(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）に罹患している対象を治療するための方法の提供。【解決手段】ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与する。また、本開示は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している患者を治療するための治療レジメンを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法。
【請求項２】
抗体またはその抗原結合部分が、単剤療法として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体またはその抗原結合部分と組み合わせて、少なくとも１つの抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの抗癌剤が、リツキシマブ、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、イブルチニブ、イデラリシブ、パノビノスタット、サリドマイド、レナリドマイド、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、フルダラビン、ベンダムスチン、デキサメタゾン、および／またはクラドリビンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体またはその抗原結合部分が、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症のための前治療の失敗後に対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
治療有効量の抗体またはその抗原結合部分が、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または月に１回の投与スケジュールで投与される０．１、０．３、０．５、１、３、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法であって、：
（ａ）治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、前記選択が
（ｉ）対象におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること；
（ｉｉ）ワルデンシュトレームマクログロブリン血症試験組織試料中の細胞が、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを評価すること；および
（ｉｉｉ）ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み；ならびに
（ｂ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している対象を治療するための方法であって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、対象に投与することを含み、ここで、対象のワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有すると決定されていることに基づいて、対象が選択されている、方法。
【請求項９】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分による治療のための、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症患者を選択するための方法であって、：
（ａ）前記患者におけるワルデンシュトレームマクログロブリン血症組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること；
（ｂ）ワルデンシュトレームマクログロブリン血症試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを評価すること；および
（ｃ）ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法。
【請求項１０】
抗ＣＸＣＲ４抗体またはその部分が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＣＸＣＲ４抗体またはその部分が、配列番号２５に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２９に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
抗ＣＸＣＲ４抗体またはその部分が、配列番号１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
対象におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療するためのキットであって：
（ａ）抗Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）抗体もしくはその抗原結合部分の１以上の用量；および
（ｂ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法において抗ＣＸＣＲ４抗体を使用するための指示書を含む、キット。
【請求項１４】
抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願全体にわたって、様々な刊行物は、著者名および日付により、または特許番号もしくは公開番号により括弧内に参照される。これらの刊行物の完全な引用は、本明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見出すことができる。本明細書で説明し、特許請求される発明の日付時点で当業者に知られた技術水準をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示は、その全体が出典明示により本出願に組み込まれる。しかし、本明細書における参考文献の引用は、このような参考文献が本発明の従来技術であることを自認するものと解釈されるべきではない。
【０００２】
発明の分野
本開示は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｅｍ’ｓ  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）を治療する方法における、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）は、胚発生中におけるリンパ球産生および骨髄（ＢＭ）骨髄造血などの生理学的状態において、重要な役割を果たす。出生後、ＣＸＣＲ４およびそのリガンドは、ＢＭニッチにＣＤ３４１細胞をホーミングすることだけでなく、リンパ球輸送（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を調節する。とりわけＣ１０１３Ｇバリアントに代表されるＣＸＣＲ４遺伝子の活性化変異の存在が原因で、いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留（ＷＨＩＭ）症候群として知られる異常に機能する免疫に特徴付けられる遺伝性ヘテロ接合性常染色体優性疾患を有する患者においてＣＸＣＲ４は変異したことがこれまでに示されている（Ｂａｌａｂａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｂａｌａｂａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。最近の証拠は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ；リンパ形質細胞性リンパ腫）におけるＣＸＣＲ４体細胞異常の存在を裏付けている（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。リンパ形質細胞性リンパ腫の進行、ならびに他のＢ細胞リンパ増殖の実体と比較して、ＷＭにとって独特のものであるか、もしくは意義不明のＩｇＭモノクローナル免疫グロブリン血症段階（ＩｇＭ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）を発症するかどうかを裏付ける際のこの変異体の機能的役割は、これまでに記載されてこなかった。
【０００４】
ＷＭは、米国では年間１００万人あたり約３例の発生率を有する稀なＢ細胞疾患である。米国では、約１，０００〜１，５００人が、毎年ＷＭと診断されている。全ゲノム配列決定は最近、この疾患の病因に寄与しうる分子メカニズムに光を当ててきた。特に、Ｌ２６５Ｐ／ＭＹＤ８８は、ＷＭ患者において優勢体細胞変異として記載されてきた（Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。インビトロ研究では、Ｌ２６５Ｐ／ＭＹＤ８８変異体が、腫瘍細胞の増殖の増大をもたらしうることが実証されており（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、これは少なくとも部分的には、腫瘍Ｂ細胞の生存、増殖、および治療に対する抵抗性を調節する既知のシグナル伝達経路である、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）のＭＹＤ−８８依存性活性化により、説明されうる（Ｌｅｌｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。また、これらの観察は、クローン性ＷＭ細胞における発癌性のあるマイクロＲＮＡ−１５５の過剰発現が、初代ＷＭ細胞においてＮＦ−κＢの活性化をもたらすという以前の発見に一致する。実際、インビボおよびインビトロにおいて、マイクロＲＮＡ−１５５の機能喪失研究はＮＦ−κＢの阻害および腫瘍増殖の低減をもたらした（Ｌｅｌｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかし、いくつかの公表された研究では、ＭＹＤ８８の変異は、進行または治療に対する抵抗性を予測せず、他の遺伝的変化が、腫瘍の進行と遠隔臓器への転移（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）にとって、重要でありうるということを示している。
【０００５】
低悪性度Ｂ細胞リンパ腫のうち、ＷＭは、過粘稠、出血ならびに末梢神経障害の合併症をもたらし得る、リンパ形質細胞のＢＭ浸潤および血清モノクローナル免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）タンパク質の分泌を特徴とするリンパ形質細胞性サブタイプを表す（Ｇｈｏｂｒｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｖｉｊａｙ  ａｎｄ  Ｇｅｒｔｚ，２００７）。診断時のＢＭの広範な侵襲（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）の証拠は、クローン性Ｂ細胞のＢＭへの細胞輸送を示唆する。これに関連して、ＢＭへの腫瘍Ｂ細胞のホーミングの主要なレギュレーターの１つは、関連リガンド間質由来因子１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２）との相互作用を介してＣＸＣＲ４によって表される。
【０００６】
全ゲノムシーケンシングの予備報告は、ＣＸＣＲ４がＷＭを有する患者の２９％（１６／５５）において変異されているであろうことを示した（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。したがって、ＷＭにおけるこの変異体のインビボにおける機能的な役割だけでなく、抗ＣＸＣＲ４抗体を用いる治療に対するＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ患者の反応を明らかにすることを目的として、ＷＭおよび種々のＢ細胞リンパ増殖性障害を有する患者において、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異体の存在および役割を調査した。
【０００７】
癌を治療する際に治療効果を示す抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０６０３６７およびＷＯ２０１３／０７１０６８に既に記載されている。これらの両出願の開示は、その全体が出典明示により本出願に組み込まれる。完全なヒトモノクローナル抗体であるウロクプルマブ（ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ）（ＷＯ２００８／０６０３６７ではＦ７と称され、また、既にＢＭＳ−９３６５６４またはＭＤＸ−１３３８とも称されており、４つの名称はすべて、本明細書で互換的に使用される）は、固形腫瘍および血液癌の両方での前臨床試験において予期しない有利な抗腫瘍特性を示した。また、ウロクプルマブは現在、再発／難治性Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者において第Ｉ相臨床試験を受けている（ＮＣＴ０１１２０４５７；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｗｅｂｓｉｔｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０００８】
発明の概要
本開示は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）に罹患している対象を治療するための方法であって、ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、対象はヒトであり、かつ抗体またはその抗原結合部分は、細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ４受容体、好ましくはＣ１０１３Ｇ変異を有するヒトＣＸＣＲ４に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合部分である。好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。
【０００９】
また、本開示はＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象の治療のための方法であって、（ａ）治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、当該選択が、（ｉ）対象におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること；（ｉｉ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを決定するためにアッセイを行うこと；および（ｉｉｉ）ＷＭ細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み；ならびに（ｂ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本開示は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象の治療のための方法であって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含み、対象のＷＭ細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有すると決定されているということに基づいて、対象が選択されている、方法をさらに提供する。
【００１１】
また、本開示は、ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分による治療のためのＷＭ患者を選択するための方法であって、（ａ）当該患者におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を提供すること；（ｂ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを決定するためにアッセイを行うこと；および（ｃ）ＷＭ細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法を提供する。
【００１２】
さらに、本開示は、対象におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを治療するための抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分を含む治療レジメンを決定するための方法であって、（ａ）対象におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を提供すること；（ｂ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを決定するためにアッセイを行うこと；および（ｃ）ＷＭ細胞がＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分を含む治療レジメンを決定することを含む、方法を提供する。一態様では、本開示はまた、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している患者を治療するための治療レジメンを提供し、そのレジメンは本方法により決定される。
【００１３】
上記の方法のいずれかの特定の実施形態では、ＷＭ患者におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞は、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、および／またはホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を含む、従来使用されていた抗ＷＭ剤に対して抵抗性を示す。特定の好ましい実施形態では、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞は、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標））に対して抵抗性がある。したがって、特定の実施形態では、対象がｍＴＯＲ、ＢＴＫおよび／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に失敗した後に、好ましくはイブルチニブによる治療の失敗後に、治療有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分がＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象に投与される。他の実施形態では、対象は治療有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体もしくはその抗原結合部分ならびに治療有効量のｍＴＯＲ、ＢＴＫもしくはＰＩ３Ｋ阻害剤の組み合わせにより治療される。特定の好ましい形態では、対象は抗ＣＸＣＲ４抗体、ウロクプルマブおよび治療有効量のＢＴＫ阻害剤、イブルチニブの組み合わせにより治療される。
【００１４】
上記の方法のいずれかの特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分は、配列が配列番号２５に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列が配列番号２９に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１５】
他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分は、配列が配列番号２５に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、および配列が配列番号２９に記載される、連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
さらなる実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。好ましい実施形態では、抗体はウロクプルマブである。
【００１７】
別の態様では、本開示は、対象におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを治療するためのキットであって、；（ａ）抗ＣＸＣＲ４抗体もしくはその抗原結合部分の用量；および（ｂ）上記の方法のいずれかひとつにおいて抗ＣＸＣＲ４抗体を使用するための指示書を含む、キットを提供する。キットで使用するための例示的な抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＷＯ２００８／０６０３６７に記載のヒトモノクローナル抗体Ｆ７（ウロクプルマブ）、Ｆ９、およびＤ１を含む。好ましい実施形態では、キットにおける抗ＣＸＣＲ４抗体は、ウロクプルマブである。
【００１８】
本開示のその他の特性および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるだろうが、それらを限定と解釈すべきではない。本出願全体にわたって引用される全参考文献、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録、特許および公開された特許出願の内容は、出典明示により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｆ７（ウロクプルマブ）ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ａ）のヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。重鎖ＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号５）、およびＣＤＲ３（配列番号９）領域が表され、かつＶ、Ｄ、およびＪ生殖細胞系列誘導体（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）が示される。Ｆ７の軽鎖可変領域（Ｂ）のヌクレオチド配列（配列番号３７）およびアミノ酸配列（配列番号２９）も示されている。軽鎖ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１７）およびＣＤＲ３（配列番号２１）領域が表され、かつＶおよびＪ生殖細胞系列誘導体が示される。
【図２】図２は、ＷＭ患者の体細胞Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントの同定を示す。ＣＤ１９１ＢＭ由来ＷＭ細胞上のフローサイトメトリーにより示されるように、野生型（ＷＴ）初代ＷＭ試料と比較して、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有する初代ＷＭ試料はより高いＣＸＣＲ４表面発現を提示する。
【図３】図３は、ＷＭ細胞におけるＣＸＣＲ４過剰発現の効率を示す。ＢＣＷＭ．１細胞をｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬｅｎｔｉＯＲＦ／ＣＸＣＲ４／ＧＦＰ（ＣＸＣＲ４＋）または空ベクター／ＲＦＰコントロールのいずれかに感染させた。ΔΔＣｔ法を用いて、ＧＡＰＤＨに対する正規化により、ヒトＣＸＣＲ４発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＰはＰ値を示す。
