(57)【要約】【課題】セルロース系バイオマスに含まれる５種の中性糖を高い収率で再現性よく分離定量する分析法を提供すること。【解決手段】本分析法は難分解性のセルロース系バイオマスを酸処理で試料を可溶化する一次加水分解と多糖を単糖及びオリゴ糖に二次加水分解する工程、酸処理液を中和して内部標準の糖を添加する工程、残存するオリゴ糖を酵素で完全に単糖化する工程、得られた糖液を分離定量する糖測定の工程を含む。これらの工程の組合せにより、セルロース系バイオマスに含まれる５種の中性糖を高い収率で再現性よく分離定量することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）から（Ｄ）の分析操作工程を含む、セルロース系バイオマスに含まれる５つの中性糖(グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース)を分離定量する方法：
（Ａ）  試料として粉砕及び／又は磨砕したバイオマスの一定量を濃硫酸で処理して溶解し、希釈してから１００℃以上の高温で加水分解を行う酸処理工程；
（Ｂ）  得られた酸加水分解液をpH３〜５に中和してから、内部標準とする糖類を一定量加える中和処理工程；
（Ｃ）  中和されたオリゴ糖を含む酸糖化液に単糖生成力に優れた酵素を加えて、単糖に変換する酵素処理工程；
（Ｄ）  高速液体クロマトグラフィによって、５つの中性糖を分離定量する糖測定工程。
【請求項２】
試料となるバイオマスが、１００μm以下の粒度にまで粉砕されている、請求項１記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【請求項３】
工程（Ａ）において、試料の水分を調整し、凍結してから濃硫酸を添加し、磨砕しながら溶解する、請求項１又は２記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【請求項４】
工程（Ｂ）において、内部標準として、デオキシグルコース、イノシトール、メチルグルコース及びフコースから選択される１種類以上を用いる、請求項１〜３のいずれか１項記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【請求項５】
工程（Ｃ）において、少なくともAspergillus aculeatusに由来する酵素を含んだ酵素を用いる、請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【請求項６】
工程（Ｄ）において、加水分解された５つの中性糖の分析に、糖分析用イオンクロマトグラフィを用いる、請求項１〜６のいずれか１項記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のバイオマス中性糖の分離定量法を用いて得られた糖量に基づいて、セルロース系バイオマスのバイオエタノールやバイオリファイナリーにおける製品の対糖収率を求める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース系バイオマスに含まれるバイオエタノールやバイオリファイナリーの原料となる多糖の組成を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスが化石燃料の代替、炭酸ガス排出の抑制、地球温暖化の防止などに役立つとして注目されている。特に、ガソリンなどの輸送用燃料の代替として、バイオエタノールの生産が急激に拡大している。しかしながら現在、バイオエタノールの原料となるバイオマスは、サトウキビやトウモロコシなどの糖液や澱粉が主流となっており、食料、穀物の高騰の原因とされている。そこで、食料との競合を避ける意味から、セルロース系バイオマスの利活用が求められている。このような状況にも関わらず、現状では、セルロース系バイオマスからのバイオエタノール生産は困難を極めている。その原因として、セルロース系バイオマスに含まれる多糖の加水分解が容易ではなく、リグニンなどが糖化反応やアルコール発酵を阻害するなどの悪影響を与えていると言われている。
【０００３】
セルロース系バイオマスは、糖質系や澱粉系バイオマスと異なり、より複雑な細胞壁多糖を形成している。その構成成分の中で酸性糖などの糖はエタノールへの変換が困難であり、利用可能な糖類は、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトースの５つの中性糖である。この中でも、キシロースのエタノールへの変換は、技術的に可能であっても、工業的に可能な領域に達しておらず、キシロースの利用率を向上させる研究開発が世界的に進められている。また、アラビノースも現状では、利用困難な糖である。
【０００４】
