(57)【要約】【課題】サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの新規なメンバー、具体的には、エンドカインαタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供すること。【解決手段】本発明は、サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの新規のメンバーに関する。特に、エンドカインαタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供される。エンドカインαポリペプチドもまた提供され、ベクター、宿主細胞およびそれらを産生するための組換え方法も同様に提供される。ＴＮＦファミリー関連障害に関する診断方法および治療方法もまた、提供される。この方法は、エンドカインαポリペプチドの治療有効量を個体に投与する工程、またはエンドカインαアンタゴニストの治療有効量を個体に投与する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの新規なメンバーに関する。より詳細には、エンドカインαタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。エンドカインαポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞および組換え方法もまた提供される。ＴＮＦファミリー関連障害に関する診断方法および治療方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野）
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα；カケクチンとも称される）は、エンドトキシン、または１７ｋＤタンパク質サブユニットの溶解性ホモ三量体のような他の刺激の応答において単球およびマクロファージによって主に分泌されるタンパク質である（Ｓｍｉｔｈ，  Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：６９５１−６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体形態もまた記載されている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  ５３：４５−５３（１９８８））。
【０００３】
蓄積した証拠は、ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節性サイトカインであることを示す。これらの活性には以下が含まれる：リポタンパク質リパーゼ合成（「カケクチン」活性）の阻害（Ｂｅｕｔｌｅｒ，  Ｂ．らＮａｔｕｒｅ  ３１６：５５２（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，  Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅｒｕｓｓｉａ，  Ｂら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８：７６５（１９８７））、細胞増殖の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃｅｋ，  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ，  Ｂ．  Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．Ｂ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８：２９１３（１９８７））、特定の形質転換細胞型における細胞傷害性活性（Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．Ｂ．ら、前出；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｚ．ら、Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ４４：８３（１９８４））、抗ウイルス活性（Ｋｏｈａｓｅ，  Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  ４５：６５９（１９８６）；Ｗｏｎｇ，  Ｇ．Ｈ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：８１９（１９８６））、骨再吸収刺激（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，  Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：５１６（１９８６）；Ｓａｋｌａｔｖａｌａ，  Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５４７（１９８６））、コラゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ，  Ｊ．−Ｍ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６２：２１６３（１９８５））；および免疫調節作用（Ｔ細胞（Ｙｏｋｏｔａ，  Ｓ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：５３１（１９８８））、Ｂ細胞（Ｋｅｈｒｌ，  Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：７８６（１９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ，  Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：８６（１９８６））、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ，  Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６７：１４７２（１９８８））の活性化、ならびに主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：４４６（１９８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ，  Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：３０４（１９８７））を含む）。
【０００４】
ＴＮＦは、以下のような組織創傷を生じるそのプロ炎症性作用について示されている：血管内皮細胞における凝血促進活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ，  Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の増強した接着（Ｐｏｂｅｒ，  Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８：３３１９（１９８７））、ならびにマクロファージ、好中球、および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ，  Ｇ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：１３９０（１９８７））。
【０００５】
最近の証拠は、ＴＮＦを、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ，  Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性症状（例えば、いくつかの悪性を伴う悪液性における）（Ｏｌｉｆｆ．  Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ５０：５５５（１９８７））の病原体、ならびに自己免疫症状および移植片対宿主症状（Ｐｉｇｕｅｔ，  Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ．  Ｅｃｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：１２８０（１９８７））に関連づける。ガンおよび感染症状とのＴＮＦの関連は、しばしば宿主代謝状態に相関する。ガン患者の主な問題は体重の減少であり、通常摂食障害と関連する。生じる大規模な衰弱は、「悪液質」として知られる（Ｋｅｒｎ，  Ｋ．Ａ．ら、Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔ．  Ｅｎｔｅｒ．  Ｎｕｔｒ．  １２：２８６−２９８（１９８８））。悪液質は、進行性の体重減少、摂食障害、および悪性増殖の応答における体重の持続性衰退を含む。従って、悪液性状態は顕著な死亡率と関連し、そして多数のガン死亡率の原因である。多数の研究が、ＴＮＦが、ガン、感染症状、および他の代謝性状態における悪液質の重要なメディエーターであることを示唆している。
【０００６】
ＴＮＦは、発熱、倦怠感、摂食障害、および悪液質を含む、グラム陰性敗血症およびエンドトキシン性ショック（Ｍｉｃｈｉｅ，  Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  ７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ，  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ，  ４６３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｓ．  Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｃｌｉｎ．  ５：２７−４７（１９８９））の病理生理学的結果における中心的役割を果たすと考えられている。エンドトキシンは、強力な単球／マクロファージアクチベーターであり、これは、ＴＮＦの産生および分泌（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，  Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：２５８５−２５９１（１９８６））、ならびに他のサイトカインを刺激する。ＴＮＦは、エンドトキシンの多くの生物学的効果を模倣し得るので、エンドトキシン関連病の臨床的徴候に応答可能な中心的メディエーターであると結論付けられた。ＴＮＦおよび他の単球誘導性サイトカインは、エンドトキシンに対する代謝性応答および神経ホルモン性応答を媒介する（Ｍｉｃｈｉｅ，  Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１８：１４８１−１４８６（１９８８））。ヒトボランティアへのエンドトキシンの投与は、発熱、頻脈、代謝速度の上昇、およびストレスホルモン放出を含むインフルエンザ様症状を伴う急病を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ，  Ａ．ら、Ａｒｃｈ．  Ｓｕｒｇ．  １２３：１６２−１７０（１９８８））。循環性ＴＮＦの上昇したレベルはまた、グラム陰性敗血症に罹患した患者において見い出されている（Ｗａａｇｅ，  Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  １：３５５−３５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅ，  Ａ．  Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ  ７１５−７１８頁、（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａ，  Ｔ．ら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃ．  Ｄｉｓ．  １６１：９８２−９８７（１９９０））。
【０００７】
ＴＮＦの中和に指向される受動的免疫治療は、上記のようにこれらの病理状態における増大したＴＮＦ産生および上昇したＴＮＦレベルに基づく、グラム陰性敗血症およびエンドトキシンにおける毒性効果を有し得る。
【０００８】
カケクチン（後にＴＮＦと同一であることが見い出された）として特徴付けられた「モジュレーター」物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍｉらによって開示された（欧州特許公開０，２１２，４８９、１９８７年３月４日）。このような抗体は、診断的免疫アッセイにおいて、および細菌性感染におけるショックの治療において有用であるといわれた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許公開０，２１８，８６８、１９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するモニクローナル抗体、このような抗体を分泌するハイブリドーマ、このような抗体を産生する方法、ならびにＴＮＦの免疫アッセイにおけるこのような抗体の使用を開示した。Ｙｏｎｅら（欧州特許公開０，２８８，０８８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ抗体（ｍＡｂを含む）および症状の免疫アッセイ診断における（特に川崎病の症状および細菌感染）それらの有用性を開示した。川崎病の症状を有する患者の体液（小児急性熱病粘膜皮膚リンパ節症候群；Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｔ．，  Ａｌｌｅｒｇｙ  １６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｔ．，  Ｓｈｏｎｉｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２６：９３５（１９８５））は、症状の進行に関連して上昇したＴＮＦレベルを有するといわれた（Ｙｏｎｅら、前出）。
【０００９】
他の研究者はインビトロでの活性を中和した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡｂを記載した（Ｌｉａｎｇ，  Ｃ−Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １３７；８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ，  Ａ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎ，  Ｔ．Ｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：４８９−５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉ，  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ９６：５７−６２（１９８７）；Ｍｏｌｌｅｒ，  Ａ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２：１６２−１６９（１９９０）））。これらのｍＡｂのいくつかは、ヒトＴＮＦのエピトープをマッピングし、酵素免疫アッセイを開発する（Ｆｅｎｄｌｙら、前出；Ｈｉｒａｌら、前出；Ｍｏｌｌｅｒら、前出）ため、および組換えＴＮＦの精製において補助する（Ｂｒｉｎｇｍａｎら、前出）ために使用された。しかし、これらの研究は、免疫原性、特異性の欠除、および／または薬学的適合性に起因して、インビボ診断的使用またはヒトにおける治療的使用のために使用され得る抗体を中和するＴＮＦを産生するための基礎を提供しない。
【００１０】
中和抗血清またはＴＮＦに対するｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有害な生理学的変化を排除し、そして実験的な内毒症および菌血症における致死的チャレンジ後の死から予防することが示されている。この効果は、例えば、げっ歯類致死率アッセイにおいて、および霊長類病理学モデル系において実証されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎ，  Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８１：１９２５−１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ，  Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ，  Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，  Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １７：３１１−３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａ，  Ａ．  Ｔ．ら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １６２：４２１−４２７（１９９０）；Ｏｐａｌ，  Ｓ．  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １６１：１１４８−１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ，  Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．  Ｓｈｏｃｋ  ３０：２７９−２９２（１９９０））。
【００１１】
今日までに、ヒトにおける抗ＴＮＦ  ｍＡｂ治療の経験は、限られているが、有用な治療結果を示している（例えば、関節炎および敗血症において）。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍら、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６６：２７２−８（１９９５）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，  Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ  ３：１−１２（１９９５）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ．  Ｍｅｄ．  ２１：Ｓ４３６−４０（１９９３）；Ｔｒａｃｅｙ  Ｋ．  Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２１  Ｓ４１５−２２（１９９３）を参照のこと。
【００１２】
サイトカインレセプターの配列分析は、以下の膜タンパク質のいくつかのサブファミリーを定義する：（１）Ｉｇスーパーファミリー、（２）ヘマトポエチン（サイトカインレセプタースーパーファミリー）、および（３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦスーパーファミリーの概説については、ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ，  Ｂｌｏｏｄ  ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）、ならびにＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ，  Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，  ７（２）：９３−１２４（１９９６）を参照のこと）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーは、少なくとも１０の異なったタンパク質を含む。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。これらのレセプターのリガンドは同定され、そして少なくとも２つのサイトカインスーパーファミリーに属する。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前出。
【００１３】
従って、病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する必要がある。このような新規のサイトカインは、ＴＮＦ様障害の治療のため、これらのＴＮＦ様サイトカインを結合する新規の抗体または他のアンタゴニストを作成するために使用され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ＴＮＦに類似し、そして類似の生物学的効果および生物学的活性を有すると考えられる、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。このサイトカインはエンドカインαと命名され、そして図１（配列番号２）のアミノ酸配列、またはバクテリア宿主中の、１９９６年６月２７日にＡＴＣＣ寄託番号９７６４０として寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列の、少なくとも一部を有するエンドカインαポリペプチドを含む。寄託されたエンドカインαｃＤＮＡクローンを配列決定することにより決定されたヌクレオチド配列は、Ｎ末端メチオニン、約１７アミノ酸残基の細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン、約１２６アミノ酸の細胞外ドメイン、および約１９ｋＤａの完全タンパク質の推論分子量を含む、約１６９アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００１５】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号２における完全なアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２における完全なアミノ酸配列を有するが、Ｎ末端メチオニン残基を引いた、エンドカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、または９５％同一の、およびより好ましくは、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
【００１７】
本発明はさらに、本明細書中で記載される核酸分子の核酸フラグメントに関する。好ましい核酸フラグメントには、以下をコードする核酸分子が挙げられる：エンドカインα細胞内ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号２）における約１〜約１７のアミノ酸残基）；エンドカインα膜貫通ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号２）における約１８〜約４３のアミノ酸残基）；およびエンドカインα細胞外ドメインを含むポリペプチド（図１（配列番号２）における約４４〜約１６９のアミノ酸残基）。
【００１８】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクターおよびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法および組換え技術によるエンドカインαポリペプチドまたはペプチドの産生のためにそれらを使用するための方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたエンドカインαポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２の完全な１６９個のアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニン残基を引いた配列番号２における完全な１６９個のアミノ酸配列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、完全なアミノ酸配列；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、以下を有するポリペプチドを含む：上記のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％または９５％同一、より好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列。
【００２０】
本発明のエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸または７アミノ酸、好ましくは少なくとも９アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸を有するそのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体までの任意の長さの、エピトープ保有部分ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）において記載されるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドに対して特異的に結合する、単離された抗体を提供する。
【００２２】
本発明に従う好ましいポリペプチドフラグメントには、以下を含むポリペプチドが挙げられる：エンドカインα細胞内ドメイン、エンドカインα膜貫通ドメイン、およびエンドカインα細胞外ドメイン。
本発明はさらに、上記のようなアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は、エンドカインα−および／またはＴＮＦ関連障害の処置におけるアンタゴニストとして、診断的または治療的に有用であり得る。本発明はまた、ＴＮＦ関連障害の存在を決定するための診断方法を提供する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目２）単離された核酸分子であって、該核酸分子は、項目１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子。
（項目３）項目１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目４）項目３に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
配列番号２の約４４〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約４４〜約５４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約５７〜約６８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約６９〜約７８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約９４〜約１０５のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約１０８〜約１３２のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および、配列番号２の約１４８〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペプチド、
からなる群から選択されるエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする、
単離された核酸分子。
（項目５）単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１に示される配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって、ここで、該フラグメントが、配列番号１由来の少なくとも５０個連続したヌクレオチドを含み、ただし、該単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド２６で開始しかつヌクレオチド４７６で終止するフラグメントまたは配列番号１のヌクレオチド２６で開始しかつヌクレオチド４７６で終止するフラグメントのサブフラグメントではない、ヌクレオチド配列；および
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列：
からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子。
（項目６）組換えベクターを作製する方法であって、項目１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する、方法。
（項目７）項目６に記載の方法によって生成された、組換えベクター。
（項目８）組換え宿主細胞を作製する方法であって、項目７に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
（項目９）項目８に記載の方法によって生成された、組換え宿主細胞。
（項目１０）エンドカインαポリペプチドを生成するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で、項目９に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目１１）単離されたエンドカインαポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸；
（ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸；
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のいずれか１つのポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列、
からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する、単離されたエンドカインαポリペプチド。
（項目１２）エンドカインαのエピトープ保有部分を含む、項目１１に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、該部分が、以下：
配列番号２の約４４〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約４４〜約５４のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約５７〜約６８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約６９〜約７８のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約９４〜約１０５のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約１０８〜約１３２のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および、配列番号２の約１４８〜約１５８のアミノ酸残基を含むポリペプチド、
からなる群から選択される、
単離されたポリペプチド。
（項目１３）組換え宿主細胞中で産生されるか、または組換え宿主細胞中に含まれる、項目１１に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１４）前記組換え宿主細胞が哺乳動物細胞である、項目１３に記載の単離されたポリペプチド。
（項目１５）エンドカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、ここで、１〜５０個の保存的アミノ酸置換以外は、該ポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択される配列を有する、
単離された核酸分子。
（項目１６）単離されたエンドカインαポリペプチドであって、ここで、１〜５０個の保存的アミノ酸置換以外は、該ポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号２の約１〜約１６９のアミノ酸；
（ｂ）配列番号２の約２〜約１６９のアミノ酸；
（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のいずれか１つのポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列、
からなる群より選択される配列を有する、
単離されたエンドカインαポリペプチド。
（項目１７）項目１１に記載のエンドカインαポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体または抗体フラグメント。
（項目１８）減少したレベルのエンドカインα活性を必要とする個体を処置するための方法であって、該方法が、項目１７に記載の単離された抗体または抗体フラグメントを含む組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１９）以下からなる群より選択される障害を有する個体を処置する方法であって：
ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害、分類不能型免疫不全、腫瘍、寄生虫病、自己免疫疾患、狼瘡、関節炎、特発性血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、慢性炎症、急性炎症、急性同種移植拒絶、対宿主性移植片病、移植拒絶、胎児吸収、糞便性腹膜炎、皮膚アレルギー、腸疾患、創傷、敗血症、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ−形質転換疾患、慢性骨髄性白血病、慢性高ガンマグロブリン血症、自己免疫血液障害、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑、グルテン過敏性腸症、自己免疫好中球減少症、尋常性天疱瘡、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円板状狼瘡、デンスデポジット病、内分泌性眼障害、ＩＢＤ、喘息、グレーヴズ病、類肉腫症、肝硬変症、若年性糖尿病、インシュリン依存性糖尿病、ブドウ膜炎、自己免疫胃炎、リンパ球減少症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、橋本病、原発性粘液水腫、多発性筋炎、混合結合組織病、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸球体腎炎、肝炎、自己免疫溶血性貧血、接触過敏疾患、一相性ＥＡＥ、ＳＣＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病および原発性側索硬化症；
ここで、該方法が、以下；
（ａ）項目１１に記載のポリペプチド；および
（ｂ）項目１６に記載のポリペプチド、
からなる群より選択されるエンドカインαポリペプチドの治療有効量を該個体に投与する工程を包含する、
方法。
（項目２０）以下からなる群より選択される障害を有する個体を処置する方法であって：
自己免疫疾患、珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症、特発性好酸球増加症候群、エンドトキシンショック、アテローム性動脈硬化症、ヒスタミン媒介アレルギー反応、ＩｇＥ媒介アレルギー反応、慢性炎症、急性炎症、慢性関節リウマチ、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、および創傷；
ここで、該方法が、エンドカインαアンタゴニストの治療有効量を該個体に投与する工程を包含する、
方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、エンドカインαタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜１７は、細胞内ドメインを、アミノ酸１８〜４３は膜貫通ドメイン（下線を引いた配列）を、そしてアミノ酸４４〜１６９は細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。
【図２】図２は、エンドカインαタンパク質（配列番号２）、組織壊死因子α（ＴＮＦ−α）（配列番号３）およびＴＮＦ−β（配列番号４）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。Ｊ．Ｈｅｉｎ法が、ＰＡＭ  ２５０残基重量表と共に使用された。黒塗りの部分は、正確に一致していることを示す。
【図３】図３は、エンドカインαアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原指数および表面確率が示される。「抗原指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて、図１のアミノ酸残基４４〜５４、５７〜６８、６９〜７８、９４〜１０５、１０８〜１３２および１４８〜１５８は、エンドカインαタンパク質の高度に抗原性の領域と一致する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するエンドカインαタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。エンドカインαは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーの新規なメンバーであり、そしてヒトＴＮＦαおよび関連のＴＮＦファミリーメンバーと配列相同性を共有する（図２）。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、１９９６年６月２７日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託され、寄託番号９７６４０が与えられたｃＤＮＡクローンを配列決定することによって得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）に含まれる。
【００２５】
（核酸分子）
他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ  ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％の同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００２６】
他に示されない限りは、本明細書中に記載される各「ヌクレオチド配列」は、デオキシヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略される）の配列として示される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてデオキシリボヌクレオチドの配列が、およびＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）の対応する配列が意図され、ここで、特定のデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換される。例えば、図１（配列番号１）の配列を有するＲＮＡ分子に対する参照は、デオキシリボヌクレオチドの略号を使用することが、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣが、対応するデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣによって置換され、そして各デオキシヌクレオチドＴが、リボヌクレオチドＵによって置換されている配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。
【００２７】
本明細書中に提供される情報（例えば、図１におけるヌクレオチド配列）を使用して、エンドカインαポリペプチドをコードする本発明の核酸分子が、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡをクローニングするための方法）を使用して得られ得る。本発明の例示として、図１（配列番号１）に記載した核酸分子は、ヒト脳線条由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて見出された。エンドカインα  ｃＤＮＡの一部に対応する発現配列タグはまた、いくつかの内皮ライブラリーおよび胎児肝臓ライブラリーにおいて見出された。
【００２８】
エンドカインα遺伝子は、約１６９アミノ酸残基のタンパク質をコードする読み取り枠、約１７アミノ酸の細胞内ドメイン（図１（配列番号２）における約１〜約１７のアミノ酸残基）、約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン（図１（配列番号２）における約１８〜約４３のアミノ酸残基）、約１２６アミノ酸の細胞外ドメイン（図１（配列番号２）における約４４〜約１６９のアミノ酸残基）；および約１９ｋＤａの推定分子量を含む。図１（配列番号２）に示されるエンドカインαタンパク質は、ヒトＴＮＦα（これは、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号Ｕ４２７６４でアクセスされ得る）に対して約３０％類似、そして約２２％同一である。
【００２９】
当業者が理解するように、上記で議論された配列決定エラーの可能性のため、寄託されたｃＤＮＡによりコードされる実際のエンドカインαポリペプチドは、約１６９アミノ酸を含むが、しかし約１５４〜１８４アミノ酸の範囲内のいずれかであり得る。当業者によって理解されるように、使用される判断基準に依存して、上記のエンドカインαタンパク質ドメインの正確な「位置（ａｄｄｒｅｓｓ）」は異なり得る。従って、例えば、図１（配列番号２）に示されるエンドカインαの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するために使用される判断基準に依存してわずかに異なり得る（例えば、正確なアドレスは、図１に示されるものと比較して約１〜約５残基異なり得る）。
【００３０】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）でもまたはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるか、または合成的に生成された、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であってもよい。このＤＮＡは、二本鎖であってもまたは一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コード鎖（センス鎖としてもまた公知である）であってもよいし、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であってもよい。
【００３１】
「単離された」核酸分子とは、その天然の環境から取り除かれた核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のためには単離されたとみなされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種宿主細胞中で維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的に、または実質に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロにおける本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。
【００３２】
しかし、ライブラリーの他のメンバーから単離されていない（例えば、クローンおよび他のライブラリーのメンバーを含む均一な溶液の形態で）、ライブラリー（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるクローン中に含まれる核酸、または細胞もしくは細胞溶解物から単離されたかもしくは取り除かれた染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド」）は、本発明の目的のためには「単離され」ていない。本明細書中でさらに議論するように、本発明に従う単離された核酸分子は、天然に、組換え的に、または合成的に産生され得る。
【００３３】
本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示される読み取り枠（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含み、さらに図１（配列番号１）に示されるＯＲＦ配列のすべてまたは一部とは実質的に異なる核酸分子を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、エンドカインαタンパク質またはそのフラグメントをなおコードするＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝コードは、当該分野において周知である。従って、当業者にとって、上記の縮重改変体を産生することは日常的である。
【００３４】
別の局面において、本発明は、１９９６年６月２７日にＡＴＣＣ寄託番号９７６４０として寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。本発明はさらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の寄託されたクローン中に含まれるエンドカインα  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記の配列のうちの１つと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離された分子（特にＤＮＡ分子）は、染色体を用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子地図作成のためのプローブとして、そしてヒト組織中のエンドカインα遺伝子の発現を検出（例えば、ノーザンブロット分析による）するためのプローブとして有用である。以下で詳細に記載されるように、特定の組織または体液中で変化したエンドクリンα遺伝子発現を検出することは、特定の障害の指標である。
【００３５】
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメントに関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、本明細書中で議論されるような診断プローブおよび診断プライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、およびさらに好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さであるフラグメントが意図される。もちろん、より大きなフラグメント、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、および５００ｎｔの長さもまた、本発明に従って有用であり、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列の、全てではないが、大部分に対応するフラグメントも、同様に有用である。この文脈において、「約」とは、いくつか（５、４、３、２または１）のヌクレオチドより大きいかまたはより小さな特定の列挙される値を含む。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントとは、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列由来の、２０個以上連続した塩基を含むフラグメントが、意図される。その遺伝子は寄託され、そして図１（配列番号１）に示されるそのヌクレオチド配列が提供されるので、そのようなＤＮＡフラグメントを生成することは、当業者には慣用的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理による剪断は、種々のサイズのフラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、そのようなフラグメントは、合成的に生成され得る。
【００３６】
さらに、本発明はまた、以下の関連するｃＤＮＡクローン：ＨＥＭＣＧ０４Ｒ（配列番号１１）を同定し、これは、ＢＬＡＳＴ分析によって、配列番号１のヌクレオチド２６〜４８２に対して９４％の同一性を有する。
【００３７】
本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：エンドカインα細胞内ドメイン（図１（配列番号２）の約１〜約１７のアミノ酸残基、またはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなそのアミノ酸残基）を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド；エンドカインα膜貫通ドメイン（図１（配列番号２）の約１８〜約４３のアミノ酸残基、またはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなそのアミノ酸残基）を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド；および、エンドカインα細胞外ドメイン（図１（配列番号２）の約４４〜約１６９のアミノ酸残基、またはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるようなそのアミノ酸残基）を含むか、あるいはそれからなるポリペプチド。
【００３８】
さらに好ましい本発明の核酸フラグメントは、エンドカインαタンパク質のエピトープ保有ペプチドをコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような核酸フラグメントは、以下のアミノ酸配列およびこれらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのいずれかの１、２、３以上を含むか、あるいはこれらからなるポリペプチドをコードする核酸分子を含む：図１（配列番号２）における約４４〜約１５８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約４４〜約５４のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約５７〜約６８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約６９〜約７８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約９４〜約１０５のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１０８〜約１３２のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１４８〜約１５８のアミノ酸残基。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがエンドカインαタンパク質の抗原性領域であることを決定した。エンドカインαタンパク質の他のこのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下で詳細に記載される。
【００３９】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチド（例えば、本明細書中で開示されたエンドクリンαポリヌクレオチドフラグメントの相補物、または１９９６年６月２７日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローン）の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における４２℃で一晩のインキュベーションに続いて、約６５℃で０．１×ＳＳＣ中におけるフィルターの洗浄を意図する。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドのうちの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらは、上記で議論されるように、そして以下でより詳細に議論されるように、診断用プローブおよび診断用プライマーとして有用である。
【００４０】
もちろん、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡクローン）のより大きな部分（例えば、５０〜３００ｎｔ長の部分）にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または参照ポリヌクレオチドの全体の長さでさえもまた、本発明に従うプローブとして有用であり、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列の、全てではないが、大部分に対応するポリヌクレオチドも、同様に有用である。例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分とは、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたはまたは図１（配列番号１）において示されるヌクレオチド配列）由来の、２０個以上連続したヌクレオチドが意図される。示されるように、このような部分は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（この全体の開示は本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、従来的なＤＮＡハイブリダイゼーション技術に従うプローブとしてまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとしてのいずれかで、診断的に有用である。
【００４１】
エンドカインα  ｃＤＮＡクローンは寄託され、そしてそのヌクレオチド配列は、図１（配列番号１）において提供されるので、エンドカインα  ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを生成することは、当業者に慣用的である。例えば、エンドカインｃＤＮＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理による剪断は、種々のサイズのＤＮＡ部分（これは、エンドカインα  ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドである）を生成するために容易に使用され得る。あるいは、ハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成的に生成され得る。
【００４２】
当然、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるエンドカインα  ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト）、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ、またはその相補体（例えば、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするからである。
【００４３】
示されるように、エンドカインαタンパク質をコードする本発明の核酸分子は、以下を含み得るが、それらに制限されない；それだけでこのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするもの；そのポリペプチドのコード配列および付加的配列（例えば、プレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列、あるいはプレプロタンパク質配列）；上記の付加的なコード配列を有するかまたは有さないポリペプチドのコード配列（これは、付加的な非コード配列（例えば、以下を含むがそれらに限定されない：イントロンならびに非コード５’配列および非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングを含む））およびポリアデニル化シグナルにおいて役割（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）を果たす、転写される非翻訳配列）を伴う）；付加的アミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供する付加的アミノ酸）をコードする付加的なコード配列。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態においては、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）で提供されるタグ）であり、それらの多くは公的に入手可能であるか、または市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応し、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）に記載されている、精製のために有用な別のペプチドである。他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端で、Ｆｃと融合した、エンドカインαタンパク質を含む。
【００４４】
本発明はさらに、エンドカインαタンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコードする本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体（例えば、天然の対立遺伝子改変体）は天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替の形態の１つが意図される。天然に存在しない改変体は、例えば、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生され得る。
【００４５】
天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して産生され得、これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
