(57)【要約】      （修正有）【課題】根からのクエン酸放出能力を強化した形質転換植物の作出。【解決手段】以下の（ａ）特定のＤＮＡ、（ｂ）特定の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつその翻訳産物が（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ、（ｃ）特定の塩基配列の一部を含み、かつその翻訳産物が（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ、および（ｄ）該（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその翻訳産物が（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、形質転換体および種子、ならびに該ＤＮＡの利用方法。【選択図】図４
2010178652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつその翻訳産物が前記（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１の塩基配列の一部を含み、かつその翻訳産物が前記（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその翻訳産物が前記（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換植物体から得られる種子。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡによってコードされる、クエン酸輸送機能を有するタンパク質。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡまたは少なくとも１５塩基のそのＤＮＡ断片を使用して、根からのクエン酸放出能をもつ植物を選抜することを含む、クエン酸放出能をもつ植物の選抜方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡまたは請求項２に記載のベクターを植物に導入して、該ＤＮＡの発現を促進することにより、植物の根からのクエン酸放出能を増強させることを含む、植物でのクエン酸放出能増強方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡまたは請求項２に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを含む、根からのクエン酸放出能が増強された植物を作出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クエン酸を輸送するクエン酸輸送体遺伝子およびその利用に関する。より詳細にはユーカリから単離されたクエン酸輸送体遺伝子およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物の光合成能力を利用した二酸化炭素の固定は、大気中に拡散した低濃度の二酸化炭素を吸収できること、二酸化炭素固定によって得られる同化産物が紙や繊維、アルコールなどのエネルギーとして、化石燃料を代替できることから重要と考えられ、この観点においては草本よりも木本が望ましい。木本植物の中でも早生樹であるユーカリは、重要な樹木である。
【０００３】
ところで、世界中の耕地において貧栄養が、作物生産および樹木生産に大きな影響を及ぼしている。その主要要因の１つはリンである。リンは通常正リン酸イオンの形で植物に吸収・利用されるが、その反応性の高さから土壌中に存在する金属イオンと反応して通常植物が利用しがたい難溶性の金属塩（たとえばリン酸アルミニウム、リン酸鉄、リン酸カルシウム）を形成する。そのために土壌溶液中の正リン酸イオン濃度はきわめて低く、粗放栽培をした場合には植物はリン酸欠乏状態に陥る。特に酸性土壌では土壌溶液中のアルミニウム濃度が高いために、またアルカリ土壌ではカルシウム濃度が高いためにリン酸欠乏ストレスは苛烈である（非特許文献１）。従って、農業および産業植林においては必ずリン酸肥料の投入が行われるが、上記の理由から施肥効果は低く、多量に施肥されているのが現状である（非特許文献２）。更に、アルミニウムはそれ自体が強い毒性を有しており、根の伸長阻害を引き起こし、根からの養水分吸収を低下させる。したがって、これらのストレスに対して強いユーカリ個体の選抜技術や作出技術の開発が望まれる。
【０００４】
上記の難溶性金属塩形成によるリン欠乏およびアルミニウム害に対する有効な機構として根からの有機酸分泌が知られている。有機酸のキレート能力により、アルミニウムと結合して無毒化する、難溶性無機態リンからリン酸を遊離するというのが有機酸の作用機作であると考えられている。したがって、根からの有機酸分泌量が多い品種や個体を選抜すること、また、根からの有機酸分泌の能力を人為的に増強することが、有効な手段であると考えられる。細胞内から細胞外への有機酸放出に大きく寄与している考えられる有機酸輸送体が最近報告され、その遺伝子の塩基配列に基づく選抜育種の可能性や遺伝子組換え技術による有機酸放出量増強の可能性が示された（特許文献１、２および非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１０５１６４
【特許文献２】特開２００８−２２０３０８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｏｐｅｚ−Ｂｕｃｉｏら，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０００）１６０，１−１３
