(57)【要約】【課題】本発明の目的は、一般的な治療上の使用に好適な改善された脂質−治療用核酸組成物を提供することである。【解決手段】本発明が解決しようとする課題は、核酸ベース薬、例えば、ｄｓＲＮＡを、ステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および特定のカチオン性脂質を有する製剤と複合体化させることによって解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および下記からなる群より選択されるカチオン性脂質を含む製剤と複合体化された核酸ベース薬を提供することを含む、核酸ベース薬を免疫細胞に送達する方法：
（ｉ）式（Ｉ）の構造を有するカチオン性脂質、その塩または異性体
【化１】
2020023585.tif 000060
（式中、
ｃｙは任意に置換された環状、任意に置換された複素環式もしくは複素環、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルまたは−リンカー−リガンドであり；
ＸおよびＹはそれぞれ独立してＯもしくはＳ、アルキルまたはＮ（Ｑ）であり；および
ＱはＨ、アルキル、アシル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルである）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の構造を有するカチオン性脂質
【化２】
2020023585.tif 000061
（式中、Ｒ１０およびＲ２０は独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されることができ、Ｒ３０およびＲ４０は独立して低級アルキルであり、あるいは、Ｒ３０およびＲ４０は一緒になり任意に置換された複素環を形成することができる）;
（ｉｉｉ）下記構造を有するカチオン性脂質
【化３】
2020023585.tif 000062
【化４】
2020023585.tif 000063
（式中、各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化５】
2020023585.tif 000064
【化６】
2020023585.tif 000065
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化７】
2020023585.tif 000066
【化８】
2020023585.tif 000067
であることを条件とし；
ここで、Ｒ１００は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ１０３、
【化９】
2020023585.tif 000068
であり、
ここでＲ１０３は、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ１０４、またはＳであり；
Ｒ１０４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される）、ならびに
（ｉｖ）下記構造を有するカチオン性脂質：
【化１０】
2020023585.tif 000069
（式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、各出現に対し、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、または任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Ｅは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、Ｓ（Ｏ）、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２−、−ＳＳ−、−０−Ｎ＝、＝Ｎ−０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、またはヘテロシクリレンであり;および
ＱはＨ、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルであり；および
Ｒ３はＨ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニル、任意に置換されたアルキル複素環、任意に置換された複素環アルキル、任意に置換されたアルキルホスフェート、任意に置換されたホスホアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロチオエート、任意に置換されたホスホロチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロジチオエート、任意に置換されたホスホロジチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホネート、任意に置換されたホスホノアルキル、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、任意に置換されたジ（アルキル）アミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキルアミノアルキル、任意に置換されたジ（アルキル）アミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００〜４０Ｋ）、任意に置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０〜４０Ｋ）、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、またはリンカー−リガンドである）。
【請求項２】
前記製剤は、１０〜７５％の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）またはそれらの混合物のカチオン性脂質、０．５〜５０％の中性脂質、５〜６０％のステロール、および０．１〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸ベース薬は、ＲＮＡベースコンストラクトである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記核酸ベース薬は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡは、免疫細胞で発現される遺伝子を標的とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記免疫細胞は、ヒトの腹膜腔または骨髄内にある、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記免疫細胞は、白血球である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単球、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記免疫細胞は、リンパ球である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記送達は、インビトロまたはインビボで実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸ベース薬は、静脈内または腹腔内注射により対象の免疫細胞に送達される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸ベース薬は、少なくとも１００ｎｍの平均粒子サイズを有する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および下記からなる群より選択される脂質を含む製剤と複合体化されたｄｓＲＮＡを対象に投与することを含む、自己免疫障害を有する対象を治療する方法：
（ｉ）式（Ｉ）の構造を有するカチオン性脂質、その塩または異性体
【化１１】
2020023585.tif 000070
（式中、
ｃｙは任意に置換された環状、任意に置換された複素環式もしくは複素環、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルまたは−リンカー−リガンドであり；
ＸおよびＹはそれぞれ独立してＯもしくはＳ、アルキルまたはＮ（Ｑ）であり；および
ＱはＨ、アルキル、アシル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルである）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の構造を有するカチオン性脂質
【化１２】
2020023585.tif 000071
（式中、Ｒ１０およびＲ２０は独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されることができ、Ｒ３０およびＲ４０は独立して低級アルキルであり、あるいは、Ｒ３０およびＲ４０は一緒になり任意に置換された複素環を形成することができる）;
（ｉｉｉ）下記構造を有するカチオン性脂質
【化１３】
2020023585.tif 000072
【化１４】
2020023585.tif 000073
（式中、各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化１５】
2020023585.tif 000074
【化１６】
2020023585.tif 000075
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化１７】
2020023585.tif 000076
【化１８】
2020023585.tif 000077
であることを条件とし；
ここで、Ｒ１００は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ１０３、
【化１９】
2020023585.tif 000078
であり、
ここでＲ１０３は、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ１０４、またはＳであり；
Ｒ１０４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される）、ならびに
（ｉｖ）下記構造を有するカチオン性脂質：
【化２０】
2020023585.tif 000079
（式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、各出現に対し、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、または任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Ｅは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、Ｓ（Ｏ）、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２−、−ＳＳ−、−０−Ｎ＝、＝Ｎ−０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、またはヘテロシクリレンであり;および
ＱはＨ、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルであり；および
Ｒ３はＨ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニル、任意に置換されたアルキル複素環、任意に置換された複素環アルキル、任意に置換されたアルキルホスフェート、任意に置換されたホスホアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロチオエート、任意に置換されたホスホロチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロジチオエート、任意に置換されたホスホロジチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホネート、任意に置換されたホスホノアルキル、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、任意に置換されたジ（アルキル）アミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキルアミノアルキル、任意に置換されたジ（アルキル）アミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００〜４０Ｋ）、任意に置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０〜４０Ｋ）、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、またはリンカー−リガンドである）。
【請求項１４】
前記核酸ベース薬は、ＲＮＡベースコンストラクトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸ベース薬は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記対象は、関節炎を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記製剤と複合体化されたｄｓＲＮＡは、静脈内注射により投与される、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記製剤と複合体化されたｄｓＲＮＡは、腹腔内注射により投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
リポソームを調製する方法であって、
ステロール、中性脂質、およびカチオン性脂質を含む混合物（前記混合物はＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない）を提供すること；
前記混合物をリポソームの形成を可能にする条件下で維持すること（前記リポソームの平均直径は少なくとも１００ｎｍである）；
前記混合物にＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を添加すること；よって、前記リポソームを形成させることを含む、方法。
【請求項２０】
核酸を前記リポソームに組み込むことをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物のｐＨは、酸性である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記混合物は、ナトリウムを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記ナトリウムの濃度は、約１０ｍＭである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ステロールは、コレステロールである、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
前記中性脂質は、ＤＳＰＣである、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
前記カチオン性脂質は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのいずれかの脂質から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
前記カチオン性脂質は、脂質Ａである、請求項１９記載の方法。
【請求項２８】
前記混合物にＰＥＧ修飾脂質を添加することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ＤＳＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項３０】
前記リポソームの平均直径は少なくとも１５０ｎｍである、請求項１９記載の方法。
【請求項３１】
前記リポソームは、０．４未満の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項３２】
前記リポソームは、０．４未満の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
請求項１９記載の方法により製造された生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２００９年５月５日に出願された米国特許仮出願第６１／１７５，７７７号；２００９年８月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／２３４，０４５号；２００９年９月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／２４２，７６１号；２００９年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／２５１，９９１号；および２００９年１１月６日に出願された米国特許仮出願第６１／２５８，８４８号の恩典を主張する。これらの先行出願の各々は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本明細書で記載される研究は、少なくとも一部、国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）により認可番号ＨＨＳＮ２６６２００６０００１２Ｃの下で与えられた米国政府からの資金を用いて実施された。そのため、政府は本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
技術分野
本発明は、免疫細胞への核酸ベース薬の送達の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
治療用核酸としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、および免疫刺激核酸が挙げられる。これらの核酸は様々な機序を介して作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合、これらの核酸はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる過程により、特定のタンパク質の細胞内レベルを下方制御することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞質中への導入に続いて、これらの二本鎖ＲＮＡコンストラクトは、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体から置換され、結合されたｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列に相補的な配列によりｍＲＮＡを認識し、結合することができる鋳型をＲＩＳＣ内で提供する。相補的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ複合体は、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、タンパク質合成のためにコードする対応するｍＲＮＡの特定の破壊を標的とすることにより、特定のタンパク質の下方制御を提供することができる。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡコンストラクトは標的タンパク質に対して誘導される任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるので、ＲＮＡｉの治療用途は著しく広範囲である。今日まで、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、インビトロおよびインビボモデルの両方において標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡコンストラクトは現在、臨床研究において評価されている。
【０００５】
最近の進歩にもかかわらず、当技術分野においては、一般的な治療上の使用に好適な改善された脂質−治療用核酸組成物の必要が未だ存在する。これらの組成物は、たとえば高効率で核酸をカプセル化し、高い薬物：脂質比を有し、カプセル化された核酸を血清中での分解およびクリアランスから保護し、全身送達に好適であり、カプセル化された核酸の細胞内送達を提供するものである。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、耐容性がよく、十分な治療指数を提供すべきであり、そのため、有効量の核酸での患者治療には、患者への有意の毒性および／または危険を伴わないことが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochim Biophys Acta. 1979 Oct 19;557(l):9-23
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、脂質を含む製剤と複合体化された核酸ベース薬を提供することにより、例えば、薬剤を免疫細胞に、薬剤の免疫細胞中への取り込みを可能にするのに十分な時間接触させることにより、核酸ベース薬を免疫細胞に送達する（または免疫細胞中の遺伝子を発現停止させる）方法を提供する。１つの実施形態では、対象の選択された区画、例えば、選択された組織または臓器の免疫細胞は、薬剤送達および遺伝子サイレンシングために標的とされる。１つの実施形態では、方法は、本明細書で記載される細胞型または区画に基づく選択性を提供するために、対象、核酸ベース薬、脂質含有製剤、または送達経路の１つ以上を選択することを含む。
【０００８】
核酸ベース薬は、例えば、ＲＮＡベースコンストラクト、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムである。１つの実施形態では、核酸ベース薬はｄｓＲＮＡである。本明細書で記載される組成物、例えば、脂質含有製剤と複合体化された核酸ベース薬は、免疫細胞への、特に、対象の腹膜腔の免疫細胞内への増強された送達を有する。このように、特色とされる組成物は、自己免疫および炎症性障害の治療における使用に特に好適である。
【０００９】
特色とされる方法は、１つの細胞型または区画（例えば、組織または臓器)、あるいは細胞型/区画の組み合わせへの選択的送達を可能にする。
【００１０】
１つの実施形態では、方法は、例えば、細胞への侵入の測定、サイレンシングの測定、または対象における治療反応の検出により、選択的送達またはサイレンシングを確認することを含む。
【００１１】
本明細書で開示される方法は、インビトロ、インビボおよびエクスビボで使用することができる。
【００１２】
１つの実施形態では、治療薬、例えばｄｓＲＮＡは、免疫細胞で発現される遺伝子、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤｌ１、ＣＤ２５、ＣＤ８、ＣＤ２９、ＣＤｌ１（例えば、ＣＤｌＩａ、ｂ、またはｃ）、ＣＤ１９、ＣＤ６９、ＣＤ３３、ＣＤ１２２、ＩＬ−２、またはＩＬ−６を標的とする。
【００１３】
別の実施形態では、第２のｄｓＲＮＡが、免疫細胞中の遺伝子を標的とするように、例えば、優性効果を生成させるように、例として、発現停止された第２の標的遺伝子を有する細胞に、他の免疫細胞の活性に影響を与えさせるように投与される。いくつかの実施形態では、第２のｄｓＲＮＡは、免疫応答の負の制御因子（例えば、ＰＤＬ−Ｉ（ＣＤ２７４分子）、ＩＬ−１Ｏ（インターロイキン−１０）、またはＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）遺伝子、例えば、ＴＧＦβｌ遺伝子またはＴＧＦβ２遺伝子）を標的とする。別の実施形態では、第２のｄｓＲＮＡは、活性炎症促進性刺激（例えば、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ−１８、などを標的とする。
【００１４】
免疫細胞は対象の局所組織、例えば対象の腹膜腔、または骨髄中に存在し得る。免疫細胞は、例えば、白血球、例えばリンパ球とすることができる。免疫細胞は、例えば、マクロファージ、樹状細胞、単球、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とすることができる。１つの実施形態では、免疫細胞は血流中に存在し、免疫細胞は、細胞が核酸ベースの治療薬を取り込んだ後対象の局所組織を標的にする。
【００１５】
１つの実施形態では、核酸ベース薬は、静脈内または腹腔内注射により対象（例えば、ほ乳類、例えばヒト）の免疫細胞に送達される。別の実施形態では、核酸ベース薬は、対象の特定の組織内の免疫細胞に、例えば対象の腹膜腔または骨髄に送達される。別の実施形態では、核酸ベース薬は対象の血流中の免疫細胞に送達され、その後、免疫細胞は、特定の組織、例えば腹膜腔、または骨髄あるいは炎症部位まで移動し、それにより取り込まれる。
【００１６】
別の実施形態では、核酸ベース薬は同時係属出願、２００９年６月１０日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ６１／１８５，８００号；２００９年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９３３号；２００９年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９３１号；２００９年１１月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９２７号；２０１０年１月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２２６１４号；および２０１０年１月２８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／２９９２９１号において記載される脂質を含む製剤に複合体化される。これらの出願の各々の内容は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
例えば、核酸ベース薬、例として、ｄｓＲＮＡは、ステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および下記からなる群より選択されるカチオン性脂質を有する製剤と複合体化させることができる：
（ｉ）式（Ｉ）の構造を有する脂質、その塩または異性体
【化１】
2020023585.tif 000002
（式中、
ｃｙは任意に置換された環状、任意に置換された複素環式もしくは複素環、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルまたは−リンカー−リガンドであり；
ＸおよびＹはそれぞれ独立してＯもしくはＳ、アルキルまたはＮ（Ｑ）；であり、および
ＱはＨ、アルキル、アシル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルである）；
（ｉｉ）式（ＩＩ）の構造を有する脂質
【化２】
2020023585.tif 000003
（式中、Ｒ１０およびＲ２０は独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されることができ、Ｒ３０およびＲ４０は独立して低級アルキルであり、あるいは、Ｒ３０およびＲ４０は一緒になり任意に置換された複素環を形成することができる）;
（ｉｉｉ）下記構造を有する脂質
【化３】
2020023585.tif 000004
【化４】
2020023585.tif 000005
（式中、各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化５】
2020023585.tif 000006
【化６】
2020023585.tif 000007
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化７】
2020023585.tif 000008
【化８】
2020023585.tif 000009
であることを条件とし；
ここで、Ｒ１００は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ１０３、
【化９】
2020023585.tif 000010
であり、
ここでＲ１０３は、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ１０４、またはＳであり；
Ｒ１０４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される）、ならびに
（ｉｖ）下記構造を有する脂質：
【化１０】
2020023585.tif 000011
（式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、または任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Ｅは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、Ｓ（Ｏ）、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２−、−ＳＳ−、−０−Ｎ＝、＝Ｎ−０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、またはヘテロシクリレンであり;および
ＱはＨ、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルであり；
Ｒ３はＨ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニル、任意に置換されたアルキル複素環、任意に置換された複素環アルキル、任意に置換されたアルキルホスフェート、任意に置換されたホスホアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロチオエート、任意に置換されたホスホロチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロジチオエート、任意に置換されたホスホロジチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホネート、任意に置換されたホスホノアルキル、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、任意に置換されたジ（アルキル）アミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキルアミノアルキル、任意に置換されたジ（アルキル）アミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００〜４０Ｋ）、任意に置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０〜４０Ｋ）、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、またはリンカー−リガンドである）。
【００１８】
１つの実施形態では、式（Ｖ）の脂質は６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（「ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ」、「ＭＣ３」、および「脂質Ｍ」とも呼ばれる）であり、下記構造を有する：
【化１１】
2020023585.tif 000012
【００１９】
この実施形態では、Ｒ１およびＲ２はどちらもリノレイルであり、ＥはＣ（Ｏ）Ｏであり、Ｒ３はジメチルアミノプロピルである。
【００２０】
１つの実施形態では方法は、下記のうちの１つ以上を可能にする：
ａ．腹膜Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、または樹状細胞における核酸ベース薬の優先送達または遺伝子サイレンシング；
ｂ．骨髄Ｂおよび／またはＴ細胞への最小送達または遺伝子サイレンシング；
ｃ．骨髄マクロファージまたは樹状細胞における優先送達または遺伝子サイレンシング；
ｄ．脾臓Ｂ細胞またはマクロファージにおける優先送達または遺伝子サイレンシング；
ｅ．パイエル板の細胞における最小送達または遺伝子サイレンシング；または
ｆ．肝細胞への最小送達。
【００２１】
１つの実施形態では、方法は、肝臓またはパイエル板内のＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、または樹状細胞が、製剤と複合体化された薬剤の送達を免れ、または遺伝子サイレンシングを免れるように、核酸ベース薬の送達を提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、本明細書で記載される脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。
【００２４】
１つの態様では、関節炎（例えば、関節リウマチまたはアテローム性動脈硬化）のような自己免疫障害を有する対象を治療する方法が提供される。方法は対象に脂質含有製剤と複合体化されたｄｓＲＮＡを投与することを含み、ｄｓＲＮＡは免疫細胞で発現される遺伝子、例えば、マクロファージ中のＣＤ４５遺伝子を標的とする。
【００２５】
別の態様では、リポソームを調製する方法が提供される。方法は、ステロール、中性脂質、およびカチオン性脂質を含む混合物（混合物はＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない）を提供すること；任意で、混合物をリポソームの形成を可能にする条件下で維持すること（リポソームの平均直径は少なくとも１００ｎｍである）；前記混合物にＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を添加すること；によって、前記リポソームを調製することを含む。
【００２６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を下記説明において記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】チオグリコレート−活性化マクロファージにおけるインビボでのＬＮＰ０１  ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングの結果を示す。図１Ａは、ＬＮＰ０１−ｓｉＲＮＡの取込み後のマクロファージの蛍光標識細胞選別の結果を示すパネルである。図１Ｂは、ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡによるマクロファージにおけるＣＤ４５遺伝子発現の下方制御を示すグラフである。
【図２】脾臓のＢ細胞、骨髄系細胞および樹状細胞におけるＡｌｅｘａ４８８−標識ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳスキャンのパネルである。
【図３】ＬＮＰ０１  ｓｉＲＮＡはマクロファージに送達された（図３Ａ、第３パネル）が、遺伝子発現のサイレンシングはなかったことを示す。ＡＤ−３１７６  ｓｉＲＮＡは、ＩＣＡＭ２  ＲＮＡを標的とし、ＡＤ−１６６１  ｓｉＲＮＡは、血清因子ＶＩＩ  ＲＮＡを標的とする。
