(57)【要約】【課題】撮像時間を短縮し解析のスループットを向上させ、データ量を減らしデータの管理コストを削減可能な細胞解析方法を提供する。【解決手段】細胞集団を撮像し、撮像した画像を用い、各細胞内の第１成分を認識して、各細胞を認識し、第１成分以外の成分の特徴量を細胞毎に評価する細胞解析方法であって、第１成分を第１色素で標識するステップ、第１成分以外の成分を第２色素で標識するステップ、第１色素からの光の輝度レベルと第２色素からの光の輝度レベルとを閾値の設定が可能な程度に異ならせて、第１成分と第１成分以外の成分を同時に撮像するステップ、得られた画像から輝度の閾値を介して第１成分と第１成分以外の成分とを認識するステップ、得られた画像のうち、第１成分以外の成分の領域における、第２色素からの光の特性を評価して、第１成分以外の成分の特徴量を細胞毎に評価する評価ステップを含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団を顕微鏡撮像装置で撮像し、撮像した細胞集団の画像を用い、各細胞内の第１の細胞成分を認識することによって、個々の細胞を認識し、第１の細胞成分以外の細胞成分の特徴量を細胞毎に評価し、評価した第１の細胞成分以外の細胞成分の特徴量を用いて、細胞１個当たりの平均値を統計的に評価する細胞解析方法であって、
前記第１の細胞成分を第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子で標識する第１の標識ステップと、
前記第１の細胞成分以外の細胞成分を第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子で標識する第２の標識ステップと、
前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの光の輝度レベルと前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの光の輝度レベルとを閾値の設定が可能な程度に異ならせて、前記第１の細胞成分と前記第１の細胞成分以外の細胞成分を同時に撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップで得られた画像から、少なくとも輝度についての閾値を介して、前記第１の細胞成分と前記第１の細胞成分以外の細胞成分とを認識する認識ステップと、
前記撮像ステップで得られた画像のうち、前記認識ステップで認識された前記第１の細胞成分以外の細胞成分の領域における、前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの光の特性を評価することによって、前記第１の細胞成分以外の細胞成分の特徴量を細胞毎に評価する評価ステップと、
を少なくとも含むことを特徴とする細胞解析方法。
【請求項２】
前記撮像ステップにおいて、
前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子を励起する第１の励起波長帯域の光と前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子を励起する第２の励起波長帯域の光のみを透過させる波長特性を有する励起フィルターと、
前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子を励起する第１の励起波長帯域の光と前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子を励起する第２の励起波長帯域の光を反射させるとともに、該第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの第１の蛍光波長帯域を含む第１の所定帯域の光と該第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの第２の蛍光波長帯域を含む第２の所定帯域の光を透過させる特性を有するダイクロイックミラーと、
前記ダイクロイックミラーを透過した光のうち、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの第１の蛍光波長帯域の光と前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの第２の蛍光波長帯域の光のみを透過させ、それ以外の波長帯域の光を吸収する特性を有する吸収フィルター、
を用いることを特徴とする請求項１に記載の細胞解析方法。
【請求項３】
前記励起フィルターにおける、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子を励起する第１の励起波長帯域の光を透過させる透過率と、前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子を励起する第２の励起波長帯域の光を透過させる透過率とに差をつけることを特徴とする請求項２に記載の細胞解析方法。
【請求項４】
前記吸収フィルターにおける、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの第１の蛍光波長帯域の光を透過させる透過率と、前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの第２の蛍光波長帯域の光を透過させる透過率とに差をつけることを特徴とする請求項２又は３に記載の細胞解析方法。
