(57)【要約】【課題】高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なＤＧＡＴ阻害剤の提供。【解決手段】エラジタンニン又はその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラジタンニン又はその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項２】
エラジタンニン又はその誘導体が、分子内に下記式（１）又は（２）
【化１】
2010070540.tif 000018
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）又は（２）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したものである請求項１記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【請求項３】
エラジタンニン又はその誘導体が、ルゴシンＡ、ルゴシンＢ、ルゴシンＤ、ユースピニンＡ、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣから選ばれる１種以上である請求項１又は２記載のＤＧＡＴ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なジアシルグリセロールアシル基転移酵素（以下、「ＤＧＡＴ」という。）阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化に伴う恒常的な脂肪の過剰摂取により、高脂血症や肥満の発症率が増加している。高脂血症や肥満は、さらにインスリン抵抗性や糖尿病といった生活習慣病を合併するため、国民の健康維持・増進の観点において大きな社会問題となっている。
【０００３】
従来の高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善を目的としたアプローチの代表例として、食事療法や食欲抑制剤（非特許文献１及び２）、脂質代謝改善薬（非特許文献３及び４）を用いる方法が挙げられる。しかし、食事療法は長期的に実行するには非常に困難であり、食欲抑制剤や脂質代謝改善薬を長期服用する場合においては副作用が懸念される。
一方、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防・改善にＤＧＡＴ阻害が有効であると考えられており（非特許文献５）、これを目的としＤＧＡＴ活性を阻害する物質の探索が行われ、ＤＧＡＴ活性を阻害する食品素材として、これまでに柑橘類に多く含まれるフラボノイド、タンゲレチンがヒト肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞のＤＧＡＴ活性を阻害することが報告されている（非特許文献６）。また、ミカン科の植物ゴシュユ（呉茱萸、Evodia rutaecarpa）の果実に含まれるキノロンアルカロイドにも、ＤＧＡＴ阻害作用があると報告されている（非特許文献７）。しかしながら、これまでに見出されている食品素材は、その効果の面で十分満足のいくものではない。
【０００４】
また、食品素材以外にもＤＧＡＴ活性を阻害する化合物として、フェノキシアセトアミド誘導体やオキサジアゾール誘導体が開示されているが（特許文献１及び２）、いずれも本発明に用いるエラジタンニンとは構造が異なるものである。
【０００５】
エラジタンニンは、植物界に広く存在し、強い抗酸化作用を有することが知られている物質である。このエラジタンニンには、ＤＯＧ型〔ヘキサヒドロキシジフェノイル基（Ｄ）→酸素（Ｏ）→ガロイル基（Ｇ）：エーテル結合の酸素がＤ側からＧ側に供給〕、ＧＯＤ型〔Ｇ→Ｏ→Ｄ：エーテル結合の酸素がＧ側からＤ側に供給〕が知られている。
【０００６】
ＤＯＧ型エラジタンニンとしては、バラ科植物ハマナス（Rosa rugosa）より同定されたルゴシン（Rugosin）Ａ〜Ｇ（非特許文献８及び９）、マンサク科植物フウ(Liquidambar formosana)より同定されたイソルゴシン（Isorugosin）Ａ、Ｂ及びＤ（非特許文献１０）、トウダイグサ科植物コニシキソウ（Euphorbia supina）より同定されたユースピニン（Eusupinin）Ａ（非特許文献１１）が挙げられる。
この内、ルゴシンＤが抗癌作用を有すること、ルゴシンＡ−Ｇが発毛作用やニキビ改善効果を有することが報告されている（特許文献３及び４）。
また、ＧＯＤ型エラジタンニンとしては、バラ科植物ワレモコウ（Sanguisorba officinails）より同定されたサンギイン（Sanguiin）Ｈ−２〜Ｈ−１１（非特許文献１２）、バラ科植物シマバライチゴ（Rubus lambertianus）より同定されたランベルチアニン（Lambertianin）Ａ〜Ｄ（非特許文献１３）、バラ科植物ローザヘンリー（Rosa henryi）より同定されたロシェニン（Roshenin）Ａ〜Ｅ（非特許文献１４）が挙げられている。
この内、サンギインＨ−４が育毛作用を有することが報告されている（特許文献５）。
【０００７】
しかしながら、ルゴシン、イソルゴシン、ユースピニン等のＤＯＧ型エラジタンニン、サンギイン、ランベルチアニン等のＧＯＤ型エラジタンニンに、ＤＧＡＴ阻害作用があることはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８２０１０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／１３８３０４号パンフレット
