(57)【要約】      （修正有）【課題】ラミンA及び／もしくはラミンC欠乏又はLMNA変異に関連した障害、例えばラミノパシー、早期老化障害、正常老化及び癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌など)などの治療又は予防における化合物の提供。【解決手段】下記化合物。2020059748.tif 000041式中：W、Y及びZの各々は、CHを表すか、あるいはW、Y及びZの一つは、窒素を表し、且つ他の2つの基は、CHを表す。【選択図】図１
2020059748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のための、式(I)の化合物、又はその医薬として
許容し得る塩もしくは溶媒和物：
【化１】
2020059748.tif 000037
（式中：
W、Y及びZの各々は、CHを表すか、あるいはW、Y及びZの一つは、窒素を表し、且つ他の
2つの基は、CHを表し；
環Aは、下記： 
【化２】
2020059748.tif 000038
を表し；
Xは、S、O又はNRaを表し；
Raは、水素、ヒドロキシル、=O、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハ
ロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ又はハロC1-6アルコキシを表し；
R5は、水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲ
ン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、COH、COOH、COOC1-6アル
キル、シアノ、NH2又はNO2を表し；
nは、0〜5から選択された整数を表し；
各R1は、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキ
ル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6
アルキル、NH2又はNO2を、独立して表し；
R2は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル又はC2-6アルキニルを表し；
R3は、水素又は-N=R4基のいずれかから選択され、但し環Aが式(i)又は(iii)を表す場合
は、R3は-N=R4を表し、並びに環Aが式(ii)を表す場合は、R3は水素を表すこととし；
R4は、-C(R4a)(R4b)、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルケニル又はベンジルを表し
、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキ
ニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒ
ドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換され；
R4a及びR4bは、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハ
ロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、C
OOH、COOC1-6アルキル、NH2、NO2、C3-8シクロアルキル又はベンジルから、独立して選択
され、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6ア
ルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ
、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換されてい
る。)。
【請求項２】
前記環Aが、式(i)を表している、請求項1記載の使用のための化合物。
【請求項３】
前記Xが、S又はO、例えばSを表している、請求項1又は請求項2記載の使用のための化合
物。
【請求項４】
前記R5が、水素又はハロゲン(すなわち、ブロモ)、例えば水素を表している、請求項1
〜3のいずれか一項記載の使用のための化合物。
【請求項５】
前記nが、1〜2の整数、例えば1を表している、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用の
ための化合物。
【請求項６】
前記R1が、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)、C1-6アルコキシ(メトキシなど)、シ
アノ、ヒドロキシル、COOH、NO2、ハロC1-6アルキル(トリフルオロメチルなど)又はハロC
1-6アルコキシ(トリフルオロメトキシなど)を表している、請求項1〜5のいずれか一項記
載の使用のための化合物。
【請求項７】
前記R1が、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)、シアノ、NO2又はハロC1-6アルキル(
トリフルオロメチルなど)、例えばシアノ又はトリフルオロメチルを表している、請求項6
記載の使用のための化合物。
【請求項８】
前記R1が、メタ(3)位及び／又はパラ(4)位、例えばパラ(4)位にある、請求項1〜7のい
ずれか一項記載の使用のための化合物。
【請求項９】
前記R2が、水素又はC2-6アルキニル、例えば水素を表している、請求項1〜8のいずれか
一項記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記R3が、-N=R4を表している、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用のための化合物
。
【請求項１１】
前記R4が、C3-8シクロアルキル、例えばシクロペンチル、特に非置換のシクロペンチル
を表している、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
前記W、Y及びZの各々が、CHを表している、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用のた
めの化合物。
【請求項１３】
前記化合物が、化合物1〜21、又はそれらの代替の医薬として許容し得る塩、溶媒和物
、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品から選択される、請求項1〜12のいずれか一項記
載の使用のための化合物。
【請求項１４】
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のための、請求項1〜13のいずれか一項記載の使
用のための化合物。
【請求項１５】
前記ラミノパシーが、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)；非定型ウェルナ
ー症候群；バラケ・シモンズ症候群；ブシュケ・オレンドルフ症候群；心筋症；シャルコ
ー・マリー・トゥース病；エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー(X-連鎖性、常染色
体優性型又は常染色体劣性型)；Dunnigan型の家族性部分型脂肪萎縮症(FPLD)；グリーン
バーグ異形成症；脱髄性成人発症型常染色体優性遺伝白質ジストロフィー(ADLD)；肢帯型
筋ジストロフィー1B型(LGMD1B)；糖尿病、脂肪肝、肥大型心筋症、及び白斑黒皮腫性丘疹
(LDHCP)を随伴する脂肪萎縮症；A型脂肪萎縮症を伴う下顎末端異形成(MADA)；B型脂肪萎
縮症を伴う下顎末端異形成(MADB)；ペルゲル・フェット核異常 (PHA)；ペリツェウス・メ
ルツバッハー病又は拘束性皮膚障害(RD)から選択される、請求項1〜14のいずれか一項記
載の使用のための化合物。
【請求項１６】
前記ラミノパシーが、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)、エメリー・ドレ
フュス型筋ジストロフィー又は非定型ウェルナー症候群から選択される、請求項15記載の
使用のための化合物。
【請求項１７】
1種以上の更なる活性成分と組合せた、請求項1〜16のいずれか一項記載の使用のための
化合物。
【請求項１８】
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のための、(a)請求項1〜16のいずれか一項記載
の化合物、又はその医薬として許容し得る塩；並びに、(b)医薬として許容し得る賦形剤
：を含有する、医薬組成物。
【請求項１９】
化合物3、化合物8、化合物11、化合物13-17及び化合物19-21から選択される式(I)の化
合物；並びに、そのいずれか一つの塩又は溶媒和物。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか一項記載の式(I)の化合物を調製する方法であって：
(a)Aが(i)を表す場合、式(II)の化合物：
【化３】
2020059748.tif 000039
(式中、R1及びnは、請求項1において定義したものであり、並びにL1は、塩素又は臭素な
どの好適な脱離基を表す)の、式(III)の化合物：
【化４】
2020059748.tif 000040
（式中、R2及びR3は、請求項1において定義したものである）との反応；
(b)式(I)の化合物の保護誘導体の脱保護；及び／又は
(c)式(I)の化合物又はそれらの保護誘導体の、更なる式(I)の化合物又はそれらの保護
誘導体への相互変換；並びに
(d)任意の、式(I)の化合物の医薬として許容し得る塩の形成：
を含む、前記方法。
【請求項２１】
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防のための、医薬品の製造における、請求項1〜19のいずれか一
項記載の化合物の使用。
【請求項２２】
請求項1〜19のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とするヒトへ
、投与することを含む、該ヒトにおけるラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(
低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌など)の治療又は予防の方法。
【請求項２３】
請求項1〜19のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とするヒトへ
、投与することを含む、該ヒトにおける癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌
など)の治療方法。
【請求項２４】
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のためのNAT10インヒビター。
【請求項２５】
癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌など)の治療における使用のためのNAT1
0インヒビター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ラミンA及び／もしくはラミンCの欠乏又はLMNA変異に関連した障害、例えば
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化及び癌などの治療又は予防における化合物に関す
る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
A型ラミン及びB型ラミンで構成される核ラミナは、核の形態を維持し、且つクロマチン
を繋ぎ止めるためのアンカープラットフォームとして機能する(T. Dechatらの文献、(200
8) Genes Dev. 22, 832)。ラミンは、数多くのクロマチン-結合タンパク質と相互作用し
、且つ同じく、ネスプリン及びSUNタンパク質を含む膜貫通タンパク質を介して、細胞骨
格に間接的に連結される(M. Crispらの文献、(2006) J. Cell Bio. 172, 41)。ラミンA及
びCをコードしているLMNAの変異は、ラミノパシーとして公知の広範なヒト疾患を引き起
こす(H. J. Worman、G. Bonneの文献、(2007) Exp. Cell Res. 313, 2121)。これらは、
エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー(AD-EDMD)(G. Bonneらの文献、(1999) Nat. Ge
net. 21, 285)及び重度の加速性の老化疾患であるハッチンソン・ギルフォード早老症候
群(HGPS)(A. De Sandre-Giovannoliらの文献、(2003) Science 300, 2055；M. Eriksson
らの文献、(2003) Nature 423, 293)を含む。A型ラミンの調節解除はまた、様々なヒト癌
においても観察され、そこではこれらは異常に発現されるか又は局在化されている(J. L.
Broersらの文献、(1993) Am. J. Pathol. 143, 211；S. F. Mossらの文献、(1999) Gut 
45, 723；R. S. Venablesらの文献、(2001) Br. J. Cancer 84, 512)。
【０００３】
ラミンA/C欠乏又はLMNA変異は、全体的クロマチン組織化の喪失に関連した拡大された
変形された核をもたらす(G. Galiovaらの文献、(2008) Eur. J. Cell Biol. 87, 291)。
まさにこの分子は、ラミノパシーに関連した広範な臨床表現型を引き起こすが、依然とし
て規定されていない。これらの病理の一部は、細胞脆弱性を引き起こすラミン組織崩壊に
おける原発性の分子欠損(primary molecular defect)を反映するが(「構造仮説」)、多く
は、クロマチン構造、遺伝子発現、又は複製、転写及びDNA修復などの追加の核プロセス
に対する下流の作用から生じる可能性があるように見える(K. L. Wilsonらの文献、(2001
) Cell 104, 647)。興味深いことに、最近の研究は、ラミノパシー細胞の核構造を改善す
ることで、クロマチン構造及び他の細胞プロセスにおけるある種の下流の欠損を改良し、
結果的に一部の疾患-関連した表現型を改善することもできることを示唆している(C. Y. 
Chenらの文献、(2012) Cell 149, 565；J. I. Tothらの文献、(2005) PNAS 102, 12873；
M. Columbaroらの文献、(2005) Cell Mol. Life Sci. 62, 2669)。
【０００４】
従って核構造欠損を補正し、且つラミノパシーのヒト細胞の細胞適応度を改善する治療
を提供し、これによりラミノパシー及び早期老化障害を治療する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
（発明の概要）
本発明の第一の態様に従い、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又は
予防における使用のための、式(I)の化合物、又はその医薬として許容し得る塩もしくは
溶媒和物が提供される：
【化１】
2020059748.tif 000003
（式中：
W、Y及びZの各々は、CHを表すか、あるいはW、Y及びZの一つは、窒素を表し、且つ他の
2つの基は、CHを表し；
環Aは、下記: 
【化２】
2020059748.tif 000004
を表し；
Xは、S、O又はNRaを表し；
Raは、水素、ヒドロキシル、=O、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハ
ロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ又はハロC1-6アルコキシを表し；
R5は、水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲ
ン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、COH、COOH、COOC1-6アル
キル、シアノ、NH2又はNO2を表し；
nは、0〜5から選択された整数を表し；
各R1は、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキ
ル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6
アルキル、NH2又はNO2を、独立して表し；
R2は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル又はC2-6アルキニルを表し；
R3は、水素又は-N=R4基のいずれかから選択され、但し環Aが式(i)又は(iii)を表す場合
は、R3は-N=R4を表し、並びに環Aが式(ii)を表す場合は、R3は水素を表すこととし；
R4は、-C(R4a)(R4b)、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルケニル又はベンジルを表し
、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキ
ニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒ
ドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換され；
R4a及びR4bは、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハ
ロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、C
OOH、COOC1-6アルキル、NH2、NO2、C3-8シクロアルキル又はベンジルから、独立して選択
され、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6ア
ルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ
、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換されてい
る。)。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1：ラミンA/C欠乏した細胞における核形状及びクロマチン凝縮を回復するKATインヒビターの同定。  A)陰性対照(siCT)と比較したU2OS細胞におけるラミンA/C欠乏(siLMNA)の分析。  B)DAPI染色により観察された核形状。  C)3つの独立した実験からの代表的MNase消化プロファイル(左側)及び対応する定量(右側)。  D)シクロペンチリデン-[4-(4'-クロロフェニル)チアゾール-2-イル)ヒドラゾン(化合物2)の分子構造。  E)化合物2による処理後、DAPI染色により観察された核形状レスキュー。  F)未処理(NT)細胞又は指定された化合物による処理細胞における核真円度の定量(n＞212による3つの独立した実験の平均±s.d.)。  G)3つの独立した実験からの代表的MNase消化プロファイル(左側)及び対応するsiLMNA細胞の定量(右側)。  H)核面積の定量(n＞198による3つの独立した実験の平均±s.d.)。  I)siLMNAによりトランスフェクションされ且つ化合物2により処理された、GFP-H2Bを発現しているU2OS細胞における核形状レスキューのライブイメージング写真。  J)フローサイトメトリーにより分析された細胞周期プロファイル。PI：ヨウ化プロピジウム。スケールバー：20μm。
【０００７】
【図２】図2：小型分子化合物2は様々なラミンA/C欠乏細胞において核形状欠損をレスキューする。  A)及びB) ラミンA/Cを欠乏させ(siLMNA)且つ様々なKATiにより処理した、HeLa細胞(A)又はRPE-1細胞(B)のDAPI染色による核形状の可視化。スケールバー：50μm。  C)及びD)  A)及びB)において示されたようなDAPI染色からのHeLa細胞(C)又はRPE-1細胞(D)の核真円度のセルプロファイラー定量(n＞252による3つの独立した実験の平均±s.d.)。  E)フローサイトメトリーにより分析された細胞周期プロファイル。PI：ヨウ化プロピジウム。  F)指定された癌細胞株におけるラミンA/C発現レベルの分析。下側パネル：正常RPE-1細胞と比較した癌細胞におけるラミンA/C発現のImage J定量。  G)化合物2による処理後の低ラミンA/C発現している癌細胞における核形状改善を示しているDAPI染色の代表的写真。スケールバー：20μm。
【０００８】
【図３】図3：化合物2による処理後のラミンA/C欠乏細胞の核形状レスキューは、有糸分裂とは無関係である。アフィディコリンによりS期に同期され且つその後有糸分裂開始を防ぐためにアフィディコリン存在下で化合物2により処理された細胞における、DAPI染色により観察された核形状レスキュー。スケールバー：20μm。
【０００９】
