(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞、例えば、初代ヒトＴリンパ球へのベクターの導入効率の亢進方法を提供する。【解決手段】初代Ｔリンパ球への核酸の導入方法であって、（ｉ）初代Ｔリンパ球を、自然免疫系の阻害薬である化合物であって、ＢＸ７９５又は２−アミノプリンである該化合物と接触させること、（ｉｉ）該初代Ｔリンパ球を、該核酸を含むレンチウイルスベクターと接触させることを含み、ここで、該初代Ｔリンパ球と該レンチウイルスベクターとの接触が行われる前に、該初代Ｔリンパ球と該化合物との該接触が行われ、これにより、該核酸が該Ｔリンパ球に導入される、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代Tリンパ球への核酸の導入方法であって、
(i) 初代Tリンパ球を、自然免疫系の阻害薬である化合物であって、BX795又は2-アミノ
プリンである該化合物と接触させること、
(ii) 該初代Tリンパ球を、該核酸を含むレンチウイルスベクターと接触させることを含
み、
ここで、該初代Tリンパ球と該レンチウイルスベクターとの接触が行われる前に、該初
代Tリンパ球と該化合物との該接触が行われ、これにより、該核酸が該Tリンパ球に導入さ
れる、前記方法。
【請求項２】
前記初代Tリンパ球が、ヒト初代Tリンパ球である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記初代Tリンパ球と前記化合物との前記接触が、該初代Tリンパ球と前記レンチウイル
スベクターとの前記接触の3時間前に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記レンチウイルスベクターが、1.5〜2.5の感染効率（MOI）で前記初代Tリンパ球と接
触する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が、
(i) 長さ10キロベース（kb）超である、
(ii) 長さ9〜20kbである、及び／又は
(iii) キメラ抗原受容体をコードする、
請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
(i) 前記BX795が、4〜8μMの濃度であるか、又は
(ii) 前記2-アミノプリンが、2.5〜10mMの濃度である、
請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記初代Tリンパ球と前記レンチウイルスベクターとの接触の前に、該初代Tリンパ球を
、T細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と接触させることをさらに含む、
請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記作用因子が、抗体又は抗原結合フラグメントであり、任意に、該抗体又は抗原結合
フラグメントが、CD3及び／又はCD28へ特異的に結合する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記作用因子が、前記初代Tリンパ球と前記レンチウイルスベクターとの接触の前に、
該初代Tリンパ球と24時間の間接触する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記初代Tリンパ球を前記化合物と、前記レンチウイルスベクターとの接触と同時に及
び／又はその後に、接触させることをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方
法。
【請求項１１】
前記初代Tリンパ球を、前記レンチウイルスベクター、及び前記化合物と、少なくとも6
時間の間同時に接触させることを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記初代Tリンパ球を形質転換試薬及びサイトカインと接触させることをさらに含み、
任意に、
(i) 該形質転換試薬が、ジエチルアミノエチル-デキストラン又はプロタミンスルファ
ートである、及び／又は
(ii) 該サイトカインが、インターロイキン2（IL-2）である、
請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ヒト初代Tリンパ球である前記初代Tリンパ球を、ジエチルアミノエチル-デキストラン
及びインターロイキン2（IL-2）の存在下で、
(i) BX795、
(ii) キメラ抗原受容体をコードする核酸である前記核酸を含む前記レンチウイルスベ
クター
と接触させることを含み、これにより、該核酸が該ヒト初代Tリンパ球に導入され、任意
に、
(a) 該BX795が、6μMの濃度である、及び／又は
(b) 該ヒト初代Tリンパ球と該BX795との該接触が、該ヒト初代Tリンパ球と該レンチウ
イルスベクターとの該接触の前に3時間の間行われ、及び／又は該ヒト初代Tリンパ球と該
BX795及び該レンチウイルスベクターとの該接触が、少なくとも6時間の間同時に行われる
、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト初代Tリンパ球と6μMの濃度の前記BX795との前記接触が、3時間の間行われ、
次いで、少なくとも6時間の該ヒト初代Tリンパ球と前記レンチウイルスベクター及び6μM
の濃度の該BX795との同時の接触が行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ヒト初代Tリンパ球である前記初代Tリンパ球を、ジエチルアミノエチル-デキストラン
及びインターロイキン2（IL-2）の存在下で、
(i) 2-アミノプリン、
(ii) キメラ抗原受容体をコードする核酸である前記核酸を含む前記レンチウイルスベ
クター
と接触させることを含み、これにより、該核酸が該ヒト初代Tリンパ球に導入され、任意
に、
(a) 該2-アミノプリンが、2.5〜10mMの濃度である、及び／又は
(b) 該ヒト初代Tリンパ球と該2-アミノプリンとの該接触が、該ヒト初代Tリンパ球と該
レンチウイルスベクターとの該接触の前に90分間行われ、及び／又は該ヒト初代Tリンパ
球と該2-アミノプリン及び該レンチウイルスベクターとの該接触が、少なくとも5時間の
間同時に行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒト初代Tリンパ球と2.5〜10mMの濃度の前記2-アミノプリンとの前記接触が、90分
間行われ、次いで、少なくとも5時間の該ヒト初代Tリンパ球と前記レンチウイルスベクタ
ー及び2.5〜10mMの濃度の該2-アミノプリンとの同時の接触が行われる、請求項１５記載
の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／０２３，６１８号の優
先権の利益を請求する。
【０００２】
（１．分野）
本明細書における開示は、細胞へのベクターの導入効率の改善方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．背景）
Ｔリンパ球は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を含む、特異的抗原を認識して当該
特異的抗原と相互作用する。Ｔリンパ球は、腫瘍細胞を殺滅することができるので、ここ
２５年間は、抗原特異的Ｔリンパ球、または１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発
現するよう遺伝的に修飾されたＴリンパ球のいずれかであるＴリンパ球を用いて腫瘍細胞
を標的化することへかなり大きな関心が見られる（例えば、Ｅｓｈｈａｒ，米国特許第７
，７４１，４６５号、Ｅｓｈｈａｒ，米国特許出願公開第２０１２／００９３８４２号を
参照されたい）。Ｔリンパ球からのＣＡＲの誘導の効率を亢進するための新たな方法につ
いての需要が当該分野にはある。
【発明の概要】
【０００４】
（３．概要）
遺伝的に修飾された細胞、例えば、Ｔリンパ球、例えばヒトＴリンパ球、例えば、初代
Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）のような免疫細胞の作製効率の亢進方法を本
明細書に提供する。任意の特定の機序または理論に結び付けられようとすることなく、自
然免疫系は、ＣＡＲ  Ｔ細胞作製のウイルス導入工程を阻害することがあると考えられ、
したがって、自然免疫系の活性を阻害すること（例えば、ウイルス導入及び／またはその
後のウイルスタンパク質産生を阻害する自然免疫系の能力を阻害すること）によって、ベ
クター（例えば、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチ
ウイルスベクター）を用いたＣＡＲ  Ｔ細胞誘導は、改善することができる。
【０００５】
本明細書に提供する方法は、任意の細胞タイプ、特に任意の哺乳類細胞、例えば、任意
のヒト細胞、例えば、細胞治療薬、ヒト細胞治療薬に使用する細胞と共に使用してもよい
。当該方法が使用してもよい細胞の非限定例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（
例えば、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第８，２
６３，０６５号においてまたは米国出願第２０１２／０１４８５５３号において開示され
る胎盤性中間型ナチュラルキラー細胞）、樹状細胞（ＤＣ）、胎盤性幹細胞（例えば、そ
の開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第７，４６８，２７
６号、第８，０５７，７８８号及び第８，２０２，７０３号に開示される胎盤性幹細胞）
、羊膜由来接着細胞（ＡＭＤＡＣ）（例えば、その開示が全体として参照により本明細書
により組み込まれる米国特許第８，３６７，４０９号に開示されるＡＭＤＡＣ）、腫瘍浸
潤リンパ球、ウイルスパッケージング細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞）、臍帯血、
胎盤血、末梢血、骨髄、歯髄、脂肪組織、骨軟骨性組織、及びこれらに類するものに由来
の間葉様幹細胞（または間葉系幹細胞若しくは間葉系間質細胞）、胚性幹細胞、胚性生殖
細胞、神経堤幹細胞、神経幹細胞、ならびに分化細胞（例えば、線維芽細胞など）が挙げ
られるが、それらに限定しない。本方法は、例えば、動物モデルの実験目的のために腫瘍
細胞株においても使用してもよい。
【０００６】
ある実施形態において、本明細書に説明する方法には、細胞（例えば、初代ヒトＴリン
パ球）を導入すること（例えば、レトロウイルス、例えばレンチウイルスで導入すること
）を含んでもよい。ある実施形態において、本明細書に説明する方法には、当該導入（例
えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前、当該導入と同時に、ま
たは当該導入の後に、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を自然免疫系の阻害薬である
化合物と接触させることを含んでもよい。特定の実施形態において、導入（例えば、レト
ロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞へ、１０キロ塩基超の単離
した核酸を導入する。さらに別の実施形態において、当該細胞へと（例えば、レトロウイ
ルス導入、例えば、初代ヒトＴリンパ球へのレンチウイルス導入を介して）導入した当該
単離した核酸、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、１つ以上のタンパク質
をコードし、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする。
【０００７】
特定の実施形態において、導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイル
ス導入）中に当該細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）と接触するよう本明細書に説明す
る方法において使用する化合物は、自然免疫系の阻害薬である。特定の実施形態において
、自然免疫系の当該阻害薬は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）及び／またはＴＡＮＫ結合
キナーゼ１（ＴＢＫ１）の阻害薬である。具体的な実施形態において、当該化合物は、Ｂ
Ｘ７９５である。具体的な実施形態において、自然免疫系の当該阻害薬は、プロテインキ
ナーゼＲ（ＰＫＲ）の阻害薬である。具体的な実施形態において、当該化合物は、２−ア
ミノプリン（２−ＡＰ）である。
【０００８】
