(57)【要約】【課題】灌流式細胞培養において、培地流量が少ない場合でも、培地の流量や状態などを簡易な構成で実時間監視（モニタリング）することが可能な灌流培地モニタリング装置を提供する。【解決手段】生物試料を収容する生物試料収容容器へ培地を灌流する培地灌流システムと、生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルと、出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出するセンサと、センサの出力から液滴数を計数する計数装置と、を備える灌流培地モニタリング装置である。【選択図】図１
2010252753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料を収容する生物試料収容容器へ培地を灌流する培地灌流システムと、
前記生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルと、
前記出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出するセンサと、
前記センサの出力から液滴数を計数する計数装置と、
を備えることを特徴とする灌流培地モニタリング装置。
【請求項２】
請求項１に記載の灌流培地モニタリング装置であって、
前記生物試料収容容器の培地入口側の配管に接続された入口側ノズルと、
前記入口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出するセンサと、
を備えることを特徴とする灌流培地モニタリング装置。
【請求項３】
生物試料を収容する生物試料収容容器へ培地を灌流し、前記生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出し、その液滴の液滴数をモニタリングすることを特徴とする灌流培地モニタリング方法。
【請求項４】
請求項３に記載の灌流培地モニタリング方法であって、
前記生物試料収容容器の培地入口側の配管に接続された入口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出し、その液滴の液滴数をモニタリングすることを特徴とする灌流培地モニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、灌流式の細胞培養における培地の流量や状態などをモニタリングする灌流培地モニタリング装置および灌流培地モニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
灌流式の細胞培養では、培地の流れにより新鮮な培地を細胞に供給し、老廃物を排出することができるため、多くの細胞を効率的に培養することができる。しかし、培地の流れが強い場合、細胞の担体への定着に支障をきたすことがあり、また、長期間の培養では、経済性を考慮する必要がある。
【０００３】
そこで、例えば培地流量が数ｍＬ／ｈｒ程度であるような微小流量による灌流式細胞培養が検討されている。しかし、従来の一般的な液体流量の測定方法では、このように培地流量が数ｍＬ／ｈｒ程度であるような小規模な培養においては培地流量の測定が困難であり、実時間の流量管理はほとんど行われていない。
【０００４】
また、培地には、細胞の培養に必要な様々な物質が含まれていて、細胞はそれらを消費し、老廃物を生成する。培養時間の経過につれて、増殖や分化などにより細胞の状態は変わり、細胞を収容する培養容器を経た後の培地の成分は変化する。特に、培地の流量が少ない場合、この変化は顕著になる。
【０００５】
培地の状態を把握し、適切な管理を行うことは、効率的な細胞培養の実現のために重要なことである。現在、灌流式細胞培養は、細胞に有用物質を産生させることを目的として、工業的に利用されることが多い。大規模な灌流式細胞培養システムでは、自動的に培地をサンプリングし、成分の濃度などの分析を行う装置がシステムに組み込まれることがある。例えば、特許文献１には、培養液が封入された培養槽と、培養槽に供給流量制御装置を介して接続された培地成分の貯留槽と、培養液を採取して分析する培地成分計測装置と、培地成分計測装置で計測された生体細胞の濃度、グルコース濃度、グルタミン濃度、乳酸濃度、アンモニア濃度の計測値から、Δｔ時間後の培養状態を推定して算出されるグルコース、グルタミンの消費量に基づいて、補充すべきグルタミンの供給量を算出する制御装置とを備え、制御装置からの指令により供給流量制御装置を制御して培養液中のグルタミン濃度を所定の範囲に維持する生体細胞の培養制御装置が記載されている。
