(57)【要約】      （修正有）【課題】鉄腐食性のメタン生成菌の検出のために特異的プローブや特異的ＰＣＲ用プライマーとして用いる核酸分子と腐食菌検出方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列、またはその相補配列からなる核酸分子。或いは、特定の配列またはその相補配列の部分配列からなる核酸分子であって、特定の配列またはその相補配列からなる塩基配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなる核酸分子、あるいは、前記特定の配列またはその相補配列の部分配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加した部分配列からなる核酸分子であって、特定の配列またはその相補配列からなる塩基配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなる核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列、またはその相補配列からなることを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列からなる核酸分子であって、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる塩基配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなる核酸分子、あるいは、前記配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加した部分配列からなる核酸分子であって、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる塩基配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなることを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列が、配列表の配列番号２から１７のいずれかの塩基配列を有し、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる核酸分子と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなることを特徴とする、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子を用いて鉄腐食性メタン生成菌を検出することを特徴とする鉄腐食性メタン生成菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄鋼材料の腐食に関わる鉄腐食性メタン生成菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年米国のＦＨＷＡ（Ｔｈｅ  ＵＳ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｈｉｇｈｗａｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により金属の腐食に関わるコストの調査結果が報告された（非特許文献１）。本報告によると、米国では金属腐食による損失は年間２７６０億ドルに達し、国内総生産（ＧＤＰ）の３．１％に相当すると報告されている。また、米国のガス産業において、パイプラインなどの腐食に掛かるコストが年間１３４億ドルに達し、このうちの約２０億ドル（約１５％）は微生物腐食によるものと報告されている（非特許文献２）。わが国においても腐食防食協会と日本防錆技術協会を中心とする腐食コスト調査委員会の調査により、１９９７年にわが国の腐食対策に講じた費用は３兆９千億円で、わが国の国内総生産（ＧＤＰ）の０．８％に相当すると報告されている（非特許文献３）。以上のように、腐食による被害額は甚大であり、これを防ぐことは資源の乏しい我が国にとって重要な課題である。
【０００３】
微生物腐食はこれまで鉄鋼材料を中心に多く報告されている。酸素が利用できる好気条件と、酸素が利用できない嫌気条件でそれぞれ異なる種類の微生物が鉄鋼材料の腐食作用を示すことが知られている。嫌気条件の微生物腐食の原因微生物として硫酸塩還元菌に関する多くの報告がある。硫酸塩還元菌は、海水などに含まれる硫酸塩を硫化物に還元する活性を有する。その結果発生する硫化水素は、鉄をはじめとしてさまざまな金属と硫化物をつくるため、強い腐食性が知られている。また、硫酸塩還元菌には、水素の酸化還元酵素であるヒドロゲナーゼを有するものがある。嫌気条件下、すなわち酸化還元電位の低い還元的な環境条件では、中性条件においても水の分解により、鉄表面でカソード反応が起こり、水素原子さらに水素分子が形成される（この反応にカップルして、アノードでは、鉄の酸化がおこり、二価鉄イオンが生成する）。この際、ヒドロゲナーゼ活性を有する硫酸塩還元菌は、カソード反応で生成する水素原子あるいは水素分子をプロトンに酸化できるため、鉄表面を復極させて、カソード反応を促進する。この結果、電子の授受が円滑にすすむため、嫌気条件における鉄のアノード溶解が促進される。このようなヒドロゲナーゼを有する硫酸塩還元菌による腐食促進メカニズムは、カソード復極説として知られている（非特許文献４）。
【０００４】
例えば油井など、石油環境では、硫酸塩還元菌による腐食影響は、大きな課題になっている。段階的な希釈により硫酸塩還元菌を検出、存在量をモニタリングするための簡易なキットなどが、石油生産に関わる産業分野では使用されている（非特許文献５）。
【０００５】
以上のように、嫌気条件における硫酸塩還元菌による微生物腐食は、広く知られており、その検出や存在量測定のための技術が報告されている。硫酸塩還元菌の増殖を抑制する方法なども考案されている。例えば、非特許文献６では、抗生物質を生産する微生物を共存させることで、硫酸塩還元菌の増殖を抑制する方法などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−０４３２５８
【特許文献２】特開２００８−２１５８５２
