(57)【要約】【課題】生活排水等の汚水を処理した際に産出される汚泥を効果的に可溶化せしめ、以て余剰汚泥の減容化に寄与し得る微生物を提供すること。【解決手段】本発明に係る微生物は、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７５２として寄託されているChromobacterium sp. TK1 菌株である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解酵素を産生し、汚泥の分解能を有する、クロモバクテリウム（Chromobacterium ）属細菌に属するグラム陰性の菌株。
【請求項２】
汚泥の濃度が２５（ｗ／ｖ）％である浮遊性固形分に対して、３７℃、３日間の培養で、１０％以上減量化させる溶解能を有する請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
Chromobacterium sp. TK1 菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７５２）である請求項１又は請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の菌株を用いることを特徴とする汚泥処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物及びそれを用いた汚泥処理方法に関するものであり、特に、活性汚泥法を用いた処理を行っている下水処理場や浄化槽等において、排出される余剰汚泥を効果的に処理することが出来る微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生活排水等の汚水は、そのまま（未処理のまま）排出すると周辺環境に悪影響を与える恐れがあるところから、多くの場合、下水処理場や浄化槽等の各種処理施設において適切な処理が施された後、周辺環境へ排出される。そのような汚水の処理過程において生じる、有機質の最終生成物が凝集してなる汚泥（本明細書においては、適宜「余剰汚泥」ともいう）について、近年、その取扱いが問題となっている。
【０００３】
具体的には、下水処理場において活性汚泥法により産出される下水余剰汚泥の排出量は、下水道の普及に伴い、年々増加し続けており、現在、下水余剰汚泥は、わが国の産業廃棄物において第一位の割合を占めている。日本下水道協会の調査によれば、２００４年度に下水処理場で発生した汚泥の量は４．１億ｍ3 以上に上り、その有効利用率は６７％となっている（非特許文献１参照）。一方、有効利用に供されていない残りの約３３％は焼却して埋め立て処分されているが、埋立処分地の確保が年々困難になっており、その残余年数は全国平均で６年程度とされている。その一方で、余剰汚泥、動物の糞尿や瓦礫類等の廃棄物は、資源循環としてリサイクル枠の拡大を図ることが勿論ではあるものの、汚泥の発生を効果的に抑制し得る手法も、方策として重要であると認識されている。
【０００４】
このような状況の下、従来より、様々な微生物を用いた廃液の処理方法等が提案されている（特許文献１乃至特許文献３参照）。しかしながら、それら特許文献においては、汚泥の発生を効果的に抑制し得る微生物、換言すれば、汚泥の減容化に寄与し得る微生物については、何ら特定されるには至っていないのである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３-２２１８９４号公報
【特許文献２】特許第２９３５６１９号明細書
【特許文献３】特開２００２−１５３８９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】国土交通省  資源のみち委員会、“資源のみちの実現に向けて（報告書案）”、http://www.mlit,go.jp/crd/city/sewerage/gyosei/sigen7th.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ここにおいて、本発明は、かかる事情を背景にして為されたものであって、その解決すべき課題とするところは、生活排水や工場廃液等の汚水を処理した際に産出される汚泥を効果的に可溶化せしめ、以て、余剰汚泥の減容化に寄与し得る微生物を提供することにある。
【０００８】
そして、本発明者等が、無菌豚の糞尿から作製した活性汚泥（活性汚泥Ａ）と、本願出願人の施設内にある浄化槽から採取した余剰汚泥とを混合し、建浴してなる活性汚泥（活性汚泥Ｂ）について検討したところ、かかる活性汚泥Ｂと前述の余剰汚泥とを、１１：１（重量比）の割合にて活性汚泥槽（容量：６２ｍ3 ）に投入すると、一日当たり所定量の余剰汚泥を分解し得ることを見出したのである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、その要旨とするところは、タンパク質分解酵素を産生し、汚泥の分解能を有する、クロモバクテリウム（Chromobacterium ）属細菌に属するグラム陰性の菌株である。
【００１０】
なお、そのような本発明に従う菌株は、有利には、汚泥の濃度が２５（ｗ／ｖ）％である浮遊性固形分に対して、３７℃、３日間の培養で、１０％以上減量化させる溶解能を有するものである。
【００１１】
また、本発明に係る菌株は、更に有利には、Chromobacterium sp. TK1 菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７５２）である。
【００１２】
