(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓、肺等の器官再生の強化又は開始のための新規方法の提供。【解決手段】器官再生の強化又は開始を必要とする対象における器官再生を強化するか又は開始させる方法であって、該対象の器官再生が望まれる体の領域に、該器官に特異的な内皮細胞又は該器官に特異的な誘導内皮細胞を投与することを含む、器官再生を強化するか又は開始させる、上記方法。前記器官としては肝臓又は肺が好ましい。前記器官が肝臓である場合、前記方法は肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）又は誘導ＬＳＥＣの肝内移植を含むことが好ましく、ＶＥＧＦ−Ａの投与を含むことが更に好ましい。前記器官が肺である場合、前記方法は肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）又は誘導ＰＣＥＣの静脈内又は気管内移植を含むことが好ましく、ＭＭＰ１４、ＶＥＧＦ−Ａ及びＦＧＦから選択される１又は２以上の投与を含むことが更に好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官再生の強化又は開始を必要とする対象における器官再生を強化するか又は開始させる方法であって、該対象の器官再生が望まれる体の領域に、該器官に特異的な内皮細胞又は該器官に特異的な誘導内皮細胞を投与することを含む、器官再生を強化するか又は開始させる、上記方法。
【請求項２】
前記器官が肝臓であり、かつ前記方法が肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）又は誘導ＬＳＥＣの肝内移植を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦ−Ａの投与をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＬＳＥＣ又は誘導ＬＳＥＣが、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３
４-第ＶＩＩＩ因子+ＬＳＥＣである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
肝細胞の投与をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記器官が肺であり、かつ前記方法が肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）又は誘導ＰＣＥＣの静脈内又は気管内移植を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＭＭＰ１４、ＶＥＧＦ−Ａ、又はＦＧＦの１つ又はそれ以上の投与をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＣＥＣ又は誘導ＰＣＥＣがＭＭＰ１４を発現する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上皮前駆細胞の投与をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記肝細胞を肝類洞内皮細胞と共培養することによって培養中の前記肝細胞を増大させる方法。
【請求項１１】
肺上皮前駆細胞を肺毛細血管内皮細胞と共培養することによって培養中の前記肺上皮前駆細胞を増大させる方法。
【請求項１２】
器官再生の強化又は誘導を必要とする対象における器官再生を強化又は誘導する方法であって、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＦＧＦ−２、ＭＭＰ１４、ＥＧＦ、又は他のＥＧＦ−受容体リガンドの１つ又はそれ以上を、該対象の器官再生の強化又は誘導に十分な量で該対象に投与することを含む、器官再生を強化又は誘導する方法。
【請求項１３】
器官が肝臓である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
器官が肺である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
器官再生を必要とする対象に投与するための医薬組成物であって、該器官に特異的な単離された内皮細胞、又は該器官に特異的な単離された誘導内皮細胞を薬学的に許容しうる担体と組み合わせて含む、上記医薬組成物。
【請求項１６】
前記内皮細胞又は誘導内皮細胞が自己細胞である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
器官が肝臓であり、かつ細胞がＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３
４-第ＶＩＩＩ因子+ＬＳＥＣである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、又はＭＭＰ１４の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項１５の医薬組成物。
【請求項１９】
器官が肺であり、かつ細胞がＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＣＤ３１+ＦＧＦＲ１+ＰＣＥＣである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+細胞である
細胞を単離することを含む、肝特異的内皮細胞を単離する方法。
【請求項２１】
ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＣＤ３１+ＦＧＦＲ１+細胞である細胞を単
離することを含む、肺特異的内皮細胞を単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１０年１１月９日に出願された米国仮出願第６１／４１１，７３２号及び２０１１年１０月１１日に出願された米国仮出願第６１／５４５，８５１号に対する優先権を請求し、それらはいずれも全体として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
連邦支援の研究に関する供述
本発明は、国立心肺血液研究所（National Heart, Lung and Blood Institute）によって認定された認可番号第５Ｐ５０ＨＬ０８４９３６−０３号の下で政府支援により行われた。米国政府は、本発明における相応の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
内皮細胞（ＥＣ）は、血管の内側、すなわち管腔表面を覆っている細胞である。胚形成中に、内皮細胞は、血液循環の発生前に器官形成を誘導する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。これらの所見は、内皮細胞が、養分及び酸素を送達する受動的な導管（passive conduit）を形成するだけでなく、また、有益な血管性ニッ
チ（vascular niche）を確立しており、これは、造血を支える内皮細胞由来のアンギオクリン因子と同様のやり方で、パラクリンのトロフォゲン（trophogens）の合成を通して器官再生を刺激することを示唆している（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。しかし、内皮細胞の組織特異的サブセットが、成体の器官形成を促進する正確な機構は、知られていない。
【０００４】
毛細血管内皮細胞（ＥＣ）は、個々の器官の微小血管系の構成単位を形成し、器官特異的表現型及び機能的属性を与えている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。毛細血管ＥＣは、酸素及び養分を送達し、また、器官発生（非特許文献２；非特許文献１；非特許文献３）及びアンギオクリン因子（angiocrine factors）とも称する、組織特異的パラクリン増殖因子の合成を通して成体の器官再生を支えている（非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００５】
肝特異的内皮細胞及び骨髄特異的内皮細胞。類洞内皮細胞（ＳＥＣ）は、骨髄及び肝臓を含む、特定の器官に血管を新生する、構造的かつ機能的に独特な毛細血管網を構成する。成体マウスでは、骨髄ＳＥＣは、特異的アンギオクリントロフォゲン、例えばＮｏｔｃｈリガンドの発現を通して、造血再生（haematopoietic regeneration）を支える（非特
許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。同様に、肝循環（hepatic circulation）では、主に肝ＳＥＣ（非特許文献１９；非特許文献２０）（ＬＳＥ
Ｃ）によって内側が覆われており、各肝細胞は、ＬＳＥＣに対して細胞の近くに存在する。肝再生には、肝細胞の増殖が必要である。しかし、肝内皮細胞の表現型の定義及び操作定義の欠如、並びに関連したマウス血管新生遺伝モデル（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３)の不足のため、肝再生の調節におけるＬＳＥＣの役割の研究は、不
利な立場に置かれている（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。
【０００６】
骨髄（ＢＭ）内のＳＥＣは、表現型的にも機能的にも控えめなＥＣの集団を含む。化学療法及び照射後、活性化されたＢＭ ＳＥＣは、Ｎｏｔｃｈリガンド及びＩＧＦＢＰのア
ンギオクリン発現によって造血性に戻る（非特許文献２９；非特許文献３０）。成体マウスのＢＭ ＳＥＣにおけるＶＥＧＦ−Ａ受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）の条件つきの欠失（
非特許文献３１）は、アンギオクリン因子の産生を損なうことによってＢＭ再生を阻害す
る。
【０００７】
肺特異的内皮細胞。肺分化中に、血管網（毛細血管）は、肺胞と平行して発生する（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。ガス交換を促進する独特な器官として、肺胞は、すべての肺胞の内側を覆っており、かつ上皮細胞に隣接して存在する肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）により、高度に血管が発達している（非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９）。肺の発生及び再生は、肺胞上皮細胞（ＡＥＣ）（非特許文献４０；非特許文献４１）及び気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣ）（非特許文献４２；非特許文献４３）のサブセットを含む、上皮前駆細胞（非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６）の増殖に依存性の過程である肺胞形成（alveologenesis）によって引き起こされる。
【０００８】
肺胞の毛細血管界面の形成は、肺ガス交換機能にとって重要である（非特許文献４７；非特許文献４８；非特許文献４９；非特許文献５０）。ＰＣＥＣは、肺胞増殖（alveolarization）の誘導（非特許文献５１；非特許文献５２）、再生肺胞のリモデリング（非特
許文献５３）に関与する特別な毛細血管系であるが、ＰＣＥＣが肺胞発生を調節する正確な機構は、知られていない。
【０００９】
増殖発芽血管新生（proliferative sprouting angiogenesis）を受けて肺胞を血管新生化するその能力（非特許文献５４；非特許文献５５；非特許文献５６）に加えて、ＰＣＥＣは、パラクリン因子産生によって、内胚葉及び中胚葉の前駆体が、肺上皮及び血管の初期前駆細胞へ分化するのを指示している（非特許文献５７；非特許文献５８）。これらの所見は、ＰＣＥＣが、アンギオクリン増殖シグナルの生成によって肺胞形成を促進しうることを示唆している。しかしながら、ＰＣＥＣ由来の指示的シグナルが、成体肺の再生肺胞増殖を誘発できるかどうかは、研究されていない。実際に、マウス肺再生遺伝モデルの不足及びＰＣＥＣの操作定義の欠如のため、成体肺の肺胞再生の誘導におけるＰＣＥＣの研究は、不利な立場に置かれている。
【００１０】
左側肺切除（left unilateral pneumonectomy）（ＰＮＸ）として知られている左肺の
外科的除去から、肺胞形成によって、残存する右肺の無傷の葉における質量及び体積の増大（expansion）が誘導される（非特許文献５９；非特許文献６０；非特許文献６１）。
しかし、ＰＮＸが未損傷の肺で再生肺胞形成を開始して持続させる正確な機構は、知られていない。肺再生を調節する細胞及び分子機構を明らかにすることは、呼吸器障害を治療する戦略の開発に不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Matsumoto, Science 294:559-563 (2001)
【非特許文献２】Lammert, Science 294:564-567 (2001)
【非特許文献３】Sakaguchi, Curr. Biol. 18:1565-1571 (2008)
【非特許文献４】Makita, Nature 452:759-763 (2008)
【非特許文献５】Butler, Cell Stem Cell 6:1-14 (2010)
【非特許文献６】Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009)
【非特許文献７】Butler, J. Nature Rev. Cancer 10:138-146 (2010)
【非特許文献８】Kabayashi, Nature Cell Biol. (doi: 10.1038/ncb2108) (2010)
【非特許文献９】Aird, Circulation research 100:158-173 (2007)
【非特許文献１０】Carmeliet, Nature 438:932-936 (2005)
【非特許文献１１】Red-Horse, Developmental cell 12:181-194 (2007)
【非特許文献１２】Ruoslahti, Annual review of immunology 18:813-827 (2000)
【非特許文献１３】Butler, Nature reviews 10:138-146 (2010a)
【非特許文献１４】Butler, Cell stem cell 6:251-264 (2010b)
【非特許文献１５】Butler, Cell Stem Cell 6:1-14 (2010)
【非特許文献１６】Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009)
【非特許文献１７】Butler, JNature Rev. Cancer 10:138-146 (2010)
【非特許文献１８】Kabayashi, Nature Cell Biol. (doi: 10.1038/ncb2108) (2010)
【非特許文献１９】Lee, Hepatology 45:817-825 (2007)
【非特許文献２０】Klein, Hepatology 47:1018-1031 (2008)
【非特許文献２１】Greene, Ann. Surg. 237:530-535 (2003)
【非特許文献２２】Van Buren, J. Clin. Oncol. 26:1836-1842 (2008)
【非特許文献２３】LeCouter, Science 299:890-893 (2003)
【非特許文献２４】Zaret, Science 322:1490-1494 (2008)
【非特許文献２５】Fausto, Hepatology 43:S45-S53 (2006)
【非特許文献２６】Michalopoulos, Science 276:60-66 (1997)
【非特許文献２７】Greenbaum, J. Clin. Invest. 102:996-1007 (1998)
【非特許文献２８】Huh, Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:4477-4482 (2004)
【非特許文献２９】Butler, Cell stem cell 6:251-264 (2010b)
【非特許文献３０】Kobayashi, Nature cell biology 12:1046-1056 (2010)
【非特許文献３１】Hooper, Cell stem cell 4: 263-274 (2009)
【非特許文献３２】Cardoso, Annual review of physiology 63:471-494 (2001)
【非特許文献３３】Metzger, Nature 453:745-750 (2008)
【非特許文献３４】White, Development 134:3743-3752 (2007)
【非特許文献３５】Bhattacharya, Chest 128:553S-555S. (2005)
【非特許文献３６】Komarova, Annual review of physiology 72:463-493 (2010)
【非特許文献３７】Muzykantov, Expert opinion on drug delivery 2:909-926 (2005)
【非特許文献３８】Petrache, Nature medicine 11:491-498 (2005)
【非特許文献３９】Voelkel, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290:L209-221 (2006)
【非特許文献４０】Chapman, The Journal of clinical investigation 121:2855-2862 (2011)
【非特許文献４１】Liu, The Journal of experimental medicine 208:1473-1484 (2011)
【非特許文献４２】Kim, Cell 121:823-835 (2005)
【非特許文献４３】Zhang, Nature genetics 40:862-870 (2008)
【非特許文献４４】Kotton, Cell and tissue research 331:145-156 (2008)
【非特許文献４５】Rock, Annual review of cell and developmental biology (2011)
【非特許文献４６】Stripp, Proceedings of the American Thoracic Society 5:328-333 (2008)
【非特許文献４７】Giordano, The Journal of biological chemistry 283:29447-29460 (2008)
【非特許文献４８】Huh, Science 328:1662-1668 (2010)
【非特許文献４９】Petersen, Science (New York, NY 329:538-541 (2010)
【非特許文献５０】Vaporciyan, Science (New York, NY 262:1580-1582 (1993)
【非特許文献５１】DeLisser, The Journal of biological chemistry 281:8724-8731 (2006)
【非特許文献５２】Leuwerke, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282:L1272-1278 (2002)
【非特許文献５３】Metzger, Nature 453:745-750 (2008)
【非特許文献５４】Alvarez, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:L419-430.(2008)
【非特許文献５５】Del Moral, Developmental biology 290:177-188 (2006)
【非特許文献５６】Shu, Development 129:4831-4842 (2002)
【非特許文献５７】Bhattacharya, Chest 128:553S-555S. (2005)
【非特許文献５８】Yamamoto, Developmental biology 308:44-53 (2007)
【非特許文献５９】Cowan, The American review of respiratory disease 111:267-277 (1975)
【非特許文献６０】Leuwerke, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282:L1272-1278 (2002)
【非特許文献６１】Nolen-Walston, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:L1158-1165 (2008)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の開示は、器官再生の強化又は誘導を必要とする対象（subject）において器官
再生を強化又は誘導する方法を提供する。一実施態様において、器官再生の強化又は開始を必要とする対象において器官再生を強化するか又は開始させる方法であって、前記対象の器官再生が望まれる体の領域に、前記器官に特異的な内皮細胞又は前記器官に特異的な誘導内皮細胞（inductive endothelial cells）を投与することを含む、器官再生を強化
又は誘導する方法を提供する。
【００１３】
別の実施態様は、肝再生の強化又は開始を必要とする対象において肝再生を強化するか又は開始させる方法であって、肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）又は誘導ＬＳＥＣ肝内移植を含む、肝再生を強化するか又は開始させる方法を提供する。この実施態様は、ＶＥＧＦ−Ａ又は肝細胞の投与をさらに含むことができる。さらなる実施態様において、ＬＳＥＣ又は誘導ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+ＬＳＥＣである。
【００１４】
さらに別の実施態様は、肺再生の強化又は開始を必要とする対象において肺再生を強化する又は開始する方法であって、肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）又は誘導ＰＣＥＣの静脈内又は気管内移植を含む、肺再生を強化する又は開始する方法を提供する。この実施態様は、上皮前駆細胞、ＭＭＰ１４、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＦＧＦの投与をさらに含むことができる。さらなる実施態様において、前記ＰＣＥＣ又は誘導ＰＣＥＣは、ＭＭＰ１４を発現する。
【００１５】
さらに別の実施態様は、肝細胞を肝類洞内皮細胞と共培養することによって、培養中の当該肝細胞を増大させる方法を提供する。さらなる実施態様は、肺上皮前駆細胞を肺毛細血管内皮細胞と共培養することによって、培養中の前記肺上皮前駆細胞を増大させる方法を提供する。
【００１６】
さらなる実施態様は、器官再生の強化又は誘導を必要とする対象において器官再生を強化又は誘導する方法であって、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＦＧＦ−２、ＭＭＰ１４、ＥＧＦ、又は他のＥＧＦ−受容体リガンドの１つ又はそれ以上を、前記対象において器官再生を強化又は誘導するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、器官再生を強化又は誘導する方法を提供する。さらなる実施態様において、器官は、肝臓又は肺である。
【００１７】
別の実施態様において、器官再生を必要とする対象への投与に有用な組成物であって、前記器官に特異的な単離された内皮細胞、又は前記器官に特異的な単離された誘導内皮細胞を、場合により薬学的に許容しうる担体と組み合わせて含む、組成物が提供される。さ
らなる実施態様において、前記内皮細胞又は誘導内皮細胞は、自己細胞である。別の実施態様において、組成物は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、又はＭＭＰ１４の１つ又はそれ以上をさらに含む。
【００１８】
別の実施態様において、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+ＬＳＥＣを含む、肝再生を必要とする対象への投与に有用な組成物を提供す
る。別の実施態様において、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＣＤ３１+ＦＧＦＲ１+ＰＣＥＣを含む、肺再生を必要とする対象への投与に有用な組成物を提供する。
【００１９】
さらなる実施態様は、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+細胞である細胞を単離することを含む、肝特異的内皮細胞の単離方法を提供す
る。別の実施態様は、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＣＤ３１+ＦＧＦＲ１+
細胞である細胞を単離することを含む、肺特異的内皮細胞の単離方法を提供する。
特許又は出願資料は、カラーで作製された図面を含む。カラー図面付きのこの特許又は特許出願刊行物のコピーは、申請して必要な料金の支払うと、官庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】肝再生及び肺再生における器官特異的内皮細胞由来のアンギオクリンシグナルの誘導的役割。Ａ、肝類洞の内側を覆っているＬＳＥＣは、肝細胞の近くにある。肝質量の７０％を切除（部分肝切除、ＰＨ）すると、誘導血管新生ＬＳＥＣ（inductive angiogenic LSECs）は、特異的アンギオクリンシグナルの合成により、近位肝細胞の再生を開始して持続させる。Ｍ、Ｒ、Ｌ、及びＣａｕは、肝臓の中葉、右葉、左葉、及び尾状葉である。Ｂ、肺上皮前駆細胞の増殖による再生肺胞増殖。ＰＮＸに誘導された肺胞再生は、主にＢＡＳＣ及びＡＥＣのＰＣＥＣ誘発性増幅（PCEC-driven amplification）によって仲介される。
【図２−１】７０％部分肝切除（ｐＨ）によって誘導された生理学的肝再生に対するＬＳＥＣの表現型の特徴及び寄与。Ａ、ＶＥＧＦＲ２−ＧＦＰレポーターマウスから得た肝臓断面図（Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009)）。肝再生中、ＶＥＧＦＲ２は、もっぱら肝内皮細胞で発現される。Ｂ、ＬＳＥＣではＶＥＧＦＲ３の発現が制限されたが、ＣＤ３４+大血管又は肝細胞では制限されなかった。Ｃ、肝非実質細胞の多変性フローサイトメトリー分析。ＣＤ４５-であるＶＥＧＦＲ２＋細胞は、内皮特異的ＶＥカドヘリンを発現する。Ｄ、主要画分（predominant fraction）がＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+Ｐｒｏｘ−１-である、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ４５-ＬＳＥＣでのＶＥＧＦＲ３の特異的発現。従って、ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-細胞として同定することができた。Ｅ、部分肝切除の４８時間後、Ｅ−カドヘリン＋Ｐ−Ｈ３＋有糸分裂肝細胞は、ＶＥ−カドヘリン+及びＶＥＧＦＲ２+内皮細胞の近くに局在化された。ｆ、ｇ、肝再生中のＬＳＥＣ増大（expansion）（Ｆ）及び肝細胞有糸分裂（Ｇ）の動態（ｎ＝４）；ｈｐｆ、強拡大視野。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。
【図２−２】７０％部分肝切除（ｐＨ）によって誘導された生理学的肝再生に対するＬＳＥＣの表現型の特徴及び寄与。Ａ、ＶＥＧＦＲ２−ＧＦＰレポーターマウスから得た肝臓断面図（Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009)）。肝再生中、ＶＥＧＦＲ２は、もっぱら肝内皮細胞で発現される。Ｂ、ＬＳＥＣではＶＥＧＦＲ３の発現が制限されたが、ＣＤ３４+大血管又は肝細胞では制限されなかった。Ｃ、肝非実質細胞の多変性フローサイトメトリー分析。ＣＤ４５-であるＶＥＧＦＲ２＋細胞は、内皮特異的ＶＥカドヘリンを発現する。Ｄ、主要画分（predominant fraction）がＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+Ｐｒｏｘ−１-である、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ４５-ＬＳＥＣでのＶＥＧＦＲ３の特異的発現。従って、ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-細胞として同定することができた。Ｅ、部分肝切除の４８時間後、Ｅ−カドヘリン＋Ｐ−Ｈ３＋有糸分裂肝細胞は、ＶＥ−カドヘリン+及びＶＥＧＦＲ２+内皮細胞の近くに局在化された。ｆ、ｇ、肝再生中のＬＳＥＣ増大（expansion）（Ｆ）及び肝細胞有糸分裂（Ｇ）の動態（ｎ＝４）；ｈｐｆ、強拡大視野。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。
【図２−３】７０％部分肝切除（ｐＨ）によって誘導された生理学的肝再生に対するＬＳＥＣの表現型の特徴及び寄与。Ａ、ＶＥＧＦＲ２−ＧＦＰレポーターマウスから得た肝臓断面図（Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009)）。肝再生中、ＶＥＧＦＲ２は、もっぱら肝内皮細胞で発現される。Ｂ、ＬＳＥＣではＶＥＧＦＲ３の発現が制限されたが、ＣＤ３４+大血管又は肝細胞では制限されなかった。Ｃ、肝非実質細胞の多変性フローサイトメトリー分析。ＣＤ４５-であるＶＥＧＦＲ２＋細胞は、内皮特異的ＶＥカドヘリンを発現する。Ｄ、主要画分（predominant fraction）がＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+Ｐｒｏｘ−１-である、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ４５-ＬＳＥＣでのＶＥＧＦＲ３の特異的発現。従って、ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-細胞として同定することができた。Ｅ、部分肝切除の４８時間後、Ｅ−カドヘリン＋Ｐ−Ｈ３＋有糸分裂肝細胞は、ＶＥ−カドヘリン+及びＶＥＧＦＲ２+内皮細胞の近くに局在化された。ｆ、ｇ、肝再生中のＬＳＥＣ増大（expansion）（Ｆ）及び肝細胞有糸分裂（Ｇ）の動態（ｎ＝４）；ｈｐｆ、強拡大視野。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。
【図３−１】ＬＳＥＣ中のＶＥＧＦＲ２−Ｉｄ１活性化は、部分肝切除によって誘導された肝再生を仲介する。Ａ、Ｂ、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝５）では、部分肝切除後の肝細胞増殖が損なわれる。Ｃ〜Ｅ、部分肝切除後のＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝４〜６）における、肝質量再生（Ｃ）及び機能性ＶＥ−カドヘリン＋イソレクチン＋血管形成（Ｄ，Ｅ）の阻害。Ｆ、Ｇ、ＶＥＧＦ−Ａ１６４の注射は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣ数（Ｇ）の漸増を伴って、肝質量（Ｆ）の再生を促進したが、ＶＥＧＦＲ１特異的リガンドＰｌＧＦは、促進しなかった（ｎ＝４）。Ｈ、Ｉｄ１VenusYFPマウス（Nam, Cell Stem Cell 5:515 -526 (2009)）の再生肝断面図。Ｉｄ１は、部分肝切除によってＶＥ−カドヘリン+血管で選択的に上方制御される。Ｉ、ＶＥＧＦＲ２欠失は、再生肝中のＩｄ１上方制御を弱める（ｎ＝５）。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦＲ２fl/+（Ｂ〜Ｅ、I）に対して、ＰｌＧＦ処置群（Ｆ）に対して。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．Ｊ、Ｒｏｓａ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxのタモキシフェン処置後の肝内皮細胞中のＶＥＧＦＲ２の選択的ノックダウン、Ｎ＝４。Ｋ、ＶＥ−カドヘリン-ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxマウスにおける内皮特異的ＶＥＧＦＲ２ノックダウンの定量。
