(57)【要約】【課題】  ジオキサン類を分解する新規微生物、当該微生物を用いてジオキサン類を分解する方法、および当該微生物を含むジオキサン類分解剤、該分解剤を用いる廃水の処理方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、リノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）属に属し、ジオキサン類を分解する能力を有する微生物の提供。また、本発明は、前記微生物を用いてジオキサン類を分解する分解方法の提供と、さらに前記微生物を含むジオキサン類分解剤、該分解剤を用いる廃水の処理方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）ＥＰ１０株（ＦＥＲＭ−ＡＰ−２１７７１）。
【請求項２】
請求項１に記載のリノクラジエラＥＰ１０株を担体に固定化してなる固定化リノクラジエラＥＰ１０株。
【請求項３】
前記担体が、セルロースである請求項２に記載の固定化リノクラジエラＥＰ１０株。
【請求項４】
請求項１に記載のリノクラジエラＥＰ１０株、又は請求項２若しくは３に記載の固定化リノクラジエラＥＰ１０株を含むジオキサン類分解剤。
【請求項５】
請求項４又は５に記載のジオキサン類分解剤を用いたジオキサン類の分解方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のジオキサン類分解剤を塩分の存在下で使用することを特徴としたジオキサン類の分解方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載のジオキサン類分解剤を用いた廃水の処理方法。
【請求項８】
請求項４又は５に記載のジオキサン類分解剤を用いた塩分を含む廃水の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はジオキサン類の分解能の高いリノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）属に属する新規な糸状菌、この糸状菌を用いるジオキサン類の分解方法、当該糸状菌を含有するジオキサン類分解剤、該分解剤を用いる廃水の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジオキサン環構造を有する化合物（本発明では「ジオキサン類」という）は、各種工業に利用されている。主として、１，４−ジオキサンは抽出・反応溶剤・塩素系溶剤の安定剤の製造に使用されている（例えば、特許文献１）。また類縁化合物の一つであるジヒドロキシアセトンダイマーは、繊維製品の防縮剤・造影剤等の製造に使用されている（例えば特許文献２、３）。
それらジオキサン類は、分解性の低いエーテル結合を、その分子内に有しており、いわゆる難分解成分として知られている。また、ジオキサンのうち、１，４−ジオキサンは国立がん研究所が「ヒトに対する発ガン性の可能性あり」（グループＢ）としている化合物であり、化審法においても指定化学物質とされる。
【０００３】
このように難分解性であるジオキサン類を含んだ廃水は、一般的な廃水微生物処理法である活性汚泥法では処理が難しい。従って環境浄化という観点から、ジオキサン類を分解する方法の開発が望まれている。ジオキサン類の分解方法としては、オゾン処理・促進酸化処理等よる物理・化学的処理（例えば、特許文献４、５参照）や、微生物を用いた処理法（例えば、特許文献６参照）が知られている。
【０００４】
一般に微生物による処理法は省エネルギーであるとされるが、廃水中には微生物生育にとって好ましくない成分を含む場合があり、それら廃水に対しても適用できる微生物が望まれている。例えば塩分を高濃度に含んだ条件下は微生物の生育には好適であるとは言えず、そのような過酷な状況下においてジオキサン類を分解できる微生物は有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−０６４０７７号公報
【特許文献２】特開平０９−０８７９６８号公報
【特許文献３】特表２００２−５２４５４７号公報
【特許文献４】特開２００５−０７４４０９号公報
【特許文献５】特開２００８−２２１１５１号公報
【特許文献６】特開２００４−２９８１１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はジオキサン類を分解する新規微生物、当該微生物を用いてジオキサン類を分解する方法、および当該微生物を含むジオキサン類分解剤、該分解剤を用いる廃水の処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前期課題を解決するために鋭意検討した結果、リノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）属に属する糸状菌が、ジオキサン類を分解できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち本発明は、リノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）属に属し、ジオキサン類を分解する能力を有することを特徴とする微生物を提供する。
