(57)【要約】      （修正有）【課題】安全かつ高蛍光強度、高耐光性を有する分散体及び該分散体を用いたバイオイメージング用蛍光標識剤の提供。【解決手段】下記一般式で表される化合物と、界面活性剤と、水とを含み、下記化合物が水中に分散されてなることを特徴とする分散体。2020023676.tif 000025（Ｒ1及びＲ2は、夫々独立に、置換又は無置換の脂肪族炭化水素基等；Ａｒ1及びＡｒ2は、夫々独立に、置換又は無置換の芳香族炭化水素基等）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物［１］と、界面活性剤と、水とを含み、化合物［１］が水中に分散されてなることを特徴とする分散体。
一般式（１）
【化１】
2020023676.tif 000024
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の脂肪族複素環基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基、置換もしくは無置換のポリオキシアルキレン基、置換もしくは無置換のアルコキシカルボニル基、または、置換もしくは無置換のアリ−ルオキシカルボニル基を表す。
Ａｒ1およびＡｒ2は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基を表す。）
【請求項２】
請求項１記載の分散体を用いることを特徴とするバイオイメージング用蛍光標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた蛍光特性を有するジケトピロロピロール分散体および該分散体を用いたバイオイメージング用蛍光標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオイメージングは、タンパク質や細胞、組織などを可視化する技術であり、生体内分子・細胞機能の解明や創薬の研究等、生物学、医学の研究領域で幅広く活用されている。
【０００３】
中でも蛍光バイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、高感度観察が可能なイメージング法である。さらに、近年では、蛍光バイオイメージング法は非侵襲的に診断可能なイメージング法として注目されており、患者への負担が少ない画像診断や手術中のリアルタイム診断など臨床現場における応用が期待されている。
【０００４】
蛍光バイオイメージング法は、主に標的部位に吸着、あるいは、標的部位でのみ発光する蛍光色素を用い、その蛍光色素に紫外〜近赤外領域の光を照射した際に色素が発する蛍光を検出することにより、標的を可視化する方法である。
【０００５】
高感度かつ安定な蛍光バイオイメージングを行うためには、高い蛍光強度、耐光性、生体適合性を兼ね備えた色素が必要である。
【０００６】
蛍光バイオイメージング用の色材としては、水溶性の有機分子であるシアニン系色素やキサンテン系色素などが用いられるが、非特許文献１に記載されるように蛍光強度や耐光性が低いことが課題であった。
【０００７】
その他の蛍光バイオイメージング用の色材として、量子ドット（特許文献１）や、蛍光色素と酸化チタンや二酸化ケイ素などの無機材料の複合粒子（特許文献２）などが知られている。しかしながら、量子ドットは、カドミウムのような生体毒性の高い元素を使用すること、酸化チタンや二酸化ケイ素のナノ粒子は、生体蓄積性や細胞毒性の観点で安全性に懸念があることなどから、いずれも生体内への投与には問題があった。
【０００８】
一方、ジケトピロロピロール色素は、優れた光学特性、高い蛍光強度、高い耐光性を有する色素として知られている。特に、Ｎ位に置換基を導入したジケトピロロピロール色素は、水素結合による結晶化を抑制することにより、有機溶媒への溶解性、蛍光特性が大きく向上するため、有機ＥＬや有機太陽電池などのオプトエレクトロニクスデバイスに応用されている。しかしながら、これらの色素は、有機溶媒にしか溶解せず、水中では凝集してしまうため、強い蛍光発光が得られず水中での用途が限定されることが課題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−１９０９７６号公報
【特許文献２】特開２０１７−１７９００３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】会澤英樹、外３名、「診断試薬用シリカナノ粒子の開発」、古河電工時報、古河電気工業株式会社、平成２０年３月、第１２１号、ｐ．１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、安全かつ高蛍光強度、高耐光性を有する分散体および該分散体を用いたバイオイメージング用蛍光標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ジケトピロロピロール色素の分散体を作製することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明に至った。
【００１３】