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＩＦＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  （２００１）ｐ１
【非特許文献３】Ｍａｇａｌｈａｅｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （２００７）３９，１１５６−１１６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
産業上有用な樹木であるユーカリは、根圏にアルミニウムが存在すると根からのクエン酸能放出を誘導することが報告されている。したがって、ユーカリは、根からのクエン酸放出を担うクエン酸輸送体遺伝子を有していると考えられる。その遺伝子を同定することができれば、根からのクエン酸放出能力の優れたユーカリ樹種や個体の効率的な判別や選抜育種、根からのクエン酸放出能力を強化した形質転換植物の作出ができる。本発明の目的は、ユーカリのクエン酸輸送体遺伝子を同定し、その遺伝子の利用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ユーカリがアルミニウム存在下のみでクエン酸を放出していることを見出し、さらに、アルミニウム、銅、ナトリウム、低ｐＨ処理した根組織からＲＮＡを抽出し、比較マイクロアレイ解析を行うことにより、アルミニウム処理特異的に発現していて、かつ膜結合領域をコードする遺伝子を選抜し、その遺伝子の中から、植物において過剰発現させることで根からのクエン酸放出を促進させることができる遺伝子を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、以下を包含する。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入又は吹かされた塩基配列からなり、かつその翻訳産物が上記（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１の塩基配列の一部を含み、かつその翻訳産物が上記（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその翻訳産物が上記（ａ）のＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸輸送機能を有するＤＮＡ
（２）上記（１）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（３）上記（２）に記載のベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞。
（４）上記（３）に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
（５）（４）に記載の形質転換植物体から得られる種子。
（６）上記（1）に記載のＤＮＡによってコードされる、クエン酸輸送機能を有するタンパク質。
（７）上記（１）に記載のＤＮＡまたは少なくとも１５塩基のそのＤＮＡ断片を使用して、根からの相対的に高いクエン酸放出能をもつ植物を選抜することを含む、クエン酸放出能をもつ植物の選抜方法。
（８）上記（１）に記載のＤＮＡまたは上記（２）に記載のベクターを植物に導入して、該ＤＮＡの発現を促進することにより、植物の根からのクエン酸放出能を増強させることを含む、植物でのクエン酸放出能増強方法。
（９）上記（１）に記載のＤＮＡまたは上記（２）に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを含む、根からのクエン酸放出能が増強された植物を作出する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、根からのクエン酸放出を強化させ、植物にアルミニウム耐性の付与ができ、また植物の難溶性無機態リン利用能力を向上できる。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を利用して根からのクエン酸放出の能力の高いユーカリ個体を選抜できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】この図は、ユーカリの各種ストレスに応答したクエン酸放出を示す。５０μＭ  ＡｌＣｌ３、１μＭ  Ｃｕ（ＮＯ３）２、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０の水溶液で２４時間処理した。反復数は３である。また、結果は平均±標準誤差を示す。
【図２】この図は、アルミニウムの濃度によるユーカリのクエン酸放出量の変化を示す。０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ  ＡｌＣｌ３を含む水溶液でユーカリを２４時間処理した。反復数は３である。また、結果は平均±標準誤差を示す。
【図３】この図は、ユーカリのクエン酸放出の時間変化を示す。５０μＭ  ＡｌＣｌ３を含む水溶液で処理を開始し、３時間ごとに溶液を更新した。処理開始から１２時間までの溶液を回収し、クエン酸を定量した。反復数は３である。また、結果は平均±標準誤差を示す。
