(57)【要約】【課題】製品、デバイス、および表面のコーティング、細胞のカプセル化および埋込みに適したポリマーを提供することであり、これらのポリマーは、埋込みに続いてより長期間の生体適合性、または、少ない異物応答、を有する。【解決手段】本発明は、カプセルを含む組成物であって、前記カプセルは、架橋したヒドロゲルを含み１５０μｍ〜５ｃｍの平均直径を有し、かつ生体材料をカプセル化しており、前記架橋したヒドロゲルは、１種もしくは複数の式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーを含む修飾されたアルギネートポリマー2020023582.tif 000135を含む、組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプセルを含む組成物であって、
前記カプセルは、架橋したヒドロゲルを含み、１５０μｍ〜５ｃｍの平均直径を有し、かつ生体材料をカプセル化しており、
前記架橋したヒドロゲルは、１種もしくは複数の式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーを含む修飾されたアルギネートポリマー
【化１Ｃ】
2020023582.tif 000096
［式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化２Ｃ】
2020023582.tif 000097
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒ１は、独立に、少なくとも１つの共有結合的に修飾されたモノマーにおいて
【化３Ｃ】
2020023582.tif 000098
であり、式ＸおよびＸＩＩの化合物について、
ｚは、０〜５の整数であり、
ｋは、１〜１０の整数であり、
Ｘｄは、非存在、ＯまたはＳであり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化４Ｃ】
2020023582.tif 000099
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
ＲａおよびＲｃは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化５Ｃ】
2020023582.tif 000100
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、複素環式環または
【化６Ｃ】
2020023582.tif 000101
を形成し、式中、Ｒ８、Ｒ９、または両方は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、
【化７Ｃ】
2020023582.tif 000102
、カルビノール、
【化８Ｃ】
2020023582.tif 000103
であり、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化９Ｃ】
2020023582.tif 000104
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
ｙは、０〜１１の整数であり、Ｒｅは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化１０Ｃ】
2020023582.tif 000105
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、およびポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、
Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０〜５の整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４’であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４’であり、Ｒ４’は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ
【化１１Ｃ】
2020023582.tif 000106
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、または置換複素環であり、
Ｒ１が式Ｘであるとき、少なくとも１個のＲａが、式ＸＩＩＩによって定義され、またはＲ１が式ＸＩＩであるとき、少なくとも１個のＲｃが、式ＸＩＩＩによって定義され、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化１２Ｃ】
2020023582.tif 000107
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化１３Ｃ】
2020023582.tif 000108
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化１４Ｃ】
2020023582.tif 000109
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｘ＊は、酸素または硫黄であり、
ＲおよびＲ＊は独立に、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、または−（ＣＨ２）ｍ’−Ｒ”であり；Ｒ”は、ヒドロキシ基、置換もしくは非置換カルボニル基、アリール、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、複素環、または多環を表し；ｍ’は、０または１〜８の範囲の整数であり、
−Ｒ６−Ｒｂについて、
Ｒ６は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒｂは、
【化１５Ｃ】
2020023582.tif 000110
である］
を含む、組成物。
【請求項２】
Ｒ８およびＲ９は、両方ともには水素ではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カプセルが、１ｍｍ〜８ｍｍの直径を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記カプセルが、１ｍｍ〜４ｍｍの直径を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記生体材料が、細胞である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞が、異種組織からの細胞、屍体からの細胞、幹細胞、幹細胞に由来する細胞、細胞系からの細胞、初代細胞、初期化された細胞、初期化された幹細胞、初期化された幹細胞に由来する細胞、遺伝子操作された細胞、またはこれらの組合せを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞が、インスリン産生細胞である、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞が、膵島細胞である、請求項５から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記修飾されたアルギネートが、イオン架橋されているか、またはイオン架橋されておりかつ共有結合的に架橋されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヒドロゲルが、修飾されていないアルギネートをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルが、アルギネートではない、修飾されていないヒドロゲル形成ポリマーをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記カプセルが、１．０ｍｍ〜１．５ｍｍの直径を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カプセルが、１ｍｍ〜２ｍｍの直径を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記カプセルが、１．５ｍｍ〜３ｍｍの直径を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヒドロゲルが、イオン架橋されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カプセルが、１ｍｍ〜３ｍｍの直径を有し、かつ前記ヒドロゲルが、前記修飾されたアルギネートポリマーと未修飾のアルギネートとの混合物から調製される、請求項１から１１または１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記修飾されていないアルギネートが、約５０，０００Ｄａ〜約１５０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１１または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーにおいて、Ｒ１が、独立に、
【化１６Ｃ】
2020023582.tif 000111
または−Ｒ６−Ｒｂである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｒ６が、−ＣＨ２−アリール−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−であり、
Ｒ４が、水素であり、
Ｒ８が、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＯＨであり、
Ｒ９が、メチル、−ＣＯＣＨ３、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、
【化１７Ｃ】
2020023582.tif 000112
である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化１８Ｃ】
2020023582.tif 000113
である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化１９Ｃ】
2020023582.tif 000114
、メチル、−ＣＯＣＨ３、または−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｘが酸素またはＮＲ４であり、Ｒ４が、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＣＨ３である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーが、
【化２０Ｃ】
2020023582.tif 000115
である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーが、
【化２１Ｃ】
2020023582.tif 000116
である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記カプセルが、哺乳動物への投与または埋込み後、２週間またはそれよりも長く、線維化効果が実質的にない、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記カプセルが、哺乳動物への投与または埋込み後、３カ月またはそれよりも長く、線維化効果が実質的にない、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ヒトまたは動物患者における疾患または障害の処置のための、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、前記ヒトまたは動物患者に埋め込まれるか、または移植されることを特徴とする、組成物。
【請求項２９】
１種もしくは複数の式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーを含む修飾されたアルギネートポリマー
【化２２Ｃ】
2020023582.tif 000117
［式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化２３Ｃ】
2020023582.tif 000118
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒ１は、独立に、少なくとも１つの共有結合的に修飾されたモノマーにおいて
【化２４Ｃ】
2020023582.tif 000119
であり、式ＸおよびＸＩＩの化合物について、
ｚは、０〜５の整数であり、
ｋは、１〜１０の整数であり、
Ｘｄは、非存在、ＯまたはＳであり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化２５Ｃ】
2020023582.tif 000120
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
ＲａおよびＲｃは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化２６Ｃ】
2020023582.tif 000121
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、複素環式環または
【化２７Ｃ】
2020023582.tif 000122
を形成し、式中、Ｒ８、Ｒ９、または両方は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、
【化２８Ｃ】
2020023582.tif 000123
、カルビノール、
【化２９Ｃ】
2020023582.tif 000124
であり、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化３０Ｃ】
2020023582.tif 000125
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
ｙは、０〜１１の整数であり、Ｒｅは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化３１Ｃ】
2020023582.tif 000126
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、およびポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、
Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０〜５の整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４’であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４’であり、Ｒ４’は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化３２Ｃ】
2020023582.tif 000127
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、または置換複素環であり、
Ｒ１が式Ｘであるとき、少なくとも１個のＲａが、式ＸＩＩＩによって定義され、またはＲ１が式ＸＩＩであるとき、少なくとも１個のＲｃが、式ＸＩＩＩによって定義され、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化３３Ｃ】
2020023582.tif 000128
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化３４Ｃ】
2020023582.tif 000129
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、
【化３５Ｃ】
2020023582.tif 000130
、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｘ＊は、酸素または硫黄であり、
ＲおよびＲ＊は独立に、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、または−（ＣＨ２）ｍ’−Ｒ”であり；Ｒ”は、ヒドロキシ基、置換もしくは非置換カルボニル基、アリール、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、複素環、または多環を表し；ｍ’は、０または１〜８の範囲の整数であり、
−Ｒ６−Ｒｂについて、
Ｒ６は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒｂは、
【化３６Ｃ】
2020023582.tif 000131
である］
を合成する方法であって、
修飾されていないアルギネートポリマーと、アミンおよびアルコールからなる群から選択される官能基を含む化合物とを反応させて、修飾されたアルギネートポリマーを生成することを含む、方法。
【請求項３０】
Ｒ８およびＲ９は、両方ともには水素ではない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｘは、酸素、またはＮＲ４であり、
Ｒ６が、−ＣＨ２−アリール−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−であり、
Ｒ７が、水素であり、
Ｒ８が、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＯＨであり、
Ｒ９が、メチル、−ＣＯＣＨ３、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、
【化３７Ｃ】
2020023582.tif 000132
である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化３８Ｃ】
2020023582.tif 000133
である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾されたアルギネートポリマーが、
【化３９Ｃ】
2020023582.tif 000134
からなる群より選択される１種もしくは複数の修飾されたモノマーを含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の助成を受けた研究であることの記載
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金ＥＢ０００２４４、ＥＢ０００３５１、ＤＥ０１３０２３およびＣＡ１５１８８４、ならびに国防総省（ＤＯＤ）によって授与された助成金Ｗ８１ＸＷＨ−１３−１−０２１５の下で政府支援により行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、その生体適合性および抗線維化特性を増進させるように化学修飾されたアルギネートの使用；材料、製品、およびデバイス、例えば、細胞、埋込体、および医療デバイスをコーティングまたはカプセル化するためのこれらの使用；ならびに修飾されたアルギネート、および修飾されたアルギネートでコーティングまたはカプセル化した材料の埋込みによって糖尿病を含めた疾患または障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
異物応答は、埋め込まれた生物医学的デバイスの正確さに影響を与える免疫介在性の反応である（Andersonら、Semin. Immunol.、２０巻：８６〜１００頁（２００８年）；Langer、Adv. Mater.、２１巻：３２３５〜３２３６頁（２００９年）；Ward,J.、Diabetes Sci. Technol. Online、２巻：７６８〜７７７頁（２００８年）；HardingおよびReynolds、TrendsBiotechnol.、３２巻：１４０〜１４６頁（２０１４年））。これらのデバイスにおける生体材料表面のマクロファージ認識は、炎症性事象のカスケードを開始させ、これによってこれらの外来性材料の線維性およびコラーゲン性のカプセル化がもたらされる（Andersonら（２００８年）；Ward（２００８年）；HardingおよびReynolds（２０１４年）；Grainger、Nat.Biotechnol.、３１巻：５０７〜５０９頁（２０１３年）；Williams、Biomaterials、２９巻：２９４１〜２９５３頁（２００８年））。このカプセル化は、経時的にデバイスの機能不全をもたらすことが多く、レシピエントに不快感をもたらし得る（Andersonら（２００８年）；HardingおよびReynolds（２０１４年）；Williams（２００８年））。これらの有害な転帰によって、異物応答を引き出さず、長期間の生物医学的デバイスの機能に対するこの重大な挑戦を克服する、生体材料についての重大な必要性が強調される。
【０００４】
埋め込まれた生体材料に対する異物応答は、埋込体のカプセル化をもたらす炎症性事象および創傷治癒プロセスの頂点である（Andersonら（２００８年））。この応答の最終的な病的産物は線維症であり、線維症は、炎症の部位における過剰な細胞外マトリックスの蓄積によって特性決定され、かつ細胞およびコラーゲン性の沈着物がデバイスを宿主から隔離するので、埋め込み可能な医療デバイスについての主要な障害である（Andersonら（２００８年）；Wickら、Annu.Rev. Immunol.、３１巻：１０７〜１３５頁（２０１３年）；WynnおよびRamalingam、Nat. Med.、１８巻：１０２８〜１０４０頁（２０１２年））。このデバイスの隔離は宿主環境の感知を妨げ得、有痛性の組織の変形、栄養分の分断（生きている細胞成分を含有する埋込体について）をもたらし得、最終的にデバイスの機能不全をもたらし得る。医療デバイス製造のために今日一般に使用される材料は異物応答を引き出し、それは埋め込まれた材料の線維性のカプセル化をもたらす（Langer（２００９年）；Ward（２００８年）；HardingおよびReynolds（２０１４年）；Williams（２００８年）；Zhangら、Nat.Biotechnol.、３１巻：５５３〜５５６頁（２０１３年））。埋め込まれたデバイスに対する異物応答を克服することによって、新たな医学的進歩を遂行するための道を開くことができ、抗炎症性および抗線維化特性の両方を有する材料の開発が決定的な医学上の必要性となっている（Andersonら（２００８年）；Langer（２００９年）；HardingおよびReynolds（２０１４年））。
【０００５】
マクロファージは材料認識の主要な成分であり、異物の表面に活発に接着する（Andersonら（２００８年）；Ward（２００８年）；Grainger、Nat.Biotechnol.、３１巻：５０７〜５０９頁（２０１３年）；Sussmanら、Ann. Biomed. Eng.、１〜９頁（２０１３年）（ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０４３９−０１３−０９３３−０））。マクロファージの食作用にとって大き過ぎる物体は、異物巨細胞中へのマクロファージの融合をもたらすプロセスを開始させる。これらの多核体は、サイトカインおよびケモカインを分泌することによって免疫応答を増幅させ、これによって線維芽細胞の動員がもたらされ、これはマトリックスを活発に堆積して、外来性材料を隔離する（Andersonら（２００８年）；Ward（２００８年）；Rodriguezら、J.Biomed. Mater. Res. A、８９巻：１５２〜１５９頁（２００９年）；Hetrickら、Biomaterials、２８巻：４５７１〜４５８０頁（２００７年））。この応答は、アルギネート、キトサン、デキストラン、コラーゲン、ヒアルロナン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリウレタン、ポリエチレン、シリコーンゴム、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、金、チタン、シリカ、およびアルミナを含めた、広範囲の物理化学的特性を包含する天然および合成の両方の起源の材料について記載されてきた（Ward（２００８年）；Ratner,J.、Controlled Release、７８巻：２１１〜２１８頁（２００２年））。
【０００６】
同じ種の遺伝的に同一でないメンバーから（すなわち、同種移植）または他の種から（すなわち、異種移植）のホルモン分泌細胞またはタンパク質分泌細胞の移植は、多くの疾患および障害の処置のための有望な戦略である。免疫隔離を実現するアルギネートマイクロカプセルを使用して、ホルモン分泌細胞またはタンパク質分泌細胞を、免疫抑制剤による広範囲の処置の必要性を伴わずに患者に移植することができる。この原理は、糖尿病ラットモデルにおけるアルギネートでカプセル化した膵臓のβ−細胞の移植によって首尾よく示されてきた（Lim, F.およびSun, A. M.、Science.、２１０巻、９０８〜９１０頁（１９８０年））。アルギネートゲル中に生体材料をカプセル化する方法は、例えば、Ｌｉｍへの米国特許第４，３５２，８８３号に記載されている。Ｌｉｍのプロセスにおいて、カプセル化されるべき生体材料を含有する水溶液を、水溶性ポリマーの溶液に懸濁させる。懸濁液を液滴に形成させるが、これは多価カチオン、例えば、Ｃａ２＋との接触によって個別のマイクロカプセルへと構成される。マイクロカプセルの表面をそれに続いてポリアミノ酸と架橋させ、カプセル化された材料の周りに半透膜を形成させる。
【０００７】
Ｌｉｍの方法は、細胞のその後の生存および機能に悪影響を与えることなく細胞をカプセル化するのに十分に穏やかな条件を用いる。このように得られたアルギマイクロカプセルは半透性であり、栄養素、廃棄物、ならびにカプセル化された細胞から分泌されたホルモンおよび／またはタンパク質が、マイクロカプセル中におよびマイクロカプセルから自由に拡散することを可能とする十分な多孔性を有し、動物宿主中に埋め込まれたとき、アルギン酸マイクロカプセルは、宿主の免疫系から、カプセル化された細胞を効果的に隔離させる。Ｖａｃａｎｔｉらへの米国特許第７，８０７，１５０号をまた参照されたい。
【０００８】
Ｈｕｂｂｅｌｌへの米国特許第６，１２９，７６１号およびAebischerら、JBiomech Eng.、１９９１年５月、１１３巻（２号）：１７８〜８３頁によって報告されているように、ブロックコポリマー、例えば、ポリエチレングリコール−ジアクリレートポリマー、ポリアクリレート、および熱可塑性ポリマーを含めた多くの他の合成材料が試みられてきた。これらの材料の概説については、Lesney、ModernDrug Discovery、４巻（３号）、４５〜４６頁、４９頁、５０頁（２００１年）を参照されたい。
【０００９】
Ｌｉｍがカプセル化された細胞の移植について最初に報告して以来、他の多くの者は、血管新生の非存在下でカプセル化材料を通した栄養素、気体および廃棄物の拡散によって細胞の生存率を維持することができ、かつ依然として異質細胞および材料に対する体の免疫防御から細胞を保護する、細胞のための「バイオリアクター」を生じさせることを試みてきた。残念ながら、これらの治療をヒト対象に変換する努力は、困難であると証明されてきた。例えば、１型糖尿病を患っているヒト対象に移植したアルギン酸でカプセル化したブタ島細胞は、最初に有意な改善を示し、減少したインスリンの投与を必要とした。しかし、第４９週までに、患者のインスリン用量は移植前のレベルに戻った（Elliot, R. B.ら、Xenotransplantation.、２００７年；１４巻（２号）：１５７〜１６１頁）。
【００１０】
米国特許第６，０６０，０５３号に記載されているように、およびその後に膀胱尿管逆流の処置のために米国食品医薬品局によって承認されているように、場合によって、例えば、細胞がかさ増し材料として埋め込まれるとき、線維症を引き出すことが望ましい。
【００１１】
時間がたつにつれての埋め込まれた細胞の有効性の減少は、アルギネートカプセルの線維芽細胞の過成長の結果である。アルギネートゲルマトリックスは、埋込みによって炎症応答を引き起こし、線維性組織によるアルギネートマトリックスのカプセル化をもたらす。アルギネートカプセル表面上の線維性組織は、カプセル化された細胞への栄養素および酸素の拡散を低減させ、これらの死亡をもたらす。より良好な結果は他の材料で得られてこなかった。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、製品、デバイス、および表面をコーティングするのに適したポリマーを提供することであり、これらのポリマーは、製品、デバイス、および表面の埋込みに続いてより長期間の生体適合性を有する。
【００１３】
本発明の目的はまた、製品、デバイス、および表面をコーティングするのに適したポリマーを提供することであり、これらのポリマーは、製品、デバイス、および表面の埋込みに続いてより少ない異物応答を有する。
【００１４】
本発明の目的はまた、細胞のカプセル化および埋込みに適したポリマーを提供することであり、これらのポリマーは、埋込みに続いてより長期間の生体適合性を有する。
【００１５】
本発明の目的はまた、細胞のカプセル化および埋込みに適したポリマーを提供することであり、これらのポリマーは、埋込みに続いてより少ない異物応答を有する。
【００１６】
本発明の目的はまた、ゲル安定性、孔径、および疎水性／親水性を含めた、改善された生体適合性および目的に合わせた生理化学的特性を伴う、化学修飾されたイオン架橋可能なアルギネートを提供することである。
【００１７】
本発明の目的はまた、より少ない異物応答を伴う化学修飾されたイオン架橋可能なアルギネートを提供することである。
【００１８】
本発明の目的はまた、修飾されたアルギネートポリマーを使用した製品、デバイス、および表面のコーティングのための方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的はまた、修飾されたアルギネートポリマーを使用した細胞のカプセル化のための方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的はまた、修飾されたアルギネートポリマーでコーティングした製品、デバイス、および表面を移植または埋め込むことによって、ヒトまたは動物患者において障害または疾患を処置する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的はまた、修飾されたアルギネートポリマー中にカプセル化された外来性の生体材料を移植することによって、ヒトまたは動物患者において障害または疾患を処置する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の目的はまた、修飾されたアルギネートポリマーの特性決定のためのハイスループット方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第４，３５２，８８３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，８０７，１５０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１２９，７６１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０６０，０５３号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Andersonら、Semin. Immunol.、２０巻：８６〜１００頁（２００８年）
【非特許文献２】Langer、Adv. Mater.、２１巻：３２３５〜３２３６頁（２００９年）
【非特許文献３】Ward, J.、Diabetes Sci. Technol. Online、２巻：７６８〜７７７頁（２００８年）
【非特許文献４】HardingおよびReynolds、Trends Biotechnol.、３２巻：１４０〜１４６頁（２０１４年）
【非特許文献５】Grainger、Nat. Biotechnol.、３１巻：５０７〜５０９頁（２０１３年）
【非特許文献６】Williams、Biomaterials、２９巻：２９４１〜２９５３頁（２００８年）
【非特許文献７】Wickら、Annu. Rev. Immunol.、３１巻：１０７〜１３５頁（２０１３年）
【非特許文献８】WynnおよびRamalingam、Nat. Med.、１８巻：１０２８〜１０４０頁（２０１２年）
【非特許文献９】Zhangら、Nat. Biotechnol.、３１巻：５５３〜５５６頁（２０１３年）
【非特許文献１０】Grainger、Nat. Biotechnol.、３１巻：５０７〜５０９頁（２０１３年）
【非特許文献１１】Sussmanら、Ann. Biomed. Eng.、１〜９頁（２０１３年）
【非特許文献１２】Rodriguezら、J. Biomed. Mater. Res. A、８９巻：１５２〜１５９頁（２００９年）
【非特許文献１３】Hetrickら、Biomaterials、２８巻：４５７１〜４５８０頁（２００７年）
【非特許文献１４】Ratner, J.、Controlled Release、７８巻：２１１〜２１８頁（２００２年）
【非特許文献１５】Lim, F.およびSun, A. M.、Science.、２１０巻、９０８〜９１０頁（１９８０年）
【非特許文献１６】Aebischerら、J Biomech Eng.、１９９１年５月、１１３巻（２号）：１７８〜８３頁
【非特許文献１７】Lesney、Modern Drug Discovery、４巻（３号）、４５〜４６頁、４９頁、５０頁（２００１年）
【非特許文献１８】Elliot, R. B.ら、Xenotransplantation.、２００７年；１４巻（２号）：１５７〜１６１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
式ＩＩＩによる構造を有する多重修飾されたアルギネートポリマー
【化６７】
2020023582.tif 000002
［式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＶにおいて示すような環状構造を形成し、
【化６８】
2020023582.tif 000003
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ４およびＲ５基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］。
（項目２）
Ｒ１が、独立に、
【化６９】
2020023582.tif 000004
または−Ｒ６−Ｒｂであり、
式中、ａは、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜５の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ｍは、３〜１６の整数であり、Ｒａは、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基から独立に選択され、Ｒｂは、
【化７０】
2020023582.tif 000005
であり、式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である、項目１に記載の多重修飾されたアルギネートポリマー。
（項目３）
Ｒ６が、−ＣＨ２−Ａｒ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−であり、
Ｒ７が、水素であり、
Ｒ８が、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＯＨであり、
Ｒ９が、メチル、−ＣＯＣＨ３、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、
【化７１】
2020023582.tif 000006
である、項目１に記載の多重修飾されたアルギネートポリマー。
（項目４）
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化７２】
2020023582.tif 000007
である、項目３に記載の多重修飾されたアルギネートポリマー。
（項目５）
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化７３】
2020023582.tif 000008
である、項目３に記載の多重修飾されたアルギネートポリマー。
（項目６）
Ｒ９が、メチル、−ＣＯＣＨ３、または−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２である、項目３に記載の多重修飾されたアルギネートポリマー。
（項目７）
Ｘが、酸素またはＮＲ４であり、式中、Ｒ４は、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＣＨ３であり、
Ｒ１が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＣＨ３［式中、ｍは、３〜１６の整数である］、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−（ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＨ３、
【化７４】
2020023582.tif 000009
である、項目１から６のいずれか一項に記載の多重修飾されたアルギネートポリマー。
（項目８）
１種もしくは複数の式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーを含む修飾されたアルギネート
【化７５】
2020023582.tif 000010
［式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、前記１種もしくは複数の修飾されたモノマーにおいて独立に、
【化７６】
2020023582.tif 000011
【化７７】
2020023582.tif 000012
または−Ｒ６−Ｒｂであり、
式中、ａは、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜５の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ｍは、３〜１６の整数であり、Ｒａは、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基から独立に選択され、Ｒｂは、
【化７８】
2020023582.tif 000013
であり、式中、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化７９】
2020023582.tif 000014
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒ６、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］。
（項目９）
Ｒ６が、−ＣＨ２−Ａｒ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−であり、
Ｒ４が、水素であり、
Ｒ８が、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＯＨであり、
Ｒ９が、メチル、−ＣＯＣＨ３、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２、
【化８０】
2020023582.tif 000015
である、項目８に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１０）
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化８１】
2020023582.tif 000016
である、項目９に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１１）
Ｒ８が、水素であり、
Ｒ９が、
【化８２】
2020023582.tif 000017
である、項目９に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１２）
Ｒ９が、メチル、−ＣＯＣＨ３、または−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２である、項目９に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１３）
Ｘが、酸素またはＮＲ４であり、式中、Ｒ４は、水素、メチル、または−ＣＨ２−ＣＨ３であり、
Ｒ１が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＣＨ３［式中、ｍは、３〜１６の整数である］、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−（ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＨ３、
【化８３】
2020023582.tif 000018
である、項目８に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１４）
１種もしくは複数の修飾されたモノマーが、
【化８４】
2020023582.tif 000019
である、項目８に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１５）
Ｙ１およびＹ２が、水素である、項目１から１４のいずれか一項に記載の修飾されたアルギネートポリマー。
（項目１６）
イオン架橋された、項目１から１５のいずれか一項に記載の修飾されたアルギネートポリマー中にカプセル化された生体材料を含む組成物。
（項目１７）
前記組成物が、同様のイオン架橋された修飾されていないアルギネートポリマー中にカプセル化された生体材料より低い異物応答を誘発する、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記生体材料が、細胞である、項目１６または１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記細胞が、異種組織からの細胞、屍体からの細胞、幹細胞、幹細胞に由来する細胞、細胞系からの細胞、初代細胞、初期化された細胞、初期化された幹細胞、初期化された幹細胞に由来する細胞、遺伝子操作された細胞、またはこれらの組合せを含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目１８または１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記細胞が、インスリン産生細胞である、項目１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
前記細胞が、膵島細胞である、項目１８から２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記修飾されたアルギネートが、さらに共有結合的に架橋されている、項目１６から２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
前記修飾されたアルギネートが、修飾されていないアルギネートをさらに含む、項目１６から２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
前記生体材料が、前記修飾されたアルギネートを含むカプセル中にカプセル化されている、項目１６から２４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
前記カプセルが、１．０ｍｍ〜１．５ｍｍの直径を有する、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
医療製品の全てもしくは一部が、イオン架橋された、項目１から１５のいずれか一項に記載の修飾されたアルギネートポリマー、または
１種もしくは複数の式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーを含む修飾されたアルギネート
【化８５】
2020023582.tif 000020
［式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化８６】
2020023582.tif 000021
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］
でコーティングされている、医療製品。
（項目２８）
前記医療製品が、同様のイオン架橋された修飾されていないアルギネートポリマーでコーティングされた同様の医療製品より低い異物応答を誘発する、項目２７に記載の医療製品。
（項目２９）
前記医療製品が、埋め込み可能なデバイス、心臓ペースメーカー、カテーテル、ニードル注射カテーテル、血餅フィルター、血管移植体、バルーン、ステント移植体、胆管ステント、腸ステント、気管支ステント、食道ステント、尿管ステント、動脈瘤充填コイルもしくは他のコイルデバイス、外科的修復メッシュ、経心筋血行再建デバイス、経皮的心筋血行再建デバイス、プロテーゼ、器官、血管、大動脈、心臓弁、チューブ、器官置換パーツ（organreplacement parts）、埋込体、繊維、中空繊維、膜、織物、保存血液、血液容器、タイタープレート、吸着媒体、透析器、連結ピース（connectingpiece）、センサー、弁、内視鏡、フィルター、ポンプチャンバー、または血液適合特性を有することを意図する別の医療デバイスである、項目２７または２８に記載の医療製品。
（項目３０）
ヒトまたは動物患者に、項目１６から２６のいずれか一項に記載の組成物、または項目２８から３０のいずれか一項に記載の医療デバイスを埋め込むか、または移植することを含む、ヒトまたは動物患者において疾患または障害を処置する方法。
（項目３１）
修飾されたアルギネートポリマーを合成する方法であって、
修飾されていないアルギネートポリマーと、アミンおよびアルコールからなる群から選択される官能基を含む第１の化合物とを反応させて、単一修飾されたアルギネートポリマーを生成することと、
前記単一修飾されたアルギネートポリマーと、ハロゲン化物およびアジドからなる群から選択される官能基を含む第２の化合物とを反応させて、多重修飾されたプレポリマーを生成することと、
前記多重修飾されたプレポリマーと、アルキン官能基を含む第３の化合物とを反応させて、多重修飾されたアルギネートポリマーを生成することと
を含む、方法。
生体適合性および物理的特性を目的に合わせるために、化学修飾されたアルギネートが開発されてきた。本明細書に記載されている修飾されたアルギネートは、修飾されていないアルギネートに対して増進された特性を実現する。さらに、出発材料、および化学修飾され反応した材料を徹底的に精製して、カプセル化を防止するために埋込み前に汚染物質を除去しなければならないという発見に基づけば、これらの材料が埋込みに続いて線維性カプセル形成を引き出す可能性は高くない。
【００２６】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーであり、
【化１】
2020023582.tif 000022
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、水素、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜３０個の炭素原子、より好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ１基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ（aroxy）、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル（phosphonyl）、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化２】
2020023582.tif 000023
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜３０個の炭素原子、より好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜３０個の炭素原子、より好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ４およびＲ５基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００２７】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーであり、
【化３】
2020023582.tif 000024
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、１種もしくは複数の修飾されたモノマーにおいて独立に、
【化４】
2020023582.tif 000025
または−Ｒ６−Ｒｂであり、
式中、ａは、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜５の整数であり、ｎは、１〜１２の整数であり、ｍは、３〜１６の整数であり、ＲａおよびＲｂは、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基から独立に選択され、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化５】
2020023582.tif 000026
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００２８】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーであり、
【化６】
2020023582.tif 000027
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、１種もしくは複数の修飾されたモノマーにおいて独立に、
【化７】
2020023582.tif 000028
であり、式中、ｋは、１〜１０の整数であり、ｚは、０〜５の整数であり、ｗは、０〜４の整数であり、Ｘｄは、非存在、ＯまたはＳであり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ３９、Ｒ４０、およびＲ４１は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒ３７は、ＣまたはＳｉであり、
ＸｇおよびＲ３８は、独立に、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキレン、置換アルキレン、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
ＲａおよびＲｃは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、複素環式環または
【化８】
2020023582.tif 000029
を形成し、式中、Ｒ８、Ｒ９、または両方は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、カルボニル、置換カルボニル、カルビノール、
【化９】
2020023582.tif 000030
であり、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
ｙは、０〜１１の整数であり、ＲｄおよびＲｅは、それぞれ独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、およびポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、
Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０〜５の整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４であり、Ｒ４は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｒ８、およびＲ９は、両方ともには水素ではなく、少なくとも１個のＲｂまたはＲｃは、式ＸＩＩＩによって定義され、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化１０】
2020023582.tif 000031
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００２９】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０〜３の整数であり、Ｒｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルチオであり、
Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、
Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０から３までの整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４であり、Ｒ４は、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルチオである。