【図４】図４は、ＣＸＣＲ４過剰発現ＷＭ細胞のインビボで転移する強化された能力を示す。ＢＣＷＭ．１細胞を、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬｅｎｔｉＯＲＦ／ＣＸＣＲ４／ＧＦＰ（ＣＸＣＲ４＋）または空ベクター／ＲＦＰ（コントロール）に感染させ、ＳＣＩＤ／Ｂｇマウス（Ｎ＝５／グループ）に静脈内注射した。３週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒトＣＤ２０およびヒトＣＸＣＲ４に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色を、大腿骨ＢＭ（Ａ）、肝臓（Ｂ）および腎臓（Ｃ）で実施した。ＣＤ２０およびＣＸＣＲ４染色の定量を行い、コントロール細胞を注入したマウスと比較して、ＣＸＣＲ４＋細胞を注入したマウスにおいてより高い数のＣＸＣＲ４／ＣＤ２０＋細胞を示した。ＰはＰ値を示す。（Ｄ）マウスを安楽死させ、３週目に採取された血清、およびヒトＩｇＭレベルをＥＬＩＳＡによって試験した。（Ｅ）ヒトＣＸＣＲ４レベルの検出を、ＢＭ大腿骨からエキソビボで単離された細胞でｑＲＴ−ＰＣＲ（ΔΔＣｔ法）により実施した。非注入マウス（ｎ＝３）およびプールされたコントロール細胞を注入したマウス（ｎ＝４）をコントロールとして使用した。ＰはＰ値を示す。バーは標準偏差を示す。
【図５】図５は、ＷＭ細胞におけるＣＸＣＲ４の過剰発現が、生存の減少、ならびにインビトロにおける接着性および増殖の強化をもたらすことを示す。ＣＸＣＲ４過剰発現細胞（ＣＸＣＲ４＋）は、関連する空ベクター感染細胞に比べ、ＢＭ（Ａ）、肝臓（Ｂ）および腎臓（Ｃ）に転移する、より積極的な能力を提供する（ヘマトキシリンエオシン×１０、抗体染色×２０と×１０倍率）。ヒトＣＤ２０およびＣＸＣＲ４染色の定量は、図４に示されている。（Ｄ）空ベクター細胞を注入したマウスに対する、ＣＸＣＲ４＋細胞を注入したマウスにおける減少した生存を示す、カプラン−マイヤー曲線（ｎ＝７／群）。ＰはＰ値を示す（ログランク検定）。（Ｅ、Ｆ）ＣＸＣＲ４の過剰発現は、初代骨髄間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）への減少した接着性、および減少した細胞増殖が観察されたＣＸＣＲ４がサイレンシングされたＷＭ細胞（ＣＸＣＲ４−Ｋ．Ｄ．）と比較した場合、初代骨髄間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）への増加したＷＭ細胞接着、および増加した細胞増殖につながった。バーは標準偏差を示す。ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；ＮＳ、有意でない。
【図６】図６は、感染したＷＭ細胞におけるＣＸＣＲ４ノックダウンの効率を示す。ＢＣＷＭ．１細胞をＣＸＣＲ４−ｓｈＲＮＡ／ＧＦＰ（ＣＸＣＲ４  Ｋ．Ｄ．）またはコントロールとしてのスクランブルプローブ／ＧＦＰのいずれかに感染させた。ΔΔＣｔ法を用いて、ＧＡＰＤＨに対する正規化により、ヒトＣＸＣＲ４発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＰはＰ値を示す。
【図７】図７は、ＷＭ細胞接着特性に対するＣＸＣＲ４機能喪失および機能獲得の効果を示す。ＢＣＷＭ．１細胞を、ＬｅｎｔｉＯＲＦ／ＣＸＣＲ４（ＣＸＣＲ４＋）（Ａ）もしくはＣＸＣＲ４  ｓｈＲＮＡ（ＣＸＣＲ４  Ｋ．Ｄ．）（Ｂ）ならびにそれぞれのスクランブルプローブのいずれかに安定に感染させた。接着性は、ＢＳＡ−（ネガティブコントロール）、ポリ−Ｄ−リジン（ポジティブコントロール）、およびフィブロネクチン−コートウェルを使用して試験された。バーは標準偏差を示す。
【図８】図８は、感染したＷＭ細胞における変異誘導効率、およびＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞を注入したマウスの脳の侵襲の欠如を示す。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ；Ａ）およびｃＤＮＡ（Ｂ）を感染させたＢＣＷＭ．１から単離した。空／コントロールベクター−感染細胞をコントロール（コントロール細胞）として使用した。Ｃ１０１３Ｇアレルの検出を、アレル特異的ＰＣＲを用いて評価した。ＰはＰ値を示す。バーは標準偏差を示す。（Ｃ）Ｃ１０１３Ｇ変異の検出を、サンガーシーケンシングを用いて評価した。（Ｄ）ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するＢＣＷＭ．１細胞またはコントロール細胞のいずれかを静脈内注射した。（Ｅ）ヒトＣＤ２０およびヒトＣＸＣＲ４に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色（Ｈ．Ｅ．）を脳で行い、腫瘍細胞浸潤の欠如を示した。（４×倍率が提供されている。）
【図９】図９は、インビボでのＷＭ細胞の転移および生存に対するＣＸＣＲ４／Ｃ１０１３Ｇ変異の効果を示す。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有するＷＭ細胞は、増加した細胞接着および細胞増殖と共に、ｍＲＮＡレベルでの変化を提示する。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有するＷＭ細胞を静脈内注射したＳＣＩＤ／Ｂｇマウスは、（Ａ）ＢＭ、（Ｂ）リンパ節、（Ｃ）肝臓、（Ｄ）肺、および（Ｅ）腎臓（×４、×１０および２０×倍率）の有意な侵襲を提示する。ヒトＣＤ２０およびＣＸＣＲ４染色の定量は、図１０に示される。（Ｆ）カプラン−マイヤー曲線は、コントロールベクター細胞を注入したマウス（右方向プロット）に対する、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４細胞を注入したマウス（左方向プロット）における減少した生存を示す（ｎ＝７／グループ）。コントロールベクター細胞を注入したマウスの死亡は３７、４８および６２日に観察された。ＰはＰ値を示す。（ログランク検定）
【図１０】図１０は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞を注入したマウスから採取された組織におけるヒトＣＤ２０およびＣＸＣＲ４発現の定量を示す。ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有するＢＣＷＭ．１細胞または空／コントロールベクター感染細胞（コントロール細胞）のいずれかを静脈内注射した。３週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒトＣＤ２０およびヒトＣＸＣＲ４に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色を、大腿骨ＢＭ、リンパ節、肝臓、肺および腎臓で実施した（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）。ＣＤ２０およびＣＸＣＲ４染色の定量を行った（ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）。ＰはＰ値を示す。Ｔ検定を、大腿骨、肝臓、腎臓および肺を分析するために使用し、そして分散分析試験をリンパ節を分析するために使用した。
【図１１】図１１は、インビボでのＷＭ細胞の接着および増殖に対するＣＸＣＲ４／Ｃ１０１３Ｇ変異の効果を示す。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞を静脈内注射したＳＣＩＤ／Ｂｇマウスにおいて、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、単独で、またはＢＭ−ＭＳＣｓとの関連のいずれかでＷＭ細胞の接着（Ａ）および増殖（Ｂ）を増加させた。（Ｃ、Ｄ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、単独で、またはＢＭ−ＭＳＣｓとの関連のいずれかでＭＷＣＬ１細胞の接着および増殖を増加させた。空／コントロールベクター−感染細胞をコントロールとして用いた。バーは標準偏差を示す。ＰはＰ値を示す。
【図１２】図１２は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞は、遺伝子レベルでコントロール細胞と異なることを示す。（Ａ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞対コントロールベクター−感染細胞（コントロール細胞）における腫瘍侵襲性（ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）、細胞増殖、抗アポトーシスおよび発癌性特徴（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）遺伝子のジーンセットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）濃縮プロット。プロットされた曲線は、濃縮スコアを示し、各遺伝子（縦線）がランク付けされた遺伝子リストの最上部または最下部に示されている程度を反映する。ヒートマップは、変異細胞において特異的に濃縮され、コントロール細胞と比較された、遺伝子の相対的な存在量（左から右）を示す。すべての遺伝子セットは、常に偽陽性率（ＦＤＲ）＜０．２５で、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞中で濃縮された。正規化された濃縮スコア（ＮＥＳ）およびＦＤＲは、分析された各遺伝子セット毎に示される。（Ｃ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞対コントロールベクター感染細胞（コントロール細胞）における、表３に記載されたアップレギュレートされた遺伝子に関するＧＳＥＡ濃縮プロット。同遺伝子を、コントロール細胞と比較して、変異した細胞において濃縮した。
【図１３】図１３は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントを有するＷＭ細胞は、薬剤抵抗性を与えることを示す。（Ａ）それぞれ、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞およびコントロールベクター感染細胞（コントロール細胞）における、多剤耐性および薬物応答性特徴遺伝子に対するＧＳＥＡ濃縮プロット。プロットされた曲線は、濃縮スコアを示し、各遺伝子（縦線）がランク付けされた遺伝子リストの最上部または最下部に示されている程度を反映する。ヒートマップは、変異細胞において特異的に濃縮され、コントロール細胞と比較された、遺伝子の相対的な存在量（左から右）を示す。遺伝子セットは、ＦＤＲが常に＜０．２５で濃縮されたと考えられた。正規化された濃縮スコア（ＮＥＳ）とＦＤＲは、分析された各遺伝子セット毎に示されている。（Ｂ−Ｆ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞株（ＢＣＷＭ１；ＭＷＣＬ１）またはコントロールベクター感染細胞（コントロール）を、エベロリムス、イブルチニブ、イデラリシブ、ボルテゾミブ、およびカーフィルゾミブに４８時間曝露した。細胞毒性は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドにより決定した。
【図１４】図１４はインビトロにおけるＷＭ細胞の遊走に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を示す。ＷＭ細胞株（ＢＣＷＭ．１；ＭＷＣＬ．１）を、トランスウェル遊走アッセイを使用して、それらの遊走特性について試験した。細胞を、増加する濃度のＢＭＳ−９３６５６４に曝露し、５時間後、遊走を測定した。トランスウェル遊走アッセイを、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下（Ａ）またはＳＤＦ−１αの存在下（Ｂ）で行った。両方の場合において、ＷＭの細胞遊走のＢＭＳ−９３６５６４依存性阻害が観察された。
【図１５】図１５は、インビトロにおけるＷＭ細胞の接着および増殖に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を示す。（Ａ）ＷＭ細胞株を４時間ＢＭＳ−９３６５６４で処置し、続いて初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓへの接着について試験した。２時間後の接着の評価は、ＷＭ細胞接着のＢＭＳ−９３６５６４依存性阻害を示した。（Ｂ、Ｃ）ＷＭ細胞株（ＢＣＷＭ．１；ＭＷＣＬ．１）を、初代ＷＭ  ＢＭＭＳＣｓの存在下または非存在下で４８時間、コントロール培地と共に、およびＢＭＳ−９３６５６４と共に培養した。細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイを用いて評価した。バーは標準偏差を示す。ＰはＰ値を示す。すべてのデータは、３回の実験の平均値（±標準偏差）を表す。ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＡＭＤ３１１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、を、コントロールとして使用した。
【図１６】図１６は、ＷＭ細胞シグナル伝達に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を示す。ＢＣＷＭ．１細胞を、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下または非存在下で６時間、ＢＭＳ−９３６５６４に曝露した。次いで、ＢＣＷＭ．１細胞を採取し、細胞溶解物を、抗ホスホ（ｐ）−ＥＲＫ１／２、抗ＥＲＫ１／２、抗ｐ−Ａｋｔ、抗Ａｋｔ、抗ｐ−ＳＲＣ、および抗ＳＲＣ抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの非存在下で培養されたＢＣＷＭ．１細胞をコントロールとして使用した。バーは標準偏差を示す。
【図１７】図１７は、インビトロで、ＷＭ細胞株の接着（Ａ）または遊走（Ｂ）に対して、コントロール抗体が影響しなかったことを示す。
【図１８】図１８は、ＷＭ細胞におけるアポトーシス関連タンパク質に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を示す。ＢＣＷＭ．１細胞を１４時間、ＢＭＳ−９３６５６４に曝露した。次いで、全細胞溶解物を回収し、抗カスパーゼ−９、抗ＰＡＲＰ、抗ｐ−βカテニン、抗β−カテニン、抗ｐ−ＧＳＫ３β、および抗チューブリン抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。
【図１９】図１９は、ＢＭＳ−９３６５６４が、インビボでＷＭ細胞中のＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞を標的とすることを示す。（Ａ−Ｅ）ＢＭＳ−９３６５６４はインビボでＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞の転移を阻害した。ヒトＣＤ２０およびＣＸＣＲ４染色は、アイソタイプコントロール処置マウス（未処置）と比較して、ＢＭＳ−９３６５６４で処置したマウスから外植された組織において有意に減少した。ＰはＰ値を示す。
【図２０】図２０は、インビボでのＷＭ細胞におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果の代表的な組織化学的画像を示す。ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するＢＣＷＭ．１細胞または空／コントロールベクター感染細胞（コントロール細胞）のいずれかを静脈内注射した。ＢＭＳ−９３６５６４またはコントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、×３／４／週；マウス：５／グループ）のいずれかでマウスを処置した。３週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒトＣＤ２０およびＣＸＣＲ４に対するヘマトキシリン−エオシン免疫組織化学的染色を、大腿骨ＢＭ（Ａ）、肝臓（Ｂ）、腎臓（Ｃ）、肺（Ｄ）およびリンパ節（Ｅ）で実施した（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ；４×、１０×または２０×の倍率が示される）。
【図２１】図２１は、ＢＭＳ−９３６５６４が、ＢＭとの関連で、ＷＭ細胞においてＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞を標的にすることを示す。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４感染ＢＣＷＭ．１細胞を、トランスウェル遊走アッセイを使用して、遊走特性について試験した。細胞を増加する濃度のＢＭＳ−９３６５６４に曝露し、５時間後、遊走を測定した。トランスウェル遊走アッセイを初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓ（Ａ）またはＳＤＦ−１α（Ｂ）いずれかの存在下において実施した。両方の場合において、ＷＭ細胞の遊走のＢＭＳ−９３６５６４依存的阻害が観察された。（Ｃ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４感染ＢＣＷＭ．１細胞を、ＢＭＳ−９３６５６４で４時間処置し、続いて初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓに対する接着について試験した。２時間後の接着の評価は、ＷＭ細胞接着のＢＭＳ−９３６５６４依存的阻害を示した。（Ｄ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４感染ＢＣＷＭ．１細胞を、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下または非存在下で４８時間、コントロール培地と共に、およびＢＭＳ−９３６５６４と共に培養した。細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイを用いて評価した。バーは標準偏差を示す。ＰはＰ値を示す。すべてのデータは、３回の実験の平均値（±標準偏差）を表す。バーは標準偏差を示した。
【図２２】図２２は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４ＷＭ細胞における生存およびアポトーシス関連シグナル伝達タンパク質に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を示す。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞は、ＢＭＳ−９３６５６４の存在下または非存在下で６時間培養され、ホスホ（ｐ）−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ｐ−Ｓｒｃの阻害を示した。同様に、細胞を１４時間、当該化合物に曝露し、アポトーシス関連経路（ｐ−ＧＳＫ３β、ｐ−β−カテニン、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ−９）の誘導を観察した。
【図２３】図２３は、ＢＭＳ−９３６５６４がインビボでＷＭホーミングを阻害し、インビボおよびインビトロでボルテゾミブに対するＷＭの化学的感受性を相乗的に高めることを示す。（Ａ，Ｂ）ＢＣＷＭ．１−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞をＳＩＤ／Ｂｇマウスに静脈注射した。マウスを、コントロール抗体またはＢＭＳ−９３６５６４（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内；×３／４／週）、ボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ腹腔内；×２／週）、もしくはＢＭＳ−９３６５６４＋ボルテゾミブ（上記と同じ用量；×２／週）のいずれかで処置した。ＢＭ細胞を試験の終了時に採取し、蛍光プレートリーダーを用いて評価した。コントロールは、コントロール抗体−処置マウスのＢＭから同定されたｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の数として意図される。血清を試験の終了時に採取した。血清ＩｇＭ分泌を、ヒトＩｇＭ  ＥＬＩＳＡキットを用いて評価した。（Ｃ、Ｄ）ＷＭ細胞株（ＢＭＷ．１；ＭＷＣＬ．１）を、単独または併用レジメンのいずれかを用いて、ＢＭＳ−９３６５６４またはボルテゾミブに４８時間曝露した。細胞毒性をＭＴＴにより行った。相乗作用はＣａｌｃｕｓｙｎソフトウェアにより評価され、ＢＭＳ−９３６５６４およびボルテゾミブの併用のアイソボログラム、併用指数（Ｃ．Ｉ．）、および影響割合（Ｆ．Ａ．）が示されている。バーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本開示は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症に罹患している患者におけるＣＸＣＲ４活性を調節する、あるいはかかる患者を治療するための、細胞表面上に発現される天然（ｎａｔｉｖｅ）ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用の方法に関する。これらの方法は、特に、ＣＸＣＲ４遺伝子中の活性化Ｃ１０１３Ｇ変異を有するＷＭ患者に適用できる。特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、単剤療法として、または、治療のファースト（“フロント”）ライン、たとえば初期または第一の治療として、組み合わせ療法の一部（たとえばｍＴＯＲ、ＢＴＫおよび／またはＰＩ３Ｋ阻害剤との組み合わせにおける）として投与される。他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、たとえば、再発後および／または第一の治療が失敗した場合を含む、同一のまたは１つ以上の異なる治療薬による初期治療後の、セカンド−またはサード−ライン治療として投与される。したがって、特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、別の抗ＷＭ剤、たとえばｍＴＯＲ、ＢＴＫおよび／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療の失敗後に投与される。
【００２１】
定義
本発明がより容易に理解されてもよいように、特定の用語を最初に定義する。特に明確に本明細書で提供される場合を除き、本出願で使用されるように、以下の用語のそれぞれは、以下に記載する意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体に記載されている。
【００２２】
「投与」は、当業者に知られた種々の方法および送達システムのいずれかを使用する、対象への治療薬を含む組成物の物理的な導入を指す。本発明の抗体のための好ましい投与経路は、たとえば注射または注入による、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脊髄または投与の他の非経口経路を含む。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の投与様式を意味する。また、投与は、たとえば一回、複数回、および／または１回以上の延長された期間にわたって、行うことができる。
【００２３】
「抗体」（Ａｂ）は、限定なく、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む、糖タンパク質免疫グロブリン、またはその抗原結合部分を含むものとする。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化できる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、それらはアミノ−末端からカルボキシ−末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系（たとえば、エフェクター細胞）の種々の細胞および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織もしくは因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
【００２４】
