(57)【要約】【課題】  様々なリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、クエン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的に安定であり、脂質部分を含有しないリン酸エステルを加水分解しない性質を有するホスホリパーゼＣを提供すること。【解決手段】  酸性から中性のｐＨにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しないホスホリパーゼＣ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性から中性のｐＨにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しないホスホリパーゼＣ。
【請求項２】
ホスファチジルイノシトール特異的ではない、請求項１記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項３】
至適ｐＨがｐＨ３乃至ｐＨ６の範囲にある、請求項１または２記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項４】
ｐＨ７における相対活性が２０％以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項５】
糸状菌によって産生される、請求項１〜４のいずれか１項記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項６】
糸状菌がアスペルギルス属である、請求項５記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項７】
アスぺルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）あるいはアスぺルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ）によって産生される、請求項６記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項８】
アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株、あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株によって産生される、請求項７に記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項９】
以下の性質：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約８７，０００を示す；
２）ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールを加水分解する；
３）グリセロホスホリルコリンおよびパラニトロフェニルリン酸を実質的に加水分解しない；
４）卵黄由来レシチンをｐＨ３乃至ｐＨ９の範囲で加水分解する；
５）０℃乃至８０℃の範囲において４）記載の加水分解活性を有する；
６）温度安定性について、ｐＨ４．５において４５℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ安定性について、ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲で安定である、
を示す請求項１〜８のいずれか１項記載のホスホリパーゼＣ。
【請求項１０】
請求項１〜４および９のいずれか１項記載のホスホリパーゼＣを生産する能力を有する、単離されたアスぺルギルス・オリザエあるいはアスぺルギルス・タマリに属する糸状菌、ただし、アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株を除く。
【請求項１１】
配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと７０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ホスホリパーゼＣ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質であるホスホリパーゼＣ。
【請求項１３】
１）請求項８に記載のアスペルギルス・オリザエあるいはアスぺルギルス・タマリを培養する工程、および、
２）１）の培養産物からホスホリパーゼＣを分離・精製する工程、
を含む、ホスホリパーゼＣの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＣ、該ホスホリパーゼＣを生産する糸状菌、糸状菌の培養物から該ホスホリパーゼＣを分離精製する方法、該ホスホリパーゼＣをコードするＤＮＡおよび該ホスホリパーゼＣの製造方法等に関する。具体的には、本発明は、食品工業および医薬品工業における使用に特に適するホスホリパーゼＣ、特に糸状菌アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）あるいはアスぺルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ）が生産するホスホリパーゼＣ、該ホスホリパーゼＣを生産する糸状菌、糸状菌の培養物から該ホスホリパーゼＣを分離精製する方法、該ホスホリパーゼＣをコードするＤＮＡおよび該ホスホリパーゼＣの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
〔１〕ホスホリパーゼＣ
従来、動物および微生物がホスホリパーゼＣを生産することが知られている。動物由来の酵素は主としてホスファチジルイノシトール選択的なホスホリパーゼＣである。また、微生物のなかでは細菌、放線菌、酵母およびカビ由来のホスホリパーゼＣが知られている。細菌、放線菌および酵母が生産するホスホリパーゼＣは、ホスファチジルイノシトール選択的あるいはホスファチジルコリン選択的なものがほとんどである。
【０００３】
細菌由来のホスホリパーゼＣとしては、例えばシュードモーナス・シュルキリエンシス（Ｐｓｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｓｃｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅｎｓｉｓ）（例えば、特許文献１参照）、ブルコールデリア・シュードマレイ（Ｂｕｌｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（例えば、非特許文献１参照）、バチラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（例えば、非特許文献２参照）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（例えば、非特許文献３参照）およびクロストリディウム・ぺルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）（例えば、非特許文献４参照）等が生産するホスホリパーゼＣが知られている。
【０００４】
放線菌由来のホスホリパーゼＣとしては、例えばストレプトマイセス・ハチジョウエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈａｃｈｉｊｙｏｅｎｓｉｓ）（例えば、特許文献２参照）が生産するホスホリパーゼＣが知られている。
【０００５】
酵母由来のホスホリパーゼＣとしては、例えばキャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（例えば、非特許文献５参照）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、非特許文献６参照）等が生産するホスホリパーゼＣが知られている。
【０００６】
カビ由来のホスホリパーゼＣは、従来２例知られている。一つはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（例えば、特許文献３参照）、もうひとつはアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）（例えば、非特許文献７参照）が生産するホスホリパーゼＣである。
【０００７】
〔２〕レシチン
レシチンは、動物、植物、菌類に広く分布している代表的なグリセロリン脂質である。グリセロリン脂質とは、１，２−ジアシルグリセロールの３位にホスホリル塩基が共有結合している化合物である。塩基としては、コリン、エタノールアミン、セリン、イノシトールおよびグリセロール等が含まれており、その組成割合は由来により異なる。レシチンはグリセロリン脂質に含有される概念として用いるものとする。
【０００８】
レシチンは、界面活性作用、酸化防止作用、生理活性作用等を有し、食品、飼料、医薬品等に利用されている。食品工業においては、卵黄レシチンや大豆レシチンなどに代表される天然レシチンが食品添加物として使用されており、食品の性質を改変するために主に乳化剤等として使用され、豊富に供給されている。
【０００９】
〔３〕レシチンの酵素処理
レシチンを酵素により部分的に加水分解し、新たな性質を付与する検討も行われている。この際に用いられる酵素がホスホリパーゼ類であり、ホスホリパーゼＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄが知られている。グリセロリン脂質の１位あるいは２位の脂肪酸を選択的に加水分解するのがホスホリパーゼＡである。非選択的に加水分解するのがホスホリパーゼＢ、ジアシルグリセロールとホスホリル塩基に加水分解するのがホスホリパーゼＣ、ホスファチジン酸と塩基に分解するのがホスホリパーゼＤである。
【００１０】
食品工業の分野において、現在最も比較的多く使用されているのはホスホリパーゼＡである。レシチンは水に難溶性であるが、レシチンにホスホリパーゼＡを作用させるとアシル基が部分的に加水分解され、水溶性のリゾレシチンが生成する。リゾレシチンを食品添加物として使用した場合には、得られる食品の物性がこれまでレシチンを用いて得られていた食品の物性とは異なる可能性がある。
【００１１】
〔４〕スフィンゴリン脂質
スフィンゴリン脂質は、グリセロリン脂質とともに、リン脂質を構成している。
スフィンゴリン脂質の代表はスフィンゴミエリンであり、セラミドの１級アルコールにコリンリン酸がリン酸ジエステル結合した化合物である。動物の臓器に広く含まれている。母乳にも含有されることから、乳児用粉ミルクに配合されることもある。
スフィンゴミエリンにホスホリパーゼＣを作用させるとコリンリン酸がはずれ、セラミドが生成する。セラミドは保湿成分として、化粧品に広く使用されている。また、アトピー性皮膚炎はセラミドが不足することにより惹起されるという報告がある。
【００１２】
〔５〕食品中でのホスホリパーゼＣの使用
ホスホリパーゼＣを用いることにより、下図に示すように水の存在下でレシチンからジアシルグリセロールを生産することができる。
【００１３】
【化１】
2010252815.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれアルキル基を、Ｒ３は、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール等の基を意味する。）
【００１５】
食品素材中でこのような反応を起こさせることにより、ホスホリパーゼＡとは本質的に異なった性質を付加した商品が提供できる可能性がある。
