(57)【要約】      （修正有）【課題】発現中にヘテロ二量体形成を促進するように工学的に作出され、プロテインＡの差動的精製技法を用いた高度精製が可能な、ＣＤ３及び疾患関連抗原に結合する新規ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。【解決手段】（ａ）第１のエピトープに結合するエピトープ結合領域、及び免疫グロブリン定常領域を含む、プロテインＡと結合する第１のポリペプチドと、（ｂ）第２のエピトープに結合するエピトープ結合領域、及び免疫グロブリン定常領域を含む、プロテインＡに結合しない第２のポリペプチドと、を含むヘテロ二量体免疫グロブリンであって、エピトープはＣＤ３タンパク質複合体又は疾患関連抗原であり、第１及び第２のポリペプチドが、タンパク質−タンパク質界面を有する、修飾されたＣＨ３ドメインを備える工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含む、特定の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列で構成される、ヘテロ二量体免疫グロブリン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１のエピトープに結合するエピトープ結合領域、及び免疫グロブリン定常領域を含む、プロテインＡと結合する第１のポリペプチドと、
（ｂ）第２のエピトープに結合するエピトープ結合領域、及び免疫グロブリン定常領域を含む、プロテインＡに結合しない第２のポリペプチドと、
を含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントであって、
第１及び第２のポリペプチドが、タンパク質−タンパク質界面を有する、修飾されたＣＨ３ドメインを備える工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、第１のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面が、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ登録商標ナンバリング）からなる群より選択される位置においてアミノ酸置換を含み、第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面が、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ登録商標ナンバリング）からなる群より選択される位置においてアミノ酸置換を含み、
第１のポリペプチドのエピトープ結合領域が、ＣＤ３タンパク質複合体に結合し、及び第２のポリペプチドのエピトープ結合領域が、疾患関連抗原に結合する、又は第１のポリペプチドのエピトープ結合領域が、疾患関連抗原に結合し、及び第２のポリペプチドのエピトープ結合領域が、ＣＤ３タンパク質複合体に結合し、
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域が、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域が、配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域が、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む、前記ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項２】
疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域が、
ｉ）配列番号２０６〜２１１、
ｉｉ）配列番号２１２〜２１７、
ｉｉｉ）配列番号２１８〜２２３、
ｉｖ）配列番号２２４〜２２９、
ｖ）配列番号２３０〜２３５、
ｖｉ）配列番号２３６〜２４１、
ｖｉｉ）配列番号２４２〜２４７、
ｖｉｉｉ）配列番号２４８〜２５３、
ｉｘ）配列番号２５４〜２５９、
ｘ）配列番号２６０〜２６５、
ｘｉ）配列番号２６６〜２７１、及び
ｘｉｉ）配列番号２７２〜２７７
からなる群よりそれぞれ選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列
、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項３】
前記第２のポリペプチドの定常領域が、ＩｇＧ３  ＣＨ３領域を含む、請求項１又は２に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項４】
前記第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面が、８４．４の位置でのアミノ酸置換、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ登録商標ナンバリング）からなる群より選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項１、２、又は３に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項５】
前記ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、又は
前記ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域が、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、又は
前記ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドの前記エピトープ結合領域が、ＶＨ３領域を含み、及び
第２のポリペプチドの前記ＶＨ３領域が、前記第２のポリペプチドのプロテインＡへの結合を低減する又は無効にする修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項７】
修飾されたＶＨ３領域が、５７、６５、８１、８２ａ、及び１９／５７／５９の組み合わせ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、請求項６に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項８】
修飾されたＶＨ３領域が、５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、８１Ｅ、８２ａＳ、及び１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａの組み合わせ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、請求項６又は７に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項９】
重鎖可変フレームワーク領域が、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、又は重鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸置換Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、アミノ酸置換Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項１０】
重鎖可変領域が、Ｗ１００ｅＦ及びＷ１００ｅＹ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、軽鎖可変領域が、Ａ２Ｉ、Ｓ２５Ａ、Ｔ２７Ａ、Ｇ２７ａＡ、Ｖ２７ｃＡ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｅ３８
Ｑ、Ｆ４４Ｐ、Ｇ４６Ｌ、Ｔ５１Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｒ５４Ａ、Ｐ５６Ａ、Ｌ６６Ｇ、Ｄ６９Ｔ、Ｆ８７Ｙ、Ｑ８９Ａ、Ｗ９１Ｆ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９４Ａ、及びＱ１００Ｇ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、又は重鎖可変領域が、アミノ酸置換Ｗ１００ｅＹ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含み、軽鎖可変領域が、アミノ酸置換Ａ２Ｉ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｔ５１Ａ、Ｆ８７Ｙ、Ｑ８９Ａ、及びＷ９１Ｆ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、若しくは軽鎖可変領域が、アミノ酸置換Ａ２Ｉ、Ｅ３８Ｑ、Ｆ８７Ｙ、及びＱ８９Ａを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項１１】
第１のポリペプチドのエピトープ結合領域がＦＡＢであり、及び第２のポリペプチドのエピトープ結合領域がｓｃＦｖである、又は
第１のポリペプチドのエピトープ結合領域がｓｃＦｖであり、及び第２のポリペプチドのエピトープ結合領域がＦＡＢである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項１２】
ｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１５９のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号４７の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６０のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号３の同起源の軽鎖と会合し、及びＨＥＲ２に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｉｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１６３のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号４７の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６４のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｉｖ）第１のポリペプチドが、配列番号１６５のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１６６の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｖ）第１のポリペプチドが、配列番号１６８のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号８９の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｖｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１６９のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１１９の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｖｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１７０のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１３８の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７１のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｖｉｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１１９の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７７のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｉｘ）第１のポリペプチドが、配列番号１７８のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１２８の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７９のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タン
パク質複合体及びＣＤ３８、
ｘ）第１のポリペプチドが、配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１７３の同起源の軽鎖と会合し、及びＯＸ４０に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０、
ｘｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１７４のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１７５の同起源の軽鎖と会合し、及びＥＧＦＲに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７１のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、
ｘｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１８０のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１８１の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ２０に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７７のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０、
と結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する方法であって、
ｉａ）第１のポリペプチドの重鎖をコードするＤＮＡベクター及び第２のポリペプチドの重鎖をコードするＤＮＡベクターを調製するステップであって、１つ若しくは両方のＤＮＡベクター、若しくは第３のＤＮＡベクターが、共通する軽鎖、又は第１若しくは第２のポリペプチドの重鎖と会合する軽鎖を任意選択的にコードする前記ステップ、又は
ｉｂ）第１及び第２のポリペプチドの重鎖をコードする１つのＤＮＡベクターを調製するステップであって、ＤＮＡベクターが、共通する軽鎖、又は第１若しくは第２のポリペプチドの重鎖と会合する軽鎖を任意選択的にコードし、前記ＤＮＡベクターが、哺乳動物の宿主細胞内での一過性の発現若しくは安定的な発現に適する前記ステップと、
ｉｉ）（ｉａ）又は（ｉｂ）に由来するＤＮＡベクターを哺乳動物の宿主細胞系統にトランスフェクト又は同時トランスフェクトするステップと、
ｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞系統、又はそれから安定的に選択されたクローンを培養し、細胞培養物上清を採集するステップと、
ｉｖ）細胞培養物上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させるステップと、
ｖ）対象とするヘテロ二量体免疫グロブリンを溶出させ、収集するステップと、
を含む前記方法。
【請求項１４】
ステップ（ｖ）から得た精製後の材料に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントが、キャピラリー電気泳動により決定したときに、少なくとも９５％の純度を有する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ３抗原及び疾患関連抗原の構成要素の両方を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリン、並びにその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞リディレクテッドキリング（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）は、多くの治療分野において望ましい作用機序である。様々な二重特異性抗体フォーマットが、Ｔ細胞リダイレクションに関わっていることが、前臨床試験及び臨床試験の両方において判明している（Ｍａｙ  Ｃら、（２０１２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、第８４巻（９）：１１０５〜１２頁；Ｆｒａｎｋｅｌ  ＳＲ、及びＢａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ、（２０１３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、第１７巻（３）：３８５〜９２頁）。すべてのＴ細胞再標的化二重特異性抗体又はそのフラグメントは、少なくとも２つの抗原結合部位を有するように工学的に作出されており、この場合、一方の部位が標的細胞上の表面抗原に結合し、他方の部位はＴ細胞表面抗原に結合する。Ｔ細胞表面抗原の中でも、ＴＣＲタンパク質複合体に由来するヒトＣＤ３のεサブユニットが、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする標的として、最も高頻度でその対象とされている。
【０００３】
多くの二重特異性抗体フォーマットが、Ｔ細胞キリングをリダイレクトするのに用いられているが、これらには、主にタンデム型のｓｃＦｖフラグメント及び二機能性抗体に基づくフォーマットが含まれ、Ｆｃベースの二重特異性抗体フォーマットについては数例しか報告されていない（Ｍｏｏｒｅ  ＰＡ、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ、第１１７巻（１７）：４５４２〜５１頁；Ｍａｙ  Ｃら、（２０１２）前出；Ｆｒａｎｋｅｌ  ＳＲ、及びＢａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ、（２０１３）前出）。ヒトＦｃ領域を含む二重特異性フォーマットは、循環半減期がより長く、有効性の強化、及び／又は頻度がより低い投与計画を実現し得る。考え得るＦｃベースの二重特異性フォーマットの中でも、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする１つの好ましいフォーマットとして、いわゆる重鎖ヘテロ二量体フォーマットが挙げられる。本フォーマットは、Ｔ細胞表面において、ヒトＣＤ３分子の複数のコピーが凝集するのを可能にせず、これによりＴ細胞の不活性化をすべて阻止するので、特に興味深い（Ｋｌｅｉｎ  Ｃら、（２０１２）ＭＡｂｓ、第４巻（６）：６５３〜６３頁）。
【０００４】
重鎖ヘテロ二量体の工学的作出について最初に記載された方法は、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）法として知られている  （ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９６２７０１１号；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ＡＭら、（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１６巻（７）：６７７〜８１頁）。最近、還元と半免疫グロブリン（ｈａｌｆ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏリシャッフリングにより、２つの抗体を１つの二重特異性抗体に統合する、ＦＡＢ−アーム交換法（ＦＡＢ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ）として知られている化学的方法が報告された（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９３５３号（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊら）及び国際公開第２０１３０６０８６７号（Ｇｒａｍｅｒ  Ｍら）；Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦら、（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第１１０巻（１３）：５１４５〜５０頁）。
【０００５】
両法及びその派生法は、現在のところ、哺乳動物の細胞宿主においてＦｃベースの二重特異性抗体フォーマットを生成するのにふさわしくない。哺乳動物の細胞宿主において、「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖ヘテロ二量体を発現する場合、ホモ二量体の存在により
、二重特異性抗体の回収率が損なわれる（Ｊａｃｋｍａｎ  Ｊら、（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２８５巻（２７）：２０８５０〜９頁；Ｋｌｅｉｎ  Ｃら、前出）。ＦＡＢ−アーム交換法及びその派生法は、同一の欠点を有する他、２つの「単一特異性」抗体を最初に分離して生成させるという更なる問題を有する。
【０００６】
ＣＤ３サブユニットの関与により、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする二重特異性抗体を開発する際には、ＣＤ３サブユニットに対して特異的なホモ二量体が、最終医薬品内に存在しないことが必須である。ＣＤ３εサブユニットを標的とする場合、痕跡量の抗ヒトＣＤ３ε抗体種（ヒトＣＤ３ε抗原に対して単一特異性及び２価性の）が存在すると、Ｔ細胞の一時的活性化、及びＴ細胞アポトーシスが生じる前のサイトカイン放出を引き起こす契機となる可能性があり、これによりＴ細胞を制御下で特異的に活性化するという最終目的を阻害する。Ｔ細胞キリングを効果的にリダイレクトする、安定かつ安全なＦｃベースの二重特異性抗体の製造では、製薬業界にとって純度及び収率に関してなおも課題が残る。従って、分泌型の二重特異性抗体生成物が、組換え哺乳動物宿主細胞系統に由来する細胞培養物上清から容易に単離されるような、抗ヒトＣＤ３ホモ二量体を含まない抗ヒトＣＤ３ベースの重鎖ヘテロ二量体を効率的に製造する技術のニーズがなおも存在する。
【０００７】
試薬に対するアフィニティーの相違に基づき、ホモ二量体から重鎖ヘテロ二量体を精製する技法は、すでに記載されている。公知の差動的アフィニティー精製技法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）に関する第１の例は、２つの異なる動物種由来の２つの異なる重鎖で、そのうちの１つがアフィニティー試薬のプロテインＡに結合しないかかる重鎖の使用と関係した（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈら、（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５５巻（１）：２１９〜２２５頁）。また、同一の著者らは、２つの異なるヒト免疫グロブリンアイソタイプ（ＩＧＨＧ１及びＩＧＨＧ３）に由来する２つの異なる重鎖で、そのうちの１つがアフィニティー試薬のプロテインＡに結合しないかかる重鎖の使用についても記載した（ＩＧＨＧ３；Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈらの米国特許第６，５５１，５９２号を参照）。より最近では、この技法の変法がＤａｖｉｓ  Ｓらにより報告され（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１５１７９２号）、またＪｅｎｄｅｂｅｒｇ（１９９７）（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ  Ｌ．ら、（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２０１巻（１）：２５〜３４頁）により記載された２つのアミノ酸置換体Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆが、ヘテロ二量体重鎖のうちの１つにおいて、試薬プロテインＡに対するアフィニティーを無効にするように実用化された。
【０００８】
本発明の公知の好ましい差動的プロテインＡアフィニティー精製技法は、３種すべて、すなわち、対象となる２つのホモ二量体種とヘテロ二量体において、プロテインＡ結合部位の合計数が、少なくとも部位１つ分異なり、また２つのホモ二量体種のうちの１つが、プロテインＡ結合部位を有さず、従ってプロテインＡに結合しない、という技法に該当する（図１に示す通り）。
【０００９】
薬物の安定性は、医薬品開発を成功させるうえで重要な側面であり、またＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はそのフラグメントは、生物学的製剤業界にとって多大な重要性を有する。ＶＨ３サブクラスに基づく治療抗体は、幅広く開発されてきたが、それはこのようなフレームワークはプロテインＡに結合し、これを免疫グロブリンにフォーマット化する前に行われる抗体フラグメントの試験がやり易いためである；例えば、抗体の探索で用いられる多くの合成抗体ファージディスプレーライブラリは、ＶＨ３サブクラスに基づく。更に、ＶＨ３ベースの抗体は、発現が良好であり、またその他の公知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも安定であることから、選択される頻度が高い。
【００１０】
ＶＨ３ドメインは、より強いアフィニティーを示す２つの部位を有するＦｃ領域と比較
して、それよりも弱いアフィニティーを示すプロテインＡ結合部位を１か所のみ有するにすぎないが（Ｒｏｂｅｎ  ＰＷら、（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５４巻（１２）：６４３７〜４５頁）、公知の差動的プロテインＡアフィニティー精製技法を相互作用するのに十分なアフィニティーが認められる。重鎖のヘテロ二量体の精製を取り扱う場合、そのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しないように工学的に作出された重鎖は、ＶＨ３ベースの抗原結合部位を１つ含み、従ってプロテインＡ結合は、ＶＨ３ドメインにより再建されるが、図１には好ましい技術を記載し、また上部のものは有用ではない（図２Ａ）。この事例では、ＶＨ３ベースの抗原結合部位内のプロテインＡ結合を無効にすることで、シンプルな解決策が提供され、所望のヘテロ二量体の初期の構造を保持できるようにする（図２Ｂ）。あるいは、重鎖ヘテロ二量体は、Ｆｃ領域内でプロテインＡに結合する重鎖上に、ＶＨ３ベースの抗原結合部位を配置させるように工学的に再構成され得る（図２Ｃ；ＶＨ３ドメインは、Ｆｃモノマーと比較して、それよりもプロテインＡに対するアフィニティーは弱く、従って対象となるヘテロ二量体は、他のホモ二量体種とは異なるｐＨ値、一般的にはｐＨ４において、なおも溶出する一方、プロテインＡに結合するホモ二量体種は、この場合２つの付加的プロテインＡ結合部位を含み、ｐＨ値≦３で溶出することに留意する）。
【００１１】
より重要なこととして、両方の重鎖がＶＨ３ベースの抗原結合部位を含むような重鎖のヘテロ二量体の精製について取り扱う場合、上記再配置戦略は、部分的にのみ役立つ可能性がある（図２Ｄ及び図１５Ｂ）。プロテインＡに基づく差動的精製は、ＶＨ３ベースの抗原結合部位の少なくとも１つ（図２Ｅ）又は両方（図２Ｆ）におけるプロテインＡ結合が無効にされる場合にのみ可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、この可変ドメインサブクラスを含む重鎖のヘテロ二量体の製造を行う際には、ＶＨ３ドメイン内でのプロテインＡ結合を無効にするニーズがなおも存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、疾患関連抗原を認識し、これに結合可能な第２の結合アームを備える新規抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【００１４】
本発明の文脈において、疾患関連抗原とは、病理学的状態と関連したあらゆる抗原又はエピトープ、例えば発癌性マーカー又はいくつかのその他の代謝的又は免疫学的機能障害のマーカー等を意味する。更に、疾患マーカーは、感染性疾患、例えば病原性ウイルス又は細菌等とも関連する。
【００１５】
本発明に基づけば、抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の２つの結合アームは、それぞれ免疫グロブリン定常領域を含み、第１のアーム又はポリペプチドは、プロテインＡと結合し、第２のアーム又はポリペプチドは、プロテインＡに結合しない。
【００１６】
本発明によれば、第１のポリペプチドがプロテインＡに結合し、第２のポリペプチドがプロテインＡに結合しないということは、第２のポリペプチドでは、プロテインＡに対する結合が若干でも残留してはならないことを意味するようには意図されておらず、むしろ、第２のポリペプチドは、第１のアームとの比較において、プロテインＡとそれほど十分に結合しないことが意図されている。
【００１７】
本発明によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントの第１及び第２のポリペプチドは、工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利に働くタンパク質−タンパク質界面を有する修飾されたＣＨ
３領域を備える。好ましい実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供するが、この場合、第１及び第２のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質界面を有する修飾されたＣＨ３ドメインを備えた工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、第１のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置においてアミノ酸置換を含み、並びに第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置において、アミノ酸置換を含む。
【００１８】
好ましくは、第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８４．４の位置におけるアミノ酸置換、及び３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置における少なくとも１つの更なる置換を含む。
【００１９】
更なる実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供するが、この場合、第１及び第２のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質界面を有する修飾されたＣＨ３ドメインを備えた工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、第１のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８８の位置と、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置とにおいてアミノ酸置換を含み、並びに第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８５．１、及び／又は８６の位置と、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置とにおいて、アミノ酸置換を含む。
【００２０】
本発明の更なる態様によれば、第１のポリペプチドのエピトープ結合領域はＣＤ３タンパク質複合体に結合し、また第２のポリペプチドのエピトープ結合領域は疾患関連抗原に結合する、又は第１のポリペプチドのエピトープ結合領域は疾患関連抗原に結合し、また第２のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ＣＤ３タンパク質複合体に結合し；
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む；又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む；又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号３５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。
【００２１】
これらの新規抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の使用には、様々なヒトの癌、並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療が含まれるが、但しこれらに限定されない。健常な細胞及び組織よりも癌細胞を特異的に破壊することが、腫瘍学における主要目的を代表する。腫瘍
関連細胞表面抗原に対してＴ細胞キリングを安全にリダイレクトし得る治療法は、臨床的有効性に改善をもたらす可能性がある。腫瘍学において未だ満たされていない臨床的ニーズの公知領域として、乳癌、転移性乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、但しこれらに限定されない。自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば乾癬、多発性硬化症、及び糖尿病等を治療する際には、疾患原因のＴ細胞を除去することが、Ｔ細胞の分化を阻害することよりも有益であり得る。
【００２２】
疾患関連抗原の好ましいセットは、遺伝子産物であるＣＤ３３、ＴＲＯＰ２、ＣＤ１０５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ１２３、ＡＤＡＭ１７、ＭＣＳＰ、ＰＳＣＡ、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＩｇＥ、インテグリンａ４ｂ１、ＣＣＲ５、ＬｅｗｉｓＹ、ＦＡＰ、ＭＵＣ−１、Ｗｕｅ−１、ＭＳＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｐグリコプロテイン、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、メソテリン、ＯＸ４０、ＣＡ１２５、ＣＡＩＸ、ＣＤ６６ｅ、ｃＭｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＨＧＦ／ＳＦ、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン、ＴＡＧ−７２、ＴＰＢＧ、β−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、カスパーゼ−８、ＣＤＫ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ゲージ−１、ゲージ−２、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ６、ＭＡＧＥ１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、スルビビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ウロプラキンｎ−３に由来する。
【００２３】
疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域が、
ｉ）配列番号２０６〜２１１、
ｉｉ）配列番号２１２〜２１７、
ｉｉｉ）配列番号２１８〜２２３、
ｉｖ）配列番号２２４〜２２９、
ｖ）配列番号２３０〜２３５、
ｖｉ）配列番号２３６〜２４１、
ｖｉｉ）配列番号２４２〜２４７、
ｖｉｉｉ）配列番号２４８〜２５３、
ｉｘ）配列番号２５４〜２５９、
ｘ）配列番号２６０〜２６５、
ｘｉ）配列番号２６６〜２７１、及び
ｘｉｉ）配列番号２７２〜２７７
からなる群よりそれぞれ選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、本発明によるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメント。
【００２４】
本発明の更なる態様に基づけば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントの第２のポリペプチドの定常領域は、ＩｇＧ３ＣＨ３領域を含む。
【００２５】
本発明の更なる態様に基づけば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントの第２のポリペプチドの定常領域は、ＩｇＧに由来するＣＨ３領域以外のＣＨ３領域を含み
、また非ＩｇＧ３ＣＨ３領域は、プロテインＡ結合を低下させる／無効にするように、少なくとも１つの置換を含む。
【００２６】
本発明の更なる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントの第２のポリペプチドのエピトープ結合領域は、プロテインＡ結合を低下させる少なくとも１つの修飾を含むＶＨ３領域を含む。
【００２７】
本発明者らは、単回のプロテインＡクロマトグラフィーステップを実施することにより、ＶＨ３ベースの抗原結合部位が、高純度で容易に生成及び精製可能であることを明らかにした。このような抗体は、その容易な製造に加えて、現在の療法よりも高い有効性を示す可能性がある。
【００２８】
本発明は、組換え哺乳動物の宿主細胞系統から、少なくとも１つのＶＨ３ベースの抗原結合部位を有する抗ヒトＣＤ３二重特異性重鎖ヘテロ二量体を製造する方法も提供するが、二重特異性抗体生成物は、プロテインＡクロマトグラフィーステップを単回実施した後、高純度で容易に単離される。
【００２９】
特に、修飾されたＶＨ３領域は、５７、６５、８１、８２ａ、及び１９／５７／５９の組み合わせ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、またなおいっそうより好ましくは、修飾されたＶＨ３領域は、５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、８１Ｅ、８２ａＳ、及び１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａの組み合わせ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含む。
【００３０】
本発明の更なる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、更なる置換を含み得るが、その場合、重鎖可変フレームワーク領域は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、並びに軽鎖可変フレームワーク領域は、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｔ５１Ａ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、又は重鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸置換Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含み、並びに軽鎖可変フレームワーク領域は、アミノ酸置換Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む。
【００３１】
更なる実施形態では、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラスの生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。好ましくは、重鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＶ３−２３の生成物である、又はこれに由来する。より好ましくは、重鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１８又は配列番号６０のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００３２】
好ましい実施形態では、ＣＤ３タンパク質複合体と結合する第１のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス又はヒトＶＫ３サブクラスの生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。好ましくは、軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＶＫ１−３９又はＶＫ３−２０の生成物である、又はこれに由来する。より好ましくは、軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）又はＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号２４）の生成物である、又はこれに由来する。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１９又は配列番号６１のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少な
くとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００３３】
好ましい実施形態では、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択される復帰突然変異を有するヒト化重鎖可変ドメイン、並びにＭ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔナンバリング）からなる群より選択される復帰突然変異を有するヒト化軽鎖可変ドメインを含む。より好ましくは、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域は、復帰突然変異Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔナンバリング）を有するヒト化重鎖可変ドメイン、並びに復帰突然変異Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔナンバリング）を有するヒト化軽鎖可変ドメインを含む。
【００３４】
本発明の更なる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントのＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又はＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
ＣＤ３タンパク質複合体は、いくつかのサブユニット、例えばδ、ε、及びγを含む。好ましい実施形態では、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ３εサブユニットと結合する。
【００３６】
本明細書に記載するようなエピトープ結合領域には、１つ又は複数の重鎖可変ドメイン、及び１つ又は複数の相補的な軽鎖可変ドメインの組み合わせが含まれ、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントが１つ又は複数のエピトープに特異的に結合できるようにする結合部位を共に形成する。本発明の一実施形態では、第１のポリペプチドのエピトープ結合領域はＦＡＢを含み、また第２のポリペプチドのエピトープ結合領域はｓｃＦｖを含む。あるいは、第１のポリペプチドのエピトープ結合領域はｓｃＦｖを含み、また第２のポリペプチドのエピトープ結合領域はＦＡＢを含む。
【００３７】
１つの実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＨＥＲ２と結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域、及びヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。
【００３８】
好ましい実施形態では、疾患関連抗原ＨＥＲ２に結合するエピトープ結合領域は、配列
番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。更に好ましい実施形態では、ＨＥＲ２に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントを形成するＧ4
Ｓリンカーにより連結した重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。好ましくは、ｓｃＦｖフラグメントの可変ドメインは、プロテインＡに対する結合を無効にする修飾を含み、この場合、アミノ酸置換は６５Ｓ（Ｋａｂａｔナンバリング）であり、またｓｃＦｖフラグメントは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む、又はこの場合、アミノ酸置換は８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）であり、ｓｃＦｖフラグメントは、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
特に、前記Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ結合アームは、配列番号２０によりコードされる重鎖可変領域、及び配列番号２１によりコードされる軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
別の実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ３８と結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１１２又は１１４又は１２２のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１１３又は１１５又は１２３のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００４１】
特に、ＣＤ３８結合ポリペプチドは、配列番号１１６／１１７、１２９／１３０、１３３／１３４、及び１３５／１３６によりコードされる、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの対を含む。
【００４２】
１つの実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＯＸ４０と結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００４３】
最も好ましくは、ヒト化重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、プロテインＡに対する結合を無効にする修飾を含む。
【００４４】
特に、ＯＸ４０結合ポリペプチドは、配列番号１４１／１４２、２７８／２８０、及び２７９／２８１によりコードされる、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの対を含む。
【００４５】
１つの実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ１９と結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、よ
り好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、また最も好ましくは、配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含み、また最も好ましくは、配列番号２９７のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、プロテインＡに対する結合を無効にする修飾を含む。
【００４６】
特に、ＣＤ１９結合ポリペプチドは、配列番号２９６／２９７によりコードされる、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの対を含む。
【００４７】
１つの実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ２０と結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００４８】
最も好ましくは、ヒト化重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、プロテインＡに対する結合を無効にする修飾を含む。
【００４９】
特に、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、配列番号１４３／１４４、２８２／２８４、及び２８３／２８５によりコードされる、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの対を含む。
【００５０】
１つの実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＥＧＦＲと結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００５１】
最も好ましくは、ヒト化重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、プロテインＡに対する結合を無効にする修飾を含む。
【００５２】
特に、ＣＤ２０結合ポリペプチドは、配列番号１４５／１４６、２８６／２８８、２８７／２８９、２９０／２９１、及び２９２／２９４によりコードされる、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの対を含む。
【００５３】
１つの実施形態では、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＩｇＥと結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む、対応するヒト化抗体の重鎖可変領域、又は配列番号３０４のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の生成物、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を更に含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む、対応するヒト化抗体の軽鎖可変領域、又は配列番号３０５のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００５４】
最も好ましくは、重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング）を含む、プロテインＡに対する結合を無効にする修飾を含む。
【００５５】
特に、ＩｇＥ結合ポリペプチドは、配列番号２９８／２９９、３００／３０２、３０１／３０３、３０４／３０５、３０６／３０８、及び３０７／３０９によりコードされる、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインの対を含む。
【００５６】
抗ＣＤ３抗体は、直接的機構及び間接的機構の両方により、毒性を引き起こすきっかけとなることが判明している。間接的機構には、Ｆｃ受容体発現性免疫細胞と共に作用し、一次的なＴ細胞の活性化及びサイトカインの放出を引き起こすＣＤ３抗体のＦｃ領域が関与する。従って、本明細書に記載するようなヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントの安全性を改善するために、第１及び／又は第２のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域では、エフェクター免疫細胞及び／又は補体Ｃ１ｑに対する結合性が低下している、又は存在しない。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、下部ヒンジ領域におけるＦｃ受容体結合を無効にするように工学的に作出される。より好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、置換（複数可）Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ（ＥＵナンバリング）を含む。最も好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵナンバリング）を含む。
【００５７】
別の態様では、本発明の開示は、エピトープ結合領域がＣＤ３タンパク質複合体のＣＤ３εサブユニットと結合し、示差走査式熱量測定（ＤＳＣ）により測定したときに、図９に記載するように、配列番号２５のアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列の軽鎖可変ドメインを含むＯＫＴ３キメラのＦＡＢ熱安定性よりも優れたＦＡＢ熱安定性を有するＦＡＢを含むような、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントについても記載する。
【００５８】
更なる態様では、本発明は、１つのエピトープ結合領域が、ＣＤ３タンパク質複合体のＣＤ３εサブユニットと結合し、また疾患関連抗原に結合する他方のエピトープ結合領域が、ＨＥＲ２に結合する、本明細書に記載するようなヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供する。かかるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントが、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする効力は、実施例に記載するように、フローサイトメトリー法（ＲＤＬ−ＦＡＣＳ）又は比色分析に基づく方法（ＲＤＬ−ＭＴＳ）を用いて、ＪＩＭＴ−１、ＢＴ−４７４、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１等のＨＥＲ２を発現する細胞系統について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで測定可能である。
