(57)【要約】【課題】被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、画像上の真の凝集物と偽の凝集物とを区別して凝集率を正確に算出することができる検出方法を提供すること。【解決手段】交流電圧の印加を停止した後、反応場を透過光観察して、粒子の中心部の明度が高く、周縁部の明度が低い画像を撮像する。粒子の周縁領域の明度と中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、透過光画像を二値化する。二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として、各粒子が隣接する他の粒子と会合しているかどうかを判別し、粒子の凝集率を算出する。【選択図】図７
2010032327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、
被検出物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている修飾粒子を準備するステップと、
試料と前記粒子とを含む混合液を調製するステップと、
前記混合液に交流電圧を印加して前記粒子をパールチェーン化させるステップと、
前記交流電圧の印加を停止した後に前記粒子を含む反応場の透過光画像を取得するステップと、
前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化するステップと、
前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として隣接する他の粒子と会合しているか否かを判別するステップと、
他の粒子と会合している粒子の数または面積と、他の粒子と会合していない粒子の数または面積とから、前記反応場における前記粒子の凝集率を算出するステップと、
を含む、被検出物質の検出方法。
【請求項２】
前記粒子の特徴量は、前記粒子の二値化画像における中心領域の面積である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記粒子の二値化画像における中心領域の面積に対する前記他の粒子の二値化画像における中心領域の面積比が０.６８〜１.５の範囲内であるときに、前記粒子が前記他の粒子と会合していると判別する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記粒子の特徴量は、前記粒子の二値化画像における中心領域と前記他の粒子の二値化画像における中心領域との中心間距離である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
前記中心間距離が前記粒子の平均直径の０.５７〜０.７５倍の範囲内であるときに、前記粒子が前記他の粒子と会合していると判別する、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記反応場の透過光画像を異なる時に２枚以上取得し、
前記透過光画像のそれぞれについて算出された前記粒子の凝集率のうち、最小値の凝集率を前記反応場における前記粒子の凝集率とする、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
前記反応場の透過光画像の取得枚数は２枚以上４枚以下である、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
容器に収容された液体中に存在する粒子の深さ位置を計測する方法であって、
粒子を含む液体の透過光画像を取得するステップと、
前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化するステップと、
前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として深さ位置を算出するステップと、
を含む、深さ位置の計測方法。
【請求項９】
前記粒子の特徴量は、前記粒子の二値化画像における中心領域の面積である、請求項８に記載の深さ位置の計測方法。
【請求項１０】
被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する装置であって、
別個に用意されたデバイスの反応場に交流電圧を印加する電圧印加部と、
前記反応場に光を照射する光源と、
前記反応場の透過光画像を撮像する撮像部と、
前記透過光画像から得られる情報に基づいて前記反応場における粒子の凝集率を算出する制御解析部と、
を有し、
前記制御解析部は、
前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化し、
前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として隣接する他の粒子と会合しているか否かを判別し、
他の粒子と会合している前記粒子の数または面積と、他の粒子と会合していない前記粒子の数または面積とから、前記反応場における前記粒子の凝集率を算出する、
被検出物質の検出装置。
【請求項１１】
液体中に存在する粒子の深さ位置を計測する装置であって、
別個に用意されたデバイスの液体が満たされた空間に光を照射する光源と、
粒子を含む前記液体の透過光画像を撮像する撮像部と、
前記透過光画像から得られる情報に基づいて前記液体中に存在する前記粒子の深さ位置を算出する制御解析部と、
を有し、
前記制御解析部は、
前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化し、
前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として深さ位置を算出する、
深さ位置の計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検出物質の検出方法および被検出物質の検出装置、ならびに粒子の深さ位置の計測方法および粒子の深さ位置の計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な診断チップが開発されている。これらの診断チップのほとんどは、マイクロタス（μ−ＴＡＳ：Micro Total Analysis System）と呼ばれる微小流路構造を有するカード型のデバイスである。流路を微細化することで、生体から採取するサンプルの必要量を微量にすることができるとともに、診断チップを含む装置全体を小型化することができる。さらに、診断チップを含む装置全体を小型化することで、診療所や家庭などで診断を行うＰＯＣＴ（Point Of Care Testing：その場診断）を実現することが可能となる。
【０００３】
医療分野や生化学分野においては、抗原抗体反応による粒子の凝集を検出して抗原や抗体の有無を検査し、病気の診断や解析が行われている（例えば、特許文献１〜３を参照）。例えば、特許文献１に開示されているパルスイムノアッセイ法では、試料溶液と、抗体などを固定化された修飾粒子とを含む反応系に交流電圧を印加して、複数の粒子を電界方向に数珠繋ぎに並べさせる（パールチェーン化）。次いで、交流電圧の印加を停止して粒子を再度分散させた後に、粒子の凝集率を測定し、抗原抗体反応を定量する。この測定で印加される交流電圧は、正・負の振幅値が周期的かつ連続的に変化することを特徴とする。交流電圧を印加することで、従来までの直流パルス電圧を印加する場合に比べて、塩の存在下でも電気分解を生じさせることなく粒子をパールチェーン化させることができる。凝集率は、例えば粒子の総数に対する凝集粒子の数の比率として算出される。
【０００４】
凝集率は、画像処理装置を用いて自動的に算出されうる。以下、図２１を参照してその手順を示す。まず、交流電圧の印加を停止した後に、試料溶液および粒子を含む反応場の画像１０が撮像装置により撮像される（図２１（Ａ）参照）。次いで、画像処理により、反応場の画像１０から粒子群（１または２以上の粒子から構成される粒子の集まり）１４が抽出される。通常は、画像の背景が白色、粒子群１４が黒色（またはその逆）となるように画像を二値化することにより、粒子群１４の抽出が行われる（図２１（Ｂ）参照）。抽出された粒子群１４のそれぞれは、その面積（例えば、ピクセル数）に基づいて複数の粒子が凝集したものかどうかを判別される。例えば、図２１（Ｂ）に示される二値化画像１２において、粒子群１４ａの面積は粒子１個分の面積より大きいため、粒子群１４ａは複数の粒子が凝集したものと判別される。一方、粒子群１４ｂの面積は粒子１個分の面積とほぼ同じため、粒子群１４ｂは１つの粒子であると判別される。最後に、１つの粒子として分散している粒子の数と凝集している粒子の数から凝集率が算出される。代表値としての凝集率は、５画面の凝集率の平均値をとって算出される。
【特許文献１】特開平７−８３９２８号公報
【特許文献２】特開２００３−７５４４１号公報
【特許文献３】特開昭５９−１７３７６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来の方法には、凝集率を正確に算出することができないという問題があった。
【０００６】
例えば、反応場内の粒子数が多い場合、撮像装置が撮像した画像上で複数の粒子が重なることがある。従来の方法では、複数の粒子が実際に凝集している「真の凝集物」と、複数の粒子が画像上で重なっているだけの「偽の凝集物」とを区別することができないため、真の凝集物だけでなく偽の凝集物も含めた凝集率を算出していた。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、画像上の真の凝集物と偽の凝集物とを区別して凝集率を正確に算出することができる被検出物質の検出方法および被検出物質の検出装置を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、液体中に存在する粒子の深さ位置の計測方法および粒子の深さ位置の計測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標とすることで、各粒子が他の粒子と会合しているかどうかを判別できること、および各粒子の深さ位置を計測できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の第一は、以下の被検出物質の検出方法に関する。
【００１１】
［１］被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、被検出物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている修飾粒子を準備するステップと、試料と前記粒子とを含む混合液を調製するステップと、前記混合液に交流電圧を印加して前記粒子をパールチェーン化させるステップと、前記交流電圧の印加を停止した後に前記粒子を含む反応場の透過光画像を取得するステップと、前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化するステップと、前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として隣接する他の粒子と会合しているか否かを判別するステップと、他の粒子と会合している粒子の数または面積と、他の粒子と会合していない粒子の数または面積とから、前記反応場における前記粒子の凝集率を算出するステップと、を含む、被検出物質の検出方法。
［２］前記粒子の特徴量は、前記粒子の二値化画像における中心領域の面積である、［１］に記載の検出方法。
