(57)【要約】【課題】  本発明は、細胞の代謝状態を正確に判定し、細胞の代謝状態を良好に維持することができる細胞状態判定装置及び細胞状態判定方法を提供することを目的とする。【解決手段】  実施形態に従う細胞状態判定装置は、培養装置３によって培養されている細胞に関して蛍光寿命測定装置４によって測定された第１の測定値Ｄ１に基づいて遊離ＮＡＤＨ相対量を算出する算出部８と、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn以上かを判定するとともに、細胞に関して蛍光スペクトル測定装置５によって測定された第２の測定値Ｄ２が第２の閾値Ｖfw以上かを判定する判定部９と、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn以上であり、第２の測定値が第２の閾値Ｖfw未満である場合に、培養装置３を制御するための制御パラメータを変更する変更部１０とを具備する。【選択図】図４
2020191836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養装置によって培養されている細胞に関して蛍光寿命測定装置によって測定された第１の測定値に基づいて遊離ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）相対量を算出する算出部と、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値以上かを判定するとともに、前記細胞に関して蛍光スペクトル測定装置によって測定された第２の測定値が第２の閾値以上かを判定する判定部と、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量が前記第１の閾値以上であり、前記第２の測定値が前記第２の閾値未満である場合に、前記培養装置を制御するための制御パラメータを変更する変更部と、
を具備する細胞状態判定装置。
【請求項２】
前記判定部は、前記第２の測定値が前記第２の閾値以上の場合に、前記培養装置の停止を命令する、請求項１の細胞状態判定装置。
【請求項３】
前記判定部は、前記遊離ＮＡＤＨ相対量が前記第１の閾値以上であり、前記第２の測定値が前記第２の閾値未満である場合に、前記培養装置に備えられた培養槽に酸素の供給を命令する、請求項１又は２の細胞状態判定装置。
【請求項４】
前記判定部は、前記遊離ＮＡＤＨ相対量が前記第１の閾値未満であり、前記第２の測定値が前記第２の閾値未満である場合に、前記培養装置の判定時点での培養条件を維持する、請求項１乃至請求項３の何れか１項の細胞状態判定装置。
【請求項５】
前記第２の測定値は、少なくとも前記蛍光スペクトル測定装置によって測定された前記細胞に関する蛍光スペクトルのピーク波長を含む、請求項１乃至請求項４の何れか１項の細胞状態判定装置。
【請求項６】
前記遊離ＮＡＤＨ相対量は、前記蛍光寿命測定装置によって測定された全レンジの蛍光寿命に対するショートレンジの蛍光寿命の割合に相当する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項の細胞状態判定装置。
【請求項７】
前記判定部は、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量が前記第１の閾値以上であり、前記第２の測定値が前記第２の閾値未満である場合、酸化的リン酸化阻害状態と判定し、
前記第２の測定値が前記第２の閾値以上の場合、壊死状態と判定し、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量が前記第１の閾値未満であり、前記第２の測定値が前記第２の閾値未満である場合、通常の生育状態と判定する、
請求項１乃至請求項６のいずれか１項の細胞状態判定装置。
【請求項８】
前記変更部は、前記第１の測定値、前記遊離ＮＡＤＨ相対量、第２の測定値、パラメータ変更のために用いられる第３の測定値のうちの少なくとも１つと、前記制御パラメータを決定するための演算式、テーブル、回帰モデルのうちの少なくとも１つとに基づいて、前記制御パラメータを変更する、
請求項１乃至請求項７のいずれか１項の細胞状態判定装置。
【請求項９】
前記細胞はＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞である、請求項１乃至請求項８のいずれか１項の細胞状態判定装置。
【請求項１０】
培養中の細胞の状態を判定する方法であって、
前記細胞の蛍光寿命を測定し、前記蛍光寿命から遊離ＮＡＤＨ相対量を算出する第１測定工程と、
前記細胞の蛍光スペクトルを測定し、蛍光スペクトルのピーク波長を得る第２測定工程と、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量及び前記蛍光スペクトルのピーク波長から細胞の状態を判定する判定工程と
