(57)【要約】【課題】  遠心分離や篩等の操作を必要とせず、かつ生産物が含まれる反応液から水不溶性基質等の残渣物を拾うことなく簡易な操作で効率的に分離回収することができるとともに、繰り返し利用が可能な固定化生体触媒を提供すること。【解決手段】  包括剤１１中に磁性粒子１３を含有させて固定化生体触媒１０に磁性を付与することにより、磁力を利用して反応液中から固定化生体触媒１０のみを分離、回収できるようにする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
包括剤中に生体触媒を包括固定してなる固定化生体触媒であって、前記包括剤中には磁性粒子が含まれていることを特徴とする固定化生体触媒。
【請求項２】
磁性粒子が、フェライト及び／又はマグネタイトを含むものであることを特徴とする請求項１記載の固定化生体触媒。
【請求項３】
生体触媒が、アクレモニウム属菌が生産するセルラーゼを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の固定化生体触媒。
【請求項４】
生体触媒と磁性粒子とを含む包括剤溶液を、ゲル化液の液面に噴霧してゲル化させることを特徴とする固定化生体触媒の製造方法。
【請求項５】
磁性粒子がフェライト又はマグネタイトからなることを特徴とする請求項４記載の固定化生体触媒の製造方法。
【請求項６】
生体触媒が、アクレモニウム属菌が生産するセルラーゼを含むことを特徴とする請求項４又は５に記載の固定化生体触媒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応液や洗浄液からの分離回収を容易に行え、繰り返し使用することができる固定化生体触媒に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有用物質の生産には、酵素や微生物に代表される生体触媒が用いられている。生体触媒を用いた化学反応は、温度等所定の条件下において、目的生成物の原料となる基質が添加された液中に生体触媒を直接投入することで行うことができる。しかし、酵素等の生体触媒の中には、生産が容易でなく、高価で入手が難しいものもあることから、工業的生産を考えた場合には生体触媒を反応液中から回収して繰り返し利用できるようにすることが求められる。
【０００３】
こうした事情に鑑みて、現在に至るまで様々な生体触媒の分離回収方法が提案されている。例えば、反応液を限外濾過膜で濾過して反応液と酵素とを分離する方法が提案されている（例えば特許文献１参照）。しかしながら、限外濾過膜を用いた方法は、反応液からの分離及び使用後の限外濾過膜の洗浄に非常に時間がかかるという難点があった。このため、分離操作中に酵素や微生物等の生体触媒の活性が低下してしまうという問題があった。また、限外濾過膜も使用に伴って目詰まりを起すため、ある程度の回数を使用した後には新しいものに交換する必要があり、工業的利用の観点からみると、回収の効率性及びコスト面から十分満足のいく方法とはいえない。また、生体触媒が微生物菌体の場合には、反応液を遠心分離して微生物を沈殿させることによって分離回収する方法があるが、沈殿中に不純物や反応残渣等が混ざってしまうだけでなく、コンタミネーションを起しやすいといった問題があった。
【０００４】
そこで、反応液からの生体触媒の分離を容易とし、これを繰り返し使用できるようにするために、生体触媒を固定化することが行われている（例えば特許文献２及び特許文献３参照）。生体触媒の固定化の方法には、担体結合法、架橋法、包括法が知られている。このうち包括法による固定化は、担体結合法や架橋法のように、担体や架橋剤と生体触媒とが直接結合反応を起さないため、多くの生体触媒への応用が可能である点で優れている。
【０００５】
こうした固定化生体触媒は、主にカラムに充填されて使用されることが多く、そこに基質を連続的に接触させることで連続反応を行うことが可能となる。しかし、カラムに充填して行う連続反応は水溶性の基質に対しては有効であるが、例えば、乾燥草木のセルロース系バイオマスのような水不溶性基質を用いる場合にはカラムを使用することができず回分式で行う必要がある。
【０００６】
