(57)【要約】      （修正有）【課題】全身性の病的状態、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかの予測に有用な方法及びキットを提供する。【解決手段】病的細胞の指標となる細胞性発現プロファイルの存在を検出する方法であって、生物学的試料中の細胞におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量（タンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又は活性レベル）を測定し、正常細胞における発現量と比較して上昇している場合、病的細胞の存在を意味する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における病的細胞の指標となる細胞性発現プロファイルの存在を検出する方法であって、
該被験者から生物学的試料を採取する工程、及び
該試料中の細胞におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を決定する工程を有し、
細胞におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量が正常細胞における発現量に比較して上昇している場合、病的細胞の存在を意味することを特徴とする方法。
【請求項２】
該生物学的試料が、骨髄、臍帯血、末梢血、組織検体、腹水、胸水又は体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの該発現をＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又は活性レベルを評価することにより決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該細胞が骨髄由来細胞、間葉幹／前駆細胞、造血幹／前駆細胞、癌幹細胞、線維芽細胞、マクロファージ、線維母細胞、筋線維芽細胞、間葉細胞などからなる群から選択される幹／前駆細胞又はその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
被験者が全身的に病的であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかを予測する方法であって、
該被験者から生物学的試料を採取する工程、及び
該試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を決定する工程を有し、
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量が正常細胞に比較して上昇している場合、被験者が全身的に病的であること、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有することを意味することを特徴とする方法。
【請求項６】
該生物学的試料が、骨髄、臍帯血、末梢血、組織検体、腹水、胸水又は体液である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの該発現をＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又は活性レベルを評価することにより決定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該細胞が骨髄由来細胞、間葉幹／前駆細胞、造血幹／前駆細胞、線維芽細胞、マクロファージ、線維母細胞、筋線維芽細胞などからなる群から選択される幹／前駆細胞又はその誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
生物学的試料中の病的細胞を同定又は検出する診断キットであって、1つ又は複数のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ試薬と、任意である使用説明書を有することを特徴とする診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病的細胞の同定・検出に有用な方法及びキットに関する。更に、本発明は、プロリン指向性プロテインキナーゼＦＡ／グリコーゲンシンターゼキナーゼ３α（ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ：ｐｒｏｌｉｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＦＡ／ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ａｌｐｈａ）を診断用指標として使用して、被験者が全身性の病的状態であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかの予測に有用な方法及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄は、損傷を受けた組織における造血及び骨格恒常性を確保するためにリクルートされて存在する、造血幹／前駆細胞及び間葉幹／前駆細胞両者及びその誘導体の主たる供給源であることは広く認められている。骨髄が創傷治癒から末期線維症及び腫瘍形成まで、全身の組織恒常性に貢献していることは今や明らかである。骨髄幹及び前駆細胞並びにそれらの誘導体である間質及び炎症細胞などにおける内因性欠陥は、異常な創傷治癒、慢性炎症並びに全身性線維症、感染症、閉塞症、塞栓及び多臓器不全などの全身性疾患及び症候群の主たる原因である可能性を有する。しかし、正常な創傷治癒、全身性潰瘍などの非治癒性損傷及び全身性線維症や腫瘍形成などの著しい過剰治癒性創傷における骨髄由来細胞（ＢＭＤＣｓ：ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）の物議を醸している、矛盾した役割は、現在の骨髄関連全身性疾患、症候群及び移植問題を解決するためには大きな困難をもたらす（Ｂｉｎｇｌｅら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００２、１９６：２５４−２６５；Ｄｅ Ｗｅｖｅｒ及びＭａｒｅｅｌ、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００３、２００：４２９−４４７；Ｄｕｎｓｍｏｒｅ及びＳｈａｐｉｒｏ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００４、１１３：１８０−１８２；Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓ及びＰｏｌｌａｒｄ、Ｃｅｌｌ、２００６、１２４：２６３−２６６；Ｙｉｎ及びＬｉ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００６、１１６：１１９５−１２０１；Ｋａｒｎｏｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４９：５５７−５６３；Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８、１８０：２０１１−２０１７、Ｋｉｓｓｅｌｅｖａ及びＢｒｅｎｎｅｒ、Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ、２００８、２３３：１０９−１２２；Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、２００８、１８８：１７８−１８８；Ｓｃｈａｆｅｒ及びＷｅｒｎｅｒ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００８、９：６２８−６３８；Ｖａｌｔｉｅｒｉ及びＳｏｒｒｅｎｔｉｎｏ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００８、２１７：２９６−３００；Ｗｙｎｎ、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００８、２１４：１９９−２１０；Ｍａｓｈｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００９、６９：１２５５−１２５８）。
【０００３】
プロリン指向性プロテインキナーゼＦＡ（ＰＤＰＫ  ＦＡ）／グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ａ（ＧＳＫ−３ａ）は、当初、特定のタンパク質ホスファターゼ活性化因子Ａとして同定された（Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７６８−１１７７４；Ｙａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７５９−１１７６７；Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、ＥＭＢＯ Ｊ、１９９０、９：２４３１−２４３８）。本研究所では、更に、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを抗アポトーシス、腫瘍形成及び様々な種類の癌細胞の浸潤や化学療法剤耐性の発達にとって不可欠である多基質／多機能ＰＤＰＫとして特徴付けた（Ｈｓｕら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８２：１４８０−１４８４；Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８９：１００４−１１０１；Ｙａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０００、６：１０２４−１０３０；Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９２：１７５３−１７５８；Ｈｓｕら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９１：６５０−６５３；Ｃｈｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：１８４０−１８４７；Ｈｓｕｅｈら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：７７５−７８３；Ｆｕ及びＹａｎｇ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４、２４：１４８９−１４９４）。しかし、特に骨髄由来細胞におけるこのシグナリング分子の全身性作用の多くは未解明であり、確立される必要がある。