を具備し、
前記判定工程は、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量が予め定められた第１の閾値以上であり、前記蛍光スペクトルのピーク波長が予め定められた第２の閾値未満である場合、酸化的リン酸化阻害状態と判定することと、
前記蛍光スペクトルのピーク波長が前記第２の閾値以上の場合、壊死状態と判定することと、
前記遊離ＮＡＤＨ相対量が前記第１の閾値未満であり、前記蛍光スペクトルのピーク波長が前記第２の閾値未満である場合、通常の生育状態と判定することと、
を具備する、細胞状態判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施形態は、細胞状態判定装置及び細胞状態判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬生産には、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）細胞のような抗体生産細胞が用いられている。抗体生産のプロセスにおいて、細胞培養環境の酸素が不足して嫌気的条件になると、細胞は乳酸発酵を始める。このような状態では抗体生産量が低下する。一方で酸素の供給量が過剰の場合は、培地中の成分が酸化して細胞に不利な影響を及ぼすおそれや、酸素の気泡の物理的な衝突により細胞が損傷するおそれがある。
【０００３】
上記のような抗体生産を始めとするバイオプロセスにおいては、一般に細胞を良好な代謝状態に保つために、種々のパラメータを監視して細胞の代謝状態を判定し、培養条件を最適に保持することが求められる。例えば、非特許文献１には、酵母などの微生物では、自家蛍光の強度を測定することにより、好気的呼吸が行われているのか又は嫌気的発酵が行われているのかを判定できることが開示されている。非特許文献２には、酵母の自家蛍光のスペクトルにより代謝状態を判定する技術が開示されている。一方で、抗体生産に使用されるＣＨＯ細胞のような細胞の場合、高い生産性及び品質を得るためには、酵母などの微生物よりも高い培養制御技術が求められる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Beyeler, W. et al., (1981) European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 13, 10-14
【非特許文献２】Long, Z. et al., (2015) Journal of Biophotonics. 8, 247-257
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞の代謝状態を正確に判定し、細胞の代謝状態を良好に維持することができる細胞状態判定装置及び細胞状態判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態に従う細胞状態判定装置は、培養装置によって培養されている細胞に関して蛍光寿命測定装置によって測定された第１の測定値に基づいて遊離ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）相対量を算出する算出部と、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値以上かを判定するとともに、細胞に関して蛍光スペクトル測定装置によって測定された第２の測定値が第２の閾値以上かを判定する判定部と、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値以上であり、第２の測定値が第２の閾値未満である場合に、培養装置を制御するための制御パラメータを変更する変更部とを具備する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施形態の細胞状態判定方法の例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、細胞のＮＡＤＨに由来する自家蛍光の蛍光寿命を表す、時間と自家蛍光との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、細胞の蛍光スペクトルのピーク波長の例を示すグラフである。
【図４】図４は、実施形態の細胞状態判定装置の例を示すブロック図である。
【図５】図５は、実施形態の培養装置の例を示す断面図である。
【図６】図６は、実施形態の制御装置で実行される制御の例を示すフローチャートである。
【図７】図７は、例におけるＥＥＭの測定結果を示すグラフを含む表である。