【図４】図4：N-アセチルトランスフェラーゼNAT10は、小型分子化合物2の細胞標的である。  A)クリック可能なアナログである化合物3及びクリック可能な不活性対照分子である参照化合物Aの分子構造。  B)U2OS核真円度の定量(n＞224による3つの独立した実験の平均±s.d.)。  C)小型分子タグ付けのためのクリック-ケミストリー戦略の原理。  D)化合物3のビオチン化されたアナログの分子構造。  E)小型分子のビオチン化された化合物3のプルダウン後のタンパク質の銀染色、及び5当量のクリック不可能な分子である化合物2の存在下で減少する特異的バンド(矢印参照)の同定。NAT10に対応するバンドは、他の特異的及び非特異的バンドと一緒に右側(*)に拡大している。  F)U2OS細胞においてプレインキュベーションしたクリック可能な分子化合物3及び参照化合物Aのプルダウン、並びに結合したタンパク質の分析。  G)ウエスタンブロット(下側パネル)により観察された、対照細胞又はNAT10欠乏細胞(siNAT10)における、NAT10(赤色)及び蛍光標識した化合物3(緑色)の高解像度の代表的顕微鏡写真。スケールバー：10μm。  H)NAT10のヘリックス特徴に対する漸増濃度の化合物2の増分作用を示す、円二色性分光法(右側)による、精製した(銀染色、左側)NAT10フォールディングの分析。  I)化合物2の安定した強力なアナログであるレモデリン(化合物1)の分子構造。
【００１０】
【図５】図5：該分子の細胞内局在、及びNAT10局在に対する該分子の作用の分析。  A)分子化合物3(図2参照)とは対照的に、非特異的染色を示す、クリック可能な対照分子である参照化合物Aの蛍光標識。スケールバー：20μm。  B)指示されたようにトランスフェクション又は処理された細胞内のラミンA/C及びNAT10染色のIF写真。スケールバー：20μm。
【００１１】
【図６】図6：核形状レスキューに関する構造必須要件を確定するための、化合物2アナログのスクリーニング。  A)指示された化合物2のアナログにより処理されたsiLMNA細胞におけるDAPI染色による核形状分析。  B)化合物2と比べレモデリンの効能が〜5倍増加することを示している、siLMNA細胞のDAPI染色により観察された投与量-依存型の核形状レスキュー。スケールバー：20μm。
【００１２】
【図７】図7：レモデリンによるNAT10活性の阻害は、LMNA欠乏細胞の核形状のレスキューを媒介する。  A)U2OS細胞におけるNAT10及びラミンA/C欠乏の分析。  B)DAPI染色により可視化された核形状(左側)及び核真円度の定量(右側)(n＞267による3つの独立した実験の平均±s.d.)。スケールバー：20μm。  C)その既知のドメインを伴ったNAT10の説明。D)において同定されたG641E変異は、アスタリスクにより示している。  D) Swiss-Prot PDB Viewerにより可視化された、アセチル-CoA結合部位(左側)及びNAT10変異によるAc-CoA結合の破壊(G641E、右側)を示しているヒトNAT10残基10〜917のモデル化された3D構造。  E)チューブリンへのNAT10のアセチルトランスフェラーゼ活性を示している、インビトロアセチル化アッセイ。  F) siRNA-抵抗性FLAG-NAT10 WT又はFLAG-NAT10 G641E(FLAG-NAT10 MUT)を安定して発現している細胞における核真円度の定量(左側)(n＞198による3つの独立した実験の平均±s.d.)、並びにDAPI染色により可視化された核形状(右側)。スケールバー：20μm。
【００１３】
【図８】図8：NAT10変異G641E(MUT)は、その局在に影響を及ぼさない。  A) G641残基の保存を示す、NAT10 GNAT(Gcn5-関連N-アセチルトランスフェラーゼ)ドメインのアラインメント。  B)ヒトHEK293細胞由来の精製されたFLAG-NAT10 WT又はG641E変異体(MUT)の銀染色。これらのタンパク質は、アセチルトランスフェラーゼ活性アッセイに使用した。  C) FLAG-NAT10 WT及びMUTのsiRNA抵抗性構築体を安定して発現しているU2OS細胞の特徴決定。これらの構築体の発現及びsiRNAへの抵抗性は、ウエスタンブロットにより観察した。並びに  D)両方の構築体の正確な局在は、抗-NAT10抗体又は抗-FLAG抗体を使用するIF染色により証明した。スケールバー：10μm。
【００１４】
【図９】図9：レモデリンは、NAT10を標的化し、HGPS細胞の核形状及び適応度を改善する。  A)同じ集団倍加でマッチした正常線維芽細胞と比較した、HGPS細胞株におけるラミンA/Cの代表的免疫蛍光測定(IF)写真。スケールバー：10μm。  B)レモデリン処理時に変形された核の定量(n＞213による3つの独立した実験の平均±s.e.m.)。  C) HGPS AG11498細胞におけるラミンA/C染色(左側)、並びに変形された核の定量(右側：n＞176による3つの独立した実験の平均±s.e.m.)。スケールバー：50μm。  D)レモデリン又はFTI処理後の、γH2AXのウエスタンブロット分析。  E)レモデリン又はATM/ATR阻害(ATM/ATRi)時の、γH2AX染色の免疫蛍光測定分析。  F) IFにより観察されたγH2AX陽性細胞の定量(n＞127による3つの独立した実験の平均±s.e.m.)。  G)レモデリン又はATM/ATR-インヒビター処理時のHGPS増殖(9つの繰り返しの平均±s.e.m)。  H)老化-関連したβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞の定量(n＞257による3つの独立した実験の平均±s.e.m.)。  I)集団倍加12でのレモデリン処理の8日後(PDL 12)並びにレモデリン処理及び12細胞分裂の数週間後(PDL 24)の、HGPS AG11498における老化に関連したβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞の定量(n＞298による2つの独立した実験の平均±s.d.)。
【００１５】
【図１０】図10：レモデリンは、投与量依存様式で、加齢したMRC5細胞の核形状をレスキューするが、WS細胞ではレスキューしない。  A)集団倍加44(PD44)で培養中のMRC5加齢細胞においてDAPI染色により観察された変形された核は、レモデリンによりレスキューされた。  B)レモデリン濃度の増加後の変形された核の定量(3つの独立した実験の平均±s.e.m.)。  C)レモデリン処理時に核形状の改善を示さない非-ラミノパシーウェルナー症候群細胞(WS)のDAPI染色。  D)変形された核のセルプロファイラー定量(3つの独立した実験の平均±s.d.、n＞273)。スケールバー：50μm。
【００１６】
【図１１】図11：レモデリンは、非-早老症細胞におけるFTI誘導した核形状欠損を防止する。  A)レモデリンはFTIではないことを示す、レモデリン又はFTI処理後のラミンA/Cプロセシングの分析。  B)指定された処理後のラミンA/C IF染色の代表的写真。矢印は、正常な線維芽細胞内のFTI誘導された変形された核を示す。スケールバー：50μm。  C)指定された細胞株及びインヒビター処理により変形された核の定量(3つの独立した実験の平均±s.e.m.、n＞178)。  D)FTI及びレモデリンのU2OS細胞の核形状に対する作用を示す、DAPI染色の代表的写真。スケールバー：20μm。
【００１７】
【図１２】図12：レモデリンは、HGPS細胞の全体的細胞の適応度を改善する。  A)ウエスタンブロットにより観察された正常線維芽細胞及びHGPS AG11498細胞におけるNAT10欠乏で、これは、siNAT10が、ラミンA/Cの発現及びプロセシングに対し作用を有さないことを示している。  B)レモデリン処理時のHGPS細胞における核形状の改善及び減少した数のγH2AX巣を示している、IF画像。スケールバー：10μm。  C)レモデリンは、試験した両方のHGPS細胞株においてγH2AXレベルを減少することを示している、ウエスタンブロット分析。  D)レモデリン処理時のエメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー細胞(EDMD)における核形状の改善及びγH2AX染色の減少した強度を示している、IF画像。スケールバー：10μm。  E)レモデリンは、EDMDにおけるγH2AXレベルを減少することを示す、ウエスタンブロット分析。  F) HGPS AG11498細胞におけるp53及びDNA損傷シグナル伝達経路に対するレモデリンの作用を示す、ウエスタンブロット分析。  G) H)において定量されたH3K9me3又はSUN1パターンの代表的IF画像。スケールバー：20μm。  I)より強く且つ均質なDAPI染色、並びにレモデリン処理時にNAT10染色により観察された核小体構造の再組織化を示す、IF染色。スケールバー：10μm。  J) DNA複製速度の増強を示す、レモデリン処理時のHGPS細胞におけるEdU取り込みの2時間後のフローサイトメトリー分析。  K) p53インヒビター(ピスフィリン)による又は指定されたKATインヒビターによる処理後の、老化-関連したβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞の定量であり、これはこれらの化合物はいずれも、HGPS AG11498における老化を減少しないことを示す。
【００１８】
【図１３】図13：NAT10アセチルトランスフェラーゼ活性の阻害は、微小管組織化を修飾し、核形状欠損をレスキューする。  A)α-チューブリンの反転IF写真による微小管ネットワークの可視化。  B)微小管又はアクチン細胞骨格破壊剤による細胞の処理後の核形状可視化。  C) siLMNA細胞における核形状(DAPI)及びゴルジ(抗-ギアンチン)の完全性の可視化。  D)レモデリン又はノコダゾール(Nocod.)処理時の、重合(P)及び可溶性(S)チューブリンの分画。  E) siNAT10によりトランスフェクションされ且つ指定されたsiRNA抵抗性構築体を発現している細胞における微小管再伸長アッセイ。α-チューブリンIF染色(左側)は、核生成相：t＝5分間及び微小管足場(t＝15分間)を示している。右側：指定されたパターンを伴う細胞の定量(n＞103による3つの独立した実験の平均±s.e.m.)。  F)ラミノパシー細胞は、脱組織化されたクロマチン構造に関連した肥大化され変形された核を有する。レモデリン処理時に、NAT10のアセチルトランスフェラーゼ活性は阻害され、中心体での微小管足場の破壊及び核外膜(nuclear envelope)上への微小管力の放出に繋がる。この核への機械的応力の放出は、核形状レスキュー及び細胞の適応度の全体的改善及びクロマチン組織化に寄与する。スケールバー：20μm。
【００１９】
【図１４】図14：レモデリンは、HGPS細胞における微小管ネットワークを標的化し、核形状を改善する。  A)微小管-破壊剤による細胞の処理後の核形状可視化及び定量。  B)レモデリンにより処理したHGPS AG11498細胞における微小管再伸長アッセイ。α-チューブリン反転IF染色は、正常な微小管脱重合(T＝0)及び核生成相(T＝5分)を示すが、レモデリン処理時には微小管足場は欠損する(T＝15分)。  C) B)におけるような微小管再伸長アッセイは、指定されたHGPS細胞株において、及び対照siRNA(siCT)によりトランスフェクションされた細胞と比べ、NAT10欠乏時(siNAT10)に微小管足場の欠損(T＝15分)を示す。スケールバー：20μm。
【００２０】
【図１５】図15：化合物2は、低いラミンA/C発現を伴う癌細胞の増殖、遊走及び浸潤を阻害する。  A) 50μMの化合物2で1週間処理された又は処理されなかった指定された癌細胞株の集団倍加時間は、低レベルのラミンAを発現している細胞は、この分子に対しより感受性があることを示している。  B) 50μMの化合物2による処理時に浸潤を示さない、前立腺22RV1癌細胞のマトリゲル浸潤アッセイの代表的写真。  C) 50μMの化合物2による処理後の、指定された低発現している癌細胞株からのトランスウェル遊走アッセイ及びマトリゲル浸潤アッセイの定量。
【００２１】
【図１６】図16：化合物2は、ラミンA/C欠乏細胞のタンパク質翻訳を減少する。  A) siRNA対照(siCT)又はsiRNAラミンA/C(siLMNA)によりトランスフェクションされたU2OS細胞を、同じ密度で播種し、タンパク質合成を阻害するためにシクロヘキシミド(CHX)により24時間処理し、且つDAPIにより染色した。DAPI染色の代表的写真は、siLMNA細胞は、CHXに対しより抵抗性であることを示している。  B)タンパク質合成を、メチオニンのクリック可能なアナログであるHPGの取り込みを定量することにより測定した。FACS分析は、化合物2の投与量増加後に、低ラミンAを発現しているU2OS細胞(B)又は正常なRPE細胞(C)におけるHPG強度の定量を示す。
【００２２】
【図１７】図17：マウスにおけるレモデリンの薬物動態アッセイ。  A)レモデリンの薬物動態は、ICRマウスにおいて、投与量レベル1mg/kgのIV及び5mg/kgのPO後に評価した。1mg/kgのIV投与後、半減期(T1/2)は0.915時間であり、且つクリアランスは139mL/分/kgであった。5mg/kgのPO投与後、半減期(T1/2)は1.81時間であり、最高血漿濃度(Cmax、409ng/mL)には0.25時間(Tmax)で到達し、且つ経口曝露は259ng/h/mL(AUC0-∞)であり、生物学的利用能は43.5％であった。  B) A)に示した曲線から得られた結果の詳細。
【００２３】
【図１８】及び
【図１９】図18及び図19：核形状レスキューのための構造必須要件の分析。この分析の結果は、実施例6に説明されている。
【００２４】
【図２０】図20：化合物2は、投与量-依存様式でA431メラノーマ細胞株の成長を阻害する。この分析の結果は、実施例7に説明されている。
【００２５】
【図２１】図21：ラミンA/CノックアウトU2OS細胞は、野生型細胞よりも、化合物2及びアナログに対しより感受性がある。この分析の結果は、実施例8に説明されている。
【００２６】
【図２２】図22：化合物2は、LMNA KO細胞において特異的に全体的タンパク質翻訳を阻害する。この分析の結果は、実施例9に説明されている。
【００２７】
【図２３】図23：NAT10の欠乏は、化合物2による処理に類似した、増殖、遊走及び浸潤の阻害に繋がる。この分析の結果は、実施例10に説明されている。
【００２８】
【図２４】図24：化合物2のインビボ毒性及びインビトロ特異性の評価。この分析の結果は、実施例11に説明されている。
【００２９】
【図２５】図25：ハッチンソン・ギルフォード早老症候群のマウスモデルに対する化合物2処置の作用。この分析の結果は、実施例12に説明されている。
【００３０】
【図２６】図26：インビボにおける化合物2の分子作用。この分析の結果は、実施例13に説明されている。
【００３１】
【図２７】図27：NAT10阻害に関する可能性のあるバイオマーカーとしてのアセチルチューブリンの評価。この分析の結果は、実施例14に説明されている。
【００３２】
【図２８】図28：遺伝子バリデーションのためのLmnaG609G/G609G/NAT10+/-マウスの遺伝子操作。この分析の結果は、実施例15に説明されている。
【００３３】
【図２９】図29：マイクロアレイ分析は、HGPS細胞における遺伝子発現調節に対する化合物2の特異性を示す。この分析の結果は、実施例16に説明されている。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
言及され得る本発明の一つの特定の態様に従い、ラミノパシー、早期老化障害、正常老
化又は癌の治療又は予防における使用のための、式(I)の化合物、又はその医薬として許
容し得る塩もしくは溶媒和物が提供される：
【化３】
2020059748.tif 000005
（式中：
W、Y及びZの各々は、CHを表すか、あるいはW、Y及びZの一つは、窒素を表し、且つ他の
2つの基は、CHを表し；
環Aは、下記： 
【化４】
2020059748.tif 000006
を表し；
Xは、S、O又はNRaを表し；
Raは、水素、ヒドロキシル、=O、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハ
ロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ又はハロC1-6アルコキシを表し；
R5は、水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲ
ン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、COH、COOH、COOC1-6アル
キル、シアノ、NH2又はNO2を表し；
nは、0〜5から選択された整数を表し；
各R1は、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキ
ル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6
アルキル、NH2又はNO2を、独立して表し；
R2は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル又はC2-6アルキニルを表し；
R3は、水素又は-N=R4基のいずれかから選択され、但し環Aが式(i)又は(iii)を表す場合
は、R3は-N=R4を表し、並びに環Aが式(ii)を表す場合は、R3は水素を表すこととし；
R4は、-C(R4a)(R4b)、C3-8シクロアルキル、又はベンジルを表し、ここで該シクロアル
キル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハロ
C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、COO
H、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換され；
R4a及びR4bは、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハ
ロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、C
OOH、COOC1-6アルキル、NH2、NO2、C3-8シクロアルキル又はベンジルから、独立して選択
され、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6ア
ルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ
、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換されてい
る。)。
【００３５】
本明細書において使用される用語「ハロ」又は「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素
又はヨウ素をいう。
【００３６】
本明細書において使用される用語「シアノ」とは、炭素原子が、窒素原子へ三重結合さ
れている基(すなわち、-C≡N)をいう。
【００３７】
本明細書において使用される用語「ヒドロキシル」とは、酸素原子が、水素原子に結合
されている基をいう。
【００３８】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「C1-6アルキル」とは、
炭素原子1〜6個を含む、線状又は分岐した飽和炭化水素基をいう。かかる基の例としては
、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、te
rt-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル又はヘキシルなどが挙げられる。
【００３９】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「C2-6アルケニル」とは
、炭素原子2〜6個を含み且つ炭素炭素二重結合を含む線状又は分岐した炭化水素基をいう
。
【００４０】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「C2-6アルキニル」とは
、炭素原子2〜6個を有し、且つ炭素炭素三重結合を含む線状又は分岐した炭化水素基をい
う。
【００４１】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「C1-6アルコキシ」とは
、C1-6アルキルが本明細書において定義されている、-O-C1-6アルキル基をいう。かかる
基の例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシなどが挙げられる。
【００４２】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「ハロC1-6アルキル」と
は、1個又は2個以上の水素原子がハロゲンにより置き換えられている、本明細書に定義さ
れたC1-6アルキル基をいう。従って用語「ハロC1-6アルキル」は、モノハロC1-6アルキル
及び同じくポリハロC1-6アルキルを含む。ハロゲンにより置き換えられた水素原子が1、2
、3個又はそれ以上存在することができ、そのためハロC1-6アルキルは、1、2、3個又はそ
れ以上のハロゲンを有することができる。かかる基の例としては、フルオロエチル、フル
オロメチル、トリフルオロメチル又はトリフルオロエチルなどが挙げられる。
【００４３】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「ハロC1-6アルコキシ」
とは、1個又は2個以上の水素原子がハロゲンにより置き換えられている、本明細書に定義
された-O-C1-6アルキル基をいう。従って用語「ハロC1-6アルコキシ」は、モノハロC1-6
アルコキシ及び同じくポリハロC1-6アルコキシを含む。ハロゲンにより置き換えられた水
素原子が1、2、3個又はそれ以上存在することができ、そのためハロC1-6アルコキシは、1
、2、3個又はそれ以上のハロゲンを有することができる。かかる基の例としては、フルオ
ロエチルオキシ、ジフルオロメトキシ又はトリフルオロメトキシなどが挙げられる。
【００４４】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「C3-8シクロアルキル」
とは、炭素原子3〜8個を含む、飽和炭化水素環をいう。かかる基の例としては、シクロプ
ロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオク
チルなどが挙げられる。
【００４５】
基として又は基の一部として本明細書において使用される用語「ベンジル」とは、CH2
基に結合されたベンゼン環をいう。
【００４６】
不確かさを避けるために、別に指定しない限りは、用語「置換された」とは、1以上の
規定された基により置換されることを意味する。基がいくつかの代替基から選択され得る
場合、選択された基は、同じ又は異なることができる。
【００４７】
不確かさを避けるために、用語「独立して」とは、2個以上の置換基が、いくつかの可
能性のある置換基から選択される場合、それらの置換基は、同じ又は異なることができる
ことを意味する。
【００４８】
一実施態様において、W、Y及びZの各々は、CHを表している。
【００４９】
一実施態様において、環Aは、式(i)又は(ii)を表している。更なる実施態様において、
環Aは、式(i)を表している。別の実施態様において、環Aは、式(ii)を表している。また
更なる別の実施態様において、環Aは、式(iii)を表している。
【００５０】
一実施態様において、Xは、S又はOを表している。更なる実施態様において、Xは、Sを
表している(すなわち、チアゾール環)。別の実施態様において、Xは、Oを表している(す
なわち、オキサゾール環)。
【００５１】
一実施態様において、R5は、水素又はハロゲン(ブロモなど)を表している。更なる実施
態様において、R5は、水素を表している。
【００５２】
一実施態様において、nは、0〜3の整数を表している。一実施態様において、nは、1〜2
の整数を表している。更なる実施態様において、nは、1を表している。別の実施態様にお
いて、nは、2を表している。
【００５３】
一実施態様において、R1は、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン(クロロもしくはブロモ
など)、C1-6アルコキシ(メトキシなど)、COOH、NO2、ハロC1-6アルキル(トリフルオロメ
チルなど)又はハロC1-6アルコキシ(トリフルオロメトキシなど)を表している。更なる実
施態様において、R1は、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)、
C1-6アルコキシ(メトキシなど)、COOH又はNO2を表している。また更なる実施態様におい
て、R1は、シアノ、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)又はNO2、例えばシアノ又はハ
ロゲンを表している。また更なる実施態様において、R1は、シアノを表している。また更
なる別の実施態様において、R1は、ハロゲン、例えばクロロを表している。また更なる別
の実施態様において、R1は、ハロC1-6アルキル、例えばトリフルオロメチルを表している
。
【００５４】
R1基は、式(I)のフェニル環上のパラ位、オルト位又はメタ位で結合されてよいことは
、当業者により理解されるであろう。一実施態様において、R1は、2、3、又は4位(すなわ
ち、オルト、メタ又はパラ位)に、特にメタ(3)及び／又はパラ(4)位にある。更なる実施
態様において、例えばR1がハロゲン又はシアノ、特にハロゲンである場合、R1は、メタ(3
)位にある。別の実施態様において、例えばR1がシアノ、クロロ又はトリフルオロメチル
である場合、R1は、パラ(4)位にある。
【００５５】
一実施態様において、nは、1を表し、且つ該R1基は、式(I)のフェニル環上の3又は4位
に存在する。
【００５６】
一実施態様において、nは、1を表し、且つR1は、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン(ク
ロロもしくはブロモなど)、C1-6アルコキシ(メトキシなど)、COOH、NO2又はハロC1-6アル
キル(トリフルオロメチルなど)を表している。更なる実施態様において、nは、1を表し、
且つR1は、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)、C1-6アルコキ
シ(メトキシなど)、COOH又はNO2を表している。
【００５７】
一実施態様において、nは、2を表し、且つ該R1基は、式(I)のフェニル環上の2及び4位
又は3及び4位又は2及び3位、例えば2及び4位又は3及び4位上に存在する。
【００５８】
一実施態様において、nは、2を表し、且つ両方のR1基は、クロロ(すなわち3,4-ジクロ
ロ)を表しているか、あるいはR1は、C1-6アルコキシ(例えばメトキシ)及びヒドロキシル(
すなわち2-ヒドロキシ-4-メトキシ)を表している。
【００５９】
別の実施態様において、nは、2を表し、且つ両方のR1基は、ヒドロキシ(すなわち3,4-
ジヒドロキシ)を表している。
【００６０】
一実施態様において、R2は、水素又はC2-6アルキニル(エチニルなど)を表している。更
なる実施態様において、R2は、水素を表している。更なる別の実施態様において、R2は、
エチニルを表している。
【００６１】
一実施態様において、R3は、-N=R4を表している。
【００６２】
一実施態様において、R4は、-C(R4a)(R4b)(-C(Me)2など)、非置換のC3-8シクロアルキ
ル、非置換のC3-8シクロアルケニル又は非置換のベンジルを表している。更なる実施態様
において、R4は、非置換のC3-8シクロアルキル又は非置換のベンジルを表している。
【００６３】
一実施態様において、R4は、C3-8シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘ
キシル(非置換のシクロペンチルもしくは非置換のシクロヘキシルなど)を表している。更
なる実施態様において、R4は、C3-8シクロアルキル、例えばシクロペンチル(非置換のシ
クロペンチルなど)を表している。
【００６４】
別の実施態様において、R4は、C3-8シクロアルケニル、例えばシクロペンテニル又はシ
クロヘキセニル(非置換のシクロペンテニルもしくは非置換のシクロヘキセニルなど)を表
している。
【００６５】
一実施態様において、R4は、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲ
ン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ又はヒドロキシルから選択
された1又は2個の基により、任意に置換されている。
【００６６】
一実施態様において、式(I)の化合物は、化合物1〜21、又はそれらの代替の医薬として
許容し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品から選択される。更なる
実施態様において、式(I)の化合物は、化合物1〜12、又はそれらの代替の医薬として許容
し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品から選択される。また更なる
実施態様において、式(I)の化合物は、化合物1〜11、例えば化合物1〜8、又はそれらの代
替の医薬として許容し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品から選択
される。また更なる実施態様において、式(I)の化合物は、化合物1〜3、又はそれらの代
替の医薬として許容し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品から選択
される。
【００６７】
別の実施態様において、式(I)の化合物は、化合物1、3、4、5、6、7及び8、例えば化合
物3もしくは8、又はそれらの代替の医薬として許容し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品も
しくは遊離塩基調製品から選択された化合物である。
【００６８】
一実施態様において、式(I)の化合物は、4-(4-シアノフェニル)-2-(2-シクロペンチリ
デンヒドラジニル)チアゾール(化合物1)、又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、
遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品である。別の実施態様において、式(I)の化合物は
、4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール、又はその
医薬として許容し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品、例えば塩酸
塩である。
【００６９】
別の実施態様において、式(I)の化合物は、4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シクロペンチ
リデン-1-(プロパ-2-イン-1-イル)ヒドラジニル)チアゾール(化合物3)、又はそれらの医
薬として許容し得る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品である。
【００７０】
別の実施態様において、式(I)の化合物は、4-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-(2-
シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール(化合物13)、又はその医薬として許容し得
る塩、溶媒和物、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品、例えば臭化水素酸塩である。
【００７１】
本発明の更なる態様に従い、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又は
予防における使用のための、式(I)aの化合物が提供される：
【化５】
2020059748.tif 000007
(式中、R1、R2、R3、R5、X及びnは、本明細書において先に定義されたものである。)。
【００７２】
本発明の更なる態様に従い、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又は
予防における使用のための、式(I)bの化合物が提供される：
【化６】
2020059748.tif 000008
(式中、R1、R2、R3、R5及びnは、本明細書において先に定義されたものである。)。
【００７３】
本発明の更なる態様に従い、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又は
予防における使用のための、式(I)cの化合物が提供される：
【化７】
2020059748.tif 000009
(式中、R1、R2、及びnは、本明細書において先に定義されたものである。)。
【００７４】
本発明の更なる態様に従い、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又は
予防における使用のための、式(I)dの化合物が提供される：
【化８】
2020059748.tif 000010
(式中、R1、及びnは、本明細書において先に定義されたものである。)。
【００７５】
ある種の式(I)の化合物は、新規であり、従って本発明の更なる態様に従い、化合物3、
化合物8、化合物11、化合物13-17及び化合物19-21；並びにそれらのいずれか一つの塩及
び溶媒和物から選択された式(I)の化合物が提供される。
【００７６】
一実施態様において、本化合物は、化合物3又は8から選択される。
【００７７】
（NAT10阻害）
より一般的に、本発明者らは、ラミンA/C欠乏した細胞又はLMNA変異を伴う細胞におけ
る、NAT10阻害と核構造及びクロマチン組織化の改善との間の新たな関連を発見したこと
は理解されるであろう。従って本発明の更なる態様において、ラミノパシー、早期老化障
害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌など)の、特にラミノパ
シー及び早期老化障害の治療又は予防における使用のための、NAT10インヒビターが提供
される。
【００７８】
「NAT10」(もしくは初期にはhALP)とも称されるN-アセチルトランスフェラーゼ10は、
細菌からヒトまで高度に保存されているN-アセチルトランスフェラーゼ酵素である(図8参
照)。哺乳動物のNAT10は、リシンアセチルトランスフェラーゼ(KAT)であることが提唱さ
れているのに対し、その細菌ホモログであるTmcAは、既知のRNAシトシンアセチルトラン
スフェラーゼである(Chimnaronkらの文献、(2009) Embo. J. 28, 1362)。KAT酵素は、ヒ
ストン及び他のタンパク質のアセチル化状態を調節し、結果的に全体的クロマチン組織化
に影響を及ぼす能力を有する。従って用語「NAT10インヒビター」への本明細書における
言及は、NAT10のアセチルトランスフェラーゼ活性を阻害することができる分子をいう。
哺乳動物のNAT10の既知の基質は、ヒストン及びチューブリンである(Shenらの文献、(200
9) Exp. Cell Res. 315, 1653)。
【００７９】
本発明者らは、微小管ネットワークの再組織化により、核形態レスキューを生じる、NA
T10の小型分子インヒビターを同定した。従って本明細書に開示された同定されたNAT10の
小型分子インヒビターは、有益な空間的及び時間的解明によりラミノパシーに関連したプ
ロセスを研究する新たな機会を提供し、且つラミノパシー又は早期老化を引き起こす疾患
を軽減するために使用することができる。
【００８０】
当業者には、阻害は、NAT10への直接的又は間接的結合のいずれかにより起こり得るこ
とは明らかであろう。
【００８１】
（スクリーニング方法）
本発明の更なる態様に従い、NAT10インヒビターのような、NAT10活性を阻害することが
可能である物質のスクリーニング方法、及びそれらの治療における使用が、提供される。
【００８２】
本発明者らは、NAT10阻害と、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又
は予防との間の関連を説明したという事実を受け、NAT10活性に対する被験物質の作用を
測定することにより、NAT10活性を阻害することが可能である該被験物質を同定すること
を含む、対象において、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌を予防又は治療又
は予防することを意図された候補製剤原料のスクリーニング方法も提供される。
【００８３】
一実施態様において、このスクリーニング方法は：
a.  ラミンA及び／又はラミンC欠乏した細胞を、被験物質と接触させること；
b.  設定された期間後に、NAT10活性のレベルを測定すること；並びに、
c.  測定されたNAT10活性のレベルを、被験物質が添加されなかった場合に観察された
レベルと比較すること、を含む。
【００８４】
一実施態様において、このスクリーニング方法は、インビトロにおいて実行される。
【００８５】
一実施態様において、ラミンA及び／又はラミンC欠乏細胞は、LMNA遺伝子の発現に干渉
するよう、低分子干渉RNA(siRNA)を使用することにより得られる。更なる実施態様におい
て、ラミンA及び／又はラミンC欠乏した細胞は、配列番号：1及び2のsiRNA二本鎖を使用
することにより得られる。
【００８６】
このスクリーニング方法は、NAT10活性を阻害し且つ核形状欠損をレスキューすること
が可能な化合物の同定に関する明確な指針を提供することは、当業者には理解されるであ
ろう。
【００８７】
（化合物の調製）
本文脈において、用語「医薬として許容し得る塩」とは、患者にとって有害ではない塩
を示すことが意図されている。かかる塩としては、医薬として許容し得る酸付加塩、医薬
として許容し得る金属塩及び医薬として許容し得るアルカリ付加塩が挙げられる。酸付加
塩は、無機酸に加え、有機酸の塩を含む。
【００８８】
式(I)の化合物及びそれらの亜群に関する言及はまた、例えば、以下に考察するように
、それらのイオン型、塩、溶媒和物、異性体(幾何異性体及び立体化学的な異性体を含む)
、互変異性体、N-オキシド、エステル、プロドラッグ、同位体及び保護された形を含み；
好ましくは、それらの塩又は互変異性体又は異性体又はN-オキシド又は溶媒和物；並びに
、より好ましくは、それらの塩又は互変異性体又はN-オキシド又は溶媒和物、更により好
ましくは、それらの塩又は互変異性体又は溶媒和物を含む。以後、本発明の任意の態様に
おいて定義されたように、化合物及びそれらのイオン型、塩、溶媒和物、異性体(幾何異
性体及び立体化学的な異性体を含む)、互変異性体、N-オキシド、エステル、プロドラッ
グ、同位体及びそれらの保護された形(化学処理中の中間体化合物は除く)は、「本発明の
化合物」と称される。
【００８９】
本明細書に記載される化合物は、任意の及び全ての立体異性体(例えば、それぞれに見
合った、ジアステレオ異性体及び鏡像異性体)の形状でのそれらの使用を含む。例えば、
キラル化合物が主張されるか、又は単独の鏡像異性体又は鏡像異性体の混合物(例えば、
ラセミ混合物)として使用されることが主張される。
【００９０】
多くの式(I)の化合物は、塩の形、例えば、酸付加塩、又はある場合においては有機塩
基及び無機塩基の塩、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩及びリン酸塩などで存在するこ
とができる。かかる塩は全て、本発明の範囲内であり、且つ式(I)の化合物の言及は、こ
れらの化合物の塩形を含む。
【００９１】
本発明の塩は、文献「医薬用塩：特徴、選択及び使用(Pharmaceutical Salts: Propert
ies, Selection, and Use)」、P. Heinrich Stahl(編集)、Camille G. Wermuth(編集)、I
SBN:3-90639-026-8、Hardcover、388頁、2002年8月に記載された方法などの、従来の化学
的方法により、塩基性及び酸性の部分を含む親化合物から合成することができる。一般に
、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸又は遊離塩基の形を、水もしくは有機溶媒中で、
又はこれら2種の混合物中で、好適な塩基又は酸と反応させることにより、調製され得；
一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルな
どの、非水性媒体が使用される。
【００９２】
酸付加塩(単塩又は複塩)は、無機及び有機の両方の多種多様な酸により形成されてよい
。酸付加塩の例としては、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコル
ビン酸(例えば、L-アスコルビン酸)、L-アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸
、4-アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)カンファー酸、カンファー-スルホン酸、(+)-
(1S)-カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、桂皮酸、クエ
ン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-
ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘ
プトン酸、D-グルコン酸、グルクロン酸(例えば、D-グルクロン酸)、グルタミン酸(例え
ば、L-グルタミン酸)、α-オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸
(例えば、臭化水素酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸)、イセチオン酸、乳酸(例えば、(+)-L
-乳酸、(±)-DL-乳酸)、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、(-)-L-リンゴ酸、マロ
ン酸、(±)-DL-マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-
1,5-ジスルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロ
チン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、L-ピロ
グルタミン酸、サリチル酸、4-アミノ-サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク
酸、硫酸、タンニン酸、(+)-L-酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデシ
レン酸及び吉草酸、更にはアシル化されたアミノ酸及び陽イオン交換樹脂からなる群から
選択された酸により形成された単塩又は複塩が挙げられる。
【００９３】
塩の一つの特定の群は、酢酸、塩化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエ
ン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスル
ホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸(メシラート)、エタンスルホン酸、ナフ
タレンスルホン酸、吉草酸、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸及び
ラクトビオン酸から形成された塩からなる。一つの特定の塩は、塩酸塩である。別の特定
の塩は、ヘミ硫酸塩としても公知である、硫酸水素塩である。
