(57)【要約】      （修正有）【課題】水溶性ポリマーを治療用タンパク質に複合化させる方法の提供。【解決手段】治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、（ａ）治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生する、及び（ｂ）水溶性ポリマーの還元システインスルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下、治療用タンパク質又はその生物学的に活性な断片をチオール還元剤、水溶性ポリマー又はその機能的誘導体に接触させるステップを含み、治療用タンパク質がアクセス可能なシステインスルフヒドリル基を１つしか有しないアミノ酸配列を有するものであり、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）及びトロンビン（ＦＩＩ）からなる群から選択される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生する、および
（ｂ）水溶性ポリマーの前記還元システインスルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、前記治療用タンパク質、またはその生物学的に活性な断片を、チオール還元剤および前記水溶性ポリマー、またはその機能的誘導体に接触させるステップを含み、
前記治療用タンパク質が、アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を１つしか有しないアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項２】
前記治療用タンパク質が、
Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質−２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン（ｅｐｉｐｉｎ）、ユコピン（ｙｕｋｏｐｉｎ）、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）からなる群から選択されるセルピンスーパーファミリーのタンパク質、
抗トロンビンＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、ヒト血清アルブミン、アルコール脱水素酵素、ビリベルジンレダクターゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、補体Ｃ５ａ、コルチゾール結合タンパク質、クレアチンキナーゼ、フェリチン、ヘパリン補助因子、インターロイキン２、タンパク質Ｃ阻害物質、組織因子、ビトロネクチン、オボアルブミン、プラスミノゲン活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補助因子ＩＩ、α１抗キモトリプシン、α１ミクログロブリンからなる群から選択されるタンパク質、ならびに、
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択される、血液凝固因子タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療用タンパク質がＡ１ＰＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
前記治療用タンパク質がヒト血清アルブミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記治療用タンパク質が糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用タンパク質がインビボでグリコシル化される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記治療用タンパク質がインビトロでグリコシル化される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
０．１００〜１０．０グラム重の量の治療用タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶性ポリマーが、３，０００〜１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶性ポリマーが直鎖であり、１０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶性ポリマーが直鎖であり、２０，０００の分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶性ポリマーが、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミドからなる群から選択されるスルフヒドリル特異的基を含有するように誘導体化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶性ポリマーがＰＥＧであり、前記スルフヒドリル特異的基がＭＡＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶性ポリマーがＰＳＡであり、前記スルフヒドリル特異的基がＭＡＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記チオール還元剤が、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システインヒドロクロリド、およびシステインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記チオール還元剤がＴＣＥＰである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記チオール還元剤の濃度が、治療用タンパク質濃度と比べて１〜１００倍モル過剰である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記チオール還元剤の濃度が、前記治療用タンパク質濃度と比べて１〜１０倍モル過剰である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療用タンパク質の前記アミノ酸配列が、システイン残基を１つしか含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記アクセス可能なシステインスルフヒドリル基が、前記治療用タンパク質の天然アミノ酸配列に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療用タンパク質の前記アミノ酸配列が、前記アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を含むように修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生するという前記条件は、前記タンパク質中の他のシステインアミノ酸間のジスルフィド結合を還元しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
治療用タンパク質が、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ含み、前記１つだけのシステイン残基は、前記治療用タンパク質のアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療用タンパク質複合体を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用タンパク質複合体が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される技術を用いて精製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療用タンパク質、水溶性ポリマー、およびチオール還元剤が共に単一の容器中でインキュベートされ、前記酸化したＳＨ基の前記還元および前記複合化反応が、同時に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記チオール還元剤が、前記治療用タンパク質とのインキュベーションの後、かつ前記治療用タンパク質を前記水溶性ポリマーとインキュベートする前に除去され、前記酸化したＳＨ基の前記還元および前記複合化反応が順次実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも７０％の前記治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、増加した半減期を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１．５倍増加する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ａ１ＰＩ複合体を調製する方法であって、
前記Ａ１ＰＩ上でのスルフヒドリル基の還元を可能にする条件下で、前記Ａ１ＰＩをＴＣＥＰと接触させるステップと、
前記水溶性ポリマーの前記還元スルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、ＭＡＬ基を含有するように誘導体化された直鎖ＰＥＧを前記Ａ１ＰＩと接触させるステップと、を含み、
前記Ａ１ＰＩが、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ含み、前記１つだけのシステイン残基は、前記Ａ１ＰＩのアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与せず、
前記ＴＣＥＰ濃度が、前記Ａ１ＰＩ濃度と比べて３〜４倍モル過剰であり、
少なくとも７０％の前記Ａ１ＰＩ複合体が、単一の水溶性ポリマーを含み、
前記Ａ１ＰＩ複合体が、天然のＡ１ＰＩと比べて、増加した半減期を有し、
前記Ａ１ＰＩ複合体が、天然のＡ１ＰＩと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、水溶性ポリマーを治療用タンパク質に複合化させるための物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性ポリマーと治療用タンパク質との間の共有結合を形成することによる複合体の調製を、様々な化学方法によって実施することができる。ポリペプチド薬物のＰＥＧ化は、循環中にそれらを保護し、それらの薬力学的および薬物動態プロファイルを改善する（Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００３；２：２１４−２１）。ＰＥＧ化プロセスは、エチレングリコールの反復単位（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を、ポリペプチド薬物に付着させる。ＰＥＧ分子は、大きな流体力学的体積（球状タンパク質の５〜１０倍の大きさ）を有し、非常に水溶性であり、水和されており、非毒性であって、非免疫原性であり、身体から迅速に除去される。分子のＰＥＧ化は、薬物の酵素分解に対する耐性の増大、インビボでの半減期の増大、投与頻度の減少、免疫原性の減少、物理的および熱安定性の増大、溶解度の増大、液体安定性の増大、凝集の低減をもたらすことができる。１９９０年代初期に最初のＰＥＧ化薬物がＦＤＡに承認された。それ以降、ＦＤＡは、経口、注入可能、および局所投与のための種々のＰＥＧ化薬物を承認している。
【０００３】
コロミン酸（ＣＡ）とも称されるポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然由来の多糖である。これはα（２→８）ケトシド連結を有するＮ−アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端に隣接ジオール基を含有する。これは負電荷を持つ、ヒトの身体の天然の構成成分である。これは大量の細菌から、規定の物理的特徴を有するように、容易に産生することができる（米国特許第５，８４６，９５１号）。細菌によって産生されたＰＳＡは、ヒトの体内で産生されたＰＳＡと化学的および免疫学的に同一であるため、細菌性ＰＳＡは、タンパク質とカップリングしたときでさえ非免疫原性である。一部のポリマーとは異なり、ＰＳＡ酸は生物分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼへのコロミン酸の共有カップリングは、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を増大することが明らかになっている。ポリシアル化アスパラギナーゼと非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル化が酵素の半減期を増加させたことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２００１；２１７：２１５−２４）。
【０００４】
ＰＥＧ誘導体とペプチドまたはタンパク質とのカップリングは、Ｒｏｂｅｒｔｓらにより検討されている（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００２；５４：４５９−７６）。水溶性ポリマーを治療用タンパク質とカップリングするための手法の１つは、タンパク質の炭水化物部分を介したポリマーの複合化である。タンパク質中の炭水化物の隣接ヒドロキシル（ＯＨ）基は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で容易に酸化され、活性アルデヒド基を形成することができる（Ｒｏｔｈｆｕｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９６３；２３８：１４０２−１０、ｖａｎ  Ｌｅｎｔｅｎ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９７１；２４６：１８８９−９４）。その後、ポリマーは、例えば活性ヒドラジド基を含有する試薬の使用によって、炭水化物のアルデヒド基とカップリングすることができる（Ｗｉｌｃｈｅｋ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂａｙｅｒ  ＥＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８７；１３８：４２９−４２）。より最近の技術は、アルデヒドと反応してオキシム連結を形成するアミノオキシ基を含有する試薬の使用である（国際公開第９６／４０６６２号、国際公開第２００８／０２５８５６号）。
【０００５】
治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化を説明するさらなる例は、フォンヴィレブランド因子中の炭水化物部分の酸化、およびヒドラジド化学を使用するＰＥＧへのその後のカップリングを教示する国際公開第０６／０７１８０１号、ｒＦＶＩＩＩの酸化、ならびにヒドラジド化学を使用するＰＥＧおよび他の水溶性ポリマー（例えば、ＰＳＡ、ＨＥＳ、デキストラン）へのその後のカップリングを教示する米国特許出願公開第２００９／００７６２３７号、異なる凝固因子（例えば、ｒＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶＩＩａ）の酸化、ならびにオキシム連結を形成することによるアミノオキシ化学を使用する、例えばＰＥＧへのその後のカップリングを教示する国際公開第２００８／０２５８５６号、およびＦＩＸの酸化、ならびにヒドラジド化学を使用するＰＥＧへのその後のカップリングを教示する米国特許第５，６２１，０３９号に説明されている。
【０００６】
近年、アルデヒドを生成するためのシアル酸の緩やかな過ヨウ素酸塩酸化後、触媒量のアニリンの存在下での、試薬を含有するアミノオキシ基との反応を含む、改善された方法が説明された（Ｄｉｒｋｓｅｎ  Ａ．，ａｎｄ  Ｄａｗｓｏｎ  ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８；１９，２５４３−８、およびＺｅｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。求核触媒の使用はまた、Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１２８：１５６０２−３（２００６）、Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ  Ｅｄ．，４５：７５８１−４（２００６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．，１０：２１４７−５０（２００９）、Ｇｉｕｓｅｐｐｏｎｅ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１２７：５５２８−３９（２００５）、およびＴｈｙｇｅｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．，７５：１７５２−５（２０１０）にも説明されている。
【０００７】
前述の技術および試薬にもかかわらず、当分野において、半減期を増加し、かつ生物学的活性を保持しながら、最小限のプロセスステップおよび高い効率性を伴う、水溶性ポリマーを治療用タンパク質に複合化するための物質および方法の必要性が残る。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、ポリマーをタンパク質に複合化する物質および方法を提供し、それはタンパク質の薬力学的および／または薬物動態的特性を改善し、同時に複合化反応の収率を最大化する。
【０００９】
本開示の一実施形態において、（ａ）治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生する、および（ｂ）還元システインスルフヒドリル基への水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、治療用タンパク質またはその生物学的に活性な断片をチオール還元剤および水溶性ポリマー、またはその機能的誘導体に接触させるステップを含み、該治療用タンパク質は、アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を１つしか有さないアミノ酸配列を有する、治療用タンパク質複合体を調製する方法が提供される。
【００１０】
別の実施形態では、治療用タンパク質は、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン（ｅｐｉｐｉｎ）、ユコピン（ｙｕｋｏｐｉｎ）、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）からなる群から選択されるセルピンスーパーファミリーのタンパク質、抗トロンビンＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、ヒト血清アルブミン、アルコール脱水素酵素、ビリベルジンレダクターゼ、ブツリルコリンエステラーゼ（ｂｕｔｕｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）、補体Ｃ５ａ、コルチゾール結合タンパク質、クレアチンキナーゼ、フェリチン、ヘパリン補助因子、インターロイキン２、タンパク質Ｃ阻害物質、組織因子、ビトロネクチン、オボアルブミン、プラスミノゲン活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補助因子ＩＩ、α１抗キモトリプシン、α１ミクログロブリンからなる群から選択されるタンパク質、ならびに第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択される血液凝固因子タンパク質からなる群から選択される、前述の方法が提供される。関連する実施形態において、治療用タンパク質はＡ１ＰＩである。別の関連する実施形態において、治療用タンパク質はヒト血清アルブミンである。
【００１１】
別の実施形態では、治療用タンパク質は糖タンパク質である、前述の方法が提供される。関連する実施形態において、治療用タンパク質はインビボでグリコシル化される。別の関連する実施形態において、治療用タンパク質はインビトロでグリコシル化される。
【００１２】
別の実施形態では、０．１００〜１０．０グラム重の量の治療用タンパク質を含む、前述の方法が提供される。様々な実施形態において、治療用タンパク質の量は、０．０１〜１０．０グラム重、０．０２〜９．０グラム重、０．０３〜８．０グラム重、０．０４〜７．０グラム重、０．０５〜６．０グラム重、０．０６〜５．０グラム重、０．０７〜４．０グラム重、０．０８〜３．０グラム重、０．０９〜２．０グラム重、および０．１０〜１．０グラム重である。このように、一実施形態において、本開示の方法は、大規模な治療用タンパク質複合体の生成に適用可能である。
【００１３】
別の実施形態では、水溶性ポリマーは、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、前述の方法が提供される。別の実施形態では、水溶性ポリマーは、３，０００〜１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、前述の方法が提供される。様々な実施形態において、水溶性ポリマーは、５，０００〜１２５，０００、６，０００〜１２０，０００、７，０００〜１１５，０００、８，０００〜１１０，０００、９，０００〜１００，０００、１０，０００〜８０，０００、１５，０００〜７５，０００、２０，０００〜６０，０００、３０，０００〜５０，０００、および３５，０００〜４５，０００Ｄａの分子量を有する。一実施形態において、水溶性ポリマーは、直鎖であり、１０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有する。また別の実施形態では、水溶性ポリマーは直鎖であり、２０，０００の分子量を有する。
【００１４】
別の実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、前述の方法が提供される。
【００１５】
また別の実施形態では、水溶性ポリマーは、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）からなる群から選択されるスルフヒドリル特異的基を含有するように誘導体化される、前述の方法が提供される。一実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、スルフヒドリル特異的基はＭＡＬである。また別の実施形態では、水溶性ポリマーはＰＳＡであり、スルフヒドリル特異的基はＭＡＬである。
【００１６】
さらに別の実施形態では、前述の方法は、チオール還元剤は、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システインヒドロクロリド、およびシステインからなる群から選択される。一実施形態において、チオール還元剤はＴＣＥＰである。
【００１７】
別の実施形態では、チオール還元剤濃度が、治療用タンパク質濃度と比べて、１〜１００倍モル過剰である、前述の方法が提供される。また別の実施形態では、チオ還元剤濃度は、治療用タンパク質濃度と比べて、１〜１０倍モル過剰である。様々な実施形態において、チオ還元剤濃度は、治療用タンパク質濃度と比べて、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、２〜４、および３〜４倍モル過剰である。
【００１８】
別の実施形態では、治療用タンパク質のアミノ酸配列は、システイン残基を１つしか含有しない、前述の方法が提供される。別の実施形態では、アクセス可能なシステインスルフヒドリル基が、治療用タンパク質の天然アミノ酸配列中に存在する、前述の方法が提供される。また別の実施形態では、治療用タンパク質のアミノ酸配列が、アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を含むように修飾される、前述の方法が提供される。さらに別の実施形態では、治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生するという条件は、タンパク質中の他のシステインアミノ酸間のジスルフィド結合を還元しない、前述の方法が提供される。別の実施形態では、前述の方法は、治療用タンパク質が、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ含み、該１つだけのシステイン残基は、治療用タンパク質のアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与しない。
【００１９】
本開示の別の実施形態では、治療用タンパク質複合体を精製するステップをさらに含む、前述の方法が提供される。様々な実施形態において、治療用タンパク質複合体は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される技術を用いて精製される。
【００２０】
また別の実施形態では、治療用タンパク質、水溶性ポリマーおよびチオール還元剤が共に単一の容器中でインキュベートされ、酸化したＳＨ基の還元および複合化反応が、同時に実施される、前述の方法が提供される。別の実施形態では、チオール還元剤が、治療用タンパク質とのインキュベーションの後、かつ治療用タンパク質をこの水溶性ポリマーとインキュベートする前に除去され、酸化したＳＨ基の還元および複合化反応が逐次実施される。
【００２１】
本開示のさらに別の実施形態では、治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持する、前述の方法が提供される。別の実施形態では、治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する。一実施形態において、治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比べて、１０〜１００％の生物学的活性を保持する。様々な実施形態において、治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の生物学的活性を保持する。
【００２２】
本開示のさらに別の実施形態では、少なくとも７０％の治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、前述の方法が提供される。別の実施形態では、１０〜１００％の治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む。様々な実施形態において、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む。
【００２３】
本開示のまた別の実施形態では、治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、増加した半減期を有する、前述の方法が提供される。別の実施形態では、治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１．５倍増加する。一実施形態において、治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１〜１０倍増加する。様々な実施形態において、治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または９．５倍増加する。
【００２４】
本開示のまた別の実施形態では、Ａ１ＰＩ上でのスルフヒドリル基の還元を可能にする条件下で、Ａ１ＰＩをＴＣＥＰと接触させ、かつ水溶性ポリマーの還元スルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、ＭＡＬ基を含有するように誘導体化された直鎖ＰＥＧをＡ１ＰＩと接触させるステップを含み、該Ａ１ＰＩが、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ含み、該１つだけのシステイン残基は、Ａ１ＰＩのアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与せず、該ＴＣＥＰ濃度はＡ１ＰＩ濃度と比べて３〜４倍モル過剰であり、少なくとも７０％のＡ１ＰＩ複合体が、単一の水溶性ポリマーを構成し、該Ａ１ＰＩ複合体が、天然のＡ１ＰＩに比べて増加した半減期を有し、該Ａ１ＰＩ複合体が天然のＡ１ＰＩに比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、Ａ１ＰＩ複合体を調製する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アルコキシアミン連結を形成する、ＮａＣＮＢＨ３による還元によるオキシム連結の安定化を示す。
【図２】第１級アミンの改良ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含有する３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンの合成を示す。
【図３】ＰＥＧ化Ａ１ＰＩから得られた、薬物動態的プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
治療用タンパク質の薬理学的および免疫学的特性は、化学修飾、および本明細書に記載されるような高分子化合物との複合化によって改善可能である。本開示は、非複合化治療用タンパク質と比べて、生物学的に活性であり、延長した半減期を有する、治療用複合体を調製する物質および方法を提供する。得られる複合体の特性は、一般に、ポリマーの構造および大きさに強く左右される。したがって、画定された狭い大きさの分布を有するポリマーが、通常、当分野において好ましいとされる。ＰＥＧ等の合成ポリマーは、狭い大きさの分布で容易に製造することができ、一方、ＰＳＡは、狭い大きさの分布を有する最終ＰＳＡ調製をもたらすような様式で精製することができる。加えて、画定されたポリマー鎖および狭い大きさの分布を有するＰＥＧ化試薬は、市場に出回っており、手頃な価格で市販されている。
【００２７】
治療用タンパク質複合体を調製する方法
本明細書に記載のように、本開示は、治療用タンパク質複合体を調製する方法を提供する。本開示によって提供される方法の様々な構成要素、例えば、治療用タンパク質、水溶性ポリマー、還元性物質等、ならびに方法によって提供される様々な条件、例えば、様々な構成要素の反応時間および濃度が、以下に記載される。
【００２８】
本開示の一実施形態において、治療用タンパク質をチオール還元剤に接触させ、治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生する。別の実施形態では、還元システインスルフヒドリル基を伴う治療用タンパク質を水溶性ポリマーに接触させ、治療用タンパク質複合体を産生する。様々な実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質に複合化する反応ステップが、別々におよび「逐次」実施される。例として、治療用タンパク質、チオール還元剤／還元性物質、および水溶性ポリマー等といった出発物質および試薬が、個々の反応ステップ間で分離される（すなわち、まず治療用タンパク質を還元し、続いて還元剤を除去し、次いで水溶性ポリマーに接触させる）。別の実施形態では、本開示に従って複合化反応を完了するために必要な出発物質および試薬は、単一の容器中で実施される（「同時に」）。
【００２９】
本開示の様々な実施形態において、スルフヒドリル−（ＳＨ）特異試薬（例えば、ＳＨ−特異的／適合末端基またはリンカーを有する水溶性ポリマー）は、治療用タンパク質上に存在するＳＨ基に複合化される。様々な実施形態において、ＳＨ基は治療用タンパク質のシステイン残基上に存在する。本開示は、治療用タンパク質が複数の（例えば、１つより多くの）システイン残基を含むが、かかるシステイン残基のうち１つのみがアクセス可能であり、それにより水溶性ポリマーへの複合化に利用できる、方法を提供する。例えば、治療用タンパク質は、その天然に存在するアミノ酸配列中に複数のシステイン残基を有し得る。しかし、かかる治療用タンパク質は、以下に記載のように、アクセス可能なシステインＳＨ基を１つしか有しない。本開示の様々な実施形態に従って、かかる治療用タンパク質は、水溶性ポリマーのアクセス可能なスルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、治療用タンパク質中に存在するジスルフィド架橋を破壊することなく、部位特異的に水溶性ポリマーに複合化される。