【００３０】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、２であり、Ｒ１８は、Ｎであり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３は、Ｓであり、両方のＲｅは、オキソであり、かつＳに結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００３１】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、２であり、両方のＲｅは、オキソであり、かつＲ２１に結合しており、Ｒ１８は、Ｎであり、Ｒ２１は、Ｓであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００３２】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、２であり、両方のＲｅは、オキソであり、かつＲ２１に結合しており、Ｒ１８は、Ｎであり、Ｒ２１は、Ｓであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重であり、Ｘｂは、非存在であり、ｑは、０であり、ｐは、１であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００３３】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アミノであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００３４】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アミノであり、かつＲ２１に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００３５】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アミノであり、かつＲ２１に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、０であり、ｑは、０である。
【００３６】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００３７】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００３８】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重であり、Ｘｂは、酸素であり、ｐは、１であり、ｑは、０であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００３９】
一部の実施形態では、式ＩＸのＲ１９およびＲ２３は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００４０】
一部の実施形態では、式ＩＸのＲ１９およびＲ２３は、Ｏであり、Ｒ１８およびＲ１９の間、およびＲ２１およびＲ２２の間の結合は、二重結合であり、環中の結合の残りは、単結合である。
【００４１】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アルコキシであり、かつＲ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００４２】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アルコキシであり、かつＲ１９に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００４３】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、メトキシであり、かつＲ１９に結合しており、Ｒ１８〜Ｒ２３は、炭素原子であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、０であり、ｑは、０である。
【００４４】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、ヒドロキシルである。
【００４５】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、メチレン基に対してパラ位において結合しているヒドロキシルである。
【００４６】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、下記に示す式ＸＩＩＩであり、
【化１１】
2020023582.tif 000032
式中、Ｒ８は置換アルキルであり、Ｒ９はジアルキルアミノであるか、またはＲ８はジアルキルアミノであり、Ｒ９は置換アルキルであり、この置換アルキルは、ヒドロキシメチルであり、このジアルキルアミノは、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノである。
【００４７】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は下記に示す式ＩＸであるか、
【化１２】
2020023582.tif 000033
またはＲ８は式ＩＸであり、Ｒ９は水素である。一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重であり、Ｘｂは、酸素であり、ｐは、１であり、ｑは、０であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００４８】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は、水素であり、Ｒ９は、下記に示す式ＶＩＩまたは式ＶＩＩＩであり、
【化１３】
2020023582.tif 000034
式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００４９】
一部の実施形態では、式ＶＩＩのＲ３１は、アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ３１は、メチルである。
【００５０】
一部の実施形態では、式ＶＩＩのＲ３１は、メチルであり、Ｒ３２およびＲ３３は、水素である。
【００５１】
一部の実施形態では、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、パラ位においてメチレン基に結合しているヒドロキシルである。
【００５２】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、１であり、Ｒｃは、ヒドロキシルである。
【００５３】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、１であり、Ｒｃは、ヒドロキシルであり、Ｘｄは、非存在である。
【００５４】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、１であり、Ｒｃは、ヒドロキシルであり、Ｘｄは、非存在であり、Ｒ１０〜Ｒ１７は、水素である。
【００５５】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、Ｒｃは、アルコキシである。
【００５６】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、Ｒｃは、メトキシであり、Ｘｄは、Ｏである。
【００５７】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、Ｒｃは、メトキシであり、Ｘｄは、Ｏであり、Ｒ１０〜Ｒ１７は、水素である。
【００５８】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、２であり、Ｒｃは、アルキルアミノである。
【００５９】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、２であり、Ｒｃは、メチルアミノであり、Ｘｄは、非存在である。
【００６０】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、２であり、Ｒｃは、メチルアミノであり、Ｘｄは、非存在であり、Ｒ１０〜Ｒ１７は、水素である。
【００６１】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｘｄは、Ｏであり、Ｒｃは、下記に示す式ＸＩＩＩであり、
【化１４】
2020023582.tif 000035
式中、Ｒ８およびＲ９は、アルキルである。
【００６２】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｘｄは、Ｏであり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８およびＲ９は、メチルである。
【００６３】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｘｄは、Ｏであり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９はカルボニルであるか、またはＲ８はカルボニルでありＲ９は、水素である。
【００６４】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｘｄは、Ｏであり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９はアセチルであるか、またはＲ８はアセチルであり、Ｒ９は水素である。
【００６５】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は下記に示す式ＩＸであるか、
【化１５】
2020023582.tif 000036
またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸである。
【００６６】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、２であり、Ｒ１８は、Ｎであり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３は、Ｓであり、両方のＲｅは、オキソであり、かつＳに結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００６７】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、２であり、両方のＲｅは、オキソであり、かつＲ２１に結合しており、Ｒ１８は、Ｎであり、Ｒ２１は、Ｓであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００６８】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、２であり、両方のＲｅは、オキソであり、かつＲ２１に結合しており、Ｒ１８は、Ｎであり、Ｒ２１は、Ｓであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重であり、Ｘｂは、非存在であり、ｑは、０であり、ｐは、１であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００６９】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アミノであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００７０】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アミノであり、かつＲ２１に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００７１】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アミノであり、かつＲ２１に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、０であり、ｑは、０である。
【００７２】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００７３】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重である。
【００７４】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合の全ては、一重であり、Ｘｂは、酸素であり、ｐは、１であり、ｑは、０であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００７５】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アルコキシであり、かつＲ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２１、Ｒ２２、またはＲ２３に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００７６】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アルコキシであり、かつＲ１９に結合しており、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重である。
【００７７】
式ＸＩＩの一部の実施形態では、ｋは、３であり、Ｒｃは、式ＸＩＩＩであり、Ｒ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであるか、またはＲ８は水素であり、Ｒ９は式ＩＸであり、式ＩＸ中のｙは、１であり、Ｒｅは、アルコキシ、例えば、メトキシであり、かつＲ１９に結合しており、Ｒ１８〜Ｒ２３は、炭素原子であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、二重であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合のうちの３つは、一重であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、０であり、ｑは、０である。
【００７８】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２１、またはＲ２２は、Ｏであり、原子価が許容すれば、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合のうちの２つは、二重結合であり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合のうちの３つは、単結合である。
【００７９】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、Ｒ１８、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃであり、Ｒ１８およびＲ２２の間、およびＲ２０およびＲ２１の間の結合は、二重結合であり、環中の結合の残りは、単結合である。
【００８０】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、Ｒ１８、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃであり、Ｒ１８およびＲ２２の間、およびＲ２０およびＲ２１の間の結合は、二重結合であり、環中の結合の残りは、単結合であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、１であり、ｑは、０であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００８１】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、またはＲ２２は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合は、単結合である。
【００８２】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、Ｒ１８、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合は、単結合である。
【００８３】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９は、Ｏであり、Ｒ１８、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合は、単結合であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、１であり、ｑは、０であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００８４】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９およびＲ２２は、Ｏであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合は、単結合である。
【００８５】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９およびＲ２２は、Ｏであり、Ｒ１８、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合は、単結合である。
【００８６】
一部の実施形態では、式ＸＩＶ中のｙは、０であり、Ｒ１９およびＲ２２は、Ｏであり、Ｒ１８、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｃであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２２の間の結合は、単結合であり、Ｘｂは、非存在であり、ｐは、１であり、ｑは、０であり、各Ｒ２５は、水素である。
【００８７】
一部の実施形態では、式ＸＶのＲ３７は、Ｓｉであり、Ｘｇは、アルキニルである。
【００８８】
一部の実施形態では、式ＸＶのＲ３７は、Ｓｉであり、Ｘｇは、エチニルであり、Ｒ３８は、アルキレンである。
【００８９】
一部の実施形態では、式ＸＶのＲ３７は、Ｓｉであり、Ｘｇは、エチニルであり、Ｒ３８は、メチレンであり、Ｒ３９、Ｒ４０、およびＲ４１は、アルキルである。
【００９０】
一部の実施形態では、式ＸＶのＲ３７は、Ｓｉであり、Ｘｇは、エチニルであり、Ｒ３８は、メチレンであり、Ｒ３９、Ｒ４０、およびＲ４１は、メチルである。
【００９１】
修飾されたアルギネートは、単一修飾されたアルギネートポリマーまたは多重修飾されたアルギネートポリマーのいずれでもよい。単一修飾されたアルギネートポリマーは、共有結合的に修飾されたモノマーの実質的に全てが同じ共有結合的修飾を有する、１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーである（すなわち、ポリマーは、１つの「タイプ」または種の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する）。多重修飾されたアルギネートポリマーは、共有結合的に修飾されたモノマーの実質的に全てが同じ共有結合的修飾を有さない、共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーである（すなわち、ポリマーは、２つもしくはそれ超の「タイプ」または種の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する）。
【００９２】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、単一修飾されたアルギネートポリマーである。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、下に示す単一修飾されたアルギネートポリマーのうちの１つである。
【化１６】
2020023582.tif 000037
【化１７】
2020023582.tif 000038
【００９３】
好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、式Ｉによって定義される第１の種もしくはタイプの共有結合的に修飾されたモノマー、および式Ｉによって定義される第２の種もしくはタイプの共有結合的に修飾されたモノマーを含有する多糖類骨格を有する多重修飾されたアルギネートポリマーである。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、下記に示す多重修飾されたアルギネートポリマーのうちの１つである。
【化１８】
2020023582.tif 000039
【化１９】
2020023582.tif 000040
【化２０】
2020023582.tif 000041
【００９４】
一部の実施形態では、多重修飾されたアルギネートは、式ＩＩＩによる構造を有する、１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーであり、
【化２１】
2020023582.tif 000042
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ１は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＶにおいて示すような環状構造を形成し、
【化２２】
2020023582.tif 000043
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ４およびＲ５基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００９５】
一部の実施形態では、Ｒ８、Ｒ９、または両方は、独立に、水素、
【化２３】
2020023582.tif 000044
であり、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００９６】
一部の実施形態では、Ｒ１は、
【化２４】
2020023582.tif 000045
であり、式中、ｋは、独立に、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜４の整数であり、Ｘｄは、ＯまたはＳであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、ＲａおよびＲｃは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、複素環式環または
【化２５】
2020023582.tif 000046
を形成し、式中、Ｒ８、Ｒ９、または両方は、独立に、水素、
【化２６】
2020023582.tif 000047
であり、式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００９７】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ１は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００９８】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ２は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【００９９】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ３は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１００】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ４は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１０１】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ５は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１０２】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ６は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１０３】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ７は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１０４】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ９は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ８は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１０５】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって記載される１つもしくは複数の共有結合的に修飾されたアルギネート単位を含有するアルギネートポリマーであり、各式について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはＲ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ９は、水素、または任意の数の炭素原子、１〜３０個の炭素原子、１〜２０個の炭素原子、もしくは１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基でなく、代表的な有機基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１０６】
修飾されたアルギネートポリマーは、任意の比のマンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および共有結合的に修飾されたモノマーを含有することができる。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマー中のモノマーの５％超、１０％超、１５％超、２０％超、より好ましくは、２５％超、最も好ましくは、３０％超は、共有結合的に修飾されたモノマーである。
【０１０７】
好ましい実施形態では、多価イオン、例えば、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、またはＢａ２＋を使用して、修飾されたアルギネートポリマーをイオン架橋させて、ヒドロゲルを形成させることができる。修飾されたアルギネートが生理学的条件中で安定なヒドロゲルを形成する能力は、本明細書に記載されているヒドロゲル形成アッセイを使用して定量化することができる。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているハイスループットアッセイを使用して測定した蛍光強度が、１５，０００〜５５，０００、好ましくは、２０，０００〜５５，０００、より好ましくは、２５，０００〜５５，０００であるような、ヒドロゲルを形成する。
【０１０８】
好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートは生体適合性であり、修飾されていないアルギネートより低い異物応答を誘発する。修飾されたアルギネートの生体適合性は、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを含めた当技術分野において公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して定量的に決定することができる。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して測定した修飾されていないアルギネートに正規化した蛍光応答が、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、または５０％未満であるように、生体適合性である。また記載されているのは、修飾されたアルギネートポリマーの特性決定のためのアッセイである。
【０１０９】
修飾されたアルギネートポリマーがヒドロゲルを形成する能力を特性決定するのに有用なハイスループットアッセイをまた記載する。一部の実施形態では、本明細書に記載されているヒドロゲル形成アッセイを使用して、アルギネートまたは修飾されたアルギネートから形成されたヒドロゲルの安定性を定量化する。好ましい実施形態では、本明細書に記載されているヒドロゲル形成アッセイをスクリーニングツールとして使用して、安定なヒドロゲルを形成することができる修飾されたアルギネートを同定する。本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイを使用して、修飾されていないアルギネートより低い異物応答を誘発する修飾されたアルギネートを同定する。修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化するためのアッセイをまた提供する。
【０１１０】
本明細書にさらに記載されているのは、修飾されたアルギネートポリマーを使用して医療製品、デバイス、および表面をコーティングする方法である。特定の実施形態では、本明細書に記載されている修飾されたアルギネートポリマーは、ヒトまたは動物患者において疾患または障害を処置する方法において使用するための製品、デバイス、および表面をコーティングするために使用される。一部の実施形態では、ヒトまたは動物患者における疾患または障害は、修飾されたアルギネートポリマーでコーティングした製品、デバイス、および表面を移植または埋め込むことによって処置される。特定の実施形態では、ヒトまたは動物患者における疾患または障害は、修飾されたアルギネートポリマーでコーティングした製品、デバイス、および表面を移植または埋め込むことによって処置される。
【０１１１】
本明細書にさらに記載されているのは、修飾されたアルギネートポリマーを使用して生体材料をカプセル化する方法である。特定の実施形態では、ヒトまたは動物患者における疾患または障害を処置する方法において使用するために、本明細書に記載されている修飾されたアルギネートポリマーを使用して、細胞をカプセル化する。一部の実施形態では、ヒトまたは動物患者における疾患または障害は、修飾されたアルギネートポリマー中にカプセル化した外来性生体材料を移植することによって処置される。特定の実施形態では、ヒトまたは動物患者における疾患または障害は、修飾されたアルギネートポリマー中にカプセル化された細胞を移植することによって処置される。より特定の実施形態では、糖尿病は、修飾されたアルギネートポリマー中にカプセル化された膵島細胞を移植することによって処置される。
【０１１２】
カプセル化および移植に適した細胞は、好ましくは、分泌もしくは代謝細胞（すなわち、これらは治療因子を分泌するか、もしくは毒素を代謝するか、もしくは両方である）または構造細胞（例えば、皮膚、筋肉、血管）、または代謝細胞（例えば、これらは毒性物質を代謝する）である。一部の実施形態では、細胞は、天然に分泌性、例えば、インスリンを天然に分泌する島細胞、または天然に代謝性、例えば、天然に解毒および分泌する肝細胞である。一部の実施形態では、細胞をバイオ工学処理して、組換えタンパク質、例えば、分泌されたタンパク質または代謝酵素を発現させる。細胞型によって、細胞は、単一の細胞、細胞集合体、球状体、またはそれどころか天然もしくはバイオ工学処理した組織として組織化し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、実施例１に記載したコンビナトリアル合成アプローチを使用して得た修飾されたアルギネートの一般構造を示す。それぞれの一般構造を有する、調製されるアルギネートの数を、下に示す。
【０１１４】
【図２】図２は、実施例２に記載したヒドロゲル形成アッセイから得たプロットである。修飾されたアルギネートについて測定した平均蛍光強度値をプロットする。１５，０００未満の蛍光値を生じさせる修飾されたアルギネートは、ヒドロゲル形成が重大な意味を持つ用途（すなわち、細胞のカプセル化）のために使用不能とみなした。
【０１１５】
【図３】図３は、陽性対照（アルギネートなし）と比較した、ＨｅＬａ細胞系の生存率に対する選択した修飾されたアルギネートの効果を示すプロットである。アルギネート（Ａｌｇ）は、５３％の生存率を有する。いくつかのポリマーはＡｌｇより細胞毒性であることが示されるが、ライブラリーの大部分は、Ａｌｇと同じか、またはより良好に機能する。
【０１１６】
【図４】図４は、実施例５に記載したｉｎ  ｖｉｖｏ方法を使用して得たプロットであり、これは選択した修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化する。蛍光応答％に関して修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化するために、実施例５に記載したｉｎ  ｖｉｖｏ方法を使用して修飾されたアルギネートについて得た蛍光応答を、修飾されていないアルギネートを使用して測定した蛍光応答に正規化した。
【０１１７】
【図５】図５は、選択した修飾されたアルギネートならびに２つの異なる修飾されていないアルギネート（ＣＭＩＴおよびＣＪＯＳ）中にカプセル化したラット膵島を移植したマウスの血中グルコース値を詳述するプロットである。破線は、マウスにおける正常血糖を表す。埋込みの５日後に、２８７＿Ｆ４、ＣＪＯＳ、２８７＿Ｂ４、２６３＿Ｃ１２、およびＣＭＩＴは破線より上であり、一方、その他は線の下である。埋込みの２０５日後に、線は、上から下に、ＣＪＯＳ、２８７＿Ｇ３、２８７＿Ｆ４、２８７Ｂ＿Ｂ４、ＣＭＩＴ、２８７Ｂ＿Ｂ８、２６３＿Ｃ１２、２６３＿Ｃ６、２８７＿Ｂ３、２８７＿Ｄ３、および２６３＿Ａ７である。
【０１１８】
【図６】図６は、修飾されたアルギネート（修飾されていないアルギネートと合わせた）に応じた炎症応答（ＶＬＶＧに正規化した蛍光によって測定した）を示す棒グラフである。
【０１１９】
【図７】図７は、アルギネートの化学修飾のために使用されるアミン、アルコール、アジド、およびアルキンの構造のダイアグラムである。「Ｎ」の記号表示は、アミド化試薬を示し、「Ｏ」の記号表示は、エステル化試薬を示し、「Ｙ」の記号表示は、クリック試薬を示す。
【０１２０】
【図８】図８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＩＰ空間において１４日後に回収したＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、Ｚ１−Ｙ１９、ＳＬＧ２０、およびＶ／Ｓカプセルから単離したマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ６８＋）および好中球（ＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６ｇ＋）のＦＡＣＳ分析のグラフである。＊＊＊＝ｐ＜０  ０００１、ｎｓ＝有意差なし。
【０１２１】
【図９−１】図９は、７７４のアルギネート類似体の合成のためのスキームのダイアグラムである。
【図９−２】図９は、７７４のアルギネート類似体の合成のためのスキームのダイアグラムである。
【０１２２】
【図１０】図１０は、ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊから回収した埋込体から単離したα−ＳＭＡタンパク質のウエスタンブロット定量化のグラフである。
【０１２３】
【図１１】図１１は、３００μｍのカプセルとして配合された、最初のスクリーニングからの上位７０の修飾されたアルギネートの二次カテプシン評価を示すグラフである。ＶＬＶＧカプセルの蛍光に正規化したデータ。最も低いカテプシンレベルを有する１０のアルギネート類似体カプセルは、より明るいシェーディングを伴って右側にある。
【０１２４】
【図１２】図１２は、１４日後のＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＰ空間から回収した上位１０のアルギネート類似体カプセルおよび対照アルギネートカプセル（ＳＬＧ２０、Ｖ／Ｓ）の３００μｍのカプセルから抽出したタンパク質のサイトカインパネル分析（Ｅｌｉｓｐｏｔ）のグラフである。各コホートについて、ｎ＝５である。＃は、ｐ＜０．０１における、平均間の有意差を示す。
【０１２５】
【図１３】図１３は、トリアゾール−チオモルホリンジオキシド（ＴＭＴＤ）アルギネートの化学構造である。
【０１２６】
【図１４】図１４は、マクロファージおよび好中球を示す、Ｃ５７ＢＬ／６におけるＩＰにおいて１４日後に回収されたカプセル化されたヒト細胞埋込体のＦＡＣＳ分析のグラフである。
【０１２７】
【図１５】図１５は、Ｂ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を示す、Ｃ５７ＢＬ／６におけるＩＰにおいて１４日後に回収されたカプセル化されたヒト細胞埋込体のＦＡＣＳ分析のグラフである。
【０１２８】
【図１６】図１６は、ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊから回収した埋込体からのタンパク質分離物において検出したタンパク質のプロテオミクス定量化のヒートマップである。ヒートマップにおける各カラムは、それぞれのコホートからの個々のＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６マウスである。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
発明の詳細な説明
アルギネートは、１−４−グリコシド連結β−Ｄ−マンヌロネート（Ｍ）およびそのＣ−５エピマーであるα−Ｌ−グルロネート（Ｇ）から形成される直鎖状多糖類コポリマーの１クラスである。アルギネートは、褐藻類ならびに少なくとも２つの属の細菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）を含めた種々の生物から産生される、天然に生じる生体ポリマーである。典型的には、市販のアルギネートは、Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ、および様々なタイプのＬａｍｉｎａｒｉａを含めた海藻類から単離する。
【化２７】
2020023582.tif 000048
【化２８】
2020023582.tif 000049
【０１３０】
３タイプの一次構造が、アルギネートの多糖類骨格を規定する。連続的グルロネートモノマーのホモポリマー領域（Ｇ−ブロック）、連続的マンヌロネートモノマーのホモポリマー領域（Ｍ−ブロック）、ならびに交互のマンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーを含有する領域（ＭＧ−ブロック）。モノマーブロックは、可撓性の伸長した構造（Ｍ−ブロック）から剛性のコンパクトな構造（Ｇ−ブロック）までの範囲の、溶液中で異なる高次構造を有する。Ｇ−ブロックの場合、コンパクトな高次構造は、多価イオン、特に、Ｃａ２＋イオンのキレート化を促進し、１つのアルギネート鎖中のＧ−ブロックを、別のアルギネート鎖中のＧ−ブロックとイオン架橋させ、安定なゲルを形成することができる。その結果、モノマーブロックの割合、長さ、および分布は、アルギネートポリマーの生理化学的特性に影響を与える。
【０１３１】
藻類から得た商業的に生産されたアルギネートの場合、分子量、一次構造、および全体的なアルギネートポリマー中のウロン酸モノマーのモル比（Ｍ／Ｇ比）は、アルギネートを産生する種、種を集める時期、ならびに藻類の藻体の場所および齢を含めたいくつかの因子によって決まる。その結果、一連の生理化学的特性、例えば、分子量および粘度を有するアルギネートが市販されている。
【０１３２】
アルギン酸は、室温および中性ｐＨでイオン架橋して、ヒドロゲルを形成することができる。生理学的に適合性の条件において安定なゲルを形成するアルギン酸の能力によって、いくつかの生物医学的用途においてアルギン酸ゲルは有用なものとなる。例えば、アルギン酸ゲルは、治療剤、診断用剤、および予防剤の薬物動態をモジュレートする薬物送達のためのマトリックスとして使用されてきた。
【０１３３】
Ｉ．定義
「アルギネート」は、本明細書において使用する場合、任意のＭ／Ｇ比のβ−Ｄ−マンヌロネートおよびα−Ｌ−グルロネートから形成される直鎖状多糖類、およびその塩ならびに誘導体を指すために使用される集合用語である。用語「アルギネート」は、本明細書において使用する場合、下記の構造を有する任意のポリマー、およびその塩を包含する。
【化２９】
2020023582.tif 000050
【０１３４】
「生体適合性」は、本明細書において使用する場合、生物中に導入されたとき、天然細胞、組織、または器官に対してかなりの炎症応答、免疫原性、または細胞毒性を誘発することなく、その所望の機能を遂行する材料を指す。生体適合性は、本明細書において使用する場合、実施例５において本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して定量化することができる。
【０１３５】
「異物応答」は、本明細書において使用する場合、組織中の任意の外来性材料の存在に対する生物組織の免疫応答を指し、これは、タンパク質吸着、マクロファージ、多核異物巨細胞、線維芽細胞、および血管形成を含むことができる。
【０１３６】
「化学修飾されたアルギネート」または「修飾されたアルギネート」は本明細書において互換的に使用され、１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギネートポリマーを指す。
【０１３７】
「共有結合的に修飾されたモノマー」は、本明細書において使用する場合、化学的プロセスによってマンヌロネートモノマーおよび／またはグルロネートモノマーから得た、マンヌロネートモノマーおよび／またはグルロネートモノマーの類似体または誘導体であるモノマーを指す。
【０１３８】
「接触させること」は、コーティングとの関連において本明細書において使用する場合、ポリマー、例えば、本明細書において開示されている修飾されたアルギネートポリマーを基材または表面上にコーティングするための任意の方法を指す。接触させることは、これらに限定されないが、手術中に行うディップコーティング、噴霧、ウェッティング、浸漬、ディッピング、塗布、結合もしくは接着、段階的表面誘導体化、または別の方法で基材もしくは表面に疎水性ポリカチオン性ポリマーを有する化合物を提供することを含むことができる。ポリマーは、基材または表面に共有結合的または非共有結合的に付着させることができる。一部の実施形態では、ポリマーは、表面と非共有結合的に会合している。
【０１３９】
「コーティング」は、本明細書において使用する場合、任意の一時的、半永久的または永久的な層、被覆または表面を指す。コーティングは、気体、蒸気、液体、ペースト、半固体、または固体として付着させることができる。さらに、コーティングを液体として付着させ、ハードコーティングへと凝固させることができる。コーティング中に弾性を工学処理し、コーティングされるべき基材または表面の可撓性、例えば、膨張または縮みに適応させることができる。好ましいコーティングは、本明細書において開示されている修飾されたアルギネートポリマーである。
【０１４０】
「独立に」は、化学式との関連において本明細書において使用する場合（および文脈によって明らかにそれ以外のことを示さない限り）、言及した群の各実体例が、その群の他の実体例とは独立に選択されることを意味する。例えば、群の各実体例は、群の全ての他の実体例、もしくはいくつかの他の実体例と異なってもよく、または他の実体例と異ならなくてもよい。複数の群が言及される場合、「独立に」は、それぞれの所与の群の各実体例が、それぞれの群の他の実体例とは独立に選択され、群のそれぞれが、他の群とは独立に選択されることを意味する。例えば、第１の群の各実体例は、第２の群（または第３の群、もしくは第４の群など）の全ての実体例、もしくはいくつかの他の実体例と異なってもよく、または他の実体例と異ならなくてもよい。
【０１４１】
「成分」は、医療製品、例えば、医療デバイスとの関連において本明細書において使用する場合、製品と構造的に統合しているその製品のパーツである。成分は、製品の基材もしくは表面に付着され得るか、製品の物質内に含有され得るか、製品の内部内に保持され得るか、または任意の他の配置であってもよく、それによってそのパーツは、製品の構造と一体的な要素である。一例として、ペースメーカーの機械的パーツを囲んでいるシリコーン被覆は、ペースメーカーの成分である。成分は、製品の管腔であり得、ここで管腔は、製品の全体的な機能に不可欠である何らかの機能を行う。組織拡張器ポートの管腔は、組織拡張器の成分である。成分は、製品の表面への流体の送達のために特に適合された製品内のレザバーまたは個別の領域を指すことができる。埋め込み可能な薬物送達デバイス内のレザバーは、そのデバイスの成分である。
【０１４２】
語句「有効量」は、コーティングとの関連において本明細書において使用する場合、１つもしくは複数の臨床的に測定可能なエンドポイント、例えば、コーティングされていない埋込体、修飾されていないコーティングでコーティングされた埋込体、または別の適切な対照と比較して、低減した異物応答を実現するために、埋込体に付着されるコーティングの量を一般に指す。語句「有効量」は、細胞、カプセル、デバイス、組成物、または化合物との関連において本明細書において使用する場合、細胞、カプセル、デバイス、組成物、または化合物の、所望の結果を実現する、無毒性ではあるが、十分な量を指す。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態；処置されている疾患の重症度；使用される特定の細胞、カプセル、デバイス、組成物、または化合物；その投与のモード；ならびに他の慣用的な変数によって対象毎に変化し得る。適当な有効量は、慣用的な実験法だけを使用して当業者が決定することができる。
【０１４３】
「表面（複数可）」は、本明細書において使用する場合、ガラス、プラスチック、金属、およびポリマーなどを含めた任意の固体または半固体材料の任意の表面を指す。これは、コーティングされた表面を含めた複数の材料から構築された表面を含む。
【０１４４】
「単一修飾されたアルギネートポリマー」は、本明細書において使用する場合、１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する修飾されたアルギネートを指し、共有結合的に修飾されたモノマーの実質的に全ては、同じ共有結合的修飾を有する（すなわち、ポリマーは、１つの「タイプ」または種の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する）。単一修飾されたアルギネートポリマーは、例えば、修飾されたアルギネートポリマーを含み、修飾されたアルギネートポリマー中のモノマーの実質的に全ては、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーによって表される。モノマーの全ては、必ずしも共有結合的に修飾されていない。
【０１４５】
「カプセル」は、本明細書において使用する場合、１つもしくは複数のポリマーシェルによって囲まれた架橋ヒドロゲルコアを有するか、１つもしくは複数の架橋ヒドロゲル層を有するか、架橋ヒドロゲルコーティングを有するか、またはこれらの組合せである、架橋ヒドロゲルで形成されている約１５０μｍ〜約５ｃｍの平均直径を有する粒子を指す。カプセルは、例えば、細胞カプセル化に適した任意の形状を有し得る。カプセルは、架橋ヒドロゲルに分散した１個もしくは複数の細胞を含有し、それによって細胞を「カプセル化」し得る。本明細書において「カプセル」への言及は、文脈によって明らかにそれ以外のことを示さない限り、マイクロカプセルを指し、含む。好ましいカプセルは、約１５０μｍ〜約８ｍｍの平均直径を有する。
【０１４６】
「マイクロカプセル」および「マイクロゲル」は、本明細書において使用する場合、互換的に使用されて、約１５０μｍ〜約１０００μｍの平均直径を有する粒子またはカプセルを指す。
【０１４７】
「生体材料」は、本明細書において使用する場合、これらに限定されないが、組織、細胞、生体マイクロ分子、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、補因子、およびホルモン、生体高分子、例えば、核酸、ポリペプチド、タンパク質（例えば、酵素、受容体、分泌タンパク質、構造およびシグナル伝達タンパク質、ホルモン、リガンドなど）、多糖類、ならびに／または任意のこれらの組合せを含めた任意の生体物質を指す。
【０１４８】
「細胞」は、本明細書において使用する場合、特に明示しない限り、個々の細胞、細胞系、初代培養物、またはこのような細胞に由来する培養物を指す。「培養物」は、本明細書において使用する場合、同じまたは異なるタイプの単離した細胞を含む組成物を指す。「細胞系」は、本明細書において使用する場合、適当な新鮮な培地および空間を与えられると無制限に増殖し、それによって細胞系を「不死」とする、永久樹立細胞培養物を指す。「細胞株」は、本明細書において使用する場合、培養するように適合された複数の細胞を有するが、有限の分裂能を有する細胞培養物を指す。「細胞培養物」は、本明細書において使用する場合、培地、例えば、寒天上で成長する細胞の集団である。
【０１４９】
細胞は、例えば、異種、自己、または同種異系でよい。細胞はまた、初代細胞でよい。細胞はまた、対象から得た細胞の培養および拡大に由来する細胞でよい。例えば、細胞はまた、幹細胞または幹細胞由来でよい。細胞はまた、不死化細胞でよい。細胞をまた遺伝子操作して、タンパク質、核酸、または他の産物を発現させることができる。
【０１５０】
「哺乳動物細胞」は、本明細書において使用する場合、哺乳動物対象に由来する任意の細胞を指す。
【０１５１】
「自己」は、本明細書において使用する場合、同じ個体から採取した移植した生体材料、例えば、細胞を指す。
【０１５２】
「同種異系」は、本明細書において使用する場合、同じ種の異なる個体から採取した移植した生体材料、例えば、細胞を指す。
【０１５３】
「異種」は、本明細書において使用する場合、異なる種から採取した移植した生体材料、例えば、細胞を指す。
【０１５４】
「内分泌細胞」は、本明細書において使用する場合、内分泌系の細胞を指す。「分泌性内分泌細胞」は、本明細書において使用する場合、１種もしくは複数のホルモンを分泌する内分泌細胞を指す。
【０１５５】
「島細胞」は、本明細書において使用する場合、哺乳動物の膵臓に由来する内分泌細胞を指す。島細胞は、グルカゴンを分泌するアルファ細胞、インスリンおよびアミリンを分泌するベータ細胞、ソマトスタチンを分泌するデルタ細胞、膵臓ポリペプチドを分泌するＰＰ細胞、またはグレリンを分泌するイプシロン細胞を含む。この用語は、これらの細胞の均質および不均質な集団を含む。好ましい実施形態では、島細胞の集団は、少なくともベータ細胞を含有する。
【０１５６】
「ホルモン産生細胞」は、本明細書において使用する場合、１種もしくは複数のホルモンを産生する細胞を指す。好ましいホルモン産生細胞は、生理的刺激、例えば、ホルモンを天然に分泌する内分泌細胞からのホルモンの分泌をもたらす生理的刺激に応答してホルモンを産生する。分泌性内分泌細胞、幹細胞に由来するホルモン産生細胞、およびホルモンを産生するように遺伝子操作された細胞は、ホルモン産生細胞の例である。
【０１５７】
「インスリン産生細胞」は、本明細書において使用する場合、インスリンを産生する細胞を指す。好ましいインスリン産生細胞は、グルコースレベルに応答してインスリンを産生する。膵島ベータ細胞、幹細胞に由来するインスリン産生細胞、およびインスリンを産生するように遺伝子操作された細胞は、インスリン産生細胞の例である。
【０１５８】
「移植」は、本明細書において使用する場合、別の源からの対象への細胞、組織、または器官の移動を指す。この用語は、特定のモードの移動に限定されない。カプセル化された細胞は、任意の適切な方法によって、例えば、注射または外科的埋込みによって移植し得る。
【０１５９】
「初代細胞」、「初代細胞系」および「初代培養物」は、本明細書において使用する場合、互換的に使用されて、対象に由来しており、培養物の限定された数の継代、すなわち、分裂のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長を可能とする、細胞および細胞培養物を指す。
【０１６０】
「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、本明細書において使用する場合、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞を含めた種々の細胞型に分化することができる間葉組織中に存在するか、または間葉組織に由来する複能性幹細胞を指す。
【０１６１】
