(57)【要約】【課題】  植物病原菌に対して優れた防除効果を有する化合物を同定し、当該化合物を利用した植物病原菌の防除剤および防除方法を提供すること【解決手段】  金属のキレートまたは塩が植物病原菌に対して優れた防除効果を有することを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属のキレートまたは塩を有効成分とする、植物病原菌の防除剤。
【請求項２】
金属が銅または亜鉛である、請求項１に記載の防除剤。
【請求項３】
金属のキレートが、グルコン酸をキレート剤として調製されるものである、請求項１に記載の防除剤。
【請求項４】
金属のキレートが、グルコン酸銅、グルコン酸亜鉛、およびグリシン亜鉛からなる群より選択される、請求項１に記載の防除剤。
【請求項５】
植物病原菌が植物病原細菌または植物病原真菌である、請求項１〜４のいずれかに記載の防除剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の防除剤を植物に施用することを含む、植物病原菌の防除方法。
【請求項７】
植物病原菌が植物病原細菌または植物病原真菌である、請求項６に記載の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属のキレートまたは塩を有効成分とする植物病原菌の防除剤、および当該防除剤を植物に施用することを含む植物病原菌の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類は食料や有用物質の生産の多くを植物に依存している。糸状菌病、細菌病、植物ウイルス病などの植物病害は植物の生産力を大きく損なう主要な要因のひとつであり、仮に、植物病害に対する保護を実施せずに栽培を行うと収穫高が70％減収すると予想されている。このように植物病害の防除による作物収量の損失の削減は、作物の大量栽培による増産に匹敵する効果を有している。
【０００３】
このため、植物病害から作物を保護するための、様々な防除剤が開発されてきた。例えば、糸状菌病や細菌病などの植物病原菌の感染による植物病害に対しては、抗生物質であるカスガマイシンやストレプトマイシンを主成分とする防除剤、ストロビルリン系殺菌剤（QoI剤）、コハク酸脱水素酵素阻害剤（SDHI剤）などの防除剤が利用されている。しかしながら、これら防除剤には、数年で耐性菌が発達し、病害防除が困難になるという問題が指摘されている。
【０００４】
一方、植物ウイルスの感染による植物病害の防除剤としては、日本においてレンテミンが農薬登録されているものの、特効薬となる化学農薬は、いまだ存在しない（レンテミンは、野田食菌工業（株）の登録商標。農薬登録第15584号、第17774号、第19439号、第19440号）。
【０００５】
このような状況下、本発明者は、金属キレートが植物ウイルスに対して防除効果があることを見出し、それらを植物ウイルスに対する防除剤として利用することを提案している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2017-178838号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物病原菌に対して優れた防除効果を有する化合物を同定し、当該化合物を利用した植物病原菌の防除剤および防除方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、種々の金属のキレートまたは塩が植物病原菌に対して優れた防除効果を有することを見出した。
【０００９】
金属キレートについては、これまで植物ウイルスに対して防除効果があることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、植物ウイルスと植物病原菌とでは、植物への感染機序が全く異なるため、植物ウイルスに防除効果を発揮する薬剤が、植物病原菌に対しても防除効果を発揮するかは予測できない。この事は、植物ウイルス病に対する唯一の農薬であるレンテミンが糸状菌病を全く抑制しなかったことからも裏付けられる（参考例１を参照のこと）。従って、金属のキレートや塩が植物ウイルスのみならず、植物病原菌に対しても防除効果を発揮したことは、驚くべきことである。
【００１０】
また、金属のキレートや塩による植物病原菌に対する防除効果は、非常に高く、しかも、シロイヌナズナ、チンゲンサイ、トマト、キュウリ、イチゴなどに感染する広範囲の植物病原菌に対して認められた。さらに、金属キレートを用いた場合には、高濃度で投与した場合でも植物への薬害は生じなかった。
【００１１】
以上から、本発明者は、金属のキレートや塩が植物病原菌に対する防除剤として有効であり、特に金属のキレートについては、優れた防除効果と安全性を兼ね備えた防除剤になり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、金属のキレートまたは塩を有効成分とする植物病原菌の防除剤、および当該防除剤を植物に施用することを含む植物病原菌の防除方法に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
【００１３】
［１］金属のキレートまたは塩を有効成分とする、植物病原菌の防除剤。
【００１４】
［２］金属が銅または亜鉛である、［１］に記載の防除剤。
【００１５】
［３］金属のキレートが、グルコン酸をキレート剤として調製されるものである、［１］に記載の防除剤。
【００１６】
［４］金属のキレートが、グルコン酸銅、グルコン酸亜鉛、およびグリシン亜鉛からなる群より選択される、［１］に記載の防除剤。
【００１７】
［５］植物病原菌が植物病原細菌または植物病原真菌である、［１］〜［４］のいずれかに記載の防除剤。
【００１８】
［６］［１］〜［４］のいずれかに記載の防除剤を植物に施用することを含む、植物病原菌の防除方法。
【００１９】
［７］植物病原菌が植物病原真菌または植物病原細菌である、［６］に記載の防除方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の防除剤を用いれば、効果的に植物病原菌を防除することが可能である。特に金属のキレートを有効成分とする防除剤は、葉の萎縮や斑点の発生などの薬害を生じることがないため、安全性にも優れている。また、本発明の防除剤によれば、植物の防御応答遺伝子の発現を高めて、植物病原菌に対する植物の抵抗性を誘導することが可能であり、耐性菌を生じるリスクも少ない。さらに、植物体において、それを施用した部位のみならず、その周辺部位においても防除効果をもたらすことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各種金属キレート処理したシロイヌナズナにおける防御応答遺伝子の発現を解析した結果を示すグラフである。図中、CuGlucはグルコン酸銅、ZnGlucはグルコン酸亜鉛、FeGlucはグルコン酸鉄をそれぞれ示す。以下、同様。
