(57)【要約】【課題】被検査液中の被検査物質を広い濃度範囲にて高精度に測定でき、且つ容易に安価に製造できるバイオセンサを提供する。【解決手段】被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部と、前記検査対象物質を固定化するための固定化試薬を保持した固定化試薬部とが少なくとも設けられたバイオセンサにおいて、前記標識試薬は不溶性粒状マーカーを含んでおり、前記不溶性粒状マーカーは、別途に作成され粒度分布の異なる少なくとも２つの粒子群が混合されてなることを特徴とする。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部と、前記検査対象物質を固定化するための固定化試薬を保持した固定化試薬部とが少なくとも設けられたバイオセンサにおいて、
前記標識試薬は不溶性粒状マーカーを含んでおり、前記不溶性粒状マーカーは、別途に作成され粒度分布の異なる少なくとも２つの粒子群が混合されてなることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
不溶性粒状マーカーの各粒子群における粒度分布の主ピークが平均粒径１から１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
不溶性粒状マーカーは、検査対象物質に対して特定の親和性を持った特異的タンパク質を標識して複合体を形成していることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
特異的タンパク質は免疫反応に関与する物質であることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサ。
【請求項５】
免疫反応が抗原抗体反応であることを特徴とする請求項４記載のバイオセンサ。
【請求項６】
不溶性粒状マーカーが金属コロイドであることを特徴とする請求項１または請求項３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項７】
金属コロイドが金コロイドであることを特徴とする請求項６記載のバイオセンサ。
【請求項８】
展開層が単層または複数層の多孔性担体からなることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項９】
イムノクロマトグラフィ試験片であることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検査液中の被検査物質を定性あるいは定量的に検出するバイオセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、在宅医療や地域医療の充実、早期診断の要求、緊急性の高い臨床検査の増加などに伴い、臨床検査の専門家でなくとも高精度の測定を簡易かつ迅速に実施できる機器が要望されている。そして、煩雑な操作を要さず短時間で信頼性の高い測定を行えるＰＯＣＴ（POINT OF CARE TESTING）向けの小型分析装置が脚光をあびている。
【０００３】
ＰＯＣＴとは一般に、診察室、病棟などの「患者の近いところ」で行われる検査の総称であり、医師が検査結果を即座に判断し、迅速な処置を施し、治療の過程や予後のモニタリングまでを行う、という診療の質の向上に大きく役立つものとして注目されている。ＰＯＣＴでの小型分析装置による検査は、検査室での検査に比べて、検体の運搬や設備などにかかる費用を抑え、トータルの検査費用の削減が可能になるといわれ、ＰＯＣＴ市場は、病院経営合理化の進む米国で急速に拡大してきており、世界的にみても成長市場となっていくことが予想される。
【０００４】
ＰＯＣＴの普及と共に、定量測定可能なイムノクロマトグラフィ試験片などが商品として市場に流通してきている。イムノクロマトグラフィ試験片に代表される乾式分析素子は、試薬の調整を必要とせず、血液や尿などの被検査液を当該分析素子上に滴下するなどの簡単な操作のみでその中の検査対象物質を分析することが可能なものであり、検査対象物質を簡便かつ迅速に分析するのに非常に有用であるため、ＰＯＣＴ向けに今日、多数実用化されている。
【０００５】
イムノクロマトグラフィ試験片は一般に、展開層の一部に抗体が固定化されるとともに、その抗体固定化部分よりも点着部寄りの位置に標識抗体が被検査液によって溶出可能な乾燥状態で保持された構成である。被検査液を点着部に必要量添加すると展開層を浸透していき、被検査液中に検査対象物質が含まれているときには、その検査対象物質が標識抗体に結合しさらに固定化抗体に結合するので、抗体固定化部分への標識抗体の結合を検出することで検査対象物質を検出することが可能である。標識抗体を構成する標識物の一例は金コロイド粒子であり、金コロイド粒子による呈色反応によって目視可能となるので、その呈色度合いより、被検査液中における検査対象物質の有無および濃度を検出（測定）することができる。
【０００６】
以上は標識抗体を用いた抗原抗体反応のサンドイッチ反応を測定原理とした場合であるが、競合反応を測定原理としても同様に、抗体固定化部分への標識試薬の結合による呈色状態によって検査対象物質の有無および濃度を検出できる。標識物としては、上記の金コロイドのほか、ラテックスが一般的であるが、磁性粒子、酵素、金コロイド以外の金属コロイド等、種々に使用されている。標識物が酵素である場合などは、使用者が測定時に酵素基質や反応停止試薬を加える操作などが必要となることもある。使用者が被検査液を点着する操作のみで測定がなされるイムノクロマトグラフィ試験片は、ワンステップイムノクロマトグラフィ試験片と呼ばれている。
【０００７】
ＰＯＣＴの市場からは、いつでもどこでも誰でも測定できることに加え、より高い分析精度が要求されている。つまり、より高感度かつ簡単迅速に、更には広い濃度範囲を測定できるようにすることが求められている。しかしリガンドとレセプターとの結合を利用する分析、特にイムノクロマトグラフィ試験片を用いる分析では、被検査液中に検査対象物質が過剰に存在する場合にプロゾーン現象が生じる。イムノクロマト法におけるプロゾーン現象とは、本来は標識抗体が検査対象物質を介して固定化抗体に捕捉されるのに、検査対象物質が多量に存在すると、標識抗体に反応しきれなかった遊離の検査対象物質が固定化抗体に対して競合し、結果として標識抗体で標識された検査対象物質の固定化抗体への結合が妨げられることをいう。これに対処するものとして、被検査液中の被検査物質への親和性が異なる固定化試薬を展開層上に複数段に配置することにより、広範囲の濃度を高精度で定量可能としたイムノクロマトグラフィ試験片が開発されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】ＷＯ０３／０１４７４０公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１のイムノクロマトグラフィ試験片では、当然に、被検査液中の測定対象物（被検査物質）に対して親和性の相違する複数の固定化試薬を用意しなければならない。イムノクロマトグラフィ試験片における反応は、語源からみても本来は免疫反応であり、特に抗原抗体反応が利用されることが多い。そして多くの場合、被検査物質に親和性を持った抗体が固定化試薬として用いられるため、親和性の異なる複数の抗体を用意する必要がある。
