(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な融合ポリペプチドを提供する。【解決手段】天然のＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン配列と転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインの融合物を含むポリペプチド。また天然のＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに特異的に結合する因子を同定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）ＴＮＦＲ２に結合でき、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のＴＲＡＦ１に結合することができ、配列番号１の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号４のＴＲＡＦ２に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号４のＴＲＡＦ２に結合することができ、配列番号１の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｇ）配列番号２のＴＲＡＦ１に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｈ）ＣＤ４０に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉ）配列番号２のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｊ）配列番号２のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｋ）配列番号４のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ｂ）のポリペプチドから誘導され、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｌ）配列番号４のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ｂ）のポリペプチドから誘導され、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｍ）配列番号４のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ｂ）のポリペプチドから誘導され、ＴＮＦＲ２に結合できるポリペプチド；
（ｎ）配列番号４のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ｂ）のポリペプチドから誘導され、ＣＤ４０に結合できるポリペプチド；
（ｏ）配列番号２の残基１８０−４０９のＴＲＡＦドメインに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｐ）配列番号２の残基１８０−４０９のＴＲＡＦドメインに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｑ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｒ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｓ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＮＦＲ２に結合できるポリペプチド；
（ｔ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤ４０に結合できるポリペプチド；
よりなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ハツカネズミＴＲＡＦ配列である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
天然のヒトＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに結合できる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
天然のヒトＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに特異的に結合できる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
天然である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ホモダイマー形である請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドとのヘテロダイマー形である請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＴＲＡＦ１（配列番号２）またはＴＲＡＦ２（配列番号４）である請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４のアミノ酸２７２−５０１と少なくとも約５０％の配列同一性を有するドメインを含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号４のアミノ酸２７２−５０１をコードするヌクレオチド配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸分子によりコードされる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
（１）配列番号１にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列またはその相補物；
（２）配列番号３にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列またはその相補物；または
（３）請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列；
よりなる群から選択される核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１２】
ベクターで形質転換された宿主細胞により認識される調節配列に作動可能に結合した請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子または該分子を含むベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドと天然のＴＮＦ−Ｒ２との相互作用を破壊させることができる抗体。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体を製造するハイブリドーマセルライン。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を用いる方法であって、その方法は宿主細胞により認識される調節配列に作動可能に結合したそのような核酸を含むベクターで形質転換された培養された宿主細胞中でそのような核酸を発現させ、宿主細胞から該核酸分子によりコードされたポリペプチドを回収する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞のＤＮＡ中に転写修飾因子を核酸分子に対し十分な近接と配向で挿入し、その転写に影響させる方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリペプチドの存在を測定する方法であって、そのようなポリヌクレオチドをコードするＤＮＡを試験サンプル核酸とハイブリダイズさせ、ポリペプチドをコードする核酸の存在を決定する方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドの転写アクチベーターの活性化ドメインへの融合物をコードする単離された核酸分子。
【請求項２１】
転写アクチベーターが酵母ＧＡＬ４である請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２３】
核酸試験サンプルを増幅する方法であって、天然のＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと結合できる請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸で核酸ポリメラーゼ反応をプライムすることを含む方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を検出する方法であって、該核酸配列の少なくとも部分に特異的に結合する検出可能なマーカーとその核酸配列を接触させ、結合したマーカーを検出する方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドと天然のＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの複合体を破壊させることができる分子を同定する方法であって、天然のＴＮＦ−Ｒ２、天然のＴＲＡＦポリペプチドおよびリポーター遺伝子を候補分子と接触させ、リポーター遺伝子によりコードされた分子を検出することによりＴＲＡＦおよびＴＮＦ−Ｒ２細胞内ドメイン配列の結合を破壊させる候補分子の能力をモニターすることを含む方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドと天然のＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの複合体を破壊させることができる分子を同定する方法であって、１．天然のＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの転写アクチベーターの活性化ドメインへの融合体、２．ポリペプチドの転写アクチベーターの活性化ドメインへの融合体、および３．リポーター遺伝子を発現する細胞を候補分子と接触させ、該ポリペプチドおよびＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの結合を破壊させる該候補分子の能力をリポーター遺伝子によりコードされる分子を検出することによってモニターすることを含む方法。
【請求項２７】
ＣＤ４０に結合できるポリペプチドおよびＣＤ４０の相互作用の阻害剤を同定する方法であって、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＴＮＦＲ２に結合でき、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号４のＴＲＡＦ２に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のＴＲＡＦ１に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｇ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｈ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、ＴＮＦＲ２へ結合できるポリペプチド；
（ｉ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；
（ｊ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｋ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｌ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＮＦＲ２に結合できるポリペプチド；
（ｍ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
よりなる群から選択され、その方法は、
ＣＤ４０およびポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞におけるＣＤ４０：ポリペプチド相互作用にその発現が依存する、リポーター遺伝子の発現を阻害する分子を選択する工程を含む方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが配列番号４のＴＲＡＦ２である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組換え宿主細胞が、配列番号２のＴＲＡＦ１および配列番号４のＴＲＡＦ２を共発現する請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
リポーター遺伝子がＮＦ−κＢ依存性である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＮＦ−κＢ依存性のリポーター遺伝子がＥ−セレクチンルシフェラーゼリポーター遺伝子構築物である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ツーハイブリッドフォーマットで行われる請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ＬＭＰに結合できるポリペプチドとＬＭＰ１の相互作用の阻害剤を同定する方法であって、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＴＮＦＲ２に結合でき、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号４のＴＲＡＦ２に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２のＴＲＡＦ１に結合することができ、配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｇ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｈ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、ＴＮＦＲ２へ結合できるポリペプチド；
（ｉ）配列番号４の１または数個のいずれかのアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；
（ｊ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２のＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｋ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４のＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｌ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＮＦＲ２に結合できるポリペプチド；
（ｍ）配列番号４の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤ４０と結合できるポリペプチド；
よりなる群から選択され、該方法はリポーター遺伝子の発現を阻害する分子を選択する工程を含んでなり、該発現はＬＭＰ１およびポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞におけるＬＭＰ１：ポリペプチド相互作用に依存する方法。
【請求項３４】
ＴＲＡＦタンパク質が配列番号４のＴＲＡＦ２である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該組換え宿主細胞が配列番号２のＴＲＡＦ１と配列番号４のＴＲＡＦ２を共発現する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
レポーター遺伝子がＮＦ−κＢ依存性である請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ＮＦ−κＢ依存性レポーター遺伝子がＥ−セレクチンルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ツーハイブリッドフォーマットで行われる請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号４の残基８７−５０１（ＴＲＡＦ２（８７−５０１）またはＣＤ４０若しくはＴＮＦＲ２媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害できるその誘導体を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なポリペプチド因子に関するものである。より詳細には、本発明は腫瘍壊死因子レセプター２型（ＴＮＦ−Ｒ２）に関連する因子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ。ＴＮＦ−αとも称される）は、主として活性化マクロファージおよび少数の他の細胞型によって産生される強力なサイトカインである。ＴＮＦにより導かれる多数の生物学的効果には、移植された腫瘍の出血性壊死、細胞毒性、エンドトキシンショックにおける役割、炎症、免疫調節、増殖性および抗ウイルス反応が包含される［非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４］。文献には、ＴＮＦおよびＩＬ−１のようなその他のサイトカインが、放射線療法の最中にもたらされる電離照射の有害な作用、例えば酵素の変性、脂質の過酸化物化、およびＤＮＡ損傷から防護し得ることが報告されている［非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；特許文献１；非特許文献８］。活性化されたリンパ球により産生される関連分子リンホトキシン（ＬＴ、ＴＮＦ−βとも称される）は、ＴＮＦと類似ではあるが同一ではない生物活性スペクトルを示す（例えば非特許文献１および非特許文献４を参照されたい）。ＴＮＦは非特許文献９に、ＬＴは非特許文献１０に記載された。
【０００３】
ＴＮＦまたはＬＴにより仲介される様々な細胞応答の誘導の第一段階は、特異的細胞表面レセプターへのそれらの結合である。およそ５５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ１）および７５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ２）である二つの明瞭なＴＮＦレセプターが同定され［非特許文献１１；非特許文献１２］、そして、両方のレセプター型に対応するヒトおよびマウスｃＤＮＡが分離および特性決定されている［非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７］。両方のＴＮＦ−Ｒは、細胞外、貫膜、および細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的構造を共有している。両レセプターの細胞外部分は、可溶性ＴＮＦ結合蛋白としても天然に見いだされている［非特許文献１８；および非特許文献１９］。ヒトＴＮＦ−Ｒ１のアミノ酸配列およびその基礎となるヌクレオチド配列は特許文献２に開示されており、一方特許文献３はヒトＴＮＦ−Ｒ２のアミノ酸およびヌクレオチド配列を開示している。
まだ系統的に研究されてはいないが、大多数の細胞型および組織は両方のＴＮＦレセプターを発現するように見える。
【０００４】
ＴＮＦ−Ｒ１またはＴＮＦ−Ｒ２のいずれかに対し特異的なポリおよびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって行われた研究が、これらのレセプターの機能および相互作用への非常に貴重な洞察を提供してはいるが、細胞のシグナル伝達におけるこの二つのＴＮＦレセプターの個別的役割、とりわけＴＮＦ−Ｒ２の役割は、十分理解されているには程遠い。
【０００５】
ＴＮＦ−Ｒ１に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はいずれもこのレセプターのための特異的アゴニストとして働き、細胞毒性、線維芽細胞増殖、クラミジアに対する耐性、およびプロスタグランジンＥ２の合成といった幾つかのＴＮＦ活性を表すことが観察されている［非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２］。
【０００６】
さらに、マウスＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２の両者に対するポリクローナル抗体が開発され、特異的レセプターアゴニストとして挙動し且つマウスＴＮＦ活性のサブセットを誘導する事が示された。マウスＴＮＦ−Ｒ１は細胞毒性のシグナル伝達および幾つかの遺伝子の誘導を司ることが示され、一方、マウスＴＮＦ−Ｒ２は、一次胸腺細胞および細胞毒性ＴセルラインＣＴ６の増殖をシグナル伝達できることが示された［非特許文献２３］。ＴＮＦ−Ｒ２がヒト胸腺細胞の増殖を刺激する能力が、ヒトレセプターに対して作製されたモノクローナル抗体を用いた実験で証明された。
【０００７】
ＴＮＦ−Ｒ１へのＴＮＦの結合を遮断しＴＮＦ作用の幾つかに拮抗するヒトＴＮＦ−Ｒ１に対するモノクローナル抗体もまた記載されている［非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２４］。
【０００８】
加えて、幾つかの報告は、ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストにより誘導される同じＴＮＦ応答（例えば細胞毒性およびＮＦ−κＢの活性化）に部分的に拮抗できる、ＴＮＦ−Ｒ２に対して作製されたモノクローナル抗体を記載した［非特許文献２２；非特許文献２４；および非特許文献２５］。
【０００９】
二つのヒトＴＮＦレセプターは共にシグナル伝達において活性であるが、これらは別個の細胞応答を仲介できることが現在でははっきりと確立されている。ＴＮＦ−Ｒ１は殆どのＴＮＦ応答のシグナル伝達を司っているように見えるが、ＴＮＦの胸腺細胞増殖刺激活性は、ＴＮＦ−Ｒ２によって特異的に仲介される。さらに、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２はいずれも転写因子ＮＦ−κＢのＴＮＦによる活性化を独立して仲介していることが示されている［非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９］。ＮＦ−κＢは、種々の重要な細胞およびウイルス遺伝子の発現を調節する、転写アクティベーターのＲｅｌファミリーの一員である［非特許文献２６ならびに非特許文献３０］。ＴＮＦ−Ｒ２はさらに、ＣＴ６細胞において顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子［非特許文献３１；非特許文献３２］およびＡ２０亜鉛フィンガー蛋白遺伝子［非特許文献３３］の転写誘導を仲介し、そして、細胞毒性のような主としてＴＮＦ−Ｒ１により仲介される応答のシグナル伝達においてＴＮＦ−Ｒ１に対するアクセサリー成分として参加する［非特許文献３４］。
【特許文献１】米国特許第４８６１５８７号
【特許文献２】ＥＰ４１７５６３（１９９１年３月２０日公開）
【特許文献３】ＥＰ４１８０１４（１９９１年３月２０日公開）
【非特許文献１】D.V.ゲッデル等、Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology、５１巻５９７−６０９頁（１９８６）
【非特許文献２】B.ビュートラーおよびA.セラミ、Ann.Rev.Biochem.、５７巻５０５−５１８頁（１９８８）
【非特許文献３】L.J.オールド、Sci.Am.、２５８（５）巻５９−７５頁（１９８８）
【非特許文献４】W.フィアス、FEBS Lett.、２８５（２）巻１９９−２１２頁（１９９１）
【非特許文献５】ネータ等、J.Immunol.、１３６（７）巻２４８３頁（１９８７）
【非特許文献６】ネータ等、Fed.Proc.、４６巻１２００頁（抄録）（１９８７）
【非特許文献７】アーバシェク等、Lymphokine Res.、６巻１７９頁（１９８７）
【非特許文献８】ネータ等、J.Immunol.、１４０巻１０８頁（１９８８）
【非特許文献９】ペニカ等、Nature、３１２巻７２１頁（１９８４）
【非特許文献１０】グレイ等、Nature、３１２巻７２４頁（１９８４）
【非特許文献１１】H.P.ホフマン等、J.Biol.Chem.、２６４巻１４９２７−１４９３４頁（１９８９）
【非特許文献１２】M.ブロックハウス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８７巻３１２７−３１３１頁（１９９０）
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【非特許文献１４】T.J.シャル等、Cell、６１巻３６１頁（１９９０）
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【非特許文献２１】T.エスペヴィック等、J.Exp.Med.、１７１巻４１５−４２６頁（１９９０）
【非特許文献２２】M.R.シャラビー等、J.Exp.Med.、１７２巻１５１７−１５２０頁（１９９０）
【非特許文献２３】Ｌ．Ａ．タータグリア等、Proｃ.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻９２９２−９２９６頁（１９９１）
【非特許文献２４】B.ナウメ等、J.Immunol.、１４６巻３０３５−３０４８頁（１９９１）
【非特許文献２５】H.P.ホフマン等、J.Biol.Chem.、２６５巻２２４０９−２２４１７頁（１９９０）
【非特許文献２６】レナードおよびバルティモア、Cell、５８巻２２７−２２９頁（１９８９）
【非特許文献２７】A.ラグレイド等、J.Biol.Chem.、２６９巻７７８５−７７９１頁（１９９４）
【非特許文献２８】ロス等、Cell、７８巻６８１−６９２頁（１９９４）
【非特許文献２９】ウィーグマン等、J.Biol.Chem.、２６７巻１７９９７−１８００１頁（１９９２）
【非特許文献３０】タノスおよびマニアティス、Cell、８０巻５２９−５３２頁（１９９５）
【非特許文献３１】ミヤタケ等、EMBO J．、４巻２５６１−２５６８頁（１９８５）
【非特許文献３２】スタンレイ等、EMBO J．、４巻２５６９−２５７３頁（１９８５）
【非特許文献３３】オピパリ等、J.Biol.Chem.、２６５巻１４７０５−１４７０８頁（１９９０）
【非特許文献３４】L.A.タータグリアおよびD.V.ゲッデル、Immunol.Today、１３巻１５１−１５３頁（１９９２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＴＮＦ自身、ＴＮＦレセプターおよび二つのレセプターにより仲介されるＴＮＦ活性は広範に研究されてきたが、レセプター後のシグナル伝達機構はわかっていない［R.ベイアートおよびW.フィアス、「腫瘍壊死因子の誘導する細胞毒性の分子機構：理解されていることおよび理解されていないこと」、FEBS Letters、３４０巻９−１６頁（１９９４）による総説を参照されたい］。この事は特に、ＴＮＦレセプターシグナル伝達カスケードの最初の工程、即ち、膜結合したレセプターがいかにしてリガンドＴＮＦによる活性化後の細胞内にシグナルを送り込むのかという問題に関して真実である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに関係するポリペプチド因子が存在し、ＴＮＦ−Ｒ２シグナル伝達カスケードに参加しているという仮説に基づいている。より詳細には、本発明は、ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに関係できＴＮＦ生物活性の細胞内レセプター後シグナル伝達に参加する、天然ポリペプチド因子の同定および分離を目的とする研究に基づいている。
【００１２】
ＴＮＦにより誘導されるマウスＣＴ６細胞の増殖はＴＮＦ−Ｒ２によって仲介されるということが知られている［タータグリア等（１９９１）、上記］。ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに関係する因子を同定するため、このレセプターを、［３５Ｓ］標識しトランスフェクトさせたＣＴ６細胞の溶菌液および標識していないトランスフェクトさせたヒト胚腎臓２９３細胞から免疫沈降させ、次いでこれらを、トランスフェクトさせていないＣＴ６細胞由来の標識した溶菌液と共にインキュベートした。見掛けの分子量が約４５ないし５０−５６ｋＤである幾つかのポリペプチドおよびおよその分子量が６８ｋＤである一つのポリペプチドが、免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と共に特異的に共同沈降した。以後、これらを腫瘍壊死因子レセプター関連ポリペプチド、またはＴＲＡＦと総称する。同定された因子のうち、これまでに二つが精製およびクローニングされている。これら二つの因子を腫瘍壊死因子レセプター関連因子１および２（ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２；配列番号２および４）と称する。ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のアミノ酸配列の比較により、これらはＣ末端ドメインに高度のアミノ酸一致を有する（２３０アミノ酸にわたり５３％の一致）が、一方Ｎ末端ドメインは関連性がないことが明らかとなった。これらの新たな因子は、ＴＮＦのレセプター後シグナル伝達で重要な役割を演じていると信じられる。ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインは他のいかなる既知のレセプターまたは蛋白に対しても配列相同性を表さないことから、これらのシグナル伝達分子は、その理解がＴＮＦの治療学的価値を改善するための新たな手段の開発に大きく貢献することのできる、新規なシグナル伝達機構を表しているかも知れない。
【００１３】
一つの態様において本発明は、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと特異的に関係することのできる、新規な因子（ＴＲＡＦ）のファミリーに関するものである。本発明は特に、任意のヒトまたはヒト以外の動物種由来の天然因子およびそれらの機能的誘導体を包含する、腫瘍壊死因子レセプター関連因子１および２（ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２、配列番号２および４）に関するものである。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＴＲＡＦポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む分離された核酸分子に関するものである。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、該ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される調節配列と機能的に結合した前記核酸分子を含む発現ベクターに関するものである。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、前記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞に関するものである。
【００１７】
さらに別の態様において本発明は、ＴＮＦ−Ｒ２レセプター関連因子およびＴＮＦ−Ｒ２の相互作用を妨げる分子（ポリペプチド、例えば抗体およびＴＲＡＦ類似体およびフラグメント、ペプチドならびに小型有機分子を包含する）に関するものである。
【００１８】
本発明は特に、天然ＴＲＡＦポリペプチドに特異的に結合できる抗体、および係る抗体を産生するハイブリドーマセルラインに関するものである。
【００１９】
別の態様において本発明は、上記定義によるＴＲＡＦポリペプチドをコードしている核酸分子を使用する方法であって、ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される調節配列と機能的に結合した該核酸分子を含むベクターによって形質転換された培養宿主細胞中で係る核酸分子を発現させ、そしてコードされているポリペプチドを宿主細胞から回収することからなる方法に関するものである。
【００２０】
本発明はさらに、上記定義によるＴＲＡＦポリペプチドを生産する方法であって、転写調節要素を、転写に影響を与えるに十分な近さおよび向きで、該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞のＤＮＡ中に挿入することからなる方法に関するものである。
【００２１】
本発明はまた、ＴＲＡＦポリペプチドの存在を決定する方法であって、係るポリペプチドをコードしているＤＮＡを被験試料の核酸とハイブリダイズし、ＴＲＡＦポリペプチドＤＮＡの存在を決定することからなる方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において本発明は、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン配列および転写アクティベーターのＤＮＡ結合ドメインの融合物をコードしている分離された核酸分子に関するものである。
【００２３】
さらに別の態様において本発明は、ＴＲＡＦと転写アクティベーターの活性化ドメインとの融合物をコードしている分離された核酸分子に関するものである。
【００２４】
本発明はさらに、前記核酸によりコードされるハイブリッド（融合）ポリペプチドに関するものである。
【００２５】
本発明はまた、前記融合蛋白をコードしている核酸分子の１または両方を含むベクターを包含する。
【００２６】
別の態様において本発明は、
（ａ）リポーター遺伝子を有する単一の宿主細胞において、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン配列と転写アクティベーターのＤＮＡ結合ドメインとの融合物、および、候補因子と転写アクティベーターの活性化ドメインとの融合物を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を発現させ；そして、
（ｂ）リポーター遺伝子によりコードされている分子を検出することによって、候補因子とＴＲＡＦ−Ｒ２細胞内ドメイン配列の結合を監視する、
ことからなる、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインに特異結合できる因子を同定するための検定に関するものである。
【００２７】
さらに本発明は、
（ａ）該ＴＮＦ−Ｒ２と特異結合できるポリペプチド因子をコードしている核酸およびリポーター遺伝子をコードしている核酸によってトランスフェクトされた単一の宿主細胞において、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン配列と転写アクティベーターのＤＮＡ結合ドメインとの融合物を含むポリペプチド、および、候補ポリペプチド因子と転写アクティベーターの活性化ドメインとの融合物を含む第二のポリペプチドをコードしている核酸分子を発現させ；そして、
（ｂ）該リポーター遺伝子によりコードされているポリペプチドを検出することによって、該候補因子と該ＴＮＦ−Ｒ２または該ＴＮＦ−Ｒ２と特異結合できる該ポリペプチド因子との関係を監視する、
ことからなる、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと特異的に関係できる因子を同定するための検定に関するものである。
【００２８】
さらなる態様において本発明は、ＴＲＡＦと天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインとの関係を妨げることのできる分子を同定するための検定であって、１．天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン配列と転写アクティベーターのＤＮＡ結合ドメインとの融合物、２．天然ＴＲＡＦポリペプチドと該転写アクティベーターの活性化ドメインとの融合物、および、３．リポーター遺伝子を発現する細胞を、候補分子と接触させ、そして、リポーター遺伝子によりコードされている分子を検出することによって、該候補分子が該ＴＲＡＦおよびＴＮＦ−Ｒ２細胞内ドメイン配列の関係を妨げる能力を監視することからなる検定に関するものである。上記の検定中の細胞は、好ましくは酵母細胞である。
【００２９】
上記の「二ハイブリッド」形式に加えて、この検定は任意の常套的結合／インヒビター検定形式で実施することができる。例えば、一方の結合相手（ＴＮＦ−Ｒ２またはＴＲＡＦ）を固定し、そして、放射性標識、例えば３２Ｐのような検出可能な標識を備えた他方の結合相手と接触させ、そして、二つの相手の結合（関係）を候補インヒビターの存在下で検出する。特異的結合検定の設計は、十分に当業者の技量内にある。
【００３０】
別の態様において本発明は、上記定義のようなＴＲＡＦポリペプチドをコードしている核酸により核酸ポリメラーゼ反応を開始することからなる、核酸被験試料を増幅する方法に関するものである。
【００３１】
別の態様において本発明は、ＴＲＡＦポリペプチドの全体または一部を含むポリペプチド分子をコードしている核酸配列または関連核酸配列を検出するための方法であって、該核酸配列を、該核酸配列の少なくとも一部と特異的に結合する検出可能なマーカーと接触させ、そしてこのように結合したマーカーを検出することからなる方法に関するものである。
【００３２】
さらに別の態様において本発明は、ＴＮＦ−Ｒ２によって完全にまたは部分的に仲介されるＴＮＦ生物活性に関連する病理学的状態を処置する方法であって、必要な患者に、治療的有効量のＴＲＡＦ、またはＴＲＡＦおよびＴＮＦ−Ｒ２の相互作用を妨げることのできる分子を投与することからなる方法に関するものである。
【００３３】
さらに別の態様において本発明は、ＴＲＡＦ蛋白とＣＤ４０との相互作用のインヒビターを同定するための検定であって、ＣＤ４０と直接または間接的に結合できるＴＲＡＦ蛋白、ＣＤ４０、およびリポーター遺伝子（ここでその発現はＣＤ４０：ＴＲＡＦ相互作用に依存している）を同時発現する組換え宿主細胞を、候補インヒビターと接触させ、そして該リポーター遺伝子の発現を阻害する分子を選択することからなる検定に関するものである。
【００３４】
さらに別の態様において本発明は、ＴＲＡＦ蛋白とＬＭＰ１との相互作用のインヒビターを同定するための検定であって、ＬＭＰ１と直接または間接的に結合できるＴＲＡＦ蛋白、ＬＭＰ１およびリポーター遺伝子（ここでその発現はＬＭＰ１：ＴＲＡＦ相互作用に依存している）を同時発現する組換え宿主細胞を、候補インヒビターと接触させ、そして該リポーター遺伝子の発現を阻害する分子を選択することからなる検定に関するものである。
【００３５】
ＴＲＡＦ蛋白とＴＮＦ−Ｒ２との相互作用に基づく検定と全く同様に、ＣＤ４０：ＴＲＡＦおよびＬＭＰ１：ＴＲＡＦ検定は「二ハイブリッド」形式で実施されるのが好ましい。しかし、これらは、前述のものと全く同様に、任意の常套的結合／インヒビター検定形式で実施することもできる。個々の検定形式の設計は、十分に当業者の技術内にある。
本発明はさらに、ＴＲＡＦ２（８７−５０１）、またはＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０もしくはＬＭＰ１により仲介される生物活性を阻害することのできるその機能的誘導体に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
Ａ．定義
「因子」、「腫瘍壊死因子レセプター関連因子」、「ＴＮＦ−Ｒ２関連因子」および「ＴＲＡＦ」という句は互換的に使用され、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと特異的に関係できる天然因子および係る天然因子の機能的誘導体を指す。この定義の文脈において、「特異的な関係」という句は最も広い意義で使用され、ヒトまたは任意の動物種の天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン内の一部位または領域との直接結合、および、さらなる分子、例えばＴＲＡＦにより仲介される天然ＴＮＦ−Ｒ２細胞内ドメインとの間接的な関係を包含する。「天然ＴＲＡＦ」という句は、天然供給源から精製され、合成され、組換えＤＮＡ技術により、またはこれらのおよび／またはその他の方法の任意の組み合わせにより生産されているとに拘わらず、任意のヒトまたは非ヒト動物種の任意の細胞型に天然に存在するＴＲＡＦポリペプチドを指し、開始メチオニンを伴っていても伴っていなくても良い。天然ＴＲＡＦは特に、このような天然に存在するポリペプチドの単量体、ホモおよびヘテロ二量体およびホモおよびヘテロオリゴマー型を包含する。天然のマウスＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２ポリペプチド（配列番号２および４）は、ＴＲＡＦ２のＮ末端領域（ＲＩＮＧフィンガードメイン）の部分では関連性がない。対照的に、このドメインの外部では、これらは４１％の配列一致を示す。この相同性はさらに二つの領域に分けられる。２８％という配列一致性の低い領域は、ＴＲＡＦ１のアミノ酸２８−１３６およびＴＲＡＦ２のアミノ酸１５９−２７１を含む。この領域は、ＴＲＡＦ１（アミノ酸１８０−４０９）およびＴＲＡＦ２（アミノ酸２７２−５０１）のＣ末端ドメインからなる２３０アミノ酸にわたり５３％という高い配列一致性を有する領域から、ＴＲＡＦ１では４３個のアミノ酸挿入によって分離されている。この配列類似性は、これによりＴＲＡＦドメインと呼称される新規な構造ドメインの証拠を提供する。天然ＴＲＡＦポリペプチドは好ましくはそれらのアミノ酸配列のＣ末端部分に新規な配列モチーフを共有しており、好ましくはこのＣ末端「ＴＲＡＦドメイン」内で少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、最も好ましくは少なくとも約５５％ホモローガスである。「ＴＲＡＦドメイン」は、天然マウスＴＲＡＦ２アミノ酸配列のほぼアミノ酸２７２ないし５０１、天然マウスＴＲＡＦ１アミノ酸配列のほぼアミノ酸１８０ないし４０９、および他の天然ＴＲＡＦおよびそれらの機能的誘導体の相同的ドメインを包含する。天然ＴＲＡＦはさらに、ＣＤ４０および／またはＬＭＰ１と結合し且つそれらの生物活性を仲介するという好ましい性質を有する。
【００３７】
「天然ＴＮＦレセプター２型」および「天然ＴＮＦ−Ｒ２」という語は互換的に用いられ、天然供給源から精製され、合成され、組換えＤＮＡ技術により、またはこれらのおよび／またはその他の方法の任意の組み合わせにより生産されているとに拘わらず、任意の（ヒトおよび非ヒト）動物種由来の任意の天然に存在する（天然）ＴＮＦレセプター２型を指し、開始メチオニンを伴っていても伴っていなくても良く、そしてＮ末端に結合したシグナル配列を伴っていても伴っていなくても良い。
【００３８】
互換的に用いられる「天然ヒトＴＮＦレセプター２型」および「天然ヒトＴＮＦ−Ｒ２」という語は、天然供給源から精製され、合成され、組換えＤＮＡ技術により、またはこれらのおよび／またはその他の方法の任意の組み合わせにより生産されているとに拘わらず、開始メチオニンを伴うまたは伴わない、そしてＮ末端に結合したシグナル配列を伴うまたは伴わない、ＥＰ４１８０１４（１９９１年３月２０日公開）に開示されているアミノ酸配列を有するヒトＴＮＦ−Ｒ２、および、天然供給源から精製され、インビトロで合成により生産され、または組換えＤＮＡ技術の方法を包含する遺伝学的操作により得られるとに拘わらず、天然全長ヒトＴＮＦ−Ｒ２の可溶性型および種々のグリコシル化型を包含する、その他の天然に存在するヒトＴＮＦ−Ｒ２を指す。
【００３９】