すなわち本発明は、下記一般式（１）で表される化合物［１］を含むことを特徴とする分散体に関する。
【００１４】
一般式（１）
【化１】
2020023676.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基、置換もしくは無置換のポリオキシアルキレン基、置換もしくは無置換のアルコキシカルボニル基、または、置換もしくは無置換のアリ−ルオキシカルボニル基を表す。
Ａｒ1およびＡｒ2は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基を表す。）
【００１５】
すなわち本発明は、少なくとも上記の化合物［１］と、界面活性剤と、水とを含み、水中に分散させることを特徴とする分散体に関する。
【００１６】
すなわち本発明は、上記記載の分散体を用いることを特徴とするバイオイメージング用蛍光標識剤に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ジケトピロロピロール色素の分散体を用いた高蛍光強度かつ高耐光性を有する分散体および該分散体を用いたバイオイメージング用蛍光標識剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
まず、一般式［１］におけるＲ１およびＲ２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の脂
肪族複素環基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基、置換もしくは無置換のポリオキシアルキレン基、置換もしくは無置換のアルコキシカルボニル基、または、置換もしくは無置換のアリ−ルオキシカルボニル基を表す。
【００２０】
Ｒ１およびＲ２における脂肪族炭化水素基としては、炭素数１〜１８の脂肪族炭化水素基を指し、そのようなものとしては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基が挙げられる。
【００２１】
ここで、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基といった炭素数１〜１８のアルキル基が挙げられる。
【００２２】
また、アルケニル基としては、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−オクテニル基、１−デセニル基、１−オクタデセニル基といった炭素数２〜１８のアルケニル基が挙げられる。
【００２３】
また、アルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、１−オクチニル基、１−デシニル基、１−オクタデシニル基といった炭素数２〜１８のアルキニル基が挙げられる。
【００２４】
また、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロオクタデシル基といった炭素数３〜１８のシクロアルキル基が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１およびＲ２における芳香族炭化水素基としては、単環、縮合環、環集合炭化水素基が挙げられる。
【００２６】
ここで、単環芳香族炭化水素基としては、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，４−キシリル基、ｐ−クメニル基、メシチル基等の炭素数６〜１８の単環芳香族炭化水素基が挙げられる。
【００２７】
また、縮合環炭化水素基としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンスリル基、２−アンスリル基、５−アンスリル基、１−フェナンスリル基、９−フェナンスリル基、１−アセナフチル基、２−アズレニル基、１−ピレニル基、２−トリフェニレル基等の炭素数１０〜１８の縮合環炭化水素基が挙げられる。
【００２８】
また、環集合炭化水素基としては、ｏ−ビフェニリル基、ｍ−ビフェニリル基、ｐ−ビフェニリル基等の炭素数１２〜１８の環集合炭化水素基が挙げられる。
【００２９】
Ｒ１およびＲ２における脂肪族複素環基としては、２−ピラゾリノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基、２−モルホリニル基といった炭素数３〜１８の脂肪族複素環基が挙げられる。
【００３０】
Ｒ１およびＲ２における芳香族複素環基としては、トリアゾリル基、３−オキサジアゾリル基、２−フラニル基、３−フラニル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、１−ピロ−リル基、２−ピロ−リル基、３−ピロ−リル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピラジル基、２−オキサゾリル基、３−イソオキサゾリル基、２−チアゾリル基、３−イソチアゾリル基、２−イミダゾリル基
