(57)【要約】【課題】無機リン酸塩含有ｐＨ緩衝剤による悪影響を受けているアッセイに使用する代替ｐＨアッセイ緩衝剤、そのｐＨアッセイ緩衝剤を含有する組成物、試薬、キット、システム、システムコンポーネント及び使用方法を提供する。【解決手段】アッセイ性能を向上させるため、ｐＨ緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物。
【請求項２】
ｐＨ緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない、アッセイに適した組成物。
【請求項３】
ｐＨ緩衝剤と、リンペプチド特異的抗体と、前記リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチドとを含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物。
【請求項４】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１、２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
１つ若しくは複数のキナーゼ、及び／又は１つ若しくは複数のキナーゼ基質をさらに含む、請求項１、２、３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
１つ若しくは複数のホスファターゼ、及び／又は１つ若しくは複数のホスファターゼ基質をさらに含む、請求項１、２、３又は４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンである、請求項１、２、３、５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｐＨ緩衝剤がトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである、請求項１、２、３、５又は６に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が１つ又は複数のＥＣＬ共反応物を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
さらにＫＯＨを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
さらに洗浄剤又は界面活性剤を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
さらに非イオン洗浄剤又は界面活性剤を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチドをさらに含む、請求項１、２又は４から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が無機リン酸塩を含まない、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
さらに停止試薬を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
さらに塩基を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
さらにＫＯＨを含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
さらにＫＯＨ及び界面活性剤又は洗浄剤を含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
さらに電気化学発光標識を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
さらに金属含有電気化学発光標識を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
さらにＲｕ又はＯｓ含有電気化学発光標識を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物のｐＨが６〜９である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物のｐＨが７〜８である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物のｐＨが７．５〜８である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物のｐＨが約７．８である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１から２８までのいずれか一項に記載の組成物を含む電気化学発光アッセイを実施するように構成された装置。
【請求項３０】
前記組成物から放出される光を検出する光検出器、及び／又は電気化学発光を誘導するのに十分な電圧を前記組成物に印加する電圧源をさらに含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
１つ又は複数の容器中に、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の組成物及び１つ又は複数の作用電極を含むアッセイモジュールを含むキット。
【請求項３２】
請求項１から２８までのいずれか一項に記載の組成物に電気化学エネルギーを与えるステップを含む電気化学発光方法を実施する方法。
【請求項３３】
放出された電気化学発光を検出するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から２８までのいずれか一項に記載の組成物を用いてアッセイを実施する方法であって、
前記組成物とキナーゼ産物を含むアッセイ混合物を形成させるステップと、前記キナーゼ産物と前記リン酸特異的抗体を含む複合体を形成させるステップとを含む、方法。
【請求項３５】
キナーゼをキナーゼ基質と接触させて前記キナーゼ産物を形成させるステップと、前記複合体を検出するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
電気化学発光を用いて前記複合体を検出する、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成させ、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップを含むアッセイを実施する方法。
【請求項３８】
キナーゼをキナーゼ基質と接触させて前記キナーゼ産物を形成させるステップと、前記キナーゼ産物を前記リン酸特異的抗体と接触させて前記複合体を形成させるステップと、前記複合体を検出するステップとをさらに含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
電気化学発光を用いて前記複合体を検出する、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
ｐＨ緩衝剤と、ＥＣＬ共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物であって、
前記ｐＨ緩衝剤は、グリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択され、前記ＥＣＬ共反応物は第三級アミンを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
【請求項４１】
前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミンである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
無機リン酸塩ではないｐＨ緩衝剤と、Ｒｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識と、ＥＣＬ共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
【請求項４３】
前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミンである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
無機リン酸塩ではないｐＨ緩衝剤と、トリプロピルアミンであるＥＣＬ共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
【請求項４６】
前記ｐＨ緩衝剤がＥＣＬアッセイｐＨ緩衝剤バックグラウンド低減剤である、請求項４２、４３、４４又は４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記共反応物の濃度が５０〜１０００ｍＭである、請求項４０、４１、４２、４３、４４、４５又は４６に記載の組成物。
【請求項４８】
電気化学発光方法に使用するのに適した組成物であって、（ａ）濃度が５０〜１０００ｍＭの範囲にあるトリプロピルアミンと、（ｂ）濃度が５０〜１０００ｍＭの範囲にあり、グリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択されるｐＨ緩衝剤とを含み、ｐＨが６．５〜８．５の範囲にある組成物。
【請求項４９】
さらにＥＣＬ成分を含む、請求項４０、４１、４５又は４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＥＣＬ成分が金属含有ＥＣＬ成分である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＥＣＬ成分がＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＥＣＬ成分が電気化学発光を繰り返し放出可能である、請求項４２、４３、４４、４９、５０又は５１に記載の組成物。
【請求項５３】
無機リン酸塩の濃度が２０ｍＭ未満である、請求項４０から５２までのいずれかに記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、請求項４０から５２までのいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
前記組成物が無機リン酸塩を含まない、請求項４０から５２までのいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、請求項５４又は５５に記載の組成物。
【請求項５７】
ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、請求項５４又は５５に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンである、請求項４０から５７までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ｐＨ緩衝剤がトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである、請求項４０から５７までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項４０から５９までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
さらにＫＯＨを含む、請求項４０から６０までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
塩、洗浄剤、保存剤、キレート化剤及び消泡剤からなる群から選択される物質をさらに含む、請求項４０から６１までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
さらに界面活性剤を含む、請求項４０から６２までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物のｐＨが６．５〜８．５である、請求項４０から６３までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記組成物のｐＨが７〜８である、請求項４０から６４までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物のｐＨが７．５〜８である、請求項４０から６５までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記組成物のｐＨが約７．８である、請求項４０から６６までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記組成物が水性である、請求項４０から６７までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記組成物が、酸化条件下で金属含有ＥＣＬ成分からＥＣＬを誘導するのに適切な環境を提供する、請求項４０から６８までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
請求項４０から６９までのいずれか一項に記載の組成物を含む、電気化学発光方法に使用するのに適した試薬。
【請求項７１】
無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤と、Ｒｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ成分とを含む試薬であって、
前記試薬はＥＣＬアッセイを実施するための組成物に使用するのに適していて、
（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物と、
（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質と、
からなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって電磁放射が放出される、試薬。
【請求項７２】
前記試薬がさらに前記ｐＨ緩衝剤と、アミン又はアミン成分と、前記グループ（ｉ）〜（ｉｉｉ）の他の２つの成分のうちの１つとを含む、請求項７１に記載の試薬。
【請求項７３】
さらに界面活性剤又は洗浄剤を含む、請求項７１に記載の試薬。
【請求項７４】
さらにＥＣＬ共反応物を含む、請求項７１に記載の試薬。
【請求項７５】
さらにＥＤＴＡを含む、請求項７１に記載の試薬。
【請求項７６】
１つ又は複数の容器中に、ｐＨ緩衝剤及びＥＣＬ共反応物を含み、前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択され、前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
【請求項７７】
１つ又は複数の容器中に、ｐＨ緩衝剤と、Ｒｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識と、ＥＣＬ共反応物とを含み、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
【請求項７８】
１つ又は複数の容器中に、ｐＨ緩衝剤とトリプロピルアミンを含み、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
【請求項７９】
１つ又は複数の容器中に、（ａ）濃度５０〜１０００ｍＭのトリプロピルアミンと、（ｂ）グリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される濃度５０〜１０００ｍＭのｐＨ緩衝剤とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
【請求項８０】
濃度５０〜１０００ｍＭのトリプロピルアミンを含む、請求項７８に記載のキット。
【請求項８１】
無機リン酸塩を含まない、請求項７６、７７、７８、７９又は８０に記載のキット。
【請求項８２】
キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、請求項７６、７７、７８、７９、８０又は８１に記載のキット。
【請求項８３】
ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、請求項７６、７７、７８、７９、８０又は８１に記載のキット。
【請求項８４】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンである、請求項７６から８３までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項８５】
前記ｐＨ緩衝剤がトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである、請求項７６から８３までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項８６】
前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、請求項７７又は８１から８３までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項８７】
前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含む、請求項７６又は７７に記載のキット。
【請求項８８】
さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項７６から８７までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項８９】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンであり、前記組成物がさらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項７６、７７又は７８に記載のキット。
【請求項９０】
さらにＫＯＨを含む、請求項７６から８９までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９１】
さらにＥＣＬ成分を含む、請求項７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９２】
電気化学発光を繰り返し放出可能であるＥＣＬ成分をさらに含む、請求項７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９３】
さらに金属含有ＥＣＬ成分を含む、請求項７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９４】
さらにＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識を含む、請求項７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９５】
塩、洗浄剤、保存剤、キレート化剤及び消泡剤からなる群から選択される１つ又は複数の物質をさらに含む、請求項７６から９４までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９６】
さらに界面活性剤を含む、請求項７６から９５までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９７】
前記キットが水性である、請求項７６から９６までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９８】
ＥＣＬ成分（ｉ）及び電解質（ｉｉ）からなる群の１つ又は複数の成分を含めて少なくとも１つの別個の成分をさらに含む、請求項７６、７８から８９まで又は９５から９７までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項９９】
（ａ）無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤と（ｂ）リン酸特異的抗体とを含む組成物において、定性的又は定量的に特異的結合アッセイを実施する方法。
【請求項１００】
前記組成物がさらにＥＣＬ共反応物を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組成物がさらにＥＣＬ標識を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記組成物がさらにリン酸特異的抗体を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
結合試薬がその上に固定された１つ又は複数のアッセイドメインを含むウェルにおいて、無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤を含む組成物を用いて、定性的又は定量的に特異的結合非洗浄アッセイを実施する方法。
【請求項１０４】
電気化学発光標識と、
キナーゼ、キナーゼ基質、キナーゼ産物及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの試薬と、
を含む組成物であって、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物を用いて、キナーゼアッセイを実施する方法。
【請求項１０５】
電気化学発光標識を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、放出された電気化学発光を検出するステップとをさらに含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組成物をリン酸特異的抗体と接触させるステップをさらに含む、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
アッセイを実施する方法であって、
（ａ）キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成させ、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップと、
（ｂ）金属含有ＥＣＬ成分を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｃ）放出された電磁放射を検出するステップとを含む方法。
【請求項１０８】
前記複合体がさらに前記金属含有ＥＣＬ成分を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
ＥＣＬ標識と、ＥＣＬ共反応物と、リン酸塩ではないｐＨ緩衝剤とを含む組成物の存在下で誘導される電気化学発光を誘導する方法。
【請求項１１０】
前記ｐＨ緩衝剤がＥＣＬアッセイｐＨ緩衝剤バックグラウンド低減剤である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、請求項１０９、１１０又は１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンである、請求項１０９、１１０、１１１又は１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記共反応物が濃度５０〜１０００ｍＭで存在し、前記ｐＨ緩衝剤が濃度５０〜１０００ｍＭで存在し、前記ｐＨが６．５〜８．５であり、前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミンであり、前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＥＣＬ標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属複合体である、請求項１０９から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記方法がさらに、
（ａ）前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｂ）放出された電磁放射を検出するステップとを含む、請求項１０９から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＥＣＬ標識が前記電極に付着している、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記電極が元素状炭素を含む、請求項１１７又は１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
第三級アミンであるＥＣＬ共反応物と、少なくとも１つの非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤とを含む電気化学発光アッセイｐＨ緩衝剤。
【請求項１２１】
前記共反応物がＴＰＡである、請求項１２０に記載の電気化学発光アッセイｐＨ緩衝剤。
【請求項１２２】
前記非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤が、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、オリゴ（グリシン）又はそれらの組合せから選択される、請求項１２０に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
【請求項１２３】
前記非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤がグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である、請求項１２０に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
【請求項１２４】
キレート化剤、洗浄剤、塩、消泡剤及び保存剤からなる群から選択される１つ又は複数の物質をさらに含む、請求項１２０から１２３までのいずれか一項に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
【請求項１２５】
さらにリン酸特異的抗体を含む、請求項１２０から１２４までのいずれか一項に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
【請求項１２６】
請求項１２０から１２５までのいずれか一項に記載のアッセイ緩衝剤とＥＣＬ標識を接触させるステップと、電気化学発光を誘導するステップと、放出された電気化学発光を検出するステップとを含む、電気化学発光を発生させる方法。
【請求項１２７】
電気化学発光標識と、非ＴＰＡ電気化学発光共反応物と、少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とを含む組成物。
【請求項１２８】
前記非ＴＰＡ電気化学発光共反応物がＰＩＰＥＳである、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記非ＴＰＡ電気化学発光共反応物が、３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸、４−［ビス−（２−ヒドロキシエタン）−アミノ］−ブタンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、アゼパン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、ピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）（ＰＰＡ）、３−モルフォリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−４−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−プロパンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシエタン−Ｎ’−３−メチルプロパノエート、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−メチルプロパノエート、１，６−ジアミノへキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビスプロピル−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−Ｔｒｉｓプロパン）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール、３−ジメチルアミノ−２−プロパノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピルプロパン−１，３，−ジアミン（ＴＰＡ２量体）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）からなる群から選択される、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記組成物が作用電極と接触している、請求項１２７、１２８又は１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記組成物が炭素ベースの作用電極と接触している、請求項１２７、１２８又は１２９に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記電気化学発光標識がＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識である、請求項１２７から１３１までのいずれかに記載の組成物。
【請求項１３３】
３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸又は４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸を含む組成物。
【請求項１３４】
さらにＥＣＬ標識を含む、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３５】
さらに金属含有ＥＣＬ標識を含む、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３６】
さらにＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識を含む、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記請求項１３３から１３６までのいずれか一項に記載の組成物を用いて電気化学発光を誘導する方法。
【請求項１３８】
電気化学発光を発生させる方法であって、
