(57)【要約】【課題】  サメやサケ由来のコンドロイチン硫酸から、コロイド粒子径が１００ｎｍ以下である保存安定性のよいコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを提供する。【解決手段】  分子量が１５,０００〜４０,０００で、その二糖組成比としてΔＤｉ-６Ｓが５０〜８５重量％かつΔＤｉ-４Ｓが１０〜３０重量％および２硫酸totalが５〜１５重量％であるコンドロイチン硫酸の水溶液にアルカリを絶えず加えながら、ｐＨコントローラーの制御目標値を９〜１１の間に設定し、当該設定値の±０.１のｐＨ変動内でコントロールしながら塩化第二鉄水溶液を添加して、コロイド粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以下であるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が１５,０００〜４０,０００で、その二糖組成比としてΔＤｉ-６Ｓが５０〜８５重量％かつΔＤｉ-４Ｓが１０〜３０重量％および２硫酸totalが５〜１５重量％であるコンドロイチン硫酸から得られるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドであって、
コロイド粒子の平均粒子径が１００ｎｍ以下であるコンドロイチン硫酸・鉄コロイド。
【請求項２】
前記コンドロイチン硫酸・鉄コロイド溶液は、６０℃で３週間以上の粒子安定性を有する請求項１に記載のコンドロイチン硫酸・鉄コロイド。
【請求項３】
コンドロイチン硫酸の由来が、サメ、サケのいずれかであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンドロイチン硫酸・鉄コロイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量元素製剤に用いられるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドに関する。
【背景技術】
【０００２】
長期にわたる高カロリー輸液療法が、鉄や亜鉛、銅、マンガン、ヨウ素、コバルト、セレンなどの人体必須微量元素の欠乏症を引き起こすことがあるのはよく知られている。この欠乏症の発症予防のため、前記必須微量元素を含有した静脈注射用の微量元素製剤が用いられる。そして、当該微量元素製剤には、鉄コロイドとして安定化したコンドロイチン硫酸ナトリウム・鉄コロイドが配合される。
【０００３】
コンドロイチン硫酸・鉄コロイドは、通例、コンドロイチン硫酸ナトリウムの水溶液に、塩化第二鉄水溶液と水酸化ナトリウムなどのアルカリ水溶液を交互に混合撹拌して製造される。この方法は、混合液のｐＨが約７〜１４のアルカリ側において、塩化第二鉄水溶液とアルカリ水溶液とを交互に加えて攪拌混合し、最後に混合液のｐＨが７〜１０となるように調整する方法である。より具体的に説明すれば、コンドロイチン硫酸ナトリウムの水溶液に、所定量の塩化第二鉄水溶液を添加した後、所定量のアルカリを加えて液のｐＨを７以上の中性付近に初期調整した上で、さらに所定量のアルカリを加え、鉄コロイドが十分に形成されると考えられる強アルカリ性（ｐＨ１２付近）とする。そして、必要とされる鉄イオン含量となるまで、塩化第二鉄水溶液とアルカリ水溶液とを交互に添加する。この間、塩化第二鉄混合後のｐＨは約７〜１０の中性に近いアルカリ域にあり、また、アルカリ混合後のｐＨは、塩化第二鉄混合後のｐＨよりも高い約１２〜１４の強アルカリ域にある。こうして、混合液のｐＨが約１０〜１４の強アルカリ域と約７〜１０のアルカリ域との間を交互に推移しながら、平均粒子径が１００ｎｍ以下のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドが製造される。
【０００４】