【図４】この図は、ＥｃＭＡＴＥ過剰発現タバコ毛状根のクエン酸放出を示す。比較対照毛状根ライン（Ｃ＃４、Ｃ＃１１）と組換え毛状根（＃３、＃４、＃５、＃７）を根端３ｃｍで切断し、１０μＭ  ＡｌＣｌ３を含む水溶液に、１つの処理液当たり５本の根端を移し、２４時間処理した。反復数は３である。また、結果は平均±標準誤差を示す。有意差検定はＬＳＤ法により行った。†と††は、それぞれ危険率０．０１と０．０５でＣ＃４と有意に異なることを示している。‡と‡‡は、それぞれ危険率０．０１と０．０５でＣ＃１１と有意に異なることを示している。
【図５】この図は、ＥｃＭＡＴＥ過剰発現タバコ毛状根のアルミニウム耐性度を示す。比較対照毛状根ライン（Ｃ＃４、Ｃ＃１１）と組換え毛状根（＃３、＃４、＃５、＃７）を根端３ｃｍで切断し、±ＡｌＣｌ３（１０μＭ）を含む水溶液に移し、３日間処理した。処理期間中に伸びた長さを伸長量とし、−Ａｌ処理液での根伸長に対する＋Ａｌ処理液での根伸長を計算することで相対根伸長を算出した。使用した根端数は１０〜２０である。結果は、平均±標準誤差を示し、有意差検定はＬＳＤ法により行った。†は、危険率０．０１でＣ＃４と有意に異なることを示している。‡は、危険率０．０１でＣ＃１１と有意に異なることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様において本発明は、細胞内から細胞外へのクエン酸の輸送機能を有するＤＮＡ
に関する。
本発明において根からのクエン酸放出能を強化する対象となる植物は特に制限されないが、被子植物、裸子植物、単子葉植物、双子葉植物、草本、木本などの植物、好ましくはタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属）植物又はユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属）植物である。たとえ植物がクエン酸放出能を有する公知の植物であっても、本発明のＤＮＡを発現可能に含むように形質転換することによってクエン酸放出能を強化することができると考えられる。
【００１３】
ユーカリ属植物としては、特に制限されないが、例えばユーカリプタス・ダニアイ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｕｎｎｉｉ）、ユーカリプタス・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、ユーカリプタス・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、ユーカリプタス・グロブラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリプタス・ナイテンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｉｔｅｎｓ）、ユーカリプタス・サリグナ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓａｌｉｇａ）、ユーカリプタス・ユーロフィラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）、ユーカリプタス・レグナンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｅｇｎａｎｓ）、ユーカリプタス・シトリオドラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、ユーカリプタス・フラキシノイデス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｆｒａｘｉｎｏｉｄｅｓ）などが挙げられる。
【００１４】
本発明のＤＮＡの例としては、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。本発明のＤＮＡには配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡも包含される。
【００１５】
本明細書で使用される「機能的に同等」という用語は、本発明のＤＮＡの翻訳産物が配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの翻訳産物と同等のまたは実質的に同等のクエン酸の輸送機能を有することを意味する。ここで「実質的に同等」とは、該機能の性質が同等でありながら該機能の程度（すなわち、活性の程度）が完全に同一である必要がないことを意味する。また、ＤＮＡの翻訳産物とは、該ＤＮＡによってコードされるタンパク質を指す。
【００１６】
クエン酸の輸送機能は、根圏におけるアルミニウム存在下で根からのクエン酸放出であり、一般に、このＤＮＡが導入された形質転換植物は、該外来ＤＮＡ含まない植物と比べて、根からのクエン酸放出量が高い。放出されるクエン酸量と、アルミニウムに対するストレス耐性度との間に正の相関関係があるし、また、放出されるクエン酸量と、クエン酸輸送遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）量との間にも正の相関関係がある。それゆえ、植物内におけるクエン酸輸送遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）量（または、翻訳産物(タンパク質)量）を測定することによって、放出されるクエン酸の相対量の度合いやストレス耐性の度合いが判る。
【００１７】
あるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡを調製する良く知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら,  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ９．４７−９．５８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。
【００１８】
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡには、配列番号１の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつその翻訳産物が配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸の輸送機能を有するＤＮＡが含まれる。ここで、「数個」とは、２以上１０以下の整数、好ましくは２以上５以下の整数、さらに好ましくは２以上３以下の整数を意味する。
【００１９】
さらに、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡには、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの一部を含み、かつその翻訳産物が配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸の輸送機能を有するＤＮＡも含まれる。ここで「一部」とは、配列番号１の塩基配列の８０％以上または８５％以上、好ましくは９０％以上または９３％以上、より好ましくは９５％以上または９７％以上、さらに好ましくは９８％以上または９９％以上、を含む部分配列を意味する。当該部分配列は、好ましくは配列番号１の塩基配列において連続する配列である。また、当該部分配列の例は、配列番号１の塩基配列の３’末端配列の一部をトランケーションした配列を含む。
【００２０】
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと機能的に同等のＤＮＡには、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつその翻訳産物が配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの翻訳産物と実質的に同一のクエン酸の輸送機能を有するＤＮＡも含まれる。
【００２１】
本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション（例えば、１〜６×ＳＳＣ、室温〜６８℃でのハイブリダイゼーション）後の洗浄において、例えば、４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで洗浄する条件であり、高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション（例えば、１〜６×ＳＳＣ、室温〜６８℃でのハイブリダイゼーション）後の洗浄において、例えば、６５℃、０．１〜×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで洗浄する条件である。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液をいう。上記のようなストリンジェントな条件下では、配列番号１の塩基配列と高い同一性、すなわち８０％以上または８５％以上、好ましくは９０％以上または９３％以上、より好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の同一性、を有する塩基配列からなるＤＮＡが、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズすることができる。
【００２２】
本明細書で使用する「同一性」という用語は、２つの塩基配列（またはアミノ酸配列）を、同一の塩基（またはアミノ酸）の数が最大となるようにアラインメントさせたときに、全塩基数（または全アミノ酸数）に対する同一塩基数（または同一アミノ酸数）のパーセンテージを表す。配列をアラインメントさせる際には、ギャップを導入してもよいし、あるいはギャップを導入しなくてもよい。ギャップを導入するとき、ギャップの数も全塩基数（または全アミノ酸数）に加える。同一性は、ＢＬＡＳＴ（具体的には、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸなど）、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５（３）：４０３−４１０，  １９９０）を利用して決定することができるし、また、このようなアルゴリズムは、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）などの核酸やタンパク質の塩基配列やアミノ酸配列のデータベースにアクセスすることによって、配列類似性を有するＤＮＡまたはタンパク質の検索のために使用することができる。
【００２３】
