(57)【要約】【課題】優れたムスク様香気を有する新規ムスク系香料を提供。【解決手段】１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンを有効成分として含有する香料組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンを有効成分として含有する香料組成物。
【請求項２】
１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンの含有量が、組成物全体に対して０．０１〜５０質量％である請求項１記載の香料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大環状ラクトン化合物を有効成分とする香料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、天然ムスク香料は動物保護の観点から入手が困難であること、また変化する流行の香気嗜好に合わせるために、これまで数多くのムスク香を有する大環状化合物の研究が行われ、成果が報告されている（例えば、非特許文献１及び２）。しかしながら、大環状ムスク化合物は合成が難しく、また高価であるため、専らムスクケトン及びムスクキシロールに代表されるニトロムスク並びにガラクソリド（登録商標）及びトナリド（登録商標）に代表される多環状ムスクがムスク系香料として用いられており、大環状ムスク化合物はわずかしか上市されていない状況であった。
しかるところ、昨今天然志向が高まっていること及び環境重視の観点から、化合物の直接的な安全性だけでなく蓄積性及び分解性にもほとんど問題がない大環状ムスク化合物が再び注目されてきている。
大環状ムスク化合物としては、大環状ラクトン化合物が代表として挙げられるが、これまでの大環状ラクトン化合物は、香気及びコスト面で、未だ満足できるものとはいえなかった。
従って、実際の調合時における香料素材としての効果及び合成に伴う技術的、経済的問題を満足する大環状ムスク化合物の開発が望まれていた。
【０００３】
一方、大環状ラクトン化合物として、１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンが知られているが（非特許文献３）、当該大環状ラクトン化合物は単離されておらず、どのような香気を有するかは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉ．Ｂ．Ｂｅｒｓｕｋｅｒら、Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．、１９９１年、１５巻、３０７頁
【非特許文献２】阿部正三、香料、Ｎｏ．９６、１９７０年９月、１９頁
【非特許文献３】L.Hinkampら、Liebigs Ann. Chem. (1992) 559-563
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れたムスク様香気を有する香料組成物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、大環状ラクトン化合物について検討したところ、１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンが優れたムスク様香気を有し、香料成分として有用であることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンを有効成分として含有する香料組成物に係るものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンは、優れたムスク様香気を有する。従って、本発明の香料組成物は、香粧品類、保健衛生材料、雑貨、食品、医薬部外品、医薬品などの香気成分として有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オン（以下、本発明化合物ともいう。）は、下記式（１）
【００１０】
【化１】
2010163491.tif 000002
【００１１】
で表される大環状ラクトン化合物である。当該化合物は公知であるが、これまで単離されたことはなく、どのような香気を有するかは知られていない。
【００１２】
尚、式（１）で表される大環状ラクトン化合物は、ラクトン環のω位に不斉炭素を有し、Ｓ体及びＲ体から選ばれる異性体が存在するが、本発明においては、これらのいずれでもよく、ラセミ体であってもよい。