ここで用いられるホスホリパーゼＣには、様々なグリセロリン脂質を加水分解することが求められる。たとえば大豆レシチンにはホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを主として、ホスファチジルグリセロールあるいはホスファチジルイノシトール等も含まれていることが知られている。また、卵黄由来レシチンにはホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンが主として含まれている。したがって、用いられるホスホリパーゼＣは、これらを区別無く加水分解することが望ましい。
【００１６】
しかし、食品中にはリン脂質以外にもリン酸エステルが多く含有されており、それらを加水分解してリン酸を遊離させることは、当該食品の性質をさらに変質させてしまうことにつながるので、好ましいものではない。したがって、リン脂質以外のリン酸エステルは加水分解しないホスホリパーゼＣが望ましく、例えばグリセロホスホリルコリンのように、リン脂質に類似するが脂質部分を含有しないリン酸エステルに対する酵素活性は無いホスホリパーゼＣが望ましい。
【００１７】
同様の観点から、用いられるホスホリパーゼＣは、ホスファターゼ活性を有さないタンパク質であることが望ましい。すなわち、ホスファターゼの基質となるパラニトロフェニルリン酸分解活性を有しないホスホリパーゼＣが望ましい。
【００１８】
また、食品工業においては、食品の変質を防ぐため中性から弱酸性域でさまざまな処理を行うことが好ましく、ホスホリパーゼ等を含む酵素剤はこのｐＨ域に高い活性を有していることが望まれる。
【００１９】
〔６〕食品工業におけるホスホリパーゼＣの使用
ホスホリパーゼＣの用途には、例えば、パンの冷凍保存生地焼成時に、その表面で発生する老化、梨肌の緩和や食用油精製工程の改善がある。
大豆・菜種等から食用油を製造する際には、着色あるいは食味の劣化の原因となるため、レシチンは除去されるべき物質である。この目的のために、従来ホスホリパーゼＡを用いてレシチンを部分的に加水分解し、リゾレシチンとすることで水溶性にして除去する方法が検討されてきた。
【００２０】
しかし、ここでホスホリパーゼＣを用いてレシチンをジアシルグリセロールとすることにより、トリアシルグリセロールと共に油の一成分にすることができる。すなわち、食用油の製造工程において、歩留まりを向上させる効果が期待される。
【００２１】
ここで用いられるホスホリパーゼＣには、様々なリン脂質を加水分解することが求められる。たとえば大豆油中には先述した様々なリン脂質が含まれている。また、綿実油あるいは菜種油中にも同様にさまざまなリン脂質が含まれている。用いられるホスホリパーゼＣは、これらを区別なく加水分解することが望ましい。
【００２２】
また、製油工業においては油以外の不純物を酸性加温条件下で除去するので、酸性域での活性が高く、ある程度温度安定性を有する酵素剤の使用が望まれる。処理される粗油を酸性にするためにクエン酸が使用されることがあるので、用いられるホスホリパーゼＣにはクエン酸存在下での活性およびある程度の温度安定性が望まれる。
【００２３】
〔７〕既知のホスホリパーゼＣの問題点
動物、細菌、放線菌あるいは酵母が生産するホスホリパーゼＣは、主としてホスファチジルイノシトールあるいはホスファチジルコリン選択的であり、様々な基質を分解する必要がある食品工業における使用には向かない。さらに、動物起源の酵素剤は、宗教的に受け入れられない国および地域があり、汎用性にも問題がある。さらに、ホスホリパーゼＣを生産する細菌は、病原性を示すものがほとんどであり、安全性に問題がある。
【００２４】
従来知られている糸状菌由来のホスホリパーゼＣは、様々なリン脂質を加水分解する性質を有している。また、従来ホスホリパーゼＣの産生に用いられているいずれの糸状菌も食用酵素生産に実績がある特徴を有している。アスペルギルス・ニガーとアスペルギルス・サイトイの両菌株由来の酵素の、温度あるいはｐＨに関する性質は極めて類似しており、分子量も同一である。いずれも酸性側で強い活性を有しているが、中性付近では全く活性がないという特徴を有している。したがって、酸性側でこれらの酵素を使用する可能性がある製油工業においては、これらの酵素は使用できる可能性がある。しかしクエン酸中での性質については記載がなく、実際に製油工業で使用できるかどうかは不明である（特許文献３および非特許文献７参照）。また、ｐＨ６での活性がほぼ０であることが示されており、中性付近で酵素反応を行うことが多いと考えられる食品工業においては、使用しづらい酵素である（特許文献３参照）。
【００２５】
さらに、アスペルギルス・ニガーが生産するホスホリパーゼＣは、ホスファターゼの基質であるホスファチジン酸の分解活性が非常に高いことが記載されている（特許文献３参照）。したがって、該酵素は、リン酸モノエステルを加水分解する能力を有することから、ホスファターゼ活性をも併せ持つタンパク質であることが推察される。さらに、アスペルギルス・サイトイが生産するホスホリパーゼＣは、２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニルホスホリルコリンの分解活性が非常に高いことが記載されている（非特許文献７参照）。したがって、該酵素は、リン脂質以外のリン酸ジエステルを加水分解する能力をも併せもつタンパク質であることが推察される。したがって、これらの酵素を用いて加工される食品は、不必要に改質されてしまう可能性がある。
【００２６】
このように、従来知られているホスホリパーゼＣは、酵素の特性として不十分であるか、あるいは安全性に問題がある等の問題点が挙げられ、ホスホリパーゼＣとして市場に流通している酵素剤は現在までに存在しない。望ましい酵素剤の性質としては、既に食品用酵素剤の生産実績がある微生物由来であり、様々なリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、製油工業においても使用可能なようにクエン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的に安定であることが挙げられる。さらには、グリセロホスホリルコリンに代表されるようなリン脂質以外のリン酸エステルを加水分解しない性質を有するホスホリパーゼＣが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】特開昭５０−１０１７１８３号公報
【特許文献２】特開昭４９−５５８９３号公報
【特許文献３】特開２０００−１６６５４３号公報
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】コルブスリサテら（Ｋｏｒｂｓｒｉｓａｔｅ  Ｓ．  ｅｔ.  ａｌ．）「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー」（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１９９９年、３７巻、ｐ．３７４２−３７４５
【非特許文献２】タンら（Ｔａｎ  Ｃ．  ｅｔ.  ａｌ．）「プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピューリフィケイション」（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１９９７年、１０巻、ｐ．３６５−３７２
【非特許文献３】ダウガーティーら（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  Ｓ．  ｅｔ.  ａｌ．）「インフェクション・アンド・イミュニティー」（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１９９３年、６１巻、ｐ．５０７８−５０８９
【非特許文献４】ティットバールら（Ｔｉｔｂａｌｌ  Ｒ．  ｅｔ.  ａｌ．）「インフェクション・アンド・イミュニティー」（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１９８９年、５７巻、ｐ．３６７−３７６
【非特許文献５】アンダルツら（Ａｎｄａｌｕｚ  Ｅ．  ｅｔ.  ａｌ．）「イースト」（Ｙｅａｓｔ）２００１年、１８巻、ｐ．７１１−７２１
【非特許文献６】パイネら（Ｐａｙｎｅ  Ｗ．  ｅｔ.  ａｌ．）「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１９９３年、１３巻、ｐ．４３５１−４３６４
【非特許文献７】マツオカら（Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｓ．  ｅｔ.  ａｌ．）「バイオテクノロジー・アンド・アプライドバイオケミストリー」（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８７年、９巻、ｐ．４０１−４０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
上述のように、望ましいホスホリパーゼＣの性質としては、様々なリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、製油工業においても使用可能なようにクエン酸緩衝液中でも活性を有するとともに、ある程度熱的に安定であることが挙げられる。さらには、グリセロホスホリルコリンに代表されるような、リン脂質以外のリン酸エステルを加水分解しない性質を有するホスホリパーゼＣであることが挙げられ、さらに好ましくは、既に食品用酵素剤の生産実績がある微生物由来のホスホリパーゼＣであることが挙げられる。
このようなホスホリパーゼＣを提供することは、この技術分野において非常に関心の高いことであった。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明者らは、安全性に優れ、様々なリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、クエン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的に安定であり、リン脂質以外のリン酸エステルを加水分解しないホスホリパーゼＣを見出すべく鋭意検討を行ったところ、アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株、あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来のホスホリパーゼＣを精製し、アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株に由来するホスホリパーゼＣ遺伝子をクローニングし、本発明を完成するに至った。
【００３１】
すなわち本発明は、（１）  酸性から中性のｐＨにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しないホスホリパーゼＣ。
（２）  ホスファチジルイノシトール特異的ではない、（１）記載のホスホリパーゼＣ。
（３）  至適ｐＨがｐＨ３乃至ｐＨ６の範囲にある、（１）または（２）記載のホスホリパーゼＣ。
（４）  ｐＨ７における相対活性が２０％以上である、（１）〜（３）のいずれか１つ記載のホスホリパーゼＣ。
【００３２】
（５）  糸状菌によって産生される、（１）〜（４）のいずれか１つ記載のホスホリパーゼＣ。
（６）  糸状菌がアスペルギルス属である、（５）に記載のホスホリパーゼＣ。