【０００９】
しかし抗体の作製時に抗原に対する親和性を制御することは困難である。目的とする被検査物質を抗原として検出するのに必要な測定範囲をカバーできる複数の抗体、つまり前記測定範囲をカバーできるような組み合わせの親和性を持った複数の抗体を用意しなければならない。そのために、親和性の異なる多数の抗体を作製し、その中から選別しなければならない。親和性の異なる多数の抗体を作製するには、多大な労力と時間、更には多くのコストが必要であり、希望する組み合わせを実現できる親和性を持った抗体を見つけることは容易ではない。抗体でなく抗原を固定化試薬に用いることを考えても同様である。
【００１０】
本発明は上記問題を解決するもので、被検査液中の被検査物質を広い濃度範囲にて高精度に測定でき、且つ容易に安価に製造できるバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部と、前記検査対象物質を固定化するための固定化試薬を保持した固定化試薬部とが少なくとも設けられたバイオセンサにおいて、前記標識試薬は不溶性粒状マーカーを含んでおり、前記不溶性粒状マーカーは、別途に作成され粒度分布の異なる少なくとも２つの粒子群が混合されてなることを特徴とする。
【００１２】
不溶性粒状マーカーの各粒子群における粒度分布の主ピークが平均粒径１から１００ｎｍの範囲にあることを特徴とする。
本発明において、不溶性粒状マーカーとは、被検査液中で不溶な粒状マーカーを言う。粒子群とは、一度に製造された粒子溶液に含まれる一群の粒子を言い、粒度分布とは、前記粒子群の粒径を、顕微鏡での観察や、光散乱法などの計数法、比重天秤法、光透過法、沈降法、ふるいわけ法などの任意の解析手法によって測定した時に得られる、粒径の頻度分布もしくは積算分布を言う。各粒子群における粒度分布の主ピークとは、当該粒子群における前記粒径の頻度分布もしくは積算分布の最大ピークを言う。各粒子群において、第２ピークや第３ピークやそれ以下のピークの平均粒径はいずれの範囲にあっても何ら問題ない。粒度の分布が１以下もしくは１００ｎｍ以上にあっても構わない。
【００１３】
不溶性粒状マーカーは、検査対象物質に対して特定の親和性を持った特異的タンパク質を標識して複合体を形成していることを特徴とする。特異的タンパク質は、タンパク質に対する親和性を持つタンパク質や、任意の基質に対する酵素、任意のホルモンに対する受容体、及び任意のビタミンや任意の毒素に親和性を持つタンパク質など任意の低分子と結合するタンパク質、ＤＮＡ結合性タンパク質やＲＮＡ結合性タンパク質など核酸と結合するタンパク質など、任意の物質に対し特定の親和性を持ったタンパク質であればよい。
【００１４】
特異的タンパク質は免疫反応に関与する物質であることを特徴とする。免疫反応に関与する物質とは、補体とその捕捉物質、Ｔ細胞受容体とそれが特異性を持った物質、サイトカインとその受容体など、免疫反応に関与する物質であればなんら制限されない。
【００１５】
免疫反応が抗原抗体反応であることを特徴とする。抗原抗体反応にかかる抗原は、本発明においては目的とする被検査物質であり、たとえば、免疫グロブリン、ホルモン、酵素、ペプチドなどのタンパク質及びタンパク質誘導体；細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫、ならびにそれらの産物及び成分などの感染性物質；治療薬、乱用薬物などの薬物；腫瘍マーカー；ビタミンや毒素などの低分子物質などがある。抗体は、一本鎖抗体やＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２などの修飾された抗体、さらにｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｍＳＥＡ−ｄｉａｂｏｄｙ及びｍｉｎｉｂｏｄｙなどの組み換え抗体など、抗原に対して特異性を有していれば、どのような形状を有していてもよい。
【００１６】
不溶性粒状マーカーとして例えば金属コロイドを使用できる。金属コロイドとは、溶液中にコロイド状に分散する、金属や合金で構成された任意の粒子を言う。金属コロイドのほか、ラテックス粒子などの着色重合体ビーズ、重合染料粒子、磁性粒子なども、不溶性粒状マーカーとして、なんら制限なく使用可能である。金属コロイドの内の好ましい例は金コロイドである。ほかに、銀、銅、白金などのコロイドも使用可能である。
【００１７】
展開層が単層または複数層の多孔性担体からなることを特徴とする。展開層は被検査液により湿潤可能であればよく、濾紙、不織布、メンブレン、布、ガラス繊維などの任意の多孔性材料からなる担体を使用することができる。
【００１８】
本発明のバイオセンサは、イムノクロマトグラフィ試験片として構成することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のバイオセンサは、標識試薬を構成する不溶性粒状マーカーとして、粒度分布の異なる少なくとも２つの粒子群を混合して用いるという簡易な構成により、被検査液中の被検査物質を広い濃度範囲にて高精度に測定することが可能になったものであり、その製造も容易に安価に行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
（実施の形態１）
図１（ａ）（ｂ）はそれぞれ、本発明の実施の形態１のバイオセンサであるイムノクロマトグラフィ試験片の分解図および斜視図である。（ｂ）では一部を透視した状態で示している。
【００２１】
図１において、２は展開層を示し、ニトロセルロースを主材とするメンブレンフィルタ（合成高分子膜）で構成されている。ニトロセルロースメンブレンに限らず、被検査液により湿潤可能な材料であれば、他のメンブレン、濾紙、不織布、布、ガラス繊維等、任意の多孔質な材料で構成できる。単層であっても多層であっても構わない。
【００２２】
４は標識試薬部を示し、被検査液中の検査対象物質を標識可能な標識試薬、ここでは金コロイドで標識した標識抗体（以下、金コロイド標識抗体ともいう）が、乾燥状態で、被検査液により溶出可能な状態で保持してある。
【００２３】