【図８】図８は、例における蛍光寿命の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、実施形態の細胞状態判定装置及び細胞状態判定方法の実施の形態について説明する。
【０００９】
・細胞状態判定方法
実施形態の細胞状態判定方法は、培養中の細胞の状態を判定する方法である。
【００１０】
細胞は、特に限定されるものではないが、ヒト又はチンパンジー等の霊長類、或いはマウス、ラット、モルモット又はハムスター等の齧歯類等の哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。特に、ＣＨＯ細胞であることが好ましい。他には、ＮＳ０細胞又はＳｐ１／２細胞等のマウス骨髄腫細胞等、物質生産に一般的に使用されている細胞を用いることが好ましい。
【００１１】
培養開始時点での培養条件は、用いられる細胞の種類に応じて選択される一般的な条件であればよく、例えば、培地は液体培地又は固体培地を用いることができるが、液体培地であることが好ましい。培地の種類は、用いられる細胞の種類に応じて選択され、例えば、ＣＤ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などの無血清合成培地を用いることができる。温度は３７℃、二酸化炭素濃度は５％であることが好ましい。酸素濃度は、例えば、溶存酸素３０％であることが好ましい。しかしながら、これらの条件は、後述する細胞状態の判定結果によって適宜変更され得る。
【００１２】
培養は、例えば、後述する制御装置２の培養装置３により行われる。しかしながら、培地の振盪又は撹拌、ガス濃度の制御等を自動的に行う他の培養装置を用いて培養を行ってもよいし、培養液を収容したチューブやシャーレ等を振盪機構付きのインキュベータに入れることによって行ってもよい。培養法は、用いられる細胞の種類に応じて選択される一般的な方法であればよく、例えば、回分培養法、連続培養法又は流加培養法等を用いることができるが、回分培養法であることが好ましい。
【００１３】
実施形態の細胞状態判定方法に係る細胞状態の判定は、培養開始から、細胞の種類や培養条件等に依存して選択される所望の時間が経過した後に行われ、例えば、培養中に時間を空けて複数回行われる。判定結果によって培養条件を逐次変更することにより、細胞の代謝状態を良好に維持することが可能である。
【００１４】
実施形態の細胞状態判定方法は、図１に示す次の工程を含む。細胞の自家蛍光のうちＮＡＤＨに由来する蛍光の蛍光寿命を測定し、蛍光寿命から遊離ＮＡＤＨ相対量を算出する第１測定工程（ステップＳ１）、細胞の蛍光スペクトルを測定し、蛍光スペクトルのピーク波長を得る第２測定工程（ステップＳ２）、遊離ＮＡＤＨ相対量及び蛍光スペクトルのピーク波長から細胞の状態を判定する判定工程（ステップＳ３）。
【００１５】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００１６】
（ステップＳ１）
細胞の蛍光寿命とは、細胞のＮＡＤＨに由来する自家蛍光の蛍光寿命であり、その一例を図２に示す。ＮＡＤＨは、例えば、３４０ｎｍ付近の励起光を吸収して、４６０ｎｍ付近の蛍光を発する。この蛍光をＮＡＤＨに由来する自家蛍光として測定することができる。ＮＡＤＨに由来する自家蛍光には、０．５ナノ秒付近で消失するショートレンジ、１ナノ秒付近で消失するミドルレンジ、８ナノ秒付近で消失するロングレンジの３種の蛍光寿命の自家蛍光が存在する。ショートレンジの蛍光寿命の自家蛍光は、ほとんどが遊離ＮＡＤＨに由来するものであり、ミドル・ロングレンジの蛍光寿命は結合型ＮＡＤＨに由来するものである。ステップＳ１では、例えば、細胞の自家蛍光の全レンジの蛍光寿命に対するショートレンジの蛍光寿命の割合を測定する。例えば、この割合を全ＮＡＤＨ量に対する遊離ＮＡＤＨの相対量とみなすことができ、その結果、ステップＳ１により遊離ＮＡＤＨの相対量が得られる。
【００１７】
蛍光寿命の測定は、細胞の自家蛍光の励起光を細胞に照射し、得られた蛍光を経時的に検出することにより測定することができる。蛍光寿命の測定及び遊離ＮＡＤＨ相対量の算出は、市販の測定装置、例えばＱｕａｎｔａｕｒｕｓ-Ｔａｕ （浜松ホトニクス製）等を用いて行うことができる。
【００１８】
（ステップＳ２）
細胞の蛍光スペクトルのピーク波長とは、細胞の自家蛍光の蛍光スペクトルのピーク波長であり、その一例を図３に示す。グラフの縦軸（Ｅｘ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ）は励起光波長を示し、横軸（Ｅｍ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ）は蛍光波長を示す。等高線は光の強度を示し、等高線の頂点がピーク（最大値）である。ステップＳ２において測定する蛍光スペクトルのピーク波長は、例えば、励起光波長のピーク波長又は蛍光波長のピーク波長、或いは両方である。例えば、図３におけるグラフにおいては、励起光のピーク波長は３４０ｎｍ、蛍光のピーク波長は４４０ｎｍである。