本明細書に説明する方法の一実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）
は、ベクター、例えば、ウイルスベクターを用いた導入（例えば、レトロウイルス導入、
例えば、レンチウイルス導入）の前に、当該導入と同時に、または当該導入の後に、本明
細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実
施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入
（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に３０分間、６０分
間、２時間または３時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−Ａ
Ｐ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は
、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス
導入）と同時に、かつその後２時間、４時間、または６時間、本明細書に説明する化合物
（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞
（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイ
ルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に３０分間、６０分間、２時間または３時
間、かつ導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）と同時にそ
の後２時間、４時間または６時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５  ２
−ＡＰ）と接触させられる。具体的な実施形態において、本明細書に説明する当該化合物
（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、それぞれ１〜２０μＭまたはｍＭの濃度で使
用する。別の実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５ま
たは２−ＡＰ）は、それぞれ２．５〜１０μＭまたはｍＭの濃度で使用する。さらに別の
実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ
）は、それぞれ４〜８μＭまたはｍＭの濃度で使用する。
【０００９】
一実施形態において、本明細書に提供する方法は、ベクター、例えばウイルスベクター
による導入（例えば、レトロウイルス、例えばレンチウイルス導入）の前にまたは当該導
入と同時に、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を形質転換試薬（例えば、ジエチルア
ミノエチルデキストランまたはプロタミンスルファート）と接触させることを追加的に含
む。
【００１０】
本明細書に説明する方法の一実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）
は、ベクター、例えばウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例え
ばレンチウイルス導入）の前に、Ｔ細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と
追加的に接触する。特定の実施形態において、当該作用因子は、抗体または抗原結合フラ
グメントである。特定の実施形態において、当該抗体または抗原結合フラグメント（複数
可）は、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８を特異的に結合する。特定の実施形態において、当
該抗体または抗原結合フラグメントは、固体基質（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商
標））へカップリングする。別の特定の実施形態において、当該抗体若しくは抗原結合フ
ラグメント（複数可）（例えば、抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８）は、固体表面、例え
ば同じ固体表面上には存在しないが、代わりに、溶液中に存在し、または細胞への抗体若
しくは抗原結合フラグメント（複数可）の提示を許容する別の化合物または組成物と複合
体形成し、例えば、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、ポリマー、ヒドロゲ
ル、アルブミン、及び／または疎水性分子と複合体形成する。ある実施形態において、抗
体または抗原結合フラグメント（複数可）が複合体形成する分子は、アジュバントではな
い。別の実施形態において、当該接触することは、ベクター、例えば、ウイルスベクター
による当該細胞の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の
少なくとも４８時間前、少なくとも４４時間前、少なくとも４０時間前、少なくとも３６
時間前、少なくとも３２時間前、少なくとも２８時間前、少なくとも２４時間前、少なく
とも２０時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも８時間前ま
たは少なくとも４時間前に生じる。
【００１１】
本明細書に説明する方法の特定の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ
球）は、１．５〜３．０の感染効率（ＭＯＩ）でウイルス（例えば、レトロウイルス、例
えば、レンチウイルス）により導入される。
【００１２】
具体的な実施形態において、本明細書に提供されるのは、初代Ｔリンパ球をｉ）核酸を
含むウイルスベクター（例えば、レトウイルス（ｒｅｔｏｖｉｒａｌ）ベクター、例えば
、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）自然免疫系の阻害薬である化合物と接触させ、そ
れにより核酸がＴリンパ球中へと導入されることを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト
初代Ｔリンパ球）の導入方法である。別の具体的な実施形態において、当該初代Ｔリンパ
球を当該化合物と当該接触させることは、当該Ｔリンパ球を当該ウイルスベクターと接触
させることの前（例えば、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、６時間
前、７時間前、８時間前、９時間前または１０時間前）及び／または同時に生じる。別の
具体的な実施形態において、当該ウイルスベクターは、１つ以上のタンパク質、例えば、
１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む。
【００１３】
別の具体的な実施形態において、当該化合物は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）または
ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する。別の具体的な実施形態において
、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻
害する当該化合物は、ＢＸ７９５（例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、
６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭまたは１０μＭのＢＸ７９５）である。別の具体的な実
施形態において、当該化合物は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する。別
の具体的な実施形態において、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する当該化
合物は、２−アミノプリン（２−ＡＰ）（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ
、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭまたは１０ｍＭの２−ＡＰ）である
。
【００１４】
別の具体的な実施形態において、初代Ｔリンパ球の導入方法はさらに、当該初代Ｔリン
パ球を、初代Ｔリンパ球をウイルスベクターと接触させることの前にＴ細胞受容体複合体
を刺激することのできる作用因子と接触させることを含む。具体的な実施形態において、
当該作用因子は、抗体または抗原結合フラグメント、例えば、ＣＤ３及び／またはＣＤ２
８へ特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントである。別の具体的な実施形態に
おいて、初代Ｔリンパ球の導入方法はさらに、初代Ｔリンパ球を形質転換試薬（例えば、
ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート）及び任意にサイト
カイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）またはイン
ターロイキン２１（ＩＬ−２１））と接触させることを含む。
【００１５】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ジエチルアミノエチル−デ
キストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２の存在下で、ヒト初代
Ｔリンパ球をｉ）１つ以上のタンパク質、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコード
する核酸を含むレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及び核酸が
Ｔリンパ球に導入される、ｉｉ）ＢＸ７９５（例えば、６μＭのＢＸ７９５）と接触させ
ることを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法である。具体
的な実施形態において、当該初代Ｔリンパ球をＢＸ７９５と当該接触させることは、当該
Ｔリンパ球を当該ウイルスベクターと接触させることの前（例えば、３時間前、６時間前
）及び／または同時に生じる。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以
上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【００１６】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジ
エチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン
２（ＩＬ−２）の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイル
スベクター、例えばレンチウイルスベクター、及びｉｉ）６μＭのＢＸ７９５と接触させ
ることを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法であり、この
中でヒト初代Ｔリンパ球を６μＭのＢＸ７９５と接触させることは約３時間生じ、次いで
ヒト初代Ｔリンパ球をウイルスベクター及び６μＭのＢＸ７９５と同時に少なくとも６時
間接触させ、それにより核酸はＴリンパ球中へと導入される。別の具体的な実施形態にお
いて、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【００１７】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジ
エチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン
２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、
例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）２−ＡＰ（例えば、２．５〜１０ｍＭの２
−ＡＰ）と接触させ、それにより核酸をＴリンパ球中へと導入することを含む、初代Ｔリ
ンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法である。具体的な実施形態において、
当該初代Ｔリンパ球を２−ＡＰと当該接触させることは、当該Ｔリンパ球を当該ウイルス
ベクターと接触させることの前に（例えば、９０分前、２時間前、または３時間前に）及