【００３０】
本開示の様々な実施形態に従って、かつ以下にさらに記載されるように、治療用タンパク質のアミノ酸配列は、システイン残基上の単一（すなわち、１つ）のアクセス可能なＳＨ基を自然に含有する。代替として、治療用タンパク質のアミノ酸配列は、標準分子生物学的技術を使用して、システイン残基上の単一のアクセス可能なＳＨ基を含有するように修飾され得る。かかる修飾は、例えば、（ｉ）治療用タンパク質の天然の（すなわち、野生型）アミノ酸配列がシステイン残基を含まない、（ｉｉ）治療用タンパク質のアミノ酸配列が複数のシステイン残基を含むが、それらのすべてがジスルフィド架橋に関与し、または、ないしはアクセス可能ではない（例えば、折り畳みタンパク質に埋め込まれた）、（ｉｉｉ）治療用タンパク質のアミノ酸配列が、アクセス可能なかかるシステイン残基を、１つより多く有する複数のシステイン残基を含む、ときに必要であり得る。前述のシナリオ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において、本開示は、単一のアクセス可能なＳＨ基を有する治療用タンパク質を得るように修飾アミノ酸配列を操作するための、標準分子生物学的技術の使用を企図する。代替として、本開示は、単一のアクセス可能なＳＨ基を有する治療用タンパク質を得るように治療用タンパク質を修飾するための、標準化学技術の使用を企図する。
【００３１】
例として、本開示は、緩還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）の存在下で実行される、ＳＨ−特異試薬（例えば、ＭＡＬ−ＰＥＧ）を用いた治療用タンパク質（例えば、Ａ１ＰＩ）のＰＥＧ化の方法を提供する。この方法は、同時手法として、または、代替として逐次手法（最初に還元、次いで複合化）を使用して、実行されてもよい。ＳＨ−特異試薬は、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の様々な実施形態において、任意の水溶性ポリマーが治療用タンパク質に複合化される前述の方法が提供される。
【００３３】
本発明の様々な実施形態において、治療用タンパク質が、ジスルフィド架橋に関与しない１つのアクセス可能な遊離ＳＨ基を含有する前述の方法が提供される。様々な実施形態において、１つの遊離したアクセス可能なＳＨ基を有する治療用タンパク質およびペプチドは、組換えＤＮＡ技術の方法によって調製される（すなわち、タンパク質上にアクセス可能なＳＨ基が１つだけ存在するように、タンパク質のアミノ酸配列が修飾される）。本開示の様々な実施形態において、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）、ならびに第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼといった血液凝固タンパク質といったセルピンは、記載の方法における使用が企図される。
【００３４】
治療用タンパク質
本明細書に記載される際、治療用タンパク質という用語は、治療用タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の治療用タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質である。本開示の様々な実施形態において、治療用タンパク質は、その天然源から産生され、精製され得る。代替として、本開示に従って、「組換え治療用タンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術を介して得られた任意の治療用タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、用語は本明細書に記載のタンパク質を含む。
【００３５】
本明細書で使用される際、「内在性治療用タンパク質」は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来する治療用タンパク質を含む。この用語はまた、該哺乳動物に存在する導入遺伝子または任意の他の外来ＤＮＡから転写された治療用タンパク質を含む。本明細書で使用される際、「外在性治療用タンパク質」は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来しない血液凝固タンパク質を含む。
【００３６】
本明細書で使用される際、「血漿由来治療用タンパク質」または「血漿性」は、タンパク質のすべての形態、例えば、凝固経路に関与する特性を有する哺乳動物に由来する血中に見られる血液凝固タンパク質、を含む。
【００３７】
本明細書で開示されるように、水溶性ポリマーの添加は、治療用タンパク質の特性を改善する一手法である。本開示のある特定の実施形態において、ポリペプチドは、以下の治療用タンパク質により例示される：酵素、抗原、抗体、受容体、血液凝固タンパク質、成長因子、ホルモン、およびリガンド。
【００３８】
ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、タンパク質（例えば、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４））のセルピンファミリーのメンバーである。セルピン（セリンプロテイナーゼ阻害物質）は、タンパク質のスーパーファミリー（３００−５００アミノ酸の大きさ）であり、それは保存構造に折り畳まれ、独特の自殺基質様阻害機序を利用する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３６）：３３２９３−３３２９６（２００１）、参照によりその全体が組み込まれる）。
【００３９】
ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、タンパク質の凝固因子ファミリーのメンバー（例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ）である。
【００４０】
様々な実施形態において、治療用タンパク質は、１つ以上の１つのシステイン残基を有する。一実施形態において、治療用タンパク質が１つだけのシステイン残基を有する際、システイン残基は、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含む。システイン上のかかるスルフヒドリル基は、治療用タンパク質のアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与しないが、精製に続いて、「遊離」システイン残基または任意の他の含硫化合物（例えば、グルタチオン）には結合し得る。本明細書に開示されるように、治療用タンパク質上のかかるシステインの還元は、例えば、水溶性ポリマーとシステイン上のスルフヒドリル基との、カップリングの効率を上昇させる。
【００４１】
別の実施形態では、治療用タンパク質は１つ以上のシステインを含有するが、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ有する（すなわち、治療用タンパク質のアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与しない、または、さもなければ、例えば、タンパク質折り畳みまたは二量体の形成等によって、埋没といったタンパク質−タンパク質内またはタンパク質−タンパク質間相互作用のためにアクセス可能ではない、１つだけのシステイン残基）。
【００４２】
様々な実施形態において、システイン残基は、添加または治療用タンパク質のアミノ酸配列から除去されてもよく、それにより、本開示による水溶性の複合化を可能にする。参照によりその全体が組み込まれる米国特許第５，７６６，８９７号は、一般的な産生「システイン−ＰＥＧ化タンパク質」を記載する。ポリペプチド変異体、類似体、および誘導体は以下で考察される。
【００４３】
本明細書に提供する治療用タンパク質は、排他的であると考えられるべきではない。むしろ、本明細書に提供する本開示から明らかなように、本開示の方法は、本開示に従う水溶性ポリマーの付着が所望されるいかなるタンパク質にも適用可能である。例えば、治療用タンパク質は、参照により全体が本明細書に援用される、米国特許第２００７／００２６４８５号に記載されている。
【００４４】
Ａ１ＰＩ
一実施形態において、Ａ１ＰＩは、本開示で提供される方法に従って、水溶性ポリマーに複合化される。Ａ１ＰＩ（α１−プロテイナーゼ阻害物質またはＡ１ＰＩまたはα１抗トリプシンまたはα１抗トリプシンまたはＡ１ＡＴ）は、ヒト血漿内に存在する３９４アミノ酸の５２ｋＤの糖タンパク質である（Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９８（５８７２）：３２９−３４（１９８２）、ユニプロットＫＢ／スイスプロット受託番号Ｐ０１００９）。ヒトα１抗トリプシンの構造および変異。１つの炭水化物鎖（Ｎ−グリカン）は、翻訳後修飾によって、３つのβ−アスパラギン残基それぞれに添加される（Ｂｒａｎｔｌｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，２７：６５２−６５４（２００２））。Ａ１ＰＩは、３つの非コードイントロンおよび４つのエクソンからなるヒト染色体１４ｑ３１〜３２．３上で、１２．２ｋｂ遺伝子によってコードされる。
【００４５】
２つのアミノ酸Ｍｅｔ３５８−Ｓｅｒ３５９は、タンパク質の活性中心である。Ａ１ＰＩは、概して肝細胞内に合成されるが、Ａ１ＰＩのタンパク質生合成はまた、腸細胞および肺の上皮細胞中の単核食細胞で起こり、血流中への放出がそれに続く（ＮＮ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６８：８１８−９００（２００３）、Ｔｒａｖｉｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５２：６５５−７０９（１９８３））。
【００４６】
Ａ１ＰＩは生体内の組織のあらゆる場所で検出され得るが、特に肺における生理学的意義を有する。広い肺の接触面および吸引された空気による、相当数の恒久的な細胞防御事象は、周囲の肺胞組織において高活性プロテアーゼの上昇した放出を引き起こす。プロテアーゼと阻害物質との間のバランスが、遺伝的に起こるＡ１ＰＩの過小発現またはタバコの煙といった有害物質によって偏ると、ＮＥが肺胞の細胞を破壊する可能性がある。これは、致死的な、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患／ＣＯＰＤ（Ｋｌｅｂｅ，ｇ．，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ，２ｎｄ  ｅｄ．，３５１−３６６（２００９））の形成を引き起こし得る。
【００４７】
それぞれ参照によりその全体が組み込まれる、国際公開第２００５／０２７８２１号および米国特許第５，９８１，７１５号、同第６，２８４，８７４号、および同第５，６１６，６９３号は、Ａ１ＰＩを精製するプロセスを開示する。米国特許第５，９８１，７１５号はまた、Ａ１ＰＩ補充またはＡ１ＰＩ増大治療を開示する。Ａ１ＰＩ欠乏は、多数の対立遺伝子変異型によって表される常染色体の劣性遺伝障害であり、プロテアーゼ阻害物質（Ｐｉ）系として示された対立遺伝子の配置に特徴付けられている。これらの対立遺伝子は、異なる個人の血清内で生じるα−１−ＰＩレベルに基づいて分類されている。正常な個人は、α−１−ＰＩの正常な血清レベルを有する（正常な個人はＰｉＭＭ表現型を有するとして示されている）。不足した個人は、平均正常レベルの３５％よりも低い血清α−１−ＰＩレベルを有する（これらの個人はＰｉＺＺ表現型を有するとして示されている）。欠損した個人は、それらの血清内に検出不能なＡ１ＰＩタンパク質を有する（これらの個人はＰｉ（ｎｕｌｌ）（ｎｕｌｌ）表現型を有するとして示されている）。
【００４８】
Ａ１ＰＩ欠乏は、低い血清（平均正常レベルの３５％よりも低い）およびＡ１ＰＩの肺レベルに特徴づけられる。これらの不足した個人は、汎細葉性肺気腫を発症する高い危険性を有する。この肺気腫は、ＰｉＺＺ、ＰｉＺ（ｎｕｌｌ）、およびＰｉ（ｎｕｌｌ）（ｎｕｌｌ）表現型を呈する個人において、圧倒的に多い。病気の症状は、３０歳から４０歳の罹患した個人において顕著である。
【００４９】
Ａ１ＰＩ欠乏に関連する肺気腫は、下気道における好中球エラスターゼを抑制するには不十分なＡ１ＰＩ濃度によって発症し、肺実質の結合組織の構造の破壊をもたらす。Ａ１ＰＩ欠乏の個人は、その下気道内の好中球によって放出される好中球エラスターゼに対しての防御をほとんど有さない。Ａ１ＰＩが不足した個人におけるこのプロテアーゼ対プロテアーゼ阻害物質の不均衡は、肺実質および肺胞壁への慢性障害、およびそれらの最終的な破壊を引き起こす。
【００５０】
深刻なＡ１ＰＩ欠乏の個人は、業界標準に決定されるように、通常５０ｍｇ／ｄｌよりも低い内在性血清Ａ１ＰＩレベルを呈する。それらの低血清Ａ１ＰＩレベルを有する個人は、８０％より高い、一生のうちに肺気腫を発症する危険性を有する。これは、米国の少なくとも４０，０００人の患者、または肺気腫を有する全患者の２％が、Ａ１ＰＩをコードする遺伝子における異常によって、この疾患を有すると推測される。Ａ１ＰＩの欠乏は、米国およびヨーロッパの白色人種の、最も一般的な致死性の遺伝性障害の１つを表す。
【００５１】
Ａ１ＰＩ欠乏の患者の治療は、血清内のＡ１ＰＩレベルの補充または増大に向けて行われる。Ａ１ＰＩの血清レベルが上昇すると、肺においてより高い濃度をもたらすことが予期され、これにより肺における好中球エラスターゼ対Ａ１ＰＩの不均衡を修正し、肺組織の破壊を阻止または減速させる。正常およびＡ１ＰＩ不足の集団の研究は、最小保護血清Ａ１ＰＩレベルが８０ｍｇ／ｄｌまたは１１μＭ（純粋標準を使用して、約５７ｍｇ／ｄｌ）であることを示唆する。したがって、Ａ１ＰＩ不足患者におけるほとんどの増大治療は、血清Ａ１ＰＩが肺胞Ａ１ＰＩの源であるため、Ａ１ＰＩの最小保護血清レベルの提供を目的とする。
【００５２】
Ａ１ＰＩ調製物は、１９８０年代中頃から治療用途に利用可能になった。主な用途は、先天性のＡ１ＰＩ欠乏に対する増大（補充）治療である。インビボでのヒトＡ１ＰＩの半減期は４．３８日で、標準偏差は１．２７日である。１週間に６０ｍｇＡ１ＰＩ／ｋｇ体重という現在推奨される用量は、Ａ１ＰＩの低血清レベルを１１μＭまたは８０ｍｇ／ｄｌの保護閾値レベルよりも上のレベルに回復する。
【００５３】
参照によりその全体が組み込まれる米国特許第４，４９６，６８９号は、Ａ１ＰＩに共有結合的に付着される水溶性ポリマーを開示する。追加の公開物は、水溶性ポリマーのＡ１ＰＩの単一のシステイン残基への複合化を開示する（Ｃａｎｔｉｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７：６５９−６６５（２００２）、Ｔｙａｇｉ，Ｓ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：５２７９−５２８５（１９９１））。
【００５４】
ＦＶＩＩ
一実施形態において、ＦＶＩＩは、本開示で提供される方法に従って、水溶性ポリマーに複合化される。ＦＶＩＩ（安定因子またはプロコンベルチンとしても公知である）は、止血および凝固で中枢的役割を有する、ビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００２；３：２８７−９９）。
【００５５】
ＦＶＩＩは肝臓で合成され、４８ｋＤの一本鎖糖タンパク質として分泌される。ＦＶＩＩは、全てのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質と類似するタンパク質ドメイン構造を共有し、これは、タンパク質と脂質膜の相互作用に関与する、９〜１２残基を有するアミノ末端γカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメイン、カルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン（触媒ドメイン）、および組織因子との相互作用を媒介する、カルシウムイオン結合部位を含有する２つの上皮成長因子様ドメインからなる。γグルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端部分内のＧｌａ残基のカルボキシル化を触媒する。このカルボキシラーゼは、その作用について還元型のビタミンＫに依存し、それはエポキシド型に酸化される。エポキシド型のビタミンＫを還元型に変換し戻すためには、ビタミンＫエポキシド還元酵素が必要とされる。
【００５６】
ＦＶＩＩの大部分は、酵素原の形態で血漿中を循環し、この形態の活性化は、アルギニン１５２とイソロイシン１５３との間のペプチド結合の切断をもたらす。その結果生じた活性ＦＶＩＩａは、単一ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１３５〜Ｃｙｓ２６２）を介して連結した、ＮＨ２由来の軽鎖（２０ｋＤ）およびＣＯＯＨ末端由来の重鎖（３０ｋＤ）からなる。軽鎖は膜結合Ｇｌａドメインを含有し、重鎖は触媒ドメインを含有する。
【００５７】
遺伝因子および環境因子によって決定されるＦＶＩＩの血漿濃度は、約０．５ｍｇ／ｍＬである（Ｐｉｎｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：３４２３−８）。ＦＶＩＩ遺伝子型が異なると、平均ＦＶＩＩレベルに数倍の差が生じる可能性がある。血漿ＦＶＩＩレベルは、健康女性の妊娠中に上昇し、また年齢とともに増加し、女性および高トリグリセリド血症患者ではより高い。ＦＶＩＩは、全ての凝固促進因子の中で最短の半減期（３〜６時間）を有する。健康な個人のＦＶＩＩａの平均血漿濃度は３．６ｎｇ／ｍＬであり、ＦＶＩＩａの循環半減期は、他の凝固因子と比較して比較的長い（２．５時間）。
【００５８】
遺伝性ＦＶＩＩ欠損症は稀な常染色体劣性出血性障害であり、有病率は一般集団において５００，０００人当たり１例と推定される（Ａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４；２２４８−５６）。阻害物質による後天的ＦＶＩＩ欠損症もまた、非常に稀である。セファロスポリン、ペニシリン、および経口抗凝固剤などの薬物に関連して発症する欠損症の例も報告されている。さらに、後天的ＦＶＩＩ欠損症は、自然に、または骨髄腫、敗血症、再生不良性貧血などの他の症状に付随して、インターロイキン−２および抗胸腺細胞グロブリン療法によって発症することが報告されている。
【００５９】
参照ＦＶＩＩポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、ゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２９３３、ｃＤＮＡのＭ１３２３２（Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ１９８６；８３：２４１２−６）、およびポリペプチド配列のＰ０８７０９（参照は、それらの全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。ＦＶＩＩの種々の多型性は、例えば、Ｓａｂａｔｅｒ−Ｌｌｅａｌら（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；１１８：７４１−５１を参照）（参照は、その全体が本明細書に組み込まれる）に説明されている。
【００６０】
第ＩＸ因子
ＦＩＸは、カルシウムイオン、リン脂質、およびＦＶＩＩＩａの存在下でＦＸをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因系経路に関与するビタミンＫ依存性血漿タンパク質である。ＦＩＸの主要な触媒能力は、セリンプロテアーゼとしての触媒能力であり、ＦＸ内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特異性を有する。ＦＸＩａによってＦＩＸの活性化が生じ、これはＦＩＸから活性化ペプチドを切除し、１つ以上のジスルフィド結合によって保持される２つの鎖を含む活性ＦＩＸ分子を産生する。ＦＩＸの欠損は、劣性Ｘ連鎖血友病Ｂの原因である。
【００６１】
血友病ＡおよびＢは、それぞれＦＶＩＩＩおよびＦＩＸポリペプチドの欠損を特徴とする遺伝性疾患である。この欠損の根本的な原因は、しばしばＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ遺伝子の突然変異の結果であり、これら双方はＸ染色体上に位置する。血友病に対する従来の療法は、健常者からのプール血漿または半精製された凝固タンパク質の静脈内投与を伴うことが多い。これらの製剤は、感染性プリオン、ＨＩＶ、パルボウイルス、Ａ型肝炎、およびＣ型肝炎などの病原体またはウイルスが混入する可能性がある。したがって、ヒト血清の使用を必要としない治療薬に対する緊急の必要性が存在する。
【００６２】
ＦＩＸ活性の減少レベルは、血友病Ｂの重症度に正比例する。血友病Ｂの現在の治療は、血漿由来または組換えＦＩＸ（ＦＩＸ置換または補充治療もしくは療法と称される）による、不足したタンパク質の補充からなる。
【００６３】
ＦＩＸのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、ユニプロットＫＢ／スイスプロット受託番号Ｐ００７４０、および米国特許第６，５３１，２９８号において見出すことができる。
【００６４】
第ＶＩＩＩ因子
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）に非共有結合する。止血中、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから分離し、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で活性化の速度を高めることによって、活性第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）媒介のＦＸ活性化のための補因子として機能する。
【００６５】
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する、約２７０〜３３０ｋＤの一本鎖前駆体として合成される。血漿から精製した場合（例えば、「血漿由来」または「血漿性」）、ＦＶＩＩＩは、重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成される。軽鎖の分子質量は、８０ｋＤであり、Ｂドメイン内のタンパク質分解により、重鎖は９０〜２２０ｋＤの範囲内である。
【００６６】
ＦＶＩＩＩはまた、出血性障害における治療用途のための組換えタンパク質として合成される。治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的有効性を判断するために、種々のインビトロアッセイが考案されている。これらのアッセイは、内在性ＦＶＩＩＩのインビボ効果を模倣する。ＦＶＩＩＩのインビトロトロンビン処理は、インビトロアッセイによって測定されるその凝固促進活性の迅速な増加およびその後の減少をもたらす。この活性化および不活性化は、重鎖および軽鎖の両方における特定の制限タンパク質分解と同時に起こり、これはＦＶＩＩＩ中の様々な結合エピトープの有用性を変更して、例えば、ＦＶＩＩＩをＶＷＦから解離させて、リン脂質表面に結合させるか、またはある特定のモノクローナル抗体に対する結合能力を変更する。
【００６７】
ＦＶＩＩＩの欠如および機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友病Ａと関連する。血友病Ａの管理に最適な治療は、血漿由来またはｒＦＶＩＩＩ濃縮物による補充療法である。ＦＶＩＩＩレベル１％未満の重度の血友病Ａ患者は、一般に、次の服用までのＦＶＩＩＩを１％超に維持することを目標とする予防療法を受ける。循環血中の種々のＦＶＩＩＩ製剤の平均半減期を考慮すると、通常はＦＶＩＩＩを週２〜３回投与することによって、この結果を達成することができる。
【００６８】
参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列には、例えば、ユニプロットＫＢ／スイスプロットＰ００４５１（ＦＡ８＿ＨＵＭＡＮ）、Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３２６−３０（１９８４）、Ｖｅｈａｒ  ＧＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２（５９９２）：３３７−４２（１９８４）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＡＲ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ，２００３：２９；１１−２９（２００２）がある。
【００６９】
フォンヴィレブランド因子
フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、サイズが約５００〜２０，０００ｋＤの範囲の一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体形態は、ジスルフィド結合によって連結した２５０ｋＤのポリペプチドサブユニットからなる。ＶＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への初期の血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を呈する。内皮細胞は大きいポリマー形態のＶＷＦを分泌し、低分子量を有するＶＷＦの形態（低分子量ＶＷＦ）はタンパク質分解的切断から生じると考えられている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体中に貯蔵され、刺激時に遊離する。
【００７０】
ＶＷＦは、大部分が繰り返しドメインからなるプレプロＶＷＦとして、内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの切断時に、プロＶＷＦは、そのＣ末端領域のジスルフィド連結によって二量体化する。この二量体は、多量体化のためのプロトマーとして機能し、これは遊離末端間のジスルフィド連結によって制御される。多量体へのアセンブリ後、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続く（Ｌｅｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４（１９９１），２５７−２６１）。
【００７１】
ＶＷＦのクローン化ｃＤＮＡから予測される一次翻訳産物は、２８１３残基の前駆体ポリペプチド（プレプロＶＷＦ）である。プレプロＶＷＦは、２２個のアミノ酸シグナルペプチドおよび７４１個のアミノ酸プロペプチドからなり、成熟ＶＷＦは２０５０個のアミノ酸を含む（Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｚ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｒｅ，Ｊ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，３０８−３１６（１９９３））。
【００７２】
ＶＷＦの欠損は、ある程度の顕著な出血性表現型を特徴とする、フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因である。３型ＶＷＤは、ＶＷＦが完全に欠損した最も重度な形態であり、１型ＶＷＤは、ＶＷＦの量的減少に関連し、その表現型は非常に軽度なこともある。２型ＶＷＤは、ＶＷＦの質的欠損に関連し、３型ＶＷＤと同じくらい重度のこともある。２型ＶＷＤには多くのサブ形態があり、高分子量多量体の損失または減少に関連するものもある。２ａ型フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ−２Ａ）は、中間体および大きい多量体の両方の損失を特徴とする。ＶＷＤ−２Ｂは、最も高分子量の多量体の損失を特徴とする。ＶＷＦに関連する他の疾患および障害は、当分野において既知である。
【００７３】
プレプロＶＷＦのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５５２およびＮＰ＿０００５４３で入手可能である。
【００７４】
本発明による他の血液凝固タンパク質は、当分野において、例えば、Ｍａｎｎ  ＫＧ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，１９９９；８２：１６５−７４に記載されている。
【００７５】
Ａ．ポリペプチド
一態様では、本開示の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。企図される治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質、完全長のタンパク質の前駆体、完全長のタンパク質の生物学的に活性なサブユニットまたは断片、ならびに治療用タンパク質のこれらの形態のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体および変異体を含む。したがって、治療用タンパク質は、（１）参照核酸によってコードされたポリペプチドまたは本明細書に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約２００個、約３００個、約４００個、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたり、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％を上回る、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの、および／または（２）本明細書に記載の参照アミノ酸配列、その免疫原性断片、および／またはその保存的に改変された変異体を含む免疫原に対して生じた抗体、例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に特異的に結合するものを含む。
【００７６】
本明細書で使用する「生物学的に活性な誘導体」、「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な類似体」、または「生物学的に活性な変異体」とは、結合特性および／またはペプチド骨格もしくは基本ポリマー単位といった同じ構造基盤といった、該分子の実質的に同じ機能および／または生物学的特性を有する分子の任意の誘導体または断片または類似体または変異体を含む。
【００７７】
「変異体」または「誘導体」といった「類似体」は、天然由来の分子と構造が実質的に同様であり、ある特定の例では、異なる程度ではあるが、同一の生物学的活性を有する化合物である。
【００７８】
例えば、「誘導体」は一種の類似体であり、例えば、化学的に修飾されている参照ポリペプチドと同一または実質的に同様の構造を共有するポリペプチドを指す。
【００７９】
例えば、ポリペプチド変異体は、一種の類似体であり、参照ポリペプチドと実質的に同様の構造を共有し、同じ生物学的活性を有するポリペプチドを指す（すなわち、「天然ポリペプチド」または「天然治療用タンパク質」）。変異体は、その変異体が由来する天然に存在するポリペプチドと比較して、（ｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域（例えば、断片）における１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端における１つ以上のアミノ酸の挿入または付加（典型的には「付加」または「融合」）および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域における１つ以上のアミノ酸の挿入または付加（典型的には「挿入」）、あるいは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列中の１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、を含む１つ以上の突然変異に基づき、アミノ酸配列の組成が異なる。