【特許文献３】特開昭６２−１２９２２０号公報
【特許文献４】特開平３−１８８０１５号公報
【特許文献５】特開２００４−９１３９０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Inoue,S.et al.,Am.J.Clin.Nutr.55,199S-202S(1992)
【非特許文献２】Ryan,D.H.et al.,Obes.Res.3,553S-559S(1995)
【非特許文献３】Monk,J.P.and Todd,P.A.,Drugs.33,539-576(1987)
【非特許文献４】多田紀夫，Ther.Res.,21,2320-2325 (2000)
【非特許文献５】Chen, H. C. et al., J. Clin. Invest. 11, 1715-1722 (2003)
【非特許文献６】Kurowska, E. M. et al., Lipids 39, 143-151 (2004)
【非特許文献７】Ko, J. S. et al., Planta Med. 68, 1131-1133 (2002)
【非特許文献８】Okuda, T. et al. Chem. Pharm. Bull. 30, 4230-4233 (1982)
【非特許文献９】Okuda, T. et al. Chem. Pharm. Bull. 30, 4234-4237 (1982)
【非特許文献１０】Hatano, T. et al. Chem. Pharm. Bull. 36, 3920-3927 (1998)
【非特許文献１１】Agata, I. et al. Chem. Pharm. Bull. 39, 881-883 (1991)
【非特許文献１２】Okuda, T. et al., Phytochemistry, 32 507-521 (1993)
【非特許文献１３】Tanaka, T. et al., Chem. Pharm. Bull., 41 1214-1220 (1993)
【非特許文献１４】Yoshida, T. et al., Chem. Pharm. Bull., 40 1997 (1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善に有効なＤＧＡＴ阻害剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＤＧＡＴの活性を阻害する作用を有する物質について探索を行った結果、エラジタンニン又はその誘導体が優れたＤＧＡＴの活性阻害作用を有し、ＤＧＡＴ阻害剤等として使用できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）エラジタンニン又はその誘導体を有効成分とするＤＧＡＴ阻害剤。
２）エラジタンニン又はその誘導体が、分子内に下記式（１）又は（２）
【００１３】
【化１】
2010070540.tif 000002
【００１４】
で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に式（１）又は（２）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したものである１）のＤＧＡＴ阻害剤。
３）エラジタンニン又はその誘導体が、ルゴシンＡ、ルゴシンＢ、ルゴシンＤ、ユースピニンＡ、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣから選ばれる１種以上である１）又は２）のＤＧＡＴ阻害剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤は優れたＤＧＡＴ阻害作用を有するため、高脂血症、肥満、インスリン抵抗性及び糖尿病の予防又は改善するための医薬品、食品等として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、エラジタンニンとは、ヘキサヒドロジフェノイル基を有し、かつ、加水分解して脱水環化することにより、エラグ酸を生成するタンニンの総称を意味する。
【００１７】
また、本発明において、エラジタンニン誘導体とは、少なくとも下記式（１）又は（２）
【００１８】
【化２】
2010070540.tif 000003
【００１９】
で表される部分構造を有するエラジタンニン関連加水分解性タンニンをいう。
【００２０】
この内、ＤＧＡＴ阻害活性の点から、好適なエラジタンニン誘導体としては、上記式（１）又は（２）で表される部分構造に、さらにグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に上記式（１）又は上記式（２）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したものが挙げられる。
また、エラジタンニンについても、式（１）又は（２）で表される部分構造及びグルコース残基を有し、当該グルコース残基の４位と６位に、上記式（１）又は（２）で表される部分構造のヘキサヒドロジフェノイル基部分が置換したものが好ましい。
【００２１】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体としては、上述のように、前記式（１）で表される部分構造を有するエラジタンニン又はその誘導体（以下、「ＤＯＧ型エラジタンニン又はその誘導体」とも云う）及び前記式（２）で表される部分構造を有するエラジタンニン又はその誘導体（以下、「ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体」とも云う）が挙げられる。
