(57)【要約】【課題】少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる新規のＡＣＥ阻害ペプチドおよび該ペプチドを含む組成物を提供すること。【解決手段】下記の構造式（１）〜（７）で表されるペプチド、およびその塩を提供する。（１）Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ−Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ【選択図】図１
2010163400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（１）〜（７）で表される新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド、およびその塩。
（１）Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ−Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ
【請求項２】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドの少なくとも１種を含有し、高血圧の症状を緩和することを特徴とする組成物。
【請求項４】
大豆を２５℃以上で麹菌培養物とともに混合攪拌することを特徴とする、請求項１記載のペプチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素を阻害することにより血圧降下の機能を発揮する新規のペプチドならびにこれらのペプチドを含有する組成物、およびその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ、以下ＡＣＥと略す）は、動物体内に存在するカルボキシペプチダーゼの一種であり、アンジオテンシンＩのペプチド結合の一つを切断してアンジオテンシンＩＩを産生する。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧作用を有するペプチドホルモンであり、血管収縮やアルドステロン分泌促進などを通じて血圧上昇を引き起こす。したがって、ＡＣＥ活性を阻害すればアンジオテンシンＩＩの産生を抑制することができ、高血圧症の治療が可能である。これまでにＡＣＥ阻害物質としてカプトプリルなどの医薬品が実用化され、広く使用されている。しかしながら、これら医薬品は作用が強力であるために副作用の懸念があり、多くのＡＣＥ阻害薬では空咳などの副作用に対する注意が必要とされている。
【０００３】
一方、ＡＣＥの基質であるアンジオテンシンＩがペプチドであることから、天然物由来のペプチドによりＡＣＥを競合的に阻害し、副作用の無い高血圧治療剤を提供する研究が行われてきた（例えば、特許文献１〜５参照）。これらのペプチドはその作用が穏やかであることから、安全性が高いと期待される一方、有効量を摂取するためにはペプチドもしくはペプチドを含有する組成物を比較的大量に摂取しなければならないという問題がある。さらには、これらのペプチドの多くは全体の疎水性が高く、このようなペプチドは一般的に苦味が強いと言われており（例えば、特許文献６、非特許文献１〜２参照）、大量に経口摂取することが難しいという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平４−０９１０９７号公報
【特許文献２】特開平５−２６２７９０号公報
【特許文献３】特開平６−０４０９４４号公報
【特許文献４】特開平７−１８８２８２号公報
【特許文献５】特開平１０−１７５９９７号公報
【特許文献６】特開２００６−７５０６４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｅｎｙｉ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ、２００５、（４）、ｐ．６３−７８．
【非特許文献２】藤巻正生ら著、「改定新版食品化学」、朝倉書店、１９７６年３月、ｐ．１１７−１１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる新規のＡＣＥ阻害ペプチドならびにこれらのペプチドを含む組成物、およびその製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、これまでにＡＣＥ阻害作用があることが知られていない化学構造（アミノ酸配列）を有し、その作用が極めて強いペプチドを見出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち本発明は、
１）下記の構造式（１）〜（７）で表される新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド、およびその塩。
（１）Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ−Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ
２）上記１）記載のペプチドの少なくとも１種を含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
３）上記１）記載のペプチドの少なくとも１種を含有し、高血圧の症状を緩和することを特徴とする組成物。
