(57)【要約】【課題】特定の組織または細胞型への薬物ミサイル弾頭を送達するのに有用な体系化薬物システムを提供すること。【解決手段】上記システムは、精製ポリリンゴ酸を基礎にする。天然原料から単離されたこのポリマーは、生物適合性であり、生物分解性でありそして非常に毒性が低い。本ポリマーは、極端に水溶性であり、多くの異なる活性分子を連結するのに使用され得る多数の遊離カルボキシル基を含む。開示された実施例において、カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、そのような分子を連結するのに使用される。上記活性分子とは、特定の細胞性取り込みを促進するモノクローナル抗体および、標的細胞の細胞性代謝を修飾するよう設計されたアンチセンス核酸のような特定のプロドラッグが挙げられる。上記のプロドラッグは、有利なように特定の条件下で放出されるよう、いくらか弱い結合により結合される。【選択図】図１ｂ
2010163468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００３年１２月５日に出願した米国仮特許出願第６０／５２７，３３０号を基礎に出願し、その出願からの優先権を主張する。
【０００２】
（本発明の背景および先行技術の説明）
本発明は、薬物の標的化送達の分野に関し、より具体的には多機能性標的化薬物送達ビヒクルに関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、いくつかの異なる分子骨格が薬物ビヒクルの合成に使用され、注目すべき例として、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー（２０〜３０ｋＤａ）（例えば、非特許文献２６参照）および他のポリアクリル酸（ｐｏｌｙｃａｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の誘導体である。しかしながら、これらは、それらの炭素−炭素主鎖の故に生物分解性と考えられておらず（例えば、非特許文献２７および本明細書の参考文献参照）、有害なアクリル酸による避けがたい汚染により問題である（例えば、非特許文献２８参照）。他の分解性骨格（例えば、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）（例えば、非特許文献２９参照）は、ペプチド結合の周りの回転制限もしくは化学合成および生成物の精製に望ましい有機溶媒における限られた溶解度のような好ましくない性質を有し得、そしてさらにペプチド主鎖の高い水素結合形成能力に起因する他の潜在的免疫原性構造に構造的近似において免疫原性の基盤になっている（例えば、非特許文献２９、３０、３１参照）。
【０００４】
（アンチセンス技術）
特定のＲＮＡ配列と結合し、そして不活性化するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、遺伝子機能、遺伝子発現の制御、遺伝子産物間の相互作用および薬物開発の新しい治療標的の実証の研究をするための最良の手段の１つであり得る。アンチセンスオリゴは、ウイルス疾患、癌および他の重篤な疾患に対する安全で有効な治療の有望性を提供する。ＲＮＡ産生のためのＤＮＡテンプレートを模倣する特定のアンチセンスオリゴは、相補的ＲＮＡへ結合し、そしてタンパク質の翻訳（例えば腫瘍マーカーのタンパク質の翻訳）を抑制するために使用される（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
神経膠腫においてアンチセンス技術の使用について有望なデータがある。インビトロおよびヌードマウスにおいて神経膠腫の増殖は、テロメラーゼに対するアンチセンスにより阻害され得る（例えば、非特許文献２参照）。パイロット研究は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するアンチセンスが神経膠腫細胞アポトーシスを誘発し、患者の臨床的改善という結果が得られたことを示した（例えば、非特許文献３参照）。いくつかの臨床試験が、他の癌の処置にアンチセンスオリゴを現在使用している（例えば、非特許文献４参照）。これらの研究は不十分な特異性、安定性および非アンチセンス効果の無い新世代のアンチセンスオリゴを活用する（例えば、非特許文献５参照）。最も有望な改善されたオリゴの種類は、モルホリノ（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）オリゴおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴである。これらの種類は、全てのアンチセンスタイプの中で最高の配列特異性を有し、そしてこの特異性を非常に広い濃度範囲にわたって維持する（例えば、非特許文献６、７、８、９、１０および１１参照）。新しい、早く進化するアンチセンスアプローチの変種は、非常に強力な遺伝子発現サイレンサーであり、潜在的な抗癌薬でもある小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代表される。
【０００６】
（インビトロおよびインビボにおける腫瘍の進行を抑制するためのいくつかの分子マーカーの組合わせによるブロッキング）
このアプローチは癌化学療法において長く成功裏に使用されてきたが、特定の腫瘍マーカーを標的化することにはまだ適用されていなかった。遺伝子／タンパク質アレイアプローチの進展の後にのみ、腫瘍の進行および再発の間の特定の遺伝子の協奏的な変化に関するデータを得て、そして関連付けることが可能となった。そのような協奏的な変化は、腫瘍の発症および進行を効率的にブロックすることを期待していくつかの遺伝子の同時変化を阻止する可能性を提供する。神経膠腫の増殖および拡散をブロックするいくつかの候補遺伝子があり、それには腫瘍の増殖をより効率的に抑制するために化学療法剤との組合わせで潜在的に使用され得るチロシンキナーゼレセプター（例えば、ＥＧＦＲ）、いくつかの成長因子および抗アポトーシス遺伝子が含まれる（例えば、非特許文献１２、１３、１４、１５および１６参照）。本発明者らの以前の研究で、別の潜在的な候補タンパク質、ラミニン−８を同定したが、それは脳腫瘍および乳癌で過剰発現され、神経膠腫の予後の悪さと関連し、神経膠腫侵襲と関連する。
【０００７】
（薬物送達）
腫瘍を処置するために癌細胞を直接標的化する目的で、薬物、例えば、モノクロ−ル抗体、アンチセンスオリゴまたは低分子（例えばタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（エルロチニブ）（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ））は、細胞膜を透過し得る。細胞内薬物送達について３種類の基本的な方法があり、それらは、膜の水性チャネルまたは孔を通る受動的拡散、膜の脂質への溶解による脂質溶解性薬物の受動的拡散およびキャリア媒介性の能動輸送（ウイルスベクター、リポソーム媒介性の遺伝子移送システム、特殊化学品）である（例えば、非特許文献１６、１７参照）。脳組織は、水溶性でイオン化または極性の薬物の透過を抑制する脳毛細血管内皮細胞間のタイトジャンクションによる特別の血液脳関門を有するので、薬物による処置が特に困難である（例えば、非特許文献１８、１９参照）。
【０００８】
高分子量分子は、高分子および脂質（分子量＞４５ｋＤａ）について癌組織で観察される高い透過性および保持性効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＲ）の故に、最近特に注目を集めている（例えば、非特許文献２０、２１および２２参照）。腫瘍を正常組織と区別しない今日使用される低分子抗癌剤と異なり、高分子（またはポリマー性）薬物は、ＥＰＲ効果により高度の選択性で癌を標的化し得る（例えば、非特許文献２２、２３参照）。そのような有望な薬物キャリアの１つとして、ポリ−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）が、本発明者らの１人により開発されてきた（例えば、非特許文献２４、２５参照）。
【非特許文献１】Ａｓｔｒｉａｂ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ａ，Ｓｅｒｇｕｅｅｖ  ＤＳ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍ，Ｓｈａｗ  ＢＲ，Ｊｕｌｉａｎｏ  ＲＬ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．」  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、２０００年、第６０巻、ｐ８３−９０
【非特許文献２】Ｋｏｍａｔａ  Ｔ，Ｋｏｎｄｏ  Ｙ，Ｋｏｇａ  Ｓ，Ｋｏ  ＳＣ，Ｃｈｕｎｇ  ＬＷ，Ｋｏｎｄｏ  Ｓ．「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ２−５Ａ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐ５３．」  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０００年、第７巻、ｐ２０７１−２０７９
【非特許文献３】Ａｎｄｒｅｗｓ  ＤＷ，Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆ  Ｍ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ＡＥ，Ｋｅｎｙｏｎ  Ｌ，Ｃｕｒｔｉｓ  Ｍ，Ｍｅｒｌｉ  Ｇ，Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ，Ｉｌｉａｋｉｓ  Ｇ，Ａｉｋｅｎ  ＲＤ．「Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ．」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００１年、第１９巻、ｐ２１８９−２２００
【非特許文献４】Ｊａｎｓｅｎ  Ｂ，Ｗａｃｈｅｃｋ  Ｖ，Ｈｅｅｒｅ−Ｒｅｓｓ  Ｅ，Ｓｃｈｌａｇｂａｕｅｒ−Ｗａｄｌ  Ｈ，Ｈｏｅｌｌｅｒ  Ｃ，Ｌｕｃａｓ  Ｔ，Ｈｏｅｒｍａｎｎ  Ｍ，Ｈｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎ  Ｕ，Ｗｏｌｆｆ  Ｋ、Ｐｅｈａｍｂｅｒｇｅｒ  Ｈ．「Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｙ  ＢＣＬ２  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．」Ｌａｎｃｅｔ、２０００年、第３５６巻、ｐ１７２８−１７３３
【非特許文献５】Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ．「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２００１年、第３４０巻、ｐ３２９−３４０
【非特許文献６】Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  Ｊ，Ｗｅｌｌｅｒ  Ｄ．「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ、１９９７年、第７巻、ｐ１８７−１９５
【非特許文献７】Ｌａｃｅｒｒａ  Ｇ，Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ  Ｈ，Ｃａｒｅｓｔｉａ  Ｃ，Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ  Ｓ，Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  Ｊ，Ｗｅｌｌｅｒ  Ｄ，Ｋｏｌｅ  Ｒ．「Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、ｐ９５９１−９５９６
【非特許文献８】Ｔａｙｌｏｒ  ＭＦ，Ｐａｕｌａｕｓｋｉｓ  ＪＤ，Ｗｅｌｌｅｒ  ＤＤ，Ｋｏｂｚｉｃ  Ｌ．「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄ  ＴＮＦ−α  ｉｎ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．」Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１９９７年、第９巻、ｐ６７２−６８１
【非特許文献９】Ａｒｏｒａ  Ｖ，Ｋｎａｐｐ  ＤＣ，Ｓｍｉｔｈ  ＢＬ，Ｓｔａｔｄｆｉｅｌｄ  ＭＬ，Ｓｔｅｉｎ  ＤＡ，Ｒｅｄｄｙ  ＭＴ，Ｗｅｌｌｅｒ  ＤＤ，Ｉｖｅｒｓｅｎ  ＰＬ．「ｃ−Ｍｙｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｃ−ｍｙｃ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ３Ａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２０００年、第２９２巻、ｐ９２１−９２８
【非特許文献１０】Ｓｈｉ  Ｎ，Ｂｏａｄｏ  ＲＪ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、ｐ１４７０９−１４７１４
【非特許文献１１】Ｂｏａｄｏ  ＲＪ，Ｋａｚａｎｔｓｅｖ  Ａ，Ａｐｏｓｔｏｌ  ＢＬ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＬＭ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｕｔｉｎｇｔｉｎ  ｇｅｎｅ．」Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２０００年、第２９５巻、ｐ２３９−２４３
