【事件の表示】
　特許第６６５１０６６号発明「ヘモグロビン類測定用試薬及びヘモグロビン類の測定方法」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。
【結　論】
　特許第６６５１０６６号の明細書及び特許請求の範囲を訂正請求書に添付された訂正明細書及び特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項〔１−６〕について訂正することを認める。
　特許第６６５１０６６号の請求項１、５及び６に係る特許を維持する。
　特許第６６５１０６６号の請求項２〜４に係る特許についての特許異議の申立てを却下する。
【理　由】
第１　手続の経緯
　特許第６６５１０６６号の請求項１〜６に係る特許についての出願は、２０１９年（令和元年）９月５日（優先権主張　２０１８年９月１２日　 日本）を国際出願日とする出願であって、令和２年１月２３日にその特許権の設定登録がされ、令和２年２月１９日に特許掲載公報が発行された。その後、その特許について、令和２年８月１７日に特許異議申立人鈴木　敏明（以下「申立人」という。）により特許異議の申立てがされ、当審は、同年１０月２８日付けで取消理由を通知した。特許権者は、その指定期間内である同年１２月２４日に意見書の提出及び訂正の請求を行い、その訂正の請求に対して、申立人は、令和３年２月９日に意見書を提出した。そして、当審は、同年３月１７日付けで取消理由（決定の予告）を通知し、特許権者は、その指定期間内である同年５月２０日に意見書の提出及び訂正の請求（以下当該訂正の請求を「本件訂正請求」という。）を行った。
　なお、上記のとおり、特許権者は本件訂正請求を行ったが、下記に記載のとおり、本件訂正請求によって特許請求の範囲の「非イオン性界面活性剤」は「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」のみに減縮され、「非イオン性界面活性剤」が「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」については申立人は既に意見を述べており、事件において提出された全ての証拠や意見を踏まえてさらに審理を進めたとしても特許を維持すべきとの結論となると合議体は判断したため、申立人に意見書の提出を求めなかった。
第２　訂正の適否
１　訂正の内容（下線は、訂正箇所を示す。）
（１）訂正事項１
　特許請求の範囲の請求項１に、
「前記非イオン性界面活性剤が、下記成分Ａ１、下記成分Ａ２、下記成分Ａ３、下記成分Ａ４、下記成分Ａ５又は下記成分Ａ６である、ヘモグロビン類測定用試薬。
　成分Ａ１：オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル
　成分Ａ２：オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル
　成分Ａ３：オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル
　成分Ａ４：オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル
　成分Ａ５：オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル
　成分Ａ６：ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル」
とあるのを、
「前記非イオン性界面活性剤が、
オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル
。
　そして、請求項１の記載を引用する、請求項５，６も同様に訂正する。
（２）訂正事項２
　特許請求の範囲の請求項２を削除する。
（３）訂正事項３
　特許請求の範囲の請求項３を削除する。
（４）訂正事項４
　特許請求の範囲の請求項４を削除する。
（５）訂正事項５
　特許請求の範囲の請求項５に、「請求項１〜４のいずれか１項」とあるのを、「請求項
１
　そして、請求項５に係る発明を引用する請求項６も同様に訂正する。
（６）訂正事項６
　特許請求の範囲の請求項６に、「請求項１〜５のいずれか１項」とあるのを、「請求項１
又は５
（７）訂正事項７
　明細書の段落【０１８６】において、「実施例２〜２３、参考例２４〜３０」とあるのを、　「実施例２
，３、参考例４
　明細書の段落【０１９４】、【０１９５】、【０１９７】、【０２０１】、【０２０６】、【０２０７】、【０２１４】において、「実施例２〜２３、参考例１，２４〜３０」とあるのを、「実施例２
，３、
４
　明細書の段落【０２０９】の【表２】において、「実施例４」、「実施例５」、「実施例６」、「実施例７」及び「実施例８」とあるのをそれぞれ、「
参考
参考
参考
参考
参考
　明細書の段落【０２１０】の【表３】において、「実施例９」、「実施例１０」、「実施例１１」、　「実施例１２」、「実施例１３」、「実施例１４」、「実施例１５」、「実施例１６」及び「実施例１７」とあるのをそれぞれ、「
参考
参考
参考
参考
参考
参考
参考
参考
　明細書の段落【０２１２】の【表５】において、「実施例１８」、「実施例１９」、「実施例２０」、「実施例２１」、「実施例２２」及び「実施例２３」とあるのをそれぞれ、「
参考
参考
参考
参考
参考
参考
　明細書の段落【０２１５】において、「実施例３１〜３８」とあるのを、「実施例３１
，３２、参考例３３
　明細書の段落【０２１６】において、「実施例３２，３４，３６〜３８」とあるのを、「実施例３２
、参考例
　明細書の段落【０２１９】及び【０２２４】において、「実施例３１〜３６」とあるのを、「実施例３１
，３２、参考例３３
　明細書の段落【０２３１】の【表７】において、「実施例３３」、「実施例３４」、「実施例３５」、「実施例３６」、「実施例３７」及び「実施例３８」とあるのをそれぞれ、「
参考
参考
参考
参考
参考
参考
　明細書の段落【０２３２】において、「実施例３１〜３６」、「実施例３７，３８」、「実施例３１〜３６」及び「実施例３１〜３６」とあるのをそれぞれ、「実施例３１
，３２、参考例３３
参考
，３２、参考例３３
，３２、参考例３３
　なお、訂正前の請求項１〜６は、請求項２〜６が訂正の対象である請求項１を引用するものであるから、訂正前において一群の請求項に該当し、上記訂正は一群の請求項に対してされたものである。
２　訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（１）訂正事項１について
　上記訂正事項１は、請求項１に規定されている非イオン性界面活性剤を、訂正前の請求項１に規定されていた成分Ａ１の下位概念である「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」に限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、本件明細書の発明の詳細な説明の段落【００７３】に、「界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ１におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは９以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは１１以上、好ましくは１９以下である。」と記載され、段落【０２０８】及び【０２０９】に実施例２及び３として、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」が記載されているから、これらの訂正は、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
（２）訂正事項２〜４について
　訂正事項２〜４は、特許請求の範囲の請求項２〜４を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。そして、この訂正が、新規事項の追加に該当せず，実質上特許請求の範囲を拡張し，又は変更するものではないことは明らかである。
（３）訂正事項５及び６について
　訂正事項５に係る請求項５についての訂正及び訂正事項６に係る請求項６についての訂正は、訂正事項２〜４により請求項２〜４が削除されたことに伴い、訂正前の請求項５及び６が引用する請求項２〜４を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。そして、この訂正が、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
（４）訂正事項７について
　訂正事項７は、上記訂正事項１〜６に伴って、訂正後の請求項１に記載の特許発明及び該請求項１に従属する訂正後の請求項５、６に記載の特許発明に、実施例４〜２３、３３〜３８が含まれなくなったことに伴い、特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載との整合を図るための訂正であるから、明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、この訂正が、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではないことは明らかである。
３　小括
　以上のとおりであるから、本件訂正請求による訂正は、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号及び第３号に掲げる事項を目的とするものであり、かつ、同条第９項において準用する同法第１２６条第５項及び第６項の規定に適合する。
　したがって、明細書、特許請求の範囲を、訂正請求書に添付された訂正明細書、特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項〔１−６〕について訂正することを認める。
第３　訂正後の本件発明
　本件訂正請求により訂正された請求項１〜６に係る発明（以下「本件発明１〜６」という。）は、訂正特許請求の範囲の請求項１〜６に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
「　　【請求項１】
　陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、
　非イオン性界面活性剤を含み、
　前記非イオン性界面活性剤が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテルである、ヘモグロビン類測定用試薬。
　　【請求項２】　削除
　　【請求項３】　削除
　　【請求項４】　削除
　　【請求項５】
　前記非イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である、請求項１に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
　　【請求項６】
　赤血球含有検体と、請求項１又は５に記載のヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、
　前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法。」
第４　取消理由通知（決定の予告）に記載した取消理由について
１　取消理由（決定の予告）の概要
　請求項１〜６に係る特許に対して、当審が令和３年３月１７日に特許権者に通知した取消理由（決定の予告）の要旨は、次のとおりである。
（１）請求項１、３〜６に係る特許は、特許請求の範囲の記載が、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
（２）請求項１〜６に係る発明は、本件特許出願前に日本国内又は外国において、頒布された下記の引用文献１〜５に記載された発明又は電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった発明に基いて、本件特許出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、請求項１〜６に係る特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。
引用文献１：特開２００１−０２１５５５号公報（甲１号証）
引用文献２：特開２００７−１６３１８２号公報（甲４号証）
引用文献３：特開２０１３−０３６９５９号公報（甲５号証）
引用文献４：特開２０１４−０２５９１８号公報（甲６号証）
引用文献５：Masahiro FUKUDA, Misao KOIDE, Kazuo OHBU, Effects of Hydrophile-Lipophile Balance of Alkyl Poly (oxyethylene) Ethers on Hemolysis, Journal of Japan Oil Chemists' Society, JP, Japan Oil Chemists' Society, １９８７年８月２０日, Volume 36 Issue 8 Pages 576-580（甲７号証）
２　引用文献の記載
（１）引用文献１について
ア　引用文献１（特開２００１−０２１５５５号公報、甲１号証）に記載された事項
　引用文献１には、以下の事項が記載されている。
（引１ａ）「【０００８】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するために、請求項１記載の本発明は、
カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬
（引１ｂ）「【００１９】上記
溶血試薬には、
（１）無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を添加してもよい。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、また、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化ストロンチウム、水酸化セシウム、水酸化ニッケル、水酸化アルミニウム、水酸化カドミウム等が挙げられる。　これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０体積％であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩などが析出しない程度で用いるのが好ましい。
【００２０】（４）
界面活性剤として、
ノニオン性界面活性剤が使用され
ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル
単独でもまた複数混合して用い
【００２１】これらの
界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１〜１０重量％である
（引１ｃ）「【００４１】
【実施例】次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００４２】（実施例１）
〔充填剤１の調製：カルボキシル基〕テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及びメタクリル酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子を得た。
【００４３】〔カラムの充填〕得られた充填剤１をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３０ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００４４】〔ヘモグロビン類の測定〕得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。
（測定条件）
　システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
　　　　　　オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
　　　　　　検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
　溶離液：溶離液Ａ：７０ｍＭのリン酸緩衝液（和光純薬社製；ｐＨ５．７）
　　　　　溶離液Ｂ：７０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２５０ｍＭ硝酸ナトリウム
　　　　　測定開始より０〜２分の間は溶離液Ａを流し、２〜２．１分の間は溶離液Ｂを流し、２．１〜３分の間は溶離液Ａを流した。
　流速：２．０ｍｌ／分
　検出波長：４１５ｎｍ
　試料注入量：１０μｌ
【００４５】
（測定試料：Ａ）健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した。これに、１５０倍量の溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）とカオトロピックイオンを生成する化合物として１００ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血試薬（ｐＨ７．５））を添加して溶血し、測定試料とした。
（測定試料Ｂ；ＡＨｂ）健常人血１０ｍｌにフッ化ナトリウムを添加し（１０ｍｇ／ｍｌ）、さらに０．３重量％アセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で３時間反応させた。これに、１５０倍量の溶血試薬（０．１重量％トリトンＸ−１００と１００ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血試薬（ｐＨ７．５））を添加して溶血し、測定試料とした。
【００４６】（測定結果）上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１、２に示す。図１は、試料Ａを測定した結果、図２は、試料Ｂを測定した結果を示す。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂを示す。図２では、ピーク４と６とが良好に分離されている。また、上記測定試料Ａ、Ｂを５検体測定し安定型ＨｂＡ１ｃの測定精度（ＳＤ；標準偏差、ＣＶ；変動係数値）を求めた結果を表１に示す。」
イ　引用文献１に記載された発明
（ア）上記（引１ａ）及び（引１ｂ）より、引用文献１には、以下の発明（以下「引用発明」という。）が記載されている。
「カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬であって、
　界面活性剤として、ノニオン性界面活性剤である、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテルを、単独でもまた複数混合して用いる溶血試薬。」
（イ）上記（引１ｃ）より、引用文献１には、実施例として以下の「測定試料：Ａ」が記載されている。
「測定試料：Ａとして、健常人血を採血し、抗血液凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌとなるよう添加し、これに、１５０倍量の溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）とカオトロピックイオンを生成する化合物として１００ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血試薬（ｐＨ７．５））を添加して溶血した測定試料：Ａ。」
（ウ）上記（イ）の「測定試料：Ａ」に使用される溶血試薬は、上記（引１ａ）より「カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬」であるから、上記ｂより引用文献１には、実施例としては以下の発明（以下「引用発明’」という。）が記載されている。
「カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬であって、
　界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）とカオトロピックイオンを生成する化合物として１００ｍＭグアニジン及び１０ｍＭリン酸緩衝溶液からなる溶血試薬（ｐＨ７．５）」
（２）引用文献２について
ア　引用文献２に記載された事項
　引用文献２には、以下の事項が記載されている。
（引２ａ）「【００１５】
　本発明に係る
溶血試薬は、ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤
を含有し、糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しない
【発明の効果】
【００１６】
　本発明に係る溶血方法および
溶血試薬
速に赤血球を完全溶血することができ、且つ酵素への活性阻害もない
　また、本発明に係る溶血方法および溶血試薬は、
糖尿病用のＨｂＡ１ｃ測定マイクロチップに使用するのに特に好適である
（引２ｂ）「【００２２】
　本発明者らは、前記特定の成分を検出するための酵素の活性を低下させることがなく、同時に迅速に完全溶血の能力を持つ溶血試薬を探索するために、数多くのノニオン性界面活性剤について検討した結果、
ＨＬＢ値が１1〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤が迅速に完全溶血でき
ことを見出すに至った。
　また、上記特性値を満たすノニオン性界面活性剤は、さらに
エーテル型ノニオン性界面活性剤であることにより、完全溶血するまでの時間をさらに短くすることができた
　ＨＬＢ値とは界面活性剤の水と油(水に不溶性の有機化合物)への親和性の程度を表す値であり、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ-Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅの頭文字を取ったものである。親水親油バランスともいう。この概念は１９４９年にＡｔｌａｓＰｏｗｄｅｒＣｏｍｐａｎｙのウィリアム・グリフィンによって提唱された。計算によって決定する方法がいくつか提案されている。
　（１）アトラス法:　エステル系の界面活性剤について、鹸化価をＳ、界面活性剤を構成する脂肪酸の酸価をＡとし、ＨＬＢ値を２０（１−Ｓ／Ａ)で定義する。
　（２）グリフィン法：　ＨＬＢ値＝２０×親水部の式量の総和／分子量で定義する。
　（３）デイビス法:　官能基によって決まる基数を定め(例えばメチル基やメチレン鎖は親油基で０．４７５、水酸基は親水基で１．９など)、ＨＬＢ値＝７＋親水基の基数の総和−親油基の基数の総和で定義する。界面活性剤の混合物のＨＬＢ値は各成分のＨＬＢ値の加重平均となる。
　（４）標準試料にＨＬＢ値を決定したい界面活性剤を添加して乳化し、実験的に決定する方法もあるが煩雑であるためあまり行われない。
　（５）高速液体クロマトグラフィーでの保持時間から決定する方法もある。
　本発明には、有機概念図（甲田善生，「有機概念図　−基礎と応用−」，ｐ．２２７(１９８４）三共出版）に基づくＩＯＢ方法で求めたＨＬＢ値を用いた。ＩＯＢ値は界面活性剤の無機性値と有機性値の比で、ＨＬＢ値はＩＯＢ値×１０の値である。
【００２３】
　本発明においては、下記一般式（１）で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤を用いることが好ましい。
　一般式（１）
　Ｒ−（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ
　上記一般式（１）中、Ｒは、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよい脂肪族炭化水素基、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい脂環式炭化水素基、または、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよい芳香族炭化水素基であり、ｎは５〜２０の整数である。
　上記脂環式炭化水素基としては、１つの環の炭素数が５〜６であり、脂環式炭化水素環の数が１〜４であるものが好ましく挙げられる。
　上記芳香属炭化水素基としては、１つの環の炭素数が５〜６であり、芳香属炭化水素環の数が１〜４であるものが好ましく挙げられる。
【００２４】
　ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤として好ましくは、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンイソセチルエーテル、ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル及び、炭素数８〜２０の直鎖でも分岐していてもよいアルキル基を置換基として有していてもよいポリオキシエチレンフェニルエーテルが挙げられる。
【００２５】
　本発明においてさらに好ましく使用される
ノニオン性界面活性剤として
　
ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１７のもの）、
　ポリオキシエチレンオレイルエーテル（オキシエチレン単位１２〜２０のもの）、
　ポリオキシエチレンステアリルエーテル（オキシエチレン単位１１〜２０のもの）、
　
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位7〜１２のもの）、
　ポリオキシエチレンイソセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１５のもの）、
　ポリオキシエチレンイソステアリルエーテル（オキシエチレン単位１０〜２０のもの）、
　ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、
　ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル（オキシエチレン単位１６〜２０のもの）及び
　ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（該アルキル基は、炭素数が８〜２０であり、直鎖でも分岐していてもよい。例えば、オキシエチレン単位平均９〜１０含有　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）
が挙げられる。
【００２６】
　本発明において溶血剤に用いられる
上記界面活性剤の使用濃度は、０．０５％〜５％（質量濃度）が好ましく、好ましくは０．０５％〜１％、より好ましくは０．１％〜１％、さらに好ましくは０．１％〜０．２％である
（引２ｃ）「【００４４】
　
表１に、
迅速溶血評価結果
をまとめて示す。
【００４５】
　上記のノニオン性界面活性剤の溶血性能と酵素への阻害評価の結果から、本願発明の
ノニオン性界面活性剤（化合物１〜化合物６）
１１〜１３という特定のＨＬＢ値範囲内のポリオキシエチレンエーテルが優れた溶血能力を有し
【００４６】
【表１】
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　」
イ　引用文献２に記載された技術事項
（ア）上記（引２ａ）より、引用文献２には、「ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤を含有」する「溶血試薬は」、「糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しない」ものであって、「迅速に赤血球を完全溶血することができ」、「糖尿病用のＨｂＡ１ｃ測定マイクロチップに使用するのに特に好適である」旨記載されている。
（イ）上記（引２ｂ）より、引用文献２には、「迅速に完全溶血でき」る「ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤が」、「エーテル型ノニオン性界面活性剤であることにより、完全溶血するまでの時間をさらに短くすることができ」る旨、「ノニオン性界面活性剤として」、「ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１７のもの）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（オキシエチレン単位１２〜２０のもの）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位7〜１２のもの）」「が挙げられる」旨記載されている。
（ウ）上記（引２ｃ）より、引用文献２には、「１１〜１３という特定のＨＬＢ値範囲内のポリオキシエチレンエーテル」である「ノニオン性界面活性剤（化合物１〜化合物６）」は、「優れた溶血能力を有」する旨記載され、「迅速溶血評価結果」が示された「表１」より、ポリオキシエチレンラウリルエーテルである化合物１〜３と、ポリオキシエチレンセチルエーテルである化合物５が、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００である化合物６と同様に「迅速溶血評価結果」が良好である旨記載されている。
（エ）上記（ア）〜（ウ）より引用文献２には、以下の技術事項（以下「技術事項２」という。）が記載されている。
「ＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤を含有する溶血試薬は、糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しないものであって、迅速に赤血球を完全溶血することができ、糖尿病用のＨｂＡ１ｃ測定マイクロチップに使用するのに特に好適であり、
　迅速に完全溶血できるＨＬＢ値が１１〜１３の範囲のノニオン性界面活性剤は、エーテル型ノニオン性界面活性剤であることにより、完全溶血するまでの時間をさらに短くすることができ、
　ノニオン性界面活性剤として、
　ポリオキシエチレンセチルエーテル（オキシエチレン単位１０〜１７のもの）、
　ポリオキシエチレンオレイルエーテル（オキシエチレン単位１２〜２０のもの）、
　ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位７〜１２のもの）
が挙げられ、
　実際に、ポリオキシエチレンラウリルエーテルである化合物１〜３と、ポリオキシエチレンセチルエーテルである化合物５が、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００である化合物６と同様に迅速溶血評価結果が良好である。」
（３）引用文献３について
ア　引用文献３に記載された事項
　引用文献３には、以下の事項が記載されている。
（引３ａ）「【００１５】
　
本発明の測定方法の特徴的な構成
　本発明の
全血検体の成分測定方法は
（１）
全血検体を
界面活性剤を含む溶液と希釈する工程
（２）
希釈した検体の目的成分を測定する工程
（３）希釈した検体のヘモグロビン（Ｈｂ）量を定量する工程。
（４）（２）における測定結果を、（３）における定量値に基づいてヘマトクリット（Ｈｔ）補正を行うことにより、血清または血漿を測定した際の測定結果に換算する工程。」
（引３ｂ）「【００１８】
「目的成分の測定」
　本発明の
成分測定方法が対象とする目的成分
は、
　目的成分としては、総タンパク質（ＴＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、コリンエステラーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、γ−ＧＴＰ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン（Ｔ．Ｂ）、直接ビリルビン（Ｄ．Ｂ）　、アミラーゼ（ＡＭＹ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、中性脂肪（トリグリセリド）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、クロール（Ｃｌ）、カルシウム（ＣＡ）、無機リン（ＩＰ）、鉄（血清鉄：ＦＥ）、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）、グルコース（ＧＬＵ）、
ＨｂＡ１ｃ
　目的成分の測定方法としては、検体と目的成分に反応する試薬とを接触させることにより生じる物理化学的変化を測定する方法など、種々の公知の測定原理を用いた方法が挙げられる。物理化学的変化としては、色素の化学変化や凝集による光学的・電気化学的変化などが例示され、その手段として、酵素などを介してもよい。
　波長は、適宜設定すればよく３００ｎｍから８５０ｎｍの間であれば、特に限定されない。ヘモグロビン量の定量と同じ波長を用いることもできる。」
（引３ｃ）「【００２５】
「界面活性剤」
　本発明の
成分測定方法で用いる界面活性剤としては、
（ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物
Ｒ−Ｏ−Ｘ　・・・（Ｉ）
（Ｒは、炭素数が９〜１８のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、ポリオキシエチレン残基である。）
　このような化合物としては、エマルゲン１３０Ｋ、エマルゲン１５０、
エマルゲン１４７、エマルゲン１２０が例示
（引３ｄ）「【００３２】
　後述の実施例でも示すように、全血検体を、本発明の方法で用いる酸化剤および界面活性剤を含む溶液で希釈することによって、迅速にＨｂの吸光度が一定になる。
　このような現象がおこる理由は、本発明
の界面活性剤を用いることでＨｂの溶血および試料の均一化が迅速に行われ
　これにより、好ましくは希釈後６０秒、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、１０秒以下でＨｂの吸光度が一定になり、迅速なＨｂ定量が可能となることから、トータルでの測定時間が、好ましくは１０分、５分、３分、２分、６０秒以下と大幅に短縮されるため、迅速な測定が可能となる。」
イ　引用文献３に記載された技術事項
　上記（引３ａ）〜（引３ｃ）より、引用文献３には、以下の技術事項（以下「技術事項３」という。）が記載されている。
「全血検体の成分測定方法は、
　全血検体を、界面活性剤を含む溶液と希釈する工程と、
　希釈した検体の目的成分を測定する工程とを含み、
　成分測定方法が対象とする目的成分は、ＨｂＡ１ｃであり、
　成分測定方法で用いる界面活性剤としては、エマルゲン１４７、エマルゲン１２０が例示され、
　これらの界面活性剤を用いることでＨｂの溶血および試料の均一化が迅速に行われる技術。」
（４）引用文献４について
ア　引用文献４に記載された事項
　引用文献４には、以下の事項が記載されている。
（引４ａ）「【００３０】
　界面活性剤ＡとＢとの組み合わせによって血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除が可能となるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように考えられる。界面活性剤Ａに、血球への溶解性の高い界面活性剤Ｂが組み合わされることにより、界面活性剤Ａ及びＢが混合ミセルを形成し、この混合ミセルが、その割合によって界面活性剤Ａの血球への選択性を邪魔することなく血球に選択的に作用し、
界面活性剤Ｂの高い溶解性により接触した血球を迅速に溶解す
（引４ｂ）「【００４５】
　［界面活性剤Ｂ］
　本開示の処理方法に使用する
界面活性剤Ｂは、赤血球を溶解する能力が
高い非イオン性界面活性剤である
【００４６】
　界面活性剤Ｂは、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、非イオン性界面活性剤であって、一又は複数の実施形態において、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００４７】
　ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル型の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、好ましくは下記式（III）で表わされる非イオン性界面活性剤である。
Ｒ3-Ｏ-(ＡＯ)m/(ＥＯ)n-Ｒ4　　（III）
［前記式（III）中、Ｒ3は炭素数１〜２４のアルキル基であり、Ｒ4は水素原子又は炭素数1〜３のアルキル基を示し、ＡＯは炭素数３〜６のオキシアルキレン基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｍ及びｎはそれぞれＡＯ及びＥＯの平均付加モル数である。ｍは１〜１００の数であり、ｎは０〜５０の数であり、／はＡＯ基及びＥＯ基が、順序に関係なく、ランダム又はブロックのいずれに付加したものであってもよいことを示す。］
【００４８】
