(57)【要約】【課題】散乱光測定を用いたセンシング方法において、Ｓ／Ｎ比を向上させより定量性の高いセンシングを可能とする。【解決手段】被検出物質Ａの量を検出するセンシング方法であって、散乱体Ｆを含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質Ｂ１が固定された、透明担体１０表面上のセンサ部１４に、被検出物質Ａの量に応じた量の標識複合体をセンサ部１４に形成せしめ、透明担体１０の少なくともセンサ部１４を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体１４の屈折率未満となるように調整し、散乱光測定を行う。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質の量を検出するセンシング方法であって、
散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定された、透明担体表面上のセンサ部に、前記被検出物質を含み得る試料を供給し、
前記被検出物質の量に応じた量の前記標識複合体を前記センサ部に形成せしめ、
前記透明担体の少なくとも前記センサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ前記透明担体の屈折率未満となるように調整し、
前記透明担体に測定光を照射して前記センサ部にエバネッセント光を生じせしめ、
前記散乱体による該エバネッセント光の散乱光を検出することを特徴とするセンシング方法。
【請求項２】
前記屈折率を１．３８以上かつ１．５１以下となるように調整することを特徴とする請求項１に記載のセンシング方法。
【請求項３】
前記屈折率が１．４２以上かつ１．４９以下となるように調整することを特徴とする請求項２に記載のセンシング方法。
【請求項４】
前記屈折率を調整するための調整液で前記透明担体の表面を満たし、該調整液の屈折率をもって該表面の屈折率を調整することを特徴とする請求項１から３いずれかに記載のセンシング方法。
【請求項５】
前記調整液が、水と混ざり合う有機溶媒、または屈折率の高い溶質の水溶液であることを特徴とする請求項４に記載のセンシング方法。
【請求項６】
屈折率を調整するための粘着性物質またはゴム性物質を前記透明担体の表面に接触させ、該粘着性物質または該ゴム性物質の屈折率をもって該表面の屈折率を調整することを特徴とする請求項１から３いずれかに記載のセンシング方法。
【請求項７】
第２のキャプチャ物質が、前記被検出物質と特異的に結合するものであり、
該第２のキャプチャ物質と該第２のキャプチャ物質が修飾された前記散乱体とからなる標識キャプチャ物質を、前記第１のキャプチャ物質に結合した前記被検出物質に特異的に結合させることにより、前記標識複合体を形成することを特徴とする請求項１から６いずれかに記載のセンシング方法。
【請求項８】
第３のキャプチャ物質が、前記被検出物質と競合して前記第１のキャプチャ物質と特異的に結合するものであり、
該第３のキャプチャ物質と該第３のキャプチャ物質が修飾された前記散乱体とからなる標識キャプチャ物質を、前記第１のキャプチャ物質に特異的に結合させることにより、前記標識複合体を形成することを特徴とする請求項１から６いずれかに記載のセンシング方法。
【請求項９】
前記散乱体が、金属性、金属酸化物性、金属窒化物性の微粒子であることを特徴とする請求項１から８いずれかに記載のセンシング方法。
【請求項１０】
前記微粒子の粒径が、３０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項９に記載のセンシング方法。
【請求項１１】
試料を注入するための注入口と、該注入口から注入された前記試料を流すための流路と、前記試料が流れるように空気を抜くための空気口と、散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定された、前記流路表面上のセンサ部とを有する透明担体チップ、および
前記流路の表面上の屈折率を調整するための、屈折率が１．３５以上かつ前記透明担体チップの屈折率未満である調整液を備え、
被検出物質を含み得る前記試料を前記センサ部に供給し、前記被検出物質の量に応じた量の前記標識複合体を前記センサ部に形成せしめ、前記透明担体チップに測定光を照射して前記センサ部にエバネッセント光を生じせしめ、前記散乱体による該エバネッセント光の散乱光を検出し、前記被検出物質の量を検出するセンシング方法に用いられるものであることを特徴とするセンシングキット。
【請求項１２】
散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定されたセンサ部を有する透明担体チップ、および
前記透明担体チップの表面上の屈折率を調整するための、屈折率が１．３５以上かつ前記透明担体チップの屈折率未満である調整液を備え、
被検出物質を含み得る前記試料を前記センサ部に供給し、前記被検出物質の量に応じた量の前記標識複合体を前記センサ部に形成せしめ、前記透明担体チップに測定光を照射して前記センサ部にエバネッセント光を生じせしめ、前記散乱体による該エバネッセント光の散乱光を検出し、前記被検出物質の量を検出するセンシング方法に用いられるものであることを特徴とするセンシングキット。
【請求項１３】
散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定されたセンサ部を有する透明担体チップ、および
前記透明担体チップの表面上の屈折率を調整するための、屈折率が１．３５以上かつ前記透明担体チップの屈折率未満である粘着性物質またはゴム性物質を備え、
被検出物質を含み得る前記試料を前記センサ部に供給し、前記被検出物質の量に応じた量の前記標識複合体を前記センサ部に形成せしめ、前記透明担体チップに測定光を照射して前記センサ部にエバネッセント光を生じせしめ、前記散乱体による該エバネッセント光の散乱光を検出し、前記被検出物質の量を検出するセンシング方法に用いられるものであることを特徴とするセンシングキット。
【請求項１４】
前記被検出物質と特異的に結合する第２のキャプチャ物質と、該第２のキャプチャ物質が修飾された前記散乱体とからなる標識キャプチャ物質を備えることを特徴とする請求項１１から１３いずれかに記載のセンシングキット。
【請求項１５】
前記被検出物質と競合して前記第１のキャプチャ物質と特異的に結合する第３のキャプチャ物質と、該第３のキャプチャ物質が修飾された前記散乱体とからなる標識キャプチャ物質を備えることを特徴とする請求項１１から１３いずれかに記載のセンシングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、散乱体によるエバネッセント光の散乱光を検出し、被検出物質の量を検出するセンシング方法、およびそれに用いられるセンシングキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明を利用したセンシング方法が注目されている。このセンシング方法は、屈折率の異なる界面で測定光が全反射する際に界面からしみ出す光、すなわちエバネッセント光と、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている標識との散乱、吸収、発光等の光学的な相互作用を分析ことにより、上記被検出物質の存在またはその量を検出する方法である。
