(57)【要約】【課題】既知の腫瘍マーカーであるＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ−IIの測定値を特徴値とする識別関数によって肝臓癌および慢性肝疾患の病態進行度の検出手段の提供。【解決手段】既知の腫瘍マーカーであるＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ−IIの測定値を特徴値とする識別関数によって、肝臓癌、特に小あるいは最小肝臓癌を高感度かつ高特異度で、しかも簡便かつ正確に検出することが可能であることを見出し、また肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度の検出が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
AFP（alpha-fetoprotein）及びPIVKA-II（Protein induced by Vitamin K absence or antagonist-II）を用いた肝臓癌検出法であって、下記の（ａ）から（ｅ）の工程を包含し、該測定値を特徴値とする識別関数によって得られた識別関数値が、該患者において肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示す、方法。
（ａ）医学的所見により病態分類された患者試料中のAFP及びPIVKA-IIを測定する工程、
（ｂ）AFP及びPIVKA-IIの測定値を特徴値として、肝臓癌の有無を検出するために、統計的パターン認識により識別関数を設計する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で設計した識別関数から、上記（ａ）記載の該患者において肝臓癌を患っていることを示す識別関数値を算出する工程、
（ｄ）上記（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中のAFP及びPIVKA-IIを測定する工程、
（ｅ）上記（ｂ）で設計した識別関数に上記（ｄ）記載の該患者におけるAFP及びPIVKA-IIの測定値を代入して識別関数値を算出し、該識別関数値が負の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていると判定し、また、該識別関数値が0あるいは正の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていないと判定する工程。
【請求項２】
前記工程（ｂ）が、フィッシャー線形識別関数のカットオフ値を変化させて、前記工程（ａ）の該患者群における最適な感度および特異度を示すカットオフ値を得る（カットオフ値を最適化する）工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）の特徴値を対数変換、または、べき乗変換して正規化し、該変換値を特徴値として、肝臓癌の有無を検出するために、統計的パターン認識により識別関数を設計した後、前記工程（ｅ）の特徴値を対数変換、または、べき乗変換して正規化し、該変換値を上記識別関数に代入して識別関数値を算出し、該識別関数値より該患者が肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
肝臓癌が小あるいは最小肝臓癌であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
試料がヒト血清、血漿、全血液、組織、血球細胞、排泄物、内・外分泌液の何れかに由来するものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
下記の識別関数を用いて識別関数値を算出することを特徴とする請求項１から請求項５記載の方法；
（式Ｉ）Ｄ＝−1.144 × AFP − 1.960 × PIVKA-II ＋ 151.545
（式II）Ｄ＝−1170.579 × AFP ＋ 6.861 × PIVKA-II ＋ 17342.832
（式III）Ｄ＝−45.954 × AFP −0.256 × PIVKA-II ＋ 1687.103
（式IV）Ｄ＝−743734.876 × AFP0.05 ＋ 24677.050 × PIVKA-II0.05 ＋ 814071.668
（式Ｖ）Ｄ＝−103044.554 × AFP0.15 − 21713.517 × PIVKA-II0.15 ＋ 199366.535
（式VI）Ｄ＝−23485.069 × AFP0.25 − 8727.211 × PIVKA-II0.25 ＋ 69816.070
（式VII）Ｄ＝−1817110.433 × AFP0.05 ＋ 160884.976 × PIVKA-II0.05 ＋ 1881877.418
（式VIII）Ｄ＝−456892.175 × AFP0.15 ＋ 14493.378 × PIVKA-II0.15 ＋ 660012.847
（式IX）Ｄ＝−193207.018 × AFP0.25 ＋ 3116.406 × PIVKA-II0.25 ＋ 372629.501
（式Ｘ）Ｄ＝−1334801.628 × AFP0.05 ＋ 157824.415 × PIVKA-II0.05 ＋ 1335806.678
（式ＸＩ）Ｄ＝−250689.564 × AFP0.15 ＋ 14282.959 × PIVKA-II0.15 ＋ 351191.238
（式ＸII）Ｄ＝−79694.207 × AFP0.25 ＋ 236.572 × PIVKA-II0.25 ＋ 157425.794
（Ｄ＜0のとき「肝臓癌あり」と判定し、Ｄ≧0のとき「肝臓癌なし」と判定する。）
【請求項７】
以下のものを含む請求項１〜５の何れかに記載の方法のために使用されるキット：
（ｉ）請求項１および２、または請求項１，２および３、または請求項６に記載の識別関数に特徴値を代入して肝臓癌の有無を検出するためのソフトウェアを記録した電子媒体、
（ii）AFPおよびPIVKA-IIを測定するための試薬。
【請求項８】
以下のものを含む請求項１から５の何れかに記載の方法のために使用される解析システム：
（ｉ）請求項１および２、または請求項１，２および３、または請求項６に記載の識別関数に特徴値を代入して肝臓癌の有無を検出するためのソフトウェアを組み込んだ装置、