【００１３】
本発明化合物は、公知の製造方法により製造でき、例えば、次の工程（Ａ）及び（Ｂ）に従い、パルミチン酸より簡便に製造できる。
【００１４】
【化２】
2010163491.tif 000003
【００１５】
工程（Ａ）は、式（２）で表されるパルミチン酸に、脂肪酸水酸化酵素を含む生体触媒を作用させることにより、式（３）で表される１３−ヒドロキシパルミチン酸を得る反応である。
【００１６】
上記脂肪酸水酸化酵素とは、脂肪酸のω亜末端を水酸化する酵素であればよく、具体的には、ＣＹＰ１０２Ａ１（Ｐ４５０  ＢＭ３）等が挙げられる。
【００１７】
工程（Ａ）において、生体触媒は、上記の脂肪酸水酸化酵素を含む限り、任意の形態で用いられ得る。これらの酵素を含む生体触媒としては、例えば、本発明の酵素を産生する動物細胞若しくは植物細胞、若しくは微生物菌体（生菌体、死滅菌体、休止菌体若しくは静止菌体等）等の生体細胞又はその培養物等が挙げられる。
【００１８】
また、工程（Ａ）においては、必要に応じて、上記の脂肪酸水酸化酵素の他に、酵素、補酵素、その他の水酸化を促す物質を用いることができる。例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが必要とされる場合には、適宜、ＮＡＤ（Ｐ）+、及びグルコースデヒドロゲナーゼとグルコース等を用いることができる。
【００１９】
当該生体触媒を用いた１３−ヒドロキシパルミチン酸の製造は、化学的手法に比べてマイルドな条件で行うことができる。例えば、ｐＨは通常、酵素の至適ｐＨ（ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ７〜８）付近に緩衝液を用いて調整される。反応温度は２０〜６０℃、好ましくは２５〜３０℃である。反応時間は、１分〜４８時間、好ましくは１〜１２時間である。
反応系には、パルミチン酸の溶解性を向上させる為に、界面活性剤又は有機溶媒を添加してもよい。また、有機溶媒としては、酵素活性を阻害せず、パルミチン酸を溶解するものであればよいが、アセトンが好ましい。
【００２０】
生体触媒として生体細胞培養物を利用する場合、例えば、当該培養物にパルミチン酸を添加することができる。水酸化反応に必要な補酵素等は、細胞内のものを利用すればよいが、必要に応じて培養物中に添加してもよい。原料及び適切な物質を添加した培養物を、適切な培養条件下で一定時間保持することにより、培養物中の本発明の酵素とパルミチン酸とが反応し、１３−ヒドロキシパルミチン酸が生成される。上記適切な培養条件及び時間は、用いる細胞の種類によって異なるが、当業者の通常の知識に従って適宜設定すればよい。
【００２１】
当該基質の濃度は特に限定されないが、０．００１〜２０％が好ましく、０．０５〜１％がより好ましい。また、脂肪酸は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００２２】
上記工程（Ａ）により得られた１３−ヒドロキシパルミチン酸は、公知の方法で単離して又は単離せずに工程（Ｂ）に用いてもよいが、単離して用いるのが好ましい。
【００２３】
工程（Ｂ）は、１３−ヒドロキシパルミチン酸を環化反応させることにより、本発明化合物を得る反応である。
【００２４】
工程（Ｂ）は、環化反応に用いられる通常の条件下であれば、環化触媒の存在下又は非存在下いずれでも行うことができるが、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、ＤＣＣともいう）と４−ジメチルアミノピリジン（以下、ＤＭＡＰともいう）との混合物（以下、ＤＣＣ／ＤＭＡＰともいう）、酸化マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグネシウム化合物、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カルボン酸活性化試剤（例えば、無水トリフルオロ酢酸、Ｎ，Ｎ’−カルボニルイミダゾール、ジ（２−ピリジル）ジスルフィドとトリフェニルホスフィンとの混合物）、トリフェニルホスフィンとジエチルアゾカルボキシレートとの混合物、ナトリウムｔ−アミルアルコキシド等の環化触媒存在下で行うのが好ましい。また、ＤＣＣ／ＤＭＡＰを環化触媒として用いる場合は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰの他に、４−ジメチルアミノピリジン塩酸塩（以下、ＤＭＡＰ・ＨＣｌともいう）を用いるのが好ましい。
