(57)【要約】【課題】被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供する。【解決手段】動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における１０種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出する構成が推奨される。該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、該評価方法を簡便に行うことができるキットも提供される。【選択図】図１
2010038898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（Ｍｓ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５０７０のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（１）と（２）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（１）マーカー物質（Ｍｓ９）は、ミオグロビン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍｓ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である。
【請求項３】
動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ａ１）と（Ａ２）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
（Ａ１）ミオグロビン又はその修飾体、
（Ａ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体。
【請求項４】
前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項５】
前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項６】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項７】
前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項８】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項９】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１０】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被験物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【請求項１４】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化改善・予防効果の評価方法及び評価用キット、並びに、物質のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する動脈硬化改善・予防効果の評価方法、該評価方法を簡便に行うことができる動脈硬化改善・予防効果の評価用キット、並びに、該評価方法を用いて動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満，糖尿病，高脂血症、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発現、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚して弾力性がなくなる病態の総称である。動脈硬化にはいくつかの種類があるが、アテローム動脈硬化（粥状硬化）と呼ばれる病態が最も多くみられる。特に注記しない場合には、動脈硬化とはアテローム動脈硬化を指すことも多い。アテローム動脈硬化は、動脈内壁に粥状のプラーク（アテローム）が沈着して血流に支障をきたす状態であり、脳、心臓、腎臓、手足などに重篤な損傷をもたらすおそれがある。すなわち、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、腎不全、手足の壊死など、生命に直接かかわる症状につながるおそれがある。動脈硬化が起こる原因については、まだ完全には解明されていない部分もあるが、上記のように肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等が発症の危険因子とされている。
【０００４】
動脈硬化のような生活習慣病に属する疾病については、予防することの重要性が強調されている。すなわち、生活習慣病は徐々に進行するものが多く、発症初期には自覚症状があまりないことが多い。その結果、発見されたときにはすでに重篤な状態まで進んでいることがあり、予防の重要性が特に高い。このような背景の下、疾病の将来の発症リスクを検出することができるようなバイオマーカー、すなわち「予防マーカー」あるいは「リスクマーカー」と呼ばれるマーカー物質の探索が盛んに行われている。生活習慣病の予防マーカーを用いれば、例えば、当該疾病の将来の発症リスクを判定することが可能となり、事前に生活習慣の是正、食事制限、運動等の適切な処置を行って当該疾病の発症を予防することが可能となる。また、予防マーカーを用いることで、被験物質が当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有するかを容易に調べることも可能となり、食品素材の機能性評価やスクリーニングにも有用である。そして、そのような評価・スクリーニング系で選抜された食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、生活習慣病を容易に予防することが可能となる。
【０００５】
生活習慣病関連では、例えば特許文献１に糖尿病の予防マーカー、特許文献２に高脂血症の予防マーカーについての開示がある。ただし、これらは動脈硬化に特化したバイオマーカーではない。一方、動脈硬化に特化したバイオマーカーを探索する試みもあり、例えば特許文献３には炎症のバイオマーカーであるＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）が、特許文献４には腫瘍マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が動脈硬化のバイオマーカーとしても使えるとの記載がある。しかしながら、ＣＲＰやＡＦＰについては動脈硬化とは全く異なる臨床的意義（炎症や発がん）が確立しており、動脈硬化のバイオマーカーとしては特異性の面で使いにくい。したがって、動脈硬化の将来の発症リスク診断や、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を可能にする新たなマーカー物質を特定することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７３１９５号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−０６４７４７号公報
【特許文献３】特表２００１−５２５０５８号公報
【特許文献４】特開２００７−０１０５６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、動脈硬化の予防マーカーとなり得るマーカー物質を新たに特定し、該マーカー物質を用いて被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（Ｍｓ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５０７０のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の１０種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。なお、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１０】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約４２１０」、「約７９４０」、「約１７４００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約４２１０は概ね４２１０±０．２％、約７９４０は概ね７９４０±０．２％、約１７４００は概ね１７４００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｍｓ１）、（Ｍｓ２）、（Ｍｓ３）、（Ｍｓ４）、（Ｍｓ８）、及び（Ｍｓ１０）の濃度はより低値を示し、（Ｍｓ５）、（Ｍｓ６）、（Ｍｓ７）、及び（Ｍｓ９）の濃度はより高値を示す。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、下記（１）と（２）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（１）マーカー物質（Ｍｓ９）は、ミオグロビン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍｓ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である。
【００１２】
ミオグロビンとアポリポタンパク質Ａ２はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によればマーカー物質（Ｍｓ９）、（Ｍｓ１０）の解析が容易である。
【００１３】
「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１４】
同様の課題を解決するための請求項３に記載の発明は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ａ１）と（Ａ２）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
（Ａ１）ミオグロビン又はその修飾体、
（Ａ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体。
【００１５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ａ１）と（Ａ２）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記（Ａ１）、（Ａ２）に属するマーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。特に、ミオグロビンとアポリポタンパク質Ａ２はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本発明においても、「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
【００１６】