【０００４】
治癒が難しい疾患の病因とは無関係に、細胞における単一の特有な分子の発現と被験者の健康状態との間に予測関係が存在すれば、好都合である。被験者における治癒が困難な疾患の発症リスクの決定に普遍的に適用可能な、細胞内の分子発現の開発は未だ成し遂げられていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｎｇｌｅら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００２、１９６：２５４−２６５
【非特許文献２】Ｄｅ Ｗｅｖｅｒ及びＭａｒｅｅｌ、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００３、２００：４２９−４４７
【非特許文献３】Ｄｕｎｓｍｏｒｅ及びＳｈａｐｉｒｏ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００４、１１３：１８０−１８２
【非特許文献４】Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓ及びＰｏｌｌａｒｄ、Ｃｅｌｌ、２００６、１２４：２６３−２６６
【非特許文献５】Ｙｉｎ及びＬｉ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００６、１１６：１１９５−１２０１
【非特許文献６】Ｋａｒｎｏｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４９：５５７−５６３
【非特許文献７】Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８、１８０：２０１１−２０１７
【非特許文献８】Ｋｉｓｓｅｌｅｖａ及びＢｒｅｎｎｅｒ、Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ、２００８、２３３：１０９−１２２
【非特許文献９】Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、２００８、１８８：１７８−１８８
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｆｅｒ及びＷｅｒｎｅｒ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００８、９：６２８−６３８
【非特許文献１１】Ｖａｌｔｉｅｒｉ及びＳｏｒｒｅｎｔｉｎｏ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００８、２１７：２９６−３００
【非特許文献１２】Ｗｙｎｎ、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２００８、２１４：１９９−２１０
【非特許文献１３】Ｍａｓｈｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００９、６９：１２５５−１２５８
【非特許文献１４】Ｖａｎｄｅｎｈｅｅｄｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７６８−１１７７４
【非特許文献１５】Ｙａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８０、２５５：１１７５９−１１７６７
【非特許文献１６】Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、ＥＭＢＯ Ｊ、１９９０、９：２４３１−２４３８
【非特許文献１７】Ｈｓｕら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８２：１４８０−１４８４
【非特許文献１８】Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２０００、８９：１００４−１１０１
【非特許文献１９】Ｙａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０００、６：１０２４−１０３０
【非特許文献２０】Ｈｓｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９２：１７５３−１７５８
【非特許文献２１】Ｈｓｕら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９１：６５０−６５３
【非特許文献２２】Ｃｈｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：１８４０−１８４７
【非特許文献２３】Ｈｓｕｅｈら、Ｃａｎｃｅｒ、２００２、９５：７７５−７８３
【非特許文献２４】Ｆｕ及びＹａｎｇ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４、２４：１４８９−１４９４
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に規定される病的細胞は、骨髄の内因的欠陥に起因する、造血、止血、恒常性及び全身性線維症に関連する免疫系の全身性脱制御や平衡失調、免疫抑制、感染症、閉塞症、塞栓症並びに多臓器不全の非常に早期の段階での検出に有用な、普遍的に適用可能な予測因子である。より詳細には、病的細胞は、その病因には無関係に、被験者が全身的に病的な状態であるか、治癒が困難な全身性疾患を発症するリスクを有するかを決定するための信頼できる予測因子である。
【０００７】
このように、１つの態様において、被験者における、病的細胞を示唆する細胞発現プロファイル、好ましくは骨髄由来細胞の存在を検出する方法を提供する。該方法は、該被験者から生物学的試料を採取し、該試料中の細胞におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を決定することを有し、被験者の細胞におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量の増加は、病的細胞の存在を示す。ある実施形態においては、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに対する特異抗体を使用する免疫測定法などによりＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質量を測定して決定する。他の態様では、活性、タンパク質、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ量を評価して、該発現を決定できる。生物学的試料としては、骨髄、臍帯血、末梢血、組織検体、腹水、胸水又は体液を使用できる。
【０００８】
１つの態様において、生物学的試料中の病的細胞を同定することは、被験者が全身性の病的状態であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかの予測に有用である。
【０００９】
他の態様において、生物学的試料中の病的細胞の存在を検出する診断キットを提供する。該キットは、該試料中のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を検出するための少なくとも１つの試薬を有し、病的細胞の存在を評価するための印刷指示書と共に容器に包装されている。その他の検出試薬が含まれていても良い。
【００１０】
また、別の態様においては、被験者が全身性の病的状態であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかを予測する方法が提供される。該方法は、該被験者から生物学的試料を採取し、該試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を決定することを有する。被験者におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量が正常細胞に比較して増加している場合は、被験者が全身性の病的状態であること、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有することを示す。ある実施形態においては、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに対する特異抗体を使用する免疫測定法などによりＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質量を測定して決定する。他の態様では、活性、タンパク質、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ量を評価して、該発現を決定できる。生物学的試料としては、骨髄、臍帯血、末梢血、組織検体、腹水、胸水又は体液を使用できる。
【００１１】
必要であれば、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量の多い病的細胞を検出するために、特異的磁性ビーズ又は基本的にはＭｏｉｏｌｉら（ＰＬｏＳ ＯＮＥ、３：ｅ３９２２、２００８）により報告されているようなフローセルソーターにより細胞を単離することができる。
【００１２】