好適な実施形態において、本発明のＤＮＡは、ユーカリ属植物の根組織から得ることができる。実験手法に関しては、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら,  （１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ）」などに基づいて実施することができる。例えば、次のようにして得ることができる。アルミニウムを含む水溶液（例えば２５〜７５μＭ  ＡｌＣｌ３の水溶液）で処理した根からＲＮＡを抽出する。精製したＲＮＡから常法によりｃＤＮＡを作製する。本発明のＤＮＡの塩基配列を基に作成したオリゴヌクレオチドプライマー（１５〜３０塩基長、好ましくは２０〜２５塩基長）を利用するＰＣＲ法、あるいは該クエン酸輸送遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列またはその一部をプローブ（少なくとも２０〜３０塩基長、好ましくは少なくとも３０〜５０塩基長、より好ましくは少なくとも７０〜１００塩基長）に用いたハイブリダイゼーション法を実施することにより、該遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するＤＮＡを得ることができる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ」には、ゲノムＤＮＡ、遺伝子またはｃＤＮＡが包含される。
本発明者らは、上記本発明のＤＮＡ（以下、クエン酸輸送体遺伝子と称する場合もある）が、細胞内から細胞外へのクエン酸輸送を促進することを見出した。したがって、本発明はまた、上記本発明のＤＮＡを導入した植物において、該ＤＮＡの発現を促進することにより、植物の根からのクエン酸放出能が強化、増強または亢進させる方法を提供する。本発明はさらに、該ＤＮＡを植物細胞に導入し植物体を再生することを含む、根からのクエン酸放出能が増強された植物の作出も提供する。これらの具体的方法については後述する。これによって、アルミニウムの濃度が高い場所であっても、根の伸長が改善され、また難溶性無機態リンの利用能も向上し、それに伴い他の栄養分の吸収も向上し、総じて植物の生育が改善する。
【００２５】
より具体的には、本発明のＤＮＡを含むベクターを植物細胞に導入し、得られた形質転換植物細胞から植物を再生させることにより、根からのクエン酸放出能が強化、増強または亢進された形質転換植物体を得ることができる。
【００２６】
本発明に関わるクエン酸輸送体遺伝子の発現を促進するために、遺伝子組換え技術、遺伝子工学技術などの慣用技術を使用することができる。例えば本発明のＤＮＡを、遺伝子を転写するために必要なプロモーターと呼ばれる塩基配列の下流に配置したものを、遺伝子導入することで、本発明は実施できる。
【００２７】
本発明は、上記本発明のＤＮＡ（または、クエン酸輸送体遺伝子）を含むベクターに関する。このベクターはベクターの所定の部分に該ＤＮＡを結合又は挿入することによって得ることができる。ベクターの種類は特に限定されないが、自立複製可能なベクター又は染色体中にＤＮＡを組み込み可能なベクターを使用することができる。ベクターは、例えばプラスミド、ファージを含むウイルス、コスミド、植物細胞の形質転換に通常使用されるベクター、例えばＴｉプラスミド、Ｔ−ＤＮＡ含有中間体ベクターなどのベクターを包含する。本発明では特に植物細胞の形質転換のために例えばバイナリーベクターが使用可能である。バイナリーベクターでは、植物ゲノムに組み込まれる左右のボーダー配列（ＲＢ及びＬＢ）にはさまれたＴ−ＤＮＡ領域のみを有しており、その領域に外来ＤＮＡが挿入される。外来ＤＮＡはＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターなどのプロモーターの下流に連結される。ベクターにはさらに、細菌での選択のためのマーカー（例えばネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子など）、植物での選択のためのマーカー（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子など）、レポーター遺伝子（例えばβ−グルクロニダーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子など）を含むことができる。その他、複製起点、ターミネーターなども含むことができる。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔなどを含む。また、中間ベクターの例は、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などを含む。
【００２８】
本発明はさらに、前記ベクターが導入された形質転換原核または真核生物細胞、好ましくは形質転換微生物又は形質転換植物細胞に関する。本発明の形質転換微生物とは、前記ベクターを宿主細胞としての微生物に導入して得られた微生物である。宿主微生物としては、例えば、アグロバクテリウム属菌などの細菌を含む原核生物細胞、酵母などの真核生物細胞などが挙げられる。また、本発明の形質転換植物細胞とは、前記ベクターを宿主細胞としての植物由来細胞に導入して得られた形質転換細胞である。
【００２９】
形質転換は、公知の手法、例えば生物学的手法であるアグロバクテリウムを用いた方法、物理的手法であるパーティクルガン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介遺伝子導入法などを用いることができる。
【００３０】
また、本発明は前記形質転換植物細胞を含む形質転換植物体を提供する。本発明の形質転換植物体とは、前記形質転換植物細胞を有する植物体であれば特に制限されないが、例えば、前記形質転換細胞から再生された形質転換植物体が挙げられる。形質転換植物細胞から植物体を再生する方法は、土肥らの方法（特開２０００−３１６４０３号公報）を参照することができる。植物体の再生には、例えばカルスやプロトプラストからの再生などが含まれる。
【００３１】