【図３−２】ＬＳＥＣ中のＶＥＧＦＲ２−Ｉｄ１活性化は、部分肝切除によって誘導された肝再生を仲介する。Ａ、Ｂ、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝５）では、部分肝切除後の肝細胞増殖が損なわれる。Ｃ〜Ｅ、部分肝切除後のＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝４〜６）における、肝質量再生（Ｃ）及び機能性ＶＥ−カドヘリン＋イソレクチン＋血管形成（Ｄ，Ｅ）の阻害。Ｆ、Ｇ、ＶＥＧＦ−Ａ１６４の注射は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣ数（Ｇ）の漸増を伴って、肝質量（Ｆ）の再生を促進したが、ＶＥＧＦＲ１特異的リガンドＰｌＧＦは、促進しなかった（ｎ＝４）。Ｈ、Ｉｄ１VenusYFPマウス（Nam, Cell Stem Cell 5:515 -526 (2009)）の再生肝断面図。Ｉｄ１は、部分肝切除によってＶＥ−カドヘリン+血管で選択的に上方制御される。Ｉ、ＶＥＧＦＲ２欠失は、再生肝中のＩｄ１上方制御を弱める（ｎ＝５）。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦＲ２fl/+（Ｂ〜Ｅ、I）に対して、ＰｌＧＦ処置群（Ｆ）に対して。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．Ｊ、Ｒｏｓａ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxのタモキシフェン処置後の肝内皮細胞中のＶＥＧＦＲ２の選択的ノックダウン、Ｎ＝４。Ｋ、ＶＥ−カドヘリン-ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxマウスにおける内皮特異的ＶＥＧＦＲ２ノックダウンの定量。
【図３−３】ＬＳＥＣ中のＶＥＧＦＲ２−Ｉｄ１活性化は、部分肝切除によって誘導された肝再生を仲介する。Ａ、Ｂ、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝５）では、部分肝切除後の肝細胞増殖が損なわれる。Ｃ〜Ｅ、部分肝切除後のＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝４〜６）における、肝質量再生（Ｃ）及び機能性ＶＥ−カドヘリン＋イソレクチン＋血管形成（Ｄ，Ｅ）の阻害。Ｆ、Ｇ、ＶＥＧＦ−Ａ１６４の注射は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣ数（Ｇ）の漸増を伴って、肝質量（Ｆ）の再生を促進したが、ＶＥＧＦＲ１特異的リガンドＰｌＧＦは、促進しなかった（ｎ＝４）。Ｈ、Ｉｄ１VenusYFPマウス（Nam, Cell Stem Cell 5:515 -526 (2009)）の再生肝断面図。Ｉｄ１は、部分肝切除によってＶＥ−カドヘリン+血管で選択的に上方制御される。Ｉ、ＶＥＧＦＲ２欠失は、再生肝中のＩｄ１上方制御を弱める（ｎ＝５）。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦＲ２fl/+（Ｂ〜Ｅ、I）に対して、ＰｌＧＦ処置群（Ｆ）に対して。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．Ｊ、Ｒｏｓａ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxのタモキシフェン処置後の肝内皮細胞中のＶＥＧＦＲ２の選択的ノックダウン、Ｎ＝４。Ｋ、ＶＥ−カドヘリン-ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxマウスにおける内皮特異的ＶＥＧＦＲ２ノックダウンの定量。
【図３−４】ＬＳＥＣ中のＶＥＧＦＲ２−Ｉｄ１活性化は、部分肝切除によって誘導された肝再生を仲介する。Ａ、Ｂ、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝５）では、部分肝切除後の肝細胞増殖が損なわれる。Ｃ〜Ｅ、部分肝切除後のＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝４〜６）における、肝質量再生（Ｃ）及び機能性ＶＥ−カドヘリン＋イソレクチン＋血管形成（Ｄ，Ｅ）の阻害。Ｆ、Ｇ、ＶＥＧＦ−Ａ１６４の注射は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣ数（Ｇ）の漸増を伴って、肝質量（Ｆ）の再生を促進したが、ＶＥＧＦＲ１特異的リガンドＰｌＧＦは、促進しなかった（ｎ＝４）。Ｈ、Ｉｄ１VenusYFPマウス（Nam, Cell Stem Cell 5:515 -526 (2009)）の再生肝断面図。Ｉｄ１は、部分肝切除によってＶＥ−カドヘリン+血管で選択的に上方制御される。Ｉ、ＶＥＧＦＲ２欠失は、再生肝中のＩｄ１上方制御を弱める（ｎ＝５）。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦＲ２fl/+（Ｂ〜Ｅ、I）に対して、ＰｌＧＦ処置群（Ｆ）に対して。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．Ｊ、Ｒｏｓａ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxのタモキシフェン処置後の肝内皮細胞中のＶＥＧＦＲ２の選択的ノックダウン、Ｎ＝４。Ｋ、ＶＥ−カドヘリン-ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxマウスにおける内皮特異的ＶＥＧＦＲ２ノックダウンの定量。
【図３−５】ＬＳＥＣ中のＶＥＧＦＲ２−Ｉｄ１活性化は、部分肝切除によって誘導された肝再生を仲介する。Ａ、Ｂ、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝５）では、部分肝切除後の肝細胞増殖が損なわれる。Ｃ〜Ｅ、部分肝切除後のＶＥＧＦＲ２fl/flマウス（ｎ＝４〜６）における、肝質量再生（Ｃ）及び機能性ＶＥ−カドヘリン＋イソレクチン＋血管形成（Ｄ，Ｅ）の阻害。Ｆ、Ｇ、ＶＥＧＦ−Ａ１６４の注射は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣ数（Ｇ）の漸増を伴って、肝質量（Ｆ）の再生を促進したが、ＶＥＧＦＲ１特異的リガンドＰｌＧＦは、促進しなかった（ｎ＝４）。Ｈ、Ｉｄ１VenusYFPマウス（Nam, Cell Stem Cell 5:515 -526 (2009)）の再生肝断面図。Ｉｄ１は、部分肝切除によってＶＥ−カドヘリン+血管で選択的に上方制御される。Ｉ、ＶＥＧＦＲ２欠失は、再生肝中のＩｄ１上方制御を弱める（ｎ＝５）。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦＲ２fl/+（Ｂ〜Ｅ、I）に対して、ＰｌＧＦ処置群（Ｆ）に対して。スケールバー、５０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．Ｊ、Ｒｏｓａ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxのタモキシフェン処置後の肝内皮細胞中のＶＥＧＦＲ２の選択的ノックダウン、Ｎ＝４。Ｋ、ＶＥ−カドヘリン-ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/floxマウスにおける内皮特異的ＶＥＧＦＲ２ノックダウンの定量。
【図４−１】ＬＳＥＣのＩｄ１上方制御は、肝再生に不可欠である。Ａ、Ｉｄ１-/-マウスは、その野生型（ＷＴ）同腹子と比較して、肝質量の再生障害を示し、これはＶＥＧＦ−Ａ164投与による救済（rescued）に失敗している（ｎ＝５）。Ｂ、Ｃ、部分肝切除後のＩｄ１-/-マウスにおける、肝細胞増殖障害（Ｂ）及びＶＥ−カドヘリン+イソレクチン+血管の構築（Ｃ）（ｎ＝５）。Ｄ、Ｅ、肝細胞増殖のＬＳＥＣ依存性刺激は、Ｉｄ１遺伝子ノックダウンによって特異的に阻害された。Ｓｃｒ、スクランブル（scrambled）。ＣＭ、ＬＳＥＣ馴化培地（ｎ＝４）。Ｆ、Ｉｄ１-/-肝臓中のＶＥＧＦＲ３+類洞血管系の内腔に組み込まれたＧＦＰ標識ＬＳＥＣの脾内移植(Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935 -945 (2008)）。Ｇ、Ｈ、Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における質量の再生（Ｇ）及び肝細胞増殖（Ｈ）を修復する（ｎ＝４）。点線、内皮細胞移植なしのＩｄ１-/-肝臓のレベル。Ｉ、移植されたＧＦＰ+Ｉｄ１+/+血管系による肝細胞有糸分裂の刺激には、細胞の近接性が不可欠である。*Ｐ＜０．０５、Ｉｄ１-/-に対して（ａ）；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦ164を用いたＩｄ１-/-に対して（Ａ）、ＷＴに対して（Ｂ、Ｃ）。スケールバー、５０μｍ（Ｄ、Ｆ）及び２０μｍ（Ｈ）。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｊ、Ｉｄ１-/-マウスにおける肝質量回復の持続性阻害。指示された期間を通して、ＶＥＧＦ−Ａ164注射は、肝再構築（hepatic reconstitution）の救済に失敗した。*Ｐ＜０．０５、ＷＴに対して、Ｎ＝４。Ｋ、ＰＨ後のＩｄ１-/-マウスにおける肝機能の再生障害（血漿ビリルビンレベルの上昇）、＃、Ｐ＜０．０１、ＷＴに対して、Ｎ＝３。
【図４−２】ＬＳＥＣのＩｄ１上方制御は、肝再生に不可欠である。Ａ、Ｉｄ１-/-マウスは、その野生型（ＷＴ）同腹子と比較して、肝質量の再生障害を示し、これはＶＥＧＦ−Ａ164投与による救済（rescued）に失敗している（ｎ＝５）。Ｂ、Ｃ、部分肝切除後のＩｄ１-/-マウスにおける、肝細胞増殖障害（Ｂ）及びＶＥ−カドヘリン+イソレクチン+血管の構築（Ｃ）（ｎ＝５）。Ｄ、Ｅ、肝細胞増殖のＬＳＥＣ依存性刺激は、Ｉｄ１遺伝子ノックダウンによって特異的に阻害された。Ｓｃｒ、スクランブル（scrambled）。ＣＭ、ＬＳＥＣ馴化培地（ｎ＝４）。Ｆ、Ｉｄ１-/-肝臓中のＶＥＧＦＲ３+類洞血管系の内腔に組み込まれたＧＦＰ標識ＬＳＥＣの脾内移植(Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935 -945 (2008)）。Ｇ、Ｈ、Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における質量の再生（Ｇ）及び肝細胞増殖（Ｈ）を修復する（ｎ＝４）。点線、内皮細胞移植なしのＩｄ１-/-肝臓のレベル。Ｉ、移植されたＧＦＰ+Ｉｄ１+/+血管系による肝細胞有糸分裂の刺激には、細胞の近接性が不可欠である。*Ｐ＜０．０５、Ｉｄ１-/-に対して（ａ）；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦ164を用いたＩｄ１-/-に対して（Ａ）、ＷＴに対して（Ｂ、Ｃ）。スケールバー、５０μｍ（Ｄ、Ｆ）及び２０μｍ（Ｈ）。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｊ、Ｉｄ１-/-マウスにおける肝質量回復の持続性阻害。指示された期間を通して、ＶＥＧＦ−Ａ164注射は、肝再構築（hepatic reconstitution）の救済に失敗した。*Ｐ＜０．０５、ＷＴに対して、Ｎ＝４。Ｋ、ＰＨ後のＩｄ１-/-マウスにおける肝機能の再生障害（血漿ビリルビンレベルの上昇）、＃、Ｐ＜０．０１、ＷＴに対して、Ｎ＝３。
【図４−３】ＬＳＥＣのＩｄ１上方制御は、肝再生に不可欠である。Ａ、Ｉｄ１-/-マウスは、その野生型（ＷＴ）同腹子と比較して、肝質量の再生障害を示し、これはＶＥＧＦ−Ａ164投与による救済（rescued）に失敗している（ｎ＝５）。Ｂ、Ｃ、部分肝切除後のＩｄ１-/-マウスにおける、肝細胞増殖障害（Ｂ）及びＶＥ−カドヘリン+イソレクチン+血管の構築（Ｃ）（ｎ＝５）。Ｄ、Ｅ、肝細胞増殖のＬＳＥＣ依存性刺激は、Ｉｄ１遺伝子ノックダウンによって特異的に阻害された。Ｓｃｒ、スクランブル（scrambled）。ＣＭ、ＬＳＥＣ馴化培地（ｎ＝４）。Ｆ、Ｉｄ１-/-肝臓中のＶＥＧＦＲ３+類洞血管系の内腔に組み込まれたＧＦＰ標識ＬＳＥＣの脾内移植(Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935 -945 (2008)）。Ｇ、Ｈ、Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における質量の再生（Ｇ）及び肝細胞増殖（Ｈ）を修復する（ｎ＝４）。点線、内皮細胞移植なしのＩｄ１-/-肝臓のレベル。Ｉ、移植されたＧＦＰ+Ｉｄ１+/+血管系による肝細胞有糸分裂の刺激には、細胞の近接性が不可欠である。*Ｐ＜０．０５、Ｉｄ１-/-に対して（ａ）；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦ164を用いたＩｄ１-/-に対して（Ａ）、ＷＴに対して（Ｂ、Ｃ）。スケールバー、５０μｍ（Ｄ、Ｆ）及び２０μｍ（Ｈ）。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｊ、Ｉｄ１-/-マウスにおける肝質量回復の持続性阻害。指示された期間を通して、ＶＥＧＦ−Ａ164注射は、肝再構築（hepatic reconstitution）の救済に失敗した。*Ｐ＜０．０５、ＷＴに対して、Ｎ＝４。Ｋ、ＰＨ後のＩｄ１-/-マウスにおける肝機能の再生障害（血漿ビリルビンレベルの上昇）、＃、Ｐ＜０．０１、ＷＴに対して、Ｎ＝３。
【図４−４】ＬＳＥＣのＩｄ１上方制御は、肝再生に不可欠である。Ａ、Ｉｄ１-/-マウスは、その野生型（ＷＴ）同腹子と比較して、肝質量の再生障害を示し、これはＶＥＧＦ−Ａ164投与による救済（rescued）に失敗している（ｎ＝５）。Ｂ、Ｃ、部分肝切除後のＩｄ１-/-マウスにおける、肝細胞増殖障害（Ｂ）及びＶＥ−カドヘリン+イソレクチン+血管の構築（Ｃ）（ｎ＝５）。Ｄ、Ｅ、肝細胞増殖のＬＳＥＣ依存性刺激は、Ｉｄ１遺伝子ノックダウンによって特異的に阻害された。Ｓｃｒ、スクランブル（scrambled）。ＣＭ、ＬＳＥＣ馴化培地（ｎ＝４）。Ｆ、Ｉｄ１-/-肝臓中のＶＥＧＦＲ３+類洞血管系の内腔に組み込まれたＧＦＰ標識ＬＳＥＣの脾内移植(Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935 -945 (2008)）。Ｇ、Ｈ、Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における質量の再生（Ｇ）及び肝細胞増殖（Ｈ）を修復する（ｎ＝４）。点線、内皮細胞移植なしのＩｄ１-/-肝臓のレベル。Ｉ、移植されたＧＦＰ+Ｉｄ１+/+血管系による肝細胞有糸分裂の刺激には、細胞の近接性が不可欠である。*Ｐ＜０．０５、Ｉｄ１-/-に対して（ａ）；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦ164を用いたＩｄ１-/-に対して（Ａ）、ＷＴに対して（Ｂ、Ｃ）。スケールバー、５０μｍ（Ｄ、Ｆ）及び２０μｍ（Ｈ）。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｊ、Ｉｄ１-/-マウスにおける肝質量回復の持続性阻害。指示された期間を通して、ＶＥＧＦ−Ａ164注射は、肝再構築（hepatic reconstitution）の救済に失敗した。*Ｐ＜０．０５、ＷＴに対して、Ｎ＝４。Ｋ、ＰＨ後のＩｄ１-/-マウスにおける肝機能の再生障害（血漿ビリルビンレベルの上昇）、＃、Ｐ＜０．０１、ＷＴに対して、Ｎ＝３。
【図４−５】ＬＳＥＣのＩｄ１上方制御は、肝再生に不可欠である。Ａ、Ｉｄ１-/-マウスは、その野生型（ＷＴ）同腹子と比較して、肝質量の再生障害を示し、これはＶＥＧＦ−Ａ164投与による救済（rescued）に失敗している（ｎ＝５）。Ｂ、Ｃ、部分肝切除後のＩｄ１-/-マウスにおける、肝細胞増殖障害（Ｂ）及びＶＥ−カドヘリン+イソレクチン+血管の構築（Ｃ）（ｎ＝５）。Ｄ、Ｅ、肝細胞増殖のＬＳＥＣ依存性刺激は、Ｉｄ１遺伝子ノックダウンによって特異的に阻害された。Ｓｃｒ、スクランブル（scrambled）。ＣＭ、ＬＳＥＣ馴化培地（ｎ＝４）。Ｆ、Ｉｄ１-/-肝臓中のＶＥＧＦＲ３+類洞血管系の内腔に組み込まれたＧＦＰ標識ＬＳＥＣの脾内移植(Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935 -945 (2008)）。Ｇ、Ｈ、Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における質量の再生（Ｇ）及び肝細胞増殖（Ｈ）を修復する（ｎ＝４）。点線、内皮細胞移植なしのＩｄ１-/-肝臓のレベル。Ｉ、移植されたＧＦＰ+Ｉｄ１+/+血管系による肝細胞有糸分裂の刺激には、細胞の近接性が不可欠である。*Ｐ＜０．０５、Ｉｄ１-/-に対して（ａ）；**Ｐ＜０．０１、ＶＥＧＦ164を用いたＩｄ１-/-に対して（Ａ）、ＷＴに対して（Ｂ、Ｃ）。スケールバー、５０μｍ（Ｄ、Ｆ）及び２０μｍ（Ｈ）。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｊ、Ｉｄ１-/-マウスにおける肝質量回復の持続性阻害。指示された期間を通して、ＶＥＧＦ−Ａ164注射は、肝再構築（hepatic reconstitution）の救済に失敗した。*Ｐ＜０．０５、ＷＴに対して、Ｎ＝４。Ｋ、ＰＨ後のＩｄ１-/-マウスにおける肝機能の再生障害（血漿ビリルビンレベルの上昇）、＃、Ｐ＜０．０１、ＷＴに対して、Ｎ＝３。
【図５−１】ＬＳＥＣ中のＷｎｔ２及びＨＧＦのＩｄ１介在性誘導は、肝再生を刺激する。ＨＧＦ及びＷｎｔ２の上方制御は、部分肝切除後のＩｄ１-/-ＬＳＥＣにおいて損なわれる（ｎ＝５）。Ｂ、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ（Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+）の両方を担持するＧＦＰ標識Ｉｄ１-/-ＬＳＥＣの脾内移植は、Ｉｄ１-/-肝質量の再生を救済する（ｎ＝４）。Ｃ、Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における肝細胞増殖障害を修復する（ｎ＝４）。Ｄ、Ｉｄ１-/-肝臓における有糸分裂肝細胞とＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣとの間の近接性。Ｅ、ＬＳＥＣ介在性肝再生におけるＶＥＧＦＲ２-Ｉｄ１経路の必要性。Ｉｄ１-/-肝類洞へのＩｄ１+/+ＬＳＥＣの脾内移植は、肝血管再生を修復する。Ｆ、移植されたＩｄ１+/+又はＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣは、肝細胞の近傍に局在化しており、誘導及び増殖血管新生を促進し、それによって生理学的肝再生を持続させる。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、スケールバー、２０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｇ、誘導血管新生ＬＳＥＣは、特異的アンギオクリンシグナルの合成により、近位の肝細胞の再生を開始して持続させる。
【図５−２】ＬＳＥＣ中のＷｎｔ２及びＨＧＦのＩｄ１介在性誘導は、肝再生を刺激する。ＨＧＦ及びＷｎｔ２の上方制御は、部分肝切除後のＩｄ１-/-ＬＳＥＣにおいて損なわれる（ｎ＝５）。Ｂ、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ（Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+）の両方を担持するＧＦＰ標識Ｉｄ１-/-ＬＳＥＣの脾内移植は、Ｉｄ１-/-肝質量の再生を救済する（ｎ＝４）。Ｃ、Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における肝細胞増殖障害を修復する（ｎ＝４）。Ｄ、Ｉｄ１-/-肝臓における有糸分裂肝細胞とＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣとの間の近接性。Ｅ、ＬＳＥＣ介在性肝再生におけるＶＥＧＦＲ２-Ｉｄ１経路の必要性。Ｉｄ１-/-肝類洞へのＩｄ１+/+ＬＳＥＣの脾内移植は、肝血管再生を修復する。Ｆ、移植されたＩｄ１+/+又はＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣは、肝細胞の近傍に局在化しており、誘導及び増殖血管新生を促進し、それによって生理学的肝再生を持続させる。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、スケールバー、２０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｇ、誘導血管新生ＬＳＥＣは、特異的アンギオクリンシグナルの合成により、近位の肝細胞の再生を開始して持続させる。
【図５−３】ＬＳＥＣ中のＷｎｔ２及びＨＧＦのＩｄ１介在性誘導は、肝再生を刺激する。ＨＧＦ及びＷｎｔ２の上方制御は、部分肝切除後のＩｄ１-/-ＬＳＥＣにおいて損なわれる（ｎ＝５）。Ｂ、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ（Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+）の両方を担持するＧＦＰ標識Ｉｄ１-/-ＬＳＥＣの脾内移植は、Ｉｄ１-/-肝質量の再生を救済する（ｎ＝４）。Ｃ、Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における肝細胞増殖障害を修復する（ｎ＝４）。Ｄ、Ｉｄ１-/-肝臓における有糸分裂肝細胞とＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣとの間の近接性。Ｅ、ＬＳＥＣ介在性肝再生におけるＶＥＧＦＲ２-Ｉｄ１経路の必要性。Ｉｄ１-/-肝類洞へのＩｄ１+/+ＬＳＥＣの脾内移植は、肝血管再生を修復する。Ｆ、移植されたＩｄ１+/+又はＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣは、肝細胞の近傍に局在化しており、誘導及び増殖血管新生を促進し、それによって生理学的肝再生を持続させる。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、スケールバー、２０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｇ、誘導血管新生ＬＳＥＣは、特異的アンギオクリンシグナルの合成により、近位の肝細胞の再生を開始して持続させる。
【図５−４】ＬＳＥＣ中のＷｎｔ２及びＨＧＦのＩｄ１介在性誘導は、肝再生を刺激する。ＨＧＦ及びＷｎｔ２の上方制御は、部分肝切除後のＩｄ１-/-ＬＳＥＣにおいて損なわれる（ｎ＝５）。Ｂ、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ（Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+）の両方を担持するＧＦＰ標識Ｉｄ１-/-ＬＳＥＣの脾内移植は、Ｉｄ１-/-肝質量の再生を救済する（ｎ＝４）。Ｃ、Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における肝細胞増殖障害を修復する（ｎ＝４）。Ｄ、Ｉｄ１-/-肝臓における有糸分裂肝細胞とＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣとの間の近接性。Ｅ、ＬＳＥＣ介在性肝再生におけるＶＥＧＦＲ２-Ｉｄ１経路の必要性。Ｉｄ１-/-肝類洞へのＩｄ１+/+ＬＳＥＣの脾内移植は、肝血管再生を修復する。Ｆ、移植されたＩｄ１+/+又はＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣは、肝細胞の近傍に局在化しており、誘導及び増殖血管新生を促進し、それによって生理学的肝再生を持続させる。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１、スケールバー、２０μｍ。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。Ｇ、誘導血管新生ＬＳＥＣは、特異的アンギオクリンシグナルの合成により、近位の肝細胞の再生を開始して持続させる。
【図６−１】ＰＮＸは、右肺再生及び肺上皮前駆細胞の増大を誘導する。（Ａ、Ｂ）左肺の切除後、残存する無傷の右肺葉における質量及び体積の修復。Ａ、ＰＮＸ法を説明する略図及びＰＮＸの１５日後に再生された右肺の代表的な画像。Ｂ、肺再生は、ＰＮＸの３日後に開始され、日１５でその最大サイズ及び体積を達成する。ｎ＝５。Ｃ、ＰＮＸ後の日３の気管支肺胞管接合部（ＢＡＤＪ）でのＣＣＳＰ+細胞の増幅。マウスにＢｒｄＵ含有飲用水を与えて、増殖している肺前駆細胞に適用した（pulse）。ＰＮＸ後の日３に、ＢＡＤＪで局在化されたＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+細胞の特異的増大がある（矢印）。その後、遠位肺胞腔中にＢｒｄＵ+細胞の分布が見られる（矢じり形）。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸの３日後のＣＣＳＰ−ＹＦＰ及びＳＰＣ−ＹＦＰマウスにおいて、ＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ−１+ＶＥ−カドヘリン-ＣＤ３１-ＢＡＳＣ様細胞を同定し、定量した。ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３１+ＰＣＥＣのＢｒｄＵ取り込みは最小限であり、この時点でＰＣＥＣは、増殖を受けないことを示している。Ｄパネルの下の挿入図中のＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（青い矢印）及び増殖ＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+ＢＡＳＣ（赤色矢印）の密な細胞並置（close cellular juxtaposition）が見られる。
【図６−２】ＰＮＸは、右肺再生及び肺上皮前駆細胞の増大を誘導する。（Ａ、Ｂ）左肺の切除後、残存する無傷の右肺葉における質量及び体積の修復。Ａ、ＰＮＸ法を説明する略図及びＰＮＸの１５日後に再生された右肺の代表的な画像。Ｂ、肺再生は、ＰＮＸの３日後に開始され、日１５でその最大サイズ及び体積を達成する。ｎ＝５。Ｃ、ＰＮＸ後の日３の気管支肺胞管接合部（ＢＡＤＪ）でのＣＣＳＰ+細胞の増幅。マウスにＢｒｄＵ含有飲用水を与えて、増殖している肺前駆細胞に適用した（pulse）。ＰＮＸ後の日３に、ＢＡＤＪで局在化されたＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+細胞の特異的増大がある（矢印）。その後、遠位肺胞腔中にＢｒｄＵ+細胞の分布が見られる（矢じり形）。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸの３日後のＣＣＳＰ−ＹＦＰ及びＳＰＣ−ＹＦＰマウスにおいて、ＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ−１+ＶＥ−カドヘリン-ＣＤ３１-ＢＡＳＣ様細胞を同定し、定量した。ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３１+ＰＣＥＣのＢｒｄＵ取り込みは最小限であり、この時点でＰＣＥＣは、増殖を受けないことを示している。Ｄパネルの下の挿入図中のＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（青い矢印）及び増殖ＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+ＢＡＳＣ（赤色矢印）の密な細胞並置（close cellular juxtaposition）が見られる。
【図６−３】ＰＮＸは、右肺再生及び肺上皮前駆細胞の増大を誘導する。（Ａ、Ｂ）左肺の切除後、残存する無傷の右肺葉における質量及び体積の修復。Ａ、ＰＮＸ法を説明する略図及びＰＮＸの１５日後に再生された右肺の代表的な画像。Ｂ、肺再生は、ＰＮＸの３日後に開始され、日１５でその最大サイズ及び体積を達成する。ｎ＝５。Ｃ、ＰＮＸ後の日３の気管支肺胞管接合部（ＢＡＤＪ）でのＣＣＳＰ+細胞の増幅。マウスにＢｒｄＵ含有飲用水を与えて、増殖している肺前駆細胞に適用した（pulse）。ＰＮＸ後の日３に、ＢＡＤＪで局在化されたＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+細胞の特異的増大がある（矢印）。その後、遠位肺胞腔中にＢｒｄＵ+細胞の分布が見られる（矢じり形）。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸの３日後のＣＣＳＰ−ＹＦＰ及びＳＰＣ−ＹＦＰマウスにおいて、ＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ−１+ＶＥ−カドヘリン-ＣＤ３１-ＢＡＳＣ様細胞を同定し、定量した。ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３１+ＰＣＥＣのＢｒｄＵ取り込みは最小限であり、この時点でＰＣＥＣは、増殖を受けないことを示している。Ｄパネルの下の挿入図中のＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（青い矢印）及び増殖ＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+ＢＡＳＣ（赤色矢印）の密な細胞並置（close cellular juxtaposition）が見られる。
【図７−１】ＰＮＸ後の日７に、ＡＥＣ及びＰＣＥＣの増大は、肺胞再生を持続させる。Ａ、ＰＮＸ後、一時的増殖期細胞（transit amplifying cells）（ＴＡＣ）にＢｒｄＵのＩ．Ｐ．投与を適用し、ＢｒｄＵ染色によって示した。ＢｒｄＵ+ＴＡＣは、右肺の全体を通じて高められ、ＰＮＸ後の日７にピークに達した。スケールバー、２．５ｍｍ．Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、残存する右肺中ＴＡＣの定量。全単核細胞の多変性フローサイトメトリー分析は、ＳＰＤ+ＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩ及びＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ４５-ＰＣＥＣの増大を示す。Ｄ、ＰＮＸ後の日７で、残存する肺中の肺胞の毛細血管界面でのＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣの増殖。ＰＣＥＣ（緑色矢印）とＢｒｄＵ＋ＡＥＣＩＩ（赤色矢印）との間の密な細胞近接性が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｅ、ＰＮＸの１５日後、残存する肺中のＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＰＣＥＣ及びＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩの定量；ＰＮＸは、ＰＣＥＣ及びＡＥＣの増殖を誘導する。ｎ＝５。
【図７−２】ＰＮＸ後の日７に、ＡＥＣ及びＰＣＥＣの増大は、肺胞再生を持続させる。Ａ、ＰＮＸ後、一時的増殖期細胞（transit amplifying cells）（ＴＡＣ）にＢｒｄＵのＩ．Ｐ．投与を適用し、ＢｒｄＵ染色によって示した。ＢｒｄＵ+ＴＡＣは、右肺の全体を通じて高められ、ＰＮＸ後の日７にピークに達した。スケールバー、２．５ｍｍ．Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、残存する右肺中ＴＡＣの定量。全単核細胞の多変性フローサイトメトリー分析は、ＳＰＤ+ＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩ及びＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ４５-ＰＣＥＣの増大を示す。Ｄ、ＰＮＸ後の日７で、残存する肺中の肺胞の毛細血管界面でのＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣの増殖。ＰＣＥＣ（緑色矢印）とＢｒｄＵ＋ＡＥＣＩＩ（赤色矢印）との間の密な細胞近接性が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｅ、ＰＮＸの１５日後、残存する肺中のＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＰＣＥＣ及びＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩの定量；ＰＮＸは、ＰＣＥＣ及びＡＥＣの増殖を誘導する。ｎ＝５。