（７）  アスぺルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）あるいはアスぺルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ）によって産生される、（６）に記載のホスホリパーゼＣ。
（８）アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株、あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株によって産生される、（７）に記載のホスホリパーゼＣ。
【００３３】
（９）  以下の性質：
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約８７，０００を示す；
２）ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールを加水分解する；
３）グリセロホスホリルコリンおよびパラニトロフェニルリン酸を実質的に加水分解しない；
４）卵黄由来レシチンをｐＨ３乃至ｐＨ９の範囲で加水分解する；
５）０℃乃至８０℃の範囲において４）記載の加水分解活性を有する；
６）温度安定性について、ｐＨ４．５において４５℃以下の温度で安定である；
７）ｐＨ安定性について、ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲で安定である。
を示す（１）〜（８）のいずれか１つに記載のホスホリパーゼＣ。
【００３４】
（１０）  下記のａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスホリパーゼＣ活性を有することを特徴とするタンパク質；
ｄ）ａ）またはｂ）に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質、
のいずれか一つに記載のタンパク質であるホスホリパーゼＣ。
【００３５】
（１１）  （１）〜（４）、（９）および（１０）のいずれか１つに記載のホスホリパーゼＣを生産する能力を有する、単離されたアスぺルギルス・オリザエあるいはアスぺルギルス・タマリに属する糸状菌。ただし、アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株を除く。
（１２）アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株である、（１１）に記載の糸状菌。
【００３６】
（１３）  下記のａ）〜ｄ）：
ａ）配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡと７０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ホスホリパーゼＣ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ；
ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
ｄ）配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、
のいずれか一つに記載のＤＮＡ。
（１４）  （１１）に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質であるホスホリパーゼＣ。
【００３７】
（１５）
１）（９）に記載のアスペルギルス・オリザエあるいはアスぺルギルス・タマリを培養する工程、および、
２）１）の培養産物からホスホリパーゼＣを分離・精製する工程、
を含む、ホスホリパーゼＣの製造方法。
【００３８】
（１６）  アスペルギルス・オリザエがアスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株、アスぺルギルス・タマリがアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株である（１５）記載の方法。
に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株由来の精製ホスホリパーゼＣの活性とｐＨとの関係を表した図である。
【図２】アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株由来の精製ホスホリパーゼＣの活性と温度との関係を表した図である。
【図３】アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株由来の精製ホスホリパーゼＣの温度安定性を表した図である。
【図４】アスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株由来の精製ホスホリパーゼＣのｐＨ安定性を表した図である。
【図５】アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来の精製ホスホリパーゼＣの活性とｐＨとの関係を表した図である。
【図６】アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来の精製ホスホリパーゼＣの活性と温度との関係を表した図である。
【図７】アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来の精製ホスホリパーゼＣの温度安定性を表した図である。
【図８】アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来の精製ホスホリパーゼＣのｐＨ安定性を表した図である。
【図９】アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株由来の精製ホスホリパーゼＣの活性とｐＨとの関係を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、特に指定しない限り、以下に示す各特性の測定方法は、後述する実施例または試験例に記載の測定方法による。
本発明は、酸性から中性のｐＨにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しないホスホリパーゼＣであるか、あるいは酸性から中性のｐＨにおいて活性を示し、かつ、ホスファターゼ活性を有しないホスホリパーゼＣである。
【００４１】
「酸性から中性のｐＨにおいて活性を示す」とは、ｐＨ約３乃至約７の範囲において、相対活性が２０％以上であることをいう。（酵素活性の測定法は「試験例１−１）ｐＨ活性」の記載に従う。）
【００４２】
また、「リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しない」とは、好ましくは、ホスファチジルコリン（卵黄由来）に対する加水分解活性を１００％とした場合における加水分解活性が、ホスファチジン酸に対しては３０％以下、さらに好ましくは２５％以下であること、および／またはグリセロホスホリルコリンに対しては１５％以下、さらに好ましくは１０％以下であること、および／またはパラニトロフェニルリン酸に対しては１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることをいう。「グリセロホスホリルコリンおよびパラニトロフェニルリン酸を実質的に加水分解しない」についても同様である。
ここで、ホスファチジン酸は、中性脂肪およびグリセロリン脂質の合成中間体であると認識されるため、本願の明細書等においてはグリセロリン脂質（リン脂質）には含まれないものとする。
【００４３】
「ホスファターゼ活性を有しない」とは、ホスファチジン酸またはパラニトロフェニルリン酸の分解活性がホスファチジルコリンの分解活性の５０％以下であることをいい、ホスファチジン酸の分解活性については、好ましくはホスファチジルコリンの分解活性の４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、最も好ましくは２５％以下である。また、パラニトロフェニルリン酸の分解活性については、好ましくはホスファチジルコリンの分解活性の３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下である。
【００４４】
本発明のホスホリパーゼＣは、スフィンゴミエリンに対する分解活性を有し、好ましくはその分解活性が、ホスファチジルコリンに対する分解活性と同等かそれ以上である。具体的には、ホスファチジルコリン（卵黄由来）に対する分解活性を１００％とした場合に、ホスファチジルコリンに対する分解活性が、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１０５％以上、最も好ましくは１１５％以上である。
【００４５】
また、本発明のホスホリパーゼＣは、ホスファチジルエタノールアミンに対する分解活性を有し、好ましくはその分解活性が、ホスファチジルコリンに対する分解活性と同等である。具体的には、ホスファチジルコリン（卵黄由来）に対する分解活性を１００％とした場合にホスファチジルエタノールアミンに対する分解活性が、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上であり、１５０％以下である。
【００４６】
ホスホリパーゼＣが、「ホスファチジルイノシトール特異的ではない」とは、ホスファチジルイノシトールの分解活性（相対活性）に比べて、ホスファチジルイノシトール以外の基質の分解活性の方が高いことを意味する。ここで、ホスファチジルイノシトール以外の基質としては、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルグリセロールである。
【００４７】
本発明のホスホリパーゼＣの至適ｐＨは、酸性から中性のｐＨの範囲にあることが好ましく、さらにｐＨ３乃至ｐＨ６の範囲にあることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ３乃至ｐＨ５の範囲であり、最も好ましくはｐＨ４乃至ｐＨ５の範囲である。
【００４８】
また、「ｐＨ７における相対活性」とは、最も活性が高いｐＨでの加水分解活性を１００％とし、ｐＨ７における酵素の加水分解活性を相対値として百分率（％）で表したものをいう。本発明のホスホリパーゼＣは、ｐＨ７における相対活性が、好ましくは２０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上である。
【００４９】
温度活性について、本発明のホスホリパーゼＣは、至適温度が、４５℃乃至７０℃の範囲にあることが好ましく、さらには５５℃乃至７０℃の範囲にあることが好ましく、最も好ましくは６０℃乃至７０℃の範囲である。また、本発明のホスホリパーゼＣは、５５℃乃至７０℃の範囲において相対活性が５０％以上であることが好ましく、さらに好ましくは４５℃乃至７０℃の範囲において相対活性が５０％以上であり、最も好ましくは３５℃乃至７０℃の範囲において相対活性が５０％である。また、５５℃乃至６５℃の範囲においては、相対活性が８０％以上であることが好ましい。
【００５０】
また、温度安定性について、「安定である」とは、４０％以上の残存加水分解活性を有していることを意味し、本発明のホスホリパーゼＣは、４５℃以下の処理温度において、残存活性が好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上である。また、本発明のホスホリパーゼＣは、処理温度が、好ましくは４５℃、さらに好ましくは５０℃、最も好ましくは６０℃において、残存加水分解活性が４０％以上である。
【００５１】
