ
Ｄ４+Ｔ細胞を上記のように生後３週間及び生後８週間のＮＯＤマウス又は生後４〜６週
間のバルブ／ｃマウスから精製し、そして１０4又は１０5細胞／ウェルで添加する。また
、０．１〜５ｐｇ／ウェルの濃度でそれぞれの抗体−ペプチド構築物も添加する。ポジテ
ィブコントロールとして、それぞれのＧＡＤ及びコントロールのペプチド自体を含める。
ペプチドをＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，カリフォルニア）で合成する。ネガティブコン
トロールのウェルは、Ｔ細胞単独又は肝臓シヌソイド単独を含む。
【００７３】
Ｔ細胞に対するＬＳＥＣによるペプチド提示について４つの見込まれる結果が存在する
：（１）ＴＧＦ−Ｐ及び／又はＩＬ−１０とＩＬ−４の産生或いはＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ
６２Ｌの発現によって特徴付けられる調節Ｔ細胞の誘導、（２）Ｔ細胞の欠損又は（３）
完全な欠落又は応答、（４）また、ペプチド提示は、応答を誘導する代わりに、Ｔｈ１細
胞産生ＩＬ−２の刺激を生じさせることも考えられる。これらの可能性を区別するために
、培地の上澄み（各１００ｐＬ）を２４時間及び４８時間目に集め、そして以下に説明す
るようにサイトカイン産生についてアッセイする。生後３週間のＴ細胞応答を生後８週間
のＮＯＤマウスのＴ細胞並びにＧＡＤに対する自発的応答を示さないバルブ／ｃマウス由
来Ｔ細胞と比較する。アッセイを３重に設定し、そして２回繰り返す。Ｔ細胞の混合物を
使用するため、上澄み液におけるサイトカイン応答は、容易には確認できないかもしれな
い。しかしながら、細胞の混合物は、生体内での状況を反映し、そしてＧＡＤ特異的Ｔ細
胞応答は、全脾臓細胞を使用して確認される（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３）。
【００７４】
調節Ｔ細胞の誘導についてのより敏感な基準として、細胞を培養３日後にＦＡＣＳ分析
によってＣＤ２５、ＣＤ４及びＣＤ６２Ｌ（Ｌａｆａｉｌｌｅ及びＬａｆａｉｌｌｅ，２
００２）のような典型的な表面マーカーの発現について評価する。全ての試薬はＢＤ−フ
ァルミンゲン社から購入できる。また、ＩＬ−４産生もＦＡＣＳによって分析する。以下
に説明するようなＬＳＥＣ／ペプチド露出Ｔ細胞の潜在的な免疫抑制特性の機能試験がこ
の系における寛容誘導についての最終的な試験である。ＬＳＥＣによって提示されたペプ
チドが細胞死を誘導する可能性を、ロシュ製細胞死ＥＬＩＳＡキットを使用して該メーカ
ーの指示に従い培地の上澄み液中で評価する。
【００７５】
脾臓細胞及びＣＤ４+Ｔ細胞の単離
ＮＯＤ又はバルブ／ｃマウスからの脾臓を滅菌環境中で取り出し、研究所において日常
的に実行されるようにＰＢＳ中に置く。細胞を１８〜２１ゲージ針を使用して分離し、そ
してより大きな断片を沈降させる。上澄み液を取り出し、そして２００Ｇで７分間遠心分
離する。赤血球細胞を脾臓当たり５ｍＬの０．８３％ＮＨ4Ｃｌを使用して溶解させる。
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで培地に再懸濁させる。ある種の実験については、全脾
臓細胞を使用する。その他の実験については、ＣＤ４+Ｔ細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ社製（
カリフォルニア州オーバーン）ＣＤ４+Ｔ細胞単離キットを使用して該メーカーの指示に
従い単離する。様々な細胞集団の磁気単離は、当業者の範囲内にある。一つの方法では、
単離は、ＣＤ８ａ、ＣＤＩ１ｂ、ＣＤ４５Ｒ、ＤＸ５及びＴｅｒ−１  １９に対するビオ
チン結合モノクローナル抗体のカクテルを使用する非ＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇に基づく。単
離された集団の純度をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、ＰＥ結合抗ＣＤ８、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１１
ｂ及びｃｙ−５結合ＣＤ４５Ｒ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州サン
ディエゴ）の混合物の染色によって評価する。予期される純度は７０％の収率で９０〜９
５％である。少なくとも１×１０8個の細胞がマウス脾臓から得られ、そして脾臓細胞の
約２５％がＣＤ４+であるから、１７５個の９６ウェルマイクロタイタープレートのウェ
ルには十分な約１．７５×１０7個の細胞が得られ得る。
【００７６】
サイトカイン産生の測定
Ｔ細胞／ＬＳＥＣ同時培養の上澄み液中におけるＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｐ、ＩＦＮ−γ
、ＩＬ−４及びＩＬ−２の存在を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって説明通りに決
定する（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ及びＲｕｂｉｎ，１９９７）。全ての抗体のペアは、
ＢＤ−ファルミンゲン社から購入できる。サイトカイン捕捉抗体をＰＢＳ中でプレート上
に一晩４℃でコートする。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後に、培地の上
澄み液とマウス組換えサイトカインの基準曲線とを加え、そしてシェーカー上で２時間室
温でインキュベートする。プレートを再度洗浄し、そして結合したサイトカインをアルカ
リ性ホスファターゼ結合抗サイトカイン抗体で検出する。３回洗浄した後に、Ｓｉｇｍａ
１０４（登録商標）基質を添加し、そしてこのプレートをＥＬＩＳＡプレート読み取り装
置（モレキュラー・デバイセズ）を使用してＯＤ405で様々な時点で読む。
【００７７】
例６：ＬＳＥＣ上に提示されたＧＡＤペプチドさらされたＴ細胞がその後にＧＡＤを提示
するプロフェッショナルＡＰＣによる自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得るかどうかの
評価
さらなる実験において、肝臓シヌソイド内皮細胞上のペプチドに３日間にわたってさら
されたＴ細胞が脾臓プロフェッショナルＡＰＣ上に提示されるペプチドによる自己反応性
Ｔ細胞の活性化を負に調節し得るかどうかを試験する。試験管内で調節特性を有するＴ細
胞が誘導される可能性が多数の研究所によって示されている（Ｗａｋｋａｃｈ外，２００
１；Ｂａｒｒａｔ外，２００２；Ｔｈｏｒｔｏｎ及びＳｈｅｖａｃｈ，１９９８）。免疫
抑制特性は、免疫刺激が正常に観察される培養系に調節Ｔ細胞を添加することによって試
験できる。ＡＰＣとＴ細胞の両方を含む生後７週間のＮＯＤマウス由来の脾臓細胞へのＧ
ＡＤペプチドの添加は、強力な増殖応答によって示されるような免疫活性化系を与える。
