(57)【要約】      （修正有）【課題】ラマン分光測定法により、被測定物内部の脂質量を簡便にかつ正確に測定する方法、及び顕微分光測定法に用いることができるコンタクト剤を提供する。【解決手段】レーザー光３０を透過可能な試料台５の一面上に被測定物１０を置き、その反対面側からレーザー光３０を照射し、得られるラマン散乱光を分光した情報から被測定物１０の脂質量を測定する方法であって、被測定物１０と試料台５との間に、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない化合物を含み、測定温度で液体のコンタクト剤を配する脂質量の測定方法、及び顕微分光測定に際してレーザー光３０を透過可能な試料台５と被測定物１０との間に配されて使用されるコンタクト剤であって、測定温度で液体の重水素化化合物を含有するコンタクト剤５０。【選択図】図１
2010210401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光を透過可能な試料台の一面上に被測定物を置き、その反対面側からレーザー光を照射し、得られるラマン散乱光を分光した情報から被測定物の脂質量を測定する方法であって、被測定物と試料台との間に、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない化合物を含む、測定温度で液体のコンタクト剤を配する脂質量の測定方法。
【請求項２】
前記化合物が重水素化化合物である、請求項１記載の脂質量の測定方法。
【請求項３】
前記コンタクト剤の３５℃での粘度が１×１０-6ｍ2/ｓ〜１×１０-2ｍ2/ｓで、かつ前記重水素化化合物の重量平均分子量が４６〜１０００００である、請求項２記載の脂質量の測定方法。
【請求項４】
前記重水素化化合物が重水素化グリセリンである、請求項２または３記載の脂質量の測定方法。
【請求項５】
前記被測定物が皮膚である、請求項１〜４のいずれか記載の脂質量の測定方法。
【請求項６】
試料台上の被測定物に対するレーザー光入射部位が三次元方向に移動可能になされている、請求項１〜５のいずれか１項記載の脂質量の測定方法。
【請求項７】
顕微分光測定に際してレーザー光を透過可能な試料台と被測定物との間に配されて使用されるコンタクト剤であって、測定温度で液体の重水素化化合物を含有するコンタクト剤。
【請求項８】
前記コンタクト剤の３５℃での粘度が１×10-6ｍ2/ｓ〜１×１０-2ｍ2/ｓで、かつ前記化合物の重量平均分子量が４６〜１０００００である、請求項７記載のコンタクト剤。
【請求項９】
前記重水素化化合物が重水素化グリセリンである、請求項７又は８記載のコンタクト剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン分光測定方法を用いて試料内部おける脂質量を測定する方法に関する。また、本発明は顕微ラマン分光測定等に使用するコンタクト剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚内部における脂質量分布を把握することにより、皮膚周囲の環境の評価、バリア能等の皮膚機能の評価、肌質の評価等を行うことができる。そのため、脂質量を測定することは、医薬品・化粧品・身体洗浄剤・入浴剤・食器洗浄剤・各種洗浄剤・空調設備機器・機能性衣料・機能性寝具・エステティック機器・エステティック手法等の開発を行う上で非常に有用である。
【０００３】
皮膚内部の脂質量測定方法としては、磁気共鳴画像法(MRI法)、減衰全反射赤外吸収法（ＩＲ−ＡＴＲ法）、近赤外拡散反射法等が従来用いられてきた。しかしこれらの手法は、空間分解能が十分でない、分析深さの制御ができない、脂質以外の因子の影響を受け易い等の課題を抱えていた。
【０００４】
２０００年代に入り、共焦点顕微ラマン分光法により皮膚内部のラマンスペクトルを非侵襲に測定し、このスペクトルから皮膚内部特定部位における組成を算出する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。この方法の出現により、皮膚内部における脂質量分布を把握できるようになり（例えば、非特許文献２参照）、多くの化粧品会社・製薬会社・皮膚医学研究者の間で、広く用いられるようになった。
【０００５】
図１０に前記方法に用いられる皮膚ラマンスペクトル測定装置の概略、図１１に当該測定装置の部分拡大図をそれぞれ示す。水平方向に可動なステージ（試料台）５上に皮膚等の被測定物１０を置き、前記可動ステージ５内に設置された窓材５ａに被測定物１０の表面を接触させ、可動ステージ５の下に配置された対物レンズ６ａを介してレーザー光を皮膚内に照射・集光し、レーザー光の焦点部位２１から発生するラマン散乱光２０を、再び同じ対物レンズ６ａを介して集光し、分光器に導き、ラマンスペクトルを得る構成となっている。あるいは、水平方向に可動なステージ（試料台）５の代わりに固定型のステージを配置し、かつ、対物レンズ６ａの代わりに水平方向（１軸）に可動な対物レンズを配置することにより、図１１の構成と同等の機能・操作性を有する皮膚ラマンスペクトル測定装置も存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ピー．ジェー．キャスパーズ（Ｐ．Ｊ．Ｃａｓｐｅｒｓ）等著，「ザ  ジャーナル  オブ  インヴェスティゲイティブ  ダーマトロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第１１６巻、第３号、ｐｐ．４３４−４４２