　前記式（III）のＲ3は、一又は複数の実施形態において、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル等が挙げられる。前記式（III）のＲ4は、水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、前記アルキル基は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基である。前記式（III）中、ＡＯとしては、一又は複数の実施形態において、ポリオキシポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。前記式（III）中、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ｍは、１〜６０が好ましく、１〜３０がより好ましい。同様に、ｎは、１〜５０が好ましく、１〜２５がより好ましい。
【００４９】
　前記式（III）の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルが好ましい。前記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、ＨＬＢ値（親水性−親油性バランス値）が、１０．０〜１８．０のものが好ましく、より好ましくは１２．０〜１５．０、さらに好ましくは１２．５〜１３．５である。さらに、前記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、同様の観点から、曇点（℃／２％水溶液）が、３４℃〜８８℃のものが好ましく、より好ましくは４０℃〜７５℃、さらに好ましくは５０℃〜６０℃である。
【００５０】
　前記式（III）の界面活性剤Ｂは、一又は複数の実施形態において、市販品として、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ−２０７、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ−２１０、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ−２１２、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ−２１５、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ−２２０、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ−２３０(以上、日本エマルジョン社製)、プルラファックＬＦ３００、プルラファックＬＦ４００、プルラファックＬＦ４３１、プルラファックＬＦ７１１、プルラファックＬＦ９００、プルラファックＬＦ９０１、プルラファックＬＦ１３００〔ＢＡＳＦジャパン（株）製〕及びエマルゲンＬＳ−１０６、エマルゲンＬＳ−１１０、エマルゲンＬＳ１１４、エマルゲンＭＳ１１０〔花王（株）製〕として市販され、ワンダーサーフＲＬ−８０、ワンダーサーフＲＬ−１００、ワンダーサーフＲＬ−１４０、ワン
ダーサーフＳ−８００、ワンダーサーフＳ−１０００、ワンダーサーフＳ−１４００（以上、青木油脂社製）、ユニセーフＰＫＡ−５０１５、ユニセーフＰＫＡ−５０１６、ユニセーフＰＫＡ−５０１７、ユニセーフＬＭ−２（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
【００５１】
　
ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）型の界面活性剤Ｂは
下記式（IV）で表わされる非イオン性界面活性剤である
Ｒ5-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ6　　　　（IV）
［前記式（IV）中、Ｒ5は炭素数１２〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって８〜２２であり、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］
【００５２】
　前記式（IV）のＲ5は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、分岐鎖を有する炭素数１２〜４０の炭化水素基であることが好ましく、より好ましくは分岐鎖を有する炭素数１２〜３０のアルキル基である。前記炭化水素基及びアルキル基の炭素数は、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、１２〜２８が好ましく、より好ましくは１４〜２６、さらに好ましくは１６〜２４、さらにより好ましくは１８〜２２、さらにより好ましくは２０である。前記式（IV）のＲ5の好ましい実施形態として、イソヘキシル基、イソノニル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソヘキサデシル基、ヘキシルデシル基、ヘキシルドデシル基、ヘキシルヘキサデシル基、オクチルデシル基、オクチルドデシル基、オクチルヘキサデシル基、ノニルデシル基、ノニルドデシル基、ノニルヘキサデシル基が挙げられ、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、オクチルドデシル基が好ましい。前記式（IV）のＲ6は、水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基であって、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、前記アルキル基は、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基である。前記式（IV）として、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、下記式（V）がより好ましい。
【００５３】
【化３】
【００５４】
　式（IV）及び（V）におけるＥＯの平均付加モル数ｎは、一又は複数の実施形態において、血液中の稀少細胞に対するダメージを抑制しつつ血球の排除をする観点から、１０〜２２が好ましく、より好ましくは１３〜２２、さらに好ましくは１５〜２１、さらにより好ましくは１８〜２１、さらにより好ましくは２０である。」
イ　引用文献４に記載された技術事項
　上記（引４ａ）及び(引４ｂ)より、引用文献４には、以下の技術事項（以下「技術事項４」という。）が記載されている。
「高い溶解性により接触した血球を迅速に溶解する界面活性剤Ｂは、赤血球を溶解する能力が高い非イオン性界面活性剤であって、
　下記式（IV）で表わされるポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）型の非イオン性界面活性剤である界面活性剤Ｂ。
　Ｒ5-Ｏ-(ＥＯ)n-Ｒ6　　　　（IV）
［前記式（IV）中、Ｒ5は炭素数１２〜４０の炭化水素基を示し、ＥＯはオキシエチレン基を示し、ｎはＥＯの平均付加モル数であって８〜２２であり、Ｒ6は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基である。］」
（５）引用文献５について
　引用文献５には、以下の事項が記載されている。
（引５ａ）「Zaslavsky et al3). reported that the hemolytic activity of nonionic surfactants does not depend on the hydrophile-lipophile balance (HLB) of the compounds. However, they claimed that when the alkyl chain length is 12, the hemolytic activity becomes the greatest in nonionic surfactant with an oxyethylene number of 9 to 15.」（５７８頁右欄４-１１行、当審訳：「Zaslavskyら３）は、非イオン性界面活性剤の溶血活性は、化合物の親水性-親油性バランス（HLB）に依存しないことを報告した。 しかし、彼らは、アルキル鎖の長さが12の場合、溶血活性は、オキシエチレン数が9〜15の非イオン性界面活性剤で最大になると主張した。」）
（６）甲２号証に記載の事項
　甲２号証（特開２００２-８２１０５号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲２ａ）「【特許請求の範囲】
【請求項１】　
ヘモグロビン類の測定方法に用いられる、カチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤
安定型ＨｂＡ１ｃ保持力試験法により、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．６０）を使用して測定した保持力パラメータが２．５〜６０、
及び／または、４５ｍＭ過塩素酸含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５０）を使用して測定した保持力パラメータが１．５〜６０であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】　請求項１記載の液体クロマトグラフィー用充填剤が、カラム筐体に充填されてなる液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項３】　請求項１記載の充填剤または請求項２記載のカラムを使用した、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法。」
（甲２ｂ）「【００５２】（６）
界面活性剤として、ノニオン性界面活性剤、
を添加し
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で測定を行う場合、溶血試薬の通過する流路等を洗浄する効果がある
界面活性剤は、好ましくはノニオン性界面活性剤が使用され、
（７）甲３号証に記載の事項
　甲３号証（特開２００３-３４４３７２号公報）には、以下の事項が記載されている。
（甲３ａ）「【０００４】
【発明が解決しようとする課題】キャリブレータ及びコントロール液は、溶液として調製した後、ＨｂＡ1ｃ値が経時的に小さくなる現象が認められる。これは、キャリブレータ及びコントロール液を冷蔵保存すると、ＨｂＡ1ｃ値が経時的に小さくなる現象が抑制されることから、前記現象はキャリブレータ及びコントロール液中のＨｂＡ1ｃが温度の影響を受けて、何らかの変性きたし、結果としてＨｂＡ1ｃの測定値が誤差を受けていると推定される。
【０００５】特に高速液体クロマトグラフィー法(以下ＨＰＬＣ法と記す。)による測定において顕著に認められるため、ＨｂＡ1ｃの３次元構造が変化している可能性がある。ただし、検体中に存在するＨｂＡ1ｃ値は経時的な変化が認められず、キャリブレータ及びコントロール液に限ってＨｂＡ1ｃ値は経時的な変化が認めらることから、一度乾燥されたＨｂＡ1ｃが、温度による影響を受けることにより、３次元構造が経時的に変化していると推測される。しかし、本発明者らが調べる限り原因は未だ解明されていない。」
（甲３ｂ）「【００２０】本発明において、好ましくは添加される上記
非イオン性界面活性剤とは
ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で表わす。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、ＰＯＥ（１７）セチル−ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル等が挙げられる。
３　当審の判断
（１）特許法３６条６項１号について
　当審は、
　本件の発明の詳細な説明において開示された有効な実施例として記載されている非イオン性界面活性剤は、成分Ａ１はオキシエチレン基の平均付加モル数及びアルキル基の炭素数が、成分Ａ２〜成分Ａ４は、オキシエチレン基の平均付加モル数が、そして、成分Ａ６はＨＬＢ値が、それぞれ特定のものであって、各成分はそれぞれ単独で使用された実施例のみであるから、訂正前の請求項１、３及び４に係る発明の非イオン界面活性剤の成分は、有効な実施例として記載された成分以外のものを含んでおり、また、複数の成分を混合することも排除していない。
　そうすると、ヘモグロビン類測定用試薬において、成分中のオキシエチレン基の平均付加モル数、アルキル基の炭素数又はＨＬＢ値が相違した場合にどの程度の効果を有するか、実際に実施してみないと予測することができないという、出願時の技術常識に照らしても発明の詳細な説明において開示された内容を、訂正前の請求項１、３及び４に係る発明の範囲まで、拡張ないし一般化できるとはいえないから、訂正前の請求項１、３及び４に係る発明が、発明の詳細な説明に記載したものであるとはいえない。
旨通知したが、本件訂正請求により、請求項１に係る発明の非イオン性界面活性剤が、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」に訂正され、請求項３及び４は削除されたので、上記理由は解消した。
（２）特許法２９条２項について
ア　本件発明１について
（ア）対比
　本件発明１と引用発明’とを対比する。
ａ　引用発明’の「カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬」は、本件発明１の「陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬」に相当する。
ｂ　引用発明’が含む「界面活性剤」である「ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）」は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０のＰＯＥオクチルフェニルエーテルであって、上記（引１ｂ）より「ノニオン性界面活性剤」であるから、本件発明１の「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテルである」「前記非イオン性界面活性剤」とは、「前記非イオン性界面活性剤」である点で共通する。
ｃ　そうすると、ａ及びｂより本件発明１と引用発明’とは、以下の一致点と相違点がある。
（一致点）「陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、
　非イオン性界面活性剤を含む、ヘモグロビン類測定用試薬。」
（相違点）ヘモグロビン類測定用試薬に含まれる非イオン性界面活性剤が、本件発明１は、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」であるのに対し、引用発明’が、「ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）」である点。
（イ）判断
　上記相違点について検討する。
ａ　上記（引１ｂ）より、引用文献１には、「カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬」に含まれる「ノニオン性界面活性剤」として、「ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル」、「ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル」、「ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル」、「ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル」が、「ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００、東京化成社製）」である「ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル」とともに、「単独でもまた複数混合して用い」ることができる旨記載されているが、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」は記載されていない。
ｂ　技術事項２には、「ノニオン性界面活性剤を含有する溶血試薬」の「ノニオン性界面活性剤」として「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」を含む「ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位７〜１２のもの）」が挙げられており、技術事項２の「溶血試薬」は、「糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しないもの」であるが、「糖化タンパク質を検出するための酵素が有する活性を阻害しない」「ノニオン性界面活性剤」の内の「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」が、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬に含まれる場合においてどの程度の効果を有するか、実際に実施してみないと予測することができないという、出願時の技術常識を考慮すると、引用発明’のヘモグロビン類測定用試薬に含まれる非イオン性界面活性剤として、技術事項２の「ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン単位７〜１２のもの）」の内のオキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるものを適用することは、当業者が容易に想到できたことであるとはいえないし、仮に、適用できたとしても、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定する際に格別顕著な効果を得られることを、当業者が予測し得たとは到底認められない。
