(57)【要約】【課題】  多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖、特にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する新種菌株およびこれに生成される多糖を提供する。【解決手段】  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）である、多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖。これらによれば、β−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有する多糖を工業的に生産することができる。【選択図】  図３
2010252680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−７３６）である、多糖生成能を有する新規微生物。
【請求項２】
新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−７３６）より生成される、多糖。
【請求項３】
多糖がβ−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有する多糖である、請求項２に記載の多糖。
【請求項４】
多糖がグルカンである、請求項２または請求項３に記載の多糖。
【請求項５】
グルカンがβ−グルカンである、請求項４に記載の多糖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖、特にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する新種菌株およびこれに生成される多糖に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖とは、単糖分子がグリコシド結合によって重合した糖をいい、食品としてのほか、繊維、製紙、化粧品、歯磨剤、接着剤、医療用材料などの広い範囲で利用される重要な物質群である。一般に親水性を有するが、水に不溶性のものと可溶性のものとがあり、いずれも生物により生成され、例えば、細胞壁、外骨格、エネルギー貯蔵物質、あるいは分泌物質などとして存在する。
【０００３】
多糖のうち、特にβ−グルカンは、マクロファージ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、あるいはキラーＴ細胞を活性化させ、免疫力や抵抗力を増強させる作用を有することが知られている。体内の免疫力や抵抗力を増強させることにより、体内に侵入した細菌や異物の排除能を高め、発病を抑制する効果を得られるとともに、アレルギー反応を鎮め、ガンなどの腫瘍を抑える効果も期待できる。さらには、血糖値の低下、利尿作用、血圧調整、血中コレステロールや中性脂肪値の低下などの効果も期待できることから、さまざまな臨床試験がなされている。
【０００４】
これに伴い、従来、β−グルカンをはじめとするさまざまな多糖を工業的に生産しようとする試みがなされている。すなわち、多糖を生成する新規微生物をスクリーニングして、この新規微生物に多糖を生産させる方法や、多糖を生成する微生物の培養条件を改良して多糖の生産効率を向上させる方法などの研究開発がなされている。例えば、新規微生物に多糖を生産させる方法として、特開２００４−０４９０１３号公報には、β−グルカンを菌体外に分泌生産するアウレオバシジウム属の新規菌株が開示されている（特許文献１）。また、多糖を生成する微生物の培養条件を改良して多糖の生産効率を向上させる方法として、特開２００８−０４３３０８号公報には、マクロホモプシスを用いたマクロホモプシスガム製造の改良法が開示されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−０４９０１３号公報
【特許文献２】特開２００８−０４３３０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、β−グルカンをはじめとするさまざまな多糖を工業的に生産するためには、さらなる研究開発が望まれる。
【０００７】
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであって、多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖、特にＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する新種菌株およびこれに生成される多糖を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する新種菌株が多糖を生成することを見いだし、下記の発明を完成した。
【０００９】
（１）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−７３６）である、多糖生成能を有する新規微生物。
【００１０】
（２）新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−７３６）より生成される、多糖。
【００１１】
（３）多糖がβ−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有する多糖である、（２）に記載の多糖。
【００１２】
（４）多糖がグルカンである、（２）または（３）に記載の多糖。
【００１３】
（５）グルカンがβ−グルカンである、（４）に記載の多糖。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖によれば、β−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有する多糖を工業的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】相同性検索により見つかったＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷとＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの塩基配列のアラインメントを示す図である。図中、※印はこれら配列の一致する箇所を示し、四角で囲んだ部分は配列が異なる箇所を示す。
【図２】培地中の炭素源の違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕ ｍ ＪＷの増殖数の違いを示す図である。
【図３】培地中の炭素源の違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの多糖生成量の違いを示す図である。
【図４】培地中のショ糖濃度の違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの増殖数の違いを示す図である。
【図５】培地中の窒素源の違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの増殖数の違いを示す図である。
【図６】培地中の窒素源の違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの多糖生成量の違いを示す図である。
【図７】培地のｐＨの違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの増殖数の違いを示す図である。
【図８】培地のｐＨの違いによるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの多糖生成量の違いを示す図である。
【図９】Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの増殖過程における培地のｐＨ変化を示す図である。
【図１０】トリフルオロ酢酸による多糖の加水分解物を薄層クロマトグラフィーにより展開した結果を示す図である。
【図１１】α−アミラーゼによる多糖の加水分解物を薄層クロマトグラフィーにより展開した結果を示す図である。
【図１２】セルラーゼまたはデキストラナーゼによる多糖の加水分解物を薄層クロマトグラフィーにより展開した結果を示す図である。
【図１３】ラミナリナーゼによる多糖の加水分解物を薄層クロマトグラフィーにより展開した結果を示す図である。