一方、特公昭３６−１５２９６号公報（特許文献１）や特開２０００−１７８１８１号公報（特許文献２）、特開２００２−１９３８１６号公報（特許文献３）などにもその製造方法が記載されているが、最終調整ｐＨや製造工程中におけるｐＨ範囲が記載されているにすぎず、その詳細な製造方法については触れられてはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭３６−１５２９６号公報、第１〜２頁
【特許文献２】特開２０００−１７８１８１号公報、第３頁
【特許文献３】特開２００２−１９３８１６号公報、第４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記製造方法においては、塩化第二鉄溶液と水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ手作業により投入しており、比較的労力を要するものであった。また、塩化第二鉄溶液、水酸化ナトリウム溶液を添加した後、混合液のｐＨがほぼ安定するまで攪拌する必要があり、作業効率も悪い方法であった。
【０００７】
そこで、本発明者らが鋭意努力したところ、一定の条件下で、いわゆるｐＨコントローラーを用いれば、作業効率よく安定に平均粒子径の小さいコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを製造できることを見出し、本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドは、分子量が１５,０００〜４０,０００で、その二糖組成比としてΔＤｉ-６Ｓが５０〜８５重量％かつΔＤｉ-４Ｓが１０〜３０重量％および２硫酸totalが５〜１５重量％であるコンドロイチン硫酸から得られるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドであって、コロイドの平均粒子径が１００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドは、例えばｐＨコントローラーを用いることにより作業効率よく製造される。このコンドロイチン硫酸・鉄コロイドはサメやサケなどウシ以外の由来によるコンドロイチン硫酸から製造され、６０℃の条件下でも１週間安定である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドは、分子量が１５,０００〜４０,０００で、その二糖組成比としてΔＤｉ-６Ｓが５０〜８５重量％かつΔＤｉ-４Ｓが１０〜３０重量％および２硫酸totalが５〜１５重量％であるコンドロイチン硫酸から得られるコンドロイチン硫酸・鉄コロイド溶液であって、コロイドの平均粒子径が１００ｎｍ以下である。このコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの製造には、サメやサケ由来のコンドロイチン硫酸が用いられる。
【００１１】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドは例えば次のようにして製造される。コンドロイチン硫酸の水溶液に攪拌しながら所定濃度のアルカリを注入しつつ、混合液のｐＨがアルカリ側の所定ｐＨ域を保つように塩化第二鉄を添加する。
【００１２】
この製造方法は、従来方法と全く異なり、端的に言えば、混合液のｐＨがほぼ一定値（目標値）となるように塩化第二鉄とアルカリとをほぼ同時に注入する方法である。しかし、両者を同時に注入するだけでは平均粒子径が大きなもの、例えば２００ｎｍを超えるものしか得ることができない。そこで、混合液のｐＨをアルカリ性の一定域内に保ちながら、アルカリを連続的に注入する一方で、塩化第二鉄を断続的に注入して、比較的小さな平均粒子径、好ましくは２００ｎｍ以下、望ましくは１００ｎｍ以下のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを得ることにしている。なお、本発明において、鉄コロイドの平均粒子径は実施例記載の方法による測定値を意味する。
