(57)【要約】【課題】植物、葉、根、果実及び種子等の植物の一部及び植物細胞で多価不飽和長鎖脂肪酸を調製するための組成物及び方法の提供。【解決手段】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓのエイコサペンタエン酸の生産に寄与する遺伝子やＶｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓにおけるドコサヘキサエン酸の生産に関連する新規な遺伝子を含めた、多価不飽和長鎖脂肪酸の生産に必要なＰＫＳ様遺伝子をコードする核酸配列及び構築物、そのような長鎖多価不飽和脂肪酸の生産に関連する１又は複数のＰＫＳ様遺伝子をコードする１又は複数の導入遺伝子を有すると共に発現するトランスジェニック植物、植物系におけるＰＫＳ様遺伝子の発現により、植物、植物の一部、及び組織の脂肪酸プロファイルを改変する、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸等の多価不飽和長鎖脂肪酸の大量生産、脂肪酸プロファイルの人為的操作による商業的な量の新規な植物油及び製品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離核酸であって、
図６に示した、ＯＲＦ６（配列番号７７）、ＯＲＦ７（配列番号７８）、ＯＲＦ８（配列番号７９）、及びＯＲＦ９（配列番号８０）から成る群より選択されたＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓヌクレオチド配列から成る単離核酸。
【請求項２】
単離核酸であって、
宿主細胞で発現されるとドコサヘキサエン酸を生産する、ポリケチド様合成系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成る単離核酸。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が海洋細菌に由来するものである請求項２に記載の単離核酸。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来するものである請求項２に記載の単離核酸。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、図６に示した、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＯＲＦ８（配列番号７９）である請求項２に記載の単離核酸。
【請求項６】
配列番号６９、７１及び７６から成る群より選択された配列番号で示された配列を含むＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍヌクレオチド配列から成る単離核酸。
【請求項７】
単離核酸であって、
図６に示した、ＯＲＦ６（配列番号７７）、ＯＲＦ７（配列番号７８）、ＯＲＦ８（配列番号７９）、及びＯＲＦ９（配列番号８０）から成る群より選択されたＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓヌクレオチド配列の少なくとも５０ヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列から成る単離核酸。
【請求項８】
請求項６に記載の単離核酸の少なくとも１つのコピーを有する組換え微生物細胞。
【請求項９】
前記細胞は長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するのに必要なポリケチド様合成系の各構成要素を有する請求項８に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１０】
前記細胞は真核生物細胞である請求項９に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１１】
前記真核生物細胞は、菌類細胞、藻類細胞又は動物細胞である請求項１０に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１２】
前記菌類細胞は酵母細胞であり、前記藻類細胞は海洋藻類細胞である請求項１１に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１３】
前記細胞は原核生物細胞である請求項８に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１４】
前記細胞は細菌細胞又はシアノバクテリア細胞である請求項１３に記載の組換え微生物細胞。
【請求項１５】
前記細菌細胞はラクトバチルス属の細胞である請求項１４に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
前記組換え微生物細胞は前記単離核酸を欠いた非組換え微生物細胞と比較して２２：６脂肪酸が増強されている請求項８に記載の微生物細胞。
【請求項１７】
微生物細胞培養物におけるドコサヘキサエン酸の生産方法であって、前記方法は複数の微生物細胞を有する微生物細胞培養物を成育する工程から成り、前記微生物細胞又は前記微生物細胞の祖先が、ポリケチド合成系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸を備えたベクターにより形質転換され、前記１又は複数の核酸は、前記１又は複数の核酸が発現して前記微生物細胞培養物中でドコサヘキサエン酸が生産されるような条件で、プロモーターと機能的に連結している、方法。
【請求項１８】
植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の生産方法であって、前記方法は複数の植物細胞を有する植物を成育する工程から成り、前記植物細胞又は前記植物細胞の祖先が、長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸を備えたベクターにより形質転換され、前記核酸の各々は、前記ペプチドが発現して前記植物細胞内で長鎖多価不飽和脂肪酸が生産されるような条件で、植物細胞内で機能するプロモーターと機能的に連結している、方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列が配列番号６９、７１及び７６から成る群より選択された配列番号で示される請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物細胞内で生産された前記長鎖多価不飽和脂肪酸が２０：５及び２２：６脂肪酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド配列が、図６に示したＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＯＲＦ６（配列番号７７）、ＯＲＦ７（配列番号７８）、ＯＲＦ８（配列番号７９）、及びＯＲＦ９（配列番号８０）、及び図４に示したＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ  ＯＲＦ６（配列番号８３）、ＯＲＦ７（配列番号８４）、ＯＲＦ８（配列番号８５）、ＯＲＦ９（配列番号８６）、並びに配列番号４と相補的なＯＲＦ３から成る群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸構築物は２又はそれより多くのポリケチド合成系に由来するものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記長鎖多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記長鎖多価不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
組換え植物細胞であって、
長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成系の１又は複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸であって、その各々が前記植物細胞内で機能するプロモーターと機能的に連結している核酸を含む組換え植物細胞。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列は配列番号６９、７１及び７６から成る群より選択された配列番号で示される請求項２５に記載の組換え植物細胞。
【請求項２７】
前記組換え植物細胞は組換え種子細胞である請求項２６に記載の組換え植物細胞。
【請求項２８】
前記組換え種子細胞は組換え胚細胞である請求項２７に記載の組換え植物細胞。
【請求項２９】
前記組換え植物細胞はアブラナ属（Brassica）、大豆、ベニバナ、及びヒマワリから成る群より選択された植物に由来する請求項２６に記載の組換え植物細胞。
【請求項３０】
請求項２６に記載の組換え植物細胞によって生産された植物油。
【請求項３１】
前記植物油はエイコサペンタエン酸を含む請求項３０に記載の植物油。
【請求項３２】
前記植物油はドコサヘキサエン酸を含む請求項３０に記載の植物油。
【請求項３３】
前記植物油はカプセルに包まれている請求項３０に記載の植物油。
【請求項３４】
請求項３０に記載の植物油を含む栄養補助食品。
【請求項３５】
組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞であって、
長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成系のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１または複数の核酸であって、その各々が前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で機能するプロモーターと機能的に連結している核酸を含む組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３６】
前記長鎖多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求項３５に記載の組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号６９、７１及び７６から成る群より選択された配列番号で示されている請求項３５に記載の組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項３８】
組換え植物細胞により生産された植物油であって、前記植物油は前記植物油に対して外因性の長鎖多価不飽和脂肪酸を含み、前記植物細胞が、
前記植物細胞又は前記植物細胞の先祖を長鎖多価不飽和脂肪酸を生産するポリケチド合成系の１または複数のポリペプチドを有するベクターにより形質転換する工程であって、前記核酸の各々が前記植物細胞内で機能するプロモーターと機能的に連結している核酸を含む工程
から成る方法に従って生産される植物油。
【請求項３９】
前記長鎖多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸である請求項３８に記載の植物油。
【請求項４０】
前記長鎖多価不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸である請求項３８に記載の植物油。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、宿主細胞内の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）を改変することができる酵素及び／又は酵素構成要素の調節と、宿主細胞でＰＵＦＡｓを生産するための構築物及び方法と関する。本発明は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ由来の遺伝子を用いたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の生産により例証される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）の２つの主要なファミリーは、エイコサペンタエン酸を例とするω３脂肪酸とアラキドン酸を例とするω６脂肪酸である。ＰＵＦＡｓは、細胞の原形質膜の重要な構成要素であり、原形質膜ではＰＵＦＡｓはリン脂質等の形式で見出され、トリグリセリドとしても見出される。ＰＵＦＡｓは、プロスタサイクリン類、ロイコトリエン類、プロスタグランジン類等の、ヒト及び動物における他の重要な分子に対する前駆物質としても機能する。重要な長鎖ＰＵＦＡｓとしては、様々な種類の魚油中に主に見出されるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｂｉｅｎｎｉｓ）、ルリジサ（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）及びクロフサスグリ（Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ）を始めとする多くの植物の種子中に見出されるガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）、魚油及び植物種子に見出されるステアリドン酸（ＳＤＡ）及びＧＬＡと共に糸状菌類に見出されるアラキドン酸（ＡＲＡ）が挙げられる。ＡＲＡは肝臓及び副腎を始めとする動物組織から精製することができる。ＥＰＡ又はＤＨＡのいずれかを合成するいくつかの海洋細菌属が知られている。ＤＨＡはＡＲＡと共にヒトの乳の中に存在する。
【０００３】
ＰＵＦＡｓは、（特に幼児の脳における）適切な発達並びに組織の形成及び修復に必要である。例としてＤＨＡは多くのヒト細胞膜（特に神経細胞（灰白質）、筋肉細胞、及び精子における細胞膜）の重要な構成要素であり、一般に脳の機能の発達に影響を及ぼし、視覚の発達に必須であると考えられている。ＥＰＡ及びＤＮＡは、多くの栄養学的及び薬理学的用途を有している。例として、糖尿病（特に非インスリン依存型）に罹患した成人はＤＨＡレベルの不足及び不均衡を示し、これが後の冠動脈の病気に寄与すると考えられている。従って、ＤＨＡのバランスが取れた食事は糖尿病患者にとって有益であり得る。
【０００４】
ＤＨＡの場合、種々の海洋生物、冷水の海洋魚から得られた油、及び卵黄の画分を始めとする、商業的生産用の多くの供給源が存在する。魚からのＤＨＡの精製は、技術的に困難であるために比較的高くつくため、ＤＨＡを高価かつ供給不足なものとしている。Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ及びＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ等の藻類やＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ等の海洋菌類では、ＤＨＡが細胞の脂肪酸含量のうちの４８％に達することもある。数種の細菌でもＤＨＡを生産することが報告されている。それらは一般にＶｉｂｒｉｃ  ｍａｒｉｎｕｓ等の深海細菌である。ＡＲＡの場合、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｐｈｙｔｉｕｍ属及びＰｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ属等の微生物を、商業的生産用に使用することができる。ＳＤＡの商業的供給源としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍａ属及びＥｃｈｉｕｍ属が挙げられる。ＧＬＡの商業的供給源としては、マツヨイグサ、クロフサスグリ及びルリヂサが挙げられる。しかし、天然供給源からのＰＵＦＡｓの商業的生産に関しては、いくつかの欠点が存在する。動物や植物等のＰＵＦＡの天然供給源は、異成分性の高い油の組成物を有する傾向がある。そのような供給源から得られた油は、１または複数の所望のＰＵＦＡを分離したり又は複数の所望のＰＵＦＡに濃縮される油を生産したりするためには、大いに精製しなければならない可能性がある。
【０００５】
天然供給源は、制御不能な有効性の変化も受ける。魚のストックは天然の変化を受けたり、魚の濫獲によって枯渇したりする可能性がある。動物油、特に魚油は、環境汚染物質を蓄積し得る。天候や病気が、魚及び植物の両供給源の生産高を変動させる可能性もある。油の生産用の代替作物の生産に有効な耕作地は、人口密度の定常的な増大と、それに関連する残りの耕作に適した土地での食物生産の必要性の増大との理由から、競争を受けやすい。ルリヂサのようにＰＵＦＡｓを生産しない作物は、商業的栽培に適合せず、モノカルチャーではうまく機能しない可能性がある。従って、そのような作物の栽培は、収益性がより高くより確立された作物を育成できる所では、経済的競争力がない。また、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ等の生物の大規模な発酵は高価である。天然動物組織は、ＡＲＡを少量含み、加工が困難である。Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ等の微生物は、商業的規模で培養するのが困難である。
【０００６】
ＰＵＦＡｓを含有する栄養補助食品及び医薬品製剤は、ＰＵＦＡ供給源の欠点を保持している。魚油カプセルのような栄養補助食品は低レベルの特定の所望成分を含有するため、多用量が必要となる。用量が多いと、汚染物質を含めた高レベルの望ましくない成分を摂取することとなる。脂肪酸の補助食品を提供する場合には注意する必要がある。その理由は、添加のしすぎが、内因性生合成経路を抑制し、インビボでの種々の脂肪画分における他の必須脂肪酸との競争につながり、望ましくない結果となる可能性があるためである。例えば、ω３脂肪酸の高い食事を摂っているエスキモー族は、出血の傾向が高い（米国特許第４，８７４，６０３号）。魚油は不快な味と臭いを有するが、これを補助食品などの所望の製品から経済的に分離することが不可能であり得る。補助食品の味及び臭いが不快であると、そのような補助食品に関する摂取プログラムが望ましくないものとなり、患者による受諾を抑制する可能性がある。
【０００７】
ＰＵＦＡ生合成に関する酵素として、多くの酵素が同定されている。リノール酸（ＬＡ，１８：２  Δ９，１２）はΔ１２−デサチュラーゼによりオレイン酸（１８：１  Δ９）から生産される。ＧＬＡ（１８：３  Δ６，９，１２）はΔ６−デサチュラーゼによりリノール酸（ＬＡ，１８：２  Δ９，１２）から生産される。ＡＲＡ（２０：４  Δ５，８，１１，１４）はΔ５−デサチュラーゼにより触媒され、ＤＧＬＡ（２０：３  Δ８，１１，１４）から生産される。エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、すべてがシス配置の、５つの二重結合（Δ５，８，１１，１４，１７）を有する２０個の炭素から成るオメガ３系列脂肪酸である。ＥＰＡとその関連のＤＨＡ（Δ４，７，１０，１３，１６，１９，Ｃ２２：６）は、一連の延長及び不飽和化反応によりオレイン酸から生産される。さらに、１８個の炭素から成るＰＵＦＡｓを２０及び２２炭素鎖長に伸ばすには、１つのエロンガーゼ（又は複数のエロンガーゼ）が必要である。しかし、動物はオレイン酸（１８：１  Δ９）をリノール酸（１８：２  Δ９，１２）に変換することができない。同様に、μ−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３  Δ９，１２，１５）も動物では合成することができない。菌類及び植物等の他の真核生物は、Δ１２位及びΔ１５位で不飽和化する酵素を有している。従って、動物の主な多価不飽和脂肪酸は、食事及び／又はリノール酸（１８：２  Δ９，１２）の不飽和化及び延長に由来するものであるか、又はμ−リノレン酸（１８：３  Δ９，１２，１５）に由来するものであるかのいずれかである。
【０００８】
多価不飽和脂肪酸は、栄養学的目的、医薬用目的、工業用目的、及び他の目的に有効であると考えられている。天然源及び化学合成からの多価不飽和脂肪酸の供給拡大は、商業上の要求に足りていない。大半の植物種に一般的なリノール酸（ＬＡ，１８：２  Δ９，１２）からのより飽和した長鎖ＰＵＦＡｓへの脂肪酸合成には多くの別個のデサチュラーゼ及びエロンガーゼ酵素が必要であるため、ＥＰＡ及びＤＨＡの発現のための植物宿主細胞の構築には、少なくともＥＰＡ及びＤＨＡに対する、発現を達成するための５つ又は６つの別個の酵素活性の発現が必要であり、そのようなＰＵＦＡｓを一定量の生産するにはさらなる構築の努力（例えば基質と競合する酵素のダウンレギュレーション、突然変異誘発による高い酵素活性の構築、又はプラスミド細胞小器官への酵素のターゲティング）が必要である。従って、ＰＵＦＡ生合成に関する遺伝子物質を、そのような脂肪酸を天然で生産する種から手に入れ、商業的な量のＰＵＦＡｓが生産されるよう操作できる異種系にて、そのような単離物質を単独で又は組み合わせて発現させることが重要である。
【０００９】
（関連文献）
ＥＰＡ又はＤＨＡのいずれかを合成する海洋細菌のいくつかの属が同定されている（ドロング（DeLong）及びヤヤノス（Yayanos ）、Applied and Environmental Microbiology（1986）51:730-737（非特許文献１））。Sagami Chemical Research Instituteの研究者は、海洋細菌であるＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓからの遺伝子クラスタにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉにおけるＥＰＡの生産を報告した。Ｅ．ｃｏｌｉでのＥＰＡの脂肪酸合成には、最小５つの読み取り枠（ＯＲＦｓ）必要である。現在までのところ、そのような遺伝子によってコードされたタンパク質の機能の詳細な特徴付けは報告されていない（ヤザワ（Yazawa）（1996）Lipids 31 ，S-297（非特許文献２）；ＷＯ第９３／２３５４５号（特許文献１）；ＷＯ第９６／２１７３５号（特許文献２））。