【図１４】セルラーゼおよびラミナリナーゼによる多糖の加水分解物を薄層クロマトグラフィーにより展開した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖について詳細に説明する。本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−７３６）である。
【００１７】
本発明において用いられる「微生物」は、「菌」、「菌株」、「微生物株」あるいは「細菌」と交換可能に用いられる。従って「新規微生物」は、例えば「新規菌株」としても表すことができる。後述の実施例に示すように、多糖を生成する能力を有し、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する公知の種に含まれない新規微生物が、発明者らにより発見された。その新規微生物は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷと命名され、平成２１年４月２０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７３６が与えられているため、この機関より入手することができる。
【００１８】
本発明に係る新規微生物は、国立大学法人北海道大学の農場に自生しているゴボウ実生の根圏土壌から単離されている。また本願においては、本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が開示されている（配列番号１）。従って最も簡易には、当業者であれば、この配列情報を基にして、本発明に係る新規微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするプローブやプライマーを合成し、ゴボウあるいはその他の植物の根に付着した土壌に目的の菌が存在するかを検出し、それを単離することもできる。特にその１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により特異的に増幅し、定量することもできる。
【００１９】
さらに、例えば、保存性の高いｒＲＮＡ領域を増幅して得られる核酸混合物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）により分離して、分離した核酸の配列を決定し濃度を測定することにより、その試料中の、同一試料中に存在する同種ないし近縁の微生物群における各種微生物の存在比を示す菌相構造を知ることも可能である。すなわち、本発明において「１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする検出」に言及する場合は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを用いた検出のほか、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としたＰＣＲなど、当該遺伝子の存在を知るためのあらゆる検出法が含まれる。
【００２０】
また、本発明に係る新規微生物には、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷのほか、自然にもしくは人工的手段によって変異させて得られる変異株および子孫であっても、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷを有するものはすべて本発明に係る微生物に包含される。
【００２１】
本発明に係る新規微生物の培養には、特に限定されず、当業者によって適宜選択することができる培地や緩衝液を用いることができる。そのような培地としては、例えば、ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ (Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ)、ＲＰＭＩ１６４０ 、ＡＩＭ−Ｖ、ＡＤＣ、ＬＰＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＢＧＪ、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｌ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ−１５）、ＭｃＣｏｙ５Ａ、Ｍ１９９、Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、ＭＷ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＷ寒天平板培地などを挙げることができる。さらに、必要に応じて、公知の構成の培地成分や、アール平衡塩溶液、ハンクス平衡塩溶液、ダルベッコＰＢＳ、スピナー塩溶液などの公知の平衡塩類組成成分、種々の細胞増殖因子、抗生物質、ビタミン類、ホルモン類、ｐＨ調整剤、血清、その他生物由来成分などを加えることができる。また、緩衝液としては、例えば、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１−ｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ゼラチン水溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などを挙げることができる。
【００２２】
また、本発明において用いる培地の組成を適宜変更して、本発明に係る新規微生物の増殖や多糖生成についての至適条件を検討することができる。例えば、培地に含まれる炭素源や窒素源を適宜変更することにより、これら至適条件を検討することができ、このような炭素源としては、例えば、ショ糖、ブドウ糖、乳糖、デキストラン、麦芽糖、果糖などを挙げることができ、窒素源としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、尿素、硝酸ナトリウムなどを挙げることができる。
【００２３】
なお、本発明において用いる培地のｐＨは、好ましくはｐＨ３〜１１であり、より好ましくはｐＨ４〜９であり、さらに好ましくはｐＨ５またはｐＨ８である。
【００２４】
次に、本発明に係る多糖は、新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−７３６）より生成される。
【００２５】
すなわち、本発明に係る多糖は、新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷが生産するという点で特徴があるが、この多糖は、β−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有しており、この多糖自体がグルカンである場合や、さらにはβ−グルカンである場合があることから、新規な多糖たり得る。
【００２６】
本発明に係る多糖の構造解析は特に限定されず、当業者によって適宜選択することができる方法や試薬、装置などを用いることができるが、例えば、塩酸、硫酸、フルオロ酢酸などの各種酸や、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、デキストラナーゼ、アミロプルラナーゼ、β−グルカナーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ）、ヘミセルラーゼ、アラバナーゼ、ペクチナーゼ、フィターゼ、キシラナーゼなどの各種加水分解酵素を用いて加水分解し、得られた加水分解物を薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＬＣ）などの各種クロマトグラフィーや、ガスクロマトグラフ質量分析法（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＧＣ−ＭＳ）などの各種質量分析法を用いて、構成する単糖やオリゴ糖あるいはそれらの結合などを解析することができる。また、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＮＭＲ）などを用いて、この多糖の構造を解析することができる。
【００２７】
本発明に係る多糖の分子量の測定は特に限定されず、当業者によって適宜選択することができる方法や試薬、装置などを用いることができるが、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて測定することができる。ゲルろ過クロマトグラフィー法による測定は常法に従って行えばよく、特に限定されるものではないが、例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ． Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、１９６４年，第２巻，第８３５−８４３頁などを参照することができる。