【請求項５】
前記第１の細胞成分を標識する第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子の濃度と、前記第１の細胞成分以外の細胞成分を標識する第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子の濃度とに差をつけることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞解析方法。
【請求項６】
前記第１の細胞成分の面積の基準値を設定する基準面積設定ステップを有し、
前記認識ステップにおいて、前記輝度についての閾値の設定を、該輝度についての閾値を設定することにより得られる前記第１の細胞成分の面積値が、前記基準面積設定ステップで設定した前記第１の細胞成分の面積の基準値に対して所定の条件を満足するように、調整して行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞解析方法。
【請求項７】
前記第１の細胞成分の形状の基準特性を設定する基準形状設定ステップを有し、
前記認識ステップにおいて、前記輝度についての閾値の設定を、該輝度についての閾値を設定することにより得られる前記第１の細胞成分の形状の特性が、前記基準形状設定ステップで設定した前記第１の細胞成分の形状の基準特性に近づくように、調整して行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞解析方法。
【請求項８】
前記基準形状設定ステップにおいて、前記第１の細胞成分を核とするときの該第１の細胞成分の形状の基準特性を真円に設定することを特徴とする請求項７に記載の細胞解析方法。
【請求項９】
前記細胞が神経細胞であり、前記第１の細胞成分以外の細胞成分が細胞質であり、前記細胞毎に評価する特徴量が神経突起長であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞解析方法。
【請求項１０】
前記細胞ががん細胞であり、前記第１の細胞成分以外の細胞成分が細胞質であり、前記細胞毎に評価する特徴量がアポトーシス誘導であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞集団を蛍光顕微鏡で撮像し、撮像された蛍光顕微鏡画像から、個々の細胞を認識して、解析対象となる細胞成分の特徴量を細胞毎に評価し、細胞１個あたりの平均値として数値化して評価を行うことにより、細胞集団の特性を定量的に解析する細胞解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞解析方法では、解析対象となる細胞成分の特徴量を細胞毎に評価するに際し、細胞画像の取得は、各細胞成分に対応した蛍光色素又は発光レポーター分子で標識し、蛍光色素に対応した波長素子を選択して、各細胞成分を個別に撮像し、撮像した各画像を重ね合わせて行っている。また、個々の細胞の認識は、核画像に基づいて行っている。
【０００３】
例えば、図７に示すような細胞画像を取得する場合、図８に示すような構成の顕微鏡撮像装置を用いる。図７中、７は核、８は細胞質である。図８中、５１は光源、５２はターレットやスライダ等の励起フィルター切換手段、５２ａ，５２ｂは励起フィルター、５３はターレットやスライダ等のダイクロイックミラー切換手段、５３ａ，５３ｂはダイクロイックミラー、５４は培養容器に培養されている細胞等の試料、５５はターレットやスライダ等の吸収フィルター切換手段、５５ａ，５５ｂは吸収フィルター、５６は光検出器である。
【０００４】
先ず、顕微鏡撮像装置における励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターとして、図９に示すような波長透過特性をそれぞれ持つ励起フィルター５２ａ、ダイクロイックミラー５３ａ、吸収フィルター５５ａを組合せて、蛍光色素にＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を用いて標識された核７の画像（図１０参照）を取得する。
次いで、顕微鏡撮像装置における励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターを、図１１に示すような波長透過特性をそれぞれ持つ励起フィルター５２ｂ、ダイクロイックミラー５３ｂ、吸収フィルター５５ｂの組合せに切換えて、蛍光色素にＦＩＴＣ
（Fluorescein isothiocianate）を用いて標識された細胞質８の画像を取得（図１２）する。
次いで、核７の画像と細胞質８の画像を合成する。これによって、図７に示すような細胞画像が得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３０７０６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞を利用した薬剤の奏功性の評価は、創薬過程の中でも極めて重要なステップであり、正確に評価するには、細胞集団の評価を統計的に行う必要がある。そのためには個々の細胞を認識し、解析対象である細胞成分の特徴量を細胞毎に解析し、細胞１個当たりの平均値として統計的に評価する必要がある。
【０００７】