（ａ）電気化学発光標識を請求項１３６に記載の組成物と接触させるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
【請求項１３９】
電気化学発光を発生させる方法であって、
（ａ）請求項１３３から１３７までのいずれか一項に記載の組成物を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
【請求項１４０】
前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、請求項１３８又は１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ＥＣＬ誘導が、実質的に洗浄剤を含まない組成物において実施される、請求項１３８又は１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
１つ又は複数の容器中に、電気化学発光標識と、非ＴＰＡ電気化学発光共反応物と、少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とを含むキット。
【請求項１４３】
１つ又は複数の容器中に、少なくとも１つのトリアルキルアミン非ＴＰＡ共反応物を含む１つ又は複数のＥＣＬアッセイ緩衝剤を含むキット。
【請求項１４４】
１つ又は複数の容器中に、金属含有電気化学発光標識、及び３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの共反応物を含むキット。
【請求項１４５】
電気化学発光を発生させる方法であって、
（ａ）電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光を検出するステップと、を含み、
前記電気化学発光共反応物がＴＰＡ以外の第三級アミンである、方法。
【請求項１４６】
電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させることを含む、電気化学発光を誘導する方法であって、
電気化学発光共反応物がトリ−ｎ−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、電気化学発光を誘導する方法。
【請求項１４７】
電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
（ａ）電気化学発光標識と、少なくとも１つの電気化学発光共反応物と、を含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物はトリ−ｎ−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識は作用電極に付着しているステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｃ）放出された電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
【請求項１４８】
電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
（ａ）電気化学発光標識と、少なくとも１つの電気化学発光共反応物とを含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物がトリ−ｎ−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識の第１の部分が作用電極に付着しており、前記電気化学発光標識の第２の部分が溶液中にあるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識の第１の部分を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光標識の第１の部分から放出された電気化学発光を選択的に検出するステップとを含む方法。
【請求項１４９】
目的分析物又は活性のアッセイを実施する方法であって、
（ａ）試料を含む組成物と、ＥＣＬ標識を含むアッセイ試薬と、電極とを形成させるステップであって、前記試料中に前記分析物又は活性が存在することによって前記電極からの前記アッセイ試薬の付着又は解離がもたらされるステップと、
（ｂ）ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤と前記電極を接触させるステップであって、前記共反応物はＴＰＡ以外の第三級アミンであるステップと、
（ｃ）前記電極上のＥＣＬ標識を誘導してＥＣＬを誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｄ）放出されたＥＣＬを測定するステップとを含む方法。
【請求項１５０】
結合現象を測定する方法であって、
（ａ）電極上に固定された結合試薬を、ＥＣＬ標識を含むアッセイ試薬と接触させるステップであって、前記結合試薬が前記アッセイ試薬に特異的に結合するステップと、
（ｂ）前記アッセイ試薬を前記結合試薬に結合させて前記標識を前記電極に付着させるステップと、
（ｃ）前記電極を、ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤と接触させるステップであって、前記共反応物はＴＰＡ以外の第三級アミンであるステップと、
（ｄ）前記電極上のＥＣＬ標識を誘導してＥＣＬを誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｅ）放出されたＥＣＬを測定するステップとを含む方法。
【請求項１５１】
前記共反応物が１つ又は複数の以下の諸特性を有する、すなわち、ｉ）１電極酸化において炭素ベース電極上で酸化されてアミンラジカルカチオンを与え、前記アミンラジカルカチオンは、プロトンをその後失ってラジカル還元剤を形成することができ、ｉｉ）炭素ベース電極上で、Ｒｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３の酸化電位と同等以上の酸化電位を有し、ｉｉｉ）炭素ベース電極において、水を分解するのに必要な電位よりも低い電位で酸化され、ｉｖ）前記ラジカル還元剤とＲｕ（ＩＩＩ）（ｂｐｙ）３が反応してＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３を生成する反応によって放出されるエネルギーが、発光励起状態のＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３を生成するのに十分であり、ｖ）前記アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の寿命が、対応するＴＰＡ誘導種よりも短い、請求項１４５から１５０までのいずれかに記載の方法。
【請求項１５２】
前記共反応物がアミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤を形成し、前記アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の拡散距離が１００ｎｍ未満である、請求項１４５から１５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記方法が洗浄ステップなしで実施される、請求項１４５から１５２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＥＣＬ共反応物をＴＰＡで置換することによって、溶液中の標識に対する電極に付着している標識からのＥＣＬ誘導の選択性が少なくとも２倍低下する、請求項１４５から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記電気化学発光共反応物がＰＩＰＥＳである、請求項１４５から１５４までのいずれかに記載の方法。
【請求項１５６】
前記共反応物が、ＮＲ１Ｒ２Ｒ３の構造を有するアミンであり、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は少なくとも２つの炭素を含むアルキル基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち１つ又は複数は親水性官能基で官能化されている、請求項１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記親水性官能基が帯電した基を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記親水性官能基が負に帯電した基を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記親水性官能基がヒドロキシル、ジアルキルアミノ、サルフェート、スルホネート、カルボキシレート及び／又はカルボン酸エステルを含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記共反応物が（ｎ−Ｐｒ）２Ｎ（ＣＨ２）ｎＲの構造を有し、式中、ｎは２以上であり、Ｒは親水性官能基である、請求項１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記共反応物が以下の式を有し、ｉ）Ｘが−（ＣＨ２）−又はヘテロ原子であり、ｉｉ）Ｒ及びＲ１が２つ以上の炭素を含むアルキル基であり、ｉｉｉ）ｎ及びｍが各々１以上であり、ｉｖ）Ｒ（及び、場合によってはＲ１）が親水性官能基を含む、請求項１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【化１】
2010181410.tif 000009
【請求項１６２】
前記共反応物が、３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸、４−［ビス−（２−ヒドロキシエタン）−アミノ］−ブタンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、アゼパン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、ピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）（ＰＰＡ）、３−モルフォリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−４−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−プロパンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシエタン−Ｎ’−３−メチルプロパノエート、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−メチルプロパノエート、１，６−ジアミノへキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビスプロピル−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−Ｔｒｉｓプロパン）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール、３−ジメチルアミノ−２−プロパノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピルプロパン−１，３，−ジアミン（ＴＰＡ２量体）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）からなる群から選択される、請求項１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記共反応物がピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）からなる群から選択される、請求項１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記電気化学発光が、１つ又は複数の炭素ベースの作用電極を用いて誘導される、請求項１４５から１６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記１つ又は複数の炭素ベースの作用電極が炭素粒子又はカーボンナノチューブを含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＥＣＬ標識を少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とも接触させる、請求項１４５から１６５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記共反応物の濃度が１０〜８００ｍＭである、請求項１４５から１６６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記標識をｐＨ緩衝剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１４６から１６７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記ｐＨ緩衝剤の濃度が好ましくは０〜８００ｍＭである、請求項１６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年９月１０日に出願された米国仮出願第６０／３１８，２８９号、及び２００２年３月１１日に出願された米国仮出願第６０／３６３，４９８号の優先権を主張するものである。この両方の米国仮出願を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本願は、アッセイ、特に電気化学発光アッセイに使用する組成物、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、薬物スクリーニングを含めた分析測定に電気化学発光（ＥＣＬ）を利用するいくつかの市販機器がある。誘導されてＥＣＬを放出することができる種（ＥＣＬ活性種）が、ＥＣＬ標識として使用されてきた。ＥＣＬ標識の例には、ｉ）トリス−ビピリジル−ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）成分などのＲｕ含有及びＯｓ含有有機金属化合物を含めて、金属が例えばＶＩＩＩ族の貴金属である有機金属化合物、並びにｉｉ）ルミノール及びその関係化合物がある。ＥＣＬプロセスにＥＣＬ標識と共に関与する種を、本明細書ではＥＣＬ共反応物（ｃｏｒｅａｃｔａｎｔ）と呼ぶ。一般に使用される共反応物としては、ＲｕＢｐｙ由来のＥＣＬに対する第三級アミン（例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第５，８４６，４８５号を参照されたい）、オキザレート及びパーサルフェート、並びにルミノール由来のＥＣＬに対する過酸化水素（例えば、米国特許第５，２４０，８６３号を参照されたい）などがある。ＥＣＬ標識が発生する光を、レポーターシグナルとして診断手続に使用することができる（Ｂａｒｄ他、米国特許第５，２３８，８０８号）。例えば、ＥＣＬ標識は、抗体、核酸プローブ、受容体又はリガンドなどの結合剤に共有結合することができる。ＥＣＬ標識から発せられるＥＣＬを測定することによって、結合相互作用への結合試薬の関与をモニターすることができる。あるいは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬシグナルによって、化学的環境を示すことができる（例えば、ＥＣＬ共反応物の形成又は破壊をモニターするＥＣＬアッセイについて記載した米国特許第５，６４１，６２３号を参照されたい）。ＥＣＬアッセイを実施するためのＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイ及び計装についてのさらに詳細な背景については、米国特許第５，０９３，２６８号、同第５，１４７，８０６号、同第５，３２４，４５７号、同第５，５９１，５８１号、同第５，５９７，９１０号、同第５，６４１，６２３号、同第５，６４３，７１３号、同第５，６７９，５１９号、同第５，７０５，４０２号、同第５，８４６，４８５号、同第５，８６６，４３４号、同第５，７８６，１４１号、同第５，７３１，１４７号、同第６，０６６，４４８号、同第６，１３６，２６８号、同第５，７７６，６７２号、同第５，３０８，７５４号、同第５，２４０，８６３号、同第６，２０７，３６９号及び同第５，５８９，１３６号、並びに国際公開第９９／６３３４７号、同第００／０３２３３号、同第９９／５８９６２号、同第９９／３２６６２号、同第９９／１４５９９号、同第９８／１２５３９号、同第９７／３６９３１号及び同第９８／５７１５４号を参照されたい。
【０００４】
市販のＥＣＬ機器は、並外れた性能を示す。これらの機器は、優れた感度、ダイナミックレンジ、精度、及び複雑な試料マトリックスの許容度を含めた理由のために広範に使用されるようになった。市販の計測手段は、恒久的に再使用可能なフローセルを含むフローセルベースの設計を用いている。最近、電極上に固定された、ＥＣＬの誘導に使用される試薬を用いるＥＣＬ計測手段が開示された（例えば、米国特許第６，１４０，０４５号、同第６，０６６，４４８号、同第６，０９０，５４５号、同第６，２０７，３６９号及び国際公開第９８／１２５３９号を参照されたい）。このようなＥＣＬ測定に適した一体型電極を有するマルチウェルプレートも最近開示された（例えば、それぞれ２００２年６月２８日に出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法（Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」と題する米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号を参照されたい）。本願と同日に出願され、参照により本明細書に援用するＧｌｅｚｅｒ他による米国特許出願第        号（発明の名称：「１つの試料について複数の測定を実施する方法及び装置（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ）」［整理番号１００４０５−０６４１０］）も参照されたい。
【０００５】
現在、無機リン酸塩を含有するｐＨ緩衝剤が多数の電気化学発光アッセイに使用されている。出願人らは、このようなｐＨ緩衝剤が、あるアッセイにおいて、アッセイと干渉し、アッセイの性能を低下させる恐れがあることを発見した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，８４６，４８５号
【特許文献２】米国特許第５，２４０，８６３号
【特許文献３】米国特許第５，２３８，８０８号
【特許文献４】米国特許第５，６４１，６２３号
【特許文献５】米国特許第５，０９３，２６８号
【特許文献６】米国特許第５，１４７，８０６号
【特許文献７】米国特許第５，３２４，４５７号
【特許文献８】米国特許第５，５９１，５８１号
【特許文献９】米国特許第５，５９７，９１０号
【特許文献１０】米国特許第５，６４１，６２３号
【特許文献１１】米国特許第５，６４３，７１３号
【特許文献１２】米国特許第５，６７９，５１９号
【特許文献１３】米国特許第５，７０５，４０２号
【特許文献１４】米国特許第５，８４６，４８５号
【特許文献１５】米国特許第５，８６６，４３４号
【特許文献１６】米国特許第５，７８６，１４１号
【特許文献１７】米国特許第５，７３１，１４７号
【特許文献１８】米国特許第６，０６６，４４８号
【特許文献１９】米国特許第６，１３６，２６８号
【特許文献２０】米国特許第５，７７６，６７２号
【特許文献２１】米国特許第５，３０８，７５４号
【特許文献２２】米国特許第５，２４０，８６３号
【特許文献２３】米国特許第６，２０７，３６９号
【特許文献２４】米国特許第５，５８９，１３６号
【特許文献２５】国際公開第９９／６３３４７号
【特許文献２６】国際公開第００／０３２３３号
【特許文献２７】国際公開第９９／５８９６２号
【特許文献２８】国際公開第９９／３２６６２号
【特許文献２９】国際公開第９９／１４５９９号
【特許文献３０】国際公開第９８／１２５３９号
【特許文献３１】国際公開第９７／３６９３１号
【特許文献３２】国際公開第９８／５７１５４号
【特許文献３３】米国特許第６，１４０，０４５号
【特許文献３４】米国特許第６，０６６，４４８号
【特許文献３５】米国特許第６，０９０，５４５号
【特許文献３６】米国特許第６，２０７，３６９号
【特許文献３７】国際公開第９８／１２５３９号
【特許文献３８】米国特許出願第１０／１８５，２７４号
【特許文献３９】米国特許出願第１０／１８５，３６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、無機リン酸塩含有ｐＨ緩衝剤による悪影響を受けているアッセイに使用する、それに代わるｐＨアッセイ緩衝剤、そのｐＨアッセイ緩衝剤を含有する組成物、及びその使用方法を見出すことが求められている。ＥＣＬアッセイにおいて性能が向上した代替ＥＣＬアッセイ緩衝剤を見出すことも求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アッセイを実施するための改良組成物、試薬、キット、システム、システムコンポーネント及び方法に関する。より詳細には、本発明は、アッセイ性能を向上させる試薬の新規な組合せの使用に関する。
【０００９】
本発明の一態様は、ＥＣＬ共反応物及び、好ましくは、ｐＨ緩衝剤を含む改良されたＥＣＬアッセイ緩衝剤に関する。このＥＣＬアッセイ緩衝剤によって、ＥＣＬ標識を効率良く誘導してＥＣＬを発生させ、ＥＣＬを測定することによってＥＣＬ標識を高感度で測定するのに適した環境が提供される。本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、場合によっては、洗浄剤、保存剤、消泡剤、ＥＣＬ活性種、塩、金属イオン及び／又は金属キレート剤を含めた追加の成分を含むことができる。本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、結合試薬、酵素、酵素基質、補助因子及び／又は酵素阻害剤を含めたバイオアッセイ成分も含むことができ、いくつかのケースではバイオアッセイ成分をＥＣＬ標識で標識することができる。本発明には、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤及び、場合によっては、追加のアッセイ成分を含むアッセイ試薬、組成物、キット、システム及びシステムコンポーネントも含まれる。本発明には、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤を用いてＥＣＬアッセイを実施する方法も含まれる。
【００１０】
本発明の別の態様は、無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤の使用に関する。このような緩衝剤は、いくつかの用途では、ＥＣＬ測定性能を有意に向上させることが見出された。このような緩衝剤は、リン酸塩が化学反応、生化学反応又は生体反応と干渉することが見出されたある種の用途で有利なことも見出された。
【００１１】
驚くべきことに、このような試薬によって、リン酸特異的抗体（すなわち、リンペプチド、ホスホアミノ酸及び／又はリンタンパク質に特異的に結合する抗体）を用いたアッセイの性能の向上を含めて、いくつかの驚くべき利点がもたらされる。これらの抗体は、おそらく無機リン酸塩に対する親和性が低く、無機リン酸塩を含まないことによってｐＨ緩衝剤のリン酸塩とリン酸特異的抗体との干渉が多いに減少すると考えられる。したがって、本発明には、フリー又は実質的にフリーである（例えば、リン酸特異的抗体と干渉するレベル未満）緩衝剤組成物を用いた、リンペプチド、ホスホアミノ酸又はリンタンパク質を測定するための方法、試薬、キット及び組成物が含まれる。このような方法、キット、組成物及び試薬は、好ましくは、反応生成物又は基質の特異的測定によるタンパク質キナーゼ又はホスホリラーゼ活性の（最も好ましくはＥＣＬ検出を用いた）測定に適用される。
【００１２】
本発明の別の態様は、電気化学発光アッセイにおけるシグナル／バックグラウンド比が高い組成物及び試薬に関する。このような性能の向上は、ＥＣＬ共反応物、ｐＨ緩衝剤、洗浄剤及びｐＨの有利な組合せを特定することによって、特に、ＴＰＡ及びリン酸塩以外のＥＣＬ共反応物及び／又はｐＨ緩衝剤を使用することによって達成された。これらの改良配合は、非洗浄アッセイ（ｎｏｎ−ｗａｓｈ  ａｓｓａｙ）及び高感度アッセイにおいて特に価値がある。本発明のいくつかの実施形態において、ＥＣＬアッセイの性能は、試薬組成物と電極組成物を最適に組み合わせることによってさらにいっそう改良される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明の組成物及び試薬によって、結合標識からのＥＣＬシグナルと遊離標識からのＥＣＬシグナルとの比が改善される。これは、電極などの固体表面に固定された試薬を含むアッセイに特に当てはまる。これは、例えば、洗浄ステップがない固相アッセイにおいて（特に、低親和性相互作用アッセイにおいて）重要である。というのは、バックグラウンドシグナルの主な部分は、溶液中に存在する標識に由来するからである。
【００１４】
本発明のさらに別の利点は、本発明の組成物を用いたアッセイの感度の向上に関する。より具体的には、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤によって、ＥＣＬ標識の非存在下におけるバックグラウンドの電気化学発光が低下して、低検出レベルにおける感度が改良される。驚くべきことに、リン酸塩以外のｐＨ緩衝剤を含み、又は無機リン酸塩を実質的に含まないＥＣＬアッセイ緩衝剤は、無機リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤を含む従来のＥＣＬアッセイ緩衝剤よりもバックグラウンドの発光が少ない。これは、シグナル／バックグラウンド比の増加によってアッセイ性能が大きく向上する低検出レベルにおいて特に有利である。
【００１５】
本発明の別の態様は、試薬が非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤を含み、ＥＣＬアッセイ緩衝剤が無機リン酸塩を実質的に含まず、かつ／又はＥＣＬアッセイ緩衝剤にＴＰＡ以外の第三級アミン共反応物が使用される、ＥＣＬアッセイ緩衝剤を含む改良試薬キットに関する。特に、１つ又は複数の容器中に、ＥＣＬアッセイ緩衝剤を含み、好ましくは１つ又は複数の他のアッセイ成分も含むキット。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明を用いて実施される改良された方法、特に、リン酸特異的抗体、低検出限界、固定化試薬及び／又は非洗浄形式を使用するアッセイ方法に関する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、本発明の組成物又は試薬を含む改良システム及び装置、及び／又は本発明の改良された方法を実施するように構成された改良システム及び装置に関する。
【００１８】
本発明には以下が包含される。
（１）  ｐＨ緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物。
（２）  ｐＨ緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない、アッセイに適した組成物。
（３）  ｐＨ緩衝剤と、リンペプチド特異的抗体と、前記リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチドとを含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物。
（４）  前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、項目１、２又は３に記載の組成物。
（５）  １つ若しくは複数のキナーゼ、及び／又は１つ若しくは複数のキナーゼ基質をさらに含む、項目１、２、３又は４に記載の組成物。
（６）  １つ若しくは複数のホスファターゼ、及び／又は１つ若しくは複数のホスファターゼ基質をさらに含む、項目１、２、３又は４に記載の組成物。
（７）  前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンである、項目１、２、３、５又は６に記載の組成物。
（８）  前記ｐＨ緩衝剤がトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである、項目１、２、３、５又は６に記載の組成物。
（９）  前記組成物が１つ又は複数のＥＣＬ共反応物を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１０）  前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、項目９に記載の組成物。
（１１）  前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含む、項目９に記載の組成物。
（１２）  さらにＫＯＨを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１３）  さらに洗浄剤又は界面活性剤を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１４）  さらに非イオン洗浄剤又は界面活性剤を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１５）  前記リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチドをさらに含む、項目１、２又は４から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
（１６）  前記組成物が無機リン酸塩を含まない、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１７）  さらに停止試薬を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１８）  さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（１９）  さらに塩基を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２０）  さらにＫＯＨを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２１）  さらにＫＯＨ及び界面活性剤又は洗浄剤を含む、項目１から１８までのいずれか一項に記載の組成物。
