(57)【要約】【課題】表面光反射を用いた、化学・バイオセンサーに好適な高感度な表面吸着量測定が可能な金属薄膜含有積層構造を提供する。【解決手段】基板上に中間薄膜層を介して金属薄膜を形成してなり；該基板の少なくとも該中間薄膜層に接する表面と、該金属薄膜とは、可視光領域に光吸収帯域を有する金属からなり；そして該中間薄膜層は、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜とは異なる材料からなり、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜との層間で、多重反射により入射光の反射率を低下させる、反射スペクトル測定用金属薄膜含有積層構造。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に中間薄膜層を介して金属薄膜を形成してなり；該基板の少なくとも該中間薄膜層に接する表面と、該金属薄膜とは、可視光領域に光吸収帯域を有する金属からなり；そして該中間薄膜層は、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜とは異なる材料からなり、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜との層間で、多重反射により入射光の反射率を低下させる、反射スペクトル測定用金属薄膜含有積層構造。
【請求項２】
基板は、少なくとも該中間薄膜層に接する表面が可視光領域に光吸収帯域を有する金属からなる請求項１に記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項３】
可視光領域に光吸収帯域を有する金属が金または銅である請求項１または２に記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項４】
中間薄膜層が金属酸化物、有機無機複合体、有機物もしくは金属から選ばれる請求項１〜３のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項５】
金属薄膜の厚さが０．１〜１００ｎｍである請求項１〜４のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項６】
金属基板が水晶発振子の金属電極である請求項１に記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項７】
金属薄膜上にさらに測定対象薄膜を吸着させた請求項１〜６のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項８】
測定対象薄膜が、金属薄膜表面に吸着され得、かつ測定媒体とは異なる材料からなる請求項７に記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項９】
測定対象薄膜がタンパク質、核酸、糖鎖、合成高分子化合物および低分子化合物から選ばれる請求項８に記載の金属薄膜含有積層構造。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造において、測定対象薄膜に光を照射し、測定媒体中で反射スペクトルの変化を測定することにより測定対象薄膜の膜厚または質量を測定する薄膜の膜厚または質量測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は反射スペクトル測定用金属薄膜含有積層構造に関し、さらに詳しくは水晶発振子マイクロバランスに好適に適用し得る金属薄膜含有積層構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学センサーやバイオセンサーによる測定のための、表面を用いた分子認識、反応解析装置としては、これまで表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス法が主に用いられてきた。これらは表面吸着膜厚を、光学的手法および電気機械音響類似という異なる物理的な概念を用いることにより測定する装置であり、高感度であることが知られている。しかしながら、表面に吸着した物質の粘弾性の変化が、測定値に無視できない影響を与えることのあることが近年明らかにされている。特に水晶発振子マイクロバランス法は振動を用いた手法であり、水晶振動子の電極表面に物質が付着するとその質量に応じて共振周波数が減少する性質を利用し極めて微量な質量変化を計測し得るが、物質の動的な特性に大きく影響を受けることが分かってきた。具体的には、粘性の大きな物質が表面に吸着すると実際よりも重く感じてしまい、タンパク質の種類によっては3倍近くも差が生じる場合がある。
