(57)【要約】      （修正有）【課題】関節炎の診断のための、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）および同様のタンパク質に対する抗体の作成法、ならびに関節炎の治療のための該タンパク質の使用法を提供する。【解決手段】関節炎を転移し得るモノクローナル抗体およびその抗体を単離する方法、ならびに組成物の抗関節炎能力を決定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の血漿または血清のサンプル中における、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に対する自己抗体の存在の検出を含む関節炎の診断方法。
【請求項２】
サンプルのＥＬＩＳＡ試験を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルのＲＩＡ試験を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質でコートされた基体の使用を含む請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質が組換えタンパク質である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＧＰＩ様タンパク質がヘキソース代謝経路に関与するＧＰＩ類似体である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＧＰＩ様タンパク質が、多くの非関節組織で発現されるが血清中に放出されるものであって、かつ自己反応性Ｔリンパ球および／または自己抗体のターゲットであるタンパク質である請求項４に記載の方法。
【請求項８】
関節炎の治療または予防のための、ＧＰＩまたは自己抗体と相互作用して該自己抗体を阻害し得るＧＰＩ様の部分を含むＧＰＩ様タンパク質の使用。
【請求項９】
以下からなる工程を包含する、ＧＰＩ様タンパク質を単離する方法：
−  関節炎の哺乳動物、好ましくはＫ／ＢｘＮトランスジェニックマウス由来の血清から、種々のＩｇＧフラクションまたはサブフラクションを調製する工程、
−  マトリクスとして該フラクションのＩｇＧを有するアフィニティークロマトグラフィーによって、ＧＰＩ様タンパク質を単離する工程。
【請求項１０】
関節炎の治療および診断のための、ＧＰＩまたは請求項９に記載の方法によって獲得できるＧＰＩ様タンパク質およびその抗体の使用。
【請求項１１】
ＧＰＩおよびＧＰＩ様タンパク質に対する免疫寛容を誘導して自己抗体の発生を防止するための、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質、あるいは免疫刺激性のエピトープを構成する該ＧＰＩまたはＧＰＩ様の部分を含むか、もしくは模倣する化合物の使用。
【請求項１２】
ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質のインビボでの発現用ＤＮＡベクター。
【請求項１３】
関節炎がＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に対する抗体の注入あるいは関節炎のＫ／ＢｘＮトランスジェニックマウス由来の血清またはそのフラクションの注入によって誘導されている関節炎の動物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の動物に組成物を投与して関節炎の経過への効果を評価することによって、該組成物の抗関節炎能力を決定する方法。
【請求項１５】
以下の工程を包含する請求項１４に記載の方法：
ｉ）既知用量の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを第一の非関節炎マウスに投与する工程であって、該マウスはまた、関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンの前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される関節炎誘発性組成物を受けている、工程、
ｉｉ）該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を検出する工程、および
ｉｉｉ）該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を、同一の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを受けているが、該抗関節炎組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過と比較する工程。
【請求項１６】
以下の工程を包含する請求項１４に記載の方法：
ｉ）既知用量の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを第一の非関節炎マウスに投与する工程であって、該マウスはまた、関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンの前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される関節炎誘発性組成物を受けている、工程、
ｉｉ）該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を検出する工程、および
ｉｉｉ）該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を、同一の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを受けているが、該抗関節炎組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度と比較する工程。
【請求項１７】
関節炎誘発性の免疫グロブリンがモノクローナル抗体またはその組合せである請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質の産生をインビボで調節し得る分子。
【請求項１９】
少なくとも１つのＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質あるいは免疫刺激性のエピトープを有するそのフラグメントを含む関節炎の診断用キット。
【請求項２０】
