(57)【要約】【課題】細胞に対する光の作用をクエンチする又は抑制するクエンチャー又はインヒビターの、光の有害な作用を逆転および／又は抑制する必要のある状況への使用。【解決手段】紫外線光によって生じる障害を抑制する、コラーゲン誘導分子の使用によって、光障害を調節するための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光障害を治療するための皮膚用組成物であって、紫外線によって引き起こされた光障害を調節するために十分な量の光障害モジュレーターを含み、ここで、前記モジュレーターがプロリン、４−ヒドロキシプロリン、又はそれらのアルキルエステルである、組成物。
【請求項２】
前記モジュレーターが、光障害を阻害する作用を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記プロリンアルキルエステルが、１〜２４の炭素原子のアルキル成分を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記プロリンアルキルエステルが、Ｌ−プロリン−ＯＣＨ３又は４−ＯＨ−Ｌ−プロリン−ＯＣＨ３である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
クリーム、ローション、シャンプー、スプレー又はパッチの形態である請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年４月１９日出願の仮出願第６０／３７４，０３３号の優先権を主張する。この出願の全開示をここに参考文献として合体させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、皮膚細胞の光毒性のモジュレーターとして有用な分子および組成物に関する。具体的には、ここでの使用において「モジュレーター」とは、光に対する露出によって生じる、細胞、例えば皮膚細胞、の障害を加速又は遅延させることが可能な物質をいう。
【背景技術】
【０００３】
光、特に、ＵＶＡ光が、皮膚細胞に対して障害を与えることはよく知られている。光毒性障害は、光と、皮膚に対して内因性のある種の化合物との反応を介して起こる。光障害が起こる機序は十分に理解されており、簡単に以下のように説明することができる。皮膚障害の感作物質又は、促進物質とさえ称することが可能な、前記関連分子は、光と反応し、酸素の存在下で、「活性酸素種」、“ＲＯＳ”を成する。発癌や光老化、但しこれらの現象に限定されることのない細胞障害に導く経路に関連しているのは、これらの分子、即ちＲＯＳ分子である。この現象の詳細は、ここにその全部を参考文献として合体させる非特許文献１に見られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ワンドラック（Wondrak）他著、J. Invest. Dermatol. 119: 489-498 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
例えば、皮膚、等に対して内因性の分子が、光毒性の促進に関っているという事実は、標的療法を示唆するものである。詳述すると、もしも、ある化合物が光の不在下では実質的に不活性であるが、光と接触すると、細胞破壊に関与するのであれば、そのような化合物は、標的化された細胞死が望まれる状況において使用可能であろう。そのような状況としては、非限定的に、乾癬、ざ瘡、光線性角化症等の前癌性および悪性過剰増殖性疾患、および当該技術で周知のその他の状態がある。
【０００６】
反対に、光で活性化され得る分子の存在は、細胞に対する光の作用をクエンチする又は抑制する分子が存在することを示唆している。そのようなクエンチャー又はインヒビターは、光の有害な作用を逆転および／又は抑制する必要のある状況に使用することが可能である。そのようなクエンチャー又はインヒビターは、予防的に、更に、治療的に使用することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、以下の開示に見られるように、細胞に対する光毒性の調節が、ここに記載される本発明の焦点である。モジュレーターとは、ここでの使用において、皮膚成分、特にコラーゲン、から誘導可能な分子を指す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例で使用された種々の分子の構造を示す図である。