【図７−３】ＰＮＸ後の日７に、ＡＥＣ及びＰＣＥＣの増大は、肺胞再生を持続させる。Ａ、ＰＮＸ後、一時的増殖期細胞（transit amplifying cells）（ＴＡＣ）にＢｒｄＵのＩ．Ｐ．投与を適用し、ＢｒｄＵ染色によって示した。ＢｒｄＵ+ＴＡＣは、右肺の全体を通じて高められ、ＰＮＸ後の日７にピークに達した。スケールバー、２．５ｍｍ．Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、残存する右肺中ＴＡＣの定量。全単核細胞の多変性フローサイトメトリー分析は、ＳＰＤ+ＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩ及びＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ４５-ＰＣＥＣの増大を示す。Ｄ、ＰＮＸ後の日７で、残存する肺中の肺胞の毛細血管界面でのＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣの増殖。ＰＣＥＣ（緑色矢印）とＢｒｄＵ＋ＡＥＣＩＩ（赤色矢印）との間の密な細胞近接性が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｅ、ＰＮＸの１５日後、残存する肺中のＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＰＣＥＣ及びＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩの定量；ＰＮＸは、ＰＣＥＣ及びＡＥＣの増殖を誘導する。ｎ＝５。
【図８−１】ＥＣにおけるＶｅｇｆｒ２の誘導性欠失及びＦｇｆｒ１の部分的ノックダウンは、肺再生を弱める。Ａ、ＰＮＸ後のＰＣＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２の逐次的活性化及びＦＧＦＲ１の上方制御。ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、ＰＮＸによって高められるのに対して、ＰＣＥＣ中の全ＶＥＧＦＲ２発現は、一定のままである。対照的に、ＰＣＥＣにおけるＦＧＦＲ１発現は、ＰＮＸ後、時間依存的に上方制御される。Ｂ、成体マウスにおけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１のＥＣ特異的ノックアウト。ＶＥ−カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性ＣｒｅＥＲＴ２の発現を引き起こすトランスジェニックマウス（ＶＥ−Ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）をＶｅｇｆｒ２loxP/loxP及びＦｇｆｒ１loxP/loxPマウスと交雑させ、タモキシフェンで処置し、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失を誘導する（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウス）。Ｃ、Ｖｅｇｆｒ２のＥＣ特異的欠失（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウス）は、ＰＮＸ後のＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＢＡＳＣ様細胞の増大を阻害する。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを対照として用いる。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおけるＰＣＥＣ（赤色の矢じり形）及びＡＥＣ（黄色の矢印）不完全な増殖、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの肺胞直径の増加（破線の矢印）が見られる。Ｆ、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失では、肺機能の回復が損われた。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺機能の修復は、対照マウスと比較して有意に阻害された。ＰＮＸ前のノックアウトマウスの正常な肺機能に注目。＃、ｐ＜０．０１、対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、ｎ＝４。Ｇ、肺質量及び体積の修復は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて損なわれた、ｎ＝４。
【図８−２】ＥＣにおけるＶｅｇｆｒ２の誘導性欠失及びＦｇｆｒ１の部分的ノックダウンは、肺再生を弱める。Ａ、ＰＮＸ後のＰＣＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２の逐次的活性化及びＦＧＦＲ１の上方制御。ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、ＰＮＸによって高められるのに対して、ＰＣＥＣ中の全ＶＥＧＦＲ２発現は、一定のままである。対照的に、ＰＣＥＣにおけるＦＧＦＲ１発現は、ＰＮＸ後、時間依存的に上方制御される。Ｂ、成体マウスにおけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１のＥＣ特異的ノックアウト。ＶＥ−カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性ＣｒｅＥＲＴ２の発現を引き起こすトランスジェニックマウス（ＶＥ−Ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）をＶｅｇｆｒ２loxP/loxP及びＦｇｆｒ１loxP/loxPマウスと交雑させ、タモキシフェンで処置し、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失を誘導する（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウス）。Ｃ、Ｖｅｇｆｒ２のＥＣ特異的欠失（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウス）は、ＰＮＸ後のＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＢＡＳＣ様細胞の増大を阻害する。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを対照として用いる。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおけるＰＣＥＣ（赤色の矢じり形）及びＡＥＣ（黄色の矢印）不完全な増殖、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの肺胞直径の増加（破線の矢印）が見られる。Ｆ、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失では、肺機能の回復が損われた。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺機能の修復は、対照マウスと比較して有意に阻害された。ＰＮＸ前のノックアウトマウスの正常な肺機能に注目。＃、ｐ＜０．０１、対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、ｎ＝４。Ｇ、肺質量及び体積の修復は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて損なわれた、ｎ＝４。
【図８−３】ＥＣにおけるＶｅｇｆｒ２の誘導性欠失及びＦｇｆｒ１の部分的ノックダウンは、肺再生を弱める。Ａ、ＰＮＸ後のＰＣＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２の逐次的活性化及びＦＧＦＲ１の上方制御。ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、ＰＮＸによって高められるのに対して、ＰＣＥＣ中の全ＶＥＧＦＲ２発現は、一定のままである。対照的に、ＰＣＥＣにおけるＦＧＦＲ１発現は、ＰＮＸ後、時間依存的に上方制御される。Ｂ、成体マウスにおけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１のＥＣ特異的ノックアウト。ＶＥ−カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性ＣｒｅＥＲＴ２の発現を引き起こすトランスジェニックマウス（ＶＥ−Ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）をＶｅｇｆｒ２loxP/loxP及びＦｇｆｒ１loxP/loxPマウスと交雑させ、タモキシフェンで処置し、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失を誘導する（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウス）。Ｃ、Ｖｅｇｆｒ２のＥＣ特異的欠失（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウス）は、ＰＮＸ後のＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＢＡＳＣ様細胞の増大を阻害する。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを対照として用いる。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおけるＰＣＥＣ（赤色の矢じり形）及びＡＥＣ（黄色の矢印）不完全な増殖、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの肺胞直径の増加（破線の矢印）が見られる。Ｆ、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失では、肺機能の回復が損われた。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺機能の修復は、対照マウスと比較して有意に阻害された。ＰＮＸ前のノックアウトマウスの正常な肺機能に注目。＃、ｐ＜０．０１、対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、ｎ＝４。Ｇ、肺質量及び体積の修復は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて損なわれた、ｎ＝４。
【図８−４】ＥＣにおけるＶｅｇｆｒ２の誘導性欠失及びＦｇｆｒ１の部分的ノックダウンは、肺再生を弱める。Ａ、ＰＮＸ後のＰＣＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２の逐次的活性化及びＦＧＦＲ１の上方制御。ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、ＰＮＸによって高められるのに対して、ＰＣＥＣ中の全ＶＥＧＦＲ２発現は、一定のままである。対照的に、ＰＣＥＣにおけるＦＧＦＲ１発現は、ＰＮＸ後、時間依存的に上方制御される。Ｂ、成体マウスにおけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１のＥＣ特異的ノックアウト。ＶＥ−カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性ＣｒｅＥＲＴ２の発現を引き起こすトランスジェニックマウス（ＶＥ−Ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）をＶｅｇｆｒ２loxP/loxP及びＦｇｆｒ１loxP/loxPマウスと交雑させ、タモキシフェンで処置し、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失を誘導する（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウス）。Ｃ、Ｖｅｇｆｒ２のＥＣ特異的欠失（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウス）は、ＰＮＸ後のＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＢＡＳＣ様細胞の増大を阻害する。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを対照として用いる。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおけるＰＣＥＣ（赤色の矢じり形）及びＡＥＣ（黄色の矢印）不完全な増殖、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの肺胞直径の増加（破線の矢印）が見られる。Ｆ、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失では、肺機能の回復が損われた。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺機能の修復は、対照マウスと比較して有意に阻害された。ＰＮＸ前のノックアウトマウスの正常な肺機能に注目。＃、ｐ＜０．０１、対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、ｎ＝４。Ｇ、肺質量及び体積の修復は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて損なわれた、ｎ＝４。
【図８−５】ＥＣにおけるＶｅｇｆｒ２の誘導性欠失及びＦｇｆｒ１の部分的ノックダウンは、肺再生を弱める。Ａ、ＰＮＸ後のＰＣＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２の逐次的活性化及びＦＧＦＲ１の上方制御。ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、ＰＮＸによって高められるのに対して、ＰＣＥＣ中の全ＶＥＧＦＲ２発現は、一定のままである。対照的に、ＰＣＥＣにおけるＦＧＦＲ１発現は、ＰＮＸ後、時間依存的に上方制御される。Ｂ、成体マウスにおけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１のＥＣ特異的ノックアウト。ＶＥ−カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性ＣｒｅＥＲＴ２の発現を引き起こすトランスジェニックマウス（ＶＥ−Ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２マウス）をＶｅｇｆｒ２loxP/loxP及びＦｇｆｒ１loxP/loxPマウスと交雑させ、タモキシフェンで処置し、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失を誘導する（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウス）。Ｃ、Ｖｅｇｆｒ２のＥＣ特異的欠失（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウス）は、ＰＮＸ後のＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＢＡＳＣ様細胞の増大を阻害する。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを対照として用いる。Ｄ、Ｅ、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおけるＰＣＥＣ（赤色の矢じり形）及びＡＥＣ（黄色の矢印）不完全な増殖、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの肺胞直径の増加（破線の矢印）が見られる。Ｆ、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１のＥＣ特異的欠失では、肺機能の回復が損われた。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺機能の修復は、対照マウスと比較して有意に阻害された。ＰＮＸ前のノックアウトマウスの正常な肺機能に注目。＃、ｐ＜０．０１、対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスと比較して、ｎ＝４。Ｇ、肺質量及び体積の修復は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて損なわれた、ｎ＝４。
【図９−１】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ及びＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣの増大を誘導する。Ａ、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の内皮特異的除去は、ＰＮＸ後の肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）におけるＭＭＰ１４の上方制御を弱めた。前述のように（(Ackah, The Journal of clinical investigation 115:2119-2127 (2005);Murakami, The Journal of clinical investigation 121 (2011)）、ＰＮＸ後の再生しているマウス肺からＰＣＥＣを単離した。シャムマウス（sham mouse）と比較したＭＭＰ１４発現の上方制御を、それぞれ日３及び７に、対照とＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC（左）又はＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+（右）マウスとの間で比較した。データは、一貫して平均±ｓ．ｅ．ｍとして示した；ｎ＝４。Ｂ、ＰＮＸ後、肺中のＶＥＧＦＲ２の選択的活性化（リン酸化）は、器官を血管化新生化したが、他では、血管新生化しなかった。異なる器官におけるＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルには、有意な違いがなかったにもかかわらず、ＶＥＧＦＲ２活性化は、日７でＰＮＸ後の肺にしか生じなかった。この所見は、ＰＮＸ後のＶＥＧＦＲ２の肺特異的活性化を示す。ＰＮＸ後の肺中のＶＥＧＦＲ２活性化の動態を図３Ａに示す。Ｃ、ＭＭＰ１４は、ＰＮＸ後、肺血管系で特異的に上方制御されたが、心臓、脾臓、又は腎臓の血管床では、そうならなかった。ＰＮＸ後のマウスの異なる器官において、ＭＭＰ１４（矢印）の発現及び局在化を調べた。ＰＮＸ後の肺及び肝臓におけるＭＭＰ１４の発現を図４Ｃに示す。Ｄ、ＭＡＰＫｉｎａｓｅ及びＡｋｔ活性化内皮細胞（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）は、ＳＰＣ+ＡＥＣＩＩの最も有意な増大を示した。ＥＣとＡＥＣとの共培養を「方法」に記載した。ｎ＝５。Ｅ、ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣは、共培養後、それらの表現型マーカーを維持した。ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+細胞を、ＥＣとの共培養後、フローサイトメトリーによって分析した。共培養後、ＢＡＳＣは、ＣＣＳＰ+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-細胞としての表現型の特徴を保持している。
【図９−２】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ及びＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣの増大を誘導する。Ａ、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の内皮特異的除去は、ＰＮＸ後の肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）におけるＭＭＰ１４の上方制御を弱めた。前述のように（(Ackah, The Journal of clinical investigation 115:2119-2127 (2005);Murakami, The Journal of clinical investigation 121 (2011)）、ＰＮＸ後の再生しているマウス肺からＰＣＥＣを単離した。シャムマウス（sham mouse）と比較したＭＭＰ１４発現の上方制御を、それぞれ日３及び７に、対照とＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC（左）又はＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+（右）マウスとの間で比較した。データは、一貫して平均±ｓ．ｅ．ｍとして示した；ｎ＝４。Ｂ、ＰＮＸ後、肺中のＶＥＧＦＲ２の選択的活性化（リン酸化）は、器官を血管化新生化したが、他では、血管新生化しなかった。異なる器官におけるＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルには、有意な違いがなかったにもかかわらず、ＶＥＧＦＲ２活性化は、日７でＰＮＸ後の肺にしか生じなかった。この所見は、ＰＮＸ後のＶＥＧＦＲ２の肺特異的活性化を示す。ＰＮＸ後の肺中のＶＥＧＦＲ２活性化の動態を図３Ａに示す。Ｃ、ＭＭＰ１４は、ＰＮＸ後、肺血管系で特異的に上方制御されたが、心臓、脾臓、又は腎臓の血管床では、そうならなかった。ＰＮＸ後のマウスの異なる器官において、ＭＭＰ１４（矢印）の発現及び局在化を調べた。ＰＮＸ後の肺及び肝臓におけるＭＭＰ１４の発現を図４Ｃに示す。Ｄ、ＭＡＰＫｉｎａｓｅ及びＡｋｔ活性化内皮細胞（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）は、ＳＰＣ+ＡＥＣＩＩの最も有意な増大を示した。ＥＣとＡＥＣとの共培養を「方法」に記載した。ｎ＝５。Ｅ、ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣは、共培養後、それらの表現型マーカーを維持した。ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+細胞を、ＥＣとの共培養後、フローサイトメトリーによって分析した。共培養後、ＢＡＳＣは、ＣＣＳＰ+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-細胞としての表現型の特徴を保持している。
【図９−３】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ及びＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣの増大を誘導する。Ａ、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の内皮特異的除去は、ＰＮＸ後の肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）におけるＭＭＰ１４の上方制御を弱めた。前述のように（(Ackah, The Journal of clinical investigation 115:2119-2127 (2005);Murakami, The Journal of clinical investigation 121 (2011)）、ＰＮＸ後の再生しているマウス肺からＰＣＥＣを単離した。シャムマウス（sham mouse）と比較したＭＭＰ１４発現の上方制御を、それぞれ日３及び７に、対照とＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC（左）又はＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+（右）マウスとの間で比較した。データは、一貫して平均±ｓ．ｅ．ｍとして示した；ｎ＝４。Ｂ、ＰＮＸ後、肺中のＶＥＧＦＲ２の選択的活性化（リン酸化）は、器官を血管化新生化したが、他では、血管新生化しなかった。異なる器官におけるＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルには、有意な違いがなかったにもかかわらず、ＶＥＧＦＲ２活性化は、日７でＰＮＸ後の肺にしか生じなかった。この所見は、ＰＮＸ後のＶＥＧＦＲ２の肺特異的活性化を示す。ＰＮＸ後の肺中のＶＥＧＦＲ２活性化の動態を図３Ａに示す。Ｃ、ＭＭＰ１４は、ＰＮＸ後、肺血管系で特異的に上方制御されたが、心臓、脾臓、又は腎臓の血管床では、そうならなかった。ＰＮＸ後のマウスの異なる器官において、ＭＭＰ１４（矢印）の発現及び局在化を調べた。ＰＮＸ後の肺及び肝臓におけるＭＭＰ１４の発現を図４Ｃに示す。Ｄ、ＭＡＰＫｉｎａｓｅ及びＡｋｔ活性化内皮細胞（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）は、ＳＰＣ+ＡＥＣＩＩの最も有意な増大を示した。ＥＣとＡＥＣとの共培養を「方法」に記載した。ｎ＝５。Ｅ、ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣは、共培養後、それらの表現型マーカーを維持した。ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+細胞を、ＥＣとの共培養後、フローサイトメトリーによって分析した。共培養後、ＢＡＳＣは、ＣＣＳＰ+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-細胞としての表現型の特徴を保持している。
【図１０−１】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、誘導ＥＣとの３Ｄアンギオスフェア（angiosphere）共培養において肺胞毛細血管様嚢（alveolar-capillary-like sac）の形成を誘導する。Ａ、ＰＮＸは、残存する右葉におけるＭＭＰ１４タンパク質の時間依存的な上方制御を誘導する。代表的なウェスタンブロット画像を示す。Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後、ＶＥ−カドヘリン＋ＰＣＥＣ中のＭＭＰ１４の特異的上方制御は、フローサイトメトリー（Ｂ）及び免疫染色（Ｃ）によって示されるように、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて弱められる。ＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（矢印）では、上方制御されたＭＭＰ１４の共局在化（colocalization）が見られるが、肺切除された対照マウスの肝ＥＣでは、見られなかった。スケールバー、１００μｍ。Ｄ、Ｅ、ＳＰＣ（ＹＦＰ）+ＡＥＣＩＩとＭＡＰＫ及びＡｋｔ活性化初代ＥＣ（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）との３Ｄ共培養は、アンギオスフェアを形成し、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生によってＳＰＣ+ＡＥＣ増大のバイオリアクターを確立する。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣは、ｃ−Ｒａｆを形質導入することによって生成され、それはＭＡＰＫ経路と、Ａｋｔ同時活性化を持続させるＥ４ＯＲＦ１遺伝子とを活性化する。種々の群の代表的画像（Ｄ）及び定量（Ｅ）を示す。ｓｃｒ、スクランブルｓｈＲＮＡ、ＣＭ、馴化培地。Ｆ、Ｇ、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣ-様細胞の増殖を支持する。さまざまな群の代表的画像（Ｆ）及び定量（Ｇ）を示す。
【図１０−２】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、誘導ＥＣとの３Ｄアンギオスフェア（angiosphere）共培養において肺胞毛細血管様嚢（alveolar-capillary-like sac）の形成を誘導する。Ａ、ＰＮＸは、残存する右葉におけるＭＭＰ１４タンパク質の時間依存的な上方制御を誘導する。代表的なウェスタンブロット画像を示す。Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後、ＶＥ−カドヘリン＋ＰＣＥＣ中のＭＭＰ１４の特異的上方制御は、フローサイトメトリー（Ｂ）及び免疫染色（Ｃ）によって示されるように、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて弱められる。ＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（矢印）では、上方制御されたＭＭＰ１４の共局在化（colocalization）が見られるが、肺切除された対照マウスの肝ＥＣでは、見られなかった。スケールバー、１００μｍ。Ｄ、Ｅ、ＳＰＣ（ＹＦＰ）+ＡＥＣＩＩとＭＡＰＫ及びＡｋｔ活性化初代ＥＣ（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）との３Ｄ共培養は、アンギオスフェアを形成し、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生によってＳＰＣ+ＡＥＣ増大のバイオリアクターを確立する。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣは、ｃ−Ｒａｆを形質導入することによって生成され、それはＭＡＰＫ経路と、Ａｋｔ同時活性化を持続させるＥ４ＯＲＦ１遺伝子とを活性化する。種々の群の代表的画像（Ｄ）及び定量（Ｅ）を示す。ｓｃｒ、スクランブルｓｈＲＮＡ、ＣＭ、馴化培地。Ｆ、Ｇ、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣ-様細胞の増殖を支持する。さまざまな群の代表的画像（Ｆ）及び定量（Ｇ）を示す。
【図１０−３】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、誘導ＥＣとの３Ｄアンギオスフェア（angiosphere）共培養において肺胞毛細血管様嚢（alveolar-capillary-like sac）の形成を誘導する。Ａ、ＰＮＸは、残存する右葉におけるＭＭＰ１４タンパク質の時間依存的な上方制御を誘導する。代表的なウェスタンブロット画像を示す。Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後、ＶＥ−カドヘリン＋ＰＣＥＣ中のＭＭＰ１４の特異的上方制御は、フローサイトメトリー（Ｂ）及び免疫染色（Ｃ）によって示されるように、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて弱められる。ＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（矢印）では、上方制御されたＭＭＰ１４の共局在化（colocalization）が見られるが、肺切除された対照マウスの肝ＥＣでは、見られなかった。スケールバー、１００μｍ。Ｄ、Ｅ、ＳＰＣ（ＹＦＰ）+ＡＥＣＩＩとＭＡＰＫ及びＡｋｔ活性化初代ＥＣ（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）との３Ｄ共培養は、アンギオスフェアを形成し、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生によってＳＰＣ+ＡＥＣ増大のバイオリアクターを確立する。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣは、ｃ−Ｒａｆを形質導入することによって生成され、それはＭＡＰＫ経路と、Ａｋｔ同時活性化を持続させるＥ４ＯＲＦ１遺伝子とを活性化する。種々の群の代表的画像（Ｄ）及び定量（Ｅ）を示す。ｓｃｒ、スクランブルｓｈＲＮＡ、ＣＭ、馴化培地。Ｆ、Ｇ、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣ-様細胞の増殖を支持する。さまざまな群の代表的画像（Ｆ）及び定量（Ｇ）を示す。
