(57)【要約】【課題】より特異性及び感受性が高い大腸癌又は胃癌の判定法や、そのためのキット、ならびに、大腸癌又は胃癌抑制剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】一人の大腸癌患者の癌原発巣及びリンパ節転移巣に由来する２種類の大腸癌細胞株の遺伝子発現パターンを、エクソンアレイを用いて網羅的に比較検討した。その結果、転移巣由来細胞株に特に高発現する遺伝子として、ＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子、ＧＦＲＡ３遺伝子、ＢＸ５３８２５４遺伝子の新規スプライシングバリアントを同定し、さらに、これらの新規スプライシングバリアントが、大腸癌細胞だけでなく、多くの胃癌細胞においても強く発現していることを見い出した。かかるスプライシングバリアントを用いると、大腸癌又は胃癌抑制物質をスクリーニングすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、大腸癌又は胃癌の診断用マーカー遺伝子のスクリーニング方法。
（ａ）大腸癌細胞株ＳＷ４８０及び大腸癌細胞株ＳＷ６２０における遺伝子発現パターンを、エクソンアレイを用いて網羅的に解析する工程；
（ｂ）上記大腸癌細胞株ＳＷ４８０及び大腸癌細胞株ＳＷ６２０において、異なるスプライシングパターンが認められる遺伝子を選択する工程；
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（iii）のいずれかのスプライシングバリアント。
（ｉ）配列番号７〜１２のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子のスプライシングバリアント；
（ii）配列番号２２又は２３に示されるＤＮＡ配列からなるＧＦＲＡ３遺伝子のスプライシングバリアント；
（iii）配列番号２６〜３１のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＢＸ５３８２５４遺伝子のスプライシングバリアント；
【請求項３】
被検者から採取した生体試料における、請求項２記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することを特徴とする大腸癌又は胃癌の判定法。
【請求項４】
スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現を検出することを特徴とする請求項３記載の判定法。
【請求項５】
請求項２記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする大腸癌又は胃癌の判定用キット。
【請求項６】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、大腸癌の抑制物質をスクリーニングする方法。
（ａ）大腸癌細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、該培養細胞における、請求項２記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定する工程；
（ｂ）被検物質の存在下における上記スプライシングバリアントの発現量が、被検物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、該被検物質を大腸癌の抑制物質と判定する工程；
【請求項７】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、胃癌の抑制物質をスクリーニングする方法。
（ａ）胃癌細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、該培養細胞における、請求項２記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定する工程；
（ｂ）被検物質の存在下における上記スプライシングバリアントの発現量が、被検物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、該被検物質を胃癌の抑制物質と判定する工程；
【請求項８】
スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現量を検出することを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌又は胃癌の診断用マーカー遺伝子のスクリーニング方法や、大腸癌又は胃癌の判定法や、大腸癌又は胃癌抑制剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、かつては欧米人に多い癌であったが、生活の習慣の欧米化にともなって、近年は日本人にも多く発生するようになってきている。大腸癌の検査法としては直腸指診、便潜血検査、超音波検査、ＣＴ検査、大腸内視鏡検査、注腸造影検査などがある。大規模な集団検診で行われる代表的な検査法は大便の免疫学的潜血反応である。この段階で精密検査を受ける人をスクリーニングできるが、偽陰性、偽陽性判定も多い。精密検査で大腸癌の確定診断を行う方法には大腸内視鏡検査、注腸造影検査、画像診断などの方法があるが、便を全て排出しなければならない、場合によっては苦痛を伴うなど、患者の肉体的、精神的負担が大きく、事前のスクリーニング段階での偽陰性、偽陽性判定を減らすことが求められている。
【０００３】
そこで、大腸癌をスクリーニング段階で検出するために、便潜血検査に加えて、特異的で感受性が高い血中腫瘍マーカー（tumor marker）を発見しそれを用いた検査を行うことが強く望まれている。血中マーカーのレベルを計測することにより、比較的安価でハイスループットな検査・診断が可能になると考えられる。これまでに、大腸癌のマーカーとしてＣＥＡ、ＣＡ１９−９などが臨床応用されている。
【０００４】
また、近年のゲノム解析またはプロテオーム解析の進歩に伴い、様々な新規の腫瘍マーカー候補が発見されており、例えば、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（特許文献１）、ＲＳ１５Ａ（特許文献２）、ＣＢＰ２（特許文献３）、ＡＳＣ（特許文献４）などがある。また、組織においてはＡｎｎｅｘｉｎ ＩＶなど１３種（非特許文献１）、Ｍｏｒｔａｌｉｎ（非特許文献２）、Ｃｙｔｏｃｈｏｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ（非特許文献３）、ＨＳＰ７０など５種（非特許文献４）、Ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎａｓｅなど２３種（非特許文献５）等のマーカー候補が発見されている。