【非特許文献２】ジョージオス  エヌ．スタマタス（Ｇｅｏｒｇｉｏｓ  Ｎ．Ｓｔａｍａｔａｓ）等著，「ジャーナル  オブ  ダーマトロジカル  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００８年、第５０巻、ｐｐ．１３５−１４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以下はステージを可動とした場合について説明する。
皮膚等の被測定物１０を可動ステージ５内の窓材５ａに接触させた状態で対物レンズ６ａ側から観察すると、皮膚表面と窓材が光学的に密着した部位が、図１２のように黒いスポット（本明細書においては、便宜上黒色部と定義する）として観察される。このとき黒色部として観測されない領域（本明細書においては、便宜上白色部と定義する）は、皮膚表面と窓材表面の間に空気層が存在する領域である。白色部では、光学収差や界面での光の散乱が生じるため、白色部を介して皮膚にレーザーを照射した場合、感度の低下と空間分解能の低下が生じる。そこで良好な測定結果を得るためには、黒色部を介してレーザーを皮膚内に照射する必要がある。
【０００８】
しかし皮膚表面には微小な凸凹を有しているため、窓材に皮膚を押しつけても、そのごく一部でしか光学的に密着した部位（黒色部）が発生しない。そこで皮膚を乗せた可動ステージを水平方向に動かすことにより、黒色部をレーザー照射部位に移動することが必要である。このような作業はたいへん煩雑である。特に洗浄後自然乾燥させた皮膚の場合、皮膚表面の水分・油分の減少により、黒色部の発生量が激減するため、黒色部を探し出し、レーザーを照射するために多大の労力が必要となる。
【０００９】
また対物レンズを上下させ、皮膚内でのレーザー光の焦点位置（測定部位）を上下させて、深さ方向（Ｚ軸）での脂質量分布を計測するだけであれば、黒色部にレーザーをセットすることで目的を達成することができる。しかし水平方向（Ｘ軸、Ｙ軸、Ｘ−Ｙ平面）でのスキャニングを加え、二次元脂質量分布（Ｘ−Ｚ平面、Ｙ−Ｚ平面）や三次元脂質量分布（Ｘ−Ｙ−Ｚ方向）の測定を行う場合、黒色部以外にもレーザーが照射されてしまう。この場合、感度・空間分解能が悪い状況での測定が混在してしまう問題があった。
【００１０】
このような問題は、顕微分光測定一般について共通の課題である。このような問題の回避のために、例えば生体用の共焦点レーザー顕微鏡の場合、黒色部を広範囲に確保するために、皮膚と窓材の間に水、グリセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等をコンタクト剤として付与することが考えられる。
しかし顕微ラマン分光で試料内の脂質を観測する場合、コンタクト剤として水、グリセリン水溶液、水性ゲル等を付与してしまうと、水が皮膚に浸透し、皮膚内の正しい脂質量を得ることができないことが分かった。
また試料内の脂質量を測定する際には、試料のラマンスペクトルにおける脂質に特徴的な信号、例えば−ＣＨ２基の信号と、タンパク質に特徴的な信号、例えば−ＣＨ３基の信号の強度比に基づいて、脂質量を算出する。従って、試料表面にグリセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等、Ｃ−Ｈ結合を含有する物質をコンタクト剤として付与した場合、コンタクト剤由来のＣ−Ｈ結合の信号が、試料由来のＣ−Ｈ結合の信号と識別できない。そのため、得られたラマンスペクトルから試料内の正しい脂質量を算出することができないことが分かった。
【００１１】
本発明は、ラマン分光測定法により、被測定物内部の脂質量を簡便にかつ正確に測定する方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、顕微分光測定法に用いることができるコンタクト剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、第１に、レーザー光を透過可能な試料台の一面上に被測定物を置き、その反対面側からレーザー光を照射し、得られるラマン散乱光を分光した情報から被測定物の脂質量を測定する方法であって、被測定物と試料台との間に、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない化合物を含む、測定温度で液体のコンタクト剤を配する脂質量の測定方法である。
また、本発明は、第２に、顕微分光測定に際してレーザー光を透過可能な試料台と被測定物との間に配されて使用されるコンタクト剤であって、測定温度で液体の重水素化化合物を含有するコンタクト剤に関する。
【発明の効果】
【００１３】
上記の第１発明の方法によって、皮膚等の被測定物内部の脂質量分布をラマン分光法によって測定する際に、被測定物表面と試料台の間の光学的接触を簡便にかつ広い面積で成立させることにより、被測定物内部の脂質量測定を容易に行ったり、部位によることなく被測定物内部での脂質分布測定を正確に行うことを可能にした。