ここで、一般的に、ＤＯＧ型とは、エーテル結合の酸素がヘキサヒドロキシジフェノイル基側からガロイル基側に供給しているタイプ（Ｄ→Ｏ→Ｇ）を云い、ＧＯＤ型とは、エーテル結合の酸素がガロイル基側からヘキサヒドロキシジフェノイル基側に供給（Ｇ→Ｏ→Ｄ）しているタイプを云う。
【００２２】
ＤＯＧ型エラジタンニン又はその誘導体の内、下記式（３）で表されるものが好ましい。
【００２３】
【化３】
2010070540.tif 000004
【００２４】
式（３）中、Ｒ1は、水素原子又はガロイル基を表す。式（３）中、「〜ＯＲ1」は、α型及び／又はβ型の存在を表す。
式（３）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって水素原子又はガロイル基を表すか、又は一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を表す。
式（３）中、Ｒ4は、
【００２５】
【化４】
2010070540.tif 000005
【００２６】
〔式中、Ｒ5及びＲ6は、同一又は異なって水素原子又はガロイル基を表す。〕を表す。
式（３）中、ｎは０又は１を表す。
【００２７】
【化５】
2010070540.tif 000006
【００２８】
ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体の内、下記式（４）で表されるものが好ましい。
【００２９】
【化６】
2010070540.tif 000007
【００３０】
式（４）中、Ｒ7は、Ｒ1と同義である。式（４）中、「〜ＯＲ7」は、α型及び／又はβ型の存在を表す。
式（４）中、Ｒ8及びＲ9は、Ｒ2及びＲ3と同義である。
式（４）中、Ｒ10は、Ｒ4と同義である。
式（４）中、ｍは０〜２（好ましくは０又は１）を表す。
【００３１】
また、ＤＯＧ型エラジタンニン又はその誘導体としては、可食植物に存在し安全性が高い点から、好適には、ルゴシンＡ、ルゴシンＢ、ルゴシンＣ、ルゴシンＤ、ルゴシンＥ、ルゴシンＦ、ルゴシンＧ、イソルゴシンＡ、イソルゴシンＢ及びイソルゴシンＤ等のルゴシン；ユースピニンＡ等のユースピニン等が例示できる。
また、ＧＯＤ型エラジタンニン又はその誘導体としては、可食植物に存在し安全性が高い点から、好適には、サンギインＨ−２、サンギインＨ−３、サンギインＨ−６、サンギインＨ−７、サンギインＨ−８、サンギインＨ−９、サンギインＨ−１０及びサンギインＨ−１１等のサンギイン；ランベルチアニンＡ，ランベルチアニンＢ、ランベルチアニンＣ、ランベルチアニンＤ等のランベルチアニン；ロシェニンＡ、ロシェニンＢ、ロシェニンＣ、ロシェニンＤ、ロシェニンＥ等のロシェニン等が例示できる。
この例示物の内、ＤＧＡＴ阻害活性の点で、ルゴシンＡ、ルゴシンＢ、ルゴシンＤ、ユースピニンＡ、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣが好ましい。
【００３２】
【化７】
2010070540.tif 000008
【００３３】
【化８】
2010070540.tif 000009
【００３４】
【化９】
2010070540.tif 000010
【００３５】
【化１０】
2010070540.tif 000011
【００３６】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体には、公知の化学合成法により得られるものや、エラジタンニン又はその誘導体を主成分とする植物抽出物（例えば、非特許文献８〜１４参照）又はその精製物等も包含される。
例えば、ルゴシンとしては、ハマナス（Rosa rugosa）やピンクローズ（Rosa centifolia）の果実或いは花弁から抽出、又はその抽出物を濃縮もしくは精製したものを使用することができ、ユースピニンとしては、コニシキソウ（Euphorbia supina）の全草やピンクローズ（Rosa centifolia）の果実或いは花弁から抽出、又はその抽出物を濃縮もしくは精製したものを使用することができる。また、サンギイン及びランベルチアニンとしては、ラズベリー（Rubus iadeus）の果実から抽出、又はその抽出物を濃縮もしくは精製したものを使用することができる。
【００３７】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体を抽出するための抽出溶剤としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；アセトン等の有機溶剤を用いるのが好ましく、有機溶剤の内でも水溶性有機溶剤を用いるのがより好ましい。これら有機溶剤は、水を含んでいても良い。
これら抽出溶剤うち、水及び／又は水溶性有機溶剤を用いるのが好ましく、更に、水、エタノール、水・エタノール混液、アセトン又は水・アセトン混液を用いるのがより好ましく、水・エタノール混液又は水・アセトン混液を用いるのがより好ましい。混液中のエタノール又はアセトン濃度は、２０〜８０容量％、より３０〜７０容量％、更に４０〜６０容量％であるのが好ましい。
また、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する方法を併用してもよい。
抽出は、例えば、所望のエラジタンニン又はその誘導体を含有する植物体１重量部に対して１〜５０重量部の溶剤を用い、常温（４℃）〜溶媒の沸点の範囲、更に４〜７０℃の範囲で３０分〜１５日間、更に２時間〜１０日浸漬又は加熱還流するのが好ましい。抽出物の分離精製手段としては、例えば、抽出物を活性炭処理、液々分配、カラムクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、精密蒸留等を挙げることができる。