【図４】図４Ａは、ｉ．ｖ．（静脈内）またはｉ．ｐ．（腹腔内）注射により投与された場合のＬＮＰ０８−製剤化ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳスキャンのパネルである。図４Ｂは、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐによるＬＮＰ０８−製剤化ｓｉＲＮＡの投与後に腹膜腔から単離されたマクロファージおよび樹状細胞におけるＣＤ４５遺伝子発現の下方制御（「ノックダウン」またはＫＤ）を示す棒グラフである。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ｉ．ｖ．（図５Ａ）またはｉ．ｐ．（図５Ｂ）により投与された場合、ＣＤ４５およびルシフェラーゼＬＮＰ０８  ｓｉＲＮＡｓが骨髄白血球により取り込まれたことを示すＦＡＣＳ分析である。図５Ｃは、ＬＮＰ０８  ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡはｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与後白血球において遺伝子発現を停止させたことを示す棒グラフである。
【図６】ｉ．ｐ．またはｉ．ｖによるＬＮＰ０８  ｓｉＲＮＡ注射後の腹膜腔のリンパ球中のＣＤ４５レベルを示す棒グラフである。
【図７】ｉ．ｐ．またはｉ．ｖによるＬＮＰ０８  ｓｉＲＮＡ注射後の脾臓細胞のリンパ球（図７Ａ）および白血球（図７Ｂ）中のＣＤ４５レベルを示す棒グラフである。
【図８】ｉ．ｐ．またはｉ．ｖによるＬＮＰ０８  ｓｉＲＮＡ注射後のパイエル板（図８Ａ）または肝臓組織（図８Ｂ）由来の白血球（図７Ｂ）中のＣＤ４５レベルを示す棒グラフである。
【図９】脂質Ａ−製剤化ｓｉＲＮＡのｉ．ｖ．投与後の腹膜腔、脾臓、骨髄（ＢＭ）および肝臓中のマクロファージおよび樹状細胞におけるＣＤ４５サイレンシングのレベルを示す棒グラフである。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、腹膜腔のマクロファージ（図１０Ａ）および樹状細胞（図１０Ｂ）への脂質Ａ−製剤化ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳ分析である。図１０Ｃは腹膜腔のマクロファージおよび樹状細胞におけるＣＤ４５サイレンシングを示す棒グラフである。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、異なる用量レベルでの腹膜腔のマクロファージ（図１１Ａ）および樹状細胞（図１１Ｂ）への脂質Ａ−製剤化ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳ分析である。図１１Ｃは様々な用量レベルでの腹膜腔のマクロファージおよび樹状細胞におけるＣＤ４５サイレンシングを示す棒グラフである。
【図１２】腹膜腔、骨髄、脾臓および血液中のマクロファージ、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞による脂質Ａ−製剤化ｓｉＲＮＡの取り込みの時間経過を示すＦＡＣＳスキャンのパネルである。
【図１３】血中単球、脾臓マクロファージ、および腹膜腔の大マクロファージによる脂質Ａ−製剤化ｓｉＲＮＡの取り込みの時間経過を示すグラフである。
【図１４】ｉ．ｖ．投与後の骨髄（図１４Ａ）、脾臓（図１４Ｂ）、血液（図１４Ｃ）および腹膜腔（図１４Ｄ）の単球およびマクロファージにおけるＣＤ４５  ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を示す棒グラフである。
【図１５】図１５Ａは、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与後の、脂質Ａ−製剤化ＣＤ４５およびルシフェラーゼｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳスキャンのパネルであり、図１５Ｂは、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与後の、白血球におけるＣＤ４５遺伝子発現の下方制御を示す棒グラフである。
【図１６】ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．による脂質Ｔ−製剤化ｓｉＲＮＡの注射後の、腹膜腔のリンパ球におけるＣＤ４５レベルを示す棒グラフである。
【図１７】図１７ＡおよびＢは、ＣＤ４５およびルシフェラーゼ脂質Ｔ−製剤化ｓｉＲＮＡは、ｉ．ｖ．（図１７Ａ）またはｉ．ｐ．（図１７Ｂ）により注射された場合、骨髄白血球により取り込まれたことを示すＦＡＣＳスキャンである。図１７Ｃは、骨髄白血球における脂質Ｔ−製剤化ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡによるサイレンシングを示す棒グラフである。
【図１８】ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．によるマウスへの脂質Ｔ−製剤化ｓｉＲＮＡの注射後の、肝臓（図１８Ａ）、脾臓（図１８Ｂ）またはパイエル板の白血球におけるＣＤ４５レベルを示す棒グラフである。
【図１９】様々な用量でのｉ．ｖ．投与後の、腹膜腔のマクロファージにおける脂質Ｔ−製剤化ｓｉＲＮＡの用量依存取り込み（図１９Ａ）および遺伝子サイレンシング（図１９Ｂ）を示す。
【図２０】様々な用量でのｉ．ｖ．投与後の、脾臓のマクロファージおよび樹状細胞における脂質Ｔ−製剤化ｓｉＲＮＡの取り込み（図２０Ａ）および遺伝子サイレンシング（図２０Ｂ）を示す。
【図２１】図２１Ａは、様々な脂質Ａ−製剤化ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡの注射後の、マクロファージおよび樹状細胞におけるＣＤ４５サイレンシングを示す棒グラフである。図２１Ｂは、様々な脂質Ａ−製剤化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡの注射後の、肝臓におけるＦＶＩＩ  サイレンシングを示す棒グラフである。
【図２２】様々な脂質Ａ組成物を用いて製剤化されたｓｉＲＮＡの注射後の、肝臓におけるＦＶＩＩノックダウンおよびマクロファージ（図２２Ａ）または樹状細胞（図２２Ｂ）におけるＣＤ４５ノックダウンを比較する相関プロットである。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂはリポソームサイズ（図２３Ａ）および多分散指数（ＰＤＩ）により測定されるサイズ分布（図２３Ｂ）に対するインキュベーション時間の効果を示すグラフである。図２３Ｃは、リポソーム融合反応の開始後の指示された時間で収集されたリポソームのサイズ分布プロファイルを示すグラフである。
【図２４】図２４Ａは、様々な粒子サイズを有する脂質Ａ−製剤化ＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡの注射後の、肝臓におけるＦＶＩＩサイレンシングを示す棒グラフである。図２４Ｂは、様々な粒子サイズを有する脂質Ａ−製剤化ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡの注射後の、腹膜細胞におけるＣＤ４５サイレンシングを示す棒グラフである。図２４Ｃは、様々な粒子サイズを有する脂質Ａ−製剤化ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡの注射後の、脾細胞におけるＣＤ４５サイレンシングを示す棒グラフである。図２４Ｄは、様々な粒子サイズを有する脂質Ａ−製剤化ｓｉＲＮＡｓの注射後の、肝臓におけるＦＶＩＩサイレンシングおよびマクロファージにおけるＣＤ４５サイレンシングを比較した相関プロットである。
【図２５】ＬＮＰ−０１（図２５Ａ）またはＬＮＰ０８（図２５Ｂ）を用いて製剤化された場合の、インビトロでの初代マクロファージにおけるＣＤ４５の用量依存サイレンシングを示す棒グラフである。
【図２６】ｓｉＲＮＡがＬＮＰ０８を用いて製剤化された場合の、腹膜腔のマクロファージおよび樹状細胞におけるＣＤ４５発現の用量依存サイレンシングを示す棒グラフである。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂは、マクロファージおよび樹状細胞による脂質Ｍ−製剤化ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳ分析である。図２７Ｃは、脂質Ｍ−製剤化ｓｉＲＮＡによる用量依存サイレンシングを示す棒グラフである。
【図２８】腹膜腔（図２８Ａ）、脾臓（図２８Ｂ）、骨髄（図２８Ｃ）、または肝臓（図２８Ｄ）の細胞による、脂質Ａ−（ＸＴＣ）または脂質Ｍ−（ＭＣ３−）製剤化ｓｉＲＮＡの複数回投与後のＣＤ４５サイレンシングを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、例えば、脂質含有製剤と複合体化された核酸ベース薬、例えば治療薬を提供し、薬剤を免疫細胞に、薬剤の免疫細胞への取り込みを可能にするのに十分な時間接触させることにより、核酸ベース薬を免疫細胞に送達する方法を提供する。核酸ベース薬は、例えば、ＲＮＡベースコンストラクト、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムである。
【００２９】
脂質製剤
本明細書で開示される組成物、すなわち、脂質製剤（脂質含有製剤とも呼ばれる）と複合体化された核酸ベース薬を含む組成物は、核酸ベース薬を免疫細胞、例えば対象内の免疫細胞に送達するのに好適である。送達方法は、薬剤、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を動物に投与すること、任意で、免疫細胞において標的遺伝子の発現を評価することを含む。典型的には、核酸ベース薬および脂質製剤を含む組成物は免疫細胞に、核酸が脂質製剤と複合体化されていない場合よりも大きな程度まで取り込まれる。例えば、薬剤の免疫細胞への取り込みは、薬剤が脂質製剤と複合体化されていない場合よりも少なくとも１０％以上（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上）である。
【００３０】
免疫細胞を標的とする組成物に好適な脂質製剤としては、式Ａのカチオン性脂質、中性脂質、ステロールおよびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を有する製剤が挙げられ、ここで、式Ａは、
【化１２】
2020023585.tif 000013
であり、式中、Ｒ１およびＲ２は独立してアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれ任意に置換することができ、Ｒ３およびＲ４は独立して低級アルキルであり、またはＲ３およびＲ４は一緒になり任意に置換された複素環を形成する。１つの実施形態では、Ｒ１およびＲ２はオレオイル、パミトイル、ステロイル、リノレイルから独立して選択され、Ｒ３およびＲ４はメチルである。別の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はオレオイル、パミトイル、ステロイル、リノレイルから独立して選択され、Ｒ３およびＲ４はメチルである。
【００３１】
１つの実施形態では、式Ａの脂質は２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（脂質ＡまたはＸＴＣとも呼ばれる）であり、下記構造を有する：
【化１３】
2020023585.tif 000014
【００３２】
１つの実施形態では、製剤は１０〜７５％の式Ａのカチオン性脂質、０．５〜５０％の中性脂質、５〜６０％のステロール、および０．１〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３３】
別の実施形態では、製剤は２５〜７５％の式Ａのカチオン性脂質、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、および０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３４】
別の実施形態では、製剤は３５〜６５％の式Ａのカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３５】
さらに別の実施形態では、製剤は４５〜６５％の式Ａのカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３６】
１つの実施形態では、製剤は１０〜５０％の式Ａのカチオン性脂質、１０〜５０％の中性脂質、２０〜５０％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３７】
１つの実施形態では、製剤は２０〜４０％の式Ａのカチオン性脂質、２０〜４０％の中性脂質、２５〜４５％のステロール、および０．５〜５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３８】
１つの実施形態では、製剤は２５〜３５％の式Ａのカチオン性脂質、２５〜３５％の中性脂質、３５〜４５％のステロール、および１〜２％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３９】
１つの実施形態では、製剤は約３０％の式Ａのカチオン性脂質、３０％の中性脂質、３８．５％のステロール、および０．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態では、カチオン性脂質は脂質Ａであり、中性脂質はＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）であり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）脂質はＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＳＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧはＰＥＧ−Ｃｅｒｌ４またはＰＥＧ−Ｃｅｒｌ８である。
【００４０】
１つの実施形態では、製剤は２５〜３５％の式Ａのカチオン性脂質、２５〜３５％の中性脂質、２５〜３５％のステロール、および５〜１５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００４１】
１つの実施形態では、製剤は約３０％の式Ａのカチオン性脂質、３０％の中性脂質、３０％のステロール、および１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態では、カチオン性脂質は脂質Ａであり、中性脂質はＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）であり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）脂質はＰＥＧ−Ｃｅｒｌ４またはＰＥＧ−Ｃｅｒｌ８である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧはＰＥＧ−Ｃｅｒｌ８である。
【００４２】
別の実施形態では、製剤は約６０％の式Ａのカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態では、式Ａのカチオン性脂質は２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランであり、中性脂質はＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）であり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）脂質はＰＥＧ−ＤＭＧ（ｌ−（モノメトキシポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール）であり、ここで、ＰＥＧは約２，０００の平均分子量を有する。
【００４３】
別の実施形態では、製剤は約５７．５％の式Ａのカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１．５％のステロール、および約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。１つの実施形態では、式Ａのカチオン性脂質は脂質Ａ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。
【００４４】
１つの実施形態では、脂質：ｄｓＲＮＡの比は少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６である。１つの実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡの比は約１〜約２０、約３〜約１５、約４〜約１５、約５〜約１３の間である。１つの実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡの比は、約０．５〜約１２の間である。
【００４５】
１つの実施形態では、本明細書で記載される脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。
【００４７】
１つの実施形態では、核酸ベース薬と複合体化させるのに好適な脂質製剤は、押出法、インライン混合法、または本明細書で記載される任意の方法により生成される。
【００４８】
押出法（プレフォームド法またはバッチプロセスとも呼ばれる）は、空のリポソーム（すなわち核酸なし）を最初に調製し、続いて、空のリポソームに核酸を添加する方法である。小細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通してリポソーム組成物を押し出すと、比較的明確なサイズ分布が得られる。典型的には、懸濁液は、所望のリポソーム複合体サイズ分布が達成されるまで、１度以上膜を通して循環される。リポソームは連続してより小さな細孔の膜を通して押し出すことができ、リポソームサイズの段階的な減少が達成される。場合によっては、形成される脂質−核酸組成物は、いずれのサイジングなしで使用することができる。これらの方法は、Ｕ．Ｓ．５，００８，０５０号；ＵＳ４，９２７，６３７号；ＵＳ４，７３７，３２３号；Biochim Biophys Acta. 1979 Oct 19;557(l):9-23; Biochim Biophys Acta. 1980 Oct 2;601(3):559-7; Biochim Biophys Acta. 1986 Jun 13;858(l):161-8;およびBiochim. Biophys. Acta 1985 812, 55-65において開示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４９】
インライン混合法は、脂質および核酸の両方が並行して混合チャンバに添加される方法である。混合チャンバは単純なＴ−コネクタまたは、当業者に知られている任意の他の混合チャンバとすることができる。これらの方法は、米国特許第６，５３４，０１８号およびＵ．Ｓ．６，８５５，２７７号；Ｕ．Ｓ．公開２００７／００４２０３１号およびPharmaceuticals Research, Vol. 22, No. 3, Mar. 2005, p. 362-372において開示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、リポソームは少なくとも約１００ｎｍの平均直径を有する粒子の形成を可能にする方法を使用して調製することができる。方法は、ステロール、中性脂質、およびカチオン性脂質を含む混合物（混合物はＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を実質的に含まない）を提供すること；任意で、混合物をリポソームの形成を可能にする条件下で維持すること（リポソームの平均直径は少なくとも１００ｎｍである）；ならびに、前記混合物にＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を添加すること；によって、前記リポソームを調製することを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、方法はまた、核酸（例えば、本明細書で記載される核酸）をリポソーム中に組み込み、核酸含有薬を形成させることを含む。核酸は一本鎖または二本鎖核酸とすることができる。核酸は、本明細書で記載されるＲＮＡ干渉核酸を含むことができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、リポソームの形成を可能にする条件は、いくつかあるパラメータの中で特に、ｐＨ、イオン強度および／またはナトリウム濃度、温度の調節を含む。いくつかの実施形態では、混合物のｐＨは酸性である（例えば、混合物中のカチオン性脂質は本質的にプロトン化されている）。いくつかの実施形態では、混合物のｐＨは、カチオン性脂質のｐＫａより低い（例えば、カチオン性脂質より少なくとも１．０低い）。いくつかの実施形態では、ｐＨは約５．５未満である（例えば、約５．２、約４．８、約３．２または約３．０）。
【００５３】
いくつかの実施形態では、混合物約５０ｍＭ未満（例えば、約２５ｍＭ以下、約１５ｍＭ以下、または約１０ｍＭ以下）のナトリウムなどのカチオン濃度を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、混合物はプロトン性溶媒、例えばエタノールを含む。
【００５５】
例示的なカチオン性脂質としては本明細書で記載されるもの、例えば、式Ｉ〜ＩＶのいずれかのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は脂質Ａを含む。例示的な中性脂質としては、本明細書で記載される任意の中性脂質、例えばＤＳＰＣが挙げられる。例示的なステロールとしては、本明細書で記載される任意のステロール、例えばコレステロールが挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、リポソームの形成を可能にする条件下で維持した後、ＰＥＧ修飾脂質、例えば本明細書で記載されるＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８）を含有させることを含み、ここで、リポソームの平均直径は少なくとも１００ｎｍ（例えば、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、または少なくとも３００ｎｍ）である。
【００５７】
ステロール、中性脂質、カチオン性脂質、およびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質の相対比は一般に本明細書で記載される通りである。リポソームが核酸（例えば、核酸ベース薬）を含む場合でも、成分比は、一般に本明細書で記載される通りである。
【００５８】
１つの実施形態では、リポソーム（核酸を含むか、または含まないかのいずれか）の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、リポソームの多分散指数（ＰＤＩ）は約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。いくつかの実施形態では、リポソームの平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ、例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）であり、ＰＤＩは、約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。本発明の製剤は、当業者に知られている任意の方法により調製することができることが、さらに理解される。
【００６０】
さらなる実施形態では、押出法により調製された代表的な製剤は、表１に描出され、ここで、脂質Ａは式Ａの化合物であり、式中Ｒ１およびＲ２はリノレイルであり、Ｒ３およびＲ４はメチルである：
【表１Ａ】
2020023585.tif 000015
【表１Ｂ】
2020023585.tif 000016
【表１Ｃ】
2020023585.tif 000017
【表１Ｄ】
2020023585.tif 000018
【表１Ｅ】
2020023585.tif 000019
【００６１】
さらなる実施形態では、インライン混合法により調製された代表的な製剤は、表２に描出され、ここで、脂質Ａは式Ａの化合物であり、式中Ｒ１およびＲ２はリノレイルであり、Ｒ３およびＲ４はメチルである：
【表２Ａ】
2020023585.tif 000020
【表２Ｂ】
2020023585.tif 000021
【００６２】
１つの実施形態では、脂質製剤は、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％封入される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、表１または表２中の製剤の脂質Ａは、別の脂質、例えば脂質Ｔまたは脂質Ｍと置換される。
【００６４】
さらに別の実施形態では、核酸ベース薬と複合体化された製剤は、下記で記載されるように、ＬＮＰ０５、ＬＮＰ０６、ＬＮＰ０７、ＬＮＰ０８、またはＬＮＰ０９を含む：
【表３】
2020023585.tif 000022
【００６５】
１つの実施形態では、脂質含有製剤はさらに、アポリポタンパク質を含む。本明細書では、「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」は、当業者に知られているアポリポタンパク質ならびにそれらの変異体および断片、およびアポリポタンパク質作動薬、類似体または下記で記載されるそれらの断片を示す。
【００６６】
脂質製剤の他の好適な実施形態は、同時係属出願である、２００９年４月２１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／１７１，４３９号、；２００９年３月２日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／１５６，８５１号および２００９年５月５日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／１７５，７７０号において開示されている。これらの仮出願の各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
１つの態様では、核酸ベース薬は構造
【化１４】
2020023585.tif 000023
を有する脂質粒子と複合体化され、式中、ｃｙは任意に置換された環状、任意に置換された複素環式もしくは複素環、任意に置換されたアリールまたは任意に置換されたヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルまたは−リンカー−リガンドであり；ＸおよびＹはそれぞれ独立してＯもしくはＳ、アルキルまたはＮ（Ｑ）であり、；および、ＱはＨ、アルキル、アシル、アルキル、アシル、アルキルアミノ またはアルキルホスフェートである。
【００６８】
１つの実施形態では、核酸ベース薬は、中性脂質および粒子凝集を低減させることができる脂質を有する脂質粒子と複合体化される。１つの実施形態では、脂質粒子は本質的には（ｉ）少なくとも１つの本発明の脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えばコレステロール；ならびに（ｉｖ）ｐｅｇ−脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡから、約２０〜６０％カチオン性脂質：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％ステロール：０．５〜１５％ＰＥＧ−脂質のモル比で構成される。１つの実施形態では、脂質は光学的に純粋である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、脂質設計は、様々なｐＫａを有する頭部基、カチオン性、１°、２°および３°、モノアミン、ジおよびトリアミン、オリゴアミン／ポリアミン、低ｐＫａ頭部基−イミダゾールおよびピリジン、グアニジンを有し、アニオン性、両性イオンおよび疎水性尾部は、対称および非対称鎖、より長いおよびより短い、飽和および不飽和鎖を含み、骨格は、骨格グリセリドおよび他の非環式類似体、エーテル、エステル、ホスフェートおよび類似体、スルホネートおよび類似体との環状、スピロ、二環状および多環状結合、ジスルフィド、アセタールおよびケタールのようなｐＨ感受性結合、イミンおよびヒドラゾン、およびオキシムを含む。
【００７０】
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、構造
【化１５】
2020023585.tif 000024
を有し、式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルまたは−リンカー−リガンドであり；
ＸおよびＹはそれぞれ独立してＯもしくはＳ、アルキルまたはＮ（Ｑ）であり；
ＱはＨ、アルキル、アシル、アルキルアミノまたはアルキルホスフェートであり；および
ＲＡおよびＲＢはそれぞれ独立してＨ、Ｒ３、−Ｚ’−Ｒ３、−（Ａ２）ｊ−Ｚ’−Ｒ３、アシル、スルホネートまたは
【化１６】
2020023585.tif 000025
であり；
Ｑ１は独立して各出現に対しＯまたはＳであり；
Ｑ２は独立して各出現に対しＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）、アルキルまたはアルコキシであり；
ＱはＨ、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルであり；
Ａ１、Ａ４、およびＡ５はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、ＣＨ２、ＣＨＦまたはＣＦ２であり；
Ｚ’はＯ、Ｓ、Ｎ（Ｑ）またはアルキルであり；
ｉおよびｊは独立して０〜１０であり；ならびに
Ｒ３はＨ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、アルキル複素環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオエート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキル、ω−チオホスホアルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００〜４０Ｋ）、ｍＰＥＧ（分子量１２０〜４０Ｋ）、ヘテロアリール、複素環またはリンカー−リガンドである。
【００７１】
脂質製剤の他の好適な実施形態は、同時係属出願である、２００９年４月２１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／１７１，４３９号、または２００９年７月１５日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／２２５，８９８号において開示されており、これらの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
別の実施形態では、核酸ベース薬と複合体化させるのに好適な製剤は脂質Ｔ（ＬＮＰ１２、Ｃ１２−２００、またはＴｅｃｈＧｌとも呼ばれる）を含む。脂質Ｔは、例えば、Love et al. "Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing" Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-9（参照により組み込まれる）において記載される。
【００７３】
さらなる実施形態では、核酸ベース薬と複合体化させるために、押出法またはインライン混合法により調製された代表的な製剤が、表３に描出されており、ここで、脂質Ｔは
【化１７】
2020023585.tif 000026
またはそれらの組み合わせである。
【表４Ａ】
2020023585.tif 000027
【表４Ｂ】
2020023585.tif 000028
【００７４】
１つの実施形態では、脂質を含み、核酸ベース薬と複合体化される製剤はステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および式（Ｉ）のカチオン性脂質を含むことができ、
【化１８】
2020023585.tif 000029
式中、
各ＸａおよびＸｂは、各出現に対し、独立してＣ１〜６アルキレンであり；
ｎは０、１、２、３、４、または５であり；
Ａは各出現に対しＮＲ２または１〜３つのＲで任意に置換された環状部分であり；
ＢはＮＲまたは１〜２つのＲで任意に置換された環状部分であり；
各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化１９】
2020023585.tif 000030
【化２０】
2020023585.tif 000031
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化２１】
2020023585.tif 000032
【化２２】
2020023585.tif 000033
であることを条件とし；
Ｒ１は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ３、
【化２３】
2020023585.tif 000034
であり、
Ｒ２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ４、またはＳであり；
Ｒ４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される。
【００７５】
１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、少なくとも２または３つの窒素を含み、別の実施形態では、ｎは１、２、または３である。別の実施形態では、少なくとも１つのＡは環状部分、例えば窒素含有環状部分、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）またはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｙｌ）部分である。別の実施形態では、少なくとも１つのＢは環状部分、例えば、窒素含有環状部分である。別の実施形態では、少なくとも１つのＢはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）またはピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｙｌ）部分である。
【００７６】
１つの実施形態では、製剤はステロール；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、中性脂質および式（ＩＩ）のカチオン性脂質を含み：
【化２４】
2020023585.tif 000035
式（ＩＩ）
各ＸａおよびＸｂは、各出現に対し、独立してＣ１〜６アルキレンであり；
ｎは０、１、２、３、４、または５であり；
各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化２５】
2020023585.tif 000036
であり、
あるいは２つのＲはそれらに結合している窒素と一緒になり環を形成し；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化２６】