ｃ　技術事項３の「成分測定方法が対象とする目的成分」である「ＨｂＡ１ｃ」を「測定する」ために「全血検体」を「希釈する」ための「溶液」に含まれる「界面活性剤」として例示されている「エマルゲン１２０」は、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」であり、技術事項４の「赤血球を溶解する能力が高い非イオン性界面活性剤であ」るポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＥＯ＝１３〜２２）型の非イオン性界面活性剤である界面活性剤Ｂ」には、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」が含まれ、引用文献５には、「アルキル鎖の長さが12の場合、溶血活性は、オキシエチレン数が9〜15の非イオン性界面活性剤で最大」となる旨記載されており、「オキシエチレン数が9〜15の非イオン性界面活性剤」は、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル」が含まれているが、引用文献３〜５に記載された非イオン性界面活性剤を含む溶液は、溶血性能が良い旨記載されているものの、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬において使用する場合の記載はないから、上記ｂと同様に、引用発明’のヘモグロビン類測定用試薬に含まれる非イオン性界面活性剤として、技術事項３、４及び引用文献５に記載された非イオン性界面活性剤を適用することは、当業者が容易に想到できたことであるとはいえないし、仮に、適用できたとしても、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定する際に格別顕著な効果を得られることを、当業者が予測し得たとは到底認められない。
ｄ　したがって、本件発明１は、引用発明’、引用文献１及び５に記載された技術事項、技術事項２〜４に基づいて、当業者が容易に発明することができたものではない。
イ　本件発明５及び６について
　本件発明５は、本件発明１の「ヘモグロビン類測定用試薬」において、「前記非イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である」旨の限定を加えたものであって、本件発明６は、「赤血球含有検体と」、本件発明１又は５の「ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法」としたものであり、何れの発明も上記相違点を有しているから、上記アと同様の理由により、本件発明５及び６は、引用発明’、引用文献１及び５に記載された技術事項、技術事項２〜４に基づいて、当業者が容易に発明することができたものではない。
（３）特許異議申立人の意見について
　申立人は、令和３年２月９日に提出した意見書において、ヘモグロビン類の測定を高精度で行う場合に、赤血球中のヘモグロビンを可溶化する必要があることは技術常識であるから、良好な溶血性能を示す非イオン性界面活性剤であれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定する際においても効果があることは、当業者であれば容易に予測できるものであるから、本件発明は、引用文献１〜５から容易に想到できるものである旨主張している。
　しかしながら、上記（２）において検討したとおり、特定の非イオン性界面活性剤が、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬に含まれる場合においてどの程度の効果を有するか、実際に実施してみないと予測することができないという、出願時の技術常識を考慮すると、引用文献２〜５に記載された非イオン性界面活性剤が良好な溶血性能を示すとしても、この非イオン性界面活性剤が陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬に含まれる場合において、格別顕著な効果を得られることを、当業者が予測し得たとは到底認められないから、本件発明は、引用文献１〜５から容易に想到できるものであるとはいえない。
第５　取消理由通知（決定の予告）において採用しなかった特許異議申立理由について
　申立人は、特許異議申立書において、訂正前の特許請求の範囲に関し、請求項１、３及び６に係る発明は、甲１〜３号証に記載の発明であって特許法２９条１号３号に該当し、特許法２９条１項に規定に違反してされたものであり、請求項１〜６に係る発明は、甲２〜７号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に想到できたものであるから、特許法２９条２項の規定に違反してされたものである旨も主張している。
　しかしながら、上記第４の３（２）で検討したとおり、本件発明１及び６と甲１号証である上記引用文献１に記載された発明である引用発明’とを対比すると上記相違点で相違し、該相違点に係る構成は引用文献１にも、甲２及び３号証にも記載されていないから、本件発明１及び６は、甲１〜３号証に記載された発明であるとはいえず、また、甲２及び３号証に記載された発明と本件発明１、５及び６とは、上記相違点で相違するから、甲２及び３号証に記載された発明からも、当業者が容易に想到できたものであるともいえない。
　したがって、申立人のかかる主張は、採用することができない。
　
第６　むすび
　以上のとおりであるから、取消理由通知（決定の予告）に記載した取消理由及び特許異議申立書に記載した特許異議申立理由によっては、本件請求項１、５及び６に係る特許を取り消すことはできない。さらに、他に本件請求項１、５及び６に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　また、請求項２〜４に係る特許は、上記のとおり、訂正により削除された。これにより、申立人による特許異議の申立てについて、請求項２〜４に係る申立ては、申立ての対象が存在しないものとなったため、特許法第１２０条の８第１項で準用する同法第１３５条の規定により却下する。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
令和３年６月２１日（２０２１．６．２１）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ヘモグロビン類測定用試薬及びヘモグロビン類の測定方法
　【技術分野】
　【０００１】
　本発明は、界面活性剤を含むヘモグロビン類測定用試薬に関する。また、本発明は、上記ヘモグロビン類測定用試薬を用いたヘモグロビン類の測定方法に関する。
　【背景技術】
　【０００２】
　従来、糖尿病及び異常ヘモグロビン病等の診断のために、ヘモグロビン類の濃度が測定されている。例えば、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０及びヘモグロビンＡ２等のヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン及びカルバミル化ヘモグロビン等の修飾ヘモグロビン、並びにヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣ等の異常ヘモグロビン等のヘモグロビン類の濃度が測定されている。これらのヘモグロビン類の中でも、特に、ヘモグロビンＡ１ｃ値が測定されている。ヘモグロビン類の濃度を測定する方法としては、主に液体クロマトグラフィー法が挙げられる。
　【０００３】
　液体クロマトグラフィー法では、血液等の検体に溶血試薬を添加し、溶血後の試料を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定し、得られたクロマトグラムのピークを演算処理することによりヘモグロビンＡ１ｃ値等のヘモグロビン類の濃度を求める。従来、溶血試薬として、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（例えば商品名「トリトンＸ−１００」）を含む組成物が用いられている。
　【０００４】
　下記の特許文献１には、ヒトの血液のサンプル中のヘモグロビンＡ１ｃを他のグリコシル化及び非グリコシル化ヘモグロビン並びにヘモグロビンＡ１ｃの前駆体のシッフ塩基から分離するヘモグロビンＡ１ｃの分離方法が開示されている。また、特許文献１の実施例では、０．３３重量％のトリトンＸ−１００を含む溶血試薬が用いられている。
　【０００５】
　下記の特許文献２には、カチオン交換液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法において、血液検体を溶血させる際に用いる溶血試薬が開示されている。上記溶血試薬は、カオトロピックイオンを含有する。また、特許文献２の実施例では、０．１重量％のトリトンＸ−１００を含む溶血試薬が用いられている。
　【先行技術文献】
　【特許文献】
　【０００６】
　【特許文献１】特開昭５８−１９１９６８号公報
　【特許文献２】特開２００１−０２１５５５号公報
　【発明の概要】
　【発明が解決しようとする課題】
　【０００７】
　特許文献１，２に記載のようなオキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む溶血試薬（ヘモグロビン類測定用試薬）は、溶血性能に優れる。そのため、全血等の検体を該溶血試薬で処理して、陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定すると、ヘモグロビン類のピークが良好に得られる。また、得られる全てのピークにおいてショルダーピーク及びピーク割れ等が生じにくい。そのため、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　【０００８】
　また、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含む溶血試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定したときに、キャリーオーバーが少ない。そのため、多数の検体を連続測定した場合でも、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　【０００９】
　一方、欧州において、ＲＥＡＣＨ規制（Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が２００７年に発効し、特定の化学品の使用が制限されることとなった。また、２０１７年には、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを０．１重量％以上含む製品がＲＥＡＣＨ規制の対象とされた。また、欧州以外の国でもオキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルの使用量を削減することは、環境負荷の軽減と人体の安全性の向上に寄与する。
　【００１０】
　本発明の目的は、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができるヘモグロビン類測定用試薬を提供することである。より具体的には、本発明の目的は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを含まなくても、該成分が配合されたヘモグロビン類測定用試薬と同等のレベルで溶血させることができ、かつ同等の精度でヘモグロビン類を測定することができるヘモグロビン類測定用試薬を提供することである。
　【００１１】
　また、本発明の目的は、上記ヘモグロビン類測定用試薬を用いたヘモグロビン類の測定方法を提供することである。
　【課題を解決するための手段】
　【００１２】
　本発明の広い局面によれば、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、下記成分Ａ１、下記成分Ａ２、下記成分Ａ３、下記成分Ａ４、下記成分Ａ５、下記成分Ａ６、下記成分Ａ７、下記成分Ａ８又は下記成分Ａ９であり、前記両性界面活性剤が、下記成分Ｂ１、下記成分Ｂ２又は下記成分Ｂ３である、ヘモグロビン類測定用試薬が提供される。
　【００１３】
　成分Ａ１：オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル
　【００１４】
　成分Ａ２：オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル
　【００１５】
　成分Ａ３：オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル
　【００１６】
　成分Ａ４：オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル
　【００１７】
　成分Ａ５：オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル
　【００１８】
　成分Ａ６：ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル
　【００１９】
　成分Ａ７：ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン
　【００２０】
　成分Ａ８：ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
　【００２１】
　成分Ａ９：サポニン
　【００２２】
　成分Ｂ１：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート
　【００２３】
　成分Ｂ２：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート
　【００２４】
　成分Ｂ３：ラウリルジメチルアミンオキサイド
　【００２５】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、前記成分Ａ１、前記成分Ａ２、前記成分Ａ３、前記成分Ａ４、前記成分Ａ５又は前記成分Ａ６を含み、前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が９、１２若しくは１９であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３若しくは２０であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、前記成分Ａ２が、オキシエチレン基の平均付加モル数が５０であるポリオキシエチレンステアリルエーテルであり、前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が９又は１３であるポリオキシエチレンオレイルエーテルであり、前記成分Ａ４が、オキシエチレン基の平均付加モル数が７又は９であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下のポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテルであり、前記成分Ａ６が、ＨＬＢ値が１２．５、１２．７又は１４．０であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである。
　【００２６】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤が、前記成分Ａ１又は前記成分Ａ３を含み、前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。
　【００２７】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記成分Ａ１が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、前記成分Ａ３が、オキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。
　【００２８】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記非イオン性界面活性剤を含み、前記非イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である。
　【００２９】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬のある特定の局面では、前記両性界面活性剤を含み、前記両性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である。
　【００３０】
　本発明の広い局面によれば、赤血球含有検体と、上述したヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法が提供される。
　【発明の効果】
　【００３１】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられる。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含む。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記非イオン性界面活性剤が、以下の成分Ａ１〜Ａ９のいずれかの成分であるか、上記両性界面活性剤が、以下の成分Ｂ１〜Ｂ３のいずれかの成分である。成分Ａ１：オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル。成分Ａ２：オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル。成分Ａ３：オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル。成分Ａ４：オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル。成分Ａ５：オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル。成分Ａ６：ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル。成分Ａ７：ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン。成分Ａ８：ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド。成分Ａ９：サポニン。成分Ｂ１：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート。成分Ｂ２：３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート。成分Ｂ３：ラウリルジメチルアミンオキサイド。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記の構成が備えられているので、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　【図面の簡単な説明】
