(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、ＣＬＳＴＮ−１を、高感度でかつ高特異性のバイオマーカーとして、ガンの検出に使用する方法、更に、当該方法において使用されるキットを提供することに関する。【解決手段】本発明は、下記工程を含むガンの検出方法を提供する：（１）被検対象より体液試料を取得する；（２）体外において、前記試料中のＣＬＳＴＮ−１（カルシンテニン−１）濃度を測定する；（３）前記試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度と、被検対象と同種の健康群の対応する試料中の正常なＣＬＳＴＮ−１濃度とを比較する；（４）前記被検試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度が、前記正常なＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて有意に高い値を示す場合、前記被検対象はガン患者であることを示す。更に、本発明は、ガン患者の治療方法又は薬剤の有効性をモニタリングする方法、ガン治療に有効な薬剤を選別する方法と、これらの方法に使用されるキットをも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンの検出方法であって
（１）被検対象より体液試料を取得する工程と、
（２）体外において、前記試料中のＣＬＳＴＮ−１（カルシンテニン−１）濃度を測定する工程と、
（３）前記試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度と、前記被検対象と同種の健康群の対応する試料中の正常なＣＬＳＴＮ−１濃度とを比較する工程と、
（４）前記被検対象の試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度が、前記正常なＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて有意に高い値を示す場合、前記被検対象はガン患者であることを示す工程と
を含むことを特徴とするガンの検出方法。
【請求項２】
前記ガンが、肺ガンであることを特徴とする請求項１に記載のガンの検出方法。
【請求項３】
前記ガンが、皮膚ガンであることを特徴とする請求項１に記載のガンの検出方法。
【請求項４】
前記体液試料が、血清試料であることを特徴とする請求項１に記載のガンの検出方法。
【請求項５】
前記工程（２）において、前記体液試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度がウェスタンブロッティング法又は酵素免疫測定法により測定されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のガンの検出方法。
【請求項６】
ガン患者の治療方法又は薬剤の有効性をモニタリングする方法であって、
（１）前記治療方法を実施する前、又は前記薬剤を投与する前及びその後の一つ又は複数の時点において、前記ガン患者より体液試料を取得する工程と、
（２）体外において、前記それぞれの試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度を測定する工程と、
（３）前記治療方法を実施する前後、又は前記薬剤の投与前後における前記試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度をそれぞれ比較する工程と、
（４）前記治療方法の実施後又は前記薬剤の投与後に取得した試料中におけるＣＬＳＴＮ−１濃度が、前記治療方法の実施前又は前記薬剤の投与前に取得した試料中におけるＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて、有意に低い値を示す場合、前記治療方法又は前記薬剤は前記ガン患者の治療に対して有効であることを示す工程と
を含むことを特徴とする、ガン患者の治療方法又は薬剤の有効性をモニタリングする方法。
【請求項７】
ガン治療に有用な薬剤を選別する方法であって、
(１)ガンに罹病した１群の哺乳動物を選出する工程と、
(２)被検薬剤を前記哺乳動物に投与する前と、投与した後の一つ又は複数の時点において、前記哺乳動物より体液試料を取得する工程と、
(３)体外で前記それぞれの試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度を測定する工程と、
(４)前記薬剤を投与した後に取得した試料中におけるＣＬＳＴＮ−１濃度が、前記薬剤を投与する前に取得した試料中におけるＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて、有意に低い値を示す場合、前記薬剤は前記ガンを治療する薬剤として有用であることを示す工程と
を含むことを特徴とするガン治療に有用な薬剤を選別する方法。
【請求項８】
ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子と、前記分子を担持する容器又は固体担体とを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法に使用されるキット。
【請求項９】
ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子を検出する試薬を更に含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子が、ＣＬＳＴＮ−１モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
ＣＬＳＴＮ−１が、ガンの検出方法において、バイオマーカーとして用いられることを特徴とする、ＣＬＳＴＮ−１の使用。
【請求項１２】
ＣＬＳＴＮ−１が、ガン患者の治療方法又は薬剤の有効性をモニタリングする方法において、バイオマーカーとして用いられることを特徴とする、ＣＬＳＴＮ−１の使用。
【請求項１３】
ＣＬＳＴＮ−１が、ガン治療に有用な薬剤を選別する方法において、バイオマーカーとして用いられることを特徴とする、ＣＬＳＴＮ−１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンの検出方法に関する。更に詳しくは、本発明は、ガン患者の治療方法又は薬剤の有効性をモニタリングする方法、ガン治療に有効な薬剤を選別する方法と、上記方法において使用されるキットを提供するものであって、とりわけ、バイオマーカーとしてＣＬＳＴＮ−１を検出に使用するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、台湾においてガンは十大死因の筆頭に挙げられ、世界でも注目の的となっている医療問題である。２００７年の統計によると、世界におけるガン患者数は、既に１２００万人以上になるといわれ、かつ、７６０万人がガンで死亡しているという。その中で、肺ガンは、世界又は台湾でもガンによる死因の筆頭に数えられ、更に、台湾において、肺ガンの発症率と致死率は、急速に上昇しつつある。肺ガンは、組織細胞の形態により小細胞ガンと非小細胞ガンに分けられる。その内、もっとも多く見られる肺ガンのタイプとしては、非小細胞ガンが挙げられ、肺ガンの約８５％以上を占める。そこで、肺ガンの重要な研究課題としては、如何にガンを早期に診断、検出し、有効な治療を施すかが挙げられている。
【０００３】
ガンの早期検出は、ガン治療の成功とガン患者の生存率の向上に関わる重大な要因である。今日、ガンの検出方法としては多くの方法が存在し、その一例としては、バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）検出方法が挙げられる。その方法としては、被検者の体液（例えば、血清）試料中に特定のタンパク質（即ち、バイオマーカー）が存在するか否か、及び／又は当該バイオマーカーの濃度を検査することにより、ガンのスクリーニングを行い、或いは、ガンの進行度、治療に対する反応及びガンの再発などをモニタリングする。バイオマーカー検出方法は、感度が高く、かつ、試料の必要量が少なくてすむので、ガンのスクリーニングとモニタリングにおいて非常に重要な位置を占めている。
【０００４】
現在、ガンの検出に常用されているバイオマーカーとしては、例えば、臨床検査において乳ガン、大腸ガン、胃ガン、前立腺ガン、卵巣ガン及び肺ガンなどの検出に常用されているガン胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ，以下ＣＥＡと略称する）と、ニューロン特異性エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ）、炭水化物抗原１２５（ＣＡ−１２５）、サイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）といった、ガンのスクリーニングと病状の進行度などのモニタリングに使用されている腫瘍細胞タンパク質が挙げられる。
【０００５】
しかし、バイオマーカーの問題としては、バイオマーカーは特異性を有する必要があり、特に、ガン細胞中における発現量と正常な細胞中における発現量との間に顕着な差異がなければならず、又、バイオマーカーは、健康な人体中においては発現が非常に低いか又は発現せず、かつ、ガン患者においては高い発現を示すことが特に好ましい。現在、例えば、ＣＥＡなどガンのスクリーニングに常用されているバイオマーカーは、感度と特異性が不充分であり、従って、高感度で高特異性のガン検出用のバイオマーカーの開発が望まれている。
【０００６】
一方で、神経系においてシナプス後膜（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に位置するタイプ１膜貫通型タンパク質（ｔｙｐｅ  １  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として、カルシウムと結合するカルシンテニン−１、以下ＣＬＳＴＮ−１と略称する）が知られている（Ｖｏｇｔら，２００１を参照）。また、米国特許第２００４００１９９１９号において、ＣＬＳＴＮ−１，２，３が神経系の疾病、特に、中枢神経系の疾病の治療に使用されることが開示されており、又、ＣＬＳＴＮが腫瘍細胞中で発現することも大雑把に提起されているが、それ以上の検討を加えてはおらず、更に、ＣＬＳＴＮ−１がガンのスクリーニング用のバイオマーカーとして用いられ得ることの示唆さえない。