さらに、上記の第２発明によって、被測定物の顕微分光測定を行う際に、被測定物表面と試料台の間の光学的接触を簡便にかつ広い面積で成立させることにより、部位によることなく被測定物内部での脂質量測定を正確に行うことを可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の脂質量測定方法の概略を示す図である
【図２】図２中、（ａ）はヒトの皮膚のラマンスペクトルを示す図であり、（ｂ）は重水素化グリセリンのラマンスペクトルを示す図であり、（ｃ）はグリセリンのラマンスペクトルを示す図である。
【図３】図３（ａ）はヒトの皮膚のラマンスペクトルを示す図であり、図３（ｂ）はペルフルオロポリエーテル１（商品名：Perfluoro(polyoxypropylene  ethyl  ether)２７００；和光純薬社製、重量平均分子量２，７００、３５℃で液体）のラマンスペクトルを示す図であり、図３（ｃ）はペルフルオロポリエーテル２（商品名：Perfluoro(polyoxypropylene  ethyl  ether)８０００；和光純薬社製、重量平均分子量８，０００、３５℃で液体）のラマンスペクトルを示す図である。
【図４】コンタクト剤を使用して測定したヒトの前腕内側の皮膚のラマンスペクトルの深さ方向の変化を示す図である。
【図５】図５（ａ）はコンタクト剤未使用時の黒色部の皮膚表面内部（深さ：５μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図５（ｂ）はコンタクト剤未使用時の白色部の皮膚表面内部（深さ：５μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図５（ｃ）はペルハロゲノ化合物を含むコンタクト剤使用時の皮膚表面内部（深さ：５μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図５（ｄ）は重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時の皮膚表面内部（深さ：５μｍ）のラマンスペクトルを示す図である。
【図６】図６（ａ）はコンタクト剤未使用時の黒色部の皮膚表面内部（深さ：１０μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図６（ｂ）はコンタクト剤未使用時の白色部の皮膚表面内部（深さ：１０μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図６（ｃ）はペルハロゲノ化合物を含むコンタクト剤使用時の皮膚表面内部（深さ：１０μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図６（ｄ）は重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時の皮膚表面内部（深さ：１０μｍ）のラマンスペクトルを示す図である。
【図７】図７（ａ）はコンタクト剤未使用時の黒色部の皮膚表面内部（深さ：１５μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図７（ｂ）はコンタクト剤未使用時の白色部の皮膚表面内部（深さ：１５μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図７（ｃ）はペルハロゲノ化合物を含むコンタクト剤使用時の皮膚表面内部（深さ：１５μｍ）のラマンスペクトルを示す図であり、図７（ｄ）は重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時の皮膚表面内部（深さ：１５μｍ）のラマンスペクトルを示す図である。
【図８】図８中、（ａ）はコンタクト剤未使用時の黒色部の皮膚の表面近傍の−ＣＨ3基由来のピークの信号強度を示す図であり、（ｂ）はコンタクト剤未使用時の白色部の皮膚の表面近傍の−ＣＨ3基由来のピークの信号強度を示す図であり、（ｃ）はペルハロゲノ化合物を含むコンタクト剤使用時の皮膚の表面近傍の−ＣＨ3基由来のピークの信号強度を示す図であり、（ｄ）は重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時の皮膚の表面近傍の−ＣＨ3基由来のピークの信号強度を示す図である。
【図９】図９（ａ）はコンタクト剤を用いずに測定した脂質分布を示す図であり、図９（ｂ）はコンタクト剤を用いて測定した脂質分布を示す図である。
【図１０】従来の脂質量測定方法の概略を示す図である。
【図１１】従来の脂質量測定方法の概略の部分拡大図である。
【図１２】従来の脂質量測定方法において、対物レンズ側から撮影した画像の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の脂質量の測定方法は、ラマン分光測定法により行うものである。ラマン分光測定法は、被測定物を切断等することなくそのままの状態で内部の化学組成を測定することができる技術である。したがって、ラマン分光測定法によれば、非侵襲的に、被測定物の脂質量を測定することができる。
【００１６】
まず、本発明を好ましい実施形態に基づき説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