【０００３】
逆にこの光学と振動を用いる二つの手法を組み合わせることによって、理想的な測定値からの偏差をそれぞれ求めることによって、表面吸着物質の粘弾性などの動的な特性を同時測定する新たな手法を創出できると考えられた。しかしながら、水晶発振子と表面プラズモン共鳴を同時測定することは、装置の構成上行うことができなかった。
【０００４】
一方で、表面吸着物質量を光学的に検出する手法として金の異常反射を用いる研究がなされてきた。この手法は、表面プラズモン共鳴法に比べると感度は十分の一程度となるが、金表面からの反射光を測定するだけなので、水晶発振子と組み合わせることが容易に可能であった。そこで、金の異常反射法と水晶発振子マイクロバランス法を組み合わせた装置を開発し、表面吸着タンパク質の測定を行ったところ、タンパク質固有の動的特性を測定することができた。
【０００５】
しかしながら、金の異常反射による変化はタンパク質が一層金電極上に吸着した場合でも１％程度であり、通常の装置では検出限界に近い。
【０００６】
金の表面に物質が吸着すると、その量に応じて近紫外から紫外の領域にかけての波長の光の反射率が比較的大きく低下することが既に知られている。すなわち、二つの物質の界面での光の反射率は、屈折率と消光係数によって決定される。金の場合はこの誘電体としての特性から、反射率の波長依存性は470 nm付近に極小値を持つ。ここで例えば470 nmの波長の光が表面に照射されると、金の表面に薄膜がある場合、金と薄膜、薄膜と媒体との間の反射が多重におこり、より反射率が低下する。この反射率低下が膜厚変化に対して比例的におこるため、これを利用した膜厚測定が可能となる。
【０００７】
この現象は金の異常反射といわれ、表面への吸着物質量を定量化する新たな手法としての応用の検討がなされているが、反射率の変化量は実際には既存の装置で検出するには限界に近い(たとえば、非特許文献１)。
【０００８】
金の屈折率および消光係数を最適化することで反射率低下を大きくする試みも行われており、金に代えて金と酸化銀の合金を用いることにより、２倍程度まで感度が向上したとする報告もあるが、さらなる向上が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】M.Watanabe et al. Sens.Actuators, B,2003,89,126-130
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明は、上記応答量を改善し、感度を向上させることの出来る金薄膜表面を作り出し、表面光反射を用いた、化学・バイオセンサーに好適な高感度な表面吸着量測定が可能な金属薄膜含有積層構造を提供することを課題とする。光反射率変化が大きくなるような新たな金等の表面修飾手法を見出すことにより、高感度に表面吸着物質量を定量化し得る金属薄膜含有積層構造を提供するものである。本発明の反射スペクトル測定用金属薄膜含有積層構造は、水晶発振子の金電極等に適用した場合にも、発振子としての特性に影響を与えない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明は、上記の課題を解決するために以下の発明を提供する。
（１）基板上に中間薄膜層を介して金属薄膜を形成してなり；該基板の少なくとも該中間薄膜層に接する表面と、該金属薄膜とは、可視光領域に光吸収帯域を有する金属からなり；そして該中間薄膜層は、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜とは異なる材料からなり、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜との層間で、多重反射により入射光の反射率を低下させる、反射スペクトル測定用金属薄膜含有積層構造；
（２）基板が非金属基板の表面に金属層を形成して該中間薄膜層に接する表面とした上記（１）に記載の金属薄膜含有積層構造；
（３）可視光領域に光吸収帯域を有する金属が金または銅である上記（２）に記載の金属薄膜含有積層構造；
（４）中間薄膜層が金属酸化物、有機無機複合体、有機物もしくは金属から選ばれる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造；