抗体は、典型的には、１０−５〜１０−１１Ｍ−１またはそれ以下の解離定数（ＫＤ）により反映される高親和性で、それらの同族抗原に特異的に結合する。約１０−４Ｍ−１以上の任意のＫＤは、一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。本明細書で使用されるように、抗原に「特異的に結合する」抗体は、約１０−７Ｍ以下、好ましくは約１０−８Ｍ以下、より好ましくは約５×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは約５×１０−１０Ｍ以下、および最も好ましくは約１０−９Ｍと約１０−１１Ｍ以下の間のＫＤを有することを意味する高親和性で、抗原および実質的に同一な抗原に結合するが、関係のない抗原とは高い親和性で結合しない抗体を指す。ある抗原が、所与の抗原に対して高い配列同一性を示す場合、たとえば、所与の抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９の配列同一性を示す場合、所与の抗原に「実質的に同一」である。一例として、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する抗体はまた、特定の霊長類種からのＣＸＣＲ４抗原と交差反応性を有しうるが、特定のげっ歯動物種からのＣＸＣＲ４抗原、またはＣＸＣＲ４以外の抗原、たとえばヒトＰＤ−１抗原と交差反応しなくてもよい。
【００２５】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ，およびＩｇＭを含むがこれらに限定されない、一般的に知られるアイソタイプのいずれかに由来してもよい。また、ＩｇＧサブクラスは当業者に知られており、かつ、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（たとえばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「抗体」は、一例として、天然に生じるおよび非天然に生じる抗体；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトまたは非ヒト抗体、完全合成抗体；ならびに一本鎖抗体である。非ヒト抗体はヒトにおける免疫原性を減少させるように組換え方法によりヒト化されてもよい。
【００２６】
明示されていない場合、および文脈がそうでないことを示さない限り、用語「抗体」はまた、前述の免疫グロブリンのいずれかの抗原結合部分を含む。抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」は、完全な抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗原結合部分」の用語内に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｄ、Ｆｖ、および一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、２価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）のまたは２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）のｓｃＦｖ、ダイアボディもしくは他の抗体の多量体（たとえば３価トリアボディまたは４価テトラボディ）、ミニボディ、ならびに単離されたＣＤＲさえも含み、これらは抗原結合機能を示しうる。抗体および関連バリアントの上記のタンパク質分解性フラグメントおよび操作されたフラグメントの全ては（より詳しくはＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，を参照のこと）、抗体の「抗原結合部分」の用語内に包含される。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）は、単一分子組成物の抗体分子の調製物、すなわち、抗体分子の一次配列が本質的に同一で、かつ特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体分子を指す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニック技術、または当業者に知られた他の技術により生産されてもよい。
【００２８】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（たとえば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異導入、またはインビボにおける体細胞変異により導入された変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書中に使用される用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列由来ＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同意語として使用されている。
【００２９】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている、一方、１つ以上のＣＤＲ領域内の一部、大部分または全てのアミノ酸は不変である。特定の抗原に結合する抗体の能力を抑止しない限りにおいて、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または改変は許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。
【００３０】
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別種に由来する抗体を指す。
【００３１】
「癌」は、体内の異常細胞の制御不能な増殖によって特徴づけられる様々な疾患の幅広い群を指す。また、制御されない細胞分裂および増殖は、隣接組織に侵襲し、またリンパ系または血流を通して体の遠隔部分に転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｅ）しうる悪性腫瘍の形成をもたらす。癌は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含む。
【００３２】
固形腫瘍は、血液、ＢＭもしくはリンパ細胞以外の体組織細胞の異常な増殖により形成される新生物（細胞の新たな増殖）または病変（解剖学的構造の損傷や生理機能の乱れ）である。それは、肝臓、結腸、胸部、または肺などの異なる組織タイプに由来しうる、最初にその細胞起源の臓器において成長する、異常な細胞の塊から構成される。しかしながら、固形腫瘍は、疾患の進行した段階で転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）腫瘍増殖を通して他の臓器に広がってもよい。
【００３３】
血液悪性腫瘍は、血液、ＢＭ、脾臓および／またはリンパ節に影響し、かつリンパ腫、白血病、骨髄腫およびリンパ性悪性腫瘍を含む癌タイプである。血液悪性腫瘍は、２つの主要な血液細胞系統、すなわち、骨髄およびリンパ細胞株のいずれかに由来し得る。骨髄細胞株は、通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、および肥満細胞を産生する、一方、リンパ系細胞株はＢ、Ｔ、ＮＫ、および形質細胞を産生する。リンパ腫（たとえば、ホジキンリンパ腫）、リンパ性白血病、および骨髄腫はリンパ球系に由来する、一方、急性および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群ならびに骨髄増殖性疾患は、骨髄に起源がある。ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）はＢ細胞リンパ腫の例であり、抗ＣＸＣＲ４抗体による治療の影響を受けやすいことが本明細書に示されている。
【００３４】
用語「ＣＸＣＲ４」（「Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４」）は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。たとえば、ＣＸＣＲ４に特異的な抗体は、特定の場合では、ヒト以外の種由来のＣＸＣＲ４と交差反応してもよい。他の実施形態では、ヒトＣＸＣＲ４に特異的な抗体は完全にヒトＣＸＣＲ４に特異的であってもよく、かつ交差反応性の種または他のタイプを示さなくてもよい。用語「ヒトＣＸＣＲ４」は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｐ６１０７３（配列番号５１）を有するヒトＣＸＣＲ４の完全なアミノ酸配列などのヒト配列ＣＸＣＲ４を指す。ＣＸＣＲ４はまた、たとえば、ＬＥＳＴＥＲ、ＦｕｓｉｎまたはＣＤ１８４として当技術分野で知られている。ヒトＣＸＣＲ４の配列は、たとえば、保存された変異または非保存領域の変異を有することにより配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と異なってもよく、ＣＸＣＲ４は配列番号５１のヒトＣＸＣＲ４と同じ生体機能を実質的に有する。
【００３５】
「ＣＸＣＲ４−発現癌」または「ＣＸＣＲ４＋癌」は、癌であって、この癌を特徴付ける悪性細胞が細胞表面上にＣＸＣＲ４を発現し、好ましくは、ＣＸＣＲ４を高レベルで発現するものである。ＷＨＩＭ症候群に既に関連しているＣＸＣＲ４遺伝子中のＣ１０１３Ｇ変異が、ＷＭ患者の２８％に存在するが、他のＢ細胞リンパ腫では存在しないか、わずか７％に存在する、のいずれかであることが本明細書中に開示されている。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異が存在するＷＭを指す。
【００３６】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト霊長類（たとえば、サル）、イヌ、ウサギ、げっ歯類、もしくはニワトリなどの非ヒト動物を含む。好ましい実施形態では、当該対象はＷＭ患者などのヒト癌患者である。用語「対象」、「患者」および「個人」は、本明細書中で互換的に使用される。
【００３７】
抗ＣＸＣＲ４抗体などの薬剤または治療薬の「治療有効量」または「治療有効用量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用された場合に、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは身体障害の予防によって証明される疾患の退行を促進する、薬剤の任意の量である。薬剤の治療有効量または治療有効用量は、疾患の発症または疾患の再発を被るリスクのある対象に、単独または別の治療薬と組み合わせて投与した場合に、疾患の進行または再発を阻害する、薬剤の任意の量である、「予防的有効量」または「予防有効用量」を含む。疾患の退行を促進する治療薬の能力は、臨床試験中のヒト対象における、ヒトでの有効性を予測できる動物モデル系におけるような、当業者に知られた様々な方法を用いて、またはインビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることにより、評価できる。
【００３８】
さらに、治療に関する用語「有効な」および「有効」は、薬理学的有効性および生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、患者における癌の退行を促進する薬剤の能力を指す。生理学的安全性は、薬剤の投与に起因する、毒性レベルまたは細胞、臓器および／もしくは生物レベルでの他の有害な生理学的効果（副作用）を指す。
【００３９】
対象の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の発症、進行、発展、重症度または再発を、逆転、緩和、改善、阻害、減速または予防の目的を有する対象に対して実施された、任意のタイプの介入もしくは処理、またはかかる患者に活性薬剤を投与することを指す。
【００４０】
代替の使用（たとえば、「または」）は、１つ、両方または選択肢の任意のその組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は任意の記載または列挙される成分の「１つ以上」を指すと理解されるべきである。
【００４１】
用語「約」、「本質的に」または「本質的に含む」は、どのように値もしくは組成が測定または決定されたかということ、すなわち、測定系の限界に部分的に依存するであろう、当業者によって決定された特定の値または組成のための許容誤差範囲内にある、値または組成を指す。たとえば「約」、「本質的に」または「本質的に含む」は、当技術における慣行につき、１以内または１より大きい標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」、「本質的に」または「本質的に含む」は、プラスまたはマイナス２０％の範囲、より通常はプラスまたはマイナス１０％の範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は値の一桁まで、または５倍まで意味し得る。本出願および特許請求の範囲で特定の値または組成が提供される場合、特に明示しない限り、「約」、「本質的に」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成のための許容誤差範囲内であると想定されるべきである。
【００４２】
本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、特に明示しない限り、記載された範囲内の任意の整数の値および適切な場合、その分数（ある整数の十分の一および百分の一など）を含むと理解されるべきである。
【００４３】
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【００４４】
治療用抗ＣＸＣＲ４抗体
ヒトモノクローナル抗体Ｆ７（ウロクプルマブ；ＢＭＳ−９３６５６４；ＭＤＸ−１３３８）、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２を含む、本発明の治療方法における使用のための例示的な抗ＣＸＣＲ４抗体の産生は、ＷＯ２００８／０６０３６７において詳細に記載されている。また、血液悪性腫瘍を治療するためのこれらの抗体の使用方法は、ＷＯ２００８／０６０３６７およびＷＯ２０１３／０７１０６８に記載されている。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、キメラ、ヒト化または、好ましくは、完全ヒト抗体であってもよく、かつ特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。たとえば、抗体は、細胞表面上に発現される天然ヒトＣＸＣＲ４に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、高い親和性で、たとえば１×１０−８Ｍ以下のＫＤで、ＣＸＣＲ４に結合する。本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、好ましくは、治療用途のために望ましい、以下の特徴
（ａ）細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ４に結合すること；
（ｂ）ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への結合を阻害すること；
（ｃ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞においてＳＤＦ−１誘導性カルシウムフラックスを阻害すること；
（ｄ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞のＳＤＦ−１誘導性遊走を阻害すること；
（ｅ）ヒト臍帯静脈内皮細胞による毛細管形成を阻害すること；
（ｆ）１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＸＣＲ４に結合すること；
（ｇ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導すること；
（ｈ）インビトロでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の増殖を阻害すること；
（ｉ）インビボでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞増殖を阻害、および／もしくはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞のアポトーシスを誘導すること；
（ｊ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）を阻害すること；ならびに
（ｋ）ＣＸＣＲ４＋腫瘍を有する対象の生存期間を増加させること；
の１つ以上を示す。
【００４５】
好ましい実施形態では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＸＣＲ４に結合し、ＣＸＣＲ４発現細胞においてアポトーシスを誘導し、かつ上述した他の特性の少なくとも５つを示す。より好ましい実施形態では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、上述した特性のすべてを示す。
【００４６】
特定の実施形態では、本開示の方法における使用のための抗ＣＸＣＲ４抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＸＣＲ４に結合し、２×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、４×１０−９Ｍ以下、３×１０−９Ｍ以下、または２×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＸＣＲ４に結合する。好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体はウロクプルマブ（ＢＭＳ−９３６５６４）である。
【００４７】
一態様では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、またはＥ２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、またはＥ２のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜４に示されている。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、およびＥ２のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５〜８に示されている。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、およびＥ２のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９〜１２に示されている。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、およびＥ２のＶｋＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３〜１６に示されている。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、およびＥ２のＶｋＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７〜２０に示されている。Ｆ７、Ｆ９、Ｄ１、およびＥ２のＶｋＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１〜２４に示されている。Ｆ７（ウロクプルマブ）ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および６つのＣＤＲはまた、図１に示されている。本開示を通じて特定されたＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して表された（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【００４８】
別の態様では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は：
（ａ）配列番号２５もしくは４１に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号２９もしくは４５に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン；
（ｂ）配列番号２６もしくは４２に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０もしくは４６に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン；  
（ｃ）配列番号２７もしくは４３に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１もしくは４７に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン；または
（ｄ）配列番号２８もしくは４４に記載の配列を有する重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３２もしくは４８に記載の配列を有する軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン
を含む。
【００４９】
他の好ましい実施形態では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は：
（ａ）配列番号１に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号９に記載の配列もしくはその保存的改変を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１３に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２１に記載の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号２に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１４に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１８に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２２に記載の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号３に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１１に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１５に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２３に記載の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または
（ｄ）配列番号４に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１２に記載の配列もしくはその保存的改変を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１６に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２０に記載の配列もしくはその保存的改変を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２４に記載の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体もしくはその抗原結合部分は、配列番号１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００５１】