図１には、被測定物１０として人の皮膚を用いて、その脂質量を測定するシステム１の概略を示している。本システムでは、試料台５上に皮膚等の被測定物１０（より具体的には、人の前腕部）を置いて試料台５内に設置された窓材５ａに皮膚表面を接触させる。試料台５下に配置された対物レンズ６ａ（レーザー光入射部位）を介してレーザー光３０を皮膚内に照射・集光する。そして、レーザー光３０の焦点部位から発生するラマン散乱光を、再び同じ対物レンズ６ａを介して集光し、分光器２に導き、ラマンスペクトルを得る構成となっている。本明細書において「窓材」とは、レーザー光を透過して被測定物に照射しうる試料台５内に設けられたガラス板、石英板などでできた部位を言う。
【００１７】
照射するレーザー光について、波長および入射角は特に限定はない。例えば、被測定物がヒトの皮膚の場合、波長は４００〜１０６４ｎｍが好ましく、６００〜８００ｎｍがより好ましい。対物レンズによるレーザー光の集光過程を無視した場合の、皮膚表面に対するレーザー光の入射角は０〜６０°が好ましく、０〜３０°がより好ましい。なおここでの入射角は、皮膚表面に対して垂直な法線からの角度とする。
使用する対物レンズについて、倍率、開口数（Ｎ．Ａ．）は特に限定はない。例えば、被測定物がヒト皮膚の場合、より高空間分解能での測定を行う場合には、倍率は４０倍〜１００倍、開口数は０．７〜１．５が好ましい。水平方向および深さ方向により広範囲の測定を行う場合は、倍率は２０倍〜６０倍、開口数は０．２〜０．７が好ましい。
【００１８】
本実施形態においては、試料台５上の被測定物１０に対するレーザー光入射部位が三次元方向に移動可能になされていることが好ましい。これにより、被測定物内部での二次元または三次元の脂質分布を測定することが可能となる。
【００１９】
例えば、具体的には、対物レンズ６ａがピエゾ６ｂによって人の皮膚等被測定物１０に対して接近・後退を行う（本明細書では、ｚ軸方向に移動、とも言う）ようになっていることが好ましい。これによって試料内部においてレーザー光が焦点を結ぶ位置を、皮膚に対して垂直方向の任意の位置に移動させることができる。
この場合、対物レンズ６ａは、ピエゾ６ｂによらなくても、Ｘ−Ｙ平面上の任意の場所に移動可能とすることが好ましい。ピエゾ６ｂ等レーザー光入射部位のｚ軸方向への移動手段を用いることによりにより、レーザー光入射部位を三次元方向に移動可能とすることができる。
あるいは、本実施形態では、試料台５は固定し、かつ、光軸系を可動とするために、レーザー光源３より試料台５側に、ガルバノミラースキャナー等の光軸可動手段８を設けることが好ましい。これは、人の腕のような重量の比較的重いものを被測定物とする場合、正確に水平方向等のＸ−Ｙ平面上の任意の場所へ試料台を動かすことは困難である。また、ピエゾを用いて対物レンズ６ａをＸ−Ｙ平面上の任意の場所へ動かすことは、光軸のズレを回避するための機構が複雑となる上に、対物レンズ６ａの移動に時間がかかるという問題が生じる。このような場合、ガルバノミラースキャナー等の光軸可動手段を設けることによって、被測定物の脂質量をＸ−Ｙ平面上の任意の正確な位置で非侵襲に測定することが容易になっている。
なお、被測定物が軽量な場合であっても、レーザー光入射部位をＸ−Ｙ平面上の任意の場所となるように光軸可動手段８を設けてもよいし、試料台５として水平方向に可動な台を用いてレーザー光入射部位が被測定物のＸ−Ｙ平面上の任意の部位となるように調整してもよいし、対物レンズ６ａが被測定物のＸ−Ｙ平面上の任意の部位に移動できるような機構を備えても良い。
【００２０】
本発明において、被測定物に対するレーザー光入射部位の深さ方向については特に制限はない。例えば、被測定物がヒトの皮膚の場合、ヒトの皮膚の表面から真皮組織までの脂質量を測定するのが好ましく、レーザー光入射部位を表面から５００μｍとするのが好ましく、１００μｍとするのがより好ましい。
【００２１】
本発明において、試料台に窓材を設けても設けなくてもよいが、設けることが好ましい。窓材５ａとしては、レーザー光を透過する材料からなる。具体的には、通常の対物レンズの材質がガラスでできているため、窓材５ａとしてはガラスと近い屈折率を有する光透過性材料を使用することが好ましい。そのような材料としては、ガラスや石英等が挙げられる。
【００２２】
本発明において、顕微ラマン分光測定システムは前記システムに限定されず、通常用いられる顕微ラマン分光測定システムを用いることができる。
例えば、本発明の方法の好ましい実施態様の一例として共焦点顕微ラマン分光測定を挙げて説明したが、本発明はこれに限られず、たとえば顕微コヒーレントアンチストークスラマン分光法、顕微誘導ラマン分光法、顕微近接場ラマン分光法や顕微表面増強ラマン分光法などの顕微ラマン分光測定一般に本発明を適用することができる。
【００２３】
本実施形態においては、測定の際に被測定物１０と窓材５ａの間に分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない化合物（以下、「コンタクト化合物」とも言う）を含有し、測定温度で液体のコンタクト剤５０を配する。