しかも、利用可能な糖類は全て単糖にする必要がある。澱粉の場合、グルコース以外のマルトースやマルトトリオースのようなオリゴ糖も酵母で利用されるが、細胞壁多糖はβ結合の多糖であり、二糖類といえども、酵母は利用できない。これらの観点から、発明者の一人(阪本禮一郎)は、パルプを各種セルラーゼで処理して得られる糖液に、さらにAspergillus aculeatus の培養液から得られるセルラーゼ系酵素群(アクセラーゼ)を作用させることにより、酵素糖化液に含まれるオリゴ糖を単糖化することに成功している（非特許文献１）。これにより、各種セルラーゼで処理された糖化液の、より正確な利用可能糖量を把握することができることを見出している。
【０００５】
しかしながら、バイオマスを直接、酵素処理によって完全に単糖まで加水分解することは困難である。なぜなら、バイオマスを構成する代表的三成分であるセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの内、リグニンは酵素分解されず、しかも、多糖加水分解酵素の作用を阻害する。細胞壁は、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンの多層構造により成り立っており、セルロース、ヘミセルロースに密着しているリグニンを除去しなければ、多糖加水分解酵素はセルロース、ヘミセルロースに作用できない。さらに、脱リグニン処理したバイオマスには、多糖加水分解酵素に対する阻害物質の生成することが知られている。従って、現状では、セルロース系バイオマスを脱リグニンしないで直接、多糖加水分解酵素で加水分解することはきわめて困難である。また、脱リグニンしたバイオマスであっても、多糖加水分解酵素で単糖にまで完全分解することは、ほとんど成功していない。セルロース系バイオマスの糖分析においても、脱リグニンしたパルプを酵素処理して得られた糖化液にはオリゴ糖が含まれており、これらを完全分解するため、糖化液をトリフルオロ酢酸（TFA）で処理している(非特許文献２)。
【０００６】
現在、木材やパルプの多糖成分を測定する方法として、Tappi Standard 法(非特許文献３)が知られており、活用されている。この方法は、乾燥した木粉やパルプに７２％濃硫酸を添加し、溶解して一次加水分解した後、酸濃度を下げてから１００℃以上の温度で二次加水分解する方法である。得られた糖液を中和して、構成糖をガスクロマトグラフ法や高速液体クロマトグラフ法で測定している。本測定法は、紙パルプ先進国である欧米で開発された方法であって、主に針葉樹を原料とするバイオマスの糖組成分析に有用である。
【０００７】
その理由は、針葉樹に含まれるヘミセルロースには過分解を受けやすい五炭糖が少ないことによる。硫酸による加水分解では、セルロースよりヘミセルロースの方が加水分解されやすく、先に単糖が生成する。生成したキシロースは６０℃以上の温度で過分解を起こすことが知られている。従って、セルロースが単糖にまで完全分解される時には、ヘミセルロースに含まれるキシロースなどの五炭糖は過分解を受けて失われる。過分解を受ける五炭糖の少ない分だけ、針葉樹の硫酸加水分解による糖の損失は少なくなる。針葉樹の糖組成分析においても、Tappi Standard 法は少量含まれるキシロースの収率が低く測定される欠点がある。
【０００８】
日本や温暖な地域では、パルプ原料として針葉樹より広葉樹の方が多く利用されている。広葉樹はヘミセルロースを多く含み、その主成分はキシロースである。さらに、草本類にもキシロースを主な成分とするヘミセルロースが多く含まれている。これら広葉樹や草本類の糖組成を正確に分析することが困難である。特に、Tappi Standard 法の条件では、セルロースを構成するグルコース量を正確に測定する条件では、ヘミセルロースを構成するキシロースが過分解される欠点が指摘されている。
【０００９】
【非特許文献１】Konno,M.Sakamoto,R.Kamaya,Y.:”Quantitative analysis of pulp-derived soluble oligosaccharides by an enzymatic-HPLC method”,J. Ferment. Bioeng.,Vol. 82,No. 6,pp. 607-609 (1996)
【非特許文献２】Syverud, K., Moe, S.T., Minja, R.J.A. (1999): "Carbohydrate analysis of pulps using enzymatic hydrolysis and High Pressure Liquid Chromatography", 10th International Symposium on Wood and Pulping Chemistry Vol. 2, pp. 232-237
【非特許文献３】TAPPI Test Method T249 cm-85:“Carbohydrate composition of extractive-free wood and wood pulp by gas-liquid chromatography” in Tappi Test Methods,Atlanta,GA:Technical Association of the Pulp and Paper Industry.
