(57)【要約】      （修正有）【課題】臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ及びその培養法と応用を提供する。【解決手段】臍帯のホウォートンゼリー組織を採取し、無血清培地で低酸素条件下で継代基準に達するまで培養し、得られたＰ１初代細胞を収集し、単細胞懸濁液を調製し、遠心分離により細胞ペレットを得て、この細胞ペレットに無血清培地を加え、低酸素条件下で継代まで培養し、Ｐ２〜Ｐ３継代まで継続的に培養し、各継代培養中にリグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を加え、細胞が所定の細胞密度に増殖した場合、消化しＰ６継代になると細胞を収集し、ＭＳＣｓの培養手順の表現型検査として、上記の収集された細胞に表現型検査を実施し、使用に備える。この方法で培養されたＭＳＣｓは、幹細胞が容易に凝集する傾向を低減できるため、人体への静脈内注射後の細胞接着、赤血球連銭形成、細胞塊塞栓症を回避でき、ＭＳＣｓ幹細胞技術を臨床応用により良くすることができる。【選択図】図９
2020191861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳＣｓの培養手順を備え、前記ＭＳＣｓの培養手順が、臍帯のホウォートンゼリー組織を採取し、無血清培地で低酸素条件下で継代基準に達するまで培養する初代培養と、
前記初代培養手順で得られたＰ１初代細胞を収集し、残留培地を除去し、単細胞懸濁液を調製し、遠心分離により細胞ペレットを得て、この細胞ペレットに無血清培地を加え、低酸素条件下で継代まで培養し、Ｐ２〜Ｐ３継代まで継続的に培養し、後続の各継代培養中にリグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を加え、細胞が所定の細胞密度に増殖した場合、細胞を消化・収集する継代培養と、
前記継代培養手順で収集された細胞に表現型検査を実施したところ、ＣＤ３１、ＨＬＡ-ＤＲ、ＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性で、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性である細胞が標的ＭＳＣｓ細胞であり、使用に備える表現型検査を備えることを特徴とする臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法。
【請求項２】
前記継代培養手順では、添加された前記リグストラジン塩酸塩の濃度が４０〜８０Ｍｇ／Ｌであり、添加された前記シェンマイ注射液の体積パーセンテージが０.５％であることを特徴とする請求項１に記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法。
【請求項３】
前記ＭＳＣｓの培養手順では、前記低酸素状態が、酸素濃度３〜１０％の二酸化炭素インキュベーターで培養することであり、前記無血清培地が、間葉系幹細胞無血清培地、またはＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０培地をベースにサイトカインを加えた培地から選択されることを特徴とする請求項１に記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法。
【請求項４】
前記初代培養手順では、前記継代基準が細胞密度８０〜９０％に増殖することであり、前記継代培養手順では、リグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を加えてから、Ｐ４〜Ｐ６継代まで継続的に培養することを特徴とする請求項１に記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法。
【請求項５】
前記ＭＳＣｓ培養手順の前に、帝王切開により得られた臍帯組織を採取し、冷蔵輸送を行い、サンプルが高エネルギー放射線に被ばくしたことがないことを確保し、組織内の血管を洗浄・剥離し、組織内のホウォートンゼリー組織を採取するＭＳＣｓ調製手順を備え、前記ＭＳＣｓ培養手順の後に、得られた標的ＭＳＣｓに細胞同定及び純度検出、細胞増殖活性検出、細菌とマイコプラズマ検出、エンドトキシン検出、外因性病原因子検出、異常免疫反応試験、腫瘍原性試験及び／または添加成分の残留含有量検出を実施する品質管理を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法。
【請求項６】
