(57)【要約】【課題】キチン含有原料から効率的にキチンの結晶化度を低下させた低結晶性キチンを基質として酵素反応を行うことで、キチン分解物を効率的に得ることができる、生産性に優れたキチン分解物の製造方法を提供する。【解決手段】キチンの結晶化度が３５％を超えるキチン含有原料から調製した低結晶性キチンを糖化する方法であって、該キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチンの含有量が１０質量％以上であり、該キチン含有原料の水分含量が０．０１〜２５質量％であり、かつ該キチン含有原料を振動ミル又は媒体撹拌式ミルで粉砕処理して、該キチンの結晶化度を３０％以下に低減した低結晶性キチンを調製した後に、該低結晶性キチンにキチン分解酵素を作用させ糖化する、キチン分解物の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンの結晶化度が３５％を超えるキチン含有原料から調製した低結晶性キチンを糖化する方法であって、該キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチンの含有量が１０質量％以上であり、該キチン含有原料の水分含量が０．０１〜２５質量％であり、かつ該キチン含有原料を振動ミル又は媒体撹拌式ミルで粉砕処理して、該キチンの結晶化度を３０％以下に低減した低結晶性キチンを調製した後に、該低結晶性キチンにキチン分解酵素を作用させ糖化する、キチン分解物の製造方法。
【請求項２】
粉砕処理が、ロッドを充填した振動ミルを用いた処理である、請求項１に記載のキチン分解物の製造方法。
【請求項３】
キチン含有原料の平均粒径が、０.０１〜１ｍｍである請求項１又は２に記載のキチン分解物の製造方法。
【請求項４】
粉砕処理時間が、０.０１〜５０Ｈｒである、請求項１〜３のいずれかに記載のキチン分解物の製造方法。
【請求項５】
キチン含有原料がα−キチンである、請求項１〜４のいずれかに記載のキチン分解物の製造方法。
【請求項６】
キチン分解酵素がキチナーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載のキチン分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチン分解物の製造方法に関し、医療用、化粧品用、健康食品用等の各種分野に応用できるキチン分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチンは、えび、かに等の甲殻類、カブトムシ、コオロギ等の昆虫類、キノコ類、微生物の細胞壁等に含まれ、生物体の骨格や外皮の形成にあずかっている主要有機成分であり、自然界に広くかつ豊富に分布している物質である。
キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのβ−１，４結合よりなる多糖類であって、化学的に極めて安定なため、温和な条件では殆どの試薬とは反応せず、これまでキチンをそのままの形で溶かす適当な溶剤も見出されていなかったので、極めて取り扱いにくいものとされていた。
【０００３】
一方、近年、キチンの加水分解物、例えばキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、キトサンオリゴ糖、グルコサミン等は、医薬、化粧品、肥料、健康食品等としての利用が期待されている。
キチンにキチナーゼ等の酵素を作用させてこれらキチンの加水分解物を製造する際には、その前工程としてキチン結晶構造が低結晶化されたキチンにすることが知られている（例えば、特許文献１、２及び非特許文献１参照）。特許文献１には、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ水溶液を用いて非晶化させたキチンを基質とする、酵素によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法が開示されている。また、特許文献２には、キチン原料を、キチン質の結晶化度として７０％以下になるように微粉砕するキチン原料微粉砕工程と、微粉砕されたキチン原料を加水分解するキチン加水分解工程とを含むキチン分解物の製造方法が開示されている。さらに、非特許文献１には、遊星ボールミルを用いてα−キチンを摩砕処理してアモルファスなキチン微粒子を得る方法が提案されている。
しかし、これらの方法は、キチンの結晶化度を低減させるにあたり、効率性及び生産性において満足できるものではない。
【０００４】
さらに、キチンの糖化方法としては、燐酸や酢酸等の溶剤により膨潤させたキチンを酵素処理する方法（例えば、特許文献３参照）や、粉砕機により微粉末化したキチンを酵素処理する方法（例えば、特許文献４参照）が知られている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
【０００５】