【０００３】
このようなセンシング方法の一例としては、蛍光性標識を用いた蛍光検出法がある。
蛍光検出法は、冷却ＣＣＤ等光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光性標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光：５２５ｎｍ、蛍光量子収率：０．６）やＣｙ５（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。さらに、表面プラズモンによる電場の増強を用いて、蛍光信号を増大することにより、１ｐＭ（ピコモーラ）を切るような高感度検出も実現されている。
【０００４】
しかしながら、蛍光色素は、光を吸収及び発光する性質上、化学構造的に弱いπ結合を有するため、強度の強い光による不可逆的破壊や雰囲気中の酸素やオゾンとの化学反応により変質してしまうという問題がある。これにより、蛍光色素全体から発せられる総蛍光量が経時的に減少する、いわゆる褪色を招いてしまうため、測定光の強度を一定以上あげることが出来ず、高感度化に限界がある。
【０００５】
そこで、全反射照明を利用したセンシング方法の別の例として、特許文献１および特許文献２に示すような散乱性標識を用いた散乱光検出法が挙げられる。
【０００６】
散乱光検出法は、金属微粒子等の散乱性標識によるエバネッセント光の散乱を利用しており、検出した散乱光の波長や強度に基づいて被検出物質の量を検出している。このような散乱光検出法は、上記のような褪色の問題が存在せず、さらに蛍光色素を用いた一般的な蛍光検出法よりも得られる検出光量が大きいため、より高い検出感度が要求されるような場合に用いる方法として利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３６０８６６５号公報
【特許文献２】特表２００７−５２５６５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記のような散乱光検出方法において、試料中に含まれる或いは透明担体上に存在する夾雑物により生じるエバネッセント光のノイズ的な散乱光が問題となっている。これは、ノイズ的な散乱光が、本来検出対象としている散乱性標識による散乱光に対するバックグラウンドを上昇させてしまうために、Ｓ／Ｎ比が低下し散乱光検出の定量性を失わせるためである。
【０００９】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、Ｓ／Ｎ比を向上させ、より高い定量性を備えたセンシング方法、およびそれに用いられるセンシングキットの提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本願発明者は、透明担体の表面上の屈折率を空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）よりも大きくすると、ある範囲の屈折率ではセンシングにおけるＳ／Ｎ比を向上させることが可能であることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明に係るセンシング方法は、
被検出物質の量を検出するセンシング方法であって、
散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定された、透明担体表面上のセンサ部に、被検出物質を含み得る試料を供給し、
被検出物質の量に応じた量の標識複合体をセンサ部に形成せしめ、
透明担体の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、
透明担体に測定光を照射してセンサ部にエバネッセント光を生じせしめ、
散乱体によるエバネッセント光の散乱光を検出することを特徴とするものである。
【００１２】
ここで、「被検出物質の量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無の検出を含み、定性的な量のみならず、定量的な量、または活性の程度を検出することも意味するものとする。
【００１３】
散乱体を含む「標識複合体」とは、標識としての散乱体と第1のキャプチャ物質とを含み、センサ部上に被検出物質の量に応じた量だけ形成される集合体を意味するものとする。すなわち、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、標識複合体は、語述するように第１のキャプチャ物質−被検出物質−第２のキャプチャ物質のサンドイッチ構造を有する集合体を意味する。一方、競合法によるアッセイを行う場合には、標識キャプチャ物質は、標識複合体は、語述するように第１のキャプチャ物質−第３のキャプチャ物質という構造を有する集合体を意味する。
【００１４】
「キャプチャ物質」とは、ある特定の対象物質と特異的に結合する物質を意味するものとする。例えば、特定の対象物質として抗原を考える場合には、キャプチャ物質としてこの抗原と特異的に結合する抗体が挙げられる。そして、上記の場合において、抗原と競合して上記抗体と特異的に結合する別の抗体もキャプチャ物質である。
【００１５】
「センサ部」とは、透明担体表面上の第1のキャプチャ物質が固定されている領域を意味するものとする。
【００１６】
「被検出物質の量に応じた量」の標識複合体とは、試料中に含まれる被検出物質の量に相関する量の標識複合体を意味するものとする。これにより、散乱体からの散乱光量から被検出物質の量を推量する。
【００１７】
さらに、本発明に係るセンシング方法において、屈折率を１．３８以上かつ１．５１以下となるように調整することが好ましく、１．４２以上かつ１．４９以下となるように調整することがより好ましい。
【００１８】
そして、屈折率を調整するための調整液で透明担体の表面を満たし、調整液の屈折率をもってこの表面の屈折率を調整することが好ましい。この場合、調整液は、水と混ざり合う有機溶媒、または屈折率の高い溶質の水溶液であることが好ましい。或いは、屈折率を調整するための粘着性物質またはゴム性物質を透明担体の表面に接触させ、粘着性物質またはゴム性物質の屈折率をもってこの表面の屈折率を調整することが好ましい。
【００１９】
また、第２のキャプチャ物質が、被検出物質と特異的に結合するものであり、第２のキャプチャ物質と第２のキャプチャ物質が修飾された散乱体とからなる標識キャプチャ物質を、第１のキャプチャ物質に結合した被検出物質に特異的に結合させることにより、標識複合体を形成することが好ましい。或いは、第３のキャプチャ物質が、被検出物質と競合して第１のキャプチャ物質と特異的に結合するものであり、第３のキャプチャ物質と第３のキャプチャ物質が修飾された散乱体とからなる標識キャプチャ物質を、第１のキャプチャ物質に特異的に結合させることにより、標識複合体を形成することが好ましい。
【００２０】
