(57)【要約】【課題】脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化を促進するための手段の提供。【解決手段】本技術により、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を有効成分として含む、脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進用組成物が提供される。前記組成物は、アストロサイトに存在する細胞外シグナル制御キナーゼのリン酸化を促進するために用いられる。前記ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンをペプシンにより分解して得られた分解物であってよい。また、当該組成物は、飲食品組成物又は医薬組成物であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を有効成分として含む、脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進用組成物。
【請求項２】
前記組成物が、アストロサイトに存在する細胞外シグナル制御キナーゼのリン酸化を促進するために用いられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラクトフェリン分解物が、ラクトフェリンをペプシンにより分解して得られた分解物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が飲食品組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外シグナル制御キナーゼ（extracellular signal-regulated kinase、以下「ＥＲＫ」ともいう）は、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（Mitogen-ACTIVATED Protein  Kinase、ＭＡＰＫ）ファミリーに属する蛋白質である。ＥＲＫは、脳内に存在し、中枢神経系において重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００３】
ＥＲＫのリン酸化に着目した研究もおこなわれている。例えば、下記特許文献１には、「対象におけるアルツハイマー病の診断方法であって、前記対象から得られた細胞をプロテインキナーゼＣ活性化因子である薬剤と接触させるステップと、前記対象におけるアルツハイマー病を診断するために、前記細胞における特異的なリン酸化ＭＡＰキナーゼタンパク質の比を測定するステップとを含んでなる方法。」（請求項２７）が記載されている。当該方法において、「前記特異的なリン酸化ＭＡＰキナーゼタンパク質の比は、リン酸化されたＥｒｋ１とリン酸化されたＥｒｋ２との比であり、リン酸化されたＥｒｋ１の標準化された量をリン酸化されたＥｒｋ２の標準化された量で割ることにより計算される」（請求項３０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５１１９０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＥＲＫはリン酸化されることで活性化される。活性化ＥＲＫは種々の脳機能に関与していると考えられている。そこで、本技術は、ＥＲＫのリン酸化を促進するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物がＥＲＫのリン酸化を促進することを見出した。すなわち、本技術は以下を提供する。
【０００７】
［１］ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を有効成分として含む、脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進用組成物。
［２］前記組成物が、アストロサイトに存在する細胞外シグナル制御キナーゼのリン酸化を促進するために用いられる、［１］に記載の組成物。
［３］前記ラクトフェリン分解物が、ラクトフェリンをペプシンにより分解して得られた分解物である、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］前記組成物が飲食品組成物である、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］前記組成物が医薬組成物である、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本技術の組成物により、脳内のＥＲＫのリン酸化を促進することができる。
なお、本技術の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の存在下におけるアストロサイト内のリン酸化ＥＲＫ量の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本技術の好ましい実施形態について説明する。ただし、本技術は以下の好ましい実施形態に限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量に基づくものである。
【００１１】
＜細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進用組成物＞
本技術に従う脳内のＥＲＫリン酸化促進用組成物は、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を有効成分として含む。
本技術の組成物は、脳内ＥＲＫのリン酸化を促進するために適している。ＥＲＫは、リン酸化されることで活性化する。活性化ＥＲＫは、脳機能の発現又は脳内細胞の機能にとって必要である。そのため、本技術の組成物による脳内ＥＲＫのリン酸化促進作用により、脳機能にとって良い効果がもたらされると考えられる。