天然ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、その天然ポリペプチドと共通の質的生物活性を有する化合物である。したがって、天然ＴＲＡＦポリペプチドの機能的誘導体は、天然ＴＲＡＦと共通の質的生物活性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それらがそれぞれの天然ポリペプチドと共通の生物活性を有するならば、任意の動物種（ヒトを包含する）由来の天然ポリペプチドのフラグメント、ならびに天然（ヒトおよび非ヒト）ポリペプチドの誘導体およびそれらのフラグメントを包含するが、これらに限定される訳ではない。「フラグメント」は成熟天然ポリペプチドの配列内にある領域を含む。「誘導体」という語は天然ポリペプチドのアミノ酸配列およびグリコシル化変異体ならびに共有結合修飾体を定義するのに用いられ、一方「変異体」という語はこの定義内のアミノ酸配列およびグリコシル化変異体を指す。好ましくは、機能的誘導体は、対応する天然ポリペプチドの配列と、少なくとも約６５％のアミノ酸配列一致、より好ましくは約７５％のアミノ酸配列一致、さらに好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列一致、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列一致を有するポリペプチドである。最も好ましくは、天然ＴＲＡＦポリペプチドの機能的誘導体は、ＴＮＦ−Ｒ２細胞内ドメインとの関係および／またはホモもしくはヘテロ二量体化に直接参加する、天然ポリペプチド配列内の領域または領域群を保持または模倣している。「機能的誘導体」という句は特に、天然ＴＲＡＦと共通の質的生物活性を有するペプチドおよび小有機分子を包含する。
機能的誘導体の定義の文脈中の「生物活性」という語は、天然ポリペプチド（例えばＴＲＡＦ）と質的に共通の少なくとも一つの接着、調節またはエフェクター機能の所有として定義される。本明細書中の天然ＴＲＡＦポリペプチドの機能的誘導体の好ましい生物学的性質は、天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係（直接結合によって、または別のＴＲＡＦとの相互作用を介して）し、それによりそれらの関係しているＴＮＦ−Ｒ２によりシグナル伝達（全面的にまたは部分的に）される生物学的応答を仲介または遮断する能力である。別の好ましい生物活性は、本発明に係るＴＲＡＦポリペプチドが転写因子ＮＦ−κＢの活性化をシグナル伝達する能力である。天然ＴＲＡＦ蛋白のさらなる好ましい機能的誘導体は、典型的には、他のＴＲＡＦと同様、ＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインと相互作用する能力を保持しつつＴＮＦ−Ｒ２仲介ＮＦ−κＢ活性化を遮断することを特徴としている。別の好ましい生物活性は、或るＴＲＡＦ機能的誘導体がＣＤ４０の細胞質ドメインと関係する能力である。このような機能的誘導体は、ＣＤ４０の生物活性を仲介または遮断することができる。ＴＲＡＦ機能的誘導体のさらなる好ましい群は、ＬＭＰ１オンコジーンと関係し（実施例６を参照されたい）その生物活性を仲介または遮断することができる。
【００４０】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する「一致」または「相同性」とは、本明細書中、いかなる同類置換も配列一致の一部とは考えずに、最大の相同性パーセントを達成するようにその配列群を並べ、必要ならば間隙を導入した後の、対応する天然ポリペプチドの残基と一致する候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。ＮもしくはＣ末端延長または挿入は、一致または相同性を低下させるとは解釈されない。並置のための方法およびコンピュータープログラムは当分野で良く知られている。
【００４１】
本発明に係るＴＲＡＦポリペプチドは特に、天然マウスＴＲＡＦ１（配列番号２）および天然マウスＴＲＡＦ２（配列番号４）、それらのホモおよびヘテロ二量体ならびにホモおよびヘテロオリゴマー型、ならびに他の哺乳動物種、例えばラット、豚、馬、牛、高等霊長類、およびヒトにおけるそれらの類似体、ならびに係る天然ポリペプチドの機能的誘導体を包含する。天然ＴＲＡＦ１または天然ＴＲＡＦ２レセプターの機能的誘導体は、好ましくは、緊縮条件下で天然ＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡの相補物とハイブリダイズすることのできるＤＮＡによってコードされている。より好ましくは、この機能的誘導体は、天然ＴＲＡＦポリペプチドの任意のドメインと、そして好ましくはＴＮＦ−Ｒ２結合ドメインおよび／または二量体化ドメインと、少なくとも約４０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約５０％の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約５５％の配列相同性、最も好ましくは少なくとも約６０％の配列相同性を共有する。最も好ましい態様において、機能的誘導体は、マウスＴＲＡＦ２のＣ末端ＴＲＡＦ領域と少なくとも約５０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約５５％の配列相同性、最も好ましくは少なくとも約６０％の配列相同性を共有し、または、緊縮条件下でマウスＴＲＡＦ２のＴＲＡＦ領域をコードしているＤＮＡの相補物とハイブリダイズすることのできるＤＮＡによってコードされている。もう一つの好ましい態様において、天然ＴＲＡＦポリペプチドの機能的誘導体は、唯一の機能的に無傷なドメインとして「ＴＲＡＦ」ドメインを有するフラグメントであって、ここで「ＴＲＡＦ」ドメインは、天然マウスＴＲＡＦ２アミノ酸配列の大体アミノ酸２７２ないし５０１、天然マウスＴＲＡＦ１アミノ酸配列の大体アミノ酸１８０ないし４０９、および他の天然ＴＲＡＦのホモローガスなドメインを包含する。さらなる好ましい態様において、天然ＴＲＡＦポリペプチドの機能的誘導体は、ＴＲＡＦ２のＲＩＮＧフィンガードメインを欠く。後者の変異体の一つであるＴＲＡＦ２（８７−５０１）は、ＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達が全くできない。
【００４２】
「緊縮条件」とは、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断鮭精子ＤＮＡからなる溶液中４２℃での一晩のインキュベーションである。
【００４３】
「アミノ酸」および「アミノ酸群」という語は、天然に存在する全てのＬ−αアミノ酸を指す。アミノ酸は一文字または三文字表記により特定される：
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸          Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  スレオニン              Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン                  Ｔｙｒ  Ｙ  チロシン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸            Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン                Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン                Ｌｙｓ  Ｋ  リジン
Ａｌａ  Ａ  アラニン                Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン              Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン                  Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン              Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギン
これらのアミノ酸はそれらの側鎖の化学的組成および性質に従って分類することができ
る。これらは大きく二つの群、荷電および非荷電に分類される。これらの群のそれぞれは
アミノ酸をより正確に分類するため、小群に分けられる：
Ｉ．荷電アミノ酸
酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン
II．非荷電アミノ酸
親水性残基：セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン
脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン
芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
【００４４】
「アミノ酸配列変異体」という語は、天然アミノ酸配列と比較してそれらのアミノ酸配列に幾らかの相違を有する分子を指す。
【００４５】
置換変異体とは、天然配列中の少なくとも１個のアミノ酸が除去され、その場所に同じ位置で異なるアミノ酸が挿入されている変異体である。置換は、分子中の１個のアミノ酸だけが置換されている単一であっても、または同じ分子中で２またはそれ以上のアミノ酸が置換されている複数であっても良い。
挿入変異体とは、天然配列の特定の一のアミノ酸と直接隣接して１またはそれ以上のアミノ酸が挿入されている変異体である。アミノ酸に直接隣接して、とは、当該アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。
除去変異体とは、天然アミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。通常、除去変異体は分子の特定の領域で１またはそれ以上のアミノ酸が除去されている。
【００４６】
「グリコシル化変異体」という語は、天然のものとは異なったグリコシル化プロフィルを有する糖蛋白、または天然型ではグリコシル化されていないポリペプチドのグリコシル化変異体を指すのに用いられる。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。Ｏ−結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまたＯ−結合グリコシル化に含めてよい。
【００４７】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖蛋白である。抗体は特異抗原に対する結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベルが、そして骨髄腫によって高レベルが産生される。
天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、二つの同一の軽（Ｌ）鎖および二つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白である。それぞれの軽鎖は一個のジスルフィド共有結合により重鎖に連結しているが、但しジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で異なっている。各々の重および軽鎖はさらに、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド橋を有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）、その後に幾つかの不変ドメインを持っている。それぞれの軽鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）、そして他方の端に不変ドメインを持っている。
軽鎖の不変ドメインは重鎖の最初の不変ドメインと並んでおり、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽および重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると信じられている［クロチア等、J.Mol.Biol.、１８６巻６５１−６６３頁（１９８５）；ノヴォトニーおよびヘイバー、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻４５９２−４５９６頁（１９８５）］。
【００４８】
「可変」という語は、可変ドメインの或る部分が配列の上で抗体間で甚だしく異なっている事実を指し、特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性に用いられる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインに均等に分布してはいない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ四つのＦＲ領域を含んでおり、これらは大抵βシートコンフィギュレーションを採用しており、三つのＣＤＲによって連結しているが、それらはこのβシート構造を連結するループを形成するか、幾つかの場合にはそのβシート構造の一部を形成している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している［E.A.カバット等、シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９９１）を参照されたい］。不変ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与している訳ではないが、抗体の抗体依存細胞毒性への参加といったような様々なエフェクター機能を示す。
【００４９】
抗体のパパイン消化は、それぞれが１個の抗原結合部位を伴うＦａｂフラグメントと呼ばれる二つの等しい抗原結合フラグメント、および、その名称が容易に結晶化する能力を反映している、残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を持ち、なお抗原と架橋できるＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する。
【００５０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密に非共有結合している１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体で構成されている。各可変ドメインの三つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位を規定しているのはこのコンフィギュレーションにおいてである。まとめると、６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与している。しかしながら、ただ一つの可変ドメイン（または、或る抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を持っている。
【００５１】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の不変ドメインおよび重鎖の最初の不変ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１またはそれ以上のシステインを含む数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に加わっている点でＦａｂフラグメントと異なっている。Ｆａｂ'−ＳＨは本明細書において、不変ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持っているＦａｂ'の表記である。Ｆ（ａｂ')２抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを持っているＦａｂ'フラグメントの対として生成された。別の、抗体フラグメントの化学的結合もまた知られている。
【００５２】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの不変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダ（λ）と呼ばれる極めて明瞭な二つのタイプのうち一つに割り当てることができる。
【００５３】
重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。五つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、があり、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２、に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖不変ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは良く知られている。
【００５４】
「抗体」という語は最も広い意味で用いられ、特に、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を包含する）、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、そして、それらが所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖ）を包含する。
【００５５】
本明細書中使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質上均質な抗体の集団から得られた抗体、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に存在する可能な突然変異を除いては同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して作製される異なった抗体を含む常套的（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の一つの決定基に対して作製されたものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質上均質な抗体の集団から得られる抗体の性格を示すものであり、特定の方法によりその抗体を産生することを要求すると解してはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができ、または、組換えＤＮＡ法により作製することができる［例えば、米国特許第４８１６５６７号（キャビリー等）を参照されたい］。
【００５６】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスである、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）および係る抗体のフラグメントを特に包含する［米国特許第４８１６５６７号；キャビリー等；モリソン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻６８５１−６８５５頁（１９８４）］。
【００５７】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、抗体の、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ')２またはその他の抗原結合サブ配列）である。大抵は、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体にも取り入れられたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の挙動をさらに洗練および最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質上全てを含み、ここで、全てまたは実質上全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てまたは実質上全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部をも含むであろう。さらなる詳細については、ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−５２５頁［１９８６］；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３−３２９頁［１９８８］；およびプレスタ、Curr.Op.Struct.Biol.、２巻５９３−５９６頁［１９９２］を参照されたい。
【００５８】
本発明の文脈中、「細胞」、「セルライン」、および「細胞培養」は互換的に用いられ、係る表現は全て子孫を包含する。全ての子孫は、故意のまたは偶然の突然変異のために、ＤＮＡ含有量が厳密に同一ではないかも知れないということもまた理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的性質を有する突然変異体子孫が包含される。
【００５９】
「形質転換」とは、或る生物中にＤＮＡを導入し、その結果そのＤＮＡが染色体外要素としてまたは染色体への統合によって複製可能となることを意味する。
【００６０】
「トランスフェクション」とは、コード化配列が実際に発現されるか否かに拘わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。
【００６１】
「形質転換された宿主細胞」および「形質転換された」という語は、細胞内へのＤＮＡの導入を指す。この細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、原核細胞でも真核細胞でもよい。典型的な原核生物宿主細胞には、大腸菌の様々な菌株が包含される。典型的な真核生物宿主細胞は、哺乳動物のもの、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胚腎臓２９３細胞である。導入されたＤＮＡは通常、挿入されたＤＮＡ断片を含むベクターの形をとっている。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来、または宿主細胞とは異なる種由来であってよく、または、幾らかの外来および幾らかのホモローガスＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。
【００６２】
「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」という語は、その中に一片の外来ＤＮＡを挿入した、通常二本鎖のＤＮＡ片を指す。外来ＤＮＡとは、宿主細胞中に天然では見いだされないＤＮＡである、ヘテロローガスなＤＮＡとして定義される。このベクターは、外来またはヘテロローガスＤＮＡを適当な宿主細胞中に運ぶために使用される。いったん宿主細胞に入ると、このベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製でき、該ベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡを数コピー作り出すことができる。さらに、このベクターはその外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳させるのに必要な要素を含んでいる。このようにして外来ＤＮＡによりコードされているポリペプチドの分子が多数、迅速に合成される。
【００６３】
「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法により化学合成される、短い一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである［例えば、ホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホルアミダイト化学、ＥＰ２６６０３２（１９８８年５月４日公開）に記載のような固相技術の使用、またはフレーラー等、Nucl.Acids Res.、１４巻５３９９頁（１９８６）に記載のようなデオキシヌクレオシドＨ−ホスホナート中間体を介する］。これらはポリアクリルアミドゲル上で精製される。
【００６４】
Ｂ．ＴＲＡＦの同定および精製
天然ＴＲＡＦポリペプチドは、ＴＮＦレセプター２型（ＴＮＦ−Ｒ２）ｍＲＮＡを有しこれを検出可能なレベルで発現することが知られている組織中に同定されそしてこれから精製することができる。したがって、マウスＴＲＡＦは、例えばマウスインターロイキン２（ＩＬ−２）依存性細胞傷害ＴセルラインＣＴ６から取得することができる［レインジズ等、J.Immunol.、１４２巻１２０３−１２０８頁（１９８９）］。マウスＴＲＡＦ１はまた脾臓、肺および精巣から精製することもでき、一方マウスＴＲＡＦ２は、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣を包含するさらに多様な組織から分離精製することができる（図１５ｂを参照されたい）。一般に、ＴＲＡＦ蛋白はＴＮＦ−Ｒ２を発現することが知られているヒト組織で発現されると予想されているが、このような組織が全て、全ＴＲＡＦを発現する訳ではない。これに代わり、ＴＲＡＦポリペプチドは、天然ＴＮＦ−Ｒ２、またはＴＲＡＦとの相互作用に参加する細胞内ドメイン配列を含むＴＮＦ−Ｒ２誘導体をコードしているＤＮＡでトランスフェクトしたセルラインから分離することもできる。天然ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する因子は、それを発現する細胞から、レセプターまたはレセプター誘導体の免疫沈降によって同定することができる。一般に免疫沈降は、もしＴＮＦ−Ｒ２が膜に結合しているならば細胞を洗浄剤で溶解し、ＴＮＦ−Ｒ２を抗ＴＮＦ−Ｒ２抗体に結合させ、抗体複合体を沈澱させ、沈澱を洗浄し、そして免疫複合体からＴＮＦ−Ｒ２と関連因子とを分離する、ということを含む、多段階工程で構成される。次に、分離された因子を電気泳動法により分析することができる。好ましい態様において、放射標識されたＴＮＦ−Ｒ２（または誘導体）を、プロテインＡ−アガロース（オンコジーン・サイエンス）またはプロテインＡ−セファロース（ファルマシア）で免疫沈降させる。この場合、ＴＮＦ−Ｒ２／抗ＴＮＦ−Ｒ２抗体免疫複合体は、アガロースまたはセファロースに結合したスタフィロコッカス・アウレウスのプロテインＡにより沈澱する。次いでこの免疫沈降体を、用いられた実際の放射標識に応じてオートラジオグラフィーまたはフルオログラフィーにより分析する。ＴＲＡＦ蛋白（これはＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する能力を特徴とする）は該レセプターまたはレセプター誘導体と共同沈降し、親和カラム上での精製といったような当分野で既知の方法によってさらに精製することができる。
【００６５】
ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する因子を精製するための大規模精製計画は、D.B.スミスおよびK.S.ジョンソン、Gene、６７巻３１−４０頁（１９８８）に記載されるように、外来ポリペプチドを大腸菌中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端との融合物として合成することを目的とするプラスミド発現ベクターを利用する。ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインは大腸菌組換え宿主細胞中でＧＳＴとの融合蛋白として発現され、グルタチオン−アガロースビーズ（シグマ）上への吸着により、粗製の細菌溶解液から精製することができる。次に、精製されるべき因子を含有する細胞溶解液をＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ２融合蛋白親和カラムに適用する。カラムに結合した蛋白（群）を溶離し、沈澱させ、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして銀染色によって可視化する。ＧＳＴ遺伝子融合ベクター（ｐＧＥＸベクター）ならびにＧＳＴ融合系のクローニングおよび発現のためのキットはファルマシアから市販品が入手できる（ファルマシアカタログ、１９９４、１３３頁；および１４２−１４３頁を参照されたい）。
【００６６】
精製された蛋白は、１２０Ａ ＰＴＨアミノ酸分析機を装備したモデル４７０Ａアプライド・バイオシステムズ気相シークエンサーを用いて自動エドマン分解により直接配列決定するか、または、種々の化学物質もしくは酵素で消化した後に配列決定することができる。ＰＴＨアミノ酸はクロムパーフェクトのデータシステムを用いて統合した（ジャスティス・イノヴェーションズ、パロアルト、ＣＡ）。配列の解釈は、ヘンゼル等、J.Chromatography、４０４巻４１頁（１９８７）に記載のようにＶＡＸ １１／７８５ディジタル・イクイップメント・コーポレーションのコンピューター上で実施することができる。幾つかの場合には、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動された溶出液をＰＶＤＦ膜（プロブロット、ＡＢＩ、フォスターシティー、ＣＡ）に電気的に移し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（シグマ）で染色する。特異的な蛋白をＮ末端配列決定用にブロットから切り取る。内部蛋白配列を決定するため、逆相毛管ＨＰＬＣにより得られた精製画分を、典型的には減圧乾燥（スピードヴァク）し、適当な緩衝液に再懸濁し、そして臭化シアンおよび／または種々のプロテアーゼ、例えばトリプシン、リジン特異酵素Ｌｙｓ−Ｃ（ワコー・ケミカルズ、リッチモンド、ＶＡ）またはＡｓｐ−Ｎ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、Ｉｎｄ．）で消化する。消化後、得られたペプチドを混合物として配列決定するか、ＨＰＬＣにより分析する。
【００６７】
Ｃ．ＴＲＡＦポリペプチドの組換え生産
好ましくは、ＴＲＡＦポリペプチドは、ＴＲＡＦポリペプチド核酸を発現するようトランスフェクトさせた（典型的には細胞を発現ベクターにより形質転換することによる）細胞を培養し、そしてこの細胞からポリペプチドを回収することによる、標準的組換え法によって製造する。しかし、ＴＲＡＦポリペプチドは、ホモローガスな組換えによって、または、ＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡを既に含んでいる細胞中に導入された調節要素を利用する組換え生産法によって生産し得るということが考えられる。例えば、強力なプロモーター／エンハンサー要素、サプレッサー、または外因性転写調節要素を、所望のＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近さおよび向きで、意図される宿主細胞のゲノムに挿入することができる。調節要素はＴＲＡＦポリペプチドをコードしておらず、このＤＮＡは宿主細胞ゲノムに固有のものである。次に、本発明に係るポリペプチドを作っている細胞、または所望により増大もしくは低下した発現レベルについてスクリーニングする。
【００６８】
したがって、本発明は、ＴＲＡＦポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞のゲノム中に転写調節要素を、その転写に影響を及ぼすに十分な該核酸分子に対する近さおよび向きで挿入し、転写調節要素および核酸分子を含む細胞を培養するさらなる工程を所望により伴う、ＴＲＡＦポリペプチドを生産する方法を意図するものである。本発明はさらに、宿主細胞により認識される外因性調節配列と機能的に結合した固有のＴＲＡＦポリペプチド核酸分子を含む宿主細胞を意図するものである。
【００６９】
１．ＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡの分離
本発明の目的のため、ＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡは、ＴＮＦレセプター２型（ＴＮＦ−Ｒ２）ｍＲＮＡを持ちこれを検出可能なレベルで発現すると信じられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ＴＮＦ−Ｒ２を発現することが知られているセルラインからポリアデニル化ｍＲＮＡを取得し、そしてこのｍＲＮＡを鋳型として使用し二本鎖ｃＤＮＡを合成することによって組み立てることができる。この目的のために好適なヒトおよび非ヒトセルラインは上に列挙した。しかしながら、ＴＮＦ−Ｒ２は、ＴＲＡＦファミリーの全ての成員が全てのＴＮＦ−Ｒ２発現組織で発現される訳ではないにしても、全てＴＲＡＦ ｃＤＮＡの供給源として働く可能性のある極めて多様なその他の組織で発現されることが知られている。これに代わり、新たなＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡを、かつて同定されたＴＲＡＦポリペプチドが検出可能レベルで発現されることが知られている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。ＴＲＡＦポリペプチド遺伝子はまた、ゲノムライブラリー、例えばヒトゲノムコスミドライブラリーから取得することができる。
【００７０】
ｃＤＮＡまたはゲノムいずれかのライブラリーは、目的遺伝子またはそれによりコードされている蛋白を同定するよう設計されたプローブでスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーのためには、好適なプローブはＴＲＡＦポリペプチドを認識しこれに特異的に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を包含する。ｃＤＮＡライブラリーのためには、好適なプローブは、同じまたは異なる種由来のＴＲＡＦポリペプチドの既知のまたは予想される部分をコードしている、注意深く選択されたオリゴヌクレオチドプローブ（通常約２０−８０塩基長）、および／または同じまたは類似遺伝子をコードしている相補的または相同的ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための適当なプローブは、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、または同じもしくは類似の遺伝子をコードしているそのフラグメント、および／またはホモローガスなゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントを包含するが、これらに限定される訳ではない。選ばれたプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９、の１０−１２章に記載されるような標準法を用いて実施することができる。
【００７１】
本発明を実施する好ましい方法は、注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いて種々の組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さがあり、且つ偽陽性を最小限とするに十分明確でなければならない。実際のヌクレオチド配列（群）は通常、コドンの重複が最小であるＴＲＡＦの領域を元に設計される。このオリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の位置で縮重していてよい。縮重オリゴヌクレオチドの使用は、或るライブラリーが、優先的コドンの使用が知られていない種からスクリーニングされる場合、特に重要である。
【００７２】
このオリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡとハイブリダイズする時に検出できるよう、標識しなければならない。好ましい標識方法は、ＡＴＰ（例えば、γ３２Ｐ）およびポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの５'末端を放射標識することである。しかしながら、ビオチニル化または酵素標識化を包含するその他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識することもできるが、これらに限定される訳ではない。
【００７３】
ＴＲＡＦをコードしているｃＤＮＡはまた、直接発現クローニングまたは米国特許第４６８３１９５号（１９８７年７月２８日登録）、サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、１９８９、１４項、またはカレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、１５章、アウスベル等編、グリーン・バブリッシング・アソシエイツおよびウィレイ−インターサイエンス、１９９１に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によるような、その他の既知の組換えＤＮＡ技術によって同定および分離することもできる。この方法は、ＴＲＡＦをコードしているＤＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用する必要がある。
【００７４】
本発明を実施するための好ましい方法によれば、ＴＲＡＦ蛋白のためのコード化配列を、これらがＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと相互作用する能力に基づき、組換えｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー中で同定することができる。この目的のためには、フィールズおよび共同研究者により記載された酵母遺伝子系［フィールズおよびソング、Nature(London)、３４０巻２４５−２４６頁（１９８９）；チエン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻９５７８−９５８２頁（１９９１）］を、シェヴレイおよびナタンス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９巻５７８９−５７９３頁（１９９１）］により開示されたように使用することができる。酵母ＧＡＬ４のような多くの転写アクティベーターは二つの物理的に別個のモジュールドメインで構成され、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前記刊行物に記載の酵母発現系（一般に「二ハイブリッド系」と称される）はこの性質を利用し、そして、一方では標的蛋白がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合し他方では候補活性化蛋白が活性化ドメインと融合する、二ハイブリッド蛋白を使用する。ＧＡＬ４−活性化されたプロモーターの調節下にあるＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子の発現は、蛋白−蛋白相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構築に依存している。相互作用しているポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼのための色素生成基質で検出する。二ハイブリッド技術を用いて二つの特異的蛋白間の蛋白−蛋白相互作用を同定するための完全なキット（マッチメーカー（商標））がクロンテクから市販されており入手できる。この系はさらに拡大して、特異的蛋白相互作用に関与する蛋白ドメインの地図作成およびこれらの相互作用に必須なアミノ酸残基の正確な指摘を行うことができる。
【００７５】
ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する蛋白をコードしている遺伝子を直接分離するために、ＴＮＦ−Ｒ２細胞内ドメインをコードしているＤＮＡまたはそのフラグメントをＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードしているＤＮＡを含むベクター中にクローニングする。次に、ＧＡＬ４転写活性化ドメインをコードしているＤＮＡを含むベクターに、候補因子をコードしている二本鎖ｃＤＮＡをクローニングすることによって、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを組み立てる。その後、リポーター遺伝子を含んでいる酵母細胞を、ＴＮＦ−Ｒ２−ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインベクターおよびライブラリープラスミドＤＮＡで同時形質転換する。典型的には、二つのリポーター遺伝子：ｌａｃＺ（βｇａｌ）およびＨｉｓ遺伝子を含んでいるS.セレヴィシアエ細胞が、同時形質転換のための宿主として働く。トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを欠く補足合成デキストロース培地上に蒔くことにより酵母形質転換体を選択し、蛋白−蛋白相互作用を、シェヴレイおよびナタンス、上記、の記載と本質上同様にして、酵母コロニーフィルターβ−ガラクトシダーゼ検定により監視する。蛋白−蛋白相互作用を伴うコロニーのみがｈｉｓプレート上で生育し、次いでさらなる対照としてのβ−ｇａｌについて分析する。
【００７６】
一つの種からＴＲＡＦをコードしているｃＤＮＡが分離されたなら、種間ハイブリダイゼーションによって他の種からもｃＤＮＡを得ることができる。このアプローチに従い、ヒトまたは他の哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、既知の基準（その中には、当該配列は十分な長さがあり且つ偽陽性を最小限とするに十分明確であるということがある）に合致して既知のＴＲＡＦ配列（例えば本出願に開示されるマウスＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２）から選択された標識化オリゴヌクレオチド配列によりプロービングする。典型的には、特にそのオリゴヌクレオチドがメチオニンまたはトリプトファンに相当する１またはそれ以上のコドンを含む場合、約３０ないし５０塩基を有する３２Ｐ標識化オリゴヌクレオチドで十分である。分離された核酸は、核酸の供給源由来の他のポリペプチドをコードしている夾雑核酸から分離同定されているＤＮＡであろう。
【００７７】
配列がわかったならば、特定のＴＲＡＦポリペプチドをコードしている遺伝子もまた、エンゲルスおよびアールマン、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.、２８巻７１６頁（１９８９）に記載の方法の一つに従い、化学合成によって取得することができる。これらの方法には、トリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホナート法、ＰＣＲおよびその他の自己プライマー法、ならびに固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成が包含される。
【００７８】
２．天然ＴＲＡＦ蛋白またはフラグメントのアミノ酸配列変異体
天然ＴＲＡＦおよびＴＲＡＦフラグメントのアミノ酸配列変異体は、天然または変異体ＴＲＡＦ ＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、または、所望ポリペプチドのインビトロ合成により、当分野で既知の方法によって製造される。アミノ酸配列変異体の組み立てには二つの主要な変数：突然変異部位の位置および突然変異の性質がある。ＴＲＡＦをコードしているＤＮＡ配列の操作を必要としない、天然に存在する対立遺伝子（アレル）を除いて、ＴＲＡＦのアミノ酸配列変異体は、好ましくは、対立遺伝子または天然に存在しないアミノ酸配列変異体に到達するために該ＤＮＡを突然変異させることにより組み立てる。