　【００３２】
　【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るヘモグロビン類測定用試薬を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。
　【図２】図２は、従来のヘモグロビン類測定用試薬を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。
　【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビンＡ０ピークの形状を評価したクロマトグラムの例である。
　【図４】図４（ａ）及び（ｂ）は、ファーストフラクションのピーク形状を評価したクロマトグラムの例である。
　【図５】図５（ａ）〜（ｃ）は、ヘモグロビンＡ０ピーク高さを評価したクロマトグラムの例である。
　【図６】図６（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と全血との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　【図７】図７（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　【図８】図８（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　【図９】図９（ａ）及び（ｂ）は、ヘモグロビン類測定用試薬と測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）との混合液におけるカラム耐久性を示す図である。
　【発明を実施するための形態】
　【００３３】
　以下、本発明を詳細に説明する。
　【００３４】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられる。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含む。
　【００３５】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記非イオン性界面活性剤が、オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル、オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル、ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、又はサポニンである。
　【００３６】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記両性界面活性剤が、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート、又はラウリルジメチルアミンオキサイドである。
　【００３７】
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル」を「成分Ａ１」と記載することがある。
　【００３８】
　成分Ａ１のうち、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル」を、本明細書において、「成分Ａ１’」と記載することがある。
　【００３９】
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル」を「成分Ａ２」と記載することがある。
　【００４０】
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル」を「成分Ａ３」と記載することがある。
　【００４１】
　成分Ａ３のうち、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル」を、本明細書において、「成分Ａ３’」と記載することがある。
　【００４２】
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル」を「成分Ａ４」と記載することがある。
　【００４３】
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテル」を「成分Ａ５」と記載することがある。
　【００４４】
　本明細書において、「ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル」を「成分Ａ６」と記載することがある。
　【００４５】
　本明細書において、「ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン」を「成分Ａ７」と記載することがある。
　【００４６】
　本明細書において、「ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド」を「成分Ａ８」と記載することがある。
　【００４７】
　本明細書において、「サポニン」を「成分Ａ９」と記載することがある。
　【００４８】
　本明細書において、「３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート」を「成分Ｂ１」と記載することがある。
　【００４９】
　本明細書において、「３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート」を「成分Ｂ２」と記載することがある。
　【００５０】
　本明細書において、「ラウリルジメチルアミンオキサイド」を「成分Ｂ３」と記載することがある。
　【００５１】
　本明細書において、「オキシエチレン基の平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル」を「成分Ｘ」と記載することがある。
　【００５２】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を含み、上記非イオン性界面活性剤が、成分Ａ１、成分Ａ２、成分Ａ３、成分Ａ４、成分Ａ５、成分Ａ６、成分Ａ７、成分Ａ８又は成分Ａ９であるか、上記両性界面活性剤が、成分Ｂ１、成分Ｂ２又は成分Ｂ３である。
　【００５３】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記の構成が備えられているので、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　【００５４】
　成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させることができ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。一方、成分Ｘを含まないヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させ、かつ高い精度でヘモグロビン類を測定することは困難である。
　【００５５】
　これに対して、本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記の構成が備えられているので、成分Ｘを含まない場合にも、成分Ｘが配合されたヘモグロビン類測定用試薬と同等のレベルで溶血させることができ、かつ同等の精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　【００５６】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、良好に溶血させることができるので、陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定したときに、ヘモグロビン類のピークを良好に得ることができる。また、得られる全てのピークにおいてショルダーピーク及びピーク割れ等が生じにくい。そのため、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。また、本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、キャリーオーバーを少なくすることができる。そのため、多数の検体を連続測定した場合でも、高い精度でヘモグロビン類を測定することができる。
　【００５７】
　また、検査センターでは、溶血試薬（ヘモグロビン類測定用試薬）と、被検査物質とを混合したあと、混合液が陽イオン交換クロマトグラフィーで測定されるまでに、一定期間（例えば数日程度）保存されることがある。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高めることができる。なお、上記被検査物質には、血液等の赤血球含有検体（例えば、被検者の血液）だけではなく、赤血球を含まないヘモグロビン類含有検体（例えば、ヘモグロビン類標準物質及び測定管理用ヘモグロビン類物質等）も含まれる。本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、上記混合液が一定期間保存されても、保存前後でヘモグロビン類のピーク形状が変化しにくく、測定値が変動しにくい。
　【００５８】
　特に、本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬が、成分Ａ１’又は成分Ａ３’を含む場合には、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性も高めることができる。
　【００５９】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられる。上記ヘモグロビン類測定用試薬は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられることが好ましい。
　【００６０】
　上記ヘモグロビン類としては、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ０及びヘモグロビンＡ２等のヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン及びカルバミル化ヘモグロビン等の修飾ヘモグロビン、並びにヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣ等の異常ヘモグロビン等が挙げられる。
　【００６１】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、上記ヘモグロビンＡ１ｃ値（ヘモグロビンＡ１ｃの濃度）を測定するために好適に用いられる。
　【００６２】
　図１は、本発明の一実施形態に係るヘモグロビン類測定用試薬を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。
　【００６３】
　図２は、従来のヘモグロビン類測定用試薬（成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬）を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する際に得られるクロマトグラムの例である。
　【００６４】
　図１及び図２において、約１９秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ１ｃのピークであり、約４０秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ０のピークである。図１及び図２は、例えば、後述する実施例で測定された測定条件で測定した際のクロマトグラムの例である。
　【００６５】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬と同等のピーク形状を得ることができる。
　【００６６】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬では、ＲＥＡＣＨ規制の対象となっている成分を含まなくすることができるので、成分Ｘを含む従来のヘモグロビン類測定用試薬と比べて、環境への影響を小さくすることができ、安全性を高めることができる。
　【００６７】
　本発明に係るヘモグロビン類測定用試薬は、上記非イオン性界面活性剤を含んでいてもよく、上記両性界面活性剤を含んでいてもよく、上記非イオン性界面活性剤と上記両性界面活性剤との双方を含んでいてもよい。
　【００６８】
　（非イオン性界面活性剤）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。上記非イオン性界面活性剤は、成分Ａ１〜Ａ９のいずれかの成分である。上記非イオン性界面活性剤は、成分Ａ１〜Ａ９のうちの１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【００６９】
　＜成分Ａ１＞
　成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルである。成分Ａ１は、下記式（１）で表される成分である。成分Ａ１は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【００７０】
　Ｒ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（１）
　【００７１】
　上記式（１）中、Ｒは炭素数１２以上１７以下のアルキル基を表し、ｎは８以上２０以下の数を表す。
　【００７２】
　オキシエチレン基の平均付加モル数が８未満であり、かつアルキル基の炭素数が１２未満であるポリオキシエチレンアルキルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が８未満であり、かつアルキル基の炭素数が１２未満であるポリオキシエチレンアルキルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が２０を超え、かつアルキル基の炭素数が１７を超えるポリオキシエチレンアルキルエーテルでは、良好なピークが得られなかったり、キャリーオーバーが生じたりすることがある。
　【００７３】
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ１におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは９以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは１１以上、好ましくは１９以下である。
　【００７４】
　本発明の効果を効果的に発揮する観点及びヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高める観点からは、成分Ａ１のアルキル基の炭素数は、好ましくは１７以下、より好ましくは１６以下であり、特に好ましくは１２又は１６である。なお、上記アルキル基の炭素数が１２である場合、成分Ａ１はポリオキシエチレンラウリルエーテルであり、上記アルキル基の炭素数が１６である場合、成分Ａ１はポリオキシエチレンセチルエーテルである。
　【００７５】
　したがって、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が８以上２０以下であるポリオキシエチレンセチルエーテルであることが特に好ましい。
　【００７６】
　成分Ａ１がポリオキシエチレンラウリルエーテルである場合に、該ポリオキシエチレンラウリルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは９以上、より好ましくは１０以上、更に好ましくは１１以上、好ましくは１９以下、より好ましくは１６以下、更に好ましくは１３以下である。また、該ポリオキシエチレンラウリルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、９、１２又は１９であることも好ましく、１２であることが最も好ましい。上記オキシエチレン基の平均付加モル数が上述の好ましい範囲又は値であると、界面活性剤の溶解性をより一層高めることができ、良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定することができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　【００７７】
　成分Ａ１がポリオキシエチレンセチルエーテルである場合に、該ポリオキシエチレンセチルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１９以下、より好ましくは１６以下、更に好ましくは１４以下である。また、該ポリオキシエチレンセチルエーテルにおけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、１３又は２０であることも好ましく、１３であることが最も好ましい。上記オキシエチレン基の平均付加モル数が上述の好ましい範囲又は値であると、界面活性剤の溶解性をより一層高めることができ、良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定することができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　【００７８】
　したがって、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が９、１２若しくは１９であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３若しくは２０であるポリオキシエチレンセチルエーテルであることが好ましい。また、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が１３であるポリオキシエチレンセチルエーテルであることが最も好ましい。
　【００７９】
　本発明の効果を効果的に発揮する観点、ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性及び該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高める観点からは、成分Ａ１は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であり、かつアルキル基の炭素数が１２以上１７以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであることが好ましい。すなわち、成分Ａ１は、成分Ａ１’であることが好ましい。