また、本技術の組成物の有効成分であるラクトフェリン及びラクトフェリン分解物は、乳蛋白質又は乳蛋白質分解物であり、食品として長年使用されてきた乳由来の成分である。これらの成分は、生体への安全性が高い。そのため、本技術の組成物は、安心してヒトに投与することができる。また、本技術の組成物を長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性が少ない。
【００１２】
ＥＲＫシグナル伝達は、脳機能において重要であり、例えば学習及び記憶のために必須であることが示されている。ＥＲＫシグナル伝達においてＥＲＫはリン酸化されて活性化される。リン酸化ＥＲＫの神経系細胞における種々の機能への関与も知られており、例えば、神経系細胞の分化、シナプス可塑性、生存、遊走、記憶、及び学習などにＥＲＫは関与する。本技術の組成物は、脳内のＥＲＫのリン酸化を促進することができるので、これらの種々の機能のいずれかの促進のために用いられてよい。
また、本技術の組成物は、脳内のＥＲＫのリン酸化を促進することができるので、脳機能の維持又は改善のために用いられてもよい。より具体的には、本技術の組成物は、神経突起伸長、神経細胞の生存促進、シナプス可塑性の維持又は向上、（特には海馬における）記憶形成能力の維持又は向上、又は知的障害の緩和などのために用いられてよい。
【００１３】
ＥＲＫは、さらにＥＲＫ１／２、ＥＲＫ３、ＥＲＫ４、ＥＲＫ５、及びＥＲＫ７などに分類される。これらのうち、ＥＲＫ１／２及びＥＲＫ５はクラシカルＭＡＰＫであり、ＥＲＫ３、ＥＲＫ４、及びＥＲＫ７はアティピカルＭＡＰＫである。本技術の組成物は、脳内のこれらのＥＲＫ群のいずれか１つ以上のリン酸化を促進するために用いられてよい。
上記のとおり、ＥＲＫには複数のサブタイプが存在するが、その中でも脳機能に関連するのがＥＲＫ１／２である。本技術の組成物は、脳内のＥＲＫ１／２のリン酸化を促進するために特に適している。そのため、本技術においてＥＲＫは好ましくはＥＲＫ１／２である。すなわち、本技術の組成物は、特には脳内のＥＲＫ１／２のリン酸化を促進するために用いられてよい。ＥＲＫ１／２は、２つのアイソフォームであるＥＲＫ１及びＥＲＫ２の総称である。ＥＲＫ１／２は、スレオニン残基及び／又はチロシン残基がリン酸化されることで活性化される。本技術の組成物は、脳内のＥＲＫ１／２のリン酸化促進により上記で述べた神経系細胞の機能のいずれかを促進するために又は上記で述べた脳機能の維持若しくは改善するために用いられてもよい。
【００１４】
本技術の組成物は、グリア細胞中のＥＲＫリン酸化を促進するために特に適している。そのため、本技術の組成物は、好ましくは、グリア細胞中のＥＲＫリン酸化を促進するために用いられる。グリア細胞は、脳に存在する細胞であり、神経細胞をサポートする役割を果たしていると考えられている。グリア細胞は、さらにアストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアの３種類に分類することができる。本技術の組成物により脳内におけるグリア細胞によるＥＲＫリン酸化が促進されることで、脳機能の改善を行うことが可能となる。
【００１５】
本技術の組成物は、アストロサイトにおけるＥＲＫリン酸化を促進するのに特に適している。そのため、本技術の組成物は、好ましくは、アストロサイトに存在するＥＲＫリン酸化を促進するために用いられる。本技術の組成物は、アストロサイトにおけるＥＲＫリン酸化を促進できるので、脳内でのＥＲＫリン酸化を効率的に促進でき、その結果、脳機能の維持又は改善が可能となる。
【００１６】
本技術の組成物は、例えば、ＥＲＫ１／２の合計物質量（リン酸化ＥＲＫ１／２及び非リン酸化ＥＲＫ１／２の合計物質量）に占めるリン酸化ＥＲＫ１／２の物質量の割合を１．１倍〜２．５倍、好ましくは１．２倍〜２倍に増やすために用いられうる。当該割合は、例えば脳内におけるＥＲＫ１／２の合計物質量に占めるリン酸化ＥＲＫ１／２の物質量の割合であってよく、より特には脳内のアストロサイトにおけるＥＲＫ１／２の合計物質量に占めるリン酸化ＥＲＫ１／２の物質量の割合であってもよい。本技術の組成物は、このような穏やかなＥＲＫ１／２のリン酸化促進作用を発揮することができる。ＥＲＫ活性化の調節はその影響が大きく、副作用を伴うことがある。本技術の組成物は、上記のとおり穏やかなＥＲＫ１／２のリン酸化促進作用を発揮することができるので、副作用の心配が少ない。
【００１７】
ラクトフェリンは、例えば乳、涙、唾液、及び血液などの体液中に存在する鉄結合性の糖蛋白質である。ラクトフェリンは、哺乳動物、例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトなどの乳に含まれる。すなわち、本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものであってよい。含有量及び入手容易性の観点から、例えばウシ又はヒトの乳が、ラクトフェリンを入手するための源として好ましい。すなわち、本技術において用いられるラクトフェリンとして、例えばウシ又はヒトの乳に由来するラクトフェリンが用いられてよい。乳は、初乳、移行乳、常乳、及び末期乳のいずれでもよい。本技術において、市販入手可能なラクトフェリンが用いられてもよい。
【００１８】
本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものに限定されない。例えば、当該乳を処理して得られる脱脂乳又はホエーから常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリン、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、又はトランスジェニック動物から産生された組換えラクトフェリン、合成ラクトフェリン、又はそれらの混合物であってもよい。また、ラクトフェリンは、非グリコシル化又はグリコシル化されたものでもよい。
【００１９】