土肥らの方法は、アグロバクテリウムを利用した形質転換植物を作出する方法であり、具体的には、以下の方法を含み、本発明における植物体の再生のために使用することができる。
【００３２】
〈アグロバクテリウム菌の感染〉感染誘導処理した植物組織を、０．１％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、ナイフで２〜１０ｍｍの大きさに切断し、アグロバクテリウム菌の感染培地、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ基本培地等に、サイトカイニン類として４−ＰＵ、４ＣＰＰＵ、ＢＡ、ＴＤＺあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と、ショ糖、ガラクトース等の糖類、アセトシリンゴン及びアグロバクテリウム菌を添加した液体培地に植え付ける。好ましくは、組織片をアグロバクテリウム菌培養液に浸けた後に、アグロバクテリウム菌以外を含有する固形培地に着床する。これを２０〜３０℃の温度、遮光条件下で１〜２日間静置培養し、アグロバクテリウム菌を感染させる。
【００３３】
〈形質転換された苗条原基の形成〉アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、基本培地として、例えばＷＰＭ、Ｂ５、ＭＳ基本培地等に、植物ホルモンであるサイトカイニン類として４−ＰＵ、４ＣＰＰＵ、ＢＡ、ＴＤＺあるいはカイネチン等を、またオーキシン類としてＮＡＡ、２，４−ＤあるいはＩＡＡ等と炭素源、アグロバクテリウム菌を殺菌するための抗生物質、更に形質転換された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した液体培地の中で竪型回転培養を行う。培養条件は、例えば１〜１０ｒｐｍの回転速度、０〜２０，０００ルクスの照度、１５〜３５℃の温度とする。１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養を継続すると、形質転換カルスの選抜を始めてから２０〜３０日で、組織片中に黄白色の形質転換したカルス形成が認められる。得られたカルスを組織片からナイフによって切り離し、更に光照射下で竪型回転培養を行い、選抜開始から４０〜１２０日で形質転換された苗条原基が誘導できる。
【００３４】
〈形質転換植物の再生〉竪型回転培養して得られた形質転換苗条原基を、苗条を再生するための培地、例えばＢ５あるいはＭＳ基本培地等に植物ホルモン類として、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＩＡＡ等のオーキシン類、ＢＡ、４−ＰＵ、４ＣＰＰＵ、カイネチン、ゼアチン、ＴＤＺ等のサイトカイニン類及び炭素源、寒天あるいはゲランガム、更に形質転換された細胞集塊を選抜するための抗生物質を添加した苗化培地で培養する。培養は、例えば１５〜３５℃の温度、２，０００〜３，０００ルクスの照度で約６０日間行って苗条を再生させ、更に、発根させて完全な形質転換植物を得ることができる。
【００３５】
形質転換植物がクエン酸放出能力をもつ植物であることの確認は、アルミニウム塩の存在下で根から放出されるクエン酸量を測定することによって行うことができる。
【００３６】
また、上記の処理条件は、形質転換される植物の種類によって変化しうると理解されるべきである。
さらにまた、本発明の形質転換植物体は、該形質転換植物体から得られる種子、および該種子から得られる植物体をも含む。
【００３７】
本発明はまた、本発明の上記ＤＮＡによってコードされるタンパク質も提供する。該タンパク質は、クエン酸輸送機能を保持するかぎり、場合により、糖鎖などの修飾基による翻訳後修飾を受けていてよいし、あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化学修飾基による修飾を受けていてもよい。
【００３８】
本発明は、本発明のクエン酸輸送体遺伝子を利用した植物の選抜方法に関する。具体的には、本発明の上記ＤＮＡまたは少なくとも１５塩基のそのＤＮＡ断片を使用して、根からクエン酸放出する能力をもつ植物を選抜する方法に関する。
【００３９】
放出されるクエン酸量とストレス耐性度には相関関係があり、放出されるクエン酸量は、本発明のクエン酸輸送体遺伝子の転写物量（ｍＲＮＡ量）と関係がある。すなわち、本発明のクエン酸輸送体遺伝子の転写物量が多い個体をストレス耐性個体として選抜することができる。実験手法に関しては、公知の手法により実施できる。例えば、次のようにして実施できる。アルミニウムを含む溶液で処理した根からＲＮＡを抽出する。精製したＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。本発明のＤＮＡの塩基配列を基に作成したオリゴヌクレオチドプライマー（１５〜３０塩基長、好ましくは２０〜２５塩基長）を利用するＰＣＲ法、あるいは該遺伝子のＤＮＡ配列をプローブ（少なくとも２０〜３０塩基長、好ましくは少なくとも３０〜５０塩基長、より好ましくは少なくとも７０〜１００塩基長）に用いたハイブリダイゼーション法を実施することにより、該遺伝子の転写物量を知ることができる。あるいは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどの蛍光物質を含む溶液中でＰＣＲ反応を行い、該遺伝子の増幅に伴って増加する蛍光量を測定することで該遺伝子の転写物量を定量するｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によっても実施できる。
【００４０】
（実施例）