【図２Ａ】３ヒドロキシピリジン中心的構造を備えた分子が、光に対する露出時に、細胞増殖の抑制を誘発するのに有効であったことを示す結果を示す図である。
【図２Ｂ】３ヒドロキシピリジン中心的構造を備えた分子が、光に対する露出時に、細胞増殖の抑制を誘発するのに有効であったことを示す結果を示す図である。
【図３Ａ】光の存在下において、図１の３−ヒドロキシピリジン化合物の、ケラチン生成細胞であるところのＨａＣａＴ細胞に対して得られた結果を比較する図である。
【図３Ｂ】光の存在下において、図１の３−ヒドロキシピリジン化合物の、ケラチン生成細胞であるところのＨａＣａＴ細胞に対して得られた結果を比較する図である。
【図４Ａ】ここに記載されるＮ−エチル誘導体を使用して、悪性メラノーマに対して得られた結果を示す図である。
【図４Ｂ】ここに記載されるＮ−エチル誘導体を使用して、悪性メラノーマに対して得られた結果を示す図である。
【図５Ａ】使用した細胞が乳癌細胞であることを除いて、図４に類似している図である。
【図５Ｂ】使用した細胞が乳癌細胞であることを除いて、図４に類似している図である。
【図６】ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）解析による、前記Ｎ−エチル誘導体が細胞をアポトーシスに駆り立てることの証拠を示す図である。
【図７】ＢＳＡ−Ｂ６複合体の合成の概略を示す図である。
【図８】図７の複合体が細胞増殖を抑制するのに有効であったことを示す図である。
【図９Ａ】光活性化された分子のエネルギー移動（図中、“ＥＴ”）によるクエンチングの推定機序を示す図であり、“Ｓ＊”は完全に励起された感作物質であり、“Ｓ”は感作物質である。
【図９Ｂ】光活性化された分子のエネルギー移動（図中、“ＥＴ”）によるクエンチングの推定機序を示す図であり、“Ｓ＊”は完全に励起された感作物質であり、“Ｓ”は感作物質である。
【図１０】クエンチャーとしてテストされたプロリン誘導体の構造を示す図。
【図１１】前記プロリン誘導体の、光線感作されたＤＮＡ障害をクエンチングさせる有効性を示すように構成されたアッセイからの結果を示す図である。
【図１２Ａ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１２Ｂ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１２Ｃ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１２Ｄ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１２Ｅ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１２Ｆ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１２Ｇ】ここに記載される化合物が一重項酸素をクエンチすることをいかにして測定したかを示す図である。
【図１３】皮膚細胞光障害を抑制する種々のクエンチャー分子の保護作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下の諸例は、対象体に対する紫外線光の作用を調節する少なくとも１つの物質を投与することによって、光障害を調節する方法に関する本発明の種々の態様を記載するものである。ここでの使用において「モジュレーター」とは、細胞増殖を阻止する必要がある状況において有用な光障害速度を増加する、又は障害速度を低下させる能力を指す。前者のカテゴリーの具体例は、例えば、乾癬、ざ瘡、光線性角化症等の前癌性および悪性過剰増殖性疾患、メラノーマ、非メラノーマ性皮膚癌、乳癌およびその他の癌、当該技術で周知の細胞の増殖を低下させる必要に関連するその他の状態がある。
【００１０】