顕微ラマン分光測定時に、被測定物１０を試料台５にいくら押し付けたとしても、試料台５に設けられている窓材５ａに完全に接触するとは限らない。これは、例えばヒトの体の一部分を被測定物とする場合、その表面に凹凸を有するからである。この場合、被測定物１０をそのまま試料台５に置くと被測定物１０の凹凸と窓材５ａとの間に空気層が生じる。この空気層を介して被測定物にレーザー光を照射しても、感度の低下と空間分解能の低下が生じてしまい、正確な脂質量を測定することができない。具体的には、照射光を被測定物の特定部位に照射・集光するにあたり、被測定物１０と窓材５ａとの間の空気層の隙間が存在すると空気層の屈折率（ｎ＝１）によって窓材−空気層界面と、空気層−被測定物界面との屈折率差が生じてしまう。これによって照射光の反射や光学収差の発生により、測定精度が落ちてしまう。
しかし、本発明によれば、前記空気層を埋めることができる。したがって、本発明によれば、コンタクト剤を用いなかった場合に空気層の存在のために脂質量を正確に測定できなかった部位であっても、正確に脂質量の測定精度を上げることができる。言い換えると、本発明の方法によれば、被測定物の脂質量の分布をラマン分光法によって測定する際に、被測定物表面と試料台の間の光学的接触を簡便にかつ広い面積で成立させることにより、被測定物表面の形状によらず、被測定物内部の脂質量分布測定を容易に行うことができ、かつ、部位による感度や空間分解能の悪化を生じることなく被測定物内部での脂質量の測定を正確に行うことができる。
【００２４】
Ｃ−Ｈ結合の伸縮振動に由来するラマンスペクトルのピークが２９００ｃｍ-1に現れるが、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を有しない化合物を用いると、当該化合物由来のピークは２９００ｃｍ-1には現れない。このため、本発明においてラマンスペクトルの２９００ｃｍ-1付近のピークは被測定物由来のピークであるため、コンタクト剤に影響されることなく、正確に被測定物の脂質量を測定することができる。
【００２５】
本発明の方法で用いられる、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を有しない化合物は、通常の炭化水素のような水素原子を含む化合物のＣ−Ｈ結合した水素原子全てが水素原子以外の原子で置換されている構造様の化合物をいう。
【００２６】
本発明に用いられるコンタクト剤の第１の態様としては、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない前記化合物が重水素化化合物であるコンタクト剤が挙げられる。
本発明に用いられるコンタクト剤は測定温度で液体である。通常測定は室温で行うこと、また被測定物としてヒトの皮膚を採用する場合などを考慮すると、３５℃で液体であることが好ましい。具体的には３５℃での粘度が１×１０-6ｍ2/ｓ〜１×１０-2ｍ2/ｓ、特に１×１０-5ｍ2/ｓ〜１×１０-3ｍ2/ｓであるものが好ましい。これは、３５℃で液体であること、そして上述のような適度な粘性を有するコンタクト剤は被測定物と試料台との隙間を確実に埋めることが可能である。この場合、空気層が存在する場合と比べて前述の屈折率差を格段に小さくするか、屈折率差を殆ど生じない状態にすることができる。したがって、上述した問題を解消することができ、正確かつ簡便な脂質量の測定を実現容易にする。また、コンタクト剤に含まれる分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない重水素化化合物としては重量平均分子量が４６〜１０００００が好ましく、４６〜１００００がさらに好ましい。これは、適度な粘度を維持しながら、ヒトの皮膚等、被測定物内部への浸透を防ぐことができるためである。なお、粘度は、Ｂ型粘度計（本明細書では東機産業（株）製のＴＶＢ−１０Ｍ、ロータ  Ｌアダプタ）により測定する。
【００２７】
前記重水素化化合物としては特に制限はないが、重水素化グリセリン、重水素化ポリエチレングリコール（PEG）、重水素化流動パラフィン、重水素化多価アルコール、重水素化シリコーン等が挙げられる。本発明においては、皮膚への安全性、入手の容易さ、浸透性の低さから、重水素化グリセリンが好ましい。
【００２８】
本発明で用いることができる重水素化化合物の具体例について以下に示すが、本発明はこれに限定するものではない。
【００２９】
【化１】
2010210401.tif 000003
【００３０】
前記重水素化化合物は通常の方法により合成することができるし、一般に入手可能である。
【００３１】
本発明に用いられるコンタクト剤の第２の態様としては、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない前記化合物が、通常の炭化水素のような水素原子を含む化合物の水素原子全てがハロゲン原子で置換した形態の化合物であるペルハロゲノ化合物であるコンタクト剤が挙げられる。
前記ペルハロゲノ化合物としては、ペルフルオロ化合物、ペルクロライド化合物が好ましく、特に、ペルフルオロ化合物が好ましい。ペルフルオロ化合物としては、ペルフルオロポリエーテルが最も好ましい。
【００３２】
本発明の方法で用いることができるペルハロゲノ化合物の具体例について以下に示すが、本発明はこれに限定するものではない。
【００３３】
【化２】
2010210401.tif 000004
【００３４】
前記ペルハロゲノ化合物は通常の方法により合成することができるし、一般に入手可能である。
【００３５】