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
ユーカリからのクエン酸輸送体遺伝子の取得
これまでにクエン酸輸送体遺伝子を同定した報告がいくつかある（特開２００８−２２０３０８、Ｍａｇａｌｈａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （２００７）  ３９：１１５６−１１６１）。したがって、一般的には、この配列情報を利用して、他の植物からのクエン酸輸送体遺伝子の単離・同定が可能であることが想像される。しかし、大きな遺伝子ファミリーを形成する遺伝子においては、それは容易ではないことが示されてきている。クエン酸輸送体遺伝子よりも先行して、リンゴ酸を輸送するリンゴ酸輸送体遺伝子がコムギから同定された（ＴａＡＬＭＴ１：特開２００４−１０５１６４）。この遺伝子と相同性の高い遺伝子が、シロイヌナズナでは１４個ある。このうちＴａＡＬＭＴ１遺伝子に最も相同性の高い遺伝子は発現しておらず、機能的なホモローグはＡｔＡＬＭＴ１遺伝子であった（Ｈｏｅｋｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００６）１０３：９７３８−９７４３、Ｍａｇａｌｈａｅｓ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００６）  １０３：９７４９−９７５０）。また、シロイヌナズナの相同性の高い遺伝子の１つは細胞膜ではなく液胞膜に局在するリンゴ酸輸送体遺伝子であることが報告された（Ｋｏｖｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２００７）  ５２：１１６９−１１８０）。さらに、トウモロコシのゲノム配列情報に対するＴａＡＬＭＴ１との相同性検索から得られたＺｍＡＬＭＴ１遺伝子は、その電気生理学的特性から、むしろ無機陰イオンの輸送体遺伝子であると結論されている（Ｐｉｎｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２００８）  ５３：３５２−３６７）。一方、クエン酸輸送体遺伝子に関しては、イネにおいて既報のクエン酸輸送体遺伝子と相同性の高い遺伝子として少なくとも６つ存在する（Ｙｏｋｏｓｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４９：２９７−３０５）。イネのゲノムサイズは３９０Ｍｂｐであるのに対し、ユーカリのゲノムサイズはおよそ６００Ｍｂｐと推定されており、ユーカリにおいてはクエン酸輸送体遺伝子のホモローグはイネよりも多いと考えられる。上述の状況から、相同性を利用して、細胞膜に局在しかつクエン酸輸送活性を有するクエン酸輸送体遺伝子をユーカリから同定することは困難である。そこで、以下に説明する方法によりユーカリのクエン酸輸送体遺伝子を同定した。
【００４２】
（１）ユーカリのクエン酸放出特性
ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）の種子を滅菌処理し、無菌的に２０％ホーグランド溶液（１％スクロース含む）で発芽、栽培した。７日間栽培後、以下の各種ストレス溶液で処理を行い、２４時間後に処理液を回収した：リンを含まない２０％ホーグランド溶液（ｐＨ４．８）を基本溶液とし、（ａ）２５、５０、７５μＭ  塩化アルミニウム（アルミニウム処理）、（ｂ）３０ｍＭ  塩化ナトリウム（ナトリウム処理）、（ｃ）１μＭ  硝酸銅（銅処理）を含む溶液、（ｄ）基本溶液のｐＨを４．０に調整した液（低ｐＨ処理）。処理液中のクエン酸の定量は、Ｋｉｈａｒａら（２００３  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４４，９０１−９０８）に従った。各種イオンストレス処理したとき、クエン酸放出はアルミニウム処理時のみに観察された（図１）。アルミニウムストレスに応答したクエン酸放出は、アルミニウムの濃度が高まるにつれて多くなった（図２）。更に、アルミニウム濃度  ５０μＭで処理したときのクエン酸放出の時間変化を調べたところ、処理後時間経過とともに放出速度が増加していた（図３）。これらの結果は、ユーカリ・カマルドレンシスはアルミニウムストレス特異的に放出に関わる遺伝子の発現を誘導していることを示唆している。したがって、アルミニウムストレス特異的に発現誘導する遺伝子の中からクエン酸輸送体遺伝子を特定できると考えられる。そこで、ユーカリｃＤＮＡをスポットしたマイクロアレイスライドを作製し、網羅的遺伝子発現解析（マイクロアレイ解析）を行った。
【００４３】
（２）ユーカリｃＤＮＡライブラリーの作製およびマイクロアレイスライドの作製
ユーカリ・カマルドレンシスの種子を滅菌処理し、２０％ホーグランド溶液上に播種した。播種から４週間後に処理液（２０％ホーグランド溶液、リン抜き、５０μＭ  塩化アルミニウム、ｐＨ４．８）に移し、２４時間後に根を回収した。回収した根からＳｕｚｕｋｉらの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００４）  ３７：５４２−５４４）によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理後、Ｖ−キャッピング法により完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製した（日立ハイテクサイエンスシステムズ）。作製したｃＤＮＡライブラリーの５‘末端からのワンパスシーケンスを実施することにより、６，０４２の異なるＤＮＡ配列を得た。これらのＤＮＡ配列を基にプローブ配列を決定し、それらのプローブをスポットしたマイクロアレイスライドを作製した。