【００５９】
１つの実施形態では、ＣＤ３ε及びＨＥＲ２と結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又
はそのフラグメントは、２１ｐＭ以下の効力で、ＪＩＭＴ−１細胞を殺傷する。あるいは、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、２ｐＭ以下の効力で、ＢＴ−４７４細胞も殺傷する。更に、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、０．２ｎＭ以下の効力で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞も殺傷する。すべての細胞系統の細胞毒性は、４８時間にわたり、１０：１のエフェクター：標的細胞比で、ヒトＰＢＭＣを用いて実施したＲＤＬアッセイ法で測定した。更に、ＪＩＭＴ−１／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験すると、このヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは強力な抗腫瘍効果を示す。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、ＪＩＭＴ−１細胞異種移植において、０．０５ｍｇ／ｋｇでＪＩＭＴ−１細胞を殺傷する。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明は、下記の物質に結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供する：
ｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１５９のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号４７の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６０のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１６１のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号３の同起源の軽鎖と会合し、及びＨＥＲ２に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｉｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１６３のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号４７の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６４のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｉｖ）第１のポリペプチドが、配列番号１６５のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１６６の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｖ）第１のポリペプチドが、配列番号１６８のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号８９の軽鎖と会合し、及びＣＤ３εに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、及びＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、
ｖｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１６９のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１１９の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｖｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１７０のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１３８の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７１のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｖｉｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１１９の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７７のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｉｘ）第１のポリペプチドが、配列番号１７８のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１２８の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ３８に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７９のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、
ｘ）第１のポリペプチドが、配列番号１７２のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が
配列番号１７３の同起源の軽鎖と会合し、及びＯＸ４０に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０、
ｘｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１７４のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１７５の同起源の軽鎖と会合し、及びＥＧＦＲに結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７１のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、
ｘｉｉ）第１のポリペプチドが、配列番号１８０のアミノ酸配列を有し、及びアミノ酸配列が配列番号１８１の同起源の軽鎖と会合し、及びＣＤ２０に結合し、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１７７のアミノ酸配列を有し、及びＣＤ３εに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０。
【００６１】
更なる実施形態では、本発明は、下記の物質に結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供する：
ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３１０のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３の軽鎖と会合し、そしてＨＥＲ２に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３１２のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号１３２の軽鎖と会合し、そしてＣＤ３８に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３１３のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号１３８の軽鎖と会合し、そしてＣＤ３８に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３１４のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３１５の軽鎖と会合し、そしてＯＸ４０に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３１６のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３１７の軽鎖と会合し、そしてＯＸ４０に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３１８のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３１９の軽鎖と会合し、そしてＣＤ２０に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３２０のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３２１の軽鎖と会合し、そしてＣＤ２０に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３２２のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３２３の軽鎖と会合し、そしてＥＧＦＲに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３２４のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３２５の軽鎖と会合し、そしてＥＧＦＲに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３２６のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３２７の軽鎖と会合し、そしてＥＧＦＲに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３２８のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３２９の軽鎖と会合し、そしてＥＧＦＲに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ１９、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３３０のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３３１の軽鎖と会合し、そしてＣＤ１９に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３３２のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３３３の軽鎖と会合し、そしてＩｇＥに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３３４のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３３５の軽鎖と会合し、そしてＩｇＥに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３３６のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３３７の軽鎖と会合し、そしてＩｇＥに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３３８のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３３９の軽鎖と会合し、そしてＩｇＥに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３４０のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号１７３の軽鎖と会合し、そしてＯＸ４０に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３４１のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号１８１の軽鎖と会合し、そしてＣＤ２０に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３４２のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号１７５の軽鎖と会合し、そしてＥＧＦＲに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３４３のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３４４の軽鎖と会合し、そしてＥＧＦＲに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ、この場合、第１のポリペプチドは、配列番号３４５のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３４６の軽鎖と会合し、そしてＩｇＥに結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する；
ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ、この場合、第１のポリペプチドは配列番号３４７のアミノ酸配列を有し、またアミノ酸配列が配列番号３４８の軽鎖と会合し、そしてＩｇＥ
に結合する一方、第２のポリペプチドは、配列番号３１１のアミノ酸配列を有し、またＣＤ３εに結合する。
【００６２】
本発明の更なる態様に基づけば、前記ＣＤ３結合ポリペプチドが、配列番号４８／５１、４９／５１、１０１／１０５、１０３／１０６、１０４／１０６、３５８／５１の群より選択される重鎖及び軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つ又は組み合わせを含み、また前記疾患関連抗原結合ポリペプチドが、配列番号２０／２１、１１６／１１７、１２９／１３０、１３３／１３４、１３５／１３６、１３９／１４０，１４１／１４２、２７８／２８０、２７９／２８１、１４３／１４４、２８２／２８４、２８３／２８５、２９６／２９７、１４５／１４６、２８６／２８８、２８７／２８９、２９０／２９１、２９２／２９４、２９３／２９５、２９８／２９９、３００／３０２、３０１／３０３、３０４／３０５、３０６／３０８、３０７／３０９の群より選択される重鎖及び軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つ又は組み合わせを含むようなヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントである。
【００６３】
二重特異性抗体の生成について上記で議論したように、分泌された二重特異性抗体生成物が組換え哺乳動物宿主細胞系統に由来する細胞培養物上清から容易に単離されるような、抗ヒトＣＤ３ホモ二量体を含まない抗ヒトＣＤ３ベースの重鎖ヘテロ二量体を効率的に生成するニーズが存在する。このような趣旨から、プロテインＡに基づく差動的精製技法が、ＶＨ３の可変ドメインサブクラスを含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを単離するのに利用可能であり、この場合、少なくとも１つ、但し好ましくは両方のＶＨ３ベースのエピトープ結合領域内にあるプロテインＡ結合部位が無効にされる。従って、別の態様では、本発明は、本明細書に記載するようなヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造する方法であって、
ｉａ）第１のポリペプチドの重鎖をコードするＤＮＡベクター及び第２のポリペプチドの重鎖をコードするＤＮＡベクターを調製するステップであって、１つ若しくは両方のＤＮＡベクター、若しくは第３のＤＮＡベクターが、共通する軽鎖、又は第１若しくは第２のポリペプチドの重鎖と会合する軽鎖を任意選択的にコードする前記ステップ、又は
ｉｂ）第１及び第２のポリペプチドの重鎖をコードする１つのＤＮＡベクターを調製するステップであって、ＤＮＡベクターが、共通する軽鎖、又は第１若しくは第２のポリペプチドの重鎖と会合する軽鎖を任意選択的にコードし、前記ＤＮＡベクターが、哺乳動物の宿主細胞内での一過性の発現若しくは安定的な発現に適する前記ステップと、
ｉｉ）（ｉ）に由来するＤＮＡベクター（複数可）を哺乳動物の宿主細胞系統にトランスフェクト又は同時トランスフェクトするステップと、
ｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞系統、又はそれから安定的に選択されたクローンを培養し、細胞培養物上清を採集するステップと、
ｉｖ）細胞培養物上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させるステップと、
ｖ）対象とするヘテロ二量体免疫グロブリンを溶出させ、収集するステップと、
を含む前記方法を提供する。
【００６４】
好ましくは、ステップ（ｖ）に由来する精製後の材料中に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、少なくとも９５％の純度である。より好ましくは、ステップ（ｖ）に由来する精製後の材料に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、少なくとも９６％の純度である。なおいっそうより好ましくは、ステップ（ｖ）に由来する精製後の材料に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントは、少なくとも９７％である。精製後の材料に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントの純度は、キャピラリー電気泳動により測定可能である。
【００６５】
本発明の更なる態様に基づけば、配列番号２２４〜２２９、２３０〜２３５、及び３５
２〜３５７の群に由来する少なくとも１つのＣＤＲ、又は配列番号１２２／１２３、１２４／１２５、１２９／１３０、１３５／１３６、１３３／１３４、１０４／１０６の群より選択される重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対、及び１２６／１２７又は１２８、１３１／１３２、１３７／１３８、３５９／３６０の群より選択される重鎖と軽鎖の配列の対からなる組み合わせを含むポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】プロテインＡを用いる、好ましい差動的アフィニティー精製技法の概略図である。重鎖は、いずれもＶＨ３ベースの抗原結合部位を含まない。凡例：［（Ａ＋）］は、機能性プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能性プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
【図２】差動的プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、１つ又は複数のＶＨ３ドメインを含む重鎖のヘテロ二量体を精製する際に直面する問題を示す概略図である。ヘテロ二量体の少なくとも１つのＶＨ３ドメイン内のプロテインＡ結合部位の突然変異に基づく解決策の例を示す。
【図２Ａ】重鎖のヘテロ二量体が重鎖内にＶＨ３ドメインを含むが、重鎖がそのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しない際に直面する問題を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しないヘテロ二量体の重鎖は、そのプロテインＡ結合部位を無効にするように突然変異したＶＨ３ドメインを含む。
【図２Ｃ】図２Ａに記載する問題に対する代替的解決策を示す図であり、ヘテロ二量体は１つのＶＨ３ドメインのみを含み、またヘテロ二量体は、そのＶＨ３ドメインが、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合する重鎖上に位置するように、工学的に作出されている（解決策としてのＶＨ３ドメイン再配置戦略）。
【図２Ｄ】ヘテロ二量体の両方の重鎖がＶＨ３ドメインを含む際に直面する問題を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｄに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、ヘテロ二量体の重鎖は、そのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しないが、そのプロテインＡ結合部位を無効にするように突然変異したＶＨ３ドメインを含む。
【図２Ｆ】図２Ｄに記載する精製問題に対する代替的解決策を示す図であり、各ＶＨ３ドメインは、そのプロテインＡ結合部位について無効にされている。四角で囲まれた種は、差動的プロテインＡクロマトグラフィープロセス期間中に、これらの種は同時溶出することを示す。ｐＨ値のＡとＢは、約１ｐＨ単位異なり、プロテインＡに結合する種の効果的な分離を可能にする。一般的に、ｐＨ  Ａ及びｐＨ  ＢのｐＨ値は、それぞれ４及び３である。すべての図の凡例：［（Ａ＋）］は機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は非機能性プロテインＡ結合部位を意味する。
【図３】Ｆｃ１３３のプロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
【図４】プロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
【図４Ａ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。
【図４Ｂ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  １３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。
【図４Ｃ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム、及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。
【図５】７つの公知のヒトＶＨフレームワークサブクラスそれぞれについて、代表的なアミノ酸配列を示す図である。配列を、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき整列させた。プロテインＡのドメインＤと相互作用するヒトＶＨ３−２３フレームワークサブクラス内の位置を太字で示す。
【図６】プロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ、及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
【図６Ａ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ。
【図６Ｂ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ａ。
【図６Ｃ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ｅ。
【図６Ｄ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｇ６５Ｓ。
【図６Ｅ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ６６Ｑ。
【図６Ｆ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ６８Ｖ。
【図６Ｇ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｑ８１Ｅ。
【図６Ｈ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｎ８２ａＳ。
【図６Ｉ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ。
【図７】ＨＥＲ２抗原に対する選択された抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ変異体の平衡解離定数（ＫＤ）を示す図である。
【図８】プロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
【図８Ａ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。
【図８Ｂ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。
【図８Ｃ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。
【図８Ｄ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。
【図９】これらの図は、すべて安定なヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化と関連する。
【図９Ａ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｂ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｃ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｄ】選択された抗体候補品のＤＳＣプロファイル。
【図９Ｅ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｆ】選択されたｓｃＦｖ−Ｆｃ候補品のＤＳＣプロファイル。
【図１０】これらの図は、すべて安定なヒトフレームワーク上のＳＰ３４ヒト化と関連する。
【図１０Ａ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。
【図１０Ｂ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ）としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ヒトとカニクイザルＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対するＳＰ３４キメラ抗体の相対的ＳＰＲデータ：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、（＋＋＋）強いが同等ではない結合、及び（＋＋＋＋）類似した結合を表す。
【図１１】これらの図は、すべて抗ヒトＣＤ３８抗体と関連する。
【図１１Ａ】ＳＰＲにより測定した、ＨＢ−７キメラ抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのＨＢ−７キメラ抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、１２５、３１、７．８、３．９、１．９、１、及び０．５ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｂ】ＳＰＲにより測定した、ヒト化ＨＢ−７最良適合抗体（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化ＨＢ−７最良適合抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｃ】ＳＰＲにより測定した、ヒト化９Ｇ７最良適合抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７最良適合抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｄ】ＳＰＲにより測定した、ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｅ】ＳＰＲにより測定した、ヒト７６７抗体とヒトＣＤ３８の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト７６７抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び１５．６ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。アフィニティーを、次の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に基づき、分析物濃度（Ｃ）に対する平衡レスポンス（Ｒｅｑ）のプロットから取得し、５０％飽和濃度はＫＤである。すべてのＳＰＲデータは、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
【図１１Ｆ】ＨＢ−７キメラ抗体及びヒト化ＨＢ−７最良適合抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｇ】９Ｇ７キメラ抗体及びヒト化９Ｇ７最良適合抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｈ】ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｉ】ヒトクローン７６７抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｊ】９Ｇ７ヒト化抗体に関する要約表である。
【図１２】代替的フォーマットのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体に関する概略図である。
【図１２Ａ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２（フォーマットＢ）抗体を示す図である。
【図１２Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３（フォーマットＣ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＤ）抗体を示す図である。
【図１２Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）（フォーマットＥ）抗体を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図１３】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のプロテインＡ精製プロファイルを示す図である（２８０ｎｍにおける吸収トレース）。カラム：１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ。流速：１ｍｌ／分。泳動バッファー：０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６。溶出バッファーＮｏ１：２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４（２０ｍｌ）。溶出バッファーＮｏ２：０．１Ｍグリシン、ｐＨ３（２０ｍｌ）。中和：１／１０容量の１Ｍトリス、ｐＨ８。
【図１４】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体調製物のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す図である。
【図１５Ａ】Ｎ８２ａＳ置換型ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
【図１５Ｂ】Ｎ８２ａＳ非置換型ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
【図１６Ａ】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＣＤ３ε抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、７４００ＲＵのヒトＣＤ３γ−ε−Ｆｃ融合タンパク質に共有結合させた。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０００、２５００、１２５０、６２５、３１２．５、及び１５６．２５ｎＭ、流速１０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニット（略号ＲＵ；Ｙ軸）の数として表す。アフィニティーを、下記の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に基づき、分析物濃度（Ｃ）に対する平衡レスポンス（Ｒｅｑ）のプロットから取得したが、５０％飽和濃度はＫＤである。
【図１６Ｂ】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＨＥＲ２抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、１５０ＲＵのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を捕捉した。ＨＥＲ２−ｈｉｓを、ＨＢＳ−Ｐ中にて、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４．１、１．４、０．５、及び０．１５ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニット（略号ＲＵ；Ｙ軸）の数として表す。
【図１６Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体のＤＳＣプロファイルを、プロファイルＡ及びＢにそれぞれ示す。
【図１７】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。抗体濃度はｎＭ表示。
【図１７Ａ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＢＴ−４７４。
【図１７Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＪＩＭＴ−１。
【図１７Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
【図１７Ｄ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。
【図１７Ｅ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
【図１７Ｆ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。
【図１７Ｇ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
【図１８】ヒトＰＢＭＣが補給されたＪＩＭＴ−１異種移植を示す図である。
【図１８Ａ】ヒトＰＢＭＣは腫瘍増殖を妨害しないことを示す図である。
【図１８Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１処理及び未処理マウスの腫瘍容積（ｍｍ3）を、ヒトＰＢＭＣドナー４例、マウス５匹のコホートについて示す図である。
【図１８Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１処理及び未処理マウスの腫瘍容積（ｍｍ3）を、ヒトＰＢＭＣドナー４例、マウス５匹のコホートについて示す図である。
【図１９】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（フォーマットＡ）、及びＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（フォーマットＢ）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２０Ａ】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体とヒトＣＤ３８抗原の間での抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧに共有結合しており、２００ＲＵのＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグ付きのタンパク質）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
【図２０Ｂ】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図２１】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：精製後のヒトＴ細胞。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー２例の平均値。標的細胞：ＲＰＭＩ８２２６。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２２】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２３】ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体を示す概略図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２４】ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、２０：１。４８時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：組換え安定ＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２５】ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体を示す概略図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２６】ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー４例の平均値。標的細胞：ＨＴ−２９細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２７】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）（フォーマットＢ）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２８】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２９】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体とヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、５００ＲＵのヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆ融合タンパク質に共有結合させた。ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２、３．１、０．８、及び０．４ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
【図３０】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体による、Ｔ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図３１】ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図３２】ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｔ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、ＣＤ３タンパク質複合体及び疾患関連抗原に結合する新規のヘテロ二量体免疫グロブリンと一般的に関連する。更に、このようなヘテロ二量体免疫グロブリンでは、プロテインＡとの結合が低下又は欠損しており、従ってアフィニティークロマトグラフィーを用いて非常に高純度の精製が可能である。
【００６８】
本明細書を解釈するために、下記の定義が適用され、また該当する場合には常に、単数形で用いられる用語には複数形も含まれ、その逆も同様である。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、制限するようには意図されないものと理解される。
【００６９】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味し、アミノ酸は、ペプチド結合により連結して、脱水合成により共に結合したアミノ酸の鎖を形成する。ポリペプチド及びタンパク質は、化学合成又は組換え発現により合成可能であり、またアミノ酸の長さは最短のものに限定されない。
【００７０】
本発明に基づけば、ポリペプチドの群は、単一のポリペプチド鎖から構成されるタンパク質である限り、「タンパク質」を含む。ポリペプチドは、多量体、例えば二量体、三量体、及びより高次のオリゴマー等を更に形成する、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる場合もある。かかる二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一であっても、また非同一であってもよい。かかる多量体の対応するより高次の構造は、従って
ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ−三量体等と呼ばれる。ヘテロ多量体の例として、抗体分子が挙げられ、これは、その本来の形態において、２つの同一の軽鎖ポリペプチド、及び２つの同一の重鎖ポリペプチドから構成される。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、天然に修飾されたポリペプチド／タンパク質とも呼ばれ、そのような修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾により有効となる。かかる修飾は、当技術分野において周知されている。更に、本発明の目的に照らせば、「ポリペプチド」とは、修飾、例えば本来の配列に対する欠損、付加、及び置換等（これらは、本来保存的であり得る）を含むタンパク質を意味する。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるように計画的であり得る、又はタンパク質を生成する宿主の突然変異等又はＰＣＲ増幅に起因する過誤により、偶発的であり得る。
【００７１】
本明細書で用いる場合、用語「ＣＤ３複合体」とは、ＣＤ３（分化抗原群３）Ｔ細胞コレセプターとして知られているタンパク質複合体を意味する（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ＫＷら、（２０１０）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ、第２巻（４）：ａ００５１４０）。ＣＤ３タンパク質複合体は、４つの異なる鎖から構成される。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）として知られている分子と会合し、ζ鎖がＴリンパ球内で活性化シグナルを生成する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ  ＰＡ、及びＤｕｓｈｅｋ  Ｏ、（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１１巻（１）：４７〜５５頁）。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は、共にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーからなる高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能力にとって不可欠である、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）又は略してＩＴＡＭとして知られている単一の保存性モチーフを含む。ＣＤ３は、Ｔ細胞活性化に必要であるため、ＣＤ３を標的とする薬物（多くの場合モノクロナール抗体）は、免疫抑制療法として研究されてきたが、現在も研究されている。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「疾患関連抗原」とは、疾患プロセスに関与する分子を意味する。疾患関連抗原の例は、広範囲の治療分野、例えば炎症、癌、及び自己免疫疾患等に見出される。腫瘍学では、疾患関連抗原は、患者母集団内の癌、例えば前立腺癌のＥｐＣＡＭ抗原をスクリーニング、及び／又はモニタリング、及び／又は治療の標的とするのに幅広く利用可能な分子である。腫瘍抗原は、腫瘍により直接的に、又は腫瘍の存在に対する反応として非腫瘍細胞により産生され得るが、好ましい腫瘍抗原は細胞表面分子である。炎症性の疾患関連抗原は公知であり、ＴＮＦ−αやＩＬ−１等の炎症促進性サイトカインが挙げられるが、但しこれらに限定されない。自己免疫疾患関連抗原も公知である；このような例として、全身性エリテマトーデスの二本鎖ＤＮＡに対する抗体や、アルツハイマー病のアミロイドβペプチドが挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【００７３】
本明細書で引用する場合、用語「免疫グロブリン」とは、用語「抗体」と交換可能に利用可能である。免疫グロブリンには、完全長抗体及びあらゆる抗原結合フラグメント又はその一本鎖が含まれる。免疫グロブリンは、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。免疫グロブリン、特に天然由来の抗体は糖タンパク質であり、４つのポリペプチド鎖から構成されるＹ字形のユニットの１つ又は複数のコピーとして存在する。各「Ｙ」字形は、２つの同一の重鎖（Ｈ）のコピーと、２つの同一の軽鎖（Ｌ）のコピーを含有し、これら鎖の相対的な分子量によりそのように命名されている。各軽鎖は重鎖と対をなし、また各重鎖は別の重鎖と対をなす。共有結合性の鎖間ジスルフィド結合及び非共有結合性の相互作用がこれらの鎖を共に繋ぐ。免疫グロブリン、特に天然由来の抗体は可変領域を含むが、これは抗原結合部位の２つのコピーである。タンパク質分解酵素のパパインは、「Ｙ」字
形を３つの異なる分子に分割し、２つは、いわゆる「Ｆａｂ」又は「ＦＡＢ」フラグメント（Ｆａｂ＝抗原結合フラグメント）、及び１つは、いわゆる「Ｆｃ」フラグメント又は「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝結晶化可能なフラグメント）である。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の全部及び重鎖の一部から構成される。重鎖は、１つの可変領域（ＶＨ）と、３又は４つの定常領域（抗体クラス又はアイソタイプに応じてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含有する。ＣＨ１とＣＨ２領域の間の領域は、ヒンジ領域と呼ばれ、Ｙ字形抗体分子の２つのＦａｂアーム間において可撓性を付与し、一定の距離で隔てられた２つの抗原決定基にうまく結合するように、２つのアームが開閉できるようにする。本明細書で引用する場合、「ヒンジ領域」とは、長さ６〜６２個のアミノ酸からなる配列領域であり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ中にのみ存在し、２本の重鎖を架橋するシステイン残基を含む。ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの重鎖は、それぞれ４つの領域、すなわち１つの可変領域（ＶＨ）と３つの定常領域（ＣＨ１〜３）を有する。ＩｇＥ及びＩｇＭは、１つの可変領域と４つの定常領域（ＣＨ１〜４）を重鎖上に有する。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び補体系古典的経路の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子との結合に関与している可能性がある。各軽鎖は、１つの共有結合性のジスルフィド結合により、重鎖と通常結合する。各軽鎖は、１つの可変領域（ＶＬ）と１つの軽鎖定常領域を備える。軽鎖定常領域は、本明細書ではＩＧＫＣと呼ぶκ軽鎖定常領域である、又は本明細書ではＩＧＬＣと呼ぶλ軽鎖定常領域である。ＩＧＫＣは、本明細書ではＣκ又はＣＫと等価で用いられ、また同一の意味を有する。ＩＧＬＣは、本明細書ではＣλ又はＣＬと等価で用いられ、また同一の意味を有する。用語「ＩＧＬＣ領域」は、本明細書で用いる場合、すべてのλ軽鎖定常領域、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７からなる群より選択されるすべてのλ軽鎖定常領域を意味する。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）と呼ばれる、より保存性の領域と共に点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かい、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列している。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトープ結合領域を含む。工学的に作出された免疫グロブリンは、異なるエピトープ結合領域フォーマット、例えばｓｃＦｖ、ＦＡＢ、又はｄＡｂフラグメント等を含み得る。これらのフラグメントは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域への遺伝子融合により、抗体様の構造に通常組み立てられる。工学的に作出された免疫グロブリンは、ヘテロ二量化増強法を使用して又は使用しないで、ホモ又はヘテロ二量体として構築され得るが、モノ又は二重特異性結合特性を有し得る。
【００７４】
用語「完全長抗体」には、本明細書で用いる場合、可変領域及び定常領域を含む、抗体の本来の生物学的形態を構成する構造が含まれる。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの完全長抗体は、四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖からなる２つの等しい対から構成され、各対は１本の軽鎖及び１本の重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリン領域ＶＬ及び軽鎖定常領域を含み、及び各重鎖は、免疫グロブリン領域ＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２  （Ｃγ２）、ＣＨ３（Ｃγ３）、及びＣＨ４（Ｃγ４）を含む（抗体クラス又はアイソタイプに応じて）。一部の哺乳動物、例えばラクダやラマでは、ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖のみから構成される場合もあり、各重鎖は、Ｆｃ領域に連結した可変領域を含む。
【００７５】
抗体は、定常領域毎に遺伝学的に決定されたアイソタイプとも呼ばれる複数のクラスにグループ化される。ヒト軽鎖定常領域は、κ（ＣＫ）軽鎖及びλ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマー（γ）、アルファ（α）、又はイプシロン（ε）として分類され、また抗体のアイソタイプを、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとそれぞれ定義する。従って、「アイソタイプ」とは、本明細書で用いる場合、その定常領域の化学的及び抗原的特徴的により定義される免疫グロブリンの
あらゆるクラス及び／又はサブクラスを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプとして、ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）、ＩＧＨＧ２（ＩｇＧ２）、ＩＧＨＧ３（ＩｇＧ３）、ＩＧＨＧ４（ＩｇＧ４）、ＩＧＨＡ１（ＩｇＡ１）、ＩＧＨＡ２（ＩｇＡ２）、ＩＧＨＭ（ＩｇＭ）、ＩＧＨＤ（ＩｇＤ）、及びＩＧＨＥ（ＩｇＥ）が挙げられる。いわゆるヒト免疫グロブリン擬ガンマーＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列化されているが、スイッチ領域の変化に起因してタンパク質をコードしない追加のヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を表す（Ｂｅｎｓｍａｎａ  Ｍら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第１６巻（７）：３１０８頁）。スイッチ領域が変化しているにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン擬ガンマーＩＧＨＧＰ遺伝子は、すべての重鎖定常領域（ＣＨ１〜ＣＨ３）及びヒンジについて、オープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常領域に関するすべてのオープンリーディングフレームは、予測された構造的特徴を有するすべてのヒト免疫グロブリン定常領域とよく一致するタンパク質領域をコードする。この更なる擬ガンマーアイソタイプは、本明細書では、ＩｇＧＰ又はＩＧＨＧＰと呼ぶ。その他の擬免疫グロブリン遺伝子、例えばヒトグロブリン重鎖定常領域εＰ１及びＰ２擬遺伝子（ＩＧＨＥＰ１及びＩＧＨＥＰ２）等も報告されている。ＩｇＧクラスが、治療目的で最も一般的に用いられる。ヒトでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＧ３を含む。