調節Ｔ細胞の添加は、この応答を排除させる。１０5又は１０6個の脾臓細胞をＬＳＥＣ及
びペプチド結合抗体にさらされたＴ細胞を含有するウェル当たり０．１、１又は１０μｍ
のペプチドと共に添加する。コントロールのウェルは、脾臓細胞をペプチド単独及びＬＳ
ＥＣ+Ｔ細胞単独と共に含む。さらに、推定される調節Ｔ細胞が増殖に有意に寄与するこ
とを排除するために、コントロールのウェルは、放射線照射を受けた脾臓細胞（６００Ｒ
ＡＤ、Ｊｏｅ  ＡｇｕｉｌｅｒａによるＵＣＳＤ照射サービス施設で実行される）と、予
めＬＳＥＣにさらされたＴ細胞と、ペプチド−抗体構築物とをも含む。放射線照射を受け
た脾臓細胞は抗原を提示できるが、増殖はしない。１μＣｉ3Ｈ−チミジンを増殖のため
の読み取りとして新たに合成されたＤＮＡを標識するための７２時間培養期間の最後の１
６時間の間にそれぞれのウェルに添加する。細胞をパッカード社製Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  
Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用して採取し、そして取り込まれた3Ｈ−ヒスチジン
をＴｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード）を使用して評価する。脾臓細胞及び予めＬＳＥＣ+ペ
プチドにさらされたＴ細胞を含有する培地中での3Ｈチミジンの取り込みが脾臓細胞培地
と比較して減少する場合には、Ｔ細胞は、調節特性によってうまく誘導されている。ペプ
チド結合抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体がＮＯＤマウスにおいて調節Ｔ細胞を誘導し得るかどうか
、また病気が停止し得るかどうかも試験する。
【００７８】
例７
マウスの抗ヒトＬ−ＳＩＧＮ抗体を組換えファージ技術を使用して同定した。組換えヒ
トＬ−ＳＩＧＮで免疫化されたマウスの重鎖及び軽鎖の組み合わせから得られたマウスラ
イブラリー（ＩｇＧ１ｋ及びＩｇＧ２ａｋ）をＷＯ０３／０２５２０２に開示された方法
によって調製した（その内容は、引用によってここに加えるものとする）。いったん調製
したら、これらのライブラリーをまずヒトＤＣ−ＳＩＧＮ上でパニングしてＤＣ−ＳＩＧ
Ｎと交差反応する抗体を除去した。結合していない上澄み液をＬ−ＳＩＧＮとユニークに
反応するクローンを選択するために使用した。これらの２つのライブラリー（ＩｇＧ１及
びＩｇＧ２ａ）のそれぞれについて９５個のコロニー（３６／ラウンド）の全てを誘導し
、そして抗体産生及びそれらのＬ−ＳＩＧＮとの反応性を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定し
た。簡単に説明すると、抗ヒトＦｃ（Ｃａｌｔａｇ）をＥＬＩＳＡプレート上に５００ｎ
ｇ／ｍＬで一晩コートした。これらのプレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッ
クし、次いで２μｇ／ｍＬの組換えＬ−ＳＩＧＮを添加した。プレートをＰＢＳで洗浄し
た後に、上澄み液を添加した。室温で１２時間インキュベートした後に、プレートを３回
洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合抗Ｆａｂ抗体を２時間にわたって添加した
。ＳｉｇｍａＳ基質の添加後のシグナルをＥＬＩＳＡ読み取り装置（モレキュラー・デバ
イセズ）を使用して評価した。
【００７９】
これらのクローンの大部分は、抗体がファージ上に良好に結合（ＯＤ405＞１．０）し
ていることを示した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａライブラリーの両方からのいくつかのクロ
ーンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとの積極的な反応性を示した。結果を図４及び５に示す：図４
は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとＩｇＧ１クローンとの反応性を表している。図５は、ヒトＬ−Ｓ
ＩＧＮとＩｇＧ２ａクローンとの反応性を表している。
【００８０】
例８
ヒトＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応するクローンを同定するために、バックグラウンド
の５倍以上のＯＤ値を有する例７からのクローンの全てを選択してそれらのヒトＤＣ−Ｓ
ＩＧＮとの反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。抗ヒトＦｃ（Ｃａｌｔａｇ）をＥＬＩ
ＳＡプレート上で５００ｎｇ／ｍＬで一晩コートした。これらのプレートを１％のＢＳＡ
を含有するＰＢＳでブロックし、次いで２μｇ／ｍＬの組換えＤＣ−ＳＩＧＮを添加した
。プレートをＰＢＳで洗浄した後に、上澄み液を添加した。室温で１２時間インキュベー
トした後に、プレートを３回洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合抗Ｆａｂ抗体
を２時間にわたって添加した。ＳｉｇｍａＳ基質の添加後のシグナルをＥＬＩＳＡ読み取
り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用して評価した。
【００８１】
ＩｇＧ１ライブラリーからの１０個のクローン及びＩｇＧ２ａライブラリーからの３個
のクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応することが分かった（ＤＣ−ＳＩＧＮ
に対して５〜１０倍高いＯＤ値）。結果を図６及び７に示す：図６は、Ｌ−ＳＩＧＮ及び
ＤＣ−ＳＩＧＮとＩｇＧ１ポジティブクローンとの反応性を示している。図７は、Ｌ−Ｓ
ＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとＩｇＧ２ａクローンとの反応性を示している。
【００８２】
例９
ヒトＬ−ＳＩＧＮのみと反応するものとして同定された１３個のクローンと、例８にお
いて同定されたようなＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮの両方と強く反応する９個のクロ
ーンとの配列を解読してユニーククローンの数を決定した。配列は、当業者に周知の技術
によって決定した。これらのクローンの配列を図８及び９に示す：重鎖クローンについて
の配列を図８Ａ〜８Ｃに示しており（配列番号１７〜３６）、軽鎖クローンについての配
列を図９Ａ〜９Ｂに示している（配列番号３７〜５５）。
【００８３】
配列決定の結果から、軽鎖と比較してさらに多様な重鎖の群が明らかになった。また、
これらの抗体クローンの多様性を異なる軽鎖と同一の重鎖とを交差対合させることによっ
ても高めた。Ｌ−ＳＩＧＮと反応する５個のユニーククローンの全てを同定し、そしてク