クロマトグラフィーに用いる固定相としては、例えば、強・弱酸性イオン交換樹脂又は強・弱塩基性イオン交換樹脂；オクタデシル化シリカゲル、オクチル化シリカゲル、ブチル化シリカゲル、トリメチルシリル化シリカゲル等の逆相樹脂；シリカゲル、フロリジール、アルミナ等の順相樹脂；スチレン−ジビニルベンゼン系、メタクリル酸エステル系等の芳香族系合成樹脂；修飾デキストラン系（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  ＬＨ−２０等）、親水性ビニルポリマー系（例えば、トヨパール  ＨＷ−４０等）等のゲルろ過クロマトグラフィー用充填剤；活性炭等が挙げられるが、この内、逆相樹脂及び芳香族系合成樹脂等が好ましい。
【００３８】
ルゴシン及びユースピニンを、ピンクローズ（花弁）から得る抽出手段の一例を挙げるが、抽出手段はこれに限定されるものではない。
ピンクローズ（花弁）から、水・エタノール混液（好ましくは、エタノール濃度が４０〜６０容量％）を用いて、水・エタノール抽出物を得る。この水・エタノール抽出物を水／ヘキサン溶剤（好ましくは、水：ヘキサン（容量比）＝１：３〜３：１）で液液分液した後、水層を分取する。この水層にブタノールを加え、水／ブタノール溶剤（好ましくは、水：ブタノール（容量比）＝１：３〜３：１）で液液分液した後、ブタノール層を分取する。このブタノール層を、芳香族系合成樹脂を用いたクロマトグラフィー（好ましくは、スチレン−ジビニルベンゼン系の芳香族系合成樹脂）に付し、低濃度エタノール水混液（好ましくは、エタノール濃度１０〜３０容量％）で溶出し、低濃度エタノール溶出画分を得る。更に、この低濃度エタノール溶出画分をゲルろ過クロマトグラフィー（好ましくは、修飾デキストラン系充填剤）に付し、メタノール水混液（好ましくは、メタノール濃度４０〜６０容量％）で洗浄後、エタノール、次いでエタノール／アセトン混液（好ましくは、エタノール：アセトン（容量比）＝１：３〜３：１）で溶出して、ルゴシンＢを含み、これを活性主成分とするエタノール画分；ルゴシンＡ、ルゴシンＤ及びユースピニンＡを含み、これらを活性主成分とするエタノール／アセトン画分を得る。このエタノール画分及びエタノール／アセトン画分をそれぞれ逆相樹脂を用いたクロマトグラフィー（好ましくは、オクタデシル化シリカゲル逆相樹脂）に付し、トリフルオロ酢酸水溶液・アセトニトリル混液中のアセトニトリルの濃度を１段階以上勾配させて溶出し、エタノール画分からルゴシンＢを、エタノール／アセトン画分からルゴシンＡ、ルゴシンＤ及びユースピニンＡを、それぞれ単離する。
【００３９】
サンギイン及びランベルチアニンを、ラズベリー（果実）から得る抽出手段の一例を挙げるが、抽出手段はこれに限定されるものではない。
ラズベリー（果実）から、水・エタノール混液（好ましくは、エタノール濃度が４０〜６０容量％）を用いて、水・エタノール抽出物を得る。この水・エタノール抽出物を、芳香族系合成樹脂を用いたクロマトグラフィー（好ましくは、スチレン−ジビニルベンゼン系の芳香族系合成樹脂）に付し、水洗後、含水エタノール（好ましくは、エタノール濃度４０〜６０容量％）で溶出して、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣ６を含み、これらを活性主成分とする含水エタノール溶出画分を得る。更に、この含水エタノール溶出画分を、逆相樹脂を用いたクロマトグラフィー（好ましくは、オクタデシル化シリカゲル逆相樹脂）に付し、ギ酸水溶液・アセトニトリル混液中のアセトニトリルの濃度を１段階以上勾配させて溶出し、保持時間から、サンギインＨ−６及びランベルチアニンＣを、それぞれ単離する。
【００４０】
得られたエラジタンニン又はその誘導体の抽出物や画分は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００４１】
本発明のエラジタンニン又はその誘導体は、後記実施例に示すように、優れたＤＧＡＴ阻害活性を有する。また、ＤＧＡＴ阻害活性を有する物質には、その酵素阻害が非特異的な作用であれば副作用も疑われるが、本発明のエラジタンニン又はその誘導体は、肝臓における主要代謝酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性及びＧ６Ｐａｓｅ活性に対して影響を及ぼさず、ＤＧＡＴに対して特異性であり、人体に対する副作用が少ないものと判断された。
【００４２】
ここで、吸収された脂質は、小腸上皮細胞内で、モノアシルグリセロールアシル基質転移酵素（ＭＧＡＴ）やＤＧＡＴ等の酵素の働きにより、ＴＧに再合成されるが、この様にＤＧＡＴは小腸から体内へのＴＧの取り込みにおいて重要な役割を果たしている。それに加え、ＤＧＡＴは肝臓における超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）の合成・分泌や脂肪組織のＴＧ蓄積においても必要とされる酵素であるため、ＤＧＡＴ活性の阻害は、ＴＧ合成抑制、高脂血症及び肥満の予防・改善の有効な手段となるものと考えられている。
また、ノックアウトマウスを用いた研究により、ＤＧＡＴ欠損マウスでは、体重の減少が見られるのに加えて、血糖値の低下、インスリン感受性の向上、脂肪細胞におけるアディポネクチン発現増加等が認められることから、ＤＧＡＴ活性を阻害することは、インスリン抵抗性や糖尿病の予防・改善の良い手段ともなるものと考えられている（Chen, H. C. et al., J. Clin. Invest. 11, 1715-1722 (2003)）。