また、キチンを機械的に粉砕処理して、微粒子キチンを得る方法として、例えば、特許文献５には、乾式メディアミルにより粗粉砕したキチン質を、湿式メディアミルで微粒化する方法が開示されている。しかし、特許文献５にはキチンの結晶化度についての記載はなく、多量の水を使用する方法が開示されている。また、特許文献６及び７には、低分子化したキチンを最終的にボールミルあるいはジェットミルで粉砕し、粉末化する方法が開示されている。しかし、特許文献６及び７には粉砕処理するときのキチンに含有される水分含量やキチンの結晶化度についての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−７８７９５号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２０２５号公報
【特許文献３】特開２００７−９７４６６号公報
【特許文献４】特表２０００−５１３９２５号公報
【特許文献５】特開平６−４１３１５号公報
【特許文献６】特開２００６−３４８０９３号公報
【特許文献７】特開２００７−２０９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】大島和浩，「α−キチン構造に及ぼす摩砕処理効果」苫小牧工業高等専門学校紀要，２００５年３月３１日，第４０号，３１−３４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、キチン含有原料からキチンの結晶化度を低下させた低結晶性キチンを基質として、キチン分解酵素による酵素反応を行うことで、キチン分解物を効率的に得ることができる、生産性に優れたキチン分解物の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特定のキチン含有原料を出発原料として、振動ミル又は媒体撹拌式ミルで粉砕処理（非晶化処理）を行った後にキチナーゼ等のキチン分解酵素による酵素反応を行うことにより、前記課題を解決できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、キチンの結晶化度が３５％を超えるキチン含有原料から調製した低結晶性キチンを糖化する方法であって、該キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチンの含有量が１０質量％以上であり、該キチン含有原料の水分含量が０．０１〜２５質量％であり、かつ該キチン含有原料を振動ミル又は媒体撹拌式ミルで粉砕処理して、該キチンの結晶化度を３０％以下に低減した低結晶性キチンを調製した後に、該低結晶性キチンにキチン分解酵素を作用させ糖化する、キチン分解物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のキチン分解物の製造方法は、キチン含有原料からキチンの結晶化度を低下させた低結晶性キチンを効率よく得ることができ、該低結晶性キチンを基質として酵素反応を行うことで、キチン分解物を効率的に生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のキチン分解物の製造方法は、キチンの結晶化度が３５％を超えるキチン含有原料から調製した低結晶性キチンを糖化する方法であって、該キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチンの含有量が１０質量％以上であり、該キチン含有原料の水分含量が０．０１〜２５質量％であり、かつ該キチン含有原料を振動ミル又は媒体撹拌式ミルで粉砕処理して、該キチンの結晶化度を３０％以下に低減した低結晶性キチンを調製した後に、該低結晶性キチンにキチン分解酵素を作用させ糖化する、キチン分解物の製造方法である。なお、本明細書において、上記粉砕処理を、非晶化処理ということがある。
【００１３】
[キチン含有原料]
本発明に用いられるキチン含有原料は、該原料から水を取り除いた残余成分中のキチンの含有量が１０質量％以上、好ましくは１５質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、さらに好ましくは６０質量％以上のものである。
前記キチン含有原料としては、特に制限がなく、本来的にはキチン類含有生物中のキチン類のいずれも本発明に使用することができるが、例えば、かに、えび等の甲殻類の甲殻、微生物の細胞壁、キノコ等を例示することができる。これらの中で、資源が豊富であり、収穫がしやすい等の理由から、かに、えび、シャコ等の甲殻、あるいはイカの甲を好ましく使用することができる。
前記キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチンの含有量は、従来知られている、例えばハックマンの方法あるいはその改良法によってキチンを単離精製することで、算出することが可能である。
市販のキチンの場合、水を取り除いた残余成分中のキチン含有量は、一般には８５〜９９質量％であり、他の成分としてタンパク質、炭酸カルシウム等の無機物等を含む。
【００１４】
また、本発明における非晶化処理に用いるキチン含有原料中の水分含量は、０．０１〜２５質量％であり、０．０１〜２０質量％が好ましく、０．０１〜１５質量％がより好ましく、０．０１〜１０質量％が更に好ましく、０．０１〜７質量％が更に好ましく、０．０１〜５質量％が更に好ましく、０．０１〜３質量％が更に好ましい。キチン含有原料中の水分含量が２５質量％以下であれば、容易に粉砕ができるとともに、後述する粉砕処理により結晶化度を容易に低減化させることができ、その後のキチン分解物の生産を効率よく行うことができる。キチン含有原料中の水分含量が２５質量％を超える場合には、後述する非晶化処理の前に、公知の方法によりキチン含有原料中の水分含量を上記範囲になるように調整することが好ましい。
