(57)【要約】【課題】  ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８およびネコＣＴＬＡ−４核酸およびポリペプチド。【解決手段】  本発明は、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンド、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンド、ネコＣＤ２８レセプター、又はネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプターをコードする分離され精製されたＤＮＡ、及びネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明は、ＣＤ８０をコードするベクター、ＣＤ８６をコードするベクター、ＣＤ２８をコードするベクター、又はＣＴＬＡ−４をコードするベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。本発明は、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、又はネコＣＴＬＡ−４の核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明は、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、又はネコＣＴＬＡ−４の核酸にコードされるポリペプチドの有効量を含むワクチンを提供する。本発明は又、病原体に由来する免疫原を更に含むワクチンも提供する。本発明は、免疫反応を促進することができるワクチンを提供する。発明は又免疫反応を抑制することができるワクチンも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコＣＤ８０リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８０リガンドをコードする単離された核酸。
【請求項２】
ネコＣＤ８６リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８６リガンドをコードする単離された核酸。
【請求項３】
ネコＣＤ２８レセプター又はネコ可溶性ＣＤ２８レセプターをコードする単離された核酸。
【請求項４】
ネコＣＴＬＡ−４レセプター又はネコ可溶性ＣＴＬＡ−４レセプターをコードする単離された核酸。
【請求項５】
前記ネコＣＤ８０リガンドが図１Ａに示すメチオニンから開始しスレオニンで終結する配列（配列番号１）を有する、請求項１の核酸。
【請求項６】
前記ネコＣＤ８６リガンドが図３Ａに示すメチオニンから開始しイソロイシンで終結する配列（配列番号５）を有する、請求項２の核酸。
【請求項７】
前記ネコＣＤ８６レセプターが図４Ａに示すメチオニンから開始しセリンで終結する配列（配列番号７）を有する、請求項３の核酸。
【請求項８】
前記ネコＣＴＬＡ−４レセプターが図５Ａに示すメチオニンから開始しアスパラギンで終結する配列（配列番号９）を有する、請求項４の核酸。
【請求項９】
前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡである請求項９の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸中に存在するユニークな配列に対し相補的な配列を有する少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
長さが少なくとも１５または１６ヌクレオチドである請求項１１のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが検出可能に標識されている請求項１１又は１２のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記検出可能な標識が放射性同位体、蛍光体、又はビオチンである請求項１３のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが選択的にメチル化されている請求項１１又は１２のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
ＰＳＩ−Ｂ７−１／８７１−３５（ＡＴＣＣ受託番号２０９８１７）と称される請求項１６のプラスミドベクター。
【請求項１８】
請求項２の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
Ｂ７−２＃１９−２／０１１２９８（ＡＴＣＣ受託番号２０９８２１）と称される請求項１８のプラスミドベクター。
【請求項２０】
請求項３の核酸を含むベクター。
【請求項２１】
ＰＳＩ−ＣＤ２８＃７／１００２９６（ＡＴＣＣ受託番号２０９８１９）と称される請求項２０のプラスミドベクター。
【請求項２２】
請求項４の核酸を含むベクター。
【請求項２３】
ＣＴＬＡ−４＃１／０９１９９７（ＡＴＣＣ受託番号２０９８２０）と称される請求項２２のプラスミドベクター。
【請求項２４】
核酸に作用可能に結合したプロモーターを含む請求項１６〜２３の何れかのベクター。
【請求項２５】
請求項１６〜２４の何れかのベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞が真核細胞又は原核細胞である請求項２５の宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞が、Ｅ．Ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、及びＧＨ４Ｃ１細胞をからなる群から選択される請求項２６の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項３０】
請求項３の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項３１】
請求項４の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項３２】
ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養することと、生産されたポリペプチドを回収することとを具備する請求項２８〜３１の何れかのポリペプチドを製造する方法。
【請求項３３】
有効量の請求項２８〜３０の何れか１項に記載のポリペプチドと適切な担体を含むワクチン。
【請求項３４】
前記有効量が用量当たり約０．０１ｍｇないし約１００ｍｇの量である請求項３３のワクチン。
【請求項３５】
前記有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇネコ体重ないし約２５ｍｇ／ｋｂネコ体重の量である請求項３３のワクチン。
【請求項３６】
更に病原体由来の免疫原を含む請求項３３−３５のワクチン。
【請求項３７】
前記病原体が、ネコ病原体、狂犬病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、イヌ糸状虫、ノミ、又は細菌性病原体である請求項３６のワクチン。
【請求項３８】
前記ネコ病原体がネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコボロナ病ウイルス、又はネコ寄生虫である請求項３７のワクチン。
【請求項３９】
ネコに請求項３６〜３８の何れか１項に記載のワクチンを所定量投与することを含むネコに免疫を誘導する方法。
【請求項４０】
ネコに請求項３６〜３８の何れか１項に記載のワクチンを所定量投与することを含むネコの免疫応答を増強する方法。
【請求項４１】
前記ワクチンを皮下、筋肉内、全身、局所、または経口的に投与する請求項３９または４０の方法。
【請求項４２】
免疫反応を効果的に抑制する量の請求項３１に記載のポリペプチドをネコに投与することを含む、ネコの免疫反応を抑制する方法。
【請求項４３】
免疫反応を効果的に抑制する量の請求項２８〜３０に記載の可溶性ポリペプチドをネコに投与することを含む、ネコの免疫反応を抑制する方法。
【請求項４４】
前記量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし約２５ｍｇ／ｋｂ体重／日である請求項４２又は４３の方法。
【請求項４５】
前記ネコが自己免疫疾患に罹患しているか、または組織若しくは臓器移植のレシピエントである請求項４２又は４３の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本明細書は、その内容が本明細書中に参照されここに取り込まれている１９９８年、５月１日出願の米国出願番号０９／０７１，６９９号の優先権を主張するものである。本明細書を通し、各種刊行物はカッコ内に引用される。これら刊行物の完全な引用は明細書末、配列表直前に見ることができるだろう。これら刊行物の開示は、本発明が関係する技術状態をより完全に記述するために、その全体が本明細書中に参照され本明細書に取り込まれる。
【０００２】
［発明の背景］
現在、ネコにおけるネコ免疫不全疾患およびネコ感染性腹膜炎疾患の予防に有効なワクチンは存在しない。現在、ネコ白血病ウイルスワクチンがあるが、その効果のレベルには疑問が残っており、ある場合には病気を起こす事もあるだろう。従って、本分野では、未だ既存のワクチンが存在しないこれらの及び他の疾病からの保護を与える、又は既存の一般的に使用されているワクチンの効力を改善する物質（ａｇｅｎｔ）又は組成物が必要とされている。更に、子ネコのワクチン投与については、子ネコ内の母親由来抗体に打ち勝つことが不可能なことから困難である。これら障害を越えるのに役立つ安全、かつ有効な作用物質も求められている。
【０００３】
宿主内の疾病に応答して生じるＴ細胞の活性化と増殖は、２種類相互作用に依存していると考えられている：ＭＨＣクラスＩ分子に関連した免疫原性ペプチドのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）による認識、およびＣＤ８０やＣＤ８６の様なアクセサリーリガンドと、Ｔ細胞上に存在するそれらの補助レセプター、ＣＤ２８および／又はＣＴＬＡ−４との二次的な相互作用である。これら２つの経路が上手く相互作用すると、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と増殖がもたらされ、Ｔｈ１およびＴｈ２型の免疫制御サイトカインの産生が増加する。Ｔ細胞の適切な共刺激が存在しないとＴ細胞が増殖し、サイトカインを分泌できない無力状態が発生する。最近２種類の分子、ＣＤ２８、及びそのリガンドであるＣＤ８０とＣＤ８６がＴ細胞応答の重要な制御因子として注目されている。ＣＤ２８は一次Ｔ細胞共刺激レセプターであり、ＣＤ８０およびＣＤ８６と相互作用すると、Ｔ細胞の増殖とサイトカインの合成を促進し、Ｔ細胞の死滅を阻止する。ＣＤ２８の相同体であるＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２とも呼ばれる）も共刺激に重要や役割を果たす。完全には解明されていないが、Ｔ細胞共刺激反応を阻害するようである。共刺激プロセスに於けるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびそれらのリガンドであるＣＤ８０とＣＤ８６間の相互作用と相互影響は、宿主の病気に対する免疫応答の全体的な誘導および抑制にとって重要である。これら４種類の共刺激性分子の発現を操作することで、Ｔ細胞反応を、拡大、抑制あるいは再方向付けを通じ制御し、特定の病原菌または疾病状態に向け所望する免疫応答を惹起させることができるかもしれない。特に、感染症に対するワクチン処理、感染症の治療および新生物性、退行性、自己免疫および免疫不全状態の治療に有益であろう。
【０００４】
哺乳動物の免疫系のＴリンパ細胞は、制御およびエフェクター機能の両方を提示する。Ｔ細胞の始源細胞は骨髄内で幹細胞より生じ、胸腺に移動する。胸腺では成熟化と選別が起こり、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）提示に関係する抗原を認識することができるが自己反応性ではない、免疫細胞のナイーブ集団の産生が起こる。胸腺での成熟に続き、各Ｔ細胞はその抗原特異性を決定するクローン毎に分配されたＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を所有する。更に、成体動物に認められる２つの主要サブセットであるＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、αおよびβサブユニットを含むＴＣＲを持っている（ＡｌｌｉｓｏｎとＬａｎｉｅｒ、１９８７）。
【０００５】
ＴＣＲタンパク質のタンパク質および遺伝子の構成は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子で観察されるそれと類似しており、Ｂ細胞上の膜結合Ｉｇに類似する多くの特性を有している（ＡｌｌｉｓｏｎおよびＬａｎｉｅｒ、１９８７）。Ｉｇ分子同様、ＴＣＲは潜在的には非常に多くの想定され得る抗原配列を認識しなければならない。その為にＴＣＲ遺伝子の構成および再配置は、Ｂ細胞で観察されるものと同様複雑である（ＤａｖｉｓとＢｊｏｒｋｍａｎ、１９８８）。Ｂ細胞により産生される抗体分子と同様に、Ｔ細胞に於けるイディオタイプ性の多様化形成には、生殖系列における複数コピーの可変域（Ｖ）遺伝子の生成、αおよびβサブユニットの無作為な再構成、および結合と挿入による多様化の形成が含まれる（ＤａｖｉｓとＢｊｏｒｋｍａｎ、１９８８）。しかしＴＣＲの可能なレパートリーはＩｇ分子のそれ同様に大きいと考えられているが、Ｂ細胞とは異なりＴ細胞は体細胞変異による多様性の形成は示さない。
【０００６】
ＴＣＲは抗原認識を担当するものの、シグナル供給能は有していない（ＡｌｌｉｓｏｎとＬａｎｉｅｒ、１９８７）。抗原提示細胞上のＭＨＣに関連し提示された抗原への結合に続くＴＣＲの立体構造の変化は、ＣＤ３およびζ＿鎖を含む非共有結合性に結合した表面分子の複合体を介してシグナルを提供する（Ｃｌｅｖｅｒｓら、１９８８）。ＴＣＲ結合はＣＤ３複合体のリン酸化をもたらし、そのが間接的に細胞内へのＣａ＋流入を誘導し、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒ産生を開始させる（ＷｅｉｓｓとＬｉｔｔｍａｎ、１９９４）。このカスケードはＴ細胞活性化の初期段階と考えられている。
【０００７】
ＴＣＲは、抗原がＭＨＣと共に提示された場合だけそれを認識する。Ｔ細胞に提示される抗原と結合するＭＨＣタンパク質には２種類のサブセットがある。ＭＨＣクラスＩは体内にある殆ど全ての有核細胞上に見いだされ、内因性に生み出されるペプチドの表面発現に機能する（Ｍａｔａｓｕｍｕｒａら、１９９２）。ＭＨＣクラスＩに関連し発現されたペプチドは、ＴＣＲと共にＣＤ８を発現しているＴ細胞により認識される（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。ＣＤ８＋Ｔ細胞はウイルス感染した細胞および悪性細胞の除去に関する免疫サーベイランスにおいて機能している。ＣＤ８＋Ｔ細胞による非自己分子の認識（悪性を示すペプチド又は変化した自己ペプチド）の結果、細胞の破壊を伝達する細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）が発生する（Ｂｅｒｋｅ、１９９４）。
【０００８】
第二の主要組織適合性サブセットであるＭＨＣクラスＩＩ分子は、特定の刺激に反応し幾つかの別の細胞集団上に誘導されることはあるが、通常はＢ細胞、マクロファージ／単球および樹状細胞を含む抗原提示担当細胞にのみ見いだされる（Ｇｅｒｍａｉｎ、１９９３）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞への外来性抗原の提示を担当している。貪食され、内部に取りこまれた、あるいは表面Ｉｇに結合され、抗原提示細胞により吸収される抗原は内在性に処理され、ＭＨＣクラスＩＩに結合する（Ｕｎａｎｕｅ、１９８７）。その後、該分子は、表面に発現され、ＣＤ４発現αβＴ細胞により認識できるようになる（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。ＣＤ４＋Ｔ細胞により抗原が認識され、多くの活性免疫反応事象の開始および拡大に必要とされるサイトカインおよび成長因子の産生が起こる（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８７）。
【０００９】
ＣＤ４およびＣＤ８はαβＴ細胞サブセットを分別し、各群の機能特性を規定するＴ細胞上へのＣＤ４およびＣＤ８の提示は相互排反的である（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。即ち、胸腺での選択および成熟に続きαβＴ細胞はＣＤ４またはＣＤ８のみを提示する。分子はＴＣＲとＭＨＣに結合した抗原間の相互作用を安定する様に作用し、Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩに関係し提示された抗原を認識するか否かを決定する（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。ＣＤ４又はＣＤ８分子の結合ドメインは、クラスＩ又はクラスＩＩ分子のそれぞれの非多型領域を認識する（Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒら、１９９４）。これら特異的領域へのＣＤ４又はＣＤ８の結合は、Ｔ細胞活性化の開始に関するＴＣＲ／抗原結合ＭＨＣ相互作用の安定化に働く（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。即ち、ＣＤ４＋Ｔ細胞はクラスＩＩに関連する抗原を発現し、ヘルパーＴ反応を開始するＡＰＣのみと機能的に相互作用するのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞はクラスＩと関連し提示される抗原のみを認識し、結合によって細胞傷害性反応を開始する（Ｇｅｒｍａｉｎ、１９９３）。ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬという二つの別個の表現型は、ＣＤ４又はＣＤ８いずれかの表面発現により分別できる。
【００１０】
ＣＤ４を有するＴ−リンパ細胞は、ＣＤ４＋ＣＴＬのサブセットとされているものも存在するが、一般には大部分がヘルパー細胞と考えられている（Ｙａｓｕｋａｗａら、１９８９）。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、刺激性および抑制性サイトカインの組み合わせの産生を通じた免疫反応の主要制御因子である（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８７）。これら細胞により産生された因子は、体液性または抗体伝達反応の開始、および細胞性又は遅延型過敏反応（ＤＴＨ）の重要な伝達因子である（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８７）。ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化され、可溶性の成長因子を産生するようになるには、複雑なカスケード現象が起こらねばならない。抗原は担当ＡＰＣ、通常はマクロファージにより検出され内在化される（Ｕｎａｎｕｅ、１９８４）。ＡＰＣはタンパク質を変性し、より小さな断片に分断し、次に１５−１８アミノ酸残基間に分断されたペプチド断片は小胞体内でＭＨＣと結合し、続いて発現のために表面に移動する（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅら、１９９４）。即ち表面に発現された抗原はＴ−リンパ細胞により認識可能となり、適当なＴＣＲイディオタイプを持ち、かつＣＤ４を発現しているＴ細胞サブセットによって認識される（Ｇｅｒｍａｉｎ、１９９３）。Ｔ細胞が適当な抗原を認識すると、適当なアクセサリーシグナルが提供され、ナイーブリンパ細胞の分化が起こり、クローンの拡大が進む。いまだ特定されていない刺激が、２型（体液性）反応に対し１型（細胞性）反応を優先的に発生させる（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８９）。
【００１１】
体液性反応と細胞性反応の両反応の活性の多くに、Ｔ細胞の支援が必要とされる。大部分の抗原に対する抗体の産生に必要なＴ細胞依存型Ｂ細胞反応は、適切なＢ細胞成熟がおこるためにＴ細胞の支援が必要である（Ｃｈｅｓｎｕｔら、１９８６）。Ｂ細胞表面上に発現したＩｇに抗原が結合すると、内部への取り込み、プロセッシング及びこれら抗原のＭＨＣクラスＩＩ表面発現が起こる（Ｇｅｒｍａｉｎ、１９９３）。適当なＴＣＲイディオタイプを持つＣＤ４＋細胞とＢ細胞間の細胞と細胞との直接の接触は、Ｔ細胞の活性化と増殖を促進する（Ｃｈｅｓｎｕｔら、１９８６）。活性化されたヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞の増殖と分化に必要な因子を分泌することでＩＩ型反応を促進できるだろう（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８９）。これら因子には、Ｂ細胞の活性化と増殖を誘導できるＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３が含まれており、Ｉｇ分子へのイディオタイプスイッチにとって重要であるが、ＩＬ−１０はＩ型反応の開始を阻止する様に作用し、体液性活性を逆にダウンレギュレートする（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８９）。
【００１２】
細胞性反応（Ｉ型）は、体液性反応（ＩＩ型）と同一の様式では成熟しない（Ｓｈｅｒら、１９９２）。Ｔ細胞の活性化とＩ型反応への成熟により、細胞性免疫に好ましい因子がＴ細胞により生産される。ＩＬ−２はＴ細胞成長因子であり、ＣＴＬ反応も促進するが、ＩＦＮγはマクロファージ、ＣＴＬ及び好中球を活性化するように作用する（Ｗａｎｇら、１９９３）。
【００１３】
即ち、ヘルパーＴ細胞は、大部分が相互に排反的である二つの応答を伝達することができる。体液性反応を開始させるサイトカインの分泌パターンには、細胞性反応を抑制する因子及びその逆の因子が含まれる（Ｍｏｓｍａｎｎ及びＣｏｆｆｍａｎ、１９８９）。ＡＰＣにより作られる抗原又は可溶性因子を提示するＡＰＣのタイプが生ずるサイトカインのパターンに影響すると提言されているものの、Ｔ細胞が１型のパターン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、及びリンフォトキシン）又は２型のパターン（ＩＬ−４、５，６，１０及び１３）のいずれを生じるのかは不明である（ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎ、１９８９）。１型と２型のヘルパー細胞に加え、その分泌のパターンが１型と２型の中間にある０型のヘルパーＴサブセットが存在している（Ｇａｊｅｗｓｋｉら、１９８９）。ヘルパーＴサブセットは主にイン・ビトロ実験で提示されているものであるが、これらはイン・ビボ環境に於ける特異的反応の発生のモジュレートにおけるヘルパーＴ細胞の役割に関する重要なモデルである。
【００１４】
ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ細胞サブセットに加え、第二のαβＴ細胞集団はＣＤ８を持つ細胞傷害性リンパ細胞を含んでいる。ＣＤ８＋ＣＴＬは、その一次機能がウイルス及び細胞内細菌に感染した細胞ならびに悪性細胞の破壊である。免疫サーベイランスシステムの主要成分と考えられている（Ｂｅｒｋｅ、１９９４）。これらの細胞はサイトカインを産生することもできるが、一般には細胞性反応（ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＴＮＦ）の誘導に関係するものだけを産生氏得る（ＦｏｎｇとＭｏｓｍａｎｎ、１９９０）。ＣＤ８と関係するこれらの細胞のＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩに関係し提示された抗原を認識する（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。一般に、全ての有核細胞は内因性に合成されたペプチドを提示するクラスＩを表面に発現している（Ｍａｔａｓｕｍａｒａ、１９９２）。具体的には、インターフェロン暴露により誘導可能であるが、脳及び精巣を含む免疫的に特別な部位では、タンパク質の発現は低レベルである（Ｍｏｆｆｅｔｔ及びＰａｄｅｎ、１９９４）。細胞の正常な代謝を通じて小胞体内に産生されたタンパク質は、表面発現の為に変性を受け、部分的に破壊され、ＭＨＣクラスＩと結合する（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、１９９４）。ポリペプチドはタンパク質分解的に直線状にされ、クラスＩに９−１２アミノ酸のエピトープで結合し、続いて細胞の表面に発現される（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、１９９４）。理論的には、全ての内因性に産生されたペプチドはこの様式にて表面に発現され、理想的には胸腺での選別の結果、全ての自己反応性Ｔ細胞の排除が起こり、免疫サーベイランスはウイルス感染した又は形質転換細胞の存在を検出できる（Ｂｅｒｋｅ、１９９３）。発現された外来ペプチドのクラスＩによる認識は、ＣＤ８＋ＣＴＬ上の抗原特異的Ｔ細胞レセプターにより促進される（Ｌｅｃｈｌｅｒら、１９９０）。活性化の進行にはエフェクター細胞と標的細胞が接触することが求められる（Ｂｅｒｋｅ、１９９４）。異物と認識される抗原がＴＣＲにより検出されると、感染細胞上のクラスＩへのＣＤ８結合により分子間相互作用は安定化する（Ｌｉｔｔｍａｎ、１９８７）。認識され、Ｔ細胞が活性化されると標的細胞とエフェクターＴ細胞の間に結合が形成され、エフェクター細胞は実行可能になる（ＴａｙｌｏｒとＣｏｈｅｎ、１９９２）。即ち、この様式では、病原体により自己タンパク質が変化し、又は細胞機構が支配される、ペプチドは免疫サーベイランスにより認識されるようになり、この免疫システム部分は病気の細胞を排除できる（Ｂｅｒｋｅ、１９９４）。
【００１５】
細胞性の細胞傷害性は２つある主要経路の１つを生ずると考えられる。ＣＴＬによる細胞障害性顆粒の放出により、細胞にアポトーシスを誘導するか、あるいは溶解される（Ｂｅｒｋｅ、１９９３）。細胞死を招く遺伝子発現を誘導するＣＴＬによる因子の放出を通し標的細胞にアポトーシスが誘導される（Ｒｕｓｓｅｌ、１９８３）。このメカニズムの利点は、細胞融解が起こらず、細胞の潜在的感染性含有物が放出される可能性が低下することである（Ｎａｇａｔａ及びＧｏｌｓｔｅｉｎ、１９９５）。しかし細胞融解は、それにより標的排除が起こるより一般的なメカニズムである。標的細胞膜に穿孔をあけるパーフォリンはＣＴＬ細胞傷害性顆粒の主要成分である（Ｌｉｕら、１９９５）。この免疫サーベイランスの型には他の型の細胞も含まれていることから、ＣＴＬは抗ウイルス及び抗腫瘍免疫の主要構成体であり、特定の病原因子に対してはその防御にとって不可欠と考えられている（ＫｕｐｆｅｒとＳｉｎｇｅｒ、１９８９）。
【００１６】
まず細胞表面タンパク質が利用され、特異的な細胞集団を分化させる。ごく最近これら分子について機能的な観点が明らかにされた結果、これらが細胞集団の分類にとっても重要ではあるが、それらが多くの細胞の機能に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある。
【００１７】
生産的免疫反応の発生において役割を果たす様々なアクセサリー及び接着分子はＴ細胞及び抗原発現細胞上に発現されている（ｖａｎ  Ｓｅｖｅｎｔｅｒら、１９９１）。接着分子は免疫系の多くの細胞上にあるレベルで発現されている。これらは細胞をある領域内に留め、細胞と細胞の接触を開始させ、また維持する上で重要である（Ｍｅｓｃｈｅｒ、１９９２）。
【００１８】
ＣＤ−２／ＬＦＡ３（ＣＤ５８）及びＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１はＴ細胞／ＡＰＣ相互作用の安定化と活性促進に関わる２種類の接着分子複合体である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９８７）。ＣＤ２は前Ｔ細胞上に最初に発現されるマーカーの１種であり、細胞の生涯を通じそのまま存在するが、ＬＦＡ−１はＴ細胞上に遅く発現され、メモリー細胞内又は誘導によりアップレギュレーションされている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９８７）。
【００１９】
アクセサリー分子複合体も接着特性を示すが、その主要な機能はおそらくリガンド結合による細胞内シグナルの供給である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８８）。レセプターとそのリガンドとの間の相互作用が確立すると、分子構造内に立体構造の変化が起こり、その結果各種シグナルが一方または両方の細胞の細胞質に伝達される（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９４）。これら分子より供給されたシグナルはＴ細胞発生の促進において様々な役割を果たしているが、これら分子により伝達されたシグナルが無い場合にはＴ細胞は無力になる（ＬｅｕｎｇとＬｉｎｓｌｅｙ、１９９４）。
【００２０】
ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用は、生産的Ｔ細胞を介した免疫反応の主要成分である（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ａ）。ナイーブＴ細胞の完全な活性化と増殖には、ＣＤ２８アクセサリー分子とそのリガンドであるＣＤ８０との相互作用が必要とされる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）。該相互作用は活性化された記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及びアポトーシス性細胞死の防止にも重要な役割を果たすと考えられる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）。相互作用の発見とそのメカニズムの解明は、Ｔ細胞によって伝達される免疫を理解する上で重要な手がかりを提供する。
【発明の概要】
【００２１】
［発明の概要］
本発明はネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンド、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンド、ネコＣＤ２８レセプター、又はネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプターをコードする単離、精製されたＤＮＡ、並びにネコＣＤ８０，ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、又はネコＣＴＬＡ−４をコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はＣＤ８０をコードするベクター、ＣＤ８６をコードするベクター、ＣＤ２８をコードするベクター、またはＣＴＬＡ−４をコードするベクターによりトランスフォームされた宿主細胞を提供する。発明はネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４によりコードされたポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明はネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４の核酸によりコードされたポリペプチドの有効量を含むワクチンを提供する。本発明は更に病原菌に由来する免疫原を更に含むワクチンも提供する。発明は免疫反応を促進できるワクチンを提供する。発明は、免疫反応を抑制できるワクチンも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−１】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号１及び２）を示す図。
【図１Ａ−２】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号１及び２）を示す図。
【図１Ｂ】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のアミノ酸配列の疎水性プロットを示す図。
【図２Ａ−１】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号３及び４）を示す図。
【図２Ａ−２】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号３及び４）を示す図。
【図２Ｂ】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のアミノ酸配列の疎水性プロットを示す図。
【図３Ａ−１】ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号５及び６）を示す図。
【図３Ａ−２】ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号５及び６）を示す図。
【図３Ｂ】ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のアミノ酸配列の疎水性プロットを示す図。
【図４Ａ】ネコＣＤ２８のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号７及び８）を示す図。
【図４Ｂ】ネコＣＤ２８のアミノ酸配列の疎水性プロットを示す図。
【図５Ａ】ネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）のＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号９及び１０）を示す図。
【図５Ｂ】ネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）のアミノ酸配列の疎水性プロットを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［発明の詳細な説明］
本発明はネコＣＤ８０リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８０リガンドをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコＣＤ８６リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８６リガンドをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコＣＤ２８レセプター又はネコ可溶性ＣＤ２８レセプターをコードする単離された核酸を含む。本発明はネコＣＴＬＡ−４レセプター又はネコ可溶性ＣＴＬＡ−４レセプターをコードする単離された核酸を含む。
【００２５】
実施形態の一つでは、本発明はメチオニンから開始し、スレオニンで終結する図１Ａに示す配列（配列番号１）を有するネコＣＤ８０リガンドをコードする核酸配列を提供する。別の実施形態では、本発明はメチオニンから開始し、グルタミンで終結する３Ａ５に示す配列（配列番号５）を有するネコＣＤ８６リガンドをコードする核酸配列を提供する。実施形態の一つでは、本発明はメチオニンから開始し、セリンで終結する図４Ａに示す配列（配列番号７）を有するネコＣＤ２８レセプターをコードする核酸配列を提供する。実施形態の一つでは、本発明はメチオニンから開始し、アスパラギンで終結する図５Ａに示す配列（配列番号９）を有するネコＣＴＬＡ−４レセプターをコードする核酸配列を提供する。
【００２６】
上記発明の実施形態では、核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。別の実施形態は、ＤＮＡはｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡである。
【００２７】
発明は、上記ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＴＬＡ−４をコードする核酸内に特異的に存在する配列に相補的な配列を有する少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。発明の別の実施形態は、上記ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はＣＴＬＡ−４をコードする核酸内に特異的に存在する配列に相補的な配列を有する少なくとも１５又は１６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２８】
上記発明の別の実施形態は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを提供する。実施形態の一つでは検出可能標識体は放射性同位体、蛍光体又はビオチンを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは選択的にメチル化される。
【００２９】
発明はネコＣＤ８０リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８０リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。発明の別の実施形態は、ＰＳＩ−Ｂ７−１／８７１−３５と称されるプラスミドベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９８１７）を提供する。このプラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ  ２０１０８−０９７１、Ｕ．Ｓ．Ａに１９９８年４月２９日に寄託された。
【００３０】
発明はネコＣＤ８６リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８６リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。発明の別の実施形態は、Ｂ７−２＃１９−２／０１１２９８と称されるプラスミドベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９８２１）を提供する。このプラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ  ２０１０８−０９７１、Ｕ．Ｓ．Ａに１９９８年４月２９日に寄託された。