また、ｐＨ安定性について、「安定である」とは、保存処理後において、５％以上の残存加水分解活性を有していることを意味し、本発明のホスホリパーゼＣは、処理ｐＨがｐＨ５乃至ｐＨ９の範囲において、好ましくは残存加水分解活性が４０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上であり、最も好ましくは６０％以上である。また、処理ｐＨがｐＨ６乃至ｐＨ８の範囲において、好ましくは残存加水分解活性が６０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、最も好ましくは８０％以上である。
【００５２】
また、本発明のホスホリパーゼＣの別の例としては、配列番号１，２および３に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、好ましくはいずれか２つ、最も好ましくは３つ全てを含み、且つ、ホスホリパーゼＣ活性を有するタンパク質が挙げられる。該タンパク質は、これら３つのうちの２つ以上のアミノ酸配列を含む場合には、各々のアミノ酸配列の順序はいかなる順序であってもよい。
【００５３】
また、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスホリパーゼＣ活性を有することを特徴とするタンパク質も本発明に含まれる。置換したアミノ酸配列を有するタンパク質が、天然型タンパク質と同等の活性を有する例として、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当するヌクレオチド配列に置換して得られたタンパク質が、ＩＬ−２活性を保持することが知られている（Wang,  A.  et  al.  (1984)  Science  224,  1431-1433）。
【００５４】
また、本発明のホスホリパーゼＣの別の例としては、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げる事ができる。また、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質であっても、ホスホリパーゼＣ活性を有する限り本発明に含まれる。
【００５５】
また、本発明のホスホリパーゼＣの別の例としては配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、糖鎖によって修飾されているタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質を含むことからなるタンパク質も、ホスホリパーゼＣ活性を有する限り本発明に含まれる。
【００５６】
本発明のホスホリパーゼＣとして好適なものは、アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来のホスホリパーゼＣ、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質および配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、糖鎖によって修飾されているタンパク質が挙げられるが、より好適なものは、アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来のホスホリパーゼＣおよび配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、且つ糖鎖によって修飾されているタンパク質である。
【００５７】
本発明において、「本発明のＤＮＡ」とは、本発明のホスホリパーゼＣをコードするＤＮＡをいう。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工的に改変されたＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡなど、現在知られる限りどのような形態であっても良い。
【００５８】
本発明のＤＮＡの例としては、配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列であり、且つ、ホスホリパーゼＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００５９】
本発明のＤＮＡの別の例としては、配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列と７０％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡなどが含まれる。
【００６０】
また、本発明のヌクレオチドのさらに他の例としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対応するコドンは、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Grantham,  R.  et  al.  (1981)  Nucleic  Acids  Res.  9,  143-174）。さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的変異導入法（site  specific  mutagenesis／Mark,  D.  F.  et  al.  (1984)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81,  5662-5666）などに従うことができる。
【００６１】
本発明のＤＮＡのまた別の例としては、配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられる。また、配列番号４のコード領域（ＣＤＳ）のヌクレオチド配列を含むＤＮＡも、ホスホリパーゼＣ活性を有するタンパク質をコードしている限り、本発明に含まれるものである。
【００６２】
また、本発明のホスホリパーゼＣには、本発明のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、本発明のホスホリパーゼＣにおいて、任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本  利光ら“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”335-354）、カセット変異法（岸本  利光、“新生化学実験講座２・核酸ＩＩＩ  組換えＤＮＡ技術”242-251）などに従うことができる。このように、本発明のＤＮＡを元に遺伝子工学的手法により得られるタンパク質であっても、ホスホリパーゼＣ活性を有する限り本発明に含まれる。このようなホスホリパーゼＣは、必ずしも配列番号５に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその部分配列からなるタンパク質であっても、該タンパク質がホスホリパーゼＣ活性を示す限り本発明のホスホリパーゼＣに包含される。また、このようなホスホリパーゼＣをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００６３】
本発明に用いるホスホリパーゼＣはホスホリパーゼＣ生産菌から精製したもの、粗精製したもの、菌体の破砕液の他、菌体の培養上清をそのまま用いたものでも良い。ホスホリパーゼＣ生産菌を培養する際には、培地中に炭素源、窒素源の他に界面活性剤を添加して培養するのが好ましい。あるいは魚粉、スリゴマ、綿実粕等天然素材の培地で培養するのが好ましい。界面活性剤としては、トライトン、トゥイーン、ショ糖脂肪酸エステル、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムおよびサポニン等を挙げることができる。
【００６４】
ホスホリパーゼＣ生産菌の培養は通常の培養装置、培地を用いて行なうことができる。培養は液体培養、固体培養等の方法を適宜選択することができる。液体培養の場合はフラスコ培養や発酵槽を用いた培養を行なうことができ、培養開始後は培地の追加のないバッチ培養法や培養中に適宜培地を添加していく流加培養法を用いることができる。培地には炭素源、窒素源を添加し、必要に応じてビタミン、微量金属等を添加することができる。炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖類、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ラクトース、スクロース等の二糖類、デンプン等の多糖類、マルトエクストラクト等を挙げることができる。窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、イーストエクストラクト、マルトエクストラクト、コーンスティープリカー、ペプトン等の有機窒素を用いることができる。これらの培地中の組成物量は適宜選択することができる。培養温度、ｐＨ、通気攪拌量はホスホリパーゼＣ生産に適するように適宜選択することができる。
【００６５】
ホスホリパーゼＣ生産菌の培養終了後に遠心分離を行ない、菌体を除いた培養上清をそのまま粗酵素液として用いることができる。また、粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー等によって粗精製したり、精製したりしたものを用いることもできる。
【００６６】
本発明にいうアスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株は、本発明のホスホリパーゼＣを産生することができるものである限り、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも含有される。即ち、本発明のホスホリパーゼＣを生産するアスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てアスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株に包含される。
【００６７】
また、本発明のホスホリパーゼＣは、ベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細胞の培養産物から得る事もできる。このように適当なベクターに本発明のＤＮＡが挿入された組換えプラスミドも本発明に含まれる。このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさまざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられるが、これに限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの好適な態様である。
【００６８】
本発明の組換えプラスミドを、各種細胞に導入することにより、宿主細胞を得ることができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００６９】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia  coli）や枯草菌（Bacillus  subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００７０】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターを使用することができる。