（ii）AFPおよびPIVKA-IIを測定するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、肝臓癌、特に従来法（従来の腫瘍マーカーの免疫測定検査およびエコー検査）では検出することが困難であった小あるいは最小肝臓癌（小肝臓癌：直径3cm以下、最小肝臓癌：直径2cm以下の肝臓癌）をも高感度かつ高特異度で検出可能とする、既知の腫瘍マーカーであるAFP(alpha-fetoprotein)及びPIVKA-II(Protein induced by Vitamin K absence or antagonist-II)の測定値を特徴値とした識別関数を利用する肝臓癌検出方法を見出し、それに用いるキット、判定システムを提供することである。さらには、この方法を利用して、肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度の検出を実現可能とし、その方法、それに用いるキットおよび判定システムも提供することである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓癌は慢性肝疾患（慢性肝炎、肝硬変）から発症するが、その多くは肝炎ウイルス持続感染による慢性肝疾患から発症する。日本の場合、肝臓癌の95％以上がＢ型肝炎ウイルス(HBV：Hepatitis B virus)ならびにＣ型肝炎ウイルス（HCV：Hepatitis C virus）の持続感染者で、特にその80％以上がHCV関連疾患由来のものであるとされている。一般的に肝炎患者は肝炎発症後20〜30年かけて段階的に重症化して肝硬変まで進行した後に肝臓癌を発症する。特に前肝硬変段階（繊維化度F3）や肝硬変（繊維化度F4）からは高率に発症し、これらの患者は10年以内に肝臓癌を発症すると言われている。
【０００３】
発症年齢は60歳以上と高年齢層が多くなっているが、肝炎発症後、比較的早期の段階や低年齢層で発症する例も認められるが、その原因は分かっていない。従来、肝臓癌の検出には、肝臓癌発症の高危険群である慢性肝疾患患者を対象とした、既存腫瘍マーカーであるAFPやPIVKA-IIの免疫測定検査によるスクリーニングやエコー検査（超音波検査）による定期的なモニタリングが行われてきた。さらに、AFP分子上の糖鎖の癌性変化をレクチンとの親和性を利用して検出するAFP-L3分画によるスクリーニング検査も合わせて行われてきた。
【０００４】
これらの検査によって肝臓癌を有することを疑われた患者はさらに詳細にエコー検査、ＣＴ検査（Computed Tomography：コンピュータ断層診断装置）あるいはＭＲＩ検査（Magnetic Resonance Imaging：磁気共鳴画像診断装置）といった画像診断で肝臓癌の発症箇所、大きさ、数などが確認される。さらに必要に応じて組織診断生検（バイオプシー）による病理学的検査で最終的な確定診断がなされる。確定診断された肝臓癌は肝切除、肝動脈塞栓術(カテーテル)、穿刺療法（エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法、マイクロウエーブ凝固療法）等の治療を受ける。しかしながら治療をしてもウイルスが除去されて肝疾患が治癒するわけではないので肝臓癌の再発率は極めて高い状況である。
【０００５】
現在利用されているエコー検査や免疫測定検査により肝臓癌が小あるいは最小肝臓癌の段階で発見され、適切な治療がなされれば比較的予後は良い。エコー検査では最近の機器性能向上により小あるいは最小肝臓癌の段階で肝臓癌を発見することが可能となったが、1回の検査に30分程度の時間を費やす、技術的熟練性を必要とする、機器性能に依存する、一般病院への普及率が低い等の問題があり、肝臓癌発症高危険患者を対象としたスクリーニング検査には適していない。また肝臓全体、特に他の臓器等で隠れた部分や肝臓内部までを完全に調べることは困難なため、肝臓癌を見落とす危険性があった。
【０００６】
AFPは、胎生期には肝臓および卵黄嚢で産生され、種々の物質の結合蛋白として母体と胎児間の物質の移送に関係し、また免疫抑制作用も持つと考えられている。一方、PIVKA-IIは凝固因子プロトロンビンの前駆体で、ビタミンKの欠乏や、肝障害によりビタミンKが不足すると血液中に出現することが知られている。上記２種類の腫瘍マーカーは何れも既に単離・精製・構造決定され、肝臓癌になると血液中に増加することが知られていることから、肝臓癌のスクリーニング検査に用いられている。ここで、これら腫瘍マーカーに要求される性能としては、肝臓癌、特に小あるいは最小肝臓癌における検出感度が高いこと、また、定期的スクリーニング検査の効率を考えると特異度が高いことも要求される。
【０００７】
肝臓癌発症の高危険群である慢性肝疾患患者を対象とした、AFP、AFP-L3やPIVKA-IIの免疫測定検査によるスクリーニング検査においては、他のスクリーニング検査同様、病理学的検査で最終的な確定診断がなされる癌、非癌疾患の鑑別点に基づき、カットオフ値を設定している。AFP、AFP-L3あるいはPIVKA-IIの測定値がカットオフ値以上の値を示すとき、肝臓癌である可能性が強く疑われる。社団法人日本肝臓学会の科学的根拠に基づく肝癌診療ガイドライン作成に関する研究班が作成した『肝癌診療ガイドライン（2005年）』によると、当該カットオフ値としては、AFP：200 ng/ml、AFP-L3：15％、PIVKA-II：40 mAU/mlが最適との報告がある。
【０００８】
しかしながら、この方法では、検出感度や特異度が不十分であり、特に小あるいは最小肝臓癌に至っては著しく検出感度が低いという問題があった（非特許文献１および非特許文献２および非特許文献３および非特許文献４参照）。具体的に、例えば、小肝臓癌である3 cm以下の肝臓癌に対するAFP、AFP-L3あるいはPIVKA-IIの検出感度は、それぞれ、30％以下であった（非特許文献１および非特許文献２および非特許文献３および非特許文献４参照）。
【０００９】
これに対して、癌、非癌疾患の鑑別点で、AFPとPIVKA-II、あるいは、AFP-L3とPIVKA-IIの測定値を組み合わせて判定することによって、肝臓癌を検出する方法が提案されている（非特許文献１、５、６参照）。この組み合わせて判定する方法も前記単独算定の方法と同様に、各腫瘍マーカーのカットオフ値に基づいた癌、非癌疾患の判別法であるが、この方法では、肝臓癌検出の特異度の低下を最小限に抑えながら、前記単独算定法に比べて、肝臓癌の検出感度を30％程度向上できることを報告している（非特許文献１、５、６参照）。
【００１０】
しかしながら、この方法でも、小あるいは最小肝臓癌を発見することは依然として困難であり、検出感度や特異度は十分ではない。さらに、各腫瘍マーカーに対して設定されているカットオフ値自体が、報告者によって異なるため、普遍的ではなく、スクリーニング検査としては実用的ではない。加えて、その法則（カットオフ値）が同じ疾患で全く別の母集団についても適用できるか否かについての十分な検証はなされておらず、論文記載の感度・特異度は当該論文の範囲でのみ成立する結果である可能性を否定できない。
【００１１】
一方、癌・非癌疾患の判別や病態を精度良く解析できる方法として、多変量解析を利用する方法が開示されている（特許文献１−３、非特許文献７参照）。多変量解析は、２群以上の母集団から抽出した標本データを得て、どの母集団に属するか不明の試料データがある場合に、この試料データがどの母集団に属するか調べる解析法であり、遺伝子の発現レベルや蛋白質の血中濃度などに関する多変量データ（x1、x2、・・・xn）を特徴値として用いる。例えば、Ｃ型肝炎患者の病態（線維化度）を判別するために、Ｃ型肝炎患者の血液検査データの中から、肝炎の病態を識別するために有効である特徴（検査項目）を特徴選択アルゴリズムＳＦＦＳ（Sequential Forward Floating Search）により抽出し、それらを用いてサポートベクターマシンにより病態を判別する方法が開示されている（特許文献１及び非特許文献７参照）。