金コロイド標識抗体は、粒度分布が異なった数種類の金コロイドの粒子群を用いて構成される。たとえば、主ピークの平均粒径が２０ｎｍの金コロイド標識抗体、３０ｎｍの金コロイド標識抗体、４０ｎｍの金コロイド標識抗体を１：１：１で混合する。ただし配合比率は任意であり、配合比率によって各被検査対象物質に応じた測定範囲への対応が可能である。２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍの粒子に限らず、１〜１００ｎｍの範囲の粒子を用いることが可能である。
【００２４】
５は試薬固定化部を示し、被検査液中の検査対象物質を捕捉可能な固定化試薬、ここでは検査対象物質に対する抗体が、検査対象物質，標識試薬と複合体が形成できるよう、乾燥状態で固定化してある。使用する抗体は、標識試薬および検査対象物質と３元複合体を形成できればよく、検査対象物質に対するエピトープが標識試薬の抗体と同じであっても異なっていてもよい。
【００２５】
図中では試薬固定化部５を１箇所設けた例を示しているが、必ずしも１箇所である必要はなく、１箇所以上であればその目的に応じて自在に選択すればよい。また試薬固定化部５をライン状（帯状）とした例を示しているが、必ずしもライン状である必要はなく、スポット状、文字形、鍵型など、自在に選択できる。
【００２６】
上述の標識試薬部４の標識試薬は、この試薬固定化部５での検査対象物質の固定を検出するために選択されるものであり、マーカーとしての金コロイドは一例に過ぎず、他の金属コロイド、合金、ラテックス粒子などの着色重合体ビーズ、重合染料粒子、磁性粒子などの不溶性粒状マーカーを使用者の必要に応じて任意に選択可能である。
【００２７】
６は液体不透過性シートを示し、ＰＥＴで構成されている。この液体不透過性シート６は、展開層２の表面を被検査液の展開方向に沿った始端部分と終端部分とを除いて密着被覆することにより、被覆部分を被検査液の接触から遮断し保護すると共に外部からの汚染を防止する。外部からの汚染とは、被検査液の不用意な接触や、被験者が手などで直接に接触することなどを指す。より高精度な測定を必要とする場合には、液体不透過性シート６が、展開層２の上面、特に標識試薬部４から試薬固定化部５にわたる上面を密着密閉し、かつ、両側面を密着密閉する構造をとればよい。液体不透過性シート６の材料は、上述のＰＥＴに限らず、展開層２を覆うことができ且つ液体不透過性であれば任意に選択できる。試薬固定化部５を覆う部分は少なくとも、試薬固定化部５の状態を透過して確認できるように透明材料を用いるのが好ましい。３は展開層２における開放部、つまり液体不透過性シート６によって被覆していない終端部分を示している。
【００２８】
７は展開層２を支持する基板を示す。この基板７は展開層２を補強する役割を持つとともに、血液、唾液、尿など、感染の危険性のある被検査液を用いる場合にそれを遮断する役割を持つもので、シートあるいはフィルムと呼ばれる厚みであってよい。展開層２が湿潤すると光透過性を帯びるものである場合などは、この基板７に、光を遮断する効果を持たせることも可能である。白色ＰＥＴを材料とするのが好ましいが、上記の効果を持つものであれば特に制限はない。
【００２９】
８は微細空間形成材を示し、液体不透過性シート６によって被覆していない展開層２の始端部分上に、被検査液が毛細管現象により流入する微細空間１を形成する役割、および、被検査液の点着後の取り扱い時に外部を汚染から保護する役割を持つ。ここでの保護とは被検査液の不用意な飛散や付着を言う。この微細空間形成材８は、ＡＢＳ、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の合成樹脂材料、金属、ガラスなど、液体不透過性の任意の材料で構成することができる。透明もしくは半透明が好ましいが、有色、不透明でも構わない。
【００３０】
９は細胞収縮試薬（細胞成分収縮剤）であり、微細空間１に配置している。細胞収縮試薬９は、細胞を収縮する効果があればよく、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩類や、グリシン、グルタミン酸等のアミノ酸、プロリン等のイミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖類、グルシトール等の糖アルコールなど用いることができる。この様な細胞収縮試薬９を含む系は、全血を被検査液とする場合に特に有効であり、細胞成分を含まない被検査液を意図する場合には特に必要ではない。
【００３１】
上記バイオセンサによる検査方法について説明する。
微細空間１の端部（以下、導入部という）に被検査液を接触させると、毛細管現象によって自然に微細空間１内に流入し、被検査液中の細胞成分が細胞収縮試薬９によって収縮されつつ展開層２を浸透していく。被検査液の流入量が十分であるかどうかは、透明な微細空間形成材８を透して確認できる。被検査液の添加量に制限がある場合、たとえば一定量が必要である場合には、予め微細空間１の体積を一定体積とすることで精度良く添加量を制限できる。被検査液の必要量に応じて微細空間１の体積を調整すればよい。
【００３２】
被検査液が標識試薬部４に到達すると標識試薬の溶出が開始され、被検査液中に検査対象物質が存在する場合は、溶出した標識試薬と反応して「標識試薬−検査対象物質」複合体を形成しながら浸透が進み、試薬固定化部５に到達するとその量に応じて「固定化試薬−検査対象物質−標識試薬」複合体を形成して捕捉され、標識試薬に含まれる金コロイドによる呈色反応が示される。
【００３３】
一方、被検査液中に検査対象物質が存在しないか、検出感度以下の量である場合には、上述のいずれの複合体も形成されず、標識試薬はその大半が結合することなく通過する。検査対象物質が存在しない場合も存在する場合も、展開層２を浸透して開放部３に到達した被検査液はここで次第に揮発もしくは蒸発する。被検査液が開放部３に滲み出す場合もあるが、当該開放部３における展開層２上にのみであり、微細空間１内の展開層２上の被検査液と同じ高さ、もしくは準じた高さまでである。
【００３４】
このように、開放部３を備えることで、展開層２での被検査液の浸透及び浸透方向は測定中一定方向に制御される。一般には展開層２に開放部３に代わる吸水部を設けることが多く、その吸水部に、展開層２の反応部分に使用する材料よりも湿潤効果、吸水効果の高い多孔質材料を用いることで、被検査液を吸水及び吸引して展開層上を通過させる働きや測定時間を短縮する働きを持たせる。ここでの開放部３はかかる吸水部と同様の効果を奏する。開放部３や微細空間１を設けることは、指先の穿刺による血液など、被検査液が極微量の場合に特に適している。
【００３５】