本発明の上記及び他の目的並びに特徴は、添付の図面及び実施例と併せて、以下の詳細な説明を読むことにより更に十分に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】進行性疾患を有する白血病患者の骨髄における、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋及びＣＤ３４−幹／前駆細胞及びＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中程度の発現（２＋〜３＋）を示すその誘導体をほとんど含まない、共免疫組織化学的染色による、骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ：ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現パターンを示す。（Ａ）はＣＤ３４との共染色の陽性パターンを示す。
【図１Ｂ】進行性疾患を有する白血病患者の骨髄における、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋及びＣＤ３４−幹／前駆細胞及びＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中程度の発現（２＋〜３＋）を示すその誘導体をほとんど含まない、共免疫組織化学的染色による、骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ：ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現パターンを示す。（Ｂ）はＣＤ３４との共染色の陰性パターンを示す。
【図２Ａ】リクルートされたＢＭＤＣにおける、胸部、胆管、結腸直腸、子宮頚部、食道、胃、肝、肺、口腔、卵巣、膵、前立腺及び腎の間質組織内でのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現の有無に対する、表１に示す非常に初期のＩ期腫瘍を有する様々なタイプの患者のカプラン・マイヤー無病生存率（ＤＦＳ）及び全生存率（ＯＳ）曲線を示す。Ａは無病生存率（ＤＦＳ）を示す。
【図２Ｂ】リクルートされたＢＭＤＣにおける、胸部、胆管、結腸直腸、子宮頚部、食道、胃、肝、肺、口腔、卵巣、膵、前立腺及び腎の間質組織内でのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現の有無に対する、表１に示す非常に初期のＩ期腫瘍を有する様々なタイプの患者のカプラン・マイヤー無病生存率（ＤＦＳ）及び全生存率（ＯＳ）曲線を示す。Ｂは全生存率（ＯＳ）を示す。
【図３Ａ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。ＡはＣＤ３４との共染色の陽性パターンを示す。
【図３Ｂ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。ＢはＣＤ３４との共染色の陰性パターンを示す。
【図３Ｃ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。Ｃはビメンチンとの共染色の陽性パターンを示す。
【図３Ｄ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。Ｄはビメンチンとの共染色の陰性パタンーンを示す。
【図３Ｅ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。ＥはＣＤ６８との共染色の陽性パターンを示す。
【図３Ｆ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。Ｆを示す。
【図３Ｇ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。Ｇはａ−ＳＭＡとの共染色の陽性パターンを示す。
【図３Ｈ】ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）に関連するＣＤ３４＋／ビメンチンー、ＣＤ３４＋／ビメンチン＋及びＣＤ３４−／ビメンチン＋細胞をほとんど含まず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）に関連するそれらの誘導体、ビメンチン＋線維芽細胞／間葉細胞、ＣＤ６８＋マクロファージ及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞を比較的大量に含む、共免疫組織化学的染色による、Ｉ期腫瘍間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの代表的な異常発現パターンを示す。Ｈはａ−ＳＭＡとの共染色の陰性パターンを示す。
【図４Ａ】癌多発家系又は反復炎症を示す小児の末梢血中において、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現に関連するＣＤ３４＋線維芽細胞様細胞の共免疫組織化学的染色による、極めて初期の病的シグナルとしてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを樹立している。Ａは陽性パターンである。
【図４Ｂ】癌多発家系又は反復炎症を示す小児の末梢血中において、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現に関連するＣＤ３４＋線維芽細胞様細胞の共免疫組織化学的染色による、極めて初期の病的シグナルとしてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを樹立している。Ｂは陰性パターンである。
【図５】川崎症候群に特徴的な免疫系異常を示す全身性の病的状態にある小児の臍帯血中において、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現に関連するＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞の共免疫組織化学的染色による、極めて初期の病的シグナルとしてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを更に樹立している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
開示を明確にするため、本発明の詳細な説明を以下のように細別して行うが、それにより制限されるものではない。
【００１５】
Ａ．定義
別に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味に用いられる。本明細書中で参照される全ての特許、出願、公開出願及びその他の刊行物並びにジェンバンク登録番号は、その全体が参照によって援用される。この項で説明される定義が、参照により本明細書中に組み込まれた特許、出願、公開出願及びその他の刊行物に説明されている定義に反しているか又は一致しない場合には、この項で説明された定義が、参照により本明細書中に組み込まれた刊行物等における定義より優先される。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ」とは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３αとしても知られている、多塩基／多機能プロリン指向性プロテインキナーゼＦＡを指す（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、ＥＭＢＯ Ｊ、１９９０、９：２４３１−２４３８；Ｙａｎｇ、Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、２００４、４：５９１−５９６）。このタンパク質に対するジェンバンク登録番号はＡＡｄ１１９８６及びＡＡＨ２７９８４である。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「生物学的試料」とは、生物学的起源であるあらゆる試料を指し、骨髄、血液、組織検体、腹水、胸水及び体液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、必要な可変領域配列を有し、抗原エピトープに特異的に結合する単離又は組換え結合物質を指す。従って、抗体は所望の生物学的活性を有する限り、すなわち、目的の抗原に特異的に結合する限り、どのような抗体型であっても又はそのフラグメントであってもよい。このように、最も広義の意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性、例えば、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに特異的に結合する限り、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ディアボディ、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）及び、これらに限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ２などの抗体フラグメントを含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「被験者」とは、任意の生体を指し、好ましくは哺乳動物である。被験者の例としては、ヒトが挙げられるが、これに限定されない。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「病的細胞」とは、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現に関連する細胞、好ましくはＢＭＤＣを指す。
【００２２】
別に指示されない限り、本明細書中で使用される全ての用語は、本技術分野及び本発明の実施において使用されるもの、当業者の知識内である生化学及び臨床病理の従来の技術におけるものと同じ意味を有する。
【００２３】
Ｂ．病的細胞の検出方法及びキット
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現に関連する細胞、好ましくはＢＭＤＣである病的細胞は、被験者が全身性の病的状態であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかを特定するための手段を提供する。１つの態様において、生物学的試料中の病的細胞の同定は、全身性疾患若しくは症候群の発症の予測に有用である。
