(57)【要約】【課題】生体骨と同等の力学的特性を有するとともに、組織侵入性及び骨伝導能に優れ、生体内に埋植した場合に生体骨へ吸収置換する人工骨を提供する【解決手段】少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含む吸収置換型人工骨、少なくともアパタイト／コラーゲン複合体シート、及びコラーゲンシートを重ねて巻いてなる円筒体を含む吸収置換型人工骨、及び少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲンシートを巻いてなる円筒体を含む吸収置換型人工骨、並びにそれらの製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含む吸収置換型人工骨。
【請求項２】
請求項１に記載の吸収置換型人工骨において、前記円筒体は少なくともアパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを重ねて巻いてなることを特徴とする吸収置換型人工骨。
【請求項３】
請求項１に記載の吸収置換型人工骨において、前記円筒体は少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートを巻いてなることを特徴とする吸収置換型人工骨。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の吸収置換型人工骨において、前記円筒体の一端面から他端面まで連通する中心空洞部の直径が100〜1000μmであることを特徴とする吸収置換型人工骨。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の吸収置換型人工骨において、前記アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層は直径100〜1000μmの孔を１個／cm2以上有することを特徴とする吸収置換型人工骨。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の吸収置換型人工骨において、前記円筒体の最外層がコラーゲン層であることを特徴とする吸収置換型人工骨。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の吸収置換型人工骨において、複数の前記円筒体を束ねてなることを特徴とする吸収置換型人工骨。
【請求項８】
少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含む吸収置換型人工骨を製造する方法であって、アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを形成する工程、及び前記アパタイト／コラーゲン複合体シート及び前記コラーゲンシートを重ねて巻くことにより前記円筒体を形成する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項９】
少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含む吸収置換型人工骨を製造する方法であって、少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートを形成する工程、及び前記シートを巻いて前記円筒体を形成する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の吸収置換型人工骨の製造方法において、アパタイト／コラーゲン複合体からなるブロックを圧縮成形することにより前記アパタイト／コラーゲン複合体シートを形成し、コラーゲンからなるブロックを圧縮成形することにより前記コラーゲンシートを形成することを特徴とする吸収置換型人工骨の製造方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の吸収置換型人工骨の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートは、アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるブロックを圧縮成形することにより形成することを特徴とする吸収置換型人工骨の製造方法。
【請求項１２】
請求項８〜11のいずれかに記載の吸収置換型人工骨の製造方法において、前記シートに直径100〜1000μmの孔を形成する工程を更に含むことを特徴とする吸収置換型人工骨の製造方法。
【請求項１３】
請求項８〜12のいずれかに記載の吸収置換型人工骨の製造方法において、複数の前記円筒体を束ねる工程を更に含むことを特徴とする吸収置換型人工骨の製造方法。
【請求項１４】
請求項８〜12のいずれかに記載の吸収置換型人工骨の製造方法において、前記円筒体を架橋処理する工程を更に含むことを特徴とする吸収置換型人工骨の製造方法。
【請求項１５】