、３−ピラゾリル基、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、１−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、２−ベンゾフリル基、２−ベンゾチエニル基、Ｎ−インドリル基、Ｎ−カルバゾリル基、Ｎ−アクリジニル基、２−チオフェニル基、３−チオフェニル基、ビピリジル基、フェナントロリル基といった炭素数２〜１８の芳香族複素環基が挙げられる。
【００３１】
Ｒ１およびＲ２におけるポリオキシアルキレン基としては、ポリオキシエチレン基、ポリオキシプロピレン基などが挙げられる。
【００３２】
Ｒ１およびＲ２におけるアルコキシカルボニル基としては、炭素数２〜１４のアルコキシカルボニル基が好ましい。このようなものとして、以下の例には限定されないが、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００３３】
Ｒ１およびＲ２におけるアリ−ルオキシカルボニル基としては、炭素数２〜１４のアリ−ルオキシカルボニル基が好ましい。このようなものとして、以下の例には限定されないが、フェノキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００３４】
これら、脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、芳香族複素環基、アルコキシカルボニル基、および、アリ−ルオキシカルボニル基は、さらに他の置換基によって置換されていても良い。そのような置換基としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子といったハロゲン原子や、置換シリル基、シアノ基、アルコキシル基、アリ−ルオキシ基、置換アミノ基や前述の脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂肪族複素環基、芳香族複素環基が挙げられる。
【００３５】
次に、一般式［１］におけるＡｒ１およびＡｒ２は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基を表す。
【００３６】
ここで、置換もしくは無置換の芳香族炭化水素基、置換もしくは無置換の芳香族複素環基としては、単環、縮合環、環集合炭化水素基が挙げられ、いずれもＲ１およびＲ２における単環、縮合環、環集合炭化水素基と同義である。
【００３７】
ここで、単環芳香族炭化水素基としては、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，４−キシリル基、ｐ−クメニル基、メシチル基等の炭素数６〜１８の単環芳香族炭化水素基が挙げられる。
【００３８】
また、縮合環炭化水素基としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンスリル基、２−アンスリル基、５−アンスリル基、１−フェナンスリル基、９−フェナンスリル基、１−アセナフチル基、２−アズレニル基、１−ピレニル基、２−トリフェニレル基等の炭素数１０〜１８の縮合環炭化水素基が挙げられる。
【００３９】
また、環集合炭化水素基としては、ｏ−ビフェニリル基、ｍ−ビフェニリル基、ｐ−ビフェニリル基等の炭素数１２〜１８の環集合炭化水素基が挙げられる。
【００４０】
また、芳香族複素環基としては、トリアゾリル基、３−オキサジアゾリル基、２−フラニル基、３−フラニル基、２−フリル基、３−フリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、１−ピロ−リル基、２−ピロ−リル基、３−ピロ−リル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピラジル基、２−オキサゾリル基、３−イソオキサゾリル基、２−チアゾリル基、３−イソチアゾリル基、２−イミダゾリル基、３−ピラゾリル基、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、１−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、２
−ベンゾフリル基、２−ベンゾチエニル基、Ｎ−インドリル基、Ｎ−カルバゾリル基、Ｎ−アクリジニル基、２−チオフェニル基、３−チオフェニル基、ビピリジル基、フェナントロリル基といった炭素数２〜１８の芳香族複素環基が挙げられる。
【００４１】
これら、芳香族炭化水素基、芳香族複素環基は、さらに他の置換基によって置換されていても良い。そのような置換基としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子といったハロゲン原子や、置換シリル基、シアノ基、アルコキシル基、アリ−ルオキシ基、置換アミノ基や前述の脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂肪族複素環基、芳香族複素環基が挙げられる。
【００４２】
以上、本発明の分散体に用いられる一般式［１］で表される化合物について説明した。
【００４３】
本発明の分散体に用いられる一般式［１］で表される化合物の代表例を、以下の表１に示すが、本発明は、この代表例に限定されるものではない。