天然由来のキチン含有原料に含まれるキチンには、α及びβの２種の結晶形が知られている。α−キチンは、かに、えび等の甲殻類の甲殻に多く含有されている。β−キチンは、イカ等の軟体動物の軟骨に多く含有されている。本発明に用いるキチン含有原料に含まれるキチンとしては、生産効率の観点から、α−キチンが好ましい。
【００１５】
[キチンの結晶化度]
本発明において製造される低結晶性キチンは、キチンの結晶化度を３０％以下に低下させたものである。キチンの結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値から算出される。具体的には、非干渉性散乱や格子の乱れ等の影響を考慮しないで、プロファイル・フィッティングの手法を用いて、結晶性回折線と非晶成分によるハロー部分とにピーク分離し、得られた各ピークの積分強度から、下記計算式（１）によりキチンの結晶化度を算出する。
キチン結晶化度（％）＝[ΣＩα／（ΣＩα＋ΣＩａｍ）]×１００      （１）
[ΣＩαは、結晶性回折線の各ピークの積分強度の和、ΣＩａｍは、非晶成分によるハロー（アモルファス部）の回折線の各ピークの積分強度の和である。]
【００１６】
また、「低結晶性」とは、キチンの結晶構造において非結晶部分の割合が多い状態を示し、具体的には上記式（１）から算出されるキチンの結晶化度が３０％以下であることを意味し、該結晶化度が０％の完全非晶化の場合を含む。
キチンの結晶化度が３０％以下であれば、キチンの反応性が向上し、例えば、キチン分解物の製造において、キチン分解酵素を加えた際に酵素糖化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、２０％以下が好ましく、１０％以下がより好ましい。さらに、結晶化度の分析で、キチンの結晶部分が検出されない０％が特に好ましい。なお、キチンの結晶化度は、その値が大きいほど、キチンの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、反応性が低下する。
【００１７】
本発明における粉砕処理（非晶化処理）には、粉砕、非晶化をより効率的に行う観点から、嵩密度が５０ｋｇ／ｍ3以上のキチン含有原料を用いることが好ましい。この嵩密度が５０ｋｇ／ｍ3以上であれば、キチン含有原料が適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、粉砕機への原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。これらの観点から、キチン含有原料の嵩密度は６０ｋｇ／ｍ3以上がより好ましく、７５ｋｇ／ｍ3以上が更に好ましい。一方、キチン含有原料の嵩密度の上限は、取り扱い性及び生産性の観点から、好ましくは５００ｋｇ／ｍ3以下、より好ましくは４００ｋｇ／ｍ3以下である。
また、本発明における粉砕処理（非晶化処理）には、上記と同様の観点から、平均粒径が０．０１〜１ｍｍのキチン含有原料を用いることが好ましい。キチン含有原料の平均粒径は、より好ましくは０．０１〜０．７ｍｍ、更に好ましくは０．０５〜０．５ｍｍである。
【００１８】
[キチン含有原料の前処理]
本発明では、キチン含有原料として、嵩密度が５０ｋｇ／ｍ3未満又は平均粒径が１ｍｍを超えるものを用いる場合、キチン含有原料を前処理することが好ましい。前処理としては、例えば、一般的な粉砕機や押出機等、好ましくは衝撃式の粉砕機や押出機を用いて、キチン含有原料を処理することで、キチン含有原料の嵩密度及び平均粒径を好ましい範囲にすることができる。
前記キチン含有原料を、好ましくは衝撃式の粉砕機や押出機で処理することにより、圧縮せん断力を作用させ、キチンの結晶構造を破壊して、キチンの含有原料を粉末化させ、所望の平均粒径及び嵩密度を有する粉砕原料が得られ、後述する粉砕処理における取扱い性を向上させることができる。
【００１９】
圧縮せん断力を作用させて機械的に粉砕する、衝撃式の粉砕機（あるいは破砕機）としては、例えば、ハンマーミル（株式会社ダルトン製）、自由型粉砕機ピンミル（株式会社奈良機械製作所製）、フィッツミル（株式会社ダルトン製）、パワーミル（パウレック株式会社製）、コーミル〔クアドロ（Ｑｕａｄｏｒｏ）社製〕、カッターミル等が挙げられる。
【００２０】
押出機としては、単軸、二軸のどちらの形式でもよいが、搬送能力を高める等の観点から、二軸押出機が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に２本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。２本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
【００２１】