本技術において用いられる「ラクトフェリン分解物」として、例えばラクトフェリンの酵素分解物、酸分解物、及びアルカリ分解物を挙げることができる。本技術において、ラクトフェリン分解物は、ＥＲＫリン酸化促進作用を有する限りにおいて、いずれの分解物が用いられてもよい。
本技術において、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量で、ラクトフェリンと同程度の脳内ＥＲＫリン酸化促進作用を発揮する。そのため、本技術の組成物は、好ましくは、ラクトフェリン分解物（特には以下で述べるラクトフェリンのペプシン分解物）を有効成分として含む。
【００２０】
好ましくは、当該ラクトフェリン分解物は、酵素による加水分解によって得られる加水分解物である。当該酵素として、例えばプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモシン、プラスミン、ペプシン、パパイン、ペプチダーゼ、及びアミノペプチダーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。当該酵素は、細菌由来又は動物由来のいずれであってもよい。細菌由来の酵素として、例えばバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、プロピオンバクター属、シュードモナス属、及びストレプトコッカス属に由来する酵素が挙げられる。動物由来の酵素として、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、及びヒトに由来する酵素を挙げることができる。本技術において用いられるラクトフェリン分解物を得るために、上述の酵素を、単独で又は２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
ラクトフェリン分解物を得るために用いられる酵素は、好ましくはペプシンである。すなわち、本技術において、ラクトフェリン分解物として、ラクトフェリンのペプシン分解物が用いられる。ラクトフェリンのペプシン分解物は、優れた脳内ＥＲＫリン酸化促進作用を有する。
【００２２】
本技術において用いられるラクトフェリン分解物の平均分子量は、好ましくは５０００ダルトン（以下、「Ｄａ」とする）以下又は未満、より好ましくは２０００Ｄａ以下である。当該平均分子量は、例えば１０００Ｄａ以上であってよい。特に好ましくは、本技術において用いられるラクトフェリン分解物は、１６００Ｄａの数平均分子量を有するペプシン分解物である。
＜平均分子量の算定方法＞
本技術におけるラクトフェリン分解物の平均分子量は、以下の数平均分子量の概念により求めるものである。
数平均分子量（Number Average of Molecular Weight）は、例えば文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６〜１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の式により定義される。
【００２３】
【数１】
2020059657.tif 000002
【００２４】
ラクトフェリンの酵素加水分解物は、例えば特開２０１６−１２１１０９号公報に記載された方法により製造可能である。当該公報に記載されているとおり、当該方法は、ラクトフェリンを酵素により加水分解する酵素反応工程を含む。当該酵素反応工程における反応条件は、例えば酵素の種類などの要因によって当業者により適宜選択されてよい。例えば、ラクトフェリンの蛋白質換算質量１ｇ当たり１０００〜２００００単位（活性単位）の割合で酵素が用いられることが好ましい。また、酵素反応の温度は特に限定されず、酵素作用が発現する範囲から選ばれ、通常３０〜６０℃の範囲から選ばれる。酵素反応の反応時間は、例えば１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間、好ましくは２〜２０時間、より好ましくは２〜１０時間である。
酵素反応は、例えば酵素を失活することにより停止される。当該失活は、酵素反応溶液を、例えば８０℃で３０分〜１３０℃で２秒間保持することにより行われる。
当該酵素反応工程後、例えば反応溶液のｐＨ調整工程及び反応産物の精製工程が行われてもよい。当該ｐＨ調整工程では、反応溶液のｐＨが例えば弱酸性〜中性に調整される。当該精製工程では、（ａ）濾過、（ｂ）精密濾過及び限外濾過膜などの膜分離処理、及び（ｃ）樹脂吸着分離からなる群から選択される、いずれか１種又はこれらの２種以上の組合せの処理が行われてよい。当該精製工程により、当該失活液中に含まれる不溶物の除去、及び、脂肪及び乳糖などの不要な成分を低減することができる。その結果、溶液状態で透明であり、かつ、溶液状態での長期保存においても混濁、沈殿、凝集及び褐変等がほとんど生じない、いわゆる保存安定性に優れたラクトフェリン分解物を得ることができる。また、精製工程により、ラクトフェリン分解物の風味及び外観を向上させることができる。
【００２５】
（ａ）の濾過は、公知の方法により実施することができ、例えば、珪藻土を用い、公知の装置により実施することができる。濾過を行うことにより、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００２６】
（ｂ）の膜分離処理は、公知の装置を用いて行うことができる。当該装置として、例えば精密濾過モジュール、並びに、限外濾過モジュールを挙げることができる。限外濾過モジュールとしては、例えば分画分子量３，０００〜２０，０００、好ましくは３，０００〜１０，０００のものを挙げることができる。これらの濾過モジュールは、例えば旭化成社より、マイクローザＭＦシリーズ及びマイクローザＵＦシリーズとして市販されている。この場合、膜分離処理後の膜透過画分としてラクトフェリン分解物を含有する溶液が得られる。膜分離処理を行うことにより、（ａ）の濾過と同様、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００２７】