一方、本発明は、上述の如き菌株を用いることを特徴とする汚泥処理方法をも、その要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
このような本発明に従う菌株にあっては、タンパク質分解酵素を産生し、汚泥の分解能を有するものであるところから、例えば、従来の活性汚泥法を利用した下水処理システムに分解槽を組み込み、かかる分解槽内において、本発明の菌株を用いて余剰汚泥を分解することにより、最終的な余剰汚泥の発生量をほぼゼロにすることが可能ならしめられるのである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る菌株を用いた合併浄化槽の一例を示すフロー図である。
【図２】実施例において、本発明に係る菌株の接種後の経過時間と汚泥溶解率との関係を表すグラフである。
【図３】実施例において、本発明に係る菌株の接種後の経過時間とタンパク質分解酵素活性との関係を表すグラフである。
【図４】実施例において、本発明に係る菌株の接種後の経過時間と脂肪分解酵素活性との関係を表すグラフである。
【図５】実施例において、本発明に係る菌株の上清にプロテアーゼ阻害剤を添加した際のかかる阻害剤の濃度と乾燥汚泥重量比との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ところで、かかる本発明に従う菌株（微生物）は、無菌豚の糞尿から作製した活性汚泥（活性汚泥Ａ）と、本願出願人の施設内にある浄化槽から採取した余剰汚泥とを混合し、建浴してなる活性汚泥（活性汚泥Ｂ）から、余剰汚泥を溶解する微生物をスクリーニングすることにより得られたものである。具体的に、本発明の菌株は、以下のようにして分離され、同定されたものである。
【００１６】
先ず、上述の活性汚泥Ｂ［無菌豚の糞尿から作製した活性汚泥Ａと、本願出願人の施設内にある浄化槽から採取した余剰汚泥（以下、本段落においては単に余剰汚泥という）とを混合し、建浴して作製された活性汚泥］：１２０ｇと、余剰汚泥：１２０ｇとを５００ｍＬ三角フラスコに採り、かかるフラスコを３７℃、６０ｒｐｍで１週間、振とうすることにより、振とう培養を実施した。次いで、三角フラスコ内の培養液に対して１：２（重量比）となるような量的割合の余剰汚泥を更に投入して、連続的に培養した。この操作（フラスコ内への余剰汚泥の追加投入）を１週間に１回、合計３回、繰り返した（３回連続培養）。
【００１７】
そのようにして得られた培養液を希釈した後、かかる希釈した培養液を、滅菌した余剰汚泥を懸濁した平面寒天培地に塗布して、培地上に３７℃で培養し、コロニーの周囲にハローの確認が出来るものを分離した。そのコロニーは紫色をしており、汚泥培地上に約１０％の割合で分離された為、優占菌種と考えられる。また、無菌豚の活性汚泥からは、この紫色コロニーの細菌は分離できなかった。
【００１８】
分離した菌株について、形態学的および生化学的／生理学的性質を調べたところ、この細菌は、２０℃〜４０℃の温度範囲、ｐＨは５．０〜９．０（好ましくは７．０〜８．０）の範囲内において増殖することが出来、グラム染色、ＯＦ試験やＡＰＩ２０ＮＥ試験（Biomerieux, France ）等を行った結果、通性好気性で、グラム陰性桿菌：Chromobacterium violaceum との相同性が高い菌であることが判明した。分離した菌株の生化学的／生理学的性質を、下記表１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
次いで、分離した菌株について、微生物の進化系統の研究に最も有効な分子マーカーとして利用されている、16S リボソームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ相同性解析を行った。先ず、本菌株の16S リボソームＲＮＡ遺伝子を、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction ）によって増幅させた。なお、かかるＰＣＲはforward primerとして63f primer（5'-caggcctaacacatgcaagtc-3' ）、reverse primerとして1387r reverse primer（5'-gggcggtgtgtacaaggc-3'）、r2L primer（5'-catcgtttacggcgtggac-3' ）、及びr3L primer （5'-ttgcgctcgttgcgggact-3'）を用い、更に反応条件（ＰＣＲサイクル）としては、（１）９６℃まで加熱し、５分間、９６℃を保った後、（２）［９６℃を３０秒間］→［５２℃を３０秒間］→［６８℃を１分３０秒間］の加熱・冷却サイクルを３０回繰り返し、更に（３）６８℃を５分間という条件を採用した。このようにして得られたＰＣＲ産物を、TOPO XL PCR Cloning Kit （商品名、米国Invitrogen社製）を用いて、プラスミドベクターに連結させた。この16S リボソームＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドを、大腸菌へ挿入し、培養したその大腸菌からプラスミドを回収した。その後、M13 forward primer、M13 reverse primerによってシーケンス反応させ、ＤＮＡシーケンサーCEQ8000 （商品名、米国Beckman Coulter 社製）にて塩基配列決定し、汚泥可溶化菌の16S リボソームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を得た。