2020023585.tif 000037
【化２７】
2020023585.tif 000038
であることを条件とし；
Ｒ１は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ３、
【化２８】
2020023585.tif 000039
であり；
式中、Ｒ３は１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基（例えば、親水性置換基）で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ４、またはＳであり；
Ｒ４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される。
【００７７】
別の実施形態では、脂質を含み、核酸ベース薬と複合体化される製剤はステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および式（ＩＩＩ）、（ＶＩ）の化合物またはその混合物を含み
【化２９】
2020023585.tif 000040
式中、各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化３０】
2020023585.tif 000041
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化３１】
2020023585.tif 000042
【化３２】
2020023585.tif 000043
であることを条件とし；
式中、Ｒ１は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ３、
【化３３】
2020023585.tif 000044
であり；
式中、Ｒ３は１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ４、またはＳであり；
Ｒ４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される。
【００７８】
１つの実施形態では、製剤は脂質Ｔを含む。脂質Ｔは、ステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および式（ＩＩＩ）、（ＶＩ）の化合物またはその混合物を含み、
【化３４】
2020023585.tif 000045
式中、各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化３５】
2020023585.tif 000046
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化３６】
2020023585.tif 000047
【化３７】
2020023585.tif 000048
であることを条件とし；
式中、Ｒ１は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ３、
【化３８】
2020023585.tif 000049
であり；
式中、Ｒ３は１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ４、またはＳであり；
Ｒ４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
ならびに、下記式（Ｖ）もしくは式（ＶＩ）の化合物、または下記式（Ｖ）および式（ＶＩ）の混合物を含む組成物である。
【化３９】
2020023585.tif 000050
【化４０】
2020023585.tif 000051
【００７９】
１つの実施形態では、本明細書で記載される脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。
【００８０】
別の実施形態では、脂質を含む製剤は、式（Ｖ）の化合物、下記式の化合物を含み：
【化４１】
2020023585.tif 000052
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して各出現に対し任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、または任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Ｅは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、Ｓ（Ｏ）、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２−、−ＳＳ−、−０−Ｎ＝、＝Ｎ−０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、またはヘテロシクリレンであり;および
ＱはＨ、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルであり；
Ｒ３はＨ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニル、任意に置換されたアルキル複素環、任意に置換された複素環アルキル、任意に置換されたアルキルホスフェート、任意に置換されたホスホアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロチオエート、任意に置換されたホスホロチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロジチオエート、任意に置換されたホスホロジチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホネート、任意に置換されたホスホノアルキル、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、任意に置換されたジ（アルキル）アミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキルアミノアルキル、任意に置換されたジ（アルキル）アミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００〜４０Ｋ）、任意に置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０〜４０Ｋ）、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、またはリンカー−リガンドである。
【００８１】
１つの実施形態では、式（Ｖ）の脂質は６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（「ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ」、「ＭＣ３」、および「脂質Ｍ」とも呼ばれる）であり、下記構造を有する：
【化４２】
2020023585.tif 000053
【００８２】
この実施形態では、
Ｒ１およびＲ２はどちらもリノレイルであり、ＥはＣ（Ｏ）Ｏであり、Ｒ３はジメチルアミノプロピルである。
【００８３】
１つの実施形態では、脂質はラセミ混合物である。
【００８４】
１つの実施形態では、脂質は１つのジアステレオマーに富み、例えば、脂質は少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％または少なくとも７０％ジアステレオマー過剰である。
【００８５】
１つの実施形態では、脂質はキラルに純粋であり、例えば単一異性体である。
【００８６】
１つの実施形態では、脂質は１つの異性体に富む。
【００８７】
１つの実施形態では、本発明の製剤は少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％封入される。
【００８８】
免疫細胞で発現される標的遺伝子
本明細書で記載される組成物、例えば、脂質含有製剤と複合体化される核酸ベース薬は、増強された免疫細胞への取り込みにより特徴づけられる。このように、核酸ベース薬（例えば、ｄｓＲＮＡ）の標的遺伝子は、典型的には免疫細胞で発現される遺伝子である。例えば、標的遺伝子はＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ８、ＣＤ２９、ＣＤ１１（例えば、ＣＤ１１ａ、ｂ、およびｃ）、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３８、ＣＤ１１６、ＣＤ２８、ＮＫ１．１、ＴＣＲ−β、ＧＲ−Ｉ、ＣＤ６９、ＣＤ１２２、ＩＬ−２、またはＩＬ−６とすることができる。
【００８９】
標的遺伝子、例えばＣＤ４５の発現の効果は、生物試料、例えば血液、血清、尿または組織試料中のＣＤ４５レベルを測定することにより評価される。１つの実施形態では、患者、例えば、関節炎を有する患者の滑液由来の標的遺伝子発現レベルがアッセイされる。
【００９０】
１つの実施形態では、腹膜腔由来の細胞中のｍＲＮＡレベルが評価される。別の実施形態では、少なくとも２つの型の評価が実施され、例えば、タンパク質レベルの評価（例えば、血液中）、およびｍＲＮＡレベルの測定（例えば、腹膜腔由来の細胞中）の両方が実施される。
【００９１】
別の実施形態では、核酸ベース薬および脂質含有製剤を含む組成物が免疫細胞、例えば白血球、例として、リンパ球、例えばＢ細胞またはＴ細胞により取り込まれる。組成物は、例えば、マクロファージ、樹状細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、単球、骨髄系細胞、顆粒球、または好中球により吸収される。他の実施形態では、組成物は、例えば、［ＣＤ５＋ＣＤ１１−細胞］（例えば、Ｔ細胞）；［ＣＤ１９＋ＩｇＭ細胞］または［ＣＤ１９＋ＩｇＤ細胞］（例えば、Ｂ細胞）；ＣＤ５−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−細胞］（例えば、骨髄系細胞）；または［ＣＤ５−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞］（例えば、樹状細胞）により取り込まれる。いくつかの実施形態では、組成物はＣＤ１１ｂ＋細胞、例えば、マクロファージもしくは顆粒球、またはＣＤ１１ｃ＋細胞により取り込まれる。別の実施形態では、コンストラクトの核酸ベース薬、例えばｄｓＲＮＡ、は、免疫細胞において発現される遺伝子、例えば、ＣＤ４５遺伝子の発現を阻止する。
【００９２】
本明細書で記載される組成物の増強された取り込みを有する免疫細胞は腹膜腔または骨髄中に存在することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば血漿または血液中の循環細胞であり、他の実施形態では、あるいはさらに、標的免疫細胞は、脾臓、または肝臓中に存在する。他の実施形態では、脂質組成物の増強された取り込みを有する免疫細胞は、炎症部位、例えば関節炎関節に存在する。典型的には、組成物は、腹膜腔内の免疫細胞、例えばマクロファージおよび樹状細胞において増強された取り込みを示す。
【００９３】
１つの実施形態では、候補の核酸ベース薬の投与後様々な時間点で、生物試料、例えば流体試料、例として、血液、血漿、もしくは血清、または組織試料が被験体からとられ、標的タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルに対する薬剤の効果について試験される。例えば、１つの実施形態では、候補薬剤はＣＤ４５を標的とするｄｓＲＮＡであり、生物試料は、ＣＤ４５タンパク質またはｍＲＮＡレベルに対する効果について試験される。１つの実施形態では、ＣＤ４５タンパク質の血漿レベルは、例えば、免疫組織化学アッセイまたは発色アッセイを使用してアッセイされる。別の実施形態では、例えば、腹膜腔または骨髄の細胞由来のＣＤ４５ｍＲＮＡレベルは、アッセイ、例えば分岐ＤＮＡアッセイ、またはノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲアッセイにより試験される。
【００９４】
１つの実施形態では、組成物、例えば脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬は毒性について評価される。さらに別の実施形態では、組成物で処置された対象は、身体的効果について、例えば、体重またはケージサイド挙動の変化によりモニタすることができる。１つの実施形態では、関節炎を有する患者の滑液は罹患組織の滑液中のマクロファージの数の減少に対してモニタされる。
【００９５】
核酸ベース薬
本明細書で記載される組成物、例えば、本明細書で記載される脂質−製剤化組成物において使用するのに好適な核酸ベース薬としては、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが挙げられる。例えば、二本鎖ＤＮＡは構造遺伝子、調節および終結領域を含む遺伝子、または自己複製系例えばウイルスまたはプラスミドＤＮＡとすることができる。二本鎖ＲＮＡは、例えばｄｓＲＮＡまたは別のＲＮＡ干渉試薬とすることができる。一本鎖核酸は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとすることができる。免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドもまた、免疫細胞へのターゲティングを増強するのに有用な組成物において使用するのに好適である。これらの薬剤はまた、下でより詳細に記載される。
【００９６】
本明細書では「アルキル」は１〜２４個の炭素原子を含む直鎖または分枝、非環状または環状、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、などが挙げられ；一方、飽和分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、などが挙げられる。代表的な飽和環状アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、などが挙げられ；一方、不飽和環状アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル、などが挙げられる。
【００９７】
「アルケニル」は隣接する炭素原子間の少なくとも１つの二重結合を含む、上で定義されるアルキルを意味する。アルケニルは、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体の両方を含む。代表的な直鎖および分枝アルケニルとしてはエチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、などが挙げられる。
【００９８】
「アルキニル」はさらに、隣接する炭素原子間の少なくとも１つの三重結合を含む、上で定義される任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが挙げられる。
【００９９】
「アシル」は下で定義されるように、結合点の炭素がオキソ基で置換された、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルはアシル基である。
【０１００】
「複素環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、１または２つの、窒素、酸素および硫黄から独立して選択されるヘテロ原子を含む、５〜７員単環または７〜１０員二環状複素環を意味し、ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意で酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は任意で四級化されてもよく、上記複素環のいずれかがベンゼン環に縮合された二環状環が含まれる。複素環はいずれのヘテロ原子または炭素原子を介して結合されてもよい。複素環は、下で定義されるヘテロアリーを含む。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、などが挙げられる。
【０１０１】
「任意に置換されたアルキル」「任意に置換されたアルケニル」「任意に置換されたアルキニル」「任意に置換されたアシル」および「任意に置換された複素環」という用語は、置換される場合、少なくとも１つの水素原子が、置換基と置換されることを意味する。オキソ置換基（＝０）の場合、２つの水素原子が置換される。この点において、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝０）Ｒｙ、−ＮＲｘＳ０２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝０）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙ（式中、ｎは０、１または２である）が挙げられ、ＲｘおよびＲｙは同じかまたは異なり、独立して水素、アルキルまたは複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基はそれぞれ、１つ以上のオキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝０）Ｒｙ−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝０）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙで、さらに置換され得る。
【０１０２】
「ハロゲン」はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、核酸ベース薬と共に使用するための脂質製剤は、保護基の使用を必要とし得る。保護基方法は当業者によく知られている（例えば、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W. et. al, Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照されたい）。簡単に言うと、本発明との関連では保護基は官能基の望まれていない反応性を減少させ、または排除する任意の基である。保護基は、ある反応中にある官能基の反応性をマスクするためにそれに付加され、その後、除去され、元の官能基を曝露させることができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の反応性を減少させ、または排除する任意の基である。保護基は、当技術分野でよく知られた技術を用いて添加し、除去することができる。
【０１０４】
核酸-脂質粒子
ある実施形態では、本明細書で特色とされる組成物は、脂質粒子と複合体化された核酸ベース薬を含む。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全にカプセル化される。本明細書では「核酸」という用語は任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。５０までのヌクレオチドを含む断片は一般に、オリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは２０〜５０ヌクレオチドの長さである。
【０１０５】
本発明との関連では、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、自然発生塩基、糖および糖間（バックボーン）結合から構成されるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを示す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、同様に機能する、非自然発生モノマーを含むポリマーまたはオリゴマー、またはその一部を含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドはしばしば、例えば、細胞取り込みの増強およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増加などの特性のために、天然型にとって代わられる。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドはデオキシリボオリゴヌクレオチまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’および３’炭素でホスフェートに共有結合により結合され交互非分枝ポリマーを形成するデオキシリボースと呼ばれる５−炭素糖から構成される。リボオリゴヌクレオチドは、同様の繰り返し構造から構成され、５−炭素糖はリボースである。
【０１０７】
本発明による脂質−核酸粒子中に存在する核酸として、知られている任意の型の核酸が挙げられる。本明細書で使用される核酸は一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとすることができる。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、調節および終結領域を含む遺伝子、ならびに自己複製系、例えばウイルスまたはプラスミドＤＮＡが挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１０８】
核酸ベース薬は様々な長さを有することができ、長さは一般に核酸の特定の形態に依存する。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は約１，０００〜１００，０００ヌクレオチド残基の長さとすることができる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１０〜１００ヌクレオチドの長さの範囲とすることができる。様々な関連する実施形態では、オリゴヌクレオチド（一本鎖、二本鎖、および三本鎖を含む）は、約１０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチドの長さの範囲とすることができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、組成物中に存在するオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、またはそれに相補的である。「特異的にハイブリダイズできる」および「相補的」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間に安定で特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズできるその標的核酸配列に対し１００％相補的である必要はないことは理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的への結合が、標的分子の正常機能を阻害し、それらの有用性または発現の損失を引き起こし、特異結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療療法の場合の、またはインビトロアッセイの場合の生理的条件下、またはアッセイが実施される条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズできる。このように、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、標的とする、または特異的にハイブリダイズする遺伝子領域またはｍＲＮＡ配列と比較して１、２、または３つの塩基置換を含む。
【０１１０】
１つの実施形態では、本明細書で記載される脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。
【０１１２】
使用方法
例えば、脂質含有製剤と複合体化された核酸ベース薬を有する、本明細書で特徴づけられる組成物は、薬剤を免疫細胞に、例えば、インビトロまたはインビボで送達させるのに使用される。細胞に導入するための典型的な核酸はｄｓＲＮＡ、免疫刺激オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスおよびリボザイムである。これらの方法は、本明細書で特徴づけられる粒子または組成物を細胞と、細胞内送達が起こるのに十分な時間の間、接触させることにより実施することができる。
【０１１３】
本明細書で記載される組成物は、免疫細胞において発現される遺伝子の過剰発現または望まれない発現により特徴づけられる障害を治療するために使用することができる。例えば、脂質含有製剤と複合体化された核酸ベース薬、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物は、自己免疫障害、例えば関節炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、ループスまたはＩＢＤ（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）を治療するために使用することができる。例えば、本明細書で特徴づけられる組成物は、樹状細胞への増強された取り込みを有することができ、この場合、例えば核酸ベース薬はＣＤ４５発現を標的とし、結果として、１つ以上のＩＢＤの症状が軽減できる。
【０１１４】
別の実施形態では、脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物は、炎症性障害、例えば関節炎を治療するために使用することができる。さらに別の実施形態では、脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物は、癌、例えば血液悪性腫瘍、例として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群を治療するために使用される。他の実施形態では特徴づけられる組成物の免疫細胞への取り込みの増強は、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、または非小細胞肺癌の治療に有用である。
【０１１５】
１つの実施形態では、本明細書で特徴づけられる組成物はエクスビボ療法で使用される。例えば、脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬を含む組成物は免疫細胞（例えば、樹状細胞）とインビトロで接触させることができ、そのため、薬剤が細胞により取り込まれ、標的遺伝子の発現が減少される。その後、細胞は、障害、例えば癌または自己免疫疾患を治療するために患者に（例えば、注射により）伝達される。１つの実施形態では、免疫細胞（例えば、樹状細胞）は患者から抽出され、脂質製剤中の核酸ベース薬と接触され、そのため薬剤は細胞に取り込まれ、そこで、遺伝子発現を減少させ、その後、細胞は患者に再導入される。このエクスビボ療法は、患者において障害、例えば癌、例として、非ホジキンリンパ腫を治療するのに有効である。
【０１１６】
本明細書で特色とされる組成物は、ほとんどすべての細胞型に吸着され得るが、特に、免疫細胞を標的とし、それらに吸着される。いったん吸着されると、核酸−脂質粒子は、細胞の一部により取り込まれるか、脂質を細胞膜と交換することができるか、あるいは、細胞と融合することができる。複合体の核酸部分の伝達または組み込みはこれらの経路のいずれか１つを介して起こり得る。いくつかの実施形態では、粒子がエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる場合、粒子はエンドソーム膜と相互作用することができ、おそらく非二重層相の形成によりエンドソーム膜の不安定化が起こり、カプセル化核酸の免疫細胞の細胞質への導入が得られる。同様に、粒子の細胞原形質膜との直接融合の場合、融合が起きた時、リポソーム膜は免疫細胞膜に統合され、リポソームの中身は細胞内液と一緒になる。細胞と脂質−核酸組成物との接触は、インビトロで実施される場合、生物学的に適合可能な媒質中で起こる。組成物濃度は、特定の適用によって広く変動し得るが、一般に、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌの間である。１つの実施形態では、脂質−核酸組成物による細胞の処置は、生理的温度（約３７℃）で、約１〜２４時間、例えば約２〜８時間の間実施される。インビトロ適用では、核酸の送達は、植物源か動物源か、脊椎動物か無脊椎贓物か、およびいずれの組織または型に関係なく、培養液中で増殖させた免疫細胞（例えば、マクロファージまたは樹状細胞）に対して実施することができる。１つの実施形態では、細胞は動物細胞、例えば、ほ乳類細胞、例えばヒト細胞である。
【０１１７】
典型的な適用としては、特定の細胞標的をノックダウンまたは発現停止させるためにｄｓＲＮＡの細胞内送達を提供するよく知られた手順を使用するものが挙げられる。また、適用は、治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。このように、欠損または不存在遺伝子産物を供給することにより遺伝性疾患に対し療法が提供される（すなわち、デュシェンヌ型ジストロフィーに対しては、Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989)を参照されたく、嚢胞性線維症では、Goodfellow, Nature 341 : 102-103 (1989)を参照されたい)。本明細書で特徴づけられる組成物の他の用途としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入が挙げられる(Bennett, et al, MoI. Pharm. 41:1023-1033 (1992)を参照されたい)。
【０１１８】
また、脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬を含む組成物は、当業者に知られた方法を用いてインビボで核酸を細胞への送達するために使用することができる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達に関しては、Zhu, et al., Science 261 :209-211 (1993)（参照により本明細書に組み込まれる）は、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を使用した、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達を記載する。Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993)（参照により本明細書に組み込まれる）は、リポソームを用いた嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のマウスの気道上皮および肺内肺胞への送達を記載する。Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989)（参照により本明細書に組み込まれる）は、マウス肺の、細胞内酵素、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能原核細胞遺伝子によるインビボトランスフェクションを記載する。このように脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬を含む組成物は感染症の治療に使用することができる。
【０１１９】
インビボ投与では、医薬組成物は典型的には非経口で、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、または真皮下に、例えば埋め込み装置により投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は静脈内または腹腔内に、ボーラス注入により投与される。一例として、Stadler, et al.,米国特許第５，２８６，６３４号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。細胞内核酸送達はまた、Straubringer, et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989)、およびBehr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993) においても記載されている。脂質ベースの治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、Rahman et al, 米国特許第３，９９３，７５４号; Sears, 米国特許第４，１４５，４１０号; Papahadjopoulos et al, 米国特許第４，２３５，８７１号; Schneider, 米国特許第４，２２４，１７９号；Lenk et al, 米国特許第４，５２２，８０３号；およびFountain et al, 米国特許第４，５８８，５７８号において記載される。
【０１２０】
他の方法では、医薬調製物は、その調製物を組織に直接適用することにより、標的組織と接触させることができる。適用は局所「開放」または「閉鎖」手順により実施され得る。「局所」は、医薬調製物の、環境に曝露された組織、例えば皮膚、中咽頭、外耳道、などへの直接適用を意味する。「開放」手順は、患者の皮膚を切開し、医薬調製物が適用される下の組織を直接可視化することを含む手順である。これは、外科的処置、例えば肺にアクセスするための開胸術、内臓脂肪にアクセスするための腹式開腹術、または他の直接的な標的組織への外科的アプローチにより一般に達成される。「閉鎖」手順は、内部標的組織が直接可視化されないが、皮膚内の小さな創傷を通して器機を挿入することによりアクセスされる侵襲的手順である。例えば、調製物は、ニードル洗浄により腹膜に投与され得る。同様に、医薬調製物は、脊髄麻酔または脊髄のメトリザミド造影のために普通実施されるように、腰椎穿刺中注入、続く患者の適切な位置決めにより髄膜または脊髄に投与される。また、調製物は、内視鏡装置により投与され得る。
【０１２１】
脂質−核酸組成物はまた、肺に吸入されるエアロゾルで（Brigham, et al, Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)を参照されたい）または疾患部位での直接注射により（Culver, Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, pp.70-71 (1994)）投与することができる。
【０１２２】
免疫細胞への取り込みを増強させるための組成物の使用方法は、様々な宿主、例えばほ乳類宿主、例えばヒト、非ヒト霊長類霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどで実施することができる。
【０１２３】
脂質−治療薬粒子のための用量は治療薬対脂質の比および患者の年齢、体重および病状に基づく投与する医師の意見に依存するであろう。
【０１２４】