（ｃ）の樹脂吸着分離は、公知の方法により実施することができ、例えば、樹脂をカラムに充填し、前記加水分解失活液を、当該カラムを通過させることにより実施することができる。樹脂としては、例えば商品名：ダイヤイオン（三菱化学社製）、セパビーズ（三菱化学社製）、アンバーライトＸＡＤ（オルガノ社製）、ＨＳ（味の素ファインテクノ社製）等が挙げられる。樹脂吸着分離は、これらの樹脂をカラムに充填して前記加水分解失活液を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記加水分解失活液中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、加水分解失活液と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。加水分解失活液中には、保存期間中に混濁、沈殿、凝集及び褐変等を惹起する因子（例えば、疎水性アミノ酸を多く含むペプチド等）が残存している可能性があり、樹脂吸着分離を行うことにより、これらの因子を除去できる。
【００２８】
精製工程後、ラクトフェリン分解物を含有する溶液を殺菌してもよい。 殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。加熱処理は、例えば７０℃３０分〜１４０℃２秒間で行われる。
【００２９】
得られたラクトフェリン分解物を含有する溶液は、そのまま本技術において使用することもでき、また、必要に応じて、当該溶液を公知の方法により濃縮して得た濃縮液を本技術において使用することもできる。また、当該溶液又は当該濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末を得、当該粉末を本技術において使用してもよい。
【００３０】
本技術の有効成分であるラクトフェリン及びラクトフェリン分解から選ばれる１又は２以上の成分の合計含有量は、本技術の組成物の全質量に対して０．０１〜７０質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜４０質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜１０質量％の範囲であることが更に好ましく、０．２〜２質量％の範囲であることが特に好ましい。
【００３１】
本技術の組成物は、好ましくは経口的に投与される。本技術の組成物による脳内のＥＲＫリン酸化促進作用の発揮にとって、経口投与が特に適している。  
【００３２】
本技術の組成物は、例えば医薬、飲食品、又は飼料として用いられてよい。本技術の組成物には、これらの用途に用いられる場合に含まれる追加成分が適宜含まれてよい。
【００３３】
＜医薬組成物＞
本技術の脳内ＥＲＫリン酸化促進用組成物は、医薬組成物として用いることができる。すなわち、本技術は、脳内ＥＲＫリン酸化促進用の医薬組成物も提供する。本技術の医薬組成物は、例えば脳機能の改善のために用いられてよい。
【００３４】
本技術における有効成分は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、患者の疾患の種類に関係なく安心して投与できる可能性が高い。また、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ない。更に、他の薬剤との併用においても安全性が高い。
【００３５】
本技術の組成物を医薬組成物として利用する場合、当該医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよく、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、例えば胃ろう、経鼻投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は髄腔内注射等を介して投与されてよい。
【００３６】
また、製剤化に際しては、本技術の医薬組成物には、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤などの種々の成分が含まれてよい。また、本技術の効果を損なわない限り、本技術の医薬組成物には、公知の又は将来的に見出される脳神経系の発達及び／又は再生のために用いられる医薬成分が含まれてよい。本技術の医薬組成物の製剤化は、剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３７】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３８】
なお、製剤担体を配合する場合、本技術の有効成分であるラクトフェリン及びラクトフェリン分解物から選ばれる１又は２以上の成分の合計含有量は、剤形に合わせて適宜選択されてよい。本技術の有効成分であるラクトフェリン及びラクトフェリン分解物から選ばれる１又は２以上の成分の合計含有量は、医薬組成物の全質量に対して０．０１〜７０質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜４０質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜１０質量％の範囲であることが更に好ましく、０．２〜２質量％の範囲であることが特に好ましい。
【００３９】
本技術の医薬組成物の投与期間は、脳内ＥＲＫリン酸化の促進が必要とされる期間に応じて適宜決定されてよい。例えば、本技術の医薬組成物は、例えば２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは２か月以上にわたって継続的に摂取されてよい。本技術の医薬組成物の摂取は、例えば摂取開始から例えば３か月後、好ましくは６か月後、より好ましくは１年後に終了されてもよい。
本技術の医薬組成物は、例えば毎日摂取されてよく、又は、例えば１日おき又は２日おきなど所定の間隔で摂取されてもよい。