前記ＭＳＣｓ調製手順の前に、１）サンプルを採取する前に、ドナーにＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、トレポネーマパリダム、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、貪食Ｔ細胞ウイルスなどの重症感染症検査を実施し、上記の重症感染症を感染したことのない場合は適格とし、２）サンプルを採取する前に、ドナーに軟骨形成不全、先天性難聴、ビタミンＤ抵抗性くる病、フェニルケトン尿症、血友病、進行性筋ジストロフィー、グルコース-６-リン酸脱水素酵素欠損症などの遺伝病の遺伝子検査を実施し、上記の感染症がすべて陰性である場合は適格とし、３）ドナーがサンプル採取前の３か月以内に、感染地域を訪れたり滞在したりしたことがないというドナースクリーニング手順を備え、上記のすべての条件を満たすものが適格ドナーであることを特徴とする請求項５に記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法に従って培養された幹細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ、ヘパリンナトリウム、複合アミノ酸及び薬学的に許容される添加剤を備えることを特徴とするＭＳＣｓ幹細胞注射液。
【請求項９】
前記複合アミノ酸が、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-リジン、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-メチオニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-セリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン、Ｌ-バリン、Ｌ-グリシン、Ｌ-アラニンを含み、前記複合アミノ酸の濃度が１０±２ｇ／１００ｍｌであることを特徴とする請求項８に記載のＭＳＣｓ幹細胞注射液。
【請求項１０】
前記ＭＳＣｓ幹細胞の濃度が（０.５〜１.５）×１０9個／１００ｍｌであることを特徴とする請求項８に記載のＭＳＣｓ幹細胞注射液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオメディカルテクノロジー分野に関し、特に臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ及びその培養法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関の予測によると、２０２０年までに非伝染性疾患が中国での疾患による死因の７９％を占めるようになり、そのうち心血管疾患が第１位である。心筋細胞は終末分化細胞であるため、壊死細胞が再生できず、瘢痕形成によりのみ置き換えることができる。その結果、心筋の収縮機能が失われ、難治性心不全により死亡に至る。中国の５０の三甲病院の症例調査によると、心不全の入院率が同時期の心血管疾患の２０％を占めているが、死亡率が４０％を占めている。５年生存率は悪性腫瘍と同様である。臨床薬、介入及び外科的治療はすべて受動的治療と救済治療であり、壊死した心筋に取って代わることができない。一方、心臓移植は、ドナーの問題により、臨床的に押し広めるのが困難である。幹細胞移植は完全に新しい治療法を提供する。
【０００３】
臍帯間葉系幹細胞（ＭｅｓｅｎｃｈｙＭａｌ ＳｔｅＭ Ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）は、新生児の臍帯組織に存在する多機能幹細胞であり、多くの種類の組織細胞に分化でき、幅広い臨床応用の見通しがあり、多方向分化能を有する間葉系幹細胞として、インビトロでの特定の誘導条件下では、線維芽細胞、脂肪細胞、血管上皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋細胞、神経細胞、肝細胞、心筋細胞、膵島β細胞及び内皮細胞などの様々な組織細胞に分化でき、連続的な継代培養と凍結保存を行っても、多方向分化の可能性がある。ＭＳＣｓは免疫原性が低く、自己ＭＳＣｓまたは同種異系ＭＳＣｓのいずれであっても、一般に宿主の免疫反応を引き起こしない。ＭＳＣｓは、衰退・虚血・損傷した組織に集まる特性があり、この特性は医学的にホーミング現象と呼ばれる。ＭＳＣｓは、臍帯、成人の間質組織、骨髄、乳歯などに存在し、そのうち、骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）が骨髄有核細胞の総数の１／１００００〜１０００００にすぎない。ＭＳＣｓは、胎盤と臍帯に多くあり、比較的純粋である。国内外の学者は、５-アザシチジン(ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ,５-ａｚａ)を使用して、インビトロで細胞継代後にＭＳＣｓの分化を誘導した結果、心筋細胞様の超微細構造を発見し、心筋特異的遺伝子の発現及び継続的な活動電位があり、心筋細胞が正常に誘導されたことを示す。他の学者は、ＭＳＣｓを自己心筋組織に直接注射した結果、心筋様細胞が形成されることを発見し、トロポニンＴ及びミオシン重鎖を有する心筋細胞特異的マーカーがあり、ＭＳＣｓがインビトロでの微小環境で心筋細胞に分化するように誘導できることを示す。