【００１３】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを製造するには、製造工程中の混合液のｐＨ目標値を約８以上のアルカリ側、好ましくは約９〜約１１、より望ましくは約１０〜１１の範囲とし、ｐＨの変動値が約０.２の範囲内、すなわち、ｐＨ目標値の±０.１以内に納まるように塩化第二鉄を添加することが重要である。ｐＨ目標値が８付近よりも低い場合や１１付近よりも高くなると、粒子径が大きくなる傾向があり、平均粒子径を１００ｎｍ以下に出来ないことがある。なお、ｐＨ目標値とは製造工程中のほぼ定常状態における平均的な値であって、製造開始直後のｐＨ上昇中は除かれる。
【００１４】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドは、ｐＨコンロトーラを用いることにより簡単に製造される。具体的には、ｐＨコントローラーの制御目標値を９〜１１の間に設定し、当該設定値の±０.１の変動内でアルカリを絶えず加えながら塩化第二鉄の添加をコントロールすればよい。
【００１５】
本発明のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドは、従来の方法では製造できなかったサメ由来、サケ由来のものから得られるものであり、特にサメ由来やサケ由来のコンドロイチン硫酸のように、以下に述べる不飽和二糖の６位に硫酸が結合したΔＤｉ-６Ｓを多く含有する。
【００１６】
コンドロイチン硫酸は、二糖体であるＮ−アセチルコンドロイシンを基本単位とするムコ多糖の硫酸化体であって、通常、二糖単位当たり１モルの硫酸が結合している。また、コンドロイチナーゼ処理は、種々の不飽和二糖を生成し、不飽和二糖の４位に硫酸が結合したもの（ΔＤｉ-４Ｓ）、６位に硫酸が結合したもの（ΔＤｉ-６Ｓ）、不飽和二糖に２モルの硫酸が結合したもの（ΔＤｉ-ｄｉＳＤ,ΔＤｉ-ｄｉＳＢ,ΔＤｉ-ｄｉＳＥ）などを生成する。これらのうち、ΔＤｉ-６Ｓを多く含むコンドロイチン硫酸は通常タイプＣと呼ばれ、ΔＤｉ-４Ｓを多く含むコンドロイチン硫酸は通常タイプＡと呼ばれる。
【００１７】
コンドロイチン硫酸は、通常水に溶解しやすい塩の形で用いられ、コンドロイチン硫酸のナトリウム塩が汎用される。その分子量は制約されるものではないが、好ましくは１０,０００〜５０,０００、さらに好ましくは１５,０００〜４０,０００、より望ましくは２０,０００〜２５,０００である。大きな分子量のものは得られるコロイド粒子の平均粒子径が大きくなり、小さすぎるとコロイド粒子の安定性が低下する傾向にある。
【００１８】
また、本発明においては、ΔＤｉ-６Ｓを多く含有するいわゆるタイプＣが好ましく用いられるが、その中でもある一定範囲の二糖体組成比を有するコンドロイチン硫酸ナトリウム、特に一定範囲量の二硫酸結合体（２硫酸total）を含有するコンドロイチン硫酸が望ましく用いられる。同じタイプＣのものであっても、二硫酸結合体含量が多い場合には得られたコロイド粒子の平均粒子径が大きくなる傾向にある。
【００１９】
従って、これらを勘案すれば、本発明に最適なコンドロイチン硫酸は、分子量が１５,０００〜４０,０００、二糖組成比としてΔＤｉ-４Ｓの含有量が１０〜３０重量％、ΔＤｉ-６Ｓの含有量が５０〜８５重量％、かつ２硫酸totalすなわち結合位置を問わず２モルの硫酸が結合した二硫酸結合体含有量（本発明においては、ΔＤｉ-ｄｉＳＤ,ΔＤｉ-ｄｉＳＢ,ΔＤｉ-ｄｉＳＥの合計量をいう。）が５〜１５重量％、さらに望ましくは５〜１０重量％のものである。なお、コンドロイチン硫酸の分子量や二糖組成比は実施例に記載された方法により測定されたものを意味する。
【００２０】
用いられるアルカリは特に制約されるものではないが、得られたコンドロイチン硫酸・鉄コロイドが医薬品の製剤原料として用いられる観点から水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、さらに望ましくは水酸化ナトリウムである。もちろん、医薬用剤に用いられるアルカリであれば、これらに限定されるものではない。また、塩化第二鉄やアルカリは通例水溶液として添加される。この濃度は、ｐＨコントロールが可能な限り特に限定されない。