［３］前記粒子の二値化画像における中心領域の面積に対する前記他の粒子の二値化画像における中心領域の面積比が０.６８〜１.５の範囲内であるときに、前記粒子が前記他の粒子と会合していると判別する、［２］に記載の検出方法。
［４］前記粒子の特徴量は、前記粒子の二値化画像における中心領域と前記他の粒子の二値化画像における中心領域との中心間距離である、［１］に記載の検出方法。
［５］前記中心間距離が前記粒子の平均直径の０.５７〜０.７５倍の範囲内であるときに、前記粒子が前記他の粒子と会合していると判別する、［４］に記載の検出方法。
［６］前記反応場の透過光画像を異なる時に２枚以上取得し、前記透過光画像のそれぞれについて算出された前記粒子の凝集率のうち、最小値の凝集率を前記反応場における前記粒子の凝集率とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の検出方法。
［７］前記反応場の透過光画像の取得枚数は２枚以上４枚以下である、［６］に記載の検出方法。
【００１２】
また、本発明の第二は、以下の粒子の深さ位置の計測方法に関する。
【００１３】
［８］容器に収容された液体中に存在する粒子の深さ位置を計測する方法であって、粒子を含む液体の透過光画像を取得するステップと、前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化するステップと、前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として深さ位置を算出するステップと、を含む、深さ位置の計測方法。
［９］前記粒子の特徴量は、前記粒子の二値化画像における中心領域の面積である、［８］に記載の深さ位置の計測方法。
【００１４】
また、本発明の第三は、以下の被検出物質の検出装置に関する。
【００１５】
［１０］被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する装置であって、別個に用意されたデバイスの反応場に交流電圧を印加する電圧印加部と、前記反応場に光を照射する光源と、前記反応場の透過光画像を撮像する撮像部と、前記透過光画像から得られる情報に基づいて前記反応場における粒子の凝集率を算出する制御解析部と、を有し、前記制御解析部は、前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化し、前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として隣接する他の粒子と会合しているか否かを判別し、他の粒子と会合している前記粒子の数または面積と、他の粒子と会合していない前記粒子の数または面積とから、前記反応場における前記粒子の凝集率を算出する、被検出物質の検出装置。
【００１６】
また、本発明の第四は、以下の粒子の深さ位置の計測装置に関する。
【００１７】
［１１］液体中に存在する粒子の深さ位置を計測する装置であって、別個に用意されたデバイスの液体が満たされた空間に光を照射する光源と、粒子を含む前記液体の透過光画像を撮像する撮像部と、前記透過光画像から得られる情報に基づいて前記液体中に存在する前記粒子の深さ位置を算出する制御解析部と、を有し、前記制御解析部は、前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の中心領域の明度との間、および前記粒子の周縁領域の明度と前記粒子の周辺領域の明度との間に閾値を設定して、前記透過光画像を二値化し、前記透過光画像に表示された各粒子について、二値化画像から得られる当該粒子の特徴量を指標として深さ位置を算出する、深さ位置の計測装置。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の被検出物質の検出方法および被検出物質の検出装置によれば、画像上の真の凝集物と偽の凝集物とを区別して凝集率をより正確に算出することができるため、被検出物質をより高精度に検出することができる。
【００１９】
また、本発明の粒子の深さ位置の計測方法および粒子の深さ位置の計測装置によれば、液体中に存在する粒子の深さ位置を計測することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
１．本発明の検出方法
本発明の検出方法は、被検出物質をパルスイムノアッセイ法で検出する方法であって、
１）被検出物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている修飾粒子を準備する第１のステップと、２）試料と第１のステップで準備した粒子とを含む混合液を調製する第２のステップと、３）第２のステップで調製した混合液に交流電圧を印加して粒子をパールチェーン化させる第３のステップと、４）交流電圧の印加を停止した後に反応場の透過光画像を取得する第４のステップと、５）第４のステップで撮像した透過光画像を二値化する第５のステップと、６）第５のステップで作成した二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として、各粒子が隣接する他の粒子と会合しているかどうかを判別する第６のステップと、７）粒子の凝集率を算出する第７のステップとを含む。
【００２１】
本発明の検出方法は、二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として各粒子が隣接する他の粒子と会合しているかどうかを判別すること（第６のステップ）を主たる特徴とする。本明細書において「検出」とは、特定の物質の有無を調べる意味だけでなく、特定の物質の濃度や量を測定する意味も含む。
【００２２】
［第１のステップ］
第１のステップでは、被検出物質に特異的に結合する認識物質をその表面に固定化されている修飾粒子を準備する。
【００２３】
認識物質を固定化される担体粒子の例には、ラテックス粒子、シリカ粒子、石英粒子、メラミン粒子などが含まれる。この中ではラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の例には、ポリスチレン系ラテックス粒子、ポリビニルトルエン系ラテックス粒子、ポリメタクリレート系ラテックス粒子などが含まれる。ラテックス粒子には、官能基モノマー（−ＣＯＯＨ，−ＯＨ，−ＮＨ２など）が共重合して導入されていてもよい。
【００２４】
担体粒子の色は無色（無着色）であることが好ましい。第４のステップにおいて透過光画像を撮像するために必要な光量を低減させることができるからである。また、担体粒子の表面粗さは小さく、ヘイズ値は高いことが好ましい。担体粒子の中心部を通過する光線が散乱しにくくなり、第４のステップにおいて粒子の中心領域の明度が高い透過光画像（図６（Ａ）参照）を撮像することができるからである。
【００２５】
担体粒子の直径（平均粒径）は、光学顕微鏡で識別可能な０.５μｍ以上、かつブラウン運動による分散が容易に生じうる１００μｍ以下が好ましい。担体粒子の直径が１００μｍを超えると、第４のステップにおいて、凝集していない修飾粒子が混合液中に分散しにくくなる。例えば、担体粒子がラテックス粒子の場合、担体粒子の直径（平均粒径）は１〜１０μｍの範囲内が好ましい。担体粒子の直径（平均粒径）は、光学顕微鏡を用いて観察したり、コールターカウンターを用いて電気抵抗を測定したり、光散乱法で散乱光変化量を測定したりすることで測定することができる。
【００２６】
担体粒子に固定化される認識物質は、被検出物質に特異的に結合しうる物質であれば特に限定されない。認識物質の例には、抗体や核酸、酵素などが含まれる。これらの認識物質を担体粒子に固定化する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、抗体をラテックス粒子に固定化する場合、疎水性相互作用を利用した物理吸着や、アミノ基やカルボキシル基などを利用した化学修飾などを用いることができる。
【００２７】
修飾粒子は、使用する際に調製してもよいし、事前に調製されたものを使用してもよいし、市販品を購入してもよい。
【００２８】
［第２のステップ］
第２のステップでは、試料と第１のステップで準備した修飾粒子とを含む混合液を調製する。
【００２９】
試料は、特に限定されず、検出対象や検出目的などに応じて適宜選択すればよい。試料の例には、血液、血漿、血清、それらの希釈物、電解質溶液などが含まれる。
【００３０】
混合液の調製方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、第１のステップで修飾粒子を懸濁液として準備した場合は、試料にその懸濁液を適量加えて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。また、第１のステップで修飾粒子を固形物（例えば、上記懸濁液の凍結乾燥物や風乾乾燥物など）として準備した場合は、その固形物に液体試料を適量加えて、必要に応じて攪拌し、さらに必要に応じてｐＨを調整すればよい。
【００３１】
混合液は、所定の濃度の塩を含んでいてもよい。混合液が適量の塩を含んでいると、抗原抗体反応などの生物学的反応が安定化する。一方、混合液が過剰の塩を含んでいると、混合液の導電率が上昇してしまう。混合液の導電率は、０.１〜３５ｍＳ／ｃｍの範囲内が好ましい。修飾粒子を含む電解質溶液を混合液とする場合、電解質溶液の塩濃度は２００ｍＭ以下が好ましい。血漿は生理食塩水と同程度の塩を含み（濃度換算で１２０ｍＭ）、その導電率は約１５ｍＳ／ｃｍである。したがって、本発明の検出方法では、血漿を試料としてそのまま使用することができる。
【００３２】
混合液に含まれる修飾粒子の濃度が高いほど、後述する第３のステップにおいてパールチェーンが形成されやすくなり、凝集反応が促進されやすくなる。例えば、担体粒子がラテックス粒子の場合、混合液中における修飾粒子の濃度は０.０１〜１重量％の範囲内が好ましく、０.１〜０.５重量％の範囲内が特に好ましい。
【００３３】
［第３のステップ］
第３のステップでは、第２のステップで調製した混合液を反応場に配置し、反応場に交流電圧を印加して修飾粒子をパールチェーン化させる。
【００３４】
混合液に外部電場を印加すると、担体粒子内で双極子が誘起され、この双極子の相互作用により分散していた修飾粒子が泳動して電界方向に一列に並ぶ（パールチェーン化）。このとき、混合液内に被検出物質が存在すれば、修飾粒子は被検出物質を介して他の修飾粒子に会合するため、複数の修飾粒子が凝集する。
【００３５】
混合液に交流電圧を印加する方法は、従来のパルスイムノアッセイ法と同じ方法でよい。後述する本発明の検出装置を用いて混合液に交流電圧を印加することができる。後述する本発明の検出装置では、デバイスの流路が反応場に相当する。
【００３６】
混合液に印加する交流電圧の波形は、矩形波、正弦波、余弦波、三角波などであればよいが、矩形波が好ましい。交流電圧の周波数は、１ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内が好ましく、１００ｋＨｚ程度が特に好ましい。
【００３７】
交流電流の実効値は、０ｍＡ〜９６ｍＡの範囲内が好ましい。交流電流の実効値が０.７ｍＡ未満であれば、熱が発生しないので特に好ましい。混合液に印加する交流電圧の電界強度は、２０〜１００Ｖ（波高値間電圧）／ｍｍの範囲内が好ましい。電界強度が２０Ｖ／ｍｍよりも小さいと、パールチェーン化が生じにくくなり、凝集反応を十分に促進することができない。一方、電界強度が１００Ｖ／ｍｍより大きいと、混合液の電気分解が生じやすくなり、検出感度が低下してしまう。