【非特許文献１２】Ｔａｎａｂｅ  Ｋ，Ｋｉｍ  Ｒ，Ｉｎｏｕｅ  Ｈ，Ｅｍｉ  Ｍ，Ｕｃｈｉｄａ  Ｙ，Ｔｏｇｅ  Ｔ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  ＨＥＲ−２  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ．」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ、２００３年、第２２巻、ｐ８７５−８１
【非特許文献１３】Ｃｈｏ  ＹＳ，Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ  ＹＳ．「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ＲＩａｌｐｈａ  ａｃｔｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３年、第９巻、ｐ１１７１−１１７８
【非特許文献１４】Ｔｏｒｔｏｒａ  Ｇ，Ｃａｐｕｔｏ  Ｒ，Ｄａｍｉａｎｏ  Ｖ，Ｃａｐｕｔｏ  Ｒ，Ｔｒｏｉａｎｉ  Ｔ，Ｖｅｎｅｚｉａｎｉ  ＢＭ，Ｄｅ  Ｐｌａｃｉｄｏ  Ｓ，Ｂｉａｎｃｏ  ＡＲ，Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ  Ｕ，Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  Ｆ．「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２，ｂｃｌ−ＸＬ，ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃａｕｓｅｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ，ａｐｏｐｔｏｔｉｃ，ａｎｄ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３年、第９巻、ｐ８６６−８７１
【非特許文献１５】Ｊｉａｎｇ  Ｚ，Ｚｈｅｎｇ  Ｘ，Ｒｉｃｈ  ＫＭ．「Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２  ａｎｄ  ｂｃｌ−ＸＬ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．」Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、２００３年、第８４巻、ｐ２７３−２８１
【非特許文献１６】Ｍｙｃｅｋ  ＭＪ，Ｈａｒｖｅｙ  ＲＡ，Ｃｈａｍｐｅ，ＰＣ．「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ」第２版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年、ｐ４７５
【非特許文献１７】Ｐａｒｋ  ＪＷ．「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．」Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００２年、第４巻、ｐ９５−９９
【非特許文献１８】Ｍａｔｓｕｋａｄｏ  Ｋ，Ｓｕｇｉｔａ  Ｍ，Ｂｌａｃｋ  ＫＬ．「Ｉｎｔｒａｃａｒｏｔｉｄ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  Ｂ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ．」Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、１９９８年、第７９２巻、ｐ１０−１５
【非特許文献１９】Ｎｉｎｇａｒａｊ  ＮＳ，Ｒａｏ  ＭＫ，Ｂｌａｃｋ  ＫＬ．「Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３年、第６３巻、ｐ８８９９−８９１１
【非特許文献２０】Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ＶＰ，Ｌｕｋｙａｎｏｖ  ＡＮ．「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ａｎｄ  ｉｎｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．」Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、２００３年、第８巻、ｐ２５９−６６
【非特許文献２１】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＣＭ，Ｓｈｉａｈ  Ｊ．，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ  Ｐ，Ｍｉｎｋｏ  Ｔ，Ｓｔｒａｉｇｈｔ  ＲＣ，Ｋｏｐｅｃｅｋ  Ｊ「ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ」Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、２００３年、第５１９巻、ｐ１０１−２３
【非特許文献２２】Ｍａｅｄａ  Ｈ，Ｆａｎｇ  Ｊ．，Ｉｎｕｔｓｕｋａ  Ｔ，Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｙ．「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ：ｖａｒｉｏｕｓ  ｆａｃｔｏｒｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、２００３年、第３巻、ｐ３１９−２８
【非特許文献２３】Ｓａｔｃｈｉ−Ｆａｉｎａｒｏ  Ｒ，Ｐｕｄｅｒ  Ｍ，Ｄａｖｉｅｓ  ＪＷ，Ｔｒａｎ  ＨＴ，Ｓａｍｐｓｏｎ  ＤＡ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＡＫ，Ｃｏｒｆａｓ  Ｇ，Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ａｎｄ  ＴＮＰ−４７０．」Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００４年、第１０巻、ｐ２５５−２６１
【非特許文献２４】Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｈ，Ｅｒｄｍａｎｎ  Ｓ，Ｈｏｌｌｅｒ  Ｅ．「Ａｎ  ｕｎｓｕａｌ  ｐｏｌｙａｎｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  α  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８９年、第２８巻、ｐ５２１９−５２２６
【非特許文献２５】Ｌｅｅ  ＢＳ，Ｈｏｌｌｅｒ  Ｅ．「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  β−ｐｏｌｙ（Ｉ−ｍａｌａｔｅ）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ．」Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９年、第５１巻、ｐ６４７−６５２
【非特許文献２６】Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｍｉｎｋｏ，Ｔ．，Ｌｕ，Ｚ．「ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｄｅｓｇｎ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００年、第５０巻、ｐ６１−８１
【非特許文献２７】Ｖｉｎｃｅｎｚｉ，Ｖ．，Ｆｅｒｒｕｔｉ，Ｐ．，Ｆｏｒｄ，Ｊ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ−ｃａｒｂｏｎａｔｅ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．」Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第１巻、ｐ１６４−１６９
【非特許文献２８】「Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  １９１．  Ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ．」［ｏｎｌｉｎｅ］Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ／Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｕｒ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ／Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ．インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｈｅｍ．ｏｒｇ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｅｈｅ／ｅｈｃ／ｅｈｃ１９１．ｈｔｍ＞
【非特許文献２９】Ｌｉ，Ｃ．「Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）−ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．」  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２００２年、第５４巻、ｐ６９５−７１３
【非特許文献３０】Ｇｉｌｌ，Ｔ．Ｊ．，Ｋｕｎｚ，Ｈ．Ｗ．  Ｐａｐｅｒｍａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｓ．１９６７．「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６７年、第２４２号、ｐ３３０６−３３１８
【非特許文献３１】Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｈ−Ｙｅｈ，Ｍ，Ｋ．「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）ｔｏ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌｏｇｙｙ．」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３年、第４巻、ｐ８−１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の要旨）
ポリリンゴ酸を使用することによる以前に悩まされた薬物キャリアシステムの問題を解決することが本発明の目的である。そのポリリンゴ酸は多くの機能性カルボキシル基を担持し、そのような基は、質量数５０，０００のポリリンゴ酸１分子当たり、少なくとも約５０であり、そして約５００を担持する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ポリリンゴ酸は分子量２，５００から少なくとも１００，０００のサイズの範囲で容易に入手できる。これは、以下のことを達成するために多数の生物学的に活性な機能的分子の連結を可能にする：
薬物キャリア分子あたりの組織標的化分子の種類および数における高い調整可能性；
薬物キャリア分子あたりの結合薬物モジュール（プロドラッグ）の種類および数における高い調整可能性；
上記機能的モジュールに加えて疎水性残基または親水性残基のいずれかを担持する基を有することにより溶解度を調節する能力；
上述の機能的モジュール以外に、例えば，ＰＥＧのような分解に対してキャリアシステムを保護する（例えば、血液循環系において寿命を増加する）ことに活性である、さらなる基を結合する能力；
上記薬物送達システムの構築単位として使用される多くの他の残基と共に、生分解性であるキャリア骨格；
ウイルス成分を使用しないシステム；
機能的モジュール（ｍＡＢまたは他の腫瘍細胞表面レセプター）、上記種類の薬物（悪性に発現した遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、および腫瘍組織に対して高い特異性（ＥＰＲ−効果）を担う全体的に高分子量の薬物送達システムを有する送達システム；ならびに
ラットの体重１ｋｇ当たり５ｍｇ程度の高い用量を可能にする低毒性の薬物システム。
【００１１】
本発明のさらなる目的は：
複雑な合成方法および制御不能な副反応を避けることにより薬物送達システムの合成を容易にすること；
容易な精製を提供する好ましい溶解度および他の性質で作製すること；
各個別の化学結合反応の規定された化学量論および再現性を可能にする最大収率を達成すること；
結合された機能的モジュールの種類と数に関する高い調整可能性の構造的および合成の基礎を用意すること；ならびに
薬物送達システムの簡単なスケールアップを可能にする技術を提供することである。
【００１２】
技術発明は以下を包含する：
非常に数多くの反応性カルボキシル基（分子量５０，０００の骨格に対して約５００）を担持する主鎖または骨格としてポリリンゴ酸を用いる薬物送達システムの選択；
それらのＮＨＳ−エステルを形成することによる、これらのカルボキシル基の殆ど（理想的には全部）の活性化；
ＮＨＳ−活性化カルボキシル基での置換の求核剤として単一のアミノ基を担持する機能的モジュールの化学的に独立した調製；
上記活性化された骨格および反応性機能的モジュールの各々を別々に調製すること；
上記ＮＨＳ−活性化骨格および各反応性機能的モジュールを、独立しているがよく規定された順に組み合わせて反応させ、新しく添加した機能的モジュールのそれぞれの添加後に所望の中間体／生成物の精製および実証を可能にすること；
これらの反応を化学量論量で組合わせること；
結合体の高くかつ再現性のよい収率を達成すること；
新しく添加した反応性機能的モジュールと既に結合されたモジュールとの副反応を、次に入って来る機能的モジュールの結合に対して順番に添加する良く組織化された階層を選択することにより避けること。
【００１３】