び／または同時に生じる。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上の
キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【００１８】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジ
エチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン
２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、
例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰを含む、初代
Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法であり、この中で、ヒト初代Ｔリ
ンパ球を２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰと接触させることは、９０分間生じ、それに次いで
、ヒト初代Ｔリンパ球をウイルスベクター及び２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰと同時に５時
間接触させ、それにより核酸はＴリンパ球中へと導入される。別の具体的な実施形態にお
いて、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスを用いた初代Ｔリンパ球の導入効率に及ぼす、ＤＥＡＥ−デキストラン単独の同時処理（図１Ａ）またはＤＥＡＥ−デキストランの存在下でのＢＸ７９５による同時処理（１μＭ、２μＭ、４μＭ、６μＭ、８μＭ及び１０μＭの濃度における図１Ｂ）の効果を示す。
【００２０】
【図２】レンチウイルス導入効率に及ぼすＢＸ７９５処理の効果を示す。キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスを用いて導入した初代Ｔリンパ球の導入効率は、種々の条件、すなわち（ｉ）ＢＸ７９５前処理、（ｉｉ）ＢＸ７９５同時処理、（ｉｉｉ）ＢＸ７９５前処理及び同時処理の併用ならびに（ｉｖ）対照処理について評価した。
【００２１】
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、初代ヒトＴリンパ球の生存率に及ぼす形質転換試薬ＤＥＡＥ−デキストラン及びプロタミンスルファートの効果（図３Ａ）ならびにレンチウイルスにより導入された初代ヒトＴリンパ球の生存率に及ぼすＤＥＡＥ−デキストランまたはプロタミンスルファートの存在下での種々の濃度の２−ＡＰの効果（図３Ｂ） を示す。
【００２２】
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、２−ＡＰの非存在下での（図４Ａ）または増大する濃度の２−ＡＰの存在下での（２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度における図４Ｂ）レンチウイルス導入効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（５．詳細な説明）
（５．１．導入方法）
（５．１．１．細胞）
本明細書に説明する方法において使用することのできる細胞の非限定例としては、Ｔリ
ンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、胎盤幹細胞（例えば、それらの開示が全体として参照により
本明細書により組み込まれる米国特許第７，４６８，２７６号、第８，０５７，７８８号
及び第８，２０２，７０３号において開示される胎盤幹細胞）、臍帯血由来の間葉様幹細
胞、胎盤血、末梢血、骨髄、歯髄、脂肪組織、骨軟骨性組織、及びこれらに類するもの、
胚性幹細胞、胚性生殖細胞、神経堤幹細胞、神経幹細胞、ならびに分化細胞（例えば、線
維芽細胞など）が挙げられる。本方法は、例えば、動物モデルの実験目的のために腫瘍細
胞株においても使用してもよい。特定の実施形態において、本明細書に説明する方法の細
胞は、初代細胞であり得る。初代細胞は、当該技術分野において周知であり、細胞老化の
開始に至らない量についてインビトロで培養または増殖される、及び細胞の不死化に至る
様式で培養または増殖されていない、対象（例えば、ヒト）から抽出した細胞を含み得る
。具体的な実施形態において、本明細書に説明する方法において使用する細胞は、ヒトＴ
リンパ球である。別の具体的な実施形態において、本明細書に説明する方法において使用
する細胞は、ナチュラルキラー細胞ではない。別の具体的な実施形態において、本明細書
に説明する方法において使用する細胞は、Ｔリンパ球細胞株ではない。
【００２４】
具体的な実施形態において、本明細書に提供する方法において使用する細胞は、初代Ｔ
リンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）である。本明細書に提供する方法において使用
する初代Ｔリンパ球は、天然のＴリンパ球またはＭＨＣの制限されたＴリンパ球であって
もよい。ある実施形態において、当該Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋である。他の実施形態にお
いて、当該Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋である。ある実施形態において、当該初代Ｔリンパ球
は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。ある実施形態において、当該初代Ｔリンパ球は
、腫瘍生検から単離されており、または腫瘍生検から単離されたＴリンパ球から増殖され
ている。ある実施形態において、当該初代Ｔリンパ球は、末梢血、臍帯血、またはリンパ
から単離され、またはそれらから単離されたＴリンパ球から増殖されている。ある実施形
態において、当該Ｔリンパ球は、特定の個体、例えば、当該Ｔリンパ球の被移植者に関し
て同種である。ある他の実施形態において、当該Ｔリンパ球は、ある個体、例えば、当該
Ｔリンパ球の被移植者に関して同種である。ある実施形態において、当該Ｔリンパ球は、
特定の個体、例えば、当該Ｔリンパ球の被移植者に関して自己である。
【００２５】
一実施形態において、初代Ｔリンパ球は、個体から得られ、任意に増殖され、次に１つ
以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を使用する本明細書に説明する方法
を用いて導入され、次に任意に増殖される。第５．２節を参照されたい。Ｔリンパ球は、
例えば、培養物中のＴリンパ球を、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８に対する抗体、例えば、
ビーズへまたは細胞培養プレートの表面へ付着した抗体と接触させることによって増殖す
ることができ、例えば、米国特許第５，９４８，８９３号、第６，５３４，０５５号、第
６，３５２，６９４号、第６，６９２，９６４号、第６，８８７，４６６号、及び第６，
９０５，６８１号を参照されたい。具体的な実施形態において、当該抗体は、抗ＣＤ３及
び／または抗ＣＤ２８であり、当該抗体は、固体表面へは結合しない（例えば、当該抗体
は、溶液中のＴリンパ球と接触する）。他の具体的な実施形態において、抗ＣＤ３抗体ま
たは抗ＣＤ２８抗体のいずれかは、固体表面（例えば、ビーズ、組織培養皿プラスチック
）へ結合し、もう１つの抗体は、固体表面へ結合していない（例えば、溶液中に存在する
）。
【００２６】
ある実施形態において、本明細書に説明する方法において使用する初代Ｔリンパ球は、
腫瘍から単離され、例えば、腫瘍浸潤リンパ球である。特定の実施形態において、このよ
うなＴリンパ球は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特
異的である。第５．２．２節を参照されたい。
【００２７】
（５．１．２．形質転換試薬）
本明細書において使用する場合、「導入」、「形質転換」、及び「トランスフェクショ
ン」のような用語は、別段の記載がない限り、相互交換可能に使用する。細胞の導入方法
は、当該技術分野で周知である。導入中、小分子及び／またはポリマーは、例えば、細胞
培養物へ添加されて、関心対象のタンパク質及び／または核酸の結合及び／または取り込
みを容易にし得る。特に、小さな極性化合物は、培養条件へ付加して、その中にあるウイ
ルス及び核酸（複数可）の結合及び導入を容易にすることができる。例示的な形質転換試
薬としては、リポフェクタミン（登録商標）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、リン酸カルシ
ウム、ジエチルアミノエチルセルロース−デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストランまたは
ＤＤ）、及びプロタミンスルファートが挙げられるが、これらに限定しない。本明細書に
説明する方法に関するある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球
）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、ＤＥＡＥ−
デキストランまたはプロタミンスルファートの存在下で生じる。本明細書に説明する方法
の特定の実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば
、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、ＤＥＡＥ−デキストラン、例
えば、１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランまたはプロタミンスルファート、例えば
、１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で生じる。
【００２８】
（５．１．３．培養条件及びＴリンパ球の活性化）
本明細書に説明する細胞は、導入（例えば、ウイルス導入）を容易にするまたは亢進す
るために特異的な培養条件下で維持することができる。特定の実施形態において、Ｔリン
パ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、導入の前にまたは同時に、Ｔリンパ球共刺激分
子（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３及び／またはＣＤ４５）へ特異的に結合する抗原または抗
原結合フラグメントによって活性化される。別の実施形態において、当該抗体または抗原
結合フラグメントは、固体基質（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））へカップリ
ングされる。特定の実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、
導入（例えば、ウイルス導入）の２４時間前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）へカッ
プリングされた抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び／または抗ＣＤ４５抗体によって刺
激される。別の特定の実施形態において、（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び
／若しくは抗ＣＤ４５抗体または他派これらの抗原結合フラグメント（複数可）の）当該
抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、固体表面上には存在しないが、代わりに
、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）の提示を許容する別の化合物または組成物
と複合体形成し、例えば、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、ポリマー、ヒ
ドロゲル、アルブミン、及び／または疎水性分子と複合体形成する。特定の実施形態にお
いて、抗体またはその抗原結合フラグメントと複合体形成したこのような分子（複数可）
は、アジュバントではない。別の実施形態において、当該接触することは、ウイルスベク
ターによる当該細胞の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入
）の少なくとも４８時間前、少なくとも４４時間前、少なくとも４０時間前、少なくとも
３６時間前、少なくとも３２時間前、少なくとも２８時間前、少なくとも２４時間前、少
なくとも２０時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも８時間
