(57)【要約】【課題】嗜好性が高く、安全性も高いグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤を提供すること。【解決手段】エピガロカテキンガレートの重合体またはその塩を有するグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤。特に、クマロン環の６位および／または８位でメチレン基を介して結合した化合物であるエピガロカテキンガレート重合体を含む上記剤。【選択図】図１０
2010053110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピガロカテキンガレート３量体またはその塩を有効成分とするグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記エピガロカテキンガレート３量体が、クロマン環の６位および／または８位でメチレン基を介して結合した化合物である、請求項１に記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項３】
前記エピガロカテキンガレート３量体が、次式（Ｉ）：
【化１】
2010053110.tif 000020
を有する化合物、次式（ＩＩ）：
【化２】
2010053110.tif 000021
を有する化合物、および次式（ＩＩＩ）：
【化３】
2010053110.tif 000022
を有する化合物
（式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｒは次式（Ａ）：
【化４】
2010053110.tif 000023
で表されるガロイル基である）
からなる群から選択される化合物である、請求項２に記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項４】
次式（ＩＶ）：
【化５】
2010053110.tif 000024
で表される化合物を有効成分とするグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
【請求項５】
エピガロカテキンガレート３量体またはその塩を有効成分とする抗う蝕剤。
【請求項６】
前記エピガロカテキンガレート３量体が、クロマン環の６位および／または８位でメチレン基を介して結合した化合物である、請求項５に記載の抗う蝕剤。
【請求項７】
前記エピガロカテキンガレート３量体が、次式（Ｉ）：
【化６】
2010053110.tif 000025
を有する化合物、次式（ＩＩ）：
【化７】
2010053110.tif 000026
を有する化合物、および次式（ＩＩＩ）：
【化８】
2010053110.tif 000027
を有する化合物
（式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｒは次式（Ａ）：
【化９】
2010053110.tif 000028
で表されるガロイル基である）
からなる群から選択される化合物である、請求項６に記載の抗う蝕剤。
【請求項８】
次式（ＩＶ）：
【化１０】
2010053110.tif 000029
で表される化合物を有効成分とする抗う蝕剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤を添加した飲食品。
【請求項１０】
前記飲食品が茶飲料である、請求項９に記載の飲食品。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤を添加した口腔衛生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピガロカテキンガレート重合体を有効成分とするグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤、およびこれを添加した飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕の原因については過去に種々の仮説が提唱されたが、現在ではミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）の化学細菌説に基づく細菌感染症の一種であると認められている。この説によれば、う蝕の発生機構は以下の通りである。即ち、口腔連鎖球菌、特にストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans、以下「Ｓ・ミュータンス」と略称する。）が産生するグルコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素、ＧＴＦ）が、口中のショ糖を基質として、粘着性で不溶性の多糖（グルカン）を生成する。Ｓ・ミュータンスの菌体は、生成したグルカンによって、歯表面に付着して菌塊（プラーク）を形成する。プラーク中では、Ｓ・ミュータンスを始め種々の微生物が共生・繁殖しているが、これら微生物の代謝によって有機酸が産生され、この有機酸の作用でプラーク内部のｐＨが低下し、歯のエナメル質表面に脱灰が生じてう蝕が発生し、進行する。また、歯垢形成は、う蝕のほかに、歯周病や口臭の原因となるとされている。
【０００３】
このようにＳ・ミュータンスを中心とする口腔連鎖球菌によって形成される歯垢がう蝕の原因となっていることから、歯垢形成を抑えることが、ひいてはう蝕の発生を予防する有効な手段となりうる。
【０００４】
近年、抗う蝕作用を有する物質として、植物などに含まれるカテキン類が注目されている。特許文献１には、フラボノイド（カテキン類の一種）をペルオキシダーゼで処理することにより製造される８００〜５０００の分子量を有するフラボノイド重合物は、処理前に比べて、グルコシルトランスフェラーゼの阻害作用が増強されることが報告されている。
【０００５】
また、非特許文献１には、フラボノイド重合物が、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）由来のグルコシルトランスフェラーゼの活性を、２．５μｇ／ｍＬで５０％阻害することが報告されている。
【０００６】
また、特許文献２には、フラバノン類／フラバノール類の還元物あるいはロイコシアニジン類をカテキン類と縮合させることにより製造される重量分子量が１０００〜１００００のフラボノイド重合物に、グルコシルトランスフェラーゼの阻害作用がみられることが報告されている。
【０００７】
しかし、これらのフラボノイド重合物は、フラボノイドの３〜５量体の混合物または２〜３量体の混合物であって、混合物中に含まれる種々の化合物の単離は行なわれておらず、したがって化合物単体の各々に関してのグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性に関しては明らかにされていない。
【０００８】
日常飲食する茶の中では、非発酵茶である緑茶に由来するカテキン類の混合物にグルコシルトランスフェラーゼ阻害作用がみられることが報告されている（非特許文献２）。しかし、ラットを用いた試験では、充分な抗う蝕作用が得られなかったことも報告されている。
【０００９】
また、半発酵茶であるウーロン茶やその精製品に、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性がみられることが報告されている（特許文献３、非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５）。また、緑茶や烏龍茶、紅茶を加熱処理することでグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性が増強されることや（特許文献４）、カテキン類を加熱処理することでグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性が増強されることが知られている（特許文献５）。
【００１０】
しかし、いずれの場合にも、茶由来の混合物のうち、どの化合物に活性があるのかについては明らかにされていない。
【特許文献１】特開平６−２４７９５９号公報
【特許文献２】特開平７−２４２５５６号公報
【特許文献３】特開平６−２７９３０２号公報
【特許文献４】特開平３−２８４６２５号公報
【特許文献５】特開平３−２８４６７１号公報
【非特許文献１】FEMS Microbiology Letters 143 (1996) 35-40, Hamada S. et al.