【００２４】
上記のように、１つの態様において、本明細書では、病的細胞を示す被験者における細胞発現プロファイルの存在を検出する方法を提供する。該方法は、該被験者から生物学的試料を採取し、該試料におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を決定することを有する。被験者の細胞中におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現量の増加は、病的細胞の存在を示している。ある実施形態においては、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに対する特異抗体を使用する免疫測定法などによりＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質量を測定して決定する。他の態様では、活性、タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡ量を評価して、該発現を決定できる。生物学的試料としては、骨髄、臍帯血、末梢血、組織検体、腹水、胸水又は体液を使用できる。
【００２５】
他の態様において、本明細書では、生物学的試料中の病的細胞の存在を検出するキットを提供する。該キットは、該試料中のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの発現を検出するための少なくとも１つの試薬を有し、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの相対的量を評価するための印刷指示書と共に容器に包装されている。
【００２６】
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ発現の検出はいずれの適当な方法を用いてもよい。発現は、生物学的試料からの細胞における活性、タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡ量を評価して決定することができる。例えば、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに特異的な抗体を使用する免疫学的測定法を使用することができる。適当な方法として、特異物質に対する免疫組織化学的分析、免疫細胞化学的分析、フローサイトメトリー分析、ウェスターンブロット分析、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ及びリン酸化アッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。免疫組織化学的染色法では、細胞試料を、通常、脱水固定により調製し、結合した遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させる。標識剤は、通常、視覚的に検出可能な、酵素標識、蛍光標識、発光標識などである。
【００２７】
１つの実施形態によれば、組織検体を被験者から採取し、該試料を包埋後、例えば、３〜５μｍに薄切し、従来の標本化技術に従って固定、標本化、乾燥する。固定化剤はホルマリンを有してよい。標本を作製するための包埋剤は、例えば、パラフィンを有してよい。試料は、この状態で保存してよい。脱パラフィン及び脱水の後、試料をＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに特異的な抗体を有する免疫試薬と接触させる。抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体を有してよく、また、完全抗体あるいはＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質に特異的に結合することができるフラグメントを有してもよい。好適なポリクローナル抗血清又はその他の抗体は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａタンパク質又はその好適なフラグメントで宿主動物を免疫して作製し、本技術分野の当業者に従来公知の方法に従って抗血清を採取、精製してよい。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａと特異的に反応するモノクローナル又はポリクローナル抗体、好ましくは、モノクローナル抗体は、本技術分野でよく知られている方法により作製してよい。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。更に、組換え抗体を本技術分野で公知の方法、例えば、本法に限定されないが、米国特許第４８１６５６７号に記載の方法により作製しても、市販のものを使用してもよい。モノクローナル抗体は、１０８Ｍ−１の結合親和性、好ましくは１０９〜１０１０Ｍ１又はそれ以上の結合親和性を有するものが好ましい。
【００２８】
抗体は、直接的又は間接的に適当な検出可能な標識を担持する。あるいは、検出可能な標識は、例えば、第１抗体に結合する抗ウサギＩｇＧヤギ抗体などの第２抗体に結合させてもよい。多くの場合、ポリペプチドや抗体は、検出可能な信号を供給する物質に共有又は非共有的に結合して標識される。好適な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
生物学的試料は任意の適当な方法により被験者から採取できる。生物学的試料は、末梢血、臍帯血、骨髄、組織検体、腹水、胸水又は体液でよい。
【００３０】
被験者が全身性の病的状態であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかを決定するキットは、家庭用の大きさの少なくとも１つの容器と、本明細書で定義されたような細胞でのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ発現の検出に有用な少なくとも１つの試薬と、生物学的試料中の細胞に一つまたは複数の病的細胞が含有されているかどうかを評価するための印刷指示書とを有する。本明細書中で使用される場合、「試薬」とは、本明細書で提供された方法を実施するのに有用な化合物、組成物又は生物学的試薬（すなわち、試料、一定量又は「用量」の細胞、抗体など）を意味し、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａに対する抗体、分析及び処理用の細胞及び／又は膜を単離及び調製するのに有用な緩衝液及び担体、飽和及び競合結合アッセイを実施するのに有用な緩衝液及び担体、放射性及び非放射性標識化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。印刷指示書は試験結果を病的細胞の表現型に関連付けるための指示書を含んでもよい。
【００３１】
Ｃ．実施形態
具体的な実施形態において別に指示されない限り、全ての免疫組織化学的分析、免疫表現型分析、免疫細胞化学的分析及び統計的分析は下記の方法に従う。
【００３２】
抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ特異抗体の産生、同定及び特性解析。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａのカルボキシル末端領域の４７１位から４８３位までのアミノ酸配列に対応するペプチドＱＳＴＤＡＴＰＴＬＴＮＳＳをペプチド合成機（９０５０型、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）により合成した。架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用するＲｅｉｃｈｌｉｎ（１９８０）に記載されている手順に従い、牛血清アルブミンへのペプチドの結合を促進するために、システイン残基をＮＨ２末端に添加した。アフィニティ精製を行った抗体産物はＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａのＣ−末端ペプチドである４７１−４８３アミノ酸によりブロックされることが認められ、この抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ特異抗体の免疫特異性が実証された。
【００３３】
免疫組織化学的分析。腫瘍細胞が最大の大きさを示した腫瘍を有するホルマリン固定パラフィン包埋組織の組織切片（５μｍ）をキシレン中で脱蝋し、段階的濃度のエタノール中で再水和した。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素でブロックした後、牛血清アルブミンで５分間ブロッキングを行った。次いで、スライドをｐＨ７．４の０．０５Ｍトリス緩衝液で希釈した抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ抗体（２μｍ／ｍＬ）と４℃で１６時間インキュベートした後、超エンハンサー（Ｓｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］、非ビオチン検出システム、［ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ、ＣＡ］）と室温で２０分、続いて高分子‐ＨＲＰ（Ｓｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］）標識剤と更に３０分間インキュベートした。最後に、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）で免疫染色した。酵素反応を終了させた後、スライドをＤＳ−エンハンサー（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ）中、室温で５分間インキュベートして２つの染色系の相互作用を防止した。次いで、スライドをＣＤ３４、ビメンチン、ＣＤ６８またはａ−ＳＭＡ抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、スライドを抗マウスアルカリホスファターゼと室温で３０分間インキュベートした。結合した抗体をＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を使用して可視化した。切片はメチルグリーン溶液で対比染色した。