得られた塩基配列を、下記配列表において配列番号１として示す。得られた1350塩基の塩基配列をもとに、代表的なＤＮＡ相同性検索エンジンであるＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）にてシーケンスマッチを行ったところ、下記表２に示すように、Chromobacterium violaceum strain 52 及びATCC12472 との相同性が最も高かった。更に、本菌株のＤＮＡ塩基組成を、YMC pack AQ-312 カラム（商品名、株式会社ワイエムシィ製）を用いて、ＨＰＬＣ法（Mesbah M., Premachandran U. and Whitman W. B.,“ Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography.”,Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 159-167(1989) 参照）で定量したところ、G＋C含量は５５．９％であった。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
上述した生化学的／生理学的試験による同定、及び16S リボソームＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ相同性が９７％以下であること、更には、実施例において後述するように下水汚泥の分解能（溶解能）を有することから、分離された菌株は、Chromobacterium 属細菌（Chromobacterium violaceum 近縁）の新菌種と判断される（Brazilian National Genome Project Consortium,“The complete genome sequence of Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial adaptability”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,100, 11660-11665 (2003)参照）。そこで、本願出願人は、この菌株をChromobacterium sp. TK1 菌株と名付けたのである。かかるChromobacterium sp. TK1 菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７５２として寄託されている。なお、Chromobacterium violaceum は、培養液中に紫色の色素を放出し、その色素が顔料（染料）として用いられていることが知られているが（Strong F. M.“Isolation of violacein ”Science 100, 287 (1944)）(3)参照）、Chromobacterium属細菌が下水汚泥を可溶化するという報告はない。
【００２３】
ところで、本発明に係る菌株（Chromobacterium sp. TK1 菌株）は、優れた汚泥分解能を有するところから、汚泥処理において有利に用いられ得るものである。本発明の菌株を用いた汚泥処理方法としては、例えば図１に示すものを挙げることが出来る。
【００２４】
すなわち、図１は、本発明に係る菌株を用いた合併浄化槽の一例を示すフロー図であって、そこにおいて、先ず、生活排水や工場廃液等の原水（被処理水）は、調整槽に流入せしめられる。次いで、この調整槽内で平準化された原水は、曝気槽に移され、原水に含まれる有機物等は、好気性の微生物によって分解され、微生物は増殖する。次に、その微生物や未分解有機物等を含む原水は沈殿槽へと移され、底に堆積する。これを汚泥と称す。かかる堆積した汚泥は、貯留槽に移される。尚、沈殿槽に堆積した汚泥の一部は、活性汚泥として曝気槽に戻される。
【００２５】
そして、貯留槽に貯えられた汚泥（余剰汚泥）は、本発明に係る菌株が生存する分解槽に移され、そこにおいて、本発明の菌株の作用によって、汚泥（余剰汚泥）が効果的に分解（可溶化）せしめられるのである。本発明者等が知得したところによれば、分解槽への汚泥の搬入量を調整することによって、分解槽に搬入された全ての汚泥が分解（可溶化）された。また、本発明の菌株（Chromobacterium sp. TK1 菌株）は、２０〜４０℃の温度領域で効果的に増殖するものであり、上述の如き分解槽の維持は安価に、且つ容易に実践することが出来るところから、余剰汚泥の減容化や標準活性汚泥法の改良等の点において、本発明の菌株及びそれを用いた汚泥処理方法は産業上の利用が期待できるものである。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明の実施例を幾つか示し、本発明を更に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるものでないことは、言うまでもないところである。
【００２７】
−汚泥溶解率の測定−
本発明に係る菌株（Chromobacterium sp. TK1 菌株）の汚泥溶解性を評価すべく、以下の実験を行った。
【００２８】
先ず、滅菌汚泥を準備した。具体的には、下水処理場より採取した余剰汚泥：２００ｇを、５００ｍＬ三角フラスコに採り、１２１℃で２０分間、蒸気滅菌し、かかる滅菌後の汚泥を滅菌済みの遠沈管に移して、４℃、８０００×ｇで遠心した。その後、上清を捨て、残った沈殿を滅菌精製水で３回洗浄した後、その重量濃度が２５（ｗ／ｖ）％となるように調整することにより、滅菌汚泥を得た。なお、通常の下水汚泥の重量濃度は、２０〜３０（ｗ／ｖ）％である。