また、本発明は、前記微生物を用いて塩分の存在下でジオキサン類を分解することを特徴とする分解方法を提供する。
さらに本発明は、前記微生物を含むジオキサン類分解剤、該分解剤を用いる廃水の処理方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ジオキサン類を分解する新規微生物、当該微生物を用いてジオキサン類を分解する方法、および当該微生物を含むジオキサン類分解剤、該分解剤を用いる廃水の処理方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】リノクラジエラＥＰ１０株の栄養菌糸の顕微鏡写真である。
【図２】リノクラジエラＥＰ１０株の栄養菌糸の顕微鏡写真である。
【図３】リノクラジエラＥＰ１０株の栄養菌糸の顕微鏡写真である。
【図４】リノクラジエラＥＰ１０株の分生子の顕微鏡写真である。
【図５】リノクラジエラＥＰ１０株のＩＴＳ−５．８ｓ  ｒＤＮＡ  塩基配列を用いた分子系統樹を示す図である。
【図６】リノクラジエラＥＰ１０株のＩＴＳ−５．８ｓ  ｒＤＮＡ  塩基配列を用いた分子系統樹を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に利用される微生物は、リノクラジエラ（Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）属に属し、ジオキサン類を分解する能力を有することを特徴とする。
【００１２】
本微生物は千葉県佐倉市ＤＩＣ総合研究所廃水より、塩分の存在下１，４−ジオキサンを炭素源とする培地よりスクリーニングされた新規微生物である。
本発明の新規微生物は下記の菌学的性質を有する。
【００１３】
（科学的性質）
塩分の存在下でジオキサン類の分解能を有する。
【００１４】
（形態学的性質）
栄養菌糸：菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、明褐色〜茶褐色、有隔壁菌糸を形成する。
分生子柄及び分生子形成細胞：分生糸は短く、栄養菌糸より直生し、分岐せず、明褐色〜茶褐色に着色する（図１、図３）。分生柄の先端部には刺状突起がややジグザグ状に形成され、その先端から分生子が形成される。（図１、図２、図３）
分生子：分生子はシンポジオ型分生子で、卵形〜長楕円形、１細胞、無色、平滑、基端がやや切断上である（図４）。
有性生殖器官：有性生殖器官の形成は認められない。
【００１５】
（分類学的性質）
ＩＴＳ−５．８ＳｒＤＮＡ領域塩基配列を解析した結果、配列番号１示す配列を有している。当該配列をアポロンＤＢ−ＦＵ２．０データベースＢＬＡＳＴ（株式会社テクノスルガ・ラボ、静岡県静岡市）により相同性を検索した結果、表１に示す相同性を得た。
【００１６】
【表１】
2010252779.tif 000002
【００１７】
この結果、子嚢菌類の一種であるＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ａｔｒｏｂｉｒｅｎｓの塩基配列を１００％の相同性を示した。
【００１８】
以上のことから、本微生物はＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａに近縁であり、Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ族の一種であると推定される。このため本微生物を新菌株と認定し、Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｓｐ．  ＥＰ１０株と命名した。本発明の新規な微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６)に寄託申請し、平成２１年２月１３日付けで受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１７７１として受領された。
以下、該微生物「ＥＰ１０株」と称することがある。
【００１９】
本発明の微生物の特徴はジオキサン類の分解が可能なことにある。また該微生物は１０％以下の塩分存在下、好ましくは５％以下の塩分存在下で増殖が可能であり、ジオキサン類の分解が可能である。
【００２０】