【００３４】
免疫細胞化学的分析。平均１×１０６個の細胞をポリリジンコートスライド上で７００ｒｐｍ、室温で３分間細胞遠心分離する（久保田、５２００、日本）。染色前、細胞スポットを３．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．２％トライトンＸ−１００で９０秒間処理する。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素でブロックした後、牛血清アルブミンで１０分間ブロッキングを行う。スライドをｐＨ７．４の０．０５Ｍトリス緩衝液で希釈した抗ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ抗体（２μｍ／ｍＬ）と４℃で１６時間インキュベートし、次いで、超エンハンサー（Ｓｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］、非ビオチン検出システム、［ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ、ＣＡ］）と室温で２０分、続いて高分子‐ＨＲＰ（Ｓｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ［商品名］）標識剤と更に３０分間インキュベートする。最後に、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）で免疫染色した。酵素反応を終了させた後、スライドをＤＳ−エンハンサー（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ）中、室温で５分間インキュベートして２つの染色系の相互作用を防止した。次いで、スライドをＣＤ３４、ビメンチン、ＣＤ６８またはａ−ＳＭＡ抗体と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、スライドを抗マウスアルカリホスファターゼと室温で３０分間インキュベートした。結合した抗体をＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を使用して可視化した。切片はメチルグリーン溶液で対比染色した。
【００３５】
統計的分析。統計的分析では、試料を病的細胞の存在と非存在の２つのグループに分けた。全生存率は診断の日時から死亡又は最後の調査の日時まで計算した。無病生存率は診断の日時から再発、転移、死亡又は最後の調査の日時まで測定した。カプラン・マイヤー法により生存確率を決定し、対数順位検定によりグループ間の生存曲線を比較した。２つのグループをカイ二乗、スチューデントｔ又はマンホイットニーＵ検定のいずれか適当な検定法を用いて比較した。コックス比例ハザード回帰モデルにより影響を分析し、ロジスティック回帰を使って癌多発家系における病的細胞の存在リスクを計算した。Ｐ＜０．０５を統計的有意差ありとした。
【００３６】
本研究は、台湾国立科学委員会の承認を受けた調査プロジェクト及び補助金の元に行われ、インフォームド・コンセント及び協会の監視及び倫理委員会により承認されている。
【００３７】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれら実施例により制限されることはない。
【実施例１】
【００３８】
骨髄由来細胞でのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現
骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）でのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの組織的役割を確立するために、２４名の白血病患者の骨髄について独立コホート研究を行った。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現は、進行性疾患を有する白血病患者のＢＭＤＣ中に頻繁に検出することができた。２４症例のコホート研究において、１４症例では陰性であったが、１０症例ではＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現に関与していることが見出された。ＣＤ３４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、ＣＤ３４のクラスＩＩＩエピトープと特異的に反応する５８１／ＣＤ３４クローンであり、ヒト造血幹／前駆細胞を特異的に認識する）による免疫表現型分析により、ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞がほとんど存在せず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）を示すＣＤ３４−間葉幹／前駆細胞（Ｍｏｉｏｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００８、３：ｅ３９２２）及びＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）を示すその誘導体（図１Ａ）が、陰性例（図１Ｂ）とは対照的に、進行性疾患を有する患者の骨髄に頻繁に検出できることが更に明らかになった。これにより、ＢＭＤＣは、多種の重要な器官において、特に異常な創傷治癒過程及び慢性炎症において、損傷組織にリクルートされ存在することは明らかである。異常な創傷治癒は、その大多数の疾患及び死亡の重要な要因である。従って、明るい面として、ＢＭＤＣは末期虚血性心疾患、動脈狭窄及び骨形成不全症を含む多くの疾患の治療効果を有する可能性がある。一方、暗い面としては、ＢＭＤＣは、種々の腫瘍を取り囲む全身性繊維症と同様、肝、肺、腎、腸及び骨髄を含む多くの重要な臓器における全身性線維症の一因であり、ＢＭＤＣが全身性疾患の発症と進行において相反する両方向に関与していることが示唆される（Ｌｅ Ｂｏｕｓｓｅ−Ｋｅｒｄｉｌｅｓら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ、２００８、１９：６９−８０；Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｒｇａｎｓ、２００８、１８８：１７８−１８８）。多基質／多機能というＰＤＰＫの性質のために、ＢＭＤＣにおけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現は全身性疾患の発症と進行を引き起こすメカニズムを意味している可能性がある。総合すると、本骨髄研究の結果は、内因性の無秩序な骨髄におけるＢＭＤＣの全身性病的シグナルとしての多基質／多機能性ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの全身性の役割を実証する証拠を初めて提供している。
【実施例２】
【００３９】
種々の治療不能なＩ期腫瘍の間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現
この実施形態においては、免疫組織化学的分析に使用した間質組織検体は、１９８７年から２００４年の間に、台湾、台北の国立台湾大学病院で治療を受けた、非常に初期のＩ期腫瘍患者３６７名の医療記録の詳細な遡及調査を通して取得した。表１に間質組織の所在、年齢、性別、生存の状況及びＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを示す。患者を２００６年４月まで観察した。
【００４０】
患者の特徴付け
【００４１】
【表１】
2010210610.tif 000002
【００４２】
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現は、治療切除後であっても、予後の不良な様々なＩ期腫瘍の間質に高頻度に検出することができた。Ｉ期腫瘍の３６７症例のコホート研究では、２４０症例で陰性、１２７症例でＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現が見られた。腫瘍間質においてこのシグナル分子の異常発現が見られた患者では、予後不良の傾向を示す（図２）。ＣＤ３４、ＣＤ６８、ビメンチン又はａ−平滑筋アクチン（ａ−ＳＭＡ）による免疫表現型分析では、ＣＤ３４＋／ビメンチン−造血幹／前駆細胞はほとんど存在せず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）を示すＣＤ３４＋／ビメンチン＋線維芽細胞及びＣＤ３４―／ビメンチン＋間葉幹／前駆細胞（Ｂｕｃａｌａ、Ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ、Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ Ｃｏ Ｉｎｃ、２００７：１−１８；Ｍｏｉｏｌｉら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２００８、３：ｅ３９２２）は、実施例Ｉで基本的に説明した、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）を示す比較的多量に存在するＣＤ６８＋マクロファージ（図３Ｅ）、ビメンチン＋線維芽細胞及び間葉細胞（図３Ｃ）及びａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞（図３Ｇ）と同様、予後良好な陰性症例（図３Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）とは対照的に、治療切除後であっても、予後の不良なＩ期腫瘍の間質に顕著に検出する（図３Ａ及びＣ）ことができることが更に明らかになった。胸部、胆管、結腸直腸、子宮頚部、食道、胃、肝、肺、口腔、卵巣、膵、前立腺及び腎の間質の病因に関わりなく、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現がある場合、Ｉ期患者は全身性繊維症、感染症、閉塞症、塞栓、潰瘍、ＵＧＩ出血及び多臓器不全を発症する傾向がある。