請求項13に記載の吸収置換型人工骨の製造方法において、複数の前記円筒体を束ねた後、架橋処理することを特徴とする吸収置換型人工骨の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体骨と同等の力学的特性を有するとともに、生体内に埋植した場合に生体骨へ吸収置換する人工骨、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷や病気により生じた骨欠損部の治療法として、患者自身の骨を採取して用いる自家骨移植、他人から提供された骨を用いる同種骨移植、チタン等の金属や水酸アパタイトセラミックスで作られた人工骨の補填等がある。水酸アパタイトセラミックスは従来の金属、高分子及びアルミナセラミックスにはない骨伝導を有し、骨と直接結合することができるため、口腔外科、脳神経外科、耳鼻咽喉科、整形外科等の幅広い領域で自家骨に代わる骨修復材料として徐々に普及してきた。しかし、水酸アパタイトに代表されるセラミックス人工骨は硬く脆いために術中に取り扱いづらいとの問題点があった。これを改善するためにスポンジ状で弾力性を有するアパタイト／コラーゲン複合体が開発され、材料の取り扱いを容易にすることができたが、力学強度が低いために荷重部位への単独使用は困難であった。
【０００３】
非特許文献１（日本セラミックス協会2008年年会講演予稿集第324頁下欄）には、波板状に成形したシート状水酸アパタイト／コラーゲンナノ複合体膜を円柱状に成形してなる連通性多孔体が開示されている。非特許文献１には、この連通性多孔体は中央に比較的大きな骨髄控を模した空洞と、周囲に細胞や組織の侵入か可能な連通孔を有するため、組織侵入性及び骨伝導能に優れると記載されている。しかしながら、この連通性多孔体は、波板状に成形したシート状複合体膜を使用し、更に比較的大きな骨髄控を模した空洞を有するため、組織侵入性及び骨伝導能には優れるものの、強度が低いといった欠点を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本セラミックス協会2008年年会講演予稿集第324頁下欄
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明の目的は、生体骨と同等の力学的特性を有するとともに、組織侵入性及び骨伝導能に優れ、生体内に埋植した場合に生体骨へ吸収置換する人工骨、及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層を有する円筒体が、十分な強度を有するとともに、組織侵入性及び骨伝導能に優れていることを見出し、本発明に想到した。
【０００７】
本発明の吸収置換型人工骨は、少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の好ましい一実施形態では、上記円筒体は、少なくともアパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを重ねて巻いてなる。
【０００９】
本発明の好ましい別の実施形態では、上記円筒体は、少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートを巻いてなる。
【００１０】
前記円筒体の一端面から他端面まで連通する中心空洞部の直径は100〜1000μmであるのが好ましい。前記アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層は直径100〜1000μmの孔を１個／cm2以上有するのが好ましい。前記円筒体の最外層はコラーゲン層であるのが好ましい。
【００１１】
本発明の吸収置換型人工骨は、複数の前記円筒体を束ねてなるのが好ましい。
【００１２】
少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含む吸収置換型人工骨を製造する本発明の第一の方法は、アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを形成する工程、及び前記アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを重ねて巻くことにより前記円筒体を形成する工程を有することを特徴とする。
【００１３】
少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる円筒体を含む吸収置換型人工骨を製造する本発明の第二の方法は、少なくともアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートを形成する工程、及び前記シートを巻いて前記円筒体を形成する工程を有することを特徴とする。
【００１４】
第一の方法では、アパタイト／コラーゲン複合体からなるブロックを圧縮成形することにより前記アパタイト／コラーゲン複合体シートを形成し、コラーゲンからなるブロックを圧縮成形することにより前記コラーゲンシートを形成するのが好ましい。
【００１５】
第二の方法では、アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるブロックを圧縮成形することにより前記アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートを形成するのが好ましい。
【００１６】