【０００５】
さらに、大腸癌の診断において、リンパ節中の癌細胞を検出するリンパ節転移診断は、手術範囲の決定や術後の化学療法の決定に有益な情報となる。現在、リンパ節転移診断は病理医により、リンパ節組織の凍結切片またはパラフィン切片を用いた組織診（例えば、ヘマトキシリン−エオジン染色、免疫組織化学法など）が行われている。しかし、それら診断結果は、病理医の経験により診断結果が異なり、ときとして癌細胞を見落としてしまうことがある。このため、現在、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method）法やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いた癌の分子診断の研究が盛んに行われるようになっている。分子診断は、分子マーカー（例えば、癌細胞に特異的に発現するタンパク質、このタンパク質をコードする遺伝子、この遺伝子のｍＲＮＡなど）を検出することにより行うことができる。大腸癌のリンパ節転移を判定するための分子マーカーとしては、サイトケラチン２０（ＣＫ２０）やヒト胎児性抗原（ＣＥＡ）が報告されている。しかし、大腸癌を特異的に、早期に発見できる腫瘍マーカーは現時点において存在せず、進行大腸癌であっても約半数が陽性を示すのみである。
【０００６】
また、胃癌は日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率が３５％と低い。また、進行胃癌術後の腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが、胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。
【０００７】
胃癌に関しては、既知のＩ型コラーゲンのＣ末端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の変動をマーカーにする進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（特許文献５参照）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて胃癌をはじめ、種々の癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（特許文献６参照）や、転移性結腸直腸癌あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キットおよび方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（特許文献７参照）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質およびミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（特許文献８参照）等が提案されている。
【０００８】
さらに、胃癌腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定する方法としては、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む方法により、胃癌由来の転移癌細胞を検出し、これらを胃癌由来の転移癌細胞のマーカーとして使用することによって、胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料を提供することができる方法（特許文献９参照）が開発されている。
【０００９】
大腸癌及び胃癌は、比較的早期で発見された場合、治療により完治可能であるが、大きな腫瘍や転移のある場合の治療成績は劣るため、早期発見の重要性が認識されている。しかし、早期の大腸癌及び胃癌は自覚症状が少ないため発見が遅れることが多い。このため、より感度の高い大腸癌や癌胃癌のマーカーの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５３
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５５
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５６
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００６／０６６９１７
【特許文献５】特開２００１−３３４６０号公報
【特許文献６】特開２００２−１１２７９９号公報
【特許文献７】特表２００３−５３２３８９号公報
【特許文献８】特表２００５−５２６９８０号公報
【特許文献９】特開２００４−３２１１０２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００５、第５巻、ｐ．２６０２−２６１１
【非特許文献２】Ｄｕｎｄａｓ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００５、第２０５巻、ｐ．７４−８１
【非特許文献３】Ｌａｎｅ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ、２００４、第４０巻、ｐ．２１２７−２１３４
【非特許文献４】Ｓｔｕｌｉｋ，Ｊ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、第２０巻、ｐ．３６３８−３６４６
【非特許文献５】Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００４、第４巻、ｐ．７９３−８１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、より特異性及び感受性が高い大腸癌又は胃癌の判定法や、大腸癌又は胃癌の抑制剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