ここで、「標識キャプチャ物質」とは、センサ部上に固定され被検出物質と特異的に結合する第１のキャプチャ物質を介して、被検出物質の量に応じた量だけセンサ部上に結合する、散乱体によって標識されたキャプチャ物質を意味するものとする。すなわち、例えばサンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、標識キャプチャ物質は、被検出物質と特異的に結合する第２のキャプチャ物質と、この第２のキャプチャ物質が修飾された散乱体とから構成される。これにより、第１のキャプチャ物質−被検出物質−第２のキャプチャ物質のサンドイッチ構造が作られ、標識キャプチャ物質がセンサ部上に結合する。ここで、被検出物質の第１のキャプチャ物質に対する結合部位と第２のキャプチャ物質に対する結合部位とは異なる。一方、競合法によるアッセイを行う場合には、標識キャプチャ物質は、被検出物質と競合して上記第１のキャプチャ物質と特異的に結合する第３のキャプチャ物質と、この第３のキャプチャ物質に修飾された散乱体とから構成される。これにより、第１のキャプチャ物質−第３のキャプチャ物質の結合が作られ、標識キャプチャ物質がセンサ部上に結合する。
【００２１】
そして、散乱体は、金属性、金属酸化物性、金属窒化物性の微粒子であることが好ましく、この場合微粒子の粒径は、３０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００２２】
ここで、微粒子の「粒径」とは、その分散液中、通常は水溶液中において独立して動く固体の直径を指し、単粒子で分散している場合はその粒子の直径、複数の粒子が凝集した状態で安定に分散している場合はその凝集塊の直径を指す。粒径は例えば動的光散乱法で測定することができる。動的光散乱によって粒子の水中粒径を測定する方法としては、具体的には大塚電子製のDLS-8000シリーズ、DLS-6500シリーズ、FPAR-1000、Malvern製ゼータサイザーナノシリーズ、Beckman Coulter製Delsa Nano Sなどの装置を用い、各装置の取扱説明書に従って測定することができる。また、微粒子がロッド形状の場合、粒径は短軸の長さを指す。
【００２３】
さらに、本発明に係るセンシングキットは、
試料を注入するための注入口と、注入口から注入された試料を流すための流路と、試料が流れるように空気を抜くための空気口と、散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定された、流路表面上のセンサ部とを有する透明担体チップ、および
流路の表面上の屈折率を調整するための、屈折率が１．３５以上かつ透明担体チップの屈折率未満である調整液を備え、
被検出物質を含み得る試料をセンサ部に供給し、被検出物質の量に応じた量の標識複合体をセンサ部に形成せしめ、透明担体チップに測定光を照射してセンサ部にエバネッセント光を生じせしめ、散乱体によるエバネッセント光の散乱光を検出し、被検出物質の量を検出するセンシング方法に用いられることを特徴とするものである。
【００２４】
或いは、本発明に係るセンシングキットは、
散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定されたセンサ部を有する透明担体チップ、および
透明担体チップの表面上の屈折率を調整するための、屈折率が１．３５以上かつ透明担体チップの屈折率未満である調整液を備え、
被検出物質を含み得る試料をセンサ部に供給し、被検出物質の量に応じた量の標識複合体をセンサ部に形成せしめ、透明担体チップに測定光を照射してセンサ部にエバネッセント光を生じせしめ、散乱体によるエバネッセント光の散乱光を検出し、被検出物質の量を検出するセンシング方法に用いられるものであることを特徴とするものである。
【００２５】
或いは、本発明に係るセンシングキットは、
散乱体を含む標識複合体を形成するための第１のキャプチャ物質が固定されたセンサ部を有する透明担体チップ、および
透明担体チップの表面上の屈折率を調整するための、屈折率が１．３５以上かつ透明担体チップの屈折率未満である粘着性物質またはゴム性物質を備え、
被検出物質を含み得る試料をセンサ部に供給し、被検出物質の量に応じた量の標識複合体をセンサ部に形成せしめ、透明担体チップに測定光を照射してセンサ部にエバネッセント光を生じせしめ、散乱体によるエバネッセント光の散乱光を検出し、被検出物質の量を検出するセンシング方法に用いられることを特徴とするものである。
【００２６】
そして、本発明に係るセンシングキットにおいて、
被検出物質と特異的に結合する第２のキャプチャ物質と、第２のキャプチャ物質が修飾された散乱体とからなる標識キャプチャ物質を備えることが好ましい。或いは、被検出物質と競合して第１のキャプチャ物質と特異的に結合する第３のキャプチャ物質と、第３のキャプチャ物質が修飾された散乱体とからなる標識キャプチャ物質を備えることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るセンシング方法、およびそれに用いられるセンシングキットは、透明担体又は流路の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、散乱光を検出している。すなわち、通常センサ部上が空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）である従来法に比して、本発明はセンサ部上の屈折率を大きくしてセンシングを行っている。本願発明者は、透明担体の表面上の屈折率を空気や水よりも大きくするとある範囲の屈折率では、検出対象とする散乱光が増加しノイズ的な散乱光が減少するという現象を見出した。したがって、透明担体の表面上の屈折率を空気や水よりも大きくすることにより、Ｓ／Ｎ比を従来法に比して向上させることが可能となる。これにより、本発明に係るセンシング方法、およびそれに用いられるセンシングキットによって、より高い定量性を備えたセンシングを行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】センシング方法の一工程を示す概略図（その１）
【図１Ｂ】センシング方法の一工程を示す概略図（その２）
【図２Ａ】設計変更に係るセンシング方法の一工程を示す概略図（その１）
【図２Ｂ】設計変更に係るセンシング方法の一工程を示す概略図（その２）
【図３】第１の実施形態に係るセンシング方法における散乱光測定を示す概略図
【図４】第２の実施形態に係るセンシング方法における散乱光測定を示す概略図
【図５】第１の実施形態に係るセンシングキットを示す概略図
【図６Ａ】第１の実施形態に係るキットを用いたセンシング方法を示す概略図（その１）
【図６Ｂ】第１の実施形態に係るキットを用いたセンシング方法を示す概略図（その２）
【図７】第１の実施形態に係るキットを用いた散乱光測定を示す概略図
【図８Ａ】第２の実施形態に係るセンシングキットを示す概略図
【図８Ｂ】第３の実施形態に係るセンシングキットを示す概略図
【図９】屈折率と信号またはＳ／Ｎ比との関係を示す概略図
【図１０】抗原濃度と信号との関係を示す概略図
【図１１】実施例における測定イメージを示す概略図
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００３０】
「センシング方法」
＜センシング方法の第１の実施形態＞
まず、本実施形態に係るセンシング方法について説明する。このセンシング方法は、サンドイッチ形式のセンシング方法である。図１は、本実施形態に係るセンシング方法の工程の一部を示す概略図である。
【００３１】