以下からなる工程を包含する関節炎を転移し得るモノクローナル抗体を単離する方法：
ａ）関節炎の哺乳動物の脾細胞、好ましくはＫ／ＢｘＮマウスの脾細胞由来のリンパ球からハイブリドーマを調製する工程、
ｂ）ＨＡＴ培地中で限界希釈条件で該ハイブリドーマを選択する工程、
ｃ）ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に指向する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
ｄ）工程ｃ）で選択されるハイブリドーマを増殖し、クローニングする工程、
ｅ）工程ｄ）で選択されたハイブリドーマによって産生される該抗体を組合せてまたは単独でその関節炎を転移する能力について試験する工程。
【請求項２１】
工程ｅ）が、既知用量の該抗体を正常なマウスに投与して該マウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の発症を検出することによって達成される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０〜２１の１項に記載の方法によって獲得できるモノクローナル抗体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎の診断のための、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼおよび同様のタンパク質に対する抗体の使用、ならびに関節炎の治療のための該タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、頻発する不全自己免疫障害である（Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９６）。これは滑膜内層の白血球浸潤およびレジデント滑膜細胞の増殖によって特徴付けられる、慢性的な進行性の関節疾患である。続くサイトカインおよび他の可溶性メディエイタの過剰産生は、軟骨の破壊、骨の侵食および関節構造の無秩序な再造形を引き起こす。ＲＡの病因および病原は論争中である。微生物抗原（Ａｇ）への無制限の炎症反応、自己の構成要素への不適切な自己免疫応答によって、またはその両方によって疾患が開始されるのかどうかは知られていない。Ｔ細胞（Ｐａｎａｙｉら、１９９２）、Ｂ細胞（Ｚｖａｉｆｌｅｒ、１９７３）および他の白血球（例えば、樹状細胞、マクロファージおよび好中球）（ＴｈｏｍａｓおよびＬｉｐｓｋｙ、１９９６）の重要な役割は議論され、論争されている。意見の一致の欠如は主として２つの要因を反映している。ＲＡは異質な症候群であり、様々な患者が、広く異なる発症の年齢、疾患の過程、遺伝的なプロファイル、および治療の介入への応答を示す。さらに、ＲＡの小動物モデル（特に、疾患のために自然に死亡するもの）が不足している。
【０００３】
最近、本発明者らは、ヒトにおける慢性関節リウマチの多くの特徴を有する疾患を自然に生じる、関節炎の新たなトランスジェニックマウスモデルを作り出した（（Ｋｏｕｓｋｏｆｆら、１９９６）、米国特許第５，６７５，０６０号）。Ｃ５７Ｂｌ／６ｘＮＯＤの遺伝的背景に基づく全てのＫＲＮ  Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニック（ｔｇ）マウス（本明細書中以後、Ｋ／ＢｘＮマウスと省略する）は、関節障害（３〜４週間の齢で始まり、この動物の可動性が深刻に弱まるまで迅速に進展する）を生じる；このとき、患者において、この疾患は、慢性、進行性、対称性であり、過酷さの近位から遠位の勾配を有する。マウスの疾患は、ヒトの疾患の主要な組織学的特徴の全てを示す：白血球浸潤、滑膜炎、パンヌス形成、軟骨および骨の破壊、無秩序な再造形。マウスモデルは、患者同様、Ｂ細胞数の増加として現れる明らかなＢ細胞の機能亢進、高ガンマグロブリン血症および自己抗体産生を含む、いくつかの免疫学的な異常性を示す。
【０００４】
Ｋ／ＢｘＮマウスにおいてこの疾患は、ＫＲＮ  ＴＣＲによる主組織適合複合体のＮＯＤ誘導Ａg7分子の交叉反応認識によって開始される。従って、Ｋ／ＢｘＮ動物において、全身的な自己反応の状況が生じ、どのようにして関節特異的な自己免疫疾患が全身的な自己反応の存在下で生じるのかという問題が生じる。本発明者らは、Ｔリンパ球のそれらの遮断が疾患を防止するので、Ｔリンパ球が関節炎の発症に必要であること（これらは疾患のより後の段階では重要ではないようであるけれども）を以前に報告している。Ｂリンパ球もまた重要である（Ｋｏｕｓｋｏｆｆら、１９９６）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明において、本発明者らは自然発生的な関節炎にはＢ細胞が必要であることを見出している。なぜならば、これらが、本発明者らがグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＥＣ．５．３．１．９）と同定するターゲットに指向する病原性免疫グロブリンを産生するからである。本発明者らは、組換えグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼがマウスの関節炎の診断試験に使用することができること、および病原性免疫グロブリンを吸着するのに使用できることを示す。
【０００６】
自己抗体は、疾患が軟骨成分（例えば、ＩＩ型コラーゲン）を用いた免疫によって誘導されるときに、動物モデル中に誘導された関節炎の状況において、以前に報告されている。ユビキタスに発現するタンパク質に対する抗体が関節炎誘発性（arthritogenic）であることは以前に見出されていない。
【０００７】
また、抗体は、ＲＡ患者由来の血清中で見出され、いくつかの診断的な価値を有する。リウマチ因子（ＲＦ；ＩｇＧのＦｃ部分に対するＡｂ）は、この疾患の特徴であると考えられている；しかし、これは、ＲＡ患者の約３０％には存在せず、他の自己免疫疾患を有する個体において（Ｍａｎｎｉｋ、１９９２、Ｒｕｄｏｌｐｈｉら、１９９７）、または慢性の免疫刺激の状況において存在する。軟骨または表皮成分に対するＡｂは、ＲＡ患者においても検出されており、例えば、ＩＩ型コラーゲン（ｃＩＩ）またはフィラグリンに指向するが、これらはまた、概して、疾患のパラメータとの限定された相関を示す（Ｒｕｄｏｌｐｈｉら、１９９７；ＣｌａｑｕｅおよびＭｏｏｒｅ、１９８４；Ｓｅｂｂａｇら、１９９５)。
【０００８】