細胞はシャーレやマイクロウエルプレートなどの培養容器に培養されるが、ウェルなどの培養容器の全領域を走査して撮像することは、時間的、あるいはコスト的な制約があり、現実には難しい。このため、大抵の場合、培養容器を部分的に走査して撮像し、得られた画像からデジタルデータを用いて細胞認識を行い、解析対象とする細胞数を評価することによって、細胞１個当たりの特徴量を統計的に評価する手法がとられている。
【０００８】
さらに、細胞１個あたりの特徴量の統計的な評価を精度よく行うには、少なくとも画像上で得られる細胞数が１万個以上必要とされており、１万個以上の細胞数の画像取得に要する撮像枚数、画像データ保管量が膨大なものとなる。
【０００９】
また、撮像に要する時間は、ほぼ撮像枚数に比例する。しかし、従来の細胞解析方法では、細胞画像取得の際に、評価対象となる、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等の細胞成分ごとに、細胞成分に応じた色素で標識し、色素に応じた波長選択素子などの光学素子を選択して、その都度、撮像を行うため、撮像時間が長くかかり、スループットを向上させることはできない。
【００１０】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、撮像時間を短縮し解析のスループットを向上させることができ、また、データ量を減らして、データの管理コストを削減可能な細胞解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明による細胞解析方法は、細胞集団を顕微鏡撮像装置で撮像し、撮像した細胞集団の画像を用い、各細胞内の第１の細胞成分を認識することによって、個々の細胞を認識し、第１の細胞成分以外の細胞成分の特徴量を細胞毎に評価し、評価した第１の細胞成分以外の細胞成分の特徴量を用いて、細胞１個当たりの平均値を統計的に評価する細胞解析方法であって、前記第１の細胞成分を第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子で標識する第１の標識ステップと、前記第１の細胞成分以外の細胞成分を第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子で標識する第２の標識ステップと、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの光の輝度レベルと前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの光の輝度レベルとを閾値の設定が可能な程度に異ならせて、前記第１の細胞成分と前記第１の細胞成分以外の細胞成分を同時に撮像する撮像ステップと、前記撮像ステップで得られた画像から、少なくとも輝度についての閾値を介して、前記第１の細胞成分と前記第１の細胞成分以外の細胞成分とを認識する認識ステップと、前記撮像ステップで得られた画像のうち、前記認識ステップで認識された前記第１の細胞成分以外の細胞成分の領域における、前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの光の特性を評価することによって、前記第１の細胞成分以外の細胞成分の特徴量を細胞毎に評価する評価ステップと、を少なくとも含むことを特徴としている。
【００１２】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記撮像ステップにおいて、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子を励起する第１の励起波長帯域の光と前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子を励起する第２の励起波長帯域の光のみを透過させる波長特性を有する励起フィルターと、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子を励起する第１の励起波長帯域の光と前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子を励起する第２の励起波長帯域の光を反射させるとともに、該第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの第１の蛍光波長帯域を含む第１の所定帯域の光と該第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの第２の蛍光波長帯域を含む第２の所定帯域の光を透過させる特性を有するダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーを透過した光のうち、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの第１の蛍光波長帯域の光と前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの第２の蛍光波長帯域の光のみを透過させ、それ以外の波長帯域の光を吸収する特性を有する吸収フィルター、を用いるのが好ましい。