【非特許文献２】Caries Res. 25 (1991) 438-443, Otake S. et al.
【非特許文献３】Applied and Environmental Microbiology, 59, No.4  (1993) 968-973, Nakahara K. et al.
【非特許文献４】The Nippon Dental review No.622 (August 1994) 179-189, Ooshima T. and Hamada S.
【非特許文献５】FEMS Microbiology Letters 228 (2003) 73-80, , Matsumoto M. et al.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のとおり、グルコシルトランスフェラーゼ阻害活性を有する植物抽出物等に関する報告はなされているが、いずれの場合にも、植物抽出物由来の混合物に活性がみられることが報告されるのみであって、具体的な活性成分（化合物）は明らかとされておらず、活性成分の同定が望まれていた。また、嗜好性の低い植物由来の成分を飲食品に利用すると、飲食品の香味および安全性を害することが予想されるので、嗜好性の高い植物由来の活性成分を探索することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、飲食物として利用することを考慮し、日常飲用されている茶に含まれる成分に着目し鋭意検討したところ、ウーロン茶などに含まれるカテキン類の一種である（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、ＥＧＣＧともよぶ）を重合して得られたＥＧＣＧ重合体に、中でも、特にＥＧＣＧ３量体に強いグルコシルトランスフェラーゼ阻害活性がみられることを見出し、本発明に至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
１．  エピガロカテキンガレート３量体またはその塩を有効成分とするグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
２．  前記エピガロカテキンガレート３量体が、クロマン環の６位および／または８位でメチレン基を介して結合した化合物である、上記１に記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
３．  前記エピガロカテキンガレート３量体が、次式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
2010053110.tif 000003
を有する化合物、次式（ＩＩ）：
【００１５】
【化２】
2010053110.tif 000004
を有する化合物、および次式（ＩＩＩ）：
【００１６】
【化３】
2010053110.tif 000005
を有する化合物
（式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｒは次式（Ａ）：
【００１７】
【化４】
2010053110.tif 000006
で表されるガロイル基である）
からなる群から選択される化合物である、上記２に記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
４．  次式（ＩＶ）：
【００１８】
【化５】
2010053110.tif 000007
で表される化合物を有効成分とするグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤。
５．  エピガロカテキンガレート３量体またはその塩を有効成分とする抗う蝕剤。
６．  前記エピガロカテキンガレート３量体が、クロマン環の６位および／または８位でメチレン基を介して結合した化合物である、上記５に記載の抗う蝕剤。
７．  前記エピガロカテキンガレート３量体が、前記式（Ｉ）を有する化合物、前記式（ＩＩ）を有する化合物、および前記式（ＩＩＩ）を有する化合物（式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｒは前記式（Ａ）で表されるガロイル基である）からなる群から選択される化合物である、上記６に記載の抗う蝕剤。
８．  前記式（ＩＶ）で表される化合物を有効成分とする抗う蝕剤。
９．  上記１〜８のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤を添加した飲食品。
１０．  前記飲食品が茶飲料である、上記９に記載の飲食品。
１１．  上記１〜８のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤を添加した口腔衛生剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明者らにより、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）重合体、特に特定のＥＧＣＧ２量体および３量体に、高いグルコシルトランスフェラーゼ阻害作用がみられることが見出された。上記のとおり、グルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧＴＦともいう）は口中で歯垢の原因となるグルカンを生成するので、ＧＴＦの活性を阻害することにより、う蝕を予防することができる。したがって、本発明のＧＴＦ阻害剤は、抗う蝕剤として用いることができる。また、本発明のＧＴＦ阻害剤は、歯垢の原因となるグルカンの生成を抑えるので、口臭を抑える効果も期待できる。さらに、本発明のＧＴＦ阻害剤は、ウーロン茶などの日常飲食する飲食品に含まれるＥＧＣＧに由来するため、嗜好性が高く、人体に対して高い安全性を有する。また、このＧＴＦ阻害剤を飲食品に一定量含有させることにより、飲食品の香味を過度に損なうことなく、嗜好性の高い、安全な、抗う蝕作用を有する飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
＜エピガロカテキンガレート重合体＞
（−）−エピカロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶などの茶に含まれるカテキン類のうちの主要な成分の１つであり、次の式：
【００２１】
【化６】
2010053110.tif 000008
により表される構造を有する化合物である。
【００２２】