細胞増殖の低下をもたらす光障害の増加は、そのファルマコフォア構造として、３−ヒドロキシピリジン環を有し、かつ、コラーゲン等の皮膚成分から誘導される少なくとも１つの化合物を使用することによって達成されることが望ましい。そのような化合物の具体例としては、３−ヒドロキシピリジン自身、ビタミンＢ６、そして最も好ましくは、Ｎ−アルキル−３−ヒドロキシピリジン誘導体、例えば、塩、であって、その誘導体のアルキル鎖が、好ましくは直鎖（但しオプションとしては分枝鎖）で、置換可能又は置換不能な、少なくとも２つ、最大で２０の炭素原子を含むものが挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基は、直鎖で２−１０、最も好ましくは、２−５の炭素原子を含む。記載したデーターによって示されたように、上述したように、前記Ｎ−エチル誘導体が特に好ましい。その化合物の皮膚内での滞留時間を長くする長いＮ−アルキル誘導体が、特定の状況、例えば、それに限定されるものではないが、その化合物の局所供与が望ましい状況、等においては好適であるかもしれない。
【００１１】
これらの分子は、標準的な薬用成分およびキャリア、例えば、クリーム、ローション、シャンプー、スプレー、パッチ、等に使用されているもの、或いは、皮膚に対して治療剤を投与するために使用される公知の薬剤送達システム、と組み合わせることができる。
【００１２】
標的化治療が特に望ましい場合は、標的化送達を改善するために、前記活性成分を、より大きなものとすることが可能な第２の分子に付着させることができる。そのような大きな分子としては、例えば、抗体、レセプターに対するリガンド、ホルモン、および、細胞を標的化する他の分子および／又は細胞によって選択的に取り込まれる他の分子が挙げられる。
【００１３】
本発明のもう１つの特徴は、光障害のクエンチング性質である。既に示したように、プロリンとその誘導体は光障害の有効なクエンチャーである。特に有効であるのは、Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３や４−ＯＨ−Ｌ−プロリン等のプロリンのアルキルエステルであるが、既に示したように、その他の化合物も有用である。その利用態様は、エンハンサーについて記載したものと全く同じである。
【実施例】
【００１４】
例１
コラーゲンに対する前記内因性皮膚成分の成分が、光毒性障害の原因物質および／又はその抑制物質である可能性が非常に高いと考えられた。従って、それらの分子を調べた。
【００１５】
ピリジノリンは、コラーゲン分子の架橋に関わるアミノ酸であり、その光毒性における役割について調べた。ピリジノリンの構造は周知であり、それを、ここに記載されるその他の分子の構造と共に、図１に示す。
【００１６】
ＨａＣａＴケラチン生成細胞とヒトＣＦ３線維芽細胞とに対して一連の実験を行った。これらの実験において、細胞サンプルを、５００μＭのピリジノリンと、ピリジノリンに関連する構造を有するエラスチン構成要素であるデスモシン５００μＭと又は５００μＭのビタミンＢ６（ピリドキシン）とに接触させた。コントロールにはなんら化合物を添加しなかった。１セットの実験において、前記細胞は、外部光源を受けなかった。別セットの実験において、それらは、ＵＶＡ光を３．３Ｊ／ｃｍ２、受けた。前記ＣＦ３線維芽細胞は、２．３Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ光と０．１２Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢ光との組み合わせである、人工太陽光（solar stimulated light）、“ＳＳＬ”、を受けた。その結果を、コントロール（化合物添加無し、光無し）に対する細胞増殖の百分率として図２に示す。測定値は、刺激の３日後に得た。
【００１７】
これらの結果は、ピリジノリンは抗増殖性作用を有するが、光の存在下においてのみこの作用を有することを示した。ビタミンＢ６は、細胞増殖の抑制において劇的に高い有効性を示した。
【００１８】
ペルオキシド捕捉剤であるカタラーゼを４００μ／ｍｌ添加した第２セットの実験を行った。前記カタラーゼはビタミンＢ６感作に対して全く何の作用も有さず、このことは、この分子についてはペルオキシド形成以外の機序が関与していることを示唆するものであった。
【００１９】
これらの結果に基づき、前記化合物の構造を、これらの分子に共通する構造的特長が有るか否か、或いは、ファルマコフォアを同定することが出来るか否かを調べるために、比較した。ビタミンＢ６とピリジノリンとの両方が３−ヒドロキシピリジン中心的構造を共有していることが銘記され、このことは、次ぎのシリーズの実験を示唆した。
【００２０】
例２
上述したものに類似する実験において、複数のヒドロキシピリジン誘導体の集団を調べた。簡単に説明すると、２，３および４−ヒドロキシピリジンを、Ｎ−エチル−３−ヒドロキシピリジンと同様に、テストした。全ての構造を図１に示す。
