(57)【要約】【課題】一周ＰＣＲを用いて簡便にランダムな遺伝子配列ライブラリーをプラスミドに導入することができるランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法、それを用いた形質転換体作成方法、および、その方法に使用するキットを提供する。【解決手段】ランダム遺伝子ライブラリープライマーと補助プライマーとをＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）により鋳型を一周ＰＣＲする。ランダム遺伝子ライブラリープライマーは、５’末端が補助プライマーと相補的であり、３’末端が鋳型と相補的であり、５’末端と３’末端との間にランダム遺伝子ライブラリーを含む部位を有する。補助プライマーは、５’末端がランダム遺伝子ライブラリープライマーと相補的であり、３’末端が鋳型と相補的であり、ランダム遺伝子部分を持たない。【選択図】図１
2020059659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型となるプラスミドＤＮＡと、ランダム遺伝子ライブラリープライマーと、補助プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用い、
前記ランダム遺伝子ライブラリープライマーは、５’末端が前記補助プライマーと相補的であり、３’末端が前記鋳型と相補的であり、５’末端と３’末端との間にランダム遺伝子ライブラリーを含む部位を有し、
前記補助プライマーは、５’末端が前記ランダム遺伝子ライブラリープライマーと相補的であり、３’末端が前記鋳型と相補的であり、５’末端と３’末端との間にランダム遺伝子部分を持たず、
ＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）により前記鋳型を一周ＰＣＲし、前記ランダム遺伝子ライブラリーをプラスミドに導入する
ことを特徴とするランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法。
【請求項２】
前記ランダム遺伝子ライブラリープライマーは、５’末端の前記補助プライマーと相補的な領域の長さが２〜１００塩基であり、３’末端の前記鋳型と相補的な領域の長さが２〜２００塩基であり、前記ランダム遺伝子ライブラリーを含む部位の長さが１〜２０００塩基であることを特徴とする請求項１記載のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法。
【請求項３】
前記補助プライマーは、５’末端の前記ランダム遺伝子ライブラリープライマーと相補的な領域の長さが２〜１００塩基であり、３’末端の前記鋳型と相補的な領域の長さが２〜２００塩基であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１に記載のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法により得られたランダム遺伝子プラスミドライブラリーを用いて宿主を形質転換することを特徴とする形質転換体作成方法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか１に記載のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法のためのキットであって、以下の構成品を含むキット。
（１）前記鋳型となるプラスミドＤＮＡ
（２）前記ランダム遺伝子ライブラリープライマー
（３）前記補助プライマー
（４）前記ＤＮＡポリメラーゼ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野において、特に、ＰＣＲ法を用いたランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法、それを用いた形質転換体作成方法、および、その方法に使用するキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ランダム遺伝子ライブラリーとは、有機合成を用いてランダムに合成したＤＮＡを持つ遺伝子あるいは酵素のＤＮＡポリメラーゼのエラー誘発などによってランダム変異させた遺伝子のライブラリーのことを示し、その遺伝子ライブラリーを発現プラスミドに挿入することで得られる。すなわちランダム遺伝子プラスミドライブラリーを作成し、そこから発現されるペプチド・蛋白質分子をある特定の機能についてスクリーニングすることにより、天然に存在しないような全く新規な性質をもつペプチド・蛋白質分子を取得可能なため有用なツールである。
【０００３】
例えば、毒物に結合するペプチド・蛋白質分子を取得したい場合、一般的な免疫によって取得することは宿主細胞が致死となるためにできない。ランダム遺伝子ライブラリーを用いることで、例えば、ファージベクターに組み込んだ場合、バクテリオファージ表面の特定の位置にペプチドあるいは蛋白質を発現させ、スクリーニングし、希望の機能ペプチドあるいは蛋白質を取得することが可能になる。また、金属粒子など一般的に免疫しがたい物質に対して相互作用するペプチドあるいは蛋白質を取得する場合にも有効な方法である。
【０００４】