癌細胞には、旺盛な増殖能を有するだけでなく、血液あるいはリンパ液の流れにのって遠く離れた組織に転移する転移能を有するものが存在し、このような高転移性癌は、最終的には予後不良を引き起こす要因となる。本発明者らは、リンパ節転移した大腸癌細胞に、何らかの遺伝子の「スプライシングパターンの変化」が関与していると仮定した。大腸癌患者の原発巣及びリンパ節転移巣からそれぞれ樹立された２種類の大腸癌細胞株に対し、エクソンアレイを用いて遺伝子発現パターンを網羅的に比較解析した結果、転移巣由来細胞株に特に高発現する遺伝子として、転移抑制遺伝子の一つであるＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子の新規スプライシングバリアントを６種、ＧＦＲＡ３遺伝子の新規スプライシングバリアントを２種、ＢＸ５３８２５４遺伝子の新規スプライシングバリアントを６種同定した。また、培養大腸癌細胞を用いて検討した結果、これらの新規スプライシングバリアントが、転移性大腸癌細胞だけでなく、多くの原発性大腸癌細胞においても特異的に強く発現することを見い出した。さらに、培養胃癌細胞を用いて、上記新規スプライシングバリアントの発現を調べた結果、これらの新規スプライシングバリアントが、培養胃癌細胞において発現することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）（ａ）大腸癌細胞株ＳＷ４８０及び大腸癌細胞株ＳＷ６２０における遺伝子発現パターンを、エクソンアレイを用いて網羅的に解析する工程；（ｂ）上記大腸癌細胞株ＳＷ４８０及び大腸癌細胞株ＳＷ６２０において、異なるスプライシングパターンが認められる遺伝子を選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、大腸癌又は胃癌の診断用マーカー遺伝子のスクリーニング方法や、（２）（ｉ）配列番号７〜１２のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子のスプライシングバリアント；（ii）配列番号２２又は２３に示されるＤＮＡ配列からなるＧＦＲＡ３遺伝子のスプライシングバリアント；（iii）配列番号２６〜３１のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＢＸ５３８２５４遺伝子のスプライシングバリアント；の（ｉ）〜（iii）のいずれかのスプライシングバリアントや、（３）被検者から採取した生体試料における、上記（２）記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することを特徴とする大腸癌又は胃癌の判定法に関する。
【００１５】
また本発明は、（４）スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現を検出することを特徴とする上記（３）記載の判定法や、（５）上記（２）記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする大腸癌又は胃癌の判定用キットや、（６）（ａ）大腸癌細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、該培養細胞における、上記（２）記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定する工程；（ｂ）被検物質の存在下における上記スプライシングバリアントの発現量が、被検物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、該被検物質を大腸癌の抑制物質と判定する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、大腸癌の抑制物質をスクリーニングする方法や、（７）（ａ）胃癌細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、該培養細胞における、上記（２）記載のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定する工程；（ｂ）被検物質の存在下における上記スプライシングバリアントの発現量が、被検物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、該被検物質を胃癌の抑制物質と判定する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、胃癌の抑制物質をスクリーニングする方法や、（８）スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現量を検出することを特徴とする上記（６）又は（７）記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により同定された、ＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子、ＧＦＲＡ３遺伝子、及びＢＸ５３８２５４遺伝子の新規スプライシングバリアントは大腸癌、特に転移性大腸癌のマーカーや、胃癌のマーカーとなりうるものであり、これらのスプライシングバリアントの発現を検出することにより大腸癌又は胃癌の判定が可能である。さらに、大腸癌細胞又は胃癌細胞における上記スプライシングバリアントの発現量を指標として、大腸癌又は胃癌抑制剤のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ＡＲＨＧＤＩＢｓｖ２ｇ）と、既知ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ＡＲＨＧＤＩＢｓｖ１）とを比較した図である。図中、Ｆ１、Ｆ２、Ｒ１はＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの位置を、Ｆ３、Ｆ４、Ｒ２，Ｒ３はｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲに用いたプライマーの位置をそれぞれ示す。
【図２】本発明の新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）、及び、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）の各種大腸癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した結果を示す図である。図中、「origin」は各癌細胞株の由来を示しており、ＰＲは原発腫瘍を、ＳＵは鎖骨上部を、ＭＮは転移性結節を、ＡＳは腹水を、ＰＷは骨盤壁を、ＰＥは腹膜をそれぞれ示す。
【図３】本発明の新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）、及び、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）の各種大腸癌細胞における発現量の比（ｓｖ１／ｓｖ２ｇ）を示す図である。