押出機としては、強い圧縮せん断力を加える観点から、スクリューのいずれかの部分に、いわゆるニーディングディスク部を備えることが好ましい。ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスク、例えば３〜２０枚、好ましくは６〜１６枚のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば９０°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にキチン含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリュエレメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、２本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
【００２２】
前処理の方法としては、前記キチン含有原料を衝撃式の粉砕機又は押出機に投入し、連続的に処理する方法が好ましい。せん断速度としては、１０ｓｅｃ-1以上が好ましく、２０〜３００００ｓｅｃ-1がより好ましく、５０〜３０００ｓｅｃ-1が更に好ましく、５００〜３０００ｓｅｃ-1が更に好ましい。その他の処理条件としては、特に制限はなく、処理温度が好ましくは５〜２００℃である。
また、押出機によるパス回数としては、１パスでも十分効果を得ることができるが、キチンの嵩密度及び平均粒径を低下させる観点から、１パスで不十分な場合は、２パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、１〜１０パスが好ましい。パスを繰返すことにより粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状のキチン含有原料を得ることができる。２パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
【００２３】
[粉砕処理（非晶化処理）]
本発明では、粉砕機として振動ミル又は媒体撹拌式ミルを用いて、キチン含有原料を粉砕処理することにより、該原料中のキチンの結晶化度を効率的に低減させる。
本発明で用いられる振動ミルとしては、中央化工機株式会社製の振動ミル、ユーラステクノ株式会社製のバイブロミル、株式会社吉田製作所製の小型振動ロッドミル１０４５型、ドイツのフリッチュ社製の振動カップミルＰ−９型、日陶科学株式会社製の小型振動ミルＮＢ−Ｏ型等を用いることができる。媒体としてロッド又はボールを振動ミルに充填することが好ましい。
【００２４】
一方、媒体撹拌式ミルとしては、タワーミル等の塔型粉砕機；アトライター、アクアマイザー、サンドグラインダー等の撹拌槽型粉砕機；ビスコミル、パールミル等の流通槽型粉砕機；流通管型粉砕機；コボールミル等のアニュラー型粉砕機；連続式のダイナミック型粉砕機等が挙げられる。この中で、粉砕効率が高く、生産性の観点から、撹拌槽型粉砕機が好ましい。
粉砕機の種類は「化学工学の進歩  第３０集  微粒子制御」（社団法人  化学工学会東海支部編、１９９６年１０月１０日発行、槇書店）を参照することができる。
振動ミル又は媒体撹拌式ミルの処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでも良い。
【００２５】
粉砕機に充填する媒体の形状としては、ロッド又はボールが好ましい。
媒体の材質としては、特に制限がなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、窒化珪素、ガラス等が挙げられる。
ロッドとは、棒状の媒体であり、ロッドの断面が四角形、六角形等の多角形、円形、楕円形等のものを用いることができる。
本発明における粉砕処理としては、キチンの結晶化度を効率よく低下させる観点から、ロッドを充填した振動ミルを用いて処理することが好ましい。
【００２６】
振動ミル又は媒体撹拌式ミル処理において、媒体がロッドの場合には、ロッドの外径としては、好もしくは０．５〜２００ｍｍ、より好ましくは１〜１００ｍｍ、更に好ましくは５〜５０ｍｍの範囲である。ロッドの長さとしては、粉砕機の容器の長さよりも短いものであれば特に限定されない。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ロッドのかけら等が混入してキチン含有原料が汚染されることなく効率的にキチンを非晶化させることができる。
【００２７】
ロッドの充填率は、粉砕機の機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、キチンとロッドとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで、充填率とは、粉砕機の容積に対するロッドのみかけの体積をいう。
【００２８】
振動ミル又は媒体撹拌式ミル処理において、媒体がボールである場合には、ボールの外径としては、好ましくは０．１〜１００ｍｍ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍの範囲である。ボールの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ボールのかけら等が混入してキチン含有原料が汚染されることなく効率的にキチンを非晶化させることができる。
ボールの充填率は、粉砕機の機種により好適な充填率が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、キチン含有原料を効率よく非晶化することができる。