前または少なくとも４時間前に生じる。さらに別の実施形態において、当該接触すること
は、ウイルスベクターによる当該細胞の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レ
ンチウイルス導入）の少なくとも４８時間〜４０時間前、４４時間〜３６時間前、４０時
間〜３２時間前、３６時間〜２８時間前、３２時間〜２４時間前、２８時間〜２０時間前
、２４時間〜１６時間前、２０時間〜１２時間前、１６時間〜８時間前、１２時間〜４時
間前または少なくとも８時間〜１時間前に生じる。
【００２９】
別の実施形態において、Ｔリンパ球の活性化及び／または増殖を刺激するサイトカイン
及び／または増殖因子は、導入の前にまたは同時に添加することができる。特定の実施形
態において、インターロイキン２（ＩＬ−２）、例えば、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２は、導
入（例えば、ウイルス導入）の前または同時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリ
ンパ球培養物）へ添加される。別の実施形態において、インターロイキン７（ＩＬ−７）
、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７は、導入（例えば、ウイルス導入）の前にまたは同
時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。別の実施形
態において、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１
２は、導入（例えば、ウイルス導入）の前にまたは同時にＴリンパ球培養物（例えば、初
代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。別の実施形態において、インターロイキン１５
（ＩＬ−１５）、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５は、導入（例えば、ウイルス導入
）の前または同時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加され
る。さらに別の実施形態において、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、例えば、２５
ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１は、導入（例えば、ウイルス導入）の前または同時に、Ｔリンパ
球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。
【００３０】
（５．１．４．自然免疫の阻害薬）
自然免疫系は、合成ウイルスを含むウイルスの遺伝子の発現を抑圧することができる。
自然免疫系が、二本鎖ＲＮＡ及び他の病原性巨大分子によって惹起することができかつ、
自然免疫活性が容易に測定できる（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、
インターフェロンδ、インターフェロンζ、インターフェロンκ及びインターフェロンτ
を含むがこれらに限定しないインターフェロンタンパク質の分泌レベル）タンパク質（例
えば、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、
ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１））を含むことは、
当該技術分野で周知である。したがって、本明細書に説明する方法の特定の実施形態にお
いて、培養細胞は自然免疫の阻害薬と接触する。別の実施形態において、Ｔリンパ球（例
えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイ
ルス導入）は、自然免疫シグナル伝達を阻害する化合物、例えば、小分子（例えば、ＢＸ
７９５、ピセタノール、ゲフィチニブ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、グリベンクラミド、Ｐｅｐ
ｉｎｈ−ＭｙＤ、ＯｘＰＡＰＣ、ＣＬＩ−０９５、ポリミキシンＢ、Ｈ−８９、２−アミ
ノプリン（２−ＡＰ）、クロロキン、バフィロマイシンＡ１またはこれらに類するもの）
の添加によって亢進することができる。
【００３１】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリ
ンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入
の前、同時または後のいずれかで、Ｔリンパ球を自然免疫応答の阻害薬と接触させること
によって亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、
Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例え
ば、レンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかで、ＩκＢキナーゼε
（ＩＫＫε）及び／またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の阻害薬を用いた処理の
際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において、
Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例え
ば、レンチウイルス導入）は、当該細胞の導入の前、同時または後のいずれかで、ＢＸ７
９５を用いた処理の際に亢進することができる。
【００３２】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒト
Ｔリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、
０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μ
Ｍ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μ
Ｍ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、またはそれより高い濃度のＢＸ７９５を用いた処理
の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において
、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例
えば、レンチウイルス導入）は、０．５μＭ〜１μＭ、１μＭ〜３μＭ、２μＭ〜４μＭ
、３μＭ〜５μＭ、４μＭ〜６μＭ、５μＭ〜７μＭ、６μＭ〜８μＭ、７μＭ〜９μＭ
、８μＭ〜１０μＭ、９μＭ〜１１μＭ、１０μＭ〜１２μＭ、１１μＭ〜１３μＭ、１
２μＭ〜１４μＭまたは１３μＭ〜１５μＭ、１０μＭ〜２０μＭ、１０μＭ〜１５μＭ
または１０μＭ〜１２μＭの濃度のＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる
。
【００３３】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリ
ンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該
細胞の導入の前にＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。例えば、本明細
書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）
の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入前の５時
間超、導入前の５時間、導入前の４時間、導入前の３時間、導入前の２時間、導入前の１
時間、導入前の３０分間、導入前の１５分間、導入前の５分間または導入と同時に、ＢＸ
７９５を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実
施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウ
イルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、形質転換の４〜５時間前、導入の３〜４
時間前、導入の２〜３時間前、導入の１〜２時間前、導入の３０分間〜１時間前または導
入と同時〜３０分間前に、ＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。本明細
書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ
球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、本明細書
に説明する時点のうちのいずれかにおける導入の前及び同時の両方で、ＢＸ７９５を用い
た処理の際に亢進することができる。
【００３４】
具体的な実施形態において、天然免疫系の当該阻害薬は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫ
Ｒ）の阻害薬である。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球
（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチ
ウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかで、プロテインキナーゼＲ（ＰＫ
Ｒ）の阻害薬を用いた処理の際に亢進することができる。具体的な実施形態において、当
該化合物は、２−アミノプリン（２−ＡＰ）である。
【００３５】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリ
ンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入
の前、同時または後のいずれかで、天然免疫応答の阻害薬を用いたＴリンパ球の処理の際
に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリン
パ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レ
ンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかにおいて、プロテインキナー
ゼＲ（ＰＫＲ）の阻害薬を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する
方法の別の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導
入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞の前、同
時または後のいずれかで、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。
【００３６】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒト
Ｔリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、
０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍ
Ｍ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭまたはそれより高い
濃度の２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別
の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例え
ば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５ｍＭ〜１ｍＭ、１ｍ
Ｍ〜３ｍＭ、２ｍＭ〜４ｍＭ、３ｍＭ〜５ｍＭ、４ｍＭ〜６ｍＭ、５ｍＭ〜７ｍＭ、６ｍ
Ｍ〜８ｍＭ、７ｍＭ〜９ｍＭ、８ｍＭ〜１０ｍＭ、９ｍＭ〜１１ｍＭ、１０ｍＭ〜１２ｍ
Ｍ、１１ｍＭ〜１３ｍＭ、１２ｍＭ〜１４ｍＭまたは１３ｍＭ〜１５ｍＭの濃度の２−Ａ
Ｐを用いた処理の際に亢進することができる。
【００３７】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリ
ンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該