表１中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を表す。また、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ４Ｈ９、−Ｃ７Ｈ１５、−Ｃ１６Ｈ３３はいずれも直鎖アルキル基を表す。
【００４４】
【表１】
2020023676.tif 000003
【表１】
2020023676.tif 000004
【表１】
2020023676.tif 000005
【表１】
2020023676.tif 000006
【表１】
2020023676.tif 000007
【表１】
2020023676.tif 000008
【表１】
2020023676.tif 000009
【表１】
2020023676.tif 000010
【表１】
2020023676.tif 000011
【表１】
2020023676.tif 000012
【表１】
2020023676.tif 000013
【表１】
2020023676.tif 000014
【表１】
2020023676.tif 000015
【表１】
2020023676.tif 000016
【表１】
2020023676.tif 000017
【表１】
2020023676.tif 000018
【表１】
2020023676.tif 000019
【表１】
2020023676.tif 000020
【表１】
2020023676.tif 000021
【表１】
2020023676.tif 000022
【００４５】
（界面活性剤）
本発明の分散体は、界面活性剤を有する。本発明に用いることができる界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等などが挙げられるが、特に限定されるものではない。こ
れらの界面活性剤は２種類以上を用いてもよい。
【００４６】
非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８５等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ５３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ７２０並びにＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ７３０等が挙げられる。
【００４７】
アニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等が挙げられる。
【００４８】
カチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。
【００４９】
高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールの市販品としては、プルロニックＦ６８（ＢＡＳＦ社製）、プルロニックＦ１２７（ＢＡＳＦ社製）等が挙げられる。
【００５０】
リン脂質としては、アミノ基、ＮＨＳ基、マレイミド又はメトキシ基のいずれかの官能基とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有するホスファチジル系リン脂質を挙げることができる。
【００５１】
ホスファチジル系リン脂質としては、３−（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ，  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、Ｎ−（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、Ｎ−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、Ｎ−（Ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ２０００）−１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ）、Ｎ−（Ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  ５０００）−１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０５０ＣＮ）等が挙げられる。
【００５２】
本発明における界面活性剤は、上記の界面活性剤に、標的部位への集積性、吸着性を向上させるための置換基を導入したものを用いてもよい。
【００５３】
本発明の分散体の作製方法としては、再沈殿法や乳化法などの公知の方法を利用することができるが、作製方法は特にこれらに限定されるものではない。
【００５４】
（再沈殿法）