媒体撹拌式ミルを用いる場合の撹拌翼の先端の周速は、好ましくは０．５〜２０ｍ／ｓ、より好ましくは１〜１５ｍ／ｓである。
【００２９】
振動ミル又は媒体撹拌式ミルの処理時間としては、粉砕機の種類、媒体の種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、キチンの結晶化度を効率よく低下させる観点から、好ましくは０．０１〜５０Ｈｒ、より好ましくは０．０５〜２０Ｈｒ、更に好ましくは０．１〜１０Ｈｒ、更に好ましくは０．１〜５Ｈｒである。処理温度は特に制限がないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
【００３０】
上記の処理方法により、前記キチン含有原料からキチンの結晶化度が３０％以下の非晶化キチンを効率よく得ることができ、粉砕機内部に粉砕物が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる低結晶キチンの平均粒径は、この低結晶性キチンを工業原料として用いる際の反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、低結晶性キチンを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
【００３１】
［キチン分解酵素による糖化］
上述した処理にて得られた低結晶性キチンは、その結晶化度が低いためにキチン分解酵素による酵素処理により、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びキチンオリゴ糖等のキチン分解物が得られ、効率よく目的とするキチン分解物の混合物を得ることができる。ここでいうキチンオリゴ糖とは、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、トリ−Ｎ−アセチルキトトリオース、テトラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサオース等といったキチン分解物を指す。
キチン分解酵素としては、キチナーゼ、キトビアーゼ（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）及びリゾチーム等が挙げられる。中でも、効率よくキチン分解物を得る観点から、キチナーゼが好ましい。ここでいうキチン分解酵素とは、キチンのβ−１,４−グリコシド結合を加水分解等により切断する酵素を指す。また、ここでいうキチナーゼとは、エンドキチナーゼ、エクソキチナーゼ、キトサナーゼ、及びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等と称される酵素の総称である。
【００３２】
かかる糖化の処理に使用されるキチン分解酵素としては特に制限はなく、市販のキチン分解酵素、動物、植物、微生物由来のものを使用することができる。キチナーゼの例としては、フルカ社等のストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus）、和光純薬工業株式会社等のバチルス  エスピー（Bacillus sp.）、シグマ社等のセラチア  マルセセンス（Serratia marcescens）由来の市販キチナーゼやバチルス  エスピー（Bacillus sp.）Ｔ−４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４５２）等の株由来のキチナーゼ、更には、バチルス  サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス  リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、ビブリオ  アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）、バークホルデリア  グラディオリ（Burkholderia gladioli）、クロストリジウム  サーモセラム(Clostridium thermocellum)、ストレプトマイセス  コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、アスペルギルス  フミガタス（Aspergillus fumigatus）、ヒポクレア  リクシイ（Hypocrea lixii）由来のキチナーゼ混合物やパイロコッカス  フリオシス（Pyrococcus furiosus）由来の耐熱性キチナーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus）由来のキチナーゼ、例えばキチナーゼ（フルカ社）を用いることにより、効率良くキチン分解物を製造することができる。
またこれらの酵素に対してキトビアーゼ等の他のキチン分解酵素を更に添加することによってキチン分解物の製造効率を向上させることもできる。添加するキトビアーゼの例としては、ペニシリウム  オキサリカム（Penicillium oxalicum）由来の酵素（例えば、生化学バイオビジネス株式会社）やセルロモナス  フィミ（Cellulomonas fimi）由来の酵素等が挙げられる。
【００３３】
