(57)【要約】【課題】サイトカイン等の分泌物質を分泌する幹細胞を選択的に分離する。【解決手段】全ての幹細胞の表面に表面マーカ抗体と分泌物質抗体とを備えるリンカーを結合する結合ステップＳ１と、幹細胞を刺激する刺激ステップＳ２と、該刺激ステップＳ２において刺激された幹細胞が分泌する分泌物質を、幹細胞の表面に設けられたリンカーの分泌物質抗体により幹細胞の表面に固定する分泌物質固定ステップＳ３と、分泌物質にマーキングを施すマーキングステップＳ４と、該マーキングステップＳ４において分泌物質に施されたマーキングに基づいて、幹細胞を分離する分離ステップＳ５とを含む細胞分離方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞に、表面マーカ抗体と分泌物質抗体とを含むリンカーを結合する結合ステップと、
前記幹細胞に刺激を与える刺激ステップと、
該刺激ステップにより刺激された幹細胞から分泌された分泌物質を前記リンカーの分泌物質抗体に結合させ前記幹細胞に固定する固定ステップと、
前記分泌物質にマーキングを施すマーキングステップと、
該マーキングステップにおいて分泌物質に施されたマーキングに基づいて、幹細胞を分離する分離ステップとを含む細胞分離方法。
【請求項２】
前記刺激ステップが、物理的な刺激および／または低分子物質を付与することによる刺激を与える請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項３】
前記マーキングステップが、蛍光標識した分泌物質抗体を添加して、幹細胞から分泌された分泌物質に固定させる請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項４】
前記マーキングステップが、磁気ビーズで標識した分泌物質抗体を添加して、幹細胞から分泌された分泌物質に固定させる請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項５】
前記結合ステップが、異なる種類の分泌物質を吸着する分泌物質抗体を備えたリンカーを幹細胞の表面に結合する請求項１に記載の細胞分離方法。
【請求項６】
前記分離ステップが、フローサイトメトリを用いて蛍光により幹細胞を分離する請求項３に記載の細胞分離方法。
【請求項７】
前記分離ステップが、磁石を用いて磁気により幹細胞を分離する請求項４に記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞治療のメカニズムは主に移植された細胞から分泌されるサイトカインが様々な効果を発揮するものと考えられている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０００−５０９２７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、幹細胞には個体差があるため、全ての幹細胞がサイトカイン等の分泌物質を分泌する訳ではないので、単に幹細胞を移植しただけでは、効率的な細胞治療を行うことはできないという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、サイトカイン等の分泌物質を分泌する幹細胞を選択的に分離することができる細胞分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、全ての幹細胞の表面に表面マーカ抗体と分泌物質抗体とを備えるリンカーを結合する結合ステップと、幹細胞を刺激する刺激ステップと、該刺激ステップにおいて刺激された幹細胞が分泌する分泌物質を、幹細胞の表面に設けられたリンカーの分泌物質抗体により幹細胞の表面に固定する分泌物質固定ステップと、分泌物質にマーキングを施すマーキングステップと、該マーキングステップにおいて分泌物質に施されたマーキングに基づいて、幹細胞を分離する分離ステップとを含む細胞分離方法を提供する。
【０００６】
本発明によれば、結合ステップにおいて、幹細胞の表面に配置されている表面マーカに、リンカーの表面マーカ抗体が結合することで、全ての幹細胞の表面に分泌物質抗体を固定することができる。そして、刺激ステップにおいて幹細胞を刺激することにより、幹細胞から分泌物質が分泌された場合には、分泌物質固定ステップにおいて、リンカーの分泌物質抗体によって分泌物質が結合されるので、分泌物質が幹細胞の表面に固定される。