被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中の（Ａ２）に属するマーカー物質の濃度はより低値を示し、（Ａ１）に属するマーカー物質の濃度はより高値を示す。
【００１７】
本発明においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱離も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、前記基準値は、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００１９】
かかる構成により、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
【００２０】
請求項５に記載の発明は、前記動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２１】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。かかる構成により、動物の飼育が容易となり、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウス（以下、「アポＥ欠損マウス」と略記する。）が挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常の飼育でアテロームを形成し、動脈硬化発症モデル動物の標準として各分野で採用されているものである。
【００２２】
請求項６に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２３】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２４】
請求項７に記載の発明は、前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２５】
かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２６】
請求項８に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２７】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００２８】
請求項９に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００２９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００３０】
請求項１０に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法である。
【００３１】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００３２】
請求項１１に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被験物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３３】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の各マーカー物質および上記（Ａ１）、（Ａ２）に属する各マーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の各マーカー物質および上記（Ａ１）、（Ａ２）に属する各マーカー物質は、いずれも動脈硬化の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、動脈硬化の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材の場合は、動脈硬化の改善効果を有する機能性食品又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３４】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３５】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００３６】
請求項１３に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体であることを特徴とする請求項１２に記載の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットである。
【００３７】
かかる構成により、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【００３８】
動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される構成が推奨される（請求項１４）。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によれば、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。
【００４０】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
【００４１】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価用キットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】質量／電荷比が４２０７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が４２３６（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が４３２１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図４】質量／電荷比が４５２８（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図５】質量／電荷比が６３６３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図６】質量／電荷比が７９３５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図７】質量／電荷比が８８５２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図８】質量／電荷比が１２１５７（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図９】質量／電荷比が１７４４１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１０】質量／電荷比が５０６５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１１】マーカー物質（Ｍｓ９）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】マーカー物質（Ｍｓ９）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【図１３】マーカー物質（Ｍｓ１０）の精製過程で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１４】マーカー物質（Ｍｓ１０）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００４４】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｍｓ１）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４２４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４３２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４５３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ５）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ７）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８８５０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２２００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ９）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｍｓ１０）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５０７０のイオンピークを生じるタンパク質。
【００４５】
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、動脈硬化の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ｍｓ１）、（Ｍｓ２）、（Ｍｓ３）、（Ｍｓ４）、（Ｍｓ８）、及び（Ｍｓ１０）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより低値を示す。一方、（Ｍｓ５）、（Ｍｓ６）、（Ｍｓ７）、及び（Ｍｓ９）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、動脈硬化を発症している状態又は動脈硬化の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより高値を示す。
【００４６】
ある条件でのペプチドマッピングやＮ末端アミノ酸配列分析によれば、マーカー物質（Ｍｓ９）はミオグロビン、マーカー物質（Ｍｓ１０）はアポリポタンパク質Ａ２の断片と同定され得る。すなわち、ある実施形態では、下記（１）と（２）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ｍｓ９）は、ミオグロビン又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ｍｓ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である。
【００４７】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の他の様相では、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記（Ａ１）と（Ａ２）のいずれかに属する少なくとも１つのマーカー物質の濃度を基準値と比較し、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ａ１）ミオグロビン又はその修飾体、
（Ａ２）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体。