【０００４】
現在、ＭＳＣｓの培養条件についてさまざまな意見がある。培養条件について、インキュベーターの酸素密度と湿度、培地の選択、血清の種類と濃度、最初の培地交換の時間、交換の頻度、交換量など、さまざまな要因がＭＳＣｓの増殖に影響する。現在、一般的なＭＳＣｓのインビトロ培養は、正常酸素濃度の完全培地で培養され、完全培地に通常、動物のウシ胎児血清が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、異なる年齢と異なる組織から抽出された間葉系種子幹細胞の生存能力に違いがあり、異なる培養方法もＭＳＣｓの特性に大きく影響し、ＭＳＣｓはＣＸＣＲ４（ケモカイン受容体４）の高発現が可能であるが、正常酸素条件下での培養後に、ＣＸＣＲ４の発現は大幅に減少した。ウシ胎児血清培養法は、ＭＳＣｓを人体に注射した後、残存する動物血清により血清病を引き起こす可能性があるため、幹細胞療法の臨床応用に役立たない。インビトロで培養されたＭＳＣｓは、静脈内注射後に人間や動物の損傷部に移植できるＭＳＣｓがごくわずかであり、ほとんどの細胞が微小血管（特に肺）に留まり死ぬ。また、ＭＳＣｓは壁に付着して増殖する特性があり、インビトロで培養されたＭＳＣｓがしばしば集塊を形成するため、人体への静脈内注射後、幹細胞の接着、集塊、細胞塊塞栓症が発生する。
【０００６】
上記の理由により、インビトロで培養されたＭＳＣｓは、疾患の治療に有害反応を引き起こし、治療効果に悪影響を及ぼし、幹細胞の臨床治療を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ及びその培養法と応用を提供することを目的とする。この方法で培養されたＭＳＣｓは、幹細胞が容易に凝集する傾向を低減できるため、人体への静脈内注射後の細胞接着、赤血球連銭形成、細胞塊塞栓症を回避できる。
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明に係る臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法は、ＭＳＣｓの培養手順を備え、前記ＭＳＣｓの培養手順が、臍帯のホウォートンゼリー組織を採取し、無血清培地で低酸素条件下で継代基準に達するまで培養する初代培養と、
前記初代培養手順で得られたＰ１初代細胞を収集し、残留培地を除去し、単細胞懸濁液を調製し、遠心分離により細胞ペレットを得て、この細胞ペレットに無血清培地を加え、低酸素条件下で継代まで培養し、Ｐ２〜Ｐ３継代まで継続的に培養し、後続の各継代培養中にリグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を加え、細胞が所定の細胞密度に増殖した場合、細胞を消化・収集する継代培養と、
前記継代培養手順で収集された細胞に表現型検査を実施したところ、ＣＤ３１、ＨＬＡ-ＤＲ、ＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性で、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性である細胞が標的ＭＳＣｓ細胞であり、使用に備える表現型検査を備える。
【０００９】
実際に、静脈内注射のためにインビトロで培養されたＭＳＣｓの場合、非常に少数のＭＳＣｓのみがレシピエントの損傷部に移植でき、ほとんどの細胞は微小血管に留まり死ぬ。また、インビトロで培養されたＭＳＣｓは、しばしば集塊を形成するため、静脈内注射後、接着、集塊、細胞塊塞栓症が発生し、疾患の治療に有害反応を引き起こし、治療効果に悪影響を及ぼし、幹細胞の臨床治療を妨げる。以上を踏まえ、細胞培養液に、気を益し免疫力を高め、陰虚を解消し体液の分泌を促す漢方薬のシェンマイ注射液と、血行を促進し淤血を解消するという特性を持つ漢方薬のセンキュウの有効成分であるリグストラジン塩酸塩を加える。それに含まれるジンセノサイドは、細胞内のＤＮＡとＲＮＡの合成を促進し、血漿のＡＭＰ値を上げ、血小板凝集を抑制し、血漿中のフィブリノーゲン含有量を減らし、微小血栓を取り除き、幹細胞の微小環境を改善する。バクモンドウは細胞膜を安定させる効果がある。リグストラジン塩酸塩は、細胞と血小板の表面電荷を高め、血小板凝集と血栓症を抑制し、血液レオロジーを改善する効果がある。リグストラジン塩酸塩は、抗酸化、抗炎症、アポトーシス阻害などのさまざまな有効成分の複合作用により、細胞保護効果を発揮し、ＭＳＣｓの集塊、静脈内注射後の接着・集塊、細胞塊塞栓症、赤血球連銭形成の発生を抑制し、臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓが心筋梗塞を予防・治療する能力を大幅に高める。