【００１９】
蛍光スペクトルのピーク波長は、例えば、市販の蛍光分光光度計ＦＰ−８５００（日本分光製）等を用いて測定することが可能である。蛍光のピーク波長は、例えば、一定の励起光を細胞に照射して、光が最も強く得られる蛍光波長を調べることにより得ることができる。励起光のピーク波長は、種々の波長の励起光を細胞に照射して、蛍光が最も強く得られる励起光の波長を調べることにより得ることができる。或いは、上記のような装置を用いて両方を同時に測定してもよい。
【００２０】
ステップＳ１及びＳ２は、例えば、培養細胞集団の一部をサンプリングして行う。或いは、培養された状態のままの細胞集団全体又は一部に対して、培養装置に備え付けられたセンサなどによって測定を行ってもよい。
【００２１】
（ステップＳ３）
ステップＳ１及びＳ２によって得られた遊離ＮＡＤＨ相対量と、蛍光スペクトルのピーク波長とから、細胞の状態を判定する。判定は、例えば、以下の表１のように行われる。
【表１】
2020191836.tif 000003
【００２２】
まず、蛍光スペクトルのピーク波長から、細胞の生死を判定することができる。蛍光スペクトルのピーク波長が予め定められた閾値（以下、「第２の閾値Ｖfw」と称する）以上である場合、細胞が壊死状態であると判断する（表１の（ｉｉｉ））。
【００２３】
壊死状態とは、例えば、細胞の２０〜４０％が、窒息による壊死などにより死細胞となった状態のことをいう。壊死状態では生細胞数が少なく、細胞集団全体としての代謝が低く、物質生産する場合は生産効率が不良である。この場合、条件を改善したとしてもこれ以上の細胞集団全体としての代謝の向上は困難であることが多い。そのため、例えば、このように判定された場合は培養を停止することにより、生産性の無い培養を防止し、コストを削減することができる。
【００２４】
他方、蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw未満である場合には、細胞が生きている状態、或いは細胞集団の生存率が高い状態であると判断する（表１の（ｉ）及び（ｉｉ））。
【００２５】
第２の閾値Ｖfwは、用いられる細胞の種類により選択される。細胞がＣＨＯ細胞である場合、例えば、励起波長３５０〜３８０ｎｍ、蛍光波長４４０〜４８０ｎｍであることが好ましい。第２の閾値Ｖfwは、例えば、生細胞と死細胞との割合が既知である細胞集団の蛍光スペクトルのピーク波長を測定することにより決定することができる。
【００２６】
蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw未満である場合（表１の（ｉ）及び（ｉｉ））、遊離ＮＡＤＨ相対量から更に細胞の状態を分類することができる。即ち、例えば、遊離ＮＡＤＨ相対量が予め定められた閾値（以下、「第１の閾値Ｖfn」と称する）未満である場合、通常の生育状態と判定し（表１の（ｉ））、第１の閾値Ｖfn以上である場合、酸化的リン酸化阻害状態と判定する（表１の（ｉｉ））。
【００２７】
通常の生育状態とは、細胞の酸化的リン酸化が阻害されておらず、好気的な代謝が行われている状態をいう。例えば、物質生産を行う細胞を用いた場合は、物質生産が効率的に行われている状態をいう。したがって、このように判定された場合、判定時点での培養条件が好適であることを意味するため、例えば、その培養条件を維持すればよい。
【００２８】
酸化的リン酸化阻害状態とは、細胞周辺の環境が嫌気的状態となり細胞が乳酸発酵を行っている状態のことをいう。この状態では、細胞の代謝（例えば、物質生産の効率）が落ちている可能性が高い。例えば、酸化的リン酸化阻害状態と判断された場合は、培養容器内又は培地内の酸素濃度が低下している可能性が高いため、酸素をより多く供給することで、細胞の好気的な代謝を回復させることが可能である。
【００２９】
第１の閾値Ｖfnは、用いられる細胞の種類により選択される。細胞がＣＨＯ細胞である場合、例えば、０．２〜０．３であることが好ましい。第１の閾値Ｖfnは、例えば、酸化的リン酸化阻害状態又は酸化的リン酸化が阻害されていない状態であることが既知である細胞の遊離ＮＡＤＨ相対値を測定することにより決定することができる。細胞にアンチノマイシンＡのような酸化的リン酸化経路を阻害する薬剤を加えて酸化的リン酸化阻害状態としての遊離ＮＡＤＨ相対値を測定することも可能である。
【００３０】
更なる実施形態においては、遊離ＮＡＤＨ相対量及び蛍光スペクトルのピーク波長の変化量を測定値として用いてもよい。変化量とは、例えば培養を開始したとき又は通常の生育状態と判定されたときのこれらの測定値からの変化量である。その場合、第１の閾値Ｖfn及び第２の閾値Ｖfwは、変化量の閾値である。
【００３１】