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｅｐｏｒｔ  ＦＨＷＡ−ＲＤ−０１−１５６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１．
【非特許文献２】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＤＥ−ＦＣ２６−０１ＮＴ４１１５８
【非特許文献３】わが国における腐食コスト（腐食防食協会、日本防錆技術協会）（１９９７）
【非特許文献４】Ｖｏｎ  Ｗｏｌｚｏｇｅｎ  Ｋｕｅｈｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ，Ｗａｔｅｒ  １６，１４７（１９３４）
【非特許文献５】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ，ＮＡＣＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐ．４３（１９９７）
【非特許文献６】Ｚｕｏ  Ｒ，Ｗｏｏｄ  ＴＫ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：７４７（２００４）
【非特許文献７】腐食反応とその制御（第３版）ユーリック、レヴィー共著（産業図書）（１９８９）
【非特許文献８】Ｄａｎｉｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７，５０９（１９８７）
【非特許文献９】Ｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｃｏｒｒ  ２００８  Ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．１０６３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、嫌気条件で微生物腐食の原因となる微生物として、硫酸塩還元菌は広く知られており、硫酸塩還元菌に対する検出方法や、腐食対策方法も報告されている。
【０００９】
また、嫌気環境に棲息する微生物生態系を構成する主要な微生物として、硫酸塩還元菌のほかに、メタン生成菌があるが、メタン生成菌を嫌気環境における腐食原因菌としては、一般的に認知されてこなかった。例えば、非特許文献７には、微生物腐食の原因菌が紹介されているが、この中でメタン生成菌は、腐食原因菌として説明されていない。これは、硫酸塩還元菌の生成する硫化水素が極めて強力な腐食原因物質であるのに対して、メタン生成菌が生成するメタンは、腐食原因物質ではないことが、メタン生成菌が腐食原因菌としてみなされてこなかったことの、大きな要因として考えられる。
【００１０】
すなわち、嫌気性微生物であるメタン生成菌を腐食の原因微生物としては必ずしも一般的には認識されていないのが現状である。しかしながら、メタン生成菌が腐食原因菌であることを示す学術的な報告はある。ダニエルス（Ｄａｎｉｅｌｓ）らは、メタン生成菌が鉄を腐食することを報告している（非特許文献８）。さらに最近、特許文献１、２において鉄腐食性のメタン生成菌が報告されている。
【００１１】
腐食原因となるメタン生成菌が、腐食部位あるいは環境中に存在するか否かを検出することは、微生物腐食であるか否かの、腐食原因の解析や、腐食の予防、対策に極めて重要である。しかしながら、腐食原因となるメタン生成菌が特定されてこなかったことから、その検出方法も確立されていない。例えば、メタン生成菌が有する遺伝子としてメタン生成酵素の遺伝子ｍｃｒＡが知られている。しかし、メタン生成菌には鉄腐食性を示さない多くのメタン生成菌がいるため、メタン生成の代謝反応に関わる酵素の遺伝子ｍｃｒＡをターゲットとしたＰＣＲを行なってメタン生成菌を検出しても、検出したメタン生成菌が鉄腐食性であるか否かは不明であり、微生物腐食を起こすメタン生成菌の検出には問題がある。
【００１２】
よって、本発明は鉄腐食性のメタン生成菌の検出のために特異的プローブや特異的ＰＣＲ用プライマーとして用いる核酸分子と腐食菌検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため、本発明者らは鉄腐食性のメタン生成菌と、この鉄腐食性のメタン生成菌を継代培養中、鉄腐食能を失った変異株のメタン生成菌のゲノム解析を実施した。鉄腐食性のメタン生成菌と非鉄腐食性の変異株のメタン生成菌のゲノムＤＮＡを比較した結果、鉄腐食性のメタン生成菌のみに存在する特徴的な塩基配列を見出し、鉄腐食性のメタン生成菌を選択的に検出する方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明の要旨とするところは次の（１）〜（４）である。
【００１４】
（１）配列表の配列番号１に示される塩基配列、またはその相補配列からなることを特徴とする核酸分子。
【００１５】
（２）配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列からなる核酸分子であって、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる塩基配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなる核酸分子、あるいは、前記配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加した部分配列からなる核酸分子であって、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる塩基配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなることを特徴とする核酸分子。
【００１６】
（３）配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列が、配列表の配列番号２から１７のいずれかの塩基配列を有し、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる核酸分子と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなることを特徴とする（２）の核酸分子。