【００３１】
本発明は、ネコＣＤ２８レセプター又はネコ可溶性ＣＤ２８レセプターをコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はＰＳＩ−ＣＤ２８  ＃７／１００２９６（ＡＴＴＣ受託番号２０９８１９）と称されるプラスミドベクターを提供する。本プラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ  ２０１０８−０９７１、Ｕ．Ｓ．Ａに１９９８年４月２９日に寄託された。
【００３２】
本発明は、ネコＣＴＬＡ−４レセプター又はネコ可溶性ＣＴＬＡ−４レセプターをコードする核酸を含むベクターを提供する。本発明はＣＴＬＡ−４＃１／０９１９９７（ＡＴＴＣ受託番号２０９８２０）と称されるプラスミドベクターを提供する。本プラスミドは特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約規定に従い、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ  ２０１０８−０９７１、Ｕ．Ｓ．Ａに１９９８年４月２９日に寄託された。
【００３３】
発明は、核酸に作用可能に結合したプロモーターを更に含む上記ベクターを提供する。別の実施形態では、発明は上記ベクターの何れかを含む宿主細胞を提供する。実施形態の１つでは、上記ベクターの一つを含む宿主細胞は真核細胞又は前核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、またはＧＨ４Ｃ１細胞である。
【００３４】
発明は、請求項１のネコＣＤ８０リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８０リガンドをコードする核酸配列によりコードされるポリペプチドを提供する。発明の実施形態はネコＣＤ８６リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８６リガンドをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。発明の別の実施形態はネコＣＤ２８レセプター又はネコ可溶性ＣＤ２８レセプターをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明はネコＣＴＬＡ−４レセプター又はネコ可溶性ＣＴＬＡ−４レセプターをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。
【００３５】
別の実施形態では、発明はポリペプチドを発現する宿主細胞を培養し、生じたポリペプチドを回収することにより上記ポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００３６】
本発明は上記ポリペプチド及び適切な担体を有効量含むワクチンを提供する。別の実施形態では、発明は上記ポリペプチド及び好適キャリアーの有効量が投与量当たり約０．０１ｍｇないし約１００ｍｇであるワクチンを提供する。別の実施形態では、発明は上記ポリペプチド及び適切な担体の有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇネコ体重／日ないし約２５ｍｇ／ｋｇネコ体重／日であるワクチンを提供する。
【００３７】
本発明は更に、病原菌に由来する免疫原を更に含む上記ワクチンを提供する。別の実施形態では、ワクチン内の免疫原は、ネコ病原菌、狂犬病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、イヌ糸状虫、ノミ、又は細菌性病原菌に由来する。別の実施形態では、発明はネコ病原菌がネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血球ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコボロナ病ウイルス、又はネコ寄生虫であるワクチンを提供する。
【００３８】
発明は更に、ネコに対し上記免疫原の何れかを含むワクチンの投与量を投与することを含むネコに免疫を誘導する方法を提供する。発明は更に、ポリペプチド、免疫原及び好適キャリアーの有効量を含む、ネコに於ける免疫反応を増強する方法も提供する。発明は上記ワクチンを皮下、筋肉内、全身、局所又は経口的に投与する方法を提供する。
【００３９】
発明の別の実施形態は、ネコに対し効果的免疫反応抑制量のポリペプチドをコードするネコＣＴＬＡ−４核酸を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応の抑制に適した方法を提供する。別の実施形態では、発明はネコに対しネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、又はネコＣＤ２８をコードする可溶性ポリペプチドの有効免疫反応抑制量を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応を抑制する方法を提供する。
【００４０】
別の実施形態では、ネコに対し約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし約２５ｍｇ／ｋｇ体重／日のポリペプチドをコードするネコＣＴＬＡ−４核酸を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応の抑制に適した方法を提供する。別の実施形態では、本発明はネコに対しネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、又はネコＣＤ２８をコードする可溶性ポリペプチドを０．２５ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし約２５ｍｇ／ｋｂ体重／日を投与することを含む、ネコに於ける免疫反応を抑制する方法を提供する。
【００４１】
本発明は、免疫反応を抑制するのに有効な量のポリペプチドをコードするネコＣＴＬＡ−４核酸をネコに投与することによって、自己免疫疾患に罹患したネコ、または組織若しくは臓器移植のレシピエントであるネコの免疫反応を抑制する方法も提供する。
【００４２】
本発明は、ネコに対しネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、又はネコＣＤ２８をコードする可溶性ポリペプチドの有効免疫反応抑制量を投与することによる、自己免疫疾患を患うネコ、又は組織あるいは臓器移植のレシピエントであるネコに於ける免疫反応を抑制する方法も提供する。
【００４３】
発明は、約９４１ヌクレオチドの単離、精製されたネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡを提供する。発明は更に、分子量約３３，４８５ｋＤａ、等電点約９．１、ｐＨ７．０に於ける総電荷が１０である未変性の膜結合又は成熟型である約２９２アミノ酸の単離、精製されたネコＣＤ８０ポリペプチドも提供する。
【００４４】
ＣＤ８０と補助刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ＣＤ２８、及び腫瘍抗原又は病原性生物の抗原との共発現は、Ｔ−リンパ細胞を活性化し、又は促進して免疫刺激性のサイトカインの産生を誘導し、別のタイプの細胞の増殖を制御する能力を有している。ＣＤ８０と補助刺激分子ＣＴＬＡ−４との共発現は、Ｔ−リンパ細胞の活性化を制御する能力を有する。
【００４５】
発明は約１１７６ヌクレオチドの単離、精製されたネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のｃＤＮＡを提供する。発明は更に、分子量約３６，３９４ｋＤａ、等電点約９．１９、ｐＨ７．０に於ける総電荷が１１．２７である未変性の膜結合又は成熟型である約３２０アミノ酸の単離、精製されたネコＣＤ８６ポリペプチドも提供する。ＣＤ８６と補助刺激分子ＣＤ２８、及び腫瘍抗原又は病原性生物の抗原との共発現は、Ｔ−リンパ細胞を活性化し、又は促進して免疫刺激性のサイトカインの産生を誘導し、別のタイプの細胞の増殖を制御する能力を有している。ＣＤ８６と補助刺激分子ＣＴＬＡ−４との共発現は、Ｔ−リンパ細胞の活性化を制御する能力を有する。
【００４６】
本発明によるネコＣＤ８０またはＣＤ８６は未変性又は膜結合供給源より得られる。本発明によるネコＣＤ８０又はＣＤ８６は、未変性及び膜結合型、又は膜貫通ドメインを欠いた分泌型を含む。
【００４７】
発明は、約６８９ヌクレオチドの単離、精製されたネコＣＤ２８のｃＤＮＡを提供する。発明は更に、分子量約２５，３１９ｋＤａ、等電点約９．１７、ｐＨ７．０に於ける総電荷が９．５８である未変性の膜結合又は成熟型である約２２１アミノ酸の単離、精製されたネコＣＤ２８ポリペプチドを提供する。
【００４８】
発明は、約７４９ヌクレオチドの単離、精製されたネコＣＴＬＡ−４のｃＤＮＡを提供する。発明は更に、分子量約２４，３８１ｋＤａ、等電点約６．３４、ｐＨ７．０に於ける総電荷が−０．９９である未変性の膜結合又は成熟型である約２２３アミノ酸の単離、精製されたネコＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供する。
【００４９】
別の態様では発明は、ネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４有り、または無しにおいて、免疫反応を増強するのに有効な量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６より前、後、あるいは実質同時に免疫原を投与することにより達成される、免疫原に対するネコ科動物に於ける免疫反応を増強する方法を提供する。
【００５０】
別の態様では発明は、ネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４有り、または無しにおいて、あるいはネコＣＤ８０あるいはネコＣＤ８６、又はネコＣＤ２８あるいはネコＣＴＬＡ−４を一部又は全部コードしているアンチセンスＲＮＡあるいはＤＮＡと共に、免疫反応抑制有効量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６より前、後、あるいは実質的に同時に免疫原を投与することにより達成される、免疫原に対するネコ科動物の免疫反応を抑制する方法を提供する。
【００５１】
別の態様では、発明は免疫原及び免疫反応増強に適したネコＣＤ８０の有効量を含む、ネコ科動物に於ける免疫原に対する免疫反応の誘導に適したワクチンを提供する。免疫原は、例えばネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコパルボウイルス、ネココロナウイルス、ネコレプトウイルス等のネコ病原菌に由来する。
【００５２】
別の態様では、発明は免疫原のＤＮＡ又はＲＮＡ、及び免疫反応をモジュレートするのに有効な量のタンパク質またはタンパク質の断片をコードするネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８アクセサリー分子のＤＮＡ又はＲＮＡを、何れかの組み合わせにて投与することで達成される、ネコ科動物の免疫原に対する免疫反応の誘導に適したワクチンを提供する。
【００５３】
ネコＣＤ８０タンパク質は、ヒト及びマウスのそのタンパク質とそれぞれ５９％及び４６％同一であるアミノ酸配列を有する。ネコＣＤ８６タンパク質は、ヒト及びウサギのそのタンパク質とそれぞれ６８％及び６４％同一であるアミノ酸配列を有する。ネコＣＤ２８タンパク質は、ヒト及びマウスのそのタンパク質とそれぞれ８２％及び７４％同一であるアミノ酸配列を有する。ネコＣＴＬＡ−４タンパク質は、ヒト及びマウスのタンパク質とそれぞれ８８％及び７８％同一であるアミノ酸配列を有する。ヒト又はマウスのＣＤ８０又はＣＤ８６タンパク質は、ネコのＣＤ８０又はＣＤ８６タンパク質を機能的に代替できない。従って、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８及びネコＣＴＬＡ−４は、ネコ科動物の免疫の制御に必要な新規試薬である。
【００５４】
本発明はネコ種のＴ細胞制御アクセサリー分子、ＣＤ８０（Ｂ７−１）又はＣＤ８６（Ｂ７−２）あるいはＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）を包含する。発明は、ネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６あるいはＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４の一部又は全部をコードする単離、精製された核酸、及び天然あるいは組換え体資源より精製されたＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供する。本発明により生産されたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は、腫瘍及び病原性生物に対するネコワクチンの有効性を高めるために、又ネコに於けるウイルス性及び細菌性疾患の治療に利用される。本発明により製造されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は、免疫反応の過度の活性化、過剰な反応、又は誤って誘導された免疫反応に起因する病気を緩和するために利用される。
【００５５】
［核酸、ベクター、トランスフォーマント］
ネコＣＤ８０（配列番号１）、ネコＣＤ８６（配列番号５）、ネコＣＤ２８（配列番号７）又はネコＣＴＬＡ−４（配列番号９）をコードするｃＤＮＡの配列は図１ないし５に示されており、ネコＣＤ８０（配列番号２）、ネコＣＤ８６（配列番号６）、ネコＣＤ２８（配列番号８）又はネコＣＴＬＡ−４（配列番号１０）の推測アミノ酸配列は図１ないし５に示されている。これらネコポリペプチドは、これらポリペプチドのヒト、又はマウス、あるいはウサギ相同体との部分アミノ酸配列相同性、ＣＤ８０又はＣＤ８６ポリペプチドのネコＣＤ２８レセプター（以下参照）又はＣＴＬＡ−４への結合能及びＴ−リンパ細胞を活性化し、あるいは刺激し、又は活性化を制御する能力に基づきＣＤ８０，ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４と命名された。更に、理論に拘泥することを望むものではないが、ネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６ポリペプチドは以下の生物活性の１またはそれ以上を有すると推測される：ＮＫ（ナチュラルキラー）の活性化、Ｂ−細胞成熟の促進、ＭＨＣ拘束細胞傷害性Ｔ−リンパ細胞の活性化、マスト細胞の増殖、サイトカインレセプターとの相互作用及び免疫−制御サイトカインの誘導。
【００５６】
遺伝子コードの縮重（即ち、特定アミノ酸を複数のコドンがコードする）により、図１ないし５に示された以外のＤＮＡ配列も図１ないし５に示されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４アミノ酸配列をコードできる。このような他のＤＮＡには、あるコドン中の一以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされているアミノ酸に変化をもたらさない、「配列保存的」変異を含有するものが含まれる。更に、ポリペプチド中の既述アミノ酸残基は、しばしば天然ポリペプチドの全体立体構造及び機能を変化させることなく変化させることができる。この様な「機能保存的」変異には、例えば酸性、塩基性、疎水性、親水性、芳香性等ののような類似の物理−化学的特性を持つアミノ酸とのアミノ酸置換（例えばリジンとアルギニン、アスパラギンとグルタミン、グリシンとアラニンの置換）が含まれるが、もとよりこれに限定されるものではない。更に、アミノ酸配列は分子の生物活性を破壊することなく付加又は欠失される。例えば付加アミノ酸配列はアミノ−又はカルボキシル末端に加えられ、ヒスチジンタグのような精製用タグ（即ち、タンパクの１段階精製を可能とするものであり、精製後にそれらは化学的又は酵素的に除去される）として利用される。あるいは、付加配列は、さらなる細胞表面結合部位を付与し、又は抗体のための抗原結合部位の付加を用いた場合のように、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４の標的細胞特異性を変化させる。
【００５７】
本発明の範囲内のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６、あるいはネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４のｃＤＮＡは、図１ないし５のｃＤＮＡ、配列保存的変異ＤＮＡｓ、機能保存的変異ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及びその組み合わせである。本発明は、単独又は他の配列あるいは成分との組み合わせに於いて、有用な程度の生物活性を有するネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４の断片を包含する。以下で説明する如く、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ２８、又はＣＴＬＡ−４の配列を予測的に取り扱い、あるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ２８、又はＣＴＬＡ−４の変種が、ある適用、又はこれらの分子の結合活性に影響を与えて有効性を増加させる適切な安定性と生物活性を有しているかどうかを確定することは、本分野における通常の技術に属する。ネコＣＤ８０及びＣＤ８６はそれぞれ補助レセプターＣＤ２８又は補助レセプターＣＴＬＡ−４と結合するだろう。これは組換え系内で変異体ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドを発現し、精製し、そのＴ細胞刺激活性及び／又は成長促進活性を細胞培養及び動物内にてアッセイした後、前記適用において試験を行うことにより達成できる。変異体ＣＤ８０は、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４レセプターへの機能的結合により生物活性について試験される。変異体ＣＤ８６は、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４レセプターに対する機能的結合により生物活性が試験される。同様の様式にて、変異体ＣＤ２８又は変異体ＣＴＬＡ−４は生物活性に関し試験される。
【００５８】
本発明は、もとよりこれに限定されるものではないが、ネコ、ライオン、トラ、チータ、ボブキャット等を含む他のネコ種に由来するネコＣＤ８０，ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ＤＮＡｓ（及びポリペプチド）も包含する。図１ないし５に示す配列のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４相同体は、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングし図１ないし５の配列の全て又は一部を含むプローブにハイブリダイズするクローンを同定することで容易に特定される。あるいは、発現ライブラリーはネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４を認識する抗体を用いてスクリーニングされる。理論に拘泥することを望むものではないが、他のネコ種のＣＤ８０又はＣＤ８６遺伝子は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４遺伝子と少なくとも約７０％相同性を共有すると考えられる。又、本発明の範囲には、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４と少なくとも約２５％のアミノ酸同一性を共有するポリペプチドをコードするＤＮＡとして規定されるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４の相同体をコードするＤＮＡである。
【００５９】
一般に、本発明による核酸の操作では、例えば分子クローニング、研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、又は現代分子生物学プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｅｄｓ．  Ａｕｆｕｂｅｌ，Ｂｒｅｎｔ、ＫＩｎｇｓｔｏｎ、Ｍｏｒｅ、Ｆｅｉｄｍａｎ、ＳｍｉｔｈとＳｔｕｈｌ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ，ＮＹ，１９９２）に開示されている様な、当業者に公知である方法を用いる。
【００６０】
本発明は、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ配列、及びセンス及びアンチセンスを包含する。発明は、さらにネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４のゲノミックＤＮＡ配列と、制御配列のような（これに限定されない）隣接配列も包含する。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、反応エレメント、シグナル配列、ポリアデニレーション配列、イントロン、５’−及び３’−非コーディング領域等の異種配列とも結合される。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡと作用可能に結合した転写制御エレメントは、原核細胞、真核細胞、原核細胞のウイルス、真核細胞のウイルス、及びその組み合わせに由来する遺伝子を発現させる能力を有するものが含まれるが限定なく含む。その他の有益な異種制御配列は当業者に公知である。
【００６１】
本発明の核酸配列は、当業者に公知の方法によって、その安定性、溶解性、結合親和性、及び特異性を変化させるために修飾される。例えば、配列は選択的にメチル化される。本発明の核酸配列は検出可能なシグナルを提供できる標識によっても直接的、又は間接的に修飾される。標識の例には放射性同位体、蛍光分子、ビオチン等が含まれる。
【００６２】
本発明は更にＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドの一部又は全部をコードする核酸を含むベクターも提供する。これらベクターは、例えば様々な真核生物又は原核生物宿主のＤＮＡ中での発現に適したプラスミドベクターを含む。好ましくは、ベクターはネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする部分に作用可能に結合されたプロモーターも含む。コードされたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、本明細書で説明される、又は当業者公知のその他の好適なベクター及び宿主細胞を用いて発現される。
【００６３】
本発明の実施の利用に好適なベクターには、ＹＥｐ３５２、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン社）、及びｐＳＦＶ１（ギブコ／ＢＲＬ社、ゲイターブルグ、メリーランド（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））。発明への利用に適した好ましいベクターの一つはｐＳＦＶ１である。適切な宿主細胞はＥ．Ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ４Ｃｌ細胞、ＢＨＫ−２１細胞及び両生類メラノフォア細胞を含む。ＢＨＫ−２１細胞は本発明の実施の利用に適した好ましい宿主細胞系である。裸のＤＮＡ又は遺伝子ワクチンの構築に適したベクターには、ｐＴａｒｇｅｔ（プロメガ社、マジソン、ウイスコンシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））、ｐＳＩ（プロメガ社、マジソン、ウイスコンシン）及びｐｃＤＮＡ（インビトロン社、カールスバッド、カリフォルニア）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む核酸は、組換えによっても細胞内に導入される。例えば、これら配列は細胞内にマイクロインジェクションされ、ポリペプチド、その類似体又は偽遺伝子、又はネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする遺伝子と実質的に同一性を有する配列をコードする内因性遺伝子の部位に相同的組換えを起こさせる。非相同的組換えのようなその他の組み換えをベースとする方法、及び相同的組換えによる内因性遺伝子の欠失も、特に多能性細胞に於いて利用できる。
【００６５】
本発明は、ネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又はネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４なしで、免疫反応を増強するのに有効な量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６より前、後、あるいは実質的に同時に免疫原を投与することにより達成される、免疫原に対するネコ科動物の免疫反応を増強する方法を提供する。
【００６６】
本発明は、ネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又はネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４なしに、ネコ病原菌由来の免疫原を含む発現ベクターと共に免疫反応を増強するのに有効な量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６アクセサリー分子を投与することにより達成される、免疫原に対する免疫反応を増強する方法を提供する。
【００６７】
本発明は、ネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又はネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４なしに、ネコ病原菌由来の免疫原を含む発現ベクターと共に、免疫反応を増強するのに有効な量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６を投与することにより達成される、免疫原に対する免疫反応を増強する方法を提供する。
【００６８】
本発明は、ネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又はネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４なしに、あるいはネコＣＤ８０、又はネコＣＤ８６を、又はネコＣＤ２８又はネコＣＴＬＡ−４をコードするアンチセンスＲＮＡ若しくはＤＮＡと共に、免疫反応を抑制するのに有効な量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６の前、後又は実質的に同時に免疫原を投与することで達成される、ネコ科動物の免疫原に対する免疫反応を抑制する方法を提供する。
【００６９】
本発明は、免疫原と、免疫反応増強用のネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又は免疫反応増強用のネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共になしに有効量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６、あるいは免疫反応抑制用のネコＣＴＬＡ−４とともに有効量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６とを含むワクチンを提供する。別の態様では、本発明は、ネコの病原体に対する免疫原の遺伝子と、免疫応答増強又は抑制用ネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又は免疫応答増強若しくは抑制用ネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４なしにＣＤ８０、ＣＤ８６の遺伝子を含有する発現ベクターとを含むワクチンを提供する。
【００７０】
［ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチド］
ネコＣＤ８０遺伝子（図１及び２に示されるｃＤＮＡ及びアミノ酸配列）は約２９２アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＤ８６遺伝子（図５及び６に示されるｃＤＮＡ及びアミノ酸配列）は約３２０アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＤ２８遺伝子（図４に示されるｃＤＮＡ及びアミノ酸配列）は約２２１アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＴＬＡ−４遺伝子（図５に示されるｃＤＮＡ及びアミノ酸配列）は約２２３アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【００７１】
天然又は組換え体採取源から得られたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、Ｃ４カラムによる逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点フォーカシング、アフィニティークロマトグラフィー等の当業者公知の方法により達成されるが、もとよりこれに限定されない。好適な実施形態では、大量の生物活性なネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４は、ｐＳＦＶ１レプリコン（ギブコ／ＢＲＬ）中の６Ｃ−末端ヒスチジン残基をコードする配列とフレーム中に融合したネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４に関するコーディング域を含む組換え体ＤＮＡ配列を構築することで得られる。このプラスミドによりコードされるｍＲＮＡは当業者に公知の技術を利用して合成され、エレクトロポレーションによりＢＨＫ−２１細胞内に導入される。細胞は、成熟したグリコシル化された６個のＣ−末端ヒスチジンを含むネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドを合成し、分泌する。修飾されたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドは細胞上清よりヒスチジン結合樹脂（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ、ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウイスコンシン）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製させる。
【００７２】
いずれかの採取源より単離されたネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６ポリペプチドは、当業者に公知の方法により修飾される。例えば、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４はリン酸化、脱リン酸化、グリコシル化又は脱グリコシル化等を受ける。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４の溶解性、安定性及び結合性及び親和性を変える修飾は特に有益である。
【００７３】
［ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４キメラ分子］
本発明は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４の何れかの組み合わせより成る断片から作られるキメラ分子の製造も包含する。例えば、ＣＤ２８結合部位の代わりにＣＴＬＡ−４の結合部位を導入し、免疫反応の増強を維持しながらＣＤ２８の結合親和性を増加する。
【００７４】
実施形態の１つでは、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８上のＣＤ８０又はＣＤ８６の結合部位は交換され、その結果ＣＤ２８上の結合域はＣＴＬＡ−４の結合域により交換される。ＣＴＬＡ−４結合領域を持つキメラＣＤ２８分子の効果は、ＣＤ８０又はＣＤ８６に対するＣＤ２８の親和性を上げ、免疫反応の増強の程度を高めることである。別の実施形態では、ＣＤ８０とＣＤ８６、並びにＣＤ８６とＣＤ２８のキメラ分子又はその断片は膜に結合しており、これら分子の免疫増強能を改善する。別の実施形態では、ＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、又はＣＤ８６とＣＴＬＡ−４のキメラ分子、又はその断片は膜に結合しており、これら分子の免疫抑制能を改善する。別の実施形態では、ＣＤ８０とＣＴＬＡ−４又はＣＤ８６とＣＴＬＡ−４のキメラ分子、又はその断片は膜に結合しており、免疫反応を再度方向付けし、所望する効果を達成する。
【００７５】
［抗−ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４抗体］
本発明は、上記に規定されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対し特異的な抗体を包含する。抗体はポリクローナル又はモノクローナルであり、様々な種のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４を識別し、機能的ドメイン等を同定する。この様な抗体はＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、研究室マニュアル、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８に開示されている方法及び成分、並びに当業者公知の免疫学的及びハイブリドーマ技術を利用して容易に作製される。天然及び合成のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４−誘導型ペプチドがネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４特異的免疫反応の誘導に利用される場合は、ペプチドはＫＬＨの様な適切な担体に容易に結合され、フレンドのアジュバントの様な適切なアジュバント中に投与される。好ましくは、選択されたペプチドはＴａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５４０９−５４１３の方法に本質従い、リジンコアキャリアーに結合される。得られた抗体は、特に内部イメージング抗イディオタイプ抗体も既知方法により調製される。
【００７６】
実施形態の１つでは、精製されたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４はマウスの免疫に利用され、その後その膵臓が取り出され、膵臓細胞を用いミエローマ細胞との細胞ハイブリッドを形成し、当業者に標準的である技術に従い抗体を分泌する細胞のクローンを得る。これら細胞より分泌され得られたモノクローナル抗体を以下の活性に関するインビトロアッセイを利用し、アッセイする：ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４への結合、及びネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４のＴ細胞刺激活性の阻害。
【００７７】
抗ネコＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８、又は抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等の免疫アッセイを利用したネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４の同定及び定量に利用される。抗ネコＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２８又は抗、ＣＴＬＡ−４抗体は、ネコＣＤ８０又はＣＤ８６、あるいはＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４の抽出物の免疫除去にも利用される。更に、これら抗体は、各種採取源からのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４を同定、分離及び精製し、細胞下レベル及び組織化学的局在研究を実施するために利用できる。
【００７８】
［応用］
本発明により製造されたネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンド、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンド、ネコＣＤ２８レセプター又はネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプターは感染症予防のワクチンとして、又は同種または異種ネコ種に於ける増殖を促進するのに有益に利用できる。例えば、ＣＤ８０又はＣＤ８６の補助促進分子であるＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４との、何れかの組み合わせによる共発現、及び腫瘍細胞又は病原生物由来の抗原。ネコＣＤ８０又はＣＤ８６とネコＣＴＬＡ−４レセプターとの共発現は、Ｔ−リンパ細胞の活性化を阻害し、免疫反応を抑制する能力を有する。具体的な例は、ＣＤ８０又はＣＤ８６と、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、又はＦＩＰ由来免疫原とウイルスベクター中、又はＤＮＡ発現ベクター中での共発現であり、ワクチンとして投与された場合には、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ−リンパ細胞の増殖を活性化、促進又は制御し、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−６等の免疫−制御サイトカインを誘導するだろう。別の具体的な例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４をウイルスベクター又はＤＮＡ発現ベクター中にて発現させるものであり、治療薬として投与されると免疫反応を制御し、又は方向付け直す。