【００２５】
工程（Ｂ）において、ＤＣＣ／ＤＭＡＰを用いる場合は、溶媒存在下で行うのが好ましい。当該溶媒としては、特に限定されないが、例えば、クロロホルム、ジクロロメタンが挙げられ、クロロホルムが好ましい。
【００２６】
すなわち、好適な環化反応の具体例として、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＡＰ・ＨＣｌのクロロホルム溶液に、水酸化脂肪酸を溶解させ、加熱還流する方法（ＫｅｃＫマクロラクトン化法）が挙げられる。
【００２７】
工程（Ｂ）において、ＤＣＣ／ＤＭＡＰを用いる場合は、ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＡＰ・ＨＣｌの使用量は、反応時間の遅延や反応速度の低下が起こらない量を適宜選択すればよいが、式（３）で表される水酸化脂肪酸に対して、それぞれ、１．５〜１０当量、１．５〜１０当量、１．５〜１０当量用いるのが好ましい。
【００２８】
工程（Ｂ）において、ＤＣＣ／ＤＭＡＰを用いる場合は、通常３０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃で、通常１０〜２４時間程度、好ましくは１５〜２０時間程度、振とう、撹拌することで行うことができる。
【００２９】
目的化合物は、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、遠心分離、各種溶媒による抽出、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて、反応系から、単離、精製することで分離することができる。
【００３０】
本発明化合物は、後記実施例に示すように、優れたムスク様香気を有する。従って、本発明化合物は、香料組成物の有効成分として使用することができ、また、香料組成物を製造するために使用できる。
【００３１】
香料組成物への本発明化合物の配合量は、香気の点で、０．０１〜５０質量％が好ましく、０．１〜２０質量％がより好ましい。
【００３２】
また、本発明の香料組成物には、本発明化合物を単独で配合してもよいが、本発明化合物の香気を阻害しない範囲で、ポリオキシエチレンラウリル硫酸エーテル等の界面活性剤；ジプロピレングリコール、ジエチルフタレート、エチレングリコール、プロピレングリコール、メチルミリステート、トリエチルシトレート等の溶剤；リモネン、α−ピネン、β−ピネン、テルピネン、セドレン、ロンギフォレン、バレンセン等の炭化水素類；リナロール、シトロネロール、ゲラニオール、ネロール、テルピネオール、ジヒドロミルセノール、エチルリナロール、ファルネソール、ネロリドール、シス−３−ヘキセノール、セドロール、メントール、ボルネオール、β−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール、フェニルヘキサノール、２,２,６−トリメチルシクロヘキシル−３−ヘキサノール、１−(２−ｔ−ブチルシクロヘキシルオキシ)−２−ブタノール、４−イソプロピルシクロヘキサンメタノール、4−メチル−２−(２‐メチルプロピル)テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−オール、２−メチル−４−(２,２,３−トリメチル−３−シクロペンテン−１−イル)−２−ブテン−１−オール、２−エチル−４−(２,２,３−トリメチル−３−シクロペンテン−１−イル)−２−ブテン−１−オール、イソカンフィルシクロヘキサノール、３,７−ジメチル−７−メトキシオクタン−２−オール等のアルコール類；
【００３３】