【００８０】
変異体ポリペプチドには、本開示の治療用タンパク質アミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基が付加された挿入変異体が含まれる。挿入は、タンパク質のいずれかまたは両方の末端に位置してもよく、および／または治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けてもよい。いずれかまたは両方の末端に付加残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質がある。一態様において、治療用タンパク質分子は、特にその分子が大腸菌といった細菌細胞で組換え発現される場合に、Ｎ−末端Ｍｅｔを任意に含有する。
【００８１】
欠失変異体では、本明細書に記載の治療用タンパク質ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、治療用タンパク質ポリペプチドの一方または両方の末端において、および／または治療用タンパク質アミノ酸配列内の１つ以上の残基の除去によって生じ得る。したがって、欠失変異体は、治療用タンパク質ポリペプチド配列の断片を含む。
【００８２】
置換変異体では、治療用タンパク質ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換される。一態様において、置換は本質的に保存的であり、この種の保存的置換は当分野で周知である。あるいは、本開示は非保存的である置換も包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５），ｐｐ．７１−７７］に記載されており、すぐ下記に示す。
2020059717.tif 000002
【００８３】
代替として、例示的な保存的置換をすぐ下記に示す。
2020059717.tif 000003
【００８４】
本明細書に記載のように、様々な実施形態において、治療用タンパク質は、水溶性ポリマー付着に対して適合性のある側鎖をもつシステイン、グリコシル化部位、または他のアミノ酸を導入または削除するように修飾される。かかる修飾は、当分野で既知の標準分子生物学的技術を用いて達成されてもよく、精製され、修飾されるタンパク質が所望の配列を含むように、組換えて（例えば、１つ以上のシステインを削除または挿入するようにアミノ酸配列を操作する）、達成されてもよい。代替として、かかる修飾は、タンパク質の産生および精製に続いて、インビトロで達成されてもよい。
【００８５】
Ｂ．ポリヌクレオチド
本開示の治療用タンパク質をコードする核酸には、例えば、遺伝子、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、多型変異体、対立遺伝子、合成変異体および天然に存在する変異体があるが、これらに限定されない。
【００８６】
また、本開示の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される参照アミノ酸配列、およびその保存的に改変された変異体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするもの、（２）本明細書に記載される参照核酸配列に対して、少なくとも約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約５００個、約１０００個、またはそれ以上のヌクレオチド（最大で、成熟タンパク質の全長配列である１２１８個のヌクレオチド）の領域にわたり、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を上回る、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するものも含まれるが、これらに限定されない。例示的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件には、４２℃、５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ（２０ｍＭ  Ｎａ・ＰＯ４、ｐＨ６．８）でのハイブリダイゼーション、および５５℃の１倍ＳＳＣで３０分間の洗浄が含まれる。ハイブリダイズする配列の長さおよびＧＣヌクレオチド含量に基づいて、これらの例示的な条件を変化させてもよいことが理解される。当分野で標準的な方法は、適切なハイブリダイゼーション条件の決定に適している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）§§９．４７−９．５１を参照されたい。
【００８７】
Ｃ．治療用タンパク質の作製
「天然に存在する」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、例えばヒトといった霊長類、例えばラット、マウス、ハムスターといった齧歯類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは任意の哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物に由来する。本開示の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば、異種であり、野生型配列もしくはその変異体をコードするもの、または非天然のもの）であってもよい。様々な実施形態において、天然に存在する治療用タンパク質は、ヒトから得られた血液または血漿試料から精製される。
【００８８】
治療用タンパク質の作製には、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの作製、（ｉｉ）例えば、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる、原核細胞および真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）該形質転換細胞の培養、（ｉｖ）治療用タンパク質の例えば構成的な、または誘導時の発現、および（ｖ）例えば培養培地からの、または形質転換細胞の採取による、精製された治療用タンパク質を得るための該血液凝固タンパク質の単離、のための当分野で既知のあらゆる方法を含む。
【００８９】
別の態様では、治療用タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を生成することを特徴とする好適な原核または真核宿主系での発現によって生成される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２などの哺乳動物細胞である。
【００９０】
多種多様なベクターが治療用タンパク質の調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現用のベクターの例には、限定するものではないが、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＢＡＤなどのプラスミドが挙げられ、原核発現ベクターに使用されるプロモーターには、限定するものではないが、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤのうちの１つ以上が挙げられる。真核発現用のベクターの例には、（ｉ）酵母での発現の場合、限定するものではないがＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用した、限定するものではないがｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞での発現の場合、限定するものではないがＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用した、限定するものではないがｐＭＴ、ＰＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現の場合、限定するものではないがＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチンなどのプロモーターを使用した、限定するものではないがｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および一態様では、限定するものではないがワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクター、が含まれる。
【００９１】
Ｄ．投与
一実施形態において、本開示の治療用複合タンパク質は、静脈注射、筋肉注射、または腹腔内注射などの注射によって投与してもよい。
【００９２】
本開示の治療用複合タンパク質を含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様において、この組成物は１つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に許容可能な」という用語は、下記に記載のように当分野で周知の経路を用いて投与したときに、安定であり、凝集および切断産物などのタンパク質分解を抑制し、さらにアレルギー性または他の有害反応を生成しない、分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容可能な担体」には、上記で開示した物質を含む、あらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。
【００９３】
本明細書で使用する際、「有効量」とは、疾患もしくは障害を治療する、または疾患もしくは障害の症状を改善するのに好適な用量を含む。一実施形態において、「有効量」は、本明細書に記載されるＡ１ＰＩ欠乏をもたらす常染色体劣性障害を有する哺乳動物を治療するのに好適な用量を含む。一実施形態において、「有効量」は、本明細書に記載される出血性障害を有する哺乳動物を治療するのに好適な用量を含む。本明細書で使用される際、「有効量」はまた、本明細書に記載される出血性障害を有する哺乳動物を治療するのに好適な用量を含む。
【００９４】
組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧によって、経膣的に、直腸に、または頭蓋内注射によって投与してもよい。本明細書において使用する非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射または注入手法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、球後、肺内注射による投与、および／または特定の部位における外科的移植も想定されている。一般に、組成物は、発熱因子、およびレシピエントに害を与え得る他の不純物を本質的に含まない。
【００９５】
組成物の単回または複数回投与は、治療する医師によって選択された用量レベルおよびパターンで実施することができる。疾患の予防または治療のための適切な投薬量は、上述のような治療する疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物の投与が予防目的なのか治療目的なのか、治療歴、患者の病歴および薬物に対する反応、ならびに担当医の裁量により異なることになる。
【００９６】
また、本開示は、有効量の本明細書に記載される治療用複合タンパク質を含む薬学的組成物にも関する。この薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、塩、緩衝剤、または賦形剤をさらに含んでもよい。この薬学的組成物は、上記で定義した出血性障害の治療に使用することができる。本開示の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥剤であってもよい。薬学的組成物の溶液に、任意の好適な凍結乾燥プロセスを行ってもよい。
【００９７】
さらなる態様として、本開示は、本開示の組成物であって、対象への投与のためのその使用を容易にするような形でパッケージ化された組成物を含むキットを含む。一実施形態において、かかるキットは、密封ボトルまたは容器などの包装容器に詰められた、本明細書に記載の化合物または組成物（例えば、治療用複合タンパク質を含む組成物）を含み、本方法を実施する際のその化合物または組成物の使用について説明したラベルが包装容器に貼られるか、またはパッケージ内に含まれる。一実施形態において、キットは、治療用複合タンパク質を含む組成物を有する第１の包装容器と、第１の包装容器中の組成物用の生理学的に許容可能な再構成液を有する第２の包装容器とを含有する。一態様において、化合物または組成物は、単位剤形でパッケージ化される。キットは、特定の投与経路による組成物の投与に好適な装置をさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の使用を説明したラベルを含有する。
【００９８】
水溶性ポリマー
本開示の一実施形態において、治療用タンパク質複合体分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体が挙げられるが、これらに限定されない水溶性ポリマーに結合される。
【００９９】
本開示の様々な実施形態に従って、水溶性ポリマーは、官能性リンカーまたは特定および所望の末端基化学構造を付着することによって、かかる水溶性ポリマー誘導体が、部位特異的に治療用タンパク質（かかる末端基化学構造に適合性のある少なくとも１つのアクセス可能な部位を有する）に付着することを可能にするように、修飾または誘導体化されてもよい。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧマレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ）、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、ＰＥＧエポキシド、酸化ＰＳＡ、アミノオキシ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧオルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、ＰＥＧヨードアセトアミド（ｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＰＥＧベンゾトリアゾール、ＰＳＡ−ＳＨ、ＭＡＬ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド、ＰＳＡヒドラジン、およびＰＳＡ−ＮＨ２といった水溶性ポリマー機能的誘導体が、本開示によって企図される。
【０１００】
本開示の一実施形態において、水溶性ポリマーは、３５０〜１５０，０００、５００〜１００，０００、１０００〜８０，０００、１５００〜６０，０００、２，０００〜４５，０００Ｄａ、３，０００〜３５，０００Ｄａ、および５，０００〜２５，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。様々な実施形態において、水溶性ポリマーは、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、または８０，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧまたはＰＳＡである。一実施形態において、水溶性ポリマーは、２０，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧまたはＰＳＡである。
【０１０１】
一実施形態において、治療用タンパク質誘導体は、天然の治療用タンパク質生成物の完全な機能活性を保持し、天然の治療用タンパク質生成物と比較して、延長したインビボ半減期を提供する。本開示の別の実施形態では、構築物の半減期は、天然の治療用タンパク質のインビボ半減期と比べて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍減少または増大する。
【０１０２】
別の実施形態では、治療用タンパク質誘導体は、天然の血液凝固タンパク質と比べて、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０パーセント（％）の生物学的活性を保持する。
【０１０３】
一実施形態において、例えば、複合化Ａ１ＰＩタンパク質および天然のＡ１ＰＩタンパク質の生物学的活性は、好中球エラスターゼ阻害能力アッセイ（Ｔｒａｖｉｓ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ（１９８１）：Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ８０，７５４−７６４）によって、決定される。
【０１０４】
一実施形態において、誘導体および天然の血液凝固タンパク質（例えば、ＦＶＩＩ）の生物学的活性は、血液凝固因子抗原値に対する色原体活性の比（血液凝固因子：Ｃｈｒ：血液凝固因子：Ａｇ）によって決定される。
【０１０５】
Ａ．シアル酸およびＰＳＡ
ＰＳＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマー（通常、ホモポリマー）からなる。二級アミノ基は、一般に、アセチル基を保有するが、その代わりにグリコシル基を保有してもよい。ヒドロキシル基における可能な置換基としては、アセチル基、ラクチル基、エチル基、硫酸基、およびリン酸基が挙げられる。
【化１】
2020059717.tif 000004
【０１０６】
ＰＳＡおよび修飾ＰＳＡ（ｍＰＳＡ）は、一般的には、２，８−または２，９−グリコシド連結、あるいはこれらの組み合わせ（例えば、２，８−および２，９−で交互に連結したもの）によって連結されたＮ−アセチルノイラミン酸部分から本質的になる直鎖状ポリマーを含む。特に好ましいＰＳＡおよびｍＰＳＡでは、グリコシド連結はα−２，８である。かかるＰＳＡおよびｍＰＳＡは、好都合には、コロミン酸に由来し、本明細書中では「ＣＡ」および「ｍＣＡ」と称される。典型的なＰＳＡおよびｍＰＳＡは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、および最も好ましくは少なくとも２０個のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、それらは、２〜３００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは５〜２００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは１０〜１００個のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含み得る。ＰＳＡおよびＣＡは、好ましくは、Ｎ−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。したがって、ＰＳＡおよびＣＡは、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。
【０１０７】
ＰＳＡおよびＣＡがＮ−アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合（例えば、ｍＰＳＡＳおよびｍＣＡ等の場合）、これらは、好ましくは、ポリマー鎖の一端または両端に位置している。例えば、そのような「他の」部分は、酸化または還元により末端Ｎ−アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分であり得る。
【０１０８】
例えば、国際公開第２００１／０８７９２２号には、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって、非還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位がアルデヒド基に変換された、かかるｍＰＳＡおよびｍＣＡが記載されている。さらに、国際公開第２００５／０１６９７４号には、還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が還元に供され、この還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位で還元的に開環し、それによって隣接ジオール基が形成され、続いて、酸化され、隣接ジオール基をアルデヒド基に変換したｍＰＳＡおよびｍＣＡが記載されている。
【０１０９】
異なるＰＳＡ誘導体は、非還元末端で単一のアルデヒド基を含有する酸化ＰＳＡから調製することができる。アミノオキシＰＳＡの調製物が、実施例５で以下に記載され、ＰＳＡマレイミドの調製物が、実施例１４で以下に記載される。末端アミノ基を含有するＰＳＡ−ＮＨ２は、ＰＳＡ−ＮＨ２と２−イミノチオラン（トラウト試薬）の反応による末端スルフヒドリル基を含有するＮＨ４ＣｌおよびＰＳＡ−ＳＨでの還元アミノ化によって、調製することができ、両方の手順が米国特許第７，６４５，８６０  Ｂ２号に記載される。ＰＳＡヒドラジンは、米国特許第７，８７５，７０８  Ｂ２号に従って、酸化ＰＳＡとヒドラジンの反応によって、調製することができる。ＰＳＡヒドラジドは、酸化ＰＳＡとアジピン酸ジヒドラジドの反応（国際公開第２０１１／０１２８５０  Ａ２号）によって、調製することができる。
【化２】
2020059717.tif 000005
【０１１０】
コロミン酸（ＰＳＡの部分集合）は、α（２→８）ケトシド連結によるＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）のホモポリマーであり、とりわけ、Ｋ１抗原を有する大腸菌の特定の株によって産生される。コロミン酸は、多くの生理学的機能を有する。それらは、薬物および化粧品の原材料として重要である。
【０１１１】
ポリシアル化および非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １３４１：２６−３４，１９９７）。
【０１１２】
本明細書で使用される際、「シアル酸部分」は、水性溶液または懸濁液中で可溶性であり、薬学的に有効量のＰＳＡ−血液凝固タンパク質複合体の投与時に、哺乳動物への副作用等の悪影響がわずか、または全くない、シアル酸モノマーまたはポリマー（「多糖類」）を含む。一態様では、ポリマーは、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００個のシアル酸単位を有することを特徴とする。ある特定の態様では、異なるシアル酸単位が鎖に組み込まれる。
【０１１３】
本開示の一実施形態において、多糖化合物のシアル酸部分は、非常に親水性であり、別の実施形態において、全化合物は、非常に親水性である。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、ならびにヒドロキシル基によって与えられる。糖類単位は、アミン基、ヒドロキシル基、または硫酸基等の他の官能基、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。これらの基は、天然の糖類化合物上に存在してもよいか、または誘導体多糖類化合物中に導入されてもよい。
【０１１４】
天然由来のポリマーＰＳＡは、広域な大きさの分布（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃ−５７６２）、および高い多分散性（ＰＤ）を示す、多分散調製物として利用可能である。多糖類は、通常、共精製する内毒素の特有のリスクを持つ細菌内で産生されるため、長いシアル酸ポリマー鎖の精製は、内毒素含有量の増大の可能性を上げる場合がある。１〜４個のシアル酸単位を有する短いＰＳＡ分子はまた、合成的に調製することができ（Ｋａｎｇ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２２７−８、Ｒｅｓｓ  ＤＫ  ａｎｄ  Ｌｉｎｈａｒｄｔ  ＲＪ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．２００４；１：３１−４６）、したがって、高い内毒素レベルのリスクを最小限化させる。しかしながら、ここで、内毒素もない、狭い大きさの分布および低い多分散性を有するＰＳＡ調製物を製造することができる。一態様では、本開示のための特定の使用の多糖類化合物は、細菌によって産生された多糖類化合物である。これらの天然の多糖類のうちのいくつかは、糖脂質として知られている。一実施形態において、多糖類化合物には、末端ガラクトース単位を実質的に含まない。
【０１１５】
Ｂ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧ化
ある特定の態様では、治療用タンパク質は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに複合化される（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ  ２００２；５４：４５９−７６）。例えば、一実施形態において、治療用タンパク質は、ＰＥＧの複合化によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態において、水溶性ポリマー、例えば、ＰＥＧは、マレイミド化学、または前酸化後に、治療用タンパク質の炭水化物部分へのＰＥＧヒドラジドもしくはＰＥＧアミンのカップリングを使用して、遊離ＳＨ基にカップリングされる。
【０１１６】
一態様では、複合化は、水溶性ポリマーの直接カップリング（またはリンカー系を介するカップリング）によって、安定結合の形成下で、治療用タンパク質に対して実行される。さらに、分解性、放出性または加水分解性リンカー系が本開示のある特定の態様に使用される（Ｔｓｕｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９：３８１１８−２４／Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９９；４２：３６５７−６７／Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ２００６；１７：３４１−５１／国際公開第２００６／１３８５７２Ａ２号／米国特許第７２５９２２４Ｂ２号／米国特許第７０６０２５９Ｂ２号）。
【０１１７】
本開示の様々な実施形態において、治療用タンパク質は、コハク酸スクシンイミジル、グルタル酸スクシンイミジル、またはプロピオン酸スクシンイミジル等の活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含有するポリエチレングリコール誘導体の使用によって、リシン残基を介して修飾される。これらの誘導体は、安定アミド結合を形成することによって、温和な条件下で、治療用タンパク質のリシン残基と反応する。加えて、リシン残基は、二級アミン結合を形成するＮａＣＮＢＨ３の存在下で、ＰＥＧアルデヒドでの還元アミノ化によって、修飾されることができる。炭水化物残基（大部分はＮ−グリカン）は、前酸化後に、アミノオキシＰＥＧまたはＰＥＧヒドラジドによって、修飾されることができる。タンパク質中の遊離ＳＨ基は、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧオルトピリジル−ジスルフィド、およびＰＥＧヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）と反応することができる。ＰＥＧ化学の概要を、Ｒｏｂｅｒｔｓら（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ２００２；５４：４５９−７６）が挙げる。
【０１１８】
本開示の様々な実施形態において、ＰＥＧ誘導体の鎖長は、５，０００Ｄａである。直鎖および分岐構造を含む、５００〜２，０００Ｄａ、２，０００〜５，０００Ｄａ、５，０００以上〜最大１０，０００Ｄａ、または１０，０００以上〜最大２０，０００Ｄａ、または２０，０００以上〜最大１５０，０００Ｄａの鎖長を有する他のＰＥＧ誘導体が、種々の実施形態に使用される。本開示の一実施形態において、ＰＥＧ誘導体の鎖長は、２０，０００Ｄａである。
【０１１９】
アミノ基のＰＥＧ化のための代替の方法としては、ウレタン結合を形成することによるＰＥＧカルボン酸との化学的複合化、または二級アミド結合を形成する還元アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本開示の様々な実施形態において、治療用タンパク質分子は、市販されるＰＥＧ誘導体を使用して化学修飾される。代替的態様におけるこれらのＰＥＧ誘導体は、直鎖または分岐構造を有する。ＮＨＳ基を含有するＰＥＧ誘導体の例が、下に列挙される。
【０１２１】
以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．、ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ試薬カタログ、Ｎｅｋｔａｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、価格表２００５〜２００６を参照）から市販されるＰＥＧ誘導体の非制限的な例である：
ｍＰＥＧ−プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）
【化３】
2020059717.tif 000006
【０１２２】
ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノアート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）
【化４】
2020059717.tif 000007
【０１２３】
ｍＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ（ＣＭ＝カルボキシメチル、ＨＢＡ＝ヒドロキシ酪酸）
【化５】
2020059717.tif 000008
【０１２４】
分岐ＰＥＧ誘導体（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の構造：
分岐ＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）
【化６】
2020059717.tif 000009
【０１２５】
分岐構造を有するこの試薬は、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら（ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２００１；５：４１９−２９）によって、より詳細に記載されている。
【０１２６】
ＰＥＧ誘導体の他の非制限的例は、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ、ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ：カタログ２００５を参照）から市販されている。
【０１２７】
直鎖ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．）の一般構造：
【化７】
2020059717.tif 000010
【０１２８】
Ｘ＝カルボキシメチル
【化８】
2020059717.tif 000011
【０１２９】
Ｘ＝カルボキシペンチル
【化９】
2020059717.tif 000012
【０１３０】
ｘ＝コハク酸
【化１０】
2020059717.tif 000013
【０１３１】
ｘ＝グルタル酸
【化１１】
2020059717.tif 000014
【０１３２】