【００９４】
式(I)の化合物が、アミン官能基を含む場合は、これらは、例えば、当業者に周知の方
法に従うアルキル化剤との反応により、4級アンモニウム塩を形成することができる。か
かる4級アンモニウム化合物は、式(I)の範囲内である。
【００９５】
本発明の化合物は、単塩又は複塩として存在してよいことは、理解されるであろう。
【００９６】
本発明の化合物の塩の形は、典型的には、医薬として許容し得る塩であり、且つ医薬と
して許容し得る塩の例は、Bergeらの文献、1977、「医薬として許容し得る塩(Pharmaceut
ically Acceptable Salts)」、J. Pharm. Sci., 66巻1-19頁において考察されている。し
かし、医薬として許容することができない塩もまた、その後医薬として許容し得る塩へ変
換され得る中間体の形として調製されてよい。例えば本発明の化合物の精製又は分離にお
いて有用であることができる、かかる医薬として許容することができない塩形もまた、本
発明の一部を形成している。
【００９７】
有機化学分野の業者は、多くの有機化合物は、その中でそれらが反応される溶媒、又は
そこからそれらが沈殿もしくは結晶化される溶媒と、錯体を形成することができることを
理解するであろう。これらの錯体は、「溶媒和物」として公知である。例えば、水との錯
体は、「水和物」として公知である。本発明の化合物の医薬として許容し得る溶媒和物は
、本発明の範囲内である。一実施態様において、本発明の化合物の医薬として許容し得る
溶媒和物は、それらの水和物を含む。
【００９８】
式(I)の化合物のある種の保護誘導体は、最終の脱保護段階の前に生成されてよく、こ
れはそれ自体では薬理活性を有さないが、しかし場合によっては、経口又は非経口に投与
されることができ、その後体内で代謝され、薬理活性がある本発明の化合物を形成するこ
とは、当業者に理解されるであろう。従ってかかる誘導体は、「プロドラッグ」として説
明されてよい。本発明の化合物のかかるプロドラッグは全て、本発明の範囲内に含まれる
。本発明の化合物に適しているプロドラッグ官能基の例は、「今日の薬剤(Drugs of Toda
y)」、19巻9号、1983年、499〜538頁、並びに「化学のトピックス(Topics in Chemistry)
」、第31章、306〜316頁、及び「プロドラッグのデザイン(Design of Prodrugs)」、H. B
undgaard著、Elsevier、1985年、第1章(その文書内の開示は引用により本明細書中に組み
込まれている)。当業者により、例えば、H. Bundgaardの「プロドラッグのデザイン」(そ
の文書内の開示は引用により本明細書中に組み込まれている)に記載されたような、「プ
ロ部分」として当業者に公知のある部分は、かかる官能性が本発明の化合物内に存在する
場合は、好適な官能性上に配置されて良いことは更に理解されるであろう。
【００９９】
同じく本発明の化合物及び様々な塩の範囲内に含まれるものは、それらの多形体である
。
【０１００】
式(I)の化合物は、いくつかの異なる幾何異性体、及び互変異性体の形で存在すること
ができ、且つ式(I)の化合物の言及は、そのような形を全て含む。
【０１０１】
本発明は、本発明の全ての医薬として許容し得る同位体-標識された化合物、すなわち
式(I)の化合物を含み、ここで1個以上の原子は、同じ原子番号を有するが、通常自然界に
認められる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子により置き換
えられている。
【０１０２】
本発明の化合物に包含されるのに適した同位体の例は、2H(D)及び3H(T)などの水素の同
位体、11C、13C及び14Cなどの炭素の同位体、36Clなどの塩素の同位体、18Fなどのフッ素
の同位体、123I、125I及び131Iなどのヨウ素の同位体、13N及び15Nなどの窒素の同位体、
15O、17O及び18Oなどの酸素の同位体、32Pなどのリンの同位体、並びに35Sなどの硫黄の
同位体を含む。
【０１０３】
ある種の同位体-標識された式(I)の化合物、例えば、放射性同位元素を取り込んでいる
ものは、薬物及び／又は基質の組織分布の研究において有用である。式(I)の化合物は、
標識された化合物と、他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素又は受容体との間の複合体
の形成を検出又は同定するために使用することができるという点で、これらはまた、価値
のある診断特性を有することができる。検出又は同定の方法は、放射性同位体、酵素、蛍
光物質、発光物質(例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリン
及びルシフェラーゼ)などの標識剤により標識された化合物を使用することができる。放
射性同位元素トリチウム、すなわち3H(T)、及び炭素-14、すなわち14Cは、それらの取り
込みの容易さ及び既にある検出手段を考慮し、この目的のために特に有用である。
【０１０４】
重水素、すなわち2H(D)などの比較的重い同位体との置換は、より大きい代謝安定性、
例えば、増大したインビボ半減期又は低下した用量必須要件から生じる、ある種の治療的
利点をもたらすことがあり、従って一部の状況においては好ましくある。
【０１０５】
例えば11C、18F、15O及び13Nなどの陽電子放出同位体による置換は、標的占有率を試験
するための、陽電子放出断層撮影(PET)試験において有用であることができる。
【０１０６】
同位体標識された式(I)の化合物は一般に、当業者に公知の従来の技術により、あるい
はこれまで利用された非標識試薬の代わりに好適な同位体標識された試薬を使用する添付
している「実施例及び調製」において説明されたプロセスに類似したプロセスにより、調
製されることができる。
【０１０７】
（化合物の調製プロセス）
本発明の更なる態様に従い、本明細書において定義された式(I)の化合物の調製プロセ
スが提供され、これは：
(a)Aが(i)を表す場合、式(II)の化合物：
【化９】
2020059748.tif 000011
(式中、W、Y、Z、R1及びnは、先に定義したものであり、並びにL1は、塩素又は臭素など
の好適な脱離基を表す)の、式(III)の化合物：
【化１０】
2020059748.tif 000012
（式中、R2及びR3は、先に定義したものである）との反応；
(b)式(I)の化合物の保護誘導体の脱保護；及び／又は
(c)式(I)の化合物又はそれらの保護誘導体の、更なる式(I)の化合物又はそれらの保護
誘導体への相互変換；並びに
(d)任意の、式(I)の化合物の医薬として許容し得る塩の形成：
を含む。
【０１０８】
プロセス(a)は、典型的には、式(II)の化合物を、式(III)の化合物と、イソプロパノー
ルなどの好適な溶媒の存在下、室温などの好適な温度で、6〜24時間反応させることを含
む。当業者により、式(I)の化合物(式中、Aは(ii)及び(iii)を表す)の調製は、プロセス(
a)に説明された手順に類似の様式で行うことができることは、理解されるであろう。
【０１０９】
前記スキームにおける2つ以上の化学工程は、中間体物質を単離せずに連続して実行さ
れてよいことは、有機合成の業者には理解されるであろう。
【０１１０】
プロセス(b)は、典型的には、いずれかの好適な脱保護反応を含み、その条件は保護基
の性質によって決まるであろう。保護基がtBocを表す場合、かかる脱保護反応は、典型的
には、好適な溶媒中での好適な酸の使用を含む。例えば、この酸は好適には、トリフルオ
ロ酢酸又は塩酸を含むことができ、並びにこの溶媒は好適には、ジクロロメタン、酢酸エ
チル、1,4-ジオキサン、メタノール又は水を含むことができる。任意に、溶媒の混合物、
例えば、水性メタノール又は酢酸エチル／1,4-ジオキサンを使用することができる。
【０１１１】
保護基がtBocを表す場合、先に説明されたような好適な酸を使用する脱保護は、医薬と
して許容し得る塩として式(I)の化合物を生成することができ、これは直接単離すること
ができることは、理解されるであろう。あるいは、式(I)の化合物は、当該技術分野にお
いて周知の方法を使用し、遊離塩基として単離され、その後任意にプロセス(d)に従い医
薬として許容し得る塩へと変換されることができる。
【０１１２】
ヒドロキシ基は、例えば、エーテル(-OR)又はエステル(-OC(=O)R)として保護されるこ
とができ：例えば、t-ブチルエーテル；テトラヒドロピラニル(THP)エーテル；ベンジル
、ベンズヒドリル(ジフェニルメチル)、又はトリチル(トリフェニルメチル)エーテル；ト
リメチルシリル又はt-ブチルジメチルシリルエーテル；又は、アセチルエステル(-OC(=O)
CH3)として、保護されることができる。
【０１１３】
アルデヒド基又はケトン基は、例えば、各々、アセタール(R-CH(OR)2)又はケタール(R2
C(OR)2)として保護されることができ、ここでカルボニル基(>C=O)は、例えば、第一級ア
ルコールにより処理される。アルデヒド基又はケトン基は、酸の存在下で大量に過剰な水
を使用する加水分解により、容易に再生される。
【０１１４】
アミン基は、例えば、アミド(-NRCO-R)又はカルバメート(-NRCO-OR)として保護される
ことができ、例えば、メチルアミド(-NHCO-CH3)として；ベンジルカルバメート(-NHCO-OC
H2C6H5、-NH-Cbz又はNH-Z)；t-ブチルカルバメート(-NHCO-OC(CH3)3、-NH-Boc)として；2
-ビフェニル-2-プロピルカルバメート(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5、-NH-Boc)、9-フルオレ
ニルメチルカルバメート(-NH-Fmoc)として、6-ニトロベラトリルカルバメート(-NH-Nvoc)
として、2-トリメチルシリルエチルカルバメート(-NH-Teoc)として、2,2,2-トリクロロエ
チルカルバメート(-NH-Troc)として、アリルカルバメート(-NH-Alloc)として、又は2(-フ
ェニルスルホニル)エチルカルバメート(-NH-Psec)として保護されることができる。
【０１１５】
アミン、例えば環状アミン及び複素環式N-H基に関する他の保護基は、トルエンスルホ
ニル(トシル)基及びメタンスルホニル(メシル)基、ベンジル基、例えばパラ-メトキシベ
ンジル(PMB)基及びテトラヒドロピラニル(THP)基を含む。
【０１１６】
プロセス(c)は、典型的には、当業者により公知の相互変換手順を含む。例えば、式(I)
の化合物において、第一の置換基は、当業者により公知の方法により、第二の別の置換基
へと変換されることができる。広範な周知の官能基相互変換は、前駆体化合物の式Iの化
合物への変換に関して、当業者により公知であり、且つ文献「最新有機化学(Advanced Or
ganic Chemistry)」、Jerry March、第4版、John Wiley & Sons社、1992年に記載されて
いる。例えば、有機錫試薬(スティル反応)、グリニャール試薬及び窒素求核試薬との反応
を使用するような可能性のある金属触媒された官能基化は、「パラジウム試薬及び触媒(P
alladium Reagents and Catalysts)」[Jiro Tsuji、Wiley社、ISBN 0-470-85032-9]、及
び「有機合成のための有機パラジウム化学の手引き(Handbook of OrganoPalladium Chemi
stry for Organic Synthesis)」[第1巻、Ei-ichi Negishi編集、Wiley社、ISBN 0-471-31
506-0]に記載されている。
【０１１７】
プロセス(d)は、好適な溶媒に溶解された遊離塩基の形の式(I)の化合物の、化学量論的
な量又は過剰な医薬として許容し得る有機酸もしくは無機酸による処理、その後の生じた
塩の当該技術分野において周知の方法、例えば溶媒の蒸発又は結晶化による単離により、
実行されることができる。
【０１１８】
適切ならば、プロセス(a)、(b)及び(c)において先に説明されたこれらの反応は、当業
者に公知の1以上の反応に続くか又は先行し、且つ他の式(I)の化合物をもたらすために、
先に定義されたR1、R2、R3、R4及びR5において必要な置換を達成するのに適した順番で、
実行される。その条件を前記文献において認めることができるかかる反応の非限定的例は
、以下を含む：
反応性官能基の保護、
反応性官能基の脱保護、
ハロゲン化、
脱ハロゲン化、
脱アルキル化、
アミン、アニリン、アルコール及びフェノールのアルキル化及びアリール化、
ヒドロキシル基のミツノブ反応、
適当な基の付加環化反応、
ニトロ、エステル、シアノ、アルデヒドの還元、
遷移金属-触媒したカップリング反応、
アシル化、
スルホニル化／スルホニル基の導入、
エステル基のケン化／加水分解、
エステル基のアミド化又はエステル転移反応、
カルボキシル基のエステル化又はアミド化、
ハロゲン交換、
アミン、チオール又はアルコールによる求核置換、
還元的アミノ化、
カルボニル基とヒドロキシルアミン基のオキシム形成、
S-酸化、
N-酸化、
塩化(salification)。
【０１１９】
式(II)の化合物は、下記スキーム1に従い、式(IV)の化合物から調製することができる
：
【化１１】
2020059748.tif 000013
(式中、W、Y、Z、R1、n及びL1は先に定義されたものである)。
【０１２０】
工程(i)は、典型的には、1.1当量のNXS、1.5当量のpTSA及びMeCNなどの、好適な試薬の
使用、それに続く2〜24時間の還流加熱を含む。
【０１２１】
式(III)の化合物は、公知であるか、又は公知の手順に従い公知の物質から調製するこ
とができるかのいずれかであることは、当業者には理解されるであろう。例えば、式(V)
の化合物(式中、R2は水素を表し、且つR3は-N=シクロプロピルを表す)は、下記スキーム2
に従い調製することができる：
【化１２】
2020059748.tif 000014
。
【０１２２】
工程(i)は、典型的には、イソプロパノールなどの好適な溶媒中で、式(V)の化合物及び
式(VI)の化合物を反応させ、引き続き16時間還流加熱することを含む。
【０１２３】
必要とされる中間体、例えば、式(IV)、(V)及び(VI)の化合物は、市販されているか、
文献において公知であるか、文献の方法に類似の方法により調製されるか、又は下記の実
施例実験手順において説明された方法に類似の方法により調製されるかのいずれかである
。
【０１２４】
（治療方法）
先に考察されるように、本発明の化合物は、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又
は癌、特にラミノパシー及び早期老化障害などの、ラミンA及び／又はラミンC欠乏又はLM
NA変異に関連した障害の治療又は予防において有用であると考えられている。
【０１２５】
従って本発明の更なる態様に従い、医薬品、好ましくはヒト医薬品としての使用のため
の本発明の化合物が、提供される。
【０１２６】
更なる態様に従い、本発明は、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌、特にラ
ミノパシー又は早期老化の治療又は予防のための医薬品の製造における本発明の化合物の
使用を提供する。
【０１２７】
本発明の更なる態様に従い、本明細書に定義された化合物の治療的有効量をそれを必要
とするヒトへ投与することを含む、該ヒトにおけるラミノパシー、早期老化障害、正常老
化又は癌を治療又は予防する方法が提供される。
【０１２８】
本明細書における「ラミノパシー」の言及は、核ラミナのタンパク質をコードしている
遺伝子の変異、例えばラミンA/C欠乏及び／又はLMNA遺伝子の欠損により引き起こされる
遺伝的障害の群をいう。ラミノパシーは、ジストロフィー及び早老症(すなわち早期老化)
疾患を含む。
【０１２９】
ラミノパシーの例としては、非定型ウェルナー症候群；バラケ・シモンズ症候群；ブシ
ュケ・オレンドルフ症候群；心筋症；シャルコー・マリー・トゥース病；エメリー・ドレ
フュス型筋ジストロフィー(X-連鎖性(EDMD)、常染色体優性型(EDMD2)又は常染色体劣性型
(EDMD3))；Dunnigan型の家族性部分型脂肪萎縮症(FPLD)；グリーンバーグ異形成症；ハッ
チンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)；脱髄性成人発症型常染色体優性遺伝白質ジス
トロフィー(ADLD)；肢帯型筋ジストロフィー1B型(LGMD1B)；糖尿病、脂肪肝、肥大型心筋
症、及び白斑黒皮腫性丘疹(LDHCP)を随伴する脂肪萎縮症；A型脂肪萎縮症を伴う下顎末端
異形成(MADA)；B型脂肪萎縮症を伴う下顎末端異形成(MADB)；ペルゲル・フェット核異常(
PHA)；ペリツェウス・メルツバッハー病；又は拘束性皮膚障害(RD)が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
【０１３０】
本明細書における「早期老化」の言及は、個体における加速性の老化を引き起こす障害
をいう。かかる障害は、「早老症障害」と称されることができ、且つハッチンソン・ギル
フォード早老症候群(HGPS)；ウェルナー症候群；ブルーム症候群；ロートムンド・トムソ
ン症候群；コケーン症候群；又は、色素性乾皮症を含む。
【０１３１】
LMNAのダウンレギュレーションはまた、いくつかの癌型においても報告されている(Zin
kらの文献、(2004) Nat. Rev.；Wuらの文献、(2009) J. Exp. Clin. Cancer Res.を参照
されたい)。一部の癌において観察されるラミンA発現の完全な喪失は、ラミンが腫瘍抑制
因子として作用することを示唆している(J.L. Broersらの文献、Am J Pathol 1993、S.F.
Mossらの文献、Gut 1999、R.S. Venablesらの文献、Br J Cancer 2001)。重要なことに
、ラミンA/C発現のダウンレギュレーションは、癌の攻撃性及び予後不良と相関している(
E.J. Beltらの文献、European journal of Cancer, 2011、N.D. Willisらの文献、PLoS O
ne 2008、N.D. Willisらの文献、Biochem Soc Trans 2008)。核内膜での機能性ラミナの
喪失は、癌細胞の変形された核の一因であるように見える。更に、ラミンA/C発現の減少
は、微小血管へとより容易に割り込む(squeeze)ことができるより柔らかい核に関連して
おり、このことはこれらの癌細胞の浸潤能の増大の一因となり得る。従って本発明の化合
物は、ラミンA/C欠乏した細胞の核形状を改善することができるので、本発明の化合物は
また、これらの癌を治療するためにも使用することができることは理解されるであろう。
実際、これらの化合物のより高い投与量は、特に低レベルのラミンA/Cを発現している癌
細胞において、癌細胞の浸潤及び遊走、更には細胞増殖を低下する。
【０１３２】
本明細書記載の化合物により治療され得る癌型の例は、乳房、腸管、膀胱、骨、脳、子
宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣
、甲状腺又は子宮の癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫又はメラノーマを含むが、これらに限
定されるものではない。癌幹細胞もまた、これらの化合物により標的化され得る。
【０１３３】
本明細書において使用される用語「医薬品」とは、疾患の治療、治癒又は改善において
、あるいは疾患症状の治療、改善又は軽減において有益な医薬製剤をいう。医薬製剤は、
それが投与される対象には有害ではない形の薬学的活性成分、並びにこの活性成分を安定
化し且つ循環もしくは標的組織へのその吸収に影響を及ぼすようにデザインされた追加の
構成物質を含有する。一実施態様において、本明細書記載の医薬品は、ヒト医薬品である
。
【０１３４】
本明細書における「治療」の言及は、予防、再発の防止、及び症状の抑制もしくは改善
(軽度、中等度又は重度のいずれか)、更には確立された状態の治療にまで及ぶことは理解
されるであろう。
【０１３５】
（医薬組成物）
更なる態様に従い、本発明は、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又
は予防における使用のための、本発明の化合物を、1種以上の医薬として許容し得る担体
、希釈剤及び／又は賦形剤と共に含有する医薬組成物を提供する。この担体、希釈剤及び
／又は賦形剤は、組成物の他の成分と相溶性があり、且つそれらのレシピエントに対し有
毒でないという意味で「許容され得」なければならない。
【０１３６】
本発明の化合物はまた、1種以上の更なる活性成分と組合せて使用することができる。
従って本発明は、更なる態様において、本発明の化合物又はそれらの医薬として許容し得
る誘導体を1種以上の更なる活性成分と一緒に含有する組合せを提供する。
【０１３７】
本発明の化合物又はそれらの医薬として許容し得る誘導体が、同じ疾患状態に対する1
種以上の更なる活性成分と組合せて使用される場合、各化合物の投与量は、この化合物が
単独で使用される場合の投与量とは異なって良い。好適な投与量は、当業者により容易に
理解されるであろう。治療における使用に必要な本発明の化合物の量は、治療される状態
の性質、並びに患者の年齢及び状態に応じて変動し、且つ最終的には担当の医師又は獣医
師の裁量によることは、理解されるであろう。
【０１３８】
1種以上の更なる活性成分は、ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌の治療又
は予防のための活性成分であることができる。かかる活性成分の好適な非限定的例として
は、プラバスタチン、ゾレドロン酸、ラパマイシン、ロナファルニブなどのファルネシル
-トランスフェラーゼインヒビターなどが挙げられる。
【０１３９】