【００１３】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記励起フィルターにおける、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子を励起する第１の励起波長帯域の光を透過させる透過率と、前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子を励起する第２の励起波長帯域の光を透過させる透過率とに差をつけるのが好ましい。
【００１４】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記吸収フィルターにおける、前記第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子からの第１の蛍光波長帯域の光を透過させる透過率と、前記第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子からの第２の蛍光波長帯域の光を透過させる透過率とに差をつけるのが好ましい。
【００１５】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記第１の細胞成分を標識する第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子の濃度と、前記第１の細胞成分以外の細胞成分を標識する第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子の濃度とに差をつけるのが好ましい。
【００１６】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記第１の細胞成分の面積の基準値を設定する基準面積設定ステップを有し、前記認識ステップにおいて、前記輝度についての閾値の設定を、該輝度についての閾値を設定することにより得られる前記第１の細胞成分の面積値が、前記基準面積設定ステップで設定した前記第１の細胞成分の面積の基準値に対して所定の条件を満足するように、調整して行うのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記第１の細胞成分の形状の基準特性を設定する基準形状設定ステップを有し、前記認識ステップにおいて、前記輝度についての閾値の設定を、該輝度についての閾値を設定することにより得られる前記第１の細胞成分の形状の特性が、前記基準形状設定ステップで設定した前記第１の細胞成分の形状の基準特性に近づくように、調整して行うのが好ましい。
【００１８】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記基準形状設定ステップにおいて、前記第１の細胞成分を核とするときの該第１の細胞成分の形状の基準特性を真円に設定するのが好ましい。
【００１９】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記細胞が神経細胞であり、前記第１の細胞成分以外の細胞成分が細胞質であり、前記細胞毎に評価する特徴量が神経突起長であるのが好ましい。
【００２０】
また、本発明の細胞解析方法においては、前記細胞ががん細胞であり、前記第１の細胞成分以外の細胞成分が細胞質であり、前記細胞毎に評価する特徴量がアポトーシス誘導であるのが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、撮像時間を短縮し解析のスループットを向上させることができ、また、データ量を減らして、データの管理コストを削減可能な細胞解析方法が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の細胞解析方法に用いる顕微鏡撮像装置の概略構成を示す説明図である。
【図２】本発明の実施例１にかかる細胞解析方法に用いる、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの波長特性を示すグラフである。
【図３】図１及び図２に示した顕微鏡撮像装置を介して同時に取得する細胞画像の一例を示す説明図である。
【図４】図３で示した細胞画像における線分Ａ−Ａでの輝度断面を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２にかかる細胞解析方法に用いる、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの波長特性を示すグラフである。
【図６】第１の細胞成分と第１の細胞成分以外の細胞成分の輝度に十分な差が生じない場合の細胞画像の輝度断面の一例を示すグラフである。
【図７】細胞画像の一例を示す説明図である。
【図８】従来の細胞解析方法において用いられる顕微鏡撮像装置の概略構成の一例を示す説明図である。
【図９】図８の顕微鏡撮像装置を用いて第１の細胞成分を取得する場合に組合せる励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの波長特性を示すグラフである。
【図１０】図９に示した波長特性を持つ励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターを組合せて取得した第１の細胞成分である核の画像を示す説明図である。
【図１１】図８の顕微鏡撮像装置を用いて第１の細胞成分以外の細胞成分を取得する場合に組合せる励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの波長特性を示すグラフである。