Ｆ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図１Ａならびに配列番号３３および２５にそれぞれ示されている。Ｆ７の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図１Ｂならびに配列番号３７および２９にそれぞれ示されている。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いるＦ７ＶＨ配列の解析は、図１Ａならびに配列番号１、５、および９にそれぞれ示されるような重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の表示につながり、図１Ｂならびに配列番号：１３、１７、および２１にそれぞれ示されるような軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域の表示につながった。
【００５２】
Ｆ９の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３４および２６に示され、かつＦ９の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３８および３０に示されている。Ｆ９重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の配列は、配列番号２、６および１０にそれぞれ示され、Ｆ９軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列は、配列番号１４、１８および２２にそれぞれ示される。
【００５３】
Ｄ１の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３５および２７に示され、かつＤ１の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３９および３１に示されている。Ｄ１重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の配列は、配列番号３、７および１１にそれぞれ示され、Ｆ９軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列は、配列番号１５、１９および２３にそれぞれ示される。
【００５４】
Ｅ２の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３６および２８に示され、かつＥ２の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号４０および３２に示されている。Ｅ２重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の配列は、配列番号４、８および１２にそれぞれ示され、Ｆ９軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列は、配列番号１６、２０および２４にそれぞれ示される。
【００５５】
さらに、特定のフレームワーク残基が生殖系列残基に置換されたＦ７、Ｆ９、Ｄ１およびＥ２の代替形態は、作成され、本明細書でＦ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬを指す。Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬのＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１、４２、４３および４４に示されている。Ｆ７ＧＬ、Ｆ９ＧＬ、Ｄ１ＧＬおよびＥ２ＧＬのＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５、４６、４７および４８に示されている。
【００５６】
一態様では、本開示の方法における使用のための抗ＣＸＣＲ４抗体は、ｍＡｂ  Ｆ７（ウロクプルマブ；配列番号２５および２９にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、ｍＡｂ  Ｆ９（配列番号２６および３０にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、ｍＡｂ  Ｄ１（配列番号２７および３１にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、ｍＡｂ  Ｅ２（配列番号２８および３２にそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）、のいずれかとＣＸＣＲ４への結合について交差競合する。ＣＸＣＲ４への結合に関して交差競合する抗体は、ＣＸＣＲ４上の同じエピトープ（つまり同一またはオーバーラップするエピトープ）に結合する。
【００５７】
特定の実施形態では、交差競合する抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体は、配列番号４９に記載のヒトＶＨ３〜４８生殖細胞系列配列由来の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含むＶＨ領域、および／または、配列番号５０に記載のヒトＶＫＬ１５生殖細胞系列配列由来の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含むＶＬ領域を含む。交差競合をする抗体は、標準ＣＸＣＲ４結合アッセイ、たとえば、参照抗体がＦＩＴＣで標識され、ＣＥＭ細胞へのＦＩＴＣ標識参照抗体の結合を阻害する試験抗体の能力が評価される、ＣＥＭ細胞とのフローサイトメトリーにおいて、ウロクプルマブ（Ｆ７）、Ｆ９、Ｄ１、Ｅ２または任意の他の基準の抗ＣＸＣＲ４抗体と交差結合する能力に基づいて同定できる。
【００５８】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、たとえば、薬学的に許容可能な担体とともに処方される、本開示のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の１つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかならびに全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射または注入による）に適している。本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、抗酸化剤、水性および非水性の担体ならびに／または防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでもよい。
【００５９】
投薬レジメンは、最適な所望の応答、たとえば治療応答または最小限の副作用を提供するように調整される。
【００６０】
ヒト抗ＣＸＣＲ４抗体の投与のために、用量は、対象の体重の約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１から約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。たとえば、用量は、０．１、０．３、１、３、５または１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。投与スケジュールは、典型的には、抗体の典型的な薬物動態学的特性に基づいた持続的な受容体占有率をもたらす曝露を達成するように設計されている。例示的な治療レジメンは、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、月に１回、３ヶ月毎に１回、または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。ＩｇＧ４抗体が典型的には２〜３週間の半減期を有することを考慮すると、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体のための好ましい投薬レジメンは、静脈内投与による０．３〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重を含み、完全な応答または確認された進行性疾患まで、最大６週間、８週間または１２週間のサイクルで、７日または１４日毎に抗体が与えられる。
【００６１】
用量およびスケジュールは、治療の経過中に変更されてもよい。たとえば、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体のための投薬レジメンは、静脈内（ＩＶ）投与による１、３または１０ｍｇ／ｋｇ体重を含み、以下の投与スケジュール：（ｉ）最大６週間のサイクルで７日毎；（ｉｉ）最大６回分について２週間に１回、その後３ヶ月毎；（ｉｉｉ）３週間毎；（ｉｖ）１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重１回、続いて２〜３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重；の１つを用いて、抗体が与えられる。
【００６２】
ＷＭ患者の２８％において見られたＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異は、疾患の進行および減少した生存につながる、著しい腫瘍増殖および骨髄外臓器への転移により記載されたように、ＷＭ細胞中で活性化する役割を果たす。抗ＣＸＣＲ４抗体、ＢＭＳ−９３６５６４の投与は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４  ＷＭモデルでは、インビボで有意な腫瘍縮小および骨髄外転移の抑止につながった（実施例６および７を参照のこと）。本発明の特定の実施形態では、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している患者は、抗ＣＸＣＲ４抗体もしくはその抗原結合部分を患者に少なくとも２回、少なくとも３回、もしくは少なくとも５回の用量で投与すること、野生型ＣＸＣＲ４遺伝子を有するＷＭ患者を治療する際に投与された用量、ならびに／または野生型ＣＸＣＲ４遺伝子を有するＷＭ患者を治療する際に投与された頻度より多い、少なくとも２回、少なくとも３回、もしくは少なくとも５回の頻度を含む治療レジメンで治療される。
【００６３】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して有毒ではなく、特定の患者、組成物、および投与様式のための所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量を得るために、変化させてもよい。選択された用量レベルは、使用される本開示の特定の組成物またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性を含む種々の薬物動態学的因子、投与経路、投与時期、使用されている特定の化合物の排出率、治療の期間、他の薬物、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される化合物および／もしくは物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医学分野でよく知られた因子等に依存するだろう。本発明の組成物は、当技術分野でよく知られた様々な方法の１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路を介して投与できる。当業者に理解されるように、投与経路および／または様式は、所望の結果に依存して変化するだろう。
【００６４】
本発明の使用および方法
本開示は、ＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合し、かつ治療的使用のために望ましい特定の機能特性を示す、治療有効量の抗体を対象に投与することを含む、ＷＭに罹患している対象を治療するための方法を提供する。
【００６５】
本開示はまた、治療有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体を対象に投与することを含む、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象を治療するための方法を提供する。
【００６６】
ＣＸＣＲ４は、広範囲の腫瘍細胞タイプに発現され、腫瘍転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、ＨＩＶ感染、炎症状態、ならびに血管形成もしくは血管新生に関与することが知られている（たとえば２００８／０６０３６７およびＷＯ２０１３／０７１０６８を参照のこと）。したがって、本明細書に開示される抗ＣＸＣＲ４抗体は、様々な臨床状況で使用できるが、本開示は、癌および特にＷＭの治療のためのこれらの抗体の使用に焦点を当てている。
【００６７】
癌におけるＣＸＣＲ４の役割
ＣＸＣＲ４の過剰発現はまた、癌の約７５％で実証され、特定の状況では、ＣＸＣＲ４の発現と患者の予後もしくは生存との間で、逆相関が確立されてきた。ＣＸＣＲ４発現またはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２経路に関連した癌の種類の非限定的な例は、乳癌（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、卵巣癌（Ｓｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、前立腺癌（Ｔａｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、非小細胞肺癌（Ｓｐａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、膵臓癌（Ｋｏｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、大腸癌（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、腎臓癌（Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、および甲状腺癌（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）などの固形腫瘍、上咽頭癌（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、黒色腫（Ｓｃａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、腎細胞癌（Ｓｔａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、神経芽細胞腫（Ｇｅｍｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、グリア芽腫（Ｒｅｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、横紋筋肉腫（Ｌｉｂｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ならびに骨肉腫（Ｌａｖｅｒｄｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ならびに急性リンパ芽球性白血病（Ｃｒａｚｚｏｌａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、多発性骨髄腫（ＭＭ）（Ａｌｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、慢性リンパ性白血病（Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、慢性骨髄性白血病（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）などの血液悪性腫瘍、ＷＭ（Ｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を含む。
【００６８】
さらに、この経路は、複数の腫瘍で転移プロセスの刺激に関与している（Ｍｕｒｐｈｙ，２００１）。臨床研究では、ＣＸＣＲ４が増加した転移の傾向および低下した生存に関連しており、ＣＸＣＲ４のより大きい発現が疾患の重症度と相関しているＡＭＬ、胸部、結腸、非小細胞肺癌、卵巣および膵臓癌の予後指標として特定されてきた（Ｓｐｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｈｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｏｔｔａｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｐａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；２００６；Ｍａｒｅｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００６９】
ＢＭ−ＭＳＣｓはＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）を分泌し、かつＣＸＣＲ４との相互作用は、ＢＭ微小環境内で造血幹細胞のホーミングおよび保持に不可欠である（Ｍｏｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。白血病細胞は、高レベルのＣＸＣＲ４を発現し、かつ経路は、順に増殖と生存を裏付けるＢＭへの白血病細胞の遊走において重要な役割を果たす。ＣＸＣＲ４は、ＣＸＣＬ１２が発現されるＢＭなどの臓器への転移性の拡散に不可欠である。まとめると、ＮＨＬおよびＭＭ患者における自家移植のための顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせた使用に関してＦＤＡにより承認された小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＡＭＤ３１００（プレリキサフォル；モゾビル）で実証されたように（Ｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ＣＸＣＲ４は、ＢＭ中の造血幹細胞のホーミングおよび保持の両方において重要な役割を果たし、かつＣＸＣＲ４のアンタゴニストは幹細胞を血流へ移動させる。別のＣＸＣＲ４阻害剤、ＡＭＤ３４６５は、ＣＸＣＬ１２−および間質−誘導性の化学遊走と拮抗することが示され、かつ白血病細胞における生存促進性のシグナル伝達経路のＣＸＣＬ１２−誘導性の活性化を阻害した（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。さらに、単独の、または顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせたＡＭＤ３４６５は、ＡＭＬ細胞および前駆細胞の血流への移動を誘導し、かつ化学療法治療およびソラフェニブの抗白血病効果を増強し、白血病負荷の顕著な減少および動物の生存の延長をもたらすことが実証された（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。かかる発見は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２相互作用の崩壊が、保護的ＢＭ微小環境を標的にすることによって、白血病細胞を化学療法治療に対して感作するために使用されてもよいことを示唆する。
【００７０】
ＷＯ２００８／０６０３６７およびＷＯ２０１３／０７１０６８に記載されるように、ＣＸＣＲ４に対する新規なファースト−イン−クラスのヒト治療モノクローナル抗体が開発された。これらのモノクローナル抗体は低ナノモルの親和性でＣＸＣＲ４を発現する細胞に結合し、ＣＸＣＬ１２がＣＸＣＲ４発現細胞に結合することを防ぎ、ＣＸＣＬ１２誘導性遊走およびカルシウムフラックスを低ナノモルのＥＣ５０値で阻害する。ＣＸＣＲ４は増殖、遊走／侵襲および血管形成を含む癌の複数の基本的な側面において役割を果たすので、アンタゴニストはＣＸＣＲ４が発現される悪性腫瘍に介入する複数の手段を潜在的に有する。有意なことに、ＣＸＣＬ１２誘導性のカルシウムフラックスおよび遊走を防ぐことに加えて、ＷＯ２０１３／０７１０６８は、ＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞のアポトーシスの抗体依存性誘導が、これらのヒト抗ＣＸＣＲ４抗体の作用機序であることを教示する。抗体誘導性アポトーシスは、複数の造血腫瘍異種移植モデル中で強固なインビボ有効性をもたらした。対照的に、ＡＭＤ３１００などの小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＢＭからのＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の移動を増加させ、それによって化学増感を高めるが、かかる腫瘍細胞を死滅させない、これは、癌細胞を死滅させる際に、小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニストと比較して高められた抗ＣＸＣＲ４抗体の効果を示唆する。
【００７１】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症
リンパ形質細胞性リンパ腫とも称呼されるＷＭは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の無痛性（増殖が遅い）サブタイプである。当該疾患は、最終分化したＢリンパ球の制御されていないクローン増殖、すなわち、ＢＭおよびリンパ節内に形成された白血球細胞により特徴付けられる。当該疾患の独特な特徴は、Ｂ細胞が過剰量のモノクローナルＩｇＭ抗体を生成し、過粘稠として知られている血液の増粘をもたらし得るということである。このＩｇＭタンパク質は、疲労、原因不明の体重減少、肥大したリンパ節もしくは脾臓、腎機能障害、全身性アミロイドーシス、衰弱ならびに原因不明の出血を含む、多くの症状をもたらし得る。また、Ｂ細胞の増殖は、赤血球の産生を妨害し、貧血をもたらす。
【００７２】
ＷＭは、米国では年間わずか約１５００例の、稀な疾患である。ＷＭのための単独の認可された治療はないが、免疫系を刺激する生物剤と化学療法の組合せを含む治療レジメンが、有望な結果を提供している（Ｔｒｅｏｎ，２００９）。ＷＭ患者の治療に現在用いられる組み合わせ療法のいくつかの例は、ＢＤＲ：ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、デキサメタゾンおよびリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））（Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）；ＲＣＤ：シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）；ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、デキサメタゾン、およびリツキシマブ（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）；Ｒ−ＣＨＯＰ：シクロホスファミド、ドキソルビシン、（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、プレドニゾンおよびリツキシマブ；ＣＰＲ：シクロホスファミド、プレドニゾンおよびリツキシマブ；ＶＲ：ボルテゾミブおよびリツキシマブ；ＦＲ：フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））およびリツキシマブ；ならびにＴＲ：サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））およびリツキシマブを含む。奏効率は高い（＞８０％）が、完全寛解率は低い（０〜１５％）。調査中の療法は、選択的ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤のイブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標））、ＷＭ細胞の表面上のＣＤ５２を標的とするアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、Ｂ細胞表面上のＣＤ２０分子を標的とするオファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、癌細胞のＤＮＡを攻撃し、細胞分裂周期を破壊するベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、細胞増殖および分裂を阻害するｍＴＯＲ阻害剤のエベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）、ＺＯＲＴＲＥＳＳ（登録商標））、ならびに選択的プロテアソーム阻害剤のカーフィルゾミブ（ＫＹＰＲＯＬＩＳ（商標））を含む。本明細書中で開示されるＷＭまたはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭの治療のための方法の特定の実施形態では、前述の薬剤のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせが、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体と組み合わせて使用されてもよい。他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＷＭを治療するために、使用されている、または開発中であるこれらの抗ＷＭ療法のいずれかに、ＷＭ患者の進行後、使用される。