本発明の微生物は常法により培養される。培地成分に用いる炭素源、窒素源、無機塩類は、該菌株が資化できる物質であれば特に限定されない。炭素源としてはグルコース、サッカーロース、デンプン等の糖類が例示される。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機態窒素、尿素、アミノ酸等の有機態窒素が例示される。無機塩類としては、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩が例示される。必要に応じて、鉄、マンガン、ニッケル等の微量成分、ビタミン類を用いても良い。またそれらを含有している、酵母エキス、ペプトン等を用いることができる。
【００２１】
ブドウ糖、ショ類、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩、亜鉛塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ１  塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
【００２２】
微生物の培養は振とう培養または通気撹拌培養で行えば良い。培養温度は通常１０−３５℃度、培養液のｐＨは４−９で行えば良い。また培地は、公知の糸状菌培地を用いて行うことができる。例えば、ＹＭ培地（０．３％イーストエクストラクト、０．３％モルトエクストラクト、０．５％ペプトン、１％ブドウ糖）あるいはポテトデキストロース培地（０．４％ポテトエキス、２％ブドウ糖）を用い、好機条件で培養することにより、培養可能である。
【００２３】
本発明のジオキサン類の分解方法は、前記のような微生物を用いてジオキサン類を分解するものであり、該方法によれば、塩類の存在下でも効率的に分解することが可能である。
【００２４】
本発明の微生物の利用方法は公知の方法であれば良い。例えば、該微生物の培養液をそのまま、あるいは水溶液に希釈して利用することができる。また培養液から、ろ過、遠心分離等の固液分離手段により回収し利用することも可能である。さらに凍結乾燥法等による乾燥状態での使用も可能である。
【００２５】
該微生物は適宜製剤化して分解剤として利用することも可能である。例えば珪藻土、タルク、活性炭、ゼオライト、カオリナイト等の多孔質物質と混合し、表面へ付着あるいは多孔質に吸着させて分解剤として利用することができる。該微生物は、担体に固定化して分解剤とすることもできる。担体への固定化方法は担体結合法、包括法、吸着法を用いることができる。担体の材質は、有機・無機いずれのものでも構わないが、本発明者等は各種固定化用担体の材質を比較検討した結果、セルロース系の多孔質担体を用いた場合に、微生物付着量が多く、かつ高い活性を発揮できることを見出した。従って固定化分解剤として効率的な利用を行うためには、セルロース系の担体が好ましい。固定化方法としては、公知の糸状菌培地にオートクレーブ処理等の殺菌処理を施した担体を添加し、通常の培養方法で行えば良い。固定化した微生物はそのまま使用したり、また遠心分離により回収して使用することが可能である。また凍結乾燥、真空乾燥等の処理により乾燥状態にしての利用も可能である。
【００２６】
（ジオキサン類について）
該微生物が分解することが可能なジオキサン類とは、ジオキサン環構造を有する化合物である。また環状骨格を形成する炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有する物質であっても差し支えない。該置換基とは、アルキル基、水酸基、脂肪属水素基等をあげることができる。具体的には、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、４−ジオキサン−２，３−ジオール、１，３−ジヒドロキシアセトン、１，４−ジオキサンジメタノール等を例示することができる。
【００２７】
本発明の分解方法では、前述した微生物とジオキサン類を共存させることにより実施することができる。共存とは微生物と化合物が接触することで、例えば分解対象物を含む水溶液中で該微生物を好適な条件で該微生物を増殖させることにより実施される。
【００２８】
以上の本発明によれば、塩分の存在下、ジオキサン類を分解する能力のあるＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ属に属する微生物、該微生物を用いてジオキサン類を分解するジオキサン類方法を提供することができる。難分解性とされるジオキサン類、特に１，４−ジオキサン及びその類縁化合物を、温和な条件下で効率的に分解することが可能であり、それら化合物を含有する工場排水等や浄水処理に利用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）  ジオキサン類分解菌の単離
（１）スクリーニング
ＤＩＣ株式会社総合研究所内より採取した排水土壌をサンプルとした。ＹＭ寒天培地（０．３％イーストエクストラクト、０．３％モルトエクストラクト、０．５％ペプトン、１％ブドウ糖、寒天１．５％）にＮＡＣｌを２％となるように添加し１２１℃、１５分の条件でオートクレーブ殺菌した。温度が６０℃となったところで、クリーンベンチ内で無菌的に１，４−ジオキサン（和光純薬社）を５００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加し、混合した後シャーレに２０ｍＬづつ取り、寒天平板培地（以下「Ａ寒天培地」と称する）を作成した。