【００７９】
突然変異の一つの群は、ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０またはＬＭＰ１の細胞内ドメインとの相互作用に関与すると同定されているドメインもしくはドメイン群の内部に作られるであろう。ＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達の能力を低下させまたは排除しつつ、ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０またはＬＭＰ１との関係（結合または間接的な関係）を促進するよう、そして／または結合能を保持するように突然変異したＴＲＡＦ変異体は、天然ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０またはＬＭＰ１蛋白により仲介される天然の生物活性のインヒビターとして有用であろう。さらに、係る変異体は、これらの蛋白の過剰発現に伴う病的状態の診断に、そしてＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０またはＬＭＰ１の精製に有用であろう。このような突然変異の標的は、ＴＲＡＦ２および関連因子のＮ末端ＲＩＮＧフィンガードメインであるが、これは、このドメインがＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインとの相互作用に関与すると信じられているためである。このようなＴＲＡＦ２変異体の典型的な代表は、天然ＴＲＡＦ２のＮ末端フィンガードメインを欠く突然変異体ＴＲＡＦ２蛋白である（ＴＲＡＦ２（８７−５０１））。この変異体はＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２と相互作用する能力を保持しているが、ＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達の点で全く不完全である。ＴＲＡＦ−ＴＮＦ−Ｒ２／ＣＤ４０／ＬＭＰ１生物活性のインヒビターとして働くその他のＴＲＡＦアミノ酸配列変異体は、例えば、下に記載される生化学的スクリーニング検定により同定することができる。
【００８０】
突然変異のもう一つの群は、他のＴＮＦ−Ｒ２関連因子との相互作用に関与する領域内で実施されるであろう。即ち、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦファミリーの他の因子のホモローガスなＣ末端ドメイン（蛋白二量体化モチーフ）内部でのアミノ酸変化は、ＴＮＦ−Ｒ２レセプターによるシグナル伝達に必要な安定な二量体を形成させるこのような因子の能力を亢進することができる。
これに代わり、またはこれに加えて、アミノ酸変化は、達成すべき目標に応じて、様々な種由来のＴＲＡＦ蛋白において相違している部位に、または高度に保存された領域に施すことができる。
このような位置にある部位は、例えば（１）最初に同類アミノ酸選択肢で、次いで、達成される結果に応じて、より過激な選択で置換することにより、（２）標的残基または残基群を除去することにより、または、（３）存在する部位に隣接して、同じまたは異なるクラスの残基を挿入することにより、または選択肢１−３の組み合わせにより、典型的には連続して修飾することができる。
【００８１】
役に立つ一つの技術は「アラニンスキャニング」である［カニングハムおよびウェルズ、Science、２４４巻１０８１−１０８５頁（１９８９）］。ここでは、或る残基または標的残基群を特定し、アラニンまたはポリアラニンによって置き換える。次に、アラニン置換に対する機能的感受性を示すドメインを、アラニン置換部位にまたは置換部位のためのさらなるまたはその他の置換を導入することによって改良する。
【００８２】
所望の突然変異を特定した後、ＴＲＡＦ変異体をコードしている遺伝子を、例えば上記のような化学合成によって得ることができる。
【００８３】
より好ましくは、ＴＲＡＦアミノ酸配列変異体をコードしているＤＮＡは、先に製造されたＴＲＡＦの変異体または非変異体をコードしているＤＮＡの位置指定突然変異生成によって製造される。位置指定（位置特異的）突然変異生成は、安定な二本鎖を、区切られている除去連結点の両側に形成するに十分な大きさおよび配列複雑性のプライマー配列を提供する、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードしている特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドを使用することにより、ＴＲＡＦ変異体の生産を可能にする。典型的には、約２０ないし２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、その配列の連結点の両側の約５ないし１０残基が変化を受ける。一般に、位置特異的突然変異生成の技術は、エーデルマン等、DNA、２巻１８３頁（１９８３）のような刊行物に例示されるように、当分野で良く知られている。理解されるように、位置特異的突然変異生成技術は、典型的には、一本鎖および二本鎖型の両方で存在するファージベクターを使用する。位置指定突然変異生成に有用な典型的なベクターは、例えばメシング等、サード・クリーヴランド・シンポジアム・オン・マクロモレキュールズ・アンド・リコンビナント・ＤＮＡ、A.ウォルトン編、エルセヴィア、アムステルダム（１９８１）により開示されるようなＭ１３ファージのようなベクターを包含する。このおよびその他のファージベクターは市販品が入手可能であり、それらの使用は当業者に良く知られている。Ｍ１３から誘導されたベクターを使用するＤＮＡフラグメントにおけるオリゴデオキシリボヌクレオチド指向位置特異的突然変異の組み立てのための多用途の且つ有効な方法は、M.J.ゾラーおよびM.スミス、Nucleic Acids Res.、１０巻６４８７−６５００頁［１９８２］により公開された。また、一本鎖ファージ複製起点を含むプラスミドベクター［ヴェイラ等、Meth.Enzymol.、１５３巻３頁（１９８７）］を使用して一本鎖ＤＮＡを得ることができる。別法として、適当なＤＮＡフラグメントをインビトロで合成し、これを当分野で既知のＰＣＲ法により増幅することによってヌクレオチド置換が導入される。
【００８４】
一般に、この位置特異的突然変異生成は、最初に、関連する蛋白をコードしているＤＮＡ配列をその配列内部に含む一本鎖ベクターを取得することにより実施される。例えばクレア等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７５巻５７６５頁（１９７８）の方法により、一般的には合成により、所望の突然変異した配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを調製する。次にこのプライマーを、一本鎖の蛋白配列含有ベクターとアニーリングし、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素を作用させて突然変異を有する鎖の合成を完成させる。このようにして、一方の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第二の鎖が所望の突然変異を有する、ヘテロ二本鎖が形成される。次いでこのヘテロ二本鎖ベクターを用いてＪＰ１０１細胞のような適当な宿主細胞を形質転換し、そして突然変異した配列の配置を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。その後、突然変異した領域を除去し、蛋白産生のための適当な発現ベクター中に入れる。
【００８５】
ＰＣＲ技術をＴＲＡＦのアミノ酸配列変異体の作成に使用することもできる。少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲにおける出発物質として使用する場合、鋳型ＤＮＡ中の対応領域と僅かに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型と異なる位置でのみ鋳型配列と異なっている特異的ＤＮＡフラグメントを比較的大量に生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導入するためには、プライマーの一方は突然変異の位置と部分重複し且つその突然変異を含むよう設計し；他方のプライマーの配列は、そのプラスミドの反対の鎖の配列一つながりと同一でなければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。しかしながら、第二のプライマーの配列は、プライマーにより境界を与えられるＤＮＡの増幅された領域全体が最終的に容易に配列決定されるよう、第一プライマーの配列の２００ヌクレオチド以内に位置させるのが好ましい。今記載したようなプライマー対を用いるＰＣＲ増幅は、プライマーにより特定される突然変異の位置で、そして鋳型の複製は多少誤りが起こり易いのであるいはその他の位置で相違するＤＮＡフラグメントの集団を生成する。
【００８６】
生成物に対する鋳型の比が極端に低い場合、生成物のＤＮＡフラグメントの大多数に所望の突然変異（群）が組み込まれる。この生成物は、標準的ＤＮＡ技術を用いて、ＰＣＲ鋳型として働いたプラスミド中の対応領域を置き換えるのに使用される。別々の位置にある突然変異は、突然変異体第二プライマーを使用することにより、または、異なる突然変異体プライマーによる第二のＰＣＲを行い、得られた二つのＰＣＲフラグメントを三部（またはそれ以上の）ライゲーションでベクターフラグメントに同時にライゲーションすることによって同時に導入することができる。
【００８７】
ＰＣＲ突然変異生成の特別な例においては、プラスミドＤＮＡ中の増幅される領域の外に特異な認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を線状化する。この物質から１００ｎｇを、４種のデオキシヌクレオチド三燐酸を含有しジーンアンプ（商標）キット（パーキン−エルマー・シータス、ノルウォーク、ＣＴおよびエメリーヴィル、ＣＡ、より入手）に含まれるＰＣＲ緩衝液、および各オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐｍｏｌｅを含有するＰＣＲ混合物に加え、最終容量５０μｌとする。この反応混合物を鉱油３５μｌに積層する。反応を１００℃で５分間変性させ、短時間氷上に置き、次いで鉱油層の下にサーマス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（５単位／ｌ、パーキン−エルマー・シータス、ノルウォーク、ＣＴおよびエメリーヴィル、ＣＡより購入）を添加する。次いでこの反応混合物を、以下のようにプログラムしたＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン−エルマー・シータスより購入）中に入れる：
５５℃２分間、
７２℃３０秒間、次いで以下を１９サイクル：
９４℃３０秒間、
５５℃３０秒間、そして
７２℃３０秒間。
【００８８】
このプログラムの終了時に反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容量）で抽出し、そしてエタノール沈澱させ、ＤＮＡを標準法により回収する。この物質を、続いてベクターへの挿入のための適当な処理に付す。
【００８９】
変異体を製造するためのもう一つの方法、カセット突然変異生成は、ウェルズ等［Gene、３４巻３１５頁（１９８５）］により記載された技術に基づく。出発物質は、突然変異させようとするＴＲＡＦ ＤＮＡを含むプラスミド（またはベクター）である。突然変異させるべきＴＲＡＦ 内のコドンを特定する。特定された突然変異部位の両側には特異な制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。このような制限部位が存在しない場合は、それらをＴＲＡＦ ＤＮＡの適当な位置に導入するための上記オリゴヌクレオチド仲介突然変異生成法を用いて、それらを作り出すことができる。制限部位がプラスミド中に導入された後、このプラスミドをこれらの部位で切断して線状化する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードしており所望の突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用いて合成する。２本の鎖を別々に合成し、次いで標準技術を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラスミドに直接ライゲーションできるよう、線状化されたプラスミドの末端と適合する３'および５'末端を有するよう設計される。その結果このプラスミドは突然変異したＴＲＡＦ ＤＮＡ配列を含むことになる。
【００９０】
さらに、いわゆるファージミドディスプレー法は、天然もしくは変異体ＴＲＡＦのアミノ酸配列変異体またはそれらのフラグメントの作成に有用であるかも知れない。この方法は、（ａ）突然変異すべきレセプターをコードしている第一の遺伝子、天然または野生型ファージコート蛋白の少なくとも一部をコードしている第二の遺伝子（ここで第一および第二の遺伝子はヘテロローガスである）、および第一および第二の遺伝子と機能的に結合している転写調節要素からなる複製可能な発現ベクターを組み立て、それにより融合蛋白をコードしている遺伝子融合物を形成させ；（ｂ）このベクターを第一遺伝子内の１またはそれ以上の選択された位置で突然変異させ、それにより関連するプラスミドのファミリーを形成させ；（ｃ）このプラスミドで適当な宿主細胞を形質転換し；（ｄ）この形質転換した宿主細胞を、ファージコート蛋白をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；（ｅ）この形質転換し感染した宿主細胞を、少なくとも該プラスミドの一部を含む組換えファージミド粒子を形成するのに好適であり且つ宿主を形質転換させることのできる条件下で（この条件は、ごく少量のファージミド粒子がその粒子表面に１コピー以上の融合蛋白を表示するように調節する）培養し；（ｆ）このファージミド粒子を適当な抗原と接触させて、ファージミド粒子の少なくとも一部がその抗原と結合するようにさせ；そして、（ｇ）結合しているファージミド粒子を結合していないものと分離する、ことを含む。（ｄ）から（ｇ）までは、１回またはそれ以上反復することができる。好ましくはこの方法において、プラスミドは転写調節要素の厳密な制御下にあり、培養条件は、粒子表面に１コピー以上の融合蛋白を表示しているファージミド粒子の量または数が約１％未満であるよう調節する。また、好ましくは、１コピー以上の融合蛋白を表示しているファージミド粒子の量は、１コピーの融合蛋白を表示しているファージミド粒子の量の１０％未満である。最も好ましくは、その量は２０％未満である。この方法において典型的には、発現ベクターはさらに、該ポリペプチドの各サブユニットをコードしているＤＮＡと融合した分泌シグナル配列を含み、転写調節要素はプロモーター系であろう。好ましいプロモーター系は、ｌａｃＺ、λＰＬ、ｔａｃ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファターゼプロモーターならびにこれらの組み合わせから選択される。また、通常この方法は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、およびＰｈｉＸ１７４から選ばれるヘルパーファージを使用するであろう。好ましいヘルパーファージはＭ１３Ｋ０７であり、好ましいコート蛋白はＭ１３ファージ遺伝子IIIコート蛋白である。好ましい宿主は大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠失株である。
【００９１】
前記の内容のさらなる詳細および類似の突然変異生成技術は、例えばサムブルック等、上記、およびカレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、アウスベル等編、上記、といったような一般的教科書に見いだされる。
【００９２】
天然に存在するアミノ酸は、共通する側鎖の性質に基づく群に分けられる：
(1)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性疎水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)鎖の向きに影響する残基：gly、pro；および、
(6)芳香族：trp、tyr、phe。
【００９３】
同類置換は一つの群の中の或る成員を同じ群の中の別の成員に交換することを含み、これに対して非同類置換は、これらのクラスのうち或るものの成員を別のものの成員に交換することを必要とする。非同類置換によって得られる変異体は、得られる変異体の生物学的性質／機能に有意な変化を産むと予想され、ＴＲＡＦ変異体が独占的にまたは主としてＴＮＦ−Ｒ２により仲介される場合、ＴＮＦ生物活性を遮断するＴＲＡＦ変異体をもたらし得る。様々な種間で、そして／またはＴＲＡＦファミリーの様々なレセプター間で保存されているアミノ酸位置は、一般に、目標が生物学的機能の保持である場合、相対的に保存的に置換されている。
【００９４】
アミノ酸配列の除去は一般に約１から３０残基まで、より好ましくは約１ないし１０残基の範囲であり、典型的には隣接している。除去はＴＮＦ−Ｒ２細胞内ドメインとの相互作用に直接関与しない領域中に導入することができる。
【００９５】
アミノ酸配列の挿入は、長さが１残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一もしくは複数アミノ酸残基の配列内挿入を包含する。配列内挿入（即ち、ＴＲＡＦ蛋白アミノ酸配列内部への挿入）は一般に、約１ないし１０残基、より好ましくは１ないし５残基、最も好ましくは１ないし３残基の範囲であり得る。末端挿入の例には、細菌組換え細胞培養中での直接発現の所産である、Ｎ末端メチオニン残基を有するＴＲＡＦポリペプチド、および、組換え宿主細胞からの成熟ＴＲＡＦの分泌を促進させるための、ＴＲＡＦ分子のＮ末端へのヘテロローガスなＮ末端シグナル配列の融合が包含される。このようなシグナル配列は一般に、意図される宿主細胞の種から得られ、従ってこれとホモローガスであろう。好適な配列には、大腸菌のためのＳＴIIまたはｌｐｐ、酵母のためのα因子、および哺乳動物細胞のためのヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルが包含される。
【００９６】
天然ＴＲＡＦ分子のその他の挿入変異体は、免疫原性ポリペプチド、例えば細菌性ポリペプチド、例えばβラクタマーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐ遺伝子座によりコードされている酵素、または酵母蛋白への、ＴＲＡＦ分子のＮまたはＣ末端の融合、および、１９８９年４月６日公開のＷＯ８９／０２９２２に記載の、半減期の長い蛋白、例えば免疫グロブリン領域（好ましくは免疫グロブリン不変領域）、アルブミン、またはフェリチンを用いたＣ末端融合を包含する。
【００９７】
変異体ＴＲＡＦの性質を前もって予測することはしばしば困難であるため、最適な変異体を選択するためにスクリーニングを必要とすることは理解できるであろう。この目的のため、下記のような生化学的スクリーニング検定が容易に利用できるであろう。
【００９８】
天然ＴＲＡＦ２蛋白の好ましいアミノ酸配列変異体は天然蛋白のアミノ酸８７−５０１を含み、ＴＲＡＦ２（８７−５０１）と呼称される。ＲＩＮＧフィンガードメインを欠くこの変異体は、ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０およびＬＭＰ１と相互作用する能力を保持するが、ＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達においては全く不完全である。
【００９９】
３．クローニング伝達体中へのＤＮＡの挿入
天然または変異体ＴＲＡＦをコードしている核酸が得られたならば、一般に、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のためにこれを複製可能な発現ベクター中にライゲーションする。
【０１００】
発現およびクローニングベクターは、当分野で良く知られており、そのベクターを１またはそれ以上の選ばれた宿主細胞中で複製することを可能にする核酸を含んでいる。適当なベクターの選択は、１）それがＤＮＡ増幅に使用されるのかまたはＤＮＡ発現に使用されるのか、２）ベクター中に挿入されるＤＮＡの大きさ、および、３）ベクターにより形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各々のベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する宿主細胞に応じて様々な構成成分を含んでいる。ベクターの構成成分は一般に、１またはそれ以上の以下のもの：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終止配列を含むが、これらに限定される訳ではない。
【０１０１】
(i)シグナル配列成分
一般に、シグナル配列はベクターの構成成分であってよく、またはこれは、ベクター中に挿入されるＴＲＡＦ分子の一部であってよい。シグナル配列がヘテロローガスである場合、それは宿主細胞によって認識され且つ処理される（即ちシグナルペプチダーゼにより開裂される）ように選択せねばならない。
ＴＲＡＦ分子は細胞内蛋白であるため、これらは天然シグナル配列を持っていそうにない。原核生物宿主細胞に好適なヘテロローガスなシグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーのような原核生物シグナル配列である。酵母の分泌のためには、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーを使用することができる。哺乳動物細胞の発現においては哺乳動物シグナル配列が適当である。
【０１０２】
(ii)複製起点成分
発現およびクローニングベクターの両者は、そのベクターを１またはそれ以上の選ばれた宿主細胞で複製できるようにする核酸配列を含んでいる。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、そのベクターを宿主染色体とは独立して複製できるようにする配列であって、複製起点または自立的複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母、およびウイルスについて良く知られている。周知のプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は殆どのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。複製起点は哺乳動物の発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含むという理由でのみ典型的に使用され得る）。殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクターであり、即ちこれらは少なくとも一つのクラスの生物で複製可能であるが、発現のため別の生物中にトランスフェクトすることができる。例えば、或るベクターは大腸菌中でクローニングされ、次いでその同じベクターが、たとえそれが宿主細胞染色体と独立して複製できなくても、発現のため酵母または哺乳動物細胞中にトランスフェクトされる。
【０１０３】
ＤＮＡは宿主ゲノム中への挿入によってクローニングすることもできる。これは、バシルス種を宿主に用いて、例えば、バシルスゲノムＤＮＡ中に見いだされる配列に相補的なＤＮＡ配列を該ベクターに含ませることによって容易に達成される。このベクターによるバシルスのトランスフェクションは、ゲノムによるホモローガスな組換えおよび所望のヘテロローガスポリペプチドをコードしているＤＮＡの挿入をもたらす。しかし、ゲノムＤＮＡの回収は、コードされているポリペプチド分子の切除に制限酵素消化を必要とするため、外因性複製ベクターの回収より複雑である。
【０１０４】
(iii)選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいなければならない。これは、ベクターにより形質転換された宿主細胞の生存または生育に必要な蛋白をコードしている遺伝子である。この遺伝子の存在は、該ベクターを欠失する任意の宿主細胞が、形質転換された宿主を上回る生育または再生の点での利点を獲得しないことを確実にする。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性突然変異体の欠失を補完し、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、蛋白をコードしている（例えばバシルスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子）。
【０１０５】
選択計画の一例は、宿主細胞の生育を停止させる薬物を利用する。ヘテロローガスな遺伝子によってうまく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与する蛋白を発現し、よって選択処方中で生き残る。このような顕著な選択の例は、薬物ネオマイシン［サザン等、J.Molec.Appl.Genet.、１巻３２７頁（１９８２）］、ミコフェノール酸［ミュリガン等、Science、２０９巻１４２２頁（１９８０）］またはハイグロマイシン［サグデン等、Mol.Cell.Biol.、５巻４１０−４１３頁（１９８５）］を使用する。上に挙げた３つの例は、細菌遺伝子を真核生物の調節の下で使用して、それぞれ適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を伝達する。
【０１０６】
哺乳動物細胞のためのその他の好適な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、所望の核酸の取り込みについてコンピテントな細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体を、マーカーを取り込んだために形質転換体のみが特異に適合して生き残るという選択圧の下に置く。培地中の選択薬物の濃度を連続的に変化させる条件の下で形質転換体を培養することによって選択圧を課し、それにより選択遺伝子および所望ポリペプチドをコードしているＤＮＡの両者の増幅を導く。増幅は、生育に必須の蛋白の産生にとって極めて重要な遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体内部で縦に反復される工程である。増幅されたＤＮＡから、増加した量の所望ポリペプチドが合成される。
【０１０７】
例えば、ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠く培地中で全形質転換体を培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞をまず同定する。この場合の適当な宿主細胞は、ウアラウプおよびチェイシン、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６頁（１９８０）による記載のように調製され増殖される、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインである。特に有用なＤＨＦＲは、ＭＴＸに対し高度に耐性である突然変異体ＤＨＦＲである（ＥＰ１１７０６０）。この選択薬剤は、内因性ＤＨＦＲの存在にも拘わらず、その他の点で適当な任意の宿主、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１ ＣＨＯ−Ｋ１と共に使用することができる。次に、ＤＨＦＲおよび所望ポリペプチドをそれぞれコードしているＤＮＡを、ＤＨＦＲを失活させる薬物（メソトレキサート、またはＭＴＸ）に暴露することにより、増幅する。次の回に常により高濃度のＭＴＸ中で生育できる細胞のみを選択することにより、その細胞がより多くのＤＨＦＲを必要とする（その結果全ての外因性ＤＮＡが増幅する）ことが確実になる。別法として、所望ポリペプチド、野生型ＤＨＦＲ、およびｎｅｏ遺伝子のような別の選択マーカーをコードしている遺伝子により同時形質転換された宿主を、Ｇ４１８のようなその選択マーカーのための選択薬剤を用いて同定し、次いで内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主においてメソトレキサートを用いて選択および増幅することができる。［米国特許第４９６５１９９号を参照されたい］。
【０１０８】
酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である［スティンチコウム等、Nature、２８２巻３９頁（１９７９）；キングズマン等、Gene、７巻１４１頁（１９７９）；またはチェンパー等、Gene、１０巻１５７頁（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する［ジョーンズ、Genetics、８５巻１２頁（１９７７）］。そうすると、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在が、トリプトファン不在下での生育による形質転換の検出のための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母株(ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０１０９】
(iv)プロモーター成分
クローニングベクターと異なり発現ベクターは、宿主生物により認識され且つ所望ポリペプチドをコードしている核酸と機能的に結合しているプロモーターを含んでいなければならない。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流に位置する（一般に約１００ないし１０００ｂｐ以内）翻訳されない配列であって、それらの調節下にある核酸の転写および翻訳を調節する。これらは典型的には二つのクラス、誘導性および構成性に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば或る栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答したそれらの調節の下で、ＤＮＡからの増強されたレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点において、可能性ある様々な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが良く知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によりそれらを供給源の遺伝子から取り出し、その後、発現されるべきポリペプチドのための開始コドンの５'に挿入することにより、所望ポリペプチドをコードしているＤＮＡと機能的に結合させる。ＴＲＡＦポリペプチドのためのゲノムプロモーターは使用できないとは言えない。しかし、一般にヘテロローガスなプロモーターは、天然ＴＲＡＦプロモーターと比較してより多くの転写および高収量の発現ＴＲＡＦをもたらすであろう。
【０１１０】
原核生物宿主と共に使用するのに好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［チャング等、Nature、２７５巻６１５頁（１９７８）；およびゲッデル等、Nature、２８１巻５４４頁（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［ゲッデル、Nucleic Acids Res.、８巻４０５７頁（１９８０）およびＥＰＯ出願公開第３６７７６号］およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター［H.デボーア等、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA、８０巻２１−２５頁（１９８３）］が包含される。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターもまた好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって当業者は、必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、ＴＲＡＦをコードしているＤＮＡにそれらを機能的にライゲーションすることができる［ジーベンリスト等、Cell、２０巻２６９頁（１９８０）］。細菌系に使用するためのプロモーターはさらに、ＴＲＡＦをコードしているＤＮＡに機能的に結合したシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列をも含んでいるであろう。
【０１１１】
酵母宿主と共に使用するための好適なプロモーター配列は、３−ホスホグリセラートキナーゼ［ヒッツェマン等、J.Biol.Chem.、２５５巻２０７３頁（１９８０）］またはその他の解糖酵素［ヘス等、J.Adv.Enzyme Reg.、７巻１４９頁（１９７８）；およびホランド、Biochemistry、１７巻４９００頁（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルク卜キナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。
【０１１２】
増殖条件により転写が調節されるというさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、その他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を司る酵素のプロモーター領域である。酵母の発現で用いられる好適なベクターおよびプロモーターは、R.ヒッツェマン等、ＥＰ７３６５７Ａにさらに記載されている。酵母のエンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１１３】
真核生物のためのプロモーター配列が知られている。実際全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域を持っている。多くの遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見いだされるもう一つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域（ここでＸは任意のヌクレオチドであってよい）である。殆どの真核生物遺伝子の３'末端には、コーディング配列の３'末端にポリＡ尾を付加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て哺乳動物の発現ベクター中に適当に挿入される。
【０１１４】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＴＲＡＦ転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合し得る限り、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス［１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４］、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥の肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、ヘテロローガスな哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱衝撃プロモーターから、そしてＴＲＡＦ配列に通常付随するプロモーターから得られるプロモーターによって調節される。
【０１１５】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる［フィアス等、Nature、２７３巻１１３頁（１９７８）、ミュリガンおよびバーグ、Science、２０９巻１４２２−１４２７頁（１９８０）；パヴラキス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７８巻７３９８−７４０２頁（１９８１）］。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、ＨｉｎｄIII Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる［グリーナウェイ等、Gene、１８巻３５５−３６０頁（１９８２）］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系がＵＳ４４１９４４６に開示されている。この系の修飾はＵＳ４６０１９７８に記載されている。さらに、サルの細胞におけるヒト免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現に関するグレイ等、Nature、２９５巻５０３−５０８頁（１９８２）；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関するレイエス等、Nature、２９７巻５９８−６０１頁（１９８２）；培養されたマウスおよびウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現に関するキャナーニおよびバーグ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻５１６６−５１７０頁（１９８２）；ならびに、プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を用いた、ＣＶ−１サル腎臓細胞、鶏の胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＨＩＮ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現に関するゴーマン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７９巻６７７７−６７８１頁（１９８２）を参照されたい。
【０１１６】
(v)エンハンサー要素成分
本発明に係るＴＲＡＦをコードしているＤＮＡの、高等真核生物による転写は、しばしばベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強される。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常約１０から３００ｂｐまでの、ｃｉｓ作動要素のＤＮＡである。エンハンサーは相対的に、方向および位置に独立しており、転写ユニットの５'［ライミンズ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７８巻９９３頁（１９８１）］および３'［ラスキー等、Mol.Cell Biol.、３巻１１０８頁（１９８３）］、イントロン内部［バネルジ等、Cell、３３巻７２９頁（１９８３）］、ならびにコーディング配列自身の内部［オスボーン等、Mol.Cell Biol.、４巻１２９３頁（１９８４）］に、見いだされている。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが包含される。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素についてのヤニヴ、Nature、２９７巻１７−１８頁（１９８２）もまた参照されたい。エンハンサーはＴＲＡＦ ＤＮＡの５'または３'位でベクター中にスプライスすることができるが、好ましくはプロモーターの５'部位に位置させる。
【０１１７】
(vi)転写終止成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、人間、または他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターはさらに、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むであろう。このような配列は普通、真核生物のまたはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５'および時には３'非翻訳領域から取得することができる。これらの領域は、ＴＲＡＦをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含んでいる。
【０１１８】
上に列挙された構成成分の１またはそれ以上、所望のコード化および調節配列を含む適当なベクターの組み立てには、標準的ライゲーション技術を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂させ、整え、そして必要なプラスミドの生成のために望まれる型に再ライゲーションする。
【０１１９】
組み立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、そして／またはメシング等、Nucleic Acids Res.、９巻３０９頁（１９８１）の方法によって、またはマクサム等、Methods in Enzymology、６５巻４９９頁（１９８０）の方法によって配列決定する。
【０１２０】
哺乳動物細胞においてＴＲＡＦをコードしているＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施において特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、その発現ベクターによりコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効率的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる一過性発現系は、クローンＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便な正の同定、および、所望の生物学的または生理学的性質についての係るポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。よって、一過性発現系は、ＴＲＡＦの類似体および変異体を同定する目的のために本発明において特に有用である。
【０１２１】
組換え脊椎動物細胞培養でのＴＲＡＦポリペプチドの合成に当てはめるのに好適なその他の方法、ベクター、および宿主細胞は、ゲティング等、Nature、２９３巻６２０−６２５頁（１９８１）；マンテル等、Nature、２８１巻４０−４６頁（１９７９）；レヴィンソン等；ＥＰ１１７０６０およびＥＰ１１７０５８に記載されている。ＴＲＡＦポリペプチドの哺乳動物細胞培養発現にとって特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５［ＥＰ３０７２４７］である。
【０１２２】
(vii)ベクターの組み立ておよび分析
上に列挙された構成成分の１またはそれ以上を含む適当なベクターの組み立てには、標準的ライゲーション技術を使用する。分離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂させ、整え、そして必要なプラスミドの生成のために望まれる型に再ライゲーションする。
【０１２３】
組み立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、そして／またはメシング等、Nuclei Acids Res.、９巻３０９頁（１９８１）の方法によって、またはマクサム等、Methods in Enzymology、６５巻４９９頁（１９８０）の方法によって配列決定する。
【０１２４】
(viii)一過性発現ベクター