また、今日まで、ＣＬＳＴＮ−１分子と肺ガンに相関性があることは、如何なる文献や特許にも報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第２００４００１９９１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、ＣＬＳＴＮ−１を、高感度でかつ高特異性のバイオマーカーとして、ガンの検出に使用する方法、更に、当該方法において使用されるキットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために、肺腺ガンなどのガン患者のガン組織中における分泌性タンパク質の発現量について、組織免疫染色法とウェスタンブロッティング法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により分析したところ、多くの分泌性タンパク質中、特に、ＣＬＳＴＮ−１の発現量が、ガン組織中と非ガン患者群の対応する組織において、非常に顕着な差異があることを発見し、更に、これらの知見を基に、ＣＬＳＴＮ−１が肺ガンなどガンのスクリーニング用バイオマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の一つの目的は、ガンの検出方法を提供することにある。その方法としては、下記の工程を含む：
（１）被検対象より体液試料を取得する；
（２）体外において前記試料中のＣＬＳＴＮ−１（カルシンテニン−１）の濃度を測定する；
（３）前記試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度と、被検対象と同種の健康群の対応する試料中の正常なＣＬＳＴＮ−１の濃度とを比較する；
（４）前記被検対象の試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度が、前記正常なＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて有意に高い値を示す場合、前記被検対象はガン患者であることを示す。
【００１１】
本発明の他の目的は、ガン患者の治療の際の、その治療方法又は薬剤の有効性をモニタリングする方法を提供することにある。その方法としては、下記の工程を含む：
（１）該当する治療方法を行う前、又は該当する薬剤を投与する前と、その後の一つ又は複数の時点において、当該ガン患者より体液試料を取得する；
（２）体外において、それぞれの試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度を測定する；
（３）該当する治療方法を実施する前後、又は該当する薬剤を投与する前後におけるこれらの試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度を比較する；
（４）該当する治療方法の実施後、又は該当する薬剤の投与後に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度が、該当する治療方法の実施前、又は該当する薬剤の投与前に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度に比べて、有意に低い場合、該当する治療方法又は該当する薬剤は当該ガン患者に有効であることを示す。
【００１２】
本発明の他の目的は、ガン治療に有用な薬剤の選別方法を提供することにある。その方法は、下記工程を含む：
（１）ガンに罹病した１群の哺乳動物を試験動物として選出する；
（２）前記試験動物に被検薬剤を投与する前と、投与した後の一つ又は複数の時点において、前記哺乳動物より体液試料を取得する；
（３）体外で前記試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度をそれぞれ測定する；
（４）前記薬剤を投与した後に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度が、前記薬剤を投与する前に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１の濃度に比べて、有意に低い場合、前記薬剤はそのガンを治療できる薬剤であることを示す。
【００１３】
本発明の他の目的は、上記のいずれの方法にも使用されるキットを提供することにある。その特徴としては、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子と、当該分子を担持する容器又は固体担体を含有する。より好ましい本発明の具体例としては、当該キットは、必要に応じて、更に、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子の検出用試薬及び／又は当該キットの使用説明書を含むものである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ガンの検出方法、ガン患者の治療方法又は薬剤の効果をモニタリングする方法、及び、ガン治療に有用な薬剤を選別する方法における、バイオマーカーとしてのＣＬＳＴＮ−１の用途を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】組織免疫染色法により検出され、非小細胞肺ガンの肺組織切片中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量を示す写真であり、その内、（Ａ）は正常な肺組織の試料を示し、（Ｂ）はI期肺ガンの組織の試料を示し、（Ｃ）はII期肺ガンの組織の試料を示し、（Ｄ）はIII期肺ガンの組織の試料を示すものである。
