(57)【要約】【課題】血管新生促進作用を有する新規ペプチドを提供すること。【解決手段】（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド、を含有する血管新生促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド、を含有する血管新生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載の血管新生促進剤を含む、医薬。
【請求項３】
請求項１に記載の血管新生促進剤を含む、虚血性疾患治療薬。
【請求項４】
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を有する発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、生体にとって生理的反応であり、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の種々の細胞増殖因子によって起こることが知られている。
中でも、ＶＥＧＦは強力な血管新生促進因子であり、がん細胞等からも産生され、がんに血管新生を促進することにより、がんを増悪させる因子としても知られている。
また、血管新生はがんの増殖、糖尿病性網膜症、動脈硬化等の病態進展・憎悪に関わっている一方、血管新生を促進することによる虚血性疾患の改善（創傷治癒の促進や、閉塞性末梢血管疾患や虚血性心疾患等の治療）に血管新生療法が期待されている。
【０００３】
既にＦＧＦが褥瘡、皮膚潰瘍治療の外用剤として広く臨床に使用され、近年、虚血組織の血流確保のため、細胞療法、遺伝子治療や、血管新生因子の局所直接投与等が試みられている。例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）については、虚血性心疾患等に対する動物実験において有効性が確認されている（非特許文献１）。
また、慢性動脈閉塞症（閉塞性動脈硬化症又はビュルガー病）を対象としたＨＧＦ遺伝子による血管新生遺伝子治療についての臨床試験も行われている。加えて、ＶＥＧＦについても虚血性疾患における遺伝子治療に用いられている（非特許文献２）。
しかしながら、血管新生因子は、強力な細胞増殖、移動、分化、血管新生を示すとともに、種々の癌遺伝子産物との相同性が指摘されているため、血管新生因子による無制限な増殖は細胞の癌化や腫瘍の悪性化を引き起こす可能性が高い。
【０００４】
また、バルトネラ属細菌のバルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）及びバルトネラ・クインタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）はヒトに感染すると、猫ひっかき病や細菌性血管腫を起こす病原細菌として知られており、血管内皮細胞の細胞増殖を促進して感染局所の血管新生を惹起することが知られている（非特許文献３）。
しかしながら、これまでに、これらバルトネラ属細菌による血管新生促進作用の原因物質は特定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J Jpn Coll Angiol, 2005;45;145-150
【非特許文献２】Circulation, 1998;97:1114-1123
【非特許文献３】Clin Microbiol Rev. 1997;10(2):203-219
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでに知られている血管新生因子とは異なる新たな血管新生因子を見出すことは、血管新生関連の基礎研究をはじめ、血管新生療法や再生医療の分野において有用であると考えられた。
本発明が解決しようとする課題は、血管新生促進作用を有する新規ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アミノ酸配列は知られていたものの、その機能が解明されていなかったタンパク質の部分配列を有するペプチドが、血管新生作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド、を含有する血管新生促進剤。
（２）
（１）に記載の血管新生促進剤を含む、医薬。
（３）
（１）に記載の血管新生促進剤を含む、虚血性疾患治療薬。
（４）
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド。
（５）
（４）に記載のペプチドをコードする核酸。
（６）
（５）に記載の核酸を有する発現ベクター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、血管新生促進作用を有する新規ペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Bartonella henselae25-534位のアミノ酸配列に相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列を示す。
【図２】B. henselae25-434位のアミノ酸配列に相当する配列番号５で示されるアミノ酸配列を示す。
【図３】Bartonella quintana25-526位のアミノ酸配列に相当する配列番号６で示されるアミノ酸配列を示す。
【図４】B. henselaeのアミノ酸配列（全長）に相当する配列番号７で示されるアミノ酸配列を示す。
【図５】B. quintanaのアミノ酸配列（全長）に相当する配列番号８で示されるアミノ酸配列を示す。
【図６】ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に対する細胞増殖促進活性の結果を示す。未処理（control）の細胞数を100%として、各群の結果を相対値で示した。
【図７】細胞増殖促進活性におけるB. henselaeに由来するアミノ酸鎖長の異なる各ペプチドの結果を示す。
【図８】安定性試験として、各種処理を行った後の細胞増殖促進活性の結果を示す。
【図９】種々の培養細胞に対する細胞増殖促進活性の結果を示す。
【図１０】HUVECに対する管腔形成試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について以下詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
本発明の血管新生促進剤は、以下のいずれかのペプチドを含有する。