そのような改変体は、ヌクオチドの置換、欠失または付加により生成される改変体を含む。この置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドを含み得る。改変体は、コード領域、非コード領域またはその両方の領域において変化し得る。コード領域における改変は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、エンドカインαタンパク質またはそれらの一部の特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加および欠失である。この点で、保存的置換もまた特に好ましい。最も非常に好ましいのは、図１（配列番号２）において示されるアミノ酸配列を有するエンドカインαタンパク質をコードする核酸分子、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるエンドカインαアミノ酸配列をコードする核酸分子である。である。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は、以下に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、または９５％同一、およびより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むかあるいはそのポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するがＮ末端メチオニンを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００４８】
エンドカインαポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチド配列が、エンドカインαポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００個のアミノ酸あたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、その参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照配列におけるヌクレオチドの５％までが、欠失または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは、参照配列における全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ酸配列の５’末端もしくは３’末端位置で生じ得るか、またはそれらの末端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、または参照配列内の１つ以上連続した群としてのいずれかで、散在される。
【００４９】
参照（問い合わせ）配列は、図１（配列番号１）に示される完全エンドカインα配列をコードするヌクレオチド配列または本明細書中に記載される任意のエンドカインαポリヌクレオチドフラグメントであり得る。
【００５０】
実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１に示されるヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【００５１】
特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性（全体的配列整列ともいう）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一性パーセントである。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失が理由で（内部欠失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これは、全体同一性パーセントを算定する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’短縮の短縮を考慮しないという事実を考慮するためである。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとして、整合／整列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を算定することによって補正される。ヌクレオチドが整合／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と整合／整列されいていない、対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基の照会配列に整列される。欠失は対象配列の５’末端で生じ、従って、そのＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端で最初の１０塩基の一致／整列を示さない。その１０個の不対合残基は、その配列の１０％（一致していない５’末端および３’末端の塩基の数）／（照会配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０残基の対象配列が、１００残基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照会と一致／整列しない対象配列の５’末端または３’末端に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、照会配列と一致／整列しない、対象配列の５’末端または３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的では��されない。
【００５２】
本出願は、上記のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸分子に関し、これらがエンドカインαタンパク質活性を有するポリペプチドをコードするか否かに拘らない。これはなぜなら、特定の核酸分子がエンドカインα活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしてどのように使用するかを理解するからである。エンドカインα活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリーからのエンドカインα遺伝子またはその対立遺伝子改変体；（２）エンドカインα遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるエンドカインαｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００５３】
しかし、上記の核酸配列に対して、このような少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましく、これらは事実、エンドカインαタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする。「エンドカインα活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるエンドカインαタンパク質と比較して、類似の活性（必ずしも同じではない）を示すポリペプチドが意図される。エンドカインα活性は、公知の方法に従ってアッセイされ得る。例えば、細胞傷害アッセイまたは細胞増殖アッセイを使用して、エンドカインαポリペプチドを培養中の細胞に添加し、細胞でのエンドカインの効果を、細胞の数の増減を測定することで決定する。
【００５４】
当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、上述の核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が、「エンドカインαタンパク質活性を有する」ポリぺプチドをコードすることを即座に認識する。事実、これらの縮重改変体は全て、同じポリぺプチドをコードするので、このことは、たとえ上記した比較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである。縮重改変体ではない核酸分子に関しては、その相当数がまた、エンドカインαタンパク質活性を有するポリぺプチドをコードすることが、当該分野においてさらに認識される。これはなぜなら、当業者は、タンパク質機能にあまり有意に影響を及ぼしそうにないか、または有意に影響を及ぼしそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸と置換する）を十分に認識しているからである。
【００５５】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンスが、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する。第１の方法は、変異が自然の選択によって容認されるか、または拒絶されるかのいずれかでの進化の過程に依存する。第２のアプローチは、機能を維持する配列を同定するために、クローン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を使用し、そして選択またはスクリーニングする。著者らが言及するように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定の位置で許容されるようであるかを示す。例えば、ほとんど埋もれているアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，前出に提供され、そしてこの参考文献が、本明細書中で引用されている。
【００５６】
「エンドカインα機能活性を有するポリペプチド」とは、例えば、特定の免疫アッセイまたは生物学的アッセイにおいて測定される、本発明のエンドカインαレセプター（完全長のポリペプチド、またはスプライス改変体のいずれか）の活性に対して、類似の活性（必ずしも同じではない）を示すポリペプチドが意図される。例えば、エンドカインα活性は、エンドカインαリガンド（例えば、ＴＲ１１（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ））と結合するエンドカインαポリペプチドの能力を決定することにより測定され得る。エンドカインα活性はまた、増殖、分化または活性化を刺激するか、またはＴＮＦ−αの産生を刺激するか、および／またはポリペプチド（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞および単球）を発現する細胞中でのＩＬ−１２の産生を阻害するようなポリペプチド（例えば、細胞表面で遊離しているか、または発現される同属リガンド）の能力を決定することで測定され得る。
【００５７】
本発明は、本明細書中に記載の単離された核酸分子（すなわち、ポリヌクレオチド）のフラグメントにさらに指向される。例えば、寄託されたｃＤＮＡ（クローン９７６４０）のヌクレオチド配列、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、図１中の寄託されたポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２）、図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）、またはこれらの相補鎖を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチド、およびなおさらにより好ましくは、少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、または６００分子長のフラグメントが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとしての多数の使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。当然のことながら、より大きなフラグメント（例えば、５０１〜１５００ヌクレオチド長のフラグメント）はまた、寄託されたｃＤＮＡ（クローン９７６４０）のヌクレオチド配列の全部ではなくてもほとんどに対応するフラグメントとして、または図１（配列番号：１）に示されるように、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ヌクレオチド長のフラグメントとは、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１（配列番号：１）に示されるようなヌクレオチド配列由来の２０以上の連続的な塩基を含むフラグメントが意図される。
【００５８】
本発明のエンドカインαポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下の配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖、または寄託されたクローンに含有されるｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるフラグメントが挙げられる：約１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、および／または１８０１から１８４０。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、あるいはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、以下の配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖を含むか、あるいはそれらからなる：９６１〜１０００、１７３０〜１７７０、１７７０〜１８００、および／または１８００から１８４０。これらのポリヌクレオチドフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドがまた、本発明によって包含される。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、エンドカインα機能活性を示すポリペプチドをコードする。「機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長エンドカインαポリペプチドと関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性としては、生物学的活性（例えば、Ｂ細胞の増殖、分化または活性化の刺激；Ｔ細胞の増殖、分化または活性化の刺激；単球でのＴＮＦ−α産生の刺激；および／または単球でのＩＬ−１２産生の阻害）、抗原性（抗エンドカインα抗体に結合する（または結合することについて、エンドカインαポリペプチドと競合する）能力）、免疫原性（エンドカインαポリペプチドに結合する抗体を産生する能力）、ネイティブなエンドカインαと多量体を形成する能力、およびエンドカインαポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＴＲ１１（米国特許出願第０９／１７６，２００を参照のこと））。
【００６１】
エンドカインαポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの機能的特性は、種々の方法でアッセイされ得る。例えば、全長エンドカインαポリケチドの抗エンドカインα抗体への結合について結合するか、またはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このようなアッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００６２】
別の実施形態では、同定されたエンドカインαリガンド（例えば、ＲＴ１１）、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基質へのエンドカインα結合のポリペプチドの結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００６３】
さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例５〜８を参照のこと）および当該分野で公知の他の方法は、エンドカインαポリペプチドならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログが、生物学的活性に関連したエンドカインαを（例えば、Ｂ細胞の増殖、分化または活性化の刺激；Ｔ細胞の増殖、分化または活性化の刺激；単球でのＴＮＦ−α産生の刺激；および／または単球でのＩＬ−１２産生の阻害（インビトロまたはインビボのいずれかで））惹起する能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００６４】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、ベクター（本発明の単離されたＤＮＡ分子を含む）、組換えベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるエンドカインαポリペプチドまたはそれらの部分の産生に関する。
【００６５】
組換え構築物が、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスべクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換のような周知の技術を使用して宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、ファージベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるかまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的な宿主細胞においてのみ起こる。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物か、または荷電された脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００６７】
目的のポリヌクレオチドの対するｃｉｓ作用コントロール領域を含むベクターが好ましい。適切なｔｒａｎｓ作用因子は、宿主細胞によって供給されるか、相補ベクターにより供給されるか、または宿主への導入の際にベクター自身によって供給され得る。
【００６８】
この点における特定の好ましい実施形態において、このベクターは、誘導性および／または型特異性であり得る、特異的発現を提供する。このようなベクターの中で特に好ましくは、温度および栄養分の添加のような処理しやすい環境因子によって誘導されるベクターである。
【００６９】
本発明において有用な発現ベクターには、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス誘導ベクターが挙げられる（例えば、細菌性プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）、ならびにこれらの組み合わせから誘導されるベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと。
【００７０】
そのＤＮＡ挿入物は、いくつかの名前を挙げると、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐプロモーター、およびＥ．ｃｏｌｉ  ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位、および転写された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、始めにＡＵＧを開始する翻訳および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置付けされる終止コドンを含む。
【００７１】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
【００７２】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００７３】
本発明における使用のために適切な公知の細菌性プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーターが挙げられる。適切な真核細胞のプロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター、および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。
【００７４】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００７５】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入により増大され得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型において、プロモーターの転写活性を増大するように作用するＤＮＡのシス作用性エレメント（通常、約１０〜３００ｂｐ）である。エンハンサーの例としては、複製起点の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００７６】
小胞体内腔中、ペリプラズム空間中、または細胞外環境中への、翻訳されたタンパク質の分泌については、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチド中に組み込まれ得る。このシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもいいし、またはそれらは、異種シグナルであってもよい。
【００７７】
このポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）において発現され得、そして分泌シグナルのみではなくさらなる異種機能領域もまた含み得る。さらなる実施例において、さらなるアミノ酸、特に荷電したアミノ酸の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加され、精製の間またはその後の取り扱いおよび貯蔵の間の、宿主細胞中での安定性および持続性を改善し得る。また、示されるように、領域はまた、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終的な調製前に除去され得る。とりわけ、安定性を改善し、かつ精製を容易にするために、分泌または排出を引き起こすペプチド部分のポリペプチドへの付加は、よく知られており、そして当該分野における慣用技術である。好ましい融合タンパク質は、レセプターを可溶化するために有用である免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰＡＯ  ０，４６４，５３３（また、カナダ国対応特許第２，０４５，８６９号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断における使用にかなり有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰＡ  ０，２３２，２６２）。一方、いくつかの使用については、記載される有利な様式において融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害であることが判明する場合、例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合がそうである。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のようなアンタゴニストを同定するためのハイズループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８（１９９５）；およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【００７８】
エンドカインαタンパク質は、周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製され得る。この方法としては、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製に用いられる。
【００７９】
本発明のポリペプチドとしては、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生される産物が挙げられる。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始改変メチオニン残基を含み得る。
【００８０】
本明細書中に議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、エンドカインαコード配列）を欠失するかまたは置換し、そして／あるいは本発明のエンドカインαポリヌクレオチドに作動可能に連結し、そして内因性エンドカインαポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作されている、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の初代宿主細胞、二次性宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。例えば、当該分野において公知の技術が、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内因性エンドカインαポリヌクレオチド配列を、相同組換えを介して作動可能に結合させるために使用され得る（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９６年６月２４日刊行）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５〜４３８（１９８９）（これらの各々の開示は、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと）。
【００８１】
（エンドカインαポリペプチドおよびペプチド）
本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、または図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、あるいは上記ポリペプチドの部分を含むペプチドまたはポリペプチドを有する、単離されたエンドカインαポリペプチドを提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、（一般に認識されるように）同義であるとみなされ、そして各用語は、状況が、ペプチジル結合によって結合される少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すために必要とする場合に、交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、１０個よりも多くのアミノ酸残基を含む鎖に対して本明細書で使用される。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右に、そしてアミノ酸末端からカルボキシ末端の方向に記載される。
【００８２】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質によって、ポリペプチドまたはタンパク質が、その本来の環境から取り出されることを意味する。例えば、組換え産生されたポリペプチドおよび組換え宿主細胞中に発現されたタンパク質は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法のような任意の適切な技術によって実質的に精製されている、ネイティブまたは組換えポリペプチドおよびタンパク質と同様に、本発明の目的について単離されたとみなされる。
【００８３】
エンドカインαポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、このタンパク質の構造および機能に有意な効果を及ぼすことなく変更され得ることが、当該分野において認識される。配列中のこのような差異が意図される場合、タンパク質上に、活性を決定する重要な領域が存在することが理解されるはずである。一般に、同様な機能を行う残基が使用される場合、三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の例では、残基の型は、タンパク質の非重要領域にて変更が生じる場合、完全に重要ではなくてもよい。
【００８４】
従って、本発明はさらに、実質的なエンドカインαポリペプチド活性を示すか、またはエンドカインαタンパク質の領域（例えば、以下に議論されるタンパク質フラグメント）を含む、エンドカインαポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異としては、欠失、挿入、反転、反復、および型の置換（例えば、ある疎水性残基を別の残基と置換すること、しかし、規則として、強力な親水性残基を強力な疎水性残基と置換しない）が挙げられる。小さな電荷またはこのような「中性」アミノ酸の置換は、一般的に、活性にほとんど効果を有しない。
【００８５】
代表的には、脂肪族アミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間の一対一の置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒおよびＴｈｒの交換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド残基のＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基のＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基の間でのＰｈｅ、Ｔｙｒの間の置換が、保存的置換として理解される。
【００８６】
上記に詳細に示されるように、表現型的にサイレントなようである（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有さないようである）アミノ酸の交換に関するさらなる指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出され得る。
【００８７】
従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたかまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてこのように置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされる残基であってもよいし、またはなくてもよい、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基を含む、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合される、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ；あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製のために使用される配列またはプロタンパク質配列のような、成熟ポリペプチドと融合される、ポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ、であり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【００８８】
特定の目的は、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸での置換である。後者は、エンドカインαタンパク質の特徴を改善するために減少された正の荷電を有するタンパク質を生じる。凝集の予防は、非常に望まれる。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみならず、薬学的処方物を調製する場合に問題であり得る。なぜなら、これらは免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７〜３７７（１９９３））。
【００８９】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、ＴＮＦ−αの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへの選択的結合を生じる特定の変異を記載している。従って、本発明のエンドカインαポリペプチドは、天然の変異か、またはヒトの操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００９０】
示されるように、タンパク質のフォールディングまたは活性に有意に影響しない保存的なアミノ酸の置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。
【００９１】
【表１】
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もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記の因子を含む多くの因子に依存する。一般的に言えば、任意の所定のエンドカインαポリペプチドの置換の数は、対象に依存して、５０、４０、３０、２０、１０、５または３より多くない。
【００９２】
機能のために必須である、本発明のエンドカインαタンパク質におけるアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘発）によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。後者の手順は、単一のアラニン変異を分子内のあらゆる残基に導入する。次いで、得られる変異型分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合またはインビトロまたはインビトロ増殖活性）について試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識法のような構造分析によって決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９〜９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６〜３１２（１９９２））。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離されたポリペプチド」によって、そのネイティブな環境から取り出されたポリペプチドが意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生され、そして／またはその中に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。組換え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「単離されたポリペプチド」として意図される。例えば、エンドカインαポリペプチドの組換え産生されたバージョンが、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ  Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的に精製され得る。
【００９４】
本発明のポリペプチドは、（ａ）図１に示されるような完全アミノ酸配列（配列番号２）；（ｂ）図１に示されるが（配列番号２）、Ｎ末端メチオニン残基を欠く完全アミノ酸配列；（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６４０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のポリペプチド、および本明細書中に記載されるポリペプチドに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％または９５％同一、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリペプチドのうちのいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなり、そしてまた、少なくとも３０個のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。
【００９５】
エンドカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列が、エンドカインαポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸ごとに５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の５％までが、欠失または、別のアミノ酸で置換され得るか、または参照配列の合計アミノ酸残基の５％までの幾らかのアミノ酸が、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置かまたはカルボキシ末端位置でか、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配列の残基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのいずれかで間に散在する。
【００９６】
実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含むか、またはこれらかなるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来のように決定され得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例えば９５％同一かどうか決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、もちろん、参照アミノ酸配列の全長に渡って同一性の百分率が算出されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の合計の数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメーターは設定される。
【００９７】
特定の実施形態において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性（全体的配列整列もいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従うと、対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対する、Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列についての、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、この実施形態の目的で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基位置のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わ��配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためにはなされない。
【００９８】
本願発明者らは、エンドカインαタンパク質が、３つの主要構造ドメインを示す１６９残基タンパク質であることを発見した。細胞内ドメインが、図１（配列番号２）の約１〜約１７の残基内に同定された。この膜貫通ドメインは、図１（配列番号２）の約１８〜約４３の残基内に同定された。この細胞外ドメインは、図１（配列番号２）の約４４〜約１６９の残基内に同定された。従って、本発明は、さらに、以下から選択されたポリペプチドを含む好ましいエンドカインαタンパク質フラグメントを提供する：エンドカインα細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドカインα細胞外ドメイン。
【００９９】
エンドカインαタンパク質の細胞外ドメインは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と組み合わせられ、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は、増加したインビボでの半減期を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示された（ＥＰ  Ａ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。（ＩｇＧ部分に起因して）ジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体細胞外ドメイン単独よりも、リガンドの結合および中和においてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１００】
本発明のポリペプチドフラグメントは、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるか、もしくは寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）核酸によってコードされる配列番号２に含まれるアミノ酸配列、または図１（配列番号１）に示されるアミノ酸配列、もしくはそれに加えてその相補鎖を含むか、あるいはそれからなるポリペプチドを含む。タンパク質フラグメントは、そのフラグメントが、部分または領域、最も好ましくは、単一の連続した領域として形成するより大きなポリペプチド内に、「自由にとどまっている（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」か、または含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、配列番号２のおおよそ以下のアミノ酸残基を含むか、あるいはそれらからなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０および／または１５１〜１６９。この脈絡において、「おおよそ（約）」は、特定の列挙された範囲、およびいずれかの末端、または両方の末端において、いくつかの（５、４、３、２または１）アミノ酸まで、より大きいかまたはより小さい範囲を含む。さらに、ポリペプチドフラグメントは、長さが、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０または１６８アミノ酸であり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドをコードするこれらの担補体に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、本発明によって包含され、これらハイブリダイジングポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも同様に包含される。
【０１０１】
エンドカインαの構造的寄与または機能的寄与によって特徴付けられるフラグメントは、本発明の特に好ましいフラグメントの１つである。このようなフラグメントには、全長エンドカインα（配列番号２）の以下を含むアミノ酸残基が挙げられる：α−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α−領域」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、ならびに高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメータを使用して同定されるように、１．５より大きいかまたは１．５に等しい抗原性指標を有する４つ以上の隣接したアミノ酸を含む）。特定の好ましい領域は、図３に示される領域であり、そして図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される、上述のタイプの領域を含むが、これらに限定されない。このような好ましい配列は、以下を含む：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ予測α−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測α−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ予測親水性領域および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域；ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域（これは、これらのコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを使用して予測された）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。
【０１０２】
上記のように、図３および／または表２に示されるエンドカインαの構造的寄与または機能的寄与を表すデータは、デフォルトパラメータを使用するＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成された。好ましい実施形態において、表２の欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに示されるデータを使用して、抗原性について高い程度の潜在性を示すエンドカインαの領域を決定し得る。高抗原性の領域が、免疫応答の初期の過程で抗原認識が起こり得る環境において、ポリペプチドの表面で曝露される傾向にあるポリペプチドの領域を表す値を選択することによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよび／またはＩＶに示されるデータから決定される。
【０１０３】
これらの関連における特定の好ましい領域が図３に説明されるが、表２に示されるように、図３に示されるデータの表による表現を使用することによって、表されるか、または同定され得る。図３を得るために使用されるＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（元々のデフォルトパラメータが使用される）を使用して、図３におけるデータを表の様式で与える（表２を参照のこと）。図３におけるデータの表様式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る。
【０１０４】
図３および表２に説明される上述の好ましい領域は、図３に説明されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述のタイプの領域を含むが、これらに限定されない。図３および表２に説明されるように、このような好ましい領域には、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ  α−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ  α−領域、β−領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  α両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚフレキシブル領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、ならびに高抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域が挙げられる。
【０１０５】
【表２】
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（アミノおよびカルボキシ末端欠失）上記のように、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失が生じるとしても、他の生物学的な活性はまだ保持され得る。従って、短くなったエンドカインα  Ｍａｄｏｎｎａｓの抗体を誘導する能力および／または抗体に結合する能力（この抗体は、ポリペプチドの完全または成熟した形態を認識する）は、一般に、完全または成熟したポリペプチドの残基の大部分未満が、Ｎ末端から除去されても保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載されるか、そうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するエンドカインαムテインは、いくつかの生物学的活性または、免疫原性活性を保持し得る。実際に、６個ほどに少ないエンドカインαアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。
【０１０６】
従って、本発明は、さらに、図１（すなわち、配列番号２）に示されるエンドカインαアミノ酸配列のアミノ末端から位置番号１６４のアスパラギン残基までの欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１（配列番号２）の残基ｎ−１６９のアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎは、２〜１６４までの範囲の整数であり、そして１６５は、エンドカインαポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要であると考えられている完全なエンドカインαポリペプチドのＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１０７】
より特に、本発明は、図１に示されるエンドカインα配列の以下の残基からなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいは、その配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０１０８】
【化１】
2010252803.tif 000012
本発明はまた、上記のエンドカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは、そのポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらのポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドはまた、本発明によって包含される。
【０１０９】
また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を起こすとしても、他の生物学的な活性はまだ保持され得る。従って、短くなったエンドカインαムテインの、抗体を誘導する能力および／または抗体に結合する能力（この抗体は、ポリペプチドの完全または成熟した形態を認識する）は、一般に、完全または成熟したポリペプチドの残基の大部分未満がＣ末端から除去されても保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載されるか、そうでなければ当該分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するエンドカインαムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る。実際に、６個ほどに少ないエンドカインαアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば、免疫応答を惹起し得る。
【０１１０】
従って、本発明は、さらに、図１（配列番号２）に示されるエンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から、位置番号６のセリン残基までの欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１（すなわち、配列番号２）の残基１−ｍのアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍは、６〜１６９までの範囲の整数であり、そして６は、エンドカインαポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要であると考えられている完全なエンドカインαポリペプチドのＣ末端からの最初の残基の位置である。
【０１１１】
より詳細には、本発明は、図１に示されるエンドカインα配列の配列の、以下：
【０１１２】
【化２】
2010252803.tif 000013
からなる群から選択されるメンバーのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のエンドカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合される上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。
【０１１３】
本発明はまた、エンドカインαポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から欠失された一つ以上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、図１（すなわち、配列番号２）の残基ｎ〜ｍを有するように一般的に記載され得る（ここで、ｎおよびｍは、上記の整数である）。
【０１１４】
本発明のエンドカインαポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のエンドカインαポリペプチド、それらの調製物およびそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。
【０１１５】
本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のエンドカインαポリペプチド（本明細書中に記載されるエンドカインαのフラグメント、改変体および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドを含む）またはホモトリマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０１１６】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のエンドカインαフラグメントおよびエンドカインαポリペプチドに加えて、異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。
【０１１７】
本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホモダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のエンドカインαポリペプチドとの、および／または本発明のエンドカインαポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号２に列挙されるかまたはクローン９７６４０によってコードされるポリペプチドに含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、エンドカインα融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のエンドカインαＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメンバー（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば、国際公開番号ＷＯ  ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１１８】
別の実施形態では、２以上の本発明のエンドカインαポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた複数のエンドカインαポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０１１９】
本発明のマルチマーエンドカインαポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合されたエンドカインαポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。可溶性マルチマーエンドカインαタンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ  ９４／１０３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成またはトリマー形成をするペプチドに融合された可溶性エンドカインαポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性マルチマーエンドカインαは、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【０１２０】
タンパク質のＴＮＦファミリーの特定のメンバーは、トリマー形態で存在すると考えられる（ＢｅｕｔｌｅｒおよびＨｕｆｆｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：６６７、１９４４；Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７３：４３１、１９９３）。従って、トリマーエンドカインαは、増強された生物学的活性という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分は、トリマーを優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，（１９９４））および米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク質由来の他のペプチドは、トリマーエンドカインαの調製において用いられ得る。
【０１２１】
別の例では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）エンドカインα融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質の会合は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）エンドカインα融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。
【０１２２】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１２３】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１２４】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本発明のエンドカインαポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのエンドカインαポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）であってよい。