「由来する」は、細胞に関して本明細書において使用する場合、組織から得られる細胞、細胞系、または次いで、培養され、継代され、分化され、誘発されるなどして、由来細胞（derived cell）を産生する細胞を指す。例えば、人工多能性幹細胞は、体細胞に由来する。
【０１６２】
「多能性」は、本明細書において使用する場合、生物において複数のタイプの細胞に分化する細胞の能力を指す。「多能性幹細胞」とは、自己再生および分化して、生物において全てのタイプの細胞を産生することができる細胞を意味する。「複能性」とは、生物において全てではないが、いくつかのタイプの細胞に、典型的には、特定の組織または細胞系統の細胞に分化する細胞の能力を意味する。
【０１６３】
「複能性細胞」および「成体幹細胞」は、本明細書において使用する場合、胚または胎仔に由来せず、一般に新規な細胞型を生じさせる限定された能力を有し（「複能性」と称される）、特定の系統に傾倒している任意のタイプの幹細胞を指す。
【０１６４】
「人工多能性幹細胞」は、本明細書において使用する場合、胚性幹（ＥＳ）細胞のように、生物において全てのタイプの細胞に分化する能力を維持する一方で、長期間に亘り培養することができるが、ＥＳ細胞（胚盤胞の内部細胞塊に由来する）とは異なり、体細胞に由来する多能性幹細胞を包含する。
【０１６５】
本明細書において考察の明確化のために、単一修飾されたアルギネートは、骨格中に組み込まれる共有結合的に修飾されたモノマーの構造を例示し、かつマンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーを省略する式を使用して定義される。例えば、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーから構成される単一修飾されたアルギネートポリマー（Ｘは、ＮＲ４であり、Ｒ１は、メチルであり、Ｒ４、Ｙ１、およびＹ２は、水素である）は、本明細書において下記の構造によって例示される。
【化３０】
2020023582.tif 000051
【０１６６】
「多重修飾されたアルギネートポリマー」は、本明細書において使用する場合、共有結合的に修飾されたモノマーの実質的に全てが同じ共有結合的修飾を有さない、共有結合的に修飾されたモノマーを含有する修飾されたアルギネートを指す（すなわち、ポリマーは、２つもしくはそれ超の異なる「タイプ」または種の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する）。多重修飾されたアルギネートポリマーは、例えば、修飾されたアルギネートポリマー中のモノマーの実質的に全てが、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および式Ｉによって定義される２つもしくはそれ超の異なるタイプの共有結合的に修飾されたモノマーによって表される、修飾されたアルギネートポリマーを含む。この文脈において使用されるように、ある「タイプ」または「種」の共有結合的に修飾されたモノマーは、全ての可能性のある可変の位置が化学的に定義されている、式Ｉによって定義される共有結合性モノマーを指す。全てのモノマーが、共有結合的に修飾されているとは限らない。
【０１６７】
本明細書において考察の明確化のために、修飾されたアルギネートは、骨格中に組み込まれた共有結合的に修飾されたモノマーを例示し、かつマンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーを省略する式を使用して定義される。例えば、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および２つの異なるタイプの共有結合的に修飾されたモノマー（第１のタイプの共有結合的に修飾されたモノマーは、ＸがＮＲ４であり、Ｒ１がメチルであり、Ｒ４、Ｙ１、およびＹ２が水素である、式Ｉによって定義され、第２のタイプの共有結合的に修飾されたモノマーは、Ｘが酸素であり、Ｒ１がエチルであり、Ｙ１およびＹ２が水素である、式Ｉによって定義される）から構成される多重修飾されたアルギネートポリマーは、下記の構造によって例示される。
【化３１】
2020023582.tif 000052
【０１６８】
「類似体」および「誘導体」は、化合物との関連において、本明細書において互換的に使用され、親化合物の構造と同様の構造を有するが、１つもしくは複数の特定の成分における差異によって親化合物とは異なる化合物を指す。類似体または誘導体は、他の原子、基、または部分構造で置き換えられている、１個もしくは複数の原子、官能基、または部分構造が親化合物とは異なる。類似体または誘導体は、少なくとも理論的に、何らかの化学的または物理的プロセスによって親化合物から形成されると想像することができる。類似体および誘導体という用語は、親化合物と同じ基礎的環構造を保持するが、環（複数可）上に１個もしくは複数の異なる置換基を有する化合物を包含する。例えば、マンヌロネートまたはグルロネートの類似体または誘導体は、モノマーのコア、例えば、ピラノース環を保持するが、環上の１個もしくは複数の置換基において異なる化合物を指す。
【０１６９】
「マンヌロネート」および「マンヌロネートモノマー」は、本明細書において使用する場合、マンヌロン酸モノマー、およびその塩を指す。
【化３２】
2020023582.tif 000053
【０１７０】
「グルロネート」および「グルロネートモノマー」は、本明細書において使用する場合、グルロン酸モノマー、およびその塩を指す。
【化３３】
2020023582.tif 000054
【０１７１】
「実質的に」は、本明細書において使用する場合、９５％もしくはそれ超、９６％もしくはそれ超、９７％もしくはそれ超、９８％もしくはそれ超、または９９％もしくはそれ超の量を特定する。
【０１７２】
「ガラス転移温度」（Ｔｇ）は、本明細書において使用する場合、硬く、相対的に脆性の状態から融解またはゴム様状態への可逆的転移がアモルファス材料において観察される温度を指す。アルギネートポリマーについてのＴｇ値は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ、１０Ｋ／分の速度で加熱および冷却）を使用して実験的に決定することができる。本明細書において全ての場合において、Ｔｇの値は、粉末ポリマー試料を使用して測定する。
【０１７３】
「クリックケミストリー」は、本明細書において使用する場合、２つの化合物を一緒にカップリングするために使用される化学反応を指し、これは高収率であり、範囲が広範であり、クロマトグラフィーを伴わずに除去することができる副生成物のみを生じさせ、立体特異的であり、遂行することが簡単であり、容易に除去可能であるか、または害のない溶媒中で行うことができる。これらの判断基準を満たす反応の例は、エポキシドおよびアジリジンの求核開環、ヒドラゾンおよび複素環の形成を含めた非アルドールタイプカルボニル反応、マイケル付加、および環化付加反応、例えば、１，３−双極環化付加反応（すなわち、ヒュスゲン環化付加反応）を含めた炭素−炭素多重結合への付加を含む。例えば、MosesおよびMoorhouse、Chem Soc. Rev.、３６巻：１２４９〜１２６２頁（２００７年）；KolbおよびSharpless、DrugDiscovery Today.、８巻（２４号）：１１２８〜１１３７頁（２００３年）；およびKolbら、Angew. Chem. Int. Ed.、４０巻：２００４〜２０２１頁（２００１年）を参照されたい。
【０１７４】
「多価カチオン」は、本明細書において使用する場合、１超の正の電荷を有するカチオンを指す。例には、これらに限定されないが、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、およびＳｒ２＋が含まれる。
【０１７５】
「置換されている」は、本明細書において使用する場合、本明細書に記載されている化合物または官能基の全ての許容できる置換基を指す。最も広範な意味において、許容できる置換基は、有機化合物の非環式および環式、分岐状および枝分かれしていない、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の置換基を含む。例示的な置換基には、これらに限定されないが、ハロゲン、ヒドロキシル基、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの任意の他の有機基が含まれる。代表的な置換基には、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、シアノ、イソシアノ、置換イソシアノ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ペプチド、およびポリペプチド基が含まれる。
【０１７６】
ヘテロ原子、例えば、窒素は、ヘテロ原子の原子価を満たす、水素置換基、および／または本明細書に記載されている有機化合物の任意の許容できる置換基を有し得る。「置換」または「置換されている」は、このような置換が、置換される原子および置換基の許容される原子価に従っていること、およびこの置換が、安定な化合物、すなわち、例えば、転位、環化、脱離などによって転換を自発的に受けない化合物をもたらすという暗黙の条件を含むことが理解される。
【０１７７】
「アリール」は、本明細書において使用する場合、Ｃ５〜Ｃ１０員の芳香環系、複素環式環系、縮合された芳香環系、縮合された複素環式環系、ビ芳香環系、またはビ複素環式環系を指す。広範に定義すると、「アリール」は、本明細書において使用する場合、０〜４個のヘテロ原子を含み得る５員、６員、７員、８員、９員、および１０員の単環芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどを含む。環構造中にヘテロ原子を有するアリール基はまた、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族化合物」と称し得る。芳香環は、１つもしくは複数の環位置において、これらに限定されないが、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ（または四級化されたアミノ）、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ；およびこれらの組合せを含めた１個もしくは複数の置換基で置換することができる。
【０１７８】
「アリール」は、２個もしくはそれ超の炭素が２個の隣接している環に共通している２つもしくはそれ超の環式環（すなわち、「縮合環」）を有する多環式環系をさらに包含し、これらの環のうちの少なくとも１つは、芳香族であり、例えば、他の環式環（複数可）は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／または複素環でよい。複素環式環の例には、これらに限定されないが、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３  ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルが含まれる。環のうちの１つまたは複数は、「アリール」について上記に定義されているように置換することができる。
【０１７９】
「アルキル」は、本明細書において使用する場合、直鎖のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基、分岐鎖のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル基、およびシクロアルキル置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基を含めた、飽和または不飽和脂肪族基のラジカルを指す。他に示さない限り、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格中に３０個もしくはそれ未満（例えば、直鎖についてＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖についてＣ３〜Ｃ３０）、好ましくは、２０個もしくはそれ未満、より好ましくは、１０個もしくはそれ未満、最も好ましくは、６個もしくはそれ未満の炭素原子を有する。アルキルが不飽和である場合、このアルキル鎖は一般に、鎖中に２〜３０個の炭素、好ましくは、鎖中に２〜２０個の炭素、より好ましくは、鎖中に２〜１０個の炭素を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、これらの環構造中に３〜２０個の炭素原子、好ましくは、これらの環構造中に３〜１０個の炭素原子、最も好ましくは、環構造中に５個、６個または７個の炭素を有する。
【０１８０】
用語「アルケニル」および「アルキニル」は、長さおよび可能性のある置換において上記のアルキルと類似しているが、それぞれ、少なくとも１個の二重結合または三重結合を含有する不飽和脂肪族基を指す。
【０１８１】
「アルキル」は、炭化水素ラジカルの１個もしくは複数の炭素原子において１つもしくは複数の置換、およびヘテロアルキルを含む。適切な置換基には、これらに限定されないが、ハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素；ヒドロキシル；−ＮＲＲ’（式中、ＲおよびＲ’は、独立に、水素、アルキル、またはアリールであり、窒素原子は、任意選択で四級化されている）；−ＳＲ（式中、Ｒは、水素、アルキル、またはアリールである）；−ＣＮ；−ＮＯ２；−ＣＯＯＨ；カルボキシレート；−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、または−ＣＯＮ（Ｒ）２（式中、Ｒは、水素、アルキル、またはアリールである）；アジド、アラルキル、アルコキシル、イミノ、ホスホネート、ホスフィネート、シリル、エーテル、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−−ＣＦ３；−ＣＮ；−ＮＣＯＣＯＣＨ２ＣＨ２；−ＮＣＯＣＯＣＨＣＨ；−ＮＣＳ；およびこれらの組合せが含まれる。
【０１８２】
「アミノ」および「アミン」は、本明細書において使用する場合、当技術分野において承認されており、置換および非置換両方のアミン、例えば、一般式：
【化３４】
2020023582.tif 000055
によって表すことができる部分を指し、式中、Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、それぞれ独立に、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、置換もしくは非置換カルボニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ’’’を表すか、あるいはＲおよびＲ’は、それらが付着しているＮ原子と一緒になって、環構造中に３〜１４個の原子を有する複素環を完成し、Ｒ’’’は、ヒドロキシ基、置換もしくは非置換カルボニル基、アリール、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、複素環、または多環を表し、ｍは、０または１〜８の範囲の整数である。好ましい実施形態では、ＲおよびＲ’のうちの１つのみは、カルボニルでよく、例えば、ＲおよびＲ’は、窒素と一緒になって、イミドを形成しない。好ましい実施形態では、ＲおよびＲ’（ならびに任意選択でＲ’’）は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、または−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ’’’を表す。このように、用語「アルキルアミン」は、本明細書において使用する場合、そこに付着した置換もしくは非置換アルキルを有する上記に定義されているようなアミン基を指す（すなわち、Ｒ、Ｒ’、またはＲ’’の少なくとも１つは、アルキル基である）。
【０１８３】
「カルボニル」は、本明細書において使用する場合、当技術分野において承認されており、一般式：
【化３５】
2020023582.tif 000056
によって表されることができるような部分（式中、Ｘは、結合であるか、または酸素もしくは硫黄を表し、Ｒは、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ’’を表す）、もしくは薬学的に許容される塩を含み、Ｒ’は、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、または−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ’’を表し、Ｒ’’は、ヒドロキシ基、置換もしくは非置換カルボニル基、アリール、シクロアルキル環、シクロアルケニル環、複素環、または多環を表し、ｍは、０または１〜８の範囲の整数である。Ｘが、酸素であり、Ｒが、上記のように定義されている場合、この部分はまた、カルボキシル基と称される。Ｘが、酸素であり、Ｒが、水素であるとき、この式は、「カルボン酸」を表す。Ｘが、酸素であり、Ｒ’が、水素である場合、この式は、「ホルメート」を表す。一般に、上記の式の酸素原子が硫黄原子で置き換えられている場合、この式は、「チオカルボニル」基を表す。Ｘが、硫黄であり、ＲまたはＲ’が、水素でない場合、この式は、「チオエステル」を表す。Ｘが、硫黄であり、Ｒが、水素である場合、この式は、「チオカルボン酸」を表す。Ｘが、硫黄であり、Ｒ’が、水素である場合、この式は、「チオホルメート」を表す。Ｘが、結合であり、Ｒが、水素でない場合、上記の式は、「ケトン」を表す。Ｘが、結合であり、Ｒが、水素である場合、上記の式は、「アルデヒド」を表す。
【０１８４】
「ヘテロアルキル」は、本明細書において使用する場合、少なくとも１個のヘテロ原子を含有する、直鎖状もしくは分岐鎖状もしくは環状の炭素含有ラジカル、またはこれらの組合せを指す。適切なヘテロ原子には、これらに限定されないが、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、ＰおよびＳが含まれ、窒素、リンおよび硫黄原子は、任意選択で酸化されており、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されている。
【０１８５】
飽和炭化水素ラジカルの例には、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの相同体および異性体が含まれる。不飽和アルキル基の例には、これらに限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、ならびに３−ブチニルが含まれる。
【０１８６】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」は、本明細書においてこれらの従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に付着しているアルキル基を指す。
【０１８７】
「アルキルアリール」は、本明細書において使用する場合、アリール基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基）で置換されているアルキル基を指す。
【０１８８】
「複素環」または「複素環の」は、本明細書において使用する場合、炭素、ならびにそれぞれが、非ペルオキシド酸素、硫黄、およびＮ（Ｙ）（式中、Ｙは、非存在であるか、またはＨ、Ｏ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、フェニルもしくはベンジルである）からなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子からなる３〜１０個の環原子、好ましくは、５〜６個の環原子を含有し、かつ１〜３個の二重結合を任意選択で含有し、かつ１個もしくは複数の置換基で任意選択で置換されている、単環式または二環式環の環炭素または窒素を介して付着している環状ラジカルを指す。複素環式環の例には、これらに限定されないが、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨ−カルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３−ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルが含まれる。複素環基は、アルキルおよびアリールについて上記に定義されているような１個もしくは複数の置換基で任意選択で置換することができる。
【０１８９】
「ハロゲン」は、本明細書において使用する場合、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。
【０１９０】
ＩＩ．修飾されたアルギネート
本明細書に記載されているのは、化学修飾されてそれらの生体適合性および物理的特性が変化したアルギネートポリマー、ならびにこれを作製する方法である。
【０１９１】
Ａ．修飾されたアルギネートポリマーの構造
修飾されたアルギネートは、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有し、
【化３６】
2020023582.tif 000057
式中、
Ｘは、酸素、硫黄、またはＮＲ４であり、
Ｒ１は、水素、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜３０個の炭素原子、より好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ１基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、
Ｙ１およびＹ２は、独立に、水素または−ＰＯ（ＯＲ５）２であるか、あるいは
Ｙ２は、非存在であり、Ｙ２は、Ｙ１およびＹ２が付着している２個の酸素原子と一緒に、式ＩＩにおいて示すような環状構造を形成し、
【化３７】
2020023582.tif 000058
式中、
Ｒ２およびＲ３は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜３０個の炭素原子、より好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ２およびＲ３基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいは
Ｒ２およびＲ３は、それらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素、または任意の数の炭素原子、好ましくは、１〜３０個の炭素原子、より好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１〜１４個の炭素原子を含有し、かつ１個もしくは複数のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、もしくは窒素基を任意選択で含む、直鎖状、分岐状、もしくは環状の構造的フォーマットの有機基であり、代表的なＲ４およびＲ５基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０１９２】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、単一修飾されたアルギネートポリマーである。特定の実施形態では、単一修飾されたアルギネートポリマーは、Ｒ１が、アジド基、アルキン基、または１，２，３−トリアゾール環を含む、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する。ある特定の実施形態では、単一修飾されたアルギネートポリマーは、Ｘが酸素でなく、Ｒ１が、非置換Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、ポリ（エチレングリコール）鎖、またはコレステリル部分ではない、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する。ある特定のさらなる実施形態では、単一修飾されたアルギネートポリマーは、ＸがＮＲ４ではなく、Ｒ１が、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、またはポリ（エチレングリコール）鎖ではない、式Ｉによって定義される１種もしくは複数の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する。
【０１９３】
代わりの実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、多重修飾されたアルギネートポリマーである。好ましい実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、式Ｉによって定義される第１の種もしくはタイプの共有結合的に修飾されたモノマー、および式Ｉによって定義される第２の種もしくはタイプの共有結合的に修飾されたモノマーを含有する多糖類骨格を含む。他の実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、マンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および式Ｉによって定義される３種もしくはそれ超の異なるタイプの共有結合的に修飾されたモノマーを含有する多糖類骨格を含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーの２つの異なる種を含有し、モノマーの両方の種において、Ｘは、ＮＲ４である。他の実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーの２つの異なる種を含有し、モノマーの両方の種において、Ｘは、酸素である。さらなる実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーの２つの異なる種を含有し、１つの種のモノマーにおいて、Ｘは、酸素であり、第２の種のモノマーにおいて、Ｘは、ＮＲ４である。
【０１９５】
一部の実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーの２つの異なる種を含有し、少なくとも１つの種のモノマーにおいて、Ｒ１は、１つもしくは複数の環状部分を含む。好ましい実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーの２つの異なる種を含有し、少なくとも１つの種のモノマーにおいて、Ｒ１は、フェニル環、フラン環、オキソラン環、ジオキソラン環、または１，２，３−トリアゾール環を含む。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、式Ｉによって定義される共有結合的に修飾されたモノマーの２つの異なる種を含有し、少なくとも１つの種のモノマーにおいて、Ｒ１は、１個もしくは複数のハロゲン部分、アジド基、またはアルキンを含む。
【０１９７】
好ましい実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、下記に示す多重修飾されたアルギネートポリマーのうちの１つである。
【化３８】
2020023582.tif 000059
【化３９】
2020023582.tif 000060
【０１９８】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ９アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ７アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルチオ、Ｃ１０アルキル、Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルコキシ、Ｃ９アルキルアミノ、Ｃ９アルキルチオ、Ｃ８アルキル、Ｃ８アルコキシ、Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ８アルキルチオ、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルコキシ、Ｃ７アルキルアミノ、Ｃ７アルキルチオ、Ｃ６アルキル、Ｃ６アルコキシ、Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ６アルキルチオ、Ｃ５アルキル、Ｃ５アルコキシ、Ｃ５アルキルアミノ、Ｃ５アルキルチオ、Ｃ４アルキル、Ｃ４アルコキシ、Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ４アルキルチオ、Ｃ３アルキル、Ｃ３アルコキシ、Ｃ３アルキルアミノ、Ｃ３アルキルチオ、Ｃ２アルキル、Ｃ２アルコキシ、Ｃ２アルキルアミノ、Ｃ２アルキルチオ、Ｃ１アルキル、Ｃ１アルコキシ、Ｃ１アルキルアミノ、またはＣ１アルキルチオである。
【０１９９】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキルチオである。
【０２００】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ９アルキルチオである。
【０２０１】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ８アルキルチオである。
【０２０２】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ７アルキルチオである。
【０２０３】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルチオである。
【０２０４】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ５アルキルチオである。
【０２０５】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ４アルキルチオである。
【０２０６】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ３アルキルチオである。
【０２０７】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ２アルキルチオである。
【０２０８】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１０アルキル、Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１０アルキルアミノ、またはＣ１０アルキルチオである。
【０２０９】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ９アルキル、Ｃ９アルコキシ、Ｃ９アルキルアミノ、またはＣ９アルキルチオである。
【０２１０】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ８アルキル、Ｃ８アルコキシ、Ｃ８アルキルアミノ、またはＣ８アルキルチオである。
【０２１１】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ７アルキル、Ｃ７アルコキシ、Ｃ７アルキルアミノ、またはＣ７アルキルチオである。
【０２１２】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ６アルキル、Ｃ６アルコキシ、Ｃ６アルキルアミノ、またはＣ６アルキルチオである。
【０２１３】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ５アルキル、Ｃ５アルコキシ、Ｃ５アルキルアミノ、またはＣ５アルキルチオである。
【０２１４】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ４アルキル、Ｃ４アルコキシ、Ｃ４アルキルアミノ、またはＣ４アルキルチオである。
【０２１５】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ３アルキル、Ｃ３アルコキシ、Ｃ３アルキルアミノ、またはＣ３アルキルチオである。
【０２１６】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ２アルキル、Ｃ２アルコキシ、Ｃ２アルキルアミノ、またはＣ２アルキルチオである。
【０２１７】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、水素、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１アルキル、Ｃ１アルコキシ、Ｃ１アルキルアミノ、またはＣ１アルキルチオである。
【０２１８】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ９アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ７アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルチオ、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルチオ、Ｃ１０アルキル、Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルコキシ、Ｃ９アルキルアミノ、Ｃ９アルキルチオ、Ｃ８アルキル、Ｃ８アルコキシ、Ｃ８アルキルアミノ、Ｃ８アルキルチオ、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルコキシ、Ｃ７アルキルアミノ、Ｃ７アルキルチオ、Ｃ６アルキル、Ｃ６アルコキシ、Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ６アルキルチオ、Ｃ５アルキル、Ｃ５アルコキシ、Ｃ５アルキルアミノ、Ｃ５アルキルチオ、Ｃ４アルキル、Ｃ４アルコキシ、Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ４アルキルチオ、Ｃ３アルキル、Ｃ３アルコキシ、Ｃ３アルキルアミノ、Ｃ３アルキルチオ、Ｃ２アルキル、Ｃ２アルコキシ、Ｃ２アルキルアミノ、Ｃ２アルキルチオ、Ｃ１アルキル、Ｃ１アルコキシ、Ｃ１アルキルアミノ、またはＣ１アルキルチオである。
【０２１９】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ１０アルキルチオである。
【０２２０】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ９アルキルチオである。
【０２２１】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ８アルキルチオである。
【０２２２】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ７アルキルチオである。
【０２２３】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルチオである。
【０２２４】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ５アルキルチオである。
【０２２５】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ４アルキルチオである。
【０２２６】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ３アルキルチオである。
【０２２７】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２アルキルアミノ、またはＣ１〜Ｃ２アルキルチオである。
【０２２８】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１０アルキル、Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１０アルキルアミノ、またはＣ１０アルキルチオである。
【０２２９】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ９アルキル、Ｃ９アルコキシ、Ｃ９アルキルアミノ、またはＣ９アルキルチオである。
【０２３０】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ８アルキル、Ｃ８アルコキシ、Ｃ８アルキルアミノ、またはＣ８アルキルチオである。
【０２３１】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ７アルキル、Ｃ７アルコキシ、Ｃ７アルキルアミノ、またはＣ７アルキルチオである。
【０２３２】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ６アルキル、Ｃ６アルコキシ、Ｃ６アルキルアミノ、またはＣ６アルキルチオである。
【０２３３】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ５アルキル、Ｃ５アルコキシ、Ｃ５アルキルアミノ、またはＣ５アルキルチオである。
【０２３４】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ４アルキル、Ｃ４アルコキシ、Ｃ４アルキルアミノ、またはＣ４アルキルチオである。
【０２３５】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ３アルキル、Ｃ３アルコキシ、Ｃ３アルキルアミノ、またはＣ３アルキルチオである。
【０２３６】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ２アルキル、Ｃ２アルコキシ、Ｃ２アルキルアミノ、またはＣ２アルキルチオである。
【０２３７】
一部の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ１７、Ｒ３１〜Ｒ３６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、独立に、アミノ、ヒドロキシル、チオール、オキソ、または置換もしくは非置換Ｃ１アルキル、Ｃ１アルコキシ、Ｃ１アルキルアミノ、またはＣ１アルキルチオである。
【０２３８】
修飾されたアルギネートポリマーは、任意の所望の分子量のものでよい。アルギネートの重量平均分子量は好ましくは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって決定される場合、１，０００〜１，０００，０００ダルトン、より好ましくは、１０，０００〜５００，０００ダルトンである。
【０２３９】
修飾されたアルギネートポリマーは、任意の比のマンヌロネートモノマー、グルロネートモノマー、および共有結合的に修飾されたモノマーを含有することができる。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマー中のモノマーの２．５％超、５％超、７．５％超、１０％超、１２％超、１４％超、１５％超、１６％超、１８％超、２０％超、２２％超、２４％超、２５％超、２６％超、２８％超、３０％超、３２．５％超、３５％超、３７．５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、または６０％超は、共有結合的に修飾されたモノマーである。好ましくは、修飾されたアルギネートポリマー中のモノマーの１０％超、より好ましくは、２０％超、最も好ましくは、３０％超は、共有結合的に修飾されたモノマーである。
【０２４０】
修飾されたアルギネートポリマーは、一連の異なる水素結合能、疎水性／親水性、および荷電状態を有する共有結合的に修飾されたモノマーを組み込んで生成することができる。アルギネートポリマー中に共有結合的に修飾されたモノマーが含まれることによって、アルギネートポリマーの生理化学的特性を変化させる。したがって、アルギネートの生理化学的特性は、共有結合的に修飾されたモノマーの選択的組込みによって所望の用途のために調節することができる。
【０２４１】
例えば、ガラス転移温度（Ｔｇ）は、共有結合的に修飾されたモノマーの組込みによって変化させることができる。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマー粉末は、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定される場合、５０℃超、６０℃超、６５℃超、７０℃超、７５℃超、８０℃超、８５℃超、９０℃超、９５℃超、１００℃超、１０５℃超、１１０℃超、１１５℃超、１２０℃超、１２５℃超、１３０℃超、１３５℃超、１４０℃超、１４５℃超、１５０℃超、１６０℃超、１７５℃超、１９０℃超、または２００℃超のＴｇを有する。
【０２４２】
アルギネートの疎水性／親水性は、疎水性および／または親水性の共有結合的に修飾されたモノマーの組込みによって変化させることができる。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、１種もしくは複数の疎水性の共有結合的に修飾されたモノマーを含有する。修飾されたアルギネートの相対的な疎水性／親水性は、ゴニオメーターを使用して修飾されたアルギネートポリマーのフィルム上の水滴の接触角を測定することによって定量的にアセスメントすることができる。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、９０°未満の接触角を有する（すなわち、これは親水性である）。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートは、９０°超の接触角を有する（すなわち、これは疎水性である）。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートは、９５°超、１００°超、１０５°超、１１０°超、１１５°超、または１２０°超の接触角を有する。
【０２４３】
細胞カプセル化のために使用される実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、多価カチオン、例えば、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、またはＢａ２＋によってイオン架橋して、ヒドロゲルを形成させることができる。修飾されたアルギネートが生理学的条件中で安定なヒドロゲルを形成する能力は、実施例２に記載されているヒドロゲル形成アッセイを使用して定量化することができる。
【０２４４】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているハイスループットヒドロゲル形成アッセイを使用して測定した蛍光強度が、１０，０００超、１５，０００超、２０，０００超、２５，０００超、３０，０００超、３５，０００超、４０，０００超、４５，０００超、５０，０００超、または５５，０００超であるような、ヒドロゲルを形成する。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているハイスループットヒドロゲル形成アッセイを使用して測定した蛍光強度が、１５，０００超であるような、ヒドロゲルを形成する。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているハイスループットヒドロゲル形成アッセイを使用して測定した蛍光強度が、１５，０００〜５５，０００、好ましくは、２０，０００〜５５，０００、より好ましくは、２５，０００〜５５，０００であるような、ヒドロゲルを形成する。
【０２４５】
細胞カプセル化のために使用される実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、ゲルマトリックス中への免疫細胞の侵入を同時に防止する一方で、栄養素、廃棄物、ならびにカプセル化された細胞から分泌されたホルモンおよび／またはタンパク質が、カプセル中におよびカプセルから自由に拡散することを可能とする十分な多孔性を有するヒドロゲルを形成する。修飾されたアルギネートヒドロゲルの多孔性および表面積は、ＢＥＴ分析を使用して測定することができる。ＢＥＴ分析の前に、真空下での修飾されたアルギネートゲルの長期に亘る加熱によって、溶媒および揮発性不純物を除去する。それに続いて、ヒドロゲル試料を真空下で、例えば、液体窒素によって冷却し、特定の圧力においてヒドロゲルに吸着される気体（典型的には、Ｎ２、Ｋｒ、ＣＯ２、またはＡｒ気体）の容量を測定することによって分析する。可変の圧力における気体の物理吸着の分析を使用して、修飾されたアルギネートポリマーによって形成されるゲルの総表面積および多孔性を特性決定する。ヒドロゲル多孔性を決定する好ましい方法は、ＢＥＴ分析である。
【０２４６】
好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートは、ゲルマトリックス中への免疫細胞の侵入を同時に防止する一方で、栄養素、廃棄物、ならびにカプセル化された細胞から分泌されたホルモンおよび／またはタンパク質が、カプセル中におよびカプセルから自由に拡散することを可能とする十分な多孔性を有するヒドロゲルを形成する。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーによって形成されたヒドロゲルの多孔性は、修飾されていないアルギネートポリマーから形成されるヒドロゲルの多孔性に対して５％、１０％、１５％、または２０％増加する。代わりの実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーによって形成されるヒドロゲルの多孔性は、修飾されていないアルギネートポリマーから形成されるヒドロゲルの多孔性に対して５％、１０％、１５％、または２０％減少する。
【０２４７】
細胞カプセル化のために使用される好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートは、生体適合性である。修飾されたアルギネートの生体適合性は、実施例５に記載する蛍光をベースとするｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して定量的に決定することができる。このアッセイにおいて、カテプシン活性を、修飾されたアルギネートに対する異物応答を定量化するｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光アッセイを使用して測定した。
【０２４８】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して測定した修飾されていないアルギネートに正規化した蛍光応答が、１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満であるように、生体適合性である。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、修飾されていないアルギネートより低い異物応答を誘発する。これは１００％未満の修飾されていないアルギネートに正規化された蛍光応答によって示される。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して測定した修飾されていないアルギネートに正規化した蛍光応答が、７５％未満、より好ましくは、６５％未満、最も好ましくは、５０％未満であるように、生体適合性である。
【０２４９】
Ｂ．カプセルおよび粒子形態
カプセルは、約１５０μｍ〜約５ｃｍの平均直径を有する粒子である。開示されているカプセルは、架橋ヒドロゲルで形成することができる。カプセル化された材料以外に、カプセルは、例えば、もっぱら架橋ヒドロゲルで形成することができるか、１つもしくは複数のポリマーシェルに囲まれた架橋ヒドロゲルコアを有することができるか、１つもしくは複数の架橋ヒドロゲル層を有することができるか、架橋ヒドロゲルコーティングを有することができるか、またはこれらの組合せである。カプセルは、例えば、細胞カプセル化に適した任意の形状を有し得る。カプセルは、架橋ヒドロゲルに分散している１個もしくは複数の細胞を含有し、それによって細胞を「カプセル化」し得る。好ましいカプセルは、開示されている修飾されたアルギネートのうちの１つまたは複数で形成されているか、またはこれらを含む。好ましいカプセルは、約１５０μｍ〜約８ｍｍの平均直径を有する。
【０２５０】
カプセルは、約１５０μｍ〜約５ｃｍの任意の平均直径を有することができる。好ましくは、カプセルは、１ｍｍ超、好ましくは、１．５ｍｍもしくはそれ超の平均直径を有する。一部の実施形態では、カプセルは、直径が約８ｍｍもの大きさでよい。例えば、カプセルは、約１ｍｍ〜８ｍｍ、１ｍｍ〜６ｍｍ、１ｍｍ〜５ｍｍ、１ｍｍ〜４ｍｍ、１ｍｍ〜３ｍｍ、１ｍｍ〜２ｍｍ、１ｍｍ〜１．５ｍｍ、１．５ｍｍ〜８ｍｍ、１．５ｍｍ〜６ｍｍ、１．５ｍｍ〜５ｍｍ、１．５ｍｍ〜４ｍｍ、１．５ｍｍ〜３ｍｍ、または１．５ｍｍ〜２ｍｍのサイズ範囲であり得る。
【０２５１】
細胞の生存のために必要なカプセルに入る分子の割合、ならびにカプセル膜を出る治療用生成物および廃棄材料の割合は、カプセル透過性をモジュレートすることによって選択することができる。カプセル透過性をまた改変して、カプセルへの免疫細胞、抗体、およびサイトカインの侵入を制限することができる。一般に、実施例によって示すように、ヒドロゲルカプセルを形成させる公知の方法によって、その透過性がカプセル中への免疫細胞、抗体、およびサイトカインの侵入を制限するカプセルを生成することができる。異なる細胞型は異なる代謝的な必要性を有するため、膜の透過性はヒドロゲル中にカプセル化される細胞型に基づいて最適化することができる。カプセルの直径は、細胞カプセルに対する免疫応答およびカプセル膜を通る質量輸送の両方に影響を与える重要な因子である。
【０２５２】
ｉｎ  ｖｉｖｏで線維症を促進するパラメーターの高まりつつある認識を、修飾されたアルギネートの性能の分析に適用した。修飾されたアルギネートカプセルの腹腔内（ＩＰ）埋込みは、修飾されたアルギネートが、修飾されていないアルギネートについて規定した条件を使用して架橋されたときに、異常な形をしたカプセルをもたらし得ることを明らかにした。これらの異常な形をしたカプセルは、ＩＰに埋め込まれた修飾されたアルギネートカプセルの遂行および解釈を複雑化し得る。カプセル形態を改善する試みにおいて、修飾されたアルギネート微粒子と共に使用するための配合方法を開発したが、ここでは修飾されたアルギネートを、少量の高分子量アルギネートとブレンドした。この混合物から調製した粒子は、改善された形態および安定性を有する粒子を生じさせた。
【０２５３】
修飾されていないアルギネートは典型的には、約５０，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。しかし、分子量を有する修飾されていないアルギネートをまた使用することができる。一部の実施形態では、重量平均分子量は、約５０，０００〜約２５０，０００ダルトン、より好ましくは、約５０，０００〜約１５０，０００ダルトンである。一部の実施形態では、重量平均分子量は、約１００，０００ダルトンである。
【０２５４】
他の実施形態では、１種もしくは複数のさらなるヒドロゲル形成ポリマーを、修飾されていないアルギネートと組み合わせて使用するか、または修飾されていないアルギネートの代わりに使用する。このようなポリマーは、当技術分野において公知である。例には、これらに限定されないが、ＰＥＧ、キトサン、デキストラン、ヒアルロン酸、絹、フィブリン、ポリ（ビニルアルコール）およびポリ（ヒドロキシルエチルメタクリレート）が含まれる。
【０２５５】
例えば、バリウムおよびマンニトールと共に配合した修飾されたアルギネート２６３＿Ａ１２微粒子から調製した粒子を、少量の修飾されていないＳＬＧ１００アルギネート（１６重量％）とブレンドした２６３＿Ａ１２から調製した粒子と比較した。修飾されたアルギネートおよび修飾されていないアルギネートの混合物から調製した粒子は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって評価すると、形状およびサイズに関してより均質な微粒子集団を生じさせた。ＳＬＧ１００とブレンドした修飾されたアルギネートでのいくつかの時点におけるｐｒｏｓｅｎｓｅによる定量的蛍光分析は、いくつかの再配合された修飾されたアルギネートが、対照アルギネートと比較して７日目により少ない炎症応答を示すことを示した。大きなカプセル（１．５ｍｍの直径）による最初の実験は、免疫適格Ｃ５７ＢＬ６マウスのＩＰ空間中での２週間後に、同じ程度にクリーンなカプセルであった。それに続く実験（実施例９）は、カプセル化されたヒト細胞が、免疫抑制を有さない免疫適格糖尿病動物において（１７０日に亘る）グルコース応答性の長期間の血糖補正を達成できることを示す。この結果は、ヒト細胞をカプセル化するために、開示されているような修飾されたアルギネートを使用して達成された。このように得られたカプセルは、ヒト細胞埋込体に対する免疫応答を軽減し、埋込み組織の壊死をもたらす線維性沈着を効果的に遅延させる。この配合物は、これらのヒト細胞が免疫適格のげっ歯類レシピエントにおいて顕在化する異種刺激にも関わらず、十分な免疫保護を実現し、長期間の血糖補正を可能とした。
【０２５６】
開示されている修飾されたアルギネートは線維症の低減を媒介するため、他の材料で作製されているが、修飾されたアルギネートでコーティングまたはカプセル化されているカプセルは、線維症の低減を達成するためのカプセルの有用な形態である。これらのカプセルは、種々の材料でできているカプセルおよび粒子を含むことができ、これは次いで、修飾されたアルギネートか、または修飾されたアルギネートを含むアルギネートでコーティングまたはカプセル化され得る。