本技術の医薬組成物を摂取する場合、ラクトフェリン及びラクトフェリン分解物から選ばれる１又は２以上の成分の合計摂取量は、例えば０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００４０】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体や基剤を用いることができる。本技術の組成物の製剤化のために用いられる成分として、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、及び矯味矯臭剤が挙げられる。
【００４１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００４２】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００４３】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００４４】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００４５】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００４６】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
【００４７】
＜飲食品＞
本技術の組成物は、飲食品組成物であってよい。すなわち、本技術は、脳内ＥＲＫリン酸化促進用飲食品組成物を提供する。本技術の飲食品組成物は、脳内ＥＲＫリン酸化促進作用を効果的に発揮することができる。
【００４８】
本技術の飲食品組成物の例として、例えば清涼飲料若しくは乳飲料などの飲料又は当該飲料の濃縮原液及び当該飲料を調製するために用いられる粉末；例えば加工乳及び発酵乳などの乳製品；育児用調製粉乳；経腸栄養食；及び機能性食品が挙げられる。
また、本技術の飲食品組成物の例として、例えば炭酸飲料、栄養飲料、若しくは果実飲料などの飲料又は当該飲料の濃縮原液及び当該飲料を調製するために用いられる粉末；例えばアイスクリーム、アイスシャーベット、及びかき氷などの冷菓；例えばそば、うどん、はるさめ、餃子の皮、しゅうまいの皮、中華麺、及び即席麺などの麺類；例えばキャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子などの菓子類；例えばかまぼこ、ハム、及びソーセージなどの水産又は畜産加工食品；例えばサラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、及びドレッシングなどの油脂及び油脂加工食品；例えばソース及びたれなどの調味料；例えばスープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、及びパンなどの調理された食品を挙げることができる。本技術の飲食品組成物は、例えば液状及びタブレット状のサプリメントであってもよい。
【００４９】
これらの飲食品は、当業者に既知の方法により製造されてよい。これらの飲食品の製造方法において、ラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物を添加する時点及び方法は、当業者により適宜選択されてよい。
【００５０】
また、本技術の飲食品組成物は、例えば脳内ＥＲＫリン酸化促進用という保健用途又は脳内ＥＲＫリン酸化促進作用に起因して奏される作用に関する保健用途が表示された飲食品として提供又は販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起又は類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、及び表示する対象物又は媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
本技術の飲食品は、例えば「脳機能の維持のために」、「脳機能の発達のために」又は「知的障害の緩和のために」などの表示が付されてよい。
【００５１】
「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００５２】
表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ（Point of purchase advertising）等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００５３】
また、「表示」には、例えば健康食品、機能性表示食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、及び医薬用部外品などの製品であることを示す表示が含まれる。より具体的な表示の例として、好ましくは消費者庁によって認可される表示、例えば特定保健用食品制度又はこれに類似する制度にて認可される表示などが挙げられる。消費者庁によって認可される表示の例として、例えば特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、及び疾病リスク減少表示などを挙げることができる。より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が、典型的な例である。
【００５４】
本技術の飲食品組成物に含まれるラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物の合計含有量は、当業者により適宜選択されてよい。本技術の有効成分であるラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物の合計含有量は、飲食品組成物の全質量に対して０．０１〜７０質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜４０質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜１０質量％の範囲であることが更に好ましく、０．２〜２質量％の範囲であることが特に好ましい。