４）大豆を２５℃以上で麹菌培養物とともに混合攪拌することを特徴とする、上記１）記載のペプチドの製造法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる新規のＡＣＥ阻害ペプチドならびにこれらのペプチドを含む組成物、およびその製造法が提供された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のペプチド（１）Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、（２）Ａｓｎ−Ｔｒｐ、（３）Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、（４）Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ、（５）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、（６）Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、（７）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏは、各アミノ酸残基を一般的に使用される３文字表記で表したジペプチドまたはトリペプチドであるが、ｐｙｒｏＧｌｕはピログルタミン酸残基を指す。これらのペプチドは、例えば、化学的に合成する方法で製造することができる。周知の方法として、例えば、アミノ末端側のアミノ酸のアミノ基をベンジルオキシカルボニル基で保護し、カルボキシル基をｐ−ニトロフェニルエステル基で活性化し、カルボキシル末端側のアミノ酸とトリエチルアミン存在下で縮合させた後、接触還元やトリフルオロ酢酸により保護基を除去する液相法と、ポリマー性の固相支持体にカルボキシル末端側のアミノ酸を結合し、アミノ基の保護とカルボキシル基の活性化を施したアミノ酸を順次ペプチド結合により結合した後、トリフルオロ酢酸やフッ化水素などを用いて固相支持体から切断し、アミノ酸側鎖の保護基を除去する固相法があるが、いずれの方法でも製造することができる。なお、ペプチド単体だけではなく、生理学的に許容されるイオンとの塩であっても、同様の効果が期待できる。
【００１１】
また、本発明のペプチドは、該アミノ酸配列を含むタンパク質を適当なプロテアーゼ剤によって加水分解した組成物からカラムクロマトグラフィー等を用いて分離精製することにより製造することもできる。この場合、該ペプチドを含有する組成物の形態で摂取しても目的の効果が得られる。前述の化学合成法と比べ、大量製造が容易であり、製造コストも少ないことから、より好ましい。
【００１２】
本発明のペプチドをタンパク質の加水分解により得る場合のタンパク質源としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、好ましくはマメ科植物を用いるのが良い。さらに好ましくは、栽培量が多く、価格が安く、タンパク質含量が多く、食経験が豊富で、分解後の組成物の呈味が良好という点から、大豆を用いるのが良い。大豆の種類としては、黄大豆、赤大豆、黒大豆などが挙げられるが、特に黄大豆が好ましい。大豆の態様としては、丸大豆（全脂大豆）、脱脂大豆、精製大豆タンパク質などを、そのままあるいは割砕、粉砕してから、適宜タンパク質変性処理を施し、用いることができる。タンパク質変性処理としては、工業的に広く行われている加圧蒸煮が好ましい。
【００１３】
本発明のペプチドをタンパク質の加水分解により得る場合のプロテアーゼ剤としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、プロテアーゼ活性が高く、価格が安く、食経験が豊富で、安全性が保証されており、分解後の組成物の呈味が良好という点から、麹菌培養物を用いるのが良い。麹菌としては、特にアスペルギルス・オリゼー及び／又はアスペルギルス・ソーヤが好適である。これらの微生物は醤油や味噌の醸造において古来よりタンパク質分解に利用されてきたばかりでなく、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）のリストに掲載され、安全性が認められている。麹菌培養物とは、大豆や小麦、米等を培地とし、麹菌を摂取して培養することにより得られるものである。その培養方法の違いにより、液体麹培養物と固体麹培養物に分類されるが、本発明においてはいずれも利用可能である。例えば、液体麹培養物は、大豆や小麦、小麦フスマ等を１〜５％含む液体培地に麹菌を接種し、２５〜４０℃で、２４〜１２０時間培養して得ることができる。また、固体麹培養物は、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、２５〜４０℃で、２４〜１２０時間培養して得ることができる。
【００１４】
前記の加水分解反応の条件としては、麹菌培養物を終濃度１０〜７０％、好ましくは３０〜５０％、大豆を終濃度５〜４０％、好ましくは１５〜３０％、食塩を終濃度０〜２５％、好ましくは６〜１８％、さらに水を終濃度０〜８５％混合し、大豆と食塩の終濃度が前記の範囲になるように調製した後、２５〜６０℃、好ましくは３０〜５５℃で、攪拌速度１０〜１５０ｒｐｍ  にて、１２〜２４０時間、好ましくは２４〜１６８時間反応させる。適宜香味向上のために、チゴサッカロマイセス属等の酵母を添加して、同時に発酵させることも可能である。
【００１５】
前記の製造法により調製した組成物は、本発明のペプチドを含有するにもかかわらず、従来知られているＡＣＥ阻害ペプチド含有組成物とは著しく異なり、苦味がほとんど感じられず、まろやかで豊富な旨味・コクと、穏やかで優れた芳香を有し、食品としておいしく摂取できるものであった。
【００１６】
前記組成物から、本発明のペプチドを分離精製するための方法としては、限外濾過、透析、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。これらは、一般に広く用いられている方法である。特に、サンプルの処理量と精製効率の点から、陽イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーが有効である。
【００１７】