１つの実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は一般に、細胞を、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することができる核酸と結合された脂質粒子と接触させることを含む。本明細書では、「調節する」という用語は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させることを指す。異なる実施形態では、調節は、増加または増強を意味することができ、あるいは、減少または低減を意味することができる。標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定する方法は、当技術分野で知られており、使用可能であり、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学技術を使用する方法が挙げられる。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルは、適切な対照値に比べ、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％超増加または減少される。例えば、ポリペプチドの発現の増加が所望される場合、核酸は所望されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとすることができる。他方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の減少が所望される場合、核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、よって標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡとすることができる。また、核酸は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドとすることができる。
【０１２５】
１つの特定の実施形態では、本発明は、細胞に、式Ａのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質から、例えば、約３５〜６５％の式Ａのカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質のモル比で構成される、または本質的に構成される脂質粒子を提供することを含み、脂質粒子はポリペプチドの発現を調節することができる核酸と結合される、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。特定の実施形態では、脂質モル比は約６０／７．５／３１／１．５または５７．５／７．５／３１．５／３．５（モル％脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）または約５０／１０／３０／１０、または５０／１０／３８．５／１．５（モル％脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８）である。別の実施形態群では、これらの組成物中の中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置換される。１つの実施形態では、本明細書で記載される脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。いくつかの実施形態では、粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。
【０１２６】
１つの特定の実施形態では、本発明は、細胞に、式Ａのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質から、例えば、約１０〜５０％の式Ａのカチオン性脂質、１０〜５０％の中性脂質、２０〜５０％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質のモル比で構成される、または本質的に構成される脂質粒子を提供することを含み、脂質粒子はポリペプチドの発現を調節することができる核酸と結合される、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。特定の実施形態では、脂質モル比は約３０／３０／３０／１０または３０／３０／３８．５／１．５（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＳＧのモル％）である。別の実施形態群では、これらの組成物中の中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置換される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８である。１つの実施形態では、本明細書で記載される脂質製剤と複合体化された核酸ベース薬の平均粒子サイズは、少なくとも直径約１００ｎｍ（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ、または少なくとも直径約３００ｎｍ）である。いくつかの実施形態では、粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は約０．５未満（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、または約０．１未満）である。
【０１２７】
１つの特定の実施形態では、本治療薬は、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択されるが、この場合、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、あるポリペプチドの発現を低下させるように、そのポリペプチド又はその相補体をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。
【０１２８】
他の実施形態では、本核酸は、あるポリペプチドもしくはその機能的変異体又はその断片の発現が上昇するように、そのポリペプチドもしくは機能的変異体又はその断片をコードするプラスミドである。
【０１２９】
関連する実施形態では、本発明は、例えば、脂質含有製剤と複合体化された核酸系薬剤を有する医薬組成物を対象に提供することによって対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患又は障害を治療する方法を提供するが、この場合、核酸系薬剤は、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、このｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、そのポリペプチド又はその相補体をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。
【０１３０】
１つの実施形態では、本医薬組成物は、例えば、式Ａの陽イオン性脂質約３５−６５％、中性脂質３−１２％、ステロール１５−４５％及びＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ又はＰＥＧ−ＤＭＡ０．５−１０％のモル比で、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ及びＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ又はＰＥＧ−ＤＭＡからなるか又は基本的にそれらからなり、治療用核酸と会合している脂質粒子を含む。特定の実施形態において、脂質のモル比は、およそ６０／７．５／３１／１．５又は５７．５／７．５／３１．５／３．５（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル％）又はおよそ５０／１０／３０／１０又は５０／１０／３８．５／１．５（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８のモル％）である。別の実施形態群において、これらの組成物中の中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＭで置き換えられる。１つの実施形態において、本明細書中に記載の脂質製剤と複合体化された核酸系薬剤の平均粒径は少なくとも直径約１００ｎｍである（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ又は少なくとも直径約３００ｎｍ）。あるいくつかの実施形態において、この粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は約０．５未満である（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満又は約０．１未満）。
【０１３１】
１つの実施形態では、本医薬組成物は、例えば、式Ａの陽イオン性脂質約１０−５０％、中性脂質１０−５０％、ステロール２０−５０％及びＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質０．５−１５％のモル比で、式Ａの陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧ修飾脂質のＰＥＧからなるか又は基本的にそれらからなり、治療用核酸と会合している脂質粒子を含む。特定の実施形態において、脂質のモル比は、およそ３０／３０／３０／１０又は３０／３０／３８．５／１．５である（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ＤＳＧのモル％）。別の実施形態群において、これらの組成物中の中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＭで置き換えられる。あるいくつかの実施形態において、ＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８である。１つの実施形態において、本明細書中に記載の脂質製剤と複合体化された核酸系薬剤の平均粒径は少なくとも直径約１００ｎｍである（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ又は少なくとも直径約３００ｎｍ）。あるいくつかの実施形態において、この粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は約０．５未満である（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満又は約０．１未満）。
【０１３２】
別の関連実施形態では、本発明は、例えば本明細書中に記載のような医薬組成物を対象に提供することによって対象におけるポリペプチドの発現低下を特徴とする疾患又は障害を治療する方法を含むが、この場合、この治療薬は、そのポリペプチド又はその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。１つの実施形態において、本明細書中に記載の脂質製剤と複合体化された核酸系薬剤の平均粒径は少なくとも直径約１００ｎｍである（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ又は少なくとも直径約３００ｎｍ）。あるいくつかの実施形態において、この粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は約０．５未満である（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満又は約０．１未満）。
【０１３３】
本発明は、核酸系薬剤が免疫刺激性のオリゴヌクレオチドである本明細書中に記載の医薬組成物を対象に提供することを含む、対象において免疫反応を誘導する方法をさらに提供する。ある種の実施形態において、この免疫反応は、例えば式Ａの陽イオン性脂質約３５−６５％、中性脂質３−１２％、ステロール１５−４５％及びＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ又はＰＥＧ−ＤＭＡ０．５−１０％のモル比で、脂質Ａ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ及びＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ又はＰＥＧ−ＤＭＡからなるか又は基本的にそれらからなり、治療用核酸と会合している、液性又は粘膜免疫反応である。特定の実施形態において、脂質のモル比は、およそ６０／７．５／３１／１．５又は５７．５／７．５／３１．５／３．５（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧのモル％）又はおよそ５０／１０／３０／１０又は５０／１０／３８．５／１．５（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８のモル％）である。別の実施形態群において、これらの組成物中の中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＭで置き換えられる。１つの実施形態において、本明細書中に記載の脂質製剤と複合体化された核酸系薬剤の平均粒径は少なくとも直径約１００ｎｍである（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ又は少なくとも直径約３００ｎｍ）。あるいくつかの実施形態において、この粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は約０．５未満である（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満又は約０．１未満）。
【０１３４】
本発明は、核酸系薬剤が免疫刺激性のオリゴヌクレオチドである、本明細書中に記載の医薬組成物を対象に提供することを含む、対象において免疫反応を誘導する方法をさらに提供する。ある種の実施形態において、この免疫反応は、例えば、式Ａの陽イオン性脂質約１０−５０％、中性脂質１０−５０％、ステロール２０−５０％及びＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質０．５−１５％のモル比で、式Ａの陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質からなるか又は基本的にそれらからなり、その脂質粒子が治療用核酸と会合している、液性又は粘膜免疫反応である。特定の実施形態において、脂質のモル比は、およそ３０／３０／３０／１０又は３０／３０／３８．５／１．５（脂質Ａ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ＤＳＧのモル％）である。別の実施形態群において、これらの組成物中の中性脂質は、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＭで置き換えられる。あるいくつかの実施形態において、このＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＣｅｒＣ１８である。１つの実施形態において、本明細書中に記載の脂質製剤と複合体化された核酸系薬剤の平均粒径は、少なくとも直径約１００ｎｍである（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ又は少なくとも直径約３００ｎｍ）。あるいくつかの実施形態において、この粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は約０．５未満である（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満又は約０．１未満）。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、第二の核酸系薬剤（例えば第二のｄｓＲＮＡ）及び／又は１以上のさらなる治療法と併用して、リポソーム製剤と複合体化された核酸系薬剤を含有する医薬組成物を投与することができる。例えば、癌の治療のために、化学療法剤とともに又は放射線療法と組み合わせて本明細書中で取り上げる組成物を投与することができる。代表的な化学療法剤としては、以下に限定されないが、テモゾロミド、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシン、アラビノシド、ビス−クロロエチルニトロスウレア（ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロスウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホール−アミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられる。全般的には、「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、第１５版、１９８７、ｐｐ．１２０６−１２２８、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊを参照のこと。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡとともに使用される場合、このような化学療法剤は、個々に（例えば、５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、しばらくの間５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチドを使用し、続いてＭＴＸ及びオリゴヌクレオチドを使用）又は１以上のその他のこのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド又は５−ＦＵ、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）、使用することができる。
【０１３６】
炎症性疾患の治療に対して、非ステロイド抗炎症剤もしくはコルチコステロイドなどの抗炎症剤又はリビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン、アシクロビルもしくはガンシクロビルなどの抗ウイルス剤と併用して、核酸系薬剤及び脂質製剤を含有する組成物を投与することができる。全般的には、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、それぞれ２４９９−２５０６及び４６−４９頁）を参照のこと。その他の非ＲＮＡｉ化学療法剤もまた本発明の範囲内である。２以上の併用化合物を一緒に又は連続して使用することができる。
【０１３７】
さらなる実施形態では、ワクチン又は抗原と組み合わせて、本医薬組成物が対象に提供される。従って、本発明自体が、免疫刺激性のオリゴヌクレオチドと複合体化され、免疫反応が所望される抗原とも会合する脂質粒子を有するワクチンを提供する。特定の実施形態において、この抗原は、腫瘍抗原であるか又は例えば、ウイルス、細菌もしくは寄生生物などの感染体と関連する。
【０１３８】
様々な腫瘍抗原、感染体抗原及び他の疾患に関連する抗原は当技術分野で周知であり、本明細書中で引用する参考文献にこれらの例が記載されている。本発明での使用に適切な抗原の例としては、以下に限定されないが、ポリペプチド抗原及びＤＮＡ抗原が挙げられる。抗原の具体例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽菌、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核及び風疹抗原である。１つの実施形態において、この抗原はＢ型肝炎組み換え抗原である。その他の態様において、この抗原はＡ型肝炎組み換え抗原である。別の態様において、この抗原は腫瘍抗原である。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原及びバーキットリンパ腫関連抗原である。さらなる態様において、この抗原はチロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原組み換え抗原である。当業者は本発明での使用に適切なその他の抗原が分かるであろう。
【０１３９】
本発明での使用に適切な腫瘍関連抗原としては、１つの腫瘍タイプを示し得、数種の腫瘍間で共通であり及び／又は正常細胞と比較して腫瘍細胞で特に発現されるかもしくは過剰発現され得る、突然変異及び非突然変異分子の両方が挙げられる。タンパク質及び糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質及びムチンの腫瘍特異的な発現パターンもまた記録されている。対象となる癌ワクチンでの使用のための代表的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子及び腫瘍細胞に特有の突然変異又は再編成があるその他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚遺伝子産物、腫瘍胎児抗原、組織特異的（腫瘍特異的ではない）分化抗原、成長因子受容体、細胞表面糖残基、外来ウイルスタンパク質及び多くのその他の自己タンパク質が挙げられる。
【０１４０】
腫瘍関連抗原の具体的な実施形態としては、例えば、突然変異が生じた抗原、例えばＲａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３及びＢＣＲ−ａｂl癌遺伝子のタンパク質産物ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８及びβカテニン；過剰発現される抗原、例えばガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２及びＫＳＡ、腫瘍胎児抗原、例えばαフェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；自己抗原、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びメラニン細胞分化抗原、例えばＭａｒｔ１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２；前立腺関連抗原、例えばＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１及びＰＳＭ−Ｐ２；再活性化胚遺伝子産物、例えばＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ及びその他の癌精巣抗原、例えばＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２及びＳＣＰ１；ムチン、例えばＭｕｃ−１及びＭｕｃ−２；ガングリオシド、例えばＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３、中性糖脂質及び糖タンパク質、例えばルイス（ｙ）及びグロボ−Ｈ；及び糖タンパク質、例えばＴｎ、トムゼン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）及びｓＴｎが挙げられる。また、本明細書中の腫瘍関連抗原には、細胞全体及び腫瘍細胞溶解液ならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用するための、Ｂリンパ球のモノクローナル増殖時に発現される免疫グロブリンイディオタイプも含まれる。
【０１４１】
病原体としては、以下に限定されないが、感染体、例えば哺乳動物、とりわけヒトに感染するウイルスなどが挙げられる。感染性ウイルスの例としては、以下に限定されないが、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる。）などのヒト免疫不全ウイルス）；及びＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばインフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばレオウイルス、オルビビウルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばアフリカブタコレラウイルス）；及び未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）であると思われる。）、非Ａ非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部感染（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）；クラス２＝非経口感染（即ちＣ型肝炎）;ノーウォーク及び関連ウイルス及びアストロウイルス）が挙げられる。
【０１４２】
また、グラム陰性及びグラム陽性細菌も脊椎動物において抗原となり得る。このようなグラム陽性細菌としては、以下に限定されないが、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が挙げられる。グラム陰性細菌としては、以下に限定されないが、大腸菌（エスケリキア・コリ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、以下に限定されないが、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（ナイセリア・ゴノレエ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ビリダン（ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（嫌気性種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（バチルス・アントラシス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（クロストリジウム・テタニ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）��パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フゾバクテリウム・ヌクレエータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）及びアクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）が挙げられる。
【０１４３】
病原体のさらなる例としては、以下に限定されないが、哺乳動物及びとりわけヒトに感染する感染性真菌が挙げられる。感染性真菌の例としては、以下に限定されないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられる。感染性寄生生物の例としては、マラリア原虫（プラスモディウム・ファルシパルム、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（プラスモディウム・マラリア、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（プラスモディウム・オバレ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）及び三日熱マラリア原虫（プラスモディウム・ビバクス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）などのマラリア原虫属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）が挙げられる。その他の感染性生物（即ち原生生物）としてはトキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。
【０１４４】
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態において、免疫細胞を標的とするための組成物中で使用される核酸系薬剤をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と会合させる。関心のある遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を妨害するために、ＲＮＡｉ分子を用いたＲＮＡ干渉法を使用し得る。この５年間、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ）は、次世代の標的化オリゴヌクレオチド薬として開発されてきており、アンチセンスＯＤＮ及びリボザイムに基本的に取って代わるようになってきた。ｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、通常は１９から２４ヌクレオチド長、例えば、１９から２１ヌクレオチド長の相補性領域を通常は有するＲＮＡ２本鎖である。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは約１０から約１５塩基対であり、他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは約２５から約３０塩基対長である。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは少なくとも１５塩基対長である。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖の一方又は両方が約１０から１５ヌクレオチド長であり、その他の実施形態において、この鎖の一方又は両方が約２５から約３０ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、このｄｓＲＮＡの一方又は両方が１９から２４ヌクレオチド長、例えば、１９から２１ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＲＩＳＣ）として知られる細胞質多タンパク質複合体と会合し得る。ｄｓＲＮＡが結合したＲＩＳＣは相同ｍＲＮＡ転写産物の分解に介在し、従ってタンパク質発現を極めて特異的にノックダウンするためにｄｓＲＮＡを設計することができる。他のアンチセンス技術とは異なり、ｄｓＲＮＡは、非コードＲＮＡを通じて遺伝子発現を調節するために進化した自然の機構を通じて機能する。これは一般に、それらの活性がインビトロ及びインビボでアンチセンスＯＤＮ又はリボザイムの何れよりも強力である理由と考えられる。例えばｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ、Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６：４４３−４５３（２００７）に記載のように、現在のところ、臨床的に意義のある標的を標的とするｄｓＲＮＡを含む様々なＲＮＡｉ試薬が医薬として開発中である。
【０１４５】
最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス及びＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、現在、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド及びＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを仲介できることが分かっている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ、Ｊ．Ｓ．及びＣｈｒｉｓｔｉａｎ、Ａ．Ｔ．（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１１１−１１９）。従って、本発明は、これらの様々なタイプの２本鎖分子の何れかを含むＲＮＡｉ分子の使用を含む。さらに、ＲＮＡｉ分子を使用し、様々な形態で細胞に導入し得ることを理解されたい。従って、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡｉ分子は、以下に限定されないが、２本の個別の鎖、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む２本鎖ポリヌクレオチド、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；２本鎖領域を形成する相補的配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド、例えば、ｓｈＲＮＡｉ分子及び、単独で又は別のポリヌクレオチドと組み合わせて２本鎖ポリヌクレオチドを形成可能である１以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターを含む、細胞においてＲＮＡｉ反応を誘導することができるあらゆる全ての分子を包含する。
【０１４６】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して、標的ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害することができる。ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを細胞又は生物に導入することによって、本発明に従い、遺伝子及び核酸発現の２本鎖ＲＮＡ介在抑制を遂行し得る。ｓｉＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含むハイブリッド分子、例えばＲＮＡ鎖１本とＤＮＡ鎖１本、であり得る。ｄｓＲＮＡの細胞への直接導入によって、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを引き起こし得ることが明らかになっている（Ｅｌｓｈａｂｉｒ、Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１））。さらに、哺乳動物細胞での抑制がＲＮＡレベルで起こったが、これは標的とする遺伝子に特異的であり、ＲＮＡとタンパク質抑制との間には強い相関があった（Ｃａｐｌｅｎ、Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４６−９７４７（２００１））。さらに、ＨｅＬａ  Ｓ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−ＫＩ及びＭＣＦ−７細胞を含む多岐にわたる細胞株が、ある程度のｓｉＲＮＡサイレンシングを起こしやすかったことが分かった（Ｂｒｏｗｎ、Ｄ．ら、ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  ９（１）：１−７、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌで入手可能（２００２年９月１日））。
【０１４７】
特異的ポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡｉ分子は、当技術分野で公知の手順に従い、容易に調製することができる。有効なｓｉＲＮＡ分子の構造的特長が特定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ、Ｓ．Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８及びＥｌｓｈａｂｉｒ、Ｓ．Ｍ．ら（２００１）、ＥＭＢＯ  ２０：６８７７−６８８８。従って、当業者にとって当然のことながら、特異的な遺伝子又は転写産物を標的とするために、多岐にわたる様々なｓｉＲＮＡ分子を使用し得る。ある種の実施形態において、本発明によるｓｉＲＮＡ分子は２本鎖であり、１６から３０又は１８から２５ヌクレオチド長（その間の各整数を含む。）である。ある種の実施形態において、ｓｉＲＮＡは１９、２０、２１、２２又は２３塩基対長である。ある種の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、０から７ヌクレオチドの３’突出部又は０から４ヌクレオチドの５’突出部を有する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は２つのヌクレオチド３’突出部を有する。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２つのヌクレオチド３’突出部があるセンス及びアンチセンス鎖２１ヌクレオチド長（即ちセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１９ヌクレオチドの相補領域がある。）である。ある種の実施形態において、突出部はＵＵ又はｄＴｄＴ３’突出部である。