キャリアまたは骨格のデザインおよび合成について説明するが、それは共有結合的に結合した薬物を標的化組織に輸送し、その組織の細胞表面レセプターに結合し、エンドソームに内在化し、エンドソームから細胞質へ抜け出し、そして細胞質において細胞質内容物のグルタチオンおよび他のスルフヒドリル基との化学反応により活性遊離薬物を放出する。高分子量薬物ビヒクルまたは粒子の特異性は、腫瘍特異的結合体標的化分子による腫瘍組織標的化ならびに単にそれらが高分子量（＞２００００）であることに起因する腫瘍における高い透過性および保持性（ＥＰＲ−効果）の両方を基礎にしている（４０，４１）。
【００１４】
本特許出願で使用される骨格ポリ（リンゴ酸）（ＰＭＬＡＨ）は、主鎖エステル結合を含み、生分解性であり（２７およびその中の参考文献）そして高分子可撓性（４９）であり、水（イオン化する場合）および有機溶媒（その酸性形態において）に溶解性であり、非毒性でありならびに非免疫原性（２７およびその中の参考文献）である。薬物担持ＰＭＬＡＨは、誘導化されたリンゴ酸ラクトンの開環重合により主に合成されてきている（２７およびその中の参考文献）。ドキソルビシン−ポリ（リンゴ酸）の合成は、化学的に合成されたポリ（β−Ｄ、Ｌ−リンゴ酸）から報告されている（４９）。天然に存在するＰＭＬＡＨからの薬物ビヒクルの合成は、行われなかった。本特許出願に記載する高度に機能的な薬物送達システムの種類は、以前に開示されたことは無かった。
【００１５】
上記キャリアは、分子主鎖または分子骨格に対応するポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＬＡ）から構成され、それはそのカルボキシル基のところで、規定された比率で、以下の仕事を遂行する種々の機能的モジュールと化学的に結合される：（１）細胞質で有効になる放出可能な機能的モジュールによるプロドラッグの放出、（２）細胞（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡＢ））の表面に結合することにより特定の組織の方へキャリアを向けること、（３）エンドソームを通っての標的細胞への内在化（通常標的表面レセプターの内在化による）、（４）エンドソーム膜へ集積し、最終的にはエンドソーム膜を崩壊させる疎水性機能的単位の力でエンドソームから細胞質へ脱出し、リソソームへの過程でのエンドソームの酸性化の間に有効になること、（５）分解性酵素活性（例えばペプチダーゼ、プロテアーゼなど）に対してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による保護。
【００１６】
本発明において「モジュール」とは、小さい薬物分子または発色団分子から、例えば、抗体またはレシチンのような完全なタンパク質分子までの範囲にわたる生物学的活性分子構造である。本明細書に示される実施例の場合に、（１）ラミニン−８（３４、５１）のα−４鎖およびβ−１鎖に対するモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが示されており、それはそれらの３’−末端に人工的に導入された−ＮＨ２（アミノ）基によるアミド結合により介在スペーサーに結合されている。そのスペーサーは、細胞質の還元環境中でグルタチオンとのスルフヒドリル−ジスルフィド交換反応において切断可能なジスルフィド部分により、キャリアと連結されている（５１、５２）。（２）組織標的化は、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）を用いてラットトランスフェリンレセプターを認識し、そして結合するよう設計される。このレセプターは、血液脳関門（ＢＢＢ）として機能する内皮細胞表面上で発現し、および特定の腫瘍では高いレベルで発現することが分かった（５３、５４）。インビトロおよびインビボの研究は、トランスフェリンレセプターがトランスフェリンまたはｍＡＢ  ＯＸ−２６または他の適切なｍＡＢと化学的に結合した薬物送達システムのための固定具として使用され得ることを示し、その抗体はトランスフェリンレセプターと結合し、そしてそれにより抗体のアロタイプに依存してラットまたはマウスまたは他の哺乳動物の血液脳関門（ＢＢＢ）を通ってトランスサイトーシスを達成することを示す（５、５６、５７；４５、５８、５９、６０、および６１）。（３）トランスフェリンレセプターと結合する抗体およびエンドソームへの内在化は、実証されている（５７、５５、および５７）。トランスフェリンレセプターの場合、任意の適切な抗体、ｍＡＢ、ヒト化抗体またはキメラ抗体またはレクチンまたはトランスフェリンレセプターに特異的な他のリガンドが使用され得ることは理解される。多数の細胞表面レセプターまたは抗原に対する適切なリガンドは、本発明に使用され得、そしてトランスフェリンレセプターは単なる例であることもまた、理解される。（４）エンドソームからの脱出は、ポリアクリル酸誘導体の場合、エンドソーム小胞からリソソームへと成熟化の間の酸性化により機能することが示された（５１、６２）。本特許出願で提案されている設計されたキャリアは、アミド結合によりポリリンゴ酸骨格と結合されている多数のバリン残基を担持する。リソソームへの過程の間の上記エンドソームの酸性化の間、上記キャリア分子のこれらの伸縮は、電荷が中和されそして疎水性になり、膜を崩壊させることができる。リソソームｐＨで電荷が中和される限り、他の分子が、バリンに代わって使用され得る。（５）ＰＥＧ化は結合タンパク質の半減期を著しく増加させる（６３）。循環時間を延長し、そして標的固体腫瘍の中への滲出を増進する（６４）。半減期を増加させることが知られている任意の他の分子は、本発明に使用される。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
薬物送達分子であって：
複数の遊離カルボン酸基を有するポリマー化したカルボン酸分子骨格；
複数の生物学的に活性な分子モジュールであり、それぞれ同じポリマー化したカルボン酸分子骨格に共有結合している、活性分子モジュールを含み、ここで該活性モジュールは：
標的化細胞により細胞性取り込みを促進する、少なくとも１つの標的化モジュール；および
標的化細胞の細胞性代謝を変える、少なくとも１つのプロドラッグモジュールを含む、薬物送達分子。
（項目２）
前記プロドラッグが、腫瘍特異的タンパク質の発現を阻害するように選択される、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目３）
前記ポリマー化カルボン酸分子骨格がポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）である、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目４）
前記ポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）が、２，５００と１００，０００との間の分子量を有する、項目３に記載の薬物送達分子。
（項目５）
前記ポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）が、少なくとも約５，０００の分子量を有する、項目４に記載の薬物送達分子。
（項目６）
前記ポリマー化カルボン酸分子骨格のそれぞれの分子が、少なくとも約５０の遊離カルボン酸基を有する、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目７）
前記複数の分子モジュールが、生物膜の崩壊を促進する分子モジュールをさらに含む、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目８）
項目７に記載の薬物送達分子であって、生物膜の崩壊を促進する前記分子モジュールが、生理的ｐＨでは荷電し、リソソームのｐＨで荷電せず、それにより該分子モジュールの親油性を増加する親油性特性および親油性基を有する分子を含む、薬物送達分子。
（項目９）
前記複数の活性分子モジュールが、前記薬物送達分子の循環を延長する分子モジュールをさらに含む、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目１０）
項目９に記載の薬物送達分子であって、該薬物送達分子の循環を延長する前記分子モジュールが、ポリエチレングリコールを含む、薬物送達分子。
（項目１１）
項目１に記載の薬物送達分子であって、前記複数の活性分子モジュールが、該薬物送達分子の細胞性取り込みを決定するレポータモジュールをさらに含む、薬物送達分子。
（項目１２）
前記レポータモジュールが蛍光分子を含む、項目１１に記載の薬物送達分子。
（項目１３）
前記標的化分子が、血液脳関門の透過を促進するように選択される、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目１４）
前記標的化分子モジュールが抗体を含む、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目１５）
前記抗体が、トランスフェリンレセプターに結合する、項目１４に記載の薬物送達分子。
（項目１６）
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目１４に記載の薬物送達分子。
（項目１７）
前記抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、項目１４に記載の薬物送達分子。
（項目１８）
項目１に記載の薬物送達分子であって、ここで前記プロドラッグ分子モジュールが、該薬物送達分子が細胞に入るときに切断される切断可能な結合で、前記ポリマー化カルボン酸分子骨格と結合される、薬物送達分子。
（項目１９）
前記切断可能な結合が、ジスルフィド結合である、項目１８に記載の薬物送達分子。
（項目２０）
前記プロドラッグ分子モジュールが、アンチセンス分子を含む、項目１に記載の薬物送達分子。
（項目２１）
前記アンチセンス分子がモルホリノアンチセンス分子である、項目２０に記載の薬物送達分子。
（項目２２）
前記アンチセンス分子が、ラミニン−８の産生を干渉する、項目２０に記載の薬物送達分子。
（項目２３）
項目２２に記載の薬物送達分子であって、ここで前記アンチセンス分子が、α４ラミニンおよびβ１ラミニンからなる群より選択されるラミニンサブユニットの産生を変化させることによりラミニン−８の産生を干渉する、薬物送達分子。
（項目２４）
薬物送達分子の合成方法であって、以下の工程：
複数の遊離カルボン酸基を有するポリマー化カルボン酸分子骨格を提供する工程；
該カルボキシル基を活性化する工程；
該活性化カルボキシル基をスルフヒドリル基およびアミノ基を含む化合物と反応させて、薬物送達分子にスルフヒドリル基を付けてスルフヒドリル薬物送達分子にする工程；
スルフヒドリル結合基を含む標的化分子を、該スルフヒドリル薬物送達分子と反応させて標的細胞による取り込みを促進する工程；ならびに
プロドラッグ分子を該標的細胞の細胞性代謝を変化させるために反応する工程を包含する、合成方法。
（項目２５）
前記プロドラッグ分子が、スルフヒドリル結合基を含むアンチセンス分子である、項目２４に記載の薬物送達分子の合成方法。
（項目２６）
項目２４に記載の薬物送達分子の合成方法であって、前記活性化カルボキシル基を、親油性部分を有し、エンドドームの酸性化の間に荷電しなくなる電荷基を含む分子と反応させ、それにより膜の崩壊を引き起こす工程をさらに含む、合成方法。
（項目２７）
項目２４に記載の薬物送達分子の合成方法であって、ここで複数の異なるプロドラッグ分子が、同じ薬物送達分子に結合し、それにより１を超えるプロドラッグ分子で、前記標的細胞を同時に処理することが可能になる、合成方法。
（項目２８）
前記標的化分子が前記血液脳関門の透過を促進するよう選択される、項目２４に記載の薬物送達分子の合成方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】図１ａは、本発明の薬物分子の全体的な構造を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、図１ａの構造を構築するために使用される工程の全体的な順序を示す。
【図２】図２は、ＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルの合成を示す略図である。
【図３】図３は、（ＰＤＰ−モルホリノ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成を示す略図である。
【図４】図４は、Ｎ−（フルオレセイン−５’−チオカルバモイル）ジアミノヘキサンの合成を示す略図である。
【図５】図５は、Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）ポリ（エチレングリコール）の合成を示す略図である；
【図６】図６は、ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２結合体の合成を示す略図である。
【図７】図７は、ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２結合体の合成を示す略図である。
【図８】図８は、ＦＩＴＣの、ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体への結合を示す略図である。
【図９】図９は、ポリマーを試験する時に使用される溶血アッセイの結果の棒グラフを示す。
【図１０ａ】図１０ａは、グルタチオンでの還元によるキャリアからのモルホリノオリゴの放出を示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、グルタチオンでの還元に応答する時間の間のオリゴ放出の％を示す。
【図１１】図１１は、薬物２Ａおよび／またはＰＢＳ（模倣）と比較して、有意差ｐ＜０．０１でｌｏｇ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔにより分析された、薬物２による処置後のラットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｒ生存曲線を示す；
【図１２】図１２は、培養神経膠腫Ｕ−８７ＭＧ細胞における薬物２（３０分）とマーカーエンドソームＦＭ４−６４との共分布である。共焦点顕微鏡により、ＦＭ４−６４が細胞質エンドソーム（左上）に見られ、そして薬物２が同じ場所（右上）に見出される。両方の標識が共局在化する（左下、黄色）。