【００７９】
ネコＣＤ８０又はＣＤ８６とＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４との相互作用を通じた免疫増強、又はネコＣＤ８０又はＣＤ８６とＣＴＬＡ−４との相互作用による免疫反応の阻害には、全身性又は長期の健康に対する有害効果も倍加することがある異物の添加に比べて、制御プロセスが自然であるという利点がある。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４分子は、その他の組換え体分子、例えば免疫誘導に関し所望される抗原をコードする分子と共に投与される。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ−４遺伝子は発現ベクター内に挿入され、標的細胞に感染またはトランスフェクションされ、標的細胞内にて遺伝子産物を発現し、それは標的細胞又は抗原提示細胞の原形質膜内に固定されるか、又は標的細胞あるいは抗原提示細胞の外に分泌される。プラスミド、セムリキ森林熱ウイルス、ポックスウイルス、又はヘルペスウイルスの様な発現ベクターは、遺伝子を抗原提示細胞に運搬する。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／又はＣＴＬＡ−４遺伝子又は遺伝子の断片の何れかの組み合わせは、ＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター内に挿入され、ネコに注射され、ネコの中で遺伝子産物を”裸の”ＤＮＡ／ＲＮＡ又は遺伝子ワクチンとして発現する。標的細胞又はネコ科動物内での免疫原とＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ−４の共発現はＴリンパ細胞、Ｂリンパ細胞及びその他の細胞の活性化に寄与し、活性化を増強し、又は制御する。あるいは、発現したタンパク質はプラスミド内で発現された後に投与することができる。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４タンパク質は通常細胞膜内に固定され、原形質膜アクセサリー分子として機能するが、その他の形、特に膜アンカー無しには存在できないだろう。
【００８０】
実施形態の１つでは、ネコＣＤ８０及びネコＣＤ８６は可溶性であり、膜貫通ドメイン又は疎水性領域を欠いており、補助刺激分子であるＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４と膜結合型又は可溶型の何れかの形で相互作用する。別の実施形態では、ネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６は膜結合しており、補助刺激分子であるＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は可溶性形状にあり、膜貫通ドメインまたは疎水領域を欠いている。可溶性ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は、好ましくは２量体であり、ネコに於けるＴ細胞介在型免疫抑制に関連した病気の治療に有用である。可溶性ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は移植組織の拒絶を防止し、自己免疫疾患の治療に利用できる。具体的には、可溶性ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は骨髄移植に於ける移植体対宿主病の防止に有用である。可溶性ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は細胞含有膜結合ネコＣＤ８０又はＣＤ８６の結合を阻止する。
【００８１】
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ＤＮＡ及びポリペプチド、又は生物活性的なネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４断片又は亜断片は、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、病原性微生物由来の抗原、抗体、又はｈｉｓ−タグあるいはレポーター遺伝子、大腸菌ｌａｃＺ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｕｉｄＡの様な精製遺伝子、または緑色蛍光タンパク質といった別の配列とフレーム内にて融合する。
【００８２】
［ワクチン］
本発明は、ネコ種に於ける免疫反応の効率を促進する方法及び成分を包含する。本実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は、それに対する免疫反応の惹起が望まれる免疫原と組み合わせて利用される。例えば、ネコ免疫不全ウイルス及びネコ白血病ウイルスの様な病原体、又はネコパルボウイルス、ネコレプトウイルス、及びネココロナウイルスの様なその他の病原体由来の免疫原を含むネコワクチンでは、ワクチン中に免疫反応の規模と質を制御するネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４を含む。この目的に関しては、天然又は組換え体採取源から精製されたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４がワクチン調剤中に約０．０１ないし１００．０ｍｇ／ワクチン／ネコ含まれる。
【００８３】
ネコワクチンの市販の採取源は、当業者に公知であり（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのコンペディウム（Ｃｏｍｐｅｄｉｕｍ）、１９９７）、より効果的ワクチンとするために本発明と組み合わせ使用される。
【００８４】
ネコに於ける免疫原に対する免疫反応を誘導し、又は制御するためのワクチンは、免疫原と、免疫反応増強用のネコＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４と共に、又は免疫反応増強用のＣＤ２８若しくはネコＣＴＬＡ−４なしに、有効量のネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６とを、又は免疫反応抑制用のネコＣＴＬＡ−４と共にネコＣＤ８０又はネコＣＤ８６とを含む。
【００８５】
免疫原は、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ｐａｒｖｏ）、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス（鼻気管炎ウイルス）、ネコボロナ病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、ネコ寄生虫、イヌ糸状虫、ノミ、細菌性病原菌等のようなネコ病原体を含むグループより選択されるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
Ｔ−リンパ細胞のような細胞種の増殖の制御又は活性化の制御は、該制御反応が細胞の増殖を刺激し、又は抑制することを意味する。ネコ科動物に於ける免疫反応の制御は、免疫反応が刺激され、又は抑制されネコ科動物の病気又は感染病原体を治療することを意味する。
【００８７】
遺伝子ワクチン又は裸ＤＮＡワクチンとして投与することを目的とした、ネコ免疫原の遺伝子を含有する発現ベクター内での、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４単独の発現、又は任意の一部又は全部を組合せた発現。ベクターには、ｐＴａｒｇｅｔ（プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン）、ｐｃＤＮＡ（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォルニア）。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＪＪ，ら、１９９７；ＨａｓｓｅｔｔとＷｈｉｔｔｏｎ、１９９６．）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の遺伝子又は遺伝子断片は、単独で、又は任意の一部若しくは全部を組み合わせて、ネコ科動物又はその他の動物の染色体に挿入又はトランスフェクトされる。このようなこれら遺伝子の組み込みは、レトロウイルスベクターと同様にして達成され、遺伝子治療の一形態として利用されるだろう。
【００８９】
本発明は、医療及び／又は市販目的のネコ種の病気に対する耐性を改善するための方法及び成分を提供する。この実施形態では、単独で、又は任意の一部若しくは全部を組合せて、且つネコ免疫原をコードする遺伝子と組み合わせて、又は組み合せずに発現されたＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、又はＣＴＬＡ−４は、適当な投与様式によりネコ科動物に投与される。増殖促進又は病気耐性に関しては、単独又は組み合わせにより発現されたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４を約０．０１ないし１００ｍｇ／ワクチン／ネコ範囲の濃度になる量、好ましくは約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日ないし約２５ｍｇ／ｋｇ／日になる量が調剤に加えられる。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４の必要量は、投与量と頻度のマトリックスを作り、マトリックスの各点について実験ユニットと被験者のグループとを比較する様な当業者に公知の日常実験により決定できることが理解されるだろう。
【００９０】
本発明によれば、天然又は組換えネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は、生理学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝化生理食塩水又は脱イオン水のような担体とともに調剤される。調剤は、光沢剤、可塑剤、吸収促進剤、殺菌剤等の当業者公知の賦形剤も含むだろう。本発明のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、静脈内、皮下、筋肉内、経筋肉的、局所、または経口経路を含む、これに限定されない有効な何れかの手段により投与される。皮下投与に関しては、例えば投与形状はネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４を滅菌生理的食塩水中に含む。経口又は呼吸器投与では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４は、賦形剤と共に、又は賦形剤なしに、例えばリポソームやミクロスフェアー中に、ミクロ−又はマクロ−カプセル化される。皮膚用パッチ（又は、除法投与形状）も利用される。
【００９１】
［例］
［例１Ａ］
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡのクローニング：
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡは、ネコｍＲＮＡと相互作用する変性プライマーを作製する程度に十分保存されている２ヶ所の配列の間の領域を増幅する第一のＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素／ポリメラーゼチェインリアクション反応）を利用してクローニングした。ｍＲＮＡの採取源は、少なくとも１６時間ＣｏｎＡにより刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であった。このＰＣＲ産物は配列決定された。配列はＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）ＰＣＲに適したプライマーの作製に使用された。５’末端は、新たに配列決定された保存域に対し相補的である下流域プライマーを使いまずｃＤＮＡを作製することで増幅された。オリゴヌクレオチドはｃＤＮＡの３’末端に結合された（ｍＲＮＡの５’末端に対する祖補体）。この配列は、新たに配列決定された領域内の別の領域に対応する下流域ＰＣＲプライマーに適合したＰＣＲである上流プライマーに関する結合部位として機能する。変性プライマーはネステッド反応に於いて複数使用されて、３’末端を得る。このＰＣＲに関する上流プライマーは、新たに配列決定された領域の配列と反応する様に設計されている。産物は直接配列決定されるか、又はＴＡクローニングベクター内にクローン化され、プラスミドより配列決定された。全オープンリーディングフレームは、既知配列より構築されたプライマーを用いたＰＣＲによってその全体が増幅され、クローン化された。ＯＲＦは３回クローン化され、配列決定された。Ｂ７−１ＯＦＲはＳＶ４０プロモーターを持つｐＳＩプラスミド、及びＳＦＶプラスミド内にサブクローン化された。ｐＳＩはＢ７−１とネコＣＤ２８との機能的相互作用の確立に利用された。
【００９２】
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲに利用されたＤＮＡプライマーは：
５’プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号１１）
３’プライマー：５’−ＣＣＴＡＧＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＧＧＣ−３’（配列番号１２）
（ネコＣＤ２８ｃＤＮＡに関するプライマーの完全リストについては上記を参照）
ネコＣＤ２８ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲに利用されたＤＮＡプライマーは：
５’プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１３）
３’プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号１４）
（ネコＣＤ２８ｃＤＮＡに関するプライマーの完全リストについては上記を参照）
ネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲに利用されたＤＮＡプライマーは：
１．第１ＰＣＲ産物（６７２ｂｐ）に関する変性プライマー：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＡＴＧＧＣＴＴ（Ｃ）ＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴ（Ｃ）ＣＡＧＣ（Ａ）ＧＧ−３’（配列番号１５）
Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＴＣＡＡＴＴＧ（Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号１６）
２．ＣＴＬＡ−４（４５５ｂｐ）の５’末端：変性された、遺伝子特異的（ＧＳＰ）及びネステッド遺伝子特異的（ＮＧＳＰ）プライマー：
第１段階ＰＣＲ：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ（Ｔ）Ｇ（Ａ）ＣＴＣＴＧ（Ａ）ＣＴＴ（Ｃ）ＣＣＴＧ−３’；（配列番号１７）
３’ＧＳＰ：５’−ＧＣＡＴＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１８）
第１段階のＰＣＲ産物によるネステッドＰＣＲ：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ（Ｔ）Ｇ（Ａ）ＣＴＣＴＧ（Ａ）ＣＴＴ（Ｃ）ＣＣＴＧ−３’；（配列番号１９）
３’ＮＧＳＰ：５’−ＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧ−３’；（配列番号２０）
３．ＣＴＬＡ−４の３’末端；アダプタープライマー１（ＡＰ１、クローンテックラブ社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂ、Ｉｎｃ．，）ＣＡ）；ネステッドアダプタープライマー（ＡＰ２、クローンテックラブ社）、遺伝子−特異的プライマー（ＧＳＰ）、及びネステッド遺伝子特異的プライマー（ＮＧＳＰ）；
３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ：
ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；（配列番号２１）
５’ＧＳＰ：５’−ＧＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＴＧ−３’；（配列番号２２）
３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの産物によるネステッドＲＡＣＥ  ＰＣＲ：
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号２３）
５’ＮＧＳＰ：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧ−３’；（配列番号２４）
４．全ＣＴＬＡ−４ゲノム用プライマー
Ｆｅｌ  ＣＴＬＡ−４  ５’プライマー：５’−ＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧ−３’；（配列番号２５）
Ｆｅｌ  ＣＴＬＡ−４  ３’プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＣＡＧ−３’；（配列番号２６）
ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲに利用されたＤＮＡプライマーは：
１．第１ＰＣＲ産物（４２３ｂｐ）に関する変性プライマー：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２７）
Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号２８）
２．第２ＰＣＲ産物（５７４ｂｐ）に関する変性プライマー：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＧＡ（Ｇ）ＣＡ（Ｔ）ＧＣＡＣＴ（Ａ）ＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧ−３’；（配列番号２９）
３’ＧＳＰ：５’−ＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号３０）
３．ＣＤ８６の５’末端：ＡＰ１、ＡＰ２（クローンテックラブ社）、変性３’−遺伝子特異的（ＧＳＰ）及び３’−ネステッド遺伝子特異的（ＮＧＳＰ）プライマー：
５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ：
ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；（配列番号３１）
３’ＧＳＰ：５’−ＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号３２）
５’ＲＡＣＥのＰＣＲ産物によるネステッド５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ：
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号３３）
３’ＮＧＳＰ：５’−ＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＡＧＣＡＣ−３’；（配列番号３４）
４．Ｂ７−２の３’末端：ＡＰ１、ＡＰ２、５’ＧＳＰ及び５’ＮＧＳＰ：
３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ：
ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；（配列番号３５）  
５  ＧＳＰ：５’−ＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＣ−３’；（配列番号３６）
３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲの産物によるネステッド３’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ：
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号３７）
５’ＮＧＳＰ：５’−ＣＡＧＴＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣ−３’；（配列番号３８）
全ＣＤ８６遺伝子
Ｆｅｌ  Ｂ７２（１）５’プライマー：５’−ＣＧＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＴＡＴＡＧ−３’；（配列番号３９）
Ｆｅｌ  Ｂ７２（１１７６）３’プライマー：５’−ＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＡＧＣＡＧＧＧＧ−３’；（配列番号４０）
［例１Ｂ］
ＣＤ８０（Ｂ７−１）−Ｓｙｎｔｒｏ／ＳＰＡＨのクローニング；プラスミド９１７−１９−８／１６
ネコ脾臓細胞をネコから抽出し、コンカナバリンＡと共に５時間培養した。細胞を沈殿させ、ＰＢＳで洗浄し、これを用いて全ＲＮＡを分離した（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙトータルＲＮＡシステム）。全ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、ＲＮＡ標本よりＤＮＡ汚染を除いた。次にＱｉａｇｅｎのオリゴテックスビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びクイックカラムを用いてこれら標本よりメッセンジャーＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマー、ｄＮＴＰｓ、ＲＮＡｓｉｎ、逆転写酵素（プロメガ）及び逆転写酵素緩衝液（プロメガ）存在下、４２℃、３０分間インキュベートしてｍＲＮＡよりコピーＤＮＡを作製した。次に、センスプライマー５／９７．５（５’−ＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧ−３’）；（配列番号４１）及びアンチセンスプライマー５／９７．５１（５’−ＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴＣ−３’）；（配列番号４２）、ｄＮＴＰｓ、Ｂ７−１ｃＤＮＡ（第１鎖）、ＭｇＳＯ４、ベントポリメラーゼ（ＢＲＬ）及びベントポリメラーゼ緩衝液（ＢＲＬ）を用いたＰＣＲによりネコＢ７−１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の２本鎖、完全長ｃＤＮＡクローンを作製した。ＰＣＲ条件は次の通りである：９４℃、１５秒１サイクル、９４℃、３０秒、４８℃２分間、７２℃２分間を３５サイクル、７２℃１０分間を１サイクル。ＰＣＲ反応体は１％低融点アガロースゲルにかけ、Ｂ７−１ＯＦＲに期待される大きさに一致するＤＮＡ断片を郡理し、ゲル精製（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ゲル精製キット、サンタクララ、カリフォルニア（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ））、インビトロゲン社製Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングきっと（サンジェゴ、カリフォルニア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用い、ｐＣＲ−ＢＬＵＮＴプラスミドベクターにクローニングした。カナマイシン耐性最近コロニーから抽出されたＤＮＡを、特異的ＮｈｅＩ部位（ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ内に含まれる）の存在について前スクリーニングした。８００−９００ｂｐの範囲の大きさで、ＮｈｅＩ部位を持つ挿入体をＡＢＩ社製蛍光自動シークエンスプロトコールと装置を使用し（パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）；アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））、配列決定した。プラスミドベクター及びＢ７−１、前もってクローン化されたＢ７−１遺伝子に由来する遺伝子特異的プライマーを用いて作製されたＤＮＡ配列ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔプライマーは１／９７．３６（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）；（配列番号４３）及び１／９７．３７（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）；（配列番号４４）である。
【００９３】
Ｂ７−１遺伝子特異的プライマーは；１２／９６．２２（５’−ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴ−３’）；（配列番号４５）、１／９７．３３（５’−ＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣ−３’）；（配列番号４６）、１２／９６．２０（５’−ＡＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡ−３’）；（配列番号４７）、１２／９６．２１（５’−ＡＴＴＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴ−３’）；（配列番号４８）、１／９７．３２（５’−ＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＧ−３’）；（配列番号４９）、１１／９６．３２（５’ＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡ−３’）；（配列番号５０）、１１／９６．３１（５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡ−３’）；（配列番号５１）である。２つのクローンが、２ヶ所のＤＮＡ点突然変異を除き元のＣＤ８０配列に相当する完全長のＣＤ８０配列を含んでいた。この点突然変異の１つはアミノ酸配列に影響しなかった。２番目の点突然へにはアミノ酸をロイシンからイソロイシンに変えた。得られたネコＣＤ８０クローンは９１７−１９．８／１６．（ＣＤ８０−Ｓｙｎｔｒｏ／ＳＰＡＨ）と命名された。
【００９４】
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩクローニングサイトを含むｐｏｘプロモーターの後へのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）遺伝子のクローニングを促進するために、２種類のプライマーを設計してＣＤ−８０ＯＦＲの５’及び３’末端上にそれぞれＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素クローニングサイトを導入した。これら２種類のプライマーは；センスプライマー１／９７．４３（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’）；（配列番号５２）及びアンチセンスプライマー１／９７．６（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’）；（配列番号５３）である。得られたＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、ＳＰＶ組換え体ウイルス生成に適したＯ１ＬＳＰＶホモロジーベクター（ブタ痘ウイルスのＨＩｎｄＩＩＩ  Ｍゲノム断片中のＡｃｃＩ挿入部位）内にクローン化した。これにより初期／後期合成ｐｏｘプロモーター、ＬＰ２ＥＰ２の後にネコＣＤ８０のＯＲＦを含むＳＰＶＯ１Ｌホモロジーベクターであり、かつ合成後期Ｐｏｘプロモーター、ＬＰ２により促進される大腸菌ＬａｃＺマーカー遺伝子カセットに接続されたカセット、９３０−２３．Ａ１が得られた。プラスミドベクター９３０−２３．Ａ１をＳＰＶ００１とコトランスフェクションし、ネコＢ７−１及び大腸菌β−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する組換え体ＳＰＶウイルスを作製した。
【００９５】
［例１Ｃ］：ｐｏｘウイルスホモロジーベクター内へのＣＤ−２８のサブクローニング
ネコＣＤ−２８のコーディング域を通常のクローニングサイトを含む合成プライマーを利用しＰＣＲ増幅し、ｐｏｘ特異的ホモロジーベクターの構築に適した何れかのｐｏｘプロモーターの後へのＣＤ−２８のクローニングを促進した。合成プライマーを作製し、ＥｃｏＲＩ及びＢｇ１ＩＩクローニングサイトをＰＣＲ断片のそれぞれ５’及び３’末端に導入した。２種類のプライマーは；センスプライマー７／９７．１（５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴ−３’）；（配列番号５４）及びアンチセンスプライマー７／９７．２（５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＣＧＣＡＡ−３’）；（配列番号５５）である。得られたＰＣＲ  ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢｇ１ＩＩで消化し、ＳＰＶ組換え体ウイルス生成に適したＯ１ＬＳＰＶホモロジーベクター内にクローン化した。これにより初期／後期合成ｐｏｘプロモーター、ＬＰ２ＥＰ２の後にネコＣＤ−２８のＯＲＦを含むＳＰＶＯ１Ｌホモロジーベクター（ブタ痘ウイルスＨＩｎｄＩＩＩ  Ｍゲノム断片内のＡｃｃＩ挿入部位）であり、かつ合成後期Ｐｏｘプロモーター、ＬＰ２により促進される大腸菌ＬａｃＺマーカー遺伝子カセットに接続されたカセット、９３０−２６．Ａ１が得られた。ホモロジーベクター９３０−２６．Ａ１をＳＰＶ００１とコトランスフェクションし、ネコＣＤ−２８及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現する組換え体ＳＰＶウイルスを作製した。
【００９６】
［例２］
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ＴＡＭＵ、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０（Ｂ７−１）−Ｓｙｎｔｒｏ／ＳＰＡＨ  ｃＤＮＡｓ及びポリペプチドの特性解析：
単離、精製された約９４１ヌクレオチドのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡは、分子量約３３，４８５ｋＤａの未変性膜結合又は成熟型で、等電点が約９．１ｐＨ７．０での総電荷が１０．２４である、約２９２アミノ酸のネコＣＤ８０ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする。タンパク質の膜貫通ドメインは約２４１ないし２７１アミノ酸。
【００９７】
ネコＣＤ８０−ＴＡＭＵ及びネコＣＤ８０−Ｓｙｎｔｒｏ／ＳＰＡＨは２種類の材料より独立に分離されたｃＤＮＡｓとポリペプチドであり、ＤＮＡ及びアミノ酸の配列は僅かに異なっている。ＣＤ８０−ＴＡＭＵ  ｍＲＮＡの資源はＣｏｎＡにより刺激されたネコ末梢血単核細胞であり、ＣＤ８０−Ｓｙｎｔｒｏ／ＳＰＡＨ  ｍＲＮＡの資源はＣｏｎＡ刺激を受けたネコ脾臓細胞であった。ネコＣＤ８０−ＴＡＭＵ及びネコＣＤ８０−Ｓｙｎｔｒｏ／ＳＰＡＨ間のｃＤＮＡ配列の差は、ヌクレオチド３５１に於けるＴからＣ及び６７０に於けるＣからＡである。アミノ酸配列に於いては、ヌクレオチド３５１の変化はサイレントであり、ヌクレオチド６７０の変化は天然アミノ酸の保存的変化、アミノ酸残基２２４でロイシンがイソロイシンを生ずる。
【００９８】
単離、精製された、約１１７６ヌクレオチドのネコＣＤ８６（Ｂ７−２）ｃＤＮＡは、分子量約３６，３９４ｋＤａ、等電点約９．１９、ｐＨ７，０での総電荷１１．２７の、未変性の膜結合型又は成熟型である、約３２０アミノ酸のネコＣＤ８６ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。
【００９９】
単離、精製された、約６８９ヌクレオチドのネコＣＤ２８のｃＤＮＡは、分子量約２５，３１９ｋＤａ、等電点約９．１７、ｐＨ７，０での総電荷９．５８の、未変性の膜結合型又は成熟型である、約２２１アミノ酸のネコＣＤ２８ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。
【０１００】
単離、精製された、約７４９ヌクレオチドのネコＣＴＬＡ−４のｃＤＮＡは、分子量約２４，３８１ｋＤａ、等電点約６．３４、ｐＨ７，０での総電荷−０．９９の、未変性の膜結合型又は成熟型である、約２２３アミノ酸のネコＣＴＬＡ−４ポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードしている。
【０１０１】
ＣＤ８０と、補助刺激分子であるＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４、及び腫瘍抗原又は病原性生物の抗原との共発現は、Ｔ−リンパ細胞、より具体的にはＴｈ−１リンパ細胞を活性化し、又活性化を増強し、その他のタイプの細胞の増殖を促進する能力を有する。補助刺激分子ＣＴＬＡ−４とのＣＤ８０の共発現は、Ｔ−リンパ細胞、より具体的にはＴｈ−１リンパ細胞の活性化を抑制する能力を有する。補助刺激分子ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４及び腫瘍抗原又は病原性生物由来の抗原とのＣＤ８６の共発現は、Ｔ−リンパ細胞、より具体的にはＴｈ−１リンパ細胞の活性化を増強し、また他のタイプの細胞の増殖を促進する能力を有する。補助刺激分子ＣＴＬＡ−４とのＣＤ８６との共発現は、Ｔ−リンパ細胞、より具体的にはＴｈ−１リンパ細胞の活性化を抑制する能力を有する。
【表０】
2010252804.tif 000002
【０１０２】
［例３］
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４のワクチンへの利用。
【０１０３】
以下の実験を行い、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４のネコワクチンに於ける免疫増強能力を評価した。
【０１０４】
別の方法では、８週齢のネコにネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４分子に関するプラスミド１００μｇを、ＦＩＶ  ｅｎｖ及びｇａｇ、又はＦｅＬＶ  ｅｎｖ及びｇａｇのｃＤＮＡを含むプラスミドと共に筋肉内注射し、あるいはＣＤ８０とＣＤ２８、又はＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、又はＣＤ８６とＣＤ２８、又はＣＤ８６とＣＴＬＡ−４  の対の組み合わせを発現するｃＤＮＡを含むプラスミド１００μｇをＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４とペアにして、ＦＩＶ  ｅｎｖとｇａｇ、又はＦｅＬＶ  ｅｎｖとｇａｇのｃＤＮＡを含むプラスミドと共に筋肉内注射したコントロールのネコはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を受け入れない。ネコに有毒性のＦｅＬＶ又はＦＩＶを接種し、上記の様な病気の徴候について観察された。接種実験の結果、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４を含むｃＤＮＡベクター、及びＦＩＶ遺伝子又はＦｅＬＶ遺伝子を含むｃＤＮＡベクターを受け取ったネコはこれら病気から１００％予防されたが、ＦＩＶ遺伝子又はＦｅＬＶ遺伝子を含むｃＤＮＡのみを受け取ったネコはこれらの病気に対し７５％の予防率を示した。
【０１０５】
別の方法では、８週齢のネコに、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４分子の精製タンパク質０．１ないし１００ｍｇを、あるいは上記組換体ｃＤＮＡベクターのＣＤ８０又はＣＤ８６とＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４タンパク質とをペアにした対の組み合わせを筋肉内注射し、そしてＦＩＶ  ｅｎｖ及びｇａｇ、又はＦｅＬＶ  ｅｎｖとｇａｇ０．１ないし１００ｍｇと共に筋肉内注射した。コントロールのネコはＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を受け入れなかった。ネコに有毒性のＦｅＬＶ又はＦＩＶ株を接種し、病気の発生を定期的に観察した。接種実験の結果、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に関する精製タンパク質及びＦＩＶ又はＦｅＬＶを含むサブユニットワクチンを受け取ったネコは、ＦＩＶ又はＦｅＬＶタンパク質を含むサブユニットワクチンのみを受け取ったネコに比べて有意に低い病気発生率を示した。
【０１０６】
［例４］
腫瘍細胞増殖の阻害と破壊へのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の利用。
【０１０７】
ネコからの腫瘍細胞にＣＤ８０又はＣＤ８６をＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４と組み合わせ発現しているベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトされた腫瘍細胞はネコに再投与され、腫瘍細胞の表面上のＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の存在はトランスフェクトされた、及びトランスフェクトされていない腫瘍細胞に対し広域の免疫反応を惹起し、局所及び転移性の腫瘍細胞を殺す。別の方法では、ネコＣＤ８０又はＣＤ８６をＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４と組み合わせて発現しているベクターをネコの腫瘍内に直接注射し、局所及び転移性の腫瘍細胞を殺滅する。