【００７３】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症におけるＣＸＣＲ４およびＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異の役割
ＷＭ細胞がＣＸＣＲ４およびＶＬＡ−４を含むケモカインおよび接着受容体を高レベルで発現し、ＣＸＣＲ４がＷＭ細胞のＣＸＣＬ１２誘導性遊走および経内皮遊走に不可欠であることが、以前から示されてきた（Ｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＸＣＲ４のノックダウンまたはＣＸＣＲ４阻害剤であるＡＭＤ３１００は、ＷＭ細胞の遊走ならびにフィブロネクチン、間質細胞、および内皮細胞へのそれらの接着を著しく阻害することが示された。ＡＭＤ３１００により誘導された間質細胞へのＷＭ細胞の減少した接着は、ボルテゾミブによる、細胞毒性に対するこれらの細胞の増加した感受性、すなわち、増殖の阻害につながった。さらに、ＣＸＣＲ４およびＶＬＡ−４は、直接、ＣＸＣＬ１２に応じて相互作用することが示された。したがって、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２軸は、ＢＭ微小環境でのＷＭ細胞の遊走および接着を制御する際に、ＶＬＡ−４と相互作用することが示された（Ｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００７４】
本明細書に記載されるように、Ｂ細胞リンパ増殖性障害を有する４１８人の患者の検査は（実施例１；表１を参照のこと）、低悪性リンパ形質細胞性リンパ腫（ＷＭ）を有する患者の２８％が、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有していることを明らかにした。したがって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントの機能的関連性を分析するため、インビボモデルを用いてＷＭ細胞転移および疾患進行を媒介する際の推定上の役割を評価するため、ならびにＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−変異リンパ形質細胞を標的にしうる新規治療アプローチを特定するために、研究が行われた。これらの研究は、ＣＸＣＲ４機能獲得型研究を用いることによってインビボで示されるように、ＢＭへのＷＭ細胞のホーミングならびに遠隔臓器へのＷＭ転移を裏付ける重要な役割をＣＸＣＲ４が果たすことを示した（実施例２）。重要なことに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有するＷＭ細胞は、ＣＸＣＲ４過剰発現細胞（実施例３）と比較して類似の表現型を発現し、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントが機能的に活性な変異を表しうることを示唆している。さらに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞は、コントロール細胞またはＣＸＣＲ４過剰発現ＷＭ細胞のいずれかと比較して、インビボで、リンパ節へ転移することを示し（実施例３）、生成されたＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントが患者において臨床的に観察されたものを再現することができたことを示す。特に、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞は肺や腎臓などの骨髄外組織をインビボでコロニー形成することができ（実施例３）、バリアントが、肺および腎臓侵襲のすべての場合に検出された、骨髄外ＷＭを有する患者において観察された表現型を反映していた。
【００７５】
観察されたＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、ＷＨＩＭ症候群において元々記載されている変異の１つである。これは異常に機能する免疫によって特徴づけられる、稀な、遺伝性ヘテロ接合性常染色体優性疾患である。これは、その細胞内輸送を損なう受容体のカルボキシ末端トーク（Ｃ末）のトランケーションを担うＣＸＣＲ４の変異により引き起こされ、ＢＭにおけるケモカインリガンドおよび好中球の保持に対する増加した応答性につながる（Ｂａｌａｂａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；２００８；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｔａｎｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。最近の証拠は、ＷＭ患者におけるＷＨＩＭ−様Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異の存在が記載されているが（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＷＭにおけるこの変異のインビボでの機能的な後遺症、ならびにＣＸＣＲ４が腫瘍細胞輸送および転移を媒介する他のＢ細胞リンパ増殖性障害で体細胞バリアントが発生するかどうかは、本研究までに記載されなかった。疾患の進行につながるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞のインビボで転移するための増加した能力は、細胞侵襲性、抗アポトーシス、細胞増殖、および腫瘍形成に関連した遺伝子の濃縮によって裏付けられた（実施例３）。これは、コントロール細胞と比較して変異細胞における生存促進経路のアップレギュレーションをもたらした。これらの効果は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞またはコントロール細胞のいずれかを注入したＷＭ保有マウスが下記で説明されるように抗ＣＸＣＲ４抗体、ウロクプルマブで治療された場合では、逆転した。
【００７６】
従来使用の抗ＷＭ剤に対するＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の変化した感受性
一般的にＷＭを治療するために使用される薬剤は、リツキシマブ、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、クラドリビン（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標））、フルダラビン、ボルテゾミブ、ベンダムスチンなどの薬剤の単独または様々な組み合わせを含む。難治性／再発ＷＭを治療するさらなる療法は、リツキシマブにアレルギーのある患者のためのオファツムマブ、エベロリムス、アレムツズマブリ、ならびに自家もしくは同種幹細胞移植を伴う高用量化学療法を含む。カーフィルゾミブ、イブルチニブおよびパノビノスタット（ＬＢＨ−５８９）を含む、新しい薬物および薬物の組み合わせのいくつかは、ＷＭのための臨床試験（いくつかは難治性／再発疾患のため）で研究されている。
【００７７】
酵素ブルトン型チロシンキナーゼの経口投与される阻害剤であるイブルチニブは、最近アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）で、マントル細胞リンパ腫および慢性リンパ性白血病の治療のために承認され、２０１３年２月にはＦＤＡによりＷＭを有する患者のための単剤療法として画期的治療薬指定が付与された。イブルチニブは、再発または難治性のＷＭを有する患者において、高活性および認容性が良好であると報告されており（Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、かつ２０１４年１０月には医薬品承認事項変更申請（ｓＮＤＡ）が、少なくとも一つの全身性ＷＭレジメンで既に治療されたＷＭ患者におけるイブルチニブの第２相臨床試験からのデータ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０１６１４８２１）に基づいてＦＤＡに提出された。しかし、ＷＨＩＭ−様ＣＸＣＲ４変異の存在は、ＷＭ細胞におけるイブルチニブ媒介増殖抑制への感受性の低下を与えることが示され（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、主要応答割合は、ＷＨＩＭ−様ＣＸＣＲ４変異を有する患者においてわずか３０％であり、対して、野生型ＣＸＣＲ４を有する患者に対しては７７％であった（Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００７８】
さらに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントは、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ｍＴＯＲ阻害剤、エベロリムス、およびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、イデラリシブ（ＺＹＤＥＬＩＧ（登録商標））を含む、従来使用の抗ＷＭ小分子に対するＷＭ細胞の抵抗性に関連し、薬剤抵抗性を媒介する際のこのバリアントの役割を裏付けることが、本明細書で示されている（実施例４）。この結果は、ｍＴＯＲ、ＢＴＫおよびＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＷＭ細胞がＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有する患者を治療する際に、効果的でなくてもよいことを示唆する。対照的に、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞および変異のないコントロール細胞はプロテアソーム阻害剤薬剤カーフィルゾミブ、およびボルテゾミブに対して同じように敏感であり（実施例４）、したがって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントを有するＷＭ患者におけるプロテアソーム阻害剤とウロクプルマブの可能な組み合わせレジメンを示唆した。
【００７９】
いかなる特定の理論に拘束されることなく、それらの特定の経路に関連した遺伝子のアップレギュレーションのため、ＢＴＫ、ＰＩ３Ｋ、およびｍＴＯＲ阻害剤は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞に対して効果的でなかったということが提案される。さらに、変異したＣＸＣＲ４細胞は、ＲＡＦの濃縮ならびにマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ／マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼキナーゼおよびｍＴＯＲ経路を提示し、したがって、さらに、ＲＡＦおよびマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼキナーゼ／ＥＲＫ／ｍＴＯＲ経路間のクロストークの存在を示唆したということが確認された（Ｄｏｗｎｗａｒｄ，２００３；ＬｉｍおよびＣｏｕｎｔｅｒ，２００５）。対照的に、ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢ−関連アポトーシス遺伝子は、コントロール細胞と比較してＣＸＣＲ４変異細胞においては、差次的に調節されなかった（データ未掲載）。これは、少なくとも部分的には、野生型細胞と比較して変異したＷＭ細胞におけるＢＴＫ−、ｍＴＯＲ−、およびＰＩ３Ｋ−阻害剤の、プロテアソーム阻害剤に対する抵抗性および感受性の存在を説明しうる。
【００８０】
抗ＣＸＣＲ４抗体によるワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療
抗ＣＸＣＲ４抗体、ＢＭＳ−９３６５６４は、ＷＭ細胞株の初代ＷＭ骨髄間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）またはＣＸＣＲ４リガンド、ＣＸＣＬ１２のいずれかへの遊走を阻害することが明細書中で示されている。（実施例５を参照のこと）。この抗ＣＸＣＲ４抗体はまた、ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓへのＷＭ細胞接着を阻害し、かつＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下でのＷＭ細胞増殖を阻害する。さらに、また、当該抗体がＷＭ細胞におけるアポトーシスを直接的に誘導しうるという証拠が提供された（実施例５）。したがって、本開示は、ＷＭ細胞を含む、細胞表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、ＷＭに罹患している対象を治療するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される抗体は、ＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合し、かつ治療的使用のために望ましい特定の機能特性を示す、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体である。かかる機能特性は、細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ４への高親和性結合、ＣＸＣＲ４発現細胞におけるＳＤＦ−１−誘導性カルシウムフラックスおよびＣＸＣＲ４発現細胞の遊走を阻害すること、インビボでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞増殖を阻害および／もしくはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞アポトーシスを誘導すること、ＣＸＣＲ４＋腫瘍−保有対象の生存期間を増加させること、ならびに／または本明細書中で記載される他の機能特性を含む。
【００８１】
また、本開示は、ＣＸＣＲ４遺伝子中のＣ１０１３Ｇ変異は、ＷＭ患者の約２８％および約２０％のＩｇＭ−ＭＧＵＳ患者において存在するが、いくつかの試験された他のＢ細胞癌においては稀である、または存在しないという実験的証拠を提供する（実施例１を参照のこと）。したがって、Ｂ細胞リンパ増殖性障害のうち、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異はＷＭ患者を特徴付ける。また、ＣＸＣＲ４の過剰発現がインビボにおけるＷＭ細胞の増殖および転移を容易にすることを示すデータが提供された（実施例２）。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異の存在は、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下で、ＷＭ細胞の接着および増殖を増加させ、ＷＭ細胞におけるＣＸＣＲ４の過剰発現の効果を再現することを示した（実施例３）。したがって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異は、疾患の進行および減少した生存をもたらす、著しい腫瘍増殖および骨髄外臓器への転移により証明された、ＷＭ細胞における活性化変異である。
【００８２】
特に、ウロクプルマブは、インビトロおよびインビボ両方で、ＢＭ微小環境の状況でＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞の接着、遊走および増殖特性を効率的に標的とすることが示された（実施例６を参照のこと）。ウロクプルマブの投与は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４ＷＭモデルにおけるインビボでの著しい腫瘍減少および骨髄外転移の抑止をもたらした。これらの発見は、ＣＸＣＲ４がＷＭ分子病態の重要なレギュレーターであり、かつ重要な治療上の標的であるということを実証する。実施例５〜７に記載のように、野生型およびＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞の両方をうまく標的とするための抗ＣＸＣＲ４抗体の使用は、これらの観察を、ＷＭ患者のための臨床試験に変換するための健全な基盤を提供する。
【００８３】
したがって、本開示は、ＷＭ細胞を含む、細胞表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを含む、ＷＭに罹患している対象を治療するための方法を提供する。本発明の方法の特定の実施形態では、対象は、ヒトＷＭ患者、好ましくはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患しているヒト患者である。特定の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、細胞表面上に発現されるＣ１０１３Ｇ変異を有するヒトＣＸＣＲ４受容体などの、細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ４受容体に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。特定の他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はＩｇＧ４アイソタイプのものである。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。さらに他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分はキメラ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合部分である。好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体またはその抗原結合部分である。さらに好ましい実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、ウロクプルマブまたはそのＣＸＣＲ４結合フラグメントである。
【００８４】
重要なことに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するために使用され、かつＷＭの治療のために積極的に試験されている薬剤の３つの重要なクラス、すなわちイブルチニブにより例示されるＢＴＫ阻害剤、エベロリムスにより例示されるｍＴＯＲ、およびイデラリシブによって例示されるＰＩ３Ｋ阻害剤に対して抵抗性であることが本明細書中に開示された（実施例４）。対照的に、抗ＣＸＣＲ４抗体がＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異および非変異ＷＭ細胞両方の増殖性および遊走を阻害する際に効果的であることが示された。これらの結果は、ｍＴＯＲ、ＢＴＫおよびＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＷＭ細胞がＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有する患者を治療する際にあまり効果的ではなく、かつかかるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを治療するための抗ＣＸＣＲ４抗体の実用性を強調するだろうと示唆する。
【００８５】
ウロクプルマブは、インビボにおいて、生存促進シグナル伝達経路の活性化を阻害し、アポトーシス促進のカスケードを刺激し、かつＷＭ細胞の転移を阻害することにより、変異状態とは独立して、ＷＭ細胞を標的とすることが本明細書中に示されている（実施例５および６）。したがって、開示された治療方法の特定の実施形態では、ＷＭ患者をＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異の存在についてスクリーニングして、それによってＢＴＫ、ｍＴＯＲまたはＰＩ３Ｋ阻害剤薬剤での治療に適していない患者を特定する、かかる患者は抗ＣＸＣＲ４抗体で治療するのに適している。かかるＷＭ患者は、ＢＴＫ、ｍＴＯＲまたはＰＩ３Ｋ阻害剤薬の治療のための良い候補ではなくてもよく、代わりにファーストラインの単剤療法として、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体で治療されてもよい。この方法の特定の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体はウロクプルマブである。他の実施形態では、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭに罹患している患者は、ウロクプルマブなどの抗ＣＸＣＲ４抗体とイブルチニブ、エベロリムス、イデラリシブ、カーフィルゾミブ、および／またはボルテゾミブなどの抗ＷＭ剤との組み合わせにより治療される。さらなる実施形態では、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ患者は、患者が１つ以上の治療に失敗した後に、セカンド−もしくはサード−ライン療法として、抗ＣＸＣＲ４抗体単独で、または別の抗ＷＭ剤との組み合わせにより治療される。たとえば、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ＷＭ患者がイブルチニブによるファーストライン療法に失敗した後に投与されてもよく、あるいは、当該抗体は、患者が化学療法ＢＤＲ（ボルテゾミブ、デキサメタゾン、およびリツキシマブ）もしくはＲＣＤ（シクロホスファミド、デキサメタゾン、およびリツキシマブ）レジメンのファーストライン治療ならびにイブルチニブによるセカンド−ライン治療の両方に失敗した後に投与されてもよい。
【００８６】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症における単剤療法のための抗ＣＸＣＲ４抗体
ＢＭＳ−９３６５６４へのＷＭ細胞の曝露は、カスパーゼ−９およびＰＡＲＰ切断の増加をもたらした（実施例５）。ＢＭＳ−９３６５６４によるＣＸＣＲ４の中和はまた、ホスホ（ｐ）−ＧＳＫ３−βおよびｐ−β−カテニンのアップレギュレーションのレベルを増加させ、β−カテニンの分解につながった。ＢＭＳ−９３６５６４は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ細胞におけるカスパーゼ−９−およびＰＡＲＰ切断を同様に増加させ、かつＧＳＫ３−β／β−カテニンシグナル伝達を調節し、ｐ−ＧＳＫ３−β／ｐ−β−カテニンのアップレギュレーションおよびβ−カテニンの分解をもたらした（実施例６）。ＢＭＳ−９３６５６４のこれらの効果は、ＷＭおよびＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ細胞におけるアポトーシス経路の活性化に一致し、かつ他のＢ細胞悪性腫瘍において実証されたＢＭＳ−９３６５６４のアポトーシス促進効果を反映する（ＷＯ２０１３／０７１０６８；Ｋｕｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。したがって、ＷＭ患者を治療するためのこれらの方法の特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはそのフラグメントはＣＸＣＲ４−またはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４発現細胞のアポトーシスを誘導する。