【０００６】
しかし、特許文献１のような培養制御装置に組み込まれる分析装置は、極めて高価である。また、グルコースなどの個別成分について分析することは可能であるが、長期間にわたる培養の場合、分析には多大の手間を要する。
【０００７】
一方、再生医療などの用途における灌流式細胞培養では、患者個々の状態に対応する複数の小規模な細胞培養が平行して行われる場合があり、このような状況に適した培地の管理装置および管理方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２４４３４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、灌流式細胞培養において、培地流量が少ない場合でも、培地の流量や状態（培地成分の濃度変化、変質など）などを簡易な構成または方法で実時間監視（モニタリング）することが可能な灌流培地モニタリング装置および灌流培地モニタリング方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、生物試料を収容する生物試料収容容器へ培地を灌流する培地灌流システムと、前記生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルと、前記出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出するセンサと、前記センサの出力から液滴数を計数する計数装置と、を備える灌流培地モニタリング装置である。
【００１１】
また、前記灌流培地モニタリング装置において、前記生物試料収容容器の培地入口側の配管に接続された入口側ノズルと、前記入口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出するセンサと、を備えることが好ましい。
【００１２】
また、本発明は、生物試料を収容する生物試料収容容器へ培地を灌流し、前記生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出し、その液滴の液滴数をモニタリングする灌流培地モニタリング方法である。
【００１３】
また、前記灌流培地モニタリング方法において、前記生物試料収容容器の培地入口側の配管に接続された入口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出し、その液滴の液滴数をモニタリングすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、生物試料収容容器へ培地を灌流する培地灌流システムと、生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルと、出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出するセンサと、センサの出力から液滴数を計数する計数装置と、を備えることにより、灌流式細胞培養において、培地流量が少ない場合でも、培地の流量や状態（培地成分の濃度変化、変質など）などを簡易な構成で実時間監視（モニタリング）することが可能な灌流培地モニタリング装置を提供することができる。
【００１５】
また、本発明では、生物試料を収容する生物試料収容容器へ培地を灌流し、生物試料収容容器の培地出口側の配管に接続された出口側ノズルから滴下する培地の液滴を検出し、その液滴の液滴数をモニタリングすることにより、培地流量が少ない場合でも、培地の流量や状態（培地成分の濃度変化、変質など）などを簡易な方法で実時間監視（モニタリング）することが可能な灌流培地モニタリング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態に係る灌流培地モニタリング装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】液体の表面張力γと、液体の溶質（糖類）濃度ｃとの関係を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る灌流培地モニタリング装置の他の例を示す概略構成図である。
【図４】本発明の実施例１におけるグルコース濃度と液滴数との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１８】