従って、当該エラジタンニン又はその誘導体は、ＤＧＡＴ阻害剤として使用でき、さらに製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＤＧＡＴ阻害剤には、当該エラジタンニン又はその誘導体を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００４３】
斯かるＤＧＡＴ阻害剤は、ＤＧＡＴ阻害活性、ＴＧ合成抑制、高脂血症の予防又は改善、肥満の予防又は改善、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の予防又は改善等の各効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品、又は飼料の有効成分として配合して使用可能である。また、当該ＤＧＡＴ阻害剤は、ＤＧＡＴ阻害活性を有すること、ＴＧ合成抑制作用を有すること、高脂血症の予防又は改善、肥満の予防又は改善、インスリン抵抗性若しくは糖尿病の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。
【００４４】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤を医薬品の有効成分として用いた場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
【００４５】
また、斯かる製剤では、本発明のＤＧＡＴ阻害剤を単独で、又は他の薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００４６】
これらの投与形態の内、経口投与が好ましく、経口投与用製剤の有効成分として用いた場合の該製剤中の本発明のエラジタンニン又はその誘導体の含有量は、通常、製剤全質量の０．０１〜８０質量％であり、０．５〜８０質量％であるのが好ましい。
【００４７】
上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人(６０ｋｇ)１人当たりの１日の投与量は、通常、エラジタンニン又はその誘導体として１〜２０００ｍｇ、１０〜１０００ｍｇ、５０〜５００ｍｇがより好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００４８】
本発明のＤＧＡＴ阻害剤を食品の有効成分として用いた場合、当該食品の形態は、固形、半固形または液状であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、及びそれらの原料が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。
【００４９】
種々の形態の食品を調製するには、ＤＧＡＴ阻害剤を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００５０】
また、食品中におけるエラジタンニン又はその誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、飲料の形態では、通常０．００１〜２質量％であり、０．００２〜１質量％が好ましく、０．０１〜０．５質量％がより好ましい。また、錠剤や加工食品などの固形食品形態では、通常０．０１〜２０質量％であり、０．０２〜１０質量％が好ましく、０．１〜５質量％がより好ましい。
【００５１】
また、本発明のＤＧＡＴ阻害剤を飼料の有効成分として用いた場合、当該飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、ＤＧＡＴ阻害剤を単独で、又はこの他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて配合し、常法により当該飼料を加工製造することがきできる。
また、飼料中におけるエラジタンニン又はその誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、０．０１〜２０質量％であり、０．０２〜１０質量％が好ましく、０．１〜５質量％がより好ましい。
【００５２】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【実施例】
【００５３】
製造例１：ピンクローズからの被験物質の調製
ピンクローズ（Rosa centifolia）の花弁６００ｇを、２０倍量（１２リットル）の５０容量％（以下、「容量％」を「％」とする）エタノールに常温で１４日間浸漬し、不溶物を濾別後、減圧濃縮し抽出物を得た（固形分２６０ｇ）。
得られた抽出物をヘキサン／水系にて液々分配し、得られた水層をブタノールで液々抽出した。減圧濃縮し得られたブタノール抽出物（５１ｇ）を、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（スチレン−ジビニルベンゼン系芳香族合成吸着剤）に吸着させ、２０％エタノールで溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮、凍結乾燥し乾燥物とした。さらに、この乾燥物２２ｇを５０％メタノールに溶解し、セファデックス（登録商標）ＬＨ−２０を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに吸着させた。５０％メタノールで洗浄した後、９９．５％エタノール、エタノール／アセトン（１：１）で溶出した。各溶出画分を減圧濃縮、凍結乾燥し、９９．５％エタノール画分（固形分４ｇ）、エタノール／アセトン画分（固形分６．６ｇ）を得た。