【００８７】
開示された抗ＣＸＣＲ４抗体のアポトーシス効果、小分子ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、たとえばＡＭＤ３１００により示されない特性は、これらの抗体が、癌を有する患者を治療するために単剤療法として、単独で使用できることを示す。インビボＡＭＬおよびＭＭ腫瘍モデルにおけるＣＸＣＲ４アンタゴニストの効果についての以前の研究は、これらのアンタゴニストは化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を高める際に、効果的であることを示唆した（Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。さらに、実施例６において本明細書に提示されたデータは、単剤療法として投与されたウロクプルマブが、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４ＷＭを注入したマウスにおけるＷＭ転移を阻害したことを実証し、コントロール抗体処置マウスと比較して、処置されたマウスにおける大腿骨、肝臓、腎臓および肺におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２０＋細胞浸潤の著しい減少によって証明された。同様に、実施例７は、ウロクプルマブがインビボで野生型ＷＭ細胞の転移を阻害したことを示す。これらの結果は、ウロクプルマブが多種多様なＡＭＬ、ＮＨＬおよびＭＭモデルにおいて単剤療法として投与された時に達成された著しい腫瘍増殖阻害と一致する（ＷＯ２０１３／０７１０６８；Ｋｕｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００８８】
したがって、野生型ＷＭまたはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを治療するための本発明の治療方法の特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはそのフラグメントは単剤療法として投与される。好ましい実施形態では、抗体およびそのフラグメントはＣＸＣＲ４またはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４発現細胞のアポトーシスを誘導する。したがって、本開示はまた、本開示の治療有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体をＷＭ対象に投与することを含む、ＣＸＣＲ４−またはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−発現ＷＭ細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００８９】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療のための抗ＣＸＣＲ４および抗癌治療の組み合わせ
実施例７に記載のように、各ＢＭＳ−９３６５６４およびボルテゾミブは、ＢＭ内の腫瘍細胞および血清ＩｇＭ抗体のレベルを著しく減少させた。しかし、ＢＭＳ−９３６５６４およびボルテゾミブの組み合わせは、腫瘍細胞および血清ＩｇＭレベルのより著しい減少を引き起こすよう、相乗的に作用した。これらの結果は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２軸が、ＢＭへのＭＭ細胞のホーミングおよび輸送において重要な役割を果たし、かつＢＭとのＭＭ癌細胞の相互作用の崩壊が、これらの細胞を治療薬に対して感作するという以前の実証に一致する（Ａｌｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｋｕｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；ＷＯ  ２０１３／０７１０６８）。
【００９０】
開示された方法の特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体または抗原結合フラグメントはＣＸＣＲ４受容体に結合し、受容体の活性を阻害する。これは、ＢＭ微小環境内のＷＭ幹細胞のホーミングおよび維持を破壊し、かつ／またはＢＭから末梢へのＷＭ細胞の移動を増加させ、かつそれにより、放射線治療もしくは化学療法薬剤の投与などの１つ以上の抗癌治療に対するＷＭ癌細胞の感受性を増加させる。
【００９１】
したがって、特定の実施形態では、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、手術および／もしくは放射線などの他の癌治療と組み合わせて使用され、かつ／または、たとえば細胞毒性薬剤、放射毒性剤もしくは免疫抑制性薬剤の１つまたは他のそれ以上の治療薬と同時投与でき、これは抗ＣＸＣＲ４抗体の治療的効果を高め、または補強する。抗体は、（免疫複合体として）薬剤に結合でき、または薬剤とは別々に投与され得る。後者の場合（別々の投与）、抗体は、薬剤の投与の以前、以降もしくは同時に投与でき、あるいは、従来の化学療法薬剤および腫瘍関連抗原もしくは免疫調節の標的に結合する抗体を含む、他の既知の治療薬と同時投与できる。
【００９２】
これらの方法での使用のための抗癌剤は、とりわけ、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、イブルチニブ、イデラリシブ、パノビノスタット、デキサメタゾン、リツキシマブ、サリドマイド、シクロホスファミド、レナリドマイド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、フルダラビン、クロラムブシル、ベンダムスチン、クラドリビン、アレムツズマブ、オファツムマブ、エベロリムス、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン、イホスファミド、カルボプラチン、およびエトポシドを含む。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞と非変異ＷＭ細胞の両方は、プロテアソーム阻害剤、カーフィルゾミブおよびボルテゾミブに対して同じように感受性であることが本明細書中で実証されている（実施例４）。さらに、ウロクプルマブおよびボルテゾミブの組み合わせは、インビボでＢＭ内のＷＭ腫瘍細胞を減少させる際かつ血清ＩｇＭレベルを減少させる際に、ならびにインビトロでＷＭ細胞における毒性を誘導する際に、相乗的に作用した（実施例７）。まとめると、これらのデータは、プロテアソーム阻害剤、たとえばボルテゾミブまたはカーフィルゾミブとのウロクプルマブの組み合わせレジメンが、野生型ＣＸＣＲ４またはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントのいずれかを有するＷＭ患者を治療する際に非常に有効であることを強く示唆する。抗新生物剤と、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合フラグメントの同時投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を発揮するための、異なる機構を介して作動する少なくとも２つの抗癌剤を提供する。抗ＣＸＣＲ４抗体と他の薬剤の可能な相乗的相互作用に加えて、かかる同時投与は、薬剤に対する抵抗性の発展、または腫瘍細胞を抗ＣＸＣＲ４抗体に非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を克服することに役立つことができる。
【００９３】
したがって、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、化学療法の効果を増強するために、ＢＭの保護環境から悪性細胞を放出するその能力によって、使用されてもよい。上述のように、ＷＭ細胞を移動させ、かつそれらの化学感作を増加させることに加えて、これらの抗体は、アポトーシスによってＭＭ細胞を直接死滅させる付加的効果を有することが示されており、かつ、それゆえに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを含む、ＷＭを治療する際に、単剤療法として投与される際に効果的である。
【００９４】
用量
ＷＭを治療するための開示された方法の特定の実施形態では、治療有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量を含む。たとえば、特定の実施形態では、治療有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分は、０．１、０．３、０．５、１、３、５、１０または２０ｍｇ／ｋｇの用量を含む。好ましい実施形態では、用量は１、３または１０ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、または月に１回の投与スケジュールで投与される。好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は７日または１４日毎に１回の投与スケジュールで投与される。特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、治療期間の間、単剤療法として投与される。他の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は毎週投与され、単剤療法としてはじめの２週間のサイクル１で、その後、たとえばボルテゾミブ、デキサメタゾン、およびリツキシマブ（ＢＤＲ）、またはシクロホスファミド、デキサメタゾン、およびリツキシマブ（ＲＣＤ）を含む化学療法レジメンと組み合わせて投与される。特定の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、静脈内投与される。他の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、皮下投与される。
【００９５】
たとえば、ＢＤＲと組み合わせたウロクプルマブによるＷＭの治療では、例示的な投薬レジメンは：（１）１、８、１５、２２および２９日目（サイクル１）ならびに１、８および１５日目（サイクル２およびその後のサイクル）に単回６０分静脈内注入として投与されたウロクプルマブ（１、３または１０ｍｇ／ｋｇ）；（２）１５、１８、２２および２５日目（サイクル１）ならびに１、４、８、１１日目（サイクル２およびその後のサイクル）に３〜５秒の静脈内プッシュとして投与されたボルテゾミブ（１．３ｍｇ／ｍ２）；（３）１５、１６、１８、１９、２２、２３、２５および２６日目（サイクル１）ならびに１、２、４、５、８、９、１１および１２日目（サイクル２およびその後のサイクル）に投与されたデキサメタゾン（２０または４０ｍｇ）；ならびに（４）２５日目（サイクル１）および１１日目（サイクル２およびその後のサイクル）に、たとえば９０分を超える遅い静脈内注入によって投与されたリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２）を含む。
【００９６】
抗ＣＸＣＲ４抗体が、他の抗ＷＭ剤による療法と組み合わせて使用される場合、これらの薬剤は典型的に、承認された、または標準の用量で使用される。たとえば、イブルチニブの例示的投薬レジメンは、許容できない毒性および疾患進行まで、４２０ｍｇ（１４０−ｍｇカプセル３個）、経口で一日１回投与することを含む。
【００９７】
別の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体の用量は、患者の体重に関わらず固定されるフラット固定用量である。たとえば、抗ＣＸＣＲ４抗体は、患者の体重に関係なく、５、２０、３５、７５、２００、３５０、７５０または１５００ｍｇの固定用量で投与されてもよい。本明細書で使用されるように、用語「固定用量」、「フラット用量」および「フラット固定用量」は互換的に使用され、患者の体重または体表面積（ＢＳＡ）に関わらず患者に投与される用量を指す。それゆえに、固定またはフラット用量はｍｇ／ｋｇ用量として提供されないが、むしろ薬剤（たとえば抗ＣＸＣＲ４抗体）の絶対量として提供される。
【００９８】
患者選択工程を含む、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異は、ＷＭにおける活性化変異であると本明細書中で示される（実施例３）。野生型ＷＭ細胞と比較して、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞のより攻撃的な表現型にもかかわらず、ＢＭＳ−９３６５６４は、ＣＸＣＲ４変異細胞の接着性、遊走および増殖特性を標的とする際に、同等に活性的であることがわかった（実施例５）。したがって、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭの治療における特定の適用性を有してもよく、治療レジメンは、Ｃ１０１３Ｇ変異を有する患者を特定するための工程を含んでもよい。したがって、一態様では、本開示は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象を治療するための方法であって、（ａ）治療のための適切な候補である対象を選択すること、ここで、当該選択が：（ｉ）対象におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を提供すること；（ｉｉ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを評価すること；および（ｉｉｉ）ＷＭ細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み；ならびに（ｂ）Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の本開示の抗体またはその抗原結合部分を、選択された対象に投与することを含む、方法を提供する。本方法の特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、抗ＷＭ剤、たとえばボルテゾミブまたはカーフィルゾミブと組み合わせて投与され、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントを有するＷＭ患者を治療する際に有効でもある。本方法のいずれかでは、試験組織試料は、腫瘍組織の生検試料または末梢で見られる腫瘍細胞の試料を含む。
【００９９】
また、本開示は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象を治療するための方法であって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する、治療有効量の本開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含み、対象のＷＭ細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有すると決定されていることに基づいて、対象が選択されている、方法を提供する。
【０１００】
本開示は、さらに、ＷＭ細胞の表面上に発現されるＣＸＣＲ４受容体に特異的に結合する本開示の抗体またはその抗原結合部分で治療するためのＷＭ患者を選択するための方法であって、（ａ）患者におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること；（ｂ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを評価すること；および（ｃ）ＷＭ細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて治療のために患者を選択することを含む、方法を提供する。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、対象におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを治療するための、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分を含む、治療レジメンを決定するための方法であって、（ａ）対象におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること；（ｂ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを評価すること；および（ｃ）ＷＭ細胞が、Ｃ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて治療レジメンを決定することを含む、方法を提供する。
【０１０２】
本方法の特定の実施形態では、Ｃ１０１３Ｇ変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、またはＤＮＡシーケンシングにより検出される。さらなる実施形態では、ＰＣＲアッセイは、リアルタイムアレル特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）アッセイである。さらなる実施形態では、ＤＮＡシーケンシングは全ゲノムＤＮＡシーケンシングである。
【０１０３】
試験組織試料中のＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異をスクリーニングすることを含む本開示の方法のいずれかでは、患者からの試験組織試料の提供を含む工程は、任意の工程であると理解されるべきである。つまり、特定の実施形態では、この方法はこの工程を含み、他の実施形態では、この工程は方法に含まれない。また、特定の実施形態では、ＷＭ試験組織試料中の細胞がＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを決定するための「評価する」工程は、変異の存在をアッセイする変形的な方法により、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを行うことにより実施されることを理解されるべきである。他の実施形態では、変形的な工程は含まれず、変異の存在は、たとえば、実験室からの試験結果の報告を検討することにより評価される。特定の実施形態では、細胞がＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するかどうかを評価することまで含む方法の工程は、治療のためのある適切な候補を選択および／または患者に対して治療薬を投与する際に使用するために、医師または他の医療従事者に提供されてもよい中間結果を提供する。特定の実施形態では、中間結果を提供する工程は、医療従事者または医療従事者の指揮下で行動する者によって行われてもよい。他の実施形態では、これらの工程は、独立した実験室または検査技師などの独立した者により行われてもよい。
【０１０４】
本開示の別の態様は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している患者を治療するための治療レジメンであって、（ａ）対象におけるＷＭ組織から得られた試験組織試料を任意に提供すること；（ｂ）ＷＭ試験組織試料中の細胞が、ＣＸＣＲ４遺伝子中にＣ１０１３Ｇ変異を有するかどうかを評価すること；および（ｃ）ＷＭ細胞が、Ｃ１０１３Ｇ変異を有するという決定に基づいて治療レジメンを決定することを含む、上記に記載の方法により決定される治療レジメンに関する。特定の実施形態では、治療レジメンは、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分を、患者に：（ａ）野生型ＣＸＣＲ４遺伝子を有するＷＭ患者を治療する際に投与される、少なくとも２回、少なくとも３回、または少なくとも５回の用量；および／または（ｂ）野生型ＣＸＣＲ４遺伝子を有するＷＭ患者を治療する際に投与される頻度よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍高い頻度で、投与することを含む。
【０１０５】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療するための好ましい抗ＣＸＣＲ４抗体
本明細書で開示される治療方法は、ＷＭ患者に、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体を投与することを含む。この抗体は、ＷＭ細胞表面上に発現される野生型ＣＸＣＲ４またはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントに特異的に結合し、治療効果に有益な、特定の構造および機能特性を示す。たとえば、望ましい構造的特徴は、抗体がＦ７（ウロクプルマブ）、Ｆ９、Ｄ１もしくはＥ２（ＷＯ２００８／０６０３６７により特定される）のＣＤＲまたは可変領域を含み、または、ＣＸＣＲ４の同じエピトープ領域への結合について、これらの抗体のいずれかと交差競合することである。望ましい機能的特徴は、インビボにおいて、細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ４に高い親和性で結合すること、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の増殖を阻害する、ことおよび／またはＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞アポトーシスを阻害することを含む。本開示の治療方法の特定の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその部分は、配列が配列番号２５に記載される連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列が配列番号２９に記載される連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【０１０６】
他の好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその部分は、配列が配列番号２５に記載される連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域、および配列が配列番号２９に記載される連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０７】
さらに他の好ましい実施形態では、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ    ｅｔ    ａｌ．，１９９１；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ，２０００）による、ＣＤＲ配列の描写にしたがって、抗ＣＸＣＲ４抗体またはその部分は、配列番号１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１３に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１７に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号２１に記載の配列を有する連続して連結したアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。より好ましい実施形態では、抗体またはそのフラグメントはウロクプルマブまたはそのＣＸＣＲ４結合フラグメントを含む。
【０１０８】
本開示の一態様は、ＷＭまたはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象を治療するための医薬の調製のための、本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分の使用である。これは、ＷＭまたはＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭに罹患している対象を治療する際の使用のための本開示の抗体またはその抗原結合部分を開示する。
【０１０９】
治療キット
