(57)【要約】【課題】  アデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の新規な向上剤を提供すること。【解決手段】  膜透過性を有するペプチドと上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを有効成分とする。本発明における膜透過性を有するペプチドと上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、例えば、より少量の光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルスベクターによる、より効果的な視覚機能の回復に寄与する。【選択図】  図１
2020191872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを有効成分とする、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤。
【請求項２】
哺乳動物細胞が網膜細胞である請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤。
【請求項３】
外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤。
【請求項４】
インビトロにおいてアデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる、哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法。
【請求項５】
上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチド。
【請求項６】
インビトロにおいてアデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法であって、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法には様々な方法が存在するが、その一つとしてウイルスベクターを利用する方法が知られている。この方法は、ゲノムに目的遺伝子を組み込んだウイルスを標的細胞に感染させることによって、目的遺伝子を標的細胞に送り込むものであり、ウイルスベクターのなかでもアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ：以下「ＡＡＶ」と略称する）ベクターは、ヒトに対する安全性が高いウイルスベクターとして、すでに遺伝子治療において実用化されている。しかしながら、ＡＡＶの哺乳動物細胞への感染効率は、細胞の種類や由来によって様々であることから、感染効率が低い細胞が標的細胞である場合、標的細胞に対する目的遺伝子の導入効率が劣ることで、充分な遺伝子治療の効果が発揮されない。
【０００３】
本発明者らは、これまで視覚障害に対する治療方法についての研究を精力的に行ってきており、その成果として、ＡＡＶベクターを用いた遺伝子治療において、標的細胞である虹彩色素上皮細胞に発現する上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下「ＥＧＦＲ」と略称する）のチロシンキナーゼ活性を阻害することで、目的遺伝子である脳由来神経栄養因子遺伝子の導入効率が向上することを、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する低分子有機化合物であるチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）を用いて確認している（非特許文献１）。しかしながら、チルホスチンは、低濃度（例えばインビトロの実験において１０μＭ）で細胞毒性を示すことが知られている。また、抗がん剤として用いられるヒドロキシ尿素も、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に外来遺伝子の導入効率を向上させる作用を有することが知られているが、その作用は極めて弱い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｒｉｋｏ  Ｓｕｇａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５；４６：３３４１−３３４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の新規な向上剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドが、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の導入効率の向上剤の有効成分として有用であることを見出した。
【０００７】
上記の点に鑑みてなされた本発明のＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを有効成分とする。
また、請求項２記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、哺乳動物細胞が網膜細胞である。
また、請求項３記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である。
また、本発明の哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法は、請求項４記載の通り、インビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる。
また、本発明は、請求項５記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドに関する。
また、本発明のインビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法は、請求項６記載の通り、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行うものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤の有効成分として、膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１における各種の物質のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を示すグラフである。
【図２】実施例２における各種の物質のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を示すグラフである。
【図３】実施例４においてｍＶＣｈＲ１遺伝子の発現によって発生する視覚誘発電位を被験物質が増大させる効果を有することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤は、膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを有効成分とする。
【００１１】
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドにおいて、膜透過性を有するペプチドは、細胞膜を通過して細胞質内へ移行する作用を持つ自体公知のアミノ酸配列を有するもの（Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＰＰ）であってよく、例えば、ＨＩＶ−１  Ｔａｔに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）、ＦＨＶ  ｃｏａｔに由来するＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号２）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖに由来するＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号３）、ＢＭＶ  Ｇａｇに由来するＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号４）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘに由来するＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号５）などが挙げられる（必要であれば例えば、二木史朗、蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．４７  Ｎｏ．１１（２００２）１４１５−１４１９を参照のこと）。これらのアミノ酸配列は、膜透過性を有する限りにおいて１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加したものであってもよい。