（２２）  さらに電気化学発光標識を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２３）  さらに金属含有電気化学発光標識を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２４）  さらにＲｕ又はＯｓ含有電気化学発光標識を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２５）  前記組成物のｐＨが６〜９である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２６）  前記組成物のｐＨが７〜８である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２７）  前記組成物のｐＨが７．５〜８である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２８）  前記組成物のｐＨが約７．８である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（２９）  項目１から２８までのいずれか一項に記載の組成物を含む電気化学発光アッセイを実施するように構成された装置。
（３０）  前記組成物から放出される光を検出する光検出器、及び／又は電気化学発光を誘導するのに十分な電圧を前記組成物に印加する電圧源をさらに含む、項目２９に記載の装置。
（３１）  １つ又は複数の容器中に、項目１から２８までのいずれか一項に記載の組成物及び１つ又は複数の作用電極を含むアッセイモジュールを含むキット。
（３２）  項目１から２８までのいずれか一項に記載の組成物に電気化学エネルギーを与えるステップを含む電気化学発光方法を実施する方法。
（３３）  放出された電気化学発光を検出するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（３４）  項目１から２８までのいずれか一項に記載の組成物を用いてアッセイを実施する方法であって、
前記組成物とキナーゼ産物を含むアッセイ混合物を形成させるステップと、前記キナーゼ産物と前記リン酸特異的抗体を含む複合体を形成させるステップとを含む、方法。
（３５）  キナーゼをキナーゼ基質と接触させて前記キナーゼ産物を形成させるステップと、前記複合体を検出するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（３６）  電気化学発光を用いて前記複合体を検出する、項目３４又は３５に記載の方法。
（３７）  キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成させ、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップを含むアッセイを実施する方法。
（３８）  キナーゼをキナーゼ基質と接触させて前記キナーゼ産物を形成させるステップと、前記キナーゼ産物を前記リン酸特異的抗体と接触させて前記複合体を形成させるステップと、前記複合体を検出するステップとをさらに含む項目３７に記載の方法。
（３９）  電気化学発光を用いて前記複合体を検出する、項目３７又は３８に記載の方法。
（４０）  ｐＨ緩衝剤と、ＥＣＬ共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物であって、
前記ｐＨ緩衝剤は、グリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択され、前記ＥＣＬ共反応物は第三級アミンを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
（４１）  前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミンである、項目４０に記載の組成物。
（４２）  無機リン酸塩ではないｐＨ緩衝剤と、Ｒｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識と、ＥＣＬ共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
（４３）  前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、項目４２に記載の組成物。
（４４）  前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミンである、項目４３に記載の組成物。
（４５）  無機リン酸塩ではないｐＨ緩衝剤と、トリプロピルアミンであるＥＣＬ共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
（４６）  前記ｐＨ緩衝剤がＥＣＬアッセイｐＨ緩衝剤バックグラウンド低減剤である、項目４２、４３、４４又は４５に記載の組成物。
（４７）  前記共反応物の濃度が５０〜１０００ｍＭである、項目４０、４１、４２、４３、４４、４５又は４６に記載の組成物。
（４８）  電気化学発光方法に使用するのに適した組成物であって、（ａ）濃度が５０〜１０００ｍＭの範囲にあるトリプロピルアミンと、（ｂ）濃度が５０〜１０００ｍＭの範囲にあり、グリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択されるｐＨ緩衝剤とを含み、ｐＨが６．５〜８．５の範囲にある組成物。
（４９）  さらにＥＣＬ成分を含む、項目４０、４１、４５又は４８に記載の組成物。
（５０）  前記ＥＣＬ成分が金属含有ＥＣＬ成分である、項目４９に記載の組成物。
（５１）  前記ＥＣＬ成分がＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識である、項目５０に記載の組成物。
（５２）  前記ＥＣＬ成分が電気化学発光を繰り返し放出可能である、項目４２、４３、４４、４９、５０又は５１に記載の組成物。
（５３）  無機リン酸塩の濃度が２０ｍＭ未満である、項目４０から５２までのいずれかに記載の組成物。
（５４）  前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、項目４０から５２までのいずれかに記載の組成物。
（５５）  前記組成物が無機リン酸塩を含まない、項目４０から５２までのいずれかに記載の組成物。
（５６）  キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、項目５４又は５５に記載の組成物。
（５７）  ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、項目５４又は５５に記載の組成物。
（５８）  前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンである、項目４０から５７までのいずれか一項に記載の組成物。
（５９）  前記ｐＨ緩衝剤がトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである、項目４０から５７までのいずれか一項に記載の組成物。
（６０）  さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、項目４０から５９までのいずれか一項に記載の組成物。
（６１）  さらにＫＯＨを含む、項目４０から６０までのいずれか一項に記載の組成物。
（６２）  塩、洗浄剤、保存剤、キレート化剤及び消泡剤からなる群から選択される物質をさらに含む、項目４０から６１までのいずれか一項に記載の組成物。
（６３）  さらに界面活性剤を含む、項目４０から６２までのいずれか一項に記載の組成物。
（６４）  前記組成物のｐＨが６．５〜８．５である、項目４０から６３までのいずれか一項に記載の組成物。
（６５）  前記組成物のｐＨが７〜８である、項目４０から６４までのいずれか一項に記載の組成物。
（６６）  前記組成物のｐＨが７．５〜８である、項目４０から６５までのいずれか一項に記載の組成物。
（６７）  前記組成物のｐＨが約７．８である、項目４０から６６までのいずれか一項に記載の組成物。
（６８）  前記組成物が水性である、項目４０から６７までのいずれか一項に記載の組成物。
（６９）  前記組成物が、酸化条件下で金属含有ＥＣＬ成分からＥＣＬを誘導するのに適切な環境を提供する、項目４０から６８までのいずれか一項に記載の組成物。
（７０）  項目４０から６９までのいずれか一項に記載の組成物を含む、電気化学発光方法に使用するのに適した試薬。
（７１）  無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤と、Ｒｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ成分とを含む試薬であって、
前記試薬はＥＣＬアッセイを実施するための組成物に使用するのに適していて、
（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物と、
（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質と、
からなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって電磁放射が放出される、試薬。
（７２）  前記試薬がさらに前記ｐＨ緩衝剤と、アミン又はアミン成分と、前記グループ（ｉ）〜（ｉｉｉ）の他の２つの成分のうちの１つとを含む、項目７１に記載の試薬。
（７３）  さらに界面活性剤又は洗浄剤を含む、項目７１に記載の試薬。
（７４）  さらにＥＣＬ共反応物を含む、項目７１に記載の試薬。
（７５）  さらにＥＤＴＡを含む、項目７１に記載の試薬。
（７６）  １つ又は複数の容器中に、ｐＨ緩衝剤及びＥＣＬ共反応物を含み、前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択され、前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
（７７）  １つ又は複数の容器中に、ｐＨ緩衝剤と、Ｒｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識と、ＥＣＬ共反応物とを含み、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
（７８）  １つ又は複数の容器中に、ｐＨ緩衝剤とトリプロピルアミンを含み、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
（７９）  １つ又は複数の容器中に、（ａ）濃度５０〜１０００ｍＭのトリプロピルアミンと、（ｂ）グリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される濃度５０〜１０００ｍＭのｐＨ緩衝剤とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
（８０）  濃度５０〜１０００ｍＭのトリプロピルアミンを含む、項目７８に記載のキット。
（８１）  無機リン酸塩を含まない、項目７６、７７、７８、７９又は８０に記載のキット。
（８２）  キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、項目７６、７７、７８、７９、８０又は８１に記載のキット。
（８３）  ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含む、項目７６、７７、７８、７９、８０又は８１に記載のキット。
（８４）  前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンである、項目７６から８３までのいずれか一項に記載のキット。
（８５）  前記ｐＨ緩衝剤がトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンである、項目７６から８３までのいずれか一項に記載のキット。
（８６）  前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンを含む、項目７７又は８１から８３までのいずれか一項に記載のキット。
（８７）  前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含む、項目７６又は７７に記載のキット。
（８８）  さらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、項目７６から８７までのいずれか一項に記載のキット。
（８９）  前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシンであり、前記組成物がさらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、項目７６、７７又は７８に記載のキット。
（９０）  さらにＫＯＨを含む、項目７６から８９までのいずれか一項に記載のキット。
（９１）  さらにＥＣＬ成分を含む、項目７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
（９２）  電気化学発光を繰り返し放出可能であるＥＣＬ成分をさらに含む、項目７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
（９３）  さらに金属含有ＥＣＬ成分を含む、項目７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
（９４）  さらにＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識を含む、項目７６又は７８から９０までのいずれか一項に記載のキット。
（９５）  塩、洗浄剤、保存剤、キレート化剤及び消泡剤からなる群から選択される１つ又は複数の物質をさらに含む、項目７６から９４までのいずれか一項に記載のキット。
（９６）  さらに界面活性剤を含む、項目７６から９５までのいずれか一項に記載のキット。
（９７）  前記キットが水性である、項目７６から９６までのいずれか一項に記載のキット。
（９８）  ＥＣＬ成分（ｉ）及び電解質（ｉｉ）からなる群の１つ又は複数の成分を含めて少なくとも１つの別個の成分をさらに含む、項目７６、７８から８９まで又は９５から９７までのいずれか一項に記載のキット。
（９９）  （ａ）無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤と（ｂ）リン酸特異的抗体とを含む組成物において、定性的又は定量的に特異的結合アッセイを実施する方法。
（１００）  前記組成物がさらにＥＣＬ共反応物を含む、項目９９に記載の方法。
（１０１）  前記組成物がさらにＥＣＬ標識を含む、項目９９に記載の方法。
（１０２）  前記組成物がさらにリン酸特異的抗体を含む、項目１０１に記載の方法。
（１０３）  結合試薬がその上に固定された１つ又は複数のアッセイドメインを含むウェルにおいて、無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤を含む組成物を用いて、定性的又は定量的に特異的結合非洗浄アッセイを実施する方法。
（１０４）  電気化学発光標識と、
キナーゼ、キナーゼ基質、キナーゼ産物及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの試薬と、
を含む組成物であって、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物を用いて、キナーゼアッセイを実施する方法。
（１０５）  電気化学発光標識を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、放出された電気化学発光を検出するステップとをさらに含む項目１０４に記載の方法。
（１０６）  前記組成物をリン酸特異的抗体と接触させるステップをさらに含む、項目１０４又は１０５に記載の方法。
（１０７）  アッセイを実施する方法であって、
（ａ）キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成させ、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップと、
（ｂ）金属含有ＥＣＬ成分を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｃ）放出された電磁放射を検出するステップとを含む方法。
（１０８）  前記複合体がさらに前記金属含有ＥＣＬ成分を含む、項目１０７に記載の方法。
（１０９）  ＥＣＬ標識と、ＥＣＬ共反応物と、リン酸塩ではないｐＨ緩衝剤とを含む組成物の存在下で誘導される電気化学発光を誘導する方法。
（１１０）  前記ｐＨ緩衝剤がＥＣＬアッセイｐＨ緩衝剤バックグラウンド低減剤である、項目１０９に記載の方法。
（１１１）  前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、項目１０９に記載の方法。
（１１２）  前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、項目１０９、１１０又は１１１に記載の方法。
（１１３）  前記ＥＣＬ共反応物が第三級アミンである、項目１０９、１１０、１１１又は１１２に記載の方法。
（１１４）  前記共反応物が濃度５０〜１０００ｍＭで存在し、前記ｐＨ緩衝剤が濃度５０〜１０００ｍＭで存在し、前記ｐＨが６．５〜８．５であり、前記ＥＣＬ共反応物がトリプロピルアミンであり、前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、項目１０９に記載の方法。
（１１５）  前記ＥＣＬ標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属複合体である、項目１０９から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
（１１６）  前記方法がさらに、
（ａ）前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｂ）放出された電磁放射を検出するステップとを含む、項目１０９から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
（１１７）  電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、項目１１６に記載の方法。
（１１８）  前記ＥＣＬ標識が前記電極に付着している、項目１１７に記載の方法。
（１１９）  前記電極が元素状炭素を含む、項目１１７又は１１８に記載の方法。
（１２０）  第三級アミンであるＥＣＬ共反応物と、少なくとも１つの非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤とを含む電気化学発光アッセイｐＨ緩衝剤。
（１２１）  前記共反応物がＴＰＡである、項目１２０に記載の電気化学発光アッセイｐＨ緩衝剤。
（１２２）  前記非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤が、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、オリゴ（グリシン）又はそれらの組合せから選択される、項目１２０に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
（１２３）  前記非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤がグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である、項目１２０に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
（１２４）  キレート化剤、洗浄剤、塩、消泡剤及び保存剤からなる群から選択される１つ又は複数の物質をさらに含む、項目１２０から１２３までのいずれか一項に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
（１２５）  さらにリン酸特異的抗体を含む、項目１２０から１２４までのいずれか一項に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
（１２６）  項目１２０から１２５までのいずれか一項に記載のアッセイ緩衝剤とＥＣＬ標識を接触させるステップと、電気化学発光を誘導するステップと、放出された電気化学発光を検出するステップとを含む、電気化学発光を発生させる方法。
（１２７）  電気化学発光標識と、非ＴＰＡ電気化学発光共反応物と、少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とを含む組成物。
（１２８）  前記非ＴＰＡ電気化学発光共反応物がＰＩＰＥＳである、項目１２７に記載の組成物。
（１２９）  前記非ＴＰＡ電気化学発光共反応物が、３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸、４−［ビス−（２−ヒドロキシエタン）−アミノ］−ブタンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、アゼパン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、ピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）（ＰＰＡ）、３−モルフォリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−４−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−プロパンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシエタン−Ｎ’−３−メチルプロパノエート、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−メチルプロパノエート、１，６−ジアミノへキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビスプロピル−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−Ｔｒｉｓプロパン）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール、３−ジメチルアミノ−２−プロパノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピルプロパン−１，３，−ジアミン（ＴＰＡ２量体）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）からなる群から選択される、項目１２７に記載の組成物。
（１３０）  前記組成物が作用電極と接触している、項目１２７、１２８又は１２９に記載の組成物。
（１３１）  前記組成物が炭素ベースの作用電極と接触している、項目１２７、１２８又は１２９に記載の組成物。
（１３２）  前記電気化学発光標識がＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識である、項目１２７から１３１までのいずれかに記載の組成物。
（１３３）  ３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸又は４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸を含む組成物。
（１３４）  さらにＥＣＬ標識を含む、項目１３３に記載の組成物。
（１３５）  さらに金属含有ＥＣＬ標識を含む、項目１３３に記載の組成物。
（１３６）  さらにＲｕ又はＯｓ含有ＥＣＬ標識を含む、項目１３３に記載の組成物。
（１３７）  前記項目１３３から１３６までのいずれか一項に記載の組成物を用いて電気化学発光を誘導する方法。
（１３８）  電気化学発光を発生させる方法であって、
（ａ）電気化学発光標識を項目１３６に記載の組成物と接触させるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
（１３９）  電気化学発光を発生させる方法であって、
（ａ）項目１３３から１３７までのいずれか一項に記載の組成物を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
（１４０）  前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、項目１３８又は１３９に記載の方法。
（１４１）  前記ＥＣＬ誘導が、実質的に洗浄剤を含まない組成物において実施される、項目１３８又は１３９に記載の方法。
（１４２）  １つ又は複数の容器中に、電気化学発光標識と、非ＴＰＡ電気化学発光共反応物と、少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とを含むキット。
（１４３）  １つ又は複数の容器中に、少なくとも１つのトリアルキルアミン非ＴＰＡ共反応物を含む１つ又は複数のＥＣＬアッセイ緩衝剤を含むキット。
（１４４）  １つ又は複数の容器中に、金属含有電気化学発光標識、及び３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの共反応物を含むキット。
（１４５）  電気化学発光を発生させる方法であって、
（ａ）電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光を検出するステップと、を含み、
前記電気化学発光共反応物がＴＰＡ以外の第三級アミンである、方法。
（１４６）  電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させることを含む、電気化学発光を誘導する方法であって、
電気化学発光共反応物がトリ−ｎ−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、電気化学発光を誘導する方法。
（１４７）  電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
（ａ）電気化学発光標識と、少なくとも１つの電気化学発光共反応物と、を含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物はトリ−ｎ−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識は作用電極に付着しているステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｃ）放出された電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
（１４８）  電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
（ａ）電気化学発光標識と、少なくとも１つの電気化学発光共反応物とを含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物がトリ−ｎ−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識の第１の部分が作用電極に付着しており、前記電気化学発光標識の第２の部分が溶液中にあるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識の第１の部分を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光標識の第１の部分から放出された電気化学発光を選択的に検出するステップとを含む方法。
（１４９）  目的分析物又は活性のアッセイを実施する方法であって、
（ａ）試料を含む組成物と、ＥＣＬ標識を含むアッセイ試薬と、電極とを形成させるステップであって、前記試料中に前記分析物又は活性が存在することによって前記電極からの前記アッセイ試薬の付着又は解離がもたらされるステップと、
（ｂ）ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤と前記電極を接触させるステップであって、前記共反応物はＴＰＡ以外の第三級アミンであるステップと、
（ｃ）前記電極上のＥＣＬ標識を誘導してＥＣＬを誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｄ）放出されたＥＣＬを測定するステップとを含む方法。
（１５０）  結合現象を測定する方法であって、
（ａ）電極上に固定された結合試薬を、ＥＣＬ標識を含むアッセイ試薬と接触させるステップであって、前記結合試薬が前記アッセイ試薬に特異的に結合するステップと、
（ｂ）前記アッセイ試薬を前記結合試薬に結合させて前記標識を前記電極に付着させるステップと、
（ｃ）前記電極を、ＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤と接触させるステップであって、前記共反応物はＴＰＡ以外の第三級アミンであるステップと、
（ｄ）前記電極上のＥＣＬ標識を誘導してＥＣＬを誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｅ）放出されたＥＣＬを測定するステップとを含む方法。
（１５１）  前記共反応物が１つ又は複数の以下の諸特性を有する、すなわち、ｉ）１電極酸化において炭素ベース電極上で酸化されてアミンラジカルカチオンを与え、前記アミンラジカルカチオンは、プロトンをその後失ってラジカル還元剤を形成することができ、ｉｉ）炭素ベース電極上で、Ｒｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３の酸化電位と同等以上の酸化電位を有し、ｉｉｉ）炭素ベース電極において、水を分解するのに必要な電位よりも低い電位で酸化され、ｉｖ）前記ラジカル還元剤とＲｕ（ＩＩＩ）（ｂｐｙ）３が反応してＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３を生成する反応によって放出されるエネルギーが、発光励起状態のＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３を生成するのに十分であり、ｖ）前記アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の寿命が、対応するＴＰＡ誘導種よりも短い、項目１４５から１５０までのいずれかに記載の方法。