　【００８０】
　成分Ａ１のＨＬＢ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｃ　Ｌｉｐｏｐｈｉｌｃ　Ｂａｌａｎｃｅ）値は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１８以下、より好ましくは１６以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　【００８１】
　成分Ａ１のＨＬＢ値、及び後述する各成分のＨＬＢ値は、グリフィン法によるＨＬＢ値を表す。ＨＬＢ値は、０以上２０以下の値をとり、ＨＬＢ値が小さいほど疎水性（親油性）が強く、ＨＬＢ値が大きいほど親水性が強い。グリフィン法によるＨＬＢ値は、下記式により算出される。
　【００８２】
　ＨＬＢ値＝２０×（親水基の分子量／分子量）
　【００８３】
　成分Ａ１の曇点は、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　【００８４】
　なお、曇点とは、透明又は半透明な液体で温度変化によって相分離が起き、その結果、液体が不透明になる温度のことである。曇点は、一般に、下限臨界溶解温度と呼ばれることもある。
　【００８５】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ１の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ１の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ１の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができ、また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　【００８６】
　成分Ａ１の市販品としては、花王社製「エマルゲン１０９Ｐ」（オキシエチレン基の平均付加モル数９のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル）、花王社製「エマルゲン１２０」（オキシエチレン基の平均付加モル数１２のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１２）ラウリルエーテル）、花王社製「エマルゲン１４７」（オキシエチレン基の平均付加モル数１９のポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１９）ラウリルエーテル）、花王社製「エマルゲン２２０」（オキシエチレン基の平均付加モル数１３のポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン（１３）セチルエーテル）、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製「Ｂｒｉｊ（登録商標）５８」（オキシエチレン基の平均付加モル数２０のポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル）等が挙げられる。
　【００８７】
　＜成分Ａ２＞
　成分Ａ２は、オキシエチレン基の平均付加モル数が４０以上６０以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテルである。成分Ａ２は、下記式（２）で表される成分である。成分Ａ２は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【００８８】
　Ｃ１８Ｈ３７Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（２）
　【００８９】
　上記式（２）中、ｎは４０以上６０以下の数を表す。
　【００９０】
　オキシエチレン基の平均付加モル数が４０未満であるポリオキシエチレンステアリルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が４０未満であるポリオキシエチレンステアリルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が６０を超えるポリオキシエチレンステアリルエーテルでは、良好なピークが得られなかったり、キャリーオーバーが生じたりすることがある。
　【００９１】
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ２におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは４５以上、好ましくは５５以下である。界面活性剤の溶解性をより一層高める観点、より一層良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ２におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、５０であることが最も好ましい。
　【００９２】
　成分Ａ２のＨＬＢ値は、好ましくは１３以上、より好ましくは１５以上、好ましくは１９以下、より好ましくは１８以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　【００９３】
　成分Ａ２のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　【００９４】
　成分Ａ２の曇点は、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上である。上記曇点が上記下限以上であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　【００９５】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ２の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ２の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ２の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【００９６】
　成分Ａ２の市販品としては、花王社製「エマルゲン３５０」（オキシエチレン基の平均付加モル数５０のポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（５０）ステアリルエーテル）等が挙げられる。
　【００９７】
　＜成分Ａ３＞
　成分Ａ３は、オキシエチレン基の平均付加モル数が９以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。成分Ａ３は、下記式（３）で表される成分である。成分Ａ３は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【００９８】
　Ｃ１８Ｈ３５Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（３）
　【００９９】
　上記式（３）中、ｎは９以上１５以下の数を表す。
　【０１００】
　オキシエチレン基の平均付加モル数が９未満であるポリオキシエチレンオレイルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が９未満であるポリオキシエチレンオレイルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が１５を超えるポリオキシエチレンオレイルエーテルでは、良好なピークが得られなかったり、キャリーオーバーが生じたりすることがある。
　【０１０１】
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ３におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは１４以下である。界面活性剤の溶解性をより一層高める観点、より一層良好に溶血させ、より一層高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ３におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、９又は１３であることが特に好ましく、１３であることが最も好ましい。
　【０１０２】
　本発明の効果を効果的に発揮する観点、ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性及び該試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高める観点からは、成分Ａ３は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１０以上１５以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルであることが好ましい。すなわち、成分Ａ３は、成分Ａ３’であることが好ましい。
　【０１０３】
　成分Ａ３のＨＬＢ値は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１７以下、より好ましくは１５以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　【０１０４】
　成分Ａ３のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　【０１０５】
　成分Ａ３の曇点は、好ましくは５０℃以上、より好ましくは８５℃以上、好ましくは１００℃以下、より好ましくは９５℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　【０１０６】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ３の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ３の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ３の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１０７】
　成分Ａ３の市販品としては、花王社製「エマルゲン４０９ＰＶ」（オキシエチレン基の平均付加モル数９のポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン（９）オレイルエーテル）、及び花王社製「エマルゲン４２０」（オキシエチレン基の平均付加モル数１３のポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１３）オレイルエーテル）等が挙げられる。
　【０１０８】
　＜成分Ａ４＞
　成分Ａ４は、オキシエチレン基の平均付加モル数が６以上１０以下であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテルである。成分Ａ４は、下記式（４）で表される成分である。成分Ａ４は、炭素数が１１以上１５以下である第２級アルコールのエチレンオキシドの付加物である。成分Ａ４は、成分Ａ１とは異なる。成分Ａ４は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１０９】
　ＣｍＨ２ｍ＋１Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（４）
　【０１１０】
　上記式（４）中、ｍは１１以上１５以下の数を表し、ｎは６以上１０以下の数を表す。
　【０１１１】
　オキシエチレン基の平均付加モル数が６未満であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテルでは、該界面活性剤が溶解しにくく、ヘモグロビン類測定用試薬を調製できないことがある。また、オキシエチレン基の平均付加モル数が６未満であり、かつアルキル基の炭素数が１１以上１５以下であるポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテルでは、良好なピークが得られないことがある。
　【０１１２】
　界面活性剤の溶解性を高める観点、良好に溶血させ、高い精度でヘモグロビン類を測定する観点から、成分Ａ４におけるオキシエチレン基の平均付加モル数は、好ましくは７以上、好ましくは９以下であり、７又は９であることがより好ましい。
　【０１１３】
　成分Ａ４のＨＬＢ値は、好ましくは１０以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１７以下、より好ましくは１５以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。
　【０１１４】
　成分Ａ４のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　【０１１５】
　成分Ａ４の曇点は、好ましくは３０℃以上、好ましくは６０℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　【０１１６】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ４の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ４の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ４の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１１７】
　成分Ａ４の市販品としては、花王社製「エマルゲン７０７」（オキシエチレン基の平均付加モル数７、かつアルキル基の炭素数１１以上１５以下のポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル）、及び花王社製「エマルゲン７０９」（オキシエチレン基の平均付加モル数９、かつアルキル基の炭素数１１以上１５以下のポリオキシエチレン−ｓｅｃ−アルキルエーテル）等が挙げられる。
　【０１１８】
　＜成分Ａ５＞
　成分Ａ５は、オキシエチレン基の平均付加モル数が１５であるポリオキシエチレントリデシルエーテルである。成分Ａ５は、下記式（５）で表される成分である。成分Ａ５は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１１９】
　Ｃ１３Ｈ２７Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１５Ｈ　　　・・・（５）
　【０１２０】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ５の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ５の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ５の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１２１】
　成分Ａ５の市販品としては、ライオン社製「レオコールＴＤ−１５０」等が挙げられる。
　【０１２２】
　＜成分Ａ６＞
　成分Ａ６は、ＨＬＢ値が１１以上１５以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、オキシプロピレン基とオキシエチレン基とを有する。成分Ａ６は、下記式（６）で表される成分である。成分Ａ６は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１２３】
　Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｍ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ　　　・・・（６）
　【０１２４】
　上記式（６）中、Ｒはアルキル基を表し、ｍは１以上の数を表し、ｎは１以上の数を表す。
　【０１２５】
　成分Ａ６のＨＬＢ値は、好ましくは１１．５以上、より好ましくは１２以上、好ましくは１４．５以下である。上記ＨＬＢ値が上記下限以上であると、ミセルの発生を抑えることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。上記ＨＬＢ値が上記上限以下であると、血球成分の細胞膜を十分に溶解させることができ、カラムの目詰まりを効果的に抑えることができる。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点及びカラムの目詰まりをより一層効果的に抑える観点からは、成分Ａ６のＨＬＢ値は、１２．５、１２．７又は１４．０であることが好ましい。
　【０１２６】
　成分Ａ６のＨＬＢ値は、上述した方法で求めることができる。
　【０１２７】
　成分Ａ６の曇点は、好ましくは３０℃以上、より好ましくは５０℃以上、好ましくは９５℃以下、より好ましくは９０℃以下である。上記曇点が上記下限以上及び上記上限以下であると、界面活性剤の溶解性を高めることができ、ヘモグロビン類測定用試薬を良好に調製することができる。
　【０１２８】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ６の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ６の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ６の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１２９】
　成分Ａ６の市販品としては、花王社製「エマルゲンＬＳ−１０６」（ＨＬＢ値１２．５のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル）、花王社製「エマルゲンＬＳ−１１４」（ＨＬＢ値１４．０のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキル（Ｃ１２−１４）エーテル）、及び花王社製「エマルゲンＭＳ−１１０」（ＨＬＢ値１２．７のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル）等が挙げられる。
　【０１３０】
　＜成分Ａ７＞