【００５５】
本技術の飲食品組成物の摂取期間は、脳内ＥＲＫリン酸化産生促進が必要とされる期間に応じて適宜決定されてよい。例えば、本技術の飲食品は、例えば２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは２か月以上にわたって継続的に摂取されてよい。本技術の飲食品の摂取は、例えば摂取開始から例えば３か月後、好ましくは６か月後、より好ましくは１年後に終了されてもよい。また、本技術の飲食品は、例えば０歳から１００歳の間のいずれかの期間に継続して摂取されてよい。
本技術の飲食品組成物は、例えば毎日摂取されてよく、又は、例えば１日おき又は２日おきなど所定の間隔で摂取されてもよい。
本技術の飲食品組成物を摂取する場合、ラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物の合計摂取量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００５６】
本技術は、以下の方法及び物も提供する。
［１］ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を、脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進用組成物の製造のために使用する方法。
［２］脳内の細胞外シグナル制御キナーゼリン酸化促進のために用いられる、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物。
［３］ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を投与することで、脳内の細胞外シグナル制御キナーゼのリン酸化を促進する方法。
【実施例】
【００５７】
以下で、実施例を参照して本技術をさらに詳しく説明するが、本技術はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５８】
［試験例１（ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物によるＥＲＫのリン酸化促進作用］
【００５９】
（１）試料の調製
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を用意した。また、ラクトフェリン分解物を以下のとおりに製造した。すなわち、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水にて５質量％となるように溶解し、塩酸溶液にてｐＨ３に調製した。調製したラクトフェリンを４５℃に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して３質量％のペプシンを添加して攪拌しながら６時間反応させて加水分解を行った。加水分解反応が終了後、反応液を８０℃に加温し、１０分間保温して酵素を失活させた。反応液を冷却後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のｐＨを６に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン分解物を製造した。なお、製造したラクトフェリン分解物の数平均分子量をHPLC法より測定し、１６００Ｄａであることを確認した。
【００６０】
（２）細胞培養試験
生まれて１日目のＷｉｓｔａｒラットから大脳皮質を採取し、当該大脳皮質から髄膜を除去して、脳組織を得た。当該脳組織を、メスを用いて細切した。細切した脳組織を、トリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅＩ （０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地に入れ、３７℃で１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引して除去し、沈殿物に１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加えて、沈殿物をガラスピペットで分散させた。分散物を培養フラスコに播き、培養を行った（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去して、アストロサイトを得た。
【００６１】
次いで、１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を入れた６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き７２時間培養した後、血清を除去するために、細胞を、無血清のＤＭＥＭ培養液で１回洗浄した。当該洗浄後、当該細胞を、無血清ＤＭＥＭ培養液中で１００μｇ／ｍｌのラクトフェリン若しくは１０μｇ／ｍｌのラクトフェリン分解物の存在下又はこれらの不在下でさらに２４時間培養した。２４時間の培養後、細胞を回収し、細胞内に発現しているリン酸化ＥＲＫ及びｔｏｔａｌ  ＥＲＫレベルを抗リン酸化ＥＲＫ抗体及び抗ｔｏｔａｌ  ＥＲＫ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行い測定した。  
【００６２】
前記Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔは、以下のとおりに行われた。