細胞の導入の前に、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。例えば、本明細
書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）
の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入前の５時
間超、導入前の５時間、導入前の４時間、導入前の３時間、導入前の２時間、導入前の１
時間、導入前の３０分間、導入前の１５分間、導入前の５分間または同時に、２−ＡＰを
用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態に
おいて、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導
入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の４〜５時間前に、導入の３〜４時間前に、
導入の２〜３時間前に、導入の１〜２時間前に、導入の３０分間〜１時間前にまたは導入
と同時〜３０分間前に、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に
説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）
の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、本明細書に説
明する時点のうちのいずれかにおける導入の前及び同時の両方で、２−ＡＰを用いた処理
の際に亢進することができる。
【００３８】
（５．１．５．ウイルス導入）
本明細書に説明する方法の一実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリン
パ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、種々の
感染効率（ＭＯＩ）のウイルスを用いて生じることができる。本明細書に説明する方法の
具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば
、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．１、０．２、０．４、０
．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２
．６、２．８、３．０またはそれより高いウイルス感染効率（ＭＯＩ）で生じる。本明細
書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ
球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．１〜
０．３、０．２〜０．４、０．４〜０．６、０．６〜０．８、０．８〜１．０、１．０〜
１．２、１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜
２．２、２．２〜２．４、２．４〜２．６、２．６〜２．８または２．８〜３．０のウイ
ルス感染効率（ＭＯＩ）で生じる。
【００３９】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒト
Ｔリンパ球）を化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させて、導入効率（
例えば、レンチウイルス導入効率）を高めることは、単離した核酸配列（例えば、キメラ
抗原受容体をコードするベクター）の導入を改善する。例えば、長さ９キロベース（ｋｂ
）、長さ１０ｋｂ、長さ１１ｋｂ、長さ１２ｋｂ、長さ１３ｋｂ、長さ１４ｋｂ、長さ１
５ｋｂ、長さ１６ｋｂ、長さ１７ｋｂ若しくは長さ１８ｋｂまたはそれより長い核酸配列
は、本明細書に説明する方法の結果として（すなわち、説明する化合物（例えば、ＢＸ７
９５または２−ＡＰ）の非存在下での導入の効率と比較して）、より高い効率で細胞中へ
と導入することができる。ある実施形態において、本明細書に説明する方法は結果的に、
核酸分子（例えば、１つ以上のタンパク質、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコー
ドするベクターを含むベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイ
ルスベクターのようなウイルスベクター）の改善された導入を生じ、この中で、当該核酸
分子は、長さ９キロベース（ｋｂ）〜長さ１０ｋｂ、長さ１０ｋｂ〜長さ１１ｋｂ、長さ
１１ｋｂ〜長さ１２ｋｂ、長さ１２ｋｂ〜長さ１３ｋｂ、長さ１３ｋｂ〜長さ１４ｋｂ、
長さ１４ｋｂ〜長さ１５ｋｂ、長さ１５ｋｂ〜長さ１６ｋｂ、長さ１６ｋｂ〜長さ１７ｋ
ｂ、長さ１７ｋｂ〜長さ１８ｋｂ、または長さ９〜１８ｋｂまたは長さ１０〜１５ｋｂで
ある。
【００４０】
本明細書に説明する方法の特定の態様において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリン
パ球）は、２つ以上の異なる単離された核酸、例えば、非同一配列の２、３、４または５
個の核酸を用いて導入する（例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスを導入す
る）ことができる。具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ
球）を化合物と接触させて導入効率（例えば、レトロウイルス導入効率、例えば、レンチ
ウイルス導入効率）を高めることは、１、２、３、４または５個の異なる単離した核酸（
例えば、１つ以上のタンパク質をコードする、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコ
ードするベクターを含むベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウ
イルスベクターのようなウイルスベクター）の導入を改善する。
【００４１】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランの存在下で抗ＣＤ３抗体
及び／または抗ＣＤ２８抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用い
て２４時間刺激され、それに次いで当該リンパ球のＢＸ７９５を用いた３時間の処理、そ
れに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１
．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつ当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と
同時に６μＭのＢＸ７９５を用いてさらに６時間処理される。
【００４２】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、抗ＣＤ
３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）
を用いて、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランの存在
下で、２４時間刺激され、それに次いで、当該リンパ球の２−ＡＰを用いた５時間の処理
、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは
、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で、当該ヒトＴリンパ球は、レンチウ
イルスの添加と同時に２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰを用いてさらに５時間処理される。
【００４３】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で、抗ＣＤ３抗
体及び／または抗ＣＤ２８抗体あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用い
て２４時間刺激され、それに次いで、ＢＸ７９５による当該リンパ球の６時間の処理、そ
れに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１
．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルス
の添加と同時に６μＭのＢＸ７９５を用いてさらに６時間処理される。
【００４４】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で、抗ＣＤ３抗
体及び／または抗ＣＤ２８抗体あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用い
て２４時間刺激され、それに次いで、当該リンパ球の５時間の処理、それに次いで、当該
リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（
ＭＯＩ）にあり、かつこの中で、当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に
２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰを用いてさらに５時間処理される。
【００４５】
（５．２．キメラ抗原受容体）
ある実施形態において、本明細書に提供する方法を使用して、１つ以上のキメラ抗原受
容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を細胞、例えば、Ｔリンパ球（例えば、初代Ｔリンパ球
）中へ導入する。ＣＡＲは、Ｔリンパ球を抗原へ方向づけ、Ｔリンパ球を刺激して、抗原
を提示する細胞を殺滅する、人工膜結合型タンパク質である。例えば、Ｅｓｈｈａｒ，米
国特許第７，７４１，４６５号を参照されたい。概して、ＣＡＲは、抗原、例えば、細胞
上の抗原へ結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び免疫細胞へ一次性活性化シグ
ナルを伝達する細胞内（細胞質）シグナル伝達ドメインを含む。他の条件がすべて満たさ
れた場合、ＣＡＲが例えばＴリンパ球の表面上に発現し、かつＣＡＲの細胞外ドメインが
抗原へ結合すると、細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナルをＴリンパ球へ伝達して、
活性化及び／または増殖させ、抗原が細胞表面上に存在すれば、当該抗原を発現する細胞
を殺滅する。Ｔリンパ球は、最大に活性化させるために、一次性活性化シグナル及び共刺
激シグナルの２つのシグナルを必要とするので、ＣＡＲは、刺激性ドメイン及び共刺激ド
メインを含むことができ、それにより、細胞外ドメインへの抗原の結合は結果的に、一次
性活性化シグナル及び共刺激シグナルの両方の伝達を生じる。
【００４６】
（５．２．１．一般的なＣＡＲ構造細胞内ドメイン）
ある実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、Ｔリンパ球の表面上に発現しかつ
当該Ｔリンパ球の活性化及び／または増殖を惹起するタンパク質の細胞内ドメインまたは
モチーフであり、あるいは当該ドメインまたはモチーフを含む。このようなドメインまた
はモチーフは、ＣＡＲの細胞外部分への抗原の結合に応じて、Ｔリンパ球の活性化に必要
な一次抗原結合シグナルを伝達することができる。典型的には、このドメインまたはモチ
ーフは、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン系活性化モチーフ）を含み、または当該ＩＴＡＭ
である。ＣＡＲに適したＩＴＡＭ含有ポリペプチドには例えば、ゼータＣＤ３鎖（ＣＤ３
ζ）またはそのＩＴＡＭ含有部分である。具体的な実施形態において、細胞内ドメインは
、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインである。他の具体的な実施形態において、細胞内
ドメインは、リンパ球受容体鎖、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体タンパク質、Ｆｃ受容体サブユニ
ットまたはＩＬ−２受容体サブユニットに由来する。
【００４７】
ある実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインまたはモチーフを、例え
ば、当該ポリペプチドの細胞内ドメインの一部として追加的に含む。当該１つ以上の共刺
激ドメインまたはモチーフは例えば、共刺激ＣＤ２７ポリペプチド配列、共刺激ＣＤ２８