【００３８】
交流電圧を印加する時間は、修飾粒子の泳動状況や印加電圧などに応じて任意に設定することができる。通常、導電率の高い溶液や生体試料（例えば、血漿）などでは、誘電泳動力が比較的弱い。交流電圧を印加する時間は、２〜１８０秒の範囲内が好ましく、６０秒程度が特に好ましい。
【００３９】
［第４のステップ］
第４のステップでは、交流電圧の印加を停止した後に反応場の画像を取得する。
【００４０】
交流電圧の印加を停止すると、被検出物質を介して会合した修飾粒子は凝集した状態が維持されるが、会合していない修飾粒子はブラウン運動により混合液中に再分散する。第４のステップでは、会合していない修飾粒子が混合液中に再分散した後に、反応場の画像を取得する。このとき、反応場の透過光画像を撮像して、修飾粒子の中心領域（中央近傍の領域）の明度が周縁領域（輪郭近傍の領域）の明度よりも高い画像を取得する（図６（Ａ）参照）。
【００４１】
交流電圧の印加を停止してから撮像するまでの時間は、修飾粒子の分散状況に応じて任意に設定することができる。通常、比重が大きい粒子や直径が大きい粒子などでは、分散が遅い。交流電圧の印加を停止してから撮像するまでの時間は、１０〜１８０秒の範囲内が好ましく、６０秒程度が特に好ましい。
【００４２】
撮像手段は特に限定されない。例えば、光学顕微鏡に接続したカメラ（ＣＣＤカメラなど）で反応場の透過光画像を撮像すればよい。後述する本発明の検出装置を用いても、反応場の透過光画像を撮像することができる。
【００４３】
［第５のステップ］
第５のステップでは、第４のステップで撮像した透過光画像を二値化する。
【００４４】
二値化の閾値は、透過光画像に表示された修飾粒子の周縁領域（輪郭線近傍の領域）の明度と中心領域（中央近傍の領域）の明度との間、および修飾粒子の周縁領域の明度と周辺領域（透過光画像の背景）の明度との間になるように設定する。このように閾値を設定することで、各粒子の周縁領域と中心領域（および背景）とを分けることができる（図６（Ｂ）参照）。
【００４５】
閾値は、透過光画像の明度の範囲内で設定される。例えば、透過光画像が８ビットのグレースケールの場合は、０〜２５５の範囲内の数値が閾値として選択される。透過光画像１枚あたりに設定される閾値の数は、１つが好ましいが、任意に選択することができる。
【００４６】
閾値の決定方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択することができる。例えば、ある値の集合を２つのクラスに分類するときに適切な閾値を決定する方法として、大津の方法が知られている。この方法では、２つのクラスについてのクラス内分散およびクラス間分散を算出し、これらの比が最小になるような（すなわち、クラス内分散はできるだけ小さく、クラス間分散はできるだけ大きくなるような）閾値を求める（大津展之, "判別及び最小２乗基準に基づく自動しきい値選択法", 電子情報通信学会論文誌, 1980, Vol.J63-D, No.4, pp.349-356.；Otsu N., "A threshold selection method from gray level histograms", IEEE Trans. Systems, Man and Cybernetics, 1979, Vol.9, pp.62-66.）。
【００４７】
また、例えば、当業者にエッジ検出法として知られる方法を用いて、透過光画像の明度の変化量に基づいて適切な閾値を決定してもよい。この方法は、修飾粒子の周縁領域の明度と中心領域の明度との間、および修飾粒子の周縁領域の明度と周辺領域の明度との間で大きく明度が変化する場合に適する。
【００４８】
二値化処理は、粒子の周縁領域と中心領域および背景とを区別することができれば、粒子の周縁領域を白（０）としてもよいし、黒（１）としてもよい。
【００４９】
［第６のステップ］
第６のステップでは、第５のステップで作成した二値化画像から得られる修飾粒子の特徴量を指標として、各粒子が隣接する他の粒子と会合しているか否かを判別する。
【００５０】
修飾粒子の特徴量の例には、二値化画像における粒子の中心領域の面積が含まれる（実施の形態１参照）。第５のステップで透過光画像を二値化することで、各粒子の中心領域は周縁領域と異なる色で表示され、各粒子の中心領域の面積を算出することができるようになる（図６（Ｂ）参照）。中心領域の面積は、その粒子の深さ位置に応じて変化する（実施例参照）。したがって、二値化画像上で２つの粒子が隣接しているときに、２つの粒子の中心領域の面積がほぼ同一であれば、これらの粒子はほぼ同一の深さ位置に存在しており、被検出物質を介して会合していると判別する。一方、２つの中心領域の面積が大きく異なっていれば、これらの粒子は異なる深さ位置に存在しており、被検出物質を介して会合していないと判別する。中心領域の面積の測定方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択することができる。
【００５１】
また、修飾粒子の特徴量の例には、二値化画像における一の粒子の中心領域と隣接する他の粒子の中心領域との中心間距離が含まれる（実施の形態２参照）。第５のステップで透過光画像を二値化することで、各粒子の中心領域の中心点を決定できるようになる（図６（Ｂ）参照）。２つの粒子が被検出物質を介して会合しているとき、これらの粒子の中心間距離は粒子の平均直径（平均半径の２倍）とほぼ同一になるはずである。したがって、二値化画像上で２つの粒子が隣接しているときに、２つの粒子の中心領域の中心間距離が粒子の平均直径とほぼ同一であれば、被検出物質を介して会合していると判別する。一方、２つの粒子の中心領域の中心間距離が粒子の平均直径と大きく異なっていれば、これらの粒子は偶然重なって存在しており、被検出物質を介して会合していないと判別する。具体的には、撮像手段に含まれるレンズの収差や歪みなどを考慮して、中心間距離が粒子の平均直径の０.５７〜０.７５倍の範囲内であれば会合とみなし、それ以外の範囲であれば、非会合と判断する。中心領域の中心間距離の測定方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択することができる。
【００５２】
粒子群が２つの粒子から構成されている場合は、これらの粒子が被検出物質を介して会合しているときのみ当該粒子群を真の凝集物と判別する。粒子群が３つ以上の粒子から構成される場合は、粒子群を構成するすべての粒子が他の粒子に被検出物質を介して会合しているときのみ当該粒子群を真の凝集物と判別してもよい。また、粒子群を構成する粒子のうちの少なくとも１つの粒子が他の粒子に被検出物質を介して会合しているときに当該粒子群を真の凝集物と判別してもよい。
【００５３】
また、２種類以上の特徴量を指標として粒子群が真の凝集物であるかどうかを判別することもできる。例えば、中心領域の面積を指標として粒子群が真の凝集物であるかどうかを判別した後、さらに中心領域の中心間距離を指標として粒子群が真の凝集物であるかどうかを判別する。この場合、いずれの指標を用いても真の凝集物であると判別される粒子群のみを真の凝集物であると判別する。
【００５４】
［第７のステップ］
第７のステップでは、反応場における粒子の凝集率を算出する。
【００５５】
前述の通り、交流電圧の印加を停止すると、凝集していない粒子は混合液中に分散するが、被検出物質を介して凝集した粒子は凝集状態のままとなる。凝集している粒子と凝集していない粒子との比率は、混合液中の被検出物質の濃度に依存する。したがって、粒子の凝集率を求めることにより、被検出物質の有無を検出したり濃度を測定したりすることができる。本発明の検出方法では、第６のステップにおいて判別した真の凝集物を構成する粒子のみを凝集している粒子として凝集率を算出する。凝集率は、例えば以下の式（１）に示すように粒子の数から算出されうる。
【数１】
2010032327.tif 000003
【００５６】
また、凝集率は、以下の式（２）に示すように粒子の面積からも算出されうる。
【数２】
2010032327.tif 000004
【００５７】
上記２つの式において、「凝集している粒子」とは、「他の粒子と会合している粒子」であってもよいし、「真の凝集物に含まれる粒子」であってもよい。例えば、粒子群を構成する粒子のうちの少なくとも１つの粒子が他の粒子に被検出物質を介して会合しているときに当該粒子群を真の凝集物と判別する場合であれば、当該粒子群に含まれるが他の粒子と会合していない粒子も「凝集している粒子」に含めてもよい。
【００５８】
以上のように、本発明の検出方法は、二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として各粒子が隣接する他の粒子と会合しているかどうかを判別することで、反応場における粒子の凝集率をより正確に算出することができる。結果として、本発明の検出方法は、高感度かつ高精度に被検出物質を検出および測定することができる。
【００５９】
上記の説明では、各ステップを１回行う例について説明したが、第４のステップ〜第７のステップを複数回繰り返し、凝集率を複数回算出してもよい。すなわち、第３のステップを終えた後、反応場の透過光画像を異なるタイミングで２枚以上撮像し、透過光画像のそれぞれについて凝集率を算出してもよい。この場合、算出された複数の凝集率のうち最小値の凝集率を反応場における凝集率として採用することで、偶然による粒子の重なりおよび接近の影響が最も少ない凝集率を得ることができる（実施の形態３参照）。
【００６０】
本発明の検出方法は、次に説明する本発明の検出装置を用いて実施することができる。
【００６１】
２．本発明の検出装置
本発明の検出装置は、別個に用意されたデバイスの反応場における粒子の凝集状態を観察し、パルスイムノアッセイ法で被検出物質を検出する装置である。
【００６２】
本発明の検出装置は、デバイスの反応場の透過光画像を取得すること、および透過光画像を二値化した画像から得られる粒子の特徴量を指標として各粒子が隣接する他の修飾粒子と会合しているかどうかを判別することを主たる特徴とする。
【００６３】
本発明の検出装置は、光源、撮像部、制御解析部および電圧印加部を有する。本発明の検出装置では、別個に用意されるデバイスは光源と撮像部との間に配置される。
【００６４】
光源は、デバイスの反応場に光を照射する。光源は、デバイスを挟んで撮像部の反対側に配置される。
【００６５】
撮像部は、制御解析部の制御の下でデバイスの反応場の透過光画像を撮像する。撮像部は、動画を撮像してもよいし静止画を撮像してもよい。撮像した透過光画像は、制御解析部に出力される。
【００６６】
制御解析部は、撮像部および電圧印加部の動作を制御する。また、制御解析部は、本発明の検出方法の第５のステップ〜第７のステップの手順により撮像部が撮像した透過光画像を解析して、デバイスの反応場に存在する粒子の凝集率を算出する。
【００６７】
電圧印加部は、デバイスの電極対に接続されており、制御解析部の制御の下でデバイスの反応場に交流電圧を印加する。
【００６８】
本発明の検出装置は、本発明の検出方法の第３のステップ〜第７のステップを自動で行い、デバイスの反応場に存在する粒子の凝集率を算出することができる（実施の形態１参照）。
【００６９】
本発明の検出装置は、ユーザに予備処理操作を要求せず、デバイスを配置した後は本発明の検出方法に従って自動で凝集率を算出することができる。したがって、本発明の検出装置を用いることで、被検出物質を容易かつ高感度に検出することができる。
【００７０】