検査結果は、試薬固定化部５での標識試薬の結合による呈色状態を確認することで得る。検査対象物質の有無を調べる定性目的であれば目視による判定も可能である。精度の高い測定が必要な場合は、拡散電磁放射線の反射光や透過光、画像による光学的手段によって、呈色度合いや標識物の結合量を測定することで、定量的な結果を得ることができる。このことについては後述する。
【００３６】
ここでの電磁放射線は可視領域もしくは近可視領域であることが好ましく、電磁放射線源としては、ＬＥＤ（Light Emitting Diode；発光ダイオード）、ＬＤ（Laser Diode；レーザーダイオード）など、使用者の必要に応じて選択可能である。画像による光学的手段とは、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどにより画像を取り込んでの任意の解析手段をいう。
【００３７】
以上は抗原抗体反応におけるサンドイッチ反応について述べたが、被検査液中の被検査物質と競合的に反応する試薬を用いて競合反応とすることもできる。抗原抗体反応以外にも、特異的な結合を形成する反応系を利用することが可能である。
【００３８】
（実施の形態２）
図２（ａ）（ｂ）はそれぞれ、本発明の実施の形態２のバイオセンサであるイムノクロマトグラフィ試験片の分解図および斜視図である。（ｂ）では一部を透視した状態で示している。
【００３９】
このイムノクロマトグラフィ試験片には、試薬固定化部５のほかに、試薬固定化部１０、試薬固定化部１１が設けられていて、その各々に、被検査液中の被検査物質に対する抗体が、被検査物質および標識試薬と複合体が形成できるよう、乾燥状態で固定化されている。その他は、上述した実施の形態１のものと同様である。
【００４０】
試薬固定化部５に用いる抗体と、試薬固定化部１０に用いる抗体及び試薬固定化部１１に用いる抗体とは、被検査物質に対する親和性が異なるように選定されている。被検査液の点着部寄り（上流側）ほど被検査液及び被検査物質に早く接触するので、上流側に、被検査物質に対する親和性が高い抗体が選定される。
【００４１】
試薬固定化部５、１０、１１に使用する抗体は、標識試薬および被検査物質と３元複合体を形成できればよいのであって、被検査物質に対するエピトープが標識試薬の抗体と同じであっても異なっていてもどちらでもよい。
【００４２】
図中では、試薬固定化部５、１０、１１という３箇所の試薬固定化部を設けているが、必ずしも３箇所である必要はなく、２箇所以上であれば、その目的に応じて自在に配置できる。３箇所以上に配置する場合は、上述のように全ての箇所に親和力の異なる固定化試薬を用いてもよいし、あるいは、親和力の異なる２種類の固定化試薬を用いた箇所を組み合わせてもよく、その場合の組み合わせは使用者の目的に応じて自由に選択可能である。
【００４３】
また試薬固定化部５、１０、１１は、図示したようなライン状である必要はなく、スポット形状、もしくは、文字形状、鍵型形状など自在に選択できる。図示したように必ずしも離れている必要もなく、見かけ上一本のライン状に見える様に接触させることも可能である。金コロイドは不溶性粒状マーカーの一例にすぎず、他の金属、合金、着色重合体ビーズ、重合染料粒子、磁性粒子などの不溶性粒状マーカーを、使用者の必要に応じて任意に選択可能である。
【００４４】
上記のバイオセンサによる検査方法について説明する。
微細空間１の端部（以下、導入部という）に被検査液を接触させると、実施の形態１で説明したのと同様にして展開層２を浸透していき、被検査液中に検査対象物質が存在する場合は、標識試薬部４で溶出した標識試薬と反応して「標識試薬−検査対象物質」複合体を形成しながら浸透が進む。
【００４５】
被検査液が試薬固定化部５に到達すると、検査対象物質の量に応じて「固定化試薬−検査対象物質−標識試薬」複合体が形成され、標識試薬を構成している金コロイドによる呈色反応が示される。
【００４６】
被検査液が試薬固定化部１０に到達すると、検査対象物質（残存している場合）の量に応じて「固定化試薬−被検査物質−標識試薬」複合体が形成され、標識試薬を構成している金コロイドによる呈色反応が示される。
【００４７】
被検査液が試薬固定化部１１に到達すると、被検査物質（残存している場合）の量に応じて「固定化試薬−被検査物質−標識試薬」複合体が形成され、標識試薬を構成している金コロイドによる呈色反応が示される。
【００４８】
被検査液中に検査対象物質が存在しないか、検出感度以下の量である場合には、上述のいずれの複合体も形成されず、標識試薬はその大半が結合することなく通過し、展開層２を浸透して開放部３に到達した被検査液は、ここで次第に揮発もしくは蒸発するか、開放部３に滲み出して当該開放部３における展開層２上にのみ溜まる。
【００４９】
検査結果は、試薬固定化部５、１０、１１での標識試薬の結合による呈色状態を確認することで得る。定性目的であれば目視による判定も可能である。精度の高い測定が必要な場合は、拡散電磁放射線の反射光や透過光、画像による光学的手段（前掲）によって、呈色度合いや標識物の結合量を測定することで、定量的な結果を得ることができる。このことについては後述する。試薬固定化部５を被検査物質の濃度検出に用い、試薬固定化部１０、１１（親和性の低い抗体を用いる）をプロゾーンの検出に用いることも可能である。
【００５０】
以上は抗原抗体反応におけるサンドイッチ反応について述べたが、被検査物質と競合的に反応する試薬を用いて競合反応とすることもできる。抗原抗体反応以外にも、特異的な結合を形成する反応系を利用することが可能である。
【００５１】
以下に具体的な実施例を挙げて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定する意図のものではない。
（実施例１）
上述の図１のイムノクロマトグラフィ試験片を以下のようにして製造した。展開層２にニトロセルロースを主材とする膜を用い、試薬固定化部５に抗ＣＲＰ抗体Ａを用い、標識試薬部４に抗ＣＲＰ抗体Ｂと金コロイドとの複合体を用いている。
【００５２】
ａ）抗体固定化ニトロセルロース膜の調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備し、この抗体溶液を溶液吐出装置にてニトロセルロース膜上に塗布して抗体固定化ライン（試薬固定化部）を設けた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後に、膜をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に移し、１０分間緩やかに振り、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中にて更に１０分間緩やかに振ることで、洗浄した。この膜を０．０５%スクロースモノラウレートを含んだＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中にて１０分間穏やかに振ることで、界面活性剤処理した。界面活性剤処理を終えた膜を取り出し、室温で乾燥させた。