【０００７】
その後、マーキングステップにおいて、分泌物質にマーキングが施されるので、分離ステップにおいては、マーキングに基づいて幹細胞が分離される。
すなわち、本発明によれば、幹細胞から分泌されるサイトカイン等の分泌物質が、培地内に放出されてしまう前に、当該分泌物質を分泌した幹細胞に固定し、その分泌物質にマーキングを施すので、分泌物質を分泌した幹細胞を容易に特定することができる。これにより、分泌物質を分泌する、細胞治療に有用な幹細胞を選択的に分離することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記刺激ステップが、物理的な刺激および／または低分子物質を付与することによる刺激を与えることとしてもよい。
このようにすることで、物理的な刺激を与えると、細胞からはＨＧＦあるいはＶＥＧＦのようなサイトカインのような分泌物質が分泌される。また、低分子物質を付与する刺激を与えると、ＨＧＦのようなサイトカインの分泌が促進される。したがって、このような分泌物質を分泌する有用な幹細胞を選択的に分離することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記マーキングステップが、蛍光標識した分泌物質抗体を添加して、幹細胞から分泌された分泌物質に固定させてもよい。
また、上記発明においては、前記マーキングステップが、磁気ビーズで標識した分泌物質抗体を添加して、幹細胞から分泌された分泌物質に固定させてもよい。
【００１０】
また、上記発明においては前記結合ステップが、異なる種類の分泌物質を吸着する分泌物質抗体を備えたリンカーを幹細胞の表面に結合することとしてもよい。
このようにすることで、幹細胞が複数の種類の分泌物質を分泌してもこれを当該幹細胞に固定して、幹細胞の有用性を判定することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記分離ステップが、フローサイトメトリを用いて蛍光により幹細胞を分離することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記分離ステップが、磁石を用いて磁気により幹細胞を分離することとしてもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、サイトカイン等の分泌物質を分泌する幹細胞を選択的に分離することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の細胞分離方法を説明する分離処理前の幹細胞を示す模式図である。
【図３】図１の細胞分離方法における結合ステップによりリンカーを結合した状態の幹細胞を示す模式図である。
【図４】図１の細胞分離方法における刺激ステップにより分泌物質が分泌された状態の幹細胞を示す模式図である。
【図５】図１の細胞分離方法における固定ステップにより分泌物質を固定した状態の幹細胞を示す模式図である。
【図６】図１の細胞分離方法におけるマーキングステップにおいてマーキングとして蛍光標識した分泌物質抗体を添加した状態の幹細胞を示す模式図である。
【図７】図１の細胞分離方法におけるマーキングステップにおいて蛍光標識した分泌物質抗体が分泌物質に結合した状態の幹細胞を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に係る細胞分離方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離方法は、図１に示されるように、幹細胞Ａにリンカー１を結合する結合ステップＳ１と、幹細胞Ａを刺激する刺激ステップＳ２と、幹細胞Ａが分泌する分泌物質２を幹細胞Ａの表面に固定する固定ステップＳ３と、分泌物質２にマーキング３を施すマーキングステップＳ４と、該マーキング３に基づいて幹細胞Ａを分離する分離ステップＳ５とを含んでいる。
【００１５】
幹細胞Ａに固定するリンカー１は、図２および図３に示されるように、幹細胞Ａの表面に存在する表面マーカ４に結合する表面マーカ抗体１ａと、幹細胞Ａが分泌するサイトカイン等の分泌物質２に結合する分泌物質抗体１ｂとを備えている。分泌物質２としては、例えば、ＨＧＦやＶＥＧＦ、あるいはインターロイキン等を挙げることができる。