　成分Ａ７は、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンである。
　【０１３１】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ７の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ７の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ７の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１３２】
　成分Ａ７の市販品としては、同仁化学社製「ＭＥＧＡ−９」等が挙げられる。
　【０１３３】
　＜成分Ａ８＞
　成分Ａ８は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
　【０１３４】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ８の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ８の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ８の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１３５】
　成分Ａ８の市販品としては、同仁化学社製「ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド」等が挙げられる。
　【０１３６】
　＜成分Ａ９＞
　成分Ａ９は、サポニンである。成分Ａ９は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１３７】
　成分Ａ９は、大豆サポニンであることが好ましく、下記式（９）で表される大豆サポニンであることがより好ましい。
　【０１３８】
　【化１】
　【０１３９】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ９の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ａ９の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ａ９の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１４０】
　成分Ａ９の市販品としては、ナカライテスク社製「サポニン」等が挙げられる。
　【０１４１】
　（両性界面活性剤）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、両性界面活性剤を含むことが好ましい。上記界面活性剤は、成分Ｂ１〜Ｂ３のいずれかの成分である。上記両性界面活性剤は、成分Ｂ１〜Ｂ３のうちの１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１４２】
　＜成分Ｂ１＞
　成分Ｂ１は、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）である。
　【０１４３】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ１の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ１の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ｂ１の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１４４】
　成分Ｂ１の市販品としては、同仁化学社製「ＣＨＡＰＳ」等が挙げられる。
　【０１４５】
　＜成分Ｂ２＞
　成分Ｂ２は、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）である。
　【０１４６】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ２の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ２の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ｂ２の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１４７】
　成分Ｂ２の市販品としては、同仁化学社製「ＣＨＡＰＳＯ」等が挙げられる。
　【０１４８】
　＜成分Ｂ３＞
　成分Ｂ３は、ラウリルジメチルアミンオキサイドである。
　【０１４９】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ３の含有量は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｂ３の含有量は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。成分Ｂ３の含有量が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１５０】
　成分Ｂ３の市販品としては、花王社製「アンヒトール２０Ｎ」等が挙げられる。
　【０１５１】
　（緩衝剤）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、緩衝剤を含むことが好ましい。上記緩衝剤を含むことにより、ｐＨの変動を抑えることができる。上記緩衝剤は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１５２】
　上記緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウム等のリン酸塩、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩、ホウ酸ナトリウム等のホウ酸塩、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリン、アニリン誘導体、アミノ酸、アミン化合物、イミダゾール化合物、アルコール化合物、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、並びにグリシルグリシン等が挙げられる。
　【０１５３】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬のｐＨを後述する好ましい範囲に維持する観点からは、上記緩衝剤は、リン酸塩であることが好ましい。
　【０１５４】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬中の上記緩衝剤の含有量は、緩衝作用を発揮できる含有量であれば特に限定されない。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記緩衝剤の含有量は、０．０１重量％以上であってもよく、０．０２重量％以上であってもよく、０．２重量％以下であってもよく、０．１重量％以下であってもよい。
　【０１５５】
　（無機塩類）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、無機塩類を含むことが好ましい。上記無機塩類を含むことにより、浸透圧を良好に調整することができる。上記無機塩類は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１５６】
　上記無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、及び硫酸カリウム等が挙げられる。
　【０１５７】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬の浸透圧を後述する好ましい範囲に維持する観点からは、上記無機塩類は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カリウムであることが好ましく、塩化ナトリウムであることがより好ましい。
　【０１５８】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬中の上記無機塩類の含有量は、特に限定されない。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記無機塩類の含有量は、０．１重量％以上であってもよく、１．０重量％以下であってもよい。
　【０１５９】
　（水）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、水を含むことが好ましい。
　【０１６０】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記水の含有量は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、更に好ましくは９５重量％以上である。
　【０１６１】
　（その他の成分）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、防腐剤、ヘモグロビン安定剤、及びｐＨ調整剤等が挙げられる。上記他の成分はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　【０１６２】
　上記防腐剤としては、アジ化ナトリウム、チモール、及びプロピオン酸ナトリウム等が挙げられる。
　【０１６３】
　上記ヘモグロビン安定剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、及びグルタチオン等が挙げられる。
　【０１６４】
　上記ｐＨ調整剤としては、塩酸、リン酸、硝酸、及び硫酸等の酸、並びに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、及び水酸化カルシウム等の塩基が挙げられる。
　【０１６５】
　（ヘモグロビン類測定用試薬の他の詳細）
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、上記非イオン性界面活性剤を含むことが好ましく、上記非イオン性界面活性剤として成分Ａ１、成分Ａ２、成分Ａ３、成分Ａ４、成分Ａ５又は成分Ａ６を含むことがより好ましく、成分Ａ１、又は成分Ａ３を含むことが更に好ましく、成分Ａ１’、又は成分Ａ３’を含むことが特に好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　【０１６６】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬が、上記非イオン性界面活性剤を含む場合に、上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記非イオン性界面活性剤の含有量（成分Ａ１〜Ａ９の合計の含有量）は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記非イオン性界面活性剤の含有量（成分Ａ１〜Ａ９の合計の含有量）は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。上記非イオン性界面活性剤の含有量（成分Ａ１〜Ａ９の合計の含有量）が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
　【０１６７】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬が、上記両性界面活性剤を含む場合に、上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記両性界面活性剤の含有量（成分Ｂ１〜Ｂ３の合計の含有量）は、好ましくは０．０１重量％以上、より好ましくは０．０５重量％以上、更に好ましくは０．０８重量％以上、特に好ましくは０．１重量％以上である。上記ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、上記両性界面活性剤の含有量（成分Ｂ１〜Ｂ３の合計の含有量）は、好ましくは１．０重量％以下、より好ましくは０．８重量％以下、更に好ましくは０．６重量％以下、特に好ましくは０．５重量％以下である。上記両性界面活性剤の含有量（成分Ｂ１〜Ｂ３の合計の含有量）が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　【０１６８】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、成分Ｘを含まないことが好ましい。本発明では、成分Ｘを含まなくても、本発明の効果を発揮させることができる。また、本発明では、成分Ｘを含まなくても、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性を高めることができる。ただし、上記ヘモグロビン類測定用試薬は、成分Ｘを含んでいてもよい。例えば、上記ヘモグロビン類測定用試薬は、成分Ｘを、ＲＥＡＣＨ規制の対象とならない濃度（ヘモグロビン類測定用試薬１００重量％中、成分Ｘの含有量が０．１重量％未満）で含んでいてもよい。
　【０１６９】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬のｐＨは、好ましくは６．０以上、より好ましくは７．０以上、好ましくは８．５以下、より好ましくは８．０以下である。上記ｐＨが上記下限以上及び上記上限以下であると、より一層良好に溶血させることができる。
　【０１７０】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬の浸透圧は、好ましくは５０ｍＯｓｍ以上、より好ましくは７５ｍＯｓｍ以上、好ましくは２００ｍＯｓｍ以下、より好ましくは１５０ｍＯｓｍ以下である。上記浸透圧が上記下限以上及び上記上限以下であると、より一層良好に溶血させることができる。
　【０１７１】
　上記浸透圧は、浸透圧計（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製「オズモメーター３２５０」）を用いて測定することができる。
　【０１７２】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、赤血球を溶血させるために好適に用いられる。上記ヘモグロビン類測定用試薬は、溶血試薬であることが好ましい。
　【０１７３】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、被検査物質と混合されて好適に用いられる。上記被検査物質としては、血液等の赤血球含有検体、ヘモグロビン類標準物質、及び測定管理用ヘモグロビン類物質等が挙げられる。
　【０１７４】
　上記ヘモグロビン類測定用試薬は、赤血球を含まず、かつヘモグロビンの濃度が既知である検体（ヘモグロビン類標準物質、及び測定管理用ヘモグロビン類物質等）を溶解又は希釈する希釈液として好適に用いられる。さらに、上記ヘモグロビン類測定用試薬は、液体クロマトグラフの洗浄液及びカラムの洗浄液としても好適に用いられる。
　【０１７５】
　（ヘモグロビン類の測定方法）
　本発明に係るヘモグロビン類の測定方法は、赤血球含有検体と、上述したヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える。
　【０１７６】
　上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーは、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーであることが好ましい。
　【０１７７】
　上記赤血球含有検体としては、血液等が挙げられる。
　【０１７８】
　一般に、上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーにおいては、患者等から採取した血液（赤血球含有検体）から調製された混合液に加えて、赤血球を含まず、かつ測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知である検体から調製された混合液も測定される。上記赤血球を含まず、かつ測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知である検体としては、測定対象のヘモグロビン類標準物質（測定対象の既知濃度のヘモグロビン類）、測定対象の測定管理用ヘモグロビン類物質（測定対象の既知濃度のヘモグロビン類、好ましくは低濃度、中濃度、高濃度等の複数濃度を測定）等が挙げられる。上記ヘモグロビン類標準物質及び上記測定管理用ヘモグロビン類物質は、好ましくは用時調製検体、凍結乾燥検体又は凍結検体である。また、上記ヘモグロビン類標準物質及び上記測定管理用ヘモグロビン類物質は、凍結乾燥品又は凍結品として市販されている。
　【０１７９】
　上記ヘモグロビン類の測定方法では、例えば、以下のようにしてヘモグロビン類の濃度を求めることが好ましい。（１）上記赤血球含有検体と、上記ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る。（２）上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する。（３）測定対象のヘモグロビン類のピーク面積の、ヘモグロビンのピーク面積の合計に対する比（測定対象のヘモグロビン類のピーク面積／ヘモグロビンのピーク面積の合計）を測定対象のヘモグロビン値（ヘモグロビン類の濃度）とする。例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ値を求める場合には、上記（３）において、ヘモグロビンＡ１ｃのピーク面積の、ヘモグロビンのピーク面積の合計に対する比（ヘモグロビンＡ１ｃのピーク面積／ヘモグロビンのピーク面積の合計）をヘモグロビンＡ１ｃ値とする。
　【０１８０】