【非特許文献４】Sakamoto,R.,Arai,M.,Murao,S.: Agric. Biol. Chem.,49,1283 (1985)
【非特許文献５】阪本禮一郎、林裕隆、森山康司、荒井基夫、村尾澤夫「Aspergillus aculeatusの粗酵素によるセルロース性物質の分解」：醗酵工学，60，333 (1982)
【非特許文献６】Suzuki,M.,Sakamoto,R ,Aoyagi,T.: Tappi J.,78(7),174 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、過分解を受けやすいキシロースを含むセルロース系バイオマスの糖組成を正確に分析することにある。従来は（１）酸加水分解法では、キシロースが過分解したり、オリゴ糖が残存する。（２）酵素加水分解法では、キシロースの過分解が起こらず、未処理のバイオマスには適用が不可である。以上の通り従来の方法にはそれぞれ一長一短があり、必ずしも満足のいくものではない。しかしセルロース系バイオマス利用を進めるにあたり糖組成分析の重要性は高まっており、正確且つ簡便な方法の開発が焦眉の急となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、多糖を完全に単糖化する糖化法を開発すべく種々検討を加えた。まず、硫酸加水分解の利点を活用して、バイオマスを可溶化する一次加水分解と低分子化する二次加水分解の組み合わせにより、キシロースが最大収量となる条件を設定した。さらに、酸加水分解の後に酸糖化液を中和処理してから単糖生成力に優れたセルラーゼ系酵素群を含む酵素液で処理する条件を検討した。その結果、未処理のバイオマスであってもバイオマスを可溶化してキシロースの過分解を防ぎながら、未分解で残るセロオリゴ糖などのオリゴ糖を完全に単糖にまで分解する条件を見出した。すなわち、主たる構成糖であるグルコースとキシロースの収量を共に最大とする処理条件の得られることを見出した。これにより、セルロース系バイオマスを構成するグルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトースの５つの中性糖をより正確に分析する測定法を完成させることができた。
【００１２】
本発明は、以下のセルロース系バイオマスの糖組成分析法によって構成される。
【００１３】
（１）以下の（Ａ）から（Ｄ）の分析操作工程を含む、セルロース系バイオマスに含まれる５つの中性糖(グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース)を分離定量する方法。
（Ａ）  試料として粉砕及び／又は磨砕したバイオマスの一定量を濃硫酸で処理して溶解し、希釈してから１００℃以上の高温で加水分解を行う酸処理工程。
（Ｂ）  得られた酸加水分解液をpH３〜５に中和してから、内部標準とする糖類を一定量加える中和処理工程。
（Ｃ）  中和されたオリゴ糖を含む酸糖化液に単糖生成力に優れた酵素を加えて、単糖に変換する酵素処理工程。
（Ｄ）  高速液体クロマトグラフィによって、５つの中性糖を分離定量する糖測定工程。
【００１４】
（２）試料となるバイオマスが、１００μm以下の粒度にまで粉砕されている、前記(１)のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【００１５】
（３）工程（Ａ）において、試料の水分を調整し、凍結してから濃硫酸を添加し、磨砕しながら溶解する、前記(１)〜(２)のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【００１６】
（４）工程（Ｂ）において、内部標準として、デオキシグルコース、イノシトール、メチルグルコース及びフコースから選択される１種類以上を用いる、前記(１)〜(３)のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【００１７】