【図１０−４】ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４は、ＰＣＥＣによって特異的に産生され、誘導ＥＣとの３Ｄアンギオスフェア（angiosphere）共培養において肺胞毛細血管様嚢（alveolar-capillary-like sac）の形成を誘導する。Ａ、ＰＮＸは、残存する右葉におけるＭＭＰ１４タンパク質の時間依存的な上方制御を誘導する。代表的なウェスタンブロット画像を示す。Ｂ、Ｃ、ＰＮＸ後、ＶＥ−カドヘリン＋ＰＣＥＣ中のＭＭＰ１４の特異的上方制御は、フローサイトメトリー（Ｂ）及び免疫染色（Ｃ）によって示されるように、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて弱められる。ＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣ（矢印）では、上方制御されたＭＭＰ１４の共局在化（colocalization）が見られるが、肺切除された対照マウスの肝ＥＣでは、見られなかった。スケールバー、１００μｍ。Ｄ、Ｅ、ＳＰＣ（ＹＦＰ）+ＡＥＣＩＩとＭＡＰＫ及びＡｋｔ活性化初代ＥＣ（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）との３Ｄ共培養は、アンギオスフェアを形成し、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生によってＳＰＣ+ＡＥＣ増大のバイオリアクターを確立する。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣは、ｃ−Ｒａｆを形質導入することによって生成され、それはＭＡＰＫ経路と、Ａｋｔ同時活性化を持続させるＥ４ＯＲＦ１遺伝子とを活性化する。種々の群の代表的画像（Ｄ）及び定量（Ｅ）を示す。ｓｃｒ、スクランブルｓｈＲＮＡ、ＣＭ、馴化培地。Ｆ、Ｇ、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＣＣＳＰ（ＹＦＰ）+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣ-様細胞の増殖を支持する。さまざまな群の代表的画像（Ｆ）及び定量（Ｇ）を示す。
【図１１−１】ＰＣＥＣ由来のＭＭＰ１４は、再生肺胞形成を支持する。Ａ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和は、肺質量及び体積の再生を止めた。Ｂ、ＭＭＰ１４の阻害は、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣの増大を弱めた、ｎ＝５。スケールｂａｒ、１００μｍ。ＭＭＰ１４ ｍＡｂで処置した肺胞において、立方体様ＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）及び鱗状ＳＰＣ-Ｅ−カドヘリン+タイプＩ様ＡＥＣ（赤色の矢じり形）の両方で欠乏が見られた。Ｃ、Ｄ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４阻害は、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣの増大を阻止したが、ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＰＣＥＣでは、阻止されなかった、ｎ＝５。Ｅ、Ｆ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４の阻害は、肺胞再増殖を抑制し、肺胞サイズが拡大された。（Ｅ）ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和及びアイソタイプＩｇＧで処置された肺切除された肺の代表的なＨ＆Ｅ染色。ｍＡｂ処置マウスでは肺胞サイズの増加が見られる（点線）。（Ｆ）ＰＮＸ後の肺胞数及び肺胞サイズの定量。スケールバー、１００μｍ。
【図１１−２】ＰＣＥＣ由来のＭＭＰ１４は、再生肺胞形成を支持する。Ａ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和は、肺質量及び体積の再生を止めた。Ｂ、ＭＭＰ１４の阻害は、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣの増大を弱めた、ｎ＝５。スケールｂａｒ、１００μｍ。ＭＭＰ１４ ｍＡｂで処置した肺胞において、立方体様ＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）及び鱗状ＳＰＣ-Ｅ−カドヘリン+タイプＩ様ＡＥＣ（赤色の矢じり形）の両方で欠乏が見られた。Ｃ、Ｄ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４阻害は、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣの増大を阻止したが、ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＰＣＥＣでは、阻止されなかった、ｎ＝５。Ｅ、Ｆ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４の阻害は、肺胞再増殖を抑制し、肺胞サイズが拡大された。（Ｅ）ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和及びアイソタイプＩｇＧで処置された肺切除された肺の代表的なＨ＆Ｅ染色。ｍＡｂ処置マウスでは肺胞サイズの増加が見られる（点線）。（Ｆ）ＰＮＸ後の肺胞数及び肺胞サイズの定量。スケールバー、１００μｍ。
【図１１−３】ＰＣＥＣ由来のＭＭＰ１４は、再生肺胞形成を支持する。Ａ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和は、肺質量及び体積の再生を止めた。Ｂ、ＭＭＰ１４の阻害は、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣの増大を弱めた、ｎ＝５。スケールｂａｒ、１００μｍ。ＭＭＰ１４ ｍＡｂで処置した肺胞において、立方体様ＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）及び鱗状ＳＰＣ-Ｅ−カドヘリン+タイプＩ様ＡＥＣ（赤色の矢じり形）の両方で欠乏が見られた。Ｃ、Ｄ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４阻害は、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣの増大を阻止したが、ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＰＣＥＣでは、阻止されなかった、ｎ＝５。Ｅ、Ｆ、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４の阻害は、肺胞再増殖を抑制し、肺胞サイズが拡大された。（Ｅ）ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和及びアイソタイプＩｇＧで処置された肺切除された肺の代表的なＨ＆Ｅ染色。ｍＡｂ処置マウスでは肺胞サイズの増加が見られる（点線）。（Ｆ）ＰＮＸ後の肺胞数及び肺胞サイズの定量。スケールバー、１００μｍ。
【図１２−１】ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＨＢ−ＥＧＦ及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様の外部ドメインを切断すること（shedding）によって肺胞形成を誘導する。Ａ、Ｂ、ＰＮＸは、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの時間依存的な放出を誘導し、それは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、又はＭＭＰ１４中和によって阻害された。代表的なウェスタンブロット画像をＡに示す。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ）により処置した；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄液。ＢＡＬＦ、ＢＡＬ液；ｎ＝４。Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４を上方制御し、ラミニン５γ２鎖の切断を生じた。Ｄ〜Ｆ、ＥＧＦ注射は、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、肺質量及び体積の再生（Ｄ）、毛細血管内のＥ−カドヘリン+ＡＥＣの組み込み（Ｅ）並びに吸気量によって測定される肺機能及び静的コンプライアンス（Ｆ）を修復した。ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（赤色の矢じり形）及びＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）と毛細血管との強化された結合が見られる。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｉ）ＰＮＸ後の日７に、静脈内ＥＧＦ注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺においてＥＧＦＲリン酸化を修復し（Ｇ）、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩの増殖を高めた（Ｈ、I）。ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ（白色矢印）では、増強された増殖が見られる。ＰＮＸ後の増幅細胞集団の定量をＩに示す、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。Ｊ、ＥＣ−ＡＥＣ／ＢＡＳＣ共培養培地及びＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ馴化培地（ＣＭ）中のＨＢ−ＥＧＦの放出は、ＭＭＰ１４に依存性である。Ｋ、ＥＧＦの局所的（気管内）送達は、肺質量及び体積の再生において改善をもたらす。ｎ＝５。
【図１２−２】ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＨＢ−ＥＧＦ及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様の外部ドメインを切断すること（shedding）によって肺胞形成を誘導する。Ａ、Ｂ、ＰＮＸは、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの時間依存的な放出を誘導し、それは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、又はＭＭＰ１４中和によって阻害された。代表的なウェスタンブロット画像をＡに示す。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ）により処置した；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄液。ＢＡＬＦ、ＢＡＬ液；ｎ＝４。Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４を上方制御し、ラミニン５γ２鎖の切断を生じた。Ｄ〜Ｆ、ＥＧＦ注射は、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、肺質量及び体積の再生（Ｄ）、毛細血管内のＥ−カドヘリン+ＡＥＣの組み込み（Ｅ）並びに吸気量によって測定される肺機能及び静的コンプライアンス（Ｆ）を修復した。ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（赤色の矢じり形）及びＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）と毛細血管との強化された結合が見られる。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｉ）ＰＮＸ後の日７に、静脈内ＥＧＦ注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺においてＥＧＦＲリン酸化を修復し（Ｇ）、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩの増殖を高めた（Ｈ、I）。ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ（白色矢印）では、増強された増殖が見られる。ＰＮＸ後の増幅細胞集団の定量をＩに示す、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。Ｊ、ＥＣ−ＡＥＣ／ＢＡＳＣ共培養培地及びＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ馴化培地（ＣＭ）中のＨＢ−ＥＧＦの放出は、ＭＭＰ１４に依存性である。Ｋ、ＥＧＦの局所的（気管内）送達は、肺質量及び体積の再生において改善をもたらす。ｎ＝５。
【図１２−３】ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＨＢ−ＥＧＦ及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様の外部ドメインを切断すること（shedding）によって肺胞形成を誘導する。Ａ、Ｂ、ＰＮＸは、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの時間依存的な放出を誘導し、それは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、又はＭＭＰ１４中和によって阻害された。代表的なウェスタンブロット画像をＡに示す。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ）により処置した；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄液。ＢＡＬＦ、ＢＡＬ液；ｎ＝４。Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４を上方制御し、ラミニン５γ２鎖の切断を生じた。Ｄ〜Ｆ、ＥＧＦ注射は、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、肺質量及び体積の再生（Ｄ）、毛細血管内のＥ−カドヘリン+ＡＥＣの組み込み（Ｅ）並びに吸気量によって測定される肺機能及び静的コンプライアンス（Ｆ）を修復した。ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（赤色の矢じり形）及びＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）と毛細血管との強化された結合が見られる。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｉ）ＰＮＸ後の日７に、静脈内ＥＧＦ注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺においてＥＧＦＲリン酸化を修復し（Ｇ）、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩの増殖を高めた（Ｈ、I）。ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ（白色矢印）では、増強された増殖が見られる。ＰＮＸ後の増幅細胞集団の定量をＩに示す、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。Ｊ、ＥＣ−ＡＥＣ／ＢＡＳＣ共培養培地及びＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ馴化培地（ＣＭ）中のＨＢ−ＥＧＦの放出は、ＭＭＰ１４に依存性である。Ｋ、ＥＧＦの局所的（気管内）送達は、肺質量及び体積の再生において改善をもたらす。ｎ＝５。
【図１２−４】ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＨＢ−ＥＧＦ及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様の外部ドメインを切断すること（shedding）によって肺胞形成を誘導する。Ａ、Ｂ、ＰＮＸは、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの時間依存的な放出を誘導し、それは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、又はＭＭＰ１４中和によって阻害された。代表的なウェスタンブロット画像をＡに示す。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ）により処置した；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄液。ＢＡＬＦ、ＢＡＬ液；ｎ＝４。Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４を上方制御し、ラミニン５γ２鎖の切断を生じた。Ｄ〜Ｆ、ＥＧＦ注射は、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、肺質量及び体積の再生（Ｄ）、毛細血管内のＥ−カドヘリン+ＡＥＣの組み込み（Ｅ）並びに吸気量によって測定される肺機能及び静的コンプライアンス（Ｆ）を修復した。ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（赤色の矢じり形）及びＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）と毛細血管との強化された結合が見られる。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｉ）ＰＮＸ後の日７に、静脈内ＥＧＦ注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺においてＥＧＦＲリン酸化を修復し（Ｇ）、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩの増殖を高めた（Ｈ、I）。ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ（白色矢印）では、増強された増殖が見られる。ＰＮＸ後の増幅細胞集団の定量をＩに示す、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。Ｊ、ＥＣ−ＡＥＣ／ＢＡＳＣ共培養培地及びＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ馴化培地（ＣＭ）中のＨＢ−ＥＧＦの放出は、ＭＭＰ１４に依存性である。Ｋ、ＥＧＦの局所的（気管内）送達は、肺質量及び体積の再生において改善をもたらす。ｎ＝５。
【図１２−５】ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＨＢ−ＥＧＦ及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様の外部ドメインを切断すること（shedding）によって肺胞形成を誘導する。Ａ、Ｂ、ＰＮＸは、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの時間依存的な放出を誘導し、それは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、又はＭＭＰ１４中和によって阻害された。代表的なウェスタンブロット画像をＡに示す。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ）により処置した；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄液。ＢＡＬＦ、ＢＡＬ液；ｎ＝４。Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４を上方制御し、ラミニン５γ２鎖の切断を生じた。Ｄ〜Ｆ、ＥＧＦ注射は、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、肺質量及び体積の再生（Ｄ）、毛細血管内のＥ−カドヘリン+ＡＥＣの組み込み（Ｅ）並びに吸気量によって測定される肺機能及び静的コンプライアンス（Ｆ）を修復した。ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（赤色の矢じり形）及びＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）と毛細血管との強化された結合が見られる。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｉ）ＰＮＸ後の日７に、静脈内ＥＧＦ注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺においてＥＧＦＲリン酸化を修復し（Ｇ）、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩの増殖を高めた（Ｈ、I）。ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ（白色矢印）では、増強された増殖が見られる。ＰＮＸ後の増幅細胞集団の定量をＩに示す、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。Ｊ、ＥＣ−ＡＥＣ／ＢＡＳＣ共培養培地及びＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ馴化培地（ＣＭ）中のＨＢ−ＥＧＦの放出は、ＭＭＰ１４に依存性である。Ｋ、ＥＧＦの局所的（気管内）送達は、肺質量及び体積の再生において改善をもたらす。ｎ＝５。
【図１２−６】ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生は、ＨＢ−ＥＧＦ及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様の外部ドメインを切断すること（shedding）によって肺胞形成を誘導する。Ａ、Ｂ、ＰＮＸは、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの時間依存的な放出を誘導し、それは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、又はＭＭＰ１４中和によって阻害された。代表的なウェスタンブロット画像をＡに示す。対照Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+マウスを、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ）により処置した；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄液。ＢＡＬＦ、ＢＡＬ液；ｎ＝４。Ｃ、ＰＮＸ後の日７に、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４を上方制御し、ラミニン５γ２鎖の切断を生じた。Ｄ〜Ｆ、ＥＧＦ注射は、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、肺質量及び体積の再生（Ｄ）、毛細血管内のＥ−カドヘリン+ＡＥＣの組み込み（Ｅ）並びに吸気量によって測定される肺機能及び静的コンプライアンス（Ｆ）を修復した。ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（赤色の矢じり形）及びＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ（黄色の矢印）と毛細血管との強化された結合が見られる。ｎ＝４。（Ｇ〜Ｉ）ＰＮＸ後の日７に、静脈内ＥＧＦ注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺においてＥＧＦＲリン酸化を修復し（Ｇ）、ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩの増殖を高めた（Ｈ、I）。ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ（白色矢印）では、増強された増殖が見られる。ＰＮＸ後の増幅細胞集団の定量をＩに示す、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。Ｊ、ＥＣ−ＡＥＣ／ＢＡＳＣ共培養培地及びＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ馴化培地（ＣＭ）中のＨＢ−ＥＧＦの放出は、ＭＭＰ１４に依存性である。Ｋ、ＥＧＦの局所的（気管内）送達は、肺質量及び体積の再生において改善をもたらす。ｎ＝５。
【図１３−１】野生型（ＷＴ）ＰＣＥＣの移植は、内皮Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１欠損マウスにおいて不完全な肺胞再生を修復する。Ａ、肺胞再生の促進におけるＰＣＥＣの寄与を明らかにするためのＥＣ移植戦略。ＰＮＸ後、ＥＣを、ＷＴ同腹子の肺及び肝臓から精製し、レンチウイルスＧＦＰで形質導入し、それぞれ日３及び７に、肺切除されたＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスに、頸静脈を通して移植した。Ｂ、機能的肺毛細血管へ移植されたＧＦＰ+ＰＣＥＣの取り込み。開存性血管系を同定するために、血管特異的イソレクチンの静脈内注入を用いた。レシピエントのＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+毛細血管に移植されたＷＴ ＰＣＥＣの機能的取り込みを示す、灌流されたイソレクチン+ＧＦＰ+ＰＣＥＣの存在が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｃ、Ｄ、ＰＣＥＣ移植後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウスにおけるＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞による潜在的増大の修復。（Ｄ）では、移植されたＧＦＰ＋ＰＣＥＣ（緑色矢印）に隣接した増殖ＢｒｄＵ+ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞（赤色矢印）の独特な局在化が見られる。Ｅ〜Ｇ、ＷＴ ＰＣＥＣの移植は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいてＳＰＣ+ＡＥＣの増殖（Ｅ、Ｆ）及び肺機能（Ｇ）を修復する。増大しているＢｒｄＵ+ＳＰＣ+ＡＥＣ（赤色矢印）は、移植されたＰＣＥＣ（緑色矢印）と緊密に細胞結合していることが認められた（Ｆ）。
【図１３−２】野生型（ＷＴ）ＰＣＥＣの移植は、内皮Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１欠損マウスにおいて不完全な肺胞再生を修復する。Ａ、肺胞再生の促進におけるＰＣＥＣの寄与を明らかにするためのＥＣ移植戦略。ＰＮＸ後、ＥＣを、ＷＴ同腹子の肺及び肝臓から精製し、レンチウイルスＧＦＰで形質導入し、それぞれ日３及び７に、肺切除されたＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスに、頸静脈を通して移植した。Ｂ、機能的肺毛細血管へ移植されたＧＦＰ+ＰＣＥＣの取り込み。開存性血管系を同定するために、血管特異的イソレクチンの静脈内注入を用いた。レシピエントのＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+毛細血管に移植されたＷＴ ＰＣＥＣの機能的取り込みを示す、灌流されたイソレクチン+ＧＦＰ+ＰＣＥＣの存在が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｃ、Ｄ、ＰＣＥＣ移植後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウスにおけるＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞による潜在的増大の修復。（Ｄ）では、移植されたＧＦＰ＋ＰＣＥＣ（緑色矢印）に隣接した増殖ＢｒｄＵ+ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞（赤色矢印）の独特な局在化が見られる。Ｅ〜Ｇ、ＷＴ ＰＣＥＣの移植は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいてＳＰＣ+ＡＥＣの増殖（Ｅ、Ｆ）及び肺機能（Ｇ）を修復する。増大しているＢｒｄＵ+ＳＰＣ+ＡＥＣ（赤色矢印）は、移植されたＰＣＥＣ（緑色矢印）と緊密に細胞結合していることが認められた（Ｆ）。
【図１３−３】野生型（ＷＴ）ＰＣＥＣの移植は、内皮Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１欠損マウスにおいて不完全な肺胞再生を修復する。Ａ、肺胞再生の促進におけるＰＣＥＣの寄与を明らかにするためのＥＣ移植戦略。ＰＮＸ後、ＥＣを、ＷＴ同腹子の肺及び肝臓から精製し、レンチウイルスＧＦＰで形質導入し、それぞれ日３及び７に、肺切除されたＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスに、頸静脈を通して移植した。Ｂ、機能的肺毛細血管へ移植されたＧＦＰ+ＰＣＥＣの取り込み。開存性血管系を同定するために、血管特異的イソレクチンの静脈内注入を用いた。レシピエントのＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+毛細血管に移植されたＷＴ ＰＣＥＣの機能的取り込みを示す、灌流されたイソレクチン+ＧＦＰ+ＰＣＥＣの存在が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｃ、Ｄ、ＰＣＥＣ移植後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウスにおけるＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞による潜在的増大の修復。（Ｄ）では、移植されたＧＦＰ＋ＰＣＥＣ（緑色矢印）に隣接した増殖ＢｒｄＵ+ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞（赤色矢印）の独特な局在化が見られる。Ｅ〜Ｇ、ＷＴ ＰＣＥＣの移植は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいてＳＰＣ+ＡＥＣの増殖（Ｅ、Ｆ）及び肺機能（Ｇ）を修復する。増大しているＢｒｄＵ+ＳＰＣ+ＡＥＣ（赤色矢印）は、移植されたＰＣＥＣ（緑色矢印）と緊密に細胞結合していることが認められた（Ｆ）。