　上記ヘモグロビン類の測定方法では、例えば、以下のようにしてヘモグロビン類の濃度を求めることもできる。（１）上記赤血球含有検体と、上記ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して第１の混合液を得る。（２）測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知であるヘモグロビン類含有検体と、上記ヘモグロビン類測定用試薬とを混合して第２の混合液を得る。（３）上記第１の混合液及び上記第２の混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する。（４）測定対象のヘモグロビン類の濃度が既知である上記ヘモグロビン類含有検体を含む上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定して得られた測定値と、上記赤血球含有検体を含む上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定して得られた測定値とを比較することで、上記赤血球含有検体中のヘモグロビン類の濃度を決定する。
　【０１８１】
　より一層良好に溶血させる観点からは、上記赤血球含有検体１ｍＬに対して、上記ヘモグロビン類測定用試薬を、好ましくは２５ｍＬ以上、より好ましくは５０ｍＬ以上、好ましくは４００ｍＬ以下、より好ましくは２００ｍＬ以下で混合することが好ましい。
　【０１８２】
　上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーは、塩濃度のグラジエント又はｐＨのグラジエントで測定されることが好ましい。上記グラジエントは、リニアグラジエントであってもよく、ステップグラジエントであってもよい。
　【０１８３】
　上記グラジエントの測定では、２種以上の溶離液が用いられることが好ましい。上記塩濃度のグラジエントで測定する場合には、上記溶離液として、低塩濃度の溶離液及び高塩濃度の溶離液（例えば、ＮａＣｌ濃度が５０ｍＭである溶離液及びＮａＣｌ濃度が２００ｍＭである溶離液）を用いることができる。上記ｐＨグラジエントで測定する場合には、ｐＨの異なる２種の溶離液（例えば、ｐＨ５．４の溶離液とｐＨ８．０の溶離液）を用いることができる。また、上記溶離液として、市販品を用いることもできる。上記溶離液の市販品としては、アークレイ社製「溶離液８０Ａ」、「溶離液８０Ｂ」、「溶離液６０Ａ−ＶＰ／ＴＰ」、「溶離液６０Ｂ−ＶＰ／ＴＰ」、及び「溶離液６０Ｃ−ＶＰ」等が挙げられる。
　【０１８４】
　上記陽イオン交換液体クロマトグラフィーで用いられる陽イオン交換カラムとして、従来公知の陽イオン交換カラムを用いることができる。上記陽イオン交換カラムは、カルボキシル基、スルホン酸基、又はリン酸基等のカチオン交換基を有する充填剤が充填されたカラムであることが好ましい。陽イオン交換カラムの市販品としては、例えば、アークレイ社製「カラムユニット８０」及び「カラムユニットＨＳＶＩ−ＶＰ」等が挙げられる。
　【０１８５】
　以下、実施例、参考例及び比較例を挙げることにより、本発明を具体的に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されない。
　【０１８６】
　（参考例１、実施例２
，３、参考例４
　ヘモグロビン類測定用試薬の調製：
　リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二カリウムと、塩化ナトリウムと、アジ化ナトリウムと、水とを混合し第１の組成物を得た。得られた第１の組成物に、表２〜６に示す界面活性剤を添加して混合し、ヘモグロビン類測定用試薬を調製した。得られたヘモグロビン類測定用試薬の組成を以下の表１に示す。表１中の界面活性剤の種類、含有量、ＨＬＢ値及び曇点は、表２〜６に示した。なお、界面活性剤のＨＬＢ値は、上述した方法で測定された値である。
　【０１８７】
　【表１】
　【０１８８】
　（評価）
　（１）界面活性剤の溶解性
　上記第１の組成物に界面活性剤を添加して混合した際の界面活性剤の溶解性を目視にて確認した。界面活性剤の溶解性を以下の基準で判定した。
　【０１８９】
　［界面活性剤の溶解性の判定基準］
　○○：界面活性剤が１５分未満で完全に溶解する
　○：界面活性剤が１５分以上３０分未満で完全に溶解する
　△：界面活性剤が３０分以上１時間未満で完全に溶解する
　×：界面活性剤が１時間以上で完全に溶解する、又は溶解しない
　【０１９０】
　（２）陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定
　採血管（積水メディカル社製）に収容された全血（赤血球含有検体）を用意した。全血１ｍＬに対して、得られたヘモグロビン類測定用試薬１００ｍＬを混合し、混合液を得た。得られた混合液を以下の条件で測定した。なお、「（１）界面活性剤の溶解性」の判定結果が×であるヘモグロビン類測定用試薬では、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定を行わなかった。
　【０１９１】
　陽イオン交換クロマトグラフィー条件：
　ＨＰＬＣ装置：グリコヘモグロビン分析装置（アークレイ社製「ＨＡ−８１８０」）
　陽イオン交換カラム：カラムユニット８０（アークレイ社製）
　溶離液Ａ：溶離液８０Ａ（アークレイ社製）
　溶離液Ｂ：溶離液８０Ｂ（アークレイ社製）
　【０１９２】
　ＨＰＬＣ装置に搭載されている測定メソッドを用いて、測定を行った。
　【０１９３】
　（２−１）ピーク分離パターン
　混合液を測定して得られたクロマトグラムについて、以下のｉ）〜ｉｉｉ）を確認した。なお、参考例Ａでは、図２に示すクロマトグラムのピークパターンが得られた。得られるクロマトグラムにおいて、約１９秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ１ｃのピークであり、約４０秒に検出されたピークがヘモグロビンＡ０のピークである。
　【０１９４】
　ｉ）ヘモグロビンＡ１ｃピークの分離
　参考例Ａで得られたヘモグロビンＡ１ｃのピーク高さと、実施例２
，３
４
　【０１９５】
　ｉｉ）ヘモグロビンＡ０ピークの形状
　参考例Ａでは、ヘモグロビンＡ０ピークのピークテール部分において、ピークは検出されない。実施例２
，３
４
　【０１９６】
　なお、良好と判定されるクロマトグラムの例を図３（ａ）に示し、不良と判定されるクロマトグラムの例を図３（ｂ）に示した。
　【０１９７】
　ｉｉｉ）ファーストフラクションのピーク形状
　参考例Ａでは、ファーストフラクションのピークにおいて、ショルダーピークは検出されない。実施例２
，３
４
　【０１９８】
　なお、良好と判定されるクロマトグラムの例を図４（ａ）に示し、不良と判定されるクロマトグラムの例を図４（ｂ）に示した。図４（ｂ）において矢印で示したピークがショルダーピークである。
　【０１９９】
　［ピーク分離パターンの判定基準］
　○：ｉ）〜ｉｉｉ）の判定が全て良好
　×：ｉ）〜ｉｉｉ）の判定のいずれかが不良
　【０２００】
　（２−２）キャリーオーバー
　全血とヘモグロビン類測定用試薬とを混合した混合液を測定した後に続けて、ヘモグロビン類測定用試薬のみを５回連続して測定した。得られたクロマトグラムについて、以下のｉ）〜ｉｉｉ）を確認した。
　【０２０１】
　ｉ）ヘモグロビンＡ０ピーク高さ
　１回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、参考例Ａで得られたヘモグロビンＡ０のピーク高さと、実施例２
，３
４
　【０２０２】
　なお、参考例Ａで得られたクロマトグラムの例を図５（ａ）に示し、良好と判定されるクロマトグラムの例を図５（ｂ）に示し、不良と判定されるクロマトグラムの例を図５（ｃ）に示した。
　【０２０３】
　ｉｉ）ヘモグロビンＡ１ｃピークの有無
　１回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、ヘモグロビンＡ１ｃピークの有無を確認した。ヘモグロビンＡ１ｃピークが観察されない場合に良好と判定し、ヘモグロビンＡ１ｃピークが観察される場合に不良と判定した。
　【０２０４】
　ｉｉｉ）ドリフトの発生の有無
　１回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、ヘモグロビンＡ０ピークのドリフトの有無を確認した。ドリフトが観察されない場合に良好と判定し、ドリフトが観察される場合に不良と判定した。
　【０２０５】
　［キャリーオーバーの判定基準］
　○：ｉ）〜ｉｉｉ）の判定が全て良好
　×：ｉ）〜ｉｉｉ）の判定のいずれかが不良
　【０２０６】
　（３）ｐＨ
　参考例Ａ、実施例２
，３
４
　【０２０７】
　（４）浸透圧
　参考例Ａ、実施例２
，３
４
　【０２０８】
　組成及び結果を下記の表２〜６に示す。なお、表２，３，５中、「Ｅ．Ｏ．」で表される値は、オキシエチレン基の平均付加モル数を意味する。
　【０２０９】
　【表２】
　【０２１０】
　【表３】
　【０２１１】
　【表４】
　【０２１２】
　【表５】
　【０２１３】
　【表６】
　【０２１４】
　実施例２
，３
４
　【０２１５】
　（参考例Ａ及び実施例３１
，３２、参考例３３
　表７に示す組成に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてヘモグロビン類測定用試薬を調製した。
　【０２１６】
　（５）ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性
　参考例Ａ及び界面活性剤の濃度が０．５重量％である実施例３２
、参考例
　【０２１７】
　一般に、ヘモグロビン類測定用試薬は室温で保存されるものである。本評価項目では、通常の保存条件よりも苛酷な温度条件でヘモグロビン類測定用試薬を保存し評価している。
　【０２１８】
　［ヘモグロビン類測定用試薬の保存安定性（６０℃、７日間）の判定基準］
　Ａ：相分離が生じない
　Ｂ：相分離が生じる
　【０２１９】
　（６）混合液の保存安定性
　（６−１）全血との混合液の保存安定性
　全血（赤血球含有検体）を用意した。また、参考例Ａ及び実施例３１
，３２、参考例３３
　【０２２０】
　ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）＝ヘモグロビンＡ１ｃのピーク面積／ヘモグロビンのピーク面積の合計
　【０２２１】
　ヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量（％）＝保存前のヘモグロビンＡ１ｃ値−保存後のヘモグロビンＡ１ｃ値
　【０２２２】
　図６（ａ）は全血との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示す図である。図６（ｂ）は、全血との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　【０２２３】
　［全血との混合液の判定基準］
　○：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％以下である
　△：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％を超え０．４％以下である
　△△：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．４％を超え０．７％以下である
　×：５日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．７％を超える
　【０２２４】
　（６−２）測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）との混合液の保存安定性
　ヘモグロビンＡ１ｃ値が５．８％である測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）を用意した。また、参考例Ａ及び実施例３１
，３２、参考例３３
　【０２２５】
　図７（ａ）は測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示す図である。図７（ｂ）は、測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　【０２２６】
　［測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）との混合液の保存安定性の判定基準］
　○：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％以下である
　△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２％を超え０．４％以下である
　△△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．４％を超え０．７％以下である
　×：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．７％を超える
　【０２２７】
　（６−３）測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）との混合液の保存安定性
　測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）を、ヘモグロビンＡ１ｃ値が１０．４％である測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）に変更したこと以外は、「（６−２）測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（低濃度）（ＩＲＣ−Ｌ）との混合液の保存安定性」と同様にして、ヘモグロビンＡ１ｃ値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量を求めた。
　【０２２８】
　図８（ａ）は測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値との関係を示す図である。図８（ｂ）は、測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）との混合液における、保存日数とヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。
　【０２２９】
　［測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）との混合液の保存安定性の判定基準］
　○：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２５％以下である
　△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．２５％を超え０．４５％以下である
　△△：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．４５％を超え０．７５％以下である
　×：１４日目のヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量において、参考例Ａとの差の絶対値が０．７５％を超える
　【０２３０】
　組成及び結果を下記の表７に示す。
　【０２３１】
　【表７】
　【０２３２】
　実施例３１
，３２、参考例３３
参考
，３２、参考例３３
，３２、参考例３３
　【０２３３】
　（７）カラム耐久性
　全血（赤血球含有検体）と、ヘモグロビンＡ１ｃ値が１０．４％である測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質（高濃度）（ＩＲＣ−Ｈ）と、参考例Ａ及び実施例３２で得られたヘモグロビン類測定用試薬とを用意した。全血を、ヘモグロビン類測定用試薬で１０１倍希釈し、液（１）を得た。また、測定管理用ヘモグロビンＡ１ｃ物質を、ヘモグロビン類測定用試薬で１０１倍希釈し、液（２）を得た。液（１）は、カラムに負荷を与えるための測定試料であり、液（２）は、ヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量及び理論段数の変化量を確認するための測定試料である。得られた液（１）及び液（２）を以下の手順及び条件で測定した。
　【０２３４】
　先ず、得られた液（２）を３回測定した。その後、得られた液（１）を複数回（数十回〜２００回）カラムに通すごとに液（２）を３回測定した。カラムへの負荷検体数が約３０００検体となるまで、上記の手順に従って液（１）及び液（２）を繰り返し測定した。
　【０２３５】
　陽イオン交換クロマトグラフィー条件：
　ＨＰＬＣ装置：グリコヘモグロビン分析装置（アークレイ社製「ＨＡ−８１６０ＶＰ」）
　陽イオン交換カラム：カラムユニットＨＳＶＩ−ＶＰ（アークレイ社製）
　溶離液Ａ：溶離液６０Ａ−ＶＰ／ＴＰ（アークレイ社製）
　溶離液Ｂ：溶離液６０Ｂ−ＶＰ／ＴＰ（アークレイ社製）
　溶離液Ｃ：溶離液６０Ｃ−ＶＰ（アークレイ社製）
　【０２３６】
　ＨＰＬＣ装置に搭載されている測定メソッドを用いて、測定を行った。
　【０２３７】
　図９（ａ）はカラムへの負荷検体数と、ヘモグロビンＡ１ｃ値の変化量との関係を示す図である。図９（ｂ）はカラムへの負荷検体数と、理論段数の変化量との関係を示す図である。
　【０２３８】
　図９（ａ）において、縦軸は、最初に測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値と、各負荷検体数で測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値との差（最初に測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値−各負荷検体数で測定した液（２）におけるヘモグロビンＡ１ｃ値）である。図９（ｂ）において、縦軸は、最初に測定した液（２）における理論段数と、各負荷検体数で測定した液（２）における理論段数との差（最初に測定した液（２）における理論段数−各負荷検体数で測定した液（２）における理論段数）である。
　【０２３９】
　実施例３２で得られたヘモグロビン類測定用試薬は、参考例Ａで得られたヘモグロビン類測定用試薬よりもカラム耐久性に優れていた。
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、
　非イオン性界面活性剤を含み、
　前記非イオン性界面活性剤が、
オキシエチレン基の平均付加モル数が１２であるポリオキシエチレンラウリルエーテル
。
　【請求項２】
　（削除）
　【請求項３】
　（削除）
　【請求項４】
　（削除）
　【請求項５】
　前記非イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１重量％以上１．０重量％以下である、請求項
１
　【請求項６】
　赤血球含有検体と、請求項１
又は５
　前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法。