進化分子工学の分野においてのランダムな遺伝子配列を誘発させる手法としては、例えば、エラープローンＰＣＲ法（例えば、非特許文献１参照)、ＤＮＡシャッフリング法（例えば、非特許文献２参照）、有機固相合成を用いたランダム遺伝子の合成（例えば、特許文献１参照）がある。前者２種の方法は、広範囲をカバーできるが、酵素の性質によるため作成し難い変異がある。後者は完全にランダムな配列を誘発できるが短い配列となる。すなわち、ペプチドレベルのランダム配列作成で言えば、固相合成を用いた方法にほぼ限られており、一般的である。そのため、ある相互作用を有する機能性ペプチドを取得する方法としては、ＤＮＡ有機合成により得られたランダム遺伝子をプラスミドに挿入したランダム遺伝子プラスミドライブラリーを用いて、ファージや大腸菌を使って発現させ機能スクリーニングをする方法に限られている。
【０００５】
これまでも有機合成によるランダム遺伝子の作成と、作成した遺伝子の連結（ライゲーション）によるプラスミドヘの挿入によってランダム遺伝子プラスミドライブラリーを作り、ファージディスプレイする方法（例えば、非特許文献３参照）は行われている。
【０００６】
注意すべきこととして、上述したこれらの手法は、通常の遺伝子のプラスミドヘの連結とは異なり、１つの目的物が得られれば良いわけではなく、多様なランダム遺伝子ライブラリーについて１０５〜１０１２規模を保った状態で、さらに、目的物以外をほとんど混入しない状態でランダム遺伝子プラスミドライブラリー化し、できるだけ多種のペプチドライブラリーを機能スクリーニングに供することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１９８４２５号公報
【特許文献２】特許第５３９００７６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，  Ｃｈｅｎ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｇｏｅｄｄｅ1，Ｄ．Ｗ．，  “Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ“  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１−１５，１９８９
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｅｍ  Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ“  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−３９１，１９９４
【非特許文献３】Ｊａｍｅｓ  Ｄ．Ｍａｒｋｓ，他４名，  “Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ“，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２２，５８１−５９７，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、既存のファージディスプレイ法は、いずれの方法においてもランダム遺伝子のプラスミドヘの挿入の過程でライゲーション操作を用いており、規模の低下、および目的物以外の混入（すなわち、鋳型の混入、セルフライゲーションおよび３断片の誤挿入）は避けられない。
【００１０】
さらに作成したプラスミドを用いた大腸菌の形質転換の効率を高めるためには、ＤＮＡの純度を上げるための精製が必要になる。ライゲーションを用いた方法の場合は、アガロースゲル電気泳動とゲルからのＤＮＡ抽出になるが、抽出効率は３０％程度である。さらにライゲーション効率は１０％程度であり、ＤＮＡのロスに伴う規模の大幅な低下を招いている。
【００１１】
プラスミドＤＮＡ収量が低いことにより、オリゴヌクレオチドプライマーもしくは高形質転換効率の大腸菌を大量に購入する必要があるためコストがかかる。
【００１２】
遺伝子操作が長く煩雑なために労力を必要とし、操作ミスをしないためには熟練も要する。
【００１３】
既存のランダム化した遺伝子をプラスミドにライゲーションを用いて挿入する方法は、上述したこれらの短所があったことから、これらよりも簡便で確実な方法が求められていた。
【００１４】
なお、要素技術として特許文献２では、遺伝子の変異処理に関してという点で、目的は異なるが、上述したような操作的短所を克服するため、５’末端が相補的であるプライマーを用いてＰＣＲ酵素に極めて忠実性の高い酵素である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであるＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲポリメラーゼを使用することにより、一周ＰＣＲを行い、遺伝子へ目的変異を効率的に挿入し、目的外変異の挿入を低減させている。しかしながら相補的な変異プライマー対を用いた手法であるため、原理上は予想できる（設計した）変異を導入することはできてもランダムな遺伝子導入は行うことができない。
【００１５】