分岐ＰＥＧ誘導体（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．）の構造：２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン（ｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ）プロパン
【化１２】
2020059717.tif 000015
【０１３３】
２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（スクシンイミジルカルボキシペンチルオキシ）プロパン
【化１３】
2020059717.tif 000016
【０１３４】
これらのプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール主鎖を示す。本開示では、１，３置換を有するグリセロール構造、または米国特許第２００３／０１４３５９６Ａ１号に説明される他の分岐構造に基づく分岐ＰＥＧ誘導体もまた、企図される。
【０１３５】
Ｔｓｕｂｅｒｙら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４；２７９：３８１１８−２４）およびＳｈｅｃｈｔｅｒら（国際公開第０４０８９２８０Ａ３号）によって説明される、分解性（例えば、加水分解性リンカー）を有するＰＥＧ誘導体もまた、企図される。
【０１３６】
Ｃ．ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）  本開示の様々な実施形態において、治療用タンパク質分子は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）またはそれらの誘導体を使用して化学修飾される。
【０１３７】
ＨＥＳは、天然由来のアミロペクチンの誘導体であり、体内でα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に最大９５重量％の濃度で存在する。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を呈し、血液量補充剤として診療所の血液希釈治療で使用される（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８、およびＷｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８）。
【０１３８】
アミロペクチンは、主鎖内にα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐鎖部位においてα−１，６−グリコシド結合が見出される、グルコース部分からなる。この分子の物理化学的特性は、主に、グリコシド結合の型によって決定される。ニックが入った（ｎｉｃｋｅｄ）α−１，４−グリコシド結合のために、１回転当たり約６つのグリコースモノマーを有するらせん構造が産生される。ポリマーの物理化学的特性ならびに生化学的特性は、置換により改変し得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化により達成することができる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコースモノマーにおけるそれぞれのヒドロキシ基の異なる反応性を活用することが可能である。この事実により、当業者は限定的に置換パターンに影響を及ぼすことができる。
【０１３９】
ＨＡＳは、少なくとも１つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体を指す。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンという用語は、末端炭水化物成分がヒドロキシアルキル基Ｒ１、Ｒ２、および／またはＲ３を含む化合物に限定されず、少なくとも１つのヒドロキシ基がどこかに存在し、末端炭水化物成分および／またはデンプン分子の残りの部分のいずれかにて、ＨＡＳ’がヒドロキシアルキル基Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３で置換されている化合物も指す。
【化１４】
2020059717.tif 000017
【０１４０】
アルキル基は、直鎖または分岐鎖アルキル基であってもよく、これは好適に置換されてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、１〜１０個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子、なおより好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましい。
【０１４１】
２つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた、本開示に含まれる。ＨＡＳに含まれる少なくとも１つのヒドロキシアルキル基は、２つ以上のヒドロキシ基を含有してもよい。一実施形態によれば、少なくとも１つのヒドロキシアルキル基から成るＨＡＳは、１つのヒドロキシ基を含有する。
【０１４２】
ＨＡＳという用語はまた、アルキル基がモノ置換または多置換である誘導体も含む。一実施形態において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素、またはアリール基で置換されていることが好ましいが、但し、ＨＡＳは水溶性のままであるものとする。さらに、ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化されてもよい。ＨＡＳ誘導体は、国際公開第２００４／０２４７７６号に説明されており、これは参照によってその全体が組み込まれる。
【０１４３】
Ｄ．付着方法
治療用タンパク質は、当業者に既知の種々の技術のいずれかによって、多糖類化合物に共有連結され得る。
【０１４４】
水溶性ポリマーのカップリングは、タンパク質への直接カップリングによって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物−選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、ＭＢＰＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド）である（Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２；２６７：１５９１６−２２）。他の例示的および好ましいリンカーは、以下に記載される。
【０１４５】
本発明の様々な態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第４，３５６，１７０号に説明される方法（参照により、本明細書に組み込まれる）によって、治療用タンパク質、例えば、アルブミン、Ａ１ＰＩ、ＦＶＩＩａ、またはセルピンもしくは血液凝固因子タンパク質ファミリーの他のメンバーに結合される。
【０１４６】
ＰＳＡをポリペプチドにカップリングするための他の技術もまた、既知であり、本開示によって企図される。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８２０９６号は、例えば、ＰＳＡのアミンまたはヒドラジド誘導体をタンパク質に複合化させることを説明する。加えて、米国特許出願公開第２００７／０１９１５９７号は、還元末端において基質（例えば、タンパク質）との反応のためのアルデヒド基を含有するＰＳＡ誘導体を説明する。これらの参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
加えて、様々な方法が米国特許第５，８４６，９５１号（参照によりその全体が組み込まれる）の７列、１５行〜８列、５行に開示される。例示的な技術は、血液凝固タンパク質もしくは多糖類のうちのいずれかの上のカルボキシル基と、血液凝固タンパク質もしくは多糖類のアミン基との間のペプチド結合、または血液凝固タンパク質もしくは多糖類のカルボキシル基と、治療用タンパク質もしくは多糖類のヒドロキシル基との間のエステル連結を介する連結を含む。治療用タンパク質が多糖類化合物に共有結合される、別の連結は、過ヨウ素酸塩酸化によって多糖類の非還元末端において形成されたアルデヒド基と反応させられる血液凝固タンパク質上の遊離アミノ基の間のシッフ塩基を介する（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ＨＪ  ａｎｄ  Ｌｕｇｏｗｓｋｉ  Ｃ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８１；１２７：１０１１−８、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＡＩ  ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７；１３４１；２６−３４）。一態様では、生成されたシッフ塩基は、ＮａＣＮＢＨ３での特異的還元によって安定化され、二級アミンを形成する。代替のアプローチは、前酸化後のＮＨ４Ｃｌでの還元アミノ化によるＰＳＡ内の末端遊離アミノ基の生成である。二官能性試薬を、２つのアミノ基または２つのヒドロキシル基を連結するために使用することができる。例えば、アミノ基を含有するＰＳＡが、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩／Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）等の試薬で、タンパク質のアミノ基にカップリングされる。加えて、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル／Ｐｉｅｒｃｅ）等のヘテロ二官能性架橋連結試薬を使用して、例えば、アミン基およびチオール基を連結する。
【０１４８】
別のアプローチでは、ＰＳＡヒドラジドが、前酸化、およびアルデヒド官能基の生成の後に調製され、タンパク質の炭水化物部分にカップリングされる。
【０１４９】
上述の通り、治療用タンパク質の遊離アミン基は、シアル酸残基の１−カルボキシル基と反応してペプチジル結合を形成するか、またはエステル連結が１−カルボン酸基と血液凝固タンパク質上のヒドロキシル基または他の好適な活性基との間に形成される。代替として、カルボキシル基は、脱アセチル化５−アミノ基とのペプチド連結を形成するか、または治療用タンパク質の分子のアルデヒド基は、シアル酸残基のＮ−脱アセチル化５−アミノ基を有するシッフ塩基を形成する。
【０１５０】
上記説明は、反応基がＰＥＧおよびＰＳＡで同じである場合、ＰＥＧに適用されてもよい。  
代替として、水溶性ポリマーは、非共有様式で治療用タンパク質と会合する。例えば、一態様では、水溶性ポリマーおよび薬学的に活性な化合物は、疎水性相互作用を介して連結される。他の非共有会合は、相互に求引する逆帯電されたイオンでの静電相互作用を含む。
【０１５１】
様々な実施形態において、治療用タンパク質は、化学量論量（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：７、１：８、１：９、または１：１０等）の水溶性ポリマーに連結、または会合される。様々な実施形態において、１〜６、７〜１２、または１３〜２０の水溶性ポリマーが治療用タンパク質に連結される。さらに他の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の水溶性ポリマーが治療用タンパク質に連結される。一実施形態において、単一の水溶性ポリマーが治療用タンパク質に連結される。別の実施形態では、単一の水溶性ポリマーが、システイン残基を介して治療用タンパク質に連結される。
【０１５２】
その上、治療用タンパク質は、１つ以上の炭水化物部分を介する水溶性ポリマーへの複合化の前に、インビボまたはインビトロでグリコシル化されてもよい。これらのグリコシル化部位は、タンパク質の水溶性ポリマーとの複合化のための標的として機能することができる（米国特許出願第２００９００２８８２２号、米国特許出願第２００９／００９３３９９号、米国特許出願第２００９／００８１１８８号、米国特許出願第２００７／０２５４８３６号、米国特許出願第２００６／０１１１２７９およびＤｅＦｒｅｅｓ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１６，９，８３３−４３）。
【０１５３】
Ｅ．アミノオキシ連結
一実施形態において、オキシム基を形成する、ヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体のアルデヒド（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後の炭水化物部分上のもの）との反応が、血液凝固タンパク質の複合体の調製に適用される。例えば、糖タンパク質（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されることが可能な、本発明に従う治療用タンパク質）をまず過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）などの酸化剤で酸化する（Ｒｏｔｈｆｕｓ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  ＥＬ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９６３，２３８，１４０２−１０、およびＶａｎ  Ｌｅｎｔｅｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｅｌｌ  Ｇ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９７１，２４６，１８８９−９４）。糖タンパク質の過ヨウ素酸塩酸化は、隣接ジオールを過ヨウ素酸で酸化して活性アルデヒド基を形成する、１９２８年に記載された古典的なマラプラード反応に基づく（Ｍａｌａｐｒａｄｅ  Ｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌ  Ｓｏｃ  Ｃｈｉｍ  Ｆｒａｎｃｅ，１９２８，４３，６８３−９６）。かかる酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、酢酸マンガン（ＭｎＯ（Ａｃ）３）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＯＡｃ）２）、酢酸タリウム（ＴｌＯＡｃ）、硫酸セリウム（Ｃｅ（ＳＯ４）２）（米国特許第４，３６７，３０９号）、または過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）（Ｍａｒｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９９７，１１９，１２６６１−２）である。「酸化剤」とは、炭水化物中の隣接ジオールを酸化し、それによって生理学的反応条件下で、活性アルデヒド基を生成することが可能な穏やかな酸化の化合物を意味する。
【０１５４】
第２のステップは、オキシム連結を形成するための、アミノオキシ基を含有するポリマーと酸化炭水化物部分とのカップリングである。本開示の様々な実施形態において、このステップは、触媒量の求核触媒アニリンまたはアニリン誘導体の存在下で実施してもよい（Ｄｉｒｋｓｅｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｄａｗｓｏｎ  ＰＥ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８、Ｚｅｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：２０７−９）。アニリン触媒は、オキシム結合を劇的に加速し、非常に低濃度の試薬の使用を可能にする。本開示の別の実施形態において、オキシム連結は、ＮａＣＮＢＨ３による還元によって安定化され、アルコキシアミン連結を形成する（図１）。さらなる触媒を下記に記載する。
【０１５５】
様々な実施形態において、水溶性リンカーを治療用タンパク質に複合化させる反応ステップは別個に逐次実施される（すなわち、出発物質（例えば、治療用タンパク質、水溶性ポリマー等）、試薬（例えば、酸化剤、アニリン等）、および反応生成物（例えば、治療用タンパク質上の酸化炭水化物、活性化アミノオキシ水溶性ポリマー等）が、個々の反応ステップ間で別々である）。別の実施形態では、本開示に従って複合化反応を完了するために必要な出発物質および試薬（例えば、治療用タンパク質、水溶性ポリマー、チオール還元剤、酸化剤等）は、単一の容器中で実施される（すなわち、「並発反応」）。一実施形態では、天然治療用タンパク質をアミノオキシ−ポリマー試薬と混合する。その後、酸化試薬を添加し、複合化反応を実施する。
【０１５６】
アミノオキシ技術に関するさらなる情報は、以下の参考文献に記載され、これらはそれぞれ全体が本明細書に援用される：欧州特許第１６８１３０３Ａ１号（ヒドロキシアルキルデンプン化エリスロポエチン）、国際公開第２００５／０１４０２４号（オキシム結合基により連結したポリマーとタンパク質の複合体）、国際公開第９６／４０６６２号（アミノオキシ含有リンカー化合物および複合体におけるそれらの用途）、国際公開第２００８／０２５８５６号（改変タンパク質）、Ｐｅｒｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８，５４，１２２６９−７８、Ｋｕｂｌｅｒ−Ｋｉｅｌｂ  Ｊ  ａｎｄ  Ｐｏｚｓｇａｙ  Ｖ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０，６８８７−９０、Ｌｅｅｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６，２４（６），７１６−２９、およびＨｅｒｅｄｉａ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００７，４０（１４），４７７２−９。
【０１５７】
様々な実施形態において、本明細書に記載のアミノオキシ技術に従って治療用タンパク質（例えば、Ａ１ＰＩ、ＦＶＩＩａ、または血液凝固因子タンパク質ファミリーもしくはセルピンの他のメンバー）の酸化炭水化物部分に連結される水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）  ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
求核触媒
様々な実施形態において、治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化は、アニリンまたはアニリン誘導体によって触媒され得る。アニリンは、アルデヒドおよびケトンのアミンとの水性反応を強く触媒して、安定なイミン、例えばヒドラゾンおよびオキシムを形成する。以下の略図は、無触媒反応とアニリン触媒オキシムライゲーション反応を比較する（Ｋｏｈｌｅｒ  ＪＪ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９；１０：２１４７−５０）：
【化１５】
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【０１５９】
アニリン触媒は、オキシムライゲーションを加速させ、短い反応時間および低い濃度のアミノオキシ試薬の使用を可能にするが、アニリンは、例えば、複合化治療用タンパク質が、薬剤の基礎を形成する際には、考慮しなければならない有毒性を有する。例えば、アニリンは、メトヘモグロビン血症を誘発することが示されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．．，ａｎｄ  Ｊｏｌｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３２（３）４２３−４３１，１９８７）。ラットの長期間の食餌療法は、脾臓中に腫瘍を誘発することが示されている（Ｇｏｏｄｍａｎ，ＤＧ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，７３（１）：２６５−７３，１９８４）。インビトロ研究はまた、アニリンが、染色体突然変異を誘発する可能性があり、遺伝毒性作用を起こす可能性があることも示している（Ｂｏｍｂｈａｒｄ  Ｅ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｅｒｂｏｌｄ  Ｂ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ３５，７８３−８３５，２００５）。
【０１６０】
様々な実施形態において、代替的オキシムライゲーション触媒としてのアニリン誘導体が提供される。かかるアニリン誘導体には、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンザミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、およびｐ−アニシジンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
様々な実施形態において、ｍ−トルイジン（別名メタ−トルイジン、ｍ−メチルアニリン、３−メチルアニリン、または３−アミノ−１−メチルベンゼン）を使用して、本明細書に記載の複合化反応を触媒する。Ｍ−トルイジンおよびアニリンは、類似する物理的特性および本質的に同じｐＫａ値（ｍ−トルイジン：ｐＫａ４．７３、アニリン：ｐＫａ４．６３）を有する。
【０１６２】
本開示の求核触媒は、オキシムライゲーション（例えば、アミノオキシ連結を使用）またはヒドラゾン形成（例えば、ヒドラジド化学を使用）に有用である。本開示の様々な実施形態において、複合化反応に求核触媒が、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、６．５ｍＭ、７．０ｍＭ、７．５ｍＭ、８．０ｍＭ、８．５ｍＭ、９．０ｍＭ、９．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭの濃度で提供される。様々な実施形態において、求核触媒は、１〜１０ｍＭで提供される。本開示の様々な実施形態において、複合化反応のｐＨ範囲は、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、および７．５である。一実施形態において、このｐＨは５．５〜６．５である。
【０１６３】
還元性物質
本発明の様々な実施形態において、穏やかな還元のステップを使用して、治療用タンパク質のアクセス可能なシステイン残基が還元され、それにより、スルフヒドリル特異的基を有する水溶性ポリマーの治療用タンパク質への複合化を可能にする。本明細書に開示されるように、還元性物質または「チオール還元剤」には、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、およびシステインヒドロクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
様々な実施形態において、マレイミド基（ＭＡＬ）は、システインのチオール（ＳＨ）基への複合化に使用される。この種の修飾の一基本要件は、アクセス可能な還元システインである。しかし、システイン側鎖は通常、ジスルフィド結合の形態で酸化状態で存在するため、好適な還元剤を用いた還元は、複合化の前に実施される。
【０１６５】
本開示に従って、還元剤は、タンパク質の天然型の活性または展開を失う可能性を防ぐように、必要最低限の濃度で使用される（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１９：７８６−７９１（２００８））。別の実施形態では、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、還元供給に添加する。これは、還元ＳＨ基の再酸化率を低く保つことを補助する（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇ．，１６：７６１−７７０（２００３））。
【０１６６】
ＤＴＴおよびＢＭＥは最も普及した還元性物質であるが、本明細書に開示されるように、ＴＣＥＰは、溶液中で優れた安定性を有する効果的な還元剤であるという優位性を提供する。ＴＣＥＰは、ジスルフィド架橋を還元することなく、酸化ＳＨ基を還元することができる。タンパク質の構造は影響されず、したがって、この試薬は「同時」手法（ワンポット反応における同時還元および複合化反応）において使用することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ＧＴ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００８）。
【０１６７】
本開示の一実施形態において、固定化ＴＣＥＰ還元ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）が、「逐次」手法での使用に企図される。
【０１６８】
様々な実施形態において、ＳＨ基への還元剤（例えば、治療用タンパク質上存在する）の割合は、等モルから最大１００倍の範囲である（すなわち、１：１００、または１００倍モル過剰）。様々な実施形態において、還元剤の量は、治療用タンパク質濃度と比べて、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍モル過剰である。
【０１６９】
複合タンパク質の精製
様々な実施形態において、酸化剤でインキュベートされているタンパク質および／または本開示に従って水溶性ポリマーで複合化されている治療用タンパク質の精製が所望される。多くの精製技術が、当分野で知られており、これには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせ等のクロマトグラフ法、濾過法、ならびに沈殿法（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ４６３（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＲＲ  ａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  ＭＰ），２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
例示的実施形態
本開示は以下の例示的実施形態を提供する：
Ａ１．治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生する、および
（ｂ）水溶性ポリマーの該還元システインスルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、該治療用タンパク質、またはその生物学的に活性な断片を、チオール還元剤および該水溶性ポリマーに接触させるステップを含み、
該治療用タンパク質が、アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を１つしか有しないアミノ酸配列を有する、方法。
【０１７１】
Ａ２．該治療用タンパク質の該アミノ酸配列は、システイン残基を１つしか含有しない、項Ａ１に記載の方法。
【０１７２】
Ａ３．０．１００〜１０．０グラム重の量の治療用タンパク質を含む、項Ａ１〜Ａ２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７３】
Ａ４．該アクセス可能なシステインスルフヒドリル基が、該治療用タンパク質の天然アミノ酸配列中に存在する、項Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７４】
Ａ５．治療用タンパク質の該アミノ酸配列は、該アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を含むように修飾される、項Ａ１〜Ａ３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
Ａ６．該治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生するという該条件は、該タンパク質中の他のシステインアミノ酸間のジスルフィド結合を還元しない、項Ａ１、およびＡ３〜Ａ５のいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
Ａ７．該条件が、該チオール還元剤と水溶性ポリマーとの間の付加物の形成を阻止する、項Ａ１〜Ａ６のいずれか１つに記載の方法。
【０１７７】
Ａ８．該治療用タンパク質がセルピンである、項Ａ１〜Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
Ａ９．該治療用タンパク質が血液凝固タンパク質である、項Ａ１〜Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７９】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｂ１．治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、
治療用タンパク質上でのスルフヒドリル基の還元を可能にする条件下で、該治療用タンパク質またはその生物学的に活性な断片をチオール還元剤と接触させるステップと、
水溶性ポリマーの該還元スルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、該水溶性ポリマーを該治療用タンパク質と接触させるステップと、を含み、
該治療用タンパク質が、少なくとも１つのシステイン残基を含み、
該治療用タンパク質が、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ含み、該１つだけのシステイン残基は、該治療用タンパク質のアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与しない、方法。
【０１８０】
Ｂ２．該チオール還元剤濃度が、該治療用タンパク質濃度に比べて、１〜１００倍モル過剰である、項Ｂ１に記載の方法。一実施形態において、該チオ還元剤濃度が、該治療用タンパク質濃度に比べて、１〜１０倍モル過剰である。
【０１８１】
Ｂ３．少なくとも７０％の該治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、先の項Ｂ１〜Ｂ２のいずれか１つに記載の方法。一実施形態において、１０〜１００％の治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む。
【０１８２】
Ｂ４．該治療用タンパク質複合体を精製するステップをさらに含む、先の項Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
Ｂ５．該治療用タンパク質複合体が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される技術を用いて精製される、項Ｂ４に記載の方法。
【０１８４】
Ｂ６．該治療用タンパク質、水溶性ポリマーおよびチオール還元剤が共に単一の容器中でインキュベートされ、該酸化したＳＨ基の該還元および該複合化反応が、同時に実施される、先の項Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
【０１８５】
Ｂ７．該チオール還元剤が、該治療用タンパク質とのインキュベーションの後、かつ該治療用タンパク質を該水溶性ポリマーとインキュベートする前に除去され、該酸化したＳＨ基の該還元および該複合化反応が逐次実施される、項Ｂ１〜Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
【０１８６】
Ｂ８．該１つだけのシステイン残基が、該治療用タンパク質の該天然アミノ酸配列中に存在する、先の項Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８７】
Ｂ９．該治療用タンパク質のアミノ酸配列が、該１つだけのシステイン残基を含むように修飾される、項Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８８】