本発明のＧＴＦ阻害剤に含まれる有効成分は、上記ＥＧＣＧの重合体である。本発明には、特に、ＥＧＣＧがそのクマロン環の６位および／または８位でメチレン基を介して２または３個結合した構造を有するＥＧＣＧ重合体を好ましく用いることができる。そのようなＥＧＣＧ重合体の具体例としては、次の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）：
【００２３】
【化７】
2010053110.tif 000009
【００２４】
【化８】
2010053110.tif 000010
【００２５】
【化９】
2010053110.tif 000011
により表されるＥＧＣＧ３量体（式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｒはガロイル基である）、および次式（ＩＶ）：
【００２６】
【化１０】
2010053110.tif 000012
で表されるＥＧＣＧ２量体などが挙げられる。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物は、ＥＧＣＧの結合様式に基づいて、ＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧと表記することができる（以下、本明細書では、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−１、またはＴｒｉ−１とよぶ）。同様に、式（ＩＩ）の化合物は、ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧと表記することができる（以下、本明細書では、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−２、またはＴｒｉ−２とよぶ）。また、式（ＩＩＩ）の化合物は、ＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：６ＥＧＣＧと表記することができる（以下、本明細書では、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４、ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−４、またはＴｒｉ−４とよぶ）。式（ＩＶ）の化合物は、ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧと表記することができる。式（ＩＶ）の化合物はウーロン茶などに含まれる化合物であることが報告されており、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ（ＯＨＢＦ−Ｂ）として知られている。なお、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、新規化合物である。
【００２８】
上記のＥＧＣＧ重合体は、エピガロカテキンガレートを、溶媒中、酸の存在下でホルムアルデヒドと反応させることによって製造することができる。
【００２９】
反応に使用することができる溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、およびイソプロパノール等のアルコール類が挙げられる。溶媒の使用量については特に制限はないが、例えば、１質量部のエピガロカテキンガレートに対して２０〜２００質量部の溶媒を用いることができる。
【００３０】
酸としては、例えば、塩酸、硫酸、および硝酸等の無機酸、ならびに、蟻酸および酢酸等の有機酸などを用いることができる。酸の使用量については特に制限はないが、例えば、１モルのエピガロカテキンガレートに対して、０．０１〜２モルの酸を用いることができる。
【００３１】
ホルムアルデヒドは、例えば、１モルのＥＧＣＧに対して、１〜１００モルで用いることができる。
【００３２】
反応の温度および時間は、用いる溶媒量等によって変わりうるが、例えば、反応温度は、−１０〜５０℃、反応時間は１０分〜１２時間である。典型的には、反応温度は室温（２５℃程度）である。
【００３３】
ＥＧＣＧとホルムアルデヒドとの反応によって得られる生成物は、通例、メチレン基によるクロマン環の連結様式が異なる化合物の少なくとも二種の化合物を含有する混合物である。例えば、ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）などのスチレン系吸着樹脂や、Ｓｈｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のようなデキストラン系樹脂によるオープンカラムクロマトグラフィー、ならびに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの公知の生成方法を用いることにより、このような混合物から、式（Ｉ）〜（ＩＶ）の各化合物を単離することができる。
【００３４】
なお、式（Ｉ）の化合物（ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−１）の調製方法は、特許文献（ＷＯ２００５／１１６００５）に、「三量体（４）」の合成および精製方法として、記載されている。また、式（ＩＶ）の化合物（ＯＨＢＦ−Ｂ）の調製方法は、文献（Chem.Pharm.Bull 37(12), 3255-3563(1989)）に記載されている。
【００３５】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤に用いられるＥＧＣＧ重合体は、塩の形態であってもよい。そのような塩としては、医薬的にまたは食品として許容可能な塩であれば特に制限されず、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩などの周期表の１族または２族の金属元素の塩を挙げることができる。このような金属塩は、例えば、ＥＧＣＧのフェノール性水酸基において形成することができる。
【００３６】
例えば、ＥＧＣＧ３量体のナトリウム塩は、ＥＧＣＧ３量体と金属ナトリウムまたは水素化ナトリウムとを、非プロトン性溶媒中で反応させて、ＥＧＣＧ３量体に含まれる水酸基（−ＯＨ）をナトリウムアルコキシド基（−ＯＮａ）に変換することによって製造することができる。この際、金属ナトリウムまたは水素化ナトリウムの使用量を調節することで、ＥＧＣＧ３量体に含まれる水酸基のすべてをナトリウムアルコキシド基に変換することができ、また、水酸基の一部のみをナトリウムアルコキシド基に変換することもできる。
【００３７】
これらのＥＧＣＧ重合体は合成によって得ることもできるが、実施例５に後述する通り、烏龍茶中にも存在することが判明した。そのため、本発明のＧＴＦ阻害剤の有効成分であるＥＧＣＧ重合体は、Camellia sinensis [A1]の葉を原料とする茶類、好ましくは烏龍茶、紅茶等の発酵茶や焙じ茶から抽出および精製することによって、単離することもできる。