オイゲノール、チモール、バニリン等のフェノール類；リナリルホルメート、シトロネリルホルメート、ゲラニルホルメート、ｎ−ヘキシルアセテート、シス−３−ヘキセニルアセテート、リナリルアセテート、シトロネリルアセテート、ゲラニルアセテート、ネリルアセテート、テルピニルアセテート、ノピルアセテート、ボルニルアセテート、イソボルニルアセテート、ｏ−ｔ−ブチルシクロヘキシルアセテート、ｐ−ｔ−ブチルシクロヘキシルアセテート、トリシクロデセニルアセテート、ベンジルアセテート、スチラリルアセテート、シンナミルアセテート、ジメチルベンジルカルビニルアセテート、３−ペンチルテトラヒドロピラン−４−イルアセテート、シトロネリルプロピオネート、トリシクロデセニルプロピオネート、アリルシクロヘキシルプロピオネート、エチル２−シクロヘキシルプロピオネート、ベンジルプロピオネート、シトロネリルブチレート、ジメチルベンジルカルビニルｎ−ブチレート、トリシクロデセニルイソブチレート、メチル２−ノネノエート、メチルベンゾエート、ベンジルベンゾエート、メチルシンナメート、メチルサリシレート、ｎ−ヘキシルサリシレート、シス−３−ヘキセニルサリシレート、ゲラニルチグレート、シス−３−ヘキセニルチグレート、メチルジャスモネート、メチルジヒドロジャスモネート、メチル２,４−ジヒドロキシ−３,６−ジメチルベンゾエート、エチルメチルフェニルグリシデート、メチルアントラニレート、フルテート等のエステル類；
【００３４】
ｎ−オクタナール、ｎ−デカナール、ｎ−ドデカナール、２−メチルウンデカナール、１０−ウンデセナール、シトロネラール、シトラール、ヒドロキシシトロネラール、ジメチルテトラヒドロベンズアルデヒド、４(３)−(４‐ヒドロキシ−４−メチルペンチル）−３−シクロヘキセン−１−カルボアルデヒド、２−シクロヘキシルプロパナール、ｐ−ｔ−ブチル−α−メチルヒドロシンナミックアルデヒド、ｐ−イソプロピル−α−メチルヒドロシンナミックアルデヒド、ｐ−エチル−α,α−ジメチルヒドロシンナミックアルデヒド、α−アミルシンナミックアルデヒド、α−ヘキシルシンナミックアルデヒド、ピペロナール、α−メチル−３,４−メチレンジオキシヒドロシンナミックアルデヒド等のアルデヒド類；メチルヘプテノン、４−メチレン−３,５,６,６−テトラメチル−２−ヘプタノン、アミルシクロペンタノン、３−メチル−２−(シス−２−ペンテン−１−イル)−２−シクロペンテン−１−オン、メチルシクロペンテノロン、ローズケトン、γ−メチルヨノン、α−ヨノン、カルボン、メントン、ショウ脳、ヌートカトン、ベンジルアセトン、アニシルアセトン、メチルβ−ナフチルケトン、２,５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３(２Ｈ)−フラノン、マルトール、７−アセチル−１,２,３,４,５,６,７,８−オクタヒドロ−１,１,６,７−テトラメチルナフタレン、ムスコン、シベトン、シクロペンタデカノン、シクロヘキサデセノン等のケトン類；
【００３５】
アセトアルデヒドエチルフェニルプロピルアセタール、シトラールジエチルアセタール、フェニルアセトアルデヒドグリセリンアセタール、エチルアセトアセテートエチレングリコールケタール等のアセタール類及びケタール類；アネトール、β−ナフチルメチルエーテル、β−ナフチルエチルエーテル、リモネンオキサイド、ローズオキサイド、１,８−シネオール、ラセミ体又は光学活性のドデカヒドロ−３ａ,６,６,９ａ‐テトラメチルナフト[２,１‐ｂ]フラン等のエーテル類；シトロネリルニトリル等のニトリル類；
【００３６】
γ−ノナラクトン、γ−ウンデカラクトン、δ−デカラクトン、γ−ジャスモラクトン、クマリン、シクロペンタデカノリド、シクロヘキサデカノリド、アンブレットリド、エチレンブラシレート、１１−オキサヘキサデカノリド等の本発明化合物以外のラクトン類；オレンジ、レモン、ベルガモット、マンダリン、ペパーミント、スペアミント、ラベンダー、カモミル、ローズマリー、ユーカリ、セージ、バジル、ローズ、ゼラニウム、ジャスミン、イランイラン、アニス、クローブ、ジンジャー、ナツメグ、カルダモン、セダー、ヒノキ、ベチバー、パチョリ、ラブダナム等の天然精油や天然抽出物等の他の香料物質等を配合することができる。当該他の成分は単独又は複数配合しても良い。
【００３７】
式（１）で表される大環状ラクトン化合物は、嗜好性の高い優れた香気付与のため、配合対象物の香気の改良を行なうために、香粧品類、保健衛生材料、雑貨、食品、医薬部外品、医薬品等の各種製品の香気成分として使用できる。
例えば、香水、コロン類等のフレグランス製品；シャンプー、リンス類、ヘアートニック、ヘアークリーム類、ムース、ジェル、ポマード、スプレーその他毛髪用化粧料；化粧水、美容液、クリーム、乳液、パック、ファンデーション、おしろい、口紅、各種メークアップ類等の肌用化粧料；石鹸、皿洗い洗剤、洗濯用洗剤、ソフトナー類、消毒用洗剤類、防臭洗剤類、室内芳香剤、ファーニチアケアー、ガラスクリーナー、家具クリーナー、床クリーナー、消毒剤、殺虫剤、漂白剤、その他の各種保健衛生用洗剤類；歯磨；マウスウォッシュ、入浴剤、制汗製品、パーマ液等の医薬部外品；トイレットペーパー、ティッシュペーパー等の雑貨；医薬品等；食品等の香気成分として使用することができる。