【００１０】
ヤザワ（Yazawa）、米国特許第５，６８３，８９８号（特許文献３）によって公表された読み取り枠（ＯＲＦ）３のタンパク質配列は、機能タンパク質ではない。ヤザワ（Yazawa）は、該タンパク質を、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＰＫＳ様クラスタ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｕ７３９３５）のヌクレオチド９０１６−９０１４の位置のメチオニンコドンから開始し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＰＫＳ様クラスタのヌクレオチド８１８５−８１８３の位置の停止コドンで終わるタンパク質として定義している。しかし、このＯＲＦをＯＲＦ３以外の完全なＰＫＳ様クラスタを含むＥ．ｃｏｌｉ株において異種プロモーターの制御下で発現させた場合、組換え細胞はＥＰＡを生産しない。
【００１１】
ポリケチドは、二次代謝産物であり、その合成は脂肪酸合成の酵素反応に類似する一連の酵素反応に関する（ホップウッド（Hopwood ）及びシャーマン（Sherman ）、Annu. Rev. Genet. （1990）24:37-66（非特許文献３）、キャッツ（Katz）及びドナジオ（Donadio ）、in Annual Review of Microbiology（1993）47:875-912（非特許文献４）の総説を参照のこと）。新規な抗生物質を生産するためのポリケチドシンターゼの使用が提唱されている（ハッチンソン（Hutchinson）とフジイ（Fujii ）、Annual Review of Microbiology （1995）49:20 1238（非特許文献５））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ第９３／２３５４５号
【特許文献２】ＷＯ第９６／２１７３５号
【特許文献３】米国特許第５，６８３，８９８号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ドロング（DeLong）及びヤヤノス（Yayanos ）、Applied and Environmental Microbiology（1986）51:730-737
【非特許文献２】ヤザワ（Yazawa）（1996）Lipids 31 ，S-297
【非特許文献３】ホップウッド（Hopwood ）及びシャーマン（Sherman ）、Annu. Rev. Genet. （1990）24:37-66
【非特許文献４】キャッツ（Katz）及びドナジオ（Donadio ）、in Annual Review of Microbiology（1993）47:875-912
【非特許文献５】ハッチンソン（Hutchinson）とフジイ（Fujii ）、Annual Review of Microbiology （1995）49:20 1238
【発明の概要】
【００１４】
植物及び植物細胞でポリケチド様合成（ＰＫＳ様）遺伝子を使用することによる、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）を調製するための新規な組成物及び方法が提供される。公知の及び提唱されている脂肪酸合成遺伝子によるＰＵＦＡの生産方法に対して、本発明によると、ＰＫＳ様系の遺伝子の使用による、ＰＵＦＡの生産のための構築物及び方法が提供される。該方法は、宿主細胞内で機能する発現カセットにより形質転換された対象の宿主細胞を生育する工程から成り、発現カセットは転写開始調節領域及び翻訳開始調節領域から成り、ＰＵＦＡｓの生産を調節することができるＰＫＳ様系の遺伝子又は構成要素のＤＮＡ配列（ＰＫＳ様遺伝子）に対して、読み枠５’内で結合される。宿主細胞のＰＵＦＡプロファイルの変更は、ＰＵＦＡ生合成を担う完全なＰＫＳ様系を宿主細胞へ導入した後の発現により達成される。本発明は、例えば、ＤＨＡ及びＥＰＡの大量生産や、宿主細胞並びに食用植物組織及び／又は植物部分の脂肪酸プロファイルの改変に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＥＰＡ遺伝子クラスタのＯＲＦｓに対する呼称を提供する。遺伝子の構成を示し、Ｅ．ｃｏｌｉでのＥＰＡの生産に必須のＯＲＦｓには番号を付けている。
【図１Ｂ】ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＥＰＡ遺伝子クラスタのＯＲＦｓに対する呼称を提供する。サブクローンに対して与えられる呼称を示す。
【図２】ＯＲＦ６（図２Ａ）、ＯＲＦ７（図２Ｂ）、ＯＲＦ８（図２Ｃ）、ＯＲＦ９（図２Ｄ）及び／又はＥ３（図２Ｅ）のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＰＫＳ様ドメイン構造、モチーフ及び「ブラスト」適合を提供する。図２ＦはＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＥＰＡ  ＯＲＦｓに存在するドメインに関連する、Ａｎａｂｅａｎａ染色体の領域の構造を示す。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＳＪ１６でのパンテテニレーション−ＯＲＦ３に対する結果を示す。イメージは、列挙したプラスミドにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（ＳＪ１６株）由来の［Ｃ14］β−アラニン標識タンパク質を示す。レーン１はｐＵＣ１９を示し、レーン２はｐＰＡ−ＮＥＢ（ΔＯＲＦ３）を示し、レーン３はｐＡＡ−Ｎｅｂ（ＥＰＡ＋）を示し、レーン４はＯＲＦ６サブクローンを示し、レーン５はＯＲＦ６＋ＯＲＦ３サブクローンを示し、レーン６はＯＲＦ３サブクローンを示す。ＡＣＰ及び未知（ではあるが以前に観察された）３５ｋＤタンパク質が、すべてのサンプルにおいて標識されている。レーン２及び５で検出された高分子量のタンパク質は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ６遺伝子の完全長（最大のバンド）及び切断された（truncated ）産物である（ウェスタン分析により確認）。Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＳＪ１６のβ−アラニン合成を条件付きでブロックしている。
【図４Ａ−１】ＯＲＦの３−９を含む、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａに見出されるＰＫＳ様クラスタに対するＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図４Ａ−２】図４Ａ−１の続きを示す図である。
【図４Ａ−３】図４Ａ−２の続きを示す図である。
【図４Ａ−４】図４Ａ−３の続きを示す図である。
【図４Ａ−５】図４Ａ−４の続きを示す図である。
【図４Ａ−６】図４Ａ−５の続きを示す図である。
【図４Ａ−７】図４Ａ−６の続きを示す図である。
【図４Ａ−８】図４Ａ−７の続きを示す図である。
【図４Ａ−９】図４Ａ−８の続きを示す図である。
【図４Ａ−１０】図４Ａ−９の続きを示す図である。
【図４Ａ−１１】図４Ａ−１０の続きを示す図である。
【図４Ａ−１２】図４Ａ−１１の続きを示す図である。
【図４Ａ−１３】図４Ａ−１２の続きを示す図である。
【図４Ａ−１４】図４Ａ−１３の続きを示す図である。
【図４Ａ−１５】図４Ａ−１４の続きを示す図である。
【図４Ａ−１６】図４Ａ−１５の続きを示す図である。
【図４Ａ−１７】図４Ａ−１６の続きを示す図である。
【図４Ａ−１８】図４Ａ−１７の続きを示す図である。
【図４Ａ−１９】図４Ａ−１８の続きを示す図である。
【図４Ａ−２０】図４Ａ−１９の続きを示す図である。
【図４Ａ−２１】図４Ａ−２０の続きを示す図である。
【図４Ａ−２２】図４Ａ−２１の続きを示す図である。
【図４Ａ−２３】図４Ａ−２２の続きを示す図である。
【図４Ａ−２４】図４Ａ−２３の続きを示す図である。
【図４Ａ−２５】図４Ａ−２４の続きを示す図である。
【図４Ａ−２６】図４Ａ−２５の続きを示す図である。
【図４Ａ−２７】図４Ａ−２６の続きを示す図である。
【図４Ａ−２８】図４Ａ−２７の続きを示す図である。
【図４Ａ−２９】図４Ａ−２８の続きを示す図である。
【図４Ａ−３０】図４Ａ−２９の続きを示す図である。
【図４Ａ−３１】図４Ａ−３０の続きを示す図である。
【図４Ａ−３２】図４Ａ−３１の続きを示す図である。
【図４Ａ−３３】図４Ａ−３２の続きを示す図である。
【図４Ａ−３４】図４Ａ−３３の続きを示す図である。
【図４Ａ−３５】図４Ａ−３４の続きを示す図である。
【図４Ａ−３６】図４Ａ−３５の続きを示す図である。
【図４Ａ−３７】図４Ａ−３６の続きを示す図である。
【図４Ａ−３８】図４Ａ−３７の続きを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示した配列のうちのヌクレオチド６１２１−８１０３によりコードされた、ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｃ】図４Ａに示した鎖であるヌクレオチド９０１６−８１８６の相補鎖から翻訳した、公表ＯＲＦ３のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４Ｄ−１】ヌクレオチド配列８１８６−９１５７（配列番号４）を示す。この配列の相補鎖は、ＥＰＡ合成に活性なＯＲＦ３をコードしている。
【図４Ｄ−２】図４Ｄ−１の続きを示す図である。
【図４Ｅ】図４Ａのヌクレオチド９６８１−１２５９０（配列番号８１）によりコードされたＯＲＦ４に対応するアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図４Ｆ】図４Ａのヌクレオチド１３０４０−１３９０３（配列番号８２）によりコードされたＯＲＦ５に対応するアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４Ｇ−１】図４Ａのヌクレオチド１３９０６−２２１７３（配列番号８３）によりコードされたＯＲＦ６に対応するアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図４Ｇ−２】図４Ｇ−１の続きを示す図である。
【図４Ｇ−３】図４Ｇ−２の続きを示す図である。
【図４Ｈ】図４Ａのヌクレオチド２２２０３−２４５１５（配列番号８４）によりコードされたＯＲＦ７に対応するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図４Ｉ−１】図４Ａのヌクレオチド２４５１８−３０５２９（配列番号８５）によりコードされたＯＲＦ８に対応するアミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図４Ｉ−２】図４Ｉ−１の続きを示す図である。
【図４Ｊ】図４Ａのヌクレオチド３０７３０−３２３５８（配列番号８６）によりコードされたＯＲＦ９に対応するアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図４Ｋ】ヌクレオチド３２８３４−３４３２７に対応するアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図５−１】ＯＲＦ６，７，８及び９を含むＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓの約４０ｋｂＤＮＡ断片におけるＰＫＳ様クラスタに対する配列（配列番号１２）を示す。各ＯＲＦについての最初及び最後のコドンは以下の通りである：ＯＲＦ６：１７３９４，２５３５２；ＯＲＦ７：２５５０９，２８１６０；ＯＲＦ８：２８２０９，３４２６５；ＯＲＦ９：３４４５４，３６１１８。
【図５−２】図５−１の続きを示す図である。
【図５−３】図５−２の続きを示す図である。
【図５−４】図５−３の続きを示す図である。
【図５−５】図５−４の続きを示す図である。
【図５−６】図５−５の続きを示す図である。
【図５−７】図５−６の続きを示す図である。
【図５−８】図５−７の続きを示す図である。
【図５−９】図５−８の続きを示す図である。
【図５−１０】図５−９の続きを示す図である。
【図５−１１】図５−１０の続きを示す図である。
【図５−１２】図５−１１の続きを示す図である。
【図５−１３】図５−１２の続きを示す図である。
【図５−１４】図５−１３の続きを示す図である。
【図５−１５】図５−１４の続きを示す図である。
【図５−１６】図５−１５の続きを示す図である。
【図５−１７】図５−１６の続きを示す図である。
【図５−１８】図５−１７の続きを示す図である。
【図５−１９】図５−１８の続きを示す図である。
【図５−２０】図５−１９の続きを示す図である。
【図５−２１】図５−２０の続きを示す図である。
【図５−２２】図５−２１の続きを示す図である。
【図５−２３】図５−２２の続きを示す図である。
【図５−２４】図５−２３の続きを示す図である。
【図５−２５】図５−２４の続きを示す図である。
【図５−２６】図５−２５の続きを示す図である。
【図５−２７】図５−２６の続きを示す図である。
【図５−２８】図５−２７の続きを示す図である。
【図５−２９】図５−２８の続きを示す図である。
【図６−１】ＯＲＦ６，７，８及び９を含む図５のＰＫＳ様クラスタの約１９ｋｂ部分に対する配列（配列番号１３）を示す。各ＯＲＦについての最初及び最後のコドンは以下の通りである：ＯＲＦ６：４１１，８３６９（配列番号７７）；ＯＲＦ７：８５２６，１１１７７（配列番号７８）；ＯＲＦ８：１１２２６，１７２８２（配列番号７９）；ＯＲＦ９：１７４７１，１９１３５（配列番号８０）。
【図６−２】図６−１の続きを示す図である。
【図６−３】図６−２の続きを示す図である。
【図６−４】図６−３の続きを示す図である。
【図６−５】図６−４の続きを示す図である。
【図６−６】図６−５の続きを示す図である。
【図６−７】図６−６の続きを示す図である。
【図６−８】図６−７の続きを示す図である。
【図６−９】図６−８の続きを示す図である。
【図６−１０】図６−９の続きを示す図である。
【図６−１１】図６−１０の続きを示す図である。
【図６−１２】図６−１１の続きを示す図である。
【図６−１３】図６−１２の続きを示す図である。
【図７】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓとＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのＰＫＳ様遺伝子クラスタの比較を示す。図７ＢはＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのオペロン配列である。
【図８】ＯＲＦ６，７及び８は読み枠２にあるが、ＯＲＦ９は読み枠３にあることを示す、図７Ｂに示したＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのＰＫＳ様遺伝子クラスタ部分の拡大図。
【図９】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ６の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ６が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ６が水平軸側に描かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。中央にある繰り返し線は、ＯＲＦ６に見出される複数のＡＣＰドメインに対応する。
【図１０】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ７の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ７が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ７が水平軸側に描かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。
【図１１】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ８の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ８が水平軸側に描かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。
【図１２】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ及びＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓのＯＲＦ９の配列相同性を実証する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ９が垂直方向軸側に描かれ、Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ９が水平軸側に描かれている。線は、６０％相同性を有するタンパク質の領域を示す。
【図１３】種々の補足実験と得られたＰＵＦＡ産物とを示す。右側には、Ｖｉｂｒｉｏ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ株において製造された最も長いＰＵＦＡが左側に示されている。白抜きボックスはＳｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のＯＲＦｓを示す。中が描かれたボックスはＶｉｂｒｉｏ由来のＯＲＦｓを示す。
【図１４】Ｅ．ｃｏｌｉＦａｄ  Ｅ−での、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のＯＲＦ８を用いた、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のｐＥＰＡＤ８（欠失ＯＲＦ８）の補足遺伝子からの脂肪酸の生産を示す。クロマトグラムは、ＥＰＡ（２０：５）ピークを示す。
【図１５】Ｅ．ｃｏｌｉＦａｄ  Ｅ−での、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のＯＲＦ８を用いた、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のｐＥＰＡＤ８（欠失ＯＲＦ８）の補足遺伝子からの脂肪酸の生産を示す。クロマトグラムは、ＥＰＡ（２０：５）ピーク及び（２２：６）ＤＨＡピークを示す。
【図１６】ＯＲＦ８の補足実験と図１５に示したクロマトグラムから得たＰＵＦＡ値の表。
【図１７】ｐＣＧＮ７７７０の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図１８】ｐＣＧＮ８５３５の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図１９】ｐＣＧＮ８５３７の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２０】ｐＣＧＮ８５２５の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２１】ヤザワ（Yazawa）（１９９６）、前掲、に定義されたＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦｓと、図４に開示したＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦｓとの比較。ヌクレオチド９１５７−９１５５の位置でロイシン（ＴＴＧ）コドンから始まりヌクレオチド８１８５８−１８３の位置で停止コドンで終わるタンパク質を、ＯＲＦ３以外の完全ＰＫＳ様クラスタを含むＥ．ｃｏｌｉ株中で異質プロモーターの制御下で発現させている場合、組換え細胞はＥＰＡを生産する。従って、公表されたタンパク質配列は間違っている可能性があり、該タンパク質のコーディング配列は、ヌクレオチド９１５７−９１５５の位置のＴＴＧコドンから始まるか、ヌクレオチド９１７２−９１７０の位置のＴＴＧコドンから始まる可能性がある。この情報は、機能ＰＫＳ様クラスタ異質系の発現に重要である。
【図２２】ｐＣＧＮ８５６０の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２３】ｐＣＧＮ８５５６の構成要素を示すプラスミドマップ。
【図２４】公表されたＯＲＦ３の上流での翻訳ＤＮＡ配列（配列番号１４）と、それがコードしている対応アミノ酸（配列番号１５）とを示す。９０１６位置のＡＴＧ開始コドンは、ヤザワ（Yazawa）ら（１９９６）、前掲、に説明されたタンパク質に対する開始コドンである。他の矢印は、細菌での開始コドンとしてやはり機能するＴＴＧ又はＡＴＴコドンを示す。ＯＲＦ３が９０１６位置の公表されたＡＴＧコドンから始まる場合、タンパク質はＥＰＡ生産のためには機能しない。ＯＲＦ３が９１５７位置のＴＴＧコドンから始まる場合、タンパク質はＥＰＡ合成を促進することができる。
【図２５】実施例１におけるプライマーを用いた、ＳＳ９  Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒに関するＰＣＲ産物（配列番号１６）を示す。
【図２６−１】実施例１に示したプライマーを用いたＰＣＲより得たプローブ配列（配列番号１７−３１）。
【図２６−２】図２６−１の続きを示す図である。
【図２６−３】図２６−２の続きを示す図である。
【図２６−４】図２６−３の続きを示す図である。