【００１７】
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸分子を用いて鉄腐食性メタン生成菌を検出することを特徴とする鉄腐食性メタン生成菌の検出方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、鉄鋼材料を腐食させるメタン生成菌の検出が可能となり、鉄鋼材料の腐食予防と対策に貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＰＣＲによる１６ＳｒＤＮＡとメチルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の検出結果を示す。
【図２】配列番号２と３、配列番号４と５、配列番号６と７のプライマーを用いたＰＣＲによる鉄腐食性メタン生成菌由来のＤＮＡの検出結果を示す。
【図３】単独微生物由来ＤＮＡを用いた定量ＰＣＲを示す。
【図４】複合微生物ＤＮＡを用いた定量ＰＣＲを示す。
【図５】ＰＣＲによるヒドロゲナーゼ構造遺伝子の検出結果を示す。
【図６】ＰＣＲによるカーボニックアンヒドラーゼ構造遺伝子の検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
まず、本発明の配列表の配列番号１に示される塩基配列について説明する。
本発明が検出対象とする腐食菌は、鉄腐食性のメタン生成菌である。前記鉄腐食性メタン生成菌を検出しようとする際に対象となる主な環境試料は、鉄または鉄を含む合金と接して存在する水、石油、スラッジ、土壌、バイオフィルムなどであるが、鉄または鉄を含む合金と接して存在しなくとも、例えば水、石油、土壌などの鉄に対する微生物腐食の可能性を知るために、これらを前記鉄腐食性メタン生成菌の検出の対象とする試料とすることもある。
【００２１】
メタン生成菌は、硫酸塩還元菌と共に、あらゆる嫌気性環境に棲息している代表的な嫌気性微生物である。このうち、特に鉄鋼材料の腐食の原因となるのは、鉄を電子供与体として、かつ、二酸化炭素を炭素源として利用可能なメタン生成菌である。
【００２２】
本発明者らは、鉄を電子供与体として、かつ、二酸化炭素を炭素源とする同じ条件で、異なる原油タンクのスラッジ等から、鉄腐食性のメタン生成菌三株をそれぞれ独立して分離、特定することに成功した。これら鉄腐食性のメタン生成菌三株は、メタノコッカレス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目メタノコッカシアエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科に属するメタノコッカス  マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）の受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−２５２で特定されるメタン生成菌メタノコッカス  マリパルディスＫＡ１株（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＫＡ１）、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−７０９で特定されるメタノコッカス  マリパルディスＯＳ７株（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＯＳ７）および受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−７０８で特定されるメタノコッカス  マリパルディスＭｉｃ１ｃ１０株（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｍｉｃ１ｃ１０）（いずれもＮＥＤＯ事業「微生物を利用した石油の環境安全対策に関する調査」で単離）である。一方、他のメタノコッカス  マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）の単離株の鉄腐食性を調べたところ、米国エネルギー省で単離されたメタノコッカス  マリパルディスＳ２株（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓ２）、メタノコッカス  マリパルディスＪＪＴ株（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＪＪＴ）、および、メタノコッカス  マリパルディスＭｉｃ４ｃ０８株（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｍｉｃ４ｃ０８）（ＮＥＤＯ事業「微生物を利用した石油の環境安全対策に関する調査」で単離）の鉄腐食性は、微生物が存在しない無菌の条件と同程度の腐食しか示さず、鉄腐食性は殆どないことも確認した。
【００２３】
さらに、前記鉄腐食性のメタン生成菌メタノコッカス  マリパルディスＫＡ１株、メタノコッカス  マリパルディスＯＳ７株、メタノコッカス  マリパルディスＭｉｃ１ｃ１０株の三株のうち、メタノコッカス  マリパルディスＫＡ１株とメタノコッカス  マリパルディスＯＳ７株の二株について、鉄腐食性をなくした突然変異株を分離することにも成功した。このうち、メタノコッカス  マリパルディスＯＳ７株から由来し、腐食能をなくした突然変異体（以降ＯＳ７ｍｕｔ１株と呼ぶ）とＯＳ７株のゲノムＤＮＡの塩基配列を比較したところ、ＯＳ７ｍｕｔ１株では、ゲノムの一部が欠損していることが解った。また、ＯＳ７株に存在し、ＯＳ７ｍｕｔ１株では欠失しているゲノムＤＮＡの領域を、腐食性メタン生成菌であるＫＡ１株は有していた。一方、ＫＡ１株より由来し、腐食能を失った株（以降ＫＡ０株と呼ぶ）では、この領域をもっていないことも解った。
【００２４】
このようにして、腐食性メタン生成菌に特有な遺伝子領域が存在し、その遺伝子領域は、腐食を誘導するのに重要な遺伝子をコードしていることが強く示唆された。
【００２５】