【００７１】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも本発明のホスホリパーゼＣの産生に使用することができる。
【００７２】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐTUB２２８（Ohmura,  K.  et  al.  (1984)  J.  Biochem.  95,  87-93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
プロモーターとしては、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００７４】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman,  Y.  (1981)  Cell  23,  175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub,  G.  and  Chasin,  L.  A.  (1980)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77,  4126-4220）等を用いることができる。
【００７５】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用することができ、さらにこれは必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani,  S.  et  al.  (1981)  Mol.  Cell.  Biol.  1,  854-864）等を挙げることができるが、これに限定されない。
【００７６】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman,  H.  and  Magnusson,  G.  (1983)  Nucleic  Acids  Res,  11,  1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham,  F.  L.  and  van  der  Eb,  A.  J.  (1973)  Virology  52,  456-457）、および電気パルス穿孔法（Neumann,  E.  et  al.  (1982)  EMBO  J.  1,  841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook,  J.  et  al.  (1989)  :  “Molecular  Cloning  A  Laboratory  Manual“  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern,  P.  J.  and  Berg,  P.  (1982)  J.  Mol.  Appl.  Genet.  1,  327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のホスホリパーゼＣを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００７７】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera  frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia  niの卵細胞由来High  Five細胞（Wickham,  T.  J.  et  al,  (1992)  Biotechnol.  Prog.  I:  391-396）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd,  I.  M.  and  V.C.  Emery  (1993)  The  use  of  baculoviruses  as  expression  vectors.  Applied  Biochemistry  and  Biotechnology  42,  137-159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Zhe-mei  Wang,  et  al.  (1998)  Biol.  Chem.,  379,  167-174)。
【００７８】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces  cerevisiaeや石油酵母Pichia  pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,  J.  L.  and  Hall,  B.  D.  (1982)  J.  Biol.  Chem.  257,  3018-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara,  A.  et  al.  (1983)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  80,  1-5）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew,  L.  Niles,et  al.  (1998)  Biotechnol.Appl.  Biochem.  28,  125-131）。
【００７９】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に本発明のホスホリパーゼＣが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。培養条件としては、ＣＯ2濃度は０乃至５０％の範囲であればよく、好適には１乃至１０％でありより好適には５％である。培養温度は０乃至９９℃であればよく、好適には２０乃至５０℃であり、より好適には３５乃至４０℃である。
【００８０】
上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に組換えタンパク質として産生される本発明のホスホリパーゼＣは、培養産物中から、そのタンパク質の物理化学的性質、化学的性質、生化学的性質(酵素活性など)等を利用した各種の分離操作（「生化学データブックII」、1175-1259項、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同人発行;Biochemistry,  vol.  25,  No.25,  p8274-8277  (1986);  Eur.  J.  Biochem.,  163,  p313-321  (1987)等参照）により分離、精製することができる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの組み合わせ等を例示することができる。上記により、高収率で所望の組換えタンパク質を工業的規模で製造することができる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のホスホリパーゼＣを大量に製造することができる。
【００８１】
以上のような方法により製造されたホスホリパーゼＣも本発明の好適な例としてあげることができる。
【００８２】
ホスホリパーゼＣ生産菌とは、実質的にホスホリパーゼＣ生産能を有する微生物をいい、ホスホリパーゼＣを菌体内に蓄積する微生物や、菌体外に分泌する微生物等を含む。ホスホリパーゼＣ生産菌の培養上清または培養上清から精製したホスホリパーゼＣを用いる場合には菌体外にホスホリパーゼＣを分泌する菌を用いることができる。
【００８３】
本発明に用いるホスホリパーゼＣとしては、アスペルギルス・オリザエまたはアスぺルギルス・タマリ由来のホスホリパーゼＣを用いることができ、より好適なものは、アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来のホスホリパーゼＣを用いることができる。ホスホリパーゼＣは、これらホスホリパーゼＣ生産菌自身が生産するものでもよいし、その変異体または修飾体が生産するものであってもよく、更に、これらホスホリパーゼＣ生産菌のホスホリパーゼＣをコードする遺伝子を宿主に導入して得られた形質転換体から生産される組換えタンパク質であってもよい。
【００８４】
ホスホリパーゼＣ生産菌の入手
アスペルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株は独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：  ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ；〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、ホームページアドレス  <http://www.nite.go.jp/>）より入手することができる。
アスペルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７（＝ＩＡＭ  １３９０７）株は東京大学分子細胞生物学研究所（ＩＡＭ：  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ  ；〒１１３−００３２  東京都文京区弥生１−１−１、ホームページアドレス  <http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/indexe.html>）より入手することができる。
【００８５】
アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株の菌学的性質を以下に示す。
アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株をクリックの文献（Ｋｌｉｃｈ，  Ｍ．  Ａ．  （２００２）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｕｔｒｅｃｈｔ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従い、４種類の培地（ＣＹＡ培地，  ＣＹ２０Ｓ培地，  ＣＺ培地，  ＭＥＡ培地）に接種して、菌学的性状を観察した。
【００８６】
色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー」（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｗａｎｓｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．  （１９７８）  Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ  （３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ）．  Ｅｒｙｅ  Ｍｅｔｈｕｅｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ．）に従った。
【００８７】
４種類の培地（ＣＹＡ培地，  ＣＹ２０Ｓ培地，  ＣＺ培地，  ＭＥＡ培地）の組成は以下の通りである。
【００８８】
ＣＹＡ培地［ザペック  イースト  アガー（Ｃｚａｐｅｋ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ）培地］