【００２１】
前述したＨａＣａＴ細胞、を増殖抑制アッセイでテストした。細胞サンプルは、前にリストした４種類の化合物の一つを同量受け、前述したように、これらを、人工太陽光（“ＳＳＬ”）、又は同様に前述したように、ＵＶＡ光のみのいずれかと接触させるか、接触させなかった。
【００２２】
その結果を図３に示す。
【００２３】
コントロールと比較して、３−ヒドロキシピリジンは抑制作用を有し、Ｎ−エチル誘導体は殺傷作用を有していた。前記Ｎ−エチル誘導体も、ＵＶＡとＵＶＢとの両方の存在下で機能したが、これに対して、３−ヒドロキシピリジンは、ＵＶＢ光の存在下で細胞増殖抑制物質として機能した。
【００２４】
例３
上述した実験に続いて、悪性メラノーマ細胞（Ｇ−３６１細胞）と悪性乳癌細胞（ＭＣＦ−７）とを使用した追加の実験を行った。これらの実験において、ＵＶＡ光を９．９Ｊ／ｃｍ２として、前述したＮ−エチル誘導体を、種々の濃度でテストした。前記処理の２日後に生存度を測定した。コントロールとして、Ｎ−エチル誘導体のみ、と、ＵＶＡ光のみとで実験を行った。
【００２５】
図４（Ｇ−３６１細胞）と図５（ＭＣＦ７細胞）に図示されている結果は、前記組み合わせによって顕著な細胞障害性がもたらされたことを示している。
【００２６】
前記Ｇ−３６１細胞をＦＡＣＳによって分析したところ、そのデーターは、これらの細胞がプログラム細胞死、即ち、アポトーシス、に追いやられたことを示した。このことは、図６に見られ、ここで、アポトーシスマーカー、アネキシンＶ、及び、ヨウ化プロピジウムでの染色は、Ｎ−エチル誘導体が使用された時、特に、ＵＶＡが３．３Ｊ／ｍ２の濃度の時、染色された細胞の顕著な増加を示した。
【００２７】
例４
本発明の有効物質は小さな分子である。小分子は有用ではあるが、時に、そのような分子をより大きな分子、例えば、タンパク質、と複合化することが望ましい。これによって、もしもそれが例えば、細胞上の特定のマーカーに対して特異的な抗体、特定のレセプターに対するリガンド、核会合タンパク質（nuclear associated protein）等、と複合化される場合に、その小分子の標的化が促進される。
【００２８】
このアプローチの実用可能性をテストするために、ビタミンＢ６分子を、ウシ血清アルブミンに結合させた。簡単に説明すると、前記ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）分子のリジン側鎖を、３５０ｍｇのそれと、ピリドキサールアルデヒド（６４ｍｇ）である、ビタミンＢ６とを反応させることによって共有結合修飾して、シッフ塩基を形成した。これに対して、前記シッフ塩基を、１．５ｍｌの０．２５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＮａＣＮＢＨ３（５８ｍｇ）で、一晩３７℃で還元し、広範囲に透析した（４８時間、４℃）。その結果得られたＢＳＡ−Ｂ６付加体を、質量分析法と蛍光分光法とによって特徴付けた。次に、前記タンパク質を、凍結乾燥し、以下の例に使用した。図７にその合成を図示している。前記分光法の作業によって、平均で、各ＢＳＡ分子が５−６のpyroxidal分子と複合化したことが示された。
【００２９】
例５
例４に記載した複合物の抗増殖作用を、何も添加しないか （コントロール）、又はＢＳＡもしくは前記ＢＳＡ−Ｂ６複合物を添加して、そして、ＨａＣａＴケラチン生成細胞のサンプルをＳＳＬで処理するか、もしくは処理しないことによってテストした。前記ＢＳＡとＢＳＡ−Ｂ６とを、１０ｍｇ／ｍｌ添加し、ＳＳＬは２．３Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡと０．１２Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢとから構成されたものであった。処理の三日後、増殖を、コールターカウンターと標準法を使用して測定した。
【００３０】
図８に図示されているその結果から、前記ＢＳＡ−Ｂ６複合物がケラチン生成細胞の増殖を抑制するのに非常に有効であったことがわかる。
【００３１】
例６