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
本発明においては、当該ペプチドを大腸菌の発現系で作製することに成功しており、遺伝子組換え技術を用いて大量作製することが可能である。また、大腸菌系で作製したペプチドは、標的とする細胞特異性、特に癌細胞の生育・癌血管新生への影響を検討し、血管内皮細胞を培養している培地中に添加することで細胞増殖を促進させること、さらに、マトリックスゲル上で血管内皮細胞の管腔形成を促進することが確認できている。
【００１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）が産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から５３４位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から５１３位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号３で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から５０１位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から４８５位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
配列番号５で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・ヘンセレが産生するタンパク質の全長８７４残基中２５位から４３４位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
全長８７４残基のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７で示される。
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、オートトランスポーターの一つであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の２５位から４２３位までの領域は、オートトランスポーターのＰａｓｓｅｎｇｅｒドメインに相当する。
【００１４】
本発明において、「オートトランスポーター」とは、細菌のもつ分泌装置の一つ（Ｖ型分泌装置）であり、Ｃ末端領域（β−ｂａｒｒｅｌドメイン）が外膜を貫通し、そこに生じたチャネルを介して、自身のＮ末端領域（Ｐａｓｓｅｎｇｅｒドメイン）を菌体外に分泌させるタンパク質である。
オートトランスポーターによってＰａｓｓｅｎｇｅｒドメインのアミノ酸配列は異なり、様々な機能を有することが知られている。
【００１５】
バルトネラ・ヘンセレ  ＡＴＣＣ４９８８２株のゲノム配列は、ゲノム配列ＩＤ：ＮＣ＿００５９５６．１として、データベース上に公開されているため、アミノ酸配列も公知となっている。
配列番号７は、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＢＨ０５５１０又はＡＹＴ＿ＲＳ０２８６０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＷＰ＿０１１１８０４８１，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｈ３ＬＸＸ９として公知となっているが、血管新生促進能を有することについては知られていない。実際、タンパク質データベースＵｎｉＰｒｏｔにおいても、当該タンパク質の機能については、「Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ」となっている。
本発明においては、当該タンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列からなるペプチドを、配列番号１〜配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するペプチドとしている。
【００１６】
本発明の血管新生促進剤の一態様としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列中２５位から４３４位までの領域に相当するアミノ酸配列を有していれば、Ｃ末端のアミノ酸は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中から適宜選択してよい。
例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列においては、Ｃ末端のアミノ酸は、配列番号７で示されるアミノ酸配列における４３４位であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列においては、Ｃ末端のアミノ酸は、配列番号７で示されるアミノ酸配列における５３４位であるから、本発明の血管新生促進剤として、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、４３４位から５３４位のアミノ酸から任意に選択してもよく、４２４位から６１２位のアミノ酸から任意に選択してもよい。
また、この時、以下に記載するように、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸ではないアミノ酸をＮ末端のアミノ酸として有していてもよい。
【００１７】
また、本発明の血管新生促進剤の一態様として、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、５３４位よりＣ末端よりに位置するアミノ酸から任意に選択してもよい。
すなわち、配列番号７で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から６１３位以降のアミノ酸配列は、膜貫通ドメインと予想されるため、Ｎ末から６１２位までのアミノ酸配列から選ばれる任意のアミノ酸をＣ末端のアミノ酸として有していてもよく、本発明の血管新生促進剤として、特に有している必要はないが、配列番号７で示されるアミノ酸配列の６１３位以降のアミノ酸配列の任意のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００１８】
本発明の血管新生促進剤の一態様としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列における部分配列を有するペプチドであって、Ｎ末端側アミノ酸として、２５位のアミノ酸を有し、アミノ酸数を４１０以上とするペプチドであってもよい。