本発明で使用するコンタクト剤は測定温度で液体である。通常測定は室温で行うこと、また被測定物としてヒトの皮膚を採用する場合などを考慮すると、３５℃で液体であることが好ましく、具体的には３５℃での粘度が１×１０-6ｍ2/ｓ〜１×１０-2ｍ2/ｓ、特に１×１０-5ｍ2/ｓ〜１×１０-3ｍ2/ｓであるものが好ましい。これは、３５℃で液体であること、そして上述のような適度な粘性を有するコンタクト剤は被測定物と試料台との隙間を確実に埋めることが可能である。この場合、空気層が存在する場合と比べて前述の屈折率差を格段に小さくするか、屈折率差を殆ど生じない状態にすることができる。したがって、上述した問題を解消することができ、正確かつ簡便な脂質量測定を実現容易にする。また、コンタクト剤に含まれる前記化合物としては重量平均分子量が３００〜３０，０００が好ましく、１，０００〜１０，０００がさらに好ましい。これは、適度な粘度を維持しながら、ヒトの皮膚等、被測定物内部への浸透を防ぐことができるためである。なお、粘度は、Ｂ型粘度計（本明細書では東機産業（株）製のＴＶＢ−１０Ｍ、ロータ  Ｌアダプタ）により測定する。
【００３６】
本発明において、コンタクト剤は測定時において試料台と被測定物に接触していればよく、コンタクト剤を被測定物に塗っても試料台に塗ってもよい。本発明において、コンタクト剤の使用量を最小限に抑えるためには、試料台に塗ることが好ましい。
接触させるコンタクト剤の量は被測定物に合わせて適宜決められるが、コンタクト剤自身による光学収差に基づく感度・空間分解能の悪化を防ぐために、あまり多量でないことが好ましい。被測定物と試料台の間において１００μｍ以下、特に１０μｍ以下となるように設けることが好ましい。
【００３７】
また、本発明の方法に用いられるコンタクト剤には、上記で規定するコンタクト化合物以外に、通常の化合物を本発明のコンタクト剤の作用を損なわない範囲で含有させてもよく、その例としてフッ素系界面活性剤、シリコーンオイル、流動パラフィン、フルオロハイドロカーボン、クロロフルオロハイドロカーボン、等が挙げられる。コンタクト剤には上記で規定するコンタクト化合物が７０〜１００質量％含まれていることが好ましく、９０〜１００質量％含まれていることがより好ましい。所望のスペクトルを精度良く得るためには、コンタクト化合物のみでコンタクト剤が構成されていることが好ましく、その際、コンタクト化合物自身が測定温度で液体である。
【００３８】
本実施形態において、被測定物としてヒトの皮膚（特に、ヒトの前腕部）を用いて説明したが、これに限られるものではない。しかしながら、表面に凹凸がある被測定物に対して有効な測定方法である。なお、表面に凹凸がないものも被測定物として用いることができ、例えば、球状または楕円形のものなど、その全体形状のために試料台一面に接触することができないようなものも、本発明において被測定物として用いることができる。
本発明の方法における被測定物の例としては、ヒトの皮膚以外に繊維、フィルム、紙、食品、生物組織が挙げられる。
【００３９】
ラマン散乱光を分光した情報から被測定物の脂質量を測定する方法について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
得られたラマンスペクトルから被測定物の脂質量を算出するには、前記非特許文献２記載の方法に基づき、各ラマンスペクトルの脂質に特徴的な2820〜2900cm-1の−ＣＨ２伸縮振動の信号強度と、タンパク質に特徴的な2910〜2965cm-1の−ＣＨ３伸縮振動の信号強度の強度比を脂質量の指標として、算出する。
【００４０】
ラマン測定に用いる励起光には、波長が１５０ｎｍ〜１０６４ｎｍまでの範囲の光を用いる。被測定物の光ダメージや、被測定物の蛍光由来の妨害を軽減するには、より長い波長を用いることが好ましい。しかし、あまり長波長側での励起を行うと、特に高波数側での信号強度が低下する問題が生じる。このような観点から、５００〜８００ｎｍの領域の励起光を用いることが最も好ましい。
【００４１】
スペクトル中のラマン散乱強度の算出時には、蛍光等に基づくベースラインの変動や、妨害物質の影響が、最も少なくなるように、ベースラインの定義や、信号強度の算出に用いる波数幅を調整してもよい。この調整の仕方は、励起波長や被測定物により異なる。
【００４２】
また脂質の算出方法として、蛋白質、脂質の各成分のスペクトルを重ね合わせて得られたスペクトルを再現し、各信号の比を得る方法や、ピークを曲線、例えばローレンツ関数やガウス関数等でフィッティングをかけて各信号の比を求める方法等を採用してもよい。
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
（１）試料台の作製
顕微ラマン分光装置（商品名：ナノファインダー３０、東京インスツルメンツ社製）に付属の倒立型顕微鏡（商品名：ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ、ニコン社製）の試料ステージ部を取り外し、アルミブロック製の皮膚測定用試料台を取り付けた。試料台中央部に窓穴を設け、窓穴上部にガラス製の窓材（厚さ１７０μｍ）を取り付けた。
【００４５】
（２）皮膚とコンタクト剤のラマンスペクトルの測定