３．本発明の深さ位置の計測方法
本発明の深さ位置の計測方法は、容器に収容された液体中に存在する粒子の深さ位置を計測する方法であって、１）計測対象の粒子を含む液体の透過光画像を取得する第１のステップと、２）第１のステップで撮像した透過光画像を二値化する第２のステップと、３）第２のステップで作成した二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として、当該粒子の深さ位置を算出する第３のステップとを含む。
【００７１】
本発明の深さ位置の計測方法は、二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として当該粒子の深さ位置を計測することを特徴とする（本発明の検出方法の第６のステップ参照）。
【００７２】
［第１のステップ］
第１のステップでは、計測対象の粒子を含む液体の画像を取得する。このとき、容器に収容された液体の透過光画像を撮像して、粒子の中心領域の明度が周縁領域の明度よりも高い画像を取得する（図６（Ａ）参照）。
【００７３】
粒子の種類は特に限定されない。粒子の例には、ラテックス粒子、シリカ粒子、石英粒子、メラミン粒子などが含まれる。
【００７４】
担体粒子の色は無色（無着色）であることが好ましい。透過光画像を撮像するために必要な光量を低減させることができるからである。また、担体粒子の表面粗さは小さく、ヘイズ値は高いことが好ましい。担体粒子の中心部を通過する光線が散乱しにくくなり、粒子の中心領域の明度が高い透過光画像（図６（Ａ）参照）を撮像することができるからである。
【００７５】
液体を収容する容器は特に限定されない。例えば、容器は後述するデバイスの流路である（実施の形態参照）。
【００７６】
撮像手段は特に限定されない。例えば、光学顕微鏡に接続したカメラ（ＣＣＤカメラなど）で透過光画像を撮像すればよい。後述する本発明の計測装置を用いても透過光画像を撮像することができる。
【００７７】
［第２のステップ］
第２のステップでは、第１のステップで撮像した透過光画像を二値化する。二値化処理は、本発明の検出方法の第５のステップと同様の手順により行うことができる。透過光画像を二値化することで、各粒子の中心領域と周縁領域とを分けることができる（図６（Ｂ）参照）。
【００７８】
［第３のステップ］
第３のステップでは、第２のステップで作成した二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標として、当該粒子の深さ位置を算出する。
【００７９】
粒子の特徴量の例には、二値化画像における粒子の中心領域の面積が含まれる（実施の形態４参照）。第２のステップで透過光画像を二値化することで、各粒子の中心領域は周縁領域と異なる色で表示され、各粒子の中心領域の面積を算出することができるようになる（図６（Ｂ）参照）。前述の通り、中心領域の面積は、その粒子の深さ位置（撮像手段からの距離）に応じて変化する（実施例参照）。したがって、粒子の中心領域の面積と粒子の深さ位置との関係を予め調べておけば、粒子の中心領域の面積から当該粒子の深さ位置を算出することができる。中心領域の面積の測定方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法から適宜選択することができる。
【００８０】
以上のように、本発明の深さ位置の計測方法は、二値化画像から得られる粒子の特徴量を指標とすることで、当該粒子の深さ位置を計測することができる。
【００８１】
本発明の深さ位置の計測方法は、次に述べる本発明の深さ位置の計測装置を用いて実施することができる。
【００８２】
４．本発明の深さ位置の計測装置
本発明の深さ位置の計測装置は、別個に用意されたデバイスの液体が満たされた空間（例えば、流路）を観察し、当該空間内に存在する粒子の深さ位置を計測する装置である。
【００８３】
本発明の計測装置は、デバイスの液体が満たされた空間の透過光画像を取得すること、および透過光画像を二値化した画像から得られる粒子の特徴量を指標として各粒子の深さ位置を計測することを主たる特徴とする。
【００８４】
本発明の計測装置は、光源、撮像部および制御解析部を有する。本発明の計測装置では、別個に用意されるデバイスは光源と撮像部との間に配置される。
【００８５】
光源は、デバイスの液体が満たされた空間に光を照射する。光源は、デバイスを挟んで撮像部の反対側に配置される。
【００８６】
撮像部は、制御解析部の制御の下でデバイスの液体が満たされた空間の透過光画像を撮像する。撮像部は、動画を撮像してもよいし静止画を撮像してもよい。撮像した透過光画像は、制御解析部に出力される。
【００８７】
制御解析部は、撮像部の動作を制御する。また、制御解析部は、本発明の深さ位置の計測方法の第２のステップおよび第３のステップの手順により撮像部が撮像した透過光画像を解析して、デバイスの液体が満たされた空間に存在する粒子の深さ位置を算出する。
【００８８】
本発明の計測装置は、本発明の計測方法の第１のステップ〜第３のステップを自動で行い、デバイスの液体が満たされた空間に存在する粒子の深さ位置を計測することができる（実施の形態４参照）。
【００８９】
本発明の計測装置は、ユーザに予備処理操作を要求せず、デバイスを配置した後は本発明の計測方法に従って自動で深さ位置を計測することができる。したがって、本発明の計測装置を用いることで、粒子の深さ位置を容易に計測することができる。
【００９０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。
【００９１】
（実施の形態１）
実施の形態１では、修飾粒子の中心領域の面積を指標として粒子群が真の凝集物であるかどうかを判別する検出装置の例を示す。
【００９２】
図１は、実施の形態１の検出装置の構成を示す模式図である。図１に示されるように、検出装置１００は、光源１０２、対物レンズ１０４、撮像部１０６、制御解析部１０８および電圧印加部１１０を有する。検出装置１００は、光源１０２と対物レンズ１０４との間に配置されたデバイス１２０の流路内（反応場）を観察し、パルスイムノアッセイ法で被検出物質を検出する。
【００９３】
光源１０２は、撮像部１０６がデバイス１２０の流路内の透過光画像を撮像するための光をデバイス１２０に照射する。
【００９４】
対物レンズ１０４は、撮像部１０６がデバイス１２０の流路内を拡大して撮像するためのレンズである。対物レンズ１０４は、デバイス１２０を挟んで光源１０２の反対側に配置される。対物レンズ１０４の倍率は、粒子直径と撮像部１０６の撮像素子の仕様に応じて、一つの粒子が縦横１０ピクセルずつ以上の大きさで撮像素子に写るよう、適宜設定される。一例として、粒子直径が２μｍの場合、撮像素子が１画素（ピクセル）サイズが３.４μｍ角の５００万画素を有するときは、対物レンズ１０４の倍率は１７倍となる。対物レンズ１０４の開口数は、特に限定されないが、一つの粒子の大きさを判別できる分解能と、反応場である流路の深さに亘ってピントが合う被写界深度を、それぞれ満足する値が選ばれる。粒子直径が２μｍで、流路の深さが１０μｍのときは、開口数は０.０５〜０.４１の範囲内が好ましい。
【００９５】
撮像部１０６は、デバイス１２０の流路内の透過光画像を撮像する。対物レンズ１０４および撮像部１０６は、光源１０２からの照射光（透過光）の光軸上に位置するように配置されることが好ましい。撮像部１０６は、動画を撮像してもよいし静止画を撮像してもよい。撮像した透過光画像は、制御解析部１０８に出力される。
【００９６】
例えば、光源１０２、対物レンズ１０４および撮像部１０６は、ＣＣＤカメラを取り付けた光学顕微鏡である。この場合、デバイス１２０は、光学顕微鏡のステージ上に載置される。
【００９７】
制御解析部１０８は、撮像部１０６および電圧印加部１１０の動作を制御するとともに、撮像部１０６が撮像した透過光画像を解析してデバイス１２０の流路内に存在する粒子の凝集率を算出する。
【００９８】
電圧印加部１１０は、コネクタ１１２を介してデバイス１２０の電極対に接続されており、制御解析部１０８の制御の下でデバイス１２０の流路（反応場）に交流電圧を印加する。
【００９９】
図２は、デバイス１２０の構成の一例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【０１００】
デバイス１２０ａは、上面基板１２２と、下面基板１２４と、前記上面基板１２２と下面基板１２４との間に配置された１対の電極１２６，１２７と、前記電極１２６，１２７とそれぞれ接続している１対の端子１２８，１２９とを有する。上面基板１２２は、下面基板１２４に面する面に凹部を有する。図２（Ａ）に示されるように、この凹部は、修飾粒子１４０を含む混合液１４２を提供される流路１３０として機能する。
【０１０１】
上面基板１２２および下面基板１２４は絶縁性の基板である。検出装置１００が流路１３０内の透過光画像を撮像するため、上面基板１２２および下面基板１２４は透明性を有することを要する。上面基板１２２および下面基板１２４の材料は、例えば透明性を有する有機絶縁材料や無機絶縁材料などである。
【０１０２】
透明性を有する有機絶縁材料の例には、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどが含まれる。上面基板１２２および下面基板１２４の材料をポリエチレンテレフタレートなどの有機材料とすることで、デバイス１２０の製造コストを抑制できるとともに製造プロセスを容易にすることができる。結果として、デバイス１２０の生産効率を大幅に向上させることができる。
【０１０３】
透明性を有する無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラスなどが含まれる。ガラスの例には、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスなどが含まれる。
【０１０４】
上面基板１２２および下面基板１２４の面積および厚さは、目的に応じて任意に設定することができる。また、流路１３０の幅および深さも、目的や提供される混合液の量に応じて任意に設定することができる。流路１３０の幅は、通常０.１〜１０ｍｍの範囲内が好ましく、０.２〜１ｍｍの範囲内が特に好ましい。流路１３０の長さは、通常５ｍｍ程度である。撮像部１０６が流路１３０内の粒子１４０を焦点ぼけすることなく撮像できるように、流路１３０の深さは２〜１５μｍの範囲内が好ましい。
【０１０５】
流路１３０の内部表面は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。また、流路１３０の内部表面の一部が親水性で、他の部分が疎水性であってもよい。さらに、流路１３０の内部表面は、修飾粒子１４０の吸着を抑制する表面処理が施されていてもよい。
【０１０６】
上面基板１２２または下面基板１２４は、流路１３０内に液体を提供するための注入口１３２、および流路１３０内の液体を排出するための排出口１３４を設けられていてもよい。注入口１３２および排出口１３４は、流路１３０と繋がっていれば、その位置や大きさは特に限定されない。
【０１０７】
電極１２６，１２７は、それぞれ端子１２８，１２９に接続されている。電圧印加部１１０のコネクタ１１２とデバイス１２０の端子１２８，１２９とを接続することで、電圧印加部１１０は電極１２６，１２７間に交流電圧を印加することができる。
【０１０８】