この鉄腐食能のあるメタン生成菌に特有な遺伝子領域の塩基配列が、本発明の配列表の配列番号１に示される塩基配列および、その相補鎖からなる核酸分子である。
【００２６】
鉄腐食性メタン生成菌に特有な配列表の配列番号１に示される塩基配列あるいはその相補配列の核酸分子を検出することで、腐食原因遺伝子領域の検出が可能となる。
【００２７】
配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列は、腐食原因微生物の有する配列番号１に記載の塩基配列あるいはその相補配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）するため、腐食原因微生物の核酸分子を特異的に検出するプローブ又はＰＣＲプライマーとなり得る。
【００２８】
また、配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列から１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列でも、腐食原因微生物の有する配列番号１に示される塩基配列あるいはその相補配列と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）するため、腐食原因微生物の核酸分子を特異的に検出するプローブ又はＰＣＲプライマーとなり得る。
【００２９】
すなわち、配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列、あるいはその部分配列から１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を含む核酸をハイブリダイゼーション・プローブあるいはＰＣＲプライマーとして用いることにより、鉄腐食性メタン生成菌を検出することが可能である。
【００３０】
特異的プローブ、特異的ＰＣＲプライマーの設計方法としては、例えば、標的遺伝子塩基配列をＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）などの既知配列に対してＢＬＡＳＴ解析を行い、既知配列と全く異なる配列部分を選抜し、人工的に合成したオリゴヌクレオチドを蛍光標識して特異的プローブとして使用する。もしくは、例えば標的遺伝子塩基配列内の少なくとも数十塩基以上離れた二か所から、其々の３’側で３塩基以上からなる相補鎖を形成せず、かつ、一分子内で相補的配列を有せず、塩基組成（ＧＣ含量）が顕著に偏っていない２０塩基前後から構成されるオリゴヌクレオチドを特異的ＰＣＲプライマーとして使用する。
【００３１】
特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションで腐食菌を検出する方法について説明する。例えば、環境試料あるいは微生物培養液から抽出したＤＮＡを熱変性（９５℃で１０分加熱後、氷水中で急冷）等で一本鎖にした後、正に荷電したナイロンメンブレン等に吸着させ、ベイキング（８０℃で６０分加熱）処理によって固定を行う。ＤＮＡを固定したナイロンメンブレンをプローブを含まない１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、７％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中でインキュベート（４２℃で６０分）した後、適当量の蛍光標識プローブを含む１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液にナイロンメンブレンを移し替え、インキュベート（４２℃で一晩）する。ハイブリダイゼーション後、ナイロンメンブレンを０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを含む２×ＳＳＣ溶液（１０ｍｌ）中で二回洗浄（各５分）し、０．１（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを含む０．１×ＳＳＣ溶液（１０ｍｌ）中で二回洗浄（各１５分）して、非特異的に結合したプローブを除去する。洗浄後のメンブレンを化学発光・蛍光検出器等で分析し、蛍光標識プローブのシグナルを検出する。ただし、前記の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションにより腐食菌を検出する方法は一例であり、これ以外の適当な方法を用いてハイブリダイゼーションにより腐食菌を検出しても勿論かまわない。
【００３２】
次に、ＰＣＲの際に鋳型として使用する環境ＤＮＡの抽出方法について説明する。
まず、ＤＮＡ断片を増幅させるための鋳型となるＤＮＡを、鉄腐食性メタン生成菌が存在するか否かを調べるための試料から抽出する方法について説明する。現在、さまざまな環境サンプルからのＤＮＡ抽出方法が確立されており、商業的に利用可能なＤＮＡ抽出キットなどもあるので、適当な方法を用いればよい。例えば、鋼板表面の腐食生成物を細かく粉砕し、Ｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、８ｍｇ  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ）中で懸濁し、３７℃で６０分間リゾチーム（終濃度２００μｇ／ｍｌ）処理を行った後、ラウリル硫酸ナトリウム（終濃度０．４％（ｗ／ｖ））およびｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加して、６０℃で３０分間溶菌処理を行なう。この溶菌液からＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｈｏｌ（２５：２４：１）処理によりタンパク質を除去し、イソプロピルアルコールにより核酸を沈殿させ、７０％（ｖ／ｖ）エタノール洗浄後、外来ＤＮＡを含まないＴＥ緩衝液や滅菌水に溶解してＤＮＡを抽出、回収するなどの方法がある。また、商業的に利用可能なＤＮＡ抽出キットとしては、例えば、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、米国）などを用いることができる。
【００３３】
尚、前記ＤＮＡの抽出、回収方法は一例であって、この他の適当なＤＮＡの抽出、回収方法を実施しても勿論かまわない。