実施形態の細胞状態判定方法に従う細胞状態の判定のタイミングは、細胞がＣＨＯ細胞である場合は、例えば、培養開始当日から、１日あたり１〜２回判定を行うことが好ましい。或いは、後述する自動的に細胞状態を測定する装置を用いる場合は培養開始から１分〜１時間ごとに判定を行うことも可能である。。このようなタイミングで判定を行うことにより、細胞の状態変化に迅速に対応し、細胞の代謝状態を良好に維持することが可能である。
【００３２】
以上に説明した細胞状態判定方法によれば、蛍光スペクトルのピーク波長及び蛍光寿命（遊離ＮＡＤＨ相対量）の測定により、細胞の状態を３つの状態、即ち、生育状態か、酸化的リン酸化阻害状態か、又は壊死状態かに正確に分類することが可能である。
【００３３】
例えば、通常の生育状態と判定された場合はそれまでの培養条件を維持し、酸化的リン酸化阻害状態と判定された場合は酸素供給量を増やすことにより、細胞がより長い時間、通常の生育状態（例えば、細胞が物質生産を活発に行う状態）となるように維持することができる。それによって、例えば、物質生産を行う細胞である場合、酸化的リン酸化阻害状態に起因する物質生産効率の低下が防止され、物質生産の効率が向上する。また、実施形態の方法によれば通常の生育状態と酸化的リン酸化阻害状態とを分類できることから、酸化的リン酸化阻害状態と判定されたときにのみ酸素供給量を増加させればよいため、通常の生育状態のときに酸素を過剰に供給してしまうことが防止される。それにより過剰な酸素による不利な効果を抑制することが可能である。加えて、細胞が壊死したことも判定可能であるため、その場合に培養を停止することで、生産性の無い培養を防止しコストを削減することができる。
【００３４】
細胞状態判定方法は、例えば、細胞の培養を伴う種々のプロセスにおいて用いることができる。細胞による物質生産やその他のバイオプロセスにおいては、特に有用である。
【００３５】
・細胞状態判定装置
以下において、本実施形態で説明した細胞状態判定方法を実施する細胞状態判定装置及び当該細胞状態判定装置を備える制御装置を説明する。
【００３６】
本実施形態の細胞状態判定装置は、細胞集団の蛍光寿命と蛍光スペクトルとに基づいて細胞の生死と代謝の状態を判定する。制御装置は、細胞状態判定装置による判定結果に基づいて、制御パラメータ（細胞集団の培養条件）を変更する。
【００３７】
図４は、本実施形態に係る細胞状態判定装置１及び当該細胞状態判定装置１を備える制御装置２の例を示すブロック図である。
【００３８】
この図４において、細胞状態判定装置１は、ＣＨＯ細胞の代謝状態を判定するが、ＣＨＯ細胞ではない他の細胞の状態判定に用いられてもよい。
【００３９】
制御装置２は、培養装置３、蛍光寿命測定装置４、蛍光スペクトル測定装置５、測定装置６、細胞状態判定装置１、培養制御装置７を備える。また、細胞状態判定装置１は、表示部１ａ、送信部１ｂ、記憶部１ｃ、処理部１ｄを備える。
【００４０】
培養装置３は、例えば図５に示すような細胞及び培地を収容する培養槽１１を備える細胞を培養するための装置である。培養装置３は、更に、培養槽１１内に設けられた撹拌翼１２、培養槽１１内に酸素等の通気を行うスパージャー１３、培養槽１１内の条件を測定するセンサ１４（例えば、温度センサ、ｐＨセンサ及び溶存酸素センサ等）、培養槽１１に試薬（例えば、消泡剤、ｐＨ調整剤等）を添加する試薬ポッド１５、培養槽１１から細胞をサンプリングするサンプリング口１６等を備える。
【００４１】
なお、センサ１４は、測定装置６の一例としてもよい。
【００４２】
蛍光寿命測定装置４は、培養装置３で培養されている細胞集団のＮＡＤＨに由来する自家蛍光に関する蛍光寿命を測定し、蛍光寿命の測定値を含む寿命測定データＤ１を細胞状態判定装置１の記憶部１ｃに記憶させる。
【００４３】
本実施形態において、寿命測定データＤ１は、ショートレンジの蛍光寿命の測定値、ミドルレンジの蛍光寿命の測定値、ロングレンジの蛍光寿命の測定値を含むとする。
【００４４】
蛍光スペクトル測定装置５は、培養装置３で培養されている細胞集団の自家蛍光の蛍光スペクトルを測定し、蛍光スペクトルの測定値を含むスペクトルデータＤ２を細胞状態判定装置１の記憶部１ｃに記憶させる。
【００４５】
測定装置６は、培養装置３の各種の状態を測定し、制御パラメータ変更に用いられる測定値を含む測定データＤ３を細胞状態判定装置１の記憶部１ｃに記憶させる。
【００４６】
細胞状態判定装置１における表示部１ａは、処理部１ｄによる処理結果を表示する。
【００４７】
送信部１ｂは、処理部１ｄによる処理結果に応じて、各種の命令を培養制御装置７に送信する。
【００４８】
記憶部１ｃは、少なくとも、寿命測定データＤ１、スペクトルデータＤ２、第１の閾値Ｖfn、第２の閾値Ｖfw、測定データＤ３、パラメータ変更データＤ４、プログラムＰを記憶する。
【００４９】