【００３８】
＜ＥＧＣＧ重合体を有効成分とするＧＴＦ阻害剤または抗う蝕剤＞
本発明者らにより、ＥＧＣＧ重合体、特に上記の式（Ｉ）の化合物であるウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、式（ＩＩ）の化合物であるウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、式（ＩＩＩ）の化合物であるウーロンホモビスフラバン−トリマー−４、および式（ＩＶ）の化合物であるウーロンホモビスフラバン−Ｂに高いグルコシルトランスフェラーゼ阻害作用がみられることが見出された。
【００３９】
グルコシルトランスフェラーゼ阻害作用の測定は、背景技術に示した先行文献等に記載されるいずれの評価法を用いても行なうことができる。例えば、Streptococcus mutansなどから調製したグルコシルトランスフェラーゼを、ショ糖を含む水溶液中に添加し、口腔内と同程度の温度（約３７℃）で、２４時間未満、好ましくは１６〜２０時間程度インキュベートして、酵素反応によりショ糖からグルカンを生成させる。グルカンは水に不溶であるため、得られた反応液の濁度（例えば波長５５０ｎｍにおける濁度）を測定することにより、グルカンの生成量を評価することができる。グルカンの生成量が少ない（すなわち、濁度が低い）場合は、グルカンの生成量が多い（すなわち、濁度が高い）場合に比べて、グルコシルトランスフェラーゼの活性がより阻害されているといえる。
【００４０】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤は、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）の活性を阻害することにより、口中で歯垢の原因となるグルカンの生成を抑えることができるから、抗う蝕剤として用いることができる。
【００４１】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤は、ウーロン茶などの日常飲食する飲食品に含まれるＥＧＣＧに由来するため、嗜好性が高く、人体に対して高い安全性を有する。
【００４２】
＜飲食品＞
本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤は、虫歯予防などの抗う蝕を目的として、各種飲食品に添加することができる。本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤を添加する飲食品の例としては、清涼飲料、茶飲料、液状強壮剤、健康飲料、栄養補給飲料、スポーツドリンク、炭酸飲料（これら飲料の濃縮原液および調製用粉末を含む）などの飲料や、ガム、キャンディー、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品、サプリメントなどの食品が揚げられる。
【００４３】
飲食品への添加量は、所望の効果が得られる範囲であれば特に限定されず、飲食品の味、色、香りなどの点を考慮することにより適宜決定できる。例えば、抗う蝕を目的とした飲料を調製する場合、飲料中に０．０１〜１０００ｐｐｍ程度の濃度でＥＧＣＧ重合体を添加することができる。また、ＥＧＣＧ重合体を固形の食品に添加する場合、固形食品の重量に対して、０．０１〜５０００μｇ／ｇ程度のＥＧＣＧ重合体を添加することができる。
【００４４】
＜口腔衛生剤＞
本発明のグルコシルトランスフェラーゼ阻害剤または抗う蝕剤は、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）の活性を阻害することにより、口中で歯垢の原因となるグルカンの生成を抑えることができるため、虫歯予防および口臭予防などの口腔衛生剤に用いることができる。本発明における口腔衛生剤の例としては、歯磨、洗口液、トローチなどが挙げられる。これらの口腔衛生剤は、当業界で慣用される担体を用いて、慣用の手法で製造することができる。担体の例としては、製剤素材として慣用の各種有機または無機担体物質を用いることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色料、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。本発明のＧＴＦ阻害剤または抗う蝕剤の口腔衛生剤への添加量は、口腔衛生剤の形態などに応じて適宜決定できるが、例えば、口腔衛生剤中に、０．０００１〜１０重量％程度の濃度となるように、ＥＧＣＧ重合体を含有させることができる。
【００４５】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
ＥＧＣＧ重合体の合成および精製
ア．合成とオープンカラムによる分画：
６ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）（ロッシュ社、Ｔｅａｖｉｇｏ（登録商標））を０．０２Ｎ  ＨＣｌを含む１２０ｍｌのエタノールに溶解し、４％ホルムアルデヒドのエタノール溶液１８０ｍｌを加え、室温で４時間、撹拌した。反応終了後、純水で１０倍に希釈し、吸着樹脂ＣＨＰ−２０Ｐカラム（６００ｍｌ、３７−７５μｍ、三菱化学株式会社）に負荷した。１２００ｍｌの水で洗浄後、９００ｍｌの２５％ＣＨ3ＣＮ、１２００ｍｌの３０％ＣＨ3ＣＮで順次溶出し、２５％ＣＨ3ＣＮ溶出画分は３００ｍｌずつ３フラクション（ｆｒ．１からｆｒ．３）に分け、３０％ＣＨ3ＣＮ溶出画分は３００ｍｌずつ４フラクション（ｆｒ．４からｆｒ．７）に分画した。
【００４７】
イ．分取ＨＰＬＣ条件：
ＣＨＰ−２０Ｐカラム精製で得られた分画物をさらに逆相の分取ＨＰＬＣで精製した。
＜条件＞  
カラム：  Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（５ｃｍφｘ５０ｃｍ、野村化学株式会社）
移動相：Ａ：０．０５％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ、Ｂ：９０％ＣＨ3ＣＮ／０．０５％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ
流速：３２ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：Ａ８０％／Ｂ２０％でアイソクラティック（３０ｍｉｎ）、Ａ８０％／Ｂ２０％からＡ６０％／Ｂ４０％へグラジエント（１００ｍｉｎ）、Ａ６０％／Ｂ４０％でアイソクラティック（２０ｍｉｎ）