ローンをそれらのアミノ酸配列の類似性に基づき分類した（以下の表１参照）。
【００８４】
【表１】
2010178758.tif 000002
【００８５】
配列決定のために選択されたクローンとＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性（
ＯＤ値）を以下の表２に示す。
【００８６】
【表２】
2010178758.tif 000003
【００８７】
図８に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３領域は、次の
アミノ酸配列：ＬＧＧＬ（配列番号５６）；ＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号５７）；ＧＬＦ
ＹＧＹＡＷＦＮ（配列番号５８）のうちの一つを有することが分かった。図９に示すよう
に、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：Ｑ
ＱＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号５９）；ＱＱＳＮＥＤＰＲＴ（配列番号６０）；ＱＱＮＮＥ
ＤＰＹＴ（配列番号６１）；ＬＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号６２）のうちの一つを有する
ことが分かった。
【００８８】
例１０
上の例７からの追加のクローンを、例７に記載した手順を使用して、それらのものがＬ
−ＳＩＧＮに結合する能力について試験した。配列は、当業者に周知の技術によって決定
した。これらの追加のクローンについての配列を図１０に示す（配列番号６３〜８２）。
図１０に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の５個の追加の重鎖ＣＤ
Ｒ３領域は、次のアミノ酸配列：ＰＳＤＮＳＹＡＷＦＡ（配列番号８３）；ＱＡＴＴＴＡ
ＦＤ（配列番号８４）；ＴＡＴＡＬＳＴＭＤ（配列番号８５）；ＮＤＹＹＷＧＦＧ（配列
番号８６）；ＴＡＴＡＬＹＴＭＤ（配列番号８７）；及びＥＦＴＴＫＡＬＤ（配列番号８
８）のうちの一つを有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのク
ローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＭＩＤＰＳＮＳＥＡＲＬＮＱＲＦＫＤ（配
列番号８９）；ＴＩＳＳＧＧＳＦＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号９０）；ＮＩＤＰＹＹＧ
ＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９１）；ＶＩＷＲＧＧＮＴＤＹＮＡＡＦＭＳ（配列番号
９２）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９３）；ＮＩＤＰＹＹＧＧＳＳ
ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９４）；及びＴＩＳＳＧＧＳＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号
９５）のうちの一つを有することが分かった。
【００８９】
表３は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づき選択された追加のＩｇＧ１ｋ
抗体クローンを示している。
【００９０】
【表３】
2010178758.tif 000004
【００９１】
表４は、追加のＩｇＧ１ｋ抗体クローンと、Ｌ−ＳＩＧＮ（相乗平均蛍光度）並びに組
換えＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示し
ている。
【００９２】
【表４】
2010178758.tif 000005
【００９３】
図１１に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加のクローンを同定した
（配列番号９６〜１１５）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＱＹＨＲＳＰＱＴ
（配列番号１１６）；ＣＱＱＦＴＳＳＰＳ（配列番号１１７）；ＱＱＹＳＧＹＰＬＴ（配
列番号１１８）；ＱＱＹＳＧＹＰＧＴ（配列番号１１９）；ＨＱＹＨＲＳＰＰＭＴ（配列
番号１２０）；ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１２１）；ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ（配列番号
１２２）；ＱＱＮＮＥＤＰＰＴ（配列番号１２３）；ＱＱＹＳＧＹＳＬＴ（配列番号１２
４）；ＱＱＹＳＧＹＰＬＭＬＴ（配列番号１２５）；ＱＱＹＧＧＹＰＬＴ（配列番号１２
６）；ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１２７）；ＱＱＹＳＧＳＰＬＴ（配列番号１２８）
のうちの一つを有するＩｇＧ１ｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−
ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＳＴＳＮ
ＬＡＳＧ（配列番号１２９）；ＬＡＳＮＬＥＳＧ（配列番号１３０）；ＳＴＳＮＱＡＰＧ
（配列番号１３１）；ＷＡＳＴＲＨＴＧ（配列番号１３２）のうちの一つを有することが
分かった。
【００９４】
表５は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づき選択された追加のＩｇＧ２ａ
ｋ抗体クローンを示している。
【００９５】
【表５】
2010178758.tif 000006
【００９６】
表６は、追加のＩｇＧ２ａｋ抗体クローンと、Ｌ−ＳＩＧＮ（相乗平均蛍光度）並びに
組換えＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示
している。
【００９７】
【表６】
2010178758.tif 000007
【００９８】
図１２に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加の重鎖クローンを同定した
（配列番号１３３〜１５４）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＴＲＥＦＴＴＫ
ＡＬＤ（配列番号１５５）；ＴＲＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号１５６）；ＡＲＴＡＴＡＬ
ＹＴＭＤ（配列番号１５７）；ＬＲＴＬＰＣＩ（配列番号１５８）；ＳＲＥＦＴＴＫＡＭ
Ｄ（配列番号１５９）；ＡＲＱＬＸＸＹＦＸＭＤ（配列番号１６０）のうちの一つを有す
るＩｇＧ２ａｋ重鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合
したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＴＩＳＳＧＧＳＦＴＹＹＰ
ＤＮＶＫＧ（配列番号１６１）；ＮＩＤＰＹＹＤＳＩＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６２
）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６３）；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹ
ＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６４）；ＸＦＸＴＤＷＦＹＸＴ（配列番号１６５）；ＮＦＤＰ
ＹＹＧＶＩＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６６）；ＴＩＳＳＧＧＧＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ
（配列番号１６７）；ＸＩＹＰＧＴＤＮＴＹＹＮＥＸＦＫＧ（配列番号１６８）のうちの
一つを有することが分かった。
【００９９】
図１３に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加の軽鎖クローンを同定した
（配列番号１６９〜１８９）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＱＱＮＮＥＤＰ
ＹＴ（配列番号１９０）；ＳＧＹＰＬＴＦＧＳ（配列番号１９１）；ＨＲＳＰＰＭＴＦＧ
（配列番号１９２）；ＱＱＮＮＥＤＰＦＴ（配列番号１９３）；ＹＳＧＹＰＬＴＦＧ（配
列番号１９４）；ＮＴＬＰＬＴＦＧ（配列番号１９５）；ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号
１９６）；ＬＱＮＮＥＤＰＹＴＦ（配列番号１９７）のうちの一つを有するＩｇＧ２ａｋ
軽鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのク
ローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１９８）；ＬＡ
ＳＮＬＥＦ（配列番号１９９）；ＮＬＡＳＧＶＰ（配列番号２００）；ＮＬＡＳＧＶ（配
列番号２０１）；ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２０２）のうちの一つを有することが分かっ
た。
【０１００】
次の文献は、引用によってここに加えるものとする。
・AspordC, Thivolet C (2002)「ＣＴＢ−インスリンの経鼻投与は、非肥満糖尿病（Ｎ
ＯＤ）マウスにおいて自己免疫糖尿病に対して活性な寛容を誘導する」Clin Exp Immunol
130 :
・AtkinsonMA, Kaufman DL, Campbell L, Gibbs KA, Shah SC, Bu DF, Erlander MG, To
bin AJ,MaclarenNK (1992)「インスリン依存性糖尿病における末梢血細胞のグルタミン
酸デカルボキシラーゼに対する応答」 Lancet 339 :458-459
・AtkinsonMA, Leiter EH(1999)「１型糖尿病のＮＯＤマウスモデル：最高か？」Nat Me
d 6: 601-604 
・AtkinsonMA, MacLaren NK, Luchetta R (1990)「予防インスリン療法によって低減し
たＮＯＤマウスの膵島炎及び糖尿病」Diabetes 39: 956-960 
・Bach JF(2001)「インスリン依存性糖尿病の免疫療法」Curr Opin Immunol 13: 601-60
5 
・BaekkeskovS, Aanstoot HJ, Christgau S, Reetz A,Lolimena M, Cascalho F, Folli 
F,Richter-Oelsen H,Decamilli P (1990)「ＧＡＢＡ合成酵素グルタミン酸デカルボキシ
ラーゼとしてのインスリン依存性糖尿病における６４Ｋ自己抗原の同定」Nature 347: 15
1-156 
・BarratFJ, Cua DJ, Boonstra A, Richards DF, Crain C,Savelkouf HF, de Waal-Male
fyt R, CoffmanRL,Hawrylowicz CM, O'Garra A(2002)「インターロイキン１０産生調節
ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の試験管内生成は、免疫抑制剤によって誘導され且つＩ型Ｔヘルパー
（Ｔｈ１）及びＴｈ２誘導サイトカインによって抑制される」J Exp Med 195: 603-616 
・BashirovaAA, Geijtenbeek TBH, van Duijnhoven GCF外,(2001)「樹状細胞特異的細胞
間付着分子３−接着性非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）関連蛋白質は、ヒト肝臓シヌソ
イド内皮細胞上で強く発現し且つＨＩＶ−１感染を促進させる」J Exp Med 193:671-678 
・BellmannK, Kolb H, Rastegar S Jee P, Scott FW (1998)「１型糖尿病の予防用アジ
ュバントによる経口インスリンの見込まれる危険性：ＮＯＤマウスに有効なプロトコール
は、ＢＢラットにおいて病気を悪化させる」Diabetologia 41 : 844-847
・BercoviciN, Heurtier A, Vizler C, Pardigon N, Cambouis C, Desreumaux P, Libla
u R (2000)「アゴニストペプチドの全身投与は、自発的ＣＤ８仲介自己免疫糖尿病遺伝子
内組換えマウスの進行をバイスタンダーを損傷させることなくブロックする」J Immunol 
165: 202-210 
・Blana E,Carbone FR, Allison H, Miller JF, Heath WR (1996)「自己抗原の経口投与
による自己免疫糖尿病の誘導」Science 274: 1707-1709
・Boitard C,Yasunami R, Dardenne M, Bach JF (1989)「ＮＯＤマウスにおける自己免
疫糖尿病の転移のＴ細胞仲介抑制」J Exp Med 169: 1669-1680 
・Calne R(1969)「ブタ肝臓移植片による免疫寛容の誘導」Nature 223: 427-476
・CameronMJ, Arreaza GA, Zucker P, Chensue SW, Strieter RM, Chakrabarti S, Delo
vitch TL (1997)「ＩＬ−４は、調節Ｔヘルパー２細胞機能の増強によって非肥満糖尿病