回分式の場合、固定化生体触媒の回収は、反応液を遠心分離して固定化生体触媒を沈殿させたり、あるいは篩にかけたりして行われていた。しかし、遠心分離や篩によって回収すると、固定化生体触媒と共に未反応の水不溶性基質も分離されてしまうため、固定化生体触媒のみを効率良く分離回収すること困難であった。また、反応とは直接関係しない遠心分離や篩等の操作を行うことは、反応液中に雑菌や不純物の混入を招くおそれがあるため好ましくない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６１−２３４７９０号公報
【特許文献２】特開昭５７−３９７９２号公報
【特許文献３】特開平７−２０３９６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、反応液中から簡易な操作で効率良く分離回収することができる固定化生体触媒を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために本発明が採った手段は、包括剤中に生体触媒を包括固定してなる固定化生体触媒であって、前記包括剤中には磁性粒子が含まれていることを特徴とする固定化生体触媒、である。すなわち、本発明に係る固定化生体触媒は、磁性粒子が有する磁力を利用して、包括固定された生体触媒のみを反応液中から分離回収できるようにしたものである。これにより、反応液中にて固定化生体触媒が未反応の水不溶性基質と混在する状態にあっても、固定化生体触媒のみを効率良く分離回収することが可能となる。
【００１０】
本発明の固定化生体触媒において、磁性粒子は、フェライト及び／又はマグネタイトを含むものであってもよい。フェライトとマグネタイトは強磁性を有するものであることから、これらを磁性粒子として固定化生体触媒に含有させることで、固定化生体触媒が磁石に引き寄せられやすくなるので、反応液からの回収をより効率よく行えるようになる。
【００１１】
また、本発明の固定化生体触媒において、生体触媒は、アクレモニウム属菌が生産するセルラーゼであってもよい。一般に、セルロース系バイオマスは水不溶性であることから、セルラーゼを用いたセルロース系バイオマスの糖化反応は回分式で行われる。この場合、反応液中にはグルコースやキシロース、マンノース等の可溶性の生成物以外に、セルロース系バイオマスの残渣物が多く含まれる。このため、従来のように遠心分離や篩といった方法で固定化生体触媒を回収すると、固定化生体触媒だけでなく、多量の残渣物も一緒に回収されてしまうこととなる。ところが、本発明に係る固定化生体触媒では、磁性粒子を含むことで磁力を利用した回収を可能としているため、セルロース系バイオマスの反応液に磁界を加えることで、磁性を有しない残渣物を反応液中に残したまま、磁性を有する固定化生体触媒のみを分離して回収することができる。このため、本発明の固定化生体触媒は、特に、水不溶性のセルロース系バイオマスの糖化反応に用いるのに特に適している。そして、この場合には、セルラーゼの中でも優れた糖化活性を有するアクレモニウム属菌が生産するセルラーゼを用いることができる。
【００１２】
さらに、本発明が採った手段は、生体触媒と磁性粒子とを含む包括剤溶液を、ゲル化液の液面に噴霧してゲル化させることを特徴とする固定化生体触媒の製造方法である。この方法は、例えば、アルギン酸ナトリウム溶液のように、ゲル化液に適下することにより表面がゲル化される包括剤を用いる場合に適用される方法である。一般に、基質と固定化生体触媒との接触面積を大きく確保することで、基質と固定化生体触媒との反応効率を向上させることが可能である。このためには、固定化生体触媒をできるだけ小径に調製し、これを数多く使用するとよい。そこで、生体触媒と磁性粒子を含んだ包括剤溶液のゲル化を行う際に、包括剤溶液をゲル化液の液面に噴霧することにより、微細な固定化生体触媒の調製が可能となる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る固定化生体触媒によれば、特に、水不溶性基質を用いた反応を行う場合において、反応液中に固定化生体触媒とともに水不溶性基質の残渣が存在する場合であっても、固定化生体触媒のみを効率良く分離回収することができる。その結果、反応液の処理工程を簡略化することができるとともに、生体触媒が稀少なものであっても繰り返し使用することができるので生産コストの低減を図ることができる。
【００１４】