【００３１】
採取したサンプル１ｇを滅菌水１０ｍＬに添加して撹拌後、その液１００μＬをＡ寒天培地に塗布し、２８℃の７日間の培養を行った。発生したコロニーを１白金耳取り、５ｍＬの滅菌水中に添加し撹拌後、１００ｍＬを同様の培地、同様の条件で培養した。この操作を均一なコロニーが得られるまで繰り返し、得られた微生物をＥＰ１０株と命名した。
【００３２】
（実施例２）  ＥＰ１０株の塩分存在下での１，４−ジオキサンの分解試験
ＥＰ１０株を用いて、塩分存在下での１，４−ジオキサンの分解試験を行った。ＹＭ寒天培地に増殖したＥＰ１０株の液体培地による前培養を行った。３００ｍＬ容量の三角フラスコにＤｉｆｃｏ社製ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ  ２．１ｇ、蒸留水１００ｍＬ、を入れ、撹拌の後１２１℃、１５分のオートクレーブ殺菌を行った。そこへ、ＹＭ寒天培地上に生育したＥＰ１０株を１白金耳採取し、無菌的に添加の後、インキュベータ内で２８℃、１４０ｒｐｍの撹拌条件で３日間培養した。この液を１，４−ジオキサン分解試験の種菌とした。以下「種菌Ａ」と称する。
【００３３】
３００ｍＬの三角フラスコを６本用意し、そこにＤｉｆｃｏ社製イーストエクトラクト０．２％、和光純薬社製リン酸水素２カリウム０．５％、和光純薬社製硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％に調整した液を１００ｍＬ添加した。また各フラスコには、和光純薬社製ＮａＣｌを、０％、１％、２％、３％、４％、５％となるように添加した後、１２１℃、１５分のオートクレーブ殺菌を行った。
殺菌後、各三角フラスコに和光純薬社製１，４−ジオキサンを無菌的に５００ｍｇ／Ｌとなるように添加し、さらに種菌Ａを３ｍＬ添加した。
【００３４】
各三角フラスコをインキュベータ内で２８℃、１４０ｒｐｍの撹拌条件で培養した。培養は１０日間実施した。０日目、１０日目にフラスコから無菌的にサンプリングし、１２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心分離した上清を０．４５μｍのメンブレンフィルターによりろ過したろ液中の１，４−ジオキサン濃度をガスクロマトグラフにより測定した。開始時の１，４−ジオキサン濃度を１００％としたときの、各食塩濃度のおける１，４−ジオキサンの分解率を表２に示す。また０日目、１０日目の各フラスコの微生物量の指標としてＯＤ６６０ｎｍにより濁度を測定した。その結果を表３に示す。
【００３５】
【表２】
2010252779.tif 000003
【００３６】
【表３】
2010252779.tif 000004
【００３７】
試験の結果、塩分５％以下の高塩濃度の存在下で増殖し、１，４−ジオキサンは食塩５％以下の存在下で１８−２２％が分解された。
【００３８】
（実施例３）  ＥＰ１０株の塩分存在下での１，３−ジヒドロキシアセトンの分解試験
ＥＰ１０株を用いて、塩分存在下での１，３−ジヒドロキシアセトンの分解試験を行った。試験方法は実施例２において、１，４−ジオキサンを１，３−ジヒドロキシアセトンとしたこと、サンプリング日数を０日、３日、５日とした以外は同一にして実施した。開始時の１，３−ジヒドロキシアセトン濃度を１００％としたときの、各食塩濃度のおける１，３−ジヒドロキシアセトンの分解率は表４に示すとおりであった。また５日目のＯＤ６６０ｎｍの測定結果を表５に示した。
【００３９】
【表４】
2010252779.tif 000005
【００４０】
【表５】
2010252779.tif 000006
【００４１】
試験の結果、塩分５％以下の高塩濃度の存在下で増殖し、１，３−ジヒドロキシアセトンは食塩５％以下の存在下で１００％分解された。
【００４２】
（実施例４）ＥＰ１０株の各種材質の担体への固定化試験
ＥＰ１０株を用いて各種材質への固定化試験を行った。使用した担体はポリウレタン性角形スポンジ（サイズ約０．５ｍｍ角、以下Ａ担体と称す）、ポリエチレングリコール系ポリウレタンスポンジ（サイズ約１０ｍｍ角、日清紡社製ＡＰＧ−ＣＣ−１０Ｂ、以下Ｂ担体と称す）、ポリビニルアルコール性球状ゲル（サイズ直径約約４ｍｍ、クラレアクア株式会社製クラゲール、以下担体Cと称す）、多孔性セルロース粒子（サイズ直径約４ｍｍ、レンゴー株式会社製ビスコパールAタイプ、以下Ｄ担体と称す）、セルローススポンジ（サイズ１０ｍｍ角、東レ・ファインケミカル株式会社製セルローススポンジ、以下Ｅ担体と称す）。これら各担体をメスシリンダーにて３０ｍＬ容量計り取り、ＥＰ１０株固定化用の担体とした。