寿命測定データＤ１及びスペクトルデータＤ２は、上述のように、それぞれ、蛍光寿命測定装置４によって測定された蛍光寿命の測定値を含むデータ及び蛍光スペクトル測定装置５によって測定された蛍光スペクトルの測定値を含むデータである。
【００５０】
第１の閾値Ｖfnは、遊離ＮＡＤＨ相対量の判定に用いられる閾値である。
【００５１】
第２の閾値Ｖfwは、蛍光波長の判定に用いられる閾値である。
【００５２】
第１の閾値Ｖfn及び第２の閾値Ｖfwは、例えば、予め実験値から決定される。
【００５３】
測定データＤ３は、上記のように、制御パラメータ変更に用いられる測定値を含む。
【００５４】
パラメータ変更データＤ４は、培養制御装置７で用いられる制御パラメータの変更が必要な場合に、新規の制御パラメータの決定に用いられるデータであり、例えば、パラメータ変更の規則を示す。パラメータ変更データＤ４は、例えば、寿命測定データＤ１、スペクトルデータＤ２、後で説明する遊離ＮＡＤＨ相対量、測定データＤ３などのうちの少なくとも１つから新規の制御パラメータを決定するための演算式、テーブル、回帰モデル、アルゴリズムなどでもよい。パラメータ変更データＤ４は、プログラムＰに含まれていてもよい。
【００５５】
制御パラメータは、例えば、通気量、酸素濃度、攪拌速度などの少なくとも１つを含む。
【００５６】
プログラムＰは、処理部１ｄによって実行されると、処理部１ｄを、相対量算出部８、判定部９、変更部１０として機能させる。なお、処理部１ｄによって実現される各種の機能・処理は、例えば、電子回路などのハードウェアによって実現されてもよい。
【００５７】
処理部１ｄは、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）などのようなプロセッサである。
【００５８】
相対量算出部８は、記憶部１ｃに記憶されている寿命測定データＤ１に基づいて、遊離ＮＡＤＨ相対量を算出する。遊離ＮＡＤＨ相対量は、遊離ＮＡＤＨが示すショートレンジの寿命の割合であり、例えば、（ショートレンジの蛍光寿命／全レンジの蛍光寿命）から求められる。なお、相対量算出部８によって算出された遊離ＮＡＤＨ相対量は、記憶部１ｃに記憶され、処理部１ｄによる各種処理で用いられてもよい。
【００５９】
判定部９は、相対量算出部８によって算出された遊離ＮＡＤＨ相対量、記憶部１ｃに記憶されているスペクトルデータＤ２、第１の閾値Ｖfn、第２の閾値Ｖfwに基づいて、ＣＨＯ細胞の生死と代謝の状態を判定する。
【００６０】
より具体的には、判定部９は、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn以上であるかを判定するとともに、スペクトルデータＤ２の示す蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw以上であるかを判定する。
【００６１】
判定部９は、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn未満であり蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw未満である場合に、現在使用されているパラメータ値を維持する。
【００６２】
判定部９は、遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn以上であり蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw未満である場合に、変更部１０に、制御パラメータの変更処理を実行させる。
【００６３】
判定部９は、蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw以上である場合、送信部１ｂ経由で培養制御装置７へ培養停止命令を送信する。
【００６４】
変更部１０は、判定部９によって制御パラメータを変更すべきと判定された場合に、記憶部１ｃに記憶されている寿命測定データＤ１、スペクトルデータＤ２、相対量算出部８によって算出された遊離ＮＡＤＨ相対量、記憶部１ｃに記憶されている測定データＤ３などのうちの少なくとも１つ、及び、記憶部１ｃに記憶されているパラメータ変更データＤ４に基づいて、新規の制御パラメータを決定し、制御パラメータの変更命令と、新規の制御パラメータとを、送信部１ｂ経由で培養制御装置７へ送信する。なお、変更部１０によって決定された新規の制御パラメータは、例えば、記憶部１ｃに記憶され、次に制御パラメータを変更する場合の処理に利用されてもよい。
【００６５】
培養制御装置７は、細胞状態判定装置１から受信した命令に応じて、培養装置３を制御する。
【００６６】
具体的には、培養制御装置７は、例えば、細胞状態判定装置１から受信した制御パラメータに基づいて、培養装置３を制御する。例えば、培養制御装置７は、培養装置３の撹拌翼の駆動、スパージャーからの通気、各センサでの条件の測定、温度調節、試薬ポッドからの試薬の添加などを制御する。