【図２Ａ】ウェスタンブロッティング法により検出された、非小細胞肺ガン患者より採血した血清試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量を示すグラフである。
【図２Ｂ】ウェスタンブロッティング法により検出された、非小細胞肺ガン患者より採血した血清試料中におけるＥＣＡの発現量を示すグラフである。その内、１は肺ガン患者の試料であり、２は健康な志願者の試料である。
【図３】ウェスタンブロッティング法により検出された、異なる時期に採血した非小細胞肺ガン患者の血清試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量を示す。
【図４】は、組織免疫染色法により検出された、黒色素細胞腫の組織切片中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量を示す写真であり、その内、（Ａ）は正常な皮膚組織の試料を示し、（Ｂ）は悪性度がII期である黒色素細胞腫の試料を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明を更に具体的に説明する。
【００１７】
本発明の一つの目的は、下記工程を含むガンの検出方法を提供するものである。
（１）被検対象より体液試料を取得する；
（２）体外において前記試料中のＣＬＳＴＮ−１（カルシンテニン−１）濃度を測定する；
（３）前記試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度と、前記被検対象と同種の健康群の対応する試料中の正常なＣＬＳＴＮ−１濃度とを比較する；
（４）前記被検対象の試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度が、前記正常なＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて有意に高い値を示す場合、前記被検対象はガン患者であることを示す。
【００１８】
本発明に係るガンの検出方法に適用されるガンは、ガン組織中のＣＬＳＴＮ−１の発現量が異常に高いものが好ましく、例えば、肺ガン、皮膚ガンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
上記本発明に係るガンの検出方法において、通常、被検対象としては、例えば、ヒト、モルモット、マウス、ウサギ、サル、牛、ブタ、ネコ、犬などの哺乳動物が挙げられ、その内、特にヒトが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
上記本発明に係るガンの検出方法において、体液試料としては血液が好ましく、更に、血清試料がより好ましい。
【００２１】
また、上記本発明に係るガンの検出方法において、体液試料の検出は、本分野における従来のタンパク質検出方法により行うことができるが、通常、酵素免疫検出方法又はウェスタンブロッティング法により実施される。これらの検出方法において、ＣＬＳＴＮ−１又はそのフラグメントを識別するために用いられる分子は、ＣＬＳＴＮ−１又はそのフラグメントと特異的に結合する能力を必ず有するものであり、通常、ＣＬＳＴＮ−１抗体が用いられ、特にモノクローナル抗体がより好ましい。
【００２２】
上記本発明に係るガンの検出方法において、「健康群」とは、被検対象と同種の動物であって、かつ、ガンに罹患していないことが判明している群体を指す。又、「正常なＣＬＳＴＮ−１濃度」とは、健康群より取得したそれぞれの試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度の平均値を指す。通常、非ガン性細胞中におけるＣＬＳＴＮ−１は、殆んど発現せず、又は発現の程度が極めて低い。
【００２３】
上記本発明のガンの検出方法において、「有意に高い値」とは、被検対象の試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度が、正常なＣＬＳＴＮ−１の濃度に比べて５倍又はそれ以上に高いことを指す。被検試料のＣＬＳＴＮ−１濃度が正常なＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて有意に高い場合、検出した対象はガン患者と判断される。
【００２４】
上記本発明に係るガンの検出方法において、ＣＬＳＴＮ−１は、その検出の正確性を高めるため、その他のバイオマーカーと組み合わせて使用しても良い。更に、本発明に係るガンの検出方法は、その他のガンの検出方法と組み合わせて用いることができる。
【００２５】
下記の実験例の結果より、ガンの症状の進行度とＣＬＳＴＮ−１濃度との間に高い相関性が存在することが判明した。従って、本発明は、下記工程を含むガン患者の治療方法又は薬剤の効果をモニタリングする方法をも提供することができる。
（１）該当する治療方法を実施する前、又は該当する薬剤を投与する前と、その後の一つ又は複数の時点で、ガン患者より体液試料を取得する；
（２）体外において、それぞれこれらの試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度を測定する；