得られた９９．５％エタノール画分の内、１２０ｍｇを用い、さらにＨＰＬＣにより分画することにより、ルゴシンＢ（４．３ｍｇ）を得た。分画条件は次の通り。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（２０ｘ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
溶媒：Ａ液  ０．５％トリフルオロ酢酸、Ｂ液  アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝８７／１３→（３０分）→８７／１３→（２０分）→５０／５０
温度：４０℃、流速：２０ｍＬ／分、検出：ＵＶ＝２５８ｎｍ
また、得られたエタノール／アセトン画分の内、３００ｍｇを用い、さらにＨＰＬＣにより分画することにより、ルゴシンＡ（７０ｍｇ），ルゴシンＤ（５９ｍｇ）、ユースピニンＡ（２１ｍｇ）を得た。分画条件は次の通り。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（２０ｘ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
溶媒：Ａ液  ０．５％トリフルオロ酢酸、Ｂ液  アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝８４／１６→（３０分）→８４／１６→（５分）→５０／５０
温度：４０℃、流速：２０ｍＬ／分、検出：ＵＶ＝２５８ｎｍ
なお、これらについて、ＮＭＲ分析（ＪＥＯＬ−５００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ； 日本電子（株））を行なったところ、これらは文献に記されたルゴシンＡ、ルゴシンＢ（非特許文献８）、ルゴシンＤ（非特許文献９）、ユースピニンＡ（非特許文献１１）のシグナルと一致した。
【００５４】
製造例２：ラズベリーからの被験物質の調製
ラズベリー（Rubus idaeus L.）果実の凍結乾燥粉末（FDラズベリーパウダー、協立物産より入手）１００ｇを、１０倍量（１Ｌ）の５０％エタノール水に常温で１５時間浸漬し、不溶物を濾別後、減圧濃縮し抽出物を得た（固形分５９ｇ）。
得られた抽出物の内２０ｇを水に再溶解した後、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（スチレン−ジビニルベンゼン系芳香族合成吸着剤）に吸着させた。ＨＰ−２０を水で洗浄した後、５０％エタノールで溶出した。得られた溶出液は減圧にて濃縮し、ＨＰ−２０分画物１．２１ｇを得た。
さらに、得られた分画物の内４００ｍｇを用い、さらにＨＰＬＣにより、保持時間（サンギインＨ−６：３８〜４１分／ランベルチアニンＣ：３６〜３８分）から分画することにより、サンギインＨ−６（４３ｍｇ）、ランベルチアニンＣ（１６ｍｇ）を得た。分画条件は次の通り。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（２０ｘ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
溶媒：Ａ液  1％ギ酸水溶液、Ｂ液  アセトニトリル
Ａ／Ｂ＝９０／１０→（１０分）→９０／１０→（３０分）→８０／２０
温度：４０℃、流速：１８．９ｍＬ／分、検出：ＵＶ＝２８０ｎｍ
なお、これらについて、ＮＭＲ分析（ブルカーアバンスIII  ６００; ブルカー・バイオスピン（株））を行なったところ、これらは文献に記されたサンギインＨ−６（非特許文献１２）、ランベルチアニンＣ（非特許文献１３）のシグナルと一致した。
【００５５】
実施例１：ＤＧＡＴ活性阻害評価
被験物質として、上記製造例１及び２で調製されたルゴシンＡ、ルゴシンＢ、ルゴシンＤ、ユースピニンＡ、サンギインＨ-６、及びランベルチアニンＣと、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート：入手先  長良サイエンス（株））を用いた。
マウス肝臓より、ミクロソーム画分を下記の様に調製し、ＤＧＡＴ活性測定に使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、６週齢）の肝臓をＳｕｃｒｏｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５））中でホモジナイズし、４℃、１２，５００  ｘ  ｇ、１５分間遠心し上清を回収した。上清をさらに４℃、１００，０００  ｘ  ｇ、６０分間遠心し、沈殿をＳｕｃｒｏｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、肝臓ミクロソーム画分として使用した。
５０μｇの肝臓ミクロソーム画分を、５μＭ又は１０μＭの被験物質を含む２００μＬのＤＧＡＴ活性測定バッファー（２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５），  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ2，  ０．８  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，  １００μＭ  Ｏｌｅｏｙｌ−ＣｏＡ  （０．０５μＣｉ／２００μｌ、５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ），  １．２  ｍＭ  １，２−Ｄｉｏｌｅｉｎ）中で、３７℃、２０分間インキュベートした。１．５  ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：１）を添加することで反応を止めた。次に、２５０μＬのＰＢＳを加えて攪拌し、遠心分離により水層と油層に分離（脂質抽出）した。下層であるクロロホルム層を回収し、窒素ガスで乾燥、クロロホルムに再溶解した。