ポリペプチド配列、共刺激ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ポリペプチド配列、共刺激４−１ＢＢ
（ＣＤ１３７）ポリペプチド配列、若しくは共刺激誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）ポリ
ペプチド配列、または他の共刺激ドメイン若しくはモチーフ、あるいはこれらの任意の組
み合わせであることができ、あるいはそれらを含む。
【００４８】
膜貫通領域は、機能的ＣＡＲ中へと組み込むことのできる任意の膜貫通領域、例えば、
ＣＤ４分子またはＣＤ８分子に由来する膜貫通領域であることができる。
【００４９】
ある実施形態において、細胞内ドメインは、検出可能な、例えば、蛍光性の、タンパク
質（例えば、緑色蛍光タンパク質）またはその公知の任意のバリアントをコードするよう
さらに修飾することができる。
【００５０】
（５．２．２．ＣＡＲ細胞外ドメイン）
ある実施形態において、本明細書に説明する方法を用いて細胞中へ導入される核酸は、
ポリペプチドをコードする配列を含み、この中で、当該ポリペプチドの細胞外ドメインは
、関心対象の抗原へ結合する。ある実施形態において、細胞外ドメインは、当該抗原へ結
合する受容体、または受容体の一部を含む。ある実施形態において、当該細胞外ドメイン
は、抗体若しくはその抗原結合部分を含みまたは当該抗体若しくはその抗原結合部分であ
る。具体的な実施形態において、当該細胞外ドメインは、一本鎖Ｆｖドメインを含みまた
は当該一本鎖Ｆｖドメインである。当該一本鎖Ｆｖドメインは例えば、可撓性リンカーに
よってＶＨへ連結されたＶＬを含むことができ、この中で、当該ＶＬ及びＶＨは、当該抗
原を結合する抗体に由来する。
【００５１】
ポリペプチドの細胞外ドメインが関心対象の任意の抗原であることができる抗原は、例
えば、腫瘍細胞上にある抗原であることができる。腫瘍細胞は、例えば、固形腫瘍中の細
胞、または血液癌の細胞であることがある。当該抗原は、任意の腫瘍または癌のタイプの
細胞、例えば、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、上咽頭癌、黒
色腫、例えば、悪性黒色腫、皮膚癌、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、
内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、末梢原始神経外胚葉性腫瘍、固形胚細胞腫瘍、肝芽腫、神
経芽腫、非横紋筋肉腫軟部組織肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫
瘍、膠芽腫、粘液腫、線維腫、脂肪腫、またはこれらに類するものの細胞上に発現する任
意の抗原であることができる。より具体的な実施形態において、当該リンパ腫は、慢性リ
ンパ性白血病（小リンパ球性リンパ腫）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性
リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細
胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫
、結節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大
細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、脈管内大細胞型Ｂ細
胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔリンパ球性前リンパ性白
血病、Ｔリンパ球性大顆粒リンパ球性白血病、侵襲性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔリンパ球性
白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔリンパ球性リンパ腫、鼻型、腸疾患型Ｔリンパ球性リ
ンパ腫、肝脾性Ｔリンパ球性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞性リンパ腫、菌状息肉症、セザリ
ー症候群、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔリン
パ球性リンパ腫、末梢性Ｔリンパ球性リンパ腫（不特定）、未分化大細胞リンパ腫、ホジ
キンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫であることができる。具体的な実施形態におい
て、当該癌が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である場合、ＣＬＬのＢ細胞は正常な核型を
有する。他の具体的な実施形態において、当該癌が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である
場合、ＣＬＬのＢ細胞は、１７ｐ欠失、１１ｑ欠失、１２ｑトリソミー、１３ｑ欠失また
はｐ５３欠失を保有する。
【００５２】
ある実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳ
Ａ）である。種々の具体的な実施形態において、制限なく、腫瘍関連抗原または腫瘍特異
的抗原は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、Ｈｅｒ２、前
立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）アルファフェトプロテイ
ン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、癌抗原１２５（ＣＡ−１２
５）、ＣＡ１９−９、カルレチニン、ＭＵＣ−１、上皮系膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮
系腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２
０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デ
スミン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、粗嚢胞疾患液体タンパク質（ＧＣＤＦ
Ｐ−１５）、ＨＭＢ−４５抗原、タンパク質ｍｅｌａｎ−Ａ（Ｔリンパ球によって認識さ
れる黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１））、ｍｙｏ−Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経
細線維、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプ
トフィシス（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｓ）、チログロブリン、甲状腺転写因子１、血管
内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ピルビン酸キナーゼイソ酵素Ｍ２型（腫瘍Ｍ２−Ｐ
Ｋ）の二量体形態、異常なｒａｓタンパク質、または異常なｐ５３タンパク質である。
【００５３】
ある実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、癌／精巣（ＣＴ）抗原、例えば、ＢＡ
ＧＥ、ＣＡＧＥ、ＣＴＡＧＥ、ＦＡＴＥ、ＧＡＧＥ、ＨＣＡ６６１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８
５、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＮＡ８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＳＡＲ
−３５、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＰＡＮＸＢ１、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ、ＳＹＣＰ１、または
ＴＰＴＥである。
【００５４】
ある実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、炭水化物またはガングリオシド、例え
ば、ｆｕｃ−ＧＭ１、ＧＭ２（癌胎児性抗原免疫原性１（ＯＦＡ−Ｉ−１））、ＧＤ２（
ＯＦＡ−Ｉ−２）、ＧＭ３、ＧＤ３、及びこれらに類するものである。
【００５５】
ある実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、アルファアクチニン４、Ｂａｇｅ−１
、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、ベータカテニン、ＣＡ１２５、ＣＡ
１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ
４３、Ｃａｓｐ−８、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ＣＥＡ、ｃｏａ−１、ｄｅ
ｌ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＢＮＡ、ＥＦ２、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＴ
Ｖ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩ
ＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２、及び３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラス
Ｉ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ
、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｇａｇｅ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−
Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、Ｓ
ＳＸ−２、ＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ
−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−
２、ｐ１５（５８）、ＲＡＧＥ、、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ
５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧ
Ｋ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ−１
８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒ
ｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、Ｃ
Ａ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、１３−カテニン、Ｍｕｍ−１、ｐ
１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ
７２、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧ
Ｆ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５
０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣ
ＡＧ１６、ＴＡ−９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２２
、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（
表皮増殖因子バリアントＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、メソテリン、ＰＡ
Ｐ（前立腺酸ホスファターゼ）、プロステイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替読み
枠タンパク質）、Ｔｒｐ−ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺１の６回膜貫通上皮抗原）、異常