配列番号７で示されるアミノ酸配列における部分配列としてのアミノ酸数は、４１０以上であれば、その部分配列となるように、８７３以下であってよく、８００以下、７００以下、６００以下、５５０以下、５４０以下、５３０以下、５２０以下、５１０以下であってもよい。
【００１９】
配列番号６で示されるアミノ酸配列は、バルトネラ・クインタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）が産生するタンパク質の全長８６３残基中２５位から５２６位までの領域に相当するアミノ酸配列である。
全長８６３残基のタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８で示される。
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、オートトランスポーターの一つであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列の２５位から４１５位までの領域は、オートトランスポーターのＰａｓｓｅｎｇｅｒドメインに相当すると考えられる。
【００２０】
バルトネラ・クインタナ  Ｔｏｕｌｏｕｓｅ株のゲノム配列は、ゲノム配列ＩＤ：ＮＣ＿００５９５５．１として、データベース上に公開されているため、アミノ酸配列も公知となっている。
配列番号８は、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＢＱ０４６８０又はＢＱ＿ＲＳ０２３７０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＷＰ＿０１１１７９２５４．１，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｈ３ＬＴＶ４として公知となっているが、血管新生促進能を有することについては知られていない。実際、タンパク質データベースＵｎｉＰｒｏｔにおいても、当該タンパク質の機能については、「Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ」となっている。
本発明においては、当該タンパク質のＮ末端領域の５０２残基のアミノ酸配列からなるペプチドを、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチドとしている。
【００２１】
本発明の血管新生促進剤の一態様としては、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、４１５位から６１４位のアミノ酸から任意に選択してもよい。
また、この時、以下に記載するように、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸ではないアミノ酸をＮ末端のアミノ酸として有していてもよい。
【００２２】
また、本発明の血管新生促進剤の一態様として、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端が２５位のアミノ酸であれば、Ｃ末端のアミノ酸は、５２６位よりＣ末端よりに位置するアミノ酸から任意に選択してもよい。
すなわち、配列番号８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から６１５位以降のアミノ酸配列は、膜貫通ドメインと予想されるため、Ｎ末から６１４位までのアミノ酸配列から選ばれる任意のアミノ酸をＣ末端のアミノ酸として有していてもよく、本発明の血管新生促進剤として、特に有している必要はないが、配列番号８で示されるアミノ酸配列の６１５位以降のアミノ酸配列の任意のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００２３】
本発明の血管新生促進剤は、血管新生を促すことにより症状を改善し得る分野で用いることができる。
血管新生を促すことにより症状を改善し得る疾患としては、特に限定されるものではないが、例えば、虚血性疾患が挙げられる。
本明細書において、虚血性疾患とは、動脈が血栓や塞栓等の要因により狭窄又は閉塞された血管の下流に存在する組織において、血液供給が減少して細胞死が進行する疾患を意味する。本発明の血管新生促進剤により、そのような損傷部位において、血管新生が促されることにより、細胞死等が起きていても、かかる状況を改善し得る。
虚血性疾患を対象として、特に限定されるものではないが、例えば、本発明の血管新生促進剤を創傷治癒促進、特に毛細血管の分布が乏しく治癒に時間がかかる腱や靭帯の損傷修復の促進、特発性大腿骨頭壊死症、動脈硬化等による血管閉塞に伴う虚血症状の改善等において用いることができる。また、虚血性疾患として、閉塞性末梢血管疾患や虚血性心疾患等も挙げられる。再生医療分野で本発明の血管新生促進剤を用いる場合には、移植細胞や臓器を製造する際の血管新生の促進に利用可能である。
本発明の血管新生促進剤は、血管新生研究、再生医療研究分野において血管新生促進活性をもつ研究用試薬としても利用することができる。本発明の血管新生促進剤は、研究用試薬として、血管新生研究や癌研究分野において、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦ等の細胞増殖因子に加えた、新たな血管新生因子として利用可能である。
また、本発明の血管新生促進剤は、血管新生を促進してもよく、血管新生を誘導してもよい。すなわち、本発明の血管新生促進剤は、血管新生誘導剤として理解されてもよい。
【００２４】
また、バルトネラ症においては、感染局所おいて菌体外に本発明の血管新生促進剤に係るペプチドが分泌され、血管内皮細胞に作用すると考えられる。感染部位又は血中から本発明の血管新生促進剤に係るペプチドを検出することができれば、バルトネラ症のバイオマーカーとして新たな診断法の開発につなげることも期待できる。
したがって、本発明における配列番号１〜配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するペプチド等を、標的とするバルトネラ症の新規診断マーカーとすることができる。
【００２５】
本発明においては、以下のペプチドも提供する。
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド。