【００１２】
また、DNAマイクロアレイ法により大腸癌原発巣組織に特異的に発現する遺伝子群の発現パターンを得て、多変量解析により大腸癌の病態を分類する方法が開示されている（特許文献２）。さらに、被験者の肝臓組織中のinsulin-like growth factor-binding protein 5(IGFBP5)、Claudin4(CLDN4)、PDZ and LIM domain 7(PDLIM7)およびBiglycan(BGN)遺伝子の発現量を得て、多変量解析により肝内胆管癌の検出、肝内胆管癌と肝細胞癌および転移性肝臓癌との分類を行う方法が開示されている（特許文献３）。
【００１３】
しかしながら、これら開示された多変量解析を利用する方法では、下記に示すいずれかの理由により、医療産業において利用するには十分に満足できる方法とは言えない。(1)肝臓癌、特に、小あるいは最小肝臓癌を高感度かつ高特異度で検出できる方法や、肝臓癌発症の高危険群である慢性肝炎患者および肝硬変患者の病態進行度を精度良く検出する方法を提供するものではない。(2)開示された法則（多変量解析）が全く新たな臨床例についても適用できるかどうかについての検証がなされておらず、当該文献・公開特許公報の範囲でのみ成立する結果である可能性を否定できない。(3)組織検体からのRNA抽出工程が複雑で時間がかかりハイスループット化が困難、汗や埃などに含まれるRNA分解酵素によって容易にRNAが分解してしまう欠点など、定期的なスクリーニング検査には適さない。
【００１４】
このように肝臓癌、特に小あるいは最小肝臓癌を検出する方法として既存の検査法では満足のいくものはなかった。さらに、肝臓癌発症の高発症危険群である前癌病変の検出に至っては検査法が全く確立されていない状況であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開2006−153582
【特許文献２】特開2006−271385
【特許文献３】特開2008−72952
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Nomura F et al., Am J Gastroenterol 94:650-4, 1999
【非特許文献２】Martinez Cerezo FJ et al., Rev Esp Enferm Dig 84:311-4, 1993
【非特許文献３】He YM et al., Hepatobiliary Pancreat Dis Int 4:50-4, 2005
【非特許文献４】Han SL et al., Hepatogastroenterology 52:348-51, 2005
【非特許文献５】Ishii M et al., AM J GASTROENTEROL 95: 1036-40, 2000
【非特許文献６】Ikoma J et al., Hepatogastroenterology 49: 235-8, 2002
【非特許文献７】Jiang Z et al., J Med Syst 30:389-94, 2006
【非特許文献８】Iizuka N et al., Lancet 361:923-929, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、肝臓癌高発症危険患者を対象とした従来の腫瘍マーカーの免疫測定検査およびエコー検査による肝臓癌のスクリーニングあるいはモニタリングを行う上での問題点を解決し、特に従来法では検出することが困難であった小あるいは最小肝臓癌をも高感度かつ高特異度で検出可能とする、既知の腫瘍マーカーであるAFPおよびPIVKA-IIの測定値を特徴値として、フィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程を含む統計的パターン認識により設計される識別関数によって肝臓癌検出方法を提供し、それに用いるキット、判定システムを提供することである。さらには、この方法を利用して、肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度の検出を実現可能とし、その方法およびそれに用いるキット、判定システムも提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは上記の課題に鑑み、既知の腫瘍マーカーであるＡＦＰおよびPIVKA-IIの測定値を特徴値として、フィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程を含む統計的パターン認識により識別関数を設計し、前記測定値を当該識別関数に代入してすることにより識別関数値を算出し、肝臓癌、特に小あるいは最小肝臓癌を高感度かつ高特異度で、しかも簡便かつ正確に検出することが可能であることを見出し、また肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度の検出が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
高感度かつ高特異度での診断（検出）を達成するためには、一般的に、診断性能を向上させる目的で大量の患者試料を解析する必要がある。しかしながら、実際には、患者試料数は限られており、十分な数の患者試料を確保できないまま解析が行なわれているのが現状である。この患者試料数の少なさに起因する診断性能の劣化を軽減できる解析方法として、フィッシャー線形識別関数（標準フィッシャー線形識別関数）が用いられており、少数の患者試料での解析で有効な結果を示すことが報告されている（非特許文献８）。
【００２０】
ここで、前記腫瘍マーカーを用いた肝臓癌の検出法については、過去に、前記腫瘍マーカーの測定値を特徴値として、病理学的検査で最終的な確定診断がなされる肝臓癌の有無を検出するために、診断性能の更なる向上を達成しうるフィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程を含む統計的パターン認識により識別関数を設計し、感度・特異度の観点から設計した識別関数の妥当性確認を行い、当該識別関数から得られた識別関数値が、肝臓癌検出、特に小あるいは最小の肝臓癌検出、並びに、肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度を精度良く検出できたという報告はない。さらに、前記識別関数を用いて得た識別関数値が、同じ疾患で全く別の母集団についても適用できることを実証し、前記識別関数の肝臓癌検出能力の普遍性を証明した報告もない。
【００２１】