【図１３−４】野生型（ＷＴ）ＰＣＥＣの移植は、内皮Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１欠損マウスにおいて不完全な肺胞再生を修復する。Ａ、肺胞再生の促進におけるＰＣＥＣの寄与を明らかにするためのＥＣ移植戦略。ＰＮＸ後、ＥＣを、ＷＴ同腹子の肺及び肝臓から精製し、レンチウイルスＧＦＰで形質導入し、それぞれ日３及び７に、肺切除されたＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスに、頸静脈を通して移植した。Ｂ、機能的肺毛細血管へ移植されたＧＦＰ+ＰＣＥＣの取り込み。開存性血管系を同定するために、血管特異的イソレクチンの静脈内注入を用いた。レシピエントのＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+毛細血管に移植されたＷＴ ＰＣＥＣの機能的取り込みを示す、灌流されたイソレクチン+ＧＦＰ+ＰＣＥＣの存在が見られる。スケールバー、１００μｍ。Ｃ、Ｄ、ＰＣＥＣ移植後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウスにおけるＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞による潜在的増大の修復。（Ｄ）では、移植されたＧＦＰ＋ＰＣＥＣ（緑色矢印）に隣接した増殖ＢｒｄＵ+ＣＣＳＰ+ＢＡＳＣ様細胞（赤色矢印）の独特な局在化が見られる。Ｅ〜Ｇ、ＷＴ ＰＣＥＣの移植は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいてＳＰＣ+ＡＥＣの増殖（Ｅ、Ｆ）及び肺機能（Ｇ）を修復する。増大しているＢｒｄＵ+ＳＰＣ+ＡＥＣ（赤色矢印）は、移植されたＰＣＥＣ（緑色矢印）と緊密に細胞結合していることが認められた（Ｆ）。
【００２１】
詳細な説明
以下の説明では、本願の一部を構成し、例として実施されうる特定の実施態様が示されている添付の図面を参照のこと。これらの実施態様は、当業者が本発明を実施できるように詳細に記載されており、他の実施態様を用いることができ、本発明の範囲を逸脱することなく論理的な変更を実施できることは理解される。従って、例となる実施態様の以下の説明は、限定的な意味でとるべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【００２２】
技術的開示の性質及び主旨を迅速に確認できるよう要約を提供する。特許請求の範囲についての範囲又は意味の解釈又は限定に用いないという理解のもとに要約を提示する。
【００２３】
本発明者らは、組織特異的内皮細胞の適用及び／又は活性化によって器官再生を誘導又は強化できることを発見した。制限されることを望むわけではないが、これらの組織特異的内皮細胞は、例えば、酸素及び養分の交換に必要な血管系を発生させることによって、そしてさらに血管新生を促進し、器官特異的組織細胞を刺激して罹患器官の失われた組織
を増殖させて再配置させる「アンギオクリン（angiocrine）」増殖因子を放出することによって、器官形成を促進すると仮定される。
【００２４】
内皮細胞及び組織特異的内皮細胞。「内皮細胞」及び「毛細血管内皮細胞」（ＥＣ）という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、血管又はリンパ管又は毛細血管の内表面を覆い、器官の微小血管系を形成し、器官特異的表現型の特徴、例えば細胞表面発現又は特異的タンパク質の発現欠如を有し、かつ器官特異的機能活性を発揮する、内皮の細胞のことである。一般に、内皮細胞は、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２+）及び
ＶＥ−カドヘリン+の発現を特徴とする。ＥＣは、ＣＤ６２Ｅ／Ｅ−セレクチン（細胞接
着分子）、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ；第ＶＩＩＩ因子の担体）、ＣＤ３１（ＦＬ−３又はＰＥＣＡＭ−１）、ｌｙｖｅ−１、及びＴｉｅ−２の１つ又はそれ以上の発現を場合によりさらに促進できる。
【００２５】
「組織特異的内皮細胞」（ＴＳＥＣ）は、特定の器官に特異的な内皮細胞である。ＴＳＥＣは、他の器官特異的細胞の増殖の誘導と、さらに再生組織の新たな血管系を形成する自己増殖との両方によって、器官組織の再増殖源を提供する。ＴＳＥＣは、本明細書に開示された組織に特異的なさらなるマーカーを加えたＥＣマーカーの発現によって同定できる。本開示は、他の細胞からＴＳＥＣを分離するのに使用できる組織特異的マーカーの同定によって、そして本明細書に記載された培養方法によって、本発明に従って使用するための組織特異的ＥＣを単離及び増大させる方法を提供する。
【００２６】
例えば、肝特異的類洞ＥＣ（ＬＳＥＣ）は、ＶＥＧＦＲ２+、ＶＥ−カドヘリン+、ＶＥＧＦＲ３+、ＣＤ３４-、及び第ＶＩＩＩ因子+を特徴とする。ＬＳＥＣは、Ｓｃａ−１-、ポドプラニン+（ムチン型膜貫通糖タンパク質）、ｌｙｖｅ−１+（ヒアルロナン受容体）、ｐｒｏｘ−１-、及びスタビリン−１+（ヒアルロナン受容体）の１つ又はそれ以上のさらなるマーカーを特徴としてもよい。
【００２７】
さらなる例として、肺特異的毛細血管ＥＣ（ＰＣＥＣ）は、ＶＥＧＦＲ２+、ＶＥ−カ
ドヘリン+、ＣＤ３４+、ＣＤ３１+、及びＦＧＦＲ１+（ＦＧＦ−２受容体）を発現する。ＰＣＥＣのさらなる任意選択のマーカー特性には、ｃ−ｋｉｔ+、ｃｘｃｒ4+、及びＣＤ
４５-の１つ又はそれ以上が含まれる。
【００２８】
別の例として、骨髄特異的類洞ＥＣは、特性マーカー：ＶＥＧＦＲ２+、ＶＥ−カドヘ
リン+、ＶＥＧＦＲ３+、及びＣＤ３４-を特徴とする。骨髄特異的類洞ＥＣのさらなる任
意選択のマーカー特性には、ｃ−ｋｉｔ+、ｃｘｃｒ４+、ＣＤ４５-、及びＳｃａ−１-の１つ又はそれ以上が含まれる。
【００２９】
さらなる例として、膵島ＴＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ２+、ＶＥ−カドヘリン+、及びＣＤ３４+を発現する。脳ＴＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ２+、ＶＥ−カドヘリン+、及びＣＤ１３３+を発現し、場合によりさらにＮｏｔｃｈリガンド+及びＩＧＦＢＰ１+（インスリン様増殖因子−結合タンパク質−１）+を発現する。
【００３０】
ＥＣ及びＴＳＥＣの単離。本開示は、本発明の方法に使用するための単離されたＥＣ及びＴＳＥＣを提供する。「単離された」及び「精製された」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、実質的に又は本質的に、その本来の環境から取り出された又はその中で濃縮された物質のことである。例えば、細胞が、通常、対象中で近くに見いだされる、他の内因性細胞タイプ、組織、及び物質から実質的に取り出される場合、細胞は単離される。細胞表面マーカーの発現に従った細胞タイプの精製及び単離の方法は、実証された方法論である。「実質的に単離された」細胞又は細胞集団は、対象の組織中に見いだされ
る他の細胞タイプ、組織、又は物質から少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれ以上単離された細胞又は細胞集団である。また、細胞又は細胞集団は、細胞サンプル中の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれ以上の細胞が、興味の細胞表面マーカーを発現するときに、「実質的に精製される」。
【００３１】
ＥＣ及びＴＳＥＣは、適当なソース器官又は組織からのサンプルを解離させることによって単離できる。「ソース器官又は組織」とは、細胞を採取する器官又は組織を意味する。解離は、当業者に知られた技術を用いて容易に実施できる。このような技術の例としては、隣接する細胞間の結合を弱める、消化酵素及び／又はキレート剤を用い、それによって、ほとんど細胞を破損することなく、組織を個別細胞の懸濁液に分散させることが可能になる、機械的解離及び／又は処理が含まれるが、これらに限定されるわけではない。具体的には、酵素的解離は、組織を切り刻み、切り刻まれた組織を、単独の又は組み合わせた任意の多くの消化性酵素により処理することによって実施できる。適した酵素には、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、及び／又はディスパーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。機械的破壊（mechanical disruption）は、グラインダー、混合機、篩、ホモジナイ
ザー、圧力セル、超音波破砕機（insonators）又は摩砕の使用を含むが、それらに限定されない多くの方法によって実施できる。Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp. 107 26.を参照のこと。
【００３２】
ソース組織を個々細胞の懸濁液にしたら、懸濁液を部分集団に分別して、そこからＥＣ及びＴＳＥＣを回収できる。分別は、特定細胞タイプのクローニング及び選択、望ましくない細胞の選択的破壊（負の選択（negative selection））、混合個体群中での細胞凝集性の差（differential cell agglutinability）に基づく分離、凍結融解法、混合個体群
中での細胞の接着性差（differential adherence properties）、濾過、通常の及びゾー
ン遠心分離、遠心水簸（centrifugal elutriation）（向流遠心分離（counter-streaming
centrifugation））、ユニット重力分離（unit gravity separation）、向流分配、電気泳動及び蛍光活性化細胞分類を含むが、それらに限定されない細胞分離用の標準技術を用いて実施できる。Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques,
2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137 68.を参照のこ
と。
【００３３】
ＥＣ及びＴＳＥＣ単離のさらなる工程として、細胞選択を用いる。選択は、ＥＣ及びＴＳＥＣの特性若しくはマーカー用いて細胞を選択するという点で「正（positive）」もよく、又は組織若しくは遠心分離された沈殿物内の他の細胞タイプの特性を用いて、ＥＣ及びＴＳＥＣからそれらの他の細胞タイプを排除若しくは除去するという点では、「負（negative）」でもよい。分類方法のタイプとしては、磁気ビーズ単離（ＭＡＣ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）及び水簸が含まれる。選択に使用できる内皮特異的マーカーは、ＥＣについて上で議論されており、ＴＳＥＣ選択は、所望のＴＳＥＣの発現パターンによって変化する。
【００３４】
培養、分化、及び増大。本発明に従って単離されたＥＣ及びＴＳＥＣは、さまざまな供給源から培養して分化させることができる。例えば、ＥＣ及びＴＳＥＣは、人工多能性細胞（induced pluripotent cell）（ＩＰＣ）（Yu et al, 2007）、造血幹細胞（ＨＳＣ）又は当分野で知られた方法を用いて処置される対象の他の細胞サンプルから誘導されたさまざまな他の幹細胞から分化させることができる。同様に、ＥＣ及びＴＳＥＣは、非自己である、さまざまなこのような幹細胞の分化によって入手できる。さらに、ＥＣ及びＴＳＥＣは、ヒト胚幹細胞（ＨＥＳＣ）（Butler, Cell stem cell 6:251-264 (2010b)）から
分化させることができる。入手したＥＣ及びＴＳＥＣを、Ｅ４ＯＲＦ１（Seandel, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105:19288-93 (2008)）でさらにトランスフェクトしてその寿命を延ばすことができる。
【００３５】
本開示は、例えばＴＳＥＣ活性化のため、又は器官再生を誘導若しくは強化する移植のため、単離された細胞集団としてＥＣ及びＴＳＥＣを培養する方法を提供する。ＥＣ及びＴＳＥＣは、上記のように組織サンプルから単離し、培養で増大させることができる。
【００３６】
例えば、ＥＣ又はＴＳＥＣを、ソース組織又は器官の血管から単離し、ＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない）で洗浄し、製造者の標準プロトコールに従って内皮細胞増殖培地（例えば、ＥＧＭ内皮増殖培地、Lonza, Inc.；又は内皮細胞培地、Becton Dickenson
）を含むゼラチンコーティングされた組織培養皿へ移すことができる。滅菌＃１０外科用メスの刃を用いて、血管の長さに沿って１ｍｍ断面切断を行う。より大きな血管は、３つの切り目を入れて最初に縦方向に切断し、血管を開いて平らにしてから、血管内腔を組織培養皿の表面に向けて反転させる。切開後すぐに、さらなる内皮細胞培地を各皿に加えることができる。培地は、培地要素、例えば、血清１％、２％、３％、５％、８％、又は１０％又はそれ以上の培地中の濃度が得られるウシ血清のような血清；増殖因子、例えばＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及び／又はＩＧＦ；及びさらなる薬剤、例えばヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、トリプシンインヒビター、抗生物質、及び／又はヘパリンを場合により含むことができる。培養物を、加湿された３７℃．５％ＣＯ2雰囲気に置く。
【００３７】
５〜２１日の培養でＥＣコロニーを確認できる。集密単層が確立された後（最適には３０日以内）、使用済みの培地を集め、内皮細胞単層をＰＢＳ（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を含まない）で十分に洗浄し、トリプシン処理し（トリプシン０．２５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、３７℃、１０分；GIBCO）、そして２０ｍＬの内皮細胞培地を含む、ゼラチンコーティングされた７５ｃｍ2のフラスコ（Costar, Cambridge, Mass.）中に継代培
養する。ＥＣ単層を、培地と共に毎週供給し、初代細胞のいくつかの継代を確立し、そして場合により保存できる。特定の実施態様では、肝特異的ＥＣ（肝類洞ＥＣ又はＬＳＥＣ）形態のＴＳＥＣを単離する。ＬＳＥＣの単離及び精製は、例えば、「マウス細胞の単離及び培養」下で、実施例１に記載したように、肝組織のコラゲナーゼ消化、続いてＬＳＥＣマーカーに特異的な結合磁気ビーズにおけるＬＳＥＣの分離によって実施できる。単離されたＬＳＥＣの培養は、「内皮細胞を用いた共培養における肝細胞増殖の測定」下で実施例１に記載したように実施できる。ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-を特徴とするのに対して、非類洞ＥＣは、ＶＥＧＦＲ３-ＣＤ３４+を特徴とする。ＬＳＥＣは、ＬＳＥＣマーカーＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+第ＶＩＩＩ因子+に
特異的な磁気ビーズの使用によってソース組織から単離してもよい。
【００３８】
単離されたＬＳＥＣの培養は、「内皮細胞を用いた共培養における肝細胞増殖の測定」下で、実施例１に記載されたように本質的に実施できる。例えば、ＬＳＥＣは、血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ164）（例えば５ｎｇ ｍｌ-1）、そしていくつかの実施態様では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、例えば、１％）で補充された、ＥＣの培養に適した培地（例えばウィリアムズＥ培地（Invitrogen））で培養できる。さらなる適した補充物としては、Ｌ−グルタミン（例えば２ｍｍｏｌ ｌ-1）、デキサメタゾン（例えば、１０-9ｍｏ
ｌ ｌ-1）、ストレプトマイシン（１００Ｕ ｍｌ-1）及びペニシリン（１００Ｕ ｍｌ-1
）が含まれる。細胞を数日から数週間、例えば、少なくとも５日、２又は３週間まで培養して、所望の数の細胞を生成させることができる。培地が、培地中にＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＶＥＧＦ−Ｅを含むような、所望のＬＳＥＣ培養を維持する要素を含むならば、培養条件の変更が許容されることは、当業者によって理解される。
【００３９】
別の特定の実施態様では、肺特異的ＥＣ形態のＴＳＥＣ（肺毛細血管ＥＣ、すなわちＰ
ＣＥＣ）を単離する。ＰＣＥＣの単離及び精製、並びに初代ＰＣＥＣの培養は、ＰＣＥＣマーカーＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ３４+ＣＤ３１+に特異的な磁
気ビーズの使用によるＰＣＥＣの分離を用いて、上記の肝組織に関するように実施できる。
【００４０】
初代ＰＣＥＣの培養は、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＶＥＧＦ−Ｅを培地に添加してＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ３４+ＰＣＥＣを生成させて、上記の肝組織に関するように実施できる。
【００４１】
誘導ＴＳＥＣ及び内皮前駆細胞。本開示は、誘導ＴＳＥＣをさらに提供する。「誘導」ＴＳＥＣとは、１つ又はそれ以上の器官発生活性を誘導するＴＳＥＣのことである。このような器官発生活性には、例えば、血管系の形成、組織特異的パラクリンの増殖因子である「アンギオクリン因子」の産生及び放出、並びに組織特異的な細胞有糸分裂及び／又は増殖の誘導が含まれる。一般に、誘導ＴＳＥＣは、上に記載されたＴＳＥＣのマーカー特性のほとんど又はすべて、並びに１つ又は複数のさらなるマーカーを発現する。例えば、誘導ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+ｗｎｔ２+及びＨＧＦ+（肝細胞増殖因子）+の発現によって定義することができる。誘導ＰＣＥＣは、ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＣＤ３１+ＦＧＦＲ１+ＭＭＰ
１４+の発現によって定義することができる。
【００４２】
誘導ＴＳＥＣを産生するため、組織特異的発現パターンに従って、ＴＳＥＣを上記の組織から単離し、組織特異的増殖因子を用いた培養によって活性化できる。例えば、ＬＳＥＣは、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＶＥＧＦ−Ｅを用いた培養によって活性化され、ＬＳＥＣ
ＶＥＧＦＲ２／Ｉｄ１経路を活性化して誘導ＬＳＥＣを生成させることできるのに対し
て、ＰＣＥＣは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ及び／又はＭＭＰ１４を用いた培養によって活性化され、ＰＣＥＣ ＶＥＧＦＲ２／ＦＧＦＲ１／ＭＡＰＫ経路を活性化して
誘導ＰＣＥＣを生成させることができる。
【００４３】
別法として、誘導ＴＳＥＣは、誘導マーカーを担持するＴＳＥＣの単離によって、例えば特異的マーカーの磁気ビーズ単離（ＭＡＣ）又は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による、誘導マーカーを担持するＴＳＥＣの正の選択によって、外科的に切除された組織から単離できる。器官喪失は、ＴＳＥＣによって感知され、ＴＳＥＣ活性化を導き、失われた組織質量を再生する。従って、誘導ＴＳＥＣは、損傷を受けた又は切除された組織から直接単離できる。特定の例として、誘導ＬＳＥＣは、外科的に除去された肝組織からＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-第ＶＩＩＩ因子+ｗｎｔ２+ＨＧＦ+細
胞の単離によって、これらの方法において直接選択できる。さらなる例として、ＰＣＥＣは、外科的に除去された肺組織からＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＣＤ３１+ＦＧＦＲ１+ＭＭＰ１４+細胞の単離によって直接選択できる。
【００４４】
本発明によるＥＣ、ＴＳＥＣ、及び誘導ＴＳＥＣは、器官再生を必要とする対象に対して自己由来、同種異系、又は異種でもよい。最も好ましくは、本発明に用いる細胞タイプは、自己由来である。異種細胞は、例えば適当な細胞マーカーを発現するトランスジェニック動物から単離できる。
【００４５】
ＴＳＥＣと他の非内皮組織特異的細胞との相互作用は、器官質量を再生する。本開示は、in vivo及びin vitroの両方で非内皮組織特異的細胞と相互作用して組織増殖を促進す
る誘導ＴＳＥＣを提供する。ＴＳＥＣの活性化は、有糸分裂及び非内皮組織特異的細胞の増殖を誘導する。非内皮組織特異的細胞の増殖は、器官質量及び機能の修復に必要であり、ＴＳＥＣ介在性アンギオクリンシグナル及び細胞間接触によって部分的に引き起こされる。肝特異的非内皮細胞の例は、肝細胞であり、肺特異的非内皮細胞の例としては、肺胞
上皮前駆細胞（ＡＥＣ、例えばＡＥＣＩＩ細胞）及びＢＡＳＣが含まれる。
【００４６】
例えば、肝臓では、誘導ＬＳＥＣが、「誘導血管新生」過程により肝細胞増殖を刺激する。すなわち、ＬＳＥＣは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びＷｎｔ２のアンギオクリン産生を介して肝細胞増殖を促進する。この誘導血管新生の後、ＬＳＥＣ自体は、「増殖血管新生（proliferative angiogenesis）」を受けて再生している肝組織の血液供給における増加した需要を満たす。
【００４７】
さらなる例として、誘導ＰＣＥＣは、肺中の機能的肺胞毛細血管嚢をまとめて再構築する肺上皮前駆細胞の増殖を刺激する。肺再生の初期には、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２の活性化によりＭＭＰ１４が上方制御され、肺上皮前駆細胞の増大が起こる。ＶＥＧＦＲ２活性化の後に、ＰＣＥＣ ＦＧＦＲ１発現レベルが、誘導される。その時、ＭＭＰ１４生成
の増大させるにあたって、ＦＧＦＲ１は、ＶＥＧＦＲ２と共同作用し、それによって、肺胞の再生を持続させる。従って、ＰＣＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の逐次的活性化は、肺上皮前駆細胞の増殖に至るＭＭＰ１４産生によって、部分的に機能的肺胞の毛細血管ユニットの再生を誘導する。
【００４８】
さらに、本開示は、ＴＳＥＣと他の非内皮組織特異的細胞とを共培養して器官再生を強化又は誘導する方法を提供する。非内皮組織特異的細胞とＴＳＥＣとの共培養は、培養中の非内皮組織特異的細胞及びＴＳＥＣの両方の細胞数を増加させることができる。例えば、ＴＳＥＣと非内皮組織特異的細胞との共培養では、ＴＳＥＣの数を、培養液中に播種されたＴＳＥＣの最初の数から、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又はそれ以上増加させることが期待される。別法として、又はさらに、ＴＳＥＣと非内皮組織特異的細胞との共培養では、非内皮組織特異的細胞の数を、培養液中に播種された非内皮組織特異的細胞の最初の数から少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又はそれ以上増加させることが期待される。in vitroで細胞数を決定する方法は、当分野で知られている。
【００４９】
一実施態様において、本開示は、肝細胞を肝類洞内皮細胞と共培養することによって、培養中の前記肝細胞を増大させる方法を提供する。ＬＳＥＣと肝細胞との共培養のため、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１００ｍｍの皿で１０，０００個の単離された初代肝細胞を培養し、５００，０００個のＬＳＥＣを播種した。培養条件は、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ ｌ-1）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ
−Ａ164）（５ｎｇ ｍｌ-1）、１０-9ｍｏｌ ｌ-1のデキサメタゾン、ストレプトマイシ
ン（１００Ｕ ｍｌ-1）及びペニシリン（１００Ｕ ｍｌ-1）で補充されたウィリアムズＥ培地（Invitrogen）を含む。２週間のインキュベーション後、細胞を集めた。単離された肝細胞をＬＳＥＣと共インキュベーション（co-incubation）すると、肝細胞数を２倍、
３倍、５倍、７倍、又は９倍又はそれ以上増加させることができる。
【００５０】
従って、本開示は、肝細胞を肝類洞内皮細胞と共培養することによって培養中の肝細胞を増大させる方法を提供する。本発明者らは、肝細胞とＬＳＥＣとの共培養が、肝細胞の増大を導くと確定した。その場合、このような肝細胞は、肝再生を必要とする対象に投与するために産生できる。
【００５１】
別の実施態様において、本開示は、肺上皮前駆細胞を肺毛細血管内皮細胞と共培養することによって、培養中の前記肺上皮前駆細胞を増大させる方法を提供する。ＰＣＥＣ及び肺特異的ＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣ上皮前駆細胞の共培養では、上記の培養条件下
で、培地にｃ−Ｒａｆを添加し、単離された上皮前駆細胞を、１０倍多いＰＣＥＣと共に
播種してＭＡＰＫ活性化ＥＣ（Ａｋｔ＋ＭＡＰＫ ＰＥＣ）を生成させる。共培養のため
、単離されたＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣを非付着性の皿で培養し、１０倍多いＡｋ
ｔ＋ＭＡＰＫ−ＰＣＥＣを播種する。Ａｋｔ＋ＭＡＰＫ−ＥＣからの馴化培地をＡＥＣに加える。共培養の後、例えば、フローサイトメトリー分析によってＡＥＣＩＩ、ＢＡＳＣ、及びＰＣＥＣを定量できる。
【００５２】
培養中の増大後、器官再生を必要とする対象へ導入するため、ＴＳＥＣ及び他の非内皮組織特異的細胞を作ることができる。培養されたＴＳＥＣ及び／又は非内皮組織特異的細胞は、例えば、非動物源から誘導された成分を含む培地を用いて、ヒト対象へ再導入するための細胞の増殖と一致した培地中で培養し、再導入された細胞に対する免疫原性反応を最小限にできる。このような特殊な培地及び培地成分は、商業的に入手可能であり（例えば、Lonza, Inc.から）、生産者のプロトコール従って使用できる。対象へ導入する前に
、細胞を洗浄して残留培地を除去し、対象に投与するための細胞製剤に処方する。本明細書に用いる「細胞製剤」とは、対象に投与できる、誘導ＴＳＥＣ、ＥＰＣ及び／又は非内皮組織特異的細胞を含む、ＴＳＥＣの組成物のことである。細胞製剤を、場合によりさらなる賦形剤と合わせて対象に導入するための医薬組成物を形成できる。
【００５３】
器官再生。本開示は、器官再生の強化又は開始を必要とする対象において器官の再生を強化するか又は開始させる方法であって、前記器官に特異的な内皮細胞又は前記器官に特異的な誘導内皮細胞を、器官再生を強化するか又は開始させるために十分な量で、前記対象中の器官再生が望まれる体の領域に投与することを含む、器官の再生を強化するか又は開始させる方法を提供する。
【００５４】
本明細書に用いる「対象」は、哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、他の齧歯動物、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類の動物、そして最も好ましくはヒトを含む、任意の動物を含む。本発明の方法及び組成物は、哺乳動物、例えばヒトに投与できるが、また、他の哺乳動物、例えば獣医学的処置を必要とする動物、例えば、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコ、及び同類のもの）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及び同類のもの）及び実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、及び同類のもの）にも投与できる。本発明の方法において処置される対象は、器官再生が望ましい対象である。
【００５５】
本明細書に用いる「器官再生」という用語は、器官又は器官の一部の増殖又は再増殖のことである。器官再生の好ましい結果は、器官機能の改善又は修復である。器官再生は、例えば、処置前の器官特異的細胞、器官特異的組織、及び／又は器官特異的機能の量と比較して器官特異的細胞、器官特異的組織及び／又は器官特異的機能の増加を特徴とすることができる。器官特異的細胞又は器官特異的組織における増加は、例えば、本発明の方法及び組成物で処置した後、器官特異的細胞の数を測定するか、又は組織量を質量若しくは体積で測定し、このような測定値を、処置前の器官特異的細胞又は組織の測定値と比較することによって決定できる。器官質量又は体積の測定は、in vivoで、例えば、ＭＲＩの
ような撮像技術を用いることにより算出してもよい。本発明の方法による処置後の器官の細胞数、質量、又は体積における増加は、処置前に推定された又は実際の前記器官の細胞数、質量、又は体積と比較して、細胞数、質量、又は体積の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又はそれ以上の増加であることができる。
【００５６】
同様に、器官特異的機能の増加は、本発明の方法及び組成物で処置した後の器官機能の１つ又はそれ以上の態様を測定し、このような測定値を処置前の器官機能の測定値と比較することによって決定できる。本発明の方法による処置後の器官特異的機能の増加は、処置前の器官機能の１つ又はそれ以上の態様と比較して、器官機能の前記１つ又はそれ以上
の態様における、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又はそれ以上の増加であることができる。このような測定を実施する方法は、当分野で知られている。
【００５７】
本明細書に用いる器官再生を「強化する」とは、再生を必要とする器官の細胞数、質量、体積、又は機能の量を高めること、又は若干の器官再生が自然に発生するかもしれないが、このような自然に発生する器官再生では、再生の量若しくは速度が不十分である対象において、器官再生速度を高めることである。不十分な再生の量又は速度は、例えば、９０日の期間で、器官特異的細胞の数、質量、体積、又は機能が１％、２％、５％、１０％、又は２０％より少ない増加である。器官再生を「開始する」とは、再生を必要とする器官の細胞数、質量、又は体積の量を高めること、又は器官再生が明らかに生じていない対象において器官再生の速度を高めることである。
【００５８】
さらに、本開示は、組織特異的ＥＣ及び誘導ＴＳＥＣを、場合により生物学的に許容しうる担体と組み合わせて、さらに場合により非内皮組織特異的細胞と組み合わせて含む、細胞製剤及び組成物を提供する。例えば、本明細書に開示された細胞は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、細胞製剤及びさらなる許容しうる担体を含むことができる。本明細書に用いる「生物学的に許容しうる担体」は、生物学的製剤投与と適合しうる、任意の及びすべての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに同類のものを含むものとする。適した担体は、当分野の標準参照テキスト、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載
されており、それは参照により本明細書に組み込まれている。
【００５９】
このような担体又は希釈剤の好ましい例には、水；生理食塩水；デキストロース溶液；ヒト血清アルブミン；ＨＢＳＳ及び関連分野の熟練技術者に知られた他の緩衝液（Ｃａ++及びＭｇ++を含むもの及びそれらを含まないもの）；及び基本培地が含まれるが、それらに限定されるわけではない。また、リポソーム及び非水性媒体、例えば固定油を用いもよい。薬学的活性物質のためのこのような培地及び薬剤の使用は、当分野でよく知られている。任意の通常の培地又は薬剤が活性化合物と適合しない以外は、組成物中のその使用が考えられる。また、補助活性化合物を組成物に組み込むことができる。例えば、医薬組成物は、増殖因子、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、又はＭＭＰ１４を場合によりさらに含んでもよい。
【００６０】
肝再生のため、特定の実施態様の医薬組成物は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+第ＶＩＩＩ因子+Ｐｒｏｘ−１-ＣＤ４５-細胞を含む。肺再生のため
、特定の実施態様の医薬組成物は、ＶＥ−カドヘリン+ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ３
４+細胞を含む。
【００６１】