【００２８】
本発明に係る多糖の粘度の測定は特に限定されず、当業者によって適宜選択することができる方法や試薬、装置などを用いることができるが、例えば、Ｂ型粘度計を用いて測定することができる。Ｂ型粘度計を用いた測定のとしては、例えば、２５℃に調整したスリープに本発明に係る多糖の水溶液を適量充填し、５分間静置した後、適当な回転数で２０秒間測定を行うことにより粘度を測定することができる。
【００２９】
本発明に係る多糖の用途は、適宜選択することができ、例えば、医薬組成物、食品添加物、皮膚外用剤などの用途に適用し得る。
【００３０】
医薬組成物として用いられる場合、その製剤化には公知の方法を用いることができる。また、投与形態は適宜選択することができ、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００３１】
食品添加物として用いられる場合、その形態は適宜選択することができ、例えば、本発明に係る多糖をそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。また、食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。
【００３２】
皮膚外用剤として用いられる場合、その剤型は適宜選択することができ、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布した製剤などを挙げることができる。また、本発明に係る多糖に、例えば、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤などの、通常の皮膚外用剤の原料として使用されているものを適宜配合し、皮膚外用剤を製造することができる。また、抗炎症性の皮膚外用剤原料であるグリチルレチン酸などの甘草抽出成分、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ−α−トコフェロールおよびその誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６などとともに用いることができる。
【００３３】
以下、本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３４】
本実施例で用いる無機塩溶液、ならびにこれを用いたＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＷ培地）およびＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙ’ｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｄｉｕｍ寒天平板培地（ＭＷ寒天平板培地）の組成は、以下のとおりである。
【００３５】
（無機塩溶液の組成；水溶液１Ｌ中）ｐＨ７．２
リン酸二水素カリウム                    ５０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物                ２５ｇ
塩化ナトリウム                          ２５ｇ
硫酸鉄七水和物                            １ｇ
四酸化モリブデン二ナトリウム二水和物      １ｇ
硫酸マンガン四水和物                      １ｇ
この無機塩溶液を１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に合わせた。また、無機塩溶液は常温保存可能であるが、無機塩が非常に溶解しづらいので、使用時に再混合した。
【００３６】
（ＭＷ培地の組成；培地１００５ｍＬ中）ｐＨ６．２
無機塩溶液                                ５ｍＬ
炭酸カルシウム                        １００ｍｇ
酵母エキス                              ５０ｍｇ
ショ糖                                  １０ｇ
調製した無機塩溶液をイオン交換水に加えて超音波処理を行い、塩を溶解させた後、炭酸カルシウム、ショ糖および酵母エキスを加えて溶解させた。次いで、０．４５μｍのＰＴＦＥ膜（ＯＭＮＩＰＯＲＥ；ミリポア社）で濾過を行った。濾過した培地を２ｍｏｌ／Ｌ硫酸でｐＨを６．２に合わせた後、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけて殺菌した。
【００３７】
（ＭＷ寒天平板培地の組成；培地１Ｌ中）ｐＨ７
ＭＷ培地                                １Ｌ
寒天                                    １５ｇ
オートクレーブにかける前のＭＷ培地に寒天を加え、１２１℃で１５分間オートクレーブにかけて殺菌した。その後シャーレに流し入れて冷まし、ＭＷ寒天平板培地を作製した。
【００３８】
＜実施例１＞新規菌株の同定
本発明者らは、国立大学法人北海道大学の農場に生育しているゴボウの根に付着した土壌から、以下の方法にて新規菌株を単離し、同定した。
【００３９】
（１）菌株の単離
【００４０】
国立大学法人北海道大学の農場に自生しているゴボウ実生の根に付着した土壌をサンプルとして採取し、これを根ごと滅菌水１０ｍＬに入れ、常温下でボルテックスミキサー（サイエンティフィックインダストリーズ社）により１分間攪拌した後、１０分間静置した。次いで、この操作により得た上清１００μＬをＭＷ寒天平板培地（ｐＨ７）に播き、コンラージ棒で塗布した後、２５℃で４日間培養した。出現したコロニーのうち、周囲に粘着性物質の生成が確認されるポリマー形成の良好な菌株を目視により選抜して白金耳で拾った。これをｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ社）上に画線し、２５℃で２日間培養することを、単一のコロニーになるまで繰り返して、菌株を単離した。単離した菌株をＭＷ培地５ｍＬに植菌し、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で２４時間振盪培養した後、得られた菌株をＬ−乾燥した。
【００４１】
（２）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの同定
本実施例（１）でＬ−乾燥した菌株を株式会社テクノスルガ・ラボにおいてｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ社）に画線し、３０℃にて２４時間培養した。得られた菌株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列解析および菌学的性状試験を行い、帰属分類群の推定を行った。
【００４２】
［２−１］１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析
まず、ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて添付の使用書に従い、菌株のゲノムＤＮＡを抽出した。この抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用い、添付の使用書に従って、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。
【００４３】
次に、この増幅した遺伝子の塩基配列を、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、添付の使用書に従ってシークエンスを行った。得られたシークエンスデータについて、ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ １．４（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．社）を用いて塩基配列決定を行った。その塩基配列を配列番号１に示す。
【００４４】