すなわち、該２腫瘍マーカーの測定値を特徴値、フィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程を含む統計的パターン認識により設計した識別関数から得られた識別関数値が、肝臓癌検出や慢性肝疾患の病態進行度の指標として利用可能であることを本発明者らが初めて見出したものである。ここで該識別関数値が負の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていると判定し、また、該識別関数値が0あるいは正の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていないと判定する。さらに、該識別関数値は、慢性肝疾患の病態進行度と負の相関を示し、病態進行度の指標として利用可能である。すなわち、該識別関数値の平均値は、慢性肝炎患者群、肝硬変患者群、肝臓癌患者群の間で統計的に有意な差を示し、病態が進行するにしたがって、正の値から負の値を示す。
【００２２】
すなわち本発明は以下の工程からなる肝臓癌検出、慢性肝疾患の病態進行度のモニタリングのための方法を主旨としたものである。
（１）AFP（alpha-fetoprotein）及びPIVKA-II（Protein induced by Vitamin K absence or antagonist-II）を用いた肝臓癌検出法であって、下記の（ａ）から（ｅ）の工程を包含し、該測定値を特徴値とする識別関数によって得られた識別関数値が、該患者において肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示す、方法。
【００２３】
（ａ）医学的所見により病態分類された患者試料中のAFP及びPIVKA-IIを測定する工程、
（ｂ）AFP及びPIVKA-IIの測定値を特徴値として、肝臓癌の有無を検出するために、統計的パターン認識により識別関数を設計する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で設計した識別関数から、上記（ａ）記載の該患者において肝臓癌を患っていることを示す識別関数値を算出する工程、
（ｄ）上記（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中のAFP及びPIVKA-IIを測定する工程、
（ｅ）上記（ｂ）で設計した識別関数に上記（ｄ）記載の該患者におけるAFP及びPIVKA-IIの測定値を代入して識別関数値を算出し、該識別関数値が負の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていると判定し、また、該識別関数値が0あるいは正の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていないと判定する工程。
【００２４】
（２）前記工程（ｂ）が、フィッシャー線形識別関数のカットオフ値を変化させて、前記工程（ａ）の該患者群における最適な感度および特異度を示すカットオフ値を得る（カットオフ値を最適化する）工程を含むことを特徴とする前記（１）記載の方法。
【００２５】
（３）前記工程（ｂ）の特徴値を対数変換、または、べき乗変換して正規化し、該変換値を特徴値として、肝臓癌有無を検出するために、統計的パターン認識により識別関数を設計した後、前記工程（ｅ）の特徴値を対数変換、または、べき乗変換して正規化し、該変換値を前記識別関数に代入して識別関数値を算出し、該識別関数値より該患者が肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示す、前記（１）記載の方法。
（４）肝臓癌が小あるいは最小肝臓癌であることを特徴とする、前記（１）から（３）に記載の方法。
（５）試料がヒト血清、血漿、全血液、組織、血球細胞、排泄物、内・外分泌液の何れかに由来するものであることを特徴とする、前記（１）から（３）に記載の方法。
【００２６】
（６）下記の識別関数を用いて識別関数値を算出することを特徴とする前記（１）から（５）記載の方法；
（式Ｉ）Ｄ＝ −1.144 × AFP − 1.960 × PIVKA-II ＋ 151.545
（式II）Ｄ＝ −1170.579 × AFP ＋ 6.861 × PIVKA-II ＋ 17342.832
（式III ）Ｄ＝ −45.954 × AFP − 0.256 × PIVKA-II ＋ 1687.103
（式IV）Ｄ＝ −743734.876 × AFP0.05 ＋ 24677.050 × PIVKA-II0.05 ＋ 814071.668
（式Ｖ）Ｄ＝ −103044.554 × AFP0.15 −21713.517 × PIVKA-II0.15 ＋ 199366.535
（式VI）Ｄ＝ −23485.069 × AFP0.25 − 8727.211 × PIVKA-II0.25 ＋ 69816.070
（式VII ）Ｄ＝ −1817110.433 × AFP0.05 ＋ 160884.976 × PIVKA-II0.05 ＋ 1881877.418
（式VIII）Ｄ＝ −456892.175 × AFP0.15 ＋ 14493.378 × PIVKA-II0.15 ＋ 660012.847
（式IX）Ｄ＝ −193207.018 × AFP0.25 ＋ 3116.406 × PIVKA-II0.25 ＋ 372629.501
（式Ｘ）Ｄ＝ −1334801.628 × AFP0.05 ＋ 157824.415 × PIVKA-II0.05 ＋ 1335806.678
（式ＸＩ）Ｄ＝ −250689.564 × AFP0.15 ＋ 14282.959 × PIVKA-II0.15 ＋ 351191.238
（式ＸII）Ｄ＝ −79694.207 × AFP0.25 ＋ 236.572 × PIVKA-II0.25 ＋ 157425.794
（Ｄ＜0のとき「肝臓癌あり」と判定し、Ｄ≧0のとき「肝臓癌なし」と判定する。）
【００２７】
（７）以下のものを含む前記（１）から（５）の何れかに記載の方法のために使用されるキット。
（ｉ）前記（１）および（２）、または前記（１）、（２）および（３）、または前記（６）に記載の識別関数に特徴値を代入して肝臓癌の有無を検出するためのソフトウェアを記録した電子媒体；
（ii）AFPおよびPIVKA-IIを測定するための試薬。
（８）以下のものを含む前記（１）から（５）の何れかに記載の方法のために使用される解析システム；
（ｉ）前記（１）および（２）、前記（１）、または（２）および（３）、または前記（６）に記載の識別関数に特徴値を代入して肝臓癌の有無を検出するためのソフトウェアを組み込んだ装置、
（ii）AFPおよびPIVKA-IIを測定するための試薬。
【００２８】
発明の効果
本発明の検査方法により、生体試料から肝臓癌、特に小あるいは最小肝臓癌を簡便かつ正確に検出することができ、また肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度を事前に知ることができ、そのことによって肝臓癌患者の治療成績向上および肝臓癌高発症危険患者の肝臓癌発症患者数減少の一助となることが期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
本発明によって検出対象となる癌の種類は肝臓癌であることが好ましく、肝細胞癌（HCC：Hepatocellular carcinoma）であることがより好ましく、HCV陽性肝細胞癌であることが特に好ましい。