（１５２）  前記共反応物がアミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤を形成し、前記アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の拡散距離が１００ｎｍ未満である、項目１４５から１５１までのいずれか一項に記載の方法。
（１５３）  前記方法が洗浄ステップなしで実施される、項目１４５から１５２までのいずれか一項に記載の方法。
（１５４）  前記ＥＣＬ共反応物をＴＰＡで置換することによって、溶液中の標識に対する電極に付着している標識からのＥＣＬ誘導の選択性が少なくとも２倍低下する、項目１４５から１５３までのいずれか一項に記載の方法。
（１５５）  前記電気化学発光共反応物がＰＩＰＥＳである、項目１４５から１５４までのいずれかに記載の方法。
（１５６）  前記共反応物が、ＮＲ１Ｒ２Ｒ３の構造を有するアミンであり、式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は少なくとも２つの炭素を含むアルキル基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち１つ又は複数は親水性官能基で官能化されている、項目１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
（１５７）  前記親水性官能基が帯電した基を含む、項目１５６に記載の方法。
（１５８）  前記親水性官能基が負に帯電した基を含む、項目１５７に記載の方法。
（１５９）  前記親水性官能基がヒドロキシル、ジアルキルアミノ、サルフェート、スルホネート、カルボキシレート及び／又はカルボン酸エステルを含む、項目１５７に記載の方法。
（１６０）  前記共反応物が（ｎ−Ｐｒ）２Ｎ（ＣＨ２）ｎＲの構造を有し、式中、ｎは２以上であり、Ｒは親水性官能基である、項目１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
（１６１）  前記共反応物が以下の式を有し、ｉ）Ｘが−（ＣＨ２）−又はヘテロ原子であり、ｉｉ）Ｒ及びＲ１が２つ以上の炭素を含むアルキル基であり、ｉｉｉ）ｎ及びｍが各々１以上であり、ｉｖ）Ｒ（及び、場合によってはＲ１）が親水性官能基を含む、項目１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
【化１】
2010181410.tif 000002
（１６２）  前記共反応物が、３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸、４−［ビス−（２−ヒドロキシエタン）−アミノ］−ブタンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、アゼパン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、ピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）（ＰＰＡ）、３−モルフォリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−４−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−プロパンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシエタン−Ｎ’−３−メチルプロパノエート、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−メチルプロパノエート、１，６−ジアミノへキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビスプロピル−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−Ｔｒｉｓプロパン）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール、３−ジメチルアミノ−２−プロパノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピルプロパン−１，３，−ジアミン（ＴＰＡ２量体）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）からなる群から選択される、項目１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
（１６３）  前記共反応物がピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）からなる群から選択される、項目１４５から１５４までのいずれか一項に記載の方法。
（１６４）  前記電気化学発光が、１つ又は複数の炭素ベースの作用電極を用いて誘導される、項目１４５から１６３までのいずれか一項に記載の方法。
（１６５）  前記１つ又は複数の炭素ベースの作用電極が炭素粒子又はカーボンナノチューブを含む、項目１６４に記載の方法。
（１６６）  前記ＥＣＬ標識を少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とも接触させる、項目１４５から１６５までのいずれか一項に記載の方法。
（１６７）  前記共反応物の濃度が１０〜８００ｍＭである、項目１４５から１６６までのいずれか一項に記載の方法。
（１６８）  前記標識をｐＨ緩衝剤と接触させるステップをさらに含む、項目１４６から１６７までのいずれか一項に記載の方法。
（１６９）  前記ｐＨ緩衝剤の濃度が好ましくは０〜８００ｍＭである、項目１６８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】異なるｐＨ緩衝剤を含む３つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤におけるリンペプチド−抗リンペプチド（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）複合体の解離速度を比較したグラフである。
【図２】ＥＣＬ共反応物としてＴＰＡ、及びｐＨ緩衝剤としてＴｒｉｓを含むＥＣＬアッセイ緩衝剤における、リンペプチド−抗リンペプチド複合体の解離速度を示すグラフである。ＥＣＬアッセイ緩衝剤を添加する前に、この複合体を洗浄して遊離抗体を除去することはしなかった。
【図３】２つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤、すなわち、１５０ｍＭ  ＴＰＡ／１５０ｍＭリン酸塩及び１００ｍＭ  ＴＰＡ／４００ｍＭグリシル−グリシンにおける、自己リン酸化されたＥＧＦ受容体からの抗ホスホチロシン抗体の解離速度を比較した最終生成物の安定性試験を示すグラフである。標識α−ホスホチロシン抗体の濃度は６．７ｎＭであった。
【図４Ａ】エッチングされていないカーボンインク電極の表面に固定された標識試薬のＥＣＬ測定における、４つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能を比較したグラフである。このグラフは、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下でのバックグラウンドシグナル、及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。
【図４Ｂ】プラズマエッチングされたカーボンインク電極の表面に固定された標識試薬のＥＣＬ測定における、４つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能を比較したグラフである。このグラフは、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナル、及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。
【図５Ａ】エッチングされていないカーボンインク電極表面に固定された標識試薬のＥＣＬ測定における４つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能を比較したグラフである。このグラフは、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナル及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。この図は、表面に結合していない標識試薬をＥＣＬアッセイ緩衝剤に導入したときに得られたシグナル、及び表面結合と表面非結合試薬とのシグナル比（Ｂ／Ｆ）も示している。
【図５Ｂ】プラズマエッチングされたカーボンインク電極表面に固定された標識試薬のＥＣＬ測定における４つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能を比較したグラフである。このグラフは、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナル及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。この図は、表面に結合していない標識試薬をＥＣＬアッセイ緩衝剤に導入したときに得られたシグナル、及び表面結合と表面非結合試薬とのシグナル比（Ｂ／Ｆ）も示している。
【図６Ａ】プラズマエッチングされたカーボンインク電極表面に固定された標識試薬からのＥＣＬシグナルに対する３つの異なる洗浄剤の効果を比較したグラフである。ＴＰＡ及びリン酸塩を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤に洗浄剤を導入した。このグラフは、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナル、及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。
【図６Ｂ】プラズマエッチングされたカーボンインク電極表面に固定された標識試薬からのＥＣＬシグナルに対する３つの異なる洗浄剤の効果を比較したグラフである。ＰＩＰＥＳ及びリン酸塩を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤に洗浄剤を導入した。このグラフは、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナル、及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。
【図７】エッチングされていないカーボンインク電極表面に固定された標識試薬からのＥＣＬシグナルに対する５つの異なる洗浄剤の効果を比較したグラフである。ＥＣＬ共反応物又はｐＨ緩衝剤の種類が異なる４つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤に洗浄剤を導入した。この図は、表面に結合した試薬からのシグナル、結合試薬の非存在下で測定されたバックグラウンドシグナル、及びシグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明、並びに、そのさらなる目的、特徴及び利点は、以下の特定の好ましい実施形態の詳細な説明からより完全に理解されるはずである。
【００２１】
ＥＣＬ活性種は、ＥＣＬ成分、ＥＣＬ標識、ＥＣＬ標識化合物、ＥＣＬ標識物質などとも呼ぶことができる。（本発明による組成物、試薬、キット、方法又はシステムの実施形態のどれかに利用するとき）他の分子、特に、生化学又はバイオアッセイの成分、例えば、分析物又はその類似物、分析物の結合相手又はその類似物、そのような上述の結合相手のさらなる結合相手、あるいは分析物、その類似物又は上述した結合相手と結合可能である反応成分と連結されるこれらのＥＣＬ活性種も本発明の範囲内である。上述の種を、１つ若しくは複数の結合相手、及び／又は１つ若しくは複数の反応成分の組合せと連結させることもできる。特定の酵素アッセイにおいては、ＥＣＬ活性種を酵素基質と連結させることができる。
【００２２】
以後時折「ＥＣＬ、組成物」又は「システム」と称する上述の「組成物」が、上述の励起状態におけるＥＣＬ成分、及び上述の強い還元剤など、ＥＣＬ反応の過程で形成される不安定種、準安定種、及び他の中間体種を含有することも同様に本発明の範囲内である。また、可視光の放出は本発明の特定の実施形態の有利な特徴であるが、赤外光又は紫外光、Ｘ線、マイクロ波など他のタイプの電磁放射を放出する組成物（以後、時折「ＥＣＬ組成物」と呼ぶ）又はシステムも本発明の範囲内である。本発明に関係する「電気化学発光」、「電気化学発光の」、「電気化学発光する（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ）」、「発光」、「発光の」及び「発光する」という用語の使用は、放出が光である必要はなく、放出がそのような他の電磁放射形式であってもよい。
【００２３】
本発明は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤、それを含有するアッセイ組成物、及びその使用方法に関する。上述したように、従来技術のリン酸塩ベースのＥＣＬアッセイ緩衝剤を使用したときに、いくつかの欠点を発見した。より具体的には、ＥＣＬ共反応物ＴＰＡの標準配合（ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：２００ｍＭリン酸塩、約１００ｍＭＴＰＡ、ｐＨ約７．５）中のリン酸塩によって、リン酸特異的抗体とリン酸化基質の結合が破壊されることを、チロシンキナーゼ活性に特異的なＥＣＬアッセイを開発中に見出した。アッセイには、ｉ）炭素電極に固定されたペプチドのキナーゼに依存したリン酸化、ｉｉ）（Ｒｕ（ｂｐｙ）３誘導体によって）標識されたリン酸特異的抗体の特異的結合、ｉｉｉ）ＥＣＬ共反応物トリプロピルアミン（ＴＰＡ）の添加、及びｉｖ）結合標識からのＥＣＬの検出が含まれる（例えば、下記実施例Ａ参照）。出願人らは、ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤の添加によってＴＰＡが加えられたときに、測定ＥＣＬシグナルが、ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤に結合複合体が曝され続けた時間に明確に依存し（図１）、測定シグナルが時間とともに急激に低下することを発見した。事実、１時間のインキュベーション後、初期シグナルのほんのわずかな部分（約１０％）しか検出されなかった。酵素反応中にプレート表面に形成されたホスホチロシン部位に対する、アッセイに使用したｐＹ２０抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ）の親和性は、溶液中の遊離リン酸塩に対する親和性よりも極めて大きかった。しかし、ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤（２００ｍＭ）中の遊離リン酸塩濃度が高いため、ホスホチロシン／ｐＹ２０複合体が解離して、シグナルが急速に減衰する結果になると現時点では考えられる。
【００２４】
この問題を回避する１つの方法は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤の投与から読み取りステップまでの時間を固定し、シグナル減衰を検量して差し引くことである。しかし、この手法は、アッセイの堅牢性及び投与プロトコルの柔軟性が望まれるハイスループットスクリーニング用途では望ましくない。
【００２５】
したがって、いくつかの異なる有機ｐＨ緩衝剤が、従来のリン酸塩ベースのアッセイ緩衝剤の代替品として試験された。しかし、（すべてＳｉｇｍａ製であるトリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳを含めて）従来の生物学的緩衝剤の多くが、ＴＰＡからのＥＣＬ発生と干渉し、ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤を用いて観測されるＥＣＬシグナルのわずか２〜２０％を与えるに過ぎなかった。しかし、出願人らは、ＴＰＡ／リン酸塩において観測されるシグナルと同等のＥＣＬシグナルを与える１組の緩衝剤を発見した。
【００２６】
したがって、出願人らは、無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤でリン酸塩緩衝剤を置換することによって、上述の欠点がなく、標準ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤において観測されるシグナルと同等のＥＣＬシグナルができることを発見した。ｐＨ緩衝剤は無機緩衝剤を含まないことが好ましい。
【００２７】
また、出願人らは、本発明のリン酸塩を含まないＥＣＬアッセイ緩衝剤が、リンペプチド結合アッセイに適用したときに有利であるだけでなく、広範なＥＣＬアッセイを改善することができる（バックグラウンドシグナルが低いことも含めた）他の有利な諸特性も有することを発見した。
【００２８】
また、出願人らは、ＥＣＬアッセイ緩衝剤に導入したときにＥＣＬアッセイ緩衝剤のバックグラウンドを低下させ、アッセイ性能を向上させるＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を発見した。これらの低減剤は、好ましくは、ｐＨ緩衝剤でもあり、最も好ましくは、ＧｌｙＧｌｙ又はＴｒｉｓである。
【００２９】
また、出願人らは、従来のＴＰＡ以外のＥＣＬ共反応物を使用する新規なＥＣＬアッセイ緩衝剤を発見した。驚くべきことに、いくつかの共反応物が、ＴＰＡが発生するＥＣＬシグナルと同等のＥＣＬシグナルを発生することを発見した。また、ＴＰＡ以外のＥＣＬ共反応物は、その性能がＴＰＡよりも向上しているため、その使用によって非洗浄ＥＣＬアッセイ性能が向上して、電極の近傍に保持されたＥＣＬ標識と溶液中に遊離している標識とが識別されることが判明した。ＴＰＡ以外の共反応物を使用することは、確認された新しい共反応物のいくつかの水溶性が高く蒸気圧が低いため別な利点もある。
【００３０】
また、出願人らは、洗浄剤の有無が、ＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能に重大な影響を及ぼし得ることを発見した。驚くべきことに、ＥＣＬに対する洗浄剤の効果は、ＥＣＬ共反応物及び作用電極材料に何を選ぶかによって左右され得る。出願人らは、異なる様々な用途及びＥＣＬシステムに適切な洗浄剤含有ＥＣＬアッセイ緩衝剤を開発した。
【００３１】
上述したように、本発明の一態様は、ＥＣＬ共反応物及び、好ましくは、ｐＨ緩衝剤を含む改良されたＥＣＬアッセイ緩衝剤に関する。このＥＣＬアッセイ緩衝剤によって、ＥＣＬ標識を効率良く誘導してＥＣＬを発生させ、ＥＣＬを測定することによってＥＣＬ標識を高感度で測定するのに適した環境が提供される。本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、場合によっては、洗浄剤、保存剤、消泡剤、ＥＣＬ活性種、塩、金属イオン及び／又は金属キレート剤を含めて追加の成分を含むことができる。本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、結合試薬、酵素、酵素基質、補助因子及び／又は酵素阻害剤を含めたバイオアッセイ成分も含むことができ、いくつかのケースではバイオアッセイ成分をＥＣＬ標識で標識することができる。
【００３２】
好ましくは、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、本質的に、水性又は実質的に水性であるが、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、他のアルコールなどの有機共溶媒を添加することが望ましい用途もある。本発明の一実施形態において、ＥＣＬアッセイ緩衝剤（又はその１つ若しくは複数の成分）は乾燥された形で提供され、使用者は、適切な溶媒又はマトリックス（好ましくは、水又は水性媒体）を添加することによって、ＥＣＬアッセイ緩衝剤溶液を作製する。
【００３３】
５．１  ＥＣＬ共反応物
すべてではないにしてもほとんどの現行の市販ＥＣＬ技術の適用例には、共反応物としてのトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰＡ）及びｐＨ緩衝剤としてのリン酸塩を含有するＥＣＬアッセイ緩衝剤の存在下におけるＥＣＬ標識（及び、特に、ルテニウムの有機金属複合体）の測定が含まれている。これらのＥＣＬアッセイ緩衝剤は、結合アッセイの固相として金属（一般に、白金）電極表面に収集された磁気粒子を使用する市販のＥＣＬ計測手段に対して最適化され、優れた性能を示す。
【００３４】
出願人らは、いくつかの用途において、ある種の官能性を持たせた第三級アルキルアミンが、ＴＰＡと同等以上の性能を示すことができることを発見した。これらの官能性第三級アミンは、炭素ベースの電極（例えば、プラスチック、インクなどの炭素粒子又はカーボンナノチューブを含む複合材料を含めた電極）及び／又は電極上に固定されたアッセイ試薬（結合試薬など）を使用するアッセイにおいて特に有用である。本発明の官能性第三級アルキルアミンは、好ましくは、１つ又は複数の以下の諸特性を有する。ｉ）官能性第三級アルキルアミンは１電極酸化（ｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）で炭素ベース電極上で酸化されてアミンラジカルカチオンとなり、アミンラジカルカチオンはプロトンをその後失ってラジカル還元剤を形成することができる（スキーム１）。ｉｉ）炭素ベース電極上で、Ｒｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３の酸化電位と同等（１５０ｍＶ以内）又はそれよりも大きい酸化電位を有する。ｉｉｉ）最も好ましくはｐＨ６〜９で、水を分解するのに必要な電位よりも低い電位で、炭素ベースの電極において酸化することができる。ｉｖ）ラジカル還元剤とＲｕ（ＩＩＩ）（ｂｐｙ）３が反応してＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３を生成する反応によって放出されるエネルギーは、発光励起状態のＲｕ（ＩＩ）（ｂｐｙ）３を生成するのに十分である。ｖ）アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の寿命は、対応するＴＰＡ誘導種（ＴＰＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ）よりも短い。
【００３５】
【化２】
2010181410.tif 000003
【００３６】
出願人らは、本発明の官能性第三級アルキルアミンを使用することによって、（溶液中に遊離しているＥＣＬ標識とは異なって）電極に結合したＥＣＬ標識に対する、電極でのＥＣＬ励起の選択性を向上させることが可能であることを発見した。理論に拘泥するのではないが、この選択性の増加は、アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の寿命が、対応するＴＰＡ誘導種よりも短い（したがって、電極表面近傍で起こるＥＣＬ反応への反応性種の関与が制限される）ためであると考えられる。好ましくは、アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の拡散距離（種がその寿命の間に拡散することができる距離）は１μｍ未満であり、より好ましくは＜５００ｎｍ、さらにより好ましくは１００ｎｍ未満、さらにより好ましくは５０ｎｍ未満、最も好ましくは＜１０ｎｍである。遊離標識と結合標識との選択性が高いことによって、非洗浄形式のＥＣＬアッセイフォーマットにおける感度が向上した。結合標識と遊離標識からのシグナル比（Ｂ／Ｆ比）は、ＴＰＡを本発明の非ＴＰＡ共反応物で置換することによって向上させることができる。この向上は、好ましくは２倍を超え、より好ましくは５倍を超え、最も好ましくは１０倍を超える。
【００３７】
本発明の官能性第三級アミン共反応物は、ＮＲ１Ｒ２Ｒ３の構造を有することが好ましい。式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、少なくとも２つ、好ましくは３つの炭素を含むアルキル基であり、１つ又は複数のＲ１、Ｒ２及びＲ３は親水性官能基、より好ましくは帯電基、最も好ましくは負の帯電基で官能化されている。好ましい官能基としては、ヒドロキシル、ジアルキルアミノ、サルフェート、スルホネート、カルボキシレート、カルボン酸エステルなどがある。
【００３８】
特に好ましい共反応物としては、（ｎ−Ｐｒ）２Ｎ（ＣＨ２）ｎＲの構造を有する化合物などがある。式中、ｎは２以上（より好ましくは３）であり、Ｒは上で定義した親水性官能基、好ましくは、カルボキシレート、ジアルキルアミノ（より好ましくはジプロピルアミノ）、最も好ましくはスルホネートである。
【００３９】
他の好ましい共反応物としては、以下の構造の化合物などがある。
【００４０】
【化３】
2010181410.tif 000004
【００４１】
式中、ｉ）Ｘは−（ＣＨ２）−又はヘテロ原子、好ましくは−Ｏ−、−Ｓ−、又は−Ｎ（Ｒ１）−であり、ｉｉ）Ｒ及びＲ１は２つ以上の（好ましくは３つ以上の）炭素を含むアルキル基であり、ｉｉｉ）ｎ及びｍは各々１以上、好ましくは２であり、ｉｖ）Ｒ（及び、場合によってはＲ１）は上で定義した親水性官能基を含む。最も好ましくは、Ｒは−（ＣＨ２）ｎ−Ｆ１である。式中、ｎは３以上であり、Ｆ１は親水性官能基、好ましくは、カルボキシレート又はスルホネートである。Ｘが−Ｎ（Ｒ１）−である場合、Ｒ１は最も好ましくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｆ２である。式中、ｎは３以上であり、Ｆ１はＨ、アルキル又は親水性官能基、最も好ましくは、カルボキシレート又はスルホネートである。
【００４２】
いわゆる「グッド」緩衝剤（Ｇｏｏｄ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５、４６７（１９６６）；Ｇｏｏｄ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２４、Ｐａｒｔ  Ｂ、５３（１９７２）、及びＦｅｒｇｕｓｏｎ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０４、３００（１９８０））の多数が第三級アミンを含み、炭素電極上でＥＣＬ共反応物として作用することが見出された。これらの「グッド」緩衝剤は、一般に、ピペラジン又はモルホリン核を有する第三級アミンを含む。炭素ベース電極上でＥＣＬ共反応物として作用する特定のアミンとしては、３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸、４−［ビス−（２−ヒドロキシエタン）−アミノ］−ブタンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、アゼパン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、ピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）（ＰＰＡ）、３−モルフォリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス−４−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−プロパンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシエタン−Ｎ’−３−メチルプロパノエート、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−メチルプロパノエート、１，６−ジアミノへキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビスプロピル−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−Ｔｒｉｓプロパン）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール、３−ジメチルアミノ−２−プロパノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピルプロパン−１，３−ジアミン（ＴＰＡ２量体）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）などがある。ＨＥＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳＯ、ＰＰＡ及びＰＩＰＥＳが、シグナルが高く、結合標識と遊離標識の識別が容易であるため特に好ましい。ＴＥＳも、シグナルが高く好ましい。
【００４３】
さらなる共反応物としては、プロリン、Ｎ−末端プロリンを有するペプチドなどがある。プロリンは、Ｎ−アルキル化されて第三級アミンを形成していることが好ましい。
【００４４】
親水性官能基を有する共反応物（及び、特に、中性ｐＨで双生イオンである共反応物）を使用することは、ＥＣＬ共反応物としての作用能力とは無関係に様々な利点がある。これらの種は、水溶性が高く、蒸気圧が低い傾向にある。そのため、使用時に必要に応じて希釈される高度に濃縮された原液を製造することが可能である。気相へ共反応物が消失する不安定さがなく、共反応物を含む乾燥試薬を調製することも可能である。また、これらの共反応物は、乾燥試薬である場合、最小限の体積に速やかに溶解する。
【００４５】
５．２  ｐＨ緩衝剤
市販のＥＣＬ機器で使用するために最適化された従来のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、一般に、リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤中にＴＰＡを含んでいる。それらの配合物は、電極上に捕獲された磁気粒子を用いる固相アッセイを実施するために特に有用であった。出願人らは、いくつかの用途において、（有機ｐＨ緩衝剤を含めて）他のｐＨ緩衝剤がリン酸塩以上の性能をもたらすことができることを発見した。これらの非リン酸塩ｐＨ緩衝剤（及び、ｐＨ緩衝剤溶液、及びこれらの緩衝剤を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤は、炭素ベースの電極（例えば、プラスチック及びインクなどの炭素粒子又はカーボンナノチューブ含有複合材料を含む電極）及び／又は電極上に固定されたアッセイ試薬（結合試薬など）を用いるアッセイに特に有用である。それらは、リン酸塩が干渉物質（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）となるアッセイに使用する場合にも有利である。好ましくは、本発明の非リン酸塩緩衝剤を用いるＥＣＬアッセイ緩衝剤は、１５ｍＭ未満の無機リン酸塩、より好ましくは５ｍＭ未満の無機リン酸塩、さらにより好ましくは１ｍＭ未満のリン酸塩を含み、さらにより好ましくは無機リン酸塩を実質的に含まない、最も好ましくは無機リン酸塩を含まない。