【図２７Ａ−１】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンのヌクレオチド配列を示す。ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５、ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６及び架橋ＰＣＲ産物が、部分ｃＤＮＡ配列（ＯＲＦ６同族体）に組み込まれている。
【図２７Ａ−２】図２７Ａ−１の続きを示す図である。
【図２７Ｂ−１】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンのヌクレオチド配列を示す。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｄ２（ｈｇｌｃ／ＯＲＦ７／ＯＲＦ８／ＯＲＦ９同族体）。
【図２７Ｂ−２】図２７Ｂ−１の続きを示す図である。
【図２７Ｂ−３】図２７Ｂ−２の続きを示す図である。
【図２７Ｃ−１】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンのヌクレオチド配列を示す。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５、ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９及び架橋ＰＣＲ産物が、部分ｃＤＮＡ配列（ＯＲＦ８／ＯＲＦ９同族体）に組み込まれている。
【図２７Ｃ−２】図２７Ｃ−１の続きを示す図である。
【図２８】Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＰＫＳ配列とＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ配列との間の類似性の略図。
【図２９Ａ】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンから推定したアミノ酸配列。ＯＲＦ６同族体。
【図２９Ｂ】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンから推定したアミノ酸配列。ｈｇｌｃ／ＯＲＦ７／ＯＲＦ８／ＯＲＦ９同族体。
【図２９Ｃ】Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンから推定したアミノ酸配列。ＯＲＦ８／ＯＲＦ９同族体。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（好ましい実施形態の説明）
本発明によれば、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ又は他の微生物に由来するポリケチド様合成（ＰＫＳ様）経路遺伝子の一部又は全部を含む、宿主細胞、特に宿主植物細胞の多価不飽和長鎖脂肪酸含量を改変するための新規なＤＮＡ配列、ＤＮＡ構築物及び方法が提供される。本発明は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ中のＥＰＡ合成遺伝子がポリケチド様合成経路を構成することを証明している。機能はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ及びＶｉｂｒｉｏ遺伝子によるものであり、宿主細胞においてＥＰＡ及びＤＨＡを生産するための方法が提供される。該方法は、宿主細胞における１または複数のＰＵＦＡの量を増大させることが可能なポリペプチドをコードするＤＮＡを有する発現カセットにより細胞を形質転換する工程から成る。好ましくは、宿主細胞のゲノムへの発現カセットの組み込みを与える組込み構築物が調製される。宿主細胞はＰＫＳ様遺伝子活性を有する１つのポリペプチド（複数のポリペプチド）をコードするセンス又はアンチセンスＤＮＡを発現するように操作される。「ＰＫＳ様遺伝子」が意味するのは、関連のＰＫＳ様活性の１または複数の任意の機能の原因となっているポリペプチドである。「ポリペプチド」が意味するのは、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）に関係ない、任意のアミノ酸鎖である。宿主細胞の性質次第で、発現された酵素に対する基質が宿主細胞によって生産されるか、又は外因的に供給される。植物組織及び／又は葉、根、果実及び種子等の植物の一部におけるＰＵＦＡ生産の選択的制御は特に重要である。本発明は、宿主細胞でＥＰＡ、ＤＨＡ、及び他の関連ＰＵＦＡｓを合成するために使用することができる。
【００１７】
ＰＵＦＡｓのトランスジェニックによる生産には多くの利点がある。例として、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａと同様トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉでは、リン脂質画分、特にｓｎ−２位置にＥＰＡが蓄積する。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ又はＥ．ｃｏｌｉのいずれかで生産される構造脂質とは実質的に異なる構造脂質を、所望の宿主細胞内で生産することが可能である。さらに、特定の宿主細胞におけるＰＵＦＡｓのトランスジェニックによる生産は、魚又は植物等の天然供給源からの精製よりも優れたいくつかの利点を提供する。トランスジェニック植物では、ＰＫＳ様の系を用いることにより、マロニルＣｏ−Ａ及びアセチルＣｏ−Ａを基質として利用する脂肪酸のデノボ生産を介してＰＵＦＡｓを生産する系により、ＰＵＦＡｓの脂肪酸合成が細胞質にて達成される。このように、基質の競合や宿主における脂肪酸合成の通常の産物のＰＵＦＡ生産への迂回等の問題が回避される。
【００１８】
組換え植物での脂肪酸の生産は、宿主に新しい合成経路を与えるか又は望ましくない経路を抑制して、レベル所望のＰＵＦＡｓ又はその共役体のレベルを増大させるか望ましくないＰＵＦＡｓのレベルを減少させることにより、天然の植物脂肪酸プロファイルを変更する能力を提供する。トランスジェニック植物における脂肪酸の生産も、特定の組織及び／又は植物の一部におけるＰＫＳ様遺伝子の発現により、そのような組織及び／又は一部における所望のＰＵＦＡｓの大きな増加が達成され、そのような組織からの回収がより経済的となることを意味するという効果を提供する。植物組織及び／又は植物の一部における発現は、特に組織又は一部が種子、葉、果実、花、根等のように容易に収穫されるものである場合には、特定の有効性を示す。例えば、種子で所望のＰＵＦＡｓを発現させることが可能であり、種子油を単離する方法はよく確立されている。所望のＰＵＦＡｓの精製のための供給源を供給することに加えて、種子油成分は、特定のＰＵＦＡプロファイルを濃縮された形で有する種子油を提供するために、単独の又はエロンガーゼ等の遺伝子と組み合わせたＰＫＳ様遺伝子の発現により操作され得る。濃縮された種子油は、動物の乳及び／又はヒトによる授乳が不可能又は望ましくないか、成人及び幼児の両方で栄養不良又は疾病の場合に幼児用調合乳として機能する合成又は半合成乳に添加することができる。
【００１９】
トランスジェニック微生物による脂肪酸の生産は、高等生物と比較して多くの微生物は非常に簡単な油の組成を有することが知られており、所望の成分の精製が容易であるという効果を提供する。微生物による生産は、天候や食物の供給などの外部変化によって生じる変動の影響を受けない。微生物によって生産された油は、環境汚染物質による汚染を実質的に受けない。さらに、微生物は特定の用途を有する特定の形式でＰＵＦＡｓを提供し得る。例えば、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）は、トリグリセリドの１位及び３位に優先的にＰＵＦＡｓを与え、膵リパーゼによる消化は、脂肪酸をそれらの位置から解離させる。スピルリナ由来のトリグリセリドのヒト又は動物による消化の後、そのようなＰＵＦＡｓは膵リパーゼにより遊離脂肪酸として解離され、例えば幼児の脳の発達に直接利用される。また、微生物油の生産は、培養条件を制御することにより、特に微生物により発現された酵素に対する特定の基質を与えるか又は望ましくない生化学経路を抑制する化合物を添加することにより、操作することができる。そのような効果に加えて、組換え微生物からの脂肪酸の生産は、宿主に新しい合成経路を与えるか又は望ましくない経路を抑制して、レベル所望のＰＵＦＡｓ又はその共役体のレベルを増大させるか望ましくないＰＵＦＡｓのレベルを減少させることにより、天然の微生物脂肪酸プロファイルを変更する能力を提供する。
【００２０】
動物での脂肪酸の生産もいくつかの利点を与える。動物でのデサチュラーゼ遺伝子の発現により、動物組織における所望のＰＵＦＡｓのレベルが非常に増大し、そのような組織からの回収をより経済的なものとすることができる。例えば、所望のＰＵＦＡｓが動物の母乳中で発現している場合、動物の乳からのＰＵＦＡｓの単離方法はよく確立されている。所望のＰＵＦＡｓの精製のための供給源を提供することに加えて、動物の母乳は、幼児の発達の種々の段階の間にヒト母乳と非常に類似したＰＵＦＡ組成物を動物の乳に与えるために、デサチュラーゼ遺伝子の発現により操作され得る。母乳化した動物の乳は、ヒトによる授乳が不可能又は望ましくないか、栄養不良又は疾病の場合に、幼児用調合乳として機能し得る。
【００２１】
所望のＰＫＳ様遺伝子をコードするＤＮＡは、種々の方法で同定することが可能である。１つの方法において、所望のＰＫＳ様遺伝子の供給源である、例えばＳｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ又はＶｉｂｒｉｏ種由来のゲノムライブラリは、酵素的に又は化学的に合成された検出可能なプローブによりスクリーニングされる。ＰＫＳ様遺伝子を有するＯＲＦｓの供給源は、高圧下又は比較的低温で選択的に成育するＤＨＡ生産又はＥＰＡ生産深海細菌を始めとする、所望のＰＵＦＡを生産する生物である。ＥＰＡ又はＤＨＡを生産するＳｈｅｗａｎｅｌｌａ等の微生物を、ＰＫＳ様遺伝子の供給源として使用することが可能である。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は非天然ヌクレオチド、若しくはそれらの混合物より製造することが可能である。プローブは通常の又はストリンジェンシーを減らしたハイブリッド形成方法で既知のＰＫＳ様遺伝子のＤＮＡから酵素的に合成することが可能である。核酸プローブの設計及びアニーリング条件の議論に関しては例えば、サンブルック（Sambrook）ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual （第2 版）、1 −3 巻、Cold Spring Harbor Laboratory ，（1989）又はC urrent Protocols in Molecular Biology，エフ  アウスベル（F. Ausubel）ら編、Greene Publishing and Wiley Interscience，New York（1987）を参照されたい。各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＵＦＡ酵素をコードしている核酸を操作する技術、例えば、発現ベクターへのポリペプチドをコードする核酸配列のサブクローニング、プローブ標識、ＤＮＡハイブリッド形成は、前掲のサンブルックに概説されている。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプローブも、供給源をスクリーニングするために使用することができ、オリゴヌクレオチドプローブは、既知のＰＫＳ様遺伝子間で保存されている配列を含む既知ＰＫＳ様遺伝子配列に基づき得るか、所望の精製タンパク質から得られるペプチド配列に基づき得る。アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子コードの縮重を包含するように縮重されるか、供給源である生物の好ましいコドンを選ぶように偏向される。代わりに、所望のタンパク質は完全に配列決定された、その実施されたポリペプチドのＤＮＡ完全合成体であり得る。
【００２３】
所望のＤＮＡが一旦単離されると、該ＤＮＡは既知の方法で配列決定される。そのような方法にはエラーが起こりやすく、同じ領域を複数回配列決定することはルーチン作業であり、得られた配列（特に、ＧＣ塩基含量の高い領域等の、繰り返しドメイン、広い二次構造、又は異常塩基組成物を有する領域）には測定できる割合の誤りがまだ存在すると予想されることが、当該技術分野では認識されている。矛盾が生じた場合には、再度の配列決定が行われ、特定の方法が使用され得る。特定の方法には、異なる温度；異なる酵素；オリゴヌクレオチドの高次構造を形成する能力を変更するタンパク質；ＩＴＰ又はメチル化ｄＧＴＰ等の変更ヌクレオチド；例えばホルムアミドの添加等の異なるゲル組成；異なるプライマー又は問題の領域とは異なる距離に位置するプライマー；又は一本鎖ＤＮＡ等の異なる鋳型を用いた配列決定条件の変更が含まれる。ｍＲＮＡの配列決定も使用することが可能である。
【００２４】
大半の場合、ＰＫＳ様遺伝子活性を有するポリペプチドに対するコード配列の一部又は全体は、天然供給源に由来するものである。しかし場合によっては、例えば発現を高めるために、宿主の好ましいコドンを用いて、コドンの全体又は一部を改変することが望ましい。宿主の好ましいコドンは、関連の特定宿主種に大量に発現しているタンパク質中の、最も頻度が高いコドンから決定することができる。このようにＰＫＳ様遺伝子活性を有するポリペプチドに対するコード配列は、全体又は一部が合成される。ＤＮＡの全体又は一部は、転写ｍＲＮＡに存在する任意の不安定化配列又は二次構造の領域を除去すべく、合成することもできる。ＤＮＡの全体又は一部は、塩基組成を所望の宿主細胞にとってより好ましい組成に変更すべく、合成することもできる。配列を合成し、配列をまとめるための方法が参考文献によく確立されている。インビトロ突然変異誘発及び選択、部位特異的突然変異誘発、又は他の手段を用いて、自然ＰＫＳ様遺伝子の変異体を得、所望の多価不飽和脂肪酸の長い半減期又は高速生産等の、宿主細胞で機能する望ましい物理的及び動力学的パラメータにより、インビボでＰＫＳ様遺伝子活性を有するポリペプチドを生産することができる。
【００２５】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ  ＯＲＦｓ並びにＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ及びＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの対応するＯＲＦｓは、特に重要である。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ  ＰＫＳ様遺伝子は、ＥＰＡの生合成を遂行するためにトランスジェニック植物で発現させることが可能である。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ  ＰＫＳ様遺伝子と配列が実質的に同一な他のＤＮＡｓ、又はＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ又はＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍから同定されたＤＮＡｓのようなＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓのＰＫＳ様遺伝子と実質的に同様なポリペプチドをコードするＤＮＡｓが使用され得る。配列が実質的に同一であるとは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ  ＰＫＳ様遺伝子のＤＮＡ配列又は該遺伝子に対するアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、順番に増加する少なくとも６０％、８０％、９０％又は９５％の相同性を示すアミノ酸又は核酸配列を糸する。ポリペプチドの場合、比較する配列の長さは一般に、少なくとも１６アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、及び最も好ましくは３５アミノ酸である。核酸の場合、比較する配列の長さは一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、及びより好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、及び最も好ましくは、１１０ヌクレオチドである。
【００２６】
相同性は一般に、配列分析ソフトウェア、例えば、Genetics Computer Group University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, ウィスコンシン州マジソン（Madison ）53705 のSequence Analysis ソフトウェアパッケージ、MEGAlign（DNAStar, Inc., 1228 S.Park St., ウィスコンシン州マジソン（Madison ）53715 ）、及び MacVector（Oxford Molecular Group, 2105S. Bascom Avenue, Suite 200,カリフォルニア州キャンベル（Campbell）95008 ）を用いて測定される。BLAST （National Center for Biotechnology Information （WCBI） www.ncbi.nlm.gov; FASTA（Pearson 及び Lipma n 、 Science（1985） 227:1435-1446）。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、及び他の修飾に対する相同性の程度の割り当てにより、同様な配列に適合する。同類置換は一般に以下のグループ内での置換を含む：グリシンとアラニン；バリン、イソロイシンと、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンとグルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニン；並びにフェニルアラニンとチロシン。置換は疎水性又は親水性の保存に基づいて（カイト（Kyte）及びドゥーリトル（Doolittle ）、J. Mel. Biol. （1982）157 ：105-132 ）、又は同様なポリペプチド二次構造を取る能力（チョウ（Chou）及びファスマン（Fasman）, Adv. Enzymol. （1978）47:45-148 、1978）に基づいて行うことも可能である。プローブ配列に対する関連タンパク質は、ｐ>０．０１、好ましくは>１０-7又は１０-8である時に同定される。
【００２７】
同じか又は別の生物由来の関連ＰＫＳ様遺伝子が本発明に包含される。そのような関連ＰＫＳ様遺伝子には、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａの同じか異なる種内で自然に生じる開示されたＰＫＳ様ＯＲＦｓの変異体、開示されたＰＫＳ様遺伝子の他の種由来の同族体、及び類似の機能及び活性を有する進化上関連するタンパク質が含まれる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓＰＫＳ様遺伝子とは実質的に同一ではないが、ＰＫＳ様系の一部としてＰＵＦＡｓを生産するように同様な様式で作用するＰＫＳ様遺伝子も含まれる。関連ＰＫＳ様遺伝子は、開示されたＰＫＳ様遺伝子と実質的に同じように機能する能力により同定される。つまり、関連ＰＫＳ様遺伝子は、対応するＳｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ又はＶｉｂｒｉｏのＯＲＦｓの代わりを果たすことができるが、なお有効にＥＰＡ又はＤＨＡを生産する。関連ＰＫＳ様遺伝子は、開示されたＰＫＳ様遺伝子と相同な配列に対する配列データベースのスクリーニングによって、開示されたＰＫＳ様遺伝子に基づくプローブを供給源生物より構築したライブラリとハイブリッド形成することによって、又は供給源生物由来のｍＲＮＡ及び開示されたＰＫＳ様遺伝子に基づくプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによっても同定することが可能である。従って、「ＰＫＳ様遺伝子」という言葉は、本明細書に開示したヌクレオチド配列のみを指すわけではなく、対立遺伝子である他の核酸又は上記ヌクレオチド配列の種変異体をも指す。そのような言葉は、組換え技術を用いた単一点突然変異等の意図的突然変異により、ＰＵＦＡ酵素をコードするＤＮＡ読み取り枠の短い部分を除去により、又は新たなコドンとの置換又は新たなコドンの添加により導入された、非自然突然変異を含むことも理解される。そのような小さな変更は、元の発現産物の免疫同一性及び／又はその生物活性を実質的に維持する。変更されたＰＵＦＡ酵素の生物学的特性は、酵素を適切な細胞系で発現させたり酵素ＰＵＦＡｓを合成する該酵素の能力を決定したりすることにより決定することができる。小さいと考えられる特定の酵素の改変には、同様な化学的特性を有するアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸をアスパラギン酸と置換又はグルタミンをアスパラギンと置換）が含まれる。
【００２８】