電極１２６，１２７の材料は、導電性を有し、かつ混合液中で交流電圧を印加しても溶解および剥離しないものであれば特に限定されない。電極１２６，１２７の材料の例には、金、銀、白金、銅、アルミ、クロム、ニッケル、タングステン、それらの合金などが含まれる。金は、スパッタにより電極１２６，１２７を下面基板１２４上に強固に成膜することが可能であり、かつ交流電圧の印加に対する安定性が高いため、電極１２６，１２７の材料として好ましい。
【０１０９】
電極１２６，１２７の膜厚は、１ｎｍ〜１０μｍの範囲内が好ましい。特に、スパッタを用いて電極１２６，１２７を形成するときは、製造時間の観点から、電極１２６，１２７の膜厚は、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内が好ましく、１００ｎｍ程度であることが特に好ましい。電極１２６，１２７の幅は、任意に設定することができるが、通常は約０.５ｍｍ〜約５ｍｍの範囲内である。
【０１１０】
電極１２６，１２７は、図２に示されるように、その一部が流路１３０内にはみ出していてもよい。電極１２６，１２７の露出幅は、０〜３ｍｍの範囲内が好ましく、０.０１〜０.２ｍｍの範囲内が特に好ましい。
【０１１１】
電極１２６，１２７間の間隔は、２０〜１０００μｍの範囲内であることが好ましい。間隔が２０μｍ未満の場合は、修飾粒子１４０がパールチェーン化するための領域を十分に確保できない。一方、間隔が１０００μｍを超える場合は、パールチェーン化を引き起こすための有効な電界強度を得るためには５０Ｖ以上の大きな電圧を印加しなければならなくなるため好ましくない。電極１２６，１２７間の間隔は、１００〜５００μｍの範囲内であることがより好ましく、５００μｍ程度であることが特に好ましい。電極１２６，１２７間の間隔は不変であるため、電圧印加部１１０は電極１２６，１２７間に印加する電圧を制御することで、反応場に印加する交流電界の電界強度を容易に制御することができる。
【０１１２】
図２に示されるデバイス１２０ａは、例えば、１）上面基板１２２および下面基板１２４を用意する第１のステップと、２）上面基板１２２に流路１３０の形状の凹部を形成する第２のステップと、３）下面基板１２４上に電極１２６，１２７を形成する第３のステップと、４）上面基板１２２と下面基板１２４とを貼り合わせる第４のステップとから作製することができる。
【０１１３】
第２のステップにおいて、上面基板１２２に凹部を形成する方法は、切削技術やレーザー除去技術、インプリント技術、フォトリソグラフィーなどの当業者に公知の技術から選択することができる。必要に応じて、注入口１３２および排出口１３４を形成してもよい。
【０１１４】
第３のステップにおいて、下面基板１２４上に電極１２６，１２７を形成する方法は、スパッタや蒸着などの薄膜堆積技術、印刷技術などの当業者に公知の技術から選択することができる。電極薄膜が薄いほど上面基板１２２と下面基板１２４との間の隙間を無くすことが可能であるが、スパッタはこのような薄い電極薄膜を容易に形成することができるので好ましい。
【０１１５】
第４のステップにおいて、上面基板１２２と下面基板１２４とを貼り合わせる方法は、当業者に公知の技術から選択することができる。
【０１１６】
図３は、デバイス１２０の構成の他の例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【０１１７】
デバイス１２０ｂは、上面基板１２２と、中間基板１３６と、下面基板１２４と、前記上面基板１２２と下面基板１２４との間に配置された１対の電極１２６，１２７と、前記電極１２６，１２７とそれぞれ接続している１対の端子１２８，１２９とを有する。デバイス１２０ｂでは、上面基板１２２に凹部を形成する代わりに、中間基板１３６を上面基板１２２と下面基板１２４との間に挟ませることで、流路１３０が形成される。
【０１１８】
デバイス１２０ｂでは、中間基板１３６の面積および厚さを調整することで、流路１３０の面積および深さを容易に制御することができる。また、平板状の上面基板１２２を使用することができる。さらに、その両面が接着性または粘着性を有する基板を中間基板１３６として用いることで、上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を容易に貼り合わせることができる。このように、デバイス１２０ｂは、製造効率の観点から優れている。
【０１１９】
図３に示されるデバイス１２０ｂは、例えば、１）上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を用意する第１のステップと、２）下面基板１２４上に電極１２６，１２７を形成する第２のステップと、３）上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を貼り合わせる第３のステップとから作製することができる。
【０１２０】
次に、上記構成を有する検出装置１００およびデバイス１２０を用いて被検出物質を検出する手順を、図４に示すフローチャートを用いて説明する。ここでは、試料と修飾粒子とを含む混合液が既に調製されているものとして説明する。
【０１２１】
まず、ステップＳ１０００で、試料と修飾粒子１４０とを含む混合液１４２がデバイス１２０の流路１３０内に提供される（図２（Ａ）参照）。流路１３０内に満たされた混合液１４２は電極１２６，１２７と接触する。混合液１４２に含まれる修飾粒子１４０は流路１３０内に所定の濃度で分散された状態となる。混合液１４２を流路１３０内に提供する代わりに、予め修飾粒子１４０を担持させた流路１３０内に液体試料を提供するようにしてもよい。
【０１２２】
次いで、ステップＳ１１００で、電圧印加部１１０はデバイス１２０の電極１２６，１２７間に交流電圧を所定の時間印加する。これにより、修飾粒子１４０は電場に平行な方向に一列に並ぶ（パールチェーン化）。
【０１２３】
次いで、ステップＳ１２００で、電圧印加部１１０は交流電圧の印加を停止する。混合液１４２中に被検出物質が存在していないときは、パールチェーン化していた修飾粒子１４０はブラウン運動により再度分散する。一方、混合液１４２中に被検出物質が存在しているときは、修飾粒子１４０は会合したままとなる。
【０１２４】
次いで、ステップＳ１３００で、撮像部１０６は、デバイス１２０の流路１３０内の透過光画像を撮像する。図６（Ａ）に示すように、撮像部１０６は、修飾粒子１４０の中心領域１４４の明度が周縁領域１４６の明度に比べて高くなるように透過光画像を撮像する。撮像した透過光画像は、制御解析部１０８に出力される。図７（Ａ）は、透過光画像の一例を示す図である。図７（Ａ）に示すように、透過光画像１５０には１または２以上の修飾粒子１４０からなる粒子群１５４ａ〜ｊが表示される。
【０１２５】
次いで、ステップＳ１４００で、制御解析部１０８は、撮像部１０６が撮像した透過光画像を解析してデバイス１２０の流路１３０内に存在する粒子群１５４ａ〜ｊが真の凝集物であるかどうかを判別する。このとき、制御解析部１０８は、透過光画像を二値化した画像から得られる修飾粒子１４０の特徴量を指標として粒子群１５４ａ〜ｊが真の凝集物であるかどうかを判別する。この粒子群判別処理については、別途詳細に説明する。
【０１２６】
次いで、ステップＳ１５００で、制御解析部１０８は、真の凝集物を構成する修飾粒子１４０の数と、修飾粒子１４０の総数から凝集率を算出する。算出された凝集率は混合液中の被検出物質の濃度に応じて高まるため、凝集率から被検出物質の濃度や量を算出することができる。
【０１２７】
次に、粒子群判別処理（ステップＳ１４００）の手順を図５に示すフローチャートを用いて説明する。
【０１２８】
まず、ステップＳ１４１０で、制御解析部１０８は、撮像部１０６が撮像した透過光画像を所定の閾値で二値化する。閾値は、修飾粒子の中心領域１４４の明度と修飾粒子の周縁領域１４６の明度との間、かつ修飾粒子の周縁領域１４６の明度と修飾粒子の周辺領域（背景）１４８の明度との間となるように設定される（図６（Ａ）参照）。このように閾値を設定して二値化することで、修飾粒子の中心領域１４４および周辺領域（背景）１４８は白色、周縁領域１４６は黒色（またはその逆）に変換される（図６（Ｂ）参照）。ここで、「修飾粒子の中心領域１４４」とは、粒子の中央近傍の領域であり、二値化により周縁領域１４６と区別されうる部分を意味する。また、「修飾粒子の周縁領域１４６」とは、粒子の輪郭近傍の領域であり、二値化により中心領域１４４と区別されうる部分を意味する。周辺領域１４８とは、粒子の外部の領域を含み、二値化により周縁領域１４６と区別されうる部分を意味する。図７（Ｂ）は、図７（Ａ）の透過光画像を二値化した画像を示す図である。
【０１２９】
次いで、ステップＳ１４２０で、制御解析部１０８は、二値化画像１５２に表示されている粒子群１５４ａ〜ｊのそれぞれについて、修飾粒子の中心領域の面積を指標としてその粒子群が真の凝集物であるか否かを判別する。具体的には、制御解析部１０８は、粒子群１５４を構成する各修飾粒子の中心領域１４４の面積を算出し、隣接する修飾粒子間の面積比が所定の範囲内であれば、これら２つの修飾粒子は会合していると判別し、範囲外であれば、これら２つの修飾粒子は会合していない（偶然重なっている）と判別する。本実施の形態では、粒子群を構成するすべての粒子が他の粒子と会合しているときに、当該粒子群が真の凝集物であると判別するものとする。
【０１３０】
図７（Ｂ）の二値化画像１５２を用いて説明する。例えば、粒子群１５４ａでは、構成する２つの修飾粒子の中心領域（白色の円）の面積はほぼ等しい。これら２つの修飾粒子間の面積比は約１となる。粒子群１５４ｄでは、構成する２つの修飾粒子の中心領域の面積は、粒子群１５４ａを構成する修飾粒子の中心領域の面積より小さいが、それぞれの面積はほぼ等しい。これら２つの修飾粒子間の面積比も約１となる。一方、粒子群１５４ｇでは、構成する２つの修飾粒子の中心領域の面積は異なっている。例えば、これら２つの修飾粒子間の面積比は０.６である。ここで面積比が０.７〜１.３の範囲内であるときに、制御解析部１０８は２つの粒子が会合していると判別するとする。この場合、粒子群１５４ａ，ｄは真の凝集物であると判別され、粒子群１５４ｇは偽の凝集物であると判別される。すなわち、粒子群１５４ｇは、修飾粒子が画像上で偶然重なって表示されているものと判別される。
【０１３１】
２つの粒子が会合しているかどうかを判別する基準となる面積比は、デバイスの流路１３０の深さや担体粒子の直径に応じて適宜設定することができる。例えば、流路１３０の深さが１０μｍで担体粒子の直径が２μｍの場合は、面積比が０.６８〜１.５の範囲内であるとき、２つの粒子が会合していると判別する。
【０１３２】
以上のように、本実施の形態の検出装置は、二値化画像から得られる粒子の中心領域の面積を指標として各粒子が隣接する他の粒子と会合しているかどうかを判別することで、デバイスの流路内に存在する粒子の凝集率をより正確に算出することができる。結果として、本実施の形態の検出装置は、高感度かつ高精度に被検出物質を検出および測定することができる。
【０１３３】
（実施の形態２）
実施の形態２では、互いに隣接する修飾粒子の中心領域の中心間距離を指標として粒子群が真の凝集物であるかどうかを判別する検出装置の例を示す。
【０１３４】
実施の形態２の検出装置は、実施の形態１の検出装置と同様の構成を有する（図１参照）。実施の形態１と実施の形態２では、制御解析部１０８が行う粒子群判別処理（ステップＳ１４００）のみが異なる。したがって、粒子群判別処理（ステップＳ１４００）の手順を図８に示すフローチャートを用いて説明する。
【０１３５】