【図１２】図１１に示した波長特性を持つ励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターを組合せて取得した第１の細胞成分以外の細胞成分である細胞質の画像を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、細胞成分の特徴量を細胞毎に評価する方法において、各細胞成分を標識した色素から得られる光の輝度に、閾値の設定が可能な程度の大きな差がつくようにして、異なる色素を組合せて標識された各細胞成分に対して、共通の光学系を用いて、同時に撮像し、得られた画像における蛍光の輝度の違いから、各細胞成分を分離して認識することを可能にし、撮像時間の短縮を図ったものである。
本発明によれば、細胞集団の顕微鏡観察において、解析対象である細胞成分毎の撮像を行う必要が無いので、撮像時間を短縮し解析のスループットを向上させることができる。また、データ量を減らせるので、データの管理コストを削減できる。
【００２４】
以下、本発明の実施例を図面を用いて詳細に説明する。
実施例１
図１は本発明の細胞解析方法に用いる顕微鏡撮像装置の概略構成を示す説明図である。図２は本発明の実施例１にかかる細胞解析方法に用いる、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの波長特性を示すグラフである。図１中、１は光源、２は励起フィルター、３はダイクロイックミラー、４は培養容器に培養されている細胞等の試料、５は吸収フィルター、６は光検出器である。
実施例１の細胞解析方法では、試料４の細胞成分を標識する第１の蛍光色素又は第１の発光レポーター分子としてＤＡＰＩ、第２の蛍光色素又は第２の発光レポーター分子としてＦＩＴＣを用い、ＤＡＰＩで本発明における第１の細胞成分としての核を標識するとともに、ＦＩＴＣで本発明における第１の細胞成分以外の細胞成分としての細胞質を標識しておく。
【００２５】
また、実施例１の細胞解析方法では、図７に示したような細胞画像を得るために、図１に示した顕微鏡撮像装置における励起フィルター２、ダイクロイックミラー３、吸収フィルター５として、図２に示すように、ＤＡＰＩとＦＩＴＣの夫々に対応したマルチバンドの波長特性をそれぞれ持つ励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの組合せを用いる。
励起フィルター２は、ＤＡＰＩを励起する励起波長帯域の光とＦＩＴＣを励起する励起波長帯域の光のみを透過させる特性を有する。また、ダイクロイックミラー３は、ＤＡＰＩを励起する励起波長帯域の光とＦＩＴＣを励起する励起波長帯域の光を反射させるとともに、ＤＡＰＩからの蛍光波長帯域を含む所定帯域の光とＦＩＴＣからの蛍光波長帯域を含む所定帯域の光を透過させる特性を有する。また、吸収フィルター５は、ダイクロイックミラー３を透過した光のうち、ＤＡＰＩからの蛍光波長帯域の光とＦＩＴＣからの蛍光波長帯域の光のみを透過させ、それ以外の波長帯域の光を吸収する特性を有する。
【００２６】
光源１から放出された光は、励起フィルター２に入射し、ＤＡＰＩとＦＩＴＣを励起する波長帯域の光のみが、励起フィルター２を透過する。励起フィルター２を透過した光は、ダイクロイックミラー３で反射されて試料４を照射する。すると、ＤＡＰＩで標識された核７、ＦＩＴＣで標識された細胞質８が、それぞれ励起されて蛍光を放出する。これらの蛍光は、ダイクロイックミラー３を透過した後、吸収フィルター５で余分な光がカットされて、光検出器６によって検出されることで、同時に１つの画像として撮像される。
【００２７】
また、実施例１の細胞解析方法を用いる顕微鏡撮像装置には、光検出器６で撮像した画像を解析する画像解析装置（図示省略）が備えられている。そして、画像解析装置には、これらの蛍光の輝度についての閾値が設定されている。
例えば、図１及び図２に示した顕微鏡撮像装置を介して、図３に示すような細胞画像が得られるものとする。この細胞画像における、線分Ａ−Ａでの輝度断面は、例えば、図４に示すような形状になる。画像解析装置は、図４に示した輝度断面において、設定された閾値９に対して輝度が大きい領域がＤＡＰＩで標識された核７であり、閾値９に対して輝度が小さい領域がＦＩＴＣで標識された細胞質８であると識別する。そして、画像解析装置は、閾値９を用いた核７と細胞質８の識別処理を、顕微鏡撮像装置を介して得られた細胞画像の全領域に対して実行する。この識別処理結果を用いて、核７と細胞質８とにそれぞれ異なる系統の色を与えて、細胞ごとに明瞭に認識可能な細胞画像に画像化することができる。
【００２８】
なお、上記の例では、細胞内における第１の細胞成分として核７を用いたが、実施例１の細胞解析方法は、他の細胞成分（ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等）を第１の細胞成分として用いても、同様に、第１の細胞成分と第１の細胞成分以外の細胞成分とを識別して画像化することができる。その場合は、顕微鏡撮像装置における励起フィルター２、ダイクロイックミラー３、吸収フィルター５として、図２に示したようなマルチバンドの波長特性をそれぞれ持つ励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの組合せの代わりに、該当する細胞成分を標識する蛍光色素または発光レポーター分子の励起吸収特性を反映したマルチバンドの波長特性をそれぞれ持つ励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの組合せを用いるとよい。