マウスの膵島炎及びインスリン依存性糖尿病を予防する」J Immunol 159: 4686-4692 
・ChaillousL, Lefevre H, Thivolet C, Boitard C, Lahlou N, Atlan Gepner C, Bouha
nick B, MognetA, Nicolino M, Carel J, Lecomte P, Marechaud R, Bougneres P, Char
bonnel B, Sai P(2000)「最近発症した１型糖尿病における経口インスリン投与及び残留
β細胞の機能：多施設臨床ランダム化比較試験」Lancet 356: 545-549 
・ChatenoudL, Primo J, Bach JF (1997)「明白な糖尿病のＮＯＤマウスにおけるＣＤ３
抗体誘導自己寛容」JImmunol 158: 2947-2954
・ChatenoudL, Thervet E, Promo J, Bach JF (1994)「抗ＣＤ３抗体は、非肥満糖尿病
マウスにおいて明白な自己免疫性の長期緩解を誘導する」Proc Natl Acad Sci USA 89: 3
434-3438 
・DanielD, Gill RG,Schloot N, Wegmann D (1995)「ＮＯＤマウスから単離されたイン
スリン特異的Ｔ細胞クローンのエピトープ特異性、サイトカイン産生プロファイル及び糖
尿病誘発活性」Eur.J Immunol25: 1056-1062
・DhodapkarMV, Steinman RM (2001)「未熟樹状細胞注入後のヒトにおけるエフェクター
Ｔ細胞機能の抗原特異的抑制」J Exp Med 193: 233-238
・DhodapkarMV, Steinman RM(2002)「抗原保有未熟樹状細胞は、ヒトにおいて生体内で
ペプチド特異的ＣＤ８（＋）調節Ｔ細胞を誘導する」Blood 100: 174-177
・DiabetesPrevention Trial-Type I (DPT) Study Group (2002):「１型糖尿病の危険性
が高い近親者における親のインスリンの影響」N Eng J Med 346: 1685-1691 
・Elias D,Cohen IR (1994)「ＮＯＤマウスにおける糖尿病のためのペプチド療法」Lanc
et 343: 704-706
・Elias D,Meilin A, Ablamuntis V, Birk OS, Carmi P, Konen-Waisman S, Cohen IR (
1997)「ＮＯＤマウスのＨｓｐ６０ペプチド療法は、Ｔｈ２サイトカインバーストを誘導
し且つ様々なβ細胞抗原に対する自己免疫を下方調節する」Diabetes 46: 758-764 
・Elias D,Reshef T, Birk OS, Van der Zee R, Walker MD, Cohen IR (1991)「ヒト６
５ｋＤａ熱ショック蛋白質のＴ細胞エピトープによる自己免疫マウスに対する予防接種」
Proc Natl AcadSci USA 88: 3088-3091 
・EngeringA, Geijtenbeek TBH, van Vliet SJ et al (2002)「樹状細胞特異的付着受容
体ＤＣ−ＳＩＧＮは、Ｔ細胞に対する提示のために抗原を内在化させる」J Immunol 168:
2118-2126
・FeutrenG, Papoz L, Assan R et al (1988)「シクロスポリンは、最近発症したインス
リン依存性糖尿病における緩解の割合及び長さを増加させる。多施設臨床二重盲式試験の
結果」Lancetii: l19-124 
・1Geijtenbeek TBH, Groot PC, Nolte MA, van Vliet SJ, Gangaram-PandayST, van Du
ijnhoven GCF,Kraal G, van Oosterhout AJM, van Kooyk Y (2002)「周縁帯マクロファ
ージは、生体内で血液−骨抗原を捕獲するＤＣ−ＳＩＧＮのネズミホモログを発現する」
Blood 100:2908-2916 
・2Geijtenbeek TBH, Krooshoop DJEB, Bleijs DA et al (2000)「ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＩＣ
ＡＭ−２相互作用は、樹状細胞のトラフィッキングを仲介する」Nat Immunol 1: 252-257
・3Geijtenbeek TBH, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GCF, AdemaGJ, van 
Kooyk Y, FigdorCG(2000)「一次免疫応答を支持する新規な樹状細胞特異的ＣＡＭ３受容
体であるＤＣ−ＳＩＧＮの同定」Cell 100: 575-585 
・HawigerD, Inaba K, Dorsett Y, Guo M, Mahnke K, Rivera M, Ravetch JV, Steinman
RM, NussenzweigMC (2001)「樹状細胞は、生体内において定常状態条件下で末梢Ｔ細胞
非応答性を誘導する」J Exp Med 194 : 769-779 
・HeathWR, Carbone FR (2001)「交差提示、樹状細胞、寛容及び免疫」Annu Rev Immuno
l 19: 47-64 
・HeroldKC, Hagopian W, Auger JA, Poumian-Ruiz E, Taylor L, Donaldson D, Gitelm
an SE, HarlanD, Xu D, Zivin RA, Bluestone JA (2002)「新たに発症した１型糖尿病に
おける抗ＣＤ３モノクローナル抗体」N Eng J Med 346: 1692-1698 
・HomannD, Holz A, Bot A, Coon B, Wolfe T, Petersen J, Dyrberg TP, Grusby MJ, v
on Herrath MG(1999)「自己反応性ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＬ−４／Ｓｔａｔ６経路を使用
したバイスタンダー抑制を介して自己免疫糖尿病から保護する」Immunity 11: 463-472 
・HoneymanMC, Cram DS, Harrison LC (1993)「グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７反
応性Ｔ細胞：インスリン依存性糖尿病のマーカー」J. Exp. Med. 177: 335-340 
・Huges S,Mougneau E Ferlin W, Jeske D, Hofman P, Homann D, Beaudoin L, Schrike
C, vonHerrath M, Lehuen A et al (2002)「膵島抗原に対する寛容及び膵島β細胞の制