また、本発明に係る固定化生体触媒の製造方法によれば、固定化生体触媒を微細に調製することができるので、反応効率の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１に係る固定化生体触媒の作製方法を説明する模式図である。
【図２】実施例１に係る固定化生体触媒を示す模式図である。
【図３（ｉ）】実施例１に係る固定化生体触媒を、液中より回収する方法を説明する    模式図である。
【図３（ｉｉ）】実施例１に係る固定化生体触媒を、液中より回収する方法を説明す    る模式図である。
【図３（ｉｉｉ）】実施例１に係る固定化生体触媒を、液中より回収する方法を説明    する模式図である。
【図４】実施例２に係る固定化生体触媒の作製方法を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の固定化生体触媒は、生体触媒と、これを包括固定化する包括剤と、磁性粒子とから構成される。本発明に用いられる生体触媒は、各種酵素及び細菌類、真菌類、酵母類、担子菌類、ウィルス等の微生物菌体、細胞内オルガネラ、またはこれらを組み合わせて用いることができる。
【００１７】
このうち、固定化生体触媒をセルロース系バイオマスの糖化処理に用いる場合には、生体触媒にアクレモニウム属菌が生産するセルラーゼ（以下、「アクレモニウムセルラーゼ」という）を用いることが好ましい。
【００１８】
セルロース系バイオマスは、グルコースが直鎖状に連なったセルロースを主成分とするが、この他にヘミセルロースやリグニンといった副成分も多く含まれている。このため、例えば、トリコデルマ属菌に由来するセルラーゼ等の従前のセルラーゼを用いてセルロース系バイオマスの糖化に行う際には、効率的な糖化を行うためにセルロース系バイオマスをアルカリ等で前処理して副成分を除去する必要があった。一方、アクレモニウムセルラーゼは、このような前処理をしていないセルロース系バイオマスに対しても優れた糖化活性を有することが知られている。このため、アクレモニウムセルラーゼを用いることで、処理工程を簡略化して効率的な糖化を行うことが可能となる。
【００１９】
生体触媒を固定する包括剤としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン等の多糖類、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリウレタン、光硬化性樹脂等の既知の包括剤を用いることができる。このうち、特に、反応液の撹拌等の物理的な衝撃が加わった場合でも崩壊が生じにくく、耐久性にも優れて繰り返し使用に適する点から、ポリアクリルアミドが好ましい。
【００２０】
固定化生体触媒の形状は特に限定されるものではなく、例えば、形状については、球形状や半球形状の他、立方体等の多面形状といったように、反応させる基質や反応条件に応じて適宜設定することができる。このうち、撹拌時や回収時に崩壊しにくい球状又は半球状とすることが特に好ましい。また、固定化生体触媒の大きさも特に限定されるものではなく、反応させる基質や反応条件に応じて適宜設定することができるが、反応効率の点からみてなるべく小径とすることが好ましい。例えば、生体触媒が酵素の場合には、直径０．１mm〜３．０ｍｍ程度、生体触媒が酵母等の微生物の場合には２．０〜５．０ｍｍ程度にすることが好ましい。
【００２１】
磁性粒子には、固定化生体触媒を磁力で回収可能とする程度の磁性を有するものであれば特に限定されないが、磁場に入れても残留磁化がなく、磁場から外した後もくっつき合うということのないフェライトやマグネタイトが好ましい。これによれば、通常は固定化生体触媒同士がくっつき合うことがなく、回収時に磁界を加えたときにのみ磁気を有するようになる。磁性粒子は単一材料でなく、複数の材料を混合させて用いてもよい。磁性粒子の粒子径は特に限定されるものではなく、固定化生体触媒内にて均一に分散できる粒子径であればよいが、特には０．５〜１５０μm程度とすることが好ましい。また、包括剤に対する磁性粒子の含有量も、固定化生体触媒に十分な磁性が付与されるように、その種類や性質に応じて適宜設定することができ、例えば、フェライトの場合には、５．０〜１０重量％の割合で含有させることが好ましい。
【００２２】