【０２５７】
開示されている組成物は、カプセル化された島細胞を含有する人工器官、例えば、人工膵臓へと作製し得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、細胞を単一のヒドロゲルコンパートメント中にカプセル化する。他の実施形態では、組成物は、生体適合性構造中に分散またはカプセル化された複数のカプセル化された細胞を含有する。
【０２５８】
Ｃ．修飾されたアルギネートポリマーの調製
修飾されたアルギネートは、任意の利用可能なアルギネートポリマーの共有結合的修飾によって調製することができる。共有結合的に修飾されたモノマーは、当技術分野において公知の種々の合成手順を使用してアルギネートポリマー中に導入することができる。一部の実施形態では、マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーを、これらのカルボン酸部分のエステル化および／またはアミド化によって共有結合的に修飾する。代わりの実施形態では、マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーを、リン酸化またはアセタール形成によって共有結合的に修飾する。共有結合的修飾の間の反応物の化学量論的バリエーションを使用して、修飾されたアルギネート中に組み込まれる共有結合的に修飾されたモノマーの量を変化させることができる。
【０２５９】
下記で考察される反応に加えて、マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーの共有結合的修飾のための代替の合成方法論は当技術分野において公知である。（例えば、March、「Advanced Organic Chemistry」、第５版、２００１年、Wiley-IntersciencePublication、New Yorkを参照されたい）。
【０２６０】
１．マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーのカルボキシレート部分による修飾
【化４０】
2020023582.tif 000061
スキーム１．代表的な反応条件：ｉ．ＨＯ−Ｒ１、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）；ｉｉ．ＨＮＲ１Ｒ７、ＣＤＭＴ、ＮＭＭ。
【０２６１】
マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーは、共有結合的修飾のポイントとしての役割を果たすことができるカルボン酸部分を含有する。好ましい実施形態では、１つもしくは複数のマンヌロネートおよび／またはグルロネート残基（１）上に存在するカルボン酸部分は、スキーム１において示すように反応する。
【０２６２】
マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）は、種々の当技術分野において公知の方法によって容易にエステル化して、共有結合的に修飾されたモノマーＢを形成することができる。例えば、Ｓｔｅｇｌｉｃｈエステル化を使用して、マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）を、カルボジイミド（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ））およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で、任意の適切なアルコール（ＨＯ−Ｒ１）との反応によってエステル化することができる。好ましい方法において、マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）を、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で、大過剰モルのアルコール（ＨＯ−Ｒ１）との反応によってエステル化する。例えば、Garrett, C. E.ら、Tetrahedron Lett.、２００２年；４３巻（２３号）：４１６１〜４１６４頁を参照されたい。エステル化における試薬として使用するための好ましいアルコールは、下記に示すものを含む。
【化４１】
2020023582.tif 000062
【０２６３】
マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）はまた、アミド化によって共有結合的に修飾して、修飾されたモノマーＣを形成することができる。例えば、マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）は、カルボジイミドおよびＤＭＡＰの存在下で任意の適切なアミン（Ｒ１−ＮＨ２）との反応によってアミド化することができる。好ましい方法において、マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）を、ＣＤＭＴおよびＮＭＭの存在下で化学量論量の適切なアミン（Ｒ１−ＮＨ２）との反応によってアミド化した。アミド化反応における試薬として使用するための好ましいアミンは、下記に示すものを含む。
【化４２】
2020023582.tif 000063
【０２６４】
２．クリックケミストリーによるマンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーの修飾
【０２６５】
一部の実施形態では、マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーを共有結合的に修飾して、官能基を導入し、これはクリックケミストリーによってさらに反応させることができる。
【０２６６】
好ましい実施形態では、アミド化および／またはエステル化を使用して、官能基を導入し、これは１，３−双極環化付加反応（すなわち、ヒュスゲン環化付加反応）を使用してさらに反応させることができる。１，３−双極環化付加反応において、アジド部分を含有する第１の分子を、末端または内部アルキンを含有する第２の分子と反応させる。下記に示すように、アジドおよびアルキン基は、分子内の１，３−双極環化付加反応を受け、２個の分子を一緒にカップリングし、１，２，３−トリアゾール環を形成させる。
【化４３】
2020023582.tif 000064
【０２６７】
１，３−双極環化付加反応の位置化学は、銅（Ｉ）触媒（アスコルビン酸ナトリウムによるＣｕＳＯ４の還元によってｉｎ  ｓｉｔｕで形成される）またはルテニウム触媒（例えば、Ｃｐ＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ３）２、Ｃｐ＊Ｒｕ（ＣＯＤ）、もしくはＣｐ＊［ＲｕＣｌ４］）を加えることによって制御することができる。例えば、銅触媒を使用して、アジドおよび末端アルキンを反応させて、１，２，３−トリアゾールの１，４−位置異性体をもっぱら得ることができる。同様に、適切なルテニウム触媒の存在下で、アジドは内部または末端アルキンと反応して、１，２，３−トリアゾールの１，５−位置異性体をもっぱら形成させることができる。
【０２６８】
一部の実施形態では、アミド化および／またはエステル化を使用して、アルキン部分を含有する共有結合的に修飾されたモノマーを形成させる。これらの実施形態では、共有結合的に修飾されたモノマー上に存在するアルキン部分は、アジド官能基を含有する第２の分子とさらに反応することができる。反応によって、アジドおよびアルキン基は、分子内の１，３−双極環化付加反応を受けて、１，２，３−トリアゾール環を形成させ、第２の分子を、共有結合的に修飾されたモノマーにカップリングさせる。
【０２６９】
アルキン含有アミド化／エステル化反応物の例は、Ｘａ−Ｒｚ−Ｃ≡Ｃ−Ｒｘを含み、式中、Ｘａは、−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、Ｒｚは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｒｘは、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０２７０】
一部の実施形態では、
（１）Ｒｚは、水素、
（Ａ）
【化４４】
2020023582.tif 000065
［式中、ｙは、１〜１１の整数であり、Ｒｅは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、およびポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒｅのうちの１つの実体例は、Ｘａであるか、またはＸａを含有し、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０〜５の整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４であり、Ｒ４は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］、
（Ｂ）  −（ＣＨ２）ｓ−Ｒ２６［式中、ｓは、０〜２０の整数であり、Ｒ２６は、−Ｘａ、−Ｏ−Ｒ２７、−Ｓ−Ｒ２７、−（ＣＨ２）ｒ−Ｒ２７、−ＣＯ−Ｒ２７、または−ＣＨＲ２８Ｒ２９であり、ｒは、０〜１９の整数であり、Ｒ２７は、−Ｘａ、−（ＣＨ２）ｕ−Ｒ３０であり、ｕは、０〜１８の整数であり、Ｒ２８は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｒ３０であり、Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｖ−Ｒ３０であり、ｔおよびｖは、０〜１８の整数であり、ｔおよびｖは、合計０〜１８であり；Ｒ３０は、−Ｘａ、メチル、−ＯＨ、−ＳＨ、または−ＣＯＯＨである］；あるいは
（Ｃ）
【化４５】
2020023582.tif 000066
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、またはＲ３６のうちの１つの実体例は、Ｘａであるか、またはＸａを含有する］
であり、
（２）Ｒｘは、水素、
（Ａ）
【化４６】
2020023582.tif 000067
［式中、ｙは、０〜１１の整数であり、Ｒｅは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、およびポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０〜５の整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４であり、Ｒ４は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］、
（Ｂ）  −（ＣＨ２）ｓ−Ｒ２６［式中、ｓは、０〜２０の整数であり、Ｒ２６は、−Ｏ−Ｒ２７、−Ｓ−Ｒ２７、−（ＣＨ２）ｒ−Ｒ２７、−ＣＯ−Ｒ２７、または−ＣＨＲ２８Ｒ２９であり、ｒは、０〜１９の整数であり、Ｒ２７は、−（ＣＨ２）ｕ−Ｒ３０であり、ｕは、０〜１８の整数であり、Ｒ２８は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｒ３０であり、Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｖ−Ｒ３０であり、ｔおよびｖは、０〜１８の整数であり、ｔおよびｖは、合計０〜１８であり；Ｒ３０は、メチル、−ＯＨ、−ＳＨ、または−ＣＯＯＨである］；あるいは
（Ｃ）
【化４７】
2020023582.tif 000068
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］
であり、
（３）ＲｚおよびＲｘは、両方ともには水素ではない。
【０２７１】
アジドを含有する第２の分子の例は、Ｒｗ−Ｎ３を含み、式中、Ｒｗは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０２７２】
一部の実施形態では、Ｒｗは、
（Ａ）
【化４８】
2020023582.tif 000069
［式中、ｋは、独立に、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜４の整数であり、Ｘｄは、ＯまたはＳであり、Ｒａは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、または複素環式環を形成し、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］、あるいは
（Ｂ）
【化４９】
2020023582.tif 000070
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］
である。
【０２７３】
代わりの実施形態では、アミド化および／またはエステル化を使用して、アジド部分を含有する共有結合的に修飾されたモノマーを形成させる。これらの実施形態では、共有結合的に修飾されたモノマー上に存在するアジド部分は、末端または内部アルキンを含有する第２の分子とさらに反応することができる。反応によって、アジドおよびアルキン基は、分子内の１，３−双極環化付加反応を受けて、１，２，３−トリアゾール環を形成させ、第２の分子を、共有結合的に修飾されたモノマーにカップリングさせる。
【０２７４】
アジド含有アミド化／エステル化反応物の例は、Ｘｃ−Ｒｗ−Ｎ３を含み、式中、Ｘｃは、−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、Ｒｗは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０２７５】
一部の実施形態では、Ｘｃは、−ＮＨ２ではなく、Ｒｗは、−ＣＨ２−Ａｒ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ではない。
【０２７６】
一部の実施形態では、Ｒｗは、
（Ａ）
【化５０】
2020023582.tif 000071
［式中、ｋは、独立に、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜４の整数であり、Ｘｄは、ＯまたはＳであり、Ｒａは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、または複素環式環を形成し、Ｒａのうちの１つの実体例は、Ｘｃであるか、またはＸｃを含有し、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、またはＲ１７のうちの１つの実体例は、Ｘｃであるか、またはＸｃを含有する］、あるいは
（Ｂ）
【化５１】
2020023582.tif 000072
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、またはＲ３６のうちの１つの実体例は、Ｘｃであるか、またはＸｃを含有する］
である。
【０２７７】
アルキンを含有する第２の分子の例は、Ｒｚ−Ｃ≡Ｃ−Ｒｘを含み、式中、ＲｚおよびＲｘは、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０２７８】
一部の実施形態では、ＲｚおよびＲｘは、独立に、水素、
（Ａ）
【化５２】
2020023582.tif 000073
［式中、ｙは、０〜１１の整数であり、Ｒｅは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、およびポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環または複素環式環を形成し、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＳであり、隣接するＲ１８〜Ｒ２３の間の結合は、原子価によって二重または一重であり、Ｒ１８〜Ｒ２３は、原子価によって０個、１個、または２個の水素に結合し、Ｒ２４は、独立に、−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−または−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｐ−Ｘｂ−（ＣＲ２５Ｒ２５）ｑ−であり、式中、ｐおよびｑは、独立に、０〜５の整数であり、Ｘｂは、非存在、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、またはＮＲ４であり、各Ｒ２５は、独立に、非存在、水素、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＲ４であり、Ｒ４は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］、
（Ｂ）  −（ＣＨ２）ｓ−Ｒ２６［式中、ｓは、０〜２０の整数であり、Ｒ２６は、−Ｏ−Ｒ２７、−Ｓ−Ｒ２７、−（ＣＨ２）ｒ−Ｒ２７、−ＣＯ−Ｒ２７、または−ＣＨＲ２８Ｒ２９であり、ｒは、０〜１９の整数であり、Ｒ２７は、−（ＣＨ２）ｕ−Ｒ３０であり、ｕは、０〜１８の整数であり、Ｒ２８は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｒ３０であり、Ｒ２９は、−（ＣＨ２）ｖ−Ｒ３０であり、ｔおよびｖは、０〜１８の整数であり、ｔおよびｖは、合計０〜１８であり；Ｒ３０は、メチル、−ＯＨ、−ＳＨ、または−ＣＯＯＨである］；あるいは
（Ｃ）
【化５３】
2020023582.tif 000074
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である］
であり、
ＲｚおよびＲｘは、両方ともには水素ではない。
【０２７９】
一部の実施形態では、アジド部分を、脱離基、例えば、Ｉ、Ｂｒ、ＯＴｓ、ＯＭｓを含有する共有結合的に修飾されたモノマーに加えることができる。一部の実施形態では、アミド化および／またはエステル化を使用して、脱離基を含有する共有結合的に修飾されたモノマーを形成させる。脱離基含有アミド化／エステル化反応物の例は、Ｘｃ−Ｒｗ−Ｌを含み、式中、Ｘｃは、−ＯＨまたは−ＮＨ２であり、Ｌは、脱離基であり、Ｒｗは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基である。
【０２８０】
一部の実施形態では、Ｘｃは、−ＮＨ２ではなく、Ｒｗは、−ＣＨ２−Ａｒ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ではない。
【０２８１】
一部の実施形態では、Ｒｗは、
（Ａ）
【化５４】
2020023582.tif 000075
［式中、ｋは、独立に、１〜３０の整数であり、ｚは、０〜４の整数であり、Ｘｄは、ＯまたはＳであり、Ｒａは、独立に、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であるか、あるいはそれらが付着している炭素原子と一緒に、３〜８員の非置換または置換されている炭素環式環、または複素環式環を形成し、Ｒａのうちの１つの実体例は、Ｘｃであるか、またはＸｃを含有し、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、スルホニル、置換スルホニル、スルホン酸、ホスホリル、置換ホスホリル、ホスホニル、置換ホスホニル、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、またはＲ１７のうちの１つの実体例は、Ｘｃであるか、またはＸｃを含有する］、あるいは
（Ｂ）
【化５５】
2020023582.tif 000076
［式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、およびＲ３６は、独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、置換アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、アロキシ、置換アロキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、フェニルチオ、置換フェニルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボニル、置換カルボニル、カルボキシル、置換カルボキシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、ポリアリール、置換ポリアリール、Ｃ３〜Ｃ２０環、置換Ｃ３〜Ｃ２０環、複素環、置換複素環、アミノ酸、ポリ（エチレングリコール）、ペプチド、またはポリペプチド基であり、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、またはＲ３６のうちの１つの実体例は、Ｘｃであるか、またはＸｃを含有する］
である。
【０２８２】
一部の実施形態では、Ｘｃは、−ＮＨ２ではなく、Ｒｗは、−ＣＨ２−Ａｒ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ではない。
【０２８３】
好ましい実施形態では、アミド化を使用して、アジド部分を含有する共有結合的に修飾されたモノマーを形成させる。それに続いて、共有結合的に修飾されたモノマー上に存在するアジド部分は末端または内部アルキンを含有する第２の分子と反応して、１，２，３−トリアゾール環を形成させ、第２の分子を、共有結合的に修飾されたモノマーにカップリングさせる。
【０２８４】
スキーム２において示すように、異なる戦略を用いて、アジド部分を含有する共有結合的に修飾されたモノマーを調製することができる。
【０２８５】
スキーム２
【化５６】
2020023582.tif 000077
【０２８６】
例えば、マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）は、カルボジイミドおよびＤＭＡＰの存在下で、アジド部分で置換されているアミン（例えば、１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン）との反応によってアミド化し、単一の合成ステップにおいてアジド官能化された修飾されたモノマーＦを形成することができる。代わりに、マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）は、アジドに容易に変換することができる任意の部分で置換されているアミンとの反応によってアミド化することができる。例えば、マンヌロネートおよびグルロネート残基は、カルボジイミドおよびＤＭＡＰの存在下で、４−ヨードベンジルアミンとの反応によってアミド化し、ヨード官能化モノマーＤを形成することができる。次いで、ヨウ素部分は、例えば、アジ化ナトリウムによる処理によってアジドに容易に変換することができる。
【０２８７】
それに続いて、アジド官能化モノマーは、アルキン官能基を含有する分子と反応することができる。例えば、アジド官能化モノマーＦおよびＥは、銅（Ｉ）触媒（アスコルビン酸ナトリウムによるＣｕＳＯ４の還元によってｉｎ  ｓｉｔｕで形成される）の存在下で末端アルキン官能基を含有する分子と反応して、共有結合的に修飾されたモノマーＧおよびＨを形成することができる。
【０２８８】
１，３−双極環化付加反応において試薬として使用するための好ましいアルキンは、下記に示すものを含む。
【０２８９】
【化５７】
2020023582.tif 000078
【０２９０】
３．マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーのヒドロキシル部分による修飾
【０２９１】
マンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーは、共有結合的修飾のポイントとしての役割を果たすことができるヒドロキシル部分を含有する。好ましい実施形態では、マンヌロネートおよびグルロネート残基（１）のヒドロキシル部分は、スキーム３において示すように反応する。
【０２９２】
スキーム３
【化５８】
2020023582.tif 000079
代表的な反応条件：ｉ．Ｉ−ＰＯ（ＯＲ５）２、ピリジン；ｉｉ．Ｒ２−ＣＯ−Ｒ３、Ｈ＋。
【０２９３】
マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）は、種々の当技術分野において公知の方法によってリン酸化して、共有結合的に修飾されたモノマーＩを形成することができる。例えば、マンヌロネートおよびグルロネート残基は、ピリジンの存在下でＩ−ＰＯ（ＯＲ５）２との反応によってリン酸化することができる（Stowell, J. K.およびWidlanski, T. S.、Tetrahedron Lett.、１９９５年；３６巻（１１号）：１８２５〜１８２６頁）。
【０２９４】
マンヌロネートおよびグルロネート残基（Ａ）はまた、当技術分野において公知の手順を使用して環状アセタールに変換することができる。例えば、環状アセタールは、酸性条件においてマンヌロネートおよびグルロネート残基と任意の適切なケトン（Ｒ２−ＣＯ−Ｒ３）との反応によって形成させることができる。
【０２９５】
４．多重修飾されたアルギネートポリマーを調製する方法
【０２９６】
単一修飾されたアルギネートポリマーの場合、単一のみの反応または一連の反応が行われ、１タイプの共有結合的に修飾されたモノマーを導入する。
【０２９７】
多重修飾されたアルギネートポリマーの場合、１つもしくは複数の反応が行われ、修飾されたアルギネートポリマー中に複数の異なるタイプの共有結合的に修飾されたモノマーが導入される。一部の実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、複数の逐次の合成反応を使用して調製する。例えば、下記に示す多重修飾されたアルギネートポリマーは、２つの逐次反応：（１）ＣＤＭＴおよびＮＭＭの存在下でのメチルアミンによるマンヌロネートモノマーおよびグルロネートモノマーのアミド化；ならびに（２）ＣＤＭＴおよびＮＭＭの存在下でのエタノールによるマンヌロネートおよびグルロネート残基のエステル化を使用して調製することができる。
【０２９８】
【化５９】
2020023582.tif 000080
【０２９９】
代わりの実施形態では、多重修飾されたアルギネートポリマーは、「ワンポット」合成を使用して調製することができる。これらの実施形態では、複数の共有結合的に修飾されたモノマーを、単一の合成ステップにおいてアルギネートポリマー中に導入する。例えば、上記の多重修飾されたアルギネートポリマーは、ＣＤＭＴおよびＮＭＭの存在下でアルギネートポリマーとメチルアミンおよびエタノールとを反応させることによって、単一の合成ステップにおいて代わりに調製することができる。
【０３００】
任意のタイプもしくは形態の修飾されたアルギネート、任意のタイプもしくは形態のアルギネート修飾、およびアルギネートを修飾するための任意のタイプもしくは形態の試薬は、開示されている修飾されたアルギネート、アルギネート修飾、アルギネート修飾のための試薬、方法、およびキットのいずれかにおいて、ならびに任意の文脈、組合せ、または使用において、独立におよび任意の組合せで、特に含むか、または除外することができる。例えば、任意のタイプもしくは形態のエステル化試薬、アミド化試薬、クリック試薬、アルキン含有試薬、アジド含有試薬、リン酸化試薬、およびケトン試薬、例えば、上記および実施例において記載したものは、独立におよび任意の組合せで、アルギネートを修飾するための使用に特に含むか、または除外することができ、このような試薬を含むか、またはこれをベースとする任意のアルギネート修飾および任意の修飾されたアルギネートは、開示されている修飾されたアルギネート、アルギネート修飾、アルギネート修飾のための試薬、方法、およびキットのいずれかにおいて、ならびに任意の文脈、組合せ、または使用において、独立におよび任意の組合せで、特に含むか、または除外することができる。
【０３０１】
別の例として、表２に記載される試薬のいずれかは、独立におよび任意の組合せで、アルギネートを修飾するための使用に特に含むか、または除外することができ、表２に記載されている試薬を含むか、またはこれをベースとする任意のアルギネート修飾および任意の修飾されたアルギネートは、開示されている修飾されたアルギネート、アルギネート修飾、アルギネート修飾のための試薬、方法、およびキットのいずれかにおいて、ならびに任意の文脈、組合せ、または使用において、独立におよび任意の組合せで、特に含むか、または除外することができる。例えば、試薬Ｙ３を除外して組み合わせた、表２に記載されている試薬の全ては、アルギネートを修飾するための使用に特に含むか、または除外することができ、試薬Ｙ３を除外して組み合わせた、表２に記載されている全ての試薬を含むか、またはこれをベースとする任意のアルギネート修飾および任意の修飾されたアルギネートは、開示されている修飾されたアルギネート、アルギネート修飾、アルギネート修飾のための試薬、方法、およびキットのいずれかにおいて、ならびに任意の文脈、組合せ、または使用において、特に含むか、または除外することができる。
【０３０２】
別の例として、米国特許出願第２０１２０３０８６５０号に記載されている任意の修飾されたアルギネート、アルギネート修飾、またはアルギネート修飾のための試薬を、独立におよび任意の組合せで、特に含むか、または除外することができる。米国特許出願公開第２０１２０３０８６５０号は、参照により本明細書中にその全体が、および特に修飾されたアルギネート、アルギネート修飾、およびアルギネート修飾のための試薬のその記載について組み込まれている。本明細書に記載されているＲ基のいずれかについてのＲ基置換基のいずれかは、それぞれのＲ基についてのオプションとして、または選択として、独立におよび任意の組合せで、特に含むか、または除外することができる。
【０３０３】
Ｄ．アルギネートの精製
【０３０４】
市販のアルギネートは一般に、藻類から得られる。海藻からの粗アルギネートは、ポリフェノール、タンパク質、および内毒素を含めた多数の汚染物質を含有する（de Vos, P,ら、Biomaterials、２００６年；２７巻：５６０３〜５６１７頁）。これらの不純物が存在することによって、埋め込まれるアルギネートの生体適合性を制限することが示されてきた。
【０３０５】
本明細書に記載されている化学修飾されたアルギネートの生体適合性を最適化するために、厳格な精製方法論が開発され、潜在的に刺激性の不純物を排除してきた。好ましい実施形態では、超高純度の低粘度アルギネート（ＵＰＶＬＶＧ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）を、共有結合的修飾のための基材として使用した。それぞれの共有結合的修飾に続いて、修飾されたアルギネートを、バルク有機不純物を捕捉することを目指す修飾されたシリカカラム、例えば、シアノ修飾されたシリカカラムに通して濾過した。最後に、アルギネートポリマーの共有結合的修飾が完了した後、修飾されたアルギネートを透析して、残ったあらゆる小分子または低分子量不純物を除去する。好ましい方法において、修飾されたアルギネートを、１０，０００分画分子量（ＭＷＣＯ）膜で透析して、残ったあらゆる小分子不純物を除去する。
【０３０６】
修飾されたアルギネートの純度は、１Ｈ  ＮＭＲ分析によって決定することができる。このような分析において、修飾されたアルギネートポリマーの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを集め、修飾されたアルギネートポリマーおよび任意の不純物に対応するピークを積分して、試料中の各種の相対量を決定する。一部の実施形態では、１Ｈ  ＮＭＲによって決定した場合の修飾されたアルギネートポリマーの純度は、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超である。好ましい実施形態では、１Ｈ  ＮＭＲによって決定した場合の修飾されたアルギネートポリマーの純度は、９０％超、より好ましくは、９５％超である。
【０３０７】
ＩＩＩ．生体材料
【０３０８】
開示されているアルギネートにおけるカプセル化のための生体材料は、任意の生体物質でよい。例えば、生体材料は、組織、細胞、生体マイクロ分子、または生体高分子でよい。生体高分子の例は、ヌクレオチド、アミノ酸、補因子、およびホルモンを含む。生体高分子の例は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、および多糖類を含む。タンパク質の例は、酵素、受容体、分泌タンパク質、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、ホルモン、およびリガンドを含む。任意のクラス、タイプ、形態、または特定の生体材料を、任意の他のクラス、タイプ、形態、または特定の生体材料と一緒に使用することができる。
【０３０９】
Ａ．細胞
【０３１０】
開示されている組成物におけるカプセル化のための選択した細胞型は、所望の治療効果によって決まる。細胞は、患者（自己細胞）から、同じ種の別のドナー（同種異系細胞）から、または別の種（異種）からでよい。異種細胞（xenogeneic cell）は容易に入手可能であるが、拒絶についての潜在性、および患者へのウイルスの伝播の可能性の危険性は、これらの臨床適用を制限する。細胞のこれらのタイプのいずれかは、自然源、幹細胞、由来細胞、または遺伝子操作された細胞からでよい。
【０３１１】
一部の実施形態では、細胞は、治療的に有効な物質、例えば、タンパク質または核酸を分泌する。一部の実施形態では、細胞は、代謝産物を産生する。一部の実施形態では、細胞は、毒性物質を代謝する。一部の実施形態では、細胞は、構造的組織、例えば、皮膚、骨、軟骨、血管、または筋肉を形成する。一部の実施形態では、細胞は、天然、例えば、インスリンを天然に分泌する島細胞、または天然に解毒する肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、異種タンパク質（heterologous protein）もしくは異種核酸を発現し、かつ／または内在性タンパク質もしくは内在性核酸を過剰発現するように遺伝子操作される。
【０３１２】
開示されている組成物におけるカプセル化のための細胞のタイプは、自然源からの細胞、例えば、異種組織からの細胞、屍体からの細胞、および初代細胞；幹細胞、例えば、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、および人工多能性幹細胞；由来細胞、例えば、幹細胞に由来する細胞、細胞系からの細胞、初期化された細胞、初期化された幹細胞、および初期化された幹細胞に由来する細胞；ならびに遺伝子操作された細胞、例えば、タンパク質または核酸を発現するように遺伝子操作された細胞、代謝産物を産生するように遺伝子操作された細胞、および毒性物質を代謝するように遺伝子操作された細胞を含む。
【０３１３】
開示されている組成物におけるカプセル化のための細胞のタイプは、肝細胞、島細胞、副甲状腺細胞、内分泌細胞、腸起源の細胞、腎臓に由来する細胞、ならびに材料を合成および分泌するか、または代謝するように主に作用する他の細胞を含む。好ましい細胞型は、膵島細胞または他のインスリン産生細胞である。ホルモン産生細胞は、１種もしくは複数のホルモン、例えば、インスリン、副甲状腺ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、成長ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン（lutenizing hormone）、チロキシン、カルシトニン、アルドステロン、コルチゾール、エピネフリン、グルカゴン、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロンを産生することができる。遺伝子操作された細胞はまた、開示されている方法によるカプセル化に適している。一部の実施形態では、細胞を工学処理して、１種もしくは複数のホルモン、例えば、インスリン、副甲状腺ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、成長ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、チロキシン、カルシトニン、アルドステロン、コルチゾール、エピネフリン、グルカゴン、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロンを産生させる。一部の実施形態では、細胞を工学処理して、血液凝固因子を分泌させる（例えば、血友病処置のため）か、または成長ホルモンを分泌させる。一部の実施形態では、細胞は、天然またはバイオ工学処理した組織中に含有される。例えば、カプセル化のための細胞は、一部の実施形態では、バイオ人工の腎糸球体である。一部の実施形態では、細胞は、神経変性疾患の処置のための中枢神経系中への移植に適している。
【０３１４】
細胞は、ドナーから直接、ドナーからの細胞の細胞培養物から、または樹立細胞培養系から得ることができる。好ましい実施形態では、細胞はドナーから直接得て、洗浄し、ポリマー材料と組み合わせて直接埋め込む。細胞は、組織培養の当業者には公知の技術を使用して培養する。
【０３１５】
細胞生存率は、標準的な技術、例えば、組織学的検査および蛍光顕微鏡法を使用してアセスメントすることができる。埋め込まれた細胞の機能は、これらの技術および機能アッセイの組合せを使用して決定することができる。例えば、肝細胞の場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝機能研究は、カニューレをレシピエントの総胆管に入れることによって行うことができる。次いで、胆汁を少しずつ集めることができる。胆汁色素は、誘導体化されていないテトラピロールを探す高圧液体クロマトグラフィーによって、またはＰ−グルクロニダーゼによる処理を伴うか、もしくは伴わずに、ジアゾ化アゾジピロールエチルアントラニレートとの反応によってアゾジピロールに変換された後で、薄層クロマトグラフィーによって分析することができる。ジコンジュゲートおよびモノコンジュゲートされたビリルビンはまた、コンジュゲートされた胆汁色素のアルカリメタノリシスの後で薄層クロマトグラフィーによって決定することができる。一般に、機能している移植した肝細胞の数が増加するにつれ、コンジュゲートされたビリルビンのレベルは増加する。単純な肝機能検査はまた、血液試料、例えば、アルブミン産生について行うことができる。類似の器官機能研究を、埋込み後の細胞機能の程度を決定するために必要に応じて当業者には公知の技術を使用して行うことができる。例えば、膵島細胞および他のインスリン産生細胞を埋め込んで、インスリンの適当な分泌によるグルコースのレギュレーションを達成することができる。他の内分泌組織および細胞をまた、埋め込むことができる。
【０３１６】
細胞が埋め込まれる部位（複数可）は、細胞の必要数と同様に、個体の必要性に基づいて決定される。器官もしくは腺の機能を置き換えるか、または補う細胞（例えば、肝細胞もしくは島細胞）について、混合物は腸間膜、皮下組織、腹膜後腔、腹膜前の空間、および筋内の空間に注射することができる。
【０３１７】
開示されている組成物、例えば、カプセルおよびマイクロカプセル中にカプセル化された細胞の量および密度は、細胞の選択、ヒドロゲル、および埋込みの部位によって変化する。一部の実施形態では、単一の細胞は、ヒドロゲル中に０．１×１０６〜４×１０６個の細胞／ｍｌ、好ましくは０．５×１０６〜２×１０６個の細胞／ｍｌの濃度で存在する。他の実施形態では、細胞は、細胞集合体として存在している。例えば、島細胞集合体（または全膵島）は好ましくは、１５０μｍの直径の各集合体について約１５００〜２０００個の細胞を含有し、これは１膵島同等物（ＩＥ）と定義される。したがって、一部の実施形態では、島細胞は、１００〜１００００ＩＥ／ｍｌ、好ましくは、２００〜３，０００ＩＥ／ｍｌ、より好ましくは、５００〜１５００ＩＥ／ｍｌの濃度で存在する。
【０３１８】
１．島細胞および他のインスリン産生細胞
【０３１９】
好ましい実施形態では、開示されている組成物は、島細胞または他のインスリン産生細胞を含有する。膵島細胞を単離する方法は、当技術分野において公知である。Fieldら、Transplantation、６１巻：１５５４頁（１９９６年）；Linetskyら、Diabetes、４６巻：１１２０頁（１９９７年）。新鮮な膵臓組織は、刻むこと、裂くこと、粉砕および／またはコラゲナーゼ消化によって分割することができる。次いで、膵島は、洗浄、フィルタリング、遠心分離または採集手順によって夾雑細胞および材料から単離することができる。島細胞を単離および精製するための方法および器具は、Ｌａｎｇｌｅｙへの米国特許第５，４４７，８６３号、Ｓｃｈａｒｐらへの同第５，３２２，７９０号、Ｌａｎｇｌｅｙへの同第５，２７３，９０４号、およびＳｃｈａｒｐらへの同第４，８６８，１２１号に記載されている。単離された膵臓細胞は、当技術分野において公知のように島細胞を培養する任意の適切な方法を使用して、マイクロカプセル化の前に任意選択で培養し得る。例えば、Ｂｒｏｔｈｅｒｓへの米国特許第５，８２１，１２１号を参照されたい。単離した細胞は、抗原性成分を排除することを助ける条件下にて培地中で培養し得る。インスリン産生細胞はまた、幹細胞および細胞系に由来することができ、インスリンを産生するように遺伝子操作された細胞でよい。
【０３２０】
２．遺伝子操作された細胞
【０３２１】
一部の実施形態では、開示されている組成物は、タンパク質または核酸（例えば、治療用タンパク質または核酸）を産生するように遺伝子操作された細胞を含有する。これらの実施形態では、細胞は、例えば、幹細胞（例えば、多能性）、前駆細胞（例えば、複能性もしくは少能性）、または最終分化細胞（すなわち、単能性）でよい。開示されている細胞型のいずれかは、遺伝子操作することができる。細胞を工学処理して、例えば、例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ｍｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉをコードする核酸、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有させることができる。上記核酸は、例えば、安定発現のために細胞ゲノムＤＮＡ中に組み込むことができるか、または例えば、発現ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ）中に存在することができる。上記ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、処置する疾患（または達成される効果）および移植または埋込みの部位に基づいて選択することができる。一部の実施形態では、上記ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、抗新生物である。他の実施形態では、上記ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、ホルモン、成長因子、または酵素である。
【０３２２】
Ｂ．ホルモン
【０３２３】
開示されているカプセルに含まれるか、または最も好ましくは、開示されているカプセル中にカプセル化された細胞から産生されるホルモンは、目的のものであり得る。
【０３２４】
内分泌性ホルモンの例には、下垂体後葉によって産生され、腎臓を標的とし、水分平衡および血圧に影響を与える抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）；下垂体後葉によって産生され、子宮、乳房を標的とし、子宮収縮および泌乳を刺激するオキシトシン；下垂体前葉によって産生され、体細胞、骨、筋肉を標的とし、成長および発達に影響を与える成長ホルモン（ＧＨ）；下垂体前葉によって産生され、乳房を標的とし、泌乳を維持するプロラクチン；下垂体前葉によって産生され、甲状腺を標的とし、甲状腺ホルモンをレギュレートする甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；下垂体前葉によって産生され、副腎皮質を標的とし、副腎皮質ホルモンをレギュレートする副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）；下垂体前葉によって産生され、卵巣／精巣を標的とし、卵子および精子の産生を刺激する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；下垂体前葉によって産生され、卵巣／精巣を標的とし、排卵および性ホルモン放出を刺激する黄体形成ホルモン（ＬＨ）；甲状腺によって産生され、体細胞を標的とし、代謝をレギュレートするチロキシン；甲状腺によって産生され、副腎皮質を標的とし、血中カルシウムを低下させるカルシトニン；副甲状腺によって産生され、骨基質を標的とし、血中カルシウムを上昇させる副甲状腺ホルモン；副腎皮質によって産生され、腎臓を標的とし、水分平衡をレギュレートするアルドステロン；副腎皮質によって産生され、体細胞を標的とし、免疫系およびストレス応答を弱めるコルチゾール；副腎髄質によって産生され、心臓、肺、肝臓、および体細胞を標的とし、一次「闘争または逃走」応答に影響を与えるエピネフリン；膵臓によって産生され、肝臓体を標的とし、血中グルコース値を上昇させるグルカゴン；膵臓によって産生され、体細胞を標的とし、血中グルコース値を低下させるインスリン；卵巣によって産生され、生殖器系を標的とし、思春期、月経、および生殖腺の発達に影響を与えるエストロゲン；卵巣によって産生され、生殖器系を標的とし、思春期、月経周期、および生殖腺の発達に影響を与えるプロゲステロン；ならびに副腎、精巣によって産生され、生殖器系を標的とし、思春期、生殖腺の発達、および精子に影響を与えるテストステロンが含まれる。
【０３２５】
ＩＶ．修飾されたアルギネートポリマーの特性決定のためのアッセイ
【０３２６】
アルギネートポリマーの共有結合的修飾は、アルギネートポリマーの生理化学的特性および生体適合性を変化させる。
【０３２７】
一部の実施形態では、ヒドロゲル形成アッセイを使用して、アルギネートまたは修飾されたアルギネートから形成されるヒドロゲルの安定性を定量化する。好ましい実施形態では、ヒドロゲル形成アッセイを、安定なヒドロゲルを形成することができる修飾されたアルギネートを同定するスクリーニングツールとして使用する。
【０３２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、修飾されたアルギネートポリマーの生体適合性を特性決定するのに有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイを使用して、修飾されていないアルギネートより低い異物応答を誘発する修飾されたアルギネートを同定する。
【０３２９】
本明細書にさらに記載されているのは、修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法である。
【０３３０】
上記アッセイを使用して、特定の用途のための修飾されたおよび修飾されていないアルギネートの両方の適応性および生体適合性をアセスメントすることができる。
【０３３１】
Ａ．ハイスループットヒドロゲル形成アッセイ
【０３３２】
アルギネートの共有結合的修飾は、アルギネートが細胞および生体分子のカプセル化に適したヒドロゲルを形成する能力を含めたアルギネートの物理的特性に影響を与える。
【０３３３】
ゲル形成アッセイは、ヒドロゲルが、蛍光化合物を捕捉し、かつヒドロゲルの安定性に基づいて洗浄の際にフルオロフォアを異なった形で（differentially）保持する能力を活用する。このアッセイにおいて、ヒドロゲルは、候補の修飾されたアルギネートを溶解したフルオロフォアを含有する水溶液中でイオン架橋することによって形成される。種々のフルオロフォアを、このアッセイにおいて使用することができる。好ましい実施形態では、フルオロフォアは、４８０ｎｍ〜７５０ｎｍの最大発光を有する。好ましい実施形態では、フルオロフォアは、５５０ｎｍ〜６００ｎｍの最大発光を有するローダミン染料である。
【０３３４】
架橋の後、ヒドロゲルを、水で繰り返し洗浄する。効率的に架橋しない候補の修飾されたアルギネートを、存在するフルオロフォアと共に洗い流す。効率的に架橋する修飾されたアルギネートは、洗浄の間にフルオロフォアを保持する。したがって、洗浄後の修飾されたアルギネートヒドロゲルの蛍光を測定することによって、安定なヒドロゲルを形成させることができる修飾されたアルギネートを容易に同定することができる。
【０３３５】
一部の実施形態では、修飾されたアルギネートがヒドロゲルを形成することができるかを決定するために、修飾されたアルギネートについて測定した相対的蛍光強度値を、陰性対照および修飾されていないアルギネートについて測定した蛍光レベルに対して比較する。代わりの実施形態では、本明細書に記載されているヒドロゲル形成アッセイを使用して、アルギネートまたは修飾されたアルギネートから形成されるヒドロゲルの安定性を定量化する。これらの実施形態では、修飾されたアルギネートについて測定した蛍光強度を使用して、アルギネートによって形成されるヒドロゲルの安定性を示す。
【０３３６】
好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、ヒドロゲルを形成し、本明細書に記載されているハイスループットヒドロゲル形成アッセイを使用して測定した蛍光強度は、１０，０００超、１５，０００超、２０，０００超、２５，０００超、３０，０００超、３５，０００超、４０，０００超、４５，０００超、５０，０００超、または５５，０００超である。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、ヒドロゲルを形成し、本明細書に記載されているハイスループットヒドロゲル形成アッセイを使用して測定した蛍光強度は、１５，０００超である。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、ヒドロゲルを形成し、本明細書に記載されているハイスループットヒドロゲル形成アッセイを使用して測定した蛍光強度は、１５，０００〜５５，０００、より好ましくは、２５，０００〜５５，０００である。
【０３３７】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイ
現在の生体適合性分析方法は遅く、組織学的分析を必要とする。本明細書に記載されているのは、ｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイであり、アルギネートポリマーの相対的生体適合性をアセスメントするのに有用である。
【０３３８】
本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイにおいて、修飾されたアルギネートポリマーおよび修飾されていないアルギネート対照を、動物試験対象の背中上にアレイフォーマットで注射し、ハイスループットスクリーニングを促進する。好ましい実施形態では、動物試験対象は、マウスである。注射の後、修飾されたアルギネートの注射の個所におけるカテプシン活性を、修飾されていないアルギネートの注射の個所におけるカテプシン活性と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを使用して埋め込まれたアルギネートに対する異物応答を比較する。好ましい実施形態では、材料の生体適合性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを使用して注射の１４日後にアセスメントした。
【０３３９】
好ましい実施形態では、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイを使用して、修飾されていないアルギネートより低い異物応答を誘発する修飾されたアルギネートを同定する。修飾されたアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度を、修飾されていないアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度と比較した。好ましい実施形態では、修飾されていないアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度より、埋込み部位においてより小さな蛍光強度を示す修飾されたアルギネートを、生体適合性として定性的に特性決定した。逆に、修飾されていないアルギネートの埋込み部位において測定する蛍光強度より。埋込み部位においてより大きな蛍光強度を示す修飾されたアルギネートを、生体適合性でないと特性決定した。
【０３４０】
上記のｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイをまた使用して、修飾されたアルギネートがｉｎ  ｖｉｖｏで機械的に安定なヒドロゲルを形成する能力を特性決定することができる。好ましい実施形態では、注射の２８日後にアルギネートゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性をアセスメントした。
【０３４１】
好ましい実施形態では、２８日後に注射の部位に残った修飾されたアルギネートゲルを、ｉｎ  ｖｉｖｏで機械的に安定なヒドロゲルを形成することができると特性決定した。逆に、２８日後に注射の部位において存在しなかった修飾されたアルギネートゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏで機械的に安定なヒドロゲルを形成することができないとみなした。
【０３４２】