まず、ステップＳ１４１０で、制御解析部１０８は、撮像部１０６が撮像した透過光画像を所定の閾値で二値化する。閾値は、修飾粒子の中心領域１４４の明度と修飾粒子の周縁領域１４６の明度との間、かつ修飾粒子の周縁領域１４６の明度と修飾粒子の周辺領域（背景）１４８の明度との間となるように設定される（図６（Ａ）参照）。このように閾値を設定して二値化することで、修飾粒子の中心領域１４４および周辺領域（背景）１４８は白色、周縁領域１４６は黒色（またはその逆）に変換される（図６（Ｂ）参照）。図９（Ａ）は、図７（Ａ）の透過光画像を二値化した画像を示す図である。
【０１３６】
次いで、ステップＳ１４３０で、制御解析部１０８は、二値化画像１５２に表示されている粒子群１５４ａ〜ｊのそれぞれについて、２つの修飾粒子の中心領域の中心間距離を指標としてその粒子群が真の凝集物であるか否かを判別する。具体的には、制御解析部１０８は、複数の修飾粒子から構成される粒子群１５４のそれぞれについて、構成する各修飾粒子の中心領域１４４の中心点を決定し、隣接する修飾粒子について中心点間の距離を算出する。制御解析部１０８は、隣接する修飾粒子の中心点間の距離が所定の範囲内であれば、これら２つの修飾粒子は会合していると判別し、範囲外であれば、これら２つの修飾粒子は会合していない（偶然重なっている）と判別する。本実施の形態では、粒子群を構成する粒子の少なくとも１つが他の粒子と会合しているときに、当該粒子群が真の凝集物であると判別するものとする。
【０１３７】
図９（Ｂ）の二値化画像１５２を用いて説明する。例えば、粒子群１５４ａでは、構成する２つの修飾粒子の中心領域（白色の円）の中心間距離は修飾粒子の直径とほぼ等しい。これら２つの修飾粒子の中心領域の中心間距離は、修飾粒子の直径の約１倍である。粒子群１５４ｅでは、構成する２つの修飾粒子の中心間距離は修飾粒子の直径よりも長い。例えば、これら２つの修飾粒子の中心領域の中心間距離は、修飾粒子の直径の約１.３倍である。粒子群１５４ｇでは、構成する２つの修飾粒子の中心間距離は修飾粒子の直径よりも短い。例えば、これら２つの修飾粒子の中心領域の中心間距離は、修飾粒子の直径の約０.７倍である。ここで２つの修飾粒子の中心領域の中心間距離が、修飾粒子の直径の０.８〜１.２倍の範囲内であるときに制御解析部１０８は２つの粒子が会合していると判別するとする。この場合、粒子群１５４ａは真の凝集物であると判別され、粒子群１５４ｅ，ｇは偽の凝集物であると判別される。すなわち、粒子群１５４ｅは、修飾粒子が画像上で偶然接近して表示されているものと判別され、粒子群１５４ｇは、修飾粒子が画像上で偶然重なって表示されているものと判別される。
【０１３８】
２つの粒子が会合しているかどうかを判別する基準となる中心間距離は、二値化画像１５２に応じて適宜設定することができる。例えば、倍率１０〜４０倍の対物レンズで撮像した複数の画像に同一の規格を適用する場合は、レンズが持つ収差などの撮像要因により、中心間距離が１倍よりも小さな範囲、具体的には、粒子の平均直径の０.５７〜０.７５倍の範囲内であるとき、２つの粒子が会合していると判別する。
【０１３９】
図１０は、３つ以上の修飾粒子から構成される粒子群を含む二値化画像の例を示す図である。前述の通り、本実施の形態では、粒子群を構成する粒子の少なくとも１つが他の粒子と会合しているときに、当該粒子群が真の凝集物であると判別するものとする。この場合、制御解析部１０８は、二値化画像１５２に表示されている粒子群１５４ｋ〜ｔのそれぞれについて、最小の中心間距離を指標としてその粒子群１５４ｋ〜ｔが真の凝集物であるか否かを判別すればよい。
【０１４０】
例えば、粒子群１５４ｍ，ｓでは、構成する３つの修飾粒子の中心領域の中心間距離はそれぞれ異なっている。この図では、最小の中心間距離を実線で示し、その他の中心間距離を破線で示している。粒子群１５４ｍ，ｓの３つの中心間距離のうちの最小の中心間距離（実線）は、修飾粒子の直径の約１倍である。したがって、粒子群１５４ｍ，ｓは真の凝集物であると判別される。また、粒子群１５４ｐでは、構成する３つの修飾粒子の中心領域の中心間距離はほぼ同じであり、それぞれ修飾粒子の直径の約１倍である。したがって、粒子群１５４ｐも真の凝集物であると判別される。一方、粒子群１５４ｋの最小の中心間距離は、例えば修飾粒子の直径の約１.３倍である。したがって、粒子群１５４ｋは偽の凝集物であると判別される。
【０１４１】
以上のように、本実施の形態の検出装置は、二値化画像から得られる隣接する粒子の中心領域の中心間距離を指標として各粒子が隣接する他の粒子と会合しているかどうかを判別することで、デバイスの流路内に存在する粒子の凝集率をより正確に算出することができる。結果として、本実施の形態の検出装置は、高感度かつ高精度に被検出物質を検出および測定することができる。
【０１４２】
（実施の形態３）
実施の形態３では、凝集率を複数回算出し、算出された複数の凝集率のうちの最小値を凝集率として採用する検出装置の例を示す。
【０１４３】
実施の形態３の検出装置は、実施の形態１，２の検出装置と同様の構成（図１参照）を有するが、凝集率の算出方法が異なる。そこで、実施の形態３の検出装置を用いて被検出物質を検出する手順を、図１１に示すフローチャートを用いて説明する。
【０１４４】
まず、ステップＳ１０００で、試料と修飾粒子１４０とを含む混合液１４２がデバイス１２０の流路１３０内に提供される。次いで、ステップＳ１１００で、電圧印加部１１０はデバイス１２０の電極１２６，１２７間に交流電圧を所定の時間印加する。次いで、ステップＳ１２００で、電圧印加部１１０は交流電圧の印加を停止する。ステップＳ１０００〜Ｓ１３００は、実施の形態１で説明した各ステップと同様の処理である。
【０１４５】
次いで、ステップＳ１３００で、撮像部１０６はデバイス１２０の流路１３０内の透過光画像を撮像する。次いで、ステップＳ１４００で、制御解析部１０８は撮像部１０６が撮像した透過光画像を解析してデバイス１２０の流路１３０内に存在する粒子群が真の凝集物であるか否かを判別する。次いで、ステップＳ１５００で、制御解析部１０８は、真の凝集物を構成する修飾粒子１４０の数と、修飾粒子１４０の総数から凝集率を算出する。ステップＳ１３００〜Ｓ１５００は、実施の形態１，２で説明した各ステップと同様の処理である。
【０１４６】
次いで、ステップＳ１６００で、凝集率を算出した回数が所定の回数に達しているかどうかを判別する。凝集率を算出した回数が所定の回数に達していない場合は（ステップＳ１６００：ＮＯ）、ステップＳ１３００に戻り、所定の回数に達するまで凝集率の算出を繰り返す。すなわち、ステップＳ１２００を終えた後、反応場の透過光画像を異なるタイミングで所定の枚数撮像し、透過光画像のそれぞれについて凝集率を算出する。凝集率を算出した回数が所定の回数に達している場合は（ステップＳ１６００：ＹＥＳ）、ステップＳ１７００に進む。
【０１４７】
ステップＳ１３００〜Ｓ１５００を繰り返す際の撮像間隔は、撮像部１０６の性能に応じて適宜設定することができる。撮像間隔は、１００ミリ秒〜６０秒の範囲内が好ましく、１〜５秒の範囲内が特に好ましい。また、ステップＳ１３００〜Ｓ１５００を繰り返す回数は、制御解析部１０８の処理能力や処理速度、画像保存容量などに応じて適宜設定することができる。透過光画像の撮像枚数は、２枚以上であれば特に限定されず、多いほど好ましい。例えば、透過光画像の撮像枚数は、４〜１５枚の範囲内であってもよい。混合液中の粒子の濃度が０.４重量％で流路の深さが１０μｍの場合は、透過光画像の撮像枚数は４枚以下で十分である。また、透過光画像の撮像開始時期は、凝集していない粒子が十分に分散した後であれば任意に選択することができる。透過光画像の撮像開始時期は、交流電圧の印加を停止してから３０〜６０秒後である。
【０１４８】
ステップＳ１７００では、ステップＳ１５００で複数回算出された凝集率のうち最小値の凝集率を選択する。本実施の形態の検出装置は、この最小値の凝集率を反応場における凝集率として採用し、被検出物質の濃度や量を算出する。
【０１４９】
以上のように、本実施の形態の検出装置は、凝集率を複数回算出し、複数の凝集率のうち最小値の凝集率を反応場における凝集率として採用することで、偶然による粒子の重なりおよび接近の影響が最も少ない凝集率を得ることができる。
【０１５０】
（実施の形態４）
実施の形態４では、粒子の中心領域の面積を指標として粒子の深さ位置を計測する計測装置の例を示す。
【０１５１】
図１２は、実施の形態４の深さ位置計測装置の構成を示す模式図である。図１２に示されるように、深さ位置計測装置２００は、光源１０２、対物レンズ１０４、撮像部１０６および制御解析部２０２を有する。深さ位置計測装置２００は、光源１０２と対物レンズ１０４との間に配置されたデバイス２１０の流路内を観察し、流路内に存在する粒子の深さ位置を計測する。
【０１５２】
光源１０２、対物レンズ１０４および撮像部１０６は、実施の形態１の検出装置の光源１０２、対物レンズ１０４および撮像部１０６と同様のものである。撮像部１０６が撮像した透過光画像は、制御解析部２０２に出力される。
【０１５３】
例えば、光源１０２、対物レンズ１０４および撮像部１０６は、ＣＣＤカメラを取り付けた光学顕微鏡である。この場合、デバイス１２０は、光学顕微鏡のステージ上に載置される。
【０１５４】
制御解析部２０２は、撮像部１０６の動作を制御するとともに、撮像部１０６が撮像した透過光画像を解析してデバイス２１０の流路内に存在する粒子の流路内における深さ位置を算出する。
【０１５５】
図１３は、デバイス２１０の構成の一例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【０１５６】
デバイス２１０ａは、上面基板１２２および下面基板１２４を有する。上面基板１２２は、下面基板１２４に面する面に凹部を有する。図１３（Ａ）に示されるように、この凹部は、粒子２１２を含む液体２１４を提供される流路１３０として機能する。上面基板１２２および下面基板１２４は、実施の形態１で説明したものと同様のものである。
【０１５７】
図１３に示されるデバイス２１０ａは、例えば、１）上面基板１２２および下面基板１２４を用意する第１のステップと、２）上面基板１２２に流路１３０の形状の凹部を形成する第２のステップと、３）上面基板１２２と下面基板１２４とを貼り合わせる第３のステップとから作製することができる。
【０１５８】
第２のステップにおいて、上面基板１２２に凹部を形成する方法は、切削技術やレーザー除去技術、インプリント技術、フォトリソグラフィーなどの当業者に公知の技術から選択することができる。必要に応じて、注入口１３２および排出口１３４を形成してもよい。
【０１５９】
第３のステップにおいて、上面基板１２２と下面基板１２４とを貼り合わせる方法は、当業者に公知の技術から選択することができる。
【０１６０】
図１４は、デバイス２１０の構成の他の例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【０１６１】
デバイス２１０ｂは、上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を有する。デバイス２１０ｂでは、上面基板１２２に凹部を形成する代わりに、中間基板１３６を上面基板１２２と下面基板１２４との間に挟ませることで、流路１３０が形成される。
【０１６２】
デバイス２１０ｂでは、中間基板１３６の面積および厚さを調整することで、流路１３０の面積および深さを容易に制御することができる。また、平板状の上面基板１２２を使用することができる。さらに、その両面が接着性または粘着性を有する基板を中間基板１３６として用いることで、上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を容易に貼り合わせることができる。このように、デバイス２１０ｂは、製造効率の観点から優れている。