以下、本発明の実施例について説明する。尚、本発明は、上記実施例に限定されるものではなく、用いる生体触媒や包括剤、磁性粒子の種類や、固定化生体触媒の形状、粒径等は、所望する反応に応じて選択することができる。
【実施例１】
【００２３】
本実施例では、包括剤にアルギン酸ナトリウムを用いるとともに、生体触媒にセルラーゼＥＳ（洛東化成工業株式会社製）を用いて固定化生体触媒を調製した。
【００２４】
まず、アルギン酸ナトリウム５．０ｇに精製水５０ｍｌを加えて攪拌して均一に溶解させ、アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。
【００２５】
次いで、アルギン酸ナトリウム水溶液に、セルラーゼＥＳ５．２ｇを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５０ｍｌに溶解させて調製したセルラーゼＥＳ溶液５０ｍｌを加え攪拌した。さらに、その中に磁性粒子としてのフェライト粒子（平均粒子径１０μｍ）５．０ｇを加えた。得られた酵素−フェライト含有アルギン酸ナトリウム水溶液を攪拌しながらパスツールピペットにて適量を採取し、図１に示すようにして、５．０％塩化カルシウム水溶液中に滴下してゲル化させることによって固定化生体触媒を調製した。その後、５．０%塩化カルシウム水溶液中に磁石を挿し入れて、得られた固定化生体触媒を磁石に引き寄せて回収した。回収された固定化生体触媒は２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４．５)中に浸漬保存した。得られた固定化生体触媒は球形で、粒径がおよそ１．０〜５．０ｍｍ程度のものが混在したものであった。
【００２６】
図２には、上記のようにして得られた固定化生体触媒１０の模式図が示されている。図２に示すように、固定化生体触媒１０は、表面がアルギン酸カルシウムからなるゲル化薄膜１１ａで被覆されており、その内部には生体触媒１２としてのセルラーゼが固定されるとともに、磁性粒子１３としてのフェライト粒子が散在している。このように、固定化生体触媒１０の内部に磁性粒子１３を散在させることで、固定化生体触媒１０に磁性を持たせることができる。
【００２７】
図３には、磁石を用いて固定化生体触媒を液中から回収する方法の一例が示されている。図３（i）に示すように、回収用磁石２０は、棒磁石２１と、棒磁石２１が挿入される
筒部材２２とからなる。筒部材２２は磁気を通し、かつ棒磁石とくっつかないプラスチック等の素材から形成されてなる。これを用いて固定化生体触媒を液中から回収するには、まず図３（ii）に示すように回収用磁石２０を液中に挿し入れる。すると、磁性粒子１３によって磁性を帯びた固定化生体触媒１０が回収用磁石２０の筒部材２２の表面に引き寄せられる。そして、回収用磁石２０を液中から引き上げた後、図３（iii）に示すようにして棒磁石２１を筒部材２２から抜き取ると、磁力から解放された固定化生体触媒１０が筒部材２２の表面から離れて、固定化生体触媒１０を回収することができる。
【実施例２】
【００２８】
本実施例は、酵素−フェライト含有アルギン酸ナトリウム水溶液の調製方法は実施例１と同様であるが、これをゲル化させる方法が異なる。従って、ここでは、酵素−フェライト含有アルギン酸ナトリウム水溶液の調製方法についての説明は省略することとし、ゲル化の方法について詳述することとする。
【００２９】
酵素−フェライト含有アルギン酸ナトリウム水溶液の適量を霧吹器に入れ、図４に示すようにしてステンレス製のバットに入れた５．０％塩化カルシウム水溶液の液面に向けて噴霧し、１０〜３０分間浸漬して表面をゲル化させた。その後、５．０%塩化カルシウム水溶液中に磁石を挿し入れて、得られた固定化生体触媒を磁石に引き寄せて回収した。回収された固定化生体触媒は２０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４．５)中に浸漬保存した。得られた固定化生体触媒は球形で、粒径がおよそ０．２〜０．５ｍｍ程度のものが混在したものであった。
【００３０】
実施例２の方法によれば、微細な固定化生体触媒をばらつきの少ない粒径で作製することができる。また、実施例１のように、酵素−フェライト含有アルギン酸ナトリウム水溶液を塩化ナトリウム水溶液に一滴ずつ滴下する場合と比べて、一時に数多くの固定化生体触媒を作製することができる。