【０１４８】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の少なくとも一方の末端が１から４個、通常は１又は２個のヌクレオチドの、１本鎖ヌクレオチド突出部を有する。少なくとも１個のヌクレオチド突出部を有するｄｓＲＮＡは、平滑末端であるものよりも予想外に優れた阻害特性を有する。さらに、存在するヌクレオチド突出部が１つだけである場合、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化され得る。突出部が１つだけであるｄｓＲＮＡは特に安定であり、インビボならびに様々な細胞、細胞培養液、血液及び血清において有効であることが証明されている。一般に、１本鎖突出部はアンチセンス鎖の３’末端に位置するか又は、あるいは、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは平滑末端も有し得、通常、これはアンチセンス鎖の５’末端に位置する。このようなｄｓＲＮＡは安定性及び阻害活性が高く、従って、低投与量、即ち１日あたり５ｍｇ／ｋｇ（受容者の体重）未満での投与が可能になる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に１から１０ヌクレオチドの突出部を有する。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に１から１０ヌクレオチドの突出部を有する。別の実施形態において、突出部の１以上のヌクレオチドがヌクレオシド三リン酸で置換される。
【０１４９】
ｄｓＲＮＡ分子は、１個の塩基対ミスマッチであっても抑制効果が低下することが示されているため、一般に、標的ＤＮＡ分子の一方の鎖に完全に相補的である。その他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、例えば２’−デオキシ−又は２’−Ｏ−メチル修飾などの修飾骨格組成を有し得る。しかし、ある種の実施形態において、ｄｓＲＮＡの鎖全体が２’デオキシ又は２’−Ｏ−修飾塩基の何れかで構成されることはない。
【０１５０】
別の実施形態において、本発明は、細胞において遺伝子発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。このベクターは、免疫細胞中の遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される制御配列を含む。
【０１５１】
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡ標的部位は、ＡＡジヌクレオチド配列の出現について標的ｍＲＮＡ転写配列を精査することによって選択される。３’に隣接するおよそ１９ヌクレオチドと組み合わせた各ＡＡジヌクレオチド配列は、ｄｓＲＮＡ標的部位となる可能性がある。１つの実施形態において、制御領域に結合するタンパク質がｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得るので、ｄｓＲＮＡ標的部位は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は開始コドン付近の領域内（およそ７５塩基内）に位置しないように選択する（Ｅｌｓｈａｂｉｒ、Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ、Ｓ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７−６８８８（２００１））。さらに、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍのＮＣＢＩサーバーで利用可能なＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５などの適切なゲノムデータベースと標的部位候補を比較し、他のコード配列と相同性が非常に高い標的配列候補を除外することができる。
【０１５２】
特定の実施形態において、短いヘアピンＲＮＡは、核酸−脂質粒子の核酸成分を構成する。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、配列特異的に標的遺伝子の発現を低下させることができるヘアピンＲＮＡ形態である。短いヘアピンＲＮＡは、一般に細胞環境でより安定であり、分解されにくいので、遺伝子発現の抑制においてｄｓＲＮＡを上回る長所があり得る。このような短いヘアピンＲＮＡ介在性の遺伝子抑制は、様々な正常及び癌細胞株ならびに、マウス及びヒト細胞を含む哺乳動物細胞で有効であることが確認されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ、Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８（２００２）。さらに、改変ｓｈＲＮＡをコードする染色体遺伝子が組み込まれているトランスジェニック細胞株が作製されている。これらの細胞は、構成的にｓｈＲＮＡを合成することができ、それにより、子孫細胞に受け継がれ得る、長期にわたるか又は構成的な遺伝子抑制が促される。Ｐａｄｄｉｓｏｎ、Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（３）：１４４３−１４４８（２００２）。
【０１５３】
ｓｈＲＮＡはステムループ構造を含有する。ある種の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、通常は１９から２９ヌクレオチド長又はその間の何れかの長さの様々なステム長を含有し得る。ある種の実施形態において、ヘアピンは１９から２１ヌクレオチドのステムを含有し、一方、その他の実施形態において、ヘアピンは２７から２９ヌクレオチドのステムを含有する。ある種の実施形態において、ループの長さは４から２３ヌクレオチド長であるが、このループの長さは、２３ヌクレオチドより長い（抑制活性に顕著な影響を及ぼさない。）場合もある。ｓｈＲＮＡ分子は、例えば、効力低下を引き起こさないｓｈＲＮＡステムの２本鎖間のＧ−Ｕミスマッチなどのミスマッチを含有し得る。実際に、ある種の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、例えば細菌中で増殖中にヘアピンを安定化するためにヘアピンステム中に１又は数個のＧ−Ｕ対形成を含むように設計される。しかし、通常は、標的ｍＲＮＡに結合するステム部分（アンチセンス鎖）とそのｍＲＮＡとの間の相補性が必要であり、この領域の僅か１個の塩基対ミスマッチでも抑制作用が欠如し得る。５’及び３’突出部は、ｓｈＲＮＡ機能に必須ではないと思われるので必要ではないが、存在してもよい（Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８）。
【０１５４】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物及び動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない、非常に保存性が高い低分子ＲＮＡ分子の１クラスである。プロセシングを受けたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、発生、細胞増殖、アポトーシス及び分化のキーとなる制御因子として同定されている、１本鎖の〜１７から２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。これらは、特異的ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することによって、遺伝子発現の制御に関与すると考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写産物切断又はその両者を通じて、遺伝子発現の下方制御に介在する。ＲＩＳＣは、多岐にわたる真核生物の核における転写抑制にも関わる。
【０１５５】
今日まで同定されてきたｍｉＲＮＡ配列数は多数にのぼり、増加の一途をたどっており、例えば、「ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ、Ｇｒｏｃｏｃｋ  ＲＪ、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  Ｓ、Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ、Ｅｎｒｉｇｈｔ  ＡＪ．ＮＡＲ、２００６、３４、Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０−Ｄ１４４；「Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ．ＮＡＲ、２００４、３２、Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９−Ｄ１１１；及びまたｍｉｃｒｏｒｎａ．ｄｏｔ．ｓａｎｇｅｒ．ｄｏｔ．ａｃ．ｄｏｔ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／のｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂでも代表的な例を見出すことができる。
【０１５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
１つの実施形態において、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は単に「アンチセンス」という用語は、標的とするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むものとする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの１本鎖である。アンチセンスＲＮＡの場合、これらは、相補的ＲＮＡ鎖に結合することによって、その相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を妨害する。特異的で相補的な（コード又は非コード）ＲＮＡを標的とするためにアンチセンスＤＮＡを使用することができる。結合が起こる場合、酵素ＲＮａｓｅ  ＨによってこのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが分解され得る。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド、例えば約１５から約３０ヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に対して正確には相補的ではないものであり得るアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。従って、本発明は、非標的特異的活性がアンチセンスで見いだされる例又は標的配列との１以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の使用に典型的である例において使用することができる。
【０１５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の、有効かつ標的指向化される阻害剤であり、結果として、標的とする遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができることが分かっている。タンパク質合成阻害に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は十分に確証されている。例えば、ポリガラクツロナーゼ及びムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それらの個々のｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号及び米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体及びヒトＥＧＦで明らかになっている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８  Ｊｕｎ  １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ及びＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｎ  １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号及び米国特許第５，６１０，２８８号）。さらに、アンチセンスコンストラクトは、例えば癌など様々な異常な細胞増殖を阻害し、治療するために使用できることも記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号及び米国特許第５，７８３，６８３号）。
【０１５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド作製方法は当技術分野で公知であり、いかなるポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するためにも容易に改変することができる。ある一定の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択した標的配列の分析及び二次構造決定、Ｔｍ、結合エネルギー及び相対的安定性に基づく。
【０１５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの、宿主細胞中での標的ｍＲＮＡに対する特異的結合を抑制するか又は妨害するであろう二量体、ヘアピン又はその他の二次構造の相対的な形成不能性に基づき選択され得る。あるいくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンに又はその付近にこれらの領域を含むように及びこれらの配列がｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的になるように選択される。例えばＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）のｖ．４及び／又はＢＬＡＳＴＮ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７、２５（１７）：３３８９−４０２）を用いて、これらの二次構造分析及び標的部位選択の判断を行うことができる。
【０１６０】
リボザイム
別の実施形態によると、核酸−脂質粒子がリボザイムと会合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保持する特異的触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（Ｋｉｍ及びＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ及びＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９８７  Ａｐｒ  ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、非常に特異的に（オリゴヌクレオチド基質において、いくつかのリン酸エステルのうち１個しか切断されないことが多い。）リン酸エステル転移反応を加速する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１  Ｄｅｃ；２７（３Ｐｔ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ及びＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｄｅｃ  ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ及びＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２  Ｍａｙ  １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、化学反応前に基質が特異的塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合するという要件に起因している。
【０１６１】
少なくとも６個の基本的な種類の天然の酵素性ＲＮＡが現在知られている。それぞれが、生理的条件下でＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解をトランスで触媒することができる（従って他のＲＮＡ分子を切断できる。）。一般に、酵素性核酸は、標的ＲＮＡに最初に結合することにより作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する酵素性核酸分子の酵素性部分に対して非常に近接するよう保持されている酵素性核酸の標的結合部分を通じて起こる。従って、この酵素性核酸は、相補的塩基対形成を通じて最初に標的ＲＮＡを認識してこれに結合し、適正な部位に結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの重要な切断により、コードされるタンパク質の合成に対するその指揮能力が破壊される。酵素性核酸が結合し、そのＲＮＡ標的を切断した後、これは別の標的を探すためにそのＲＮＡから放出され、繰り返し新しい標的に結合してこれを切断することができる。
【０１６２】
酵素性核酸分子は、例えばハンマーヘッド、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、グループＩイントロン又はＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と会合）又はアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ  ＲＮＡモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体例は、Ｒｏｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９２  Ｓｅｐ  １１；２０（１７）：４５５９−６５により記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開第ＥＰ０３６０２５７号）、Ｈａｍｐｅｌ及びＴｒｉｔｚ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９  Ｊｕｎ  １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０  Ｊａｎ  ２５；１８（２）：２９９−３０４及び米国特許第５，６３１，３５９号により記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ及びＢｅｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２  Ｄｅｃ  １；３１（４７）：１１８４３−５２により記載されており；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ．１９８３  Ｄｅｃ；３５（３Ｐｔ２）：８４９−５７により記載されており；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ及びＣｏｌｌｉｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９９０  Ｍａｙ  １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ及びＣｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｏｃｔ  １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＯｌｉｖｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３  Ｍａｒ  ２３；３２（１１）：２７９５−９）により記載されており；グループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明により使用される酵素性核酸分子の重要な特徴は、それが、１以上の標的遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡ領域に相補的である特異的基質結合部位を有するということ及びそれが、分子にＲＮＡ切断活性を付与する基質結合部位内又はその周囲のヌクレオチド配列を有するということである。従って、リボザイムコンストラクトは、本明細書中で言及される特異的モチーフに限定する必要はない。
【０１６３】
何らかのポリヌクレオチド配列に標的指向化されたリボザイムを作製する方法は当技術分野で公知である。国際出願公開ＷＯ９３／２３５６９号及び国際出願公開ＷＯ９４／０２５９５号（それぞれが、参照により具体的に本明細書中に組み込まれる。）に記載されるようにリボザイムを設計し、その文献中で記載のように、インビトロ及びインビボで試験するために合成することができる。
【０１６４】
リボザイム結合アームの長さを変化させるか又は血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防ぐ修飾があるリボザイムを化学合成することによって、リボザイム活性を最適化することができるが（例えば、国際出願公開ＷＯ９２／０７０６５号；国際出願公開ＷＯ９３／１５１８７号；国際出願公開ＷＯ９１／０３１６２号；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；及び国際出願公開ＷＯ９４／１３６８８号（酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に対してなし得る様々な化学修飾を記載）参照）、修飾により細胞におけるそれらの有効性が向上し、ステムＩＩ塩基を除去するとＲＮＡ合成時間が短縮され、化学的必要条件が少なくなる。
【０１６５】
本明細書中で取り上げられる組成物及び方法での使用に適切なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のさらなる具体的核酸配列は、米国特許出願第６０／３７９，３４３号、米国特許出願第０９／６４９，５２７号、国際公開第ＷＯ０２／０６９３６９号、国際公開第ＷＯ０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号及びＲａｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２９８：１１８５−１１９２（２００１）に記載されている。ある種の実施形態において、ＯＤＮは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格又はホスホロチオアート（「ＰＳ」）骨格及び／又はＣｐＧモチーフにおいて少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
【０１６６】
核酸修飾
１９９０年代に、ＤＮＡに基づくアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）及びリボザイム（ＲＮＡ）によって、薬物設計及び開発に対する大胆な新しい枠組みがもたらされたが、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性ならびに細胞内送達がうまくいかないことにより、インビボでそれらを使用することができない。オリゴヌクレオチド（オリゴ）薬物がヌクレアーゼ酵素により認識されるのを防いだがそれらの作用機構を阻害しなかった化学修飾へと幅広く研究を行った後、分解に関する問題は効果的に克服された。この研究は大きな成功を収め、インビボにおいては、未修飾分子の場合、未変化状態であるのが数分であるのに対して、今日開発中のアンチセンスＯＤＮ薬物は、数日間未変化状態であり続ける（Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｊ．２００３．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７０：１６２８−４４）。しかし、細胞内送達及び作用機構の問題があるために、現在のところ、アンチセンスＯＤＮ及びリボザイムを臨床用の製品とする上で制限がある。
【０１６７】
ＲＮＡ２本鎖は、本質的にヌクレアーゼに対して１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡよりも安定しており、アンチセンスＯＤＮとは異なり、未修飾ｄｓＲＮＡは、それらが細胞質に接近すると良好な活性を示す。そうではあるが、アンチセンスＯＤＮ及びリボザイムを安定化するために開発した化学修飾は、化学修飾がどの程度耐容性があり得、薬物動態及び薬力学的活性が促進され得るか否かを判定するために、体系的にｄｓＲＮＡにも適用されている。ｄｓＲＮＡ２本鎖によるＲＮＡ干渉には、アンチセンス及びセンス鎖（これらは異なる機能を有する。）が必要である。両者とも、ｄｓＲＮＡをＲＩＳＣに移行できるようにすることが必要であるが、一旦移行すると、２本の鎖が分離し、そのセンス鎖が分解され、一方でアンチセンス鎖は留まってＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡに導く。ＲＩＳＣへの移行は、標的ｍＲＮＡの認識及び切断よりも構造的に厳格性が低いプロセスである。結果として、センス鎖の多くの様々な化学修飾が可能であるが、アンチセンス鎖が耐えられる変化は限られたもののみである（Ｚｈａｎｇら、２００６）。
【０１６８】
当技術分野で公知のように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドに対して、糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分の何れかにリン酸基が連結され得る。オリゴヌクレオチド形成において、リン酸基が隣接するヌクレオシドに互いに共有結合し、直線状のポリマー性化合物を形成する。同様に、この直線状ポリマー性構造の個々の末端をさらに連結して、環状構造を形成することができる。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常な結合又は骨格は、３’から５’のホスホジエステル結合である。
【０１６９】
本発明による脂質−核酸粒子で使用される核酸は、公知である何らかの形態の核酸を含む。従って、この核酸は、ヌクレアーゼ耐性及び血清安定性を向上させるために以前に使用されたタイプの修飾核酸であり得る。しかし、驚くべきことに、天然核酸ポリマーのホスホジエステル結合に対する修飾がない核酸から脂質−核酸粒子を製剤化することによって、許容可能な治療用製品を調製することもできる。従って、あるいくつかの実施形態において、核酸系薬剤には、未修飾ホスホジエステル結合（即ち結合の全てがホスホジエステル結合である核酸）が含まれる。
【０１７０】
骨格修飾
本発明において有用なアンチセンス、ｄｓＲＮＡ及びその他のオリゴヌクレオチドとしては、以下に限定されないが、修飾を受けた骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾を受けた骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格中にリン原子を保持するもの及び骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及びその他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む。）、ホスフィネート、ホスホロアミダート（３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含む。）、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホロセレナート、メチルホスホネート又はＯ−ホスホトリエステル結合及び通常の３’−５’結合を有するボラノリン酸、これらの２’−５’連結類似体及びヌクレオシド単位の連続的な対が３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２に連結されている、逆の極性を有するものが挙げられる。
【０１７１】
様々な塩、混合塩及び遊離塩形態も含まれる。上記結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；及び同第５，６２５，０５０号が挙げられる。
【０１７２】
ある種の実施形態において、その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合又は１以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、例えば、モルホリノ結合（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される。）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；及びＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２の混合構成部分を有するその他のものが含まれる。上記オリゴヌクレオシドを記載する代表的な米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；及び同第５，６７７，４３９号が挙げられる。
【０１７３】
ホスホジエステル結合の非架橋酸素がイオウで置換される、ホスホロチオアート骨格修飾は、ヌクレアーゼ分解に対して核酸薬を安定化するために使用される最早の最も一般的な手段の１つである。一般に、活性にあまり影響を与えることなく、両方のｄｓＲＮＡ鎖に対してＰＳ修飾を幅広く行うことができると考えられている（Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−４４、２００３）。しかし、ＰＳオリゴは、非特異的にタンパク質と強く結合し、その結果、特にｉ．ｖ．投与時に毒性が生じることが知られている。従って、ＰＳ修飾は通常３’及び５’末端の１又は２個の塩基に制限される。ボラノリン酸リンカー（表３、＃２）は、ＰＳよりも明らかに安定であり、ｄｓＲＮＡ活性を促進し、毒性が低い最新の修飾である（Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３２：５９９１−６０００、２００４）。
【０１７４】
その他の有用な核酸誘導体としては、架橋酸素原子（ホスホエステル結合を形成するもの）が−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２−などで置換されている核酸分子が挙げられる。ある種の実施形態において、使用される、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ又はその他の核酸への変更は、核酸に付随する負電荷に完全には影響を与えない。従って、本発明は、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ及び、結合の一部が例えば中性メチルホスホネート又はホスホロアミダート結合で置換されているその他の核酸の使用を企図する。中性結合が使用される場合、ある種の実施形態において、そのように置換されるのは核酸結合の８０％未満であるか又はそのように置換されるのは核酸結合の５０％未満である。
【０１７５】
塩基修飾
塩基修飾は骨格及び糖に対する修飾ほど一般的ではない。０．３−６で示される修飾は全て、ヌクレアーゼに対してｄｓＲＮＡを安定化し、活性には殆ど影響がないと思われる（Ｚｈａｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：８９３−９００、２００６）。
【０１７６】
従って、オリゴヌクレオチドには、核酸塩基（当技術分野で単に「塩基」と呼ばれることが多い。）修飾又は置換も含まれ得る。本明細書中で使用される場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ又はｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル及び、アデニン及びグアニンのその他のアルキル誘導体、２−プロピル及び、アデニン及びグアニンのその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール，８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及びその他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなど、他の合成及び天然核酸塩基が挙げられる。
【０１７７】
ある種の核酸塩基は、オリゴマー化合物の結合親和性を向上させるために特に有用である。これらの核酸塩基としては、例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む。）が挙げられる。５−メチルシトシン置換は、０．６−１．２℃、核酸２本鎖の安定性を向上させることが分かっている（Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９３、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、２７６−２７８頁）。これらは、特定の実施形態において２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられ得る。ある種のこれらの修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する米国特許としては、以下に限定されないが、上述の米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第及び５，６８１，９４１号が挙げられる。
【０１７８】
糖修飾