次に、配列番号１に示す本実施例（２）［２−１］の塩基配列について、アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ社）を用いて、細菌基準株データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ Ｖｅｒ４．０；テクノスルガ・ラボ社）および国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪおよびＥＭＢＬ）上の既知遺伝子と比較し、相同性検索を行った（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. 、１９９７年、第２５号、第３３８９頁）。
【００４５】
さらに、配列番号１に示す本実施例（２）［２−１］の塩基配列について、細菌基準株データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ Ｖｅｒ４．０；テクノスルガ・ラボ社）における相同性検索上位１５株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対して、アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ社）を用いて簡易分子系統解析を行った（Ｎ．ＳＡＩＴＯＵら、Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ；ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．、１９８７年、第４号、第４０６頁）。
【００４６】
細菌基準株データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ Ｖｅｒ４．０；テクノスルガ・ラボ社）における相同性検索の結果、配列番号１の塩基配列は、最も相同性の高い塩基配列として、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ１９３５８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のものと９９．４％の相同性を示した。一方、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪおよびＥＭＢＬ）における相同性検索の結果、配列番号１の塩基配列は、最も相同性の高い塩基配列として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のものと１００％の相同性を示した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは現在、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒに移籍統合されていることから、細菌基準株データベース（アポロンＤＢ−ＢＡ Ｖｅｒ４．０；テクノスルガ・ラボ社）における相同性検索の結果と国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪおよびＥＭＢＬ）における相同性検索の結果は、いずれもこの菌株がＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒと近縁であることを示唆している。
【００４７】
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をもちいた簡易分子系統解析の結果、この菌株はＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子で形成される系統群において、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とクラスターを形成することから、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列上、近縁であることが示された。
【００４８】
［２−２］菌学的性状試験
次に、この単離した菌株について、株式会社テクノスルガ・ラボにおいて菌学的性状試験を行った。その結果は次のとおりである。
１）形態学的性状
ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ社）上、３０℃
１．細胞形態                                  桿状
２．細胞の大きさ                              ０．６〜０．７×１．２〜１．５μｍ
３．運動性                                    あり
４．グラム染色                                陰性
５．コロニー形態
５−１．培地                                ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ培地
５−２．培養時間                            ２４時間
５−３．直径                                １．０〜２．０ｍｍ
５−４．色調                                淡黄色
５−５．形                                  円形
５−６．隆起状態                            レンズ状
５−７．周縁                                全縁
５−８．表面の形状など                      スムーズ
５−９．透明度                              不透明
５−１０．粘調度                            バター状
２）生理学的性状
１．生育温度試験
１−１．３７℃                              ＋
１−２．４５℃                              −
２．カタラーゼ                                ＋
３．オキシダーゼ                              ＋
４．グルコースからの酸生成                    −
５．グルコースからのガス生成                  −
６．Ｏ／Ｆテスト（酸化）                      ＋
７．Ｏ／Ｆテスト（発酵）                      −
８．硝酸塩の還元                              ＋
９．インドール生成                            ＋
１０．グルコースの酸性化                      −
１１．アルギニンジヒドロラーゼ                −
１２．ウレアーゼ                              ＋
１３．エスクリン加水分解                      ＋
１４．ゼラチン加水分解                        −
１５．β−ガラクトシダーゼ                    ＋
１６．２％ＮａＣｌ存在下での生育              ＋
１７．マッコンキー寒天培地での生育            ＋
１８．キシロースからの酸生成                  ＋
１９．マンニトールからの酸生成                ＋
２０．ラクトースからの酸生成                  ＋（反応弱い）
２１．資化性試験
２１−１．グルコース                        ＋
２１−２．Ｌ−アラビノース                  ＋
２１−３．Ｄ−マンノース                    ＋
２１−４．Ｄ−マンニトール                  ＋
２１−５．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン    ＋
２１−６．マルトース                        ＋
２１−７．グリセロール                      ＋
２１−８．グルコン酸カリウム                ＋
２１−９．ｎ−カプリン酸                    −
２１−１０．アジピン酸                      −
２１−１１．ｄ１−リンゴ酸                  ＋
２１−１２．クエン酸ナトリウム              −
２１−１３．酢酸フェニル                    −
【００４９】