【図２】グルコン酸亜鉛処理したチンゲンサイにおけるアブラナ科植物黒斑細菌病菌の感染抑制効果を示すグラフである。品種としては、青帝とシャオパオを用いた。
【図３】各種金属キレート処理したチンゲンサイにおけるアブラナ科植物黒斑細菌病菌の感染抑制効果を示すグラフである。品種としては、シャオパオを用いた。図中、CuSO4は硫酸銅、ZnSO4は硫酸亜鉛をそれぞれ示す。以下、同様。
【図４】各種金属キレート処理したチンゲンサイにおけるアブラナ科野菜類炭疽病菌の感染抑制効果を示すグラフである。品種としては、シャオパオを用いた。
【図５】各種金属キレート処理したシロイヌナズナにおけるアブラナ科野菜類炭疽病菌の感染抑制効果を示すグラフである。
【図６】各種金属キレート処理したシロイヌナズナにおけるアブラナ科植物黒斑細菌病菌の感染抑制効果を示すグラフである。
【図７】各種金属キレート処理したトマトにおける斑葉細菌病菌の感染抑制効果を示すグラフである。
【図８】各種金属キレート処理したキュウリにおけるウリ類炭疽病菌の感染抑制効果を示すグラフである。
【図９】各種金属キレート処理したイチゴにおけるイチゴ炭疽病菌の感染抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の防除剤に用いる金属のキレートまたは塩としては、植物病原菌の防除効果を有するものであれば特に制限はない。
【００２３】
本発明に用いる金属としては、例えば、銅、亜鉛、鉄、マンガン、モリブデン、マグネシウム、ケイ素、ホウ素、カルシウム、コバルト、ニッケルなどが挙げられるが、植物に対する毒性が低いことから、好ましくは銅または亜鉛である。
【００２４】
金属イオンをそのまま（無機のまま）土壌に与えた場合、その金属イオンは土壌中のリン酸などと化合して不溶性の沈殿を形成し、所望の効果を十分に得ることができない場合がある。そこで、予めキレート剤と化合させてキレートを作製し、それを施用することにより他の成分との化合を防止して本来の効果を発揮させることができる。また、金属のキレートは植物に吸収され易いという性質を持つ。このような観点から、本発明の防除剤の有効成分としては、金属のキレートが好ましい。
【００２５】
なお、本発明においては、キレート化合物またはキレート塩を一般的にキレートと称する。
【００２６】
金属のキレートを調製するためのキレート剤としては、例えば、グルコン酸、グリシン、EDTA（エチレンジアミン四酢酸、Ethylendiaminetetraacetic  acid）、DTPA（ジエチレントリアミンペンタアセテート酸、Diethylenetriamine  pentaacetic  acid）、NTA（ニトリロ三酢酸、Nitrilotriacetic  acid）、EDDS（エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸、Ethylenediamine-N,N’-disuccinic  acid）、DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸）、クエン酸、蟻酸、フィチン酸、エチレンジアミン、ビピリジン、フェナントロリンなどが挙げられるが、植物に対する毒性が低いことから、好ましくはグルコン酸またはグリシンである。グルコン酸銅、グルコン酸亜鉛、および、グリシン亜鉛は、優れた防除効果と毒性の低さを兼ね備えていることから、本発明の防除剤の有効成分として最も好適に用いることができる。
【００２７】
なお、汎用性の観点からは、EDTA系キレート剤を好適に用いることができ、自然分解性の観点からはEDDSなどを好適に用いることができる。
【００２８】
金属の塩としては、例えば、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩などが挙げられるが、金属塩であれば特に限定されない。
【００２９】
本発明の防除剤においては、上記有効成分を1種単独でまたは2種以上組み合わせて使用することができる。
【００３０】
また、本発明の防除剤は、植物病原菌の防除効果が阻害されない限り、他の任意の成分を含有していてもよい。他の任意成分としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、稀釈剤、賦形剤、界面活性剤、展着剤、アミノ酸類、ペプチド、肥料要素、天然物由来成分等を挙げることができる。
【００３１】
植物病原菌に対する防除効果をさらに高めるため、あるいは、適用対象とする植物病原菌の範囲を広げるため、本発明の防除剤は、植物病原菌の防除に寄与する既知の薬剤と組み合わせて用いることができる。また、既知の殺虫剤、殺ダニ剤、植物ウイルス防除剤などと組み合わせて用いることもできる。
【００３２】
本発明の防除剤の植物への施用方法は特に制限されず、例えば、散布、塗布、土壌潅注、土壌混和、育苗箱施用、種子消毒などが挙げられる。本発明の防除剤が施用されている領域では非常に高い感染防除効果が認められることから、施用方法としては、散布や塗布などによる植物体の全体や葉への施用、あるいは土壌潅注や土壌混和などによる根への施用が好ましい。本発明の防除剤は、施用された部位の周辺部位においても、植物病原菌に対する防除効果を示すことができる点で有利である。
【００３３】
本発明の防除剤の剤型は、上記施用方法などに応じて各種の形態を採ることができ、例えば、乳剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤などの液剤の他、水和剤、水溶剤、粉剤、粒剤などが挙げられる。散布などにより植物体へ施用する場合には、施用時に液状にすることができる剤型が好ましい。
【００３４】
施用時における各薬剤の濃度は、植物病原菌に対して防除効果を有し、かつ、植物体への薬害が生じない濃度であれば特に制限はない。通常0.1〜50mMの範囲内であるが、例えば、グルコン酸亜鉛であれば、2〜20mMが好ましく、グルコン酸鉄であれば、0.2〜2mMが好ましく、グルコン酸銅であれば、0.1〜5mM、グリシン亜鉛であれば、2〜20mMが好ましい。また、硫酸亜鉛であれば、0.1〜5mMが好ましく、硫酸銅であれば、0.1〜5mMが好ましい。
【００３５】
本発明の防除剤の植物への施用時期は特に制限されないが、予防的な防除が有効である。