本発明による細胞製剤は、ＴＳＥＣ及び誘導ＴＳＥＣを、場合により非内皮組織特異的細胞と組み合わせて、そしてさらに支持する生物学的又は合成細胞外マトリックス又はマトリックス物質（ＥＣＭ）と混合して又は合わせて含むことができる。当業者にとっては明らかであるが、「ＥＣＭ」という用語は、多細胞生物の体の至るところに分布している非細胞性物質のことである。このような混合物は、器官組織の増殖の足場を提供できる。ＥＣＭは、多様な成分、例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、複合体炭水化物、及び他の分子を含む。ＥＣＭの主な機能としては、構造的支持、引張強さ、又は緩衝作用を提供すること；細胞接着及び細胞移動のための基質（substrates）及び経路を提供すること；並びに細胞分化及び代謝的機能を調節すること、が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ＥＣＭタンパク質には、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、テネイシン（
サイトアクチン（cytoactin））、エンタクチン（ニドジェン）、オステオネクチン（Ｓ
ＰＡＲＣ）、アンコリンＣＩＩ、コンドロネクチン、結合タンパク質、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、エピネクチン（epinectin）、ヒアルロネク
チン、アミロイドＰ成分、フィブリリン、メロシン、ｓ−ラミニン、ウンダリン（undulin）、エピリグリン（epilligrin）、及びカリニンが含まれる。本発明による使用に好ま
しいＥＣＭタンパク質には、コラーゲン、アルギナート、アガロース、フィブリン、フィブリン糊、フィブリノーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ＨＳＰ、キトサン、ヘパリン及び／又は他の合成ポリマー又はポリマーの足場が含まれる。
【００６２】
組成物又は製剤は、注射、例えばボーラス注射、又は持続注入による非経口投与のために処方できる。組成物は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液又は乳濁液のような形態をとることができ、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤のような製剤化剤（formulatory agents）を含んでもよい。別法として、組成物又は製剤は、例えば、外科手術中に、例えば、罹患した器官又はその一部を除去した直後、患部に投与される移植片として、作製してもよい。
【００６３】
本発明による組成物の投与は、患者の種、年齢、体重、性別、及び医学的状態；再生が望まれる、損傷を受けた又は罹患した器官のタイプ及び重症度；投与経路；及び使用する特定の細胞を含む、さまざまな因子に従って実施される。通常の知識を有する医師又は獣医は、器官再生の強化又は誘導に必要な有効量を容易に決定し、処方できる。
【００６４】
本明細書に用いる「十分な量」は、上に定義された、器官特異的細胞、器官特異的組織及び／又は器官特異的機能における増加を達成するため、対象に投与する細胞又は医薬組成物の量である。例えば、本発明の方法又は組成物による処置は、処置前の器官特異的細胞の数、質量、体積、又は機能の量と比較して、１８０日の期間にわたって、器官特異的細胞の数、質量、体積、又は機能を、１％より多く、２％より多く、５％より多く、１０％より多く、又は２０％より多く高めることができる。
【００６５】
本発明のＴＳＥＣ、誘導ＴＳＥＣ、又は組成物は、受療体（patients）の処置に十分な量で受療体に投与され、それは、熟練した専門家によって決定できる。処置に必要な細胞数は、器官のタイプ、ＭＲＩのような医用撮像技術を用いて決定される、失われた又は損傷を受けた器官成分のサイズ（又は領域）、受療体の年齢及び／又は体重などを含む多くの因子によって決まる。一般に、１×１０6〜１０×１０6、より好ましくは２×１０6〜
８×１０6の範囲の細胞数を受療体に投与できることが期待される。従って、特定の受療
体及び処置する器官に応じて、投与する細胞数は、約２×１０6、３×１０6、４×１０6
、５×１０6、６×１０6、７×１０6、又は８×１０6であることができる。これらの量は、例えば、ＬＳＥＣ及び肝細胞の肝共投与におけるように、ＴＳＥＣを、他の非内皮組織特異的細胞と共投与する場合、ＴＳＥＣの総数、又は対象に投与するすべての細胞の合計のことであってもよい。さらなる実施態様では、ＴＳＥＣ増殖因子、例えばＬＳＥＣ活性化にはＶＥＧＦ、又はＰＣＥＣ活性化にはＥＧＦを、対象へのＴＳＥＣの投与中か又はその後に投与する。
【００６６】
本発明による細胞又は組成物の投与後、器官再生は、上記のように、細胞数、器官質量、又は体積、及び／又は器官機能における増加によって測定できる。
【００６７】
本発明の実施態様では、本発明の医薬組成物又は細胞製剤を、器官の外科的切除中か又はその後に、例えば、肝切除若しくは肺切除中か又はその後に投与する。
【００６８】
肝特異的再生。本開示は、肝再生を強化する方法を提供する。本発明の一実施態様は、肝再生の強化を必要とする哺乳動物において肝再生を強化する方法であって、肝特異的内
皮細胞又は誘導肝特異的内皮細胞の肝内投与を含む、肝再生を強化する方法を提供する。
【００６９】
肝変性に至る肝疾患は、肝細胞がん、肝硬変、肝線維症及び肝炎でありうる。肝線維症は、慢性アルコール乱用；薬物（例えば、アセトアミノフェン、アミオダロン、アスピリン、アザチオプリン、イソニアジド、メチルドパ、メトトレキセート、ミトルフラントイン、プロピルチオウラシル、スタチン、及びスルホンアミド）の慢性暴露；特定の化学薬品（例えば、四塩化炭素、ジメチルニトロソアミン、塩化ビニル、ポリ塩化ビフェニル、アフラトキシン、及び農薬）の慢性暴露；マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）に
よる感染；糖尿病；自己免疫障害（例えば、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、ルポイド肝炎）、及び炎症性腸疾患；並びに他の状態を含むが、それらに限定されない、さまざまな慢性毒性傷害のいずれかに起因する、肝臓中の瘢痕組織の増殖のことである。肝硬変は、肝実質が悪化し、小葉が脂肪で浸潤され、密集した小葉辺縁性結合組織が形成される、変性状態である。結果として、残存する細胞への血液供給が低下して門脈亢進症、そして最終的に死亡に至る。さらに、いくつかの遺伝性疾患、例えばウイルソン病、ＨＨＣ、及びα１抗トリプシン欠損症があり、それらは肝臓に機能障害を生じ、肝硬変又は慢性肝炎を生じることがある。
【００７０】
さらに、本開示は、ＶＥＧＦを単独で又はＬＳＥＣの投与と組み合わせて投与することを含む、肝再生を強化するか又は開始させる方法を提供する。本発明者らは、ＬＳＥＣが肝臓中でＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３を発現し、そしてＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＶＥＧＦ−Ｅの投与により、ＬＳＥＣ活性化、肝細胞増殖のＬＳＥＣ介在性刺激、ＬＳＥＣ増殖、肝再生、及び肝血管再生が誘導されることを発見した。
【００７１】
さらに、本開示は、肝再生の強化又は誘導を必要とする対象にＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、又はＦＧＦ−２、及び／又はＩｄ１アゴニストを投与することによって、肝再生を強化又は誘導する方法を提供する。本発明者らは、これらの増殖因子が、組織再生における肝細胞及びＬＳＥＣ生成の誘導並びに血管新生によって肝器官形成を促進し、このように正常な肝機能を促進することを確定した。
【００７２】
さらに、本開示は、ＬＳＥＣの肝内投与によって肝再生を強化又は誘導する方法を提供する。本発明者らは、ＬＳＥＣが、肝細胞の増殖を誘導して新たな組織を形成することを見いだした。肝細胞増殖の誘導後、ＬＳＥＣ自体は、増殖して組織を再生する血管を支持する。
【００７３】
また、本開示は、肝機能低下を患っている対象において乏血管性（hepatovascular）機能を改善する方法であって、肝細胞とＬＳＥＣ、特にＶＥＧＦＲ２+Ｉｄ１+ＬＳＥＣとの肝内同時移植を含む、乏血管性機能を改善する方法を提供する。
【００７４】
本明細書に用いる「肝機能」という成句は、タンパク質合成、例えば血清タンパク質［例えば、アルブミン、凝固因子、アルカリホスファターゼ、アミノトランスフェラーゼ（例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、５'−ヌ
クレオシダーゼ、ガンマ−グルタミニルトランスペプチダーゼ、など］、ビリルビンの合成、コレステロールの合成、及び胆汁酸の合成；炭水化物代謝、アミノ酸及びアンモニア代謝、ホルモン代謝、並びに脂質代謝を含むが、それらに限定されない肝代謝機能；外因性薬物の解毒；コレステロール、胆汁酸、リン脂質及びビリルビンの排泄（excertion）
機能；並びに内臓及び門脈血流動態を包含する血流力学的機能を含むが、それらに限定されない肝臓の機能のことである。
【００７５】
肺特異的再生。本開示は、肺再生を強化又は誘導する方法を提供する。一実施態様において、本開示は、肺又は肺胞の再生を必要とする哺乳動物における肺又は肺胞の再生を誘
導する方法であって、肺再生の強化又は誘導に十分な量での肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）又は誘導ＰＣＥＣの静脈内又は気管内投与を含む、肺又は肺胞の再生を誘導する方法を提供する。
【００７６】
本発明の別の実施態様は、ＭＭＰ１４を発現するＰＣＥＣ又はＥＣの静脈内又は気管内投与によって、肺胞形成を必要とする哺乳動物において肺胞形成を誘導する方法を提供する。
【００７７】
本発明のさらなる実施態様は、ＭＭＰ１４を投与することによって、肺胞形成を必要とする哺乳動物において肺胞形成を誘導する方法を提供する。
【００７８】
また、本発明は、肺胞形成を必要とする哺乳動物において肺胞形成を誘導する方法であって、ラミニン５γ２からのＨＢ−ＥＧＦ及びＥＧＦ様フラグメントを含む、上皮増殖因子（ＥＧＦ）又はＥＧＦ受容体リガンドを発現するＰＣＥＣの静脈内又は気管内投与による、肺胞形成を誘導する方法を提供する。
【００７９】
本発明のさらなる実施態様は、ＥＧＦを投与することによって、肺胞形成を必要とする哺乳動物において肺胞形成を誘導する方法を提供する。
【００８０】
本発明の別の実施態様は、ＰＣＥＣで発現されたＶＥＧＦＲ２又はＦＧＦＲ１の活性化のため、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｅ、又はＦＧＦ−２の投与によって、肺胞形成を必要とする哺乳動物において肺胞形成を誘導する方法を提供する。
【００８１】
本発明の方法によって誘導される肺再生は、肺機能が損なわれるか又は肺気量が低下する、さまざまな肺疾患及び損傷の処置に有用である。これらの方法は、損傷した、罹患した又はがんにかかった肺組織の外科的切除後の肺組織の再生に有用である。これらの方法は、例えば、炎症及び／又は内皮細胞の早期死滅（premature death）を含む肺疾患にさ
らに有用である。これらの方法で処置できる肺疾患には、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤ）、外傷性ＡＲＤ、気腫、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、喘息、気腫、肺形成不全、肺高血圧症、嚢胞性線維症、肺がん、喘息、肺外傷、又は他の遺伝的若しくは先天的肺異常、例えば、気管支性嚢胞、肺無形成及び形成不全、多肺胞葉、肺胞毛細血管異形成、動静脈奇形（ＡＶＭ）及び三日月刀症候群を含む分画症、肺リンパ管拡張症、又は先天性大葉性肺気腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８２】
肺損傷は、化学的に誘発された肺損傷であることができる。肺損傷は、肺疾患によって生じることがある。肺損傷は、肺線維症、サルコイドーシス、石綿症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、肺炎、肺結核、リウマチ様肺疾患、気管支拡張症、気管支炎、気管支肺異形成又は間質性肺疾患からなる群から選択される少なくとも１つの状態によって生じることがある。
【００８３】
本明細書に用いる「肺機能」及び「肺の機能」という成句は、呼吸、酸素摂取量、ＣＯ呼出、呼吸、ガス交換、並びに粘液及び気管支分泌物の産生を含む、それらに限定されない、肺及び／又は肺系統の機能のことである。
【実施例】
【００８４】
本説明を、以下の実施例によってさらに例示するが、それらはなんら制限するものとして解釈すべきではない。すべての引用文献（本願に引用された、参照文献、発行された特許、公開された特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書によって明白に組み込まれる。
【００８５】
〔実施例１〕
肝再生
トランスジェニックレポーター及び遺伝子標的化動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Jackson Laboratoriesから得た。ＶＥＧＦＲ２−ＧＦＰマウスは、J. Rossant (Ema, Blood 107:111-117 (2006))から入手した。Ｉｄ１-/-マウス
を、以前に記載されたとおり（Nam, Cell Stem Cell 5:515 -526 (2009)）生成させ、そ
してR. Benezra and D. Lyden.から得た。
【００８６】
ＶＥＧＦＲ２loxP/loxPマウスを、T.N. Satoによって生成させて、内皮特異的誘導性ＶＥＧＦＲ２ノックアウトマウスを用いた実験を、以前に記載されたとおり実施した（Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009)）。簡潔には、潜在的Ｃｒｅ介在性毒性を説明す
るため、ＶＥＧＦＲ２loxP/loxPマウスと、それからＲｏｓａＣｒｅ−ＥＲT2トランスジ
ェニックマウスとを交配させてＲｏｓａＣｒｅ−ＥＲT2ＶＥＧＦＲ２loxP/loxP系統及び
対照ＲＯＳＡ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２loxP/+を確立した。また、ＶＥＧＦＲ２の内皮特異的ノックダウンを誘導するため、L. Iruela-Arispaによって提供されたＶＥ−カドヘリン−ＣｒｅＥＲT2マウスを、ＶＥＧＦＲ２loxP/loxPマウスと交雑させてＶＥ−カドヘ
リン−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２loxP/loxPマウスを生成させた。ＶＥＧＦＲ２遺伝子除
去（gene ablation）を誘導するため、６〜８週齢の雄マウスを、タモキシフェン２５０
ｍｇ ｋｇ-1ヒマワリ油の用量で６日間、腹腔内処置し、第３の投与（the third dose）
後、３日間中断した。３日休止後、第４の投与（fourth dose）をさらに３日間再開して
、両方の対立遺伝子でＶＥＧＦＲ２が欠損したＲＯＳＡ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２flox/flox（ＶＥＧＦＲ２fl/fl）マウス、内皮細胞特異的ＶＥＧＦＲ２ノックダウンを有した、対照ＲＯＳＡ−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２fl/+マウス又はＶＥ−カドヘリン−ＣｒｅＥＲT2ＶＥＧＦＲ２fl/flマウスを生成させた。すべての動物実験は、動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって設定されたガイドラインの下で実施した。
【００８７】
７０％部分肝切除モデルを用いてマウスの生理学的肝再生を誘導した。肝質量の７０％を構成する、３つのほとんどの前葉（右葉内側、左葉内側及び左葉外側）を、尾状葉及び右葉への血液供給を損傷することなく切除した。１００ｍｇ ｋｇ-1の腹腔内ケタミン及
び１０ｍｇ ｋｇ-1のキシラジンによってマウスに麻酔をかけた。正中線開腹術（midline
laparotomy）を、麻酔下のマウスで実施した。上腹部を開いて肝臓を露出させた後、切
除する左葉を静かに持ち上げると同時に、５−０絹製縫合糸の結び目（silk suture tie
）（Roboz）を葉の下側に置き、葉の起点のできるだけ近くに配置した。下大静脈近くの
葉底部から肝葉の上部にかけて縫合糸の両端を結んだ。３つの結び目をつくり、顕微解剖用はさみ（microdissecting）を用いて縫合糸に対してちょうど遠位で結ばれた葉を切断
した。この過程を、他の中葉について繰り返して７０％の部分肝切除を行った。その次に、腹膜を、連続した（running）５−０絹製縫合糸で再接合し、皮膚を連続した４−０絹
製縫合糸で閉じた。
【００８８】
シャム手術マウス（Sham-operated mice）には、肝切除なしに開腹術を行った。肝質量及び機能の再生を特徴づけるため、残存肝葉の質量を測定して、部分肝切除後のさまざまな日数の時点でマウス体重に対して標準化し、そしてそれぞれ、７０％部分肝切除後の血漿ビリルビンレベルを評価した（Genzyme Diagnostics）。部分肝切除モデルをＣＣｌ4誘導肝損傷モデルと比較するため、以前に記載されたとおり（LeCouter, Science 299:890-893 (2003)）、ＣＣｌ4を腹腔内に注射した。ＶＥＧＦ−Ａ又はＰｌＧＦによって促進さ
れた肝再生を試験するため、マウスを、１５μｇ ｋｇ-1の組換え型ＶＥＧＦ164（Biovision）及び同量のＰｌＧＦ（Biovision）で、手術１２時間前、そしてその後１日２回処置した。また、Ｉｄ１-/-マウス及び野生型同腹子にも、手術の前及び後に同様のＶＥＧＦ
１６４及びＰＢＳ処置を施した。
【００８９】
肝免疫蛍光検査及びＧＦＰの検出
ＶＥＧＦＲ２−ＧＦＰ、ＶＥＧＦＲ２fl/fl、Ｉｄ１-/-及び同腹子対照マウスを部分肝切除又はシャム手術にかけ、４％パラホルムアルデヒドで灌流させ、低温保護し（cryoprotected）、そしてＯＣＴ中で瞬間凍結させた。肝微小血管系の分析のため、以前に記載
されたとおり（Hooper, Cell Stem Cell 4:263 -274 (2009)）、殺す５分前に、マウスに２ｍｇ ｋｇ-1のGriffonia simplicifoliaレクチン（イソレクチンＢ４、Invitrogen）を静脈注射した。免疫蛍光顕微鏡検査のため、肝切片（１０μｍ）をブロックし（５％ロバ血清／０．３％トライトンＸ−１００）、そして一次抗体：抗ＶＥＧＦＲ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ、ｍＦ４−３１Ｃ１、１０μｇ ｍｌ-1、ImClone）、抗ＶＥ−カドヘリンポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ、２μｇ ｍｌ-1、R&D Systems）、抗ＣＤ３４ｍＡｂ（５５３７３１、５μｇ ｍｌ-1、BD Biosciences）、抗ホスホ−ヒストンＨ３（Millipore）及び抗ＨＮＦ４Ａ抗体（Abcam）中にインキュベートした。フルオロフォア結合二次抗体（
２．５μｇ ｍｌ-1、Jackson ImmunoResearch）中でインキュベーション後、切片をＴＯ
ＰＲＯ３又はＤＡＰＩ（Invitrogen）で対比染色した。
【００９０】
in vivo肝細胞増殖をＢｒｄＵ取り込みによって測定した。簡潔には、マウスに、死亡
６０分前に腹腔内へのＢｒｄＵ（Sigma）の単回投与（５０ｍｇ ｋｇ-1動物体重の用量で）を行った。死亡時に、マウスには麻酔がかかっており、血液を下大静脈から採取し、残存する肝葉を取り出し、計量し、そしてさらに処理した。BrdU Detection System（BD Biosciences）及びフルオロフォア結合二次抗体（２．５μｇ ｍｌ-1、Jackson ImmunoResearch）を用いて凍結切片を染色した。
【００９１】
画像収集及び画像分析
オリンパス（Olympus）ＢＸ５１顕微鏡（Olympus America）に装備されたAxioVisionソフトウェア（Zeiss）を用いて、肝切片の免疫組織化学画像を得た。免疫蛍光検査画像は
、AxioVert LSM510、又は710共焦点顕微鏡（Zeiss）で得た。Image J（National Institutes of Health）を用いて、デジタル画像を内皮マーカー（ＶＥ−カドヘリン+）及び機能的灌流血管（イソレクチン+）の密度について分析した。血管密度は、それぞれ強拡大視
野×４００中の全領域に対する正の成分のパーセンテージによって表した。
【００９２】
マウス細胞の単離及び培養
変更を伴う二段階コラゲナーゼ灌流技術によって、シャム手術及び部分肝切除を受けたマウスから、肝細胞、ＬＳＥＣ、星細胞及びクッパー細胞を単離した（Tam, Nature Med.
12:793-800 (2006);Passino, Science 315:1853-1856 (2007) ; Kumar, J. Clin. Invest. 116:512-520 (2006) ; Winau, Immunity 26:117-129 (2007) ; Kreamer, In Vitro Cell. Dev. Biol. 22:201-211 (1986))。簡潔には、下大静脈にカニューレを挿入して門脈
を切断した後、肝臓に、下大静脈を通してLiver Perfusion Medium（Invitrogen）を３７℃、５ｍｌ分-1で１０分間灌流させ、続いて、Liver Digest Medium（Invitrogen）を、
さらに１０分間灌流させた肝臓を、Hepatocyte Wash medium（Invitrogen）中で解離させ、７０μｍの孔を有するダクロンファブリックを通過させ、そして低速遠心分離（５０ｇ×５分）によって非実質性肝細胞減損画分（ＮＰＣ）から分離させ、それを、以前に記載されたとおり（Kreamer, In Vitro Cell. Dev. Biol. 22:201-211 (1986)）、ストックパーコール溶液を用いたパーコール勾配遠心分離によってさらに精製した。ＮＰＣを含む上清を集め、５０ｇで５分間、２回洗浄し、３５０ｇで７分間沈殿させ（pelleted）、そして以前に記載されたとおり（Kreamer, In Vitro Cell. Dev. Biol. 22:201-211 (1986)）、７５％ストックパーコール溶液及び３５％ストックパーコール溶液を用いたパーコール勾配遠心分離（９００ｇ×２０分）で分別した。ＬＳＥＣを含む画分を富化し、等量のＰＢＳと混合し、そして９００ｇで７分間遠心分離した。沈殿物をＤＭＥＭ（Invitrogen）により３５０ｇで７分間洗浄し、そしてマウスＬＳＥＣ結合磁気ビーズ（Miltenyi）によ
ってさらに標識した。ＬＳＥＣの精製は、製造者のプロトコールに従って実施した。星細胞及びクッパー細胞の精製は、以前に記載されたとおり実施した（Passino, Science 315:1853-1856 (2007); Kumar, J. Clin. Invest. 116:512-520 (2006); Winau, Immunity 26:117-129 (2007)）。
【００９３】
ＬＳＥＣのフローサイトメトリー分析、同定及び定量
精製されたモノクローナル抗体を、生産者のプロトコール（Molecular Probes/Invitrogen）に従ってAlexa Fluor色素又はQdotsに結合させた。精製された肝細胞減損ＮＰＣ（hepatocyte-depleted NPC）をＬＳＲＩＩＳＯＲＰ（BD）で分析した。データをFACSDiva 6.1ソフトウェア（BD）で処理した。ＦＳＣ−Ｗ×ＦＳＣ−Ｈ及びＳＳＣ−Ｗ×ＳＳＣ−Ｈ分析によってダブレット（doublets）を排除し、補正のため単一染色チャネルを用い、フルオロフォアマイナスワン（fluorophore minus one）対照をゲーティング（gating）に
用いた。モノクローナル抗体は、注釈された場合を除いて、BDから購入した：ＶＥ−カドヘリン（ＢＶ１３、ImClone）；ＶＥＧＦＲ３（ｍＦ４−３１Ｃ１、ImClone）；ＶＥＧＦＲ２（ＤＣ１０１、ImClone）；ＣＤ４５（３０−Ｆ１１、BD Biosciences）；ＣＤ３４
（１４−０３４１、eBioscience）。
【００９４】
ＬＳＥＣの定量のため、肝臓を上のように機械的に調製し、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３４に対する結合抗体を用いた共染色によってＳＥＣ数を定量した。ＳＥＣ数は、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+細胞の数に等しい。ＶＥＧＦＲ３-ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+細胞を非ＳＥＣとして評価した。
【００９５】
内皮細胞との共培養における肝細胞増殖の測定
ヒトＬＳＥＣは、ScienCell Research Laboratoriesから得た。ＬＳＥＣ中でＩｄ１を
選択的にノックダウンするため、Fugene 6（Roche Applied Science）によって、２９３
Ｔ細胞中に、Ｉｄ１／スクランブルｓｈＲＮＡ、ｐＥＮＶ／ＶＳＶ−Ｇ ３μｇ、ｐＲＲ
Ｅ５μｇ及びｐＲＳＶＲｅｖ ２．５μｇを含むシャトルレンチウイルスベクター１５μ
ｇを、同時形質移入することによって、Ｉｄ１／スクランブル低分子ヘアピン型ＲＮＡ（Scrambled short hairpin RNA）（ｓｈＲＮＡ）を生成させた。ウイルス性の上清を、超
遠心分離によって濃縮した。これらの濃縮ウイルス性製剤を用いてＬＳＥＣ又は肝細胞に形質導入した。
【００９６】
共培養研究のため、１０，０００個の単離された初代肝細胞をＩ型コラーゲンでコーティングされた１００ｍｍの皿中で培養し、それぞれ、５００，０００個のＬＳＥＣ、又はＩｄ１／スクランブルｓｈＲＮＡレンチウイルスで処理されたＬＳＥＣを播種した。培養条件は、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌｌ-1）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ１６４）（５ｎｇ ｍｌ-1）、１０-9ｍｏｌ ｌ-1のデキサメタゾン、ストレプトマイシン（１００Ｕ ｍｌ-1）及びペニシリン（１００Ｕ ｍｌ-1）で補充されたウィリアムズＥ培地（Invitrogen）からなる。各群からの細胞を２週後に集めた。ＬＳＥＣ及び肝細胞を視覚化するため、上記のように、ＬＳＥＣをｍＣｈｅｒｒｙレンチウイルス（ｐＣＣＬ主鎖中）によって標識し、肝細胞をＧＦＰレンチウイルスで感染させた。また、２週間培養した５００，０００個のＬＳＥＣから馴化培地を集め、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、そしてＬＳＥＣ共培養がない場合、１：２の希釈度で１０，０００個の肝細胞に加えた。ＬＳＥＣ及び肝細胞の数を、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰシグナルのフローサイトメトリー分析によって評価した。回収した肝細胞数を、最初に播種した肝細胞数と比較することによって肝細胞増殖を定量した。
【００９７】
アフィメトリクス分析及び定量的リアルタイムＰＣＲ分析
ＲＮｅａｓｙ（Qiagen）を用いて肝臓からＲＮＡを新たに単離し、Superscript II（In
vitrogen）を用いて相補的ＤＮＡに変換した。マイクロアレイは、Mouse U133 2.0（Affymetrix）を用いて実施した。ＲＮＡ品質、サンプル標識化、ハイブリダイゼーション及び発現分析の方法の詳細は、Affymetrix Microarray Kitのマニュアルに従った。定量的Ｐ
ＣＲは、マウスＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｉｄ１、ＨＧＦ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ９Ｂ及びＴＭ（Applied Biosystems）のTaqman遺伝子発現システムを用いて実施した。
【００９８】
再生ＬＳＥＣの肝移植
野生型（Ｉｄ１+/+）マウス並びに週齢及び性別がマッチしたＩｄ１-/-マウスにおいて多小葉７０％の部分肝切除を実施した。部分肝切除の４８時間後、ＬＳＥＣを、野生型マウス（Ｉｄ１+/+再生ＬＳＥＣ）から単離し、上記のようにＧＦＰレンチウイルス（ｐＣ
ＣＬ主鎖中）形質導入によって標識化した。移植方法は、以前に記載されたものから改良した（Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935 -945 (2008)）。簡潔には、部分肝切除の４８時間後、Ｉｄ１-/-マウスに麻酔かけ、右側臥位に配置した。左側腹部をベタジンでス
クラブし、皮膚及び腹壁を縦方向に（脊椎と並行に）切開した。脾臓を体外に出した後、Ｉｄ１+/+再生ＬＳＥＣを、２７ゲージ注射針によって脾実質に注射した。注射後、脾摘
出を実施した。また、Ｉｄ１+/+再生ＬＳＥＣの救済効果を比較するため、Ｉｄ１-/-及び野生型マウスを、部分肝切除（シャム移植（sham transplant））の２日後、ＰＢＳの脾
内注射及び脾摘出にかけた。ＬＳＥＣ中のＷｎｔ２及びＨＧＦ発現を導入するため、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ相補ＤＮＡをOpen Biosystemsから購入し、上記のようにレンチウイルス
ベクターにクローニングした。Ｗｎｔ２若しくはＨＧＦをコードするウイルス、又は同量の混合型Ｗｎｔ２及びＨＧＦによるＬＳＥＣの感染を、ＧＦＰレンチウイルス感染により実施した。
【００９９】
データ分析
すべてのデータは、少なくとも３つの別々の実験の平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示した。スチューデントｔ検定又は分散分析を用いて、統計的有意性について群間の違いを試験した。統計的有意性をＰ＜０．０５に設定した。
【０１００】
部分肝切除及び肝再生。
本発明者らは、肝再生の仲介におけるＬＳＥＣの指示的役割を解明するため、生理学的に関連した部分肝切除モデルを用いた（図１Ａ）。ＬＳＥＣの組織化を損ない、組織低酸素、細胞死及び炎症を生じる肝毒性化学物質の投与（Lee, Hepatology 45:817-825 (2007)；LeCouter, Science 299:890-893 (2003)；Friedman, Physiol. Rev. 88:125-172 (2008)）と対照的に、部分肝切除モデルにおいて、肝質量の７０％切除は、残存肝血管系の完全性を乱すことなく（Greene, Ann. Surg. 237:530-535 (2003)）、肝細胞再生を活性化
する（Fausto, Hepatology 43:S45-S53 (2006); Michalopoulos, Science 276:60-66 (1997); Greenbaum, J. Clin. Invest. 102:996-1007 (1998)）。このように、本モデルは、肝再生の支持における構造的かつ機能的に無傷のＬＳＥＣの役割を調べるための有益なモデルを提供する。
【０１０１】
ＶＥＧＦは、肝再生に関与する。
ＶＥＧＦファミリーが、骨髄ＳＥＣの再生における役割を果たすため（Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274 (2009） ； Ferrara, Nature Med. 9:669-676 (2003） ； Carmeliet, Nature 438:932-936 (2005) ; Alitalo, Nature 438:946-953 (2005))、本発明者らは、ＶＥＧＦＲ２又はＶＥＧＦＲ３を含むＶＥＧＦ受容体も、またＬＳＥＣ機能を調節すると仮定した。従って、本発明者らは、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３が、肝内皮細胞中で排他的に発現されることを示すため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現がＶＥＧＦＲ２の天然プロモーター（native promoter）によって誘発される、ＶＥＧＦＲ２−ＧＦＰ
マウスを用いた。これに対して、本発明者らは、他の肝細胞タイプ、例えば肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４Ａ）+肝細胞では、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３が発現されないことを
見いだした（図２Ａ）。特に、ＶＥＧＦＲ３発現の分布は、ＣＤ３４+ＶＥＧＦＲ３-大血管から分岐したＶＥＧＦＲ２+ＬＳＥＣに制限される。ＶＥＧＦＲ３発現は、体中に血液
を運ぶ動脈及び静脈のようなより大きな血管系を形成するＥＣについては典型的ではない。従って、ＬＳＥＣ中のＶＥＧＦＲ３の発現により、ＬＳＥＣは、器官特異的でないＥＣと区別される（図２Ｂ）。
【０１０２】