なｒａｓタンパク質、または異常なｐ５３タンパク質である。別の具体的な実施形態にお
いて、当該腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、インテグリンαｖβ３（ＣＤ６１）、
ガラクチン、Ｋ−Ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子）
、またはＲａｌ−Ｂである。他の腫瘍関連抗原及び腫瘍特異的抗原は、当業者に公知であ
る。
【００５６】
ＴＳＡ及びＴＡＡへ結合する抗体及びｓｃＦｖには、当該技術分野で公知の抗体及びｓ
ｃＦＶを、これらをコードするヌクレオチド配列と同様に含む。
【００５７】
ある具体的な実施形態において、抗原は、ＴＳＡまたはＴＡＡであるとみなされない抗
原であるが、それにもかかわらず、当該抗原は、腫瘍細胞、または腫瘍に起因する損傷と
関連している。ある実施形態において、例えば、当該抗原は、例えば、増殖因子、サイト
カインまたはインターロイキン、例えば、血管新生または脈管形成と関連する増殖因子、
サイトカインまたはインターロイキンである。このような増殖因子、サイトカイン、また
はインターロイキンには、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽増殖因
子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インス
リン様増殖因子（ＩＧＦ）、またはインターロイキン８（ＩＬ−８）を含むことができる
。腫瘍は、腫瘍に対して局所的な低酸素性環境も作ることができる。このようなものとし
て、他の具体的な実施形態において、抗原は、低酸素症関連因子、例えば、ＨＩＦ−１α
、ＨＩＦ−１β、ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−２β、ＨＩＦ−３α、またはＨＩＦ−３βであ
る。腫瘍は、正常組織に対する限局的な損傷も引き起こすことができ、損傷関連分子パタ
ーン分子（ＤＡＭＰ、アラーミンとしても公知）として公知の分子の放出を引き起こす。
ある他の具体的な実施形態において、それゆえ、抗原は、ＤＡＭＰ、例えば、熱ショック
タンパク質、染色質結合タンパク質高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、Ｓ１００Ａ８
（ＭＲＰ８、カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４、カルグラニュリンＢ）
、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）であり、またはデオキシリボ核酸、アデノシン三リン酸、
尿酸、若しくはヘパリンスルファートであることができる。
【００５８】
本明細書に説明するポリペプチドのある実施形態において、細胞外ドメインは、当該膜
貫通ドメインへ直接的に、あるいはリンカー、スペーサーまたはヒンジポリペプチド配列
、例えば、ＣＤ２８由来の配列若しくはＣＴＬＡ４由来の配列によって結合する。
【００５９】
（５．３．単離された核酸）
当業者は、本明細書に説明する方法が任意の特定のタイプのベクターの導入に限定され
るものではないこと、及び導入されたベクターが当該ベクターの含む核酸の特定のタイプ
に関して限定されるものではないことを認識するであろう。したがって、本明細書に説明
する方法に従って細胞へ導入するために使用する核酸を含むベクターが、例えば、関心対
象の任意のタンパク質またはポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）をコードする任意の核酸を
含み得ることは理解されるべきである。
【００６０】
ある実施形態において、当該核酸は、免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球の導入に適した任
意のポリヌクレオチドベクター内に含有され得る。例えば、Ｔリンパ球は、関心対象のポ
リペプチド（例えば、キメラ受容体）をコードするポリヌクレオチドを含有する合成ベク
ター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、自律的に複製する
プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ま
たはヘルペスウイルス）、またはこれらに類するものを用いて形質転換または導入され得
る。
【００６１】
具体的な実施形態において、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクタ
ーは、本明細書に説明する方法に従って使用する。Ｔリンパ球の形質転換または導入に適
したレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターには、それらの開示が全
体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号、第６
，１６５，７８２号、第６，４２８，９５３号、第７，０８３，９８１号、及び第７，２
５０，２９９号において説明されるレンチウイルスベクターを含むが、これらに限定しな
い。
【００６２】
別の具体的な実施形態において、ＨＩＶベクターは、本明細書に説明する方法に従って
使用する。Ｔリンパ球の導入に適したＨＩＶベクターには、その開示が全体として参照に
より本明細書により組み込まれる米国特許第５，６６５，５７７号において説明されるベ
クターを含むが、これらに限定しない。
【００６３】
例えば、Ｔリンパ球内でのポリペプチドの産生に有用な核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ま
たは核酸類似体を含む。核酸類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修
飾することができ、デオキシチミジンへのデオキシウリジン置換、デオキシシチジンへの
５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジン置換を
含むことができる。糖部分の修飾には、２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を
形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を含むことができる。デオキシリボ
ースリン酸骨格は、モルホリノ核酸を生成するために修飾することができ、この中で、各
塩基部分が６員のモルホリノ環へ連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格
が偽ペプチド骨格によって置き換えられかつ４つの塩基が保有されるペプチド核酸を生じ
るよう修飾することができる。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ（１９９７
）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７：１８７〜１
９５、ならびにＨｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈａｉｎ．４：
５〜２３を参照されたい。加えて、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオアート
骨格若しくはホスホロジチオアート骨格、ホスホロアミダイト骨格、またはアルキルホス
ホトリエステル骨格と置き換えることができる。
【実施例】
【００６４】
（６．実施例）
（６．１．実施例１：ＢＸ７９５への同時曝露を伴う初代Ｔリンパ球導入）
（６．１．１．ＤＥＡＥ−デキストランを用いた初代ヒトＴリンパ球の同時処理は、レ
ンチウイルス導入を容易にする）
初代ヒトＴリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０
培地中で培養し、３：１のＤｙｎａｂｅａｄ：Ｔリンパ球比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎ
ａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて活性化した。活性化の２４時間後、５０Ｕ／ｍｌのＩ
Ｌ−２を培地へ、ＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＤ）とともにまたはなしで添加した。ＶＥ
ＧＦＲ２及びＧＦＰタンパク質から構成されるキメラ抗原受容体をコードするベクターＪ
Ｌ２８．２（ＶＥＧＦＲ２−ＣＤ２８ＴＭ−ＣＤ２８ＩＣ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ）をコードす
るレンチウイルスを、活性化したＴリンパ球培地へ１．８の感染効率（ＭＯＩ）で添加し
た。蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて、上手く導入された細胞についてのマーカ
ーとしてのＶＥＧＦＲ２を発現するＴリンパ球の比を判定した。図１Ａに示すように、ニ
セ処理した細胞（すなわち、ウイルスを受容しなかった細胞）の２．６１％はＶＥＧＦＲ
２＋であり、レンチウイルスとともにインキュベートされたがＤＤを有さない細胞の３．
９９％はＶＥＧＦＲ２＋であったのに対し、レンチウイルス及びＤＤとともにインキュベ
ートした細胞の９．８０％はＶＥＧＦＲ２＋であった。したがって、ＤＥＡＥ−デキスト
ランを用いた初代ヒトＴリンパ球の処理が、レンチウイルス導入を容易にすることが判定
された。
【００６５】
（６．１．２．ＢＸ７９５を用いた同時処理は、初代ヒトＴリンパ球の導入効率を亢進
する）
初代ヒトＴリンパ球を第６．１．１節にあるように培養及び活性化し、レンチウイルス
と同時に添加して６時間インキュベートしておくＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＤ）及びあ
る範囲の濃度のＢＸ７９５の存在下で、ベクターＪＬ２８．２を用いて導入した。次に、
導入したリンパ球をＦＡＣＳによって分析して、上手く導入した細胞の比を判定した。図
１Ｂに示すように、増大した濃度のＢＸ７９５と相関するウイルス伝達効率の増加があっ
た（１μＭのＢＸ７９５を用いて処理した場合、導入した細胞の７．６３％はＶＥＧＦＲ
２＋であり、１０μＭのＢＸ７９５を用いて処理した場合、導入した細胞の１０．５％は
ＶＥＧＦＲ２＋であった）。したがって、高用量（１０μＭ）におけるレンチウイルス及
びＢＸ７９５を用いたＴリンパ球の同時処理は結果的に、レンチウイルスベクターによる
細胞の導入効率の増大を生じることが判定された。
【００６６】
（６．２．実施例２：ＢＸ７９５を用いた前処理は、初代ヒトＴリンパ球の導入効率の
増大に必要とされる。）
初代ヒトＴリンパ球を実施例１において説明するとおり培養及び活性化したが、１つの
細胞集団は、ＤＤのみを用いて処理し（「ＤＤのみの対照」）、１つの細胞集団は、レン
チウイルス導入と同時に６μＭのＢＸ７９５を用いて６時間処理し（「同時」）、１つの
細胞集団は、レンチウイルス導入前に３時間、６μＭのＢＸ７９５を用いて処理し（「前
処理」）、１つの細胞集団は、レンチウイルス導入の前及び同時の両方で６μＭのＢＸ７
９５を用いて合計９時間処理した（「前処理＋同時」）。
【００６７】
Ｔリンパ球を導入後８日間培養し、ＶＥＧＦＲ２発現を導入３日後及び８日後にモニタ
ーした。図２に示すように、Ｔリンパ球培養物へレンチウイルスと同時に添加したＢＸ７
９５は、ＤＤのみの対照培養物と比較して、３日後及び８日後のいずれにおけるＶＥＧＦ
Ｒ２発現における改善も示さなかった。ＢＸ７９５を用いたＴリンパ球の前処理は、ＤＤ
のみの対照培養物と比較して、３日後及び８日後の両方において、ＶＥＧＦＲ２発現の亢
進をもたらした。レンチウイルス導入の前及び間の両方においてＢＸ７９５を用いて処理
したＴリンパ球培養物は、ＤＤのみの培養物のほぼ２倍の高さでかつその他の２つのＢＸ
７９５処理したリンパ球のうちのいずれかよりも高いレベルでＶＥＧＦ２を発現した（細
胞の９．８０％は、３日後の前処理＋同時群における１８．４％のＶＥＧＦＲ２＋細胞と
比較して、３日後にＤＤのみの対照におけるＶＥＧＦＲ２＋であり、細胞の４．９５％は
、前処理＋同時群における１０．６％のＶＥＧＦＲ２＋細胞と比較して、８日後にＤＤの
みの対照におけるＶＥＧＦＲ２＋であった）。
【００６８】
（６．３．実施例３：２−アミノプリンを用いた初代ヒトＴリンパ球の処理）
（６．３．１．２−アミノプリンは細胞生存率を変化させない）
初代ヒトＴリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ
−１６４０培地中で培養し、３：１のＤｙｎａｂｅａｄ：Ｔリンパ球の比において抗ＣＤ
３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて２４時間活性化した。２−アミノ