検出：Ａ２８０ｎｍ
サンプル：ＣＨＰ−２０Ｐカラム精製で得られたｆｒ．２からｆｒ．７を、それぞれ２０％ＣＨ3ＣＮに溶解し、数回に分けて全量を負荷した。
【００４８】
上記の分析条件おいて、保持時間１１３分（化合物１）、１２０分（化合物２）、１３０分（化合物３）、および保持時間８５分（化合物４）、保持時間１０６分（化合物５）、保持時間１０４分（化合物６）に相当する各ピークを集めた。
【００４９】
ウ．化合物の構造解析：
分取ＨＰＬＣで単離した化合物について、ＭＳおよびＮＭＲ測定を行った。このうち、化合物４〜６のＭＳをＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）により、ネガティブ、Ｖモードで測定したところ、それぞれｍ／ｚ９２７．１６０、９２７．１６３、１３９７．２４８の［Ｍ−Ｈ］-のイオンピークが認められた。また、化合物４のＮＭＲスペクトルデータは文献（Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ  ３７（１２），  ３２５５−３５６３（１９８９））に記載のウーロンホモビスフラバン−ＡのＮＭＲスペクトルデータと一致した。化合物５のＮＭＲスペクトルデータは文献（Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ  ３７（１２），  ３２５５−３５６３（１９８９））に記載のウーロンホモビスフラバン−ＢのＮＭＲスペクトルデータと一致した。さらに、化合物６のＮＭＲスペクトルデータから、化合物６は、上記の式（Ｉ）の化合物、すなわち、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−１であることがわかった。これらの結果から、化合物４はＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧの結合様式を有するＥＧＣＧ２量体であるウーロンホモビスフラバン−Ａ（ＯＨＢＦ−Ａ）であり、化合物５はＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧの結合様式を有するＥＧＣＧ２量体であるウーロンホモビスフラバン−Ｂ（ＯＨＢＦ−Ｂ）であり、化合物６はＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧの結合様式を有するＥＧＣＧ３量体であるウーロンホモビスフラバン−トリマー−１（本願では、ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−１またはＴｒｉ−１ともよぶ）であることが確認された。なお、上記のＥＧＣＧ間の６：８または８：８と記した結合はＥＧＣＧのＡ環の６位または８位の炭素が間にメチレン基を挟んで架橋した状態を表す。上記の各化合物の構造式を以下に示す。
【００５０】
【化１１】
2010053110.tif 000013
【００５１】
【化１２】
2010053110.tif 000014
【００５２】
【化１３】
2010053110.tif 000015
化合物１から化合物３については、以下のＭＳ、ＮＭＲにより構造解析を行った。ＭＳはＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  （Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）でイオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔ．：４５Ｖ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐ：１８０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］-）を用いた。
【００５３】
その結果、化合物２はｍ／ｚ１３９７．２４７９［Ｍ−Ｈ］-の分子イオンを与え、分子式Ｃ68Ｈ54Ｏ33（ｅｒｒ．：０．７ｐｐｍ）、化合物３はｍ／ｚ１３９７．２５０９［Ｍ−Ｈ］-の分子イオンを与え、分子式Ｃ68Ｈ54Ｏ33（ｅｒｒ．：２．９ｐｐｍ）と算出され、ＥＧＣＧ３分子が２つのメチレンにより架橋された物質であると推定された。また、化合物１はｍ／ｚ１８６７．３１００［Ｍ−Ｈ］-の分子イオンおよび２価の９３３．１１５１［Ｍ−２Ｈ］2-を与え、分子式Ｃ91Ｈ72Ｏ44（ｅｒｒ．：−１１．７ｐｐｍ）と算出され、ＥＧＣＧ４分子が３つのメチレンにより架橋された物質であると推定された。
【００５４】
ＮＭＲは、化合物２についてはＣＤ2ＯＨに溶解し、化合物３についてはＤＭＳＯ−ｄ６（（ＣＤ3）2ＳＯ）に溶解して測定を行った。化合物２は、ＣＤ3ＯＨのプロトンと13Ｃの残存ピークであるδ３．３０およびδ４８．９７を内部標準とし、化合物３は、ＤＭＳＯ−ｄ６の1Ｈの２．５０ｐｐｍと13Ｃの残存ピークδ３９．４３を内部標準とした。測定項目は1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲ、1Ｈ｛13Ｃ｝−ＨＳＱＣ、1Ｈ｛13Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＢＲＵＫＥＲ  ＢＩＯＳＰＩＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。ＮＭＲの結果、化合物２はＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧの結合様式を有する上記式（ＩＩ）の化合物（すなわち、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、本願では、ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−２またはＴｒｉ−２ともよぶ）であり、化合物３はＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：６ＥＧＣＧの結合様式を有する上記式（ＩＩＩ）の化合物（すなわち、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４、本願では、ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−４またはＴｒｉ−４ともよぶ）であることが明らかとなった。化合物２の1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲスペクトルを図１および２に、また化合物３の1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲスペクトルを図３および４に示す。