【０１２５】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変されるエンドカインαポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいずれをも、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０１２６】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離を可能にし得る。
【０１２７】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、エンドカインαの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１２８】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０１２９】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ  ０  ４０１  ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０１３０】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質（またはポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１３１】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを結合する抗体を生成するための供給源としての用途、および当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとしての用途を含むが、これらに限定されない用途を有する。
【０１３２】
（タンパク質改変）
さらに、本発明のタンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９８３）およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本発明のエンドカインαポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのエンドカインαポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が一般に挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、α−Ａｂｕ、α−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、α−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、α−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）であってよい。
【０１３３】
天然に存在しない改変体は、当該分野において公知の変異誘発技術（オリゴヌクレオチド媒介変異誘発、アラニン走査、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３１７：４１５（１９８６）参照のこと）を含むが、これらに限定されない）を使用して産生され得る。
【０１３４】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変されるエンドカインαポリペプチドを含む。多数の化学的改変のうちのいずれも、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成、など。
【０１３５】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離を可能にし得る。
【０１３６】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、エンドカインαの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１３７】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１３８】
上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝状構造であり得る。分枝状ポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５４５号、Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載され、そのそれぞれの開示が、本明細書中で参考として援用される。
【０１３９】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ  ０  ４０１  ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０１４０】
上で示したように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のいずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインの残基に共有結合を介してタンパク質に連結され得る。１つ以上の反応化学を使用して、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）に、またはタンパク質のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびその組み合わせ）の１つより多いタイプに結合し得る。
【０１４１】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコールを本発明の組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１４２】
上記のように、本発明のタンパク質のぺグ化は、任意の多くの手段によって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接または介在するリンカーのいずれかによって、タンパク質に結合され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するリンカーを使用しない系は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｎｍａｔｏｌ．６８：１−１８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載され、このそれぞれの開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０１４３】
介在するリンカーなしで、タンパク質のアミノ酸残基に直接ポリエチレングリコールを結合するための１つの系は、トレシル化ＭＰＥＧ（塩化トレシル（ＣｌＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3）を使用するモノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の改変によって生成される）を使用する。トレシル化ＭＰＥＧとタンパク質との反応のときに、ポリエチレングリコールをタンパク質のアミン基に直接結合する。従って、本発明は、本発明のタンパク質と２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子との反応によって生成されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０１４４】
ポリエチレングリコールはまた、多数の示差的な介在するリンカーを使用してタンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）は、ポリエチレングリコールをタンパク質に連結するためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコールがリンカーによってタンパク質に結合するタンパク質−ポリエチレングリコール結合体はまた、タンパク質とＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニルカーボネート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような化合物との反応によって作製され得る。多数のさらなるポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリコールをタンパク質に結合する反応化学は、ＷＯ９８／３２４６６に記載され、その開示の全体は、本明細書中で参考として援用される。本明細書中に記載される反応化学を使用して生成されるぺグ化タンパク質生成物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４５】
本発明のそれぞれのタンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）は、多様であり得る。例えば、本発明のぺグ化タンパク質はまた、平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、タンパク質分子当たり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または１８〜２０のポリエチレングリコール部分の範囲内での平均の置換の程度である。置換の程度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）に議論される。
【０１４６】
（抗体およびエピトープ）
以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得、これは以下に記載されるようなエンドカインαタンパク質発現を検出するための診断的アッセイにおいて、またはエンドカインαタンパク質の機能を阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、酵母ツーハイブリッド系において、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるエンドカインαタンパク質結合タンパク質を「捕捉」するために使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６（１９８９））に記載される。
【０１４７】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘導する、タンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子のいくつかの遺伝子座に制限されると考えられる。一方、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２（１９８４）を参照のこと。
【０１４８】
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択について、タンパク質配列の一部に模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０〜６６６（１９８３）を参照のこと。タンパク質反応性の血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列においてしばしば示され、一組の単純な化学法則によって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。非常に疎水性であるペプチドおよび６個以下の残基のペプチドは、一般的に模倣タンパク質に結合する抗体の誘導には効果がなく；より長い可溶性のペプチド、特にプロリン残基を含むものは、通常効果的である。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６１頁。例えば、これらのガイドラインに従って設計された、インフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％をカバーする８〜３９の残基を含む３０個のペプチドのうちの１８個は、ＨＡ１タンパク質と反応する抗体、またはインタクトなウイルスを誘導した：ＭｕＬｖポリメラーゼからの１２／１２のペプチドおよび狂犬病糖タンパク質からの１８／１８のペプチドは、それぞれのタンパク質を沈澱させる抗体を誘導した。
【０１４９】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、従って本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合によって得られたハイブリドーマの高い比率は、一般的に、ネイティブなタンパク質と反応性の抗体を分泌する。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６３頁。抗原性エピトープ保有ペプチドまたは抗原性エピトープ保有ポリペプチドによって惹起される抗体は、模倣タンパク質を検出するために有用であり、異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の発生運命を追跡するために使用され得る。ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッセイ（例えば、競合的アッセイ）に使用され得る。なぜならそれは、短いペプチド（例えば、約９個のアミノ酸）でさえ免疫沈降アッセイにおいて結合し、大きなペプチドを置換し得ることが示された。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７〜７７８（１９８４）の７７７を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知の方法を使用する吸着クロマトグラフィーによって、模倣タンパク質の精製に有用である。
【０１５０】
上記ガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる好ましくは少なくとも７の、より好ましくは少なくとも９の、および最も好ましくはおよそ少なくとも約１５と約３０との間のアミノ酸の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチド（約３０〜約５０のアミノ酸を含むか、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列を含むまでの任意の長さを含む）はまた、考慮される本発明のエピトープ保有ペプチドまたはエピトープ保有ポリペプチドであり、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するために有用である。好ましくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒に実質的に可溶性を提供するために使用され（すなわち、配列が比較的親水性の残基を含み、そして高い疎水性の配列が好ましくは避けられる）；そしてプロリン残基を含む配列は、特に好ましい。
【０１５１】
エンドカイン特異的ポリクローナル抗体およびエンドカイン特異的モノクローナル抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドの限定されない例は、これらのポリペプチドをコードする以下のアミノ酸配列およびポリヌクレオチドのいずれかのうちの１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含むかあるいはそれらからなるポリペプチドを含む：図１（配列番号２）における約４４〜約１５８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約４４〜約５４のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約５７〜約６８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約６９〜約７８のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約９４〜約１０５のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１０８〜約１３２のアミノ酸残基；図１（配列番号２）における約１４８〜約１５８のアミノ酸残基。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがエンドカインαタンパク質の抗原性領域であることを決定した。
【０１５２】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用して組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合し得る。エピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製され特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合研究による）ＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一のアミノ酸改変体を示す２４８個の異なる１３残基ペプチド１０〜２０ｍｇのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｖｉ．ＵＳＡ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２２１号において、さらに記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、固相方法に含まれる多くの同一の反復工程の最適の使用を可能にする、別々の溶媒浸透性パケットに含まれる。完全にマニュアルの手順によって、５００〜１０００またはそれ以上の合成が同時に行われ得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４頁。
【０１５３】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０〜９１４；およびＢｉｔｔｌｅＦ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４  （１９８５）を参照のこと。一般的に、動物は、遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システインを含むペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合体化され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。
【０１５４】
ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）により上昇し得る。
【０１５５】
本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、全タンパク質が免疫原性である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）が、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）、前出は、酵素連結免疫吸着アッセイにおいて反応するために十分な純度の数百のペプチドの、固相支持体上での迅速な同時合成のための手順を開示する。次いで、合成ペプチドと抗体との相互作用は、それらを支持体から外すことなく容易に検出される。この方法において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドが、当業者によって慣用的に同定され得る。
【０１５６】
例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質の免疫学的に重要なエピトープを、Ｇｅｙｓｅｎらは、このタンパク質の全２１３個のアミノ酸配列をカバーする２０８の可能なヘキサペプチド全ての重複セットの合成によって、７個のアミノ酸の分解能で、位置決定した。次いで、全ての２０個のアミノ酸がエピトープ内の全ての位置で次いで置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応に特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法によって慣用的に作製され得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）に対する米国特許第４，７０８，７８１号は、さらに所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドを同定するためのこの方法を記載する。
【０１５７】
さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に対して相補的なエピトープ（すなわち「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓに関するＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）の米国特許第５，４８０，９７１号は、直鎖Ｃ1−Ｃ7−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ）オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。
【０１５８】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭならびにＩｇＹを含む。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖抗体全体を含む抗体全体およびそれらの抗原結合フラグメントを含むことを意味する。最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）ならびにＶLドメインまたはＶHドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。
【０１５９】
単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせもまた本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
【０１６０】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多重の多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種組成物（例えば、異種ポリペプチド）の両方もしくは固体支持体物質に特異的であり得る。例えば、ＷＯ  ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１６１】
本発明の抗体は、この抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載されるかまたは特定され得る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端位置およびＣ末端位置により、連続するアミノ酸残基のサイズにより、または表および図に列挙されて、本明細書中に記載される様に特定され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体もまた排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこれの排除を可能にする抗体を含む。
【０１６２】
本発明の抗体はまた、その交差反応性に関して記載または特定され得る。本発明のポリペプチドの他のアナログ、オーソログまたはホモログのいずれをも結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。さらに本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書において記載のような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのみ結合する抗体が含まれる。本発明の抗体はまた、その結合親和性に関して記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫdの親和性が挙げられる。
【０１６３】
本発明の抗体は、インビトロおよびインビボの両方における診断方法および治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための当該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない用途を有する。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するための免疫アッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（全体が参考として援用されている）を参照のこと。
【０１６４】
本発明の抗体は、単独、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種のポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種のポリペプチド、薬物または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ  ０  ３９６  ３８７を参照のこと。
【０１６５】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージのクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクローナル抗体が生成される方法をいうわけではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。
【０１６６】
ハイブリドーマ技術は、当該分野で公知の技術を含み、そしてＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される。
【０１６７】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解切断によって産生され得る。
【０１６８】
あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用して、組換えＤＮＡ技術およびファージディスプレイ技術を適用して、または合成化学を通して生成され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７〜１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；およびＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、および同第５，７３３，７４３号（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０１６９】
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に生成するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法は、例えば、以下に開示される方法である：ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４〜８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら、ＡＪＲＩ  ３４：２６〜３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３（１９８８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０１７０】
単鎖のＦｖおよび抗体を生成するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６〜８８（１９９１）；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５〜７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。抗体は、以下を含む種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（ＥＰ  ０  ２３９  ４００；ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ０  ５９２  １０６；ＥＰ  ０  ５１９  ５９６；Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．ら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ方法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（上記の参考文献はその全体が参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１７１】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に結合体化（共有結合および非共有結合体化の両方を含む）した抗体が含まれる。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合体化することにより、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型へ標的化するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに対して融合または結合体化された抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いてインビトロ免疫アッセイおよび精製方法において用いられ得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出、およびＷＯ  ９３／２１２３２；ＥＰ  第０  ４３９  ０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８〜１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２（１９９１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１７２】
本発明は、可変領域以外の抗体ドメインと融合または結合体化された本発明のポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域またはその一部分と融合され得るか、またはそれに結合体化され得る。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインまたはドメイン全体もしくはその一部の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの半減期を増大させるか、または免疫アッセイにおいて使用するために、当該分野で公知の方法を用いて、上記の抗体部分に融合され得るか、またはそれに結合体化され得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融合されるか、またはそこに結合体化されて、マルチマーを形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間のジスルフィド結合によってダイマーを形成し得る。より高次のマルチマー形態は、ＩｇＡおよびＩｇＭの一部分にそのポリペプチドを融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合体化するための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ０  ３０７  ４３４、ＥＰ  ０  ３６７  １６６；ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、ＰＮＡＳ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９４）；ならびにＶｉｌ，Ｈ．ら、ＰＮＡＳ  ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１７３】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的または完全にかのいずれかで本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。リガンド結合およびレセプター活性化を両方とも妨害するレセプター特異的抗体もまた含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨害する中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を妨害するが、リガンドがレセプターに結合することを妨害しない抗体が含まれる。レセプターを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンド媒介レセプター活性化により影響を及ぼされる生物学的活性の全てまたは全て未満のいずれかについてのアゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書中に開示された特異的活性を含む生物学的活性についてのアゴニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１７４】
この節「ポリペプチドおよびペプチド」中に引用される各文書の全ての開示は、本明細書中によって参考として本明細書中に援用される。
【０１７５】
（エピトープ）
本発明は、以下を含むポリペプチドか、あるいは以下からなるポリペプチドを含む：配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あるいは、寄託されたクローン（寄託情報）中に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるか、または上記に定義されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくは低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の配列の相補体もしくはＡＴＣＣ寄託番号９７６４０（１９９６年６月２７日）として寄託されたクローンに含まれる配列の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープ。ｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピトープ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるエピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１に開示される配列など）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条ハイブリダイゼーション件下で、この相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１７６】
用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ましくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセイによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。
【０１７７】
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生され得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０１７８】
本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５アミノ酸配列を含み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。抗原性エピトープは、有用である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するため）。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０１７９】
同様に、例えば、当該分野において周知の方法に従って抗体を誘導するために免疫原性エピトープが用いられ得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープとしては、分泌タンパク質が挙げられる。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、アルブミンのようなキャリアタンパク質とともに抗体応答を誘発するために動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得るか、またはそのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリペプチドはキャリアなしに、提示され得る。しかし、わずか８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピトープが、少なくとも変性ポリペプチドにおける直鎖状エピトープと結合可能である抗体を惹起させるのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにおいて）。
【０１８０】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。例えば、ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）により上昇し得る。
【０１８１】
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、およびこれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加し得る。このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示された。例えば、ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇＧ部分ジスルフィド結合に起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和において効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ  ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７（１９９１））。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子の読み取り枠（オープンリーディングフレーム）が、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローンされる。このタグは、融合タンパク質についての基質結合ドメインとして働く。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１８２】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、このような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１８３】
（抗体）
本発明はさらに、本発明のポリペプチド、好ましくはエピトープに（特異的抗体−抗原結合をアッセイするための当該分野で周知のイムノアッセイにより決定される場合）免疫特異的に結合する抗体およびＴ−細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体が挙げられる）、および任意の上記の抗体のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの分子であり得る。
【０１８４】
最も好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、そしてＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独であるいは以下：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全体または部分との組み合わせで含み得る。ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインと可変領域の任意の組み合わせをもまた含む抗原結合フラグメントもまた、本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ（ｓｈｉｐ  ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックでかつ内因性免疫グロブリンを発現しない動物（以下および、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような）から単離された抗体を含む。
【０１８５】
本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多価の多重特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１８６】
本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分によって記載され得るかまたは特定化され得る。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置により、または連続するアミノ酸残基のサイズにより、特定化され得るか、または表および図に列挙され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そしてこのポリペプチドの排除を可能にする抗体を含む。
【０１８７】
本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載され得るか、または特定化され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。さらに本発明には、（本明細書中に記載されるような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体が含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するその結合親和性によって記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、または１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫdを有する結合親和性が挙げられる。
【０１８８】
本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープに対する結合を競合的に阻害する。
【０１８９】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンドと本発明のポリペプチドとの相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を妨げないがレセプターの活性化を妨げるレセプター特異的抗体を特徴とする。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、（例えば、上記されたような）免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によって、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいはその基質を検出することによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の非存在下の活性の少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体を提供する。
【０１９０】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、そして、好ましくは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しない抗体を特徴とする。同様に、本発明には、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することは妨げない抗体が含まれる。さらに本発明に含まれるのは、レセプターを活性化する抗体である。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、リガンド媒介のレセプター活性化の生物学的活性のすべてまたはサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）のいずれかを増強または活性化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特定の生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニストとして特定化され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献はすべて、その全体が本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
【０１９１】
本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法および治療方法を含めて、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのために使用され得るが、これに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１９２】
以下により詳細が議論されるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素）に組換え的に融合または結合体化され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１９３】
本発明の抗体は、例えば、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着により、改変された、誘導体を含む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１９４】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１９５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてその生成される方法ではない。
【０１９６】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例３に詳細に議論される。簡略には、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。
【０１９７】
従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成する方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
【０１９８】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって産生され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９９】
例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０２００】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０２０１】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０２０２】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、およびＷＯ  ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０２０３】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発展させ、そしてキメラマウスを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０２０４】
選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０２０５】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと。）例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドのマルチマー化ドメインおよび／または結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。そのような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０２０６】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントな、またはより低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０２０７】
ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるような）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅。
【０２０８】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０２０９】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。
【０２１０】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０２１１】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０２１２】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２１３】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。
【０２１４】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０２１５】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのトランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０２１６】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０２１７】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０２１８】
昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２１９】
哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスに基づいた発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目的の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイルスを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特定の開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所望のコード配列のリーディングフレームと同調（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増大され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２２０】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特有の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーで形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮された培地中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、そして増殖し、次いで細胞株にクローニングおよび増殖され得る、増殖巣（ｆｏｃｉ）を形成することを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０２２２】
多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子に関する選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０））；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１）；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。使用され得る当該分野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、これらはその全体が本明細書において参考として援用される。
【０２２３】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の培養液に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合しているために、この抗体の産生もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２２４】
その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用され得る。このような状況において、この軽鎖は、過剰の有毒な遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２２５】
一旦、本発明の抗体分子が、組換え発現されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製に関する当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー（特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの後の特異的抗原へのアフィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、またはタンパク質の精製に関する他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするために、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合され得る。
【０２２６】
（抗体結合体）
本発明は、融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、そのポリペプチドの少なくとも１０、２０、または５０個のアミノ酸）に組換え的に融合されたか、あるいは化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）された抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を通して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはそれらの一部、好ましくは、そのポリペプチドの少なくとも１０、２０、または５０個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、本発明のポリペプチドを、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させるかまたは結合させることによって、抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するために使用され得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２１２３２；ＥＰ  ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと。
【０２２７】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合された本発明のポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポリペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分に融合または結合され、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る。より高次な多量体形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ３０７，４３４；ＥＰ  ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６／０４３８８；ＷＯ  ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２２８】
上記で議論されたように、本発明のポリペプチドは、上記の抗体部分に融合または結合されて、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合または結合された本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および中和においてより効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ  Ａ  ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、好ましい。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の発見において、例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃ部分と融合された。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。）
さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合される抗体またはそのフラグメントを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターするために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽子射出断層撮影法を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。本発明に従う診断剤として使用するための抗体に結合され得る金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子群複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例には、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃが挙げられる。
【０２３０】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオンに結合され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０２３１】
本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤または薬物部分は、慣用の化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子）、が挙げられ得る。
【０２３２】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３３】
このような治療部分を抗体に結合する技術は、周知である、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２３４】
あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌにより米国特許第４，６７６，９８０号（その全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、第二の抗体に結合され、抗体ヘテロ結合体を形成し得る。
【０２３５】
単独または細胞毒因子および／もしくはサイトカインと組合せて投与される抗体（その抗体に結合する治療部分を有するまたは有さない）は、治療剤として使用され得る。
【０２３６】
（抗体結合アッセイ）
本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的アッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使用する、少し例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと。これはその全体が本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に記載される（しかし限定として意図されない）。
【０２３７】
免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム、１％  Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、ならびにＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を含む。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、評価され得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加させるように、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前に清澄化する工程）に関して、精通し得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４），１０．１６．１を参照のこと。
【０２３８】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でタンパク質サンプルを電気泳動する工程、タンパク質サンプルをそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％  ＢＳＡまたは脱脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、その膜を洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、その膜を洗浄緩衝液中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を含む。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、精通し得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４），１０．８．１を参照のこと。
【０２３９】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合した二次抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、精通し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４），１１．２．１を参照のこと。
【０２４０】
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、放射免疫アッセイであり、放射免疫アッセイは、標識した抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。二次抗体との競合はまた、放射免疫アッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標識二次抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２４１】
（エンドカインα関連障害の診断）
エンドカインαは、ＴＮＦファミリーのサイトカインの新規なメンバーである。エンドカインα関連障害については、「標準」のエンドカインα遺伝子発現レベル（すなわち、この障害を有さない個体からの組織または体液中のエンドカインα発現レベル）と比較して実質的に変化した（上昇したかまたは低下した）レベルのエンドカインα遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取した、組織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、エンドカインα関連障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の組織または他の細胞または体液中のエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、ならびに測定された遺伝子発現レベルを標準のエンドカインα遺伝子の発現レベルと比較し、これにより、標準と比較して上昇または低下した遺伝子発現レベルは、エンドカインα関連障害を表す、工程を包含する。
【０２４２】
個体によって、哺乳動物個体、好ましくはヒトが意図される。「エンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程」によって、第１の生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質のレベルまたはエンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または見積もることによる）または相対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較することによる）のいずれかで、定性的または定量的に測定することまたは見積もることが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のエンドカインαのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または見積もられ、そして標準のエンドカインαのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、この障害を有さない個体から入手した第２の生物学的サンプルから採取されるか、またはエンドカインαを含む障害を有さない個体集団からのレベルを平均化することによって決定される。当該分野で認識されるように、一旦標準的なエンドカインαのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になれば、これは、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
【０２４３】
「生物学的サンプル」により、エンドカインαのタンパク質またはｍＲＮＡを含有する個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られた任意の生物学的サンプルを意図する。示したように、生物学的サンプルとしては、分泌型の成熟エンドカインαタンパク質を含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、またはエンドカインαを発現することが見出された組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検は好ましい供給源である。
【０２４４】
本発明は、当該分野で公知であるかまたは本明細書中で提示されるようなＴＮＦ様障害と同様に、哺乳動物、好ましくはヒトにおける種々のエンドカインα関連障害の診断に有用である。これらとしては、免疫調節に関連する障害、ならびに炎症、細胞増殖、新脈管形成、腫瘍転移、アポトーシス、敗血症および内毒素症が挙げられる。
【０２４５】
総細胞ＲＮＡは、生物学的サンプルから、任意の適切な技術（例えば、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載される一工程グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法）を用いて単離され得る。次いで、エンドカインαポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらとしては、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。
【０２４６】
ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら，Ｃｅｌｌ  ６３：３０３−３１２（１９９０）に記載されるように行われ得る。手短には、総ＲＮＡは、上記のように生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットについては、ＲＮＡは、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウム緩衝液）中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロセルロースフィルターに転写される。ＵＶリンカーによってＲＮＡがフィルターに連結された後、このフィルターを、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハルト溶液、変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイブリダイズする。任意の適切な方法（例えば、32ＰマルチプライムＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識したエンドカインαタンパク質ｃＤＮＡをプローブとして用いる。一晩のハイブリダイゼーション後、このフィルターを洗浄し、そしてＸ線フィルムに曝露する。本発明に従ってプローブとして使用するためのｃＤＮＡは、上記の節に記載され、そして好ましくは少なくとも１５ｂｐ長である。
【０２４７】
Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら，Ｃｅｌｌ  ４９：３５７−３６７（１９８７）に記載されるように行われ得る。Ｓ１マッピングにおいて使用するためのプローブＤＮＡを調製するために、上記のｃＤＮＡのセンス鎖をテンプレートとして用いて、標識されたアンチセンスＤＮＡを合成する。次いで、アンチセンスＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、所望の長さのさらなるＤＮＡプローブを作製し得る。このようなアンチセンスプローブは、標的ｍＲＮＡ（すなわち、エンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡ）に相当する保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロット分析は、上記のように行われ得る。
【０２４８】
好ましくは、エンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、Ｍａｋｉｎｏら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ２：２９５−３０１（１９９０）に記載されるＲＴ−ＰＣＲ法を用いてアッセイされる。この方法によって、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン」の放射能は、標的ｍＲＮＡの初期濃度に線形に関連付けされる。手短には、この方法は、生物学的サンプルから単離された総ＲＮＡを、ＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物に添加する工程を包含する。プライマーアニーリングのためのインキュベーションの後、この混合物に、ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆転写酵素が補充され得る。インキュベーションしてＲＮＡの逆転写を達成した後、次いで、このＲＴ産物は、標識されたプライマーを用いるＰＣＲに供される。あるいは、プライマーを標識するよりも、標識されたｄＮＴＰを、ＰＣＲ反応混合物中に含め得る。ＰＣＲ増幅は、従来の技術に従ってＤＮＡサーマルサイクラーにおいて行われ得る。増幅を達成するに適切な回数の後、ＰＣＲ反応混合物を、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。このゲルを乾燥した後、適切なバンド（エンドカインαタンパク質をコードするｍＲＮＡに相当する）の放射能を、画像化分析器を用いて定量する。ＲＴおよびＰＣＲ反応の成分および条件、試薬ならびにゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲ法についてのバリエーションは、当業者に明らかである。
【０２４９】
逆転写された標的ｍＲＮＡを増幅する任意のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、上記の節において記載されるように用いられ得、そして設計され得る。
【０２５０】
生物学的サンプル中でエンドカインαタンパク質のレベルをアッセイすることは、当該分野で公知の任意の方法を用いて行われ得る。生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質のレベルをアッセイするために好ましいのは、抗体ベースの技術である。例えば、組織中のエンドカインαタンパク質の発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る。これらにおいては、特異的認識が、一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出システムは、蛍光、酵素または他の結合体化二次抗体を利用し得る。結果として、病理学的検査のための組織切片の免疫学的染色が得られる。組織はまた、ウェスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためのエドカインαタンパク質の遊離のために、尿素または中性の界面活性剤を用いて抽出され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））。カチオン性固相の使用に基づくこの技術では、エンドカインαタンパク質の定量は、単離されたエンドカインαタンパク質を標準として用いて達成され得る。この技術はまた、体液にも適用され得る。これらのサンプルを用いて、モル濃度のエンドカインαタンパク質は、血清、血漿、尿、滑液、髄液などのような異なる体液についてエンドカインαタンパク質含量の標準の値を設定するのを補助する。次いで、エンドカインαタンパク質の正常な出現量は、健常な個体からの値を用いて設定され得、これは、試験被験体から得られた値と比較され得る。
【０２５１】
エンドカインαタンパク質レベルを検出するために有用な他の抗体ベースの方法としては、免疫アッセイ（例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。例えば、エンドカインαタンパク質特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤および酵素標識プローブの両方として用いられて、エンドカインαタンパク質を検出および定量し得る。サンプル中に存在するエンドカインαタンパク質の量は、線形回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標準調製物中に存在する量を参照して算出され得る。腫瘍抗原を検出するためのこのようなＥＬＩＳＡは、Ｌａｃｏｂｅｌｌｉら，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １１：１９−３０（１９８８）に記載される。別のＥＬＩＳＡアッセイでは、２つの別個の特異的モノクローナル抗体を用いて、体液中のエンドカインαタンパク質を検出し得る。このアッセイでは、抗体のうちの一方が免疫吸着剤として用いられ、そして他方が酵素標識プローブとして用いられる。
【０２５２】
上記の技術は、「一工程」アッセイまたは「二工程」アッセイとして本質的に行われ得る。「一工程」アッセイは、エンドカインαタンパク質を、固定化抗体と接触させる工程、および洗浄を伴わずに、この混合物を標識抗体と接触させる工程を含む。「二工程」アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄する工程を含む。他の従来の方法もまた適切に用いられ得る。アッセイ系の１つの成分を支持体上に固定化し、それにより、この系の他の成分が、この成分と接触して、このサンプルから容易に除去されるのを可能にすることが通常所望される。
【０２５３】
適切な酵素標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の産生を触媒するオキシダーゼ群由来の標識が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、良好な安定性を有することおよびその基質（グルコース）が容易に利用可能であることから、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反応により形成される過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイされ得る。酵素の他に、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）およびテクネチウム（99mＴｃ））；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２５４】
個体から得られた生物学的サンプル中のエンドカインαタンパク質のレベルをアッセイすることに加えて、エンドカインαタンパク質はまた、インビボで画像化によって検出され得る。エンドカインαタンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーとしては、Ｘ線撮影法、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法に関しては、適切な標識としては、検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかには有害ではない、放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲについて適切なマーカーとしては、検出可能な特有のスピンを有するマーカー（例えば、重水素）が挙げられる。このマーカーは、適切なハイブリドーマについての栄養素を標識することによって抗体中に取り込まれ得る。
【０２５５】
適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位体（例えば、131Ｉ、111Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透物質または核磁気共鳴によって検出可能な物質）を用いて標識された、エンドカインαタンパク質特異的抗体または抗体部分は、障害について検査される哺乳動物に（例えば、非経口的に、皮下的にまたは腹腔内に）導入される。当該分野において、被験体の大きさおよび用いられる画像化系が、診断画像を生ずるために必要な画像化部分の量を決定することが理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注射される放射能の量は通常、約５ミリキュリー〜２０ミリキュリーの範囲の99mＴｃである。次いで、標識された抗体または抗体部分は、エンドカインαタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら，「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｏｒｔｉｏｎｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）の第１３章）に記載される。
【０２５６】
本発明において使用するためのエンドカインαタンパク質特異的抗体は、インタクトなエンドカインαタンパク質またはその抗原性ポリペプチド部分（これらは、アルブミンのようなキャリアタンパク質を、動物の系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して一緒に提示し得るか、または充分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合、キャリアなしで提示し得る）に対して惹起され得る。
【０２５７】
本明細書中で使用する場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子ならびにエンドカインαタンパク質に特異的に結合し得る抗体部分（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2部分）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2部分は、インタクトな抗体のＦｃ部分を欠き、循環からより迅速にクリアランスされ、そしてインタクトな抗体のあまり非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらの部分が好ましい。
【０２５８】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、エンドカインαタンパク質またはその抗原性部分を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法では、エンドカインαタンパク質の調製物が、上記のように調製され、そして精製されて、この調製物が天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、このような調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０２５９】
最も好ましい方法では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそのエンドカインαタンパク質結合部分）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０−１９９６）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第６章〜第９章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌ，下記、第１１章を参照のこと、これらの参考文献は、本明細書中で参考として完全に援用される）。
【０２６０】
一般に、このような手順は、動物（好ましくは、マウス）を、エンドカインαポリペプチド抗原またはエンドカインαポリペプチド発現細胞で免疫する工程を含む。適切な細胞は、抗エンドカインαタンパク質抗体に結合する能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地（例えば、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化）を補充し、約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地）中で培養され得る。このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ2Ｏ））は、本発明に従って用いられ得る。融合後、得られるハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，下記の第７章に記載されるような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、エンドカインα抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンが同定される。
【０２６１】
あるいは、このエンドカインα抗原に結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、エンドカインαタンパク質特異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞は、このエンドカインαタンパク質特異的抗体に結合する能力がこのエンドカインαタンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、このエンドカインαタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてこのような抗体は、動物を免疫してさらなるエンドカインαタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０２６２】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2ならびに他の部分が、本明細書中に開示される方法によって使用され得ることが、理解される。このような部分は、代表的には、パパイン（Ｆａｂ部分を生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ）2部分を生成するため）のような酵素を使用して、タンパク質分解性切断によって生成される。あるいは、エンドカインαタンパク質結合部分が、組換えＤＮＡ技術の適用を介してかまたは合成化学を介して、生成され得る。
【０２６３】
ヒトにおける診断のためにエンドカインαタンパク質のレベルの増大を検出するためにインビボ画像化が使用される場合、「ヒト化」キメラ抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０２６４】
本発明のエンドカインαタンパク質特異的抗体のためのさらに適切な標識が、以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが、挙げられる。
【０２６５】
適切な放射性同位体標識の例としては、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどが、挙げられる。111Ｉｎおよび99mＴｃが、インビボ画像化が使用される場合に好ましい同位体である。なぜなら、これらは、肝臓による125Ｉまたは131Ｉで標識されたモノクローナル抗体の脱ハロゲン化という問題を回避するからである。さらに、これらの放射性核種は、画像化のためにより好ましいγ放射エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６〜３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１〜２８７（１９８７））。例えば、１−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）−ＤＰＴＡを有するモノクローナル抗体に結合した111Ｉｎは、非腫瘍組織（特に、肝臓）にてほとんど取り込みを示さず、従って、腫瘍位置決定の特異性を増大する（Ｅｓｔｅｂａｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１〜８７０（１９８７））。
【０２６６】
適切な非放射性同位体標識の例としては、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒ、および56Ｆｅが、挙げられる。
【０２６７】
適切な蛍光標識の例としては、152Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアナート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｙｄｅ）標識およびフルオレサミン標識が、挙げられる。
【０２６８】
適切な毒素標識としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が、挙げられる。
【０２６９】
化学発光標識の例としては、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が、挙げられる。
【０２７０】
核磁気共鳴造影剤の例としては、重金属核種（例えば、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅ）が、挙げられる。
【０２７１】
抗体に上記の標識を結合するための代表的技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１〜３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８１：１〜４０（１９７７））に提供される。後者にて言及される結合技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法であり、これらの方法全ては、本明細書中に参考として援用される。
【０２７２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩＧＹが、挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）とは、単鎖抗体全体を含む抗体全体、およびその抗原結合フラグメントを含むことが、意味される。最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含むが、これらに限定されない。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含む、任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来である。
【０２７３】
単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独でかあるいは以下：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全体または部分と組み合わせて、含み得る。ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインと可変領域の任意の組み合わせもまた、本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、キメラ、ヒト化、およびヒトの、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含む。
【０２７４】
本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的またはより多価の多重特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種組成物（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ  ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号；同第４，４７４，８９３号；同第５，６０１，８１９号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。本発明の抗体は、その抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して、記載され得るかまたは特定され得る。このエピトープ部分またはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば、Ｎ末端およびＣ末端の位置により、連続するアミノ酸残基のサイズにより、特定され得るか、あるいは表および図面に列挙され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、そしてこのポリペプチドの排除を可能にする、抗体を含む。
【０２７５】
本発明の抗体はまた、その交差反応性に関して、記載され得るか、または特定され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）またはホモログに結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。本発明にさらに含まれるのは、ストリンジェントな条件（本明細書中に記載されるような）下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにのみ結合する抗体である。本発明の抗体はまた、その結合親和性に関しても、記載され得るかまたは特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫdを有する結合親和性が挙げられる。
【０２７６】
本発明の抗体は、インビトロおよびインビボでの診断方法および治療方法の両方を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するのための当該分野で公知の方法を含むがこれに限定されない、用途を有する。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２７７】
本発明の抗体は、単独でかまたは他の組成物と組み合わせてのいずれかで、用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、または毒素）に、組換え的により融合または結合され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ  ０  ３９６  ３８７を参照のこと。
【０２７８】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントが、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む、当該分野で公知の種々の技術を使用して調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２７９】
ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、タンパク質分解切断によって産生され得る。
【０２８０】
あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を使用する組換えＤＮＡ技術の適用を介してかまたは合成化学を介して、産生され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原（代表的には、固体表面またはビーズに結合または捕捉された、抗原）を用いて直接的に選択することによって、レパートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有する、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；および同第５，７３３，７４３号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０２８１】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えにより産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０２８２】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。抗体は、以下を含む種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−移植（ＥＰ  ０  ２３９  ４００；ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ  ０  ５９２，１０６；ＥＰ  ０  ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ，Ｍ．Ａ．ら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。また、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号；および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ  ９８／４６６４５（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０２８３】
さらに本発明に含まれるのは、本発明のポリペプチドに、組換えにより融合されるかまたは化学的に結合（共有結合または非共有結合の両方を含む）される。この抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかで、特定の細胞型に本発明のポリペプチドを標的化するために、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに融合または結合することによって、使用され得る。本発明のポリペプチドに融合または結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用して、インビトロイムノアッセイおよび精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら（前出）およびＷＯ  ９３／２１２３２；ＥＰ  ０  ４３９  ０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８〜１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ．Ｈ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２（１９９１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２８４】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合したかまたは結合した、本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域またはその一部に、融合または結合され得る。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは一部の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して、そのポリペプチドのインビボでの半減期を増加するため、またはイムノアッセイにおける使用のために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチドはまた、マルチマーを形成するように、上記の抗体部分に融合または結合され得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合したＦｃ部分は、そのＦｃ部分間のジスルフィド結合を介して、ダイマーを形成し得る。より大きなマルチマーが、ＩｇＡおよびＩｇＭの一部にこのポリペプチドを融合することによって生成され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ０  ３０７  ４３４、ＥＰ  ０  ３６７  １６６；ＷＯ  ９６／０４３８８、ＷＯ  ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、ＰＮＡＳ  ８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１５４：５５９０〜５６００（１９９５）；ならびにＶｉｌ．Ｈ．ら、ＰＮＡＳ  ８９：１１３３７〜１１３４１（１９９２）（上記参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２８５】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的にかまたは完全にかのいずれかで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンドの相互作用を中断する抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が、含まれる。リガンドの結合を妨げないが、レセプターの活性化を妨げる、レセプター特異的抗体が、含まれる。レセプターの活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載されるかさもなければ当該分野で公知の技術によって、測定され得る。また、リガンド結合およびレセプターの活性化の両方を妨げる、レセプター特異的抗体も含まれる。同様に、リガンドに結合しかつレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合しそれによりレセプター活性化を妨げるがリガンドがレセプターに結合するのは妨げない抗体が、含まれる。レセプターを活性化する抗体が、さらに含まれる。これらの抗体は、リガンド媒介レセプター活性化により影響を受ける、生物学的活性のすべてまたはすべてよりも少なくのいずれかについての、アゴニストとして作用し得る。この抗体は、本明細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性についての、アゴニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、以下を参照のこと：ＷＯ  ９６／４２０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１〜１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６８８〜３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６〜１７９４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９〜３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０〜３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（第２部）：２３７〜２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７〜１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ  ９（４）：２３３〜２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５〜１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５〜７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３〜１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４〜２０（１９９６）上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０２８６】
（トランスジェニック動物）
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。
【０２８７】
当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。
【０２８８】
当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導された胚細胞、胎児細胞または成体の細胞に由来する核の、除核した卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７））これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２８９】
本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、ならびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、１つの導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型においてのみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。この節で記載された文書の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２９０】
一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きたことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子を配置するための交配。
【０２９１】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、エンドカインαポリペプチドの生物学的機能の詳述、異常なエンドカインα発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【０２９２】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／または本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身的に導入し得る。あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら，Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｓａｍｅ）；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）；および米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｚｙｇｏｔｅｓ）；もまた参照のこと（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２９３】
投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、この導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認識されることを可能にしない。
【０２９４】
（アンタゴニスト）
特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号１に含まれる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／開示されるクローン９７６４０に含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において考察される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０２９５】
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする。
【０２９６】
１つの実施形態において、本発明のエンドカインαアンチセンス核酸は、外来の配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、エンドカインαアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。エンドカインαをコードする配列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
本発明のアンチセンス核酸は、少なくともエンドカインα遺伝子のＲＮＡ転写物の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；従って、本発明の二本鎖エンドカインαアンチセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、エンドカインα  ＲＮＡ配列とのより多くの塩基ミスマッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。
【０２９８】
メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照のこと。従って、図１に示されるヌクレオチド配列の５’−または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性エンドカインα  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。エンドカインα  ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２９９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であり得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切断剤など）に結合体化され得る。
【０３００】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、α−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０３０１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０３０２】
さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０３０３】
さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のβ−ユニットとは反対に、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、２−０’−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））。
【０３０４】
本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動ＤＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用により調製され得る。
【０３０５】
一方、エンドカインαコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０３０６】
本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して、エンドカインα  ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に記載される。エンドカインαのヌクレオチド配列（図１）内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がエンドカインα  ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。
【０３０７】
アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得、そしてインビボにおいてエンドカインαを発現する細胞に送達されるべきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｌ  ＩＩプロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因性エンドカインαメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率のために必要とされる。
【０３０８】
内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用してエンドカインα遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発明の変異体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが、発現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的化された相同組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ  １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ  １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。この節で記載された文書の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０３０９】
他の実施形態において、本発明によるアンタゴニストは、エンドカインαの可溶形態（例えば、全長レセプターの細胞外領域由来のリガンド結合ドメインを含む、図１に示すエンドカインαポリペプチドのフラグメント）を含む。このようなエンドカインαの可溶形態（これは、天然に存在するかまたは合成され得る）は、ＴＮＦファミリーリガンドを結合するためのレセプターの細胞表面結合形態と競合することによって、エンドカインαにより媒介されるシグナル伝達を拮抗する。本発明のアンタゴニストはまた、ＴＮＦファミリーリガンドおよびエンドカインα−Ｆｃ融合タンパク質に対して特異的である抗体を含む。
【０３１０】
「ＴＮＦファミリーリガンド」によって、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを結合し得、そしてリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導および／またはブロックし得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成リガンドが意図される。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーとしては、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−ａ（ＬＴ−ａ、ＴＮＦ−ｂとしても公知）、ＬＴ−ｂ（複合体異種三量体ＬＴ−ａ２−ｂにおいて見出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌおよび神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１１】
ＴＮＦ−αは、単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）による感染からマウスを保護することが示されている。Ｒｏｓｓｏｌ−Ｖｏｔｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４３〜１４７（１９９１）。ＴＮＦ−αの保護効果の機構は未知であるが、インターフェロンもＮＫ細胞殺傷も関与しないようである。ＴＮＦＲファミリーの１つのメンバーは、ＨＳＶ−１が細胞に入ることを媒介することが示されている。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｗｔ．７：１５９（１９９６）。さらに、このＴＮＦＲの細胞外ドメインに対して特異的である抗体は、ＨＳＶ−１が細胞に入ることをブロックする。従って、本発明のエンドカインαアンタゴニストは、エンドカインαアミノ酸配列、およびＴＮＦＲにより媒介されてウイルスが細胞に入ることを防止し得る抗体の両方を含む。このような配列および抗体は、細胞表面に局在化するＴＮＦＲがウイルスに結合することと競合すること、またはウイルスが細胞表面レセプターに結合することを直接ブロックすることのいずれかによって、機能し得る。
【０３１２】
本発明による抗体は、本発明のエンドカインαレセプター免疫原を使用する、種々の標準的な方法のいずれかによって、調製され得る。このようなエンドカインαレセプター免疫原は、図１（配列番号２）に示すエンドカインαレセプタータンパク質（これは、リーダー配列を含んでもよいし、含まなくてもよい）、およびこのエンドカインαレセプターのリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、レセプターのポリペプチドフラグメントを含む。
【０３１３】
本発明によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストまたはアンタゴニストは、本明細書中に開示される方法に従って、ならびに／または、例えば、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ  ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９１３７（これら３つの文献の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される方法のように当該分野で公知の方法に従って、惹起され得、そして好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリぺプチドに対して特異的である。
【０３１４】
当業者が理解するように、本発明のエンドカインαポリペプチドおよび上記そのエピトープを保有するフラグメントは、異種ポリペプチド配列に結合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ならびにそれらの任意の組み合わせ（それらのドメイン全体および部分の両方を含む））と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そして増加した半減期を示す。
【０３１５】
遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を使用して、エンドカインαの活性を調節し得、これによって、エンドカインαのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々の全体が本明細書により参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチド、および対応するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメントを所望のエンドカインα分子に構築することを含む。別の実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前に誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、エンドカインαの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、区切り、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。好ましい実施形態において、異種の分子は、例えば、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（ＬＴ−α２−β異種三量体の複合体中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１１９０）、ｅｎｄｏｋｉｎｅ−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０および同ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＰＧ，ＯＸ４０、神経増殖因子（ＮＧＦ）、および可溶型のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、ＴＲ１２、およびＴＮＦ−Ｒ１、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３／ＡＰＯ−３／ＷＳＬ／ＬＡＲＤ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＤＲ４／ＡＰＯ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＲ５、ＤｃＲｌ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ３／ＴＲＩＤ／ＬＩＴ、ＤｃＲ２／ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＣＡＤ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＭＰ、およびｖ−ＦＬＩＰである。
【０３１６】
さらに好ましい実施形態において、異種分子は、ＴＮＦファミリーの任意のメンバーである。
【０３１７】
（染色体アッセイ）
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。その配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る。さらに、染色体上の特定の部位を同定する必要性が、現在存在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体位置を印付けするためには、ほとんど利用可能ではない。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関付ける際の、重要な第一段階である。
【０３１８】
この点における特定の好ましい実施形態において、本明細書中で開示されるｃＤＮＡを使用して、エンドカインαのタンパク質の遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およびライブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡを、インサイチュ染色体マッピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用する。代表的に、染色体マッピングのための慣用的な手順に従って、良好なインサイチュのハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために、いくらかの試行錯誤が必要であり得る。
【０３１９】
さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮＡにおける１より多くのエキソンにまたがる（従って、増幅プロセスを複雑にする）ことのないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用する。このプライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅された部分を与える。
【０３２０】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てるための、迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、サブ位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が、特定の染色体からの部分のパネルまたは大きなゲノムクローンのプールによって、類似の様式で達成され得る。その染色体に対してマッピングするために同様に使用され得る、他のマッピングストラテジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、フロー選別した標識染色体での予備スクリーニングおよび染色体特異的なｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択が挙げられる。
【０３２１】
中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブとともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０３２２】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上のその配列の物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通して同定する。
【０３２３】
次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異を決定することが必要である。変異が、罹患している個体のいくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては全く観察されない場合、その変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。
【０３２４】
物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度を用いると、疾患と関連する染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０３２５】
（エンドカインαの使用）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーリガンドは、最も多面発現性のサイトカインであることが公知であり、多数の細胞応答（細胞傷害性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）を誘導する（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ら、「Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ，Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１９８８）；Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）；Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１））。ＴＮＦ−ファミリーリガンドは、ＴＮＦ−ファミリーレセプターに結合することによって、このような種々の細胞応答を誘導する。
【０３２６】
本発明のエンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、エンドカインαの欠損または不十分な量のエンドカインαにより（直接的または間接的に）媒介される、任意の障害のための処置の開発において、使用され得る。エンドカインαポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、このような障害に苦しむ患者（例えば、哺乳動物、特にヒト）に投与され得る。あるいは、遺伝子治療アプローチが、このような障害を処置するために適用され得る。エンドカインαヌクレオチド配列の本明細書中の開示は、欠損エンドカインα遺伝子の検出、および正常なエンドカインαコード遺伝子での欠損エンドカインα遺伝子の置換を可能にする。欠損遺伝子は、インビトロ診断アッセイにおいて、本明細書中に開示されるエンドカインαヌクレオチド配列を、この遺伝子の欠損を有すると疑われる患者由来のエンドカインα遺伝子のヌクレオチド配列と比較することによって、検出され得る。
【０３２７】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＴＲ１１／エンドカインα相互作用の阻害から生じる、異なる細胞型に対する生物学的効果を試験するための、研究ツールとして使用される。エンドカインαポリペプチドはまた、ＴＲ１１またはエンドカインαまたはその相互作用を検出するために、インビトロアッセイにおいて使用され得る。
【０３２８】
上記のように、ＴＮＦは、組織損傷を生じるそのプロ炎症性作用（例えば、血管内皮細胞における凝血原活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球の接着の増加（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９（１９８７））、ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３９０（１９８７））について注目される。最近の証拠は、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性病理学（例えば、いくつかの悪性腫瘍を伴う悪液質において（Ｏｌｉｆｆ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ５０：５５５（１９８７））の病原において、ならびに自己免疫病理学および対宿主性移植片病理学（Ｐｉｇｕｅｔ，Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７））において、ＴＮＦを関係付けている。多くの研究は、ＴＮＦが、癌、感染病理および他の異化状態における悪液質の重要な媒介物であることを示唆してきた。
【０３２９】
従って、本発明のエンドカインαタンパク質は、腫瘍の標的化のために、好ましくは、放射性同位体または細胞増殖抑制性の薬物との結合体化の後に、使用され得る（ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、Ｂｌｏｏｄ  ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５））。エンドカインαは、黒色腫および肉腫を有する患者において、局所的な注射によって、腫瘍の後退および患者の寿命の長さの延長のために使用され得るか、または隔離された四肢の潅流において使用され得る（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＮａｔａｒａｊａｎ、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．７（２）：９２−１２４（１９９６））。
【０３３０】
本発明のエンドカインαはまた、特定の状況において、治療的役割（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、および他の感染（トキソプラスマ症、マンソン住血吸虫、リステリア菌およびＢＣＧを含む）に対する活性、）を有し得る。エンドカインαのこれらの効果は間接的であり得、従って好ましくは、マクロファージ、好酸球、線維芽細胞、または好中球の活性化により、媒介される。
【０３３１】
ＴＮＦはまた、グラム陰性敗血症および内毒素ショックの病態生理学的（熱、倦怠感、食欲不振および悪液質を含む）な結果において中心的な役割を果たすと考えられる（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ，４６３−４６６頁（１９８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｃｌｉｎ．５：２７−４７（１９８９））。内毒素は、ＴＮＦ（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２５８５−２５９１（１９８６））および他のサイトカインの産生および分泌を刺激する強力な単球／マクロファージ活性化因子である。増大したレベルの循環するＴＮＦはまた、グラム陰性敗血症を罹患する患者において見出されてきた（Ｗａａｇｅ，Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ｌ：３５５−３５７（１９８７））；Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｓｈｏｃｋ  Ｆｏｒｕｍ  ７１５−７１８頁（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１６１：９８２−９８７（１９９０））。
【０３３２】
ＴＮＦに対する中和抗血清またはｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有害な生理学的変化を廃止し、そして実験的な内毒素血症および菌血症における致死のチャレンジの後に、死を予防することが示された。この効果は、例えば、げっ歯類の死亡率アッセイおよび霊長類の病理モデル系において、実証された（Ｍａｔｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１９２５−１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：３１１−３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：４２１−４２７（１９９０）；Ｏｐａｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：１１４８−１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ  ３０：２７９−２９２（１９９０））。現在まで、ヒトにおける抗ＴＮＦ  ｍＡｂ治療の体験は制限されていたが、有益な治療結果（例えば、関節炎および敗血症において）を示した（例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６６：２７２−８（１９９５）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ  ３：１−１２（１９９５）：Ｗｈｅｒｒｙら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．２１：Ｓ４３６−４０（１９９３；Ｔｒａｃｅｙ  Ｋ．Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２１：Ｓ４１５−２２（１９９３）を参照のこと）。
【０３３３】
エンドカインαは、ＴＮＦの生物学的効果の多くを示すと考えられるので、本発明は、抗体に基づく治療にさらに関し、この治療は、１つ以上の上記の障害を処置するために、抗エンドカインα抗体を、哺乳動物（特にヒト）患者に処置する工程を包含する。抗エンドカインαポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生するための方法は、上に詳細に記載される。このような抗体は、当該分野において公知であるか、または本明細書中に記載されるような、薬学的に受容可能な組成物において提供され得る。
【０３３４】
本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／または状態の診断および処置または予防において、有用である。このような疾患および状態は、癌（例えば、免疫細胞に関連した癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、、膠芽腫、ｐ５３の変異または改変に付随する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頚部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、など）リンパ球増殖性の疾患（例えば、リンパ節症およびリンパ腫（例えば、ＥＢＶにより誘導されるリンパ増殖およびホジキン病））、微生物（例えば、ウィルス、細菌、など）の感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−２感染、ヘルペスウィルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むがこれらに限定されない）、アデノウィルス感染、ポックスウィルス感染、ヒトパピローマウィルス感染、肝炎感染（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、など）、ヘリコバクターピロリ感染、侵襲性ブドウ球菌感染、など）、寄生虫感染、腎炎、骨の疾患（例えば、骨粗しょう症）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、新生血管形成低下または循環低下（例えば、虚血性の疾患（例えば、心筋梗塞、発作、など）））、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性疾患、（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変質、など）、移植片拒絶（急性および慢性）、対宿主移植片病、骨髄形成異常による疾患（例えば、再生不良性貧血、など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝臓病（例えば、急性肝炎および慢性肝炎、肝損傷、ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体糸球体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレイブ（Ｇｒａｖｅ）病、橋本甲状腺炎、など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ、ぜん息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、および潰瘍性大腸炎を含むが、限定されない。
【０３３５】
本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成、創傷（例えば、創傷、やけど、および骨折）治癒を促進すること、ならびに骨形成の調節および骨粗しょう症の処置において、有用である。
【０３３６】
本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原、および／または抗ウイルス免疫応答に対して免疫応答性を増強するためのアジュバンドとして、有用である。
【０３３７】
さらに一般的に、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応答を調節する（すなわち、上昇および減少する）ことにおいて有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線療法、化学療法、および移植の準備または回復において有用であり得、あるいは高齢者および免疫無防備状態の個体において免疫応答および／または回復を高めるために使用され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド、ならびに／またはそのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、例えば、自己免疫障害の処置または予防において、あるいは移植拒絶（ｔｒａｎｓｏｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の予防として有用である。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、本明細書中に記載されるような、または当該分野において公知である、慢性炎症、アレルギーまたは自己免疫状態を、処置または予防するために使用される。
【０３３８】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法をまとめると、身体内で局所的にまたは全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、エンドカインαを結合させることを含む。これらのアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法を知る。
【０３３９】
本発明の薬学的組成物は、その意図される目的を達成する任意の手段によって、投与され得る。抗体、それらのフラグメントまたは誘導体の投与の量およびレジメンは、ＴＮＦ関連疾患を処置する臨床分野の当業者によって、容易に決定され得る。
【０３４０】
例えば、投与は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋内経路、腹腔内経路、経皮経路、または口腔内経路により得る。あるいは、または同時に、投与は経口経路により得る。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、併用する処置の種類（あるならば）、処置の頻度、および所望される効果の性質に依存する。
【０３４１】
本発明の範囲内にある組成物は、抗体、フラグメントまたは誘導体が、その意図される目的を達成するために有効な量で含まれている、すべての組成物を包含する。個々の必要性は変動するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該分野の技術の範囲内である。有効用量は、個々のキメラ抗体またはモノクローナル抗体、結合体化された治療剤（以下を参照のこと）の存在および性質、患者および患者の臨床状態の関数であり、そして約１０μｇ／ｋｇ体重から約５０００ｍｇ／ｋｇ体重まで変動し得る。好ましい投薬量は、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【０３４２】
薬理学的に活性な成分に加えて、新規の薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。好ましくは、調製物は、約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性化合物（単数または複数）を賦形剤と共に含有する。
【０３４３】
同様に、非経口投与のための本発明のエンドカインα抗体またはフラグメントの調製物（例えば、画像化のための検出可能に識別された形態または治療のための遊離もしくは結合体化された形態）は、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）、非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムを含む）、乳酸リンガー、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくものなど）が挙げられる。防腐剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような）もまた存在し得る。一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０を参照のこと。
【０３４４】
特に、本発明の抗体、フラグメント、および誘導体は、本明細書中に記載されるようなエンドカインα関連障害を有するかまたは発症する被験体を処置するために有用である。このような処置は、単回用量または複数回用量の抗体、フラグメントもしくは誘導体、またはそれらの結合体を非経口的に投与する工程を包含する。
【０３４５】
本発明の抗体は、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つ他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体、またはリンホカインもしくは造血増殖因子などと組み合わせて有利に利用され得る。
【０３４６】
エンドカインα（ＴＮＦと同様）の循環濃度は、極めて低い傾向にある（敗血症でない個体において約１０ｐｇ／ｍｌの範囲、そして敗血症患者において約５０ｐｇ／ｍｌに達し、そしてＴＮＦについての敗血症症候群では約１００ｐｇ／ｍｌを超え（Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、１９８９、前出））か、またはエンドカインα関連障害の部位でわずかに検出可能であるのみであり得るので、エンドカインαイムノアッセイおよびエンドカイン関連障害の治療の両方のためには、高親和性および／または強力なインビボエンドカインα阻害抗体および／または中和抗体、フラグメントまたはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、Ｋａとして表される、少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは、少なくとも１０9Ｍ-1（例えば、５×１０8Ｍ-1、８×１０8Ｍ-1、、２×１０9Ｍ-1、４×１０9Ｍ-1、６×１０9Ｍ-1、８×１０9Ｍ-1）のヒトエンドカインαに対する親和性を有する。
【０３４７】
ヒトの治療的用途に好ましいのは、本発明に従って、インビボで強力なエンドカイン阻害活性および／または中和活性を有する（例えば、細胞接着分子（例えば、ＥＬＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１）のエンドカインに誘導されるＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦの分泌、凝血促進活性、発現およびマイトジェン活性をインビボ、インサイチュ、およびインビトロにおいてブロックする）、高親和性のマウスおよびマウス／ヒト、またはヒト／ヒトキメラ抗体、ならびにフラグメント、領域、および誘導体である。
【０３４８】
本発明のさらなる好ましい実施形態としては、以下の適用におけるエンドカイン−αポリペプチドおよび機能的アゴニストの使用が挙げられるが、これらに限定されない：
特異的抗原に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバント。
【０３４９】
腫瘍特異的免疫応答を増強するためのアジュバント。
【０３５０】
抗ウイルス免疫応答を増強するためのアジュバント。
【０３５１】
病原体に対するＢ細胞応答の刺激物質として。
【０３５２】
Ｔ細胞のアクチベーターとして。
【０３５３】
免疫抑制治療を受ける前に、個体の免疫状態を上昇させる薬剤として。
【０３５４】
免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として；高齢の集団の間で免疫応答性を追加免疫するための薬剤として；骨髄移植後の免疫系エンハンサーとして。
【０３５５】
個体の免疫系を、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）および／またはＴＨ１細胞性応答の発生に指向させるための薬剤として。
【０３５６】
腫瘍増殖を誘導するため、従ってそれを抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にさせるための手段として。例えば、多発性骨髄腫は、緩徐に分裂する疾患であり、従って、実質的にすべての抗腫瘍レジメンに対して難治性である。これらの細胞をより迅速に増殖させる場合、これらの感受性プロフィールはおそらく変化する。
【０３５７】
細胞増殖の特定のアクチベーターまたはインヒビターが結合し得る細胞（例えば、内皮細胞）特異的結合タンパク質を発現するＢ細胞および他のリガンドとして。結果は、正常なＢ細胞集団、罹患したＢ細胞集団、または腫瘍性Ｂ細胞集団に対するこのようなアクチベーターまたはインヒビターの活性に焦点をあわせるべきである。
【０３５８】
Ｂ系列細胞および／またはリガンド発現細胞（例えば、内皮細胞）を、その特異性によって検出する手段として。この適用は、検出の手段を提供するためにビオチンまたは他の薬剤を用いてタンパク質を標識することを必要とし得る。
【０３５９】
病理（例えば、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、および／または分類不能型免疫不全）におけるＢ細胞産生の刺激物質として。
【０３６０】
Ｂ細胞選択デバイスの一部としてであって、その機能は、細胞型の異種混合物からＢ細胞ならびに他のリガンド発現細胞（例えば、内皮細胞）を単離することである。エンドカインαは、固体支持体に結合され得、次いで、この固体支持体にＢ細胞は特異的に結合する。結合しない細胞は洗い流され、そして結合した細胞は引き続いて溶出される。この技術は、移植前に、例えば、骨髄または末梢血から腫瘍細胞を除去することを可能にする。
【０３６１】
外科手術、外傷、または遺伝的欠陥に続く、リンパ組織の産生および／または再生のための治療として。
【０３６２】
免疫不全（例えば、ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような）を生じる遺伝学的に遺伝する障害のための遺伝子に基づく治療として。
【０３６３】
エンドカインα媒介応答を阻害または増強するための抗体の産生についての抗原として。
【０３６４】
単球に影響する寄生生物性疾患（例えば、リーシュマニア（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ））に対して防御するために、単球／マクロファージを活性化する手段として。
【０３６５】
移植前の骨髄サンプルの前処理として。このような処置は、Ｂ細胞提示を増加させ、従って回復を促進する。
【０３６６】
エンドカインαによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段として。
【０３６７】
所望されないＴＨ１応答の阻害。ＩＬ−１２が、ＴＨ１分化を指向する際に重要なサイトカインであることを実証するため強力な証拠が存在する。ＩＬ−１２産生のエンドカインα誘導阻害は、ＴＨ１関連状態（例えば、自己免疫疾患、炎症、急性同種移植拒絶、胎児吸収（ｆｅｔａｌ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ））を制御するにおいて有益であり得る。
【０３６８】
炎症応答の低下。ＩＬ−１０およびＭＣＰ−１の誘導は、糞便性腹膜炎（ｆｅｃａｌ  ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ）を改善することが示されている。
【０３６９】
病原体に対する抵抗性の増強。酸化バースト（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｕｒｓｔ）の産物（例えば、Ｈ2Ｏ2）は、食作用した病原体を殺傷するため、または細胞の細胞外破壊（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ）のために、単球によって使用される。
【０３７０】
上記のすべての適用を、同様に、獣医学的医薬に適用し得る。
【０３７１】
エンドカインαレセプターの結合抗体および／または阻害抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、あるいは可溶性形態を含むエンドカインαのアンタゴニスト。これらは、上記のリガンドの多くの活性を逆転し、そして以下のような臨床的または実用的適用を見出すと予期される：
外来因子または自己に対する免疫応答の種々の局面をブロックする手段。例としては、例えば、狼瘡のような自己免疫障害、および関節炎、ならびに皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、外傷、および病原体に対する免疫応答性が挙げられる。本発明者らの現在のデータは、Ｂ細胞、Ｔ細胞および単球に関連した病原体におけるエンドカインαの潜在的役割を直接的に示すが、他の細胞型が、発現またはエンドカインαに対する応答性を獲得し得ることは依然として可能である。従って、エンドカインαは、ＣＤ４０およびそのリガンドと同様に、免疫系の状態およびその細胞が位置付けられる微小環境によって調節され得る。
【０３７２】
自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑症、全身性エリテマトーデスおよびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖および／またはＴ細胞増殖、ならびにＩｇ分泌を予防するための治療。
【０３７３】
内皮細胞におけるＢ細胞移動および／またはＴ細胞移動のインヒビター。この活性は、組織構築（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）および同種の応答を破壊し、そして例えば、免疫応答を破壊する際および敗血症をブロックする際に有用である。
【０３７４】
対宿主性移植片病または移植拒絶のインヒビター。
【０３７５】
Ｂ細胞および／またはＴ細胞悪性疾患（例えば、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、およびＥＢＶ−形質転換疾患（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ））の治療。
【０３７６】
意義不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、および関連の特発性単一クローン性高ガンマグロブリン血症のような疾患における慢性高ガンマグロブリン血症事象の治療。
【０３７７】
慢性骨髄性白血病に関連したＢ細胞およびＩｇの関与を低下させる手段。
【０３７８】
免疫抑制剤。
【０３７９】
エンドカインα誘導Ｂ細胞活性化に関連しているＥＲＫ１、ＣＯＸ２およびＣｙｃｌｉｎＤ２の関与するシグナル伝達経路のインヒビター。
【０３８０】
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記のように、薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。
【０３８１】
アンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫疾患および慢性炎症性疾患および感染性疾患において、エンドカインαの走化性そしてマクロファージおよびそれらの前駆体の活性化、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化されたＴ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞）ならびにナチュラルキラー細胞の活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインシュリン依存性真性糖尿病が挙げられる。
【０３８２】
アンタゴニストはまた、単核食細胞の補充および活性化を予防することによって、感染性疾患（珪肺症、類肉腫症、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を含む）を処置するために使用され得る。これらはまた、好酸球の産生および移動を予防することによって、特発性好酸球増加症候群を処置するために使用され得る。エンドトキシンショックはまた、マクロファージの移動および本発明のエンドカインαポリペプチドのその産生を予防することによって、アンタゴニストにより処置され得る。アンタゴニストはまた、動脈壁における単球の浸潤を予防することによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
【０３８３】
アンタゴニストはまた、ケモカイン誘導肥満細胞および好塩基球脱顆粒ならびにヒスタミンの放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介アレルギー反応および免疫学的障害（晩期アレルギー反応、慢性じんま疹、およびアトピー性皮膚炎を含む）を処置するために使用され得る。ＩｇＥ媒介アレルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹）もまた処置され得る。
【０３８４】
アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引を予防することによって、慢性および急性の炎症を処置するために使用され得る。慢性および急性の炎症性肺疾患は、肺における単核食細胞の壊死巣分離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）に関連しているので、これらはまた、正常な肺のマクロファージ集団を調節するために使用され得る。アンタゴニストはまた、患者の関節における滑液中に単球を誘引すること予防することによって、慢性関節リウマチを処置するために使用され得る。単球の流入および活性化は、変性関節炎および炎症性関節炎の両方の病因において重要な役割を果たす。アンタゴニストは、主にＩＬ−１およびＴＮＦに帰する有害なカスケードを干渉するために使用され得、これは他の炎症性サイトカインの生合成を予防する。この様式において、アンタゴニストは、炎症を予防するために使用され得る。アンタゴニストはまた、エンドカインαによって誘導されるプロスタグランジン非依存性発熱（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｅｖｅｒ）を阻害するために使用され得る。アンタゴニストはまた、骨髄欠陥の症例（例えば、再生不良性貧血および骨髄異形成症候群）を処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、肺における好酸球の蓄積を予防することによって喘息およびアレルギーを処置するために使用され得る。アンタゴニストはまた、喘息の肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置するために使用され得る。
【０３８５】
エンドカインαに対する抗体は、外傷後に肺への好中球の浸潤を予防することによって、ＡＲＤＳを処置するためにエンドカインα活性に結合するために使用され得る。本発明のアンタゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、本明細書中の以降で記載するように薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。
【０３８６】
本発明のアゴニストおよびアンタゴニストはまた、創傷および組織の修復を刺激する際、新脈管形成を刺激する際、脈管またはリンパの疾患または障害の修復を刺激する際における用途を有する。さらに、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
【０３８７】
本発明の組成物は、単独または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る治療剤としては、ＴＮＦファミリーの他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインおよび／または増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。併用物は、同時に（例えば、混合物として、別々であるが、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）もしくは同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ））または連続的にのいずれかで投与され得る。これは、併用されるた薬剤が、治療用合剤として共に投与される提示、およびまた、併用される薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同一個体への別々の静脈内ラインを通して）投与される手順を包含する。「組み合わせにおける」投与はさらに、第１に与えられる１つの化合物または薬剤（これは、第２物によって続けられる）の別々の投与を包含する。
【０３８８】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーの他のメンバーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ分子、ＴＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性形態の、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロ三量体ＬＴ−α２−βの状態で見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態の、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態の、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３。
【０３８９】
本発明の組成物とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ステロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９０】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、抗生物質剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤としては、テトラサイクリン、メトロニダゾル、アモキシリン、β−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、マクロライド、キノロン類、フルオロキノロン類、セファロスポリン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９１】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を、単独または抗炎症剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症剤は、糖質コルチコイドおよび非ステロイド性抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキシアミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロル、パラリニン、ペリソキサール、ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプを含むが、限定されない。
【０３９２】
別の実施形態において、本発明の組成物を、化学療法剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法剤は、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクシウリジン、インターフェロンαー２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シス−プラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎ）、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、二リン酸ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、チョランブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組合せ（例えば、リン酸ベタメタソンナトリウム；およびその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）を含むが、これらに限定されない。
【０３９３】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、脈管形成タンパク質と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る脈管形成タンパク質としては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム誘導増殖因子（Ｇｉｌｉｏｍａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２（ＰｌＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるような血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【０３９５】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子としては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９６】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、他の治療レジメンまたは予防レジメン（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
【０３９７】
本発明のエンドカインα組成物はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性組成物の適切な例は、ポリマー材料（例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスのような適切な）、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩のような）を包含する。
【０３９８】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０３９９】
徐放性組成物はまた、リポソームに封入された本発明の組成物を包含する（一般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）。エンドカインαポリぺプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適なエンドカインαポリぺプチド治療のために調整される。
【０４００】
別の実施形態では、本発明の徐放性（ｓｙｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）組成物は、当該分野で公知の結晶処方物を含む。
【０４０１】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、ポンプによって送達される（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【０４０２】
本発明の組成物は、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬ。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＱＳ−２１と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の組成物とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向するワクチンならびに／またはＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TM。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与される説明を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０４０３】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組合せて使用され、感染ならびに／または感染に関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態を処置、予防、および／または診断する。１つの実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組合せて使用されて、任意のグラム陽性菌感染ならびに／またはグラム陽性菌感染に関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態を処置、予防、および／または診断する。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組合せて使用されて、感染ならびに／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメンバーに関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態を処置、予防、および／または診断する。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMとの任意の組合せで使用されて、感染ならびに／またはＢ群連鎖球菌の１つ以上のメンバーに関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態を、処置、予防、および／または診断する。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組合せて使用され、感染ならびに／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態を、処置、予防、および／または診断する。
【０４０４】
本発明の組成物は、単独で、または他の治療的薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物とともに投与され得る治療的薬剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、ならびにサイトカイン。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される説明を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０４０５】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦ関連、またはＴＮＦ様の分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおいて見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１およびＷＯ９８／１８９２１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）１１８５−１１９０）、エンドカイン−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、ＯＸ４０、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、ならびにＴＲ１２。
【０４０６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、単独あるいはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４０の可溶性形態（例えば、ＡＶＲＥＮＤ）、ＣＤ４０Ｌの生物学的に活性なフラグメント、改変体、もしくは誘導体、抗−ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、および／または抗−ＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）と組合せて投与される。
【０４０７】
特定の実施形態において、本発明の組成物を、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビター、非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビター、および／またはプロテアーゼインヒビターと共に投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビターは、ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ／ｄｄＣ）／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）を含むが、限定されない。本発明の組成物と組み合わされて投与され得る非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビターは、ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎ））、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲTM（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ））を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターは、ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビター、非ヌクレオシド逆トランスクリプターゼインヒビター、および／またはプロテアーゼインヒビターは、本発明の組成物と任意に組み合わせて、使用され、ＡＩＤＳを処置、予防、および／もしくは診断し得、ならびに／またはＨＩＶ感染を処置、予防、および／もしくは診断し得る。
【０４０８】
他の実施形態において、本発明の組成物を抗日和見性感染剤と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見性剤は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスティム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サーグラモスティム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMと任意に組み合わせて使用され、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ菌複合感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、と任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、予防、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性サイトメガロウイルス感染を予防的に処置、予防、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性真菌感染を予防的に処置、予防、および／または診断する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、および／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｉ型単純疱疹ウイルス感染および／またはＩＩ型単純疱疹ウイルス感染を予防的に処置、予防、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性細菌感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断する。
【０４０９】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を、抗ウイルス剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）を含むが、これらに限定されない。
【０４１０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物を抗生物質剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤は、アモキシリン、アミノ酸糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン類、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリペトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０４１１】
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る、従来の非特定の免疫抑制剤は、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドＩＶ、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤を含むが、これらに限定されない。
【０４１２】
特定の実施形態において、本発明の組成物を、免疫抑制薬と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制薬製剤調製物は、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴTM（マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））、アザチオプリン、グルコルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM（シロリマス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移植の拒絶を妨ぐために使用され得る。