再沈殿法を用いる場合は、界面活性剤を含む水中に、化合物［１］の有機溶媒溶液を滴下し、分散体を作製する。このとき、化合物［１］の有機溶媒溶液に界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を含む化合物［１］の有機溶媒溶液を、界面活性剤を含まない水中に滴下して分散体を作製することもできる。また、界面活性剤を含む有機溶媒溶液中に、水を滴下してもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【００５５】
（乳化法）
乳化法を用いる場合は、化合物［１］を油滴中に含む水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルションを作製する。その際、水、界面活性剤、化合物［１］の混合物に機械的エネルギーを加えることにより、分散体を作製する。このとき、分散しやすくするために有機溶媒を含んでいてもよい。機械的エネルギーを加える方法としては、プロペラ攪拌機やタービン撹拌機等のミキサーを利用する攪拌、コロイドミル、ホモジナイザー、超音波照射等がある。これらの方法は、単独で用いても、あるいは複数を組み合わせて用いてもよい。また、エマルションは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００５６】
本製造方法で用いる有機溶媒としては、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン等の炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等の非プロトン性極性溶媒類、及びピリジン誘導体を挙げることが出来る。これらの溶媒は、単独で使用してもよく、任意に混合して使用してもよい。
【００５７】
本発明の分散体の調製に使用した有機溶媒は、イメージングをする上で細胞や生体などに影響がない範囲で含んでいても構わないが、従来公知の方法により留去することができる。溶媒留去の方法としては透析法あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができるが、本発明に必要な物性を損なわない範囲であれば、上記方法に限定されない。
【００５８】
本発明の分散体中の化合物［１］の濃度は、蛍光が検出できる範囲であれば特に限定されないが、蛍光強度や分散性の観点から０．００１〜１００μｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００５９】
本発明の分散体中の界面活性剤の濃度は、色素を均一に分散でき、蛍光が検出できる範囲であれば特に限定されないが、分散媒に対して０．０１〜３０．０質量％が好ましい。
【００６０】
本発明の分散体に用いる分散媒は、水であるが、注射用蒸留水や、生理条件に近づけるために水に塩を加えた生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）など、用途に応じた分散媒を使用することができる。
【００６１】
作製した分散体は、従来公知の方法により精製することができる。精製方法は、例えば、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法、限外濾過法、透析法、遠心分離法を挙げることが出来るが、本発明に必要な物性を損なわない範囲であれば、上記方法に限定されない
。
【００６２】
本発明の分散体の粒径は、イメージング用途に応じた機能を発現する範囲であれば特に限定されないが、細胞内への取込み効率や生体内における安定性などの観点から、１ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがより好ましい。
【００６３】
本発明の分散体の粒径は、動的光散乱法やレーザー回折法など、従来公知の方法により測定することができる。
【００６４】
本発明の分散体の粒子は、蛍光を発するものであればどのような形状でもよく、真球状、楕円状、平面状、一次元のひも状などのいずれでもよい。
【００６５】
本発明の分散体は、分散体を調製した後、凍結乾燥により乾燥させ、再度分散媒に分散させることにより使用することもできる。
【００６６】
本発明の分散体は、水中で蛍光を発する粒子を含む分散体であり、可視〜近赤外領域の光を照射し、色素が発する蛍光を検出することにより蛍光バイオイメージングが可能であるため、バイオイメージング用蛍光標識剤として使用することができる。
【００６７】
（蛍光標識剤）
蛍光バイオイメージングに用いる蛍光標識剤は、細胞や生体成分、組織などを標識する機能を有する蛍光色素であり、鮮明に標識するために高い蛍光強度を有する必要がある。
【００６８】
（蛍光量子収率）
蛍光量子収率φは、下記の式のように、吸収された光子数に対し、蛍光として放出された光子数の割合を示し、０（非蛍光性物質）から１の数値で表される。発光効率として０（非蛍光性物質）から１００％の数値で表される場合もある。
φ＝放出された光子数／吸収された光子数
色素の蛍光強度は蛍光量子収率に比例することが知られており、高い蛍光強度が必要になる蛍光バイオイメージングにおいて、高い蛍光量子収率を示す色素は優れたイメージング用蛍光標識剤となる。
【００６９】
（蛍光量子収率の測定）