【００２９】
上述の如くして得られた滅菌汚泥に対して、ＬＢ液体培地（Tryptone：１０ｇ／Ｌ、Yeast extract ：５ｇ／Ｌ、NaCl：５ｇ／Ｌ、ｐＨ：７．０）を用いて３７℃、１２０ｒｐｍで１６時間前培養したChromobacterium sp. TK1 菌株を接種し（最終菌量：約１０6 ｃｆｕ／ｍＬ）、恒温振とう培養機にて３７℃、６０ｒｐｍで培養した。Chromobacterium sp. TK1 菌株が接種された滅菌汚泥の一部を、接種直後及び経時的に採取し、採取した滅菌汚泥中の浮遊性固形分（suspended solid ：ＳＳ）の乾燥重量（以下、ＳＳ乾燥重量という）を測定した。具体的には、採取した滅菌汚泥を１８０００×ｇで１０分間、遠心した後、上清を取り除いて得られた沈殿を、１０５℃で２日間、乾燥させ、得られた乾燥物の質量を測定して、ＳＳ乾燥重量とした。
【００３０】
そして、Chromobacterium sp. TK1 菌株を接種した直後の滅菌汚泥におけるＳＳ乾燥重量［ＳＳ（０）］を基準として、下記式より汚泥溶解率（％）を算出した。汚泥溶解率と接種後の経過時間（日）との関係を示すグラフを図２として示す。
［汚泥溶解率］＝｛［ＳＳ（０）−ＳＳ（ｘ）］／ＳＳ（０）｝×１００（％）
但し、ＳＳ（ｘ）：接種からｘ日経過後の滅菌汚泥のＳＳ乾燥重量である。
【００３１】
図２からも明らかなように、本発明に係るChromobacterium sp. TK1 菌株は、３７℃での培養５日間目で約２５％の汚泥溶解率を示した。また、同時に本菌株の増殖も認められたところから、Chromobacterium sp. TK1 菌株は、汚泥を溶解して、その溶解産物を炭素源及び窒素源として増殖するものと考えられる。
【００３２】
−Chromobacterium sp. TK1 菌株が産生する汚泥可溶化因子の検討−
Chromobacterium sp. TK1 菌株を、汚泥を懸濁した平面寒天培地に塗布して培養すると、形成したコロニーの周囲に汚泥を溶解したハローが形成される。即ち、本菌株は、菌体外に汚泥に対する可溶化因子を放出することで汚泥を溶解していると考えられる。また、本菌株をカゼイン又はスキムミルク寒天培地に塗布した場合、コロニーの周辺にハローが形成されることから、この可溶化因子はタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）であることが示唆される。
【００３３】
そこで、Chromobacterium sp. TK1 菌株が産生するタンパク質分解酵素の活性を、カゼインを基質とした酵素反応で生成するアミノ酸を定量する方法（Okamura Y., Inoue N. and Nikai T.,“Isolation and characterization of a novel acid proteinase, tropiase from Candida tropicalis IFO 0589”J.Med.Mycol., 48, 19-25(2007)参照）で検討したところ、図３に示すように、３７℃で４日間培養した時に、最も高いタンパク質分解酵素活性を示すことが判明した。なお、図３において、酵素活性の単位（unit）は、酵素反応時間（１５分）において、６６０ｎｍでの吸光度を１分当たりに０．００１上昇させる時の酵素活性を１unitと定義したものである。この４日間培養した上清をポリアクリルアミド電気泳動で調べた結果、明瞭なバンドが確認された。
【００３４】
また、Chromobacterium sp. TK1 菌株は、図４に示すように、脂肪分解酵素（リバーゼ）も産生しており、その活性は３７℃で３日間培養した時に、最も高い酵素活性を示すことが判明した。なお、脂肪分解酵素活性は、リパーゼキットＳ（商品名、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）によって測定されたものであり、また、図４において、酵素活性の単位（unit）は、酵素反応時間（３０分）において、４１２ｎｍでの吸光度を１分当たりに０．００１上昇させる時の酵素活性を１unitと定義したものである。
【００３５】
さらに、余剰汚泥を溶解する可溶化因子を調べるため、タンパク質分解酵素又は脂肪分解酵素の阻害剤を、酵素活性が最も高いChromobacterium sp. TK1 菌株の培養液上清（粗酵素液）に添加して、上述した「ＳＳ乾燥重量の測定」に従って乾燥汚泥重量比を測定した。その結果を、図５にグラフとして示す。かかる図５のグラフからも明らかなように、タンパク質分解酵素の阻害剤であるプロテアーゼインヒビターカクテル（品番：P2714 、米国Sigma 社製）（原液１ｍＭ×６種類）を０．６ｍＭから１．２ｍＭまで加えた汚泥のみが、段階的に汚泥重量が回復している。即ち、タンパク質分解酵素がプロテアーゼインヒビターによって阻害を受け、余剰汚泥を溶解できなかったことを示しているのである。その一方、脂肪分解酵素の阻害剤ではその現象が認められなかった。これらの結果から、汚泥可溶化因子はタンパク質分解酵素であることが判明したのである。
【受託番号】
【００３６】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７５２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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