（５）金属薄膜の厚さが０．１〜１００ｎｍである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造；
（６）金属基板が水晶発振子の金属電極である上記（１）に記載の金属薄膜含有積層構造；
（７）金属薄膜上にさらに測定対象薄膜を吸着させた上記（１）〜（６）のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造；
（８）測定対象薄膜が、金属薄膜表面に吸着され得、かつ測定媒体とは異なる材料からなる上記（７）に記載の金属薄膜含有積層構造；
（９）測定対象薄膜がタンパク質、核酸、糖鎖、合成高分子化合物および低分子化合物から選ばれる上記（８）に記載の金属薄膜含有積層構造；ならびに
（１０）上記（７）〜（９）のいずれかに記載の金属薄膜含有積層構造において、測定対象薄膜に光を照射し、測定媒体中で反射スペクトルの変化を測定することにより測定対象薄膜の膜厚または質量を測定する薄膜の膜厚または質量測定方法、
である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、表面光反射を用いた、化学・バイオセンサーに好適な高感度な表面吸着量測定が可能な反射スペクトル測定用金属薄膜含有積層構造を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】未修飾金基板および修飾基板を用いたとき、水晶発振子マイクロバランスの周波数変化に対する反射率変化を示す一例。
【図２】未修飾金基板および修飾基板を用いたとき、反射率応答に対する増幅比を示す一例。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本願発明は、基板上に中間薄膜層を介して金属薄膜を形成してなる。基板の少なくとも中間薄膜層に接する表面と、金属薄膜とは、互いに相異なっていてもよい、可視光領域に光吸収帯域を有する金属からなる。
【００１５】
基板は、少なくとも中間薄膜層に接する表面が可視光領域に光吸収帯域を有する金属からなる。たとえば基板としては、水晶発振子の金電極自体を用いることができる。
【００１６】
また、基板は非金属基板等の表面に、可視光領域に光吸収帯域を有する金属層を形成することにより中間薄膜層に接する表面としたものも好適である。このための基板としては、一般的にはガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シリコン、石英等が使用される。基板の厚さは特には限定されないが、通常０．１〜２mm程度である。金属層の厚さは１ｎｍ〜２ｍｍ程度から選ばれる。
【００１７】
金属層の形成は常法によることでき、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、好ましくは、均一に膜形成が可能な手法である、スパッタ法、蒸着法である。
【００１８】
可視光領域に光吸収帯域を有する金属としては、金または銅を主体とする金属が好適であり、上記の反射率低下の大きさから金層が最適である。これらの金属は、純金属またはそれらの合金を含む。それらは少量の他の金属、たとえば銀、等との合金であってもよく、２０ｗｔ％以下程度の少量の酸化物、たとえば酸化銀、酸化イリジウム、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化銅等、を含有していてもよい。
【００１９】
中間薄膜層は、多重反射により入射光の反射率を低下させるために、該基板の該中間薄膜層に接する表面と該金属薄膜とは異なる材料からなり、厚さは０．１〜８００ｎｍ、好ましくは０．１〜４００ｎｍであり、さらに好適には１〜１００ｎｍ、最適には２〜１０ｎｍである。厚さが０．１ｎｍより小さいと反射率を低下させることが期待できず、一方厚さが８００ｎｍを超えると定量性が不良となる。
【００２０】
中間薄膜層としては金属酸化物、有機・無機酸化物複合体、有機物もしくは金属から選ばれるのが好適である。
【００２１】
たとえば、この中間薄膜層は、金等の基板表面にアルカンチオール、タンパク質、糖鎖、核酸、合成高分子（シロキサン誘導体等）、等の有機物；シリカ表面に共有結合で有機物の官能基が修飾されたシリカ修飾物、等の有機・無機酸化物複合体；シリカ、チタニア、ジルコニア、アルミナ等の金属酸化物；銀、アルミニウム等の金属、を物理吸着、化学結合、縮合反応、真空蒸着、スパッタ法等の方法によって上記の厚みで積層するのが好ましい。中間薄膜層として、金属を用いる場合には金属基板の中間薄膜層に接する部分と金属薄膜とは異なる金属が用いられる。たとえば、金属基板の中間薄膜層に接する部分と金属薄膜とが金である場合には、銀を使用し得る。