（５）工程（Ｃ）において、少なくともAspergillus aculeatusに由来する酵素を含んだ酵素を用いる、前記(１)〜(４)のいずれか１項記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【００１８】
（６）工程（Ｄ）において、加水分解された５つの中性糖の分析に、糖分析用イオンクロマトグラフィを用いる、前記(１)〜(５)のいずれか１項記載のバイオマスに含まれる中性糖の分離定量法。
【００１９】
（７）前記(１)〜(６)のいずれか１項記載のバイオマス中性糖の分離定量法を用いて得られた糖量に基づいて、セルロース系バイオマスのバイオエタノールやバイオリファイナリーにおける製品の対糖収率を求める方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の糖分析法は、セルロース系バイオマスを構成する５つの中性糖(グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース)をより正確に測定する方法である。本発明の測定法により、セルロース系バイオマスを原料として、バイオエタノールの生産やバイオリファイナリーによる化学製品の生産において、より精度の高い対糖収率を求めることができる。
【００２１】
これにより、セルロース系バイオマスの利活用技術の開発に重要な指標としての糖組成を正確に把握することが可能となり、技術開発及び生産の効率向上などに活用され得る。また、実生産の工程管理においても極めて有用な技術となり得る。
【００２２】
本測定法により、各種のセルロース系バイオマスに含まれる多糖を加水分解して得られる５つの中性糖(グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース)を、高い収率で、より正確に分離定量することができる。これによりバイオマスの利活用に役立つ糖組成情報を提供することが可能となり、各種バイオマスから得られるエタノールなど生産物の限界収率を求めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明の糖組成分析法は、セルロース系バイオマスを試料とし、その利活用に重要な意味を持つ５つの中性糖(グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトース)を正確に分離定量する測定法である。
【００２４】
試料として利用されるセルロース系バイオマスとは、木本類や草本類が含まれる。すなわち、セルロース、ヘミセルロース、リグニンの三成分を含むバイオマスであれば、種類に関係なく分析試料として用いることができる。もちろん、セルロース系バイオマスに、澱粉など他の多糖が混在する試料でも測定は可能である。その場合、澱粉とセルロースを分離定量することもできる。
【００２５】
前処理していないセルロース系バイオマスの粗試料の形態は、分析精度に大きい影響を与える。可能な限り、細かく裁断された試料が好ましい。分析精度を高めるため、乾燥した試料の場合、１００μm以下に粉砕された試料を用いることが推奨される。さらに、可能であれば５０μm以下の粒度に粉砕された試料が好ましい。湿潤な試料であっても、凍結処理してから濃硫酸を添加して温度上昇を抑制しつつ試料を溶解することが可能である。
【００２６】
試料の硫酸による溶解(一次加水分解)を促進する手段として、磨砕が効果的である。特に、粉砕することで大きく損失するなど試料を粉砕することが困難な試料や、細かくできない湿潤な試料を溶解するには、硫酸を添加してから磨砕によって磨り潰すことが必要となる。もちろん、乾燥試料を粉砕したものでも、硫酸添加後に磨砕することにより、試料の溶解が大きく促進され、糖測定の収率向上、再現精度の向上が図れる。
【００２７】