上述の例１−５に記載したデーターは、細胞破壊を促進する分子に関するものである。しかし、これは必ずしも望ましいものではなく、この例と、以下の例とにおいては、このプロセスを抑制する分子について説明する実験が記載される。これらの分子を、以降、光励起状態のクエンチャー、又は“ＱＰＥＳ”と称する。これらの化合物は、その後、上述したようなタイプの細胞死を誘発することになる分子の光励起状態を失活させる能力によって特徴付けられる。
【００３２】
これらの分子が機能する推定機序を図９に示すが、本出願人は、この推定機序によって限定されることを望むものではない。簡単に説明すると、分子のＵＶ照射によって、電子の励起（励起状態は図中“Ｓ＊”によって示されている）と、励起された一重項の形成とが起こり、項間交差（ＩＳＣ）後に、三重項状態となる。これらが、細胞の光障害の重要な中間体である。ＱＰＥＳ化合物は、エネルギー移動（“ＥＴ”）による光障害に関連する前記化合物の励起エネルギーを受け入れ、基底状態に緩和して戻る光毒性中間物を中和し、そのエネルギーを無害な振動エネルギーまたは熱を介して散逸させることによってこの作用を無効にする。前記ＱＰＥＳ化合物自身は、このプロセスにおいて枯渇せず、複数の光障害分子を中和する。
【００３３】
例７
ΦＸ１７４プラスミドは、人工太陽光からの照射と、ＵＶ感作物質として作用するＡＧＥ−色素濃縮（enriched）タンパク質との組み合わせの作用によってのみ開裂されることがよく知られている。ＡＧＥ−ＢＳＡ（「終末糖化産物」改変ウシ血清アルブミン）は、前述したタイプの内因性皮膚感作物質の蓄積のモデルである。これを示すアッセイの詳細は、ここにその全部を参考文献として合体させるワンドラック（Wondrak）他 Photochem. Photobiol. Sci. 1:355-363(2002)に見られる。このアッセイをこの例において使用した。
【００３４】
プラスミドの開裂を、サンプルを１％アガロースゲル上にランすることによって可視化し、障害、即ち、閉環形状（非障害状態）からの緩和された開環形状の形成、を、濃度測定によって定量化し、これによって、化合物の保護作用の評価を可能とした。
【００３５】
ＡＧＥ−開裂は、酸素の不在下で進行し、抗酸化物によっては完全に抑制することができない。従って、もしもある化合物がプラスミド開裂を抑制するとしても、それを単純に抗酸化物と見なすことはできない。これに対して、上述したように、励起状態のクエンチングによる抑制を、推定しなければならない。
【００３６】
結果を下記の表に示す。光励起状態のクエンチャーとして知られている、細胞毒性ＮａＮ３は、有効であった。そして、グルタチオン（“ＧＳＨ”）、Ｄ−ペニシラミン、およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン（“ＮＡＣ”）を含むチオール化合物も同様であった。
【００３７】
このアッセイは、例７に記載した原理を証明するものである。
【００３８】
【表１】
2010163461.tif 000002
【００３９】
このアッセイを使用して、一連のプロリン関連化合物とプロリンとをテストした。これらの化合物の構造を図１０に示す。図１１にこれらの実験結果を示す。前記テスト化合物は１００ｍＭ、添加され、前記プラスミドを、ＵＶＡ光（２．３Ｊ／ｃｍ２）とＡＧＥ−ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）の一方、又は両方と接触させるか、又は、これらのいずれとも接触させなかった。
【００４０】
Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３が、これらのクエンチャー中最も強力であったが、すべてが有効であった。
【００４１】
例８
上述したように、光励起された酸素、即ち、基底状態の、三重項酸素又は“３Ｏ２”のスピン対相同物、である一重項酸素、“１Ｏ２”が、光毒性に関与していることが知られている最も重要な励起状態の分子である。特に、細胞ＤＮＡ、膜脂質、およびケラチンやコラーゲン等の構造タンパク質、に対する光酸化障害における一重項酸素の関与は、十分に記載されてきた。一重項酸素を失活させることにおける、上述したプロリンおよびプロリン誘導体の有効性を測定するためのアッセイが開発された。ここにその全体を参考文献として合体させるライオン（Lion）他，Nature 263:442-443(1976)を参照。
【００４２】