【００５３】
ｂ）２０ｎｍ金コロイド標識抗体の調製
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸溶液を終濃度０．０３％になるように加えることによって調製した。還流を２５分間続けた後、室温放置にて冷却を行った。こうして得られた金コロイドについて、動的光散乱計（ゼーターナノＺＳ、シスメックス株式会社）にて粒径の分布である粒度分布を測定したところ、粒度分布のピークは１９．１ｎｍであった。この平均粒径１９．１ｎｍのピークを持った金コロイド粒子群を２０ｎｍ金コロイドと呼ぶ。
【００５４】
ｐＨ９に調製した前記２０ｎｍ金コロイドに抗ＣＲＰ抗体Ｂを加えて５分間攪拌し、さらにｐＨ９に調整した１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になるように加えて攪拌することで、２０ｎｍ金コロイド−抗体複合体（標識抗体）を調製した。この標識抗体溶液を４℃、２０１００Ｇで５０分間遠心し、分離物を１％ＢＳＡ・５％スクロース（ｐＨ８．９）液中に懸濁し、再び前記の遠心を行うことで、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を０．４５μｍのフィルタにて濾過した後に、５２０ｎｍの吸光度が１５０になるように１％ＢＳＡ・５％スクロース（ｐＨ８．９）液で希釈し、これを２０ｎｍ金コロイド標識抗体として４℃で保存した。
【００５５】
ｃ）３０ｎｍ金コロイド標識抗体の調製
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸溶液を終濃度０．０２３％になるように加えることによって調製した。還流を２５分間続けた後、室温放置にて冷却を行った。こうして得られた金コロイドについて、動的光散乱計（ゼーターナノＺＳ、シスメックス株式会社）にて粒径の分布である粒度分布を測定したところ、粒度分布のピークは２９．４ｎｍであった。この平均粒径２９．４ｎｍのピークを持った金コロイド粒子群を３０ｎｍ金コロイドと呼ぶ。ｐＨ９に調製した前記３０ｎｍ金コロイドを用いて、上述の２０ｎｍ金コロイドと同様に、３０ｎｍ金コロイド−抗体複合体（標識抗体）を調製し、洗浄単離（４℃、１５０００Ｇで５０分間遠心）、濾過、希釈を経て、３０ｎｍ金コロイド標識抗体として４℃で保存した。
【００５６】
ｄ）４０ｎｍ金コロイド標識抗体の調製
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸溶液を終濃度０．０１５％になるように加えることによって調製した。還流を２５分間続けた後、室温放置にて冷却を行った。こうして得られた金コロイドについて、動的光散乱計（ゼーターナノＺＳ、シスメックス株式会社）にて粒径の分布である粒度分布を測定したところ、散乱光強度のピークは２つあり、主ピークは４２．５ｎｍであった。この平均粒径４０ｎｍ付近に主ピークを持った金コロイド粒子群を４０ｎｍ金コロイドと呼ぶ。ｐＨ９に調製した前記４０ｎｍ金コロイドを用いて、上述の２０ｎｍ金コロイドと同様に、４０ｎｍ金コロイド−抗体複合体（標識抗体）を調製し、洗浄単離（４℃、８０００Ｇで５０分間遠心）、濾過、希釈を経て、４０ｎｍ金コロイド標識抗体として４℃で保存した。
【００５７】
ｅ）混合金コロイド標識抗体Iの調製
上述の３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体とを液量にて１：１になるように混合し、よく攪拌したうえで、混合金コロイド標識抗体Iとして４℃で保存した。
【００５８】
ｆ）混合金コロイド標識抗体IIの調製
上述の２０ｎｍ金コロイド標識抗体と３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体とを液量にて１：１：１になるように混合し、よく攪拌したうえで、混合金コロイド標識抗体IIとして４℃で保存した。
【００５９】
ｇ）金コロイド標識抗体の塗布
上述の５種類の金コロイド標識抗体溶液をそれぞれ溶液吐出装置にセットし、上述のニトロセルロース膜にその試薬固定化部よりも被検査液導入部寄りとなるように塗布し、塗布後のニトロセルロース膜を真空凍結乾燥させた。これにより、試薬固定化部と標識試薬部とを持った５種類の展開層を得た。
【００６０】
ｈ）組立て
上述の５種類の展開層をそれぞれ厚さ０．５ｍｍの白色ＰＥＴからなる基板上に貼り付け、２．０ｍｍの幅で裁断し、裁断後の各片について、標識試薬部よりも始端部寄りの位置から試薬固定化部よりも終端部寄りの位置までの所定範囲を厚さ１００μｍの透明テープを巻き付けて覆い、透明テープで覆わない始端部に微細空間を形成する微細空間形成材を貼り付けることにより、５種類のイムノクロマトグラフィ試験片を複数個ずつ得た。なお微細空間形成材は、あらかじめ１．５Ｍに調整した塩化カリウム水溶液を点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行うことにより、塩化カリウムが乾燥状態で保持された収縮剤保持部を持たせた。各イムノクロマトグラフィ試験片を、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、混合金コロイド標識抗体試験片２Ａと呼ぶ。
【００６１】
図３に、２０ｎｍ金コロイド、３０ｎｍ金コロイド、４０ｎｍ金コロイドについて、動的光散乱計（ゼーターナノＺＳ、シスメックス株式会社）にて粒径の分布（粒度分布）を調べた結果を示す。
［試験例１］
ａ）試料の調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ・２Ｋを加えたヒト血液をヘマトクリット値４０％になるように調整し、調整後の血液（血漿）にＣＲＰ溶液を加えて、ＣＲＰ濃度が０．０３ｍｇ／ｄｌ、０．０６ｍｇ／ｄｌ、０．１ｍｇ／ｄｌ、０．３ｍｇ／ｄｌ、０．６ｍｇ／ｄｌ、１．０ｍｇ／ｄｌ、３．０ｍｇ／ｄｌ、６．０ｍｇ／ｄｌ、１０．０ｍｇ／ｄｌである血液試料を調製した。各血液試料のＣＲＰ濃度は、ラテックス免疫凝集法を用いた市販装置（７０２０型生化学自動分析装置  日立製作所製）及び試薬を用いて確認した。
【００６２】
ｂ）測定
上述の５種類のイムノクロマトグラフィ試験片、すなわち、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、本発明にかかる混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ及び混合金コロイド標識抗体試験片２Ａの各々の試料導入部に、各濃度の血液試料５μＬを添加し、添加から５分後に試薬固定化部の呈色状況を反射吸光度測定器（ＣＳ９３００  島津製作所製）を用いて６３５ｎｍの反射吸光度を測定した。測定は各濃度あたり５回行い、平均値をとった。