哺乳動物細胞においてＴＲＡＦポリペプチドをコードしているＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施において特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、その発現ベクターによりコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効率的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。サムブルック等、上記、１６．１７−１６．２２頁。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる一過性発現系は、所望の生物学的または生理学的性質についての係るポリペプチドの簡便な正のスクリーニングを可能にする。よって、一過性発現系は、ＴＲＡＦの生物活性を有する天然ＴＲＡＦポリペプチドの類似体および変異体を同定する目的のために本発明において特に有用である。
【０１２５】
(ix)好適な脊椎動物細胞ベクターの例
組換え脊椎動物細胞培養でのＴＲＡＦポリペプチド（天然蛋白の機能的誘導体を包含する）の合成に当てはめるのに好適なその他の方法、ベクター、および宿主細胞は、ゲシング等、Nature、２９３巻６２０−６２５頁（１９８１）；マンテイ等、Nature、２８１巻４０−４６頁（１９７９）；レヴィンソン等、ＥＰ１１７０６０；およびＥＰ１１７０５８に記載されている。ＴＲＡＦポリペプチドの哺乳動物細胞培養発現にとって特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７）またはｐＳＶＩ６Ｂ[ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０８２９１号]である。
【０１２６】
Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換
本明細書に記載のベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、または上記の高等真核生物細胞である。適当な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば大腸菌、またはバシルスを包含する。好ましいクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、シュードモナス種、またはセラティア・マルセサンスのようなその他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物もまた適当である。
【０１２７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、本発明に係るベクターのための好適な宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアエ、またはパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、幾つかのその他の属、種、および菌株、例えばS.ポンベ［ビーチおよびナース、Nature、２９０巻１４０頁（１９８１）］、クルイヴェロミセス・ラクティス［ルーヴェンコート等、J.Bacteriol.、７３７頁（１９８３）］；ヤロウィア［ＥＰ４０２２２６］；ピチア・パストリス［ＥＰ１８３０７０］、トリコデルマ・リーシア［ＥＰ２４４２３４］、ニューロスポラ・クラッサ［ケイス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７６巻５２５９−５２６３頁（１９７９）］；およびアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニデュランス［バランス等、Biochem.Biophys.Res.Commun.、１１２巻２８４−２８９頁（１９８３）；ティルバーン等、Gene、２６巻２０５−２２１頁（１９８３）；イェルトン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻１４７０−１４７４頁（１９８４）］およびＡ．ニガー［ケリーおよびハインズ、EMBO J.、４巻４７５−４７９頁（１９８５）］が一般的に利用でき且つ本発明において有用である。
【０１２８】
好適な宿主細胞は多細胞生物からも誘導される。このような宿主細胞は、複雑な処理およびグリコシル化活動が可能である。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養由来の如何に拘わらず、任意の高等真核生物細胞培養が使用可能であるが、人間のような哺乳動物由来の細胞が好ましい。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が包含される。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに、スポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蛾）、アエデス・アルボピクトゥス（蛾）、ドゥロソフィラ・メランガスター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリ宿主細胞のような宿主からの対応する受容可能な昆虫宿主細胞が特定されている。例えば、ラッコウ等、Bio/Technology、６巻４７−５５頁（１９８８）；ミラー等、Genetic Engineering、J.K.セットロウ等編、８巻（プレナム・パブリッシング、１９８６）、２７７−２７９頁；およびマエダ等、Nature、３１５巻５９２−５９４頁（１９８５）を参照されたい。このような様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異体が一般に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明に従い本明細書に記載のウイルスとして、特にスポドブテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使用することができる。
【０１２９】
綿花、トウモロコシ、馬鈴薯、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコといった植物細胞培養を宿主として利用できる。典型的には、ＴＲＡＦ ＤＮＡを含むよう前もって操作しておいた細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの或る菌株と共にインキュベートすることにより、植物細胞をトランスフェクトする。Ａ．トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、ＴＲＡＦをコードしているＤＮＡがその植物細胞宿主に移され、これがトランスフェクトされ、そして適当な条件の下でＴＲＡＦ ＤＮＡを発現する。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合し得る調節およびシグナル配列が利用できる。デピッカー等、J.Mol.Appl.Gen.、１巻５６１頁（１９８２）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化または増強することができる。１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６を参照されたい。
【０１３０】
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、自体良く知られている。ティシュー・カルチャー、アカデミック・プレス、クルースおよびパターソン編（１９７３）を参照されたい。有用な哺乳動物宿主セルラインの例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１ライン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓セルライン［２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞。グラハム等、J.Gen.Virol.、３６巻５９頁（１９７７）］；ハムスター乳児腎細胞９ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ、ウアラウプおよびチェイシン、Proｃ.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４２１６頁（１９８０）］；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４、マザー、Biol.Reprod.、２３巻２４３−２５１頁（１９８０）］；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞［マザー等、Annals.N.Y.Acad.Sci.、３８３巻４４０６８頁（１９８２）］；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌セルライン（Ｈｅｐ Ｇ２）である。好ましい宿主細胞はヒト胚腎臓２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【０１３１】
本発明の目的にとって特に好ましい宿主細胞は、ＴＲＡＦポリペプチドを産生する脊椎動物細胞である。
【０１３２】
もう一つの特に好ましい態様において、本発明に係るＴＲＡＦポリペプチドは昆虫細胞で発現される。この発現は、例えば、ファーミノゲン、サンディエゴから市販品を入手し得るバキュロウイルス発現キット（バキュロゴールド）を用いてＨｉ５昆虫細胞（インビトロゲン、サンディエゴ）で行うことができる。
【０１３３】
宿主細胞をトランスフェクトし、そして好ましくは上記の発現またはクローニングベクターにより形質転換し、プロモーターの誘導または増幅された遺伝子を含む形質転換体の選択にとって適当であるよう修飾した常套的栄養培地で培養する。
【０１３４】
Ｅ．宿主細胞の培養
本発明に係るＴＲＡＦポリペプチドの産生に使用される原核細胞は、サムブルック等、上記、に一般的に記載されるような適当な培地で培養される。
【０１３５】
哺乳動物細胞は様々な培地で培養することができる。ハムのＦ１０（シグマ）、最少必須培地（ＭＥＭ、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）のような市販品が入手できる培地が、当該宿主細胞の培養に適している。さらに、ハムおよびワレス、Meth.Enzymol.、５８巻４４頁（１９７９）、バーンズおよびサトー、Anal.Biochem.、１０２巻２５５頁（１９８０）、ＵＳ４７６７７０４；４６５７８６６；４９２７７６２；もしくは４５６０６５５；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５または米国特許Ｒｅ．３０９８５に記載される任意の培地を当該宿主細胞のための培養基として使用することができる。これらの培地はいずれも、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（最終濃度が通常マイクロモルの範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を、必要に応じて添加することができる。他の必要な添加物もまた、当業者により知られる適当な濃度で含有させることができる。温度、ｐＨ等といった培養条件は、場合によってはクローニングまたは発現のために選択された宿主細胞についてかつて用いられた条件であるのが適当であり、当業者には明らかであろう。
【０１３６】
本明細書中で言及される宿主細胞は、インビトロ細胞培養中の細胞および宿主動物または植物内にある細胞を包含する。
【０１３７】
さらに、本発明に係るＴＲＡＦポリペプチドは、ホモローガスな組換えによって、または、特定のＴＲＡＦをコードしているＤＮＡを既に含んでいる細胞中に導入された調節要素を利用する組換え生産法を用いて生産することができるということが考えられる。
【０１３８】
Ｆ．遺伝子の増幅／発現の検出
遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、本明細書中に供される配列に基づき、適当に標識されたプローブを用いて、常套的サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング［トマス、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻５２０１−５２０５頁（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイトゥハイブリダイゼーションによって直接試料中で測定することができる。様々な標識、最も一般的には放射性同位元素、特に３２Ｐが使用できる。しかしながら、ポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドの使用といったようなその他の技術を利用することもできる。次いでこのビオチンは、多岐にわたる標識、例えば放射性核種、蛍光剤、酵素等で標識することのできるアビジンまたは抗体への結合部位として働く。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−蛋白二本鎖を包含する特異的二本鎖を認識できる抗体を使用することもできる。次いで、抗体を標識し、二本鎖が表面に結合しているところで検定を実施し、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在が検出できる。
【０１３９】
別法として、遺伝子の発現を、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養または体液の検定といった免疫学的方法により測定して、遺伝子産物の発現を直接定量することもできる。免疫組織化学的染色技術では、典型的には脱水および固定により細胞試料を作成し、その後、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常、酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等のような視覚的に検出できるものである。本発明における使用に好適な特に鋭敏な染色技術は、シュー等、Am.J.Clin.Pharm.、７５巻７３４−７３８頁（１９８０）に記載されている。
【０１４０】
試料液の免疫組織化学的染色および／または検定に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであってよく、任意の動物で作成することができる。簡便には、この抗体は、下にさらに記載されるように、天然ＴＲＡＦポリペプチドに対して、または本明細書に供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して作製することができる。
【０１４１】
Ｇ．ＴＲＡＦポリペプチドの精製
ＴＲＡＦポリペプチドは典型的には宿主細胞溶菌液から回収する。
ＴＲＡＦポリペプチドがヒト起源以外の組換え細胞で発現される場合、このＴＲＡＦは、ヒト起源の蛋白またはポリペプチドを全く含んでいない。しかし、ＴＲＡＦに関して実質上均質な調製品を得るためには、ＴＲＡＦ蛋白を組換え細胞蛋白またはポリペプチドから精製することが必要である。第一段階として、培養基または溶菌液を遠心して粒状の細胞破片を除去する。次に、膜および可溶性蛋白画分を分離する。次いで、ＴＲＡＦ蛋白を可溶性蛋白画分から精製することができる。以下の方法は、好適な精製法の例である：免疫親和またはイオン交換カラム上での分画；エタノール沈澱化；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈澱化；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；およびＩｇＧのような夾雑物を除くためのプロテインＡセファロースカラム。特異的精製法は上に記載されている。
【０１４２】
残基が除去され、挿入され、そして／または置換されたＴＲＡＦ機能的誘導体は、その変化により惹起された性質の実質的変化を考慮に入れて、天然レセプター鎖と同じ様式で回収される。例えば、ＴＲＡＦ蛋白と、別の蛋白またはポリペプチド、例えば細菌またはウイルス抗原との融合物は、精製を促進し；当該抗原に対する抗体を含む免疫親和カラムを用いて該融合物を吸着することができる。ウサギポリクローナル抗ＴＲＡＦカラムのような免疫親和カラムを使用して、少なくとも１個の残存している免疫エピトープに結合させることにより、ＴＲＡＦ変異体を吸着することができる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターもまた、精製中の蛋白分解的減成を阻害するのに有用であり、また、偶発的汚染物質の生育を防止するため、抗生物質を含有させることができる。本発明に係るＴＲＡＦ蛋白は、ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと特異的に関係する能力に基づき、親和クロマトグラフィーによって簡便に精製される。
【０１４３】
当業者には、天然ＴＲＡＦに好適な精製法は、組換え細胞培養中での発現時の天然ＴＲＡＦまたはその変異体の性質の変化を説明できる修飾が必要となり得るという事が理解できるであろう。
【０１４４】
Ｈ．ＴＲＡＦポリペプチドの共有結合的修飾
ＴＲＡＦの共有結合的修飾は本発明の範囲内に包含される。このような修飾は、選ばれた側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体形成試薬とＴＲＡＦの標的アミノ酸残基を反応させることによって、または、選ばれた組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって、常套的に導入される。得られた共有結合的誘導体は、生物活性、ＴＲＡＦのイムノアッセイ、または組換え体の免疫親和精製のための抗ＴＲＡＦレセプター抗体の作製のために重要な残基の同定を目的とする計画に有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後の蛋白の生物活性の完全な失活は、少なくとも１個のアルギニンまたはリジン残基がその活性に必須であることを示唆するものであり、その後、選ばれた条件下で修飾された個々の残基を、修飾されたアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの分離によって同定する。このような修飾は当分野における通常の知識の範囲内にあり、過度の実験をすることなく実施される。
【０１４５】
システイン残基は、最も一般的にはα−ハロアセタート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により、誘導体化される。
【０１４６】
ヒスチジン残基はｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジン側鎖に対し相対的に特異的であるためである。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、この反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６．０で実施する。
【０１４７】
リジンおよびアミノ末端残基は無水琥珀酸またはその他のカルボン酸無水物と反応する。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の好適な試薬は、イミドエステル類、例えばメチルピコリンイミダート；燐酸ピリドキサル；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応を包含する。
【０１４８】
アルギニン残基は１または数種の常套的試薬との反応により修飾され、それらの中にはフェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、アルギニンのε−アミノ基と同様リジンの基とも反応するかも知れない。
【０１４９】
チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基へのスペクトル標識の導入に特段の興味を伴って行われる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体が形成される。チロシン残基は、ラジオイムノアッセイに使用するための標識化蛋白を製造するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化される。
【０１５０】
カルボキシ側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオンとの反応により、アスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。
【０１５１】
グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば、対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。別法としてこれらの残基は緩和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基はいずれの型も本発明の範囲内にある。
【０１５２】
その他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン、スレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（T.E.クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、W.H.フリーマン・アンド・Ｃｏ．、サンフランシスコ、７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシ基のアミド化が包含される。この分子はさらに、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５５３４（１９９０年５月３１日公開）または米国特許４６４０８３５；４４９６６８９；４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２または４１７９３３７に開示される方法で、非蛋白性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類に共有結合させることができる。
【０１５３】
二価の試薬による誘導体形成は、ＴＲＡＦとポリペプチドとの分子内凝集体の製造にとって、そして検定または親和精製で使用するための、水不溶性支持体マトリックスまたは表面へのＴＲＡＦポリペプチドの架橋にとって有用である。さらに、鎖間架橋の研究は、コンホメーション構造に関する直接の情報を提供するであろう。一般的に用いられる架橋剤は、１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、ホモ二価イミドエステル類、および二価マレイミド類を包含する。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような誘導体形成試薬は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化中間体を生成する。別法として、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスおよび米国特許第３９５９６４２号；３９６９２８７号；３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号；４０５５６３５号；および４３３０４４０号に記載の系反応性基質が、蛋白の固定および架橋に使用される。
【０１５４】
ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドへの組換え宿主細胞の作用の所産である。グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基へと翻訳後脱アミド化される。別法として、これらの残基は緩和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内にある。
その他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン、スレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化［T.E.クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、W.H.フリーマン・アンド・Ｃo.、サンフランシスコ、７９−８６頁（１９８３）］が包含される。
【０１５５】
その他の誘導体には、非蛋白性ポリマーと共有結合した本発明に係る新規ペプチドが包含される。非蛋白性ポリマーとは、通常、親水性合成ポリマー、即ち他の状態では天然に見いだされないポリマーである。しかしながら、天然に存在し組換えまたはインビトロ法により産生されるポリマーは有用であり、天然から分離されるポリマーもまた同様である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは本発明の範囲内にある。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエーテル類が特に有用である。
【０１５６】
ＴＲＡＦポリペプチドは、米国特許第４６４０８３５；４４９６６８９；４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２または４１７９３３７号に開示される方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類のような様々な非蛋白性ポリマーに結合させることができる。
【０１５７】
ＴＲＡＦは、例えばコアセルベーション技術または界面重合により製造されたマイクロカプセル内に、コロイド薬物デリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に捕捉することができる。このような技術はレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、１６版、Ａ．オソール編（１９８０）に開示されている。
【０１５８】
Ｉ．ＴＲＡＦのグリコシル化変異体
天然ＴＲＡＦはグリコシル化されていないと信じられているが、グリコシル化されている変異体は本発明の範囲内にある。容易にするため、天然ポリペプチドのグリコシル化パターンにおける変化は、アミノ酸配列変異体に関して上に論じた技術を本質的に使用して、通常ＤＮＡレベルで施す。したがって、グリコシル化シグナルは天然ＴＲＡＦポリペプチドのＤＮＡ配列中に導入することができる。
【０１５９】
本発明に係る分子のＴＲＡＦ分子へのグリコシドの化学的または酵素的結合もまた炭水化物置換基の添加に使用することができる。これらの方法は、Ｏ結合（またはＮ結合）グリコシル化が可能なポリペプチドを産生させる必要が無いという点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシ基、（ｃ）遊離ヒドロキシ基、例えばシステインの遊離ヒドロキシ基、（ｄ）遊離スルフヒドリル基、例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離スルフヒドリル基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合させることができる。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）、およびアプリンおよびリストン、CRC Crit.Rev.Biochem.、２５９−３０６頁に記載されている。
【０１６０】
Ｊ．抗ＴＲＡＦ抗体の製造
（ｉ）ポリクローナル抗体
ＴＲＡＦ分子に対するポリクローナル抗体は一般に、ＴＲＡＦおよびアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物において作製される。ＴＲＡＦまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、二価または誘導体形成試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水琥珀酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である］を用いて、免疫される種において免疫原性である蛋白、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターとコンジュゲートさせることが有用であるかも知れない。
【０１６１】
動物は、コンジュゲート１ｍｇまたは１μｇ（それぞれウサギまたはマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と合し、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後、動物を採血し、抗ＴＲＡＦ抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じＴＲＡＦのコンジュゲートで、但し異なった蛋白にコンジュゲートさせた、そして／または異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた、蛋白融合物として組換え細胞培養中で製造することができる。さらに、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために使用される。
【０１６２】
（ii）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質上均質な抗体の集団、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量存在するかも知れない天然に起こる可能性のある突然変異を除いて同一であるような集団から取得される。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、別々の抗体の混合物ではないという、抗体の性格を示している。
【０１６３】
例えば、本発明に係る抗ＴＲＡＦモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、２５６巻４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、または組換えＤＮＡ法［キャビリー等、米国特許第４８１６５６７号］によって作製することができる。
【０１６４】
ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫に用いられた蛋白と特異的に結合する抗体を産生する、または産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる［ゴディング、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、５９−１０３頁（アカデミック・プレス、１９８６）］。
【０１６５】
このようにして製造されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を好ましくは含有する適当な培養基に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養基は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１６６】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも好ましい骨髄腫セルラインは、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ−２細胞から誘導されるものである。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫セルラインもまた記載されている［コズボア、J.Immunol.、１３３巻３００１頁（１９８４）；ブロデュア等、モノクローナル・アンティボディー・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、５１−６３頁（マーセル・デッカー、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）］。
【０１６７】
ハイブリドーマ細胞が生育している培養基を、ＴＲＡＦに対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、マンソンおよびポラード、Anal.Biochem.、１０７巻２２０頁（１９８０）のスキャッチャード分析により測定することができる。
【０１６８】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生することが確定された後、このクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準法により増殖させることができる。ゴディング、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、５９−１０４頁（アカデミック・プレス、１９８６）。この目的にとって好適な培養基は、例えばダルベッコの改良イーグル培地またはＲＰＭＩ１６４０培地を包含する。加えて、このハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１６９】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和クロマトグラフィーのような常套的免疫グロブリン精製法により、培養基、腹水、または血清から好適に分離される。
【０１７０】
本発明に係るモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に分離および配列決定される。本発明に係るハイブリドーマ細胞は、係るＤＮＡの好ましい供給源として働く。分離されたならば、このＤＮＡは発現ベクター中に入れ、次にこれを、これ以外では免疫グロブリン蛋白を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。このＤＮＡはまた、例えば、ホモローガスなマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖不変ドメインのコード化配列で置換することにより（モリソン等、Proc.Nat.Acad.Sci.、８１巻６８５１頁［１９８４］）、または、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一部または全てを共有結合させることにより、修飾することができる。このようにして、本発明に係る抗ＴＲＡＦモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が作製される。
【０１７１】
典型的には、本発明に係る抗体の不変ドメインを、または本発明に係る抗体の１個の抗原結合部位の可変ドメインを、このような非免疫グロブリンポリペプチドで置換して、ＴＲＡＦに対する特異性を有する１個の抗原結合部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１７２】
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を用いる方法を包含する、合成蛋白化学において知られる方法を用いてインビトロで製造することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエステル結合を形成することにより、組み立てることができる。この目的のための好適な試薬の例は、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートを包含する。
【０１７３】
診断への適用のため本発明に係る抗体は、典型的には、検出可能な原子団で標識されるであろう。検出可能な原子団は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成することのできる任意のものとすることができる。例えば、検出可能な原子団は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位元素、蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリン；ビオチン；放射性同位元素標識、例えば１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、または３Ｈ、または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであってよい。
【０１７４】
ハンター等、Nature、１４４巻９４５頁（１９６２）；デイヴィッド等、Biochemistry、１３巻１０１４頁（１９７４）；ペイン等、J.Immunol.Meth.、４０巻２１９頁（１９８１）；およびニグレン、J.Histochem.and Cytochem.、３０巻４０７頁（１９８２）に記載の方法を包含する、検出可能な原子団に抗体を別々にコンジュゲートするための当分野で知られる任意の方法を使用することができる。
【０１７５】
本発明に係る抗体は、競合的結合検定、直接および間接サンドイッチ検定、および免疫沈降検定といったような任意の既知の検定法に使用することができる。ゾラ、モノクローナル・アンティボディーズ：ア・マニュアル・オブ・テクニークス、１４７−１５８頁（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．、１９８７）。
【０１７６】
競合的結合検定は、標識された標準（これはＴＲＡＦポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分であってよい）が限られた量の抗体との結合について被験試料検体（ＴＲＡＦ）と競合する能力に依るものである。被験試料中のＴＲＡＦの量は、抗体と結合するようになる標準の量と逆比例する。結合するようになる標準の量の測定を容易にするため、抗体は一般に競合の前または後に不溶化し、その結果、抗体に結合する標準および検体が、未結合のままである標準および検体から簡便に分離され得るようにする。
【０１７７】
サンドイッチ検定は二つの抗体の使用を含み、各々が、検出すべき蛋白の異なる免疫原性部分またはエピトープと結合することができる。サンドイッチ検定においては、被験試料検体は、固体支持体上に固定された第一の抗体と結合し、その後第二の抗体が検体と結合し、こうして不溶性三部複合体が形成される。デイヴィッドおよびグリーン、米国特許第４３７６１１０号。第二の抗体は、検出可能な原子団で自身標識されていてよく（直接サンドイッチ検定）、または検出可能な原子団で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することもできる（間接サンドイッチ検定）。例えば、サンドイッチ検定の一つの型はＥＬＩＳＡ検定であり、この場合、検出可能な原子団は酵素である。
【０１７８】
（iii）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で良く知られている。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターおよび共同研究者の方法［ジョーンズ等、Nature、３２１巻５２２−５２５頁（１９８６）；リーチマン等、Nature、３３２巻３２３−３２７頁（１９８８）；ベルホーエン等、Science、２３９巻１５３４−１５３６頁（１９８８）］に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されている、キメラ抗体である（キャビリー等、上記）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基およびことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１７９】
抗体は、抗原に対する高親和性およびその他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい態様によれば、親配列および様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を製造する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における当該残基の可能な役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析、が可能となる。このようにして共通および移入配列からＦＲ残基を選択しそして結びつけることができ、その結果、所望の抗体の性格、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接且つ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。さらなる詳細については、１９９１年６月１４日出願の出願番号第０７／７１５２７２号の一部継続出願である１９９２年８月２１日出願の米国出願第０７／９３４３７３号を参照されたい。
【０１８０】
別法として、免疫時に内因性免疫グロブリンの産生無しにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできる、形質転換動物（例えば、マウス）を作ることが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、ジャコボヴィッツ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９０巻２５５１−２５５頁（１９９３）；ジャコボヴィッツ等、Nature、３６２巻２５５−２５８頁（１９９３）を参照されたい。
【０１８１】
（iv）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。本発明の場合、一方の結合特異性はＴＲＡＦに対するものであり、他方は他の任意の抗原、好ましくは別のレセプターまたはレセプターサブユニットに対するものである。例えば、二つの異なるＴＲＡＦ、またはＴＮＦレセプター（好ましくはＴＮＦ−Ｒ２）およびＴＲＡＦと特異結合する二重特異性抗体は本発明の範囲内にある。
【０１８２】
二重特異性抗体を作製する方法は当分野において既知である。
常套的には、二重特異性抗体の組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの二つの重鎖は異なる特異性を持っている［ミルシュタインおよびキュエロ、Nature、３０５巻５３７−５３９頁（１９８３）］。免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、親和クロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、そして生成物の収率は低い。同様の方法は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／０８８２９号（１９９３年５月１３日公開）およびトラウネッカー等、EMBO、１０巻３６５５−３６５９頁（１９９１）に開示されている。
【０１８３】