Ｂ１０．該治療用タンパク質が糖タンパク質である、先の項Ｂ１〜Ｂ９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
Ｂ１１．該治療用タンパク質がインビボでグリコシル化される、項Ｂ１０に記載の方法。
【０１９０】
Ｂ１２．該治療用タンパク質がインビトロでグリコシル化される、項Ｂ１０に記載の方法。
【０１９１】
Ｂ１３．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、増加した半減期を有する、先の項Ｂ１〜Ｂ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１９２】
Ｂ１４．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１．５倍増加する、項Ｂ１３に記載の方法。一実施形態において、該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１〜１０倍増加する。
【０１９３】
Ｂ１５．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持する、先の項Ｂ１〜Ｂ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
Ｂ１６．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、項Ｂ１５に記載の方法。一実施形態において、該治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比べて、１０〜１００％の生物学的活性を保持する。
【０１９５】
Ｂ１７．該チオール還元剤が、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、システインヒドロクロリド、およびシステインからなる群から選択される、先の項Ｂ１〜Ｂ１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
Ｂ１８．該チオール還元剤がＴＣＥＰである、項Ｂ１７に記載の方法。
【０１９７】
Ｂ１９．該水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、先の項Ｂ１〜Ｂ１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
Ｂ２０．該水溶性ポリマーが、３，０００〜１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、先の項Ｂ１〜Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
Ｂ２１．該水溶性ポリマーが直鎖であり、１０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｂ２０に記載の方法。一実施形態において、該水溶性ポリマーは直鎖であり、２０，０００の分子量を有する。
【０２００】
Ｂ２２．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、先の項Ｂ１〜Ｂ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
Ｂ２３．該水溶性ポリマーが、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）からなる群から選択されるスルフヒドリル特異的基を含有するように誘導体化される、項Ｂ２２に記載の方法。
【０２０２】
Ｂ２４．該水溶性ポリマーがＰＥＧであり、該スルフヒドリル特異的基がＭＡＬである、項Ｂ２３に記載の方法。
【０２０３】
Ｂ２５．該水溶性ポリマーがＰＳＡであり、該スルフヒドリル特異的基がＭＡＬである、項Ｂ２３に記載の方法。
【０２０４】
Ｂ２６．該治療用タンパク質が、α−１プロテイナーゼ阻害物質（Ａ１ＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、ヒト血清アルブミン、アルコール脱水素酵素、ビリベルジンレダクターゼ、ブツリルコリンエステラーゼ、補体Ｃ５ａ、コルチゾール結合タンパク質、クレアチンキナーゼ、凝固因子Ｖ（ＦＶ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、フェリチン、ヘパリン補助因子、インターロイキン２，タンパク質Ｃ阻害物質、組織因子、およびビトロネクチンからなる群から選択される、先の項Ｂ１〜Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
一実施形態において、該治療用タンパク質は、オボアルブミン、プラスミノゲン活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補助因子ＩＩ、α１抗キモトリプシン、α１ミクログロブリン、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、および凝固因子ＸＩＩＩ（ＸＩＩＩ）からなる群から選択される。
【０２０６】
別の実施形態では、該治療用タンパク質は、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）からなる群から選択される、セルピンスーパーファミリーのタンパク質である。
【０２０７】
別の実施形態では、該治療用タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択される血液凝固因子タンパク質である。
【０２０８】
Ｂ２７．該治療用タンパク質がＡ１ＰＩである、項Ｂ２６に記載の方法。
【０２０９】
Ｂ２８．先の項Ｂ１〜Ｂ２７のいずれか１つに記載の方法によって産生される、治療用タンパク質複合体。
【０２１０】
Ｂ２９．Ａ１ＰＩ複合体を調製する方法であって、
該Ａ１ＰＩ上でのスルフヒドリル基の還元を可能にする条件下で、該Ａ１ＰＩをＴＣＥＰと接触させるステップと、
該水溶性ポリマーの該還元スルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、ＭＡＬ基を含有するように誘導体化された直鎖ＰＥＧを該Ａ１ＰＩと接触させるステップと、を含み、
該Ａ１ＰＩが、完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含むシステイン残基を１つだけ含み、該１つだけのシステイン残基は、該Ａ１ＰＩのアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与せず、
該ＴＣＥＰ濃度が、該Ａ１ＰＩ濃度と比べて、３〜４倍モル過剰であり、
少なくとも７０％の該Ａ１ＰＩ複合体が、単一の水溶性ポリマーを構成し、
該Ａ１ＰＩ複合体が、天然のＡ１ＰＩと比べて増加した半減期を有し、
該Ａ１ＰＩ複合体が、天然のＡ１ＰＩと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、方法。
【０２１１】
Ｂ３０．セルピン複合体を調製する方法であって、複合化を可能にする条件下で、水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体を、セルピンまたはその生物学的に活性な断片に接触させることを含み、
該水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体が、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、ＰＥＧエポキシド、酸化ＰＳＡ、アミノオキシ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド（ＰＳＡ−Ｈｚ）、ＰＳＡヒドラジン、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧオルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、ＰＥＧヨードアセトアミド（ｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＰＥＧベンゾトリアゾール、ＰＳＡチオール（ＰＳＡ−ＳＨ）、ＭＡＬ−ＰＳＡ、およびアミノＰＳＡ（ＰＳＡ−ＮＨ２）からなる群から選択され、
該セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、方法。
【０２１２】
Ｂ３１．少なくとも７０％の該セルピン複合体が、少なくとも１つの水溶性ポリマーを構成する、項Ｂ３０に記載の方法。一実施形態において、１０〜１００％の該セルピン複合体が、少なくとも１つの水溶性ポリマーを構成する。
【０２１３】
Ｂ３２．該セルピン複合体を精製するステップをさらに含む、項Ｂ３０〜Ｂ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
Ｂ３３．該セルピン複合体が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される技術を用いて精製される、項Ｂ３２に記載の方法。
【０２１５】
Ｂ３４．該セルピンが糖タンパク質である、項Ｂ３０〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
Ｂ３５．該セルピンがインビボでグリコシル化される、項３４に記載の方法。
【０２１７】
Ｂ３６．該セルピンがインビトロでグリコシル化される、項Ｂ３４に記載の方法。
【０２１８】
Ｂ３７．該セルピン複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、増加した半減期を有する、項Ｂ３０〜Ｂ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
Ｂ３８．該セルピン複合体が、天然のセルピンと比べて、半減期が少なくとも１．５倍増加する、項Ｂ３７に記載の方法。一実施形態において、該セルピン複合体は、天然のセルピンと比べて、半減期が１〜１０倍増加する。
【０２２０】
Ｂ３９．該セルピン複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持する、項Ｂ３０〜Ｂ３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２２１】
Ｂ４０．該セルピン複合体が、天然のセルピンと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、項Ｂ３９に記載の方法。一実施形態において、該セルピン複合体は、天然のセルピンと比べて、１０〜１００％の生物学的活性を保持する。
【０２２２】
Ｂ４１．該水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、項Ｂ３０〜Ｂ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０２２３】
Ｂ４２．該水溶性ポリマーが、３，０００〜１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、項Ｂ３０〜Ｂ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０２２４】
Ｂ４３．該水溶性ポリマーが直鎖であり、１０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｂ４２に記載の方法。
【０２２５】
Ｂ４４．該水溶性ポリマー機能的誘導体がＰＥＧ−ＮＨＳである、項Ｂ３０〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２２６】
Ｂ４５．該水溶性ポリマー機能的誘導体がアミノオキシ−ＰＥＧであり、該セルピンがグリコシル化される、項Ｂ３０〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２２７】
Ｂ４６．該水溶性ポリマー機能的誘導体がアミノオキシ−ＰＳＡであり、該セルピンがグリコシル化される、項Ｂ３０〜Ｂ４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
Ｂ４７．該グリコシル化セルピンの炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝剤を用いたインキュベーションによって、該水溶性ポリマー機能的誘導体と接触させる前に酸化され、オキシム連結が、該水溶性ポリマー機能的誘導体上で該酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基との間に形成される、項Ｂ４５〜Ｂ４６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２９】
Ｂ４８．該酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、項Ｂ４７に記載の方法。
【０２３０】
Ｂ４９．該アミノオキシ−ＰＳＡが、活性化アミノオキシリンカーと酸化ＰＳＡの反応によって調製され、
該アミノオキシリンカーが、
ａ）式
【化１６】
2020059717.tif 000019
【０２３１】
の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー
ｂ）式
【化１７】
2020059717.tif 000020
【０２３２】
の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、
および
ｃ）式
【化１８】
2020059717.tif 000021
【０２３３】
の３，６，９，１２，１５−ペナトキサ（ｐｅｎａｔｏｘａ）−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択され、
該ＰＳＡが、該ＰＳＡの該非還元末端において、末端アルデヒド基を形成するように、酸化剤を用いたインキュベーションによって、酸化される、項Ｂ４６に記載の方法。
【０２３４】
Ｂ５０．該酸化炭水化物部分と該活性化水溶性ポリマー機能的誘導体の接触は、アニリン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンザミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、ｐ−アニシジン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される求核触媒を含む緩衝剤中で生じる、項Ｂ４７〜Ｂ４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
Ｂ５１．該治療用タンパク質を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝剤中でインキュベートすることによって、該オキシム連結を還元するステップをさらに含む、項Ｂ４７〜Ｂ５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
Ｂ５１Ａ．該セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｂ３０〜Ｂ５１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
Ｂ５２．項Ｂ３０〜Ｂ５１、およびＢ５１Ａのいずれか１つに記載の方法によって、調製されるセルピン複合体。
【０２３８】
Ｂ５３．治療用タンパク質複合体であって、
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基を含む治療用タンパク質またはその生物学的に活性な断片であって、該治療用タンパク質が完全にまたは部分的に酸化されたアクセス可能なスルフヒドリル基を含む１つだけのシステイン残基を含み、該１つだけのシステイン残基は、該治療用タンパク質のアミノ酸配列中の別のシステイン残基とのジスルフィド結合に関与しない、治療用タンパク質またはその生物学的に活性な断片と、
（ｂ）該治療用タンパク質の該スルフヒドリル基に結合される１つの水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体、を含む、治療用タンパク質複合体。
【０２３９】
Ｂ５４．該１つだけのシステイン残基が、該治療用タンパク質の該天然アミノ酸配列中に存在する、項Ｂ５３に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４０】
Ｂ５５．該治療用タンパク質のアミノ酸配列が、該１つだけのシステイン残基を含むように修飾される、項Ｂ５３に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４１】
Ｂ５６．該治療用タンパク質が糖タンパク質である、項Ｂ５３〜Ｂ５５のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４２】
Ｂ５７．該治療用タンパク質がインビボでグリコシル化される、項Ｂ５６に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４３】
Ｂ５８．該治療用タンパク質がインビボでグリコシル化される、項Ｂ５６に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４４】
Ｂ５９．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１．５倍増加する、項Ｂ５３〜Ｂ５８のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。一実施形態において、該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも１〜１０倍増加する。
【０２４５】
Ｂ６０．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、項Ｂ５３〜Ｂ５９のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。一実施形態において、治療用タンパク質複合体は、天然の治療用タンパク質と比べて、１０〜１００％の生物学的活性を保持する。
【０２４６】
Ｂ６１．該水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、項Ｂ５３〜Ｂ６０のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４７】
Ｂ６２．該水溶性ポリマーが、３，０００〜１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、項Ｂ５３〜Ｂ６１のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４８】
Ｂ６３．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｂ５３〜Ｂ６２のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。
【０２４９】
Ｂ６４．該水溶性ポリマーが、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）からなる群から選択されるスルフヒドリル特異的基を含有するように誘導体化される、項Ｂ５３〜Ｂ６３のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。
【０２５０】
Ｂ６５．該水溶性ポリマーがＰＥＧであり、該スルフヒドリル特異的基がＭＡＬである、項Ｂ６４に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２５１】
Ｂ６６．該水溶性ポリマーがＰＳＡであり、該スルフヒドリル特異的基がＭＡＬである、項Ｂ６４に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２５２】
Ｂ６７．該治療用タンパク質が、Ａ１ＰＩ  α−１プロテイナーゼ阻害物質（Ａ１ＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、ヒト血清アルブミン、アルコール脱水素酵素、ビリベルジンレダクターゼ、ブツリルコリンエステラーゼ、補体Ｃ５ａ、コルチゾール結合タンパク質、クレアチンキナーゼ、凝固因子Ｖ（ＦＶ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、フェリチン、ヘパリン補助因子、インターロイキン２、タンパク質Ｃ阻害物質、組織因子、およびビトロネクチンからなる群から選択される、項Ｂ５３〜Ｂ６６のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体。
【０２５３】
一実施形態において、該治療用タンパク質は、オボアルブミン、プラスミノゲン活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補助因子ＩＩ、α１抗キモトリプシン、α１ミクログロブリン、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）、および凝固因子ＸＩＩＩ（ＸＩＩＩ）からなる群から選択される。
【０２５４】
別の実施形態では、該治療用タンパク質は、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）からなる群から選択される、該セルピンスーパーファミリーのタンパク質である。
【０２５５】
別の実施形態では、該治療用タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択される血液凝固因子タンパク質である。
【０２５６】
Ｂ６８．該治療用タンパク質がＡ１ＰＩである、項Ｂ６７に記載の治療用タンパク質複合体。
【０２５７】
Ｂ６９．セルピン複合体であって、
（ａ）セルピンまたはその生物学的に活性な断片と、
（ｂ）該セルピンまたはその生物学的に０活性な断片に結合される少なくとも１つの水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体であって、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、ＰＥＧエポキシド、酸化ＰＳＡ、アミノオキシ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド（ＰＳＡ−Ｈｚ）、ＰＳＡヒドラジン、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧオルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、ＰＥＧヨードアセトアミド（ｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＰＥＧベンゾトリアゾール、ＰＳＡチオール（ＰＳＡ−ＳＨ）、ＭＡＬ−ＰＳＡおよびアミノＰＳＡ（ＰＳＡ−ＮＨ２）からなる群から選択される、該水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体、を含み、
天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、セルピン複合体。
【０２５８】
Ｂ７０．該セルピンが糖タンパク質である、項Ｂ６９に記載のセルピン複合体。
【０２５９】
Ｂ７１．該セルピンがインビボでグリコシル化される、項Ｂ７０に記載のセルピン複合体。
【０２６０】
Ｂ７２．該セルピンがインビトロでグリコシル化される、項Ｂ７０に記載のセルピン複合体。
【０２６１】
Ｂ７３．該セルピン複合体が、天然のセルピンと比べて、半減期が少なくとも１．５倍増加する、項Ｂ６９〜Ｂ７２のいずれか１つに記載のセルピン複合体。一実施形態において、該セルピン複合体が、天然のセルピンと比べて、半減期が少なくとも１〜１０倍増加する。
【０２６２】
Ｂ７４．該水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、項Ｂ６９〜Ｂ７３のいずれか１つに記載のセルピン複合体。
【０２６３】
Ｂ７５．該水溶性ポリマーが、３，０００〜１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する、項Ｂ６９〜Ｂ７４のいずれか１つに記載のセルピン複合体。
【０２６４】
Ｂ７６．該水溶性ポリマーが直鎖であり、１０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｂ７５に記載のセルピン複合体。一実施形態において、該水溶性ポリマーは直鎖であり、２０，０００Ｄａの分子量を有する。
【０２６５】
Ｂ７７．該水溶性ポリマー機能的誘導体がＰＥＧ−ＮＨＳである、項Ｂ６９〜Ｂ７６のいずれか１つに記載のセルピン複合体。
【０２６６】
Ｂ７８．該水溶性ポリマー機能的誘導体がアミノオキシ−ＰＥＧであり、該セルピンがグリコシル化される、項Ｂ６９〜Ｂ７６のいずれか１つに記載のセルピン複合体。
【０２６７】
Ｂ７９．該水溶性ポリマー機能的誘導体がアミノオキシ−ＰＳＡであり、該セルピンがグリコシル化される、項Ｂ６９〜Ｂ７６のいずれか１つに記載のセルピン複合体。
【０２６８】
Ｂ８０．該セルピンが、Ａ１ＰＩ、抗トロンビン（ａｎｔｉｈｒｏｍｂｉｎ）ＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、オボアルブミン、プラスミノゲン活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、およびヘパリン補助因子ＩＩからなる群から選択される、項Ｂ６９〜Ｂ７９のいずれか１つに記載のセルピン複合体。
【０２６９】
Ｂ８１．疾患を治療する方法であって、該疾患を治療するのに有効な量の、項Ｂ５３〜Ｂ６８のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体を投与することを含む、方法。
【０２７０】
Ｂ８２．疾患を治療する方法であって、該疾患を治療するのに有効な量の、項Ｂ６９〜Ｂ８０のいずれか１つに記載のセルピン複合体を投与することを含む、方法。
【０２７１】
Ｂ８３．疾患を治療する方法における、薬学的組成物の使用について記載したラベルを伴う容器にパッケージ化された、ｉ）項Ｂ５３〜Ｂ６８のいずれか１つに記載の治療用タンパク質複合体、およびｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤、を含む、該薬学的組成物を含む、キット。
【０２７２】
Ｂ８４．疾患を治療する方法における、薬学的組成物の使用について記載したラベルを伴う容器にパッケージ化された、ｉ）項Ｂ６９〜Ｂ８０のいずれか１つに記載のセルピン複合体、およびｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤、を含む、該薬学的組成物を含む、キット。
【０２７３】
Ｂ８５．該薬学的組成物が、単位剤形でパッケージ化された、項Ｂ８３〜Ｂ８４のいずれか１つに記載のキット。
【０２７４】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｃ１．治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、
スルフヒドリル基の還元を可能にする条件下で、単一の、アクセス可能、および酸化可能なスルフヒドリル基を含む治療用タンパク質を、チオール還元剤と接触させるステップと、
水溶性ポリマーの該還元スルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、該水溶性ポリマーを該治療用タンパク質と接触させるステップと、を含む、方法。
【０２７５】
Ｃ１Ａ．該治療用タンパク質が、α−１プロテイナーゼ阻害物質（Ａ１ＰＩ）、抗トロンビンＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、オボアルブミン、プラスミノゲン−活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補助因子ＩＩ、α１抗キモトリプシン、α１ミクログロブリン、アルブミン、アルコール脱水素酵素、ビリベルジンレダクターゼ、ブツリルコリンエステラーゼ、補体Ｃ５ａ、コルチゾール結合タンパク質、クレアチンキナーゼ、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、フェリチン、ヘパリン補助因子、インターロイキン２、タンパク質Ｃ阻害物質、組織因子、およびビトロネクチン、またはそれらの生物学的に活性な断片、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、項Ｃ１に記載の方法。
【０２７６】
Ｃ１Ｂ．該チオール還元剤が、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＤＴＥ、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）からなる群から選択される、項Ｃ１〜Ｃ１Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
Ｃ１Ｃ．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｃ１〜Ｃ１Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
Ｃ２．該チオール還元剤がＴＣＥＰである、項Ｃ１Ｂに記載の方法。
【０２７９】
Ｃ２Ａ．該治療用タンパク質、水溶性ポリマー、およびチオール還元剤が、共に単一の容器中でインキュベートされる、項Ｃ２に記載の方法。
【０２８０】
Ｃ３．該チオール還元剤濃度が、該治療用タンパク質濃度に比べて、１〜１００倍モル過剰である、項Ｃ１〜Ｃ２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
Ｃ４．該チオール還元剤濃度が、該治療用タンパク質濃度と比べて、３倍モル過剰である、項Ｃ１〜Ｃ３のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
Ｃ５．該水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーからなる群から選択される、項Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
Ｃ６．該水溶性ポリマーが、３，０００〜１５０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｃ５に記載の方法。
【０２８４】
Ｃ７．該水溶性ポリマーが直鎖であり、２０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｃ６に記載の方法。
【０２８５】
Ｃ８．該水溶性ポリマーがＰＥＧである、項Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
Ｃ９．該水溶性ポリマーがＰＳＡである、項Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８７】
Ｃ１０．該水溶性ポリマーが、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）からなる群から選択される、スルフヒドリル基特異的薬剤で誘導体化される、項Ｃ１〜Ｃ９のいずれか１つに記載の方法。
【０２８８】
Ｃ１１．該スルフヒドリル基特異的薬剤がＭＡＬである、項Ｃ８に記載の方法。
【０２８９】
Ｃ１２．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｃ１１に記載の方法。
【０２９０】
Ｃ１３．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＳＡである、項Ｃ１１に記載の方法。
【０２９１】
Ｃ１４．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持する、項Ｃ１〜Ｃ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０２９２】