この菌株についての、本実施例（２）［２−２］の菌学的性状は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの菌学的性状にほぼ一致した（坂崎利一監訳、臨床材料にみられる腸内細菌以外のグラム陰性、好気性および通性嫌気性菌の同定、近代出版、１９９３年、Ｊ．Ｍ．Ｙｏｕｎｇら、Ａ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ Ｆｒａｎｋ １８８９，ｗｉｔｈ ａｎ ｅｍｅｎｄｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｏｎｎ １９４２ ａｎｄ Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｕｎｄｉｃｏｌａ ｄｅ Ｌａｊｕｄｉｅ ｅｔ ａｌ．１９９８ ａｓ ｎｅｗ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ，Ｒ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ，Ｒ. ｒｕｂｉ，Ｒ．ｕｎｄｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｒ．ｖｉｔｉｓ、Ｉｎｔ．Ｊ. Ｓｙｓｔ. Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００１年、第５１号、第８９頁）。このことから、この菌株は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒと菌学的性状上、近縁であることが示された。
【００５０】
（３）分類学的考察
以上より、この菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と高い相同性を示したこと、および本菌株の菌学的性状がＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの菌学的性状とほぼ一致したことから、この菌株はＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒに近縁であることが確認された。
【００５１】
しかしながら、この菌株とＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列には、図１に示すように、９塩基の相違点があり、いずれも明確に異なっていた。このことから、この菌株はＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒに近縁ではあるものの、種としては異なるといえる。
【００５２】
以上の結果から、この菌株は新規微生物であり、これをＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷと命名し、平成２１年４月２０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７３６として寄託した。
【００５３】
＜実施例２＞Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの培養および多糖の生成における至適条件の検討
実施例１にて単離し同定したＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷを培養し、多糖を生成させた。この際、培地に添加する炭素源、窒素源および培地のｐＨを変えて、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの培養および多糖の生成を試みることにより、炭素源、窒素源およびｐＨの違いによる菌体の増殖量および多糖生成量について比較検討した。また、菌体の増殖過程における培地のｐＨ変化を確認した。
【００５４】
（１）至適炭素源の検討
培地に含まれる炭素源を変化させることにより、菌体の増殖および多糖生成に至適な炭素源を検討した。
【００５５】
［１−１］菌体の増殖量の確認
まず、国立大学法人北海道大学の農場に自生しているゴボウ実生の根に付着した土壌をサンプルとして採取し、これを根ごと滅菌水１０ｍＬに入れ、常温下でボルテックスミキサー（サイエンティフィックインダストリーズ社）により１分間攪拌した後、１０分間静置した。次いで、この操作により得た上清１００μＬをＭＷ寒天平板培地（ｐＨ７）に播き、コンラージ棒で塗布した後、２５℃で４日間培養した。出現したコロニーのうち、周囲に粘着性物質の生成が確認されるポリマー形成の良好な菌株を目視により選抜して白金耳で拾うことにより菌株を単離した。単離した菌株をＭＷ培地５ｍＬに植菌し、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で２４時間振盪培養した。この培養液５ｍＬのうちの３ｍＬを、ＭＷ培地のショ糖を他の炭素源に変えて作製した培地１００ｍＬに加え、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で１０日間振盪培養した。前記炭素源としては、ショ糖、ブドウ糖、乳糖、デキストラン、麦芽糖および果糖をそれぞれ用いた。各培養液の濁度（吸光度６００ｎｍ）を毎日測定することにより菌体の増殖量を確認した。その結果を図２に示す。
【００５６】
図２に示すように、ショ糖を炭素源とした場合の菌体の増殖量は、ブドウ糖、乳糖、デキストラン、麦芽糖、果糖を各々炭素源とした場合と比較して、最も多いことが確認された。
【００５７】
［１−２］抽出した多糖の乾燥重量の測定
次に、本実施例（１）［１−１］と同様の手法で１０日間培養したそれぞれの培養液に含まれる菌体について、菌体内で生成され、かつ培養液中に分泌された多糖を抽出してその乾燥重量を測定した。その抽出方法を以下に詳述する。
【００５８】
本実施例（１）［１−１］で得られた粘着性の培養液１００ｍＬを７０℃に１５分置くことにより殺菌した。その後４℃、１５０００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離を行い、細胞を含む沈殿物と多糖を含む上清１００ｍＬを分取した。
【００５９】
次に、細胞を含む沈殿物に滅菌水約１０ｍＬを加えて混ぜた後、４℃、１５０００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離を行い、細胞を含む沈殿物と多糖を含む上清とを分けることにより洗浄を行った。この沈殿物洗浄の操作を２回行った後、細胞を含む沈殿物を除去することにより、上清約２０ｍＬを得た。
【００６０】
それぞれ得られた上清を合わせて約１２０ｍＬとし、これに冷却されたイソプロパノールを３倍量加えて混合して４℃で２４時間静置することにより、上清に含まれる多糖を沈殿させた。その後、４℃、１５０００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離を行った。上清を除去して多糖を回収した後、蒸留水５０ｍＬに溶解した。この操作を２回おこなうことにより蒸留水５０ｍＬに溶解された多糖を得た。
【００６１】
その後、これに等量の１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを加えて混合し、４℃、１００００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離をおこなった。沈殿物を除去して上清を回収した後、中性になるまで３ｍｏｌ／Ｌの酢酸をこれに加えて多糖を沈殿させ、さらに等量のメタノールを加えて混合した。４℃、１００００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離を行った後、上清を除去して多糖を回収し、最終濃度５％となるよう蒸留水を加えて溶解した。さらに回収した多糖を精製するため、等量のメタノールを加えて多糖を沈殿させ、４℃、１００００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離を行った。再度上清を除去して多糖を回収し、蒸留水３０ｍＬを加えて溶解した。
【００６２】