第一及び第二の方法のいずれも、前記シートに直径100〜1000μmの孔を形成する工程を更に含むのが好ましい。複数の前記円筒体を束ねる工程を更に含むのが好ましい。前記円筒体を架橋処理する工程を更に含むのが好ましい。複数の前記円筒体を束ねた後、架橋処理するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の吸収置換型人工骨は、生体内のあらゆる部位に補填できるため、これまでのように患者自身から採取していた自家骨を使用する必要がなくなり、骨補填を必要とする患者の負担が軽減される。更に埋植時の自家骨の採取も不要となるため、手術時の医師の負担も軽減される。また、本発明の吸収置換型人工骨の製造方法により、生体骨と類似組成であり、かつ類似構造の人工骨が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の人工骨を作製する手順の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の人工骨の作製方法を図１に示す。アパタイト／コラーゲン複合体層2a及びコラーゲン層2bからなるシート２は、例えばWO 2004/041320 A1に記載のアパタイト／コラーゲン複合体ゲルにコラーゲンゲルを重ねて凍結乾燥することによりアパタイト／コラーゲン複合体層1a及びコラーゲン層1bが一体となった二層構造の多孔体（図１(a)）を形成し、この二層構造の多孔体を架橋する前に一軸加圧機等で圧縮する（図１(b)〜(d)）ことによって得られる。アパタイト／コラーゲン複合体のアパタイトとコラーゲンとの重量比は、骨形成の点からアパタイト過多の方が好ましく、6：4〜9：1であるのが望ましい。シート２にはあらかじめ直径100〜1000μmの孔３を１個／cm2以上の密度でパンチなどにより空けておくのが好ましい（図１(e)）。
【００２０】
シート２を筒状に巻き（図１(f)）、好ましくは100〜1000μmの径の中心空洞部４を有する円筒体５を形成する（図１(g)）。このときコラーゲン層2bが外側になるようにシート２を巻くのが好ましい。コラーゲン層2bを外側に位置させることにより、複数の円筒体５を束ねて架橋処理する際、架橋反応が効率的に行なわれ、得られる人工骨の強度が向上する。円筒体は１本だけで人工骨として使用することもできるが、更に複数の前記円筒体を束ねて人工骨６を形成するのが好ましい（図１(h)）。架橋処理は、シート２を巻いて円筒体５を形成した後、又は複数の円筒体５を束ねた後に行うのが好ましい。円筒体５の密度を高めるため、架橋処理前に必要に応じて加圧処理してもよい。また人工骨６は、束ねた複数の円筒体５の周りにシート２を巻いて一体化したものでも良い。束ねた複数の円筒体５の周りに巻くシート２は孔３を空けたものが好ましい。このシート２は、アパタイト／コラーゲン複合体層2aが外側になるように巻くのが好ましい。
【００２１】
図１ではアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層が一体となったシート２を形成する例を示したが、アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを別々に作製し、それらを重ねて筒状に巻いてもよい。アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートは図１に示した例と同様に、凍結及び乾燥して得られる多孔体を、架橋する前に一軸加圧機等で圧縮することによって得られる。
【００２２】
[1] アパタイト／コラーゲン複合体からなる多孔体の作製
アパタイト／コラーゲン複合体からなる多孔体は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が集合してなる複数の繊維層からなる。繊維層は10〜500μm程度の厚さを有する板状であり、ランダムな向き及びランダムな層数で重なっている。繊維層の間には、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が集合してなる柱が散在する。微視的に見ると、繊維層の重なり方向は散在する柱によって支持されているだけであるので、この方向にはアパタイト／コラーゲン多孔体は比較的脆いと考えられる一方、層方向には強度を有すると考えられる。しかし、上述のように、繊維層の重なりはランダムであるので、巨視的に見ると、繊維層の重なり方向は平均化されており、強度の異方性はさほど大きくない。
【００２３】
繊維層の間に柱が散在することによって形成された気孔はほぼ板状である。ほぼ板状の気孔の厚さは、繊維層の0.5〜10倍程度である。このアパタイト／コラーゲン複合体からなる多孔体を生体内に埋入したときに、ほぼ板状の気孔に血管や比較的大きなタンパク質等が入り込みやすいので、骨形成が促進されると考えられる。なお、気孔は板状に限らず、球状でも良い。
【００２４】
(1) アパタイト／コラーゲン複合体繊維
(a) 原料
アパタイト／コラーゲン複合体繊維は、コラーゲン、リン酸又はその塩、及びカルシウム塩を原料とする。コラーゲンとしては特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。なお由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ及びネズミ）や鳥類（例えばニワトリ）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ及びサメ）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法も特に限定されず、一般的な抽出方法によることができる。また動物組織から抽出したものではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