【０４１３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組合せて投与される。本発明の組成物と組合せて投与され得るステロイドとしては、経口コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロン（例えば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、プレドニゾンと組合せて投与される。さらなる特定の実施形態では、本発明の組成物は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組合せて投与される。本発明の組成物およびプレドニゾンと共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド（ｃｙｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態では、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組合せて投与される。本発明の組成物およびメチルプレドニゾロンと共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１４】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、抗マラリア薬と組合せて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１５】
好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投与される。
【０４１６】
非排他的な実施形態においては、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０、またはそれより多い以下の薬物と組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ（Ａｂｂｏｔｔ）、ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、ｅｌｔｅｎａｃ（Ｂｙｋ  Ｇｕｌｄｅｎ）、ｃａｍｐａｔｈ、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ  Ｗｈａ）、ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター  １（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ｔｒｏｃａｄｅ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＬｅｕｋｏＶａｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）、およびｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。
【０４１７】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５またはそれ以上の以下の薬物と組み合わせて投与される：メトトレキサート、スルファサラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリン、ペニシラミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、本明細書中で記載されるような）、シクロホスファミド、クロランブシル、金、ＥＮＢＲＥＬTM（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。
【０４１８】
より好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトトレキサート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＮＢＲＥＬTMおよび／またはスルファサラジンと組み合わせて投与される。１つの実施形態においては、本発明の組成物は、メトトレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、メトトレキサート、抗ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTMと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTMおよびメトトレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ＥＮＢＲＥＬTM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態においては、１以上の抗マラリア薬が、上記列挙される組み合わせの１つと組み合わされる。特定の実施形態においては、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、ＥＮＢＲＥＬTM、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態においては、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮＦ抗体、およびメトトレキサートと組み合わせて投与される。
【０４１９】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、単独で、または１以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  Ｓ／ＤTM、およびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、本発明の組成物は、移植治療（例えば、骨髄移植）において、静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０４２０】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、単独で、または抗炎症薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グルココルチコイドおよび非ステロイド系抗炎症薬、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジタゾール（ｄｉｔａｚｏｌ）、エモルファゾン、グアイアズレン（ｇｕａｉａｚｕｌｅｎｅ）、ナブメトン、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、オルゴテイン（ｏｒｇｏｔｅｉｎ）、オキサセプロール（ｏｘａｃｅｐｒｏｌ）、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリゾキサール、ピフォキシム（ｐｉｆｏｘｉｍｅ）、プロクアゾン（ｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、プロキサゾール（ｐｒｏｘａｚｏｌｅ）、およびテニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）。
【０４２１】
別の実施形態においては、本発明の組成物は、化学療法薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法薬としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害性薬剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、ｃｉｓ−プラチン、およびビンクリスチンスルフェート）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンホスフェートナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、メゲストロールアセテート、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コラムブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組み合わせ（例えば、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）ナトリウムホスフェート）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎ）、アスパラギナーゼ、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、硫酸ビンクリスチン、ビンブラスチンスルフェート、およびエトポシド）。
【０４２２】
特定の実施形態においては、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）またはＣＨＯＰの構成成分の任意の組み合わせと組み合わせて投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの構成成分の任意の組み合わせと共に投与される。
【０４２３】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得るサイトカインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗−ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−β。別の実施形態においては、本発明の組成物は、任意のインターロイキンと共に投与され得、そのインターロイキンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ＩＬ４およびＩＬ１０と組み合わせて投与される。
【０４２４】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、ケモカインと共に投与される。別の実施形態においては、本発明の組成物は、ケモカインβ−８、ケモカインβ−１、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−４と共に投与される。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、ケモカインβ−８と共に投与される。
【０４２５】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、ＩＬ−４アンタゴニストと共に投与される。本発明の組成物と共に投与され得るＩＬ−４アンタゴニストとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチド、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチドの多量体形態；ＩＬ−４によって誘発される生物学的シグナルを変換することなく、ＩＬ−４レセプターと結合する、抗ＩＬ−４レセプター抗体、１以上のＩＬ−４レセプターへのＩＬ−４の結合をブロックする、抗ＩＬ−４抗体、およびＩＬ−４レセプターに結合するが、ＩＬ−４によって誘発される生物学的シグナルを変換しない、ＩＬ−４のムテイン。好ましくは、この方法に従って使用される抗体は、モノクロナール抗体（抗体フラグメント（例えば、本明細書中に記載されるような抗体フラグメント）を含む）である。
【０４２６】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、造血成長因子と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血成長因子としては、ＬＥＵＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭTM）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２７】
さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、線維芽細胞成長因子と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る線維芽細胞成長因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５。
【０４２８】
さらに、本発明の組成物は、単独で、または放射線療法が挙げられるがこれに限定されない、他の治療レジメンと組み合わせて投与され得る。このような組み合わせの治療は、連続的におよび／または同時に投与され得る。
【０４２９】
（治療的使用）
本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、これは、本発明の抗体を、１つ以上の記載された障害を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を包含する。本発明の治療的化合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるようなそれらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態を処置、阻害または予防するために使用され得、それらの疾患、障害または状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：本明細書中に記載される１以上の任意の疾患、障害または状態（例えば、このような疾患または障害（自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑病（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑病）、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性肺炎、ギャン−バレー症候群、インシュリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症眼、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能不全症（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーゼス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、グレーヴズ病、重症筋無力症、およびインシュリン抵抗性）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アディソン病、不妊症、糸球体腎炎（例えば、一次糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、真性糖尿病、およびアドレナリン作動性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬剤耐性を含む）、活動性慢性肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性筋障害、ならびに他の炎症性、肉芽種性、変性および萎縮性障害、ならびに免疫不全が挙げられるが、これらに限定されない）に関連する、自己免疫疾患、障害または状態、あるいは対宿主性移植片病および移植片拒絶を含むがこれらに限定されない疾患または障害に関連する状態。
【０４３０】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は、慢性関節リウマチを処置、阻害、予後の判定、診断または予防するために使用される。
【０４３１】
別の特定の実施形態においては、本発明の抗体は、全身性エリテマトーデスを処置、阻害、予後の判定、診断または予防するために使用される。
【０４３２】
本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患および障害の処置および／または予防としては、これらの疾患および障害に関連する症状の軽減が挙げられるが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載される、薬学的に受容可能な組成物で提供され得る。
【０４３３】
本発明の抗体が治療的に使用され得る様式の概要としては、身体における局所的もしくは全身的な本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの結合、または抗体の直接的な細胞傷害性による様式（例えば、補体（ＣＤＣ）もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって媒介されるような）を含む。これらのアプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書に提供される教示によって、当業者は、過度の実験なして、診断目的、モニタリング目的または治療目的のための本発明の抗体の使用法を理解する。
【０４３４】
本発明の抗体は、例えば、この抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つ、他のモノクロナール抗体もしくはキメラ抗体、またはリンホカインもしくは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７など）と組み合わせて、有利に使用され得る。
【０４３５】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン治療、免疫療法および抗腫瘍剤）と組み合わせて投与され得る。一般に、（抗体の場合は）患者と同じ種である、種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒト抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０４３６】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０４３７】
１つの実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシン、またはプロドラッグに会合するエンドカインαポリペプチドまたは抗エンドカインα抗体を含む組成物）を、標的細胞に送達し、それらの表面上にエンドカインαの膜結合形態を発現するか、あるいはそれらの表面上にエンドカインαレセプター（例えば、ＴＲ１１）を発現する方法を提供する。本発明のエンドカインαポリペプチドまたは抗エンドカインα抗体は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシンまたはプロドラッグに会合し得る。
【０４３８】
１つの実施形態においては、本発明は、異種ポリペプチドまたは異種核酸に会合する本発明のポリペプチド（例えば、エンドカインαまたは抗エンドカインα抗体）を投与することによる、本発明の組成物の特異的送達のための方法を提供する。１つの例においては、本発明は、治療的タンパク質を標的細胞に送達するための方法を提供する。別の例においては、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスもしくはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を標的細胞に送達するための方法を提供する。
【０４３９】
別の実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、エンドカインαポリペプチドまたは抗エンドカインα抗体）をトキシンまたは細胞傷害性プロドラッグと共に投与することによる、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０４４０】
特定の実施形態においては、本発明は、エンドカインαポリペプチドをトキシンまたは細胞傷害性プロドラッグと共に投与することにより、それらの表面上にＴＲ１１を発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞および／またはＴ細胞および／またはＢ細胞関連白血病もしくはリンパ腫）の特異的破壊のための方法を提供する。
【０４４１】
別の特異的な実施形態においては、本発明は、抗エンドカインα抗体をトキシンまたは細胞傷害性プロドラッグと共に投与することによる、それらの表面上にエンドカインαの膜結合形態を発現する細胞（例えば、内皮細胞）の特異的破壊のための方法を提供する。
【０４４２】
「トキシン」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、ラジオアイソトープ、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型トキシン、トキシンの触媒サブユニット、細胞毒素（細胞傷害性薬剤）または細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない規定の条件下で細胞死を引き起こす任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得るトキシンとしては、当該分野で公知のラジオアイソトープ、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクター系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体結合））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、αトキシン、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素が含まれるが、これらに限定されない。「トキシン」はまた、細胞成長抑止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬剤または放射性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、213Ｂｉまたは他の放射性同位体（例えば、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イットリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウムおよび188レニウム）；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンを含む。
【０４４３】
当該分野において公知の技術は、本発明の標識タンパク質（抗体を含む）に適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中にその全体が参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞毒素または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、以下が挙げられる：パクリタキソール（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログ。治療薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビジン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。
【０４４４】
「細胞障害性プロドラッグ」とは、通常、細胞に存在する酵素によって細胞障害性化合物に転化された非毒性の化合物が意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞障害性プロドラッグとしては、安息香酸カラシアルキル化試薬のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４５】
本発明の組成物は、機能的な内因性抗体分子を産生できない動物、または他の損なわれた免疫を有する動物（上記の動物が挙げられるが、これらに限定されず、そして、トランスジェニック動物もまた挙げられる）に投与され得る。しかし、この動物は、他の動物由来の再構成または部分的に再構築された免疫系を使用してヒト免疫グロブリン分子を産生可能である（例えば、刊行されたＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、ＷＯ  ９１／１０７４１を参照のこと）。本発明の組成物としては、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−αポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニスト、抗体、アンチ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４６】
本明細書中に記載される組成物は、特定の抗体に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバントとして使用され得る。特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されるエンドカインαポリペプチドである。別の特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されるエンドカインαポリヌクレオチドである（すなわち、エンドカインαポリヌクレオチドは、遺伝的ワクチンアジュバントである）。本明細書中に議論されるように、エンドカインαポリヌクレオチドは、当該分野で公知の技術（リポソームの送達、組み換えベクター送達、裸のＤＮＡの注入、および遺伝子銃送達を含むが、これらに限定されない）を用いて投与され得る。
【０４４７】
本明細書中に記載される組成物はまた、腫瘍特異的な免疫応答を増強するために使用されるアジュバントであり得る。
【０４４８】
本発明の組成物をアジュバントとして使用する増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、ウイルスおよびウイルス関連疾患または本明細書中に記載されるか、あるいは当該分野で公知の別の症状が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を増強するアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、日本脳炎、インフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、フニン、チクングニヤ、リフトバレー熱、単純ヘルペス、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される。
【０４４９】
本発明の組成物をアジュバントとして使用して増強され得る抗細菌または抗真菌免疫応答としては、細菌または真菌および本明細書中で記載されるか、または当該分野で公知の他の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：破傷風、ジフテリア、ボツリスム、および髄膜炎Ｂ型からなる群より選択される細菌または真菌、疾患、または症状免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：コレラ菌、らい菌、チフス菌、パラチフス菌、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌属、赤痢菌属、腸毒性大腸菌、腸出血性大腸菌、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およびプラスモディウム属（マラリア）からなる群より選択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用される。
【０４５０】
アジュバントとして本発明の組成物を使用する増強され得る抗寄生生物免疫応答は、寄生生物および本明細書中に記載されるか、または当該分野において公知の他の寄生生物に関連した疾患または症状を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対する免疫応答を増強するアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プラスモディウム属（マラリア）に対する免疫応答を増強するアジュバントとして使用される。
【０４５１】
本発明の組成物は、病原体に対するＢまたはＴ細胞の反応性の刺激物質として使用され得る。
【０４５２】
本発明の組成物は、免疫抑制療法を受ける前に個々の免疫状態を上昇させる薬剤として使用され得る；高度な親和性抗体を誘導するための薬剤として；血清免疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として；免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として；老いた集団の中で免疫応答性をブーストするための薬剤として；および骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または異種の器官移植）前、または最中、または後の免疫系のエンハンサーとして。
【０４５３】
移植に関して、本発明の組成物は、移植の前、同時および／または後に投与され得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔ細胞集団の回復の開始の前に、移植後に投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔ細胞集団の回復の開始後の移植の後、初めに投与されが、Ｂ細胞の集団の完全な回復の前である。
【０４５４】
本発明の組成物は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾摘出を受けた個体）間の免疫応答性をブーストするための薬剤として使用され得る。エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストの投与によって回復され得るか、または処置され得るＢ細胞免疫不全としては、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ結合、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ−結合無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ結合乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、乳児の過渡性高ガンマグロブリン血症、不特定の高ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ結合免疫不全、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ結合免疫不全、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うか、または伴わない）、正常または上昇したＩｇｓを伴う抗体不全、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠損、カッパ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択性ＩｇＭ免疫欠損、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、網様発育不全、新生児好中球減少症、重症の先天性白血球減少症、免疫欠損を有するリンパ形成不全−発育不全症または形成異常症、運動失調−毛細血管拡張症、短肢小人症、Ｘ−結合リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇｓを伴うネゼロフ症候群−混合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０４５５】
エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、またはそのアゴニスト投与によって回復され得るか、または処置され得るＴ細胞免疫欠損としては、ＤｉＧｅｏｒｇｅ異常、胸腺発育不全、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損、特発性ＣＤ４＋  Ｔ−リンパ球減少症、および優勢なＴ細胞欠損を有する免疫欠損、対宿主性移植片病、移植片拒絶および免疫欠損に関連した炎症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】
エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、またはそのアゴニスト投与によって回復され得るか、または処置され得る後天性のＢまたはＴ細胞機能の損失を生じるさらなる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄、およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５７】
本発明の組成物はまた、一時的な免疫欠損を有する個々の間の免疫反応性をブーストするための薬剤として使用され得る。エンドカインαポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストの投与によって回復さえ得るか、または処置され得る一時的な免疫欠損を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養不良に関連した状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連した状態、麻疹からの回復、血液輸血からの回復、およびが手術からの回復が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５８】
好ましい実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、体の種々の粘液性膜の任意の１以上に発症する疾患または障害、または関連した状態の処置、予防、および／または診断に使用される。このような疾患または障害としては、例えば、ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ、粘膜破壊、粘液性結腸炎、皮膚粘膜リーシュマニア症（例えば、アメリカリーシュマニア症、皮膚フランベシア、鼻咽頭リーシュマニア症、および新世界リーシュマニア症のような）、皮膚粘膜リンパ節症候群（例えば、川崎病）、小腸粘膜炎、粘液性類表皮癌、粘液類上皮腫、粘膜上皮形成異常、類粘液腺癌、ムコイド変性、ミクソイド（ｍｙｘｏｉｄ）変性、ミクソイド（ｍｙｘｏｍａｔｏｕｓ）変性、ムコイド中膜変性（例えば、嚢胞性中膜壊死）、ムコリピドーシス（例えば、ムコリピドーシスＩ、ムコリピドーシスＩＩ、ムコリピドーシスＩＩＩ、およびムコリピドーシスＩＶを含む）、粘液溶解障害、粘液性膜性腸炎、小腸粘膜炎、ムコ多糖体症（例えば、Ｉ型ムコ多糖体症（すなわち、フルラー症候群）、ＩＳ型ムコ多糖体症（すなわち、シャイエ症候群またはＶ型ムコ多糖体症）、ＩＩ型ムコ多糖体症（すなわち、ハンター症候群）、ＩＩＩ型ムコ多糖体症（すなわち、サンフィリポ症候群）、ＩＶ型ムコ多糖体症（すなわち、モルキオ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖体症（すなわち、マロトー−ラミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖体症（すなわち、βグリクロニダーゼ欠損に起因するムコ多糖体症）、およびムコスルファチドーシスのような）、ムコ多糖体尿、粘液膿性結膜炎、膿様粘液、ムコール菌症（すなわち、粘液腫症）、粘膜病（すなわち、ウシのウイルス性下痢）、粘液性大腸結腸炎（例えば、粘液性結腸炎および粘液性大腸結腸炎のような）、およびムコビシドーシス（例えば、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ）、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵線維嚢胞症、ムコビシドーシスおよび粘液過剰症のような）が挙げられるが、これらに限定されない。高度に好ましい実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ、特に化学療法に関連した処置、予防、および／または診断のために使用される。
【０４５９】
本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアゴニストあるいはアンタゴニストは、１以上の以下：原発性免疫欠損、免疫媒介性血小板減少症、川崎症、骨髄移植（例えば、成人または子供の最近の骨髄移植）、慢性Ｂ細胞リンパ球白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人または小児ＨＩＶ感染）、慢性炎症脱髄性多発ニューロパシー、および移植後の紫斑の疾患、または障害、あるいはそれらに関連した状態の診断、予知、処置、または予防に使用され得る。
【０４６０】
さらに、本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、１以上の以下：ギヤン−バレー症候群、貧血（例えば、パルボウイルスＢ１９に関連した貧血）、感染の危険の高い安定な多発性骨髄腫を有する患者の疾患（例えば、再発性感染）、自己免疫性溶血性貧血（温暖型自己免疫性溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小板減少症）、および免疫媒介性好中球減少症、移植術（例えば、ＣＭＶ−陽性器官のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−陰性受容者）、ｈｙｐｏｇａｍｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ（例えば、低ガンマグロブリン（例えば、感染または病的状態の危険因子を有するｈｙｐｏｇａｍｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉｃ）新生児）、てんかん、（例えば、難治性てんかん）、全身管脈症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、重症筋無力症（例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎および多発性筋炎の障害、またはそれらに関連する状態の診断、予知、処置、または予防に使用され得る。
【０４６１】
本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、哺乳動物（特にヒト）における種々の免疫系関連疾患および／またはこれらの疾患に関連する状態の処置、予防、および／または診断に使用され得る。多くの自己免疫疾患は、免疫細胞による外来物質としての自身の不適切な認識に起因する。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導く免疫応答を生じる。従って、免疫応答（特に、Ｂ細胞の増殖、および／または免疫グロブリンの産生）を示し得る本発明のエンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の処置および／または予防における有効な療法であり得る。従って、好ましい実施形態において、本発明のエンドカインαアンタゴニスト（例えば、エンドカインαのポリペプチドフラグメントおよび抗エンドカインα抗体）は、自己免疫障害の処置、予防、および／または診断に使用される。
【０４６２】
本発明のエンドカインαポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）で処置、予防、および／または診断され得る自己免疫疾患、およびこれらの疾患に関連した状態としては、自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼結膜炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑）、Ｒｅｉｔｅｒ’ｓ病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン−バレー症候群、スティッフマン症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症眼疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６３】
本発明の組成物で処置、予防、および／または診断され得る、さらなる自己免疫障害（非常にありそうな）としては、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）（しばしば例えば、細胞媒介性およびホルモン甲状細胞毒性によって特徴付けられる）、全身性エリテマトーデス（例えば、循環および局所的に生成された免疫複合体によってしばしば特徴づけられる）、グッドパスチャー症候群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）、天疱瘡（しばしば例えば、表皮棘融解抗体によって特徴付けられる）、自己免疫レセプター（しばしば例えば、グレーヴズ病（例えば、ＴＳＨレセプター抗体によって特徴付けられる）、重症筋無力症（しばしば例えば、アセチルコリンレセプター抗体によって特徴付けられる）、およびインスリン耐性（しばしば例えば、インスリンレセプター抗体によって特徴付けられる）、自己免疫溶血性貧血（しばしば例えば、抗体感作ＲＢＣの食菌作用によって特徴付けられる）、および自己免疫特発性血小板減少性紫斑病（しばしば例えば、抗体感作小板の食菌作用によって特徴付けられる）のような）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６４】
本発明の組成物で処置、予防、および／または診断され得るさらなる自己免疫障害としては、リウマチ様動脈炎（しばしば間接における免疫複合体によって特徴付けられる）、抗コラーゲン抗体を有するｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ（しばしば例えば、核小体および他の核抗体によって特徴付けられる）、混合結合組織病（抽出可能な核抗原（しばしば例えば、リボ核蛋白）に対する抗体によって特徴付けられる）、多発性筋炎／皮膚筋炎（しばしば例えば、リボ核蛋白ＡＮＡによって特徴付けられる）、悪性貧血（しばしば例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内性因子抗体によって特徴付けられる）、特発性アディソン病（しばしば体液および細胞媒介性腎傍細胞毒性、不妊症（しばしば例えば、抗精子抗体によって特徴付けられる）によって特徴付けられる）、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症のような糸球体腎炎（しばしば例えば、糸球基底膜抗体または免疫複合体によって特徴付けられる）、水胞性天疱瘡（しばしば例えば、基底膜におけるＩｇＧおよび補体によって特徴付けられる）、シェーグレン症候群（しばしば例えば、多発性組織抗体、および／または特異的非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によって特徴付けられる）、糖尿病蜜剤（しばしば例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によって特徴付けられる）およびアドレナリン作用性薬物耐性（ぜん息または嚢胞性線維症を有するアドレナリン作用性薬物耐性を含む）（しばしば例えば、βアドレナリン作用性レセプター抗体によって特徴付けられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６５】
本発明の組成物で処理、予防、および／または診断され得る、さらに（可能な）自己免疫障害としては慢性活動性肝炎（しばしば例えば、平滑筋抗体によって特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（しばしば例えば、ミトコンドリア（ｍｉｔｃｈｏｎｄｒｉａｌ）によって抗体特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（しばしば例えば、ある場合においては、特定組織の抗体によって特徴付けられる）、白斑（しばしば例えば、メラノサイト抗体によって特徴付けられる）、脈管炎（しばしば例えば、血管壁および／または低血清組成物におけるＩｇおよび補体によって、特徴付けられる）、ＭＩ後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）（しばしば心筋抗体によって、特徴付けられる）、心臓切開術症（しばしば心筋抗体によって、特徴付けられる）、じんま疹（しばしば例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によって、特徴付けられる）、ぜん息（しばしば例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体として、特徴付けられる）、炎症性ミオパシー、および多くの他の炎症、顆粒性、変性、および萎縮性障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６６】
好ましい実施形態において、上記の自己免疫疾患および障害および／またはこの疾患および障害に関連する状態は、抗エンドカインα抗体を使用して処置、予防、および／または診断される。
【０４６７】
特定の好ましい実施形態において、リウマチ様動脈炎は、本発明の抗エンドカインα抗体および／または他のアンタゴニストを使用して処置、予防および／または診断される。
【０４６８】
特定の好ましい実施形態において、狼瘡は、本発明の抗エンドカインα抗体、および／または他のアンタゴニストを使用して処置、予防、および／または診断される。
【０４６９】
特定の好ましい実施形態において、狼瘡に関連する腎炎は、本発明の抗エンドカインα抗体および／または他のアンタゴニストを使用して処置、予防、および／または診断される。
【０４７０】
特定の実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）は、全身性エリテマトーデスのおよび／または疾患、障害および／またはそれに関連した状態の処置、または予防のために使用される。エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、または本発明のアンタゴニストで処置、または予防され得る狼瘡に関連した疾患、障害、または状態としては、血液学的障害（例えば、溶血性貧血、白血球減少症、リンパ球減少症、および血小板減少症）、免疫学的障害（例えば、抗ＤＮＡ抗体、および抗Ｓｍ抗体）、発疹、羞明、口潰瘍、関節炎、熱、疲労、重量喪失、漿膜炎（例えば、胸膜炎）、腎障害（例えば、腎炎）、神経学的障害（例えば、発作、末梢性ニューロパシー、ＣＮＳ関連障害）、胃腸障害、レーノー現象、および心膜炎が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）は、全身性エリテマトーデスに関連した障害の処置または予防に使用される。最も好ましい実施形態において、エンドカインαポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアンタゴニスト（例えば、抗エンドカインα抗体）は、全身性エリテマトーデスに関連した腎炎の処置または予防に使用される。
【０４７１】
特定の実施形態において、本発明の溶解性エンドカインαポリペプチドまたはそのアゴニストは、免疫欠損（例えば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成体発生無ガンマグロブリン血症、後期発症ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症（ｄｙｓｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ、ｈｙｐｏｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、乳児の一過性低ガンマグロブリン血症、不特定の低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正常または増大したＩｇｓを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠損、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、退縮無ガンマグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全、重症の先天性白血球減少、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全−発育不全または形成異常、運動失調、短肢小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇｓを伴うネゼロフ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）および重症の複合免疫欠損、ディ・ジョージ異常、胸腺発育不全、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損、特発性ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球減少、ならびに優性Ｔ細胞欠損を伴う免疫欠損または免疫欠損に付随する状態）の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７２】
特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫不全の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７３】
特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７４】
別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７５】
別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７６】
別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖Ｉｇ欠損の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７７】
別の特定の実施形態において、本発明のエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ディ・ジョージ異常の処置、予防、予後判定、および／または診断のために投与される。
【０４７８】
別の特定の実施形態において、ＩＬ−１０およびエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせは、Ｔ細胞応答に関連する病理学、特に、自己免疫疾患、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および組織移植拒絶の抑制において有利に使用され得る。本発明は、同種移植拒絶およびＧＶＨＤのような細胞媒介反応を抑制するために使用され得る。さらに、ＩＬ−１０の多様な生物学的活性を考慮すると、ＩＬ−１０およびエンドカインαポリペプチドまたはポリヌクレオチドの併用は、同種異系骨髄移植におけるＧＶＬ（対白血病性移植）を支持し得る。
【０４７９】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、拒絶反応の防止または皮膚、骨、ニューロン組織、滑膜、心臓、腎臓、膵臓、骨髄、小腸、肺、心肺の組合わせ、角膜組織、肝臓などの同種異系移植組織の生存を延長するために使用され得る。移植された組織自体は代表的にはヒトが起源であるが、アカゲザル、ヒヒまたはブタのような別の種からでもあり得る。本明細書中で使用される場合、用語「組織」は、血液細胞のような個々の細胞を含み、これには、それらの前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、および膵細胞、ならびに固形器官などを含む。用語固形器官は、心臓、皮膚、肝臓、肺、角膜、腎臓、膵臓、腸、内分泌腺、膀胱、骨格筋などを意味する。
【０４８０】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、大きな範疇の疾患を、その発生の前および／または後に処置するために使用され得、このような疾患としては、自己免疫疾患（病因学を有する炎症性疾患（関節炎のような自己免疫成分（例えば、慢性関節リウマチ、関節炎慢性プログレジエンテ（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）および慢性関節リウマチ）ならびにリウマチ性疾患）が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４８１】
自己免疫疾患は、２つの一般的な型、すなわち全身性自己免疫疾患（関節炎、狼瘡および強皮症によって例示される）、および器官特定（多発性硬化症、糖尿病およびアテローム性動脈硬化症によって例示され、このうち後者の場合、脈管構造が特定器官としてみなされる）に分類され得る。本発明の組成物が使用され得る特定の自己免疫疾患としては、自己免疫血液学的障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、赤芽球ろうおよび特発性血小板減少が挙げられる）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーヴンズ‐ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられる）、自己免疫甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑（ｖｉｔｉｌｏｇｏ）、グルテン過敏性腸症（ｇｌｕｔｅｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）、自己免疫好中球減少症（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａｓ）、尋常天疱瘡、グッドパスチャー疾患、水疱性類天疱瘡、円板状狼瘡（ｄｉｓｃｏｉｄ  ｌｕｐｕｓ）、デンスデポジット病、内分泌性眼障害、ＩＢＤ、ぜん息、グレーヴズ病、類肉腫症、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変を含む肝硬変、若年性糖尿病（真性糖尿病１型）、インスリン依存性糖尿病、（すなわち、ＩＤＤＭ、または自己免疫糖尿病）、ブドウ膜炎（前側および後側）、自己免疫胃炎、リンパ球減少、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ）病、橋本病、原発性粘液水腫、多発性筋炎、混合結合組織病、乾性角結膜炎および春季カタル、間隙性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群を伴うものおよび伴わないもの（例えば、特発性ネフローゼ症候群または最少変化腎症が挙げられる））、若年性皮膚筋炎、活動性慢性肝炎を含む肝炎、器官拒絶、ならびに他の病気が挙げれられるがこれらに限定されない。他の疾患および状態としては、自己免疫甲状腺炎、自己免疫溶血性貧血、および接触過敏疾患（ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの疾患および状態は、例えば、ツタウルシのような植物物質によって引き起こされ得る。他の疾患および状態には、慢性および急性の一相性ＥＡＥ（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ  ＥＡＥ）の抑制、ＨＩＶ関連状態、ＡＩＤＳ、ＳＣＩＤＳ、アジュバント関節炎、リンパ悪性疾患または免疫障害、および筋萎縮側索硬化のような神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、および原発性側索硬化症が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明の組成物は、創傷の治癒の促進および感染疾患の処置のために使用され得る。
【０４８２】
上記に記載の疾患は、本明細書中で言及される場合、これらの疾患についての動物モデルによって示されるものを含む（例えば、ＩＤＤＭについての非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、および多発性硬化症についての実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスなど）。他の状態としては、免疫系関連流産および炎症性障害が挙げられる。本発明の開示はまた、子宮内膜症を含む不妊症のような顕著な自己免疫疾患を処置するために適用され得る。
【０４８３】
さらに、多くの脈管障害（このような障害のアテローム性動脈硬化形態を含む）が、自己免疫成分を有し、そして脈管疾患を有する多くの患者が循環する自己抗体を有することが徐々に明らかとなってきている。
【０４８４】
一般に、本発明の組成物は、免疫調節、特に免疫抑制において、およびＴリンパ急の過増殖によって特徴付けられる白血病（ウイルス誘導白血病（例えば、ＨＴＬＶ−１誘導白血病）を含む）の処置において有用である。免疫機能における改善または回復は、免疫応答を高める能力の部分的または全体の回復の観察によって評価され得る。自己免疫疾患の場合、改善または回復は、自己免疫疾患によって引き起こされる炎症に付随する臨床的症状（例えば、慢性間接リウマチにおける間接痛または腫脹あるいは凝り、慢性再発性多発性硬化症における大発作の数；慢性進行性多発性硬化症における運動機能の安定化または改善；クローン病の場合の腸炎；および血清学的測定（例えば、二本鎖ＤＮＡに対する抗体、補体成分および循環免疫複合体）、ならびに全身性エリテマトーデスについての皮膚の発赤拡大または筋痛、間接痛、白血球減少、あるいは血小板減少の数および重症度）の有意な減少または消失によって最も評価され得る。自己免疫疾患におけるレジメンの有効性をモニターするために使用され得るこれらの症状は、一般的に当該分野で周知である。
【０４８５】
本発明の組成物は、種々の抗原に対するＴ細胞耐性を誘導するために適用され得る。例えば、Ｔ細胞耐性は、溶解性抗原（例えば、溶解性タンパク質）に対して誘導され得る。Ｔ細胞は、異常免疫応答に関連する自己免疫疾患または障害に関与する抗原に対して寛容化され得る。例えば、１つの実施形態において、抗原は自己抗原である。別の実施形態において、抗原はアレルゲン（ａｌｌｅｒｇａｎ）である。あるいは、Ｔ細胞は、外来性細胞上で発現される抗原に対して寛容化され得る。従って、さらに他の実施形態において、抗原は同種抗原または異物抗原である。同種抗原または異物抗原に対するＴ細胞耐性の誘導は、例えば、ドナー移植片（例えば、組織または器官の移植片または骨髄移植）の移植受容者による拒絶を阻害するために、特に移植において使用される。さらに、骨髄植皮片中のドナーのＴ細胞の寛容化は、対宿主性移植片病の阻害に有用である。
【０４８６】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０４８７】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０４８８】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）を参照のこと。使用され得る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０４８９】
好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコードする配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体核酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラグメントを含む。