本発明において、肝臓癌を検出するとは、被検体が肝臓癌を有していることを疑われるか否かの判定を行うことを意味する。被検体が肝臓癌を有していることが疑われた場合、画像診断および病理学的検査によって肝臓癌の確定診断が行われる。
【００３１】
本発明において、肝臓癌発症危険性を検出するとは、被検体が近い将来に肝臓癌を発症する可能性が高いか否かの判定を行うことを意味する。
生体試料としては、被検体から得られるものであれば特に限定されない。例えば、血清、血漿、全血液、組織、血球細胞、排泄物、内・外分泌液などを挙げることができるが、血清、血漿、全血液が好ましく、血清が特に好ましい。また組織としては生検組織、外科的切除された組織などが挙げられ、排泄物としては糞便、尿が挙げられ、内・外分泌液としては胆汁、膵液などが挙げられる。
【００３２】
被検体としては、ヒトであれば特に限定されないが、肝臓癌発症高危険患者（慢性肝炎、肝硬変）あるいは肝臓癌患者であることが好ましく、HCV陽性の肝臓癌発症高危険患者あるいは肝臓癌患者であることが特に好ましい。また、肝臓癌発症高危険患者には肝臓癌治療後の患者が含まれても良い。
【００３３】
生体試料中のAFPを測定する方法としては、特に制限は無く、公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より全血2ｍＬ以上採取し、室温で1時間以上静置して、冷却遠心機にて1500Ｇ、10分間冷却遠心して血清部分と血餅部分を分け、上清（血清）部分を別の試験管に分取後、抗原抗体反応を測定原理として、ラテックス凝集による免疫測定法、フェライト粒子固相アッセイ、免疫蛍光測定法、免疫化学発光法、電気化学発光免疫測定法など、既知の方法を用いて測定することができる。この中で、特に、検出感度の観点から、電気化学発光免疫測定法が好ましい。
【００３４】
市販のＡＦＰ試薬・機器としては、IMx（商標）AFPアッセイシステム（アボット社製）、ECLusys 2010（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、AIA-600II（東ソー社製）、ルミパスプレストAFP（富士レビオ社製）などがある。
【００３５】
生体試料中のPIVKA-IIを定量する方法としては、特に制限は無く、公知の方法を用いることができる。具体的に例えば、採血用注射器を用いて、主に患者の肘正中静脈より全血2ｍＬ以上採取し、室温で1時間以上静置した後、冷却遠心機にて1500Ｇ、10分間冷却遠心して血清部分と血餅部分を分け、上清（血清）部分を別の試験管に分取し、これを測定検体として、抗原抗体反応を測定原理として、特異的に結合する抗体を用いて測定対象を検出するラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法などを用いて定量する方法等が知られている（例えば、臨床検査マニュアル、1988年、文光堂、311〜316頁）。さらに、測定を効率的に実施するため、測定検体を凍結又は冷蔵保存して一定数の測定検体をまとめて定量する方法等も知られている（例えば、イムノアッセイ、1984年、ジェイエムシー、173〜174頁）。
【００３６】
また、最近では反応系の微量化、感度の向上、反応時間の短縮を目的として、ラテックス凝集による免疫測定法をはじめフェライト粒子固相アッセイ、免疫蛍光測定法、免疫化学発光法が好ましく用いられているが、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を結合したビーズを固相とし、電気化学的変化で発光するルテニウム（Ru）錯体を標識した抗プロトロンビンポリクロナール抗体を用いたサンドイッチ法による電気化学発光免疫測定法が特に好ましい。
【００３７】
電気化学発光免疫測定法としては、具体的に、例えば、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体結合ビーズと検体を反応させ、ビーズを洗浄後、ビーズに結合したPIVKA-IIにルテニウム標識抗プロトロンビンポリクローナル抗体を反応させて、サンドイッチ状に結合させる。ここで、ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、PIVKA-IIを介してビーズに結合したルテニウム標識抗プロトロンビンポリクローナル抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光量を計測することにより、検体中のPIVKA-II量を正確に測定することができる。
【００３８】
市販のPIVKA-II試薬・機器としては、ピコルミPIVKA-II（三光純薬社製）、エイテストPIVKA-II（三光純薬社製）、ルミパルスPIVKA-II（三光純薬社製）、ルミパルスプレスト PIVKA-II（三光純薬社製）などがある。
【００３９】
また、本発明は、肝臓癌検出や慢性肝疾患の病態進行度を検出する方法であって、
（ａ）医学的所見により病態分類された患者試料中のAFP及びPIVKA-IIを測定する工程、
（ｂ）AFP及びPIVKA-IIの測定値を特徴値として、病理学的検査で最終的な確定診断がなされる肝臓癌の有無の検出をフィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程を含む統計的パターン認識により識別関数を設計する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で作成した識別関数から、上記（ａ）記載の該患者において肝臓癌を患っていること、および、肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度を示す識別関数値を算出する工程、
（ｄ）上記（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中のAFP及びPIVKA-IIを測定する工程、
（ｅ）上記（ｂ）で作成した識別関数に上記（ｄ）記載の該患者におけるAFP及びPIVKA-IIの測定値を代入して識別関数値を算出し、該識別関数値が負の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていると判定し、また、該識別関数値が0あるいは正の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていないと判定する工程、
を経て、肝臓癌検出および慢性肝疾患の病態進行度を検出することを特徴とする解析方法である。
【００４０】
一方、標準フィッシャー線形識別関数は公知であり、以下に示す工程から求めることができる。
(i) 例えば、肝臓癌ありとしてクラスＡ、また肝臓癌なしとしてクラスＢがあるとき、クラスｉの患者試料数をｎiとすると、クラスｉの事前確率Ｐ(ｉ)は
【００４１】
【数１】
2010243406.tif 000002
となる。
【００４２】
【数２】
2010243406.tif 000003
【００４３】
(iv) 標準フィッシャー線形識別関数は、
【数３】
2010243406.tif 000004
【００４４】
となり、患者試料Xがｆ（ｘ）＜０を示したとき肝臓癌ありと識別する。それ以外ならば肝臓癌なしと識別する。