【００２９】
実施例２
図５は本発明の実施例２にかかる細胞解析方法に用いる、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターの波長特性を示すグラフである。
【００３０】
実施例１の細胞解析方法を用いて、図１及び図２に示した顕微鏡撮像装置を介して細胞の画像を撮像し、撮像した画像を画像解析装置（図示省略）で解析するときに、図６に示すように、ＤＡＰＩで標識された核７（あるいは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等の他の細胞成分）とＦＩＴＣで標識された細胞質８とに十分な輝度差が生じず、輝度に対する閾値の設定が困難な場合がある。
【００３１】
そのような場合には、励起フィルター２や吸収フィルター５などの、マルチバンドの波長特性を持つフィルターにおける、ＤＡＰＩ用の波長帯域の波長特性とＦＩＴＣ用の波長帯域の波長特性とに差をつけると、ＤＡＰＩで標識された核７（あるいは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等の他の細胞成分）とＦＩＴＣで標識された細胞質８とに十分な輝度差を与えることができ、輝度に対する閾値の設定が可能になる。
【００３２】
実施例２の細胞解析方法では、図１に示した顕微鏡撮像装置において、図５に示す波長特性を持つ励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターを、それぞれ励起フィルター２、ダイクロイックミラー３、吸収フィルター５として用いる。その他の構成は、実施例１の細胞解析方法と略同じである。
【００３３】
図５に示すように、励起フィルター２として、ＦＩＴＣ用の励起波長帯域の光の透過率がＤＡＰＩ用の励起波長帯域の光の透過率に比べて低い波長特性を持つ励起フィルターを用いると、ＦＩＴＣの励起を抑えることができる。また、吸収フィルター５として、ＦＩＴＣ用の蛍光波長帯域の光の透過率がＤＡＰＩ用の蛍光波長帯域の光の透過率に比べて低い波長特性を持つ吸収フィルターを用いると、ＦＩＴＣで励起された蛍光の量を抑えることができる。図５の例では、励起フィルター、吸収フィルターにおけるＦＩＴＣ用の波長透過特性は、図２に示した励起フィルター、吸収フィルターにおけるＦＩＴＣ用の波長透過特性に比べて、共に３０％以下になっているので、ＦＩＴＣからの蛍光の透過率を総合的には１０％以下に抑えることが可能となる。その結果、ＤＡＰＩで標識された核７（あるいは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等の他の細胞成分）とＦＩＴＣで標識された細胞質８の輝度に十分な差を与えることが可能となる。
なお、図５の例では、励起フィルター２、吸収フィルター５の両方のフィルターに対して、ＤＡＰＩ用の波長帯域の波長特性とＦＩＴＣ用の波長帯域の波長特性とに差をつけたが、励起フィルター２、吸収フィルター５のいずれか一方のフィルターに対して、このような波長特性の差をつけてもよい。
【００３４】
実施例３
実施例３の細胞解析方法では、図１及び図２に示した顕微鏡撮像装置を介して細胞の画像を撮像し、撮像した画像を画像解析装置（図示省略）で解析する場合、例えば、核７を標識するＤＡＰＩなどの第１の蛍光色素又は発光レポーター分子の濃度を大きくする、あるいは、細胞質８を標識する第２のＦＩＴＣなどの蛍光色素又は発光レポーター分子の濃度を小さくするなど、標識する蛍光色素又は発光レポーター分子の濃度に差をつける。
【００３５】
実施例２の撮像解析方法を用いれば、実施例１の細胞解析方法を用いて、図１及び図２に示した顕微鏡撮像装置を介して細胞の画像を撮像し、撮像した画像を画像解析装置（図示省略）で解析するときに、図６に示すように、ＤＡＰＩで標識された核７（あるいは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等の他の細胞成分）とＦＩＴＣで標識された細胞質８の輝度に十分な差が生じず、輝度に対する閾値の設定が困難となるような場合であっても、ＤＡＰＩで標識された核７（あるいは、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体等の他の細胞成分）とＦＩＴＣで標識された細胞質８の輝度に十分な差を与えることができ、輝度に対する閾値の設定が可能になる。
【００３６】
実施例２の細胞解析方法として、標識する蛍光色素又は発光レポーター分子の濃度に差をつける方法について説明したが、さらに、その他の方法として、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣなどの、蛍光色素又は発光レポーター分子の組合せに関し、モル吸光係数や量子収率などの蛍光特性に大きな差があるもの同士を組合せてもよい。
【００３７】
実施例４
実施例４の細胞解析方法は、実施例１、２、３の細胞解析方法における、閾値９の再設定を行って解析の精度を向上させる方法である。
実施例４の細胞解析方法では、第１の細胞成分の面積の基準値を予め設定しておき、輝度についての閾値９の設定を、輝度についての閾値を設定することにより得られる第１の細胞成分の面積値が、第１の細胞成分の面積の基準値に対して所定の条件（例えば、基準値の範囲内）を満足するように調整して行う。