【００１０】
さらに、前記継代培養手順では、添加された前記リグストラジン塩酸塩の濃度が４０〜８０Ｍｇ／Ｌであり、添加された前記シェンマイ注射液の体積パーセンテージが０.５％である。前記シェンマイ注射液は、人体に直接注射できる注射用シェンマイ注射液から選択される。
【００１１】
さらに、前記ＭＳＣｓの培養手順では、前記低酸素状態が、酸素濃度３〜１０％の二酸化炭素インキュベーターで培養することであり、酸素濃度５％が好適である。前記無血清培地が、間葉系幹細胞無血清培地、またはＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０培地をベースにサイトカインを加えた培地から選択される。上記の間葉系幹細胞無血清培地は、友康生物社製品が好適である。
【００１２】
通常のＭＳＣｓは正常酸素条件下で培養され、ＭＳＣｓの移植率は低い。対照的に、低酸素下（酸素濃度３〜１０％であり、酸素濃度５％が好適である）で培養されたＭＳＣｓは、インビトロで培養されたＭＳＣｓが血管内の低酸素環境に耐える能力を向上させることができる。低酸素下で培養されたＭＳＣｓ細胞は、増殖とコロニー形成能力が向上したため、人体への注射後のＭＳＣｓの体内への移植率を高め、それによりＭＳＣｓの治療効果を改善できることが証明されている。また、従来のＭＳＣｓ培養システムでは、多かれ少なかれウシ胎児血清を使用している。本発明は、無血清培地培養技術を採用し、ＭＳＣｓ製剤を人体に注射した後、残存する動物血清により引き起こす恐れがある血清病を回避することができる。
【００１３】
さらに、前記初代培養手順では、前記継代基準が細胞密度８０〜９０％に増殖することであり、前記継代培養手順では、リグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を加えてから、Ｐ４〜Ｐ６継代まで継続的に培養する。
【００１４】
さらに、前記ＭＳＣｓ培養手順の前に、帝王切開により得られた臍帯組織を採取し、冷蔵輸送を行い、サンプルが高エネルギー放射線に被ばくしたことがないことを確保し、組織内の血管を洗浄・剥離し、組織内のホウォートンゼリー組織を採取するＭＳＣｓ調製手順を備え、前記ＭＳＣｓ培養手順の後に、得られた標的ＭＳＣｓに細胞同定及び純度検出、細胞増殖活性検出、細菌とマイコプラズマ検出、エンドトキシン検出、外因性病原因子検出、異常免疫反応試験、腫瘍原性試験及び／または添加成分の残留含有量検出を実施する品質管理を備える。
【００１５】
さらに、前記ＭＳＣｓ調製手順の前に、１）サンプルを採取する前に、ドナーにＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、トレポネーマパリダム、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、貪食Ｔ細胞ウイルスなどの重症感染症検査を実施し、上記の重症感染症を感染したことのない場合は適格とし、２）サンプルを採取する前に、ドナーに軟骨形成不全、先天性難聴、ビタミンＤ抵抗性くる病、フェニルケトン尿症、血友病、進行性筋ジストロフィー、グルコース-６-リン酸脱水素酵素欠損症などの遺伝病の遺伝子検査を実施し、上記の感染症がすべて陰性である場合は適格とし、３）ドナーがサンプル採取前の３か月以内に、感染地域を訪れたり滞在したりしたことがないというドナースクリーニング手順を備え、上記のすべての条件を満たすものが適格ドナーである。
【００１６】
上記のドナースクリーニングにおいて、培養された臍帯ＭＳＣｓが先天性遺伝病感受性遺伝子を持つことにより患者に悪影響を与えるのを防ぐために、本発明は、細胞製品の品質を厳密に管理し、原材料、半製品、製品の３つの視点から管理する。
【００１７】
さらに、本発明は、上記のＭＳＣｓの培養法に従って培養された幹細胞を開示する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記のＭＳＣｓ幹細胞、ヘパリンナトリウム、複合アミノ酸及び薬学的に許容される添加剤を備えるＭＳＣｓ幹細胞注射液を開示する。
【００１９】
本発明のＭＳＣｓは、心筋梗塞及び重度の冠動脈疾患・冠動脈狭窄症を予防・治療するための複合製剤の調製に使用されることができる。
【００２０】
さらに、前記複合アミノ酸が、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-リジン、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-メチオニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-セリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン、Ｌ-バリン、Ｌ-グリシン、Ｌ-アラニンを含み、前記複合アミノ酸の濃度が１０±２ｇ／１００ｍｌである。前記複合アミノ酸は、複合アミノ酸注射液１８ＡＡ-IIIを直接使用することができる。