異なったそしてより好ましいアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。この融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ならびに免疫グロブリン重鎖の第二および第三不変領域（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む免疫グロブリン重鎖不変ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖不変領域（ＣＨ１）を、融合物の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合物、および、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。この事により、組み立てに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適の収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらす時、または、その比率が特に重要性を持たない時は、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、一方の腕に第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、そして他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。その二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にするとわかった。このアプローチは、１９９２年８月１７日出願の同時係属出願第０７／９３１８１１号に開示されている。
【０１８４】
二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えばスレッシュ等、Methods inEnzymology、１２１巻２１０頁（１９８６）を参照されたい。
【０１８５】
（ｖ）ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結した二つの抗体で構成される。このような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため［米国特許第４６７６９８０号］、そしてＨＩＶ感染の処置のため［ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９］に提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１８６】
Ｌ．ＴＲＡＦ分子の用途
本発明に係るＴＲＡＦ蛋白の重要な一つの適用は、ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０および／またはエプスタイン−バールウイルストランスフォーミング蛋白ＬＭＰ１の細胞質ドメインと、直接的または間接的に関係する能力に基づくものである。したがって、ＴＲＡＦ蛋白は、ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０および／またはＬＭＰ１により仲介される生物活性のインヒビターを同定する生化学検定に使用することができる。例えば、ＴＮＦ−Ｒ２ ＴＲＡＦ蛋白、例えばＴＲＡＦ２の相互作用のインヒビターは、ＴＮＦの発現に付随する種々の病理学的状態、例えばエンドトキシン（敗血症性）ショックおよび慢性関節リウマチ（ＲＡ）の処置に有用となり得る。同様に、ＬＭＰ１：ＴＲＡＦ（例えばＴＲＡＦ２）相互作用のインヒビターは、ＬＭＰ１オンコジーンにより仲介される病理学的状態の遮断に使用できる。
【０１８７】
好ましくは、これらの検定は、例えばマッチメイカー・二ハイブリッド系（クロンテク）を用いて、本質的には下記の実施例に例示されるように、「二ハイブリッド」検定様式で実施する。ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０またはＬＭＰ１の細胞質ドメインを含む組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白の大規模生産および精製は、実施例に記載のように行う。組換えＴＲＡＦ蛋白の大規模生産のため、対応するＴＲＡＦ ｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系（ファーミノゲン、サンディエゴから入手し得る市販の「バキュロゴールド」発現キット）を用いてＨｉ５昆虫細胞（インビトロゲン、サンディエゴ）において発現させる。組換えＴＲＡＦに、精製を可能にするためのポリヒスチジン標識（実施例４の抗ＴＲＡＦ抗体の産生の記述を参照されたい）、および、インビトロでの放射性標識化のための心筋キナーゼ（シグマ）の認識部位を付ける。生化学的スクリーニング検定をロボット自動化システムで実施するが、そこでは、ＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ２または／ＣＤ４０または／ＬＭＰ１融合蛋白を９６ウェル微量定量プレート中に被覆し、放射標識されたＴＲＡＦ蛋白を種々の化合物の存在下で加える。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄して非結合ＴＲＡＦ蛋白を除去し、捕捉された放射能を計数する。化合物が添加されなかった対照ウェルと比較して低下した捕捉放射能によって、ＴＲＡＦ蛋白およびＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ２／ＣＤ４０／ＬＭＰ１融合蛋白の間の相互作用を防止するインヒビターを同定する。
【０１８８】
特別な態様において、ＴＲＡＦ／ＴＮＦ−Ｒ２、ＴＲＡＦ／ＣＤ４０、および／またはＴＲＡＦ／ＬＭＰ１相互作用のインヒビターは天然ＴＲＡＦの機能的誘導体、例えばアミノ酸配列変異体である。このようなアミノ酸配列変異体の一つは、天然ＴＲＡＦ２とＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０およびＬＭＰ１の相互作用の強力なインヒビターである、天然ＴＲＡＦ２アミノ酸配列のアミノ酸８７−５０１を含む蛋白：ＴＲＡＦ２（８７−５０１）である（実施例６を参照されたい）。ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと特異的に関係するそれらの能力に基づき、本発明に係るＴＲＡＦ分子はＴＮＦ−Ｒ２の精製に使用できるが、一方このＴＮＦ−Ｒ２は、可溶性ＴＮＦ−Ｒ２蛋白として、または免疫グロブリン融合蛋白の形で、ＴＮＦの発現に付随する様々な病理学的状態、例えばエンドトキシン（敗血症性）ショックおよび慢性関節リウマチ（ＲＡ）の処置に有用である。これらのおよびその他の疾病の処置に有効な用量は、常套的実験により決定することができる。ＣＤ４０およびＬＭＰ１は、ＴＲＡＦ蛋白、例えばＴＲＡＦ２がこれらの蛋白に結合する能力を利用して、類似の方法で精製することができる。
【０１８９】
本発明に係るＴＲＡＦ分子はさらに、遮断（アンタゴニスト）またはアゴニスト抗ＴＲＡＦ抗体（これはＴＮＦ−Ｒ２により仲介（全面的にまたは部分的に）されるＴＮＦ生物活性の遮断もしくは模倣に、または該抗体が結合するエピトープを有する他のＴＲＡＦ蛋白の精製に使用することができる）の作成に使用することができる。抗ＴＲＡＦ抗体を作製する遺伝学的方法は上に記載されており、特に実施例４に例示されている。このような抗体は、ＴＲＡＦ／ＴＮＦ−Ｒ２／ＣＤ４０／ＬＭＰ１相互作用のインヒビターの同定のために上に記載されたものと類似の検定系で、アゴニストおよびアンタゴニスト性についてスクリーニングすることができる。
【０１９０】
本発明に係るＴＲＡＦ蛋白を用いて同定されまたは精製された抗体、他のポリペプチドまたは小有機分子を含む、または本発明に係るＴＲＡＦ蛋白（機能的誘導体を包含する）を含む治療用調製品は、所望の純度を有する活性成分を、所望により生理学的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤と混合［レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、１６版、Ａ．オソール編（１９８０）］することにより、凍結乾燥調整品または水溶液の形で保存用に製造される。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度において受容者にとって非毒性であり、燐酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を包含する抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのような蛋白；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プルロニクスまたはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を包含する。
【０１９１】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術または界面重合（それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）により製造されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物デリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に捕捉することもできる。このような技術はレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、上記、に開示されている。
【０１９２】
インビボ投与のために使用される調製物は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、無菌濾過膜での濾過によって容易に達成される。
【０１９３】
本発明に係る治療用組成物は、一般に、無菌取り出し口を有する容器、例えば静脈内溶液用袋または皮下注射針が貫通し得る栓を有するバイアル中に入れる。
【０１９４】
投与経路は既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病変内経路による注射または注入、局所投与、または持続放出系に従う。
【０１９５】
持続放出製剤の好適な例には、成型された材料の形の半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルムまたはマイクロカプセルが包含される。徐放性マトリックスは、ポリエステル類、ヒドロゲル類、ポリラクチド類［米国特許３７７３９１９、ＥＰ５８４８１］、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー［U.シドマン等、Biopolymers、２２（１）巻５４７−５５６頁（１９８３）］、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）［R.ランガー等、J.Biomed.Mater.Res.、１５巻１６７−２７７頁（１９８１）およびR.ランガー、Chem.Tech.、１２巻９８−１０５頁（１９８２）］、エチレンビニルアセタート［R.ランガー等、同］またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸［ＥＰ１３３９８８Ａ］を包含する。持続放出組成物はリポソームをも包含する。本発明の範囲内の分子を含有するリポソームは、自体既知の方法によって製造される：ＤＥ３２１８１２１Ａ；エプシュタイン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８２巻３６８８−３６９２頁（１９８５）；ファング等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７巻４０３０−４０３４頁（１９８０）；ＥＰ５２３２２Ａ；ＥＰ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ；ＥＰ１４２６４１Ａ；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許４４８５０４５および４５４４５４５；ならびにＥＰ１０２３２４Ａ。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ％コレステロール以上である、小さな（約２００−８００オングストローム）単層型のものであり、選択される比率は最適なＮＴ−４療法のために調節される。
【０１９６】
活性分子の有効量は、例えば治療目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。したがって治療者は、最適の治療効果の獲得に必要な用量を滴定し投与経路を修飾する必要があるであろう。典型的な日用量は、上に述べた因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでまたはこれ以上の範囲となろう。典型的には、臨床医は、本発明に係る分子を、必要な生物学的効果を提供する用量に到達するまで投与するであろう。この治療の進行は常套的検定により容易に監視される。
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例から明らかであろう。
【０１９７】
実施例１  ＴＲＡＦ１の精製
Ａ．細胞培養および生物学的試薬
マウスインターロイキン２（ＩＬ−２）依存性細胞障害性ＴセルラインＣＴ６［レインジズ等、J.Immunol.、１４２巻１２０３−１２０８頁（１９８９）］を、１０−２０単位の組換えヒトＩＬ−２（ベーリンガー・マンハイム）、１０−１５％牛胎児血清（ハイクローン）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０−５Ｍβ−メルカプトエタノール、ｍｌ当たり１００単位のペニシリン、およびｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシン（ジブコ／ＢＲＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ヒトＴ細胞リンパ腫ラインジャーカットをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ）より取得し、１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。ヒト胚腎臓セルライン２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）およびｈＴＮＦ−Ｒ２を過剰発現する２９３細胞（２９３／ＴＮＦ−Ｒ２）を、記載に従って維持した［ペニカ等、J.Biol.Chem.、２６７巻２１１７２−２１１７８頁（１９９２）］。組換えｈＴＮＦおよび組換えｍＴＮＦ（比活性＞１０７単位／ｍｇ）はジェネンテク・マニュファクチュアリング・グループにより提供された。ウサギ抗ヒトおよび抗マウスＴＮＦ−Ｒ２抗体はかつて記載された［ペニカ等、上記；タータグリア等、J.Biol.Chem.、２６７巻４３０４−４３０７頁（１９９１）］。抗ヒトＴＮＦ−Ｒ１モノクローナル抗体９８６（ＩｇＧ２ａイソタイプ）および抗ヒトＴＮＦ−Ｒ２モノクローナル抗体１０３６、１０３５および１０３８（それぞれＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂイソタイプ）は記載のようにして作製した［ペニカ等、Biochemistry、３１巻１１３４−１１４１頁（１９９２）］。
【０１９８】
Ｂ．ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの突然変異分析
ＴＮＦにより誘導されるマウスＣＴ６細胞の増殖は７５ｋｄＴＮＦレセプターにより仲介されることが示された［ＴＮＦ−Ｒ２；タータグリア等、１９９１、上記］。さらに、ＴＮＦ−Ｒ２は転写因子ＮＦ−κＢを活性化し［レナードおよびバルティモア、Cell、５８巻２２７−２２９頁（１９８９）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子［ミヤタケ等、EMBO J.、４巻２５６１−２５６８頁（１９８５）；スタンレイ等、EMBO J.、４巻２５６９−２５７３頁（１９８５）］およびＡ２０亜鉛フィンガー蛋白遺伝子［オピパリ等、J.Biol.Chem.、２６５巻１４７０５−１４７０８頁（１９９０）］の転写誘導をＣＴ６細胞中で仲介する（図１）。
【０１９９】
ＴＮＦシグナル伝達に必要なｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン（ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ）内の配列を同定するため、末端切除された細胞内ドメインを有するレセプターをコードしている一連の突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２発現ベクターを作成した。Ｃ末端切除されているｈＴＮＲ−Ｒ２ｉｃｄを含むＤＮＡフラグメントを、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を用いるＰＣＲによって、全長発現ベクターｐＲＫ−ＴＮＦ−Ｒ２から増幅した［タータグリア等、Cell、７３巻２１３−２１６頁（１９９３）］。ＰＣＲを、９５℃６分間の最初の工程後、２０サイクル（９５℃で４５秒間；５５℃で６０秒間；７２℃で６０秒間）実施した。野生型ｈＴＮＦ−Ｒ２のアミノ酸４２４−４３９を欠く細胞内ドメインをコードしている０．５ｋｂＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＣＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧ−３'（配列番号２３）および５'−ＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣ−３'（配列番号２４）を用いて増幅した。このフラグメントをＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIで消化し、ゲル精製し、そして発現ベクターｐＲＩＳを用いてｈＴＮＦ−Ｒ２ ｃＤＮＡ中に再クローニングした［タータグリアおよびゲッデル、J.Biol.Chem.、２６７巻４３０４−４３０７頁（１９９２）；ｈＴＮＦ−Ｒ２（−１６）］。アミノ酸４０３−４３９（５'−ＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣＴＴ−３'（配列番号２５）；ｈＴＮＦ−Ｒ２（−３７））、アミノ酸３８１−４３９（５'−ＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡ−３'（配列番号２６）；ｈＴＮＦ−Ｒ２（−５９）、アミノ酸３４６−４３９（５'−ＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧ ＣＣＣＧＧＧＣＣＴＣ−３'（配列番号２７）；ｈＴＮＦ−Ｒ２（−９４））およびアミノ酸３０８−４３９（５'−ＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡ−３'（配列番号２８）；ｈＴＮＦ−Ｒ２（−１３２））を欠くレセプターをコードしている類似の突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２発現ベクターを作成した。ｈＴＮＦ−Ｒ２のアミノ酸３０４−３４５の除去は、ｐＲＫ−ＴＮＦ−Ｒ２のＳａｃＩによる部分消化およびこのベクターの再ライゲーションによって組み立てた（ｈＴＮＦ−Ｒ２（△３０４−３４５））。ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン全体の除去は、貫膜ドメインに隣接するＰｓｔＩ部位とＣｌａＩ部位との間の配列を、Ｇｌｎ２７３の直後のフレーム内停止コドンを含む二本鎖オリゴヌクレオチド（５'−ＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴ−３'（配列番号２９）および５'−ＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡ−３'）（配列番号３０）で置き換えることにより、ｐＲＫ−ＴＮＦ−Ｒ２から組み立てた。Ｓｅｒ３９３をＡｌａに変換する突然変異を、記載のような位置指定突然変異生成によってｈＴＮＦ−Ｒ２ｃＤＮＡに導入した［タータグリア等、Cell、７４巻８４５−８５３頁（１９９３）；ｈＴＮＦ−Ｒ２（Ｓ３９３Ａ）］。正しく修飾されたｃＤＮＡの確認を、シークエナーゼ２．０配列決定キット（U.S.バイオケミカル）を用いる二本鎖配列決定によって行った。
【０２００】
無傷のおよび末端切除されたｈＴＮＦ−Ｒ２をコードしている発現ベクターを、電気穿孔によりＣＴ６細胞中に導入した。ＲＰＭＩ１６４０培地０．３ｍｌ中の５ｘ１０６細胞を、キャパシタンスエキステンダーつきのバイオ−ラド・ジーン・パルサー（０．４ｃｍキュベット、９６０μＦ、２５０Ｖ）を用いて、ＳｃａＩ消化されたｐＲＫ．ｎｅｏ０．５μｇ［タータグリアおよびゲッデル、１９９２、上記］およびＳｃａＩ消化されたｈＴＮＦ−Ｒ２発現ベクター２０μｇで同時トランスフェクトした。電気穿孔された細胞を培地５０ｍｌに再懸濁し、２日後、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジブコ／ＢＲＬ）を含有する選択培地での限界希釈により９６ウェル微量定量プレートに入れた。３週間後、個々のＧ４１８耐性クローンを釣り上げ、拡張した。ｈＴＮＦ−Ｒ２を発現するクローンを、記載のようにＦＡＣＳ分析によって同定した［表１；ペニカ等、J.Biol.Chem.、１９９２、上記］。
【０２０１】
全長および末端切除されたｈＴＮＦ−Ｒ２を発現するＣＴ６クローンの増殖を、記載のように［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定した［タータグリア等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻９２９２−９２９６頁（１９９１）］。ＮＫ−κＢ活性化を、記載のように、刺激または非刺激ＣＴ６細胞から調製された核抽出物を用いる電気泳動移動度シフト検定によって分析した［シュッツェ等、Cell、７１巻７６５−７７６頁（１９９２）］。
表１は、ＣＴ６細胞におけるトランスフェクトされたｈＴＮＦ−Ｒ２シグナルの増幅およびＮＦ−κＢ活性化を示している。さらに、Ｃ末端１６アミノ酸または内部４２アミノ酸３０４−３４５を欠く突然変異体ヒトレセプターはこれらの活性の仲介において尚機能的である。対照的に、Ｃ末端３７アミノ酸を欠く、またはさらなるＣ末端除去を含む突然変異体レセプターはこれらの検定において不活性である。これらの結果は、アミノ酸３４６−４２３を含むｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン中の７８個のアミノ酸領域が、ＴＮＦシグナル伝達の仲介に必要であることを示している。この領域は、可能性ある蛋白キナーゼＣ燐酸化部位（Ｓｅｒ３９３−Ｐｒｏ３９４−Ｌｙｓ３９５）を含んでおり、これはマウスＴＮＦ−Ｒ２において保存されている。しかしながら、Ｓｅｒ３９３の代わりにＡｌａを含む突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２は生物学的に機能的であり（表１）、これは、この燐酸化部位がＴＮＦ−Ｒ２仲介シグナル伝達に関与していないことを示すものである。
【０２０２】
Ｃ．ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する因子の同定
ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する因子を同定するため、［３５Ｓ］標識されトランスフェクトされたＣＴ６細胞の溶解液由来のレセプターの免疫沈降を行った。野生型ｈＴＮＦ−Ｒ２を発現するＣＴ６細胞５ｘ１０６を、システインおよびメチオニン無しの低グルコースダルベッコ改良イーグル培地で２回洗浄し、新しい培地中で３０分間インキュベートした。この細胞を、［３５Ｓ］システインおよび［３５Ｓ］メチオニン（Ｌ−［３５Ｓ］−インビトロ細胞標識化混合物５０μＣｉ／ｍｌ；アマーシャム）を含有する培地（システインおよびメチオニン無し）５ｍｌを入れた１００ｍｍプレートに蒔いた。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦで１０分間刺激し、収穫し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、２５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌベンズアミジン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する０．１％ＮＰ４０溶菌緩衝液１ｍｌで４℃で２０分間溶菌した。４℃、１００００ｘｇで１０分間遠心することにより、核および細胞の破片を除去した。この細胞溶菌液をパンソルビン（カルビオケム）５０μｌで４℃で１時間、前もって清澄化した。トランスフェクトしていないＣＴ６細胞由来の非標識化溶菌液１ｍｌを用いて前吸着しておいた抗ｈＴＮＦ−Ｒ２モノクローナル抗体１０３５および１０３８各１μｇ（ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞外ドメインの異なったエピトープに対するもの）と共に４℃で８時間、溶菌液をインキュベートし、そしてプロテインＡ−アガロースビーズ（オンコジーン・サイエンス）１５μｌと共に集めた。ビーズを溶菌緩衝液で良く洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し、そして上清を４−１２％または８％トリス／グリシンポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルを固定し、アンプリファイ（アマーシャム）中でインキュベートし、乾燥し、そして−８０℃でフィルムに暴露した。
【０２０３】
４５ないし５０−５６ｋｄの範囲の幾つかのバンドおよびおよそ６８ｋｄの１個のバンドが、ＣＴ６細胞において免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と共に特異的に共同沈降した（図２ａ）。ｈＴＮＦ−Ｒ２を非標識化２９３／ＴＮＦ−Ｒ２細胞から免疫沈降させ、続いてトランスフェクトしていないＣＴ６細胞からの標識化溶菌液と共にインキュベーションする時にも同じ結果が得られた（図２ｂ）。ｈＴＮＦ−Ｒ２と共同沈降したバンドのパターンは、溶菌液がｈＴＮＦで刺激しておいた細胞から調製されたか、または、刺激していない細胞から調製されたかに拘わらず、同一であったが、これは、これらの蛋白がｈＴＮＦ−Ｒ２と構造的に関係していることを示すものである。これは、エリスロポエチンレセプターの細胞内ドメインと関係しているチロシンキナーゼＪＡＫ２について観察される結果と同様である[ウィトフーン等、Cell、７４巻２２７−２３６頁（１９９３）]。
【０２０４】
ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄと関係する因子のための大規模精製法を確立するため、ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白として発現させた［スミスおよびジョンソン、１９８８、上記］。ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインを、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣ ＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡ−３'（配列番号３１）および５'−ＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＴＧＧＧＣ−３'（配列番号３２）を使用し上記のようにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによってｐＲＫ−ＴＮＦ−Ｒ２から増幅させた。増幅した０．５５ｋｂ ＤＮＡフラグメントを平滑末端化し、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ消化されたｐＧＥＸ−２ＴＫベクター中にクローニングした（ファルマシア；ｐＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ）。このｐＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄプラスミドを、染色体上にｌａｃＩｑ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉＫ１２のプロテアーゼ欠失株（ジェネンテク）中に導入し、一夜培養を、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含有する新鮮なＬＢ培地で１：１０に希釈し、そして３７℃で２時間増殖させた。０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した後、細胞を３７℃で１時間増殖させ、ペレット化し、冷ＰＢＳで１回洗浄した。この細胞を、２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌベンズアミジン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する再懸濁緩衝液１／１００培養容量に再懸濁した。氷上で超音波処理した後、不溶性物質を４℃、１００００ｘｇで１５分間遠心することにより除去した。トリトンＸ−１００を１％となるまで加え、細胞溶解液を、培養容量１Ｌ当たりＰＢＳ中のグルタチオン−アガロースビーズの５０％スラリー（硫黄結合；シグマ）５００μｌと共に、回転体上で３０分間室温でインキュベートした。５００ｘｇで短時間遠心することによりビーズを集め、再懸濁緩衝液で良く洗浄した。精製されたＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３）。５−８ｍｇの融合蛋白／ｍｌ（膨潤したビーズ）の濃度が常法により得られた。
【０２０５】
共有結合したＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白親和マトリックスを調製するため、５０ｍＭ還元型グルタチオン（シグマ）を含有する２５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０の１ビーズ容量による３ｘ３０分間洗浄を用いて遊離グルタチオンと競合させることにより、この融合蛋白をグルタチオン−アガロースビーズから溶離した。溶離した融合蛋白を、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１５０ｍＭＮａＣｌに対して透析し、製造者の指示に従ってアフィゲル１０／１５（２：１比；バイオ−ラド）と共有結合させた。１０ｍｇ／ｍｌ（膨潤したビーズ）までの融合蛋白濃度が得られた。
【０２０６】
融合蛋白３μｌを、上記のようにして［３５Ｓ］標識したＣＴ６細胞から調製された細胞溶菌液１ｍｌとインキュベートすることにより、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白による共同沈降実験を実施した。４℃で８時間の後、融合蛋白ビーズを溶菌緩衝液で良く洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。バンドのパターンは、グルタチオン−アガロースビーズに結合した、またはアフィゲル１０／１５に共有結合したＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白と特異的に共同沈降することが判明し（図４）、これは免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と共同沈降しているバンドと極めて大きさが似ていた（図３を参照されたい）。この事は、大腸菌で発現されたＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白こそが、ＣＴ６細胞中で野生型ｈＴＮＦ−Ｒ２と同じ細胞内因子と関係することを示唆している。
【０２０７】
上記の突然変異分析に従って、突然変異体細胞内ドメインを有するＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白をコードしている発現ベクターを作成した。突然変異体−１６、−３７、−５９および△３０４−３４５ｈＴＮＦ−Ｒ２をコードしている野生型ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ ＤＮＡフラグメントのための方法と同じ方法を用いて、細胞内ドメインをＰＣＲにより増幅し、そしてｐＧＥＸ−２ＴＫベクター中にクローニングした。さらに、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡ ＧＣＣＣＣ−３'（配列番号５３）および５'−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧ−３'（配列番号５４）を用いて０．１４ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＧＥＸ−２ＴＫ中にクローニングした。このＤＮＡフラグメントはｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄのアミノ酸３８４−４２４に対応する４１アミノ酸のペプチドをコードしている。融合蛋白を発現させ、精製し、そして共同沈降する蛋白について上記のように検定した。
【０２０８】
図５に示されるように、機能的レセプター突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２（−１６）およびｈＴＮＦ−Ｒ２（△３０４−３４５）の細胞内ドメインを含むＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白は、野生型ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄを含む融合蛋白と同じバンドを共同沈降させた。対照的に、不活性突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２（−３７）およびｈＴＮＦ−Ｒ２（−５９）の細胞内ドメインを含むＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白は、これらのバンドを共同沈降させなかった。突然変異体細胞内ドメインを伴うｈＴＮＦ−Ｒ２の生物活性と、対応するＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白で得られた共同沈降結果との間のこの相関は、野生型ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白が免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と同じ細胞内因子と関係するという観察を支持するものである。
【０２０９】
加えて、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（３８４−４２４）融合蛋白は、他の融合蛋白より程度は弱いものの、４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８ｋｄにバンドを共同沈降させることができた（図５）。このＧＳＴ融合蛋白中に含まれるｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄの４１個のアミノ酸は、ＣＴ６細胞においてＴＮＦシグナル伝達を仲介するのに必要であると同定されている（上記参照）ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄの７８アミノ酸領域の中に含まれている。この事は、ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄのこの短い領域が、可能性あるシグナル伝達分子とレセプターとの関係の仲介に十分であることを示唆している。
【０２１０】
ｈＴＮＦ−Ｒ２を非標識化２９３／ＴＮＦ−Ｒ２細胞から免疫沈降させ、次いで、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白ビーズ５０μｌで前もって清澄化しておいた標識化ＣＴ６細胞溶菌液とインキュベートする、競合的共同沈降実験を実施した。ＧＳＴビーズのみまたはＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−３７）およびＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−５９）融合蛋白ビーズとのＣＴ６抽出液の前インキュベーションは、免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と共同沈降する蛋白のパターンに影響しなかった（図６）。ところが、細胞溶菌液をＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄまたはＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−１６）融合蛋白ビーズで前もって清澄化した場合、これらの蛋白は免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と共同沈降せず、この事は、これらがＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白によって、標識化ＣＴ６細胞抽出液から涸渇していたことを示すものである。この結果は、野生型ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白が、免疫沈降したｈＴＮＦ−Ｒ２と同じ細胞内因子と関係することを証明する。したがって、このＧＳＴ融合蛋白材料は、ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する因子の大規模精製に使用することができる。［３５Ｓ］標識化ヒトジャーカット細胞から調製された細胞溶菌液によるＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合ビーズの共同沈降実験は、マウスＣＴ６溶菌液で観察されたパターンと大きさが極めて似通った共同沈降蛋白のパターンを明らかにした（図７）。この事は、ＴＮＦ−Ｒ２関連因子がマウスおよびヒトの種間で密接に関連していることを示唆している。
【０２１１】
ｈＴＮＦ−Ｒ２関連因子の細胞内局在を研究するため、ＣＴ６細胞の細胞質画分および膜画分を、本質上、記載のようにして調製した［ドイチャー、Methods in Enzymol.、１８２巻：アカデミック・プレス、サンディエゴ（１９９０）］。簡潔に述べると、［３５Ｓ］標識化ＣＴ６細胞を冷ＰＢＳで１回、そして５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する等張塩緩衝液で１回洗浄した。細胞を５ｍｌの等張塩緩衝液に再懸濁し、そしてガラスドウンサー（フィートン）中、「Ｂ」乳棒を用いて２０ストロークで溶菌した。大きな細胞破片を７５０ｘｇで１０分間４℃で遠心することにより除去し、そして上清を１０００００ｘｇで３０分間、４℃で超遠心に付した。細胞質画分を構成する上清を除去し、ペレットを、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチンに再懸濁した。この粗製の膜画分をＰＢＳ中の３５％ｗ／ｖショ糖のクッション上に積層し、そして３００００ｘｇで４５分間４℃で遠心した。ショ糖および緩衝液相の間の界面にある精製された細胞膜画分を注意深く除去し、１０００００ｘｇで３０分間、４℃での遠心により濃縮し、そして４℃で３０分間、０．１％ＮＰ４０溶菌緩衝液で抽出した。細胞膜溶菌液および細胞質画分を、上記のように、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２融合蛋白ビーズによる共同沈降実験に使用した。
ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄと関係する因子は、細胞質の細胞画分に存在することが判明した（図８）。これらの因子がｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄと構成的に関係しているという観察（上記参照）と合致して、少量が、精製された細胞膜画分にも検出された。
Ｄ．大規模精製
【０２１２】
ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ関連因子の大規模精製のため、ＣＴ６細胞（３ｘ１０１０細胞）６０ｌを収穫し、そして冷ＰＢＳで２回洗浄した。以下の全ての操作は４℃で行った。１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する０．１％ＮＰ４０溶菌緩衝液１２０ｍｌを添加することにより、細胞を溶菌し、３０分間穏やかに振盪した。１００００ｘｇで１０分間遠心することにより、不溶性物質を除去した。次に、上清を１０００００ｘｇで１時間遠心し、そして５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶菌緩衝液に対して透析した。以下の全ての精製工程は、５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶菌緩衝液中で実施した。細胞溶菌液を、１５ｍｌのグルタチオン−アガロースＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−３７）融合蛋白前吸着カラムに通した。流出液を、０．３ｍｌアフィゲル１０／１５ ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白親和カラムに適用した。対照のため、平行してこの溶菌液を、類似のアフィゲル１０／１５ ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−３７）融合蛋白親和カラムに通した。良く洗浄した後、樹脂に結合した蛋白を、０．１Ｍ ＤＴＴを含有するイムノピュア・ジェントルＡｇ／Ａｂ溶離緩衝液（ピアス）５カラム容量で溶出し、メタノール／クロロホルムで沈澱させ、そして５％ＳＤＳを含有するＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁した。この物質の十分の一を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色により可視化した（図９）。ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白親和カラムから特異的に溶出した蛋白バンドは、およそ４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８−７０ｋｄに観察された。
【０２１３】
残りの精製された物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ配列決定膜（ミリポア）に電気泳動的に移し、蛋白をＲ２５０での染色により可視化した。４５ｋｄの蛋白バンド（ＴＮＦレセプター関連因子１またはＴＲＡＦ１）を切り取り、アプライド・バイオシステムズシークエンサー上で自動エドマン分解によるアミノ酸配列分析に付した。この物質はＮ末端遮断されているとわかったため、内部配列情報は、個々のペプチドをプロテアーゼ消化後、逆相毛管ＨＰＬＣにより精製した後に配列分析して得た。それぞれトリプシンおよびリジンＣ消化から得られた２個のペプチドは、配列ＡＰＭＡＬＥＲおよびＫＨＡＹＶＫ（配列番号４１および４２）を持っていた。
【０２１４】
実施例２  ＴＲＡＦ１の組換え生産