Ｃ．生体適合性を定量化する修飾されたアルギネートのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング
【０３４３】
本明細書にさらに記載されているのは、修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法である。
【０３４４】
この方法において、修飾されたアルギネートポリマーを、動物試験対象の背中に注射する。好ましい実施形態では、動物試験対象は、マウスである。注射後、修飾されたアルギネートの注射の個所におけるカテプシン活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光アッセイを使用して測定した。好ましい実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを使用して、注射の７日後に蛍光アッセイを行った。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化するために、蛍光強度を測定し、修飾されていないアルギネートを使用して測定した蛍光応答に正規化した。
【０３４５】
好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、修飾されていないアルギネートより低い異物応答を誘発する（すなわち、修飾されていないアルギネートに正規化した蛍光応答は、１００％未満である）。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、生体適合性であり、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して測定した修飾されていないアルギネートに正規化した蛍光応答は、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満である。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、生体適合性であり、本明細書に記載されているｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性アッセイを使用して測定した修飾されていないアルギネートに正規化した蛍光応答は、７５％未満、より好ましくは、６５％未満、最も好ましくは、５０％未満である。
【０３４６】
Ｖ．使用の方法
アルギネートは、食品、製薬、化粧品、農業、印刷、および紡績産業における種々の用途において使用される。アルギネートは、増粘剤、ゲル化剤、安定化剤、粘稠化剤（bodying agent）、懸濁化剤（suspending agent）、および乳化剤（emulsifying agent）として食品産業において広範に用いられている。アルギネートは、治療剤、予防剤、および／または診断用剤の送達を制御するマトリックスとして使用することができる。アルギネートは、医薬組成物中に添加剤として組み込むことができ、ここでこれらは粘稠剤（viscosifier）、沈殿防止剤（suspensionagent）、乳化剤（emulsifier）、結合剤、および崩壊剤（disintigrant）として作用することができる。アルギネートはまた、歯科用印象材料、創傷被覆材の成分として、および印刷剤として使用される。本明細書において開示されている修飾されたアルギネートは、アルギネートが現在用いられている任意の用途において使用することができることを当業者は認識する。
【０３４７】
本明細書に記載されている修飾されたアルギネートは、市販のアルギネートと比較して改善された生体適合性および物理的特性（例えば、抗線維化であること）が好ましい用途において使用することができることが特に意図される。
【０３４８】
Ａ．細胞のカプセル化
アルギネートは、室温にて水中で二価カチオンとイオン架橋して、ヒドロゲルマトリックスを形成することができる。例えば、Ｌｉｍへの米国特許第４，３５２，８８３号を参照されたい。Ｌｉｍのプロセスにおいて、カプセル化される生体材料を含有する水溶液を水溶性ポリマーの溶液に懸濁させ、その懸濁液を液滴に形成させるが、これは多価カチオンとの接触によって個別のカプセルへと構成され、次いで、カプセルの表面をポリアミノ酸と架橋させ、カプセル化された材料の周りに半透膜を形成させる。
【０３４９】
電荷を帯びた側基を有する水溶性ポリマーを、該ポリマーと、反対の電荷の多価イオン（該ポリマーが酸性側基を有する場合、多価カチオン、または該ポリマーが塩基性側基を有する場合、多価アニオン）を含有する水溶液とを反応させることによって架橋させる。ヒドロゲルを形成させる酸性側基を有するポリマーの架橋のための好ましいカチオンは、二価および三価のカチオン、例えば、銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、およびスズであるが、二官能性、三官能性または四官能性有機カチオン、例えば、アルキルアンモニウム塩、例えば、
【化５９Ａ】
2020023582.tif 000081
をまた使用することができる。これらのカチオンの塩の水溶液をポリマーに加え、柔らかい高度に膨張したヒドロゲルおよび膜を形成させる。カチオンの濃度がより高いほど、または原子価がより高いほど、ポリマーの架橋度はより大きい。０．００５Ｍほどの低さからの濃度は、ポリマーを架橋させることが示されてきた。より高い濃度は塩の溶解度によって限定される。
【０３５０】
ヒドロゲルを形成させる塩基性側鎖を含有するポリマーの架橋のための好ましいアニオンは、二価のおよび三価のアニオン、例えば、低分子量ジカルボン酸、例えば、テレフタル酸（terepthalic acid）、硫酸イオンおよび炭酸イオンである。カチオンに関して記載されているように、これらのアニオンの塩の水溶液をポリマーに加えて、柔らかい高度に膨張したヒドロゲルおよび膜を形成させる。
【０３５１】
種々のポリカチオンを使用して複合体を形成し、それによってポリマーヒドロゲルを半透性表面膜中へと安定化させることができる。使用することができる材料の例は、塩基性反応性基、例えば、３，０００〜１００，０００の好ましい分子量を有するアミンまたはイミン基を有するポリマー、例えば、ポリエチレンイミンおよびポリリシンを含む。これらは市販されている。１つのポリカチオンは、ポリ（Ｌ−リシン）である。合成ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、およびポリ（アリルアミン）である。また、天然ポリカチオン、例えば、多糖類、キトサンが存在する。
【０３５２】
ポリマーヒドロゲル上の塩基性表面基との反応によって半透膜を形成するために使用することができるポリアニオンは、アクリル酸、メタクリル酸およびアクリル酸の他の誘導体のポリマーおよびコポリマー、ペンダントＳＯ３Ｈ基を有するポリマー、例えば、スルホン化ポリスチレン、ならびにカルボン酸基を有するポリスチレンを含む。
【０３５３】
好ましい方法において、細胞は、修飾されたアルギネートポリマー中にカプセル化される。好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートカプセルは、カプセル化ツール（例えば、Ｉｎｏｔｅｃｈカプセル化ツール）を使用して懸濁した細胞を含有する修飾されたアルギネートの溶液から作製する。一部の実施形態では、修飾されたアルギネートを、多価カチオン、例えば、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋、またはＳｒ２＋とイオン架橋させる。特に好ましい実施形態では、修飾されたアルギネートを、ＢａＣｌ２を使用して架橋させる。一部の実施形態では、カプセルは、形成の後にさらに精製される。好ましい実施形態では、カプセルを、例えば、ＨＥＰＥＳ溶液、クレブス溶液、および／またはＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄する。
【０３５４】
細胞は、ドナーから直接（directed）、ドナーからの細胞の細胞培養物から、または樹立細胞培養系から得ることができる。好ましい実施形態では、細胞はドナーから直接得て、洗浄し、ポリマー材料と組み合わせて直接埋め込む。細胞は、組織培養の当業者には公知の技術を使用して培養する。好ましい実施形態では、細胞は、自己、すなわち、細胞が移植される個体に由来するが、同種異系または異種であってもよい。
【０３５５】
細胞付着および生存率は、走査型電子顕微鏡法、組織学的検査、および放射性同位体による定量的アセスメントを使用してアセスメントすることができる。埋め込まれた細胞の機能は、上記の技術および機能アッセイの組合せを使用して決定することができる。例えば、肝細胞の場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ肝機能研究は、カニューレをレシピエントの総胆管に入れることによって行うことができる。次いで、胆汁を少しずつ集めることができる。胆汁色素は、誘導体化されていないテトラピロールを探す高圧液体クロマトグラフィーによって、またはＰ−グルクロニダーゼによる処理を伴うか、もしくは伴わずに、ジアゾ化アゾジピロールエチルアントラニレートとの反応によってアゾジピロールに変換された後で、薄層クロマトグラフィーによって分析することができる。ジコンジュゲートおよびモノコンジュゲートされたビリルビンはまた、コンジュゲートされた胆汁色素のアルカリメタノリシスの後で薄層クロマトグラフィーによって決定することができる。一般に、機能している移植した肝細胞の数が増加するにつれ、コンジュゲートされたビリルビンのレベルは増加する。単純な肝機能検査はまた、血液試料、例えば、アルブミン産生について行うことができる。類似の器官機能研究を、埋込み後の細胞機能の程度を決定するために必要に応じて当業者には公知の技術を使用して行うことができる。例えば、肝細胞を埋め込んで、糖尿病を治癒するためのインスリンの適当な分泌によるグルコースのレギュレーションを達成するために特に使用されるのと同様の様式で、膵臓の島細胞を送達し得る。他の内分泌組織をまた埋め込むことができる。標識したグルコースを使用した研究、およびタンパク質アッセイを使用した研究を遂行して、ポリマー足場上の細胞塊を定量することできる。次いで、細胞塊のこれらの研究は、何が適当な細胞塊であるかを決定する細胞機能研究と相関し得る。軟骨細胞の場合、機能は周囲の付着した組織のための適当な構造的支持を提供することと定義される。
【０３５６】
この技術を使用して、新たな組織または組織同等物を生じさせる目的のために多数の細胞の効率的な転移および移植体生着の促進のための三次元スカフォールド内で、遺伝子改変細胞を含めた複数の細胞型を用意する（provide）ことができる。これはまた、新たな組織または組織同等物が宿主免疫系を排除することによって成長する一方で、細胞移植体の免疫保護のために使用することができる。
【０３５７】
本明細書に記載のように埋め込むことができる細胞の例は、軟骨細胞、および軟骨を形成する他の細胞、骨芽細胞、および骨を形成する他の細胞、筋細胞、線維芽細胞、および器官細胞を含む。本明細書において使用する場合、「器官細胞」は、肝細胞、島細胞、腸起源の細胞、腎臓に由来する細胞、ならびに材料を合成および分泌するか、または代謝するように主に作用する他の細胞を含む。好ましい細胞型は、膵島細胞である。
【０３５８】
ポリマーマトリックスを体液性因子と合わせて、細胞の移植および生着を促進することができる。例えば、ポリマーマトリックスは、血管形成因子、抗生物質、抗炎症物質、成長因子、分化を誘導する化合物、および細胞培養の当業者には公知の他の因子と合わせることができる。
【０３５９】
例えば、体液性因子は、移植のための埋込体の形成の前に、緩徐放出形態で細胞−アルギネート懸濁物と混合することができた。代わりに、ヒドロゲルを修飾して、単離した細胞懸濁物との組合せの前に、体液性因子またはシグナル認識配列を結合することができた。
【０３６０】
本明細書に記載されている技術を多くの異なる細胞型の送達のために使用して、異なる組織構造を達成することができる。好ましい実施形態では、細胞をヒドロゲル溶液と混合し、ヒドロゲルの硬化の前に、細胞を埋め込むのに望ましい部位に直接注射する。しかし、マトリックスをまた、体の１つもしくは複数の異なる領域において成形および埋め込み、特定の用途に適切であるようにし得る。特定の構造設計が所望であるか、または細胞が埋め込まれる領域が、細胞の成長および増殖を促進する特定の構造もしくは支持を欠いている場合、この用途は特に当てはまる。
【０３６１】
細胞が埋め込まれる部位（複数可）は、細胞の必要数と同様に、個体の必要性に基づいて決定される。器官機能を有する細胞、例えば、肝細胞または島細胞について、混合物は腸間膜、皮下組織、腹膜後腔、腹膜前の空間、および筋内の空間に注射することができる。軟骨の形成のために、細胞を軟骨形成が望ましい部位に注射する。外部モールドをまた適用して注射した溶液を成形することができる。さらに、重合率を制御することによって、粘土を成形するように、細胞−ヒドロゲル注射埋込体を成形することが可能である。代わりに、混合物をモールド中に注入し、ヒドロゲルを硬化させ、次いで、その材料を埋め込むことができる。
【０３６２】
Ｂ．コーティング製品および表面
種々の技術を使用して、医療製品を開示されている修飾されたアルギネートポリマーでコーティングすることができる。種々の技術の例は、噴霧、ディッピング、およびブラシコーティングを含む。ポリマーコーティングは典型的には、ポリマーを適当な、好ましくは、有機溶媒に溶解すること、および噴霧、ブラッシング、ディッピング、塗布、または他の同様の技術により付着させること（applying）によってコーティングする表面に付着させる。コーティングは表面上に堆積し、非共有結合的相互作用によって表面と会合する。もたらされたコーティングされた製品および表面を特に意図し、開示する。
【０３６３】
一部の実施形態では、表面の特性を修飾する適当な溶液または懸濁液で表面を事前処理し、それによって修飾された表面およびコーティングの間の非共有結合的相互作用を強化し得る。
【０３６４】
ポリマー溶液を、適当な温度にて十分な期間、表面に付着させ、表面上にコーティングを形成し、ここでコーティングは抗線維化表面を形成するのに有効である。典型的な温度は室温を含むが、より高い温度を使用し得る。典型的な期間は、５分もしくはそれ未満、３０分もしくはそれ未満、６０分もしくはそれ未満、および１２０分もしくはそれ未満を含む。一部の実施形態では、溶液を１２０分もしくはそれ超付着させ、所望の抗線維化活性を有するコーティングを形成させることができる。しかし、好ましくは、より短い期間を使用する。抗線維化活性は、本明細書において開示されているか、または当技術分野において公知の方法のいずれかで測定することができる。好ましくは、抗線維化活性は、本明細書に記載のように決定した異物応答でよい。
【０３６５】
開示されている修飾されたアルギネートポリマーは、製品、デバイス、および表面と共有結合的または非共有結合的に会合することができる。修飾されたアルギネートポリマーが製品、デバイス、もしくは表面と共有結合的に会合しているこれらの実施形態について、ポリマーは、例えば、製品、デバイス、もしくは表面を反応官能基、例えば、求核基で官能化すること、および求核基とポリマー上の反応官能基、例えば、求電子基とを反応させることによって、製品、デバイス、もしくは表面に付着させる（attached）ことができる。代わりに、ポリマーは、求核基で官能化することができ、該求核基は製品、デバイス、もしくは表面上の求電子基と反応する。
【０３６６】
特定の実施形態では、修飾されたアルギネートポリマーは、製品、デバイス、もしくは表面と非共有結合的に会合している。ポリマーは、噴霧、ウェッティング、浸漬、ディッピング、塗布、結合もしくは接着または別の方法で製品、デバイス、もしくは表面に修飾されたアルギネートポリマーを有する化合物を提供することによって、製品、デバイス、もしくは表面に付着させることができる。一実施形態では、ポリマーを、噴霧、塗布、またはディッピングまたは浸漬によって付着させる。例えば、ポリマーペイントは、修飾されたアルギネートポリマーを適切な溶媒（一般に水性）に溶解すること、および溶液を任意選択で超音波処理して、ポリマーが完全に溶解することを確実にすることによって調製することができる。コーティングされる製品、デバイス、もしくは表面を、適切な期間、例えば、５秒間、ポリマー溶液に浸し、それに続いて乾燥、例えば、空気乾燥させることができる。この手順を必要に応じて何度でも繰り返し、適正な被覆を達成することができる。コーティングの厚さは一般に、約１ｎｍ〜約１ｃｍ、好ましくは、約１０ｎｍ〜１ｍｍ、より好ましくは、約１００ｎｍ〜約１００ミクロンである。
【０３６７】
コーティングは、製品、デバイス、もしくは表面を製造するときに付着させることができるか、または製品、デバイス、もしくは表面の製造に続いて付着させることができる。一部の実施形態では、コーティングは、製品、デバイス、もしくは表面の使用の直前に製品、デバイス、もしくは表面に付着させる。これは手術中に行うコーティングと称される。「直前」は、本明細書において使用する場合、埋込みまたは使用の１分以内、２分以内、５分以内、１０分以内、１５分以内、２０分以内、３０分以内、４５分以内、６０分以内、７５分以内、９０分以内、１２０分以内、１５０分以内、１８０分以内もしくはそれ超以内を意味する。一部の実施形態では、製品、デバイス、もしくは表面を、病院において、例えば、２０分、１５分、１０分、または５分の埋込みまたは使用を伴って、手術室においてコーティングする。使用の直前のコーティングは、製造のときにおいてコーティングされた製品、デバイス、および表面の限界、例えば、製品、デバイス、もしくは表面の貯蔵および／もしくは輸送の間のコーティングのダメージ、ならびに／またはコーティングが過酷（例えば、高温、高湿、紫外線への曝露など）であり得る環境条件に曝露された場合の経時的なコーティングの有効性の減少を克服し得る。
【０３６８】
コーティングされた医療製品は、コーティングされていないまたは異なってコーティングされた形態の医療製品の公知の使用および目的のために使用することができる。
【０３６９】
１．医療製品
コーティングのために有用な医療製品は、少なくとも部分的に、患者の体における埋込みのための任意のタイプの使用される医療デバイスを含む。例には、これらに限定されないが、埋込体、埋め込み可能な医療製品、埋め込み可能なデバイス、カテーテルおよび他のチューブ（泌尿器チューブおよび胆管チューブ、気管内チューブ、創傷ドレーンチューブ、ニードル注射カテーテル、末梢から挿入可能な中心静脈カテーテル、透析カテーテル、長期トンネル型中心静脈カテーテル、末梢静脈カテーテル、短期中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、肺カテーテル、スワン−ガンツカテーテル、尿路カテーテル、腹腔カテーテルを含めた）、血管カテーテルポート、血餅フィルター、泌尿器デバイス（長期泌尿器デバイス、組織結合泌尿器デバイス、人工泌尿器括約筋、泌尿器拡張器を含めた）、シャント（脳室または動静脈シャント、ステント移植体、胆管ステント、腸ステント、気管支ステント、食道ステント、尿管ステント、および水頭症シャントを含めた）、バルーン、ペースメーカー、埋め込み可能な除細動器、整形外科製品（ピン、プレート、スクリュー、および埋込体を含めた）、移植体（器官、血管移植体、血管、大動脈、心臓弁、および器官置換パーツを含めた）、プロテーゼ（乳房埋込体、陰茎プロテーゼ、血管グラフトプロテーゼ、心臓弁、人工関節、人工喉頭、耳鼻科用埋込体、人工心臓、人工血管、および人工腎臓を含めた）、動脈瘤充填コイルおよび他のコイルデバイス、経心筋血行再建デバイス、経皮的心筋血行再建デバイス、チューブ、繊維、中空繊維、膜、血液容器、タイタープレート、吸着媒体、透析器、連結ピース、センサー、弁、内視鏡、フィルター、ポンプチャンバー、外科用メス、ニードル、ハサミ（および侵襲的な外科的、治療、または診断手順において使用される他のデバイス）、ならびに抗線維化特性を有することを意図する他の医療製品およびデバイスが含まれる。表現「医療製品」は広範であり、特に、血液と短時間（例えば、内視鏡）または永続的に（例えば、ステント）接触する製品を指す。
【０３７０】
有用な医療製品は、バルーンカテーテルおよび血管内プロテーゼ、特に、ステントである。従来の設計のステントは、金属ストラットから構成されるフィリグリーの支持構造を有する。支持構造は最初に体への挿入のために拡張されていない状態で提供され、次いで、適用部位において拡張された状態に広がる。ステントは、バルーン上に圧着される前または後にコーティングすることができる。多種多様の医療用内部プロテーゼ、または高度に多様な用途のための医療製品もしくは埋込体が公知である。これらは、例えば、血管、中空器官、および管系（血管内埋込体）を支持するために、組織埋込体および組織移植体に付着し、一時的に付加する（affix）ために、ならびに整形外科目的のため（例えば、ピン、プレート、またはスクリュー）に使用される。
【０３７１】
修飾されたアルギネートポリマーは、種々の異なる基材および表面に付着されるか、吸収されるか、またはカップリングすることができる。適切な材料の例は、金属、金属材料、セラミクス、ポリマー、繊維、不活性な材料、例えば、ケイ素、およびこれらの組合せを含む。
【０３７２】
適切なポリマー材料には、これらに限定されないが、スチレンおよび置換スチレン、エチレン、プロピレン、ポリ（ウレタン）、アクリレートおよびメタクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリエーテル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、そのコポリマー、およびこれらの組合せが含まれる。
【０３７３】
基材は、フィルム、粒子（ナノ粒子、微粒子、またはミリメートル直径のビーズ）、繊維（創傷被覆材、包帯、ガーゼ、テープ、パッド、織布および不織布スポンジを含めたスポンジ、ならびに歯科または眼科手術のために特に設計されたもの）、センサー、ペースメーカーリード、カテーテル、ステント、コンタクトレンズ、骨埋込体（股関節置換物、ピン、リベット、プレート、骨セメントなど）、または組織再生もしくは細胞培養デバイス、または体内もしくは体と接触させて使用される他の医療デバイスの形態であるか、あるいはこれらの部分を形成することができる。
【０３７４】
修飾されたアルギネートポリマーコーティングでコーティングした埋込体は、本明細書に記載されている。「埋込体」は、哺乳動物、例えば、ヒトの体に入れることを意図する任意の物体であり、それは生きている組織ではない。埋込体は、医療製品の一形態である。埋込体は、加工された天然由来の物体を含み、それゆえこれらの生きている組織は失活されている。一例として、これらの生細胞が除去されるように骨グラフトを加工することができるが、これらの形状は、宿主からの骨の内部成長のためのテンプレートとしての役割を果たすために保持される。別の例として、天然に生じたサンゴを加工して、特定の整形外科および歯科治療のために体に付着させることができるヒドロキシアパタイト調製物を生じさせることができる。埋込体はまた、人工成分を含む物品でよい。用語「埋込体」は、整形外科用途、歯科用途、耳、鼻、および咽頭（「ＥＮＴ」）用途、ならびに心血管用途を含めた、人体または哺乳動物の体に入れることを意図する全範囲にわたる医療デバイスに適用することができる。
【０３７５】
一部の実施形態では、「埋込体」は、本明細書において使用する場合、埋込みのためのデバイス、または埋込みのためのデバイスの表面、および修飾されたアルギネートポリマーコーティングを含めた肉眼的組成物を指す。これらの実施形態では、用語「埋込体」は、ナノ粒子および／または微粒子を包含しない。「肉眼的」は、本明細書において使用する場合、一般に、肉眼によって確かめることができるデバイス、埋込体、または組成物を指す。
【０３７６】
埋め込み可能な医療デバイス、ならびに生体適合性コーティングを使用することができる医療デバイスおよび機械的構造物の例には、これらに限定されないが、ステント、導管（conduit）、スカフォールド、心臓弁輪、心血管弁、ペースメーカー、股関節置換デバイス、埋込型センサーデバイス、食道ステント、心臓埋込体、心臓弁のための生体適合性内層、透析装置および心肺バイパスシステムのための酸素供給器管類が含まれる。
【０３７７】
一般に、ステントは典型的には、体の管腔、例えば、血管または管中に挿入され、局在的な流れの狭窄を防止または対抗する、形状が管状であるデバイスである。ステントの目的は、場合によって、体液導管の機械的開放をささえることである。酸素を含んだ血液の適正な送達を維持するために、ステントを使用して、器官および四肢への血流量の減少を軽減することが多い。ステントの最も一般な使用は冠動脈においてであるが、ステントはまた他の体の導管、例えば、中心および末梢の動脈および静脈、胆管、食道、結腸、気管、大気管支、尿管、および尿道などにおいて広範に使用される。しばしば、管腔に挿入されるステントは挿入後に拡張させることができるか、または自動拡張型である。例えば、金属ステントは、バルーンカテーテルを使用して閉塞した動脈中に配置され、拡張して血流量を回復する。例えば、ステンレス鋼ワイヤーメッシュステントは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓから市販されている。
【０３７８】
一部の実施形態では、埋込体は、整形外科用埋込体である。「整形外科用埋込体」は、骨を置き換える、もしくは骨への固定を実現する、関節の摺動面を置き換える、プロテーゼのための支台歯を提供する、もしくはこれらの組合せであるか、または骨を置き換えること、もしくは骨への固定を実現すること、関節の摺動面を置き換えること、プロテーゼのための支台歯を提供すること、およびこれらの組合せにおいて補助する、埋込体として定義される。
【０３７９】
整形外科用埋込体を使用して、骨を置き換えるか、もしくは骨への固定を実現する、関節の摺動面を置き換える、プロテーゼのための支台歯を提供する、もしくはこれらの組合せであるか、または骨を置き換えること、もしくは骨への固定を実現すること、関節の摺動面を置き換えること、歯科用途を含めたプロテーゼのための支台歯を提供すること、およびこれらの組合せにおいて補助することができる。
【０３８０】
適切な整形外科用埋込体には、これらに限定されないが、ワイヤー、キルシュナーワイヤー、骨プレート、スクリュー、ピン、タック（tac）、ロッド、ネイル、ナット、ボルト、ワッシャー、スパイク、ボタン、ワイヤー、骨折プレート、再構築および安定化デバイス、内部および外部プロテーゼ（関節および非関節）、骨内経皮的プロテーゼ、スペーサー、メッシュ、インプラントアバットメント、アンカー、バーブ、クランプ、縫合糸、椎体間固定デバイス、任意の幾可学的形状のチューブ、スカフォールド、およびこれらの組合せが含まれる。
【０３８１】
他の実施形態では、埋込体は、耳、鼻、および／または咽頭（「ＥＮＴ」）の埋込体である。例示的なＥＮＴ埋込体には、これらに限定されないが、耳チューブ、気管内チューブ、換気チューブ、蝸牛埋込体および骨に固定された聴覚デバイスが含まれる。
【０３８２】
他の実施形態では、埋込体は、心血管の埋込体である。例示的な心血管の埋込体は、心臓弁または異物的形成術による血管壁支持体（alloplastic vessel wall support）、完全人工心臓埋込体、心室補助デバイス、血管グラフト、ステント、電気信号担持デバイス、例えば、ペースメーカーおよび神経リード、除細動器リードなどである。
【０３８３】
埋込体は、種々の材料から調製することができる。一部の実施形態では、材料は、生体適合性である。一部の実施形態では、材料は、生体適合性および非生分解性である。例示的な材料には、金属材料、金属酸化物、分解性および非分解性ポリマー材料を含めたポリマー材料、セラミクス、ポーセレン、ガラス、同種異系、異種の（xenogenic）骨または骨基質；遺伝子操作された骨；ならびにこれらの組合せが含まれる。
【０３８４】
適切な金属材料には、これらに限定されないが、金属およびチタンをベースとする合金（例えば、ニチノール、ニッケルチタン合金、熱記憶合金材料）、ステンレス鋼、タンタル、パラジウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ニッケル−クロム、またはコバルト−クロムおよびコバルト−クロム−ニッケル合金、例えば、ＥＬＧＩＬＯＹ（登録商標）およびＰＨＹＮＯＸ（登録商標）を含めた特定のコバルト合金が含まれる。有用な例には、ステンレス鋼グレード３１６（ＳＳ３１６Ｌ）（Ｆｅ、＜０．３％のＣ、１６〜１８．５％のＣｒ、１０〜１４％のＮｉ、２〜３％のＭｏ、＜２％のＭｎ、＜１％のＳｉ、＜０．４５％のＰ、および＜０．０３％のＳから構成される）、タンタル、クロムモリブデン合金、ニッケル−チタン合金（例えば、ニチノール）およびコバルトクロム合金（例えば、ＭＰ３５Ｎ、ＡＳＴＭ材料の記号表示：３５Ｃｏ−３５Ｎｉ−２０Ｃｒ−１０Ｍｏ）が含まれる。ステントのために現在使用されている典型的な金属は、ＳＳ３１６Ｌ鋼およびＭＰ３５Ｎを含む。また、「Comparing and Optimizing Co-Cr Tubing for Stent Applications」、Poncin,P、Millet, C.、Chevy, JおよびProfit, J. L.、Materials & Processes for MedicalDevices Conference、２００４年８月、ASM Internationalを参照されたい。
【０３８５】
適切なセラミック材料には、これらに限定されないが、遷移元素の酸化物、炭化物、または窒化物、例えば、酸化チタン、酸化ハフニウム、酸化イリジウム、酸化クロム、酸化アルミニウム、および酸化ジルコニウムが含まれる。ケイ素をベースとする材料、例えば、シリカをまた使用し得る。
【０３８６】
適切なポリマー材料には、これらに限定されないが、ポリスチレンおよび置換ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセチレン、ポリスチレン、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリオレフィンコポリマー、ポリ（ウレタン）、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ポリアクリルアミドおよびポリメタクリルアミド、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリエーテル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリフルオロカーボン、ＰＥＥＫ（登録商標）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン、ＰＴＦＥ）、シリコーン、エポキシ樹脂、Ｋｅｖｌａｒ（登録商標）、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）（エチレングリコールおよびテレフタル酸から得た縮合ポリマー）、ナイロン、ポリアルケン、フェノール樹脂、天然および合成のエラストマー、接着剤およびシーラント、ポリオレフィン、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、生体ポリマー、例えば、多糖類および天然ラテックス、コラーゲン、セルロースポリマー（例えば、アルキルセルロースなど）、多糖類、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリジオキサノン（ＰＤＡ）、またはラセミポリ（乳酸）、ポリカーボネート、（例えば、ポリアミド（ナイロン）；フッ素プラスチック、炭素繊維、ならびにそのブレンドまたはコポリマーが含まれる。
【０３８７】
ポリマーは、表面と共有結合的または非共有結合的に会合することができる。しかし、特定の実施形態では、ポリマーは、表面と非共有結合的に会合している。ポリマーは、これらに限定されないが、噴霧、ウェッティング、浸漬、ディッピング、例えば、ディップコーティング（例えば、手術中に行うディップコーティング）、塗布、または別の方法による埋込体の表面への疎水性ポリカチオンポリマーの付着を含めた当技術分野における種々の技術によって付着させることができる。
【０３８８】
医療環境における使用に適合させた製品の表面は、オートクレーブ処理、殺生物剤曝露、照射、またはガス処理技術、例えば、酸化エチレン曝露を使用して滅菌することができる。医療環境において見出される表面は、使い捨てであろうと、または繰り返しの使用を意図しようとも、様々な機器およびデバイスの内側および外側の側面を含む。
【０３８９】
２．ヒドロゲル
医療製品はまた、ヒドロゲルでできているか、またはヒドロゲルを使用することができる。開示されている修飾されたアルギネートポリマーは、この目的および他の目的のためにヒドロゲルを形成し得る。他のヒドロゲルでできている製品はまた、開示されている修飾されたアルギネートポリマーでコーティングすることができる。このように、開示されている修飾されたアルギネートポリマーは、製品もしくは表面上のコーティングとして使用することができるか、または製品自体として使用することができる。ヒドロゲルは、大量の水または生体液を吸収することができる三次元の親水性ポリマーネットワークである（Peppasら、Eur. J. Pharm. Biopharm.、２０００年、５０巻、２７〜４６頁）。これらのネットワークは、ホモポリマーまたはコポリマーから構成され、化学的架橋または物理的架橋、例えば、絡み合い（entanglement）または結晶子の存在によって不溶性である。ヒドロゲルは、側基の性質に基づいて中性またはイオン性として分類することができる。さらに、これらは、アモルファス、半結晶質、水素結合構造、超分子構造および親水コロイド集合体（hydrocolloidalaggregate）であり得る（Peppas, N.A.、Hydrogels. In:Biomaterials science:an introductionto materials in medicine；Ratner, B.D.、Hoffman, A.S.、Schoen, F.J.、Lemons, J.E.、編；AcademicPress、１９９６年、６０〜６４頁；Peppasら、Eur. J. Pharm. Biopharm.、２０００年、５０巻、２７〜４６頁）。ヒドロゲルは、合成または天然のモノマーまたはポリマーから調製することができる。好ましいヒドロゲルは、本明細書において、開示されている修飾されたアルギネートポリマーである。
【０３９０】
ヒドロゲルは、数ある中でも、合成ポリマー、例えば、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体［例えば、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ｐＨＥＭＡ）］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ならびにそのコポリマーおよびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）から調製することができる（BellおよびPeppas、Adv. Polym. Sci.、１２２巻：１２５〜１７５頁（１９９５年）；Peppasら、Eur. J.Pharm. Biopharm.、５０巻：２７〜４６頁（２００）；LeeおよびMooney、Chem.Rev.、１０１巻：１８６９〜１８７９頁（２００１年））。合成ポリマーから調製されるヒドロゲルは一般に、生理学的条件において非分解性である。ヒドロゲルはまた、これらに限定されないが、多糖類、タンパク質、およびペプチドを含めた天然ポリマーから調製することができる。開示されている修飾されたアルギネートポリマーは、好ましい例である。これらのネットワークは一般に、化学的または酵素的手段によって生理学的条件において分解する。
【０３９１】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、関連性のあるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で非分解性である。安定なヒドロゲルコーティングは、中心静脈カテーテルコーティング、心臓弁、ペースメーカーおよびステントコーティングを含めた特定の用途のために必要である。他の場合では、ヒドロゲルの分解は、例えば、組織工学コンストラクトにおいて優先的なアプローチであり得る。
【０３９２】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、デキストランによって形成することができる。デキストランは、α−１，６連結Ｄ−グルコピラノース残基から本質的になる細菌性多糖類であり、数パーセントのα−１，２、α−１，３、またはα−１，４−連結側鎖を有する。デキストランは、その生体適合性、低毒性、相対的な低コスト、および単純な修飾のために生物医学的用途のために広範に使用されている。この多糖類は、血漿増量剤、末梢血流促進剤および抗血栓溶解剤として、臨床的に半世紀超使用されてきた（Mehvar, R. J.、Control. Release、２０００年、６９巻、１〜２５頁）。さらに、これは、循環血液中の治療剤の寿命を主に増加させるための、薬物およびタンパク質の送達のための高分子担体として使用されてきた。デキストランは、ゲルを調製する化学的または酵素的手段を使用することによってビニル基で修飾することができる（Ferreiraら、Biomaterials、２００２年、２３巻、３９５７〜３９６７頁）。
【０３９３】
デキストランをベースとするヒドロゲルは、血管内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞の接着を防止し（Massia, S.P.；Stark, J. J.、Biomed. Mater. Res.、２００１年、５６巻、３９０〜３９９頁、Ferreiraら、２００４年、J.Biomed. Mater. Res.、６８Ａ巻、５８４〜５９６頁）、デキストラン表面は、タンパク質吸着を防止する（Oesterbergら、J. Biomed. Mat. Res.、１９９５年、２９巻、７４１〜７４７頁）。
【０３９４】
本明細書に記載のように、開示されている修飾されたアルギネートポリマーを使用して、細胞をカプセル化することができる。一部の実施形態では、カプセル化された細胞は、マクロデバイスに作製することができる。例えば、一部の実施形態では、修飾されたアルギネートヒドロゲル中にカプセル化された細胞は、表面、例えば、平面状の表面上にコーティングすることができる。一部の実施形態では、細胞を含有するカプセルは、生体適合性粘着剤を使用して対象の組織に接着させることができる。他の実施形態では、細胞を含有するカプセルは、埋込みに適した医療デバイス上にコーティングすることができる。
【０３９５】
Ｃ．疾患または障害の処置
カプセル化された細胞は、それを必要とする患者に移植して、疾患または障害を処置することができる。一部の実施形態では、カプセル化された細胞は、同じ種の遺伝的に同一ではないメンバーから得る。代わりの実施形態では、カプセル化された細胞は、患者と異なる種から得る。好ましい実施形態では、ホルモン分泌またはタンパク質分泌細胞をカプセル化し、患者に移植し、疾患または障害を処置する。
【０３９６】
好ましい実施形態では、疾患または障害は、患者における正常に機能しないホルモン分泌細胞もしくはタンパク質分泌細胞によってもたらされるか、またはこれらが関与する。好ましい実施形態では、疾患または障害は、糖尿病である。
【０３９７】
修飾されたアルギネートポリマーでコーティングした医療製品、デバイス、および表面は、それを必要とする患者に移植または埋め込んで、疾患または障害を処置することができる。
【０３９８】
開示されているカプセル、製品、デバイス、および表面は、線維化効果が実質的にないままで留まることができるか、または投与もしくは埋込み後、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、もしくはそれより長く、低減した異物応答を示し続けることができる。
【０３９９】
開示されているカプセル、製品、デバイス、および表面は、単独で、または任意の適切な薬物もしくは他の治療と組み合わせて投与または埋め込むことができる。このような薬物および治療はまた、カプセル、製品、デバイス、および表面が患者において存在する期間の間に、別々に投与（すなわち、平行に使用）することができる。開示されているカプセル、製品、デバイス、および表面は、カプセル、製品、デバイス、および表面に対する線維症および免疫反応を低減させるが、カプセル、製品、デバイス、および表面と一緒の、またはこれらと平行した、抗炎症薬および免疫系抑制薬の使用は除外されない。しかし好ましい実施形態では、開示されているカプセル、製品、デバイス、および表面は、抗炎症薬および免疫系抑制薬の使用を伴わずに使用される。好ましい実施形態では、線維症は、使用される任意の抗炎症薬または免疫系抑制薬の使用、濃度、効果、またはこれらの組合せが有効レベル未満に落ちた後で低減したままである。例えば、線維症は、使用される任意の抗炎症薬または免疫系抑制薬の使用、濃度、効果、またはこれらの組合せが有効レベル未満に落ちた後で、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、またはこれ超低減したままであり得る。
【０４００】
本発明は、下記の非限定的実施例を参照することによってさらに理解される。
【実施例】
【０４０１】
（実施例１）
化学修飾されたアルギネートのコンビナトリアル合成
材料の生体適合性を支配する確定されたパラメーターは、不明のところが多い。したがって、改善された生体適合性を有する修飾されたアルギネートの合理的設計および合成は骨の折れるものである。改善された生体適合性および物理的特性を有する修飾されたアルギネートを同定する試みにおいて、コンビナトリアルアプローチを使用して、一連の共有結合的修飾を有する修飾されたアルギネートのライブラリーを調製した。
【０４０２】
１．一般のコンビナトリアル戦略
１２のアルコール、９つのアミン、アジド部分を導入するために使用される２つのアミン（アミド化に続いてアジド部分に変換される、アジド部分を含有する１つのアミン、およびヨージド部分を含有する１つのアミン）、ならびに一連の異なる化学構造、疎水性／親水性、水素結合能、および荷電状態を有する１９のアルキンのプールを、修飾されたアルギネートのコンビナトリアル合成のための試薬として選択した。アルギネートポリマー中に存在する不純物が、埋め込まれたアルギネートの生体適合性を制限することが示されてきたことが分かっているので、超高純度の低粘度アルギネート（ＵＰＬＶＧ、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）を、修飾実験のための出発材料として選択した。
【０４０３】
１，３−双極環化付加のための試薬として使用されるアルキン
【化６０】
2020023582.tif 000082
【０４０４】
エステル化のための試薬として使用されるアルコール
【化６１】
2020023582.tif 000083
【０４０５】
アミド化のための試薬として使用されるアミン
【化６２】
2020023582.tif 000084
【０４０６】
アジド部分を導入する試薬として使用されるアミン
【化６３】
2020023582.tif 000085
【０４０７】
修飾されていないアルギネートポリマーを、コンビナトリアル様式で、上で示すエステル、アミン、および／またはアルキンの１つ、２つ、または３つとの反応によって共有結合的に修飾した。図１は、この方法を使用して得た修飾されたアルギネートの一般構造を示す。
【０４０８】
２．代表的な反応条件
修飾プロセスの平行およびコンビナトリアルな性質によって、ロボットのコアモジュールを使用して合成反応を行った。ＵＰＬＶＧアルギネートを、修飾実験のための出発材料として選択した。第１のコンビナトリアル反応において、修飾されていないアルギネートを、アルコール、アミン；および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下でアジド部分を導入するために使用されるアミンの１つと反応させた。第２のコンビナトリアルステップにおいて、上記で形成された修飾されたアルギネートポリマーのそれぞれを、アルコール、アミン；または２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下でアジド部分を導入するために使用される別のアミンと反応させた。最終のコンビナトリアルステップにおいて、アジド部分を導入するために使用されるアミンと反応したライブラリーの全てのメンバーを、１，３−双極環化付加反応を使用してさらに官能化した。４−ヨードベンジルアミンと反応したライブラリーのこれらのメンバーを、アジ化ナトリウムと最初に反応させ、ヨージド部分をアジド部分に変換した。それに続いて、アジド部分を導入するために使用されるアミンと反応したライブラリーの全てのメンバーを、ＣｕＳＯ４／アスコルビン酸ナトリウムの存在下で１，３−双極環化付加のための試薬として使用したアルキンの１つと反応させた。
【０４０９】
化学修飾されたアルギネートの生体適合性を最適化するために、厳格な精製方法論を開発して、潜在的に刺激性の不純物を排除した。それぞれの共有結合的修飾に続いて、修飾されたアルギネートを、バルク有機不純物を捕捉することを目指すシアノ修飾されたシリカカラムに通して濾過した。最終的に、全ての共有結合的修飾ステップを完了した後、修飾されたアルギネートを、１０，０００ＭＷＣＯ膜で透析し、残った小分子または低分子量不純物を除去した。
【０４１０】
修飾されたアルギネートの純度を、１Ｈ  ＮＭＲ分析によって決定した。それぞれの修飾されたアルギネートポリマーの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを集め、修飾されたアルギネートポリマーおよび任意の不純物に対応するピークを積分して、試料中の各種の相対量を決定した。
【０４１１】
（実施例２）
ヒドロゲル形成アッセイを使用した修飾されたアルギネートのハイスループットスクリーニング
アルギネートの共有結合的修飾は、アルギネートが細胞および生体分子のカプセル化に適したヒドロゲルを形成する能力を含めた、アルギネートの物理的特性に影響を与える。ヒドロゲルを形成する能力を喪失した修飾されたアルギネートを排除し、より強い候補に対する本発明者らのスクリーニングの試みにさらに焦点を合わせるために、蛍光をベースとする架橋アッセイを使用して、修飾されたアルギネートがヒドロゲルを形成する能力を定量化した。
【０４１２】
本明細書に記載されているヒドロゲル形成アッセイは、ヒドロゲルが、蛍光化合物を捕捉し、かつヒドロゲルの安定性に基づいて洗浄の際にフルオロフォアを異なった形で保持する能力を活用する。実施例１に記載したコンビナトリアルアプローチを使用して調製した修飾されたアルギネートのそれぞれを、水に溶解した。５８０ｎｍで蛍光を発するローダミン染料を、各試料に加えた。次いで、修飾されたアルギネート試料を、バリウム塩またはカルシウム塩、例えば、ＢａＣｌ２を加えることによって架橋し、ヒドロゲルの形成を誘導した。１０分間のインキュベーション後、各試料を水で繰り返し洗浄した。蛍光計を使用して各試料の蛍光強度を測定した。
【０４１３】
各修飾されたアルギネートを３回スクリーニングし、３回のトライアルにおいて得られた結果を平均した。各修飾されたアルギネートについての平均蛍光強度値を、陰性対照（水）および修飾されていないアルギネート（ＵＰＬＶＧ）の蛍光レベルと比較した。陰性対照未満の蛍光値を生じさせる修飾されたアルギネートを、ヒドロゲル形成が重大な意味を持つ用途（すなわち、細胞のカプセル化）について使用不能とみなした。
【０４１４】
（実施例３）
生体適合性についての修飾されたアルギネートのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
ＨｅＬａ細胞に対する修飾されたアルギネートポリマーの細胞毒性を評価して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生体適合性についてスクリーニングした。実施例２においてヒドロゲルを形成することができると同定された修飾されたアルギネートを、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングした９６ウェルプレートのウェル中に添加した。修飾されていないアルギネートおよび食塩水をまた、対照としてポリ−Ｌ−リシンでコーティングした９６ウェルプレートのウェル中に添加した。１００ｍＭのＢａＣｌ２架橋溶液を、９６ウェルプレートのウェルの全てに分注した。次いで、過剰な架橋剤を吸引した。ＨｅＬａ細胞をウェル中に播種し、加湿したチャンバー中で３７℃にて３日間インキュベートした。
【０４１５】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を使用した細胞生存率アッセイを行い、ここで培地を全てのウェルから吸引し、フェノールレッドを有さない１００μｌのＤＭＥＭ培地、および１０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートのウェルの全てに加えた。プレートを、加湿したチャンバー中で３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーション後に、８５μｌの溶液を吸引し、１００μｌのＤＭＳＯを加えた。紫色のホルマザン結晶が、各ウェル中に存在する生存可能なＨｅＬａ細胞の数に比例してアッセイの間に形成される。測定の前に、各ウェルの内容物をピペットにより上下に動かし、ホルマザン結晶を可溶化させた。プレートを３７℃にて１０分間インキュベートし、この後で撹拌からの気泡を除去した。プレートを、７００ｎｍでの参照を伴う５４０ｎｍにてＵＶ／Ｖｉｓプレートリーダーを使用して読み取った。生存率を、アルギネートを有さないウェルに播種した細胞に正規化した。
【０４１６】
細胞生存率の結果を図３に示し、これは陽性対照（アルギネートなし）と比較した、ＨｅＬａ細胞系の生存率に対する選択した修飾されたアルギネートの効果をプロットする。アルギネート（Ａｌｇ）は、５３％の生存率を有する。アッセイは、修飾されていないアルギネートに対して細胞毒性の減少を示した修飾されたアルギネートポリマーを同定した。これらをさらなる分析のために選択した。
【０４１７】
（実施例４）
生体適合性をアセスメントするための修飾されたアルギネートのｉｎ  ｖｉｖｏハイスループットスクリーニング
現在の生体適合性分析方法は遅く、組織学的分析を必要とする。本明細書に記載されているコンビナトリアル合成方法を使用して調製される多数の修飾されたアルギネートをスクリーニングするために、ｉｎ  ｖｉｖｏハイスループット生体適合性アッセイを使用して、アルギネートポリマーの相対的生体適合性をアセスメントした。
【０４１８】
１．ｉｎ  ｖｉｖｏハイスループットスクリーニングのプロトコル
８〜１２週齢の雄性ＳＫＨ１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅによって認定されたマサチューセッツ工科大学の動物施設においてマウスを保持し、１２時間の明／暗サイクルを伴う標準条件下で収容した。水および食物の両方は自由に提供した。
【０４１９】
ＩＳＯ１０９９３−６：２００１によって注射を行った。注射の前に、０．２２μｍの濾過によって全ての材料を滅菌した。１〜４％イソフルラン／残余Ｏ２の濃度のイソフルラン吸入によってマウスに麻酔をして、動きを最小化した。ハイスループットスクリーニングのために、マウスの背中を７０％イソプロピルアルコールでこすり、修飾されたアルギネートをその動物の背中上にアレイフォーマットで注射した。６回の注射を各マウスにおいて行い、その注射の１つは修飾されていないアルギネート対照であった。注入量は１００μｌであった。
【０４２０】
注射後の１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に、修飾されたアルギネートの埋込みに応答した宿主細胞活性を、丸ごとの動物の蛍光イメージングを使用して動態学的に撮像した。ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングの２４時間前に、１５０μｌの無菌のＰＢＳに溶解した２ｎｍｏｌのＰｒｏＳｅｎｓｅ−６８０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、励起波長６８０±１０ｎｍ、発光７００±１０ｎｍ）を各マウスの尾静脈に注射し、カテプシン活性を撮像した。
【０４２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを、ＩＶＩＳ−スペクトル測定システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で行った。２．５Ｌ／分流量の１００％酸素中の１〜４％イソフルランを使用して動物を吸入麻酔下に維持した。８×８のビニングおよび１３．１ｃｍの視野を、イメージングのために使用した。それぞれの取得した画像について曝露時間およびｆ／ｓｔｏｐ（アパーチャーの開口の相対的サイズ）を最適化した。データを取得し、製造業者の専有の（manufacturer’s proprietary）Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ３．１ソフトウェアを使用して分析した。全ての画像は蛍光収率で提示し、これを集めた蛍光強度と、選択したイメージング設定における入射強度の内部標準との比として定義する。所見領域（ＲＯＩ）は、それぞれの注射の部位の周りで示した。
【０４２２】