【００１２】
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドにおいて、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドは、自体公知のアミノ酸配列を有するものであってよく、例えば、ＥＧＦＲの自己リン酸化部位であるＹ９９２に由来するＤＥＹＬＩ（配列番号６）、Ｙ１０６８に由来するＶＰＥＹＩＮＱ（配列番号７）、Ｙ１１４８に由来するＤＹＱＱＤ（配列番号８）、Ｙ１１７３に由来するＥＮＡＥＹＬＲ（配列番号９）などが挙げられる（必要であれば例えば、Ｍｉｎｅｏ  Ａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００６；１４７：４０２−４１１を参照のこと）。これらのアミノ酸配列は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する限りにおいて１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加したものであってもよい。
【００１３】
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、膜透過性を有するペプチドのＣ末端にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させてもよいし、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドのＣ末端に膜透過性を有するペプチドを結合させてもよい。具体例としては、ＨＩＶ−１  Ｔａｔに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲのＣ末端にＹ１０６８に由来するＶＰＥＹＩＮＱやＹ１１４８に由来するＤＹＱＱＤを結合させたペプチド、ＦＨＶ  ｃｏａｔに由来するＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲのＣ末端にＹ１１７３に由来するＥＮＡＥＹＬＲを結合させたペプチド、Ｙ１０６８に由来するＶＰＥＹＩＮＱのＣ末端にＨＩＶ−１  Ｔａｔに由来するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを結合させたペプチドなどが挙げられる。
【００１４】
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、ペプチド合成機を用いて化学合成することができるが、遺伝子工学的手法によって調製してもよい。
【００１５】
なお、本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際の安定性を保つことなどを目的として、そのＮ末端をアセチル化したりＣ末端をアミド化したりしてもよい。
【００１６】
本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、例えば水溶性の粉末である。従って、インビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、細胞の培養液に溶解して例えば１〜２４時間、３７℃でインキュベートした後、ウイルスを細胞に感染させることで、外来遺伝子の導入効率を向上させることができる。また、インビボにおいては、本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドを、外来遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液に溶解してから、体内に投与してウイルスを細胞に感染させることで、外来遺伝子の導入効率を向上させることができる。本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドの、細胞の培養液への溶解量や外来遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液への溶解量は、例えば０．１μＭ〜１０Ｍの範囲になるように適宜設定すればよい。なお、本発明において、哺乳動物細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ 、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌなどの各種の部位の細胞であってよい。外来遺伝子は、標的細胞に対して導入されることで、例えば疾患の治療効果を発揮するものなどであってよい。具体的には、哺乳動物細胞としては、哺乳動物の網膜細胞（網膜を構成する神経細胞やグリア細胞や色素上皮細胞など）が挙げられる。外来遺伝子としては、視覚機能に重要な役割を果たす光受容チャネルロドプシンなどの光感受性陽イオン選択的チャネルの遺伝子が挙げられる。ＡＡＶベクターへの光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子の組み込みや、光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの網膜細胞への導入は、例えばＴｏｍｉｔａ  Ｈｉｒｏｓｈｉ，ｅｔ  ｓｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２０１４；２２（８）：１４３４−１４４０に記載の方法に従って行うことができる。本発明者らは、この文献において、光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターを網膜細胞に導入にすることによって視覚機能が回復することを報告したが、本発明における膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、より少量の光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターによる、より効果的な視覚機能の回復に寄与する。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１８】
実施例１：
カニクイザル由来の繊維芽細胞株であるＣＹＮＯＭ−Ｋ１を９６ウェルプレートにそれぞれ１×１０４個ずつ播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で、１日、３７℃でインキュベートした。１×ＤＰＢＳで２回ｗａｓｈした後、４０ｍＭのヒドロキシ尿素（ＨＵ）（１ｍＭの酪酸ナトリウムを含む）、１０μＭのチルホスチン（Ｔｙｒ）、被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＰＥＹＩＮＱ−ＣＯＮＨ２（配列番号１０：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）をそれぞれ加え、５時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートを終了した後、２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で２回ｗａｓｈしてから、市販のＡＡＶとｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１  Ｖｅｃｔｏｒを用いてメーカのマニュアルに従って作製したＡＡＶ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ（１×１０１２〜１３ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）２．５μＬ＋２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地４７．５μＬをウイルス溶液として加え、２時間、３７℃でインキュベートした後、１８％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を５０μＬ加えた。１日後に培地交換を行い、さらに３日間培養した。その後、核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を５μｇ／ｍＬになるように加え、３０分間、室温でインキュベートし、蛍光顕微鏡で細胞の写真を撮影した。撮影した写真から、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって核が青色に染色された全細胞数に対する、ｍＣｈｅｒｒｙによって核が赤色に染色された細胞数の比率として計算した。結果を図１に示す（無処理群をコントロールとする相対値）。図１から明らかなように、被験物質である膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、濃度依存的にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の導入効率を向上させることで発現効率を向上させ、その作用はチルホスチンに匹敵するものであった。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