他の生物由来のＰＵＦＡ  ＰＫＳ様系を使用した場合、ポリペプチドＰＫＳ様遺伝子活性に重要なＰＫＳ様遺伝子の領域は定型の突然変異誘発、得られた変異ポリペプチドの発現及びその活性の決定により決定することができる。変異体のコーディング領域には、欠失、挿入及び点突然変異、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。一般的な機能分析は、タンパク質が機能するのに必要なタンパク質のＮ及びＣ末端の限界を決定する欠失突然変異誘発から始まり、次に、機能するのに必要な領域をさらに詳しく決定するために、内部欠失、挿入又は点突然変異が読取り枠で行われる。カセット突然変異誘発又は全合成のような他の技術も使用することが可能である。欠失突然変異誘発は、例えば、５’又は３’コーディング領域を逐次除去するエキソヌクレアーゼを用いることにより達成される。そのような技術のためのキットを利用することが可能である。欠失後、コーディング領域は開始コドン又は停止コドンを含むオリゴヌクレオチドを５’又は３’欠失後の欠失したコーディング領域にライゲートすることにより完成される。
【００２９】
代わりに、開始コドン又は停止コドンを含むオリゴヌクレオチドは部位特異的突然変異誘発、突然変異ＰＣＲ又は既存の制限部位で消化したＤＮＡに対するライゲートを始めとする種々の方法によりコーディング領域に挿入される。内部欠失は、部位特異的突然変異誘発又は突然変異ＰＣＲを介した突然変異プライマーの使用により、ＤＮＡの既存の制限部位の使用を含む種々の方法により同様に行われ得る。挿入はリンカー走査突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又は突然変異ＰＣＲ等の方法により行われる。点突然変異は、部位特異的突然変異誘発又は突然変異ＰＣＲ等の技術により行われる。
【００３０】
活性に重要なＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドの領域を同定するためには、化学的突然変異誘発も使用される。変異構築物を発現させ、得られた変更タンパク質のＰＫＳ様遺伝子として機能する能力が評価される。そのような構造−機能分析では、どの領域が欠失し、どの領域が挿入を許容し、どの点突然変異が天然ＰＫＳ様遺伝子と実質的に同じ様に機能する突然変異タンパク質を許容するかを決定することができる。それらをコードするすべてのそのような突然変異タンパク質及びヌクレオチド配列は、本発明の範囲内にある。ＥＰＡはＳｈｅｗａｎｅｌｌａではＰＫＳ様系の産物として生産され、ＥＰＡ遺伝子はその系の構成要素をコードしている。Ｖｉｂｒｉｏでは、同様な系によりＤＨＡが生産される。そのような脂肪酸を合成するクラスタ遺伝子によりコードされる酵素は、通常細菌及び植物で見出されるＣ１６及びＣ１８脂肪酸の合成に関与する酵素をコードする脂肪酸合成遺伝子とは異なる遺伝子クラスタによってコードされる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＥＰＡ遺伝子はＰＫＳ様遺伝子クラスタを示し、ＥＰＡの生産は、少なくともある程度は、細菌のタイプＩＩ型ＦＡＳ系から独立している。従って、植物細胞の細胞質におけるＥＰＡの生産は、適切な植物調節信号下での植物細胞におけるＰＫＳ様経路遺伝子の発現により達成することができる。
【００３１】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＥＰＡ遺伝子により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉでのＥＰＡの生産は、嫌気的成長の間進行し、Ｏ2依存的なデサチュラーゼ反応は関与しないことを示している。ＥＰＡの生産に必須のＯＲＦｓによりコードされたタンパク質の分析により、ＰＫＳ様系の特徴であるドメイン構造が存在することが明らかとなっている。図２Ａは「ＢＬＡＳＴ」データバンクサーチにより検出されたドメイン、モチーフ、及び重要な相同性の概要を示す。ＥＰＡはＰＫＳ様経路で生産される他の物質の多くとは異なるため、すなわち分子に沿って３炭素間隔で離間した５個のｃｉｓ二重結合を有するため、ＥＰＡの合成のためのＰＫＳ様系は予想されていない。
【００３２】
さらに  ＥＰＡ  ＯＲＦｓに存在するドメインを用いたＢＬＡＳＴサーチにより、いくつかのドメインがＡｎａｂｅａｎａに見出されたＰＫＳ様遺伝子クラスタによりコードされたタンパク質に関連することが明らかになっている。Ａｎａｂｅａｎａ染色体のそのような領域の構造を図２Ｆに示す。Ａｎａｂｅａｎａ  ＰＫＳ様遺伝子は、異質細胞の糖脂質層に見出された長鎖（Ｃ２６）のヒドロキシ脂肪酸の合成と結びつけられる。Ａｎａｂｅａｎａタンパク質に対する相同なＥＰＡタンパク質ドメインを図２Ｆに示す。
【００３３】
ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦ６は、活性部位モチーフ（ＤＸＡＣ*）（配列番号３２）と同様、多くのＴｙｐｅ  ＩＩ  ＫＡＳタンパク質の端部に存在する「ＧＦＧＧ」モチーフ（配列番号３３）を含む、ＫＡＳドメインを有する（図２Ａを参照されたい）。延長されたモチーフも存在するが、本明細書には示さない。次はマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインである。活性部位モチーフ（ＧＨＳ*ＸＧ）（配列番号３４）付近の配列は、メチルマロン酸塩ではなくマロン酸塩を移動させる、すなわち酢酸塩様ＡＴｓに類似することを示唆している。リンカー領域の後、各々が約１００アミノ酸の長さである６個の繰り返しドメインから成り、ＰＫＳ様ＡＣＰ配列と相同なクラスタが存在する。各々は、パンテテイン結合部位モチーフ（ＬＧＸＤＳ*（Ｌ／Ｉ））（配列番号３５及び３６を含む）。６個のそのようなＡＣＰドメインの存在は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）又はＰＫＳ様系では以前には観察されていなかった。タンパク質の端部付近には、β−ケト−ＡＣＰレダクターゼ（ＫＲ）に対する相同性を示す領域が存在する。ＫＲは、ピリジンヌクレオチド結合部位モチーフ「ＧＸＧＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）（配列番号３７、３８及び３９）を含む。
【００３４】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８は活性部位と終結モチーフ（図２）とを含むＫＡＳドメインから始まる。データバンクで最もよく適合したのは、Ａｎａｂｅａｎａ  ＨｇｌＤである。  ＨｇｌＣのＮ末端半分と相同な配列を有するドメインも存在する。この領域は、活性部位及び終結モチーフを欠いているが、やはりＫＡＳタンパク質に対する弱い相同性を示す。該領域は、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＰＫＳ様系のいわゆる鎖長因子（ＣＬＦ）と呼ばれる特性を有する。ＯＲＦ８はＰＫＳ様系によるＥＰＡ対ＤＨＡの生産を指向していると思われる。また、ＯＲＦ８はβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ（ＤＨ）と相同な２つのドメインを有する。両ドメインに対して最もよく適合するのは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦａｂＡ、つまり得られた二重結合の脱水反応及び異性化（ｔｒａｎｓからｃｉｓへの）の両方を遂行する二つの作用を有する酵素である。第１のＤＨドメインは、ＦａｂＡ触媒作用に関連する活性部位ヒスチジン（Ｈ）及び隣接システイン（Ｃ）を含む。第２のＤＨドメインは活性部位Ｈは有するが隣接Ｃを欠いている（図２Ｃ）。第２ＤＨドメインに関するＢｌａｓｔサーチはＦａｂＺ、すなわちイソメラーゼ活性を持たない第２のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨに対して適合していることも示す。
【００３５】
ＯＲＦ７（図２Ｂ）のＮ末端半分は、データバンクで有意に適合するものがない。Ｃ末端半分と最もよく適合するのは、Ａｎａｂｅａｎａ  ＨｇｌｃのＣ末端部分である。このドメインはアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）モチーフ（ＧＸＳＸＧ）（配列番号４０）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉマロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰ  ＡＴの結晶構造に基づいて延長された活性部位配列を比較すると、ＯＲＦ７は活性部位（Ｅ．ｃｏｌｉ名称；Ｑ１１及びＲ１１７）から水を排除するのに必要な２つの残基を欠いていることが明らかである。以上のデータは、ＯＲＦ７がチオエステラーゼとして機能し得ることを示唆している。
【００３６】
ＯＲＦ９（図２Ｄ）は、Ａｎａｂｅａｎａ  Ｈｇｌクラスタの未知の機能を有するＯＲＦと相同である。ＯＲＦ９は、窒素固定細菌における調節タンパク質であるＮＩＦＡとも非常に弱い相同性を示す。ＯＲＦ９タンパク質に関する調節の役割はこれまで排除されていない。ＯＲＦ３（図２Ｅ）はＡｎａｂｅａｎａ  ＨｅｔＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥｎｔＤ、及びバチルスのＳｆｐと相同である。近年、ＨｅｔＩ、ＥｎｔＤ及びＳｆｐを含むリン酸パンテテニルトランスフェラーゼの新しい酵素ファミリーが同定されている。（ランブロット  アール  エイチ（Lamblot RH）ら（1996）A new enzyme superfamily-the phophopantetheinyl transferases. Chemistry&Biology,第3 巻、第11号、923-936 ）。図３のデータは、ＯＲＦ３の存在がＯＲＦ６タンパク質へのβ−アラニン（すなわちパンテテイン）の添加に必要であることを証明している。このように、ＯＲＦ３は、ＯＲＦ６  ＡＣＰドメインに特異的なリン酸パンテテニルトランスフェラーゼをコードしている（ヘイドック  エス  エフ（Haydock SF）ら（1995）を参照のこと。互いに異なる配列モチーフが、モジュラーポリケチドシンターゼの（メチル）マロニル−ＣｏＡ：アシルキャリアタンパク質トランスアシラードメインの基質特異性と相関関係にあった。FEBS Lett.,374, 246-248 ）マロン酸塩は、ＥＰＡ合成の延長反応に使用される炭素の供給源である。その上、マロニル−ＡＣＰではなくマロニル−ＣｏＡがＡＴ基質である。すなわち、ＯＲＦ６のＡＴ領域はマロニル−ＣｏＡを利用する。
【００３７】
ＰＵＦＡ生産を担う生物のＰＫＳ様遺伝子をコードするＤＮＡ配列が一旦得られると、該ＤＮＡ配列は宿主細胞内の複製が可能なベクターに配置されるか、ＰＣＲ又はロングＰＣＲ等の技術によりインビトロで増幅される。複製用のベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド等を含み得る。望ましいベクターには、対象の遺伝子の突然変異誘発用や対象の遺伝子の宿主細胞での発現用に有効なベクターが含まれる。ＰＵＦＡ合成酵素又は相同タンパク質は、組換えにより作成された種々の細胞で発現させることが可能である。ＰＵＦＡ酵素をコードするＤＮＡを発現させるためには、多くの発現系が利用可能である。ＰＵＦＡ酵素をコードする天然又は合成核酸の発現は、通常、発現ベクター内のプロモーター（構成プロモータ又は誘導プロモータ）にＤＮＡを機能的に連結させることにより達成される。発現ベクターとは、その転写を与える追加セグメントと機能的に連結した、ＰＵＦＡ酵素をコードするセグメントを有する線形又は円形のＤＮＡ分子を意味する。そのような追加セグメントには、プロモーター及びターミネーター配列が含まれる。発現ベクターは、１または複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含み得る。発現ベクターは一般にプラスミド又はウイルスＤＮＡに由来し、両方の構成要素を含み得る。「機能的に連結した」とは、セグメントが、例えば、転写がプロモーターで始まりコーディングセグメントを介してターミネータまで進むというように、その意図された目的と適合して機能するように配列されることを意味する。サンブルックら、前掲を参照されたい。
【００３８】
ロングＰＣＲの技術は、大きな構築物のインビトロ増幅を可能にし、突然変異誘発や発現シグナルの付加等の対象遺伝子の改変及び得られた構築物の増幅が、複製用ベクター又は宿主細胞を使用しなくても完全にインビトロで起こるようになっている。インビトロでの発現は、例えば、インビトロでの使用のために設計された発現ベクター内に、デサチュラーゼポリペプチドに対するコーディング領域を配置し、ウサギ網赤血球溶菌液と補因子を添加することにより達成することが可能である。標識アミノ酸を所望に応じて組み込み得る。そのようなインビトロ発現ベクターは、使用する系に必要な発現シグナルの一部又は全部を提供し得る。上記方法は当該技術分野においてよく知られており、系の構成要素は市販されている。反応混合物は、例えばＰＫＳ用酵素の活性を決定することによりＰＫＳ用酵素用に直接測定されるか、合成酵素を精製して測定し得る。
【００３９】
宿主細胞での発現は、一時的な又は安定な様式で遂行することが可能である。一時的発現は、宿主細胞で機能する発現シグナルを含む導入構築物から起こる。ただし、構築物が複製しなかったり宿主細胞にめったに融合しなかったりする場合や、宿主細胞が増殖しない場合は除く。一時的発現は、対象遺伝子と機能的に連結した調節可能なプロモーターの活性を誘導することによっても遂行することが可能であるが、そのような誘導システムはしばしば発現の基礎レベルが低い。安定な発現は、宿主ゲノムに組み込み可能であるか又は宿主細胞で自律的に複製する核酸構築物の導入により達成することが可能である。対象遺伝子の安定な発現は、発現構築物上に位置するか発現構築物により移入された選択マーカーの使用によって選択され、後にマーカーを発現している細胞が選択される。安定な発現が組込みによる場合、構築物の組込みは宿主ゲノム内でランダムに起こるか、宿主の座との標的組換えに十分な程度の宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含む構築物の使用によって狙いを定められる。構築物が内因性の座を標的とする場合、転写及び翻訳調節領域の全体又は一部が該内因性の座によって与えられる。宿主細胞での発現を達成するために、形質転換ＤＮＡは、宿主細胞で機能する転写及び翻訳の開始及び終結調節領域と機能的に連結される。
【００４０】
転写及び翻訳開始及び終結領域は、発現すべきＤＮＡ、既知の又は所望の系での発現を可能にすると推測されている遺伝子、発現ベクター、化学合成を始めとする種々の非限定的な供給源に由来する。終結領域は開始領域が得られた遺伝子の３’領域に由来するか、異なる遺伝子に由来し得る。多数の終結領域が知られており、それらは同じ及び異なる属及び種に由来する種々の宿主で満足のいくものであることが判明している。終結領域は、任意の特定の特性のためというより便宜のため選択される。同じ細胞中で２以上のＰＫＳ様ＯＲＦを発現させる場合、適切な調節領域及び発現方法を使用すべきである。導入された遺伝子は、複製用ベクターの使用か、宿主ゲノムへの組込みにより宿主細胞で増幅される。２又はそれより多い遺伝子が別個の複製ベクターで発現している場合、各ベクターは異なる複製手段を有することが望ましい。導入された各構築物は、組み込まれていようが組み込まれていまいが、安定な発現を維持し構築物間での構成要素の再結合を防止するために、異なる選択手段を有すると共に、他の構築物との相同性を欠いているべきである。調節領域の賢明な選択、選択手段及び導入された構築物の増幅方法は、導入された遺伝子がすべて所望の産物の合成を与えるのに必要なレベルで発現されるように、実験的に決定することができる。
【００４１】
ＰＵＦＡ酵素を発現させるためには種々の原核生物発現系を使用することが可能である。転写のためのプロモーター、リボゾーム結合部位、及び転写ターミネーターを有する発現ベクターを構築することが可能である。Ｅ．ｃｏｌｉにおける上記目的に適した調節領域の例は、ヤノフスキ（Yanofsky）（1984）J. Bacteriol., 158:1018-1024に説明されたようなＥ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレータ領域や、ハースコヴィッツ（Hersko witz）とハーゲン（Hagen ）（1980）Ann. Rev. Genet., 14:399-445に説明されたようなファージラムダ（Ｐλ）の左方向プロモーターである。Ｅ．ｃｏｌｉ中で形質転換されるＤＮＡベクターに選択マーカーを入れることも有効である。そのようなマーカーの例には、アンピシリン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールへの耐性を明確に示す遺伝子が含まれる。細菌宿主での外来遺伝子の発現に使用されるベクターは、一般に、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーと宿主細胞において機能するプロモーターとを含む。細菌を形質転換するのに有効なプラスミドには、ｐＢＲ３２２（ボリバー（Bolivar ）ら、（1977）Gene 2:95-113 ）、ｐＵＣプラスミド（メッシング（Messing ）（1983）Meth. Enzymol. 101:20-77、ヴィエラ（Vieira）とメッシング（Messing ）、（1982）Gene 19:259-268 ）、ｐＣＱＣ２（Queen 、前掲）、及びそれらの派生物が含まれる。プラスミドは、ウイルスの構成要素と細菌の構成要素の両方を含んでいてもよい。生物学的に活性な形式でタンパク質を回収する方法については、米国特許第４，９６６，９６３号及び４，９９９，４２２号に議論されている。両特許は参照により本明細書に組み込まれる。他の原核生物発現系の説明についてはサンブルックらの文献を参照されたい。
【００４２】
真核生物における発現の場合、本発明の実施に使用される宿主細胞としては、ホ乳類、鳥類、植物、昆虫類、及び菌類細胞が包含される。例として、植物の場合、プロモーターの選択は、構成又は誘導による発現が望ましいかどうかということや、植物の特定の生育段階及び／又は特定の組織においてＰＵＦＡｓを生産することが望ましいかどうかということに一部依存する。ＯＲＦｓの発現のために特定の組織及び／又は生育段階を選択するという考えは、競合する基質又は特定のＰＵＦＡの発現を許容する宿主細胞の能力によって決まり得る。米国特許第５，４６３，１７４号、米国特許第４，９４３，６７４号、米国特許第５，１０６，７３９号、米国特許第５，１７５，０９５号、米国特許第５，４２０，０３４号、米国特許第５，１８８，９５８号、及び米国特許第５，５８９，３７９号に説明されたような特定の調節配列を用いることにより、発現は、種子、葉、果実、花及び根等の宿主植物内の特定位置に定められる。宿主細胞が酵母である場合、特に宿主種由来の、酵母細胞で機能する転写領域と翻訳領域が与えられる。転写開始調節領域は、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ等の解糖経路の遺伝子や、酸性ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ等の調節可能な遺伝子から得られる。構成転写又は誘導転写が望ましいかどうか、問題の読み取り枠と関連させたプロモーターの特定の有効性、強力なプロモーターを誘導転写を許容する異なるプロモーター由来の制御領域と結合させる能力、構築のし易さ等に従って、特定の状況で多くの調節配列のうちの任意の１つを使用することが可能である。特に重要なのは、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターである。ガラクトースで誘導されるプロモーター（ＧＡＬ１、ＧＬＡ７、及びＧＡＬ１０）は酵母において高レベルレベルかつ調節されたタンパク質の発現を得るために広く使用されている（ルー（Lue ）ら、（1987）Mol. Cell. Biol.7 :3446; ジョンストン（Johnston）、（1987）Microbiol. Rev. 51:458）。ＧＡＬプロモーターからの転写は、ＧＡＬ４タンパク質により活性化される。ＧＡＬ４タンパク質はガラクトースが存在する場合にプロモーター領域に結合し、転写を活性化させる。ガラクトースが存在しない場合、アンタゴニストＧＡＬ８０がＧＡＬ４に結合し、ＧＡＬ４による転写の活性化を防止する。ガラクトースの添加により、ＧＡＬ８０によるＧＡＬ４の活性化抑制が防止される。好ましくは、終結領域は酵母遺伝子、特にサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）又はクルベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。２つのホ乳類遺伝子の３’領域、つまりγインターフェロンとα２インターフェロンも酵母で機能することが知られている。
【００４３】
翻訳開始コドンＡＴＧを包囲するヌクレオチド配列が酵母細胞での発現に影響を及ぼすことがわかっている。所望のポリペプチドが酵母で少量しか発現していない場合、内因性遺伝子のヌクレオチド配列を、最良の遺伝子発現を得るのに有効な酵母翻訳開始を含むように改変することが可能である。配列サッカロマイセスでの発現の場合、それは、発現が有効でない遺伝子をフレーム内で内因性サッカロマイセス遺伝子（好ましくはラクターゼ遺伝子のように高度に発現する遺伝子）と融合させることにより、該発現が有効でない遺伝子の部位特異的突然変異誘発により行うことができる。
【００４４】