材料の生体適合性を、注射の１４日後に調査した。修飾されたアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度を、修飾されていないアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度と比較した。修飾されていないアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度より、埋込み部位においてより小さな蛍光強度を示す修飾されたアルギネートを生体適合性として特性決定した。修飾されていないアルギネートの埋込み部位において測定した蛍光強度より、埋込み部位においてより大きな蛍光強度を示す修飾されたアルギネートを、生体適合性でないとして特性決定した。
【０４２３】
アルギネートゲルのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を、注射の２８日後にアセスメントした。２８日後に注射の部位において残った修飾されたアルギネートを、ｉｎ  ｖｉｖｏで機械的に安定なヒドロゲルを形成することができると特性決定した。２８日後に注射の部位において存在していない修飾されたアルギネートは機械的に安定なヒドロゲルをｉｎ  ｖｉｖｏで形成することができないとみなし、「機能不全（failure）」と分類した。
【０４２４】
生体適合性であり、およびｉｎ  ｖｉｖｏで機械的に安定なヒドロゲルを形成することができると両方で特性決定された修飾されたアルギネートは、「ヒット」として同定し、さらなる研究のために選択した。
【０４２５】
２．ｉｎ  ｖｉｖｏハイスループットスクリーニングプロトコルの検証
上記のｉｎ  ｖｉｖｏハイスループットスクリーニングアッセイを検証するために、修飾されたアルギネートを、マウスの皮下にアレイフォーマットで注射し、ｉｎ  ｓｉｔｕで上記のように架橋させた。マウスを、注射後１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に丸ごとの動物の蛍光イメージングを使用して画像処理し、組織学的分析のためイメージングの後に組織試料を集めた。組織学的分析のための組織試料を得るために、マウスをＣＯ２による窒息によって安楽死させ、注射した生体材料および周辺組織を切除した。次いで、組織を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍの切断片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して染色し、有資格の病理学者が組織学的分析を行った。
【０４２６】
線維症をスケールによってレーティングした。０は、線維症が関与せず、１は、１〜２層の線維症を伴う部分的被覆を示し、２は、埋込体を殆ど被覆したより厚い線維化層を示し、３は、ポリマーの集中的な線維性被覆を意味する。多形核（ＰＭＮ）細胞およびマクロファージの両方をスケールによってレーティングした。観察された細胞がない場合は、０と示し、散らばった細胞は１とスコア付けし、ポリマーの側にクラスター化している多数の細胞は２とスコア付けし、材料を取り囲んでいる多数の細胞は、３とした。組織学的スコア、およびアルギネートに正規化した蛍光応答の両方を、全ライブラリーについて調査し、修飾されていないアルギネートより優れた材料を生体適合性であると判定した。これは正規化した＜１００％の蛍光シグナルおよび＜３の線維症スコアに対応する。
【０４２７】
丸ごとの動物のイメージングを使用して獲得したデータは、組織学的分析と比較して、生体材料への食細胞の細胞の動員における同様の一時的な傾向を呈することが示された。したがって、上記のｉｎ  ｖｉｖｏハイスループットスクリーニング方法を検証した。
【０４２８】
（実施例５）
生体適合性を定量化するための修飾されたアルギネートのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング
８〜１２週齢の雄性ＳＫＨ１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅによって認定されたマサチューセッツ工科大学の動物施設においてマウスを保持し、１２時間の明／暗サイクルを伴う標準条件下で収容した。水および食物の両方は自由に提供した。
【０４２９】
ＩＳＯ１０９９３−６：２００１によって注射を行った。注射の前に、０．２２μｍの濾過によって全ての材料を滅菌した。１〜４％イソフルラン／残余Ｏ２の濃度のイソフルラン吸入によってマウスに麻酔をして、動きを最小化した。マウスの背中を７０％イソプロピルアルコールでこすり、その動物に修飾されたアルギネートを注射した。注入量は１００μｌであった。
【０４３０】
カテプシン活性を、修飾されたアルギネートに対する異物応答を定量化するｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光アッセイを使用して注射７日後に測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングの２４時間前に、１５０μｌの無菌のＰＢＳに溶解した２ｎｍｏｌのＰｒｏＳｅｎｓｅ−６８０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、励起波長６８０±１０ｎｍ、発光７００±１０ｎｍ）を各マウスの尾静脈に注射し、カテプシン活性を撮像した。
【０４３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングを、ＩＶＩＳ−スペクトル測定システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で行った。２．５Ｌ／分の流量の１００％酸素中の１〜４％イソフルランを使用して、動物を吸入麻酔下に維持した。８×８のビニングおよび１３．１ｃｍの視野を、イメージングのために使用した。それぞれの取得した画像について、曝露時間およびｆ／ｓｔｏｐ（アパーチャーの開口の相対的サイズ）を最適化した。データを取得し、製造業者の専有のＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ３．１ソフトウェアを使用して分析した。全ての画像は蛍光収率で提示し、これを集めた蛍光強度と、選択したイメージング設定における入射強度の内部標準との比として定義する。所見領域（ＲＯＩ）は、それぞれの注射の部位の周りで示した。
【０４３２】
蛍光画像を、注射７日後に取得したが、これは選択した修飾されたアルギネートの注射の個所における相対的なカテプシン活性を例示していた。修飾されたアルギネートの生体適合性を定量化するために、蛍光強度を測定し、修飾されていないアルギネートを使用して測定した蛍光応答に正規化した。選択した修飾されたアルギネートについて得た結果が、図４に含まれる。
【０４３３】
（実施例６）
ＳＴＺにより誘発された糖尿病マウスにおける糖尿病の処置
生体適合性アルギネートでカプセル化したベータ細胞の移植は、糖尿病の処置としての潜在性を提示する。ラット膵臓の島細胞を、上で詳述したアッセイを使用して同定した１４の生体適合性の修飾されたアルギネートポリマー（ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｂ＿Ｂ４、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｆ２、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｇ３、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｂ３、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｂ＿Ｂ８、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ａ４、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｂ１、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｅ３、ＰＦ＿Ｎ２６３＿Ｃ１２、ＰＦ＿Ｎ６３＿Ａ１２、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｅ１、ＰＦ＿Ｎ２８７＿Ｄ３、ＰＦ＿Ｎ２６３＿Ａ７、およびＰＦ＿Ｎ２６３＿Ｃ６を含めた）を使用してカプセル化した。アルギネートでカプセル化した膵島カプセルを、３００μｍのノズルを有する１．０５ｋＶの電圧、１２２５Ｈｚの振動、および１０〜２５ｍｌ／分の流量に設定したＩｎｏｔｅｃｈカプセル化ツール（Ｉｎｏｔｅｃｈ）を使用して懸濁させた、懸濁した１，０００個の膵島を含有する脱イオン水中の、それぞれの修飾されたアルギネートの７５０μｌの４％（ｗ／ｖ）溶液から作製した。アルギネートを、２０ｍＭのＢａＣｌ２溶液中で架橋させた。カプセル化の後、カプセルをＨＥＰＥＳ溶液で２回、クレブス溶液で４回、およびＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄した。
【０４３４】
カプセル化されたラット島細胞を、ＳＴＺにより誘発された糖尿病マウスに移植した。移植の前に、マウスに０．５Ｌ／分で酸素を有する１〜４％イソフルラン（isofluorane）の連続流下で麻酔をした。サイズ＃４０のクリッパーブレードを有するシェーバーを使用して、毛を除去し、動物腹部の腹側正中上の約２ｃｍ×２ｃｍの領域をあらわにする。剪毛した全領域を、ポビドンによって最小で３サイクルこすり、それに続いて７０％アルコールですすぐことによって無菌的に調製した。ポビドンによる最終の皮膚への塗布をまた行った。手術部位を無菌の使い捨ての紙で覆い、周囲の毛が手術部位に接触することから回避した。鋭い手術用ブレードを使用して、皮膚および白癬（linea alba）を介して腹部へと０．５〜０．７５ｃｍの正中切開を行った。無菌のプラスチックピペットを使用して、アルギネートカプセルを腹膜腔中に移した。腹筋を、５−０ＥｔｈｉｃｏｎブラックシルクまたはＰＤＳ−吸収性５．０〜６．０モノフィラメント吸収性糸で縫合することによって閉じた。外皮膚層を、創傷クリップを使用して閉じた。これらの創傷クリップを、完全な治癒が確認された後、手術後７〜１０日に除去した。
【０４３５】
ＳＴＺにより誘発された糖尿病マウスにおける血中グルコース値は、尾を７０％イソプロピルアルコールでこすり、尾の皮膚上に浅い切り傷をつけて、一滴の血液を生じさせることによって得た一滴の血液を使用して、移植後２０日〜３０日の間毎日モニターした。試料採取の間にマウスを回転する尾部インジェクター（rotating tail injector）に拘束した。
【０４３６】
ＳＴＺにより誘発された糖尿病マウスにおける膵島移植に続く血中グルコース値を図５に示す。黒色の破線は、マウスにおける正常血糖を表す。修飾されたアルギネート中にカプセル化したラット膵臓の島細胞は全ての場合において血中グルコース値を低減させることができ、場合によって、正常血糖を誘導させることさえできた。
【０４３７】
（実施例７）
修飾されたアルギネート（複数可）および修飾されていないアルギネートの混合物から調製した粒子
ｉｎ  ｖｉｖｏで線維症を促進するパラメーターの高まりつつある認識を、修飾されたアルギネートの性能の分析に適用した。修飾されたアルギネートカプセルの腹腔内（ＩＰ）埋込みは、修飾されたアルギネートが、修飾されていないアルギネートについて定義した条件を使用して架橋されたときに、異常な形をしたカプセルをもたらし得ることを明らかにした。これらの異常な形をしたカプセルは、ＩＰに埋め込まれた修飾されたアルギネートカプセルの実現および解釈を複雑化し得る。カプセル形態を改善する試みにおいて、修飾されたアルギネート微粒子と共に使用するための配合方法を開発したが、ここでは修飾されたアルギネートを、少量の高分子量アルギネートとブレンドした。この混合物から調製した粒子は、改善された形態および安定性を有する粒子を生じさせた。
【０４３８】
修飾されたアルギネートの６％溶液（ｗ／ｗ）を、修飾されていないアルギネートの１．１５％溶液（ｗ／ｗ）と１：１の容量で合わせた。混合した後、この溶液を静電液滴発生装置に通し、それに続いて２０ｍＭの塩化バリウム水溶液中のポリマーの架橋によってカプセルを形成する。
【０４３９】
バリウムおよびマンニトールと共に配合した修飾されたアルギネート２６３＿Ａ１２微粒子から調製した粒子を、少量の修飾されていないＳＬＧ１００アルギネート（１６重量％）とブレンドした２６３＿Ａ１２から調製した粒子と比較した。修飾されたアルギネートおよび修飾されていないアルギネートの混合物から調製した粒子は、より均質の微粒子集団を生成した。ＳＬＧ１００とブレンドした修飾されたアルギネートによるいくつかの時点におけるｐｒｏｓｅｎｓｅによる定量的蛍光分析を遂行した。結果を図６に示す。いくつかの再配合された修飾されたアルギネートは、対照アルギネートと比較して７日目により少ない炎症応答を示した。大きなカプセル（１．５ｍｍの直径）による最初の実験は、免疫適格Ｃ５７ＢＬ６マウスのＩＰ空間中に２週間あった後、同じ程度にクリーンなカプセルを示す。
【０４４０】
これらの制御されたカプセルについてこれまでに集めたデータは、再配合およびカプセル形態が、ｐｒｏｓｅｎｓｅによって測定するとおり炎症に対して有意な効果を有することができることを示す。改善された炎症応答がいくつかのポリマーにおいて観察され（図６）、一方、その他はマイナスの影響を受ける。
【０４４１】
（実施例８）
修飾されたアルギネートの抗線維化活性の表示
この実施例において、化学修飾アプローチを行い、ＮＨＰを含めた前臨床線維症モデルにおけるアルギネートミクロスフィアの免疫認識を軽減したが、これはヒトにおける置き換えに当てはまる。リード材料は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびカニクイザルの両方のＩＰ空間において免疫認識および線維症を回避する。このアルギネートは、マクロファージ接着をブロックし、異物応答の活性化を妨げ、埋め込まれた材料の線維症を克服するのに必要な表面特性への洞察を提供する。
【０４４２】
Ｉ．方法
Ａ．アルギネート化学修飾
１．アルギネートアミド化
アルギネート（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘからのＰｒｏｎｏｖａ  ＵＰＶＬＶＧ、１当量、反応に利用可能である１００ｍｇ＝０．５２ｍｍｏｌのＣＯＯＨ）を、２％アルギネート溶液として３：２の水：アセトニトリル混合物（５ｍｌの総容量）に溶解した。次いで、アミン（Ｎ１〜Ｎ９、Ｚ１、Ｚ２）（１当量、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）を、カップリング剤である２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ、０．５当量、４５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および４−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１当量、５６μｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に混合物に加えた。混合物を５５℃にて一晩撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。このように得られた固体を水に溶解し、シアノ修飾されたシリカゲル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）に通して濾過し、不溶性沈殿物を除去した。次いで、このように得られた溶液を脱イオン水によって１０，０００ＭＷＣＯ透析膜に対して一晩透析し、ポリマーをさらに精製した。次いで、このように得られた溶液を凍結乾燥し、精製した化合物を得た。
【０４４３】
２．アルギネートエステル化
アルギネート（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘからのＰｒｏｎｏｖａ  ＵＰＶＬＶＧ、１当量、反応に利用可能である１００ｍｇ＝０．５２ｍｍｏｌのＣＯＯＨ）を、２％アルギネート溶液として３：２の水：アルコール（Ｏ１〜Ｏ１２）混合物（５ｍｌの総容量）に溶解した。次いで、カップリング剤である２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ、０．５当量、４５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および４−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１当量、５６μｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、混合物を５５℃にて一晩撹拌した。翌日、溶媒を減圧下で除去した。このように得られた固体を水に溶解し、シアノ修飾したシリカゲル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）に通して濾過し、不溶性沈殿物を除去した。次いで、このように得られた溶液を脱イオン水によって１０，０００ＭＷＣＯ透析膜に対して一晩透析し、ポリマーをさらに精製した。次いで、このように得られた溶液を凍結乾燥し、精製した化合物を得た。
【０４４４】
３．ヒュスゲン環化付加（「クリック」）
第２のステップにおいて、Ｚ２と反応したアルギネートを、水：メタノール１：１の溶液（全部で５ｍｌ）に溶解した。アジ化ナトリウム（０．２５当量、１９ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（０．０５当量、１９ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｔｒａｎｓ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミン（０．２５当量、典型的には２０μｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．５当量、１０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、カップリング剤として加えた。次いで、０．５１ｍｍｏｌのそれぞれのアルキン（Ｙ１〜Ｙ２０）を加え、混合物を５５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。このように得られた固体を水に溶解し、シアノ修飾されたシリカゲルに通して濾過し、不溶性沈殿物を除去した。透明な溶液を凍結乾燥し、５ｍｌの水に溶解し、透析した。次いで、このように得られた溶液を脱イオン水によって１０，０００ＭＷＣＯ透析膜に対して一晩透析し、ポリマーをさらに精製した。次いで、このように得られた溶液を凍結乾燥し、精製した化合物を得た。
【０４４５】
第２のステップにおいて、Ｚ１と反応したアルギネートを、水：メタノール１：１の溶液（全部で５ｍｌ）に溶解した。トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ、０．２当量、５０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリエチルアミン（Trietylamine）（０．２５当量、典型的には１５μｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．２５当量、５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ
Ａｌｄｒｉｃｈ）を、カップリング剤として加えた。次いで、０．５１ｍｍｏｌのそれぞれのアルキンを加え、混合物を５５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。このように得られた固体を水に溶解し、シアノ修飾したシリカゲルに通して濾過し、不溶性沈殿物を除去した。透明な溶液を凍結乾燥し、５ｍｌの水に溶解し、透析した。次いで、このように得られた溶液を脱イオン水によって１０，０００ＭＷＣＯ透析膜に対して一晩透析し、ポリマーをさらに精製した。次いで、このように得られた溶液を凍結乾燥して、精製した化合物を得た。
【０４４６】
４．Ｚ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５およびＺ１−Ｙ１９の調製のための最適化した合成：
Ｚ２−Ｙ１２アミン：
１０ｇの２−（２−プロピニルオキシ）テトラヒドロピラン（tetrahydopyran）（１当量、７１．３６ｍｍｏｌ）を、５．１ｇのアジ化ナトリウム（１．１当量、７８．５ｍｍｏｌ）、１．４１ｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．１当量、７．１４ｍｍｏｌ）、２．２９ｍｌのＴｒａｎｓ−Ｎ−Ｎ’−ジメチルシクロヘキサン−１，２−ジアミン（０．２５当量、１７．８３ｍｍｏｌ）、３．４ｇのヨウ化銅（Ｉ）（０．０２５当量、１７．８３ｍｍｏｌ）のメタノール（７５ｍｌ）溶液に加えた。この混合物に、１９．９７ｇの４ヨードベンジルアミドＨＣｌを加えた。反応物を５５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗反応物を、シリカゲルにおけるジクロロメタン：ウルトラ（３％ＮＨ４ＯＨを有するＤＣＭ中の２２％ＭｅＯＨ）混合物０％から４０％による液体クロマトグラフィーによって精製した。次いで、生成物を、下記のとおりアルギネートと反応させた。
【０４４７】
Ｚ１−Ｙ１５アミン：
３．５ｇの４−プロパルギルチオモルホリン（Propagylthiomorpholine）１，１−ジオキシド（１当量、２０ｍｍｏｌ）を、２．５ｇのＴＢＴＡ（０．２当量、４ｍｍｏｌ）、７５０μｌのトリエチルアミン（０．５当量、１０ｍｍｏｌ）、２５０ｍｇのヨウ化銅（Ｉ）（０．０６当量、１．３ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍｌ）溶液に加えた。混合物を０℃に冷却し、５．２５ｍｌの１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（１当量、２０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を５５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗反応物を、Ｃ１８カラムおけるジクロロメタン：ウルトラ（３％ＮＨ４ＯＨを有するＤＣＭ中の２２％ＭｅＯＨ）混合物０％から１００％による液体クロマトグラフィーによって精製した。次いで、生成物を、下記のとおりアルギネートと反応させた。
【０４４８】
Ｚ１−Ｙ１９アミン：
３ｇの４−エチニルアニリン（１当量、２０．２ｍｍｏｌ）を、２．５ｇのＴＢＴＡ（０．２当量、４ｍｍｏｌ）、７５０μｌのトリエチルアミン（０．５当量、１０．１ｍｍｏｌ）、２５０ｍｇのヨウ化銅（Ｉ）（０．０６当量、１．３１ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍｌ）溶液に加えた。混合物を０℃に冷却し、５．２５ｍｌの１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン（１当量、２０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を５５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗反応物を、シアノ官能化シリカカラムにおけるジクロロメタン：ウルトラ（３％ＮＨ４ＯＨを有するＤＣＭ中の２２％ＭｅＯＨ）混合物０％から３０％による液体クロマトグラフィーによって精製した。次いで、生成物を、下記のとおりアルギネートと反応させた。
【０４４９】
アルギネート反応：
１．５ｇのＵＰＶＬＶＧ（１当量）を４５ｍｌの水に溶解し、６７５ｍｇの２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ、０．５当量）および８４０μｌのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ、１当量）を加えた。次いで、７．６５ｍｍｏｌのＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、またはＺ１−Ｙ１９アミンを２２．５ｍｌのアセトニトリルに溶解し、混合物に加えた。反応物を５５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、固体を水に溶解した。溶液をシアノ官能化シリカのパッドに通して濾過し、水を減圧下で除去し、溶液を濃縮した。次いで、これを脱イオン水中で一晩１０，０００ＭＷＣＯ膜に対して透析した。水を減圧下で除去し、官能化アルギネートを得た。
【０４５０】
Ｂ．カプセル形成
静電液滴発生装置を、下記の通りに設定した。ＥＳシリーズ０〜１００ＫＶ、２０ワット高圧発電装置（Ｇａｍｍａ  ＥＳシリーズ、Ｇａｍｍａ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＦＬ、ＵＳＡ）を、先端がとがっていないニードル（ＳＡＩ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）の上部および下部に接続する。このニードルは、５ｍＬのルアーロックシリンジ（ＢＤ、ＮＪ、ＵＳＡ）に取り付けられており、これは垂直に配向しているシリンジポンプ（ポンプ１１Ｐｉｃｏ  Ｐｌｕｓ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）にクリップで留められている。シリンジポンプによって、アルギネートを２０ｍＭのバリウム５％マンニトール溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するガラス皿中にポンプで送り出す。ＰｉｃｏＰｌｕｓシリンジポンプの設定は、１２．０６ｍｍの直径および０．２ｍＬ／分の流量である。カプセルが形成された後、これらを次いで集め、次いで、ｈｅｐｅｓ緩衝液（１５．４２８ｇのＮａＣｌ、０．７０ｇのＫＣｌ、０．４８８ｇのＭｇＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、５０ｍＬのｈｅｐｅｓ（１Ｍ）緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、２ＬのＤｉＨ２Ｏ中）で４回洗浄する。アルギネートカプセルを、４℃にて一晩静置する。次いで、カプセルを０．８％食塩水中で２回洗浄し、使用するまで４℃にて保持する。
【０４５１】
アルギネートの可溶化：ＳＬＧ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ）を、１．４％の重量対容量（weight to volume）で０．８％食塩水に溶解させた。ＳＬＧ１００（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ）を、１．２％の重量対容量で０．８％食塩水に溶解させた。ＵＰＶＬＶＧ（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ）を、５％の重量対容量で０．８％食塩水に溶解させた。全ての修飾されたアルギネートを最初に、５％の重量対容量で０．８％食塩水に溶解させた。次いで、調節剤（Modifies）を３％の重量対容量のＳＬＧ１００とブレンドし、０．８％食塩水に溶解した（比について表１を参照されたい）。
【０４５２】
異なるサイズのカプセルの形成：３００μｍ直径のカプセルについて、３０ゲージの先端がとがっていないニードル（ＳＡＩ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、７〜８ｋＶの電圧と共に使用した。５００μｍ直径のカプセルについて、２５ゲージの先端がとがっていないニードル（ＳＡＩ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、５〜７ｋＶの電圧と共に使用した。１．５ｍｍのカプセルについて、１８ゲージの先端がとがっていないニードル（ＳＡＩ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、５〜７ｋＶの電圧と共に使用した。
【０４５３】
【表１】
2020023582.tif 000086
表１の説明文：修飾されたアルギネートを、ＳＬＧ１００とブレンドし、カプセルを作製する。修飾されたアルギネートおよびＳＬＧ１００を、５ｍＬのシリンジ中に取り出し、カプセル化の前に充分にボルテックスする。異なる修飾されたアルギネートは、球状カプセルを作製するために加える異なる容量パーセントのＳＬＧ１００を必要とする。＊ＶＬＶＧ／ＳＬＧ１００は、対照ブレンドである。修飾されていないＶＬＶＧを、ＳＬＧ１００とブレンドする。
【０４５４】
Ｃ．ヒドロゲルカプセルおよび他の材料球の移植
【０４５５】
全ての動物プロトコルは、ＭＩＴ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって承認され、全ての手術手順および手術後ケアは、ＭＩＴ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの獣医学スタッフによって監督された。免疫適格雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に酸素中の３％イソフルランで麻酔をし、これらの腹部を剪毛し、ベタジンおよびイソプロパノールを使用して滅菌した。ブラントジセクションを使用して、腹部の正中に沿って０．５ｍｍの切開を行い、腹膜の内層を露出させた。次いで、腹膜壁を鉗子でつかみ、０．５〜１ｍｍの切開を白線に沿って行った。次いで、所望の容量のカプセルを無菌のピペット中に取り、切開部を通して腹膜腔中に移植した。次いで、５−０テーパー先端のポリジオキサノン（ＰＤＳ  ＩＩ）吸収性縫合糸を使用して切開部を閉じた。次いで、創傷クリップおよび組織接着剤を使用して皮膚の切開部を閉じた。手術前に、全てのマウスにまた、脱水を防止するための皮下への０．３ｍＬの０．９％食塩水と共に、手術前の鎮痛剤として皮下への０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のブプレノルフィンを投与した。
【０４５６】
Ｄ．細胞、組織、および材料の回収
【０４５７】
移植後の所望の時点において、図および結果において特定したように、ＣＯ２投与、それに続く頚椎脱臼によってマウスを安楽死させた。場合によっては、腹腔内洗浄（lavage）を行うために５ｍｌの氷冷のＰＢＳを最初に注射し、浮動性の腹腔内の免疫細胞をすすぎ、集めた。次いで、腹部皮膚および腹膜壁に沿って鉗子およびハサミを使用して切開を行い、腹腔内洗浄容量を新鮮な１５ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブ（それぞれは５ｍｌのＲＰＭＩ細胞培養培地と共に調製）中にピペットで入れた。次に、洗浄ボトルの先端を、腹腔中に挿入した。次いで、ＫＲＥＢＳ緩衝液を使用して、腹部からペトリ皿中へと全ての材料カプセルを収集のために洗い出した。全てのカプセルが洗い出されるか、または手作業で回収されたことを確実にした後、腹腔内組織に直接線維組織を形成した場合、これらを下流の加工およびイメージングのために５０ｍＬの円錐管中に移した。腹腔内洗浄およびカプセル回収の後に、残留している線維組織を形成した腹腔内組織をまた、下流のＦＡＣＳおよび発現分析のために切除した。
【０４５８】
Ｅ．回収した材料カプセルのイメージング
【０４５９】
位相差イメージングのために、回収した材料をクレブス緩衝液を使用して穏やかに洗浄し、Ｅｖｏｓ  Ｘｌ顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｇｒｏｕｐ）を使用した位相差顕微鏡観察のために３５ｍｍのペトリ皿中に移した。
【０４６０】
Ｆ．ＰｒｏＳｅｎｓｅアッセイ
【０４６１】
雌性ＳＫＨ１マウス（６週齢）をこのアッセイのために利用した。１００ｕｌのカプセルを２００ｕｌの食塩水に再懸濁し、マウスの上背の左側の皮下に注射した。マウスにＡＩＮ−９３Ｇ精製済みげっ歯類用食餌（ＴＤ９４０４５、Ｈａｒｌａｎ）を与え、注射後の蛍光バックグラウンドを最小化した。６日後、マウス毎に１００ｕｌ（４ｎｍｏｌ）のＰｒｏＳｅｎｃｅ７５０ＦＡＳＴ（ＮＥＶ１１１７１、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）を、尾静脈を介して静脈内に注射した。７日目に（すなわち、ＰｒｏＳｅｎｓｅ７５０ＦＡＳＴ静脈内投与の２４時間後）、マウスをＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）によってスキャンした。酸素中の３％イソフルランを使用してマウスに麻酔をし、手順の間ずっと同じ割合で維持し、ＩＶＩＳスペクトルシステムの設定は、曝露＝７．５０、ビニング＝中程度、ＦＳｔｏｐ＝２、励起＝６０５および発光＝６６０であった。画像をＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアで分析し、同じマウスの上背の右側をシグナル定量化の間の対照として使用した。
【０４６２】
Ｇ．細胞染色および共焦点免疫蛍光法
【０４６３】
回収した試料を、４％パラホルムアルデヒド中に一晩（１×ＰＢＳに希釈）貯蔵した。次いで、試料を、クレブス緩衝液（７．８８９ｇのＮａＣｌ、０．３５ｇのＫＣｌ、５．９５８ｇのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｏｎｔａｎａ、ＵＳＡ）、０．１６３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．１４４ｇのＭＧＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０００ｍＬのＤｉＨ２Ｏ中）中で洗浄した。試料を１０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを吸引し、２０ｍＬの１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｏｎｔａｎａ、ＵＳＡ）溶液を使用して、細胞を透過処理した。試料を室温にて１０分間インキュベートした。次いで、試料を１５ｍＬの１％アルブミン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｏｎｔａｎａ、ＵＳＡ）中でインキュベートし、１×ＰＢＳ中で室温にて３０分間希釈した。全て１％アルブミン溶液に希釈した３ｍＬの抗体溶液（１：２００、ＣＤ６８  ４８８抗マウス（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、１：２００、抗マウスアクチン、α−平滑筋−Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｏｎｔａｎａ、ＵＳＡ）、１：３０、ファロイジン抗マウス６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ＤＡＰＩ（ＮｕｃＢｌｕｅ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、１ｍＬ毎に２滴）を、各試料に加えた。試料を染色溶液中で室温にて４５分間インキュベートした。次いで、染色溶液を吸引した。次いで、試料を２０ｍＬの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｏｎｔａｎａ、ＵＳＡ）で２回洗浄し、１×ＰＢＳに希釈した。次いで、試料を２０ｍＬの１×ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、試料を２４ウェルガラス底プレートに移した。過剰なＰＢＳを吸引し、１ｍＬの５０％グリセロール溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｏｎｔａｎａ、ＵＳＡ）を加えた。ＺＥＮ顕微鏡ソフトウェアを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００システムを使用して、染色した試料を画像処理および分析した。得られた画像を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用したプレゼンテーションのために線形に調整した。
【０４６４】
Ｈ．タンパク質抽出
【０４６５】
回収したカプセル上の細胞を、１００ｍＭのＰＭＳＦおよび１×プロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤単回使用カクテル、カタログ番号７８４３０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含み、１００ｕｌのカプセルと２００ｕｌとの溶解緩衝液の比の、ＮＰ４０細胞溶解緩衝液（カタログ番号ＦＮＮ００２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、氷上、７０％振幅（ＱＳｏｎｉｃａ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、モデル＃Ｑ１２５、ＱＳｏｎｉｃａ  ＬＬＣ）で、３回の３０秒間オン３０秒間オフサイクルの超音波処理によって溶解した。ライセートを１２０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離した。タンパク質を含有する上清を氷上に保持した新鮮なチューブ中に吸引した。ペレットを同じ容量の溶解緩衝液で洗浄し（すなわち、１００ｕｌのカプセルのペレットを、２００ｕｌの溶解緩衝液で洗浄した）、次いで、１２０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離し、上清を先の上清と合わせた。タンパク質を将来の使用のために−８０℃にて貯蔵した。
【０４６６】
Ｉ．Ｅｌｉｓｐｏｔ（マウスサイトカインアレイ）
【０４６７】
このアッセイは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ＰｒｏｆｉｌｅｒマウスサイトカインアレイパネルＡキット（カタログ番号ＡＲＹ００６、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）で行った。各膜について、２００ｕｌのタンパク質溶液を、１００ｕｌの試料緩衝液（アレイ緩衝液４）および１．２ｍｌのブロック緩衝液（アレイ緩衝液６）と混合し、次いで、１５ｕｌの再構成したマウスサイトカインアレイパネルＡ検出抗体カクテルと共に加え、室温にて１時間インキュベートした。その間にアレイ膜をブロック緩衝液（アレイ緩衝液６）と共にロッキングプラットフォームシェーカー上で２時間インキュベートし、次いで、ブロック緩衝液を吸引し、調製した試料／抗体混合物を膜上に加え、ロッキングプラットフォームシェーカー上で４℃にて一晩インキュベートした。膜を２０ｍｌの１×洗浄緩衝液によってロッキングプラットフォームシェーカー上で１０分間３回洗浄し、脱イオン水で１回すすぎ、次いで、ロッキングプラットフォームシェーカー上でフルオロフォアをコンジュゲートしたストレプトアビジン（１：５，０００希釈、カタログ番号９２６−３２２３０、Ｌｉ−Ｃｏｒ）で室温にて３０分間プローブし、上記のステップにおけるように、洗浄緩衝液で３回洗浄し、脱イオン水で再び１回すすいだ。抗体−抗原複合体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、シリアルナンバーＯＤＹ−２３２９）を使用して８００ｎｍの波長にて可視化した。スポットの密度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって分析した。
【０４６８】
Ｊ．ウエスタンブロッティング
【０４６９】
各レーンについて１×ローディング緩衝液（ＳＤＳ−試料緩衝液、カタログ番号ＢＰ−１１１Ｒ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）と混合した１２ｕｌのタンパク質溶液を９５℃にて２０分間沸騰させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ａｎｙ  Ｋｄ１５−ｗｅｌｌ  ｃｏｍｂ  ｍｉｎｉ−ｇｅｌ、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号４５６−９０３６）で電気泳動を行い、３ｕｌのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｘｔｒａ  Ｓｔａｎｄｓ（カタログ番号１６１−０３７７、Ｂｉｏ−ｒａｄ）をラダーとして使用して、バンドの位置を示し、次いで、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６２−０２１３）上にブロットした。ブロットを、ローディング対照として、抗α平滑筋アクチン抗体（１：４００希釈、アルファ平滑筋アクチンに対するウサギポリクローナル；カタログ番号ａｂ５６９４、ＡｂＣａｍ）および抗βアクチン抗体（１：４０００希釈、マウスにおいて産生されたモノクローナル抗β−アクチン抗体；カタログ番号Ａ１９７８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｉｒｃｈ）、それに続いてロバ抗ウサギ（１〜１５，０００希釈、カタログ番号９２６−３２２１３、Ｌｉ−Ｃｏｒ）およびヤギ抗マウス（１〜１５，０００希釈、カタログ番号９２６−６８０７０、Ｌｉ−Ｃｏｒ）フルオロフォアをコンジュゲートした二次抗体でプローブした。抗体−抗原複合体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、シリアルナンバーＯＤＹ−２３２９）を使用して７００ｎｍおよび８００ｎｍの波長にて可視化した。バンドの密度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアによって分析した。
【０４７０】
Ｋ．ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析
【０４７１】
モック移植（ＭＴ）対照、または５００μｍもしくは１，５００μｍのアルギネートカプセル担持マウス（ｎ＝５匹／群）についてのＲＮＡを、移植後の様々な時点で採取した組織試料から単離した。それぞれのＲＮＡを定量化し、適当な濃度に希釈し（１００ｎｇ／μｌ）、次いで、５００ｎｇの各試料を、本発明者らのカスタマイズされた多重化５３−遺伝子マウスマクロファージサブタイピングパネルを介して、発現分析のためのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ製造業者プロトコルに従い、処理した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）定量化に続いてＲＮＡレベル（絶対コピー数）を得て、群試料をｎＳｏｌｖｅｒ分析ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して分析した。
【０４７２】
Ｌ．ＦＡＣＳ分析
【０４７３】
新たに切除した組織の単一細胞懸濁液を、製造業者のプロトコルによってｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して調製した。単一細胞懸濁液をＰＥＢ解離緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で調製し、懸濁液を７０μｍのフィルター（カタログ番号２２３６３５４８、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に通過させた。次いで、全ての組織および材料の試料に由来する単一細胞集団を、５ｍｌの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（カタログ番号００−４３３３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５分間４℃にて赤血球溶解に供した。２０ｍｌの無菌の１×ＰＢＳを加えることによって反応を終了させた。残った細胞を３００〜４００ｇで４℃にて遠心分離し、抗体インキュベーションのために最小容量（約５０μｌ）のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ染色緩衝液（カタログ番号００−４２２２）に再懸濁させた。次いで、全ての試料を、細胞マーカーＣＤ６８（試料毎に１μｌ（０．５μｇ）；ＣＤ６８−Ａｌｅｘａ６４７、クローンＦＡ−１１、カタログ番号１１−５９３１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ−６Ｇ（Ｇｒ−１）（試料毎に１μｌ（０．５μｇ）；Ｌｙ−６Ｇ−Ａｌｅｘａ−６４７、クローンＲＢ６−８Ｃ５、カタログ番号１０８４１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（試料毎に１μｌ（０．２μｇ）；またはＣＤ１１ｂ−Ａｌｅｘａ−４８８、クローンＭ１／７０、カタログ番号１０１２１７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に対して特異的な蛍光でタグ付けしたモノクローナル抗体の２つと共に、４℃にて暗中で２５分間共染色した。次いで、２ｍｌのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅフローサイトメトリー染色緩衝液（カタログ番号００−４２２２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、試料を４００〜５００ｇで４℃にて５分間遠心分離した。上清を吸引によって除去し、この洗浄ステップを染色緩衝液でさらに２回繰り返した。３回目の洗浄に続いて、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カタログ番号３４２９７５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、来たるべきＦＡＣＳ分析のために、各試料を５００μｌのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁し、４０μｍのフィルター（カタログ番号２２３６３５４７、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通過させた。適当なバックグラウンドおよびレーザー強度設定のために、未染色の単一抗体、およびＩｇＧ（Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−６４７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄで標識）対照についてまた実行した。
【０４７４】
Ｍ．生体イメージング
【０４７５】
生体イメージングのために、５００μｍおよび１５００μｍのサイズのＳＬＧ２０ヒドロゲルを、Ｑｄｏｔ６０５（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と共にロードし、上記のようにＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｃｓｆ１ｒ−ＥＧＦＰ−ＮＧＦＲ／ＦＫＢＰ１Ａ／ＴＮＦＲＳＦ６）２Ｂｃｋ／Ｊマウスに外科的に埋め込んだ。移植の７日後に、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、小さな切開を当初の手術の部位において行い、ビーズを露出させた。マウスを倒立顕微鏡上に置き、８６０ｎｍの励起波長でＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶＢ−１０００ＭＰ多光子顕微鏡上で２５×、Ｎ．Ａ．１．０５対物レンズを使用して撮像した。２００μｍのＺ−スタック（１０μｍのステップ）を、画像に依存して、２０〜４５分の時系列について２分の間隔で取得した。マウスを持続したイソフルラン麻酔下に保持し、イメージングセッションに亘ってモニターした。得られた画像をＶｅｌｏｃｉｔｙ  ３Ｄ  Ｉｍａｇｅ分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して分析した。
【０４７６】
Ｎ．共焦点ラマン分光法
【０４７７】
試料の調製：緩衝溶液を有する１滴のヒドロゲルカプセルを、石英カバーガラス（０４３２１０−ＫＪ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）上で乾燥させた。乾燥した緩衝溶液から塩を除去するために、一滴の蒸留水を乾燥した試料上に穏やかに付着させ、直ちに組織に吸収させた。これを行うことによって、乾燥したヒドロゲルカプセルをラマンマッピングのために調製する。
【０４７８】
計器類：注文製作のＮＩＲ共焦点ラマン顕微鏡システムは、従前に報告した（Kangら、Combinedconfocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedicaldiagnosis.Biomed. Opt. Exp.、２巻（９号）：２４８４〜２４９２頁（２０１１年）；Kangら、Measuring uptakedynamics of multiple identifiable carbon nanotube species via high-speedconfocal Raman imaging of live cells. Nano Letters、１２巻（１２号）：６１７０〜６１７４頁（２０１２年））。手短に言えば、７８５ｎｍの波長のＴｉ：サファイアレーザー（３９００Ｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を、試料励起のために使用した。平行ビーム（collimatedbeam）を帯域通過フィルター（ＢＰＦ、ＬＬ０１−７８５−１２．５、Ｓｅｍｒｏｃｋ）によってフィルターをかけ、二軸ガルバノミラー（dual axesgalvanometer mirror）に再び方向付けた。ガルバノミラー（ＣＴ−６２１０、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって高速ＸＹスキャニングを行った。１．２ＮＡ水浸型対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＵＰＬＳＡＰＯ６０ＸＷＩＲ６０Ｘ／１．２０）を使用して、レーザー光を試料上に焦点を合わせ、後方散乱光を集めることの両方を行った。差動マイクロメーター（ＤＲＶ５１７、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）と合わせたピエゾアクチュエーターを使用して、試料焦点の、それぞれ、粗い調節および微細な調節を行った。フリップミラーを結像レンズの後に置いたが、その結果、７５×拡大率を有するビデオカメラを使用して非干渉性透過源からの試料焦点面を観察することができる。試料からの後方散乱ラマン光は２つのダイクロイックミラー（ＤＭ１：Ｓｅｍｒｏｃｋ  ＬＰＤ０１−７８５ＲＵ−２５、ＤＭ２：Ｓｅｍｒｏｃｋ  ＬＰＤ０１−７８５ＲＵ−２５×３６×１．１）を通過させ、マルチモードファイバー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｍ１４Ｌ０１）によって集めた。集めたシグナルをスペクトログラフ（Ｈｏｌｏｓｐｅｃ  ｆ／１．８ｉ、Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に送達し、熱電冷却した背面照射および深空乏型（deepdepleted）ＣＣＤ（ＰＩＸＩＳ：１００ＢＲ＿ｅＸｃｅｌｏｎ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって検出した。ＬａｂＶｉｅｗ８．６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、データ収集ボード（ＰＣＩ−６２５１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＭＡＴＬＡＢ２０１３ソフトウェア（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を使用して、システムを制御し、データを取得し、データを分析した。
【０４７９】
ラマン分光法測定：６０ｍＷの７８５ｎｍレーザー出力を、ミクロンスポットサイズ上に焦点を合わせ、ヒドロゲル試料をラスタースキャンするために使用した。３０×３０スペクトルを、４５μｍ×４５μｍの領域から積分時間１．０ｓ／ピクセルで取得した。総測定時間は概ね１５分であった。
【０４８０】
データ加工：２つのラマンバンドの強度に基づいて、２つのラマン画像を生じさせる。これらのラマン画像をサイズ変更して、赤色および緑色として同じ領域からの対応する明視野像の上にオーバーレイした。
【０４８１】
ＩＩ．ポリマーおよび化合物の特性決定
N7:  1H (400 MHz; D2O):3.10-4.10 (m, アルギネートプロトン), 4.20 (2H, s, H2N-CH2-Ph), 4.40-5.20(m, アルギネートプロトン), 7.41 (2H, m, フェニル), 7.49 (3H, m, フェニル)
IR (ATR): 3234, 1579, 1465, 1407, 1368, 1078, 810, 692,517.