本発明は、このような問題に基づきなされたものであり、一周ＰＣＲを用いて簡便にランダムな遺伝子配列ライブラリーをプラスミドに導入することができるランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法、それを用いた形質転換体作成方法、および、その方法に使用するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法は、鋳型となるプラスミドＤＮＡと、ランダム遺伝子ライブラリープライマーと、補助プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用い、
ランダム遺伝子ライブラリープライマーは、５’末端が補助プライマーと相補的であり、３’末端が鋳型と相補的であり、５’末端と３’末端との間にランダム遺伝子ライブラリーを含む部位を有し、
補助プライマーは、５’末端がランダム遺伝子ライブラリープライマーと相補的であり、３’末端が鋳型と相補的であり、５’末端と３’末端との間にランダム遺伝子部分を持たず、
ＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）により鋳型を一周ＰＣＲし、ランダム遺伝子ライブラリーをプラスミドに導入するものである。
【００１７】
本発明の形質転換体作成方法は、本発明のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法により得られたランダム遺伝子プラスミドライブラリーを用いて宿主を形質転換するものである。
【００１８】
本発明のキットは、本発明のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法のためのキットであって、以下の構成品を含むものである。
（１）前記鋳型となるプラスミドＤＮＡ
（２）前記ランダム遺伝子ライブラリープライマー
（３）前記補助プライマー
（４）前記ＤＮＡポリメラーゼ
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ランダム遣伝子ライブラリープライマーのランダム遺伝子ライブラリーを含む部位を補助プライマーと相補鎖にしないことにより、一周ＰＣＲの過程でランダム配列部分の相補鎖が自動的に生成され、ランダム配列部分を含む発現プラスミドの合成を達成することができる。したがって、原理上ほとんどの配列を作成可能であり、新規ペプチド、および新規蛋白質を取得することができ、基礎研究、産業利用研究を問わず広い分野において利用することができる。
【００２０】
また、本発明によれば、操作が簡単で、ライブラリー規模を保ったランダム遣伝子プラスミドライブラリーを作成することができる。よって、特別なトレーニングを受けていない人でも容易にランダム遣伝子プラスミドライブラリーを作成することができる。
【００２１】
更に、本発明は、ランダム遺伝子、ベクター、宿主を選ばず、制限酵素切断部位の導入などを必要としないため、あらゆる新規ペプチドあるいは蛋白質の探索に幅広く利用できる。ＰＣＲ産物で宿主（例えば大腸菌）を形質転換するというきわめて簡便な操作で確実にランダムペプチドライブラリー、あるいはランダム蛋白質ライプラリーを取得できるためハイスループットの標的取得に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施の形態に係るランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法および形質転換体作成方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００２４】
図１は、本発明の一実施の形態に係る方法について、想定されうる一態様を表したものである。しかしながら、本発明の方法は、下記態様に限定されるものではない。
【００２５】
（１）本実施の形態のランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法、および、形質転換体作成方法
本方法は、鋳型となるプラスミドＤＮＡと、ランダム遺伝子ライブラリーを導入するためのランダム遺伝子ライブラリープライマーと、補助プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用いることを特徴とする。この時、導入されるランダム遣伝子配列は、少なくともランダム遣伝子ライブラリープライマーに含まれる。また、ランダム遺伝子ライブラリープライマーを用いてランダム遺伝子プラスミドライブラリーを作成する際の変異導入方法は、ランダム遺伝子部分の置換、欠失、挿入変異のいずれにおいても同様に使用できる。
【００２６】
鋳型となるプラスミドＤＮＡは、例えば、環状の２本鎖構造をとる。２本鎖の環状ＤＮＡのうち、鎖の一部にニックを有するＤＮＡ、および鎖の一部が一本鎖になっているＤＮＡも環状構造をとることができれば２本鎖の環状ＤＮＡに含まれる。プラスミドＤＮＡは発現プロモーター、ターミネーター、複製起点、セレクシンョマーカーを含む発現プラスミドであることが望ましい。さらにプラスミドはファージディスプレイ法に用いられるようなファージベクターであることで好適に使用できる。
【００２７】