【００２５】
リン酸又はその塩（以下単に「リン酸（塩）」という）としてはリン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウムが挙げられる。またカルシウム塩としては炭酸カルシウム、酢酸カルシウム及び水酸化カルシウムが挙げられる。リン酸塩及びカルシウム塩はそれぞれ均一な水溶液又は懸濁液の状態で添加するのが好ましい。
【００２６】
使用するアパタイト原料［リン酸（塩）及びカルシウム塩］とコラーゲンとの質量比により、生成物中のアパタイト／コラーゲンの質量比を制御できる。このため使用するアパタイト原料とコラーゲンとの質量比は、目的とするアパタイト／コラーゲン複合体繊維の組成比により適宜決定する。アパタイト／コラーゲン複合体繊維中のアパタイト／コラーゲンの比率は6/4〜9/1（質量比）であるのが好ましく、約8/2（質量比）であるのが特に好ましい。
【００２７】
(b) 溶液の調製
リン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液の濃度は、リン酸（塩）とカルシウム塩とが所望の配合比にあれば特に限定されないが、後述する滴下操作の都合上、リン酸（塩）水溶液の濃度は50〜250 mM程度、カルシウム塩水溶液の濃度は200〜600 mM程度であるのが好ましい。コラーゲンは一般的にはリン酸水溶液の状態で、前述のリン酸（塩）水溶液にあらかじめ加える。コラーゲンのリン酸水溶液は、コラーゲンの濃度が0.5〜１質量％及びリン酸の濃度が10〜30 mMであるのが好ましい。更に好ましくは、コラーゲンの濃度は0.8〜0.9質量％及びリン酸の濃度は15〜25 mMであり、特に好ましくは、コラーゲンの濃度は約0.85質量％及びリン酸の濃度は約20 mMである。
【００２８】
(c) 製造方法
添加すべきカルシウム塩水溶液の量とほぼ同量の（好ましくは添加すべきカルシウム塩水溶液の0.5〜２倍、より好ましくは0.8〜1.2倍）の水をあらかじめ反応容器に入れ、40℃程度に加熱する。そこに、コラーゲンを含有するリン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液を同時に滴下する。滴下条件によって、合成するアパタイト／コラーゲン複合体繊維の長さを制御できる。滴下速度は10〜50 ml/min程度であるのが好ましく、反応溶液は50〜300 rpm程度で撹拌するのが好ましい。滴下中、反応溶液中のカルシウムイオン濃度を3.75 mM以下、かつリン酸イオン濃度を2.25 mM以下に維持するのが好ましい。これにより、反応溶液のpHは8.9〜9.1に保たれる。カルシウムイオン及び／又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、複合体の自己組織化が妨げられる。本明細書中「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、ハイドロキシアパタイト（アパタイト構造を有するリン酸カルシウム）が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのC軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。以上の滴下条件により、アパタイト／コラーゲン複合体繊維は、多孔体の原料として好適な１mm以下の長さで、自己組織化したものとなる。
【００２９】
滴下終了後、スラリー状になったアパタイト／コラーゲン複合体繊維の分散物を凍結乾燥する。凍結乾燥は、−10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。
【００３０】
(2) アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む分散物の調製
アパタイト／コラーゲン複合体繊維に水、リン酸水溶液等の液体を加えて撹拌し、ペースト状の分散物を調製する。この分散物が含有する液体の含有量は、80〜99体積％であるのが好ましく、90〜97体積％であるのがより好ましい。つまり、複合体繊維の含有量は、1〜20体積％であるのが好ましく、3〜10体積％であるのがより好ましい。アパタイト／コラーゲン複合体繊維にはあらかじめ水蒸気を付着させておくのが好ましい。この場合は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維に付着させた水蒸気の量を差し引いて、加える液体の量を決める必要がある。
【００３１】
製造する多孔体の気孔率P（％）は分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体繊維と液体との体積比に依存し、下記式(1)：
P = Y /(X+Y)×100    ・・・  (1)
［ただし、Xは分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体繊維の体積、Yは分散物中の液体の体積を示す。］により表される。このため加える液体の量によって、多孔体の気孔率Pを制御することができる。液体を加えた後で分散物を撹拌することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が切断され繊維長の分布幅が大きくなるため、製造する多孔体の強度が向上する。
