(57)【要約】 【課題】従来のマイクロアレイ用基板では達成できない可視化での感度を確保し、高価な蛍光試薬や高価な読み取り機を用いなくとも、簡易的な検査においては十分な感度を確保できる各種マイクロアレイ用基板を提供すること。【解決手段】  生物由来物又を捕獲する物質又は生物由来物を基板表面の所定範囲に点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、検体捕獲部表面は粗面であり、かつ親水性ゲルの性質を有するポリマーがコートされていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来物又を捕獲する物質又は生物由来物を基板表面の所定範囲に点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、検体捕獲部表面は粗面であり、かつ親水性ゲルの性質を有するポリマーがコートされていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。
【請求項２】
前記検体捕獲部表面の粗面が、凹凸の高低差で０．５〜５μｍ、凹凸の間隔が０．５〜５μｍである請求項１記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項３】
前記ポリマーの厚みが、１０〜１００ｎｍである請求項１又は２記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項４】
前記ポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、及びアルデヒド基の内、少なくとも１つの基と反応結合性を有する請求項１〜３いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項５】
前記ポリマーが、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである請求項１〜４いずれか記載のマイクロアレイ用基板
【請求項６】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである請求項１〜４いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項７】
発色の方法が、発色基質を含有する溶液を添加し酵素の反応により発色基質を発色させものである請求項１〜６いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項８】
前記酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである請求項７記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の検体捕獲部に、生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化したマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分野にて用いられる、DNAマイクロアレイ等のマイクロアレイに用いられるマイクロアレイ用基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常に行なわれている。従来遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってＤＮＡマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみることが行なわれている。従来からの電気泳動による方法では、ＰＣＲによる増幅反応や電気泳動時間等検出までに時間を要し、また電気泳動の操作に煩わしさがある。
また、マイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出に高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出機を必要とし、使用も研究分野の一部の研究機関に限られ、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでいたっていない。
【０００３】
上記、問題を解決するために、可視による遺伝子の検出方法が、特許文献１に開示されている。本特許文献に記載されている方法は、ＬＡＭＰ法により遺伝子の増幅を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉなどインターカレーターを用いて可視化を行うものであるが、乾燥した状態ではＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉの蛍光は減弱し検出は不可能である。
【０００４】
特許文献２には、遺伝子の検出において、基板表面にプライマーDNA鎖を固定し、検体のDNAを鋳型としてプライマーを伸長させ、その際酵素を導入し、酵素反応により発色を行い可視化により検出を行う方法が開示されている。しかし、本方法は基板上でのDNAポリメラーゼによる伸長反応が必要である。この反応では伸長反応により酵素が多く入ることにより、ある程度の感度の確保ができるが、伸長反応を行わない、一般のハイブリダイゼーションによる遺伝子の検出や抗原抗体反応のような検出では、可視化による検出感度は低いものとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１５４００８号公報
【特許文献２】特開２００６−３２２７３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、従来のマイクロアレイ用基板では達成できない可視化での感度を確保し、高価な蛍光試薬や高価な読み取り機を用いなくとも、簡易的な検査においては十分な感度を確保できる各種マイクロアレイ用基板を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、鋭意検討の結果、マイクロアレイにおける検体捕獲部を粗面化することにより、可視化によるマイクロアレイを用いた検出において高い検出感度を得ることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）生物由来物又を捕獲する物質又は生物由来物を基板表面の所定範囲に点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、検体捕獲部表面は粗面であり、かつ親水性ゲルの性質を有するポリマーがコートされていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。