皮膚測定試料台の窓材上に、ヒトの皮膚、構造（１）の重水素化グリセリン（商品名：Glycerol-d5、C/D/N  Isotopes社製、３５℃で液体（粘度3×10-4ｍ2/ｓ、35℃、グリセリンでの値））およびグリセリン（商品名：特級  グリセリン、和光純薬社製）を載せて測定したラマンスペクトルをそれぞれ図２（ａ）〜（ｃ）に示す。
上記測定において、ヒトの皮膚については、表面から5μｍの部分を測定した。また、皮膚を窓材上に配置した際のペルフルオロポリエーテル層の厚さが10μｍ以下となるように、皮膚を窓材に押し付けた。
【００４６】
同様に、ヒトの皮膚、構造（２）のペルフルオロポリエーテル１（商品名：Perfluoro(polyoxypropylene  ethyl  ether)２７００；和光純薬社製、重量平均分子量２，７００、３５℃で液体（粘度３×１０-5ｍ2／ｓ））および構造（２）のペルフルオロポリエーテル２（商品名：Perfluoro(polyoxypropylene  ethyl  ether)８４００；和光純薬社製、重量平均分子量８，４００、３５℃で液体（粘度２６×１０-5ｍ2／ｓ））を載せて測定したラマンスペクトルをそれぞれ図３（ａ）〜図３（ｃ）に示す。
上記測定において、ヒトの皮膚については、表面から５μｍの部分を測定した。また、皮膚を窓材上に配置した際のペルフルオロポリエーテル層の厚さが１０μｍ以下となるように、皮膚を窓材に押し付けた。
【００４７】
ラマンスペクトルの測定には、市販の共焦点顕微ラマン分光器（商品名：ナノファインダー３０、東京インスツルメンツ社製、励起波長：６３２．８ｎｍ、試料上でのレーザー出力：８ｍＷ、対物レンズ：１００×、ＮＡ１．３、Ｗ．Ｄ．２００μｍ）を使用した。このラマン分光器にはガルバノミラースキャナー（Ｘ−Ｙ平面スキャニング用）が設けられている。また、対物レンズにおいて、Ｚ軸方向に移動可能なピエゾシステムを採用した。
【００４８】
図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、重水素化グリセリンはＣ−Ｄ伸縮振動（２１５０ｃｍ-1付近）領域にラマン信号を持つが、Ｃ−Ｈ伸縮振動（２９００ｃｍ-1付近）領域にラマン信号を持たないことがわかった。
また、図３（ａ）〜図３（ｃ）に示すように、ペルフルオロポリエーテルもＣ−Ｈ伸縮振動（２９００ｃｍ-1付近）領域にラマン信号を持たないことがわかった。
【００４９】
（３）コンタクト剤の皮膚浸透性の確認
前述の試料台の窓材中央部上に、コンタクト剤としてPerfluoro(polyoxypropylene  ethyl  ether)２７００（商品名、和光純薬社製）を２０μＬ塗布した。この上にヒトの前腕内側を載せ、照射レーザー光の焦点を前記ピエゾシステムによりヒトの前腕の深さ方向に変化させながらラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定装置及び測定条件は前述と同様とした。
【００５０】
コンタクト剤使用時の、深さ方向でのラマンスペクトル変化を図４に示す。
前腕内側の皮膚の外側６μｍのスペクトルは窓材（ガラス）のラマンスペクトルである。皮膚の外側４μｍでは窓材の信号（４５０ｃｍ-1、９３０ｃｍ-1）に加えて、コンタクト剤の信号（８２０ｃｍ-1）が重畳している。皮膚の外側２μｍではコンタクト剤の信号（６８０ｃｍ-1、８２０ｃｍ-1、１２１０ｃｍ-1、１３３０ｃｍ-1）が支配的となっている。皮膚の表面では、コンタクト剤の信号（６８０ｃｍ-1、８２０ｃｍ-1、１２１０ｃｍ-1、１３３０ｃｍ-1）と、皮膚由来の信号（１３００ｃｍ-1、１４５０ｃｍ-1、１６５０ｃｍ-1）の双方が観測されている。皮膚の内部２μｍでは、コンタクト剤の信号はほぼ消失し、皮膚由来の信号（１３００ｃｍ-1、１４５０ｃｍ-1、１６５０ｃｍ-1）が観測されている。
以上の結果から、本発明のコンタクト剤は、ヒトの皮膚の内部には浸透しないことがわかる。
【００５１】
（４）コンタクト剤の使用による測定感度と空間分解能の変化
前述の試料台の窓材中央部上に、構造（１）の重水素化グリセリン（商品名：Grycerol-d5、C/D/N  Isotopes社製）又はペルハロゲノ化合物（商品名：フォンブリン、和光純薬製、重量平均分子量２７００、３５℃で液体（粘度３×１０−６ｍ2／ｓ））を含むコンタクト剤を１０μＬ塗布した。この上にヒトの前腕内側を載せ、ラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定装置及び測定条件は前述と同様とした。
また、コンタクト剤を使用しない場合についても、同様にラマンスペクトルを測定した。
【００５２】
コンタクト剤未使用時に、ヒトの前腕内側の皮膚を窓材に接触させたときに対物レンズ側から観察したところ、皮膚表面と窓材が光学的に密着した部位（黒色部）と、皮膚表面と窓材表面の間に空気層が存在する領域（白色部）が存在した。これに対して、コンタクト剤を使用した場合、皮膚表面と窓材表面の間に空気層が存在する領域（白色部）は存在せず、黒色部のみが存在し皮膚表面全体が窓材と光学的に密着していた。
コンタクト剤未使用時の黒色部、白色部、およびコンタクト剤使用時の黒色部（全面）にレーザーを合わせ、焦点位置を皮膚表面より５μｍ、１０μｍ、１５μｍの深さでヒト前腕内側の皮膚のラマンスペクトルを測定した結果を、それぞれ図５（ａ）〜図５（ｄ）、図６（ａ）〜図６（ｄ）、及び図７（ａ）〜図７（ｄ）、に示す。