上述した処理により得られた低結晶性キチンをキチン分解酵素による酵素処理で糖化する場合の反応条件について、上述したキチン含有原料の粉砕処理により得られた低結晶性キチンの結晶化度や使用する酵素により適宜選択することができる。例えば、キチン分解酵素としてフルカ社製のキチナーゼを使用し、試薬キチン由来の結晶化度０％のキチンを基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対して、フルカ社製キチナーゼを０．００１〜１５％（ｗ／ｖ）（タンパク質として０．００３４〜５.２％相当）となる様に添加し、ｐＨ２〜１０（用いる酵素の種類により適当なｐＨを選ぶことが好ましく、フルカ社製キチナーゼを用いる場合、好ましくはｐＨ３〜７、特に好ましくはｐＨ５付近）の緩衝液中、反応温度１０〜９０℃（用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、フルカ社製キチナーゼを用いる場合、好ましくは２０〜７０℃、特に好ましくは約５０℃）で、反応時間０．５〜１０日間、好ましくは０．５〜７日間反応させることによりキチン分解物を製造することができる。
【実施例】
【００３４】
キチン含有原料及び低結晶性キチンの嵩密度、平均粒径、結晶化度、キチン含有原料の水分含量、及びキチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチン含有量の測定は、下記に記載の方法で行った。また、低結晶性キチン等の各種キチンの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
【００３５】
（１）嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、サンプルを規定の容器（容量１００ｍＬ）に投入し、該容器中のサンプルの質量を測定することにより算出した。
（２）平均粒径の測定
平均粒径は、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ−９２０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定条件は、試料測定前に超音波で1分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、体積基準のメジアン径を、温度２５℃にて測定した。
【００３６】
（３）結晶化度の算出
キチンの結晶化度は、サンプルのＸ線回折強度を、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、前記計算式に基づいて算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Cu／Kα−radiation,管電圧：４０ｋＶ,管電流：１２０ｍＡ,測定範囲：回折角：５〜４５°で測定した。測定用サンプルは、面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
（４）水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、「ＦＤ−６１０」）を使用し、１５０℃にて測定を行った。
（５）キチン含有量の測定
キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチン含有量は、キチンを塩酸加水分解し、その加水分解物中のＤ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）の量をアミノ酸自動分析機で測定し、キチン含有量を算出した。
【００３７】
（６）糖化反応
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の低結晶性キチン等の各種キチン基質を３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、蓋つきスクリュー管（Ｎｏ．５、φ２７×５５ｍｍ  株式会社マルエム）に懸濁し、適量のキチン分解酵素を加えて５０℃で振とう攪拌（１５０ｒｐｍ、タイテック株式会社製恒温振とう機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら、所定の時間で反応させた。反応終了後、遠心分離（１７，０００×ｇ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を以下に示すＤＮＳ法及びＨＰＬＣ法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
【００３８】
（７）ＤＮＳ法（生物化学実験法  還元糖の定量法  学会出版センター）による糖の定量
ＤＮＳ溶液（０．５質量％ ３，５−ジニトロサリチル酸、３０質量％酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６質量％水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとは発色の程度が異なるため、以下のＨＰＬＣ法等とは異なる値が得られる場合もある。
【００３９】
（８）ＨＰＬＣ法による糖の定量