【００１９】
実施例２：
被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＹＱＱＤ−ＣＯＮＨ２（配列番号１１：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）を用いること以外は実施例１と同様にしてそのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を評価した。結果を図２に示す。図２から明らかなように、被験物質のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率の向上作用はチルホスチンに匹敵するものであった。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
【００２０】
実施例３：
被験物質としての各種の濃度のＡｃｅｔｙｌ−ＶＰＥＹＩＮＱＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＮＨ２（配列番号１２：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社のペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた化学合成による水溶性の白色粉末）を用いること以外は実施例１と同様にしてそのｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率に対する作用を評価したところ、チルホスチンに匹敵するｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現効率の向上作用を示した。なお、この被験物質は、チルホスチンよりも低毒性であった（例えばインビトロの実験において１ｍＭでも細胞毒性を示さない）。
【００２１】
実施例４：
Ｔｏｍｉｔａ  Ｈｉｒｏｓｈｉ，ｅｔ  ｓｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２０１４；２２（８）：１４３４−１４４０に記載の方法に従って以下の実験を行った。緑藻類ボルボックス由来のチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）を基本構造とした改変型チャネルロドプシン（ｍＶＣｈＲ１）の遺伝子をＡＡＶベクターに組み込み、ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの溶液（２．５×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）５μＬを、３２ゲージハミルトンマイクロシリンジを用いて、失明に至った６ヶ月齢以上の遺伝性網膜変性症（ＲＣＳ，ｒｄｙ／ｒｄｙ）ラット（日本クレア社より購入）の一方の硝子体内に麻酔下で投与した。他方の硝子体内には、ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターと、実施例１に記載の被験物質（Ａｃｅｔｙｌ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＰＥＹＩＮＱ−ＣＯＮＨ２：Ｔａｔ−Ｙ１０６８）を含む溶液５μＬを投与した（ｍＶＣｈＲ１遺伝子を組み込んだＡＡＶベクターの最終濃度は対側眼と同じで被験物質の最終濃度は４０μＭ）。投与から２ヶ月後に視覚誘発電位を測定した。具体的には、測定の１週間前に脳視覚野に記録用電極の埋め込み手術を行ったラットの眼前にＬＥＤ光源を配置し、１秒間隔で１０ｍｓの光刺激を２００回行い、光刺激に伴って誘発される視覚野の電位変化を記録した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、被験物質である膜透過性を有するペプチドとＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドの結合ペプチドは、網膜細胞へのｍＶＣｈＲ１遺伝子の導入効率を向上させることで発現効率を向上させ、視覚誘発電位の振幅を増大させた（遺伝子導入される主たる細胞は神経節細胞である）。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、ＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の新規な向上剤を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2020191872.tif 000003
【図２】
2020191872.tif 000004
【図３】
2020191872.tif 000005
【配列表】
2020191872000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月13日(2020.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜透過性を有するペプチドのＣ末端に上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドを有効成分とする、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤。
【請求項２】
哺乳動物細胞が網膜細胞である請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤。
【請求項３】
外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤。
【請求項４】
インビトロにおいてアデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、膜透過性を有するペプチドのＣ末端に上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる、哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法。
【請求項５】
膜透過性を有するペプチドのＣ末端に上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチド。
【請求項６】
インビトロにおいてアデノ随伴ウイルスベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法であって、膜透過性を有するペプチドのＣ末端に上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行う方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
上記の点に鑑みてなされた本発明のＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際に用いる、外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の通り、膜透過性を有するペプチドのＣ末端にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドを有効成分とする。
また、請求項２記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、哺乳動物細胞が網膜細胞である。
また、請求項３記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤は、請求項１記載の外来遺伝子の導入効率の向上剤において、外来遺伝子が光感受性陽イオン選択的チャネル遺伝子である。
また、本発明の哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率を向上させる方法は、請求項４記載の通り、インビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する際、膜透過性を有するペプチドのＣ末端にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドを存在させることによる。
また、本発明は、請求項５記載の通り、膜透過性を有するペプチドのＣ末端にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドに関する。
また、本発明のインビトロにおいてＡＡＶベクターを用いて哺乳動物細胞に対して外来遺伝子を導入する方法は、請求項６記載の通り、膜透過性を有するペプチドのＣ末端にＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害するペプチドを結合させた結合ペプチドの存在下で行うものである。