さらに、クロロホルムと１−ブタノールとを体積比４：１となるように混合して得た溶液（Ｓｅｖａｇ溶液）を等量加えて１０分間ボルテックスミキサー（サイエンティフィックインダストリーズ社）により攪拌した後、３０分室温に静置した。４℃、１００００×ｇ、２０分間の条件で遠心分離を行い、分離したＳｅｖａｇ溶液を除去することによりタンパク質の除去を行った後（Ｓｔａｕｂ，Ａ．Ｍ．Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｖａｇ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ：Ｒ．Ｌ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．５〜６．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９６５．）、１日につき３回蒸留水の交換を行うことにより２日間透析を行い、多糖を精製した。精製した多糖は凍結乾燥し、−２０℃で保存した。以上のようにして抽出した、それぞれ、ショ糖、ブドウ糖、乳糖、デキストラン、麦芽糖および果糖を炭素源として培養し得られた多糖の乾燥重量を図３に示す。
【００６３】
図３に示すように、ショ糖を炭素源として培養し得られた多糖の乾燥重量は、ブドウ糖、乳糖、デキストラン、麦芽糖および果糖を各々炭素源とした場合と比較して、最も多いことが確認された。
【００６４】
本実施例（１）［１−１］および［１−２］の結果より、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの培養および多糖生成の炭素源として、ショ糖が好適であることが確認された。
【００６５】
（２）至適ショ糖濃度の検討
次に、培地に含まれるショ糖の濃度を変化させることにより、菌体の増殖に至適なショ糖濃度を検討した。
【００６６】
まず、本実施例(１)［１−１］と同様の手法で得られた培養液３ｍＬを、ＭＷ培地のショ糖濃度を、０．２ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％、２．０ｗ／ｖ％および３．０ｗ／ｖ％に変えた培地１００ｍＬにそれぞれ加え、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で５日間振盪培養した。各々の培養液の濁度（吸光度６００ｎｍ）を毎日測定することにより菌体の増殖量を確認した。その結果を図４に示す。
【００６７】
図４に示すように、１．０％のショ糖を含むＭＷ培地で培養した場合の菌体の増殖量は、重量比０．２％、０．５％、１．０％、２．０％、３．０％のショ糖をそれぞれ含むＭＷ（培地で培養した場合と比較して、最も多いことが確認された。以上の結果より、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの培養における好適なショ糖濃度は１．０％であることが確認された。
【００６８】
（３）至適窒素源の検討
次に、培地に含まれる窒素源を変化させることにより、菌体の増殖および多糖生成に至適な窒素源を検討した。
【００６９】
［３−１］菌体の増殖量の確認
まず、本実施例(１)［１−１］と同様の手法で得られた培養液３ｍＬを、ＭＷ培地の酵母エキスを他の窒素源に変え、その濃度を重量比０．０１％として作製した培地１００ｍＬに加え、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で１０日間振盪培養した。前記窒素源としては、酵母エキス、トリプトン、尿素および硝酸ナトリウムをそれぞれ用いた。各培養液の濁度（吸光度６００ｎｍ）を毎日測定することにより菌体の増殖量を確認した。その結果を図５に示す。
【００７０】
図５に示すように、尿素を窒素源とした場合の菌体の増殖量は、トリプトン、酵母エキス、硝酸ナトリウムを各々窒素源とした場合と比較して、最も多いことが確認された。
【００７１】
［３−２］抽出した多糖の乾燥重量の測定
本実施例（１）［１−２］と同様の手法により抽出した、それぞれ、酵母エキス、トリプトン、尿素および硝酸ナトリウムを窒素源として培養し得られた多糖の乾燥重量を図６に示す。
【００７２】
図６に示すように、酵母エキスを窒素源として培養し得られた多糖の乾燥重量は、トリプトン、尿素および硝酸ナトリウムを各々窒素源とした場合と比較して、最も多いことが確認された。
【００７３】
本実施例（１）［３−１］および［３−２］の結果より、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの培養における窒素源としては、尿素が好適であることが確認され、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの多糖の生成における窒素源としては、酵母エキスが好適であることが確認された。
【００７４】
（４）至適ｐＨの検討
次に、培地のｐＨを変化させることにより、菌体の増殖および多糖生成に至適なｐＨを検討した。
【００７５】
［４−１］菌体の増殖量の確認
まず、本実施例(１)［１−１］と同様の手法で得られた培養液３ｍＬを、ＭＷ培地に１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムまたは２ｍｏｌ／Ｌの硫酸を加えることによってｐＨをそれぞれ４、５、６、７および８に調製した培地１００ｍＬに加え、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で１０日間振盪培養した。各々の培養液の濁度（吸光度６００ｎｍ）を毎日測定することにより菌体の増殖量を確認した。その結果を図７に示す。
【００７６】
図７に示すように、培地のｐＨが５または８とした場合の菌体の増殖量は、培地のｐＨが４、６および７の場合と比較して、より多いことが確認された。
【００７７】
［４−２］抽出した多糖の乾燥重量の測定
本実施例（１）［１−２］と同様の手法により抽出した、それぞれ、ｐＨを４、５、６、７および８として培養し得られた多糖の乾燥重量を図８に示す。
【００７８】
図８に示すように、培地のｐＨを８として培養し得られた多糖の乾燥重量は、培地のｐＨを４、５、６および７として培養した場合と比較して、最も多いことが確認された。
【００７９】
本実施例（１）［４−１］および［４−２］の結果より、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの培養および多糖の生成の培地のｐＨとして、ｐＨ８が好適であることが確認された。
【００８０】
（５）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの増殖過程における培地のｐＨ変化の確認
次に、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷの増殖過程における培地のｐＨ変化を経時的に確認した。
【００８１】
まず、本実施例(１)［１−１］と同様の手法で得られた培養液３ｍＬを、ＭＷ培地１００ｍＬに加え、２５℃、１００ｒｐｍの条件下で１０日間振盪培養した。培養液のｐＨを毎日測定することにより菌体の増殖過程における培地のｐＨ変化を確認した。その結果を図９に示す。
【００８２】
図９に示すように、ＭＷ培地調製時のｐＨであるｐＨ６．２が、培養２日後には約ｐＨ５．６となり、その後わずかに低下するものの、ほぼ一定であることが確認された。
【００８３】
＜実施例３＞Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖の物性についての検討
（１）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖の溶解性の検討
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖の濃度が１ｍｇ／１ｍＬになるように様々な溶媒に溶かし、その溶解性について検討した。前記溶媒としては、蒸留水、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、０．６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、０．８ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、テトラヒドロフラン、エーテル、トルエンおよび酢酸エチルである。その結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2010252680.tif 000003
【００８５】