【００５５】
化合物２：
ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２（ＣＤ3ＯＨ中）の1ＨＮＭＲは、δ 6.95, 6.92, 6.90, 6.60, 6.54, 6.44, 6.08, 6.02, 5.57, 5.55, 5.49, 5.18, 5.12, 4.91, 3.86, 3.83, 3.81, 3.76, 3.03, 3.01, 2.94, 2.89, 2.89, 2.82のシグナル、13ＣＮＭＲは、δ 167.72, 167.46, 167.37, 156.29, 155.25, 155.08, 154.79, 154.43, 153.64, 152.91, 151.64, 151.20, 147.00, 146.93, 146.38, 146.38, 146.34, 146.29, 140.03, 139.89, 139.89, 134.65, 134.48, 133.85, 130.64, 129.29, 129.10, 121.33, 121.14, 121.14, 110.31, 110.24, 110.24, 109.19, 108.07, 107.42, 107.05, 107.02, 106.79, 106.10, 101.59, 101.00, 100.45, 97.23, 96.71, 80.07, 79.94, 78.45, 70.00, 69.32, 69.28, 27.21, 27.21, 26.81, 17.91, 17.91のシグナルが認められた。
【００５６】
化合物３：
ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４（ＤＭＳＯ−ｄ６中）の1ＨＮＭＲは、δ 10.46, 9.18, 9.16, 9.16, 9.12, 9.06, 9.05, 8.90, 8.88, 8.84, 8.72, 8.69, 8.69, 8.46, 8.34, 8.05, 8.02, 8.00, 6.81, 6.78, 6.78, 6.52, 6.47, 6.35, 6.03, 5.93, 5.48, 5.46, 5.39, 5.04, 4.95, 4.89, 4.05, 3.95, 3.56, 3.56, 3.06, 3.00, 2.98, 2.76, 2.71, 2.67のシグナル、13ＣＮＭＲは、δ 165.11, 165.09, 164.99, 157.66, 154.29, 153.82, 153.48, 153.07, 152.68, 152.23, 152.18, 150.88, 145.56, 145.52, 145.50, 145.26, 145.24, 145.23, 138.43, 138.43, 138.39, 132.34, 132.23, 132.19, 128.34, 128.34, 128.23, 119.17, 119.12, 119.04, 110.35, 110.31, 110.29, 109.19, 108.59, 108.56, 108.51, 106.97, 106.63, 105.26, 105.26, 105.13, 104.73, 101.28, 99.44, 99.41, 98.21, 97.34, 97.15, 96.03, 79.48, 79.07, 78.47, 69.95, 69.39, 69.28, 27.18, 26.98, 26.58, 18.16, 17.13のシグナルが認められた。
【００５７】
また、化合物１はＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、1Ｈと13Ｃの残存ピークδ２．５０、δ３９．４３を内部標準としてＮＭＲ測定を行った。測定項目は1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲ、1Ｈ｛13Ｃ｝−ＨＳＱＣ、1Ｈ｛13Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＢＲＵＫＥＲ  ＢＩＯＳＰＩＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。ＮＭＲの結果、化合物１はＥＧＣＧ８：６ＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧの結合様式を有するＥＧＣＧ４量体である化合物（ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２、本願では、ＯＨＢＦ−Ｔｅｔ−２またはＴｅｔ−２ともよぶ）であることが明らかになった。化合物１の1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲスペクトルを図５および図６に示す。
【００５８】
化合物１：
ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２は1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、δ 9.91, 9.25, 9.16, 8.09, 7.22, 6.81, 6.76, 6.74, 6.52,  5.94, 5.50, 5.38, 4.77, 4.52, 3.95, 3.95, 3.80, 3.54, 2.80, 2.74, 2.73, 2.67のシグナル、13ＣＮＭＲは、δ 165.08, 165.01, 154.06, 152.83, 152.35, 151.45, 150.78, 150.26, 145.52, 145.52, 145.24, 145.18, 138.49, 138.44, 132.21, 132.10, 128.42, 127.63, 119.05, 118.95, 108.58, 108.46, 108.46, 106.95, 105.74, 104.92, 104.06, 98.32, 97.81, 76.59, 75.94, 66.69, 66.35,26.33, 25.26, 16.72, 15.99のシグナルが認められた。
【００５９】
上記の通り同定された各化合物の構造式を以下に示す。
【００６０】
【化１４】
2010053110.tif 000016
【００６１】
【化１５】
2010053110.tif 000017
【００６２】
【化１６】
2010053110.tif 000018