【０１０８】
［例５］
［ネコＣＤ８０ｃＤＮＡのクローニングと配列決定］
［序］
サイトカインに加え、幾つかの細胞表面分子は特定の免疫反応を増強又は抑制することが示されている。ＣＤ８０（Ｂ７−１）はＴ細胞上のそのレセプターであるＣＤ２８に結合するアクセサリー分子である（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。この相互作用は二次刺激に於いて、ＭＨＣの関係にて提示された抗原のＴ細胞レセプターによる認識より供給される一次刺激と組み合わさって機能しＴ細胞の活性化と増殖をもたらす（ＡｌｌｉｓｏｎとＬａｎｉｅｒ、１９９４）。これはまずＢ−細胞抗原として報告されたが、その後ＣＤ８０は各種細胞上に発現している事、多くが抗原提示する毛細血管を伴うことが示された（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。
【０１０９】
霊長類及び齧歯類では、ＣＤ８０分子は約２９０アミノ酸より成る６０ｋＤａのポリペプチドである（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８７；Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。推定アミノ酸配列の確認より、それを免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーの特徴を有することを示唆した（Ｐｅａｃｈら、１９９５）。それは２種類の細胞外ＩｇＳＦドメイン、疎水性膜貫通ドメイン及び短い細胞質テールを含む（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。成熟ペプチドの細胞外ドメインは、１００アミノ酸のＩｇＳＦ定常（Ｃ）様ドメインが続く１２４残基のＮＨ３末端ＩｇＳＦ可変（Ｖ）様ドメインを持つ（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。ヒトの対応部分は８個の潜在的Ｎ−結合グリコシル部位を有し、これら炭水化物残基は結合ドメインと反対側に向いていると考えられていることからＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４への結合には関与しないと考えられている（Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９９４）。更に、炭水化物残基の除去は結合能に影響しないと考えられ、むしろそれらの機能は分子の細胞外部分の可溶性を増すことにあると提言されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ａ）。
【０１１０】
ＣＤ８０は、Ｔ細胞が活性化される間の異なる時点に於いて、２種類の異なるレセプターに結合する。ＣＤ２８は各種リンパ細胞及びナイーブ及び活性化Ｔ細胞上に認められており、またＴ細胞の活性化及び増殖に於いて顕著な役割を果たしている（Ａｒｕｆｆｏ、１９８７）。第２のＣＤ８０レセプターであるＣＴＬＡ−４は、通常は遅れて完全に活性化されたＴ細胞上に認められる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ｂ）。ＣＴＬＡ−４の役割は明瞭にされていないが、この分子が作用し、活発な既存Ｔ細胞の反応を抑制するだろうと仮定されている（Ｈｕｔｃｈｃｒｏｆｔ及びＢｉｅｒｅｒ、１９９６）。
【０１１１】
ＣＤ８０分子自体はシグナル能を有していないと考えられている。細胞質領域は比較的短く、シグナルまたは酵素機能を示す残基を有していない（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。成熟及びヒトペプチドの間に細胞質テールが保存されていないことは、ＣＤ８０がシグナル機能を欠き、そしてＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４との相互結合にのみ作用する可能性にも反映される（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ａ）。
【０１１２】
ＣＤ８０及びＣＤ２８間の相互作用がナイーブＴ細胞の活性化状態への成熟、即ち一次Ｔ細胞反応の開始に必要であることが示されている（Ｄａｍｌｅら、１９８８）。ＣＤ８０はまず活性化されたＢ細胞上に認められたが（Ｆｒｅｅｄｍａｎら、１９８７）、続いてマクロファージ／単核細胞を含む大部分の専任（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞Ｆｒｅｅｄｍａｎら、１９８７）、ランゲルハンス細胞（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎら、１９９３）、樹状細胞（Ｌｉｕら、１９９２）、活性化Ｔ細胞（Ｒａｚｉ−Ｗｏｌｆら、１９９２）及び各種腫瘍株（Ｃｈｅｎら、１９９２）に見いだされている。ＡＰＣ上でのＣＤ８０分子の存在はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に重要であることが示されている（ＡｌｌｉｓｏｎとＬａｎｉｅｒ、１９９４；Ｂｅｌｌｏｎｅら、１９９４）。分子は通常専任ＡＰＣ上にのみ有意なレベルで存在しているが、幾つかの腫瘍細胞株はシグナル分子をアップレギュレートすることが示されている（Ｃｈｅｎら、１９９２）。
【０１１３】
形質転換に対する反応では、幾つかの腫瘍株はＣＤ８０発現をアップレギュレートすると考えられている。これら非抗原提示細胞由来の腫瘍、並びに幾つかの不死化細胞株では、ＣＤ８０は、Ｔ細胞の完全な活性化を促進するのに十分なレベルで表面に発現される（Ｃｈｅｎら、１９９２）。発現の動態は不明確であるが、腫瘍由来ＣＤ８０は「腫瘍形成性傷害」に対する反応であり、それを通じて免疫系が形質転換又は腫瘍形成性細胞を除去できる進化的な機序であり得る（Ａｎｔｏｎｉａら、１９９５）。
【０１１４】
ＣＤ２８−Ｂ７相互作用の役割は一次Ｔ細胞活性化にとって重要と考えられた。ＴＣＲによるＭＨＣが関連した抗原の認識は、それ自体ではＴ細胞の最適な増殖と活性化の開始には不十分である（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９２）。アクセサリーシグナルが無い状態での刺激はＴ細胞集団に於ける抗原反応不顕性又は低反応性状態を導くことができる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９８７）。Ｔ細胞上のＣＤ２８分子と抗原提示細胞上のＣＤ８０分子との結合は、Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを提供するだろう（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９２）。ＴＣＲが結合すると、この第２のシグナルがない状態でナイーブ細胞は活性化されず、抗原反応不顕性になる（Ｌａｎｉｅｒら、１９９５）。このＣＤ２８−ＣＤ８０相互作用に関する重要な役割は、ナイーブＣＤ４＋細胞の活性化だけでなく、ＣＤ４＋Ｔｈ１及びＴｈ２クローン、及び小休止末梢血リンパ細胞に由来するナイーブ及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞についても明瞭に示されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ａ）。
【０１１５】
ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ファミリーの場合と同様に、ＣＤ８０に関連した別の相手方レセプターが少なくとも１つ存在する。一次免疫反応に於けるＣＤ８０の重要性を示すことを試みた初期の研究は、ＣＴＬＡ−４Ｉｇが免疫系を阻害したものの、ＣＤ８０に対するモノクローナ（ｍＡｂ）ル抗体を加えた場合には同様の結果が得られないことから問題を抱えてしまった（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９３）。ＣＤ８０ノックアウトマウスの開発は、偶然第２ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８レセプターの発見をもたらした（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３）。これらマウスはそれまでに開発された不適切なＴ細胞反応を示すＣＤ２８ノックアウトマウスと類似の表現形を共有する様に感じられた（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３）しかし、ＣＤ８０ノックアウトマウスでは、反応は通常に起こっており、ＡＰＣはＴ細胞の成熟化に必要な第２シグマ留を発していることが分かった（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３）。これら結果より、第二のレセプターが仮定され、実際に分離された。続いて関連するＣＤ８６（Ｂ７−２又はＢ７−０）レセプターが発見されたことから、ＣＤ８０ノックアウトに見られた矛盾は解決し、構造及び結合の類似性に関連して分子が共通の機能と起源を共有している可能性が反映されたものと考えられた（Ｈａｔｃｈｏｃｋら、１９９４）。
【０１１６】
ＣＤ８６（Ｂ７−２）は、ＣＤ８０とある程度類似性を示し、構造的に類似の細胞外ＩｇＳＦ  Ｖ領域及びＣ領域を共有している（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３）。しかしながら、保存された残基が両細胞外ドメインの反対面に散在しているものの、前記分子間の全体的な相同性は２５％未満である（Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９９４）。結合領域はいずれの分子についても特定されていないが、配列の相同性により、推定相互作用部位として提案された予想領域が与えられている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ａ）。保存性は欠くものの、ＣＤ８０及びＣＤ８６は両レセプターに対して類似の結合活性を保持しているが、ＣＤ８６はＣＴＬＡ−４からより早く解離する（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。
【０１１７】
ＣＤ８６はＣＤ８０と類似の発現パターンを示し、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び単核細胞上に発現する（Ａｚｕｍａら、１９９３ａ）。しかし発現の動態は２つの分子で若干異なっている（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。ＣＤ８６は一般にＣＤ８０に比べて早く活性免疫反応に出現し、単核細胞上に持続的に発現されると思われる（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９１）。ＣＤ８０は初期刺激から２４時間までに出現するが、ＣＤ８６は反応初期に出現するか骨髄性細胞上に低レベルで持続的に出現していると思われる（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。前記２種類の表面タンパク質はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの上にあるそれぞれに対応するレセプターと結合し、類似の細胞内反応を惹起する（Ｌａｎｉｅｒら、１９９５）。Ｔ細胞の活性化及び増殖を開始させ、又はＣＴＬ活性を誘導する能力について、両分子の間に差は認められない（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。即ち、データは両分子がＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４ぞれぞれの結合に対して類似のシグナルカスケードを開始することを示唆している（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。両分子は対応するレセプターに対して同一の反応速度で結合し、その効果に差はないと考えられることから、この「２リガンド／２レセプター」システムの進化上の意義については不明である（Ｌａｎｉｅｒら、１９９５）。
【０１１８】
ＣＤ８０は本来Ｂ−細胞のマーカーとして報告されており、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、抗−Ｉｇ、抗−ＣＤ４０、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ｃＡＭＰ、ＩＬ−２及びＩＬ−４により刺激を受けたＢ細胞上ではＣＤ８０及びＣＤ８６は共に高いレベルで見いだされている（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。ＩＦＮγ及びＩＬ−５に関しヒトシステム又はＣＤ８０についてのデータはないものの、これら免疫システム制御因子はマウスＢ−細胞に於いてはＣＤ８６をアップレギュレートすることが示されている（Ａｚｕｍａら、１９９３ａ）。発現の反応速度は、Ｂ細胞では各分子により若干違いがある。ＣＤ８６は刺激後すぐに（６時間）発現されるが、ＣＤ８０はほとんど２４時間になるまで存在せず、又４８時間後になるまで発現はピークに達しない（Ｌｅｎａｃｈｏｗら、１９９３）。Ｂ−細胞上のＣＤ８０のアップレギュレーションもＭＨＣクラスＩＩ介在シグナリングにより制御されていると考えられている（Ｎａｂａｖｉら、１９９２）。２種類の他の表面レセプターもＣＤ８０の表面発現において重要と考えられている。Ｉｇまたは対応レセプターを発現するＴ細胞によってＢ細胞上に発現されたＣＤ４０が交叉結合されると、ＣＤ８０発現が増す（Ａｚｕｍａら、１９９３ｂ）が、Ｆｃレセプターとの交叉結合は両分子の発現をダウンレギュレーションする（Ｂａｒｃｙら、１９９５）。
【０１１９】
ＣＤ４０及びそのリガンドであるＣＤ４０Ｌは、ＡＰＣ上に於けるＣＤ８０発現制御の経路として提案されている（Ｐａｇｅら、１９９４）。ＣＤ４０はＢ細胞、単核細胞、樹状細胞、繊維芽細胞及びヒト内皮細胞を含む様々なタイプの細胞上に発現され、ＩＦＮγ存在下にこれらの細胞上でアップレギュレートされている（ｄｅ  Ｂｏｅｒら、１９９３）。ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合は、ＡＰＣに於けるＣＤ８０の発現をアップレギュレーションすることが示されているが、内皮細胞を含むレセプターを発現している他のタイプの細胞での発現は誘導しないと考えられている（Ｐａｇｅら、１９９４）。
【０１２０】
ＣＤ８０及びＣＤ８６分子は、そのアミノ酸同一性は２５％以下であるにもかかわらず構造類似性を有しており、遠く関連していると考えられている（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３）。相同残基はＩｇ−様ドメイン内に集中しており、膜貫通又は細胞質ドメイン内の保存残基はごく少数である（Ｊｕｎｅら、１９９５）。ＣＤ８０及びＣＤ８６に加えブチロフィリン（ＢＴ）、ミエリン／オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ニワトリＭＨＣ類似体、Ｂ−Ｇを含む、Ｂ７遺伝子を含むファミリーが提言されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ｂ）。ＢＴ、ＭＯＧ及びＢ−Ｇは全てＭＨＣ遺伝子複合体によりコードされており、これらはＭＨＣと必須共刺激性分子間の潜在的な進化的結びつきを示している（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ｂ）。
【０１２１】
休止状態のマウス及びヒトＴ細胞は低レベルのＣＤ８６を発現しているが、抗−ＣＤ３で活性化されたヒト及びマウスＴ細胞（及びＴ細胞クローン）はＣＤ８０とＣＤ８６を高いレベルで発現する（Ｍａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。活性化Ｔ細胞上でのＣＤ８０及びＣＤ２８の発現は、自己分泌による共刺激を介したＴ細胞の拡大能力を反映するだろう（Ａｚｕｍａら、１９９３ｂ）。興味深いことに、ＣＤ８０はＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞上ではアップレギュレートされているが、それに伴ってＣＤ２８はダウンレギュレートされることが示されている。これは、未感染ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２８／ＣＤ８０を介し感染リンパ細胞と接触した時の、ウイルス感染の想定メカニズムとして提案されている（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。
【０１２２】
ヒト末梢血単核細胞は低レベルのＣＤ８０と高レベルのＣＤ８６を発現しているが、ＧＭ−ＣＳＦ又はＩＦＮγに曝されるとＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現は共にアップレギュレーションされる（Ｂａｒｃｙら、１９９５）。ＬＰＳはヒト末梢血単核細胞に於けるＣＤ８０発現の強力な誘導因子である（Ｓｃｈｍｉｔｔｅｌら、１９９４）。ヒトシステムでの腹腔マクロファージに関するデータは無いが、休止状態にあるマウスマクロファージは低レベルのＣＤ８０及びＣＤ８６を発現している（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９１；Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。ＬＰＳ及びＩＦＮγによるマウスのマクロファージ刺激は表面発現を増加させるが、インターロイキン１０と組み合わせたＩＦＮγは両レセプターをダウンレギュレーションする（Ｄｉｎｇら、１９９３）。
【０１２３】
脾臓樹状細胞は両分子を低レベルに発現しており、ランゲルハンス細胞はＣＤ８６を低レベル発現しているが、いずれの細胞も培養により発現が増す傾向にある（Ｌａｒｓｅｎら、１９９４）。樹状細胞の場合、培養によりＣＤ８６はより強力にアップレギュレートされ、より早く出現し、樹状細胞を介したシグナル伝達においてより重要な役割を果たすだろう（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。興味深いことに、ＩＬ−１０は樹状細胞に於けるＣＤ８０発現に影響を及ぼさないものの、それはＣＤ８６発現をダウンレギュレートする様に作用する（Ｂｕｅｌｅｎｓら、１９９５）。Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、（１９９３）は、ＣＤ８０の初期値は低いものの、成熟すると樹状細胞はより高レベルのＣＤ８０を提示することを報告している。ＣＤ８０のランゲルハンス細胞の発現はＩＬ−１０及びＩＦＮγの両方により阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦへの暴露はＩＬ−１０による阻害には作用しないもののＩＦＮγによる阻害は逆行させる（Ｏｚａｗａら、１９９６）。
【０１２４】
ヒト及びマウスでは、特異的サイトカインがＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を制御することが示されている。ＩＬ−４はＣＤ８６の強力な誘導因子であり、Ｂ細胞上のＣＤ８０に対する作用は弱いが（Ｓｔａｃｋら、１９９４）、ＩＦＮγはＢ細胞単核細胞及びマクロファージを含む様々な細胞上でのＣＤ８６の発現を増加する（Ｈａｔｈｃｏｃｋら、１９９４）。ＩＦＮγは単核細胞でのＣＤ８０発現をアップレギュレーションすると考えられているが、マクロファージでは発現をダウンレギュレーションする様に作用するだろう。ＩＬ−１０は、ＩＦＮγが存在する場合でも、単核細胞上でのＣＤ８０及びＣＤ８６の発現のダウンレギュレーションに作用する（Ｄｉｎｇら、１９９３）。この相互作用はＴｈ１反応（ＤＴＨ）からＴｈ２反応（体液）へのスイッチの潜在メカニズムであろう。しかしＩＬ−１０は樹状細胞上でのＣＤ８０発現に影響しない（Ｂｕｅｌｅｎｓら、１９９５）。樹状細胞は２型反応の開始に於いて重要と考えられることから、この事は更にこれら分子のヘルパーＴサブセット制御に於いて果たす役割を反映しているだろう。ＩＬ−７は他の細胞に対する作用は未確定であるもののＴ細胞上ではＣＤ８０の発現を増加する（Ｙｓｓｅｌら、１９９３）が、一方、Ｂ細胞のＣＤ８０の発現はｐ７５ＴＮＦレセプターの交叉結合を介して伝達されることが示されており、発現はＩＬ−４存在時に増加できる（ＲａｎｈｅｉｍとＫｉｐｐｓ、１９９５）。興味深いことにＴＮＦは別の強力なＣＤ８０発現開始体であるＣＤ４０と同一の分子ファミリーに属する。ＧＭ−ＳＦは樹状細胞及びランゲルハンス細胞の表面ＣＤ８０の発現をアップレギュレーションすると考えられているが、一方ＩＦＮγはこれら細胞に於いてＣＤ８６のアップレギュレーションのみを起こす（Ｌａｒｓｅｎら、１９９４）。
【０１２５】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ−リンパ細胞（ＣＴＬ）による形質転換及びウイルス感染標的細胞の認識、結合及び溶解は、長い間ＭＨＣクラスＩの関連において発現される外来ペプチドのＴＣＲ認識を通じてのみ伝達されると考えられていた（Ｂｅｒｋｅ、１９９３）。最近、ＣＴＬ及び標的細胞の両方により発現された各種表面分子が完全な相互作用の生起に必要とされることが解明された（Ｍｅｓｃｈｅｒ、１９９２）。この相互作用に於ける重要な因子はＣＤ８０及びその対応レセプターであるＣＤ２８である。Ｂ７−ＣＤ２８相互作用により供給されるアクセサリーシグナルは、ＣＤ８＋小休止リンパ細胞が傷害性状態に分化するのに必要である（Ｍｅｓｃｈｅｒ、１９９２）。興味深いことに、一度ＣＴＬが分化すれば、傷害特性の発現にこの２次シグナルはもはや必要なくなる（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。
【０１２６】
ＣＴＬはウイルス性免疫の重要なメディエイターとして長く知られてきた。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者に於いては、長期間の無進行にはＧａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖに特異的な高いレベルのＣＤ８＋メモリーＣＴＬ、及び末梢血単核細胞中の極めて低レベルのＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡが伴う（Ｒｉｎａｌｄｏ、１９９５）。逆に、感染後期にある患者ではメモリーＣＴＬ（ｍＣＴＬ）は大きく低下している（Ｚａｎｕｓｓｉら、１９９６）。これら所見の相関性は、ｍＣＴＬが感染の宿主制御の主要因子であり、ナイーブな未感染個体に於ける防御免疫の確率に於いて重要な役割を果たしているという考えを支持している（Ｚａｎｕｓｓｉら、１９９６）。更に、ＨＩＶ感染との病理学的相関性は、病気の進行に於けるＣＤ８０及びＣＤ２８の潜在的役割を反映している。
【０１２７】
ＣＤ８０はＨＩＶ感染の病原性の発生においても役割を果たしていると提言されている（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。Ｔ細胞は通常ＣＤ８０を発現しているが、そのレベルは極めて低く、また活性化後にのみ発現する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９２）。同種刺激された一次Ｔ細胞株に於けるＨＩＶのイン・ビトロ研究では、ＣＤ２８はダウンレギュレーションされると考えられ、ＣＤ８０発現はＭＨＣ  ＣＩＩにより増強されると考えられている（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。これら事象の原因は不明であるが、潜在的な傷害的役割が仮定されている。クラスＩＩと結びついた表面上でのＣＤ８０の存在は、感染Ｔ細胞と未感染ＣＤ４＋細胞間の接触を増大させる（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。この相互作用はＴ細胞間の伝達速度を高めるよう作用するが、別の役割は感染細胞上のＣＤ８０とＣＤ８＋Ｔ細胞により発現されたＣＤ２８間の相互作用による２次シグナル供給を介し、ＣＴＬに仲介された認識と殺滅を増加することであろう（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。これによりＡＩＤＳ関連疾患の発症に関連して、ＣＤ４＋細胞集団の減少は加速されるだろう（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。
【０１２８】
マウス及びヒトシステムの両方に於いて、Ｂ７ファミリータンパク質の発現は、形質転換細胞の免疫認識に於いて重要な因子と考えられている（Ｃｈｅｎら、１９９２）。発現は幾つかの形質転換細胞に認められるものの、多くの腫瘍は通常ＣＤ８０又はＣＤ８６を発現しておらず、従って潜在的に免疫原性な腫瘍抗原が発現された場合にＴ細胞による完全な認識が起こるとは考えにくい（Ｃｈｅｎら、１９９３）。しかし、ＣＤ８０分子を用い殺腫瘍細胞融解するトランスフェクション実験は成功することが証明されている（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。
【０１２９】
機能的ＣＤ８０分子を発現しているレトロウイルス及びワクシニアベースのベクターは、悪性細胞のトランスフェクトに利用されている（Ｌｉら、１９９４；Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。通常腫瘍抗原の認識が不要であることに加えＣＤ８０を発現しているこれら細胞が宿主内に再導入されると、悪性細胞上に発現した腫瘍抗原に対し細胞性免疫が生ずると考えられている（ＴｏｗｎｓｅｎｄとＡｌｌｉｓｏｎ、１９９３）。驚くべき事に、複数の型の腫瘍を用いたこれら実験の結果は有効であった。多くの場合、宿主は悪性体に対し強力な細胞反応を加えることができ、これをコントロールまたは排除できた（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。
【０１３０】
続いて、ＣＤ８０有り、及び無しに腫瘍細胞を宿主内に再導入すると、同様のレベルの抗腫瘍免疫が生じた（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。即ち、一度記憶が成立すると、反応の維持又は再導入が起こった場合にそれを開始するのにＣＤ８０分子は必要とされないと考えられる（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。これらの実験は、ＣＤ８０分子は細胞免疫の効果的メディエイターであり、特異的反応を誘導され、悪性病変を制御し再定着を予防することが可能であることを示している（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。
【０１３１】
増加したＣＤ８０の発現は、自己免疫の幾つかの形の発生に見られる様に障害作用を持つことができる。多発性硬化症（ＭＳ）の初期発生では、ＩＬ−１２と相乗作用するＣＤ８０が重要でありＴ細胞刺激とＤＴＨの発生を起こすと考えられている（Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら、１９９５）。実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、実験体に対し可溶性ＣＴＬＡ−４Ｉｇを投与することで部分的に阻害できる。ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用の遮断による脱ミエリン化の阻害は、病気の増悪化に於けるこの相互作用に関する潜在的役割を反映する（Ａｒｉｍａら、１９９６）。
【０１３２】
効果的免疫反応の進行に於けるＣＤ８０の重要性は明らかである。タンパク質をコードするｃＤＮＡは齧歯類及び霊長類にて分離されているが、これらの属外からは分離されていない。ネコは重要なペット動物であり、レトロウイルス疾患の潜在的モデルである。ネコ科動物からの免疫作用物質のクローニングは、獣医分野に於ける重要な病気の研究に適した、他の種に於ける病気の進行又は予防に利用できる可能性を持つする道具を提供するだろう。
【０１３３】
［材料と方法］
［初期断片の単離］
ｍＲＮＡは、１６時間ＣｏｎＡにて刺激した末梢血単核細胞より、ＲＮＡｚｏｌＢ  ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、ヒューストン、テキサス（Ｂｉｏｔｅｘｃ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ））を用い抽出された。まずこのＲＮＡより、３’プライマーとしてオリゴｄＴを使った逆転写（ＲＴ）反応によりｃＤＮＡを得た。要約すると、ＲＮＡ及びオリゴｄＴを７５度で３分間加熱し、２次構造を除いた。次にＲＴ、ｄＮＴＰ、緩衝液及び蒸留水を加え、混合液を１時間４２℃にてインキュベーションした。このインキュベーション後、サンプルを９５℃にて５分間加熱し、ＲＴを失活させた。次に、遺伝子の定常ドメイン内の中心域をコードする３４４ヌクレオチド（ｎｔｄ．）断片の初期増幅に関し、ヒト及びマウスＣＤ８０の公表配列（ジーンバンク、ガイサーブルグ、マサチューセッツ（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ））内のコンセンサス域より得た変性プライマーを使用した：
５’プライマーＢ７−２  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  Ａ（ＣＴ）Ａ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＧＧＡ  Ｃ
３’プライマーＢ７−３    ＣＡＧ  （ＡＴ）ＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  Ｃ（ＣＴ）Ｔ  ＧＧＧ  ＡＡＡ  （ＣＴ）ＴＧ。
【０１３４】
Ｔａｑポリメラーゼを利用するホットスタートポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法を使い、産物を増幅した。Ｔａｑ酵素を欠いた反応混合液をまず９５℃に５分間のホットスタートステップで加熱し、プライマーダイマーの形成を阻止した。温度サイクルを開始する前に酵素を加えた。次にＰＣＲ反応体を９５℃で３０秒加熱し、２本鎖ＤＮＡを融解した。次に反応液を４２℃、３０秒間冷却し、変性プライマーのアニーリングを促進した。低アニーリング温度を使い、相同性が１００％以外であるプライマーの結合を促進した。次に反応体を、Ｔａｑポリメラーゼに取って最適温度である７２℃で４５秒間加熱し、プライマーを伸長し、反対側のＤＮＡ鎖をコピーした。温度サイクルは３０回繰り返された。３０サイクル後、７２℃、７分間の最終伸長ステップを利用し、未完成産物の伸長を促進した。１％アガロースゲル上にて視認した後、配列決定用に産物を一晩、１６℃にてＴＡクローニングベクター（インビトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア）に連結した。連結反応液２μｌを使い、コンピテントＩｎｖαＦ’細胞を形質導入した。形質導入された細菌をＬＢプレート（５０μｇ／ｍｌアンピシリン）上に画線し、５０μｇ／ｍｌのｘ−ｇａｌ液、４０μｌでコートした。翌日、白色のコロニーを選別し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＫＢ培地５ｍｌ中に接種し、２２５ｒｐｍにて振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。
【０１３５】
一晩培養したものをＭｉｎｉ−Ｐｒｅｐにかけ、正確な挿入体を持つプラスミドを含むクローンを特定した。通常のアルカリ溶解法を使い、培養体からプラスミドを抽出し、さらにＤＮＡをフェノール：クロロフォルム抽出法により精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。ＤＮＡは２倍量のエタノールにより沈殿され、続いてＥｃｏＲＩにて消化された。消化物を１％アガロース上にて視覚化し、適当な挿入体を含むプラスミドを有するコロニーを決定した。次に陽性クローンからプラスミドを精製し、シークエナーゼをベースとした（ＵＳＢ、クリーブランド、オハイオ）Ｓ３５放射標識ジデオキシターミネーターシークエンシング、又は蛍光色素ターミネーターサイクルシークエンシング（パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット）を用いて配列決定した。ｃＤＮＡの配列より、ｃＤＮＡ端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）反応及び、３’非翻訳域（ＵＴＲ）からの変性プライマーに関連した３’配列誘導に適した特異的３’及び５’プライマーを構築した。
【０１３６】
［５’領域の単離］
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅法（クローンテック、パロアルト、カルフォルニア）を使い、遺伝子の５’配列を誘導した。ｍＲＮＡは１２時間ＣｏｎＡにて、続いて４時間ＬＰＳにて刺激したＰＭＢＣより作製された。ｍＲＮＡはＵＬＴＲＡＳＰＥＣ  ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を使い抽出された。ｃＤＮＡは、ポリＡテールの５’終末端へのプライマーの結合を促進する５’末端の変性ヌクレオチドを持つアンカーオリゴｄＴプライマーを使い作製された。次にｃＤＮＡは上記の如くに転写された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使い、特異的リンカーをｃＤＮＡに結合する。前に増幅された領域に対し特異的な内部３’プライマー：
Ｂ７−２８４：ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＧ
Ｂ７−１９０：ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧ
及び、接続されたリンカー配列に対し相補的なアンカープライマーを使い、タッチダウンＰＣＲをｃＤＮＡについて行った。ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア）を用いたタッチダウンＰＣＲ反応のパラメーターは次の通りである：９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、７２℃、３０秒及び６８℃、４５秒を５サイクル；９５℃、３０秒、６５℃、３０秒及び６８℃、４５秒を５サイクル；９５℃、３０秒、６０℃、３０秒及び６８℃、４５秒を２５サイクル。この反応液１μｌを５０μｌの水で希釈し、この希釈液５μｌを使い、リンカー特異的アンカープライマー及び初期プライマーの５’に位置する遺伝子特異的３’プライマー（図６）を利用したネステッドＰＣＲ反応を行った（ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックスを利用し、９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、６５℃、３０秒及び６８℃、４５秒を３０サイクル）。
【０１３７】
Ｂ７−２０：ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＧＴＧ
Ｂ７−１３５：ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  Ｇ。
【０１３８】
各反応液２０μｌを１．５％アガロースゲル上で視覚化し、適当な断片をゲルより切り出した。ゲルスライスをゲルネブライザーとマイクロピュア０．２２μｍフィルター（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｒｅｒｌｙ，ＭＡ）を通すことで、ｃＤＮＡをアガロースより抽出し、精製した。次に精製ＤＮＡを、直接色素ターミネーターサイクルシークエンシング（パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット）を用い配列決定した。
【０１３９】
［３’領域の単離］
遺伝子の３’領域は、３４４ｎｔｄ．断片及び先に配列決定された５’領域より５種類の遺伝子特異的プライマーを選択することで実施された：
Ｂ７−ｓ２２０  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  Ｇ
Ｂ７−５０  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  Ｃ
Ｂ７−１４０：ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  Ｇ
Ｂ７−５５０：ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＴＣＣ
Ｂ７−６２０：ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＣＴＴ  Ｃ。
【０１４０】
次に変性３’プライマーが、ヒト及びマウスＣＤ８０３’ＵＴＲのコンセサンス領域より選択された。
【０１４１】
Ｂ７−１２８１  Ｃ（Ａ／Ｇ）Ａ  ＡＧＡ  （Ａ／Ｔ）ＴＧ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＧＡ（Ｇ／Ｔ）  ＣＣ
Ｂ７−１２６０  ＣＡ（Ｃ／Ｔ）  （Ａ／Ｃ）ＡＴ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＴＡＧ  ＧＧ。
【０１４２】
ｃＤＮＡはＵＬＴＲＡＳＰＥＣ（バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を使い、既報の如くにＣｏｎＡ及びＬＰＳにて刺激されたＰＢＭＣより抽出されたＲＮＡから産出される。アンカーされたオリゴｄＴをｃＤＮＡへのＲＮＡ転写用初期３’プライマーとして使用した。このｃＤＮＡについて、特異的５’プライマー及び変性３’プライマーを使用したＴａｑポリメラーゼをベースとしたＰＣＲ反応（９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、４２℃、３０秒及び７２℃、４０秒を３０サイクル；７２℃、７分間）を実施した。正確な大きさの単一断片を得る前に、２回目のネステッド反応が必要とされた。この産物を１．５％アガロースゲルより切り取り、前記同様にして精製し、色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより配列決定した（パーキンエルマー。ノルウォーク、コネチカット）。