【００４５】
ここで、前記（式ＸVII ）記載の標準フィッシャー線形識別関数では、カットオフ値は事前確率の比の対数
【００４６】
【数４】
2010243406.tif 000005
【００４７】
であり、患者とは無関係な値である。これに対して、前記工程（ｂ）および工程（ｅ）記載のフィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程とは、上記事前確率の比の対数を定数項θ（X）に置き換え、患者Ｘからの情報を踏まえ、このθ（X）を最適化することによって識別関数を設計する工程である（式ＸVIII）。
【００４８】
【数５】
2010243406.tif 000006
【００４９】
具体的に、例えば、クラスＡ（医学的所見により「肝臓癌有り」と病態分類された患者試料）、クラスＢ（医学的所見により「肝臓癌無し」と病態分類された患者試料）におけるAFPおよびPIVKA-IIを測定する。次いで、表１に示すように、上記（式ＸVIII）の定数項θ（X）を-3から3の範囲、0.001刻みで変化させて、患者試料Xが各定数項θ（X）値においてｆ’（X） < 0を示すときクラスA（肝臓癌有）、それ以外であればクラスB（肝臓癌無）と分類し、各定数項θ（X）値におけるクラスＡ、Ｂ（肝臓癌の有無）の感度、特異度を算出する。
【００５０】
このとき、最適化の条件として、例えば、特異度80％以上、かつ、感度が最大の値を示すときの上記定数項θ（X）値を算出する。この最適化条件を満たす上記定数項θ（X）値が複数個得られた場合は、特異度が最大値を示す定数項θ（X）値を最適値とする。表１の場合、感度59.3％、特異度92.9％を示す、θ(X) = 0.098が最適値である。
このように、肝臓癌を患っていることを関連付けた感度と特異度の結果に基づいた上記定数項θ（X）値を最適化する工程が、前記フィッシャー線形識別関数のカットオフ値を最適化する工程である。
【００５１】
【表１】
2010243406.tif 000007
【００５２】
一方、このときの感度と特異度の推定法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができるが、例えば、leave-one-out法やブーストラップ法などを用いることが好ましい。この中で、患者試料数が少なくても有効であり、かつ計算コストも高くないleave-one-out法をより好ましく用いることができる。
【００５３】
このようにして、前記工程（ｂ）における識別関数値を算出する識別関数は、前記最適化したカットオフ値を有するフィッシャー線形識別関数（式ＸVIII）から設計される（ＸIX）。
（式ＸIX）Ｄ ＝ ｆ’(ｘ) 
ここで、Ｄ＜0のとき「肝臓癌あり」と判定し、Ｄ≧0のとき「肝臓癌なし」と判定する。
【００５４】
また、特徴値である前記工程（ｂ）のAFP及びPIVKA-IIの測定値の正規化を行い、該変換値を特徴値として、肝臓癌の有無を検出するため、統計的パターン認識により識別関数を設計した後、前記工程（ｅ）の測定値の正規化を行い、該変換値を前記工程（ｂ）で得た識別関数に代入して識別関数値を算出し、該識別関数値より該患者が肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示すことができる。
【００５５】
測定値を正規化する方法としては、特に制限されず、公知の方法を用いることができるが、べき乗変換あるいは対数変換を用いることが好ましい。具体的に例えば、xが変換される値で、pをべき乗数とすると、べき変換は
X = xp、
となり、一方、対数変換は
X = log(x)
となる。また、べき乗変換あるいは対数変換を組み合わせて測定値を正規化して識別関数を設計しても良い。
【００５６】
また、AFPおよびPIVKA-IIの測定値を特徴値として、肝臓癌の有無を検出する統計的パターン認識により識別関数を設計するまでの前記工程（ａ）〜（ｂ）を、前以って、多数の肝臓癌患者試料及び慢性肝疾患患者試料を用いて行っておいても良い。あるいは、AFPおよびPIVKA-IIの測定値を特徴値として、肝臓癌の有無を検出する統計的パターン認識により識別関数を設計するまでの前記工程（ａ）〜（ｂ）を、前記工程（ｄ）記載の工程（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中のAFPおよびPIVKA-IIを測定する際に行っても良い。
【００５７】
また本発明は、肝臓癌検出および慢性肝疾患の病態を解析するためのキットあるいは解析システムであって、
（ｉ）入力手段から入力された、前記工程（ａ）記載の医学的所見により病態分類された肝臓癌及び慢性肝疾患生体試料由来のＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ−IIの測定値を特徴値とし、肝臓癌の有無を検出するために、前記工程（ｂ）記載の統計的パターン認識により識別関数を設計する工程、
（ii）上記（i）で設計した識別関数から、前記工程（ａ）記載の該患者において肝臓癌を患っていることを示す識別関数値を算出する工程、
（iii）入力手段から入力された、前記工程（ｄ）記載の前記工程（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中のAFP及びPIVKA-IIの測定値を特徴値として、上記（i）で作成した識別関数に代入して識別関数値を算出し、該識別関数値が負の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていると判定し、また、該識別関数値が0あるいは正の値を示すとき、該患者が肝臓癌を患っていないと判定する工程、
をコンピュータに実行させるためのソフトウェアを記録した電子媒体あるいはソフトウェアを組み込んだ装置である。
【００５８】
上記肝臓癌検出および慢性肝疾患の病態を解析するためのキットあるいは解析システムには、AFPおよびPIVKA-IIを測定するために必要な試薬、識別関数に特徴値を代入して肝臓癌の有無を検出するためのソフトウェアを記録した電子媒体、あるいは、ソフトウェアを組み込んだ装置を含むことができる。
【００５９】
また、上記肝臓癌検出および慢性肝疾患患者の病態を解析するためのキットあるいは解析システムは、コンピュータに前記工程（ｉ）及び（iii ）のみを実行させることが可能であり、且つ、コンピュータに前記工程（ｉ）及び（ii）を前以って実行させて得られた肝臓癌の状態と識別関数値とを関係付けた識別関数を利用して前記工程（iii ）を実行させることも可能である。
【００６０】
さらに、前記肝臓癌検出および慢性肝疾患患者の病態を解析するためのキットあるいは解析システムは、前記工程（ｉ）及び（iii ）において、特徴値を対数変換、または、べき乗変換して正規化する手段を搭載し、該変換値を前記識別関数に代入して識別関数値を算出して、該識別関数値より該患者が肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示す識別関数値を算出することもできる。
【００６１】