【図４】本発明の新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）、及び、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）の各種胃癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した結果を示す図である。
【図５】本発明の新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）、及び、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）の各種胃癌細胞における発現量の比（ｓｖ１／ｓｖ２ｇ）を示す図である。
【図６】本発明の新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）、及び、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）の正常胃組織及び胃癌組織における発現を検討した結果を示す図である。
【図７】本発明の新規ＧＦＲＡ３スプライシングバリアント（ＧＦＲＡ３ｓｖ００２及びＧＦＲＡ３ｓｖ００３）と、既知ＡＧＦＲＡ３スプライシングバリアント（ＧＦＲＡ３ｓｖ００１及びＧＦＲＡ３ｓｖ２０１）とを比較した図である。図中、矢印はＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの位置を示す。
【図８】本発明の新規ＧＦＲＡ３スプライシングバリアントの各種大腸癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した結果を示す図である。
【図９】本発明の新規ＧＦＲＡ３スプライシングバリアントの各種胃癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した結果を示す図である。
【図１０】本発明の新規ＢＸ５３８２５４スプライシングバリアント（ＢＸ５３８２５４ｓｖ００１〜ｓｖ００６）と、既知ＡＧＦＲＡ３スプライシングバリアント（ＢＸ５３８２５４ｓｖ０００）とを比較した図である。図中、矢印はＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの位置を示す。
【図１１】本発明の新規ＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの各種大腸癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した結果を示す図である。
【図１２】本発明の新規ＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの各種胃癌細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、スプライシングバリアントとは、ゲノムＤＮＡの一次転写産物である不均質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）から、イントロンを切除し、エクソン配列を連結して最終的なｍＲＮＡ分子を形成するスプライシング過程において、異なるパターンのスプライシングが起こることにより産生される、特定のＤＮＡ配列によりコードされる領域を含む異なるｍＲＮＡ、その逆転写物である異なるｃＤＮＡ、及びそれらの翻訳産物である異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し、スプライスバリアントとしての異なるｍＲＮＡは、異なるエクソン・イントロン配列構造、また、場合によっては、異なる転写開始位置をもつこともあり、そのため、異なるスプライシングバリアントｍＲＮＡからは、異なるｃＤＮＡが逆転写され、また、異なるアミノ酸配列を有するタンパク質が翻訳される。上記ｍＲＮＡは、上記タンパク質の製造やｍＲＮＡのアンチセンス鎖からなるスプライシングバリアント検出用プローブの作製に有用であり、上記ｃＤＮＡは上記タンパク質の製造やスプライシングバリアント検出用プライマーセットの作製に有用であり、上記タンパク質は、スプライシングバリアント検出用抗体作製用の抗原として有用である。
【００１９】
本発明の大腸癌又は胃癌の診断用マーカー遺伝子のスクリーニング方法としては、（ａ）大腸癌細胞株ＳＷ４８０及び大腸癌細胞株ＳＷ６２０における遺伝子発現パターンを、エクソンアレイを用いて網羅的に解析する工程；（ｂ）上記大腸癌細胞株ＳＷ４８０及び大腸癌細胞株ＳＷ６２０において、異なるスプライシングパターンが認められる遺伝子を選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含むものであれば特に制限されず、かかるスクリーニング方法により、以下に示すようなスプライシングバリアントをマーカー遺伝子として具体的に得ることができる。本発明は、このようにして得られたスプライシングバリアントにも関する。
【００２０】
本発明のスプライシングバリアントとしては、（ｉ）配列番号７〜１２のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子のスプライシングバリアント；（ii）配列番号２２又は２３に示されるＤＮＡ配列からなるＧＦＲＡ３遺伝子のスプライシングバリアント；（iii）配列番号２６〜３１のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＢＸ５３８２５４遺伝子のスプライシングバリアント；の（ｉ）〜（iii）のいずれかのスプライシングバリアントであれば特に制限されず、また、本発明の大腸癌又は胃癌の判定法としては、被検者から採取した生体試料における、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出することにより大腸癌又は胃癌と判定する方法であれば特に制限されないが、スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現を検出する方法であることが好ましく、具体的には、例えば、生体試料における、本発明の配列番号７〜１２のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＡＲＨＧＤＩＢ（Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta）遺伝子の新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量と、配列番号１〜６のいずれかに示されるＤＮＡ配列によりコードされる領域を含まない既知のＡＲＨＧＤＩＢのスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量を比較検討し、本発明の新規スプライシングバリアントの発現が、既知のＡＲＨＧＤＩＢのスプライシングバリアントの発現より多い場合に、上記生体試料に大腸癌細胞が含まれていると判定する方法や、生体試料における、配列番号２２又は２３に示されるＤＮＡ配列からなるＧＦＲＡ３（GDNF