本発明は、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）ならびにグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ様タンパク質（ＧＰＩ様（GPI like））に対する抗体を扱う。
【０００９】
該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、その調製に使用される技術は、当業者に公知である。
【００１０】
ＧＰＩ様タンパク質は、血清中で見出されたタンパク質であり、それに対する抗体は、関節炎誘発能力を有する。概して、該ＧＰＩ様は、多くの組織で発現し、通常、血清中に放出される。しかし、これは完全な免疫寛容を誘導することは不可能であり、従って、自己反応性Ｔリンパ球および/または自己抗体のターゲットである。
【００１１】
ＧＰＩ様タンパク質はまた、抗ＧＰＩまたは抗ＧＰＩ様抗体、とりわけ自己抗体に干渉し得る少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質またはポリペプチドは、合成的なものまたは組換え的なものであってもよく、他のタンパク質の配列を含んでいてもよい。特に、該タンパク質またはポリペプチドは、治療的な用途に使用される場合、いかなる病理も誘導することができない。
【００１２】
本発明の実施例は、当業者に、ＧＰＩ様タンパク質の同定法に関する詳細な指示を与える。この点について、本発明は、ＧＰＩ様タンパク質を単離し、その関節炎誘発特性を決定する試験を提供する。１つの可能なルーチン手順は以下である：
−  関節炎の哺乳動物、例えばＫ／ＢｘＮトランスジェニックマウスから血清を得ること、
−  該血清の種々のＩｇＧフラクションを調製し、該フラクションの関節炎を誘導する能力についてそれらを試験し、最終的にこれらのフラクションに基づくサブフラクションを調製すること、
−  該フラクションのＩｇＧを有するアフィニティークロマトグラフィーカラムを調製すること、
−  該カラムによって、同一哺乳動物の器官由来のタンパク質抽出物から、ＧＰＩ様タンパク質を単離し、精製すること。
【００１３】
ＧＰＩ様タンパク質として定義されるこれらの単離タンパク質は、配列決定などの標準的な技術によってさらに特徴付けられ得る。ＧＰＩの同定へと導く、実施される実験についての技術的な詳細は、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｉ．ら、(１９９９)およびＫｏｒｇａｎｏｗ ＡＳ．ら（１９９９）に記載され、これらは本明細書中に言及によって援用される。
【００１４】
従って、本発明の別の局面は、以下からなる工程を包含するＧＰＩ様タンパク質を単離する方法に関する：
−  関節炎の哺乳動物、好ましくはＫ／ＢｘＮトランスジェニックマウス由来の血清から、種々のＩｇＧフラクションまたはサブフラクションを調製する工程、
−  マトリクスとして該フラクションのＩｇＧを有するアフィニティークロマトグラフィーによって、ＧＰＩ様タンパク質を単離する工程。
【００１５】
該ＧＰＩ様タンパク質は、本質的に、酵素であり、例えば、ヘキソース代謝経路に関与する酵素、好ましくは、ＧＰＩ類似体である。
【００１６】
本発明はまた、関節炎の治療および診断のための、上記の方法によって獲得できるＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質およびその抗体の使用に関する。
【００１７】
本発明の抗体は、ＩＩ型コラーゲンなどの軟骨成分に関する先行文献に記載の公知の関節炎誘発性抗体とは異なる。本発明の抗体は、主に、多くの非関節性組織において発現され、血清中に放出されるタンパク質に指向するものである。
【００１８】
本発明の別の実施態様は、患者の血漿または血清のサンプル中におけるＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に対する自己抗体の検出を含む、関節炎の診断方法を扱う。
【００１９】
サンプル中に存在するＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に対する抗体の存在または量について試験する方法は、サンプル中で該タンパク質を該抗体に結合させること、および該タンパク質に結合した抗体を検出することを包含する。
【００２０】
血漿または血清中の抗体の検出方法は当該分野において周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ試験が使用され得る。ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質でコートされた基体（例えば、アッセイプレート）を使用し、次いで、適切な標識された抗体を用いて該ＧＰＩ上に固定される抗体の存在を検出することが可能である。これらの標識のうちで好ましいものとして、放射性同位体、同位体を含む化合物、酵素（特に、色原体、蛍光原物質（fluorigenes）または発光物質（luminescents）との反応に感受性の酵素（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ（alcaline phosphatase）））、発色団、色原体化合物、蛍光原物質または発光物質、塩基類似体、およびビオチンなどのリガンドが挙げられる。
【００２１】
本発明によれば、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質は、天然のタンパク質自体、組換えタンパク質、合成タンパク質、または該タンパク質の組換えエピトープのみ（これらは専門用語、ＧＰＩ様に包含される）であってもよい。従って、本発明はさらに、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に対する抗体の診断を実施するためのキットを扱う。該キットは、タンパク質および第二の抗体からなる診断剤を含み、該タンパク質は、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質あるいは血漿もしくは血清の自己抗体と相互作用し得るそのエピトープであり、該第二の抗体は、該自己抗体と結合することができ、検出用に標識されている。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、関節炎の治療または予防のための、ＧＰＩまたは自己抗体と相互作用して該自己抗体を阻害もしくは除去し得るＧＰＩ様の部分を含むＧＰＩ様タンパク質の使用に関する。
【００２３】