以上の合成および精製手順により得られた各化合物の収量は、ウーロンホモビスフラバン−Ａ（９８４ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ（３７４ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−１（４６８ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２（７３ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４（１２ｍｇ）、およびウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２（４４ｍｇ）であった。
【実施例２】
【００６３】
リコンビナントグルコシルトランスフェラーゼ（ｒＧＴＦ）の調製
ｒＧＴＦを、論文M.matsumoto et al, FEMS Microbiology Letters 228 (2003) 73-80に記載の方法に準じて調製した。すなわち、Streptococcus mutansのグルコシルトランスフェラーゼＢ（ＧＴＦＢ）をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＳＫ６を保有するEscherichiacoli XL-2株を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬ含有Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ液体培地中で３７℃で１６時間振盪培養した。培地を遠心分離して菌体を集め、菌体を冷却した１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、超音波発生機（ＵＤ２０１型、トミー精工、東京）で氷冷下で菌体を破砕した。破砕後、１２，０００ｘ ｇで３０分間遠心分離することにより沈査を取り除いた。得られた上清をリコンビナントグルコシルトランスフェラーゼＢ（ｒＧＴＦＢ）として後の実験に用いた。
【００６４】
同様に、Streptococcus mutansのグルコシルトランスフェラーゼＣ（ＧＴＦＣ）をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＳＫ６を保有するEscherichiacoli XL-2株を用いて、リコンビナントグルコシルトランスフェラーゼＣ（ｒＧＴＦＣ）を調製し、後の実験に用いた。
【００６５】
ｒＧＴＦＢは比活性が５０３ｍＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのものを用い、ｒＧＴＦＣは比活性が６．３〜２２．３ｍＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのものを混合して用いた。ここで、活性１Ｕは、１分間に、スクロース由来のグルコース１．０ｍＭをグルカンへと転換した際の酵素活性を示す。タンパク質の定量は、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）（ＢＣＡプロテインアッセイキット、ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて行なった。
【実施例３】
【００６６】
グルコシルトランスフェラーゼ阻害作用の評価（１）
実施例１により得られたウーロンホモビスフラバンＡ（ＯＨＢＦ−Ａ）、ウーロンホモビスフラバンＢ（ＯＨＢＦ−Ｂ）、およびウーロンホモビスフラバン−トリマー−１（Ｔｒｉ−１）、ならびに論文（Hashimoto, F. Nonaka, G. Nishioka, I. Chem. Pharm. Bull. 36 (5), 1676-1684 (1988)）に準じて調製したテアシネンシンＡ（ＴＳＮ−Ａ）の各々についてのグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）阻害作用を、以下の手順により評価した。なお、ここで比較として用いたテアシネンシンＡ（ＴＳＮ−Ａ）は、ＥＧＣＧのＢ環の２’位同士が対称的に結合した物質であり、以下の構造を有する：
【００６７】
【化１７】
2010053110.tif 000019
１％スクロース含有０．１％デキストランＴ１０を含む０．１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２ｍＬに、実施例２により得られたｒＧＴＦＢまたはｒＧＴＦＣ（１５ｍＵ相当量）と、上記の各サンプル（０．１ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を混和し、３７℃で一晩インキュベートした。得られた反応液の濁度（５５０ｎｍ）を測定することにより、非水溶性グルカンの生成量を測定した。非水溶性グルカンの生成量がより少ない（すなわち、濁度がより低い）ことは、グルコシルトランスフェラーゼの活性がより阻害されたことを示す。結果を図７および図８に示す。なお、図中のコントロール（Ｃｏｎｔ）は、上記サンプルを混和しない場合の濁度を示す。
【００６８】
図７および８に示されるとおり、ＯＨＢＦ−Ａは、ＧＴＦＢの活性を阻害したものの、ＧＴＦＣについては、逆に、活性をやや強めることがわかった。また、ＴＳＮ−Ａは、ＧＴＦＢの活性にほとんど影響を及ぼさず、ＧＴＦＣについては、逆に、活性を非常に強めることがわかった。一方、ＯＨＢＦ−ＢおよびＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−１は、ＧＴＦＢとＧＴＦＣの両方について、活性を阻害することがわかった。特に、３量体であるＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−１は、２量体である他の化合物に比べて、ＧＴＦＢおよびＧＴＦＣの両者の活性を最も強く阻害することがわかった。
【実施例４】
【００６９】
グルコシルトランスフェラーゼ阻害作用の評価（２）
実施例１により得られたウーロンホモビスフラバン−トリマー−１（ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−１）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２（ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−２）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４（ＯＨＢＦ−Ｔｒｉ−４）、およびウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２（ＯＨＢＦ−Ｔｅｔ−２）の各々についてのグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）阻害作用を、以下の手順により評価した。