【００４６】
ｐＨ緩衝剤は、ＥＣＬを放出するために用いられる諸条件下で酸化されず、ＥＣＬの生成を干渉しないことが好ましい。特に有用であることが証明された２つのｐＨ緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）及びオリゴ（グリシン）、好ましくはグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である。出願人らは、ＴＰＡ／Ｔｒｉｓ又はＴＰＡ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ  ＥＣＬアッセイ緩衝剤を用いた炭素ベース電極上でのＥＣＬアッセイでは、電極に結合したＥＣＬ標識からのシグナルが、従来のＴＰＡ／リン酸塩緩衝剤によって観測されるシグナルと同等であることを発見した。しかし、ＥＣＬ標識の非存在下におけるバックグラウンドシグナルは、Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ緩衝剤の方が極めて少ない。バックグラウンドシグナルが低下したことによって、シグナル／バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）が高くなり、新しい配合物を用いたＥＣＬアッセイの感度が上昇した。本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤のＳ／Ｂ比は、リン酸塩ベースのシステムを用いて得られるＳ／Ｂ比の２倍、より好ましくは５倍、最も好ましくは１０倍良好であることが好ましい。
【００４７】
理論に拘泥するものではないが、出願人らは、Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−ｇｌｙベースのＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能向上が、アッセイ緩衝剤バックグラウンドの原因である第三級アミン酸化生成物及び／又は他の反応性酸化種（例えば、アミンラジカルカチオン及びラジカル還元剤）と反応しそれを破壊することによるＥＣＬアッセイ緩衝剤還元剤としての緩衝剤の作用能力に関係しているとの仮説を立てている。この効果は、電極表面から離れてこれらの種の濃度がより低く、したがって、Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−ｇｌｙ成分が電極結合標識からのシグナルに影響を及ぼさない場所で最も顕著である。Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−ｇｌｙ緩衝剤によって、観測される結合／遊離比（ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｆｒｅｅ  ｒａｔｉｏ）も改善され得る。ただし、この効果は、ＰＩＰＥＳなどの非ＴＰＡ緩衝剤に置換することによって観測される効果よりは小さい。
【００４８】
出願人らは、Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−ｇｌｙ緩衝システムが、ＰＩＰＥＳなどの非ＴＰＡ共反応物を用いて使用するのにも適していることを見出した。ｐＨ緩衝剤として作用し得るＰＩＰＥＳなどの共反応物を使用すると、追加の緩衝剤を省略することができる。
【００４９】
５．３  洗浄剤
出願人らは、洗浄剤の有無が、ＥＣＬシグナルに対して驚くほど大きな効果を及ぼし得ることを発見した。この効果の性質は、予想外なことに、電極によって決まる。ＴＰＡ含有ＥＣＬアッセイ緩衝剤に曝された酸化電極（例えば、炭素粒子又はカーボンナノチューブを含有するプラズマ酸化カーボンインク又はプラズマ酸化ポリマー複合材料）上では、この効果は、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｎｏｎｉｄｅｔシリーズの洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのフェニルエーテル含有洗浄剤の場合を除き、比較的小さいように見える。ＥＣＬを発生させる一般的な方法は、傾斜電位（ｒａｍｐ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を使用することである。一般に、ＥＣＬ強度と印加された電位のプロットは、ピーク形状をしている。ＥＣＬは、標識の酸化電位と共反応物の酸化電位が近づくにつれ増加する。この電位を過ぎてスキャンし続けると、結局、共反応物が消費されてＥＣＬ強度が減少し始め、水の酸化が起き始める。出願人らは、フェニルエーテル含有洗浄剤を添加することによって、ＥＣＬ主ピークよりも高電位で小さなＥＣＬピークが追加されることを観測した。このピークは、純粋なＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて観測される酸化波とほぼ同じ電位にあり、したがって、出願人らは新しいピークが洗浄剤（又は同伴する不純物）の酸化及びＥＣＬ反応へのその酸化生成物の関与と関連があると推測している。
【００５０】
非酸化炭素ベース電極（及び、特に、未処理カーボンインク電極）での挙動は極めて異なっている。これらの電極では、ＴＰＡ含有緩衝剤の存在下のＥＣＬシグナル（並びにＳ／Ｂ比）が、洗浄剤の添加によって大幅に改良された。この効果は、洗浄剤の性質に比較的依存しないように思えるが（非イオン洗浄剤は、生体系を変性させる能力が比較的弱いために好ましいが）、洗浄剤濃度が洗浄剤の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）とほぼ同等以上である必要がある。好ましい本発明の実施形態においては、ＥＣＬアッセイ緩衝剤に洗浄剤を添加することによって、（好ましくは炭素ベースの電極、最も好ましくはカーボンインク電極によって誘導された）アッセイシグナル又はＳ／Ｂが、２倍を超えて、より好ましくは５倍を超えて、最も好ましくは１０倍を超えて改善される。
【００５１】
非ＴＰＡ含有ＥＣＬアッセイ緩衝剤、特に、非ＴＰＡ含有ＥＣＬアッセイ緩衝剤（特に、本発明の非ＴＰＡ第三級アミン共反応物、好ましくはＮ−置換モルホリン又はピペラジン、最も好ましくはＰＩＰＥＳを含む緩衝剤）の挙動は、炭素電極の性質にあまり依存しないように見える。例えば、出願人らは、共反応物としてＰＩＰＥＳを用いるアッセイが、フェニルエーテル含有物質、特に、フェニルエーテル含有洗浄剤を添加することによって、酸化電極でも非酸化電極でも予想外に大きく改善されることを見出した。フェニルエーテル成分を含まない他の洗浄剤は、この効果を示さなかった。好ましい本発明の実施形態において、非ＴＰＡベースのＥＣＬアッセイ緩衝剤（好ましくは、ＰＩＰＥＳベースのＥＣＬアッセイ緩衝剤）に洗浄剤を添加すると、（好ましくは炭素ベースの電極、最も好ましくはカーボンインク電極を用いて誘導される）アッセイシグナル又はＳ／Ｂが、１０倍を超えて、より好ましくは３０倍を超えて、最も好ましくは１００倍を超えて改善される。
【００５２】
ある種のアッセイ、例えば、生体膜などの洗浄剤感受性成分を含むアッセイにおいては、ＥＣＬアッセイ緩衝剤から洗浄剤を削減（例えば、＜０．１％に）又は排除することが有利なことがある。本発明の様々な洗浄剤含有配合は、これらの洗浄剤感受性用途向けに、洗浄剤の少ない形でも洗浄剤のない形でも調製することができることを理解すべきである。好ましい実施形態において、洗浄剤感受性成分を用いるアッセイでは、以下の共反応物、すなわち、ＴＰＡ、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸又はＡ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＢ２のうちの１つを含有するＥＣＬアッセイ緩衝剤が使用される。式中、Ａ及びＢはアルキル基（好ましくは、プロピル）であり、ｎは整数（好ましくは３又は４、最も好ましくは３）である。
【００５３】
５．４  保存剤
ＥＣＬアッセイ緩衝剤を保存するときには、微生物増殖を防止する保存剤を入れることが有利な場合がある。保存剤は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤を用いて発生したＥＣＬに対してほとんど又はまったく影響を及ぼさないことが好ましく、特に炭素ベースの電極でＥＣＬアッセイ緩衝剤を使用するときにはそうである。アジドは、適切な保存剤であることが判明した。イソチアゾロン（例えば、Ｋａｔｈｏｎ、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン及び５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）、オキサゾリジン（例えば、Ｏｘａｂａｎ  Ａ又は４，４ジメチルオキサゾリジン）及び関係する保存剤は、ＥＣＬとの高い相溶性、高い活性、安全上の問題又は環境問題に関連する諸問題が少ないことのために、特に好ましい。
【００５４】
５．５  消泡剤
特にＨＴＳ用途では、バブル、即ち、泡の生成を回避することが有利なことがある。このため、消泡剤をＥＣＬアッセイ緩衝剤に添加することが望ましいことがある。出願人らは、（Ａｎｔｉｆｏａｍｓ  ｏ−３０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９を含めて）多数の市販の消泡剤が、ＥＣＬアッセイ緩衝剤の性能に有意な影響を及ぼすことなくＥＣＬアッセイ緩衝剤に添加できることを見出した。
【００５５】
５．６  ＥＣＬ標識
本発明の組成物はＥＣＬ標識を含むことができる。ＥＣＬ標識は、従来のＥＣＬ標識でもよい。ＥＣＬ標識の例としては、ｉ）トリス−ビピリジル−ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）成分などのＲｕ含有及びＯｓ含有有機金属化合物を含めて、金属が、例えば、ＶＩＩＩ族貴金属から選択される有機金属化合物、並びにｉｉ）ルミノール及び関係化合物がある。ＥＣＬ標識は、電気化学発光を繰り返し放出できることが好ましい。好ましいＥＣＬ標識は、ルテニウム又はオスミウム含有有機金属種である。より好ましくは、これらのルテニウム又はオスミウム含有有機金属は、ポリピリジルリガンド（最も好ましくは、ビピリジン、フェナントロリン及び／又はその置換誘導体）とキレートを形成しているルテニウム又はオスミウムを含む。最も好ましくは、ＥＣＬ標識は、ルテニウム−トリス−ビピリジンを含み、ビピリジンリガンドは、場合によっては、例えば、標識をアッセイ試薬に結合させる連結基で置換されている。
【００５６】
ＥＣＬ標識は、場合によっては連結基によって、アッセイ試薬に連結されていてもよい。ＥＣＬ標識と連結することができる結合試薬の例としては、細胞全体、細胞表面抗原、細胞下の粒子（例えば、細胞小器官又は膜断片）、ウイルス、プリオン、チリダニ又はその断片、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸（及び合成アナログ）、タンパク質（及び合成アナログ）、リポタンパク質、多糖、阻害剤、補助因子、ハプテン、細胞受容体、受容体リガンド、リポ多糖、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、酵素基質、酵素生成物、セカンドメッセンジャー、細胞代謝産物、ホルモン、薬物、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザー、バルビツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換え又は誘導タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンがある。アッセイ試薬は、例えば、結合アッセイ又は酵素アッセイにおいて、結合試薬又は酵素基質として有用であることが好ましい。
【００５７】
５．７  組成物
本発明の一態様は、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤を含む組成物に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤を含むアッセイに使用するのに適した組成物に関する。適切なｐＨ緩衝剤には、グリシルグリシン（「Ｇｌｙｇｌｙ」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Ｔｒｉｓ」）又はそれらの組合せが含まれる。やはり無機リン酸塩を実質的に含まない又はまったく含まない他のｐＨ緩衝剤も、本発明に使用するのに適している。
【００５９】
本発明の一実施形態によれば、本組成物はｐＨ緩衝剤を含み、好ましくは、無機リン酸塩を実質的に含まず、好ましくは１つ又は複数のＥＣＬ共反応物（好ましくは、ＴＰＡ又は非ＴＰＡ共反応物、より好ましくはＮ−置換モルホリン又はピペラジン、最も好ましくはＰＩＰＥＳ）をさらに含む。特に好ましい実施形態によれば、本組成物は、無機リン酸塩を含まない。適切なｐＨ緩衝剤としては、ｇｌｙｇｌｙ、ｔｒｉｓなどがある。さらなる緩衝剤を、ある好ましい諸特性、すなわち、ｉ）ｐＨ６．５〜８．５、好ましくは７〜８における緩衝能力（より好ましくは、緩衝剤のｐＫａは６．５〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５の範囲である）、ｉｉ）低価格での商業的入手性、ｉｉｉ）ＥＣＬに対する阻害効果がないこと、及び／又はｉｖ）０〜１．２Ｖ、より好ましくは０〜１．５Ｖ（Ｒｕ（ｂｐｙ）３及びＴＰＡの酸化に対する電圧ウィンドウ）の範囲に有意な酸化波がないことに基づいて選択することができる。
【００６０】
本発明の別の実施形態によれば、本組成物は、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤を含み、好ましくは１つ又は複数のＥＣＬ共反応物（好ましくは、ＴＰＡ又は非ＴＰＡ共反応物、より好ましくはＮ−置換モルホリン又はピペラジン、最も好ましくはＰＩＰＥＳ）をさらに含む。好ましくは、本組成物は、１５ｍＭ未満の無機リン酸塩、より好ましくは５ｍＭ未満の無機リン酸塩、さらにより好ましくは１ｍＭ未満のリン酸塩を含み、さらにより好ましくは無機リン酸塩を実質的に含まず、最も好ましくは無機リン酸塩を含まない。適切なｐＨ緩衝剤としては、ｇｌｙｇｌｙ、ｔｒｉｓなどがある。さらなる緩衝剤を、ある好ましい諸特性、すなわち、ｉ）ｐＨ６．５〜８．５、好ましくは７〜８における緩衝能力（より好ましくは、緩衝剤のｐＫａは６．５〜８．５、より好ましくは７．５〜８．５の範囲である）、ｉｉ）低価格での商業的入手性、ｉｉｉ）ＥＣＬに対する阻害効果がないこと、及び／又はｉｖ）０〜１．２Ｖ、より好ましくは０〜１．５Ｖ（Ｒｕ（ｂｐｙ）３及びＴＰＡの酸化に対する電圧ウィンドウ）の範囲に有意な酸化波がないことに基づいて選択することができる。
【００６１】
これらの実施形態に用いられるＥＣＬ共反応物は、電極によって誘導される発光反応（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（例えば、電気化学発光）における使用に適していることが好ましい。適切なＥＣＬ共反応物としては、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）などがある。非ＴＰＡ共反応物（好ましくは、上記共反応物の項に記載したＴＰＡ以外の第三級アミン）は、いくつかの用途、特に、非洗浄形式のアッセイにおいて有利である。
【００６２】
本組成物は、１０〜２０００ｍＭ、より好ましくは５０〜１２００ｍＭ、さらにより好ましくは１００〜６００ｍＭ、最も好ましくは３００〜５００ｍＭのｐＨ緩衝剤を含むことが好ましい。
【００６３】
本組成物は、１０〜１０００ｍＭ、より好ましくは３０〜６００ｍＭ、さらにより好ましくは５０〜２００ｍＭ、最も好ましくは７５〜１５０ｍＭのＥＣＬ共反応物を含むことが好ましい。
【００６４】
Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−Ｇｌｙを含有するｐＨ緩衝剤におけるＴＰＡ濃度の最適範囲は、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）緩衝剤の濃度に極めて類似している（すなわち、５０〜２００ｍＭの範囲）。Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ緩衝剤濃度の試験範囲は１００〜６００ｍＭである。好ましくは、濃度は２００ｍＭである。本発明の非ＴＰＡ共反応物（好ましくは、ＰＩＰＥＳ）を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤は、ほぼ同じ範囲の濃度の共反応物を含むことができる。ただし、多数の用途において、好ましい範囲は、１０〜１００ｍＭ、最も好ましくは２０〜５０ｍＭである。
【００６５】
別の好ましい実施形態によれば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ／ＴＰＡ緩衝剤の最終配合は、２００ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、１００ｍＭ  ＴＰＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ＝７．８±０．０５である。
【００６６】
別の好ましい実施形態によれば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ／ＴＰＡ緩衝剤の最終配合は、５０〜１０００ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、５０〜１０００ｍＭ  ＴＰＡ、ｐＨ＝７．８±１である。この配合は、０．２％〜２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又は２０〜５００ｍＭ塩も含むことが好ましい。
【００６７】
別の好ましい実施形態によれば、Ｔｒｉｓ／ＴＰＡ緩衝剤の最終配合は、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＴＰＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ＝７．８±０．０５である。
【００６８】
別の好ましい実施形態によれば、Ｔｒｉｓ／ＴＰＡ緩衝剤の最終配合は、５０〜１０００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０〜１０００ｍＭ  ＴＰＡ、ｐＨ＝７．８±０．０５である。この配合は、０．２％〜２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又は２０〜５００ｍＭ塩も含むことが好ましい。
【００６９】
別の好ましい実施形態によれば、ＰＩＰＥＳ／Ｐｈｏｓ緩衝剤の最終配合は、４０〜１０００ｍＭリン酸塩（好ましくは、リン酸カリウム）、１０〜２００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ＝７．８±０．０５である。この配合は０．２％〜２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００も含むことが好ましい。
【００７０】
Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−Ｇｌｙアッセイ緩衝剤の使用によって、ＥＣＬベースのチロシンキナーゼアッセイにおけるリンペプチド−抗リンペプチド複合体の安定性がかなり向上した。しかし、Ｔｒｉｓ緩衝剤においてこの複合体が一部解離することが認められた。ただし、その速度は、ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤におけるよりもはるかに遅かった。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ緩衝剤の場合、酵素反応を抑える停止試薬をアッセイ溶液に導入しなかったので、ＥＣＬシグナルが徐々に増大した。
【００７１】
好ましい一実施形態によれば、組成物はさらに、停止試薬（すなわち、反応を停止するために添加される試薬、又は反応との干渉を抑えるために添加される試薬）を含む。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤は、Ｍｇ依存キナーゼアッセイにおける一般的な停止試薬である。ＥＤＴＡは、ＡＴＰを正常に活性化させるために必要なＭｇ２＋イオンに結合する。例えば、５ｍＭ  ＥＤＴＡをＧｌｙ−Ｇｌｙアッセイ緩衝剤に添加すると、残留チロシンキナーゼ酵素活性を停止させるのに役立つ。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＧｌｙ−Ｇｌｙ／ＴＰＡ緩衝剤におけるリンペプチド−抗リンペプチド複合体の解離は、非洗浄形式のアッセイにおいて１時間当たり１％を超えなかった。ＥＤＴＡは、１０ｍＭよりも高濃度では、ＥＣＬシグナルの絶対値に対して負の効果を及ぼし得るが、アッセイ緩衝剤中でのインキュベーションによってＥＣＬシグナルの安定性が損なわれることはない。９６ウェルプレートの所望の最終読み取り体積（ｆｉｎａｌ  ｒｅａｄ  ｖｏｌｕｍｅ）（１００μｌ又は２５０μｌ）及びアッセイのタイプ（洗浄又は非洗浄）に応じて、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ／ＴＰＡ溶液配合が異なり得る。
【００７２】
好ましくは、本組成物のｐＨは６〜９、より好ましくは７〜８、さらにより好ましくは７．５〜８、最も好ましくは約７．８である。好ましい一実施形態によれば、ｐＨは、酸又は塩基、好ましくはＫＯＨ、より好ましくは１０％ＫＯＨを添加して調節される。
【００７３】
本発明の一実施形態は、
（ａ）好ましくは０．１〜０．７Ｍ、より好ましくは０．３〜０．５Ｍ、最も好ましくは約０．２Ｍのグリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）と、
（ｂ）好ましくは０．０１Ｍ〜０．３Ｍ、より好ましくは０．０５〜０．２、最も好ましくは約０．１Ｍのトリプロピルアミン（ＴＰＡ）とを含むＥＣＬアッセイ緩衝剤に関する。
【００７４】
このアッセイ緩衝剤はさらに、ＥＤＴＡ（好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ）を含むことが好ましい。このアッセイ緩衝剤のｐＨは、好ましくは６〜９、より好ましくは７〜８、さらにより好ましくは７．５〜８、最も好ましくは約７．８である。好ましい一実施形態によれば、ｐＨは酸又は塩基、好ましくはＫＯＨ、より好ましくは１０％ＫＯＨを添加して調節される。
【００７５】
本発明の別の好ましい実施形態は、
（ａ）好ましくは０．１〜０．７Ｍ、より好ましくは０．３〜０．５Ｍ、最も好ましくは約０．２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）と、
（ｂ）好ましくは０．０１Ｍ〜０．３Ｍ、より好ましくは０．０５〜０．２Ｍ、最も好ましくは約０．１Ｍのトリプロピルアミン（ＴＰＡ）とを含むＥＣＬアッセイ緩衝剤に関する。
【００７６】
このアッセイ緩衝剤は、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をさらに含むことが好ましい。本組成物のｐＨは、好ましくは６〜９、より好ましくは７〜８、さらにより好ましくは７．５〜８、最も好ましくは約７．８である。好ましい一実施形態によれば、ｐＨは、酸又は塩基、好ましくはＫＯＨ、より好ましくは１０％ＫＯＨを添加して調節される。
【００７７】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＴＰＡ以外の共反応物、好ましくは（共反応物の項に記載したように）親水性官能基を有するトリアルキルアミンを含むＥＣＬアッセイ緩衝剤に関する。好ましくは、この共反応物はＰＰＡ又はＰＩＰＥＳであり、最も好ましくはＰＩＰＥＳである。この共反応物の濃度は、好ましくは１０〜８００ｍＭ、最も好ましくは１０〜２００ｍＭ、最も好ましくは２０〜５０ｍＭである。ＥＣＬアッセイ緩衝剤は、ｐＨ緩衝剤、好ましくは、リン酸塩、Ｔｒｉｓ又はＧｌｙ−Ｇｌｙも含むことが好ましい。ｐＨ緩衝剤の濃度は、好ましくは０〜８００ｍＭ、より好ましくは０〜４００ｍＭ、さらにより好ましくは２０〜２００ｍＭ、最も好ましくは７５〜１５０ｍＭである。本組成物のｐＨは、好ましくは６〜９、より好ましくは７〜８、さらにより好ましくは７．２〜７．８、最も好ましくは約７．５である。ＥＣＬアッセイ緩衝剤は、フェニルエーテル成分及び／又は洗浄剤、好ましくは非イオン洗浄剤、さらにより好ましくはフェニルエーテル含有洗浄剤、最も好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む物質も含むことが好ましい。洗浄剤濃度は、好ましくは０．０２％よりも高く、より好ましくは０．０５％よりも高く、最も好ましくは０．０５〜０．５％よりも高い。
【００７８】
好ましい一実施形態によれば、本発明の試薬又は組成物はさらに、１つ又は複数の洗浄剤及び／又は界面活性剤（例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ、Ｂｒｉｊ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｈｅｓｉｔ、Ｌｕｂｒｏｌ、Ｇｅｎａｐｏｌ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ、Ｆ１０８及びＳｐａｎの商品名で知られるクラスの非イオン洗浄剤／界面活性剤）を含む。特に好ましい洗浄剤としては、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０、Ｔｈｅｓｉｔなどがある。
【００７９】
本発明の別の好ましい実施形態は、上述のアッセイ緩衝剤を濃縮して含む試薬組成物に関する。この試薬組成物は、好ましくは水溶液で希釈して、アッセイ、好ましくはＥＣＬアッセイに使用するための最適成分濃度を有するアッセイ緩衝剤にできることが好ましい。
【００８０】
別の実施形態は、上述の乾燥されたアッセイ緩衝剤の１つを含む乾燥試薬前駆体に関する。この乾燥試薬前駆体は、溶液、好ましくは水溶液と混合して、アッセイ、好ましくはＥＣＬアッセイに使用するための最適成分濃度を有するアッセイ緩衝溶液にできることが好ましい。
【００８１】
本発明の別の態様は、アッセイ、好ましくは発光アッセイ、より好ましくは化学発光アッセイ、又は電極誘導発光アッセイ、最も好ましくは電気化学発光アッセイを実施するための組成物の準備に使用するのに適した、無機リン酸塩を実質的に含まない１つ又は複数のｐＨ緩衝剤を含有する試薬に関する。
【００８２】
本発明の別の態様は、アッセイ、好ましくは発光アッセイ、より好ましくは化学発光アッセイ又は電極誘導発光アッセイ、最も好ましくは電気化学発光アッセイを実施するための組成物の準備に使用するのに適した１つ又は複数のＥＣＬアッセイバックグラウンド低減剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含有する試薬に関する。好ましくは、この試薬は、１５ｍＭ未満の無機リン酸塩、より好ましくは５ｍＭ未満の無機リン酸塩、さらにより好ましくは１ｍＭ未満のリン酸塩を含み、さらにより好ましくは無機リン酸塩を実質的に含まず、最も好ましくは無機リン酸塩を含まない。
【００８３】
一実施形態によれば、この試薬は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤還元剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含み、かつ／又は無機リン酸塩を実質的に含まず、ＥＣＬアッセイを実施するための組成物の調製に使用するのに適している。ここで、電磁放射はアッセイ組成物から放出され、アッセイ組成物は、
（ｉ）電磁放射から励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物（好ましくはアミン又はアミン成分、最も好ましくは第三級アミン、最も好ましくはＴＰＡ）と、
（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記ＥＣＬ共反応物がその中で酸化され得る媒体として機能できる電解質と、
からなる群から選択される成分を含む。
【００８４】
前記試薬は、前記ｐＨ緩衝剤、前記ＥＣＬ共反応物、及び前記基（ｉ）〜（ｉｉｉ）の他の２つの成分の１つを含むことが好ましい。
【００８５】
本発明の別の態様は、１つ又は複数の結合試薬と、酵素及び／又は基質と、本発明のｐＨ緩衝剤とを含むアッセイ組成物に関する。
【００８６】
本発明の別の態様は、タンパク質キナーゼ及びホスホリラーゼアッセイを実施するための、かつ／又はリンペプチド、リンタンパク質及びホスホアミノ酸を測定するための組成物、試薬、キット及び方法に関する。本発明の一実施形態は、ｐＨ緩衝剤とリンペプチド特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物に関する。組成物は、無機リン酸塩を含まないことが好ましい。組成物は、リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチド、ホスホアミノ酸及び／又はホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｅｄ）タンパク質をさらに含むことが好ましい。
【００８７】
好ましくは、ｐＨ緩衝剤は、グリシルグリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される。
【００８８】
本組成物は、キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分をさらに含むことが好ましい。別の実施形態によれば、本組成物は、ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分を含む。
【００８９】
本組成物のｐＨは６〜９、好ましくは７〜８、より好ましくは７．５〜８、最も好ましくは約７．８であることが好ましい。