蛍光量子収率を測定する方法としては、積分球を用いて未知試料の量子収率を直接測定する絶対法と、量子収率が既知の蛍光物質を標準試料として未知試料の量子収率を算出する相対法があり、各方法により測定した蛍光量子収率をそれぞれ絶対蛍光量子収率、相対蛍光量子収率という。絶対法は、測定試料が吸収／放出した光子数を直接測定するため、標準試料の調製が必要なく、溶液や固体などの試料形状を問わずに簡便に蛍光量子収率の絶対値を測定できる方法である。絶対蛍光量子収率は、市販の絶対蛍光量子収率測定装置を用いることにより測定できる。
【００７０】
本発明の分散体を使用した蛍光バイオイメージングを行う装置は、用いる色素に適した励起光を照射し、色素が発する蛍光を検出できる装置であれば、どのような装置でも使用することができる。
【００７１】
本発明の分散体は、蛍光イメージングをするにあたり、蛍光が検出できる範囲であれば、必要に応じて抗がん剤などの治療薬や薬理上許容できる添加剤を混合してもよい。治療薬や添加剤は、蛍光色素分散体の調製の際に混合してもよく、蛍光色素と治療薬や添加剤
のそれぞれの分散体を混合してもよい。
【実施例】
【００７２】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、実施例中「部」とは、「質量部」を表す。
【００７３】
［合成例１］（３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロールの合成）
窒素雰囲気下、ｔｅｒｔ−アミルアルコール１２５部中、攪拌下に水素化ナトリウム（６０％）４．２８部を添加する。さらに、２−シアノフラン１０部、コハク酸ジイソプロピル９．７１部をｔｅｒｔ−アミルアルコール９部に溶解し、添加した。１００℃ まで
加熱昇温し、４時間撹拌した。その後６０℃ まで冷却し、この温度において酢酸１２．
６部及びメタノール１８０部の混合液を滴下し、滴下終了後、０．５時間６０℃加熱を施した。次にろ過し、メタノールにより洗浄した後に６０℃ で乾燥し、暗赤色粉末を８．
８８部得た。
【００７４】
［合成例２］（Ｎ，Ｎ’−ジエチル−３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロールの合成）
窒素雰囲気下、ジメチルアセトアミド３２部に、合成例１で得られた３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロール２．６８部、水素化ナトリウム（６０％）０．８８部を加え、５０℃ まで加熱し、３０分間撹拌した。次に、ヨウ化エチル３．４３部を加え、
５０℃において３時間攪拌した。反応液を氷水１６０部に注入し、室温下に１時間攪拌した。濾過した後、水、メタノール洗浄し、６０℃乾燥することによりＮ，Ｎ’−ジエチル−３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロールを暗赤色粉末として、３．０７部得た。得られた粗成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。マススペクトル（ブルカーダルトニクス社製、ＡｕｔｏｆｌｅｘII）、 １Ｈ‐ＮＭＲ、および１
３Ｃ‐ＮＭＲ（日本電子社製、ＥＣＸ−４００Ｐ）によって同定した。
【００７５】
［合成例３］（３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロールの合成）
窒素雰囲気下、ｔｅｒｔ−アミルアルコール１２５部中、攪拌下に水素化ナトリウム（６０％）４．２８部を添加する。さらに、２−シアノチオフェン１１．７部、コハク酸ジイソプロピル９．７１部をｔｅｒｔ−アミルアルコール９部に溶解し、添加した。１００℃ まで加熱昇温し、４時間撹拌した。その後６０℃ まで冷却し、この温度において酢酸１２．６部及びメタノール１８０部の混合液を滴下し、滴下終了後、０．５時間６０℃加熱を施した。次にろ過し、メタノールにより洗浄した後に６０℃ で乾燥し、暗赤色粉末
を８．８８部得た。
【００７６】
［合成例４］（Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロールの合成）
窒素雰囲気下、ジメチルアセトアミド３２部に、合成例３で得られた３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロール３．００部、水素化ナトリウム（６０％）０．８８部を加え、５０℃ まで加熱し、３０分間撹拌した。次に、ヨウ化イソブチル４．０４部を加
え、５０℃において３時間攪拌した。反応液を氷水１６０部に注入し、室温下に１時間攪拌した。濾過した後、水、メタノール洗浄し、６０℃乾燥することによりＮ，Ｎ’−ジイソブチル−３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロールを暗赤色粉末として、３．５７部得た。得られた粗成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。マススペクトル（ブルカーダルトニクス社製、ＡｕｔｏｆｌｅｘII）、 １Ｈ‐ＮＭＲ、
および１３Ｃ‐ＮＭＲ（日本電子社製、ＥＣＸ−４００Ｐ）によって同定した。
【００７７】
［実施例１］（分散体（Ｄ−１）の調製）