先に言及された組合せは、好都合なことに医薬製剤の形での使用について提示されてよ
く、従って医薬として許容し得る担体又は賦形剤と一緒に先に定義された組合せを含有す
る医薬製剤は、本発明の更なる態様を構成する。かかる組合せの個々の成分は、個別の又
は組合せた医薬製剤において、任意の簡便な経路により、連続して又は同時に投与するこ
とができる。
【０１４０】
投与が連続的である場合、本発明の化合物又は1種以上の更なる活性成分のいずれかが
、最初に投与されてよい。投与が同時である場合、この組合せは、同じ又は異なる医薬組
成物中のいずれかで投与されてよい。
【０１４１】
同じ製剤中に組合せられる場合、これら2種の化合物は、安定しており、且つ互いに及
びその製剤の他の成分と相溶性がなければならないことは理解されるであろう。個別に製
剤される場合、これらは、任意の簡便な製剤において、好都合なことに当該技術分野にお
いてかかる化合物に関して公知であるような様式で提供されてよい。
【０１４２】
（投与）
本発明の化合物は、原(raw)化学物質として投与されることができるが、この活性成分
は、医薬製剤として提示されることが好ましい。
【０１４３】
本発明の化合物は、当該技術分野において周知の従来型の手順に従い、本発明の化合物
を、標準の医薬担体又は希釈剤と組合せることにより調製された従来型の剤形において、
投与されることができる。これらの手順は、所望の調製品に見合った該成分の混合、造粒
及び圧縮もしくは溶解に関与することができる。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は、任意の経路による投与のために製剤されることができ、且つヒ
トを含む哺乳動物への経口、局所的又は非経口的投与に適合された形でそれらを含む。
【０１４５】
本組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、舐剤、クリーム、又は経口のもしくは
無菌の非経口の液剤もしくは懸濁剤などの、液体調製品の形状であることができる。
【０１４６】
本発明の局所用製剤は、例えば、軟膏、クリーム又はローション、眼軟膏及び点眼薬も
しくは点耳薬、含浸包帯及びエアロゾルとして提示されることができ、且つ保存剤、薬物
の浸透を補助するための溶媒、並びに軟膏及びクリーム中の皮膚軟化剤などの好適な従来
型の添加物を含むことができる。
【０１４７】
本製剤はまた、クリーム又は軟膏の基剤などの相溶性のある従来型の担体、及びローシ
ョンのためのエタノール又はオレイルアルコールも含むことができる。かかる担体は、該
製剤の約1％から最大約98％で存在することができる。より通常は、これらは該製剤の最
大約80％を形成するであろう。
【０１４８】
経口投与のための錠剤及びカプセル剤は、単位投与量で提供される形であることができ
、且つ結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、
又はポリビニルピロリドンなど；充填剤、例えば、ラクトース、糖、トウモロコシ-デン
プン、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシンなど；打錠滑沢剤、例えば、ステア
リン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカなど；崩壊剤、例えば
、ジャガイモデンプンなど；あるいは、許容し得る湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウ
ムなどの従来型の賦形剤を含むことができる。これらの錠剤は、通常の医薬の実践におい
て周知の方法に従い、コーティングされてよい。経口液体調製品は、例えば、水性又は油
性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤又はエリキシル剤の形であることができるか、ある
いは使用前に水又は他の好適なビヒクルにより再構成される乾燥製品として提示されるこ
とができる。かかる液体調製品は、懸濁化剤、例えば、ソルビトール、メチルセルロース
、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は食用硬化油脂など；乳化剤、例えば、レシチ
ン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシアなど；非水性ビヒクル(これは食用油を含
むことができる)、例えば、アーモンド油、油性エステル、例えばグリセリン、プロピレ
ングリコール、又はエチルアルコール；保存剤、例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルも
しくはプロピル又はソルビン酸などの従来型の添加剤、並びに望ましいならば従来型の香
味剤又は着色剤を含むことができる。
【０１４９】
坐薬は、従来型の坐薬基剤、例えばココア-バター又は他のグリセリドを含むであろう
。
【０１５０】
非経口的投与に関して、液体単位剤形は、本化合物及び無菌のビヒクルを利用し調製さ
れ、水が好ましい。本化合物は、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸
濁されるか又は溶解されるかのいずれかであることができる。溶液の調製において、本化
合物は、注射用に、水中に溶解され、且つ好適なバイアル又はアンプルへの充填前にフィ
ルター滅菌され、且つ密封されることができる。
【０１５１】
有利なことに、局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤などの物質は、ビヒクル中に溶解するこ
とができる。安定性を増強するために、本組成物は、バイアルへの充填後に凍結され、且
つ水が真空下で除去されることができる。その後無水の凍結乾燥された散剤は、バイアル
中に密封され、且つ注射用水の附属するバイアルが、使用前に液体を再構築するために供
給され得る。非経口懸濁剤は、本化合物が、溶解される代わりに、ビヒクル中に懸濁され
、且つ滅菌は濾過により達成することができないこと以外は、実質的に同じ様式で調製さ
れる。本化合物は、無菌ビヒクル中に懸濁する前に、エチレンオキシドへの曝露により滅
菌することができる。有利なことに、界面活性剤又は湿潤剤は、本化合物の均一な分散を
促進するために、本組成物中に含まれる。
【０１５２】
本組成物は、投与方法に応じて、該活性物質を0.1重量％から、例えば、10〜60重量％
含有することができる。本組成物が用量単位を含む場合、各単位は、例えば該活性成分を
5〜1000mg含有するであろう。成人ヒト治療において使用されるような用量は、投与の経
路及び頻度に応じて、10〜3000mg/日の範囲であることができる。経口投与に関して、典
型的投与量は、50〜1500mg/日、例えば120〜1000mg/日の範囲であることができる。
【０１５３】
本発明の化合物の最適量及び個々の投薬の間隔は、治療される状態の性質及び程度、投
与の形態、経路及び部位、並びに治療される特定の哺乳動物により決定され、且つそのよ
うな最適条件は、従来の技術により決定され得ることは、当業者により、認められるであ
ろう。治療の最適コース、すなわち指定された日数にわたり、1日に与えられる本発明の
化合物の投与量の回数は、従来の治療コース決定試験を使用し、当業者により把握するこ
とができることも、当業者により理解されるであろう。
【０１５４】
本明細書に引用された特許及び特許出願を含むが、これらに限定されるものではない、
全ての刊行物は、各々の個別の刊行物が、まるで明記されたように引用により本明細書中
に組み込まれていることが具体的且つ個別に指摘されるように、引用により本明細書中に
組み込まれている。
【実施例】
【０１５５】
（実施例）
本発明は、以下に説明される実施例により例証される。
【０１５６】
以下の手順においては、各出発材料後に、型通りの「説明」又は「実施例」の言及が、
典型的には提供されている。これは、熟練化学者を単に支援するために提供される。出発
材料は、必ずしも言及されたバッチから調製されるものではない。
【０１５７】
言及が、当業者により理解されるように、「類似」手順を使用するためになされる場合
、かかる手順は、例えば、反応温度、試薬／溶媒量、反応時間、後処理条件又はクロマト
グラフィー精製条件などの小さい変動を伴ってよい。
【０１５８】
全ての溶媒及び試薬は、標準技術を用いて精製されたか、又は商業的供給業者(Sigma-A
ldrich社)から供給されたままで使用した。NMRスペクトルは、Bruker 500MHz装置上で、3
00Kで重水素化された溶媒を用いて、得た。1H NMRスペクトルの分裂パターンに関する表
記は、以下を含む：一重線(s)、二重線(d)、三重線(t)、ブロード(br)及び多重/重複ピー
ク(m)。シグナルは、ppmのδ値として示され、且つカップリング定数(J)は、ヘルツで示
される。質量スペクトルは、Micromass(登録商標)Q-Tof(ESI)分光計上で記録した。
【０１５９】
（一般的手順）
好適なケトン又はアルデヒドを、最終濃度0.5Mで、イソプロパノール中に溶解し、等モ
ル量のチオセミカルバジドの存在下で24時間還流した。対応するチオセミカルバゾンを、
濾過により単離し、温エタノールから再結晶させた。等モル量のチオセミカルバゾン及び
所望のハロケトンを、最終濃度0.2Mで、イソプロパノール中で、室温で一晩攪拌した。生
じた生成物を、温エタノールから数回再結晶させ、純粋な生成物を生じ、これを更に精製
することなく使用した。
【０１６０】
（化合物1  4-(4-シアノフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール(
レモデリン)）
【化１３】
2020059748.tif 000015
2-シクロペンチリデンヒドラジン-1-カルボチオアミド(これは前記スキーム2において
説明したように調製することができる)(1g, 4.46mmol)及び2-ブロモ-4’-シアノアセトフ
ェノン(これは前記スキーム1において説明したように調製することができる)(700mg, 4.4
5mmol)を、イソプロパノール12ml中で、室温で一晩攪拌した。この沈殿を濾過し、温エタ
ノールから再結晶させ、所望の化合物の臭化水素酸塩(559mg, 1.98mmol, 45％)を明黄色
針状物として生じた。これを、細胞アッセイにおいて使用するために、DMSO中に濃度10mg
/mLで再懸濁した。
【化１４】
2020059748.tif 000016
HRMS (m/z)：[M]+ C15H15N4Sの計算値、283.1009；実測値、283.1017。
【０１６１】
（化合物2  4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール塩
酸塩）
【化１５】
2020059748.tif 000017
チオセミカルバジド(20g, 220mmol)とシクロペンタノン(19.43ml, 220mmol)を、イソプ
ロパノール500ml中で24時間還流した。この沈殿を濾過し、温エタノールから再結晶させ
、対応するチオセミカルバゾン(2-シクロペンチリデンヒドラジン-1-カルボチオアミド)
を淡黄色結晶として提供した。2-シクロペンチリデンヒドラジン-1-カルボチオアミド(10
g, 63mmol)及び2,4’-ジクロロアセトフェノン(12g, 63mmol)を、イソプロパノール300ml
中で室温で一晩攪拌した。この沈殿を濾過し、温エタノールから再結晶させ、所望の化合
物の塩酸塩(16g, 48mmol, 77％)を明黄色針状物として生じた。これを、細胞アッセイに
おいて使用するために、DMSO中に濃度10mg/mLで再懸濁した。スペクトルデータは、先に
文献(F. Chimentiらの文献、(2009) J. Med. Chem. 52, 530)に説明されたものと一致し
た。
【０１６２】
（化合物3  4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シクロペンチリデン-1-(プロパ-2-イン-1-イル)
ヒドラジニル)チアゾール）
【化１６】
2020059748.tif 000018
新たに蒸留したDMF(75ml)中の化合物2(1g, 3mmol)の溶液へ、K2CO3(1.375g, 10mmol)、
トリエチルアミン(1.4ml, 10mmol)及び臭化プロパルギル(1.2ml, 5mmol, トルエン中80重
量％)を添加した。この溶液は、室温で12時間後に、紫色に変化した。臭化プロパルギル(
1.2ml)を添加し、この反応混合物を、更に12時間攪拌した。次にこの溶媒を減圧下で蒸発
させ、粗残渣をCH2Cl2中に溶解させ、NH4Cl及びNaClの飽和溶液で数回洗浄し、MgSO4上で
乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させ、通常のカラムクロマトグラフィー後に、所望の生成
物(0.35g, 1mmol, 34％)を、茶色油状物として得た。TLC(ヘキサン：CH2Cl2、80:20)：Rf
＝0.25；
【化１７】
2020059748.tif 000019
HRMS (m/z)：[M]+ C17H16ClN3Sの計算値、329.0758；実測値、329.0747。
【０１６３】
化合物4-12は、先に説明した化合物1-3に類似した様式で生成することができることは
理解されるであろう：
【表１】
2020059748.tif 000020
2020059748.tif 000021
2020059748.tif 000022
【０１６４】
（化合物13  4-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル
)チアゾール臭化水素酸塩）
【化１８】
2020059748.tif 000023
2-シクロペンチリデンヒドラジン-1-カルボチオアミド(3.0g, 18.7mmol)及び2-ブロモ-
4’-(トリフルオロメチル)アセトフェノン(5.0g, 18.7mmol)を、イソプロパノール(150mL
)中で、室温で24時間攪拌した。この沈殿を濾過し、温エタノールから3回再結晶させ、表
題化合物の臭化水素酸塩を、明黄色針状物(1.5g, 3.7mmol, 20％)として生じた。
【化１９】
2020059748.tif 000024
HRMS (m/z)：[M+H]+ C15H15F3N3Sの計算値、326.0933；実測値、326.0950。
【０１６５】
化合物14-21は、先に説明した化合物1-3及び13に類似した様式で生成することができる
ことは理解されるであろう：
【表２】
2020059748.tif 000025
2020059748.tif 000026
2020059748.tif 000027
【０１６６】
（実験データ）
（材料及び方法）
（細胞培養及びトランスフェクション）
U2OS及びSaOS-2骨肉腫細胞、HeLa子宮頸癌細胞、A431メラノーマ細胞、NCI-SNU5胃癌細
胞、MRC-5肺線維芽細胞及びウェルナー症候群患者由来のSV40線維芽細胞を、10％ウシ胎
仔血清(BioSera社)、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイ
シンを補充した、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich社)において増殖さ
せた。正常な皮膚の初代線維芽細胞GM03440並びにハッチンソン・ギルフォード早老症候
群(HGPS)皮膚の初代線維芽細胞AG11498及びAG06297は、Coriell Cell Repositories社か
ら購入し、且つ各々、継代数9〜12及び20〜23の間に使用した。細胞は、前述のように補
充したDMEMにおいて増殖させた。RPE-1レチナール色素上皮細胞は、前述のように補充し
且つ炭酸水素ナトリウムにより緩衝させ、DMEM及びHam F12混合培地において増殖させた
。HMV-IIメラノーマ細胞株、22RV1前立腺癌細胞、NCI-H82及びNCI-H69肺癌細胞、並びにN
CI-N87胃癌細胞株は、前述のように補充したRPMI-1640培地(Sigma-Aldrich社)において増
殖させた。安定してトランスフェクションされたU2OS細胞は、1mg/ml G418 (Invitrogen
社)を含有する標準培地において維持した。siRNA二本鎖は、Life Sciences社から入手し
た：ラミンA/CステルスRNAi：
【化２０】
2020059748.tif 000028
NAT10ステルスRNAi：
【化２１】
2020059748.tif 000029
並びに対照siRNAとしての、ステルスRNAi陰性対照二本鎖を使用した。プラスミドDNA及び
siRNAトランスフェクションは、各々、リポフェクタミン2000及びリポフェクタミンRNAiM
ax(Life Sciences社)を、製造業者の指示に従い使用し、実行した。細胞は、トランスフ
ェクション後48〜72時間で分析した。
【０１６７】
（薬物処理）
下記のKATインヒビター及びKDACインヒビターを、核形状レスキュースクリーニングに
おいて使用し、細胞を下記分子と共に16時間インキュベーションした：トリコスタチンA(
1μM)、酪酸ナトリウム(5mM)、ツバシン(10μM)、SAHA(5μM)、クルクミン(10μM)、ガル
シノール(50μM)、アナカルド酸(1μM)、MB-3(5μM)、4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シク
ロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール(化合物2)(50μM)、4-(4-クロロフェニル)-2-(2
-シクロペンチリデン-1-(プロパ-2-イン-1-イル)ヒドラジニル)チアゾール(化合物3)(50
μM)及びシクロペンチリデン-[4-(4-シアノフェニル)チアゾール-2-イル)ヒドラジン(化
合物1)(レモデリン)(10〜50μM)。HGPS細胞適応度アッセイに関しては、レモデリンを、3
日毎に培地を新しくしながら、1μMで1〜10日間インキュベーションした。長期間の老化
アッセイに関しては、細胞を、12集団倍加のために、1μMレモデリン又はDMSOのみを含有
する培地において、維持し継代した。老化は、レモデリン処理の8日後、細胞が集団倍加1
2となった時点で、その後レモデリン処理の7週間後、細胞が集団倍加24に到達した時点で
、Cell Signalling社の老化β-ガラクトシダーゼ染色キット#9860を用いて評価した。ノ
コダゾール、コルヒチン及びラトルンクリンA(Sigma-Aldrich社)は、各々、200ng/ml、1
μg/ml及び1μMで使用した。アフィディコリン(Sigma-Aldrich社)は、5μg/mlで16時間使
用した。ファルネシルトランスフェラーゼインヒビターFTI-277は、Tocris Bioscience社
から購入し、且つ5μMで使用した。ATMi(KU55933)及びATRi(ATR-45)は、各々、Tocris Bi
oscience社及びオハイオ州立大学から入手し、10μM及び500nMで使用した。ピフィスリン
アルファ(Sigma-Aldrich社)は、10μMで使用した。
【０１６８】
（GFP-H2B細胞のライブイメージング）
U2OS細胞を、(化合物2)の50μMの添加前に、siLMNAにより48時間トランスフェクション
した。写真は、100×UPlanSApo/1.40油浸対物レンズ(Olympus社)を装着し且つSoftWoRxソ
フトウェア(Applied Precision社)により制御されたDeltavision PersonalDV(Applied Pr
ecision社、512×512 CoolSNAP HQ2カメラ)により、0.2μm間隔のz-スタックで、16時間
にわたり15分毎に獲得した。次に動画を、写真からImageJソフトウェアにより構成した。
【０１６９】
（フローサイトメトリー）
EdU 10μMを、指定された時点で、2時間インキュベーションした。細胞を、4％パラホ
ルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)により固定した。Click-iT(登録商標)EdUフローサイト
メトリーアッセイキット(Life Sciences社)を用い、EdUを蛍光標識した。DNAを、0.1％Tr
iton-X-100及び0.5mg/ml DNase非含有RNase A(Sigma-Aldrich社)を含有するリン酸緩衝溶
液(PBS)中の、50mg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma-Aldrich社)により染色した。試料を、C
ellQuestソフトウェア(Becton Dickinson社)を装着したFACSCaliburフローサイトメータ
ー上で処理した。結果は、FlowJoソフトウェア(TreeStar社)を用いて解析した。
【０１７０】
（核真円度及び核面積の定量）
セルプロファイラーソフトウェアを使用し、DAPI染色写真から、「被写体サイズ形状」
測定を用い、核真円度及び核面積を定量した。AreaShape測定は、真円に対応する形状因
子(Form Factor)指数の計算(4×π×面積/外周2)(形状因子1は完全な円形を反映している
)、更には核面積の計算を可能にした。
【０１７１】
（増殖アッセイ）
HGPS細胞を、24ウェルディッシュに同数で播種した。翌日、レモデリン(1μM)又は小型
分子である化合物2(1〜10μM)を、これらのウェルに添加し、プレートをIncuCyte顕微鏡(
Essen BioScience社)に移した。位相差写真を、数日間にわたり2時間毎に獲得した。細胞
集密度の割合を、Cell Player統合ソフトウェア (Essen BioScience社)により計算し、且
つGraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアにより解析した。
【０１７２】