植物細胞細胞質でのＰＫＳ様遺伝子の代替方法は、葉緑体を酵素の標的にする方法がある。葉緑体をタンパク質の標的にする１方法は、タンパク質のＮ末端に取り付けられたリーダーペプチドを必要とする。一般的に使用されているリーダーペプチドは、植物リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニットに由来するものである。他の葉緑体タンパク質に由来するリーダー配列も使用することが可能である。葉緑体をタンパク質の標的にする他の方法は、葉緑体ゲノムの形質転換である（レシピエント細胞の外来ＤＮＡで被覆された高速タングステンミクロ投射物との衝撃を用いたクラミドモナス  ラインハーティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（緑藻の１つ）の葉緑体の安定な形質転換が説明されている。例えば、ブラウワーズ（Blowers ）ら、Plant Cell（1989）1:123-132 及びデバキー（Debuchy ）ら、EMBO J（1989）8:2803-2809 を参照されたい。）タングステンミクロ投射物を用いた形質転換技術はクライン（Kline ）ら、Nature（ロンドン）（1987）327:70-73 ）に説明されている。葉緑体の形質転換の最も一般的な方法は微粒子銃技術の使用に関するが、この目的で開発された他の技術も使用することが可能である。外来遺伝子産物を葉緑体（シリアー（Shrier）ら、EMBO J. （1985）4:25-32 ）又はミトコンドリア（mitochnodria）（ボウトリ（Boutry）ら、前掲）へ狙いを定めて入れる方法が説明されている。核内遺伝子産物を葉緑体内に転位するための運搬ペプチドの利用についてのトマイ（Tomai ）ら、Gen. Biol. Chem.（1988）263:15105-15109 及び米国特許第４，９４０，８３５も参照されたい。タンパク質の輸送を葉緑体に向ける方法はケナウフ（Kenauf）TIBTECH （1987）5:40-47 に概説されている。
【００４５】
ＰＵＦＡｓを鳥類種及び鳥類の細胞で生産する場合、遺伝子の移行は当該技術分野において周知の手順に従って細胞ＰＵＦＡ酵素をコードする核酸配列を導入することにより行われる。トランスジェニック動物が望ましい場合、多能性の胚性幹細胞に導入遺伝子をコードするＰＵＦＡ酵素を備えたベクターを与え、成動物中で生育することができる（米国特許第５，１６２，２１５号；オノ（Ono ）ら、（1996）Comparative Biochemistry and Physiology A 113 (3 ):287-292 ；ＷＯ第９６１２７９３号；ＷＯ第９６０６１６０号）。大半の場合、導入遺伝子はＰＵＦＡｓの生産を増大させるべく高レベルのＰＫＳ様酵素を発現するように改変される。導入遺伝子は、例えば、特定組織や卵黄のような卵の一部における発現を指向するプロモーターのように、鳥類細胞で機能する転写調節領域及び／又は翻訳調節領域を与えることにより改変することができる。遺伝子調節領域はニワトリ貧血ウイルス又は鳥類白血病ウイルス又はニワトリ卵白アルブミン等の鳥類遺伝子を始めとする種々の供給源より得ることができる。
【００４６】
昆虫細胞におけるＰＵＦＡｓの生産は、ＰＫＳ様移行遺伝子を入れたバキュロウイルス発現ベクターの使用により行うことが可能である。バキュロウイルス発現ベクターは、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）等のいくつかの市販先から入手可能である。デサチュラーゼ導入遺伝子を有し該遺伝子を発現する海洋藻類等の藻類のハイブリッド及びトランスジェニック株を生産する方法も提供される。例えば、トランスジェニック海洋藻類は、米国特許第５，４２６，０４０号に説明されているように調製することが可能である。上述した他の発現系に関して、タイミング、発現の程度及びデサチュラーゼ導入遺伝子の活性は、ポリペプチドコーディング配列を特定用途のために選択された適切な転写調節領域及び翻訳調節領域と適合させることにより調節することが可能である。特に重要なのは、予め選択した成長条件下で誘導可能なプロモーター領域である。例えば、デサチュラーゼ導入遺伝子コーディング配列、その調節領域、及び／又は細胞ゲノムへの、温度感受性突然変異及び／又は代謝産物応答性突然変異の導入が上記目的に使用され得る。
【００４７】
形質転換した宿主細胞は、所望の最終結果に適合された適切な条件下で成育する。宿主細胞を培養物中で成育する場合、ＰＵＦＡｓの最も多い収率か最も経済的な収率が得られるように条件は最適下され、これには選択デサチュラーゼ活性に関連する。最適化し得る培地条件には、炭素源、窒素源、基質の添加、添加した基質の最終濃度、添加した基質の形、好気性又は嫌気性培養、成育温度、誘導剤、誘導温度、誘導時の成育時期、採取時の成育時期、ｐＨ、密度、及び選択のメンテナンスが包含される。例えば、酵母等の微生物は、好ましくは、酵母ペプトンブロス（ＹＰＤ）と最小培地（アミノ酸、酵母窒素塩基、硫酸アンモニウムを含むが、例えばウラシル等の自由選択の成分を欠いている）とを含む問題の選択培地を用いて成育される。好ましくは、添加する予定の基質は、最初にエタノールに溶解される。必要な場合、例えばＧＡＬプロモーターから発現を誘導すべくガラクトースを含むか添加することにより、問題のポリペプチドの発現が誘導され得る。
【００４８】
ＰＫＳ様遺伝子システムからＰＵＦＡを発現する宿主細胞において、ＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドの発現の増大が望まれる場合、いくつかの方法を使用することができる。ＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドをコードするさらなる遺伝子を宿主生物に導入することが可能である。天然ＰＫＳ様遺伝子座からの発現も、例えばより強力なプロモーターを宿主ゲノムに挿入して発現を増大させたり、不安定化配列を宿主ゲノムからその情報を削除することによりｍＲＮＡ又はコードされたタンパク質から除去したり、又は安定化配列をｍＲＮＡに加えたり（米国特許第４，９１０，１４１号及び米国特許第５，５００，３６５号を参照）することにより、相同的組換えを介して増大させることができる。従って、対象の宿主は、少なくとも１つの発現構築物のコピーを有し、遺伝子をゲノムに組込んで増幅させるか、又は複数のコピー数を有する染色体外の構成要素上に存在するかによって２つかそれ以上の発現構築物のコピーを有する場合もある。対象の宿主が酵母である場合、４つの主なタイプの酵母プラスミドベクターを使用することができる。すなわち、酵母組込プラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＩｐｓ）、酵母複製プラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＲｐｓ）、酵母動原体プラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＣｐｓ）、及び酵母エピソームプラスミド（Ｙｅａｓｔ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ）（ＹＥｐｓ）である。ＹＩｐｓは酵母複製起点を欠いており、酵母ゲノムの組込要素として増殖しなければならない。ＹＲｐｓは染色体に由来する自律性複製配列及びであり、プラスミドを自律的に複製し、不安定に分離する中程度のコピー数（２０から４０）として増殖する。ＹＣｐｓは複製開始点も動原体配列も有し、プラスミドを自律的に複製し、安定に分離する低い程度のコピー数（１０から２０）として増殖する。ＹＥｐｓは酵母２μｍプラスミド由来の複製起点を有し、プラスミドを自律的に複製し不規則に分離する高い程度のコピー数として増殖する。酵母におけるプラスミドの存在は、プラスミド上のマーカーに対する選択を維持することにより確かめられる。特に重要なのは、酵母ベクターｐＹＥＳ２（ウラシルプロトトロピー及び発現用ＧＡＬ１ガラクトース誘導プロモーターを与えるインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から入手可能なプラスミド。）及びｐＹＸ４２４（構成ＴＰ１プロモーターを有し、ロイシンプロトトロピーを与えるＹＥｐプラスミド。アルバー（Alber ）とカワサキ（K awasaki）（1982） J. Mel. & Appl. Genetics 1:419 ）である。
【００４９】
宿主細胞の選択は、トランスジェニック細胞の所望のＰＵＦＡプロファイル及び宿主細胞の天然プロファイルによって一部左右される。宿主細胞が１つのＰＵＦＡに対するＰＫＳ様遺伝子活性を発現している場合であっても、他のＰＫＳ様システムのＰＫＳ様遺伝子の発現を、宿主細胞によって生産されない新規なＰＵＦＡの生産のために与えることも可能である。ＰＫＳ様遺伝子活性の発現を異なるＰＵＦＡを生産する生物のＯＲＦ８  ＰＫＳ様遺伝子の発現と結びつけた特定の例では、宿主細胞はＯＲＦ８に対する低いＰＫＳ様遺伝子活性を天然状態で有しているか又は変異により有することになることが好ましい。例として、ＥＰＡの生産の場合、使用するＤＮＡ配列は、ＥＰＡを生産する生物のＰＫＳ様遺伝子活性を有するポリペプチドをコードするが、他方、ＤＨＡの生産の場合、使用するＤＮＡ配列は、ＤＨＡを生産する生物に由来するＤＮＡ配列である。すでにＰＫＳ様遺伝子活性を発現している宿主細胞で使用する場合、所望のＰＫＳ様遺伝子を単独か又はアンチセンス又は相互抑制効果等の既存のＰＫＳ様システムの既存のＯＲＦの活性をダウンレギュレートする構築物と共に過剰発現する、発現カセットを使用することが必要である。同様に、ＰＫＳ様システムを用いて同じか異なるＰＵＦＡｓを生産する別個の生物に由来するＯＲＦｓを組み合わせを使用することが可能である。例えば、ＶｉｂｒｉｏのＯＲＦ８は、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦ８と結合するとＥＰＡを生じるＯＲＦ３、６、７及び９がＳｈｅｗａｎｅｌｌａのものであっても、宿主細胞でのＤＨＡの発現を指向する。従って、エイコサペンタエン酸の生産（ＥＰＡ）の場合、使用される発現カセットは、一般に、海洋細菌Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ＥＰＡの生産用）又はＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ（ＤＨＡ生産用）等のＰＵＦＡ生産生物に由来するＯＲＦ３、６、７、８及び９を含む１または複数のカセットから成る。ＯＲＦ８はＤＨＡ生産を誘導するために使用することが可能であり、ＶｉｂｒｉｏのＯＲＦ８はＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦｓ３、６、７及び９と共に使用することが可能である。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ遺伝子クラスタで同定されたＯＲＦｓの構成及び番号付けスキームを図１Ａに示す。本研究において言及したいくつかのサブクローンのマップを図１Ｂに示す。ＰＫＳ用遺伝子ポリペプチドの発現の場合、宿主細胞で機能する転写及び翻訳開始及び終結領域は、ＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドをコードするＤＮＡと機能的に連結される。
【００５０】
問題のＰＫＳ様ＯＲＦを含む構築物は、宿主細胞の種類に一部依存して、種々の任意の標準的方法により宿主細胞に導入することができる。そのような方法には、形質移入、感染、ボリスティック（bolistic）衝撃、電気穿孔法、マイクロインジェクション、引っ掻き（scraping）、又は対象の遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法（米国特許第４，７４３，５４８号、米国特許第４，７９５，８５５号、米国特許第５，０６８，１９３号、米国特許第５，１８８，９５８号、米国特許第５，４６３，１７４号、米国特許第５，５６５，３４６号及び米国特許第５，５６５，３４７号を参照）が含まれる。使用される形質転換法には、酢酸リチウム形質転換（Methods in Enzymology 、（1991）194:186-187 ）が含まれる。便宜のため、ＤＮＡ配列又は構築物を持つように任意の方法により操作された宿主細胞のことを、本明細書では「形質転換」又は「組換え」と称される。対象の宿主は、少なくとも１つの発現構築物のコピーを有し、遺伝子がゲノムに組込まれて増幅されるか、又は複数のコピー数を有する染色体外の構成要素上に存在するかによって２つかそれ以上の発現構築物のコピーを有する場合もある。
【００５１】
ＰＵＦＡｓの生産の場合、宿主細胞によるが、ｐＥＰＡ、ＯＲＦ３、６、７、８及び９によって生産されるいくつかのポリペプチドが、個々の発現構築物として導入されるか、又は宿主細胞に個別に導入されるか同時形質転換される２又はそれより多くのカセットに結合される。標準的な形質転換プロトコルが使用される。植物の場合、ＰＵＦＡ合成に必要なすべてのＰＫＳ様遺伝子よりも少ないＰＫＳ様遺伝子が１つの植物に挿入され、１又は複数の補足遺伝子を含む植物が、所望のＰＵＦＡを合成するためのＰＫＳ様遺伝子の完全な補足遺伝子を含む植物を得るために交雑される。
【００５２】
ＰＫＳ様媒介性のＰＵＦＡｓの生産は、原核生物の宿主細胞でも真核生物の宿主細胞でもいずれでも行うことができる。細胞は動物を始めとする宿主生物の一部又は全体として培養又は作成することが可能である。ウイルス及びバクテリオファージも、特に遺伝子移入、細胞のターゲティング及び細胞の選択用に、ＰＵＦＡｓの生産に適した細胞と共に使用することが可能である。双子葉植物、単子葉植物、及び穀類を始めとする任意の種類の植物細胞を宿主細胞用に使用することができる。特に重要なのはアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ダイズ、トウモロコシ等の収穫植物である。対象の原核生物の細胞には、大腸菌属（）、バチルス属（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、シアノバクテリア属（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）等が含まれる。真核生物の細胞には、植物細胞、授乳している動物の細胞等のホ乳類細胞、ニワトリ等の鳥類の細胞、及び昆虫細胞、菌類細胞及び藻類細胞等の遺伝子操作を受けやすい他の細胞が含まれる。宿主動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤク等、の、遺伝子操作と導入遺伝子発現密度を急速に拡大するクローニングとを受けやすい動物が含まれる。動物の場合、遺伝子調節領域の改変により、ＰＫＳ様導入遺伝子は標的の細胞小器官、組織及び体液にて発現するように適合させることが可能である。特に重要なのは、宿主動物の母乳でのＰＵＦＡｓの生産である。
【００５３】
宿主微生物の例には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、カンジダ属やクルベロマイセス属等の他の酵母、又は例えば、コウジカビ属、アカパンカビ、アオカビ属等の糸状菌類が含まれる。宿主微生物の望ましい特性には、例えば、遺伝学的に十分に特徴付けられているものや、超高密度発酵を用いた高レベル産物の発現に使用することができるものや、提唱最終産物がヒトによって消化されるよう意図されているためＧＲＡＳ（ＦＤＡにより一般に安全と認められる表示）リストにのっているものが含まれる。特に重要なのは、本発明の細胞宿主としての、酵母、詳細にはパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。特に重要な株は、ＳＣ３３４（Ｍａｔ  α  ｐｅｐ４−３  ｐｒｂｌ−１１２２  ｕｒａ３−５２  ｌｅｕ２−３、１１２ｒｅｇｌ−５０１  ｇａｌｌ；（ホフランド（Hovland ）ら（1989）Gene 83:57-64 ）；ＢＪ１９９５（Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Douner Laboratory, カリフォルニア州バークレー（Berkeley）,94720）、ＩＮＶＳＣ１（Ｍａｔ  α  ｈｉｗ３Δ１  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２（Invitrogen, 1600 Faraday Ave.,カリフォルニア州カールズバッド（Carlsbad）,92008）及びＩＮＶＳＣ２（Ｍａｔ  α  ｈｉｓΔ２００  ｕｒａ３−１６７；（Invitrogen）である。細菌細胞も宿主細胞として使用することが可能である。そのようなものとしては、Ｅ．ｃｏｌｉが含まれ、これは発酵プロセスに有効であり得る。代わりに、ラクトバチルスの種等の宿主をＰＫＳ様経路の産物をヨーグルト等の製品に導入するための宿主として使用することも可能である。
【００５４】
形質転換宿主細胞は、導入構築物に含まれるマーカーに関する選択により同定することができる。代わりに、多くの形質転換技術が宿主細胞に複数のＤＮＡ分子を導入するため、別のマーカー構築物を所望の構築物に導入することもできる。一般に、形質転換宿主は、選択培地で成長できるその能力により選択される。選択培地は、抗生物質を含有してもよいし、形質転換されていない宿主の成長に必要な栄養素又は成長因子等の因子を欠いていてもよい。その結果、導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質耐性を与えるか、必須の成長因子又は酵素をコードし、形質転換宿主細胞で発現された場合に選択培地での成長を許容する好ましくは、カナマイシン耐性及びアミノ配糖体Ｇ４１８が特に重要である（米国特許第５，０３４，３２２号を参照）。酵母の形質転換体の場合、ウラシル、ロイシン、リジン又はトリプトファンを欠いた培地で成長できる能力等の、酵母で機能する任意のマーカーを使用することが可能である。
【００５５】
形質転換宿主の選択は、発現したマーカータンパク質が直接又は間接的に検出された場合に起こる。マーカータンパク質は、単独で発現させてもよいし、他のタンパク質に対する融合タンパク質として発現させてもよい。マーカータンパク質はその酵素活性によって検出されるタンパク質であり得る。例えば、β−ガラクトシダーゼは、Ｘ−ｇａｌ基質を着色生成物に変えることができ、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生成物に変えることができる。マーカータンパク質は、その光生成特性又は改変特性により検出されるタンパク質であり得る。例えば、Aequorea victoria の緑色蛍光タンパク質は青色光で照射したときに蛍光を発する。マーカータンパク質又は例えば問題のタンパク質上の分子タグを検出するために、抗体を使用することが可能である。マーカータンパク質又はタグを発現する細胞は、例えば、視覚により、又はＦＡＣＳや抗体を用いたパニング等の方法により、選択することができる。
【００５６】
主題の方法を用いて生産されたＰＵＦＡｓ及び組成物は、宿主植物組織及び／又は植物の一部において、遊離脂肪酸として、及び／又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質又は糖脂質等の共役体として見出され、種々の当該技術分野において周知の手段によって宿主細胞から抽出することができる。そのような手段には、有機溶媒による抽出、超音波処理、（例えば二酸化炭素を用いた）超臨界流体抽出、圧力等の物理的手段又はそれらの組み合わせが含まれる。特に重要なのはメタノール及びクロロホルムによる抽出である。適切な場合、水層を酸性化して、負に帯電した部分に陽子を加え、それによって有機層への所望の産物の分配を増大させてもよい。抽出後、有機溶媒は窒素流下で蒸発によって除去することができる。共役体で単離された場合、遊離脂肪酸又は複合度の低い対象共役物を放出するように、生成物は酵素的又は化学的に解裂され、所望の最終産物を生成するようにさらに操作を受ける。好ましくは、脂肪酸の共役型は、水酸化カリウムによって解裂する。
【００５７】
精製がさらに必要な場合、標準的な方法を使用することができる。そのような方法には、抽出、尿素処理、分別晶出、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィ、高速遠心又は蒸留、又はそのような技術の組み合わせが含まれる。酸の基又はアルケニル基のような反応基の保護は、例えばアルキル化又はヨード化等の既知の技術により、任意のステップで行うことができる。使用される方法には、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が含まれる。同様に、保護基は任意のステップで除去してよい。好ましくは、ＤＨＡ及びＥＰＡを含む画分の精製が、尿素処理及び／又は分別蒸留により達成される。
【００５８】
主題の発明の使用方法はいくつか存在する。本発明のＤＮＡに基づくプローブは、関連分子の単離方法や又はＰＫＳ様遺伝子を発現している生物の検出方法に使用される。プローブとして使用された場合、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドは検出される必要がある。これは通常、（例えば修飾残基の組込により）内側部位に標識を取り付けるか５’又は３’末端に標識を取り付けるかにより達成される。そのような標識は、直接検出されるか、検出可能に標識された二次分子と結合するか、非標識二次分子と検出可能に標識された三次分子と結合する。このプロセスは、容認できないバックグラウンドシグナルレベルのない十分に検出可能なシグナルが達成されるように、実現可能な限りで延長することができる。二次システム、三次システム、又は架橋システムは、任意の他の分子（標識又は他の抗体）に対する抗体の使用を含むか、互いに結合する任意の分子（例えばビオチンとストレプトアビジン／アビジンシステム）を含む。検出可能な標識には、通常、放射性同位元素、化学的又は酵素的に光を発生するか光を変化させる分子、検出可能な反応生成物を生成する酵素、磁気分子、蛍光分子、又は蛍光又は発光特性が結合のときに変化する分子が含まれる。標識方法の例は、米国特許第５，０１１，７７０号に見出される。代わりに、標的分子の結合は、等温滴定熱量計によりプローブがターゲットに結合したときの熱の変化を測定するか、又はプローブ又はターゲットをある表面にコーティングすることにより直接検出することができ、ターゲット又はプローブの結合によって生じる該表面からの光の散乱の変化の検出は、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにより行われる。