プリン（２−ＡＰ）を培養物へ添加し、３７Ｃで９０分間培養した。ＤＥＡＥ−デキスト
ラン（ＤＤ）またはプロタミンスルファート（ＰＳ）を、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及びＪ
Ｌ２８．２レンチウイルスベクターの存在下で培養物へ３のＭＯＩで添加した。細胞をＦ
ＡＣＳによって生存率について分析した。
【００６９】
２−ＡＰの非存在下で、ＤＤ及びＰＳのいずれも用いずに処理した細胞の８４％は、レ
ンチウイルス導入後に生存していたのに対し、細胞の７３．６％は、ＤＤの存在下で導入
した場合生存しており、細胞の８４．９％は、ＰＳの存在下で導入した場合、生存してい
た。（図３Ａ）初代Ｔリンパ球を、２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭのいずれかで２−
ＡＰを添加して先のとおり培養した場合、生存率は、２−ＡＰの非存在下で培養した細胞
と比較して低下しておらず（図３Ｂ）、２−ＡＰが、培養物中の活性化した初代ヒトＴリ
ンパ球の生存率を変化させないことを示した。
【００７０】
（６．３．２．２−アミノプリンを用いた処理は、初代ヒトＴリンパ球のレンチウイル
ス導入効率を亢進する）
初代ヒトＴリンパ球を第６．３．１節にあるように培養し、ＶＥＧＦＲ２の発現につい
てＦＡＣＳによって分析した。図４Ａに示すように、ＤＤまたはＰＳのいずれかの非存在
下でレンチウイルスを用いて導入した細胞の４．４９％は、ＶＥＧＦＲ２について陽性で
あるのに対し、ＤＤ単独を用いて処理した細胞の１．２５％は、ＶＥＧＦＲ２＋であり、
ＰＳ単独を用いて処理した細胞の０．５６５％は、ＶＥＧＦＲ２＋であった。
【００７１】
ＤＤまたはＰＳのいずれかの存在下で、レンチウイルス導入は、初代ヒトＴリンパ球を
２−ＡＰを用いて９０分間前処理して、培養物中でレンチウイルス及び種々の濃度の２−
ＡＰとともに５時間維持した場合、亢進した（図４Ｂ）。全濃度の２−ＡＰ（すなわち、
２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭ）は、２−ＡＰへ曝露されていない細胞（対照）と比
較して、導入効率を亢進した。これらの結果は、２−ＡＰを用いた処理が、ＤＥＡＥ−デ
キストランまたはプロタミンスルファートのいずれかの存在下で初代ヒトＴリンパ球の導
入効率を亢進することを示す。
【００７２】
（等価物）
本開示は、本明細書に説明する具体的な実施形態による範囲に制限されることになって
はいない。実際、本明細書に提供する対象の種々の改変は、上述の明細書から当業者に明
らかとなるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に収まるよう企図され
る。
【００７３】
種々の公開物、特許及び特許出願は、本明細書に引用されており、それらの開示は全体として参照により組み込まれる。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
初代Ｔリンパ球をｉ）核酸を含むウイルスベクター及びｉｉ）自然免疫系の阻害薬であ
る化合物と接触させ、それにより前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入されることを含む
、初代Ｔリンパ球の導入方法。
（構成２）
前記初代Ｔリンパ球は、ヒト初代Ｔリンパ球である、構成１に記載の方法。
（構成３）
前記初代Ｔリンパ球を前記化合物と接触させることは、前記ウイルスベクターと前記接
触させることの前に、前記接触させることと同時に及び／または前記接触させることの後
に生じる、構成１または２に記載の方法。
（構成４）
前記核酸は、長さ１０キロベース（ｋｂ）超である、構成１〜３のいずれか一項に記載
の方法。
（構成５）
前記核酸は、長さ約９〜２０ｋｂである、構成１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（構成６）
前記核酸は、キメラ抗原受容体をコードする、構成１〜５のいずれか一項に記載の方法
。
（構成７）
前記化合物は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ
１）の活性を阻害する、構成１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（構成８）
前記化合物は、ＢＸ７９５である、構成７に記載の方法。
（構成９）
ＢＸ７９５は、４〜８μＭのＢＸ７９５である、構成８に記載の方法。
（構成１０）
前記化合物は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する、構成１〜６のいず
れか一項に記載の方法。
（構成１１）
前記化合物は、２−アミノプリンである、構成１０に記載の方法。
（構成１２）
２−アミノプリンは、２．５〜１０μＭの２−アミノプリンである、構成１１に記載の
方法。
（構成１３）
前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクターと接触させる前に、前記初代Ｔリンパ球を
、Ｔ細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と接触させることをさらに含む、
構成１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（構成１４）
前記作用因子は、抗体または抗原結合フラグメントである、構成１３に記載の方法。
（構成１５）
前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８へ特異的に結合
する、構成１４に記載の方法。
（構成１６）
前記作用因子は、前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクターと接触させる前に前記初
代Ｔリンパ球を２４時間接触させる、構成１５に記載の方法。
（構成１７）
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであ
る、構成１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（構成１８）
前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターは、１．５〜２．５の感染
効率（ＭＯＩ）で前記初代Ｔリンパ球と接触する、構成１７に記載の方法。
（構成１９）
前記初代Ｔリンパ球を前記化合物と接触させることは、前記初代Ｔリンパ球を前記ウイ
ルスベクターと接触させる３時間前に生じる、構成１〜１８のいずれか一項に記載の方法
。
（構成２０）
前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクター及び前記化合物と接触させることは、少な
くとも６時間同時に生じる、構成１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（構成２１）
前記初代Ｔリンパ球を形質転換試薬及びサイトカインと接触させることをさらに含む、
構成１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（構成２２）
前記形質転換試薬は、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファ
ートである、構成２１に記載の方法。
（構成２３）
前記サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ−２）である、構成２１または２２に
記載の方法。
（構成２４）
ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２
の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまた
はレトロウイルスベクター、及びｉｉ）ＢＸ７９５と接触させ、それにより前記核酸は前
記Ｔリンパ球中へと導入されることを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法。
（構成２５）
前記ＢＸ７９５は、６μＭのＢＸ７９５である、構成２４に記載の方法。
（構成２６）
前記ヒト初代Ｔリンパ球の前記接触することは、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記リンチ
ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターと前記接触させることの前に３時間生じ
る、構成２４または２５に記載の方法。
（構成２７）
前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター
及び前記化合物と前記接触させることは、少なくとも６時間同時に生じる、構成２４〜２
６のいずれか一項に記載の方法。
（構成２８）
ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２
の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまた
はレトロウイルスベクター、及びｉｉ）６μＭのＢＸ７９５と接触させることを含む、ヒ
ト初代Ｔリンパ球の導入方法であって、ヒト初代Ｔリンパ球を６μＭのＢＸ７９５と前記
接触させることは、３時間生じ、次いで、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルス
ベクターまたはレトロウイルスベクター及び前記６μＭのＢＸ７９５と同時に少なくとも
６時間接触させ、それにより前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入される、前記方法。
（構成２９）
ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２
の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまた
はレトロウイルスベクターと接触させ、それにより前記核酸が前記Ｔリンパ球中へと導入
されることを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法。
（構成３０）
前記２−アミノプリンは、２．５〜１０μＭの２−アミノプリンである、構成２９に記
載の方法。
（構成３１）
前記ヒト初代Ｔリンパ球の前記接触は、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルス
ベクターまたはレトロウイルスベクターと前記接触させることの前に９０分間生じる、構
成２９または３０に記載の方法。
（構成３２）
前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター
及び前記化合物と前記接触させることは、少なくとも５時間同時に生じる、構成２９〜３
１のいずれか一項に記載の方法。
（構成３３）
ヒト初代Ｔリンパ球をジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２の
存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまたは
レトロウイルスベクター及びｉｉ）２．５〜１０μＭの２−アミノプリンと接触させるこ
とを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法であって、前記ヒト初代Ｔリンパ球と前記２．
５〜１０μＭの２−アミノプリンとの接触は、９０分間生じ、それに次いで、前記ヒト初
代Ｔリンパ球を前記前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター及び前記
２．５〜１０μＭの２−アミノプリンとの少なくとも５時間の同時の接触があり、それに
より、前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入される、前記方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
2020191901.tif 000004
【図２Ａ】
2020191901.tif 000005
【図２Ｂ】
2020191901.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020191901.tif 000008
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月18日(2020.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に実質的に記載された、新規な物、方法及び製造方法。