【００３２】
複合体の分散物にバインダーとなるコラーゲンを加え、更に撹拌する。コラーゲンの添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維100質量％に対して、１〜10質量％であるのが好ましく、３〜６質量％であるのがより好ましい。複合体の場合と同様に、コラーゲンはリン酸水溶液の状態で加えるのが好ましい。コラーゲンのリン酸水溶液の濃度等は特に限定されないが、実用的にはコラーゲンの濃度が0.8〜0.9質量％（例えば0.85質量％）、リン酸の濃度が15〜25 mM（例えば20 mM）である。
【００３３】
(3) 分散物のゲル化
コラーゲンのリン酸（塩）水溶液の添加により酸性となっている分散物に、水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを約７に調節する。分散物のpHは6.8〜7.6とするのが好ましく、7.0〜7.4とするのがより好ましい。分散物のpHを6.8〜7.6とすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
【００３４】
分散物にリン酸緩衝溶液（PBS）の2.5〜10倍程度の濃縮液を加えて撹拌し、イオン強度を0.2〜0.8に調整する。分散物のイオン強度を大きくすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
【００３５】
分散物を成形型に入れた後、35〜43℃の温度に保持することにより分散物をゲル化させる。保持温度は35〜40℃であるのが更に好ましい。分散物を十分にゲル化させるため、保持する時間は0.5〜3.5時間であるのが好ましく、１〜３時間であるのがより好ましい。分散物の温度を35〜43℃に保持することにより、バインダーとして加えたコラーゲンが繊維化し、分散物がゲル状となる。分散物がゲル化することにより、アパタイト／コラーゲン複合体繊維が分散物中で沈降するのを防ぐことができ、均一な多孔体を製造することが可能となる。
【００３６】
(4) ゲル体の凍結及び乾燥
アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むゲル体を凍結させる。アパタイト／コラーゲン多孔体の平均気孔径は、ゲル体の凍結に要する時間に依存する。凍結する温度は−100〜０℃であるのが好ましく、−100〜−10℃であるのがより好ましく、−80〜−20℃であるのが特に好ましい。−100℃未満では、得られるアパタイト／コラーゲン多孔体の平均気孔径が小さ過ぎる。０℃超では、凍結しないか、多孔体の平均気孔径が大き過ぎる。
【００３７】
凍結させたゲル体は、凍結乾燥にし多孔体とする。つまり、アパタイト／コラーゲン複合体繊維の場合と同様に、−10℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させる。凍結乾燥は分散物が十分に乾燥するまで行えばよく時間は特に制限されないが、一般的には24〜72時間程度である。
【００３８】
コラーゲンの多孔体も、アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むゲル体と同様に、コラーゲンのゲル体を凍結乾燥して作製する。また、アパタイト／コラーゲン複合体ゲル体及びコラーゲンゲル体を重ねた状態で凍結及び乾燥することにより、アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層が一体となった多孔体を得ることができる。このようにゲルの状態で一体化させることにより、より密着性に優れたアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなるシートが得られる。
【００３９】
[2] シートの作製
ブロック状に成形した架橋前のアパタイト／コラーゲン複合体多孔体及びコラーゲン多孔体、又はアパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層が一体となった多孔体を、一軸加圧機等で圧縮してシート状に成形する。多孔体の圧縮率は、１〜20％であるのが好ましく、３〜15％であるのが更に好ましく、５〜12％であるのがより好ましい。ここで「圧縮率」とは、多孔体の元の厚さをT0、圧縮後の厚さをT1としたとき、（T1／T0）×100％を意味する。圧縮後のシート膜厚は、0.1〜５ mmであるのが好ましく、0.1〜３ mmであるのが更に好ましく、0.2〜１ mmであるのがより好ましい。加圧は１〜10000 kg/cm2で行うのが好ましく、100〜1000 kg/cm2で行うのが更に好ましい。加圧時間は、１〜30分が好ましい。また、加圧時に30〜40℃の熱をかけても良い
【００４０】
人工骨の組織侵入性を高めるため、シートにはあらかじめ直径100〜1000μmの孔を空けておくのが好ましい。孔を空ける方法は特に限定されないが、パンチ等により行うのが好ましい。前記孔はシート１ cm2あたり１個以上であるのが好ましく、４〜99個であるのが更に好ましく、９〜49個であるのがより好ましい。また、シート全体に満遍なく孔が空いているのが好ましい。
【００４１】
[3] 円筒体の作製