【００５９】
組換え手段によって生産されたＰＵＦＡｓには、様々な分野での用途が見出される。ヒト又は動物の種々の形式でのＰＵＦＡｓの補充は、添加したＰＵＦＡｓのレベルを増大させるだけでなく、代謝後続産物のレベルも増大させる。複雑な調節機構は、望ましい種々のＰＵＦＡｓを結合や、又は異なるＰＵＦＡｓの共役体の添加を可能にし、そのような機構が固体における特定のＰＵＦＡｓの所望レベルを達成するのを防止したり、抑制したり、又は克服したりする。本件の場合、ＰＫＳ様遺伝子又はアンチセンスＰＫＳ様遺伝子転写物の発現が、植物の一部及び／又は植物組織に見出される特定のＰＵＦＡｓのレベル又はその誘導体のレベルを変え得る。ＰＫＳ様遺伝子ポリペプチドのコーディング領域は、所望のＰＵＦＡｓを高い割合で含むか又は非修飾組織及び／又は植物の一部よりもヒト母乳の組成に非常に類似したＰＵＦＡ組成物（プリエト（Prieto）ら、ＰＣＴ国際出願公開公報ＷＯ第９５／２４４９４号）を含む組織及び／又は植物の一部を作成するために、単独で又は他の遺伝子と共に発現される。
【００６０】
開示した方法によって作成されたＰＵＦＡｓ又はその誘導体は、静脈栄養を受けている患者に対する栄養補助食品として、又は栄養不良を予防又は治療するための栄養補助食品として使用することができる。栄養補助食品用に、ＰＵＦＡｓ又はその誘導体は通常の使用の際に受容者が所望量のＰＵＦＡを受け取れるように調製された料理油、脂肪又はマーガリンに組み込まれる。ＰＵＦＡｓは、幼児用調合乳、栄養補助職人又は他の食物製品にも組み込むことができ、抗炎症剤コレステロール低下剤として使用される。
【００６１】
ＥＰＡ等の特定の脂肪酸は、ヒト母乳のＰＵＦＡ組成をより良好に複製すべく幼児用調合乳の組成を変えるために使用することができる。ヒトの乳中の優勢なトリグリセリドは、１，３−ジ−オレオイル−２−パルミトイルであると報告されており、２−パルミトイルグリセリドは２−オレオイル又は２−リネオイルグリセリドよりもよく吸収されることが報告されている（米国特許第４，８７６，１０７号を参照のこと）。一般に、ヒト母乳はＤＨＡとして約０．１５％から約０．３６％、ＥＰＡとして約０．０３％から約０．１３％、ＡＲＡとして約０．３０％から約０．８８％、ＤＧＬＡとして約０．２２％から約０．６７％、及びＧＬＡとして約０．２７％から約１．０４％を含む脂肪酸プロファイルを有する。幼児用調合乳のＧＬＡ：ＤＧＬＡ：ＡＲＡの好ましい比は、それぞれ約１：１：４から約１：１：１である。ＰＵＦＡのそのような比を与える油の量は、当業者による過度の実験を伴わずに決定することができる。ＰＵＦＡｓ又はそれを含む宿主細胞も、動物組織又は乳中の脂肪酸組成をよりヒト又は動物の消費用に望ましい組成に変えるための動物の栄養補助食品として使用することができる。
【００６２】
医薬として使用する場合（ヒト又は家畜において）、組成物は一般に経口投与されるが、例えば、腸管外（すなわち皮下、筋内又は静脈内）、直腸又は膣内又は局所（例えば皮膚の軟膏又はローションとして）等の、組成物の吸収がうまくいく任意の経路により投与することができる。利用可能な場合、ゼラチンカプセルは経口投与の好ましい形式である。上述した栄養補助食品も経口投与経路を与え得る。本発明の不飽和酸は、共役型で、又は塩、エステル、アミド、若しくは脂肪酸のプロドラッグとして投与することができる。医薬として許容される任意の塩が本発明に包含される。特に好ましいのは、ナトリウム塩、カリウム塩、又は、リチウム塩である。ＰＣＴ国際出願出願公開第ＷＯ９６／３３１５５号に説明されたＮ−メチルグルカミンのようなＮ−アルキルポリヒドロキサミンの塩も包含される。好ましいエステルはエチルエステルである。
【００６３】
本発明のＰＵＦＡｓは、単独で投与することも、医薬として許容されるキャリア又は賦形剤と共に投与することもできる。固体の塩として、ＰＵＦＡｓは錠剤の形で投与することもできる。静脈内投与の場合、ＰＵＦＡｓ又はその誘導体はIntralipids のような市販の製剤に組み込むことができる。望ましい場合、１又は複数の用途のために、製剤の個々の成分はキットの形式で与えられる。特定の脂肪酸の一般的投与量は、一日０．１ｍｇ〜２０ｇ又は１００ｇまででさえあり、好ましくは一日必要量として１０ｍｇ〜１、２、５又は１０ｇ、又はその誘導体型のモル等量である。トリグリセリドとして計算して約２から約３０重量パーセントの脂肪酸を含む腸管外栄養組成物は本発明に包含される。他のビタミン、特にビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＬ−カルニチン等の脂溶性ビタミンを任意に含むことができる。望ましい場合、トコフェロール等の保存料が一般に約０．１重量％加えられる。
以下、実施例を、制限ではなく例示として示す。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ由来のＯＲＦｓの同定
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（Ｓｐ  ＯＲＦ６）のＯＲＦ６配列に基づくプライマー（Ｖｉｂｒｉｏ及びＳＳ９の各々に対する前方５’プライマーＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＡＡＣＣＧＴＧ（配列番号４１）及びＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＡＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＧ（配列番号４２）、並びにＶｉｂｒｉｏ及びＳＳ９に対する３’後方プライマー：ＣＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＣＧＡＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣ（配列番号４３）と、ＥＰＡを生産するＶｉｂｒｉｏ及びｂａｒｏｐｈｙｌｌｉｃ  ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒ由来のゲノムＤＮＡ鋳型（バートレット（Bartlett）博士、ＵＣサンディエゴ（San Diego ）より供与）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、相同なアミノ酸を直接数えることにより決定したＳｐ  ＯＲＦ６（図２５を参照）の対応断片に対して７５％よりも高い相同性を示す、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ（Ｖｉｂｒｉｏ）に対する約４００塩基対のＰＣＲ産物と、及びＳＳ９に対する約９００塩基対のＰＣＲ産物とを得た。
【００６５】
次にＶｉｂｒｉｏコスミドライブラリを調製し、Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ６  ＰＣＲ産物をプローブとして利用して（図２６を参照）、少なくともＯＲＦ６を含むクローンをコロニーハイブリダイゼイションにより選択した。
【００６６】
コスミド９番及びコスミド２１番等の選択コスミドのさらなる配列により、ＯＲＦｓ６−９と相同で、（ＯＲＦ６９）ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦｓ６−９と同じ配列順序に編成されたＯＲＦｓを備えたＶｉｂｒｉｏクラスタ（図５）を得た（図７）。この配列に由来するＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓは、１７３９４から３６１１５の位置にあることがわかり、ＯＲＦ６−９を包含している。
【００６７】
［表１］
Ｖｉｂｒｉｏオペロンの形態
１７３９４から２５３４９    長さ＝７９５６ヌクレオチド
２５５０９から２８１５７    長さ＝２６４９ヌクレオチド
２８２０９から３４２６２    長さ＝６０５４ヌクレオチド
３４４５４から３６１１５    長さ＝１６６２ヌクレオチド
【００６８】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ遺伝子に対するＯＲＦの名称は、図４に開示した名称に基づいており、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａクラスタ（ヤザワ（Yazawa）ら、米国特許第５，６８３，８９８号）に対して公表された名称とは異なっている。例えば、ヤザワらの米国特許第５，６８３，８９８号と比較すると、図４のＯＲＦ３は他のＯＲＦｓから逆方向に読まれ、ヤザワ（Yazawa）らの米国特許第５，６８３，８９８号（図２４参照）には開示されていない。
【００６９】
ＯＲＦ３と相同な配列は、ＯＲＦ６（ＯＲＦ６の上流の１７０００塩基）又はＯＲＦ９（ＯＲＦ９の下流の約４０００塩基）の付近では見出されなかった。リン酸パンテテニルトランスフェラーゼに特徴的なモチーフ（ランバロット（Lambalot）ら（1996）Current Biology 3:923-936 ）は、そのようなモチーフを求めてスクリーニングしたＶｉｂｒｉｏ配列では欠けていた。さらに、Ｖｉｂｒｉｏ及びＳＣ２Ａ  Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ（サンディエゴ大学より供与された、やはりＥＰＡを生産可能な別の細菌）のゲノム消化物ではＳｐ  ＯＲＦ３に由来するプローブとマッチするものはなかった。ＯＲＦ３はＶｉｂｒｉｏに存在し得るが、そのＤＮＡＳｐ  ＯＲＦ３のＤＮＡと相同ではなく、及び／又は配列決定されていないゲノムの部分に位置する可能性がある。
【００７０】
図６は、ＯＲＦｓ６−９を含む約１９ｋｂ  Ｖｉｂｒｉｏクローンの配列を含む。図７及び８は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉａｎｓの  ＰＫＳ様系の遺伝子クラスタ編成を比較したものである。図９から１２は、対応するＯＲＦｓ６、７、８及び９それぞれの間の配列の相同性のレベルを示す。
【００７１】
（実施例２）
ＯＲＦ８のＤＨＡ生産への指向
実施例１に説明したように、Ｓｐ  ＯＲＦ６と相同なＤＮＡが、関係のない種であるＳＳ９Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒで見つかった。ＳＳ９  ＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒもＥＰＡを生産することができる。その上、Ｓｐ  ＯＲＦ６−９と相同なＯＲＦｓがＤＨＡ生産Ｖｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ（Ｖｉｂｒｉｏ）で見出された。そのようなＯＲＦｓから、Ｅ．ｃｏｌｉでのＥＰＡ合成を抑制するＳｐ  ＯＲＦ６−９の各々の欠失（ヤザワ（Yazawa）（1996）前掲）を遺伝子Ｖｉｂｒｉｏ由来の対応する相同な遺伝子によって補足した、一連の実験を設計した。
【００７２】
任意のＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓ６−９がＤＨＡの生産に寄与しているかどうかを決定するためにＳｐ  ＥＰＡクラスタを使用した。各Ｓｐ  ＯＲＦｓに対して与えた欠失突然変異は、ＥＰＡ及びＤＨＡの無効である。各欠失はｌａｃプロモーター（図１３）の後方で発現された対応Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦによって補足した。
【００７３】
Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ６によるＳｐ  ＯＲＦ６欠失の補足により、ＥＰＡの生産を復活した。同様な結果が、Ｓｐ  ＯＲＦ７及びＯＲＦ９欠失の補足によっても得られた。対照的に、Ｓｐ  ＯＲＦ８欠失の補足では、Ｃ２２：６が生産された。従って、Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ８はＤＨＡの合成の重要な要素であると考えられる。図１４及び１５はＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ６に関するＳｐ  ｄｅｌ  ＯＲＦ６の補足（ＥＰＡ有り、ＤＨＡ無し）とＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ８に関するＳｐ  ｄｅｌ  ＯＲＦ８（ＤＨＡ有り）の補足による脂肪酸プロファイルのクロマトグラムを示す。図１６はＯＲＦ８補足に対する脂肪酸パーセントを示し、ここでも、ＯＲＦ８がＤＨＡの生産に寄与していることが明らかである。
【００７４】
以上のデータは関連する又は類似のＯＲＦｓを有するポリケチド様合成遺伝子が異種系で結合及び発現され、宿主系で異なるＰＵＦＡ種を生産するために使用できることを示すと共に、ＯＲＦ８が最終的な鎖長の決定に役割を果たしていることを示す。Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓ６、７、８、及び９はＥＰＡ合成を復元する。ＶｉｂｒｉｏＯＲＦ８の場合、ＥＰＡ（約０．６％）と共にＤＨＡ（約０．７％）も存在し、該遺伝子が上記系に関してＤＨＡ対ＥＰＡの合成を指向するのに重要な役割を果たしていることを示す。
【００７５】
（実施例３）
ＤＨＡの生産のための要件
クラスタＯＲＦ６−９のＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓがどのようにＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ８と組み合わせて使用されるかを決定するために、又は他のＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓ６−９クラスターの一部又は全部とＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ８とのいくつかの組み合わせを形成し、ＤＨＡの合成を説明した。
【００７６】
Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ６−９はＳｐ  ＯＲＦ３によって補われた。この補足の結果を図１６ｂ及び１６ｃに示す。測定したＤＨＡがかなりの量（約９％よりも大きい）であり、ＥＰＡが存在しないことは、Ｓｐ  ＯＲＦ３と組み合わせるとＤＨＡの合成にＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓ６−９以外のＯＲＦｓが必要ではないことを示唆している。このことは、Ｓｐ  ＯＲＦ３が細菌ＰＵＦＡｓの合成に一般的な機能を果たしていることを示唆している。
【００７７】
ＤＨＡ対ＥＰＡの生産に関して、特にＤＨＡを生産するためにＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ８を６−９クラスタの他のＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓと組み合わせることが必要である可能性がある。Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ９及びＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓ（６、８）、（７、８）、（８、９）等の各組み合わせのＤＨＡ合成における役割は現在研究中である。
【００７８】
（実施例４）
植物発現構築物
長い断片のクローニングと及びそれらの後の操作を容易にするために、制限部位の非常に少ないクローニングベクターを作成した。オリゴヌクレオチドを配列ＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴ（配列番号４４）及びＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＧＣＴ（配列番号４５）とアニーリングすることによりアダプタを組み立てた。制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７８及びＳｓｔＩによりベクターpBluescript II SK+（Stratagene）を消化した後、このアダプタをベクターにライゲートした。得られたベクターであるｐＣＧＮ７７６９は、平滑末端ＤＮＡ断片のクローニングのための一つのＳｒｆＩクローニング部位を有し（及びＳｍａＩを埋設し）ていた。
【００７９】
ｐＣＧＮ３２２３由来のナピン（napin ）カセットを有するプラスミド（米国特許第５、６３９、７９０号）を、複数の制限部位を有する長いＤＮＡ断片のクローニングに有効にすると共に複数のナピン融合遺伝子の植物バイナリー形質転換ベクターへのクローニングを許容するために改変した。配列ＣＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴ（配列番号４６）の自己アニーリングするオリゴヌクレオチドから成るアダプタを、ベクターpBC SK+ （Stratagene）を制限エンドヌクレアーゼＢｓｓＨＩＩで消化した後でベクターにライゲートし、ベクターｐＣＧＮ７７６５を構築した。プラスミドｐＣＧＮ３２２３及びｐＣＧＮ７７６５は、ＮｏｔＩで消化し、互いにライゲートした。得られたベクターｐＣＧＮ７７７０（図１７）は、ｐＣＧＮ７７６５骨格と、ｐＣＧＮ３２２３のナピン種子特異的発現カセットとを有する。
【００８０】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ構築物
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａタンパク質をコードする遺伝子を突然変異させ、ＰＣＲを用いて適当なクローニング部位５’及び３’ＯＲＦｓを導入した。ＰＣＲ反応用の鋳型はコスミドＥＰＡ（ヤザワら、前掲）のＤＮＡであった。ＰＣＲ反応は製造業者のプロトコルに従ってＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。ＰＣＲ産物はｐＣＧＮ７７６９で消化したＳｒｆＩでクローニングした。プライマーＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＣ（配列番号４７）及びＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＧＡ（配列番号４８）を使用してＯＲＦ３を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ８５２０を作成した。プライマーＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＡＣＡ（配列番号４９）及びＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＧＴＴＴＧＣＴ（配列番号５０）を使用してＯＲＦ６を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ７７７６を作成した。プライマーＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＣＡＣＴＴＡＴＣ（配列番号５１）及びＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＧＧ（配列番号５２）を使用してＯＲＦ７を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ７７７１を作成した。プライマーＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＴＴＣＴ（配列番号５３）及びＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＡＧ（配列番号５４）を使用してＯＲＦ８を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ７７７５を作成した。プライマーＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＧＡＡ（配列番号５５）及びＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣ（配列番号５６）を使用してＯＲＦ９を増幅し、プラスミドｐＣＧＮ７７７３を作成した。
【００８１】
ＰＣＲ産物の完全性は、ｐＣＧＮ７７７１、ｐＣＧＮ８５２０、及びｐＣＧＮ７７７３のインサートのＤＮＡ配列決定により確認した。ＯＲＦ６及びＯＲＦ８はサイズが非常に大きかった。クローン全体の配列決定を避けるため、ＯＲＦｓの中心部分をＥＰＡの制限断片で置き換えた。ＯＲＦ６の中心部分を含むｐＥＰＡの６．６キロベースのＰａｃＩ／ＢａｍＨＩ断片をＰａｃＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＣＧＮ７７７６にライゲートし、ｐＣＧＮ７７７６Ｂ４を得た。ＯＲＦ８の中心部分を含むＥＰＡの４．４キロベースのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片をＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐＣＧＮ７７７５にライゲートし、ｐＣＧＮ７７７５Ａを得た。ＥＰＡ断片に隣接する領域クローニング接合部はＤＮＡ配列決定により確認した。
【００８２】