限されたアポトーシスによって誘導される糖尿病からの予防」Immunity 16: 169-181 
・HurlbertMS, Stallard JF, Furlanetto RW (2001)「シンポジウムの概要」Experiment
al Biology. JInvestig Med 49: 554-558 
・HutchingsPR, Cooke A (1990)「ＮＯＤマウスにおける自己免疫糖尿病の転移は、若い
男性から得られる正常脾臓細胞中に存在する別個の細胞集団によって抑制又は促進できる
」JAutoimmun 3: 175-185 
・JonuleitH, Schmitt E, Schuler G, Knop J, Enk AH (2000)「同種未熟ヒト樹状細胞
による繰り返し刺激による調節特性を有するインターロイキン１０産生非増殖性ＣＤ４Ｔ
細胞の誘導」 JExp Med 192: 1213-1222
・Kamei T,Callery MP, Flye MW (1990)「ドナー抗原の移植前門脈投与及び門脈同種移
植物ドレナージは、ラットの同種心臓移植生存を相乗的に長くする」Surgery 108: 415-4
21 
・KaufmanDL, Claire-Salzler M, Tian J, Forsthuber T, Ting GSP, Robinson P, Atki
nson MA,Sercarz EE, Tobin AJ, Lehmann PV (1993)「ネズミのインスリン依存性糖尿病
におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼに対するＴ細胞寛容の自発的欠如」Nature 366
: 69-72 
・KaufmanDL, Erlander MG, Clare-Salzer M., Atkinson MA, Maclaren NK, Tobin AJ (
1992)「インスリン依存性糖尿病におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼの２つの形態
に対する自己免疫性」J. Clin. Invest. 89: 283-292 
・King C,Mueller HR, Malo CM, Murali-Krishna K, Ahmed R, King E, Sarvetnick N (
2002)「インターロイキン−４は、抗原提示樹状細胞の部位で細胞毒性ＣＤ８+Ｔ細胞応答
を逆調節するように作用する」Nat Med 7: 206-214 
・KlugewitzK, Blumenthal-Barby F, Schrage A, Knolle PA, Hamann A, Crispe IN (20
02)「肝臓の内部調節の影響：静脈内蛋白質免疫化後の活性化ＣＤ４+細胞の欠失及びＩＦ
Ｎ−γ産生細胞の抑制」J Immunol 169: 2407-2413 
・1Knolle P, Gerken G (2000)「肝臓における免疫応答の局所調節」Immunol Rev 174: 2
1-34
・2Knolle PA, Germann T,Treichel U, Uhrig A, Schmitt E, Hegenbarth S,Lohse AW, 
Gerken G (1999)「エンドトキシンは、抗原提示肝臓シヌソイド内皮細胞によるＴ細胞活
性化を下方調節する」J Immunol 162: 1401-1407 
・3Knolle PA, Schmitt E, Jin S, Germann T, Duchmann R, Hegenbarth S,Gerken G, L
ohse AW (1999)「抗原提示ネズミ肝臓シヌソイド内皮細胞によるナイーブＣＤ４Ｔ細胞内
でのサイトカイン産生の誘導（ただしＴｈ１細胞への分化を誘導することができない）Ga
stroenterology116: 1428-1440
・KnookDL,Sleyster ECH (1976)「遠心エルトリエーションによるラット肝臓のクッパー
細胞及び内皮細胞の分離」Exp Cell Res 99: 444-449 
・Kretz-RommelA, Boelsterli UA (1995)「ジクロフェナクにさらされた培養同系肝細胞
に対するジクロフェナック免疫化マウスからのＴ細胞及び非Ｔ細胞の細胞毒性活性」Hepa
tology 22:213-222 
・Kretz-RommelA, Rubin RL (1997)「狼瘡誘導薬であるプロカインアミドは、Ｔ細胞ク
ローンにおける無感作誘導を阻害する」J Immunol 158: 4465-4470 
・KurtsC,Sutherland RM, Davey G, LiM, Lew AM, Blanas E, Carbone FR, Miller JFAP
, Heath WR(1999)「膵島抗原に対するＣＤ８Ｔ細胞の無教育又は寛容は、抗原の投与量
に依存する」ProcNatl Acad Sci USA 96: 12703-12707 
・LafailleMACD and Lafaille JJ (2002)「自己免疫及びアレルギーにおけるＣＤ４+調
節Ｔ細胞」CurrOpin Immunol 14: 771-778 
・LimmerA, OhI J, Kurts C, Ljunggren HG, Reiss Y, Groettrup M, Momburg, F, Amol
d B, Knolle PA(2000)「ＣＤ８+Ｔ細胞に対する肝臓内皮細胞による外因性抗原の効率的
な提示は、抗原特異的Ｔ細胞寛容を生じさせる」Nat Med 6: 1348-1354 
・LohmanT, Leslie RGD, Londei M (1996)「正常の被検体及びインスリン依存性糖尿病
患者からの増大したグルタミン酸デカルボキシラーゼ６５のエピトープに対するＴ細胞ク
ローン」JAutoimmun 9: 385-389 
・LohseAW, Knolle PA, Bilo K, Uhrig A, Waldmann C, The M, Schmitt E, Gerken G, 
Meyer ZumBuschenfelde KH (1996)「ネズミシヌソイド内皮細胞及びクッパー細胞の抗原
提示機能及びＢ７発現」Gastroenterology 110: 1175-1181 
・Ma SW, ZhaoDL, Yin ZQ, Mukherjee R, Singh B, Qin HY, Stiller CR, Jevnikar AM 
(1997)「口腔免疫寛容を誘導するためにマウスに与えられた自己抗原を発現する形質転換
植物」NatMed 3: 793-796 
・MahnkeK, Guo M, Lee S, Sepulveda H, Swain SL, Nussenzweig M, Steinman RM (200
0)「エンドサイトーシスのための樹状細胞受容体ＤＥＣ−２０５は、主要組織適合複合体
クラスII−ポジティブリソソーム区画を介して抗原提示を再循環させ且つ向上させ得る」
J Cell Biol151: 673-685 
・MiyazakiA et al (1985)「前白血病非肥満（ＮＯＤ）マウスの膵島及び脾臓における