適当な大きさに切り抜いた前記シートを巻き、円筒体を形成する。アパタイト／コラーゲン複合体シートとコラーゲンシートとを別々に作製した場合、これらのシートを重ね合わせて巻く。アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層が一体となったシートを作製した場合、この一体的シートを巻く。コラーゲン単独からなる層を含むことにより、シート全体としての可撓性及び強度が増し、シートを巻いて円筒体を形成する作業が容易になる。シートを巻く方法は、特に限定されないが、テフロン（登録商標）等の棒を芯として巻くのが好ましい。芯棒を用いることにより、簡単にシートを巻くことができるとともに、形成される円筒体の中心空洞部の直径を制御することができる。円筒体を形成したシートの端部は、少量の水又はコラーゲン水溶液を付着させて留めることもできるが、雑菌等の混入を防止するため圧着等の物理的方法で留めるのが好ましい。
【００４２】
円筒体の中心部に連通する空洞の直径は100〜1000μmであるのが好ましく、200〜700μmであるのがより好ましく、200〜500μmであるのが最も好ましい。円筒体の長さは８〜1000 mmであるのが好ましく、10〜500 mmであるのが更に好ましく、10〜100 mmであるのがより好ましい。円筒体の直径は0.5〜５ mmであるのが好ましく、1〜3 mmであるのが更に好ましい。円筒体の中心空洞部の直径を上記範囲に設定しているため、本発明の人工骨は高い強度を有し、組織侵入性及び骨伝導能に優れていると考えられる。すなわち、円筒体の中心空洞部の直径が100〜1000μm であることにより、100μmよりも小さい場合に生じる骨形成に関与する細胞の侵入性が劣ったり、1000μmを超える場合に生じる繊維性組織の侵入により骨形成が劣ったりすることがないと考えられる。
【００４３】
[4] 人工骨の作製
作製した円筒体は、１本だけで人工骨として用いても良いが、複数の円筒体を束ねて人工骨としても良い。束ねる円筒体の本数は、１本の円筒状アパタイト／コラーゲン複合体の直径や人工骨の適用部位にもよるが、10〜1250本であるのが好ましく、13〜25本であるのが更に好ましい。複数の円筒体を束ねてなる人工骨はどのような形状であってもよいが、円柱や角柱であるのが好ましい。なお、所望サイズ（所望の直径）の人工骨を得るには、シートの巻き回数を調整すればよい。あるいは束ねる円筒体の本数を調整してもよい。後者では、複数の円筒体を束ねるため、各円筒体に設けられている中心空洞部が複数存在することになり、その結果、埋入後の人工骨は体液の流通が向上することで骨形成が促進し、好ましい。更に、複数の円筒体を束ねることにより、円筒体の軸方向からの負荷に対する強度が著しく増加する。
【００４４】
１本だけで人工骨とする場合は、円筒状のアパタイト／コラーゲン複合体に対して架橋処理を行うことにより、コラーゲン同士が架橋した一体的な円筒体が得られる。複数の円筒体を束ねて人工骨とする場合は、束ねて仮留めの状態で架橋処理を行うことにより、コラーゲン同士が架橋して複数の円筒体が一体化する。コラーゲンは物理的架橋方法（γ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いる方法）又は化学的架橋方法（架橋剤や縮合剤を用いる方法）で架橋することができる。
【００４５】
化学的架橋方法の場合、アパタイト／コラーゲン複合体を架橋剤の溶液に浸すことにより行う。架橋剤としては、アルデヒド系架橋剤（グルタールアルデヒド及びホルムアルデヒド等）、イソシアネート系架橋剤（ヘキサメチレンジイソシアネート等）、カルボジイミド系架橋剤（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等）、ポリエポキシ系架橋剤（エチレングリコールジエチルエーテル等）、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤のうち、架橋度の制御しやすさや及び架橋アパタイト／コラーゲン複合体の生体適合性の面からグルタールアルデヒドが特に好ましい。
【００４６】
グルタールアルデヒドを用いて架橋する場合、グルタールアルデヒド溶液の濃度は、0.005〜0.015質量％であるのが好ましく、0.005〜0.01質量％であるのがより好ましい。グルタールアルデヒド溶液の溶媒としてエタノール等のアルコールを使用すると、コラーゲンの架橋と同時に脱水を行うことができる。架橋処理後、未反応のグルタールアルデヒドを除去するため２質量％程度のグリシン水溶液にアパタイト／コラーゲン複合体を浸漬し、次いで水洗する。更にエタノール等のアルコールに浸漬することによりアパタイト／コラーゲン複合体を脱水した後、室温で乾燥させる。
【００４７】
熱脱水架橋は、アパタイト／コラーゲン複合体を100〜160℃及び０〜100 hPaの真空オーブン中に10〜12時間保持することにより行う。
【実施例】
【００４８】
本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１
(A) アパタイト／コラーゲン複合体繊維の合成