【００２１】
さらに具体的な手順を示しながらその製造方法を詳細に説明する。まず、コンドロイチン硫酸ナトリウムを水に溶解する。その初期濃度は約０.１〜５w/v％であり、好ましくは約１〜４w/v％である。この溶液に、攪拌しながら所定濃度のアルカリ水溶液を一定速度で連続的に注入し始める。ここで「連続的に」とは間断なくとの意であり、ロータリーポンプなどによる連続注入の他、自然落下などによる滴下をも含む。そして、その添加速度は適宜定められるが、約１〜４時間、好ましくは２〜４時間程度で所要量の塩化第二鉄が添加されるように調整するのが好ましい。すなわち、約１〜４時間程度の攪拌時間を確保するのが好ましい。
【００２２】
塩化第二鉄は、アルカリの添加と同時に添加を始めてよいが、アルカリを添加して液のｐＨが目標値に達した後に添加を開始するのが好ましい。
【００２３】
塩化第二鉄を添加すれば、コロイドの形成に伴って混合液のｐＨが低下する。そして、混合液のｐＨが目標値を下回った時点で塩化第二鉄の添加を一時的に止める。この時点で、混合液のｐＨは僅かに目標値を下回るが、アルカリは引き続き添加されているので、混合液のｐＨは再び上昇し始める。そして、目標値を上回れば再び塩化第二鉄を添加し、目標値を下回った時点でその添加を一時的に止める。このように、混合液のｐＨ変動が所定範囲内となるように塩化第二鉄を断続的に添加する。なお、製造工程中、塩化第二鉄の添加によるｐＨ降下がアルカリによるｐＨ上昇よりも大きくなるように、濃度や添加速度が決定される。
【００２４】
ｐＨ変動域は約０.２、すなわち、目標値の±約０.１の範囲であり、好ましくは目標値の±約０.０５（ｐＨ変動域として約０.１）である。この値は、塩化第二鉄溶液やアルカリ溶液の添加濃度、添加速度それにｐＨコントローラーの制御精度に依存する。
【００２５】
こうして、コンドロイチン硫酸の水溶液を攪拌しながら所定濃度のアルカリ水溶液を前記水溶液に一定速度で連続注入しつつ、混合液のｐＨがアルカリ側の所定ｐＨ域を保つように塩化第二鉄水溶液を断続的に添加する。そして、ｐＨ調整のために必要と想定される塩化第二鉄量を残して、所定量の塩化第二鉄を添加したならば、目標値までアルカリを添加し、しばらく攪拌を続ける。その後、残余の塩化第二鉄を添加してさらに攪拌をし、必要に応じて酸（あるいはアルカリ）を加えて、ｐＨを７〜８の中性付近に調整する。この後、必要があればさらに水による液量調整、加熱滅菌を行い、微量元素製剤の製造に供する。
【００２６】
このように上記製造方法においては、攪拌しながらコンドロイチン硫酸の水溶液に所定濃度のアルカリを一定速度で連続注入しつつ、混合液のｐＨがアルカリ側の所定ｐＨ域を保つように塩化第二鉄水溶液を断続的に添加しているので、ｐＨコントローラーを用いた機械制御による製造が行える。
【００２７】
また、上記製造方法によれば、ウシ由来以外のサメやサケ等を由来とするコンドロイチン硫酸を用いて、本発明の１００ｎｍ以下の平均粒子径を有するコンドロイチン硫酸・コロイド鉄が簡単に得られる。
【実施例１】
【００２８】
以下、実施例に基づいて本発明についてさらに詳細に説明する。
コンドロイチン硫酸ナトリウム（マルハ株式会社製、Lot.PUC-790,サメ由来）の３.９w/v％水溶液１０００mLに、当該水溶液を攪拌（１０００rpm）しながら水酸化ナトリウム水溶液（５.９w/v％）を１０mL／hの速度で添加を始めた。混合液のｐＨ目標値が９.０、変動域が０.１（ｐＨ目標値±０.０５）となるように塩化第二鉄水溶液（ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ  ２３.７w/v％）を１０mL／hの速度で加え、所定量の塩化第二鉄（塩化第二鉄水溶液２８.５mL）が添加されるまで、約３時間の添加攪拌を続けた。この間、塩化第二鉄水溶液および水酸化ナトリウム水溶液の添加は、ｐＨコントローラー（株式会社日伸理化製、ＮＰＨ−８８００）により制御された。添加終了後、ｐＨコントローラーによる制御を止め、攪拌しながら残量の塩化第二鉄水溶液（１.５ml）を添加した。この液のｐＨは７.４、得られた鉄コロイド粒子の平均粒子径は１２６ｎｍであった。