【０１４３】
５’及び３’領域の配列データより、ネコＣＤ８０遺伝子の全オープンリーディングフレームをコードする領域を増幅するプライマーが構築された：
Ｂ７  ＳＴＡＲＴ：ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＴＧＧ
Ｂ７−９６０：ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  Ｃ。
【０１４４】
先に作製され、そして遺伝子をコードするＤＮＡを含むことが既知であるＰＢＭＣのｃＤＮＡを使用した。このＰＣＲ反応（９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、４２℃、３０秒及び７２℃を３０サイクル；７２℃７分間）は、Ｔａｑポリメラーゼに伴いしばしば起こるランダムエラーを減らすことを目的にいくらかの５’エンドヌクレアーゼ活性を保持した酵素カクテルであるＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼを利用した。反応は９６０塩基対（ｂｐ）の断片を増幅し、これはＴＡクローニングベクター内にクローン化され（インビトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア）、前記同様にして配列決定された。遺伝子の最終配列には２種類の動物由来のｃＤＮＡが含まれた。遺伝子の各塩基対は、個々のＰＣＲ反応に由来する、少なくとも３つの分離配列について独立に検証され、ＰＣＲにより誘導された誤りによるエラーの可能性を下げた。
【０１４５】
［結果］
実験ネコＮＫ５より抽出されたＲＮＡを、ＣＤ８０に関する初期増幅に使用したが、その後このネコは屠殺され、追加産物は別の動物で作製された。ＨＮＫのＣｏｎＡで刺激されたＰＢＭＣ  ＲＮＡを初期増幅した結果、ヒトＣＤ８０遺伝子と７０％の相同性を有する３４４ｂｐの産物を得た（図７及び８）。プライマーはＩｇＣ様ドメインに対応するコーディング配列の中央内の領域に対し特異的であった。これら初期実験ではより多くのペプチドをコードする領域を増幅するために別の変性プライマーも利用されたが、Ｂ７−２（５’）及びＢ７−３（３’）の組み合わせ以外は適当な大きさの産物を生じなかった。これら遺伝子特異的プライマーによる追加の変性プライマーを使ったその後の実験は成功しなかった。即ち、５’及び３’領域は他の方法を利用して得なければ成らなかった。
【０１４６】
初期産物から得られた配列データより、新たに６組の遺伝子特異的プライマー（Ｂ７−２０  ５’、１３５  ５’、１４０  ３’、５０  ３’、２８４  ５’、及び１９０  ５’）が作られた。まず３’プライマーを、ＣＤ２８分子の５’領域の増幅に成功した時の方法に若干類似した５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法に使用された。この方法を使用した場合、産物は得られなかった。
【０１４７】
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅システム（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）は、５’コーディング領域をコードする領域を上手く増幅した。ＣｏｎＡ刺激されたＥＫ６より得たＲＮＡはこの方法により上手く増幅された。初回増幅はＢ７−２８４及びＢ７−３、及びアンカープライマーＡＰ１により行われた。この反応は特定の１本のバンドを生じなかったため、この産物を鋳型に使ったネステッド反応を、Ｂ７−２０及びＢ７−１３５をネステッド３’プライマーに、そしてアンカープライマーＡＰ−１を５’プライマーに使用し実施した。これら反応それぞれより、適当な長さの産物が得られた（図９）。
【０１４８】
ＲＡＣＥ産物のダイレクトシークエンシングに由来する配列データは、最初に配列決定された３４４ｂｐ産物と重複する完全に同一な２０及び１３５ｂｐの領域を提供した。断片は、既知５’領域よりネコ遺伝子の５’ＡＴＧ開始コドンを通り５’非翻訳領域内に伸びた。これら産物に由来する５’コーディング配列とヒトＣＤ８０遺伝子の５’領域との間の同一性は、ネコ遺伝子の３４４ｂｐ域とヒト配列中の類似領域との間の同一性よりも低かった。同様の相同性の欠如は、同様領域内のヒト及びマウス配列間にも見いだされた。コーディング領域外に由来する配列の比較からは、更に顕著な保存性の低下が示された（データ示さず）。
【０１４９】
３’非翻訳領域をコードする変性プライマーの新しいプールを、ヒト及びマウス配列の３’ＵＴＲ内のコンセンサス域より合成した。これらプライマーは、ネコＥＤ３より得たＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより単離されたＲＮＡよりｃＤＮＡを上手く増幅した。初期増幅法とは異なり、最終産物を得るためには一連のネステッド反応を実施しなければならなかった。３４４ｂｐ断片及び５’領域内のこれら変性プライマー及びアンカープライマーを利用した一次ＰＲＣ反応は初めは明瞭な同定可能なバンドを生じなかった（図１０）。しかし、希釈された一次産物及び追加の特異的５’プライマーを用いたネステッド反応の結果、残りの３’領域をコードする産物を産生した（図１１）。
【０１５０】
３’産物の配列決定により、この場合も定常域の外側では同一性が低いことが判明した。コーディング配列の遠位端は極めて低い同一性を示したが、停止コドンの後は更に低かった。
【０１５１】
３’配列からは、ヌクレオチド９６０より始まるコーディング域外側のリバースプライマーが構築された。この構築体は開始コドンを包含するプライマーとの組み合わせると、予想通りの大きさの産物を増幅した。最終産物の配列決定は、これまでに決定された領域それぞれが実際に重複していること、またこの断片がネコＣＤ８０遺伝子の連続した完全な配列を提供することを示した（図１２）。
【０１５２】
最終産物の増幅のため、動物ＥＤ３及びＥＫ６のＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより得たＲＮＡからサンプルが増幅された。少なくとも各動物からの２産物が完全に配列決定され、少なくとも３回の正確に読みとられた配列により各配列位置のチェックと確認が行われた。次に今後の参照と作業の為に、動物ＥＫ６からの産物をＴＡクローニングベクター内にクローン化した。完全核酸配列は図８に提供されている。
【０１５３】
９６０ヌクレオチド断片は、位置１の開始コドン、ヌクレオチド８８８の停止コドン、及び３’非翻訳域の追加の７２ヌクレオチドを含む（図１３）。全断片の包含体を作製、配列決定し、追加の５’及び３’領域が配列決定された（データ示さず）。５’ＲＡＣＥ産物からの５’開始コドンの上流域の配列決定は、位置１−３のＡＴＧが最初のフレーム内メチオニン部位であること及びマウス及びヒト配列内の類似位置に合致することを示している。位置８８８に存在する停止コドンも、既に配列決定された遺伝子内の同様位置に合致した。配列のアラインメントは、公表ヒト及びマウスＣＤ８０核酸配列とそれぞれ７７％及び６２％の同一性を示した（図１４）。他の霊長類及び齧歯類配列との相同性は、それぞれヒト及びマウスに観察されたレベルと同等であった。各種のＣＤ８６遺伝子との同一性は２５％以下であった。
【０１５４】
ＭａｃＶｅｃｔｏｒＤＮＡ分析ソフトウエアー（ＩＢＩ、ロチェスター、ニューヨーク（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ））を利用し、核酸配列はアミノ酸に翻訳された。翻訳の結果、長さに関し同一ではないがマウス及びヒト両タンパク質に類似の２９２アミノ酸のペプチドが得られた（図１５）。シグナルペプチドは位置１から２５までの範囲と提言された。分子の細胞外領域は、残基１３９を通り広がる１１５塩基のＩｇＳＦ可変様ドメイン、及びおよそ残基２４０まである１００塩基のＩｇＳＦ定常様ドメインを含む。残基２４１−２７１の膜内ドメインに続き２１残基の短い細胞質テールがある。ヒト分子同様に、ネコポリペプチドはドメイン中に８個の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を含むが、その位置は同一ではない。ネコ、ヒト及びマウスペプチド間の相同性は、核酸配列に観察された同一性に比べ明らかに低かった（表１）。
【表１】
2010252804.tif 000003
【０１５５】
ネコＣＤ８０について提案されているペプチド配列と提案されている前記ヒトタンパク質とを並置することにより、２つの分子間の相同性の多くが定常領域（残基１４０−２４０）に起因することが示された。シグナル配列中のペプチド間の相同性は低く、同一性の欠如はＩｇＶ様ドメインに及んだ。既述の如く、保存性は定常ドメインを通じて強いが、この同一性は連続的なものでなく、ネコペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞内細胞質テールと、ヒト分子中の類似領域との間に相同性は殆どなかった（図１６）。
【０１５６】
ネコ、ヒト及びマウスＣＤ８０遺伝子とマウス及びヒトＣＤ８６遺伝子とのアラインメントからは、２つのＢ７ファミリーメンバーの間には限定された全体相同性のみ認められるが、Ｂ７遺伝子ファミリーの指標と考えられている残基はネコペプチドにより保持されていた（図１７）。これら分子は、折りたたみに関係すると考えられている残基、及び結合領域と言われる領域を含む。
【０１５７】
ヒト及びネコＣＤ８０配列間の相同性は、２種類のＣＤ２８分子間の同一性ほど大きくなく、提案されている親水性プロットの比較は特定アミノ酸配列内に様々な変化があるものの、これらの変化は相同的なことが多く、ペプチドの表面特性を変えない可能性を示している（図１８）。
【０１５８】
［考察］
ネコとヒト、及びネコとマウスのＣＤ８０間のヌクレオチドの同一性は中程度であるが、このヌクレオチド相同性の大きさはペプチドに翻訳されない。遺伝子コードは縮重されるものの、ある分子では（例えばＣＤ２８）ヌクレオチド配列間の差はペプチドを大きく変化させず、ＣＤ８０の全体的なアミノ酸保全性は重要ではなく、従って種を越えた分子内の進化的変化がより許容されると考えられた。
【０１５９】
核酸の全体配列は比較的低い同一性を有するが、完全長配列を得るには複雑さを伴う。初期ＣＤ８０産物は、クローン化された種のｃＤＮＡ内において高い保存性を示す領域である分子の定常域より得られた。この領域を認識し、産物を上手く増殖するプライマーは容易に作製され、良く保存されたＩｇＣ領域を含む３４４ｎｔｄの断片を生じた。残念なことに、シグナルペプチド及び細胞質ドメイン及び３’ＵＴＲ内に相同性を欠いたために、これら領域の配列の分離にはより複雑な操作が必要とされた。しかし、中央域からの配列データの存在が、残りの分子が推測できる強いアンカー点を提供した。ネコＣＤ８０は、短い分子より得て、そしてＲＡＣＥ法、及び変性プライマーと配列決定された領域からのアンカープライマーとを組み合わせ利用することにより、全長配列が容易に得ることができるかの好例である。
【０１６０】
これらクローン化されたＣＤ８０分子の推定アミノ酸配列の比較からは、全体的な相同性が無いことが示された。マウス及びヒトポリペプチドは、アミノ酸レベルにおいて５０％以下の相同性を示した。この値は、ネコとヒト間の同一性５９％、及びネコとマウスポリペプチド間の同一性４６％に匹敵するものであり、種の進化的近接性を反映するだろう。その相対的親水性に基づき露出、又は埋没の可能性のあるアミノ酸を示す、ネコ及びヒト残基の推定親水性の比較からは、アミノ酸レベルではあるが特定アミノ酸が保持されないらしいこと、及び変化が比較的保存されていることが示された。このことは、分子の親水性／疎水性の特性が保持されているる可能性を示しており、従って全体として構造的に類似のポリペプチドを反映するだろう。表面タンパク質は、結合に直接関与する特定のアミノ酸、及び結合領域との相互作用を可能にする構造の保持にのみ必要な他の構造アミノ酸を有すると考えられている。
【０１６１】
霊長類、齧歯類及びネコ種からのＣＤ８０分子内のアミノ酸残基同一性には幅があるものの、ＩｇＳＦの特徴は保持されている。ネコＣＤ８０分子はアミノ末端のＩｇＣ様ドメイン、及び膜結合域に隣接したＩｇＶ様ドメインを含む。マウスとヒトＣＤ８０間の保存性同様に、同一性は可変域に比べると定常域ではるかに高くなる（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。全体として、可変域の保存性は５０％を越える程度であるが、定常域では７０％を越え、残基１６４−１９８の短い範囲（最初の３４４ｎｔｄ断片を得た領域）ではそれ以上の同一性を示す。定常域内の５６アミノ酸の中心域（残基１６５−２１１）はヒトとネコ配列の間で８７％の相同性を示し、２８アミノ酸（残基１７１−１９８）の突出域では差は１個のみである。ネコの領域も、マウスポリペプチド内の対応残基に対し高い相同性を示す。この領域内のアミノ酸の親水性の特性は、表面への発現の可能性が高いこと、及び、種間での保存のレベル故に、リガンド／受容体相互作用に関与していることを示している。該分子のＩｇＣ部分はレセプターリガンド相互作用に関する結合ドメインの提示に直接関係している（Ｐｅａｃｈら、１９９５）。しかし、可変及び定常モチーフの何れもが効果的な結合に必要であることが実験的に示されている（Ｐｅａｃｈら、１９９５）。細胞外ドメイン中のＩｇＣ領域に相同残基が集中することは、膜貫通及び細胞質ドメイン内に於いて大きなバラツキがあることと併せ、ＣＤ８０の役割がシグナル伝達能ではなくリガンドであることをさらに確認する。
【０１６２】
ヒト及びマウスＣＤ８０同様に、ネコ分子も高度にグリコシル化されている。炭水化物残基は結合に直接関与しないと考えられているが、分子の細胞外タンパク質の溶解性の増加を助けるだろう（Ｐｅａｃｈら、１９９５）。ヒトペプチド内に見いだされる８ヶ所の潜在部位の内、７ヶ所はネコタンパク質でも同一位置に局在する。ネコ分子中アミノ酸残基３９に位置する部位は、ヒトＣＤ８０には見つからないが、ネコタンパク質には見いだされない残基２３２に部位がある（Ｆｒｅｅｄｍａｎら、１９８７）。マウスでは同一位置である２ヶ所を含む７ヶ所の部位が発見されているが、これらは一般にネコ及びヒトのペプチドと同一分子域に存在している（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９）。グリコシル化部位の数と位置が保持されることは、分子機能に於けるモチーフの重要性を反映するものと考えられる。
【０１６３】
様々なネコＣＤ８０の潜在的応用がある。既に考察したように、分子は成熟Ｔ細胞反応の適切な発生にとって重要である。ＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方にて遺伝子の発現をモニタリングすることは、ネコ免疫システムが感染を処理している方法の確立に役立つ。他のモデルシステムの研究より得た観察と組み合わせることで、このシステムが特異的病原を処理する方法はヒト免疫反応について更に深い考察を提供するだろう。さらに重要なペット動物と同様に、ネコシステムが有益に操作される方法の洞察は高い任意選択性を持つ動物薬を提供するだろう。
【０１６４】
他の種に於いて提言されているＣＤ８０分子に関するその他重要な応用は、宿主内への再導入によるＣＴＬをベースとした腫瘍免疫の惹起を含む、形質導入細胞へのＣＤ８０遺伝子導入による腫瘍特異免疫の誘導である（ＴｏｗｎｓｅｎｄとＡｌｌｉｓｏｎ、１９９３）。上記考察のごとく、腫瘍細胞によるＣＤ８０の表面発現の結果として悪性疾患に対し特異的ＣＴＬ反応が生ずる（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。更に、ＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリー集団が宿主内に確立される（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。この技術は腫瘍免疫に関するものであるが、そのアナロジーより抗ウイルス免疫の確立にも応用できるだろう。
【０１６５】
前記考察の様に、後天性免疫不全症候群に於ける長期の無進行は、強い抗−ＨＩＶ  ＣＴＬ反応の初期確立を介すると考えられている（Ｌａｎｄａｙら、１９９４）。感染後長期にわたり無症候状態を維持できる個体は、ウイルスに対する強力なＣＴＬ反応を発生し、維持できるだろう。
【０１６６】
従来のワクチンは液性反応の確立を目的とするものであるが、ワクチンが抗−ＨＩＶ／ＦＩＶ  ｍＣＴＬ集団の発生を誘導できれば、この集団は長期無進行者に見られるものに類似の防御を提供するだろう。ナイーブな個体では、ＦＩＶタンパク質にＣＤ８０ペプチドを組み合わせた遺伝子ベースのワクチンの導入はＦＩＶエピトープのＭＨＣ  ＣＩ提示と組合わさった補助刺激分子の表面発現を生じるだろう。上手くいけば、これによりナイーブ個体の中にＦＩＶ特異的ｍＣＴＬ集団の拡大がもたらされる。続いて有毒性ウイルスに暴露されると、ワクチン投与された個体はプライムされウイルスに感染した細胞に対する免疫反応が出現し、ウイルスがそれ自体を確立し、免疫システムの成分の破壊を開始する前にそれらを排除する。
【０１６７】
［例６］
［ネコＣＤ２８ｃＤＮＡのクローニングと配列決定］
［序］
ＣＤ２８は、同一のジスルフィド結合された４４ｋＤａサブユニットより構成されるホモダイマーとして通常発現される表面糖タンパク質である。それは免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、単一の細胞外Ｖ領域、膜貫通ドメイン及び短い細胞内テールにより特徴付けられている（ＡｒｕｆｆｏとＳｅｅｄ、１９８７）。分子は糖化されているものの、成分は結合には役割を持たず、細胞外ドメインの可溶性を増すと仮定されている（Ｐｅａｃｈら、１９９４）。ヒト、ラット、マウス及びウサギペプチド、及びニワトリの類似タンパク質をコードするｃＤＮＡがクローン化され、配列決定されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。
【０１６８】
ＣＤ２８は大部分のＣＤ４＋ＣＤ８＋リンパ細胞、及び末梢のＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞に認められ、αντＬ−ｘ△３、ＰＨＡ及びＰＭＡ刺激により、発現は増加し、抗ＣＤ２８の結合により抑制される（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ｂ）。その発見直後には、ＣＤ２８がＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化制御に重要な役割を果たすことが発見された（Ｊｕｎｅら、１９９０）。Ｔ細胞活性化及び増殖の促進に加え、更にこの２次シグナルの提供はＣＴＬでの細胞融解活性の誘導に作用することも示された（Ａｚｕｍａら、１９９３ｃ）。
【０１６９】
ＣＤ２８はＴ細胞の成熟において初期に発現される。未熟ＣＤ３−細胞は通常ＣＤ２８−であり、中間型ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞は低レベルで発現し、そしてＣＤ４＋又はＣＤ８＋、ＣＤ３＋胸腺細胞は高レベルでＣＤ２８を発現する（Ｔｕｒｋａら、１９９１）。成熟後、ヒトではは殆ど全てのＣＤ４＋及び半数以上のＣＤ８＋Ｔ細胞に（Ｔｕｒｋａら、１９９１）、そしてマウスＴ細胞でもほぼ１００％にレセプターが見いだされる（Ｊｕｎｅら、１９９０）。分子は細胞表面に一定レベルでは発現されない（Ｔｕｒｋａら、１９９０）Ｔ細胞活性化後に表面の発現は増加するが、活性化された細胞ではそのリガンド又は特異的ｍＡｂによる分子結合は、ｍＲＮＡ及びタンパク質両方のレベルでの遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ａ）。多くはＣＤ２８はＴ細胞系リンパ細胞に発見されているが、骨髄生検からの形質細胞種上にも報告されており（Ｋｏｚｂｅｒら、１９８７）、ナチュラルキラー様白血病細胞株の培養でも発現される（Ａｚｕｍａら、１９９２）。
【０１７０】
ＣＤ２８は他のＢ７レセプターであるＣＴＬＡ−４とある程度の構造相同性を有しており、両者はＩｇＳＦグループ内のサブファミリーに分類されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。この２つの分子は細胞外ＩｇＶ領域、単一膜内ドメイン、及び短い細胞質シグナル伝達ドメインを持つ（Ａｒｕｆｆｏら、１９８７）。２つの分子間の全体的相同性は約３１％に過ぎないが、２分子間には完全に保存された短い領域及び特異的残基があり、Ｂ７認識と構造上の完全性に於いてこれらモチーフが重要な役割を果たしている可能性を反映している（ＬｅｕｎｇとＬｉｎｓｌｅｙ、１９９４）。６残基域であるＭＹＰＰＰＹモチーフは、分離されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバー全てに保持されている（Ｐｅａｃｈら、１９９４）。これは分子内のＣＤ３−様ループ域にマップされ、変異により変更されるとＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に対する結合力が低下する（Ｐｅａｃｈら、１９９４）。この領域はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４タンパク質上での潜在的リガンド結合部位と言われているが、この領域がＢ７に対する実際の結合部位であるか、又は結合の発生にとって間接的に必要とされる構造モチーフであるかは決定されれていない（Ｐｅａｃｈら、１９９４）。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の間には保存残基が共有されているが、ＣＴＬＡ−４はＣＤ２８に比べるとより強い結合力でＣＤ８０及びＣＤ８６の両方に結合する（Ｅｌｌｉｓら、１９９６）。即ち、ＣＴＬＡ−４は活性化Ｔ細胞上ＣＤ２８レベルの２−３％でしか発現していないが、イン・ビトロでは２０倍強い結合力で結合する（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ｂ）。
【０１７１】
ＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８分子は進化的に関連し、共通リガンドを共有するが、機能及びシグナル伝達能は関連しないと考えられている（Ｂａｌａｚａｎｏら、１９９２）。各分子のシングナル伝達領域を比較しても高い同一性はみとめられず、分子毎に異なるシグナル伝達経路が開始されることが示唆されている（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９６）。
【０１７２】
ＣＤ２８は休止状態のＴ細胞に発現し、活性化に反応しまずアップレギュレーションされが、ＣＴＬＡ−４の発現は活性化４８時間後にピークを形成し、活性化後９６時間までにベースラインのレベルに戻る（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９２ａ）。ＣＴＬＡ−４の発現はＣＤ２８のダウンレギュレーションに対応すると考えられる（Ｌｉｎｄｓｔｅｎら、１９９３）。更に、ＣＤ２８分子のリガンド結合を通じ伝達されるシグナル経路はＣＴＬＡ−４の発現のアップレギュレーションにおいて重要と思われる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ａ）。ＣＤ２８−であるＴ細胞は、ＰＭＡ又はカルシウムイオノフォアーによる刺激に対する反応では、ＣＴＬＡ−４を顕著に発現しない（Ｌｉｎｄｓｔｅｎら、１９９３）。
【０１７３】
あるカスケードは仮定されているものの（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９６）、ＣＤ２８が介在するシグナル伝達事象の完全な順序はまだ決まってはいない。ＣＤ２８のシグナル伝達は細胞内Ｃａ＋の移動、フォスフォ−イノシタイドの代謝とタンパク質チロシンリン酸化の導入を含むことが示唆されている（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９６）。
【０１７４】
ＣＤ２８分子の細胞質テールは、ＣＤ８０又はＣＤ８６により交叉結合された後の細胞内シグナル伝達に関与すると考えられている（Ｊｕｎｅら、１９９４）。４１個のアミノ酸よりなる細胞質内領域には酵素活性は認められず、細胞内チロシン活性化モチーフ（ＴＣＲの様な）も、Ｓｒｃファミリー細胞質チロシンキナーゼの結合に関するシステイン残基も含まれていない（Ｊｕｎｅら、１９９４）。しかし、分離された配列内には複数の潜在的リン酸化部位が保存されている（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９６）。ＣＤ２８による活性に関係する酵素は明らかにされていないが、細胞内酵素活性及びタンパク質−タンパク質相互作用は差別的タンパク質リン酸化により制御されていることが多い（Ｌｕら、１９９２）。細胞質内テールに存在するコンセンサス部位、ＹＭＸＭはＳｒｃ相同性２フォスフォ−チロシン−結合ドメイン（ＳＨ２ドメイン）依存性フォスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）結合の部位として提案されている（Ｐｒａｓａｄら、１９９５）。これはＣＤ２８に関する考え得る１つのシグナル経路であるが、ＰＩ３キナーゼの活性がＩＬ−２活性に相関しないことが示されており、そしてＩＬ−２産生の増加がＣＤ２８シグナル伝達の一次コンセンサスであることを考えると、細胞内シグナル伝達に由来する活性化には別の経路があると思われる（Ｊｕｎｅら、１９９４）。
【０１７５】
これら事象の役割は完全には理解されていないが、ＣＤ２８の共刺激はＴ細胞によるサイトカインの産生を増加させる。抗ＣＤ３又はＰＨＡにより活性化されたＣＤ２８＋Ｔ細胞では、抗−ＣＤ２８はＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、リンフォトキシン、ＩＦＮγ、及び顆粒細胞−単核細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）並を含む一連のサイトカイン及びＩＬ−２レセプターの定常ＲＮＡレベルを増加する（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９６）。定常状態のｍＲＮＡの増加は、転写体の安定化と転写の増加に拠る（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９６）。
【０１７６】
ＣＤ２８共刺激はＣＤ４＋Ｔ細胞クローンでまず報告された（Ｍａｒｔｉｎら、１９８６）が、現在ＣＤ２８は多くのタイプの細胞の活性化に役割を持つことが知られている。この経路の共刺激は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のサブポピュレーションではＩＦＮγの産生、Ｔｈ１型サイトカイン及びＩＬ−４の産生、Ｔｈ２型サイトカインを制御することが示されている（Ｓｅｄｅｒら、１９９４）。ＣＤ２８の共刺激経路はＣＤ８＋ＣＴＬの活性化にとっても重要であるが、ＣＴＬ介在殺滅のエフェクター期にとっては必要とは考えられていない（Ｈｏｄｇｅら、１９９４）。興味深いことに、ＣＤ２８はＨＩＶ感染でも役割を持っている。ウイルス陽性の複数の個体より培養されたリンパ細胞では、モノクローナル抗体によるＣＤ２８の結合はＨＩＶ産生の増加をもたらした（Ａｓｊｏら、１９９３）。
【０１７７】
霊長類及び齧歯類では、ＣＤ８０とＣＤ２８との結合により供給される２次シグナルはＴ細胞の初期活性化の中に明らかに大きな役割を果たしている（ＡｒｕｆｆｏとＳｅｅｄ、１９８７）。しかし最近のデータは、相互作用の主な影響はアポトーシスの発生を防ぐととで増殖を持続させるここであると示唆している（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９６）。増殖のＧ０期にある休止Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体の形成を通じて活性化できるが、ＣＤ２８交叉結合無しには増殖及びＩＬ−２の分泌はできず、いわゆるクローン性の無力化状態になる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）。成熟Ｔ細胞は、ＴＣＲとＡＰＣ上のＭＨＣとの結合を通じてのみ活性化できるが、時にこれはアポトーシスによる活性化誘導細胞死を誘導する（Ｒａｄｖａｎｉら、１９９６）。他の二次的相互作用（即ち、ＩＣＡＭ−１共刺激）も補助的増殖シグナルを提供できるが、ＣＤ２８が伝達する共刺激はクローン性無力化及びアポトーシスの継続発生を阻止する上で特異的である（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ａ）。ＣＤ２８は、アポトーシスからのＴ−リンパ細胞防御に於いて重要な役割を果たすことが知られている制御遺伝子について、重要な役割を担っている（Ｂｏｉｓｅら、１９９５）。ｂｃｌ−ｘξ発現の持続的増加が、ＣＤ２８交叉結合により刺激されたＴ細胞について観察されている（Ｂｏｉｓｅら、１９９５）。ＣＤ２８共刺激はアポトーシスの発生を阻止する、コードされたポリペプチドの発現によりｂｃｌ−ｘξｍＲＮＡの安定化に作用するだろう（Ｒａｄｖａｎｙｉら、１９９６）。
【０１７８】
各種ヘルパーＴ１型及び２型サイトカインの産生の促進について、ＣＤ２８の結合が役割を持つことが示されている（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９６）。又、この相互作用は特異的ヘルパーＴサブセットの発生にも役割を持つと考えられている。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８／ＣＤ８０伝達シグナルが無い場合には、通常Ｔｈ１表現形を発生するだろう（Ｌｅｎｓｈｏｗら、１９９６）。これはＩＬ−２が外来性に添加されたことにより誘導されるＩＬ−４産生の間接的役割であり、ＩＬ−２産生に於けるＣＤ２８シグナル伝達の役割は常に考察されている（Ｓｅｄｅｒら、１９９４）。ＣＤ２８ノックアウトマウスを含むその他の研究からも、Ｔｈ２細胞の発生に於けるレセプターの役割は支持されている。
【０１７９】
ＣＤ２８由来２次シグナル無しの状態での感染に動物がどう適応するかを調べる目的で、ＣＤ２８＋／−マウスがＳｈａｎｉｎｉａと共同研究者により作られた（Ｓｈａｈｉｎｉａｎら、１９９３）。第２エクソンをネオマイシン耐性遺伝子により部分弛緩することで、胚性幹細胞中に遺伝子は破壊された（Ｓｈａｈｉｎｉａｎら、１９９３）。ノックアウトについてホモ接合体であるマウスのＰＢＭＣは、そのＴ細胞上にＣＤ２８を発現しないが、ヘテロ接合体ＣＤ２８−／＋は低下した分子表面発現を有することが見いだされている（Ｓｈａｈｉｎｉａｎら、１９９３）。ＣＤ２８−／＋マウス由来のＴ細胞のマイトジェン刺激はＴ細胞増殖と、外来性ＩＬ−２によって部分的にのみ回復されるサイトカインの産出を減少させた。高度に精製されたＴ細胞はＡＰＣが存在しない状態ではレクチンにより活性化されないことが示されている（Ｕｎａｎｕｅ、１９８４）。このノックアウト株を使い、ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用がＴ細胞レクチンのマイトジェン活性に必要であることが示された（Ｓｈａｎｉｎｉａｎら、１９９３）。相互作用は抗原に対する反応に於けるＢ細胞によるイディオタイプのスイッチの伝達に於いても重要であることが見いだされている（Ｓｈａｈｉｎｉａｎら、１９９３）。ＣＤ８０ノックアウトとは異なり、ＣＤ２８に関し提示された役割については遺伝子ノックアウト技術により決定できた。ＣＴＬＡ−４ノックアウトマウスはまだ報告されていないが、ＣＴＬＡ−４  Ｉｇを過剰発現するトランスジェニックマウスが研究されている（Ｌａｎｅら、１９９４）。予想通り、この株はＣＤ２８欠失株に似た幾つかの特徴を有している（Ｌａｎｅら、１９９４）。分離されたＴ細胞は正常な量のＩＦＮγを産生し、刺激により産生されるＩＬ−４の量は明らかに少なかった（Ｒｏｎｃｈｅｓｅら、１９９４）。これによりＢ細胞は適切な液性反応を発生、又は維持できなくなる（Ｒｏｎｃｈｅｓｅら、１９９４）。Ｔｈ１及びＴｈ２分化について提示されている多くの経路を通して、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用はＴ細胞サブセットの分化に大きな影響を与える。
【０１８０】
インターロイキン−２ｍＲＮＡの安定化はＣＤ２８交叉結合の重要な機能ではあるが、この相互作用により多くの他のサイトカインも直接又は間接的に影響を受けることが示されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）。炎症メディエイターであるＩＬ−１α、ＩＬ−６及びＴＮＦαはＣＤ２８シグナル伝達に反応してメモリＴ細胞手段内に産生されるが、ナイーブ集団ではＩＬ−１αのみ産生される（Ｇｅｒｄａｎら、１９９１；ｖａｎ  Ｋｏｏｔｅｎら、１９９１）。ＩＬ−４発現もＣＤ２８シグナル伝達経路により制御を受けている（Ｓｅｄｅｒら、１９９４）。他の重要な液性反応のメディエイターであるＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３も相互作用によりアップレギュレーションされている（ｄｅＷａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔら、１９９３、Ｍｉｎｔｙら、１９９３）。更にＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１及びＩＬ−３を含むコロニー刺激及び増殖因子及びＩＬ−８を含む化学誘引因子も全てＣＤ２８により供給されるシグナルによりアップレギュレーションされる（Ｈａｒｌａｎら、１９９５）。
【０１８１】
癌免疫の誘導に於けるＣＤ８０の応用の可能性についてはこれまでも考察されてきたが、ＣＤ２８及びＣＤ８０に関しては他の様々な臨床利用にちても提言されている。齧歯類のモデルシステムは、ＣＤ２８とＣＤ８０間の相互作用を阻止すると、幾つかの自己免疫疾患の予防又は治療を、臓器拒絶又は移植体対宿主病の発生の予防を、そして敗血症に伴うサイトカイン放出の阻止を促進することが示されている（Ｈａｒｌａｎら、１９９５；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、１９９３；Ｔｈｏｍａｓら、１９９４；Ｚｈｏｕら、１９９４）。マウスではＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用を阻止するためのＣＴＬＡ−４  Ｉｇの添加は、ＮＺＢ／ＮＺＷマウスに於けるループス用症状を防止し、ラットに於いては致死的ＥＡＥ及び致死的腎臓炎を部分的に予防した（Ｈａｒｌａｎら、１９９５）。ヒトに於ける自己免疫疾患についてはこの様式の免疫治療は試みられていないが、ヒトについては乾癬及びリューマチ性関節炎に於いて、それら生検がＣＤ８０の発現を示すのに対し正常生検にはこの発現が存在しないことが示されている（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆら、１９９３；Ｔｈｏｍａｓら、１９９４）。マウスでの骨髄及び臓器移植体、及びイン・ビトロでのヒト実験では、ＣＴＬＡ−４  Ｉｇの添加及びＣＤ２８／Ｂ７相互作用の阻止により、臓器拒絶からの少なくとも部分的な保護、ＧＶＨＤの防止、又は抗原特異的寛容性の導入が誘導できる（Ｈａｒｌａｎら、１９９５）。また、最終的には、イン・ビボでのＣＴＬＡ−４投与によりマウスではサイトカインの放出、及び敗血症性のショック又は敗血症につながる敗血症の発症が防止できる（Ｚｈｏｕら、１９９４）。ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用の操作は、Ｔ細胞共刺激のより完全な理解を提供し、様々な問題の解決法確立に見識を提供する。
【０１８２】
［材料と方法］
［ＣＤ２８の初期断片の単離］
ｍＲＮＡは、１６時間ＣｏｎＡにて刺激したＨＫ５の末梢血リンパ細胞より、ＲＮＡｚｏｌＢ  ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、ヒューストン、テキサス（Ｂｉｏｔｅｘｃ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ））を用い抽出された。まずこのＲＮＡより、３’プライマーとしてオリゴｄＴを使った逆転写（ＲＴ）反応によりｃＤＮＡを得た。要約すると、ＲＮＡ及びオリゴｄＴを７５度で３分間加熱し、２次構造を除いた。次にＲＴ、ｄＮＴＰ、緩衝液及び蒸留水を加え、混合液を１時間４２℃にてインキュベーションした。このインキュベーション後、サンプルを９５℃にて５分間加熱し、ＲＴを失活させた。次に、ヒト、マウス及びウサギのＣＤ２８の公開核酸配列（ジーンバンク、ガイサーブルグ、マサチューセッツ（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ））内のコンセンサス域より得た変性プライマーを使い、オープンリーディングフレームの大部分をコードする６７３ｎｔｄの断片の初期増幅をおこなった。
【０１８３】
ＣＤ２８−１１３：ＣＡＡ  ＣＣＴ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ
ＣＤ２８−７６８：ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＧＧ。
【０１８４】
Ｔａｑポリメラーゼを利用するホットスタートＰＣＲプロトコールを使い、産物を増幅した（９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒間、４８℃、３０秒間及び７２℃、４５秒間、３０サイクル；７２℃７分間、１サイクル）。次に前述同様に、断片を１％アガロースゲル上にて視認し、ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン、サンジェゴ、カリフォルニア）に連結、配列決定した。ｃＤＮＡの配列より、ｃＤＮＡ端の５’ＲＡＣＥ反応の使用に適した特異的３’プライマーを構築した。
【０１８５】
ＣＤ２８１９０：ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  Ｃ
ＣＤ２８  ２３９：ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＴＣＣ。
【０１８６】
［５’領域の単離］