【００３６】
本発明の防除剤における植物病原菌の防除作用は、植物病原菌の感染を抑制・阻害させる作用、増殖・伸展・移動を抑制または阻害する作用、および死滅させる作用を含む。本発明の防除剤が防除作用を示す植物病原菌は、特に制限されるものではなく、細菌であっても、糸状菌などの真菌であってもよい。
【００３７】
植物病原細菌としては、例えばPseudomonas属菌、Erwinia属菌、Xanthomonas属菌、Ralstonia属菌、Streptomyces属菌、Clavibacter属菌、Agrobacterium属菌、Curtobacterium属菌、Acidovorax属菌、Burkholderia属菌が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３８】
具体的な植物病原細菌としては、例えば、アブラナ科植物黒斑細菌病菌（Pseudomonas  syringae  pv.  maculicola、Pseudomonas  cannabina  pv.  alisalensis）、トマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas  syringae  pv.  tomato）、レタス腐敗病菌（Pseudomonas  cichorii、  Pseudomonas  marginalis、Pseudomonas  viridiflava）、モモせん孔細菌病菌（Xanthomonas  arboricola  pv.  pruni、Pseudomonas  syringae  pv.  syringae、Brenneria  nigrifluens、Erwinia  nigrifluens）、アカクローバ斑点細菌病菌・アズキ褐斑細菌病菌・カンキツ褐斑細菌病菌など（Pseudomonas  syringae  pv.  syringae）、ダイズ斑点細菌病菌（Pseudomonas  savastanoi  pv.  glycinea）、キュウリ斑点細菌病菌（Pseudomonas  syringae  pv.  lachrymans）、タバコ野火病菌(Pseudomonas  syringae  pv.  tabaci)、エンドウつる枯細菌病菌(Pseudomonas  syringae  pv.  pisi)、キウイフルーツかいよう病菌（Pseudomonas  syringae  pv.  actinidiae）、ハクサイ・キャベツ・ダイコン・レタス等軟腐病菌(Erwinia  carotovora)、イネ白葉枯病菌(Xanthomonas  oryzae  pv.  oryzae)、ダイズ葉焼病菌(Xanthomonas  campestris  pv.  glycinea、Xanthomonas  axonopodis  pv.  glycinea)、キャベツ・ブロッコリー等アブラナ科植物黒腐病菌(Xanthomonas  campestris  pv.  campestris)、レタス斑点細菌病菌(Xanthomonas  axonopodis  pv.  vitians)、カンキツかいよう病菌(Xanthomonas  citri  subsp.  citri)、トマト・ナス・ピーマン・イチゴ・ショウガ青枯病菌(Ralstonia  solanacearum)、ジャガイモそうか病菌（Streptomyces  spp.）、トマトかいよう病菌（Clavibacter  michiganensis  subsp.  michiganensis）、キク科・バラ科植物等根頭がんしゅ病菌（Agrobacterium  tumefaciens）、メロン毛根病菌（Agrobacterium  rhizogenes）、ブドウ根頭がんしゅ病菌（Agrobacterium  vitis、Rhizobium  radiobacter）、インゲンマメ萎ちょう細菌病菌（Curtobacterium  flaccumfaciens  pv.  flaccumfaciens）、チューリップかいよう病（Curtobacterium  flaccumfaciens  pv.  oortii）、スイカ果実汚斑細菌病菌（Acidovorax  avenae  subsp.  citrulli）、イネ褐条病菌・トウモロコシ褐条病菌（Acidovorax  avenae  subsp.  avenae）、イネもみ枯細菌病菌(Burkholderia  glumae)、イネ苗立枯細菌病菌(Burkholderia  plantarii)、ジャガイモ黒あし病菌（Pectobacterium  carotovorum、Pectobacterium  atrosepticum）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３９】
また、植物病原真菌としては、例えば、Colletotrichum属菌、Phytophthora属菌、Podosphaera属菌、Sphaerotheca属菌、Leveillula属菌、Oidium属菌、Oidiopsis属菌、Erysiphe属菌、Uncinula属菌、Botrytis属菌、Fusarium属菌、Pyricularia属菌、Fulvia属菌、Pseudocercospora属菌、Gibberella属菌、Monographella属菌、Pestalotiopsis属菌、Corynespora属菌、Puccinia属菌、Alternaria属菌、Plasmopara属菌、Bremia属菌、Peronospora属菌、Cochliobolus属菌、Rhizoctonia属菌、Sclerotinia属菌、Verticillium属菌、Venturia属菌、Monilinia属菌、Cercospora属菌、Leptosphaeria属菌が挙げられるが、これらに制限されない。
【００４０】