このようにして得られた本発明のペプチドは、ＡＣＥ阻害剤すなわち血圧上昇抑制／降下剤として、経口又は非経口投与により用いることができる。常法に従い、経口投与の場合には、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤などの形態とすることができ、非経口投与の場合には、注射薬製剤、経皮剤、坐剤などとすることができる。
【００１８】
また、高血圧予防及び／又は治療を目的とした飲食品（例えば、健康食品、健康志向食品、機能性食品、特定保健用食品等）に用いることができる。本発明のペプチドを各種飲食品に添加して製造することもできるが、前述の通りペプチドを含有する組成物の形態でも、その風味が良好であるがゆえに、各種飲食品に添加するのは容易である。さらには、組成物そのものを摂取することも容易である。このようにして得られる飲食品としては、例えば、しょうゆ、しょうゆ加工品、粉末しょうゆ、味噌、つゆ・スープ類、だし類、豆乳、発酵乳、清涼飲料、飲料濃縮原液および調整用粉末、酒類、油脂含有食品、麺類、水産加工食品、畜肉加工食品、半固形状食品、ペースト状食品、固形状食品等が挙げられる。
【００１９】
これらのペプチドの投与量は、予防あるいは治療目的・手段により異なるが、ペプチドとして一日当たり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲が好ましい。また、各種飲食品として摂取する場合には、ＩＣ５０で表されるＡＣＥ阻害活性が全体として１ｍｇ／ｍｌ以下になるのが好ましい。
【００２０】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
＜化学合成法によるペプチドの製造＞
以下にＡｓｎ−Ｔｒｐの製造を例示する。なお、特記以外の試薬は和光純薬製を使用した。まず、１２０ｍｇの  Ｌ−トリプトファン塩酸塩を２ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、１５０μｌのトリエチルアミンと３００ｍｇのＺ−Ａｓｎ−Ｏｎｐ（国産化学製）を加え、室温で２４時間攪拌した。次いで、２０ｍｌの１％アンモニア水を加え、−１０℃で１時間放置して生じた析出物を濾取し、析出物を冷水で洗浄した。この析出物を２０ｍｌのメタノールに溶解し、２０ｍｇのパラジウム活性炭素を加え、窒素ガス封入後、接触還元反応を行った。反応は室温、大気圧下で振盪しながら水素ガスを接触させ、３日間行った。反応後、不溶物を濾過除去し、メタノールを溜去した後、蒸留水に溶解した。次いで、ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−８Ａ）に接続したＯＤＳカラム（ナカライテスク製Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ  ２０×２５０ｍｍ）により分取精製を行った。溶離液Ａは超純水＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶離液Ｂはアセトニトリル＋０．１％  ＴＦＡとし、常法に従いグラジエント溶出した。各フラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で展開し、ニンヒドリン試薬でスポットが現れるフラクションから８７ｍｇのＡｓｎ−Ｔｒｐを得た。この化学構造は、プロテインシークエンサー（アプライドバイオシステムズ製Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２）、及びＮＭＲ（ブルカー製ＡＶＡＮＣＥ  ５００）、及びＬＣ−ＭＳ（アジレントテクノロジーズ製１１００、アプライドバイオシステムズ製ＱＳＴＡＲ  Ｅｌｉｔｅ、カラムは野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ）を用いて常法に従い確認した。
【００２２】
前記合成法により得られたペプチドのＡＣＥ阻害活性を測定した。測定法としては、Ｙａｍａｍｏｔｏらの方法を一部改変した方法で行った。すなわち、１００μｌの基質溶液（１２．５ｍＭ  Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（シグマ製）、１００ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．３、１Ｍ  ＮａＣｌ）に１４０μｌのサンプル溶液と１０μｌの酵素溶液（０．３Ｕ／ｍｌ  ＡＣＥ（ウサギ肺由来、シグマ製）、５０ｍＭホウ酸バッファーｐＨ８．３）を加え、３７℃で３０分間反応した。次いで、２５０μｌの１Ｎ塩酸を加えて反応を停止し、１．５ｍｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、遠心分離後、１ｍｌの酢酸エチル層を遠心濃縮乾固し、１ｍｌの超純水に溶解して、２２８ｎｍの吸光度を測定した。ＡＣＥ阻害率は、次式で表される。
【００２３】
ＡＣＥ阻害率（％）＝｛１−（ＯＤｓ−ＯＤｓｂ）／（ＯＤｃ−ＯＤｃｂ）｝×１００
なお、ＯＤｓは前記の通りサンプルに酵素溶液を加えて反応させたときの吸光度であり、ＯＤｓｂは酵素溶液の代わりに超純水を加えたときの吸光度、ＯＤｃはサンプル溶液の代わりに超純水を加えたときの吸光度、ＯＤｃｂは酵素溶液とサンプル溶液の代わりに超純水を加えたときの吸光度である。また、この反応系に対し５０％の酵素活性阻害率を与えるサンプルの濃度をＩＣ５０値とする。
【００２４】
本発明のペプチドのＡＣＥ阻害活性を表１に示す。なお、これまでに報告された主なＡＣＥ阻害ペプチド、約４００種類のＩＣ５０値は約１〜１０００μＭであった（山田耕路編著、「食の科学ライブラリー３  食品成分のはたらき」、朝倉書店、２００４年３月、ｐ．６３−６７）。本発明のペプチドは、既知のペプチドと比較して充分に強い活性を有しているため、産業上有用と考えられる。
【００２５】
【表１】