【００６３】
ｃ）結果
図４は測定結果を示す。横軸はＣＲＰ濃度を対数で示しており、縦軸は吸光度を対数で示している。菱形プロットは２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で得られた結果、四角プロットは３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で得られた結果、三角プロットは４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で得られた結果、白丸プロットは混合金コロイド標識抗体試験片１Ａで得られた結果、黒丸プロットは混合金コロイド標識抗体試験片２Ａで得られた結果である。各試験片でＣＲＰに対するレスポンスが明らかに異なっている。
【００６４】
図４の測定結果を図５に模式的に示す。図５から明らかなように、各試験片はＣＲＰに対するレスポンスが異なる結果、測定レンジが異なっている。
図中の濃度Ａでは混合金コロイド標識抗体試験片１Ａからのみシグナルが得られており、この濃度Ａについては、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａでのみ測定が可能である。濃度Ｂでは混合金コロイド標識抗体試験片１Ａでシグナルが得られ、また４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片から測定器の測定限界付近のシグナルが得られており、これらの２試験片で濃度Ｂについての測定が可能である。
【００６５】
濃度Ｃについては、同様に、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、混合金コロイド標識抗体試験片２Ａで測定が可能である。濃度Ｄについては、同様に、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、混合金コロイド標識抗体試験片２Ａ、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で測定が可能である。濃度Ｅについては、同様に、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、混合金コロイド標識抗体試験片２Ａ、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で、つまり全ての試験片で測定が可能である。
【００６６】
濃度Ｆになると、全ての試験片でシグナルが得られているが、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片でのシグナルは直線回帰の可能な領域にはなく、すでにプロゾーン領域に入っているものと考えられる。したがってこの濃度Ｅについては、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片を除いた試験片、つまり、混合金コロイド標識抗体試験片２Ａ、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片でのみ、測定が可能である。
【００６７】
濃度Ｇについても同様に、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片でのみ、測定が可能である。濃度Ｈについても同様に、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片のみ、測定が可能である。
【００６８】
言い換えると、２０ｎｍコロイド標識抗体試験片では濃度Ｅ〜Ｈ（およびそれ以上）、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片では濃度Ｄ〜Ｈ、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片では濃度Ｂ〜Ｆ、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａでは濃度Ａ〜Ｆ、混合金コロイド標識抗体試験２Ａでは濃度Ｃ〜Ｇの範囲が測定可能である。
【００６９】
試験片に担持させた標識試薬の種類によって、つまり各標識試薬を構成している金コロイドの粒径によって、測定可能な濃度範囲が異なる結果となっている。粒径が大きくなるにつれて測定可能範囲は低濃度側に移動（シフト）している。
【００７０】
一方、金コロイド粒径と移動度との関係は一定ではない。第１に、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片（以下、金コロイド標識抗体試験片を単に金コロイド試験片と呼ぶ。）、３０ｎｍ金コロイド試験片、４０ｎｍ金コロイド試験片での測定限界濃度Ｂ、Ｄ、Ｅについて見ると、３０ｎｍ金コロイド試験片の測定限界濃度Ｄは濃度Ｂと濃度Ｅとの中間点になると予想されるが、実際には濃度Ｅにより近い。
【００７１】
第２に、混合金コロイド試験片１Ａについては、３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体との１：１の混合溶液を固定化してあるので、その測定限界濃度Ａは、３０ｎｍ金コロイド試験片と４０ｎｍ金コロイド試験片の各々の測定限界濃度Ｄ、Ｅの中間点になると予想される。しかし実際の測定限界濃度Ａは４０ｎｍ金コロイド試験片の測定限界濃度Ｂを大きく下回っており、低濃度側へと測定範囲が広がっている。
【００７２】
第３に、混合金コロイド試験片２Ａについては、２０ｎｍ金コロイド標識抗体と３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体との１：１の混合溶液を固定化してあるので、３０ｎｍ金コロイド試験片での測定限界濃度Ｄの付近であると予想される。しかし実際の測定限界濃度Ｃは濃度Ｄ付近ではなく、より低濃度側、つまり４０ｎｍ金コロイド試験片の測定限界濃度Ｂに近くなっている。
【００７３】
金コロイド調製法として、上述した塩化金酸とクエン酸とを用いる方法が、粒径の制御が容易であるため従来から一般に広く使用されているのであるが、粒度分布の制御を行うことは容易ではない。第１の結果はこのことに起因していると推測される。
【００７４】
第２、第３の結果は、本発明にかかる混合金コロイド試験片１Ａ，２Ａによれば、理論上は同じ平均粒径を持った金コロイド標識抗体を用いる場合よりもＣＲＰ濃度−吸光度曲線を低濃度側にシフトさせて、測定範囲を低濃度側に広げることが可能であることを示している。
【００７５】
（実施例２）