セルロース系バイオマスを前処理した試料は、如何なる前処理であっても分析可能である。むしろ、バイオマスの前処理は、加水分解を容易にするための処理法であって、本糖分析法においては、分析操作が容易となったり、分析精度や再現性が向上する場合が多い。アルカリ処理したバイオマスも、必要であれば硫酸の添加量を増して溶解処理することができる。使用する硫酸の量は試料に対して大量であり、多くの場合、硫酸の添加量を増す必要性は少ない。また、硫酸やアルカリなどの量が多くなり、中和後の塩類濃度が高くなっても、本分析法では糖分析感度が高いことにより、酵素処理に影響を与えることは、ほとんどない。もちろん、塩濃度は低いほうが好ましい。
【００２８】
バイオマス試料の採取量は限定されないが、量が多いと分析操作を煩雑にすることとなり、乾燥重量で１００mg程度(mg単位で計測)を目安としている。これより多い試料では、硫酸による二次加水分解の液量が１００mLを越えることとなり、容量の大きい耐圧ガラス容器が必要となり、磨砕する試料では、磨り潰す時間を多く要する。試料の量が１０mg以下(０．１mg単位で計測)のように少ない場合、分析精度と再現性に問題が生じる。重量を正確に測定することが必要となり、湿潤な試料では困難となる場合がある。
【００２９】
硫酸の添加量は試料に含まれる水分を含めて硫酸濃度が７０〜７７％の範囲となるように調整する。硫酸の濃度は、試料の種類や水分含量、保存状態などにより、適正な濃度が微妙に異なる。しかし、７０％より低い硫酸濃度では、試料の溶解が不充分となり、正確な測定が困難となる。また、硫酸濃度を７７％以上に設定すると、糖の過分解が生じて糖化液の着色が著しくなり、正確な測定が困難となる。硫酸による試料の溶解は、通常、室温で行うが、必要に応じて４０〜５０℃に加温することができる。ただし、６０℃以上に加温すれば、糖の過分解が生じるため、好ましくない。
【００３０】
硫酸による二次加水分解の条件は、一次加水分解と同様に、試料の種類や水分含量、保存状態などにより、微妙に異なる。一次加水分解で溶解された試料は、洗浄液と共に耐圧ガラス容器に移される。多くの場合は、硫酸濃度として、４．０〜４．５％、加熱温度１２０℃(オートクレーブ加圧)、加熱時間１０〜２５分の条件で最適な処理が得られる。これらの条件に限定されず、硫酸濃度、加熱温度、加熱時間を選定して、最適に条件を設定することもできる。
【００３１】
二次加水分解が終了した試料の耐圧ガラス容器は水冷により、４０℃以下にまで冷却されてから、中和操作に移る。中和はNaOH溶液で行われる。次の酵素処理工程で、糖化液は酢酸緩衝液が使用されるため、NaOHを添加する前に、酢酸ナトリウム溶液を加えて、０．１M濃度に調製することが好ましい。次いで、NaOH溶液を加えて、糖化液をpH ４〜５に調整する。
【００３２】
中和した酸糖化液に、内部標準とする糖液を添加し、全量の重量をmg単位で計測する。内部標準に用いる糖は、デオキシグルコース、イノシトール、メチルグルコース、フコースなどの中から選択される。必要に応じて、２種類以上の内部標準を使用することができる。内部標準の糖液をこの時点で加えることにより、この操作以後の操作における測定の変動要因の影響を最小限とすることが可能となる。
【００３３】
中和され、内部標準を添加された酸糖化液には、セルロース由来のセロオリゴ糖などのオリゴ糖が含まれている。ヘミセルロース由来のキシロオリゴ糖が残存する条件もあり得る。従って、これらのオリゴ糖を単糖にまで分解しなければ、糖分析が複雑となり、分析が困難となる。そこで、単糖生成力の優れたセルラーゼ系酵素が必要となる。セルラーゼ力価が強いだけでなく、ヘミセルラーゼの分解力が強く、全てを単糖にまで分解できる酵素群が必要である。
【００３４】
セルラーゼ系酵素群の中で、単糖生成力に優れた酵素としては、Aspergillus属の酵素群がよく知られている。中でも、最も優れた単糖生成力を有する酵素としては、A. aculeatus No.F-50 の培養液から得られた粗酵素(アクセラーゼ)が最も推奨される。アクセラーゼに含まれる酵素群の中には、糖転移反応を生じないで、セロオリゴ糖に最も強い活性を有する Cellooligo-glucosidaseが含まれている(非特許文献４)。しかも、広葉樹由来の漂白パルプやアルカリ前処理稲ワラから８％の糖液が得られ、生成糖はペーパー・クロマトグラフィによってオリゴ糖の検出されないことが示されている(非特許文献５)。