【００９０】
好ましい一実施形態によれば、組成物はさらに、１つ又は複数のＥＣＬ共反応物を含む。ＥＣＬ共反応物はアミン又はアミン成分を含むことが好ましい。より好ましくは、ＥＣＬ共反応物はトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含む。
【００９１】
別の好ましい実施形態によれば、組成物はさらに停止試薬を含む。停止試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことが好ましい。
【００９２】
別の好ましい実施形態によれば、組成物はさらに酸又は塩基、好ましくはＫＯＨを含む。
【００９３】
好ましい一実施形態によれば、本発明の試薬又は組成物はさらに、１つ又は複数の洗浄剤及び／又は界面活性剤（例えば、Ｂｒｉｊ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｈｅｓｉｔ、Ｌｕｂｒｏｌ、Ｇｅｎａｐｏｌ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ、Ｆ１０８及びＳｐａｎの商品名で知られるクラスの非イオン洗浄剤／界面活性剤）を含む。
【００９４】
本組成物は、阻害剤及び／又は酵素、より好ましくはリン酸化又は脱リン酸化反応の阻害剤及び／又は酵素を含むことが好ましい。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、ｐＨ緩衝剤及びＥＣＬ共反応物を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物に関する。組成物は、無機リン酸塩を含まないことが好ましい。
【００９６】
ｐＨ緩衝剤は、グリシルグリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択されることが好ましい。
【００９７】
本組成物は、キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分、あるいはホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される１つ又は複数の成分を含むことが好ましい。
【００９８】
本組成物のｐＨは６〜９、好ましくは７〜８、より好ましくは７．５〜８、最も好ましくは約７．８であることが好ましい。
【００９９】
ＥＣＬ共反応物は、アミン又はアミン成分を含むことが好ましい。より好ましくは、ＥＣＬ共反応物はトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を含む。
【０１００】
別の好ましい実施形態によれば、組成物はさらに停止試薬を含む。停止試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことが好ましい。
【０１０１】
別の好ましい実施形態によれば、組成物はさらに酸又は塩基、好ましくはＫＯＨを含む。
【０１０２】
本組成物は、阻害剤及び／又は酵素、より好ましくはリン酸化反応又は脱リン酸化反応の阻害剤及び／又は酵素を含むことが好ましい。
【０１０３】
好ましい一実施形態によれば、ｐＨ緩衝剤はグリシルグリシンであり、前記組成物はさらにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びＴＰＡを含む。組成物は、さらにＫＯＨ及び／又はＥＣＬ成分も含むことが好ましい。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、ｐＨ緩衝剤を含む試薬に関する。前記ｐＨ緩衝剤は、無機リン酸塩を実質的に含まず、前記試薬は、ＥＣＬアッセイを実施するための組成物の準備に使用するのに適している。ここで、電磁放射は、
（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物と、
（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質とからなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって放出される。
【０１０５】
試薬は、前記ｐＨ緩衝剤、ＥＣＬ共反応物（好ましくはアミン又はアミン成分）及び前記基（ｉ）〜（ｉｉｉ）の他の２つの成分の１つをさらに含むことが好ましい。
【０１０６】
本発明の別の実施形態は、ｐＨ緩衝剤を含む試薬に関する。前記ｐＨ緩衝剤は、無機リン酸塩を実質的に含まず、前記試薬はＥＣＬアッセイを実施するための組成物の準備に使用するのに適している。ここで、電磁放射は、
（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成する、アミン又はアミン成分（好ましくはＴＰＡ）であるＥＣＬ共反応物と、
（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質とからなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって放出される。
【０１０７】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）リン酸特異的抗体と、
（ｂ）リン酸化酵素、リン酸化酵素の基質又はそれらの組合せからなる群から選択される試薬と、
（ｂ）ｐＨ緩衝剤とを含み、無機リン酸塩を実質的に含まない、好ましくは含まない組成物に関する。組成物は、ＥＣＬ共反応物（例えば、ＴＰＡ）も含むことが好ましい。
【０１０８】
５．８  キット
本発明の一態様は、１つ又は複数の容器中に、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤の１つ又は複数の成分を含むキットに関する。それらの成分を、場合によっては、追加の試薬と組み合わせて、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤を形成させることができる。このキットには、ＥＣＬ標識、ＥＣＬ標識アッセイ試薬、酵素、結合試薬、電極、アッセイプレートなど追加のアッセイ関連成分も含めることができる。
【０１０９】
本発明の別の態様は、１つ又は複数の容器中に、ＴＰＡ以外の本発明のトリアルキルアミン共反応物を含む１つ又は複数のＥＣＬアッセイ緩衝剤を含むキットに関する。このキットは、緩衝剤内容、並びにアッセイにおける適切な保管及び使用についての指示に関する情報が適切にラベル表示された１つ又は複数のガラス又はプラスチック容器に入れられていることが好ましい。ＥＣＬアッセイ緩衝剤成分のいくつか又はすべては、乾燥状態で保存することができる。このキットには、酵素、結合試薬、電極、アッセイプレートなど他のアッセイ関連成分をさらに含めることができる。
【０１１０】
本発明の別の態様は、１つ又は複数の容器中に、無機リン酸塩を実質的に含まない、かつ／又はＥＣＬアッセイ緩衝剤還元剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含む１つ又は複数のＥＣＬアッセイ緩衝剤を含むキットに関する。このキットは、緩衝剤内容、並びにアッセイにおける適切な保管及び使用についての指示に関する情報が適切にラベル表示された１つ又は複数のガラス又はプラスチック容器に入れられていることが好ましい。ＥＣＬアッセイ緩衝剤成分のいくつか又はすべては、乾燥状態で保存することができる。このキットには、ＥＣＬ標識、ＥＣＬ標識アッセイ試薬、酵素、結合試薬、電極、アッセイプレートなど他のアッセイ関連成分をさらに含めることができる。
【０１１１】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ／ＴＰＡ緩衝剤の貯蔵安定性に関する正式な研究は実施されていない。しかし、３〜４ヶ月経過したアッセイ緩衝剤を使用しても、アッセイ性能に影響はなかった。出願人らは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ安定性に対しても、例えば、ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤と同じ注意を払うべきであると考える。溶液中の二価イオンの濃度は、μＭレベル以下に保たれることが好ましい。
【０１１２】
このキットは、組成物から放出される電磁放射を検出するＥＣＬアッセイを実施できるように構成されている又は実施するのに適していることが好ましい。このキットは、１つ又は複数の容器中にｐＨ緩衝剤を含み、好ましくは、無機リン酸塩を実質的に含まない、かつ／又はＥＣＬアッセイ緩衝剤還元剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含む。このキットには、（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物（好ましくはアミン又はアミン成分）と、（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記ＥＣＬ共反応物（例えば、アミン又はアミン成分）がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質とからなる群から選択される少なくとも１つの他の成分も含まれる。前記キットには、前記ＥＣＬ成分（ｉ）、ＥＣＬ共反応物（ｉｉ）、及び電解質（ｉｉｉ）からなる群の１つ又は複数の成分を含む少なくとも１つの単独成分が含まれる。
【０１１３】
本発明の別の態様は、アッセイ、好ましくは発光アッセイ、より好ましくは電極誘導発光アッセイ、最も好ましくは電気化学発光アッセイの実施に使用されるキットに関する。このキットは、１つ又は複数の容器中に、無機リン酸塩を実質的に含まない１つ又は複数のｐＨ緩衝剤と、（ａ）少なくとも１つの発光標識（好ましくは電気化学発光標識）、（ｂ）少なくとも１つのＥＣＬ共反応物、（ｃ）１つ又は複数のリン酸特異的結合試薬、（ｄ）１つ又は複数の電極及び／又は磁気ビーズ、（ｅ）１つ又は複数の遮断薬、（ｆ）保存剤、（ｇ）安定剤、（ｈ）酵素、（ｉ）洗浄剤、（ｊ）乾燥剤、及び／又は（ｋ）吸湿剤からなる群から選択される少なくとも１つのアッセイ成分とを含む。
【０１１４】
このキットには、それぞれ２００２年６月２８日に出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法（Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」と題する米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号による、１つ又は複数のアッセイ電極、好ましくはアッセイプレート、より好ましくはマルチウェルアッセイプレートと、１つ又は複数、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上の容器に入れられたアッセイ成分とを含むアッセイモジュールが含まれることが好ましい。
【０１１５】
一実施形態によれば、このキットでは、１つ又は複数のアッセイ成分が、１つ又は複数のマルチウェルプレートウェルに、好ましくは乾燥された形で含まれる。
【０１１６】
一実施形態によれば、各アッセイ成分は別々の容器に入れられている。別の実施形態によれば、このキットには、結合試薬及び安定剤を入れた容器が含まれる。別の実施形態によれば、ウェルの試薬（ｗｅｌｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）には、結合試薬、安定剤が含まれ得る。キットは、ウェル中に液体を含まないことが好ましい。
【０１１７】
好ましい一実施形態は、アッセイプレート、好ましくはマルチウェルアッセイプレートと、１つ又は複数のｐＨ緩衝剤と、少なくとも１つの発光標識（好ましくは、電気化学発光標識）及び少なくとも１つの電気化学発光共反応物からなる群から選択される少なくとも１つのアッセイ成分とを含む電極誘導発光アッセイ（好ましくは、電気化学発光アッセイ）の実施に使用されるキットに関する。前記ｐＨ緩衝剤は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含み、又は実質的にリン酸塩を含まず、かつ／又は前記ＥＣＬ共反応物がＴＰＡでない（好ましくは、官能性第三級アルキルアミン、最も好ましくはＰＩＰＥＳである）。
【０１１８】
別の実施形態は、マルチウェルプレートと、ｐＨ緩衝剤と、少なくとも１つの電極誘導発光標識（好ましくは、電気化学発光標識）、及び／又は少なくとも１つのバイオ試薬、及び／又は少なくとも１つの遮断薬（例えば、ＢＳＡ）とを含むキットに関する。このキットには、ＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤（好ましくは、非リン酸塩緩衝剤）が含まれ、無機リン酸塩が実質的に含まれず、かつ／又はＴＰＡ以外のＥＣＬ共反応物（好ましくは官能性第三級アルキルアミン、最も好ましくはＰＩＰＥＳ）が含まれる。
【０１１９】
好ましい一実施形態によれば、このキットには、完全な細胞、細胞溶解物、細胞断片、細胞膜、膜ゴースト、細胞小器官、細胞小器官断片、細胞小器官膜、ビリオン、ビリオン断片、ビリオン膜、リポソーム、洗浄剤可溶性タンパク質、洗浄剤可溶性脂質又はそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの材料が含まれる。
【０１２０】
別の実施形態によれば、このキットには、原形質膜断片、エンドソーム、クラスリン被覆小胞、エンドプラミック断片、シナプス小胞、ゴルジ断片、メンブレンサブドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｂｄｏｍａｉｎ）、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リソソーム、リポソーム、ウイルス粒子、細胞から分離されウイルスによって誘導される膜に包まれた粒子（ｖｉｒａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｎｃｌｏｓｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｓ）、及び完全な生物由来の脂質膜体（ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｄｉｅｓ）からなる群から選択される生体用材料が含まれる。
【０１２１】
好ましい一実施形態によれば、このキットには、抗体、抗体断片、タンパク質、酵素、酵素基質、阻害剤、補助因子、抗原、ハプテン、リポタンパク質、リポサッカライド、細胞、細胞下成分、細胞受容体、ウイルス、核酸、抗原、脂質、糖タンパク質、炭水化物、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、タンパク質結合リガンド、薬物、発光標識（好ましくは、ＥＣＬ標識）又はそれらの組合せから選択されるプレート表面に好ましくは固定された少なくとも１つのバイオ試薬が含まれる。少なくとも１つのバイオ試薬は、１つ又は複数の膜に結合するようになされ又は選択されて、そのような固定化膜を有する電極を生じることが好ましい。
【０１２２】
生体用材料は、チロシンキナーゼ固有活性を有する１回膜貫通受容体；非チロシンキナーゼ膜貫通受容体（例えば、トランスフェリン受容体）；Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）；ＧＰＣＲエフェクタータンパク質（例えば、アデニル酸シクラーゼ）；ホスホイノシチド（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５ビスリン酸塩（ＰＩＰ２））；リン脂質又はスフィンゴ脂質の組成物、同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又は機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（すなわち、アポトーシス中のホスフォチジルセリンの存在における変化）；細胞小器官に結合したＧＴＰ加水分解酵素／グアニンヌクレオチド交換因子（ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）（ＧＥＦ）／ＧＴＰ加水分解酵素活性化タンパク質（ＧＡＰ）；サイトカイン／ケモカイン受容体；細胞接着分子（例えば、ＶＣＡＭ、インテグリン）；細胞質外在性膜タンパク質キナーゼ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ）（例えば、ｓｒｃ）；細胞内タンパク質キナーゼアダプタ／ドッキングタンパク質（例えば、インシュリン受容体基質１、ＧＲＢ２）；イオンチャネル（例えば、ニコチンアセチルコリン受容体、ＣＦＴＲなど）；受動輸送体（例えば、グルコース）；能動（ＡＴＰ駆動）輸送体；イオン連結輸送体（ｉｏｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）（例えば、Ｎａ＋／グルコース）；グリコシルトランフェラーゼ／糖タンパク質修飾酵素；核膜断片；及び可溶性受容体からなる群から選択される少なくとも１つの活性タンパク質を含む脂質／タンパク質層を含むことが好ましい。
【０１２３】
このキットは、タンパク質、核酸又はそれらの組合せを含む固定化試薬を含むことが好ましい。
【０１２４】
好ましい一実施形態によれば、複数のウェルが少なくとも２つの異なるバイオ試薬を含む。例えば、１つのウェルが、異なるバイオ試薬を含む２つ以上のアッセイドメインを含むことができる。
【０１２５】
このキットは、少なくとも１つの電気化学発光共反応物及び／又は少なくとも１つの電極誘導発光標識（好ましくは電気化学発光標識）を含むことが好ましい。
【０１２６】
別の実施形態によれば、このキットは、複数のアッセイに適合する。このキットは、放射能アッセイ、酵素アッセイ、化学比色アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ及びそれらの組合せからなる群から選択される追加のアッセイに使用される追加のアッセイ試薬をさらに含むことが好ましい。
【０１２７】
別の実施形態によれば、このキットには、２つ以上、好ましくは４つ以上、より好ましくは８つ以上、より好ましくは１５個以上、最も好ましくは２５個以上のアッセイモジュール又はプレートが含まれる。好ましい一実施形態によれば、このキットは、何度でも封ができるバッグ又は容器（例えば、ジップロック式）に納められている。
【０１２８】
バッグ又は容器は、水を実質的に通さないことが好ましい。一実施形態によれば、バッグは金属箔、好ましくはアルミニウム処理箔であることが好ましい。
【０１２９】
パッケージングは、半透明、透明又は不透明とすることができる。プレートは、アルミニウムによって裏打ちされた乾燥又は不活性雰囲気を含むプラスチック容器又はバッグで包装されていることが好ましい（例えば、窒素又はアルゴン雰囲気下でバッグを密封することができ、又はバッグに乾燥剤を入れることができる）。別の実施形態によれば、容器は減圧密封されている。
【０１３０】
容器には１つのプレートが含まれることが好ましい。別の実施形態によれば、容器には１０個のプレートが含まれる。別の実施形態によれば、容器には１０〜１００個のプレートが含まれる。
【０１３１】
アッセイモジュール又はプレートは、無菌であり、かつ／又はダスト及び他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。
【０１３２】
アッセイモジュールも、実質的に無菌であることが好ましい。
【０１３３】
一実施形態によれば、このキットは、「クリーンルーム」環境において（少なくとも部分的に）製造及び／又は包装される。このキットは、＜１００，０００粒子（０．５ミクロン粒子カウント数によるクリーンルーム粒子カウント）／立方フィート（３５３万粒子／立方メートル）のクラス１００，０００クリーンルーム内で（少なくとも部分的に）製造及び／又は包装されることが好ましい。
【０１３４】
好ましくは、キットの汚染粒子カウント（０．５ミクロン未満の粒子）は、６０００万／立方メートル未満、より好ましくは３０００万／立方メートル、さらにより好ましくは２０００万未満、さらにより好ましくは１５００万未満、最も好ましくは１０００万未満である。
【０１３５】
好ましくは、脱イオン水中の不揮発性残渣は、０．５０ｇ／ｍ２未満、より好ましくは０．２５ｇ／ｍ２未満、さらにより好ましくは０．１５ｇ／ｍ２未満、最も好ましくは０．１０ｇ／ｍ２未満である。
【０１３６】
好ましくは、汚染イオン濃度は、５０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ未満、さらにより好ましくは１０ｐｐｍ未満、さらにより好ましくは５ｐｐｍ未満、最も好ましくは１ｐｐｍ未満である。
【０１３７】
５．９  方法
本発明の別の態様は、本発明の改良された緩衝剤、試薬及び／又は組成物を用いる方法に関する。
【０１３８】
本発明の一実施形態は、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤の存在下で電気化学発光が誘導される電気化学発光アッセイを実施する方法に関する。電気化学発光は、炭素ベースの電極を用いて誘導されることが好ましい。
【０１３９】
本発明の別の実施形態は、ＥＣＬ標識の量を測定する方法に関する。ＥＣＬ標識は、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤の存在下で誘導されて電気化学発光を放出し、その電気化学発光を測定することによってＥＣＬ標識量が測定される。電気化学発光は、炭素ベース電極を用いて誘導されることが好ましい。ＥＣＬ標識は電極近傍に結合し保持されることが最も好ましい。
【０１４０】
本発明の別の実施形態は、分析物の量又は活性を測定する方法に関する。分析物は、ＥＣＬ標識を含む標識物質と反応し、ＥＣＬ標識を含む標識物質と複合体を形成し、又はＥＣＬ標識を含む標識物質と特異的結合相互作用において競合する。ＥＣＬ標識は、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤の存在下で誘導されて電気化学発光を放出し、電気化学発光を測定して分析物の量又は活性を測定する。電気化学発光は、炭素ベース電極を用いて誘導されることが好ましい。分析物の存在又は活性によって、（例えば、特異的結合複合体の形成を介して、又は化学結合の切断又は形成を介して）標識が電極に結合し、又は電極から放出されることが最も好ましい。
【０１４１】
本発明の一実施形態は、電気化学発光アッセイを実施する方法に関する。電気化学発光は、ｐＨ緩衝剤とＥＣＬ共反応物を含む組成物の存在下で誘導され、前記組成物は無機リン酸塩を実質的に含まず、かつ／又はＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含む。
【０１４２】
本発明の別の実施形態は、電気化学発光アッセイを実施する方法に関する。電気化学発光は、ｐＨ緩衝剤とＥＣＬ共反応物を含む組成物の存在下で誘導される。ＥＣＬ共反応物は、官能性トリアルキルアミン、好ましくはＰＩＰＥＳである。
【０１４３】
本発明の別の実施形態は、電磁放射放出を起こす方法であって、
（ａ）（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物（好ましくはアミン又はアミン成分）と、
（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記ＥＣＬ共反応物（例えば、アミン又はアミン成分）がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質と、
（ｉｖ）ｐＨ緩衝剤とを含む組成物を形成するステップであって、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まず、ＥＣＬバックグラウンド低減剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含み、かつ／又は前記ＥＣＬ共反応物が官能性第三級アルキルアミンであるステップと、
（ｂ）組成物を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な量の電気化学エネルギーに適切な諸条件下で組成物を曝すステップと、
（ｃ）放出された電磁放射を検出するステップとを含む、電磁放射放出を起こす方法に関する
【０１４４】
本発明の別の実施形態は、無機リン酸塩及びリン酸特異的抗体を実質的に含まないｐＨ緩衝剤を含む試料又は組成物において、特異的結合アッセイを定性的又は定量的に実施する方法に関する。試料又は組成物はさらにＥＣＬ共反応物を含むことが好ましい。
【０１４５】
本発明の別の実施形態は、結合試薬がその上に固定された１つ又は複数のアッセイドメインを含むウェルにおいて、無機リン酸塩を実質的に含まないｐＨ緩衝剤を含む組成物を用いて、特異的結合アッセイを定性的又は定量的に実施する方法に関する。組成物はさらにリン酸特異的抗体を含むことが好ましい。
【０１４６】
本発明の別の実施形態は、結合試薬がその上に固定された１つ又は複数のアッセイドメインを含むウェルにおいて、無機リン酸塩を実質的に含まず、かつ／又は官能性トリアルキルアミンＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤を含む組成物を用いて、特異的結合非洗浄アッセイを定性的又は定量的に実施する方法に関する。
【０１４７】
本発明の別の実施形態は、キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成するステップを含むアッセイを実施する方法であって、前記複合体を無機リン酸塩に曝さない方法に関する。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成するステップであって、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップと、
（ｂ）金属含有ＥＣＬ成分を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｃ）放出された電磁放射を検出するステップとを含むアッセイを実施する方法に関する。
【０１４９】
複合体はさらに前記金属含有ＥＣＬ成分を含むことが好ましい。
【０１５０】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）ｐＨ緩衝剤を含み、無機リン酸塩を実質的に含まず、（ｉ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分、（ｉｉ）酸化されると強い還元剤を形成するアミン又はアミン成分、及び／又は（ｉｉｉ）前記ＥＣＬ成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質を含む組成物を形成するステップと、
（ｂ）適切な諸条件下で、組成物を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な量の電気化学エネルギーに組成物を曝すステップと、
（ｃ）放出された電磁放射を検出するステップとを含む電磁放射放出を起こす方法に関する。
【０１５１】
本発明の別の態様は、改良アッセイに関する。本発明は、例えば、１つ又は複数の目的分析物の検出及び／又は定量化を可能にするのに有用である。それらの反応には、例えば、抗原−抗体相互作用、リガンド−受容体相互作用、ＤＮＡとＲＮＡの相互作用、酵素反応、及び他の既知の反応がある。特定の実施形態において、本発明は、多成分試料又は多成分システム中の目的分析物の存在を定性的かつ定量的に検出する方法に関する。（本願と同日に出願され、参照により本明細書に援用するＧｌｅｚｅｒ他による米国特許出願第        号（発明の名称：「１つの試料について複数の測定を実施する方法及び装置（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ）」［代理人参照番号１００４０５−０６４１０］）も参照されたい。
【０１５２】
本発明の好ましい一態様には、（ａ）リン酸特異的抗体、（ｂ）電極を含む又は電極に隣接した固体表面に固定された捕獲試薬（ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）を含むアッセイ、及び／又は（ｃ）低検出レベルを含む（かつ／又は高いシグナル／バックグラウンド比を要する）アッセイのうち１つ又は複数を含む方法が含まれる。
【０１５３】
本発明の実施形態を用いて、目的分析物又は活性を含み得る様々な試料を試験することができる。このような試料は、固体、エマルジョン、懸濁液、液体又は気体の形とすることができる。これらは、例えば、（生又は死）細胞及び細胞から誘導される生成物、不死化細胞、細胞断片、細胞画分、細胞溶解物、細胞小器官、細胞膜、ハイブリドーマ、（ハイブリドーマなどの抗体産生生物からの上清を含めた）細胞培養上清、廃水又は飲料水、食品、飲料、薬学的組成物、血液、血清、血しょう、毛、汗、尿、糞便、組織、生検試料、流出液、分離及び／又は分画試料、分離及び／又は分画液体、器官、唾液、動物の一部、動物副産物、植物、植物の一部、植物副産物、土壌、鉱物、鉱床、水、上水道、水源、流体（気体及び液体）のろ過残渣、ビール（ｓｗｉｐｅｓ）、吸収剤材料、ゲル、細胞骨格、タンパク質複合体、未分画試料、未分画細胞溶解物、内分泌因子、パラクリン因子、オートクリン因子、サイトカイン、ホルモン、細胞情報伝達因子及び又は成分、セカンドメッセンジャー情報伝達因子及び／又は成分、細胞核、核画分、化学物質、化学溶液、構造生物学的成分、骨格（靭帯、腱）成分、分離及び／又は分画骨格成分、毛、毛皮、羽毛、毛画分及び／又は分離物、皮膚、皮膚試料、皮膚画分、真皮、内皮、真核細胞、原核細胞、菌、酵母、抗体、抗体断片、免疫因子、免疫細胞、薬物、治療薬物、オイル、抽出物、粘液、毛皮、オイル、下水、環境試料、有機溶媒又は空気を含む試料、あるいはこれらから誘導される試料とすることができるが、これらだけに限定されない。試料は、さらに、例えば、水、有機溶媒（例えば、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチルピロリドン又はアルコール）又はそれらの混合物を含むことができる。
【０１５４】