クロロホルムに溶解した脂質の一部を液体シンチレーションカウンターに供し、放射活性を測定した。約２０００ｄｐｍの抽出脂質の一部をＨＰＴＬＣプレート（２０  ｘ  １０  ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  Ｍｅｒｋ）を用いて分画した。展開溶媒には、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（８０：２０：１）を使用した。ＢＡＳ２５００（富士フィルム）を用いてフルオログラフィー及び定量解析を行った。抽出脂質に取り込まれた総放射活性に対するＴＧに取り込まれた放射活性の割合をＤＧＡＴ活性とした。
【００５６】
各被験物質の存在下でのＤＧＡＴ活性を、表１及び表２に示す。ＤＧＡＴ活性は、溶媒コントロールのＤＧＡＴ活性を１００とした相対値で表す。
表１、及び表２に示される様に、ルゴシンＡ、ルゴシンＢ、ルゴシンＤ、ユースピニンＡ、サンギインＨ-６、及びランベルチアニンＣは、ＤＧＡＴ活性に対し有意な阻害を示した。一方、比較対照としたエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）は、ＤＧＡＴ活性に対し阻害作用を示さなかった。
この様に、エラジタンニンはＤＧＡＴ活性について優れた阻害作用を示すことから、ＤＧＡＴ阻害剤として、更にＴＧ合成抑制剤、高脂血症予防改善剤、肥満予防改善剤、インスリン抵抗性予防改善剤、及び糖尿病予防改善剤としても有用であると考えられる。
【００５７】
【表１】
2010070540.tif 000012
【００５８】
【表２】
2010070540.tif 000013
【００５９】
実施例２：他の酵素活性阻害評価
実施例１で示した様に調製したマウス肝臓ミクロソーム画分を用いて、グルコース６リン酸脱リン酸化酵素（Ｇ６Ｐａｓｅ）活性測定、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素活性の測定を行った。
Ｇ６Ｐａｓｅ活性測定は、マウス肝臓ミクロソーム画分（５０  μｇ）を、５μＭ又は１０μＭの被験物質の存在下で、１００  μｌの反応液（５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ７．２）、１００  ｍＭ  ＫＣｌ、２．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１  ｍＭ  ＤＴＴ、１０  ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で３７℃、３０  分間インキュベートした。次に、４００μｌの反応停止液（０．４２％  ａｍｍｏｎｏｎｉｕｍ  ｍｏｌｙｂｄａｔｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ  ｉｎ  １Ｎ  Ｈ2ＳＯ4、１０％  ＳＤＳ、１０％  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄの６：２：１  混合液）を添加し、５０℃、３０  分間インキュベートした。生じた青色色素を吸光度測定（ＯＤ820）し、無機リン酸溶液を用いて作製した標準曲線より、生じたリン酸濃度を算出することによりＧ６Ｐａｓｅ活性を算出した。
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、マウス肝臓ミクロソーム画分（５０  μｇ）を、５μＭ又は１０μＭの被験物質の存在下で、14Ｃ標識ＨＭＧ−ＣｏＡを含む反応液（０．１２８  ｍＭ  ＨＭＧ−ＣｏＡ  （14Ｃ−ＨＭＧ−ＣｏＡ，  ７２  ＭＢｑ／ｍｍｏｌ），  １  ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０  ｍＭ  ＤＴＴ、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｉｎ  ０．１２  ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ７．２））中で、３７℃、３０  分間インキュベートした。次に、１０分の１容量（２０  μＬ）の５Ｎ  ＨＣｌを添加し、さらに３０分間インキュベート（酸性処理）した。内部標準として４−14Ｃ−ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  （０．０８  ｎＣｉ）を加えた後、酸性処理によりＨＭＧ−ＣｏＡの反応産物メバロン酸から変換、生成するメバロノラクトンを等量の酢酸エチルで抽出した。抽出物の一部を展開溶媒には、ベンゼン−アセトン（１：１）を用いてＴＬＣ分画した。ＢＡＳ２５００を用いてフルオログラフィー及び定量解析を行い、メバロノラクトンに含まれる放射活性よりＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を算出した。
各被験物質の存在下でのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、及びＧ６Ｐａｓｅ活性を、表３〜表６に示す。これら酵素活性は、溶媒コントロールの酵素活性を１００とした相対値で表す。
【００６０】