（ヒト細胞からのタンパク精製）
HEK293細胞を、NAT10構築体により一過性にトランスフェクションし、PBS中で48時間後
に収集した。細胞を、50U/mlベンゾナーゼ及びEDTA-非含有プロテアーゼインヒビターカ
クテル(Roche社)を新たに補充したIP溶解緩衝液(20mMトリス pH7.5、40mM NaCl、2mM MgC
l2、0.5％NP-40)中、室温で、5分間溶解した。この最初の溶解工程後、NaCl濃度を450mM
に調節し、試料を回転しながら4℃でインキュベーションした。溶解液を、遠心分離(13,2
00rpm、4℃で20分間)により清明化し、回収後、NaCl濃度を150mMと平衡とした。溶解液を
、プロテアーゼインヒビターを補充したIP緩衝液(25mMトリス(pH7.5)、150mM NaCl、1.5m
M DTT、10％グリセロール、0.5％NP-40)中での、免疫沈降反応のために使用した。標的タ
ンパク質を、タンパク質A/G-Dynabeads(Life Sciences社)にカップリングした抗-FLAG抗
体(M2、Sigma-Aldrich社)により捕獲した。複合体を、漸増量のNaCl(250mM、500mM、及び
1M)を含有するIP緩衝液により洗浄した。この後、この免疫複合体を、漸減量のNaCl(1M、
500mM、250mM、及び150mM)を含有するTBS中で洗浄した。この時点で、過剰なトリプル-Fl
agペプチド(Sigma Aldrich社)を使用し、溶離を実行した。溶離したタンパク質を、ゲル
上に装加し、この精製物を、銀染色(SilverQuestキット、Life Sciences社)により検証し
た。
【０１７３】
（可溶性又は重合されたチューブリンの分析）
5μMレモデリンで16時間又は10μMノコダゾールで8時間前処理したU2OS細胞を、MT安定
化緩衝液(MSB)(4μg/mlタキソールを含む85mM PIPES [pH6.9]、1mM EGTA、1mM MgCl2、2M
グリセロール、0.5％Triton)中に溶解した。溶解液を、4℃で2分間維持し、次に13,000rp
mで10分間遠心分離した。タンパク質の可溶性画分を示している上清を、新たなチューブ
に移し、Laemmli緩衝液を添加した。タンパク質の重合画分を示しているペレットを、Tri
tonを含まないMSB中で1回洗浄し、次にLaemmli緩衝液中に再懸濁した。等量の溶解液を、
勾配ゲルに装加した。
【０１７４】
(微小管再伸長アッセイ)
siRNAトランスフェクションの48時間後に、5〜10μMレモデリンにより16時間前処理し
た又は処理していない細胞中で、4℃で1時間の冷処理により、微小管を脱重合した。冷た
い培地を、予め温めた培地と置き換え、且つ細胞を37℃で5分間又は15分間インキュベー
ションし、各々、微小管の重合核形成(nucleation)及び固定化を可能にした。細胞を、PF
A中に固定し、免疫蛍光測定手順に記載されたように、抗α-チューブリン抗体により染色
した。
【０１７５】
(免疫ブロッティング)
全細胞抽出物を、SDS溶解緩衝液(4％SDS、20％グリセロール、及び120mMトリス-HCl(pH
6.8))中で細胞をスクレーピングし、95℃で5分間煮沸し、引き続き25-ゲージ針を通して1
0ストロークさせることにより、調製した。装加前に、溶解液を、0.01％ブロモフェノー
ルブルー及び200mM DTTの溶液により希釈し、95℃で5分間煮沸した。タンパク質を、4-12
％勾配ゲル(NUPAGE、Life Sciences社)上で、SDS-PAGEにより分離し、且つニトロセルロ
ースメンブレン(Protran；Whatman社)に転写した。IRDye発蛍光団に結合した二次抗体は
、LI-COR Biosciences社由来であった。検出及び定量は、撮像装置(Odyssey；LI-COR Bio
sciences社)により行った。
【０１７６】
(免疫蛍光測定)
細胞を、PBSにより洗浄し、PBS中の2％PFAにより20分間固定した。細胞を、PBS/0.2％T
riton X-100により5分間かけて透過性とし、5％BSAを含有するPBS/0.2％Tween 20(PBS-T)
によりブロッキングした。カバースリップを、一次抗体と共に1時間、Alexa Fluor 488又
は594発蛍光団(Life Technologies社)に結合させた好適な二次抗体と共に30分間インキュ
ベーションし、その後2μg/ml DAPIと共にインキュベーションした。写真は、FluoView 1
000共焦点顕微鏡(Olympus社)により取得した。高解像画像に関して、z-スタックを、両方
共100×UPlanSApo/1.40油浸対物レンズ(Olympus社)を装着し且つSoftWoRxソフトウェア(A
pplied Precision社)により制御された、Deltavision PersonalDV(Applied Precision社
、1024×1024 CoolSNAP HQ2カメラ、0.2μm間隔のz-スタック)によるか、又は通常モード
のDeltavision OMX V3(Applied Precision社、512×512 Cascade IIカメラ(Photometrics
社)、0.125μm間隔のz-スタック)により取得した。その後デコンボリューションを、Soft
WoRx(Applied Precision社)により保守的モード(conservative mode)で行った。異なるチ
ャンネルを、順次取得した。
【０１７７】
(クリック可能な分子の蛍光標識)
細胞を、クリック可能な分子である化合物3又は参照化合物A(1-クロロ-4-エチニルベン
ゼン、Sigma-Aldrich社から購入)と共に、2時間プレインキュベーションし、その後前述
のように固定し且つ透過性を高めた。クリック反応は、Invitrogen Click-iT試薬を、Ale
xa fluor 488アジドと共に用いて調製し、固定した細胞を暗所で1時間インキュベーショ
ンした。別のタンパク質と同時標識する場合は、クリック反応は、抗体インキュベーショ
ン前に行った。
【０１７８】
(抗体)
本試験において使用した抗体は、下記である：
【表３】
2020059748.tif 000030
【０１７９】
(ミクロコッカスヌクレアーゼ消化感受性アッセイ)
1×106個の細胞を、トリプシン処理し、収集し、且つ1×RSB緩衝液(10mMトリス、pH7.6
、15mM NaCl、及び1.5mM MgCl2)1mlにより1回洗浄した。遠心分離(3,00×g)後、細胞ペレ
ットを、1％Triton-X 100を含む1×RSB緩衝液1ml中に再懸濁し、緩く嵌合したガラス製の
ペストルを使った5ストロークによりホモジナイズし、核を放出した。核を、遠心分離(13
,000×g)により収集し、緩衝液A(15mMトリス、pH7.5、15mM NaCl、60mM KCl、0.34Mショ
糖、0.5mMスペルミジン、0.15mMスペルミン、0.25mM PMSF、及び0.1％β-メルカプトエタ
ノール)1mlにより2回洗浄した。核は、緩衝液A中に再懸濁し、100μlアリコートへと、ア
リコート化した。0.1M CaCl2の1.2μlを、各アリコートへ添加し、且つ核を、200U/ml MN
ase(Sigma-Aldrich社)の0.25μlの添加により消化し、且つ30℃でインキュベーションし
た。各アリコートを、異なる時点で氷上に戻し、3μl EDTAを添加することにより、消化
をただちに停止した。DNAを、Qiagen社PCR精製キットを用いて精製し、DNAの1500ngを、1
.5％アガロースゲル上で分析した。消化プロファイルを、ImageJを用いて解析し、DNA装
加変動を補正するために、値を各レーンの全強度に対して調節した。
【０１８０】
(リシンアセチルトランスフェラーゼ(KAT)アッセイ)
KATアッセイは、HEK293細胞から精製したNAT10及び精製したMAP濃厚化ブタチューブリ
ン(Tebu-bio)5μgを基質として使用する蛍光HATアッセイキット(Active Motif社)を用い
て行った。レモデリン及びクリック可能な分子2は、50μMで使用した。
【０１８１】
(円二色性(CD)分光法)
CD実験は、Chirascan円二色性分光計(Applied Photophysics社、英国)を用いて行った
。TBS 0.1％ NP-40(Sigma-Aldrich社)の最終濃度10μMの精製したFLAG-NAT10 200μlを、
光路長1mmの石英キュベット中に入れ、分光計に移した。CDスキャンは、波長範囲180nmか
ら350nmまで、1秒の反応時間、1nmピッチ及び1.5-nmバンド幅で、25℃において記録した
。DMSO中に溶解した化合物2を添加し、この溶液を5分間インキュベーションし、その後ス
キャンを記録した。CDスペクトルは、緩衝液を減算し、300nmでゼロ点補正し、基準化し
た(モル楕円率θは、105 deg・cm2/dmolで示される)。
【０１８２】
(DNA操作)
全てのDNA構築体は、DNA配列決定により、変異を含まないことが、バリデーションされ
た。この試験において使用したDNAオリゴヌクレオチドのリストは、以下に提示している
。pICE-FLAGは、アニーリングしたプライマーFLAG-S及びFLAG-ASのHindIII-及びBamHI-消
化したpICEへのクローニングにより、作製し、新規合成プラスミドは哺乳動物細胞に対す
るピューロマイシン-抵抗性をもたらした(Britton S, Coates J, Jackson SPの文献、J C
ell Biol. 2013)。NAT10 siRNAに抵抗性のあるNAT10 cDNAを作製するために、NAT10 cDNA
は、IMAGEクローン5166101(Source Bioscience社)から、プライマー対NAT10-FとNAT10-si
R-R、又はNAT10-siR-FとNAT10-Rを用いて増幅した。得られるPCR産物を、プライマーNAT1
0-F及びNAT10-Rを使用するPCRにより、一緒に融合した。得られるPCR産物を、BamHI及びM
luIにより消化し、同じ制限酵素で消化したpICE-FLAGへクローニングした。pICE-FLAG-NA
T10-G641Eを作製するために、G641E変異を、QuickChange部位特異的変異誘発キット(Agil
ent Technologies社)を、製造業者の指示に従い用い、且つプライマーNAT10-G641E-F及び
NAT10-G641E-Rを用いて、pICE-FLAg-NAT10へ導入した。
【０１８３】
表1：DNAオリゴヌクレオチドのリスト
【表４】
2020059748.tif 000031
【０１８４】
(タンパク質プルダウンアッセイのための小型分子)
ビオチン化された誘導体は、化合物3(「ビオチン化された化合物3」)から、市販のO-(2
-アミノエチル)-O’-(2-アジドエチル)ヘプタエチレングリコール及び(+)-ビオチンN-ヒ
ドロキシスクシンイミドを使用し合成した。化合物3の更なるビオチン化された誘導体(「
PEG4ビオチン化された化合物3」)及び対照の参照化合物A(「PEG4ビオチン化された化合物
A」)は、PEG4カルボキサミド-6-アジドヘキサニルビオチン(Life Sciences社)及び細胞抽
出物中のクリック試薬の添加により、インサイチュにおいて生成した。
【０１８５】
(ビオチン化された小型分子のプルダウン)
細胞は、PBS中に収集し、1mM PMSF及びプロテアーゼインヒビター(Roche社)を補充した
RIPA緩衝液中で、回転しながら4℃で30分間溶解した。上清を、16,000×gで10分間の遠心
分離により収集した。その後上清を、40μMのビオチン化された小型分子(ビオチン化され
た化合物3)と共に、又は競合実験に関しては200μMの(化合物2)及び40μMの(ビオチン化
された化合物3)と共に、2時間インキュベーションした。ストレプトアビジンでコートさ
れた磁気ビーズ(Dynabeads M-280ストレプトアビジン、Life Sciences社)を、結合緩衝液
(25mMトリス・HCl、150mM NaCl、0.1％ Triton)で3回洗浄し、且つ上清と共に、回転しな
がら4℃で1時間インキュベーションした。磁気ビーズを、結合緩衝液により、3回洗浄し
、引き続きLaemmli緩衝液中で5分間煮沸し、これらのタンパク質を溶離した。その後試料
を、4-12％勾配ゲル(NUPAGE、Life Sciences社)に装加し、銀染色(SilverQuest染色キッ
ト、Life Sciences社)により分析し、特異的バンドを切断し、LC-MS/MSにより分析した。
【０１８６】
【化２２】
2020059748.tif 000032
(クリック可能な小型分子プルダウン)
PEG4ビオチン化された化合物3を、化合物2、市販のO-(2-アミノエチル)-O’-(2-アジド
エチル)ヘプタエチレングリコール及び(+)-ビオチン N-ヒドロキシスクシンイミドから合
成し、その後細胞抽出物と共にインキュベーションした(プルダウン分析及び質量分析に
使用)。
【０１８７】
ビオチン化された化合物3及びPEG4ビオチン化された化合物Aは、化合物2及び化合物3か
らインサイチュで生成し、生存細胞中で2時間インキュベーションし、その後市販のPEG4
カルボキサミド-6-アジドヘキサニルビオチン及び細胞抽出物中のクリック試薬を添加し
た(クリックプルダウン及びウエスタンブロットバリデーションにおいて使用)。
【０１８８】
クリック反応試薬を、下記のような細胞溶解液に添加した：10μMビオチンアジド(PEG4
カルボキサミド-6-アジドヘキサニルビオチン、Life Sciences社)、10mMアスコルビン酸
ナトリウム(Sigma-Aldrich社)、2mM CuSO4(Life Sciences社)。クリック反応を、暗所に
おいて、回転しながら4℃で1時間インキュベーションした。その後ストレプトアビジンビ
ーズを、1時間インキュベーションし、試料を溶離し、前述のようにゲル上に装加し、そ
の後免疫ブロットした。
【０１８９】
（結果）
（実施例1：KATインヒビターによる核形状レスキュー）
ラミンタンパク質は、核構造を維持し且つクロマチンを核周縁で係留するためのスカフ
ォールドとして作用するので(J. Gotzmann、R. Foisnerの文献、(1999) Crit. Rev. Euka
ryot. Gene Expr. 9, 257)、低分子干渉RNA(siRNA)が媒介したラミンA/Cの欠乏(siLMNA)
は、様々なヒト細胞株において核形状欠損を引き起こす(図1A、B及び図2A、B)。とりわけ
、ラミンA/C欠乏はまた、増大されたミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)感受性及び増大
された核面積により観察されるように全体的クロマチン緩和に関連していることがわかっ
た(図1B、C)。従ってラミンA/C欠乏細胞におけるクロマチン再凝縮は、それらの核構造欠
損を若干改善し得ると判断される。リシンアセチルトランスフェラーゼ(KAT)及びリシン
デアセチラーゼ(KDAC)酵素は、ヒストン及び他のタンパク質のアセチル化状態を調節する
能力を有し、その結果全体的クロマチン組織化に影響を及ぼす。従って個々のKAT又はKDA
C酵素の活性を阻害することがわかっている様々な天然の及び合成の小型分子(「材料及び
方法」を参照)の作用を、siLMNA細胞のクロマチン凝縮及び核形状において評価した。こ
れは、KATインヒビターである4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジ
ニル)チアゾール(化合物2)(F. Chimentiらの文献、(2009) J. Med. Chem. 52, 530)(図1D
)を、ラミンA/C欠乏した様々な細胞株において核形状及び真円度を完全に回復するものと
して同定した(図1E、F及び図2A-D)。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるGCN5
ネットワークのインヒビターとして(F. Chimentiらの文献、(2009) J. Med. Chem. 52, 5
30)、古典的GCN5インヒビターMB-3として(M. Bielらの文献、(2004) Angew. Chem. Int. 
Ed. Engl. 43, 3974)最初に同定された小型分子の化合物2は、siLMNA細胞の核真円度を改
善しないが(図1F)、このことはこの小型分子依存性の核形状レスキューは、GCN5阻害とは
無関係であることを示唆している。分子化合物2はまた、減少したMNase感受性(図1G)、及
び減少した核面積(図1H)により認められるように、siLMNA細胞における全体的クロマチン
凝縮も改善した。GFP-タグ付きヒストンH2B(GFP-H2B)を発現している細胞を使用すること
により、siLMNA細胞における完全な核形状レスキューは、化合物2による処理時には12時
間以内に生じ、有糸分裂とは無関係であり(図1I及び図3)、並びに細胞周期プロファイル
への顕著な影響を伴わない(図1J及び図2E)ことが、ライブイメージングにより観察された
。更に、化合物2は、減少したラミンA/C発現を示しているいくつかの癌細胞株において核
形態を改善し(図2F、G)、このことはこの観察された作用は、siRNA-媒介したラミンA/C欠
乏に特異的ではないことを指摘している。
【０１９０】
（実施例2：化合物2の化学標識によるタンパク質標的の同定）
分子化合物2の推定される生物学的標的を同定し且つそれが核形態を改善する機序を解
明するために、薬物-会合したタンパク質複合体を検索し且つバリデートするための「ク
リック化学」による、該分子の細胞機能化に関与する分子-ベースの戦略を、確立した。
この目的のために、アルキン基を、化合物2のヒドラゾン部分に戦略的に導入し、これに
より化合物2と同等な細胞活性を示す(図4B)「クリック可能な」アナログである化合物3を
生成し(図4A)、並びに陰性対照として不活性のクリック可能な分子である参照化合物Aを
使用した(図4A、B)。アルキン部分は生物学的に不活性であるが、これは銅曝露時に、ア
ジド基を保有する任意の分子と選択的に反応することができ(V. V. Rostovtsevらの文献
、(2002) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596)、結果的に細胞内の小型分子のタグ付
けを可能にする(図4C)。第一の工程として、化合物3のビオチン化された誘導体が生成さ
れ(ビオチン化された化合物3)(図4D)、細胞抽出物と共にインキュベーションされた。そ
の後ビオチン化された化合物3に会合されたタンパク質は、ストレプトアビジンビーズに
より検索され、ゲル電気泳動により分離された(図4E)。競合実験の実行により、過剰な競
合相手の化合物2の存在下では、その染色強度が低下されたいくつかのタンパク質種が同
定された。次にそのような競合判定によりビオチン化された化合物3と選択的に相互作用
するタンパク質は、ゲルから切り出され、且つ質量分析(LC-MS/MS)により同定された。
【０１９１】
著しくは、N-アセチルトランスフェラーゼ10(NAT10)は、上記手順により同定された唯
一のKATタンパク質であり(表2参照)、従って化合物2の唯一の見込みのある関連標的であ
った。
【０１９２】
表2：アセチル-トランスフェラーゼタンパク質NAT10をプルダウンする化合物2のビオチン
アナログ。小型分子のビオチン化された化合物3により検索され且つ液体クロマトグラフ
ィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)により同定された特異的タンパク質のヒット。
【表５】
2020059748.tif 000033
2020059748.tif 000034
2020059748.tif 000035
2020059748.tif 000036
【０１９３】
化合物2の生物学的に関連のある標的としてのNAT10の能力を更に強調し、NAT10は、SUN
1核膜タンパク質に先に連結されていることが注目されおり(Y. H. Chiらの文献、(2007) 
J. Bio. Chem. 282, 27447)、その欠乏は、LMNA欠乏細胞において核形状をレスキューす
ること(C. Y. Chen らの文献、(2012) Cell 149, 565)、並びにNAT10のKAT活性は、微小
管及びヒストン基質に対し実証さていること(Shenらの文献、(2009) Exp. Cell Res. 315
, 1653)が、最近示された。NAT10と化合物2の間の相互作用をバリデートするために、細
胞を、クリック可能な生体活性アナログ化合物3又は非生体活性対照の参照化合物Aと共に
予めインキュベーションし、生存細胞中でのタンパク質標的へのそれらの結合を可能にし
た。次に、これらの分子を、ビオチン-含有リンカーの添加により機能化し、次にストレ
プトアビジンビーズを使用し、結合したタンパク質を検索した。この分析は、化合物3はN
AT10を特異的に検索したが、参照化合物Aは検索しなかった(図4F)ことを明らかにし、こ
れによりNAT10は、生存細胞の状況において化合物2の標的であることを確立し、且つこの
プロトコールは、光-架橋剤を使用せずに、特異的タンパク質パートナーを選択したこと
を示した(S. E. Ongらの文献、(2009) PNAS 106, 4617；X. Li、T. M. Kapoorの文献、(2
010) J. Am. Chem. Soc. 132, 2504)。並行した試験において、細胞を、化合物3又は参照
化合物Aにより処理し、固定し、次に化合物3を発蛍光団により機能化し(R. Rodriguezら
の文献、(2009) Nat. Chem. Biol. 8, 301)、高解像度顕微鏡によるそれらの細胞内分布
の可視化を可能にした(図4G)。重要なことは、細胞染色は、不活性対照の参照化合物Aに
ついてほとんど又は全く認められなかった(図5A)が、核小体内の化合物3の顕著な蓄積に
加え、核周縁での及び細胞質内の若干の染色が存在した(図4G及び図5A)。その上、標識し