測定することができる分析物としては、試料中に存在する細胞全体、細胞表面抗原、細胞下粒子（例えば、細胞小器官又は膜断片）、ウイルス、プリオン、チリダニ又はその断片、ウイロイド、抗体、抗原、ハプテン、脂肪酸、核酸（及び合成アナログ）、タンパク質（及び合成アナログ）、リポタンパク質、多糖、阻害剤、補助因子、ハプテン、細胞受容体、受容体リガンド、リポ多糖、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、酵素基質、酵素生成物、セカンドメッセンジャー、細胞代謝産物、ホルモン、薬物、合成有機分子、有機金属分子、トランキライザー、バルビツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、レクチン、組換え又は誘導タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、無機分子などがあるが、これらだけに限定されない。測定することができる活性としては、ホスホリラーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、トランスグルタミナーゼ、核酸損傷活性（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）、トランスフェラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、グリコシダーゼ、リボソーム、タンパク質プロセシング酵素（例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、タンパク質ホファターゼ、ユビキチン−タンパク質リガーゼなど）、核酸プロセシング酵素（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、テロメラーゼなど）、細胞受容体活性化、セカンドメッセンジャーシステム活性化などの活性があるが、これらだけに限定されない。
【０１５５】
細胞全体（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）は、動物、植物又は細菌であってもよく、生きていても死んでいてもよい。例としては、菌類、線虫などの植物病原体がある。「細胞下粒子」という用語は、例えば、細胞下細胞小器官、分裂した細胞の膜粒子、細胞壁断片、リボソーム、複数の酵素の複合体、及び生きている生物から誘導することができる他の粒子を包含するものである。核酸としては、例えば、染色体ＤＮＡ、プラスミドＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及び複数の源から誘導される組換えＤＮＡがある。核酸には、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ及び転移ＲＮＡも含まれる。ポリペプチドとしては、例えば、酵素、輸送タンパク質、受容体タンパク質、及びウイルスのコートタンパク質などの構造タンパク質がある。好ましいポリペプチドは酵素及び抗体である。特に好ましいポリペプチドは、モノクローナル抗体である。ホルモンとしては、例えば、インシュリン及びＴ４甲状腺ホルモンがある。薬物としては、例えば、強心配糖体がある。合成ポリペプチド、合成核酸、及び合成メンブレン、小胞及びリポソームなどの生物学的材料に化学的に類似した合成物質を含むことも当然本発明の範囲内にある。上記は、本発明における使用に適した生物学的物質の包括的リストではなく、広範な本発明の範囲を説明するためのものに過ぎない。
【０１５６】
本発明の組成物又は試薬は好ましくは水性である。この組成物又は試薬は、非水性とすることもできる。適切な有機液体の例は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、エタノール、及び上記の２つ以上の混合物である。例を挙げると、テトラブチルアンモニウムテトラフルオロホウ酸塩などのテトラアルキルアンモニウム塩は、有機液体に可溶であり、有機液体と共に用いて非水性電解質を形成することができる。
【０１５７】
また、一般に、目的分析物は、１０−３モル以下、例えば、少なくとも１０−１８モルの濃度で存在する。目的分析物を含有し得る試料は、固体、エマルジョン、懸濁液、液体又はガスの形とすることができ、例えば、細胞及び細胞によって誘導される生成物、水、食品、血液、血清、毛、汗、尿、糞便、組織、唾液、オイル、有機溶媒又は空気から誘導することができる。試料は、さらに、例えば、水、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチル−ピロリドン又はアルコールを含むことができる。
【０１５８】
一実施形態において、試薬は、抗体、抗原、核酸、ハプテン、小さなヌクレオチド配列、オリゴマー、リガンド、酵素、又は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、若しくは、それらの複合体、又は、タンパク質相互作用によって第１の結合相手に結合可能である他の第２の結合相手、に複合されたＥＣＬ成分などである。
【０１５９】
本発明の一実施形態は、ＥＣＬアッセイによって目的分析物を検出又は定量する方法に関する。この方法は、
（１）（ａ）目的分析物について試験される試料と、
（ｂ）（ｉ）追加の目的分析物又は目的分析物のアナログと、
（ｉｉ）目的分析物又はその前記アナログの結合相手と、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合可能である反応成分とからなる群から選択される少なくとも１つの物質と、
（ｃ）電磁放射が放出される励起状態に転化可能であり、（ｂ）目的分析物又は（ｂ）（ｉ）、（ｂ）（ｉｉ）又は（ｂ）（ｉｉｉ）に定義した物質と結合相互作用可能である金属含有ＥＣＬ成分と、
（ｄ）酸化されると強い還元剤を形成するＥＣＬ共反応物（好ましくは、アミン又はアミン成分）と、
（ｅ）前記ＥＣＬ成分及び前記種をその中で酸化することができる媒体として機能することができる電解質とを含む組成物を形成するステップと、
（２）組成物を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な量の電気化学エネルギーに前記組成物を曝すステップと、
（３）放出された電磁放射を検出するステップとを含み、試料はアッセイ性能に有害な無機リン酸塩に曝されず、前記組成物はさらにＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤（好ましくは、非リン酸塩ｐＨ緩衝剤）を含む。好ましくは、組成物は、１５ｍＭ未満の無機リン酸塩、より好ましくは５ｍＭ未満の無機リン酸塩、さらにより好ましくは１ｍＭ未満のリン酸塩を含み、さらにより好ましくは無機リン酸塩を実質的に含まず、最も好ましくは無機リン酸塩を含まない。
【０１６０】
固相アッセイ形式（例えば、固相結合アッセイ）では、生物活性又は結合反応が、表面への標識の付着又は表面からの標識の解離と組み合わされることが多い。例えば、付着している結合試薬と標識分析物の結合相互作用によって、固定化結合試薬を支持している固相上に標識が局在化することになる。測定すべき生物活性又は結合反応を、固相上の標識を測定することによって定量することができる。多くの固相アッセイ形式には、固相上の標識を検出する前に非結合標識を除去する洗浄ステップが含まれる（洗浄アッセイ）。この洗浄ステップを含まないアッセイは、検出方法が遊離標識と結合標識を識別することができるときに実施することができる。洗浄ステップは多数の用途において実施が困難又は手間がかかり得るので、非洗浄アッセイ形式が望ましい。しかし、多くの場合、非洗浄アッセイ性能は、遊離標識と結合標識の識別が不完全なためにバックグラウンドシグナルが高く、限定されている。
【０１６１】
出願人らは、驚くべきことに、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤では、ＥＣＬアッセイにおいて、ＥＣＬを誘導するために使用される作用電極に（例えば、共有相互作用、特異的結合相互作用、非特異的吸着などによって）付着したアッセイ試薬を用いて、遊離標識と結合標識の識別（すなわち、電極に結合された標識を選択的に検出する能力）が向上することを見出した。より具体的には、本発明の組成物及び試薬によって、結合標識からのＥＣＬシグナルと遊離標識からのＥＣＬシグナルの比が向上する。本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤によって、ＥＣＬ標識が誘導されて発光を起こす固体電極表面からの距離が減少すると考えられる。これによって、（電極に結合していない）遊離標識に対する（電極表面に結合している）結合標識のシグナルが増加する。これを特徴付ける別の方法は、「有効励起長（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）」（遊離ＥＣＬ標識が励起され得る最大距離）によるものである。「有効励起長」は、ｉ）ＥＣＬの生成に関与する短寿命中間体（例えば、ＴＰＡの酸化生成物）が破壊的な副反応で破壊されるまでに電極から拡散することができる距離（これらの中間体の寿命及び拡散定数の関数）、及びｉｉ）遊離標識又は標識試薬が、これらの反応性中間体との反応に関与するために電極に十分近い領域まで拡散する速度（非結合ＥＣＬ標識又は標識試薬の拡散定数の関数）の影響を受ける。
【０１６２】
本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤を用いると、有効励起長は、＞５０％、好ましくは＞７５％、さらにより好ましくは＞９０％短縮される。したがって、本発明のＥＣＬアッセイ緩衝剤は、アッセイ性能を向上させる結合／遊離ＥＣＬシグナル比を最大にするので望ましい。これらの考察は、溶液中に高濃度の標識種が存在することが必要であるが、洗浄ステップ中に結合複合体が解離するためにかなりのシグナル損失も予想される低親和性相互作用を測定する場合に特に重要である。
【０１６３】
したがって、本発明の別の態様は、ｐＨ緩衝剤無機リン酸塩を実質的に含まず、結合／遊離ＥＣＬシグナル比を最大にする非洗浄形式アッセイに関する。このアッセイは、電極表面を含む表面又はそれに隣接する表面においてＥＣＬ標識を捕獲するものであることが好ましい。例えば、米国特許第６，０６６，４４８号、同第６，０９０，５４５号、同第６，１４０，０４５号、同第６，２０７，３６９号、同第６，２１４，３６９号、及びそれぞれ２００２年６月２８日に出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法（Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」と題する米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号を参照されたい。
【０１６４】
したがって、本発明の別の実施形態は、一般に、表面（好ましくは、電極表面）に固定された試薬を使用し、有利な有効励起長を有する電気化学発光アッセイに関する。好ましくは、このアッセイでは、有効励起長が１００ミクロン未満、より好ましくは７５ミクロン未満、さらにより好ましくは５０ミクロン未満、さらにより好ましくは２５ミクロン未満、さらにより好ましくは１０ミクロン未満、さらにより好ましくは５ミクロン未満、最も好ましくは１ミクロン未満となる。特に好ましい実施形態によれば、有効励起長は０．５ミクロン未満、好ましくは０．２ミクロン未満、さらにより好ましくは０．１ミクロン未満である。
【０１６５】
５．１０  システム
本発明のさらに別の態様は、アッセイを実施するための、本発明の試薬及び／又は組成物を含む又は使用するシステムに関する。
【０１６６】
本発明の一実施形態は、試料中の目的分析物のＥＣＬ検出又は定量のためのシステムに関する。前記システムは、
（ａ）ｐＨ緩衝剤と
（ｂ）試料と、
（ｃ）（ｉ）添加された目的分析物又は目的分析物のアナログと、
（ｉｉ）目的分析物又はその前記アナログの結合相手と、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合可能である反応成分とからなる群から選択される少なくとも１つの物質であって、前記物質の１つが、電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分に、直接又は１つ若しくは複数の他の分子を介して連結されている物質と、
（ｄ）強い還元剤及び電解質に転化可能であるＥＣＬ共反応物、好ましくはアミン又はアミン成分と、
（ｄ）ＥＣＬ成分を誘導して電磁放射を放出させる１つ又は複数の電極と、
（ｅ）放出された放射エネルギーを測定して試料中の目的分析物の有無又は量を決定するための１つ又は複数の検出器とを含み、
前記ｐＨ緩衝剤は、実質的にリン酸塩を含まないＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤であり、かつ／又は前記ＥＣＬ共反応物は官能性第三級アミンである。
【０１６７】
本発明の別の実施形態は、試料中の目的分析物のＥＣＬ検出又は定量のためのシステムに関する。前記システムは、
（ａ）ｐＨ緩衝剤と
（ｂ）試料と、
（ｃ）（ｉ）添加された目的分析物又は目的分析物のアナログと、
（ｉｉ）目的分析物又はその前記アナログの結合相手と、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と結合可能である反応成分とからなる群から選択される少なくとも１つの物質であって、前記物質の１つが、電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ＥＣＬ成分に、直接又は１つ若しくは複数の他の分子を介して連結されている物質と、
（ｄ）強い還元剤及び電解質に転化可能であるＥＣＬ共反応物、好ましくは官能性第三級アミンと、
（ｄ）ＥＣＬ成分を誘導して電磁放射を放出させる１つ又は複数の電極と、
（ｅ）放出された放射エネルギーを測定して試料中の目的分析物の有無又は量を決定するための１つ又は複数の検出器とを含む。
【０１６８】
１１  生物活性化合物を選択し新規な薬物を製造する方法
本発明の別の態様は、２００２年６月２８日にそれぞれ出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法（Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」と題する米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号のパラグラフ６．１１に記載されたように、生物活性化合物を選択し又は同定し、場合によっては、このような生物活性化合物を適切な担体組成物に適切な用量で組み込むための改良された方法及びシステムに関する。
【０１６９】
一実施形態は、新しい薬物を、好ましくは５０を超える、より好ましくは１００、より好ましくは５００、さらにより好ましくは１，０００、最も好ましくは５，０００のスクリーニングを含む、好ましくはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）によって、スクリーニングするための本発明の使用に関する。特に好ましい実施形態によれば、スクリーニングは、１０，０００を超える、５０，０００を超える、１００，００を超える、５００，０００を超える、及び／又は１，０００，０００を超える化合物を含む。
【０１７０】
本発明の試薬、組成物、方法、装置及び／又はアッセイプレート若しくはモジュールは、様々なスクリーニング及び／又は創薬方法に、組み込まれかつ／又はその中で使用されることが有利である。このようなスクリーニング及び／又は創薬方法としては、Ｂｌａｋｅの米国特許第５，５６５，３２５号、Ｃｈｅｎ他の米国特許第５，５９３，１３５号、Ｔｈａｓｔｒｕｐ他の米国特許第５，５２１，１３５号、Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓ他の米国特許第５，６８４，７１１号、Ｄｏｗｅｒ他の米国特許第５，６３９，６０３号、Ａｓｈｂｙ他の米国特許第５，５６９，５８８号、米国特許第５，５４１，０６１号、米国特許第５，５７４，６５６号、及びＰｅｔｅｒｓｏｎ他の米国特許第５，７８３，４３１号に示された方法などがある。
【０１７１】
別の実施形態によれば、本発明はさらに、薬物に付随する副作用を同定するステップと、その副作用に関する情報をデータベースに保存するステップとを含む。Ｃｌａｓｓｅｎの米国特許第６，２１９，６７４号を参照されたい。
【０１７２】
本発明の別の態様は、本発明の方法を用いて調製される改良された生物活性化合物及び／又は薬物に関する。
【実施例】
【０１７３】
以下の実施例は、本発明の範囲内にある電極、プレート、キット及び方法のいくつかを説明するものである。これらの実施例が、決して本発明を限定するものと考えるべきでないことは言うまでもない。本発明に関する多数の変更形態及び改変形態が、当業者によって不必要な実験をすることなくなされ得る。
【０１７４】
（実施例１）
ＥＣＬ測定
別段に示さない限り、一体型カーボンインク電極を有するマルチウェルプレートを用いてＥＣＬ測定を実施した（２００２年６月２８日にそれぞれ出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法（Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」と題する同時係属中の米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号の実施例６．１及び、特に、プレートタイプＡ及びＢを参照されたい）。電極を、場合によっては、結合試薬で被覆する前に酸素プラズマで処理した（以後、プラズマ処理及び非プラズマ処理プレートを、それぞれＰＴ又はＮＰＴプレートと表す）。米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号に記載された方法又はその改造方法を用いて、結合試薬をプレートの作用電極に固定した。別段に示さない限り、これらのマルチウェルプレートを使用するように構成されたマルチウェルプレートリーダーを用いてＥＣＬ測定を実施した。リーダー及びそれらの使用は、米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号の実施例６．３に記載されている。米国特許出願第１０／１８５，２７４号及び同第１０／１８５，３６３号及び、特に、プレートタイプ、固定化方法、プレートリーダー及びＥＣＬ測定方法の記述を、参照により本明細書に援用する。報告するＥＣＬ強度は相対値であり、個々の実験で使用する機器、ゲイン設定及びプレートによって左右され得る。このため、異なる実験において報告された絶対値を直接比較することはできない。
【０１７５】
（実施例２）
チロシンキナーゼアッセイ
構成には、ＥＣＬ測定（実施例Ｉ参照）用に構成されたマルチウェルプレート中の電極に固定されたキナーゼ基質のリン酸化、標識抗ホスホチロシン抗体への生成物の複合体形成、及びＥＣＬ共反応物を含むＥＣＬアッセイ緩衝剤の存在下におけるＥＣＬ測定による表面結合標識の検出が含まれる。電極を酸素プラズマでエッチング前処理して露出炭素量を増加させた。ＧｌｕとＴｙｒの比が４：１であり、分子量が２０，０００〜５０，０００ダルトンであるポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）（ＰＧＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）のキナーゼ基質を、プレートのウェル中の作用電極表面に非特異的に吸着させて固定した。各ウェル中の作用電極を、ＰＢＳ緩衝剤で希釈した１ｍｇ／ｍｌ  ＰＧＴを含有する溶液１５００ｎＬで処理した。次いで、プレートを終夜乾燥し、ウシ血清アルブミンの５％溶液中４℃でブロックした。プレートを洗浄して、使用前に遮断剤を除去した。
【０１７６】
可溶性チロシンキナーゼ（ｃ−ｓｒｃ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ルテニウム−トリス−ビピリジンのスルホン化誘導体（Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ（商標）標識、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で標識された抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（Ａｂｚｙｍｅ、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＡＴＰ及びＭｇ＋２を含有する緩衝溶液５０μＬを各ウェルに添加することによってアッセイを実施した。反応を１時間進行させた。プレートを洗浄し、トリプロピルアミンを含有するＥＣＬアッセイ緩衝剤１００μＬを添加した。実施例１に記載したように電気化学発光検出によってプレートを分析した。
【０１７７】
リン酸塩緩衝剤で希釈したＴＰＡを含有する従来のＥＣＬアッセイ緩衝剤（ＯＲＩＧＥＮ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をこの手順に使用すると、標識抗体とリン酸化基質で形成された複合体は、リン酸塩イオンと標識抗体との競合的な結合のために、３０分から１時間で解離した（解離の大部分は最初の数分で起きた）。この問題を回避する一手法は、形成された複合体を無機リン酸塩含有溶液に暴露する時間を制御することである。しかし、この手法は、多数のプレートを含むハイスループットアッセイなどのいくつかのアッセイでは、実行不可能な場合がある。
【０１７８】
出願人らは、この問題を克服する他の解決法がリン酸塩を含まない緩衝剤を使用することであることを発見した。驚くべきことに、ＥＣＬの発生を助けるＥＣＬアッセイ緩衝剤の能力を損なうことなく、リン酸塩を他の緩衝剤で置換できることを発見した。
【０１７９】
以下の２つのＥＣＬアッセイ緩衝剤組成物を用いてアッセイを実施した。
Ｇｌｙ−Ｇｌｙアッセイ緩衝剤：
０．４Ｍグリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）
０．１Ｍトリプロピルアミン（ＴＰＡ）
１２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
ｐＨ＝７．８（１０％ＫＯＨを添加して調整）
Ｔｒｉｓアッセイ緩衝剤：
０．４Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
０．１５Ｍトリプロピルアミン（ＴＰＡ）
１２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
ｐＨ＝７．８（１０％ＫＯＨを添加して調整）
【０１８０】
新しいＥＣＬアッセイ緩衝剤にＥＤＴＡを添加して、キナーゼ活性に必要なイオンであるＭｇ＋２を封鎖することによって、リン酸化反応を停止させた（マグネシウムイオンに対するリン酸塩の親和性が高いので、リン酸塩ベースのＥＣＬアッセイ緩衝剤ではＥＤＴＡは不要であった）。この組成物によって、２つのステップ（停止溶液及び実際のアッセイ緩衝剤の添加）をまとめて１ステップにすることができた。ＥＤＴＡは１０ｍＭよりも高い濃度でＥＣＬ発生と干渉するが、ＥＣＬシグナルの減少をほんの僅かに抑えながら反応を停止させるには５〜１２ｍＭのＥＤＴＡで十分であることを出願人らは見出した。
【０１８１】
図１に、リンペプチド−抗体複合体由来のＥＣＬの減少を、アッセイ緩衝剤の添加からＥＣＬ測定までの時間の関数として示す。驚くべきことに、複合体は、リン酸塩含有ＯＲＩＧＥＮアッセイ緩衝剤に曝されると（プレートをＥＣＬリーダーに置くのに要した０分の時間内に）ほぼ完全に解離したが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（４０分で＜８０％解離）及びＴｒｉｓ（４０分で＜５５％解離）アッセイ緩衝剤中では優れた安定性を示した。
【０１８２】
複合体の安定性は、アッセイ緩衝剤を添加する前の洗浄ステップを省略することによってさらに改良された。図２に、洗浄ステップを介在させずに（ＥＤＴＡ濃度が５ｍＭであり、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が添加された以外は上述した）Ｇｌｙ−Ｇｌｙアッセイ緩衝剤２００μＬを反応混合物に直接添加した実験の結果を示す。ＥＣＬを測定する前に２０時間プレートを保存しても、シグナルはわずか１５％減少しただけであった。
【０１８３】
この手順のさらに驚くべき利点の１つは、その堅牢性であった。驚くべきことに、リン酸化ステップの時間が、再現性のある結果を得るために厳格に制御する必要がある唯一の時間であった。アッセイ結果は、他の全ステップ間の時間に左右されなかった。
【０１８４】
（実施例３）
リン酸化ＥＧＦ受容体の検出
サンドイッチ免疫測定法を用いて、ＥＧＦ活性化Ａ−４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から調製された細胞溶解物中の自己リン酸化α−表皮成長因子受容体（α−ＥＧＦＲ）を検出した。このアッセイには、α−ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対するビオチン標識捕獲抗体、及びホスホチロシンに特異的なＳｕｌｆｏ−ＴＡＧ標識検出抗体（実施例２参照）を使用した。ビオチン標識と電極表面に受動的に吸着されたアビジンとの相互作用によって、ＥＣＬアッセイ（実施例１参照）に使用するように構成されたマルチウェルプレートの作用電極上にビオチン標識抗体を固定した。次いで、（ＲＩＰＡ、デオキシコレート含有緩衝剤中の）可溶化ＥＧＦＲを添加し、抗ＥＧＦＲ抗体に結合させた。次いで、Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ標識α−ホスホチロシン抗体を添加して自己リン酸化ＥＧＦＲを検出した。
【０１８５】
最終生成物の安定性実験において、上述したようにアッセイを実施し、ＥＣＬを誘導し測定する前に、得られたサンドイッチ複合体を、２つの異なるＥＣＬアッセイ緩衝剤、すなわち、１５０ｍＭ  ＴＰＡ／１５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４８及び１００ｍＭ  ＴＰＡ／４００ｍＭグリシン−グリシン、ｐＨ７．８中で時間を変えてインキュベートした。図３は、リン酸塩含有緩衝剤の存在下で時間に依存してシグナルがかなり減衰することを示している。すなわち、シグナルは、１時間後およそ８０％減少した。グリシン−グリシン緩衝剤では、この減少がおよそ２０％に抑えられた。シグナルがリン酸塩緩衝剤で大きく減少するのは、抗ホスホチロシン抗体に対してリン酸塩イオンがリン酸化タンパク質と競合するためと考えられる。また、シグナル／バックグラウンド比は、グリシル−グリシンアッセイ緩衝剤によって２．５倍に増加した。
【０１８６】
（実施例４）
特異的シグナルとアッセイ緩衝剤バックグラウンドの識別能力に対するＥＣＬアッセイ緩衝剤組成物の効果
多数のＥＣＬアッセイ形式において、ＥＣＬ標識の測定感度は、ＥＣＬ標識の非存在下におけるＥＣＬアッセイ緩衝剤によって生成される光シグナル（及び光シグナル中のノイズ）（ＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンド）の制限を受ける。この制限は、非特異的結合レベルが低くかつ／又は高感度低ノイズ光検出器を有するＥＣＬリーダーを使用する洗浄アッセイにおいて特に明白である。出願人らは、ＥＣＬアッセイ緩衝剤組成物と、ＥＣＬ標識によるシグナルとＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンドとの識別能力との関係を調べた。特に、出願人らは、ＥＣＬ共反応物の種類及び／又はｐＨ緩衝剤の種類を変えた４つのＥＣＬアッセイ緩衝剤配合、すなわち、ＴＰＡ／リン酸塩、ＴＰＡ／Ｔｒｉｓ、ＴＰＡ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ及びＰＩＰＥＳ／リン酸塩（ここで、ＰＩＰＥＳは１，４−ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸を表す）を試験した。
【０１８７】
作用電極上に固定されたアビジンを含む（実施例１に記載した）マルチウェルプレート上で実験を実施した。酸素プラズマで処理したプレート（ＰＴプレート）及び未処理プレート（ＮＰＴプレート）上で実験を実施した。０．５ｍｇ／ｍＬアビジン及び０．００３５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶液２．５ｕＬを各ウェルの作用電極に施し、溶液を蒸発させて１時間以上乾燥させ、ウェルの残りの表面を４℃で終夜５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液でブロッキングすることによって、アビジンをＰＴプレート上に固定した。０．５ｍｇ／ｍＬアビジン及び０．００７５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する溶液２．５ｕＬを各ウェルの作用電極に施し、溶液を蒸発させて終夜乾燥させ、ウェルの残りの表面を５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液で２時間ブロッキングすることによって、アビジンをＮＰＴプレート上に固定した。ビオチンで標識されたウシＩｇＧとタンパク質（ＢＴ−ＩｇＧ＊）１つにつき約１．９個のＳｕｌｆｏ−ＴＡＧ標識とを含有する溶液でウェルを処理することによって、電極表面近傍に様々な量のＥＣＬ標識を組み込んだ。１ｎＭ  ＢＴ−ＩｇＧ＊を含有するＰＢＳ溶液５０ｕＬをウェルに添加し、６０分間振とうさせながらインキュベートすることによって、ＢＴ−ＩｇＧ＊を結合させた。ウェルを水で洗浄し、ＥＣＬアッセイ緩衝剤１００ｕＬを添加し、ＥＣＬを測定した。ＢＴ−ＩｇＧ＊を省略した以外は上述した実験を繰り返して、ＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンドによるシグナルを測定した。
【０１８８】
試験する共反応物とｐＨ緩衝剤の４つの組合せを最適化して、ＢＴ−ＩｇＧ＊からのシグナルとＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンドの最良の比（Ｓ／Ｂ比）を与える共反応物濃度、ｐＨ緩衝剤濃度、及びｐＨを特定した。共反応物の濃度をＴＰＡでは２５〜２００ｍＭ、ＰＩＰＥＳでは１３〜２００ｍＭで変化させた。ｐＨ緩衝剤の濃度を、リン酸塩では５０〜３００ｍＭ、Ｔｒｉｓでは１００〜６００ｍＭ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙでは５０〜８００ｍＭで変化させた。ｐＨを７〜８で変化させた。すべてのケースにおいて、ＥＣＬアッセイ緩衝剤には、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００も入れた。所望のｐＨにするために、ＫＯＨ又はＨＣｌを必要に応じて添加した。試験範囲内で、すべての配合が、ＥＣＬアッセイに使用するのに十分な性能を示したが、以下の最適配合、すなわち、ＴＰＡ／リン酸塩（１２５ｍＭ  ＴＰＡ、２００ｍＭリン酸塩、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５）、ＴＰＡ／Ｔｒｉｓ（１２５ｍＭ  ＴＰＡ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．８）、ＴＰＡ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（１００ｍＭ  ＴＰＡ、２００ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．８）、及びＰＩＰＥＳ／Ｐｈｏｓ（２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭリン酸塩、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５）をそれらのＳ／Ｂ比に基づいて特定した。