【００３４】
次に、抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりＤＮＡ断片を増幅する方法について説明する。
【００３５】
上記の方法を用い抽出されたＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅方法についてであるが、ＰＣＲの反応条件は、変性、アニーリング、伸長反応の各温度と時間設定、サイクル数などを適当な条件に設定することで、増幅しようとするＤＮＡ断片を良好に増幅する条件を設定することができる。
【００３６】
鉄腐食性のメタン生成菌を検出するためのＰＣＲでは、プライマーとして、例えば、以下に示す塩基配列を有するＤＮＡを組み合わせて用いることができる：配列表の配列番号２と３の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号４と５の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号６と７の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号８と９の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号１０と１１の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号１２と１３の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号１４と１５の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号１６と１７の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３７】
このうち、特に配列表の配列番号２と３の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号４と５の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列表の配列番号６と７の塩基配列を有するＤＮＡのいずれかのＤＮＡの組み合わせをＰＣＲのプライマーとして用いると、前記鉄腐食性メタン生成菌であるメタノコッカス  マリパルディスＫＡ１株、ＯＳ７株、Ｍｉｃ１ｃ１０株の全てについてＤＮＡ断片が増幅されるが、非鉄腐食性のメタノコッカス  マリパルディスＫＡ０株、ＯＳ７ｍｕｔ１株、Ｓ２株、ＪＪＴ株、Ｍｉｃ４ｃ０８株ではＤＮＡ断片は増幅されない。すなわち、配列番号２と３の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号４と５の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号６と７の塩基配列を有するＤＮＡのいずれかのＤＮＡの組み合わせをＰＣＲのプライマーとして用いると、前記鉄腐食性メタン生成菌を特異的にＰＣＲで検出できた。
【００３８】
また、定量ＰＣＲによって、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片の増幅前の存在量を推定することも可能である。通常、定量ＰＣＲでは、増幅されるＤＮＡ断片が１００ｂｐから２００ｂｐの短い断片であることが理想とされるので、例えば前記プライマーのうち、配列表の配列番号８と９の塩基配列を有するプライマーの組み合わせ、あるいは、配列表の配列番号１０と１１の塩基配列を有するプライマーの組み合わせを用いることができる。しかし、これらは一例であり、これら以外の適当なプライマーを設計して定量ＰＣＲに用いても勿論構わない。
【００３９】
さらに、前記配列番号１に記載の鉄腐食性のメタン生成菌に特異的な遺伝子領域に存在して、鉄腐食の原因となり得る酵素の遺伝子を調べた結果、水素の酸化還元反応を触媒する新規なヒドロゲナーゼと、二酸化炭素と炭酸の化学変換を触媒する新規なカーボニックアンヒドラーゼの遺伝子が存在することが予測された。本発明者らは、前記鉄腐食性のメタン生成菌メタノコッカス  マリパルディスＯＳ７株の培養液から、０．２μｍ孔径のフィルターろ過により菌体を除いたろ過液のみでも、鉄腐食と水素発生が促進されることを見出した。また、本ろ過液中に前記ヒドロゲナーゼと前記カーボニックアンヒドラーゼが存在することをプロテオーム解析により確認した。前記ヒドロゲナーゼは水素発生のカソード反応を促進して、鉄腐食を促進することが想定される。また、前記カーボニックアンヒドラーゼは、メタン生成菌が炭素源として利用する二酸化炭素の供給を促進することで、間接的にメタン生成菌による鉄腐食を促進することが想定される。したがって、鉄腐食性メタン生成菌に特有な配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、前記ヒドロゲナーゼと前記カーボニックアンヒドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列については、遺伝子と遺伝子の間の介在配列など機能を持たない塩基配列に比べより保存性が高く、ハイブリダイゼーション・プローブやＰＣＲプライマーの設計を行うに適した塩基配列を持つと考えられる。前記ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を検出するためのＰＣＲプライマーとして、例えば配列表の配列番号１２と１３、あるいは配列表の配列番号１４と１５に記載の塩基配列を有する核酸分子を用いることが可能である。また、前記カーボニックアンヒドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を検出するためのＰＣＲプライマーとして、例えば配列表の配列番号１６と１７に記載の塩基配列を有する核酸分子を用いることが可能である。
【００４０】