（２）前記検体捕獲部表面の粗面が、凹凸の高低差で０．５〜５μｍ、凹凸の間隔が０．５〜５μｍである（１）記載のマイクロアレイ用基板。
（３）前記ポリマーの厚みが、１０〜１００ｎｍである（１）又は（２）記載のマイクロアレイ用基板。
（４）前記ポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、及びアルデヒド基の内、少なくとも１つの基と反応結合性を有する（１）〜（３）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（５）前記ポリマーが、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである（１）〜（４）いずれか記載のマイクロアレイ用基板
（６）前記ポリマーが、ポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである（１）〜（４）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（７）発色の方法が、発色基質を含有する溶液を添加し酵素の反応により発色基質を発色させものである（１）〜（６）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（８）前記酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである（７）記載のマイクロアレイ用基板。
（９）（１）〜（８）のいずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の検体捕獲部に、生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化したマイクロアレイ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によるマイクロアレイ用プラスチック基板により、食品検査をはじめとする検査用途に適用できる、可視化で感度良く検出が可能な身近なマイクロアレイの供給が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に使用するプラスチック製の基板の材質は、各種のプラスチックが適用できるが、特にポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリル樹脂などの汎用性樹脂がコスト面から好適である。
【００１０】
基板の全体の形状としては、特に制限はないが、従来からマイクロアレイ基板と使用されているスライドガラス形状が、反応操作等の際、従来のスライドガラス用の器具類の使用がそのまま可能となることから好適である。具体的には最大厚みは１ｍｍ程度、縦２５ｍｍ程度、横７５ｍｍ程度の寸法である。
【００１１】
基板表面には、基板表面全体或いは一部に検体捕獲部が設けられる。検体捕獲部表面は粗面となっており、粗面の度合いが、凹凸の高低差で０．５〜５μｍ、凹凸の間隔が０．５〜５μｍであることが好適である。下限値未満では、可視化検出におけるシグナルの感度向上への効果が得にくく、上限値を超えると、ＤＮＡ等の検体捕獲物を点着する際、スポット形状がにじむなどの不都合が生じる恐れがある。
プラスチック基板表面の検体捕獲部を粗面にする方法としては、成形する金型作製時に金型のキャビティの検体捕獲部分を化学的処理あるいはサンドブラスト処理により表面を粗して粗面化し、該金型でプラスチックを射出成形することで粗面をもった基板が得られる。又は、通常の金型で成形したプラスチック基板にサンドブラスト法等により成形品表面を粗して粗面化することも可能である。
【００１２】
、
検体捕獲部表面は親水性を有することが、検体の水溶液を検体捕獲部上に供給する上で必要であり、発色による可視化反応においては、親水性ゲルの性質を有するポリマーをコートすることが有効である。親水性ゲルの性質を有するポリマーとは、該ポリマーをキャスティングなとにより製膜した場合、その膜が含水性や膨潤性を有し、さらに物質透過性を有するポリマーのことをいう。この親水性ゲルの性質を有するポリマーにより、発色した基質が、スポットの周りのゲル内にとどまり、発色したスポットがより鮮明に可視化認識を可能にすることができる。
【００１３】
さらに親水性ゲルの性質を有するポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、及びアルデヒド基の内、少なくとも１つと反応結合性を有することが好ましい。これにより、検体捕獲物質を共有結合させることが可能となり、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸鎖、タンパク質、ペプチド、抗体や酵素、糖鎖などの生体由来物や、種々の合成薬物などの検体捕獲物を確実にポリマー上に固定化することが可能となる。
【００１４】
ポリマーとしては、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマー、又はポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーであることが好ましい。
このようなポリマーの例としては、ＭＰＣ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等の親水性基を有する化合物と活性エステル基を有する化合物との共重合ポリマーなどが挙げられる。
【００１５】
また、これらのポリマーは、ＤＮＡやタンパク質などの生体由来物の非特異的な吸着が少なく、検体捕獲部のコートに用いるポリマーとして好適である。検体捕獲部平面の親水性ゲルの性質を有するポリマーの厚みは、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。下限値未満では、ポリマーをコートする効果が認められなくり、上限値を超えると、コート厚みの制御が難しく、コート厚みのバラつきが大きくなり、発色による可視化シグナルのばらつきが大きくなる恐れがある。また、ゲル内の洗浄が不十分となり、検出の際の非特異シグナルの上昇につながることになり、感度を下げる恐れがある。