【０１６３】
図１４に示されるデバイス２１０ｂは、例えば、１）上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を用意する第１のステップと、２）上面基板１２２、中間基板１３６および下面基板１２４を貼り合わせる第２のステップとから作製することができる。
【０１６４】
次に、上記構成を有する深さ位置計測装置２００およびデバイス２１０を用いて被検出物質を検出する手順を、図１５に示すフローチャートを用いて説明する。ここでは、粒子を含む液体が既に調製されているものとして説明する。
【０１６５】
まず、ステップＳ２０００で、粒子２１２を含む液体２１４がデバイス２１０の流路１３０内に提供される（図１３（Ａ）参照）。液体２１４は流路１３０内に満たされ、粒子２１２は流路１３０内に所定の濃度で分散された状態となる。粒子２１２を含む液体２１４を流路１３０内に提供する代わりに、予め粒子２１２を担持させた流路１３０内に液体を提供するようにしてもよい。
【０１６６】
次いで、ステップＳ２１００で、撮像部１０６は、デバイス２１０の流路１３０内の透過光画像を撮像する。撮像部１０６は、粒子２１２の中心領域の明度が周縁領域の明度に比べて高くなるように透過光画像を撮像する（図６（Ａ）参照）。撮像した透過光画像は、制御解析部２０２に出力される。
【０１６７】
次いで、ステップＳ２２００で、制御解析部２０２は、撮像部１０６が撮像した透過光画像を所定の閾値で二値化する。閾値は、粒子２１２の中心領域の明度と粒子２１２の周縁領域の明度との間、かつ粒子２１２の周縁領域の明度と粒子２１２の周辺領域（背景）の明度との間となるように設定される（図６（Ａ）参照）。このように閾値を設定して二値化することで、粒子２１２の中心領域および周辺領域（背景）は白色、周縁領域は黒色（またはその逆）に変換される（図６（Ｂ）参照）。
【０１６８】
次いで、ステップＳ２３００で、制御解析部２０２は、二値化画像に表示されている各粒子２１２の中心領域の面積を算出する。
【０１６９】
次いで、ステップＳ２４００で、制御解析部２０２は、予め作成された粒子２１２の深さ位置と粒子２１２の中心領域の面積との関係式を参照して、各粒子２１２の流路１３０内における深さ位置を算出する。
【０１７０】
以上のように、本実施の形態の計測装置は、二値化画像から得られる粒子の中心領域の面積を指標として各粒子の深さ位置を算出することができる。例えば、本実施の形態の計測装置は、ラテックス凝集法などにおいて隣接する粒子が凝集しているかどうかを判別することもできる。
【実施例】
【０１７１】
以下、本発明を実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【０１７２】
［実施例１］
実施例１では、流路内に分散させた粒子の深さ位置を実施の形態４に記載の方法および装置を用いて計測した例を示す。
【０１７３】
１．粒子懸濁液の調製
平均直径２μｍのラテックスビーズ（Bangs Laboratories社）を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に希釈して、粒子懸濁液（粒子０.４％）を調製した。
【０１７４】
２．デバイスの作製
本実施例では、パルスイムノアッセイ用のデバイス（図３参照）を使用した。
【０１７５】
厚さ１ｍｍの石英ガラス基板（下面基板）上に電極パターンを有するステンシルマスク（ステンレス製）を通してスパッタして、電極および端子となる膜厚１００ｎｍの金薄膜を形成した。長辺が対向するように配置された１対の矩形電極間の間隔は０.５ｍｍとした。次いで、流路パターンを有する両面接着ＰＥＴフィルム（中間基板）を流路部分が電極間に位置するようにガラス基板および電極上に貼りあわせ、さらにこのＰＥＴフィルム上に厚さ０.３ｍｍのカバーガラス（上面基板）を貼りあわせて、深さ１０μｍ程度の流路を有するデバイスを作製した（図３参照）。
【０１７６】
３．測定
デバイスの流路内に粒子懸濁液を１μＬ提供した後、倒立型システム顕微鏡（オリンパス株式会社）を用いて流路内を透過光観察し、流路内の透過光画像（撮像範囲：２７５×２２０μｍ）を撮像した。対物レンズは、倍率が４０倍、開口数が０.１のものを使用した。光源にはハロゲンランプを使用し、ケラー照明系を通じてデバイスの流路に照明光を照射した。撮像素子は、１／１.８インチＣＣＤ（５００万画素，有効画素２５６０×１９２０ピクセル）を使用した。
【０１７７】
取得した画像を８ビット（２５６階調）のグレースケールに変換した後、さらに二値化した。二値化の閾値は、前述の大津の方法を用いて画像ごとに最適な値を算出した。その結果、粒子の周縁領域のみを黒色に変換し、粒子の中心領域および周辺領域（背景）を白色に変換することができた。二値化画像を解析し、各粒子の中心領域の面積を求めた。
【０１７８】
また、倒立型システム顕微鏡による観察と併せて、レーザー変位計（ＬＴ−９０００：株式会社キーエンス）を用いてデバイスの上面から流路内の各粒子の深さ位置を計測した。
【０１７９】
４．結果
図１６は、流路内の透過光画像および落射光画像（比較例）である。図１６（Ａ）は１つの粒子の透過光画像であり、図１６（Ｂ）は２つの粒子から構成される粒子群の透過光画像である。図１６（Ｃ）は図１６（Ｂ）の画像の二値化画像（閾値：１３４）である。また、図１６（Ｄ）は１つの粒子の落射光画像であり、図１６（Ｅ）は２つの粒子から構成される粒子群の落射光画像である。図１６（Ｆ）は図１６（Ｅ）の画像の二値化画像（閾値：１１２）である。
【０１８０】
図１６（Ａ）〜（Ｃ）に示されるように、流路内を透過光観察した場合は、粒子の中心領域の明度が粒子の周縁領域の明度よりも高い画像を撮像することができた。一方、図１６（Ｄ）〜（Ｆ）に示されるように、流路内を落射光観察した場合は、粒子の中心領域および周縁領域の明度が背景（周辺領域）よりも低い画像しか撮像できなかった。
【０１８１】
図１７は、各粒子の深さ位置と二値化画像における中心領域の面積との関係を示すグラフである。横軸は各粒子の深さ位置（上面基板の下面からの距離）を示し、縦軸は各粒子の二値化画像における中心領域の面積を示す。デバイスの上面からレーザー光を照射して各粒子の深さ位置を測定したため、横軸は上面基板の下面と各粒子の上端との最短距離を示していると推測される。したがって、直径２μｍの粒子が流路（深さ１０μｍ）の底に沈んでいるときは、この粒子の深さ位置は８μｍとなる。図１７のグラフにおいて、深さ位置が６〜８μｍの粒子が多いのは、粒子の比重（１.０５ｇ／ｍＬ）が緩衝液の比重に比べて大きく、粒子が流路の底面付近に分散しているためと考えられる。
【０１８２】
図１７のグラフに示されるように、粒子の二値化画像における中心領域の面積と粒子の深さ位置との間には良好な相関関係が観察された。決定係数は０.６９であった。このように、粒子の二値化画像における中心領域の面積を求めることで、流路内に分散させた粒子の深さ位置を計測することができた。
【０１８３】
［実施例２］
実施例２では、実施の形態１に記載の方法および装置を用いて粒子の凝集率を算出した例を示す。
【０１８４】
１．修飾粒子懸濁液および試料溶液の調製
Ｃ反応性タンパク（C-reactive protein；以下「ＣＲＰ」と略記する）を緩衝溶液に溶解させて、それぞれ異なる濃度の試料溶液を複数調製した。ＣＲＰは、体内で炎症反応や組織の破壊が起きているときに血中に現れるため、炎症反応の指標となりうるタンパク質である。試料溶液中のＣＲＰの濃度は、４.８×１０−７Ｍ，４.８×１０−８Ｍ，４.８×１０−９Ｍ，４.８×１０−１０Ｍ，４.８×１０−１１Ｍ，４.８×１０−１２Ｍ，４.８×１０−１３Ｍ，４.８×１０−１４Ｍとした。
【０１８５】
平均直径２μｍのラテックスビーズを担体粒子として用意し、抗ＣＲＰポリクローナル抗体をその表面に固定化した。抗体を固定化された修飾粒子を緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０ｍＭ グリシン，０.１％ ＢＳＡ，ｐＨ８.６）に希釈して、修飾粒子懸濁液（担体粒子０.４重量％）を調製した。
【０１８６】
２．デバイスの作製
実施例１と同様の手順でパルスイムノアッセイ用のデバイスを作製した。
【０１８７】
３．測定
デバイスに印加する電圧ならびにその周波数および波形を制御するべく、ファンクションジェネレータ（３３１２０Ａ；アジレント・テクノロジー株式会社）および高速バイポーラ電源（４０５５；株式会社エヌエフ回路設計ブロック）を電圧印加部としてデバイスに接続した。
【０１８８】
試料溶液を修飾粒子懸濁液に加えて調製した混合液１μＬをデバイスの流路内に提供した。試料溶液を修飾粒子懸濁液に加えてから９０秒後に、デバイスの１対の電極間に交流電圧（１００ｋＨｚ，２０Ｖｐ−ｐ，矩形波）を６０秒間印加して、修飾粒子をパールチェーン化させた。電圧の印加を停止してから６０秒後に、倒立型システム顕微鏡を用いて流路内を透過光観察し、流路内の透過光画像を５秒おきに合計１２枚撮像した。倒立型システム顕微鏡および撮像素子は、実施例１と同様のものである。
【０１８９】
取得した画像を実施例１と同様の手順で二値化した。その結果、修飾粒子の周縁領域のみを黒色に変換し、担体粒子の中心領域および周辺領域（背景）を白色に変換することができた。
【０１９０】
二値化画像上の各修飾粒子を、他の粒子に会合している粒子（以下「会合粒子」という）と他の粒子に会合していない粒子（以下「非会合粒子」という）とに分類した。具体的には、他の粒子と隣接していない粒子については、すべて非会合粒子に分類した。他の粒子と隣接している粒子については、当該他の粒子の二値化画像における中心領域の面積に対する当該粒子の二値化画像における中心領域の面積が０.６８〜１.５の範囲内であるものを会合粒子に分類し、範囲外であるものを非会合粒子に分類した。
【０１９１】
各試料溶液について、会合粒子の数と非会合粒子の数とから、以下の式（３）で修飾粒子の凝集率を算出した。
【数３】
2010032327.tif 000005
【０１９２】
また、比較例として、二値化画像における中心領域の面積を参照せずに、他の粒子と隣接している粒子を会合粒子に分類し、他の粒子と隣接していない粒子を非会合粒子に分類した。各試料溶液について、会合粒子の数と非会合粒子の数とから、修飾粒子の凝集率を算出した。
【０１９３】
４．結果
図１８は、試料溶液中の抗原（ＣＲＰ）の濃度と凝集率との関係を示すグラフである。横軸は抗原の濃度を示し、縦軸は凝集率を示している。実線（黒丸）は、二値化画像における中心領域の面積を参照して凝集率を算出した結果（実施例）を示し、破線（白四角）は、二値化画像における中心領域の面積を参照しないで凝集率を算出した結果（比較例）を示す。エラーバーは標準偏差を示している。
【０１９４】
図１８に示すように、凝集率が２０％以下となる抗原濃度（１×１０−１１〜１×１０−１４Ｍ）では、実施例の凝集率が比較例の凝集率に比べて有意に低い値となった。例えば、抗原濃度が４.８×１０−１４Ｍのとき、比較例の凝集率は１４.３％であったのに対し、実施例の凝集率は８.４％と６％近く低い値であった。一方、凝集率が７０％以上となる抗原濃度（１×１０−９〜１×１０−８Ｍ）では、実施例の凝集率と比較例の凝集率との間に有意な差は見られなかった。例えば、抗原濃度が４.８×１０−８Ｍのとき、比較例の凝集率は８２.４％であったのに対し、実施例の凝集率は７９.９％とほとんど同じ値（２.５％の差）であった。