プラスミドｐＣＧＮ７７７１はＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩにより切断し、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ７遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８３と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ８５２０はＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩにより切断し、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ３遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ８５２８と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ７７７３はＳａｌＩ及びＢａｍＨＩにより切断し、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ９遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８５と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ７７７５ＡはＳａｌＩにより切断し、ＳａｌＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ８遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８２と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ７７７６Ｂ４はＸｈｏＩにより切断し、ＳａｌＩで消化した後、ｐＣＧＮ７７７０にライゲートした。得られたナピン／ＯＲＦ６遺伝子融合プラスミドをｐＣＧＮ７７８６Ｂ４と名付けた。
【００８３】
植物形質転換に対するバイナリーベクターｐＣＧＮ５１３９を、ｐＣＧＮ１５５８から構築した（マクブライド（McBride ）とサマーフェルト（Summerfelt）（1990）Plant Molecular Biology, 14:269-276 ）。ｐＣＧＮ１５５８のポリリンカーを、固有の制限エンドヌクレアーゼ部位である、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、ＳｗａＩ、ＢａｍＨＩ、及びＮｏｔＩを有するポリリンカーにより、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片として置き換えた。ｐＣＧＮ５１３９には、Ａｓｐ７１８及びＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が保持されている。ＰＣＧＮ５１３９は、ＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＣＧＮ７７８６Ｂ４ナピン／ＯＲＦ６遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３３と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ８３３をＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化したｐＣＧＮ７７８２とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ６遺伝子融合部及びナピン／ＯＲＦ８遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３５と名付けた（図１８）。
【００８４】
植物バイナリー形質転換ベクターｐＣＧＮ５１３９を、Ａｓｐ７１８で消化し、Ａｓｐ７１８で消化したｐＣＧＮ８５２８とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ３遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３２と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ８５３２をＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＣＧＮ７７８３とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ３遺伝子融合部及びナピンＯＲＦ７遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３４と名付けた。プラスミドｐＣＧＮ８５３４をＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化したｐＣＧＮ７７８５とライゲートした。ナピン／ＯＲＦ３遺伝子融合部、ナピン／ＯＲＦ７遺伝子融合部及びナピン／ＯＲＦ９遺伝子融合部を含む得られたバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５３７と名付けた（図１９）。
【００８５】
（Ｖｉｂｒｉｏ構築物）
植物発現用のＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦｓはすべて開始分子としてＶｉｂｒｉｏコスミド９番を用いて得た。Ｖｉｂｒｉｏコスミド９番は実施例１に説明したＶｉｂｒｉｏＯＲＦ６ＰＣＲ産物を用いてＶｉｂｒｉｏコスミドライブラリから単離したコスミドの一つである。
【００８６】
Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ７（図６）をコードする遺伝子を突然変異し、ＰＣＲプライマー：ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＧＴ（配列番号５７）及びＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＧＴＧＴＴＴＧＣＴＡＴＡＴＧ（（配列番号５８）を用いて読み取り枠の上流にＳａｌＩ部位及び読み取り枠の下流にＢａｍＨＩ部位を導入した。Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ９（図６）をコードする遺伝子を突然変異し、ＰＣＲプライマー：ＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＡＡＧＴＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＣＡ（配列番号５９）及びＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＴＡＡＣＴＴＧＣＣ（配列番号６０）を用いて読み取り枠の上流にＢａｍＨＩ部位及び読み取り枠の下流にＸｈｏＨＩ部位を導入した。制限部位はＰＣＲを用いて導入し、変異プラスミドの完全性はＤＮＡ配列により確認した。Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ７遺伝子はＳａｌ−ＢｇｌＩ断片としてＳａｌ−ＢｇｌＩ消化したｐＣＧＮ７７７０（図１７）のナピンカセット内でクローニングし、ｐＣＧＮ８５３９を得た。Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ９遺伝子はＳａｌ−ＢａｍＨＩ断片としてＳａｌ−ＢａｌＩ消化したｐＣＧＮ７７７０（図１７）のナピンカセット内でクローニングし、ｐＣＧＮ８５４３を得た。
【００８７】
Ｖｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ６及びＯＲＦ８をコードする遺伝子を突然変異し、読み取り枠に隣接するＳａｌＩ部位を導入した。ＯＲＦ６に隣接するＳａｌＩ部位はＰＣＲを用いて導入された。使用したプライマーは：ＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡ（配列番号６１）及びＣＣＣＧＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＧＡＣＡＴＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡ（配列番号６２）であった。ＰＣＲ産物の中心の７．３ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ７断を、対応するＶｉｂｒｉｏコスミド９番由来の断片と置き換えた。変異ＯＲＦ６をｐＣＧＮ７７７０のナピンカセットのＳａｌＩ部位に入れてクローニングし、プラスミドｐＣＧＮ８５５４を得た。
【００８８】
ＯＲＦ８の突然変異誘発には異なるストラテジーをとった。ＯＲＦ８を含むＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＨＣ７９でサブクローニングし、コスミド９"番を得た。コーディング領域の上流のＳａｌＩ部位を、オリゴヌクレオチドＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＣ（配列番号６３）及びＣＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＴＴＡＧＣＡＡＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧ（配列番号６４）から成るアダプタ上に導入した。ＳａｌＩ及びＸｍａＩによる消化後、アダプタをコスミド９"番とライゲートした。突然変異誘発を誘発するためにＰＣＲを用いて停止コドンの下流にＳａｌＩ部位を導入した。停止コドンを有するＤＮＡ断片はコスミド９番"を鋳型として使用し、プライマーＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＣＧＡＴＡＣ（配列番号６５）及びＴＣＡＴＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴ（配列番号６６）を用いて生成した。ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩ及びＡａｔＩＩで消化し、同じ酵素で消化したコスミド９"番派生物中でクローニングし、プラスミド８Ｐ３を得た。８Ｐ３由来のＳａｌＩ断片をＳａｌＩ消化ｐＣＧＮ７７７０中でクローニングし、ｐＣＧＮ８５１５を得た。
【００８９】
ナピンプロモーターの制御下のＳｈｅｗａｎｎｅｌｌａ  ＯＲＦ３を含むＰＣＧＮ８５３２バイナリー植物形質転換ベクターを、ＮｏｔＩで消化し、ナピンＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ７遺伝子融合部を含むｐＣＧＮ８５３９のＮｏｔＩ断片を挿入し、ｐＣＧＮ８５５２を得た。Ｓｈｅｗａｎｎｅｌｌａ  ＯＲＦ３と、ナピンプロモーター制御下のＶｉｂｒｉｏ  ＯＲＦ７及び９とを含むプラスミドｐＣＧＮ８５５６（図２３）を、ｐＣＧＮ８５４３由来のＳｓｅ８３５７断片をＳｓｅ８３８７で消化したｐＣＧＮ８５５２中でクローニングすることにより構築した。
【００９０】
プラスミドｐＣＧＮ８５１５由来のＮｏｔＩ消化したナピン／ＯＲＦ８遺伝子を、ＮｏｔＩ消化した植物バイナリー形質転換ベクターｐＣＧＮ５１３９中でクローニングし、ｐＣＧＮ８５４８を得た。ｐＣＧＮ８５５４由来のＳｓｅ８３８７消化したナピン／ＯＲＦ６遺伝子を、ｐＣＧＮ８５６６のＳｓｅ８３８７部位に入れて引き続きクローニングした。得られたナピン／ＯＲＦ６遺伝子融合部及びナピン／ＯＲＦ８遺伝子融合部を含むバイナリーベクターをｐＣＧＮ８５６０（図２２）と名付けた。
【００９１】
（実施例５）
植物の形質転換とＰＵＦＡの生産
ＥＰＡの生産
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ構築物ｐＣＧＮ８５３７及びｐＣＧＮ８５３７を、同じか又は異なる別個の植物に入れて、形質転換することができる。別個の植物が使用される場合、トランスジェニック植物を交雑すると、両方の構築物を含むヘテロ接合型の種子が得られる。
【００９２】
ｐＣＧＮ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７はＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓに別々に入れて形質転換される。植物はカナマイシンを含む培地上で選択され、構築物の完全長インサートによる形質転換はサザン解析により確認される。未成熟な種子も、ウェスタン解析を用いて、ＯＲＦ３、６、７、８、又は９によりコードされた酵素タンパク質の発現について試験される。いずれの場合も、最も発現が良好なｐＣＧＮＥ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７Ｔ1形質転換植物を選択し、更なる実験及び交雑のために成長させる。代わりに、サザンによりインサートを示すＴ1形質転換植物は、両方のインサートを有するＴ2を互いに生産するように交雑される。この種子に関して、種子の半分は脂肪酸画分におけるＥＰＡの発現から直接分析した。ＥＰＡの生産が最良であった残りの半分の種子は成育され、ＥＰＡの生産するＢｒａｓｓｉｃａ系を提供するよう従来の育種法により発達させる。
【００９３】
プラスミドｐＣＧＮ７７９２及びｐＣＧＮ７７９５も、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ宿主細胞に同時に導入される。標準的な形質転換プロトコルを使用する（例えば米国特許第５，４６３，１７４号及び米国特許第５，７５０，８７１号を参照、）が、両方のプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを混合し、Ｂｒａｓｓｉｃａ  と共にインキュベートし、同時培養中にＢｒａｓｓｉｃａの子葉と共にインキュベートする。得られた植物の多くが、両プラスミドによって形質転換される。
【００９４】
（ＤＨＡの生産）
ｐＣＧＮ８５５６及びｐＣＧＮ８５６０を導入することにより、ＥＰＡの生産に関して説明したように別個の植物中で又は同じ植物中で同時に、植物がＤＨＡの生産用に形質転換される。
【００９５】
代わりに、植物を構築物ｐＣＧＮ８５６０及びｐＣＧＮ７７９５で形質転換したり、植物細胞内での対応するＯＲＦｓの発現を許容したりすることにより、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦｓはＶｉｂｒｉｏのＯＲＦ６及び８と調和した様式で使用することも可能である。この組み合わせは、Ｖｉｂｒｉｏ由来のＯＲＦ６及びＶｉｂｒｉｏ由来のＯＲＦ８との、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＯＲＦｓ３、７及び９から成るＰＫＳ様遺伝子の整列を提供する。上述したように、ＯＲＦ８は最終ＰＵＦＡ産物の同一性を制御するＰＫＳ様遺伝子である。このように、得られた形質転換植物は植物油にＤＨＡを生成する。
【００９６】
（実施例６）
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＰＵＦＡ遺伝子を有するトランスジェニック植物
Ｂｒａｓｓｉｃａ植物
プラスミドｐＣＧＮ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７により同時形質転換された５２体の植物をＰＣＲを用いて分析し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦｓがトランスジェニック植物中に存在するかどうかを決定した。４１体の植物がプラスミドｐＣＧＮ８５３７を含み、３５体の植物がｐＣＧＮ８５３５を含んでいた。１１体の植物がＥＰＡの合成に必要な５つのＯＲＦｓを含んでいた。いくつかの植物はバイナリープラスミドの両方に由来する遺伝子を含んでいたが、少なくとも１つのＯＲＦｓを喪失しているようであった。分析は約２０体のさらなる植物について現在行っているところである。
【００９７】
ｐＣＧＮ８５３５のみにより形質転換された２３体の植物をＰＣＲを用いて分析し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦがトランスジェニック植物中に存在するかどうかを決定した。１３体の植物がＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ８を共に含んでいた。６体の植物が一方のＯＲＦのみを含んでいた。
【００９８】
ｐＣＧＮ８５３７のみにより形質転換された１９体の植物をＰＣＲを用いて分析し、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦがトランスジェニック植物中に存在するかどうかを決定した。１８体の植物がＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ３、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ７、及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ９を含んでいた。１体の植物がＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ３及び７を含んでいた。
【００９９】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
プラスミドｐＣＧＮ８５３５及びｐＣＧＮ８５３７により同時形質転換した４０体よりも多いトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を本願発明者の成育チャンバで成育した。どのＯＲＦｓが植物中に存在するかを決定するＰＣＲ解析は現在行っている最中である。
【０１００】
（実施例７）
ＰＫＳシステムのＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍにおけるＰＵＦＡ合成の証拠
本実験の目的は、ＰＫＳ遺伝子の更なる供給源を同定することであった。多価不飽和長鎖脂肪酸がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ油中に同定された。さらに、多価不飽和脂肪酸の生産がＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの培地中に検出された。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍの新鮮な希釈培地を［14Ｃ］−酢酸（５ｕＣｉ／ｍＬ）の存在下で、２４℃、３０分間、撹拌しながらインキュベートした（１５０ｒｐｍ）。次に細胞を遠心により収集し、凍結乾燥し、トルエン（酸性メタノールの２体積当たりトルエン１体積）を第２の溶媒とした酸性メタノール（９％Ｈ2ＳＯ4）の存在下で９０分間、９０℃まで加熱することに関するエステル交換プロトコルに供した。得られたメチルエステル有機溶媒（ヘキサン）により抽出し、ＴＬＣ（シリカゲルＧ、ヘキサン：ジエチルエーテル（１９：１）で３回展開）により分離した。ＴＬＣプレート上の放射能をスキャナ（ＡＭＢＩＳ）を用いて検出した。ＴＬＣプレート上に２つの顕著なバンドを検出した。定位置にＴＬＣプレート上を移動したそれらのバンドは短鎖（１４〜１６炭素）の飽和メチルエステル（上側のバンド）及び多価不飽和長鎖（２０〜２２炭素）脂肪酸（下側のバンド）のメチルエステルと予想された。それらは、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ油のＦＡＭＥｓのＧＣ分析により検出された主な種類の脂肪酸でもあった。
【０１０１】
並行実験において、タイプＩＩ型脂肪酸合成系とＳｈｅｗａｎｅｌｌａ由来のＰＫＳ遺伝子で形質転換したＥ．ｃｏｌｉによるＥＰＡの生産を始めとするいくつかのポリケチド合成系との周知の阻害剤であるチオールアクトミオシンをＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ細胞培養物及び及び［14Ｃ］酢酸の添加の前に種々の濃度（０、１、１０及び１００μｇ／ｍｌ）の試験管に加えた。上述したように、［14Ｃ］酢酸の取り込み分析により、１００μｇ／ｍＬのチオールアクトミオシンが多価不飽和脂肪酸の合成を完全にブロックすることが明らかとなったが、１０μｇ／ｍＬのチオールアクトミオシンでは不飽和脂肪酸合成の部分的阻害が観察された。短鎖飽和脂肪酸の合成は試験したすべてのチオールアクトミオシン濃度において影響を受けなかった。チオールアクトミオシンはタイプＩ型脂肪酸合成系を阻害せずマウスにとって毒性ではない。このことは、チオールアクトミオシンがＥＰＡ又はＤＨＡの生成に至る延長系を阻害しないことを示唆する。さらに、チオールアクトミオシンはＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍにおけるＰＵＦＡ合成に至る延長系を阻害しなかった。従って、ＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍはタイプＩ型脂肪酸合成系を有することが知られているが、データによると、該生物で生産された多価不飽和脂肪酸は、短鎖脂肪酸を生産するタイプＩ型脂肪酸合成系とは異なる系と、マウス及びＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍで見出された延長／非飽和経路に類似する系とに由来するものであることが示唆された。データはＶｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓに見出されたＰＫＳ経路の結果であるＤＨＡの形成と一致している。
【０１０２】
（実施例８）
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ由来のＰＫＳ関連配列