トルイジンブルー（“ＴＢ”）は、照射されると、１Ｏ２を発生することがよく知られている。公知の方法において、１Ｏ２は、２，２，６，６，テトラメチルピペリジン又は“ＴＥＭＰ”、を介して捕捉される。安定したフリーラジカル、即ち、２，２，６，６，テトラメチルピペリジン−１−オキシル、又は“ＴＥＭＰＯ”が形成され、これをその後、１Ｏ２生成の判定として測定することができる。このアッセイの重要点は、他の反応性酸素種は、ＴＥＭＰと反応してＴＥＭＰＯを生成しないという事実であり、これによって、このアッセイは、１Ｏ２の形成に対して特異的なものとなる。
【００４３】
ＴＥＭＰ，ＴＢおよび上述した分子の１つを、組み合わせ、それを可視光で５分間、３６Ｊ／ｃｍ２の総線量、照射した。詳述すると、１００μＭのＴＢと、７ｍＭのＴＥＭＰと２０ｍＭのテスト化合物を、１００μlの容積（１．５×９０ｍｍ）の石英製キャピラリーチューブ内で、リン酸緩衝食塩水中にて組み合わせた。ＴＥＭＰＯフリーラジカルシグナルを、市販の装置を使用して電子常磁性共鳴を介して測定した。テスト化合物の不在下で、但し、光の存在下でのシグナルと、標準ＴＥＭＰＯ共鳴シグナルとを測定するために、コントロールも実行した。
【００４４】
図１２のパネルＡ−Ｇに示すその結果は、以下のデーターを提供する。パネルＡは、ＴＥＭＰＯシグナルを生成する完全な一重項酸素生成システムを図示している。パネルＢは、市販のＴＥＭＰＯリファレンスのスピンシグナルを図示している。パネルＣは、パネルＤ−Ｇに観察される作用が、テスト化合物のＴＥＭＰＯとの直接反応によって引き起こされたものではないことを示している。パネルＤとＧとは、プロリン誘導体による一重項酸素のクエンチングを示し、プロリンのカルボキシ基の誘導体化又は４−ヒドロキシル化はクエンチング活性に対して影響しないことを証明している。更に、それは、前記化合物の全てが有効なクエンチャーであったことを示している。
【００４５】
前記クエンチング分子が物理的なクエンチャーであり、前記反応において消費されなかったことを示すために、アミノ酸分析の標準逆相ＨＰＬＣ法を使用して、可視光（３６Ｊ／ｃｍ２）に対して長時間露出させた前と後とに、ＰＢＳ中のＴＢとＬ−Ｐｒｏとの混合物のアミノ酸含有量を測定した。ピーク、リテンションタイム、又はＡＵＣ値のいずれにも変化は観察されず、１Ｏ２に対する化学的不活性が示され、反応消費ではなく、物理的なクエンチングの証拠が提供された。
【００４６】
例９
これらの実験は、クエンチャーであることが証明された前記化合物が皮膚細胞を保護するのに有効であるか否かを調べるために構成された。
【００４７】
培養皮膚線維芽細胞（ＣＦ３細胞）を、ｉｎ  ｓｉｔｕで色素感作によって形成された１Ｏ２からの光酸化ストレスに対して露出させた。
【００４８】
簡単に説明すると、５０，０００の線維芽細胞を、３５ｍｍの培養皿に播種し、次に、１日後、ＴＢ（ハンクス緩衝塩水溶液中で３．３μＭ）の存在下又は不在下で、可視光（１０．８Ｊ／ｃｍ２を提供する９０秒間の露出）で処理した。処理の５分間後、細胞を、リン酸緩衝食塩水で洗浄した。照射中、前記培地に、テスト化合物（１０ｍＭ）を存在又は不在とした。３日間の培養後、細胞を、トリプシン処理によって収集し、コールターカウンターを使用して計数した。
【００４９】
その結果、ＴＢと光との組み合わせによって細胞増殖は高度に（７０％）抑制されたが、これらのいずれか一方のみではそうならなかったことが示された。図１３に図示され、下記の表に数値化されているように、前記化合物Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３と４−ＯＨ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３は、非常に明白な保護作用を示した。
【００５０】
【表２】
2010163461.tif 000003
【００５１】
保護は次の式によって決定した。
【００５２】
【数１】
2010163461.tif 000004
【００５３】
これらの実験におけるより活性度の高い化合物はエステル化合物であった。図１０に図示されているように、これらの化合物のｌｏｇ  Ｐ値を周知の方法を使用して決定した時、前記エステルは、非エステル型化合物よりも遥かに高いｌｏｇ  Ｐ値を有していた。高いｌｏｇ  Ｐ値は、より高い親油性を示すので、それらの優れた効果は、皮膚の中でより長い滞留時間を維持して細胞膜と反応することによるためかもしれない。約−１．００から約＋８．００のｌｏｇ  Ｐ値を有するプロリンエステル誘導体は、特に有用であると予想される。
【００５４】
例１０