改良型ギブコ社製５’ＲＡＣＥプロトコール（ギブコＢＲＬ、ガイサーブルグ、メリーランド）を使い、ネコＣＤ２８分子の残りの５’配列を得た。ＲＮＡは１６時間のＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより抽出される。第１鎖ｃＤＮＡ合成には３’遺伝子特異的プライマーを使用した。ＲＮＡ及びプライマーは、その他のＲＴ試薬を加える前に７５℃にて５分間加熱された。変性後、混合液を４℃まで冷却し、反応緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＲＴ（ギブコＢＲＬ、ガイサーブルグ、メリーランド）を加えた。ＲＴ混合液を４２℃にて３０分間インキュベーションし、続いて７０℃で１５分間加熱しＲＴを変性した。次にＲＮａｓｅカクテルを加え、反応液を５５℃にて１０分間インキュベーションし、残ったＲＮＡを除き誤ったターミナルトランスレラーゼ（ＴｄＴ）伸長を阻止した。続いてｃＤＮＡをＧｌａｓｓＭａｘ（ギブコＢＲＬ、ガイサーブルグ、メリーランド）スピンカラムにかけ精製し、取り込まれていないｄＮＴＰ及びプライマーを除いた。次に、カラムより溶出された精製ｃＤＮＡにＴｄＴを接続した。ＴｄＴを使い、ｃＤＮＡに２０−３０ヌクレオチドのｄＣテールを加えた。ｃＤＮＡを９５℃にて３分間変性した後、精製されたｃＤＮＡ、塩化マグネシウム、反応緩衝液及びｄＣＴＰの混合液に、酵素を加えた。反応液を３７℃、１０分間インキュベーションし、続いて酵素を７０℃で更に１０分間加熱し、不活性化した。テールの付いたｃＤＮＡをＴａｑポリメラーゼをベースとしたホットスタートＰＣＲ反応で増幅した（９５℃、５分間；９５℃、３０秒間、５５℃、３０秒間及び７２℃、４５秒間、３５サイクル；７２℃、７分間）。この反応のプライマーは、ｃＤＮＡ合成プライマーの５’に位置する３’プライマー、及びｄＣリンカに対し特異的であり、僅かなｄＩ残基を含み大部分がｄＧであるアンカープライマーを含む。この反応液１μｌを５０μｌの水で希釈し、この希釈液５μｌを使い、ｄＧ／ｄＩ５’アンカープライマー及びその他の上流遺伝子特異的３’プライマーを使ったネステッドＰＣＲ反応を行った（ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックスを利用し、９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、５５℃、３０秒及び７２℃、４５秒を３０サイクル）。
【０１８７】
次に、ネステッド反応液３０μｌを１．５％アガロースゲル上で視覚化し、適当な断片をゲルより切り出した（図１９）。ｃＤＮＡを前記同様にしてＡｍｉｃｏｎゲルネブライザーとマイクロピュアフィルター（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｒｅｒｌｙ，ＭＡ）を使い精製した。精製ｃＤＮＡは、色素ターミネーターサイクルシークエンシング（パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット）を用い配列決定した。完成した断片より、コンセンサス配列を得た。配列よりネコＣＤ２８遺伝子の全オープンリーディングフレームを包含するプライマーペアを構築した。
【０１８８】
ｆｅＣＤ２８  ５’：ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＧ
ｆｅＣＤ２８  ３’：ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  Ｇ。
【０１８９】
これらプライマーを利用し、全コーディング域を含むｃＤＮＡ分子を、ＣｏｎＡ刺激したＥＫ６およびＥＤ３  ＰＢＭＣ由来ｃＤＮＡより増幅した。このＰＢＭＣ  ｃＤＮＡは前の作製され、遺伝子をコードするＲＮＡを含むことが示されている。このＴａｑポリメラーゼに伴いしばしば起こるランダムエラーを少なくすることを期待し行われたＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼを利用したＰＣＲ反応（９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、４２℃、３０秒及び７２℃、４５秒を３０サイクル；７２℃、７分間）は７５４ｂｐの断片を生じ、これはＴＡクローニングベクター内にクローン化され、前記同様に配列決定された。ＣＤ８０分子同様に、各ヌクレオチドの位置は少なくとも独立に得られた３配列によって確認された。
【０１９０】
［結果］
マウス、ヒト及びウサギＣＤ２８のｃＤＮＡ配列内のコンセンサス域より選択された変性プライマーがＰＣＲ反応に使用され、ネココーディング配列の殆ど全てを包含する産物を得た。ＣＤ２８分子に見られる高い保存性により、変性プライマーを使用した初期増幅は実際に全体分子を産生した。最初に短い中央部の断片のみが作られたネコＣＤ８０分子とは逆に、ＣＤ２８ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームからは最も５’側にある１１３ｎｔｄのみが失われていた（図２０）。この配列初期断片は、ヒト配列内の同類域と８６％の相同性を有し、ウサギｃＤＮＡとは８６％の同一性を、そしてマウスコーディング配列とは７９％の相同性を有していた。
【０１９１】
５’ＡＴＧ及びその他の１１０ｎｔｄ、並びに幾つかの上流５’配列が、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ（ギブコ、ガイサーブルグ、メリーランド）を利用し単離された。テーリング反応にはＥＫ６ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより転写されたｃＤＮＡが利用された。この材料を使い、プライマーＣＤ２８−７８６及びアンカープライマーｄＧによる増幅の結果極僅かな特定可能な物質を得た（図２１）。
【０１９２】
同定可能なバンドはプライマーの組み合わせｄＧ／ＣＤ−７８６により増幅されたが、その反応液からの希釈ｃＤＮＡはネステッドＣＤ２８プライマーであるＣＤ２８−１８２及びＣＤ２８−２３９を使い増幅された。視認可能なバンドが約６００ｐｂの位置に存在した。この産物をアガロースゲルより分離し、配列決定したところ、開始コドンを含み、かつ連続する５’上流の配列を含んでいた（図２２）。
【０１９３】
これら産物の配列より、開始コドンを含む５’プライマーを得た。このプライマーは、３’構築体と組み合わせ使用し、ＥＫ６及びＥＤ３のＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを増幅し、７５４ｂｐの産物を得た（図２３）。
【０１９４】
各動物ついて少なくとも２産物を完全に配列決定し、各ヌクレオチド部位は独立に正確に読みとられた３配列により確認された。配列決定後、完全長の産物をＴＡクローニングベクターより配列決定し、産物が安定かつ再現性あるものであることを確認した。
【０１９５】
全オープンリーディングフレームをコードする最終の６８５ｂｐ断片内では、５’ＴＡＧは位置１に位置し、停止コドンは位置６６４−６６に位置し、更に１９ヌクレオチドが３’ＵＴＲ内に存在していた（図２４）。ｆｅＣＤ８０分子同様、ＡＴＧコドンの５’位置は、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物の配列決定により確認された（データ示さず）
配列決定したところ、ネコＣＤ２８遺伝子はウサギ及びヒト配列と極めて近く、全体的な同一性を示した（図２５）。マウスｃＤＮＡとの相同性も高かったが、ニワトリ配列との同一性には、ウサギ配列と他の哺乳動物遺伝子間の変動と同程度の変動があった。
【表２】
2010252804.tif 000004
【０１９６】
アミノ酸ペプチド配列は前記同様にして核酸配列より得られた。他の公開遺伝子より得られたアミノ酸配列との同一性は、ヌクレオチドレベルの同一性と同等であった。ペプチドのシグナル配列は５’メチオニンから残基１９までの範囲であった。ネコ分子では、他のクローン化ＣＤ２８ポリペプチド同様に、残基１９−１５３の範囲に単一の細胞外ＩｇＳＦ可変様ドメインがあると考えられた。疎水性の膜内ドメインは続く２７残基の範囲であり、そしてそれに４１アミノ酸の細胞質テールが続く。ヒトＣＤ２８分子同様に、ネコポリペプチドも５ヶ所の潜在的Ｎ−結合糖化部位を持っている（図２６）。
【０１９７】
ネコ及びヒトＣＤ２８タンパク質の推定アミノ酸配列の比較は、相同域にも幾つかの違いがあることを示した（図２７）。変化の多くは膜貫通ドメイン及びシグナル配列、そしてＮＨ３末端ドメインに認められた。最も高い相同性は、中央部のＩｇＳＦ  Ｖ−様ドメインと細胞質テール内に認められた。
【０１９８】
ネコＣＤ２８分子とＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４のヒト及びマウスメンバーの推定アミノ酸配列との比較からは、このグループのメンバー間の全体相同性は２５％に過ぎないが、特定領域及び残基は維持されていることが示された。ＭＹＰＰＰＹモチールはこのグループの全てのメンバーで維持されていた。ネコ分子内には、多くの保存システイン残基を含む構造保全に取って重要と思われる残基も保持されていると考えられた（図２８）。
【０１９９】
ネコＣＤ２８分子の細胞質ドメインは、他の公開配列、特に哺乳動物の配列に比べ緩やかに保存されていた（図２９）。レセプターの細胞外部分の交叉結合の結果、様々な細胞内シグナル伝達経路が伝達されると考えられている（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９５）。
【０２００】
ネコＣＤ２８の推定アミノ酸配列の親水性プロットは、ヒトポリペプチドの同様のプロットと比べると、それぞれのタンパク質が同様の構造上の完全性を保持している可能性を示した。しかし、アミノ酸配列内に変化が起こっている場合でも分子の親水性には大きな変化は起こっておらず、従ってアミノ酸配列内の変化は大部分が相同的であると考えられる。ネコ及びヒトペプチドの相同性が７５％に過ぎない疎水性膜内ドメインでさえ極めて似た親水性プロフィールを有することは注目に値する（図３０）。
【０２０１】
［考察］
クローン化ＣＤ２８分子の配列は全て、進化的に中程度に保存されていることを示した。Ｔ細胞伝達免疫の活性化及び伝達に於ける分子の役割は、より高等な様々な脊椎動物、フクロウから齧歯類、肉食動物、そしてより高等な霊長類でも保持されていると考えられている。
【０２０２】
それぞれの分子の推定アミノ酸配列を比較すると、リガンド結合に関係すると考えられている細胞外ドメイン、及び細胞内シグナル伝達の促進に関係すると考えられている細胞内領域では相同性は中度である。全体としては、ネコポリペプチド中の残基１１８−１２３からのＩｇＶドメイン内に存在する、リガンド結合部位、ＭＵＰＰＰＹの周辺領域で最も相同性は高い。
【０２０３】
ペプチドのシグナル配列と思われる領域は、５’メチオニンから残基１９までである（Ａｒｕｆｆｏら、１９８７）。単量体のＣＤ２８が、残基１９−１５３の範囲にある単一細胞外ＩｇＳＰ可変域−様ドメインの中に含まれている（Ａｒｕｆｆｏら、１９８７）。疎水性の膜内ドメインは続く２７残基の範囲であり、これに４１アミノ酸よりなる細胞質テールが続く（Ａｒｕｆｆｏら、１９８７）。ネコタンパク質は、５ヶ所の潜在的Ｎ−結合糖化部位をヒトタンパク質に見られる場合と同一位置に持っている。興味深いことに、ネコタンパク質の残基１０５にある糖化部位はＮＱＳであるが、ヒトではＮＱＴである。このアミノ酸の変動は、分子間には配列の変化はあるものの全体構造の特徴は保持されていることを反映している。
【０２０４】
タンパク質に認められる相同性のレベルから推測される様に、ネコ及びヒトのＣＤ２８の親水性プロットの比較からは分子が部分的に似た立体構造のパターンを持つことが示された。しかし、それは残基が変化する場合、その変化が一般的に相同的であることも意味している。
【０２０５】
膜貫通ドメインは最も低い保存性を持つ分子域であり、求められる親水性の特性を単純に保持し、ｆｅＣＤ２８分子の細胞質ドメインは他の公表配列を中程度に保存している。レセプターの細胞外部分の交叉結合を介して様々な細胞内シグナル伝達経路が伝達されると考えられており、ＣＤ２８ポリペプチドの細胞内部分には本質的な酵素活性はないが、リガンド結合により細胞内エフェクター分子の活性化をもたらす（Ａｒｕｆｆｏら、１９８７）。チロシンリン酸化の潜在部位として４ヶ所の保存されたチロシン残基（Ｙ１７３、Ｙ１８８、Ｙ１９１及びＹ２００）がある（Ｌｕら、１９９２）。更に、ネコ分子の残基１９３より始まるＭＮＭ配列は、ヒト及びマウスタンパク質に於けるＳＨ２ドメイン部位であると言われている（Ｐｒａｓａｄら、１９９５）。プロテインキナーゼＣによりリン酸化される潜在部位はＳ１８５に保持されており、一方セリン／スレオニンキナーゼ活性に対するＥｒｋ１又はＥｒｋ２プロリンはＴ２０２と考えられている（ＨｕｔｃｈｃｒｏｆｔとＢｉｅｒｅｒ、１９９６）。既に考察した様に、ＣＤ２８レセプターのシグナル伝達機能は多面的であり、従ってペプチドの細胞質テールが複数の潜在的シグナル伝達因子をもつっていても不思議ではない。
【０２０６】
ネコＣＤ２８の別の応用としては、レセプターの表面発現、及びＦＩＶの様なウイルスに感染した後のＣＤ２８の発現をモニタリングする手段の開発が含まれる。タンパク質検出に適した手段が既存のメッセージ検出法と組み合わせることができれば、感染中の発現レベルに関する有益な情報た得られるだろう。慢性ＦＩＶ感染の経過中のＣＤ２８発現パターンの更なる関連性は、ネコシステムをヒトに於けるＨＩＶ感染の不良例として例証し、両システムに於ける感染経過に関しより明確な回答をもたらすだろう。
【０２０７】
［例７］
［ＣＤ２８／ＣＤ８０タンパク質発現］
［序］
免疫系に於ける連絡は多くは液性因子により伝達されるが、霊長類及び齧歯類の一次Ｔ細胞反応の開始は、細胞と細胞の直接接が必要であることが判明している（Ｍｅｓｃｈｅｒ、１９９２）。元来、この相互作用にはＴ細胞上のＴＣＲと抗原提示細胞上のＭＨＣとの間の相互作用のみ関与すると考えられていたが、Ｔ細胞の完全な活性化にはアクセサリー分子間の結合も必要であることが明らかになった（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９２）。考察した様に、ＣＤ２８とＣＤ８０間の相互作用がこのアクセサリーシグナルのメディエイターであることが支持する証拠がある（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）。
【０２０８】
脊椎動物に於ける重要なレセプター及びリガンドの多くはＩｇＳＦサブファミリーのメンバーである（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９０）。分子は、通常分子の細胞外部分にある免疫グロブリン様領域の存在により特徴付けられている（Ｂｕｃｋ、１９９２）。保存性は様々であるが、Ｉｇ折りたたみ構造の形成に必要とされる残基にのみ保存性が限定されることが多い（Ｂｅａｌｅ、１９８５）。Ｉｇドメインの特徴には、保存トポロジーに続く、ループにより結合された２本の近接し、随伴する逆平行β鎖がある（ＷｉｌｌｉａｍｓとＢａｒｃｌａｙ、１９８８）。このファミリーのメンバー間には共通する構造特性があるが、このファミリーには特徴的な結合相互作用及びシグナル伝達の配列の多様性がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８８）。
【０２０９】
ＩｇＳＦファミリーのメンバーとして、ＣＤ２８及びＣＤ８０は共にその細胞外ドメインにある程度の構造類似性を有している。ＣＤ２８はジスルフィド結合ヘテロダイマーとして発現されるが、単一の細胞外Ｖ領域を有している（Ａｒｕｆｆｏら、１９８７）。ＣＤ８０分子の細胞外領域はＶ−様ドメインとＣ型ドメインの両方を持つが、モノマーとして発現される（Ｆｒｅｅｄｍａｎら、１９８９）。ＩｇＳＦファミリーメンバーは構造特性を共有することから、結晶化されていない関連分子の３次元構造の考えを確立には鋳型が限定ベースで利用される（Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９９３）。ＣＤ２８あるいはＣＤ８０ポリペプチドは共に結晶化されていないため、類似の細胞外ドメインを持つ分子であるＣＤ２Ｆｒｉｓｃｏｌｌら、１９９１）及びＣＤ８（Ｌｅａｈｙら、１９９２）がＸ−線結晶学で検証され、ＩｇＳＦグループの関連メンバーの構造について幾つかの考えが提出されている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。
【０２１０】
前述の如く、ＣＤ８０及びＣＤ８６はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に対し類似の結合力を有している。しかし、ＣＤ２８はこのリガンドに関する低親和性レセプターであるのに対し、ＣＴＬＡ−４は両分子に対し高い親和性を有している（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ａ）。可能性のあるメカニズムが提出されてはいるもののＣＤ２８により保持されている様な迅速な解離速度を持つ低親和性レセプターがどの様にしてＴ細胞の発生に必要な共刺激シグナルを供給できるのかは不明である（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。Ｔ細胞表面上のＣＤ２８のＣＤ８０結合は産出架橋（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）およびシグナル供給を容易にするレセプターの多量化を促進すると仮定する（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。ＣＤ２８は活性化されたＴ細胞上に均一に分布していることから、分子はＴ細胞が結合した後に膜上を移動すると言われている（Ｄａｍｌｅら、１９９４）。高濃度の多量化ＣＤ２８は細胞：細胞接触域内の遊離型ＣＤ２８の最結合を促進するため、解離速度が早くともシグナル供給を促進すると考えられている（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。ＣＤ２８／ＣＤ８０の相互作用については直接観察されてはいないものの、相互キャッピングと呼ばれるこのプロセスは同様の細胞：細胞接触が求められる他のレセプターについて提示されている（Ｓｉｎｇｅｒ、１９９２）。
【０２１１】
ＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用はＴ細胞を介した免疫反応の発効にとって重要であることが示されているが、このシグナル伝達経路の正確なメカニズムについては不明な点が多い（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９３ａ）。この相互作用に於いて２種類のレセプター及び２種類のリガンドの存在からＴ細胞の活動にそれぞれた果たす役割に関し疑問が生じる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９２ｂ）。ＣＴＬＡ−４はより強く結合するものの、それは活性化後より遅れて発現され、またＣＤ２８に関してもシグナル伝達経路が提言されているが、シグナルがリガンドのＣＴＬＡ−４との結合により供給されるか否かは決定されていない（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９５ａ）。
【０２１２】
［材料と方法］
［挿入体の調整］
以下のプライマーを使用し、発現ベクターへの挿入するためのネコＣＤ２８及びＣＤ８０遺伝子の全オープンリーディングフレームを増幅した：
ｆｅＣＤ８０  ５’：ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  Ｃ
ｆｅＣＤ８０−９６０：ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  Ｃ
ｆｅＣＤ２８  ５’：ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＧ
ｆｅＣＤ２８  ３’：ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  Ｇ。
【０２１３】
５’ＣＤ８０プライマー及び両ＣＤ２８プライマーはＢａｍＨＩ部位と複数のクローニング部位内への挿入を促進する適当なリンカーを使い作製された。３’ＢａｍＨＩ部位はＴＡクローニングベクターを消化し、ＣＤ８０配列上に構築された。５’プライマーは共にコザックボックス及び５’ＡＴＧも含む。何れの場合もプライマーを使い、前述の如くＴＡベクローニングクター内に前もってクローン化された各遺伝子の全配列をコードする以外より増幅した。あるいは各プラスミド約１０ナノグラムをＴａｑポリメラーゼをベースとしたＰＣＲ増幅に利用した（９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、６８℃、４５秒を３０サイクル、６８℃、７分間１サイクル）。増幅産物は前述同様にアガロースゲル上に電気泳動し、視覚化した後ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社、サンジェゴ、カリフォルニア）内に接続した。前述と同様に、接続反応体を用いＩｎｖαＦ’コンペテント細胞を形質転換し、陽性クローンをスクリーング、選別した。
【０２１４】
［ｐＳＩ中へのクローニング］
ＣＯＳ−７細胞の形質転換に使用するｐＳＩベクターへのクローニングのために、プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、続いて酵素をマイクロピュアＥＺカラム（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ）を用いて除いた。酵素除去後、プラスミドをフェノール：クロロフォルムで処理し、残存タンパク質を除き、アルコールで沈殿した。挿入体を接続しているベクター中に見いだされるＥｃｏＲＩ部位を利用し、適当な挿入体を持つＴＡクローニングベクターを含むクローンより５０μｇのＱＩＡＧＥＮ精製プラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、チャットワース、カリフォルニア）から挿入体を消化し得た。１００μｌの消化体を１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、消化された断片を切り出した。次にゲルネブライザーとミクロコンフィルター（アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ）を使い挿入体をアガロースゲルより精製した。ＥｃｏＲＩ消化されたｐＳＩのアルカリフォスファターゼ処理は、ベクターの自己連結の機会を減らす。１時間、３７℃にて０．１Ｕ／μｇのウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、ベクターの消化末端を脱リン酸化した。ＣＩＰを６５℃、３０分熱変性して除き、さらにＭｉｃｒｏｐｕｒｅＥＺスピンカラム（アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ）を使いスピン精製した。挿入体は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使い、１６℃、一晩にて切断され脱リン酸化されたｐＳＩベクター内に直接接続された。ベクターと接続体とのモル比はおよそ３：１であり、ｐＳＩ０．１μｇに対しＣＤ２８又はＣＤ８０挿入体０．０５μｇであった。接続反応液１μｌを使ってＩｎｖαＦ’コンペテント細胞を形質転換した。細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上に線条接種した。プレートは一晩、３７℃にて培養され、翌日コロニーは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種された。３７℃、一晩、２２０ｒｐｍによる振盪インキュベーションの後、プラスミドＤＮＡをアルカリ融解により抽出し、ＤＮＡをフェノール：クロロフォルム抽出にて精製し、２倍量の９５％エタノールで沈殿させた。ＤＮＡをＲＮａｓｅで処理した後、１０ＵのＥｃｏＲＩで消化した。消化体を１％アガロースゲル上で視覚化し、陽性クローンを特定した。続いてプラスミドＤＮＡを、陽性クローンの一晩培養体５ｍｌよりＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムを用い抽出した（ＱＩＡＧＥＮ、チャットワース、カリフォルニア）（図３１）。次に精製ＤＮＡを、内部３’プライマーを使った色素ターミネーターサイクルシークエンシングを用いて配列決定し、プラスミド内の挿入体の方向を決定した。プライマーはクターと挿入体の間の接続部を越えて配列決定できる位置にあり、方向が正確でることが確認された。次に適切な方向にプラスミドを持つ各遺伝子クローンを１００ｍｌの培養液柱に増殖し、プラスミドをＱＩＡＧＥＮ（チャットワース、カリフォルニア）ｍａｘｉ−ｐｒｅｐカラムを使い抽出した。
【０２１５】
［ＳＦＶ内へのクローニング］
ＳＦＶベクターへの挿入のために、挿入体とプラスミドを殆ど同様の方法で処理した。ＳＦＶベクター１００μｇを３７℃にて１時間、１２０ＵのＢａｍＨＩで処理した（図３２）。マイクロピュターＥＺフィルターを通し遠心して、消化体より酵素を除いた（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ）。次にプラスミドをＣＩＰ処理した。ＣＩＰは加熱し不活性化されてから、プラスミドは再度マイクロピュアＥＺフィルターにかけられた。挿入体はＢａｍＨＩ消化により精製されたＴＡクローニングベクターＤＮＡより抽出された。挿入体は前述の如くにして精製され、ベクター内に結合された。ＩｎｖαＦ’コンペテント細胞の形質転換に続いて、前述同様にしてプラスミドの挿入及びその方向は色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより決定された。各遺伝子について、陽性クローンを利用し大規模プラスミドが調整された。
【０２１６】
［ｐＳＩタンパク発現］
真核細胞のｐＳＩ形質転換のために、ＣＯＳ−７細胞を米国標準株コレクション（ＡＴＣＣ）より得た。凍結ストックを１５ｍｌのＤＭＥＭに１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を加えたものに再懸濁した。次に培養体をＴ−７５フラスコ内で単層培養した。トランスフェクションする前の晩に、細胞を０．２５％トリプシンＥＤＴＡ液で処理した後にＰＢＳで洗浄しフラスコより取り出した。次に細胞を集密度〜２０％で１００ｍｍ組織培養皿に接種し、集密度〜５０％まで翌日中培養した。トランスフェクトする皿毎に、５ｍｌのＤＭＥＭ−ＮｕＳｅｒｕｍ（コラボレイティブバイオメディカルプロダクツ、ベ−スラインドフォールド、マサチューセッツ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を０．２ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン／クロロキン液と混合した。次に、精製されたｐＳＩプラスミド１０μｇ／ｍｌを混合液に加えた。培地をＣＯＳ細胞より吸引し、ＤＭＥＭ−ＮｕＳｅｒｕｍ／ＤＥＡＥ−デキストラン／クロロキン／ＤＮＡ液を細胞に加えた。培養体を３．５時間、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションし、続いて培地を除き、５ｍｌの１０％ＤＭＳＯのＰＢＳ液に交換した。２分後、この液を吸引して除き、細胞を一晩５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で培養した。翌日、細胞を２枚の１００ｍｍ培養皿に分けた。３日後、培地を吸引し、形質転換した細胞をＰＢＳ／０．５μＭ  ＥＤＴＡで除いた。ＰＢＳ／ＥＤＴＡ混合液を細胞に加え、それらを１５分間３７℃でインキュベーションした。上清を除き、続くＰＢＳ洗浄液と合わせた。次に上清と洗浄液を遠心分離した。得られた沈殿をＤＭＥＭ／ＦＢＳに再懸濁し、ＣＯＳ細胞数を測定した。
【０２１７】
［ＳＦＶタンパク発現］
ＳＦＶベクターによるトランスフェクションをベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞にて実施した。精製されたプラスミド３０μｇをＳＰｅＩにより１時間、３７℃にて消化した。次に酵素をマイクロピュアＥＺフィルター（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ）により除去し、２．５倍量の９５％ＥｔＯＨでＤＮＡを沈殿させた。次に１．５μｇのプラスミドをＳｐ６を使ったイン・ビトロ転写用の鋳型として使用した。要約すると、ＤＮＡを１時間、３７℃にて以下と共にインキュベーションした：転写緩衝液，１００ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｒＮＴＰ混合体、水、ＲＮａｓｉｎ及びＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼ６０Ｕ。転写後、反応液を一部取り出し、サンプルを１％アガロースゲル上で目視確認した。転写反応液５５μｌを使い、Ｔ−７５フラスコ内に於いて集密度〜８０％にてＢＨＫ細胞をトランスフェクトした。ＧＭＥＭ培地に１０％ＦＣＳを加えた培地を細胞より吸引し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地と交換した。２分のインキュベーション後、この培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地／９μｇ／ｍｌのリフォフェクチン／転写ＲＮＡと交換した。培養体を２時間、３７℃にて５％ＣＯ２内で頻繁に手で振盪しながらインキュベーションした。２時間後、培地を取り除き、ＧＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。培養体を７−９時間インキュベーションし、次に細胞をトリプシン処理して除いた。
【０２１８】
［ｐＱＥ内へのクローニング］
バクテリア性発現ベクターｐＱＥもネコＣＤ８０及びＣＤ２８遺伝子を使い構築した。前述同様に調整、精製された切断されＣＩＰ処理されたｐＱＥプラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼを使い、５０ｎｇのゲル精製されたＣＤ２８又はＣＤ８０と挿入体：プラスミドモル比１：４で接続された。接続対は１６時間、１６℃でインキュベーションされた。次に２μｌの接続反応液を使いＩＮＶαＦ’コンペテント細胞をトランスフォームした。陽性クローンを選別し、配列決定して挿入方向を確認した。精製プラスミドの大規模調整を実施し、これを用いて塩化ルビジウム処理により反応化されたＭ１５  ｐＲＥＰ４細胞をトランスフォームした。形質転換した細胞は５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及びアンピシリンを含むＬＰプレート上で増殖され、これらコロニー中にｐＱＥ及びヘルパーｐＲＥ４プラスミドが保持されているか確認した。次に陽性クローンをアルカリ融解ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ及びＢａｍＨＩ制限消化によりスクリーニングした。挿入体が確認されたコロニーは、将来の利用に備え５０％グリセロールストック液内に凍結された。
【０２１９】
［結合アッセイ］
ネコＣＤ８０及びネコＣＤ２８を発現しているトランスフェクト細胞に関し、Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ａ既述のプロトコールに従い結合アッセイを実施した。トランスフェクション１日後、ＣＤ２８を発現するＣＯＳ−７細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理によりＴ−７５フラスコから外した。細胞を２４ウェルプレート中に１×１０５細胞／ｍｌの濃度で接着させた。２日後、ｆｅＣＤ８０／ｐＳＩトランスフェクトＣＯＳ−７細胞をＰＢＳ／０．５μＭＥＤＴＡによりＴ−７５フラスコから取り外した。次にこれら細胞を、０．５ＭのカルセインＡＭ（モレキュラープローブ、ユージン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））の滅菌ＰＢＳ／１％ＢＳＡ液を用い、３０分間、３７℃にて蛍光標識した（ＡｋｅｓｏｎとＷｏｏｄｓ、１９９３）。模擬トランスフェクトＣＯＳ−７細胞も同様に標識された。次に標識細胞をＤＭＥＭに１０％ＦＣＳを加えた液で３回洗浄し、取り込まれなかった標識体を除き、測定し、単層に直接加えた。２つの細胞集団を１時間、３７℃で相互作用させた。単層細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで穏やかなに３回洗浄し、非接着細胞を除いた。洗浄後、各ウェルの蛍光をマイクロプレートフルオロメーター上で定量化した。トランスフェクトされた集団を含むウェルの蛍光を、ｐＳＩプラスミド単独でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞にＣＤ８０発現細胞を加えたウェルの蛍光と比較された。
【０２２０】
相互作用の特異性を示すために、ＣＴＬＡ−４  Ｉｇ及びＣＤ８０  Ｉｇ融合タンパク質（Ｐ．Ｌｉｎｓｌｅｙ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから好意により提供された）を使い細胞／細胞相互作用を阻止する競業的結合アッセイを計画した。カルセイン標識後で、ＣＤ８０発現細胞を単層に加える前に、１μｇ／ｍｌの濃度のＣＴＬＡ−４  ＩｇのＤＭＥＭ／ＦＣＳを３０分間標識感染細胞とインキュベーションした。細胞は２回ＤＭＥＭ／ＦＣＳで洗浄され、単層に加えられた。あるいは、単層中のＣＤ２８発現細胞を３０分間、ＣＤ８０と１μｇ／ｍｌの濃度のＤＭＥＭ／ＧＣＳ液中にインキュベーションし、洗浄後蛍光標識されたＣＤ８０発現細胞が加えられた。融合タンパク質による結合の阻害は、これらウェル中の蛍光を競合体無しのウェルに観察された結合と比較することで測定された。
【０２２１】
［ＲＴ−ＰＣＲ］
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ転写についてもアッセイされた。３日後、ＲＮＡがＦｅＣＤ２８、ｆｅＣＤ８０でトランスフェクトされた、または挿入体なしにトランスフェクトされた細胞より抽出された。ＲＮＡは無ＲＮａｓｅＤＮａｓｅで処理され、ＤＮＡ汚染の可能性が除かれた。次にオリゴｄＴプライマー及びＭｕＭＬＶ逆転写酵素を利用して、ＲＮＡ０．５μｇをｃＤＮＡに逆転写した。次に各ｃＤＮＡサンプルはＣＤ２８、ＣＤ８０，及びＧ３ＰＤＨに対し特異的なプライマーのセットといかの温度サイクルにより増幅された：９５℃、５分１サイクル；９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒；３０サイクル；７２℃５分、１サイクル。次に各反応体２０μｌを１％アガロースゲル上で視覚化した。
【０２２２】
ネコＣＤ２８及びＣＤ８０に関する遺伝子は３種類のタンパク質発現ベクター（ｐＳＩ、ＳＦＶ及びｐＱＥ）中に上手く挿入された。各ベクター内に接続された後、遺伝子を利用してＩＮＶαＦ’コンペテント細胞を形質転換した。図３３−３８は、適当なｃＤＮＡ挿入体を持つベクターを示す。
【０２２３】
結合アッセイを実施し、機能的タンパク質が発現できることが示された。初期アッセイを実施し、ＣＤ２８とＣＤ８０トランスフェクトＣＯＳ−７及びＣＤ２８トランスフェクト並びに模擬トランスフェクトＣＯＳ−７細胞の結合間の関連が決定された。蛍光標識された非接着ＣＤ８０トランスフェクト細胞が加えられたウェル中の蛍光は、初期２回希釈のコントロールウェルに比べると高かった。相互作用は容量反応的であり、初期２回希釈後の蛍光保持率は接着細胞が模擬トランスフェクトコントロールと同様に表面細胞を発現しているウェルの率と同じであった（図３９）。
【０２２４】
この相互作用が阻害可能であるか示すために、混合前にトランスフェクトされた細胞株を対応する可溶性レセプターとインキュベーションした。５×１０５及び１×１０５細胞の濃度では、ＣＤ２８及びＣＤ８０発現ＣＯＳ細胞を含むウェル中の蛍光は、前回の実験で観察されたものに近いものであった。接着細胞を混合前にＣＤ８０Ｉｇ対応レセプターとインキュベーションしたウェルでは、蛍光保持率はコントロールの模擬トランスフェクトウェルのものと同等であたあった。しかし、ＣＤ８０ｐＳＩでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を、ＣＤ２８  ｐＳＩトランスフェクト細胞に曝される前に可溶性ＣＴＬＡ−４とインキュベーションすると、蛍光は完全には阻害されなかった。レベルは非阻害群に見られる程十分ではないものの、コントロール又はその他の実験群に比べると明らかに大きかった（図４０）。
【０２２５】
ＲＴ−ＰＣＲをｐＳＩ−ＣＤ２８、ｐＳＩ−ＣＤ８０で形質転換された、及び模擬トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞のＲＮＡについて実施し、細胞株中に各遺伝子に特異的なｍＲＮＡが存在していることを示した。図３２は、各細胞株の１％アガロースゲルを示す。Ｇ３ＰＤＨの遺伝子は各セットで増幅されており、ＲＮＡが保全されていること、そして模擬トランスフェクトセットが陽性コントロールとなることが示された。ＣＤ８０  ｐＳＩトランスフェクトＣＯＳ−７細胞はＣＤ８０ｍＲＮＡ及びＧ３ＰＤＨメッセージを発現したが、ＣＤ２８ｐＳＩトランスフェクトＣＯＳ−７細胞は、ＣＤ２８とＧＰＤＨの遺伝子を発現した。模擬トランスフェクト細胞はＧ３ＰＤＨのみを発現した（図４１）。
【０２２６】
［考察］
好適な抗体を欠くことは、ペプチド発現を示す直接アッセイが実施できないことを意味する。市販の抗−ｈｕＣＤ２８及び抗−ｈｕＣＤ８０モノクローナル抗体を分離されたリンパ細胞上で試験し、交叉反応性があるか調べた。細胞上の抗体を用いたＦＡＣＳ分析はＰＣＲにより確認され、いずれの表面タンパク質に関するメッセージも発現されていなかった。このことを抗体がｐＳＩトランスフェクトした細胞上の表面発現を認識しないという事実を考え合わせると、これら抗体は交叉反応的でないと結論される。ＣＤ８０抗体は交叉反応することは期待できなかった。ヒトとネコのＣＤ８０分子の間の相同性は限定的であることは、モノクローナルな抗体の交叉反応性の可能性を制限するだろう。しかし、抗−ｈｕＣＤ２８は交叉反応的でないことはいささか以外であった。クローン化されたＣＤ２８分子間には高い保存性があるにも関わらず、市販の抗−ｈｕＣＤ２８抗体はマウスタンパク質と交叉反応を示さなかった。抗−ｈｕＣＤ８０抗体同様、ｈｕＣＤ２８モノクローナル抗体の試験は失敗した。即ち、ペプチドが発現される可能性を示すことができるだけでなく、それが機能的であり相互作用できることも示すアッセイを考案する必要があった。
【０２２７】
ネコＣＤ８０及びＣＤ２８のｃＤＮＡは一連の発現ベクター内に上手く挿入された。ｐＳＩベクターは結合アッセイに求められる全ての条件を満たしたが、他のベクターは今後のタンパク発現を促進するだろう。
【０２２８】