本発明はまた、インビボでのＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質を発現するに十分なエレメントを包含するベクターの使用を介したインビボでのＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質の発現を扱う。該ベクターはウイルス起源であってもよく、プラスミドであってもよく、またはＶＩＣＡＬ技術に記載されるような純合成ＤＮＡもしくは裸のＤＮＡであってもよい。該タンパク質の発現は、関節炎誘発性の抗体を吸着するＧＰＩ様タンパク質を提供する（この明細書の実施例を参照のこと）。
【００２４】
潜在的な抗関節炎組成物の効力は、Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清、またはそれから誘導された免疫グロブリン、または抗ＧＰＩもしくは抗ＧＰＩ様抗体の注入によって正常なマウスにおいて誘発される関節炎への組成物の効果を決定することによって評価することができる。このように評価される組成物は、化学化合物、生物学的薬剤（例えば、抗体、ポリペプチド、抗炎症剤、ホルモン、寛容原）を含むが、これらに限定されない。これらは抗ＧＰＩもしくは抗ＧＰＩ様抗体のそれらのターゲットへの結合あるいはこの結合の病理学的な結果を阻害する。
【００２５】
これは、以下の工程によって実施することができる：ｉ）既知用量の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを第一の非関節炎マウスに投与する工程であって、該マウスはまた、関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンの前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される関節炎誘発性組成物を受けている、工程、ｉｉ）該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を検出する工程、およびｉｉｉ）該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を、同一の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを受けているが、該抗関節炎組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過と比較する工程。
【００２６】
工程ｉｉ）の別の可能性は、該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を検出することであり、工程ｉｉｉ）の別の可能性は、該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を、同一の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを受けているが、該抗関節炎組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度と比較することである。
【００２７】
この方法において、関節炎誘発性の免疫グロブリンは、モノクローナル抗体またはその組合せ、特に、以下に記載の抗体であり得る。
【００２８】
関節炎を治療するために、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質の産生を調節し得る分子を試験することも可能である。該分子は、例えば、非病原性の抗体であってもよい。
【００２９】
病理学的な抗体の量を減少させるための体外の回路における血清の処理のために、ＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質でコートされた表面を使用することも可能である。
【００３０】
本発明の別の局面は、以下からなる工程を包含する、関節炎を転移し得るモノクローナル抗体を単離する方法に関する：
ａ）関節炎の哺乳動物の脾細胞、好ましくはＫ／ＢｘＮマウスの脾細胞由来のリンパ球からハイブリドーマを調製する工程、
ｂ）ＨＡＴ培地中で限界希釈条件で該ハイブリドーマを選択する工程、
ｃ）ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に指向する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
ｄ）工程ｃ）で選択されるハイブリドーマを増殖し、クローニングする工程、
ｅ）工程ｄ）で選択されたハイブリドーマによって産生される該抗体を組合せてまたは単独でその関節炎を転移する能力について試験する工程。
【００３１】
工程ｅ）の試験は、ｉ）：既知用量の該抗体を正常なマウスに投与すること、ｉｉ）該マウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の発症を検出することによって達成され得る。
【００３２】
上記の方法が当該分野に関連した周知の技術によって達成され得、任意の特定の手順に限定されないことを理解すべきである。
従って、本発明は、このような方法によって獲得できるモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ株に関する。実施例５に示す抗体のうち、抗体２．９９および６．１２１が好ましい（以下の図９を参照のこと）。これらの抗体は、上記の血清または抗ＧＰＩ免疫グロブリンと同じ目的で使用され得る。
【００３３】
本発明のいくつかのさらなる特徴および利点は、以下の図面を参照して説明される以下の実施例から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は関節炎を転移できる。Ａ：７２時間前に関節炎Ｋ／ＢｘＮマウス由来または対照（ｃｔｌ）非関節炎同腹仔由来の血清（１５０μｌ）を注射した正常マウスの足。関節炎の血清を注射したマウスにおける腫脹および赤みに注目されたい。関節炎は、足関節の厚みの測定または臨床的指標(clinical index)評価（右パネル）によって具体化する(objectivate)ことができる。臨床的スコアを、０：正常、１：疑わしい、２：２つの足が冒された、３：３つの足が冒された、４：全肢が冒された、のように定義する。
【図１Ｂ】Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は関節炎を転移できる。Ｂ：血清導入により誘導される疾患は、トランスジェニックであろうとなかろうと、全レシピエントに存在するが、自己反応性Ｔ細胞を有するがＢ細胞が欠乏しているために関節炎を発症することができないレシピエント（Ｋ／ＢｘＮ−μＭo/o）でより強かった。