本方法に用いるランダム遣伝子ライブラリープライマーは、その５’末端に、補助プライマーと相補的な領域を有し、３’末端に、鋳型と相補的な領域を有する。ランダム遣伝子ライブラリープライマーの中間部分、すなわち５’末端と３’末端との間には、ランダム遺伝子ライブラリーを含む部位を有している。置換あるいは変異の場合、ランダム配列を短くすることによって変更する部分のみに変異を入れることで好適に達成できる。ランダム遣伝子ライブラリープライマーと補助プライマープライマーとの相補的な領域は、ランダム遺伝子ライブラリーを含む部位より５’末端側にあれば良く、一周ＰＣＲを行った後にできた二本鎖ＤＮＡの突出末端が互いにアニールするための相補的な配列を提供できることが望まれる。
【００２８】
ランダム遣伝子ライブラリープライマーの５’末端の補助プライマーと相補的な領域の長さは、２〜１００塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜８０塩基であり、特に好ましくは６３塩基である。
【００２９】
ランダム遺伝子ライブラリープライマーの３’末端の鋳型と相補的な領域は、特異的にＰＣＲできる長さを持つことが好ましく、その長さは、例えば、２〜２００塩基、より好ましくは１０〜１００塩基であり、特に好ましくは５８塩基である。
【００３０】
ランダム遣伝子ライブラリープライマーのランダム遺伝子ライブラリーを含む部位の長さは、１〜２０００塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜１０００塩基であり、更に好ましくは２０〜１００塩基であり、特に好ましくは５８塩基である。
【００３１】
本方法において、ランダム遣伝子ライブラリープライマーの設計は、置換、欠失、いずれの場合も同様の操作を行えばよく、挿入よりもより好適に行えることは自明である。本方法において、特に限定はされないが、例えば、置換の場合は１〜３０塩基の範囲、特に好ましくは、１〜５塩基の範囲で変異導入を効果的に行うことができる。特に欠失の場合は、欠失させる鎖長に制限はない。
【００３２】
本方法において、ランダム遣伝子ライブラリープライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーのみならず、その類似体も好適に使用できる。
【００３３】
本方法に用いる補助プライマーは、その５’末端に、ランダム遺伝子ライブラリープライマーと相補的な領域を有し、３’末端に、鋳型と相補的な領域を有する。ランダム遣伝子ライブラリープライマーの中間部分、すなわち５’末端と３’末端との間には、ランダム遺伝子部分を持っていない。
【００３４】
補助プライマーの５’末端のランダム遺伝子ライブラリープライマーと相補的な領域の長さは、２〜１００塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜８０塩基であり、特に好ましくは６３塩基である。
【００３５】
補助プライマーの３’末端の鋳型と相補的な領域は、特異的にＰＣＲできる長さを持つことが好ましく、その長さは、例えば、２〜２００塩基、より好ましくは１０〜１００塩基であり、特に好ましくは５８塩基である。
【００３６】
本方法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法に用いることができる酵素全般好ましいが、校正活性に優れるＤＮＡポリメラーゼが特に好適である。特に限定はないが、例えば、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）、ＫＯＤ    ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  Ｃｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）等が好適に使用できる。
【００３７】
本方法では、上述した鋳型となるプラスミドＤＮＡと、ランダム遺伝子ライブラリープライマーと、補助プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用い、ＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応）により鋳型を一周ＰＣＲし、ランダム遺伝子ライブラリーをプラスミドに導入する。ランダム遣伝子ライブラリープライマーは、５’末端および３’末端で鋳型であるプラスミドＤＮＡにアニールし、補助プライマーは、５’末端および３’末端、すなわち全部で鋳型であるプラスミドＤＮＡにアニールする。ランダム遣伝子ライブラリープライマー、および、補助プライマーからの伸長した鎖は、鋳型である環状のプラスミドＤＮＡに沿って一回りしてプライマー自身の５’末端に到達して伸長停止する。その結果、お互いのプライマーから生じる伸長鎖同士がアニールした分子は両端に相補な５’突出末端をもつ互いに相補的な２本鎖となり、水素結合により安定に保たれるため環状プラスミド構造となる。
【００３８】
なお、ランダム遣伝子ライブラリープライマーにおいて、ランダム遣伝子ライブラリーを含む部位は鋳型とアニーリングしないが、補助プライマーから伸長した鎖は、鋳型を一周してランダム遺伝子ライブラリーを含む部位に相補的な鎖を合成し、結果としてランダム遣伝子ライブラリーが挿入されたプラスミドＤＮＡを生成する。
【００３９】
その際、２本鎖ＤＮＡの一部は、突出部分の相補鎖が合成されて突出部のない２本鎖ＤＮＡとなりそうだが、鋳型の３’末端にもプライマーの５’末端の塩基配列がアニーリングするため、伸長がブロックされることにより、形成される末端形状は５’突出になる。本方法では、相補領城をプライマーのアニールに十分な鎖長に設定しているため、ＰＣＲ反応中に以上のような好適な反応が起こると考えられる。