トランスフェクション後、ＣＯＳ−７形質転換細胞株によるＣＤ２８及びＣＤ８０ｍＲＮＡの発現はＲＴ−ＰＣＲにより確認された。ＰＣＲ反応前のＲＮＡに対するＤＮａｓｅ処理は、ゲノミック又はプラスミドＤＮＡの汚染の確立を有意に下げるだろう。更にＣＯＳ−７細胞が天然にいずれのリガンドも発現するとは思われず、これは模擬トランスフェクトコントロールではいずれの表面タンパク質のメッセージも欠いていたことにより更に確認された。トランスフェクトされた細胞のＲＮＡからの適当なメッセージの増幅は、細胞内にｐＳＩの鋳型が存在しており、そしてプラスミドによりコードされたメッセージが転写されることを示していると考えられる。
【０２２９】
Ｐｅｔｅｒ  Ｌｉｎｓｌｅｙにより実施された結合アッセイに従い実施アッセイをモデル化し、ヒトＣＤ８０及びＣＤ８６が同様の結合力を持つことを示した（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４ａ）。改良されたフォーマットを使い、表面に発現されたネコＣＤ２８が表面に発現されたＣＤ８０と結合すること、そして相互作用が可溶性レセプターにより阻害されることを示した。結合のレベルは特異的ウェル中の蛍光標識細胞の保持率より推測できた。蛍光プレートリーダーを使用したことから、蛍光測定前に細胞を融解する必要はなかった。
【０２３０】
初期アッセイは、蛍光標識されたＣＤ８０−ｐＳＩトランスフェクトＣＯＳ細胞の保持率は、接着細胞が模擬トランスフェクトされたウェルに比べ接着細胞がＣＤ２８−ｐＳＩでトンランスフェクトされたウェルでより大きいことを示した。コントロール細胞、挿入体を欠いたｐＳＩでトランスフェクトされた模擬ＣＯＳ細胞により、ベクターの存在、トランスフェクションのプロセスそのもの、あるいは細胞の接着特性だけではＣＤ８０及びＣＤ２８を発現する表面間の相互作用により伝達されう細胞間の接着を生じないことを示した。１×１０６細胞の初期希釈では、細胞がＣＤ２８を発現しているウェル中の蛍光は、蛍光標識されたＣＤ８０トランスフェクト細胞が模擬トランスフェクト細胞を含むウェルに加えられたウェルの蛍光に比べて約５倍高いかった。５×１０５細胞では、蛍光は細胞数の減少により有意に低下したが、そのレベルはまだコントロールの蛍光に比べ有意に高かった。１×１０５細胞の濃度では、実験とコントロールとの差は統計的に識別できず、１×１０４ではそれらはほぼ同一であった。このアッセイは、相互作用がＣＤ８０トランスフェクト細胞とＣＤ２８トランスフェクト細胞間で起こっており、その結果蛍光標識ＣＤ８０トランスフェクト細胞がウェル中に保持されたことを示している。しかし、接着細胞が表面タンパク質を発現しない場合には、ＣＤ８０トランスフェクト細胞は穏やかな洗浄により除かれた。この作用は滴定可能であり、１×１０４細胞ではウェル中の蛍光は実質同一であった。相互作用が起こっているか確認するために、可溶性れせぷたーを導入しＣＤ２８／ＣＤ８０相互作用を阻害した。
【０２３１】
第２アッセイは、接着相手との相互作用を阻害することを目的とした、各ペプチドに対応したレセプターの可溶型の導入が含まれた。２種類の細胞を混合する前に、ＣＤ８０の可溶性レセプター、ｈｕＣＴＬＡ−４Ｉｇ及びＣＤ２８の可溶性レセプター、ｈｕＣＤ８０−Ｉｇを、各分子に対応するレセプターを発現しているトランスフェクトされたＣＯＳ細胞とインキュベーションした。可溶性タンパク質はネコ起源ではないが、ヒト分子に提案されている結合領域と、ネコ分子の類似領域との間の保存性のレベルより十分に交叉反応性があると考えられた。更に、ヒト融合パートナーはマウスの該当レセプターと結合する（Ｐ．Ｌｉｎｓｌｅｙ、私信）。アッセイに必要な細胞の数から、１×１０６細胞を使ったアッセイの実施は不可能であった。第１濃度は５×１０５細胞であり、ＣＤ２８／ＣＤ８０トランスフェクト細胞単独では前回の実験で観察されたと同様の平均蛍光を示した。なぜ可溶性ＣＤ８０レセプターとインキュベーションした接着細胞が模擬トランスフェクトされたコントロールに近い蛍光を示し、非接着ＣＤ８０トランスフェクト蛍光標識細胞が可溶性ＣＴＬＡ−４とインキュベーションされた場合に約２ないし３倍高い蛍光をしめすのかは不明である。可溶性レセプターのタイプにより差はあるものの、レセプターが存在しないウェル中に比べて可溶性レセプターが導入されたウェルでは、蛍光量は大きく減少した。これまでのアッセイにより示された相互作用は、細胞を混合する前に適当な可溶性の相手方レセプターを導入することで阻害できた。
【０２３２】
表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、一般にはこのタイプのアッセイに好適であるが、適当な試薬が存在しない場合、機能的な相手方レセプターがある場合に可能なフォーマットであることを意味している。競合的結合アッセイと組み合わせた初期結合アッセイの結果より、機能的ネコＣＤ８０及びＣＤ２８ｃＤＮＡが分離されたことが確認され、更にメッセージにより発現されたタンパク質が機能的に無傷であることも確認された。このタイプの結合アッセイの応用性には限界があるものの、機能的表面発現及び相互作用の可能性を示す有効なシステムである。
【０２３３】
［例８］
［感染］
［序］
Ｌｗｏｆｆはウイルスを”感染期を有する厳密に細胞内及び強力な病原体にあって、１）１種類の核酸を有し、２）その遺伝的材料の形状を複製し、３）２分裂で増殖及び分裂できず、そして４）Ｌｉｐｐｍａｎｎシステムから外れるもの”と定義した（Ｌｗｏｆｆ、１９５７）。ウイルスは自然界では非細胞性であり、そのゲノムはＲＮＡ又はＤＮＡであり、感染宿主細胞によりビリオン粒子の合成を方向付ける（ＬｕｒｉａとＤａｒｎｅｌｌ、１９６８）。ウイルス疾患は、Ｂ７／ＣＤ２８シグナル伝達複合体の実務的応用を示すことができる興味深いシステムである。レトロウイルスの中では、ヒトに於けるＨＩＶ感染及びネコに於けるネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の排除を通し生ずると仮定されている正常免疫機能の破壊をもたらす（Ｆａｕｃｉら、１９８４；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８７）。ＣＤ２８／ＣＤ８０シグナル伝達複合体は病気にある役割を持ち、レセプター発現の操作により感染を軽減できると考えられている（Ｈａｒｌａｎら、１９９５）。
【０２３４】
ＦＩＶはヒトに於けるＨＩＶに極めて良く似た一連の臨床及び臨床下症状を起こす、飼いネコにとって重大な臨床問題である（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８７）。ＦＩＶに関する情報が集まるにつれ、これがヒトＡＩＤＳの動物モデルとして相応しいことが明らかとなり、ヒトに於ける病気の進行を極めてよく模擬する非霊長類モデルであることが明らかになった（Ｓｉｅｂｅｌｉｎｋ、１９９０）。分子、生物学及び病理学的類似性からも、ＨＩＶ研究で得られた情報の多くがネコに於けるＦＩＶ感染の理解を促進することを示唆された。
【０２３５】
まず、ＨＩＶ感染はセロコンバージョン時期付近の症状に似た単核細胞症の発生を伴う一過性の白血球減少により顕在化する（Ｃｌａｒｋら、１９９１）。短期のＣＤ４＋Ｔ細胞集団の減少とＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、その結果としてＣＤ４：ＣＤ８比の減少が起こり、これが病気の無症候性気管中の病気の進行をもたらす（Ｃｏｏｐｅｒら、１９８４）。ＡＩＤＳ関連症状の出現まで、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は大きく損なわれ、病気が終末期に進行すると全リンパ細胞集団は劇的に減少する（Ｆａｕｃｉら、１９８４）。初期のリンパ細胞減少症はおそらく他のウイルス疾患に見られるものと同じコルチコ−ステロイド誘導による免疫細胞集団のシフトによるものであるが、その後のＣＤ４＋Ｔ細胞の消失とＣＤ８＋Ｔ細胞の増加はウイルス増殖及び病理発生に関係すると考えられている（ＦａｕｃｉとＤａｌｅ、１９７５；Ｆａｕｃｉら、１９８４）。適当なモデルシステムの開発は、感染及びウイルス誘導疾患のメカニズムをさらに推測する上で重要なステップである。
【０２３６】
ＦＩＶ、Ｔリンパ栄養性レトロウイルスはまず繰り返し慢性感染症を起こすカリフォルニアのネココロニーで報告された（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８７）。病気それ自体はヒトでのＨＩＶに似た様式で発症し、分類学的には遠く関連するものであるが、抗原性としてはヒトのＡＩＤＳ原因因子とは異なるものである（Ｓｉｅｂｅｌｉｎｋら、１９９０）。感染の伝播はＨＩＶ同様に感染した体液を開始起こるが、性的感染が一次感染経路であったＨＩＶとは異なり、ＦＩＶでは感染の大部分は噛みつきによる唾液を介し起こる（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８９）。感染経路に違いはあるものの、免疫不全症状が起こることはヒトに於ける関連疾患の最善のモデルの１つである（Ｓｉｅｂｅｌｉｎｋら、１９９０）。
【０２３７】
ＦＩＶの臨床進行はＨＩＶに似ており、病気は５つの臨床段階に分類される。初期段階は発熱、悪寒そしてリンパ性疾患により特徴つけられ、感染後長期間の無症状期が続き、体重減少や２次及び日和見感染が多発する最終の３段階まで進行する（Ｅｎｇｌｉｓｈら、１９９４）。細胞性の感染の経路も同一であるかは不明であるが、ＦＩＶはＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を指向している（Ｂｒｗｏｎら、１９９１）。ウイルス感染した動物は、おそらく融合細胞形成と細胞融解によるＣＤ４＋Ｔ細胞活性の減少を経験する（ＳＩｅｂｅｌｉｎｋら、１９９０）。感染の最終段階の開始に一致して、重大なＣＤ４＋Ｔ細胞の消失と、ＣＤ４：ＣＤ８比の低下が起こる（Ｎｏｖｏｔｎｅｙら、１９９０）。ＨＩＶ及びＦＩＶが誘導する疾患は同様の様式でＣＤ４＋Ｔ細胞消失を起こすものではないが、生じる表現形及び免疫系の破壊は極めて類似した様式にて表現される。
【０２３８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＨＩＶの感染は正常免疫反応の発生に有害な作用を及ぼすことは明らかであるが、免疫不全をもたらす相互作用の正確なメカニズムについては結論されていない。感染後期では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少をもたらす事象は特定されない（Ｃｏｎｎｏｒら、１９９３）。細胞融合体の形成、アポトーシスの誘導、ＣＴＬによる排除は全てＨＩＶ感染に於けるＴ細胞集団を低下することが示されている（ＳｃｈａｔｔｎｅｒとＬａｕｒｅｎｃｅ、１９９４；Ｆｏｕｃｈｉｅｒら、１９９６）が、ＣＤ２８を介したメカニズムについても提言されている（Ｈａｆｆａｒら、１９９５）。感染Ｔ細胞株は同種抗原刺激を受けるとタンパク質及びｍＲＮＡの両レベルにおいてＣＤ２８の発現をダウンレギュレーションすることが示されている（Ｈａｆｆａｒら、１９９５）。これまでに考察した様に、ＣＤ２８交叉結合はＴ細胞反応の成熟化にとって重要な刺激である（Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９１ａ）。もしＨＩＶ感染がＣＤ２８の表面発現のダウンレギュレーションをもたらすのであれば、提示された抗原を認識する感染Ｔ細胞は感染に活性化されるのではなくアポトーシスを起こすだろう（ＳｃｈａｔｔｎｅｒとＬａｕｒｅｎｃｅ、１９９４）。アポトーシスはＨＩＶ感染細胞死の正常メカニズムであるが、この経路は随伴性Ｔ細胞の排除の追加寄与因子でもある（Ｂｒｉｎｃｈｍａｎｎら、１９９４）。
【０２３９】
ＣＤ８＋ＣＴＬは、ＡＩＤＳ感染個体中に見られる長期無進行を伴う高レベルＣＴＬを有するＨＩＶ長期生存例の発生に関係している（Ｌａｎｄａｙら、１９９４）。逆に、液性免疫はレンチウイルス関連疾患の治療においては一般に無効であるばかりでなく、抗体も実際には病気を増悪化することが示されている（Ｌｏｍｂａｒｄｉら、１９９４；Ｓｉｅｂｅｌｉｎｋら、１９９５）。ＨＩＶ感染と随伴する免疫不全の最終臨床段階の発生は、多くの患者において細胞性の１型反応から液性の２型反応への切り替えに関連している（ＳｃｈｔｔｎｅｒとＬａｕｒｅｎｃｅ、１９９４）。これに一致して、ＣＤ８＋ＣＴＬを介した抗ウイルス活性の低下に関係する健康な状態からＡＩＤＳへの進行が観察される（Ｌｅｗｉｓら、１９９４）。ＣＤ８＋ＣＴＬ上でのＣＤ２８の発現も抗ウイルス活性に関係しており、感染患者の中のＣＤ８集団でのＣＤ２８の発現には強いＣＴＬを介した抗ウイルス活性が伴うと考えられている。（Ｌａｎｄａｙら、１９９３）。
【０２４０】
ＨＩＶ抵抗性の促進に必要なメディエイターとされているＣＤ２８の表面発現は、感染及び悲感染Ｔ細胞が存在する状態においてＨＩＶにより有害な影響を受ける（Ｃａｒｕｓｏら、１９９４）。ＨＩＶ感染の無症候期の開始、ＣＤ２８を有するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の低下が認められる（Ｌｅｗｉｓら、１９９４）。これは感染初期に見られるサイトカイン分泌パターンの異常（Ｃａｒｕｓｏら、１９９４）及び、後期段階に於けるＣＤ８＋Ｔ細胞反応の変化（Ｚａｎｕｓｓｉら、１９９６）によると考えられている。、ＣＤ２８発現ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ−２に反応し増殖することから、ＨＩＶ感染個体では初期段階のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖低下はＣＤ２８のダウンレギュレーションに関連すると考えられている（Ｂｒｉｎｃｈｍａｎｎら、１９９４）。残念なことに、感染個体ではＣＤ２８−、ＣＤ２８＋Ｔ細胞はＣＤ８＋集団の７５％を構成しているのに対し、正常個体ではそれらは集団の２５％に過ぎない（Ｓａｋｋｏｎｅｎら、１９９３）。即ち、ＣＤ８＋集団は感染個体中に正常に保持されてはいるが、感染初期においてさえこれら集団では効果的な抗ウイルス免疫反応を生じることができる集団の有効性に有害な作用が及んでいる（Ｃａｒｕｓｏら、１９９４）。
【０２４１】
研究は、ＣＤ２８シグナル伝達もウイルスの活動に関係することを示している（Ａｓｊｏら、１９９３；Ｓｍｉｔｈｇａｌｌら、１９９５）。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によるＨＩＶ感染末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞の共刺激は、抗ＣＤ３単独による刺激に比べより高いウイルス複製をもたらす（Ｓｍｉｔｈｇａｌｌら、１９９５）。この反応はＣＤ８０レセプターの可溶型であるＣＴＬＡ−４を添加することで無効にでき、抗−ＩＬ−２により軽減される（Ｓｍｉｔｈｇａｌｌら、１９９５）。感染ＣＤ４＋Ｔ−リンパ細胞を用いた別の研究は、患者の４０％に於いて、追加刺激を必要とせずＣＤ２８結合のみでウイルス生産がアップレギュレーションされることを示した（Ａｓｊｏら、１９９３）。
【０２４２】
リンパ細胞集団をＨＩＶ表面糖タンパクｇｐ１２０で前処理すると、ＡＰＣ表面上のＣＤ８０のダウンレギュレーションが起こる（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ、１９９５）。Ｔ細胞上でのＣＤ２８の発現はＨＩＶ感染によりダウンレギュレーションされると思われるが、これら細胞上でのＣＤ８０の発現はアップレギュレーションされる（Ｈａｆｆｎｅｒら、１９９３）。これは感染が未感染Ｔ細胞に伝播するメカニズムが、未感染Ｔ細胞上のＣＤ２８と感染Ｔ細胞上のＣＤ８０間の相互作用が細胞と細胞の接触を促進してウイルスの移動を起こすものであることを提言している（Ｈａｆｆａｒら、１９９３）。
【０２４３】
ＨＩＶに於けるＣＤ２８の効果が調べられる一方で、ＦＩＶに於ける表面タンパクの役割については識別されていない。もしネコについてヒトシステムに観察されたものと同様の結果が示されれば、ネコのレトロウイルスモデルとしての有用性が更に確認されるだろう。
【０２４４】
［材料と方法］
［イン・ビボ感染］
３匹の成体特異的無病原体（ＳＰＦ）メスネコに、ＦＩＶウイルスのメリーランド株、１×１０５のＴＣＩＤ５０を静脈注射した。２匹の同様の雌ネコにウイルスを含まない血清で疑似感染し、コントロールとして利用した。感染前及び７週間毎週１飼い血液を抽出した。感染第一週では、ネコは毎日２飼いモニターされ、注射による初期反応がおきていないことを確認した。感染が進行した場合、動物は毎日モニターされた。臨床的疾患の急性期では、毎週５−１０ｍｌの血液を採取しＣＢＣ測定及びＰＢＭＣ分離を行った。ＣＢＣはディップ−クイック血液スメアー中の細胞型を計測し、決定した（ジョルゲンセンラブ、ラブランド、コロラド（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  Ｌａｂ、Ｌｏｖｅｒｌａｎｄ、ＣＯ）。
【０２４５】
ＰＢＭＣはヒストパーク勾配（シグマ、セントルイス、ミズリー）上に分離し、血液より抽出された。アルスエバー（Ａｌｓｅｖｅｒ）液で初回洗浄した後、〜５×１０５細胞を取り出し、４８ウェルプレートの５つのウェルに分割して入れた。細胞は５００μｌの完全ＲＰＭＩに懸濁され、続いてＣＤ４又はＣＤ８に対し作製された抗体で標識された。１時間室温にて、緩やかに揺すりながらインキュベーションした後、細胞を２回ＰＢＳで洗浄した。
【０２４６】
洗浄後、２次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＦＩＴＣ標識（ＫＰ＆Ｌ、ガイサーブルグ、メリーランド）を１：５００の濃度で加え、室温にて緩やかに揺すりながら１時間インキュベーションした。続いて細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、３．７％のフォルムアルデヒドにて固定した。次に蛍光標識した集団をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメターター上で定量化した。
【０２４７】
残ったＰＢＭＣを更に１回、１０ｍｌのアルスエバー液で洗浄した。遠心分離後、上清を取り出し、ＲＮＡ抽出用のＵＬＴＲＡＳＰＥＣ（バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を１ｍｌ加えた。ＲＮＡは前述同様にして精製、沈殿した。次に、分光光度計にて２６０ｎｍの吸光度を測定し、定量化した。続いてＲＮＡを５０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、使用時まで−７０℃に凍結した。
【０２４８】
［半定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
サンプルのＲＮＡをＰＣＲ増幅する前に、最終瀉血ネコより６０ｍｌの血液を歳出した。ＰＢＭＣは前述同様に単離された。細胞はヘマサイトメーターを用い計測され、５×１０５細胞／ｍｌの濃度で４つのフラスコに分けられた。前記同様に遠心分離し、ＵＬＴＲＡＳＰＥＣを用いて細胞沈殿よりＲＮＡを抽出する前に細胞はＣｏｎＡにより０、８、１６及び２４時間刺激を受けた。ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡ１．５μｇからＭＭＬＶ逆転写酵素と３’プライマーを使いｃＤＮＡを転写し、実施した。ＲＮＡ、ｄＴプライマー及びＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏを５分間、７０℃でインキュベーションしＲＮＡの２次構造を取り除き、プライマーをアニーリングできるようにした。次に転写緩衝液、ＭｇＣｌ２，ｄＮＴＰ及びＤＴＴを加え、混合液を２時間、４２℃でインキュベーションした。次に逆転写酵素１μｌを加え、反応をさらに３０分間続けさせた。２５μｌのＲＴ反応液の中の４μｌを次にＣＤ８０増幅用のチューブ３本及びＣＤ２８増幅用のチューブ３本にそれぞれ加えた。
【０２４９】
次に１０×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ及びＣＤ２８又はＣＤ８０特異的プライマーの混合液をｃＤＮＡに加えた。ＣＤ８０用プライマーは次の取りである：
Ｂ７−Ｓ２２０  ５’プライマー：５’  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧ
Ｂ７−２８４  ３’プライマー：ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＧ。
【０２５０】
一方ＣＤ２８用プライマーは次の通りである：
ＣＤ２８  ５’スタート：ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＧ
ＣＤ２８−２３９  ３’：ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＴＣＣ。
【０２５１】
次に、各産物のチューブ３本を９５℃で５分間でインキュベーションした後、２．５μｌのＴａｑポリメラーゼを含む水１０μｌを各チューブに加えた。反応液を以下の温度プロフィールのサイクルにかけた：９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、そして７２℃、３０秒。チューブを２０、２５及び３０サイクル時にそれぞれ取り出した。各反応体より２０μｌを１％アガロースゲル上で視覚化した。アガロースゲルの写真を撮影し、産物が出現するサイクル数を決定した。この様な予備実験の後、前もって感染動物及びコントロール動物から抽出しておいたＲＮＡを同様にして増幅した。
【０２５２】
［イン・ビトロ感染］
イン・ビトロにてＦＩＶ感染Ｔ細胞株をＣｏｎＡにより０時間、及び１６時間刺激し、ＣＤ２８及びＣＤ８０の発現を判定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を利用しアッセイした。ＦＥＴＪ細胞株は増殖培地中にＩＬ−２が無くとも増殖する混合Ｔ細胞集団である。これら細胞の独立した亜集団をＦＩＶウイルスのメリーランド株及びペタルマ（Ｐｅｔａｌｕｍａ）株に暴露した。約２０００万個の正常ＦＥＴＪ、ペタルマ感染ＦＥＴＪ及びメリーランド感染ＦＥＴＪを、８μｇ／ｍｌのＣｏｎＡにより０及び１６時間刺激した。インキュベーション後、これら細胞からＵＬＴＲＡＳＰＥＣ  ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を使いＲＮＡを抽出し、前述同様に精製した。
【０２５３】
ＭＣＨ５．４は慢性的にＦＩＶに感染される株ではないが、繰り返しＦＩＶに感染したコロニーのネコに由来するＴ細胞株である。約２０００万個のＭＨＣ５．４細胞を遠心して沈殿し、５ｍｌの濃ＦＩＶ感染上清中に再懸濁した。細胞をこの濃度で５％ＣＯ２中に３０分間インキュベーションして、その後濃度を〜５×１０５細胞に調整し、２４時間培養した。正常及び感染したＭＨＣ５．４を、８μｇ／ｍｌのＣｏｎＡにより０及び１６時間刺激した。インキュベーション後、これら細胞からＵＬＴＲＡＳＰＥＣ  ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を使いＲＮＡを抽出し、前述同様に精製した。
【０２５４】
［ノーザンブロッティング］
ノーザンブロッティング分析のために、２６０ｎｍの分光光度分析によりＲＮＡ濃度を決定した。各ＲＮＡサンプル１５μｌを３μｇ／μｌの濃度に濃縮し、３倍量のサンプルローディングバッファー中に再懸濁した。次にサンプルを７０℃で１５分間加熱し、ＲＮＡを変性して２次構造をトリの自他。サンプル２０μｌ量を１％の変性アガロースゲルにかけ、７０ボルト、２．５時間、ブロモフェノールブルーがゲル底部の２ｃｍ以内に達するまで電気泳動した。次にＲＮＡをゲルからジーンスクリーン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）ナイロン膜（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に下方毛細管作用を利用し転写した。ＲＮＡは低強度のＵＶ光で３分間処理し膜上にＵＶ交叉結合され、続いてＵＶシャドウイングを利用して各レーンについてリボソーマルバンド強度を視覚化した。
【０２５５】
ネコＣＤ２８特異的プローブをランダムプライムｃＤＮＡ標識を利用し作った。完全長のＣＤ２８分子をＴＡクローニングベクターより、フランキングＥｃｏＲＩ部位を利用して切り出された。断片はゲル電気泳動及により精製され、アミコンゲルネブライザー（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ）を使いアガロースより抽出された。精製産物２５ｎｇをランダムデカマーと５分間、９５℃でインキュベーションし２次構造を除いた（アンビオン、オースチン、テキサス）。反応液を液体窒素中で急激凍結し、ｄＡＴＰを架空ｄＮＴＰ及びＰ３２αｄＡＴＰを混合液に加えた。３７℃で１分間インキュベーションした後、クレノーＤＮＡポリメラーゼを１μｌ加え、混合液を３０分間インキュベーションした。反応は０．５ＭのＥＤＴＡを１μｌ加え停止し、続いてセファデックスＧ−５０スピンカラム（シグマ、セントルイス、ＭＯ）にて精製し取り込まれていない放射標識ヌクレオチドを除いた。反応液１μｌは１ｍｌのシンチレーション液中に希釈され、プローブの活性をシンチレーションカウンターにより決定した。ブロットは５ｍｌのＲａｐｉｄ  Ｈｙｂハイブリダイゼーション液（アマシャムライフサイエンス、クリーブランド、オハイオ）中に、１５分間、６５℃で前ハイブリダイゼーションされた。３−５×１０６ｃｐｍ／μｌの濃度のプローブを５μｌを各ブロットに加え、回転しながら１．５時間、６５℃にてインキュベーションした。プローブを取り除き、ブロットを室温において２回、１％のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いて１５分間、洗浄した。次にブロットをガイガーカウンターでスキャンし、必要に応じて６５℃で再度洗浄を行った。標識はＢｅｔａＧｅｎスキャニング装置上で定量測定された。６５℃、１５分の最終洗浄を行い、ブロットを増感スクリーンと共にフィルムの上、１６−２４時間、−７０℃で置いた。オートラジオグラフを現像し、バンドをデンシトメーターで定量化した。ＲＮＡの保全性と濃度は、同様の方法により標識しハイブリダイズされたＧ３ＰＤＨ特異的プローブ（Ｊ．Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ教授、テキサスＡ＆Ｍ大学、より好意により提供された）を使い確認された。
【０２５６】
［イン・ビトロ感染細胞からの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
ＣＤ２８の存在は、さらに半定量的ＰＣＲにより測定された。前述の如く、抽出されたＲＮＡの濃度は２６０ｎｍに於ける分光光度測定値より推定された。ＲＮＡ２μｇ（最終容積２５μｌ）をオリゴｄＴプライマーとＭＭＬＶ逆転写酵素を使い、前述同様にしてｃＤＮＡに転写した。次にＲＴ反応液３．５μｌを７本のＰＣＲチューブに移した。３本のチューブはＣＤ８０特異的プライマーを用いて増幅され、３本はＣＤ２８特異的プライマーを用い増幅され、残りの１本のチューブはＧ３ＰＤＨ特異的プライマーを使い増幅された：
Ｇ３ＰＤＨ  ５’：ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  Ｔ
Ｇ３ＰＤＨ  ３’：ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ。
【０２５７】
前述の如く、チューブは２０、２５及び３０サイクル時に取り出された。各サンプル２０μｌを１％アガロースゲル上で視覚化した。更に、特定Ｔ細胞に由来するサイトカインの存在についても、ＦＥＴＪ及びＭＨＣ５．４細胞由来のＲＮＡと同様にしてアッセイされた。以下の特異的プライマー；
ＩＬ−２  ５’：ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  Ｇ
ＩＬ−２  ３’：  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＴＴＧ
ＩＬ−４  ５’：ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＣＣ
ＩＬ−４  ３’：ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＣＡＧ
ＩＦＮγ  ５’：ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＴＴＧ
ＩＦＮγ  ３’：ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ｃ  
を使い、１．２５μｇのＲＮＡよりｃＤＮＡを増幅した。転写反応の２０％は各サイトカインのために増幅された。残りのｃＤＮＡはＧ３ＰＤＨ特異的プライマーを使い増幅された。ｃＤＮＡは以下のパラメータにより３０サイクル増幅された：９５℃５分、１サイクル；９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒、３０サイクル；７２℃５分１サイクル。次に反応液２０μｌを１％アガロースゲル上で視覚化した。
【０２５８】
［感染を決定するＲＴ−ＰＣＲ］
ＦＥＴＪ及びＭＣＨ５．４細胞の感染はｇａｇ特異的配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅により確認された。１．２５μｇの濃度のＲＮＡを前述のパラメターに従い、ＭＭＬＶ  ＲＴ及びｇａｇ特異的３’プライマーを使用しｃＤＮＡに転写した。ＲＴ反応液１０μｌは以下のパラメータによるホットスタートＰＣＲにより増幅された。９５℃５分；９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒、３０サイクル；７２℃５分。増幅後、各反応液２０μｌを１％アガロースゲル上で視覚化された。
【０２５９】
［結果］
ＣＤ２８発現に及ぼすイン・ビボに於ける急性感染の効果を調べる為に、ネコＡＵ０４、ＡＵＵ３及びＯＡＣ２にはウイルスを静脈注射し感染させ、一方ネコＡＷＧ３及びＯＡＥ６には培地のみを注射した。ＦＡＣＳ分析は、実験動物とコントロールとのＣＤ４：ＣＤ８比には幾つかの違いがあることを示す。コントロール動物は全体としてほぼ１：２の比を保っていたのに対し、実験系では若干のふらつきが認められ、１動物では比は１；１まで低下していた（図３）。
【表３】
2010252804.tif 000005
【０２６０】
ＣＤ８０及びＣＤ２８ＲＮＡ発現の時間経過を追うことで各分子のメッセージが存在していること、そしてＣｏｎＡ刺激後０、８、１６及び２４時間の時点でＰＣＲにより増幅できることが示された。この半定量的ＰＣＲ法は、視覚的にバンドが検出できる最低の増幅サイクルを探し、それよりメッセージの相対量を推測するものである。実験群では、ＣＤ８０特異バンドはいずれの感染時期においても２０及び２５サイクルでは出現しなかったが、３０サイクルでは何れの時期ついてもゲル上にＣＤ８０のメッセージを視覚的に確認することができた（図４２）。ＣＤ２８メッセージも、２５サイクルでは１６時間で僅かに視認できるバンドがあったが、３０サイクルでは何れの時点についても視覚確認できた（図４３）。
【０２６１】
同様のプロトコールをＦＩＶ感染及び悲感染ネコのＰＢＭＣより抽出されたＲＮＡについて実施した。ＣＤ２８及びＣＤ８０特異的ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を利用して、各ペプチドに関し転写されたメッセージ量の相対的アイディアを示した。時間経過実験で既に行われた様に、サンプルを２０、２５及び３０サイクル時に取り出した。ＣＤ８０及びＣＤ２８産物は２５サイクルでは視認できたが、２０サイクルではメッセージは検出できなかった（表４）。実験群とコントロール群の間では、いずれのメッセージの発現についても差は示されなかった。いずれのサブセットについても、産物が視認できた増幅サイクル点には変動が認められた。
【表４】
2010252804.tif 000006
【０２６２】
ＦＩＶｇａｇ特異的プライマーを用いたＦＥＴＪ及びＭＣＨ５．４細胞株のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅は、ＭＣＨ５．４細胞株が感染可能であり、活動的感染を示したのに対し、ＦＥＴＪ細胞株はｇａｇ特異的ＲＮＡの増幅を起こさないことを示した。ＦＩＶ特異的産物は、感染ＭＣＨ５．４サンプルより抽出されたＲＮＡから容易に増幅できるが、非感染コントロールから同様に抽出されたＲＮＡからは増幅されなかった（図４４）。同様の反応を、ＦＩＶペタルム及びメリーランド株に曝したＪＥＴＪ細胞株より抽出されたＲＮＡについて行ったが、同様の条件においては視認できる産物は得られなかった（データ未提示）。
【０２６３】
ＣＤ２８メッセージを検出するためのノーザンブロッティングと半定量的ＰＣＲを、正常ＦＥＴＪ及びＭＣＨ５．４細胞株について実施した。ＭＣＨ５．４細胞株は感染した実験群及び非感染コントロールを有していたが、ＦＥＴＪ細胞株は非許容Ｔ細胞コントロールとして利用された。
【０２６４】
半定量的ＰＣＲは、各細胞株がＣＤ２８メッセージを生ずることができることを示した。ＦＥＴＪ非感染コントロールでの増幅からは、発現パターンが前記のＣＤ２８に関する時間経過でのパターンに似ていることが示された。刺激後０時ではバンドは３０サイクルまで視認できないが、刺激後１６時間目では２５サイクルによりバンドは視認できた（図４５）。興味深いことに、感染ＭＣＨ５．４細胞株は、いずれのコントロールとも異なるパターンを示した。実験群では、メッセージは３０サイクルまで０又は１６時間にいずれにつてもバンドは認められなかった。Ｇ３ＰＤＨメッセージはコントロールとして増幅され、ＲＮＡの保全性と濃度は確認された（図４６）。感染はＣＤ２８ＲＮＡメッセージの発現に影響すると考えられた。
【０２６５】
ノーザンブロット分析は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を利用し発見されたデータの確認に利用された。１６時間ＣｏｎＡ刺激された未感染ＭＣＨ５．４細胞からのＲＮＡは、最も強いプローブハイブリダイゼーションを示した。未感染株の未刺激サンプルは、刺激された、又は刺激されていない感染ＭＣＨ５．４細胞株Ｒなのいずれよりも強いハイブリダイゼーション率を示した（図４７）。
【０２６６】
オートラジオグラフに加えて、ＢｅｔａＧｅｎ上に放射活性が測定された。ＣＤ２８ハイブリダイゼーションの生測定値は、続けて行われたブロットのＧＡＰＤＨプローブから得た数値により正規化された（図４８）（表５）。
【表５】
2010252804.tif 000007
【０２６７】
ＭＨＣ５．４細胞株のサイトカインＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲからはＩＬ−２に関するメッセージのみが増幅可能であることが示された。ＩＬ−４、ＩＬ−６又はＩＦＮγは３０サイクルにおいても増幅されなかったが、ＩＬ−２メッセージは容易に検出された（図４９）。
【０２６８】
［考察］
ＣＤ２８メッセージをイン・ビボ及びイン・ビトロ感染で測定し、ＣＤ２８発現がアッセイできるか、又レテロウイルスによる感染がメッセージ発現を変えるか調べた。ＣＤ２８メッセージの測定は十分な量のＲＮＡが回収できればノーザンブロッティングにより、回収が限られている場合には半定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより測定された。
【０２６９】
イン・ビボ実験に続いて、前述の如くにＦＩＶのメリーランド株を３匹の動物に感染させ、これら感染動物と非感染コントロールからの血液より分離されたＰＢＭＣから抽出されたＲＮＡよりＣＤ２８及びＣＤ８０特異的メッセージが増幅された。ノーザンブロッティングによる測定が好ましいが、細胞数及び利用可能なＲＮＡ量に限りがあることから半定量的ＲＴ−ＰＣＲが使用された。ネコは毎週定期的に採血され、最大１０ｍＬの血液が各実験に利用できた。
【０２７０】
感染動物より得たＰＢＭＣのＣＤ４／ＣＤ８比に関するＦＡＣＳ分析は８週間にわたり減少を示したのに対し、非感染動物では比は比較的一定に保たれていた。２つの実験群の間に差が認められた。ＣＤ４／ＣＤ８比は感染対非感染動物で異なる様に見えるが、ＣＢＣ又はＣＤ８０及びＣＤ２８発現に真の差は認められなかった（データ示さず）。
【０２７１】
ＣＤ２８発現を至適に測定するには、純粋なＴ細胞が必要である。ＰＢＭＣより分離されるものは、平均して細胞の４０％が真のＴ細胞であろう。これら細胞の内のほぼ半数がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞と同濃度にはＣＤ２８を発現しない。このことと、別の種ではＣＤ２８が休止中のＴ細胞（循環しているＴ細胞の大部分を構成する）では高レベルに発現されていないという事実と考え合わせ、ノーザンブロッティングではなくむしろＰＣＲ決定を使用することにした。ＰＢＭＣから抽出したＲＮＡ２０μｇよりＣＤ２８メッセージを検出しようと試みた予備実験は成功しなかった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応はＣＤ２８をコードするＲＮＡの存在を検出しなかった。この技術はＣＤ８０に対し特異的なメッセージの増幅にも利用された。
【０２７２】
ＣＤ２８メッセージがノーザンブロッティングにより検出されたイン・ビトロ細胞株がＲＮＡを提供した。ＭＣＨ５．４はＴ細胞株として全ての細胞がＣＤ２８メッセージを発現する可能性を持ち、既に誘導株が慢性ウイルス感染を起こしていることから選択された。最後のメリットは、細胞株として、単一動物より得られる血液のリンパ細胞から入手できるＲＮＡに比べてはるかに大きなＲＮＡリザーバーになることである。
【０２７３】
ノーザンブロッティングによりＣＤ８０メッセージを検出する試みも行われた。ＣＤ８０は休止中のＢ−細胞及び単核細胞に低濃度で存在するものの、刺激を受けた単核細胞及びマクロファージ中には最高レベルの発現が認められた。ネコ抗原を提示する細胞株は無く、Ｔ細胞は通常ペプチドを低レベルでのみ発現している。ＰＢＭＣから抽出されたＲＮＡよりＣＤ８０特異的メッセージを検出する実験は不成功であったが、これはＣＤ２８のところで考察したのと同様の理由によるものであろう。これとは別に、判定量ＰＣＲを感染動物に由来する細胞についても行い、ＣＤ８０とＣＤ２８メッセージを示した。メッセージの量に関しては明確な答えは得られなかったものの、このアッセイはメッセージが存在すること、そしてその量の相対的に提示した。
【０２７４】
ネコＴ細胞株のＣＤ２８メッセージのノーザンブロット分析は成功しなかった。ＣＤ２８に関するメッセージを感染細胞と非感染細胞について比較すると、発現パターンに差が認められた。ＣＤ２８メッセージはＣｏｎＡに１６時間曝された非感染細胞に置いて最も豊富であった。メッセージは非刺激及び非感染細胞にも検出された。メッセージは刺激された、及び刺激されていないＦＩＶ感染細胞のＲＮＡにも検出可能であったが、レベルは非感染細胞に比べ極めて小さかった。このデータはＲＴ−ＰＣＲ検出技術を利用した同様の所見と良く相関した。