（３）該当する治療方法を実施する前後、又は該当する薬剤を投与する前後におけるこれら試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度を比較する；
（４）該当する治療方法の実施後、又は該当する薬剤の投与後に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度が、該当する治療方法の実施前又は該当する薬剤の投与前に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて、有意に低い値を示す場合、その治療方法又は薬剤はそのガン患者に対して有効であることを示す。
【００２６】
本発明は、また、ガン治療に有用な薬剤を選別する下記工程を含む方法をも提供する。
（１）ガンに罹病した１群の哺乳動物を試験動物として選出する；
（２）前記試験動物に被検薬剤を投与する前と、投与した後の一つ又は複数の時点において、前記哺乳動物より体液試料を取得する；
（３）体外で前記試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度をそれぞれ測定する；
（４）前記薬剤を投与した後に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度が、前記薬剤を投与する前に取得した試料中のＣＬＳＴＮ−１濃度に比べて、有意に低い値を示した場合、前記薬剤はそのガンを治療する薬剤として有用であることを示す。
【００２７】
本発明の他の目的は、上記のいずれの方法にも使用されるキットを提供することにある。その特徴としては、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子と、その分子を担持する容器又は固体担体を含む点にある。本発明のより好ましい具体例としては、当該キットは、必要に応じて、更に、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別できる分子の検出用試薬及び／又は当該キットの使用説明書をも含む。
【００２８】
本発明のキットにおいて、「ＣＬＳＴＮ−１の特異的フラグメント」とは、ＣＬＳＴＮ−１だけが有するフラグメントであり、ＣＬＳＴＮ−１中にのみ存在し、その他のタンパク質やペプチド中に存在しないフラグメントを指す。
【００２９】
本発明のキットにおいて、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別するために用いられる分子は、必ずＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントと特異的に結合する能力を有するものであり、通常、ＣＬＳＴＮ−１抗体が用いられ、より好ましくはＣＬＳＴＮ−１モノクローナル抗体が使用される。ＣＬＳＴＮ−１抗体は、周知の抗体の製造方法により製造され得る。
【００３０】
ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別するために用いられる分子は、固体或いは溶液に溶解又は懸濁させた液体の形態であっても良い。例えば、バイアル（ｖｉａｌ）など適当な容器を用いて、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別するための分子を収容するか、又は、例えば、当該分子をシャーレなどに塗布するなど固体担体で当該分子を担持しても良い。
【００３１】
本発明のキットにおいて、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別する分子（例えば、ＣＬＳＴＮ−１抗体）を検出するために用いられる試薬としては、組織免疫染色法、酵素免疫測定法又はウェスタンブロッティング法などのタンパク質検出方法において常用される周知の任意の適当な試薬、例えば、蛍光物質、酵素、酵素基質などが挙げられる。本発明のより好ましい具体例においては、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別するために用いられる分子は、ＣＬＳＴＮ−１モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり、かつ、ＣＬＳＴＮ−１又はその特異的フラグメントを識別する分子を検出するために用いられる試薬は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）又はその他の標識物を結合したＣＬＳＴＮ−１一次抗体である。
【００３２】
本発明のキットは、更にその使用説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）をも含むことができる。当該説明書には、当該キットの測定条件、操作方法及び注意事項などが記載されており、本分野の技術を熟知する者は、この説明書に記載の事項を理解することができ、その内容に基づいて検出を行うことができる。
【００３３】
また、本発明は、ＣＬＳＴＮ−１を用いたガンの検出方法、ＣＬＳＴＮ−１を用いたガン患者の治療方法又は薬剤の効果のモニタリング方法と、上記方法においてバイオマーカーとして使用されるＣＬＳＴＮ−１の用途と、上記方法で用いられるバイオマーカー又は組成物を製造する際に使用されるＣＬＳＴＮ−１の用途などを提供する。