糖類における修飾の殆どは、好都合な反応部位を与えるＲＮＡ糖環の２’−ＯＨで起こる（Ｍａｎｏｈａｒａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：５７０−９、２００４号；Ｚｈａｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：８９３−９００、２００６）。２’−Ｆ及び２’−ＯＭＥ（０．７及び８）は一般的なものであり、両者とも安定性を向上させ、２’−ＯＭＥ修飾は鎖あたり４ヌクレオチド未満に制限される限り、活性を低下させることはない（Ｈｏｌｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２４０１−７、２００３）。２’−Ｏ−ＭＯＥ（０．９）は、修飾塩基がその分子の中央領域に限定される場合、ｄｓＲＮＡにおいて最も有効である（Ｐｒａｋａｓｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−５３、２００５）。活性の喪失なくｄｓＲＮＡを安定させることが分かっているその他の修飾は０．１０−１４で示す。
【０１７９】
修飾オリゴヌクレオチドはまた１以上の置換糖部分も含有し得る。例えば、本発明は、２’位に次のうち１つを含むオリゴヌクレオチドを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル又はＯ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（このアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は未置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル又はＣ２−Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。）。典型的な実施形態は、例えば、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎ及びｍは１から約１０である。）を含む。その他のオリゴヌクレオチドは、２’位に次のもののうち１つを含む：Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基（ＲＮＡ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基及び同様の特性を有するその他の置換基。ある修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる。）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５、７８、４８６−５０４）、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。その他の修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる。）及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）が含まれる。
【０１８０】
さらなる修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドのその他の位置、特に３’末端ヌクレオチド又は２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位でもなされ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；及び同第５，７００，９２０号が挙げられる。
【０１８１】
その他のオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の、糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち骨格が新規の基で置換されるが、この塩基単位は適切な核酸標的化合物とハイブリッド形成するよう維持される。このようなあるオリゴマー化合物、即ち優れたハイブリッド形成特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。この核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００）で見出すことができる。
【０１８２】
あるいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはホスホロチオアート骨格を含み、オリゴヌクレオシドは、上述の米国特許第５，４８９，６７７号の、−−ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格と呼ばれる。）−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−及び−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−（式中、ネイティブのホスホジエステル骨格は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−で表される。）などのヘテロ原子骨格及び上述の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を含む。その他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、上述の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を含む。
【０１８３】
キメラオリゴヌクレオチド
ある化合物の位置全てが均一に修飾される必要はなく、実際に、１つの化合物に又はオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドにさえも、上述の修飾の複数が組み込まれ得る。あるいくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」又は「キメラ」とは、本発明の内容においては、２以上の化学的に別個の領域を含有し、それぞれが少なくとも１ヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは通常、１以上の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性向上、細胞への取り込み促進、ＲＮＡ標的に対する結合親和性向上など）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域及びＲＮａｓｅ  Ｈ切断に対する基質である領域を含有する。
【０１８４】
１つの実施形態において、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を向上させるように修飾された少なくとも１領域を含む。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は通常、オリゴヌクレオチド及び標的が解離（解離は分光光度計で検出）する温度であるオリゴヌクレオチド／標的ペアのＴｍ値を測定することによって決定される。Ｔｍ値が高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が大きい。あるいくつかの実施形態において、標的ｍＲＮＡ結合親和性を向上させるように修飾されたオリゴヌクレオチド領域は、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドなど、糖の２’位が修飾された少なくとも１個のヌクレオチドを含む。このような修飾は通常オリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、ある標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ値を有する（即ち標的結合親和性がより高い。）ことが示されている。このような親和性向上効果は、標的遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害を大きく促進することである。
【０１８５】
別の実施形態において、キメラオリゴヌクレトイド（ｎｕｃｌｅｔｏｉｄｅ）は、ＲＮＡｓｅ  Ｈに対する基質として作用する領域を含む。言うまでもなく、オリゴヌクレオチドが本明細書中に記載の様々な修飾の何らかの組み合わせを含み得ることを理解されたい。
【０１８６】
オリゴヌクレオチドの別の適切な修飾は、活性、細胞分布もしくはオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進する１以上の部分又は複合物へのオリゴヌクレオチドの化学的結合を含む。このような複合物及びその調製方法は当技術分野で公知である。
【０１８７】
当業者にとって当然のことながら、治療効果などのインビボでの有用性に対して妥当な経験則は、ある配列のチオ化型のものが遊離形態で機能するならば、同じ配列の、何らかの化学物質の封入粒子もまた有効であろうということである。封入粒子はまたインビボでも幅広く有用であり得、アンチセンス療法に反応性があることが知られていない条件及びモデルで有効性を示す。当業者にとって公知であるが、本発明を応用すれば、アンチセンス療法に現在反応する古いモデルを見出し得る。さらに、当業者は、本発明を使用することによって、使用されなくなっているアンチセンス配列又は化学物質を再検討し、有効性を見出し得る。
【０１８８】
本発明に従い使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に及び日常的に、固相合成の周知の技術を通じて作製することができる。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む数社から発売されている。このような合成のためのいかなる他の手段も使用でき；オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内である。ホスホロチオアート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための類似技術を使用することも周知である。
【０１８９】
脂質粒子
脂質粒子中で本薬剤及び／又はアミノ脂質を製剤処方することができる。脂質粒子としては、以下に限定されないがリポソームが挙げられる。本明細書中で使用される場合、リポソームは、内部の水性部分を取り囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、１以上の脂質膜を有し得る。本発明は、ユニラメラ（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）と呼ばれる単層リポソーム及びマルチラメラ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）と呼ばれる多層リポソームの両方を企図する。核酸と複合体化される場合、脂質粒子は、例えばＦｅｌｇｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎに記載のようなＤＮＡ層間に挟まれた陽イオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスでもあり得る。
【０１９０】
脂質粒子は１以上のさらなる脂質及び／又はコレステロールなどのその他の成分をさらに含み得る。脂質酸化を防ぐため又はリポソーム表面上にリガンドを結合させるためなど、様々な目的で、その他の脂質がリポソーム組成物に含まれ得る。両親媒性、中性、陽イオン性及び陰イオン性脂質を含め、脂質はいくつでも存在し得る。このような脂質は単独で又は組み合わせて使用することができる。存在し得るさらなる脂質成分の具体例を下記で示す。
【０１９１】
脂質粒子に存在し得るさらなる成分としては、ポリアミドオリゴマー（例えば米国特許第６，３２０，０１７号参照）などの二重層安定化成分、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、ホスファチジルエタノールアミンにカップリングされたＰＥＧ及びセラミドと複合体化されたＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号参照）などの脂質−誘導体が挙げられる。
【０１９２】
脂質粒子は、第二のアミノ脂質又は陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール及び、形成中に脂質粒子の凝集を低下させる（これは、粒子が立体的に安定化し、これにより形成中の電荷誘導性凝集が妨げられる結果であり得る。）ために選択される脂質の１以上を含み得る。
【０１９３】
核酸製剤への複合体化に適切な脂質の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１及びポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）、例えば（米国特許第６，３２０，０１７号に記載）などである。ＰＥＧ、Ｇｍ１又はＡＴＴＡのような、形成中の凝集を防ぐ、非荷電であり親水性であり立体障害部分があるその他の化合物も脂質とカップリングさせることができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質複合物は、例えば米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号及び同第５，８８５，６１３号に記載されている。通常、凝集を抑制するために選択される脂質成分の濃度は約１から１５％（脂質のモル％）である。
【０１９４】
本発明において有用であるＰＥＧ修飾脂質（又は脂質−ポリオキシエチレン複合物）の具体例は、脂質小胞の表面にＰＥＧ部分を固定するための様々な「アンカー」脂質部分を有し得る。適切なＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、参照により本明細書中に組み込まれる同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４８６，２１４に記載のＰＥＧ−セラミド複合物（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールが代表的である。
【０１９５】
ＰＥＧ又はＡＴＴＡなどの立体的に大きい部分が脂質アンカーと複合体化されている実施形態において、脂質アンカーの選択は、複合物が脂質粒子とどのタイプの結合を有するかに依存する。粒子が循環から除去されるまで、おそらく数日間、ｍｅＰＥＧ（分子量２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）がリポソームと会合し続けることは周知である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などのその他の複合物は同様の滞留能を有する。しかし、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に曝露されるとこの製剤から急速に放出され、一部のアッセイではＴ１／２が６０秒未満となる。米国特許出願第０８／４８６，２１４号で示されるように、少なくとも３つの特徴、即ちアシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度及び立体障害頭部基の大きさが放出速度に影響を与える。これらの特性が適切に改変されている化合物は本発明に有用であり得る。一部の治療への応用に関しては、ＰＥＧ修飾脂質がインビボで核酸−脂質粒子から迅速に失われることが望ましいものであり得、従ってＰＥＧ修飾脂質は比較的短い脂質アンカーを保持することになろう。その他の治療への応用において、核酸−脂質粒子は、血漿循環寿命がより長いことが好ましいものであり得、これ故にＰＥＧ修飾脂質の脂質アンカーは比較的長いものとなろう。代表的な脂質アンカーとしては、長さが約Ｃ１４から約Ｃ２２、例えば約Ｃ１４から約Ｃ１６などであるものが挙げられる。あるいくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ−ＮＨ２の大きさは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００又は２０，０００ダルトンである。
【０１９６】
注目すべきは、凝集妨害化合物が、正しく機能するために必ずしも脂質複合体化を必要とするわけではないないことである。溶液中の遊離ＰＥＧ又は遊離ＡＴＴＡは凝集を妨害するのに十分であり得る。形成後に粒子が安定である場合、対象に投与する前にＰＥＧ又はＡＴＴＡを透析により除去することができる。
【０１９７】
脂質粒子中に存在する場合、中性脂質は、生理的ｐＨで非荷電又は中性の両性イオン形態の何れかで存在する多くの脂質種の何れでもあり得る。このような脂質としては、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン及びセレブロシドが挙げられる。本明細書中に記載の粒子での使用のための中性脂質の選択は通常、例えば、リポソームの大きさ及び血流中でのリポソームの安定性を考慮することにより行われる。通常、中性脂質成分は、２個のアシル基を有する脂質（即ち、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。鎖長及び飽和度が様々である様々なアシル鎖基を有する脂質が入手可能であるか又は周知の技術により単離もしくは合成できる。ある実施形態群において、Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する脂質が使用される。別の実施形態群において、Ｃ１４からＣ２２の範囲の炭素鎖長の一価又は二価不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。通常、本発明で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ又は何らかの関連ホスファチジルコリンである。本発明において有用な中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン又は、セリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質からも構成され得る。
【０１９８】
存在する場合、脂質混合物のステロール成分は、リポソーム、脂質小胞又は脂質粒子調製の分野で従来から使用されるステロールの何れかであり得る。代表的ステロールはコレステロールである。
【０１９９】
上記で具体的に記載したものに加えて、生理的ｐＨ前後で正味の正電荷を有するその他の陽イオン性脂質も本脂質粒子に含まれ得る。このような陽イオン性脂質としては、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「Ｃ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられる。さらに、例えば、リポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む。）及びリポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む。）など、多くの陽イオン性脂質の市販製剤を使用することができる。特定の実施形態において、陽イオン性脂質はアミノ脂質である。
【０２００】
本脂質粒子での使用に適切な陰イオン性脂質としては、以下に限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノーロアミン（Ｎ−ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール及び中性脂質に連結されるその他の陰イオン性修飾基が挙げられる。
【０２０１】
多くの実施形態において、両親媒性脂質が脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」は、脂質物質の疎水性部分が疎水相に向き、親水性部分が水相に向いている何らかの適切な材料を指す。このような化合物としては、以下に限定されないが、リン脂質、アミノ脂質及びスフィンゴ脂質が挙げられる。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファトジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジリノレイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール及びβ−アシルオキシ酸などのその他のリン欠損化合物も使用することができる。さらに、このような両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールなどのその他の脂質と容易に混合することができる。
【０２０２】
プログラム可能な融合脂質も脂質粒子に含まれるものとして適切である。このような脂質粒子は、細胞膜と融合し、あるシグナル事象が起こるまでそれらの負荷物を送達する傾向を殆ど示さない。これにより、生体又は疾患部位に注射後、脂質粒子が細胞と融合する前に、脂質粒子がより均一に分布できるようになる。シグナル事象は例えばｐＨ、温度、イオン環境又は時間の変化であり得る。後者の場合、ＡＴＴＡ−脂質複合物又はＰＥＧ−脂質複合物など、融合遅延又は「遮蔽（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」成分は、長時間にわたり脂質粒子膜から単純に放出され得る。代表的脂質アンカーとしては、長さが約Ｃ１４から約Ｃ２２、例えば約Ｃ１４から約Ｃ１６などであるものが挙げられる。あるいくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ−ＮＨ２の大きさは約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００又は２０，０００ダルトンである。
【０２０３】
１つの実施形態において、本明細書中に記載の脂質製剤と複合体化された本核酸系薬剤の平均粒径は、少なくとも直径約１００ｎｍである（例えば、少なくとも直径約１１０ｎｍ、少なくとも直径約１２０ｎｍ、少なくとも直径約１５０ｎｍ、少なくとも直径約２００ｎｍ、少なくとも直径約２５０ｎｍ又は少なくとも直径約３００ｎｍ）。
【０２０４】
あるいくつかの実施形態において、本粒子の多分散度指数（ＰＤＩ）は約０．５未満である（例えば、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満又は約０．１未満）。
【０２０５】
脂質粒子が身体において適切に分布するまでに、脂質粒子は、十分に遮蔽剤（ｃｌｏａｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を喪失し、融合性となる。その他のシグナル事象とともに、炎症部位での温度上昇など、疾患部位又は標的細胞と関連するシグナルを選択することが望ましい。
【０２０６】
核酸製剤に複合体化された脂質粒子は、標的指向化部分、例えば細胞タイプ又は組織に特異的な標的指向化部分も含み得る。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えばリボフラビン）、葉酸及びモノクローナル抗体（例えばβ７インテグリン（β７Ｉ）に対する抗体）などの様々な標的指向化部分を用いた脂質粒子の標的指向化が既に記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び同第４，６０３，０４４号参照）。標的指向化部分にはタンパク質全体又はその断片が含まれ得る。標的指向化の機構には、通常、標的指向化部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるように、標的指向化剤が脂質粒子表面上に位置することが必要である。例えばＳａｐｒａ、Ｐ．及びＡｌｌｅｎ、ＴＭ、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）；及びＡｂｒａ、ＲＭら．、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１−３、（２００２）に記載のものを含め、当技術分野で様々な異なる標的指向化剤及び方法が公知であり、利用可能である。
【０２０７】
標的指向化のための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖の表面コーティング付きの、脂質粒子、即ちリポソームの使用が提案されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７：９９−１０８（１９９５）；ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１８：６１０１−６１０４（１９９６）；Ｂｌｕｍｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１４９：１８０−１８４（１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：３２１−３３４（１９９２）；米国特許第５，０１３５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９（Ｌａｓｉｃ及びＭａｒｔｉｎ、編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌ（１９９５））。ある方法において、脂質粒子を標的指向化するための抗体などのリガンドが、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基と連結される。別の方法において、標的指向化リガンドは、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端に連結される（Ｋｌｉｂａｎｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：３２１−３３４（１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８８：１１５−１１８（１９９６））。
【０２０８】
標的指向化剤をカップリングするための標準的方法を使用することができる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを使用することができ、これは、標的指向化剤又は、脂質誘導体化ブレオマイシンなどの誘導体化脂溶性化合物の連結のために活性化することができる。例えばタンパク質Ａを組み込むリポソームを用いて、抗体で標的指向化したリポソームを構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）及びＬｅｏｎｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：２４４８−２４５１（１９９０）参照）。抗体複合体化のその他の例は、参照により本明細書中に組み込まれる教示である米国特許第６，０２７，７２６号で開示されている。標的指向化部分の例としては、新生物又は腫瘍に関連する抗原を含む細胞成分に特異的なその他のタンパク質を挙げることもできる。標的指向化部分として使用されるタンパク質は共有結合を介してリポソームに連結され得る（Ｈｅａｔｈ、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、１４９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９８７）参照）。その他の標的指向化方法にはビオチン−アビジン系が含まれる。
【０２０９】
定義
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲中で使用される一定の用語及び句の意味を以下で与える。本明細書の他の部分での用語の使用と、この節で与えられるその定義との間に明らかな乖離がある場合、この節中の定義が優先される。
【０２１０】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン及びウラシルを含有するヌクレオチドを示す。しかし、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」の用語が、下記でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチド又は代替置換（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）部分も指し得ることを理解されたい。当業者にとって当然のことながら、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルは、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく、その他の部分によって置換され得る。例えば、制限なく、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン又はウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。これ故に、ウラシル、グアニン又はアデニンを含有するヌクレオチドは、例えばイノシンを含有するヌクレオチドによって、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において置換され得る。別の例において、標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成するために、オリゴヌクレオチドのあらゆる場所のアデニン及びシトシンをグアニン及びウラシルでそれぞれ置換することができる。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げられる組成物及び方法に適切である。
【０２１１】
本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含め、遺伝子転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。
【０２１２】
本明細書中で使用される場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて言及される配列により述べられるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【０２１３】
本明細書中で使用される場合及び別段の断りがない限り、「相補的な」という用語は、ヌクレオチド対の内容で使用するとき、古典的なワトソン−クリック対、即ちＧＣ、ＡＴ又はＡＵを意味する。これは、例えばｒｂｏｓｅ修飾又はリン酸骨格修飾によってヌクレオチドの一方又は両方が本明細書中に記載のように修飾されている古典的ワトソン−クリック対形成にも及ぶ。これは、塩基対形成特性を実質的に変化させないイノシン又はその他のものとの対形成も含み得る。
【０２１４】
当業者にとって当然のことながら、本明細書中で使用される場合及び別段の断りがない限り、「相補的な」という用語は、第二のヌクレオチド配列に関連して第一のヌクレオチド配列を述べるために使用されるとき、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ある一定の条件下で第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、２本鎖構造を形成する能力を指す。相補性とは、生理的条件下、例えば生体内で遭遇し得るような生理的に適切な条件下で、ハイブリッド形成を可能にするための、完全な相補性、実質的な相補性及び十分な相補性を含み得る。完全相補性とは、第一及び第二の配列の対全てにおいて個々の対に対する上記で定義するとおりの相補性を指す。配列が本明細書中の第二の配列に関して「実質的に相補的」である場合、この２つの配列は完全に相補的であり得るか又はこれらは、ハイブリッド形成時に１以上の、しかし通常は４個以下、３又は２個のミスマッチ塩基対を形成し得、一方で、その最終的な適用に最も適切な条件下でハイブリッド形成する能力を保持している。実質的な相補性とは、ストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成としても定義することができ、この場合、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２から１６時間、その後洗浄という段階を含み得る。当業者は、ハイブリッド形成したヌクレオチドの最終的な適用に従い、２つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができる。
【０２１５】
しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成時に１以上の１本鎖突出部を形成するように設計される場合、このような突出部は、相補性の判定に関してミスマッチとはみなさない。例えば、２１ヌクレオチド長の１本のオリゴヌクレオチド及び２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ（長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む場合）も「完全に相補的」と言うことができる。
【０２１６】
「相補的」配列は、本明細書中で使用される場合、それらのハイブリッド形成能に関して上記の必要条件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み得るか又はそれらから完全に形成され得る。このような非ワトソン−クリック塩基対としては、以下に限定されないが、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対形成又はフーグスティーン塩基対形成が挙げられる。
【０２１７】
生理的条件下、例えば生体内で遭遇し得るような生理的に適切な条件下でハイブリッド形成を可能にする、「相補的」、「完全に相補的」、「実質的に相補的」及び十分な相補性という用語は、本明細書中で、それらの使用の内容から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用され得る。
【０２１８】
本明細書中で使用される場合、「相補的」、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部と実質的に相補的であるポリヌクレオチドとは、関心のある（例えばＣＤ４５をコードする）ｍＲＮＡの連続部分に相補的である、例えば実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＣＤ４５をコードするｍＲＮＡの連続的な部分と実質的に相補的である場合、ＣＤ４５ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【０２１９】
「２本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書中で使用される場合、逆平行で、上記で定義のように実質的に相補的な２本の核酸鎖を含む２本鎖構造を有する、リボ核酸分子又はリボ核酸分子の複合体を指す。２本鎖構造を形成するこの２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であり得るか又はこれらは個別のＲＮＡ分子であり得る。この２本の鎖が、より大きい１つの分子の一部であり、従って、２本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、別個の他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖により連結される場合、この連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。この２本の鎖が、２本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、別個の他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖以外によって共有結合される場合、この連結構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同じであるか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖におけるヌクレオチド数である。２本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１以上のヌクレオチド突出部を含み得る。ｄｓＲＮＡは、本明細書中で使用される場合、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ剤」、「ｉＲＮＡ剤」又は「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる。