【００３８】
詳しくは、実施例４の細胞解析方法では、実施例１、２、３の細胞解析方法において、図１に示す顕微鏡撮像装置を介して、図３に示すような細胞画像を取得した後、図示省略した画像解析装置を介して、一旦、ディフォルトで設定した閾値９によって、核７などの第１の細胞成分の構成要素を認識する。
さらに、画像解析装置を介して、顕微鏡撮像装置が取得した画像から核７などの第１の細胞成分の面積を算出させる。画像解析装置には、予め、核７などの第１の細胞成分の面積の基準値を設定しておく。面積の基準値は、通常、ある幅を持たて、最小値、最大値の組合せで設定する。
そして、取得した画像から算出した核７などの第１の細胞成分の面積を、この面積の基準値と比較する。
【００３９】
取得した画像から算出した核７などの第１の細胞成分の面積が、この面積の基準値における最小値を下回る場合、輝度断面において、実際の第１の細胞成分とそれ以外の細胞成分との境界部の輝度よりも大きい輝度で、第１の細胞成分とそれ以外の細胞成分とに識別するための閾値９を設定していることになるので、より小さい輝度で閾値９を設定し直す。
一方、取得した画像から算出した核７などの第１の細胞成分の面積が、この面積の基準値における最大値を上回る場合、輝度断面において、実際の第１の細胞成分とそれ以外の細胞成分との境界部の輝度よりも小さい輝度で、第１の細胞成分とそれ以外の細胞成分とに識別するための閾値９を設定している、つまり、境界部よりも細胞質８により近い部分に閾値９を設定していることになるので、より大きい輝度に閾値９を設定し直す。これらの閾値の調整処理を逐次繰り返していくことで、最適な閾値９を設定することができる。
【００４０】
なお、画像解析装置にあらかじめ設定する核７などの第１の細胞成分の面積の基準値に最小値、最大値の幅を持たせず、一定値としてもよい。その場合は、取得した画像から算出した核７などの面積と基準値との大小関係を判断し、例えば、取得画像上で算出された核７など第１の細胞成分の面積が、面積の基準値を上回る場合には最適な閾値９が設定されたものとし、下回る場合には閾値９の設定が不十分であるなどのメッセージを測定者に示すようにする。
【００４１】
また、実施例４の細胞解析方法の変形例として次のような方法を用いてもよい。
図３に示すような細胞画像を取得し、図示省略した画像解析装置を介して、一旦、ディフォルトで設定した閾値９によって、核７などの第１の細胞成分の構成要素を認識した後、画像解析装置を介して、顕微鏡撮像装置が取得した画像から核７などの第１の細胞成分の形状の特性を認識させる。画像解析装置には、予め、核７などの第１の細胞成分の形状の基準特性のパターンを設定しておく。
取得した画像から算出した核７などの第１の細胞成分の形状の特性を、この形状の基準特性のパターンと比較し、その形状の基準特性のパターンに近づくように閾値９を設定し直す。この閾値の調整処理を逐次繰り返していくことで、最適な閾値９を設定することができる。なお、第１の細胞成分を核７とする場合、その形状の基準特性のパターンは真円に設定する。
【００４２】
実施例１〜４の細胞解析方法によれば、細胞内の第１の細胞成分と第１の細胞成分以外の細胞成分とを同時に画像化することができ、細胞集団の顕微鏡観察において、解析対象である細胞成分毎に光学系を切り替えて撮像を行う必要が無いので、撮像時間を短縮し解析のスループットを向上させることができる。さらには、データ量を減らせるので、データの管理コストを削減できる。
【００４３】
なお、実施例１〜４の細胞解析方法は、神経細胞を対象として、細胞ごとに神経突起長を評価する場合や、がん細胞を対象として、細胞ごとにアポトーシス誘導を評価する場合に好適である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の細胞解析方法は、顕微観察装置を用いて多数の生細胞の画像を取得し、取得した画像から個々の細胞を認識して、解析対象となる細胞成分の特徴量を細胞毎に評価し、細胞１個あたりの平均値として数値化して評価を行うことにより、細胞集団の特性を定量的に解析するバイオテクノロジーの分野に有用である。
【符号の説明】
【００４５】
１                光源
２                励起フィルター
３                ダイクロイックミラー
４                試料
５                吸収フィルター
６                光検出器
７                核
８                細胞質
５１              光源
５２              励起フィルター切換手段
５２ａ、５２ｂ    励起フィルター
５３              ダイクロイックミラー切換手段
５３ａ、５３ｂ    ダイクロイックミラー
５４              試料
５５              吸収フィルター切換手段
５５ａ、５５ｂ    吸収フィルター
５６              光検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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