【００３８】
また、本願発明の香料組成物の製品への配合量は、式（１）で表される大環状ラクトン化合物として、０．００１〜５０質量％が好ましく、０．０１〜２０質量％がより好ましい。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
参考例１  Ｐ４５０  ＢＭ３の発現
（ｉ）Ｐ４５０ ＢＭ３、ＧＤＨ共発現大腸菌の構築
タンパク質生産用宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１Ｓｔａｒ(ＤＥ３)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。高発現ベクター用プラスミドとしてｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製）を用いた。遺伝子のサブクローニングに用いる大腸菌宿主としてＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（タカラバイオ社製）を用いた。
Ｐ４５０ ＢＭ３（配列番号１）の遺伝子源として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４５８１株を用いた。グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）(配列番号２)の遺伝子源として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株（ＡＴＣＣ  ２３８５７）を用いた。
Ｐ４５０ ＢＭ３及びＧＤＨを高発現するベクターであるｐＥＴＢＭ３−ｇｄｈは、ＢＭ３遺伝子をｐＥＴ２１ａのマルチクローニングサイトに挿入した後、ＧＤＨ遺伝子をＢＭ３遺伝子の下流に挿入したプラスミドである。ＢＭ３遺伝子の増幅はＢ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １４５８１株ゲノムを鋳型とし、プライマーとしてＢＭ３／ＢａｍＨＩ ＦＷ、ＢＭ３／ＥｃｏＲＩ ＲＶを使用して行った。（配列番号３，４）。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲの組成、反応条件は添付のプロトコールに従った。
増幅した約３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＢａｍ ＨＩ、Ｅｃｏ ＲＩで処理し、ｐＥＴ２１ａのＢａｍ ＨＩ、Ｅｃｏ ＲＩサイトに挿入し、ｐＥＴＢＭ３を構築した。ＧＤＨ遺伝子の増幅はＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株ゲノムを鋳型とし、プライマーとしてＢＳｇｄｈ／ＥｃｏＲＩ ｆ１、ＢＳｇｄｈ／ＸｈｏＩ ｒ１（配列番号５，６）を使用して行った。増幅した約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏ ＲＩ、Ｘｈｏ Ｉで処理し、ｐＥＴＢＭ３のＥｃｏ ＲＩ、Ｘｈｏ Ｉサイトに挿入しｐＥＴＢＭ３−ｇｄｈを構築した。
遺伝子配列の確認にはＤＮＡ塩基配列解析装置として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、添付のプロトコールに従って、Ｂｉｇ ＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いプラスミドをテンプレートとしてサンプルを調製した。
構築した発現ベクターの大腸菌への導入は、コンピテントセル法により行った。氷上で融解させたＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル４０μＬもしくはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ (ＤＥ３)コンピテントセル４０μＬに適量のプラスミドＤＮＡを加え、氷上で３０分間静置した。４２℃で４５秒間熱ショックを加え、すぐに氷上で２分間静置した。あらかじめ３７℃にインキュベートした３６０μＬのＳＯＣ培地（タカラバイオ社製）を加え、３７℃、１５０ｒｐｍで６０分間振盪した。振盪した液を１００ｐｐｍのアンピシリンナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で１６時間培養し生育した菌を形質転換体として分離した。