【０２２０】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド突出部」は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びているか又はその逆である場合に対形成していないヌクレオチド又はｄｓＲＮＡの２本鎖構造から突出するヌクレオチドを指す。「平滑」又は「平滑末端」は、そのｄｓＲＮＡの末端に対形成していないヌクレオチドがないこと、即ちヌクレオチド突出部がないことを意味する。「平滑末端化」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり２本鎖であるｄｓＲＮＡであり、即ちその分子の何れの末端にもヌクレオチド突出部がない。
【０２２１】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書中で使用される場合、「相補性の領域」という用語は、配列、例えば本明細書中に記載のような標的配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖における領域を指す。相補性領域が標的配列に完全に相補的でない場合、分子の内部又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、最も許容性が高いミスマッチは、末端領域、例えば、５’及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド内に存在する。
【０２２２】
「センス鎖」という用語は、本明細書中で使用される場合、そのアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【０２２３】
配列を比較することにより判定される場合、「同一性」という用語は、２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。同一性とは、このような配列の線の間の一致により判定される場合、ポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いも意味する。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を評価するための方法は多数存在すると同時に、この用語は当業者にとって周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照）。「実質的に同一」とは、本明細書中で使用される場合、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応部分との間の相同性の度合いが非常に高い（例えば１００％配列同一性）ことを意味する。しかし、本発明において配列同一性が９０％又は９５％より大きいｄｓＲＮＡを使用することができ、従って遺伝子突然変異、系統多型（ｓｔｒａｉｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）又は進化的分岐に起因して予想され得る配列変動も許容され得る。１００％同一性が一般的ではあるが、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡと標的遺伝子との間に１個又は複数の塩基対ランダムミスマッチを含有し得る。
【０２２４】
「細胞への導入」とは、当業者により理解されるように、ｄｓＲＮＡに言及する場合、細胞への取り込み又は吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは、自発的拡散性の又は能動的な細胞プロセスを通じて又は助剤もしくは装置によって起こり得る。この用語の意味はインビトロでの細胞に限定されず；ｄｓＲＮＡはまた、細胞が生きている生物の一部である場合も、「細胞に導入」され得る。このような例において、細胞への導入は生物への送達を含む。例えば、インビボ送達の場合、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射するか又は全身的に投与を行うことができる。インビボ送達は、米国特許第５，０３２，４０１号及び同第５，６０７，６７７号及び米国公開第２００５／０２８１７８１号に記載のものなど、β−グルカン送達系によるものでもあり得る。米国特許第５，０３２，４０１号及び同第５，６０７，６７７号及び米国公開第２００５／０２８１７８１号は、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。細胞へのインビトロ導入には、電気穿孔法及びリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。
【０２２５】
「抑制（サイレンス、ｓｉｌｅｎｃｅ）」及び「の発現を阻害」、「の発現を下方制御」、「の発現を抑制」などの用語は、それらが免疫細胞で発現される遺伝子、例えばマクロファージで発現される、例えばＣＤ４５を指す限り、本明細書中で、ＣＤ４５遺伝子が転写され、ＣＤ４５遺伝子の発現が阻害されるように処理されたか又は処理されている第一の細胞又は細胞群から単離され得るＣＤ４５  ｍＲＮＡの量が、第一の細胞又は細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第二の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した場合に減少していることにより明らかとなるような、ＣＤ４５遺伝子発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害度は通常、
（（対照細胞中のｍＲＮＡ）−（処理済み細胞中のｍＲＮＡ））／（対照細胞中のｍＲＮＡ）・１００％として表される。
【０２２６】
あるいは、阻害度は、例えば、ある一定の表現型、例えばアポトーシスを示す細胞又は多くの細胞において発現されるか又はそれらにより分泌される、ＣＤ４５遺伝子によりコードされるタンパク質の量など、ＣＤ４５遺伝子発現と機能的に関連があるパラメータの低下として与えられ得る。原則として、構成的に又はゲノム操作によってＣＤ４５を発現する何らかの細胞において、何らかの適切なアッセイにより、ＣＤ４５遺伝子サイレンシングを判定し得る。しかし、あるｄｓＲＮＡがある一定の程度までＣＤ４５遺伝子の発現を阻害するか否かを判定するためには基準が必要であり、従って、本発明に基準が包含される場合、下記の実施例で提供されるアッセイがこのような基準として役立つ。
【０２２７】
例えば、ある一定の例において、実施例で下に記載のとおりのアッセイによって遺伝子発現が測定される場合、核酸系薬剤、例えばｄｓＲＮＡの投与によって、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％又は少なくとも約５０％、ＣＤ４５遺伝子の発現が抑制される。１つの実施形態において、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約８０％、ＣＤ４５遺伝子が抑制される。別の実施形態において、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％、ＣＤ４５遺伝子が抑制される。
【０２２８】
本明細書中で使用される場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤が転写されるプラスミドなどの核酸を含む内部の少量の水性部分を覆う脂質の小胞を指す。ＳＮＡＬＰは例えば米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、同第２００７０１３５３７２号及び２００８年４月１５日出願のＵＳＳＮ６１／０４５，２２８に記載されている。これらの出願書類は参照により本明細書により組み込まれる。
【０２２９】
「治療する」、「治療」などの用語は、疾患又は障害の緩和又は改善を指す。本明細書中、下記で引用される他の状態の何れかとそれが関連する限りの内容において（例えば自己免疫又は炎症性障害などのＣＤ４５介在性の状態）、「治療する」、「治療」などの用語は、このような状態に付随する少なくとも１つの症状を緩和もしくは改善するか又はこのような状態の進行を遅延させるかもしくは回復に向かわせることを意味する。
【０２３０】
「治療上適切な」組成物は、適切な用量で投与される場合、疾患もしくは障害又は疾患もしくは障害の症状を改善し得る。
【０２３１】
本明細書中で使用される場合、「ＣＤ４５介在性の状態又は疾患」という用語及び関連用語及び句は、不適切な、例えば正常より高いＣＤ４５活性を特徴とする状態又は障害を指す。不適切なＣＤ４５機能活性は、正常ではＣＤ４５を発現しない細胞におけるＣＤ４５発現又はＣＤ４５発現上昇の結果として生じ得る（例えば、炎症性障害又は自己免疫疾患の症状につながる。）。ＣＤ４５介在性の状態又は疾患には、不適切なＣＤ４５機能活性が完全に又は部分的に介在し得る。しかし、ＣＤ４５介在性の状態又は疾患は、ＣＤ４５の調節の結果、原因となる状態又は障害にある程度の効果をもたらすものである（例えばＣＤ４５阻害剤によって少なくとも一部の患者で患者の健康がある程度改善する。）。
【０２３２】
本明細書中で使用される場合、「自己免疫疾患」は、身体中の物質及び組織に対する身体の過剰反応から生じる何らかの障害である。本明細書中に記載の組成物を用いた治療に適切な代表的な自己免疫疾患としては、関節炎（例えば関節リウマチ）、アテローム性動脈硬化症、紅斑性狼瘡、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎）、糖尿病（例えばＩ型糖尿病）、慢性免疫不全症及び自己免疫不全症（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＩＤＳ）が挙げられる。
【０２３３】
本明細書中で使用される場合、「炎症性障害」は、炎症が付随する何らかの障害である。炎症性障害は自己免疫障害でもあり得る。本明細書中に記載の組成物を用いた治療に適切な代表的な炎症性障害としては、関節炎（例えば関節リウマチ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎）が挙げられる。
【０２３４】
本明細書中で使用される場合、「治療的有効量」及び「予防的有効量」という句は、自己免疫又は炎症性疾患又はこのような障害の明らかな症状、例えば、関節もしくは筋肉痛、腫脹、衰弱又は炎症の治療、予防又は管理において治療的効果をもたらす量を指す。治療的に有効な具体的量は、通常の医師が容易に決定でき、例えば自己免疫障害のタイプ、患者の病歴及び年齢、疾患ステージ及びその他の薬剤の投与など、当技術分野で公知の因子に依存して変動し得る。
【０２３５】
本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡ及び医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」又は単純に「有効量」は、所望の薬理学的、治療的又は予防的結果を得るのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患又は障害に関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下する場合にその臨床治療が有効とみなされるとき、その疾患又は障害の治療用薬物の治療的有効量は、そのパラメータを少なくとも２５％低下させるのに必要な量である。
【０２３６】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を指す。このような担体としては、以下に限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられる。細胞培養液はこの用語から特に除外される。経口投与される薬物の場合、医薬的に許容可能な担体としては、以下に限定されないが、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑剤、甘味剤、香味料、着色剤及び保存料などの医薬的に許容可能な賦形剤が挙げられる。適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム及びラクトースが挙げられるが、コーンスターチ及びアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤としてはデンプン及びゼラチンを挙げることができ、一方、存在する場合、滑剤は一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクとなろう。必要に応じて、錠剤は、消化管での吸収を遅延させるためにモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの材料で被覆され得る。
【０２３７】
本明細書中で使用される場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子が発現され得るベクターが導入されている細胞である。
【０２３８】
医薬組成物
例えば核酸系薬剤、例えば脂質製剤と複合体化されたｄｓＲＮＡを含む、本明細書中で提供される組成物は、医薬組成物を提供するための医薬的に許容可能な担体も含み得る。本医薬組成物は、遺伝子の発現又は活性に関連する疾患又は障害を治療するために有用である。このような医薬組成物は送達方式に基づき製剤化される。一例は、非経口送達を介した全身投与のために製剤化される組成物である。
【０２３９】
特定される薬剤を含む医薬組成物は、標的遺伝子、例えばＣＤ４５遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。一般に、ｄｓＲＮＡ剤の適切な用量は、１日あたり０．０１から２００．０ミリグラム／キログラム受容者体重の範囲、一般には１日あたり０．０２から５０ｍｇ／キログラム体重の範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、１回の投与あたり０．０１、０．１、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。本医薬組成物は、１日１回投与してもよいし、又は本ｄｓＲＮＡは、１日を通じて適切な間隔で２、３回以上、各分割用量（ｓｕｂ  ｄｏｓｅ）で投与してもよいし、又は連続的な点滴もしくは放出制御製剤を通じた送達を使用することもできる。その場合、各分割用量（ｓｕｂ  ｄｏｓｅ）中に含有されるｄｓＲＮＡは、１日総投与量を達成するために相応してより少量となるはずである。投与量単位は、例えば数日間にわたりｄｓＲＮＡを持続放出させる従来の持続放出製剤を用いて、数日間にわたる送達のために調合することもできる。持続放出製剤は当技術分野で周知であり、本明細書中に記載の核酸系薬剤とともに使用され得るものなどの薬剤の膣内送達に特に有用である。この実施形態において、投与量単位は、１日用量の対応する複数倍を含有する。
【０２４０】
当業者にとって当然のことながら、以下に限定されないが、疾患又は障害の重症度、治療歴、全身健康状態及び／又は対象の年齢及び存在する他の疾患を含め、ある種の因子が、効率的に対象を治療するために必要とされる投与量及びタイミングに影響し得る。さらに、治療的有効量の組成物を用いた対象の治療は、単回の治療又は一連の治療を含み得る。本明細書中の他の部分に記載のように、従来の方法を用いて又は適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて、本発明に包含される個々のｄｓＲＮＡに対する有効投与量及びインビボ半減期の推定を行うことができる。
【０２４１】
特定の実施形態において、取り上げられる脂質−核酸に基づく粒子を含有する医薬組成物は標準的技術に従い調製され、医薬的に許容可能な担体をさらに含む。一般に、医薬的に許容可能な担体として生理食塩水が使用される。その他の適切な担体としては、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性を促進するための糖タンパク質を含め、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。食塩水又はその他の塩含有担体を含有する組成物において、担体は通常、脂質粒子形成後に添加される。従って、脂質−核酸組成物の形成後、生理食塩水などの医薬的に許容可能な担体中で本組成物を希釈することができる。
【０２４２】
得られた医薬製剤は、従来の周知の安定化技術によって安定化することができる。次に、水溶液を使用のために封入するか又は無菌状態下でろ過し、凍結乾燥し、この凍結乾燥製剤を投与前に滅菌水溶液と合わせることができる。本組成物は、生理的状態に近い状態に対して必要とされるように、ｐＨ調整及び緩衝化剤、等張性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど、医薬的に許容可能な補助物質を含有し得る。さらに、脂質縣濁液は、保存時にフリーラジカル及び脂質−過酸化障害から脂質を保護する脂質保護剤を含み得る。α−トコフェロールなどの脂溶性のフリーラジカル捕捉剤及びフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤が適切である。
【０２４３】
医薬製剤中の脂質粒子又は脂質−核酸粒子の濃度は幅広く変動し得、即ち約０．０１％未満から、通常は約０．０５〜５％又は少なくとも約０．０５〜５％から１０〜３０重量％までに及び、選択される特定の投与方式に従い、主に液量、粘度などにより選択される。例えば、治療に伴う流体負荷を低下させるために濃度を高くし得る。これは、アテローム性動脈硬化症関連のうっ血性心不全又は重度の高血圧に罹患している患者において特に所望され得る。あるいは、投与部位の炎症を軽減するために、刺激性の脂質からなる複合体を希釈して濃度を低下させることができる。ある実施形態群において、本核酸は、標識が結合され、（相補的核酸の存在を示すことによって）診断に使用される。この例において、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断される疾患状態及び医師の判断に依存するが、通常は、約０．０１から約５０ｍｇ／キログラム体重の間、例えば約０．１から約５ｍｇ／ｋｇ体重の間などであろう。
【０２４４】
上記のように、脂質−治療薬（例えば核酸）粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾リン脂質、ＰＥＧ−セラミド又はガングリオシドＧＭ１−修飾脂質又は凝集を防ぐかもしくは制限するのに有効なその他の脂質を含み得る。このような成分の添加は単純に複合体凝集を防ぐだけではない。むしろこれは、循環寿命の延長及び標的組織への脂質−核酸組成物の送達を促進するための手段も提供し得る。
【０２４５】
本発明はまた、キット形態で脂質−治療薬組成物も提供する。本キットは、通常、キットの様々な要素を保持するために区画化されている容器を含む。本キットは、それらの再水和又は希釈及び投与のための説明書とともに、粒子又は医薬組成物、例えば乾燥又は濃縮形態など、を含有する。ある種の実施形態において、この粒子は活性薬剤を含み、一方でその他の実施形態において、それらは活性薬剤を含まない。
【０２４６】
脂質製剤と複合体化された核酸系薬剤を含有する本医薬組成物は、局所又は全身治療が所望されるか否か及び治療しようとする部位に依存して多くの方法で投与し得る。投与は、局所、肺、例えば、噴霧器によるものを含む、粉剤又はエアロゾルの吸入又は吹送によって；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮）、経口又は非経口であり得る。投与は、例えば関節内への直接的な関節内注射による、胃腸管への直接的な送達のための直腸投与による、子宮頸部及び膣への送達のための膣内投与による、眼への送達のための硝子体内投与によるなど、局所送達を通じて特定の組織へ選択的に局在するように設計することもできる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、関節内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射；又は頭蓋内、例えば、髄腔内又は脳室内の投与が挙げられる。
【０２４７】
局所投与用の医薬組成物及び製剤としては、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性の基材、増粘剤などが必要又は望ましい場合がある。コーティングを施したコンドーム、手袋なども有用であり得る。代表的な局所製剤としては、核酸系薬剤、例えばｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤又は界面活性剤などの局所送達成分と混合されているものが挙げられる。代表的な脂質及びリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡは、リポソーム内に封入され得るか又はそれらと、特に陽イオン性リポソームと複合体と形成し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質、特に陽イオン性脂質と複合体化され得る。代表的な脂肪酸及びエステルとしては、以下に限定されないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン又はＣ１−１０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又は医薬的に許容可能なそれらの塩が挙げられる。局所製剤は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５，２９８号で詳述されている。
【０２４８】
経口投与のための組成物及び製剤としては、粉剤もしくは顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水中もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。代表的な経口製剤は、核酸系薬剤、例えばｄｓＲＮＡが、１以上の浸透促進剤、界面活性剤及びキレート剤と組み合わせられて投与されるものである。代表的な界面活性剤としては、脂肪酸及び／又はそのエステルもしくは塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。代表的な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ‐フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。代表的な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンもしくはモノグリセリド、ジグリセリド又は医薬的に許容可能なそれらの塩（例えばナトリウム塩）が挙げられる。浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩、も一般的である。典型的な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。その他の浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。核酸系薬剤、例えば脂質製剤と複合体化されたｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥した粒子を含む顆粒形態又はマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体化された形態で経口送達し得る。核酸系薬剤との使用のための複合体化剤としては、例えば、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース及びデンプンが挙げられる。代表的な複合体化剤としては、例えば、キトサン、Ｎ‐トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ‐乳酸）、（ＤＬ−乳酸グリコール酸）コポリマー（ＰＬＧＡ）、アルギネート及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口製剤及びそれらの調製は、各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）及び同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）で詳細に記載されている。
【０２４９】
非経口、髄腔内又は脳室内投与のための組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤及び、以下に限定されないが、浸透促進剤、担体化合物及びその他の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤などのその他の適切な添加物も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。
【０２５０】
医薬組成物としては、以下に限定されないが、溶液剤、乳剤及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、以下に限定されないが、予め調製された液剤、自己乳化型の固体及び自己乳化型の半固体を含む様々な成分から調製され得る。
【０２５１】
医薬製剤は、単位剤形で好都合に与えられ得るが、医薬業界で周知の従来技術に従い調製され得る。このような技術には、有効成分を医薬担体又は賦形剤と混合する工程が含まれる。一般に、この製剤は、有効成分を液体担体又は微粉固体担体又はその両方と均一かつ完全に混合し、次いで必要に応じて生成物を成形することにより調製される。
【０２５２】
本明細書中で取り上げられる組成物は、以下に限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤及び浣腸剤などの多くの可能な投与形態の何れかへと製剤化され得る。本組成物は、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液としても製剤化され得る。水性懸濁液は、この懸濁液の粘性を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどをさらに含有し得る。懸濁液には安定化剤も含み得る。
【０２５３】
１つの実施形態において、本医薬組成物は、泡剤（ｆｏａｍｓ）として製剤化し、使用し得る。医薬用泡剤には、以下に限定されないが、乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤及びリポソームなどの製剤が挙げられる。実際は基本的に類似しているが、これらの製剤の成分及び最終生成物の粘稠度は異なる。このような組成物及び製剤の調製は一般に製薬及び製剤分野の当業者にとって公知であり、本明細書中で取り上げられる組成物の製剤化に適用し得る。
【０２５４】
本発明は、その適用において、次の記述に記載の成分の構築及び配合の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態を行うことが可能であり、様々な方法で実施可能であるか又は遂行可能である。また、本明細書中で使用される表現及び用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとみなすべきではない。本明細書中での「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」及びその変形物の使用は、本明細書中で後に列挙するもの及びそれらの同等物ならびにさらなるものを包含するものとする。
【０２５５】
実施例
次の実施例は、説明のために提供されるものであり、主張する発明を限定するものではない。
【０２５６】
実施例１
ＬＮＰ０１と複合体化されたＣＤ４５ｓｉＲＮＡは、チオグリコール酸活性化マクロファージにおいてＣＤ４５遺伝子発現を抑制した。
【０２５７】
マウス（ｎ＝４）にチオグリコール酸をＩＰ注射により投与して、マクロファージを活性化した。チオグリコール酸投与から３日及び５日後、ＬＮＰ０１を配合した１０ｍｇ／ｋｇ  ＣＤ４５、ＩＣＡＭ２又はＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをこのマウスにＩＰ注射によって投与し、次いで第４日にマウスを屠殺した（ＬＮＰ０１製剤は、例えば国際出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載）。マクロファージを単離し、フローサイトメトリーによって分析してｓｉＲＮＡの取り込みを測定し、遺伝子発現におけるｓｉＲＮＡの影響を評価した。ＣＤ４５及びＧＦＰ  ＬＮＰ０１−ｓｉＲＮＡはマクロファージによって取り込まれたが、ＩＣＡＭ２  ｓｉＲＮＡは取り込まれなかった。ＣＤ４５ｓｉＲＮＡの取り込みの結果、ＣＤ４５遺伝子発現が６５％低下した。図１Ａ及び１Ｂを参照のこと。
【０２５８】
実施例２
ＬＮＰ０１中のＡｌｅｘａ４８８−標識ｓｉＲＮＡが免疫細胞により取り込まれた。
マウスにＬＮＰ０１中の５ｍｇ／ｋｇのＡｌｅｘａ４８８−ｓｉＲＮＡを注射し、２時間後に屠殺した。脾臓、肝臓及び骨髄からの白血球をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ５＋、ＣＤ１１−であるものとしてＴ細胞を同定し、Ｂ細胞をＣＤ１９＋、ＩｇＭ／ＩｇＤであるものとして同定し、骨髄細胞をＣＤ５−、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ−として同定し；ＣＤ５−、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋として樹状細胞を特定した。骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞には、マクロファージ及び顆粒球が含まれる。この結果から、Ｂ細胞、骨髄細胞及び樹状細胞によってＡｌｅｘａ４８８−ｓｉＲＮＡが取り込まれたことが示唆された。Ｂ細胞はＴ細胞よりも効率的にｓｉＲＮＡに結合した（図２）。
【０２５９】
実施例３
全身送達されたＬＮＰ０１配合ｓｉＲＮＡを用いて、肝臓マクロファージにおいてサイレンシングは観察されなかった。
Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたりｎ＝４）に、ＩＣＡＭ２（ＡＤ３１７６）又は第ＶＩＩ因子（ＡＤ−１６６１）ＬＮＰ０１配合ｓｉＲＮＡを静脈注射により７．５ｍｇ／ｋｇで投与した。第１、３及び４日にマウスにｉ．ｖ．注射し、次いで第６日に屠殺した。脾臓及び肝臓マクロファージにおけるＩＣＡＭ２発現及び血清第ＶＩＩ因子の発現をＦＡＣＳ分析により測定した。この結果から、血清第ＶＩＩ因子発現が第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡによって阻害されたが、肝臓及び脾臓マクロファージにおけるＩＣＡＭ２発現は抑制されなかった（図３Ａ及び３Ｂ）ことが示唆された。この結果から、マクロファージがｓｉＲＮＡを吸収したが、標的遺伝子サイレンシングがなかったことが示唆された。
【０２６０】
実施例４
ＳＮＡＬＰ（安定な核酸脂質粒子）リポソーム製剤はｓｉＲＮＡを白血球に標的指向化した。
ＳＮＡＬＰリポソーム中のリポソーム中に配合されたＣｙ３−標識ｓｉＲＮＡ（Ｔｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ））は、以前ラットにおけるＤＭＡ及びＤＡＰ製剤によって、マクロファージに富む領域への局在を示した。従って、マクロファージにおける遺伝子サイレンシングについてこれらのｓｉＲＮＡを試験した。
【０２６１】
次の４種類の異なるＳＮＡＬＰリポソームとともにＣＤ４５及びＩＣＡＭ２  ｓｉＲＮＡを製剤処方した。
ＤＬｉｎＤＭＡ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）
ＤＬｉｎＤＡＰ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）
ＤＯＤＭＡ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（２５：２０：４５：１０モル比）
ＤＬｉｎＤＭＡ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（５０：４０：１０モル比）。
【０２６２】
リポソーム配合ｓｉＲＮＡを静脈内及び腹腔内投与した。
【０２６３】
これらの製剤を用いて、脾臓においてサイレンシングは観察されなかった。
【０２６４】
実施例５
脾臓ＬＮＰ−ＳＮＡＬＰ局在から白血球取り込みが示唆される。
Ｃｙ３−ＳＮＡＬＰ−ＣＤ４５をマウスに静脈内及び腹腔内投与した。１．５時間後、ｓｉＲＮＡの取り込み先は、主にマクロファージ、繊維芽細胞、赤血球及び白血球を含有する脾臓の血管に富む組織である「赤脾髄」であった。４時間後、このｓｉＲＮＡは依然として主に赤脾髄に局在していたが、主にリンパ球が存在する脾臓の境界域に移動し始めていた。１０時間後、ｓｉＲＮＡ取り込み先は主に、（ｉ）Ｂリンパ球を含有する胚中心及び（ｉｉ）境界域を含むリンパ系組織である、白髄であった。２４時間後、ｓｉＲＮＡ取り込みは、主に白髄及び胚中心で観察された。
【０２６５】
実施例６
ＬＮＰ０８（ＸＴＣ）配合ＣＤ４５ｓｉＲＮＡはマウス腹腔の白血球においてＣＤ４５発現を抑制した。
ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に３ｍｇ／ｋｇでＣＤ４５ｓｉＲＮＡ又はＬｕｃ  ｓｉＲＮＡの何れかを含有するＬＮＰ０８製剤を静脈内又は腹腔内注射により注入した。注射から３日後、脾臓、骨髄、腹腔、パイエル板及び肝臓からの白血球の分析を行った。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＧＲ−１、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５、ＮＫ１．１、ＣＤ１９及びＴＣＲ−βの組み合わせに対する抗体を用いて白血球を染色した。
【０２６６】
ＣＤ４５ｓｉＲＮＡのｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．注射の何れかの後、ＣＤ４５が腹腔のＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞で（マクロファージ及び樹状細胞で）下方制御されることが観察された（図４Ａ及び４Ｂ）。当業者は、一般に、ｉ．ｖ．投与によるｓｉＲＮＡの結果、有効な遺伝子サイレンシングが起こらないと考えてきたので、ｉ．ｖ．によるｓｉＲＮＡの投与後に観察されるサイレンシング活性は驚くべきものであった。
【０２６７】
ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．により投与した場合、ＬＮＰ０８配合ＣＤ４５及びルシフェラーゼｓｉＲＮＡは両者とも、骨髄白血球に取り込まれ（図５Ａ及び５Ｂ）、ＣＤ４５ｓｉＲＮＡは、両投与経路によって遺伝子発現を抑制することができた（図５Ｃ）。ここでも、ｉ．ｖ．によるｓｉＲＮＡ投与が遺伝子発現を下方制御するのに有効であったことは特に驚くべきことであった。
【０２６８】
ｉ．ｐ．によるｓｉＲＮＡ注射後のＢ細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞及びＴ細胞及びｉ．ｖ．注射後のＢ細胞及びＮＫ細胞を含め、腹腔のリンパ球におけるＣＤ４５発現に対する軽度の作用も観察された（図６）。ここでも、ｉ．ｖ．投与後に遺伝子発現の下方制御が見出されるのは驚くべきことであった。
【０２６９】
脾臓細胞において、ＣＤ４５ｓｉＲＮＡは、ｉ．ｐ．注射後のＢ細胞リンパ球及びｉ．ｐ．注射後のＣＤ１１ｂ＋白血球で発現を低下させた（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０２７０】
ＣＤ４５ｓｉＲＮＡは、パイエル板の、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞又はＣＤ１１ｂ＋ＧＲ−１＋細胞（図８Ａ）においても肝臓の白血球（図８Ｂ）においてもＣＤ４５遺伝子発現に対して効果がなかった。
【０２７１】
製剤取り込みとサイレンシングとの間の相関関係を調べるために、脂質ＸＴＣを含有する脂質Ａ製剤も試験した。３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝３匹のマウスで、ＣＤ４５（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼｓｉＲＮＡの何れかを含有する脂質Ａ製剤をｉ．ｖ．によりマウスに注射した。ＣＤ４５及びＧＦＰは多量に存在しかつ非常に安定なタンパク質である。注射から３日後、脾臓、骨髄、腹腔、パイエル板、肝臓及びリンパ節から白血球を分析した。タンパク質レベルでのサイレンシングについてフローサイトメトリーにより白血球亜集団をアッセイした。
【０２７２】
分析のために生細胞全てをゲーティングした。細胞表面マーカーに基づき個々の集団を同定し、個別にゲーティングした。各集団に対してＣＤ４５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、ｓｉＲＮＡ処置マウスと対照マウスとの間のＭＦＩの％差をとることによって、％ノックダウンを計算した。
【０２７３】
ＣＤ４５サイレンシングは、腹腔のマクロファージ及び樹状細胞でもっとも強く観察された（図９）。脾臓、骨髄及び肝臓で観察されたサイレンシングはそれより弱く、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞）では顕著なノックダウンは観察されなかった。ＡｐｏＥ−／−マウスでは、脾臓及び腹腔骨髄細胞で野生型マウスと同程度のノックダウンが認められた。図９で示す結果は、独立した４回の実験にわたり平均した。
【０２７４】
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）分析から、腹腔のマクロファージ及び樹状細胞による脂質Ａ配合ＣＤ４５ｓｉＲＮＡの取り込みが示された（図１０Ａ及び１０Ｂ）。注射から７２時間後（図１０Ｃ）、腹膜白血球でＣＤ４５サイレンシングが観察され、ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいてＧＦＰｓｉＲＮＡによって同様の結果が見られた。
【０２７５】
用量反応実験において、０．３ｍｇ／ｋｇではマクロファージ及び樹状細胞サイレンシングの両方が観察されたが、０．１ｍｇ／ｋｇでは観察されなかった（図１１Ｃ）。図１１Ａ及び１１Ｂから、投与量レベルが高いほどｓｉＲＮＡの取り込みが多かったことが示される。
【０２７６】
別の一連の実験において、Ａｌｅｘａ６４７標識ｓｉＲＮＡを封入する脂質Ａ製剤を１ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した（１群あたりマウスｎ＝３匹）。ＦＡＣＳを使用して、腹腔、骨髄、脾臓、大動脈周囲リンパ節及び血液のマクロファージ、単球、Ｂ細胞及びＴ細胞による脂質の取り込みを測定した。この結果を図１２で示す。大動脈周囲リンパ節では骨髄よりも取り込みが少なかった。
【０２７７】
この実験の結果から、脂質Ａ製剤が血液単球により効率的に取り込まれ、最大取り込みが１５分までに達成されたことが示された。血液単球は、ＬＮＰ取り込み後、腹腔に移動し得る（図１３参照）。脾臓マクロファージでの取り込みは、血液で見られた取り込みよりも少なく、腹腔の骨髄細胞で観察された取り込みは大きかったが、取り込み速度は脾臓及び血液単球に対して観察されたものよりも遅かった。腹腔で高取り込みが観察されたのは、腹腔で高いサイレンシングが観察されたことと矛盾しない。
【０２７８】
実施例７
ＬＮＰ０９配合ｓｉＲＮＡは脾臓、血液及び腹腔の白血球での遺伝子発現を抑制した。
先行実験から、投与後７２時間までに、脂質配合ｄｓＲＮＡによってサイレンシングを示す殆どのマクロファージが腹腔に局在するようになることが示された。従って、脂質配合ｄｓＲＮＡが腹腔の細胞に対して標的指向化されるのか又は他所に局在化した細胞が最初にｄｓＲＮＡを取り込み、次いでその細胞が腹腔に移動するのか否かという疑問を解明するために、さらなる実験を計画した。
【０２７９】
ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）にＬＮＰ０９−（ＸＴＣ−）配合ＣＤ４５ｄｓＲＮＡ又はルシフェラーゼｄｓＲＮＡを注射した。３ｍｇ／ｋｇで静脈内に注射した。白血球（マクロファージ及び単球を含む。）を脾臓、末梢血液、骨髄及び腹腔から、投与後１５分、１時間及び２時間後に単離し、さらなる活性化刺激を与えずに、この細胞をインビトロで７２時間培養した。次いで細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＣＤ４５レベルを定量した。表面マーカー：ＣＤ４５、ＧＲ−１、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）及びＣＤ１１ｃの組み合わせに対する抗体で白血球を染色した。結果を図１４Ａから１４Ｄで示す。
【０２８０】
図１４Ａは、ＣＤ４５ｄｓＲＮＡ投与後、骨髄から単離された白血球が何らサイレンシング活性を示さなかったことを示す。図１４Ｂは、脾臓組織から単離された白血球で最初の１時間にわたりサイレンシングが向上しており、次の１時間を通じてこのサイレンシングレベルが維持されることを示す。図１４Ｄは、腹腔から単離された白血球では、２時間にわたりＣＤ４５遺伝子サイレンシング効果上昇が明らかになったことを示す。対照的に、図１４Ｃは、血流中の白血球において最初の遺伝子サイレンシング効果が認められたが、その後の時点ではＣＤ４５サイレンシングがあったと認められた細胞が僅かだったことを示す。
【０２８１】
これらの実験から、サイレンシングは、末梢白血球（血流及び脾臓中の白血球）で起こり、５０−６０％のサイレンシングに到達し、これはエクスビボでの注射から３日後までに腹腔で見られる効果に匹敵することが明らかになった。
【０２８２】
この結果から、ｓｉＲＮＡ含有ＬＮＰ製剤によって末梢白血球を首尾よく標的とすることができることが示された。腹腔は移動部位及び／又は後のリポソーム移動経路の何れかであり得る。
【０２８３】
実施例８
脂質Ｔ配合ＣＤ４５ｓｉＲＮＡはマウス腹腔の白血球においてＣＤ４５発現を抑制した。
ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に、ＣＤ４５ｓｉＲＮＡ（ＡＤ３２１５）又はＬｕｃ  ｓｉＲＮＡの何れかを含有する脂質製剤を３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．注射により注入した。この製剤は、次のモル％で脂質Ｔ、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧを含んでいた:
【表５】
2020023585.tif 000054
【０２８４】
ＡＤ３２１５ｓｉＲＮＡは、下で示されるようなセンス及びアンチセンス鎖をそれぞれ有する：
【表６】
2020023585.tif 000055
【０２８５】
注射から３日後、脾臓、骨髄、腹腔、パイエル板及び肝臓からの白血球を分析した。細胞表面マーカーＣＤ４５、ＧＲ−１、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５、ＮＫ１．１、ＣＤ１９及びＴＣＲ−βの組み合わせに対する抗体で白血球を染色した。ＣＤ１１ｂは、マクロファージに豊富にある骨髄細胞マーカーであり；ＣＤ１１ｃは樹状細胞ならびに他の骨髄細胞で高密度で見出される骨髄細胞マーカーであり；ＧＲ−１は顆粒球マーカーであり；ＣＤ１９はＢ細胞マーカーであり、ＴＣＲ−βはＴ細胞マーカーであり、ＮＫ１．１はナチュラルキラー細胞に対するマーカーである。
【０２８６】
腹腔のマクロファージ及び樹状細胞においてＣＤ４５ｓｉＲＮＡによるサイレンシングが観察され（図１５Ａ及び１５Ｂ）、一方、リンパ球でのＣＤ４５は観察されなかった（図１６）。ここでも、実に驚くべきことに、ｉ．ｖ．注射によるｓｉＲＮＡ投与後に遺伝子サイレンシング活性が観察された。
【０２８７】
ｉ．ｐ．又はｉ．ｖ．による投与後、ＣＤ４５ｓｉＲＮＡは骨髄白血球にも取り込まれ（図１７Ａ及び１７Ｂ）、ｓｉＲＮＡは、何れの投与経路でも、白血球の遺伝子発現を抑制するのに有効であった（図１７Ｃ）。ここでも、実に驚くべきことに、ｉ．ｖ．注射によるｓｉＲＮＡ投与後、遺伝子サイレンシング活性が観察された。
【０２８８】
肝臓（図１８Ａ）、脾臓（図１８Ｂ）の白血球又はパイエル板リンパ球（図１８Ｃ）におけるＣＤ４５遺伝子発現に対する影響についても、ＣＤ４５ｓｉＲＮＡを試験した。
【０２８９】
一連の第二の実験において、脂質Ｔを含有する脂質製剤（ＴｅｃｈＧ１）であるＬＮＰ１２中で製剤処方したｄｓＲＮＡを上述のようにナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）にｉ．ｖ．注射により投与した。注射から３日後、脾臓、骨髄、腹腔、肝臓及びリンパ節から白血球を分析した。フローサイトメトリーによるタンパク質レベルでのサイレンシングについて白血球亜集団をアッセイした。生細胞全てを分析のためにゲーティングした。細胞表面マーカーに基づき個々の集団を同定し、個別にゲーティングした。各集団に対してＣＤ４５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、ｓｉＲＮＡ処置マウスと対照マウスとの間のＭＦＩの％差としてノックダウン％を計算した。
【０２９０】
これらの実験から、腹腔のマクロファージにおいて、約９０％ノックダウンが明らかになった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。脾臓のマクロファージ及び樹状細胞においてサイレンシング向上も観察された（図２０Ａ及び２０Ｂ）。脂質Ｔを含有する脂質製剤（例えばＬＮＰ１２）が脂質Ａ（ＸＴＣ）又は脂質Ｍ（ＭＣ３）を含有する脂質製剤よりも脾臓において活性をより効果的に抑制することが認められた。
【０２９１】
ｉ．ｖ．単回ボーラス投与から調べた場合の、ナイーブマウスにおける非標的指向化リポソームに対するＩＣ５０値を下記の表で示す。最大サイレンシングは腹腔で観察された。脂質Ｔは、現在のところ白血球サイレンシングに対する最も有効な脂質成分であることが証明された（ＩＣ５０＝０．３ｍｇ／ｋｇ）。
【表７】
2020023585.tif 000056
【０２９２】
実施例９
免疫細胞標的指向化促進のための脂質Ａ含有製剤の最適化
免疫細胞への薬剤送達性が向上したリポソーム製剤を特定するために、ｓｉＲＮＡによる免疫細胞における第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、肝臓−特異的遺伝子及びＣＤ４５（ＥＣ３．１．３４）を標的とするｓｉＲＮＡを含有する様々な脂質粒子を製剤処方した。ＣＤ４５ｓｉＲＮＡ又はＬｕｃ／第ＶＩＩ因子（９：１）ｓｉＲＮＡの何れかを含有する、様々な量の脂質Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質（ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）であるＣ１４−ＰＥＧ又はＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）であるＣ１８−ＰＥＧの何れかであり；双方の場合とも、ＰＥＧ部分の平均分子量が約２，０００である。）を含む全部で８種類の製剤を、３ｍｇ／ｋｇの量でナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにｉ．ｖ．投与することによって試験した（Ｎ＝３）。脂質Ａを含有するベース製剤は肝臓サイレンシングに対して白血球サイレンシングよりも１０倍活性が高いので、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡの使用量はより少量であった。ｓｉＲＮＡの総用量をＣＤ４５ｓｉＲＮＡ製剤の場合と同等とするために、Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを第ＶＩＩ因子製剤に添加した。注射から３日後、白血球を腹腔から回収し、第ＶＩＩ因子を血清から定量した。マクロファージ特異的マーカーとしてＣＤ４５、ＧＲ−１、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）及び樹状細胞（ＤＣ）マーカーとしてＣＤ１１ｃを含む表面マーカーの組み合わせに対する抗体で白血球を染色した。
【０２９３】
試験した脂質Ａ含有製剤は以下のとおりであった。
【表８】
2020023585.tif 000057
【０２９４】
ｓｉＲＮＡ３２１５、１９５５及び１６６１は、それぞれＣＤ４５、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）及び第ＶＩＩ因子を標的とする。
【０２９５】
Ｍａｃ１＋マクロファージ又はＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）におけるＣＤ４５のサイレンシングを図２１Ａで示す。肝臓におけるＦＶＩＩのサイレンシングは図２１Ｂで示す。ＣＤ４５及びＦＶＩＩサイレンシングに対する相関プロットを図２２Ａ及び２２Ｂで示す。
【０２９６】
マクロファージにおいて、一部の製剤は、ＣＤ４５の強いサイレンシングを示した（例えば、Ｎ／Ｏ又はＥ／Ｆ＞Ｇ／Ｈ＞Ｐ／Ｑ＞Ｊ／Ｋ）。同様に、一部の製剤が樹状細胞においてＣＤ４５の強いサイレンシングを示した（例えば、Ｅ／Ｆ＞Ｇ／Ｈ＞Ｎ／Ｏ＞Ｐ／Ｑ＞Ｊ／Ｋ）。
【０２９７】
結論として、Ｅ／Ｆ、Ｇ／Ｈ、Ｊ／Ｋ、Ｎ／Ｏ及びＰ／Ｑなどの製剤は免疫細胞（マクロファージ及び樹状細胞の両方）において強いサイレンシングを示した。一部の製剤（例えばＮ／Ｏ及びＰ／Ｑ）では、肝臓と比較した場合に、免疫細胞においてより選択的なサイレンシングであると思われた。
【０２９８】
実施例１０
様々なサイズのリポソームの調製
様々な粒径のリポソーム製剤が特異的免疫細胞標的指向化において有効であるかを調べるために、様々なサイズのリポソーム粒子を調製するための新しい方法を開発した。次の手順は、リポソーム粒子が、融合を妨害する薬剤（例えばＰＥＧ−脂質）の非存在下で、ある一定の条件下で融合反応を起こし得るという考え方に基づくものであった。このような融合反応の進行を慎重に監視することによって、大きなサイズのリポソームを再現性よく調製することができる。
【０２９９】
酢酸ナトリウム緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ５．２）を脂質予混合溶液に添加することによって、リポソームを調製した。各脂質保存溶液から、この脂質予混合溶液（エタノール中、脂質Ａ／コレステロール／ＤＳＰＣ＝５０：１０：３０モル比を含有する２０．４ｍｇ／ｍＬ総脂質濃度）を調製した。この脂質予混合溶液にはＰＥＧ−脂質は含有されなかった。
【０３００】
脂質予混合溶液に酢酸ナトリウム緩衝液を添加した後、脂質Ａに対する酢酸の０．５というモル比で混合物を水和させた（得られた混合物のエタノール濃度は約９７％であった。）。続いて、激しく攪拌しながらこの混合物を１．８５体積のクエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ３．０）と混合することによって脂質を水和した。次に、融合を誘導するために３７℃でリポソーム溶液をインキュベートした。様々な時点で一定分量を採取した。
【０３０１】
インキュベーション中のリポソームの大きさの変化を調べるために、一定分量のリポソーム溶液を回収し、希釈（１：５００）してそれらのサイズを測定した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いてリポソーム粒径（ｄ、ｎｍ）及びリポソームの多分散度指数（ＰＤＩ）を測定した。リポソームのサイズは時間関数的に大きくなった（図２３Ａ）。温度、ナトリウム濃度及びｐＨを含め、ある一定のパラメータがリポソーム直径の拡大速度に影響を与えることが分かった。例えば、リポソームの拡大は、高温であるほど速かった。対照的に、ナトリウム濃度が低い場合、凝集及びリポソーム拡大速度が低下し：１００ｍＭ以上のナトリウム濃度では、リポソームの凝集があまりに高速であったためサイズの拡大を監視できず、一方で、本明細書中で使用するようにナトリウム濃度を低下させると、融合反応の進行が制御しやすくなった。
【０３０２】
融合反応におけるリポソーム粒子の無作為な融合の結果、融合反応が進行するにつれて、サイズ分布が安定して向上するようになると予想される。驚くべきことに、リポソームサイズが時間関数的に安定して拡大した一方で（図２３Ａ）、リポソームの多分散度指数（ＰＤＩ）は低いままであり（図２３Ｂ）、つまり、リポソームのサイズ分布が融合事象によるサイズ拡大にかかわらず、極めて均一なままであったことが示唆される。従って、サイズ分布プロファイルは殆ど平行にシフトした（例えば図２３Ｃ参照）。
【０３０３】
ＰＥＧ−脂質の添加が融合を抑制し、リポソームをそのサイズに維持することに役立ち得るかどうかを調べるために、融合反応開始後、融合反応中の一定分量のリポソームを様々な時点で採取し（ｔ＝０から１５０分）、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度でＰＥＧ脂質水溶液（保存液＝３５％（ｖ／ｖ）エタノール中、１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＥＧ−Ｃ１４）と激しく攪拌しながら混合した。結果から、ＰＥＧ−脂質を添加すると、リポソームのさらなる拡大を効果的に抑制しながら、明らかに顕著なさらなる融合事象なくリポソームのサイズが維持されたことが分かった。
【０３０４】
ＰＥＧ脂質の添加後、ｓｉＲＮＡ溶液（保存液＝３５％エタノール中の１．５ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡ）の半量を添加することによって空のリポソームにｓｉＲＮＡを投入し、続いて３７℃で３０分間インキュベーションを行った。続いて、混合物をＰＢＳ中で一晩透析した。結果として、多分散度指数が低い様々なサイズのリポソームが得られた。この方法を用いて、〜２００ｎｍの粒径のリポソーム及び３００ｎｍを超えるか又はさらに６００ｎｍを超えるものを容易に調製することができた。
【０３０５】
これらの結果から、ＰＥＧ−脂質が、融合反応中のリポソームサイズの拡大を効果的に抑制するために役立ち得ることが示された。従って、融合を妨害するＰＥＧ−脂質などの成分がない混合物中で融合反応を行い、続いて、所望のリポソームサイズが得られるまで融合反応を継続させた後、ＰＥＧ−脂質を添加することによって、様々なサイズのリポソームを好都合に得ることができる。この反応は、サイズ及びサイズ分布について容易に監視し（例えばＰＤＩを測定することによる。）、さらなる融合を阻害する薬剤（例えばＰＥＧ−脂質）を添加するか又は希釈によって停止することができる。この方法を用いて得られるリポソームは、ＰＤＩ値が比較的低いことから分かるように、驚くべきことにサイズが均一である。
【表９】
2020023585.tif 000058
【０３０６】
実施例１１
免疫細胞標的指向化促進のための脂質粒径の最適化
様々な粒径を有するリポソーム製剤の、免疫細胞を選択的に標的とする能力を試験するために、ＰＥＧ−Ｃ１４（ＰＥＧ−ＤＭＧ）又はＰＥＧ−Ｃ１８（ＰＥＧ−ＤＳＧ）の何れかを使用して、基本的に上述の実施例９に記載のような方法を用いて第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、肝臓特異的遺伝子又は免疫細胞に存在するＣＤ４５（ＥＣ３．１．３４）を標的とするｓｉＲＮＡを含有する様々な脂質粒子を製剤処方した。全部で８対の脂質粒子を調製した。これらの脂質粒子は、脂質製剤における組成物の性質及び／又は量又は粒径の何れかが異なる。３ｍｇ／ｋｇの量でナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにｉ．ｖ．投与することによって、ＣＤ４５ｓｉＲＮＡ又はＬｕｃ／第ＶＩＩ因子（９：１）ｓｉＲＮＡの何れかを含有する脂質粒子を試験した（Ｎ＝３）。ｓｉＲＮＡ３２１５、１９５５及び１６６１は、それぞれＣＤ４５、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）及び第ＶＩＩ因子を標的とする。脂質Ａを含有するベース製剤は肝臓サイレンシングに対して、白血球サイレンシングに対する場合よりも１０倍活性が高いので、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡの使用量はより少量であった。ｓｉＲＮＡの総用量をＣＤ４５ｓｉＲＮＡ製剤の場合と同等にするために、Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを第ＶＩＩ因子製剤に添加した。
【０３０７】
注射から３日後、白血球を腹腔及び脾臓から回収し、製造者のプロトコールに従い、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ、ＤｉａＰｈａｒｍａ  Ｇｒｏｕｐ、ＯＨ又はＢｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩ、Ａｎｉａｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＯＨ）を用いて第ＶＩＩ因子を血清から定量した。マクロファージ特異的マーカーとしてＣＤ４５、ＧＲ−１、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）及び樹状細胞（ＤＣ）マーカーとしてＣＤ１１ｃを含む表面マーカーの組み合わせに対する抗体で白血球を染色した。試験した製剤は下記表５で示すとおりである。示されるようなＣ１４−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ））又はＣ１８−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ））の何れかを製剤中で使用した。両ケースにおいて、Ｃ１４−ＰＥＧ及びＣ１８−ＰＥＧのＰＥＧ部分の平均分子量は約２，０００である。
【表１０】
2020023585.tif 000059
【０３０８】
結果を図２４Ａ−２４Ｄで示す。図２４Ａは、肝臓におけるＦＶＩＩのサイレンシングを示す。図２４Ｂは腹膜ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）又はＭａｃ１＋マクロファージにおけるＣＤ４５のサイレンシングを示す。図２４Ｃは、ＣＤ１１ｃ＋又はＭａｃ１＋脾臓細胞におけるＣＤ４５のサイレンシングを示す。図２４ＤはマクロファージにおけるＣＤ４５サイレンシング及び肝臓におけるＦＶＩＩサイレンシングに対する相関プロットを示す。
【０３０９】
図２４Ａ及び２４Ｄで示されるように、同じ配合を有し、粒径のみが異なる脂質粒子は、顕著に異なるＦＶＩＩのサイレンシングを示した。例えば、製剤Ｅ／Ｆは製剤Ｔ／Ｕよりも強いＦＶＩＩのサイレンシングを示し、この製剤Ｔ／Ｕは製剤Ｒ／Ｓよりもかなり強いＦＶＩＩサイレンシングを示した。図２４Ｂから２４Ｄで示されるように、粒径が異なる製剤ではＣＤ４５サイレンシングに対する効果が大きく低下した。よりサイズが大きいリポソーム製剤は白血球におけるサイレンシングを劇的に低下させなかったが、肝臓細胞でのサイレンシングを顕著に低下させるようであった。図２４Ｄで示されるように、製剤Ｐ／Ｑ及びＲ／Ｓは、肝臓と比較した場合、免疫細胞においてより選択的なサイレンシングであると思われた。
【０３１０】
さらに、図２４Ｂ及び２４Ｃで示されるように、同様の粒径である製剤ＣＣ／ＤＤ及びＥ／Ｆは、マクロファージにおいて同様のＣＤ４５サイレンシングを示した。
【０３１１】
実施例１２
リポソーム製剤は、インビトロで初代マクロファージにおいて用量依存的に遺伝子発現を抑制する。
ＬＮＰ−０１は、インビトロで用量依存的に初代マクロファージにおいてＣＤ４５サイレンシングを示した（図２５Ａ）。ＩＣ５０値を測定したところ、約１００ｎＭとなった。インビトロでのＬＮＰ０８製剤を用いた初代マクロファージにおけるＣＤ４５サイレンシングも用量依存的であった（図２５Ｂ）。ＬＮＰ０８製剤を用いた場合のＩＣ５０値を測定したところ、約５ｎＭとなった。
【０３１２】
ＬＮＰ０８製剤も、腹腔のマクロファージ及び樹状細胞においてインビボで用量依存的にＣＤ４５をサイレンシングすることが分かった（図２６）。細胞中でｓｉＲＮＡが蓄積するにもかかわらず、脂質製剤ＬＮＰ−０ｌ、ＤＯＤＭＡ又はＤＬｉｎＤＭＡを用いた場合にインビボでの全身性サイレンシングは観察されなかった。
【０３１３】
実施例１３
脂質Ｍ配合ｓｉＲＮＡ（ＭＣ３を配合）は、脂質Ａ（ＸＴＣ）配合ｓｉＲＮＡよりも勾配が緩い用量反応を示し、ＩＣ５０が低かった。
用量反応実験の結果を図２７Ａ−Ｃで示す。脂質Ｍ配合ｓｉＲＮＡを用いた場合、脂質Ａ（ＸＴＣ）配合ｓｉＲＮＡの場合よりも勾配が緩い用量反応が観察された。脂質Ｍ配合ｓｉＲＮＡもＩＣ５０がより低く、サイレンシングの最大値が低かった。マクロファージ及び樹状細胞への脂質Ｍ配合ｓｉＲＮＡの取り込みを示すＦＡＣＳ分析を図２７Ａ及び２７Ｂで示す。サイレンシングのデータを図２７Ｃに示す。サイレンシングは用量依存的であった。３ｍｇ／ｋｇの用量以下では樹状細胞においてサイレンシングは殆ど観察されなかった。
【０３１４】
脂質Ｍ（ＭＣ３）及び構造的に類似する脂質は、少なくとも２００９年１１月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９３３号；２００９年１１月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９３１号；２００９年１１月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９２７号；２０１０年１月２９日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１０／２２６１４号；２００９年６月１０日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／１８５，８００号；及び２０１０年１月２８日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／２９９２９１号で開示されている。これらの出願書類の各内容は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書中に参照により組み込まれる。
【０３１５】
実施例１４
反復投与計画によりサイレンシングが促進された。
サイレンシングが向上され得るかどうかか、及び腹腔以外の場所において、より効率的に白血球に到達させられ得るかを調べるために、次のプロトコールに従いＬＮＰ−ｓｉＲＮＡの複数回投与を行った。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、３日間連続して又は１回、脂質Ａ（ＸＴＣ）又は脂質Ｍ（ＭＣ３）含有製剤を１ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した（ｎ＝２）。最後の注射から３日後、腹腔、脾臓、骨髄、肝臓及び血液から白血球及びリンパ球を分析した。結果を図２８Ａから２８Ｄで示す。
【０３１６】
複数回投与の結果として、腹腔単球において及びＢ細胞においてある程度のサイレンシングの向上が認められた。脂質Ａ及び脂質Ｍ含有製剤の両方で、脾臓樹状細胞でサイレンシングの向上が認められた（図２８Ａ及び２８Ｂ）。また、複数回投与の結果、脂質Ａを３回投与して、骨髄マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞において初めて検出可能な信頼性のあるサイレンシングが得られた（図２８Ｃ）。従って、反復投与計画により、白血球サイレンシングに対するさらなる標的器官がもたらされ、より多くの細胞型に到達させることができる。
【０３１７】
本発明の少なくとも１実施形態のいくつかの態様について説明してきたが、当然のことながら、当業者は様々な改変、修飾及び改善を容易に行うことができることを理解されたい。かかる改変、修飾及び改善は、本開示の一部であるものとし、本発明の精神及び範囲内に包含されるものとする。従って、前述の記載は単なる例にすぎない。
【図１】
2020023585.tif 000080
【図２】
2020023585.tif 000081
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020023585.tif 000089
【図１１】
2020023585.tif 000090
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020023585.tif 000093
【図１５】
2020023585.tif 000094
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020023585.tif 000099
【図２１】
2020023585.tif 000100
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月22日(2019.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロール；中性脂質；ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質；および下記からなる群より選択されるカチオン性脂質を含む製剤と複合体化された核酸を含む、核酸の免疫細胞への送達剤：
（ｉ）下記構造を有するカチオン性脂質
【化１】
2020023585.tif 000108
（式中、各Ｒは独立してＨ、アルキル、
【化２】
2020023585.tif 000109
【化３】
2020023585.tif 000110
であり；
ただし、少なくとも１つのＲは
【化４】
2020023585.tif 000111
【化５】
2020023585.tif 000112
であることを条件とし；
ここで、Ｒ１００は、各出現に対し、独立してＨ、Ｒ１０３、
【化６】
2020023585.tif 000113
であり、
ここでＲ１０３は、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０２は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ１０３は、各出現に対し、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換され；
Ｙは、各出現に対し、独立してＯ、ＮＲ１０４、またはＳであり；
Ｒ１０４は、各出現に対し、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルであり；それらはそれぞれ、１つ以上の置換基で任意に置換される）、ならびに
（ｉｉ）下記構造を有するカチオン性脂質：
【化７】
2020023585.tif 000114
（式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、各出現に対し、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルコキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルケニルオキシ、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニル、任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アルキニルオキシ、または任意に置換されたＣ１０〜Ｃ３０アシルであり；
Ｅは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｑ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−、Ｓ（Ｏ）、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｑ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｑ）Ｓ（Ｏ）２−、−ＳＳ−、−０−Ｎ＝、＝Ｎ−０−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｎ＝、−Ｎ（Ｑ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、またはヘテロシクリレンであり;および
ＱはＨ、アルキル、ω−アミノアルキル、ω−（置換）アミノアルキル、ω−ホスホアルキルまたはω−チオホスホアルキルであり；および
Ｒ３はＨ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０アルキニル、任意に置換されたアルキル複素環、任意に置換された複素環アルキル、任意に置換されたアルキルホスフェート、任意に置換されたホスホアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロチオエート、任意に置換されたホスホロチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホロジチオエート、任意に置換されたホスホロジチオアルキル、任意に置換されたアルキルホスホネート、任意に置換されたホスホノアルキル、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルキルアミノ、任意に置換されたジ（アルキル）アミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアルキルアミノアルキル、任意に置換されたジ（アルキル）アミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１００〜４０Ｋ）、任意に置換されたｍＰＥＧ（分子量１２０〜４０Ｋ）、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換された複素環、またはリンカー−リガンドである）。
【外国語明細書】
2020023585000001.pdf