【００３５】
酵素処理に使用される酵素群はセルロース由来のオリゴ糖だけでなく、キシランなどのヘミセルロース由来のオリゴ糖をも単糖にまで加水分解する酵素が必要である。従って、単独の微生物由来のセルラーゼ系酵素群だけでは、単糖化処理が困難となる可能性がある。このような場合でも、起源の異なる微生物由来のセルラーゼ系酵素群や単独酵素を組み合わせて使用することも可能である。例えば、アクセラーゼに Trichoderma 属由来の酵素群を組み合わせると、酵素添加量が少なくても、単糖化の反応が速やかに進んだり、分解限度が高くなったりすることがある。
【００３６】
酵素処理の条件は、原料であるバイオマスの種類や水分含量、保存状態、前処理の有無、酸処理の条件などによって、大きく異なる。また、添加する酵素の力価や単糖生成力によっても処理条件が異なる。一例として、アクセラーゼを使用した場合には、１mgの単糖を含む糖化液に対して、酵素添加量は１mg以下であり、好ましくは１０〜５０μgである。その他の処理条件として、pH ４．５、処理温度 ４５℃、処理時間 １〜１２時間の範囲が設定されている。
【００３７】
酵素処理工程を経た糖化液は、適宜希釈されて常法どおり、高速液体クロマトグラフィで糖を分離定量する。発明者の一人が設定している糖分析用イオンクロマトグラフィを用いて１５分間隔で試料糖液を分析する方法が公開されている(非特許文献６)。測定の条件は、分析装置、分離カラムなどの種類により、条件が異なる。
【００３８】
本発明の方法で得られたバイオマスの糖組成は、Tappi Standard法に比べて、キシロース含量が高く検出され、各種のセルロース系バイオマスの糖組成分析に利用できる。特に、広葉樹や草本類のように、キシロース含量の高いバイオマスの糖分析に優れた性能を発揮する。もちろん、キシロース含量の少ない針葉樹の糖組成分析も、より正確な測定値を提供することができる。
【００３９】
セルロース系バイオマスを構成する５つの中性糖、グルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトースを正確に測定することができれば、バイオマスから得られるバイオエタノールや化学品の生産の可能性が把握できることから、バイオマスの正確な評価が可能となる。また、バイオマスから効果的に生産物を得るための研究開発でも、構成糖の正確な分析が可能となれば、より的確な処理技術の開発が促進される。そしてまた、バイオマスからのバイオエタノールなどの実生産においても、正確な糖分析が工程管理を助けて、より効率の高い生産性を上げる技術の向上に役立つこととなる。
【００４０】
このように、セルロース系バイオマスの糖組成を的確に測定する技術の確立は、バイオマスの利活用技術の開発と生産に大きく貢献するものと期待される。
【００４１】
以下、本発明の詳細について実施例を挙げて説明するが、本発明は下記の実施例により、その技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
２００７年に柏市で栽培された稲の稲ワラをカッターミル（増幸産業製、MKCM-5）とアトマイザー（増幸産業製、MKA-5J）を用いて、φ１．０mmの篩いを通過するまでに粉砕した。以下、稲ワラの粉砕物を試料という。ガラス製すり鉢（外径１０．５cm）に、絶乾１００mgの試料を採取し、水（全て純水を使用）を加えて最終重量を１gとして、すり鉢をポリ袋で包み封印した。これを冷凍庫で一晩凍結した。凍結した試料に素早く濃硫酸３gを降りかけ、ガラス製すり棒で５分間磨り潰した。引き続き５０℃の恒温槽で保温しながら２５分間磨り潰し、大きな粒子や繊維を溶解させ試料の可溶化を進めた。溶解後、試料液を１００mL容の耐圧ガラス容器に移し、共洗いを繰り返し、洗浄液を含めて試料液を８０ｇとした。これをオートクレーブで、１２１℃１０分間処理し、酸による二次加水分解を行った。加熱終了後、速やかに耐圧ガラス容器を取り出し、最初、５０℃の温水に漬けて冷却し、さらに水道水で室温まで冷却した。硫酸二次加水分解した試料糖液に、５NのNaOH溶液の適量と１Mの酢酸ナトリウム溶液５mLを用いて、pH４．５に中和した。中和後、内部標準として２％デオキシグルコース溶液１mlを添加し、mg単位で添加量を計測し、さらに全液量をmg単位で計測した。