【実施例】
【００３４】
［参考例１］
ＣＬＳＴＮ−１抗体の調製
免疫原として、ヒトＣＬＳＴＮ−１のアミノ酸配列中第５６１〜５７９番目の１９個のアミノ酸を含有するペプチドを用い、ウサギを免疫化して、ＣＬＳＴＮ−１抗体を得る。
【００３５】
免疫化する前に、ウサギの血を採取して対照群とし、次に、２５０ｍｇの抗原と完全アジュバントとを皮下注射し、その日を第０日とする。その後、第２、４、６、８、１０週目に抗原の追加免疫（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｏｏｓｔ）を行い、一回の追加免疫につき、１５０ｍｇの抗原と不完全アジュバントを注射する。その間、第７、９、１１週目に採血し、血清を分離して抗体力価を測定する。抗体が一定の力価に到達した後、ウサギの血を採取し、血清を分離することによりＣＬＳＴＮ−１抗体を得る。
【００３６】
［実験例］
本発明の実験例は、台湾慈済医院人体試験委員会の同意の下で行ったものである。
【００３７】
［実験例１］
非小細胞肺ガンの肺組織切片中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量を組織免疫染色法によって検出する。
先ず、市販の肺ガン組織アレイの切片（Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｒａｙ，  ＬＵＣ９６１０１；米国、Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ社）を購入する。当該切片には、I期非小細胞肺ガンの試料が４点、II期非小細胞肺ガンの試料が５点、およびIII期又はそれ以降の病期の非小細胞肺ガンの試料１０点が含まれる。更に対照群として、正常な（ガンに罹患していない）肺組織切片の試料４点を準備する。
【００３８】
これら肺組織の切片をマイクロウェーブにより加熱し、２％の過酸化水素を含むエタノール溶液中に放置し、更に、２％ＢＳＡ、０．１％トリトンX−１００及び１％羊血清を用いて固定する。当該組織切片とＣＬＳＴＮ−１モノクローナル抗体とを３７℃下で２時間培養した後、更に西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ドイツ、Ｂｉｏｇｅｎｅｓ社）を加え、室温下において３０分間作用させ、続いて、３，３’−ジアミノジフェニルアミンを用いて現像する。その結果を図１に示す。
【００３９】
図１より、ＣＬＳＴＮ−１は、肺ガン組織中においては、肺ガン細胞の細胞質中で大量かつ強烈に発現し、それとは反対に、正常な肺組織においては、正常肺胞細胞の細胞質中で殆んどその発現がみられない。かつ、I期、II期、III期肺ガンの組織免疫染色の結果より、肺ガンの病状の程度とＣＬＳＴＮ−１の発現量との間には、高い相関性があることが判明した。
【００４０】
［実験例２］
非小細胞肺ガン患者から採取した血清試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量をウェスタンブロッティング法によって検出する。
実験対象として、通常の健康検査より２０名の非小細胞肺ガン患者（III期肺ガンとIV期肺ガン患者をそれぞれ１０名）をスクリーニングし、更に、上記のガン患者と年齢／性別が対応する１０名の健康な志願者を募り、健康群（対照群）とする。上記の実験対象と正常群より血液試料を採取し、それぞれの血液試料を遠心分離して血清試料を得る。
【００４１】
上記で得た血清試料に対しウェスタンブロッティング法により検出作業を行う。血清に対して１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動を行い、血清中に含まれたタンパク質を分離させる。電気泳動後のゲルをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写する。次に、その膜を、上記参考例１において調製されたＣＬＳＴＮ−１抗体と、西洋わさびペルオキシダーゼを結合した二次抗体（抗ウサギＩｇＭ抗体）とを用いて順次１時間処理する。続いて、ＥＣＬ化学発光免疫分析器（ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に露光させ、その検出結果を数量化した。その結果を図２Ａに示す。
【００４２】
また、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（米国、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、上記の如くウェスタンブロッティング法により血清試料のＣＥＡを検出し数量化した。その結果を図２Ｂに示す。
【００４３】
図２Ａより、肺ガン患者の血清試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量が高いことが判明した。これに反して、健康な志願者の血清試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量は殆んど見られないか、又は非常に低く、かつ、肺ガン患者における血清試料中のＣＬＳＴＮ−１の発現量は、健康な志願者のそれと比較して、５倍以上と高く、その差異は統計学上顕着であること（ｐ＝０．００２）が判明した。
【００４４】