Ｔリンパ球の優勢：長期的研究」Clin Exp Immunol 60: 622-630 
・NotkinsAL, Lernmark A (2001)「自己免疫１型糖尿病：問題の解決及び未解決」J Cli
n Invest 108 :1247-1252 
・O'ReillyLA, Hutchings PR, Crocker PR, Simpson E, Lund T, Kiousses D, Takei F,
Baird J,Cooke A (1991)「ＮＯＤマウスにおける膵島細胞浸潤物のキャラクタリゼーシ
ョン：細胞転移及び導入遺伝子の発現の影響」Eur J Immunol 21: 1171-1180 
・PakkalaSV, Kurrer MO, Katz JD (1997)「Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞は、免疫妥協
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて急性膵炎及び糖尿病を誘導する」J Exp Med 186:
299-306 
・Park CG,Takahara K, Umemoto E et al (2001)「ヒト樹状細胞Ｃ型レクチンＤＣ−Ｓ
ＩＧＮの５種のマウスホモログ」Int Immunol 13:1283-1290 
・ParvingHH, Tarnow L, Nielsen F, Rossing P, Mandrup-Poulsen T, Osterby R, Neru
p J (1999)「１型糖尿病患者におけるシクロスポリン腎毒性：７年間の追跡研究」Diabet
es Care 22:478-483
・PohlmannS, Soilleux EJ, Baribaud F et al (2001)「内皮細胞内で発現するＤＣ−Ｓ
ＩＧＮホモログであるＤＣ−ＳＩＧＮＲは、ヒト及び類人猿の免疫不全ウイルスに結合し
、そして感染をトランスに活性化させる」Proc Natl Acad Sci USA 98: 2670-2675
・Poul MA,Becerril B, Nielsen UB, Morisson P, Marks JD (2000)「ファージライブラ
リーからの腫瘍特異的内在化ヒト抗体の選択」J Mol Biol 301: 1149-1161 
・PozziliP, Pitocco D, Visalli N, Cavall MG, Buzzetti R, Crino A, Spera S, Sura
ci C, MultariG, Cervoni M (2000)「経口インスリンは近年発症した１型糖尿病（ＩＭ
ＤＩＡＢ  VII）における残留β細胞機能には何ら影響を及ぼさない」Diabetologia43 :
1000-1004
・PuglleseA, Brown D,Garza D, Murchison D, Zeller  Mi, Redondo M, Diez J, Eisen
barth GS, PatelDD, Ricordi C(2001)「糖尿病関連自己抗原を発現する自己抗原提示細
胞は、胸腺及び末梢リンパ器官の両方に存在する」J Clin Invest 107: 555-564
・Quinn A,Mclnerney MF, Sercarz EE(2001)「グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５分
子上のＭＨＣクラスＩ制限決定基は自発的ＣＴＬ活性を誘導する」J Immunol 167: 1748 
1757 
・Raz I,Elias D, Avron A, Tamir M, Metzger M, Cohen IR (2001)「新たに発症した１
型糖尿病におけるＰ細胞機能及び熱ショック蛋白質ペプチド（ＤｉａＰｅｐ２７７）によ
る免疫調節：ランダム化二重盲式試験」Lancet 358: 1749-1753
・ReijonenH, Novak EJ, Kochik S, Henninger A, Liu AW, Kwok WW, Nepom GT (2002)
「１型糖尿病患者及び危険な状態の被検体における主要組織適合複合体クラスII四量体に
よるＧＡＤ６５特異的Ｔ細胞の欠失」Diabetes 51: 1375-1382 
・Roep BO,Arden SD, de Vries RRP, Hutton JC (1990)「１型糖尿病患者からのＴ細胞
クローンはインスリン分泌顆粒蛋白質に応答した」Nature 345: 632-634 
・RohanePW, Shimada A, Kim DT, Edwards CT, Charlton B, Shultz LD, Fathman CG (1
995)「前糖尿病ＮＯＤマウスからの膵島浸潤性リンパ球は、糖尿病をＮＯＤ−スキッド／
スキッドマウスに迅速に転移させた」Diabetes 44: 550-554
・RoncaroloMG, Levings MK, Traversi C (2001)「未成熟樹状細胞による調節Ｔ細胞の
分化」J ExpMed 193: F5-F9 
・RubinsteinD, Roska AK, Lipsky PE (1986)「肝臓シヌソイド内皮細胞は、クラスII主
要組織適合抗原を発現するが、新たな同種リンパ球の場合には貧弱な刺激因子である」J 
Immunol 137:1803-3818 
・Sempe P,Richard MF, Bach JF, Boitard C (1994)「非肥満糖尿病の雄マウスにおける
ＣＤ４+調節Ｔ細胞の証拠」Diabetologica 37: 337-343 
・SkylerJ, Rabinovitch A (1992)「最近発症した１型糖尿病におけるシクロスポリンの
効果：膵島β細胞機能に及ぼす効果」Miami Cyclosporine Diabetes Study Group. J Dia
betes 6: 77-88 
・SmithJA, Tang Q, Bluestone JA (1998)「Ｆｃ−Ｒ非結合性抗ＣＤ３モノクローナル
抗体によって送達される部分的なＴＣＲシグナルは、個々のＴｈサブセットを区別的に調
節する」JImmunol 160 : 4841-4849 
・SmithJA, Tso JY, Clark MR, Cole MS, Bluestone JA (1997)「非細胞分裂性抗ＣＤ３
抗体は部分Ｔ細胞受容体シグナルを送達し、そしてクローン無感作を誘導する」J Exp Me
d 185:1413-1422 
・SoilleuxEJ, Batten R, Trowsdale J (2000)「最先端:ＤＣ−ＳＩＧＮ;関連遺伝子Ｄ
Ｃ−ＳＩＧＮＲ;及びＣＤ２３は１９〜１３でクラスターを形成する」JImmunol 165: 29
37-2942 
・ThorntonAM, Shevach EM (1998)ＣＤ４+ＣＤ２５+免疫調節Ｔ細胞は、インターロイキ
ン２産生を阻害することによって試験管内でポリクローナルＴ細胞活性化を抑制する」J 
Exp Med 188:287-296 