Ｃ１５．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、項Ｃ１４に記載の方法。
【０２９３】
Ｃ１６．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて増加した半減期を有する、項Ｃ１〜Ｃ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２９４】
Ｃ１７．該治療用タンパク質複合体が、天然の治療用タンパク質と比べて、半減期が少なくとも２倍増加する、項Ｃ１６に記載の方法。
【０２９５】
Ｃ１８．該治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、項Ｃ１〜Ｃ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２９６】
Ｃ１９．少なくとも２０％の該治療用タンパク質複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、項Ｃ１８に記載の方法。
【０２９７】
Ｃ２０．該単一の、アクセス可能および酸化可能なスルフヒドリル基が、システイン残基上のスルフヒドリル基である、項Ｃ１〜Ｃ１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２９８】
Ｃ２１．該システイン残基が、該治療用タンパク質の該天然アミノ酸配列中に存在する、項Ｃ２０に記載の方法。
【０２９９】
Ｃ２２．該治療用タンパク質がヒト血漿から精製される、項Ｃ２１に記載の方法。
【０３００】
Ｃ２３．該治療用タンパク質が、自然にグリコシル化されたＡ１ＰＩである、項Ｃ２２に記載の方法。
【０３０１】
Ｃ２４．該治療用タンパク質が、宿主細胞内で組換え産生される、項Ｃ２１に記載の方法。
【０３０２】
Ｃ２５．該宿主細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および細菌細胞からなる群から選択される、項Ｃ２４に記載の方法。
【０３０３】
Ｃ２６．自然にグリコシル化された治療用タンパク質が、該哺乳動物細胞によって産生される、項Ｃ２５に記載の方法。
【０３０４】
Ｃ２７．自然にグリコシル化されたＡ１ＰＩが、該哺乳動物細胞によって産生される、項Ｃ２６に記載の方法。
【０３０５】
Ｃ２８．該治療用タンパク質が、該細菌細胞によって産生される、項Ｃ２５に記載の方法。
【０３０６】
Ｃ２９．該治療用タンパク質が、該細菌細胞からの精製に続いて、インビトロでグリコシル化される、項Ｃ２８に記載の方法。
【０３０７】
Ｃ３０．Ａ１ＰＩが、該細菌細胞からの精製に続いて、インビトロでグリコシル化される、項Ｃ２９に記載の方法。
【０３０８】
Ｃ３１．該治療用タンパク質の該天然アミノ酸配列が、該システイン残基上に単一の、アクセス可能および酸化可能なスルフヒドリル基を含むように修飾される、項Ｃ２０に記載の方法。
【０３０９】
Ｃ３２．１つ以上のシステイン残基が、該治療用タンパク質の該天然アミノ酸配列内で、挿入、削除、または置換されている、項Ｃ３１に記載の方法。
【０３１０】
Ｃ３３．該治療用タンパク質が、宿主細胞内で組換え産生される、項Ｃ３２に記載の方法。
【０３１１】
Ｃ３４．該宿主細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および細菌細胞からなる群から選択される、項Ｃ３３に記載の方法。
【０３１２】
Ｃ３５．自然にグリコシル化された治療用タンパク質が、該哺乳動物細胞によって産生される、項Ｃ３４に記載の方法。
【０３１３】
Ｃ３６．該治療用タンパク質が、該細菌細胞によって産生される、項Ｃ３４に記載の方法。
【０３１４】
Ｃ３７．該治療用タンパク質が、該細菌細胞からの精製に続いて、インビトロでグリコシル化される、項Ｃ３６に記載の方法。
【０３１５】
Ｃ３８．該治療用タンパク質複合体を精製するステップをさらに含む、項Ｃ１〜Ｃ３７のいずれか１つに記載の方法。
【０３１６】
Ｃ３９．該治療用タンパク質複合体が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される技術を用いて精製される、項Ｃ３８に記載の方法。
【０３１７】
Ｃ４０．項Ｃ１〜Ｃ３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される、治療用タンパク質複合体。
【０３１８】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｄ１．グリコシル化セルピン複合体を調製する方法であって、複合化を可能にする条件化で、水溶性ポリマーをグリコシル化セルピンと接触させることを含み、
該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持し、
該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、増加した半減期を有する、方法。
【０３１９】
Ｄ１Ａ．該グリコシル化セルピンが、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）からなる群から選択される、項Ｄ１に記載の方法。
【０３２０】
Ｄ１Ｂ．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｄ１〜Ｄ１Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０３２１】
Ｄ１Ｃ．該水溶性ポリマー誘導体が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧマレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ）、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、ＰＥＧエポキシド、酸化ＰＳＡ、アミノオキシ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド、ＰＳＡヒドラジン、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧオルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、ＰＥＧヨードアセトアミド（ｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＰＥＧベンゾトリアゾール、ＰＳＡ−ＳＨ、ＭＡＬ−ＰＳＡ、およびＰＳＡ−ＮＨ２からなる群から選択される、項Ｄ１Ｂに記載の方法。
【０３２２】
Ｄ１Ｄ．該水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体が、３，０００〜１５０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｄ１〜Ｄ２Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０３２３】
Ｄ２．該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、項Ｄ１に記載の方法。
【０３２４】
Ｄ３．該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、半減期が少なくとも２倍増加する、項Ｄ１〜Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
【０３２５】
Ｄ４．該グリコシル化セルピン複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、項Ｄ１〜Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
【０３２６】
Ｄ５．少なくとも２０％の該グリコシル化セルピン複合体が、単一の水溶性ポリマーを含む、項Ｄ４に記載の方法。
【０３２７】
Ｄ６．該グリコシル化セルピンが、単一の、アクセス可能および酸化可能なスルフヒドリル基を含む、項Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０３２８】
Ｄ７．該単一の、アクセス可能および酸化可能なスルフヒドリル基が、システイン残基上のスルフヒドリル基である、項Ｄ６に記載の方法。
【０３２９】
Ｄ８．該スルフヒドリル基の該還元を可能にする条件下で、単一の、アクセス可能および酸化可能なスルフヒドリル基を有する該グリコシル化セルピンを、チオール還元剤と接触させることを、さらに含む、項Ｄ７に記載の方法。
【０３３０】
Ｄ９．該チオール還元剤が、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＤＴＥ、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）からなる群から選択される、項Ｄ８に記載の方法。
【０３３１】
Ｄ１０．該チオール還元剤がＴＣＥＰである、項Ｄ９に記載の方法。
【０３３２】
Ｄ１１．該治療用タンパク質、水溶性ポリマー、およびチオール還元剤が、共に単一の容器中でインキュベートされる、項Ｄ８〜Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０３３３】
Ｄ１２．該チオール還元剤濃度が、該グリコシル化セルピン濃度に比べて、１〜１００倍モル過剰である、項Ｄ８〜Ｄ１１のいずれか１つに記載の方法。
【０３３４】
Ｄ１３．該チオール還元剤濃度が、該グリコシル化セルピン濃度に比べて３倍モル過剰である、項Ｄ８〜Ｄ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０３３５】
Ｄ１４．該システイン残基が、該グリコシル化セルピンの該天然アミノ酸配列中に存在する、項Ｄ８〜Ｄ１３のいずれか１つに記載の方法。
【０３３６】
Ｄ１５．該グリコシル化セルピンがヒト血漿から精製される、項Ｄ１４に記載の方法。
【０３３７】
Ｄ１６．該グリコシル化セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｄ１５に記載の方法。
【０３３８】
Ｄ１７．該セルピンが、宿主細胞内で組換え産生される、項Ｄ１４に記載の方法。
【０３３９】
Ｄ１８．該宿主細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および細菌細胞からなる群から選択される、項Ｄ１７に記載の方法。
【０３４０】
Ｄ１９．自然にグリコシル化されたセルピンが、該哺乳動物細胞によって産生される、項Ｄ１８に記載の方法。
【０３４１】
Ｄ２０．該自然にグリコシル化されたセルピンが、Ａ１ＰＩである、項Ｄ１９に記載の方法。
【０３４２】
Ｄ２１．該セルピンが、該細菌細胞によって産生される、項Ｄ１８に記載の方法。
【０３４３】
Ｄ２２．該セルピンが、該細菌細胞からの精製に続いて、インビトロでグリコシル化される、項Ｄ２１に記載の方法。
【０３４４】
Ｄ２３．該セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｄ２２に記載の方法。
【０３４５】
Ｄ２４．該水溶性ポリマーが、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）からなる群から選択される、スルフヒドリル基特異的薬剤で誘導体化される、項Ｄ６〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０３４６】
Ｄ２５．該スルフヒドリル基特異的薬剤がＭＡＬである、項Ｄ２４に記載の方法。
【０３４７】
Ｄ２６．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｄ２５に記載の方法。
【０３４８】
Ｄ２７．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＳＡである、項Ｄ２５に記載の方法。
【０３４９】
Ｄ２８．該水溶性ポリマー誘導体が、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマー誘導体からなる群から選択される、項Ｄ２４に記載の方法。
【０３５０】
Ｄ２９．グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体を調製する方法であって、
該スルフヒドリル基の該還元を可能にする条件下で、単一の、アクセス可能および酸化可能なスルフヒドリル基を含むグリコシル化Ａ１ＰＩタンパク質を、ＴＣＥＰを含む溶液に接触させることと、
複合化を可能にする条件下で、水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体を該グリコシル化Ａ１ＰＩに接触させることと、を含み、
該グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体が、天然のグリコシル化Ａ１ＰＩと比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持し、
該グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体が、天然のグリコシル化Ａ１ＰＩと比べて、増加した半減期を有し、
少なくとも７０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、方法。
【０３５１】
Ｄ３０．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｄ２９に記載の方法。
【０３５２】
Ｄ３１．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＳＡである、項Ｄ２９に記載の方法。
【０３５３】
Ｄ３２．該治療用タンパク質、水溶性ポリマー、およびチオール還元剤が、共に単一の容器中でインキュベートされる、項Ｄ２９〜Ｄ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０３５４】
Ｄ３３．該水溶性ポリマーが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）からなる群から選択されるリシン特異的薬剤で誘導体化される、項Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０３５５】
Ｄ３４．該水溶性ポリマー誘導体がＰＥＧ−ＮＨＳである、項Ｄ３３に記載の方法。
【０３５６】
Ｄ３５．該水溶性ポリマー誘導体がＰＳＡ−ＮＨＳである、項Ｄ３３に記載の方法。
【０３５７】
Ｄ３６．該水溶性ポリマーが、アミノオキシリンカーで誘導体化される、項Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
【０３５８】
Ｄ３７．該水溶性ポリマー誘導体がアミノオキシ−ＰＥＧである、項Ｄ３６に記載の方法。
【０３５９】
Ｄ３８．該水溶性ポリマー誘導体がアミノオキシ−ＰＳＡである、項Ｄ３６に記載の方法。
【０３６０】
Ｄ３９．該グリコシル化セルピンの炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝剤を用いたインキュベーションによって、該水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体と接触される前に酸化され、
オキシム連結が、該アミノオキシリンカーで誘導体化された水溶性ポリマー上の該酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基との間に形成され、それにより、該グリコシル化セルピン複合体を形成する、項Ｄ３６〜Ｄ３８のいずれか１つに記載の方法。
【０３６１】
Ｄ４０．該酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、項Ｄ３９に記載の方法。
【０３６２】
Ｄ４１．該アミノオキシリンカーで誘導体化された水溶性ポリマーが、アミノオキシ−ＰＥＧである、項Ｄ３６〜Ｄ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６３】
Ｄ４２．該アミノオキシリンカーで誘導体化された水溶性ポリマーが、アミノオキシ−ＰＳＡである、項Ｄ３６〜Ｄ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０３６４】
Ｄ４３．該アミノオキシ−ＰＳＡが、活性化アミノオキシリンカーと酸化ＰＳＡの反応によって調製され、
該アミノオキシリンカーが、
ａ）式
【化１９】
2020059717.tif 000022
【０３６５】
の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
ｂ）式
【化２０】
2020059717.tif 000023
【０３６６】
の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、
および
ｃ）式
【化２１】
2020059717.tif 000024
【０３６７】
３，６，９，１２，１５−ペナトキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択され、
該ＰＳＡが、該ＰＳＡの該非還元末端において、末端アルデヒド基を形成するように、酸化剤を用いたインキュベーションによって、酸化される、項Ｄ４２に記載の方法。
【０３６８】
Ｄ４４．該酸化炭水化物部分と該活性化水溶性ポリマーの接触は、アニリン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンザミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、ｐ−アニシジン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される求核触媒を含む緩衝剤中で生じる、項Ｄ３９〜Ｄ４３のいずれか１つに記載の方法。
【０３６９】
Ｄ４５．該治療用タンパク質を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝剤中でインキュベートすることによって、該オキシム連結を還元するステップをさらに含む、項Ｄ３９〜Ｄ４４のいずれか１つに記載の方法。
【０３７０】
Ｄ４６．項Ｄ１〜Ｄ４５のいずれか１つに記載の方法によって産生される、グリコシル化セルピン複合体。
【０３７１】
Ｄ４７．グリコシル化セルピン複合体であって、
ａ）グリコシル化セルピンタンパク質、および
ｂ）（ａ）の該グリコシル化セルピンタンパク質に結合する少なくとも１つの水溶性ポリマー、を含み、それにより、グリコシル化セルピン複合体を形成し、
該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持し、
該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、増加した半減期を有する、グリコシル化セルピン複合体。
【０３７２】
Ｄ４８．該グリコシル化セルピンが、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）からなる群から選択される、項Ｄ４７に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７３】
Ｄ４９．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｄ４８〜Ｄ４９のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７４】
Ｄ５０．該水溶性ポリマー誘導体が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧマレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ）、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、ＰＥＧエポキシド、酸化ＰＳＡ、アミノオキシ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド、ＰＳＡヒドラジン、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧオルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、ＰＥＧヨードアセトアミド（ｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＰＥＧベンゾトリアゾール、ＰＳＡ−ＳＨ、ＭＡＬ−ＰＳＡ、およびＰＳＡ−ＮＨ２からなる群から選択される、項Ｄ４９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７５】
Ｄ５１．該水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体が、３，０００〜１５０，０００Ｄａの分子量を有する、項Ｄ４８〜Ｄ５０のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７６】
Ｄ５２．該水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体が、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーまたはその機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｄ４８〜Ｄ５１のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７７】
Ｄ５３．該水溶性ポリマーが、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン、オルトピリジル−ジスルフィド（ＯＰＳＳ）、およびヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔａｍｉｄｅｓ）からなる群から選択される、スルフヒドリル基特異的薬剤で誘導体化される、項Ｄ４９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７８】
Ｄ５４．該スルフヒドリル基特異的薬剤がＭＡＬである、項Ｄ５３に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３７９】
Ｄ５５．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｄ５４に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８０】
Ｄ５６．該水溶性ポリマー誘導体がＭＡＬ−ＰＳＡである、項Ｄ５４に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８１】
Ｄ５７．該水溶性ポリマーが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）からなる群から選択されるリシン特異的薬剤で誘導体化される、項Ｄ４９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８２】
Ｄ５８．該リシン特異的薬剤がＮＨＳである、項Ｄ５７に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８３】
Ｄ５９．該水溶性ポリマー誘導体がＰＥＧ−ＮＨＳである、項Ｄ５７に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８４】
Ｄ６０．該水溶性ポリマー誘導体がＰＳＡ−ＮＨＳである、項Ｄ５７に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８５】
Ｄ６１．該水溶性ポリマーが、アミノオキシリンカーで誘導体化される、項Ｄ４９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８６】
Ｄ６２．該水溶性ポリマー誘導体がアミノオキシ−ＰＥＧである、項Ｄ６１に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８７】
Ｄ６３．該水溶性ポリマー誘導体がアミノオキシ−ＰＳＡである、項Ｄ６１に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３８８】
Ｄ６４．該アミノオキシリンカーが、
ａ）式
【化２２】
2020059717.tif 000025
【０３８９】
の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
ｂ）式
【化２３】
2020059717.tif 000026
【０３９０】
の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー
および
ｃ）式
【化２４】
2020059717.tif 000027
【０３９１】
の３，６，９，１２，１５−ペナトキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択される、項Ｄ６１〜Ｄ６３のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３９２】
Ｄ６５．グリコシル化セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｄ４６〜Ｄ６５のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０３９３】
Ｄ６６．セルピンに関連する疾患を治療する方法であって、該疾患を治療するのに有効な量の、項Ｄ４６〜Ｄ６５のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体を投与することを含む、方法。
【０３９４】
Ｄ６７．該グリコシル化セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｄ６６に記載の方法。
【０３９５】
Ｄ６８．該水溶性ポリマーがＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｄ６７に記載の方法。
【０３９６】
Ｄ６９．該疾患が気腫である、項Ｄ６７〜Ｄ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０３９７】
Ｄ７０．該セルピンに関連する疾患を治療する方法における、薬学的組成物の使用について記載したラベルを伴う容器にパッケージ化された、ｉ）項Ｄ４６〜Ｄ６５のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体、およびｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤、を含む、該薬学的組成物を含む、キット。
【０３９８】
Ｄ７１．該薬学的組成物が、単位剤形でパッケージ化された、項Ｄ７０に記載のキット。
【０３９９】
Ｄ７２．項Ｄ４６〜Ｄ６５のいずれか１つに記載のグリコシル化セルピン複合体を含む第１の容器、および該第１の容器中の該組成物用の生理学的に許容可能な再構成溶液を含む第２の容器を含むキットであって、該キットは、該セルピンに関連する疾患を治療する方法における、該薬学的組成物の使用について記載したラベルと共にパッケージ化される、キット。
【０４００】
Ｄ７３．該薬学的組成物が、単位剤形でパッケージ化された、項Ｄ７２に記載のキット。
【０４０１】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｅ１．複合化が可能である条件下で、水溶性ポリマーをグリコシル化治療用タンパク質に接触させることを含む、グリコシル化治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持し、該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、増加した半減期を有する、方法。
【０４０２】
Ｅ２．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも３０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ１に記載の方法。
【０４０３】
Ｅ２Ａ．該グリコシル化治療用タンパク質が、精製の前にインビボでグリコシル化される、項Ｅ１に記載の方法。
【０４０４】
Ｅ３．該グリコシル化治療用タンパク質が、精製に続いて、インビトロでグリコシル化される、項Ｅ１に記載の方法。
【０４０５】
Ｅ４．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｅ１〜Ｅ３のいずれか１つに記載の方法。
【０４０６】
Ｅ５．該複合化が並発反応内で生じる、項Ｅ１に記載の方法。
【０４０７】
Ｅ６．該グリコシル化治療用タンパク質が、血漿由来α−１プロテイナーゼ阻害物質（Ａ１ＰＩ）、組換えＡ１ＰＩ、抗トロンビンＩＩＩ、α−１抗キモトリプシン、オボアルブミン、プラスミノゲン活性化因子阻害物質、ニューロセルピン、Ｃ１−阻害物質、ネキシン、α−２抗プラスミン、ヘパリン補助因子ＩＩ、α１抗キモトリプシン、α１ミクログロブリン、アルブミン、アルコール脱水素酵素、ビリベルジンレダクターゼ、ブツリルコリンエステラーゼ、補体Ｃ５ａ、コルチゾール結合タンパク質、クレアチンキナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、フェリチン、ヘパリン補助因子、インターロイキン２、タンパク質Ｃ阻害物質、組織因子、およびビトロネクチンまたはそれらの生物学的に活性な断片、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択される、項Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
【０４０８】
Ｅ７．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも４０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ１〜Ｅ６のいずれか１つに記載の方法。
【０４０９】
Ｅ８．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも５０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ７に記載の方法。
【０４１０】
Ｅ９．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも６０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ８に記載の方法。
【０４１１】
Ｅ１０．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも７０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ８に記載の方法。
【０４１２】
Ｅ１１．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも８０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ８に記載の方法。
【０４１３】
Ｅ１２．該グリコシル化治療用タンパク質複合体が、天然のグリコシル化治療用タンパク質と比べて、少なくとも９０％の生物学的活性を保持する、項Ｅ８に記載の方法。
【０４１４】
Ｅ１２Ａ．該グリコシル化治療用タンパク質複合体の該半減期が、該天然のグリコシル化治療用タンパク質よりも少なくとも２倍多い、項Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０４１５】
Ｅ１２Ｂ．該グリコシル化治療用タンパク質複合体の該半減期が、該天然のグリコシル化治療用タンパク質よりも８倍多い、項Ｅ１２Ａに記載の方法。
【０４１６】