【００７６】
本明細書で用いる場合、用語「免疫グロブリンフラグメント」には、（ｉ）例えばＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３領域を含む領域、（ｉｉ）Ｆａｂ’及びＦａｂ’−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、又はＣＫ、及びＣＨ１領域からなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨ領域及びＣＨ１領域からなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一の可変領域から構成される、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ＥＳら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻（６２４２）：５４４〜６頁）、（ｉｖ）２つの連結したＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）2フラグメント、（ｖ）ＶＨ領域及びＶＬ領域が、ペ
プチドリンカーにより結合し、２つの領域が会合して抗原結合部位を形成するのを可能にしている単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻（４８７７）：４２３〜６頁；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第８５巻（１６）：５８７９〜８３頁）、（ｖｉ）「二重特異性抗体」又は「三重特異性抗体」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性フラグメント（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら、（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第９０巻（１４）：６４４４〜８頁；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ、及びＨｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、第３２６巻：４６１〜７９頁）、（ｖｉｉ）ｓｃＦｖ、二機能性抗体又はＦｃ領域と融合した領域抗体、並びに（ｖｉｉｉ）同一の抗体又は異なる抗体と融合したｓｃＦｖが含まれるが、但しこれらに限定されない。
【００７７】
用語「可変領域」とは、抗原結合に関与する領域又はドメインを意味し、また特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。天然由来の抗体では、抗原結合部位は、特異性を規定する２つの可変領域から構成される：一方は重鎖に所在し、本明細書では重鎖可変領域（ＶＨ）と呼び、また他方は軽鎖に所在し、本明細書では軽鎖可変領域（ＶＬ）と呼ぶ。ヒトでは、重鎖可変領域（ＶＨ）は、７つのサブグループ又はサブクラス：ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、及びＶＨ７に分割され得る。場合によっては、特異性は、ラクダ類に見出される重鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体のように、２つの領域のうちの１つにのみもっぱら存在する可能性がある。Ｖ領域は、通常、長さ約１１０個のアミノ酸であり、また長さが７〜１７個のアミノ酸「高度可変領域」と呼ばれる極めて可変性のより短い領域により分離された、１５〜３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ又は「非ＣＤＲ領域」）と呼ばれるアミノ酸配列の比較的不変性のストレッチ（ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｓｔｒｅｔｃｈ）から構成される。本来の重鎖及び軽鎖
の可変ドメインは、４つのＦＲを含み、主としてβ−シートコンフィギュレーションの構成を採り、ループを形成する３つの高度可変領域により連結される。各鎖内の高度可変領域は、ＦＲにより接近して共に保持され、また他の鎖に由来する高度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、前出を参照）。用語「高度可変領域」とは、本明細書で用いる場合、抗原結合に関わる抗体のアミノ酸残基を意味する。高度可変領域は、後ろになるほど配列変動が最も高くなる及び／又は抗原認識に関与する「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を一般的に含む。可変領域のナンバリングは、すべてＫａｂａｔに基づく（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、前出）。
【００７８】
いくつかのＣＤＲ定義が現在使用されており、本明細書でも取り入れている。Ｋａｂａｔの定義は、配列変動に基づき、また最も一般的に用いられている（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、前出）。Ｃｈｏｔｈｉａは、むしろ構造的なループの場所を引用する（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ  Ｊ、（１９８７）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第１９６巻：９０１〜９１７頁）。ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第８６巻：９２６８〜９２７２頁；Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、第２０３巻：１２１〜１５３頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、第１巻：１２６〜１３６頁；Ｒｅｅｓ  ＡＲら、（１９９６）Ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１〜１７２頁）で用いられている。接触定義が最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭら、（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第２６２巻：７３２〜７４５頁）、タンパク質データバンクで入手可能である利用可能な複合体構造の解析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）によるＣＤＲの定義（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）は、すべての種のすべての免疫グロブリン及びＴ細胞レセプターＶ領域に関するＩＭＧＴナンバリングに基づく（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２７巻（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ  Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２８（１）巻：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２９（１）巻：２０７〜９；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第３１（１）巻：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第２９巻（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ  Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第６巻（４）：２５３〜６４頁）。すべての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、本発明で引用する場合、好ましくは以下のように定義される（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、前出によるナンバリング）：ＬＣＤＲ１：２４〜３４、ＬＣＤＲ２：５０〜５６、ＬＣＤＲ３：８９〜９８、ＨＣＤＲ１：２６〜３５、ＨＣＤＲ２：５０〜６５、ＨＣＤＲ３：９５〜１０２。
【００７９】
可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている。ＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２３（ＦＲｌ）、３５〜４９  （ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、及び９９〜１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２５（ＦＲｌ）、３６〜４９（ＦＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＦＲ４）を含む。
【００８０】
本発明のＣＤＲは、上記定義に基づき、また以下のような可変ドメイン残基を有する「拡張型ＣＤＲ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ＣＤＲ）」を含み得る：ＬＣＤＲ１：２４〜３６、ＬＣＤＲ２：４６〜５６、ＬＣＤＲ３：８９〜９７、ＨＣＤＲ１：２６〜３５、ＨＣＤＲ２：４７〜６５、ＨＣＤＲ３：９３〜１０２。これらの拡張型ＣＤＲも、やはり、Ｋａｂａｔら、前出によりナンバリングされる。ＶＬ領域の「非拡張型ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２３（ＦＲ１）、３７〜４５（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、及び９８〜約１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非拡張型ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２５（ＦＲ１）、３７〜４６（ＦＲ２）、６６〜９２（ＦＲ３）、及び１０３〜約１１３（ＦＲ４）を含む。
【００８１】
用語「Ｆａｂ」若しくは「ＦＡＢ」、又は「Ｆａｂ領域」若しくは「ＦＡＢ領域」には、本明細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及び軽鎖定常免疫グロブリン領域を含むポリペプチドが含まれる。Ｆａｂは、この領域単独を指す、又は完全長抗体又は抗体フラグメントにおけるこの領域を指す場合がある。
【００８２】
用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」には、本明細書で用いる場合、抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドが含まれるが、但し第１の定常領域免疫グロブリン領域を除く。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後２つの定常領域免疫グロブリン領域、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後３つの定常領域の免疫グロブリン領域、及びこれらの領域に対してＮ末端側の可撓性ヒンジを意味する。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリン領域Ｃガンマー２及びＣガンマー３（Ｃγ２及びＣγ３）、及びＣガンマー１（Ｃγｌ）及びＣガンマー２（Ｃγ２）の間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むように通常定義され、この場合のナンバリングはＥＵインデックスに基づく。Ｆｃは、この領域単独を指す、又はＦｃポリペプチド、例えば抗体におけるこの領域を指す場合がある。
【００８３】
用語「免疫グロブリン定常領域」は、本明細書で用いる場合、ヒト又は動物種に由来する免疫グロブリン又は抗体重鎖定常領域を意味し、またすべてのアイソタイプを含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒト由来であり、またＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ２  ＣＨ１、ＩＧＨＧ３  ＣＨ１、ＩＧＨＧ４  ＣＨ１、ＩＧＨＡ１  ＣＨ１、ＩＧＨＡ２  ＣＨ１、ＩＧＨＥ  ＣＨ１、ＩＧＨＥＰ１  ＣＨ１、ＩＧＨＭ  ＣＨ１、ＩＧＨＤ  ＣＨ１、ＩＧＨＧＰ  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２、ＩＧＨＧ２  ＣＨ２、ＩＧＨＧ３  ＣＨ２、ＩＧＨＧ４  ＣＨ２、ＩＧＨＡ１  ＣＨ２、ＩＧＨＡ２  ＣＨ２、ＩＧＨＥ
ＣＨ２、ＩＧＨＥＰ１  ＣＨ２、ＩＧＨＭ  ＣＨ２、ＩＧＨＤ  ＣＨ２、ＩＧＨＧＰ  ＣＨ２、ＩＧＨＧ１  ＣＨ３、ＩＧＨＧ２  ＣＨ３、ＩＧＨＧ３  ＣＨ３、ＩＧＨＧ４  ＣＨ３、ＩＧＨＡ１  ＣＨ３、ＩＧＨＡ２  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ３、ＩＧＨＥＰ１  ＣＨ３、ＩＧＨＭ  ＣＨ３、ＩＧＨＤ  ＣＨ３、ＩＧＨＧＰ  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ４
及び  ＩＧＨＭ  ＣＨ４からなる、但しこれらに限定されない群から選択される。好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのＩＧＨＥ  ＣＨ２、ＩＧＨＭ  ＣＨ２、ＩＧＨＧ１  ＣＨ３、ＩＧＨＧ２  ＣＨ３、ＩＧＨＧ３  ＣＨ３、ＩＧＨＧ４  ＣＨ３、ＩＧＨＡ１  ＣＨ３、ＩＧＨＡ２  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ３、ＩＧＨＭ  ＣＨ３、ＩＧＨＤ
ＣＨ３  及び  ＩＧＨＧＰ  ＣＨ３からなる群より選択される。より好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのＩＧＨＧ１  ＣＨ３、ＩＧＨＧ２  ＣＨ３、ＩＧＨＧ３  ＣＨ３、ＩＧＨＧ４  ＣＨ３、ＩＧＨＡ１  ＣＨ３、ＩＧＨＡ２  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ３、ＩＧＨＭ  ＣＨ３、ＩＧＨＤ  ＣＨ３、及びＩＧＨＧＰ  ＣＨ３からなる群より選択される。
【００８４】
用語「エピトープ結合領域」には、免疫グロブリン分子が１つ又は複数のエピトープと特異的に結合可能にする、最低限のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのフラグメ
ントが含まれる。天然由来の抗体は、抗原結合、又は複合部位、又はパラトープとしても公知である２つのエピトープ結合領域を有する。天然由来の抗体中のエピトープ結合領域は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲ領域内に限局しており、そこでアミノ酸媒介性のエピトープ結合が見出される。天然由来の抗体に付加して、人工的なＶＨドメイン、又はＶＬドメイン、又はそのフラグメント、及びその組み合わせを工学的に作出して、エピトープ結合領域を提供することができる（Ｈｏｌｔ  ＬＪら、（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２１巻（１１）：４８４〜４９０頁；Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ  Ｌら、（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、第３巻（６）：ｅ２３７１頁）。非免疫グロブリンに基づくエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域を工学的に作出するための「スキャフォールド」として用いられる人工タンパク質ドメイン（Ｂｉｎｚ  ＨＫら、（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２３巻（１０）：１２５７〜１２６８頁）、又はペプチド模倣体（Ｍｕｒａｌｉ  Ｒ、及びＧｒｅｅｎｅ  ＭＩ（２０１２）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、第５巻（２）：２０９〜２３５頁）に見出すことができる。好ましくは、用語「エピトープ結合領域」には、免疫グロブリン分子が１つ又は複数のエピトープと特異的に結合可能にする結合部位を共に形成する、１つ又は複数の重鎖可変ドメインと１つ又は複数の相補的な軽鎖可変ドメインとの組み合わせが含まれる。本発明に例示するようなエピトープ結合領域の例として、ｓｃＦｖ及びＦＡＢが挙げられる。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「エピトープ」には、動物において、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒトにおいて、抗原誘発性又は免疫誘発性の活性を有するポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子のフラグメントが含まれる。免疫誘発性の活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を引き起こすポリペプチド又はタンパク質のフラグメントである。抗原誘発性の活性を有するエピトープは、当業者にとって周知の任意の方法、例えば免疫測定法により決定されるような、抗体又はポリペプチドが特異的に結合するポリペプチド又はタンパク質のフラグメントである。抗原誘発性のエピトープは、必ずしも免疫誘発性である必要はない。好ましくは、用語「エピトープ」は、本明細書で用いる場合、少なくとも約３〜５個、好ましくは約５〜１０、又は１５個のアミノ酸であって、かつ約１，０００個以下のアミノ酸（又はその間の任意の整数）からなるポリペプチド配列を意味し、かかる配列に応答して生成された抗体と、そのもの又はより長い配列の一部として結合する配列を定義する。フラグメントの長さについて上限臨界値は存在せず、ほぼ完全長のタンパク質配列、又は１つ又は複数のエピトープを含む融合タンパク質さえも含み得る。対象とする発明で用いられるエピトープは、導出元の親タンパク質の部分の配列と全く同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。従って、用語「エピトープ」は、本来の配列と同一の配列の他、本来の配列の修飾、例えば欠損、付加、及び置換等（一般的に保存的な性質の）を含む。タンパク質抗原のエピトープは、その構造及びエピトープ結合部位との相互作用に基づき、立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）及び直線状エピトープ（ｌｉｎｅａｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ）の２つのカテゴリーに分割される（Ｇｏｌｄｓｂｙ  Ｒら、（２００３）“Ａｎｔｉｇｅｎｓ  （Ｃｈａｐｔｅｒ３）”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、５７〜７５頁、ＩＳＢＮ  ０−７１６７−４９４７−５）。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションから構成される。このエピトープは、抗原の３Ｄ表面特性、及び形状、又は三次構造に基づき、パラトープと相互作用する。ほとんどのエピトープは、立体構造エピトープである。対照的に、直線状エピトープは、その一次構造に基づき、パラトープと相互作用する。直線状エピトープは、抗原由来の連続的なアミノ酸配列により形成される。
【００８６】
用語「ヘテロ二量体ヘテロ免疫グロブリン」、又は「ヘテロ二量体フラグメント」、又は「ヘテロ二量体」、又は「重鎖のヘテロ二量体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン分子、又は第１及び第２のポリペプチドを少なくとも含むその部分、例えば第１及び第２の領域を含み、第２のポリペプチドのアミノ酸配列は第１のポリペプチドの配列と
異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、２本のポリペプチド鎖を含み、第１の鎖は、第２の鎖とは非同一の少なくとも１つの領域を有し、また両方の鎖はその非同一領域を介して会合する、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、少なくとも２つの異なるリガンド、抗原、又は結合部位に対して結合特異性を有する、すなわち二重特異性である。ヘテロ二量体免疫グロブリンには、本明細書で用いる場合、完全長二重特異性抗体、二重特異性Ｆａｂ、二重特異性Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ
領域と融合した二重特異性ｓｃＦｖ、Ｆｃ領域と融合した二機能性抗体、及びＦｃ領域と融合したドメイン抗体が含まれるが、但しこれらに限定されない。
【００８７】
用語「ホモ二量体免疫グロブリン」、又は「ホモ二量体フラグメント」、又は「ホモ二量体」、又は「重鎖のホモ二量体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン分子、又は第１及び第２のポリペプチドを少なくとも含むその部分、例えば第１及び第２の領域を含み、第２のポリペプチドのアミノ酸配列は、第１のポリペプチドの配列と同一である。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンは、２本のポリペプチド鎖を含み、第１の鎖は、第２の鎖と同一の少なくとも１つの領域を有し、また両方の鎖はその同一の領域を介して会合する、すなわち相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンフラグメントは、少なくとも２つの領域を含み、第１の領域は、第２の領域と同一であり、また両方の領域は、そのタンパク質−タンパク質界面を介して会合する、すなわち相互作用する。
【００８８】
本発明に含まれるすべての免疫グロブリン定常領域について、ナンバリングは、ＩＭＧＴ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標）；前出）に準拠し得る。
【００８９】
ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、及びＩＧＨＧ４からなる群より選択されるすべてのヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常領域について、ナンバリングは、「ＥＵナンバリングシステム」（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第６３巻（１）：７８〜８５頁）に準拠し得る。ＩＧＨＧ１のヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域に関する文献全文は、ＩＭＧＴデータベースに見出すことができる（ＩＭＧＴ（登録商標）；前出）。
【００９０】
ヒトκ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＫＣ）について、ナンバリングは、「ＥＵナンバリングシステム」（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、前出）に準拠し得る。ヒトＣＫ領域に関する文献全文は、ＩＭＧＴデータベースに見出すことができる（ＩＭＧＴ（登録商標）；前出）。
【００９１】
ヒトλ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７）について、ナンバリングは、「Ｋａｂａｔナンバリングシステム」（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、前出）に準拠し得る。ヒトＩＧＬＣ領域に関する文献全文は、ＩＭＧＴデータベースに見出すことができる（ＩＭＧＴ（登録商標）；前出）。
【００９２】
ヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリン重鎖定常領域は、本明細書で引用する場合、下記の領域境界を有する：ＣＨ１領域（ＥＵナンバリング：１１８〜２１５）、ヒンジγ１領域（ＥＵナンバリング：２１６〜２３０）、ＣＨ２領域（ＥＵナンバリング：２３１〜３４０）、及びＣＨ３領域（ＥＵナンバリング：３４１〜４４７）。本明細書で引用するヒトＣＫ領域は、残基１０８〜２１４（ＥＵナンバリング）に及ぶ。本明細書で引用するヒトＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７領域は、残基１０８〜２１５（Ｋａｂａｔナンバリング）に及ぶ。
【００９３】
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」には、本明細書で用いる場合、天然のアミノ酸の他に、非天然のアミノ酸が含まれる。好ましくは、天然のアミノ酸が含まれる。
【００９４】
用語「修飾」又は「アミノ酸修飾」には、本明細書では、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠損が含まれる。用語「置換」又は「アミノ酸置換」又は「アミノ酸残基置換」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列内の第１のアミノ酸残基が第２のアミノ酸残基と置換することを意味し、この場合、第１のアミノ酸残基は、第２のアミノ酸残基とは異なる、すなわち置換したアミノ酸残基は置換されたアミノ酸とは異なる。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、９４の位置のアルギニンがリジンと置換した、変異ポリペプチドを意味する。例えば、９４Ｋは、９４の位置におけるリジンとの置換を表す。本明細書の場合、多重置換は、スラッシュ又はコンマにより一般的に区別される。例えば「Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖ」又は「Ｒ９４Ｋ，Ｌ７８Ｖ」は、置換Ｒ９４Ｋ及びＬ７８Ｖを含む二重変異体を意味する。「アミノ酸の挿入」又は「挿入」とは、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列内の特定の位置にアミノ酸を付加することを意味する。例えば、挿入−９４は、９４の位置における挿入を表す。「アミノ酸の欠損」又は「欠損」とは、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列内の特定の位置でアミノ酸を除去することを意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４の位置におけるアルギニンの欠損を表す。
【００９５】
特定の実施形態では、プロテインＡとの結合が「減少する」、「低下する」、又はその「低下」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、修飾された免疫グロブリン又はそのフラグメントとプロテインＡとの結合が、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％、最大１００％（除去）の全体的な減少を意味し、標準技術による公知の方法、例えば本明細書に記載する方法等により検出される。ある特定の実施形態では、これらの用語は、あるいは全体的な減少の倍率が、１０倍（すなわち、１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（又は３ｌｏｇ）、１０，０００倍（又は４ｌｏｇ）、又は１００，０００倍（又は５ｌｏｇ）を意味し得る。
【００９６】
プロテインＡ結合を「取り除く」、「無効にする」、その「除去」、又は「無効」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、修飾された免疫グロブリン又はそのフラグメントとプロテインＡとの結合が全体として１００％減少すること、すなわち修飾された免疫グロブリン又はそのフラグメントのプロテインＡとの結合が完全喪失することを意味し、標準技術による公知の方法、例えば本明細書に記載する方法等により検出される。
【００９７】
同様に、アフィニティー試薬との結合が「減少する」、「低下する」、又はその「低下」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、修飾された免疫グロブリン又はそのフラグメントとアフィニティー試薬との結合が、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％、最大１００％（除去）の全体的な減少を意味し、標準技術による公知の方法、例えば本明細書に記載する方法等により検出される。ある特定の実施形態では、これらの用語は、あるいは全体的な減少の倍率が、１０倍（すなわち、１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（又は３ｌｏｇ）、１０，０００倍（又は４ｌｏｇ）、又は１００，０００倍（又は５ｌｏｇ）を意味し得る。
【００９８】
アフィニティー試薬との結合を「取り除く」、「無効にする」、その「除去」、又は「無効」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、修飾された免疫グロブリン又はそのフラグメントとアフィニティー試薬との結合が全体として１００％減少すること、すなわち修飾された免疫グロブリン又はそのフラグメントのアフィニティー試薬との結合が完全喪失することを意味し、標準技術による公知の方法、例えば本明細書に記載する方法等によ
り検出される。
【００９９】
「二重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクロナール抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、親の抗体と比較して、ＶＨ領域内に１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。また、二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるのにも利用可能である。このような抗体は、標的抗原結合アーム、及び例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体ハプテン等の細胞毒性薬に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製可能である。二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、２対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖の同時発現に基づき、この場合、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、第３０５巻：５３７〜４０頁）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖は非選択組み合わせであることから、そのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる抗体分子の混合物を生成する可能性があり、そのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィーステップにより通常実施されるが、この精製法はかなり煩雑であり、生成物の収率も低い。類似した手順は、国際公開第１９９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒらの（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ、第１０巻：３６５５〜９頁に開示されている。異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常領域配列と融合している。融合の相手は、例えばヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を備えた第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、少なくとも１つの融合体中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、異なる発現ベクターに挿入され、適する宿主生物内に同時トランスフェクトされる。こうすれば、構築で用いられる３本のポリペプチド鎖の比が等しくなく、そのような比が最適な収率を実現するような実施形態においては、３本のポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する際に柔軟性が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖が等しい比で発現し、これが高収率を実現する場合、又は比が特に重要でない場合には、２本又は３本すべてのポリペプチド鎖に関するコーディング配列を、１つの発現ベクター内に挿入することも可能である。
【０１００】
二重特異性抗体には、架橋型又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート内の１つの抗体はアビジンと、他方はビオチンと結合可能である。かかる抗体は、免疫系細胞が、例えば望ましくない細胞を標的とするように（米国特許第４，６７６，９８０号）、またＨＩＶ感染の治療用として（国際公開第１９９１／００３６０号、同第１９９２／００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を用いて作製可能である。適する架橋剤は、いくつかの架橋技法と共に当技術分野において周知されている（米国特許第４，６７６，９８０号を参照）。３価以上の抗体も考えられる。例えば、三重特性抗体が調製可能である（Ｔｕｔｔ  Ａら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻：６０〜９頁を参照）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本開示は、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはそのフラグメント、又はＣＤ３と、腫瘍抗原、サイトカイン、血管増殖因子、及びリンパ脈管新生増殖因子（ｌｙｍｐｈｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の群の内より選択される疾患関連抗原とに結合する二重特異性完全長抗体を提供する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはそのフラグメント又は二重特異性抗体は、ＣＤ３と、ＣＤ３３、ＴＲＯＰ２、ＣＤ１０５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＥＡ
、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ１２３、ＡＤＡＭ１７、ＭＣＳＰ、ＰＳＣＡ、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＩｇＥ、インテグリンａ４ｂ１、ＣＣＲ５、ＬｅｗｉｓＹ、ＦＡＰ、ＭＵＣ−１、Ｗｕｅ−１、ＭＳＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｐグリコプロテイン、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、メソテリン、ＯＸ４０、ＣＡ１２５、ＣＡＩＸ、ＣＤ６６ｅ、ｃＭｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＨＧＦ／ＳＦ、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン、ＴＡＧ−７２、ＴＰＢＧ、β−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、カスパーゼ−８、ＣＤＫ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ゲージ−１、ゲージ−２、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ６、ＭＡＧＥ１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３  ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、スルビビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ウロプラキンｎ−３、ＰＳＭＡからなる群より選択される疾患関連抗原とに結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはそのフラグメント、又は二重特異性抗体は、ＣＤ３とＨＥＲ２、又はＣＤ３とＣＤ３８、又はＣＤ３とＯＸ４０とに結合する。
【０１０２】
プロテインＡ：プロテインＡは、黄色ブドウ球菌のいくつかの系統により産生される細胞壁構成要素であり、単一のポリペプチド鎖から構成される。プロテインＡ遺伝子産物は、病原体の細胞壁に直列に連結した５つの相同的リピートから構成される。５つのドメインは、長さ約５８個のアミノ酸であり、ＥＤＡＢＣで表され、それぞれは免疫グロブリン結合活性を示す（Ｔａｓｈｉｒｏ  Ｍ、及びＭｏｎｔｅｌｉｏｎｅ  ＧＴ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、第５巻（４）：４７１〜４８１頁）。５つの相同的免疫グロブリン結合ドメインは、３束のヘリックスに折り畳まれている。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、とりわけＩｇＧに結合することができる（Ｈｏｂｅｒ  Ｓら、（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、第８４８巻（１）：４０〜４７頁）。プロテインＡは、ほとんどの免疫グロブリンの重鎖に、Ｆｃ領域において結合するだけでなく、ヒトＶＨ３ファミリーの場合はＦａｂ領域においても結合する（Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｂら、（１９９８）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２０巻（１）：６９〜７８頁）。プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギ、及びモルモットを含む様々な種に由来するＩｇＧに結合するが、ヒトＩｇＧ３には結合しない（Ｈｏｂｅｒ
Ｓら、（２００７）前出）。ヒトＩｇＧ３がプロテインＡに結合できないのは、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域内にはＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ置換が存在することにより説明可能である（ＥＵナンバリング、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２０１巻（１）：２５〜３４頁）。ＩｇＧの他に、プロテインＡは、ＩｇＭ及びＩｇＡとも相互作用する。
【０１０３】
ヒトＶＨサブクラスの中でも、ＶＨ３は、プロテインＡに結合する唯一のサブクラスであり（Ｇｒａｉｌｌｅ  Ｍら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、第９７巻（１０）：５３９９〜５４０４頁）、またプロテインＡの５つすべてのドメインは、この可変ドメインサブクラスに結合することが公知である（Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｂら、（１９９８）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２０巻（１）：６９〜７８頁）。ＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はそのフラグメントは、バイオテクノロジー業界にとって多大な重要性を有する。ＶＨ３ベースの分子がプロテインＡ
に結合する能力は、その機能的な事前スクリーニングをし易くするので、ＶＨ３ベースの分子は幅広く開発されており、従って多くの合成若しくはドナーベースのファージディスプレーライブラリ、又は抗体の探索で用いられる遺伝子組換え動物技術は、ＶＨ３サブクラスに基づく。更に、ＶＨ３ベースの分子は、その他の公知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも発現及び安定性において良好であることから、頻繁に選択される。
【０１０４】
プロテインＡが、そのように高いアフィニティーを有して抗体に結合する能力は、生物医薬品においてそれを工業的規模で使用する動機付けとなる。バイオ医薬品業界で抗体を製造する際に用いられるプロテインＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での組換え法により通常製造され、また天然のプロテインＡと実質的に同様に機能する（Ｌｉｕ  ＨＦら、（２０１０）ＭＡｂｓ、第２巻（５）：４８０〜４９９頁）。最も一般的には、組換えプロテインＡは、抗体精製用の固定相クロマトグラフィー樹脂に結合している。最適な結合は、ｐＨ８．２で生ずるが、結合は、中性又は生理条件（ｐＨ７．０〜７．６）においても良好である。溶出は、酸性ｐＨ（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５〜３．０）に向かってｐＨを変化させることにより通常実現する。この溶出法は、タンパク質構造に永久的な影響を及ぼすことなく、ほとんどのタンパク質−タンパク質及び抗体−抗原結合相互作用を有効に解離させる。それにもかかわらず、一部の抗体やタンパク質は、低ｐＨにより損傷を受けることがあり、低ｐＨ条件に置かれる時間を最低限に抑えるために、回収直後に１／１０容量のアルカリ性バッファー、例えば１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０等を添加して中和するのが最良である。
【０１０５】
様々なプロテインＡクロマトグラフィー樹脂が市販されている。これらのメディア間の主要な差異として、支持マトリックスの種類、プロテインＡのリガンド修飾，ポアサイズ、及び粒子サイズが挙げられる。このような因子の差異は、吸着剤の圧縮率、化学的及び物理的頑健性、拡散抵抗、及び結合能力の差異の原因となる（Ｈｏｂｅｒ  Ｓら、（２００７）、前出）。プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の例として、実施例で用いられるような、ＧＥヘルスケア社製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂、及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ樹脂が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【０１０６】
用語「クロマトグラフィー」は、タンパク質液体クロマトグラフィーを意味し、タンパク質の混合物を分析又は精製するのに多くの場合用いられる液体クロマトグラフィーの形態の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含む。その他の形態のクロマトグラフィーと同様に、混合物の異なる成分は、２つの物質、多孔性の固体（固定相）とこれを通過する移動流体（移動相）に対して異なる親和性を有するので、分離が可能である。ＦＰＬＣでは、移動相は水溶液又は「バッファー」である。バッファーの流速は、重力流下で操作可能、又は一定速度に通常保たれる容積移送式真空ポンプにより制御可能であり、一方バッファーの組成は、２つ又はそれ以上の外部リザーバーから異なる割合で液体を供給することにより変化し得る。固定相は、ビーズ、通常架橋されたアガロースから構成された樹脂であり、円筒形のガラス製又はプラスチック製のカラムに充填される。ＦＰＬＣ樹脂が、用途に応じて、ビーズサイズ及び表面リガンドについて幅広い範囲で利用可能である。
【０１０７】
「アフィニティークロマトグラフィー」のプロセスは、固定相に架橋しており、また特定の分子又は分子のクラスに対して結合アフィニティーを有するリガンドとして、アフィニティー試薬を使用することと関係する。リガンドは、タンパク質リガンドのような生体分子であり得る、又は合成分子であり得る。いずれの種類のリガンドも、良好な特異性を有する傾向がある。製造で最も一般的に用いられるタンパク質リガンドは、アフィニティー試薬のプロテインＡである。アフィニティークロマトグラフィーでは、溶液（例えば、対象とするタンパク質を含有する未精製の細胞上清）がカラム上に負荷されると、汚染物
質（その他のタンパク質、脂質、炭水化物、ＤＮＡ、顔料等）は、カラムを通過可能である一方、標的タンパク質は通常吸着する。吸着剤そのものがクロマトグラフィーカラムに通常充填される；しかし、吸着段階は、バッチ結合モードにおいて、撹拌されたスラリーとして吸着剤を用いることにより実施可能である。吸着後の次の段階は洗浄段階であり、この段階では、残留汚染物質を除去するために、吸着剤が洗浄される。結合したタンパク質は、次に半純粋又は純粋の形態で溶出する。溶出は、タンパク質が、固定リガンドともはや相互作用できず、遊離するように、バッファー又は塩組成を変更することにより通常達成される。いくつかの事例では、対象とするタンパク質は、アフィニティー樹脂に結合しない場合もあり、またアフィニティークロマトグラフィーは、望ましくない汚染物質を結合させるのが目的であり、従って対象とするタンパク質を単離するために未結合分画が収集される。アフィニティークロマトグラフィーは、固定化したベッド又は流動化したベッド内でも実施可能である。
【０１０８】
用語「グラジエントモードクロマトグラフィー」とは、「溶出」バッファー（バッファーＢ）の割合が、漸進的に又は段階的に０％〜１００％まで増加するクロマトグラフィー法を意味する。
【０１０９】
用語「捕捉溶出モード（ｃａｐｔｕｒｅ−ｅｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）クロマトグラフィー」又は「捕捉溶出精製モード」又は「捕捉溶出精製」とは、「溶出」バッファー（バッファーＢ）の割合が漸進的又は段階的に０％〜１００％まで増加するのではなく、捕捉後に１００％で直接適用され、また任意選択的に泳動バッファーによる洗浄ステップ（バッファーＡ）を伴うクロマトグラフィー法を意味する。
【０１１０】
ＣＤ３を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリンの開発
本発明は、上記のような重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含み、またヒト遺伝子ＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の生成物である、又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を更に含むＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体ＯＫＴ３の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、７つ以下、好ましくは６つ以下、好ましくは５つ以下、好ましくは４つ以下、より好ましくは３つ以下、なおいっそうより好ましくは２つ以下、最も好ましくは１つを超えないアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供し、この場合、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は、３４、４８、４９、５８、６９、７１、及び７３からなる群より選択されるアミノ酸の位置においてアミノ酸置換を含み：また、各群メンバーのアミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき示される。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ、Ｒ５８Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋからなる群より選択される。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、３４、４９、及び７１からなる群より選択されるアミノ酸の位置にある。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔからなる群より選択される。
【０１１１】
更なる態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合する第１のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）、及びＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号２４）からなる群より選択されるヒト遺伝子の生成物である、又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む対応するマウス抗体ＯＫＴ３の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域に由来する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾はアミノ酸置換である。一般的に、８つ以下、好ましくは７つ以下、好ましくは６つ以下、好
ましくは５つ以下、好ましくは４つ以下、より好ましくは３つ以下、なおいっそうより好ましくは２つ以下、最も好ましくは１つを超えないアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供し、この場合、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は、４、３３、３４、４６、４７、６６、７１、及び９６からなる群より選択されるアミノ酸の位置においてアミノ酸置換を含む。好ましくは、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆからなる群より選択される。軽鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、４、４６、及び４７からなる群より選択されるアミノ酸の位置にある。軽鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３タンパク質複合体と結合する第１のポリペプチドのエピトープ結合領域は、上記のような重鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾、及び上記のような軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾を含み得る。
【０１１２】
本開示は、配列番号２７〜３８、６４〜６８、及び３５９からなる群より選択される、好ましくは配列番号３５９より選択される重鎖配列を含むＣＤ３タンパク質複合体と結合する抗体又はそのフラグメントも提供する。本開示は、配列番号３９〜４７、６９〜９０、及び３６０からなる群、好ましくは配列番号３６０より選択される軽鎖配列を含むＣＤ３タンパク質複合体と結合する抗体又はそのフラグメントも提供する。
【０１１３】
このような重鎖及び軽鎖可変領域配列のそれぞれは、ＣＤ３タンパク質複合体に結合可能であることを踏まえれば、重鎖及び軽鎖可変領域配列は、本発明の抗ＣＤ３結合分子を生み出すのに「混合及びマッチ」可能である。かかる「混合及びマッチ」した抗体のＣＤ３結合は、例えば実施例に記載されているような結合アッセイ法を用いて試験可能である。
【０１１４】
ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進する免疫グロブリン定常領域の工学的作出
ヘテロ二量体免疫グロブリンを生成する方法は、当技術分野において公知であり、最も単純な方法の１つは、２つの異なる免疫グロブリン鎖の単細胞内発現法に準拠する（国際公開第９５／３３８４４号、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ、及びＴｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ  Ｓ）。工学を用いないこの単純な方法は、対象とするヘテロ二量体よりもホモ二量体種が形成されることにより制限される（Ｋｕｆｅｒ  Ｐら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２２巻（５）：２３８〜２４４頁）。重鎖のヘテロ二量化を強化する相補的な技術を用いると（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ＡＭら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１６巻（７）：６７７〜６８１頁）、より多くのヘテロ二量体の生成を実現し得るが、なおも有意な量の望ましくないホモ二量体の生成を引き起こす（Ｊａｃｋｍａｎ  Ｊら、（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、第２８５巻（２７）：２０８５０〜９頁；Ｋｌｅｉｎ  Ｃら、（２０１２）ＭＡｂｓ、第４巻（６）：６５３〜６３頁）。従って、本発明は、ＢＥＡＴ（登録商標）技術に記載されている方法を利用するが（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２／１３１５５５号）、同方法は、先行技術の方法よりも優れたヘテロ二量体化を示すバイオミミクリーという独自の概念に基づく。ＢＥＡＴ技術は、天然由来のホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメインの対間の界面交換に基づき、Ｆｃベースの二重特異性抗体のための構成ブロックとして利用可能である新規のヘテロ二量体を生み出す。
【０１１５】