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【実施例２】
【００２６】
＜大豆を麹菌培養物で分解する方法によるペプチドの製造＞
加熱変性した丸大豆と小麦を等量含む固体培地に、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子を添加して、２５〜４０℃で７２時間培養することにより麹菌培養物を得た。次に、加熱変性した丸大豆１４ｋｇ、麹菌培養物２ｋｇ、水１６Ｌ、食塩３ｋｇを混合し、４５℃、１００ｒｐｍで５日間攪拌して諸味を得た。次いで、酵母チゴサッカロマイセス・ルーキシーを１．５×１０６個／ｍｌの割合で混合し、２５℃で７日間静置した。次いで、油圧式圧搾機を用いて諸味から不溶性固形分を除去し、清澄液を得た。さらに、ＨＳ殺菌機（日阪製作所製）を用いて１１７℃で５秒間加熱することにより酵素失活と殺菌を行い、５０℃で３日間静置した後、滓成分を含まない上清のみを２０Ｌ採取した（組成物１）。
【００２７】
５Ｌの組成物１を電気透析により食塩約０％まで脱塩し、カラム容積１８ＬのＯＤＳカラム（ダイソー製ＳＰ−１２０−４０／６０−ＯＤＳ−Ｂ）にロードした。溶離液Ａは０．１％  ＴＦＡを含む蒸留水、溶離液Ｂは０．１％  ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル、溶離液Ｃは０．１％  ＴＦＡを含むアセトニトリルとし、ＡからＢまで２０時間、次いでＢからＣまで５時間のリニアグラジエント溶出を行った。流速は４５ｍｌ／ｍｉｎとし、１６００ｍｌずつのフラクションを得た。６本ずつのフラクションを合わせてエバポレーターで濃縮し、凍結乾燥粉末を得た。これらのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０値）を測定した。
【００２８】
上記の凍結乾燥粉末を超純水に溶解後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、島津製作所）に接続したＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ−５Ｃ１８−ＡＲＩＩ  ２０  ｘ  ２５０ｍｍ、ナカライテスク）にロードした。溶離液Ａは０．１％  ＴＦＡを含む超純水、溶離液Ｂは０．１％  ＴＦＡを含む７０％  アセトニトリルとし、Ｂ：０％で１０分ホールド後、Ｂ：０％からＢ：３０％まで７０分間、次いでＢ：１００％まで２０分間のリニアグラジエント溶出を行った。流速は５ｍｌ／ｍｉｎとし、７．５ｍｌずつのフラクションを得た。各フラクションから１００μｌずつサンプリングし、遠心濃縮乾固後、５００μｌの超純水に再溶解し、ＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００２９】
さらに、ＡＣＥ阻害活性を有するフラクションをＣ３０カラム（野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ−ＡＲ  ２０×２５０ｍｍ）にロードした。溶離液Ａは超純水＋０．１％  ＴＦＡ、溶離液Ｂは４０％アセトニトリル＋０．１％  ＴＦＡとし、グラジエント条件は、（Ａ１００％：１０分間）→（Ｂ３０％までグラジエント：６０分間）→（Ｂ１００％までグラジエント：３０分間）とし、流速５ｍｌ／分、フラクションサイズ６ｍｌで分画した。そのクロマトグラムを図１に示す。ＡＣＥ阻害活性を測定したところ、矢印で示したピークにのみ活性が見られた。このフラクションをエバポレーターで濃縮し、プロテインシークエンサー、ＮＭＲ、ＬＣ−ＭＳで構造解析したところ、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏであった。同様にして、他の画分から、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏを単離した。
【００３０】
前記のＬＣ−ＭＳを用いて組成物１に含まれる本発明のペプチドを定量した。まず、化学合成により得られたペプチドを標品として検量線を作成した。次いで、組成物１を電気透析により脱塩し、適宜希釈して分析を行い、各ペプチドに由来する検出されたイオン量から含有量を計算した。その結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2010163400.tif 000004
【００３２】
同様に、条件の異なる製造法で得られた組成物に含まれる、本発明のペプチドの含有量を表３に示す。比較例として、大豆の代わりに小麦、麹菌培養物の代わりに食品用プロテアーゼ剤（ノボザイムズ製アルカラーゼ２．４Ｌ−ＦＧ）を使用した。表３の結果から、原料としては大豆が優れ、酵素剤としては麹菌培養物が優れ、反応温度は２５℃以上が優れることが判る。すなわち、大豆を麹菌培養物とともに２５℃以上で混合攪拌することにより、本発明のペプチドを特に効率的に製造できる。
【００３３】
【表３】
2010163400.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明で得られる新規アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、少量の摂取でＡＣＥを有効に阻害し、かつ副作用の心配が無く、高血圧者が日常生活の中で容易に経口摂取できる。また、該ペプチドを含み、風味に優れ、安全性が高く、食品としての摂取が容易な組成物の製造法を提起したことにより、高血圧者の生活の質の向上に大きく貢献することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】組成物１からＡｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを単離した際のＵＶピークを示す図である。
【図１】
2010163400.tif 000006