本実験の目的は、ＰＫＳ遺伝子をコードするＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍに由来する配列を同定することであった。Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ由来のｃＤＮＡライブラリを構築し、約８，０００個のランダムクローン（ＥＳＴ）を配列決定した。ＳｈｅｗａｎｅｌｌａのＥＰＡ合成遺伝子によりコードされたタンパク質の配列をＳｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントアルゴリズムを用いてＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴの予測アミノ酸配列と比較した。ＯＲＦ６（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）のタンパク質配列をＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴ由来のアミノ酸配列と比較した場合、３８個のＥＳＴクローンが有意な相同性の程度を示した（Ｐ<０．０１）。ＯＲＦ７のタンパク質配列をＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴにより比較した場合、４個のＥＳＴクローンが有意な相同性を示し（Ｐ<０．０１）、分子が均質であることが示唆された。ＯＲＦ８及びＯＲＦ９のタンパク質配列をＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴと比較した場合、７及び１４個のクローンがそれぞれ有意な相同性を示した（Ｐ<０．０１）。
【０１０３】
（実施例９）
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｃＤＮＡクローンの分析
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ＥＳＴクローンの制限酵素分析を利用して、最も長いクローンを決定し、該クローンの全体を次に配列決定した。実施例８に説明したすべてのＥＳＴ配列を５ＤＮＡクローンの一部であると決定した。
【０１０４】
ＤＮＡクローンのうちの２つは、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６と相同であった。ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５は、ＯＲＦ６のＣ末端と相同であった。ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５の配列はアミノ酸２０９３から前方へＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６と整列させることができた。ＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５の読み取り枠は配列の５’末端まで伸びていたため、このクローンが完全長である可能性は低い。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６はＯＲＦ６のＡＣＰドメインに対する相同性を共有していた。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６は６個のＡＣＰ繰り返しを有していた。そのＤＮＡクローンはポリ−Ａ−テイルを有しておらず、ＤＮＡの追加領域が配列の下流に見出される、部分ｃＤＮＡである可能性が高かった。ＰＣＲプライマーＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＧ（配列番号６７）及びＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＡ（配列番号６８）を使用して、ＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍゲノムＤＮＡ由来の約５００ヌクレオチド断片を増幅した。プライマーＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＣＡＡＧＧはＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６に由来し、プライマーＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＡはＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５に由来する。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６及びＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５は同じｍＲＮＡの異なる部分を示し（図２８を参照）、図２９Ａ（配列番号７０）の配列に関するタンパク質をコードすると予測されている、１つの部分ＤＮＡ配列（配列番号６９）に組み込むことができた（図２７Ａを参照）。読み取り枠は配列の５’末端まで延びていたため、この部分ＤＮＡは完全長である可能性が低い。更なるＤＮＡ又はゲノムクローンの分析により、クローンＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６及びＬＩＢ３０３３−０４７−Ｂ５により表されたｍＲＮＡの全長を決定することができるであろう。それは、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ６のＮ末端付近に見出されるのと同様の縮合酵素関連ドメインを含み得る。
【０１０５】
ＤＮＡクローンの１つであるＬＩＢ３０３３−０４６−Ｄ２は、３’末端がＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ９と相同であった。このクローンは５’末端がＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８の鎖長要因領域と相同であった。該クローンはＡｎａｂｅａｎａ  ＨｇｌＣ  ＯＲＦの読み取り枠全体とも相同であった。Ａｎａｂｅａｎａ  ＨｇｌＣ  ＯＲＦはＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ７の鎖長要因領域と相同である。従ってそのＤＮＡ（図２７Ｂ）（配列番号７１）はＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ７及びＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ９（図２８を参照）の一部と相同である。ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｄ２の読み取り枠によりコードされたアミノ酸配列（図２９Ｂ）（配列番号７２）は、配列の５’末端まで延びていた。従ってそのクローンは完全長である可能性が低い。さらなるＤＮＡ又はゲノムクローンの分析により、ＬＩＢ３０３３−０４６−Ｅ６により表されたｍＲＮＡの全長を決定することができるであろう。それは、ＳｈｅｗａｎｅｌｌａＯＲＦ８のＮ末端付近に見出されるのと同様の縮合酵素関連ドメインを含み得る。
【０１０６】
２つのさらなるＤＮＡクローンがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８と相同であった。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５はＯＲＦ８のＣ末端と相同であった。ＬＩＢ０８１−０１５−Ｄ５の５’配列は、アミノ酸１９００から前方へＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦと整列させることができた。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５の３’末端は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ９（図２８参照）と整列させることができた。ＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５の読み取り枠によってコードされたアミノ酸配列（図２９）（配列番号７３）は配列の５’末端まで延びていたため、このクローンは完全長である可能性が低い。ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ＯＲＦ８のアミノ酸１１５０〜１８５０と相同であった。ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９はポリ−Ａ−テイルを有しておらず、従って追加領域が配列の下流に見出される、部分ＤＮＡである可能性が高かった。ＰＣＲプライマーＴＡＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣ（配列番号７４）及びＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＴＧ（配列番号７５）を使用して、ＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍゲノムＤＮＡ由来の約５００ヌクレオチド断片を増幅した。プライマーＴＡＣＣＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９に由来し、プライマーＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＴＧにはＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５に由来した。従って、ＬＩＢ８１−０４２−及びＬＩＢ８１−０１５−Ｄ５は同じｍＲＮＡの異なる部分を示し、１つの部分ＤＮＡ配列（図２７Ｃを参照）（配列番号７６）内に組み込むことができた。ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９の読み取り枠も５’末端まで延びていたため、この部分ＤＮＡは完全長である可能性が低い。更なるＤＮＡ又はゲノムクローンの分析により、ＬＩＢ８１−０４２−Ｂ９により表されたｍＲＮＡの全長を決定することができるであろう。
【０１０７】
本発明により、種々の生物に由来するＰＫＳ様遺伝子を使用して、植物細胞を形質転換したり、形質転換した植物細胞でのＰＵＦＡｓ生合成を介して植物細胞膜又は植物種子油の脂肪酸組成物を改変したりすることができる。ＰＫＳ様系の性質により、植物細胞で生産された脂肪酸の最終産物は、多くの特定の化学構造を含むように選択又は設計することが可能である。例えば、脂肪酸は以下の変化を有し得る：炭素鎖に沿った種々の位置におけるケト又はヒドロキシ基の数の変化；二重結合の数及び種類（シス又はトランス）の変化；線形炭素鎖の分岐（メチル、エチル、又はより長い分岐部分）の数及び種類の変化；及び飽和炭素の変化。さらに、最終産物である脂肪酸の特定の長さは、使用する特定のＰＫＳ様遺伝子によって制御することが可能である。
【０１０８】
本明細書で言及したすべての公表物及び特許出願は本発明が関連する当業者の技能のレベルを示す。あたかも各公表物又は特許出願が詳細に及び個別に参照により組み込まれるのと同じ程度に、すべての公表物及び特許出願は本願に参照により組み込まれる。
【０１０９】
さて、本発明を完全に説明したが、当業者には特許請求の精神又は範囲から逸脱することなく本発明に対して多くの変更及び改変を行いうることが理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ａ−５】
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【図４Ａ−６】
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【図４Ａ−７】
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【図４Ａ−８】
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【図４Ａ−９】
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【図４Ａ−１０】
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【図４Ａ−１１】
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【図４Ａ−１２】
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【図４Ａ−１３】
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【図４Ａ−１４】
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【図４Ａ−１５】
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【図４Ａ−１６】
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【図４Ａ−１７】
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【図４Ａ−１８】
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【図４Ａ−１９】
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【図４Ａ−２０】
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【図４Ａ−２１】
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【図４Ａ−２２】
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【図４Ａ−２３】
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【図４Ａ−２４】
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【図４Ａ−２５】
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【図４Ａ−２６】
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【図４Ａ−２７】
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【図４Ａ−２８】
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【図４Ａ−２９】
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【図４Ａ−３０】
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【図４Ａ−３１】
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【図４Ａ−３２】
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【図４Ａ−３３】
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【図４Ａ−３４】
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【図４Ａ−３５】
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【図４Ａ−３６】
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【図４Ａ−３７】
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【図４Ａ−３８】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−２】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ−１】
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【図４Ｇ−２】
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【図４Ｇ−３】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ−１】
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【図４Ｉ−２】
2010252811.tif 000055
【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
2010252811.tif 000067
【図５−１１】
2010252811.tif 000068
【図５−１２】
2010252811.tif 000069
【図５−１３】
2010252811.tif 000070
【図５−１４】
2010252811.tif 000071
【図５−１５】
2010252811.tif 000072
【図５−１６】
2010252811.tif 000073
【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【図５−２１】
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【図５−２２】
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【図５−２３】
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【図５−２４】
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【図５−２５】
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【図５−２６】
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【図５−２７】
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【図５−２８】
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【図５−２９】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
2010252811.tif 000089
【図６−４】
2010252811.tif 000090
【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【図７】
2010252811.tif 000100
【図８】
2010252811.tif 000101
【図９】
2010252811.tif 000102
【図１０】
2010252811.tif 000103
【図１１】
2010252811.tif 000104
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2010252811.tif 000109
【図１７】
2010252811.tif 000110
【図１８】
2010252811.tif 000111
【図１９】
2010252811.tif 000112
【図２０】
2010252811.tif 000113
【図２１】
2010252811.tif 000114
【図２２】
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【図２３】
2010252811.tif 000116
【図２４】
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【図２５】
2010252811.tif 000118
【図２６−１】
2010252811.tif 000119
【図２６−２】
2010252811.tif 000120
【図２６−３】
2010252811.tif 000121
【図２６−４】
2010252811.tif 000122
【図２７Ａ−１】
2010252811.tif 000123
【図２７Ａ−２】
2010252811.tif 000124
【図２７Ｂ−１】
2010252811.tif 000125
【図２７Ｂ−２】
2010252811.tif 000126
【図２７Ｂ−３】
2010252811.tif 000127
【図２７Ｃ−１】
2010252811.tif 000128
【図２７Ｃ−２】
2010252811.tif 000129
【図２８】
2010252811.tif 000130
【図２９Ａ】
2010252811.tif 000131
【図２９Ｂ】
2010252811.tif 000132
【図２９Ｃ】
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【配列表】
2010252811000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月31日(2010.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６９、７１及び７６から成る群より選択された配列番号で示された配列を含むＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍヌクレオチド配列を含む単離核酸。