分離した形質転換体はＬＢ寒天培地上に画線植菌した後、３０℃で１６時間培養した。生育した菌を滅菌した２０％グリセロール０．５ｍＬ中に懸濁した後−８０℃で凍結保存し、凍結保存菌体として用いた。
（ii）大腸菌を宿主とした目的タンパク質の誘導発現、及び酵素溶液の調製
大腸菌の培養、タンパク質の誘導発現は以下のように行った。φ２４ｍｍ×２００ｍｍ大型試験管（ＬＢ培地４ｍＬ仕込み）にて３７℃、３００ｒｐｍで８時間振盪培養した種培養液を、５００ｍＬ容坂口フラスコ（ＬＢ培地１００ｍＬ仕込み）に１％（ｖ／ｖ）植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝約０．４になるまで（約２．５時間）振盪培養した。次に終濃度として、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ、５−アミノレブリン酸を１ｍＭ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを０．００１％となるよう添加し、２５℃、１２０ｒｐｍで、１６時間振盪した。試薬は全てフィルターろ過して用いた。培養液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心して集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で1回洗菌を行った。
１００ｍＬの培養液から回収した菌体を、コンプリートＥＤＴＡフリー（ロシュ社製）を１錠／５０ｍＬとなるよう溶解させた５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２ｍＬ溶液に懸濁した。菌懸濁液をＦａｓｔＰｒｅｐ（Ｑ−Ｂｉｏ ｇｅｎｅ社製）に供し、破砕ビーズにはＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ（Ｑ−Ｂｉｏ ｇｅｎｅ社製）を使用し、添付のプロトコールに従い菌体を破砕した。培養液が１Ｌを越える際には、上記と同様の比率で菌体懸濁液を調製し、ＦＲＥＮＣＨ ＰＲＥＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社製）を用いて１５０００ｐｓｉで１００滴／分となるよう、１回通過させ菌体破砕液を得た。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取得した。上清に等量のグリセロールを加え、−３０℃で保存した。この保存液を菌体抽出液とした。
【００４０】
実施例１  脂肪酸の水酸化反応
参考例１記載のように調製した酵素液を用いて、パルミチン酸（ＳＩＧＭＡ社製、純度９９％）の水酸化を試みた。酵素反応は以下のように行った。
【００４１】
終濃度として、１００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）、０．５ｇ／Ｌ パルミチン酸、 ５ｍＭグルコース、菌体抽出液５０ｍＬ／Ｌになるよう、２００ｍＬの反応液を５００ｍＬ坂口フラスコに３０本調製し、２５℃で２分間インキュベートした。インキュベートした溶液にＮＡＤＰ+を終濃度０．０５ｍＭとなるよう添加し、２５℃、１２０ｒｐｍで１４時間インキュベートした。反応液に濃塩酸を２％（ｖ／ｖ）添加した後、ヘキサン５０％（ｖ／ｖ）で抽出した。抽出後減圧乾固し、ヘキサン抽出物１．７０ｇを得た。ヘキサン抽出物中に含まれる水酸化物量は、メチルエステル化、トリメチルシリル化した後、ＧＣ−ＭＳにて分析した。
装置はＨＰ ６８９０／５９７３ ＧＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、カラムはＤＢ−１ ＭＳ ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、２０℃／分、３００℃（５分）で行った。水酸化脂肪酸のコントロールとして、１６−ヒドロキシパルミチン酸を用いた。
【００４２】
反応により、収率０．８％で１３−ヒドロキシパルミチン酸を得た。
なお、１３−ヒドロキシパルミチン酸、１４−ヒドロキシパルミチン酸及び１５−ヒドロキシパルミチン酸の総量は１２０ｍｇであり、その水酸化割合はω−１位:３２．９％、ω−２位:４７．１％、ω−３位:２０．０％であった。