【００４３】
上記で調整した試料糖液１５０μLに１M酢酸緩衝液（pH４．５）１００μLと酵素液（A.aculeatus由来）１００μLを加えて、全量１０００μLになるように加水した。これを４５℃で一晩保温し、酵素加水分解反応を行った。
【００４４】
酵素加水分解処理した試料を、１ml注射器に採取し０．４５μｍのフィルターで濾過し、これをイオンクロマトグラフィに供した。イオンクロマトグラフィ用送液ポンプ、コントローラー、電気化学電気伝導度検出器には、ダイオネックス社製のものを使用した。カラムはダイオネックス社製CarboPac PA1を用い、流速１ml/minでカラム温度室温にて行った。移動相には水を用い、洗浄液には０．３Nの水酸化ナトリウム水溶液、０．１Nの水酸化カリウム水溶液、０．２５Nの炭酸ナトリウム水溶液を用いた。中性糖は、アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、マンノースの順序で分離されて溶出した。分析結果はダイオネックス社製ソフトのPeakNetを用いて解析した。得られた結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2010032274.tif 000002
【００４６】
糖含量の計算方法
糖組成からの糖含量の計算方法は、イオンクロマトグラフィの解析結果から、処理した試料中のアラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、マンノースの算出量を求め、アラビノース量とキシロース量には０．８８を、ガラクトース量とグルコース量とマンノース量には０．９０を掛けて合計した数値を、試料重量で割算して、糖含量を計算した。
【比較例１】
【００４７】
TAPPI STANDARD法による糖組成分析
絶乾で試料０．３５gをコニカルガラス遠心管に採取し、これに３mlの７２％硫酸を加え、撹拌棒を用いて十分に撹拌した。３０℃の恒温槽を用い時々撹拌しながら１時間保持して溶解させた。中身を８４mlの水でビーカーに完全に洗い出す。ビーカーに時計皿で蓋をしてオートクレーブに供し１０３kPaで１時間処理した。冷却後、１％イノシトール水溶液を１０ml加え十分に混合した。飽和水酸化バリウム水溶液を用いてpH４．６に中和した。これを遠心分離して透明な上清を得た。TAPPI STANDARD法では、上清中の単糖を、糖アルコールに還元し、アセチル化してガスクロマトグラフィに供しているが、比較例１では実施例１と同様にイオンクロマトグラフィで糖組成分析を行った。また内部標準には、実施例１と同様にデオキシグルコースを用いた。得られた結果を表２に示す。
【比較例２】
【００４８】
酵素加水分解による糖組成分析
稲ワラ粉砕物０．１％懸濁液４５０μLに１．０M酢酸緩衝液（pH４．５)１００μLと酵素液（A.aculeatus由来）１００μLと水を加えて１mlにし、十分に混合してから４５℃で一晩酵素加水分解を行った。反応液は実施例１と同様にイオンクロマトグラフィで糖組成分析を行った。また内部標準には、実施例１と同様にデオキシグルコースを用いた。得られた結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2010032274.tif 000003
【００５０】