コックス回帰分析により、更に陽性のＩ期患者では、全身性疾患又は症候群を発症するリスクが陰性Ｉ期患者の６倍以上であることが明らかになった（無病生存率に対して、危険率：６．２５８、９５％ＣＩ：４．１２５−９．４９３、Ｐ＜０．００１）。Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ（Ｃｅｌｌ、２０００、１００：５７−７０）は、癌の特質を列挙しているが、先進の治療であっても患者の約半数では失敗に終わっている。最近の研究では、不治の初期段階の腫瘍は単に全身性骨髄疾患の最終産物であって、全身性慢性疾患の割合は少数に過ぎないということについて疑問視している。骨髄と腫瘍間質の間の緊密な関係は今や広く知られている。骨髄は異常な創傷治癒から末期の全身性線維症及び／又は新生組織形成まで様々な場合において間質系統の一因であり、ＢＭＤＣは多数が線維性組織及び／又は発育中の腫瘍の間質を形成する細胞型である（ＤｉｒｅｋｚｅとＡｌｉｓｏｎ、Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ、２００６、２４：１８９−１９５；ＢｅｌｌｉｎｉとＭａｔｔｏｌｉ、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、２００７、８７：８５８−８７０；Ｋａｒｎｏｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４９：５５７−５６３；Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、２００８、１８８：１７８−１８８）。細胞の局部存在及びＥＭＴ過程に加えて、ＢＭＤＣは異常な創傷治癒から末期の全身性線維症及び／又は新生組織形成まで全身性組織恒常性に貢献する最初の資源を意味するということは��や明確である。骨髄幹／前駆細胞及び間質及び炎症細胞などのそれらの誘導体における内因性異常は、上述のように、異常な創傷治癒、慢性炎症及び関連全身性疾患及び症候群を意味すると考えられる。従って、局部切除によっても不治であるＩ期腫瘍の疾患の実体は、もはや腫瘍特異的疾患ではない。すなわち、発病時には宿主特異的な、骨髄性全身性疾患である。総合すれば、これらの結果は、内因性の無秩序な骨髄におけるＢＭＤＣの全身性病的シグナルとしてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの全身性の役割を実証する更なる証拠を提供している。結果をまとめると、全身性の異常な創傷治癒の非常に早い段階で、予測及び治癒が難しい疾患の病因とは無関係に、被験者の全身性の病的状態の全身性シグナルとして、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａが確立される。結果をまとめると、腫瘍を進行させる間質及び／又は線維組織は、異常な創傷治癒に非常に類似する様々な間質細胞のリクルートを伴うことが多く、成長因子、サイトカイン、マトリクスリモデリングタンパク質及び結合組織要素の一定の沈着を引き起こし、多臓器不全の原因となる、という本概念が支持される。また、結果をまとめると、Ｔａｋａｉｓｈｉら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２８７６−２８８２）が提唱したように、ＢＭＤＣは慢性的に炎症を起こしている組織に集まると、最も未発達な不確定癌幹細胞に相当するという概念に一致する。ここで、場合によっては、不治のＩ期腫瘍の間質におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現を伴う癌幹細胞の特徴として、ＣＤ４４＋細胞がほとんど存在しないことを確認した（データの説明なし）。ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ及び実施例１及び２で説明したＢＭＤＣ系を用いて、被験者が全身性疾患又は症候群を発症するリスクを決定するために普遍的に適用可能な分子及び細胞発現プロファイルを開発することができる。本発明は、ＢＭＤＣにおけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを、病因に関わりなく、異常な創傷治癒における全身性播種により、治癒が難しい疾患を被験者が発症する可能性又は感受性を予測する非常に信頼性の高い因子として確立する。
【実施例３】
【００４３】
炎症線維組織におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現
上記に確立された概念に合致して、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現を実際に炎症線維組織中に頻繁に検出することができた。線維症を有さない２６症例と線維症を有する９症例からなる、扁平上皮過形成組織３５症例の独立コホート研究では、図１及び３に示すように、ＢＭＤＣ中のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現は、線維症を有する過形成組織に顕著に検出された。すなわち、９症例中７症例ではＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ陽性であった。一方、線維症陰性組織の２６症例では、１８症例がＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａ陰性であることが認められた（カイ二乗検定、Ｐ＝０．０２２）。ＣＤ３４、ＣＤ６８、ビメンチン又はａ−ＳＭＡによる免疫表現型分析では、実施例Ｉ及びＩＩで基本的に説明したように、ＣＤ３４＋／ビメンチン−造血幹／前駆細胞はほとんど存在せず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）を示すＣＤ３４＋／ビメンチン＋線維芽細胞及びＣＤ３４―／ビメンチン＋間葉幹／前駆細胞は、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）を示す多量に存在するＣＤ６８＋マクロファージ、ビメンチン＋線維芽細胞及び間葉細胞並びにａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞と同様、線維症を有さない陰性症例とは対照的に、炎症性線維性組織内に頻繁に検出できることが更に明らかになった。図１に示すように、ＢＭＤＣは、組織部、特に炎症線維組織での異常な創傷治癒における幹／前駆細胞及びその誘導体である、ビメンチン＋線維芽細胞、ａ−ＳＭＡ＋筋線維芽細胞及びＣＤ６８＋マクロファージなどの新規個体群の一因であることの証拠が増えている。線維症は世界的に罹患及び死亡の重要な原因である。線維症は様々な多くの重要な臓器に起こり、全身性線維症の過程は全ての臓器に共通である。この過程に関与する型の異なるＢＭＤＣは、結合組織要素の沈着を促進するように一緒に働き、正常な組織構造を徐々に破壊し臓器の機能を失わせ、死に至らしめると思われる（Ｄｕｎｓｍｏｒｅ及びＳｈａｐｉｒｏ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００４、１１３：１８０−１８２；Ｂｅｌｌｉｎｉ及びＭａｔｔｏｌｉ、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、２００７、８７：８５８−８７０；Ｂｕｃａｌａ、Ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ、Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ Ｃｏ Ｉｎｃ、２００７：１−１８；Ｌｅ Ｂｏｕｓｓｅ−Ｋｅｒｄｉｌｅｓら、Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ、２００８、１９：６９−８０；Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、２００８、１８８：１７８−１８８）。以上をまとめると、結果は、ＢＭＤＣ内のＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現は、上記のように、異常な創傷治癒及び慢性炎症の特徴を示す線維症を伴うことを証明する最初の証拠を提供する。実施例１〜３に示されるような結果の全てを合わせると、内因性の無秩序な骨髄におけるＢＭＤＣの全身性病的シグナルとしてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの全身性の役割を実証する証拠が更に提供される。
【実施例４】
【００４４】
癌多発家系又は反復炎症を示す全身性の病状にある小児の末梢血中におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現
ＣＤ３４＋／ビメンチン＋線維芽細胞、末梢血中の骨髄由来間葉前駆体は、異常な創傷治癒及び炎症性線維化過程での線維芽細胞及び筋線維芽細胞の新規個体群の一因であることの証拠が増えている（Ｂｕｃａｌａら、Ｍｏｌ Ｍｅｄ、１９９４、１：７１−８１；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００３、１７１：３８０−３８９；Ｂｅｌｌｉｎｉ及びＭａｔｔｏｌｉ、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ、２００７、８７：８５８−８７０；Ｂｕｃａｌａ、Ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ、Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ Ｃｏ Ｉｎｃ、２００７：１−１８；Ｌｉｎら、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、２００８、１８８：１７８−１８８）。この考えに一致して、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現を伴うＣＤ３４＋線維芽細胞様細胞が、反復性炎症を有する異なる３家系からの小児３名の末梢血中に検出できた（図４）。この種の病的細胞は、ヒト肥大性瘢痕、腎性全身性線維症、アテローム性動脈硬化症及び主にＢＭＤＣ由来の肺性線維症に関連している。実施例Ｉ〜ＩＩＩに示されるような結果の全てを合わせると、内因性の無秩序な骨髄におけるＢＭＤＣの非常に早期の病的シグナルとしてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの全身性の役割を実証する包括的な証拠が提供される。