Ｅ１２Ｃ．該水溶性ポリマーが、直鎖、分岐、またはマルチアーム水溶性ポリマーの群から選択される、項Ｅ１〜Ｅ１２Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０４１７】
Ｅ１２Ｄ．該水溶性ポリマーがＰＥＧである、項Ｅ１〜Ｅ１２Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０４１８】
Ｅ１２Ｅ．該ＰＥＧが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧマレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ）、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、およびＰＥＧエポキシドからなる群から選択される、項Ｅ１２Ｄに記載の方法。
【０４１９】
Ｅ１３．該ＰＥＧが、３，０００〜８０，０００Ｄａである、項Ｅ１２Ｅに記載の方法。
【０４２０】
Ｅ１３Ａ．該水溶性ポリマーがＰＳＡである、項Ｅ４に記載の方法。
【０４２１】
Ｅ１４．該ＰＳＡが、酸化ＰＳＡ、アミノオキシ−ＰＳＡ、ＰＳＡヒドラジド、ＰＳＡ−ＳＨ、ＭＡＬ−ＰＳＡ、およびＰＳＡ−ＮＨ２からなる群から選択される、項Ｅ１３Ａに記載の方法。
【０４２２】
Ｅ１５．該ＰＳＡが、３，０００〜８０，０００Ｄａである、項Ｅ１４に記載の方法。
【０４２３】
Ｅ１５Ａ．該グリコシル化治療用タンパク質がヒト血漿から精製される、項Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０４２４】
Ｅ１６．該グリコシル化治療用タンパク質が、宿主細胞内で組換え産生される、項Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０４２５】
Ｅ１７．該宿主細胞が動物細胞である、項Ｅ１６に記載の方法。
【０４２６】
Ｅ１８．該動物細胞が哺乳動物細胞である、項Ｅ１７に記載の方法。
【０４２７】
Ｅ１９．該哺乳動物細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２からなる群から選択される、項Ｅ１８に記載の方法。
【０４２８】
Ｅ２０．該グリコシル化治療用タンパク質が、細菌細胞内で組換え産生される、項Ｅ３に記載の方法。
【０４２９】
Ｅ２１．該細菌細胞が、大腸菌からなる群から選択される、項Ｅ２０に記載の方法。
【０４３０】
Ｅ２２．該水溶性ポリマーがＮＨＳ−ＰＥＧである、項Ｅ１２に記載の方法。
【０４３１】
Ｅ２３．該水溶性ポリマーがアミノオキシ−ＰＥＧである、項Ｅ１２に記載の方法。
【０４３２】
Ｅ２４．該治療用タンパク質の炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝剤を用いたインキュベーションによって、複合化の前に酸化され、オキシム連結が、該アミノオキシ−ＰＥＧ上で、該酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基との間に形成され、それにより、該治療用タンパク質複合体を形成する、項Ｅ２３に記載の方法。
【０４３３】
Ｅ２５．並発反応である、項Ｅ２４に記載の方法。
【０４３４】
Ｅ２６．該酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、項Ｅ２４またはＥ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０４３５】
Ｅ２７．該水溶性ポリマーがアミノオキシ−ＰＳＡである、項Ｅ１４に記載の方法。
【０４３６】
Ｅ２８．該治療用タンパク質の炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝剤を用いたインキュベーションによって、複合化の前に酸化され、オキシム連結が、該アミノオキシ−ＰＳＡ上で、該酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基との間に形成され、それにより、該治療用タンパク質複合体を形成する、項Ｅ２７に記載の方法。
【０４３７】
Ｅ２９．並発反応である、項Ｅ２８に記載の方法。
【０４３８】
Ｅ３０．該酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、項Ｅ２８またはＥ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０４３９】
Ｅ３０Ａ．該アミノオキシ−ＰＳＡが、活性化アミノオキシリンカーと酸化ＰＳＡの反応によって調製され、
該アミノオキシリンカーが、
ａ）式
【化２５】
2020059717.tif 000028
【０４４０】
の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
ｂ）式
【化２６】
2020059717.tif 000029
【０４４１】
の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、
および
ｃ）式
【化２７】
2020059717.tif 000030
【０４４２】
の３，６，９，１２，１５−ペナトキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択され、
該ＰＳＡが、該ＰＳＡの該非還元末端において、末端アルデヒド基を形成するように、酸化剤を用いたインキュベーションによって、酸化される、項Ｅ２７に記載の方法。
【０４４３】
Ｅ３０Ｂ．該アミノオキシリンカーが、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンである、項Ｅ３０Ａに記載の方法。
【０４４４】
Ｅ３０Ｃ．該酸化剤がＮａＩＯ４である、項Ｅ２８に記載の方法。
【０４４５】
Ｅ３１．該酸化炭水化物部分と該活性化水溶性ポリマーとの接触が、アニリンおよびアニリン誘導体からなる群から選択される、求核触媒を含む緩衝剤中で生じる、項Ｅ２４〜Ｅ２６またはＥ２８〜Ｅ３０Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０４４６】
Ｅ３２．該治療用タンパク質を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝剤中でインキュベートすることによって、該オキシム連結を還元するステップをさらに含む、項Ｅ２４〜Ｅ２６またはＥ２８〜Ｅ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０４４７】
Ｅ３３．該還元化合物がシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）である、項Ｅ３２に記載の方法。
【０４４８】
Ｅ３４．該水溶性ポリマーがＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｅ１２に記載の方法。
【０４４９】
Ｅ３５．該グリコシル化治療用タンパク質のスルフヒドリル基（−ＳＨ）部分が、Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）、ＤＴＴ、ＤＴＥ、ＮａＢＨ４、およびＮａＣＮＢＨ３からなる群から選択される還元性物質を含む緩衝剤を用いたインキュベーションによって還元される、ｖＥ３４に記載の方法。
【０４５０】
Ｅ３６．該還元性物質がＴＣＥＰである、項Ｅ３５またはＥ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０４５１】
Ｅ３７．並発反応である、項Ｅ３６に記載の方法。
【０４５２】
Ｅ３８．該ＴＣＥＰ濃度が、該治療用タンパク質濃度に比べて１〜１００倍モル過剰である、項Ｅ３６またはＥ３７のいずれか１つに記載の方法。
【０４５３】
Ｅ３８．該グリコシル化治療用タンパク質がＡ１ＰＩである、項Ｅ３７に記載の方法。
【０４５４】
Ｅ３９．該グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体がモノＰＥＧ化される、項Ｅ３８に記載の方法。
【０４５５】
Ｅ４０．少なくとも２０、３０、４０  ５０、６０、７０、８０、または９０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、項Ｅ３９に記載の方法。
【０４５６】
Ｅ４１．グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体を調製する方法であって、複合化が可能である条件下で、ＭＡＬ−ＰＥＧを該グリコシル化Ａ１ＰＩに接触させることを含み、該グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体が、天然のグリコシル化Ａ１ＰＩと比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持し、該グリコシル化Ａ１ＰＩ複合体が、天然のグリコシル化Ａ１ＰＩと比べて、増加した半減期を有し、該グリコシル化Ａ１ＰＩのシステイン２３２における該スルフヒドリル基（−ＳＨ）部分が、ＴＣＥＰを用いたインキュベーションによって還元され、少なくとも２０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、方法。
【０４５７】
Ｅ４２．少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、項Ｅ４１に記載の方法。
【０４５８】
Ｅ４３．該治療用タンパク質複合体が、複合化に続いて精製される、項Ｅ１〜Ｅ４２のいずれか１つに記載の方法。
【０４５９】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｆ１．項Ｅ１〜Ｅ４６のいずれか１つに記載の方法によって産生される、グリコシル化セルピン複合体。
【０４６０】
Ｆ２．グリコシル化セルピン複合体であって、
（ａ）グリコシル化セルピン、および
（ｂ）（ａ）の該グリコシル化セルピンに結合する少なくとも１つの水溶性ポリマーを含み、該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも２０％の生物学的活性を保持し、該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、増加した半減期を有する、グリコシル化セルピン複合体。
【０４６１】
Ｆ２Ａ．精製の前にインビボでグリコシル化される、項Ｆ１に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６２】
Ｆ３．精製に続いて、インビトロでグリコシル化される、項Ｆ１に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６３】
Ｆ４．該グリコシル化セルピンが、Ａ１ＰＩ（α−１プロテイナーゼ阻害物質）、またはＡ１ＡＴ（α−１抗トリプシン）、ＡＴＲ（α−１抗トリプシン関連タンパク質）、ＡＡＣＴまたはＡＣＴ（α−１抗キモトリプシン）、ＰＩ４（プロテイナーゼ阻害物質４）、ＰＣＩまたはＰＲＯＣＩ（タンパク質Ｃ阻害物質）、ＣＢＧ（コルチコステロイド結合グロブリン）、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、ＡＧＴ（アンギオテンシノーゲン）、センテリン、ＰＺＩ（タンパク質Ｚ依存性プロテアーゼ阻害物質）、ＰＩ２（プロテイナーゼ阻害物質２）、ＰＡＩ２またはＰＬＡＮＨ２（プラスミノゲン活性化因子阻害物質２）、ＳＣＣＡ１（扁平上皮癌抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮癌抗原２）、ＰＩ５（プロテイナーゼ阻害物質５）、ＰＩ６（プロテイナーゼ阻害物質６）、メグシン、ＰＩ８（プロテイナーゼ阻害物質８）、ＰＩ９（プロテイナーゼ阻害物質９）、ＰＩ１０（プロテイナーゼ阻害物質１０）、エピピン、ユコピン、ＰＩ１３（プロテイナーゼ阻害物質１３）、ＰＩ８Ｌ１（プロテイナーゼ阻害物質８様１）、ＡＴ３またはＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、ＨＣ−ＩＩまたはＨＣＦ２（ヘパリン補助因子ＩＩ）、ＰＡＩ１またはＰＬＡＮＨ１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質１）、ＰＮ１（プロテイナーゼネキシンＩ）、ＰＥＤＦ（色素上皮由来因子）、ＰＬＩ（プラスミン阻害物質）、Ｃ１ＩＮまたはＣ１  ＩＮＨ（血漿プロテイナーゼＣ１阻害物質）、ＣＢＰ１（コラーゲン結合タンパク質１）、ＣＢＰ２（コラーゲン結合タンパク質２）、ＰＩ１２（プロテイナーゼ阻害物質１２）、およびＰＩ１４（プロテイナーゼ阻害物質１４）、またはそれらの生物学的に活性な断片、誘導体もしくは変異体からなる群から選択される、項Ｆ２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６４】
Ｆ５．該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標）（Ｗａｒｗｉｃｋ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、ＵＫ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択される、項Ｆ２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６５】
Ｆ８．該水溶性ポリマーが約２０ｋＤａである、項Ｆ５に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６６】
Ｆ９．該セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも４０％の生物学的活性を保持する、項Ｆ２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６７】
Ｆ１０．該グリコシル化セルピン複合体が、天然のグリコシル化セルピンと比べて、少なくとも５０％の生物学的活性を保持する、項Ｆ９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６８】
Ｆ１１．該セルピン複合体の該半減期が、該天然のグリコシル化セルピンよりも少なくとも１〜１００倍多い、項Ｆ２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４６９】
Ｆ１２．該セルピン複合体の該半減期が、該天然のグリコシル化セルピンよりも３倍多い、項Ｆ１１に記載のセルピン複合体。
【０４７０】
Ｆ１３．該水溶性ポリマーがＰＥＧである、項Ｆ５に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７１】
Ｆ１４．該ＰＥＧが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル−ＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）、アミノオキシ−ＰＥＧ、マレイミド−ＰＥＧ（ＭＡＬ−ＰＥＧ）、ＰＥＧカルボン酸、ＰＥＧアルデヒド、アミノオキシ−ＰＥＧ、ＰＥＧヒドラジド（ＰＥＧ−Ｈｚ）、ＰＥＧヒドラジン、ＰＥＧチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）、アミノＰＥＧ（ＰＥＧ−ＮＨ２）、カルボキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシルＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＨ）、およびＰＥＧエポキシドからなる群から選択される、項Ｆ１３に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７２】
Ｆ１５．該水溶性ポリマーがＰＳＡである、項Ｆ５に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７３】
Ｆ１６．該ＰＳＡがアミノオキシ−ＰＳＡからなる群から選択される、項Ｆ１５に記載のセルピン複合体。
【０４７４】
Ｆ１７．該セルピンがヒト血漿から精製される、項Ｆ２に記載のセルピン複合体。
【０４７５】
Ｆ１８．該グリコシル化セルピンが、宿主細胞内で組換え産生される、項Ｆ２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７６】
Ｆ１９．該宿主細胞が動物細胞である、項１８に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７７】
Ｆ２０．該動物細胞が哺乳動物細胞である、項Ｆ１９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７８】
Ｆ２４．該水溶性ポリマーがＮＨＳ−ＰＥＧである、項Ｆ１４に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４７９】
Ｆ２５．該水溶性ポリマーがアミノオキシ−ＰＥＧである、項Ｆ１４に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８０】
Ｆ２６．該アミノオキシ−ＰＥＧが、該グリコシル化セルピン上の酸化炭水化物部分を介して、該グリコシル化セルピンに付着される、項Ｆ２５に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８１】
Ｆ２７．該水溶性ポリマーがアミノオキシ−ＰＳＡである、項Ｆ１６に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８２】
Ｆ２８．該アミノオキシ−ＰＳＡが、活性化アミノオキシリンカーと酸化ＰＳＡの反応によって調製され、
該アミノオキシリンカーが、
ａ）式
【化２８】
2020059717.tif 000031
【０４８３】
の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー、
ｂ）式
【化２９】
2020059717.tif 000032
【０４８４】
の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー、
および
ｃ）式
【化３０】
2020059717.tif 000033
【０４８５】
の３，６，９，１２，１５−ペナトキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択され、
該ＰＳＡが、該ＰＳＡの該非還元末端において、末端アルデヒド基を形成するように、酸化剤を用いたインキュベーションによって、酸化される、項Ｆ２７に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８６】
Ｆ２９．該水溶性ポリマーがＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｆ１４に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８７】
Ｆ３０．該ＭＡＬ−ＰＥＧが、該グリコシル化セルピン上の還元スルフヒドリル基（−ＳＨ）部分を介して、該セルピンに付着される、項Ｆ２９に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８８】
Ｆ３１．該グリコシル化セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｆ２７に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４８９】
Ｆ３２．該Ａ１ＰＩ複合体がモノＰＥＧ化される、項Ｆ３１に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４９０】
Ｆ３３．少なくとも５０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、項Ｆ３２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４９１】
Ｆ３４．少なくとも６０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、項Ｆ３２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４９２】
Ｆ３５．少なくとも７０％の該Ａ１ＰＩがモノＰＥＧ化される、項Ｆ３２に記載のグリコシル化セルピン複合体。
【０４９３】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｇ１．セルピンに関連する疾患を治療する方法であって、該疾患を治療するのに有効な量の、上記いずれかの項に記載のグリコシル化セルピン複合体を投与することを含む、方法。
【０４９４】
Ｇ２．該セルピンがＡ１ＰＩである、項Ｇ１に記載の方法。
【０４９５】
Ｇ３．該水溶性ポリマーがＭＡＬ−ＰＥＧである、項Ｇ２に記載の方法。
【０４９６】
Ｇ４．該疾患が気腫である、項Ｇ３に記載の方法。
【０４９７】
本開示はまた、以下の例示的実施形態を提供する：
Ｈ１．該セルピンに関連する疾患を治療する方法における、薬学的組成物の使用について記載したラベルを伴う容器にパッケージ化された、ｉ）上記項のいずれかに記載のグリコシル化セルピン複合体、およびｉｉ）薬学的に許容可能な賦形剤、を含む、該薬学的組成物を含む、キット。
【０４９８】
Ｈ２．該薬学的組成物が、単位剤形でパッケージ化された、項Ｈ１に記載のキット。
【０４９９】
Ｈ３．上記項のいずれかに記載のグリコシル化セルピン複合体を含む第１の容器、および該第１の容器中の該組成物用の生理学的に許容可能な再構成溶液を含む第２の容器を含むキットであって、該キットは、該セルピンに関連する疾患を治療する方法における、該薬学的組成物の使用について記載したラベルと共にパッケージ化される、キット。
【０５００】
Ｈ４．該薬学的組成物が、単位剤形でパッケージ化された、項Ｈ３に記載のキット。
【０５０１】
以下の実施例は、制限を意図するものではなく、本開示の特定の実施形態の例示に過ぎない。
【０５０２】
実施例
【実施例１】
【０５０３】
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２
【化３１】
2020059717.tif 000034
【０５０４】
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って、第１級アミンの改良ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含有する（３オキサペンタン−１，５−ジオキシアミン）を合成した（図２）。第１のステップでは、２，２−クロロジエチルエーテルの１つの分子を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。得られた中間体から、エタノール中でのヒドラジン分解によって、所望のホモ二官能性生成物を調製した。
【実施例２】
【０５０５】
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２
【化３２】
2020059717.tif 000035
【０５０６】
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って、第１級アミンの改良ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含有する（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）を合成した（図２）。第１のステップでは、ビス−（２−（２−クロロエトキシ）−エチル）−エーテルの１つの分子を、ＤＭＦ中で、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。得られた中間体から、エタノール中でのヒドラジン分解によって、所望のホモ二官能性生成物を調製した。
【実施例３】
【０５０７】
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２の調製
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２
【化３３】
2020059717.tif 000036
【０５０８】
Ｂｏｔｕｒｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って、第１級アミンの改良ガブリエル合成を採用する２ステップ有機反応で、２つの活性アミノオキシ基を含有する（３，６，９，１２，１５−ペナトキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン）を合成した。第１のステップでは、ヘキサエチレングリコール二塩化物の１つの分子を、ＤＭＦ中で、エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドの２つの分子と反応させた。得られた中間体から、エタノール中でのヒドラジン分解によって、所望のホモ二官能性生成物を調製した。
【実施例４】
【０５０９】
３−オキサ−ペンタン−１，５ジオキシアミンの詳細な合成
３−オキサ−ペンタン−１，５ジオキシアミンを、実施例１に概説される２ステップ有機合成で、Ｂｏｔｙｒｙｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９７；５３：５４８５−９２）に従って合成した。
【０５１０】
ステップ１：
７００ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（５９．０ｇ、１．００当量）の溶液に、無水Ｋ２ＣＯ３（４５．５１ｇ、１．００当量）および２，２−ジクロロジエチルエーテル（１５．８４ｍＬ、０．４１当量）を添加した。反応混合物を５０℃で２２時間撹拌した。混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、２Ｌのジクロロメタン中で懸濁し、ＮａＣｌ飽和水溶液（各１Ｌ）で２回、抽出した。ジクロロメタン層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで、減圧下で乾燥するまで蒸発させ、高真空内で乾燥して、白黄色の固体（中間体１）として６４．５ｇの３−オキサペンタン−１，５−ジオキシ−エンド−２’，３’−ジカルボキシジイミドノルボルネンを得た。
【０５１１】
ステップ２：
８００ｍＬの無水エタノール中の中間体１（６４．２５ｇ、１．００当量）の溶液に、３１．０ｍlのヒドラジン水和物（４．２６当量）を添加した。次いで、反応混合物を２時間還流させた。混合物を、減圧下で溶媒を蒸発させることによって、出発体積の半分まで濃縮した。生じた沈殿物を濾去した。残りのエタノール層を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。粗生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを含有する残渣を、真空内で乾燥させ、４６．３ｇを得た。粗生成物をさらに、カラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０、ジクロロメタン／メタノール混合物での定組成溶離、９＋１）によって精製して、１１．７ｇの純最終生成物３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを得た。
【実施例５】
【０５１２】
アミノオキシ−ＰＳＡの調製
Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から得た１０００ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１６ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した。次いで、１７０ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応混合物に付与した。室温で２時間振とうした後、７８．５ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、反応を、一晩かけて１８時間行った。次いで、反応混合物を、再生成されたセルロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から作製された５ｋＤのカットオフを有する膜を使用する限外濾過／透析濾過の手順（ＵＦ／ＤＦ）に供した。
【０５１３】
代替として、アミノオキシＰＳＡは、還元ステップを伴わずに調製されてもよい。
【０５１４】
Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から得た５７３ｍｇの酸化ＰＳＡ（分子量＝２０ｋＤ）を、１１．３ｍＬの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０（緩衝液Ａ）中に溶解した。次いで、９４ｍｇの３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを反応混合物に付与した。室温で５時間振とうした後、混合物は次いで、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥ６５０−Ｍクロマトグラフィーゲル（カラム寸法：ＸＫ１６／１０５）を採用する、弱陰イオン交換クロマトグラフィーステップに供された。反応混合物を５０ｍｌの緩衝液Ａで希釈し、１ｃｍ／分の流速で、緩衝剤Ａで事前に平衡化したＤＥＡＥカラム上に負荷した。次いで、カラムを２０ＣＶの緩衝剤Ｂ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．０）で洗浄し、２ｃｍ／分の流速で、遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよびシアン化物を除去した。アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、６７％の緩衝液Ｂおよび４３％の緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）からなるステップ勾配で溶出した。溶出液を、ポリエーテルスルホン（５０ｃｍ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から作製された５ｋＤの膜を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して行った。調製物を、全ＰＳＡ（レゾルシノールアッセイ）および全アミノオキシ基（ＴＮＢＳアッセイ）を測定し、修飾の度合いを決定することによって分析的に特徴付けた。さらに、多分散性、ならびに遊離３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを決定した。
【実施例６】
【０５１５】
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の凍結乾燥
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を実施例５に従い調製した。透析濾過後、生成物を−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、試薬を適切な体積の水中で溶解し、炭水化物修飾を介するＰＳＡ−タンパク質複合体の調製のために使用した。
【実施例７】
【０５１６】
ＰＥＧマレイミドを用いたＡ１ＰＩのＰＥＧ化（逐次方法）
２５ｍｇの精製されたＡ１ＰＩを反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。この溶液に、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）原液（５ｍｇのＴＣＥＰ／ｍｌ反応緩衝液）のアリコートを添加し、３Ｍ  ＴＣＥＰのモル過剰を得た。混合物を暗室において室温で１時間インキュベートした。次いで、ＴＣＥＰを、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したゲル濾過によって、分離した。続いて、Ａ１ＰＩを、１０モル過剰で分岐ＰＥＧマレイミド２０ｋＤ（ＮＯＦ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＡ  Ｓｅｒｉｅｓ）を用いて、化学的に修飾した。修飾反応を暗室においてＴ＝＋２〜８℃の温度で１時間行い、Ｌ−システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を用いた反応停止ステップが続いた。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな振とう下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートした。