【図１Ｃ】Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は関節炎を転移できる。Ｃ：短期間のＫ／ＢｘＮ血清投与の後、臨床的指標として読みとれる関節炎の減退（白丸）。しかし、反復注射後は持続する（黒丸）。
【図１Ｄ】Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は関節炎を転移できる。Ｄ：血清ＩｇＧフラクションの関節炎誘発活性。左パネル：ＲＡＧO/Oマウスに、（開始容量に対して）等量の、関節炎Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清（星）、プロテインＧカラムからのフロースルー（十字）または溶出フラクション（黒丸）を注射した。右パネル：非ＴＣＲ  ｔｇ同腹仔由来ＩｇＧの２倍量では、関節炎を誘導できなかった。
【図２】Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は、関節炎を転移することができる。典型的なＫ／ＢｘＮマウス（左）または関節炎Ｋ／ＢｘＮ動物由来の血清２００μｌの２回注射１０日後の正常マウス（右）由来の膝部分。両ケースにおいて、滑膜内層の肥厚、軟骨まで広がりその破壊が始まっている大規模な下層の炎症性浸潤、および関節腔における多核白血球の存在に注目されたい。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＋Ｅ）染色、１０×対物レンズ。
【図３】６０ｋＤのタンパク質が、Ｋ／ＢｘＮ自己抗体の主なターゲットである。足関節（Ａ）、脾臓（Ｓ）または腎臓（Ｋ）由来の全タンパク質抽出物（ＮＰ−４０抽出）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、エレクトロブロッティングにより移し、Ｋ／ＢｘＮ関節炎マウスまたは対照同腹仔由来の血清でプローブした。主要な６０ｋＤバンドの位置を示す。
【図４】Ｋ／ＢｘＮ血清の６０ｋＤタンパク質ターゲットはグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼである。腎臓抽出物由来の６０ｋＤタンパク質をＫ／ＢｘＮ免疫グロブリンを用いて作製した免疫吸着剤で免疫精製した。トリプシンによる消化の後、ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、いくつかを自動化エドマン分解(degredation)により配列決定した。得られた３つのペプチド配列はグルコース−６−ホスフェートイソメラーゼに属し、これに下線を施す。この同定をさらに確認すべく、４番目のペプチドの分子量を質量分析により決定し、これはＧＰＩのトリプシンフラグメントの質量と完全に一致する(concide)（波下線）。
【図５】関節炎血清は組換えＧＰＩを結合する。ロードしたタンパク質が大腸菌中で産生した組換えＧＰＩ（ＧＳＴとの融合タンパク質として）であったこと以外は、図３におけるようにウエスタンブロットを行った。ブロットを関節炎Ｋ／ＢｘＮまたは対照マウス由来の血清でプローブした。
【図６】ＥＬＩＳＡアッセイは関節炎マウス由来の血清中の抗ＧＰＩ抗体を検出するが、対照中では検出しない。この酵素結合免疫アッセイでは、上述のように産生した組換えＧＰＩを使って、ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコートした。これらを使用して、関節炎または対照マウス由来の血清において、抗ＧＰＩ  ＩｇＧに関して試験した。ここに示した値は、１／１６  ０００の血清希釈で得られたが、ポジティブなシグナルは、１／１，０００，０００程度の希釈でも依然得られた(obtyain)。アッセイ中唯一ネガティブな関節炎マウスは血清を採取したまさにその日に関節炎になった動物であった。
【図７】Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清は関節炎を転移し得る。Ａ：上述のように作製した組換えＧＰＩまたは対照組換えタンパク質（ＧＳＴ単独）を固形支持体に結合し、免疫吸着剤として使用して、Ｋ／ＢｘＮ血清由来抗ＧＰＩ抗体を取り除いた。全ての抗ＧＰＩ  ＩｇＧは、予測したように、結合フラクション中にあった。関節炎を転移する能力は結合フラクション中でのみ見られ、カラムを流れ過ぎるフラクションから除去された。Ｂ：代表的な実験（ここでは、正常マウスにＡに示した精製スキーム由来の様々なフラクションを注射した）。関節炎を評価し、上述のように記録した。
【図８】Ｋ／ＢｘＮ血清の導入は、モノクローナル抗体処置の治療的有効性を試験できる。未処置のＣ５７Ｂ１／６系統の４週齢マウスに、Ｋ／ＢｘＮマウス由来のプール血清（２００μｌ）を０日目と３日目に投与した。また、試験抗体ＢＢ５．１（これはＣ５相補因子をブロックする）を−２日目、−１日目、＋１日目、＋５日目、＋８日目に、またはビヒクルのみを、マウスに注射した。関節炎の発症は、足関節の厚みをその次の日に測定することによって追跡した。モノクローナル抗体で処置したマウスは関節炎から防御されたが、ビヒクルのみを注射したマウスは疾患を呈した。
【図９】モノクローナル抗ＧＰＩ抗体は、未処置マウス中に一緒に注射した場合、関節炎を誘導する。未処置の４週齢のＢａｌｂ／ｃ系統マウスに、リン酸緩衝化生理食塩水に溶解した抗ＧＰＩ  ｍＡｂ  ６．１２１および２．９９由来の精製ＩｇＧ（１ｍｇ）、またはそれぞれ１ｍｇを、０日目と３日目に注射した。関節炎の発症を、その次の日における足関節の厚みを測定することによって追跡した。２種の抗ＧＰＩモノクローナル抗体を合わせて処置したマウスは関節炎を呈したが、いずれかのｍＡｂを単独で注射したものは呈さなかった。
【００３５】
〔実施例１〕
［免疫グロブリンがＫＲＮ関節炎を媒介する］