【００４５】
この概念に合致して、１０歳から６５歳まで（平均±ＳＤ：４２．５±１３．１）の健常者３３名（男性１３名、女性２０名）において、癌多発性家系の人では血中に病的細胞が検出される傾向を有している（Ｐ＝０．００１）。ロジスティック回帰は、癌多発家系の人では病的細胞を有するリスクが、非癌多発家系の人の１３倍以上であることが明らかになった（病的細胞の存在のＯＲ：１３．３３３、９５％、ＣＩ：２．４５４−７２．４５２、Ｐ＝０．００３、表２）。この結果は、癌多発家系の人ではＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを高発現する病的ＢＭＤＣを有する骨髄に内因性欠陥を発症するリスクを有する傾向があることを更に実証しており、実施例１〜４において構築されたように、被験者が全身的に病的であること、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクがあることを予測する方法を提供する。
【００４６】
癌多発家系における病的細胞の存在のリスク
【００４７】
【表２】
2010210610.tif 000003
略語：ＯＲ：オッズ比、９５％ＣＩ：９５％信頼区間
Ｐ＊＜０．０５は統計的有意差ありと判断される（†：カイ二乗検定、‡：ロジスティック回帰）
【実施例５】
【００４８】
川崎症候群である全身性の病的小児の臍帯血中におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現
上記の結果に一致するようなタイプの病的ＢＭＤＣが、川崎症候群の免疫系異常の特徴を有する全身性の病的小児の臍帯血中にも検出された（図５）。この結果は、臍帯血及び骨髄幹／前駆細胞に関する非常に早期の病的シグナル分子としてのＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの全身性の役割を実証する更なる証拠を提供する。全ての結果をまとめると、本発明は、全身性疾患のある被験者の非常に早期の症状発症期から非常に末期の症状発症期までの寿命を通して、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａをＢＭＤＣの全身性の病的シグナルとして確立した。
【実施例６】
【００４９】
病的創傷である潰瘍におけるＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現
ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現を潰瘍性間質に頻繁に検出できた。潰瘍を有する口腔組織３９症例の独立コホート研究では、ＣＤ３４＋／ビメンチン−造血幹／前駆細胞はほとんど存在せず、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの強発現（＞３＋）を示すＣＤ３４−／ビメンチン＋間葉幹／前駆細胞及び上記したように（追加の説明なし）基本的に間質内でＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの中から強程度の発現（２＋〜３＋）を示すそれらの誘導体からなるＢＭＤＣの階層集団においては、３９症例中３４症例がＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの異常発現に関与していた。この結果は、骨髄に内因性欠陥を有するＢＭＤＣの損なわれた創傷治癒関連病的シグナルとしての、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａの全身性の役割を実証する更なる証拠を提供する。
【００５０】
要約すれば、本発明は、骨髄及び臍帯血中の非常に早期の病的シグナル及び末期の致死シグナルとして、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを確立した。従って、ＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａはＢＭＤＣの内因性無秩序の全身性病的シグナルを意味する。このように、本発明は、移植に先立って、骨髄及び臍帯血の健康及び疾患の状態を診断、予測する検出システムを提供する。本発明により示される病的ＢＭＤＣ及びＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａは、全身性骨髄に問題を有する被験者の寿命を通して健康及び疾患の状態を予測するための、非常に早期の分子及び細胞系を意味する。
【００５１】
上記において、本発明は、診断マーカーとしてＰＤＰＫ  ＦＡ／ＧＳＫ−３ａを使用することにより、被験者が全身的に病的であるかどうか、又は全身性疾患若しくは症候群を発症するリスクを有するかどうかを予測する方法を提供する。
【００５２】
参考文献
1. Bellini A, Mattoli S (2007), 反応性及び修復性線維症における、骨髄由来間葉前駆細胞、線維芽細胞の役割(The role of the fibrocyte, a bone marrow-derived mesenchymal progenitor, in reactive and reparative fibrosis.) Lab Invenst 87: 858-870
2. Bingle L, Brown NJ, Lewis CE (2002), 腫瘍の進行における腫瘍関連マクロファージの役割：新しい抗癌治療への影響(The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies.) J Pathol 196: 254-265
3. Biswas SK, Sica A, Lewis CE (2008), 進行性腫瘍におけるマクロファージ機能の可塑性：独自の分子機構による制御(Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.) J Immunol 180: 2011-2017
4. Bucala R (2007), 線維芽細胞(Fibrocytes.) Fibrocytes, World Scientific Pub Co Inc: 1-18
5. Bucala R, Siegel LA, Chesney J, Hogan M, Cerami A (1994), 循環線維芽細胞は組織修復を介在する新しい白血球亜集団である(Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair.) Mol Med 1: 71-81
6. Chung YC, Chan KJ, Yang CC, Lai MT, Hsu CP, Hsueh SF, Peng CC, Fu HH, Chang YF, Yang SD (2002), プロリン指向性プロテインキナーゼＡＦのヒト結腸癌の腫瘍形成、浸潤、予後不良との関連性(Association of proline-directed protein kinase AF with tumorigenesis, invasion, and poor prognosis of human colon carcinoma.) Cancer 95: 1840-1847
7. Condeelis J, Pollard JW (2006), マクロファージ：腫瘍細胞の移動、浸潤、転移のために必要なパートナー(Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis.) Cell 124: 263-266
8. De Wever O, Mareel M (2003), 癌細胞の浸潤における組織間質の役割(Role of tissue stroma in cancer cell invasion.) J Pathol 200: 429-447
9. Direkze NC, Alison MR (2006), 骨髄と腫瘍間質：その密接な関連(Bone marrow and tumour stroma: an intimate relationship.) Hematol Oncol 24: 189-195
10. Dunsmore SE, Shapiro SD (2004), 骨髄はその傷跡を残す：肺線維症の新しい概念(The bone marrow leaves its scar: new concepts in pulmonary fibrosis.) J Clin Invest 113: 180-182
11. Fu HH, Yang SD (2004), プロリン指向性プロテインキナーゼＦ（Ａ）の抑制によりヒト膵管腺癌の悪性成長が抑制される(Suppression of proline-directed protein kinase F(A) inhibits the malignant growth of human pancreatic ductal adenocarcinoma.) Anticancer Res 24: 1489-1494
12. Hsu CP, Hsueh SF, Yang CC, Yang SD (2000), プロリン指向性プロテインキナーゼＦ（Ａ）の発現の抑制によりヒト慢性骨髄性白血病細胞の成長が抑制される(Suppression of proline-directed protein kinase F(A) expression inhibits the growth of human chronic myeloid leukaemia cells.) Br J Cancer 82: 1480-1484