本発明においては、本発明の血管新生促進剤としては、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドを利用可能である。
【００２６】
本明細書においてアミノ酸配列を構成する「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書における「アミノ酸」としては、天然タンパク質性Ｌ−アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジン等）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の血管新生促進剤としてのペプチドについては、天然アミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましいが、そのアミノ酸配列の一部において天然アミノ酸以外のアミノ酸が含まれていてもよい。
【００２７】
本明細書において「１から複数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有する」という場合、付加、置換又は欠失されるアミノ酸の個数は、結果として得られるペプチドが血管新生促進作用を有する限り特に限定されないが、例えば、１個〜２０個の範囲の整数とすることができる。「１個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、「１〜２０個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、１〜２０個の範囲内であれば、１〜任意の整数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有していてもよい。
すなわち、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、あるいは１個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有していてもよい。
アミノ酸の付加、置換又は欠失の位置は、血管新生促進剤としての機能が保持される限り、アミノ酸が欠失、置換又は付加されるアミノ酸配列中のどこの位置であってもよい。
【００２８】
本明細書において、「８０％以上の相同性を有する」とは、変異前のアミノ酸配列と当該アミノ酸配列から変異した配列を有するペプチドのアミノ酸配列一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、変異前のアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
相同性は８０％以上であって、血管新生促進剤としての機能を保持する限り特に限定されないが、例えば８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上とすることができる。
本明細書において、配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と「８０％以上の同一性を有する」とは、配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と変異した配列を有するペプチドのアミノ酸配列を比較して、一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
【００２９】
本明細書において配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の「１から複数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有する」あるいは配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と「８０％以上の同一性を有する」とは、そのペプチドの構造において、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端側アミノ酸が２５位のアミノ酸であってもよいが、２５位のアミノ酸よりＮ末端側のアミノ酸をＮ末端アミノ酸として有してもよく、また、２５位のアミノ酸よりＣ末端側のアミノ酸をＮ末端アミノ酸として有してよい。
なお、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から１〜２４位のアミノ酸配列は、シグナル配列といえるので、本発明の血管新生促進剤としてのペプチドとして、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列の１〜２４位のアミノ酸配列の任意のアミノ酸配列を有していてもよい。
また、本発明の血管新生促進剤としてのペプチドは、そのペプチドの構造において、配列番号７又は８で示されるアミノ酸配列の部分構造となるアミノ酸配列をそのまま有していてもよく、その部分構造となるアミノ酸配列の一部アミノ酸が付加、置換又は欠失されていてもよく、その部分構造となるアミノ酸配列と相同性が８０％以上となるようなアミノ酸配列として有していてもよい。
【００３０】
本発明の血管新生促進剤となるペプチドについては、従来公知の方法により製造することができる。
【００３１】
本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸をも提供する。
当該核酸としては、特に限定されるものではないが、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ及びウイルスベクター等の任意の適切なベクター中に含まれうるＤＮＡ又はＲＮＡ分子として提供され得る。
本発明の核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸であれば特に限定されるものではないが、ベクター中に取り込まれた形態であり得る。
ベクター中においては、転写や翻訳に必要な因子と共に取り込まれて、それら因子と連続して、あるいは、不連続に存在する。
本明細書において、「ベクター」は、クローニングベクターや、発現ベクターを包含する意味で用いられ、ホスト、好適には、細胞を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）をホスト細胞に導入することができるビヒクルを意味する。
本発明の核酸としては、本発明のペプチドのアミノ酸配列の各アミノ酸をコードするコドンが連続する核酸であることが好ましいが、本発明のペプチドをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸であってもよい。
本発明のペプチドをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸も、従来公知の方法により、本発明のペプチドをコードする核酸とすることができるので、かかる相補的な塩基配列を有する核酸も本発明に包含される。
【００３２】
本発明は、本発明の核酸を含むベクターをも提供する。
当該ベクターには、転写や翻訳に必要な因子が含まれていてよい。
核酸を含むベクターがホストにおいて、ペプチドの発現を引き起こすために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の転写や翻訳の調節因子を含んでいてもよい。
プラスミドや、ベクターとしては、特に限定されるものではなく、公知のプラスミドやベクターを用いることが可能である。
【００３３】
本発明において、本発明の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクションされた形質転換体を含む。形質転換体としては、本発明のペプチドを発現させるホスト、好ましくは細胞である。
本明細書において、「形質転換」は、ホスト、好ましくは細胞が導入後の遺伝子又は配列を発現して、所望のペプチドを産生するように、核酸やベクターをホストに導入することを意味する。
導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを、好ましくはベクターの形態で含むホスト、好ましくは細胞は、「形質転換」された形質転換体である。
【００３４】
本発明のペプチドは、本発明の核酸、ベクターや形質転換体を用いて製造することが可能であり、大腸菌を初めとした細菌、動物細胞、昆虫細胞等を用いたタンパク質発現系によりペプチドを調製することが可能である。
本発明のペプチドは、従来公知の方法により化学合成することも可能である。
【００３５】
ペプチドの精製方法も特に限定されるものではなく、一般には、カラムクロマトグラフィーにより精製される。
【００３６】
本発明においては、
（ｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチド、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜配列番号６のいずれかで示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有し、血管新生促進作用を有するペプチドの用途は、特に限定されるものではないが、医薬用途が挙げられる。
本発明の医薬は、本発明のペプチドを含有し、本発明のペプチドが血管新生促進作用を有することにより、当該作用に基づいて医薬として利用可能となる。
当該医薬としては、虚血性疾患治療薬として用いることも可能である。
【００３７】
本発明における医薬は、医薬製剤の製造法として一般的に用いられている公知の方法（例えば、日本薬局方に記載の方法）に従って、製造することができる。
医薬製剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤（例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠を含む）、散剤、顆粒剤（例えば、細粒を含む）、カプセル剤（例えば、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、液剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤を含む）、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤を含む）坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤を含む）、ペレット、吸入剤（例えば、経鼻剤、経肺剤を含む）、及び点滴剤等が挙げられる。
固形製剤となる、錠剤、散剤、顆粒剤等は、従来公知の技術を用いて徐放性製剤や速崩性製剤としてもよい。
これら医薬製剤は、経口的又は非経口的（例、局所、直腸、静脈投与等）に投与することができる。
【００３８】
医薬製剤とするにあたって用いられる薬理学的に許容される添加剤としては、本技術分野においてはん用される成分を用いることが可能である。
当該添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。
必要に応じて、当該添加剤として、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等を適宜、適量用いてもよい。
【００３９】
本発明のペプチドの投与量及び投与方法は、特に限定されるものではなく、投与対象、症状等に応じて適宜選択してよい。
本発明のペプチドの投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、一日につき約０.０１〜１０００ｍｇであり、当該範囲内で、約０．１ｍｇ以上、約１ｍｇ以上、約２ｍｇ以上、約５ｍｇ以上、約１０ｍｇ以上としてもよく、約５００ｍｇ以下、約２００ｍｇ以下、約１００ｍｇ以下、約５０ｍｇ以下、約２０ｍｇ以下、約１０ｍｇ以上としてもよい。
当該投与量のペプチドを一日の投与回数に応じて、分割して投与してもよい。
投与回数は、一日あたり１回であってもよく、２回であってもよく、３回であってもよく、投与時間も、食後、食前、食間、空腹時、就寝前等適宜設定してよい。
投与間隔も、特に限定されるものではなく、例えば、毎日、１日おき、２日おき、１週間おき、隔週と適宜設定して投与してよい。
【００４０】
投与対象となる対象は特に限定されるものではなく、例えば、患者が挙げられる。投与対象としての患者も特に限定されるものではなく、小児であっても、大人であってもよく、その場合の投与量は適宜設定される。
本発明の血管新生促進剤は、それを必要とする対象、例えば、患者に、薬理学的に、薬学的に、あるいは製薬学的に有効量投与することにより、医薬として用い得る。好適には、有効量の本発明のペプチドを対象に投与することにより、血管新生を促すことにより症状を改善し得る疾患の治療又は予防に用いてもよく、その場合、血管新生を促すことにより症状を改善し得る疾患の治療方法又は予防方法が提供される。
【００４１】
本発明においては、本発明の血管新生促進剤による作用を高める目的として、本発明の血管新生促進剤の用量を減じることを目的として、また、所望の薬効を高める目的として、他の薬剤と併用してもよい。