本発明の実施形態に係る灌流培地モニタリング装置は、灌流式細胞培養において、培地流量が少ない場合でも、培地の流量や状態（培地成分の濃度変化、変質など）などの実時間監視（モニタリング）を簡易な構成で実現するものである。本実施形態に係る灌流培地モニタリング装置の一例の概略を図１に示し、その構成について説明する。灌流培地モニタリング装置１は、生物試料を収容して培養を行うための生物試料収容容器１２と、生物試料収容容器１２へ培地を灌流する培地灌流システム１０と、生物試料収容容器１２の培地出口側の配管に接続された出口側ノズル１４と、出口側ノズル１４から滴下する培地の液滴を検出するセンサ１６と、センサ１６の出力から液滴数を計数する計数装置２０と、計数装置２０により計数したデータを記録可能な記録・表示装置２２とを備える。培地灌流システム１０は、培地容器２４と、送液ポンプ２６とを備える。
【００１９】
灌流培地モニタリング装置１において、培地容器２４は、送液ポンプ２６の流入側に配管などにより接続され、送液ポンプ２６の吐出側に配管などにより生物試料収容容器１２の入口が接続されている。生物試料収容容器１２の出口は、配管などにより出口側ノズル１４に接続され、出口側ノズル１４の先端部は、出口側ノズル１４から排出された培地の液滴を検出するための容器１８の入口に挿入されている。容器１８には、出口側ノズル１４から滴下する培地の液滴を検出することが可能なようにセンサ１６が設置されている。センサ１６には、計数装置２０が電気的接続などにより接続され、計数装置２０には、記録・表示装置２２が電気的接続などにより接続されている。
【００２０】
生物試料収容容器１２としては、担体に接着された細胞などの生物試料を収容して培養を行うための収容部と、収容部に通じる入口部および出口部とを有し、液体である培地を収容部に流すことができるものであればよく、特に制限はない。生物試料収容容器１０は、収容部に、ガラスまたは樹脂などの透明材料を用いた観察窓を有していてもよい。
【００２１】
出口側ノズル１４の吐出口の内外径および形状は、培地の送液速度などに応じて適宜選択される。出口側ノズル１４の吐出口の内外径および形状は、後述する式１から想起されるように液滴重量と関連がある。
【００２２】
センサ１６としては、液滴を検出するものであればよく、特に制限はないが、検出対象からの光反射、散乱、吸収などを利用する各種方式の光学センサなどが挙げられる。センサ１６は、液滴の大きさ、使用する容器１８などにより、適宜選択すればよい。
【００２３】
容器１８は、センサ１６により液滴を検出可能なものであればよく、特に制限はないが、例えば、ガラス、樹脂などの実質的に光学的に透明な瓶であっても、配管系の途中に設置されるサイトフローであってもよい。液滴を滴下させる容器１８には、測定環境条件により発生する結露などによって検出が妨げられないように、ヒータなどの加熱装置を設置してもよい。
【００２４】
送液ポンプ２６としては、少ない流量（例えば、２ｍＬ／ｈｒ程度）で、流量精度、再現性がよいものであることが好ましい。
【００２５】
本実施形態に係る灌流培地モニタリング装置１を用いた、灌流培地モニタリング方法について説明する。
【００２６】
培地の流量や培地の状態などのモニタリングは、所定の時間ごとにノズル１４から滴下する液滴を計数、記録することにより行う。ここで、液滴の滴下に関して、以下の式（１）が知られている。
２πｒγ＝ｍｇθ        （１）
（式（１）において、ｒ：ノズルの吐出口の半径（ｃｍ）、γ：液体の表面張力（ｄｙｎ／ｃｍ）、ｍ：液滴の質量（ｇ）、ｇ：重力（ｃｍ／ｓ２）、θ：補正係数である。）
【００２７】
補正係数θは、実際に滴下する液滴がノズルの吐出口で釣り合う液滴の液量の一部であることによる補正のためのものであり、θ＝ｆ（ノズルの吐出口の半径／液滴の体積）として、実験的に求めることができる。式（１）より明らかなように、ノズルの吐出口の内径、外径、形状、材質などが等しい場合、液滴の質量ｍは、液体の表面張力γに依存する。液体のノズルへの送液速度が一定であれば、液滴質量の変化は所定時間当たりの滴下数の変化として現れる。液体の表面張力γは、液体の温度と液体中の溶質濃度に依存する。細胞培養に用いられる培地には、通常、無機塩類の他に、タンパク質や糖類などが含まれ、それらの濃度は表面張力γに影響を与える（図２参照）。例えば、培地の主要な成分である糖類（グルコースなど）は細胞により消費されるが、培養中の細胞のグルコース消費量は、細胞の増殖や分化より異なる。したがって、一定の温度条件の下で、液滴の滴下計数率を監視し、その変化が培地の流量変化ではないことが確認できれば、何らかの原因（例えば、細胞による糖類などの消費、あるいはその他の原因）により、液体の表面張力γに影響を及ぼす培地成分の濃度などが変化している可能性があることを示す。
【００２８】