13. Hsu CP, Yang CC, Hsueh SF, Peng CC, Fu HH, Yang SD (2001), プロリン指向性プロテインキナーゼＦ（Ａ）の抑制によりヒト急性リンパ芽球性白血病細胞におけるアポトーシス誘起が促進され化学療法感受性が著しく高められる(Suppression of proline-directed protein kinase F(A) potentiates apoptotic induction and greatly enhances chemosensitivity in human acute lymphoblastic leukemia cells.) Cancer 92: 1753-1758
14. Hsu CP, Yang CC, Yang SD (2000), プロリン指向性プロテインキナーゼＦ（Ａ）発現の抑制によりヒト骨髄性白血病細胞の赤血球分化が促進される(Suppression of proline-directed protein kinase F(A) expression potentiates erythroid differentiation of human myeloid leukemia cells.) Cancer 89: 1004-1011
15. Hsu CP, Yang CC, Yang SD (2001), プロリン指向性プロテインキナーゼＦ（Ａ）の抑制によりヒト急性白血病細胞の成長が全身的に抑制される(Suppression of proline-directed protein kinase F(A) systemically inhibits the growth of human acute leukemia cells.) Int J Cancer 91: 650-653
16. Hsueh SF, Lai MT, Yang CC, Chung YC, Hsu CP, Peng CC, Fu HH, Cheng YM, Chang KJ, Yang SD (2002), 膀胱癌患者における化学療法剤耐性、浸潤、再発とのプロリン指向性プロテインキナーゼＦ（Ａ）の過剰発現の関連性(Association of overexpressed proline-directed protein kinase F(A) with chemoresistance, invasion, and recurrence in patients with bladder carcinoma.) Cancer 95: 775-783
17. Karnoub AE, Dash AB, Vo AP, Sullivan A, Brooks MW, Bell GW, Richardson AL, Polyak K, Tubo R, Weinberg RA (2007), 腫瘍間質内の間葉幹細胞は乳癌転移を促進する(Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.) Nature 449: 557-563
18. Kisseleva T, Brenner DA (2008), 線維組織成長のメカニズム(Mechanisms of fibrogenesis.) Exp Biol Med 233: 109-122
19. Le Bousse-Kerdiles MC, Martyre MC, Samson M (2008), 骨髄及び肝線維症における細胞及び分子機構：総説(Cellular and molecular mechanisms underlying bone marrow and liver fibrosis: a review.) Eur Cytokine Netw. 19: 69-80
20. Lin WR, Brittan M, Alison MR (2008), 線維症における骨髄由来細胞の役割(The role of bone marrow-derived cells in fibrosis.) Cells Tissues Organs 188: 178-188
21. Mishra PJ, Glod JW, Benerjee D (2009), 間葉幹細胞：別の視点から(Mesenchymal stem cells: flip side of the coin.) Cancer Res 69: 1255-1258
22. Moioli EK, Clark PA, Chen M, Dennis JE, Erickson HP, Gerson SL, Mao JJ (2008), 血管を新生するバイオ工学処理された組織における造血及び間葉幹／前駆細胞の相乗作用(Synergistic actions of hematopoietic and mesenchymal stem/progenitor cells in vascularizing bioengineered tissues.) PLoS ONE 3: e3922
23. Schafer M, Werner S (2008), 過剰治癒創傷としての癌：古い仮説の再考(Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited.) Nat Rev Mol Cell Biol 9: 628-638
24. Schmidt M, Sun G, Stacey MA, Mori L, Mattoli S (2003) 喘息における気管支筋線維芽細胞の前駆体としての循環線維芽細胞の同定(Identification of circulating fibrocytes as precursors of bronchial myofibroblasts in asthma.) J Immunol 171: 380-389
25. Valtieri M, Sorrentino A (2008), 間葉間質細胞の恒常性への関与(The mesenchymal stroma cell contribution to homeostasis.) J Cell Physiol 217: 296-300
26. Vandenheede JR, Yang SD, Goris J, Merlevede W (1980), ウサギ骨格筋由来ＡＴＰｘＭｇ依存プロテインホスファターゼ．ＩＩ．活性化因子の精製と合成酵素キナーゼ活性を有する二官能性タンパク質としての特徴付け(ATP x Mg-dependent protein phosphatase from rabbit skeletal muscle. II. Purification of the activating factor and its characterization as a bifunctional protein also displaying synthase kinase activity.) J Biol Chem 255: 11768-11774
27. Woodgett JR (1990), グリコーゲン合成酵素キナーゼ‐３／因子Ａの分子クローニング及び発現(Molecular cloning and expression of glycogen synthase kinase-3/factor A.) EMBO J 9: 2431-2438
28. Wynn TA (2008), 線維症の細胞及び分子機構(Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.) J Pathol 214: 199-210
29. Yang CC, Hsu CP, Yang SD (2000), プロリン指向性プロテインキナーゼＦＡのアンチセンス抑制によりヒト前立腺癌細胞の化学療法剤感受性が高められる(Antisense suppression of proline-directed protein kinase FA enhances chemosensitivity in human prostate cancer cells.) Clin Cancer Res 6: 1024-1030
30. Yang SD (2004), ヒト癌の診断と治療の潜在的標的としてのプロリン指向性プロテインキナーゼＦＡ(Proline-directed protein kinase FA as a potential target for diagnosis and therapy of human cancers.) Curr Cancer Drug Targets 4: 591-596
31. Yang SD, Vandenheeds JR, Goris J, Merlevede W (1980), ウサギ骨格筋由来ＡＴＰｘＭｇ依存プロテインホスファターゼ．Ｉ．酵素の精製とその活性化タンパク質因子との相互作用による制御(ATP x Mg-dependent protein phosphatase from rabbit skeletal muscle. I. Purification of the enzyme and its regulation by the interaction with an activating protein factor.) J Biol Chem 255: 11759-11767
32. Yin T, Li L (2006), 幹細胞は骨に作られる(The stem cell niches in bone.) J Clin Invest 116: 1195-1201
【図１Ａ】
2010210610.tif 000004
【図１Ｂ】
2010210610.tif 000005
【図２Ａ】
2010210610.tif 000006
【図２Ｂ】
2010210610.tif 000007
【図３Ａ】
2010210610.tif 000008
【図３Ｂ】
2010210610.tif 000009
【図３Ｃ】
2010210610.tif 000010
【図３Ｄ】
2010210610.tif 000011
【図３Ｅ】
2010210610.tif 000012
【図３Ｆ】
2010210610.tif 000013
【図３Ｇ】
2010210610.tif 000014
【図３Ｈ】
2010210610.tif 000015
【図４Ａ】
2010210610.tif 000016
【図４Ｂ】
2010210610.tif 000017
【図５】
2010210610.tif 000018
【配列表】
2010210610000001.app
【外国語明細書】
2010210610000001.pdf