【００７０】
１％スクロース含有０．１％デキストランＴ１０を含む０．１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２ｍＬに、実施例２により得られたｒＧＴＦＢまたはｒＧＴＦＣ（１５ｍＵ相当量）と、上記の各サンプル（０．０５ｍｇ／ｍＬ、最終濃度）を混和し、３７℃で一晩インキュベートした。得られた反応液の濁度（５５０ｎｍ）を測定することにより、非水溶性グルカンの生成量を測定した。非水溶性グルカンの生成量がより少ない（すなわち、濁度がより低い）ことは、グルコシルトランスフェラーゼの活性がより阻害されたことを示す。結果を図９および図１０に示す。なお、図中のコントロール（Ｃｏｎｔ）は、上記サンプルを混和しない場合の濁度を示す。
【００７１】
図９および１０に示されるとおり、ＥＧＣＧ４量体であるＴｅｔ−２は、ＧＴＦＣの活性を有意に阻害したものの、ＧＴＦＢに対しては有意な阻害効果が認められなかった。一方、ＥＧＣＧ３量体であるＴｒｉ−１、Ｔｒｉ−２、およびＴｒｉ−４の各々については、ＧＴＦＢおよびＧＴＦＣに対して有意な阻害作用が認められ、ＧＴＦＣの阻害活性に関しては、ＥＣＧＣ４量体であるＴｅｔ−２のＧＴＦＣの阻害活性よりも高かった。
【００７２】
以上の結果より、ＥＧＣＧ３量体であるＴｒｉ−１、Ｔｒｉ−２、およびＴｒｉ−４、ならびにＥＧＣＧ２量体であるＯＨＢＦ−Ｂに高いＧＴＦ阻害作用がみられることが判った。特に、ＥＧＣＧ３量体であるＴｒｉ−１、Ｔｒｉ−２、およびＴｒｉ−４は、ＥＧＣＧの２量体であるＯＨＢＦ−Ａ、ＯＨＢＦ−Ｂ、およびＴＳＮ−Ａ、ならびにＥＧＣＧの４量体であるＴｅｔ−２に比べて、高いＧＴＦ阻害作用を有することがわかった。
【実施例５】
【００７３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる重合ポリフェノールの定量
トリマーおよびテトラマーのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件とサントリー黒烏龍茶の定量
ＥＧＣＧ重合物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定は、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（アプライド社製）で、ターボイオンスプレーを用い、以下の条件で測定した。Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：４６ｅＶ（ｎｅｇａ．）、Ｉｏｎｓｐｒａｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：４５００Ｖ、Ｔｅｍｐ：４５０℃。  
【００７４】
各化合物のＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）における測定チャンネルはウーロンホモビスフラバン−トリマー類は、６９８．４０／１６８．９０（ｎｅｇａ．２価）で、標準物質にはウーロンホモビスフラバン−トリマー−１を用いた。ウーロンホモビスフラバン−テトラマー類は、９３３．１６／１６８．９０（ｎｅｇａ．２価）で標準物質にはウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２を用いた。以下の測定条件で行った。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（野村化学、３ｍｍφ×１５０ｍｍ）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ、
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ／Ｈ2Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨ／ＣＨ3ＣＮ
グラジエントプログラム：Ａ９１％／Ｂ９％（０ｍｉｎ）→Ａ４０％／Ｂ６０％（１７ｍｉｎ）→Ａ１５％／Ｂ８５％（１７．１ｍｉｎ）、続いてＡ１５％／Ｂ８５％でアイソクラティック（１７．１〜１９ｍｉｎ）  
これらの化合物は黒烏龍茶中に微量しか含まれないため、直接定量することは不可能であった。そこで、黒烏龍茶（殺菌前）をＣＨＰ−２０Ｐカラム（三菱化学株式会社）でステップワイズに分画し、各フラクションの定量を行った後、各フラクションに検出された濃度を合算して茶中の濃度とした。黒烏龍茶中の濃度は、トリマー類は検出された５成分をウーロンホモビスフラバン−トリマー−１換算で合算し、１７２ｎｇ／ｍｌであった。テトラマー類は検出された４成分を合算し、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２換算で５５ｎｇ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、化合物２の1ＨＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、化合物２の13ＣＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、化合物３の1ＨＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、化合物３の13ＣＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、化合物１の1ＨＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、化合物１の13ＣＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】図７は、ＥＧＣＧ２量体および３量体の各化合物のグルコシルトランスフェラーゼＢに対する阻害作用の評価結果を示す。
【図８】図８は、ＥＧＣＧ２量体および３量体の各化合物のグルコシルトランスフェラーゼＣに対する阻害作用の評価結果を示す。
【図９】図９は、ＥＧＣＧ３量体および４量体の各化合物のグルコシルトランスフェラーゼＢに対する阻害作用の評価結果を示す。
【図１０】図１０は、ＥＧＣＧ３量体および４量体の各化合物のグルコシルトランスフェラーゼＣに対する阻害作用の評価結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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