＜測定対象の生物試料の準備＞
測定対象となる細胞などの生物試料を、例えばガラス板などの担体に接着などして、担体ごと生物試料収容容器１２に収容する。
【００２９】
測定対象となる生物試料としては、細胞などが挙げられる。生物試料を接着する担体としては、ガラス、樹脂などが挙げられる。例えば、細胞をガラス板により単層培養したものを用いればよいが、灌流系に組み込める形態であれば、どのような培養形態であってもよい。
【００３０】
＜培地の加温・脱ガス＞
培地容器２４内には培地を収容する。培地は、生物試料の生存に適した成分を含む液体である。培地容器２４内の培地は、必要に応じてスターラなどの撹拌装置により撹拌しながら、恒温槽などにより所定の温度（例えば、３７℃前後）に加温、制御することが好ましい。また、培地容器２４内の培地の温度は、温度センサなどによりモニタリングし、必要に応じて記録・表示装置２２により、データとして記録し、グラフなどによって表示してもよい。
【００３１】
＜生物試料の培養および培地のモニタリング＞
培地容器２４内の培地を、送液ポンプ２６により生物試料収容容器１２へ送液し、生物試料収容容器１２内の細胞などの生物試料の培養を行う。培地の送液流量は、例えば、外径０．５ｍｍ程度のノズルを使用する場合には２〜６０ｍＬ／ｈｒ程度である。必要に応じて、送液流量を高くして、配管系のパージを行ってもよい。培地は、生物試料収容容器１２から流出し、出口側ノズル１４の吐出口から液滴として容器１８に滴下する。この滴下する液滴をセンサ１６によって検出する。センサ１６は、液滴を検出するごとにパルスなどを出力し、接続される計数装置２０により所定の時間ごとの計数またはパルス間隔などの平均値から所定時間ごとの液滴計数率が得られる。液滴計数率は、例えば、液滴計数率に比例するアナログ電圧に変換し、記録・表示装置２２により経時的にデータとして記録し、必要に応じてグラフなどによって表示する。生物試料収容容器１２内の温度は、温度センサなどによりモニタリングし、必要に応じて記録・表示装置２２により、記録、表示してもよい。
【００３２】
細胞培養において、細胞は培地中の糖類（グルコースなど）を主に消費する。例えば、細胞がグルコースを消費すると、培地中のグルコース濃度が低下し、表面張力が低下する。これにより、液滴が小さくなり、滴下する間隔が短くなると考えられる。また、培地の流量が変化した場合にも滴下する間隔が変化する。したがって、液滴数または液滴数から得られる所定時間ごとの液滴計数率を計数することにより、培地の流量や状態（培地成分の濃度変化、変質など）などを簡易な方法でモニタリングすることができる。
【００３３】
また、液滴計数率が変化した場合に、アラームなどの警報装置が作動するようにしてもよい。
【００３４】
本実施形態において、図３に示すように、送液ポンプ２６の後流側かつ生物試料収容容器１２の培地入口側で配管を分岐し、生物試料収容容器１２を通過した液と、生物試料収容容器１２を通過せずにバイパスした液とのそれぞれについて、液滴を計数し、それらを比較することにより、送液ポンプ２６などに起因する培地の流量変化と、培地の状態などの変化とを区別してモニタリングすることができる。培地の状態の変化（培地成分の濃度変化、変質など）により、例えば、なんらかの培養状態の変化があったことが推測される。
【００３５】
図３の灌流培地モニタリング装置３において、図１の灌流培地モニタリング装置１の構成に加えて、送液ポンプ２６の後流側かつ生物試料収容容器１２の培地入口側の配管に配管などにより接続された入口側ノズル２８と、入口側ノズル２８から滴下する培地の液滴を検出するセンサ３０と、を備える。
【００３６】
入口側ノズル２８は、配管などによりに生物試料収容容器１２の入口側の配管と接続され、入口側ノズル２８の先端部は、入口側ノズル２８から排出された培地の液滴を検出するための容器３２の入口に挿入されている。容器３２には、入口側ノズル２８から滴下する培地の液滴を検出することが可能なようにセンサ３０が設置されている。センサ３０には、計数装置２０が電気的接続などにより接続されている。入口側ノズル２８を接続する配管は、流路が切り替え可能な三方バルブなどを介して、生物試料収容容器１２の入口側の配管と接続されてもよい。
【００３７】