【００６７】
培養制御装置７は、例えば、細胞状態判定装置１から培養停止命令を受信した場合に、培養装置３による細胞の培養を停止する。
【００６８】
培養制御装置７は、例えば、細胞状態判定装置１から制御パラメータの変更命令と新規の制御パラメータとを受信した場合に、新規の制御パラメータに基づいて、培養装置３を制御する。
【００６９】
図６は、本実施形態に係る制御装置２で実行される制御の例を示すフローチャートである。
【００７０】
ステップＳ１１において、培養制御装置７は、培養装置３を制御パラメータに基づいて制御する。培養装置３は、ＣＨＯ細胞の培養を行う。
【００７１】
ステップＳ１２ａにおいて、蛍光寿命測定装置４は、培養装置３におけるＣＨＯ細胞の蛍光寿命を測定し、寿命測定データＤ１を細胞状態判定装置１の記憶部１ｃに記憶させる。
【００７２】
ステップＳ１２ｂにおいて、細胞状態判定装置１の処理部１ｄ（具体的には、相対量算出部８）は、記憶部１ｃに記憶されている寿命測定データＤ１に基づいて、遊離ＮＡＤＨ相対量を算出する。
【００７３】
ステップＳ１２ｃにおいて、蛍光スペクトル測定装置５は、培養装置３におけるＣＨＯ細胞の蛍光スペクトルを測定し、スペクトルデータＤ２を細胞状態判定装置１の記憶部１ｃに記憶させる。
【００７４】
ステップＳ１３において、判定部９は、遊離ＮＡＤＨ相対量と第１の閾値Ｖfnとを比較するとともに、記憶部１ｃに記憶されているスペクトルデータＤ２で示される蛍光スペクトルのピーク波長と第２の閾値Ｖfwとを比較し、細胞の状態を判定する。
【００７５】
遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn未満であり、蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw未満である場合、処理は、ステップＳ１１に戻る。
【００７６】
蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfwである場合、ステップＳ１４において、判定部９は、送信部１ｂ経由で培養制御装置７へ培養停止命令を送信し、培養制御装置７は、培養装置３を停止する。
【００７７】
遊離ＮＡＤＨ相対量が第１の閾値Ｖfn以上であり、蛍光スペクトルのピーク波長が第２の閾値Ｖfw未満である場合、ステップＳ１５において、変更部１０は、記憶部１ｃに記憶されている寿命測定データＤ１、スペクトルデータＤ２、相対量算出部８によって算出された遊離ＮＡＤＨ相対量、測定データＤ３などのうちの少なくとも１つ、及び、パラメータ変更データＤ４に基づいて、新規の制御パラメータを決定し、制御パラメータの変更命令と、新規の制御パラメータとを、送信部１ｂ経由で培養制御装置７へ送信する。その後、処理はステップＳ１１に戻り、培養制御装置７は、新規の制御パラメータに基づいて培養装置３を制御する。
【００７８】
本実施形態に係る細胞状態判定装置１による判定は、例えば上記表１のように行われる。
【００７９】
即ち、遊離ＮＡＤＨ相対量＜第１の閾値Ｖfnであり、蛍光スペクトルのピーク波長＜第２の閾値Ｖfwである場合、培養されている細胞は、通常の生育状態（Normal growth）であると判定される。
【００８０】
遊離ＮＡＤＨ相対量≧第１の閾値Ｖfnであり、蛍光スペクトルのピーク波長＜第２の閾値Ｖfwである場合、酸化的リン酸化阻害（酸素呼吸阻害）状態（Respiration inhibited）であると判定される。
【００８１】
蛍光スペクトルのピーク波長≧第２の閾値Ｖfwである場合（遊離ＮＡＤＨ相対量の状態に関しては、遊離ＮＡＤＨ相対量＜第１の閾値Ｖfnでもよく、遊離ＮＡＤＨ相対量≧第１の閾値Ｖfnでもよい）、壊死状態（Necrosis）であると判定される。
【００８２】
例えば、実験値などから得られる通常の生育状態に相当する範囲の境界値（上限値）などに基づいて、第１の閾値Ｖfn及び第２の閾値Ｖfwが予め決定される。
【００８３】
以上説明した本実施形態に係る細胞状態判定装置１及び制御装置２を用いることにより、先で説明した細胞状態判定方法を実現することができ、ＣＨＯ細胞の蛍光寿命と蛍光スペクトルとに基づいて細胞の生死と代謝の状態を判定することができ、判定結果に基づいて培養装置３を適切に制御することができる。
【００８４】
より具体的に説明すると、細胞状態判定装置培養中のＣＨＯ細胞が正常の生育状態か、酸化的リン酸化阻害状態か、又は壊死したかを自動的に判定し、それぞれの判定結果に合わせて培養装置３の条件を適切に制御して、細胞が通常の生育状態（例えば、細胞が物質生産を活発に行う状態）となるように維持することができる。それによって、例えば、より効率的な細胞による物質生産の自動化が可能である。
【００８５】
［例］
以下、実施形態の細胞状態判定方法を実施した例について記載する。