【００４０】
本方法で得られたプラスミドＤＮＡ、すなわちランダム遺伝子プラスミドライブラリーを含むＰＣＲ溶液は、連結反応などなしに宿主細胞の形質転換に直接使用できる。本方法において用いる宿主（細胞）は、原核細胞であれば良く、特に好ましくは大腸菌であり、コンピテントセルでも良い。本方法では、そのまま発現プラスミド産物を用いて宿主を形質転換し、生物での標的遣伝子発現やファージの表面への標的ペプチドあるいは蛋白質ライプラリーの提示を行い、１０５〜１０１２の規模のペプチドあるいは蛋白質から、機能スクリーニングすることで効果的に機能ペプチドおよび蛋白質を取得する。
【００４１】
本方法において形質転換の方法は、生きた大腸菌にプラスミドを導入できる方法ならば特に制限はないが、好ましくは、エレクトロポレーション法あるいは塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法などの化学試薬による方法がよい。
【００４２】
本方法によれば、高い効率でＤＮＡに遣伝子を挿入することができる。本方法により目的の遣伝子挿入をした細胞が得られる効率は、全形質転換細胞に対して６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９３％以上である。
【００４３】
（２）本方法のためのキット
本キットは、上述したランダム遺伝子プラスミドライブラリー作成方法を実施するためのキットである。本キットは、当該方法を実施する上で使用するための単数又は複数の酵素又はその他の試薬を含む。本キットには、当該方法を実施するときに精度と正確さの両方を確保するよう、予め測定された量の試薬が含まれていてもよい。また、本キットには、実施方法が記載された指示書が含まれていてよい。
【００４４】
本キットは、最低限、以下のものを含む。
（１）鋳型となるプラスミドＤＮＡ
（２）ランダム遺伝子ライブラリープライマー
（３）補助プライマー
（４）ＤＮＡポリメラーゼ
これらについては上述した通りである。
【００４５】
本キットには、個々のヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの等モル混合物を含む）、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物、変異導入用プライマー、凍結コンピテントセル、ＰＣＲ緩衝液、などを含んでいてもよい。
【００４６】
このように本方法によれば、ランダム遣伝子ライブラリープライマーのランダム遺伝子ライブラリーを含む部位を補助プライマーと相補鎖にしないことにより、一周ＰＣＲの過程でランダム配列部分の相補鎖が自動的に生成され、ランダム配列部分を含む発現プラスミドの合成を達成することができる。したがって、原理上ほとんどの配列を作成可能であり、新規ペプチド、および新規蛋白質を取得することができ、基礎研究、産業利用研究を問わず広い分野において利用することができる。
【００４７】
また、本方法によれば、操作が簡単で、ライブラリー規模を保ったランダム遣伝子プラスミドライブラリーを作成することができる。よって、特別なトレーニングを受けていない人でも容易にランダム遣伝子プラスミドライブラリーを作成することができる。
【００４８】
更に、本方法は、ランダム遺伝子、ベクター、宿主を選ばず、制限酵素切断部位の導入などを必要としないため、あらゆる新規ペプチドあるいは蛋白質の探索に幅広く利用できる。ＰＣＲ産物で宿主（例えば大腸菌）を形質転換するというきわめて簡便な操作で確実にランダムペプチドライブラリー、あるいはランダム蛋白質ライプラリーを取得できるためハイスループットの標的取得に有用である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５０】
（１）ランダム遣伝子ライブラリープライマーの作製
Ｍ１３ファージベクターの塩基配列を鋳型に２種のプライマーを設計し、有機合成による作成をＦａｓｍａｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄに委託した。すなわち、鋳型ＤＮＡに相補的な部分とランダム遺伝子ライブラリーを含む部分とを併せ持つランダム遣伝子ライブラリープライマーＩｎｖｓ＿ＣＸ１２Ｃ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーと、鋳型ＤＮＡに相補的な補助プライマーＩｎｖｓ＿Ｆｗ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーである。
【００５１】
Ｉｎｖｓ＿ＣＸ１２Ｃ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーと、Ｉｎｖｓ＿Ｆｗ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーは、いずれもその５’末端より６３塩基がプライマー間で相補的であり、Ｉｎｖｓ＿ＣＸ１２Ｃ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーはその５’末端から６４〜１２１番目の塩基が鋳型ＤＮＡと相補的ではなく、その５’末端より７１〜１０６番目の塩基がランダムな配列になっている。また、Ｉｎｖｓ＿ＣＸ１２Ｃ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーは全長１３８塩基中８０塩基が鋳型ＤＮＡに相補的であり、Ｉｎｖｓ＿Ｆｗ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅプライマーは全長８０塩基すべてが鋳型ＤＮＡに相補的である。