上のペプチドの配列に基づき、以下の縮重オリゴヌクレオチドを設計した：ＢＰ５０−１センス、５'−ＧＣＮＣＣＮＡＴＧＧＣＮＹＴＮＧＡＲＣ／ＡＧ（配列番号３３−３５）；ＢＰ５０−１アンチセンス、５'−ＣＴ／ＧＹＴＣＮＡＲＮＧＣＣＡＴＮＧＧＮＧＣ（配列番号３６−３８）；ＢＰ５０−１１センス、５'−ＡＡＲＣＡＹＧＣＮＴＡＹＧＴＮＡＡ（配列番号３９）；ＢＰ５０−１１アンチセンス、５'−ＴＴＮＡＣＲＴＡＮＧＣＲＴＧＹＴＴ（配列番号４０）。ＣＴ６細胞から分離されたポリ(Ａ)＋ｍＲＮＡ１μｇをオリゴ（ｄＴ）プライミングし、そして製造者の指示に従いｃＤＮＡサイクル・キット（インビトロゲン）を用いて逆転写した。第一の鎖ＣＴ６ｃＤＮＡを、上に列挙した縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせにより、シータス・ジーンアンプ・キットおよびパーキン−エルマー・サーモサイクラーを用いてＰＣＲに付した。ＰＣＲは、９５℃６分間の最初の工程後、３５サイクル（９５℃で４５秒間；５５℃で６０秒間；７２℃で１５０秒間）実施した。ＰＣＲ生成物を１．６％アガロースゲル上の電気泳動により分析した。ＢＰ５０−１センスおよびＢＰ５０−１１アンチセンス クーマニー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０（シグマ）というプライマーの組み合わせにより得られたＰＣＲ反応は、およそ０．７５ｋｇの増幅されたＤＮＡフラグメントを含んでいた。このフラグメントをゲル精製し、ｐブルースクリプトＫＳ（ストラタジーン）中にサブクローニングし、そして配列決定した。
【０２１５】
クローニングされたＰＣＲフラグメントから０．６５ｋｂ ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメントを分離し、Ｔ７クイック・プライム・キット（ファルマシア）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。製造者の指示に従い、ｃＤＮＡ合成およびラムダクローニングのためのスーパースクリプトラムダシステム（ジブコ／ＢＲＬ）を使用し、λｇｔ２２ａ中に組み立てておいたＣＴ６ ｃＤＮＡライブラリー由来のおよそ１ｘ１０６の組換えファージクローンをスクリーニングするため、この標識されたフラグメントを使用した。ハイブリダイゼーションおよびフィルターの洗浄を、標準プロトコルに従い高緊縮条件下で実施した［アウスベル等、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィレイ・インターサイエンス、ニューヨーク、１９８７］。４個の陽性クローンを二次スクリーニングによりプラーク精製した。これらのファージクローンのｃＤＮＡ挿入物をｐブルースクリプトＫＳ中にサブクローニングし、両方の鎖について配列決定した（図１０）。最長のｃＤＮＡは２ｋｂであるとわかった。他の３個のｃＤＮＡクローンは、この２ｋｂ ｃＤＮＡクローンの末端切除型を表していた。２ｋｂ ｃＤＮＡクローンは、４０９アミノ酸の蛋白をコードしているオープンリーディングフレームを含んでいた（図１０）。予想された蛋白内部には、配列ＡＰＭＡＬＥＲ（配列番号４１）およびＫＨＡＹＶＫ（配列番号４２）、ならびに蛋白配列分析から得られた別の２個のペプチド配列に対応する配列ＰＧＳＮＬＧＳ（配列番号４３）およびＫＤＤＴＭＦＬＫ（配列番号４４）があった。これらの結果により、分離された２ｋｂ ｃＤＮＡクローンが、精製されたＴＲＡＦ１をコードしていることが確認できる。
【０２１６】
ＴＲＡＦ１および他の既知の配列の間の類似性を分析するため、ＴＲＡＦ１配列をジェネンテク蛋白データベースに対して検索した。ＴＲＡＦ１および他の既知の蛋白の間には有意性のある明白な類似性は見いだされず、この事はＴＲＡＦ１が新規な分子であることを示している。
【０２１７】
実施例３  ＴＲＡＦ２の同定およびクローニング
ＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する蛋白をコードしている遺伝子を直接分離するため、蛋白−蛋白相互作用の検出のための酵母二ハイブリッド系（フィールズおよびソング、Nature、３４０巻２４５−２４５頁［１９８９］）を使用した。
【０２１８】
オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＴＣＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＡ−３'（配列番号４５）および５'−ＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＧＣＣＡＣＴＴＴ−３'（配列番号４６）を使用し、上記のようにしてＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲにより、ｈＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインをｐＲＫ−ＴＮＦ−Ｒ２から増幅した。増幅された０．５５ｋｂ ＤＮＡフラグメントをＳａｌＩおよびＢｇｌIIで消化し、ゲル精製し、そしてＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインベクターｐＰＣ９７（シェヴレイおよびナタンス、１９９２、上記；ｐＰＣ９７−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ）中にクローニングした。ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−１６）（５'−ＣＴＡＧＡ ＧＡＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣ−３'（配列番号４７）；ｐＰＣ９７−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−１６））、ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−３７）（５'−ＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣ ＴＴ−３'（配列番号４８）；ｐＰＣ９７−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−３７））、ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−５９）（５'−ＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣ ＴＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡ−３'（配列番号４９）；ｐＰＣ９７−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ（−５９））およびマウスＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメイン（５'−ＴＣＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＡ−３'（配列番号５０）。５'−ＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＧＣＣＡＣＴＴＴ−３'（配列番号５１）；ｐＰＣ９７−ｍＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ）と融合させたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含む類似の組み立て物を作成した。
【０２１９】
ＧＡＬ４転写活性化ドメインベクターｐＰＣ８６におけるプラスミドｃＤＮＡライブラリー［シェヴレイおよびナタンス、１９９２、上記］を、記載のようにして［シェヴレイおよびナタンス、１９９２、上記］ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ適合させた二本鎖胎児肝間質セルライン７−４ｃＤＮＡ（B.ベネットおよびW.マシューズの寄贈）から組み立てた。プラス
ミドＤＮＡを２ｘ１０６の形質転換させたＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ（ジブコ／ＢＲＬ）コロニーから直接分離した。
S.セレヴィシアエＨＦ７ｃ（クロンテク）を、ｐＰＣ９７−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄおよび２５０μｇのライブラリープラスミドＤＮＡによって、マッチメーカー二ハイブリッド系（クロンテク）に記載されるようにして連続的に形質転換した。最終的形質転換混合物を、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジンを欠失し、２０ｍＭ３−アミノトリアゾール（シグマ）を含有する５０個の１５０ｍｍ合成デキストロース寒天プレート上に蒔いた。合計で２ｘ１０６の形質転換されたコロニーを蒔いた。３０℃で４日後、４２個の生き残ったＨｉｓ＋コロニーが得られ、うち１５個が、フィルター検定でβ−ガラクトシダーゼ活性について陽性であった［ブリーデンおよびナスミス、酵母ＨＯ遺伝子の調節、Cold Spring Harbor Sympodia on Quantitative Biology、５０巻６４３−６５０
頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（１９８５）］。酵母ＤＮＡを調製し［ホフマンおよびウィンストン、Gene、５７巻２６７−２７２頁（１９８７）］、電気穿孔によりＥ．ＣｏｌｉＤＨ１０Ｂに導入し、そしてｐＰＣ８６ライブラリープラスミドを含むコロニーを制限分析により同定した。１５個のうち１４個のｃＤＮＡ挿入物がおよそ２．１ｋｂという類似の大きさであった。ＤｄｅＩによる制限分析により、これらが同じｍＲＮＡ種から誘導された独立したｃＤＮＡクローンであることが明らかとなった。
【０２２０】
それぞれｐＰＣ９７およびｐＰＣ９７−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄによる、ＨＦ７ｃ細胞中への３個の代表的ｃＤＮＡクローンの再導入は、コードされているＧＡＬ４活性化ドメイン融合蛋白は、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン単独では相互作用しないがＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白とのみ相互作用することを確認した。一つの代表的クローン（ｐＰＣ８６Ｙ１７）の２．１ｋｂ ｃＤＮＡ挿入物を、両方の鎖について配列決定した（図１１）。さらに、他の６個の独立したｃＤＮＡクローンの５'および３'領域を配列決定したところ、これらは同じｍＲＮＡ種から誘導されていることが確認された。全てのクローンは、同じリーディングフレームで互いに２０ヌクレオチド以内でＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合することが示された。
【０２２１】
さらに２個のｃＤＮＡクローンがＣＴ６λファージｃＤＮＡライブラリーから分離され（上記参照）、そしてさらに５個のクローンが、ｐＰＣ８６Ｙ１７ ｃＤＮＡ挿入物の５'領域由来の［３２Ｐ］標識化０．５ｋｂ ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、マウス肝λファージｃＤＮＡライブラリー（クロンテク）から分離された。これらのｃＤＮＡ挿入物はいずれもｐＰＣ８６ ｃＤＮＡ挿入物の５'配列を延長しなかった。さらに、ｐＰＣ８６ ｃＤＮＡ挿入物の大きさは、ＣＴ６ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析により明らかとなった実際のメッセージの大きさに良く対応する（下記参照）。これらの発見は、二ハイブリッド系で分離されたｃＤＮＡ挿入物は全長のクローンを表していること、そして、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインへの融合は、ｐＰＣ８６Ｙ１７ｃＤＮＡ挿入物の３０位にイニシエーターＡＴＧを伴うフレーム内の非常に短い５'−非翻訳領域で起こったという事を示している（やはり下記を参照されたい）。このｃＤＮＡクローンは、５０１アミノ酸の蛋白をコードしているオープンリーディングフレームを含んでいる（ＴＮＦレセプター関連因子２またはＴＲＡＦ２；図１１）。
【０２２２】
ＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインと関係した、生化学的に精製された５６ｋｄ蛋白のアミノ酸配列分析（図９を参照されたい）は、この蛋白をＴＲＡＦ２と同定し、このＴＲＡＦ２配列をｃＤＮＡ配列から予想されたものとして確認した（図１１を参照されたい）。
【０２２３】
ジェネンテク蛋白データベースに対するＴＲＡＦ２配列の相同性検索は、ＴＲＡＦ２がＮ末端ＲＩＮＧフィンガー配列モチーフを含む新規な蛋白であることを明らかにした［フリーモント等、Cell、６４巻４８３−４８４頁（１９９１）］；ハウプト等、Cell、６５巻７５３−７６３頁（１９９１）；イノウエ等、上記；図１２ａ］。この配列モチーフは幾つかの調節蛋白のＮ末端ドメインで観察されており、蛋白−ＤＮＡ相互作用に関与するらしい２個の亜鉛結合フィンガー構造を形成すると考えられる［フリーモント等、上記；ハウプト等、上記；レディ等、Trends Biochem.Sci.、１７巻３４４−３４５頁（１９９２）］。ＲＩＮＧフィンガーファミリーの成員は推定のＤＮＡ結合蛋白であり、その幾つかは、転写調節、ＤＮＡ修復、および位置特異的組換えに関係している（図１２ａを参照されたい）。さらに、ＲＩＮＧフィンガーモチーフおよび他の亜鉛結合配列モチーフは、蛋白−蛋白相互作用に関与していると議論されてきた［フリーモント等、上記；ハウプト等、上記；バーグ、J.Biol.Chem.、２６５巻６５１３−６５１６頁（１９９０）］。ＴＲＡＦ２中のこの構造的モチーフの重要性は、分離されている全てのＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインＴＲＡＦ２融合物はＴＲＡＦ２の完全なＮ末端を含んでいるという発見によって支持される（上記参照）。この事は、ＴＲＡＦ２のＮ末端ＲＩＮＧフィンガードメインがＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインとの相互作用に関与しているという事を示唆するものである。
【０２２４】
加えて、ＴＲＡＦ２は、ツメガエルＴＦIIIＡ型亜鉛フィンガー蛋白の亜鉛フィンガーモチーフと配列類似性を共有する［ミラー等、EMBO J．、４巻１６０９−１６１４頁（１９８５）；バーグ、上記；図１２ｂ］。ＴＦIIIＡ様亜鉛フィンガーモチーフは、ＲＩＮＧフィンガー蛋白ＲＡＤ１８およびＵＶＳ−２にも観察されている（図１２）。
【０２２５】
ＴＲＡＦ２のＣ末端ドメインと他のどの既知蛋白の間にも、有意性のある明白な類似性は見いだされなかった。ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の配列比較は、これらがＣ末端ドメインに高度のアミノ酸一致を共有していることを明らかにした（２３０アミノ酸にわたり５３％の一致；図１３）。両蛋白は、新規な配列相同性モチーフ「ＴＲＡＦドメイン」を含む、蛋白の新たなファミリーの成員を構成している。より保存性の低い、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のＴＲＡＦドメイン内のＮ末端領域は、ことによるとロイシンジッパー様構造を形成しているかも知れない（図１０、１１、１３）。ロイシンジッパーは、アミノ酸７個毎の間隔で存在するロイシンを含むＤＮＡ結合蛋白の一員中に最初発見された、αヘリックス構造である［ランドシュルツ等、Science、２４０巻１７５９−１７６４頁（１９８８）；ヴィンソン等、Science、２４６巻９１１−９１６頁（１９８９）］。この構造は、ロイシン側鎖の分子間相互作用により蛋白の二量体化を仲介する。ロイシンジッパー構造はまた、他の二つのＲＩＮＧフィンガーファミリー成員、ＳＳ−Ａ／Ｒｏリボ核蛋白およびｃ−ｃｂｌプロトオンコジーンの遺伝子産物にも予想されている（図１２を参照されたい）。ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のＮ末端ドメインは、特にＴＲＡＦ２のＲＩＮＧフィンガードメインに関しては関連性が無い。
【０２２６】
実施例４  ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の機能分析
ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のハイドロパシープロフィル［カイトおよびドゥーリトル、１９８２、上記］（図１４）は、これらはシグナル配列および明らかな貫膜領域を欠き、全体として親水性である事を示唆している。したがって、実験的に決定されたＴＲＡＦの細胞質局在に合致して、これらは細胞内蛋白であるようである（上記参照）。
【０２２７】
ポリ(Ａ)＋ｍＲＮＡをＣＴ６細胞から調製した［バドリー等、Current Opinion in Structural Biology、３巻１１−１６頁（１９８８）］。上に記載されたような放射標識化ＴＲＡＦ２ハイブリダイゼーションプローブを用いたノーザン分析［サムブルック等、１９８９、上記］は、ＴＲＡＦ２がＣＴ６細胞中で２．１ｋｂメッセージとして発現されることを示した（図１５ａ）。同様に、ＴＲＡＦ１はＣＴ６細胞において２ｋｂメッセージとして発現される（図１５ａ）。
【０２２８】
ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２ ｍＲＮＡの組織分布を調べるため、製造者の指示に従いマウス多組織ノーザンブロット（クロンテク）を、放射標識されたＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２プローブとハイブリダイズさせた。ＴＲＡＦ２は、調べたマウスの組織全てにおいて構成的に発現される（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣；図１５ｂ）。最も高いレベルの発現は脾臓で観察された。対照的に、ＴＲＡＦ１は組織特異的発現を示した。ＴＲＡＦ１ ｍＲＮＡは脾臓、肺および精巣で検出されただけであった（図１５ｂ）。
【０２２９】
ＨＦ７ｃ細胞での、ｐＰＣ８６Ｙ１７（ｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２）の、上記ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合組み立て物との同時形質転換は、ＴＲＡＦ２は、ヒトおよびマウスＴＮＦ−Ｒ２両方の野生型細胞内ドメインと、そして生物活性突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２（−１６）の細胞内ドメインと相互作用することを示した（表２）。しかし、これは、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインのみとは相互作用せず、また生物学的に不活性な突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２（−３７）およびｈＴＮＦ−Ｒ２（−５９）の細胞内ドメインとも相互作用しない。この事は、ＣＴ６細胞抽出物における野生型および突然変異体ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白との共同沈降実験から得られる結果と合致する(上記参照)。
【０２３０】
ＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白をコードしている発現ベクターを組み立てた。オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧ ＴＴＧＴ（配列番号５５）および５'−ＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＡＴＧＴ（配列番号５６）を使用し、上記のようにしてＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲにより、ＴＲＡＦ２コード化領域をｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２から増幅した。増幅された１．６ｋｂ ＤＮＡフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑末端化し、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ消化されたｐＧＥＸ−２ＴＫベクター中にクローニングした。ＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白を１ｍＭ ＺｎＣＬ２の存在下に発現させ、上記のように精製した。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白ビーズを２９３および２９３／ＴＮＦ−Ｒ２細胞由来の溶菌液と共にインキュベートし、ＥＣＬ検出試薬（アマーシャム）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析［サムブルック等、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、N.Y.（１９８９）］によって分析した。ｈＴＮＦ−Ｒ２およびｈＴＮＦ−Ｒ１の細胞外ドメインに対する一次抗体（対照として）は０．５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、二次ヒツジ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（アマーシャム）は１：６０００の希釈で使用した。図１６に示されるように、ＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白は２９３細胞抽出物中でｈＴＮＦ−Ｒ２を共同沈降させ、したがって、二つのハイブリッド分析で得られた結果が確認された。
【０２３１】
ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの間のホモおよびヘテロマー的蛋白−蛋白相互作用の可能性について試験するため、ｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２の２．１ｋｂ ｃＤＮＡ挿入物をＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化することにより切り取り、そしてｐＰＣ９７中にクローニングした（ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ２）。ＴＲＡＦ１コーディングおよび３'非翻訳領域を、Ｔ７配列決定プライマー（ストラタジーン）およびオリゴヌクレオチドプライマー５'−ＴＣＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴ−３'（配列番号５２）を使用し上記のようにしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲによってｐブルースクリプトＫＳで全長ＴＲＡＦ１ ｃＤＮＡクローンから増幅した。増幅された１．７ｋｂ ＤＮＡフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そしてｐＰＣ９７およびｐＰＣ８６の両方にクローニングした（ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ１；ｐＰＣ８６ＴＲＡＦ１）。
【０２３２】
野生型ヒトおよびマウス細胞内ドメインをコードしているＧＡＬ４ＤＮＡ結合ＴＮＦ−Ｒ２融合組み立て物による、ＨＦ７ｃ細胞中へのｐＰＣ８６ＴＲＡＦ１の同時導入は、ＴＲＡＦ１およびＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインの間の直接相互作用が弱いことを示した（表２）。しかし、ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ１およびｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２またはｐＰＣ９７ＴＲＡＦ２およびｐＰＣ８６ＴＲＡＦ１の同時形質転換は、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２が互いに相互作用することを明らかにし（表２）、この事は、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のヘテロ二量体複合体がＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと関係する事を示唆するものである。続いて、ＴＲＡＦ２が直接発現される、即ちＧＡＬ４融合蛋白としてではなく発現される酵母ベクターを組み立てた。ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ２をＨｉｎｄIIIおよびＳａｌＩで消化してＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインをコードしている０．５ｋｂＤＮＡフラグメントを放出させ、クレノウ酵素で末端を満たし、ゲル精製し、そして再ライゲーションした（ｐＰＣＴＲＡＦ２）。さらに、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣ ＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＣＴＴＣＣＣＣＴ（配列番号５７）および５'−ＣＴＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号５８）を使用し上記のようにしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによりｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２からＴＲＡＦ２を増幅した。増幅された２．１ｋｂ ＤＮＡフラグメントをＸｈｏＩで消化し、クレノウ酵素で末端を満たし、ＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そして、ＨｉｎｄIIIで消化し、末端を満たし、そしてＮｏｔＩで消化したｐＰＣ９７中にクローニングした（ｐＰＣＴＲＡＦ２ＮＬＳ）。この発現ベクターは、ＴＲＡＦ２のＮ末端に融合したサルウイルス４０大腫瘍抗原核局在シグナル（met-pro-lys-lys-lys-arg-lys-val；シェヴレイおよびナタンス、１９９２と比較されたい）をコードしている。プラスミドｐＰＣ８６ＴＲＡＦ１およびｐＰＣ９７ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄまたはｐＰＣ９７ｍＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄを有するＨＦ７ｃ細胞中への、ｐＰＣＴＲＡＦ２ではなくｐＰＣＴＲＡＦ２ＮＬＳの導入は、この宿主細胞のヒスチジン欠失を補完した（表３）。この結果は、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のヘテロ二量体複合体がＴＮＦ−Ｒ２の細胞内ドメインと相互作用することを確認するものである。この蛋白複合体において、突然変異分析および共同沈降実験から示唆されるように（上記参照）、主としてＴＲＡＦ２が、恐らくはそのＲＩＮＧフィンガードメインと、ヒトＴＮＦ−Ｒ２のアミノ酸３０４−３４５からなる細胞内ドメインのＣ末端領域との相互作用によって、レセプターと直接接触する。ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ１およびｐＰＣ８６ＴＲＡＦ１またはｐＰＣ９７ＴＲＡＦ２およびｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２の同時形質転換により示されるように、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２は、ホモ二量体複合体をも形成することができる（表２）。これらの結果は、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のホモローガスなＣ末端ドメインが新規な蛋白二量体化モチーフを表す事を示唆している。同様に、アラビドプシス・タリアナ由来のＲＩＮＧフィンガー蛋白ＣＯＰ１のＣ末端ドメインは、蛋白−蛋白の��識に関与していると論じられた三量体Ｇ蛋白のβサブユニットとの相同性を有する領域を含んでいる［デング等、Cell、７１巻７９１−８０１頁（１９９２）］。
【０２３３】
ＴＲＡＦ１の組織特異的発現に基づくと（上記参照）、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の間のヘテロマー的複合体の形成は、脾臓、肺および精巣といったマウスの或る組織でのみ起こり得る。この事により、他のＴＲＡＦドメイン蛋白が、構成的に発現されるＴＲＡＦ２のための組織特異的二量体化の相手である可能性が浮上する。恐らくは異なった生物活性を有するこのような組織特異的ヘテロ複合体は、様々な組織においてＴＮＦ−Ｒ２により仲介される異なったＴＮＦ応答を決定し得る。
【０２３４】
ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２に対する特異的抗体を作製するため、両蛋白のＮ末端ドメインを、ＱＩＡ発現系（キアゲン）を用いて６ｘｈｉｓ標識融合物として大腸菌で発現させた。ＴＲＡＦ１のアミノ酸２−１８１をコードしているＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴ（配列番号５９）および５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣ（配列番号６０）を使用し上記のようにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲによってｐブルースクリプトＫＳで全長ｃＤＮＡクローンから増幅した。増幅された０．５５ｋｂＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ消化したｐＱＥ１２ベクター（キアゲン）中にクローニングした。発現ベクター中に正しい向きのＤＮＡ挿入物を含む形質転換体を制限分析によって決定した（ｐＱＥＴＲＡＦ１）。同様に、ＴＲＡＦ２のアミノ酸１−１６２をコードしているＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号６１）および５'−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＡＧＧ ＣＴＣ ＴＴＴＴＧＧＧＧＣＡ（配列番号６２）を使用してｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２から増幅し、ＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ消化したｐＱＥ１２ベクター中にクローニングした（ｐＱＥＴＲＡＦ２）。
【０２３５】
プラスミドｐＱＥＴＲＡＦ１およびｐＱＥＴＲＡＦ２をＥ．ｃｏｌｉＭ１５［ｐＲＥＰ４］（キアゲン）に導入した。細胞を増殖させ、誘導し、収穫し、そして６ｘｈｉｓ標識ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２融合蛋白を、製造者の指示に従って変性条件下でＮｉ−ＮＴＡ親和クロマトグラフィー（キアゲン）により精製した。精製されたＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２融合蛋白を１３％トリス／グリシンポリアクリルアミドゲル上で分離し、０．０５％クマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０水溶液で染色し、適当なバンドを切り取った。１００−２００μｇのＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２融合蛋白を含有するゲル切片を、ウサギの免疫に使用した。
【表１】
2010131018.tif 000002
無傷のおよび末端切除されたｈＴＮＦ−Ｒ２をコードしている発現ベクターをＣＴ６細胞中にトランスフェクトした。個々のＣＴ６クローンの野生型または突然変異体レセプターの発現レベルをフローサイトメトリーにより分析し、値を平均の蛍光として表す。機能分析のため、２個の独立したＣＴ６クローンを、取り揃えられた細胞のプールを表すｈＴＮＦ−Ｒ２（△３０４−３４５）以外の各ｈＴＮＦ−Ｒ２突然変異体について調べた。抗ｈＴＮＦ−Ｒ２ポリクローナル抗体の１：１０００希釈液で２４時間処理しておいた細胞の［３Ｈ］チミジン取り込みによって増殖を測定した。値を、無関係な抗体で処理しておいた細胞と比較した刺激の倍率として表した。示されたデータは三重の測定の平均である。標準偏差は一般に５％未満である。抗ｈＴＮＦ−Ｒ２ポリクローナル抗体の１：５００希釈液で２０分間刺激しておいた細胞から調製された核抽出物を用いる電気泳動移動度シフト検定によって、ＮＦ−κＢ活性化を分析した。プラス記号は、無関係な抗体で処理しておいた細胞から調製された核抽出物と比較した、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の誘導を示す。全てのＣＴ６クローンは、内因性マウスＴＮＦ−Ｒ２を介した増殖およびＮＦ−κＢ活性化を誘導する能力を保持していた（データは示されていない）。ｎｄは測定されていない。
【表２】
2010131018.tif 000003
示されるように、種々のＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）およびＧＡＬ４転写活性化ドメイン(ＴＡ)融合蛋白をコードしているプラスミド（明細書を参照されたい）でＨＦ７ｃ細胞を同時形質転換した。同じ形質転換混合物のアリコートを、ｔｒｐおよびｌｅｕを欠く合成デキストロースプレートならびにｔｒｐ、ｌｅｕ、ｈｉｓを欠き３−アミノトリアゾール２０ｍＭを含有するプレート上に蒔いた。プラス記号は、形質転換された酵母コロニーがそれぞれのプレート上で生育したことを示す。同じ形質転換混合物から、極めて似通った数の形質転換体（９０−１００％）が、ｔｒｐ、ｌｅｕ、ｈｉｓを欠くプレートならびにｔｒｐおよびｌｅｕのみを欠くプレート上で得られた。マイナス／プラス記号は、ｔｒｐ、ｌｅｕ、ｈｉｓを欠くプレート上で生育する形質転換体の数が、ｔｒｐおよびｌｅｕのみを欠くプレート上の同じ形質転換体混合物から得られるコロニーの数のおよそ１−２％であったことを示す。三種のアミノ酸全てを欠くプレート上で生育するコロニーについて、β−ガラクトシダーゼ活性のためのフィルター検定を実施した。全てのコロニーが青色を発色した（データは示されていない）。
【表３】
2010131018.tif 000004
示されているＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢ）融合蛋白、ＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＴＡ）ＴＲＡＦ１融合蛋白、および、ＴＲＡＦ２またはサルウイルス４０大腫瘍抗原核局在シグナル（ＮＬＳ）に融合させたＴＲＡＦ２をコードしているプラスミド（明細書を参照されたい）でＨＦ７ｃ細胞を連続して形質転換した。最終的形質転換混合物を、ｔｒｐ、ｌｅｕ、ｈｉｓを欠き３−アミノトリアゾール２０ｍＭを含有する合成デキストロースプレート上に蒔いた。プラス記号は、それぞれのプレート上で形質転換した酵母コロニーが生育したことを示す。*表２を参照されたい。
【０２３６】
実施例５  ＴＲＡＦ２の構造−機能分析
ホモ二量体化、ＴＲＡＦ１とのヘテロ二量体化、およびＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインとの相互作用に必要なＴＲＡＦ２蛋白内の領域を同定するため、突然変異体ＴＲＡＦ２蛋白を発現するＧＡＬ４−ＴＲＡＦ２融合蛋白ベクターを組み立てた。オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＣＡＡ ＧＡＴ（配列番号６３）および５'−ＣＴＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号６４）を使用し、前記実施例に記載のようにして、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲによって、ＴＲＡＦ２のアミノ酸８７−５０１をコードしている１．９ｋｂ ＤＮＡフラグメントをｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２から増幅した。同様に、このプラスミドから、オリゴヌクレオチドプライマー５'−ＧＡＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＴＣＣＡＧ（配列番号６５）および５'−ＧＴＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＣＴＧ（配列番号６６）を使用して、ＴＲＡＦ２のアミノ酸２６４−５０１をコードしている１．４ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅した。増幅されたＤＮＡフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そしてｐＰＣ９７およびｐＰＣ８６中にクローニングした（ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ２（８７−５０１）；ｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２（８７−５０１）；ｐＰＣ９７ＴＲＡＦ２（２６４−５０１）；ｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２（２６４−５０１））。第４表に列記されるＨＦ７ｃ細胞の同時形質転換実験は、ＲＩＮＧフィンガードメイン（アミノ酸１−８６）の除去された突然変異体ＴＲＡＦ２蛋白が尚ＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインと関係できることから、ＴＲＡＦ２のＲＩＮＧフィンガードメインはＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインとの相互作用にとって必要でないことを示している。さらに、この突然変異体ＴＲＡＦ２蛋白はＴＲＡＦ１および野生型ＴＲＡＦ２の両者とも関係できる。ＴＲＡＦドメインおよび幾つかのさらなるアミノ酸（アミノ酸２６４−５０１；第４表）のみを含む突然変異体ＴＲＡＦ２蛋白についても同じ結果が得られた。これらの結果は、ＴＲＡＦ２のＴＲＡＦドメインは、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のホモおよびヘテロ二量体化ならびにＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインとＴＲＡＦ２の相互作用にとって十分であることを証明している。
【表４】
2010131018.tif 000005
実施例４中および前記表２の後に記載された方法を用いて、この表に開示されるデータを作成した。
【０２３７】
本発明は、必然的に好ましい態様および個々の実施例と結びつけて記載してきたが、当業者は、前述の明細書の読後に、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に開示される事柄に様々な変化、置換または等価物、および変更を施すことができるであろう。よって本発明は、本明細書に個別に記載された以外の方法で実施することができる。このような修飾は全て本発明の範囲内にあることが意図されている。
本明細書中に引用される全ての文献は、説明のため引用されて本明細書の一部とする。
【０２３８】
実施例６  ＴＲＡＦの機能的役割
Ａ．ＴＲＡＦの相互作用
ＴＲＡＦ２はＴＮＦ−Ｒ２の細胞質ドメインと直接に関係し、一方ＴＲＡＦ１およびＴＮＦ−Ｒ２の間の相互作用がＴＲＡＦ２を介して仲介される［ロース等、Cell、７８巻６８１頁（１９９４）］。安定なヘテロマー複合体を形成することに加えて、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２はホモ二量体を形成することができる。本発明者等は、ＴＲＡＦ３［元々はＣＤ４０ｂｐ、ＣＲＡＦ、またはＬＡＰ１と命名された。フー等、J.Biol.Chem.、２６９巻３００６９頁（１９９４）；チェング等、Science、２６７巻１４９４頁（１９９５）；およびモシアロス等、Cell、８０巻３８９頁（１９９５）。］がＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２と相互作用するか否かを決定するため、酵母二ハイブリッド系を使用した。酵母二ハイブリッド系における、ＴＲＡＦおよびＴＮＦレセプタースーパーファミリー成員の細胞質ドメインのための発現ベクターはかつて報告されている［ロース等、Cell、７８巻６８１頁（１９９４）；フー等、J.Biol.Chem.、２６９巻３００６９頁（１９９４）］。ベイト・アンド・プレイコード化融合蛋白間の二ハイブリッド相互作用分析は、記載のように実施された［ロース等、上記、フー等、J.Biol.Chem.、２６９巻３００６９頁（１９９４）］。ＴＲＡＦ３は自己結合したが、ＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ２のいずれともヘテロ型複合体を形成しなかった（表５）。この発見は、許容され得るホモ−および／またはヘテロマーの組み合わせを特定するオリゴマー化インターフェースが、ＴＲＡＦファミリー成員の内部に存在することを示唆している。
【０２３９】
Ｂ.ＴＲＡＦとＴＮＦレセプタースーパーファミリーの他の成員との相互作用
次に本発明者等は、各ＴＲＡＦとＴＮＦレセプタースーパーファミリーの他の成員との相互作用を試験した。三つのＴＲＡＦはいずれもＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓ抗原のいずれの細胞質ドメインとも関係しなかった（表５）。また、ＴＲＡＦ１はＣＤ４０と相互作用せず、ＴＲＡＦ３もまたＴＮＦ−Ｒ２と相互作用しなかった。しかし、ＴＲＡＦ２は、ＣＤ４０およびＴＮＦ−Ｒ２両者の細胞質ドメインと強く関係することが判明した（表５）。
【０２４０】
ＴＮＦおよびＣＤ４０リガンドはいずれもＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達ができる。ＴＮＦによるＮＦ−κＢ活性の誘導は、ヒト胚腎臓２９３細胞を包含する多数の細胞型で立証されている［シュー等、Cell、印刷中（１９９５）］（図１７）。レセプター特異的アゴニスト抗体での刺激により明らかであるように、２９３細胞におけるＴＮＦ誘導されたＮＦ−κＢ活性化は、恐らくは内因性ＴＮＦ−Ｒ２のレベルが低いため（下記参照）、専らＴＮＦ−Ｒ１によって仲介される（図１７）［ペニカ等、J.Biol.Chem.、２６７巻２１１７２頁（１９９２）］。ＮＦ−κＢ活性化におけるＴＲＡＦに対する機能的役割を調べるため、２９３細胞をＴＲＡＦ発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。２４時間後、核抽出物を調製し、電気泳動移動度シフト検定によりＮＦ−κＢ活性について検定した。
【０２４１】
ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ２（８７−５０１）のための発現ベクターは、ｐＲＫにおいて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター−エンハンサーの転写調節下に、それぞれのコード化領域を含んでいた［シャル等、Cell、６１巻３６１頁（１９９０）］。一過性トランスフェクトされた２９３細胞でのＴＲＡＦ蛋白の発現は、それぞれＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２に対するポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブロット分析によって確認された（ロースおよびゲッデル、公開されていない結果）。ＴＲＡＦ３、ＣＤ４０［フー等、J.Biol.Chem.、２６９巻３００６９頁（１９９４）］およびＴＮＦ−Ｒ２［タータグリア等、Cell、７３巻２１３頁（１９９３）］のための発現ベクターは、かつて記載された。
【０２４２】
２９３細胞をＴＲＡＦ発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。２４時間後、核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を電気泳動移動度シフト検定により分析した［シュッツェ等、上記］。活性化されたＮＦ−κＢ複合体の組成を、特異的ＮＦ−κＢサブユニットを認識する抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー）を用いるスーパーシフト分析により調べた。ＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ３の発現はＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の誘導を導かなかった。対照的に、ＴＲＡＦ２を発現している２９３細胞は 有意な量の活性化ＮＦ−κＢを含んでいた（図１７）。特異的ＮＦ−κＢサブユニットに対する抗体を用いるスーパーシフト実験により示されるように、活性ＮＦ−κＢ複合体の主要な成分はｐ６５：ｐ５０ヘテロ二量体らしく見受けられた（図１７）。
【０２４３】
Ｃ．ＴＲＡＦ２発現によるＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子の活性化
ＴＲＡＦ２発現がＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子を活性化できるか否かを決定するため、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター組み立て物［シンドラーおよびバイクウォール、上記］を、様々なＴＲＡＦ発現ベクターで２９３細胞中に同時トランスフェクトした。同時トランスフェクト実験のために、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミド０．５μｇ［シンドラーおよびバイクウォール、Mol.Cell.Biol.、１４巻５８２０頁（１９９４）］および各発現組み立て物１μｇで３ｘ１０５の２９３細胞をトランスフェクトした。ｐＲＫでの抑制により、ＤＮＡ濃度を一定に維持した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を溶菌し、ルシフェラーゼ検定系（プロメガ）を用いてリポーター遺伝子活性を測定した。ｐＲＳＶ−βｇａｌベクター（０．５μｇ）を用いてトランスフェクション効率を正規化した。ＴＲＡＦ２発現はリポーター遺伝子を強く活性化したが、一方ＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ３の発現は効果がなかった（図１８ａ）。全ての場合において、リポーター遺伝子の活性は、ＴＮＦの添加によるＴＮＦ−ＲＩ経路を介して（同時）誘導され得た（図１８ａ）。ＴＲＡＦ２発現が、Ｅ−セレクチンプロモーター中のＮＦ−κＢ部位が突然変異している対照リポーター組み立て物を活性化することができなかったことから、観察されたリポーター遺伝子誘導はＮＦ−κＢ活性化に依存していた。これらの結果は、ＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ３ではなくＴＲＡＦ２の過剰発現だけで、２９３細胞でのＮＦ−κＢ活性化を誘導するのに十分であることを証明している。
【０２４４】
ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３は、ＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４０との相互作用に必要とされないＮ末端ＲＩＮＧフィンガーモチーフを含んでいる［ロース等、上記；フー等、上記；チェング等、Science、２６７巻１４９４頁（１９９５）；およびモシアロス等、Cell、８０巻３８９頁（１９９５）］。ＲＩＮＧフィンガードメインを含むＮ末端８６アミノ酸を欠失するＴＲＡＦ２の末端切除変異体（ＴＲＡＦ２（８７−５０１））は、ＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４０の細胞質ドメインならびにＴＲＡＦ１および野生型ＴＲＡＦ２と関係する能力を保持している（表５）(ロース等、上記)。興味深いことに、他の点では機能的なこのＴＲＡＦ２（８７−５０１）蛋白は、２９３細胞でのＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性の誘導においては全く無効である（図１８ａ）。したがって、ＴＲＡＦ２のＲＩＮＧフィンガードメインがＮＦ−κＢ活性化にとって必要であるようである。
【０２４５】
２９３細胞で得られた結果を確認するため、マウス細胞毒性ＴセルラインＣＴ６において類似の一過性トランスフェクション実験を実施した。ＣＴ６細胞は、検出可能レベルのＴＮＦ−Ｒ１を発現せず［ルイス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８８巻２８３０頁（１９９１）］、そしてこのセルラインにおけるＴＮＦ誘導されたＮＦ−κＢ活性化はＴＮＦ−Ｒ２によって仲介される［ロース等、上記］。２９３細胞で観察されたように、野生型ＴＲＡＦ２の発現はＣＴ６細胞においてＥ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子を強く誘導したが、一方ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ３、およびＴＲＡＦ２（８７−５０１）は誘導しなかった（図１８ｂ）。ＣＴ６細胞の一過性トランスフェクションをＤＥＡＥ−デキストラン法を用いて実施した［F.M.アウスベル等、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（グリーン・パブリッシング・アソシエイツ／ウィレイ・アンド・サンズ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４）］。１０７のＣＤ６細胞を、２５０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン中、計１０μｇのプラスミドＤＮＡで９０分間トランスフェクトした。トランスフェクションの４０時間後にリポーター遺伝子活性を検定した。さらに、突然変異体ＴＲＡＦ２（８７−５０１）の発現は、ＣＴ６細胞のＴＮＦ刺激により誘導されるＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性を抑制したが、野生型ＴＲＡＦ１、２または３は抑制しなかった。このように、ＴＲＡＦ２（８７−５０１）は、ＣＴ６細胞におけるＴＮＦ−Ｒ２仲介ＮＦ−κＢ活性化の顕著な負のインヒビターとして働く。
【０２４６】
ＣＴ６細胞とは対照的に、２９３細胞におけるＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ活性化はＴＮＦ−Ｒ１により仲介される（上記参照）。２９３細胞における突然変異体ＴＲＡＦ２（８７−５０１）の過剰発現は、ＴＮＦ誘導Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子活性を僅かに低下させただけであり（図１８ａ）、これは、ＴＮＦ−Ｒ１シグナル伝達が顕著な負のＴＲＡＦ２突然変異により遮断されないことを示している。２９３細胞におけるＴＮＦ−Ｒ２シグナル伝達に及ぼすＴＲＡＦの効果を試験するため、ＴＮＦ−Ｒ２を野生型または突然変異体ＴＲＡＦで一過性に同時発現させた。ＴＮＦの同時刺激が無くとも、ＴＮＦ−Ｒ２の過剰発現だけでＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性の開始に十分であった（図１９ａ）。同様に、外因性ＴＮＦの不在下でのＴＮＦ−Ｒ１過剰発現は、ＨｅＬａ細胞および２９３細胞の両者においてアポトーシスおよびＮＦ−κＢ活性化を誘導することが知られている［ボールディン等、J.Biol.Chem.、２７０巻３８７頁（１９９５）；シュー等、上記］。突然変異体ＴＲＡＦ２（８７−５０１）の同時発現は、ＴＮＦ−Ｒ２により誘導されるリポーター遺伝子活性化を完全に損なった（図１９ａ）。このように、ＣＴ６細胞の場合と同様、ＴＲＡＦ２（８７−５０１）は、２９３細胞でのＴＮＦ−Ｒ２シグナル伝達に顕著な負の効果を及ぼす。しかしながら、ｈＴＮＦ−Ｒ２およびＴＲＡＦ２（８７−５０１）を同時発現した２９３細胞でのＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性は、ＴＮＦの添加によりＴＮＦ−Ｒ１経路を介して、尚誘導された（図１９ａ）。これらの観察は、ＴＲＡＦ２シグナル伝達経路はＴＮＦ−Ｒ２により仲介される反応には必須であるが、ＴＮＦ−Ｒ１シグナル伝達には関わっていないことを証明している。
【０２４７】
Ｄ．ＴＲＡＦ２はＣＤ４０によるＮＦ−κＢ活性化を仲介している
ＴＲＡＦ２がＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４０の両者と関係することから（上記参照）、次に本発明者等は、ＴＲＡＦ２がＣＤ４０によるＮＦ−κＢ活性化をも仲介しているか否かを調べた。ＴＮＦ−Ｒ２について観察されるように、２９３細胞におけるＣＤ４０の過剰発現は、リガンドの不在下でＮＦ−κＢ活性化を誘導するに十分である（図１９ｂ）。ＣＤ４０および突然変異体ＴＲＡＦ２（８７−５０１）の同時発現は、ＣＤ４０により誘導されるリポーター遺伝子活性を完全に阻害し（図１９ｂ）、この事は、ＴＲＡＦ２（８７−５０１）が、ＣＤ４０シグナル伝達およびＴＮＦ−Ｒ２シグナル伝達に顕著な負の効果を及ぼしていることを証明している。これらの結果は、ＴＲＡＦ２がＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４０の両者のためのＮＦ-κＢ活性化の共通仲介物質であることを示している。
【０２４８】
２９３細胞における野生型ＴＲＡＦ２およびＴＮＦ−Ｒ２またはＣＤ４０の同時発現は、ＴＲＡＦ２単独の発現より実質上強いＥ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子活性をもたらさなかった（図１８ａ、１９ａ、ｂ）が、この事は、シグナル伝達カスケード中の下流の要素が２９３細胞中に限定されていることを示唆している。本発明者等の結果はさらに、ＴＲＡＦ１：ＴＲＡＦ２ヘテロ二量体がＮＦ−κＢ活性化において機能的であり得ることを示している。ＴＲＡＦ１およびＣＤ４０の同時発現はＣＤ４０の誘導するＮＦ−κＢ活性化の微弱な低下をもたらしたものの（図１９ｂ）、内因性ＴＲＡＦ２ホモ二量体をＴＲＡＦ１：ＴＲＡＦ２ヘテロ二量体中へ運ぶと予想されているＴＲＡＦ１の過剰発現は、ＣＴ６または２９３細胞のいずれにおいてもＴＮＦ−Ｒ２仲介リポーター遺伝子活性化を阻害しなかった。むしろ、ＴＮＦ−Ｒ２およびＴＲＡＦ１が２９３細胞で同時発現される時には、僅かな、それでいて再現性のあるリポーター遺伝子活性の増加が観察された（図１９ａ）。
【０２４９】
驚くべき結果は、野生型ＴＲＡＦ３が２９３細胞においてＣＤ４０誘導されたＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性を抑制したことである（図１９ｂ）。即ち、ＴＲＡＦ２はＣＤ４０誘導されたＮＦ−κＢ活性化を仲介する正のシグナル伝達体として働き、一方ＴＲＡＦ３は、恐らくはＣＤ４０上の部分重複しているＴＲＡＦ合体部位に結合することにより、この活性に拮抗する。ＴＲＡＦ３はまた、２９３細胞においてＴＮＦ−Ｒ２誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図１９ａ）が、この効果はＣＴ６細胞では観察されなかった（図１８ｂ）。二ハイブリッド分析によりＴＲＡＦ３とＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２またはＴＮＦ−Ｒ２との直接の相互作用は検出されなかった（上記参照）が、２９３細胞におけるＴＲＡＦ３の顕著な負の効果は、ＴＲＡＦ３がこれらの構成因子の一つと弱く相互作用していることを意味しているかも知れない。それならばＴＮＦ−Ｒ２仲介されたＮＦ−κＢ活性化の阻害は、ＣＴ６細胞と比較して２９３細胞中でのＴＲＡＦ３の高いレベルの過剰発現によって説明できる。さらに、ＴＲＡＦ３は、ＴＲＡＦ２仲介されたＮＦ−κＢ活性化経路とは異なったシグナル伝達経路に参加しているということもあり得る。ＴＲＡＦ２との類推により、このような経路の始まりはＴＲＡＦ３のＲＩＮＧフィンガードメインを含んでいるかも知れない。チェング等［チェング等、上記］は近年、分子のＮ末端側半分を欠失する末端切除ＴＲＡＦ３蛋白が、ＣＤ４０の仲介するＣＤ２３の誘導を抑制することを観察した。チェング等［チェング等、上記］が天然ＴＲＡＦ３の効果を報告しなかったのに対し、本発明者等の結果は、ＣＤ４０によるＣＤ２３発現の誘導がＴＲＡＦ２により仲介され、そして天然ＴＲＡＦ３により阻害され得ることを指摘することができた。
【０２５０】
Ｅ．ＴＲＡＦ２とＬＭＰ１との相互作用
エプスタイン−バールウイルストランスフォーミング蛋白ＬＭＰ１のＣ末端細胞質ドメインはＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３と相互作用することが報告された［モシアロス等、Cell、８０巻３８９頁（１９９５）］。ＴＲＡＦ１およびＬＭＰ１の間の相互作用は間接的であることが判明し、そしてまだ未知のＴＲＡＦ蛋白により仲介されているという仮説が立てられた。本発明者等は、酵母二ハイブリッド系を用いてＴＲＡＦ２がＬＭＰ１と相互作用するか否かを調べた。表６に示されるとおり、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ２（８７−５０１）およびＴＲＡＦ３はＬＭＰ１のＣ末端細胞質ドメインと強く関係している。これらの発見に基づくと、ＴＲＡＦ２はＴＲＡＦ１−ＬＭＰ１相互作用を仲介していると信じられる。ＬＭＰ１は、細胞増殖および遺伝子の発現に多数の下流効果を有する支配的オンコジーンであり、少なくともその幾つかはＮＦ−κＢ活性化を必要とする［ラハーティ等、J.Biol.Chem.、２６７巻２４１５７頁（１９９２）；ロウウェ等、J.Virol.、６８巻５６０２頁（１９９４）］。既知の３種のＴＲＡＦの全てについての本発明者等の比較分析は、ＴＲＡＦ２が、ＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０およびことによるとＬＭＰ１のための共通のシグナル伝達体としてＮＦ-κＢ活性化を開始させるということを示唆している。
【０２５１】
考察
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの幾つかの成員により始動する重要な活性は、転写因子ＮＦ−κＢの活性化である。本明細書に報告されている結果は、ＴＲＡＦ１またはＴＲＡＦ３ではなくＴＲＡＦ２の過剰発現がＮＦ−κＢ活性化の誘導にとって十分であることを証明している。さらに、Ｎ末端ＲＩＮＧフィンガードメインを欠く末端切除されたＴＲＡＦ２蛋白は、支配的な負の突然変異として働くことにより、ＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４０で仲介されるＮＦ−κＢ活性化を抑制する。故に本発明者等は、ＴＲＡＦ２はＮＦ−κＢの活性化に決定的に関わる、ＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４０シグナル伝達の共通仲介物質であると結論付ける。概念的には、このシグナル伝達カスケードは、レセプターの集中またはＴＲＡＦ２過剰発現が引き金となって起こるＴＲＡＦ２凝集によって活性化される。さらに本発明者等は、ＴＲＡＦ２がＬＭＰ１のためのシグナル伝達物質であるらしいということを示した。
【０２５２】
この研究において概説された発見は、ＴＮＦ仲介されるＮＦ−κＢ活性化におけるＴＲＡＦ２の関与はＴＮＦ−Ｒ２シグナル伝達に限定され、ＴＮＦ−Ｒ１によるＮＦ−κＢ活性化には必要ないことを立証するものである。この観察は、ＴＲＡＦファミリーには無関係でＴＮＦ−Ｒ１によるＮＦ−κＢ活性化を仲介する新規な蛋白ＴＲＡＤＤの最近の同定によって支持される［シュー等、上記］。二つの別個なシグナル伝達物質ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＤＤの同定は、ＮＦ−κＢの活性化は複数の独立したシグナル伝達経路を介して達成されるという初期の指摘に対する分子上の証拠を提供する［タノスおよびマニアティス、同書、８０巻５２９頁（１９９５）］。Ｎ末端ＲＩＮＧフィンガードメインを欠く突然変異体ＴＲＡＦ２蛋白がＴＮＦ−Ｒ２、ＣＤ４０、ＴＲＡＦ１、およびＴＲＡＦ２と相互作用する能力を保持し、それでいてＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達において全く不完全であるという事は注目に値する。この発見は、ＴＲＡＦ２のＲＩＮＧフィンガードメインが、ＮＦ−κＢ活性化に関与し、そしてシグナル伝達カスケードにおいてＴＲＡＦ２を次の工程に連結する、可能性ある蛋白−蛋白相互作用ドメインを表していることを示唆するものである。
表５。ＴＲＡＦおよびＴＮＦレセプタースーパーファミリーの成員の間の相互作用。酵母Ｙ１９０細胞を、示されたＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよびＧａｌ４転写活性化ドメイン融合蛋白をコードしている発現ベクターで同時形質転換した。それぞれの形質転換混合物を、トリプトファンおよびロイシンを欠く合成デキストロースプレート上に蒔いた。融合蛋白間の相互作用を検出するため、β−ガラクトシダーゼ活性についてのフィルター検定を実施した。プラス記号は、検定の１時間以内の強い色素発色を示す。マイナス記号は、２４時間以内に色素の発色がないことを示す。空のＧａｌ４ベクターによる対照の形質転換は陰性であり、列記していない。
【表５】
2010131018.tif 000006
表６。ＴＲＡＦおよびＬＭＰ１の細胞質ドメインの間の相互作用。酵母Ｙ１９０細胞を
、示されたＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよびＧａｌ４転写活性化ドメイン融合蛋白（
１４）をコードしている発現ベクターで同時形質転換した。Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイ
ン−ＬＭＰ１組み立て物は、ＬＭＰ１のＣ末端の１７６アミノ酸を含んでいた（S.フェン
ネワルド、V.ヴァン・サンテン、E.キエフ。潜在的成長トランスフォーミングウイルス感
染において転写されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、それが膜蛋白をコードしているか
も知れないことを示している。J.Virol.、５１巻４１１−４１９頁、１９８４）。各々の
形質転換混合物を、トリプトファンおよびロイシンを欠く合成デキストロースプレート上
に蒔いた。融合蛋白間の相互作用を検出するため、β−ガラクトシダーゼ活性についての
フィルター検定を実施した。プラス記号は、検定の１時間以内の強い色素発色を示す。マ
イナス記号は、２４時間以内に色素の発色がないことを示す。空のＧａｌ４ベクターによ
る対照の形質転換は陰性であり、列記していない。
【表６】
2010131018.tif 000007
【０２５３】
本明細書に引用されている全ての文書およびその中に引用されている参考文献は、説明的に引用して本明細書の一部とするものである。
特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の下に、１９９５年２月１０日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、ＭＤ、U.S.A.に以下の寄託をおこなった。
名称：                                          ＡＴＣＣ番号
ＴＲＡＦ２プラスミドｐＰＣ８６−ＴＲＡＦ２      ９７０５３
ＴＲＡＦ１プラスミドｐＢｓｔ−ＴＲＡＦ１        ９７０５４
この寄託の実施は、本発明を可能とするために寄託が必要であることの容認では断じてない。逆に、本発明はこれらの寄託に関係なく完全に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】ＣＴ６細胞におけるＴＮＦ−Ｒ２による転写因子ＮＦ−κＢの活性化。１：５００希釈の抗ｍＴＮＦ−Ｒ２ポリクローナル抗体またはそれぞれの免疫前血清で２０分間刺激しておいたＣＴ６細胞から調製された核抽出物６μｇを、２個の野生型（ｗｔ）または突然変異体（ｍｔ）ＮＦ−κＢ結合部位のいずれかを含む放射標識された二本鎖オリゴヌクレオチドとインキュベートし、そして、電気泳動移動度シフト検定によってＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の誘導について分析した［シュッツェ等、Cell、７１巻７６５−７７６頁（１９９２）］。結合反応は、競合オリゴヌクレオチド無しで、または、突然変異体ＮＦ−κＢ結合部位もしくは転写因子ＡＰ−１のための結合部位を含む非標識化競合オリゴヌクレオチドの５００倍過剰の存在下で実施した［P.エンジェル等、Mol.Cell.Biol.、７巻２２５６−２２６６頁（１９８７）］。ＦおよびＢはそれぞれ遊離のオリゴヌクレオチドプローブおよび蛋白と複合体形成しているオリゴヌクレオチドプローブを指す。
【図２】ｈＴＮＦ−Ｒ２の免疫沈降。  （Ａ）３５Ｓ標識されたＣＴ６細胞またはｈＴＮＦ−Ｒ２を発現するＣＴ６細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦで１０分間刺激するかまたは処置せずにおいた。細胞を溶解し、ｈＴＮＦ−Ｒ２を本明細書に記載のように免疫沈降させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。星印は７５−８０ｋｄのｈＴＮＦ−Ｒ２に相当するバンドを示している。  （Ｂ）ｈＴＮＦ−Ｒ２を非刺激またはＴＮＦ刺激２９３または２９３／ＴＮＦ−Ｒ２細胞から免疫沈降させ、３５Ｓ標識化ＣＴ６細胞からの溶解液と共にインキュベートした。矢印は、両実験でｈＴＮＦ−Ｒ２により特異的に共同沈降する４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８ｋｄのバンドを示している。分子量マーカーを右側にｋｄで示す。
【図３】ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白の精製。  グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白を大腸菌で発現させ、本明細書に記載のように精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色により分析した。分子量マーカーを右側にｋｄで示す。
【図４】ＣＴ６細胞抽出物中でのＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白の共同沈降。  ＧＳＴおよびＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白ビーズを本明細書に記載のように３５Ｓ標識化ＣＴ６細胞からの溶解液と共にインキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。矢印は、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白により特異的に共同沈降する４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８ｋｄのバンドを示している。分子量マーカーを右側にｋｄで示す。
【図５】ＣＴ６細胞抽出物中でのＧＳＴ−突然変異体ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白の共同沈降。  ＧＳＴおよびｈＴＮＦ−Ｒ２の突然変異体細胞内ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白をグルタチオン−アガロースビーズに結合させ、３５Ｓ標識化ＣＴ６細胞からの溶解液とインキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。矢印は、ｈＴＮＦ−Ｒ２の野生型（ｗｔ）、突然変異体−１６、△３０４−３４５および３８４−４２４細胞内ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白とは特異的に共同沈降するが、突然変異体−３７および−５９細胞内ドメインとは関係しない４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８ｋｄのバンドを示している。非標識化融合蛋白が同じ大きさの位置に移動するため、幾つかの場合ではこれらのバンドのパターンが圧縮されていることに留意さたい。分子量マーカーは右側にｋｄで示す。
【図６】ＴＮＦ−Ｒ２関連因子とＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白との競合。  （Ａ）ｈＴＮＦ−Ｒ２を２９３および２９３／ＴＮＦ−Ｒ２細胞から免疫沈降させ、競合物質として示されたＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白ビーズ５０μｌと共にプレインキュベートしておいた３５Ｓ標識化ＣＴ６細胞からの溶解液と共にインキュベートした。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。矢印は、ｈＴＮＦ−Ｒ２と特異的に共同沈降し、ｈＴＮＦ−Ｒ２の野生型（ｗｔ）および突然変異体−１６細胞内ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白とのプレインキュベーションにより涸渇しているが突然変異体−３７および−５９細胞内ドメイン融合蛋白とのプレインキュベーションによっては涸渇していない、４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８ｋｄのバンドを示している。  （Ｂ）（Ａ）に記載のものと類似の実験の６８ｋｄ領域を示す。  分子量マーカーは右側にｋｄで示す。
【図７】ジャーカット細胞抽出液中でのＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白の共同沈降。  ＧＳＴおよびＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白ビーズを、１００ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦで１０分間刺激したまたは非処置のままでおいた３５Ｓ標識化ジャーカット細胞からの溶解液と共にインキュベートした。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。矢印は、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白と特異的に共同沈降する４５ないし５０−５６ｋｄ、６７ｋｄおよび７３−７５ｋｄのバンドを示している。分子量マーカーは右側にｋｄで示す。
【図８】ＴＮＦ−Ｒ２関連因子の細胞内位置決定。  本明細書に記載のようにして３５Ｓ標識化ＣＴ６細胞から細胞質および細胞膜画分を調製した。これらの画分およびＣＴ６細胞からのデタージェント（総）抽出液をＧＳＴおよびＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合ビーズと共にインキュベートし、この反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。矢印は、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白と特異的に共同沈降する４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８ｋｄのバンドを示している。分子量マーカーは右側にｋｄで示す。
【図９】ＴＮＦ−Ｒ２関連因子の精製。  ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白親和クロマトグラフィーによるＣＴ６細胞からのＴＮＦ−Ｒ２関連因子の大規模精製を、本明細書に記載のように実施した。得られた材料の十分の一をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析した。矢印は、ＧＳＴ−ｈＴＮＦ−Ｒ２ｉｃｄ融合蛋白親和カラムから特異的に溶出した４５ないし５０−５６ｋｄおよび６８−７０ｋｄのバンドを示している。分子量マーカーは右側にｋｄで示す。
【図１０ａ】ＴＲＡＦ１ ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列（配列番号１および２）。  ＴＲＡＦ１ ｃＤＮＡの核酸配列を、ＳａｌＩクローニングリンカー後の最初の塩基から始まる番号を付けて示す。推定蛋白配列を、開始メチオニンから番号を付して上部に示す。開始メチオニンの上流のフレーム内停止コドンに下線を付す。精製されたＴＲＡＦ１蛋白の配列決定により同定されたアミノ酸を太字で示す。ＴＲＡＦドメイン（明細書を参照されたい）はアミノ酸１８０（＞）−４０９（＜）を含んでいる。考え得るロイシンジッパー領域（明細書を参照されたい）はアミノ酸１８３（＋）−２５９（−）の間に広がっている。この七個組のモチーフを規定する領域内のアミノ酸をイタリック体で示す。
【図１０ｂ】図１０ａの続きである
【図１１ａ】ＴＲＡＦ２ ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列（配列番号３および４）。  最長のＴＲＡＦ２ ｃＤＮＡの核酸配列を、ＳａｌＩクローニングリンカー後の最初の塩基から始まる番号を付けて示す。さらに、４個の独立して分離されているｐＰＣ８６ ｃＤＮＡ挿入物（＊）および最長のλファージｃＤＮＡ挿入物（＾）の最初のヌクレオチドを示す。推定蛋白配列を、全ての分離されたｐＰＣ８６ＴＲＡＦ２ ｃＤＮＡクローンにおいてＧＡＬ４活性化ドメインコード化領域のフレーム内にある、予想開始メチオニンから番号を付して上部に示す（明細書を参照されたい）。ＲＩＮＧフィンガーモチーフを規定するシステインおよびヒスチジン残基、ならびに２個のＴＦIIIＡ様亜鉛フィンガーモチーフ（明細書を参照されたい）を、それぞれ太字でまたは下線を付して示す。ＴＲＡＦドメイン（明細書を参照されたい）はアミノ酸２７２（＞）−５０１（＜）を含む。考え得るロイシンジッパー領域（明細書を参照されたい）はアミノ酸２７５（＋）−３５１（−）の間に広がっている。七個組モチーフを規定しているこの領域内のアミノ酸をイタリック体で示す。
【図１１ｂ】図１１ａの続きである。
【図１２ａ】ＴＲＡＦ２内の領域と亜鉛結合モチーフとの配列類似性。  （Ａ）ＲＩＮＧフィンガーモチーフを含むアミノ酸配列の比較。ＴＲＡＦ２ ＲＩＮＧフィンガーモチーフを、A.タリアナ由来の調節蛋白ＣＯＰ１［デング等、Cell、７１巻７９１−８０１頁（１９９２）；配列番号５］、ヒトエストロゲン応答フィンガー蛋白ＥＦＰ［イノウエ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９０巻１１１１７−１１１２１頁（１９９３）；配列番号６］、S.セレヴィシアエおよびN.クラッサにおけるＤＮＡ修復にそれぞれ要するＲＡＤ１８およびＵＶＳ−２遺伝子産物［ジョーンズ等、Nucl.Acids Res.、１６巻７１１９−７１３１頁（１９８８）；配列番号７］；［トミタ等、Mol.Gen.Genet.、２３８巻２２５−２３３頁（１９９３）；配列番号８］、ヒトＶ（Ｄ）Ｊ組換え活性化遺伝子産物ＲＡＧ−１［シャッツ等、Cell、５９巻１０３５−１０４８頁（１９８９）；配列番号９］、ヒト５２ｋｄリボクレオ蛋白ＳＳ−Ａ／Ｒｏ［チャン等、J.Clin.Invest.、８７巻６８−７６頁（１９８７）］；イトー等、J.Clin.Invest.、８７巻１７７−１８６頁（１９８７）；文献１のＡ５２は文献２のＰ５２である；配列番号１０］；ヒトＲＩＮＧ１［ロヴァリング、ＧＢＴＲＡＮＳ受理番号Ｚ１４０００（１９９２）；配列番号１１］、マウスＴリンパ球調節蛋白ＲＰＴ−１［パターカ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８５巻２７３３−２７３７頁（１９８８）；配列番号１２］、ヒト調節蛋白ＲＦＰ［タカハシ等、Mol.Cell.Biol.、８巻１８５３−１８５６頁（１９８８）；配列番号１３］、およびヒトプロトオンコジーンｃ−ｃｂｌの産物［ブレイク等、Oncogene、６巻６５３−６５７頁（１９９１）；配列番号１４］の各々の亜鉛結合モチーフと並置する。  （Ｂ）ＴＦIIIＡ型亜鉛フィンガーモチーフを含むアミノ酸配列の比較。２個の隣接する共通配列Ｃ／Ｈ−Ｘ２−４−Ｃ／Ｈ−Ｘ２−１５−Ｃ／Ｈ−Ｘ２−４−Ｃ／Ｈの反復を含むＴＲＡＦ２中の領域［バーグ、J.Biol.Chem.、２６５巻６５１３−６５１６頁（１９９０）］を、発育と共に調節されるD.ディスコイデウム由来のＤＧ１７遺伝子産物［ドリスコルおよびウィリアムズ、Mol.Cell.Biol.、７巻４４８２−４４８９頁（１９８７）；配列番号１５］、転写因子IIIＡ型X.ラエヴィス［ミラー等、EMBO J．、４巻１６０９−１６１４頁（１９８５）；配列番号１６］、ツメガエル亜鉛フィンガー蛋白ＸＬＣＯＦ１４およびＸＦＩＮ［ニートフェルド等、J.Mol.Biol.、２０８巻６３９−６５９頁（１９８９）；配列番号１７］；［ルイーズ・イ・アルタバ等、EMBO J．、６巻３０６５−３０７０頁（１９８７）；配列番号１８］、マウスＺＦＹ１／２およびＭＦＧ２遺伝子産物［マードンおよびペイジ、Cell、５６巻７６５−７７０頁（１９８９）：配列番号１９］；［パサナンティ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８６巻９４２１−９４７１頁（１９８９）；配列番号２０］、およびＲＡＤ１８およびＵＶＳ−２蛋白（上記参照；配列番号２１および２２）の類似の亜鉛結合モチーフと並置する。
【図１２ｂ】図１２ａの続きである。
【図１３】ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の間の相同性。  ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２の蛋白配列の最適化された並置を示す。同一のアミノ酸に囲みを付す。Ｃ末端ＴＲＡＦドメイン(明細書を参照されたい)は、ＴＲＡＦ１のアミノ酸１８０−４０９およびＴＲＡＦ２の２７２−５０１からなる。
【図１４ａ】ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２のハイドロパシー。  ２０のアミノ酸のウインドウを用いるカイトおよびドゥーリトル、J.Mol.Biol.、１５７巻１０５−１３２頁（１９８２）の方法によって、ＴＲＡＦ１（Ａ）およびＴＲＡＦ２（Ｂ）のアミノ酸配列のハイドロパシープロフィルを得た。各プロットの下の数は、それぞれの蛋白のアミノ酸の位置を示す。
【図１４ｂ】図１４ａの続きである。
【図１５】ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。  （Ａ）ＣＴ６細胞におけるＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。列当たりＣＴ６細胞由来のポリ(Ａ)＋ＲＮＡ３μｇがある。  （Ｂ）マウス組織におけるＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。マウスの複数組織ノーザンブロット（クロンテク）を、本明細書に記載のように、放射標識されたＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２プローブとハイブリダイズさせた。
【図１６】２９３細胞抽出液におけるＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白の共同沈降。  ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白ビーズを、本明細書に記載のように２９３および２９３／ＴＮＦ−Ｒ２細胞由来の溶解液と共にインキュベートした。反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに抗ヒトＴＮＦ−Ｒ１モノクローナル抗体９８６（０．５μｇ／ｍｌ）および抗ヒトＴＮＦ−Ｒ２モノクローナル抗体１０３６（０．５μｇ／ｍｌ）を用いるウェスタンブロット分析によって分析した。矢印は、ＧＳＴ−ＴＲＡＦ２融合蛋白と特異的に共同沈降する７５−８０ｋｄ ｈＴＮＦ−Ｒ２バンドを示す。分子量マーカーは右側にｋｄで示す。
【図１７】転写因子ＮＦ−κＢをＴＲＡＦ２過剰発現により活性化する。２９３細胞（１０６）を、７．５μｇのｐＲＫ対照（第１−５列）またはＴＲＡＦ１（第６列）、ＴＲＡＦ３（第７列）およびＴＲＡＦ２（第７−１６列）のための発現ベクターでトランスフェクトした。発現ベクターおよび２９３細胞での一過性トランスフェクションは実施例６に記載されている。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ（第２列）、免疫前血清（第３列）、抗ヒトＴＮＦ−Ｒ１抗体（第４列）または抗ヒトＴＮＦ−Ｒ２抗体（第５列）を用い１：５００の希釈で、収穫前に１時間処理した［ロース等、Cell、７８巻６８１頁（１９９４）］。核抽出物をトランスフェクションの２４時間後に調製し、６μｇのアリコートを、２個のＮＦ−κＢ結合部位を含む放射標識化二本鎖オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした［シュッツェ等、Cell、７１巻７６５頁（１９９２）］。野生型（第９列）または突然変異した（第１０列）ＮＦ−κＢ配列のいずれかを含む５０倍過剰の非標識化競合物質オリゴヌクレオチドを各反応に添加した［シュッツェ等、上記］。反応混合物を、１μｌの免疫前血清（第１１列）、抗ｐ５０血清（第１２列）、抗ｐ６５血清（第１３列）、抗ｃ−ｒｅｌ血清（第１４列）、抗ｒｅｌＢ血清（第１５列）または抗ｐ５２血清（第１６列）と共にインキュベートした［サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー］。ＦおよびＢはそれぞれ遊離オリゴヌクレオチドプローブまたは蛋白と複合体形成しているオリゴヌクレオチドプローブを指す。
【図１８】ＴＲＡＦ２の過剰発現はＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性を誘導する。（Ａ）２９３細胞における、ＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性に及ぼすＴＲＡＦ過剰発現の効果。２９３細胞を、実施例６に記載のように、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミド［シンドラーおよびバイクウォール、Mol.Cell.Biol.、１４巻５８２０頁（１９９４）］およびＴＲＡＦ発現ベクター（１μｇ）を用いて一過性に同時トランスフェクトさせた。細胞は、処置しない（塗りつぶした棒）かまたは収穫前に１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦで８時間刺激（斜線を施した棒）した。ルシフェラーゼの活性を測定し、β−ガラクトシダーゼ発現に基づいて正規化した。示されている値は一つの代表的実験の平均値（平均±ＳＤ）であって、ここで各トランスフェクションは三重に実施した。（Ｂ）ＣＴ６細胞におけるＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性に及ぼすＴＲＡＦ発現の効果。ＣＴ６細胞を、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミド（実施例６に記載の通り）およびＴＲＡＦ発現ベクター（６μｇ）を用いて一過性に同時トランスフェクトした。（ＣＴ６細胞の一過性トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いて実施した［F.M.アウスベル等、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（グリーン・パブリッシング・アソシエイツ／ウィレイ・アンド・サンズ、Ｉｎｃ.)、ニューヨーク（１９９４）]。１０７のＣＴ６細胞を、２５０μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン中のプラスミドＤＮＡ計１０μｇで９０分間トランスフェクトした。リポーター遺伝子活性を、トランスフェクションの４０時間後に検定した)。２４時間後、細胞を非処置のまま放置（塗りつぶした棒）、または１００ｎｇ／ｍｌマウスＴＮＦでさらに１６時間刺激（斜線を施した棒）した後、収穫した。ルシフェラーゼ活性を測定し、β−ガラクトシダーゼ発現に基づき正規化した。示されている値は一つの代表的実験の平均値（平均±ＳＤ）であって、ここで各トランスフェクションは三重に実施した。数字は、それぞれのトランスフェクションに関してＴＮＦ刺激によりリポーター遺伝子活性の誘導された倍数を表す。
【図１９】ＴＲＡＦ２は、ＴＮＦ−Ｒ２およびＣＤ４ＯによるＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性の誘導を仲介する。（Ａ）２９３細胞における、ＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性に及ぼすＴＮＦ−Ｒ２およびＴＲＡＦの同時発現の効果。２９３細胞を、実施例６に記載のように、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミド［シンドラーおよびバイクウォール、上記］およびＴＮＦ−Ｒ２（１μｇ）およびＴＲＡＦ（１μｇ）のための発現ベクターを用いて一過性に同時トランスフェクションした。細胞を、収穫前に非処置（塗りつぶした棒）とするかまたは１００ｎｇ／ｍｌヒトＴＮＦで８時間刺激（斜線を施した棒）した。ルシフェラーゼ活性を測定し、β−ガラクトシダーゼ発現に基づき正規化した。示されている値は一つの代表的実験の平均値（平均±ＳＤ）であって、ここで各トランスフェクションは三重に実施した。（Ｂ）２９３細胞における、ＮＦ−κＢ依存性リポーター遺伝子活性に及ぼすＣＤ４０およびＴＲＡＦの同時発現の効果。２９３細胞を、実施例６に示されるような、Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミド［シンドラーおよびバイクウォール、上記］およびＣＤ４０（１μｇ）およびＴＲＡＦ（１μｇ）のための発現ベクターを用いて一過性に同時トランスフェクションした。２４時間後、細胞を収穫し、ルシフェラーゼ活性を測定し正規化した（塗りつぶした棒）。示されている値は一つの代表的実験の平均値（平均±ＳＤ）であって、ここで各トランスフェクションは三重に実施した。
【０２５５】
SEQUENCE LISTING
<110>Doe
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(i) APPLICANT: Genentech, Inc.