細胞をRIPA溶液中で１０秒間超音波処理し、15,000rpm、10分、4℃で遠心後、上清を回収した。上清にサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間熱処理してWestern blot用のサンプルを得た。１０％SDS-ポリアクリルアミドゲルに、各サンプル２０ μｇを入れて電気泳動を行い蛋白質を分離した。分離された蛋白質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％  ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ−Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ−Ｔ）で１０分間、１回洗浄した。洗浄後、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｃａｔ  Ｎｏ．９１０１、リン酸化ＥＲＫ１／２に対して特異的な抗体）又は抗ｔｏｔａｌ  ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｃａｔ  Ｎｏ．９１０２、リン酸化ＥＲＫ１／２及び非リン酸化ＥＲＫ１／２の両方に対する抗体）をＴＢＳ−Ｔバッファーで１,０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンと接触させ、４℃で１６時間反応を行った。反応後、メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｒａｂｂｉｔ二次抗体（２．５％  ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した。化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ−６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置で検出した。１００μｇ／ｍｌのラクトフェリン又は１０μｇ／ｍｌのラクトフェリン分解物の存在下でアストロサイトを２４時間培養した場合に得られた発光強度を、ラクトフェリン及びラクトフェリン分解物のいずれも不在下でアストロサイトを２４時間培養した場合に得られた発光強度により除した値（以下、相対発光強度という）を算出した。以上の細胞培養試験を３回（ｎ＝３）行い、３回の試験で得られた相対発光強度の平均値を算出した。
【００６３】
（３）結果
抗リン酸化ＥＲＫ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った場合に得られた相対発光強度の平均値を以下の表１及び図１に示す。表１及び図１において、「対照」が、ラクトフェリン及びラクトフェリン分解物のいずれも不在下でアストロサイトを２４時間培養した場合の結果であり、「ＬＦ」が、１００μｇ／ｍｌラクトフェリンの存在下で培養した場合の結果であり、及び、「ＬＦ分解物」が、１０μｇ／ｍｌのラクトフェリン分解物の存在下で培養した場合の結果である。
【００６４】
【表１】
2020059657.tif 000003
【００６５】
表１及び図１に示されるとおり、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の存在下でアストロサイトを培養した場合に得られた発光強度の平均値は、これらの不在下の場合と比べて有意により高かった。
また、抗ｔｏｔａｌ  ＥＲＫ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った場合に得られた相対発光強度の平均値は、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の存在下でアストロサイトを培養した場合とこれらの不在下の場合でアストロサイトを培養した場合との間でほぼ同程度であった。
すなわち、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の存在下でアストロサイトを培養した場合とこれらの不在下の場合でアストロサイトを培養した場合との間で、リン酸化ＥＲＫ１／２及び非リン酸化ＥＲＫ１／２の合計量は同程度であったが、前者の場合において当該合計量のうちリン酸化ＥＲＫ１／２が占める割合が増加した。
以上の結果より、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物によってアストロサイトにおけるＥＲＫ１／２のリン酸化が促進されたことが分かる。
【００６６】
また、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物によって、相対発光強度は約１．５倍に増加した。すなわち、全ＥＲＫ物質量のうちのリン酸化ＥＲＫ１／２の物質量の割合が約１．５倍に増加したと考えられる。そのため、本技術の組成物によって、穏やかなＥＲＫ１／２の活性化を達成することができる。
【００６７】
また、以上の試験において、ラクトフェリン分解物の量はラクトフェリンの量の１０分の１であったが、ラクトフェリン分解物によって、ラクトフェリンと同程度の相対発光強度が測定された。そのため、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量でより効果的にＥＲＫリン酸化促進作用を発揮することができることが分かる。
【００６８】
［試験例２］
【００６９】
試験例１で用いたラクトフェリン又はラクトフェリン分解物を含む飼料を複数のマウスに３か月間継続摂取させた。また、ラクトフェリン及びラクトフェリン分解物のいずれも含まないこと以外は同じ飼料を複数のマウスに同様に３か月間継続摂取させた。
【００７０】
３カ月後に、マウス脳内におけるリン酸化ＥＲＫ１／２及び非リン酸化ＥＲＫ１／２の合計量のうちのリン酸化ＥＲＫ１／２が占める割合を、試験例１と同じ抗体を用いて測定した。その結果、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物によって脳内におけるＥＲＫ１／２のリン酸化が促進されたことが確認された。
また、試験例２においても、ＥＲＫリン酸化の促進の程度は、試験例１の場合と同様に穏やかであった。
また、試験例２においても、試験例１の場合と同様に、ラクトフェリン分解物は、ラクトフェリンよりも少ない量で、ラクトフェリンと同程度のＥＲＫリン酸化促進作用を発揮した。
【図１】
2020059657.tif 000004