【００５２】
Ｉｎｖｓ＿ＣＸ１２Ｃ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：
ＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧ
（１３８  ｂａｓｅ／電気泳動精製／５’末端のリン酸化／Ｔｍ値７５．３℃）
【００５３】
Ｉｎｖｓ＿Ｆｗ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：
ＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣ
（８０  ｂａｓｅ／電気泳動精製／５’末端のリン酸化／Ｔｍ値６６．６℃)
【００５４】
（２）ランダム遣伝子ライブラリー挿入のための一周ＰＣＲ
Ｍ１３ＫＥファージベクター（全長７２２２ｂｐ,  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｒａｂ）にアンピシリン耐性遺伝子を遺伝子操作により挿入し、ファージベクターＭ１３ＫＥ／ＡｍｐＲ（全長８５２９ｂｐ）を作製した。そしてＭ１３ＫＥ／ＡｍｐＲ  １ｎｇを鋳型に、上記（１）で委託合成した１０ｐｍｏｌのランダム遺伝子ライブラリープライマーと１０ｐｍｏｌの補助プライマーとを用いて、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ，３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ校正機能の高いＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ１．２５Ｕ(タカラバイオ社製）を用いて、添付の反応緩衝液１０μｌを取り扱い説明書の通りに扱い、反応容量５０μｌになるように滅菌蒸留水と混合し、インバースＰＣＲを行った。
【００５５】
反応条件は熱変性９８℃  １０秒、アニーリング６５℃  ５秒、伸長７２℃  ９分を１サイクルとする３０サイクル反応で反応機器、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｅｒｉｔｉ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて行った。次に、ＰＣＲ反応終了後の反応液をＰＣＩ処理、エタノール沈殿し、鋳型プラスミドを消化するために制限酵素であるＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇ１ａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を６０Ｕ、添付の反応緩衝液２０μｌを添加し、反応容量２００μｌになるように滅菌蒸留水と混合し、３７℃にて２時間反応させた。ＤｐｎＩ処理した反応液を再びＰＣＩ処理、エタノール沈殿し９μｌ用いて、大腸菌ＥＲ２７３８エレクトロコンピテントセル（コスモ・バイオ社製）をエレクトロポレーンションによって形質転換を行った。形質転換体を含む菌体液は、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地上にまき、翌日生えてきたコロニーの数を数えた。
【００５６】
数十個のコロニーをつついてそれぞれ液体培養し、遺伝子のシークエンシングを行った。そうして目的の遺伝子が入っている割合と、変異の多様性およびライブラリー規模を評価した。その結果を表１に示す。本実施例によれば、効果的に９３％の変異遣伝子ライブラリーを得ることができた。
【００５７】
【表１】
2020059659.tif 000003
【００５８】
ＤＮＡシークエンサーを用いて配列解析し、９０配列中８４配列がランダムであることを調べた。増幅の操作をはさんでいないので原理的に重複は起こらず、鋳型以外はすべて異なる配列と想定できる。コロニー数と遣伝子挿入成功率からライブラリーの規模を算出すると、１．４×１０７となった。
【００５９】
以上、実施の形態及び実施例を挙げて本発明を説明したが、本発明は上記実施の形態及び実施例に限定されるものではなく、種々変形可能である。例えば、上記実施の形態及び実施例では、各構成要素について具体的に説明したが、全ての構成要素を備えていなくてもよく、また、他の構造を有するように構成してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明により、簡便な操作でランダム遣伝子配列を導入したプラスミドを作成でき、発現できる方法を提供できる。さらには、当該方法のためのキットが提供される。それによって、多くの人が、新規有用タンパク質の研究開発に参入できるようになり、基礎研究および産業利用のためのシーズ開発につながり、経済的に多大な利益をもたらす。
【図１】
2020059659.tif 000004