【００４４】
（３）マイクロアレイ解析
ユーカリ・カマルドレンシスについて、次のストレスを与えたときの遺伝子発現を、上記マイクロアレイスライドを使用して解析した：（ａ）アルミニウム、（ｂ）ナトリウム、（ｃ）銅、（ｄ）低ｐＨ。ストレス処理の方法は以下の通りである。種子を滅菌処理し、２０％ホーグランド溶液上に播種した。播種したから３週間後に各ストレス溶液に移し、処理を開始した。ストレス溶液は、リンを含まない２０％ホーグランド溶液（ｐＨ４．８）を基本溶液とし、５０μＭ  塩化アルミニウム、３０ｍＭ  塩化ナトリウムあるいは１μＭ  硝酸銅を加え、処理液とした。低ｐＨ処理については、基本溶液のｐＨを４．０に調整したものを処理液とした。また、基本溶液で処理したものを比較対照とした。処理開始から２４時間後に根を回収し、Ｓｕｚｕｋｉらの方法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出して、マイクロアレイ解析を行った（反復数３）。アルミニウム処理により３倍以上遺伝子発現が亢進し、かつその他の処理により遺伝子発現亢進が３倍以下である遺伝子数は２４２であった。これらのうち、細胞膜タンパク質と相同性の高い遺伝子は１１であった（表１）。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
この中で、クエン酸放出が認められる３時間目で遺伝子発現が亢進し、その後も遺伝子発現が亢進する遺伝子は以下の３つであった；２７＿Ｇ０１、０２＿Ｍ０４、２７＿Ｐ１２（表１）。２７＿Ｇ０１は、アルミニウムの移送に関与するＡＬＳ３遺伝子（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ４１：３５３−３６３）と相同性が高く、クエン酸輸送体遺伝子ではないと考えられた。０２＿Ｍ０４と２７＿Ｐ１２は、導管中にクエン酸を分泌することで鉄の移送に貢献しているＦＲＤ３（Ｄｕｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （２００７）  １４４：１９７−２０５）と相同性が高かった。０２＿Ｍ０４と２７＿Ｐ１２は、塩基配列レベルでほとんど一致するが、開始コドンを含むおよそ２００ｂｐの５’領域が大きく異なっていた。したがって、０２＿Ｍ０４と２７＿Ｐ１２は対立遺伝子である可能性が考えられる。しかし、５’領域の違いにより、０２＿Ｍ０４はフレームシフトがおき、成熟タンパク質をつくれないと考えられた。
【００４７】
（４）遺伝子組換えタバコの評価
配列番号１に示される２７＿Ｐ１２（以下、ＥｃＭＡＴＥとする）の配列の塩基番号１−２０７２の配列を、バイナリーベクターｐＢＩ１２１−Ｈｍ（Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  （１９９０）  ３１：８０５−８１３）上のＧＵＳ遺伝子と入れ替えることで、組換え用バイナリーベクターを構築した。このバイナリーベクターをアグロバクテリウム・リゾゲネス（ＡＴＣＣ１５８３４）に導入し、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染し、遺伝子組換え毛状根を作製した。作製した遺伝子組換え毛状根は、１／４強度のＭＳ無機栄養塩溶液（２％スクロースを含む）で旋回培養した。根端３ｃｍを切断し、処理液（１／２０強度のＭＳ無機栄養塩溶液、リン抜き、２％スクロースを含む、±ＡｌＣｌ３（１０μＭ）、ｐＨ４．８）に移した。処理開始から２４時間後に処理液を更新した。２４時間処理した溶液中のクエン酸を定量することで、クエン酸放出量を算出した。処理液更新から２日後に根端の長さを測定し、処理開始時の長さを差し引くことで根伸長を算出した。−Ａｌ（アルミニウム）処理液での根伸長に対する＋Ａｌ処理液での根伸長を計算することで相対根伸長を算出した。処理開始２４時間のクエン酸放出量を比較すると、ＥｃＭＡＴＥ遺伝子が導入された組換え毛状根のクエン酸放出量がコントロール毛状根よりも約２倍多かった。Ａｌに対する耐性度、つまり相対根伸長を比較すると、Ｃ＃１１と＃５の間に有意差がないことを除くと、ＥｃＭＡＴＥ組換え毛状根はコントロールよりも有意にＡｌ耐性度が高まっていた。これらのことは、ＥｃＭＡＴＥ遺伝子はクエン酸の輸送を担うクエン酸輸送体遺伝子であり、ＥｃＭＡＴＥ遺伝子を組換えることで根からのクエン酸放出量が増加し、そのことによりＡｌに対する耐性を向上させうることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、本発明遺伝子を導入することによって、クエン酸放出能が向上した草本および木本植物を提供することができる。この植物は、アルミニウム過剰害が問題である酸性土壌および／または必須多量栄養素であるリンが難溶性リン酸塩として固定されている不良土壌において生育が改善する。また、本発明遺伝子の塩基配列を利用して本発明遺伝子の発現レベルを調べることで、上記ストレスに対する耐性度の高いユーカリ個体を選抜することができる。本発明の植物は、これまで栽培が制限されていた土壌における事業の経済性の向上、不良土壌等の土壌資源の有効利用、植生拡大による二酸化炭素の固定量が増大するという作用効果を奏するため、産業上高い利用価値を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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