株式会社日立ハイテクノロジーズ社製のＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅクロマトグラフィーシステム；カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（Ｓｈｏｄｅｘ社  ４．６×２５０ｍｍ）、検出器：Ｌ-２４９０形ＲＩ検出器、溶離液：７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を用い、流速１ｍＬ／分でアイソクラティックにより糖を分析した。標準として１％（ｗ／ｖ）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（和光純薬工業株式会社製）、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
（９）タンパク質の定量
ＤＣプロテインアッセイキット（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
【００４０】
製造例１
キチン含有原料として、キチン（和光純薬工業株式会社製試薬、キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチン含有量９２．３質量％、キチン中の水分含量２．３質量％、キチンの結晶化度４４％、平均粒径１６５μｍ、嵩密度１０７ｋｇ／ｍ3）８０ｇを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５Ｌ）に投入し、ロッド（断面形状：円形、直径：３０ｍｍ、長さ：２１８ｍｍ、材質：ステンレス）１１本を振動ミルに充填（充填率５０％）して、振幅８ｍｍ、回転数１２００ｃｐｍの条件で１時間処理を行った。得られた低結晶性キチンの結晶化度は０％、平均粒径は４８μｍであり、その温度は、粉砕処理に伴う発熱により４０℃であった。粉砕処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にキチンの固着物等はみられなかった。結果を表１に示す。
【００４１】
製造例２〜５
表１に示すキチン含有原料を用いて、振動ミルの処理時間を表１に示す時間としたこと以外は、製造例１と同様に操作して低結晶性キチンを得た。結果を表１に示す。
【００４２】
製造例６
表１に示すキチン含有原料を用い、粉砕機及び媒体の種類を、バッチ式媒体撹拌式ミル（「サンドグラインダー」：容器容積８００ｍＬ、５ｍｍφジルコニアボールを７２０ｇ充填、充填率２５％、撹拌翼径７０ｍｍ）に変えて、処理条件を撹拌回転数２０００ｒｐｍ、撹拌速度７．３ｍ／ｓとし、処理時間を４時間としたこと以外は、製造例１と同様に操作して低結晶性キチンを得た。得られた低結晶性キチンの温度は、処理に伴う発熱により３０〜７０℃であった。粉砕処理終了後、媒体撹拌式ミル内の壁面や底部にキチンの固着物等はみられなかった。結果を表１に示す。
【００４３】
製造例７〜８
キチン含有原料として、かに殻（三陸フィッシュミール株式会社製、キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチン含有量１８．１質量％、かに殻中の水分含量８．９質量％、最大２０ｍｍ×２０ｍｍ×１．５ｍｍのチップ状、嵩密度３１３ｋｇ／ｍ3）８０ｇをカッターミル（株式会社ダルトン製、「Ｐ−０２Ｓ型」）に投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．３時間処理した。
次に、カッターミル処理して得られたキチン含有原料（キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチン含有量１８．１質量％、かに殻中の水分含量８．９質量％、キチンの結晶化度５０％、平均粒径２１２μｍ、嵩密度３８７ｋｇ／ｍ3）を用いて、媒体撹拌式ミルの処理時間を表１に示す時間に変えたこと以外は、製造例６と同様に操作して低結晶性キチンを得た。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2010193858.tif 000002
【００４５】
比較製造例１
製造例３で使用したキチン含有原料のキチンの結晶化度及び平均粒径を表２に示す。
【００４６】
比較製造例２及び４
表２に示すキチン含有原料８０ｇをカッターミル（株式会社ダルトン製、「Ｐ−０２Ｓ型」）に投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．３時間処理した。その結果、低結晶性キチンではなく結晶性キチンが得られた。その温度は、処理に伴う発熱により３５℃であった。結果を表２に示す。
【００４７】
比較製造例３
キチン（和光純薬工業株式会社製試薬、キチン含有原料から水を除いた残余成分中のキチン含有量９２．３質量％）８０ｇをカッターミル（株式会社ダルトン製、「Ｐ−０２Ｓ型」）に投入し、回転数３０００ｒｐｍの条件で０．３時間処理した。
次に、カッターミル処理して得られたキチン（水分含量２８．２質量％、平均粒径２２６μｍ、嵩密度１３４ｋｇ／ｍ3）８０ｇを振動ミルに投入し、処理時間を４時間としたこと以外は、製造例１と同様に操作した。その結果、低結晶性キチンではなく結晶性キチンが得られた。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2010193858.tif 000003