上述の図２のイムノクロマトグラフィ試験片を以下のようにして製造した。展開層２にニトロセルロースを主材とする膜を用い、標識試薬部４に抗ＣＲＰ抗体Ｂと金コロイドとの複合体を用い、試薬固定化部５に抗ＣＲＰ抗体Ａを用い、試薬固定化部１０に抗ＣＲＰ抗体Ａよりも親和力が低い抗ＣＲＰ抗体Ｃを用い、試薬固定化部１１に抗ＣＲＰ抗体Ｃよりも親和力が低い抗ＣＲＰ抗体Ｄを用いている。
【００７６】
ａ）抗体固定化ニトロセルロース膜の調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ａ溶液を準備し、この抗体溶液を溶液吐出装置にてニトロセルロース膜上に塗布して抗ＣＲＰ抗体Ａの固定化ラインを設けた。同様にして、それより２ｍｍ下流側に抗ＣＲＰ抗体Ｃの固定化ライン、更にそれより２ｍｍ下流に抗ＣＲＰ抗体Ｄの固定化ラインを設けた。
【００７７】
このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後に、膜をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に移し、１０分間緩やかに振り、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中にて更に１０分間緩やかに振ることで、洗浄した。この膜を０．０５%スクロースモノラウレートを含んだＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中にて１０分間穏やかに振ることで、界面活性剤処理した。界面活性剤処理を終えた膜を取り出し、室温で乾燥させた。
【００７８】
ｂ）金コロイド標識抗体の塗布
実施例１で調製した２０ｎｍ金コロイド標識抗体、３０ｎｍ金コロイド標識抗体、４０ｎｍ金コロイド標識抗体、混合金コロイド標識抗体I、混合金コロイド標識抗体IIの溶液をそれぞれ溶液吐出装置にセットし、上述のニトロセルロース膜にその試薬固定化部よりも被検査液導入部寄りとなるように塗布し、塗布後のニトロセルロース膜を真空凍結乾燥させた。これにより、試薬固定化部と標識試薬部とを持った５種類の展開層を得た。
【００７９】
ｃ）組立て
上述の５種類の展開層を用いて、実施例１と同様にして、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、本発明にかかる混合金コロイド標識抗体試験片１Ａおよび混合金コロイド標識抗体試験片２Ａを組み立てた。
［試験例２］
ａ）試料および測定
実施例１で調製した、ＣＲＰ濃度が０．０３ｍｇ／ｄｌ、０．０６ｍｇ／ｄｌ、０．１ｍｇ／ｄｌ、０．３ｍｇ／ｄｌ、０．６ｍｇ／ｄｌ、１．０ｍｇ／ｄｌ、３．０ｍｇ／ｄｌ、６．０ｍｇ／ｄｌ、１０．０ｍｇ／ｄｌである血液試料を用いた。各血液試料のＣＲＰ濃度は、ラテックス免疫凝集法を用いた市販装置（７０２０型生化学自動分析装置  日立製作所製）及び試薬を用いて確認した。
【００８０】
実施例１と同様にして、上述の５種類のイムノクロマトグラフィ試験片、すなわち、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片、混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ、及び混合金コロイド標識抗体試験片２Ａの各々の試料導入部に、各濃度の血液試料５μＬを添加し、添加から５分後に試薬固定化部の呈色状況を反射吸光度測定器（ＣＳ９３００  島津製作所製）を用いて６３５ｎｍの反射吸光度を測定して調べた。測定は各濃度あたり５回行い、平均値をとった。
【００８１】
ｂ）結果
図６は測定結果を示す。横軸はＣＲＰ濃度を対数で示しており、縦軸は吸光度を対数で示している。図６（ａ）は２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で得られた結果、図６（ｂ）は３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で得られた結果、図６（ｃ）は４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片で得られた結果、図６（ｄ）は混合金コロイド標識抗体試験片１Ａで得られた結果、図６（ｅ）は混合金コロイド標識抗体試験片２Ａで得られた結果を示している。図６（ａ）〜（ｅ）において、黒丸プロットは試薬固定化部I（図２での５）から得られた結果、黒三角プロットは前記試薬固定化部II（図２での１０）、黒四角プロットは試薬固定化部III（図２での１１）から得られた結果を示している。各試験片において、実施例１の試験片、つまり試薬固定化部が１箇所である試験片よりも、測定範囲が大幅に広がっている。
【００８２】
図６（ａ）〜（ｅ）の測定結果を図７（ａ）〜（ｅ）に概略的に示す。図７から明らかなように、各試験片は、試薬固定化部Iと試薬固定化部II、試薬固定化部IIIとで異なるＣＲＰレスポンスを示している。図７（ａ）〜（ｅ）において、低濃度側の測定限界濃度（３箇所の試薬固定化部における最小の測定限界濃度）をＡ（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５）と表した。高濃度側の測定限界濃度（３箇所の試薬固定化部のＣＲＰ濃度−吸光度曲線につき、直線回帰可能な限界濃度の最大値）をＢ（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５）と表した。各試験片において、濃度Ａ〜Ｂの範囲が測定範囲となる。
【００８３】
図７（ａ）〜（ｅ）から明らかなように、各試験片によって測定範囲が相違している。この測定範囲の相違は、実施例１でも説明したように、低濃度側の測定範囲の相違によるものが大きい。４０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片および混合金コロイド標識抗体試験片１Ａの試薬固定部IIIのシグナルは、ＣＲＰ濃度−吸光度が相関性のある曲線形状を示さず、高濃度側は試薬固定化部IIでの測定限界をとったため、測定範囲３および測定範囲４がその他の測定範囲より狭まった結果となった。
【００８４】
図８に、図７（ａ）〜（ｅ）で得られた測定範囲１〜５を黒塗りのバーとして並べて示す。横軸はＣＲＰ濃度を示している。横軸に記載されたＡ１〜Ａ５、Ｂ１〜Ｂ５は、図７と同意義を有している。測定範囲３及び測定範囲４は上述した理由で狭まっている。測定範囲１、測定範囲２、測定範囲５は、高濃度側の測定限界濃度はほぼ近似しているが、低濃度側の測定限界濃度は異なっている。
【００８５】