表１に示すように、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液に非常によく溶け、０．６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液および０．８ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液によく溶けることが確認された。また、０．６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、０．８ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液および１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液には劣るものの、蒸留水および０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液に溶けることが確認された。さらに、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、０．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、テトラヒドロフラン、エーテル、トルエンおよび酢酸エチルには溶けないことが確認された。
【００８６】
（２）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖を構成する単糖の検討
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖をトリフルオロ酢酸により加水分解し、多糖を構成する成分について検討した。
【００８７】
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖３．５ｍｇに２ｍｏｌ／Ｌのトリフルオロ酢酸１ｍＬを加え、１００℃で３０分、１時間ないし２時間それぞれ反応させ、加水分解を行った。その後、加水分解物に含まれるトリフルオロ酢酸を８０℃で揮発させ、数滴のエタノールを加える行程を２度繰り返すことにより、加水分解物を乾燥させた。乾燥させた加水分解物はＭｉｌｌｉＱ水（ミリポア社）０．０１ｍＬに溶解し、薄層クロマトグラフィーを用いて、加水分解物に含まれる成分を確認した。展開溶媒は８５％アセトニトリルを用い、２回の多重展開を行った。指示薬はナフトールが０．０３％および硫酸が５％となるようそれぞれを含むエタノール溶液をスプレー試薬として用いた。その結果を図１０に示す。
【００８８】
図１０に示すように、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖をトリフルオロ酢酸によって加水分解し、得られた加水分解物に含まれる成分はすべてグルコースであった。この結果より、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖を構成する成分はグルコースのみであること、すなわちＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖はグルカンであることが確認された。
【００８９】
（３）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖を構成するグルコースの結合形態の検討
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖を様々な酵素により加水分解し、多糖が有するグルコースの結合形態を検討した。
【００９０】
［３−１］α−アミラーゼによる加水分解
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖２ｍｇを１ｍＬの蒸留水に溶解し、１８２０Ｕのα−アミラーゼを含む等量の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を加えた。この反応溶液を２０℃で３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間および２４時間、それぞれ反応させた後、１００℃に１０分間静置することにより反応を止めた。薄層クロマトグラフィーを用いて、加水分解物に含まれる成分を確認した。展開溶媒は８５％アセトニトリルを用い、２回の多重展開を行った。指示薬はナフトールが０．０３％および硫酸が５％となるようそれぞれを含むエタノール溶液をスプレー試薬として用いた。その結果を図１１に示す。
【００９１】
図１１に示すように、α−アミラーゼにより加水分解された成分は検出されず、原点の位置に分離されずに残った多糖が濃く検出された。ショ糖の位置に薄いシグナルが検出されたが、これは培地に由来するショ糖が精製不十分のため検出されたものと考えられる。このことから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、α−アミラーゼによる加水分解を受けないことが示され、α−（１→４）結合を有さないことが確認された。
【００９２】
［３−２］セルラーゼによる加水分解
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖２ｍｇを１ｍＬの蒸留水に溶解し、１３８Ｕのセルラーゼを含む等量の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５）溶液を加えた。この反応溶液を３７℃で１０分、３０分、１時間、２時間および４時間、それぞれ反応させた後、１００℃に１０分間静置することにより反応を止めた。薄層クロマトグラフィーを用いて、加水分解物に含まれる成分を確認した。展開溶媒は８５％アセトニトリルを用い、２回の多重展開を行った。指示薬はナフトールが０．０３％および硫酸が５％となるようそれぞれを含むエタノール溶液をスプレー試薬として用いた。その結果を図１２に示す。
【００９３】
図１２に示すように、セルラーゼにより加水分解された成分がグルコースを示す位置に濃いシグナルとして検出された。また、マルトースを示す位置よりやや下側と加水分解物をスポットした位置の間に薄いシグナルが多数検出されたが、これらはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖がセルラーゼにより分解された結果生成したオリゴ糖を示すものであった。また、加水分解物をスポットした位置には、展開せずに残存した加水分解物のシグナルが濃く検出された。このことから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、セルラーゼによる加水分解を受けてグルコースやオリゴ糖を生成することが示された。すなわち、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、β−（１→４）結合したグルカンを有することが確認された。さらに、加水分解物をスポットした位置に多糖が残存していることから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、セルラーゼにより分解されるβ−（１→４）結合以外の結合形態を有することが示唆された。
【００９４】
［３−３］デキストラナーゼによる加水分解
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖２ｍｇを１ｍＬの蒸留水に溶解し、２５８Ｕのデキストラナーゼを含む等量の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ６）溶液を加えた。この反応溶液を３７℃で１０分、３０分、１時間、２時間および４時間、それぞれ反応させた後、１００℃に１０分間静置することにより反応を止めた。薄層クロマトグラフィーを用いて、加水分解物に含まれる成分を確認した。展開溶媒は８５％アセトニトリルを用い、２回の多重展開を行った。指示薬はナフトールが０．０３％および硫酸が５％となるようそれぞれを含むエタノール溶液をスプレー試薬として用いた。その結果を図１２に示す。
【００９５】
図１２に示すように、デキストラナーゼにより加水分解された成分は検出されず、加水分解物をスポットした位置には、展開せずに残存した加水分解物のシグナルが濃く検出された。このことから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、デキストラナーゼによる加水分解を受ないことが示され、α−（１→６）結合を有さないことが確認された。
【００９６】
［３−４］ラミナリナーゼによる加水分解
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖２ｍｇを１ｍＬの蒸留水に溶解し、３．３８Ｕのラミナリナーゼを含む等量の５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）溶液を加えた。この反応溶液を５０℃で１５分、３０分、１時間、３時間、６時間、１８時間および２４時間、それぞれ反応させた後、１００℃に１０分間静置することにより反応を止めた。薄層クロマトグラフィーを用いて、加水分解物に含まれる成分を確認した。展開溶媒は８５％アセトニトリルを用い、２回の多重展開を行った。指示薬はナフトールが０．０３％および硫酸が５％となるようそれぞれを含むエタノール溶液をスプレー試薬として用いた。その結果を図１３に示す。