【００４８】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００４９】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
【００５０】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法では、（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）の各マーカー物質並びに（Ａ１）、（Ａ２）に属する各マーカー物質の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
【００５１】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００５２】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）動脈硬化を発症していない動物又は動脈硬化の発症リスクが低い動物に、普通食又は被験物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）動脈硬化を発症している動物又は動脈硬化の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、（３）動脈硬化を発症している動物又は動脈硬化の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させる群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００５３】
さらに、基準値として、（４）動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。「動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質」の例としては、アゼルニジピン等の降圧剤（カルシウム拮抗薬）、酢酸、発酵乳、紅花種子抽出物が挙げられる。紅花種子抽出物の動脈硬化に対する改善効果等については、例えば、国際公開第０３／０８６４３７号パンフレット、国際公開第２００５／０３４９７５号パンフレットに記載されている。
【００５４】
「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、「動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」としては、動脈硬化の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、アポＥ欠損マウスが挙げられる。アポＥ欠損マウスは通常飼育で動脈硬化を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
【００５５】
なお、アポＥ欠損マウスを通常飼育するといずれ動脈硬化を発症するが、その発症は飼育２０週目ごろから検出可能となることが分かっている（例えば、Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology; 2004; 24; 1006-1014）。よって、飼育２０週目以前、例えば飼育１４週目のアポＥ欠損マウスは、動脈硬化の発症直前段階にあるといえる。本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法で用いるマーカー物質（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）及び（Ａ１）、（Ａ２）のいずれかに属するマーカー物質は、飼育１４週目のアポＥ欠損マウスの体液中に存在し、動脈硬化の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてアポＥ欠損マウスを用いる場合には、例えば、飼育１４週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
【００５６】
一方、高コレステロール食を摂取するとアテローム形成するような動脈硬化自然発症モデル動物を用いることもできる。この場合には、例えば、被験物質とコレステロールとを同時摂取させることにより、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
【００５７】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００５８】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法における被験物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００５９】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００６０】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００６１】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００６２】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００６３】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００６４】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００６５】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００６６】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
【００６７】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００６８】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００６９】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００７０】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００７１】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法によって被験物質を評価し、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００７２】
本発明の動脈硬化改善・予防効果の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。なお本キットは、動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするためのキットとしても使用できる。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００７３】
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
【００７４】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７５】
１．動脈硬化発症モデル動物を使った動物実験
動脈硬化発症モデル動物としてアポＥ欠損マウス（The Jackson Laboratory社）、正常動物としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウス（以下、単に「正常マウス」と略記する。）を採用した。また、与える飼料として通常飼料と、紅花種子抽出物を２％（１０００ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有する通常飼料（以下、単に「紅花種子抽出物含有飼料」と略記する。）を採用した。
【００７６】
マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定した。
第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
第２群：アポＥ欠損マウスを通常飼料で飼育
第３群：アポＥ欠損マウスを紅花種子抽出物含有飼料で飼育
第４群：正常マウスを紅花種子抽出物含有飼料で飼育
すなわち、第１群は動脈硬化を発症しない群、第２群は動脈硬化を発症する群、第３群は動脈硬化の発症が抑制される群、に相当する。第４群は紅花種子抽出物の作用検証用の群である。
【００７７】
６週齢より所定の条件で飼育を開始し、飼育９週（１３週齢）、１４週（２０週齢）の各ポイントで、第１群と第４群は各５匹、第２群と第３群は各７匹のマウスを屠殺した。各マウスから血液を採取し、血漿を調製した。
【００７８】
アポＥ欠損マウスにおいて動脈硬化が発症し始める飼育期間である１４週目（２０週齢）の血漿を動脈硬化の発症直前段階の体液試料とし、以下のプロテオーム解析に供した。
【００７９】
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
各血漿２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
【００８０】
得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）〜（４）の条件を指標として９個の候補ピークを選抜した。
【００８１】
（１）候補ピーク探索（基本）
第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）紅花種子抽出物効果検証
第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
【００８２】
３．マーカー物質（Ｍｓ１）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４２０７（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８３】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７６５
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０１２
【００８４】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４２１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ１））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ１）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４２１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８５】