１つの態様では、本発明は、第１及び第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供するが、第１及び第２のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質界面を有する修飾されたＣＨ３ドメインを備えた、工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合、第１のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界
面は、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、並びに第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８４．４の位置及び３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む。
【０１１６】
更なる実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供し、この場合、第１及び第２のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質界面を有する修飾されたＣＨ３ドメインを備えた、工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、第１のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８８の位置、及び３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、並びに第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８５．１及び／又は８６の位置、及び３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域内の８８の位置で置換されたアミノ酸残基は、第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域内の８５．１及び／又は８６の位置で置換されたアミノ酸残基と相互作用するが、但し各群メンバーのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。
【０１１７】
好ましくは、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８８の位置において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗ及びその保存的なアミノ酸置換であり、アミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。より好ましくは、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８８の位置において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗであり、並びに第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ａ、２０Ｖ、２０Ｔ、２０Ａ、２０Ｎ、２０Ｑ、２０Ｅ、２０Ｓ、２０Ｋ、２０Ｗ、２２Ａ、２２Ｇ、２２Ｔ、２２Ｌ、２２Ｉ、２２Ｖ、２６Ｒ、２６Ｑ、２６Ｔ、２６Ｋ、２６Ｖ、２６Ｓ、２６Ｎ、２６Ｅ、７９Ｙ、８５．１Ｔ、８５．１Ｍ、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｒ、８５．１Ｈ、８５．１Ｋ、８５．１Ｆ、８５．１Ｃ、８５．１Ｎ、８５．１Ｗ、８６Ｓ、８６Ｉ、８６Ｔ、８６Ｈ、８６Ｑ、８６Ｖ、８６Ｗ、８６Ｙ、８６Ｆ、及び９０Ｎからなる群より選択されるが、但しアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。
【０１１８】
好ましくは、第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８５及び８６の位置において置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｃ、及び８６Ｓ、並びにその保存的なアミノ酸置換からなる群より選択される（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）。より好ましくは、第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｃ、及び８６Ｓからなる群より選択され、そして第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、２６Ｔ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８８Ｒ、及び９０Ｒ、並びにその保存的なアミノ酸置換からなる群より選択される（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）。
【０１１９】
好ましい実施形態では、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８８の位置において置換されるアミノ酸残基は８８Ｗであり、並びに第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面
内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ａ、２０Ｋ、２２Ｖ、２６Ｔ、７９Ｙ、８５．１Ｓ、８６Ｖ、及び９０Ｎであり、また第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８５．１及び８６の位置において置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、又は８５．１Ａ、及び８６Ｓであり、並びに第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、２６Ｔ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８４．４Ｑ、８８Ｒ、及び９０Ｒである（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）。
【０１２０】
代替的実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントを提供し、この場合、第１及び第２のポリペプチドは、タンパク質−タンパク質界面を有する修飾されたＣＨ３ドメインを備えた、工学的に作出された免疫グロブリン定常領域を含み、第１のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、２０の位置、及び３、５、７、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、並びに第２のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、２６の位置、及び３、２２、２７、７９、８１、８４、８５．１、８６、及び８８からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域内の２０の位置で置換されたアミノ酸残基は、第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域内の２６の位置で置換されたアミノ酸残基と相互作用するが、但し各群メンバーのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。
【０１２１】
好ましくは、第１の工学的に作出された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２０及び２２の位置にアミノ酸残基、並びに任意選択的に３、５、７、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置に更なるアミノ酸残基を含み、また第２の工学的に作出された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２６の位置並びに３、５、７、２０、２２、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置に更なるアミノ酸残基を含むが、但し各群メンバーのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。好ましくは、第１の工学的に作出された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２０及び２２の位置にアミノ酸残基、並びに任意選択的に３、５、７、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置に更なるアミノ酸残基を含み、また第２の工学的に作出された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２６及び８６の位置、並びに任意選択的に３、５、７、２０、２２、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８８、及び９０からなる群より選択される位置に更なるアミノ酸残基を含むが、但し各群メンバーのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。
【０１２２】
より好ましくは、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２０の位置において置換されるアミノ酸残基は、２０Ｖ、２０Ｔ、２０Ａ、２０Ｎ、２０Ｑ、２０Ｋ、２０Ｓ、２０Ｗ、及び２０Ｅからなる群より選択され、並びに第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ａ、２２Ａ、２２Ｇ、２２Ｌ、２２Ｉ、２２Ｖ、２２Ｔ、２６Ｋ、２６Ｒ、２６Ｑ、２６Ｔ、２６Ｖ、２６Ｓ、２６Ｎ、２６Ｅ、７９Ｙ、８５．１Ｗ、８５．１Ｆ、８５．１Ｔ、８５．１Ｍ、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｒ、８５．１Ｈ、８５．１Ｋ、８５．１Ｃ、８５．１Ｎ、８６Ｗ、８６Ｙ、８６Ｓ、８６Ｉ、８６Ｈ、８６Ｑ、８６Ｖ、８６Ｔ、８６Ｆ、８８Ｑ、８８Ｌ、８８Ｖ、８８Ｒ、８８Ｅ、８８Ｔ、８８Ｉ、８８Ｙ、８８Ｋ、８８Ｗ、及び９０Ｎからなる群より選択され、
そして第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２６の位置において置換されるアミノ酸残基は、２６Ｔ及び２６Ｅ、並びにその保存的なアミノ酸置換からなる群より選択されるが、但しアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリングに基づき表される。
【０１２３】
最も好ましい実施形態では、第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２０の位置において置換されるアミノ酸残基は２０Ｋであり、並びに第１の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ａ、２２Ｖ、２６Ｔ、７９Ｙ、８５．１Ｓ、８６Ｖ、８８Ｗ、及び９０Ｎであり、また第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２６の位置において置換されるアミノ酸残基は、２６Ｔであり、並びに第２の工学的に作出された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換される更なるアミノ酸残基は、３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８４．４Ｑ、８５．１Ｃ／Ｓ／Ａ、８６Ｓ、８８Ｒ、及び９０Ｒである（ＩＭＧＴ（登録商標）ナンバリング）。
【０１２４】
ＣＤ３及び疾患関連抗原を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリンの開発
第１のステップ（実施例１）として、プロテインＡとの結合を低減する又は無効にする置換を、ＦＡＢ又はｓｃＦｖフラグメントに基づくホモ二量体免疫グロブリンについてアッセイした。プロテインＡとの結合を低減する又は無効にするための置換を有するＶＨ３サブクラスの可変重鎖ドメインが重鎖内に存在すると、プロテインＡに基づくあらゆる差動的アフィニティー法は妨害されることが判明した。このような重要な障害に対する解決策は、プロテインＡに基づく差動的アフィニティー法において、プロテインＡがＶＨ３サブクラスと結合するのを低減する又は無効にするフレームワーク置換の形態で見出された。
【０１２５】
第２のステップ（実施例２．１）では、ヒトＣＤ３（εサブユニット）を標的とするヒト化抗体を、マウス抗ＣＤ３抗体のＣＤＲを、ＩＧＶＨ３−２３及びＩＧＶＫ１又はＩＧＶＫ３ヒト生殖細胞系統フレームワーク上にグラフトすることにより生成した。最良のヒト化変異体では、そのＶＨドメイン中に存在するプロテインＡ結合部位を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて無効にした。このような変異体を、ＦＡＢ又はｓｃＦｖフラグメントとしてフォーマット化した。
【０１２６】
第３のステップでは、疾患関連抗原を標的とする抗体の抗原結合部位を生成した。マウス抗体のＣＤＲは、ヒト生殖細胞系統フレームワークのＩＧＶＨ３−２３及びＩＧＶＫ１（実施例２．３、２．４、及び２．６〜２．１０）上にグラフト可能であった。あるいは、ファージディスプレーライブラリから単離された抗体のＣＤＲは、ＶＨ３可変ドメインサブクラスに基づくことが可能、又はヒト生殖細胞系統フレームワークのＩＧＶＨ３−２３及びＩＧＶＫ１上にグラフト可能であった（実施例２．５及び２．６）。エピトープ結合領域のＶＨドメイン内にあるプロテインＡ結合部位を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて無効にした。
【０１２７】
第４のステップでは、ＢＥＡＴ（登録商標）技術（国際公開第２０１２／１３１５５５号に記載の通り）に基づきヘテロ二量体抗体を生成したが、この場合、実施例２．１で得た抗ＣＤ３抗体及び実施例２．２〜２．１０に記載するような疾患関連抗原のエピトープ結合領域を、ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットで用いたが、その逆も同様である（実施例３．１）。ホモ二量体種とヘテロ二量体種との間では、プロテインＡ結合部位の数に差異があり、その差異を、プロテインＡクロマトグラフィーによるヘテロ二量体種の単離に利用することが可能なので、本発明の二重特異性抗体を工学的に作出して、プロテインＡ結合部位を有さない、従ってプロテインＡ樹脂に結合しない２つのホモ二量体種のうちの１つ
を得た。更に、ＢＥＡＴ抗体の安全性プロファイルを改善するために、Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域内に２つの置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵナンバリング）を工学的に作出することにより、Ｆｃ受容体結合を低減又は除去した。
【実施例】
【０１２８】
材料及び方法
一過性哺乳動物細胞発現用の発現ベクターの構築
異なるポリペプチド鎖を一部又は全部コードするｃＤＮＡを、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）により最初に遺伝子合成し、これを標準的な分子生物学技法を用いて修飾した。ＰＣＲ生成物を、適するＤＮＡ制限酵素で消化、精製を行い、そしてＣＭＶプロモーター及び同じＤＮＡ制限酵素で予め消化しておいたウシホルモンポリアデニル化物（ポリ（Ａ））を担持する修飾されたｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、Ｚｕｇ、スイス）にライゲートした。すべてのポリペプチド鎖を、この発現ベクターに独立にライゲートし、同ベクターにおいて、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより分泌を行わせた。
【０１２９】
組換えタンパク質の発現
抗体、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、ＢＥＡＴ抗体、及び抗原は、別途明示しない限り、以下に記載するように発現した。一過性発現の場合、工学的に作出された鎖それぞれについて等量のベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ社、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を用いて、懸濁順応化（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ａｄａｐｔｅｄ）ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、英国；カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）に同時トランスフェクトした。一般的に、密度が１ｍｌ当たり細胞０．８〜１．２百万個である懸濁状態の細胞１００ｍｌをＤＮＡ−ＰＥＩ混合物と共にトランスフェクトする。各工学的に作出された鎖の遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、免疫グロブリン構築物が、細胞を４〜５日間、更に培養することにより産生され、培養培地（０．１％プルロニック酸、４ｍＭグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌジェネテシンが補充されたＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地（Ｓｉｇｍａ社））中への分泌が可能となる。分泌された免疫グロブリンを含有する細胞を含まない培養物上清を、遠心分離とその後の滅菌濾過により調製し、更なる分析で用いた。
【０１３０】
差動的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（実施例１）
Ｆｃ１３３フラグメント及びホモ二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫グロブリンの精製
捕捉溶出モードクロマトグラフィー
上清を、精製前に、０．１容量（Ｖ）の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で調整した。プロテインＧセファロース（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス；カタログ番号１７−０６１８−０１）を、調整後の上清に添加した。混合物を、４℃、オーバーナイトでインキュベーションした。インキュベーション後、結合したタンパク質を、１０ＣＶのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、４カラムボリューム（ＣＶ）の０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出し、そして０．１Ｖの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）により非還元条件下で分析した。
【０１３１】
グラジエントモードクロマトグラフィー
生成後、Ｆｃ１３３フラグメントを含有する細胞培養物上清を、プロテインＧセファロース（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（上記）を用いて、捕捉溶出モードクロマトグラフィーで最初に精製した。捕捉溶出モードクロマトグラフィーから得られた溶出物質を、１
ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（プロテインＡ結合部位突然変異体）にその後負荷した。カラムを０．２Ｍリン酸クエン酸バッファー、ｐＨ８．０で事前に平衡化し、そしてＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）クロマトグラフィーシステム（カラム及び装置はいずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社；カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）上、流速１ｍｌ／分で稼働させた。様々な量の２つのバッファー（泳動バッファー（Ａ）：０．２Ｍリン酸クエン酸バッファー、ｐＨ８．０、及び溶出バッファー（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸クエン酸バッファー、ｐＨ３．０）を混合しながら、ｐＨリニアグラジエントにより溶出を実施した。リニアグラジエントを、０％Ｂから１００％Ｂまで５カラムボリューム（ＣＶ）で実施した。溶出分画を０．１Ｖの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）により非還元条件下で分析した。
【０１３２】
ホモ二量体ＦＡＢ−Ｆｃ免疫グロブリン及びＦＡＢフラグメントの精製
生成後、細胞培養物上清を、０．１Ｖの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で調整した。プロテインＬ樹脂（Ｇｅｎｅｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、米国）を調整後の上清に添加し、４℃、オーバーナイトでインキュベーションした。インキュベーション後、結合したタンパク質を１０ＣＶのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、４ＣＶの０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出し、そして最終的に０．１Ｖの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。プロテインＡ結合を評価するために、プロテインＬ精製後のＦＡＢを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）に、ｐＨ８．０（クエン酸／Ｎａ2ＨＰＯ4バッファー）にて注入した。様々な量の２つのバッファー（泳動バッファー（Ａ）：０．２Ｍリン酸クエン酸バッファーｐＨ８．０、及び溶出バッファー（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸クエン酸バッファー、ｐＨ３．０）を混合して、ｐＨリニアグラジエントにより溶出を実施した。リニアグラジエントを、０％Ｂから１００％Ｂまで５ＣＶで実施した。溶出分画を０．１Ｖの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）により非還元条件下で分析した。
【０１３３】
Ｆｃ及びＶＨ３ドメインにおけるプロテインＡ結合が無効にされたＶＨ３ベースのホモ二量体ＦＡＢ−Ｆｃ及びｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫グロブリンの精製及び試験
精製スキームには、上記手順に基づき、捕捉溶出モードクロマトグラフィーと、その後のグラジエントモードクロマトグラフィーが含まれた。
【０１３４】
差動的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（実施例１及び３）
生成後、細胞を含まない上清を、０．２Ｍリン酸クエン酸バッファー、ｐＨ６．０中で事前に平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム上に負荷し、そしてＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）クロマトグラフィーシステム（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社；カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）上、流速１ｍｌ／分で稼働させた。泳動バッファーは、０．２Ｍリン酸クエン酸バッファー、ｐＨ６であった。対象とするヘテロ二量体の溶出を、２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４を用いて実施する一方、ホモ二量体種を０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出の後に２８０ｎｍでのＯＤ読み取りが続いた；対象とするヘテロ二量体を含有する分画をプールし、０．１容量の１Ｍトリス、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ社）で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）により非還元条件下で分析した。
【０１３５】
示差走査式熱量測定（ＤＳＣ）
抗体の熱安定性を、熱量測定法を用いて比較した。熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査式マイクロカロリメーター（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）（ＭｉｃｒｏＣａｌ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）上で実施した。細胞容積は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は１℃／分であり、また過剰圧力は６４ｐ．ｓ．ｉ．に保った。すべてのタンパク質フラグメントは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量を、同一のバッファーを含有するがタンパク質が省略された複製サンプルとの比較により見積もった。部分的なモル熱容量及び融解曲線を、標準手順を用いて分析した。サーモグラムはベースライン補正し、またソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖ７．０内の非二状態モデル（Ｎｏｎ−Ｔｗｏ  Ｓｔａｔｅ  ｍｏｄｅｌ）を用いて更に分析する前に、濃度について標準化した。
【０１３６】
ヒトＩｇＧサブクラスについて予測される融解プロファイルは公知であり（Ｇａｒｂｅｒ  Ｅ、及びＤｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪ、（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、第３５５巻（３）：７５１〜７頁）、またすべてのプロファイルは、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＦＡＢドメインの独立したアンフォールディングに対応する、３つのアンフォールディング変化（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を含むことが判明した。４つのヒトＩｇＧサブクラスのうち、ＩＧＨＧ１は、最も安定なＣＨ３ドメインを有する（約８５℃）；一方、その他のサブクラスのＣＨ３ドメインは、いずれも７０℃未満で融解するかは不明であるが、それほど安定ではない。同様に、すべてのサブクラスは、ＣＨ２ドメインについて約７０℃の融解温度を有することが公知である。
【０１３７】
キャピラリーゲル電気泳動による純度評価（実施例３．２）
非還元型サンプル調製
４０μｇの脱塩されたタンパク質サンプルを、５ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ社）を含有するＳＤＳサンプルバッファー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．社、Ｎｙｏｎ、スイス；ＩｇＧ純度キット、カタログ番号：Ａ１０６６３）内で緩衝化した。１０ｋＤａの内部標準をサンプルに添加した。サンプル混合物を７０℃で１０分間加熱した。
【０１３８】
キャピラリーゲル電気泳動
サンプル調製後、２２０ｎｍに設定したフォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）が取り付けられたＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＰＡ  ８００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．社、Ｎｙｏｎ、スイス）上で、サンプルを測定した。ＩＤ５０μｍ×３０．２ｃｍ（検出器までの有効長さ２０．２ｃｍ）のベア溶融シリカキャピラリー（Ｂａｒｅ−ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）を分離メディアとして用いた。サンプル注入及び分離を、逆極性を用いて、ＳＤＳ−分子量ゲルバッファー中にて、５及び１５ｋＶの一定電圧でそれぞれ実施した。２Ｈｚの速度でデータを記録したが、電流は、分離期間中安定であった。キャピラリー及びサンプルを２５℃にサーモスタット制御した。
【０１３９】
ＳＰＲによるアフィニティー測定（実施例１）
プロテインＡ結合が無効にされたＦＡＢフラグメントのＳＰＲ試験
ＩＧＨＧ１  Ｆｃフラグメントと融合したヒトＨＥＲ２細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、上記重鎖及び軽鎖発現ベクターと類似した発現ベクターにクローン化し、そしてＰＥＩ法を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトした（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号を参照）。実施例１に記載するように、上清を０．１Ｖの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で調整し、抗原をプロテインＡ捕捉溶出クロマトグ
ラフィーにより精製した。ＳＰＲ実験の場合、モノクロナールマウス抗ヒトＩｇＧ  （Ｆｃ）抗体センサーチップを用いたが、これは、Ｆｃ融合組換えＨＥＲ２抗原を正しい向きで捕捉するのを可能にした（ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社）。測定をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）上で記録した。抗ＨＥＲ２  ＦＡＢの異なる希釈物（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５７、０．７８、０．３９ｎＭ）を、３０μｌ／分で４分間、センサーチップ上に注入した。測定毎に、７分間の解離後、３ＭのＭｇＣｌ2溶液を、３０μｌ／分で１分間、再生目的で注入した。データ（センサーグラム：ｆｃ
２−ｆｃ１）を１：１ラングミュアで近似した。各測定開始時に、捕捉されたＨＥＲ２−Ｆｃの実験変動を説明するために、すべての近似においてＲｍａｘ値をローカルに設定した。二重で測定を実施し、参照用としてゼロ濃度サンプルを含めた。実験データと個々の結合モデルとの間の近似の質を評価するために、Ｃｈｉ２及び残差の両方の値を用いた。
【０１４０】
ＳＰＲによるアフィニティー測定（実施例２及び３）
ＳＰＲ分析を、異なる抗体（マウス及びヒト化抗体）の結合キネティクスに関する結合解離速度定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ
ｃｏｎｓｔａｎｔ）を測定するのに用いた。抗体の結合キネティクスを、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）上、室温で測定し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１、ＢＩＡｃｏｒｅ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社）を用いて分析した。ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、カタログ番号：ＢＲ−１０００−１４）上で、市販のアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、カタログ番号：ＢＲ−１０００−５０）を用いて対象とするリガンドと個々に結合させて測定を実施した。プロテインＧリガンドは、Ｐｉｅｒｃｅ社製（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓ．Ａ．、Ｌａｕｓａｎｎｅ、スイス、カタログ番号：２１１９３）であった。
【０１４１】
データ（センサーグラム：ｆｃ２−ｆｃ１）は、示すように、１：１ラングミュアモデルを用いて、物質移動有り、無しについて近似した。捕捉実験では、各測定開始時の実験変動を説明するために、Ｒｍａｘ値をすべての近似においてローカルに設定した。解離時間は少なくとも３５０秒であった。三重で測定を実施し、参照用としてゼロ濃度サンプルを含めた。実験データと個々の結合モデルとの間の近似の質を評価するために、Ｃｈｉ２及び残差の両方の値を用いた。
【０１４２】
ＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のアフィニティー測定
ＦＡＣＳ染色では、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ、カタログ番号：ＡＣＣ４８３）を、ＣＤ３陽性細胞系として用いた。ＨＰＢ−ＡＬＬを１０％のＦＣＳ及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ  １６４０内で維持した。ＯＫＴ３キメラ抗体及びヒト化変異体の希釈系列、１００μｌを、４×１０5個のＨＰＢ−ＡＬＬ細胞と共に、１％のＢＳ
Ａ及び０．１％のアジ化ソーダが補充されたＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファーと呼ばれる）内、氷上で、４５分間インキュベーションした。無関係のヒトＩｇＧ１を、アイソタイプコントロールとして、またＯＫＴ３キメラ抗体を陽性対照として用いた。洗浄後、細胞を、１／２００に希釈した抗ヒトＦｃ−ＰＥ（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）と共に、氷上で４５分間インキュベーションした。次に、細胞を再度洗浄し、ＦＡＣＳバッファー、２００μｌ中に再懸濁した。各サンプルの相対的な平均蛍光強度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）上で測定し、結果をＯＫＴ３キメラ抗体と比較したＨＢＰ−ＡＬＬの相対的な染
色強度として図９にまとめる。
【０１４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ用の細胞系統
ヒトＨＥＲ２陽性細胞系統
ＨＥＲ２抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１０８１２７号に記載されている。本明細書で用いられるＨＥＲ２陽性ヒト細胞系統は、以下の通りであった：
ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＨＴＢ−２０）
培養条件：１５０ｃｍ2の組織培養フラスコ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス
；カタログ番号：９０１５０）中、１０％の熱失活したＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％のピルビン酸ナトリウム溶液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア；カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｍ１１−００ｄｓｍｚ３）、及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：３５０５０−０３８）が補充されたＲＰＭＩ培地。細胞を１週間に２回継代した。
ＪＩＭＴ−１（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ、カタログ番号：ＡＣＣ５８９）
培養条件：１０％の熱失活したＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％のピルビン酸ナトリウム溶液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｍ１１−００３）、及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：３５０５０−０３８）が補充されたダルベッコ改変必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ（１×））＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：３１９６６−０１２）。細胞を１週間に２〜３回継代した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＨＴＢ−２６）。
培養条件：ＪＩＭＴ−１と同一の培養条件。
ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−１２１）。
培養条件：１０％の熱失活したＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：１０３７８−０１６）、及び１％のグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：２５０３０−０２４）が補充されたＥＭＥＭ培地内で、ＨＴ１０８０細胞を培養した。細胞は、１週間に３回分裂するように培養する（１／６希釈）。
ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−５８２２）。
培養条件：ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は、１０％の熱失活したＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％のピルビン酸ナトリウム溶液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア；カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｍ１１−００ｄｓｍｚ３）、及び１％のグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：２５０３０−０２４）を含むＲＰＭＩ１６４０培地内で培養する。細胞は、１週間に２回分裂する（１／３希釈）。
【０１４４】
ヒトＣＤ３８陽性細胞系統
ＣＤ３８抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００５１０３０８３号、同第２００８０４７２４２号、同第２０１１１５４４５３号、及び同第２０１２０９２６１２号に記載されている。本明細書で用いられるＣＤ３８陽性ヒト細胞系統は、以下の通りであった：
安定な組換えＣＨＯ［ＣＤ３８］細胞
ヒトＣＤ３８をコードする遺伝子をＳｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社に発注した（Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ、カタログ番号．：ＩＲＡＵ３７Ｄ１１、４３０９０８６）。Ｋｏｚａｋ配列、開始コドンとこれに続くシグナルペプチド（マウスＶリーダー）を５’末端に、及びＮｈｅＩ制限部位を３’末端に付加するプライマーを用いて、ヒトＣＤ３８を増幅した。アンプリコンをＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出し、そしてｐＴ１の発現カセットにクローン化し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社）由来のベクターを社内で開発した。ｐＴ１の発現カセットは、２つのＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）を用いて、多シストロン性ｍＲＮＡ上で、対象遺伝子の発現をＧＦＰ及びＰＡＣ（ピュロマイシン耐性遺伝子）の発現と結びつける。プラスミドのミディプレップを調製し、クローン化したＣＤ３８のオープンリーディングフレームを、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＣＨＯ−Ｓ細胞懸濁物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）を、ポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）を用いて、５０ｍｌのバイオリアクターフォーマット（ＴｕｂｅＳｐｉｎ５０バイオリアクター、ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス）中でトランスフェクトした。この目的のために、指数増殖細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号．：３１９８５−０４７）に播種した。ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を細胞に添加した。エンドサイトーシスを目的として、細胞をＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体と共に、振盪（２００ＲＰＭ）しながら３７℃で５時間インキュベーションした後、４ｍＭのＧｌｎが補充された１容量の培養培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（Ｌｏｎｚａ社、ＲＵＷＡＧ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅの販売業者、Ｂｅｔｔｌａｃｈ、スイス、カタログ番号：ＢＥ１２−７７１Ｑ）を、細胞懸濁物に添加した。次に、３７℃、５％のＣＯ２及び８０％の湿度にて、振盪プラットフォーム上で細胞をインキュベーションした。トランスフェクション後１日経過して、ピュロマイシン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｐ８８３３−２５ｍｇ）を含有する選択培地中、異なる濃度で、細胞を９６ウェルプレートに播種した。静的条件下での選択から約１４日後に、ＴｕｂｅＳｐｉｎ５０バイオリアクターを用いて、４６個の高ＧＦＰ発現細胞プール品を、懸濁培養物として増殖させた。懸濁にうまく順応したら、細胞をＦＡＣＳによりＣＤ３８について分析した。均質なＣＤ３８染色プロファイルを有する安定なＣＨＯ［ＣＤ３８］クローンを選択し、本発明で用いた。
その他のＣＤ３８陽性細胞系統として下記のものが含まれた：
ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−９０６８）。
Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−１４３２）。
Ｕ２６６（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＴＩＢ−１９６）。
ＲＰＭＩ  ８２２６（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−１５５）。
培養条件：１０％の熱失活したＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）、及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地。
Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−８６）。
Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−２１３）。
【０１４５】
ヒトＯＸ４０陽性細胞系統
ＯＸ４０抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に記載されている。
末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）及びＨＢＰ−ＡＬＬは、ヒトＯＸ４０陽性細胞系統の例である。
安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞を本発明で用いた。ヒトＯＸ４０をコードする合成ｃＤＮＡを担持する組換えＣＨＯ細胞系統を、上記安定な組換えＣＨＯ［ＣＤ３８］細胞系統のプロトコールと類似したプロトコールを用いて工学的に作出した。
【０１４６】
ヒトＣＤ２０陽性細胞系統
ＣＤ２０抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１００９５０３１号に記載されている。ＣＤ２０＋癌細胞の例として、Ｄａｕｄｉ癌細胞系統（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；  カタログ番号：ＣＣＬ−２１３）が挙げられ、このようなＢリンパ芽球癌細胞は、２０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓ；１％のＬ−Ｇｌｕｔ；１％のＮａ−Ｐｙｒ及び１％のＮＥＡＡが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社）内で培養する。細胞は、５％のＣＯ２を補給しながら３７℃で培養する。
【０１４７】
ヒトＥＧＦＲ陽性細胞系統
ＥＧＦＲ抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１０８１２７号に記載されている。ＥＧＦＲ＋癌細胞の例として、ＨＴ−２９癌細胞系統（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＨＴＢ−３８）が挙げられ、このような結腸直腸癌細胞は、１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓ；１％のＬ−Ｇｌｕｔ；１％のＮａ−Ｐｙｒ及び１％のＮＥＡＡが補充されたマッコイの５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ社）内で培養する。細胞は、５％のＣＯ２を補給しながら３７℃で培養する。
【０１４８】
ヒトＣＤ１９陽性細胞系統
ＣＤ１９抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０９５０３１号に記載されている。Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−１４３２）及びＲａｊｉ  ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−８６）は、ヒトＣＤ２０陽性細胞系統の例である。
【０１４９】
ヒトメンブレンＩｇＥ陽性細胞系統
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０３３７３６号の７１頁には、インターロイキン−４（ＩＬ−４）及び抗ＣＤ４０抗体の添加による、ヒトＰＢＭＣをＩｇＥ産生Ｂ細胞にクラス変換する方法について記載する。
【０１５０】
組換え標的抗原
ヒトＣＤ３γ−ε−Ｆｃ融合タンパク質
２６残基ペプチドリンカー（配列：ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳ；配列番号１８６）により、ヒトＣＤ３ε細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号：Ｐ０７７６６、残基２２〜１１８（配列番号１８５））と融合したヒトＣＤ３γ細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号：Ｐ０９６９３残基２３〜１０３（配列番号１８４）；ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアム（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第４１巻（データベース版）：Ｄ４３−７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）をコードするｃＤＮＡを、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）により最初に合成した。この合成遺伝子を、標準的なオーバーラップＰＣＲ法を用いてヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分に融合させ、またヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡテンプレートもＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧから取得した。得られたｃＤＮＡを、上記修飾されたｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローン化した。
【０１５１】
ＣＤ３γ−ε−Ｆｃタンパク質（配列番号１８７）の一過性発現の場合、上記のように、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、組換えベクターを、懸濁順応化ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。次に、組換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａメディア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて、ＣＤ３γ−ε−Ｆｃ構築物を、細胞を含まない上清から精製し、そして更なる分析で用いた。
【０１５２】
ヒト及びカニクイザルのＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質
ヒトＣＤ３εペプチド  １−２６（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号：Ｐ０７７６６、アミ
ノ酸２３〜４８、配列番号１８８）をコードするｃＤＮＡ、及びカニクイザルＣＤ３εペプチド１−２６（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号：Ｑ９５ＬＩ５、アミノ酸２２〜４７、配列番号１８９）をコードするｃＤＮＡを、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε細胞外領域について、ＧＥＮＥＡＲＴ  Ａ．Ｇ．から取得した合成ｃＤＮＡからそれぞれＰＣＲ増幅した。その後、標準的なオーバーラップＰＣＲ法を用いて、増幅生成物をヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分に融合させた。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡテンプレートを、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧから取得した。得られたｃＤＮＡを上記の修飾されたｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローン化した。
【０１５３】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε構築物（それぞれ、配列番号１９０及び１９１）の一過性発現の場合、上記のように、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、組換えベクターを、懸濁順応化ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。次に、組換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａメディア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて、ＣＤ３ε融合構築物を、細胞を含まない上清から精製し、そして更なる分析で用いた。これら２つの融合タンパク質を、本明細書では、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質と呼ぶ。
【０１５４】
ヒトＨＥＲ２細胞外領域
ＨＥＲ２可溶性細胞外領域の調製法は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号に記載されている。ポリ−ヒスチジンタグと融合したヒトＨＥＲ２可溶性細胞外領域（本明細書では、ＨＥＲ２−ｈｉｓと呼ぶ）、又はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合したヒトＨＥＲ２可溶性細胞外領域（本明細書では、ＨＥＲ２−Ｆｃと呼ぶ）を調製した。
【０１５５】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３８細胞外領域
ヒトＣＤ３８に関するｃＤＮＡを、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｒｗｉｎ−Ｎｅｇｅｌｅｉｎ−Ｈａｕｓ、ドイツ、カタログ番号．：ＩＲＡＵ３７Ｄ１１、４３０９０８６）から取得し、その細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔ  受け入れ番号：Ｐ２８９０７残基４３〜３００）を、ＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社）に由来する内作の発現ベクターにクローン化した。この発現ベクターは、ｋｏｚａｋ配列及び開始コドンとこれに続くマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドを５’末端に、並びに６−Ｈｉｓ−タグをその多重クローニング部位の３’末端に含んだ。６−Ｈｉｓ−タグ（配列番号１９２）と融合したヒトＣＤ３８の可溶性細胞外領域を発現させ、以下の通り精製した：ＨＥＫ細胞、０．１％のプルロニック酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社）、発現ベクター、及びポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）を含有する１容量のＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｅ１５−０３９）を、３７℃、５％のＣＯ2、及び８０％の湿度においてシェイカーフラスコ内でイン