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、センシング方法は、透明担体上の所定領域に被検出物質と特異的に結合する第１のキャプチャ物質を固定してセンサ部を形成し（Ｓｔｅｐ１ａ）、被検出物質を含みうる試料をセンサ部に供給し（Ｓｔｅｐ１ｂ）、被検出物質を第１のキャプチャ物質に結合せしめた後センサ部上を洗浄し（Ｓｔｅｐ１ｃ）、次いで被検出物質と特異的に結合する標識キャプチャ物質をセンサ部上に供給し（Ｓｔｅｐ１ｄ）、標識キャプチャ物質を第１のキャプチャ物質に結合した被検出物質に結合せしめた後センサ部上を洗浄し（Ｓｔｅｐ１ｅ）、そして、センサ部上にギャップカバーグラス１２を乗せてその隙間に屈折率調整用の調整液を注入し（Ｓｔｅｐ１ｆ）、その後散乱光測定を行うものである。ここで、標識キャプチャ物質は、被検出物質と特異的に結合する第２のキャプチャ物質と、第２のキャプチャ物質が修飾された散乱体とからなる。また、別法としてＳｔｅｐ１ｃを行わずにＳｔｅｐ１ｂとＳｔｅｐ１ｄを同時に行う方法、つまり被検出物質を含み得る試料と標識キャプチャ物質を予め混合してからセンサ部上に供給する方法も挙げられる。
【００３２】
透明担体１０は、その一表面の所定領域にセンサ部が形成されたものである。透明担体１０は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。樹脂製基板を用いた場合には、基板が安価であるという利点があり、ガラス製基板を用いた場合には、不純物や表面凹凸による散乱（この散乱は検出信号に対するノイズとなる）が小さいという利点があるため、用途および検出条件に合わせ適宜選択することが望ましい。このような透明担体においては、透明担体の屈折率はおおむね１．５〜１．６となる。透明担体１０を形成する樹脂の材料としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等が好ましい。透明担体は、散乱光測定において全反射照明についての導波路となる。ここで「導波路」とは、光が多重点で内部全反射し、全表面又はほぼ全表面に実質的に均質なエバネッセント光を形成するような二次元内部全反射素子を意味するものとする。二次元導波路の構造は平面状でも曲面状でもよい。
【００３３】
センサ部は、透明担体表面上の第１のキャプチャ物質が固定されている領域である。センサ部は、１つであっても複数であっても構わない。センサ部が複数ある場合には、複数の被検出物質を検出することができるため、いわゆる多項目アレイ検出が可能となる。センサ部が複数ある場合は、それらのセンサ部は、非センサ部（すなわち、第１のキャプチャ物質が固定されていない領域）によって、分離されていることが好ましい。また、センサ部の２次元形状は、棒状、円形状等特に限定されるものではない。
【００３４】
第１のキャプチャ物質は、被検出物質に対して特異的に結合するキャプチャ物質である。このようなキャプチャ物質は、特に制限されるものではなく、検出条件（特に被検出物質２）に応じて適宜選択することができる。例えば被検出物質が抗原である場合は、このようなキャプチャ物質としてそれに対する抗体が挙げられる。例えば、抗原がｈＣＧ抗原（分子量３８０００ Ｄａ）の場合、この抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いることができる。固定化方法としては、透明担体に対して物理的に吸着させる方法、透明担体に表面修飾を施すことによってカルボキシル基、アミノ基、チオール基、などの官能基を導入し、そこに静電的にまたは化学結合を介して固定化する方法、キャプチャ分子に結合する構造を予め導入して固定化する方法などが挙げられる。化学結合の方法として例えば、透明担体をカルボキシル基化し、更に活性化させることによって第１のキャプチャ物質のアミノ基と結合させる、所謂アミンカップリング法を用いることができる。また、第１のキャプチャ物質と表面担体の間にリンカーやゲルなどの層を介する方法も挙げられる。
【００３５】
標識キャプチャ物質は、被検出物質Ａの量に応じた量だけセンサ部１４上に結合する、散乱体により標識されたキャプチャ物質である。標識キャプチャ物質は、図１に示すように、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合には、被検出物質Ａと特異的に結合するキャプチャ物質と散乱体とから構成されるものである。また、標識キャプチャ物質は、後記する競合法によるアッセイを行う場合には、被検出物質と競合するキャプチャ物質と散乱体とから構成されるものである。より具体的には、透明担体１０としてセンサ部１４に被検出物質Ａと特異的に結合する第１のキャプチャ物質Ｂ１が固定されてなるものを用いた場合、サンドイッチ法における標識キャプチャ物質ＢＦは、被検出物質Ａと特異的に結合する第２のキャプチャ物質Ｂ２と、この第２のキャプチャ物質Ｂ２が修飾された散乱体とからなるものである。一方同様の場合、競合法における標識キャプチャ物質は、被検出物質と競合して第１のキャプチャ物質と特異的に結合する第３のキャプチャ物質と、この第３のキャプチャ物質が修飾された散乱体とからなるものである。被検出物質Ａが抗原である場合、第１、第２のキャプチャ物質として抗体を用いればよい。
【００３６】
散乱体Ｆは、特に制限なく検出条件によって適宜選択されるが、散乱性および直径制御の観点から、金属微粒子、金属酸化物微粒子または金属窒化物微粒子であることが好ましい。さらに金属微粒子については、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉからなる群より選択される少なくとも１種以上の金属にて構成される金属微粒子であることがより好ましい。また、金属酸化物微粒子または金属窒化物微粒子の材料の例としては、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ゼオライト、酸化亜鉛、酸化イットリウム、酸化セリウム、酸化錫、酸化鉄、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化チタン、窒化クロムおよび窒化鉄等を挙げることができる。ここで、微粒子の粒径は、散乱強度の観点から、３０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍが良く、単位面積当たりの散乱体の最大結合量の観点、引いてはダイナミックレンジの観点から３００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００３７】
第２のキャプチャ物質は、被検出物質に対して特異的に結合するキャプチャ物質であって、散乱体を修飾しているキャプチャ物質である。ここで、第１および第２のキャプチャ物質は、被検出物質のそれぞれ異なる結合部位（抗体の場合にはエピトープ）に結合する。これにより、本実施形態に係るセンシング方法は、第１のキャプチャ物質−被検出物質−第２のキャプチャ物質のサンドイッチ構造を形成するサンドイッチ形式となる。また、サンドイッチ形式で複数の被検出物質を複数のセンサ部で検出する場合、第２のキャプチャ物質として複数の被検出物質の共通構造に特異的に結合する物質を用いることができる。具体的には、被検出物質として特定抗原に対する抗体を検出する場合、第２のキャプチャ物質として、抗体のＦｃ部のような共通構造に結合する物質を用いることができる。
【００３８】