４．マーカー物質（Ｍｓ２）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４２３６（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８６】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９００
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７６５
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０１５
【００８７】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４２４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ２））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ２）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４２４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８８】
５．マーカー物質（Ｍｓ３）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４３２１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００８９】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７３５
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０１９
【００９０】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４３２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ３））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ３）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４３２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９１】
６．マーカー物質（Ｍｓ４）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が４５２８（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９２】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００９
【００９３】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４５３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ４））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ４）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約４５３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９４】
７．マーカー物質（Ｍｓ５）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が６３６３（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９５】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．９１３
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０００２
【００９６】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６３６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ５））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ５）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約６３６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００９７】
８．マーカー物質（Ｍｓ６）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７９３５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【００９８】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８３７
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０００２
【００９９】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７９４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ６））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ６）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７９４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１００】
９．マーカー物質（Ｍｓ７）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８８５２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図７に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０１】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．８７１
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７４０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０３９
【０１０２】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８８５０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ７））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ７）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８８５０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０３】
１０．マーカー物質（Ｍｓ８）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１２１５７（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０４】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．８７１
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００１
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７８６
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００５
【０１０５】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１２２００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ８））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ８）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１２２００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０６】
１１．マーカー物質（Ｍｓ９）の特定
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７４４１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図９に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１０７】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９２９
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．０００２
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．７６０
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．０１２
【０１０８】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７４００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ９））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ９）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１７４００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１０９】
１２．マーカー物質（Ｍｓ１０）の特定
画分３（ｐＨ３．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５０６５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１０に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。各ＲＯＣ面積と各ｐ値は以下のとおりとなった。
【０１１０】
ＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）：０．９８６
ｐ値（第１群ｖｓ第２群）：０．００００４
ＲＯＣ面積（第２群ｖｓ第３群）：０．８３７
ｐ値（第２群ｖｓ第３群）：０．００２
【０１１１】