【００９７】
図１３に示すように、ラミナリナーゼにより加水分解された成分がグルコースを示す位置に濃いシグナルとして検出された。また、マルトースを示す位置よりやや下側に薄いシグナルが検出されたが、これらはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖がラミナリナーゼにより分解された結果生成したオリゴ糖を示すものであった。また、加水分解物をスポットした位置には、展開せずに残存した加水分解物のシグナルが濃く検出された。このことから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、ラミナリナーゼによる加水分解を受けてグルコースやオリゴ糖を生成することが示された。すなわち、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、β−（１→３）結合したグルカンを有することが確認された。さらに、加水分解物をスポットした位置に多糖が残存していることから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、ラミナリナーゼにより分解されるβ−（１→３）結合以外の結合形態を有することが示唆された。
【００９８】
［３−５］セルラーゼおよびラミナリナーゼによる加水分解
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖２ｍｇを１ｍＬの蒸留水に溶解し、１３８Ｕのセルラーゼを含む等量の５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５）溶液と、３．３８Ｕのラミナリナーゼを含む等量の５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６．８）溶液とを加えた。この反応溶液を３７℃で１５分、３０分、１時間、３時間、６時間、１８時間および２４時間、それぞれ反応させた後、１００℃に１０分間静置することにより反応を止めた。薄層クロマトグラフィーを用いて、加水分解物に含まれる成分を確認した。展開溶媒は８５％アセトニトリルを用い、２回の多重展開を行った。指示薬はナフトールが０．０３％および硫酸が５％となるようそれぞれを含むエタノール溶液をスプレー試薬として用いた。その結果を図１４に示す。
【００９９】
図１４に示すように、セルラーゼおよびラミナリナーゼにより加水分解された成分がグルコースを示す位置に濃いシグナルとして検出された。また、マルトースを示す位置よりやや下側から加水分解物をスポットした位置の間にオリゴ糖を示す薄いシグナルが検出された。さらに、加水分解物をスポットした位置には、展開せずに残存した加水分解物のシグナルが濃く検出された。このことから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、セルラーゼおよびラミナリナーゼによる加水分解を受けてグルコースやオリゴ糖を生成することが示された。すなわち、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、β−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有することが確認された。
【０１００】
また、加水分解物をスポットした位置に多糖が残存していることから、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷにより生成される多糖は、セルラーゼにより分解されるβ−（１→４）結合および／またはラミナリナーゼにより分解されるβ−（１→３）結合および／またはセルラーゼとラミナリナーゼの共同作用により分解される結合以外の結合形態（分岐構造が予想される）を有することが示唆された。
【０１０１】
以上のような本実施例によれば、β−（１→３）結合したグルカンおよび／またはβ−（１→４）結合したグルカンを有する多糖を工業的に生産することができる。
【０１０２】
なお、本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖は、前述した実施形態に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【図１】
2010252680.tif 000004
【図２】
2010252680.tif 000005
【図３】
2010252680.tif 000006
【図４】
2010252680.tif 000007
【図５】
2010252680.tif 000008
【図６】
2010252680.tif 000009
【図７】
2010252680.tif 000010
【図８】
2010252680.tif 000011
【図９】
2010252680.tif 000012
【図１０】
2010252680.tif 000013
【図１１】
2010252680.tif 000014
【図１２】
2010252680.tif 000015
【図１３】
2010252680.tif 000016
【図１４】
2010252680.tif 000017
【配列表】
2010252680000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月22日(2009.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）である、多糖生成能を有する新規微生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）より生成される、多糖。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
（１）Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）である、多糖生成能を有する新規微生物。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（２）新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）より生成される、多糖。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
以下、本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物およびこれに生成される多糖について詳細に説明する。本発明に係る多糖生成能を有する新規微生物は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明において用いられる「微生物」は、「菌」、「菌株」、「微生物株」あるいは「細菌」と交換可能に用いられる。従って「新規微生物」は、例えば「新規菌株」としても表すことができる。後述の実施例に示すように、多糖を生成する能力を有し、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する公知の種に含まれない新規微生物が、発明者らにより発見された。その新規微生物は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷと命名され、平成２１年４月２０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６が与えられているため、この機関より入手することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
次に、本発明に係る多糖は、新規微生物であるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷ（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６）より生成される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
以上の結果から、この菌株は新規微生物であり、これをＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ＪＷと命名し、平成２１年４月２０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７３６として寄託した。