上述した化合物４−ＯＨ−Ｌ−プロリンメチルエステルは、新規なグループの化合物を代表する新規な化合物であると考えられる。この化合物の合成、このファミリーの他のメンバーの合成のガイドラインについて次に記載する。
【００５５】
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを、二炭酸ｄｉ−ｔｅｒｔ−ブチルと、１Ｎ  ＮａＯＨ中にて、５℃で３０分間反応させ、その後、室温で、更に３．５時間、攪拌した。
【００５６】
それによって得られた保護された４−ヒドロキシプロリンを、次に、ジメチルホルムアミドと炭酸カリウムおよびヨウ化メチルと、０℃で３０分間反応させ、その後、一時間、室温で攪拌して前記メチルエステルを産生した。
【００５７】
次に、トリフルオロ酢酸と標準法を使用して、二炭酸ｄｉ−ｔｅｒｔ−ブチルの脱保護
を行った。
【００５８】
この反応における重要成分はヨウ化メチルである。前記ハロゲン化アルキルを変えることによって、１−３０、好ましくは１−２６の炭素原子を有するアルキル基を含むエステルを得ることができる。
【００５９】
以上の諸例は、対象体に対する紫外線光の作用を調節する少なくとも１つの物質を投与することによって、光障害を調節する方法に関する本発明の種々の態様を記載するものである。ここでの使用において「モジュレーター」とは、細胞増殖を阻止する必要がある状況において有用な光障害速度を増加する、又は障害速度を低下させる能力を指す。前者のカテゴリーの具体例は、例えば、乾癬、ざ瘡、光線性角化症等の前癌性および悪性過剰増殖性疾患、メラノーマ、非メラノーマ性皮膚癌、乳癌およびその他の癌、当該技術で周知の細胞の増殖を低下させる必要に関連するその他の状態がある。
【００６０】
細胞増殖の低下をもたらす光障害の増加は、そのファルマコフォア構造として、３−ヒドロキシピリジン環を有し、かつ、コラーゲン等の皮膚成分から誘導される少なくとも１つの化合物を使用することによって達成されることが望ましい。そのような化合物の具体例としては、３−ヒドロキシピリジン自身、ビタミンＢ６、そして最も好ましくは、Ｎ−アルキル−３−ヒドロキシピリジン誘導体、例えば、塩、であって、その誘導体のアルキル鎖が、好ましくは直鎖（但しオプションとしては分枝鎖）で、置換可能又は置換不能な、少なくとも２つ、最大で２０の炭素原子を含むものが挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基は、直鎖で２−１０、最も好ましくは、２−５の炭素原子を含む。記載したデーターによって示されたように、上述したように、前記Ｎ−エチル誘導体が特に好ましい。その化合物の皮膚内での滞留時間を長くする長いＮ−アルキル誘導体が、特定の状況、例えば、それに限定されるものではないが、その化合物の局所供与が望ましい状況、等においては好適であるかもしれない。
【００６１】
これらの分子は、標準的な薬用成分およびキャリア、例えば、クリーム、ローション、シャンプー、スプレー、パッチ、等に使用されているもの、或いは、皮膚に対して治療剤を投与するために使用される公知の薬剤送達システム、と組み合わせることができる。
【００６２】
標的化治療が特に望ましい場合は、標的化送達を改善するために、前記活性成分を、より大きなものとすることが可能な第２の分子に付着させることができる。そのような大きな分子としては、例えば、抗体、レセプターに対するリガンド、ホルモン、および、細胞を標的化する他の分子および／又は細胞によって選択的に取り込まれる他の分子が挙げられる。
【００６３】
本発明のもう１つの特徴は、光障害のクエンチング性質である。既に示したように、プロリンとその誘導体は光障害の有効なクエンチャーである。特に有効であるのは、Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ３や４−ＯＨ−Ｌ−プロリン等のプロリンのアルキルエステルであるが、既に示したように、その他の化合物も有用である。その利用態様は、エンハンサーについて記載したものと全く同じである。
【００６４】
本発明のその他の特徴は、当業者にとって明らかであろう。従って、ここでは繰り返す必要はない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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