以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５０７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ｍｓ１０））が、動脈硬化を発症しているマウス、又は動脈硬化の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、動脈硬化のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた動脈硬化を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ｍｓ１０）の濃度を指標として、被験物質が有する動脈硬化の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５０７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、動脈硬化の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【０１１２】
なお、ヒトの体液中にもマーカー物質（Ｍｓ１）〜（Ｍｓ１０）と同等のタンパク質が存在する場合には、ヒトの体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、動脈硬化の発症の有無、又は将来の発症リスクを診断できる可能性も示唆された。
【実施例２】
【０１１３】
マーカー物質（Ｍｓ９）の精製と同定
【０１１４】
強陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ５．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ５．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した。変性処理したサンプルを１２，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。Ｍｉｌｌｅｘ ＨＶ ０．４５μｍフィルター（ミリポア社）で回収した上清をろ過した後、平衡化した前記カラムに添加し、非吸着画分を回収した。回収画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍｓ９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１５】
強陽イオン交換樹脂Ｈｉ Ｔｒａｐ ＳＰ １ｍＬ（ＧＥヘルスケア社）を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）にて平衡化した。先の回収画分を５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で１０倍希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。２００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）でカラムを洗浄した後、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）で溶出・回収した。回収画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍｓ９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１１６】
回収画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ−５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１０）。図１０中、レーン１〜３は回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１７．４ｋＤａバンド（図１１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍｓ９）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１２の矢印）。
【０１１７】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１７．４ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１８９６．０２」、「１４８３．８３」、「１６１１．９２」、「２０４３．１１」、「１９１５．０２」、「７４８．４４」、「１３６０．７２」、及び「９４１．４６」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１〜８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「ミオグロビン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。既報のマウスミオグロビンのアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【０１１８】
【表１】
2010038898.tif 000003
【実施例３】
【０１１９】
マーカー物質（Ｍｓ１０）の精製と同定
【０１２０】
強陰イオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（バイオラッド社）を充填したスピンカラム（１ｍＬ）を平衡化バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。Ｃ５７ＢＬマウス血清（清水実験材料社）５．５ｍＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清１．２ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー ｐＨ５．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．８ｍＬ加えて変性処理した。変性処理したサンプルをＭｉｌｌｅｘ ＨＶ ０．４５μｍフィルター（ミリポア社）でろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）、１００ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）でカラムを順次洗浄した後、３３．３％イソプロパノール／１６．７％ 
アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡで溶出・回収した。回収画分２．５ｍＬを遠心エバポレーターにかけて有機溶媒を除去した後、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍｓ１０）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２１】
強陽イオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したスピンカラム（８０μＬ）を５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で平衡化した。この平衡化したカラムに、先の回収画分１ｍＬを添加した。５０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを順次洗浄した後、２５ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ１１．０）／３３．３％ イソプロパノール／１６．７％ アセトニトリルで溶出・回収した。回収画分に対してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍｓ１０）の質量／電荷比（平均値：５０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
【０１２２】
回収画分を遠心エバポレーターにかけて有機溶媒を除去し、さらにアセトン沈殿処理した後、ＰＡＧＥ（６Ｍ尿素を含む１６．５％ポリアクリルアミドゲルを使用）に供した（図１３）。図１３中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５．１ｋＤａのバンド（図１３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｍｓ１０）の質量／電荷比（平均値：５０６５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１４の矢印）。
【０１２３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約５．１ｋＤａのバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも４個のピークが検出され、それらの精密質量は「１６５７．７９」、「２８３２．４３」、「１８３１．９７」、及び「１１９３．６９」と算出された。これらのデータを元に実施例２と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１０〜１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
【０１２４】
【表２】
2010038898.tif 000004
【０１２５】
あらためて同様のＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦ膜に転写し、約５．１ｋＤａのバンド部分をＮ末端アミノ酸解析に供した。その結果、配列番号１４で表される１０アミノ酸が決定された。このアミノ酸配列はマウスアポリポタンパク質Ａ２（配列番号１５）の一部と完全一致していた。さらに、配列番号（配列番号１５）のアミノ酸番号２９（Ｖａｌ）〜７３（Ｌｅｕ）の部分に相当するタンパク質断片（４５アミノ酸）の予想される等電点が８．３６、分子量が５０５９であり、これらの値がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果とよく一致した。このことから、マーカー物質（Ｍｓ１０）は「アポリポタンパク質Ａ２の断片」と同定された。当該タンパク質断片に相当する、配列番号（配列番号１５）のアミノ酸番号２９（Ｖａｌ）〜７３（Ｌｅｕ）の部分のアミノ酸配列を配列番号（配列番号１６）に示す。
【図１】
2010038898.tif 000005
【図２】
2010038898.tif 000006
【図３】
2010038898.tif 000007
【図４】
2010038898.tif 000008
【図５】
2010038898.tif 000009
【図６】
2010038898.tif 000010
【図７】
2010038898.tif 000011
【図８】
2010038898.tif 000012
【図９】
2010038898.tif 000013
【図１０】
2010038898.tif 000014
【図１２】
2010038898.tif 000015
【図１４】
2010038898.tif 000016
【図１１】
2010038898.tif 000017
【図１３】
2010038898.tif 000018
【配列表】
2010038898000001.app