キュベーションした。４時間後に、６ｍＭのグルタミンが補充された１容量のＥｘＣｅｌｌ２９３培地を混合物に添加し、そしてインキュベーションを合計５日間、更に継続した。生成後、遠心分離により細胞を含まない上清を調製し、そして０．２μｍフィルターを用いて濾過し、トリス１Ｍ、ｐＨ８．７を用いてｐＨを７．４（４℃）に調整した。Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｅｘｃｅｌｌビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号：１７−３７１２−０３）を溶液に添加し、４℃、撹拌下、オーバーナイトでインキュベーションした。重力流精製するために、溶液を、Ｅｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ社、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス、カタログ番号：７３７−４２５２）に負荷した。ＰＢＳ（２×）、２０ｍＭのイミダゾール中でビーズを洗浄し、そしてタンパク質を、ＰＢＳ、５００ｍＭのイミダゾール中で溶出した。溶出した分画をプールし、そして４℃での２回の透析ステップによりＰＢＳにバッファー交換した。精製されたヒトＣＤ３８細胞外領域を、０．２２μｍのシリンジフィルターを用い
て濾過した。
上記のような方法を用いて、６−Ｈｉｓ−タグ（配列番号１９３）と融合したカニクイザルＣＤ３８抗原の可溶性細胞外領域について、クローン化、発現、及び精製を行った。
【０１５６】
ヒトＯＸ４０細胞外領域
ヒトＯＸ４０の可溶性細胞外領域を調製する方法は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に記載されている。
【０１５７】
ヒトＥＧＦＲ細胞外領域
ＥＧＦＲ可溶性細胞外領域抗原の調製の例は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号に記載されている。
【０１５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞リダイレクションキリングアッセイ法
末梢血液単核球の調製
末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を生成するために、ヒト白血球を含有する血液フィルターを、スイス、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓの血液収集センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ、ｒｕｅ  Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ  ２９、ＣＨ−２３００）から収集した。１０Ｕ／ｍｌのｌｉｑｕｅｍｉｎ（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ  ＡＧ社、Ｌｕｃｅｒｎ、スイス）を含有するＰＢＳ、６０ｍｌを用いて、逆流置換により細胞をフィルターから取り出した。次に、製造業者の説明書に従い、５０ｍＬのＢｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒチューブ（Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、スイス）でＰＢＭＣを精製した。チューブを８００ｇ、室温で２０分間遠心分離し（ブレーキ操作無し）、細胞を界面から収集した。細胞を、ＦＢＳ又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含まないＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ、ＰＡＡ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）培地で３回洗浄した。ＰＢＭＣをＲＤＬ培地（１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ）内で細胞１０ｅ６個／ｍＬに再懸濁し、アッセイ前に、５％のＣＯ2インキュベータ内、３７℃、オーバーナイトで培養した。
【０１５９】
Ｔ細胞の調製
Ｔ細胞の精製を、ＰＢＭＣ単離後、製造業者の説明書に従い、ｐａｎ−Ｔ  ｃｅｌｌアイソレーションキットＩＩ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ、カタログ番号：１３０−０９１−１５６）を用いて直接実施した。精製後、Ｔ細胞をＲＤＬ培地内で細胞１０ｅ６個／ｍＬに再懸濁し、アッセイ前に、５％のＣＯ2インキュベータ内、３７℃、オーバーナイトで培養した。
【０１６０】
アッセイの読み取り
非常に類似した結果をもたらした２つの異なる読み取り法を、リディレクテッドキリングを定量化するのに用いた。
フローサイトメトリー法は、本明細書ではＲＤＬ−ＦＡＣＳ法と呼ぶが、同法はＳｃｈｌｅｒｅｔｈ  Ｂら（（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６５巻：２８８２〜２８８９頁）、Ｍｏｏｒｅ  ＰＡら（（２０１１）Ｂｌｏｏｄ、第１１７巻（１７）：４５４２〜５１頁）、及びＦｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｍら（（２０１２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、第１１巻：２６６４〜２６７３頁）に記載されるように、蛍光−サイトメトリーに基づく。標的細胞を捕集、計測し、１回洗浄した後、ＰＢＳ＋１μＭのカルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｓｉｇｍａ社）中、細胞５×１０ｅ６個／ｍＬで再懸濁した。細胞を、５分毎に穏やかに撹拌しながら１５分間、３７℃でインキュベーションした。ＣＦＳＥを負荷した細胞を、ＲＤＬ培地で３回洗浄し、ＲＤＬ培地内で細胞２×１０ｅ５個／ｍＬに再懸濁した。ＰＢＭＣを捕集、計測し、そしてＲＤＬ培地内
で細胞２×１０ｅ６個／ｍＬに再懸濁した。抗体連続希釈物（３×溶液）を、ＲＤＬ培地内で調製した。標的細胞（５０μｌ／ウェル）、Ｔ細胞（５０μｌ／ウェル）、及び３×抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を、平底９６ウェルプレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス）に分配した。エフェクター：標的物の比は１０：１であった。プレートを、５％のＣＯ2インキュベータ中、３７℃で４８時間インキュベーションした。インキ
ュベーション後、プレートを３００ｇで３分間遠心分離し、プレートをフリッキングして上清を廃棄した。プレートを、２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、再度遠心分離し、そしてＰＢＳを廃棄した。予備加温したａｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社）を添加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベーションした。１００μＬのＲＤＬ培地を添加した後、上下にピペッティングして、脱離した接着細胞を再懸濁した。溶液を、底部がＵ字形の９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に移した。底部がＵ字形のプレートを、３００ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、そして１／４０希釈で７−ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ社、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）が補充された冷却ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋１０％のバーセネート液）、２００μｌ内で、細胞を再懸濁した。プレートを、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＧ社、Ｚｕｇ、スイス）上に速やかに確保した。各ウェルについて、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて、ＣＦＳＥ陽性７ＡＤＤ陰性母集団についてゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベーションした条件を用いて、特異的細胞毒性の割合（％）をサンプル毎に決定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、米国）を用いた非線形可変スロープ回帰法（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して、ＥＣ50値を決定した。特異的リダイレクト溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）（ＲＤＬ）の割合（％）を、抗体を含まない条件の特異的細胞毒性の割合（％）を、試験抗体を添加した条件での割合（％）から減じることにより計算した。
【０１６１】
細胞生存率判定法（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）は、本明細書ではＲＤＬ−ＭＴＳ法と呼ぶが、Ｂｕｈｌｅｒ  Ｐら（（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、第５７巻：４３〜５２頁）、Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦら（（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第１１０巻（１３）：５１４５〜５０頁）、及びＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１４３５２４号に記載されているように、同法は比色法に基づき細胞生存率を評価する。標的細胞を捕集、計測し、１回洗浄した後、ＲＤＬ培地内で細胞２×１０ｅ５個／ｍｌに再懸濁した。ＰＢＭＣを捕集、計測し、そしてＲＤＬ培地内で細胞２×１０ｅ６個／ｍｌに再懸濁した。抗体連続希釈物（３×溶液）をＲＤＬ培地内で調製した。標的細胞（５０μｌ／ウェル）、Ｔ細胞（５０μｌ／ウェル）、及び３×抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を、平底９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に分配した。エフェクター：標的物の比は１０：１であった。プレートを、５％のＣＯ2インキュベータ内、３７℃で４８時間インキュベーションした。インキュベー
ション後、上清を廃棄し、プレートを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄してＰＢＭＣを取り出し、次に１００μｌのＲＤＬ培地を各ウェルに添加した。読み取りをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＧ社、Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）を用いて、製造業者の説明書に従い実施した。要するに、１０〜２０μｌのＭＴＳ試薬を、各ウェルに添加し、そしてプレートを、５％のＣＯ2インキュベータ内、３７℃で２〜６
時間インキュベーションした。次に、ＢｉｏＴｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  ＡＧ社、Ｌｕｚｅｒｎ、スイス）上で、４９０ｎｍの吸収を読み取った。特異的キリングの割合（％）を以下の式を用いて計算した：特異的キリング＝１００×［（ＳＤ−Ｓｐ）／（ＳＤ−ＭＤ）］。ＳＤは、標的細胞を単独でインキュベーションした自然死条件において測定された吸収である。Ｓｐは、各試験条件で測定された吸収である
（標的細胞＋ＰＢＭＣ＋抗体）。ＭＤは、標的細胞を３回の凍結及び解凍サイクルにより溶解させた最大死亡条件において測定された吸収である。特異的リダイレクト溶解（ＲＤＬ）の割合（％）は、抗体を含まない条件の特異的細胞毒性の割合（％）を、試験抗体を添加した条件の特異的細胞毒性の割合（％）から減じて計算した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いた非線形可変スロープ回帰法を利用して、ＥＣ50値を決定した。
【０１６２】
異種移植モデル
ＪＩＭＴ−１異種移植
細胞系統及び試薬
乳癌ＪＩＭＴ−１細胞系統を、ＤＳＭＺ（カタログ番号：ＡＣＣ５８９）から取得した。１０％の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＡＭＩＭＥＤ、Ｌｏｎｄｏｎ、英国、カタログ番号：Ｚ１０８３４Ｐ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％のピルビン酸ナトリウム溶液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号：Ｍ１１−００３）、及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：３５０５０−０３８）が補充されたＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：３１９６６−０２１）を含むＤＭＥＭ（１×）内で細胞を維持した。ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：Ａ１１１０５−０１）を用いて、細胞を１週間に２回分裂させた。
【０１６３】
末梢血液単核球（ＰＭＢＣ）を、スイス、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓの血液収集センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｅｔ
Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ、ｒｕｅ  Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ  ２９、ＣＨ−２３００）から入手したヒト白血球を含有する血液フィルターから収集した。１０Ｕ／ｍｌのｌｉｑｕｅｍｉｎ（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ  ＡＧ社、Ｌｕｃｅｒｎ、スイス）を含有するＰＢＳ、６０ｍｌを用いて、逆流置換により細胞をフィルターから取り出した。次に、製造業者の説明書に従い、５０ｍＬのＢｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒチューブ（Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）でＰＢＭＣを単離した：チューブを８００ｇ、室温で２０分間遠心分離し（ブレーキ操作無し）、細胞を界面から収集した。細胞を、ＦＢＳを含まないＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社、カタログ番号：２１８７５−０９１）で３回洗浄した。ＰＢＭＣを、１０％のＦＢＳ（ＡＭＩＭＥＤ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ社）が補充されたＲＰＭＩ培地内で細胞１０ｅ６個／ｍｌに再懸濁し、そして５％のＣＯ2の下、３７℃
、オーバーナイトで培養した。標的細胞を捕集、計測し、１回洗浄した後、ＰＢＳ内で細胞５×１０ｅ６個／ｍｌに再懸濁した。
【０１６４】
マウス及び実験条件
Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞の欠損により特徴付けられる５週齢免疫不全ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ  （ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）メスマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ社、Ｓｔ  Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ、フランス）を対象としてｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実施した。標準齧歯類マイクロアイソレータケージ（２０±１℃の室温、５０±１０％の相対湿度、１２時間明光−暗光リズム）内、滅菌状態の標準化された環境条件下でマウスを維持した。マウスには照射済み食料、床敷き、及び０．２２μｍ濾過済み飲料水を与えた。管轄する州当局（Ｎｅｕｃｈａｔｅｌ  Ｃａｎｔｏｎ、スイス）から許可を得て、スイス動物保護法令に従い、すべての実験を実施した。腫瘍容積が２０００ｍｍ3を上回ったときに、動物保護法令を順守してマウスを安楽死させた
。溶媒対照群と対応する治療群の平均腫瘍容積について、統計分析を一元配置ＡＮＯＶＡ
及びボンフェローニパラメトリック検定により実施した。
【０１６５】
移植前に、ＶＥＥＴクリーム（Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ  ＡＧ社、Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ、スイス）を用いて、すべてのマウスの右側を脱毛した。マウスの写真撮影及び体重測定を、移植日と以後週１回、実施した。動物毎に、５×１０ｅ６個のヒトＰＢＭＣを、５×１０ｅ６個のＪＩＭＴ−１乳癌細胞と、最終容積が０．２ｍｌのＰＢＳ内で混合した。４つの異なるＰＢＭＣドナーが含まれた。ＰＢＭＣ／ＪＩＭＴ−１混合物を、各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右側に皮下注入した。ヒトＰＢＭＣを一切含まず、最終容積が０．２ｍｌのＰＢＳ内に５×１０ｅ６個のＪＩＭＴ−１乳癌細胞を含む対照群が含まれた。１０匹のＪＩＭＴ−１／ＰＢＭＣが移植された動物（１ＰＢＭＣドナー毎に１つの群）からなる群毎に、５匹の動物について、１００μｌの容積を用いて移植後３時間経過して、０．０５ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２／ＣＤ３−１二重特異性抗体で経静脈的に治療した。治療を１週間に３回、２日置きに、２週間反復した。腫瘍を、直角をなす２つの寸法についてカリパスを用いて、１週間に２回測定し、次の式により腫瘍容積を計算した：腫瘍容積＝［（幅２×長さ）／２］。
【実施例１】
【０１６６】
ＶＨ３サブクラスにおいてプロテインＡへの結合を低減する又は無効にする突然変異の判定
免疫グロブリン定常領域におけるプロテインＡ結合を無効にする方法は公知である（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  Ｈ．ら、（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｎｏｌ、第１５５巻（１）：２１９〜２２５頁；米国特許第６，５５１，５９２号；Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ  Ｌ．ら、（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２０１巻（１）：２５〜３４頁；ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１５１７９２号）。完全長ホモ二量体免疫グロブリンにおけるプロテインＡ無効法の使用を評価するために、ＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３  Ｆｃ混合フォーマットに基づく抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリン、及び対応するＦｃ１３３対照フラグメントを調製した。抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンは、天然の抗体と同様にフォーマット化し、またＦｃ１３３フラグメントと融合した、抗ＨＥＲ２特異的ＦＡＢフラグメントから構成された（Ｆｃ配列は、天然のヒトＩＧＨＧ３アイソタイプに由来し、ヒンジ配列は、ヒンジ配列全体にわたり、天然のヒトＩＧＨＧ１アイソタイプと置換されており、略号はＦｃ１３３であり、配列番号１を有する−この場合、名称内の数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序で、各ドメインの免疫グロブリンγアイソタイプサブクラスに対応する；対応する完全長抗ＨＥＲ２免疫グロブリンは、本明細書では、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３と呼ぶ；重鎖は配列番号２、及び軽鎖は配列番号３を有する）。トランスフェクション後、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３ホモ二量体、及びＦｃ１３３フラグメントを、プロテインＡ結合について、材料及び方法のセクションに記載するプロトコールに従い、グラジエントクロマトグラフィーによりアッセイした。図３及び図４Ａに示す通り、Ｆｃ１３３フラグメントは、市販のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ社）に結合しなかったが、一方抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は結合することができた。
【０１６７】
ＦＡＢ定常ドメインの寄与を評価するため、上記抗ＨＥＲ２ホモ二量体を、抗ＨＥＲ２
ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子として再フォーマット化したが、この場合、ｓｃＦｖユニットは１５個のアミノ酸リンカーが融合した親免疫グロブリン可変ドメインから構成された（本明細書では抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３と略す；重鎖は配列番号４を有する）。従って、得られた抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は、親抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３ホモ二量体免疫グロブリンと同一であったが、ＣＨ１及びＣＫ定常ドメインを欠いた。図４Ｂに示す通り、ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は、親抗ＨＥＲ２ホモ−二量体免疫グロブリンで認められたように、プロテインＡ結合性を示した。この所見から、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢフラグメントの可変ドメインは、ホモ二量体免疫グロブリンのＦｃ部
分内のプロテインＡ結合を無効にする方法の有効性阻害に関与しているという結論が導かれる。より重要なこととして、ホモ二量体免疫グロブリンの可変ドメイン内でのプロテインＡ結合は、プロテインＡの差動的精製技法に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨害するものと結論付けられた。
【０１６８】
プロテインＡの５つのドメインすべては、ＶＨ３可変ドメインサブクラスに由来する可変重鎖ドメインに結合することが公知であり（Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｂら、（１９９８）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２０巻（１）：６９〜７８頁）、プロテインＡは、ＶＨ３ベースのＦＡＢとＦｃフラグメントの両方に結合することから、抗体分子全体をパパイン消化した後に、ＶＨ３ベースのＦＡＢフラグメントを調製する際にこれを妨げることが公知である特性である。ホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリン又はそのｓｃＦｖ−Ｆｃバージョンに見出される重鎖可変ドメインは、ＶＨ３−２３サブクラスに属し、またこのようなホモ二量体分子が、その工学的に作出されたＦｃ領域内にプロテインＡ結合部位を有さないにもかかわらず、プロテインＡに結合した理由について説明する。
【０１６９】
ＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はそのフラグメントは、バイオテクノロジー業界にとって多大な重要性を有する。ＶＨ３ベースの分子は幅広く開発されてきたが、それはそのような分子はプロテインＡに結合することができ、機能的な事前スクリーニングをし易くするためであり、従って多くの合成若しくはドナーベースのファージディスプレーライブラリ、又は抗体の探索で用いられる遺伝子組換え動物技術は、ＶＨ３ドメインサブクラスに基づく。更に、ＶＨ３ベースの分子は、その他の公知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも発現及び安定性において良好であることから、頻繁に選択される。ＶＨ３ベースのＦＡＢフラグメントに結合しないプロテインＡの組換えバージョンが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社により、商標名ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）として開発及び商品化されている。
【０１７０】
上記で議論した２つのホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリンについて、そのプロテインＡ結合性評価を行うのに、本発明ではＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂を用いたので、プロテインＡ差動的精製技法を用いる場合、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂は、少なくとも１つのＶＨ３可変ドメインを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製には不向きであったと結論付けられるが、それは、Ｆｃ領域内でプロテインＡと結合しないホモ二量体種は、そのＶＨ３ドメインを介してなおもプロテインＡに結合するためである。
【０１７１】
ＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリン又はそのフラグメントがプロテインＡに結合するのを無効にする又は低減する置換を調査するために、ＶＨ３ベースのＦＡＢ変異体をプロテインＡ結合についてアッセイする必要がある。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）の樹脂タイプは、ＶＨ３ドメインサブクラスにおける結合を欠くことが公知であるが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）として公知の別の市販プロテインＡ樹脂（やはりＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）はＶＨ３ドメインサブクラスに結合し、ＶＨ３ベースのＦＡＢ変異体をプロテインＡ結合について分析するのに選択した。
【０１７２】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂の使用は、ＶＨ３−２３可変ドメインサブクラス（本明細書では抗ＨＥＲ２  ＦＡＢと略す；重鎖は配列番号５、及び軽鎖は配列番号３を有する）であることが公知の、これまでに記載した親抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンに由来する組換え抗ＨＥＲ２  ＦＡＢフラグメントを調製し、並びにフラグメントをＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＶＫサブクラスＩに基づく軽鎖を有する；プロテインＡグラジエントクロマトグラフィーをＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラム上で実施する前に、
ＦＡＢフラグメントを、プロテインＬクロマトグラフィーを用いて、捕捉溶出モードで最初に精製した；両カラムに関するプロトコールは、材料及び方法のセクションに記載するプロトコールに準拠した）に負荷してアッセイすることにより妥当性確認した。図４Ｃに示す通り、ＶＨ３ベースの抗ＨＥＲ２  ＦＡＢのみが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムに結合し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂は、ＶＨ３ベースのＦＡＢフラグメントに対する結合性を欠くことが確認された；少なくとも単量体ＶＨ３ベースのＦＡＢフラグメントが関係する限り、及びプロテインＡに結合しない工学的に作出されたＦｃ領域を有するＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンについてこれまでに認められた結果と更に対比した場合。反対に、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムに対して強い結合性を示し、プロテインＡへの結合が認められない又は低下したＶＨ３ベースのＦＡＢ変異体についてアッセイの可能性をもたらした。
【０１７３】
ＶＨ３ベースのＦＡＢフラグメントにおけるプロテインＡ結合を無効にするために、ＶＨ３ドメイン内の重要なプロテインＡ結合残基を、プロテインＡのＤドメインと複合体を形成したヒトＦＡＢフラグメントの結晶構造から同定した（ＰＤＢコード：１ＤＥＥ；ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ；Ｇｒａｉｌｌｅ  Ｍら、（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、米国、第９７巻（１０）：５３９９〜５４０４頁）。実施された置換の性質が、ヒト由来のプロテインＡ結合性ＶＨサブクラスと非プロテインＡ結合性ＶＨサブクラスとの間の配列比較に基づくような合理的な設計のための出発点として、この結晶構造解析法を用いた。図５は、ヒト重鎖可変ドメインサブクラス毎に、１つの代表的なフレームワークの配置を示す。アミノ酸の位置１５、１７、１９、５７、５９、６４、６５、６６、６８、７０、８１、８２ａ、及び８２ｂ（Ｋａｂａｔナンバリング）を、プロテインＡのＤドメインと１ＤＥＥ構造内のＶＨ３ベースのＦＡＢフラグメントとの間のタンパク質−タンパク質相互作用界面部分として同定した。ヒトＶＨサブクラスの中でも、ＶＨ３はプロテインＡに結合する唯一のサブクラスであり、またその他のサブクラス内の等価なアミノ酸配列位置にある残基を、プロテインＡ結合を無効にする又は低減するための置換源として選択したが、但し免疫原性を低下させる可能性を有した−それは、このような置換は、非プロテインＡ結合性ヒトＶＨサブクラスに見出される等価なアミノ酸位置と同じアミノ酸位置において、１つの残基が別の天然の残基と置換することと関係するためである。
【０１７４】
標準的なＰＣＲに基づく突然変異誘発技術により、上記抗ＨＥＲ２  ＦＡＢフラグメントの配列に突然変異を導入し、下記の置換を行った：Ｇ６５Ｓ（重鎖は配列番号６、及び軽鎖は配列番号３を有する）、Ｒ６６Ｑ（重鎖は配列番号７、及び軽鎖は配列番号３を有する）、Ｔ６８Ｖ（重鎖は配列番号８、及び軽鎖は配列番号３を有する）、Ｑ８１Ｅ（重鎖は配列番号９、及び軽鎖は配列番号３を有する）、Ｎ８２ａＳ（重鎖は配列番号１０、及び軽鎖は配列番号３を有する）、及びＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａの組み合わせ（重鎖は配列番号１１、及び軽鎖は配列番号３を有する）。
【０１７５】
更に、Ｔ５７Ａ置換（重鎖は配列番号１２、及び軽鎖は配列番号３を有する）、及びＴ５７Ｅ置換（重鎖は配列番号１３、及び軽鎖は配列番号３を有する）を行った。Ｔ５７Ａは、国際公開第２０１００７５５４８号で、プロテインＡ結合を無効にすることがこれまでに判明しており、またＴ５７Ｅは、ＶＨ３−プロテインＡ相互作用を破綻させる可能性がある荷電残基が導入されるように設計された。ＶＫサブファミリーＩに基づく軽鎖を得て、材料及び方法のセクションに記載するように、プロテインＬクロマトグラフィーを用いて、捕捉溶出モードでＦＡＢ突然変異体を最初に精製し、またグラジエントモードで稼働するＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムを用いて、プロテインＡ結合について更にアッセイした。図６は、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｅ、Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１Ｅ、Ｎ８２ａＳ、及びＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａの組み合わせのみが、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢがＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂に結合するのを無効にする又は低減することを示す。ＶＨ３ベースのＦＡＢ
フラグメントにおいてプロテインＡ結合を無効にする際には、置換Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１Ｅ、及びＮ８２ａＳが好ましいが、それは、このような突然変異では、非プロテインＡ結合性ＶＨサブクラスに見出される配列等価残基が置換しており、これにより免疫原性を低下させる可能性があるためである。
【０１７６】
抗体のアフィニティー及び特異性は、ＣＤＲ領域に実質的に限定されているが、しかしフレームワーク置換は、いくつかのヒト化抗体のケースで明らかなように、抗体特性に影響を与える可能性がある。上記置換が、ＶＨ３由来の抗体の特異性及び／又はアフィニティーに影響を及ぼす可能性があるか評価するために、好ましいＦＡＢ突然変異体のうちの２つについて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりＨＥＲ２抗原結合をアッセイした。材料及び方法のセクションに記載するように、組換えＨＥＲ２抗原を用いたＳＰＲ測定を実施した。好ましい突然変異体は、オリジナルのＦＡＢ分子（図７）と比較して、いずれもＨＥＲ２抗原に同様に結合することを示し、この置換が特異性又はアフィニティーに関して影響を及ぼさないことを実証した。従って、このような置換は、抗原結合性を有意に失うことなく、ＶＨ３由来の抗体分子内にプロテインＡ結合部を工学的に作出するのに幅広く用いられ得ると期待される。
【０１７７】
このような好ましい置換のうちの２つを、抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリン及びこれまでに記載されている抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子に導入し、そして変異体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂への結合についてアッセイした。下記の変異体を調製した：抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３（重鎖は配列番号１４を有する）、抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３（重鎖は配列番号１５を有する）、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３（重鎖は配列番号１６、及び軽鎖は配列番号３を有する）、及び抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３（重鎖は配列番号１７、及び軽鎖は配列番号３を有する）。
【０１７８】
図８は、４つの突然変異体すべてについて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）クロマトグラフィーから得られたプロファイルを示す。ここでは、すべての変異体は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）カラムへの結合は、ほとんどなくなるまで低減したことを示し、これまでに同定された置換により、プロテインＡへの結合性はうまく除去されることを示唆した。より重要なこととして、プロテインＡ差動的精製技法と組み合わせれば、ＶＨ３ベースのＦＡＢのプロテインＡに対するアフィニティーを無効にする又は低減する置換により、少なくとも１つのＶＨ３可変ドメインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製が可能となるものと結論付けられた。
【実施例２】
【０１７９】
ヒトＣＤ３抗原、腫瘍関連抗原、及び炎症細胞表面抗原を標的とする抗原結合部位
ヒトＣＤ３抗原に対する抗原結合部位
二重特異性が関与するＴ細胞リダイレクトキリングを行わせるために、ヒトＣＤ３εサブユニットを選択した。
【０１８０】
マウスＯＫＴ３抗体のヒト化変異体
本発明で用いた抗ヒトＣＤ３ε抗原結合部位は、マウスＯＫＴ３抗体（ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、商標名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ社より市販され、その後中止された；マウス可変重鎖及び軽鎖ドメインは、配列番号１８及び１９をそれぞれ有する）に由来する。ＯＫＴ３マウス可変ドメインをヒト化し、ｓｃＦｖ及びＦＡＢフラグメントとしてフォーマット化した。
【０１８１】
ＦＡＢ及びｓｃＦｖの両方のフォーマット化に適する極めて安定なヒト化変異体を生成するために、ヒト化は、Ｊｕｎｇ  Ｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ（１９９７、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ  Ｅｎｇ、第１０巻（８）：９５９〜６６頁）により記載されている方法に従った。当該方法は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、ｈｕＭＡＢ４Ｄ５−８、トラスツズマブ又は商標名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；米国特許公開第５，８２１，３３７号；可変重鎖及び軽鎖ドメインは、配列番号２０及び２１をそれぞれ有する）に見出される、ＶＨ／ＶＬドメインの極めて安定な対を利用し、また固定化されたフレームワーク上でのヒト化プロセスのワークフローに従う（Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣ及びＦｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ（２００８）、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、第１３巻：１６１９〜３３頁）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体は、生殖細胞系統フレームワークＶＨ３及びＶＫ１の極めて安定なヒトファミリーに本来由来するので、これら２つのファミリーに由来する生殖細胞系統フレームワークは、固定化されたフレームワークの供給源として同じように利用可能である。あるいは、ヒトＶＫ３生殖細胞系統軽鎖フレームワークファミリーは、良好な安定特性も有するので、これをＶＫ１の代わりに利用可能である（Ｅｗｅｒｔ  Ｓら、（２００３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第３２５巻：５３１〜５５３頁）。マウス抗体に付加して、ヒト抗体も、安定性を改善するために、この固定化されたフレームワーク法を用いて工学的に作出可能である。配列番号２２、２３、及び２４をそれぞれ有するヒト生殖細胞系統フレームワークＩＧＨＶ３−２３＊０４、ＩＧＫＶ１−３９＊０１、及びＩＧＫＶ３−２０＊０１を使用するのが好ましい（ＩＭＧＴ（登録商標）（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づき引用；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２７巻（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ  Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２８巻（１）：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２９巻（１）：２０７〜９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第３１巻（１）：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第２９巻（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ  Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、第６巻（４）：２５３〜６４頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）。
【０１８２】
この目的で、第１のヒト化抗体を構築したが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の可変ドメイン内のＣＤＲは、マウスＯＫＴ３抗体に由来するＣＤＲでそれぞれ置換されており、またマウスＯＫＴ３キメラ抗体（可変重鎖及び軽鎖は、配列番号２５及び２６を有し、本明細書ではＯＫＴ３キメラ抗体と呼ぶ）に照らしてベンチマーク評価した。
【０１８３】
プロトタイプ抗体（可変重鎖及び軽鎖は、配列番号２７及び３９を有し、ＶＨ／ＶＬと略す）では、一過性発現試験における生成レベルが増加しており、またＦＡＢ安定性も示差走査熱量測定により測定されるように向上したが、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ＦＡＣＳ実験でのメジアン蛍光強度により評価した、材料及び方法のセクションを参照）、ヒトＣＤ３ε陽性Ｔ細胞腫瘍系統との結合は認められなかった（図９Ａ）。
【０１８４】
可変ドメインの第１のプロトタイプの対に関する３Ｄモデルに基づき、復帰突然変異（ＣＤＲグラフト結合Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）プロトタイプからマウスＯＫＴ３配列への）のサブセットを選択及び試験した：可変重鎖内のＩ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ、Ｒ５８Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋドメイン、及び可変軽鎖（Ｋａｂａｔナンバリング）内のＭ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ。Ｒ５８Ｎ置換は、ＣＤＲグラフト結合Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）プロトタイプ→マウスＯＫＴ３突然変異に対応する一方、Ｒ５８Ｙ置換は、ＣＤＲグラフト結合Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）プロトタイプ→ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４生殖細胞系統置換に対応することに留意する。置換の組み合わせに関するエンジニアリング戦略は、異なる複数の置換がＣＤＲ領域、及び／又は可変ドメインパッキング
、及び／又は免疫原性に影響を及ぼすと推定される場合、その影響に関するそのような置換の相補性に基づいた。
【０１８５】
第１のアプローチでは、すべての候補品をヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化した。発現量、ＦＡＢフラグメントの熱安定性、及びＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合能力に基づき、最良の変異体を選択した。最良のヒト化変異体は、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて無効にされた、ＶＨドメイン内に存在するプロテインＡ結合部位を有した。このエンジニアリングステップは、抗ＣＤ３ホモ二量体を含まない安全なＴ細胞再標的化ＢＥＡＴ抗体を更に生成するのに必要とされる。
【０１８６】
Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１ＴのＶＨ内の復帰突然変異は、Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１ＹのＶＬ内の復帰突然変異と共にアフィニティーを回復させた。可変ドメインの最良の組み合わせは、ＶＨ８／ＶＬ４、ＶＨ８／ＶＬ８、ＶＨ１１／ＶＬ４、及びＶＨ１１／ＶＬ８であったが、それは、これらはほとんどの親細胞の結合性を保持していたためである（図９Ａ〜Ｃ）。更に、ＶＨ８／ＶＬ８（配列番号４８及び５１をそれぞれ有する可変ドメイン）及びＶＨ１１／ＶＬ８（配列番号４９及び５１をそれぞれ有する可変ドメイン）の組み合わせは、ＦＡＢ安定性が強化されていた（それぞれ＋２．８℃及び＋１．６℃、図９Ｄ）。
【０１８７】
最終的に、最良のヒト化変異体も、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体として再フォーマット化し、一時発現させた。このフォーマットで、変異体の相対的なアフィニティー、安定性、一過性トランスフェクションにおける発現量について、変異体をランク付けした（図９Ｅ）。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合フォーマットにおける可変ドメインの最良の組み合わせは、抗体フォーマット：ＶＨ８−ＶＬ４（ｓｃＦｖフラグメントは配列番号５８を有する）及びＶＨ８−ＶＬ８（ｓｃＦｖフラグメントは配列番号５９を有する）において同定された組み合わせと類似した。両ｓｃＦｖフラグメントは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合フォーマットについて良好な熱安定性を有した（図９Ｆ）。
【０１８８】
マウスＳＰ３４抗体のヒト化変異体
マウス抗体ＳＰ３４は、１９８５年に最初に記載されている（Ｐｅｓｓａｎｏ  Ｓら、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ、第４巻（２）：３３７〜４４頁）。これは、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞由来の変性タンパク質抽出物で免疫化したマウスから得られたハイブリドーマより生成され、抗体はヒト特異性及びカニクイザルに対する交差反応性を有する。ヒト及びカニクイザルＣＤ３εサブユニット上ＳＰ３４エピトープは公知である。
【０１８９】
前出の本実施例に記載する方法及びワークフローに従い、配列番号６０のＶＨドメイン及び配列番号６１のＶＬドメインを有する、マウスＳＰ３４抗体に関するヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、ＶＨ３−２３及びＶＫ３生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、それぞれ工学的に作出した。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインでは、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの利用に応じて、プロテインＡ結合は、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にされ得る。
【０１９０】
この目的で、生殖細胞系統ＶＨ３重鎖ドメイン及び生殖細胞系統ＶＫ３軽鎖ドメインを有するヒト抗体生殖細胞系統の可変ドメイン内のＣＤＲが、マウスＳＰ３４抗体由来のＣＤＲでそれぞれ置換された第１のヒト化抗体を構築した。得られたヒト化抗体を、更なるアフィニティーの改善のための出発点として用い、またＳＰ３４抗体（重鎖及び軽鎖は配列番号６２及び６３をそれぞれ有し、本明細書ではＳＰ３４キメラ抗体と呼ぶ）のキメラに照らしてベンチマーク評価した。
【０１９１】
プロトタイプ抗体（可変重鎖及び軽鎖は配列番号６４及び６９を有し、ＶＨ１／ＶＬ１
と略す）が有するヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対する結合性は低かった（ＳＰＲによる評価、材料及び方法のセクション、並びに図１０Ａを参照）。
【０１９２】
可変ドメインの第１のプロトタイプの対に関する３Ｄモデルに基づき、ＣＤＲグラフト結合ヒト生殖細胞系統ＶＨ３／ＶＫ３プロトタイプと、マウスＳＰ３４配列（ヒト→マウス又はマウス→ヒト置換）の間の復帰突然変異、又は合理的に設計されたアミノ酸変化のいずれかに対応した置換のサブセットを選択した。下記の変化を生じさせ、様々な組み合わせで試験した：可変重鎖ドメイン内のＷ１００ｅＦ及びＷ１００ｅＹ、並びに可変軽鎖内のＡ２Ｉ、Ｓ２５Ａ、Ｔ２７Ａ、Ｇ２７ａＡ、Ｖ２７ｃＡ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｅ３８Ｑ、Ｆ４４Ｐ、Ｇ４６Ｌ、Ｔ５１Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｒ５４Ａ、Ｐ５６Ａ、Ｌ６６Ｇ、Ｄ６９Ｔ、Ｆ８７Ｙ、Ｑ８９Ａ、Ｗ９１Ｆ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９４Ａ、及びＱ１００Ｇ（Ｋａｂａｔナンバリング；図１０Ａを参照）。置換の組み合わせに関するエンジニアリング戦略は、異なる複数の置換がＣＤＲ領域、及び／又は可変ドメインパッキング、及び／又は免疫原性、及び／又は哺乳動物細胞における一過性発現へのインパクトに影響を及ぼすと推定される場合、その影響に関するそのような置換の相補性に基づいた。
【０１９３】
第１のアプローチでは、すべての候補品をヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化し、その後、Ｇ６５Ｓを用いて無効にされた、ＶＨドメイン内に存在するプロテインＡ結合部位を有するいくつかの変異体と共に、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質フォーマット（図１０Ｂ）で更に試験した。発現量、及びＳＰＲにより求めた、ヒト及びカニクイザルＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対する結合能力に基づき、最良のヒト化候補品を選択した。
【０１９４】
抗原結合及び組換え発現に関する重鎖及び軽鎖可変ドメインの好ましい組み合わせは以下の通りであった：軽鎖ドメインＶＬ２１（配列番号１０５）及びＶＬ３２（配列番号１０６）と対をなすＶＨ１（配列番号１０１）、又はＶＨ２（配列番号１０２）、又はＶＨ３（配列番号１０３）、又はＶＨ５（配列番号１０４）。
【０１９５】
ＨＥＲ２
ＨＥＲ２陽性癌細胞を殺傷するように、Ｔ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒト乳癌を治療するのに有用である。抗ＨＥＲ２抗体が記載されており（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ  ＧＭら、（２０１３）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第１９巻（１８）：４９１１〜６頁）、その一部はクリニックで現在用いられている、又はヒトを対象とした臨床試験において現在調査されている（Ｔｓａｎｇ  ＲＹ及びＦｉｎｎ  ＲＳ（２０１２）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、第１０６巻（１）：６〜１３頁）。
【０１９６】
抗ＨＥＲ２抗原結合部位は、本発明で用いる場合、ＦＡＢフラグメント（ＦＡＢ重鎖フラグメントは配列番号５、及び軽鎖は配列番号３を有する）、又はｓｃＦｖフラグメント（配列番号１０７）としてフォーマット化された組換えヒト化抗ＨＥＲ２抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（セクション１．１を参照）に由来した。いくつかのフォーマットでは、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５のＶＨドメイン（ＶＨ３ドメインサブクラス）中に存在するプロテインＡ結合部は、Ｇ６５Ｓ置換（ＦＡＢフラグメントは、配列番号１０８を有する重鎖及び配列番号３の軽鎖を有する、又はｓｃＦｖフラグメントは配列番号１０９を有する）、又はＮ８２ａＳ置換（ＦＡＢフラグメントは、配列番号１１０を有する重鎖及び配列番号３の軽鎖を有する、又はｓｃＦｖフラグメントは配列番号１１１を有する）を用いて無効にした。
【０１９７】
ＣＤ３８
ＣＤ３８は、ＩＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、造血細胞上及び固体組織内に通常見
出される。ＣＤ３８も、様々な悪性血液病において発現している。ＣＤ３８陽性癌細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、多発性骨髄腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ワルデンストレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、ＮＫ−細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む様々な悪性血液病を治療するのに有用である。いくつかの抗ＣＤ３８抗体は、研究試薬又は治療候補品として記載されている（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００６０９９８７５号）。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトＣＤ３８抗体として、ＯＫＴ−１０及びＨＢ−７マウスハイブリドーマが挙げられる（Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｓら、（１９９７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５８巻（２）：７４１〜７頁）。