ただし、前記配列番号２から１７に記載の塩基配列の核酸分子は本発明の一例であり、本発明はこれらに限られるものではない。前記のように、配列表の配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列であって、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる核酸分子と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなり得る核酸分子、あるいは、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の部分配列から１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列であっても、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列からなる核酸分子と特異的に会合（ハイブリダイゼーション）することにより特異的プローブ又は特異的ＰＣＲプライマーとなり得る核酸分子であれば、使用可能である。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４２】
実施例１  ＰＣＲによる鉄腐食性メタン生成菌の検出
鉄腐食性のメタン生成菌であるメタノコッカス  マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）ＯＳ７株、ＫＡ１株、Ｍｉｃ１ｃ１０株、および同じメタノコッカス  マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）でありながら、鉄腐食性のないメタノコッカス  マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）Ｓ２株、ＪＪＴ株、Ｍｉｃ４ｃ０８株のそれぞれを、表１に記載の培地で増殖させた。次いで、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ，米国）を用いて、各メタン生成菌由来のＤＮＡを抽出しした。上述の方法により得られたＤＮＡを鋳型として各ＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅を行った。まず、比較のために、下記の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３４１番から９０７番の間の塩基配列を増幅するためのプライマーおよび、メタン生成菌のメチルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子（ｍｃｒ）のＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲによる増幅を試みた。
【００４３】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のＤＮＡ断片増幅用ＰＣＲプライマー；
フォワードプライマー
３４１Ｆ：  ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ
リバースプライマー
９０７Ｒ：  ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＲＡＧＴＴＴ
【００４４】
メチルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子（ｍｃｒ）のＤＮＡ断片増幅用ＰＣＲプライマー；
フォワードプライマー
ＭＥ１：  ＧＣＭＡＴＧＣＡＲＡＴＨＧＧＲ
リバースプライマー
ＭＥ２：  ＴＣＡＴＫＧＣＲＴＡＧＴＴＤＧＧＲＴＡＧＴ
【００４５】
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）を用い、Ｔ−３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）上でサーマルサイクルを行った。サーマルサイクルの条件を以下に示す。
【００４６】
ＰＣＲ条件
16S rDNA         mcr(dsr)         配列番号2&3,4&5  配列番号6&7
変性１       94℃(120 sec)    94℃(120 sec)    94℃(120 sec)    94℃(120 sec)
変性２       94℃(30 sec)     94℃(30 sec)     94℃(30 sec)     94℃(30 sec)
アニーリング 55℃(30 sec)     50℃(30 sec)     60℃(30 sec)     55℃(30 sec)
伸長反応１   72℃(90 sec)     72℃(60 sec)     72℃(60 sec)     72℃(60 sec)
伸長反応２   72℃(240 sec)    72℃(240 sec)    72℃(240 sec)    72℃(240 sec)
保温         4℃              4℃              4℃              4℃
＊変性２→アニーリング→伸長反応１を３０サイクル。
【００４７】
ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル上で電気泳動を行い、目的遺伝子断片の増幅を確認した（図１）。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域、および、メタン生成菌のメタン生成において重要な酵素であるメチルコエンザイムＡ還元酵素の遺伝子断片は、全てのメタン生成菌で増幅が観察された。
【００４８】
配列表の配列番号２と３、配列番号４と５、配列番号６と７のＰＣＲプライマーを用いた場合、前記鉄腐食性メタン生成菌であるメタノコッカス  マリパルディスＫＡ１株、ＯＳ７株、Ｍｉｃ１ｃ１０株のみで特異的にＤＮＡ断片が増幅された（図２）。
【００４９】
【表１Ａ】
2010193807.tif 000002
【００５０】
【表１Ｂ】
2010193807.tif 000003
【００５１】
実施例２  鉄腐食性メタン生成菌と硫酸塩還元菌が共存する場合における定量ＰＣＲによる鉄腐食性メタン生成菌の検出
リアルタイムＰＣＲによる定量ＰＣＲ