[0578]
N8:  1H (400 MHz; D2O):3.00-3.20 (m, アルギネートプロトン), 3.60 (8H, m, エトキシ), 3.60-5.10 (m, アルギネートプロトン).
IR (ATR): 3233, 2927, 2358, 1591, 1405, 1318, 1022, 945,810.
[0580]
O3:  1H (400 MHz; D2O):1.90-2.10 (m, 4H, フルフリル), 3.23 (m, 2H, フルフリル) 3.26-4.00 (m, アルギネートプロトン), 4.03(3H, m, O-CH2-C[フルフリル]), 4.10-5.20 (m, アルギネートプロトン)
IR (ATR): 3202, 3070, 2344, 1711, 1594, 1398, 1021, 715,549
[0580]
O6:  1H (400 MHz; D2O):3.60-4.52 (m, アルギネートプロトン), 4.59 (2H, m, O-CH2-C[フルフリル]), 4.6-5.2 (m, アルギネートプロトン),6.45 (2H, m, CH-CH=CH-O フルフリル), 7.53 (1H, m, CH-CH=CH-O フルフリル).
IR (ATR): 3232, 2360, 1614, 1410, 1028, 538.
[0582]
O9:  1H (400 MHz; D2O):0.20 (s, 9H, フルフリル),) 3.10-5.20 (m, アルギネートプロトン).
IR (ATR): 3310, 2939, 2360, 1592, 1406, 1316, 1081, 1020,902, 770.
[0584]
O11:  1H (400 MHz; D2O): 3.05-4.50 (m, アルギネートプロトン), 4.52 (2H, s, O-CH2-Ph), 4.52-5.2 (m, アルギネートプロトン),6.88 (2H, m, フェニル), 7.26 (2H, m, フェニル).
IR (ATR): 3370, 3089, 1597, 1517, 1454, 1235, 1207, 989,835, 801, 561.
[0586]
Z1-Y2:  1H (400 MHz; D2O):3.05-3.40 (m, アルギネートプロトン), 3.40-3.66 (16H, m, エトキシ), 3.75 (3H, s, メトキシ) 3.8-5.1(m, アルギネートプロトン), 7.19 (1H, m, フェニル), 7.50 (1H, m, フェニル), 7.94 (1H, m, フェニル),8.00 (1H, m, フェニル), 8.49 (1H, s, トリアゾール).
IR (ATR): 3144, 2922, 1592, 1400, 1329 1019, 943.
[0588]
Z1-Y15:  1H (400 MHz; D2O):3.07 (4H, s, N-CH2-CH2-S), 3.17-3.40 (m, アルギネートプロトン),3.46 (4H, s, N-CH2-CH2-S), 3.50-3.70 (16H, m, エトキシ),3.7-5.2 (m, アルギネートプロトン), 8.08 (1H, s, トリアゾール).
IR (ATR):3268, 2933, 2250, 1602, 1409, 1292, 1119, 1023,946.
[0590]
Z1-Y19:  1H (400 MHz; D2O):3.05-3.40 (m, アルギネートプロトン), 3.40-3.66 (16H, m, エトキシ), 4.4-5.1 (m, アルギネートプロトン),6.96 (2H, m, フェニル), 7.63 (3H, m, フェニル), 8.23 (1H, s, トリアゾール).
IR (ATR): 3234, 2929, 2361, 1593, 1406, 1317 1024, 947,810.
[0592]
Z2-Y12:  1H (400 MHz; D2O):1.57-1.78 (m, 6H, ピラン), 3.10-4.40 (m, アルギネートプロトン), 4.48 (4H, m, ピラン), 4.50-5.10(m, アルギネートプロトン), 7.56 (2H, m, フェニル), 7.76 (3H, m, フェニル), 8.51 (1H, s, トリアゾール).
IR (ATR):  3235, 2933, 2111, 1592, 1405, 1290, 1023,946.
[0594]
N4-N2:  1H (400 MHz; D2O):2.72 (s, 3H, N-CH3 ジオキソラン) 2.77 (s, 3H, N-CH3 ベンジル), 3.36(2H, d, N-CH2-ジオキソラン), 3.55-4.20 (m, アルギネートプロトン), 4.22 (2H, m, N-CH2-Ph),4.50-5.10 (m, アルギネートプロトン), 5.19 (1H, m, CH2-CH-O ジオキソラン), 7.51 (5H, m, フェニル).
IR (ATR):  3250, 2894, 1601, 1409, 1127, 1088, 1029,946.
[0596]
O3-O10:  1H (400 MHz; D2O):1.60-2.20 (m, 4H, テトラヒドロフルフリル), 3.55-5.10 (m, アルギネートプロトン), 3.78 (2H, m, CH2-CH2-Oテトラヒドロフルフリル ), 3.85 (3H, s, COO-CH3), 4.13 -4.30 (3H, m, N-CH2-テトラヒドロフルフリル).
IR (ATR):  3448, 2926, 2111, 1618, 1420, 1290, 1096,948, 904.
[0598]
N9-O8:  1H (400 MHz; D2O):1.28 (m, 3H, N-CH2-CH3), 1.32 (m, 3H, O-CH2-CH3),1.63 (m, 3H, N-CH2-CH2-CH2-CH2-OH)1.74 (m, 3H, N-CH2-CH2-CH2-CH2-OH),3.09-3.40 (m, 6H, CH3-CH2- N-CH2-CH2-CH2-CH2-OH),3.55-5.10 (m, アルギネートプロトン), 4.06 (m, 3H, O-CH2-CH3).
IR (ATR): 3422, 1709, 1655, 1611, 1474, 1395, 1042, 798.
【０４８２】
小分子調製物：
Ｚ２−Ｙ１２アミン：
【化６４】
2020023582.tif 000087
1H (400MHz; MeOD):  1.57 (m, 4H, ピラン), 1.72 (m, 1H, ピラン), 1.82 (m, 1H,ピラン) 3.58(m, 1H, ピラン), 3.87 (s, 1H, NH2-CH2-Ph), 3.92 (m, 1H, ピラン),4.68 (d, 1H, J= 12Hz, O-CH2-トリアゾール), 4.79 (m, 1H, O-CH-O ピラン), 4.97(d, 1H, J=12Hz, O-CH2-トリアゾール), 7.54 (m, 2H, 芳香族), 7.80 (m, 2H, 芳香族),8.49 (s, 1H, トリアゾール).
13C (400MHz; MeOD): 20.3 (CH2 ピラン), 26.5 (CH2 ピラン), 31.5 (CH2ピラン), 46.1 (NH2CH2), 61.0 (O-CH2-C), 63.3 (CH2-Oピラン), 99.5 (O-CH-O ピラン), 121.6 (CH 芳香族), 123.17 (CH トリアゾール), 129.9 (CH 芳香族),137.1 (Cq-N 芳香族), 144.9 (Cq-C 芳香族), 146.9 (C トリアゾール).
高分解能ＭＳ：Ｍ＋１＝２８９．１６６５＋３．１ｐｐｍ。
【０４８３】
Ｚ１−Ｙ１５アミン：
【化６５】
2020023582.tif 000088
1H (400MHz; D2O): 2.86 (2H, s, NH2), 3.01 (4H, m, N-CH2-CH2-S),3.10 (4H, m, N-CH2-CH2-S), 3.55 (2H, t, J=5.2Hz , NH2-CH2),3.61(8H, m, PEG) 3.85 (2H, s, チオモルホリン-CH2-トリアゾール), 3.90 (2H, t, J=5.2Hz,N-CH2-CH2-O), 4.59 (t, 2H, J=5.2, N-CH2-CH2-O),7.99 (1H, s, トリアゾール).
13C (400MHz; MeOH): 41.7 (NH2-CH2), 51.42 (N-CH2),51.48 (N-CH2 チオモルホリン) 52.1 (S-CH2 チオモルホリン) 52.4 (チオモルホリン-CH2-トリアゾール),70.4-72.1 (m, PEG), 126.0 (CH トリアゾール), 144.5 (C トリアゾール).
高分解能ＭＳ：Ｍ＋１＝３９２．１９６８−６．１ｐｐｍ。
【０４８４】
Ｚ１−Ｙ１９アミン：
【化６６】
2020023582.tif 000089
1H (400MHz; MeOD): 2.79 (t, 2H, J=5.2Hz, NH2-CH2), 3.46 (t, 2H,J=5.2, NH2-CH2-CH2), 3.53 (m, 4H, PEG), 3.61(m, 4H, PEG), 3.91 (t, 2H, J=5.2, N-CH2-CH2-O), 4.58 (t,2H, J=5.2, N-CH2-CH2-O) 6.76 (m, 2H, 芳香族), 7.54 (m, 2H, 芳香族),8.14 (s, 1H, トリアゾール).
13C (400MHz; MeOD): 41.6 (NH2-CH2), 51.4 (N-CH2),70.3-71.9 (m, PEG), 116.4 (CH 芳香族), 121.1 (Cq-C), 121.5 (CH トリアゾール), 127.7 (CH 芳香族),149.4 (C-NH2 芳香族), 149.5 (C トリアゾール).
高分解能ＭＳ：Ｍ＋１＝３３６．２０３６−８．３ｐｐｍ。
【０４８５】
ＩＩＩ．結果
【０４８６】
表２に列挙するアミンおよびアルコールを使用して、修飾されたアルギネートを調製した。最初のコンビナトリアル反応において、ＵＰＬＶＧアルギネートを、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で表２における化合物の１つと反応させた。多重修飾されたアルギネートを調製するために、第１のステップを、表２からの異なるアルコールまたはアミンを使用して繰り返した。次いで、アミンＺ２で修飾したアルギネートを、アジ化ナトリウムと反応させて、対応するアジド修飾されたアルギネートを調製した。次いで、テトラゾール修飾されたアルギネートを調製するために、これらのアルギネートを、アミンＺ１で修飾したアルギネートと共に、ＣｕＳＯ４およびアスコルビン酸ナトリウムの存在下で表２に列挙するアルキンの１つと反応させた。
【０４８７】
それぞれの共有結合的修飾に続いて、修飾されたアルギネートをシアノ修飾されたシリカカラムに通して濾過し、バルク有機不純物を捕捉した。最終的に、全ての共有結合的修飾ステップを完了した後、修飾されたアルギネートを、１０，０００ＭＷＣＯ膜に対して透析し、残った小分子または低分子量不純物を除去した。
【０４８８】
修飾されたアルギネートの純度を、１Ｈ  ＮＭＲ分析によって決定した。それぞれの修飾されたアルギネートポリマーの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを集め、修飾されたアルギネートポリマーおよび任意の不純物に対応するピークを積分し、試料中の各種の相対量を決定した。
【表２】
2020023582.tif 000090
【０４８９】
Ａ．アルギネートの化学修飾は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて異物応答を抑える
【０４９０】
抗線維化特性を支配する物理化学的パラメーターについての理解は現在不十分であり、合理的に設計されたアプローチを骨の折れるものとしている（Williams、Biomaterials、２９巻：２９４１〜２９５３頁（２００８年））。どの構造的フィーチャが抗線維化特性に適しているかをよりよく理解するために、ポリマーアルギネート骨格上の潜在した官能性および特性を修飾することができる多様な化合物のプールを選択した（図７）。７７４のメンバーのアルギネート類似体ライブラリーを、種々のアミン、アルコール、アジド、およびアルキンで構築した（図９）。７７４のアルギネート類似体のうち、３５の類似体は許容されがたく低い収率をもたらし、６３４のアルギネートは、修飾の後でゲル化できることが決定された。次いで、これらのアルギネートを、皮下ハイスループットマウスにおいてバルクヒドロゲルとして評価し、急性炎症のレベルを測定した（表３〜７）。２００のアルギネート類似体は、ライブラリー合成のための出発材料として使用されるアルギネートである対照アルギネートＵＰＶＬＶＧより低いレベルのカテプシン活性を示した。成分の記号表示は、表２および図７の成分を指す。このアッセイは、増加した好中球が媒介するカテプシン活性に応答して増加した蛍光を生じさせるイメージング剤によって皮下での好中球活性化をモニターする。２００の類似体は、ベースの修飾されていない超高純度のＶＬＶＧアルギネートより低い蛍光レベルを示した（図１１）。
【０４９１】
マイクロカプセルは、薬物送達および細胞カプセル化用途の両方において好ましいアルギネートの幾可学的形状であったため、最初のスクリーニングからの上位２００の成績のポリマーの７０（表２）を３００μｍのカプセルへと作製し、皮下炎症アッセイにおいて再評価した（図１２）。ミクロスフィアを構築することにおいて化学修飾されたアルギネートを使用することは問題があることが証明され、少量の超高純度のＳＬＧ１００アルギネートとアルギネート類似体溶液とをブレンドすることによって良好なカプセル形態が回復した。
【表３】
2020023582.tif 000091
【０４９２】
【表４】
2020023582.tif 000092
【０４９３】
【表５】
2020023582.tif 000093
【０４９４】
【表６】
2020023582.tif 000094
【０４９５】
【表７】
2020023582.tif 000095
【０４９６】
全ての修飾したマイクロカプセル配合物はこのブレンディングを必要とし、修飾されていないアルギネートＶＬＶＧおよびＳＬＧ１００のブレンドした溶液から作製したカプセル（Ｖ／Ｓ）および従来のＳＬＧ２０カプセル配合物は対照としての役割を果たした。７０の配合されたアルギネートマイクロカプセルの内、改善された炎症応答がいくつかのポリマーで観察された（図１２）。上位１０の修飾されたマイクロカプセルは、対照アルギネートより１０〜４０％低い炎症レベルを示した。これらのより低いレベルの急性炎症がより低いレベルの線維症に置き換えられる（translated into）かを確かめるために、２８日後に、これらの上位１０のアルギネートの埋込み部位を、試料採取し、切断し、組織学的に処理した。３つの修飾されたアルギネートであるＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９は、最小の線維性過成長を示し、カプセルは周辺組織から完全に剥離させることができた。
【０４９７】
皮下の結果が他の埋込み部位に置き換えられるかを試験するために、上位１０のリード修飾されたアルギネートの３００μｍのカプセルを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内（ＩＰ）空間に埋め込んだ。カプセルを１４日後に回収し、細胞組織および線維性組織の蓄積について評価した。回収した対照カプセルの位相差イメージングは、ロバストな線維化応答を示し、白色の線維性コラーゲン性の沈着が茶色のカプセル凝集（capsule clumping）を有するカプセル上で観察された。比較すると、上位１０のリード修飾されたアルギネートは、異なる程度の線維症を示し、修飾されたアルギネートであるＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９は、線維性沈着を殆ど示さず、抗線維化特性を有する材料であることが明らかになる。
【０４９８】
Ｚ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９カプセルの細胞染色および共焦点顕微鏡検査は、マクロファージ（ＣＤ６８）、筋線維芽細胞（ＳＭＡ）または全体的な細胞の沈着（ＤＡＰＩ）が殆どないか全くないことを示した。しかし、従来のマイクロカプセルアルギネートは、回収したカプセル上で有意な量のこれらの細胞集団を示した。細胞の沈着は材料認識の主要な機構的成分、およびコラーゲン性の沈着の初発因子であり、カプセル表面上に細胞が存在しないことは、これらの修飾されたアルギネートの抗線維化特性のさらなる例示である。これらの結果を確認するために、Ｚ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、Ｚ１−Ｙ１９、および対照カプセルのＳＭＡレベルを、ウエスタンブロッティングによって定量化した。回収したマイクロカプセルから抽出したタンパク質試料からの４０の異なるサイトカインをまたプロファイルした。Ｚ２−Ｙ１２マイクロカプセルのサイトカインプロファイルは、全ての試験した試料のうちで最も低いサイトカインレベルを示し、これは全体的により低い炎症応答を示す。重要なことに、回収したＺ２−Ｙ１２カプセルは、低いタンパク質レベルのＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ４を有したが、これらは異物応答および線維症の公知のメディエーターである（Rodriguezら、J. Biomed. Mater. Res.A８９巻：１５２〜１５９頁（２００９年））。回収したカプセルから単離した公知の炎症因子および免疫細胞マーカーの７９のＲＮＡ配列の定量化はまた、Ｚ２−Ｙ１２埋込体についてより低いレベルの炎症を支持する。Ｚ２−Ｙ１２を埋め込んだマウスの周囲のＩＰ液および脂肪組織におけるＲＮＡプロファイルはまた、対照カプセルを埋め込んだマウスよりモック処置によく似ていたが、これはこの材料のより低い炎症の潜在性をさらに示す。
【０４９９】
Ｂ．抗線維化アルギネートは、より低いマクロファージ接着を示す
ＩＰにおいて１４日後に回収したカプセル上でＦＡＣＳ分析を行い、対照カプセルと比較して、Ｚ２−Ｙ１２カプセルへと動員された異なる免疫集団を特性決定した（図８）。Ｚ２−Ｙ１２カプセルは、有意により低い百分率のマクロファージおよび好中球集団を示したが、これはＺ２−Ｙ１２カプセルが免疫細胞集団の動員、または炎症応答の増幅を妨げ得ることを示唆する。より低いマクロファージ動員がｉｎ  ｖｉｖｏで明らかであったかを確かめるために、ＩＰ生体イメージングをＭＡＦＩＡマウス（ここではマクロファージは、ＧＦＰを発現している）における蛍光Ｚ２−Ｙ１２カプセルの埋込みの７日後に行い、これらを蛍光ＳＬＧ２０カプセルと比較した。ＳＬＧ２０カプセルは、これらのカプセルの表面において活発に凝集しているマクロファージの大きな集団を示し、これは、異物巨細胞形成、および線維症への明らかなステップを示す。Ｚ２−Ｙ１２カプセルは、比較するとカプセルの近くで非常により低いレベルのマクロファージを示し、明らかなマクロファージ凝集は存在しなかった。
【０５００】
Ｚ２−Ｙ１２カプセルの表面への免疫細胞の動員／活性化の欠乏は、他とは異なる表面を生じさせるポリマー鎖の化学修飾と一致する。共焦点ラマン分光マッピングを行って、マイクロカプセルにおけるＺ２−Ｙ１２化学修飾の分布を決定した。際立って、テトラヒドロピラニル修飾についての診断上のラマンシグネチャは、コアにおいてよりマイクロカプセルの表面においてより高い強度を有した。次いで、フリーズフラクチャー低温−ＳＥＭをＺ２−Ｙ１２マイクロカプセル上で行って、アルギネート類似体ミクロスフィアの表面およびコアトポグラフィーの両方を調査し、これらを対照カプセル配合物と比較した。Ｚ２−Ｙ１２カプセルは、ブレンドした対照、またはサイズが１μｍ〜１０μｍの範囲の細孔を有する従来のＳＬＧ２０カプセルと比較してカプセルコアを通してより可変の多孔性を示す。異なるカプセル配合物の間の表面のフィーチャは、全く別個である。Ｚ２−Ｙ１２カプセルの表面は、より少ないクレーターがあるフィーチャを示す。これらの表面の差異は、修飾されたポリマー鎖および周囲の水溶液の間の境界層における相互作用によって生じる可能性がある。
【０５０１】
Ｃ．ヒトではない霊長類においてＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９は線維症に対して抵抗する
リード材料であるＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９を、霊長類研究に前進させて、ＮＨＰモデルにおけるこれらの抗線維化特性を試験した。本発明者らの研究室からの従前の報告は、線維症の軽減において球状体のサイズがまた主要なパラメーターであることが確立され、より大きな球（＞１ｍｍ）は抗線維化特性を示した。従来のＳＬＧ２０カプセル、ならびに新規なＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９配合カプセルの１．５ｍｍのカプセルを、最小侵襲腹腔鏡下手順を使用して、ヒトではない霊長類（それぞれｎ＝３）に別々に移植した。カプセルを、２週間および４週間においてＩＰ洗浄によって回収し、各コホートからの１つの霊長類は６カ月間継続した。移植後１４日までに、ＳＬＧ２０の１．５ｍｍのカプセルはまた大部分は遊離しており、２週間においても組織中に包埋されなかった。しかし、多数のカプセルは線維組織を形成し、一緒に凝集した。１．５ｍｍのＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９は、高い回収率、および周辺組織中への最小の包埋を保持した。２週間および４週間の両方において、Ｚ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９カプセルは、１．５ｍｍのＳＬＧ２０カプセルと比較して位相差イメージングにおいて有意に低減した線維化応答を示した。回収したカプセルの共焦点イメージングおよびＦＡＣＳ分析は、大きな１．５ｍｍのＳＬＧ２０カプセルが、より広範囲の免疫マクロファージおよび線維症と関連する活性化した筋線維芽細胞の被覆を有したことを示したが、これは位相差イメージングにおいて見られる明らかな線維性過成長と一致している。
【０５０２】
カプセルサイズの増加および／または修飾した化学的性質（chemistry）がより長期間に亘り改善された抗線維化活性を維持するかを調査するために、６カ月後にＮＨＰから回収したカプセルで共焦点染色をまた行った。ＳＬＧ２０カプセルは、有意で広範囲の線維性過成長を示し、一方、Ｚ２−Ｙ１２カプセルはまだクリーンであり、マクロファージまたは筋線維芽細胞の会合を示さなかった。ＦＡＣＳ分析は、同様の結果を示し、回収したＺ２−Ｙ１２カプセルと関連するマクロファージの構成（composition）はより少なかった。
【０５０３】
カプセルサイズの増加（１．５ｍｍ）および修飾された（Ｚ２−Ｙ１２）化学的性質の両方の組合せは、６カ月の時点においてでさえ生体適合性を実質的に改善させた。大きな１．５ｍｍのＺ２−Ｙ１２カプセルは、全ての時点を通して最小（殆ど存在しない）レベルの線維症を有するように見えたが、これは大きなカプセルサイズの抗線維化効果は、修飾されたＺ２−Ｙ１２の化学的性質の抗線維化効果と相乗作用を示す。
【０５０４】
この実施例における結果は、最も広範に使用される生体材料の１つであるアルギネートの化学修飾が、げっ歯類およびヒトではない霊長類の両方において異物反応に対して抵抗することができるヒドロゲルを産生することを実証する。リードアルギネート類似体であるＺ２−Ｙ１２、Ｚ１−Ｙ１５、およびＺ１−Ｙ１９は、げっ歯類およびヒトではない霊長類の両方において、６カ月後においてさえ（Ｚ２−Ｙ１２）、マクロファージおよび他の免疫細胞による最小の認識、低レベルの炎症性サイトカイン、ならびに殆ど目に見える線維性沈着がないことを示す。Ｚ２−Ｙ１２化学修飾の分布は、マクロファージ接着を阻害し、生体材料に対する異物応答を効果的に軽減する独特のヒドロゲル表面をもたらす。結果は、現存する生体材料の化学修飾がこれらの異物応答を克服する実行可能な戦略であることを示す。これらはヒトではない霊長類において異物応答に対して抵抗する最初の生体材料であり、アルギネートをベースとする材料としてのこれらの多用途性は複数の生物医学的用途におけるその使用を可能とする。
【０５０５】
（実施例９）
免疫適格動物における修飾されたアルギネートでカプセル化したヒト細胞の抗線維化活性の実証
この実施例は、ロバストな免疫適格ＳＴＺ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて長期間埋め込まれた修飾されたアルギネートでカプセル化したヒト細胞の抗線維化特性を実証する。カプセル化されたヒト細胞は、これらに限定されないが、タンパク質を含めた異種物質（xenogeneic substance）を活発に分泌する。異種物質は、マウスから激烈な免疫応答を誘発するはずである。したがって、この試験は、埋め込まれた修飾されたアルギネートに対する激しい免疫負荷を表す。それにも関わらず、埋め込まれた修飾されたアルギネートは異物応答に対して抵抗し、カプセル化されたヒト細胞を宿主異物応答から長期間遮蔽する。その結果、ヒト細胞の有益な効果は、長期間発揮される。この実施例は、インスリンを分泌する修飾されたアルギネートでカプセル化したヒト細胞の試験であって、ＳＴＺにより誘発された糖尿病マウスにおいて血中グルコース値を低減させ、正常血糖を維持するこれらの能力についての試験を記載する。埋込体は、ＳＴＺ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、免疫抑制剤を必要とせずに、血中グルコース値を低減させ、正常血糖を長期間維持する。
【０５０６】
糖尿病は、３億人超の人々を苦しめている世界的な流行病である（Shawら、DiabetesRes. Clin. Pract.、８７巻：４〜１４頁（２０１０年））。外因性インスリンの毎日の注射と組み合わせた血中グルコースのモニタリングの厳格なレジメンは、依然として１型糖尿病患者についての主要な処置である一方、患者はまた毎日の服薬遵守と関連する難題による有害効果を被っている（Pickupら、N.Engl. J. Med.、３６６巻：１６１６〜１６２４頁（２０１２年））。さらに、血中グルコース値に応答したランゲルハンスの膵島のベータ細胞によるインスリン分泌のレギュレーションは、高度に動的プロセスであり、これは定期的なインスリン注射によって不完全にシミュレートされる（Robertsonら、N.Engl. J. Med.、３５０巻：６９４〜７０５頁（２００４年））。膵臓移植または屍体の膵島の注入のいずれかの形態であるドナー組織の移植は、臨床的に１型糖尿病患者についてインスリン非依存を達成する１つの戦略として現在遂行されている（Shapiroら、N.Engl. J. Med.、３５５巻：１３１８〜１３３０頁（２００６年）；Shapiroら、N. Engl. J. Med.、３４３巻：２３０〜２３８頁（２０００年）；Qiら、ActaDiabetologica、５１巻：８３３〜８４３頁（２０１４年））。このアプローチは、２つの主要な欠点によって制限されてきた：（１）利用可能なドナー組織の限定された供給、および（２）生涯に亘る免疫抑制と関連する有害効果（Hirshbergら、CurrentDiabetes Reports、７巻：３０１〜３０３頁（２００７年）；Giblyら、Diabetologia、５４巻：２４９４〜２５０５頁（２０１１年）；O’Sullivanら、EndocrineReviews、３２巻：８２７〜８４４頁（２０１１年））。生涯の免疫抑制の必要性を緩和する方法を開発して、最も広範な臨床的実施を可能としなければならない（Hirshbergら、CurrentDiabetes Reports、７巻：３０１〜３０３頁（２００７年）；Shapiroら、The Review of Diabetic Studies:RDS、９巻：３８５〜４０６頁（２０１２年）；Vogelら、Diabetologia、５６巻：１６０５〜１６１４頁（２０１３年））。
【０５０７】
細胞カプセル化は、宿主拒絶から治療用の組織を保護することによって、免疫抑制の必要性を克服する有望な技術である（Dolgin、Nat. Med.、２０巻：９〜１１頁（２０１４年）；Jacobs-Tulleneers-Thevissenら、Diabetologia、５６巻：１６０５〜１６１４頁（２０１３年））。膵島カプセル化治療のための最も一般に調査されている方法は、アルギネートミクロスフィア中への単離した膵島の処方である（Jacobs-Tulleneers-Thevissenら、Diabetologia、５６巻：１６０５〜１６１４頁（２０１３年）；Scharpら、AdvancedDrug Delivery Reviews、６７〜６８巻：３５〜７３頁（２０１４年））。屍体のヒト膵島を用いた糖尿病患者におけるこの技術の臨床的評価は、短期間の血糖補正のみを達成した（Jacobs-Tulleneers-Thevissenら、Diabetologia、５６巻：１６０５〜１６１４頁（２０１３年）；Bastaら、DiabetesCare、３４巻：２４０６〜２４０９頁（２０１１年）；Calafioreら、Diabetes Care、２９巻：１３７〜１３８頁（２００６年））。これらの研究からの埋込体は、線維性沈着、栄養素分離（nutrientisolation）、およびドナー組織の壊死をもたらす強い免疫介在性異物応答によって特性決定される（de Grootら、Journal of SurgicalResearch、１２１巻：１４１〜１５０頁（２００４年）；Tuchら、Diabetes Care、３２巻：１８８７〜１８８９頁（２００９年））。同様の結果は、前臨床糖尿病マウス、またはヒトではない霊長類モデルにおけるカプセル化された異種膵島および膵臓の前駆細胞で観察され、カプセル化された屍体のヒト膵島およびブタ膵島の両方の治療有効性（Hirshbergら、CurrentDiabetes Reports、７巻：３０１〜３０３頁（２００７年））は、免疫応答によって妨げられる（Elliotら、TransplantationProceedings、３７巻：３５０５〜３５０８頁（２００５年）；Omerら、Diabetes、５２巻：６９〜７５頁（２００３年）；Schneiderら、Diabetes、５４巻：６８７〜６９３頁（２００５年））。
【０５０８】
カプセル化された細胞埋込体の性能に対する主要な一因は、細胞カプセル化のために使用される生体材料に対する免疫応答である（Limら、Science、２１０巻：９０８〜９１０頁（１９８０年）；Jacobs-Tulleneers-Thevissenら、Diabetologia、５６巻：１６０５〜１６１４頁（２０１３年）；Scharpら、AdvancedDrug Delivery Reviews、６７〜６８巻：３５〜７３頁（２０１４年））。埋め込まれた材料に対する免疫介在性異物応答は組織カプセル形成を一般にもたらし、これは埋込体の機能不全の原因となる（Kingら、Journalof Biomedical Materials Research、５７巻：３７４〜３８３頁（２００１年））。ロバストな免疫系を有するヒトではない霊長類またはげっ歯類、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの腹腔内空間中に埋め込まれたとき（Kingら、Journalof Biomedical Materials Research、５７巻：３７４〜３８３頁（２００１年）；Dangら、Biomaterials、３２巻、４４６４〜４４７０頁（２０１１年））、アルギネートミクロスフィアは、異物反応および線維症を誘発する（Kingら、Journalof Biomedical Materials Research、５７巻：３７４〜３８３頁（２００１年）；Dangら、Biomaterials、３２巻：４４６４〜４４７０頁（２０１１年））。
【０５０９】
化学修飾されたアルギネートの大きなライブラリーが最近開発され、げっ歯類およびヒトではない霊長類モデルの両方において埋込体拒絶に対して抵抗するこれらの潜在性について評価した。この実施例は、トリアゾール−チオモルホリンジオキシド（ＴＭＴＤ；図１３）アルギネートでカプセル化したヒト細胞が、免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて異物応答を軽減することができたことを示す研究に及ぶ（図１４〜１６）。その結果、ＴＭＴＤアルギネートでカプセル化したヒト細胞は、長期間の血糖補正およびグルコース応答性を実現することができる。これらの新規な材料を使用して、マイクロカプセル化されたヒト細胞の埋込みによって長期間の血糖補正を実現することができ、このように、このような埋め込まれた細胞の治療効果を改善させることを、これらの結果は実証する。
【０５１０】
この実施例は、免疫抑制を伴わない正常血糖の回復について、免疫適格動物におけるカプセル化されたヒト細胞の成功した使用の潜在性を実証する。これは、開示されている修飾されたアルギネートを使用して、細胞をカプセル化し、材料をコーティングし、これらが埋め込まれる対象において細胞および材料に対する免疫反応を寄せ付けないことができるという予想を示す。これらの研究において適当な生体適合性アセスメントを確実にするために、免疫適格のストレプトゾトシンにより誘発された糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルを使用した。これは、この系統がヒト患者において観察されるのと同様の強い線維化および異物応答を生じさせることが公知であるためである（Kolbら、J. Respir. Cell. Mol. Biol.、２７巻：１４１〜１５０頁（２００２年））。他の組織源、例えば、アルギネートによる従来のマイクロカプセル化（Limら、Science、２１０巻；９０８〜９１０頁（１９８０年）；Calafioreら、DiabetesCare、２９巻：１３７〜１３８頁（２００６年））およびより大きな球配合物（Veisehら、Nat. Mater.、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＡＴ４２９０）を利用して血糖補正を示した配合物は、ヒト細胞で血糖補正を支持することができなかった。
【０５１１】
承認されたプロトコルおよび連邦ガイドラインに従い、全ての材料を腹腔内に埋め込み、特定のときにおいて免疫適格のストレプトゾトシンにより誘発された糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６またはＢ６．１２９Ｓ６−Ｃｃｒ６ｔｍ１（ＥＧＦＰ）Ｉｒｗ／Ｊマウスから回収した。試料加工、染色、ＦＡＣＳ、およびイメージングは、下記に詳述するように行った。
【０５１２】
Ｉ．材料
他に断らない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得て、細胞培養試薬はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から得た。抗体：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８をコンジュゲートした抗マウスＣＤ６８（カタログ番号１３７０１２、クローンＦＡ−１１）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７をコンジュゲートした抗マウスＬｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ（Ｇｒ−１）（カタログ番号１３７０１２、クローンＲＢ６−８Ｃ５）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｃｙ３をコンジュゲートした抗マウスアルファ平滑筋アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）から購入した。アクチンフィラメント（Ｆ−アクチン）特異的Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８をコンジュゲートしたファロイジンは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。抗グルカゴン、カタログ番号ａｂ８２２７０、抗インスリン、カタログ番号ａｂ７８４２、ヤギ抗モルモットＩｇＧ  Ｈ＆ＬをコンジュゲートしたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、カタログ番号ａｂ１５０１８５、およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆ＬをコンジュゲートしたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、カタログ番号ａｂ１５０１１６は、ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。抗ヒトＣ−ペプチド、カタログ番号ＧＮ−１Ｄ４は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（アイオワ大学、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、Ｉｏｗａ）から購入した。この研究において使用した球の試料採取は、商業的販売業者（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が内毒素試験のために提出したが、結果は球が＜０．０５ＥＵ／ｍｌの内毒素レベルを含有したことを示した。
【０５１３】
ＩＩ．方法
Ａ．アルギネートヒドロゲルカプセルの作製および細胞カプセル化