具体的な植物病原真菌としては、例えば、アブラナ科類炭疽病菌（Colletotrichum  higginsianum）、ウリ類炭疽病菌（Colletotrichum  orbiculare）、イチゴ炭疸病菌（Colletotorichum  acutatum、Colletotrichum  gloeosporioides種複合体；C.  aenigma、C.  fructicola、C.  siamense）、ダイコン炭疽病菌(Colletotrichum  incanum、Colletotrichum  dematium)、ブドウ晩腐病（Colletotrichum  gloeosporioides）、イネ科植物炭疽病菌（Colletotrichum  graminicola)、野菜・他の宿主植物の炭疽病菌（Colletotrichum  spp.）、ジャガイモ・トマト疫病菌（Phytophthora  infestans）、イチゴ疫病菌（Phytophthora  nicotianae、Phytophthora  cactorum、  Phytophthora  sp.）、サトイモ疫病菌（Phytophthora  colocasiae）、野菜・観賞植物・タバコ・他の宿主植物の疫病菌（Phytophthora  spp.）、イチゴうどんこ病菌（Podosphaera  aphanis、Sphaerotheca  aphanis、Sphaerotheca  humuli）、トマトうどんこ病菌（Leveillula  taurica、Oidium  sp.、Oidium  lycopersici、Oidium  neolycopersici）、キュウリうどんこ病菌（Sphaerotheca  fuliginea、Sphaerotheca  cucurbitae、Oidiopsis  sicula、Erysiphe  polygoni、Oidium  sp.）、オオムギ・コムギうどんこ病菌（Erysiphe  graminis）、ブドウうどんこ病菌（Erysiphe  necator、Uncinula  necator）、エンドウうどんこ病菌(Erysiphe  pisi)、カボチャうどんこ病菌（Sphaerotheca  cucurbitae、Oidium  citrulli）、ナスうどんこ病菌(Erysiphe  cichoracearum、Sphaerotheca  fuliginea、Oidiopsis  sicula)、野菜・観賞用植物・他の宿主植物のうどんこ病病菌、トマト・イチゴ・キュウリ・野菜・ブドウ・他の宿主植物の灰色かび病菌(Botrytis  cinerea)、イチゴ萎黄病菌(Fusarium  oxysporum  f.sp．fragariae)、イネいもち病菌（Pyricularia  grisea（P.  oryzae)）、トマト葉かび病菌（Fulvia  fulva）、トマトすすかび病菌（Pseudocercospora  fuligena）、コムギ赤かび病（Gibberella  zeae、Fusarium  avenaceum、Fusarium  culmorum、Fusarium  crookwellense、Monographella  nivalis）、チャ輪斑病菌（Pestalotiopsis  longiseta、Pestalotiopsis  theae）、ダイズ急性枯死症菌（Fusarium  tucumaniae、Fusarium  virguliforme）、キュウリ褐斑病菌（Corynespora  cassiicola）、オオムギ・コムギの黒さび病菌（Puccinia  graminis）、オオムギ・コムギの黄さび病菌（Puccinia  striiformis  Westendorp  var.  striiformis）、オオムギの小さび病菌（Puccinia  hordei  Otth）、コムギの赤さび病菌（Puccinia  recondita  Roberge  ex  Desmazieres）、ネギ類さび病菌（Puccinia allii）、キク類白さび病菌（Puccinia horiana  Hennings）、コーヒー・西洋なし・リンゴ・落花生・野菜・観賞用植物・他の宿主植物のさび病菌、ナシ黒斑病菌（Alternaria  alternata）、キャベツ黒すす病菌（Alternaria  brassicicola）、ハクサイ黒斑病菌（Alternaria  brassicae、Alternaria  brassicicola、Alternaria  japonica）、その他の野菜（例えば、キュウリ・アブラナ科野菜）・リンゴ・トマト・他の宿主植物の黒斑病菌（Alternaria  spp.）、ブドウベト病菌（Plasmopara  viticola）、レタスベト病菌（Bremia  lactucae）、キュウリべト病菌（Pseudoperonospora  cubensis）、ハクサイベト病菌(Peronospora  parasitica)、ダイズ・タバコ・タマネギ・他の宿主植物のべと病菌（Peronospora  spp.）、イネごま葉枯病菌（Cochliobolus  miyabeanus）、キュウリつる割病菌（Fusarium  oxysporum  f.  sp.  cucumerinum）、トマト萎ちょう病菌（Fusarium  oxysporum  f.  sp.  lycopersici）、イネばか苗病菌（Gibberella  fujikuroi）、キュウリ、ナスなどリゾクトニア苗立枯病菌（Rhizoctonia  solani）、トマト小粒菌核病菌（Sclerotinia  minor）、ジャガイモ半身萎ちょう病菌（Verticillium  albo-atrum、Verticillium  dahliae、Verticillium  nigrescens、Verticillium  tricorpus）、トマト輪紋病菌（Alternaria  solani）、野菜類菌核病菌（Sclerotinia  sclerotiorum）、リンゴ黒星病菌（Venturia  inaequalis）、モモ灰星病菌（Monilinia  fructicola）、ダイズ紫斑病菌（Cercospora  kikuchii）、テンサイ褐斑病菌（Cercospora  beticola）、コムギふ枯病菌（Leptosphaeria  nodorum）が挙げられるが、これらに制限されない。
【００４１】
植物病原菌の防除を行う植物の代表的なものとしては、例えば、トマト、ナス、ピーマン、トウガラシ、タバコ、ジャガイモなどのナス科植物、キュウリ、カボチャ、メロンなどのウリ科植物、イチゴ、リンゴ、ナシ、ウメ、モモなどのバラ科植物、ハクサイ、チンゲンサイ、キャベツ、コマツナ、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、ダイズなどのマメ科植物、イネ、コムギなどのイネ科植物、サトイモなどのサトイモ科植物などが挙げられるが、本発明は、上記植物病原菌が感染する、その他多くの植物にも広範に適用できる。
【００４２】
なお、植物病原菌と宿主植物との関係については、日本植物病名データベース（農業生物資源ジーンバンク）を参照のこと。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
[実施例１]  各種金属キレート処理したシロイヌナズナにおける防御応答遺伝子の発現の解析