【実施例３】
【００３１】
本実施例では、包括剤にアクリルアミドゲルを用いるとともに磁性粒子にフェライトを用い、生体触媒にアクレモニウムセルラーゼを用いて固定化生体触媒を調製した。
【００３２】
まず、アクリルアミド２９ｇとビスアクリルアミド１ｇを、脱イオン水で１００ｍｌにメスアップして、３０％アクリルアミド溶液を調製した。この３０％アクリルアミド溶液１６．６７ｍｌに対して、フェライト粉末５ｇ及びアクレモニウムセルラーゼ粉末（明治製菓株式会社製）０．５ｇを加え、さらに重合促進剤としての１０％過硫酸アンモニウム溶液１．０ｍｌ及びＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）０．１ｍｌを添加し、最後に脱イオン水で１００ｍｌにメスアップして酵素−アクリルアミド溶液を調製した。
【００３３】
そして、酵素−アクリルアミド溶液をマイクロプレート（丸底、９６ウェル、ウェル径：３．２ｍｍ）の各ウェルに適下して１時間程放置して十分にゲル化した後、各ウェルから取り出し、脱イオン水で洗浄して過剰のアクリルアミドを除去して、略半球状の固定化生体触媒を得た。
【００３４】
こうして得られた固定化生体触媒と、粒度２５０μｍに粉砕処理した乾燥刈芝とを、ｐＨ４．５に調整した２０ｍＭ／クエン酸緩衝液に添加し、撹拌しながら糖化処理を行なった。そして、反応終了後に、実施例１と同様の回収用磁石を用いて反応液中から固定化生体触媒を回収した。その結果、残渣物を反応液中に残存させたまま、添加した固定化生体触媒のほぼ全量を回収することができた。また、回収された固定化生体触媒に大きな崩壊はみられず、添加前の形状がほぼそのまま維持されていた。
【００３５】
実施例３に係る固定化生体触媒では、包括剤にアクリルアミドを用いたことにより、撹拌や振盪によって、固定化生体触媒同士が衝突する等して衝撃が加わっても、他の包括剤と比べて崩壊が生じにくいので、初期の形状を維持したまま繰り返し使用することができる。また、磁性粒子として強磁性を有するフェライトを含有することで、反応液中で固定化生体触媒のみが磁石に強く引き寄せられるため、残渣物を拾うことなく効率的に回収することができる。一方で、フェライトは、磁界を加えたときにのみ磁気を有するため、反応中に互いにくっつき合うことがなく、反応性に影響を及ぼすこともない。さらに、生体触媒にアクレモニウムセルラーゼを用いたことで、セルロース系バイオマスから副成分を除去するための前処理をしなくとも効率的な糖化を行うことができる。
【００３６】
このように、実施例３に係る固定化生体触媒によれば、セルロース系バイオマスの反応液中から残渣物を拾うことなく効率的に回収することができる。また、強度及び耐久性に優れることから、初期の形状を維持した状態で繰り返し使用することができるので、糖化処理に不可欠なセルラーゼに要するコストを低減することができる。さらに、糖化活性に優れるアクレモニウムセルラーゼを採用したことにより、セルロース系バイオマスから副成分を除去するための前処理を省略することができるので、糖化工程の全体にわたって作業を簡略化することができる。
【００３７】
尚、実施例３においては、酵素−アクリルアミド溶液をゲル化させる際にマイクロプレートを用いることにより、略半球形状の固定化生体触媒を形成しているが、この他に、例えば、酵素−アクリルアミド溶液をバットに流し込んで平板状にゲル化させた後に、ステープラ等を用いてサイコロ状にカットして形成してもよい。また、セルラーゼにはアクレモニウムセルラーゼ一種だけなく、例えば、アビセラーゼ活性やβ−グルコシダーゼ活性等を有する他の酵素と組み合わせて用いてもよい。
【符号の説明】
【００３８】
１０  固定化生体触媒
１１  包括剤
１２  生体触媒（セルラーゼ）
１３  磁性粒子（フェライト粒子）
２０  回収用磁石
２１  棒磁石
２２  筒部材
【図１】
2010131005.tif 000003
【図２】
2010131005.tif 000004
【図３（ｉ）】
2010131005.tif 000005
【図３（ｉｉ）】
2010131005.tif 000006
【図３（ｉｉｉ）】
2010131005.tif 000007
【図４】
2010131005.tif 000008