本発明者らは、ＫＲＮ関節炎発現に必要な遺伝因子を全て保持するがＢリンパ球を欠損するマウスが疾患を免れていることを以前に示した（（Ｋｏｕｓｋｏｆｆら、１９９６）、米国特許第５．６７５．０６０号）。ＫＲＮモデルにおいて関節炎発症が特定のＢ細胞産物に決定的に依存する可能性を検討するために、本発明者らは、Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清の導入により非関節炎マウスに疾患を誘発することを試みた。激しい関節腫脹が関節炎Ｋ／ＢｘＮドナー由来の血清を注射した動物に現れたが、非関節炎ＢｘＮ対照由来の血清を受けたものには現れなかった（図１Ａ）。疾患はＫ／ＢｘＮ血清１００μｌ程度で誘導することができ、再現性を示した。それは非常に迅速に誘発された（血清注射後２日以内ですでに明白な、臨床的スコアまたは足関節の厚みのいずれかにより測定した）。関節炎は、関節炎ドナー由来の血清を、正常マウス、リンパ球欠損ＲＡＧO/O宿主、またはＢ細胞欠損Ｋ／ＢｘＮマウス（Ｋ／ＢｘＮマウス−μＭＴO/O）に注射して得ることができた（図１Ｂ）。これらの結果はＫ／ＢｘＮマウス由来の血清成分が関節炎を与えるのに十分であることを示すが、後者の動物で見られるより悪性の(agressive)疾患はＫ／ＢｘＮ  Ｔ細胞がエフェクター相において恐らく補助的な増強の役割を果たすことを示している。
【００３６】
血清導入により誘導される関節炎は、通常のＫ／ＢｘＮマウスにおいて、該疾患の組織学的特徴全て（炎症細胞の浸潤、滑膜細胞の肥厚化、パンヌス形成、および軟骨破壊を含む）を提示する（図２ＡおよびＢ）。
【００３７】
血清注射により誘導される関節炎は一過性のものである。注射一組を受けたマウスでは、関節の炎症は約１５日後治まり始めた（図１Ｃ）。３０日後には、最初完全に関節炎であった動物においてさえ、関節のうちのいくつかは全く正常に見えた。疾患の一過性は、関節炎マウス由来の血清の反復注射により解消することができた（図１Ｃ）。このことがＲＡＧO/Oレシピエントにさえも当てはまることは、血清化合物の不安定さが、この疾患の一過性の性質の説明となることを示唆している。
【００３８】
関節炎誘発性血清因子は、Ｂ細胞が産生する免疫グロブリン（Ｉｇ）である。Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清のＩｇＧおよび非ＩｇＧ成分への分画後、ＩｇＧフラクションのみがＲＡＧO／O宿主において関節炎を誘導することができる。その能力は、（開始容量に比例して）全血清のものに類似している（図１Ｄ）（それが誘導した疾患の組織学的特徴がそうであるように（データ示さず））。
【００３９】
〔実施例２〕
［病原性免疫グロブリンの分子ターゲット］
従って、Ｂリンパ球により産生されるＩｇはＫ／ＢｘＮマウスにおける関節炎発症の鍵である。次いで、本発明者らは、その分子ターゲットを定めることを試みた。始め、これらが、Ｂ細胞表面上のＡｇ７分子に反応性であるトランスジェニックＴ細胞の相互作用により何らかの形で産生される、関節の特定の成分に指向する抗体であるかもしれないと想像することが可能であった（これは、Ｂ細胞の自己成分に対する正常な耐性を防止するかもしれないし、またはポリクローナルＢ細胞刺激および自己（ことによると重合体の）成分に反応性のＩｇの合成を誘導するかもしれなかった）。本発明者らは、この問題に以下により取り組んだ：
１）Ｋ／ＢｘＮマウス由来Ｉｇの導入後のＲＡＧｏ／ｏマウスの免疫組織化学的分析。これらの分析により、関節の滑膜組織だけでなく多くの他の器官（脾臓、腎臓、肝臓、筋肉；データ示さず）の内膜(lining membrane)において導入Ｉｇの堆積が示された。
２）ウエスタンブロット分析。全タンパク質抽出物をＲＡＧo/oマウスの足関節からおよびいくつかの他の器官から調製し（抽出物におけるＩｇの存在を避けるために）、変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ブロットし、Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清でプローブした。Ｉｇ結合は、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧとのプロービングにより明らかとなった。図３に見られるように、およそ分子量６０ｋＤに単一の主要なタンパク質バンドがこれらのブロット上で検出できた。このバンドは、多数のＫ／ＢｘＮ関節炎マウス由来の血清を用いた時に繰り返し見られたが、対照非関節炎同腹仔由来の血清では見られなかった。他のタンパク質はいくつかの血清で検出されたが一貫性がなく、それらは常に６０ｋＤバンドよりも弱かった。
【００４０】
次いで、本発明者らは、この６０ｋＤタンパク質の同定を試みた。この目的で、Ｋ／ＢｘＮ血清のラージプール由来のＩｇＧを、プロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。この精製したＩｇ（１，５ｍｇ）をＣＮＢｒ活性化セファロースに共有結合した。次いで、このマトリクスを免疫吸着剤として用い、この上に、ＲＡＧo/oマウスの腎臓由来のＮＰ−４０抽出物（５０ｍｇ）をロードした。カラムをよく洗浄し、結合タンパク質を酸性ｐＨで溶出した。これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色により分析した。上述した結果から予測されるように、６０ｋＤの主要バンドが見られた。このバンドを切り取り、タンパク質を（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）に記載されるようにトリプシンによりゲルスライス中で消化し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離した。いくつかのペプチドを同定した。次いで、これらのうち３つをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７０Ａ装置での自動化エドマン分解により配列決定した。この配列をＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース上のＢＬＡＳＴプログラムを用いて公共のデータベースと比較した。３つ全てが、タンパク質グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（別名ホソホヘキソース−イソメラーゼ；ＥＣ  ５．３．１．９；Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース番号Ｐ０６７４５；配列登録番号１２３０７４１；本明細書以下、ＧＰＩと略す）に属することがわかった。これらの位置を図４に示す。得られたペプチドのうち別のものはまた、質量分析（これは、配列（図４）から予測される分子量と正確に一致した）に基づいて、ＧＰＩに属することがわかった。
【００４１】
ＧＰＩの分子量（６２６３６ｋＤ）はＰＡＧＥによる分子量推定の精度内でウエスタンブロットから予測されるＫ／ＢｘＮ血清のターゲットの分子量と非常によく一致している。
【００４２】