表１に示すとおり、本発明方法を用いた実施例では、稲ワラ試料の糖含量が５８．０％と算出された。しかし比較例１では、糖含量が５４．７％であり、操作中のキシロース過分解による糖収量減が起こっていると考えられる。また比較例２では、糖含量が６．３％であり、試料の加水分解が殆ど進んでいないと考えられる。
以上の結果から、従来の方法ではセルロース系バイオマスを試料とした場合、正確な糖組成を測定することが難しいが、本発明の方法を用いることによって、より正確な糖組成を測定することが可能となる。
【実施例２】
【００５１】
ガラス製すり鉢(外径 １０．５cm)に試料 １２５mg(絶乾 １０４mg)を採取し、水(全て純水を使用) ９５０mgを添加してポリ袋に包み、冷蔵庫のフリーザーで一夜放置した。凍結した試料を取り出して、素早く濃硫酸 ３．００gを試料に降りかけて、ガラス製すりこぎで試料を磨り潰した。５０℃の恒温槽に、すり鉢を保持して加温しながら磨り潰した。加温して磨り潰す作業を３０分程度行い、硫酸濃度７４％による試料の可溶化を進めた。
【００５２】
粉体の稲ワラが溶解したら、水を加えて１００mL容の耐圧ガラス容器に試料溶解液を移し、洗浄水で残液が残らないように注意深く洗いこんだ。洗浄水を含めて全量を７０mLとし、硫酸濃度は４．２％であった。耐圧ガラス容器の蓋を確実に閉めてから、オートクレーブにかけて二次加水分解を行った。加熱条件は、１２１℃、１５分とした。加熱終了後、速やかに耐圧ガラス容器を取り出し、最初、５０℃の温水に漬けて冷却し、さらに水道水で室温まで冷却した。
【００５３】
硫酸二次加水分解した試料糖液に、１M 酢酸ナトリウム ５mLと適量の５N NaOHを添加して、pH ４．５ に調節した。これに、内部標準糖液として、２％のデオキシグルコースを１mL加えた。添加量は１,００３mgであった。この時の全液量は９０mLであり、液重量は９０,０６２mgであった。
【００５４】
次いで、中和して内部標準糖液を加えた糖液 ７０μLをエッペン・チューブに採取した。採取重量は７８mgであり、これに０．１M 酢酸ナトリウム緩衝液 １００μLとAspergillus aculeatus の粗酵素液 １００μL(粗酵素 ２mg含有)を添加し、全量を１mLとした。これを４５℃の恒温槽に静置し、１５時間放置した。
【００５５】
酵素糖化反応終了液は、適宜希釈されて糖分析用イオンカラムクロマトグラフ装置(DIONEX社製)で分離定量された。使用したカラムはPA-1であり、溶出は水のみで１mL/minの速度で行われた。中性糖は、アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、マンノースの順序で分離されて溶出した。内部標準のデオキシグルコースはアラビノースより先に溶出した。
【００５６】
溶出糖量の定量のため、別途、前記５種の中性糖を同じ条件で分離し、測定面積と各糖の重量が直線性に優れた標準曲線の得られる条件を設定した。さらに、内部標準のデオキシグルコースに対する各糖の一次回帰分析から換算係数を求めた。得られた各糖の換算係数と前記測定された面積から、試料稲ワラ粉体に含まれる中性糖の含量を算出した。アラビノース ３．７％、ガラクトース ０．３％、グルコース ４６．５％、キシロース ２１．６％、マンノース １．７％と算出され、合計量は、７３．７％となる。糖含量は６５．９％となる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、難分解性である故に糖組成を正確に分析することの困難なセルロース系バイオマスを構成する５種の中性糖を高い収率で再現性よく分離定量する分析法を提供するものである。セルロース系バイオマスの利活用が地球環境を守る上で重要性を増す中で、最も重要な利用可能性を示す中性糖の正確な分離定量法を得ることができた。これにより、セルロース系バイオマスの利用性を把握することが容易となり、利用法の開発に大きく貢献するだけでなく、実生産においても、バイオエタノールなどの収率向上に寄与する技術の開発に大いに貢献するものと期待される。