表３、表４、表５及び表６に示される様に、いずれのエラジタンニンもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、及びＧ６Ｐａｓｅ活性に対して阻害作用を示さなかった。
この様に、エラジタンニンはＤＧＡＴ活性について優れた阻害作用を示す一方で、その他の酵素活性には阻害作用を示さないことから、ＤＧＡＴ活性に対する特異性が高い化合物であることが示された。このことは、エラジタンニンが副作用の少ない化合物であることを意味するものと考えることができる。
【００６１】
【表３】
2010070540.tif 000014
【００６２】
【表４】
2010070540.tif 000015
【００６３】
【表５】
2010070540.tif 000016
【００６４】
【表６】
2010070540.tif 000017
【００６５】
実施例３
下記の成分を混合後ゼラチンカプセルに充填し、１錠２５０ｍｇの軟カプセル剤を得た。
（組成）                （％）
ルゴシンＢ              ２．５
大豆レシチン          １０
菜種油                ８７．５
【００６６】
実施例４
下記の成分を混合後ゼラチンカプセルに充填し、１錠２５０ｍｇの軟カプセル剤を得た。
（組成）                （％）
ルゴシンＢ              ０．５
ユースピニンＡ          ２．５
大豆レシチン          １０
紅花油                ８７
【００６７】
実施例５
下記成分を用い、常法に従って１錠２００ｍｇの錠剤を製造した。
（組成）                                      （％）
ルゴシンＤ、又はユースピニンＡ                ２．５
ヒドロキシプロピルセルロース                ４５．５
軽質無水ケイ酸                                ５
乳糖                                        １３
結晶セルロース                              １３
タルク                                      １３
ジアシルグリセロール                          ８
【００６８】
実施例６
下記成分を用い、常法に従って１錠２００ｍｇの錠剤を製造した。
（組成）                                      （％）
ルゴシンＢ又はユースピニンＡ                  ５
デンプン                                    ９０
ステアリン酸マグネシウム                      ５
【００６９】
実施例７
緑茶葉３０ｇを６５℃の水１０００ｍＬで５分間抽出、ろ別することにより緑茶液を得た。この緑茶液を用いて下記組成物を混合した後、重曹を用いてｐＨ６．０に調整し、肥満・糖尿病予防・改善用緑茶飲料を製造した。
（組成）
ルゴシンＢ                  ５０ｍｇ
ビタミンＣ              １０００ｍｇ
緑茶液                  １０００ｍＬ
【００７０】
実施例８
下記組成物を混合し、肥満・糖尿病予防・改善用果汁飲料を製造した。
（組成）
ルゴシンＢ                ５０ｍｇ
ビタミンＣ              ５００ｍｇ
レモン果汁                  ５ｍＬ
炭酸水                  ４７５ｍＬ
香料                      若干量
アスパルテーム              ５ｇ
【００７１】
実施例９
下記組成物を打錠し、１錠１０００ｍｇのチュアブルタイプのタブレット食品を製造した。
（組成）                      （％）
ユースピニンＡ                ２．５
麦芽糖                      １１
乳糖                        ３０
ブドウ糖                    １５
ビタミンＣ                  ２０
ビタミンＥ                    １
セルロース                  １０
キシリトール                １０
香料                          ０．５
【００７２】
実施例１０
下記成分を用い、常法に従って一錠1０００ｍｇのペットフードを製造した。
（組成）                                        （％）
サンギインＨ−６、又はランベルチアニンＣ          １
大麦                                            ３８
チキンミール                                    １８
コーングルンテンミール                          １８
ソルガム（レッドマイロ）                        １０
菜種、大豆混合油                                  ５
ピートパルプ                                      ５
ビタミンミックス                                  ３
ミネラルミックス                                  ２
チキンオイル                                      １