全ての緩衝液をオートクレーブによって滅菌し、アルギネート溶液を０．２ｕｍのフィルターを通す濾過によって滅菌した。溶液を滅菌した後、タイプＩＩクラスＡ２バイオセイフティーキャビネットにおけるカプセル形成を遂行することによって無菌的処理を実現し、それに続く埋込みのための製造したマイクロカプセル／球の無菌性を維持した。実施例８に記載されているプロトコルに従ったヒドロゲルカプセル。
【０５１４】
アルギネートを可溶化するために、ＳＬＧ２０（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ）を、１．４％の重量対容量で０．８％食塩水に溶解した。ＴＭＴＤアルギネートを５％の重量対容量で０．８％食塩水に最初に溶解し、次いで、８０％ＴＭＴＤアルギネート対２０％ＳＬＧ１００の容量比で、３％の重量対容量のＳＬＧ１００（また０．８％食塩水に溶解する）とブレンドした。
【０５１５】
０．５ｍｍの球の形成のために、２５Ｇのとがっていないニードル、５ｋＶの電圧および２００μｌ／分の流量で生じさせた。１．５ｍｍの球の形成のために、５〜７ｋＶの電圧を伴って１８ゲージの先端がとがっていないニードル（ＳＡＩ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。
【０５１６】
培養したヒト細胞を、カプセル化のために使用した。カプセル化の直前に、培養したヒト細胞クラスターを１，４００ｒｐｍで１分間遠心分離し、Ｃａ非含有のクレブス−ヘンセレイト（ＫＨ）緩衝液（４．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７．４、約２９０ｍＯｓｍ）で洗浄した。洗浄後、ヒト細胞を再び遠心分離し、全ての上清を吸引した。次いで、ヒト細胞ペレットを、ＳＬＧ２０またはＴＭＴＤアルギネート溶液（上記）に０．５ｍｌのアルギネート溶液毎に１，０００クラスター、２５０クラスター、および１００クラスターのクラスター密度で再懸濁した。ＢａＣｌ２ゲル化溶液を使用して球を架橋させ、これらのサイズを上記のように制御した。架橋の直後に、カプセル化されたヒト細胞クラスターを、５０ｍＬのＣＭＲＬＭ培地で４回洗浄し、移植の前にスピナーフラスコにおいて３７℃にて一晩培養した。カプセル化プロセスの間のヒト細胞クラスターの回避不能な喪失によって、カプセル化されたクラスターの総数をカプセル化後に再計数した。
【０５１７】
Ｂ．移植手術
全ての動物プロトコルは、ＭＩＴ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって承認され、全ての手術手順および手術後ケアは、ＭＩＴ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの獣医学スタッフによって監督された。免疫適格雄性のＳＴＺにより誘発された糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）または雄性Ｂ６．１２９Ｓ６−Ｃｃｒ６ｔｍ１（ＥＧＦＰ）Ｉｒｗ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に酸素中の３％イソフルランで麻酔をし、マウスの腹部を剪毛し、ベタジンおよびイソプロパノールを使用して滅菌した。手術前に、全てのマウスにまた、脱水を防止するための皮下への０．３ｍＬの０．９％食塩水と共に、手術前の鎮痛剤として０．０５ｍｇ／ｋｇ用量のブプレノルフィンを皮下に投与した。ブラントジセクションを使用して、腹部の正中に沿って０．５ｍｍの切開を行い、腹膜の内層を露出させた。次いで、腹膜壁を鉗子でつかみ、０．５〜１ｍｍの切開を白線に沿って行った。次いで、所望の容量の球（膵島を除いた全ての材料、およびラット膵島をカプセル化したＳＬＧ２０球）を無菌のピペット中に取り、切開部を通して腹膜腔中に埋め込んだ。次いで、５−０テーパー先端のポリジオキサノン（ＰＤＳ  ＩＩ）吸収性縫合糸を使用して切開部を閉じた。次いで、創傷クリップおよび組織接着剤を使用して皮膚の切開部を閉じた。
【０５１８】
Ｃ．血中グルコースのモニタリング
インスリン依存性糖尿病マウスを生じさせるために、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＩＴへの発送の前に、販売業者（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）がストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処置した。全てのマウスの血中グルコース値を、移植の前に再試験した。その非絶食時の血中グルコース値が連続２日間４００ｍｇ／ｄＬ超であったマウスのみを糖尿病とみなし、移植を行った。
【０５１９】
膵島含有アルギネートカプセルの移植に続いて、血中グルコース値を週３回モニターした。ランセットを使用して血液の小滴を尾静脈から集め、市販のグルコメーター（Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｏｎｅ、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を使用して試験した。２００ｍｇ／ｄＬ未満の非絶食時の血中グルコース値を有するマウスは、正常血糖であるとみなした。実験の時点に達するまでモニタリングを続け、その時点でマウスを安楽死させ、球を回収した。
【０５２０】
Ｄ．ヒトｃ−ペプチドのモニタリング
ヒト細胞含有アルギネートカプセルの移植に続いて、ヒトｃ−ペプチドレベルを３週間毎にモニターした。マウスを採血の前に１時間絶食させ、この時点で概ね１００〜１５０μＬの血液を後眼窩から血清収集チューブへと集めた。集めた血液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血清を取り出し、アッセイするまで２０℃にて貯蔵した。血清を、製造業者の指示によってＡｌｐｃｏヒトｃ−ペプチドキット（カタログ番号：８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ１０）を使用してヒトｃ−ペプチドについてアッセイした。
【０５２１】
Ｅ．細胞、組織および材料の回収
細胞、組織および材料の回収を、実施例８において上記のように行った。
【０５２２】
Ｆ．回収した材料球のイメージング
回収した材料の位相差イメージングを、実施例８に記載したプロトコルに従って行った。
【０５２３】
回収した材料の明視野イメージングのために、クレブス緩衝液を使用して試料を穏やかに洗浄し、Ｌｅｉｃａ実体顕微鏡を使用した明視野イメージングのために３５ｍｍのペトリ皿中に移した。
【０５２４】
Ｇ．共焦点免疫蛍光法
免疫蛍光イメージングを使用して、球に付着した免疫集団を決定した。材料をマウスから回収し、４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃にて一晩固定した。次いで、試料をＫＲＥＢＳ緩衝液で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００溶液を使用して３０分間透過処理し、それに続いて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を使用して１時間ブロックした。次に、球を、ＢＳＡ中のＤＡＰＩ（５００ｎＭ）、特異的マーカープローブ（１：２００希釈）からなる免疫染色カクテル溶液中で１時間インキュベートした。染色の後、球を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄し、５０％グリセロール溶液中に維持した。次いで、球をガラス底の皿に移し、５×および１０×対物レンズを備えたＬＳＭ７００ポイントスキャニング共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｊｅｎａ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して撮像した。得られた画像を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用してプレゼンテーションのために線形に調整した。
【０５２５】
Ｈ．プロテオミクス解析
１．還元、アルキル化およびトリプシン消化
回収した試料を、尿素細胞溶解緩衝液（８Ｍの尿素、Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）に懸濁させ、４℃にて一晩インキュベートした。等しい量のタンパク質を還元し（１０ｍＭのジチオトレイトール、５６℃、４５分間）、アルキル化した（５０ｍＭのヨードアセトアミド、室温、暗所中、１時間）。タンパク質をそれに続いて、１００ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ８．９中でトリプシン（シークエンシンググレード、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって１：５０の酵素／基質比で室温にて一晩消化させた。ギ酸を５％の最終濃度まで加えることによってトリプシン活性をクエンチした。ペプチドをＣ１８ＳｐｉｎＴｉｐｓ（Ｐｒｏｔｅａ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して脱塩し、次いで、凍結乾燥し、−８０℃にて貯蔵した。
【０５２６】
２．ＴＭＴ標識
ペプチドを、製造業者の指示によってＴＭＴ６ｐｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ）で標識した。凍結乾燥した試料を７０μＬのエタノールおよび３０μｌの５００ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム、ｐＨ８．５に溶解し、ＴＭＴ試薬を３０μｌの無水アセトニトリルに溶解した。ペプチドおよびＴＭＴ試薬を含有する溶液をボルテックスし、室温にて１時間インキュベートした。６種の異なる同位体ＴＭＴ試薬で標識した試料を合わせ、真空遠心分離機において完了するまで濃縮した。第１の分析のために、試料をＴＭＴ６ｐｌｅｘチャネルを使用して下記の通り標識した：１２６−ＲＺＡ、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復１；１２７−ＲＺＡ、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復２；１２８−ＳＬＧ２０、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復１；１２９−ＳＬＧ２０、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復２；１３０−ＳＬＧ２０、５００μｍ、２５０の生物学的反復１；および１３１−ＳＬＧ２０、５００μｍ、２５０の生物学的反復２。第２の分析のために、試料をＴＭＴ６ｐｌｅｘチャネルを使用して下記の通り標識した：１２６−ＲＺＡ、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復３；１２７−ＲＺＡ、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復４；１２８−ＳＬＧ２０、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復３；１２９−ＳＬＧ２０、１．５ｍｍ、２５０の生物学的反復４；１３０−ＳＬＧ２０、５００μｍ、２５０の生物学的反復３；および１３１−ＳＬＧ２０、５００μｍ、２５０の生物学的反復４。
【０５２７】
３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
次いで、ペプチドをプレカラム上にロードし、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用したナノエレクトロスプレーの前に、１４０分の勾配に亘り逆相ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅａｓｙ  ｎＬＣ１０００）によって分離した。質量分析計をデータ依存型モードで操作した。フルスキャンＭＳのためのパラメーターは、３５０〜２０００ｍ／ｚに亘り７０，０００の分解能、ＡＧＣ３ｅ６、および最大ＩＴ５０ｍｓであった。３２のＮＣＥおよび３０ｓの動的排除を伴って、各サイクルにおいて上位１０の前駆イオンについてフルＭＳスキャン、およびその後に続くＭＳ／ＭＳを行った。未加工の質量スペクトルデータファイル（．ｒａｗ）を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）およびＭａｓｃｏｔバージョン２．４．１（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して検索した。Ｍａｓｃｏｔ検索パラメーターは、以下の通りであった：前駆イオンについて１０ｐｐｍの質量許容差；０．８Ｄａｔｈｅフラグメントイオン質量許容差；２つの未切断のトリプシン；固定された修飾は、システインのカルバミドメチル化であり、可変の修飾は、メチオニン酸化であった。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用してＴＭＴ定量化を得て、製造業者の指示によって同位体的に補正した。
【０５２８】
Ｉ．Ｈ＆Ｅおよびマッソントリクローム染色のための組織学的処理
回収した材料を、４％パラホルムアルデヒドを使用して４℃にて一晩固定した。固定の後、アルギネート球または回収した組織試料を、７０％アルコールを使用して洗浄した。次いで、材料を４度のカルシウム−冷却Ｈｉｓｔｏｇｅｌ（ＶＷＲ、カタログ番号６０８７２−４８６）と混合した。モールドが硬化した後、ブロックを標準的な組織学的方法によってパラフィン包埋、薄片作製および染色のために処理した。
【０５２９】
Ｊ．組織学的免疫染色
パラフィン包埋し薄片作製した試料を、下記について染色した：ヒトインスリン（抗インスリン、カタログ番号ａｂ７８４２、ａｂｃａｍ）、ヒトｃ−ペプチド（Ｃ−ペプチド、カタログ番号ＧＮ−１Ｄ４、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、アイオワ大学）、ヒトグルカゴン（抗グルカゴン、カタログ番号ａｂ８２２７０、ａｂｃａｍ）。細胞核を、ＤＡＰＩ（カタログ番号Ｄ１３０６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。
【０５３０】
パラフィンスライドを、下記の溶媒中でのそれに続くインキュベーションによって脱パラフィン化した（キシレン、５分、２×、１００％ＥＴＯＨ、２分×２、９５％、２分×２、７０％、２分×２  蒸留水（d-water））。切断片を３０分間氷で冷却したＰＢＳ中でインキュベートし、次いで、３％ウマ血清でブロッキングして、３０分間ブロックすることによって抗原回収を行った。次いで、抗体混合物を下記の通り適用した：一次Ａ−グルカゴン１〜２００およびｃ−ペプチド１〜５００を一緒に混合する。一次Ｂ−ヒトインスリン１〜５００およびグルカゴン１〜２００を一緒に混合し、２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中で１０分×４洗浄する。二次Ａ−抗マウスＡＦ５９４、１〜５００および抗ラットＡＦ４８８、１〜５００を加える。二次Ｂ−抗モルモットＡＦ４８８、１〜５００を抗マウスＡＦ５９４、１〜５００と共に加え、３０分間インキュベートし、次いで、１０分、４×洗浄する。次いで、スライドをＤＡＰＩで染色し、ｐｒｏｌｏｎｇ  ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してカバーガラスを載せた。
【０５３１】
Ｋ．ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロット分析のために、タンパク質を材料から直接抽出した。タンパク質分析のために、氷上のプロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤単回使用カクテル、カタログ番号７８４３０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を有するＰｉｅｒｃｅ  ＲＩＰＡ緩衝液（カタログ番号８９９０１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に材料を浸漬し、次いで、超音波処理（３０秒間オン、３０秒間オフ、２回、７０％振幅）によって溶解することによって回収した材料を調製した。次いで、試料を４℃にて２時間の持続した撹拌に供した。次いで、ライセートを１２，０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離し、タンパク質含有上清を氷上に保持した新鮮なチューブ中に集めた。脂肪組織からの試料において、上清を移す前に、過剰な脂肪（上清上の上部層）を最初に除去した。各レーンについて、２０μｇのタンパク質（ＢＣＡアッセイによって定量化、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット、カタログ番号２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を９５℃にて５分間沸騰させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し（Ａｎｙ  ｋＤ１５−ｗｅｌｌ  ｃｏｍｂ  ｍｉｎｉ−ｇｅｌ、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号４５６−９０３６）、次いで、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６２−０２１３）上にブロットした。ブロットを、ローディング対照として、抗α平滑筋アクチン抗体（１：４００希釈、アルファ平滑筋アクチンに対するウサギポリクローナル；カタログ番号ａｂ５６９４、ＡｂＣａｍ）、抗ＰＤＸ１抗体（１：１０００希釈、膵臓および十二指腸のホメオボックス１に対するウサギポリクローナル；カタログ番号０６−１３７９、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、および抗β−アクチン抗体（１：４０００希釈、マウスにおいて産生されたモノクローナル抗β−アクチン抗体；カタログ番号Ａ１９７８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、それに続いて、ロバ抗ウサギ（１：１５，０００希釈、カタログ番号９２６−３２２１３、Ｌｉ−Ｃｏｒ）およびヤギ抗マウス（１：１５，０００希釈、カタログ番号９２６−６８０７０、Ｌｉ−Ｃｏｒ）フルオロフォアをコンジュゲートした二次抗体でプローブした。抗体−抗原複合体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、シリアルナンバーＯＤＹ−２３２９）を使用して７００ｎｍおよび８００ｎｍの波長にて可視化した。
【０５３２】
Ｌ．ＦＡＣＳ分析
新たに切除した組織の単一細胞懸濁液を、製造業者のプロトコルによってｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用して調製した。単一細胞懸濁液を受動ＰＥＢ解離緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で調製し、懸濁液を７０μｍのフィルター（カタログ番号２２３６３５４８、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に通過させた。このプロセスは、表面に接着した細胞の大部分（＞９０％）を除去した。次いで、全ての組織および材料の試料に由来する単一細胞集団を、５ｍｌの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（カタログ番号００−４３３３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５分間４℃にて赤血球溶解に供した。２０ｍｌの無菌の１×ＰＢＳを加えることによって反応を終了させた。残った細胞を３００〜４００ｇで４℃にて遠心分離し、抗体インキュベーションのために最小容量（約５０μｌ）のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ染色緩衝液（カタログ番号００−４２２２）に再懸濁させた。次いで、全ての試料を、細胞マーカーＣＤ６８（試料毎に１μｌ（０．５μｇ）；ＣＤ６８−Ａｌｅｘａ６４７、クローンＦＡ−１１、カタログ番号１１−５９３１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ−６Ｇ（Ｇｒ−１）（試料毎に１μｌ（０．５μｇ）；Ｌｙ−６Ｇ−Ａｌｅｘａ−６４７、クローンＲＢ６−８Ｃ５、カタログ番号１０８４１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（試料毎に１μｌ（０．２μｇ）；またはＣＤ１１ｂ−Ａｌｅｘａ−４８８、クローンＭ１／７０、カタログ番号１０１２１７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（試料毎に１μｌ（０．２μｇ）；ＣＤ１９−Ａｌｅｘａ−６４７、クローンＨＩＢ１９、カタログ番号３０２２２２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、またはＩｇＭ（試料毎に１μｌ（０．２μｇ）；ＩｇＭ−ＦＩＴＣ、クローンＲＭＭ−１、カタログ番号４０６５０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８＋（試料毎に１μｌ（０．２μｇ）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に対して特異的な蛍光でタグ付けしたモノクローナル抗体の２つと共に、４℃にて暗所中で２５分間共染色した。次いで、２ｍｌのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅフローサイトメトリー染色緩衝液（カタログ番号００−４２２２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、試料を４℃にて４００〜５００ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引によって除去し、この洗浄ステップを染色緩衝液でさらに２回繰り返した。３回目の洗浄に続いて、各試料を５００μｌのフローサイトメトリー染色緩衝液に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カタログ番号３４２９７５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、来たるべきＦＡＣＳ分析のために４０μｍのフィルター（カタログ番号２２３６３５４７、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通過させた。適当なバックグラウンドおよびレーザー強度設定のために、未染色の単一抗体、およびＩｇＧ（Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−６４７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄで標識）対照についてまた実行した。
【０５３３】
Ｍ．生体イメージング
生体イメージングのために、０．５ｍｍおよび１．５ｍｍサイズのヒト細胞含有ヒドロゲルをＱｄｏｔ６０５（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で作製し、上記のようにＢ６．１２９Ｓ６−Ｃｃｒ６ｔｍ１（ＥＧＦＰ）Ｉｒｗ／Ｊマウスに外科的に埋め込んだ。
【０５３４】
埋込み後の１４日以降に、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、小さな切開を当初の手術の部位において行い、ビーズを露出させた。マウスを倒立顕微鏡上に置き、８６０ｎｍの励起波長でＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶＢ−１０００ＭＰ多光子顕微鏡上で２５×、Ｎ．Ａ．１．０５対物レンズを使用して撮像した。２００μｍのＺ−スタック（１０μｍのステップ）を、画像に依存して、２０〜４５分の時系列について２分の間隔で取得した。マウスを持続したイソフルラン麻酔下に保持し、イメージングセッションに亘ってモニターした。得られた画像を、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ３Ｄ  Ｉｍａｇｅ分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して分析した。
【０５３５】
Ｎ．ｉｎ  ｖｉｖｏグルコース負荷（ＧＳＩＳ）
【０５３６】
マウスを、グルコース負荷の前に一晩（１２時間）絶食させた。負荷の日に、空腹時血中グルコース値を測定し、次いで、マウスの尾静脈にグルコースの３０ｇ／Ｌ溶液を２００ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。次いで、血中グルコースを１５分毎に２時間モニターした。
【０５３７】
Ｏ．膵臓の取出しおよびインスリンの定量化
【０５３８】
１７４日後、ＴＭＴＤ−アルギネート中にカプセル化したヒト細胞で処置したマウスを安楽死させ、各マウスの膵臓を取り出した。各膵臓を秤量し、次いで、ステンレス鋼ボールを有するバイアル中に入れ、その間試料を液体窒素中で冷凍して維持した。３ｍｌの容量の酸エタノール（acid ethanol）を各バイアルに加え、組織が粉砕されるまで試料をＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ上で１０００ｒｐｍにて１分刻みでホモジナイズした。試料バイアルをアルミニウムブロックによって保持し、アルミニウムブロックは各サイクルの間に液体窒素中に置おいて、これを冷たく保つことができる。次いで、バイアルを２４００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離した。上清（今やインスリンを含有する）を除去して貯蔵した。その一方、バイアルをさらなる酸エタノールで充填し、ボルテックスする。バイアルを、４℃にて振盪しながら一晩静置した。再び、バイアルを２４００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離し、上清を集め、先に貯蔵した上清に加えた。酸エタノールをバイアルに再び加え、ボルテックスし、一晩インキュベートし、遠心分離し、上清を集めて、合わせた。上清溶液をＧｅｎｅｖａｃ  ＥＺ−２ｐｌｕｓを使用して蒸発させた。試料を、使用するまで−８０℃にて貯蔵した。インスリン定量化の前に、試料をＰＢＳに再懸濁し、製造業者の指示によってマウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏカタログ番号：８０−ＩＮＳＭＳ−Ｅ１０）を使用して定量化した。この同じ手順を、健康な野性型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳＴＺで処置したＣ５７ＢＬ／６マウスについて繰り返した。
【０５３９】
Ｐ．統計解析
【０５４０】
データは平均±ＳＥＭとして表し、時点毎および処置群毎にＮ＝５匹のマウスである。ラット研究のために、処置毎にＮ＝３匹である。これらの試料サイズは、以前の文献に基づいて選択した。予期しない疾病または病的状態の場合を除いて、全ての動物を分析に含めた。動物コホートをランダムに選択した。調査者は遂行した実験に対してブラインドでなかった。ＦＡＣＳデータを、他に示さない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５において実行するように、対応のない両側ｔ検定、またはボンフェローニ多重比較補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡによって統計的有意性について分析した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．００１、および＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
示した定量化したデータは、群の平均値±ＳＥＭである。
【０５４１】
ＩＩ．結果
【０５４２】
Ａ．ＴＭＴＤアルギネートは、カプセル化されたヒト細胞に対する免疫応答を軽減する。
【０５４３】
ミクロスフィアのサイズは、埋め込まれたアルギネートに対する免疫応答に対して抵抗することに対して有益な影響を有することができ、１．５ｍｍの直径およびそれ超の球およびＴＭＴＤアルギネートは、げっ歯類およびヒトではない霊長類の両方において線維化応答を軽減することが最近示されてきた（Veisehら、印刷中およびVegasら、提出済み）。ＴＭＴＤの化学構造を図１３に示す。
【０５４４】
これらの球に対する免疫応答を評価するために、カプセル化されたヒト細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＰに埋め込み、１４日後に回収した。球の外側と会合している細胞を単離し、ＦＡＣＳによって分析した（図１４および１５）。ＳＬＧ２０対照（配合物１、２）と比較して、統計的に有意なより低いレベルのマクロファージ、好中球、Ｂ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＴＭＴＤアルギネートでカプセル化されたヒト細胞（配合物３）について測定された。ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて８０〜９０日後に回収した埋込体によって、ＴＭＴＤアルギネート球が非常により低いレベルの線維性沈着を有したことが明らかにされた。細胞の沈着（ＤＡＰＩ、Ｆ−アクチン）および筋線維芽細胞（α−ＳＭＡ）についてのこれらの回収した球の免疫蛍光染色は、ＴＭＴＤアルギネート球上で有意により低いレベルの細胞の沈着を示した。これらのタンパク質抽出物のプロテオミクス解析は１８のコラーゲンアイソフォームを検出し、１８の検出したコラーゲンタンパク質のうち１０は、ＴＭＴＤアルギネート移植体において有意に低減し、これらの材料が線維化応答を軽減することができることをさらに示す（図１６）。
【０５４５】
回収した埋込体から抽出したα−ＳＭＡタンパク質のウエスタンブロット定量化は、ＴＭＴＤ球上のより低い線維症レベルと一致している（図１０）。
【０５４６】
最後に、これらの結果と一致して、ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６マウスから９０日超後に回収したＴＭＴＤカプセル化されたヒトクラスターの組織学的処理および免疫染色は、成熟ヒト細胞マーカーヒトインスリンおよびｃ−ペプチドの陽性共局在化染色を有する細胞クラスターを明らかにした。共局在化染色が、ヒトｃ−ペプチドおよびグルカゴンの間またはヒトインスリンおよびグルカゴンの間で最小限に観察されたか、もしくは観察されなかったが、このことは、研究全体を通して、ヒト細胞が自身の分化状態を保持していることと一致する。
【０５４７】
ＴＭＴＤアルギネート球がカプセル化されたヒト細胞の免疫隔離を実現する能力を次に特性決定した。球のフリーズフラクチャー低温走査型電子顕微鏡法（低温−ＳＥＭ）は、サイズがサブミクロンから１〜３μｍの範囲の孔径を有する不均質な細孔構造を示し、これは細胞および大きなタンパク質による浸透を防止することができる範囲である。Ｂ６．１２９Ｓ６−Ｃｃｒ６ｔｍ１（ＥＧＦＰ）Ｉｒｗ／Ｊマウス（Ｔ、Ｂ、および樹状細胞は、ＥＧＦＰを発現している）における１４日後の移植された球の生体イメージングは、ヒト細胞を含有する球の領域にＣＣＲ６＋細胞が局在化しているが、これらの細胞が接触して細胞毒性事象を開始させることができないことを示した。
【０５４８】
Ｂ．トリアゾール−チオモルホリンジオキシド（ＴＭＴＤ）アルギネートによるヒト細胞のカプセル化は、ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊにおいて血糖補正を可能とする。
【０５４９】
血糖補正を実現するヒト細胞のマイクロカプセル化の潜在性を調査するために、細胞を３つの異なる配合物において使用した：（１）膵島カプセル化のために従来使用される５００μｍのアルギネートマイクロカプセル（Limら、Science、２１０巻：９０８〜９１０頁（１９８０年）；Calafioreら、Diabetes Care、２９巻：１３７〜１３８頁（２００６年））、（２）１．５ｍｍのアルギネート球（Veisehら、印刷中）、および（３）１．５ｍｍのＴＭＴＤアルギネート球。これらの配合物のそれぞれを、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに３つの異なる用量のヒト細胞クラスターで移植し、正常血糖を回復するこれらの能力について評価した。裸のカプセル化されていないヒト細胞は、埋込み部位に関わらず、この糖尿病モデルにおいて血糖補正を実現することができない。
【０５５０】
５００μｍのアルギン酸バリウムマイクロカプセル中へのカプセル化は、膵島移植のための一般に実行されている配合である（Limら、Science、２１０巻、９０８〜９１０頁（１９８０年）；Calafioreら、Diabetes Care、２９巻：１３７〜１３８頁（２００６年））。５００μｍのマイクロカプセル中にカプセル化したヒト細胞を移植したマウスは、最も低いレベルの血糖コントロールを示したが、最も高い用量の移植されたクラスターのみが正常血糖を１５日間回復することができた。１．５ｍｍのアルギネート球中にカプセル化したヒト細胞は、５００μｍのマイクロカプセル配合物より良好に機能し、正常血糖は２つのより高い用量について２０〜３０日間維持されたが、これはラット膵島を使用して得た従前の結果と一致する（Veisehら、印刷中）。１．５ｍｍのＴＭＴＤアルギネート球について試験した３種の用量全てで、持続性の正常血糖が７０日に亘り達成された。ロバストなヒトｃ−ペプチドレベルを、この研究の過程の間の２１日、４３日、および６３日に測定したが、これはヒト細胞機能と一致し、ＴＭＴＤアルギネート球は、最も高いレベルのヒトｃ−ペプチドを示した。
【０５５１】
Ｃ．カプセル化されたヒト細胞は、ＳＴＺ−Ｃ５７ＢＬ／６Ｊにおいて持続性の正常血糖およびグルコース応答性を支持する。
【０５５２】
ＴＭＴＤアルギネートでカプセル化されたヒト細胞移植体が正常血糖を持続させる能力を評価するために、移植された糖尿病マウスのコホートを６カ月間追跡した。移植されたマウスは、６カ月の期間に亘り血糖補正を首尾よく維持し、５匹は同様の期間に亘り追跡した野性型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血中グルコース値に密接にマッチした。さらに、１００ｐｍｏｌ／Ｌを超えたロバストなヒトｃ−ペプチドレベルを、研究を通して複数のポイントにおいて記録した。これらのマウスにおいて移植の１５０日後にグルコース負荷をまた行い、カプセル化されたヒト細胞は、野性型マウスに匹敵するほど正常血糖を回復した。各コホートについての宿主膵臓インスリン値をまた分析して、成功したＳＴＺ処置、および内在性膵臓細胞再生の欠如を確認した。６カ月後に回収したヒト細胞埋込体は、線維性過成長の徴候を示さず、カプセル上にコラーゲン性および細胞の沈着は殆ど明らかでなかった。３カ月後に回収した球は最小レベルの線維症を示したため、ＴＭＴＤアルギネートが、免疫認識／活性化動態を変化させることによって免疫応答を軽減することをこれは示す。
【０５５３】
結果は、カプセル化されたヒト細胞が、免疫抑制を有さない免疫適格糖尿病動物においてグルコース応答性の長期間の血糖補正（１７０日に亘る）を達成することができることを示す。この結果は、ヒト細胞埋込体に対する免疫応答を軽減し、埋込み組織の壊死をもたらす線維性沈着を効果的に遅延させる新規なＴＭＴＤアルギネート配合物を実現することによって達成された。この配合物は、これらのヒト細胞が免疫適格げっ歯類レシピエントにおいて顕在化する異種刺激にも関わらず、長期間の血糖補正を可能とする十分な免疫保護を提供した。これらの結果は、開示されている修飾されたアルギネート中にカプセル化されているヒト細胞が、１型糖尿病を患っている患者についてインスリン非依存を実現することができるという予想を支持する。これらの結果は、開示されている修飾されたアルギネート中にカプセル化されているヒト細胞が、カプセル化された細胞によって産生された産物を、患者に長期間提供することができるという予想を支持する。
【図１】
2020023582.tif 000136
【図２】
2020023582.tif 000137
【図３】
2020023582.tif 000138
【図４】
2020023582.tif 000139
【図５】
2020023582.tif 000140
【図６】
2020023582.tif 000141
【図７】
2020023582.tif 000142
【図８】
2020023582.tif 000143
【図９−１】
2020023582.tif 000144
【図９−２】
2020023582.tif 000145
【図１０】
2020023582.tif 000146
【図１１】
2020023582.tif 000147
【図１２】
2020023582.tif 000148
【図１３】
2020023582.tif 000149
【図１４】
2020023582.tif 000150
【図１５】
2020023582.tif 000151
【図１６】
2020023582.tif 000152
【外国語明細書】
2020023582000001.pdf