【図１３】図１３は、血管密度が正常脳と比較して腫瘍において増加し、そして薬物２が腫瘍血管密度を５５％減少させることを示すグラフである。
【図１４】図１４は、Ｕ８７／ＭＧ神経膠腫培養物のラミニン鎖に関する免疫蛍光染色を示す。ＰＭＬＡビヒクル結合アンチセンスオリゴ（薬物２）は、ラミニン発現を抑制する（α４は赤色であり、β１は緑色である）。核は、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色される。
【図１５】図１５は、ヒトラミニンβ１鎖に対するモノクロナル抗体を使用して異種移植された腫瘍の免疫蛍光分析を示す；ラミニンβ１鎖合成が、薬物２の投与後、ＧＢＭにおいて阻害された。
【図１６】図１６は、２つの多型膠芽腫（ＧＢＭ）細胞培養物、Ｕ８７ＭＧ、およびＴ９８Ｇにおけるラミニン−８鎖発現の阻害のウェスタンブロッティング分析を示す：−、未処置、＋、薬物２で処置。
【図１７】図１７は、薬物２が、上記ＢＢＢを通過することができることを示し、ここで赤色は、薬物の血管内投与の後の脳血管および移植腫瘍内で視覚化された薬物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
以下の説明は、当業者が発明物を作製し、そして利用することが可能なように提供され、発明を実施する発明者により企図された最良の様式を示す。しかしながら、種々の改変が、当業者には容易に明らかである。何故なら本発明の一般的な原理が、ポリ−Ｌ−リンゴ酸を基礎としたアンチセンス抗腫瘍薬物により実証された新規な薬物送達システムを提供するように本明細書に具体的に規定されているからである。
【００１９】
薬剤および生物製剤のためのキャリアマトリックスまたは分子輸送ビヒクルとしてのＰＭＬＡの魅力的な性質は、以下の通りである：それは、非毒性でかつ非免疫原である；その疎水性は、疎水性側鎖またはスペーサーを導入することにより、調節され得る（３０）；それは、生分解性である（３１）；そしてそれは、血流で安定である。アンチセンスオリゴを特定の器官またはコンパートメントに標的化するために、例えば、レセプター媒介性エンドサイトーシスに有利な腫瘍特異的抗体のような標的化実体は、ＰＭＬＡポリマーに結合され得る。理想的には、上記系は、分子輸送ビヒクルからその薬物を放出するための放出システムを含み；あり得る放出システムとしては：ａ）細胞内グルタチオンにより切断可能なジスルフィド結合、ｂ）ｐＨ感受性ヒドラゾン結合、ｃ）リソソームカテプシンＢ（または他のペプチダーゼ）（その活性は、種々の腫瘍において増加する）により切断されるテトラペプチド、；ｄ）エンドソームからの本来の放出機能（３２，３３）；およびｅ）エステル結合のような他の不安定な、または切断可能な結合、が挙げられる。最も重要なことに、多数の分子標的インヒビターが、１つのＰＭＬＡ分子に容易に連結され得る。
【００２０】
天然物、Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍの変形体（２７およびその中の参考文献）由来のＰＭＬＡは、本特許出願に記載の薬物送達システムの合成のための出発物質であった。ここで用いられる化学合成の方法は、合成化学における一般的な公知の（ｆｕｎｄｕｓ）方法からであり、ここで記載されているポリリンゴ酸ベースのシステムとは関係なく、他の系において記載されている。これらの方法の殆どは、本状況に適合されなければならず、特にキャリア系の化学的構築の進行の間の、出発物質の性質に適合されなければならず、そして生成物の精製方法に関しても適合されなければならなかった。上記ポリリンゴ酸骨格に結合される機能的部分の予測可能でかつ再現性のある化学量論的に誘導体化を成功裏に達成するために、上記骨格との反応の順序を、制御されていない反応は不可能であるような方法で確立および構築しなければならなかった。生成物の有効性およびその純度が達成され、段階的な合成の間に、定性化学アッセイおよび定量化学アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および紫外光／可視光／ＩＲ光スペクトル分析ならびにＮＭＲスペクトル方法を含むインシチュ分析で制御された。完全に構築された薬物ビヒクルの膜崩壊的性質およびその合成の中間体の膜崩壊的性質もまた、慣用的で実験的な溶血膜アッセイ（５１を参照のこと）により評価された。
【００２１】
ここで使用された方法の開発を基礎とした標準的な合成方法参考は、特に以下である：
（６９）の方法に類似する方法での、ＰＭＬＡＨ−カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとしての活性化；
（５１およびその中の参考文献）に記載の方法と類似の方法での、（２−ピリジルジチオ）プロピオニル基の、モルホリノ（ＰＤＰ）−モルホリノ）アンチセンスオリゴヌクレオチドへの結合；
（７１）のＮ−（フルオロセイン−５’−チオカルバミル）ジアミノヘキサンの形成の方法と類似の方法での、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアナート）−結合；
（７０）に記載の方法と類似の方法での、Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）ポリ（エチレングリコ−ル）の合成；
（７２、５１およびその中の参考文献）に記載の技術と類似の技術での、チオール基の抗体への導入；
（５２および６９）で実施された反応に類似して、ｍＡＢ  ＯＸ−２６−スルフヒドリルとＮ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミド結合体との反応が行われた；
本明細書に記載されるようにＮＨＳ活性化されたカルボキシレートからのアミド形成により、ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体の合成が原理的に行われた；
スルフヒドリル基とマレイミドとの反応によるＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２結合体の合成；
本明細書に記載されるようにＮＨＳ活性化されたカルボキシレートの求核攻撃により主にアミド形成を表す、ＦＩＴＣ−スペーサーの、ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体への結合。
【００２２】
既存の薬物送達システムは以下の１つから数個の問題に悩まされる：
既存の薬物送達システムは多機能的ではなく、即ち、キャリア１分子あたりの組織標的化基の種類および量における可変性に関して限定される；
既存の薬物送達システムは、キャリア１分子あたりの結合薬物（プロドラッグ）の種類と量により限定される。
【００２３】
既存の薬物送達システムは、生理学的流体中への溶解度により限定される。
【００２４】
既存の薬物送達システムは、循環系における分解に対する不十分な安定性により限定される。
【００２５】
既存の薬物送達システムは、生分解性ではない；
既存の薬物送達システムは、ウイルス核酸または他のウイルスフラグメントを含む；
既存の薬物送達システムは、腫瘍組織に特異的ではなく健全な宿主組織を損傷する；
既存の薬物送達システムは、毒性がある；
薬物送達システムの合成は、制御不可能な副反応に悩まされる；
薬物送達システムの合成は、反応生成物の精製を困難もしくは不可能にする溶解度または他の問題に悩まされる；
薬物送達システムの合成は、再現性のある結果が得られない；
新成分を含有し、従って薬物送達システムの特異性を増進し、薬物送達システムの抗腫瘍活性を強くする、構造的変更物／拡大物の合成は不可能である；
薬物送達システムの合成はスケールアップが容易にできない。
【００２６】
各反応性機能的モジュールの、ポリリンゴ酸骨格のＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−活性化カルボキシル基との制御された結合は、種々の異なる種類の反応性機能的モジュールを結合させることを可能にし、従って種々の異なる標的化分子、薬物（プロドラッグ）分子などを導入できる。種々のモジュールは、全く同一の骨格分子に結合され得るか、または２成分もしくは３成分などの薬物混成体を作製可能なように、または異なる骨格分子へ結合され得る。全く同一の骨格分子上の多機能性モジュールは、細胞に同時に導入される場合生物学的に相乗効果を示し得る。
【００２７】
生分解性は、骨格および他の生分解性構築単位（アミノ酸、タンパク質）として生分解性リンゴ酸を用いることで達成され得る。
【実施例】
【００２８】
（特定の実施例による本発明の説明）
（モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの腫瘍標的送達のためのポリリンゴ酸ベースの多機能性キャリアシステムの合成）
図１ａは、本発明の代表的な薬物分子の全体的な構造を示す。ブロック（ｚ＋ｗ）の合成のために、ポリリンゴ酸のカルボキシル基（ブロックｗ）を、ＮＨＳ−エステルとして活性化し、そしてアミド結合を介してＬ−バリンに結合する。ブロックｙ３は、ジスルフィド薬物放出単位を含むプロドラッグモルホリノアンチセンスオリゴである。ブロックｙ１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを介してブロックｚ＋ｗに結合しているモノクローナル抗体（ＯＸ２６）標的化分子である。ブロックｘは、分解に対するＰＥＧ−保護基であって、アミド結合により連結されており、市販されているＰＥＧ−アミンから形成される。ブロックｙ２は、残っているスルフヒドリル固定基を表し、この時点でそれは合成に消費されず、置換Ｎ−エチルマレイミドの２重結合との反応により更なる機能性モジュールの結合に使用され得るか、または単に置換Ｎ−エチルマレイミドとの反応でブロックされ得る。ブロックｎ（蛍光レポータ基）をフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＮ１−Ｂｏｃ−１，６−ジアミノヘキサンから調製する。上記薬物構造を、注意深い化学量論的制御下で、図１ｂに示されるように成長中の結合体への、上記ブロック（すなわち、モジュール）の段階的結合により構築する。工程の順序は、異なるシナリオに合うように容易に調整され得る。カルボジイミド試薬を用いて有機溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド中で、結合反応を実施した。以下の標準的な方法で側鎖の適切な保護により副反能を抑制する。
【００２９】
ブロックｗについては、非常に精製度の高いポリリンゴ酸を、Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍの培養物から得る（２４、２５）。バイオポリマーを同時にそして酵素的にＬ−リンゴ酸（（３１、２６）に分解し、それは炭酸ガスおよび水へと代謝され。そのナトリウム塩はマウスおよびウサギのそれぞれで毒性も無く、免疫原性もない（２７およびその中の参考文献）。マウスに静脈内投与した後、ポリリンゴ酸は、腎臓経由の排泄により速く除かれた（７３）。特定のポリリンゴ酸誘導体およびブロックポリマーは、実際にラットにおいて骨修復および筋再生に対して正の効果をを示した（３０）。または特定のポリリンゴ酸誘導体およびブロックポリマーは、他の研究（３２）において生体適合性であることがわかった。ポリリンゴ酸は、非常に多くの修飾可能なカルボキシル基の故に薬物キャリアデバイスの設計には優れた候補である。これらは、それらの化学量論および集積度に関して完全に制御可能な様式で種々の異なる生物学的に活性な分子に、容易に結合され得る。ブロックｚは、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンのような親油性基を含むポリマーを基礎にし、そしてエンドソームのリソソームへの成熟の間に周囲のｐＨが６以下に低下する場合、プロトン化され益々親油性になる。この増加する親油性で上記エンドソームの膜は漏れやすくなり、細胞質への高分子内容物の放出を生じる（３３、７４、７５）。ブロックｙ３は、ジスルフィド結合を含有し、それは脳毛細血管を含む血液循環においては安定であるが、細胞の還元的環境においては切断される（３８）。ブロックｙ１は、上記組織標的部分が標的細胞表面のレセプターに結合する事を可能にするポリエチレングリコールスペーサーを含む。それはまた、標的化ポリペプチドの分解に対しても保護する。（ｙ３）例えばラミニンのα１鎖のような腫瘍必須遺伝子の発現を特異的にブロックするモルホリノオリゴヌクレオチドが、使用される。原則的に、任意の他の薬物またはプロドラッグがここでおよび単一キャリア分子上の異なる薬物のアレイで結合され得る。これらの結合体は、細胞質内で薬物放出単位でキャリアから切断されそして薬物（単数または複数）が有効になる。ブロックｙ１は、上記ＢＢＢの内皮細胞上のトランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体により標的化されるＢＢＢを突破し易くする（５５）。ブラジキニン単独または他の分子と結合されたブラジキニンは、特異的レセプターに基づいて脳腫瘍に使用されるべき標的化分子になり得る（７７、１８および７８）。脳腫瘍特異的標的化に関する更なる可能性は、ヒトＥＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体を使用することである（３７，７９）。ブラジキニンＢ２レセプターおよびＥＧＦＲは、腫瘍細胞上で過剰発現し、トランスフェリンレセプターとの組合わせで、脳腫瘍標的化部位として使用され得る。ブロックｎは、任意の蛍光標識（ここではフルオロセイン）を付加し、受容体の腫瘍細胞のエンドソームにおいて上記キャリアのホーミング研究を容易にする薬物構造に結合する。
【００３０】
（材料および方法）
ポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＬＡ）を、（２５）から開発された方法を使用して培養Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ変形体のブロスから精製した。塩の形態の上記ポリマーをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムでサイズ分画をした。数平均分子量５０ｋＤａ（多分散度１．２）を有する画分をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０（Ｈ＋形態）を通して遊離酸ポリマー（ＰＭＬＡ−Ｈ）に変換しキャリア合成に使用するまで凍結乾燥で保存した。Ｄ２Ｏ中の１Ｈ−ＮＭＲは以下のδ値：３．３ｐｐｍ（ｄ、ポリエステル主鎖のメチレンのプロトン）、５．３ｐｐｍ（ｔ、ポリエステル主鎖のメチンのプロトン）、を示した。プロトン−ブロード−バンド−デカップル（Ｐｒｏｔｏｎ−ｂｒｏａｄ−ｂａｎｄ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ）１３Ｃ−ＮＭＲは、以下のδ値：１７８．４ｐｐｍ（−ＣＯＯＨ）、７４．５ｐｐｍ（−ＣＨＯＨ−）、３８．９ｐｐｍ（−ＣＨ２−）および１７４．５ｐｐｍ（−ＣＯ−）を示した。精製ＰＭＬＡ−Ｈは、２２０ｎｍ以下のみの波長にＵＶ光吸収を示し、核酸およびタンパク質のそれぞれの代表的な２６０および２８０での吸収はない（更なる詳細は２７に概説されている）。ラミニン−８のα−４鎖（ＡＧＣ−ＴＣＡ−ＡＡＧ−ＧＣＡ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＧＣ−ＴＧＡ−Ｃ）およびラミニン−８のβ−１鎖（ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＡＣＴ−ＧＧＡ−ＧＡＡ−ＧＣＣ−ＣＣＡ−ＴＧＣ−Ｃ）（５０、３４）に対するモルホリノＴＭ−３’−ＮＨ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（（６）をＧｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ（ＵＳＡ）より購入した。１０ｍＭアジ化ナトリウムを含有する１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳの濃度におけるラットトランスフェリンレセプターＣＤ７１に対するマウスモノクローナル抗体（クローンＯＸ−２６、アイソタイプＩｇＧ２ａ）をＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ（ＵＫ）から得た。マウスＩｇＧ２ａ，κ（ＵＰＣ１０）をＳｉｇｍａ（ドイツ）から購入した。クロマトグラフィーで純粋なｍＰＥＧ−アミン（分子量  ５０００）およびアミン−ＰＥＧ−アミン（分子量  ３４００）をＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＵＳＡ）から得た。Ｍｅｒｃｋ（ドイツ）、Ｓｉｇｍａ（ドイツ）Ｐｉｅｒｃｅ（ＵＳＡ）から得た試薬および溶媒は、入手可能な最高純度のものであった。ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を、モレキュラーシーブ（０．４ｎｍ）で乾燥した。
【００３１】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＤＭＸ−５００フーリエ変換スペクトル計に記録し、化学シフトを、ＴＭＳを内部標準として相対的にｐｐｍ（δ）で示す。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを１２５．８ＭＨｚで操作する同じスペクトル計で記録した。クロマトグラフ的な分離を、ＵＶおよび蛍光の検出器を備え付けたＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ分析用ＬａＣｈｒｏｍ  Ｄ−７０００  ＨＰＬＣ系で実施した。１．５ｍｌ／分の流速で０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水溶液−０．０７％ＴＦＡアセトニトリル溶液の２勾配のＭａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ  Ｃ１８−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ逆相（ＲＰ）カラム（２５０×４ｍｍ）、または流速０．７５ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４を用いるサイズ排除カラムＢｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ２５０−５（５μｍ、３００×７．８ｍｍ）のいずれかを使用した。ポリマーのＮａ塩またはＫ塩の分子量を、規定された分子量の標準ポリスチレンスルホン酸塩（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をＭｅｒｃｋの予めコートされているシリカゲル６０  Ｆ２５４アルミニウムシート上で実施した。溶出液は、ｎ−ブタノール、水および酢酸（容量比ベースで４：２：１）を含有した。
【００３２】
（合成）
（ＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルの合成）
１．１６ｇのＰＭＬＡ−Ｈ（リンゴ酸モノマーに関して１０ｍｍｏｌ）を、３０ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１５ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍ）に溶解し、これを、ＰＭＬＡ−Ｈ溶液に添加した。温度を氷浴で０℃まで下げて、その後１０ｍｌのＤＭＦに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１５ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を、気体の泡が発生しなくなるまで減圧下、室温で保持した。０℃で３０分後に、その反応混合物を室温で４８時間攪拌した。上記反応混合物を、上述のように減圧下で保持し、反応の最初の日の間は２時間ごとに、その後、反応の２日目の間は６時間ごとにインキュベーションをした。反応の２日後、ジシクロヘキシル尿素をろ過で除去し、そしてその反応容量を減圧下エバポレーションで減少させた。新鮮な無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）を添加し、残りのジシクロヘキシル尿素を再び濾過により除去した。透明な反応混合物を、室温で１２時間攪拌し、ジシクロヘキシル尿素の残量（もしあれば）を、ろ過で除去した。その容量を１〜３ｍｌにまで、減圧下エバポレーションにより減少させ、そしてその生成物を酢酸エチルを加えて沈殿させた。その薄黄色の生成物（Ｐ１）を、ろ過で収集した。ジエチルエーテルを、最終比率１：１（酢酸エチル：ジエチルエーテル）を合わせるように、ろ液に加え、そしてさらなる明るい褐色の生成物（Ｐ２）を、ろ過で収集した。次いで、ｎ−ヘキサンを、最終比率が１：１：１（酢酸エチル：ジエチルエーテル：ｎ−ヘキサン）になるようにろ液に加えて、さらなる褐色の生成物（Ｐ３）をろ過で収集した。上記沈殿物を、それらの沈殿に使用したのと同じ溶媒に分散させ、低温（−２０℃）で一晩放置した。その生成物を濾過して、同じ冷溶媒で繰り返し洗浄した。その生成物を、ＤＭＦを溶出液として重力で流してＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０を通すことによりさらに精製した。生成物含有画分を、収集しそして溶媒を減圧下、エバポレートさせた。最後にその生成物をジエチルエーテルに分散し、ろ過により収集し、真空で乾燥し、−２０℃で保存した。
【００３３】
ＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルのこれらの調製物の純度／組成を、１Ｈ−ＮＭＲおよびＵＶ−ＶＩＳ分光法ににより分析した。ＮＨＳ基の含量を、ＮＨＳエステル基のｎ−ブチルアミンでのアミノリシス後に決定した。１０ｍｇのＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルを、０．５ｍｌのＤＭＦに溶解した。０．５ｍｌの１０％  ｎ−ブチルアミンの１部分をこの溶液に加え、そしてその反応混合物を、室温で３０分間インキュベートした。遠心分離後、２０μＬのサンプルを、８０μＬの水と混合し、水／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを溶出液として用いてＰＲ−ＨＰＬＣにより分析した。ＮＨＳ基を、２６０ｎｍの吸光度でモニターした。それらの含量は、既知量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド標準物質の吸光度と比較して計算した。ＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルサンプル中のリンゴ酸残基とＮＨＳ基とのモル比を、これらの結果と、１Ｈ−ＮＭＲで測定したマリル残基の量と合わせて計算した。代表的には、その比はＰ１、Ｐ２、およびＰ３に対してそれぞれ３５％、５９％および８５％であった。（ＣＤ３）２ＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲは、以下のδ値：２．８ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、Ｎ−ＣＯ−ＣＨ２−）、３．３５ｐｐｍ（ｄ、上記ポリエステル主鎖のメチレンのプロトン）、５．８５ｐｐｍ（ｔ、ポリエステル主鎖のメチンプロトン）を示した。上記反応は、図２に示される。
【００３４】
（（２−ピリジルジチオ）プロピオニル−モルホリノ（ＰＤＰ−モルホリノ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成）
モルホリノ−３（−ＮＨ２アンチセンスオリゴマー（１μｍｏｌ）を、９００μＬのＤＭＦおよび１００μＬの脱イオン水の混合物の中に溶解した。この混合物の中に、２０μＬの１００ｍＭのＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のＤＭＦ溶液を加え室温で２時間放置した。その溶媒を、減圧下、室温でロータリーエバポレーターで除去した。その残渣を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１ｍｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解し、緩衝液Ａで予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５マイクロスピンカラムで精製した。ＰＤＰ−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を、１ｍＭに調整して−２０℃で保存した。
【００３５】
その生成物の純度を、ＴＬＣおよびＵＶ分光法によりＮＨＳおよびＳＰＤＰの不存在を示して確認した。ＰＤＰ基の含量を、以下のようなジスルフィド還元後の２−チオピリドンの濃度を測定して決定した：ＰＤＰ−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ  トリス緩衝液ｐＨ９．０中の０．２Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）と室温で３０分間インキュベートした。その反応混合物を、最初１０分間蒸留水で洗浄し、次いで３０分間、０〜６０％のアセトニトリルの勾配で溶出することによりＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。その反応生成物２−チオピリドンを、３４１ｎｍのＵＶ吸光度で検出した。２−チオピリドンの濃度を、還元された２−アルドリチオール（ＤＰＤＳ）の既知量の吸光度を標準として使用して測定した。ＰＤＰ−モルホリノアンチセンスヌクレオチドの収率は、出発量のモルホリノ−３’−ＮＨ２オリゴヌクレオチドの８０％より通常は高かった。この反応は、図３に示される。
【００３６】
（Ｎ−（フルオレセイン−５’−チオカルバモイル）ジアミノヘキサンの合成）
フルオロセインイソチオシアネートアイソマーＩ（９０ｍｇ）（ＦＩＴＣ、最小９８％、０．２３ｍｍｏｌ）を、３ｍｌ  ＤＭＦに溶解し、そして７６ｍｇのＮ１−Ｂｏｃ−１，６−ジアミノヘキサン塩酸塩（０．３ｍｍｏｌ）を添加した。結合反応を０．６ｍｍｏｌのトリエチルアミンを滴下することにより始めた。その反応混合物を、室温で２時間インキュベートし、その容量を、減圧下エバポレーションにより減少させた（最終容量は、約０．５ｍｌ）。冷水（５ｍｌ）を、残っている混合物に加え、そして１Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。その沈殿を遠心分離で収集し、３回冷水で洗浄し、その後遠心分離し、上清にＮ１−Ｂｏｃ−１，６−ジアミノヘキサンがＴＬＣおよびニンヒドリン試験により検出されなくなった。上記最終生成物をＰ２Ｏ５で乾燥した。この合成は図４に示される。
【００３７】
そのＢｏｃ保護基を除去するために、その乾燥生成物を３ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、温度を氷浴で低下させた。２ｍｌのＴＦＡを、その溶液に加え、次いでこれを氷上で３０分間、攪拌した。その反応を、ＴＬＣで追跡した。蛍光スポットは、ＵＶ光で見えた。上記溶媒を減圧下でエバポレートし、蝋状生成物をアセトンに溶解しそしてジエチルエーテルの添加により沈殿させた。精製のために上記生成物を、１００ｍｌの混合物の中に４ｍｌの酢酸を含有する３ｍｌのＤＣＭ／エタノール（３：２，ｖ／ｖ）に溶解し、同じ溶媒で平衡化した２ｃｍ×１２ｃｍ  ＳｉＯ２カラムに通した。生成物はＴＬＣによると純粋であった。そのＲｆ値は、ＦＩＴＣに対しては、０．９５であり、Ｎ１−（フルオレセイン−５’−チオカルバモイル）−Ｎ６−ＢＯＣ−１，６−ジアミノヘキサンに対しては０．９８であり、Ｎ−（フルオレセイン−５’−チオカルバモイル）ジアミノヘキサンに対しては０．６４であった。
【００３８】
（Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）ポリ（エチレングリコール）の合成）
３ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した０．５ｇのＮＨ２−ＰＥＧ３４００−ＮＨ２（０．１４７ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した（３−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル）（１０６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）に室温で激しく攪拌しながら滴下した。上記反応の完結を、ＴＬＣおよびニンヒドリン試験陰性により確認した。室温で２時間インキュベーション後、その溶媒を減圧下、室温でロータリーエバポレータで除去した。生成物を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２ｍｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解した。不溶性の不純物を、遠心分離で除去した。透明な上清を、予め緩衝液Ａで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムに通した。上記生生物はＴＬＣおよびニンヒドリン試験では純粋であった。上記生成物の水溶液を、−２０℃で保存した。
【００３９】
（ＣＤ３）２ＳＯに溶解した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、以下のδ値：７．０５ｐｐｍ、ｓ、４Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ−；３．７４ｐｐｍ、ｔ、２Ｈ  Ｎ−ＣＨ２；３．５、ｓ、ＰＥＧからの水素；３．０３、ｔ、２Ｈ  ＣＨ２−ＣＯＮＨを示した。上記の値は、予測されるＮ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）ポリ（エチレングリコール）ジアミドである生成物と一致した。マレイミド基の含量を、−ＨＣ＝ＣＨ−と所定量の２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）のスルフヒドリル基との反応に依存する方法および未反応スルフヒドリル基の、５，５’−ジチオビス−２−ニトロベンゾエート（ＤＴＮＢ，Ｅｌｌｍａｎ試薬）での以下のような滴定により、間接的に測定した。水中の適切な量の２−ＭＥＡを、Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）ポリ（エチレングリコール）ジアミドの水溶液に加え、室温で３０分間インキュベートした。ＤＴＮＢ（２５μＬの１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液）を加え、そして室温で１０分間インキュベートした後、４１２ｎｍの吸光度を読んだ。その吸光度は、既知の量の２−ＭＥＡで標準化し、未反応スルフヒドリル基の量を計算した。Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）ポリ（エチレングリコール）ジアミドのサンプル中のマレイミド基の含量を、２−ＭＥＡの量を最初の量から未反応２−ＭＥＡの引き算することにより計算した。この値からＮ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ポリ（エチレングリコール）ジアミドの合成の収率は、６５％と計算された。この合成は、図５に示される。
【００４０】
（抗体へのチオール基の導入：固有のジスルフィド結合の、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）による還元）
ラットトランスフェリンレセプターＣＤ７１（クローンＯＸ−２６、アイソタイプＩｇＧ２ａ）に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を、１０ｍＭのアジ化ナトリウムを含有する１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳの濃度の市販品を入手した。ｍＡＢ  ＯＸ−２６の代わりにマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ，κ（ＵＰＣ  １０、Ｓｉｇｍａ）を使用し、コントロール結合体およびタンパク質測定用の標準曲線を作製そた。上記ｍＡＢ  ＯＸ２６溶液をミクロ遠心膜フィルター（Ｓｉｇｍａ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬミクロ遠心膜フィルター、再生セルロース、カットオフ３０ｋＤａ）を使用して、４℃、５０００×ｇで濃縮した。上記ｍＡＢ貯蔵緩衝液を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に変えた。ｍＡＢの濃度を３〜５ｍｇ／ｍｌに調整した。マウスｍＡＢ  ＵＰＣ  １０を、緩衝液Ａに溶解し、ｍＡＢ
ＯＸ２６と同じ濃度にした。固体の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）（６ｍｇ／ｍｌ）を、抗体溶液の中に攪拌し、その混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。そのジスルフィドが還元された抗体を、ミクロ遠心膜フィルター（再生セルロース、カットオフ３０ｋＤａ）を使用して、４℃、５０００×ｇで、緩衝液Ａ（Ｎ２下で脱気）を用いて膜分離精製した。その工程を、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ，Ｅｌｌｍａｎ試薬）とのインキュベーションの後に４１２ｎｍで分光光学的に測定して、膜分離精製物に２−ＭＥＡが完全に無くなるまで実施した。ジスルフィド還元抗体溶液中のチオール基の数を、ｐＨ８．０で０．５ｍｌの抗体溶液と２５μｌのＤＴＮＢ溶液（エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ）とを１０分間インキュベートした後で、４１２ｎｍの吸光度（２５℃で、ｅ＝１４．１５×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）を読み取って計算した。その抗体タンパク質の濃度を、（６５）の方法に従って測定した。結果は、上記ジスルフィド還元抗体が、Ｉｇ分子１モルあたり３．１〜３．５のチオール基を含むことを示した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、分子量１５０ｋＤａの１つのピークのみを示し、これは上記還元抗体がその分子の集積度を維持していることを示した。還元剤が不存在でさえも、ＥＤＴＡの存在下では上記調製物はむしろ安定であって、そして遊離のチオール基の有意な損失は４℃で一晩では観察されなかった。
【００４１】
（ｍＡＢ  ＯＸ−２６／Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミド結合体の合成）
調製直後に、還元抗体の溶液を攪拌しているＮ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミド（抗体のチオール基に対して５０倍のモル過剰なマレイミド基）の水溶液に、室温で滴下した。その反応混合物を、室温で２時間インキュベートし、未反応のＮ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミドを、緩衝液Ａ（５０ｋＤ膜、一晩で緩衝液交換３回）の中で透析により除去した。抗体−Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミド結合体の調製物を、さらなる合成反応のために直ちに使用した。
【００４２】
上記結合反応の完結をＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果で示した。２２０ｎｍで吸光度を測定している場合、溶出した物質のみが、結合体をあらわす７．２０〜７．２６分の位置にあり、一方、未反応Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミドに関する１３．４〜１３．７分の位置には、何も溶出しなかった。上記抗体結合体のマレイミド基の含量を、Ｎ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミドの合成に関する上述の２−ＭＥＡおよびＥｌｌｍａｎ試薬を使用して間接的に決定した。抗体タンパク質の濃度を、（６５）の方法に従って決定した。その結果は、抗体１分子あたり３．０のマレイミド基を示し、そしてジスルフィド還元抗体調製物の遊離のチオール基が、完全にＮ，Ｎ’−ビス−（３−マレイミドプロピオニル）−ＰＥＧジアミドと反応したとする仮定と一致した。さらに、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、分子量１５０ｋＤａの１つのピークのみを示したので、架橋生成物は除外され得る。
【００４３】
（ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２結合体の合成）
ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体の合成のために、１ｍｍｏｌ（マリル単位に関して）のＰＭＬＡ−ＮＨＳエステル（調製物Ｐ３：８５％ＮＨＳエステル）を、１０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解した。最初に、ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２（２ｍＬ  ＤＭＦ中５０μｍｏｌ、ＮＨＳ活性化マリル単位の５モル％に相当する）および２００μｍｏｌのＮ−エチルモルホリンを、この順で加え、そして上記混合物を室温で３０分、反応がＴＬＣとニンヒドリン試験（原点でのニンヒドリン反応陽性に対して反応陰性）により完結するまで攪拌した。次にＤＭＦ中の２００μｍｏｌの５０ｍＭの２−ＭＥＡ（ＮＨＳ−活性化マリル基の２０モル％に相当する）のＤＭＦ溶液と２００μｍｏｌのＮ−エチルモルホリンを、上記反応混合物に加えて、室温で３０分間攪拌した。再び上記反応をＴＬＣ（２−ＭＥＡに対してＲｆ＝０．２７、ポリマー結合体に対してＲｆ＝０）とニンヒドリン試験とで完結させた。この合成は、図６に示される。
【００４４】
添加試薬の化学量論に従うと、ＰＭＬＡ−ＮＨＳエステル当量の４．５％および１９．３％が、それぞれＰＥＧおよび２−ＭＥＡに置き換えられた。残存する未反応ＮＨＳエステル当量を、Ｌ−バリン（５ｍｌの水に１ｍｍｏｌ）に結合させ、０．１ｇのＮａＨＣＯ３（１．２ｍｍｏｌ）の存在下で滴下した。その反応混合物を、室温で１時間攪拌し、冷却しながら０．１Ｍ  ＨＣｌで中和した。その溶媒を、減圧下３０℃でエバポレートさせた。乾燥生成物を１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍｌの０．５ＭのＤＴＴを含有する１０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解した。室温で１０分後、その混合物を２００００×ｇで、５分間遠心分離し、透明な上清を、予め緩衝液Ａで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（２．５ｃｍ×６０ｃｍ）を通し、そして生成物含有画分を凍結乾燥した。
【００４５】
ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体の組成を１Ｈ−ＮＭＲおよびＵＶ−ＶＩＳ分光光学分析により分析した。チオール基の含量を、１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０、１００ｍＭ）に溶解した１ｍｇの凍結乾燥結合体に２５μｌのＤＴＮＢ溶液（エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分間インキュベーションした後４１２ｎｍの波長での吸光度を読取ることにより測定した。ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２／ＦＩＴＣ結合体の調製の場合（以下を参照のこと）、反応混合物はまた、ミクロ遠心分離膜フィルター（再生セルロース、５ｋＤａカットオフ）を使用して、５０００×ｇで膜分離精製し、４１２ｎｍの吸光度を読んだ。チオールを分析するＥｌｌｍａｎ方法は、チオールと発色性ＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸、ＦＷ  ３９６．４）との反応に基づいており、それにより黄色の５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の形成が測定される。
【００４６】
【化１】
2010163468.tif 000003
ＦＩＴＣ−結合体の場合のろ過の理由は、蛍光の存在がＴＮＢの検出を不可能にするので、ＴＮＢをＦＩＴＣ結合体から分離するためである。そのろ過の間、ＴＮＢは膜を通過し、ＦＩＴＣ−結合体が留まり、そして、ろ液の吸光度が測定される（上記ろ過は遊離の色素の除去のためではない。上記遊離の色素はこの反応の前に既に除去されている）。
【００４７】
スルフヒドリル含量を、２−ＭＥＡ標準に関して計算した。Ｌ−バリン部分の含量を、以下のようにトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用した加水分解およびＲＰ−ＨＰＬＣの後に、遊離のアミノ基を定量することにより決定した：１ｍｇの上記結合体と３０〜５０μＬの６Ｎ  ＨＣｌを、１００μＬキャピラリー試験管に入れた。封をしたきゃピラリーを１００℃で１２〜１６時間、オーブンでインキュベートした。加水分解の後に、内容物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ（定量的にするためにそのキャピラリー試験管を水で濯ぐ）に移して、穏やかに加温することにより完全に乾固するまでエバポレートさせた。この物質を水に溶解して、そして遠心分離した。１０〜３０μｌアリコートの上記上清を、３００μＬの重炭酸ナトリウム緩衝液（１０ｍｌの水に０．４ｇの重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．５）に添加した。１５０μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ水溶液の添加後に、上記混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。遠心分離後、２０μＬのその反応混合物を３０分の線型勾配（０〜１０分、１００％水、１０〜４０分、０〜６０％アセトニトリル）を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。バリル部分の含量を既知量のＬ−バリンを標準として溶出物の３４０ｎｍの吸光度を基礎にして計算した。ｍＰＥＧ：バリン：２−ＭＥＡのモル比を１Ｈ−ＮＭＲにより決定した。