【０１９８】
第１のアプローチでは、抗ヒトＣＤ３８抗原結合部位は、マウスハイブリドーマＯＫＴ１０（可変重鎖及び軽鎖は、配列番号１１２及び１１３をそれぞれ有する）、又はＨＢ−７（可変重鎖及び軽鎖は、配列番号１１４及び１１５をそれぞれ有する）、及びＦＡＢ又はｓｃＦｖフラグメントとして更にフォーマット化可能なこれらのヒト化バージョンに由来し得る。実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、ＨＢ−７ハイブリドーマのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、それぞれ工学的に作出可能である。
【０１９９】
第２のアプローチでは、Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣ及びＦｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ（Ｆｔｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、（２００８）第１３巻：１６１９〜３３頁）が記載するいわゆる最良適合ヒト化法に従い、ＨＢ−７ハイブリドーマの最良適合ヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、ヒトＩＧＨＶ４−５９＊０３及びＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、それぞれ工学的に作出した（前出のＩＭＧＴ（登録商標）に基づき引用）。異なる復帰突然変異度のヒト化ＶＨ及びＶＬ変異体をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで調べ、そしてヒト化ＶＨ及びＶＬについて選択を行い、そのうちの好ましい１つを、ヒトＩｇＧ１フォーマットとして一過性発現させ、これを本明細書では、ヒト化ＨＢ−７最良適合ＶＨ（配列番号１１６）及びＶＬ（配列番号１１７）ドメインと呼んだ。下記のマウス復帰突然変異を導入した：（ＶＨ）Ｓ３５Ｈ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｆ７８Ｖ、Ｙ９１Ｆ、及び（ＶＬ）：Ｍ４Ｌ、Ｌ４８Ｉ、Ｙ４９Ｓ、Ｔ６９Ｋ（Ｋａｂａｔナンバリング）。
ＦＡＣＳによるヒト化ＨＢ−７最良適合抗体（重鎖は配列番号１１８、及び軽鎖は配列番号１１９を有する）染色ＣＨＯ［ＣＤ３８］組換え細胞（データは示さない）。
ヒト化ＨＢ−７最良適合抗体は、ＳＰＲによりアッセイしたとき、ＣＤ３８細胞外領域に対して、ＨＢ−７キメラ抗体（重鎖は配列番号１２０、及び軽鎖は配列番号１２１を有する）の結合アフィニティーと類似した結合アフィニティーを有した（それぞれ３．６及び２．５ｎＭのＫＤ；図１１Ａ（キメラ）及び図１１Ｂ（ヒト化））。驚くべきことに、ヒト化ＨＢ−７最良適合抗体は、熱量測定プロファイルから判断されるように、ＦＡＢフラグメントの安定性について、ＨＢ−７キメラ抗体と比較して、それよりも有意な改善（＋１４．６℃）を示した（７６．４℃（キメラ）と９１．０℃（ヒト化）、図１１Ｆ）。
【０２００】
第３のアプローチでは、ヒトＣＤ３８に対する新規のハイブリドーマ候補品を生成するのに、ヒトＣＤ３８細胞外ドメイン及びヒトＣＤ３８＋細胞で免疫化したマウスを用いた。ハイブリドーマを生成する方法は公知であり、また本発明で用いた方法は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号で開示されている方法と類似した。９Ｇ７マウス抗体候補品は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８の両方に対して高いアフィニティーを有した（可変重鎖及び軽鎖は、配列番号１２２及び１２３をそれぞれ有する）。本実施例ですでに記載した方法に基づき、このマウス抗体を最初にヒト化した。最良適合アプローチを用いて、生殖細胞系統ＶＨフレームワークＩＧＨＶ２−５＊０９及びＶＫフレームワークＩＧＫＶ１−３３＊０１（前出のＩＭＧＴ（登録商標）に基づき引用）を、ヒト化プロ
セスの出発点として選択した。ＣＤＲグラフティング後、第１の抗体プロトタイプ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプとしてフォーマット化、重鎖は配列番号１２４、及び軽鎖は配列番号１２５）は、ヒトＣＤ３８に対して強い結合性を示し、ＳＰＲにより判断されたように、マウス親抗体の１／３に低下したにすぎなかった（配列番号１２６の重鎖、及び配列番号１２７の軽鎖を有する９Ｇ７キメラ抗体；９Ｇ７キメラ抗体（データは示さない）及び第１のヒト化プロトタイプ（データは示さない）のそれぞれについて０．３ｎＭ及び１ｎＭのＫＤ）。抗体の可変軽鎖内にＦ３６Ｙ復帰突然変異を導入するとアフィニティーは２倍改善した（Ｋａｂａｔナンバリング）（得られた抗体は、本明細書では、配列番号１２４の重鎖及び配列番号１２８の軽鎖を有するヒト化９Ｇ７最良適合抗体と呼ぶ；ヒトＣＤ３８に対して０．５ｎＭのＫＤ、図１１Ｃ）。ヒト化９Ｇ７最良適合抗体は、カニクイザルＣＤ３８抗原に対する高いアフィニティーも示し（３．２ｎＭのＫＤ、データは示さない）、また９Ｇ７キメラ抗体よりもＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンから得たＦＡＢ  Ｔｍ）が改善した（ヒト化９Ｇ７最良適合抗体及びの９Ｇ７キメラ抗体について、それぞれ９４℃と８２．２℃；図１１Ｇを参照）。ヒト化９Ｇ７最良適合抗体は、配列番号１２９の重鎖可変ドメイン、及び配列番号１３０の軽鎖可変ドメインを有する。
【０２０１】
更に、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングによる最良フレームワークアプローチに従い、９Ｇ７マウス抗体をヒト化した。異なる復帰突然変異度のヒト化ＶＨ及びＶＬ変異体をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで調べ、そしてヒト化ＶＨ及びＶＬの組み合わせについて選択を行い、そのうちの好ましい１つを、ヒトＩｇＧ１抗体として一過性発現させた（得られた抗体は、本明細書では、配列番号１３１の重鎖及び配列番号１３２の軽鎖を有するヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体と呼ぶ）。下記のマウス復帰突然変異を導入した：（ＶＨ）Ａ２４Ｆ、Ｖ３７Ｉ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ａ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ｖ、及びＫ９４Ｒ、並びに（ＶＬ）Ｆ３６Ｙ（Ｋａｂａｔナンバリング）。この抗体は、ヒトＣＤ３８及びカニクイザルＣＤ３８に対して強い結合性を示し、ヒト化９Ｇ７最良適合抗体の結合と類似した親和定数を有した（ヒト及びカニクイザルＣＤ３８について、それぞれ０．４及び１ｎＭのＫＤ；図１１Ｄ）。ＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンから得たＦＡＢ  Ｔｍ）も、９Ｇ７最良適合Ｆ３６Ｙヒト化変異体の熱安定性と非常に類似した（８９．２℃、図１１Ｈを参照）。図１１Ｊは、すでに記載した異なるヒト化９Ｇ７抗体を要約する。ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体は、配列番号１３３の重鎖可変ドメイン及び配列番号１３４の軽鎖可変ドメインを有する。
【０２０２】
第４のアプローチでは、抗体ファージライブラリをスクリーニングして、ヒトＣＤ３８に対する追加のｓｃＦｖフラグメントを生成した。ライブラリは、天然のヒトＶ遺伝子に基づく多様性を有した。このドナー由来の抗体ファージディスプレーライブラリは、ヒトドナー４８例に由来する血液リンパ球から増幅されたｃＤＮＡを用いたが、同ヒトドナー４８例のうち７０％が、自己免疫疾患（脈管炎、全身性エリテマトーデス、脊椎関節障害、リウマチ性関節炎、及び強皮症）を有した。ライブラリの構築は、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら（２００７、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．、第８巻（１１）：Ｒ２５４）が記載するプロトコールに従い、多様性の合計は２．５３×１０ｅ１０クローンであった。ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３８を認識するＳｃＦｖフラグメントを、このドナー由来のファージディスプレーライブラリから以下のように単離した。ＳｃＦｖフラグメントを、組換え誘導型のヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３８抗原上で一連の選択サイクルを反復して単離した（材料及び方法のセクションを参照）。抗体ファージディスプレーライブラリをスクリーニングする方法は公知である（Ｖｉｔｉ  Ｆら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、第３２６巻：４８０〜５０５頁）。要するに、ライブラリと共にインキュベーションした後、プラスチック製イムノチューブ上に予めコーティングして抗原を固定化し（２０μｇ／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ内、オーバーナイト）、又はストレプトアビジンビーズ上で捕捉して抗原を固定化し（ビオチン標識形態の抗原を用いる場合、選択プロセス
全体を通じて、抗原は５０ｎＭの濃度で捕捉される）、結合したファージを回収する一方、未結合のファージを洗い流した。Ｍａｒｋｓら（Ｍａｒｋｓ  ＪＤら、（１９９１）Ｊ
Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第２２２巻（３）：５８１〜９７頁）の記載に従い、結合したファージを回復させ、選択プロセスを３回反復した。第２及び第３ラウンドのパニングから得た１０００を超えるクローンを発現させ、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８抗原に対するＥＬＩＳＡ法により分析した。陽性クローンについてＤＮＡ配列決定を実施し、いくつかの特有のクローンを、ヒトＣＤ３８を発現する細胞系統に結合するその能力について更に分析した。ストレプトアビジンビーズ上に固定化されたヒトＣＤ３８抗原のビオチン標識バージョンに基づく第１ラウンドのパニング、及びストレプトアビジンビーズ上に固定化されたカニクイザルＣＤ３８抗原のビオチン標識バージョンに基づく第２ラウンドのパニングの後に、配列番号１３５の可変重鎖配列、及び配列番号１３６の可変軽鎖を有する１つの好ましいｓｃＦｖフラグメント（クローン番号７６７）を、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８の両方に結合するその能力から選択した。ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化した際に、クローン７６７は、ヒトＣＤ３８について約３００ｎＭ（図１１Ｅ）、及びカニクイザルＣＤ３８について約１．２μＭ（データは示さない）のＫＤを有した（クローン７６７ＩｇＧ１抗体は、本明細書では、配列番号１３７の重鎖、及び配列番号１３８の軽鎖を有するヒト７６７抗体と呼ぶ）。ＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンから得たＦＡＢ  Ｔｍ）は７０．２℃であった（図１１Ｉ）。クローン７６７ＶＨドメインは、ＶＨ３ドメインサブクラスに属する。
【０２０３】
ＯＸ４０
ＣＤ３及びＯＸ４０を標的とする二重特異性抗体は、活性化Ｔリンパ球の標的化及び枯渇化を可能にする。この組み合わせでは、ＣＤ３及びＯＸ４０分子の両方を発現させる活性化したＴリンパ球が、急速な細胞消失を引き起こす相互殺傷プロセスに関わるようになる。二重特異性抗体によりヒトＣＤ３及びＯＸ４０の両方が同時に関与するようになれば、病原性Ｔ細胞を短期間に有効に除去し得る。ＯＸ４０は、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーであり、またラット由来の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現する５０ｋＤａの糖タンパク質として、１９８７年に初めて同定された（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ＤＪら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２４巻：１２８１〜９０頁）。ＣＤ２８とは異なり、ＯＸ４０は、無感作Ｔ細胞上では構成的に発現しないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与後に誘発される。ＯＸ４０は、二次共刺激分子であり，活性化後２４〜７２時間経過して発現する；そのリガンドであるＯＸ４０Ｌも休止期抗原提示細胞（ｒｅｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）上では発現しないが、その活性化後に発現する。
【０２０４】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号（重鎖及び軽鎖ドメインは配列番号１３９及び１４０をそれぞれ有する）で開示されるマウス抗ヒトＯＸ４０抗体は、抗ヒトＯＸ４０抗原結合部位供給源として利用可能である。最良適合ヒト化法に基づくこの抗体のヒト化バージョンも、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号で開示されている（重鎖及び軽鎖ドメインは配列番号１４１及び１４２をそれぞれ有し、両抗体はＢＥＡＴフォーマットに再フォーマット化されるように修正可能である）。
【０２０５】
実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、抗ヒトＯＸ４０ハイブリドーマ用のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインをそれぞれ工学的に作出する。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインを、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、プロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にする。２つのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインのみを、異なる復帰突然変異度毎に区別して調査した。第１のプロトタイプ抗体及び実施例２．１に記載するアプローチと同様に、復帰突然変異を、親抗体可変ドメインと、ＣＤＲグラフト結合ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アライ
メントから同定した。これらのＣＤＲグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフト（ｍｉｎｇｒａｆｔ）と呼ぶ。次に、これまでのアライメントから同定されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフト（ｍａｘｇｒａｆｔ）と呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列をまとめる：
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化抗ＯＸ４０ＶＨ；ヒト化抗ＯＸ４０／ミングラフトＶＨと略す（配列番号２７８）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化抗ＯＸ４０ＶＨ；ヒト化抗ＯＸ４０／マックスグラフトＶＨと略す（配列番号２７９）。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化抗ＯＸ４０ＶＬ；ヒト化抗ＯＸ４０／ミングラフトＶＬと略す（配列番号２８０）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化抗ＯＸ４０ＶＬ；ヒト化抗ＯＸ４０／マックスグラフトＶＬと略す（配列番号２８１）。
【０２０６】
ＣＤ２０
ＣＤ２０発現性Ｂ細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒトリンパ腫、癌を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトＣＤ２０抗体が、研究試薬又は治療候補品として記載されている。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトＣＤ２０抗体として、リツキシマブキメラ抗体及びそのヒト化変異体が挙げられる（リツキシマブキメラ抗体、商標名リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）、ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９４０１１０２６号；配列番号１４３のマウスＶＨドメイン及び配列番号１４４のマウスＶＬドメイン。
【０２０７】
実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、リツキシマブキメラ抗体用のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、それぞれ工学的に作出する。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインを、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、プロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にする。２つのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、異なる復帰突然変異度毎に区別して調査する。第１のプロトタイプ抗体及び実施例２．１に記載するアプローチと同様に、復帰突然変異を、親抗体可変ドメインと、ＣＤＲグラフト結合ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから識別した。これらのＣＤＲグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフトと呼ぶ。次に、これまでのアライメントから識別されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフトと呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。
得られた配列をまとめる：
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化リツキシマブＶＨ；ヒト化リツキシマブ／ミングラフトＶＨと略す（配列番号２８２）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化リツキシマブＶＨ；ヒト化リツキシマブ／マックスグラフトＶＨと略す（配列番号２８３）。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化リツキシマブＶＬ；ヒト化リツキシマブ／ミングラフトＶＬと略す（配列番号２８４）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化リツキシマブＶＬ；ヒト化リツキシマブ／マックスグラフトＶＬと略す（配列番号２８５）。
【０２０８】
ＥＧＦＲ
ＥＧＦＲ陽性癌細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒト癌、好ましくはヒト膵癌及びヒト結腸癌を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトＥＧＦＲ抗体が、研究試薬又は治療候補品として記載されている。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトＥＧＦＲ抗体として、セツキシマブキメラ抗
体及びそのヒト化変異体が挙げられる（セツキシマブキメラ抗体、商標名アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標）、Ｃ２２５、ＩＭＣ−Ｃ２２５；ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９６４０２１０号；配列番号１４５のマウスＶＨドメイン及び配列番号１４６のマウスＶＬドメイン。
【０２０９】
実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標）キメラ抗体用のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、それぞれ工学的に作出する。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインを、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、プロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にする。２つのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、異なる復帰突然変異度毎に区別して調査する。第１のプロトタイプ抗体及び実施例２．１に記載するアプローチと同様に、復帰突然変異を、親抗体可変ドメインと、ＣＤＲグラフト結合ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから識別した。これらのＣＤＲグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフトと呼ぶ。次に、これまでのアライメントから識別されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフトと呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。
得られた配列をまとめる：
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化アービタックスＶＨ；ヒト化アービタックス／ミングラフトＶＨと略す（配列番号２８６）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化アービタックスＶＨ；ヒト化アービタックス／マックスグラフトＶＨと略す（配列番号２８７）。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化アービタックスＶＬ；ヒト化アービタックス／ミングラフトＶＬと略す（配列番号２８８）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化アービタックスＶＬ；ヒト化アービタックス／マックスグラフトＶＬと略す（配列番号２８９）。
【０２１０】
別の十分に特徴付けられている抗ヒトＥＧＦＲ抗体として、ヒトパニツムマブ抗体及びそのヒト化変異体が挙げられる（ヒトパニツムマブ抗体、商標名ベクチビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（登録商標）、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３８９９７号；配列番号２９０のマウスＶＨドメイン及び配列番号２９１のマウスＶＬドメイン。
【０２１１】
実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、ベクチビックス（登録商標）キメラ抗体用のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインをそれぞれ工学的に作出する。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインを、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、プロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にする。２つのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、異なる復帰突然変異度毎に区別して調査する。第１のプロトタイプ抗体及び実施例２．１に記載するアプローチと同様に、復帰突然変異を、親抗体可変ドメインと、ＣＤＲグラフト結合ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから識別した。これらのＣＤＲグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフトと呼ぶ。次に、これまでのアライメントから識別されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフトと呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。
得られた配列をまとめる：
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化ベクチビックスＶＨ；ヒト化ベクチビックス／ミングラフトＶＨと略す（配列番号２９２）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化ベクチビックスＶＨ；ヒト化ベクチビックス／マックスグラフトＶＨと略す（配列番号２９３）。
復帰突然変異を有さないヒト化及び安定化ベクチビックスＶＬ；ヒト化ベクチビックス／
ミングラフトＶＬと略す（配列番号２９４）。
すべての考え得る復帰突然変異を有するヒト化及び安定化ベクチビックスＶＬ；ヒト化ベクチビックス／マックスグラフトＶＬと略す（配列番号２９５）。
【０２１２】
ＣＤ１９
ＣＤ１９発現性Ｂ細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる形態のヒト血液及び骨髄の癌を治療するのに有用である。ヒトＣＤ１９分子は、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（すなわち、未成熟Ｂ細胞）、最終的に形質細胞に分化した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含む、但しこれらに限定されないヒトＢ細胞表面上で発現する構造的に異なる細胞表面受容体である。ＣＤ１９は、ほとんどのプレＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンスリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、有毛状細胞性白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及びヌル急性リンパ芽球性白血病の一部で発現している（Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭら、（１９８３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１３１巻：２４４〜２５０頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＫＣら、（１９８４）Ｂｌｏｏｄ、第６３巻：１４２４〜１４３３頁；Ｌｏｋｅｎ  ＭＲら、（１９８７）Ｂｌｏｏｄ、第７０巻：１３１６〜１３２４頁；Ｕｃｋｕｎ  ＦＭら、（１９８８）Ｂｌｏｏｄ、第７１巻：１３〜２９頁；Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ  ＲＨ、及びＲａｃｉｌａ  Ｅ、（１９９５）Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、第１８巻：３８５〜３９７頁）。形質細胞上でのＣＤ１９の発現は、分化したＢ細胞腫瘍、例えば多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンシュトレーム型腫瘍（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ  ｔｕｍｏｒ）等上で発現し得ることを更に示唆する（Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ＭＬら、（１９９８）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ、第１０２巻：５０９〜１５頁；Ｔｒｅｏｎ  ＳＰら、（２００３）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、第３０巻：２４８〜５２頁）。
【０２１３】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０９５０３１号に記載されているヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、ＶＨ３−２３及びＶＫ１可変ドメインフレームワークを利用し、実施例２．１に記載するような二重特異性抗体を生成するのに利用可能である。配列番号２９６のＶＨドメイン、及び配列番号２９７のＶＬドメインを有するヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を用い、これをそのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、プロテインＡ結合を更に無効にする。
【０２１４】
ＩｇＥ
膜結合型のＩｇＥ陽性Ｂ細胞を殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトする二重特異性抗体は、異なる炎症性疾患、例えば喘息又は線維症等を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトＩｇＥ抗体が、研究試薬又は治療候補品として記載されている。とりわけ、最も詳細に特徴付けられている抗ヒトＩｇＥ抗体として、オマリズマブ抗体（商標名ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ）（登録商標）、米国特許商標庁公開番号：米国第６，７６１，８８９号、同第６，３２９，５０９号、及び同第２００８０００３２１８Ａ１号；Ｐｒｅｓｔａ
ＬＧら、（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５１巻：２６２３〜２６３２頁；配列番号２９８のヒト化ＶＨドメイン、及び配列番号２９９のヒト化ＶＬドメイン）、及びその変異体が挙げられる。
【０２１５】
実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、オマリズマブ抗体用のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインをそれぞれ工学的に作出する。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインを、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、プロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にする。２つの安定化ＶＨ及びＶＬドメインを、異なる復帰突然変異度毎に区別して調査する。第１のプロトタイプ抗体及び実施例２．１に記載するアプローチと同様に、復帰突然変異を、親抗体可変ドメインと、ＣＤＲグラフト結合ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから識別
した。これらのＣＤＲグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフトと呼ぶ。次に、これまでのアライメントから識別されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフトと呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。
得られた配列をまとめる：
復帰突然変異を有さない安定化オマリズマブＶＨ；安定化オマリズマブ／ミングラフトＶＨと略す（配列番号３００）。
すべての考え得る復帰突然変異を有する安定化オマリズマブＶＨ；安定化オマリズマブ／マックスグラフトＶＨと略す（配列番号３０１）。
復帰突然変異を有さない安定化オマリズマブ；安定化オマリズマブ／ミングラフトＶＬと略す（配列番号３０２）。
考え得る復帰突然変異をすべて有する安定化オマリズマブＶＬ；安定化オマリズマブ／マックスグラフトＶＬと略す（配列番号３０３）。
【０２１６】
抗ヒトＩｇＥ抗体の別の例として、マウス抗体Ｂｓｗ１７が挙げられる（Ｖｏｇｅｌ  Ｍら、（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、第３４１巻（２）：４７７〜８９頁；配列番号３０４のマウスＶＨドメイン及び配列番号３０５のマウスＶＬドメイン）。
【０２１７】
実施例２．１に記載する方法及びワークフローに従い、ヒト化Ｂｓｗ１７抗体用のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖細胞系統フレームワーク上へのＣＤＲグラフティングにより、それぞれ工学的に作出する。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインを、そのＢＥＡＴ抗体フォーマットでの使用に応じて、プロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて更に無効にする。２つの安定化ＶＨ及びＶＬドメインを、異なる復帰突然変異度毎に区別して調査する。第１のプロトタイプ抗体及び実施例２．１に記載するアプローチと同様に、復帰突然変異を、親抗体可変ドメインと、ＣＤＲグラフト結合ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから識別した。これらのＣＤＲグラフト結合可変ドメインは復帰突然変異を有さず、本明細書ではミングラフトと呼ぶ。次に、これまでのアライメントから識別されたすべての復帰突然変異が含まれるように、この配列を更に修飾し、本明細書ではマックスグラフトと呼ぶ、修飾された可変ドメイン配列を得た。
得られた配列をまとめる：
復帰突然変異を有さない安定化Ｂｓｗ１７ＶＨ；安定化Ｂｓｗ１７／ミングラフトＶＨと略す（配列番号３０６）。
すべての考え得る復帰突然変異を有する安定化Ｂｓｗ１７ＶＨ；安定化Ｂｓｗ１７／マックスグラフトＶＨと略す（配列番号３０７）。
復帰突然変異を有さない安定化Ｂｓｗ１７ＶＬ；安定化Ｂｓｗ１７／ミングラフトＶＬと略す（配列番号３０８）。
考え得る復帰突然変異をすべて有する安定化Ｂｓｗ１７ＶＬ；安定化Ｂｓｗ１７／マックスグラフトＶＬと略す（配列番号３０９）。
【実施例３】
【０２１８】
Ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリンの生成
３．１  ＢＥＡＴ（登録商標）技術及びビルトイン式精製システム
ＢＥＡＴ抗体は、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）」技術よりも優れたヘテロ二量化を示すバイオミミクリーという特有の概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号）。ＢＥＡＴプラットフォームは、天然のホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメインの対において、その間の３Ｄ上、等価の位置にある界面アミノ酸の置換に基づき、Ｆｃベースの二重特異性抗体のための構成ブロックとして利用可能である新規のヘテロ二量体を生み出す。当該技術は、任意のタイプの抗原結合スキャフォールドを用いて、Ｆｃベースの二重特異性抗体を
設計できるようにする。ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットは、本明細書ではＦｃベースの二重特異性抗体を設計するのに用いられ、両方の抗原結合部位について、共通する軽鎖を開発する必要がない。
【０２１９】
ＢＥＡＴ抗体は、重鎖ヘテロ二量体であるので、２つの異なる重鎖間で区別する必要がある。これらの重鎖を本明細書ではＢＴＡ鎖及びＢＴＢ鎖と呼ぶ。本発明で用いたＢＴＡ鎖及びＢＴＢ鎖は、抗原結合部位、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプに由来するＣＨ２ドメイン、及びヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプに由来する修飾されたＣＨ３ドメインを含む。いくつかのＢＴＡ及びＢＴＢ  ＣＨ３ドメインは同一であった、又はＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号に記載されているドメインの修飾された変異体であった。ＢＴＡ及びＢＴＢ  ＣＨ３ドメインを、（ＢＴＡ）配列番号１４７、１４８、１４９、１５３、１５４、及び１５５、並びに（ＢＴＢ）配列番号１５０、１５１、１５２、１５６、１５７、及び１５８からなる群より選択した。好ましいＢＴＡ−ＢＴＢ  ＣＨ３ドメインの対は、配列番号１４７と配列番号１５０、配列番号１４８と配列番号１５０、配列番号１４９と配列番号１５１、配列番号１４７と配列番号１５２、及び配列番号１４８と配列番号１５２からなる群より選択される。最も好ましいＢＴＡ−ＢＴＢ  ＣＨ３ドメインの対は、配列番号１４７と配列番号１５６、配列番号１４８と配列番号１５６、配列番号１５４と配列番号１５０、及び配列番号１５４と配列番号１５２からなる群より選択される。
【０２２０】
上記のように、プロテインＡと非対称的に結合するＢＥＡＴ重鎖ヘテロ二量体は、プロテインＡと結合しない免疫グロブリンアイソタイプに由来する親ドメインを用いて生み出され得る（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号）。ホモ及びヘテロ二量体の種間でプロテインＡ結合部位数が相違するが、そのような相違は、プロテインＡクロマトグラフィーによってこれらの分子種を分離するのに特に有用である。プロテインＡクロマトグラフィーによる種間分離を妨害する残留結合を避けるため、ヒト重鎖可変ドメインのＶＨ３サブクラス内に通常見出される二次的なプロテインＡ結合部位をすべて無効にする必要がある。抗原結合部位が、ＶＨ３ファミリーに由来する場合、そのプロテインＡ結合部位の無効は、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）により実現可能である。
【０２２１】
ＶＨ３起源の１つの抗原結合部位及びＶＨ３に由来しない１つの抗原結合部位を用いて、本発明に含まれる二重特異性抗体を調製する際には、ＶＨ３起源の抗原結合部位は、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合する該重鎖上に位置する必要がある。あるいは、ＶＨ３起源の抗原結合部位は、プロテインＡ結合が無効となるように、Ｎ８２ａＳ置換又はＧ６５Ｓ置換又はその同等の置換で置換され得る。ＶＨ３起源の一対の抗原結合部位を用いて本発明の二重特異性抗体を調製する際には、唯一の可能性は、上記のアミノ酸置換を通じて、ＶＨ３ベースの抗原結合部位のうちの少なくとも１つについて、プロテインＡ結合を無効にすることである。好ましくは、本発明の二重特異性抗体は、２つのホモ二量体うちの１つについて、プロテインＡ結合部位を有さないものが生み出されるように工学的に作出される。より好ましくは、本発明の二重特異性抗体は、プロテインＡ結合部位を有さない１つのホモ二量体と、対象とするヘテロ二量体に対してプロテインＡ結合部位の数に相当な差異（少なくとも１つのプロテインＡ結合部位、好ましくは２つのプロテインＡ結合部位）を有する他方のホモ二量体とが生み出されるように工学的に作出される。
【０２２２】
単一特異性抗ヒトＣＤ３ε抗体により引き起こされる毒性の機構は、幅広く調査中である；直接的な機構は、抗体のアフィニティー、エピトープ、及び価数と関連したが、毒性の間接的な機構についても記載されている。この毒性の間接的な機構には、免疫細胞を発現するＦｃ受容体と相互作用し、また一過性のＴ細胞活性化及びサイトカインの放出を引き起こす抗ヒトＣＤ３ε抗体のＦｃ領域が関与している。安全性を改善することを最終目
的として、ヒトＣＤ３εを標的とするＢＥＡＴ抗体を、その下部ヒンジ領域におけるＦｃ−受容体結合について無効にした。Ｆｃ受容体結合は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を用いて無効又は抑制されたが（ＥＵナンバリング；Ｓｔｒｏｈｌ  ＷＲら、（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻（６）：６８５〜９１頁）；上記置換はＬＡＬＡ置換と多くの場合呼ばれる。
【０２２３】
プロテインＡ結合が無効にされた少なくとも１つのＶＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ抗体の例
ＨＥＲ２／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＨＥＲ２及び抗ＣＤ３εアームは、天然の抗体の場合と同様に、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖフラグメントからなる重鎖として、又はＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢフラグメントからなるｓｃＦｖ−Ｆｃタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、またＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、内部に残留するプロテインＡ結合を適宜無効にした。ヒトＨＥＲ２抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化した：
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＨＥＲ２アームについて、実施例２．１及び２．２にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、第１のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、Ｎ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を有する可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号４７）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５９）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡとは結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｎ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、これにより、重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６０）から構成された。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体と呼ぶ（図１２ＡフォーマットＡ）。
【０２２４】
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＨＥＲ２アームについて、実施例２．１及び２．２にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、第２のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２のアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号３）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含む、ＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６１）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６２）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡとは結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｎ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、これにより、重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体と呼ぶ（図１２ＡフォーマットＢ）。
【０２２５】
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＨＥＲ２アームについて、実施例２．１及び２．２にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、第３のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、Ｇ６５Ｓ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を有する可変重鎖ドメイン、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号４７）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６３）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡとは結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、これにより、重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６４）から構成された。ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９４０２９３５０号に記載するように、重鎖４４（Ｇ４４Ｃ）及び軽鎖１００（Ｑ１００Ｃ）のＫａｂａｔ位置において、重鎖と軽鎖ドメインとの間でジスルフィド結合を工学的に作出し、この結合を用いて二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分を更に安定化した。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３抗体と呼ぶ（図１２ＢフォーマットＣ）。
【０２２６】
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＨＥＲ２アームについて実施例２．１及び２．２にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、第４のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号１６６）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６５）から構成された。この重鎖及び軽鎖会合体は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載されるような抗ヒトＣＤ３ε抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンを含んだ。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６７）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡと結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、Ｎ８２ａＳ置換を含むようにＶＨドメインを突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体と呼ぶ（図１２ＢフォーマットＤ）。
【０２２７】
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＨＥＲ２アームについて実施例２．１及び２．２にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、第５のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号８９）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６８）から構成された。この二重特異性抗体のアームは、実施例２．１に記載するヒト化ＳＰ３４ＶＨ１／ＶＬ２１抗体の可変ドメインを含んだ。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６７）から構成された。このアーム
は、上記ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗ＨＥＲ２アームと同等である（図１２ＢフォーマットＤを参照）。重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡと結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したので、Ｎ８２ａＳ置換を含むようにＶＨドメインを突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体と呼ぶ（図１２ＣフォーマットＥ）。
【０２２８】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体を一時的に発現させ、精製し、そしてそれらのＨＥＲ２及びＣＤ３ε抗原に対するアフィニティー、それらの安定性、及びそれらのＴ細胞キリングをリダイレクトする能力について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。一過性発現の収率は、すべてのＢＥＡＴ抗体について、培養物上清１リットル当たり５〜１５ｍｇの範囲であった。重要なこととして、すべての二重特異性抗体では、単一のプロテインＡクロマトグラフィーステップ後、その調製物内に認められるホモ二量体汚染物質のレベルは非常に低かった。
これらのＢＥＡＴ抗体は、両アームのいずれもがＶＨ３ドメインを含むように設計されたので、少なくとも１つのＶＨ３ドメインにおいてプロテインＡ結合を無効にしさえすれば、好ましい差動的精製法の１つを用いて、対象とするヘテロ二量体を容易に精製することができた（図２Ｅを参照）。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体に関する差動的プロテインＡ精製トレースの例を図１３に示すが、また図１４は、精製されたヘテロ二量体のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。ホモ二量体汚染物質の含有量はほんのわずかであることが、このプロファイルから同定され得る。ＦＡＢ部分を担持するようにフォーマット化された重鎖のホモ二量体は、プロテインＡに結合しないので、見出されなかった。ｓｃＦｖフラグメントを担持するようにフォーマット化された重鎖のホモ二量体は、わずかな割合（２．５％）で認められ、単一のプロテインＡクロマトグラフィーステップ後のヘテロ二量体含有量として９７％を実現した。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）、及びＢＥＡＴ
ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体は、単一のプロテインＡクロマトグラフィーステップ後に、類似したレベルの均質性及び純度まで精製された。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３抗体は、プロテインＡクロマトグラフィー後、ある割合のジスルフィド結合したヘテロ二量体凝集物を示したが（２７％）、陽イオン交換クロマトグラフィーにより除去された。
【０２２９】
ＶＨ３ベースの重鎖ヘテロ二量体内のプロテインＡ結合を無効にすると、プロテインＡクロマトグラフィー後の純度に大きな影響を及ぼすことを更に実証するために、ＢＥＡＴ
ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を、上記のＮ８２ａＳ置換を含めないで工学的に作出した。図１５Ａ及び１５Ｂは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びその非Ｎ８２ａＳ置換バージョンについて、それらのプロテインＡクロマトグラフィー溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をそれぞれ示す。ｐＨ４では、非Ｎ８２ａＳ置換バージョンの溶出分画は、ＦＡＢアームを担持するようにフォーマット化された重鎖のホモ二量体に対応する追加バンドを示す（図１５Ｂ）一方、Ｎ８２ａＳ置換ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３バージョンでは認められないが（図１５Ａ）、それは、ＦＡＢアームを担持するようにフォーマット化された重鎖は、そのＦｃ領域（ヒトＩｇＧ３アイソタイプに基づくＦｃ領域）においてプロテインＡと結合しないためであり、これから唯一推測され得ることとして、このホモ二量体種に見出されるＶＨ３ベースの可変ドメインは、プロテインＡ結合に関係することが挙げられる。この結果は、ＶＨ３ベースの重鎖ヘテロ二量体内でのプロテインＡ結合の無効の有用性を明確に物語っている。