さらに、本発明は、前記（式Ｉ）〜（式ＸII）記載の少なくとも一種類以上の識別関数が組み込まれ、かつ、前記工程（ｄ）記載の工程（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中に含まれるAFPおよびPIVKA-IIの測定値を特徴値として、少なくとも１つ以上の前記（式Ｉ）〜（式ＸII）記載の識別関数に代入して識別関数値を算出する手段と、得られる識別関数値を指標として肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を検出する手段を含んでなる、ソフトウェアを記録した電子媒体である。
【００６２】
さらに、本発明は、少なくとも１つ以上の前記（式Ｉ）〜（式ＸII）記載の識別関数が組み込まれ、前記工程（ｄ）記載の工程（ａ）とは異なる母集団から得た患者試料中に含まれるAFPおよびPIVKA-IIの測定値を特徴値として、少なくとも１つ以上の前記（式Ｉ）〜（式ＸII）記載の識別関数に代入して識別関数値を算出する手段と、得られる識別関数値を指標として肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を検出する手段を含んでなる、ソフトウェアを組み込んだ装置である。
【００６３】
ここで、上記識別関数により得た識別関数値を指標として肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を検出するためのソフトウェアとしては、上記特徴値を対数変換、または、べき乗変換して正規化する手段を組み込むことができ、次いで、該変換値を前記（式Ｉ）〜（式ＸII）記載の少なくとも１つ以上の識別関数に代入して識別関数値を算出して、該識別関数値より該患者が肝臓癌を患っていることおよび慢性肝疾患の病態進行度を示すこともできる。
【実施例】
【００６４】
次に、医学的所見により病態分類された患者試料を用いた実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。つまり、本発明の最適化カットオフ値を有するフィッシャー線形識別関数を用いる統計的パターン認識は、AFPおよびPIVKA-II測定値を特徴値として識別関数を設計するだけではなく、例えば、癌抑制遺伝子であるp53遺伝子やAPC遺伝子などのmRNA発現量を特徴値とした統計的パターン認識により識別関数を設計して遺伝子発現頻度解析法により癌の判別を行なうこともでき、同様に、遺伝子メチル化解析、蛋白質発現解析や糖鎖解析などにも適用できる。さらに、カットオフ値を最適化する工程は、本発明の標準フィッシャー線形識別関数のカットオフ値だけではなく、二次識別関数のカットオフ値の最適化にも適用することができる。
【００６５】
実施例１. 医学的所見により病態が分類されている患者血清試料中のAFPおよびPIVKA-II測定値を用いて構築した識別関数を用いたときの肝臓癌検出の感度、特異度
血清試料（HCV陽性肝臓癌患者108症例（腫瘍サイズ3cm以下の小肝臓癌51症例を含む）とHCVキャリア56症例]）におけるPIVKA-II及びAFPの血中濃度値を既存の市販診断用試薬を用いて測定し、得られた測定値をべき乗変換して正規化した。
【００６６】
次いで、べき乗変換したPIVKA-II及びＡＦＰの血中濃度値を用いて、（１）肝臓癌患者108症例とHCVキャリア56症例、および、（２）３cm以下の小肝臓癌51症例とHCVキャリア56症例を対象として、最適カットオフ値を利用するフィッシャー線形識別関数に基づく、２種類の識別関数を設計した。さらに、再代入法によって、該識別関数より肝臓癌検出の感度、特異度を算出した。これらの試料は、医学的所見により病態が分類されている。
【００６７】
ここで、肝臓癌検出の感度とは、（医学的所見により肝臓癌を患っていると診断された患者の内、識別関数値Ｄ<０を示した患者数）/（医学的所見により肝臓癌を患っていると診断された患者の総数）×100（％）であり、肝臓癌検出の特異度とは、（医学的所見により肝臓癌を患っていないと診断された患者数の内、識別関数値Ｄ≧０を示した患者数）/（医学的所見により肝臓癌を患っていないと診断された患者総数）×100（％）である。また、再代入法とは、識別関数の設計のために用いた患者群に対する診断性能を推定する方法である。
【００６８】
（１）肝臓癌患者108症例とHCVキャリア56症例
構築した識別関数を下記に示す。
Ｄ＝ −23485.069 × AFP0.25 −  8727.211 × PIVKA-II0.25 ＋ 69816.070（式VI）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度69％、特異度80％で肝臓癌を検出可能であった。
【００６９】
（２）３cm以下の小肝臓癌51症例とHCVキャリア56症例
構築した識別関数を下記に示す。
＝ −1334801.628 × AFP0.05 ＋ 157824.415 × PIVKA-II0.05 ＋ 1335806.678（式Ｘ）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度69％、特異度86％で肝臓癌を検出可能であった。
【００７０】
一方、従来から広く行われてきたカットオフ値（PIVKA-II：40 mAU/ml、AFP：200 ng/ml）を設定して肝臓癌検出能を解析した場合、
（１）肝臓癌患者108症例とHCVキャリア56症例
PIVKA-II：感度60％、特異度89％、
AFP：感度30％、特異度100％
（２）３cm以下の小肝臓癌51症例とHCVキャリア56症例
PIVKA-II：感度47％、特異度89％
AFP：感度24％、特異度100％
で肝臓癌を検出した。
【００７１】
このように、本発明で見出した識別関数を利用した肝臓癌検出方法は、肝臓癌検出能、特に小肝臓癌検出能において従来のAFPおよびPIVKA-IIを用いた判定法に比べて優れていることが示された。
【００７２】
実施例２. 前記識別関数に、前記患者群とは全く異なる母集団から得た患者血清試料中のAFPおよびPIVKA-II測定値を代入して識別関数値を算出したときの肝臓癌検出の感度、特異度
血清試料（HCV陽性肝臓癌患者76症例（腫瘍サイズ３cm以下の小肝臓癌54症例を含む）とHCVキャリア117症例）におけるPIVKA-II及びAFPの血中濃度値を既存の市販診断試薬を用いて測定し、得られた測定値をべき乗変換して正規化した。次いで、べき乗変換したPIVKA-II及びAFPの血中濃度値を測定値として実施例１記載の識別関数に代入して識別関数値を算出し、該識別関数値により該患者が肝臓癌を患っているか否か判定した。その結果を示す。
【００７３】
（１）肝臓癌患者76症例とHCVキャリア117症例
べき乗変換した値を代入した識別関数を下記に示す。
Ｄ＝ −23485.069 × AFP0.25 −  8727.211 × PIVKA-II0.25 ＋ 69816.070（式VI）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度68％、特異度73％で肝臓癌を検出可能であった。
【００７４】
（２）３cm以下の小肝臓癌54症例とＨＣＶキャリア117症例