植物材料として、シロイヌナズナ(生態型：コロンビア)を、土（スーパーミックスA（サカタのタネ）：ホワイトバーミキュライト（A-2、旭工業株式会社）：黒曜石パーライト（フヨーライト3号）＝2：1：1）に播種し、22℃にて24時間の明暗サイクル（明時間12時間および暗時間12時間）で栽培した。播種して1週間後に1鉢当たり5個体になるように植え替えを行い、同条件下でさらに3週間栽培した。0.01％の展着剤（マイリノー）を添加した各種薬剤を、上述したように栽培したシロイヌナズナに対し、1鉢当り3〜5mlで噴霧処理した。
【００４５】
処理後、22℃にて、明時間12時間および暗時間12時間のサイクル条件下で静置し、2日後にサンプリングした。
【００４６】
サンプリングした植物体は液体窒素で凍結し、MaxwellTMRSC  simplyRNA  Tissue  Kit（Promega社製）を用いて全RNAを抽出した。続いて、PrimeScript  RT  reagent  Kit（タカラ社製）を用いて全RNAから一本鎖cDNAを合成した。さらに、SsoAdvancedTM  Universal  SYBRTM  Green  Supermix（バイオラッド社製）を用いて定量的RT-PCRを行った。また、定量的RT-PCRは、1×SsoAdvancedTM  Universal  SYBRTM  Green  Supermix、200nMのフォワードプライマーとリバースプライマーの反応液を、95℃で10秒間の変性ステップの後、95℃で5秒、65℃で20秒(CBP20については、60℃で20秒)のステップを1サイクルとし、40サイクル行った。
【００４７】
各サンプル間の標準化は、シロイヌナズナで恒常的に発現しているCBP20遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をCBP20遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００４８】
シロイヌナズナにおける各遺伝子の定量的RT-PCRに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００４９】
CBP20(At5g44200;フォワードプライマー5'-TGTTTCGTCCTGTTCTACTC-3'／配列番号：1、リバースプライマー5'-CCCATTGTCTTCCTTCTTG-3'／配列番号：2)。
【００５０】
PR1(At2g14610;フォワードプライマー5'-CCCACAAGATTATCTAAGGGTTCAC-3'／配列番号：3、リバースプライマー5'-CCCTCTCGTCCCACTGCAT-3'／配列番号：4)(Jirage  et  al.  (2001)  Plant  J  26:  395-407)。
【００５１】
PDF1.2(At5g44420;フォワードプライマー5'-TTGCTGCTTTCGACGCA-3'／配列番号：5、リバースプライマー5'-TGTCCCACTTGGCTTCTCG-3'／配列番号：6)。
【００５２】
試料は、定量的RT-PCR法により、PR1遺伝子とPDF1.2遺伝子の発現をモニターした。結果を図1に示す。
【００５３】
[実施例２]  各種金属キレート処理したチンゲンサイにおける植物病原菌の感染抑制効果
（１）チンゲンサイにおけるアブラナ科植物黒斑細菌病の感染抑制
以下の方法で、黒斑細菌病菌に対する感染抑制効果を評価した。
【００５４】
植物材料として、アブラナ科植物のチンゲンサイ（品種：青帝、シャオパオ）を、実施例１と同様の条件下で播種し、24℃にて24時間の明暗サイクル（明時間16時間および暗時間8時間）で栽培した。播種後10日間栽培したチンゲンサイに、0.1％の展着剤（アプローチBI）を添加した薬剤を茎葉散布した。薬剤散布から2日後、チンゲンサイに黒斑細菌病菌（1×108cfu/ml）を噴霧接種した。接種した植物は湿室下に静置した。接種から3日後、接種葉をサンプリングし、実施例1と同様の方法でqRT-PCR法により、黒斑細菌病菌のrpoD遺伝子(Psm-rpoD)の発現量を測定することでチンゲンサイへの感染量を定量した。ただし、RT-PCRの反応は、95℃で10秒間の変性ステップの後、95℃で5秒、60℃で20秒(BrACT2については、65℃で20秒)のステップを1サイクルとし、40サイクル行った。なお、コントロールとして、金属を含まない展着剤(0.1%アプローチBI）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００５５】
各サンプル間の標準化は、チンゲンサイで恒常的に発現しているBrACT2遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をBrACT2遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００５６】
チンゲンサイにおける各遺伝子の定量的RT-PCRに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００５７】
Psm-rpoD(フォワードプライマー5'-CCGAGATCAAGGACATCAAC-3'／配列番号：7、リバースプライマー5'-GAGATCACCAGACGCAAGTT-3'／配列番号：8)
BrACT2(フォワードプライマー5'-GCCGAGGCTGATGACATT-3'／配列番号：9、リバースプライマー5'-CATGATGTCTTGGCCTACCA-3'／配列番号：10)。
【００５８】
その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図2）。なお、グルコン酸亜鉛（ZnGluc）処理では薬害が認められなかった。
（２）チンゲンサイにおけるアブラナ科植物黒斑細菌病の感染抑制
以下の方法で、黒斑細菌病菌に対する感染抑制効果を評価した。
【００５９】
植物材料として、アブラナ科植物のチンゲンサイ（品種：シャオパオ）を、実施例１と同様の条件下で播種し、24℃にて24時間の明暗サイクル（明時間16時間および暗時間8時間）で栽培した。播種後10日間栽培したチンゲンサイに、0.01％の展着剤（マイリノー）を添加した各種薬剤を茎葉散布した。薬剤散布から2日後、チンゲンサイに黒斑細菌病菌（1×108cfu/ml）を噴霧接種した。接種した植物は湿室下に静置した。接種から3日後、接種葉をサンプリングし、実施例２(１)と同様の方法でqRT-PCR法により、黒斑細菌病菌のrpoD遺伝子(Psm-rpoD)の発現量を測定することでチンゲンサイへの感染量を定量した。