【０２３０】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体の両方は、ヒトＨＥＲ２及びヒトＣＤ３ε抗原について類似したＫＤ値を有した。ＫＤ値は、ヒトＨＥＲ２抗原について０．５０〜２ｎＭ、及びヒトＣＤ３ε抗原について１〜２μＭの範囲であった（ヒトＣＤ３γ−ε−Ｆｃ構築物を用いて、ＳＰＲにより測定した場合）（材料及び方法のセクションを参照；図１６Ａ及び１６Ｂ）。２つの二重特異性抗体に関するＤＳＣプロファイルは類似したが、両ケースでは、ヒトＨＥＲ２又はヒトＣＤ３εに関与するｓｃＦｖ部分は、Ｔｍが６８℃の範囲の良好な熱安定性プロファイルを保持した。両抗体内のＦＡＢ部分は、８２〜８３℃（図１６Ｃ）の範囲のＴｍを有した。
【０２３１】
ヒト化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＨＥＲ２抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＨＥＲ２抗原結合部位について、実施例２．１及び２．２にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２３２】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１０）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２３３】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ  ナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２３４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ細胞キリングアッセイ
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の作用機序は、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ３抗原と標的の対象となる細胞上に発現するＨＥＲ２抗原を架橋することにより、細胞傷害性Ｔ細胞キリングを、標的対象となる細胞に標的化することに基づく。
【０２３５】
Ｔ細胞キリングをリダイレクトするＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体の効力を、フローサイトメトリーに基づく方法（本明細書ではＲＤＬ−ＦＡＣＳ法と呼ぶ）、又は比色分析に基づく方法（本明細書ではＲＤＬ−ＭＴＳ法と呼ぶ）を用いて測定した。高発現性ＨＥＲ２細胞系統ＪＩＭＴ−１、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）耐性乳癌細胞系統、高発現性ＨＥＲ２細胞系統ＢＴ−４７４、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）感受性乳癌細胞系統、及び低ＨＥＲ２発現性乳腺癌細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ヒトＰＢＭＣ、及びＢＥＡＴ
ＨＥＲ２／ＣＤ３−１又は−２抗体又は対照抗体の連続希釈物の存在下で４８時間、個別に培養した。このアッセイでは、供血から得たヒトＰＢＭＣを、細胞傷害性Ｔリンパ球の供給源として用いた。エフェクター：標的細胞の比として１０：１をすべてのアッセイにおいて用いた。陰性対照は、抗体処理を行わないサンプルの形態で提供した（標的細胞及びヒトＰＢＭＣのみ）。インキュベーション期間後に、細胞毒性を、ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法又はＲＤＬ−ＭＴＳ法を用いて測定した（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、対照抗体は、特異的Ｔ細胞媒介型細胞毒性を引き起こさないことが明らかであった。対照的に、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体は、非常に強力な、用量依存性
の腫瘍標的細胞死を誘発した。最大キリングはほぼ１００％であった。両法の読み取りは、近い結果を示した。ドナー間変動では、方法間のＥＣ50に約１０倍の相違が認められた。測定されたＥＣ50は、標的細胞系統によるＨＥＲ２抗原発現量と相関した。
【０２３６】
ＢＴ−４７４細胞は、最も多くのＨＥＲ２抗原を発現し、またＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体の両方のＥＣ50は、サブピコモルからピコモルの範囲内であった（それぞれ０．６及び２ｐＭ、図１７Ａ）。ＪＩＭＴ−１細胞は、その細胞表面上でＨＥＲ２抗原を隠蔽し（Ｎａｇｙ  Ｐら、（２００５）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６５巻（２）：４７３〜４８２頁）、従って高いＨＥＲ２発現性を有するにもかかわらず、低Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）結合性を示した。驚くべきことに、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体は、いずれもＲＤＬ−ＭＴＳ法で測定した場合、ＪＩＭＴ−１細胞に対してピコモル範囲のＥＣ50を有した（それぞれ２１及び１６ｐＭ；図１７Ｂ）。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体は、１．４ｐＭのＥＣ50を有した。低ＨＥＲ２発現性乳腺癌細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、前出の２つの細胞系統よりも感受性は低く、両抗体はサブナノモルのＥＣ50を示した（両方の数値は、ほぼ０．２ｎＭ；図１７Ｃ）。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体は、０．０８ｎＭのＥＣ50を有した。これらを総じて考慮すると、これらの結果より、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体は、様々なＨＥＲ２発現性乳癌細胞系統に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明白である。
【０２３７】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体には、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載されている抗ヒトＣＤ３ε抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンが含まれた。このＢＥＡＴ抗体フォーマットがＴ細胞キリングをＨＥＲ２＋細胞に対してリダイレクトする能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。２つの異なるＨＥＲ２＋細胞系統、すなわち高ＨＥＲ２発現性細胞系統（ＮＣＩ−Ｎ８７）及び低ＨＥＲ２発現性細胞系統（ＨＴ−１０８０）をキリングアッセイで用いた（材料及び方法のセクションを参照）。図１７Ｄ〜Ｅは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＴ−１０８０細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングをそれぞれ示す。アッセイでは、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１を用い、また４８時間のインキュベーション期間後にＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体は、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＴ−１０８０細胞をそれぞれ標的としたとき、ＥＣ50が０．３５及び２９ｐＭであるように、ＨＥＲ２＋細胞系に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明白である。
【０２３８】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体には、実施例２．１に記載する抗ヒトＣＤ３ε抗体のヒト化バージョン（ＳＰ３４−κ１）ＶＨ１／ＶＬ２１が含まれた。このＢＥＡＴ抗体フォーマットがＴ細胞キリングをＨＥＲ２＋細胞に対してリダイレクトする能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。２つの異なるＨＥＲ２＋細胞系統、すなわち高ＨＥＲ２発現性細胞系統（ＮＣＩ−Ｎ８７）及び低ＨＥＲ２発現性細胞系統（ＨＴ−１０８０）をキリングアッセイで用いた（材料及び方法のセクションを参照）。図１７Ｆ〜Ｇは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体によるＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＴ−１０８０細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングをそれぞれ示す。アッセイでは、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１を用い、また４８時間のインキュベーション期間後にＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体は、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＴ−１０８０細胞をそれぞれ標的としたとき、ＥＣ50が０．４６及び３３８ｐＭであるように、ＨＥＲ２＋細胞系に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明白である。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
ＪＩＭＴ−１異種移植
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を、ＪＩＭＴ−１／ＰＢＭＣ異種移植モデルを用いて調査した。供血から得たヒトＰＢＭＣを細胞傷害性Ｔリンパ球の供給源として用いた。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）耐性乳癌ＪＩＭＴ−１細胞を、非刺激ヒトＰＢＭＣ（４つの異なるドナー）と１：１の比で混合し、その後免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの皮下に注入した。移植後、２週間にわたり週３回、動物をＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体で、経静脈的に処理した。抗体処理は、移植後３時間経過して開始し、その後２、４、７、９、及び１１日目に継続して行った。
【０２４０】
ＰＢＭＣ無しで腫瘍増殖を評価するために、５つのうち１つのコホートについて、ヒトＰＢＭＣが存在しない状態で５×１０ｅ６個のＪＩＭＴ−１細胞を皮下に接種した一方、残りのコホートには、健常ドナーから得た５×１０ｅ６個の非刺激ヒトＰＢＭＣと混合された５×１０ｅ６個のＪＩＭＴ−１細胞からなる混合物を皮下注入した。
【０２４１】
ヒトＰＢＭＣは、抗体が存在しない場合には、腫瘍増殖に対してマイナス効果を示さなかった（図１８Ａ）。ヒトエフェクター細胞存在下で、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を用いて処理すると、ほとんどの動物において腫瘍増殖の完全抑制が誘発された（１８／２０腫瘍、図１８Ｂ〜Ｃ）。処理最終日後１８日経過して、増殖を再開した腫瘍は１１％に過ぎない（２／１８）。これらのデータは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体の抗腫瘍効果は強力であることを、極めて明瞭に示している。
【０２４２】
ＣＤ３８／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＣＤ３８及び抗ＣＤ３εアームは、天然の抗体の場合と同様に、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖフラグメントからなる重鎖として、又はＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢフラグメントからなるｓｃＦｖ−Ｆｃタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、またＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、内部に残留するプロテインＡ結合を適宜無効にした。ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化した：
ヒト化ＨＢ７最良適合ＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第１の例を、以下のようにフォーマット化した：
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ３８アームについて実施例２．１及び２．３にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１１９）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６９）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６２）から構成された。この重鎖には、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部が含まれ、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｎ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。このアームは、上記ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗ＣＤ３εアームと同等である（図１２ＡフォーマットＢを参照）。二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ
３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体と呼ぶ（図１９フォーマットＡ）。
【０２４３】
ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体を一時的に発現させ、精製し、そしてそのＣＤ３８及びＣＤ３ε抗原に対するアフィニティー、その安定性、及びそのＴ細胞キリングをリダイレクトする能力について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＫＤ値は、ヒトＣＤ３８抗原について３．２ｎＭであった（ＳＰＲ測定；図２０Ａ）。二重特異性抗体に関するＤＳＣプロファイルは、良好な熱安定性プロファイルを示し、ｓｃＦｖ部分についてＴｍは約６８℃であった。ＦＡＢ部分のＴｍは約９１℃であった（図２０Ｂ）。
【０２４４】
ＣＤ３８発現細胞系統（材料及び方法のセクションを参照）を、実施例３．２．１に記載するアッセイ法と類似したアッセイ法でリダイレクトされたＴ細胞キリングを評価するのに用いた。図２１は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体を用いて行った、ＲＰＭＩ８２２６ミエローマ細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイでは、エフェクター細胞として精製されたＴ細胞を、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１で用いたことに留意する。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定すると、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体のＥＣ50は２．２ｐＭであった（ドナー２例の平均値、４８時間インキュベーション）。
【０２４５】
ヒトクローン７６７ＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第２の例を、以下のようにフォーマット化した：
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ３８アームについて実施例２．１及び２．３にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３抗体を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１３８）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７０）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７１）から構成された。この重鎖には、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部が含まれ、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体と呼ぶ（図１９フォーマットＢ）。
【０２４６】
ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体を一時的に発現させ、精製し、そしてそのＣＤ３８及びＣＤ３ε抗原に対するアフィニティー、その安定性、及びそのＴ細胞キリングをリダイレクトする能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＣＤ３８発現細胞系統（材料及び方法のセクションを参照）を、実施例３．２．１に記載するアッセイ法と類似したアッセイ法でリダイレクトされたＴ細胞キリングを評価するのに用いた。図２２は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体を用いて行った、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１で用いたことに留意する。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定すると、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体のＥＣ50は、２４４ｐＭであった（ドナー３例の平均値、２４時間インキュベーション）。
【０２４７】
ヒト化９Ｇ７最良フレームワークＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ３８抗原結合部位について、実施例２．１及び２．３
にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２４８】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１３２）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１２）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２４９】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良フレームワーク／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２５０】
ヒトクローン７６７ＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ３８抗原結合部位について、実施例２．１及び２．３にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２５１】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１３８）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１３）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２５２】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２５３】
ＯＸ４０／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ３εアームは、天然の抗体の場合と同様に、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖフラグメントからなる重鎖として、又はＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢフラグメントからなるｓｃＦｖ−Ｆｃタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、またＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、内部に残留するプロテインＡ結合を適宜無効にした。ヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化した：
【０２５４】
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＯＸ４０アームについて、実施例２．１及び２．４にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体の例を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号（配列番号１４１及び１４２をそれぞれ有する可変重鎖及び軽鎖ドメイン）で開示されるヒト化抗ヒトＯＸ４０抗体の可変ドメインを用い、また可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号１７３）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７２）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６２）から構成された。この重鎖には、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部が含まれ、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｎ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。このアームは、上記ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗ＣＤ３εアームと同等である（図１２ＡフォーマットＢを参照）。二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体と呼ぶ（図２３）。
【０２５５】
ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体がＯＸ４０＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞系統をキリングアッセイ法で用いた。図２４は、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体による、安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイ法では、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞：標的細胞の比として２０：１で用い、また４８時間のインキュベーション期間後、ＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体は、ＥＣ50が０．５ｎＭであるように、安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高いことが明らかである（ドナー３例の平均値）。
【０２５６】
ヒト化抗ＯＸ４０／マックスグラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＯＸ４０抗原結合部位について、実施例２．１及び２．４にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２５７】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３１５）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１４）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２５８】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＯＸ４０マックスグラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２５９】
ヒト化抗ＯＸ４０／ミングラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＯＸ４０抗原結合部位について、実施例２．１及び２．４にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２６０】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３１７）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１６）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２６１】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＯＸ４０ミングラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２６２】
ＣＤ２０／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
マウスリツキシマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化した：
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ２０アームについて、実施例２．１及び２．５にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を工学的に作出した。
【０２６３】
ヒト化リツキシマブ／マックスグラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ２０抗原結合部位について、実施例２．１及び２．５にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２６４】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３１９）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１８）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２６５】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ２０マックスグラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２６６】
ヒト化リツキシマブ／ミングラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ２０抗原結合部位について、実施例２．１及び２．５にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２６７】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３２１）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２０）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２６８】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ２０ミングラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２６９】
ＥＧＦＲ／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ３εアームは、天然の抗体の場合と同様に、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖフラグメントからなる重鎖として、又はＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢフラグメントからなるｓｃＦｖ−Ｆｃタイプの重鎖としてフォーマット化され得る。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、またＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、内部に残留するプロテインＡ結合を適宜無効にした。ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化した：
【０２７０】
ヒトＥＧＦＲ及びヒトＣＤ３ε抗原の両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲアームについて、実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ
ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１７５）と会合したγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含む、マウスアービタックス抗体可変ドメイン（配列番号１４５及び１４６をそれぞれ有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン）に基づくＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７４）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７１）から構成された。この重鎖には、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部が含まれ、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、ＶＨドメインを、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位をすべて除去した。このアームは、上記ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗ＣＤ３εアームと同等である（図１９フォーマットＢを参照）。二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体
と呼ぶ（図２５）。
【０２７１】
ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体を、一時的に発現させ、精製し、そしてそのヒトＥＧＦＲ＋細胞系統に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＨＴ−２９細胞系統をキリングアッセイで用いた。図２６は、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体によるＨＴ−２９細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイ法では、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１で用い、そして４８時間のインキュベーション期間後に、ＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体は、ＥＣ50が７０．６ｐＭ（ドナー４例の平均値）であるように、ＨＴ−２９細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高いことが明らかである。
【０２７２】
ヒト化アービタックス／マックスグラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲ抗原結合部位について、実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２７３】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３２３）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２２）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２７４】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲセツキシ−マックスグラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２７５】
ヒト化アービタックス／ミングラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲ抗原結合部位について、実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２７６】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３２５）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２４）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２７７】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３ε部分は、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１
γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲセツキシ−ミングラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２７８】
ヒト化ベクチビックス／マックスグラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲ抗原結合部位について、実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２７９】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３２７）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２６）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２８０】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲパニ−マックスグラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２８１】
ヒト化ベクチビックス／ミングラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いて、ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲ抗原結合部位について、実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
【０２８２】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３２９）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２８）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２８３】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲパニ−ミングラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２８４】
ＣＤ１９／ＣＤ３  ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３重鎖は、天然の抗体の場合と同様に、第１のＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖフラグメントからなる重鎖のｃＦｖ−Ｆｃタイプとして、又は第１のＢＥＡ
Ｔ鎖と融合したＦＡＢフラグメントからなる重鎖としてフォーマット化され得る。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、またＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、内部に残留するプロテインＡ結合を適宜無効にした。国際公開第２０１００９５０３１号に記載されている抗ＣＤ１９ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＣＤ１９抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化する：
【０２８５】
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ１９抗原結合部位について、実施例２．１及び２．７にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ１９／ＣＤ３の例を工学的に作出する。
【０２８６】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ１９アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３３１）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ
ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３０）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２８７】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ１９／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２８８】
リダイレクトされたＴ細胞キリングを、実施例３．２．１に記載するアッセイ法と類似したアッセイ法で評価するのに、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０９５０３１号に記載されているＣＤ１９発現細胞系統を用いる。
【０２８９】
ＩｇＥ／ＣＤ３  ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＩｇＥ及び抗ＣＤ３重鎖は、天然の抗体の場合と同様に、第１のＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖフラグメントからなる重鎖のｓｃＦｖ−Ｆｃタイプとして、又は第１のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢフラグメントからなる重鎖としてフォーマット化され得る。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位を形成するには、その同起源の軽鎖と会合する必要がある。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、またＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔナンバリング）を用いて、内部に残留するプロテインＡ結合を適宜無効にした。
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＩｇＥ抗原結合部位について、実施例２．１及び２．８にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＩｇＥ／ＣＤ３抗体を工学的に作出する。
ＩｇＥを細胞表面上で発現する細胞系統は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０３３７３６号に記載されており、リダイレクトされたＴ細胞キリングを、実施例３．２．１に記載するアッセイ法と類似したアッセイ法で評価するのに利用可能である。
【０２９０】
安定化したオマリズマブ／マックスグラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化する：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域
、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３３３）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３２）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２９１】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＩｇＥオマリ−マックスグラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２９２】
安定化したオマリズマブ／ミングラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマット化する：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３３５）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３４）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２９３】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥオマリ−ミングラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２９４】
安定化したＢｓｗ１７／マックスグラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマット化する：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３３７）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３６）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２９５】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥ  ｂｓｗ１７−マックスグラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２９６】
安定化したＢｓｗ１７／ミングラフトＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマット化する：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号３３９）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３８）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、従ってプロテインＡに結合しないが、本明細書で用いた重鎖は、ＶＨ３フレームワークに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、ＶＨドメインは、Ｇ６５Ｓ置換を含むように突然変異しており、これにより重鎖内の追加的なプロテインＡ結合部位はすべて除去されている。
【０２９７】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥ  ｂｓｗ１７−ミングラフト／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０２９８】
１つのＶＨ３ドメインのみを含むＢＥＡＴ抗体の例
ＣＤ３８／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
ヒト化ＨＢ７／最良適合ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマット化した：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ３８アームについて、実施例２．１及び２．３にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１１９）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７６）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したので、プロテインＡと結合しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７７）から構成された。この重鎖及び軽鎖会合体は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載される抗ヒトＣＤ３ε抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンを含んだ。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体（図２７フォーマットＡ）と呼ぶ。
【０２９９】
ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体が、Ｔ細胞キリングをＣＤ３８＋細胞に対してリダイレクトする能力をｉｎ−ｖｉｔｒｏで調査した。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞系統Ｄａｕｄｉを、キリングアッセイで用いた。図２８は、ＢＥＡＴ
ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイ法では、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１で用い、そして２４時間のインキュベーション期間後、ＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体は、ＥＣ50が１．８ｐＭ（ドナー３例の平均値）であるように、Ｄａｕｄｉ  ＣＤ３８＋細胞系統に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明白である。
【０３００】
ヒト化９Ｇ７最良適合ＶＨ及びＶＬ配列（それぞれ配列番号１２９及び１３０）を用いた、ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第２の例を、以下のようにフォーマット化した：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ３８アームについて実施例２．１及び２．３にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を工学的に作出した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及びその同起源の軽鎖（配列番号１２８）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７８）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有したので、プロテインＡと結合しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７９）から構成された。この二重特異性抗体のアームは、実施例２．１に記載するヒト化ＳＰ３４  ＶＨ５／ＶＬ３２抗体の可変ドメインを含んだ。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ（図２７フォーマットＢ）。ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体は、ヒトＣＤ３  １−２６＿Ｆｃ融合タンパク質について、１８ｎＭのＫＤ値を有した（図２９）。
【０３０１】
ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体が、Ｔ細胞キリングをＣＤ３８＋細胞に対してリダイレクトする能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞系Ｄａｕｄｉを、キリングアッセイ法で用いた。図３０は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体によるＤａｕｄｉ細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイ法では、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１で用い、そして２４時間のインキュベーション期間後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体は、ＥＣ50が２ｐＭ（ドナー３例の平均値）であったように、Ｄａｕｄｉ
ＣＤ３８＋細胞系統に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力が極めて高かったことが明らかである。
【０３０２】
ＯＸ４０／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
ヒト化抗ＯＸ４０抗体ＶＨ及びＶＬ配列（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号）を用いた、ヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマット化する：
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＯＸ４０抗原結合部位について、実施例２．１及び２．４にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号１７３）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４０）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインＡと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０３０３】
実施例３．２．４に記載するアッセイ法と類似したアッセイ法で、上記ヒトＯＸ４０発現細胞系統を、リダイレクトされたＴ細胞キリングを評価するのに用いる。
【０３０４】
ＣＤ２０／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
マウスリツキシマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化した：
抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ２０アームについて、実施例２．１及び２．５にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を工学的に作出した。
【０３０５】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号１８１）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むマウスリツキシマブ抗体可変ドメイン（配列番号１４３及び１４４をそれぞれ有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン）に基づくＢＥＡＴ重鎖（配列番号１８０）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したので、プロテインＡと結合しなかった。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖  （配列番号１７７）から構成された。このアームは、上記ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗ＣＤ３εアームと同等である（図２７フォーマットＡを参照）。このｓｃＦｖフラグメントには、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号（配列番号１８２及び１８３をそれぞれ有するＶＨ及びＶＬドメイン）に記載される抗ヒトＣＤ３ε  ＳＰ３４抗体のヒト化バージョンが含まれた。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体と呼ぶ（図３１）。
【０３０６】
ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体を一時的に発現させ、精製し、そしてそのＴ細胞キリングをヒトＣＤ２０＋細胞系統に対してリダイレクトする能力について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞系統Ｄａｕｄｉをキリングアッセイ法で用いた。図３２は、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＤａｕｄｉ細胞のＴ細胞リディレクテッドキリングを示す。アッセイ法では、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞：標的細胞の比として１０：１で用い、そして２４時間のインキュベーション期間後に、ＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果より、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体は、ＥＣ50が２５ｐＭ（ドナー３例の平均値）であるように、Ｄａｕｄｉ細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力は極めて高いことが明白である。