【００２２】
たとえば金とシリカ等の無機酸化物のような、基板表面と中間薄膜層の組み合わせによって、その接着性が不十分である恐れがある場合には、その接着性を向上させるために、中間薄膜層は、基板表面と中間薄膜層の両方に接着性の良好な接着剤薄膜層を基板表面側に有することができる。
【００２３】
さらに中間薄膜層上に、金等の金属薄膜を０．１〜４００ｎｍ、好適には１〜１００ｎｍ、さらに好適には２〜１０ｎｍ程度、蒸着、スパッタ等により積層させて、光検知表面が作成される。これにより、物質吸着による反射率変化が通常の金表面に比較して著しく上昇するので高感度測定が可能となる。
【００２４】
反射スペクトル測定に際しては、金属薄膜上にさらに測定対象薄膜を吸着させ、測定対象薄膜に光を照射し、その変化を測定することにより薄膜の膜厚または質量が測定される。
【００２５】
測定対象薄膜としては、金属薄膜表面に吸着され得、かつ測定媒体とは異なる材料からなるものであれば特に制限されないが、好ましくはタンパク質、核酸、糖鎖、合成高分子等の有機物、エタノール、アセトン等のアルコール類、ケトン類等の低分子化合物から選ばれる。
【００２６】
たとえば水晶発振子の金電極表面に中間薄膜層を形成させ、さらにその上に金薄膜を蒸着あるいはスパッタ法により積層させた後に、この表面に対して光を照射し、測定媒体中で反射スペクトルを測定しながら、タンパク質を吸着させる。タンパク質が水晶発振子の表面に吸着すると振動数は減少するが、その変化に対して、反射スペクトル変化が未修飾の金基板よりも大きく変化し、高感度測定が達成される。このようにして、測定媒体中で反射スペクトルの変化を測定することにより測定対象薄膜の膜厚または質量を測定することができる。水晶発振子を用いる測定法自体は通常の水晶発振子マイクロバランス法によることができる。
【００２７】
測定媒体は、空気等の気体または水等の液体のいずれでもよい。すなわち、本願発明の金属薄膜含有積層構造は、たとえば金基板／中間薄膜層／金薄膜／測定対象薄膜／測定媒体という積層構造とすることで、各層間における多重反射が多重に起こることで金による吸収が効率よくおこり、光の反射率が大きく低下するので高感度測定が達成されると推察される。この構成では、測定対象薄膜はあくまで金表面に吸着するので、化学的にもこれまでの金表面と同様に扱えることになる。また、金を微粒子化することによって光応答を検出する局在プラズモン共鳴法に対して、本法は表面の凹凸がないので、この修飾を水晶発振子に対して行う場合、発振特性に対して悪影響もない利点がある。
【００２８】
本発明の表面修飾を行う場合、金基板をそのまま用いていた場合に比べ、同一のタンパク質が同一量表面に吸着した場合の470 nmの光の反射率変化を大きく向上し得る。本発明によれば、反射光強度測定に有用である金属薄膜含有積層構造を提供し得る。
【実施例】
【００２９】
実施例１  （表面修飾法１）
２７MHz水晶発振子の金電極（2.5 mm φ）を過酸化水素水：濃硫酸（１：３）溶液（ピランハ溶液）により３分間二回洗浄後、真空蒸着器により銀を40 オングストローム蒸着した。さらに、その上に金を40 オングストローム蒸着した。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例２  （表面修飾法２）
２７MHz水晶発振子の金電極（2.5 mmφ）を過酸化水素水：濃硫酸（１：３）溶液（ピランハ溶液）により３分間二回洗浄後、真空蒸着器により銀を90 オングストローム蒸着した。さらに、その上に金を40 オングストローム蒸着した。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例３  （表面修飾法３）
２７MHz水晶発振子の金電極（2.5 mmφ）を過酸化水素水：濃硫酸（１：３）溶液（ピランハ溶液）により３分間二回洗浄後、1 mg/mLのBSA（牛血清アルブミン）水溶液に１時間浸し、BSAを金基板上に一層物理吸着させた。乾燥後、この上に真空蒸着器により金を40 オングストローム蒸着した。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例４  （表面修飾法４）
２７MHz水晶発振子の金電極（2.5 mmφ）を過酸化水素水：濃硫酸（１：３）溶液（ピランハ溶液）により３分間二回洗浄後、1 mg/mLのデカンチオールエタノール溶液に１晩浸し、自己集合膜を金表面上に形成させた。エタノール洗浄し、乾燥後、この上に真空蒸着器により金を40 オングストローム蒸着した。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例５  （表面修飾法５）