た化合物3及びNAT10の染色の特筆すべき重複が認められ、更にこの親和性プルダウン試験
を裏付けた。これらの知見と一致して、NAT10のsiRNA-媒介した欠乏(図4G、下側パネル)
は、核小体の構造の変化を伴わずに、核小体内の分子化合物3の蓄積の顕著な減少に繋が
った(図4G)。まとめると、これらのデータは、NAT10は、細胞における化合物2の特異的標
的であることを確立した。
【０１９４】
化合物2とNAT10の間の相互作用は直接であるかどうかを評価するために、ヒトHEK293細
胞から精製したNAT10(図4H、左側パネル)を、化合物2により滴定し、NAT10高次構造を、
円二色性分光法によりモニタリングした(図4H、右側パネル)。化合物の非存在下で、NAT1
0スペクトルは、210nmに特徴的負シグナルを示し、これはα-ヘリックスの存在を反映し
ていた。化合物2の添加時に、絶対モル楕円率の明確な増加が、濃度-依存的様式で認めら
れ、先に説明された共有結合した分子内の留め金(stapling)を想起させるプロセスの、巨
大分子の留め金によるタンパク質の安定化(R. E. Moelleringらの文献、(2009) Nature 4
62, 182)と一致していた。これらのデータは、化合物2とNAT10の間の直接の物理的相互作
用を明らかにし、且つ該分子によるタンパク質フォールディングの安定化は、NAT10活性
を阻害し得ることを示唆した。本発明者らの分析の際に、化合物2は光又は空気への曝露
時に急速に分解されたことがわかった。これのために及びより強力な分子を同定すること
を試みて、変動する投与量でLMNA欠乏細胞の核形態をレスキューする化合物2の構造的変
種の能力を調べた。これは、中心のチアゾールヒドラゾンコアは核形状レスキューに必要
である一方、シクロペンタン環は劇的に変更されることができるのに対し、わずかな芳香
環修飾のみが容認されたことを明らかにした(図6A)。従ってこれらの試験は、パラ位置に
シアノ官能基を含有する化合物1(図4I)を、このシリーズの最も強力且つ安定したアナロ
グとして同定し、これは化合物2と比べ5倍の効力の向上を伴った(図6B)。このアナログは
、siLMNA細胞の核構造をリモデリングするその能力を基に、「レモデリン」と命名し、且
つ下記の実験において使用した。
【０１９５】
（実施例3：NAT10阻害は核形状レスキューを媒介する）
前記試験は、レモデリン及び関連化合物は、NAT10標的化により、ラミンA/C欠乏細胞の
核形状を逆行することを示唆している。この考えを調べるために、NAT10及びラミンA/Cを
、ヒトU2OS細胞において同時欠乏した(図7A)。著しくは、これは、レモデリンにより認め
られた作用と同等に、NAT10欠乏は、ラミンA/C欠乏により引き起こされた核形態欠損を完
全にレスキューしたことを明らかにした(図7B；類似の作用が、RPE-1細胞及びHeLa細胞に
おいて認められた)。レモデリンのアナログである分子化合物2は、KATインヒビターとし
て発見されたので、NAT10アセチルトランスフェラーゼ活性は、レモデリンにより変更さ
れるかどうか、及びラミンA/C欠乏細胞における核形状レスキューに関与したかどうかを
評価した。この目的のために、ヒトNAT10の10から917の領域の3D-モデルを、その高度に
保存された細菌のホモログであるTmcA構造(Chimnaronkらの文献、(2009) Embo. J. 28, 1
362)から、Phyre2オンラインサーバー(L. A. Kelley、M. J. Sternbergの文献、(2009) N
at. Protoc. 4, 363)を用いて、作製した(図7C、D)。次にアセチル-CoA結合の部位を、こ
のモデルの、Ac-CoAとの複合体中の当初のTmcA構造との並置により予測した(図7D)。次に
保存されたGly 641を、Gluへ変異させ(G641E)(図8A)、これはNAT10アセチルトランスフェ
ラーゼ活性をブロックすることが予測された(図7D、右側)。実際、ヒトHEK293細胞から発
現され且つ精製されたNAT10タンパク質の野生型(WT)及びG641E変異体(MUT)による生化学
アッセイ(図8B)は、G641E変異は、NAT10 KAT活性を無効にしたことを示した(図7E)。その
上、これらの反応におけるレモデリン又はクリック可能な生体活性化合物3の包含は、NAT
10 WT KAT活性を無効にし、これはレモデリンはNAT10インヒビターであることを明らかに
した。
【０１９６】
核形状の制御におけるNAT10 KAT活性の機能を調べるために、siRNA-抵抗性NAT10のWT又
はG641E構築体を発現している安定した細胞株を、作製した。両方のタンパク質の正確な
発現及び細胞内局在を考慮して(図8C、D)、ラミンA/C及び内因性NAT10タンパク質を、共
欠乏し、且つ核形状の形態を研究した。著しくは、ラミンA/C欠乏は、NAT10 WTを発現し
ている細胞における核真円度を損なったが、これは、触媒的に不活性化されたNAT10 MUT
を発現している細胞の場合とは異なった(図7F)。まとめると、これらのデータは、変異又
はレモデリン作用によるNAT10 KAT活性の失活は、siLMNA細胞の正常な核形態を回復する
ことが、これにより確立された。
【０１９７】
（実施例4：レモデリンは、NAT10を標的化し、HGPS細胞の適応度を改善する）
レモデリンは、ラミンA/C欠乏細胞の核形状欠損をレスキューするということがわかっ
たので、LMNA変異された細胞の核形状に対するその作用を、ヘテロ接合性ドミナント点変
異LMNA c.1824C>T, p.G608Gを有する、HGPS患者由来の2種の初代線維芽細胞株(AG11498及
びAG06267)を使用することにより、調べた。この変異のために、HGPS細胞は、プロジェリ
ンと称される、ラミンAの永久にファルネシル化された切断型を発現し、これは細胞継代
数と共に、核の周縁に蓄積する。これは、核膜のフォールディング及び核小疱形成に繋が
り(図9A)、且つ少なくとも一部はHGPS患者の早期老化表現型の一因となる(K. Caoらの文
献、(2011) J. Clin. Invest. 121, 2833)。とりわけ、レモデリンは、変形された核を伴
うHGPS細胞の数を有意に減少し(図9A、B)、同じく長い継代時に変形され始め且つプロジ
ェリンを蓄積する培養物中の加齢された初代MRC5線維芽細胞に対してもこの作用を有した
(図10A、B)(P. Scaffidi、T. Misteliの文献、(2006) Science 312, 1059)。対照的に、
レモデリンは、非-ラミノパシーのウェルナー症候群細胞の変形された核に対して、検出
可能な作用を有さず、このことは核形状レスキューは、ラミン-関連した欠損に特異的で
あることを指摘している(図10C、D)。
【０１９８】
ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター(FTI)は、HGPS細胞において、核膜での
ファルネシル化されたプロジェリンの毒性蓄積を防止するために使用されている。実際、
非-ファルネシル化プロジェリンは、核外膜から脱離して再局在化され、結果的に、核小
疱形成が減少される(B. C. Capellらの文献、(2005) PNAS 102, 12879)。レモデリンは、
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害に繋がるかどうかを決定するために、ラミンAプロ
セシングを、ウエスタンブロットにより試験した(図11A)。重要なことに、これは、プレ-
ラミンA中間体の蓄積を引き起こすFTIとは異なり、レモデリンは、プレ-ラミンAの切断及
び変異をブロックしないことを明らかにした。これは、レモデリンはファルネシルトラン
スフェラーゼ活性を阻害しないことを指摘した一方で、レモデリン及びFTIは、核形状改
善に対し相乗的に作用しなかったことがわかり、このことはこれらは共通経路に影響を及
ぼすことを示唆した(図11B、C)。重大なことに、レモデリンについて観察されたものとは
異なり、FTIは、その提唱された作用様式に従い、LMNA-欠乏した細胞において核形態を改
善しない。更に、FTIは、HGPS細胞の核形状は改善するが、恐らく中心体分離の欠損によ
るプロセシングされないラミンA及びBの一緒の蓄積及び不適切な局在に繋がるFTI処理を
通じて(V. L. Verstraetenらの文献、(2011) PNAS 108, 4997；M. W. Glynn、T. W. Glov
erの文献、(2005) Hum. Mol. Genet. 14, 2959；Y. Wangらの文献、(2012) Nucleus 3, 4
52)、プロジェリンを発現しない正常細胞に対し、これは反対の作用を有する(図11B、C)
。対照的に、レモデリンは、正常ヒト線維芽細胞において核形状欠損を誘導せず；且つ実
際に、かかる線維芽細胞におけるFTI-誘導した核形状欠損を防止した(図11B-D)。極めて
重要なことに、変形された核の数の同等の減少が、レモデリン処理時又はNAT10欠乏時のH
GPS細胞において認められ(図9C及び図12A)、これは-siLMNA細胞の場合のように-レモデリ
ンによるNAT10阻害は、HGPS細胞における核形状の改善に寄与するという結論に我々を導
く。
【０１９９】
核形状改善は、HGPS細胞表現型の全体の改善に常には関連しないが(M. X. Ibrahimらの
文献、(2013) Science 340, 1330)、本発明者らは、γH2AXの減少した定常状態レベル及
び自己リン酸化ATM(修復されないDNA二本鎖切断のマーカー)及び減少したDNA損傷シグナ
ル伝達(図9D及び図12B、C、F)、H3K9me3及びNAT10染色により評価されるような改善され
たクロマチン及び核小体の組織化、並びに核外膜での減少したSUN1蓄積(図12G-I)により
認められるように、レモデリンは全体的HGPS-細胞適応度を改善したことを発見した。レ
モデリンは、siLMNA細胞中のSUN1の発現及び局在化に検出できるように影響を及ぼさない
ということは、レモデリンによる核形状レスキューの機序は、SUN1欠乏時に認められたも
の(C. Y. Chenらの文献、(2012) Cell 149, 565)とは異なることを暗示している。興味深
いことに、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー(EDMD)患者由来の細胞もまた、レモ
デリン処理時にγH2AXの減少したレベルを示し(図12D、E)、このことはレモデリンが他の
型のラミノパシーに対し広範な適用を有し得ることを示唆している。アピカル側DNA-損傷
応答キナーゼATM及びATRによるシグナル伝達のブロックもまた、γH2AXを減少する(図9E
、F)。しかし、レモデリン-これはまた、DNA複製を改善し(図12J)、細胞増殖能を増強し(
図9G)、且つ老化を減少した(図9H、I；このことは、他のKATインヒビターは老化を減少し
なかった図12Kから注目されるべきである)-とは異なり、ATM及びATRの阻害は、増殖を減
少し且つ老化を誘導した(図9G、H)。図12Kに示されるように、類似の作用が、p53-経路阻
害時に認められた。従ってこれらのデータは、レモデリンは、HGPS細胞におけるDNA損傷
の量を減少するが、ATM/ATR阻害時には、損傷は依然存在するが、最早適切にシグナリン
グされず、このことは細胞成長停止及び老化に繋がるという見解を、裏付けている。加え
てレモデリンは、NAT10局在を変更することなく(図12I)、DAPI染色強度により認められる
ように(図12G)HGPS細胞クロマチン凝縮、並びに核小体の組織化を改善した。重要なこと
に、増大したDNA複製(図12J)、増強された細胞増殖能(図9G)及び減少した老化細胞の割合
(図9H)により認められるように、これらのレモデリンの作用は、HGPS細胞の適応度を全体
的に増加したことに関連している。その可能性のある長期恩恵を強調し、レモデリンは、
数週間の処置後であっても、HGPS細胞の老化を防止する(図9I)ことがわかった。
【０２００】
（実施例5：NAT10阻害は、微小管を再組織化し、核形状を回復する）
NAT10は主に、その役割が全体的核組織化を維持することである核の区画である、核小
体中に局在化し、並びに核形状は、核小体タンパク質ヌクレオホスミン(NPM1)、フィブリ
ラリン又はSENP5の欠乏が核形状の変化に繋がることを示す試験により明らかにされてい
る(M. A. Aminらの文献、(2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 320；A. Di Bac
coらの文献、(2006) Mol. Cell Biol. 26, 4489；M. A. Aminらの文献、(2008) Biochem.
J. 415, 345)。NPM1の場合、これは微小管安定性の変化を通じて生じることが確立され
ており(G. Wangらの文献、(2010) J. Biol. Chem. 285, 19060)、これは次に細胞骨格と
核外膜の間の連結を介して核に影響を及ぼす。このために及びチューブリンは公知のNAT1
0基質であるので、細胞の微小管ネットワークを、免疫蛍光測定により試験し、且つレモ
デリン処理時の特筆すべき再組織化が観察された。更に、細胞相補性(cell complementat
ion)システムを使用することにより、同等な微小管再組織化は、NAT10欠乏によるか又はN
AT10触媒ドメインの変異による失活により引き金をひかれることが確立された(図13A)。
微小管再組織化とレモデリン処理又はNAT10阻害による核形状レスキューの間に機能的連
結が存在していることに従い、微小管を不安定化する薬物であるノコダゾール及びコルヒ
チンもまた、siLMNA細胞(図13B)及びHGPS細胞(図14A)の核形状欠損をレスキューしたのに
対し、アクチン重合のインヒビターであるラトルクリンAは、核の歪みを増大した(図13B)
。これによりこれらの結果は、アクチン骨格ではなく微小管の再組織化は、ラミンA/C欠
乏の状況において、核形状をレスキューすることができることを指摘した。重要なことに
、レモデリンの作用は、ゴルジ装置断片化又はチューブリン脱重合には結びつけられない
ことが確立され、その理由は、レモデリンは、ノコダゾール又はコルヒチンとは対照的に
、ゴルジ装置の完全性(図13C)又はチューブリンの重合体への集成(図13D)には影響を及ぼ
さないからである。これらの違いは、ノコダゾール又はコルヒチン曝露に対する反応の状
況とは異なり、レモデリン処理時には、細胞は有糸分裂で蓄積しないことの理由の説明を
助けている。
【０２０１】
どのようにNAT10は微小管組織化を修飾するかの洞察を得るために、微小管動態を、低
温-誘導した脱重合及び温培地への放出後の再伸長アッセイを行うことにより、分析した
。最初の微小管再伸長(核形成相)は、siLMNA細胞(図13E、t＝5分間)及びHGPS細胞(図14B)
におけるNAT10阻害後には正常にみえたが、微小管の中心体への固定化は、siLMNA細胞(図
13E)及びHGPS細胞(図14B)の両方においてレモデリン処理により、又はNAT10 G641E変異に
より(図13E、t＝15分間)、明らかに影響を受け、このことはNAT10 KAT活性は、微小管固
定化を促進することを示している。このことに従い、核形状レスキューは、微小管固定化
に関与しているPCM-1タンパク質の欠乏時に、siLMNA細胞において認められた(A. Dammerm
ann、A. Merdesの文献、(2002) J. Cell Biol. 159, 255)。微小管は核外膜の変形(defor
mation)に寄与する核に対する外力を発揮するので(M. C. Kingらの文献、(2008) Cell 13
4, 427)、従ってこれらの結果は、ラミノパシー細胞におけるNAT10 KAT活性の阻害は、微
小管固定化を減少し、これにより核外膜上に外力を放出し、且つ核形状レスキュー及び細
胞適応度の全体的増大に寄与する(図13F)というモデルを裏付けている。このモデルは、
基質の強固さの修飾による核に対する微小管力の放出は、ラミノパシー細胞の核形状を正
常化することを示唆する先行する研究(C. Tamielloらの文献、(2013) Nucleus 4, 61)と
一致し、且つレモデリンが、他の微小管再組織化する薬剤のように(N. Suzukiらの文献、
(1998) PNAS 95, 10499)、非早老症細胞におけるFTI-誘導した核形状欠損を補正する(図1
1)理由の説明を助ける。
【０２０２】
（実施例6：核形状レスキューのための構造必須要件の分析）
ラミンA/Cは、U2OS細胞においてsiRNAにより欠乏し(siLMNA)、変形された核を誘導する
。次に細胞を、化合物2の様々なアナログにより16時間処理し、核形状レスキューを、DAP
I染色により分析した。これらの結果は、図18及び図19に示し、これらは、試験した分子
の構造及びそれらの核形状をレスキューする能力を示している。
【０２０３】
（実施例7：化合物2は投与量-依存的様式でA431メラノーマ細胞株の成長を阻害する）
低レベルのラミンAタンパク質を発現しているA431細胞(図2参照)を、低密度で播種し、
指定された濃度の化合物2により処理した。細胞増殖を、IncuCyte ZOOM(登録商標)を用い
、自動的に経時的にモニタリングした。結果を、図20に示している。この増殖アッセイは
、A431細胞増殖は、投与量-依存的様式で阻害されることを示している。レモデリン濃度1
0μMは、これらの細胞の増殖を約50％だけ低下するのに十分であるのに対し、高レベルの
ラミンA/Cを発現している細胞は、最大50μMのレモデリンによっても影響されなかった(
図15参照)。
【０２０４】
（実施例8：ラミンA/CノックアウトU2OS細胞は野生型細胞よりも化合物2及びアナログに
対しより感受性がある）
LMNAノックアウト(KO)U2OS細胞株は、CripR/Cas9技術を用いて遺伝子操作した。LMNA K
O細胞の化合物2に対する感受性を、野生型LMNAを発現している細胞(LMNA WT)と比較した
。細胞増殖は、IncuCyte ZOOM(登録商標)を用い、自動的に経時的にモニタリングした。
結果は、図21に示しており、これは曲線の読み取りをより容易にするために、2つのグラ
フに分けている。上側パネルは、化合物2の、LMNA KO細胞の細胞増殖の阻害に対する特異
性を示している。下側パネルは、LMNA KO細胞増殖阻害に対する化合物2と比べ化合物13の
増大した効能を示している。
【０２０５】
（実施例9：化合物2は、LMNA KO細胞において全体的タンパク質翻訳特異性を阻害する）
野生型又はKO LMNAを発現しているU2OS細胞を、化合物2により24時間処理し、クリック
可能なメチオニンアナログHPGと共に1時間インキュベーションし、全体的タンパク質翻訳
を測定した。次にHPGを、Alexa fluor 488によりクリックし、10000個の細胞において全
体的蛍光強度を、FACSにより定量した。図22のグラフは、LMNA KO細胞においては化合物2
添加時に全体的タンパク質翻訳が強力に低下されるが、しかしLMNA WT細胞では低下され
ないことを示し、これは先の図面で観察された細胞増殖阻害の差異を説明することができ
る。
【０２０６】
（実施例10：NAT10の欠乏は、化合物2による処理に類似した増殖、遊走及び浸潤の阻害に
つながる）
NAT10を、U2OS細胞においてsiRNAにより欠乏させ(siNAT10)、次に細胞を、化合物2によ
り16時間処理し、その後遊走／浸潤アッセイのためにマトリゲル上に播種した。並行して
、同じプレート由来の細胞を、細胞増殖を評価するために、別に播種した。結果は、図23
に示し、且つ未処理の対照細胞(siCT)と比較した細胞数の割合として提示した。これらの
グラフは、NAT10の化合物2による阻害又はNAT10のsiRNAによる欠乏は、細胞の増殖、遊走
及び浸潤の同様の減少に繋がることを示している。
【０２０７】
（実施例11：化合物2のインビボ毒性及びインビトロ特異性の評価）
化合物2を、マウスに、指定された1日量で、14日間経口投与し、且つ結果を図24に示し
た。図24の左側パネル：体重の変化は、本化合物は、経口で、最大で400mg/kg/日の高投
与量まで、忍容性が良好であり、有意な体重の減少を伴わないことを示す。図24の右側パ
ネル：14日間処置の終了時の、指定された投与量で処置したマウスの心臓及び筋肉中の化
合物2の濃度の測定。このグラフは、心臓及び筋肉中の両方の非常に高濃度の本化合物を
示し、これは経時的な化合物蓄積を示唆している。
【０２０８】
図24の下側パネルは、化合物2は、インビトロにおける主要なリシンアセチルトランス
フェラーゼタンパク質(KAT)のそれらのヒストン基質に対する活性を阻害しないことを示
し、これはNAT10阻害に対する高い特異性、結果的にインビボにおける潜在的に低い毒性
を示唆している。
【０２０９】
（実施例12：化合物2処理のハッチンソン・ギルフォード早老症候群のマウスモデルに対
する作用）
図25の左側パネル：両遺伝子座上にG609G変異を保有するように遺伝子操作したHGPSマ
ウスモデルは、野生型マウスと比較して、より小さいサイズで背中の弯曲を示した。図25
の中央パネル：HGPSマウスは、3週齢から、20％を超える体重減少のために処分されるま
で、化合物2の毎日の経口投与量100mg/kg/日で処置した。化合物2による数日間の処置後
、マウスは、標的の関与(engagement)を反映している毛の灰色化を示した。図25の右側パ
ネル：ベクターのみで処理した(LmnaG609G/G609G V)又は化合物2により処置した(LmnaG60
9G/G609G 2)HGPSマウス(LmnaG609G/G609G)の全体的生存であり、これは化合物2処置時の
マウスの生存中央値の有意な増加(＋25％)を示している。マウス数／群n＝10。
【０２１０】
（実施例13：インビボにおける化合物2の分子作用）