ＧＰＩは解糖系の必須酵素である。それは、動物の胚形成の最も初期の段階から生涯の末期まで、いくらか量的ばらつきはあるが、本質的に全ての組織（正常であれ腫瘍性であれ）において発現される酵素である（Ｗｅｓｔら、１９９０；Ｈａｌｌｂｏｏｋら、１９８９；Ｗａｒｎｅｒら、１９８５）。それは通常は細胞質酵素であるが、可溶性ＧＰＩは、血清中に見られ得る；それは腫瘍患者（様々な器官）での上昇が見られるが、それを信頼性のあるマーカーとするような様式でではない（例えば、（Ｎｅｒｉら、１９８３；Ｓｃｈｗｅｍｍｅｒら、１９８５；Ｐａｕｌｉｃｋら、１９８７；Ｇｏｍｍら、１９８８；Ｇｕｒｎｅｙら、１９８６）を参照）。ＧＰＩはまた、「ニューロロイキン」、「成熟因子」または「自己分泌運動因子」（神経栄養性薬剤としてまたは細胞移動もしくは腫瘍細胞分化を促進する薬剤としてしばしば限られた効能を有する分泌因子）として独立して精製されている（Ｇｕｒｎｅｙら、１９８６；Ｆａｉｋら、１９８８；Ｎｉｉｎａｋａら、１９９８；Ｘｕら、１９９６）。ＧＰＩにおける遺伝子の欠如は、溶血性貧血症候群を引き起こす（例えば（Ｋａｎｎｏら、１９９６；Ｂａｒｏｎｃｉａｎｉら、１９９６）を参照のこと）。
【００４３】
ＧＰＩがＫ／ＢｘＮ血清に存在するＩｇによって認識されるタンパク質であることを確認するために、本発明者らは、大腸菌中で組換えＧＰＩを作製した。マウスＧＰＩのコード配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、産物をプラスミドｐＧＥｘ−４Ｔ−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でクローニングした。組換えタンパク質（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合産物）をグルタチオンセファロース４Ｂカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けし、それは予測したサイズを示した（データ示さず）。ゲルをブロットし、ストリップをＫ／ＢｘＮまたは非トランスジェニック同腹仔対照由来の血清でプローブした。図５に見られるように、全てのＫ／ＢｘＮ血清は強く反応したが、対照血清はネガティブであった。これにより、ＧＰＩタンパク質が、Ｋ／ＢｘＮ血清中、抗６０ｋＤ抗体の分子ターゲットであることが確認された。
【００４４】
また、組換えタンパク質を酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）において使用し、異なった年齢のＫ／ＢｘＮマウスの血清中でＧＰＩに対する反応性を検出した。以前記載されているように（Ｋｏｕｓｋｏｆｆら、１９９６）、ＫＲＮ関節炎は２８〜３２日齢で現れる。図６に示すように、Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清中、このアッセイは、バックグラウンドを超える有意な反応性を検出した（１／２０  ０００希釈まで）。そのような反応性は対照同腹仔では見られなかった。従って、このアッセイは、これらのマウスにおける関節炎の良好な診断テストとして役立ち得る。
【００４５】
〔実施例３〕
［抗ＧＰＩ抗体は病原性免疫グロブリンである］
抗ＧＰＩ抗体はＫ／ＢｘＮ血清の病原性の特異性全てを構成し、それらの除去がその血清の病原性能力を排除し得る。この問題に取り組むために、本発明者らは、５ｍｇの組換えＧＰＩまたは対照ＧＳＴタンパク質（上述のように調製）をＣＮＢｒ結合セファロースに結合した。プールしたＫ／ＢｘＮマウス由来の血清をこれらのカラムに連続して付与した。結合タンパク質を酸性ｐＨで溶出し、未処置マウスに導入することによって試験した（出発物質およびフロースルーフラクションのアリコートも）。図７に示すように、全ての関節炎誘発活性がＧＰＩ結合カラムに結合したフラクションで見られ、フロースルーでは見られなかった（後者が免疫グロブリンの大部分を含んでいたにもかかわらず）。これらの結果は、抗ＧＰＩ抗体が実際に、関節炎Ｋ／ＢｘＮマウス由来の血清中の病原性Ｉｇであり、組換えＧＰＩタンパク質に結合し得ることを示している。
【００４６】
これらのデータから、本発明者らは、トランスジェニックマウスにおいて産生される抗ＧＰＩ抗体が関節炎を誘導すると結論づけた。本発明者らは、ＫＲＮレセプターを発現するＴ細胞がＧＰＩ抗原に曝露した抗原提示細胞により特異的に刺激されることがわかった（未公開データ）。これらのＴ細胞は、次いで、抗ＧＰＩ免疫グロブリンを産生するＢ細胞（これは、ＧＰＩを効率的にインターナライズし、従って、非特異的Ｂ細胞よりも容易にＴ細胞からの助けを受ける（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９８５））を刺激する。従って、ＧＰＩまたは関連する循環タンパク質（血液循環中に限定量存在し、従って、免疫系の麻痺耐性を誘導することができない）に対する自己反応性Ｔ細胞が、ＲＡ等のヒトの状態において類似の関節炎誘発性抗体を誘導するかもしれないということが提案される。
【００４７】
〔実施例４〕
関節炎誘発性血清または免疫グロブリンとの同時投与によって可能性のある抗関節炎製剤を試験し得るモデルが、関節炎Ｋ／ＢｘＮ由来の血清の導入により提供される。
【００４８】
原理の証拠として、本発明者らは、Ｋ／ＢｘＮモデルでの関節炎発症を干渉する抗Ｃ５モノクローナル抗体の能力を試験した。本発明者らは、他の関節炎のマウスモデルにおけるおよびヒトＲＡ患者における関節損傷の発生における相補成分（特にＣ５）に関係する先の証拠により、この試薬を選択した（Ｗａｔｓｏｎら、１９８７；Ｗａｎｇら、１９９５）。マウスに、Ｋ／ＢｘＮマウス由来関節炎誘発性血清および同時に抗Ｃ５モノクローナル抗体ＢＢ５．１（Ｃ５活性をブロックすることが公知である（Ｆｒｅｉら、１９８７））を注射した。図８から分かるように、抗Ｃ５モノクローナルを注射したマウスは疾患から防御された。
【００４９】
〔実施例５〕
Ｋ／ＢｘＮマウスの血清中に存在する免疫グロブリンが関節炎を転移することが可能であるならば、未処置のレシピエントに疾患を転移することも可能なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を単離することが可能なはずである。３０および５０日齢のＫ／ＢｘＮマウス由来の脾細胞を、ハイブリドーマ誘導についての標準プロトコール（ｄｅ  ＳｔＧｒｏｔｈおよびＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ、１９８０）に従って融合し、９６ウェルプレート中限界希釈状態のＨＡＴ培地においてハイブリドーマを選択した。組換えＧＰＩを結合抗原としてそして抗マウスＩｇＧを発色試薬として用いて培養上清をＥＬＩＳＡアッセイで試験することによって、ＧＰＩに反応性の免疫グロブリン産生に関してハイブリッドをスクリーニングした。増殖、限界希釈によるクローニング、およびハイブリドーマ株の安定性試験のためにいくつかポジティブなウェルを選択した。抗ＧＰＩ  ＩｇＧを産生する１１個の安定なハイブリドーマ株をそのようにして得た（下の表１を参照）。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