下記プライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、亜硫酸還元酵素遺伝子ｄｓｒＢ、メチルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子ｍｃｒ、配列表の配列番号８と９および配列番号１０と１１のＰＣＲプライマーにより鉄腐食性のメタン生成菌のＤＮＡから増幅されるＤＮＡ断片に対してリアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ量の定量を行った。リアルタイムＰＣＲはＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）を用いて、７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によりサーマルサイクルを行った。リアルタイムＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、鉄腐食性メタン生成菌はＯＳ７株とＫＡ１株、非鉄腐食性メタン生成菌はＳ２株、硫酸塩はＭＩＣ５−１５株からそれぞれ抽出したＤＮＡを用いた。
【００５２】
リアルタイムＰＣＲ用プライマー；
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子用プライマー
３４１Ｆ：  ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ
５１８Ｒ：  ＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ
【００５３】
亜硫酸還元酵素遺伝子（ｄｓｒＢ）用プライマー
ＤＳＲｐ２０６０Ｆ：  ＣＡＡＣＡＴＣＧＴＹＣＡＹＡＣＣＣＡＧＧＧ
ＤＳＲ４Ｒ：  ＧＴＧＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＣＧＣＡ
【００５４】
メチルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子（ｍｃｒ）用プライマー
ＭＣＲｆ：  ＴＡＹＧＡＹＣＡＲＡＴＨＴＧＧＹＴ
ＭＣＲｒ：  ＡＣＲＴＴＣＡＴＮＧＣＲＴＡＲＴＴ
【００５５】
鉄腐食性のメタン生成菌に特異的なＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号８：  ＧＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣ
配列番号９：  ＧＧＡＧＴＧＡＴＧＴＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣ
【００５６】
鉄腐食性のメタン生成菌に特異的なＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号１０：  ＡＧＣＧＡＧＣＴＴＣＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣ
配列番号１１：  ＡＧＴＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＣＡＧＡＡＣＣ
【００５７】
ＰＣＲ反応溶液組成
2×Power SYBR Green Master Mix   25.0μl
10μM Forward primer              2.5μl
10μM Reverse primer              2.5μl
Template DNA                      1.0μl
滅菌水                           19.0μl
全量                             50.0μl
【００５８】
ＰＣＲ反応条件
ポリメラーゼ活性化（９５℃、１０ｍｉｎ）の後、変性（９５℃、１５ｓｅｃ）→アニーリングおよび伸長反応（６０℃、６０ｓｅｃ）で４０サイクル。各サイクルの伸長反応後に蛍光強度を採取。
【００５９】
尚、各ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片について、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を用いて精製した後、ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）によりＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡ濃度とＤＮＡ断片の鎖長からコピー数を算出し、検量線作成のための標準溶液とした。
【００６０】
試験結果
リアルタイムＰＣＲの結果、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的としたプライマーセットで鉄腐食性メタン生成菌、非鉄腐食性メタン生成菌、および硫酸塩還元菌の全てが定量できた（図３）。硫酸塩還元菌を標的としたプライマーセットでは、硫酸塩還元菌のみを特異的に増幅し、検出することが出来た。鉄腐食能の有無に関わらず、全てのメタン生成菌を対象としたプライマーセットでは、使用した三株全ての検出が可能であった。さらに、鉄腐食性メタン生成菌を対象としたプライマーセットでは、鉄腐食性メタン生成菌ＯＳ７株およびＫＡ１株のみを特異的に検出することが出来た。
【００６１】
さらに、単独微生物由来のＤＮＡを鋳型にするだけでなく、様々な微生物種から抽出したＤＮＡの混合物を用いても、これらの特異的検出が可能かどうか検討を行った（図４）。硫酸塩還元菌、鉄腐食性メタン生成菌、および非腐食性メタン生成菌のＤＮＡを混ぜた状態でリアルタイムＰＣＲを行った結果、鉄腐食性メタン生成菌を標的としたプライマーセットで、鉄腐食性メタン生成菌が存在するときのみ特異的に検出することが可能であり、その検出量も単独微生物での定量結果と遜色の無い定量性を示した。同様に、硫酸塩還元菌を標的としたプライマーセットでは硫酸塩還元菌を、メタン生成菌全般を標的としたプライマーセットでは鉄腐食能の有無に関わらずメタン生成菌を定量することが出来た。
以上の結果より、これら鉄腐食性メタン生成菌が有するＤＮＡを対象としたリアルタイムＰＣＲを行うことで、複数種の微生物が混在するような条件の環境試料から抽出したＤＮＡ試料に関して、鉄腐食性メタン生成菌を定量的に検出することが可能であることを確認できた。