調整液は、透明担体表面上の屈折率を調整するためのものである。調整液は、屈折率が１．３５以上かつ透明担体チップの屈折率未満であることが好ましい。この調整液をセンサ部上に配置することにより、この調整液の屈折率をもって、透明担体表面上の屈折率を調整する。さらに、調整液は、屈折率が１．３８以上かつ１．５１以下であることが好ましく、１．４２以上かつ１．４９以下であることがより好ましい。例えば、下記表１に示すものの中から種々の屈折率を有する物質を適宜選択することができる。ただし、屈折率を調整するための調整液は、下記の物質に限定されるものではない。
【表１】
2010210378.tif 000003
【００３９】
また、調整液は、透明担体表面上の必要以上に広範囲に配置せず、少なくともセンサ部を含むセンサ部の近傍の範囲のみに配置することが好ましい。全反射照明型の測定を行う場合、透明担体の屈折率とその表面上の屈折率が近くなることで、エバネッセント光として光エネルギーが漏れやすくなり、光エネルギーの利用効率が低下するためである。
【００４０】
次に、センシング方法における散乱光測定について図３を用いて説明する。図３は、散乱光測定に用いられる検出装置を示す概略断面図である。図３に示す検出装置は、センサ部を有する透明担体と、センサ部を覆うギャップカバーグラスと、センサ部の屈折率を調整するようにギャップカバーグラス内に注入された調整液と、透明担体の端面へ向けて測定光を照射する光源と、測定光が上記端面のみを透過し透明担体中を導波するように透明担体の端部に配置された遮光板と、測定光の導波に起因して生じるエバネッセント光の散乱光を検出する光検出器とを備えている。そして図３中には、センサ部に固定された第１のキャプチャ物質、この第１のキャプチャ物質に結合した被検出物質、およびこの被検出物質に結合した標識キャプチャ物質も示されている。
【００４１】
測定光は、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。本実施形態に係る検出装置では、透明担体の端面から測定光を照射し透明担体を導波させるため、容易にエバネッセント波を生じせしめることが可能である。測定光Ｌｏの波長は、可視、紫外および近赤外領域の値を用いることができ、特に制限されない。
【００４２】
光源２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源２１は、測定光Ｌｏを透明担体１０の表面に対して、この表面で全反射条件を満たすように誘電体透明担体１０を通して入射させるために、測定光を導光するためのミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。また、遮光板は、光源から発生する迷光の影響を最小限に抑えるためのものである。遮光板は、吸光材を使用するとより効果的である。
【００４３】
光検出器３０としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。特に検出感度の観点から、冷却ＣＣＤを用いることが好ましい。また、光検出器３０は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。好ましい光検出器３０として、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）等を挙げることができる。
【００４４】
本願発明者は、透明担体の表面上の屈折率を空気や水よりも大きくするとある範囲の屈折率では、検出対象とする散乱光が増加しノイズ的な散乱光が減少するという現象を見出した。通常透明担体の屈折率とその表面上の屈折率とが近づくと、エバネッセント光の強度が増大することが知られている。したがって、技術常識的には検出対象とする散乱光（すなわち、散乱体からの散乱光）の強度が増大し、ノイズ的な散乱光（すなわち、透明担体表面の夾雑物等からの散乱光）の強度も増大すると考えられる。しかしながら、本願発明者は、特に「ノイズ的な散乱光が減少する」という驚くべき現象を見出した。これにより後述するように、本発明に係るセンシング方法によって、Ｓ／Ｎ比を格段に向上させることができる。
【００４５】
本発明に係るセンシング方法は、透明担体の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、散乱光を検出している。すなわち、通常センサ部上が空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）である従来法に比して、本発明はセンサ部上の屈折率を大きくしてセンシングを行っている。したがって、透明担体の表面上の屈折率を空気や水よりも大きくすることにより、Ｓ／Ｎ比を従来法に比して向上させることが可能となる。これにより、本発明に係るセンシング方法、およびそれに用いられるセンシングキットによって、より高い定量性を備えたセンシングを行うことが可能となる。
【００４６】
＜設計変更＞
また、上記において、サンドイッチ形式のセンシング方法について説明してきたが、本発明は上記の態様に限られない。すなわち、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、競合形式のセンシング方法とすることも可能である。
【００４７】
この場合、センシング方法は、透明担体上の所定領域に被検出物質と特異的に結合する第１のキャプチャ物質を固定してセンサ部を形成し（Ｓｔｅｐ２ａ）、被検出物質を含みうる試料をセンサ部に供給し（Ｓｔｅｐ２ｂ）、被検出物質を第１のキャプチャ物質に結合せしめた後センサ部上を洗浄し（Ｓｔｅｐ２ｃ）、次いで被検出物質と競合して第１のキャプチャ物質と特異的に結合する標識キャプチャ物質をセンサ部上に供給し（Ｓｔｅｐ２ｄ）、標識キャプチャ物質を第１のキャプチャ物質に結合せしめた後センサ部上を洗浄し（Ｓｔｅｐ２ｅ）、そして、センサ部上にギャップカバーグラスを乗せてその隙間に屈折率調整用の調整液を注入し（Ｓｔｅｐ２ｆ）、その後散乱光測定を行うものである。
【００４８】
＜センシング方法の第２の実施形態＞
まず、本実施形態に係るセンシング方法について説明する。このセンシング方法は、サンドイッチ形式のセンシング方法である。本実施形態に係るセンシング方法は、第1の実施形態に係るセンシング方法と同様の構成であるが、屈折率が１．３５以上かつ透明担体チップの屈折率未満である粘着性物質またはゴム性物質を用いて、透明担体表面上の屈折率を調整している点で異なる。したがって、第1の実施形態に係るセンシング方法と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
【００４９】
粘着性物質またはゴム性物質は、透明担体表面上の屈折率を調整するためのものである。使用上容易なことから、支持体とその支持体上に形成された粘着性物質層またはゴム性物質層とからなるテープ状のもの（調整テープ）が好ましい。ここで、光検出の観点から、支持体は透明であることが好ましい。ただし、必ずしも透明である必要はない。この場合、この調整テープの粘着性物質層またはゴム性物質層が形成されている側をセンサ部に接触させることにより、これら粘着性物質またはゴム性物質の屈折率をもって、透明担体表面上の屈折率を調整する。粘着性物質またはゴム性物質は、屈折率が１．３５以上かつ透明担体チップの屈折率未満であることが好ましい。さらに、粘着性物質またはゴム性物質は、屈折率が１．３８以上かつ１．５１以下であることが好ましく、１．４２以上かつ１．４９以下であることがより好ましい。
【００５０】