結合ステップＳ１においては、図２に示されるように、幹細胞Ａを含む培地内にリンカー１を添加することにより、図３に示されるように、その表面マーカ抗体１ａを、幹細胞Ａの表面の表面マーカ４に結合させて、リンカー１を全ての幹細胞Ａの表面に固定するようになっている。
【００１６】
刺激ステップＳ２は、例えば、幹細胞Ａを低酸素状態に配するか、もしくは３７〜４２℃の環境下で１〜６０分間、望ましくは３９℃の環境下に３０分間配すること等、幹細胞Ａに物理的な刺激を与える方法がある。また、炎症性物質やビタミンＣ、血管内皮ＮＯ合成促進剤、ＡＣＥ阻害剤あるいはヘムオキシゲナーゼ等の低分子物質を付与して幹細胞Ａに刺激を与える方法が挙げられる。
物理的な刺激を与えると、図４に示されるように、幹細胞ＡからはＨＧＦあるいはＶＥＧＦのようなサイトカインのような分泌物質２が分泌される。また、炎症性物質を付与するような刺激を与えると、幹細胞Ａからはインターロイキンのような分泌物質２が分泌される。低分子物質を付与する刺激を与えると、ＨＧＦのようなサイトカインの分泌が促進される。
【００１７】
固定ステップＳ３においては、図５に示されるように、幹細胞Ａが分泌した分泌物質２を、その分泌した幹細胞Ａ自体に固定するようになっている。すなわち、幹細胞Ａの表面には、表面マーカ４に表面マーカ抗体１ａを結合することによりリンカー１が固定され、該リンカー１には分泌物質抗体１ｂが含まれているので、幹細胞Ａから分泌物質２が分泌された場合には、即座に分泌物質抗体１ｂに結合されて、その幹細胞Ａ自体に固定される。
【００１８】
マーキングステップＳ４は、例えば、図６に示されるように、マーキング３として蛍光標識した分泌物質抗体５を培地に添加することにより、分泌された分泌物質２に分泌物質抗体５を結合させる。上述したように、幹細胞Ａが分泌した分泌物質２は、その分泌した幹細胞Ａの表面に固定されているので、図７に示されるように、蛍光標識された分泌物質抗体５がその分泌物質２に結合されることにより、その幹細胞Ａの表面にマーキング３としての蛍光標識を固定することができる。
【００１９】
そして、分離ステップＳ５においては、例えば、フローサイトメトリ等を用いて、幹細胞Ａに標識されている蛍光に基づいて幹細胞Ａを分離する。すなわち、刺激を与えることによって幹細胞Ａから分泌物質２が分泌されている場合には、その分泌した幹細胞Ａが全て同一の蛍光標識によってマーキング３を施されるので、フローサイトメトリを用いて、同じ蛍光標識を有する幹細胞Ａ群を、蛍光標識を有しない幹細胞Ａ群から容易に分離することができる。
【００２０】
このように、本実施形態に係る細胞分離方法によれば、多数の幹細胞Ａの中から分泌物質２を分泌する幹細胞Ａを簡易に選択して分離することができる。したがって、細胞治療の治療効果の高い幹細胞Ａを得ることができる。
【００２１】
なお、本実施形態においては、マーキングステップＳ４において蛍光標識された分泌物質抗体５を分泌物質２に結合させることとしたが、これに代えて、磁気ビーズ（図示略）で標識された分泌物質抗体５を分泌物質２に結合させることにしてもよい。このようにすることで、磁石による磁気吸引力によって磁気標識された幹細胞Ａを選択的に分離することができる。
【００２２】
また、本実施形態においては、結合ステップＳ１において、特定の分泌物質２に結合するリンカー１を添加することとしたが、複数種の分泌物質２にそれぞれ結合可能な複数種のリンカー１を添加することにしてもよい。このようにすることで、幹細胞Ａが分泌する分泌物質２毎に、異なるリンカー１を結合させて、分離ステップＳ５において、分泌物質２毎に幹細胞Ａを分離することができる。したがって、細胞治療の効果毎に幹細胞Ａを分類して回収することができるという利点がある。
【符号の説明】
【００２３】
Ａ  幹細胞
Ｓ１  結合ステップ
Ｓ２  刺激ステップ
Ｓ３  固定ステップ
Ｓ４  マーキングステップ
Ｓ５  分離ステップ
１  リンカー
１ａ  表面マーカ抗体
１ｂ  分泌物質抗体
２  分泌物質
３  マーキング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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