同じ深さでのスペクトル間を比較すると、コンタクト剤を使用することにより、コンタクト剤使用後に視野全体に広がった黒色部において、コンタクト剤未使用時の黒色部と同等の感度でラマンスペクトルが得られていることがわかる。
【００５３】
また、コンタクト剤未使用時の黒色部及び白色部にと、ペルハロゲノ化合物を含むコンタクト剤使用時及び重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時のそれぞれにおける黒色部（全面）にレーザーを合わせ、焦点位置をヒト前腕内側の皮膚の表面近傍で変化させた際の、−ＣＨ3基由来のピーク（２９１０〜２９６５ｃｍ-1）の信号強度の変化を図８に示す。なお、図８において、縦軸の値は−ＣＨ3基由来のピークの最大値で規格化して示している。
これらの図から分解能を計算したところ、コンタクト剤未使用時の黒色部の分解能は２．０μｍ、白色部の分解能は４．０μｍであった。これに対して、コンタクト剤使用時の分解能は、ペルハロゲノ化合物を含むコンタクト剤使用時の分解能は２．１μｍ、重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時の分解能は１．７μｍであった。なお、「分解能」は、皮膚内部において、−ＣＨ3基由来のピーク（2910〜2965ｃｍ-1）面積が最大値の10％から90％となる距離を意味する。
【００５４】
これらの結果より、コンタクト剤を使用することにより、コンタクト剤使用後に視野全体に広がった黒色部において、コンタクト剤未使用時の黒色部と同等の空間分解能でラマンスペクトルが得られていることがわかる。
空間分解能が悪化する（大きくなる）と、得られるラマンスペクトルは、より広い空間領域の平均的な組成情報を反映し、目標の狭い領域の組成情報に焦点を合わせることができない。従って、例えば皮膚表面直下に焦点を合わせた場合、空間分解能が悪いと皮膚外部の組成情報も一部反映してしまう。また、例えば皮膚表面より１０μｍ深部に焦点を合わせた場合では、空間分解能の良い条件では例えば９〜１１μｍの深さの幅の狭い平均情報が得られるのに対して、空間分解能が悪い条件では例えば７〜１３μｍの深さの幅の広い平均情報しか得られないといった問題が生じる。即ち、空間分解能が悪化すると、特定の深さにおける脂質量を正確に求めることができなくなる。このような問題の発生を、コンタクト剤の使用により回避できることがわかった。
【００５５】
（５）ヒトの皮膚における二次元（Ｘ−Ｚ平面の）脂質分布測定
前述の試料台の窓材中央部上に、構造（１）の重水素化グリセリン（商品名：Grycerol-d5、C/D/N  Isotopes社製）を含むコンタクト剤を１０μＬ塗布した。この上にヒトの前腕内側を載せ、照射レーザー光の焦点を前記ピエゾシステムによりＺ軸方向に変化させながらラマンスペクトルを測定した。ラマンスペクトルの測定装置及び測定条件は前述と同様とした。
また、コンタクト剤を使用しない場合についても、同様にラマンスペクトルを測定した。
【００５６】
上記で測定した各ラマンスペクトルから、各点における脂質量を算出し、ヒトの前腕内側の皮膚断面（Ｘ−Ｚ平面）での脂質分布を測定した。
【００５７】
なお、ラマンスペクトルから脂質量を算出する手順は、前記非特許文献２記載の方法に基づき、各ラマンスペクトルの脂質に特徴的な2820〜2900ｃｍ-1の−ＣＨ２伸縮振動の信号強度と、タンパク質に特徴的な2910〜2965ｃｍ-1の−ＣＨ３伸縮振動の信号強度の強度比を脂質量の指標として、算出した。
【００５８】
このようにして得たヒトの前腕内側の皮膚断面（Ｘ−Ｚ平面）での脂質分布画像を図９（ａ）及び図９（ｂ）に示す。図９（ａ）は、コンタクト剤未使用時のラマンスペクトルに基づき測定した脂質分布を示す図である。図９（ｂ）は、重水素化グリセリンを含むコンタクト剤使用時のラマンスペクトルに基づき測定した脂質分布を示す図である。図９（ａ）および図９（ｂ）の２枚の図は、いずれも上方が皮膚表面である。
測定条件は以下のとおりである。
測定条件
ピンホール                １５０μｍ
スキャン間隔              Ｘ方向：２μｍ    Ｚ方向：２μｍ
スキャン幅                Ｘ方向：２０μｍ  Ｚ方向：４０μｍ
スキャン点数              Ｘ方向：１１点    Ｚ方向：２１点      合計２３１点
１点当たりの積算時間      ５ｓ
【００５９】
コンタクト剤を用いない場合は、皮膚と窓材との間に空気層が形成されているため、感度と空間分解能が悪く、非常にノイズの多い脂質分布のイメージングとなっている。
それに対し、コンタクト剤を用いた場合は、皮膚と窓材との間に空気層が形成されないため、ノイズレベルが良好で、皮膚表面側ほど脂質量が多いことが明瞭に確認できる。
【符号の説明】
【００６０】
２  分光器
３  レーザー光源
５  試料台
５ａ  窓材
６ａ  対物レンズ
６ｂ  ピエゾ
８  光軸可動手段
１０  被測定物
２０  ラマン散乱光
２１  共焦点部位
３０  レーザー光
５０  コンタクト剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図９】
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