本実施形態に係るセンシング方法も、透明担体の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、散乱光を検出している。すなわち、通常センサ部上が空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）である従来法に比して、本発明はセンサ部上の屈折率を大きくしてセンシングを行っている。したがって、第１の実施形態と同様の効果を得ることが可能となる。
【００５１】
「センシングキット」
＜センシングキットの第１の実施形態＞
本実施形態のセンシングキット６０ａについて説明する。図５はセンシングキット６０ａの構成を示す模式図である。センシングキット６０ａは、流路と、センサ部と、センサ部の上流側に乾燥固定された標識キャプチャ物質とを有する透明担体チップ、および流路表面上の屈折率を調整するための調整液を備えている。ここで、調整液についてはセンシング方法の第１の実施形態の場合と同様である。また、図５では、調整液６３はアンプル６２に入れられ密閉されている。
【００５２】
透明担体チップ５０は、誘電体プレートからなる基台５１と、基台５１上に液体試料Ｓを保持し、液体試料Ｓの流路５２を形成するスペーサ５３と、試料Ｓを注入する注入口５４ａおよび流路５２を流下した試料を排出する排出口となる空気孔５４ｂを備えたガラス板からなる上板５４とから構成され、流路５２の注入口５４ａと空気孔５４ｂとの間の試料接触面となる基台５１の所定領域上に設けられたセンサ部５８、５９が備えられている。また、注入口５４ａから流路５２に至る箇所にはメンブレンフィルター５５が備えられ、流路５２下流の空気孔５４ｂに接続する部分には廃液だめ５６が形成されている。そして、センサ部の上流側には標識キャプチャ物質が乾燥固定されている。
【００５３】
本発明のセンシング方法において、本実施形態のセンシングキット６０ａを用い、血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図６Ａおよび図６Ｂを参照して説明する。
ｓｔｅｐ６ａ：注入口５４ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図６Ａ中において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ６ｂ：血液Ｓｏはメンブレンフィルター５５により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。
ｓｔｅｐ６ｃ：血漿Ｓ（メンブレンフィルター５５で血球分離された血液）が毛細管現象で流路５２に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図６Ａ中において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ６ｄ：流路５２に染み出した血漿Ｓと抗体Ｂ２が付与された散乱体（標識抗体ＢＦ、すなわち標識キャプチャ物質）とが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ６ｅ：血漿Ｓは流路５２に沿って空気孔５４ｂ側へと徐々に流れ、標識抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、第１の測定エリア５８上に固定されている固定化抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが固定化抗体Ｂ１と標識抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ６ｆ：抗原Ａと結合しなかった標識抗体ＢＦの一部は第２の測定エリア５９上に固定されている固定化抗体Ｂ０と結合する。さらに抗原Ａまたは固定化抗体Ｂ０と結合しなかった標識抗体ＢＦが測定エリア上に残っている場合があっても、後続の血漿Ｓが洗浄の役割を担い、プレート上に浮遊および非特異吸着していた標識抗体ＢＦを洗い流す。
ｓｔｅｐ６ｇ：流路表面上の屈折率を調整するための調整液を注入口５４ａから注入する。
ｓｔｅｐ６ｈ：調整液が毛細管現象で流路５２に染み出す。先ほどと同様に、検出時間を短縮するために、空気孔５４ｂにポンプを接続し、調整液をポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
ｓｔｅｐ６ｉ：調整液がセンサ部をほぼ覆ったところで、流路表面の屈折率の置換が完了する。
【００５４】
その後、図７に示すような検出装置を用いて、散乱光測定を行う。この検出装置は、透明担体チップを収容する収容部１９と、センサ部１４に測定光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、測定光Ｌｏの照射により生じる、被検出物質Ａに応じた量の光を検出する光検出手段３０とを備えている。
【００５５】
励起光照射光学系２０は、測定光Ｌｏを出力する半導体レーザ（ＬＤ）等からなる光源２１と、透明担体チップ１０に一面が接触するように配置されたプリズム２２とを備えている。プリズム２２は、透明担体１０の界面で測定光Ｌｏが全反射するように透明担体チップ１０内に測定光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と透明担体チップ１０とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。光源２１は、プリズム２２の他の一面からセンサチップ１０の試料接触面で測定光Ｌｏが全反射角以上で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。
【００５６】
収容部１９は、透明担体１０を収容する際に、透明担体のセンサ部１４がプリズム２２上に配置され、光検出器３０で散乱光が検出できるよう構成されている。収容部１９に対し透明担体１０は、図中矢印Ｘ方向に出し入れすることができる。
【００５７】
そして、所定領域に測定光を全反射照射して、エバネッセント光Ｄを生じせしめ、標識抗体中の散乱体によるこのエバネッセント光の散乱光を検出することにより、被検出物質の量を検出することが可能となる。
【００５８】
このように、血液Ｓｏを注入口５４ａから注入し、第１の測定エリア５８上に抗原Ａが固定化抗体Ｂ１と標識抗体ＢＦで挟まれたサンドイッチが形成されるまでのｓｔｅｐ６ａからＳｔｅｐ６ｉの後、第１の測定エリア５８からの散乱光信号（以下、検出信号）を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を検出することができる。その後、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出できるように試料セル５０をＸ方向に移動させ、第２の測定エリア５９からの検出信号を検出する。標識抗体ＢＦと結合する固定化抗体Ｂ０を固定している第２の測定エリア５９からの検出信号は、標識抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した信号であると考えられ、この検出信号をリファレンスとして、第１の測定エリア５８からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、第２の測定エリア５９に既知量の標識物質（光散乱物質、金属微粒子）をあらかじめ固定した場合であっても、同様に、第２の測定エリア５９からの光信号をリファレンスとして第１の測定エリア５８からの検出信号を補正することができる。