【０３０７】
リツキシマブキメラ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＣＤ２０抗原結合部位について、実施例２．１及び２．５にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号１８１）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４１）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変
ドメインを有するので、プロテインＡと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０３０８】
ＥＧＦＲ／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
マウスアービタックス抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲ抗原結合部位について実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号１７５）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４２）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインＡと結合しない。
【０３０９】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲセツキシ／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０３１０】
ヒトベクチビックス抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＥＧＦＲ抗原結合部位について実施例２．１及び２．６にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号３４４）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４３）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインＡと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲパニ／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０３１１】
ＩｇＥ／ＣＤ３標的ＢＥＡＴ抗体の例
ヒト化オマリズマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を、以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＩｇＥ抗原結合部位について実施例２．１及び２．８にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＩｇＥ／ＣＤ３を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域
、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号３４６）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４５）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインＡと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＩｇＥオマリ／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０３１２】
マウスＢｓｗ１７抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いた、ヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３εの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマット化する：抗ヒトＣＤ３ε及び抗ヒトＩｇＥ抗原結合部位について、実施例２．１及び２．８にそれぞれ記載するが、その抗原結合部位の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＩｇＥ／ＣＤ３を工学的に作出する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ３ＣＨ２領域、及び同起源の軽鎖（配列番号３４８）と会合したγ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４７）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を含み、また非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来するその重鎖可変ドメインを有するので、プロテインＡと結合しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３εアームは、ｓｃＦｖフラグメント、ＣＨ１γ１領域、γ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵナンバリング）を有するγ１ＣＨ２領域、及びγ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを含むＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＩｇＥ  ｂｓｗ１７／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体と呼ぶ。
【０３１３】
記載するようなメンブレンＩｇＥ発現細胞系統が、リダイレクトされたＴ細胞キリングを、上記アッセイ法と類似したアッセイ法で評価するのに用いられる。
【０３１４】
【表１】
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【図１】
2020023516.tif 000047
【図２Ａ】
2020023516.tif 000048
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2020023516.tif 000052
【図２Ｆ】
2020023516.tif 000053
【図３】
2020023516.tif 000054
【図４Ａ】
2020023516.tif 000055
【図４Ｂ】
2020023516.tif 000056
【図４Ｃ】
2020023516.tif 000057
【図５】
2020023516.tif 000058
【図６Ａ】
2020023516.tif 000059
【図６Ｂ】
2020023516.tif 000060
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
2020023516.tif 000077
【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
2020023516.tif 000079
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
2020023516.tif 000081
【図１１Ｂ】
2020023516.tif 000082
【図１１Ｃ】
2020023516.tif 000083
【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
2020023516.tif 000089
【図１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
2020023516.tif 000093
【図１３】
2020023516.tif 000094
【図１４】
2020023516.tif 000095
【図１５Ａ】
2020023516.tif 000096
【図１５Ｂ】
2020023516.tif 000097
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2020023516.tif 000099
【図１６Ｃ】
2020023516.tif 000100
【図１７Ａ】
2020023516.tif 000101
【図１７Ｂ】
2020023516.tif 000102
【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
2020023516.tif 000105
【図１７Ｆ】
2020023516.tif 000106
【図１７Ｇ】
2020023516.tif 000107
【図１８Ａ】
2020023516.tif 000108
【図１８Ｂ】
2020023516.tif 000109
【図１８Ｃ】
2020023516.tif 000110
【図１９】
2020023516.tif 000111
【図２０Ａ】
2020023516.tif 000112
【図２０Ｂ】
2020023516.tif 000113
【図２１】
2020023516.tif 000114
【図２２】
2020023516.tif 000115
【図２３】
2020023516.tif 000116
【図２４】
2020023516.tif 000117
【図２５】
2020023516.tif 000118
【図２６】
2020023516.tif 000119
【図２７】
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【図２８】
2020023516.tif 000121
【図２９】
2020023516.tif 000122
【図３０】
2020023516.tif 000123
【図３１】
2020023516.tif 000124
【図３２】
2020023516.tif 000125
【配列表】
2020023516000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
本発明の更なる態様に基づけば、配列番号２２４〜２２９、２３０〜２３５、及び３５２〜３５７の群に由来する少なくとも１つのＣＤＲ、又は配列番号１２２／１２３、１２４／１２５、１２９／１３０、１３５／１３６、１３３／１３４、１０４／１０６の群より選択される重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対、及び１２６／１２７又は１２８、１３１／１３２、１３７／１３８、３５９／３６０の群より選択される重鎖と軽鎖の配列の対からなる組み合わせを含むポリペプチドが提供される。
［図面の簡単な説明］
［図１］プロテインＡを用いる、好ましい差動的アフィニティー精製技法の概略図である。重鎖は、いずれもＶＨ３ベースの抗原結合部位を含まない。凡例：［（Ａ＋）］は、機能性プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能性プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
［図２］差動的プロテインＡクロマトグラフィーを用いて、１つ又は複数のＶＨ３ドメインを含む重鎖のヘテロ二量体を精製する際に直面する問題を示す概略図である。ヘテロ二量体の少なくとも１つのＶＨ３ドメイン内のプロテインＡ結合部位の突然変異に基づく解決策の例を示す。
［図２Ａ］重鎖のヘテロ二量体が重鎖内にＶＨ３ドメインを含むが、重鎖がそのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しない際に直面する問題を示す図である。
［図２Ｂ］図２Ａに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しないヘテロ二量体の重鎖は、そのプロテインＡ結合部位を無効にするように突然変異したＶＨ３ドメインを含む。
［図２Ｃ］図２Ａに記載する問題に対する代替的解決策を示す図であり、ヘテロ二量体は１つのＶＨ３ドメインのみを含み、またヘテロ二量体は、そのＶＨ３ドメインが、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合する重鎖上に位置するように、工学的に作出されている（解決策としてのＶＨ３ドメイン再配置戦略）。
［図２Ｄ］ヘテロ二量体の両方の重鎖がＶＨ３ドメインを含む際に直面する問題を示す図である。
［図２Ｅ］図２Ｄに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、ヘテロ二量体の重鎖は、そのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しないが、そのプロテインＡ結合部位を無効にするように突然変異したＶＨ３ドメインを含む。
［図２Ｆ］図２Ｄに記載する精製問題に対する代替的解決策を示す図であり、各ＶＨ３ドメインは、そのプロテインＡ結合部位について無効にされている。四角で囲まれた種は、差動的プロテインＡクロマトグラフィープロセス期間中に、これらの種は同時溶出することを示す。ｐＨ値のＡとＢは、約１ｐＨ単位異なり、プロテインＡに結合する種の効果的な分離を可能にする。一般的に、ｐＨ  Ａ及びｐＨ  ＢのｐＨ値は、それぞれ４及び３である。すべての図の凡例：［（Ａ＋）］は機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は非機能性プロテインＡ結合部位を意味する。
［図３］Ｆｃ１３３のプロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
［図４］プロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
［図４Ａ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。
［図４Ｂ］抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  １３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。
［図４Ｃ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム、及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。
［図５］７つの公知のヒトＶＨフレームワークサブクラスそれぞれについて、代表的なアミノ酸配列を示す図である。配列を、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき整列させた。プロテインＡのドメインＤと相互作用するヒトＶＨ３−２３フレームワークサブクラス内の位置を太字で示す。
［図６］プロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ、及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
［図６Ａ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ。
［図６Ｂ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ａ。
［図６Ｃ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ｅ。
［図６Ｄ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｇ６５Ｓ。
［図６Ｅ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ６６Ｑ。
［図６Ｆ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ６８Ｖ。
［図６Ｇ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｑ８１Ｅ。
［図６Ｈ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｎ８２ａＳ。
［図６Ｉ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ。
［図７］ＨＥＲ２抗原に対する選択された抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ変異体の平衡解離定数（ＫＤ）を示す図である。
［図８］プロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを、破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
［図８Ａ］抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。
［図８Ｂ］抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。
［図８Ｃ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。
［図８Ｄ］抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。
［図９］これらの図は、すべて安定なヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化と関連する。
［図９Ａ］ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
［図９Ｂ］ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
［図９Ｃ］ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
［図９Ｄ］選択された抗体候補品のＤＳＣプロファイル。
［図９Ｅ］ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
［図９Ｆ］選択されたｓｃＦｖ−Ｆｃ候補品のＤＳＣプロファイル。
［図１０］これらの図は、すべて安定なヒトフレームワーク上のＳＰ３４ヒト化と関連する。
［図１０Ａ］ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。
［図１０Ｂ］ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ）としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ヒトとカニクイザルＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対するＳＰ３４キメラ抗体の相対的ＳＰＲデータ：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、（＋＋＋）強いが同等ではない結合、及び（＋＋＋＋）類似した結合を表す。
［図１１］これらの図は、すべて抗ヒトＣＤ３８抗体と関連する。
［図１１Ａ］ＳＰＲにより測定した、ＨＢ−７キメラ抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのＨＢ−７キメラ抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、１２５、３１、７．８、３．９、１．９、１、及び０．５ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
［図１１Ｂ］ＳＰＲにより測定した、ヒト化ＨＢ−７最良適合抗体（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化ＨＢ−７最良適合抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
［図１１Ｃ］ＳＰＲにより測定した、ヒト化９Ｇ７最良適合抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７最良適合抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
［図１１Ｄ］ＳＰＲにより測定した、ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
［図１１Ｅ］ＳＰＲにより測定した、ヒト７６７抗体とヒトＣＤ３８の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト７６７抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び１５．６ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。アフィニティーを、次の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に基づき、分析物濃度（Ｃ）に対する平衡レスポンス（Ｒｅｑ）のプロットから取得し、５０％飽和濃度はＫＤである。すべてのＳＰＲデータは、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
［図１１Ｆ］ＨＢ−７キメラ抗体及びヒト化ＨＢ−７最良適合抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
［図１１Ｇ］９Ｇ７キメラ抗体及びヒト化９Ｇ７最良適合抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
［図１１Ｈ］ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
［図１１Ｉ］ヒトクローン７６７抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
［図１１Ｊ］９Ｇ７ヒト化抗体に関する要約表である。
［図１２］代替的フォーマットのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体に関する概略図である。
［図１２Ａ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２（フォーマットＢ）抗体を示す図である。
［図１２Ｂ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３（フォーマットＣ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＤ）抗体を示す図である。
［図１２Ｃ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）（フォーマットＥ）抗体を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
［図１３］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のプロテインＡ精製プロファイルを示す図である（２８０ｎｍにおける吸収トレース）。カラム：１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ。流速：１ｍｌ／分。泳動バッファー：０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６。溶出バッファーＮｏ１：２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４（２０ｍｌ）。溶出バッファーＮｏ２：０．１Ｍグリシン、ｐＨ３（２０ｍｌ）。中和：１／１０容量の１Ｍトリス、ｐＨ８。
［図１４］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体調製物のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す図である。
［図１５Ａ］Ｎ８２ａＳ置換型ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
［図１５Ｂ］Ｎ８２ａＳ非置換型ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
［図１６Ａ］ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＣＤ３ε抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、７４００ＲＵのヒトＣＤ３γ−ε−Ｆｃ融合タンパク質に共有結合させた。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０００、２５００、１２５０、６２５、３１２．５、及び１５６．２５ｎＭ、流速１０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニット（略号ＲＵ；Ｙ軸）の数として表す。アフィニティーを、下記の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に基づき、分析物濃度（Ｃ）に対する平衡レスポンス（Ｒｅｑ）のプロットから取得したが、５０％飽和濃度はＫＤである。
［図１６Ｂ］ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＨＥＲ２抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、１５０ＲＵのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を捕捉した。ＨＥＲ２−ｈｉｓを、ＨＢＳ−Ｐ中にて、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４．１、１．４、０．５、及び０．１５ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニット（略号ＲＵ；Ｙ軸）の数として表す。
［図１６Ｃ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体のＤＳＣプロファイルを、プロファイルＡ及びＢにそれぞれ示す。
［図１７］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。抗体濃度はｎＭ表示。
［図１７Ａ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＢＴ−４７４。
［図１７Ｂ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＪＩＭＴ−１。
［図１７Ｃ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
［図１７Ｄ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。
［図１７Ｅ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
［図１７Ｆ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。
［図１７Ｇ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
［図１８］ヒトＰＢＭＣが補給されたＪＩＭＴ−１異種移植を示す図である。
［図１８Ａ］ヒトＰＢＭＣは腫瘍増殖を妨害しないことを示す図である。
［図１８Ｂ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１処理及び未処理マウスの腫瘍容積（ｍｍ3）を、ヒトＰＢＭＣドナー４例、マウス５匹のコホートについて示す図である。
［図１８Ｃ］ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１処理及び未処理マウスの腫瘍容積（ｍｍ3）を、ヒトＰＢＭＣドナー４例、マウス５匹のコホートについて示す図である。
［図１９］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（フォーマットＡ）、及びＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（フォーマットＢ）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
［図２０Ａ］ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体とヒトＣＤ３８抗原の間での抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧに共有結合しており、２００ＲＵのＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグ付きのタンパク質）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
［図２０Ｂ］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
［図２１］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：精製後のヒトＴ細胞。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー２例の平均値。標的細胞：ＲＰＭＩ８２２６。抗体濃度はｎＭ表示。
［図２２］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ。抗体濃度はｎＭ表示。
［図２３］ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体を示す概略図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
［図２４］ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、２０：１。４８時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：組換え安定ＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
［図２５］ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体を示す概略図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
［図２６］ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー４例の平均値。標的細胞：ＨＴ−２９細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
［図２７］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）（フォーマットＢ）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
［図２８］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
［図２９］ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体とヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、５００ＲＵのヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆ融合タンパク質に共有結合させた。ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２、３．１、０．８、及び０．４ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
［図３０］ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体による、Ｔ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
［図３１］ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
［図３２］ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｔ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
【図１】プロテインＡを用いる、好ましい差動的アフィニティー精製技法の概略図である。重鎖は、いずれもＶＨ３ベースの抗原結合部位を含まない。凡例：［（Ａ＋）］は、機能性プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能性プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
【図２Ａ】重鎖のヘテロ二量体が重鎖内にＶＨ３ドメインを含むが、重鎖がそのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しない際に直面する問題を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しないヘテロ二量体の重鎖は、そのプロテインＡ結合部位を無効にするように突然変異したＶＨ３ドメインを含む。
【図２Ｃ】図２Ａに記載する問題に対する代替的解決策を示す図であり、ヘテロ二量体は１つのＶＨ３ドメインのみを含み、またヘテロ二量体は、そのＶＨ３ドメインが、重鎖Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合する重鎖上に位置するように、工学的に作出されている（解決策としてのＶＨ３ドメイン再配置戦略）。
【図２Ｄ】ヘテロ二量体の両方の重鎖がＶＨ３ドメインを含む際に直面する問題を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｄに記載する精製問題に対する解決策を示す図であり、ヘテロ二量体の重鎖は、そのＦｃ領域においてプロテインＡに結合しないが、そのプロテインＡ結合部位を無効にするように突然変異したＶＨ３ドメインを含む。
【図２Ｆ】図２Ｄに記載する精製問題に対する代替的解決策を示す図であり、各ＶＨ３ドメインは、そのプロテインＡ結合部位について無効にされている。四角で囲まれた種は、差動的プロテインＡクロマトグラフィープロセス期間中に、これらの種は同時溶出することを示す。ｐＨ値のＡとＢは、約１ｐＨ単位異なり、プロテインＡに結合する種の効果的な分離を可能にする。一般的に、ｐＨ  Ａ及びｐＨ  ＢのｐＨ値は、それぞれ４及び３である。すべての図の凡例：［（Ａ＋）］は機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は非機能性プロテインＡ結合部位を意味する。
【図３】Ｆｃ１３３のプロテインＡグラジエントモードクロマトグラフィーのトレースを示す図である（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。移動相の総容積に対する２８０ｎｍにおける吸収のプロットを実線で示す。移動相のｐＨ及び移動相中に存在する溶出バッファー（Ｂ）の割合（％）に関するプロットを破線及び一点鎖線でそれぞれ示す。
【図４Ａ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。
【図４Ｂ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  １３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。
【図４Ｃ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム、及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。
【図５】７つの公知のヒトＶＨフレームワークサブクラスそれぞれについて、代表的なアミノ酸配列を示す図である。配列を、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき整列させた。プロテインＡのドメインＤと相互作用するヒトＶＨ３−２３フレームワークサブクラス内の位置を太字で示す。
【図６Ａ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ。
【図６Ｂ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ａ。
【図６Ｃ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ｅ。
【図６Ｄ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｇ６５Ｓ。
【図６Ｅ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ６６Ｑ。
【図６Ｆ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ６８Ｖ。
【図６Ｇ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｑ８１Ｅ。
【図６Ｈ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｎ８２ａＳ。
【図６Ｉ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ。
【図７】ＨＥＲ２抗原に対する選択された抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ変異体の平衡解離定数（ＫＤ）を示す図である。
【図８Ａ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。
【図８Ｂ】抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。
【図８Ｃ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。
【図８Ｄ】抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。
【図９Ａ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｂ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｃ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｄ】選択された抗体候補品のＤＳＣプロファイル。
【図９Ｅ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ＯＫＴ３キメラ抗体に対する相対的ＨＰＢ−ＡＬＬ染色強度：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、及び（＋＋＋）類似した結合を表す。
【図９Ｆ】選択されたｓｃＦｖ−Ｆｃ候補品のＤＳＣプロファイル。
【図１０Ａ】ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。
【図１０Ｂ】ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ）としてフォーマット化したヒト化候補品について要約した図である。ヒトとカニクイザルＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対するＳＰ３４キメラ抗体の相対的ＳＰＲデータ：（−）は非結合、（＋）より弱い結合、（＋＋）中等度の結合、（＋＋＋）強いが同等ではない結合、及び（＋＋＋＋）類似した結合を表す。
【図１１Ａ】ＳＰＲにより測定した、ＨＢ−７キメラ抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのＨＢ−７キメラ抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、１２５、３１、７．８、３．９、１．９、１、及び０．５ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｂ】ＳＰＲにより測定した、ヒト化ＨＢ−７最良適合抗体（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化ＨＢ−７最良適合抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｃ】ＳＰＲにより測定した、ヒト化９Ｇ７最良適合抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７最良適合抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｄ】ＳＰＲにより測定した、ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体とヒトＣＤ３８抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。
【図１１Ｅ】ＳＰＲにより測定した、ヒト７６７抗体とヒトＣＤ３８の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、２００ＲＵのヒト７６７抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び１５．６ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。アフィニティーを、次の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に基づき、分析物濃度（Ｃ）に対する平衡レスポンス（Ｒｅｑ）のプロットから取得し、５０％飽和濃度はＫＤである。すべてのＳＰＲデータは、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
【図１１Ｆ】ＨＢ−７キメラ抗体及びヒト化ＨＢ−７最良適合抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｇ】９Ｇ７キメラ抗体及びヒト化９Ｇ７最良適合抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｈ】ヒト化９Ｇ７最良フレームワーク抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｉ】ヒトクローン７６７抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図１１Ｊ】９Ｇ７ヒト化抗体に関する要約表である。
【図１２Ａ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２（フォーマットＢ）抗体を示す図である。
【図１２Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３（フォーマットＣ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＤ）抗体を示す図である。
【図１２Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）（フォーマットＥ）抗体を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図１３】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のプロテインＡ精製プロファイルを示す図である（２８０ｎｍにおける吸収トレース）。カラム：１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ。流速：１ｍｌ／分。泳動バッファー：０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６。溶出バッファーＮｏ１：２０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４（２０ｍｌ）。溶出バッファーＮｏ２：０．１Ｍグリシン、ｐＨ３（２０ｍｌ）。中和：１／１０容量の１Ｍトリス、ｐＨ８。
【図１４】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体調製物のキャピラリー電気泳動プファイルを示す図である。
【図１５Ａ】Ｎ８２ａＳ置換型ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
【図１５Ｂ】Ｎ８２ａＳ非置換型ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味し、また［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。溶出ｐＨを示す。
【図１６Ａ】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＣＤ３ε抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、７４００ＲＵのヒトＣＤ３γ−ε−Ｆｃ融合タンパク質に共有結合させた。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０００、２５００、１２５０、６２５、３１２．５、及び１５６．２５ｎＭ、流速１０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニット（略号ＲＵ；Ｙ軸）の数として表す。アフィニティーを、下記の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に基づき、分析物濃度（Ｃ）に対する平衡レスポンス（Ｒｅｑ）のプロットから取得したが、５０％飽和濃度はＫＤである。
【図１６Ｂ】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＨＥＲ２抗原の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧと共有結合しており、１５０ＲＵのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を捕捉した。ＨＥＲ２−ｈｉｓを、ＨＢＳ−Ｐ中にて、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４．１、１．４、０．５、及び０．１５ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニット（略号ＲＵ；Ｙ軸）の数として表す。
【図１６Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体のＤＳＣプロファイルを、プロファイルＡ及びＢにそれぞれ示す。
【図１７Ａ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＢＴ−４７４。
【図１７Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＪＩＭＴ−１。
【図１７Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
【図１７Ｄ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。
【図１７Ｅ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
【図１７Ｆ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。
【図１７Ｇ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ１）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
【図１８Ａ】ヒトＰＢＭＣは腫瘍増殖を妨害しないことを示す図である。
【図１８Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１処理及び未処理マウスの腫瘍容積（ｍｍ3）を、ヒトＰＢＭＣドナー４例、マウス５匹のコホートについて示す図である。
【図１８Ｃ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１処理及び未処理マウスの腫瘍容積（ｍｍ3）を、ヒトＰＢＭＣドナー４例、マウス５匹のコホートについて示す図である。
【図１９】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（フォーマットＡ）、及びＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（フォーマットＢ）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２０Ａ】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体とヒトＣＤ３８抗原の間での抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、プロテインＧに共有結合しており、２００ＲＵのＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体を捕捉した。ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリ−ヒスチジンタグ付きのタンパク質）を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
【図２０Ｂ】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体のＤＳＣプロファイルを示す図である。
【図２１】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：精製後のヒトＴ細胞。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー２例の平均値。標的細胞：ＲＰＭＩ８２２６。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２２】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２３】ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体を示す概略図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２４】ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、２０：１。４８時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：組換え安定ＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２５】ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体を示す概略図である。凡例：［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は、非機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２６】ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＭＴＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。４８時間インキュベーションしたドナー４例の平均値。標的細胞：ＨＴ−２９細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２７】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）（フォーマットＢ）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図２８】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図２９】ＳＰＲにより測定した、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体とヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質の間の抗体−抗原相互作用を示す図である。ＣＭ５センサーチップは、５００ＲＵのヒトＣＤ３ε１−２６＿Ｆ融合タンパク質に共有結合させた。ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７最良適合／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体を、ＨＢＳ−Ｐ中にて、５０、２５、１２．５、６．２、３．１、０．８、及び０．４ｎＭ、流速３０μｌ／分で注入した。データを、時間（Ｘ軸）に対するレスポンスユニットの数（略号ＲＵ；Ｙ軸）として表す。
【図３０】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３（ＳＰ３４−κ２）抗体による、Ｔ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。
【図３１】ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体を示す概略図である。［（Ａ＋）］は、機能的プロテインＡ結合部位を意味する。
【図３２】ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｔ細胞リディレクテッドキリングの例を示す図である。読み取り法：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。エフェクター細胞：標的対象細胞の比は、１０：１。２４時間インキュベーションしたドナー３例の平均値。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度はｎＭ表示。