（Ｋ2ＨＰＯ4  １．０ｇ，＊ザペック濃縮液  １０ml，イーストエキス  ５ｇ，シュークロース  ３０ｇ，寒天  １５ｇ，蒸留水  １０００ml）
＊ザペック濃縮液（ＮａＮＯ3  ３０ｇ，  ＫＣｌ  ５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ，ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ，ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ，蒸留水１００ml）
【００８９】
ＣＹ２０Ｓ培地［２０％  シュークロース  ザペック  イーストアガー（Ｃｚａｐｅｋ  Ｙｅａｓｔ  ＥｘｔｒａｃｔＡｇａｒ  ｗｉｔｈ  ２０％  Ｓｕｃｒｏｓｅ）培地］
（Ｋ2ＨＰＯ4  １．０ｇ，＊ザペック濃縮液  １０ml，イーストエキス  ５ｇ，シュークロース  ２００ｇ，寒天  １５ｇ，蒸留水  １０００ml）
【００９０】
ＣＺ培地［ザペック  ドックス  アガー  （Ｃｚａｐｅｋ  Ｄｏｘ  Ａｇａｒ）培地］
（Ｋ2ＨＰＯ4  １．０  ｇ，  ＊ザペック濃縮液  １０  ml，  シュークロース  ３０  ｇ，  寒天  １７．５  ｇ，  蒸留水  １０００  ml）
【００９１】
ＭＥＡ培地［モルト  エキス  アガー（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｇａｒ）培地］
（モルトエキス  ２０ｇ，ペプトン  １ｇ，グルコース  ２０ｇ，寒天  ２０ｇ，蒸留水  １０００ml）
【００９２】
１）菌学的性状
アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株の菌学的性状
ＣＹＡ培地でのコロニーは、２５℃、１週間の培養で直径３６−４０mmである。コロニーはやや厚く、羊毛状で、中心部では綿毛状となり、中心部から放射状の溝を形成する。菌糸は白色である。分生子は中心部に疎に形成され、灰黄色（４Ｂ４）から黄白色（４Ａ２）を呈する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は淡黄色（２Ａ４）から白色（２Ａ１）で、中心部から放射状の溝を形成する。可溶性色素は観察されない。
ＣＹＡ培地でのコロニーは、３７℃、１週間の培養で直径５４−５８mmである。コロニーは厚く、羊毛状である。菌糸は白色である。分生子は、中心部に形成され、灰黄色（４Ｂ４）から黄白色（４Ａ２）を呈する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は薄橙色（４Ａ４）から白色（４Ａ２）で、中心部から放射状の溝を形成する。可溶性色素は観察されない。
【００９３】
ＣＹ２０Ｓ培地でのコロニーは、２５℃、１週間の培養で直径３５−４１mmである。コロニー性状はＣＹＡ培地と同様となるが、中心部の綿毛状の菌糸がやや多い。
【００９４】
ＣＺ培地でのコロニーは、２５℃、１週間の培養で直径１７−２１mmである。コロニー性状はＣＹＡ培地と同様となるが、コロニーは小さく、分生子の形成が疎となる。
【００９５】
ＭＥＡ培地でのコロニーは、２５℃、１週間の培養で直径３７−４１mmである。コロニーは薄く、綿毛状である。菌糸は白色である。分生子は中心部に疎に形成され、暗緑色（２６Ｄ４）から灰緑色（２６Ｄ６）を呈する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は灰黄色（４Ｂ３）から黄白色（４Ａ２）で、可溶性色素は観察されない。
１４℃から４２℃まで生育し、１８℃から３８℃まで分生子形成が観察された。
【００９６】
分生子頭は放射状から緩い円柱状である。分生子柄は幅６．７−１３．６μm、長さ３０２．２−１３９８．０μm、無色、粗面である。頂嚢は亜球形からフラスコ形、幅は１４．６−２９．３μmである。アスペルギラ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌａ）は主に単列（ｕｎｉｓｅｒｉａｔｅ）、まれに２列（ｂｉｓｅｒｉａｔｅ）である。メトレまたはフィアライドは頂嚢の上部半分から形成される。メトレは１１．３−２８．３×５．２−９．９μmである。フィアライドはフラスコ形で、８．４−２１．３×３．８−７．７μmである。分生子は滑面、亜球形から卵形、直径４．２−６．３μmである。
【００９７】
以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックの文献に記載されているアスペルギルス  オリザエ（アールブルク）コーン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（Ａｈｌｂｕｒｇ）Ｃｈｏｎ）の性状とほぼ一致した。よって、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株をアスペルギルス・オリザエ（アールブルク）コーン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  （Ａｈｌｂｕｒｇ）Ｃｈｏｎ）と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【００９８】
ホスホリパーゼＣ生産菌から得られたホスホリパーゼＣの具体的な性質について以下に示すが、本発明のホスホリパーゼＣの有する性質は必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００９９】
アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株により生産され、精製されたホスホリパーゼＣは、以下の性質を有する。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約８７，０００を示す。
２）卵黄由来レシチン（ナカライ・テスク（株）製）をｐＨ３乃至ｐＨ９の範囲で加水分解する。
３）０℃乃至８０℃の範囲で４）記載の加水分解活性を有する。
４）ｐＨ４．５において４５℃以下の温度で安定である。
５）ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲で安定である。
６）２）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ４．５である。
７）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ４．５では６５℃である。
８）ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルグリセロールを加水分解するが、グリセロホスホリルコリンおよびパラニトロフェニルリン酸を実質的に加水分解しない。
【０１００】
一例として、卵黄由来ホスファチジルコリンに対する活性を１００％としたときの相対活性を表１に示した。なお、表中卵黄由来基質および大豆由来基質はその旨を記載した。また、卵黄由来レシチンはナカライテスク（株）、大豆由来レシチンは辻製油（株）から購入し、それ以外の基質はシグマアルドリッチジャパン（株）から購入した。
【０１０１】
【表１】
2010252815.tif 000003
【０１０２】
９）下記に示す部分アミノ酸配列を有する。配列はＮ末端から記す。
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ（配列番号１）。
【０１０３】
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ（配列番号２）。
【０１０４】
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−
Ａｌａ（配列番号３）。
【０１０５】
１０）タンパク質が糖鎖で修飾されている。
【０１０６】
以上のことから、本発明のホスホリパーゼＣの有する性質としては以下のようなものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて分子量約８７，０００を示す。
２）卵黄由来レシチン（ナカライテスク（株））をｐＨ３乃至ｐＨ９の範囲で加水分解する。
３）０℃乃至８０℃の範囲で４）記載の加水分解活性を有する。
４）ｐＨ４．５において４５℃以下の温度で安定である。
５）ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲で安定である。
【０１０７】
また、本発明のホスホリパーゼＣを製造する方法も本発明に含まれる。
アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株を初めとするホスホリパーゼＣ産生微生物を培地で培養することにより、ホスホリパーゼＣを生産することができる。例えば、０．１乃至５．０％ポリペプトン（和光純薬工業（株））、０．１乃至１．０％イーストエクストラクト（日本ベクトン・ディッキンソン（株））に０．０５乃至１．０％デオキシコール酸ナトリウムを添加した培地または０．１乃至４．０％ファーマメディア（TRANDERS  PROTEIN（株））に０．０５から１．０％トライトンＸ−１００（シグマアルドリッチジャパン（株））もしくは０．０５乃至０．３％卵黄レシチンを添加した培地あるいは１乃至１０％魚粉（池口喜一郎商店）の培地で、１６乃至４５℃で１乃至１５日間、１００乃至２５０rpmで振とう培養する。
【実施例】
【０１０８】
以下に、実施例および試験例を挙げるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【０１０９】
実施例１  アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株からのホスホリパーゼＣの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表２の組成の培地１００mlが入っている５００ml容の三角フラスコ（種フラスコ）にフィルター滅菌した５％デオキシコール酸ナトリウム溶液１mlおよびアスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株の菌体を接種し、２６℃にて７日間、１７０rpmの振とう培養を行った。
【０１１０】
【表２】
2010252815.tif 000004
【０１１１】
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１１２】
２）酵素活性測定法
ホスホリパーゼＣの加水分解活性は以下のようにして測定した。
<1>レシチンの加水分解反応
卵黄レシチン（ナカライテスク（株））１．５ｇを４％（wt/v）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ５０mlに溶解した基質溶液６０μlに２００mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）６０μlを加えて３７℃で保温した。この混合液に酵素液６０μlを加え撹拌して均一にし、３７℃で保温して３時間酵素反応を行った。
【０１１３】
<2>遊離ホスホリル塩基の加水分解反応
酵素反応の結果生じるホスホリル塩基をアルカリホスファターゼで加水分解した。<1>で調整した酵素反応液５０μlに２００mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０μlおよびアルカリホスファターゼ（シグマアルドリッチジャパン（株））１μlを加えて３７℃で４０分反応を行った。なおこのときブランクとしてアルカリホスファターゼを加えないサンプルも同時に調整した。