構築した識別関数を下記に示す。
Ｄ＝ −1334801.628 × AFP0.05 ＋ 157824.415 × PIVKA-II0.05 ＋ 1335806.678（式Ｘ）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度61％、特異度68％で肝臓癌を検出可能であった。
【００７５】
一方、従来から広く行われてきたカットオフ値（PIVKA-II：40 mAU/ml、AFP：200 ng/ml）を設定して肝臓癌検出能を解析した場合、
（１）肝臓癌患者76症例とHCVキャリア117症例
PIVKA-II：感度54％、特異度91％
AFP：感度18％、特異度94％
（２）３cm以下の小肝臓癌54症例とＨＣＶキャリア117症例
PIVKA-II：感度44％、特異度91％
AFP：感度9％、特異度95％
で肝臓癌を検出した。
【００７６】
このように、本発明で見出した識別関数を利用した肝臓癌検出方法は、全く別の母集団に対しても再現性よく肝臓癌を検出でき、また、特に小肝臓癌検出能において従来のAFPおよびPIVKA-IIを用いた判定法に比べて優れていることが示された。
【００７７】
実施例３. AFPおよびPIVKA-II測定値を用いて設計した識別関数を用いた、肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者、肝硬変患者）、および肝臓癌患者を対象とした病態進行度検出
HCV陽性肝臓癌患者76症例（腫瘍サイズ3cm以下の小肝臓癌54症例を含む）とHCVキャリア117症例（慢性肝炎患者47症例、肝硬変患者70症例））を対象として、上述した肝臓癌検出の性能評価の際に構築された識別関数から算出された識別関数値を用いて肝臓癌発症リスク検出に関する臨床評価を行った。
【００７８】
具体的にはAFPおよびPIVKA-IIの血中濃度値をべき乗変換した後、該識別関数：Ｄ＝ −23485.069 × AFP0.25 − 8727.211 × PIVKA-II0.25 ＋ 69816.070（式VI）より識別関数値を算出し、該識別関数値を慢性肝炎患者47症例、肝硬変患者70症例、腫瘍サイズ3cm以下の小肝臓癌患者（≦3cm小肝臓癌患者）54症例および腫瘍サイズ3cmを超える進行肝臓癌患者（>3cm進行肝臓癌患者）22症例との間で、マン・ホイットーニーのＵ検定による母平均の差の検定を行った。その結果、慢性肝炎患者に比べて肝硬変患者の方が有意に低い識別関数値（p<0.00005）を示した（表２）。同様に、肝硬変患者に比べて≦3cm小肝臓癌患者の方が有意に低い識別関数値（p<0.005）を示し、さらに、≦3cm小肝臓癌患者に比べて>3cm進行肝臓癌患者の方が有意に低い識別関数値（p<0.05）を示した（表２）。
【００７９】
以上の結果より、本発明で見出した識別関数を利用する肝臓癌検出方法は、慢性肝疾患患者の病態進行モニタリングにも利用可能であることが示された。
【００８０】
【表２】
2010243406.tif 000008
【００８１】
実施例４. 実施例２記載の母集団から得た患者血清試料中のAFPおよびPIVKA-II測定値を用いて、従来の解析法により識別関数値を算出したときの肝臓癌検出の感度、特異度
実施例１記載の血清試料（HCV陽性肝臓癌患者108症例とHCVキャリア56症例）におけるPIVKA-II及びAFPの血中濃度値を既存の市販診断用試薬を用いて測定した。これらの試料は、医学的所見により病態が分類されている。
【００８２】
次いで、前記PIVKA-II及びAFPの血中濃度値を用いて、肝臓癌患者108症例とHCVキャリア56症例を対象として、（Ａ）最適カットオフ値を利用するフィッシャー線形識別関数、従来の解析法として（Ｂ）標準フィッシャー線形識別関数、（Ｃ）二次識別関数、および二次識別関数を改良した（Ｄ）Toeplitz近似二次識別関数に基づいて、識別関数を設計した〔（式Ｉ）および（式ＸＸ）〜（式ＸＸII）〕。
【００８３】
次いで、実施例２記載の血清試料（ＨＣＶ陽性肝臓癌患者76症例とHCＶキャリア117症例）におけるPIVKA-II及びAFPの血中濃度値を既存の市販診断試薬を用いて測定し、得られた測定値を前記識別関数〔（式Ｉ）および（式ＸＸ）〜（式ＸＸII）〕に代入して識別関数値を算出し、該識別関数値により該患者が肝臓癌を患っているか否か判定した。その結果を示す。
【００８４】
（Ａ）最適カットオフ値を利用するフィッシャー線形識別関数
PIVKA-II及びAFPの血中濃度値を代入した識別関数を下記に示す。
Ｄ＝ −1.144 × AFP −  1.960 × PIVKA-II ＋ 151.545  （式Ｉ）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度51％、特異度89％で肝臓癌を検出可能であった。
【００８５】
一方、従来から広く行われてきた統計的パターン認識により肝臓癌検出能を解析した場合、
（Ｂ）標準フィッシャー線形識別関数
PIVKA-II及びAFPの血中濃度値を代入した識別関数を下記に示す。
Ｄ＝  −1.144 × AFP − 1.960 × PIVKA-II − 55726.409  （式ＸＸ）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度100％、特異度0％で肝臓癌を検出した。
【００８６】
（Ｃ）二次識別関数
PIVKA-II及びAFPの血中濃度値を代入した識別関数を下記に示す。
Ｄ ＝ −220.453 × AFP2 − 0.200 × AFP × PIVKA-II − 0.002 × PIVKA-II2 ＋ 4624.467 × AFP ＋ 6.038 × PIVKA-II ＋ 801288.321    （ＸＸＩ）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度28％、特異度91％で肝臓癌を検出した。
【００８７】
（Ｄ）Toeplitz近似二次識別関数
PIVKA-II及びAFPの血中濃度値を代入した識別関数を下記に示す。
Ｄ＝ −220.453 × AFP2 ＋ 0.000 × AFP × PIVKA-II − 0.002 × PIVKA-II2 + 4377.612 × AFP + 4.080 × PIVKA-II + 803596.659    （式ＸＸII）
識別関数値Ｄ＜0のとき肝臓癌ありと判定すると、上記肝臓癌患者を感度29％、特異度91％で肝臓癌を検出した。
【００８８】
このように、本発明で見出した（Ａ）最適カットオフ値を利用するフィッシャー線形識別関数を利用する本肝臓癌検出方法は、従来の（Ｂ）標準フィッシャー線形識別関数、（Ｃ）二次識別関数および（Ｄ）Toeplitz近似二次識別関数に比べて精度良く肝臓癌を検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は肝臓癌の検査、特に肝臓癌スクリーニング検査、肝臓癌高発症危険患者（慢性肝炎患者および肝硬変患者）の病態進行度の検出に用いるものであり、臨床検査薬産業、医薬産業、試薬産業、医療機器産業等において利用することができる。