【００４８】
（ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体の合成）
新しく調製されたｍＡＢ  ＯＸ−２６−ＰＥＧ−マレイミドを、ＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体に、４℃で、攪拌しながら滴下した。マレイミド基に対して１００モル過剰の遊離チオール基（結合体）を用いて、全ての抗体が上記ポリマーと結合するようにした。３０分のインキュベーション後、上記反応を完結した。上記反応の完結度をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認した。上記ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体を、ミクロ遠心分離膜フィルター（再生セルロース、分子量  １００ｋＤａカットオフ）を使用して、緩衝液Ａの中で４℃、５０００×ｇでの膜分離精製により精製した。ｍＡＢ含有ＰＭＬＡ結合体は、フィルターに留められ、そしてタンパク質フリーのＰＭＬＡ／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体のみがそのフィルターを通過した。上記膜分離精製を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認して膜分離精製物にタンパク質フリーののポリマー結合体の痕跡も無くなるまで繰り返した。
【００４９】
ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体のタンパク質含量を、（６６）の方法により測定した。非結合ｍＡｂの同じ量が、約１０％高い吸光度を示し、従って、測定されたタンパク質含量を０．９のファクターで補正した（このファクターは、抗体が、膜分離精製で洩れないことが分かったが、留まった（結合）抗体は、原料抗体の９０％しか達しなかった事実から実験的に引き出されたものであった）。この食い違いの理由は、不明である。タンパク質含有結合体の残存する遊離のチオール基の濃度を、上述の如く決定した。最初のチオール基の約７０％が、まだ存在していたことを見出した。タンパク質含有結合体の濃度を、チオール基に関して３ｍＭに調整した。
【００５０】
次の工程で、ラミニン８のα４およびβ１鎖に対する５μｍｏｌのＰＤＰ−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（５ｍｌの１ｍＭ  ＰＤＰ−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液）を、１５μｍｏｌ遊離のチオール基の濃度と等しくして、ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体（５ｍｌの３ｍＭ  タンパク質含有結合体溶液）の精製した溶液に、攪拌しながら滴下した。アンチセンスα４鎖：アンチセンスβ１鎖のモル比は、１：１であった。その反応混合物を４℃で一晩インキュベートした。上記反応の完結度を、２６０ｎｍの吸収を有する溶出物の単一ピーク、および遊離のＰＤＰ−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置における吸収の不存在を示すＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認した。得られたＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体を、ミクロ遠心分離膜フィルター（再生セルロース、分子量  １００ｋＤａカットオフ）を使用して、４℃、５０００×ｇでの膜分離精製により精製した。この段階での遊離スルフヒドリル基の含量を、４１２ｎｍで、Ｅｌｌｍａｎ試薬で決定した。アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドの含量を、ジスルフィド基の５０ｍＭ  ＤＴＴによる３７℃、２時間の還元およびＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分離後、２６０ｎｍにおける吸光度により測定した。特に、その２６０ｎｍの光吸収ピークを、還元されたＰＤＰ−モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを標準として得られるピーク比較した。
【００５１】
ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体のタンパク質含量を、（６５）の方法で測定した。抗体：モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのモル比はは１：２０〜１：２６で変化したが、それでｙ１値が０．１９％〜０．２５％になる（全体の合成は、図７を参照のこと）。遊離のスルフヒドリル基を、Ｎ−エチルマレイミドでブロックし、未反応試薬を上のような膜分離精製により除去した。
【００５２】
（ＦＩＴＣのＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体への結合）
生物学的条件下での検出のために、ＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体を、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で、共有結合的に標識化した。この標識は、しかしながら、上で示されたＰＥＧ−ＮＨ２のＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルへの結合の後に導入された。Ｎ−（フルオレセイン−５’−チオカルバモイル）ジアミノ−ヘキサンの溶液を、ＤＭＦおよびＰＢＳ（１：１）の混合物中で最終濃度が２５ｍＭになるように調製した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２／ＰＭＬＡ結合体の溶液（ＰＭＬＡ−ＮＨＳエステルのマリル単位に対して１ｍｍｏｌ、調製Ｐ３：８５％  ＮＨＳエステル）に、２５μｍｏｌのＮ−（フルオレセイン−５’−チオカルバモイル）ジアミノ−ヘキサン（図７のｎ＝２．５％）および１００μｍｏｌのＮ−エチレンモルホリンを加えて、それからその混合物を室温で３０分間インキュベートした。その反応をＴＬＣで追跡した。反応完結後に、蛍光を原点のみにおいて検出した。ＦＩＴＣのＰＭＬＡ／ｍＡＢ  ＯＸ−２６／モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド／Ｌ−バリン／２−メルカプトエチルアミン／ｍＰＥＧ−ＮＨ２結合体への構築については、色素の不存在下、上述と同じ経路に従った。上記結合体のＦＩＴＣ含量を、４９０ｎｍでのＦＩＴＣ部分の吸収により測定した。ＦＩＴＣ−担持結合体もまた、４４７ｎｍにセットした励起波長および５１４ｎｍにセットした発光波長でＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈ蛍光検出計により検出した。ＦＩＴＣの含量を、上述の如くポリマーを担持する変化する量のＦＩＴＣの定量的な結合により形成した標準サンプルの吸光度または蛍光とサンプルの吸光度または蛍光を比較して計算した。上記結合体を、直接細胞培養実験に使用した。この合成は図８に示される。
【００５３】
（溶血アッセイ）
図９は、赤血球（ＲＢＣ）溶血アッセイを使用して測定したポリマーの膜崩壊活性を示す。新鮮なヒトＲＢＣを、ヒト全血を２０００ｇで５分間遠心分離することにより単離した。上記ＲＢＣを所望のｐＨ（ｐＨ５．８５またはｐＨ５．５）の冷１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄した。最終ペレットを同じ緩衝液に再懸濁して、１ｍｌあたり１０８  ＲＢＳを有する溶液にした。そのポリマーを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、所望のｐＨにおける１００ｍＭの２塩基性のリン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。上記ポリマー濃度は、２．５ｎｍｏｌ／１０８  ＲＢＣであった。１００％リーシスを達成するために、蒸留水中での溶血を使用した。ポリマーを有さない緩衝液中のＲＢＣを、参照コントロールとして使用した。溶血アッセイを、１ｍｌの適切な緩衝液に懸濁したＲＢＣに上記ポリマーを添加することにより実施した。上記ＲＢＣを、数回試験管をひっくり返して混合し、３７℃の水浴で１時間インキュベートした。インキュベーション後、上記ＲＢＣを１３，５００×ｇで１０分間遠心分離をし、インタクトな細胞を沈降させ、リーシスを、ＲＢＣにより放出されたヘモグロビンの量を反映する５４１ｎｍにおける上清の吸光度を測定することにより決定した。細胞のない上清の５４１ｎｍの波長における吸光度の相対的増加１００（Ａ−Ａ０）Ａ合計を、膜崩壊の指標として測定した。その結果は、ＲＢＣ膜を安定化するＰＭＬＡ−ＰＥＧとは反対に、ＰＭＬＡ−ＰＥＧ−バリン、ＰＭＬＡ−ＰＥＧ−バリン−ＡＳ、およびＰＭＬＡ−ＰＥＧ−バリン−ＡＳ−ｍＡＢは、膜不安定性を暗示することを示す。比較は、不安定性はＰＭＬＡ−結合バリンの存在に起因することを示す。ｐＨが下がっていく（エンドドームのリソソームへの成熟を模擬する）と、バリンのカルボキシル基がプロトン化され、電荷が中和されたバリン部分の増加した親油性に起因して、不安定性は、増加する。
【００５４】
（モルホリノ−オリゴの放出）
図１０ａおよび図１０ｂは、グルタチオン（グルタチオン−ＳＨ）によりジスルフィド結合の切断に起因する、薬物キャリアからのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの放出を示す。ジスルフィド結合の切断は、２工程反応である。最初の工程は、１当量のグルタチオン−ＳＨが、ジスルフィドと反応して混成ジスルフィドアンチセンスオリゴヌクレオチド−Ｓ−Ｓ−グルタチオン（縞の縦棒）（図１０ａ）および１当量の遊離のアンチセンスオリゴヌクレオチド−ＳＨ（１色の縦棒）を形成する。時間が経つにつれて混成ジスルフィドが減少し、遊離のアンチセンスが増加する。この反応は、図１０ｂに示されるように迅速である。２番目の工程は、混成ジスルフィドが第２当量のグルタチオンと反応してジスルフィドグルタチオン−Ｓ−Ｓ−グルタチオンおよび遊離のオリゴヌクレオチド−ＳＨを生じる。この第２反応はゆっくりである。この反応の２工程のメカニズムおよび相対的速度は、いわゆるジスルフィド交換反応と呼ばれるこの反応に関して代表的である。その結果は、上記オリゴヌクレオチドが、細胞質で薬物キャリアから非常に効率的に切断され、それはこの所定の濃度のグルタチオンを含むことを示す。
【００５５】
図に示されるように、薬物ビヒクルからアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドの細胞質放出を模倣するために、５ｍＭ  ＧＳＨ（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン、分子量３０７．３３）を、室温で上記反応混合物に添加した。その混合物は、水中に０．２５ｍＭの薬物ビヒクルを含有した。いろいろな時に、全スルフヒドリル部分に対して過剰のＮ−エチルマレイミド（最終濃度、２０ｍＭ）の添加により、上記反応を停止した。還元アンチセンスをＮ−エチルマレイミジルアンチセンスとして検出した。上記反応生成物を、ＨＰＬＣにより分離し、放出されたアンチセンスモルホリノを２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により検出した。その結果は、図１０ｂに示される。完全な（１００％）放出は、５０ｍＭ  ＤＴＴの存在下において３７℃１時間の還元と関係付けられる。ＨＰＬＣ分析を、ゲルろ過カラムを使用してＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈ分析用ＨＰＬＣで実施した。分離については、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を使用して、流速０．７５ｍｌ／分でＭａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ  １２５−５  ＧＦＣ−ＨＰＬＣカラム（３００×７．７ｍｍ）で実施した。
【００５６】
（ヌードラットの脳で増殖したヒト神経膠腫の、ポリリンゴ酸に結合したラミニン−８アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理）
腫瘍を処置し、そして正常細胞に対する副作用を減少させる特定の薬物送達は、すばらしいことである。タンパク質合成のレベルにおいて数種の分子標的を同時に阻害することは、腫瘍の増殖および進行を抑制することに非常に有効であり得る。ラミニン−８鎖の過剰発現は、神経膠腫の進行と関連し、ラミニン−８をブロッキングすることは、インビトロで神経膠腫侵襲を阻害する（３４）。
【００５７】
（方法）
（ポリリンゴ酸（ＰＭＬＡ））
多機能性薬物送達構築物は、ポリリンゴ酸（ＰＭＬＡ）のぶら下がっている（ペンダントな）カルボキシル基に結合するモジュールより構成される。そのポリマーは、Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍの天然産物である（２７）。上記モジュールは、以下である：（１）ジスルフィド結合により上記骨格に結合するモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（その結合が、細胞質で切断され、遊離の薬物を放出する）、（２）癌細胞標的化およびレセプター媒介性エンドサイトーシスのためのトランスフェリンレセプターの抗体、（３）短鎖ＰＥＧ結合Ｌ−ロイシンおよび直接結合Ｌ−バリン（両方がアミド結合を介して連結されているが、エンドソーム膜を崩壊させるｐＨ依存性の親油性を提供する）、（４）循環時間を増加する長鎖ＰＥＧ、および（５）組織／細胞内において構築分子を検出する蛍光レポータ分子（フルオレセイン、Ｃｙ５または同様な発色団）。