【０２７５】
ＣＤ２８メッセージを検出する能力は、ＣＤ８０分子について認められたものと同じ限界による妨害は受けない。しかし、ＣＤ８０を発現する細胞の大集団が分離できれば、ノーザンブロッティングによりメッセージの検出も実行的になる。ペプチド特異的モノクローナル抗体がこれら表面タンパク質に対し開発されれば、これらペプチドに関する表面発現量とメッセージレベルとを相関させることは興味深いだろう。
【０２７６】
サイトカインｃＤＮＡが増幅され、感染された株と非感染株に差がないことが確認された。感染状態に関わらず、各群からＩＬ−２が増幅された。他のサイトカインのメッセージは増幅されなかった。
【０２７７】
ノーザンブロットは、ｍＲＮＡレベルでのＣＤ２８発現はイン・ビトロではＦＩＶの存在によりダウンレギュレーションされることを示している。本所見は表面タンパク質の発現を測定することで確認されなければならないが、イン・ビトロでのＦＩＶ感染はＨＩＶ感染したヒトＴ細胞で示されたようにＣＤ２８発現に影響するだろう（Ｂｒｉｎｃｈｍａｎｎら、１９９４）。
【０２７８】
［結論］
ネコシステムのＣＤ２８及びＣＤ８０シグナル伝達複合体をコードするｃＤＮＡのクローニング及び配列決定は、他のシステムより分離された分子に同類な断物をもたらした。ネコタンパク質の推定アミノ酸は、ヒト及びマウスポリペプチドに対し同一性が相対的に低いこと、これまでにクローン化された分子間相同性の比較、特徴的残基が保持されていること、そして表面リガンドがシグナル伝達機能を持たないと考えられることを示し、分離された産物が実際にＣＤ８０のネコアナログであると結論するに至った。これに対し、ネコＣＤ２８分子は核酸及び推定アミノ酸レベルのいずれに於いても中度の同一性を保っており、他種でクローン化された分子に類似していた。
【０２７９】
分子の性質は結合アッセイに於いて相互作用が示されたことにより更に同定された。他種類似タンパク質に対し作られたモノクローナル抗体が発現したネコタンパク質とは反応できなかった。即ち、結合アッセイのセットを計画し、相互作用が起こること、そして相互作用が可溶性レセプターにより阻害されることが示された。これらアッセイでは、結合は蛍光標識された細胞が保持されること、そしてこれが可溶性の対応レセプターの導入により阻害されることにより示された。これらアッセイは、ネコＣＤ８０及びＣＤ２８に関するタンパク質が発現できるだけでなく、表面発現分子が相互作用できることも示した。
【０２８０】
活動性の感染に於ける分子の発現も特徴付けられた。ＣＤ２８及びＣＤ８０の発現はＦＩＶウイルスに曝されたイン・ビボ及びイン・ビトロシステムでアッセイされた。ＨＩＶウイルスに感染したヒト細胞で変化することが示されいてる（Ａｓｊｏら、１９９３）ＣＤ２８及びＣＤ８０の発現も、ネコＴ細胞のＦＩＶ感染により有害な影響を受けた。病気の進行に於けるこれら分子それぞれの発現に関する更なる情報により、ネコシステムはレトロウイルス感染の重要なモデルとして確立されるだろう。
【０２８１】
これら分子の長期応用は大きな可能性を持っている。免疫システムのヒトシステムからの進化的多様化について理解することにより、初めてヒトに於けるシステムの機能をより完全に理解することができるだろう。更に、ネコ種のレトロウイルス感染のモデルとしての重要性は明瞭に確立されている（Ｓｉｅｂｅｌｉｎｋら、１９９０）。ＣＤ８０は抗レトロウイルスワクチンに於いてメモリーＣＴＬを誘導する潜在的アジュバントとして提言されている。ネコシステムは、該システムの有効性を検証する例外的なモデルであろう。
【参照文献】
【０２８２】
2010252804.tif 000008
2010252804.tif 000009
2010252804.tif 000010
2010252804.tif 000011
2010252804.tif 000012
2010252804.tif 000013
2010252804.tif 000014
2010252804.tif 000015
2010252804.tif 000016
2010252804.tif 000017
2010252804.tif 000018
2010252804.tif 000019
2010252804.tif 000020
2010252804.tif 000021
2010252804.tif 000022
2010252804.tif 000023
2010252804.tif 000024
2010252804.tif 000025
2010252804.tif 000026
2010252804.tif 000027
2010252804.tif 000028
【図１Ａ−１】
2010252804.tif 000029
【図１Ａ−２】
2010252804.tif 000030
【図１Ｂ】
2010252804.tif 000031
【図２Ａ−１】
2010252804.tif 000032
【図２Ａ−２】
2010252804.tif 000033
【図２Ｂ】
2010252804.tif 000034
【図３Ａ−１】
2010252804.tif 000035
【図３Ａ−２】
2010252804.tif 000036
【図３Ｂ】
2010252804.tif 000037
【図４Ａ】
2010252804.tif 000038
【図４Ｂ】
2010252804.tif 000039
【図５Ａ】
2010252804.tif 000040
【図５Ｂ】
2010252804.tif 000041
【配列表】
2010252804000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月16日(2010.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコＣＤ８６リガンド又はネコ可溶性ＣＤ８６リガンドをコードする単離された核酸。
【請求項２】
ネコＣＤ２８レセプター又はネコ可溶性ＣＤ２８レセプターをコードする単離された核酸。
【請求項３】
前記ネコＣＤ８６リガンドが、配列番号５の配列を有する、請求項１の核酸。
【請求項４】
前記ネコＣＤ２８レセプターが、配列番号７の配列を有する、請求項２の核酸。
【請求項５】
前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１または２に記載の核酸。
【請求項６】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡである請求項５の核酸。
【請求項７】
請求項１または２に記載の核酸中に存在するユニークな配列に対し相補的な配列を有する少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
長さが少なくとも１５または１６ヌクレオチドである請求項７のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが検出可能に標識されている請求項７又は８のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記検出可能な標識が放射性同位体、蛍光体、又はビオチンである請求項９のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
当該オリゴヌクレオチドが選択的にメチル化されている請求項７又は８のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
Ｂ７−２＃１９−２／０１１２９８（ＡＴＣＣ受託番号２０９８２１）と称される請求項１２のベクター。
【請求項１４】
請求項２の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
ＰＳＩ−ＣＤ２８＃７／１００２９６（ＡＴＣＣ受託番号２０９８１９）と称される請求項１４のベクター。
【請求項１６】
当該核酸に作用可能に結合したプロモーターを含む請求項１２〜１５の何れかのベクター。
【請求項１７】
請求項１２〜１６の何れかのベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
当該宿主細胞が真核細胞又は原核細胞である請求項１７の宿主細胞。
【請求項１９】
当該宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、及びＧＨ４Ｃ１細胞をからなる群から選択される請求項１８の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２の核酸によりコードされるポリペプチド。
【請求項２２】
当該ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養することと、生産された当該ポリペプチドを回収することとを具備する請求項２０または２１のポリペプチドを製造する方法。
【請求項２３】
有効量の請求項２０または２１に記載のポリペプチドと適切な担体を含むワクチン。
【請求項２４】
前記有効量が用量当たり約０．０１ｍｇないし約１００ｍｇの量である請求項２３のワクチン。
【請求項２５】
前記有効量が1日当たり約０．２５ｍｇ／ｋｇネコ体重ないし1日当たり約２５ｍｇ／ｋｂネコ体重の量である請求項２３のワクチン。
【請求項２６】
更に病原体由来の免疫原を含む請求項２３〜２５の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記病原体が、ネコ病原体、狂犬病ウイルス、クラミジア、トキソプラズマ原虫、イヌ糸状虫、ノミ、又は細菌性病原体である請求項２６のワクチン。
【請求項２８】
前記ネコ病原体がネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンシチアルウイルス、ネコザルコーマウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコボロナ病ウイルス、又はネコ寄生虫である請求項２７のワクチン。
【請求項２９】
ネコに請求項２３〜２８の何れか１項に記載のワクチンを所定量投与することを含むネコに免疫を誘導する方法。
【請求項３０】
ネコに請求項２３〜２８の何れか１項に記載のワクチンを所定量投与することを含むネコの免疫応答を増強する方法。
【請求項３１】
前記ワクチンを皮下、筋肉内、全身、局所、または経口的に投与する請求項２９または３０の方法。
【請求項３２】
免疫反応を効果的に抑制する量の請求項２０または２１に記載の可溶性ポリペプチドをネコに投与することを含む、ネコの免疫反応を抑制する方法。
【請求項３３】
前記量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし約２５ｍｇ／ｋｂ体重／日である請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記ネコが自己免疫疾患に罹患しているか、または組織若しくは臓器移植のレシピエントである請求項３２の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
［５’領域の単離］
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅法（クローンテック、パロアルト、カルフォルニア）を使い、遺伝子の５’配列を誘導した。ｍＲＮＡは１２時間ＣｏｎＡにて、続いて４時間ＬＰＳにて刺激したＰＭＢＣより作製された。ｍＲＮＡはＵＬＴＲＡＳＰＥＣ  ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、ヒューストン、テキサス）を使い抽出された。ｃＤＮＡは、ポリＡテールの５’終末端へのプライマーの結合を促進する５’末端の変性ヌクレオチドを持つアンカーオリゴｄＴプライマーを使い作製された。次にｃＤＮＡは上記の如くに転写された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使い、特異的リンカーをｃＤＮＡに結合する。前に増幅された領域に対し特異的な内部３’プライマー：
Ｂ７−２８４：ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＧ
Ｂ７−１９０：ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧ
及び、接続されたリンカー配列に対し相補的なアンカープライマーを使い、タッチダウンＰＣＲをｃＤＮＡについて行った。ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア）を用いたタッチダウンＰＣＲ反応のパラメーターは次の通りである：９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、７２℃、３０秒及び６８℃、４５秒を５サイクル；９５℃、３０秒、６５℃、３０秒及び６８℃、４５秒を５サイクル；９５℃、３０秒、６０℃、３０秒及び６８℃、４５秒を２５サイクル。この反応液１μｌを５０μｌの水で希釈し、この希釈液５μｌを使い、リンカー特異的アンカープライマー及び初期プライマーの５’に位置する遺伝子特異的３’プライマーを利用したネステッドＰＣＲ反応を行った（ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックスを利用し、９５℃、５分間１サイクル；９５℃、３０秒、６５℃、３０秒及び６８℃、４５秒を３０サイクル）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
［結果］
実験ネコＮＫ５より抽出されたＲＮＡを、ＣＤ８０に関する初期増幅に使用したが、その後このネコは屠殺され、追加産物は別の動物で作製された。ＨＮＫのＣｏｎＡで刺激されたＰＢＭＣ  ＲＮＡを初期増幅した結果、ヒトＣＤ８０遺伝子と７０％の相同性を有する３４４ｂｐの産物を得た。プライマーはＩｇＣ様ドメインに対応するコーディング配列の中央内の領域に対し特異的であった。これら初期実験ではより多くのペプチドをコードする領域を増幅するために別の変性プライマーも利用されたが、Ｂ７−２（５’）及びＢ７−３（３’）の組み合わせ以外は適当な大きさの産物を生じなかった。これら遺伝子特異的プライマーによる追加の変性プライマーを使ったその後の実験は成功しなかった。即ち、５’及び３’領域は他の方法を利用して得なければ成らなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅システム（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）は、５’コーディング領域をコードする領域を上手く増幅した。ＣｏｎＡ刺激されたＥＫ６より得たＲＮＡはこの方法により上手く増幅された。初回増幅はＢ７−２８４及びＢ７−３、及びアンカープライマーＡＰ１により行われた。この反応は特定の１本のバンドを生じなかったため、この産物を鋳型に使ったネステッド反応を、Ｂ７−２０及びＢ７−１３５をネステッド３’プライマーに、そしてアンカープライマーＡＰ−１を５’プライマーに使用し実施した。これら反応それぞれより、適当な長さの産物が得られた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
３’非翻訳領域をコードする変性プライマーの新しいプールを、ヒト及びマウス配列の３’ＵＴＲ内のコンセンサス域より合成した。これらプライマーは、ネコＥＤ３より得たＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより単離されたＲＮＡよりｃＤＮＡを上手く増幅した。初期増幅法とは異なり、最終産物を得るためには一連のネステッド反応を実施しなければならなかった。３４４ｂｐ断片及び５’領域内のこれら変性プライマー及びアンカープライマーを利用した一次ＰＲＣ反応は初めは明瞭な同定可能なバンドを生じなかった。しかし、希釈された一次産物及び追加の特異的５’プライマーを用いたネステッド反応の結果、残りの３’領域をコードする産物を産生した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
３’配列からは、ヌクレオチド９６０より始まるコーディング域外側のリバースプライマーが構築された。この構築体は開始コドンを包含するプライマーとの組み合わせると、予想通りの大きさの産物を増幅した。最終産物の配列決定は、これまでに決定された領域それぞれが実際に重複していること、またこの断片がネコＣＤ８０遺伝子の連続した完全な配列を提供することを示した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
９６０ヌクレオチド断片は、位置１の開始コドン、ヌクレオチド８８８の停止コドン、及び３’非翻訳域の追加の７２ヌクレオチドを含む。全断片の包含体を作製、配列決定し、追加の５’及び３’領域が配列決定された（データ示さず）。５’ＲＡＣＥ産物からの５’開始コドンの上流域の配列決定は、位置１−３のＡＴＧが最初のフレーム内メチオニン部位であること及びマウス及びヒト配列内の類似位置に合致することを示している。位置８８８に存在する停止コドンも、既に配列決定された遺伝子内の同様位置に合致した。配列のアラインメントは、公表ヒト及びマウスＣＤ８０核酸配列とそれぞれ７７％及び６２％の同一性を示した。他の霊長類及び齧歯類配列との相同性は、それぞれヒト及びマウスに観察されたレベルと同等であった。各種のＣＤ８６遺伝子との同一性は２５％以下であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
ＭａｃＶｅｃｔｏｒＤＮＡ分析ソフトウエアー（ＩＢＩ、ロチェスター、ニューヨーク（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ））を利用し、核酸配列はアミノ酸に翻訳された。翻訳の結果、長さに関し同一ではないがマウス及びヒト両タンパク質に類似の２９２アミノ酸のペプチドが得られた。シグナルペプチドは位置１から２５までの範囲と提言された。分子の細胞外領域は、残基１３９を通り広がる１１５塩基のＩｇＳＦ可変様ドメイン、及びおよそ残基２４０まである１００塩基のＩｇＳＦ定常様ドメインを含む。残基２４１−２７１の膜内ドメインに続き２１残基の短い細胞質テールがある。ヒト分子同様に、ネコポリペプチドはドメイン中に８個の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を含むが、その位置は同一ではない。ネコ、ヒト及びマウスペプチド間の相同性は、核酸配列に観察された同一性に比べ明らかに低かった（表１）。
【表１】
2010252804.tif 000066
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
ネコＣＤ８０について提案されているペプチド配列と提案されている前記ヒトタンパク質とを並置することにより、２つの分子間の相同性の多くが定常領域（残基１４０−２４０）に起因することが示された。シグナル配列中のペプチド間の相同性は低く、同一性の欠如はＩｇＶ様ドメインに及んだ。既述の如く、保存性は定常ドメインを通じて強いが、この同一性は連続的なものでなく、ネコペプチドの膜貫通ドメイン及び細胞内細胞質テールと、ヒト分子中の類似領域との間に相同性は殆どなかった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
ネコ、ヒト及びマウスＣＤ８０遺伝子とマウス及びヒトＣＤ８６遺伝子とのアラインメントからは、２つのＢ７ファミリーメンバーの間には限定された全体相同性のみ認められるが、Ｂ７遺伝子ファミリーの指標と考えられている残基はネコペプチドにより保持されていた。これら分子は、折りたたみに関係すると考えられている残基、及び結合領域と言われる領域を含む。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
ヒト及びネコＣＤ８０配列間の相同性は、２種類のＣＤ２８分子間の同一性ほど大きくなく、提案されている親水性プロットの比較は特定アミノ酸配列内に様々な変化があるものの、これらの変化は相同的なことが多く、ペプチドの表面特性を変えない可能性を示している。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
次に、ネステッド反応液３０μｌを１．５％アガロースゲル上で視覚化し、適当な断片をゲルより切り出した。ｃＤＮＡを前記同様にしてＡｍｉｃｏｎゲルネブライザーとマイクロピュアフィルター（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｒｅｒｌｙ，ＭＡ）を使い精製した。精製ｃＤＮＡは、色素ターミネーターサイクルシークエンシング（パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット）を用い配列決定した。完成した断片より、コンセンサス配列を得た。配列よりネコＣＤ２８遺伝子の全オープンリーディングフレームを包含するプライマーペアを構築した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
［結果］
マウス、ヒト及びウサギＣＤ２８のｃＤＮＡ配列内のコンセンサス域より選択された変性プライマーがＰＣＲ反応に使用され、ネココーディング配列の殆ど全てを包含する産物を得た。ＣＤ２８分子に見られる高い保存性により、変性プライマーを使用した初期増幅は実際に全体分子を産生した。最初に短い中央部の断片のみが作られたネコＣＤ８０分子とは逆に、ＣＤ２８ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームからは最も５’側にある１１３ｎｔｄのみが失われていた。この配列初期断片は、ヒト配列内の同類域と８６％の相同性を有し、ウサギｃＤＮＡとは８６％の同一性を、そしてマウスコーディング配列とは７９％の相同性を有していた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
５’ＡＴＧ及びその他の１１０ｎｔｄ、並びに幾つかの上流５’配列が、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ（ギブコ、ガイサーブルグ、メリーランド）を利用し単離された。テーリング反応にはＥＫ６ＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより転写されたｃＤＮＡが利用された。この材料を使い、プライマーＣＤ２８−７８６及びアンカープライマーｄＧによる増幅の結果極僅かな特定可能な物質を得た。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
同定可能なバンドはプライマーの組み合わせｄＧ／ＣＤ−７８６により増幅されたが、その反応液からの希釈ｃＤＮＡはネステッドＣＤ２８プライマーであるＣＤ２８−１８２及びＣＤ２８−２３９を使い増幅された。視認可能なバンドが約６００ｐｂの位置に存在した。この産物をアガロースゲルより分離し、配列決定したところ、開始コドンを含み、かつ連続する５’上流の配列を含んでいた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
これら産物の配列より、開始コドンを含む５’プライマーを得た。このプライマーは、３’構築体と組み合わせ使用し、ＥＫ６及びＥＤ３のＣｏｎＡ刺激ＰＢＭＣより抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを増幅し、７５４ｂｐの産物を得た。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
全オープンリーディングフレームをコードする最終の６８５ｂｐ断片内では、５’ＴＡＧは位置１に位置し、停止コドンは位置６６４−６６に位置し、更に１９ヌクレオチドが３’ＵＴＲ内に存在していた。ｆｅＣＤ８０分子同様、ＡＴＧコドンの５’位置は、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物の配列決定により確認された（データ示さず）
配列決定したところ、ネコＣＤ２８遺伝子はウサギ及びヒト配列と極めて近く、全体的な同一性を示した。マウスｃＤＮＡとの相同性も高かったが、ニワトリ配列との同一性には、ウサギ配列と他の哺乳動物遺伝子間の変動と同程度の変動があった。
【表２】
2010252804.tif 000067
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
アミノ酸ペプチド配列は前記同様にして核酸配列より得られた。他の公開遺伝子より得られたアミノ酸配列との同一性は、ヌクレオチドレベルの同一性と同等であった。ペプチドのシグナル配列は５’メチオニンから残基１９までの範囲であった。ネコ分子では、他のクローン化ＣＤ２８ポリペプチド同様に、残基１９−１５３の範囲に単一の細胞外ＩｇＳＦ可変様ドメインがあると考えられた。疎水性の膜内ドメインは続く２７残基の範囲であり、そしてそれに４１アミノ酸の細胞質テールが続く。ヒトＣＤ２８分子同様に、ネコポリペプチドも５ヶ所の潜在的Ｎ−結合糖化部位を持っている。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
ネコＣＤ２８の推定アミノ酸配列の親水性プロットは、ヒトポリペプチドの同様のプロットと比べると、それぞれのタンパク質が同様の構造上の完全性を保持している可能性を示した。しかし、アミノ酸配列内に変化が起こっている場合でも分子の親水性には大きな変化は起こっておらず、従ってアミノ酸配列内の変化は大部分が相同的であると考えられる。ネコ及びヒトペプチドの相同性が７５％に過ぎない疎水性膜内ドメインでさえ極めて似た親水性プロフィールを有することは注目に値する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
［ｐＳＩ中へのクローニング］
ＣＯＳ−７細胞の形質転換に使用するｐＳＩベクターへのクローニングのために、プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、続いて酵素をマイクロピュアＥＺカラム（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ）を用いて除いた。酵素除去後、プラスミドをフェノール：クロロフォルムで処理し、残存タンパク質を除き、アルコールで沈殿した。挿入体を接続しているベクター中に見いだされるＥｃｏＲＩ部位を利用し、適当な挿入体を持つＴＡクローニングベクターを含むクローンより５０μｇのＱＩＡＧＥＮ精製プラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、チャットワース、カリフォルニア）から挿入体を消化し得た。１００μｌの消化体を１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、消化された断片を切り出した。次にゲルネブライザーとミクロコンフィルター（アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ）を使い挿入体をアガロースゲルより精製した。ＥｃｏＲＩ消化されたｐＳＩのアルカリフォスファターゼ処理は、ベクターの自己連結の機会を減らす。１時間、３７℃にて０．１Ｕ／μｇのウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、ベクターの消化末端を脱リン酸化した。ＣＩＰを６５℃、３０分熱変性して除き、さらにＭｉｃｒｏｐｕｒｅＥＺスピンカラム（アミコン、バーバーリー、マサチューセッツ）を使いスピン精製した。挿入体は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使い、１６℃、一晩にて切断され脱リン酸化されたｐＳＩベクター内に直接接続された。ベクターと接続体とのモル比はおよそ３：１であり、ｐＳＩ０．１μｇに対しＣＤ２８又はＣＤ８０挿入体０．０５μｇであった。接続反応液１μｌを使ってＩｎｖαＦ’コンペテント細胞を形質転換した。細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上に線条接種した。プレートは一晩、３７℃にて培養され、翌日コロニーは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に接種された。３７℃、一晩、２２０ｒｐｍによる振盪インキュベーションの後、プラスミドＤＮＡをアルカリ融解により抽出し、ＤＮＡをフェノール：クロロフォルム抽出にて精製し、２倍量の９５％エタノールで沈殿させた。ＤＮＡをＲＮａｓｅで処理した後、１０ＵのＥｃｏＲＩで消化した。消化体を１％アガロースゲル上で視覚化し、陽性クローンを特定した。続いてプラスミドＤＮＡを、陽性クローンの一晩培養体５ｍｌよりＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムを用い抽出した（ＱＩＡＧＥＮ、チャットワース、カリフォルニア）。次に精製ＤＮＡを、内部３’プライマーを使った色素ターミネーターサイクルシークエンシングを用いて配列決定し、プラスミド内の挿入体の方向を決定した。プライマーはクターと挿入体の間の接続部を越えて配列決定できる位置にあり、方向が正確でることが確認された。次に適切な方向にプラスミドを持つ各遺伝子クローンを１００ｍｌの培養液柱に増殖し、プラスミドをＱＩＡＧＥＮ（チャットワース、カリフォルニア）ｍａｘｉ−ｐｒｅｐカラムを使い抽出した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
［ＳＦＶ内へのクローニング］
ＳＦＶベクターへの挿入のために、挿入体とプラスミドを殆ど同様の方法で処理した。ＳＦＶベクター１００μｇを３７℃にて１時間、１２０ＵのＢａｍＨＩで処理した。マイクロピュターＥＺフィルターを通し遠心して、消化体より酵素を除いた（アミコン、バーバリー、マサチューセッツ）。次にプラスミドをＣＩＰ処理した。ＣＩＰは加熱し不活性化されてから、プラスミドは再度マイクロピュアＥＺフィルターにかけられた。挿入体はＢａｍＨＩ消化により精製されたＴＡクローニングベクターＤＮＡより抽出された。挿入体は前述の如くにして精製され、ベクター内に結合された。ＩｎｖαＦ’コンペテント細胞の形質転換に続いて、前述同様にしてプラスミドの挿入及びその方向は色素ターミネーターサイクルシークエンシングにより決定された。各遺伝子について、陽性クローンを利用し大規模プラスミドが調整された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２２】
ネコＣＤ２８及びＣＤ８０に関する遺伝子は３種類のタンパク質発現ベクター（ｐＳＩ、ＳＦＶ及びｐＱＥ）中に上手く挿入された。各ベクター内に接続された後、遺伝子を利用してＩＮＶαＦ’コンペテント細胞を形質転換した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
結合アッセイを実施し、機能的タンパク質が発現できることが示された。初期アッセイを実施し、ＣＤ２８とＣＤ８０トランスフェクトＣＯＳ−７及びＣＤ２８トランスフェクト並びに模擬トランスフェクトＣＯＳ−７細胞の結合間の関連が決定された。蛍光標識された非接着ＣＤ８０トランスフェクト細胞が加えられたウェル中の蛍光は、初期２回希釈のコントロールウェルに比べると高かった。相互作用は容量反応的であり、初期２回希釈後の蛍光保持率は接着細胞が模擬トランスフェクトコントロールと同様に表面細胞を発現しているウェルの率と同じであった。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
この相互作用が阻害可能であるか示すために、混合前にトランスフェクトされた細胞株を対応する可溶性レセプターとインキュベーションした。５×１０５及び１×１０５細胞の濃度では、ＣＤ２８及びＣＤ８０発現ＣＯＳ細胞を含むウェル中の蛍光は、前回の実験で観察されたものに近いものであった。接着細胞を混合前にＣＤ８０Ｉｇ対応レセプターとインキュベーションしたウェルでは、蛍光保持率はコントロールの模擬トランスフェクトウェルのものと同等であった。しかし、ＣＤ８０ｐＳＩでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を、ＣＤ２８  ｐＳＩトランスフェクト細胞に曝される前に可溶性ＣＴＬＡ−４とインキュベーションすると、蛍光は完全には阻害されなかった。レベルは非阻害群に見られる程十分ではないものの、コントロール又はその他の実験群に比べると明らかに大きかった。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
ＲＴ−ＰＣＲをｐＳＩ−ＣＤ２８、ｐＳＩ−ＣＤ８０で形質転換された、及び模擬トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞のＲＮＡについて実施し、細胞株中に各遺伝子に特異的なｍＲＮＡが存在していることを示した。各細胞株の１％アガロースゲルを示す。Ｇ３ＰＤＨの遺伝子は各セットで増幅されており、ＲＮＡが保全されていること、そして模擬トランスフェクトセットが陽性コントロールとなることが示された。ＣＤ８０  ｐＳＩトランスフェクトＣＯＳ−７細胞はＣＤ８０ｍＲＮＡ及びＧ３ＰＤＨメッセージを発現したが、ＣＤ２８ｐＳＩトランスフェクトＣＯＳ−７細胞は、ＣＤ２８とＧＰＤＨの遺伝子を発現した。模擬トランスフェクト細胞はＧ３ＰＤＨのみを発現した。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
［結果］
ＣＤ２８発現に及ぼすイン・ビボに於ける急性感染の効果を調べる為に、ネコＡＵ０４、ＡＵＵ３及びＯＡＣ２にはウイルスを静脈注射し感染させ、一方ネコＡＷＧ３及びＯＡＥ６には培地のみを注射した。ＦＡＣＳ分析は、実験動物とコントロールとのＣＤ４：ＣＤ８比には幾つかの違いがあることを示す。コントロール動物は全体としてほぼ１：２の比を保っていたのに対し、実験系では若干のふらつきが認められ、１動物では比は１；１まで低下していた。
【表３】
2010252804.tif 000068
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６０】
ＣＤ８０及びＣＤ２８ＲＮＡ発現の時間経過を追うことで各分子のメッセージが存在していること、そしてＣｏｎＡ刺激後０、８、１６及び２４時間の時点でＰＣＲにより増幅できることが示された。この半定量的ＰＣＲ法は、視覚的にバンドが検出できる最低の増幅サイクルを探し、それよりメッセージの相対量を推測するものである。実験群では、ＣＤ８０特異バンドはいずれの感染時期においても２０及び２５サイクルでは出現しなかったが、３０サイクルでは何れの時期ついてもゲル上にＣＤ８０のメッセージを視覚的に確認することができた。ＣＤ２８メッセージも、２５サイクルでは１６時間で僅かに視認できるバンドがあったが、３０サイクルでは何れの時点についても視覚確認できた。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６１】
同様のプロトコールをＦＩＶ感染及び悲感染ネコのＰＢＭＣより抽出されたＲＮＡについて実施した。ＣＤ２８及びＣＤ８０特異的ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を利用して、各ペプチドに関し転写されたメッセージ量の相対的アイディアを示した。時間経過実験で既に行われた様に、サンプルを２０、２５及び３０サイクル時に取り出した。ＣＤ８０及びＣＤ２８産物は２５サイクルでは視認できたが、２０サイクルではメッセージは検出できなかった（表４）。実験群とコントロール群の間では、いずれのメッセージの発現についても差は示されなかった。いずれのサブセットについても、産物が視認できた増幅サイクル点には変動が認められた。
【表４】
2010252804.tif 000069
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
ＦＩＶｇａｇ特異的プライマーを用いたＦＥＴＪ及びＭＣＨ５．４細胞株のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅は、ＭＣＨ５．４細胞株が感染可能であり、活動的感染を示したのに対し、ＦＥＴＪ細胞株はｇａｇ特異的ＲＮＡの増幅を起こさないことを示した。ＦＩＶ特異的産物は、感染ＭＣＨ５．４サンプルより抽出されたＲＮＡから容易に増幅できるが、非感染コントロールから同様に抽出されたＲＮＡからは増幅されなかった。同様の反応を、ＦＩＶペタルム及びメリーランド株に曝したＪＥＴＪ細胞株より抽出されたＲＮＡについて行ったが、同様の条件においては視認できる産物は得られなかった（データ未提示）。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
半定量的ＰＣＲは、各細胞株がＣＤ２８メッセージを生ずることができることを示した。ＦＥＴＪ非感染コントロールでの増幅からは、発現パターンが前記のＣＤ２８に関する時間経過でのパターンに似ていることが示された。刺激後０時ではバンドは３０サイクルまで視認できないが、刺激後１６時間目では２５サイクルによりバンドは視認できた。興味深いことに、感染ＭＣＨ５．４細胞株は、いずれのコントロールとも異なるパターンを示した。実験群では、メッセージは３０サイクルまで０又は１６時間にいずれにつてもバンドは認められなかった。Ｇ３ＰＤＨメッセージはコントロールとして増幅され、ＲＮＡの保全性と濃度は確認された。感染はＣＤ２８ＲＮＡメッセージの発現に影響すると考えられた。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
ノーザンブロット分析は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を利用し発見されたデータの確認に利用された。１６時間ＣｏｎＡ刺激された未感染ＭＣＨ５．４細胞からのＲＮＡは、最も強いプローブハイブリダイゼーションを示した。未感染株の未刺激サンプルは、刺激された、又は刺激されていない感染ＭＣＨ５．４細胞株Ｒなのいずれよりも強いハイブリダイゼーション率を示した。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
オートラジオグラフに加えて、ＢｅｔａＧｅｎ上に放射活性が測定された。ＣＤ２８ハイブリダイゼーションの生測定値は、続けて行われたブロットのＧＡＰＤＨプローブから得た数値により正規化された（表５）。
【表５】
2010252804.tif 000070
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
ＭＨＣ５．４細胞株のサイトカインＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲからはＩＬ−２に関するメッセージのみが増幅可能であることが示された。ＩＬ−４、ＩＬ−６又はＩＦＮγは３０サイクルにおいても増幅されなかったが、ＩＬ−２メッセージは容易に検出された。
【外国語明細書】
2010252804000001.pdf