３００ｍＬ容量の三角フラスコに、Ｄｉｆｃｏ社製ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ  ２．１ｇ、蒸留水１００ｍＬ、を入れ、撹拌の後１２１℃、１５分のオートクレーブ殺菌を行った。そこへ、ＹＭ寒天培地上に生育したＥＰ１０株を１白金耳採取し、無菌的に添加の後、インキュベータ内で２８℃、１４０ｒｐｍの撹拌条件で3日間培養し固定化試験用の種菌とした。
３００ｍＬ容量の三角フラスコを5本用意し、そこへＤｉｆｃｏ社製ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ  ２．１ｇ、固定化用担体、蒸留水１００ｍＬを入れ、撹拌の後１２１℃、１５分のオートクレーブ殺菌を行った。そこへ、上記種菌を１ｍＬ無菌的に添加の後、インキュベータ内で２８℃、１４０ｒｐｍの撹拌条件で3日間、固定化のための培養を行った。培養終了後、各担体を無菌的に取り出し無菌水で洗浄した。以下それら担体を、ＥＰ１０株固定化Ａ担体、Ｂ担体、Ｃ担体、Ｄ担体、Ｅ担体と称す。
次いで３００ｍＬ容量の三角フラスコを5本用意し、そこへＤｉｆｃｏ社製ＹＭ  Ｂｒｏｔｈ  ２．１ｇ、蒸留水１００ｍＬ、を入れ、撹拌の後１２１℃、１５分のオートクレーブ殺菌を行った。そこへ無菌水にて洗浄した各ＥＰ１０株固定化担体を１０ｍＬ容量計り取り添加の後、インキュベータ内で２８℃、１４０ｒｐｍの撹拌条件で３日間培養した。３日後に各三角フラスコの液中のＥＰ１０株の菌数を血球計測板にて計測した。
各ＥＰ１０株固定化担体を添加した三角フラスコ中のＥＰ１０株の個数は以下のとおりであった。
【００４３】
【表６】
2010252779.tif 000007
【００４４】
３日後の培養液中のＥＰ１０株の菌数は、材質がセルロースであるＥＰ１０株固定化Ｄ担体及びＥＰ１０株固定化Ｅ担体を用いた場合が高く、担体に多量の菌が固定化されていた結果である。
【００４５】
（実施例5）ＥＰ１０株固定化担体による１．３−ジヒドロキシアセトンの分解
実施例４で作成したＥＰ１０株固定化担体を用いて、塩分の存在下で、１，３−ジヒドロキシアセトンの分解試験を行った。試験方法は実施例3において、塩分濃度を０%、３%としたこと、サンプリング日数を０日、５日としたこと、ＥＰ１０株として実施例４で得たＥＰ１０株固定化Ｄ担体を用いたこと以外は同一にして実施した。開始時の１，３−ジヒドロキシアセトン濃度を１００％としたときの、各食塩濃度における１，３−ジヒドロキシアセトンの分解率は表７に示すとおりであった。また５日目のＯＤ６６０ｎｍの測定結果を表８に示した。
【００４６】
【表７】
2010252779.tif 000008
【００４７】
【表８】
2010252779.tif 000009
【００４８】
試験の結果、塩分３％存在下で増殖し、セルロースが材質であるD担体に固定化したＥＰ１０株は、１，３−ジヒドロキシアセトンは食塩３％の存在下で１００％分解された。
【００４９】
（実施例６）微生物の同定
ＥＰ１０株の同定を株式会社テクノスルガ社に依頼して実施した。同定は２８ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２及びＩＴＳ−５．８ＳｒＤＮＡ解析、巨視的及び微視的形態観察により行った。
【００５０】
（ＤＮＡ解析）
ＥＰ１０株の２８ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を配列番号２に示す。また当該塩基配列の相同性検索及び簡易系統解析を国際塩基配列データベース（ＢｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）及びアポロンＤＢ−ＦＵ２．０（株式会社テクノスルガ・ラボ，静岡県静岡市）により行った。
【００５１】
２８ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２の国際塩基配列データベースＢＬＡＳＴ検索結果の上位３０塩基配列との相同率を表９に示す。
【００５２】
【表９】
2010252779.tif 000010
【００５３】
ＥＰ１０株はＥｘｏｐｈｉｌａｉａ  ｓｐｉｎｉｆｅｒａ及びＬｅｐｔｏｄｏｎｉｔｉｄｉｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓと９９．５％の相同率を示した。
またアポロンＤＢ−ＦＵ  ＢＬＡＳＴ検索結果の上位３０塩基配列との相同率を表１０に示す。
【００５４】
【表１０】
2010252779.tif 000011
【００５５】
ＥＰ１０株はＥｘｏｐｈｉｌａｉａ  ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉと９９％の相同率を示した。また得られた上位の塩基配列を基に作成した系統樹を図５に示す。ＥＰ１０株はＬｅｐｔｏｄｏｎｉｔｉｄｉｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓと同一の系統枝を形成した。