family receptor-alpha 3）遺伝子の新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量と、配列番号２０又は２１に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＧＦＲＡ３の既知のスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量を比較検討し、本発明の新規スプライシングバリアントの発現が、既知のＧＦＲＡ３のスプライシングバリアントの発現より多い場合に、上記生体試料に大腸癌細胞が含まれていると判定する方法や、生体試料における、本発明の配列番号２６〜３１のいずれかに示されるＤＮＡ配列からなるＢＸ５３８２５４遺伝子の新規スプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量と、既知のＢＸ５３８２５４のスプライシングバリアントｓｖ０００のｍＲＮＡ発現量を比較検討し、本発明の新規スプライシングバリアントの発現が、既知のＢＸ５３８２５４のスプライシングバリアントの発現より多い場合に、上記生体試料に大腸癌細胞が含まれていると判定する方法等を好適に示すことができる。
【００２１】
上記生体試料としては、被検者から採取した組織、細胞、血液、便などであっても、これらの試料から作製した培養細胞であってもよく、また、被検者から手術等により切除したリンパ節組織や、生検などによりリンパ節から採取された複数のリンパ節細胞を含有する試料を用いることにより、原発巣からこのリンパ節組織に癌細胞が転移しているか否かを判定することができる。また、上記スプライシングバリアントの発現を検討する方法としては、ＲＮＡ−ＦＩＳＨ法や、ＲＴ−ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等のスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現を検出する方法や、ＥＬＩＳＡ法や、免疫染色法や、ウエスタンブロット法等のスプライシングバリアントのタンパク発現を検出する方法を例として好適に挙げることができ、複数の検出方法を組み合わせて行うことがより好ましい。
【００２２】
本発明の大腸癌又は胃癌の判定用キットとしては、本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた大腸癌又は胃癌の判定用キットであれば特に制限されるものではなく、ＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとしては、具体的には、配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセット（Ｆ２、Ｒ１）や、１８及び１９に示される塩基配列からなるプライマーセット（Ｆ４、Ｒ３）を、ＧＦＲＡ３遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとしては、具体的には、配列番号２４及び２５に示される塩基配列からなるプライマーセットを、ＢＸ５３８２５４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマーセットとしては、具体的には、配列番号３２及び３３に示される塩基配列からなるプライマーセットを、それぞれ好適に例示することができる。また、上記プローブとしては、配列番号１〜６のいずれかに示される塩基配列に相当するＲＮＡとハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部からなるプローブであればとくに制限されるものではないが、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記ＲＮＡと一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることもできる。
【００２３】
上記標識物としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。
【００２４】
本発明の大腸癌抑制物質のスクリーニング方法としては、（ａ）大腸癌細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、該培養細胞における、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定する工程；（ｂ）被検物質の存在下における上記スプライシングバリアントの発現量が、被検物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、該被検物質を大腸癌の抑制物質と判断する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、大腸癌の抑制物質をスクリーニングする方法であれば特に制限されず、より具体的には、大腸癌細胞を、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下で培養し、該培養細胞における、少なくとも１以上の本発明のスプライシングバリアントの発現量を測定し、スプライシングバリアントの発現量が、被検物質非存在下における場合と比べて有意に減少しているとき、被検物質は大腸癌抑制物質として有用である可能性があるといえる。また、上記大腸癌細胞としては、初代培養細胞であっても、株化培養細胞株であってもよいが、ヒト由来の株化大腸癌細胞であることが好ましく、具体的には、Ｌｏｖｏ、ＤＬＤ−１、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ９４８、ＳＫ−ＣＯ−１、ＨＣＣ−５６、ＬＳ１２３、Ｃ１７０、ｃｏｌｏ７４１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０等の株化細胞を好適に例示することができる。また、上記スプライシングバリアントの発現量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法や、リアルタイムＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等のスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量を測定する方法であっても、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法等のスプライシングバリアントのタンパク発現量を測定する方法であってもよいが、複数の測定方法を組み合わせて行うことがより好ましい。