【００２９】
なお、用いたコンドロイチン硫酸ナトリウムは、平均分子量２１,５００、ΔＤｉ-６Ｓが７４.６重量％、ΔＤｉ-４Ｓが１６.５重量％、２硫酸totalが７.３重量％であった。
【００３０】
〔コンドロイチン硫酸ナトリウムの平均分子量の測定〕
コンドロイチン硫酸ナトリウム２０mgを精密に量り、移動相で正確に１０mLとして試料溶液とした。別にプルラン標準品（分子量20,000）２０mgを精密に量り、移動相で正確に２０mLとして標準溶液とした。試料溶液および標準溶液３００μLにつき、次の操作条件で液体クロマトグラフ法により試験を行い、光散乱データ処理 GPC LALLSプログラムにより試料の平均分子量を算出した。
【００３１】
試験条件
HLC-8120GPCシステム
検出器：示差屈折計、光散乱光度計
カラム：TOSOH TSK-GEL G3000PWXL 7.8mm×300mm
カラム温度：４０℃
移動相：０.２mol/L NaNO3水溶液
流量：０.８mL/min
【００３２】
〔不飽和二糖の測定〕
コンドロイチン硫酸ナトリウム５mgにコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液０.５mLを加えて溶解させ、３７℃の恒温槽中で４時間反応させた。反応後、沸騰水浴中で１分間加熱したものを試料溶液とした。別に標準となるΔＤｉ-ＨＡ、ΔＤｉ-０Ｓ、ΔＤｉ-ＵＡ２Ｓ、ΔＤｉ-６Ｓ、ΔＤｉ-４Ｓ、ΔＤｉ-ｄｉＳＤ,ΔＤｉ-ｄｉＳＢおよびΔＤｉ-ｄｉＳＥそれぞれ２５０μgを０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）０.２５mLに溶解させ、それぞれ２０μLを合わせて標準溶液とした。試料溶液及び標準溶液１０μLにつき、下記の操作条件で液体クロマトグラフ法により試験した。
【００３３】
試験条件
検出器：SPD-10A 測定波長：２３２ｎｍ
カラム：TOSOH TSKgel Amido80（4.6×250mm）
温度：７０℃
移動相：アセトニトリル／メタノール／ギ酸アンモニウム緩衝液＝６０／２５／１５
流量：１mL／min
Integrator：Class  LC10
【００３４】
〔試液の調整〕
コンドロイチナーゼＡＢＣ溶液：コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）に０.０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）を加えて溶かし、２Ｕ/mLとする。
ギ酸アンモニウム緩衝液：０.５mol/Lギ酸アンモニウム溶液にギ酸を加えてｐＨ４.８に調整する。
【００３５】
〔コンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径の測定〕
１０mmのセルにコンドロイチン硫酸・鉄コロイド溶液を１mL入れ、蒸留水を加えて４mLとし試料溶液とした。この試料溶液を光散乱光度計 ELS8000 （大塚電子株式会社製）にて平均粒子径を測定した。ただし、濃度が薄いまたは濃い場合には、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド溶液をさらに加えるかまたは希釈して再度測定した。
【実施例２】
【００３６】