【００５９】
本発明に係るセンシングキットは、流路の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、散乱光を検出するものである。すなわち、通常センサ部上が空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）である従来法に比して、本発明はセンサ部上の屈折率を大きくしてセンシングを行っている。したがって、透明担体の表面上の屈折率を空気や水よりも大きくすることにより、Ｓ／Ｎ比を従来法に比して向上させることが可能となる。これにより、本発明に係るセンシング方法、およびそれに用いられるセンシングキットによって、より高い定量性を備えたセンシングを行うことが可能となる。
【００６０】
＜センシングキットの第２の実施形態＞
本実施形態のセンシングキット６０ｂについて説明する。図８Ａはセンシングキット６０ｂの構成を示す模式図である。センシングキット６０ｂは、センサ部を有する透明担体、および透明担体表面上の屈折率を調整するための調整液、および標識キャプチャ物質を含む標識液を備えている。ここで、調整液についてはセンシング方法の第１の実施形態の場合と同様である。また、標識キャプチャ物質は、第２のキャプチャ物質とこの第２のキャプチャ物質が修飾された散乱体とから構成されている。さらに、図８Ａでは、調整液６３および標識液６５は、それぞれアンプル６２および６４に入れられ密閉されている。
【００６１】
本実施形態に係るセンシングキットによって、＜センシング方法の第１の実施形態＞で述べたセンシング方法と同様のセンシングを行うことができる。
【００６２】
本発明に係るセンシングキットも、透明担体の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、散乱光を検出するものである。すなわち、通常センサ部上が空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）である従来法に比して、本発明はセンサ部上の屈折率を大きくしてセンシングを行っている。したがって、センシングキットの第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６３】
＜センシングキットの第３の実施形態＞
本実施形態のセンシングキット６０ｃについて説明する。図８Ｂはセンシングキット６０ｃの構成を示す模式図である。センシングキット６０ｃは、センサ部を有する透明担体、および透明担体表面上の屈折率を調整するための調整テープ６６、および標識キャプチャ物質を含む標識液６５を備えている。ここで、調整テープ６６についてはセンシング方法の第２の実施形態の場合と同様である。また、標識キャプチャ物質は、第２のキャプチャ物質とこの第２のキャプチャ物質が修飾された散乱体とから構成されている。さらに、図８Ｂでは、標識液６５はアンプル６４に入れられ密閉されている。
【００６４】
本実施形態に係るセンシングキットによって、＜センシング方法の第２の実施形態＞で述べたセンシング方法と同様のセンシングを行うことができる。
【００６５】
本発明に係るセンシングキットも、透明担体の少なくともセンサ部を含む表面上の屈折率を、１．３５以上かつ透明担体の屈折率未満となるように調整し、散乱光を検出するものである。すなわち、通常センサ部上が空気（屈折率１．００）や水（屈折率１．３３）である従来法に比して、本発明はセンサ部上の屈折率を大きくしてセンシングを行っている。したがって、センシングキットの第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【実施例】
【００６６】
本発明に係るセンシング方法の実施例を以下に示す。
【００６７】
＜実施例１＞
実施例１は以下の工程により行われた。ＭＡＳガラススライド（松浪硝子工業製）上にφ５ｍｍの穴の空いたＰＤＭＳ板を乗せてウェルを作製し、ＰＢＳで洗浄を２回行った。そして、１００ｎＭ 抗ｈＣＧ抗体のＰＢＳ溶液を８ｕｌ分注して室温で１時間静置し、その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。次いで、カゼイン１％のＴＢＳ溶液を２０ｕｌ分注して室温で１時間静置し、その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。１ｎＭもしくは１０ｎＭの ｈＣＧ抗原ＰＢＳ溶液、もしくはＰＢＳのみを２０ｕｌ分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄を行った。次いで、抗ｈＣＧ抗体固定化金コロイド懸濁液（水中粒径５０ｎｍ、５２０ｎｍの吸光度が３.４６の懸濁液をＰＢＳ２％ＰＢＳ溶液で１０倍希釈したもの）を１０ｕｌずつ分注して室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで４回、純水で１回洗浄を行って液を完全に取り除いた。そして、ウェルを形成していたＰＤＭＳ板を剥がし、ギャップカバーグラスを乗せてその隙間にイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を注入した。最後に、ガラススライドの側面からスライド内を全反射で伝播するように測定光を照射し、抗体を固定化したセンサ部における散乱光強度を冷却ＣＣＤで検出した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率が１．３７７に調整される。
【００６８】
＜実施例２＞
ＩＰＡの代わりにＤＭＦを用いること以外は上記実施例１の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率が１．４２７に調整される。
【００６９】
＜実施例３＞
ＩＰＡの代わりにＤＭＳＯを用いること以外は上記実施例１の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率が１．４７８に調整される。
【００７０】
＜実施例４＞
ＩＰＡの代わりにマッチングオイルを用いること以外は上記実施例１の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率が１．５１０に調整される。
【００７１】
＜比較例１＞
ＩＰＡ塗布を行わずセンサ部を乾燥させること以外は上記実施例１の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率は１．０００である。
【００７２】
＜比較例２＞
ＩＰＡの代わりに純水を用いること以外は上記実施例１の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率は１．３３３である。
【００７３】
上記＜実施例１＞から＜実施例４＞、並びに＜比較例１＞および＜比較例２＞についての実施データを図９に示す。
【００７４】
図９Ａは、それぞれの実施例および比較例におけるセンサ部からの散乱光強度を示すグラフである。ここで、縦軸は透明担体表面上が空気である場合（屈折率：１．０００）を基準に規格化して表示している。このグラフから、表面上の屈折率が増加するに従い、センサ部からの散乱光強度も増大することがわかる。
【００７５】