【０１１４】
<3>無機リン酸の定量
<2>の結果生じた無機リン酸をホスファＣテストワコー（和光純薬工業（株））で定量した。<2>で得られた反応液１００μlにホスファＣテストワコーのＡ液およびＢ液を各１ml添加し、３７℃で２０分間反応した。この混合液の７５０nmにおける吸光度を測定した。ブランクとの差がホスホリパーゼＣ活性になる。酵素反応1分間当たり１μmolのホスホリル塩基を生成する酵素活性を１単位とした。
【０１１５】
３）精製酵素液の調製
１）で得られた粗酵素液１，２００mlを１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８，０００mlに対して１２時間ずつ８回透析した。これを、予め１０mMトリス・塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株））カラム（直径２．２cm×長さ２０cm）に添加し、吸着させた。１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で該カラムを十分洗浄した後、１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００ml中に０乃至０．２Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．０５M乃至０．０８Mの画分（９０ml）に溶出された。これを粗精製酵素画分とした。
【０１１６】
得られた活性画分９０mlを２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４，０００mlに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（アマシャムバイオサイエンス（株））カラム（直径１０mm×長さ１０cm）に添加し、吸着させた。該カラムを２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ml中に０乃至０．２Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．１M乃至０．１２Mの画分（２５ml）に溶出された。
【０１１７】
得られた活性画分２５mlを濃縮し、予め０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００ｐｇ（アマシャムバイオサイエンス（株））カラム（直径１６mm×６０cm）に添加した後、０．１５M塩化ナトリウムを含む１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は、溶出量が６０ml乃至７０mlの画分に溶出された。
この画分を精製酵素溶液とした。
【０１１８】
４）精製酵素の分子量測定
１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法（Laemmli,  U.K.,  Nature,  227,  680(1970)参照）により、精製酵素の分子量を求めた。標準タンパク質として次のものを用いた：ａ．ホスホリラーゼ（phosphorylase）、分子量９４，０００：ｂ．アルブミン（albumin）、分子量６７，０００：ｃ．オバルブミン（ovalbumin）、分子量４３，０００：ｄ．カルボニック・アンヒドラーゼ（carbonic  anhydrase）、分子量３０，０００：ｅ．トリプシン・インヒビター（trypsin  inhibitor）、分子量２０，１００：ｆ．α−ラクタルブミン（α-lactalbumin）、分子量１４，４００。
精製酵素は分子量約８７，０００の単一バンドを示した。
【０１１９】
実施例２  アスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株からのホスホリパーゼＣの精製
１）粗酵素液の調製
表２に示した組成の培地１００mlが入っている５００ml容の三角フラスコ（種フラスコ）にフィルター滅菌した５％デオキシコール酸ナトリウム溶液１mlおよびアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株の菌体を接種し、２６℃にて５日間、１７０rpmの振とう培養を行った。培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１２０】
２）精製酵素液の調製
実施例１.  ３）と同様に精製を行い、精製酵素溶液を得た。
【０１２１】
３）精製酵素の分子量測定
実施例１.  ４）と同じ方法で測定した。
精製酵素は分子量約８７，０００の単一バンドを示した。
【０１２２】
実施例３  アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株からのホスホリパーゼＣの精製
１）粗酵素液の調製
滅菌した表３の組成の培地１００mlが入っている５００ml容の三角フラスコ（種フラスコ）にアスペルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株の菌体を接種し、２６℃にて７日間、１７０rpmの振とう培養を行った。
【０１２３】
【表３】
2010252815.tif 000005
【０１２４】
培養終了後、４℃、１０，０００×Ｇにて１０分間の遠心分離を行った。得られた上清を粗酵素液とした。
【０１２５】
２）精製酵素液の調製
１）で得られた粗酵素液６００mlを１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８，０００mlに対して１２時間ずつ５回透析した。これを、予め１０mMトリス・塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株））カラム（直径２．２cm×長さ２０cm）に添加し、吸着させた。１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で該カラムを十分洗浄した後、１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）６００ml中に０乃至０．６Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．３０M乃至０．３５Ｍの画分（５０ml）に溶出された。これを粗精製酵素画分とした。
【０１２６】
得られた活性画分５０mlを２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）４，０００mlに対して１２時間ずつ３回透析した後、予め２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＭｏｎｏＱ（アマシャムバイオサイエンス（株））カラム（直径１０mm×長さ１０cm）に添加し、吸着させた。該カラムを２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分洗浄した後、２０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５０ml中に０乃至０．６Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は塩化ナトリウム濃度が０．１２M乃至０．２０Mの画分（３５ml）に溶出された。
【０１２７】
得られた活性画分３５mlを濃縮し、予め０．１５M塩化ナトリウムを含む１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ２００pg（アマシャムバイオサイエンス（株））カラム（直径１６mm×６０cm）に添加した後、０．１５M塩化ナトリウムを含む１０mMトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は、溶出量が６０ml乃至７０mlの画分に溶出された。
この画分を精製酵素溶液とした。
【０１２８】
３）精製酵素の分子量測定
実施例１の４）と同じ方法で測定した。
精製酵素は分子量約８７，０００の単一バンドを示した。
【０１２９】
実施例４  アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株からのホスホリパーゼＣの部分アミノ酸配列の決定
精製した酵素溶液を約１mg/ml程度まで限外濾過膜（ザルトリウス（株）VIVASPIN2、分子量分画１万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液１５０μlにDenature buffer（６M塩酸グアニジン、１０mM  EDTA、０．１M炭酸水素アンモニウムｐＨ７．８）１５０μlおよび５０mM  ジチオスレイトール６μlを加え、９５℃で１０分間反応させた。室温まで冷却後、反応液にDenature buffer溶液に溶解した５０mMヨードアセトアミド３０μlを加え、暗所室温で１時間反応させた。この溶液を２０mM炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）で予め平衡化しておいたHitrap Desalting（アマシャムバイオサイエンス（株））カラムに添加した後、２０mM炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）にて溶出させた。溶出量が１．５ml乃至２．５mlの画分に溶出した溶液を凍結乾燥し、２０mM炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）１００μlに溶解した。得られた溶液にトリプシン（Modified、プロメガ（株））６０ユニットを加え、３７℃で１８時間酵素反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（日立製作所（株））にかけて分解アミノ酸のピークを分離した。分離条件を以下に示す。
【０１３０】
カラム：東ソー（株）  TSKgel ODS-120T (４．６mm×１５０mm)
A  buffer：０．１％TFA/Water
B  buffer：０．１％TFA/Acetonitril
グラジエント：１０→７０％B  ２％／ml
Flow：１ml/分
【０１３１】
分離した分解アミノ酸のうち、３本のピーク（B  buffer濃度  ３０から３８％程度）を分取し、これについてアミノ酸配列解析装置（Procise cLC、アプライドバイオシステムズジャパン（株））でアミノ酸配列を解析した。その結果得られた部分アミノ酸配列をアミノ末端側から記す。
【０１３２】
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ（配列番号１）。
【０１３３】
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ（配列番号２）。
【０１３４】
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−
Ａｌａ（配列番号３）。
【０１３５】
実施例５  アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株由来のホスホリパーゼＣをコードするＤＮＡの同定
１）全ＲＮＡの精製
アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株を液体培地（２％ ポリペプトン、０．５％ イースト  エクストラクト、０．０２％ リン酸水素2カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム）２０mlで２６℃、１日間前培養した。その後、液体培地（５％魚粉）に１％植菌し、２６℃で４日間培養した。培養した菌体を吸引集菌し、−８０℃で冷やした乳鉢（オートクレーブ滅菌済）に移した。液体窒素を加えながら、乳棒で菌体を破砕し、粉末状にした。完全に粉末状になった菌体をRNeasy Plant Mini Kit(キアゲン（株）)を用いて全ＲＮＡの精製を行った。９０５ng/μlの濃度の溶液が、５０μl得られた。
【０１３６】
２）ホスホリパーゼＣ遺伝子の解読
５'ＲＡＣＥ法および３'ＲＡＣＥ法にて遺伝子配列の解読をおこなった。具体的には、５'ＲＡＣＥ Systemおよび３'ＲＡＣＥ System（いずれもインビトロジェン（株））を使用し、ポリメラーゼとしてEx TaqTM(タカラバイオ（株）)を用いてＰＣＲをおこなった。このときに使用したＰＣＲプライマーは、5'側の遺伝子配列増幅用に5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'および5'-GACAGTGTAGTCGAGCACAGCGAA-3'、3'側の遺伝子配列増幅用に5'-GACTCTGCCACCGCAATCGGCTA-3'および5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'を用いた。ＰＣＲサイクルは、９４℃・５分、（９４℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・２分３０秒）×３０、７２℃・１０分、４℃で増幅した。５'側の遺伝子配列約１２００b.p.、３'側の遺伝子配列約８００b.p.の長さのＤＮＡが増幅された。
【０１３７】
各々のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動をおこなった後、QIAquick Gel Extarction Kit（キアゲン（株））で精製した。精製物をTOPOTMTAクローニングキット（インビトロジェン（株））を用いてベクターに連結し、形質転換をおこなった。形質転換した大腸菌を３７℃、一晩寒天培地（ＬＢ/Agar（和光純薬工業（株）））上で培養した後、生育したコロニーを３７℃、一晩液体培地（ＬＢbroth（和光純薬工業（株）））で培養した。増殖した大腸菌からプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン（株））を用いて精製し、DNA配列解析をおこなった。DNA配列解析の結果を配列番号４に示した。また、DNA配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５に示した。
【０１３８】
実施例６  アスぺルギルス・オリザエＮＢＲＣ  ４１９０株由来ホスホリパーゼＣのグリコペプチダーゼ処理
１）酵素反応
精製した酵素溶液を限外濾過膜（ザルトリウス（株）VIVASPIN2、分子量分画１万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液２０μlに、蒸留水１５μl、０．２５mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０μlおよび１M ２-メルカプトエタノール/２％ドデシル硫酸ナトリウム溶液２．５μlを加え、９５℃にて５分間反応した。急冷後、１５％Triton X-100（シグマアルドリッチジャパン（株））２．５μlを加え、グリコペプチダーゼF（シグマアルドリッチジャパン（株））１０ユニットを加えて、３７℃にて２０時間反応した。
【０１３９】
２）反応後の分子量測定
実施例１の４）と同じ方法で測定した。
酵素反応後の分子量約６３,０００の単一バンドを示した。
【０１４０】
試験例１  アスペルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株由来ホスホリパーゼＣの精製酵素液の諸性質
実施例１の３）で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
【０１４１】
１）ｐＨ活性
実施例１の２）に示した方法に拠った。ただし酵素反応時間は３７℃、１０分間とした。また、緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ２．３乃至ｐＨ３．７の場合、グリシン−塩酸緩衝液：ｐＨ３．３乃至ｐＨ６．２の場合、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．１乃至ｐＨ８．０の場合、ＭＯＰＳ緩衝液：ｐＨ８．２乃至ｐＨ９．２の場合、Ａｔｋｉｎｓ−Ｐａｎｔｉｎ緩衝液。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図１に記載した。至適ｐＨはクエン酸緩衝液中ｐＨ４．５付近であった。
【０１４２】
２）温度活性
クエン酸緩衝液ｐＨ４．５における温度活性を測定した。測定法は実施例１の２）に示した方法に拠った。ただし酵素反応時間は３７℃、２０分間とした。最も活性が高かった温度条件での加水分解活性を１００％とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図２に記載した。至適温度は６５℃付近であった。
【０１４３】
３）温度安定性
精製酵素溶液を種々の温度で３０分間処理した後、その残存加水分解活性を測定した。あらかじめ処理温度に保持した２５mMクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）９０μlに、精製酵素液１０μlを加え撹拌して均一にし、３０分間保温した。実施例1で作製した卵黄レシチン溶液６０μlに２００mMクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６０μlを加え３７℃に保持し、加温処理した酵素液６０μlを加え、３７℃で３０分間酵素反応を行った。遊離ホスホリル塩基の定量は実施例１の２）にしたがった。最も高い残存加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図３にまとめた。ｐＨ４．５において少なくとも６０℃以下の温度で安定であった。
【０１４４】
４）ｐＨ安定性
精製酵素液３０μlに、以下に述べる各ｐＨの２００mM緩衝液３０μlを添加し、３７℃にて３０分間保温した。緩衝液は次のものを用いた：ｐＨ２．７乃至ｐＨ３．２の場合、グリシン−塩酸緩衝液：ｐＨ３．５乃至ｐＨ６．１の場合、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液：ｐＨ６．３乃至ｐＨ７．９の場合、ＭＯＰＳ緩衝液：ｐＨ８．３乃至ｐＨ１０．８の場合、Ａｔｋｉｎｓ−Ｐａｎｔｉｎ緩衝液。２００mMクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６０μl、および実施例１の２）記載の卵黄レシチン溶液６０μlの混合液に、加温した酵素混合液６０μlに水６０μlを加えた溶液のうち６０μlを加え撹拌して均一にし、３７℃で１０分間酵素反応を行った。遊離ホスホリル塩基の定量は実施例１の２）にしたがった。最も高い残存加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける加水分解活性を相対値として図４にまとめた。ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲で安定であった。
【０１４５】
５）精製酵素の基質選択性
次に、基質選択性を測定した。実施例１の３）で調製した精製酵素液を用いた。測定方法は実施例１の２）に拠った。ただし、酵素反応は２００mMクエン酸緩衝液ｐＨ４．５中で３７℃で保温して１０分間行った。卵黄由来ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表４に示す。
【０１４６】
【表４】
2010252815.tif 000006
【０１４７】
試験例２．アスペルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来ホスホリパーゼＣの精製酵素液の諸性質
実施例２の２）で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
【０１４８】
１）ｐＨ活性
試験例１．に示した方法に拠った。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図５に記載した。至適ｐＨはｐＨ４．５付近であった。
【０１４９】
２）温度活性
試験例１．に示した方法に拠った。最も活性が高かった温度条件での加水分解活性を１００％とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図６に記載した。至適温度は６５℃付近であった。
【０１５０】
３）温度安定性
試験例１．に示した方法に拠った。最も高い残存加水分解活性を１００％とし、各温度における加水分解活性を相対値として図７にまとめた。ｐＨ４．５において４５℃以下の温度で安定であった。
【０１５１】
４）ｐＨ安定性
試験例１．に示した方法に拠った。最も高い残存加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける加水分解活性を相対値として図８にまとめた。ｐＨ３乃至ｐＨ１０の範囲で安定であった。
【０１５２】
２）精製酵素の基質選択性
試験例１．に示した方法に拠った。卵黄由来ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表５に示す。
【０１５３】
【表５】
2010252815.tif 000007
【０１５４】
試験例３．アスペルギルス・オリザエＮＢＲＣ４１９０株由来ホスホリパーゼＣの精製酵素液の諸性質
実施例３の２）で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
【０１５５】
１）ｐＨ活性
試験例１．に示した方法に拠った。最も活性が高かったｐＨ条件での加水分解活性を１００％とし、各ｐＨにおける酵素の加水分解活性を相対値として図９に記載した。至適ｐＨはｐＨ４．５付近であった。
【０１５６】
２）精製酵素の基質選択性
試験例１．に示した方法に拠った。卵黄由来ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１００％としたときの、相対活性を表６に示す。
【０１５７】
【表６】
2010252815.tif 000008
【０１５８】
発明の効果
以上述べたように、本発明のホスホリパーゼＣはアスぺルギルス・オリザエＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２００株またはＮＢＲＣ  ４１９０株あるいはアスぺルギルス・タマリＩＡＭ  １３９０７株由来であり安全性に優れ、様々なグリセロリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、クエン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的に安定であり、リン脂質以外のリン酸エステルを加水分解しない酵素であり、食品工業および製油工業いずれの分野においても優れた効果をあげられる酵素である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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