化合物2で処理した野生型マウス又はLmnaG609G/G609Gマウスから組織を収集し、且つタ
ンパク質を抽出し、ウエスタンブロット上に装加し、これを図26に示した。LmnaG609G/G6
09Gマウスは、プロジェリン発現(主に肺組織において容易に検出可能)を実際に示し、そ
れらの遺伝子型を確認した。DNA損傷は、Licor Odysseyイメージングシステムを用いて定
量したDNA2本鎖切断マーカーγH2AXにより評価した。総H2AXと比べたγH2AXの相対量を、
ウエスタンブロットの下側に示し、これは未処置のマウスと比べ、化合物2で処置したLmn
aG609G/G609Gマウス由来の組織における、心臓及び肺の両方におけるDNA損傷の明らかな
減少を示している。肝臓抽出物における作用は、認められず、このことは化合物2は、肝
臓には蓄積しないことを示唆している。
【０２１１】
（実施例14：NAT10阻害に関する可能性のあるバイオマーカーとしてのアセチルチューブ
リンの評価）
チューブリンはNAT10の直接基質であるので、HGPS患者由来の細胞におけるチューブリ
ンアセチル化レベル(図27の左側及び下側パネル)に加え、LmnaG609G/G609Gマウスにおけ
るレベル(図27の右側パネル)を、評価した。チューブリンアセチル化は、患者細胞及びLm
naG609G/G609Gマウスの両方においてより高いように見え、このことはNAT10は、より高度
に活性化され得ることを示唆している。化合物2によるLmnaG609G/G609Gマウスの処置は、
チューブリンアセチル化レベルの減少に繋がり(図27の右側パネル)、このことはこのアセ
チル化マークは、インビボにおけるNAT10阻害の良好なバイオマーカーであることができ
ることを示唆している。
【０２１２】
（実施例15：遺伝子バリデーションのためのLmnaG609G/G609G/NAT10+/-マウスの遺伝子操
作）
図28の上左側パネル：肺タンパク質抽出物中のNAT10発現レベルの評価は、WT又はLmnaG
609G/G609Gと比べ、NAT10+/-マウスにおけるNAT10発現の約50％の低下(図28の上右側パネ
ル)を示している。図28の下側パネル：指定されたマウス遺伝子型の体重は、LmnaG609G/G
609Gマウスと比べ、LmnaG609G/G609G/NAT10+/-マウスにおける体重の強力な増大を示し、
このことはNAT10の50％低下は、LmnaG609G/G609G HGPSマウスの表現型のレスキューに十
分、少なくとも部分的に十分であることを示唆している。
【０２１３】
（実施例16：マイクロアレイ分析は、化合物2のHGPS細胞における遺伝子発現調節への特
異性を示す）
正常線維芽細胞又はHGPS線維芽細胞を、1μMの化合物2の長期間処理による、12集団倍
加の間、培養物中で維持するか(図29の上側パネル)、又はNAT10に対するsiRNAにより3日
間トランスフェクションした(図29の下側パネル)。RNAを抽出し、且つ全体的遺伝子発現
を、マイクロアレイにより分析した。ボルケーノプロットは、化合物2のHGPS細胞の遺伝
子発現調節に対する、非常に高い特異性を示し、約1000個の遺伝子が2倍以上影響を受け
たのに対し、正常線維芽細胞においては、わずかに24遺伝子が影響を受けた。ベン図(図2
9のパネル2)は、正常線維芽細胞と比べHGPSにおいて誤調節された遺伝子の約半分が、化
合物2処理によりレスキューされたことを示している。図29の下側パネル：ボルケーノプ
ロット及びベン図は、NAT10欠乏(NAT10欠乏の効力について下記WBを参照)は、正常線維芽
細胞と比べ、HGPS細胞における約2倍より多い遺伝子の発現の変化に繋がることを示して
いる。HGPS細胞においてNAT10欠乏により影響された遺伝子の約30％も同じく、長期間の
化合物2処理により影響を受け、このことはこれらがNAT10アセチル-トランスフェラーゼ
活性により調節された遺伝子であることを示唆している。
【０２１４】
結論として、本発明者らは、小型分子レモデリンを、早老症細胞及びラミンA/C欠乏細
胞の両方の核形状及び適応度を改善する新規薬剤として同定し且つ特徴付けている。本発
明者らの知る限りでは、レモデリンは、HGPS細胞におけるγH2AXの定常状態レベルも低下
する最初の分子であり、これはそれらの早期老化の表現型に寄与すると考えられる。重要
なことに、偏りのないインビボ及びインビトロクリック化学ベースのアプローチを使用す
ることにより、NAT10は、微小管ネットワークの再組織化により、核形態のレスキューに
係わるレモデリンの細胞標的として同定された。従ってNAT10の「小型分子インヒビター
」は、有益な空間的及び時間的解明によりラミノパシーに関連したプロセスを研究する新
たな機会を提供し(T. U. Mayerらの文献、(1999) Science 286, 971)、且つジストロフィ
ー疾患及び早期老化障害を軽減するための薬物の新規クラスをやがて生じるであろう。
【０２１５】
本明細書及び以下の請求の範囲を通して、別に文脈が必要としない限りは、語句「含む
(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」などの変形
は、言及された整数、工程、整数群又は工程群の包含を暗示するが、いずれか他の整数、
工程、整数群又は工程群の排除を暗示するものではないことは理解されるであろう。
【０２１６】
本記載及び請求の範囲が一部を形成する本出願は、任意の後願に関する優先権の基礎と
して使用され得る。かかる後願の請求の範囲は、本明細書記載のいずれかの特徴又は特徴
の組合せに関することができる。これらは、製品、組成物、方法、又は用途請求の範囲の
形状をとることができ、且つ下記の請求の範囲を、限定ではなく例証のために含むことが
できる。
【図１】
2020059748.tif 000042
【図２】
2020059748.tif 000043
【図３】
2020059748.tif 000044
【図４】
2020059748.tif 000045
【図５】
2020059748.tif 000046
【図６】
2020059748.tif 000047
【図７】
2020059748.tif 000048
【図８】
2020059748.tif 000049
【図９】
2020059748.tif 000050
【図１０】
2020059748.tif 000051
【図１１】
2020059748.tif 000052
【図１２】
2020059748.tif 000053
【図１３】
2020059748.tif 000054
【図１４】
2020059748.tif 000055
【図１５】
2020059748.tif 000056
【図１６】
2020059748.tif 000057
【図１７】
2020059748.tif 000058
【図１８】
2020059748.tif 000059
【図１９】
2020059748.tif 000060
【図２０】
2020059748.tif 000061
【図２１】
2020059748.tif 000062
【図２２】
2020059748.tif 000063
【図２３】
2020059748.tif 000064
【図２４】
2020059748.tif 000065
【図２５】
2020059748.tif 000066
【図２６】
2020059748.tif 000067
【図２７】
2020059748.tif 000068
【図２８】
2020059748.tif 000069
【図２９】
2020059748.tif 000070
【配列表】
2020059748000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化合物3、化合物8、化合物11、化合物13〜17、及び化合物19〜21から選択される化合物：
4-(4-クロロフェニル)-2-(2-シクロペンチリデン-1-(プロパ-2-イン-1-イル)ヒドラジニル)チアゾール
【化１】
2020059748.tif 000071
3-(2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール-4-イル)ベンゾニトリル
【化２】
2020059748.tif 000072
3-(2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール-4-イル)安息香酸
【化３】
2020059748.tif 000073
4-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール臭化水素酸塩
【化４】
2020059748.tif 000074
2020059748.tif 000075
2020059748.tif 000076
。
【請求項２】
4-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-(2-シクロペンチリデンヒドラジニル)チアゾール臭化水素酸塩である、請求項１記載の化合物：
【化５】
2020059748.tif 000077
。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項４】
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化、又は低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌の治療又は予防における使用のための請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ラミノパシーが、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)；非定型ウェルナー症候群；バラケ・シモンズ症候群；ブシュケ・オレンドルフ症候群；心筋症；シャルコー・マリー・トゥース病；エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー(X-連鎖性、常染色体優性型又は常染色体劣性型)；Dunnigan型の家族性部分型脂肪萎縮症(FPLD)；グリーンバーグ異形成症；脱髄性成人発症型常染色体優性遺伝白質ジストロフィー(ADLD)；肢帯型筋ジストロフィー1B型(LGMD1B)；糖尿病、脂肪肝、肥大型心筋症、及び白斑黒皮腫性丘疹を随伴する脂肪萎縮症(LDHCP)；A型脂肪萎縮症を伴う下顎末端異形成(MADA)；B型脂肪萎縮症を伴う下顎末端異形成(MADB)；ペルゲル・フェット核異常 (PHA)；ペリツェウス・メルツバッハー病又は拘束性皮膚障害(RD)から選択される、請求項４記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記ラミノパシーが、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー又は非定型ウェルナー症候群から選択される、請求項５記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物が、１種以上の医薬として許容し得る賦形剤を追加的に含む、請求項４〜６のいずれか一項記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物が、１種以上の更なる活性成分を追加的に含む、請求項４〜７のいずれか一項記載の使用のための医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
本記載及び請求の範囲が一部を形成する本出願は、任意の後願に関する優先権の基礎と
して使用され得る。かかる後願の請求の範囲は、本明細書記載のいずれかの特徴又は特徴
の組合せに関することができる。これらは、製品、組成物、方法、又は用途請求の範囲の
形状をとることができ、且つ下記の請求の範囲を、限定ではなく例証のために含むことが
できる。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のための、式(I)の化合物、又はその医薬として
許容し得る塩もしくは溶媒和物：
（化１）
2020059748.tif 000078
（式中：
W、Y及びZの各々は、CHを表すか、あるいはW、Y及びZの一つは、窒素を表し、且つ他の
2つの基は、CHを表し；
環Aは、下記： 
（化２）
2020059748.tif 000079
を表し；
Xは、S、O又はNRaを表し；
Raは、水素、ヒドロキシル、=O、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハ
ロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ又はハロC1-6アルコキシを表し；
R5は、水素、ヒドロキシル、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲ
ン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、COH、COOH、COOC1-6アル
キル、シアノ、NH2又はNO2を表し；
nは、0〜5から選択された整数を表し；
各R1は、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキ
ル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6
アルキル、NH2又はNO2を、独立して表し；
R2は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル又はC2-6アルキニルを表し；
R3は、水素又は-N=R4基のいずれかから選択され、但し環Aが式(i)又は(iii)を表す場合
は、R3は-N=R4を表し、並びに環Aが式(ii)を表す場合は、R3は水素を表すこととし；
R4は、-C(R4a)(R4b)、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルケニル又はベンジルを表し
、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキ
ニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒ
ドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換され；
R4a及びR4bは、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ハロゲン、ハ
ロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ、ヒドロキシル、COH、C
OOH、COOC1-6アルキル、NH2、NO2、C3-8シクロアルキル又はベンジルから、独立して選択
され、ここで該シクロアルキル又はベンジルは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6ア
ルキニル、ハロゲン、ハロC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ハロC1-6アルコキシ、シアノ
、ヒドロキシル、COH、COOH、COOC1-6アルキル、NH2又はNO2により、任意に置換されてい
る。)。
（構成２）
前記環Aが、式(i)を表している、構成1記載の使用のための化合物。
（構成３）
前記Xが、S又はO、例えばSを表している、構成1又は構成2記載の使用のための化合物。
（構成４）
前記R5が、水素又はハロゲン(すなわち、ブロモ)、例えば水素を表している、構成1〜3
のいずれか一項記載の使用のための化合物。
（構成５）
前記nが、1〜2の整数、例えば1を表している、構成1〜4のいずれか一項記載の使用のた
めの化合物。
（構成６）
前記R1が、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)、C1-6アルコキシ(メトキシなど)、シ
アノ、ヒドロキシル、COOH、NO2、ハロC1-6アルキル(トリフルオロメチルなど)又はハロC
1-6アルコキシ(トリフルオロメトキシなど)を表している、構成1〜5のいずれか一項記載
の使用のための化合物。
（構成７）
前記R1が、ハロゲン(クロロもしくはブロモなど)、シアノ、NO2又はハロC1-6アルキル(
トリフルオロメチルなど)、例えばシアノ又はトリフルオロメチルを表している、構成6記
載の使用のための化合物。
（構成８）
前記R1が、メタ(3)位及び／又はパラ(4)位、例えばパラ(4)位にある、構成1〜7のいず
れか一項記載の使用のための化合物。
（構成９）
前記R2が、水素又はC2-6アルキニル、例えば水素を表している、構成1〜8のいずれか一
項記載の使用のための化合物。
（構成１０）
前記R3が、-N=R4を表している、構成1〜9のいずれか一項記載の使用のための化合物。
（構成１１）
前記R4が、C3-8シクロアルキル、例えばシクロペンチル、特に非置換のシクロペンチル
を表している、構成1〜10のいずれか一項記載の使用のための化合物。
（構成１２）
前記W、Y及びZの各々が、CHを表している、構成1〜10のいずれか一項記載の使用のため
の化合物。
（構成１３）
前記化合物が、化合物1〜21、又はそれらの代替の医薬として許容し得る塩、溶媒和物
、遊離酸調製品もしくは遊離塩基調製品から選択される、構成1〜12のいずれか一項記載
の使用のための化合物。
（構成１４）
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のための、構成1〜13のいずれか一項記載の使用
のための化合物。
（構成１５）
前記ラミノパシーが、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)；非定型ウェルナ
ー症候群；バラケ・シモンズ症候群；ブシュケ・オレンドルフ症候群；心筋症；シャルコ
ー・マリー・トゥース病；エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー(X-連鎖性、常染色
体優性型又は常染色体劣性型)；Dunnigan型の家族性部分型脂肪萎縮症(FPLD)；グリーン
バーグ異形成症；脱髄性成人発症型常染色体優性遺伝白質ジストロフィー(ADLD)；肢帯型
筋ジストロフィー1B型(LGMD1B)；糖尿病、脂肪肝、肥大型心筋症、及び白斑黒皮腫性丘疹
(LDHCP)を随伴する脂肪萎縮症；A型脂肪萎縮症を伴う下顎末端異形成(MADA)；B型脂肪萎
縮症を伴う下顎末端異形成(MADB)；ペルゲル・フェット核異常 (PHA)；ペリツェウス・メ
ルツバッハー病又は拘束性皮膚障害(RD)から選択される、構成1〜14のいずれか一項記載
の使用のための化合物。
（構成１６）
前記ラミノパシーが、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群(HGPS)、エメリー・ドレ
フュス型筋ジストロフィー又は非定型ウェルナー症候群から選択される、構成15記載の使
用のための化合物。
（構成１７）
1種以上の更なる活性成分と組合せた、構成1〜16のいずれか一項記載の使用のための化
合物。
（構成１８）
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のための、(a)構成1〜16のいずれか一項記載の
化合物、又はその医薬として許容し得る塩；並びに、(b)医薬として許容し得る賦形剤：
を含有する、医薬組成物。
（構成１９）
化合物3、化合物8、化合物11、化合物13-17及び化合物19-21から選択される式(I)の化
合物；並びに、そのいずれか一つの塩又は溶媒和物。
（構成２０）
構成1〜19のいずれか一項記載の式(I)の化合物を調製する方法であって：
(a)Aが(i)を表す場合、式(II)の化合物：
（化３）
2020059748.tif 000080
(式中、R1及びnは、構成1において定義したものであり、並びにL1は、塩素又は臭素など
の好適な脱離基を表す)の、式(III)の化合物：
（化４）
2020059748.tif 000081
（式中、R2及びR3は、構成1において定義したものである）との反応；
(b)式(I)の化合物の保護誘導体の脱保護；及び／又は
(c)式(I)の化合物又はそれらの保護誘導体の、更なる式(I)の化合物又はそれらの保護
誘導体への相互変換；並びに
(d)任意の、式(I)の化合物の医薬として許容し得る塩の形成：
を含む、前記方法。
（構成２１）
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防のための、医薬品の製造における、構成1〜19のいずれか一項
記載の化合物の使用。
（構成２２）
構成1〜19のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とするヒトへ、
投与することを含む、該ヒトにおけるラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低
レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌など)の治療又は予防の方法。
（構成２３）
構成1〜19のいずれか一項記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とするヒトへ、
投与することを含む、該ヒトにおける癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌な
ど)の治療方法。
（構成２４）
ラミノパシー、早期老化障害、正常老化又は癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けら
れる癌など)の治療又は予防における使用のためのNAT10インヒビター。
（構成２５）
癌(低レベルのLMNA発現により特徴付けられる癌など)の治療における使用のためのNAT1
0インヒビター。
【外国語明細書】
2020059748000001.pdf