抗ＣＸＣＲ４抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそれらの組成物ならびに使用のための指示書、たとえば、ＷＭ患者に対して抗体またはその組成物を投与することを医療従事者または患者に可能にする投与スケジュールを含む指示書、を含むキットもまた、本開示の範囲内である。したがって、本開示は、対象におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ＷＭを治療するためのキットであって、（ａ）本開示の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその結合部分のいずれかの１回以上の用量、および（ｂ）本明細書に記載される治療方法のいずれかにおいて抗ＣＸＣＲ４抗体またはそのフラグメントを使用するための指示書を含む、キットを提供する。たとえば、特定の実施形態では、キット中の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。好ましい実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、ウロクプルマブである。任意に、本明細書中に記載の方法に従って、単回投与のための有効量の抗ＣＸＣＲ４抗体をそれぞれ含む、単回用量の医薬組成物の複数のパッケージを含む。このキットはさらに、化学療法薬剤もしくは放射性毒性薬物、または異なる抗原を標的とする１つ以上のさらなる抗体などの本明細書に記載される１つ以上の追加的治療用試薬を含み得る。特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、単位用量剤形中に１つ以上の他の治療薬とともにパッケージされる。
【０１１０】
医薬組成物を投与するために必要な装置または機械もまた、キット内に含まれてもよい。たとえば、キットは、１つ以上のシリンジを含んでもよい。特定の実施形態では、１つ以上のシリンジは、ある量の抗ＣＸＣＲ４抗体があらかじめ充填されている。また、キットは典型的に使用のための指示書とともにキットの内容物の用途を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上で、もしくはキットと一緒に供給され、あるいはキットに付属する任意の文書もしくは記録物を含む。
【０１１１】
本発明は、さらに、以下の実施例によって例示されるが、これらは単なる例示であり、多くの変形および等価物が、実施例は本開示を読むことによって当業者に明らかになるであろうが、いかなる方法であっても本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本出願全体にわたって引用した全図面および全参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ登録、特許および公開された特許出願の内容は、出典明示により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例１】
【０１１２】
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異についてのＢ細胞リンパ増殖性障害を有する患者のスクリーニング
様々なＢ細胞リンパ増殖性障害を有する患者が、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異体の存在についてスクリーニングされた。
【０１１３】
臨床試料
腫瘍試料は、様々なＢ細胞リンパ増殖性障害（Ｂ−ＬＰＤ）を有する４１８名の患者から採取され、以下のとおり割り振られた：ＷＭ（ｎ＝１３１）；ＩｇＭ  ＭＧＵＳ（ｎ＝４０）；びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ｎ＝７５）；脾辺縁帯リンパ腫（ｎ＝１４）；Ｂ細胞慢性リンパ球性リンパ腫（ｎ＝３７、Ｍ成分を有する１６を含む）；有毛細胞白血病（ｎ＝３５）；ＭＭ（ｎ＝３６、ＩｇＭアイソタイプのうち３）；ＩｇＡ／ＩｇＧ  ＭＧＵＳ（ｎ＝２２）；ＷＭ基準なしのリンパ形質細胞性リンパ腫（ｎ＝１３）；アミロイドーシス（ｎ＝６）；および他に特定されないＢ−ＬＰＤ（ｎ＝９）。診断は、造血およびリンパ組織の腫瘍の最新のＷＨＯの分類にしたがって行った（Ｃａｍｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。３２名の健常者もまた、コントロールとして本研究に含まれた。
【０１１４】
診断組織における免疫表現型分析およびクローン細胞定量
免疫表現型評価は、既に記載された従来のモノクローナル抗体のパネルを使用して（Ｐａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、かつ血液悪性腫瘍の免疫表現評価のためＥｕｒｏＦｌｏｗグループの一般的な推奨事項にしたがって、従来どおりに行われた（ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これらの症例は、表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）ならびに細胞質Ｉｇラムダおよびカッパ（ｃｙＩｇλおよびｃｙＩｇκ）に加えて、最大２０の異なる抗原を含む、４色の組み合わせを用いて、免疫表現型解析された。クローン細胞の割合は、ｓＩｇＭ／ＣＤ２５／ＣＤ１９／ＣＤ３８  ＭｏＡｂを含むチューブにより数えた。データ取得は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ［ＢＤＢ］  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア、ならびにトータルおよびＣＤ１９＋のみのイベントのための２段階の取得手順を用いて行われた。データ解析は、Ｉｎｆｉｎｉｃｙｔソフトウェアを用いて行われた（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ；Ｓａｌａｍａｎｃａ，Ｓｐａｉｎ）。診断組織における免疫表現型分析およびクローン細胞の定量後、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントの検出が、リアルタイムアレル特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）を用いて行われた。骨髄外ＷＭの１０例もまた、これらの研究に含まれた。これらの研究のためにダナ・ファーバー癌研究所および大学病院のサラマンカ施設内治験審査委員会から承認が得られた。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言にしたがって提供された。
【０１１５】
ＣＸＣＲ４  Ｃ１０１３Ｇ変異を同定するためのリアルタイムＡＳ−ＰＣＲ
リアルタイムＡＳ−ＰＣＲアッセイは、記載されるように（Ｐａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、それぞれのプライマーが野生型または変異アレルのいずれかに特異的であるように、最後の２つのヌクレオチド（３’位）において異なる２つのリバースプライマーの使用に基づいて開発された。マッチングしないプライマーの増幅を阻害するために（それによる特異性を増加させる）、さらなるヌクレオチドミスマッチ（Ｃ＞Ｇ）が変異ヌクレオチドの隣に導入された。プライマーの特異的な長さおよび位置は、オリゴ６．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて計算された。リバースプライマーは：５’−ＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧ−３’（リバース野生型プライマー）および５’−ＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣ−３’（リバース変異型プライマー）であった。１６５ｂｐのＰＣＲ産物を生成するための共通のフォワードプライマーは５’−ＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣ−３’であった。さらに、特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアｖ３．０．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して設計され、以下のレポーター、配列およびクエンチャー：６ＦＡＭ：５’−ＴＡＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡ−３’：ＮＦＱ−ＭＧＢを生成した。
【０１１６】
リアルタイムＡＳ−ＰＣＲの開発のために、各実験は２回の異なるＰＣＲ反応を必要とした：ＣＸＣＲ４  Ｃ１０１３Ｇ変異の検出のために１回（変異型リバースプライマーを用いる）、およびＤＮＡクオリティのコントロールとしてのもう１回（野生型リバースプライマーを用いる）。各反応は、３００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭのプローブ、１×のＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）および２０ｎｇのゲノムＤＮＡを含む、２０μｌの最終量で行われた。実験は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ  システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行われ、１０分９５℃の第一の変成工程は、続いて９５℃で１５秒および６０℃で６０秒の５０サイクルから構成された。データは、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）ソフトウェア２．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析され、蛍光がバックグラウンドから区別され始めるサイクルとして考えられるＣＴ値を与える。
【０１１７】
結果
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、ＷＭを有する患者において生じる
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異は、ＷＭ患者の２８．２％（３７／１３１）、およびＴｇＭ−ＭＧＵＳ患者の２０％（８／４０）において検出された。表１を参照のこと。さらに、当該バリアントは、脾辺縁帯リンパ腫を有する患者の７％（１／１４）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫を有する１．３％（１／７５）において検出された一方、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、ＭＭおよびＩｇＧ／ＩｇＡ  ＭＧＵＳでは存在せず（表１）、ＷＭの分子病態およびＩｇＭ−ＭＧＵＳ前駆段階の分子病態を裏付ける際の、このバリアントの潜在的な役割を示唆している。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、ＣＸＣＲ４における単一ヌクレオチド変化Ｃ→Ｇをもたらし、アミノ酸位置３３８のセリンのかわりに推定終始コドン（Ｓ３３８Ｘ）をもたらす。これは、ＣＸＣＲ４のＣ末端ドメインのトランケーションに既に関連づけられていて（Ａｌａｐｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、障害された細胞内トランスロケーションを引き起こす。
【０１１８】
観察されたバリアントが、たしかにＷＭ細胞の表面上でＣＸＣＲ４の変化を誘導し得ることをさらに証明するために、バリアントを有する（ｎ＝３）または有しない（ｎ＝８）、独立初代ＷＭ患者ＢＭ由来ＣＤ１９１細胞上のＣＸＣＲ４表面発現が評価され、より高い表面発現が、野生型／ＣＸＣＲ４患者と比較して、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異体を有する患者において見られた（図２）。さらに、骨髄外ＷＭ組織学的診断で確認された１０名の患者もまた、体細胞バリアントの存在について評価された：ゲノムＤＮＡでのＡＳ−ＰＣＲにより検出されるように（表２）、肺（３／３）および腎臓（１／１）の侵襲を有する患者は変異したＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４を提示したが、この変異は小腸（２／２）および軟組織（４／４）では存在せず、この変異が骨髄外侵襲を有する患者においてより広く認められることを示唆した。
表１：Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントを有するワルデンシュトレームマクログロブリン血症患者
【表１】
2020023499.tif 000002
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、ＷＭを有する患者の２８％において生じ、Ｂ細胞リンパ増殖異常症を有する患者では、存在しないまたは少数において存在する、のいずれかである。Ｂ−ＣＬＬ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病；ＭＧＵＳ、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症；ＮＯＳ、他に特定されない。
表２：Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、骨髄外ＷＭ疾患を有する患者の肺および腎臓組織中に存在する
【表２】
2020023499.tif 000003
【実施例２】
【０１１９】
ＷＭ細胞の増殖および転移に対するＣＸＣＲ４過剰発現の効果
ＷＭ生態を裏付ける際にＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントのインビボでの機能的関連性を分析するために、ＣＸＣＲ４（ＧＦＰ＋）過剰発現ＷＭ細胞（ＣＸＣＲ４＋）は、インビボでのＷＭにおけるＣＸＣＲ４の役割への見識を最初に提供するものであった。
【０１２０】
免疫組織化学
マウス組織（ＢＭ、肝臓、腎臓、肺およびリンパ節）を、ヒトＣＤ２０およびヒトＣＸＣＲ４の発現について解析および定量した。マウスの組織は、ホルマリン１０％で固定し、エタノール７０％は保存液として使用し、パラフィンで包埋した。パラフィン切片を、ライカボンドＩＩＩ自動染色プラットフォーム（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて、抗ヒトＣＸＣＲ４（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）および抗ヒト−ＣＤ２０（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）モノクローナル抗体とインキュベートした。二次抗体は、ボンドＩＩＩリファイン検出キット（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の一部として提供され、切片を、ボンドＩＩＩリファイン検出キットで提供されるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）−ペルオキシダーゼ基質とインキュベートし、ヘマトキシリン−エオシンで対比染色し、脱水し、マウントし、およびデジタル写真を撮影した（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ，Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）。ＣＤ２０およびＣＸＣＲ４染色の定量は、ＮＩＳエレメントソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて行われた。
【０１２１】
組織免疫蛍光
組織免疫蛍光イメージングが、記載されているように（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、マウスから採取された大腿骨、肝臓および腎臓の、ＧＦＰ＋／ＣＸＣＲ４過剰発現ＷＭ細胞またはＲＦＰ＋／スクランブルＷＭ細胞の評価のために行われた。目的の細胞は、ＢＣＷＭ．１−ＧＦＰ＋またはＢＣＷＭ．１−ＲＦＰ＋のいずれかである。核染色ＤＡＰＩを各スライドに追加した。スライドを、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ；ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ４０Ｘ  ｐｌａｎ  ｆｌｕｏｒ  ０．７５ＮＡ）を用いて分析した。ＭＭ．１Ｓ−ＧＦＰ＋細胞を、スライドあたり４つの個別のフィールドからカウントした。画像は、浜松オルカＥＲのカメラとＮＩＳエレメントソフトウェアを用いて撮影した。ＩｍａｇｅＪを、２つの異なるチャネルを併合するために使用した。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡ
ヒト血清ＩｇＭレベルは、製造元のプロトコルにしたがって、ヒト血清ＩｇＭ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を用いて決定した。
【０１２３】
インビトロでの細胞接着、遊走および増殖の研究
初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓに対するＷＭ細胞の接着性は、カルセインＡＭで標識されたＭＭ細胞を用いて、インビトロ接着性アッセイにより評価された。蛍光の程度は、既に記載されたように（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、分光光度計（４８５〜５２０）を用いて測定された。フィブロネクチンへのＷＭ細胞の接着は、製造元の推奨事項（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従い、フィブロネクチンに対するインビトロ接着性アッセイを用いて、記載されたように評価した（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＷＭ細胞株の遊走は、トランスウェル遊走プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を用いて、既に記載されたように（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＳＤＦ−１αまたは初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓのいずれかに対して評価された。ＷＭ細胞増殖は、既に記載されたように（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、初代ＢＭ−ＭＳＣｓとの共培養の４８時間後に、［３Ｈ］−チミジン（［３Ｈ］−ＴｄＲ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）取り込みによって測定されるＤＮＡ合成を評価することにより評価された。細胞毒性は、既に記載されているように（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ａｚａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を測定することにより評価された。
【０１２４】
機能の喪失および獲得研究
ＣＸＣＲ４の機能の獲得または喪失研究は、既に記載されたように（Ｒｏｃｃａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、単独または初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓとの関連でのいずれかでＷＭ細胞株（ＢＣＷＭ．１；ＭＷＣＬ１）を用いて行われてきた。簡潔には、ＣＸＣＲ４を、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；クローン１７１、６４９）およびレンチウイルス媒介感染を用いてＷＭ細胞においてノックダウンし、製品仕様に従って（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、スクランブルプローブを、標的配列（クローン１７１、６４９）を含むコントロールまたはスクランブルコントロールとして使用した。導入効率を、定量的逆転写ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）によって、および蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ，Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いるＧＦＰ発現細胞の検出を評価することによって、検証した。
【０１２５】
ＣＸＣＲ４の過剰発現は、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬｅｎｔｉＯＲＦ／ＣＸＣＲ４／ＧＦＰ（ＣＸＣＲ４＋）またはコントロールとして用いられたスクランブルプローブ／ＲＦＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して、ＷＭ細胞において得られた。過剰発現効率を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、および蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ，Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）でＧＦＰ−およびＲＦＰ−発現細胞を検出することにより、確認した。
【０１２６】
統計
記載された特定の統計的手法はまた、他の実施例において使用される。インビトロアッセイのために与えられたＰ値はＴ検定（両側；α  ０．０５）またはＡＮＯＶＡに基づく。Ｐ値は各図のために与えられる。薬物相乗作用は、２５〜２７に記載されているように、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアプログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，ＭＯ）を用いたアイソボログラム分析により解析された。カプラン−マイヤー曲線はグラフパッドプリズムを用いて得られ、Ｐ値をログランク検定（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に基づいて計算した。
【０１２７】
結果
インビボでのＣＸＣＲ４の機能的関連性
ＣＸＣＲ４＋／ＧＦＰ＋細胞および空ベクター／ＲＦＰ＋細胞の両方を、ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに注入した。感染効率をｑＲＴ−ＰＣＲ（図３）および免疫蛍光イメージング（データ未掲載；Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）により確認した。ＣＸＣＲ４＋／ＧＦＰ＋細胞および空ベクター／ＲＦＰ＋細胞の両方をＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに注入した。疾患の進行により、マウスを３週間後に安楽死させ、ＷＭ細胞中のＣＸＣＲ４過剰発現が、空ベクター細胞を注入したマウスと比較してＣＸＣＲ４＋細胞を注入したマウスにおいて著しく高い臓器の侵襲によって証明された、より攻撃的な表現型をもたらすことを実証した（Ｐ＜０．０１；図４Ａ−Ｃ）。
【０１２８】
エキソビボ研究は、ＣＸＣＲ４＋ＷＭ細胞が、ＢＭならびに肝臓および腎臓を含む他の臓器でより急速に転移し、増殖したことを実証した（図４；図５Ａ−Ｃ）。これらの発見をまた、免疫蛍光イメージングにより確認し、それぞれＣＸＣＲ４＋および空ベクター感染細胞を代表する、ＲＦＰ＋細胞と比較してより高いＧＦＰ＋の浸潤を示した（データ未掲載；Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。重要なことに、空ベクター細胞を注入したマウスと比較して、減少した生存がＣＸＣＲ４＋細胞を有するマウスにおいて観察された（Ｐ＝０．０２；図５Ｄ）。さらに、ＣＸＣＲ４＋細胞を注入したマウスは、非注入または空ベクター細胞を注入したマウスのいずれかと比較して、増加した血清ＩｇＭ分泌を提示した（Ｐ＝０．０２；図４Ｄ）。エキソビボのＣＸＣＲ４＋細胞の存在をまた、ＣＸＣＲ４＋細胞または空ベクターのいずれかを注入したマウスの大腿骨から採取したＢＭ細胞でｑＲＴＰＣＲを行うことにより確認した（図４Ｅ）。