【０４９０】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクターに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子治療としてそれぞれ公知である。
【０４９１】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセプターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化され得る（例えば、１９９２年４月１６日付のＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号（Ｗｕら）；１９９２年１２月２３日付の同第ＷＯ９２／２２６３５号（Ｗｉｌｓｏｎら）；１９９２年１１月２６日付の同第ＷＯ９２／２０３１６号（Ｆｉｎｄｅｉｓら）；１９９３年７月２２日付の同第ＷＯ９３／１４１８８号（Ｃｌａｒｋｅら）；および１９９３年１０月１４日付けの同第ＷＯ９３／２０２２１号（Ｙｏｕｎｇ）を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０４９２】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要とされないレトロウイルス性配列を除去する。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
【０４９３】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染することができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０４９４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０４９５】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０４９６】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法により実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないならば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ましくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０４９７】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０４９８】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０４９９】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自己である。
【０５００】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるように細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、１９９４年４月２８日の日付となっているＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）を参照のこと）。
【０５０１】
具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能である。
【０５０２】
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０５０３】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましくは本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０５０４】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０５０５】
様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０５０６】
具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルの手段により、坐剤の手段により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）の手段により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０５０７】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと）。
【０５０８】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０５０９】
他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０５１０】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０５１１】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０５１２】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０５１３】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０５１４】
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插され得る。
【０５１５】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０５１６】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０５１７】
（診断および画像化）
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０５１８】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
【０５１９】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０５２０】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０５２１】
被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するために必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化抗体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）において、記載される。
【０５２２】
使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０５２３】
１つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、疾患または障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０５２４】
標識分子の存在は、当該分野において公知のインビボ走査の方法を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。
【０５２５】
特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射線反応性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合物で標識され、そして蛍光反応性の走査機器を用いて患者から検出される。別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）において検出される。さらに別の実施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴像（ＭＲＩ）を用いて患者において検出される。
【０５２６】
（キット）
本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形態においては、キットは、１以上の容器に入った本発明の抗体（好ましくは精製された抗体）を含む。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキットに含まれる抗体に対して特異的に免疫反応性のエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を、さらに含む。別の特定の実施形態においては、本発明のキットは、抗体と目的のポリペプチドとの結合を検出するための手段（例えば、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物）と結合し得る抗体、または検出可能な基質と結合し得る一次抗体を認識する二次抗体）を含む。
【０５２７】
本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を含み得る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体に対して特異的に免疫反応性のエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含み得る。さらに、このようなキットは、この抗体の抗原への結合を検出するための手段（例えば、フローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化合物と結合し得る抗体）を含む。特定の実施形態においては、このキットは、組み換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を含み得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
【０５２８】
より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を含む。この実施形態においては、抗体とポリペプチド抗原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０５２９】
さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性の実質的に単離された抗体、およびポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原と抗体との結合を検出する手段を含む。１つの実施形態においては、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、その抗体は、モノクロナール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識モノクロナール抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された競合抗原を含み得る。
【０５３０】
１つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合する抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗体を除去するため、再度洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光定量的基質、発光基質または比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
【０５３１】
上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（例えば、高分子ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に反応性の基（例えば、活性なカルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０５３２】
従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。このキットは、一般的に、表面結合された組み換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト抗体を含む。
【０５３３】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。これらは、説明のために提供されるものであり、限定することを意図しない。
【実施例】
【０５３４】
（実施例）
（実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるエンドカインαの発現および精製）
寄託されたｃＤＮＡクローン中のエンドカインαタンパク質をコードするＤＮＡ配列をこのエンドカインαタンパク質のアミノ末端配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを５’配列および３’配列のそれぞれに付加した。
【０５３５】
５’オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を引いたＮｃｏＩ制限部位を含む配列
【０５３６】
【化３】
2010252803.tif 000014
を有する。
【０５３７】
３’プライマーは、下線を引いたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む配列
【０５３８】
【化４】
2010252803.tif 000015
を有する。
【０５３９】
この制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ６０における制限酵素部位に対して便利であり、このベクターは、本実施例においてＭ１５／ｒｅｐ４宿主細胞における細菌発現のために使用する（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位を含む。
【０５４０】
増幅したエンドカインαタンパク質ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ６０の両方をＮｃｏＩおよびＨｉｄＩＩＩで消化し、次いで、消化されたＤＮＡを互いに連結する。エンドカインαタンパク質ＤＮＡの制限化されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、エンドカインαタンパク質コード領域をベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーターの下流に置き、かつベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーターとエンドカインαタンパク質の翻訳のためにおおよそ位置決めされた開始ＡＴＧとインフレームで作動可能に連結した。
【０５４１】
連結混合物を、標準的な手順を使用してコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される。ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与える、プラスミドｐＲＥＰ４の多コピーを含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載された例示的な実施例を実施するのに使用する。エンドカインαタンパク質を発現するために適切である多くのうちの１つであるこの株は、Ｑｉａｇｅｎから市販される。
【０５４２】
形質転換体は、それらがアンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクローン化ＤＮＡの同一性を、制限分析によって確認した。
【０５４３】
所望の構築物を含むクローンは、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地の液体培養において一晩（「Ｏ／Ｎ」）で増殖する。
【０５４４】
Ｏ／Ｎ培養物を大量培養に約１：１００〜１：２５０の希釈で接種するために使用する。この細胞を、６００ＮＭでの光学密度（「ＯＤ６００」）が０．４と０．６との間まで増殖する。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加し、最終濃度１ｍＭとして、ｌａｃリプレッサーを不活性化することによってｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞を連続的に３〜４時間さらにインキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集し、そして標準的な方法によって破砕する。封入体を破砕された細胞から慣用的な収集技術を使用して精製し、そしてタンパク質を封入体から８Ｍ尿素へ可溶化する。可溶化タンパク質を含む８Ｍ尿素溶液を２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムに通し、これによって、尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳む。このタンパク質を、エンドトキシンを除去するためにクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製する。次いで、精製タンパク質を、滅菌濾過する。滅菌濾過したタンパク質調製物を、２×ＰＢＳ中に保存した。
【０５４５】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるエンドカインαのクローニングおよび発現）
寄託されたクローンにおけるエンドカインαタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’領域および３’領域に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。
【０５４６】
５’プライマーは、下線を引いたＢａｍＨＩ制限酵素部位および図１におけるエンドカインαタンパク質の一部をコードするヌクレオチドを含む配列
【０５４７】
【化５】
2010252803.tif 000016
を有する。
【０５４８】
３’プライマーは、下線を引いたＢａｍＨＩ制限部位および図１におけるエンドカインαタンパク質の一部をコードする配列に相補的な配列を含む配列
【０５４９】
【化６】
2010252803.tif 000017
を有する。
【０５５０】
増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そして再度１％アガロースゲルで精製する。このフラグメントは、本明細書中でＦ２と称される。
【０５５１】
ベクターｐＡ２−ＧＰを使用して、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載のような標準的な方法を使用して、バキュロウイルス発現系においてエンドカインαタンパク質を発現する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて簡便な制限部位を含む。Ｎ末端メチオニンを含むＡｃＭＮＰＶ  ｇｐ６７のシグナルペプチドは、ＢａｍＨＩの直ぐ上流に位置される。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリへドリンプロモーターと同方向で、続いて、ポリへドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを挿入する。ポリへドリン配列を、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列によって両方の側で隣接させ、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを作製する。
【０５５２】
多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、インフレームなＡＵＧおよびシグナルペプチドを含む）を提供する限りにおいて、ｐＡ２−ＧＰの代わりに使用され得る。このようなベクターは、数ある中でＬｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９に記載される。
【０５５３】
このプラスミドを、当該分野で公知の慣用的な手順を使用して、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離する。このベクターを、本明細書中で「Ｖ２」と称する。
【０５５４】
フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に塗り広げた。ＢａｍＨＩを使用して個々のコロニー由来のＤＮＡを消化し、次いで、ゲル電気泳動によって消化産物を分析することによってヒトエンドカインα遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。このクローン化フラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０５５５】
５μｇのプラスミドを、１．０μｇの市販の直線化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMバキュロウイルスＤＮＡ」Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ」）とともに、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェルにおいて混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清のグレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に滴下する。このプレートを前後に揺らし、そして新しく添加した溶液と混合する。次いで、このプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をこのプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。このプレートをインキュベーターに戻し、そして培養を２７℃で４日間継続する。
【０５５６】
４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ  Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする。（この型の「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって頒布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド９−１０頁の中に見出され得る）。
【０５５７】
連続希釈から４日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーション後、青く染色したプラークを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットのチップで拾う。次いで、この組換えウイルスを含む寒天を２００μｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて再懸濁する。この寒天を短時間遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍ皿において播種されたＳＦ９細胞を感染する。４日後、これらの培養皿の上清を採集し、次いで４℃で保存する。適切に挿入されたエンドカインαを含むクローンを、このプラスミドの制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ分析によって同定する。
【０５５８】
Ｓｆ９細胞を、１０％熱不動化ＦＢＳを補充したグレース培地において増殖する。この細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバキュロウイルスで感染させる。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００  ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇから入手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集し、溶解し、そして標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって可視化する。
【０５５９】
（実施例３：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
ベクターｐＣ４を、エンドカインαタンパク質の発現のために使用する。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．，およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を発達する。第二の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発し得ることは当該分野で公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、宿主細胞の１以上の染色体に取り込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。
【０５６０】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８−４４７（１９８５））の長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーターに加えてヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後ろに、このプラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターもしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎの遺伝子発現システムならびに類似のシステムを使用して、哺乳動物細胞中に調節された方法でエンドカインαを発現し得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）での同時トランスフェクトの際に選択され得る。初めに１より多い選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有用である。
【０５６１】
プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化し、次いで当該分野に公知の手順により仔ウシ腸ホスフェートを用いて、脱リン酸化する。このベクターを、次いで１％アガロースゲルから単離する。
【０５６２】
完全エンドカインαタンパク質のリーダー配列を含むこのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。この５’プライマー配列は、下線のＢａｍ  ＨＩ制限酵素部位を含む配列５’ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＧＣＣＡＴＴＣ３’（配列番号９）を含有し、続いて、真核生物細胞における翻訳の開始のために効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるような）および図１（配列番号１）に示されるエンドカインαのコード配列の１７塩基を含有する。この３’プライマーは、下線のＡｓｐ７１８Ｉ制限部位を含む配列５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＴＧ３’を含有し、続いて図１（配列番号１）中に示されるエンドカインα遺伝子の翻訳されていない領域に相補的な多くのヌクレオチドを含有する。
【０５６３】
この増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍ  ＨＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化し、次いで１％アガロースゲル上で精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化したベクターをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１またはＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば、制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４へ挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０５６４】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。ＰＧＲＰ−Ｋ、ＰＧＲＰ−Ｗ、またはＰＧＲＰ−Ｃのいずれかの発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によるか、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０５６５】
（実施例４：エンドカインα発現の組織分布）
数ある中で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）によって記載された方法を用いるノーザンブロット分析を実行し、ヒト組織内のエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現のレベルを試験した。本発明のエンドカインαタンパク質のヌクレオチド配列全体（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、32Ｐで標識した。標識後、このプローブを、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製した。次いで、精製した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現について試験した。
【０５６６】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブを用いて試験した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、このブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露し、そしてこのフィルムを標準的な手順に従って現像した。
【０５６７】
本発明のエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現は、ヒトの脳線条および膵臓組織において検出された。
【０５６８】
（実施例５：ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの新規な活性化誘導タンパク質およびそのリガンドの同定）
（背景）
ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーは、細胞外ドメインの同様な複数のシステインが豊富な擬似繰り返しを共有し、各々が、６つのシステインを伴なう３０〜４５のアミノ酸を含む（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ７６：９５９〜９６２（１９９４））。ＴＮＦＲ１（Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊら、Ｃｅｌｌ  ６１：３６１〜３７０（１９９０））、Ｆａｓ（Ｔｒａｕｔｈ，Ｂ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３０１〜３０５（１９８９）、Ｙｏｎｅｈａｒａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７〜１７５６（１９８９）、およびＯｅｈｍ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０７０９〜１０７１５（１９９２））、ＤＲ３（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９０〜９９２（１９９６）、Ｋｉｔｓｏｎ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３７２〜３７５（１９９６）、Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．−Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：７９〜８８（１９９７）およびＳｃｒｅａｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４６１５〜４６１９（１９９７））、ＤＲ４（Ｗｉｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６７３〜６８２（１９９５）、Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２６８７〜２６９０（１９９６）およびＰａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１１〜１１３（１９９７））、ＤＲ５（Ｗａｌｃｚａｋ，Ｈ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５３８６〜５３９７（１９９７）、Ｍａｃ  Ｆａｒｌａｎｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５４１７〜２５４２０（１９９７）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８３１〜８３６（１９９７）、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８２１〜８３０（１９９７）およびＳｈｅｒｉｄａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１８〜８２１（１９９７）、ならびにデコイＴＲＡＩＬレセプター（Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ａ．ら、Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．７：１００３〜１００６（１９９７）、Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１５〜８１５（１９９７）、Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１６５〜１１７０（１９９７）およびＤｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ，Ｍ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８１３〜８２０（１９９７））を含む細胞死ドメイン含有ファミリーを除いて、注目すべき類似性は、これらの分子の細胞内ドメイン内には、見出されない。しかし、マウスおよびヒトの４−１ＢＢ、ＣＤ２７ならびにＴＮＦＲスーパファミリーメンバー内のマウスＧＩＴＲ（Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１９６３〜１９６７（１９８９）、Ｃａｍｅｒｉｍｉ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３１６５〜３１６９（１９９１）、およびＮｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６２１６〜６２２１（１９９７））の細胞質ドメインにおいて際立った相同性がある。酸性アミノ酸は、このサブファミリーの細胞質ドメインにおいて特に高度に保存されている。他のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ７���：９５９〜９６２（１９９４））のように、このサブファミリーは、多様な生物学的機能に関する。まず第１に、４−１ＢＢおよびＣＤ２７分子は、それらのそれぞれのリガンドまたは拮抗抗体で結合される場合、Ｔ細胞増殖についての強力な補助的刺激のシグナルを提供する（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ７６：９５９〜９６２（１９９４）およびＰｏｌｌｏｋ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：７７１〜７８１（１９９３））。補助的分子としての機能に加えて、ＣＤ２７は、アポトーシス（Ｓｉｖａと言われる細胞死ドメイン含有分子（Ｐｒａｓａｄ，Ｋ．Ｖ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６３４６〜６３５１（１９９７））によって媒介される）を誘導する。近年同定されたマウスＧＩＴＲは、ＴＣＲ誘導アポトーシスを阻害することが示されている（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６２１６〜６２２１（１９９７））。
【０５６９】
サブファミリーメンバーの免疫学的機能は、比較的に良好に規定されてきたが、それらのシグナル伝達経路についての見識は、ほんの近年明確にされた（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５８〜５６５（１９９８）、Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８）、Ｓａｏｕｌｌｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１８４９〜１８６２（１９９８）およびＡｋｉｂａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３３５３〜１３３５８（１９９８））。２つのグループ（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５８〜５６５（１９８８）、およびＪａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８））は、ＴＲＡＦ２分子との４−１ＢＢの会合が、ＮＦ−κＢの活性に導くシグナルカスケードを開始するということを示すデータを提供した。ＣＤ２７シグナル伝達通路において、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５の両方は、ＮＦ−κＢおよびＳＡＰＫ／ＪＮＫ（ストレス活性化タンパク質キナーゼ／ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ）活性化およびＮＩＫ（ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ）（これは、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ５の共通の下流のキナーゼである）を媒介する（Ａｋｉｂａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３３５３〜１３３５８（１９９８））。
【０５７０】
ＴＮＦＲメンバーの数が、急速に拡大しているので、さらにより多くの数のスーパーファミリーが、存在すると予測された。マウスＧＩＴＲ配列を用いるＰＣＲに基づくストラテジーおよびＥＳＴ（発現された配列タグ）データベースを検索することによって、ＴＮＦＲの新しいメンバーが、発見され、ＴＲ１１と名づけられた。以下は、レセプターＴＲ１１およびそのリガンドであるエンドカインαの特徴付けを提供する。
【０５７１】
（実験手順）
（ｃＤＮＡクローン化）  ７５０より多くの異なるｃＤＮＡライブラリーから得た２百万より多くのＥＳＴを含むデータベースが、ランダムに選択したヒトｃＤＮＡクローンのハイスループット自動化ＤＮＡ配列分析を用いて、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって作製された。このデータベースに対するＴＮＦＲメンバーの公知のアミノ酸配列およびモチーフを用いる特異的相同性およびモチーフの検索は、ＴＮＦＲファミリーの翻訳された配列に３５〜５５％相同な翻訳された配列を有する幾つかのＥＳＴを明確にした。幾つかのクローンは、ＰＨＡ活性化Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、白血球、癒合腹部創傷、一次樹状細胞および脂肪組織のｃＤＮＡライブラリーから同定された。インタクトなＮ末端シグナルペプチドをコードする全長ＴＲ−１１  ｃＤＮＡクローンを、ヒト活性化Ｔ細胞ライブラリーから得、そしてさらなる調査のために選択した（米国特許出願番号第０９／１７６，２００号（１９９８年１０月２１日出願）を参照のこと）。このクローンの鎖の両方の完全ｃＤＮＡ配列を決定し、そしてＴＮＦＲメンバーに対するその相同性を確認した。同一の遺伝子がまた、マウスＧＩＴＲ配列を用いるＰＣＲに基づくストラテジーによって同定された。同様に、エンドカイン−α（ＴＮＦリガンド６）が、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーとの配列の相同性の系統的な比較を通して同定された。ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列に対して２５％相同である部分的なエンドカイン−αの配列が、内皮ｃＤＮＡライブラリー、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）ｃＤＮＡライブラリー、脳ｃＤＮＡライブラリーおよび胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから同定された。全長のｃＤＮＡクローンがヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから得られた。
【０５７２】
（発現ベクター）  推定ＴＲ−１１タンパク質全体（アミノ酸２６〜２３４）をコードする、全長ＴＲ−１１およびＨＡ（血球凝集素Ａエピトープ）タグ化ＴＲ−１１を、センス（それぞれ、５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＶＶＶＡＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣ−３’および５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣ−３’）プライマーならびにアンチセンス（５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧ−３’）プライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、Ｎｈｅ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉで切断し、そしてＣＤ５リーダー配列（Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８））の下流域にインフレームで、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１）およびｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１）にそれぞれ融合した。全長エンドカイン−αを、ＰＣＲ（センス、５’−ＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴ  ＡＴＧＡＧＡＣＧＣ−３’；アンチセンス、５’−ＡＧＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡ  ＧＡＡＧＧＣ−３’）によって増幅し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／ＢａｍＨ  Ｉを用いて切断し、そしてｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１／エンドカイン−α）およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ｐＣＥＰ４／エンドカイン−α）に挿入した。Ｆｌａｇタグ化全長ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＮＩＫ、ドミナントネガティブＴＲＡＦ２（ｄｎＴＲＡＦ２）またはｄｎＮＩＫをコードするｐＲＫ５ベースの発現ベクターが、記載されてきた（Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３〜６２０（１９９８）、Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２１〜１４２７（１９９５）、Ｈｕ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３００６９〜３００７２（１９９４）、Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４６６１〜１４６６４（１９９６）、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９３５〜１９９４２（１９９６）、Ｃａｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：４４３〜４４６（１９９６）およびＳｏｎｇ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９７９２〜９７９６（１９７７））。ＮＦ−κＢ依存性Ｅ−セレクチン−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＥＬＡＭ−Ｌｕｃ）およびｐＲＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（ｐＲＳＶ−β−ｇａｌ）プラスミドもまた、他に記載されてきた（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２１〜１４２７（１９９５）およびＳｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｕ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５８２０〜９７９６（１９９４））。
【０５７３】
（ノーザンブロットおよびＲＴ（逆転写）−ＰＣＲ分析）  ノーザンブロット分析について、ｃＤＮＡプローブを、製造業者の使用説明書に従って、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔ，ＩＬ）を用いて32Ｐで標識した。組み込まれていないヌクレオチドを、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−１００（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて標識プローブから除去した。種々のヒト組織由来の１レーンあたり約２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを含有する２つのヒト多重組織ポリ（Ａ）ＲＮＡブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。さらに、異なる細胞株由来の２０ｍｇの全ＲＮＡを含有する２つの細胞株ブロットを使用した。ノーザンブロットを、製造業者のマニュアルに従って、発現されたハイブリダイゼーション溶液（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて実行した。ＲＴ−ＰＣＲ分析について、全ＲＮＡを、デキサメタゾン、ＰＭＡ／イオノマイシンまたは抗ＣＤ−３／ＣＤ２８  ｍＡｂを用いる刺激の後、ヒトＰＢＭＣから単離し、そして刺激されてないかまたはＬＰＳ刺激されたＨＵＶＥＣ細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、標準条件下で実行した。
【０５７４】
（ＴＲ−１１とＴＲＡＦとの相互作用）  ｐｃＤＮＡ３／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−ＨＡプラスミド（５μｇ／１０ｃｍプレート）を、標準的なリン酸カルシウム沈殿方法によって、ｐＲＫ／ＴＲＡＦ１、２、３、５または６−Ｆｌａｇベクター（５μｇ／プレート）を用いて、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（２×１０6細胞／プレート）に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％のグリセロールおよびプロテアーゼインヒビター）を用いて、溶解させた。免疫沈降について、溶解物を、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）またはコントロールマウスＩｇＧ１  ｍＡｂを用いて４℃で１時間インキュベートし、続いて、２０μｌのプロテインＧ−セファロース（１：１スラリー）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてさらに１時間インキュベートした。沈殿物を、溶解緩衝液を用いて徹底的に洗浄し、次いで、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｅ，ＭＡ）に移す前に、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画した。ウェスターンブロット分析を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮと結合体化した抗ＨＡ  ｍＡｂを用いて実行し、そして増強された化学発光ウェスターンブロット検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。
【０５７５】
（レポーターアッセイによるＮＦ−κＢの分析）  約０．５×１０6ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１およびＴＲＡＦ、ｄｎＴＲＡＦ２、ＮＩＫまたはｄｎＮＩＫをコードするｐＲＫ５プラスミドの種々の組合せを用いて、標準的なリン酸カルシウム沈殿方法により、トランスフェクトした。プラスミドの全量を、空のベクターを添加することにより、２．０μｇに調整した。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、２００μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に溶解させた。ルシフェラーゼ活性を、２０μｌの細胞抽出物を用いて測定した。５μｌの細胞抽出物を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を内部コントロールとしてアッセイし、そして発光値を、個々のβ−ガラクトシダーゼ活性によって正規化した。
【０５７６】
（組換えタンパク質の産生および精製）  ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質を、リガンドスクリーニングおよび細胞結合実験のために使用した。ＴＲ−１１の測定した細胞外ドメイン（アミノ酸２６〜１３９）をコードするフラグメントを、Ｎｈｅ  Ｉ部位に隣接したセンスプライマー（５’−ＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＴＧ−３’）およびＢｇｌ  ＩＩ部位に隣接したアンチセンスプライマー（５’−ＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣ−３’）を用いて、増幅した。増幅したフラグメントを、Ｎｈｅ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩを用いて切断し、そして５’末端ではＣＤ５Ｌと、そして３’末端ではヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆｃ）とインフレームで、哺乳動物ベクターｐＣＥＰ４にクローン化した。ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−Ｆｃを、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。ＴＲ−１１−Ｆｃ−融合タンパク質を、プロテインＧカラムを用いて、ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１−ＦｃでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞上清から精製した。エンドカイン−αタンパク質のＦｌａｇタグ化可溶性形態（アミノ酸３９〜１６９）を産生するために、ｆｌａｇタグ化エンドカイン−α発現ベクター（ｐＣＥＰ４／ＣＤ５Ｌ−エンドカイン−α−Ｆｌａｇ）を、センス（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣ−３’）プライマーおよびアンチセンス（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ−３’）プライマーを用いて、エンドカイン−αコード配列のＰＣＲ増幅しＮｈｅ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉを用いて産物を消化し、ｐＣＥＰ４にＣＤ５Ｌ配列とインフレームでクローン化することによって構築した。この構築物を、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において発現させた。分泌エンドカイン−α−Ｆｌａｇを含有するトランスフェクトされた細胞上清を収集し、そして結合アッセイのために使用した。いくつかの実験のために、エンドカイン−α−Ｆｌａｇタンパク質を、製造業者の使用説明書に従って、抗Ｆｌａｇゲル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．ＭＯ）を用いて、収集した上清から精製した。
【０５７７】
（結合アッセイ）  タンパク質結合アッセイを、Ｐａｎ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１１〜１１３（１９９７）に記載されるように、本質的に行った。細胞結合アッセイについて、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、上記のようにｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１またはｐｃＤＮＡ３．１を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を収集し、そしてエンドカイン−α−Ｆｌａｇ含有上清、抗Ｆｌａｇ抗体およびＦＩＴＣ結合体化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いて連続的にインキュベートした。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて実行した。ジャーカットＴ細胞を、直鎖化ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＤ５Ｌ−ＴＲ−１１を用いてエレクトロポレーションによって安定にトランスフェクトし、そしてＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で選択した。この細胞株についての結合アッセイを、上記のように実行した。ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質の、膜結合エンドカイン−αに結合する能力を試験するために、ｐＣＥＰ４／エンドカイン−αを、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に安定にトランスフェクトした。ハイグロマイシンの存在下での選択の後、エンドカイン−α発現細胞を収集し、ＴＲ−１１−Ｆｃタンパク質とともにインキュベートし、続いて、ＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎをフローサイトメトリー分析のために使用した。
【０５７８】
（結果および考察）
ＴＲ１１を、ＥＳＴデータベースの検索およびマウスＧＩＴＲ配列を用いたＰＣＲに基づくストラテジーによって同定した。仮にＴＲ−１１と名付けられる（活性化誘導性ＴＮＦＲファミリーのメンバーとして）ヒト活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー由来のクローンの全長ｃＤＮＡは、算出された２５ｋＤａの分子量を有する、２３４アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質をコードする。このレセプターは、シグナルペプチド（最初の２５アミノ酸）および一つの膜貫通領域（アミノ酸１４０〜１５８）を有する。他のＴＮＦＲファミリーのメンバーの細胞外ドメインと比較する場合、ＴＲ−１１は、それぞれ第二のＴＮＦＲモチーフ、第三のＴＮＦＲモチーフおよび第四のＴＮＦＲモチーフに対応する３つのシステインリッチな偽反復（ｐｓｅｕｄｏｒｅｐｅａｔ）を提示する。第一のシステイン偽反復は、８つのシステイン残基を含み、そしてＣ４を欠失する。従って、Ｃ１〜Ｃ２、Ｃ３〜Ｃ５およびＣ４〜Ｃ６のジスルフィド結合の規範的な型は、このモチーフ中に存在するようである。第二の偽反復は、第三のＴＮＦＲモチーフのいくつかの特性を示すが、たとえこの第二の偽反復が７つのシステイン残基を含むとしても、Ｃ５が存在しない点において典型的ではない。第三の偽反復は、４−１ＢＢの第四の偽反復との広範な相同性を示す。この細胞質ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７およびＧＩＴＲの細胞質ドメインにおいて高度に保存される酸性アミノ酸を含む。全般的に、ＴＲ−１１は、マウスのＧＩＴＲに対して高い相同性（５５％の同一性）を示すが、ＧＩＴＲとＴＲ−１１との間の第一のシステインリッチな偽反復において、ミスマッチが存在する。なぜなら、ＧＩＴＲの第一の偽反復が、第一のＴＮＦＲのシステインリッチなモチーフに対応するからである（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６２１６−６２２１（１９９７））。
【０５７９】