これらのモノクローナルの疾患を転移する能力を、これらのハイブリドーマにより産生されるｍｇ量のＩｇＧのプロテインＧ精製、および未処置のＢａｌｂ／ｃレシピエントへの静脈注射によって、試験した。図９に見られるように、６．１２１および２．９９ハイブリドーマ細胞由来の抗ＧＰＩ免疫グロブリンを一緒に注射することによってレシピエントにおいて関節炎が誘発されたが、単独に注射した場合には疾患を誘導できた抗体はなかった。これらの抗体のうち、いくつかは機能したが（例えば、２．９９および６．１２１抗体）、他は機能しなかった。しかし、本発明に従って関節炎を転移し得る抗体を単離する方法の工程ｅ）により、作用するものを選択することができる。
【００５２】
［参考文献］
【００５３】
【表２−１】
2010252795.tif 000003
【００５４】
【表２−２】
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【００５５】
【表２−３】
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【００５６】
【表２−４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月2日(2010.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節炎がＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に対する抗体の注入あるいは関節炎のＫ／ＢｘＮトランスジェニックマウス由来の血清またはそのフラクションの注入によって誘導されている関節炎の動物。
【請求項２】
請求項１に記載の動物に組成物を投与して関節炎の経過への効果を評価することによって、該組成物の抗関節炎能力を決定する方法。
【請求項３】
以下の工程を包含する請求項２に記載の方法：
ｉ）既知用量の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを第一の非関節炎マウスに投与する工程であって、該マウスはまた、関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンの前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される関節炎誘発性組成物を受けている、工程、
ｉｉ）該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を検出する工程、および
ｉｉｉ）該第一のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過を、同一の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを受けているが、該抗関節炎組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症および関節の破壊の時間経過と比較する工程。
【請求項４】
以下の工程を包含する請求項２に記載の方法：
ｉ）既知用量の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを第一の非関節炎マウスに投与する工程であって、該マウスはまた、関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンの前、一緒に、もしくは後のいずれかで投与された、試験される関節炎誘発性組成物を受けている、工程、
ｉｉ）該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を検出する工程、および
ｉｉｉ）該第一のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度を、同一の関節炎誘発性の血清または免疫グロブリンを受けているが、該抗関節炎組成物に晒されなかった同一遺伝子型の第二のマウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の程度と比較する工程。
【請求項５】
関節炎誘発性の免疫グロブリンがモノクローナル抗体またはその組合せである請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下からなる工程を包含する関節炎を転移し得るモノクローナル抗体を単離する方法：
ａ）関節炎の哺乳動物の脾細胞、好ましくはＫ／ＢｘＮマウスの脾細胞由来のリンパ球からハイブリドーマを調製する工程、
ｂ）ＨＡＴ培地中で限界希釈条件で該ハイブリドーマを選択する工程、
ｃ）ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＧＰＩまたはＧＰＩ様タンパク質に指向する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
ｄ）工程ｃ）で選択されるハイブリドーマを増殖し、クローニングする工程、
ｅ）工程ｄ）で選択されたハイブリドーマによって産生される該抗体を組合せてまたは単独でその関節炎を転移する能力について試験する工程。
【請求項７】
工程ｅ）が、既知用量の該抗体を正常なマウスに投与して該マウスにおける炎症、関節の破壊および四肢の変形の発症を検出することによって達成される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法によって獲得できるモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を産生するハイブリドーマ株。
【外国語明細書】
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2010252795000002.pdf
2010252795000003.pdf
2010252795000004.pdf