【０１９５】
パルスイムノアッセイ法の原理より、凝集率が７０％以上となると会合粒子が支配的となり、凝集率が２０％以下となると非会合粒子が支配的となる。本実施例において、非会合粒子が支配的となる領域で凝集率が顕著に低減したということは、偶然による修飾粒子の重なりなどの偽の凝集物を的確に排除し、より真の値に近い凝集率を算出できたことを示している。さらに、会合粒子が支配的となる領域で凝集率が低減していないことから、同じ抗原濃度範囲に対する凝集率の応答レンジが拡大したといえる。
【０１９６】
以上のように、修飾粒子の二値化画像における中心領域の面積を参照して各粒子が他の粒子と会合しているかどうかを判別することによって、被検出物質をより高感度かつ高精度に検出することができた。
【０１９７】
［実施例３］
実施例３では、実施の形態２に記載の方法および装置を用いて修飾粒子の凝集率を算出した例を示す。
【０１９８】
１．修飾粒子懸濁液および試料溶液の調製
実施例２と同様の手順で修飾粒子懸濁液および試料溶液を調製した。
【０１９９】
２．デバイスの作製
実施例１と同様の手順でパルスイムノアッセイ用のデバイスを作製した。
【０２００】
３．測定
実施例２と同様の手順で修飾粒子をパールチェーン化させた後、流路内の透過光画像を５秒おきに合計１２枚撮像した。
【０２０１】
取得した画像を実施例１と同様の手順で二値化した。その結果、修飾粒子の周縁領域のみを黒色に変換し、修飾粒子の中心領域および周辺領域（背景）を白色に変換することができた。
【０２０２】
二値化画像上の各修飾粒子を会合粒子と非会合粒子とに分類した。具体的には、他の粒子と隣接していない粒子については、すべて非会合粒子に分類した。他の粒子と隣接している粒子については、当該粒子の二値化画像における中心領域と他の粒子の二値化画像における中心領域との中心間距離が修飾粒子の平均直径の０．５７〜０．７５倍の範囲内であるものを会合粒子に分類し、範囲外であるものを非会合粒子に分類した。
【０２０３】
各試料溶液について、会合粒子の数と非会合粒子の数とから、前述の式で修飾粒子の凝集率を算出した。
【０２０４】
また、比較例として、二値化画像における中心領域の中心間距離を参照せずに、他の粒子と隣接している粒子を会合粒子に分類し、他の粒子と隣接していない粒子を非会合粒子に分類した。各試料溶液について、会合粒子の数と非会合粒子の数とから、修飾粒子の凝集率を算出した。
【０２０５】
４．結果
図１９は、試料溶液中の抗原（ＣＲＰ）の濃度と凝集率との関係を示すグラフである。横軸は抗原の濃度を示し、縦軸は凝集率を示している。実線（黒丸）は、二値化画像における中心領域の中心間距離を参照して凝集率を算出した結果（実施例）を示し、破線（白四角）は、二値化画像における中心領域の中心間距離を参照しないで凝集率を算出した結果（比較例）を示す。エラーバーは標準偏差を示している。
【０２０６】
図１９に示すように、凝集率が２０％以下となる抗原濃度（１×１０−１１〜１×１０−１４Ｍ）では、実施例の凝集率が比較例の凝集率に比べて有意に低い値となった。例えば、抗原濃度が４.８×１０−１４Ｍのとき、比較例の凝集率は１４.３％であったのに対し、実施例の凝集率は９.０％と５％近く低い値であった。一方、凝集率が７０％以上となる抗原濃度（１×１０−９〜１×１０−８Ｍ）では、実施例の凝集率と比較例の凝集率との間に有意な差は見られなかった。例えば、抗原濃度が４.８×１０−８Ｍのとき、比較例の凝集率は８２.４％であったのに対し、実施例の凝集率は８１.０％とほとんど同じ値（１.５％の差）であった。
【０２０７】
本実施例において、非会合粒子が支配的となる領域で凝集率が顕著に低減したということは、偶然による修飾粒子の重なりなどの偽の凝集物を的確に排除し、より真の値に近い凝集率を算出できたことを示している。さらに、会合粒子が支配的となる領域で凝集率が低減していないことから、同じ抗原濃度範囲に対する凝集率の応答レンジが拡大したといえる。
【０２０８】
以上のように、修飾粒子の二値化画像における中心領域の中心間距離を参照して各粒子が他の粒子と会合しているかどうかを判別することによって、被検出物質をより高感度かつ高精度に検出することができた。
【０２０９】
［実施例４］
実施例４では、実施の形態３に記載の方法および装置を用いて担体粒子の凝集率を算出した例を示す。
【０２１０】
１．修飾粒子懸濁液および試料溶液の調製
実施例２と同様の手順で修飾粒子懸濁液および試料溶液を調製した。
【０２１１】
２．デバイスの作製
実施例１と同様の手順でパルスイムノアッセイ用のデバイスを作製した。
【０２１２】
３．測定
実施例２と同様の手順で修飾粒子をパールチェーン化させた後、流路内の透過光画像を５秒おきに合計１２枚撮像した。取得した画像を実施例１と同様の手順で二値化した。その結果、修飾粒子の周縁領域のみを黒色に変換し、修飾粒子の中心領域および周辺領域（背景）を白色に変換することができた。
【０２１３】
二値化画像上の各修飾粒子を会合粒子と非会合粒子とに分類した。具体的には、他の粒子と隣接していない粒子については、すべて非会合粒子に分類した。他の粒子と隣接している粒子については、当該他の粒子の二値化画像における中心領域の面積に対する当該粒子の二値化画像における中心領域の面積が０.６８〜１.５の範囲内であるものを会合粒子に分類し、範囲外であるものを非会合粒子に分類した。
【０２１４】
各試料溶液について、二値化画像（全１２枚）ごとに前述の式で修飾粒子の凝集率を算出した。算出された１２の凝集率のうちの最小値を当該試料溶液における凝集率とした。
【０２１５】
４．結果
図２０は、試料溶液中の抗原（ＣＲＰ）の濃度と凝集率との関係を示すグラフである。横軸は抗原の濃度を示し、縦軸は凝集率を示している。実線（黒丸）は、二値化画像における中心領域の面積を参照して算出した凝集率の最小値（実施例）を示し、破線（三角）は、二値化画像における中心領域の面積を参照しないで凝集率を算出した結果（比較例）を示す。エラーバーは標準偏差を示している（比較例のみ）。
【０２１６】
図２０に示すように、凝集率が２０％以下となる抗原濃度（１×１０−１１〜１×１０−１４Ｍ）では、実施例の凝集率が比較例の凝集率に比べて有意に低い値となった。例えば、抗原濃度が４.８×１０−１３Ｍのとき、比較例の凝集率は１２.９％であったのに対し、実施例の凝集率は１.７％と１１％近く低い値であった。一方、凝集率が７０％以上となる抗原濃度（１×１０−９〜１×１０−８Ｍ）では、実施例の凝集率と比較例の凝集率との間にそれほど大きな差は見られなかった。例えば、抗原濃度が４.８×１０−８Ｍのとき、比較例の凝集率は８２.４％であったのに対し、実施例の凝集率は７６.７％とそれほど大きな差は見られなかった（５.７％の差）。
【０２１７】
前述の通り、本実施例において、非会合粒子が支配的となる領域で凝集率が顕著に低減したということは、偶然による修飾粒子の重なりなどの偽の凝集物を的確に排除し、より真の値に近い凝集率を算出できたことを示している。さらに、会合粒子が支配的となる領域で凝集率が低減していないことから、同じ抗原濃度範囲に対する凝集率の応答レンジが拡大したといえる。
【０２１８】
以上のように、修飾粒子の二値化画像における中心領域の面積を参照して各粒子が他の粒子と会合しているかどうかを判別し、かつ複数回算出した凝集率のうちの最小値を参照することによって、被検出物質をより高感度かつ高精度に検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【０２１９】
本発明の検出方法および検出装置は、生体試料、特に血液などに含まれるタンパク質などの生体構成成分を分析する検出方法および検出装置として有用である。本発明の検出方法および検出装置は、血液試料に含まれるタンパク質や健康指標物質などを検出するＰＯＣＴ診断バイオセンサなどの用途にも応用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】実施の形態１の検出装置の構成を示す模式図である。
【図２】検出装置のデバイスの構成の一例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【図３】検出装置のデバイスの構成の他の例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【図４】実施の形態１の検出装置の動作を示すフローチャートである。
【図５】実施の形態１の検出装置の粒子群判別処理の内容を示すフローチャートである。
【図６】（Ａ）は粒子の透過光画像の模式図であり、（Ｂ）は粒子の二値化画像の模式図である。
【図７】（Ａ）は反応場の透過光画像の模式図であり、（Ｂ）は反応場の二値化画像の模式図である。
【図８】実施の形態２の検出装置の粒子群判別処理の内容を示すフローチャートである。
【図９】（Ａ），（Ｂ）ともに反応場の二値化画像の模式図である。
【図１０】反応場の二値化画像の模式図である。
【図１１】実施の形態３の検出装置の動作を示すフローチャートである。
【図１２】実施の形態４の深さ位置計測装置の構成を示す模式図である。
【図１３】深さ位置計測装置のデバイスの構成の一例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【図１４】深さ位置計測装置のデバイスの構成の他の例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図である。
【図１５】実施の形態４の深さ位置計測装置の動作を示すフローチャートである。
【図１６】（Ａ），（Ｂ）は流路内の透過光画像であり、（Ｃ）は（Ｂ）の画像の二値化画像である。（Ｄ），（Ｅ）は流路内の落射光画像であり、（Ｆ）は（Ｅ）の画像の二値化画像である。
【図１７】実施例１の結果を示すグラフである。
【図１８】実施例２の結果を示すグラフである。
【図１９】実施例３の結果を示すグラフである。
【図２０】実施例４の結果を示すグラフである。
【図２１】従来の検出方法を説明するための模式図であって、（Ａ）は反応場を撮像した画像を示す図、（Ｂ）は（Ａ）の画像を二値化した画像を示す図である。
【符号の説明】
【０２２１】
１０  反応場の画像
１２  二値化画像
１４  粒子群
１００  検出装置
１０２  光源
１０４  対物レンズ
１０６  撮像部
１０８，２０２  制御解析部
１１０  電圧印加部
１１２  コネクタ
１２０，２１０  デバイス
１２２  上面基板
１２４  下面基板
１２６，１２７  電極
１２８，１２９  端子
１３０  流路
１３２  注入口
１３４  排出口
１３６  中間基板
１４０  修飾粒子
１４２  混合液
１４４  中心領域
１４６  周縁領域
１４８  周辺領域（背景）
１５０  透過光画像
１５２  二値化画像
１５４  粒子群
２００  深さ位置計測装置
２１２  粒子
２１４  液体
【図１】
2010032327.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2010032327.tif 000020
【図１７】
2010032327.tif 000021
【図１８】
2010032327.tif 000022
【図１９】
2010032327.tif 000023
【図２０】
2010032327.tif 000024
【図２１】
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【図１６】
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