【００８６】
実験方法
２５０ｍＬの三角フラスコ中、３０ｍＬのｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅで、３７℃、５％ＣＯ２で、４日間及び１５日間、ハーセプチン産生ＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養した。培地は、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標） ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）及び６ｍＬのグルタミンを混合したものを用いた。
【００８７】
（４日培養した培養液）
４日培養した培養液から一部サンプリングし、トリパンブルーで染色し、セルカウンターＴＣ−２０（バイオ・ラッドラボラトリーズ製）で総細胞数と染色細胞数を計数し、生存率を測定した。
【００８８】
また、更に一部サンプリングし、２００ｇ×３ｍｉｎで遠心した後、沈殿した細胞をＰＢＳで懸濁し、蛍光分光光度計ＦＰ−８５００（日本分光製）で蛍光スペクトル（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ：ＥＥＭ）を測定した。測定範囲は、励起が３００ｎｍ〜４５０ｎｍ、蛍光が３５０ｎｍ〜７５０ｎｍとした。
【００８９】
残りの培養液を８ｍＬずつ１２５ｍＬの三角フラスコ３本に分注し、それぞれに終濃度０μＭ、５μＭ、１０μＭとなるようにアンチノマイシンＡを添加し、酸素呼吸鎖による酸化的リン酸化の代謝経路を阻害した。その後、上記と同じ条件で約４時間インキュベートした。
【００９０】
インキュベート後、それぞれのフラスコから一部サンプリングし、上記と同様の方法で生存率とＥＥＭとを測定した。
【００９１】
残りの培養液は２００ｇ×３ｍｉｎで遠心した後、沈殿を５００μＬのＰＢＳに懸濁し、蛍光寿命測定装置Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ-Ｔａｕ（浜松ホトニクス製）を用いて蛍光寿命を測定した。測定波長は、ＥＥＭでピークを示した波長（励起３４０ｎｍ、蛍光４４０ｎｍ）とした。
【００９２】
（１５日培養した培養液）
１５日間培養した培養液は、アンチノマイシン処理せずに、上記と同様の方法でＥＥＭと蛍光寿命とを測定した。なお、蛍光寿命の測定波長はＥＥＭでピークを示した波長（励起３６５ｎｍ、蛍光４７０ｎｍ）とした。
【００９３】
実験結果
ＥＥＭの結果を図７に示す。各グラフの縦軸（Ｅｘ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ）は励起光波長を示し、横軸（Ｅｍ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ）は蛍光波長を示す。また、括弧内に生存率を示す。
【００９４】
４日培養のアンチノマイシンＡの処理前の生存率は９７％、ＥＥＭのピーク波長は励起３４０ｎｍ付近、蛍光４４０ｎｍ付近であった。アンチノマイシンＡの処理を行った場合でも生存率及びＥＥＭピーク波長に大きな変化はなかった。しかしながら１５日培養後は、生存率が３７％と大きく低下し、ＥＥＭピーク波長も励起３６５ｎｍ付近、蛍光４７０ｎｍ付近と大きく変化した。この結果から、ＥＥＭのピーク波長から細胞の生存率（死細胞の増加）を判定することが可能であることが示された。
【００９５】
蛍光寿命の測定結果を図８に示す。グラフの縦軸は、全レンジの蛍光寿命に対するショートレンジの蛍光寿命の相対量を示す。ショートレンジの蛍光寿命の相対量は、遊離ＮＡＤＨ相対量を示す。また、括弧内に生存率を示す。
【００９６】
４日培養において、遊離ＮＡＤＨ相対量は、アンチノマイシンＡの濃度が高くなるにつれて（すなわち、酸化的リン酸化代謝経路の阻害度が高くなるにつれて）高くなった。この結果から、蛍光寿命により、細胞の代謝状態を判定することが可能であることが示された。即ち、ショートレンジの蛍光寿命の相対量が高いほど、酸化的リン酸化代謝経路の阻害度が高いと判定することができる。一方１５日培養では０．２７程度であることから、蛍光寿命は生存率には相関が無いことが示された。
【符号の説明】
【００９７】
１…細胞状態判定装置
３…培養装置
４…蛍光寿命測定装置
５…蛍光スペクトル測定装置
８…相対量算出部
９…判定部
１０…変更部
１１…培養槽
Ｄ１…寿命測定データ（第１の測定値）
Ｄ２…スペクトルデータ（第２の測定値）
Ｄ３…測定データ（第３の測定値）
Ｄ４…パラメータ変更データ
Ｖｆｎ…第１の閾値
Ｖｆｗ…第２の閾値
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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