【００６０】
なお、コントロールとして、金属を含まない展着剤(0.01%マイリノー添加）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００６１】
各サンプル間の標準化は、チンゲンサイで恒常的に発現しているBrACT2遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をBrACT2遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００６２】
その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図3）。
【００６３】
なお、硫酸銅（CuSO4）溶液および硫酸亜鉛（ZnSO4）溶液の処理区では薬剤処理のみで斑点などの薬害が認められたが、金属キレートであるグルコン酸銅（CuGluc）およびグルコン酸亜鉛（ZnGluc）の処理区では薬害が認められなかった。
【００６４】
（３）チンゲンサイにおけるアブラナ科野菜類炭疽病菌の感染抑制
以下の方法によりアブラナ科野菜類炭疽病菌に対する感染抑制効果を評価した。
【００６５】
植物材料として、アブラナ科植物のチンゲンサイ（品種：シャオパオ）を、実施例１と同様の条件下で播種し、24℃にて24時間の明暗サイクル（明時間1６時間および暗時間8時間）で栽培した。播種後10日間栽培したチンゲンサイに、0.01％の展着剤（マイリノー）を添加した各種薬剤を茎葉散布した。薬剤散布から2日後、チンゲンサイにアブラナ科野菜類炭疽病菌（5×105胞子/ml）を噴霧接種した。接種した植物は湿室下に静置した。接種から5日後、接種葉をサンプリングし、実施例２(１)と同様の方法でqRT-PCR法により、アブラナ科野菜類炭疽病菌のアクチン遺伝子(Ch-ACT)の発現量を測ることでチンゲンサイへの感染量を定量した。ただし、RT-PCRの反応は、95℃で10秒間の変性ステップの後、95℃で5秒、65℃で20秒のステップを1サイクルとし、40サイクル行った。コントロールとして、金属を含まない展着剤(0.01%マイリノー添加）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００６６】
各サンプル間の標準化は、チンゲンサイで恒常的に発現しているBrACT2遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をBrACT2遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００６７】
チンゲンサイにおける各遺伝子の定量的RT-PCRに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００６８】
Ch-ACT(フォワードプライマー5'-CTCGTTATCGACAATGGTTC-3'／配列番号：11、リバースプライマー5'-GAGTCCTTCTGGCCCATAC-3'／配列番号：12)。
【００６９】
その結果、コントロールと比較して、金属キレート溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図4）。
【００７０】
なお、硫酸銅（CuSO4）溶液および硫酸亜鉛（ZnSO4）溶液の処理区では薬剤処理のみで斑点などの薬害が認められたが、金属キレートであるグルコン酸銅（CuGluc）およびグルコン酸亜鉛（ZnGluc）の処理区では薬害が認められなかった。
【００７１】
[実施例３]  各種金属キレート処理したシロイヌナズナにおける植物病原菌の感染抑制効果
（１）シロイヌナズナにおけるアブラナ科野菜類炭疽病菌の感染抑制
植物材料として、シロイヌナズナ(生態型：コロンビア)を、実施例１と同様の条件下で栽培した。播種して1週間後に1鉢当たり5個体になるように植え替えを行い、同条件下でさらに3週間栽培した。0.01％の展着剤（マイリノー）を添加した各種薬剤を、1鉢当り3〜5mlで茎葉散布した。薬剤散布から2日後、シロイヌナズナにアブラナ科野菜類炭疽病菌（5×105胞子/ml）を噴霧接種した。接種した植物は湿室下に静置した。接種から5日後、接種葉をサンプリングし、実施例1および２(３)と同様の方法でqRT-PCR法により、アブラナ科野菜類炭疽病菌のアクチン遺伝子(Ch-ACT)の発現量を測ることでシロイヌナズナへの感染量を定量した。コントロールとして、金属を含まない展着剤(0.01%マイリノー）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００７２】
各サンプル間の標準化は、シロイヌナズナで恒常的に発現しているCBP20遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をCBP20遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００７３】
その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図5）。
【００７４】
なお、硫酸銅（CuSO4）溶液処理区と硫酸亜鉛（ZnSO4）溶液処理区では、薬剤処理のみで斑点などの薬害が認められたが、金属キレートであるグルコン酸銅（CuGluc）、グルコン酸亜鉛（ZnGluc）、グルコン酸鉄（FeGluc）では薬害が認められなかった。
【００７５】
（２）シロイヌナズナにおけるアブラナ科植物黒斑細菌病菌の感染抑制
実施例１と同様に栽培したシロイヌナズナ(生態型：コロンビア)に対し、0.01％の展着剤（マイリノー）を添加した各種薬剤を、1鉢当り3〜5mlで茎葉散布した。薬剤散布から2日後、シロイヌナズナに黒斑細菌病菌（1×108cfu/ml）を噴霧接種した。接種した植物は湿室下に静置した。接種から3日後、接種葉をサンプリングし、実施例1および２(１)と同様の方法でqRT-PCR法により、黒斑細菌病菌のrpoD遺伝子(Psm-rpoD)の発現量を測定することでシロイヌナズナへの感染量を定量した。コントロールとして、金属を含まない展着剤(0.01%マイリノー添加）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００７６】
各サンプル間の標準化は、シロイヌナズナで恒常的に発現しているCBP20遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をCBP20遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００７７】