・ThortonAM, Shevach EM (2000)「ＣＤ４+ＣＤ２５+免疫調節Ｔ細胞のサプレッサー機
能は抗原非特異的である」J Immunol 164: 183-190 
・TianJD,Clare-Salzler M, Herschenfeld A, Middleton B, Newman D, Mueller R, Ari
ta S, Evans C,Atkinson MA, Mullen Y, Sarvetnick N, Tobin AJ, Lehmann PV, Kaufma
n DL (1996)「ＧＡＤに対する自己免疫応答の調節は、前糖尿病マウスにおいて病気の進
行を抑制し且つ膵島移植組織の存続を長くする」Nat Med 2: 1348-1353
・Tian J,Atkinson MA,Clare-Salzer M, Herschenfeld A, Forsthuber T, Lehmann PV, 
Kaufman DL(1996)「グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）ペプチドの経鼻投
与は、Ｔｈ２応答を誘導し且つネズミインスリン依存性糖尿病を予防する」J Exp Med 18
3: 1561-1567 
・TischR., Yang XD, Singer SM, Liblau R, Fugger L, McDevitt H (1993)「グルタミ
ン酸デカルボキシラーゼに対する免疫応答は、非肥満糖尿病マウスにおいて膵島炎と相関
関係がある」Nature366: 72-75 
・Tisch R,Wang B, Atkinson MA, Serreze DV, Friedline R (2001)「グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ６５特異的Ｔｈ２細胞クローンは、非肥満糖尿病マウスにおいて自己免疫
糖尿病を免疫調節する」J Immunol 166: 6925- 2936
・Tisch R,Wang B, Serreze DV (1999)「グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５特異的Ｔ
ｈ２細胞の誘導及び病気の後期での自己免疫糖尿病の抑制は、エピトープ依存性である」
J Immunol 163:1178-1187
・WakkachA, Cottrez F, Groux H (2001)「調節Ｔ細胞の分化は、ＣＤ２共刺激によって
誘導される」JImmunol 167: 3107-3113
・WeinerHL (2001)「口腔寛容：Ｔｈ３型ＴＧＦβ分泌性調節Ｔ細胞の免疫機構及び発生
」MicrobesInfect 3: 947-954 
・Wen L,Wong FS, Burkly L, Altieri M, Mamalaki C, Kioussis D, Flavell RA, Sherw
in RS (1998)「ヒトＤＱ遺伝子導入マウスからのグルタミン酸デカルボキシラーゼペプチ
ド特異的及びＣＤ４（＋）Ｔ細胞による膵島炎の誘導」J Clin Invest 102: 947-957 
・Wong FS,Visintin I, Wen L, Flavell RA, Janeway CA Jr (1996)「若年性非肥満（Ｎ
ＯＤ）膵島からのＣＤ８Ｔ細胞クローンは、ＮＯＤマウスにおいてＣＤ４細胞の非存在下
に迅速な発症糖尿病を転移させ得る」J Exp Med 183: 67-76 
・Yagi H,Matsumoto M, Kunimoto K, Kawaguchi J, Makino S, Harada M (1992)「ＮＯ
Ｄ胸腺欠損マウスへの転移を使用したＮＯＤマウスの自己免疫糖尿病におけるＣＤ４+及
びＣＤ８+Ｔ細胞の部分の分析」Eur J Immunol 22: 2387-2393 
・YamigawaS, Gray JD, Hashimoto S, Horwitz DA (2001)「ヒト末梢血からのＣＤ４+Ｃ
Ｄ２５+調節Ｔ細胞の発生及び拡大におけるＴＧＦ−βの役割」J Immunol 166: 7282-728
9 
・Yang R,Liu Q, Grosfeld JL, Pescovitz MD(1994)「肝臓を介した腸静脈ドレナージは
、口腔寛容誘導のために必須である」J Pediatr Surg 29: 1145-1148
・ZechelMA,Elliott JF, Atkinson MA, Singh B (1998)「ＮＯＤマウスにおいて自己免
疫応答に関連する６５ｋＤａ及び６７ｋＤａグルタミン酸デカルボキシラーゼ上の新規な
Ｔ細胞エピトープのキャラクタリゼーション」J Autoimmun 1: 83-95 
・ZekzerD, Wong SF,Ayalon 0,Millet I, Altieri M, Shigeki S, Solimena M, Sherwin
R (1998)「ＧＡＤ反応性ＣＤ４+Ｔｈｌ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて糖尿病
を誘導する」JClin. Invest 101: 68-73
・ZhangZJ,Davidson L,Eisenbarth G, Weiner HL (1991)「ブタインスリンの経口投与に
よる非肥満糖尿病マウスにおける糖尿病の抑制」Proc Natl Acad Sci USA 88: 10252-102
56。
【０１０１】
上記記載は限定であると解釈すべきではなく、好ましい具体例の単なる例示であると解
釈すべきである。当業者であれば、この開示の範囲及び精神内でその他の改変を考えるで
あろう。
【０１０２】
ここに開示された具体例に対する様々な変更をなし得ることが理解されるであろう。例
えば、当業者であれば認識するであろうが、ここに記載された特定の配列を、抗体又は抗
体フラグメントの機能性に必ずしも悪影響を及ぼすことなく僅かに変更することができる
。例えば、抗体配列における単一の又は複数のアミノ酸の置換を、抗体又はフラグメント
の機能性を破壊することなく高い頻度でなし得る。従って、ここに記載される特定の抗体
に対して７０％以上の相同性を有する抗体は、本発明の範囲内にあることを理解すべきで
ある。特に有用な具体例では、ここに記載された特定の抗体に対して約８０％以上の相同
性を有する抗体が予期される。その他の有用な具体例では、ここに記載された特定の抗体
に対して約９０％以上の相同性を有する抗体が予期される。従って、上記記載は、限定と
解釈すべきでなく、好ましい具体例の単なる例示と解釈すべきである。当業者であれば、
本発明の範囲及び精神内で様々な変更を考えるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１１】
2010178758.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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