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(A) ADDRESSEE: Genentech, Inc.
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(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: Dreger, Ginger R.
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2088 bases
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CCCAGCCCGG TTCTCTGCCC CAAGGACGCT ACCGCCCAAT GCGAGCAGAA 50
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GAAAACGAGT TTCAATTTGG TTGCCCCCCT GCTCCCTGCC AGGACCCATC 300
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ATGATGAGGA TCGGATCTGT CCTAAATGCA GAGCAGACAA CCTCCATCCT 400
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CTGTACCTGC TGCTGGCGGT CTTAAAGGAG TGGAAATCCT CACCAGGCTC 600
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GAAGGAGAAG CTGCTGGCTC AGCTGGAGGA GAAGCTGCGT GTGTTTGCAA 800
ACATTGTTGC TGTCCTCAAC AAGGAAGTGG AGGCTTCCCA CCTGGCACTG 850
GCCGCCTCCA TCCACCAGAG CCAGTTGGAC CGAGAGCACC TCCTGAGCTT 900
GGAGCAGAGG GTGGTGGAAT TACAGCAAAC CCTGGCTCAA AAAGACCAGG 950
TCCTGGGCAA GCTTGAGCAC AGTCTGCGAC TCATGGAGGA GGCATCCTTT 1000
GATGGTACTT TCCTGTGGAA GATCACCAAT GTCACCAAGC GGTGCCACGA 1050
GTCAGTGTGT GGCCGGACTG TCAGCCTCTT CTCTCCAGCT TTCTACACTG 1100
CCAAGTATGG TTACAAGTTG TGCCTGCGCT TGTACCTGAA CGGGGATGGC 1150
TCAGGCAAGA AGACCCACCT GTCCCTCTTC ATCGTGATCA TGAGAGGAGA 1200
ATACGATGCT CTCCTGCCCT GGCCTTTCAG GAACAAGGTC ACCTTTATGC 1250
TACTTGACCA GAACAACCGA GAGCATGCTA TTGATGCCTT CCGGCCTGAC 1300
CTGAGCTCAG CCTCCTTCCA GCGGCCACAG AGTGAGACCA ACGTGGCCAG 1350
CGGCTGCCCG CTCTTCTTCC CCCTCAGCAA GCTGCAGTCA CCCAAGCACG 1400
CCTACGTCAA AGATGACACA ATGTTCCTCA AATGCATTGT GGACACTAGT 1450
GCTTAGGGAT GGGGGGAGGG GGTGTCTCCT GACAGAACCA GCTTAGACTG 1500
GGGGACTTAG CTAGACAGCC AGGCCCTGCC TGCCCTTGGA GCCCACAGCC 1550
CACGACAAGG AGGAGCCAAG GCTGGCATGA CTTCAGCGCC ACAGCATGCT 1600
GGTTATGGCT GATGTGAGGC TGGAGAAACG TGTGCGTACA GAGACAGAGT 1650
GGAGGAGAAG ACAGAAGTGC TCTTTTCACA CAGACTACAC GACACCAGGA 1700
GGCCAGCATG CCAGCAGCTT CTGAATGTTG AGACCAGCCT AGATCAGGAT 1750
GAAAAGAGCC AGGCCTGAGG CTTGGACATT GAGCCAAGGC TATGGGGCCT 1800
AAGTGGAGGG GCACTCCTAC CAGGACATTC TCTCGAGGTC AGGGCATAAC 1850
TGGAAAAATG CCCCCATCTC TCTGTTCAGA CTCAAAACTA GAACCACAGG 1900
GCAGAAGGGT CAGACATTAA TGTGAATTTA ACCTGCCCTG GACTGAGTTC 1950
CTATGTTAAC AGACACGCAA ACAGGTAAAC CCAGAAACTG CCCTGGGAAA 2000
TGCTTTCTGG CTGCATCTGG AGATCTTTGA TGTTTTTACC GACAAAACAA 2050
ATAACAAAAG CCTTGAATTG CAAAAAAAAA AAAAAAAA 2088
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 409 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
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Met Ala Ser Ser Ser Ala Pro Asp Glu Asn Glu Phe Gln Phe Gly
1               5                  10                  15
Cys Pro Pro Ala Pro Cys Gln Asp Pro Ser Glu Pro Arg Val Leu
20                  25                  30
Cys Cys Thr Ala Cys Leu Ser Glu Asn Leu Arg Asp Asp Glu Asp
35                  40                  45
Arg Ile Cys Pro Lys Cys Arg Ala Asp Asn Leu His Pro Val Ser
50                  55                  60
Pro Gly Ser Pro Leu Thr Gln Glu Lys Val His Ser Asp Val Ala
65                  70                  75
Glu Ala Glu Ile Met Cys Pro Phe Ala Gly Val Gly Cys Ser Phe
80                  85                  90
Lys Gly Ser Pro Gln Ser Met Gln Glu His Glu Ala Thr Ser Gln
95                 100                 105
Ser Ser His Leu Tyr Leu Leu Leu Ala Val Leu Lys Glu Trp Lys
110                 115                 120
Ser Ser Pro Gly Ser Asn Leu Gly Ser Ala Pro Met Ala Leu Glu
125                 130                 135
Arg Asn Leu Ser Glu Leu Gln Leu Gln Ala Ala Val Glu Ala Thr
140                 145                 150
Gly Asp Leu Glu Val Asp Cys Tyr Arg Ala Pro Cys Cys Glu Ser
155                 160                 165
Gln Glu Glu Leu Ala Leu Gln His Leu Val Lys Glu Lys Leu Leu
170                 175                 180
Ala Gln Leu Glu Glu Lys Leu Arg Val Phe Ala Asn Ile Val Ala
185                 190                 195
Val Leu Asn Lys Glu Val Glu Ala Ser His Leu Ala Leu Ala Ala
200                 205                 210
Ser Ile His Gln Ser Gln Leu Asp Arg Glu His Leu Leu Ser Leu
215                 220                 225
Glu Gln Arg Val Val Glu Leu Gln Gln Thr Leu Ala Gln Lys Asp
230                 235                 240
Gln Val Leu Gly Lys Leu Glu His Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu
245                 250                 255
Ala Ser Phe Asp Gly Thr Phe Leu Trp Lys Ile Thr Asn Val Thr
260                 265                 270
Lys Arg Cys His Glu Ser Val Cys Gly Arg Thr Val Ser Leu Phe
275                 280                 285
Ser Pro Ala Phe Tyr Thr Ala Lys Tyr Gly Tyr Lys Leu Cys Leu
290                 295                 300
Arg Leu Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Ser Gly Lys Lys Thr His Leu
305                 310                 315
Ser Leu Phe Ile Val Ile Met Arg Gly Glu Tyr Asp Ala Leu Leu
320                 325                 330
Pro Trp Pro Phe Arg Asn Lys Val Thr Phe Met Leu Leu Asp Gln
335                 340                 345
Asn Asn Arg Glu His Ala Ile Asp Ala Phe Arg Pro Asp Leu Ser
350                 355                 360
Ser Ala Ser Phe Gln Arg Pro Gln Ser Glu Thr Asn Val Ala Ser
365                 370                 375
Gly Cys Pro Leu Phe Phe Pro Leu Ser Lys Leu Gln Ser Pro Lys
380                 385                 390
His Ala Tyr Val Lys Asp Asp Thr Met Phe Leu Lys Cys Ile Val
395                 400                 405
Asp Thr Ser Ala
409
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 2121 bases
(B) TYPE: nucleic acid
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
GCGCGAAGAC CGTTGGGGCT TTGTGGTGTG TGGGGGTTGT AACTCACATG 50
GCTGCAGCCA GTGTGACTTC CCCTGGCTCC CTAGAACTGC TACAGCCTGG 100
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CTGTGCTGCC TGTGTCTATG AAGGCCTGTA TGAAGAAGGC ATTTCTATTT 300
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GAAAGAATAC GAGAGCTGCC ACGAAGGACT TTGCCCATTC CTGCTGACGG 450
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ACCCTGTAGC CACGTGGACC TGGAGGTACA CTATGAGGTC TGCCCCAAGT 600
TTCCCTTAAC CTGTGATGGC TGTGGCAAGA AGAAGATCCC TCGGGAGACG 650
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TTGGAGGCCC AAGCCTCTCC AGGAACCTTG AACCAGGTGG GGCCAGAGCT 850
ACTCCAGCGG TGCCAGATTT TGGAGCAGAA GATAGCAACC TTTGAGAACA 900
TTGTCTGCGT CTTGAACCGT GAAGTAGAGA GGGTAGCAGT GACTGCAGAG 950
GCTTGTAGCC GGCAGCACCG GCTAGACCAG GACAAGATTG AGGCCCTGAG 1000
TAACAAGGTG CAACAGCTGG AGAGGAGCAT CGGCCTCAAG GACCTGGCCA 1050
TGGCTGACCT GGAGCAGAAG GTCTCCGAGT TGGAAGTATC CACCTATGAT 1100
GGGGTCTTCA TCTGGAAGAT CTCTGACTTC ACCAGAAAGC GTCAGGAAGC 1150
CGTAGCTGGC CGGACACCAG CTATCTTCTC CCCAGCCTTC TACACAAGCA 1200
GATATGGCTA CAAGATGTGT CTACGAGTCT ACTTGAATGG CGACGGCACT 1250
GGGCGGGGAA CTCATCTGTC TCTCTTCTTC GTGGTGATGA AAGGCCCCAA 1300
TGATGCTCTG TTGCAGTGGC CTTTTAATCA GAAGGTAACA TTGATGTTGC 1350
TGGACCATAA CAACCGGGAG CATGTGATCG ACGCATTCAG GCCCGATGTA 1400
ACCTCGTCCT CCTTCCAGAG GCCTGTCAGT GACATGAACA TCGCCAGTGG 1450
CTGCCCCCTC TTCTGCCCTG TGTCCAAGAT GGAGGCCAAG AATTCCTATG 1500
TGCGGGATGA TGCGATCTTC ATCAAAGCTA TTGTGGACCT AACAGGACTC 1550
TAGCCACCCC TGCTAAGAAT AGCAGCTCAG TGAGGAGCTG TCACATTAGG 1600
CCAGCCAGGC CCTGCCACAC ACGGGTGGGC AGGCTTGGTG TAAATGCTGG 1650
GGAGGGCCTC AGCCTAGAGC CAATCACCAT CACACAGAAA GGCAGGAAGA 1700
AGCCTCCAGT TGGCCTTCAG CTGGCAAACT GAGTTGGACG GTCCACTGAG 1750
CTCAAGGGCC TGGTGGAGCC CGCTGGGGAG CTTCTCAGCT TTCCAATAGG 1800
AAAGCTCCTG CTGTCTCCTC TGTCTGGGGA AGGGAGAGAC CTGTAGGTGG 1850
GTGCTCAGAA AGGGCCTCTC CAGAGAGAGT CTCAAGAGCT GCAGCAGGAG 1900
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CTGAGACATA GGCCCTCACT GGAGAAGGGC CTGCCTGGGC TGCACAGCCT 2050
TGCCAGGTGG CCTGTATGGG GGAGAAGTGA TTAAATGTTG AGATGTCACA 2100
CGACAAAAAA AAAAAAAAAA A 2121
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 501 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
Met Ala Ala Ala Ser Val Thr Ser Pro Gly Ser Leu Glu Leu Leu
1               5                  10                  15
Gln Pro Gly Phe Ser Lys Thr Leu Leu Gly Thr Arg Leu Glu Ala
20                  25                  30
Lys Tyr Leu Cys Ser Ala Cys Lys Asn Ile Leu Arg Arg Pro Phe
35                  40                  45
Gln Ala Gln Cys Gly His Arg Tyr Cys Ser Phe Cys Leu Thr Ser
50                  55                  60
Ile Leu Ser Ser Gly Pro Gln Asn Cys Ala Ala Cys Val Tyr Glu
65                  70                  75
Gly Leu Tyr Glu Glu Gly Ile Ser Ile Leu Glu Ser Ser Ser Ala
80                  85                  90
Phe Pro Asp Asn Ala Ala Arg Arg Glu Val Glu Ser Leu Pro Ala
95                 100                 105
Val Cys Pro Asn Asp Gly Cys Thr Trp Lys Gly Thr Leu Lys Glu
110                 115                 120
Tyr Glu Ser Cys His Glu Gly Leu Cys Pro Phe Leu Leu Thr Glu
125                 130                 135
Cys Pro Ala Cys Lys Gly Leu Val Arg Leu Ser Glu Lys Glu His
140                 145                 150
His Thr Glu Gln Glu Cys Pro Lys Arg Ser Leu Ser Cys Gln His
155                 160                 165
Cys Arg Ala Pro Cys Ser His Val Asp Leu Glu Val His Tyr Glu
170                 175                 180
Val Cys Pro Lys Phe Pro Leu Thr Cys Asp Gly Cys Gly Lys Lys
185                 190                 195
Lys Ile Pro Arg Glu Thr Phe Gln Asp His Val Arg Ala Cys Ser
200                 205                 210
Lys Cys Arg Val Leu Cys Arg Phe His Thr Val Gly Cys Ser Glu
215                 220                 225
Met Val Glu Thr Glu Asn Leu Gln Asp His Glu Leu Gln Arg Leu
230                 235                 240
Arg Glu His Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ser Phe Leu Glu Ala Gln
245                 250                 255
Ala Ser Pro Gly Thr Leu Asn Gln Val Gly Pro Glu Leu Leu Gln
260                 265                 270
Arg Cys Gln Ile Leu Glu Gln Lys Ile Ala Thr Phe Glu Asn Ile
275                 280                 285
Val Cys Val Leu Asn Arg Glu Val Glu Arg Val Ala Val Thr Ala
290                 295                 300
Glu Ala Cys Ser Arg Gln His Arg Leu Asp Gln Asp Lys Ile Glu
305                 310                 315
Ala Leu Ser Asn Lys Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu
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Lys Asp Leu Ala Met Ala Asp Leu Glu Gln Lys Val Ser Glu Leu
335                 340                 345
Glu Val Ser Thr Tyr Asp Gly Val Phe Ile Trp Lys Ile Ser Asp
350                 355                 360
Phe Thr Arg Lys Arg Gln Glu Ala Val Ala Gly Arg Thr Pro Ala
365                 370                 375
Ile Phe Ser Pro Ala Phe Tyr Thr Ser Arg Tyr Gly Tyr Lys Met
380                 385                 390
Cys Leu Arg Val Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Gly Arg Gly Thr
395                 400                 405
His Leu Ser Leu Phe Phe Val Val Met Lys Gly Pro Asn Asp Ala
410                 415                 420
Leu Leu Gln Trp Pro Phe Asn Gln Lys Val Thr Leu Met Leu Leu
425                 430                 435
Asp His Asn Asn Arg Glu His Val Ile Asp Ala Phe Arg Pro Asp
440                 445                 450
Val Thr Ser Ser Ser Phe Gln Arg Pro Val Ser Asp Met Asn Ile
455                 460                 465
Ala Ser Gly Cys Pro Leu Phe Cys Pro Val Ser Lys Met Glu Ala
470                 475                 480
Lys Asn Ser Tyr Val Arg Asp Asp Ala Ile Phe Ile Lys Ala Ile
485                 490                 495
Val Asp Leu Thr Gly Leu
500 501
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 44 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
Asp Leu Leu Cys Pro Ile Cys Met Gln Ile Ile Lys Asp Ala Phe
1               5                  10                  15
Leu Thr Ala Cys Gly His Ser Phe Cys Tyr Met Cys Ile Ile Thr
20                  25                  30
His Leu Arg Asn Lys Ser Asp Cys Pro Cys Cys Ser Gln His
35                  40              44
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 47 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
Glu Leu Ser Cys Ser Ile Cys Leu Glu Pro Phe Lys Glu Pro Val
1               5                  10                  15
Thr Thr Pro Cys Gly His Asn Phe Cys Gly Ser Cys Leu Asn Glu
20                  25                  30
Thr Trp Ala Val Gln Gly Ser Pro Tyr Leu Cys Pro Gln Cys Arg
35                  40                  45
Ala Val
47
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 44 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
Leu Leu Arg Cys His Ile Cys Lys Asp Phe Leu Lys Val Pro Val
1               5                  10                  15
Leu Thr Pro Cys Gly His Thr Phe Cys Ser Leu Cys Ile Arg Thr
20                  25                  30
His Leu Asn Asn Gln Pro Asn Cys Pro Leu Cys Leu Phe Glu
35                  40              44
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 44 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
Ala Phe Arg Cys His Val Cys Lys Asp Phe Tyr Asp Ser Pro Met
1               5                  10                  15
Leu Thr Ser Cys Asn His Thr Phe Cys Ser Leu Cys Ile Arg Arg
20                  25                  30
Cys Leu Ser Val Asp Ser Lys Cys Pro Leu Cys Arg Ala Thr
35                  40              44
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 45 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
Ser Ile Ser Cys Gln Ile Cys Glu His Ile Leu Ala Asp Pro Val
1               5                  10                  15
Glu Thr Asn Cys Lys His Val Phe Cys Arg Val Cys Ile Leu Arg
20                  25                  30
Cys Leu Lys Val Met Gly Ser Tyr Cys Pro Ser Cys Arg Tyr Pro
35                  40                  45
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 45 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
Glu Val Thr Cys Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val
1               5                  10                  15
Ser Ile Glu Cys Gly His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln
20                  25                  30
Val Gly Lys Gly Gly Gly Ser Val Cys Ala Val Cys Arg Gln Arg
35                  40                  45
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 46 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:
Glu Leu Met Cys Pro Ile Cys Leu Asp Met Leu Lys Asn Thr Met
1               5                  10                  15
Thr Thr Lys Glu Cys Leu His Arg Phe Cys Ser Asp Cys Ile Val
20                  25                  30
Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn Lys Glu Cys Pro Thr Cys Arg Lys
35                  40                  45
Lys
46
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 50 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
Glu Val Thr Cys Pro Ile Cys Leu Glu Leu Leu Lys Glu Pro Val
1               5                  10                  15
Ser Ala Asp Cys Asn His Ser Phe Cys Arg Ala Cys Ile Thr Leu
20                  25                  30
Asn Tyr Glu Ser Asn Arg Asn Thr Asp Gly Lys Gly Asn Cys Pro
35                  40                  45
Val Cys Arg Val Pro
50
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 47 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:
Glu Thr Thr Cys Pro Val Cys Leu Gln Tyr Phe Ala Glu Pro Met
1               5                  10                  15
Met Leu Asp Cys Gly His Asn Ile Cys Cys Ala Cys Leu Ala Arg
20                  25                  30
Cys Trp Gly Thr Ala Glu Thr Asn Val Ser Cys Pro Gln Cys Arg
35                  40                  45
Glu Thr
47
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 48 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
Phe Gln Leu Cys Lys Ile Cys Ala Glu Asn Asp Lys Asp Val Lys
1               5                  10                  15
Ile Glu Pro Cys Gly His Leu Met Cys Thr Ser Cys Leu Thr Ser
20                  25                  30
Trp Gln Glu Ser Glu Gly Gln Gly Ser Ser Gly Cys Pro Phe Cys
35                  40                  45
Arg Cys Glu
48
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
Gly Gly Phe Lys Leu Val Thr Cys Asp Phe Cys Lys Arg Asp Asp
1               5                  10                  15
Ile Lys Lys Lys Glu Leu Glu Thr His Tyr Lys Thr Cys
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
Gln Asp Leu Ala Val Cys Asp Val Cys Asn Arg Lys Phe Arg His
1               5                  10                  15
Lys Asp Tyr Leu Arg Asp His Gln Lys Thr His
20                  25  26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
Thr Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ser Phe
1               5                  10                  15
Met Asp Lys Arg Tyr Leu Lys Ile His Ser Asn Val His
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Thr Val Cys Gly Lys Lys Phe
1               5                  10                  15
Ile Asp Arg Ser Ser Val Val Lys His Ser Arg Thr His
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:
Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Cys Gly Glu Cys Gly Lys Gly Phe
1               5                  10                  15
Arg His Pro Ser Ala Leu Lys Lys His Ile Arg Val His
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
Ser Glu Glu Lys Pro Phe Glu Cys Glu Glu Cys Gly Lys Lys Phe
1               5                  10                  15
Arg Thr Ala Arg His Leu Val Lys His Gln Arg Ile His
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:
Pro Asn Glu Gln Met Ala Gln Cys Pro Ile Cys Gln Gln Phe Tyr
1               5                  10                  15
Pro Leu Lys Ala Leu Glu Lys Thr His Leu Asp Glu Cys
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:
Pro Asp Asp Gly Leu Val Ala Cys Pro Ile Cys Leu Thr Arg Met
1               5                  10                  15
Lys Glu Gln Gln Val Asp Arg His Leu Asp Thr Ser Cys
20                  25          28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:
CCTTGTGCCT GCAGAGAGAA G 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:
CTAGGTTAAC TTTCGGTGCT CCCCAGCAGG GTCTC 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:
CTAGGTTAAC TGGAGAAGGG GACCTGCTCG TCCTT 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:
CTAGGTTAAC TGCTGGCTTG GGAGGAGCAC TGTGA 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:
CTAGGTTAAC TGCTCCCGGT GCTGGCCCGG GCCTC 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 34 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:
CTAGGTTAAC TGCACTGGCC GAGCTCTCCA GGGA 34
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 15 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:
GTGATGAGAA TTCAT 15
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:
CGATGAATTC TCATCACTGC A 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 33 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:
GATCGGATCC AAAAAGAAGC CCTTGTGCCT GCA 33
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:
GCCTGGTTAA CTGGGC 16
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:
GCNCCNATGG CNYTNGARC 19
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:
GCNCCNATGG CNYTNGARA 19
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:
GCNCCNATGG CNYTNGARG 19
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:
GYTCNARNGC CATNGGNGC 19
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:
TYTCNARNGC CATNGGNGC 19
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 19 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:
CYTCNARNGC CATNGGNGC 19
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:
AARCAYGCNT AYGTNAA 17
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:
TTNACRTANG CRTGYTT 17
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 7 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:
Ala Pro Met Ala Leu Glu Arg
1               5       7
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 6 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:
Lys His Ala Tyr Val Lys
1               5   6
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 7 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:
Pro Gly Ser Asn Leu Gly Ser
1               5       7
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 8 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:
Lys Asp Asp Thr Met Phe Leu Lys
1               5           8
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 37 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:
TCGATCGTCG ACCAAAAAGA AGCCCTCCTG CCTACAA 37
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:
CTAGAGATCT CAGGGGTCAG GCCACTTT 28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 41 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:
CTAGAGATCT GTTAACTTTC GGTGCTCCCC AGCAGGGTCT C 41
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 41 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:
CTAGAGATCT GTTAACTGGA GAAGGGGACC TGCTCGTCCT T 41
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 41 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:
CTAGAGATCT GTTAACTGCT GGCTTGGGAG GAGCACTGTG A 41
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 37 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50:
TCGATCGTCG ACCAAAAAGA AGCCCTCCTG CCTACAA 37
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:
CTAGAGATCT CAGGGGTCAG GCCACTTT 28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 34 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52:
TCGATCGTCG ACCGCCTCCA GCTCAGCCCC TGAT 34
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 31 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53:
GATCGGATCC GGAGACACAG ATTCCAGCCC C 31
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54:
GATCGAATTC TTAACTCTTC GGTGCTCCCC AGCAG 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:
GATCGGATCC TTGTGGTGTG TGGGGGTTGT 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 17 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:
CCTGGCTGGC CTAATGT 17
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 60 bases
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:57:
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GACTTCCCCT 60
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 31 bases
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
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GATCGGATCC GCTCAGGCTC TTTTGGGGCA 30
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GATCGAGTCG ACCAGTAGTT CGGCCTTTCA AGAT 34
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CTCTGGCGAA GAAGTCC 17
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GTACGTGCGG CCGCCTACCA CCTGGTTCAA GGTTCCTG 38
【図１】
2010131018.tif 000008
【図２】
2010131018.tif 000009
【図３】
2010131018.tif 000010
【図４】
2010131018.tif 000011
【図５】
2010131018.tif 000012
【図６】
2010131018.tif 000013
【図７】
2010131018.tif 000014
【図８】
2010131018.tif 000015
【図９】
2010131018.tif 000016
【図１０ａ】
2010131018.tif 000017
【図１０ｂ】
2010131018.tif 000018
【図１１ａ】
2010131018.tif 000019
【図１１ｂ】
2010131018.tif 000020
【図１２ａ】
2010131018.tif 000021
【図１２ｂ】
2010131018.tif 000022
【図１３】
2010131018.tif 000023
【図１４ａ】
2010131018.tif 000024
【図１４ｂ】
2010131018.tif 000025
【図１５】
2010131018.tif 000026
【図１６】
2010131018.tif 000027
【図１７】
2010131018.tif 000028
【図１８】
2010131018.tif 000029
【図１９】
2010131018.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月25日(2010.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４０に結合できるポリペプチドおよびＣＤ４０の相互作用の阻害剤を同定する方法であって、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＴＮＦ−Ｒ２に結合でき、配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２に結合することができ、配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１に結合することができ、配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、ＴＮＦ−Ｒ２へ結合できるポリペプチド；
（ｉ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＮＦ−Ｒ２に結合できるポリペプチド；
（ｍ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
よりなる群から選択され、その方法は、
ＣＤ４０およびポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞におけるＣＤ４０：ポリペプチド相互作用にその発現が依存する、リポーター遺伝子の発現を阻害する分子を選択する工程を含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換え宿主細胞が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１および配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２を共発現する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
リポーター遺伝子がＮＦ−κＢ依存性である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＮＦ−κＢ依存性のリポーター遺伝子がＥ−セレクチンルシフェラーゼリポーター遺伝子構築物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ツーハイブリッドフォーマットで行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＬＭＰ１に結合できるポリペプチドとＬＭＰ１の相互作用の阻害剤を同定する方法であって、ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＴＮＦ−Ｒ２に結合でき、配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２に結合することができ、配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１に結合することができ、配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号３に示す塩基配列の相補物にストリンジェント条件下にハイブリダイズできる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導され、ＴＮＦ−Ｒ２へ結合できるポリペプチド；
（ｉ）配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれかの１または数個のアミノ酸の置換、削除または付加により（ａ）のポリペプチドから誘導されるポリペプチド；
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１に結合できるポリペプチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２に結合できるポリペプチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＮＦ−Ｒ２に結合できるポリペプチド；
（ｍ）配列番号４に示すアミノ酸配列の残基２７２−５０１のＴＲＡＦドメインに、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤ４０と結合できるポリペプチド；
よりなる群から選択され、該方法はリポーター遺伝子の発現を阻害する分子を選択する工程を含んでなり、該発現はＬＭＰ１およびポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞におけるＬＭＰ１：ポリペプチド相互作用に依存する方法。
【請求項８】
ＴＲＡＦタンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該組換え宿主細胞が配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ１と配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＲＡＦ２を共発現する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
レポーター遺伝子がＮＦ−κＢ依存性である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＦ−κＢ依存性レポーター遺伝子がＥ−セレクチンルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ツーハイブリッドフォーマットで行われる請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号４に示すアミノ酸配列の残基８７−５０１（ＴＲＡＦ２（８７−５０１）またはＣＤ４０若しくはＴＮＦ−Ｒ２媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害できるその誘導体を含むポリペプチド。
【外国語明細書】
2010131018000001.pdf
2010131018000002.pdf
2010131018000003.pdf
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