混合金コロイド標識抗体試験片１Ａは、２０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片及び３０ｎｍ金コロイド標識抗体試験片に比べて低濃度側に大幅に測定範囲を広げることができたが、高濃度側の測定限界を犠牲する結果となった。これに対し、混合金コロイド標識抗体試験片２Ａは、高濃度側の測定限界を犠牲にすることなく、低濃度側の測定限界を広げることができた。
【００８６】
実施例１、実施例２の結果によれば、３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体とを１：１で混合した本発明の混合金コロイド標識抗体試験片１Ａによれば低濃度側の測定範囲が広がり；２０ｎｍ金コロイド標識抗体と３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体とを１：１：１で混合した混合金コロイド標識抗体試験片２Ａによれば低濃度側でも高濃度側でも測定範囲が広がり；いずれの試験片１Ａ，２Ａでも、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍの金コロイド標識抗体から得られる測定範囲以上の測定範囲が得られる。また、いずれの混合金コロイド標識抗体を用いた試験片１Ａ，２Ａでの測定範囲も、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍの金コロイド標識抗体で得られる測定範囲から平均的もしくは比例的に広がるのでなく、不均一に大きく広がる。これらの結果は、本発明の混合金コロイド標識抗体試験片１Ａ，２Ａのように、粒径の異なる金コロイド粒子群で構成した金コロイド標識抗体を混合することによって、より自由に測定範囲を設定可能となることを示している。
【００８７】
以上の実施例１、実施例２は例示であって、２０ｎｍ金コロイド標識抗体、３０ｎｍ金コロイド標識抗体、４０ｎｍ金コロイド標識抗体の混合比率は任意であり、混合比率を適宜に変更することで、各種の被検査物質に応じた測定範囲の設定が可能となる。また粒径が２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍの粒子に限らず、１〜１００ｎｍの範囲の粒子を用いて測定範囲の設定が可能である。
【００８８】
金コロイドの粒度分布は動的光散乱法を用いて測定したが、これに限られるものではなく、レーザー回析法、静的光散乱法などの光散乱法や、顕微鏡での測定、ふるいわけ法や比重天秤法、光透過法などの沈降法などほかの測定法を採用しても問題はない。標識試薬を構成する標識物としても、金コロイドに限られるものではなく、他の金属コロイド、合金、ラテックス粒子などの着色重合体ビーズ、重合染料粒子など、不溶性粒状マーカーであれば何でもよい。
【００８９】
測定目的に応じてより多数の試薬固定化部を設けること、また使用する抗体の親和力により各試薬固定化部の関係を変更するなど、必要に応じて変更可能であることは言うまでもない。測定に用いたシグナルは、試薬固定化部における、結合した標識試薬からの信号であり、その必要性により、目視で判定することも可能であるが、より正確に測定するためには、上述した吸光度測定器など任意の検出器を用いることが好ましい。
【００９０】
標識試薬部も必ずしも一箇所である必要はなく、複数の試薬固定化部と複数の標識試薬部の組合せにより構成することもできる。例えば複数の試薬固定化部で各々の上流側に標識試薬部を配した構成を取ることも可能である。製造上の工法は複雑になるが、任意の位置に任意の数で設置できる。
【００９１】
バイオセンサ（イムノクロマトグラフ試験片）は、ニトロセルロース膜上に標識試薬部と試薬固定化部とを設けた上述の構成に限られず、ニトロセルロースとは異なる材料、例えば不織布のような多孔質性担体に標識試薬を担持したものを支持体上に配しても何ら問題はない。
【００９２】
被検査液としては、例えば、水や、尿、血液、血漿、血清、唾液などの体液、固体及び粉体や気体を溶かした（水）溶液などがあり、尿検査、血液検査、便検査、水質検査や土壌分析などの環境分析、食品分析などに本発明のバイオセンサを利用可能である。
【００９３】
被検物質としてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を例示したが、そのほかに、抗体、免疫グロブリン、ホルモン、酵素及びペプチドなどのタンパク質及びタンパク質誘導体や、細菌、ウイルス、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫ならびにそれらの産物及び成分などの感染性物質、治療薬及び乱用薬物などの薬物及び腫瘍マーカーが挙げられる。具体例は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン、濾胞形成ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン、副腎脂質刺激ホルモン、エストラジオール、前立腺特異抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、ミオグロビン、ＣＲＰ、心筋トロポニン、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン等である。
【００９４】
いずれにしても、バイオセンサを上述した構成とすることにより、高感度・高性能で、被検査物質の濃度の測定範囲が十分に広くなり、簡便かつ迅速に測定を実施することができ、製造も容易となる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明にかかるバイオセンサは、臨床分野等の医療診断現場に限らず、食品衛生関連分野、環境計測分野などの様々な分野において、簡易、正確、かつ迅速な測定を行うものとして利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の実施の形態１におけるバイオセンサを示す分解図と斜視図
【図２】本発明の実施の形態２におけるバイオセンサを示す分解図と斜視図
【図３】図１および図２のバイオセンサに用いる金コロイドの粒度分布図
【図４】図１のバイオセンサでの測定結果図
【図５】図４の概略図
【図６】図２のバイオセンサでの測定結果図
【図７】図６の概略図
【図８】図７の概略図
【符号の説明】
【００９７】
１    微細空間
２    展開層
３    開放部
４    標識試薬
５    試薬固定化部
６    液体不透過性シート材
７    基板
８    微細空間形成材
９    細胞収縮試薬
１０  試薬固定化部
１１  試薬固定化部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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