平均分子量２１,２００、ΔＤｉ-６Ｓが６８.４重量％、ΔＤｉ-４Ｓが２０.５重量％、２硫酸totalが９.２重量％のコンドロイチン硫酸ナトリウム（マルハ株式会社製、Lot.PUC-794,サメ由来）を用い、当該水溶液を攪拌（１０００rpm）しながら水酸化ナトリウム水溶液（５.９w/v％）を１５mL／hの速度で添加を始めた。次に、混合液のｐＨ目標値を１０.０、ｐＨ変動域を０.１（ｐＨ目標値±０.０５）となるように、塩化第二鉄水溶液（ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ  ２３.７w/v％）を１５mL／hの速度で加えた。そして、所定量の塩化第二鉄（塩化第二鉄水溶液２６.５mL）が添加されるまで、約２時間の添加攪拌を続けた。この間、塩化第二鉄水溶液および水酸化ナトリウム水溶液の添加は、ｐＨコントローラー（株式会社日伸理化製、ＮＰＨ−８８００）により制御された。添加終了後、ｐＨコントローラーによる制御を止め、攪拌しながら残量の塩化第二鉄水溶液（３.５ml）を添加した。この液のｐＨは７.５であり、その後水酸化ナトリウム水溶液を加えて液のｐＨを８.０に調整した。得られた鉄コロイド粒子の平均粒子径は７３ｎｍであった。
【実施例３】
【００３７】
混合液のｐＨ目標値を１０.０、ｐＨ変動域を０.１（ｐＨ目標値±０.０５）となるようにし、水酸化ナトリウム水溶液の添加速度を約３.７５mL／hの速度で攪拌（１０００rpm）しながら添加を始めた。次に、塩化第二鉄水溶液を７.５mL／hの速度で加えた。そして、所定量の塩化第二鉄（塩化第二鉄水溶液２６.０mL）が添加されるまで、約４時間の添加攪拌を続けた。そして、攪拌しながら残量の塩化第二鉄水溶液（４.０ml）を添加した他は実施例１と同様にした。この液のｐＨは７.８であり、得られた鉄コロイド粒子の平均粒子径は８１ｎｍであった。
【実施例４】
【００３８】
混合液のｐＨ目標値を１１.０、ｐＨ変動域を０.１（ｐＨ目標値±０.０５）となるようにし、塩化第二鉄水溶液及び水酸化ナトリウム水溶液の添加速度を約３０mL／hの速度で加え、所定量の塩化第二鉄（塩化第二鉄水溶液２７.０mL）が添加されるまで、約１時間の添加攪拌を続けた。そして、攪拌しながら残量の塩化第二鉄水溶液（３.０ml）を添加した他は実施例１と同様にした。この液のｐＨは８.０であり、その後塩酸を加えて液のｐＨを７.８に調整した。得られた鉄コロイド粒子の平均粒子径は９１ｎｍであった。
【実施例５】
【００３９】
（微量元素製剤の製造）
実施例３で得たコンドロイチン硫酸・鉄コロイド溶液５Ｌに水１３Ｌを加えた。この溶液に、攪拌しながら２w/v％塩化マンガン溶液０.１Ｌ、３５w/v％硫酸亜鉛溶液０.５Ｌ、２５w/v％硫酸銅溶液０.０５Ｌおよび１７w/v％ヨウ化カリウム溶液０.０１Ｌを順次加えた。さらに１％w/v水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６に調整し、蒸留水で全量を２０Ｌにした。この溶液を２mLずつガラス容器に充填・密封した後、加熱滅菌して微量元素製剤を得た。この製剤中のコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径は６５ｎｍであった。この製剤を６０℃で３週間保存すると共に１週間経過毎に平均粒子径および外観試験を実施したところ、いずれの時点においても製造直後と差がほとんどなく、安定な微量元素製剤が得られた。
【００４０】
（比較例１）
混合液のｐＨ目標値を８.０、ｐＨ変動域を０.１（ｐＨ目標値±０.０５）となるようにし、塩化第二鉄水溶液及び水酸化ナトリウム水溶液の添加速度を約１０mL／hの速度で加え、所定量の塩化第二鉄（塩化第二鉄水溶液２８.５mL）が添加されるまで、約３時間の添加攪拌を続けた。そして、攪拌しながら残量の塩化第二鉄水溶液（１.５ml）を添加した他は実施例１と同様にした。得られた液のｐＨは７.４であり、鉄コロイド粒子の平均粒子径は２００ｎｍであった。
【００４１】
（比較例２）
混合液のｐＨ目標値を１２.０、ｐＨ変動域を０.１（ｐＨ目標値±０.０５）となるようにし、攪拌回転数を１５００rpmとした以外は、実施例２と同様にした。残量の塩化第二鉄溶液を添加した後のｐＨは９.１であり、その後塩酸でｐＨ７.９に調整した。得られた鉄コロイド粒子の平均粒子径は３０２ｎｍであった。