120 mMのリン酸水溶液168 mlに、コラーゲンのリン酸水溶液（コラーゲン濃度：0.85質量％、リン酸濃度：20 mM）を235 g加えて撹拌し、希釈コラーゲンリン酸水溶液を調製した。さらに、400 mMの水酸化カルシウム懸濁液を200 ml調製した。反応容器に200 mlの純水を入れ、40℃に加熱した。この反応容器に希釈コラーゲンリン酸水溶液と水酸化カルシウム懸濁液とをそれぞれ約30 ml/分の速度で同時に滴下し、得られた反応溶液を200 rpmで撹拌して、アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むスラリーを作製した。滴下中の反応溶液のpHは8.9〜9.1に保持した。生成したアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は概ね１mm以下であった。アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むスラリーは凍結乾燥した。アパタイト／コラーゲン複合体繊維中のアパタイト／コラーゲンの配合比は、質量基準で8/2であった。
【００５０】
(B) アパタイト／コラーゲン複合体多孔体の作製
凍結乾燥したアパタイト／コラーゲン複合体繊維１gに純水3.6 mlを加えて撹拌し、ペースト状の分散物とした。このペースト状分散物にコラーゲンのリン酸水溶液４gを加えて撹拌した後、１NのNaOH水溶液をpHがほぼ７になるまで加えた。アパタイト／コラーゲン複合体繊維とコラーゲンとの配合比は質量基準で97/3であった。次いで分散物のイオン強度が0.8となるまで、10倍濃縮のPBSを加えた。液体（純水＋希釈コラーゲンリン酸水溶液＋NaOH水溶液＋PBS）の添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体繊維の95体積％であった。
【００５１】
得られた分散物を成形型に入れ、37℃で２時間保持してゲル化させることにより、ゼリー状の成形体を得た。この成形体を−20℃で凍結し、次いで凍結乾燥機を用いて乾燥させ、アパタイト／コラーゲン複合体多孔体を得た。
【００５２】
(C) コラーゲン多孔体の作製
コラーゲンの0.5質量％水溶液をアパタイト／コラーゲン複合体多孔体の場合と同様にして37℃で２時間保持してゲル化させ凍結及び乾燥し、コラーゲン多孔体を得た。
【００５３】
(D) 人工骨の作製
10 mm×10 mm×２mmのアパタイト／コラーゲン複合体多孔体の10 mm×10 mmの面に一軸加圧機で100 kg/cm2の圧力を室温で60秒間かけ、圧縮して10 mm×10 mm×0.15 mmのアパタイト／コラーゲン複合体シートを得た。同様にして、10 mm×10 mm×２mmのコラーゲン多孔体を圧縮し、10 mm×10 mm×0.15 mmのコラーゲンシートを得た。
【００５４】
アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを重ねて、コラーゲンシートが外側になるように直径500μmのテフロン棒を芯にして巻き付け、シート端面を圧着し、長さ10 mm、直径1.1 mm、及び中心空洞部の直径500μmの円筒体を得た。
【００５５】
この円筒体を同様にして16本作製し、それらを軸に垂直な断面の形状がほぼ正方形になるように束ねて140℃で熱脱水架橋することにより、円筒体を束ねてなる人工骨を得た。
【００５６】
実施例２〜５
アパタイト／コラーゲン複合体シート及びコラーゲンシートを巻き付ける芯の太さを変更して、表１に示すように、中心空洞部の直径を変更した円筒体を作製し、実施例１と同様にして人工骨を作製した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施例６
実施例１と同様にして作製したアパタイト／コラーゲン複合体のゲルを成形型に入れ、その上にコラーゲンの0.5質量％水溶液を流し込み、37℃で２時間保持してゲル化させることにより、ゼリー状の成形体を得た。この成形体を−20℃で凍結し、次いで凍結乾燥機を用いて乾燥させ、２ mmのアパタイト／コラーゲン複合体層及び２ mmのコラーゲン層が密着し一体化した10 mm×10 mm×４mmの２層構造の多孔体ブロックを得た。
【００５９】
この２層構造の多孔体ブロックに一軸加圧機で100 kg/cm2の圧力を室温で60秒間かけて圧縮し、厚さ0.15 mmのアパタイト／コラーゲン複合体層及び厚さ0.15 mmのコラーゲン層からなる10 mm×10 mm×0.3 mmの２層構造のシートを得た。この２層構造のシートをコラーゲン層が外側になるように直径500μmのテフロン棒を芯にして巻き付け、シート端面を圧着し、長さ10 mm、直径1.1 mm、中心空洞部の直径500μmの円筒体を得た。
【００６０】
同様にして25本の円筒体を作製し、それらを軸に垂直な断面の形状がほぼ正方形になるように束ねて140℃で熱脱水架橋することにより、円筒体を束ねてなる人工骨を得た。
【００６１】
実施例７〜10
アパタイト／コラーゲン複合体層及びコラーゲン層からなる２層構造のシートを巻き付ける芯の太さを変更した以外実施例６と同様にして、表２に示す中心空洞部の直径を有する円筒体を作製し、人工骨を作製した。
【００６２】
【表２】
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【符号の説明】
【００６３】
１・・・アパタイト／コラーゲン複合体及びコラーゲンからなる多孔体
1a・・・コラーゲン多孔体
1b・・・アパタイト／コラーゲン複合体多孔体
２・・・シート
2a・・・コラーゲン層
2b・・・アパタイト／コラーゲン複合体層
３・・・孔
４・・・中心空洞部
５・・・円筒体
６・・・人工骨
【図１】
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