合成例２で得られたＮ，Ｎ’−ジエチル−３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロール０．３２４部をＮ−メチル−２−ピロリドン１．５部に溶解し、８００ｒｐｍで撹拌させた、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１０質量％水溶液１０００部中に滴下、３０分間撹拌し、分散体を得た。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１０質量％水溶液で１００倍に希釈した後、分散体１０ｍＬを、Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＥ透析チ
ューブ（スペクトラム・ラボラトリーズ株式会社製、ＭＷＣＯ：０．１−０．５）に入れ、イオン交換水１Ｌ中で３０分間撹拌、イオン交換水を交換して三度繰返し、分散体Ｄ−１を得た。
【００７８】
［実施例２］（分散体（Ｄ−２）の調製）
合成例４で得られたＮ，Ｎ’−ジイソブチル−３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロール０．４１３部を、非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０の１０質量％水溶液１０００００部に加え、超音波（株式会社エスエヌディ社製  ＵＳ−２ＫＳ  ３８ｋＨｚ）を３０分間照射して分散体Ｄ−２を得た。
【００７９】
［実施例３］（分散体（Ｄ−５）の調製）
合成例４で得られたＮ，Ｎ’−ジイソブチル−３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロール０．４１３部を、高分子界面活性剤としてプルロニックＦ１２７の１０質量％水溶液１０００００部に加え、超音波（株式会社エスエヌディ社製  ＵＳ−２ＫＳ  ３８ｋＨｚ）を３０分間照射して分散体Ｄ−５を得た。
【００８０】
［比較例１］（分散体（Ｄ−３）の調製）
合成例２で得られたＮ，Ｎ’−ジエチル−３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロール０．３２４部を、８００ｒｐｍで撹拌させたイオン交換水１０００００部中に滴下、３０分間撹拌し、分散体Ｄ−３を得た。
【００８１】
［比較例２］（分散体（Ｄ−４）の調製）
合成例４で得られたＮ，Ｎ’−ジイソブチル−３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロール０．４１３部をイオン交換水１０００００部に加え、超音波（株式会社エスエヌディ社製  ＵＳ−２ＫＳ  ３８ｋＨｚ）を３０分間照射して分散体Ｄ−３を得た。
【００８２】
［比較例３］（溶液（Ｓ−１）の調製）
合成例２で得られたＮ，Ｎ’−ジエチルー３，６−フラニル−１，４−ジケトピロロピロール０．３２４部を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン１０００００部に加え、超音波（株式会社エスエヌディ社製  ＵＳ−２ＫＳ  ３８ｋＨｚ）を３０分間照射して溶液Ｓ−１を得た。
【００８３】
［比較例４］（溶液（Ｓ−２）の調製）
合成例４で得られたＮ，Ｎ’−ジイソブチル−３，６−チエニル−１，４−ジケトピロロピロール０．４１３部を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン１０００００部に加え、超音波（株式会社エスエヌディ社製  ＵＳ−２ＫＳ  ３８ｋＨｚ）を３０分間照射して溶液Ｓ−２を得た。
【００８４】
分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５は色素が均一に分散し、目視で粒子が確認できなかった。一方、分散体Ｄ−３、Ｄ−４は、均一に分散せず、色素が沈殿した。
【００８５】
（粒径測定）
動的光散乱法による粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製  ＮａｎｏｔｒａｃＷａｖｅ）を用い、分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５の粒径を測定した結果、分布の中央値を表すメジアン径（Ｄ５０）はそれぞれ１２．０ｎｍ、１１．５ｎｍ、１１．０ｎｍであった。分散体Ｄ−３、Ｄ−４については、均一に分散せず色素が沈殿したため、上記の測定を行うことができなかった。
【００８６】
（分析方法）
吸収スペクトルは、分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−４１００）、絶対蛍光量子収率は、絶対ＰＬ量子収率測定装置（浜松ホトニクス株式会社製、Ｃ９
９２０−０２）を用いて測定した。
【００８７】
分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５、溶液Ｓ−１、Ｓ−２の吸収スペクトル、絶対蛍光量子収率を測定した。測定結果を表２に示す。絶対蛍光量子収率φは、吸収スペクトルの測定結果における最大吸収波長（λｍａｘ）を励起波長（λｅｘ）として測定した。絶対蛍光量子収率φは、数値が１に近いほど蛍光強度が高く良好である。