図９Ｂは、それぞれの実施例および比較例における非センサ部からの（ノイズ的な）散乱光強度を示すグラフである。ここで、縦軸は透明担体表面上が空気である場合（屈折率：１．０００）を基準に規格化して表示している。このグラフから、表面上の屈折率が増加するに従い、ノイズ的な散乱光強度はまず減少してから増大することがわかる。前述したように、通常透明担体の屈折率とその表面上の屈折率とが近づくと、ノイズ的な散乱光強度は増大すると考えられるため、この現象は驚くべき現象である。これは、透明担体表面上屈折率が増加することにより、表面上の夾雑物等がエバネッセント光に認識されなくなっていることに起因していると考えられる。すなわち、エバネッセント光の強度増大に伴うノイズの増加と、屈折率増加に伴う夾雑物等の非認識との間にトレードオフ的な関係が起因していると考えられる。
【００７６】
図９Ｃは、それぞれの実施例および比較例におけるＳ／Ｎ比を示すグラフである。ここで、縦軸は透明担体表面上が空気である場合（屈折率：１．０００）を基準に規格化して表示している。このグラフから、表面上の屈折率が増加するに従い、Ｓ／Ｎ比はまず増加しから減少することがわかる。特に、調整液としてＤＭＦ（屈折率：１．４２７）を用いた場合には、Ｓ／Ｎ比は１２倍以上も向上している。すなわち、透明担体表面上の屈折率がある範囲においては、非常に高いＳ／Ｎ比で測定実施できるといえる。
【００７７】
次に、屈折率を調整するための調整テープを用いた場合、および調整液を広い領域に渡り塗布した場合の実施例について説明する。
【００７８】
＜実施例５＞
ＩＰＡを注入する代わりに粘着性テープ（アクリル樹脂系粘着テープ）をセンサ部上に貼ること以外は上記実施例１の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率がおよそ１．４〜１．５に調整される。本実施形態においても、Ｓ／Ｎ比が９倍も向上するという結果を得た。これより、屈折率の調整は調整液以外にも、粘着性物質またはゴム性物質でも可能であることが示された。
【００７９】
＜実施例６＞
ギャップカバーグラスを透明担体上に乗せてＤＭＦを注入する領域を光照射側の非センサ部に拡大すること以外は上記実施例２の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率が１．４２７に調整され、その調整の範囲が広範囲に渡っている。本実施形態においては、検出対象であるセンサ部からの散乱光が、上記実施例２に比して若干減少するという結果を得た。これは前述したように、測定光がセンサ部にまで導波する間に光エネルギーを損失しているからであると考えられる。しかしながら、それでも、Ｓ／Ｎ比は１２倍近く向上するという結果を得た。したがって、本発明は光エネルギーの利用効率が若干劣る態様であっても、充分にＳ／Ｎ比を向上させることができる顕著な効果を有することが示された。
【００８０】
さらに、ＣＲＰ抗原とその抗体を用いた以下の実施例および比較例を示す。
【００８１】
＜実施例７＞
実施例７は以下の工程により行われた。ＭＡＳガラススライド（松浪硝子工業製）上にφ５ｍｍの穴の空いたＰＤＭＳ板を乗せてウェルを作製し、ＰＢＳで洗浄を２回行った。そして、１００ｎＭ 抗ＣＲＰ抗体のＰＢＳ溶液を８ｕｌ分注して室温で１時間静置し、その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。次いで、カゼイン１％のＴＢＳ溶液を２０ｕｌ分注して室温で１時間静置し、その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄を行った。０, ９, ３００, ９０００ｐＭの ＣＲＰ抗原ＰＢＳ溶液、もしくはＰＢＳのみを２０ｕｌ分注して室温で１時間静置し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄を行った。次いで、抗ＣＲＰ抗体固定化金コロイド懸濁液（５２０ｎｍの吸光度が３.４６の懸濁液をＰＢＳ２％ＰＢＳ溶液で１０倍希釈したもの）を１０ｕｌずつ分注して室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで４回、純水で１回洗浄を行って液を完全に取り除いた。そして、ウェルを形成していたＰＤＭＳ板を剥がし、ギャップカバーグラスを乗せてその隙間にＤＭＦを注入した。最後に、ガラススライドの側面からスライド内を全反射で伝播するように測定光を照射し、抗体を固定化したセンサ部における散乱光強度を冷却ＣＣＤで検出した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率が１．４２７に調整される。すなわち、ＣＲＰ抗原とその抗体を用いること、濃度を０, ９, ３００, ９０００ｐＭに設定したこと以外では、上記実施例２の工程と同様の工程で実施した。
【００８２】
＜比較例３＞
ＤＭＦ塗布を行わずセンサ部を乾燥させること以外は上記実施例７の工程と同様の工程で実施した。本実施例では、透明担体表面上の屈折率は１．０００である。
【００８３】
上記＜実施例７＞および＜比較例３＞についての実施データを図１０および図１１に示す。
【００８４】
図１０ＡおよびＢは、それぞれ実施例７および比較例３についてのＣＲＰ抗原濃度変化に対する散乱強度変化を示している。一方、図１１ＡからＣは、それぞれ実施例７の測定イメージ画像、比較例３の測定イメージ画像、およびイメージ画像中の各センサ部の濃度情報を示している。これらにより、本発明に係るセンシング方法が、ノイズを低減し検出対象信号を増大させることにより、Ｓ／Ｎ比を格段に向上させる非常に顕著な効果を有する方法であることが示された。
【符号の説明】
【００８５】
２     被検出物質
６     誘電体プリズム基板
９     励起光
１０   透明担体
１１    ウェル
１２    ギャップカバーグラス
１４   センサ部
１９   収容部
２０   励起光照射光学系
２１   光源
２２   プリズム
３０   光検出器
６０ａ センシングキット
６０ｂ センシングキット
６０ｃ センシングキット
６３   調整液
６５   標識液
６６   調整テープ
Ａ     被検出物質
ＢＦ   標識キャプチャ物質
Ｄ     エバネッセント光
Ｆ     散乱体
Ｌｏ   測定光
【図１Ａ】
2010210378.tif 000004
【図１Ｂ】
2010210378.tif 000005
【図２Ａ】
2010210378.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図３】
2010210378.tif 000008
【図４】
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【図５】
2010210378.tif 000010
【図６Ａ】
2010210378.tif 000011
【図６Ｂ】
2010210378.tif 000012
【図７】
2010210378.tif 000013
【図８Ａ】
2010210378.tif 000014
【図８Ｂ】
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【図９】
2010210378.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
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