その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図6）。
【００７８】
なお、硫酸亜鉛（ZnSO4）溶液処理区は、薬剤処理のみで斑点などの薬害が認められたが、金属キレートであるグルコン酸亜鉛（ZnGluc）では薬害が認められなかった。
【００７９】
[実施例４]  各種金属キレート処理したトマトにおける植物病原菌の感染抑制効果
（１）トマトにおける斑葉細菌病菌の感染抑制
植物材料として、ナス科植物のトマト（品種：レジナ）を、実施例１と同様の条件下で播種し、24℃にて24時間の明暗サイクル（明時間16時間および暗時間8時間）で栽培した。播種後3週間栽培したトマトに、各化合物(0.1%アプローチBI添加）を茎葉散布した。各化合物の散布から3日後、Pseudomonas  syringae（1×108cfu/ml）を噴霧接種した。接種から3日後、接種葉をサンプリングし、実施例1および２(１)と同様の方法でqRT-PCR法により、Pseudomonas  syringaeのrpoD遺伝子(Ps-rpoD)の発現量を測定することでトマトへの感染量を定量した。ただし、RT-PCRの反応は、95℃で10秒間の変性ステップの後、95℃で5秒、60℃で20秒のステップを1サイクルとし、40サイクル行った。なお、コントロールとして、化合物を含まない展着剤(0.1%アプローチBI添加）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００８０】
各サンプル間の標準化は、トマトで恒常的に発現しているSLTIP41遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をSLTIP41遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００８１】
トマトにおける各遺伝子の定量的RT-PCRに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００８２】
SLTIP41(フォワードプライマー5'-ATGGAGTTTTTGAGTCTTCTGC-3'／配列番号：13、リバースプライマー5'-GCTGCGTTTCTGGCTTAGG-3'／配列番号：14)。
【００８３】
その結果、コントロールと比較して、金属キレート溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図7）。
（２）トマトにおける灰色かび病菌の感染抑制
以下の方法によりトマト灰色かび病菌(Botrytis  cinerea)に対する感染抑制効果を評価した。
【００８４】
トマトに、各化合物(0.1%アプローチBI添加）を茎葉散布した。各化合物の散布から3日後、1/2ジャガイモ煎汁培地にトマト灰色かび病菌の胞子を懸濁し（2x105個/mL）、トマト株に噴霧接種した。接種から6日後、病徴の調査によりトマト灰色かび病菌の感染量を評価した。コントロールとして、化合物を含まない展着剤(0.1%アプローチBI添加）のみを散布し、同様の評価を行った。
【００８５】
発病度は以下の式で表される。
発病度=｛(1n1+2n2+3n3+4n4+5n5)/(5×調査数)｝×100
発病調査は発病程度を以下の5つに区分して調査した。
0：病徴なし、1：調査株のごく一部に病斑が認められる、2：調査株の1/3未満に病斑が認められる、3：調査株の1/3以上2/3未満に病斑が認められる、4：調査株の2/3以上に病斑が認められる、5：枯死
n1からn5は個体数
防除価は以下の式で表される。
防除価=｛1-処理区の発病度/無処理区の発病度）｝×100
その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（表1）。
【００８６】
【表１】
2020132552.tif 000002
【００８７】
[実施例５]  各種金属キレート処理したキュウリにおける植物病原菌の感染抑制効果
キュウリ（品種：新北星）に、各化合物(0.1%アプローチBI添加）を茎葉散布した。各化合物の散布から3日後、ウリ類炭疽病菌（5x105個/mL）を噴霧接種した。接種から7日後、接種葉をサンプリングし、実施例1と同様の方法でｑRT-PCR法により、ウリ類炭疽病菌のアクチン遺伝子(Co-ACT)の発現量を測定することでキュウリへの感染量を定量した。ただし、RT-PCRの反応は、95℃で10秒間の変性ステップの後、95℃で5秒、65℃で20秒(CsEF1αについては、60℃で20秒)のステップを1サイクルとし、40サイクル行った。コントロールとして、化合物を含まない展着剤(0.1%アプローチBI）のみを散布し、同様の定量を行った。コントロールの感染量を100としたときの相対感染病原菌量を示した。
【００８８】
各サンプル間の標準化は、キュウリで恒常的に発現しているCsEF1α遺伝子を用い、各サンプルにおける目的遺伝子の発現量をCsEF1α遺伝子の発現量で除することにより行った。
【００８９】
キュウリにおける各遺伝子の定量的RT-PCRに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
【００９０】
Co-ACT(フォワードプライマー5'-CTCGTTATCGACAATGGTTC-3'／配列番号：15、リバースプライマー5'-GAGTCCTTCTGGCCCATAC-3'／配列番号：16)。
【００９１】
CsEF1α(フォワードプライマー5'-ACTGTGCTGTCCTCATTATTG-3'／配列番号：17、リバースプライマー5'-AGGGTGAAAGCAAGAAGAGC-3'／配列番号：18)。
【００９２】
その結果、コントロールと比較して、金属キレート溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図8）。
【００９３】
[実施例６]  各種金属キレート処理したイチゴにおける植物病原菌の感染抑制効果
（１）イチゴにおける炭疽病菌の感染抑制
以下の方法によりイチゴ炭疽病菌(Colletotrichum  fructicola)に対する感染抑制効果を評価した。
【００９４】
イチゴ（品種：女峰）に、各化合物(0.1%アプローチBI添加）を茎葉散布した。各化合物の散布から3日後、イチゴ炭疽病菌（5x105個/mL）を噴霧接種した。接種から6日後、病徴の調査によりイチゴ炭疽病菌のイチゴへの感染量を評価した。コントロールとして、化合物を含まない展着剤(0.1%アプローチBI）のみを散布し、同様の評価を行った。
【００９５】
発病度は以下の式で表される。