ＬＳＥＣの独特な発現表現型の同定により細胞特異的定量、精製及び分子プロファイリングが可能である。
本発明者らは、非造血性ＶＥＧＦＲ３+ＶＥＧＦＲ２+ＣＤ４５-ＬＳＥＣでの内皮特異
的マーカーＶＥ−カドヘリンの発現を示すため、非実質細胞（ＮＰＣ）における多変性フローサイトメトリー分析を実施した。本発明者らは、これらの細胞の９７．６％が、凝固第ＶＩＩＩ因子を発現するＰｒｏｘ１-ＣＤ３４-内皮細胞であることを見いだした（図２Ｃ、Ｄ）。Ｐｒｏｘ１-ＣＤ３４-細胞は、非リンパ細胞である（Alitalo, Nature 438:946 -953 (2005)）。これは、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+第
ＶＩＩＩ因子+Ｐｒｏｘ−１-ＣＤ４５-血管として成体マウスのＬＳＥＣの独特な表現型
の特徴及び操作上の特徴（operational signature）が、ＶＥＧＦＲ３-ＣＤ３４+ＶＥＧ
ＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+ＣＤ４５-非類洞内皮細胞及びＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４+Ｐｒｏ
ｘ−１+第ＶＩＩＩ因子-ＣＤ４５-リンパ管内皮細胞からのものとは区別されることを示
している。ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-としてのＬＳＥＣ及びＶＥＧＦＲ３-ＣＤ３４+としての非類洞内皮細胞の同定は、非類洞ＥＣからＬＳＥＣの定量、精製、及び分子プロファイリングに十分である。
【０１０３】
肝細胞とＬＳＥＣとの間の再生相互作用の同定
ＬＳＥＣが肝臓増殖を調節する機構を確定するため、本発明者らは、部分肝切除後の肝細胞及びＬＳＥＣの再生動態を試験した。本発明者らは、ＶＥ−カドヘリン、上皮肝細胞マーカー（Ｅ）−カドヘリン及び有糸分裂マーカーリン酸化ヒストン−３を用いた染色によって示されるように、部分肝切除の２日後、Ｐ−Ｈ３+Ｅ−カドヘリン+有糸分裂肝細胞が、非増殖ＬＳＥＣの近位にあることを見いだした（Ｐ−Ｈ３；図２Ｅ）。これは、ＬＳＥＣが血管新生増殖シグナルを放出して、肝細胞の有糸分裂及び増殖を誘導することを示唆している。本発明者らは、部分肝切除後のＬＳＥＣ血管新生シグナル伝達の初期段階の後、ＬＳＥＣ増殖が日４で認められ、日８にプラトーに達することを見いだした（図２Ｆ）。ＬＳＥＣ増殖と対照的に、本発明者らは、Ｐ−Ｈ３+ＨＮＦ４Ａ+肝細胞の定量によって示されるように、肝細胞増殖が最初の４日でピークに達し、日８に安定になることを確定した（図２Ｇ）。
【０１０４】
これらの結果は、肝再構築の仲介におけるＬＳＥＣの経時的二段階寄与（chronologically biphasic contribution）を示している。部分肝切除の初期段階（部分肝切除の後日
１〜３）で、非増殖ＬＳＥＣ中の誘導血管新生は、例えばアンギオクリン因子の放出によって肝再生を刺激する。肝細胞増殖の初期段階後、このモデルでは部分肝切除の４日後、ＬＳＥＣが増殖して、再生している肝臓のために増加した血液供給の需要を満たす。
【０１０５】
従って、本発明者らは、部分肝切除後、肝ＳＥＣ（ＬＳＥＣ）が、「誘導血管新生」の過程により肝細胞増殖を刺激し、すなわち、ＬＳＥＣが、肝細胞増殖因子及びＷｎｔ２のアンギオクリン産生を介して肝細胞増殖を促進することを確定した。さらに、本発明者らは、この誘導血管新生後に、ＬＳＥＣ自体が「増殖血管新生」を受けて、再生している肝組織の血液供給における増加した需要を満たすことを確定した。
【０１０６】
肝増殖を開始及び維持するためにＬＳＥＣを刺激するには、Ｐｌ−ＧＦ／ＶＥＧＦＲ１ではなく、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ２の活性化が重要である。
ＬＳＥＣ誘発性肝再生中のＶＥＧＦ受容体の有意性を研究するため、ＶＥＧＦＲ２loxP
/loxPマウスをＲＯＳＡ−ＣｒｅＥＲT2マウスと交雑させて条件つきでＶＥＧＦＲ２遺伝
子を欠失させ、誘導性ＶＥＧＦＲ２欠損ＶＥＧＦＲ２flox/flox（ＶＥＧＦＲ２fl/fl）マウスを生成させるように実験を設計した（図３Ｊ）（Hooper, Cell Stem Cell 4:263-274
(2009)）。肝中のＶＥＧＦＲ２の内皮細胞特異的発現のために、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウスでは肝内皮細胞だけでなく、非内皮細胞も、また機能的欠陥を呈すると考えられる。対照マウスは、ＶＥＧＦＲ２遺伝子（ＶＥＧＦＲ２fl/+）のヘテロ接合欠失を有した。部分肝切除の４８時間後、ブロモデオキシウリジン+肝細胞増殖（ＢｒｄＵ+ＨＮＦ４Ａ+細胞
数）は、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウスで６７％減少した（図３Ａ、Ｂ）。特に、この初期段
階でＶＥ−カドヘリン+イソレクチン+潅流血管の開存性にもかかわらず、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウスでは、肝質量の再生が弱められた（図３Ｃ）。従って、肝再生の初期段階（部
分肝切除日１〜３）では、ＶＥＧＦＲ２を標的設定すると、主に肝細胞再生を誘導する内皮由来のアンギオクリン因子の効果が損なわれるが、血管灌流能力は損なわれない。従って、ＶＥＧＦＲ２は、肝再生の初期段階でアンギオクリンシグナルに反応して肝細胞増殖を誘導するのに重要である。
【０１０７】
さらに、本発明者らは、ＶＥＧＦが増殖血管新生及び正常な器官機能の修復にも重要であることを確定した。本発明者らは、肝再生の後期段階（部分肝切除日４〜８）で、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウスでは増殖血管新生が不完全であり（図３Ｃ）、開存性ＶＥ−カドヘ
リン＋イソレクチン＋血管系の構築を妨げ（図３Ｄ、Ｅ）、それによって、少なくとも２８日間、肝質量の修復を弱めることを見いだした。さらにまた、ＶＥＧＦＲ２fl/flマウ
スでは、血漿ビリルビンレベルの上昇によって明らかなように、部分肝切除後の肝機能が異常であった。肝再生の仲介における内皮特異的ＶＥＧＦＲ２機能を確認するため、ＶＥＧＦＲ２loxP/loxPマウスをＶＥ−カドヘリン−ＣｒｅＥＲT2マウスとも交雑させてＶＥ
ＧＦＲ２の内皮選択的欠失を誘導した（図３Ｋ）。ＶＥ−カドヘリン-ＣｒｅＥＲT2ＶＥ
ＧＦＲ２fl/flマウスにおける肝質量及び灌流血管の形成は、いずれも、部分肝切除後に
低下し、それは肝再生の仲介におけるＶＥＧＦＲ２の有意性を強調している。
【０１０８】
本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ２経路が、ＬＳＥＣ誘発性肝再生を促進する場合、ＶＥＧＦ−Ａが肝再生を誘導又は強化するはずであると仮定した。本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａの投与が、肝再生を促進することを見いだした。本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａ164の効果を、ＶＥＧＦＲ１だけを選択的に活性化する胎盤増殖因子（Ｐｌ−ＧＦ）と
比較した（Carmeliet, Nature 438:932-936 (2005)）。部分肝切除後、ＶＥＧＦ164は、
肝質量及びＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣの数の両方の再生を促進し、それは少なくとも２８日間持続したが、ＰｌＧＦでは、そうならなかった（図３Ｆ、Ｇ）。従って、部分肝切除後、Ｐｌ−ＧＦ／ＶＥＧＦＲ１ではなく、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ２の活性化が、肝増殖を開始及び維持するためにＬＳＥＣを刺激するのに重要である。
【０１０９】
Ｉｄ１の上方制御によるＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ２経路の活性化は、肝再生を誘発する。
肝再生を刺激するアンギオクリンシグナルを同定するためにマイクロアレイ分析を用いた。内皮特異的遺伝子の中で、転写因子Ｉｄ１は、部分肝切除によって活性化された内皮細胞中で特異的に上方制御された（Lyden, Nature 401:670-677 (1999)）。ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰ発現がＩｄ１プロモーターによって誘発される、Ｉｄ１venusYFPレポーターマウス（Nam, Cell Stem Cell 5:515-526 (2009)）を用いて、部分肝切除の４８時間後に、ＬＳＥＣ中でＩｄ１上方制御が排他的に見いだされ（図３Ｈ）、それは、ＶＥＧＦＲ２fl/fl
マウスにおいて有意に弱められた（図３Ｉ）。注目すべきことに、部分肝切除後のＩｄ１欠損（Ｉｄ１-/-）マウスの肝質量回復は、２８日間損なわれ、そしてＶＥＧＦ−Ａ164投与しても変わらなかった（図４Ａ、Ｊ）。さらにまた、部分肝切除後、Ｉｄ１-/-マウス
は、有糸分裂ＢｒｄＵ+ＨＮＦ４Ａ+肝細胞数の有意な減少、機能性ＶＥ−カドヘリン＋イソレクチン＋血管形成の破壊、ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＬＳＥＣの増殖の低下、及び血漿
ビリルビンレベルの増加によって立証される肝機能異常を示した（図４Ｂ、Ｃ、Ｋ）。従って、Ｉｄ１の上方制御によるＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ２経路の活性化は、肝再生を誘発する。
【０１１０】
ＬＳＥＣ−肝細胞共培養は、肝細胞再生の機能的ＬＳＥＣ誘導にＩｄ１が必要であることを示す。
また、肝細胞増殖におけるＬＳＥＣのアンギオクリン機能を仲介する際のＩｄ１上方制御の役割を、ＬＳＥＣ−肝細胞共培養系によって試験した。単離された肝細胞と、初代ＬＳＥＣとの共インキュベーションでは、肝細胞数が９倍増加し、これを、ＬＳＥＣ中のＩｄ１のノックダウンによって選択的に除去した（図４Ｄ、Ｅ）。ＬＳＥＣからの馴化培地は、肝細胞増殖の支持に失敗し、ＬＳＥＣから誘導されたアンギオクリン機能における細胞接触の重要性を強調している。従って、Ｉｄ１の欠如は、ＬＳＥＣの誘導機能不全を生じ、肝細胞再生を損なう。
【０１１１】
Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣの移植は、Ｉｄ１-/-肝臓における肝再生を修復する。
Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣのin vivoアンギオクリン効果が、Ｉｄ１-/-マウスで肝細胞再生を
開始できるかどうかを決定するため、部分肝切除後の日２に、脾内移植アプローチを用いてＩｄ１-/-肝血管系にＬＳＥＣを移植した（図４Ｆ）（Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935-945 (2008)）。ＧＦＰ標識Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣをＶＥＧＦＲ３+類洞血管内腔に選択的に組み込むと、肝質量の再生及びＬＳＥＣ増大が修復された（図４Ｇ）。対照的に、移植されたＩｄ１-/-ＬＳＥＣは、Ｉｄ１-/-肝臓の再生の修復に失敗した。さらに、Ｉｄ１-/-肝臓では、部分肝切除後の日２にＧＦＰ+Ｉｄ１+/+ＬＳＥＣを移植すると、そのすぐ
近位で肝細胞の増殖が開始された（図４Ｈ、I）。従って、Ｉｄ１コンピテントＬＳＥＣ
（Id1-competent LSECs）の組み込みによってもたらされた部分的血管性キメリズムは、
Ｉｄ１-/-肝臓中の肝増殖を開始するのに十分な内皮細胞由来の誘導シグナルを生成させ
る。
【０１１２】
ＬＳＥＣ中のＩｄ１上方制御は、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ発現の誘導により肝細胞増殖を開始する。
肝再生を誘導する内皮由来アンギオクリン因子を同定するため、部分肝切除の４８時間後に野生型及びＩｄ１-/-マウスから精製されたＬＳＥＣを分析した。知られている肝ト
ロフォゲン（Klein, Hepatology 47:1018-1031 (2008); Huh, Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:4477-4482 (2004) ; Goessling, Cell 136:1136-1147 (2009); Ober, Nature 442:688-691 (2006) ; Thompson, Hepatology 45:1298-1305 (2007）では、Ｗｎｔ２及びＨＧＦの発現が、Ｉｄ１-/-ＬＳＥＣにおいて急激に弱められたが、Ｗｎｔ９Ｂ及びトロンボ
モジュリンのようなＬＳＥＣによって発現される他のトロフォゲンでは、弱められなかった（図５Ａ）。これらの結果は、ＬＳＥＣ中のＩｄ１上方制御が、Ｗｎｔ２及びＨＧＦ発現の誘導により肝細胞増殖を開始することを本発明者らに示唆した。
【０１１３】
ＬＳＥＣの脾内移植は、Ｉｄ１／Ｗｎｔ２／ＨＧＦを通して肝切除後の肝再生を誘導する。
肝再生におけるＩｄ１及びＷｎｔ２／ＨＧＦシグナル伝達の効果を試験するため、Ｗｎｔ２、ＨＧＦ、又は両方で形質導入されたＩｄ１-/-ＬＳＥＣを、部分肝切除後の日２に
、脾内移植によってＩｄ１-/-肝血管系に移植した。Ｗｎｔ２及びＨＧＦ（Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+）を担持するＩｄ１-/-ＬＳＥＣのみ、Ｉｄ１-/-肝臓中の質量の再生及びＬＳＥＣ増大を修復し（図５Ｂ）、それはＨＧＦとＷｎｔ２との間の共同効果を示唆している。特に、Ｉｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＬＳＥＣ又はＩｄ１+/+ＬＳＥＣをＩｄ１-/-マウ
スに移植すると、有糸分裂ＢｒｄＵ+ＨＮＦ４Ａ+肝細胞数が非常に増加した（図５Ｃ）。有糸分裂肝細胞は、移植されたＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＧＦＰ+ＬＳＥＣに隣接して配置されていることがわかった（図５Ｄ）。従って、Ｉｄ１活性化ＬＳＥＣは、Ｗｎｔ２及
びＨＧＦの合成により並置された肝細胞の増殖を誘導する（図５Ｅ）。
【０１１４】
従って、条件つきのＶＥＧＦＲ２ノックアウトＩｄ１-/-マウス及び内皮細胞移植の使
用は、部分肝切除によって誘導された生理学的肝再生を組織化する際に、ＶＥＧＦＲ３+
ＣＤ３４-ＶＥＧＦＲ２+ＶＥ−カドヘリン+第ＶＩＩＩ因子+Ｐｒｏｘ１-ＣＤ４５-ＬＳＥＣとして操作上定義される、特定の器官特異的血管性ニッチ細胞の不可欠なアンギオクリンの役割を示した。血管新生腫瘍血管中のＩｄ１の上方制御（Lyden, Nature 401:670-677 (1999)）と同様に、Ｉｄ１発現は、正常なＬＳＥＣでは最小限であるが、部分肝切除後に、ＶＥＧＦＲ２の活性化は、血管新生ＬＳＥＣ中のＩｄ１の排他的上方制御を誘導する。
【０１１５】
さらに、部分肝切除後の最初の３日に、ＶＥＧＦＲ２-Ｉｄ１経路の活性化により非増
殖ＶＥＧＦＲ３+ＣＤ３４-ＶＥＧＦＲ２+Ｉｄ１+ＬＳＥＣにおける誘導血管新生プログラムのスイッチが入り、これにより、アンギオクリン因子Ｗｎｔ２及びＨＧＦの産生を通して、肝増殖が惹起されることが示された。その後、再生している肝臓がさらなる血液供給を必要とするため、ＬＳＥＣのＶＥＧＦＲ２-Ｉｄ１介在性増殖血管新生が、肝血管性質
量を再構成する。理論によって拘束されることなく、このデータは、ＬＳＥＣが二相機構を通して肝再生を支持することを示唆している。すなわち、部分肝切除直後の初期段階で、誘導血管新生ＬＳＥＣがアンギオクリン因子の放出を通して、器官形成を促進するのに対して、増殖血管新生ＬＳＥＣは、増大する肝質量を血管新生化して持続させる。
【０１１６】
本研究は、Ｉｄ１-/-マウスへのＩｄ１-/-Ｗｎｔ２+ＨＧＦ+ＬＳＥＣの移植が、肝再生を誘導及び強化することを示す。この発見、並びにＶＥＧＦＲ２及びＩｄ１欠損マウスにおいて肝増殖がひどく弱められるという観察は、ＬＳＥＣには、アンギオクリン因子を合成することによって肝増殖を開始するために誘導血管性ニッチを確立する能力が与えられていることを示している。さらに、別法として、肝再生を開始及び修復するため、肝臓以外の組織から誘導された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を、ＬＳＥＣの代わりに代用できる。特に、ＶＥＧＦＲ２+Ｉｄ１+ＥＰＣは、構造的に血管壁に組み込むよりはむしろアンギオクリン因子の放出を通して血管新生を開始できる。このように、ＥＰＣの肝内移植は、肝再生を促進する細胞療法の新たな方法を切り開く。
【０１１７】
本研究に用いる部分肝切除モデルでは、残存肝葉の血管完全性は、最小限の炎症性反応で維持され、それによって、内皮依存性肝再生を研究するための理想的なモデルを確立している。しかし、化学的に誘発された肝損傷において、重度の血管損傷及び細胞死では、肝再生を支持するため、星細胞を含む他の非内皮細胞（Friedman, Physiol. Rev. 88:125-172 (2008)）及び血管新生促進造血細胞（pro-angiogenic haematopoietic cells）、例えばＣＸＣＲ４+ＶＥＧＦＲ１+造血前駆細胞（hemangiocytes）（Jin, Nature Med. 12:557-567 (2006)）の補充が必要となることがある。
【０１１８】
部分肝切除後の肝臓の迅速な再生には、多くの肝細胞の集合的かつ包括的な増殖が必要である。実際に、各肝細胞がＬＳＥＣに隣接して存在するため、肝細胞のこの著しく調和のとれた活性化は、部分肝切除後の残存肝臓を通して成熟肝細胞の増殖を誘導するアンギオクリン依存性再生プログラムのスイッチを入れることによって達成される。また、アンギオクリン因子は、成熟肝細胞に加えて、肝前駆細胞の増殖も促進できる（Zaret, Science 322:1490-1494 (2008)）。
【０１１９】
本研究において、Ｗｎｔ２及びＨＧＦは、肝再生を誘発する肝特異的アンギオクリン因子として認められた。また、本発明は、肝再生を調節するため、Ｗｎｔ２及びＨＧＦと共同作用できる他のアンギオクリン因子の存在、例えば内皮特異的細胞外マトリックス成分、プロテアーゼ、接着分子及びケモカインを提供する。
【０１２０】
さらに、本開示は、発生的器官形成及び成体の器官形成の調節における血管系の特異性を解明できる、定義されたアンギオクリン因子の組織特異的発現を提供する。
【０１２１】
これまで、肝細胞移植による肝再生の試みは、限定的に成功している（Follenzi, J. Clin. Invest:118, 935-945 (2008)）。ここに示された研究は、肝細胞又はその前駆細胞
（Zaret, Science 322:1490-1494 (2008)）とＶＥＧＦＲ２+Ｉｄ１+ＬＳＥＣ又はＥＰＣ
との同時移植は、現在、外傷性又は感染性の肝損傷を負った受療体において乏血管性機能を救うための有効な戦略のデザインをもたらすことを示している。
【０１２２】
〔実施例２〕
肺再生
トランスジェニックレポーター及び遺伝子標的化動物
内皮特異的Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１誘導性ノックアウトマウスの生成を、
記載されたとおり（Hooper, Cell stem cell 4:263-274 (2009);Wang, Nature 465:483-486 (2010)）実施した。簡潔には、Ｖｅｇｆｒ２loxP/loxP及びＦｇｆｒ１loxP/loxPマウ
スを、ＶＥ−カドヘリン−ＣｒｅＥＲＴ２トランスジェニックマウスと交配させてＶＥ−カドヘリン−ＣｒｅＥＲＴ２+Ｖｅｇｆｒ２LoxP/LoxP及びＶＥ−カドヘリン−ＣｒｅＥＲＴ２+Ｖｅｇｆｒ２loxP/loxPＦｇｆｒ１loxP/+マウスを確立した。これらのマウスを、タモキシフェンで腹腔内処置して、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の内皮特異的欠失を導いた。
【０１２３】
ＳＰＣ及びＣＣＳＰプロモーター誘発性ｒｔＴＡ（ＳＰＣ−ｒｔＴＡ、ＣＣＳＰｒｔＴＡ）及び（ｔｅｔＯ）７ＣＭＶ誘発性ｃｒｅ（（ｔｅｔＯ）７−ｃｒｅ）を有するマウス（Perl, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:10482-10487 (2002)）を、記載されたようなＲｏｓａ２６Ｒ−ｅＹＦＰマウ
ス（Rawlins, Cell stem cell 4:525-534 (2009)）と交雑させ、テトラサイクリン処置してＳＰＣ−ＹＦＰ及びＣＣＳＰ−ＹＦＰレポーターマウスを得た。すべての実験は、動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって設定されたガイ
ドラインの下で実施した。
【０１２４】
ＰＮＸモデル及び肺機能の生理学的測定
ＰＮＸ法を、記載されたように（Nolen-Walston, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:L1158-1165 (2008)）適合させた。簡潔には、麻酔して機械的に通気させたマウス
に経口気管内挿管を施した。左肺葉を、門のまわりに結びつけた縫合糸で持ち上げて切除した。シャムマウスには、葉切除することなく開胸術を施した肺質量及び体積を測定し、ＰＮＸ後の体重に対して標準化した。ＰＣＥＣの単離並びにリン酸化及びＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１のタンパク質レベルの試験は、実施例１に記載したように、そしてMurakami, The Journal of clinical investigation 121 (2011)のように実施した。深吸気量は、Flexiventソフトウェア（Scireq）を用いて、肺気量（ＴＬＣ）と機能的残気量（ＦＲＣ
）とのプラトー圧測定値間で決定した。静的コンプライアンスは、圧力−体積曲線から決定した。
【０１２５】
免疫蛍光検査（ＩＦ）及びフローサイトメトリー分析
ＩＦ研究を実施するため、低温保存された切片を、ＶＥ−カドヘリン（R&D）、ＣＤ３
４（BD）、Ｅ−カドヘリン（eBiosciences）、及びＳＰＣ（Abcam）を認識する抗体、並
びにフルオロフォア結合第二抗体、（Jackson Immuno Research）中でインキュベートし
た。移行細胞増幅（transit cell amplification）を、ＢｒｄＵ取り込みによって測定した（Ding, Nature 468:310-315 (2010)）。増殖するＢＡＳＣ様細胞を追跡するため、飲
用水中にＢｒｄＵを入れた（Nolen-Walston, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294:
L1158-1165 (2008)）。AxioVert LSM710顕微鏡（Zeiss）で画像をとらえた。肺胞数及び
平均肺胞隔壁間距離（mean linear intercept）の形態学的分析を実施した（DeLisser, The Journal of biological chemistry 281:8724-8731 (2006)）。全肺細胞を単離し、Ｌ
ＳＲＩＩ−ＳＯＲＰ（BD）で分析した（Ding, Nature 468:310-315 (2010)）。ＡＥＣ及
びＰＣＥＣを、それぞれ、ＳＰＣ＋Ｅカドヘリン及びＶＥ−カドヘリン＋ＣＤ３４に対する結合抗体を用いた染色によって定量した。
【０１２６】
ＥＧＦの薬理学的投与及びＭＭＰ１４に対するｍＡｂの中和
マウスに、ＰＮＸの１２時間前、そして１日おきに、マウスＭＭＰ１４に対するｍＡｂ（ＭＭＰ１４ ｍＡｂ、５０ｍｇ／ｋｇ、Abcam）及びＩｇＧ対照を注射した。肺胞再生における組換え型のＥＧＦの役割を決定するため、マウスに、ＰＮＸ後、毎日５００μｇ／ｋｇのＥＧＦ（Abcam）を静脈注射した。マウスに、１日おきに１００μｇ／ｋｇのＥＧ
Ｆ（５０μｌ中）を気管内注射してＥＧＦの局所的効果を試験した。
【０１２７】
初代ＥＣとの共培養におけるＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣ増殖の測定
Ａｋｔ活性化を維持するため、初代ＥＣをＥ４ＯＲＦ１遺伝子と共に形質導入した（Seandel, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105:19288-93 (2008)）。ＭＡＰＫｉｎａｓｅ経路を同時活性化するため、ｃ−
Ｒａｆを初代Ｅ４ＯＲＦ１+ＥＣに導入した。生成したＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ（Kobayashi, Nature cell biology 12:1046-1056 (2010)）を、ＳＰＣ及びＣＣＳＰ−ＹＦＰマウスから単離されたＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣと共培養した（Kim, Cell 121:823-835 (2005)）。Ｍｍｐ１４又はスクランブルｓｈＲＮＡを用いて、ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ又はＡＥＣ
中のＭｍｐ１４をノックダウンした（Ding, Nature 468:310-315 (2010)）。共培養研究
のため、単離されたＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣを非付着性の皿中で培養し、１０倍
多いＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣを播種した。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣからの馴化培地をＡＥＣに加えた。共培養後、ＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣを、フローサイトメトリー分析によって定量した。
【０１２８】
ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、及び免疫ブロット分析
ＰＮＸ後、全ＲＮＡをマウス肺から単離し、Taqman発現システム（Applied Biosystems）を用いてｑＰＣＲを行った。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（Santa Cruz）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットによってＢＡＬＦ中のＨＢ−ＥＧＦ濃度を調べ、そしてγ２鎖に対する抗体（Santa Cruz）を用いてラミニン５γ２鎖の切断を試験した。
【０１２９】
データ分析
すべてのデータを、平均±ｓｅｍとして示した。スチューデントｔ検定、又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、統計的有意性について群間の違いを試験した。統計的有意性を、Ｐ＜０．０５に設定した。
【０１３０】
ＰＮＸは、上皮前駆細胞の増大を誘導する。
ＰＮＸ後１５日以内に、残存する右肺葉の質量及び体積において劇的な再生があった（図６Ａ、Ｂ）。クラーラ細胞（Clara cell）によって同定されたＢＡＳＣのサブセットを含む、肺上皮前駆細胞は、タンパク質（ＣＣＳＰ）+ｐｒｏ−サーファクタント・プロテ
インＣ（ＳＰＣ）+Ｓｃａ−1+（ＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ１+）細胞を分泌し、そしてＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+細胞によってＩＩ型ＡＥＣ（ＡＥＣＩＩ）は、肺胞上皮形成に寄与する（Beers, The Journal of clinical investigation 121: 2065-2073 (2011）。上皮前
駆細胞の肺再生への寄与を決定するため、ＰＮＸ後、本発明者らは、飲用水中にＢｒｄＵを入れて、ゆっくり分裂する細胞（slow-cycling cells）を検出した。ＰＮＸ後の日３に、本発明者らは、気管支肺胞管接合部（ＢＡＤＪ）でＢｒｄＵ+ＣＣＳＰ+細胞の増幅を認めた（図６Ｃ）。ＢｒｄＵ+ＣＣＳＰ+細胞の増大を追跡するため、本発明者らは、ＣＣＳ
Ｐ及びＳＰＣプロモーターがＹＦＰ発現を誘発するレポータートランスジェニックマウス（ＣＣＳＰ−ＹＦＰ及びＳＰＣ−ＹＦＰマウス）（Perl, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:10482-10487 (2002)）を用
いた（図６Ｄ、Ｅ）。本発明者らは、ＰＮＸ後、日３に、再生している肺中のすべての単核細胞の多変性フローサイトメトリー分析を実施した。ＢＡＤＪ領域に局在化したＣＣＳＰ+ＢｒｄＵ+細胞は、ＢＡＳＣにおいて観察される表現型の特徴、ＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ−１+ＶＥ−カドヘリン-ＣＤ３１-細胞であった（Kim, Cell 121:823-835 (2005)）。
この初期の時点で、本発明者らは、ＳＰＣ+Ｓｃａ−１-ＣＣＳＰ-ＡＥＣＩＩ又はＶＥ−
カドヘリン+ＣＤ３１+ＰＣＥＣの増殖を検出しなかった。従って、ＰＮＸは、ＡＥＣ及びＰＣＥＣの増殖が最小限である場合、肺再生の初期段階で、ゆっくり分裂する（slow cycling）ＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ−1+ＢＡＳＣ様細胞の増大を誘導する。
【０１３１】
ＰＮＸは、肺胞毛細血管界面で共存しているＰＣＥＣ及びＡＥＣの増大を誘導する。
ＡＥＣ及びＰＣＥＣが有意な増殖を受けるときのＰＮＸ後の時点を特定するため、本発明者らは、残存する葉における腹腔内に注射されたＢｒｄＵの取り込みの動態を調べて、ＰＮＸ後の日７でピークに達した移行増殖細胞（ＴＡＣ）の全体的な様相を見いだした（図７Ａ）。シャム手術されたマウス肺では、ＢｒｄＵの取り込みが少なかった。ＰＮＸ後の日７でのＴＡＣ中の細胞タイプを特徴づけるため、本発明者らは、ＳＰＣ−ＹＦＰレポーターマウスにおいてＰＮＸを実施した。プロ−サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）及びＥ−カドヘリン、ＡＥＣＩＩを表すマーカーを同時発現するＳＰＣ＋細胞の増殖が増加した（Beers, The Journal of biological chemistry 269:20318-20328 (1994);Whitsett, Annual review of medicine 61:105-119 (2010)）（図７Ｂ）。
【０１３２】
残存するＳＰＣ-ＴＡＣは、ＣＣＳＰ＋気道クラーラ細胞（Rawlins, Cell stem cell 4:525-534 (2009)）及びＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣの小画分からなる。ＢｒｄＵ取り込みの分析は、ＰＮＸ後の日７に、増殖しているＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+ＦＧＦＲ１+Ｖ
ＥＧＦＲ２+ＣＤ４５-ＰＣＥＣが単核細胞の７％を占め（図７Ｃ）、それらがＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩ付近に局在化していることを示した（図７Ｄ）。ＡＥＣＩＩ及びＰＣＥＣの操作上のマーカーとして、それぞれＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+及びＶＥ−カドヘリン+ＣＤ３４+を用いて、本発明者らは、ＰＮＸ後の日１５に、ＡＥＣＩＩ及びＰＣＥＣの両集団で３倍の増加があることを見いだした（図７Ｅ）。従って、ＰＮＸ後、肺質量及び体積における増加は、ＰＣＥＣ及び上皮前駆細胞の増殖のためであり、ＢＡＳＣ様の細胞が初期の時点（日３）で増大するのに対して、ＡＥＣＩＩは、後期の時点で増殖する。
【０１３３】
ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の逐次的活性化は、機能的肺胞再生に不可欠である。
ＰＮＸは、ＰＣＥＣの活性化を通して肺再生を開始して上皮活性アンギオクリン因子を産生する。ＶＥＧＦ−Ａの主要なチロシンキナーゼ受容体は、ＶＥＧＦＲ２として、アンギオクリン因子の誘導において重要な役割を果たしているため（Ding, Nature 468:310-315 (2010);Hooper, Cell stem cell 4:263-274 (2009)）、本発明者らは、ＰＮＸ後のＰ
ＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２の活性化を分析した。ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルが変わらないにもかかわらず、ＰＮＸ後、リン酸化されたＶＥＧＦＲ２の範囲は広がり、右葉を再生するＥＣ中のこのＶＥＧＦ−Ａ受容体の活性化を示している（図８Ａ）。
【０１３４】
ＦＧＦＲ１は、ＰＣＥＣ中で発現され、ＶＥＧＦＲ２の発現及び活性化状態を相互に調節して（Murakami, The Journal of clinical investigation 121 (2011);White, Development 134:3743-3752 (2007)）アンギオクリン因子産生を誘発できるため、本発明者らは、ＰＣＥＣによってＦＧＦＲ１の発現を研究した。ＰＮＸ後、ＦＧＦＲ１タンパク質は、時間依存的に上方制御された。従って、肺再生の初期段階では、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２の活性化が肺胞形成を開始するのに対して、後期段階では、ＦＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２
との同時活性化が、共同作用して再生上皮形成を持続させると考えられる。
【０１３５】
肺中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の内皮特異的機能を解明するため、本発明者らは、ＶＥ−カドヘリンプロモーターがタモキシフェン反応性Ｃｒｅ（ＶＥ−Ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ２）の発現を誘発するトランスジェニックマウス（Wang, Nature 465:483-486 (2010)）を用いて、成体マウスＥＣ中で選択的にＶｅｇｆｒ２遺伝子を欠失させる誘導性ノッ
クアウト戦略を用いた（図８Ｂ）。タモキシフェン処置は、ＥＣ中のＶｅｇｆｒ２（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウス）を選択的に欠失させる。ＣｒｅＥＲＴ２による標的でない
毒性を説明するため、本発明者らは、対照としてヘテロ接合Ｖｅｇｆｒ２欠損マウス（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/+）を用いた。また、本発明者らは、ＥＣ中でＶｅｇｆｒ２及びＦｇｆ
ｒ１が欠失したマウスを生成させた。しかし、これらのマウスは、血管の不安定性のため、外科的処置を許容できなかったので、本発明者らは、ＥＣ中の誘導性Ｖｅｇｆｒ２及び部分的Ｆｇｆｒ１欠失（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウス）によって、肺胞形成の支持におけるＦＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の同時活性化の役割を研究した。
【０１３６】
ＰＮＸ前に、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスは、肺質量又は機能における変化を示さなかった。対照的に、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECマウスでは、ＰＮＸ後の日３に、ＣＣＳＰ+Ｓｃａ１+ＢＡＳＣ様細胞の増殖が止まったが（図３Ｃ）、ＰＮＸ後のＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスのこれらの細胞の増大には、さらなる阻害がなかった。これらのデータは、肺再生の初期段階での上皮形成の支持におけるＶＥＧＦＲ２活性化の重要な役割を確立している。
【０１３７】
そこで、本発明者らは、ＰＣＥＣ及びＡＥＣＩＩの増幅におけるＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１同時活性化の役割を研究した。再生している肺を、日７に、ＢｒｄＵ、ＶＥ−カドヘリン及びＳＰＣで同時染色したところ、マウスにおけるＶｅｇｆｒ２の内皮特異的ノックダウン（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC）は、ＰＣＥＣ及びＡＥＣＩＩの両方の増殖を抑止
することがわかった（図８Ｄ、Ｅ）。特に、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１（Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+）の内皮特異的ノックダウンは、この時点でＰＣＥＣ及びＡＥＣＩＩの増殖をさらに止めており、そのことは、ＰＣＥＣを刺激する際、ＦＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ２と共同作用してＡＥＣＩＩ増幅及び血管新生を支持することを示唆している。
【０１３８】
ＰＣＥＣ中のＶｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の欠失は、肺胞構造及び機能の修復を損なう。
ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の同時活性化が肺機能の改善において役割を果たすかどうかを決定するため、本発明者らは、ＰＮＸの前及び後に、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇ
ｆｒ１iΔEC/+及び対照マウスにおいて吸気量及び静的コンプライアンスを調べた。これ
らの肺機能のパラメーターは、呼吸容量（respiratory capacity）の生理学的に関連した指数を提供する。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスでは、対照マウスが完全回復を示した時点で、ＰＮＸ後の肺機能の修復は、有意に損なわれた（図８Ｆ）。同様に、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスでは、ＰＮＸ後の肺質量、体積、及び細胞増大の修復が、すべて損なわれた（図８Ｇ）。これらのデータは、ＰＮＸ後、非増殖ＶＥ−カドヘリン+ＥＣが、ＶＥＧＦＲ２活性化を介してＢＡＳＣ様細胞の初期増
大を誘導することを示している。ＰＮＸ後の後期段階で、ＶＥＧＦＲ２と連携したＦＧＦＲ１の上方制御は、ＰＣＥＣを活性化して上皮形成及び血管の発芽（vascular sprouting）を指示して、呼吸容量を修復する（図１Ｂ）。従って、ＰＣＥＣは、アンギオクリン因子を産生し、機能的呼吸器の肺胞ユニットの生成を促進する血管新生に関与する。
【０１３９】
ＰＮＸは、上皮前駆細胞を増大させるＰＣＥＣにおいてＭＭＰ１４の特異的上方制御を誘導する。
上皮形成を開始する誘導アンギオクリンのキュー（cue）を同定するため、本発明者ら
は、再生肺の遺伝子発現プロファイルを比較して、肺胞形成因子の中で、膜タイプ１のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１４）は、野生型のＰＣＥＣにおいて特異的に上方制御されるが、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔEC又はＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１i
ΔEC/+マウスは、そうならないことを見いだした（図９Ａ）。肺切除された肺中のＭＭＰ１４タンパク質レベルの分析は、その一時的な上方制御が、日７でピークに達し、その後、横ばいになることを示した（図１０Ａ）。免疫染色及びフローサイトメトリー分析は、ＰＮＸ後のＭＭＰ１４のＰＣＥＣ特異的局在化を説明しており、それはＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺中で弱められる（図１０Ｂ、Ｃ）。ＭＭＰ１４は、肝臓、心臓、脾臓、及び腎臓を含む他の血管の豊富な器官では上方制御されず（図９Ｂ、Ｃ）、それは、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４が、ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１誘導ＰＣＥＣ中で選択的に上方制御されることを示している。
【０１４０】
ＭＭＰ１４のアンギオクリン発現が上皮前駆細胞の増殖を促進する機構を明確にするため、本発明者らは、ＳＰＣ−Ｙ ＦＰ及びＣＣＳＰ−ＹＦＰマウスから、それぞれＡＥＣ
ＩＩ及びＢＡＳＣを単離して、初代ＥＣと共培養した。ＹＦＰ発現を用いて共培養中のその結末（fate）を追跡した。Ａｋｔ経路の活性化を通してアンギオクリンの能力を維持するＥ４ＯＲＦ１遺伝子を、初代ＥＣに導入した（Seandel, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 105:19288-93 (2008), Kobayashi, Nature cell biology 12:1046-1056 (2010)）。ＭＭＰ１４がＭＡＰ−キナーゼ活
性化ＥＣ中で上方制御されたので、本発明者らは、ｃ−Ｒａｆも導入してＥ４ＯＲＦ１+
ＥＣ（ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ）中のＭＡＰ−キナーゼを構成的に刺激した（Kobayashi, Nature cell biology 12:1046-1056 (2010)）。次に、３次元（３Ｄ）アンギオスフェア
アッセイ（3-dimensional (3D) angiosphere assay）において、ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ
を、ＡＥＣＩＩ／ＢＡＳＣと共培養した。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣとの共培養は、ＳＰＣ+ＡＥＣＩＩ及びＣＣＳＰ+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-ＢＡＳＣの最も有意な増大を導き（図１
０Ｄ〜Ｇ、図９Ｄ、Ｅ）、３Ｄアンギオスフェアが形成され、ＥＣが、増大する上皮細胞を取り囲んでおり、それは肺胞毛細血管嚢の構造に似ている。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ中
のＭＭＰ１４ノックダウンは、ＢＡＣＳ及びＡＥＣＩＩの増大を止める（図１０Ｄ、Ｆ）。ＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣからの馴化培地（ＣＭ）は、ＡＥＣＩＩ及びＢＡＳＣ増殖の促
進におけるごくわずかな効果を示し、ＥＣと上皮細胞との間の細胞間接触の必要性を強調している（図１０Ｅ、Ｇ）。従って、左肺の切除は、ＭＭＰ１４産生を誘発するＰＣＥＣにおいてＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１を活性化し、順に、上皮前駆細胞の増殖を刺激する。
【０１４１】
ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４阻害は、ＡＥＣの再構築を抑止するが、ＰＣＥＣの再構築を抑止しない。
肺胞形成の調節におけるＭＭＰ１４の生理学的有意性を決定するため、本発明者らは、ＭＭＰ１４に対する中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＷＴマウスに注射した。ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４ ｍＡｂは、ＷＴマウスの残存肺の質量及び体積の増加を弱めたが、Ｖｅ
ｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１ｉΔEC/+マウスでは、そうならず、それは、ＭＭＰ１４
が、ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１誘導ＰＣＥＣから誘導されることを示している（図１１Ａ）。ＭＭＰ１４阻害は、ＶＥ−カドヘリン＋ＰＣＥＣの再構築を損なうことなく、Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣの増大を阻止する（図１１Ｂ）。ＭＭＰ１４阻害後のＡＥＣ及びＰＣＥＣの不適当な増大は、ＭＭＰ１４が、ＰＣＥＣ増殖（増殖血管新生）を促進するよりむしろＡＥＣ（誘導血管新生）の増殖を誘導することを示している。
【０１４２】
さらにＭＭＰ１４中和によるＡＥＣの弱められた増大が、フローサイトメトリー分析によって示されたが、ＰＣＥＣでは示されなかった（図１１Ｃ、Ｄ）。さらにまた、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂで注射されるマウスにおいて、形態学的試験は、肺胞数の減少及び平均肺胞隔壁間距離（mean alveolar intercept）によって測定された肺胞サイズの増加に
よって明らかなように、肺胞再増殖の阻害を示した（図１１Ｅ、Ｆ）。コラーゲン合成は、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂで注射されたマウスにおいて変わらないままであった。従って、ＰＣＥＣ由来のＭＭＰ１４は、新たな肺胞増殖（neoalveolarization）を刺激し、正常な成体肺胞に似た肺胞嚢を形成する。
【０１４３】
ＭＭＰ１４は、潜在性ＥＧＦ様リガンド（cryptic EGF-like ligand）のアンマスキング
（unmasking）を介して肺胞形成を刺激する。
次に、本発明者らは、ＭＭＰ１４が再生肺胞増殖を調節する機構を解明しようとした。ＭＭＰ１４は、ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を結合するヘパリンの外部ドメインを切断することがわかっている（Koshikawa, Cancer research 70:6093-6103 (2010); Stratman, Blood 116:4720-4730 (2011)）。さらに、ＭＭＰ１４は、ラミニン５γ２鎖を切断して上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を活性化するＥＧＦ様のフラグメントを生成させる（( Schenk, The Journal of cell biology 161:197-209 (2003)）。本発明者らは、ＰＮＸ後の日３及び７に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＨＢ−ＥＧＦが増加したことを見いだした（図１２Ａ、Ｂ）。ＰＮＸ後の日７で、再生している肺中にラミニン５γ２鎖の切断されたフラグメントが現れた（図１２Ｃ）。しかし、これらのＥＧＦＲリガンドのレベルは、ＭＭＰ１４に対するｍＡｂで処置された対照マウス及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/i
ΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの両方で低下し、その際、ＭＭＰ１４の発現は、弱められ
た。また、ＢＡＳＣ及びＡＥＣと３Ｄ内皮共培養におけるＭＡＰＫ＋Ａｋｔ ＥＣ中のＭ
ＭＰ１４のノックダウンは、培養上清へのＥＧＦＲリガンドの放出を抑止した（図１２Ｊ）。従って、ＰＮＸ後、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化は、ＭＭＰ１４のアンギオクリン産生を導き、それは、次に、肺胞再生を刺激する、潜在性ＥＧＦＲリガンドをマンマスギングする。
【０１４４】
ＥＧＦは、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて肺胞形成を修復する。
切断されたＨＢ−ＥＧＦ及び切断されたラミンン５γ２鎖の両方は、上皮形成を誘発するＥＧＦＲを活性化する。これらの所見は、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆ
ｒ１iΔEC/+マウスにおける肺の肺胞増殖不全は、ＥＧＦＲリガンドのバイオアベイラビ
リティの減少のためであることを示唆しており、ＥＧＦの注射が、上皮形成を強化することによって、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺胞増殖を修復しうることを意味している。組換え型ＥＧＦの静脈注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦ
ｇｆｒ１iΔEC/+マウス及びＭＭＰ１４に対するｍＡｂで処置されたマウスにおいて肺質
量及び体積を修復した（図１２Ｄ）。気管内注射による気管支肺胞上皮へのＥＧＦの直接導入は、肺胞再生の救済における同様の効果を示した（図１２Ｋ）。従って、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおけるＡＥＣの不完全な再生は、ＥＧＦＲリガンドのバイオアベイラビリティを弱めるＰＣＥＣによるＭＭＰ１４産生の減少によって生じる。
【０１４５】
特に、ＥＧＦで注射されたＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスでは、Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣとＶＥ−カドヘリン+ＰＣＥＣとの細胞結合が強化され（図１２Ｅ）、肺機能を修復した（図１２Ｆ）。Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスへのＥＧＦ注射は、ＡＥＣの再生を刺激したが、ＰＣＥＣの再生を刺激せず、それは、ＥＧＦが、血管新生の誘発効果に乏しく、上皮形成の誘発により有効であることを示唆している。この仮説を試すため、本発明者らは、ＰＮＸ後の日７で細胞増幅におけるＥＧＦ投与の効果を分析した。ＥＧＦの注射は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+肺中でＥＧＦＲリン酸化を強化した（図１２Ｇ）。ＢｒｄＵ取り込み分析は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおいて、ＥＧＦが、ＡＥＣＩＩの増殖を修復するが、ＰＣＥＣの増殖を修復しないことを示した（図１２Ｈ、I）。従って、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスの肺胞形成欠陥は、再生している肺への血管灌流障害よ
りはむしろ上皮活性なアンギオクリン因子の生成障害のためである。
【０１４６】
ＷＴ ＰＣＥＣの移植は、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１iΔEC/+マウスにおける肺
胞増殖を修復する。
ＣｒｅＥＲＴ２のＰａｎ−内皮ＶＥ−カドヘリンプロモーター誘発性発現は、他の血管床のＥＣ中のＶｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１を欠失させるはずである。肺再生に対する誘導ＰＣＥＣの特異的寄与を研究するため、本発明者らは、肺ＥＣ移植モデルを設計した。肺切除されたＷＴ同腹子マウスの肺又は肝臓のいずれかからＥＣを精製し、Ｖｅｇｆｒ２i
ΔEC/iΔEC及びＶｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆｒ１ｉΔEC/+マウスの頸静脈に注入した
（図１３Ａ）。また、肺切除されたＷＴマウスから血漿を採取し、レシピエントノックアウトマウスに注射して、肺再生に対する全身の可溶性増殖因子の寄与を調べた。
【０１４７】
移植されたＧＦＰ+ＥＣを、レシピエントマウスの肺毛細血管の約２６％中に組み込ん
だ（図１３Ｂ）。重要なことに、肺切除された肺から得た移植ＥＣは、上皮細胞の増幅を修復したが、肝臓からのものは修復しなかった（図１３Ｃ〜Ｆ）。増殖しているＢｒｄＵ＋ＣＣＳＰ＋ＢＡＳＣ様細胞及びＢｒｄＵ＋ＳＰＣ＋ＡＥＣＩＩは、移植されたＧＦＰ＋ＰＣＥＣの近位に位置しており、それは、注入されたＷＴ ＰＣＥＣから誘導された誘導
シグナルが肺再生を修復することを示している。従って、肺機能は、ＰＣＥＣの移植によって改善されたが、しかし、肺切除されたＷＴマウスから入手した血漿の注射では、改善されなかった（図１３Ｇ）。従って、ＰＮＸは、ＰＣＥＣの肺特異的活性化を誘導して、再生肺の肺胞増殖を支持するアンギオクリン因子を生成する（図１３Ｈ）。
【０１４８】
肺切除モデルシステム及び結果
成体肺再生に関与する経路を確定するため、本発明者らは、残存する無傷の肺中の再生肺胞増殖を促進する片肺切除（ＰＮＸ）モデルを用いた。本発明者らは、片肺切除（ＰＮＸ）モデルを用いて肺胞再生の支持におけるＰＣＥＣの役割を研究した。左肺の外科的切除は、残存する右葉の血管完全性を乱すことなく、これらの残存葉の再増殖を誘導する。本発明者らは、ＰＮＸが、ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の活性化を通して、残存する右葉のＰＣＥＣを誘導してアンギオクリンマトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ１４を産生することを確定した。次に、ＭＭＰ１４は、上皮前駆細胞の増殖を刺激する、潜在性上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リガンドのアンマスキングによって再生肺胞増殖を促進する。従って、ＰＣＥＣは、肺障害の処置のために治療上活用できる。
【０１４９】
本研究は、ＰＮＸが肺毛細血管内皮細胞（ＰＣＥＣ）を刺激して、肺胞形成を支持する上皮前駆細胞の増殖を誘導するアンギオクリン増殖因子を産生することを示している。さらに、内皮細胞は、ＭＭＰ１４発現を通して、上皮増殖を促進し、肺胞毛細血管嚢に似た３次元アンギオスフェア（3Dimensional angiospheres）を形成する。ＰＮＸ後、マウス
中のＶｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の内皮特異的誘導性の遺伝子除去（genetic ablation）は、ＭＭＰ１４の産生を阻害し、肺胞増殖を損なった。ＭＭＰ１４は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）を活性化する、潜在性ＥＧＦ様外部ドメインのアンマスキングによって上皮前駆細胞の増大を促進する。これと一致して、ＭＭＰ１４の中和は、ＥＧＦＲ介在性肺胞再生を損なうが、肺切除されたＶｅｇｆｒ２／Ｆｇｆｒ１欠損マウスへのＥＧＦの投与又はＭＭＰ１４+ＰＣＥＣの血管内移植は、肺胞形成及び肺吸気量及びコンプライアンス機能を
修復する。従って、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１活性化は、ＥＧＦＲリガンドのＭＭＰ１４依存性バイオアベイラビリティを高めて肺胞形成を開始して持続させる。
【０１５０】
ＰＮＸ後、ＰＣＥＣの活性化は、上皮前駆細胞の増大を支持する。
ＰＮＸに誘導された肺胞再生モデル、Ｖｅｇｆｒ２及びＦｇｆｒ１の内皮特異的ノックダウン、並びに３次元内皮−上皮共培養アンギオスフェアバイオリアクターを用いて、本発明者らは、再生肺胞形成の促進におけるＰＣＥＣの必須の役割を確立した。本明細書に
記載された研究は、ＨＢ−ＥＧＦの切断及びラミニン５γ２鎖からＥＧＦ様フラグメントの生成が、ＢＡＳＣ及びＡＥＣのサブセットを含む肺上皮前駆細胞の増幅を刺激し、肺胞増殖を支持する、ＭＭＰ１４のアンギオクリン役割を明らかにした。肺胞形成の促進におけるＭＭＰ１４／ＥＧＦＲ活性化の役割は、ＰＮＸ後、Ｖｅｇｆｒ２iΔEC/iΔECＦｇｆ
ｒ１iΔEC/+マウスへのＥＧＦ投与が肺胞再生を修復する研究で確認された。さらに、本
発明者らは、新たな肺胞増殖を行う能力が損なわれたマウスの上皮形成の修復において、機能的に組み込まれたＰＣＥＣの必須の役割を定義するための肺ＰＣＥＣ移植モデルを確立した。まとめると、本発明者らは、ＰＮＸ後、ＰＣＥＣが、新たな血管の形成によって及び上皮活性なアンギオクリン因子の指示的産生を通して再生肺胞増殖を組織化することを示した。
【０１５１】
ＰＮＸは、上皮前駆細胞の増幅を介して肺胞再生を誘導する。
初期段階（日０〜３）で、ＰＮＸは、ＢＡＤＪに局在化されたＣＣＳＰ+ＳＰＣ+Ｓｃａ−１+ＣＤ３１-ＶＥ−カドヘリン-ＢＡＳＣ様細胞の増大を誘導する。後期段階（日７〜
１５）で、ＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣＩＩ及びＰＣＥＣは、増大し、機能性肺胞毛細血管ユニットを再構築する。ＭＭＰ１４阻害すると、立方体様ＳＰＣ＋Ｅ−カドヘリン＋だけでなく、また鱗状ＳＰＣ−Ｅ−カドヘリン＋ＡＥＣの肺胞被覆率（alveolar coverage）の損失は、一時的に増幅されたＳＰＣ+Ｅ−カドヘリン+ＡＥＣＩＩがＳＰＣ-Ｅ−カドヘリン+タイプＩ ＡＥＣを潜在的に生成し（Beers, The Journal of clinical investigation 121: 2065-2073 (2011); Morrisey, Developmental cell 18:8-23 (2010); Rock,
Annual review of cell and developmental biology (2011)）、ＰＮＸ後の肺胞表面の
十分な再構築を導くことを意味している。従って、誘導ＰＣＥＣは、機能性肺胞毛細血管嚢をまとめて再構築する、特定の肺上皮細胞の再生を誘発する。
【０１５２】
ＰＣＥＣは、ＥＧＦＲリガンドのＭＭＰ１４介在性放出を通して肺胞形成を開始する。
ＰＣＥＣ由来のＭＭＰ１４は、上皮細胞の増大並びに肺胞構造及び肺機能の修復に必要である。マウス胎児肺では、ＭＭＰ１４は、上皮増殖及び移動の惹起（Chun, Cell 125:577-591 (2006); Hiraoka, Cell 95:365-377 (1998); Stratman, Blood 114:237-247 (2009); Yana, Journal of cell science 120:1607-1614 (2007)）によって肺胞形成を調節する（Atkinson, Dev Dyn 232:1079-1090 (2005); Irie, Medical molecular morphology 38:43-46 (2005); Oblander, Developmental biology 277:255-269 (2005)）。出生後、ＭＭＰ１４欠損マウスは、不完全な肺胞増殖、異常な小嚢形成、及びＡＥＣによる血管統合障害（impaired vascular integration）を示し、ＭＭＰ１４が肺胞毛細血管クロストー
クを仲介することを示唆している（Lee, Nature medicine 10:1095-1103 (2004); Li, Cell 111:635-646 (2002); Morris, Nature 422:169-173 (2003); Page-McCaw, Nature reviews 8:221-233 (2007)）。従って、本発明者らは、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４の阻害は、肺
胞再増殖だけでなく内皮増殖を妨げ、肺胞サイズを拡大することを示した。ＭＭＰ１４は、増殖血管新生に不必要かもしれないが、再生肺胞増殖の誘導において重要な役割を果たす。本研究は、ＭＭＰ１４が肺胞形成を調節する機構には、肺胞腔へのＨＢ−ＥＧＦの切断及びラミニン５γ２鎖からのＥＧＦ様フラグメントの生成が含まれることを示している。その後、生物学的に利用可能なＥＧＦＲ−リガンドの増加は、上皮前駆細胞の再生を開始する。これに関して、ＭＭＰ１４は、再生肺胞増殖を誘発するＰＣＥＣ特異的アンギオクリンキューとして作動する。
【０１５３】
ＭＭＰ１４のＰＣＥＣ特異的誘導は、肺血管系の独特な機能的特徴を明らかにする。
各器官は、独特な表現型の、機能的及び構造的特質によって同定される、毛細血管ＥＣの特定集団によって血管新生される。骨髄ＳＥＣ（Butler, Cell stem cell 6:251-264 (2010b); Hooper, Cell stem cell 4: 263-274 (2009)）と肝ＳＥＣとは、ＶＥＧＦＲ２+
ＶＥＧＦＲ３+ＶＥ−カドヘリン+血管によって区別され、器官再生を誘発するアンギオクリン因子の確定されたセットを発現する。上記のように、部分肝切除後、ＶＥＧＦＲ２誘
導肝ＳＥＣ及びＩｄ１誘導肝ＳＥＣは、ＨＧＦ及びＷＮＴ２を産生して肝細胞増殖を誘導する。対照的に、骨髄ＶＥＧＦＲ２誘導ＳＥＣは、Ｎｏｔｃｈリガンド及びＩＧＦＢＰ（Butler, Cell stem cell 6:251-264 (2010b); Kobayashi, Nature cell biology 12:1046-1056 (2010)）を発現して造血細胞の再構築を誘導する。
【０１５４】
ＰＣＥＣは、ＶＥＧＦＲ２+ＦＧＦＲ１+ＣＤ３４+ＶＥ−カドヘリン+血管として同定される明瞭な表現型の特徴を有する。注目すべきことに、ＰＮＸ後、ＭＭＰ１４の産生は、他の血管の豊富な器官ではなく、ＶＥＧＦＲ２活性化ＰＣＥＣ及びＦＧＦＲ１活性化ＰＣＥＣに制限され、肺胞再生におけるＰＣＥＣの独特な機能的特徴を強調している。肺胞形成の修復における、肺切除されたＷＴマウスから得られた血漿のごくわずかな効果は、肺胞形成の仲介における非肺血管系からの全身の可溶性増殖因子の寄与が最小限であることを示した。これらのデータは、ＰＮＸがＰＣＥＣ特異的プログラムを起動して肺胞再生を促進する概念を明確に説明している。
【０１５５】
ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の逐次的活性化は、肺胞再生中にＰＣＥＣを刺激する。
ＰＮＸの後、ＰＣＥＣがＭＭＰ１４の発現を誘導する機構は、ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の階層的な活性化及び上方制御によって仲介される。ＰＮＸの初期段階で、ＢＡＳＣ様細胞の増大は、主にＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２の活性化に依存しており、それは、ＥＣ増殖を誘導することなくＭＭＰ１４の上方制御を生じる。ＰＮＸ後のＶＥＧＦＲ２の初期の活性化及び安定発現と対照的に、ＦＧＦＲ１発現レベルは、その後に誘導され、日７にピークに達する。ＦＧＦＲ１は、ＭＭＰ１４生成の増大においてＶＥＧＦＲ２と共同作用し、それによって肺胞の再生を持続させる。従って、ＰＣＥＣ中のＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の逐次的活性化は、ＭＭＰ１４産生を誘導し、機能的肺胞毛細血管ユニットの再生を促進する。
【０１５６】
ＰＣＥＣ由来のアンギオクリン因子のＰＣＥＣ移植及び投与は、呼吸器疾患の処置の新たなアプローチを提供する。
肺障害を有する受療体において呼吸容量を修復する治療的な戦略の開発は、肺再生機構があまり理解されてないたま不利な立場に置かれている（Jiang, Nature medicine 11:1173-1179 (2005); Kajstura, The New England journal of medicine 364:1795-1806 (2011); Matthay, Annual review of pathology 6:147-163 (2011); Morris, Nature 422:169-173 (2003); Petrache, Nature medicine 11:491-498 (2005); Whitsett, Annual review of medicine 61:105-119 (2010)）。本明細書に記載された本研究は、吸気量及び静的
コンプライアンスによって測定されるように、ＰＮＸ後、誘導ＰＣＥＣが、呼吸容量の修復に有望な役割を果たすことを示している。特に、ＥＧＦの投与又は誘導ＰＣＥＣの移植は、マウスの呼吸器の機能を改善した。従って、適当に活性化されたＰＣＥＣの移植又は肺特異的アンギオクリンメディエーターの注射は、肺障害を有する受療体のサブセットにおいて肺機能を改善できる。
【０１５７】
実施例２に記載された研究は、ＰＣＥＣは、ＭＭＰ１４のような誘導アンギオクリン増殖シグナルを伝達することによって再生肺胞形成を組織化することを示している。ＶＥＧＦＲ２及びＦＧＦＲ１の選択的活性化、又はＭＭＰ１４だけでなく、本明細書に記載された他のアンギオクリン因子の産生における増加は、肺の肺胞増殖を促進でき、それによって消耗性肺疾患を有する受療体の低酸素血を改善する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【外国語明細書】
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