【０１８９】
図４Ａ及び４Ｂに、それぞれＮＰＴプレート及びＰＴプレート上で実施したアッセイに対する４つの最適配合の性能を比較した。本発明者らは、ＴＰＡ／リン酸塩とＴＰＡ／Ｔｒｉｓ緩衝剤がＢＴ−ＩｇＧ＊に対してほぼ同等のシグナルを与えるが、ＴＰＡ／ＴｒｉｓシステムのＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンドが低いので、ＴＰＡ／リン酸塩緩衝剤よりもＳ／Ｂ比がかなり改善されることを見出した。バックグラウンドのノイズがバックグラウンドシグナルにほぼ比例すると仮定すると、Ｓ／Ｂ比の４〜６倍の向上は、検出限界の４〜６倍の向上に直接反映される。特異的シグナルが低いにもかかわらず、ＴＰＡ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ緩衝剤は、ＴＰＡ／Ｔｒｉｓ緩衝剤のＳ／Ｂ比とほぼ同じＳ／Ｂ比を有し、したがって、検出限界もほぼ同じであると予想される。ＰＩＰＥＳ／リン酸塩緩衝剤は、（Ｓ／Ｂ比に関して）ＴＰＡ／リン酸塩緩衝剤よりも、エッチングされていないプレート上ではわずかに良好であり、エッチングされたプレートではわずかに劣った。
【０１９０】
（実施例５）
電極表面に結合しているＥＣＬ標識と溶液中に遊離しているＥＣＬ標識との識別能力に対するＥＣＬアッセイ緩衝剤組成物の効果
いくつかのＥＣＬアッセイ形式において、電極近傍に保持されたＥＣＬ標識の測定感度は、溶液中のＥＣＬ標識によって生成される光シグナル（及び光シグナルのノイズ）の制限を受ける。この制限は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤の添加及びＥＣＬ測定の前の洗浄によって溶液中の標識が除去されないアッセイ（非洗浄アッセイ）において特に明白である。出願人らは、ＥＣＬアッセイ緩衝剤組成物と、電極に結合している（又は近傍に保持されている）ＥＣＬ標識と溶液中に遊離しているＥＣＬ標識によるシグナル間の識別能力との関係を調べた。
【０１９１】
これらの実験において、結合ＥＣＬ標識からの特異的シグナルを、実施例４に記載したように、アビジン被覆電極に結合したＢＴ−ＩｇＧ＊を用いて測定した。ＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンドを、やはり実施例４に記載したようにＢＴ−ＩｇＧ＊を用いないで測定した。ウェルに添加したＥＣＬアッセイ緩衝剤がタンパク質（ＩｇＧ＊）１つにつき３．９個の標識を含む１０ｎＭウシＩｇＧを含む以外は、ＥＣＬアッセイ緩衝剤バックグラウンドと同様に、溶液中の遊離ＥＣＬ標識からのＥＣＬシグナルを測定した。結合ＢＴ−ＩｇＧ＊からのＥＣＬシグナルと遊離ＩｇＧ＊からのＥＣＬシグナルとの比（Ｂ／Ｆ比）によって、溶液中の遊離ＥＣＬ標識の存在下で結合ＥＣＬ標識を検出することができる感度が示される。
【０１９２】
実施例４で最適化された４つのＥＣＬアッセイ緩衝剤を、表面結合ＥＣＬ標識間の識別能力について試験した。結果を表ＩＡ及びＩＢに示す。リン酸塩をＴｒｉｓで置換すると、ＴＰＡ含有緩衝剤の場合、Ｂ／Ｆ比が向上した。しかし、最も極端な向上は、共反応物成分を置換することによって、すなわち、ＴＰＡをＰＩＰＥＳに置換することによって得られた。ＴＰＡ／ＰｈｏｓをＰＩＰＥＳ／Ｐｈｏｓで置換することによってＢ／Ｆ比が４〜５倍向上した。
【０１９３】
【表１】
2010181410.tif 000005
【０１９４】
【表２】
2010181410.tif 000006
【０１９５】
ＰＩＰＥＳ含有ＥＣＬアッセイ緩衝剤を、緩衝剤としてリン酸塩、Ｔｒｉｓ又はＧｌｙ−Ｇｌｙを用いて調製した。これらの混合物の各々のＢ／Ｆ比を、ＰＩＰＥＳ濃度及び緩衝剤成分を変えてさらに最適化した。ＰＩＰＥＳ濃度を、リン酸塩ベースの緩衝剤では１２．５〜２００ｍＭ、Ｔｒｉｓ及びＧｌｙ−Ｇｌｙ緩衝剤では２５〜１００ｍＭで変化させた。緩衝剤濃度を１００〜４００ｍＭで変化させた。すべてのケースにおいて、ＥＣＬアッセイ緩衝剤には、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００も入れた。所望のｐＨにするために、ＫＯＨ又はＨＣｌを必要に応じて添加した。試験範囲内で、緩衝剤成分を添加していない組成物を含めて、すべての配合が、ＥＣＬアッセイに使用するのに十分な性能を示した。ＰＩＰＥＳがｐＨ緩衝剤として作用可能であるために、緩衝剤を添加しないで、十分な性能を得ることも可能である。２０〜１００ｍＭのＰＩＰＥＳ濃度によって、妥当なＥＣＬ強度が維持されつつ高いＢ／Ｆ比がもたらされることが判明した。リン酸塩濃度がＰＩＰＥＳ濃度のほぼ２〜４倍であるときに最高性能が得られた。Ｓ／Ｂ比が高いこと及びシグナル強度が妥当であることに基づいて、以下の最適配合、すなわちＰＩＰＥＳ／リン酸塩（２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭリン酸塩、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．５）、ＰＩＰＥＳ／Ｔｒｉｓ（２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．８）、及びＰＩＰＥＳ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．８）を特定した。
【０１９６】
図５Ａ及び５Ｂに、それぞれＮＰＴプレート及びＰＴプレート上で実施した非洗浄アッセイに対する３つの最適配合の性能を比較した。図では、従来のＴＰＡ／リン酸塩緩衝剤に対して性能を比較している。本発明者らは、試験した３つの緩衝剤で、共反応物としてＰＩＰＥＳを使用することによって、ＴＰＡ／リン酸塩に対してＢ／Ｆ比がかなり（４〜５倍も）向上することを見出した。
【０１９７】
（実施例６）
ＥＣＬアッセイ緩衝剤性能に対する洗浄剤の効果
図６に、アビジン被覆プラズマ処理電極に結合したＢＴ−ＩｇＧ＊からのＥＣＬシグナルに対する様々な非イオン洗浄剤の有無による効果を示す。２つのＥＣＬアッセイ緩衝剤のうちの１つに洗浄剤を０．５％（ｗ／ｖ）添加した。図６Ａに、１５０ｍＭ  ＴＰＡ、２５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５を用いて得られた結果を示す。図６Ｂに、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５を用いて得られた結果を示す。ＢＴ−ＩｇＧ＊（０．０１ｎＭ溶液５０μＬ）をアビジン表面に結合させた。プレートを洗浄し、ＥＣＬアッセイ緩衝剤を添加し、ＥＣＬを検出してプレートを分析した。図に、ＥＣＬアッセイ緩衝剤の各々を用いて測定したアッセイ緩衝剤バックグラウンド、シグナル、及び（実施例４と同様に計算した）Ｓ／Ｂ比を示す。試験した洗浄剤のうち、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のみが性能に対して有意な効果を示した。ＰＩＰＥＳベースの緩衝剤の場合、その効果は大きく、Ｔｒｉｔｏｎの添加によってＳ／Ｂ比が＞２．５倍増加した。ＴＰＡベースの緩衝剤に対するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の効果は極めてわずかであった。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、フェノールエーテル成分を含有している点で、使用した他の洗浄剤とは異なる。出願人らは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の有利な効果は、電極でのフェノールエーテル成分の酸化、及びＥＣＬ反応へのＴｒｉｔｏｎ酸化生成物の関与に起因しているとの仮説を立てている。
【０１９８】
驚くべきことに、非プラズマ処理プレート上で実施されるアッセイに対する洗浄剤の効果は異なり極めて大きい。図７に、ＴＰＡ／Ｐｈｏｓ、ＴＰＡ／Ｔｒｉｓ、ＴＰＡ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ及びＰＩＰＥＳ／Ｐｈｏｓアッセイ緩衝剤（洗浄剤の組成及び量以外は実施例４の最適配合）に対する異なる５つの非イオン洗浄剤の効果を示す。Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｈｅｓｉｔ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４の濃度はすべて０．０５％（ｖ／ｖ）であった。β−オクチルグルコピラノシドの濃度は４％（ｖ／ｖ）であった。この実験においては、ストレプトアビジン被覆電極を体積５０ｕＬ中０．０１８ｐｍｏｌのＢＴ−ＩｇＧ＊（タンパク質１つにつき６．３個の標識）で処理した。図から、すべての洗浄剤で、ＴＰＡ含有アッセイ緩衝剤の存在下で測定されたＥＣＬシグナルが、洗浄剤の非存在下における同じアッセイ緩衝剤よりもかなり向上していることがわかる。ほとんどのケースで２倍以上向上した。追加実験では、各アッセイ緩衝剤において観測された最大シグナルが、洗浄剤の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）以上で発生する傾向にあることが観察された。ＴＰＡ含有ＥＣＬアッセイ緩衝剤とは対照的に、ＰＩＰＥＳの性能は、フェノールエーテル含有洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）の添加によって約３０倍向上したが、Ｔｗｅｅｎ及びＴｈｅｓｉｔ洗浄剤の存在下では極めてわずかなシグナルの向上しか観測されなかった。
【０１９９】
出願人らは、ＰＩＰＥＳ／Ｐｈｏｓ緩衝剤に対するＴｒｉｔｏｎ洗浄剤の効果は、ＥＣＬプロセスへのＴｒｉｔｏｎ酸化生成物の関与に関係があるという仮説を立てている。これに対し、ＮＰＴ電極上でのＴＰＡ含有アッセイ緩衝剤からのＥＣＬシグナルに対する洗浄剤の効果は、より一般的な現象であり、洗浄剤ミセル中のＴＰＡ酸化生成物の安定化に関係しているように見える。
【０２００】
洗浄剤のより大きなスクリーニングを実施して、ＴＰＡ／リン酸塩の存在下でストレプトアビジン被覆ＮＰＴ電極上のＢＴ−ＩｇＧ＊からのＥＣＬシグナルを向上させる他の洗浄剤を同定した。試験した非イオン洗浄剤（ＡＰＯ−１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、β−ノニルグルコシド、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｇｅｎａｐｏｌ及びペンタエチレングリコールモノ−ｎ−ドデシルエーテル）及び双生イオン洗浄剤（ＡＳＢ−１４及びＥｍｐｉｇｅｎ）のすべてを添加すると、ＥＣＬシグナルが増加した。
【０２０１】
（実施例７）
選択した第三級アミンのＥＣＬ活性
いくつかの第三級アミンを、共反応物としての作用能力についてスクリーニングした。実施例４及び５に記載した方法と同様にして測定を実施した。選択した第三級アミン（２００ｍＭ）、リン酸塩緩衝剤（２００ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１％）を含有し、ｐＨ７．５に調節されたＥＣＬアッセイ緩衝剤を調製した。電極に付着した標識からのシグナルを以下の手順により測定した。ｉ）ＥＣＬアッセイ緩衝剤中に０．３ｎＭ  Ｂｔ−ＩｇＧ＊（Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ及びビオチンで標識されたＩｇＧ）を含有する溶液を、ストレプトアビジン被覆９６ウェルＮＰＴ又はＰＴプレートのウェルに導入した。ｉｉ）プレートを２時間振とうさせながらインキュベートしてＢｔ−ＩｇＧ＊を表面に結合させた。ｉｉｉ）プレートを４回洗浄し、ＥＣＬアッセイ緩衝剤１５０μＬを添加した。ｉｖ）標識からのＥＣＬを測定した。ＥＣＬアッセイ緩衝剤１５０ｕＬをストレプトアビジン被覆プレートに導入し、ＥＣＬを測定することによって、アッセイ緩衝剤バックグラウンドを測定した。１０ｎＭ  ＩｇＧ＊（Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧで標識されビオチンでは標識されていないＩｇＧ）を含有する溶液をストレプトアビジン被覆９６ウェルＮＰＴ又はＰＴプレートのウェルに導入し、ＥＣＬを測定することによって、溶液中の遊離ＥＣＬ標識からのＥＣＬシグナルを測定した。
【０２０２】
表ＩＩａ及びＩＩｂは、それぞれＮＰＴ及びＰＴプレートでの実験結果を示している。結果から、様々な第三級アミンが、共反応物としての使用に適していることがわかる。一般に、官能性をもたせることによって、結合シグナルと遊離シグナルの比が向上するように見えた。Ｎ−置換モルホリン核又は、さらにいっそう有利には、ジ−Ｎ−置換ピペラジン核（特に、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ及びＥＰＰＳ）を含む第三級アミンは、（特にＮＰＴ表面で）結合シグナルと遊離シグナルを識別するのに特に適しているように見えた。ＰＴ及びＮＰＴプレート上での相対性能にはやや違いがあった。例えば、ＭＯＰＳはＰＴプレート上で特に良好に機能し、一方、ビス−Ｔｒｉｓ−プロパンは、ＮＰＴプレート上で例外的に高いシグナルを示すことが見出された。
【０２０３】
洗浄剤を含まない、又はＴｗｅｅｎ  ２０を洗浄剤として使用している以外はほぼ同じ緩衝剤において、共反応物を用いてＥＣＬを測定した。ＴＰＡ以外の２つの共反応物は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸及びＴＰＡ２量体）の有無にほとんど依存せず突出していた。これらの洗浄剤は、ＴＰＡよりも結合／遊離比を有し、洗浄剤感受性成分を含む非洗浄アッセイに特に適切である。
【０２０４】
追加実験から、これらの共反応物は、異なる様々なｐＨ緩衝剤、例えば、ＧｌｙＧｌｙ、Ｇｌｙ、Ｔｒｉｓ、トリシン及びリン酸塩で緩衝されたＥＣＬアッセイ緩衝剤において使用できることが判明した。
【０２０５】
【表３】
2010181410.tif 000007
【０２０６】
【表４】
2010181410.tif 000008
【０２０７】
本発明は、本明細書に記載する具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載する実施形態に加えて本発明の様々な変更形態が、上述の説明及び添付した図から当業者には明らかになるはずである。このような変更形態も、特許請求の範囲内にあるものとする。様々な出版物を本明細書に引用したが、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
【図１】
2010181410.tif 000010
【図２】
2010181410.tif 000011
【図３】
2010181410.tif 000012
【図４Ａ】
2010181410.tif 000013
【図４Ｂ】
2010181410.tif 000014
【図５Ａ】
2010181410.tif 000015
【図５Ｂ】
2010181410.tif 000016
【図６Ａ】
2010181410.tif 000017
【図６Ｂ】
2010181410.tif 000018
【図７】
2010181410.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月25日(2010.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学発光標識を含む組成物を、電気化学発光共反応物と非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤とを含み、かつ、リン酸塩を含まない試薬と混合するステップと、
電気化学発光を誘導するステップと、
放出された電気化学発光を検出するステップと、
を含む、電気化学発光を発生させる方法であって、
前記電気化学発光共反応物が第三級アミンであり、
前記非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤が、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択される、
電気化学発光を発生させる方法。
【請求項２】
前記非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤がグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記電気化学発光標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属錯体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法がさらに、
（ａ）前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｂ）放出された電磁放射を検出するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電極が元素状炭素を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記電気化学発光標識が前記電極に付着している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
電気化学発光標識を含む組成物を、電気化学発光共反応物と非リン酸塩ベースのｐＨ緩衝剤とを含み、かつ、リン酸塩を含まない試薬と混合するステップと、
電気化学発光を誘導するステップと、
放出された電気化学発光を検出するステップと、
を含む、電気化学発光を発生させる方法であって、
前記電気化学発光共反応物が第三級アミンである、
電気化学発光を発生させる方法。
【請求項１０】
電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させることを含む、電気化学発光を誘導する方法であって、
前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、電気化学発光を誘導する方法。
【請求項１１】
電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
（ａ）電気化学発光標識と、少なくとも１つの電気化学発光共反応物と、を含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物は親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光標識は作用電極に付着しているステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｃ）放出された電気化学発光を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１２】
電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
（ａ）電気化学発光標識と、少なくとも１つの電気化学発光共反応物とを含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光標識の第１の部分が作用電極に付着しており、前記電気化学発光標識の第２の部分が溶液中にあるステップと、
（ｂ）前記電気化学発光標識の第１の部分を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｃ）前記電気化学発光標識の第１の部分から放出された電気化学発光を選択的に検出するステップと、を含む方法。
【請求項１３】
試料中の目的分析物又は活性のアッセイを実施する方法であって、
（ａ）試料を含む組成物と、電気化学発光標識を含むアッセイ試薬と、電極とを形成させるステップであって、前記試料中に前記分析物又は活性が存在することによって前記電極からの前記アッセイ試薬の付着又は解離がもたらされるステップと、
（ｂ）電気化学発光共反応物を含む電気化学発光アッセイ緩衝剤と前記電極を接触させるステップであって、前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであるステップと、
（ｃ）前記電極上の電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｄ）放出された電気化学発光を測定するステップと、を含む方法。
【請求項１４】
結合現象を測定する方法であって、
（ａ）電極上に固定された結合試薬を、電気化学発光標識を含むアッセイ試薬と接触させるステップであって、前記結合試薬が前記アッセイ試薬に特異的に結合するステップと、
（ｂ）前記アッセイ試薬を前記結合試薬に結合させて前記電気化学発光標識を前記電極に付着させるステップと、
（ｃ）前記電極を、電気化学発光共反応物を含む電気化学発光アッセイ緩衝剤と接触させるステップであって、前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであるステップと、
（ｄ）前記電極上の電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
（ｅ）放出された電気化学発光を測定するステップと、を含む方法。
【請求項１５】
前記電気化学発光共反応物がアミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤を形成し、前記アミンラジカルカチオン及び／又はラジカル還元剤の拡散距離が１００ｎｍ未満である、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が洗浄ステップなしで実施される、請求項９から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電気化学発光共反応物をＴＰＡで置換することによって、溶液中の電気化学発光標識に対する電極に付着している電気化学発光標識からの電気化学発光誘導の選択性が少なくとも２倍低下する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記電気化学発光共反応物がＰＩＰＥＳである、請求項９から１６までのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記電気化学発光共反応物が以下の式を有し、ｉ）Ｘが−（ＣＨ２）−又はヘテロ原子であり、ｉｉ）Ｒ及びＲ１が２つ以上の炭素を含むアルキル基であり、ｉｉｉ）ｎ及びｍが各々１以上であり、ｉｖ）Ｒが親水性官能基を含み、ｖ）Ｒ１が親水性官能基を含んでもよく、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【化１】
2010181410.tif 000020
【請求項２０】
前記電気化学発光共反応物が、３−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−プロパンスルホン酸、４−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）−ブタンスルホン酸、４−［ビス−（２−ヒドロキシエタン）−アミノ］−ブタンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、アゼパン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、ピペリジン−Ｎ−（３−プロピオン酸）（ＰＰＡ）、３−モルフォリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３−モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−エタンスルホン酸（ＢＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリエタノールアミン、Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−４−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−プロパンスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシエタン−Ｎ’−３−メチルプロパノエート、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−３−メチルプロパノエート、１，６−ジアミノへキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ，Ｎ−ビスプロピル−Ｎ−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（ビス−Ｔｒｉｓプロパン）、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール、３−ジメチルアミノ−２−プロパノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラプロピルプロパン−１，３−ジアミン（ＴＰＡ２量体）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン）スルホン酸（ＰＯＰＳＯ）及び２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）からなる群から選択される、請求項９から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記電極が元素状炭素を含む、請求項９から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記電気化学発光標識を少なくとも１つのフェニルエーテル含有洗浄剤とも接触させる、請求項９から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
電気化学発光標識と、電気化学発光共反応物と、ｐＨ緩衝剤と、を含む組成物の存在下で、電気化学発光を誘導する、電気化学発光を誘導する方法。
【請求項２４】
前記ｐＨ緩衝剤が電気化学発光アッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｐＨ緩衝剤がグリシルグリシン、トリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、無機リン酸塩を実質的に含まない、請求項２３から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記電気化学発光共反応物が第三級アミンである、請求項２３から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記電気化学発光標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属錯体である、請求項２３から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法がさらに、
（ａ）前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
（ｂ）放出された電磁放射を検出するステップと、
を含む、請求項２３から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記電気化学発光標識が前記電極に付着している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記電極が元素状炭素を含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記電気化学発光共反応物が第三級アミンであり、前記電気化学発光標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属錯体であり、前記組成物は無機リン酸塩を実質的に含まない、請求項２３に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
５．１  電気化学発光共反応物
すべてではないにしてもほとんどの現行の市販電気化学発光技術の適用例には、共反応物としてのトリ−ｎ−プロピルアミン（ＴＰＡ）及びｐＨ緩衝剤としてのリン酸塩を含有する電気化学発光アッセイ緩衝剤の存在下における電気化学発光標識（及び、特に、ルテニウムの有機金属錯体）の測定が含まれている。これらの電気化学発光アッセイ緩衝剤は、結合アッセイの固相として金属（一般に、白金）電極表面に収集された磁気粒子を使用する市販の電気化学発光計測手段に対して最適化され、優れた性能を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＴＰＡ以外の共反応物、好ましくは（共反応物の項に記載したように）親水性官能基を有するトリアルキルアミンを含む電気化学発光アッセイ緩衝剤に関する。好ましくは、この共反応物はＰＰＡ又はＰＩＰＥＳであり、最も好ましくはＰＩＰＥＳである。この共反応物の濃度は、好ましくは１０〜８００ｍＭ、最も好ましくは１０〜２００ｍＭ、最も好ましくは２０〜５０ｍＭである。電気化学発光アッセイ緩衝剤は、ｐＨ緩衝剤、好ましくは、リン酸塩、Ｔｒｉｓ又はＧｌｙ−Ｇｌｙも含むことが好ましい。ｐＨ緩衝剤の濃度は、好ましくは０〜８００ｍＭ、より好ましくは０〜４００ｍＭ、さらにより好ましくは２０〜２００ｍＭ、最も好ましくは７５〜１５０ｍＭである。本組成物のｐＨは、好ましくは６〜９、より好ましくは７〜８、さらにより好ましくは７．２〜７．８、最も好ましくは約７．５である。電気化学発光アッセイ緩衝剤は、フェニルエーテル成分及び／又は洗浄剤、好ましくは非イオン洗浄剤、さらにより好ましくはフェニルエーテル含有洗浄剤、最も好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む物質も含むことが好ましい。洗浄剤濃度は、好ましくは０．０２％よりも高く、より好ましくは０．０５％よりも高く、最も好ましくは０．０５〜０．５％である。