２７MHz水晶発振子の金電極（2.5 mmφ）を過酸化水素水：濃硫酸（１：３）溶液（ピランハ溶液）により３分間二回洗浄後(ピランハ処理)、20 μLオルトケイ酸テトラメチルを乗せ、一時間放置した。アセトン、水で洗浄後、乾燥した。この上に真空蒸着器により金を40 オングストローム蒸着した。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例６  （表面修飾法６）
実施例５においてオルトケイ酸テトラメチルの代わりにオルトケイ酸テトラエチルを用いる外は同様の操作を行い、金表面修飾を行った。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例７  （表面修飾法７）
実施例５においてオルトケイ酸テトラメチルの代わりにチタンテトライソプロポキシドを用いる外は同様の操作を行い、金表面修飾を行った。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例８  （表面修飾法８）
実施例５においてオルトケイ酸テトラメチルの代わりにジルコニウムイソプロポキシド（７０％ヘプタン溶液）を用いる外は同様の操作を行い、金表面修飾を行った。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例９  （表面修飾法９）
２７MHz水晶発振子の金電極（2.5 mmφ）を過酸化水素水：濃硫酸（１：３）溶液（ピランハ溶液）により３分間二回洗浄後、4 mM 3,3’-ジチオジプロピオン酸(-[S(CH２) ２COOH] ２)水溶液中に１時間浸し、自己集合化膜(SAM)を形成した。水洗後、電極上に100 mg/mLの 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド (EDC)水溶液20 μLと100 mg/mL のN-ヒドロキシスクシイミド (NHS)水溶液20μLを乗せ、ピペッティングにより混和した。これを３０分静置し、SAM表面のカルボン酸を活性化した。水洗後この発振子をさらに、1 mg/mlのオクタ(3-アミノプロピル)オクタシルセスキオキサン(POSS-NH２)の水：アセトン（４：１）溶液に３時間浸漬した。水洗、乾燥後、この上に真空蒸着器により金を45 オングストローム蒸着した。金蒸着後ピランハ処理を一回行った。
実施例１０〜１８  （表面修飾法１０〜１８）
金蒸着量を38, 39, 40, 43, 44, 46, 48, 54, 60オングストロームとする外は実施例９と同様に操作を行い修飾金基板を作成した。
実施例１９〜３６  （水晶発振子、光反射応答測定１〜１８）
実施例１から１８で作成した修飾金電極を有するそれぞれの水晶発振子を、1 x 2 x 4 cmのガラスセルに入れた4 mLの純水中に浸し、発振回路により発振させた。発振の振動数はユニバーサルカウンターによりモニターした。また、電極表面にはガラスを通してバンドル型光ファイバーにより白色LEDからの光を照射し、反射光をバンドルされた７本のうち一本の光ファイバーを通して分光器に入れ、470 nmの反射光強度を測定した。振動数、反射光強度が一定となったところで、BSA水溶液(1 mg/mL)を100μLセルに打ち込み、BSAの電極表面への物理吸着に基づく振動数変動と、反射光強度変動を経時的に追跡した。図１に示したように、実施例２７では、通常の金の応答に比べ、５〜６倍感度が上昇した。図１は、未修飾金基板（○）および実施例９の修飾基板（□）によるBSA吸着時の水晶発振子マイクロバランスの周波数変化に対する反射率変化を示す（実施例27）。
【００３０】
また、実施例27〜36での結果から、蒸着金薄膜の膜厚に依存して感度が変化することもわかった。図２は、実施例9〜18で作成した修飾水晶発振子に対するBSA吸着実験時（実施例  27〜36）の、未修飾Au基板へのBSA吸着時の反射率応答に対する増幅比を示す。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によれば、表面光反射を用いた、化学・バイオセンサーに好適な高感度な表面吸着量測定が可能な金属薄膜含有積層構造を提供し得る。
【図１】
2010210520.tif 000003
【図２】
2010210520.tif 000004