発病度=｛(1n1+2n2+3n3+4n4+5n5)/(5×調査数)｝×100
発病調査は発病程度を以下の5つに区分して調査した。
0：病徴なし、1：微小斑点、2：葉の25％未満の面積に病斑が認められる、3：葉の25％以上50％未満の面積に病斑が認められる、4：葉の50％以上の面積に病斑が認められるまたは葉柄が折れる、5：枯死
n1からn5は個体数
防除価は以下の式で表される。
防除価=｛1-処理区の発病度/無処理区の発病度）｝×100
その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（図9）。
【００９６】
なお、硫酸銅（CuSO4）、酢酸銅（CuOAc）、硫酸亜鉛（ZnSO4）の各溶液処理区は薬剤処理のみで斑点などの薬害が認められたが、金属キレートであるグルコン酸銅（CuGluc）、グルコン酸亜鉛（ZnGluc）、グリシン亜鉛では薬害が認められなかった。
【００９７】
（２）イチゴにおけるうどんこ病菌の感染抑制
以下の方法によりイチゴうどんこ菌に対する感染抑制効果を評価した。
【００９８】
イチゴうどんこ病がわずかに発生しはじめたイチゴ苗（品種：女峰）（複葉に１コロニー程度）に、各化合物(0.1%アプローチ添加）を茎葉散布した。散布から7日後、病徴の調査によりイチゴうどんこ病菌のイチゴへの感染量を評価した。コントロールとして、化合物を含まない展着剤(0.1%アプローチ添加）のみを散布し、同様の評価を行った。その結果、コントロールと比較して、金属溶液において有意に感染抑制効果が認められた（表2）。
【００９９】
【表２】
2020132552.tif 000003
【０１００】
[実施例７]  各種金属キレート処理したハクサイにおける植物病原菌の感染抑制効果
供試植物（ハクサイ品種：無双）を播種後、14日間栽培した。4mMグルコン酸銅、4mMグルコン酸亜鉛(0.1%アプローチBI添加）を茎葉散布し、散布3日後の苗に、1×105個/mlのハクサイ軟腐病菌（Erwinia  carotovora  subsp.  carotovora）を傷接種した。接種6日後に、発病程度を調査した。発病程度から防除価を算出した。
発病度は以下の式で表される。
発病度=｛(1n1+2n2+3n3+4n4)/(4×調査数)｝×100
発病調査は発病程度を以下の4つに区分して調査した。
0：病徴なし、1：葉の5％未満の面積に病斑が認められる、2：葉の5％以上25％未満の面積に病斑が認められる、3：葉の25％以上50％未満の面積に病斑が認められる、4：葉の50％以上の面積に病斑が認められる
n1からn4は個体数
防除価は以下の式で表される。
防除価=｛1-処理区の発病度/無処理区の発病度）｝×100
その結果、上記化合物は、何れも軟腐病に対して30%の防除価を示した（表3）。
【０１０１】
【表３】
2020132552.tif 000004
【０１０２】
[実施例８]  各種金属キレート処理したベンサミアーナタバコにおける植物病原菌の感染抑制効果
播種後4週間のベンサミアーナタバコ（ナス科植物）にグルコン酸銅、グルコン酸亜鉛、グルコン酸鉄を含む溶液を葉面散布した。処理3日後にジャガイモ疫病菌の遊走子1000個を含む遊走子懸濁液の小滴（10-20μL)を点滴接種した。接種5日後に病徴を検定した。その結果、対照区に比して、キレート溶液処理区は発病を顕著に抑制した。
【０１０３】
[参考例１]  植物ウイルス病に対する防除効果と植物病原菌に対する防除効果の関係
植物病理学的見地からは、ウイルスと病原菌（糸状菌、細菌）は、それぞれ植物に対する感染行動が異なるため、ある薬剤が植物ウイルス病の防除効果があったとしても、植物病原菌に対しても防除効果があるか否かは、当業者に予測できないと考えられる。
【０１０４】
この事を検証するために、本発明者は、植物ウイルス病を防除する唯一の農薬であるレンテミンの植物病原菌に対する防除効果を検証した。
【０１０５】
10倍希釈のレンテミン溶液（0.1%アプローチBI添加）を用いて、実施例6(1)と同様の評価を行ったところ、レンテミンでは、イチゴ炭疽病菌による感染を抑制せず、むしろ、コントロールよりも激しく感染した（表4）。
【０１０６】
【表４】
2020132552.tif 000005
【０１０７】
また、殺菌剤として市販されているZボルドー（銅を含む）またはジオゼット（亜鉛を含む）をベンサミアーナタバコに処理したところ、これら薬剤はトマトモザイクウイルス（ToMV）の感染を抑制しなかった（データは示していない）。
【０１０８】
これらの結果は、ある薬剤の植物ウイルス病に対する防除効果と植物病原菌に対する防除効果の間には、直接の相関がないことを裏付けるものである。
【０１０９】
この意味で、植物ウイルス病に対する防除効果が知られている金属キレート（特許文献1）が、本実施例において、植物病原菌に対しても防除効果を示したのは、予想外の驚くべきことであった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
上記の通り、本発明の防除剤は、植物病原菌に対して優れた防除効果を示すことができる。有効成分として金属のキレートを用いれば、葉の萎縮や斑点の発生などの薬害を生じることなく、植物病原菌に対して防除効果を発揮することができることから、安全性と効果を兼ね備えた農薬として、農業分野において大きく貢献しうるものである。
【図１】
2020132552.tif 000006
【図２】
2020132552.tif 000007
【図３】
2020132552.tif 000008
【図４】
2020132552.tif 000009
【図５】
2020132552.tif 000010
【図６】
2020132552.tif 000011
【図７】
2020132552.tif 000012
【図８】
2020132552.tif 000013
【図９】
2020132552.tif 000014
【配列表】
2020132552000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月1日(2019.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコン酸亜鉛、グリシン亜鉛、およびグルコン酸鉄の少なくとも１つを有効成分とする、植物病原菌の防除剤。
【請求項２】
植物病原菌が植物病原細菌または植物病原真菌である、請求項１に記載の防除剤。
【請求項３】
請求項１に記載の防除剤を植物に施用することを含む、植物病原菌の防除方法。
【請求項４】
植物病原菌が植物病原細菌または植物病原真菌である、請求項３に記載の防除方法。