【００２５】
本発明の胃癌抑制物質のスクリーニング方法としては、（ａ）胃癌細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、該培養細胞における、上記本発明のスプライシングバリアントのうち、少なくとも１以上のスプライシングバリアントの発現量を測定する工程；（ｂ）被検物質の存在下における上記スプライシングバリアントの発現量が、被検物質の非存在下における発現量と比較して低下した場合に、該被検物質を胃癌の抑制物質と判断する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次含む、胃癌の抑制物質をスクリーニングする方法であれば特に制限されず、より具体的には、胃癌細胞を、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下で培養し、該培養細胞における、少なくとも１以上の本発明のスプライシングバリアントの発現量を測定し、スプライシングバリアントの発現量が、被検物質非存在下における場合と比べて有意に減少しているとき、被検物質は胃癌抑制物質として有用である可能性があるといえる。また、上記胃癌細胞としては、初代培養細胞であっても、株化培養細胞株であってもよいが、ヒト由来の株化胃癌細胞であることが好ましく、具体的には、ＨＧＣ−２７、ＮＣＬ−Ｎ８７、Ｈｓ７４６Ｔ、ＡＧ５、ＮＣＬ−ＳＮＵ−１６、ＮＣＬ−ＳＮＵ−１、ＫＡＴＡＩＩＩ、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ１、ＡＺ５２１−Ｐ７ａ−１Ｇ３、ＡＺ５２１−Ｐ７ａ−ＡＳＣ、ＡＺ５２１、ＭＫＮ４５Ｐ１４ＧＡ、ＭＫＮ４５等の株化細胞を好適に例示することができる。また、上記スプライシングバリアントの発現量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法や、リアルタイムＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等のスプライシングバリアントのｍＲＮＡ発現量を測定する方法であっても、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法等のスプライシングバリアントのタンパク発現量を測定する方法であってもよいが、複数の測定方法を組み合わせて行うことがより好ましい。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
[エクソンアレイによる解析]
同一大腸癌患者に由来する２種類の大腸癌細胞株ＳＷ４８０（転移能が無い；American Type Culture Collection）と、ＳＷ６２０（高転移能を有する；American Type Culture Collection）とを培養し、それぞれの細胞より全ＲＮＡを抽出した。Whole Transcript Sense Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix社製）を用いてｍＲＮＡの精製、逆転写およびラベル化を行い、GeneChip Exon Array System for Human（Affymetrix社製）によるエクソンレベルでの網羅的遺伝子発現解析を行った。得られたアレイデータの解析はPartek Genomics Suite（Partek社製）を用いて行い、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０における遺伝子発現パターンの違いを比較検討した。
【実施例２】
【００２８】
[ＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子スプライシングパターン解析]
実施例１の結果から、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０において異なるスプライシングパターンの存在が示唆された遺伝子に関して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、シークエンスを確認した。その結果、ＳＷ６２０において強い発現が認められるＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子の新規な第１エクソン領域を同定した。図１に示すように、ＡＲＨＧＤＩＢの新規な第１エクソンには６種類のバリエーションが存在し、それぞれｓｖ２ａ〜ｓｖ２ｆと命名した（ｓｖ２ａ〜ｓｖ２ｆを総称してｓｖ２ｇとする）。新規エクソンの配列を配列番号１〜６に、新規ＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子スプライシングバリアントの配列を配列番号７〜１２に示す。
【実施例３】
【００２９】
[大腸癌細胞株におけるＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアントの発現]
正常大腸組織及び１２種類の株化大腸癌細胞における、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）及び、新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）の発現を、配列番号１３〜１９に示される塩基配列からなるプライマーセットをＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。図２に結果を示すように、ｓｖ１は正常組織では高発現していたが、ほとんどの癌細胞株では低発現あるいは発現が確認できなかった。一方、ｓｖ２ｇの発現は正常組織では全く確認できなかったが、転移性及び原発性の多くの大腸癌細胞株で高発現していることが明らかとなった。また、定量化したｓｖ１及びｓｖ２の発現量の比（ｓｖ１／ｓｖ２ｇ）を図３に示す。