分散体Ｄ−３、Ｄ−４については、均一に分散しなかったため、上記の測定を行うことができなかった。
【００８８】
（耐光性評価方法）
分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５、溶液Ｓ−１、Ｓ−２に対し、蛍光光度計（日本分光株式会社製、ＦＰ−６５００）を用いてそれぞれの最大吸収波長と同じ波長の光を２時間照射し、照射前後における最大吸収波長の吸光度の変化量を比較した。得られた吸光度の変化量から、分散体および溶液の耐光性を、照射後の吸光度／照射前の吸光度が、０．８以上のとき◎（極めて良好）、０．６以上０．８未満のとき○（良好）、０．４以上０．６未満のとき△（普通）、０．４未満のとき×（不良）と表して評価した。光照射条件は、蛍光光度計の励起光をそれぞれの最大吸収波長、励起バンド幅を２０ｎｍとした。分散体Ｄ−３、Ｄ−４については、均一に分散せず色素が沈殿したため、上記の評価を行うことができなかった。
【００８９】
（生理条件下における安定性評価）
生理条件で投与した場合の安定性を評価するため、分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５、溶液Ｓ−１、Ｓ−２に関し、調製した分散液または溶液１ｍＬを、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）  ｐＨ７．２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０ｍＬに滴下し、３０分間静置した後、分散が維持されるか（沈殿が生じないか）を目視により確認した。均一な分散を維持している場合は◎（良好）、沈殿が生じた場合は×（不良）と表して評価した。分散体Ｄ−３、Ｄ−４については、分散体調製の時点で均一に分散せず色素が沈殿したため、上記の評価を行うことができなかった。
【００９０】
【表２】
2020023676.tif 000023
【００９１】
比較例１と比較例３、比較例２と比較例４の対比からわかるように、蛍光色素は、溶液状態で最も蛍光量子収率が高く、溶解しない溶媒中では色素が凝集してしまい、蛍光量子収率が低下してしまうため、高い蛍光強度を維持することができない。しかしながら、表２に示すように、本発明の分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５は、水中で均一に微細な分散体を形成し、有機溶媒に溶解したＳ−１と同等の蛍光量子収率を示した。有機溶媒に溶解した比較例３と比較例４は高い蛍光量子収率を示したが、生理条件に近いＰＢＳ中に滴下すると沈殿が生じてしまうため、バイオイメージングには使用できない。
【００９２】
（細胞培養と蛍光顕微鏡観察）
ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに播種（５×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）し、１０質量％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１質量％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で２４時間培養した。その後、培地を取り除き、分散体Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−５をＭＥＭで１０倍希釈したものを１００μＬ添加し、インキュベーター内に２４時間静置した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。適切な波長の励起フィルターおよび蛍光フィルターを設置した蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＺ−Ｘ７１０）を用いて、細胞の暗視野像と蛍光像を観察した結果、蛍光標識された細胞を明瞭に確認することができた。
【００９３】
本発明に係るジケトピロロピロール色素は、水に溶解しないため、水中では蛍光を発さず、バイオイメージング用の蛍光色素として使用することができなかった。しかしながら、本発明において、界面活性剤を用い、ジケトピロロピロール色素を微細に分散させることにより、水中でも高い蛍光量子収率を示す分散体が得られた。そして、細胞を明瞭に蛍光標識することが確認できた。
【００９４】
さらに、実施例１と比較例３、実施例２と比較例４の対比からわかるように、微細な粒子を形成することにより、完全に溶解した場合よりもジケトピロロピロール色素の耐光性が向上した。
【００９５】
ジケトピロロピロール色素は、非常に蛍光量子収率、耐光性が高い色素であり、置換基を変えることにより、可視光〜近赤外領域まで容易に吸収／蛍光波長を制御することが可能である。本発明により、ジケトピロロピロール色素を用いて、水中で可視光〜近赤外領域で強い蛍光を発する分散体が得られ、優れた蛍光バイオイメージング用蛍光標識剤が提供できる。