【００１６】
マイクロアレイ用プラスチック基板の検体捕獲部表面に、生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化してマイクロアレイを作製する。検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定することができる。
【００１７】
検体捕獲部における、検出対象物の捕獲の状況は、検出対象物に酵素標識を施しておき、この酵素の発色基質を含有する溶液を添加し、酵素の反応により発色基質を発色させる。
酵素としては、生物化学の分野で検出に広く使用されている、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼを用いることができる。発色基質としては、ウェスタンブロット等において、使用されるOPDやBCIP/NBTを用いることが出来る。
【実施例】
【００１８】
《実施例１》
飽和環状ポリオレフィン樹脂を使用して射出成形により、縦２５ｍｍ、横７５ｍｍ、厚さ１ｍｍのスライドガラス形状の基板の成形品を得た。使用した金型面の一部にはシボ加工（粗面化）が施されており、基板表面の一部にはシボ加工（粗面化）が形成されている。シボ加工部の凹凸の度合いは顕微鏡による測定を行ったところ、凹凸の高低差及び凹凸の間隔は、１．２〜１．７μｍであった。このシボ加工部分に１５ｍｍ×１５ｍｍの大きさで検体捕獲部を設定し、この設定した検体捕獲部に、次のように表面にポリマーコート処理を施した。まず、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン‐ブチルメタクリレート‐ｐ‐ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（poly(MPC-co-BMA-coNPMA)(PMBN)溶液を調製し、本溶液を検体捕獲部にコートを行い、乾燥後、純水にて洗浄を行った。乾燥状態でのポリマーコートの厚みは、エリプソメーターにより測定を行ったところ、１５〜４０nmであった。以上のように作製したマイクロアレイ用基板を、発色による可視化検出評価に供した。
【００１９】
《比較例１》
実施例1と同じ射出成形基板の平滑平面部分に１５ｍｍ×１５ｍｍの検体捕獲部を設定し、上記PMBN溶液によりコートを行い、洗浄、乾燥を行い、マイクロアレイ用基板を作製し、発色による可視化検出評価に供した。
【００２０】
《比較例２》
実施例1と同じ射出成形基板に、低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後、基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板を得た。この基板の粗面部分に１５ｍｍ×１５ｍｍの検体捕獲部を設定し、発色による可視化検出評価に供した。
【００２１】
《比較例３》
上記、比較例２のアルデヒド基板の平滑平面部分において１５ｍｍ×１５ｍｍの検体捕獲部を設定し、発色による可視化検出評価に供した。
【００２２】
（発色による可視化検出評価用マイクロアレイの作製）
上記で作製したマイクロアレイ用基板の検体捕獲部にＤＮＡプローブを固定した。５‘末端がアミノ基で修飾された、配列ＴＧＴＡＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＧＣＴＣＣＣＴ（配列番号１）のＤＮＡプローブ（２５塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのＤＮＡプローブ溶液を調製した。この溶液をピン方式スポッター（日立ソフトウェアエンジニアリング製ＭａｒｋｓＩ）を用いて、５００μｍ径のクロスカットピンで、それぞれの基板の検体捕獲部にアレイヤーによりスポットし固定化した。検体捕獲部に３０スポット固定化をおこない、ＤＮＡプローブの固定化の後、ブロッキング処理を行い、以下評価実験に供した。
【００２３】
（発色による可視化検出評価）
上記ＤＮＡプローブに相補配列を有し、５‘末端にビオチンが導入された、配列ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＡＡＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡ（配列番号２）の３５塩基のＤＮＡ断片溶液をDNA濃度０．２μMに調製した。上記にて作製した各マイクロアレイの検体捕獲部にＤＮＡ断片溶液を滴下し、ポリスチレン製のカバー（寸法：縦２５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．７ｍｍ）を被せ、ＤＮＡプローブスポット部全体に溶液をいきわたらせ、ハイブリダイゼーションを行った。
【００２４】
上記にてハイブリダイゼーションを行った後、アルカリホスファターゼ標識したアビジン溶液をＤＮＡプローブスポット部に供給し、上記と同様ポリスチレン製のカバーを被せてアビジン溶液をいきわたらせ３０分間放置した。次いでカバーを外し、洗浄用緩衝液で洗浄したのち、乾燥させ、次にＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を供給し、上記同様ポリスチレン製カバーで覆い２０分間放置し、発色反応を行った。各ＤＮＡプローブスポットにおける発色度合いを画像処理により数値化し、シグナル強度の比較をおこなった。
結果を、表１に示す。（Ｓ）は、３０スポットの数値化したシグナル強度の平均値であり、（Ｎ）は、検体捕獲部のＤＮＡプローブをスポットしていない部分３０点での強度の平均値であり、Ｓ／Ｎの比較によりシグナル感度の比較ができる。実施例１では、比較例１、２、３に比較し、格段に感度が高いことが確認された。
【００２５】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明のマイクロアレイ用プラスチック基板を用いて作製されたマイクロアレイは、発色での可視化によるマイクロアレイを用いた簡易的な検出を可能とし、可視化検出において高い感度を実現することが可能であり、高価な測定器を用いず低コストにてマイクロアレイによる各種検査の実現を図ることが出来る。
【配列表】
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