図３の灌流培地モニタリング装置３において、培地容器２４内の培地を、送液ポンプ２６により生物試料収容容器１２へ送液し、生物試料収容容器１２内の細胞などの生物試料の培養を行う。培地は、生物試料収容容器１２から流出し、出口側ノズル１４の吐出口から液滴として容器１８に滴下する。この滴下する液滴をセンサ１６によって検出する。一方、生物試料収容容器１２の培地入口側の配管で分岐された培地は、入口側ノズル２８の吐出口から液滴として容器３２に滴下する。この滴下する液滴をセンサ３０によって検出する。センサ１６，３０は、それぞれ液滴を検出するごとにパルスなどを出力し、接続される計数装置２０により所定の時間ごとの計数またはパルス間隔などの平均値から所定時間ごとの液滴計数率がそれぞれ得られる。液滴計数率は、例えば、液滴計数率に比例するアナログ電圧に変換し、記録・表示装置２２により経時的にデータとして記録し、必要に応じてグラフなどによって表示する。入口側ノズル２８からの液滴計数率の変化は、送液ポンプ２６などに起因する培地の流量変化を表す。したがって、出口側ノズル１４からの液滴計数率と、入口側ノズル２８からの液滴計数率とを比較する（例えば、差分、変化率などを求める）ことにより、送液ポンプ２６などに起因する培地の流量変化と、培地の状態などの変化とを区別してモニタリングすることができる。
【００３８】
また、液滴計数率が変化した場合に、アラームなどの警報装置が作動するようにしてもよい。例えば、送液ポンプ２６などに起因する培地の流量変化が生じた場合は、送液ポンプ２６などにフィードバックして、送液ポンプ２６などを制御してもよい。
【００３９】
入口側ノズル２８の吐出口の内外径および形状は、出口側ノズル１４と同様に、培地の送液速度に応じて適宜選択される。センサ３０、容器３２は、センサ１６、容器１８とそれぞれ同様のものである。
【００４０】
このように、本実施形態に係る灌流培地モニタリング装置および灌流培地モニタリング方法では、液滴計数率のモニタリングによって得られる液体の表面張力の変化から培地の流量の変化や状態の変化（培地成分の濃度変化、変質など）を検知するものであり、表面張力の変化の原因となった物質の特定やその変化量、濃度を示すものではないが、再生医療などのように比較的長い培養期間を要する小規模な細胞培養、組織培養などにおいて、培地の流量や状態の実時間監視を容易に可能とすることにより、効率的、経済的な培養の実現に寄与することができる。
【００４１】
また、本実施形態に係る灌流培地モニタリング装置において、構成する各要素は、それほどコストがかかるものではなく、また、可動機構部品をほとんど含まず、化学分析で必要となる校正などの手間や高価な消耗品をほとんど必要としないため、装置の導入や維持、管理に要するコストが低くなる。
【００４２】
このように、灌流式細胞培養において、培地の流量や状態などの実時間監視が可能となる。また、ネットワーク接続可能な記録装置を利用すれば、これらの遠隔監視も容易に実現することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
＜実施例１＞
以下の構成の装置を用いて、試料液を送液ポンプにより送液し、注射針より滴下する液滴を計数し、液滴の、培地中のグルコースの濃度依存性を測定した。
［送液ポンプ］
ポンプ：ペリスタ・バイオミニポンプ（ＡＣ−２１２０、アトー株式会社製）
流量：２ｍＬ／ｈｒ
［送液配管］
送液チューブ：サンゴバン社製、Ｔｙｇｏｎ３６０３、内径１ｍｍ／外径３ｍｍ
［ノズル（注射針）］
テルモ社製、ＮＮ−２５１６Ｒ、内径０．３２ｍｍ／外径０．５ｍｍ
［センサ］
光学センサ：センサヘッド（キーエンス社製、ＬＶ−Ｓ６２）、アンプユニット（キーエンス社製、ＬＶ−１１ＳＢ）
［計数装置および記録装置］
オムロン社製、ＺＲ−ＲＸ４０
【００４５】
培地は以下のものを用いた。
［培地］
ＰＢＳ（リン酸緩衝液）、グルコース、卵アルブミン
培地流量：２ｇ／ｈｒ，６．７ｇ／ｈｒ，２０ｇ／ｈｒ，７０ｇ／ｈｒ
【００４６】
結果を図４に示す。図４において、グルコース濃度を変えたとき（０ｇ／Ｌ，１．４ｇ／Ｌ，２．９ｇ／Ｌ）の液滴数を、グルコース濃度が２．９ｇ／Ｌのときの液滴数を基準とした偏差（％）で表している。このように、注射針より滴下する液滴数と、培地中のグルコースの濃度とは相関が見られ、液滴計数率のモニタリングによって培地の状態の変化（培地成分の濃度変化、変質など）を検知することが可能であることがわかった。
【符号の説明】
【００４７】
１，３  灌流培地モニタリング装置、１０  培地灌流システム、１２  生物試料収容容器、１４  出口側ノズル、１６，３０  センサ、１８，３２  容器、２０  計数装置、２２  記録・表示装置、２４  培地容器、２６  送液ポンプ、２８  入口側ノズル。
【図１】
2010252753.tif 000003
【図２】
2010252753.tif 000004
【図３】
2010252753.tif 000005
【図４】
2010252753.tif 000006