【０１２９】
ＷＭ細胞におけるＣＸＣＲ４機能獲得によるインビトロの続発性を、ＣＸＣＲ４＋細胞をＣＸＣＲ４−ノックダウン細胞と比較することにより表した。感染効率を、ｍＲＮＡレベルで（図６）、および免疫蛍光イメージングにより（データ未掲載；Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）確認した。初代ＷＭ−ＢＭ間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）に接着し、ＢＭ−ＭＳＣｓとの関連で増殖するＷＭ細胞の能力は、ＣＸＣＲ４＋ＷＭ細胞で高められ、ＣＸＣＲ４ノックダウンＷＭ細胞の場合では阻害されることが示された（図５Ｅ、Ｆ）。同様に、フィブロネクチンに対する阻害されたＷＭ細胞の接着性を提示するＣＸＣＲ４がサイレンシングされた細胞とは対照的に、ＣＸＣＲ４過剰発現は、フィブロネクチンに対するＷＭ細胞の増加した接着能力をもたらした（図７Ａ、Ｂ）。まとめると、これらの発見は、ＣＸＣＲ４がインビボのＷＭ細胞の増殖および転移を容易にする際に重要であることを示す。
【実施例３】
【０１３０】
ＷＭ病理に対するＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異の影響
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、疾患の進行をもたらすＷＭ病理を積極的に裏付けるかどうかという疑問が解明された。
【０１３１】
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４突然変異誘発
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントは、製造元の指示書に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いた部位特異的突然変異誘発により、ＷＭ細胞株（ＢＣＷＭ．１；ＭＷＣＬ１）において生成された。コントロールベクターで感染させた細胞はコントロールとして考えられ、本明細書中で「コントロール細胞」として記載されている。ＷＭ感染細胞におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントの検出は、感染細胞から単離したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかでアレル特異的ＰＣＲを行うことによって評価した。（フォワードプライマー：５’−ＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣ−３’；リバース野生型プライマー：５’−ＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧ−３’；リバース変異型プライマー：５’−ＧＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣ−３’）。データはＤＮＡシーケンシングによりさらに確認された。
【０１３２】
遺伝子発現研究
遺伝子発現プロファイリングは、ＨＧ−Ｕ１３３プラス２アレイ（ＧＳＥ５０６８３）を用いて、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＢＣＷＭ．１細胞で行われた。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。データは、ｄ−Ｃｈｉｐソフトウェアを用いて正規化した。差次的に発現した遺伝子の痕跡は、既に報告されているように（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ジーンセットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を用いて解析した。遺伝子セットは公衆に利用可能なソース（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からダウンロードした。
【０１３３】
結果
安定Ｃ１０１３Ｇ−変異ＷＭ細胞（Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ）が生成され、コントロールベクター−感染ＷＭ細胞がコントロールとして用いられた。突然変異誘発効率は、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）レベルで、それぞれ定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびｑＲＴ−ＰＣＲによって確認され、さらにサンガーＤＮＡシークエンシングによって検証された（図８Ａ−Ｃ）。
【０１３４】
変異を有するＷＭ細胞により誘導されたインビボ表現型は、その後調べられた。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞を注入したマウスは、腫瘍細胞の遠隔臓器への著しい転移および増加した血清ＩｇＭ分泌を提示し（図８Ｄ）、したがって、ＣＸＣＲ４＋過剰発現ＷＭ細胞を注入したマウスで観察された効果を再現した。すでに実証された肝臓、腎臓およびＢＭの侵襲に加えて、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞を注入したマウスは、増大したリンパ節および肺の侵襲を提示した。中枢神経系への転移は観察されなかった。組織病理学解析は、脳を除くすべての調べられた組織においてＣＸＣＲ４−およびＣＤ２０−陽性細胞の存在を示し（図８Ｅ；図９Ａ−Ｅ）、ＣＸＣＲ４およびＣＤ２０陽性はコントロール細胞を注入したマウスと比較してＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞を注入したマウスにおいて高かった（Ｐ＜０．０５；図１０）。重要なことに、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞を注入したマウスは、減少した全生存を提示した（Ｐ＝０．００３；図９Ｆ）。
【０１３５】
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞（ＢＣＷＭ．１）はさらにインビトロにおいて特徴付けられ、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下における増加した接着性および細胞増殖性を示し、したがって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントが、ＷＭ細胞におけるＣＸＣＲ４の過剰発現の効果を再現できることが確認された（図１１Ａ、Ｂ）。同様の発見は、異なるＷＭ細胞株を用いて検証された（ＭＷＣＬ１；図１１Ｃ、Ｄ）。
表３：Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ患者における遺伝子のアップレギュレーション
【表３】
2020023499.tif 000004
Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するＷＭ患者（ｎ＝１０）における遺伝子のアップレギュレーションをＣＸＣＲ４／野生型ＷＭ患者（ｎ＝３０）と比較した。
【０１３６】
ＷＭ細胞の転移をインビボで容易にするＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントの能力をより説明するために、変異細胞はｍＲＮＡレベルで特徴付けられた。ＧＳＥＡを用いて、侵襲性、細胞増殖、抗アポトーシスおよび発癌性に関する遺伝子（Ｒｉｚｋｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）が、ＷＭコントロールベクター−感染細胞と比較して、Ｃ１０１３／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞において濃縮されており、コントロール細胞と比較した、変異細胞のより攻撃的な表現型に一致した（図１２Ａ）。ｍＲＮＡレベルで観察された変化と共に、これらのインビボの観察は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭバリアントがＷＭ細胞における活性化突然変異として作用することを示唆する。
【０１３７】
ＷＭ患者を、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルでプロファイルし、ＷＭ生態を裏付けると知られているマイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ＢＴＫ、およびＰＩ３Ｋ経路に関するいくつかの遺伝子（Ｃｈｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）が、ＣＸＣＲ４／野生型ＷＭ患者（ｎ＝３０）と比較してＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−変異ＷＭ患者（ｎ＝１０）において著しくアップレギュレートされることが発見された（表３）。重要なことに、それらの変化は、コントロールベクター−感染細胞と比較して、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−変異ＢＣＷＭ１細胞において、同じように濃縮されており、したがって、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−操作ＢＣＷＭ．１細胞が、初代ＷＭ腫瘍細胞で観察されたものを代表することをさらに確認した（図１２Ｂ）。
【実施例４】
【０１３８】
従来の抗ＷＭ剤に対するＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭバリアントの抵抗性
従来使用の抗ＷＭ小分子に対する、１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４バリアントを有するＷＭ細胞の感受性を調べた。
【０１３９】
材料および方法
試薬
エベロリムス、イデラリシブ、イブルチニブ、ボルテゾミブ、およびカーフィルゾミブを、セレックケミカルズ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）より購入した。薬剤は、ジメチルスルホキシドに溶解し、その後、使用の直前に細胞培養培地中（１０％ウシ胎仔血清）に希釈した。ジメチルスルホキシドの最大最終濃度（０．１％）は、細胞増殖に影響せず、かつ、試験された細胞株で細胞毒性を誘導しなかった。
【０１４０】
ＢＭＳ９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８およびコントロールヒトＩｇＧ４アイソタイプコントロールは、ブリストル−マイヤーズスクイブ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から取得した。
【０１４１】
ジーンセットエンリッチメント解析
ＧＳＥＡは実施例３に記載されているように行った。
【０１４２】
ＧＳＥＡ研究は、薬物抵抗性に関連する遺伝子が、変異を有するＷＭ細胞株において濃縮された一方、薬剤反応性に関する遺伝子がＷＭコントロール細胞において濃縮されたことを示した（図１３Ａ）。これは、新規抗ＷＭ剤が、ＣＸＣＲ４−変異ＷＭ細胞との関連で、それらの抗腫瘍効果を変更し得るかどうかの調査を促した。Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４体細胞バリアントを有するＷＭ細胞がＢＴＫおよびＰＩ３ＫならびにｍＴＯＲ阻害剤に対して抵抗性を提示することが見いだされた（図１２Ｂ−Ｄ）。これらのデータは、ＷＨＩＭ−様変異ＣＸＣＲ４を有するＷＭ患者が、イブルチニブベースの治療に対して抵抗性を提示することを示す最新のデータ（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を裏付けるものである。重要なことに、プロテアソーム阻害剤は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞およびコントロール細胞の両方に対して毒性を及ぼす際に、同様に効果的だった（図１３Ｅ−Ｆ）。
【実施例５】
【０１４３】
抗ＣＸＣＲ４抗体  ＢＭＳ−９３５５６４によるＷＭ細胞の標的化
ＷＭの進行を裏付ける際にＣＸＣＲ４の生物学的関連性に基づいて、抗ＣＸＣＲ４ヒトモノクローナル抗体ＢＭＳ−９３５５６４（ＷＯ２００８／０６０３６７においてＦ７で称され；ウロクプルマブまたはＭＤＫ−１３３８としても知られる）を、ＷＭ細胞の標的化における活性について試験した。ＷＭ細胞の接着性、遊走および増殖を測定するためのアッセイは、実施例２で記載されているように行い、遺伝子発現研究は、実施例３で記載されているように行った。
【０１４４】
イムノブロッティング
タンパク質溶解物は、５ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ポリメチルスルホニルフルオライド）、５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、および５μｇ／ｍＬ  アプロチニンを補った溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中で、非変性条件下でホモジナイズすることによりＷＭ細胞から得られた。全細胞溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に転写した。イムノブロッティングのために使用した抗体は：抗ホスホ（ｐ）−ＥＲＫ、抗ＥＲＫ、抗ｐ−Ａｋｔ、抗Ａｋｔ、抗ｐ−Ｓｒｃ、抗Ｓｒｃ、抗カスパーゼ−９、抗ＰＡＲＰ、抗ｐ−β−カテニン、抗β−カテニン、抗ｐ−ＧＳＫ３、抗ＧＡＰＤＨおよび抗α−チューブリン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を含んだ。
【０１４５】
結果
ＢＭＳ−９３６５６４は、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓまたはＳＤＦ−１のいずれかに対してＷＭ細胞株の遊走を阻害することが示された（図１４Ａ、Ｂ）。
【０１４６】
同様に、ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓに対するＷＭ細胞接着性のＢＭＳ−９３６５６４依存的阻害およびＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの存在下におけるＷＭ細胞の増殖阻害が実証された（図１５Ａ−Ｃ）。
【０１４７】
ＷＭシグナル伝達に影響を与える際のＢＭＳ−９３６５６４が果たし得る役割を分析するために、ＷＭ細胞を、増加する濃度の抗ＣＸＣＲ４抗体と共に、初代ＷＭ  ＢＭ−ＭＳＣｓの非存在下または存在下で培養した。ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ＥＲＫ、およびｐ−Ｓｒｃの薬剤依存的阻害がＢＭ−ＭＳＣｓとの関連で培養したＷＭ細胞中で観察され、ＢＭ環境の関連でさえ、ＷＭ細胞を標的とするＢＭＳ−９３６５６４の能力を示唆した（図１６）。
【０１４８】
アイソタイプコントロールは、インビトロでＷＭ細胞の接着および遊走に影響を及ぼさなかった（図１７Ａ、Ｂ）。
【０１４９】
ＢＭＳ−９３６５６４は、Ｂ細胞悪性腫瘍におけるアポトーシス促進性の効果を及ぼしうる（ＷＯ２０１３／０７１０６８；Ｋｕｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。したがって、ＷＭ細胞をＢＭＳ−９３６５６４に曝露し、カスパーゼ−９およびＰＡＲＰ開裂の増加を引き起こした（図１８）。
【０１５０】
ＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４とβ−カテニンの間の相互作用は、既に転移性固形腫瘍のモデルで示されてきた（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。さらに、リン酸化ＧＳＫ３βはβ−カテニンの分解を容易にすることが知られている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐｏｌａｋｉｓ，２００１）。したがってβ−カテニンに対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を調査した。ＣＸＣＲ４をＢＭＳ−９３６５６４で中和することによって、ＷＭ細胞は、増加したホスホ（ｐ）−ＧＳＫ３−βおよびｐ−β−カテニンのアップレギュレーションを提示し、β−カテニンの分解をもたらした（図１９）。これらの発見は、少なくとも部分的には、ＷＭ細胞におけるＢＭＳ−９３６５６４誘導アポトーシスの可能なメカニズムを説明しうる。
【実施例６】
【０１５１】
インビトロおよびインビボにおけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４−ＷＭ細胞に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果
インビボ研究
ＳＣＩＤ／Ｂｇマウス（ｎ＝５／グループ）に、ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＬｅｎｔｉＯＲＦ／ＣＸＣＲ４／ＧＦＰ（ＣＸＣＲ４＋）−または空ベクタープローブ／ＲＦＰ（コントロール）−感染ＢＣＷＭ．１細胞のいずれかに感染したＢＣＷＭ．１細胞を注入した。３週間後、マウスを安楽死させ、臓器を採取した。ヒト−ＣＤ２０および−ＣＸＣＲ４のためのヘマトキシリン−エオシン染色、免疫組織化学は、外植臓器で行った。生存の違いを評価するために、独立した実験を行った（ＳＣＩＤ／Ｂｇマウス、ｎ＝７／グループ）。同様の研究が、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞およびコントロールベクター−感染細胞（コントロール細胞）を用いて行われた。インビボにおけるホーミングの研究は、ＢＣＷＭ．１−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を用いて行った：当該細胞を、ＳＩＤ／Ｂｇマウスに静脈内注射し、かつＢＭＳ−９３６５６４またはコントロール抗体のいずれかで処置（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；１週間あたり３〜４回を３週間）した。ＢＭ、脾臓およびリンパ節にホーミングするＷＭを調節するＢＭＳ−９３６５６４の能力を、外植組織上で、３週間目にエキソビボで蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて評価した（Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１５２】
ＢＭＳ−９３６５６４の活性は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異細胞に感染したＳＣＩＤ／Ｂｇマウスにおいて試験された。コントロールマウスは、アイソタイプコントロール抗体で処置した（ｎ＝５マウス／グループ；ＢＭＳ−９３６５６４またはコントロール抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；１週間あたり３〜４回を３週間）。
【０１５３】
結果
ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果を、インビボで調べた。ＢＭＳ−９３６５６４は、コントロール抗体で処置したマウスと比較して、処置したマウスにおける大腿骨、肝臓、腎臓および肺におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２０＋細胞の浸潤の著しい減少によって示されるように、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４ＷＭ細胞を注入したマウスでＷＭ転移を阻害した（図１９Ａ−Ｅ；図２０Ａ−Ｄ）。重要なことに、リンパ節の侵襲はＢＭＳ−９３６５６４で処置したマウスにおいては存在しなかった（図２０Ｅ）。
【０１５４】
これらの発見をさらにインビトロにおいて確認した。ＢＭＳ−９３６５６４はＢＭ環境との関連で、ＣＸＣＲ４変異細胞の接着性、遊走および増殖特性を標的とする際に同様に活性であるということを発見した（図２１Ａ−Ｄ）。
【０１５５】
重要なことに、ＢＭＳ−９３６５６４は、ＣＸＣＲ４変異ＷＭ細胞において、カスパーゼ−９およびＰＡＲＰ開裂を増加させ、また、ＧＳＫ３−β／β−カテニンシグナル伝達を調節し、ｐ−ＧＳＫ３−β／ｐ−β−カテニンのアップレギュレーションおよびβ−カテニン分解をもたらした（図２２）。さらに、ＢＭＳ−９３６５６４は、Ｃ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するＷＭ細胞におけるｐ−ＥＲＫ、ｐ−Ａｋｔ、およびｐ−Ｓｒｃの用量依存的阻害を誘導した（図２２）。
【実施例７】
【０１５６】
インビボにおける野生型ＷＭ細胞に対するＢＭＳ−９３６５６４の効果
また、ＢＭＳ−９３６５６４の抗ＷＭ活性を、野生型ＷＭ細胞を用いてインビボで調べた。ＢＣＷＭ．１−ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞はＳＣＩＤ／ＢｇマウスならびにＢＭＳ−９３６５６４もしくはコントロール抗体のいずれかで処置したマウスに静脈内注射された。採取したＢＭ、脾臓およびリンパ節の免疫蛍光イメージングは、エキソビボでのＷＭ細胞の転移を阻害するＢＭＳ−９３６５６４の能力を実証した（データ未掲載；Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１５７】
ＣＸＣＲ４阻害が幹細胞および腫瘍細胞の移動を誘導すると考えられているように、ＢＭＳ−９３６５６４もまた、抗ＷＭ剤に対する増加した化学感受性をもたらすＷＭ細胞の移動を誘導しうることが仮定された。したがって、腫瘍の進行およびインビボでの遠隔ＢＭニッチへのＷＭ細胞転移を調節する際のＢＭＳ−９３６５６４の効果を、単剤療法としてまたはボルテゾミブとの組み合わせで評価した。（ボルテゾミブを病院薬局から得、ＤＭＳＯで希釈し、使用まで−２０℃で保存し、そして、使用直前に培養培地で希釈した。ＤＭＳＯの最大終濃度（＜０．１％）は細胞増殖に影響を及ぼさず、試験した細胞株で細胞毒性を誘導しなかった（データ未掲載）。）
【０１５８】
ＢＭＳ−９３６５６４で処置したマウスは、ＢＭ内の腫瘍細胞の著しい減少、ボルテゾミブ処置マウスで観察された同様の効果、ならびにＢＭＳ−９３６５６４およびボルテゾミブの組み合わせで処置したマウスにおけるより著しい阻害を提示した（Ｐ＜０．０５；図２３Ａ）。同様に、マウスをＢＭＳ−９３６５６４またはボルテゾミブのいずれかで処置すると、血清ＩｇＭレベルは著しく減少したが、ＢＭＳ−９３６５６４およびボルテゾミブの両方にマウスを曝露した場合は、さらにより著しく減少した（Ｐ＜０．０５；図２３Ｂ）。ＷＭ細胞における毒性を誘導することにおける、ＢＭＳ−９３６５６４およびボルテゾミブの組み合わせ効果のさらなる試験は、インビトロでの相乗作用を確認した（図２３Ｃ、Ｄ）。
【０１５９】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ−Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月11日(2019.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症細胞の表面上に発現されるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４変異を有するＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を含む、対象におけるＣ１０１３Ｇ／ＣＸＣＲ４関連ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を治療するための医薬組成物。
【外国語明細書】
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