【００４９】
実施例１及び２と比較例１
実施例１及び２として、製造例３及び４におけるロッドを充填した振動ミル処理によって調製した低結晶性キチン（実施例１；結晶化度０％、平均粒径５９μｍ、実施例２；結晶化度１７％、平均粒径６１μｍ）、ならびに比較例１として、比較製造例１における結晶性キチン（結晶化度３７％、平均粒径１５５μｍ）のキチナーゼ酵素標品（キチナーゼ、フルカ社製）による糖化反応を行った。低結晶性キチンまたは結晶性キチン０．０３ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）キチナーゼ（タンパク質０．０３４％相当））に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、４８時間、１０４時間及び１４７時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン換算）した。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
2010193858.tif 000004
【００５１】
実施例３
実施例１で得られた糖化液上清（反応１４７時間）を、株式会社日立ハイテクノロジーズ社製のＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅクロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ〔ショウデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）社  ４．６×２５０ｍｍ〕、検出器：Ｌ-２４９０形ＲＩ検出器、溶離液：７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を用い、流速１ｍＬ／分でアイソクラティックにより糖を分析した。標準として１％（ｗ／ｖ）のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（和光純薬工業株式会社製）、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは保持時間約４．７分、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースは約５．４分にピークが現われた。糖化液上清は２倍希釈し、２０μＬを注入した。結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
2010193858.tif 000005
【００５３】
実施例４及び比較例２
実施例４として、製造例６におけるボールを充填した媒体攪拌式ミル処理によって調製した低結晶性キチン（結晶化度０％、平均粒径２８μｍ）、ならびに比較例２として、比較製造例１における結晶性キチン（結晶化度３７％、平均粒径１５５μｍ）のキチナーゼ酵素標品（キチナーゼ、フルカ社製）による糖化反応を行った。低結晶性キチンまたは結晶性キチン０．０３ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）キチナーゼ（タンパク質０．０３４％相当））に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間３時間、６時間、２４時間、３２時間、４８時間及び１４８時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン換算）した。結果を表５に示す。
【００５４】
【表５】
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【００５５】
実施例５及び６と比較例３
実施例５及び６として、製造例７及び８におけるキチン含有原料としてかに殻を用い、ボールを充填した媒体攪拌式ミル処理によって調製した低結晶性キチン（実施例５；結晶化度０％、平均粒径１１μｍ、実施例６；結晶化度０％、平均粒径１０μｍ）、ならびに比較例３として、比較製造例４におけるキチン含有原料としてかに殻を用い、カッターミル処理によって調製した結晶性キチン（結晶化度５０％、平均粒径２１２μｍ）のキチナーゼ酵素標品（キチナーゼ、フルカ社製）による糖化反応を行った。低結晶性キチンまたは結晶性キチン０．０３ｇを３ｍＬの酵素反応液（１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）キチナーゼ（タンパク質０．０３４％相当））に懸濁し、５０℃で振とう攪拌しながら反応時間６時間、２４時間、７２時間及び１６８時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法によって定量（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン換算）した。結果を表６に示す。
【００５６】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のキチン分解物の製造方法は、生産性に優れ、キチン分解物を効率的に得ることができる。得られたキチン分解物は医療、化粧品、健康食品等の各種分野において有用である。