【０５１７】
修飾Ａ１ＰＩを、平衡化緩衝液（２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．５）で希釈し、溶液の伝導率を４．５ｍＳ／ｃｍ未満に修正し、ｍｌ／分の流速の５ｍｌのカラム体積（ＣＶ）で、事前に充填されたＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。次いで、カラムを、１０ＣＶの平衡化緩衝液（流速：２ｍｌ／分）で平衡化した。最終的に、ＰＥＧ−Ａ１ＰＩを、溶出緩衝液（２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）の直線勾配で溶出した。
【実施例８】
【０５１８】
ＰＥＧマレイミドを用いたＡ１ＰＩのＰＥＧ化（同時手法）
３０ｍｇの精製されたＡ１ＰＩを反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。この溶液に、ＴＣＥＰ原液（５ｍｇのＴＣＥＰ／ｍｌ反応緩衝液）のアリコートを添加し、４Ｍ  ＴＣＥＰのモル過剰を得た。混合物を１０分間インキュベートし、次いで、化学修飾を、１０モル過剰で分岐ＰＥＧマレイミド２０ｋＤ（ＮＯＦ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＡ  Ｓｅｒｉｅｓ）の添加によって、開始した。修飾反応を暗室においてＴ＝＋２〜８℃の温度で１時間行い、Ｌ−システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を用いた反応停止ステップが続いた。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな振とう下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートした。
【０５１９】
修飾Ａ１ＰＩを、平衡化緩衝液（２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．５）で希釈し、溶液の伝導率を４．５ｍＳ／ｃｍ未満に修正し、１ｍｌ／分の流速を用いた５ｍｌのカラム体積（ＣＶ）で、事前に充填されたＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。次いで、カラムを、１０ＣＶの平衡化緩衝液（流速：２ｍｌ／分）で平衡化した。最終的に、ＰＥＧ−Ａ１ＰＩを、溶出緩衝液（２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）の直線勾配で溶出した。
【実施例９】
【０５２０】
ＰＥＧ−Ａ１ＰＩ  ＥＬＩＳＡで観察したＰＥＧ化Ａ１ＰＩの薬物動態的研究
ＰＥＧ−Ａ１ＰＩ  ＥＬＩＳＡを使用して、ラット薬物動態的研究から得られた血漿試料中のＰＥＧ化Ａ１ＰＩの濃度を特異的に測定した。アッセイは基本的に、米国特許出願第１２／３４２，４０５号に従った。端的には、本発明者は、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５中５μｇ／ｍＬの濃度で、ウサギ抗ＰＥＧ  ＩｇＧ（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、＃ＹＧ−０２−０４−１２Ｐ）をＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｆ９６プレートに被覆し、結合ＰＥＧ化Ａ１ＰＩが、抗ヒトＡ１ＰＩ−ペルオキシダーゼ調製物（結合部位、ＰＰ０３４）を使用して検出された。アッセイは、Ａ１ＰＩ−結合ＰＥＧ  ２〜３２ｎｇ／ｍＬの範囲の線形線量濃度関係を示した。本発明者は、このアッセイ範囲を、ＰＥＧ化Ａ１ＰＩの調製物をＰＥＧの既知の濃度で連続的に希釈することによって証明し、Ｎａｇら（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１９９６；２３７：２２４−３１）によって説明される比色分析法によって測定した。比色分析アッセイはアンモニウムフェロチオシアネート）を用いて、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール化タンパク質を推算し、試料のシグナルを推定するために得られた検量線を使用した。図３は、得られた薬物動態プロファイルを示す。
【０５２１】
ＰＥＧ化Ａ１ＰＩは、投与後の全ての時点で、内在的な非ＰＥＧ化されたラットのＡ１ＰＩによる、いかなる干渉を伴わずに、特異的に測定可能であり、最後の試料は投与から４８時間後に採られた。測定された濃度は、予期されたように、経時的に低下し、観察期間中にラットの循環に生じるＰＥＧ化Ａ１ＰＩの大規模な脱ＰＥＧ化の兆候は無かった。このように、ラットモデル内で得られたＰＫプロファイルは、ラットの循環中でＰＥＧ化Ａ１ＰＩの安定性を示し、これは特定のアッセイがその濃度の観測に使用されたためである。
【実施例１０】
【０５２２】
ＰＥＧ−ＮＨＳを伴うＡ１ＰＩにおけるリシン残基のＰＥＧ化
Ａ１ＰＩは、２０ｋＤの分子量を有し、活性ＮＨＳエステル（組織名：２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（１，５−ジオキソ−５−スクシンイミジルオキシ，ペンチルオキシ）プロパン））を含有するＰＥＧ化試薬（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−２００ＧＳ／ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、ＰＥＧ化された。５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５中の精製されたＡ１ＰＩの溶液を、３．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整し、ＰＥＧ化試薬（原液：５０ｍｇ試薬／ｍｌ  ２ｍＭのＨＣｌ）を添加し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。ＰＥＧ化反応を、穏やかな攪拌下で、室温で２時間実施した。次いで、反応をグトリシン（ｇｔｌｙｃｉｎｅ）（最終濃度１０ｍＭ）の添加によって１時間停止した。続いて、反応のｐＨを２ＮのＨＣｌの添加によって６．５に調整し、混合物を２５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５で事前に平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ／ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。次いで、カラムを、過剰な試薬を除去するために２０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、ＰＥＧ化Ａ１ＰＩを、１ｍｌ／分の流速を用いた溶出緩衝液（２５ｍＭのリン酸緩衝液、１ＭのＮａＣｌ）で溶出した。
【０５２３】
最終的に、溶出液を、ポリエーテルスルホンからなる膜および１０ｋＤの分子量カットオフを伴う、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｍａｎｙ）を使用する限外濾過／透析濾過によって濃縮した。最終透析濾過ステップを、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に対して行った。
【実施例１１】
【０５２４】
Ａ１ＰＩ中の炭水化物残基のＰＥＧ化（逐次方法）
１．５ｍｌの２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解した２．０ｍｇのＡ１ＰＩに、水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍＭ）を添加し、１００μＭの最終濃度を得た。混合物を、暗室において４℃で１時間振とうし、１Ｍのグリセロール溶液（最終濃度：１０ｍＭ）の添加によって、室温で１５分間反応停止させた。次いで、低分子量の混入物質を、ゲル濾過によって、同じ緩衝系で事前に平衡化されたＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、分離した。続いて、直鎖アミノオキシ−ＰＥＧ試薬（ＮＯＦ  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ  ２００Ｃ／ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を、留分を含有するＡ１ＰＩに添加し、混合物を、ｐＨ６．０、４℃で１８時間振とうした。最終的に、複合体を、上述の条件下でＩＥＸによって、さらに精製した。
【実施例１２】
【０５２５】
Ａ１ＰＩ中の炭水化物残基のＰＥＧ化（同時手法）
１０ｍｇのＡ１ＰＩを、１２ｍｌのヒスチジン−緩衝液、ｐＨ６．０（２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解する。次いで、水性過ヨウ素酸ナトリウム溶液（５ｍＭ）を添加し、１２０μＭの最終濃度を得る。続いて、２０ｋＤの分子量を伴う、直鎖ＰＥＧ−アミノオキシ試薬（試薬（ＮＯＦ  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ  ２００Ｃ／ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を添加し、ＰＥＧ試薬の５倍モル過剰を得る。混合物を、穏やかな攪拌下で、暗室において４℃で１８時間インキュベートし、２５μｌの１Ｍの水性システイン溶液の添加によって、室温で１５分間反応停止させる。最終的に、複合体を、上述の条件下でＩＥＸによって、さらに精製する。
【実施例１３】
【０５２６】
求核触媒の存在下における、Ａ１ＰＩ中の炭水化物残基のＰＥＧ化
Ａ１ＰＩは、上述のように、炭水化物残基を介してＰＥＧ化される。アミノオキシ試薬との化学反応を、１０ｍＭの濃度を用いて、求核触媒アニリン（Ｚｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：２０７−９）の存在下で行う。この触媒の代替として、ｍ−トルイジン（濃度：１０ｍＭ）を使用する。化学反応を、４℃で１８時間の代わりに、室温で２時間実施する。代替として、米国特許第２０１２／００３５３４４  Ａ１号に記載のｍ−トルイジンまたは他の求核触媒を使用してもよい。
【実施例１４】
【０５２７】
ＰＳＡマレイミドの調製
０．６８ｇの酸化ＰＳＡを、１５．１ｍｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解し、４３ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。次いで、マレイミドおよびヒドラジド基を含有する二官能性ＥＭＣＨリンカー（Ｐｉｅｒｃｅ／５０ｍＭのリン酸緩衝液中１６．７ｍｇ／ｍｌ）の５０ｍＭの溶液を添加した。ｐＨをｐＨ６．０に修正し、溶液を暗室において室温で３０分間、穏やかな攪拌下で、インキュベートした。続いて、２．６ｍｌの１Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮ溶液（＝５０Ｍ過剰）を添加し、暗室において室温で１８０分間、穏やかな攪拌下で、別のインキュベーションを実行した。次いで、溶液を５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６で１：１に希釈し、伝導率を下げた（約７ｍＳ／ｃｍ）。次いで、混合物を、４ｍｌ／分の流速でＰＳＡマレイミドリンカーを精製するために、８ｍｌの総容積の事前充填されたＩＥＸカラム（モノリス型ＤＥＡＥ  ＣＩＭ／ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）上に適用した。次いで、カラムを、４０ｍｌ／分の流速を用いて、３２カラム体積の５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で洗浄した。次いで、リンカーを、勾配５９％の５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０、および勾配４１％の５０ｍＭのリン酸緩衝液／１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶出した。最終的に、溶出液を、ポリエーテルスルホン膜（型ＢＩＯＭＡＸ５／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する、限外濾過／透析濾過に供した。最終透析濾過ステップを、９０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に対して、実施した。
【実施例１５】
【０５２８】
ＰＳＡマレイミドを用いたＡ１ＰＩのポリシアル化（逐次方法）
Ａ１ＰＩを、活性マレイミド基を含有するポリシアル化試薬の使用によってポリシアル化する。この種の試薬の実施例が上述される（二官能性ＥＭＣＨリンカー（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた酸化ＰＳＡの反応およびイオン交換クロマトグラフィーによるその後の精製）。
【０５２９】
Ａ１ＰＩを、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度および３Ｍの試薬過剰を用いて、反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中で、ＴＣＥＰ試薬（Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で還元する。混合物を、暗室において、室温で１時間インキュベートする。次いで、ＴＣＥＰを、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過によって、分離する。続いて、Ａ１ＰＩを、１０モル過剰の試薬を用いて、反応緩衝液中で、ＰＳＡマレイミドで化学的に修飾する。修飾反応を暗室において４℃の温度で１時間行い、Ｌ−システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を用いた反応停止ステップが続く。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな振とう下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートする。最終的に、ポリシアル化Ａ１ＰＩをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上でＩＥＸによって精製する。
【実施例１６】
【０５３０】
ＰＳＡマレイミドを用いたＡ１ＰＩのポリシアル化（同時手法）
Ａ１ＰＩを、活性マレイミド基を含有するポリシアル化試薬の使用によってポリシアル化する。この種の試薬の実施例が上述される（二官能性ＥＭＣＨリンカー（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた酸化ＰＳＡの反応およびイオン交換クロマトグラフィーによるその後の精製）。
【０５３１】
Ａ１ＰＩを、反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。この溶液に、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）原液（５ｍｇのＴＣＥＰ／ｍｌ反応緩衝液）のアリコートを添加し、４倍モル過剰を得る。混合物を、１０分間インキュベートし、次いで、１０モル過剰のＰＳＡマレイミド試薬（実施例１４）の添加によって、化学修飾を開始する。
【０５３２】
修飾反応を暗室において、４℃で１時間実行する。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな攪拌下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートする。最終的に、ポリシアル化Ａ１ＰＩをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上でＩＥＸによって精製する。
【実施例１７】
【０５３３】
ＰＥＧマレイミドを用いたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）におけるＳＨ基の修飾
３０ｍｇの精製されたＨＳＡを反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。この溶液に、ＴＣＥＰ原液（５ｍｇのＴＣＥＰ／ｍｌ反応緩衝液）のアリコートを添加し、４のモル過剰を得る。混合物を１０分間インキュベートする。末端マレイミド基を含有する１０倍モル過剰の分岐ＰＥＧ試薬（分子量２０ｋＤ）の添加によって、化学修飾を開始する。この種の試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＡ  ｓｅｒｉｅｓである。修飾反応を暗室においてＴ＝＋２〜８℃の温度で１時間行い、Ｌ−システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を用いた反応停止ステップが続く。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな振とう下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートする。次いで、ｐＨ値を０．１ＭのＨＣｌの滴加によって６．８に調整する。
【０５３４】
続いて、複合体をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上で陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。反応混合物を、クロマトグラフィーカラム（体積：２０ｍｌ）上に適用する。次いで、カラムを１０カラム体積（ＣＶ）の開始緩衝剤（２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．２）で洗浄する。ＰＥＧ−ＨＡＳ複合体を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ４．５で溶出し、２８０ｎｍの光学濃度を測定する。留分を含有する複合体を貯え、再生成されたセルロースの１０ｋＤ膜を使用する、限外濾過／透析濾過に供する。
【実施例１８】
【０５３５】
組換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）におけるＳＨ基の修飾
遊離およびアクセス可能なスルフヒドリル基を含有する組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）変異体を、米国特許第７，６３２，９２１  Ｂ２号に従って、組換えＤＮＡ技術により調製し、遊離ＳＨ基を介する化学修飾に使用する。この変異体を、末端マレイミド基を含有する分岐ＰＥＧ試薬（分子量２０ｋＤ）の１０倍モル過剰を使用して、化学的に修飾する。この種の試薬の例は、ＮＯＦ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＡ  ｓｅｒｉｅｓである。反応を、５倍過剰のＴＣＥＰの存在下で、室温で１時間実施する。次いで、複合体を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製する。イオン強度を、８Ｍの酢酸アンモニウム（８Ｍの酢酸アンモニウム、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を含有する緩衝剤の添加により増加し、２．５Ｍの酢酸アンモニウムの最終濃度を得る。次いで、反応混合物を、平衡化緩衝液（２．５Ｍの酢酸アンモニウム、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）で平衡化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦで充填されたクロマトグラフィーカラム上に負荷する。生成物を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）で溶出し、溶出液を、再生成されたセルロースから作製された３０ｋＤ膜を使用する限外濾過／透析濾過によって、濃縮する。
【実施例１９】
【０５３６】
他の治療用タンパク質のポリシアル化
本明細書に記載のｍ−トルイジンまたはｏ−アミノ安息香酸のような代替的な求核触媒の存在下で行われるポリシアル化反応は、他の治療用タンパク質まで拡大され得る。例えば、本開示の様々な態様において、上述のポリシアル化または上述のようにＰＳＡアミノオキシまたはＰＥＧアミノオキシ試薬によるＰＥＧ化反応を、本明細書に説明されるこれらのタンパク質等の治療用タンパク質で繰り返す。
【実施例２０】
【０５３７】
分岐ＰＥＧを使用した治療用タンパク質のＰＥＧ化
本開示の治療用タンパク質のＰＥＧ化は、アルデヒドおよび活性アミノオキシ基を含有する好適なリンカーから作製される分岐鎖または直鎖ＰＥＧ化試薬まで拡大され得る。
【実施例２１】
【０５３８】
他の治療用タンパク質のポリシアル化
本明細書に記載のｍ−トルイジンまたはｏ−アミノ安息香酸のような代替的な求核触媒の存在下で行われるポリシアル化反応は、他の治療用タンパク質まで拡大され得る。例えば、本開示の様々な態様において、上述のポリシアル化または上述のようにＰＳＡアミノオキシまたはＰＥＧアミノオキシ試薬によるＰＥＧ化反応を、本明細書に説明されるこれらのタンパク質等の治療用タンパク質で繰り返す。ポリシアル化反応を、個々の反応ステップにおいて、または、代替としては、本明細書に記載の並発反応において、実施する。
【実施例２２】
【０５３９】
分岐ＰＥＧを使用する治療用タンパク質のＰＥＧ化
本開示の治療用タンパク質のＰＥＧ化は、本明細書に提供される実施例に従って、アルデヒドおよび活性アミノオキシ基を含有する好適なリンカーから作製される分岐鎖または直鎖ＰＥＧ化試薬まで拡大され得る。
【実施例２３】
【０５４０】
分岐ＰＥＧを使用する治療用タンパク質のＰＥＧ化
本開示の治療用タンパク質のＰＥＧ化は、上述のように、アルデヒドおよび活性アミノオキシ基を含有する好適なリンカーから作製される分岐鎖または直鎖ＰＥＧ化試薬まで拡大され得る。ＰＥＧ化反応を、個々の反応ステップにおいて、または、代替としては、本明細書に記載の並発反応において、実施する。
【実施例２４】
【０５４１】
アルブミンのポリシアル化［逐次手法］
ＰＳＡマレイミドを実施例１４に従って調製し、逐次手法を使用する遊離ＳＨ基を介したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のポリシアル化に使用する。ＨＳＡを、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度および３Ｍの試薬過剰を用いて、反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中で、ＴＣＥＰ試薬（Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で還元する。混合物を、暗室において室温で１時間インキュベートする。次いで、ＴＣＥＰを、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過によって分離する。続いて、ＨＳＡを１０モル過剰の試薬を使用し、反応緩衝液中のＰＳＡマレイミドで化学的に修飾する。修飾反応を暗室において４℃の温度で１時間行い、Ｌ−システイン（最終濃度：１０ｍＭ）を用いた反応停止ステップが続く。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな攪拌下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートした。最終的に、ポリシアル化ＨＳＡをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上でＩＥＸによって精製する。
【実施例２５】
【０５４２】
アルブミンのポリシアル化（同時手法）
ＰＳＡマレイミドを実施例１４に従って調製し、同時手法を使用する遊離ＳＨ基を介したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のポリシアル化に使用した。ＨＳＡを反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。この溶液に、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィンヒドロクロリド／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）原液（５ｍｇのＴＣＥＰ／ｍｌ反応緩衝液）のアリコートを添加し、４倍モル過剰を得る。混合物を、１０分間インキュベートし、次いで、１０倍モル過剰のＰＳＡマレイミド試薬（実施例１４）の添加によって、化学修飾を開始する。修飾反応を暗室において４℃で１時間行う。Ｌ−システインの添加後、反応混合物を、穏やかな攪拌下で、同じ温度でさらに１時間インキュベートする。最終的に、ポリシアル化ＨＳＡをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上でＩＥＸによって精製する。
【実施例２６】
【０５４３】
Ａ１ＰＩのＰＥＧ化
１ｍｌの反応緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中の２．６ｍｇのＡ１ＰＩ（純Ａ１ＰＩ出発物質）での数回のバッチが、還元剤ＴＣＥＰの異なるモル過剰の使用によって、処理された。これらの研究の目標は、ＰＥＧ−マレイミドとＡ１ＰＩの反応に対するＴＣＥＰ濃度の最適化であった。
【０５４４】
ＰＥＧ化反応を１０倍モル過剰のＰＥＧ中で、一方では還元と同時に行い、他方では還元剤の除去後に逐次行った。最適なモル過剰のＴＣＥＰが、両方の変異体に対して試験された。
【０５４５】
最終的に、混合物を、使用されたＰＥＧ試薬の量に基づいて１０倍モル過剰のシステインで、室温で１時間反応停止させた。
【０５４６】
最適な還元剤の過剰の決定。
【０５４７】
ＴＣＥＰのモル過剰の例外以外のすべての要因は、修飾バッチにおいて一定に保たれた。２０ｋＤ−ＭＡＬ−ＰＥＧをＡ１ＰＩのシステインにのみ選択的に結合することが、この技術の目的であったため、ＨＰＬＣ分析について考慮しなければならなかったことは、モノ−ＰＥＧ−Ａ１ＰＩ対天然のＡ１ＰＩの割合だけであった。ポリ−ＰＥＧ−Ａ１ＰＩは、適用条件下で観察されず、これは、特異的なカップリングの前提を裏付ける。
【０５４８】
２つの複合化の比較は、逐次還元／ＰＥＧ化の場合、同時手法よりもはるかに優位に複合化が進んだということを示した。３モル過剰のＴＣＥＰを用いても、モノＰＥＧ  Ａ１ＰＩの約７９％の最大比が達成され、一方、同時プロセスにおいて、ＴＣＥＰ上の４モル過剰では約７４％の最高モノ−ＰＥＧ−Ａ１ＰＩ比が得られた。濃度０．４、２、および４ｍＭ（＝８、４０、８０倍モル過剰）におけるメルカプトエタノールを用いた還元をまた、連続変異体において試験し、また比較のため、最高ＰＥＧ化ターンオーバーの濃度（２ｍＭ）を含んだ。メルカプトエタノールは、ＭＡＬ−ＰＥＧ反応に適合しないため、逐次手法の代替に有用であり得るが、同時複合化プロセスではそうではないことが判明した。
【表１】
2020059717.tif 000037
【０５４９】
最適なモル過剰のＰＥＧの試験
ＰＥＧ化反応に対するＰＥＧ過剰の影響を、同時および逐次プロセスの両方で試験した。このために、還元剤（ＴＣＥＰ）の最適化に関して、修飾バッチを同じ反応条件下で扱った。同時プロセスを４倍、および逐次プロセスを３倍モル過剰のＴＣＥＰ、すなわち、先に決定された理想の還元剤過剰に調整した。ＰＥＧ過剰を除くすべての要因が一定に保たれた。それぞれのバッチのＰＥＧ化ターンオーバーの分析は、ＨＰＬＣによって実施された。
【表２】
2020059717.tif 000038
【０５５０】
両方のＰＥＧ化変異体（表２）の比較は、逐次プロセスにおいて、３倍モル過剰ＰＥＧでさえも最大８５％の最大ＰＥＧ化ターンオーバーをもたらすことをさらに示した。一方、同じ反応条件下（３倍モル過剰ＰＥＧ）で実施された同時プロセスは、このＰＥＧ化ターンオーバーの半分でさえ達成しなかった。その上、表２は、高すぎるＰＥＧ過剰は、天然のＡ１ＰＩの高い比率によって、恐らくＰＥＧ化反応を妨げるということを示す。
【０５５１】
還元Ａ１ＰＩは、ＰＥＧに直接反応することが可能であり、より高いＰＥＧ化ターンオーバーとなるため、より良いＰＥＧ化レートはまた、ＰＤ−１０カラムを用いたＴＥＣＰの除去中に、それぞれのＰＥＧ過剰で充填されたＦａｌｋｏｎ管で還元Ａ１ＰＩを収集することによって、逐次プロセスにおいて達成される。
【０５５２】
比較のため、この短い滞留時間の後でさえ、還元Ａ１ＰＩのごく一部が再酸化したように見え、ＰＥＧターンオーバーが小さかったように、ＰＥＧ試薬をＴＣＥＰ最適化中に実施されたＰＤ−１０カラム手順の後にのみ添加した。
【実施例２７】
【０５５３】
ＰＥＧ化Ａ１ＰＩを用いたエラスターゼの阻害
モノＰＥＧ化Ａ１ＰＩを、実施例８に記載のように、ＭＡＬ−ＰＥＧ  ２０ｋＤとの反応によるＳＨ基の修飾を介して調製し、インビトロ活性試験に供した。この試験は、ブタ膵臓エラスターゼを抑制する能力を、その機能活性の評価基準として判定する。要するに、Ａ１ＰＩまたはＡ１ＰＩ誘導体のエラスターゼ阻害物質活性を、２ステップ反応で判定した。第１のステップにおいて、Ａ１ＰＩ試料を過剰なブタエラスターゼでインキュベートした。これは、錯体形成およびエラスターゼの活性化を引き起こす。第２のステップにおいて、残りのエラスターゼ活性を、エラスターゼ特異的発色性基質Ｓｕｃ（Ａｌａ）３−ｐＮＡの添加によって測定した。ｐＮＡの放出を、測光法で、４０５ｎｍで測定することができ、残留エラスターゼ活性の直接的尺度である。残留エラスターゼ活性は、Ａ１ＰＩ濃度に対する間接比例の所定の範囲内である。アッセイ検定を、α１抗トリプシン（ＷＨＯ０５／１６２；１２．４ｍｇ  機能的に活性なＡ１ＰＩ／ｍＬ）の第１のＷＨＯ標準に対して検査するＡ１ＰＩ基準調製物を使用して、達成する。結果を、ｍｇ活性Ａ１ＰＩ／ｍｌに表した。加えて、総タンパク質含有量をブラッドフォードアッセイによって測定し、活動比率／総タンパク質を検査した。
【０５５４】
結果として、非修飾Ａ１ＰＩと比較して、７４％の活性がモノＰＥＧ化Ａ１ＰＩ修飾変異体に対して判定された。
【図１】
2020059717.tif 000039
【図２】
2020059717.tif 000040
【図３】
2020059717.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月20日(2019.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）治療用タンパク質上に還元システインスルフヒドリル基を産生する、および
（ｂ）水溶性ポリマーの前記還元システインスルフヒドリル基への複合化を可能にする条件下で、前記治療用タンパク質、またはその生物学的に活性な断片を、チオール還元剤および前記水溶性ポリマー、またはその機能的誘導体に接触させるステップを含み、
前記治療用タンパク質が、アクセス可能なシステインスルフヒドリル基を１つしか有しないアミノ酸配列を有するものであり、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、およびトロンビン（ＦＩＩ）からなる群から選択される、方法。
【外国語明細書】
2020059717000001.pdf