【００６２】
実施例３  ヒドロゲナーゼの構造遺伝子配列のＰＣＲによる検出
鋳型ＤＮＡとして、鉄腐食性メタン生成菌ＯＳ７株のゲノムＤＮＡと、ＯＳ７株のゲノムＤＮＡからヒドロゲナーゼの構造遺伝子を含む領域を欠失した非鉄腐食性の変異株ＯＳ７ｍｕｔ１株のゲノムＤＮＡを用いた。Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｒｅｍｉｘ−ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社）を用いた。鋳型ＤＮＡとして、１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液を２μｌ使用し、反応総量は２０μｌである。鋳型ＤＮＡの代わりに滅菌水を使用したものを、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとした。配列表の配列番号１２と１３、およびの配列番号１４と１５の塩基配列のプライマーを用いて、以下の条件でＰＣＲを実施した。
９５℃  １ｍｉｎ
９５℃  ３０ｓｅｃ，５８℃  ３０ｓｅｃ，７２℃  ３０ｓｅｃを３０サイクル
【００６３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図５に示す。
配列表の配列番号１２と１３のプライマーを用いたＰＣＲでは、鉄腐食性のＯＳ７株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみに、７４８ｂｐのＰＣＲ産物が検出された。非鉄腐食性のＯＳ７ｍｕｔ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には、ＰＣＲ産物は検出されなかった。
【００６４】
配列表の配列番号１４と１５のプライマーを用いたＰＣＲにおいても、鉄腐食性のＯＳ７株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみに、１３４７ｂｐのＰＣＲ産物が検出された。非鉄腐食性のＯＳ７ｍｕｔ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には、ＰＣＲ産物は検出されなかった。したがって、配列表の配列番号１２と１３あるいは配列番号１４と１５の塩基配列のＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲによって、鉄腐食の原因となるヒドロゲナーゼの構造遺伝子を検出できることが確認された。
【００６５】
実施例４  カーボニックアンヒドラーゼの構造遺伝子配列のＰＣＲによる検出
鋳型ＤＮＡとして、鉄腐食性メタン生成菌ＯＳ７株のゲノムＤＮＡと、ＯＳ７株のゲノムＤＮＡからカーボニックアンヒドラーゼの構造遺伝子を含む領域を欠失した非鉄腐食性の変異株ＯＳ７ｍｕｔ１株のゲノムＤＮＡを用いた。
【００６６】
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｒｅｍｉｘ−ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社）を用いた。鋳型ＤＮＡとして、１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液を２μｌ使用し、反応総量は２０μｌ。鋳型ＤＮＡの代わりに滅菌水を使用したものを、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとした。
配列番号１６と１７の塩基配列のプライマーを用いて、以下の条件でＰＣＲを実施した。
９５℃  １ｍｉｎ
９５℃  ３０  ｓｅｃ，５８℃  ３０ｓｅｃ，７２℃  ３０ｓｅｃを３０サイクル
【００６７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図６に示す。
配列表の配列番号１６と１７のプライマーを用いたＰＣＲでは、鉄腐食性のＯＳ７株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のみに、５６１ｂｐのＰＣＲ産物が検出された。非鉄腐食性のＯＳ７ｍｕｔ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には、ＰＣＲ産物は検出されなかった。したがって、配列番号１６と１７の塩基配列のＤＮＡをプライマーに用いるＰＣＲによって、鉄の炭酸腐食の原因となるカーボニックアンヒドラーゼの構造遺伝子を検出できることが確認された。
【受託番号】
【００６８】
１．メタノコッカス  マリパルディス（Ｍｉｃ１ｃ１０株）
（１）微生物の識別の表示：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｍｉｃ１ｃ  １０
（２）受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−７０８
（３）受領日：２００９年２月２０日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
２．メタノコッカス  マリパルディス  ＯＳ７株
（１）微生物の識別の表示：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  Ｓｔｒａｉｎ  ＯＳ７
（２）受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−７０９
（３）受領日：２００９年２月２０日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
【図３】
2010193807.tif 000004
【図４】
2010193807.tif 000005
【図１】
2010193807.tif 000006
【図２】
2010193807.tif 000007
【図５】
2010193807.tif 000008
【図６】
2010193807.tif 000009
【配列表】
2010193807000001.app