ＴＲ−１１  ｍＲＮＡの発現は、ノザンブロットハイブリダイゼーションによって、複数のヒト組織において研究した。１．２５ｋｂのｍＲＮＡが、リンパ節、ＰＢＬで検出され、そして脾臓で弱く検出された。本発明者らはまた、ＴＲ−１１  ｍＲＮＡの発現について、種々の腫瘍細胞株を試験した。１．２５ｋｂのメッセージが、試験した細胞株の中で、結腸直腸腺癌細胞株であるＳＷ４８０のみにおいて検出された。実質的にすべてのメンバーのＴＮＦＲスーパーファミリーの発現が、抗原刺激／リンパ球活性化によって増強される（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ７６：９５９−９６２（１９９４））。この認識と矛盾せずに、ＴＲ−１１発現は、刺激後にＰＢＭＣにおいてアップレギュレートされた。ＴＲ−１１のメッセージは、本発明者らが高感度ＲＴ−ＰＣＲ法を使用した場合に、刺激を受けていないＰＢＭＣにおいて検出不可能であった。ＴＲ−１１発現は、２４時間以内に、代表的なＰＢＭＣ刺激（例えば、ＰＭＡならびにイオノマイシンでの処理、または可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂでの処理）によって、明らかに誘導された。しかし、ＴＲ−１１発現についてのＦＡＣＳ分析は、活性化ＰＢＭＣの小集団が、刺激後４８時間で細胞表面上にＴＲ−１１を発現したことを示し、これは、長期の刺激が、ＴＲ−１１の最大の発現に必要であることを示唆した（ＢＫ、未公表データ）。ＴＲ−１１の発現は、デキサメタゾンでの処理によって誘導されなかった。この性質は、ＧＩＴＲの性質とは異なった（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６２１６−６２２１（１９９７））。
【０５８０】
最近、４−１ＢＢ分子が、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３と関連することが示された（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５８−５６５（１９９８）、Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３−６２０（１９９８）およびＳａｏｕｌｌｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１８４９−１８６２（１９９８））。ＴＲ−１１の細胞質ドメインが、４−１ＢＢの細胞質ドメインに類似するので、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において過剰発現された６つの公知のＴＲＡＦのうちの５つを共沈殿する能力を試験した。ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３とのＴＲ−１１の相互作用が観察されたが、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６との相互作用については観察されなかった。ＴＲＡＦ２とのＴＲ−１１の会合は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーと同様に（Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５５８−５６５（１９９８）、Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２４２：６１３−６２０（１９９８）、Ａｋｉｂａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３３５３−１３３５８（１９９８）、Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２１−１４２７（１９９５）、Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４９４−１４９８（１９９５）、Ｄｕｃｋｅｔｔ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：１５３５−１５４２（１９９７）およびＶａｎＡｒｓｄａｌｅ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２４６０−２４６５（１９９６））、ＴＲ−１１が、ＴＲＡＦ２を通じてＮＦ−κＢ活性化を媒介し得ることを示唆した。この可能性を試験するために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞におけるＮＦ−κＢレポーター系を使用した（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２１−１４２７（１９９５））。ＴＲ−１１発現ベクターを用いる同時トランスフェクションは、ベクタートランスフェクションコントロールと比較した場合に、代表的には、３倍より高いルシフェラーゼ活性を誘導した。ＴＲＡＦ２とともに共発現させた場合、ＴＲ−１１は、ＴＲＡＦ２単独で発現させたよりも高いルシフェラーゼ活性を誘導した。より重要なことには、ＲＩＮＧモチーフおよびジンクフィンガーモチーフを欠失するドミナントネガティブなＴＲＡＦ２（Ｒｏｔｈｅ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４２１−１４２７（１９９５））の過剰発現は、ＴＲ−１１によって誘導されたルシフェラーゼ活性を排除した。これは、ＴＲＡＦ２が、ＴＲ−１１についてのＮＦ−κＢ活性化の重要なメディエータであることを示す。同様の観察が、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路においてＴＲＡＦ２の下流に位置すると考えられるＮＩＫの活性が、ドミナントネガティブなＮＩＫ（これは、触媒ドメインの２つのリジン残基を欠失する）の過剰発現によってブロックされた場合になされた（Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９７９２−９７９６（１９９７））。まとめると、これらのデータは、ＴＲ−１１が、ＴＲＡＦ２／ＮＩＫ経路を通じてＮＦ−κＢ活��化を媒介することを示す。ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３が、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞においてＴＲ−１１と会合することが見出されたので、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３の、ＴＲ−１１によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対する効果を調べた。ＴＲＡＦ３の導入は、ＴＲ−１１の過剰発現によって誘導されたルシフェラーゼ活性をほとんど廃止した。より少ない程度に、ＴＲＡＦ１の過剰発現は、ＴＲ−１１によって誘導されたＮＦ−κＢ活性化を減少した。これらのデータは、ＴＲＡＦ１および特にＴＲＡＦ３が、ＴＲ−１１に誘導されたＮＦ−κＢ活性化をダウンレギュレートすることを示唆する。
【０５８１】
ＴＲ−１１のリガンドを同定するために、ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質への結合のためのＦｌａｇタグ化された候補ＴＮＦリガンドタンパク質のパネルを、免疫沈降によってスクリーニングした。試験したＦｌａｇタグ化されたＴＮＦリガンドタンパク質の中で、ＴＲ−１１−Ｆｃが、選択的にエンドカイン−α−Ｆｌａｇを結合した。本発明者らの条件において、４−１ＢＢおよびＴＲ２（ＨＶＥＭ）は、これらの同族リガンドである４−１ＢＢＬおよびＬＩＧＨＴ（Ｍａｕｒｉ，Ｄ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：２１−３０（１９９８））をそれぞれ結合した。さらに、このデータは、エンドカイン−α−Ｆｌａｇタンパク質が、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞の細胞表面上で一過性に発現されたＴＲ−１１およびＪｕｒｋａｔ細胞の細胞表面上で構成的に発現されたＴＲ−１１を結合したことを明らかに示した。エンドカイン−αが、膜貫通タンパク質であるので（下記を参照のこと）、フローサイトメトリーを使用し、ＴＲ−１１−Ｆｃ融合タンパク質が、全長のエンドカイン−αで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を結合し得るか否かを決定した。結果は、ＴＲ−１１−Ｆｃタンパク質が、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞上で発現されたエンドカイン−αを結合し得たことを示す。
【０５８２】
次に、ＴＲ−１１とエンドカイン−αとの間の相互作用が、ＮＦ−κＢ活性化を生じるか否かを決定した。ＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて、リガンド依存性ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＲ−１１との膜貫通エンドカイン−αの同時トランスフェクション、またはエンドカイン−αを発現するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクションによって示された。さらに、ＴＲ−１１を、可溶性エンドカイン−αタンパク質を構成的に分泌したＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に一過性にトランスフェクトした場合、ＮＦ−κＢ活性化は、空のベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞と比較すると、顕著に増大した。同様に、より高いＮＦ−κＢ活性化が、ＴＲ−１１で一過性にトランスフェクトされた可溶性のエンドカイン−αタンパク質ＨＥＫ２９３細胞で処理することによって誘導された。これは、エンドカイン−αが、ＮＦ−κＢのＴＲ−１１特異的活性化を誘発し得ることを示す。エンドカイン−αによるＮＦ−κＢのより高い誘導が、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞におけるＴＲＡＦ２とのＴＲ−１１のより強い会合と関連するようである。なぜなら、ＴＲＡＦ２とのＴＲ−１１のより強い会合が、ＴＲ−１１単独でトランスフェクトされた細胞よりも、エンドカイン−αで同時トランスフェクトされた細胞において観察されたからである。
【０５８３】
エンドカイン−αは、ＥＳＴデータベースサーチによって最初に同定されたＴＮＦリガンドタンパク質の一つであった。脳ｃＤＮＡライブラリー由来の全長エンドカイン−αのクローンの親水性分析により、一つの疎水性膜貫通ドメイン、およびシグナル配列の不在を推定される。エンドカイン−αは、Ｃ末端領域に２つの可能性のあるグリコシル化部位を含む。これらの特徴は、エンドカイン−αが、細胞外Ｃ末端領域を有するＩＩ型膜タンパク質であることを示唆する。ヒト組織ＲＮＡのノザンブロット分析が、膵臓における一つの２．４ｋｂのエンドカイン−αのｍＲＮＡの発現を明らかにした。種々のヒト細胞株およびＰＢＭＣもまた、エンドカイン−α発現について調べた。なんのメッセージも、刺激されていないかまたは刺激されたかのいずれかであるＴ細胞株（ＣＥＭ−６およびＪｕｒｋａｔ）、刺激されていないかまたは刺激されたかのいずれかであるＢ細胞株（ＰｒｉｅｓｓおよびＦｒｅｖ）、刺激されていないかまたは刺激されたかのいずれかである前骨髄球性細胞株（ＨＬ−６０）、刺激されていないかまたは刺激されたかのいずれかである単球細胞株（ＴＩＩＰ−１）および刺激されていないかまたは刺激されたかのいずれかであるＰＢＭＣにて、ＲＴ−ＰＣＲによって検出不可能であった。対照的に、ＨＵＶＥＣ細胞は、構成的にエンドカイン−αを発現し、そしてその発現は、ＬＰＳでの刺激後にアップレギュレートされた。従って、ＴＲ−１１およびそのリガンドが、活性化Ｔリンパ球と血管との間の相互作用のために重要であると考えられる。
【０５８４】
ＴＲ−１１は、アミノ酸レベルでマウスのＧＩＴＲと５５％の同一性を有する。ヒトとマウスとの間の高い配列保存は、ＴＲ−１１がマウスのＧＩＴＲのヒトホモログであるという証拠を提供する。しかし、この時点で、これらの２つのレセプターが、以下の事実に基づいて、互いに異なる機能を供給し得るという可能性が残る：（１）ＧＩＴＲとＴＲ−１１との間の第一のシステインリッチな偽反復においてミスマッチが存在する；（２）ＧＩＴＲと対照的に、ＴＲ−１１が、デキサメタゾンによって誘導不可能である。
【０５８５】
要約すれば、ＴＲＡＦ２媒介性メカニズムを通じてＮＦ−κＢを活性化するＴＮＦＲスーパーファミリーの新規のタンパク質であるＴＲ−１１が同定された。ＴＲ−１１の発現は、活性化誘導性である。ＴＲ−１１についてのリガンドであるエンドカイン−αは、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーであり、そして内皮細胞株において、構成的に発現される。これは、ＴＲ−１１およびそのリガンドが、活性化Ｔ細胞の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に関与し得ることを示す。
【０５８６】
（実施例６：単球に対するエンドカインαの効果）
これらの研究は、エンドカイン−αでの処理が、単球からのＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８およびＩＬ−１０の放出を誘導し、そして単球におけるＩＬ−１２の産生を阻害したことを開示する（データは示さず）。
【０５８７】
（方法）
（単球精製）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じて遠心分離することによって、単一のドナーロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製した。単球を、向流遠心性エルトリエーションによってＰＢＭＣから単離した。
【０５８８】
（ＥＬＩＳＡ）ヒト単球を、漸増濃度のエンドカイン−αとともに、５×１０5細胞／ｍｌの密度でインキュベートした。ＩＬ−１２産生のために、この細胞を、エンドカイン−αの存在下で、ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて一晩プライムした。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。馴化培地を、２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結させた。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定のためのＥＬＩＳＡキットを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。各々の値は、三連のサンプル±標準偏差の平均であった。
【０５８９】
（酸化バースト）  精製された単球を、２〜１×１０5細胞／ウェルで、９６ウェルプレートにプレーティングした。漸増濃度のエンドカイン−αを、総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）中でウェルに添加する。３日間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、そして培地を、ウェルから取り除く。マクロファージの単層に対して、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５．５ｍＭ  デキストロース、０．５６ｍＭ  フェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌ  ＨＲＰＯ）を、刺激物（２００ｎＭ  ＰＭＡ）とともに添加した。このプレートを、３７℃で２時間インキュベートし、そして反応を、１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより停止した。吸光度を、６１０ｎｍで読みとった。マクロファージによって産生されたＨ2Ｏ2の量を算出するために、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線を各々の実験について行った。
【０５９０】
【表３】
2010252803.tif 000018
（実施例７：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するためのアッセイ）
（背景）
機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系統細胞とそれらの微小環境との間の可溶性シグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナルは、Ｂ系統細胞にそのプログラムされた発達を継続させる正の刺激、またはその細胞にその現在の発達経路を停止することを指示する負の刺激を与え得る。現在までに、多数の刺激性シグナルおよび阻害性シグナルが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ１４およびＩＬ１５を含むＢ細胞の応答性に影響を及ぼすことが見出された。興味深いことに、これらのシグナルは、単独では弱いエフェクターであるが、種々の同時刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団の間の活性化、増殖、分化、ホーミング、耐性および死を誘導し得る。Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの一つは、ＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、これらのそれぞれのリガンドであるＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３とともに、種々の免疫応答を調節することが見出された。これらのＢ細胞集団およびこれらの前駆体の、増殖および分化の、検出および／または観察を可能にするアッセイは、増殖および分化に関して、これらのＢ細胞集団に対して種々のタンパク質が有し得る効果を決定するのに価値ある手段である。以下に列挙されたものは、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖または阻害の検出を可能にするように設計された２つのアッセイである。
【０５９１】
（実験手順）
（インビトロアッセイ）精製されたエンドカイン−αタンパク質またはその短縮型形態が、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体における活性化、増殖、分化または阻害および／または死を誘導する能力について評価される。０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の用量にわたって定性的に測定された、精製ヒト扁桃Ｂ細胞に対するエンドカイン−αタンパク質の活性が、標準的なＢリンパ球同時刺激アッセイにおいて評価される。このアッセイにおいて、精製扁桃Ｂ細胞を、プライミング剤として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｗａｎ  Ｉ（ＳＡＣ）または固定化抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。第二のシグナル（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５）は、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋とともに協同し、トリチル化チミジン取り込みによって測定されるようなＢ細胞増殖を誘発する。新規の協同因子は、このアッセイを用いて容易に同定され得る。このアッセイとしては、ＣＤ−３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によって、ヒト扁桃Ｂ細胞を単離する工程を含む。得られた細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現によって評価されるように、９５％よりも多くがＢ細胞である。各々のサンプルの種々の希釈物は、９６ウェルプレートの個々のウェルに配置され、このプレートに、総量１５０μｌの培養培地（１０％  ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ  ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよびＳＡＣの１０-5希釈物を含む、ＲＰＭＩ  １６４０）に懸濁された１０5個のＢ細胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添加７２時間後より3Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）を用いて、２０時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）によって定量化する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地である。
【０５９２】
（インビボアッセイ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみか、または１ｋｇあたり２ｍｇのエンドカイン−αタンパク質、あるいはその短縮型形態を、１日あたり２回注射（ｉ．ｐ．）する。マウスにこの処置を継続して４日間与え、この時点で、マウスを屠殺し、そして種々の組織および血清を分析のために収集する。正常な脾臓およびエンドカイン−αタンパク質で処置された脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞に対するエンドカイン−αタンパク質の活性の結果（例えば、動脈周囲のリンパ鞘の拡散および／または赤色脾髄領域の有核の細胞性（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）の有意な増加）を同定し、これは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る。Ｂ細胞マーカーである抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を使用する免疫組織化学的研究を、脾細胞に対するなんらかの生理学的変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、確立したＴ細胞領域を浸潤する大まかに規定されたＢ細胞ゾーン内の増加したＢ細胞提示に起因するか否かを決定するために使用する。
【０５９３】
エンドカイン−αタンパク質処置マウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析を、エンドカイン−αタンパク質が、コントロールマウスにおいて観察される比率を超えて、ＴｈＢ＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ダル（ｄｕｌｌ）Ｂ細胞の比率を特異的に増加させるか否かを示すために使用する。
【０５９４】
同様に、インビボでの増加した成熟Ｂ細胞提示の推定結果が、血清Ｉｇ力価における相対的増加である。従って、血清ＩｇＭレベルおよび血清ＩｇＡレベルを、緩衝液処置マウスとエンドカイン−αタンパク質処置マウスとの間で比較する。
【０５９５】
（実施例８：Ｔ細胞の増殖および分化の刺激または阻害を検出するためのアッセイ）
抗ＣＤ３および／またはＰＨＡ同時刺激アッセイを、Ｔ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するために使用する。
【０５９６】
（アッセイパラメータ）
細胞：
１ウェルあたりのＰＢＭＣ：１０5
１ドナーあたりの回収されたＰＢＭＣ：２００×１０6
１日あたりの総プレート：２０
１プレートあたりの上清：４８（各々２連でアッセイした）
１ドナーあたり１日あたりの総上清：９６０（１日あたり２ドナー）
新規のアッセイを適応させるために、１週あたりさらに４ユニットの血液が必要である。
【０５９７】
（試薬）
抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（各ウェルで最終濃度２５ｐｇ／ｍＬ）
ＰＨＡ
ｒｈＩＬ−２（ポジティブコントロール）
3Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル、６．７Ｃｉ／ミリモル）
９６−ウェルプレート
（プロトコール）
ＰＢＭＣを精製する。
適切なコントロールを有するプレートを調製する。
３７℃にて３〜４時間インキュベーションする。
3Ｈ−ＴｄＲを添加し、そしてインキュベーターに戻してさらに２０〜２４時間インキュベーションする。
収集して計数する。
【０５９８】
（結果）
このアッセイは、Ｅｎｄｏｋｉｎｅ−αがＰＭＢＣの抗ＣＤ３依存性増殖を促進するかまたは阻害するのか、およびＥｎｄｏｋｉｎｅ−αが同時刺激シグナルの非存在下でＰＢＭＣ増殖を刺激するか否かの決定を可能にする。
【０５９９】
（実施例９：ｓｃＦｖｓのライブラリーからの本発明のポリペプチドに対する抗体フラグメントの単離）
ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、本発明のポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメントの大きいライブラリーに構築する。ドナーは、この本発明のポリペプチドに曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０６００】
（ライブラリーのレスキュー）ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵを接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）する。２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパーファージ（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。
【０６０１】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグメントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合アビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間インキュベートする。細胞をスピンダウン（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ  ８，４００  ｒ．ｐ．ｍで１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精製および濃縮し、２ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得た。
【０６０２】
（ライブラリーのパニング）Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、１００ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのいずれかの本発明のポリヌクレオチドの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをこのチューブに適用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出し、その後、この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレーティングする。次いで、生じた細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０６０３】
（結合剤の特徴付け）３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ  ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実施する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０６０４】
（実施例１０：Ｅｎｄｏｋｉｎｅ  α遺伝子における変化の決定方法）
ＲＮＡを、目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次いで、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：７０６（１９９１）に記載の緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；および７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０６０５】
次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、それらの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。エンドカインαの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、エンドカインαにおける疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【０６０６】
エンドカインαのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，Ｍ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、そしてＴ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しない変異により同定する。
【０６０７】
ゲノム再配置もまた、エンドカインα遺伝子における改変を決定する方法として観察する。当該分野で公知の技術により単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ、Ｃ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９９１）に記載のようにＦＩＳＨを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う。
【０６０８】
染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウムで対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃ．Ｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析および染色体部分長測定を行う。エンドカインαのゲノム領域（プローブがハイブリダイズする）の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらのエンドカインαの変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。
【０６０９】
（実施例１１：生物学的サンプル中のエンドカインαの異常レベルを検出する方法）
エンドカインαポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてエンドカインαレベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者が以下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが、理解される。
【０６１０】
例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生物学的サンプル中のエンドカインαを検出する。マイクロタイタープレートのウェルを、特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、そして実施例１０に記載の方法により産生される。ウェルに対するエンドカインαの非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０６１１】
次いで、コーティングしたウェルを、エンドカインα含有サンプルを用いてＲＴで２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用して結果を確認すべきである。次いで、このプレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄し、非結合エンドカインαを除去する。
【０６１２】
次いで、５０μｌの特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体を２５〜４００ｎｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。このプレートを再び脱イオン水または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０６１３】
７５μｌの４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン酸（ＮＰＰ）基質溶液を各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートし、基質および蛍光の切断を可能にする。蛍光をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。Ｘ軸（対数スケール）にサンプル濃度をプロットし、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットし、コントロールサンプルの系列希釈からの実験結果を使用して標準曲線を作成した。次いで、そのサンプルの測定した蛍光に基づく標準曲線を使用して、サンプル中のエンドカインαポリペプチドの濃度を補間する。
【０６１４】
（実施例１２：エンドカインαの減少したレベルを処置する方法）
本発明はまた、身体において増加したレベルのエンドカインαの生物学的活性を必要としている個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療的有効量のエンドカインαまたはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。
【０６１５】
さらに、個体中のエンドカインαの標準または正常な発現レベルの減少により引き起こされる状態が、好ましくは可溶性形態および／または分泌形態のエンドカインαを投与することにより処置され得ることは理解される。従って、本発明はまた、増加したレベルのエンドカインαポリペプチドを必要としている個体を処置する方法を提供し、この方法は、そのような個体においてエンドカインαの生物学的活性を増加する量のエンドカインαを含む薬学的組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。
【０６１６】
例えば、減少したレベルのエンドカインαポリペプチドを有する患者は、６日間連続して日用量が０．１〜１００μｇ／ｋｇのポリペプチドを受ける。好ましくは、このポリペプチドは可溶性形態および／または分泌形態である。
【０６１７】
（実施例１３：エンドカインαの増加したレベルを処置する方法）
本発明は、身体における減少したレベルのエンドカインαの生物学的活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療的有効量のエンドカインαのアンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。本発明における使用のための好ましいアンタゴニストは、エンドカインα特異的抗体またはエンドカインαアンチセンスポリヌクレオチドである。
【０６１８】
アンチセンス技術を使用してエンドカインαの産生を阻害する。この技術は、癌のような様々な病因に起因するエンドカインα、好ましくは分泌形態のエンドカインαのレべルを低下させる方法の１つの例である。
【０６１９】
例えば、エンドカインαのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。
【０６２０】
（実施例１４：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／またはマウスのエンドカインαポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中に置き、小片に分割する。小塊の組織を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、このフラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０６２１】
この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大きなフラスコにスケールアップする。
【０６２２】
Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して精製する。
【０６２３】
エンドカインαをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントの連結に適した条件下で維持する。次いで、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次いで、その連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換し、それを、次いでベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認するために、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングする。
【０６２４】
アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増殖させる。次いで、エンドカインα遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞はエンドカインα遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０６２５】
形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、続いて１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０６２６】
次いで、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【０６２７】
（実施例１５：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、エンドカインαポリペプチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）エンドカインα配列の導入に関する。エンドカインαポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるそのエンドカインαポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏ  Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ  Ｊ．Ａ．、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ  Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０６２８】
エンドカインαポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入）によって送達され得る。このエンドカインαポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０６２９】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、エンドカインαポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ．Ｌ．らＡｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９（１９９５）およびＡｂｄａｌｌａｈ  Ｂ．らＢｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８５：１−７（１９９５）で教示されたもの）中で送達され得る。
【０６３０】
この遺伝子治療方法において使用されるエンドカインαポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０６３１】
このエンドカインαポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞など）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特に適格である。
【０６３２】
裸のエンドカインαポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５μｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のエンドカインαポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０６３３】
インビボでの筋肉における注入されたエンドカインαポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下のようにして決定する。エンドカインαポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のための適切なエンドカインα鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０６３４】
５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。エンドカインα鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【０６３５】
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、エンドカインαタンパク質について組織化学的に染色する。エンドカインαタンパク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のエンドカインαＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のエンドカインαＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。
【０６３６】
（実施例１６：内因性エンドカインα遺伝子を使用する遺伝子治療）
本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性エンドカインα配列を、例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日公布）；国際公開第ＷＯ  ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ  ９４／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターと作動可能に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包含する。プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。この標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性エンドカインαの５’非コード配列に相同である。この標的化配列は、エンドカインαの５’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０６３７】
この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化した標的化配列を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製する。
【０６３８】
この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーションを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方法は、当該分野で公知である。
【０６３９】
一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生じて、この内因性エンドカインα配列に作動可能に連結される。これは、この細胞中におけるエンドカインαの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０６４０】
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直後に実施すべきである。
【０６４１】
プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、エンドカインα遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのエンドカインα非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のエンドカインα非コード配列（エンドカインαフラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａ部位を備えて増幅する；他方のエンドカインα非コード配列（エンドカインαフラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびエンドカインαフラグメントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；エンドカインαフラグメント１−ＸｂａＩ；エンドカインαフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０６４２】
プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１〜５×１０6細胞を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。容量および電圧を、それぞれ、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２０ｍｓｅｃが観察されるはずである。
【０６４３】
エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらにこの細胞を１６〜２４時間インキュベートする。
【０６４４】
次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。
【０６４５】
（実施例１７：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化への、エンドカインαの効果）
樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じる。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連する。
【０６４６】
表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、本発明のエンドカインαまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０６４７】
（サイトカインの生成への効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6／ｍｌ）を、本発明のエンドカインαの漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供される標準的プロトコールを用いる。
【０６４８】
（ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果）細胞表面抗原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃレセプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同時刺激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−Ｉ）の発現の調節は、単球の抗原提示能力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの発現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と相関し得る。
【０６４９】
ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を、エンドカインαまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０６５０】
（単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（もしくは、不活化する）および／または単球の生存を増加する（もしくは、単球生存を低下させる）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するために慣用的に適用され得る。エンドカインα、エンドカインαのアゴニストまたはアンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単離する。
【０６５１】
（１．単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（アポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コントロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムにおけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【０６５２】
（２．サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団への調節活性である。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、エンドカインαの漸増する濃度とともにか、またはエンドカインαの非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、エンドカインαの存在下でＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用い、キットに提供される標準的プロトコールを適用して実施する。
【０６５３】
（３．酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。エンドカインαの漸増濃度を、ウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベーション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロファージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物質（２００ｎＭ  ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加して反応を停止する。吸光度を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成されるＨ2Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線をそれぞれの実験について実施する。
【０６５４】
本実施例において記載される研究は、エンドカインαの活性を試験した。しかし、当業者は、エンドカインαポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、エンドカインαアゴニストの活性および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０６５５】
（実施例１８：Ｔ細胞増殖の刺激または阻害を検出するためのアッセイ）
ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（０．０５Ｍ  炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾配遠心分離により単離し、そしてエンドカインαタンパク質の種々の濃度での存在下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプレートの４通りのウェル（５×１０4／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃での培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００μｌの上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場合、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウェルに０．５μＣｉの3Ｈチミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体をエンドカインαタンパク質の効果についての陰性コントロールとして用いる。
【０６５６】
本実施例において記載される研究は、エンドカインαタンパク質の活性を試験した。しかし、当業者は、エンドカインαポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、エンドカインαのアゴニストの活性、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０６５７】
（実施例１９−抗体の産生）
（ａ．ハイブリドーマ技術）
本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、エンドカインαを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、エンドカインαタンパク質の調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このような調製物は、動物に導入される。
【０６５８】
タンパク質エンドカインαに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、エンドカインαポリペプチドで、またはより好ましくは分泌エンドカインαポリペプチド発現細胞で免疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地において、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。
【０６５９】
このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次いで、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、エンドカインαポリぺプチドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０６６０】
あるいは、エンドカインαポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞は、抗体のエンドカインαタンパク質特異的抗体に結合する能力がエンドカインαによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、エンドカインαタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるエンドカインαタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用される。
【０６６１】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中に議論される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０６６２】
（ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのエンドカインαに対して指向される抗体フラグメントの単離）
ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかまたは曝され得なかったエンドカインαに対する反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０６６３】
ライブラリーのレスキュー。  ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約１０９個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。
【０６６４】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグメントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合アビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらなる時間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ  ８，４００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精製および濃縮し、２ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０１３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０６６５】
ライブラリーのパニング。Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをチューブに適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで２０倍に増加する。
【０６６６】
結合剤の特徴付け。第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ  ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０６６７】
本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得ることは、明らかである。
【０６６８】
本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０６６９】
本発明の中に参照される全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明細書によって参考として援用される。
［配列表］
【０６７０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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