他の薬剤との併用においては、合剤であってもよく、併用剤として、両者を単剤として投与してもよい。単剤同士を併用して患者に投与する場合には、同時に投与してもよく、別時に投与してもよい。
【実施例】
【００４２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸及び配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする核酸のクローニング
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド（ぺプチド１）をコードする核酸は、Bartonella henselae ATCC49882株のゲノムDNAを鋳型にPCRで増幅した。
プライマー配列は以下のとおりである。
Forward:  AGTGAGAATAAGAATAGGGCG（配列番号９）
Reverse:   TGACTGCTGTTGTTCATCAG（配列番号１０）
配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチド（ぺプチド６）をコードする核酸はBartonella quintana Toulouse株のゲノムDNAを鋳型にPCRで増幅した。
プライマー配列は以下のとおりである。
Forward:  GGTAAAAGCCGTAATGCAGG（配列番号１５）
Reverse:  CGGTTTCTGCTGTTCATCAC（配列番号１６）
【００４３】
なお、配列番号２〜５のアミノ酸配列を有するペプチド（それぞれ、ペプチド２〜５という）をコードする核酸のクローニングには以下のプライマー配列を用いた。Forward配列は共通である。
（配列番号２）
Reverse:  TTTTTCTAAAAATGGAATCGTC（配列番号１１）
（配列番号３）
Reverse:  ATGCTGTGCATCTCTCAAATG（配列番号１２）
（配列番号４）
Reverse:  TTCATTATTTTTTCTACGGGTAGTCTG（配列番号１３）
（配列番号５）
Reverse:  ATTATTCGAACGATCTGCC（配列番号１４）
また、配列番号７における２５位〜２７４位のアミノ酸配列を有するぺプチド（ペプチド７）をコードする核酸のクローニングには以下のプライマー配列を用い、
Forward:   AGTGAGAATAAGAATAGGGCG（配列番号９）
Reverse:   TCGCTCACCAACTCCG（配列番号１７）
配列番号７における１３４位〜５３４位のアミノ酸配列を有するぺプチド（ペプチド８）をコードする核酸のクローニングには以下のプライマー配列を用いた。
Forward:   AATGGAGTAGTGGGGCAG（配列番号１８）
Reverse:   TGACTGCTGTTGTTCATCAG（配列番号１０）
【００４４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドあるいは配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドの調製
得られたPCR産物は、pASK-IBA17plus（IBA GmbH）に組み込み、大腸菌BL21株で発現させた。
大腸菌BL21株内で無水テトラサイクリンによる発現誘導を3時間行い、遠心分離することにより菌体を回収し、超音波処理により菌体を破砕した。続いて、Strep-tag融合タンパク質として発現させたタンパク質を、Strep-Tactinレジン (IBA-GmbH)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００４５】
細胞増殖促進活性の測定
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC、PromoCell）を96ウェルプレートに播種後、種々の増殖因子（ペプチド１又はペプチド２ 1 μg/mL、VEGF（富士フイルム和光純薬：223-01311） 20 ng/mL、bFGF（Sigma-Aldrich：SRP3043） 20 ng/mL）を添加し、3日間培養した。培養後の細胞をHoechst 33342及びCellMask Deep Redで蛍光染色し、イメージングアナライザーOpera Phenix（PerkinElmer）を用いて細胞数を測定した。
結果を図６に示す。アミノ酸鎖長の異なる種々のペプチドを用いて細胞増殖促進活性の測定結果を図７に示す。
【００４６】
安定性の測定
ペプチド１をそれぞれ、未処理、凍結融解処理（3回）、37℃ 3時間処理、95℃ 10分間処理した。
HUVECを一晩培養した後、培地をM199/10% FCSに交換し、各種処理したペプチド１を添加し、4日間培養した。
細胞数を定量した結果を図８に示す。
【００４７】
種々の培養細胞に対する細胞増殖促進作用
VEGF 20 ng/mL、bFGF 20 ng/mL、ペプチド１又はペプチド６ 1 μg/mLを各細胞を培養している培地に添加し、3日培養後の細胞数を計測した。
未処理（Control）の細胞数を100%として結果を図９に示す。
【００４８】
HUVECの管腔形成試験
bFGF 20 ng/mL, VEGF 20 ng/mL, ペプチド１及びペプチド２ 200 μg/mLのいずれかを含む1%ウシ胎児血清含有Medium 199培地（Thermo Fisher社）でHUVECを懸濁後、ゼラチンコートディッシュ（コーニング社）に播種して24時間培養後、HUVECを回収した。Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix（Thermo Fisher社）を各ウェルに50 μLずつ加えてゲル化させた96ウェルプレートを準備しておき、そこに回収したHUVECを2.0×104 個/ウェルになるように播種して、上記と同じ培地中で12時間培養して管腔を形成させた。形成された管腔はCalcein AM（Cell Biolab社）で蛍光染色後、Opera Phenixで画像を撮影し、画像処理ソフトHarmony（Perkin Elmer社）を用いて1視野あたりの管腔の全長を計測した。
結果を図１０に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の血管新生促進剤は、新規な血管新生因子として、血管新生関連の基礎研究をはじめ、血管新生療法や再生医療の分野等で利用でき、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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