【実施例４】
【００３０】
[胃癌細胞株におけるＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアントの発現]
正常胃組織及び１４種類の株化胃癌細胞における、既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）、及び、新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。図４に結果を示すように、ｓｖ１は正常組織では高発現していたが、ｓｖ２ｇの発現は正常組織では全く確認できなかった。また、ｓｖ２ｇは転移性及び原発性の多くの大腸癌細胞株で高発現していることが明らかとなった。定量化したｓｖ１及びｓｖ２の発現量の比（ｓｖ１／ｓｖ２ｇ）を図５に示す。
【実施例５】
【００３１】
[胃癌組織におけるＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアントの発現]
文書でインフォームド・コンセントの得られた患者１０例と、健常人１例を採取源として、胃癌組織と正常胃組織を内視鏡を用いて採取した。それぞれのサンプルにおける既知のＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ１）、及び、新規ＡＲＨＧＤＩＢスプライシングバリアント（ｓｖ２ｇ）の発現をＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。コピー数解析の結果を図６に示す。正常胃組織における、ＡＲＨＧＤＩＢｓｖ２ｇのコピー数は０であったのに対し、胃癌組織においてはＡＲＨＧＤＩＢｓｖ２ｇのコピー数が増加していることが明らかとなった。
【実施例６】
【００３２】
[ＧＦＲＡ３遺伝子スプライシングパターン解析]
実施例１の結果から、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０において異なるスプライシングパターンの存在が示唆された遺伝子に関して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、シークエンスを確認した。その結果、ＧＦＲＡ３遺伝子の新規な第６エクソン領域を同定した。図７に示すように、ＧＦＲＡ３の新規な第６エクソンには２種類のバリエーションが存在し、それぞれｓｖ００２、ｓｖ００３と命名した。既知のＧＦＲＡ３ｓｖ００１及びＧＦＲＡ３ｓｖ２０１の塩基配列を配列番号２０及び２１に、新規のＧＦＲＡ３ｓｖ００２及びＧＦＲＡ３ｓｖ００３の配列を配列番号２２及び２３にそれぞれ示す。
【実施例７】
【００３３】
[大腸癌細胞株におけるＧＦＲＡ３スプライシングバリアントの発現]
正常大腸組織及び１２種類の株化大腸癌細胞における、新規のＧＦＲＡ３スプライシングバリアントｓｖ００２及びｓｖ００３の発現を、配列番号２４及び２５に示される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。図８に結果を示すように、ＧＦＲＡ３スプライシングバリアントｓｖ００２及びｓｖ００３は正常組織では発現していなかったが、いくつかの癌細胞株では高発現していることが明らかとなった。
【実施例８】
【００３４】
[胃癌細胞株におけるＧＦＲＡ３スプライシングバリアントの発現]
正常胃組織及び１４種類の株化胃癌細胞における、新規のＧＦＲＡ３スプライシングバリアントｓｖ００２及びｓｖ００３の発現を、配列番号２４及び２５に示される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。図９に結果を示すように、ＧＦＲＡ３スプライシングバリアントｓｖ００２及びｓｖ００３は正常組織では発現していなかったが、いくつかの癌細胞株では発現していることが明らかとなった。
【実施例９】
【００３５】
[ＢＸ５３８２５４遺伝子スプライシングパターン解析]
実施例１の結果から、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０において異なるスプライシングパターンの存在が示唆された遺伝子に関して、ＲＴ−ＰＣＲを行い、シークエンスを確認した。その結果、ＢＸ５３８２５４遺伝子の新規な第３〜５エクソン領域を同定した。図１０に示すように、ＢＸ５３８２５４には６種類の新規のスプライシングバリアントが存在し、それぞれｓｖ００１〜ｓｖ００６と命名した。６種の新規ＢＸ５３８２５４巣プライシングバリアントの塩基配列を配列番号２６〜３１に示す。
【実施例１０】
【００３６】
[大腸癌細胞株におけるＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの発現]
正常大腸組織及び１２種類の株化大腸癌細胞における、新規ＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの発現を、配列番号３２及び３３に示される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。図１１に結果を示すように、正常組織におけるＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの発現はわずかに認められたが、いくつかの癌細胞株では高発現していることが明らかとなった。
【実施例１１】
【００３７】
[胃癌細胞株におけるＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの発現]
正常胃組織及び１４種類の株化胃癌細胞における、新規ＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントの発現を、配列番号３２及び３３に示される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ及びｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより検討した。図１２に結果を示すように、新規ＢＸ５３８２５４スプライシングバリアントは正常組織ではわずかな発現しか認められなかったが、多くの癌細胞株では高発現していることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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