図２Ｂより、従来のＣＥＡバイオマーカーでは、肺ガン患者の血液試料中におけるその発現量は、健康な志願者のそれと比較して、統計学的に顕着な差異（ｐ＝０．０７）が見られるものの、ＣＬＳＴＮ−１において見られる差異には及ばないことが判明した。言い替えると、検出の感度については、従来のＣＥＡに比べてＣＬＳＴＮ−１の方が優れていることが明らかである。
【００４５】
［実験例３］
ガンの程度が異なるステージに採取した非小細胞肺ガン患者の血清試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量をウェスタンブロッティング法により検出する。
実験対象として、検診患者より非小細胞肺ガン患者を１５名スクリーニングする。その内訳は、肺ガンI期、II期及びIII期以降の患者、それぞれ５名ずつである。これらの実験対象より血液試料を採取し、遠心分離によりそれぞれの血清試料を得る。
【００４６】
上記により得た血清試料に対しウェスタンブロッティング法により検出作業を行う。これらの血清試料に対し、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動を行い、血清中に含まれたタンパク質を分離させる。電気泳動後のゲルをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写する。次に、その膜を、上記参考例１において調製されたＣＬＳＴＮ−１抗体と、西洋わさびペルオキシダーゼを結合した二次抗体（抗ウサギＩｇＭの抗体）とを用いて順次１時間処理する。続いて、ＥＣＬ化学発光免疫分析器を用いて露光した。その結果を図３に示す。
【００４７】
図３に示すように、I期からIII期以降のすべての非小細胞肺ガン患者においてＣＬＳＴＮ−１が検出される。血液中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量と、肺ガンの程度との間には、高い相関性は見られない。しかし、初期の非小細胞肺ガンの患者の血液中において、ＣＬＳＴＮ−１の発現を容易に検出することができ、かつ、その感度は従来の血清マーカーＣＥＡに比べて非常に高いことが明らかとなり、ＣＬＳＴＮ−１が肺ガンをスクリーニングする血清バイオマーカーとして有用であることが証明された。
【００４８】
［実験例４］
その他のガン疾病において、組織免疫染色法によるＣＬＳＴＮ−１検出を応用する。
市販の黒色素細胞腫を含むII期メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ、ｇｒａｄｅII）程度のガン組織アレイの切片（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｒａｙ，  ＭＴＵ３９１０１；米国、Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ社）を購入し、ＣＬＳＴＮ−１の検出を行った。また、別に正常な（ガンに罹患していない）皮膚組織の切片試料を用いて対照群とした。
【００４９】
これら皮膚組織の切片をマイクロウェーブで加熱し、２％の過酸化水素を含むエタノール溶液中に放置し、更に、２％ＢＳＡ、０．１％トリトンＸ−１００及び１％羊血清を用いて固定した。当該組織切片とＣＬＳＴＮ−１モノクローナル抗体とを３７℃下で２時間培養した後、更に西洋わさびペルオキシダーゼを加え、室温下おいて３０分間作用させ、続いて３，３’−ジアミノジフェニルアミンを用いて現像した。その結果を図４に示す。
【００５０】
図４より、ＣＬＳＴＮ−１は、黒色素細胞腫の組織中において大量に発現するが、それに反して、正常な皮膚組織中においては殆んど発現しないことが判明した。従って、ＣＬＳＴＮ−１は皮膚ガンの検出用のバイオマーカーとして利用できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
発明の効果
上記の実験例より、早期肺ガン患者と健康な志願者の血液試料中におけるＣＬＳＴＮ−１の発現量は、統計学的に有意な差異を示すことから、ＣＬＳＴＮ−１は肺ガンのスクリーニング用のバイオマーカーとして用いることができ、かつ、その検出感度は従来使用されている周知のＣＥＡに比べて非常に優れていることが証明された。更に、上記の組織切片の染色結果の差異は、肺ガンの病状の程度と高い相関性があることが認められた。また、上記の実験例より、ＣＬＳＴＮ−１は、肺ガンだけでなく、その他のガン（例えば、皮膚ガン）にも利用できることが証明された。
【００５２】
従って、ＣＬＳＴＮ−１は、ガン患者の治療方法又は薬剤の有効性などのモニタリング用のバイオマーカーとして用いることができる。又、上記の特性に基づき、ＣＬＳＴＮ−１は、ガン治療用の薬剤の選別にも使用することができる。
【００５３】
上記の実施例は、本発明を例示したものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当業者の知識に基づき、上記実施例について修飾又は変更を加えることが可能であり、そうした修飾や変更は本特許請求の範囲に入るものである。ここで、本発明の権利の保護範囲を後述の特許請求の範囲に示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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