【００４３】
実施例２  水酸化脂肪酸の分子内環化
ジシクロヘキシルカルボジイミド ２．７２ｇ、 4-ジメチルアミノピリジン ２．４２ｇ、 ４−ジメチルアミノピリジン塩酸塩 ２．０９ｇ のクロロホルム ２９４．９２ｇ 溶液に、加熱還流条件下、実施例１で得られた生成物 １．７０ｇ の ＴＨＦ ３９．６ｍＬ溶液を、シリンジポンプを用いて１６時間かけて滴下した。滴下終了後、加熱還流下、３０分間撹拌した後、室温まで冷却した。溶媒を減圧留去後、ジエチルエーテルで希釈し不溶物を濾別した。
得られた濾液の溶媒を減圧留去することで、粗生成物２．７７ｇを得た。得られた粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；１．６％−ＴＨＦ−ヘキサン）により精製し、ラクトン化物 ０．９８ｇ（異性体合計純度 ４．８％）を得た。
【００４４】
実施例３  大環状ラクトン化合物の構造確認及び官能評価
得られた生成物はジシクロヘキシルカルボジイミドなどの不純物を含むため、大環状ラクトン化合物を、分取ガスクロマトグラフィーにより分離した。
まず、実施例２で得られた生成物０．１ｇをエタノールで１０％濃度に調製し、スプリットレス測定で５μＬ注入しクロマトグラムを得た。注入後、主生成物の保持時間だけ冷却濃縮装置（Ｇｅｒｓｔｅｌ社製Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）に導入し、この操作を８０回繰り返すことで主成分の濃縮物を得た。これを０．５ｍｌのエタノールで流し出し、通常のガスクロマトグラフィーから保持時間の短い順に７．３％、５３．９％、３８．８％の３成分をそれぞれ単離した。そして、マスフラグメントから、上記３成分が、１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オン、１５−エチルオキサシクロペンタデカン−２−オン及び１６−メチルオキサシクロヘキサデカン−２−オンであると同定した。上記３成分の混合物は、官能評価よりムスクチンキを想起させる華やかできれいなムスク香を有することを確認した。分子量の同じ市販のシクロヘキサデカノリドと比べ、本発明品は甘さが強い特徴を持つことから、分岐アルキル基はムスコンのようなより天然に近い匂いをもたらすものと考えられる。
また、におい嗅ぎガスクロマトグラフィー（ＧＣ−Ｏｌｆａｃｔｏｍｅｔｒｙ）により、１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オンがムスク香を有することを確認した。
【００４５】
１６−メチルオキサシクロヘキサデカン−２−オン
ＭＳ;  ２５４(４， Ｍ+)， ２３７(１０， Ｍ+  −  ＣＨ3)， ２３６(５１， Ｍ+  −  Ｈ2Ｏ)， ２１０(２７， Ｍ+  −  ＨＣＯＣＨ3), ９８(４８)， ９７(６１)， ９６(４４)， ８４(４１)， ８３(５９)， ６９(６４)， ５５(１００)， ４１(６６)
【００４６】
１５−エチルオキサシクロペンタデカン−２−オン
ＭＳ;  ２５４(４， Ｍ+)， ２３６(４７， Ｍ+  −  Ｈ2Ｏ)， ２２５(４１， Ｍ+  −  Ｃ2Ｈ5)， １９６(２９， Ｍ+  −  ＨＣＯＣ2Ｈ5)， ９８(４８)， ９７(６６)， ９６(４１)， ９５(４２)， ８３(６０)， ６９(６８)， ５５(１００)， ４１(６９)
【００４７】
１４−ｎ−プロピルオキサシクロテトラデカン−２−オン
ＭＳ;  ２５４(３， Ｍ+)， ２３６(４１， Ｍ+  −  Ｈ2Ｏ)， ２１１(５５， Ｍ+  −  Ｃ3Ｈ7)， １８２(４６， Ｍ+  −  ＨＣＯＣ3Ｈ7)， １１１(４１)， ９８(６３)， ９７(５３)， ８３(５７)， ６９(５２)， ５５(１００)， ４３(４６)， ４１(７２)
【００４８】
実施例４  衣料用洗剤用香料組成物
表１に示した組成を持つ香料組成物８５質量部に、実施例２で得られたラクトン化物を１５質量部加えることにより、花様で清潔感のある、柔らかなムスクの香りを特徴とする衣料用洗剤用香料組成物を得ることができた。
【００４９】
【表１】
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【配列表】
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