【００５６】
ＥＰ１０株のＩＴＳ−５．８ＳｒＤＮＡ塩基配列を配列番号２に示す。ＩＴＳ−５．８ＳｒＤＮＡの国際塩基配列データベースＢＬＡＳＴ検索結果の上位３０塩基配列との相同率を表１１に示す。
【００５７】
【表１１】
2010252779.tif 000012
【００５８】
ＥＰ１０株はＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ａｔｏｒｏｖｉｒｅｎｓ、ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｓｐ．６／９７−３６、ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｓｐ．６／９７−１０と１００％の相同率を示した。またアポロンＤＢ−ＦＵ  ＢＬＡＳＴ検索結果の上位３０塩基配列との相同率を表１に示す。ＥＰ１０株はＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ａｔｏｒｏｖｉｒｅｎｓと１００％の相同率を示した。また得られた上位の塩基配列を基に作成した系統樹を図６に示す。ＥＰ１０株はＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ａｔｏｒｏｖｉｒｅｎｓ、Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｓｉｍｉｌｉｓ、ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｓｐ．、Ｌｅｐｔｏｄｏｎｉｔｉｄｉｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓと同一の系統枝を形成した。
【００５９】
両塩基配列の結果、Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ａｔｏｒｏｖｉｒｅｎｓ、Ｒｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｓｉｍｉｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｄｏｎｉｔｉｄｉｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓと同一系統枝を形成することから近縁のＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ属またはＬｅｐｔｏｄｏｎｉｔｉｄｉｕｍ属の一種であると推定される。
【００６０】
（巨視的及び微視的観察）
ＥＰ１０株を以下の条件で培養した菌体を供試菌体とした。
培地    ポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ」（日本製薬社）・・・ＰＤＡ
２％モルトアガー・・・（ＭＡ）
バクト  オートミールアガー（ベクトンデッキンソン社）・・・ＯＡ
ＬｃＡ（三浦培地）・・・ＬｃＡ
培養温度  ２５℃
培養期間  １〜２週間
各培養平板において１週間培養後から巨視的観察を行い、コロニーの直径・色調（コロニー表面及び裏側）・表面性状・可溶性色素生産の有無について調べた。培養１０日後のＥＰ１０株の各平板の巨視的観察結果を表１２に示す。なおコロニー色調に冠する記述はＫｏｒｎｅｒｕｐ  ａｎｄ  Ｗａｎｓｃｈｅｒに準拠した。
【００６１】
【表１２】
2010252779.tif 000013
【００６２】
光学微分干渉顕微鏡により微視的観察を行った。
栄養菌糸：菌糸は寒天表面上もしくは寒天内に形成され、明褐色〜茶褐色、有隔壁菌糸を形成する。
分生子柄及び分生子形成細胞：分生糸は短く、栄養菌糸より直生し、分岐せず、明褐色〜茶褐色に着色する（図１、図３）。分生柄の先端部には刺状突起がややジグザグ状に形成され、その先端から分生子が形成される（図１、図２、図３）。
分生子：分生子はシンポジオ型分生子で、卵形〜長楕円形、１細胞、無色、平滑、基端がやや切断上である（図４）。
有性生殖器官：有性生殖器官の形成は認められない。
【００６３】
コロニーの性状及び形態観察の結果、ＥＰ１０株は灰緑褐色のコロニーを形成し、茶褐色に着色した分生子柄の先端に無色で１細胞性のシンポジオ型分生子を形成するなどＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ属の形態的特長が観察された。一方塩基配列の観察結果から、近縁と推定されたＬｅｐｔｏｄｏｎｉｔｉｄｉｕｍ属の特徴とは異なり区別することができる。
【００６４】
以上の結果から、ＥＰ１０株はＲｈｉｎｏｃｌａｄｉｅｌｌａ属の一種であるとした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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