【００５８】
（動物処置に使用された薬物の配合）
薬物１：ラミニンα４に対するアンチセンスオリゴ＋ラミニンβ１に対するアンチセンスオリゴ（α４：β１＝１：１）；
薬物２：ラミニンα４に対するアンチセンスオリゴ＋ラミニンβ１に対するアンチセンスオリゴ（α４：β１＝１：１）＋速く分裂している細胞に対する送達ビヒクルとしての抗トランスフェリンレセプターモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからのラットＣＤ７１に対する抗体ＯＸ−２６）（３５、３６、３７および３８）；
薬物３：ラミニンα４に対するアンチセンスオリゴ＋ラミニンβ１に対するアンチセンスオリゴ＋ＥＧＦＲに対するアンチセンスオリゴ（α４：β１：ＥＧＦＲ＝１：１：１）；
薬物４：ラミニンα４に対するアンチセンスオリゴ＋ラミニンβ１に対するアンチセンスオリゴ＋ＥＧＦＲに対するアンチセンスオリゴ（α４：β１：ＥＧＦＲ＝１：１：１）＋抗トランスフェリンレセプター抗体；
薬物１Ａ、２Ａ、３Ａおよび４Ａは、対応する番号の薬物に対して同一である（即ち薬物１と薬物１Ａは同じである）。対応するセンスオリゴを、アンチセンスオリゴの代わりに使用した。
【００５９】
薬物１：ＰＭＬＡに結合したラミニンα４鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびラミニンβ１鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド；薬物２：ＰＭＬＡに結合したラミニンα４鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ラミニンβ１鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗トランスフェリンレセプターモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからの抗体ＯＸ−２６）。コントロール（薬物１Ａおよび薬物２Ａ）は、対応するセンスオリゴにより置き換えられたアンチセンスオリゴとの同じキャリア結合体であった。上記ヒトＵ−８７ＭＧ神経芽膠腫細胞株を、インビトロ実験に使用し、異系勾配されたホモ接合体のＮＨＲＮＵ−Ｍ  ＮＩＨヌードラット（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｉｎｃ．）に、頭蓋内に注入した。
【００６０】
異系勾配されたＮＩＨヌードラット（Ｔａｃ：Ｎ：ＮＩＨ−Ｗｈｎ、Ｔａｃｏｎｉｃ）を、これらの試験に使用した。アンチセンス処置について、最も特異的で、安定でインビトロおよびインビボに有効であるとしてモルホリノオリゴ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣ）を使用した。モルホリノは、インビトロ研究で過去に成功裏に使用されたが、インビボでは、それらの送達はうまく行かなかった（６、７）。ポリ−Ｌ−リンゴ酸（ＰＭＬＡ）は、細胞にモルホリノを細胞に入れる送達キャリアとして使用された。ＰＭＬＡの精製方法の原理が、（２５）に記載されている。最近のＰＭＬＡのスケ−ルアップ生産方法（２７）を使用した。ＰＭＬＡ官能基の化学が調査され（２８、２９）、そして有機溶媒および水性溶媒両方における生成物の誘導体化および精製は容易に達成し得る。我々の実験に関して、ＰＭＬＡを、標的化腫瘍に特異的なラミニン−８鎖に加えて、ＰＭＬＡはトランスフェリンレセプターに対するモノクローナル抗体に化学的に結合し、早く分裂する細胞に最も特異的な薬物を作製した（３５、３６、３７および３８）。
【００６１】
予備的な毒性研究を、合成が完了した後に、モルホリノオリゴヌクレオチド、ＰＭＬＡおよびそれらの結合体について実施した。それぞれの化学品を投与後３０日に、肉眼での病理学的分析および顕微病理学的分析を行ったが、異常な変化は認められなかった。動物は、神経学的異常を発症しなかったし、それらの食欲もまた、正常であった。動物試験被験体は、定位的デバイスを使用してヒト経芽膠腫細胞Ｕ−８７ＭＧを頭蓋内に注入することにより作製した。薬物処置は、腫瘍細胞注入後３日目で開始した。
【００６２】
頭蓋内処置について、以下に図示するように、ラットにアンチセンスオリゴを３日目、７日目、１０日目および１４日目（全部で４処置）に注入した。
【００６３】
【化２】
2010163468.tif 000004
各群１２匹のラットにラミニン−８α４鎖に対するオリゴ＋β１鎖に対するオリゴを、０．５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇの用量で注入した。各コントロール群１１匹のラットに、α４鎖に対するセンスオリゴ＋β１鎖に対するセンスオリゴを、０．５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇの用量で注入した。全ての外科的および非外科的操作を、２００３年８月付けのＩＡＣＵＣプロトコル００１１１８に従って行った。頚動脈内の処置について、腫瘍移植直後にカテーテルを頚動脈に移植した。カテーテルを、移植可能な皮下注入ポートに結合した。ラットに９００μｌのアンチセンスオリゴ溶液およびセンスオリゴ溶液（１分当たり０．０６ｍｌで１５分間、蠕動ポンプで）を右頚動脈に皮下ポートチャンバ経由で潅注し、引き続きヘパリンロック（ｈｅｐａｒｉｎ  ｆｌｕｓｈ）した。ラットを潅注終了後３０分以内に安楽死させた。上記コントロールは：（ａ）正常なコントロール組織を得るために如何なる処置もせず、４０日目に安楽死させた３匹のラット、および（ｂ）腫瘍を有し、１日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目にＰＢＳで頭蓋内に擬似注入し、腫瘍の進行に起因する神経症状を発症させるとすぐに組織採取のために安楽死させた４匹のラットからなった。
【００６４】
（結果）
（頭蓋内腫瘍処置）
薬物２の０．５および２．５ｍｇ／ｋｇの用量は、生存率研究における処置と同等であった。頭蓋内投与による薬物２の４回の投薬後に、動物の生存時間が、ＰＢＳ（擬似）またはセンスオリゴ（薬物２Ａ）で処置されたラットと比較して、３０％増加した、ｐ＜０．００８（図１１）。しかしながら、２つの処置は、僅かな効果しかなかった。トランスフェリンレセプター抗体の無い薬物１は、生存率には影響しなかった。従って、薬物細胞送達のメカニズムは、おそらくトランスフェリン媒介性エンドサイトーシスである。興味深いことに、アンチセンスをＥＧＦＲ結合薬物２（薬物４）へ添加することにより、活性が無くなったが、おそらくＥＧＦＲが阻害された低酸素状態で、神経膠腫細胞の生存率の増加に起因するであろう（３９）。
【００６５】
薬物の内在化のメカニズムを、培養神経膠腫細胞において調査した。細胞がフルオレセイン標識化薬物２およびローダミン標識化エンドソームマーカーＦＭ  ４−６４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で処理された場合、両方の化合物の染色は、共局在化を示した。１０分以内に細胞膜の近くに共局在化し、３０分以内に両方の標識がエンドソームに見出された（図１２）。
【００６６】
細胞がトランスフェリンレセプターで予め処理され、次いで１０分以内に薬物２で処理された場合、上記薬物は、細胞質に見られなかった（データは、示されていない）。これらの結果は、トランスフェリンレセプター抗体が、活性薬物の一部として必要であることを示唆する。何故なら、それは薬物の細胞への透過を、レセプター媒介性のエンドサイトーシスにより可能にし、その後上記アンチセンスオリゴが標的細胞内に放出され得るからである。もし上記細胞がトランスフェリンに対する遊離抗体で処理される場合、上記レセプターは、ブロックされ、上記薬物上の抗体は結合できない。
【００６７】
本発明者らは、薬物２がヌードラットに異種移植されたヒト神経膠腫における血管密度および特異的なラミニン鎖発現を減少させることを、発見した。本発明者らは、ラミニン−８発現を阻害するよう設計された薬物２が腫瘍における血管密度を減少させることを、示した。これらの血管を、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子を免疫染色することにより可視化した。血管の数を、薬物処置動物および未処置動物において、画像計測システム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）に連結されたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ顕微鏡を使用して、２００倍の倍率で、３つの連続切片について５つの顕微鏡視野（１腫瘍ににつき１５視野）において数えた。このデータをＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウエアに入力し血管密度を定量した。統計的有意差を、ＡＮＯＶＡにより決定した。
【００６８】
（血管新生）
図１３に示されるように、処置しないＵ８７ＭＧヒト腫瘍における毛細血管密度は、正常脳より有意に高かった。薬物２での４回の頭蓋内処置後、腫瘍血管密度は、５５％減少した。データは、３匹の擬似手術した（正常）ラット（４５顕微鏡視野）、未処置腫瘍を有する５匹のラット（７５顕微鏡視野）および薬物２処置腫瘍を有する５匹のラット（７５顕微鏡視野）について提示された。この結果は、ラミニン−８発現を阻害するよう設計された薬物２の作用の抗血管新生メカニズムを確証する。
【００６９】
（ラミニン鎖免疫染色）
薬物２が事実上標的化ラミニン−８鎖の発現を阻害することを示すことは重要である。この目的に対して、インビボおよびインビトロで実験を実施した。腫瘍の免疫染色について、ラットラミニンを認識しないが腫瘍由来ラミニンとは反応するヒトラミニン−８β１鎖に対する抗体を、使用した。図１４は、上記アンチセンスが免疫染色を、効果的に除去する細胞培養における効果を示す。図１５に示されるように、薬物２がまた、異種移植したヒト腫瘍においてラミニンβ１鎖についての免疫染色を、効果的に減少させた。
【００７０】
インビトロにおけるラミニン−８発現の阻害は、薬物２で３日間処置した２種の培養されたヒト神経膠腫、Ｕ８７ＭＧおよびＴ９８Ｇ、の条件培地で評価した。図１６のウエスタンブロット分析は、ラミニンα４鎖の著しい減少（密度計測により３倍の減少）およびラミニンβ１鎖の消失を示す。従って、薬物２は、インビボおよびインビトロの両方において、標的ラミニン鎖の発現を効果的に阻害する。
【００７１】
（インビボにおける頸動脈内腫瘍処置および静脈内腫瘍処置）
頸動脈内処置のために、ラット脳にヒトＵ８７−ＭＧ神経膠腫細胞を接種した１４日後に、３匹のラットの群は、腫瘍移植後直ちに、頚動脈内にカテーテルを移植した。そのカテーテルを移植可能な注入ポートに連結した。そのラットに、９００μｌのアンチセンスおよびセンスオリゴ溶液（１分あたり０．０６ｍｌで、１５分間蠕動ポンプで）を、皮下ポートチャンバー経由で右頚動脈に潅注し、ヘパリンロックした。薬物２を、頚動脈処置のために２．５μｇ／ｋｇの濃度で注入したか、または５μｇ／ｋｇの濃度で、尾静脈経由で注入した（同様に３匹のラット）。薬物分布を注入後１時間、３時間、１２時間および２４時間で調べた。蛍光単位を使用して、本発明者らは、移植された腫瘍細胞（濃い染色）および脳の血管細胞（より薄い染色）における薬物を検出した（図１７）。薬物２を、薬物２により担持されるトランスフェリン抗体を（赤で）標識化するローダミン染色抗体を用いて可視化した。上記細胞核をＤＡＰＩ（青）で対比染色する。移植されたＵ８７ＭＧ腫瘍細胞（左パネル）は濃く標識化されるが、ラット脳（右パネル）は、限られた（主に血管の）染色を示す。これらの位置の最大濃度は、薬物注入後３時間および１２時間の時点で達成された。これらの結果は、薬物２が血液脳関門（ＢＢＢ）を、おそらくレセプター媒介性エンドサイトーシスで透過することを確証する。
【００７２】
（結論）
ラミニン−８の発現およびヒト腫瘍におけるその阻害を研究するのに適切なインビボのモデルを開発した。ラミニン−８のα４鎖およびβ１鎖に対するアンチセンスオリゴ（ラミニン−８のブロッキング）と新規な薬物送達ビヒクル，ＰＭＬＡ、との組合わせは、ラットにおいて異種移植した頭蓋内ヒト神経膠腫におけるラミニン−８発現を効率的に阻害した。予備的な４回のアンチセンス処置後に、処置された神経膠腫を担持する動物の生存率が、有意に増加した、ｐ＜０．００８。これらのデータは、治療標的としてラミニン−８を使用するＰＭＬＡベースのアンチセンス薬物が、ヒト脳腫瘍を阻害するのに有効であることを示す。
【００７３】
従って、添付の特許請求の範囲は、上に具体的に説明されそして記載されたもの、概念的に等価のもの、自明に置換し得るものおよびまた、本発明の本質的な思想を本質的に取り込むものを含むことが理解されるべきである。当業者は、上述の好ましい実施形態の種々の改昨および改変は、本発明の範囲から逸脱しないで設定され得ることを理解する。説明された実施形態は、単なる例証の意図で示されたもので本発明を限定するとして考えられべきではない。従って、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外でも実施され得ると理解されるべきである。
【００７４】
（参考文献）
【００７５】
【化３】
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【００７６】
【化４】
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【００７７】
【化５】
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【００７８】
【化６】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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