【００２１】
上記の比率で調製されたアミノ酸混合液は、直接血液に注射し栄養を補い、血漿を部分的に置き換えることができ、外傷、火傷、手術後の患者の耐病性を向上させ、心筋梗塞患者の快復を促進できる。
【００２２】
さらに、前記ＭＳＣｓの濃度が（０.５〜１.５）×１０9個／１００ｍｌである。
【００２３】
本発明はまた、心筋梗塞を予防・治療するための薬物の調製における上記の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの適用を開示する。
【００２４】
従来技術と比べて、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明に係る臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓの培養法は、低酸素の無血清条件下でＭＳＣｓを培養し、インビトロで培養されたＭＳＣｓの増殖とコロニー形成能力を向上させ、血管内の低酸素環境での増殖に適応する能力を向上させ、人体への注射後のＭＳＣｓの体内への移植率を高め、ＭＳＣｓ製剤を人体に注射した後、残存する動物血清により引き起こす恐れがある血清病を回避することができる。また、革新的に細胞培養液に、気を益し免疫力を高め、陰虚を解消し体液の分泌を促す漢方薬のシェンマイ注射液と、血行を促進し淤血を解消するという特性を持つ漢方薬のセンキュウからのリグストラジン塩酸塩を加え、性質が安定しているリグストラジン塩酸塩は、ＭＳＣｓ細胞の集塊、静脈内注射後の接着・集塊、赤血球連銭形成、細胞塊塞栓症の発生を効果的に防止し、臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓが心筋梗塞を予防・治療する能力を大幅に高める。
【００２５】
本発明は材料の採取に非常に厳格であり、生産されたＭＳＣｓのトレーサビリティを確保するために、先駆けてドナー及び生産に使用されるすべての臍帯に対し、重度の遺伝病の遺伝子検査を実施し、先天性遺伝病感受性遺伝子を持つことにより患者に悪影響を与えるのを防ぐ。
【００２６】
本発明は、低酸素の無血清培地で培養されたＭＳＣｓで複合製剤を調製する。この複合製剤は、あらかじめ調製された１８種のＬ-アミノ酸、低酸素の無血清ＭＳＣｓ、ＭＳＣｓ混合液、及び後で注射するヘパリン含有生理食塩水を組み合わせて調製するものである。この方法で得られたＭＳＣｓ幹細胞製剤は、心筋梗塞及び重度の冠動脈疾患・冠動脈狭窄症の予防と治療の効果を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施形態１のＰ３継代細胞にシェンマイ注射液を加えた後の初日の細胞図である。
【図２】実施形態１のＰ３継代細胞にリグストラジン塩酸塩を加えた後の初日の細胞図である。
【図３】実施形態１のＰ３継代細胞にリグストラジン塩酸塩及びシェンマイ注射液を加えた後の初日の細胞図である。
【図４】実施形態１のＰ４継代細胞にシェンマイ注射液を加えた後の初日の細胞図である。
【図５】実施形態１のＰ４継代細胞にリグストラジン塩酸塩を加えた後の初日の細胞図である。
【図６】実施形態１のＰ４継代細胞にリグストラジン塩酸塩及びシェンマイ注射液を加えた後の初日の細胞図である。
【図７】実施形態１のＰ５継代細胞にシェンマイ注射液を加えた後の初日の細胞図である。
【図８】実施形態１のＰ５継代細胞にリグストラジン塩酸塩を加えた後の初日の細胞図である。
【図９】実施形態１のＰ５継代細胞にリグストラジン塩酸塩及びシェンマイ注射液を加えた後の初日の細胞図である。
【図１０】実施形態３の対照群の末梢血の細胞図である。
【図１１】実施形態３の投与群の末梢血の細胞図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の理解を容易にするために、図面を参照して本発明をより完全に説明する。図面は、本発明の好ましい実施形態を示す。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書で説明される実施形態に限定されない。これらの実施形態は、本発明をより完全で包括的に理解するために提供される。
【００２９】
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語と科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の本発明に関する説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される「及び／または」という用語は、１つまたは複数の関連する項目の任意とあらゆる組み合わせを含む。
【００３０】
＜実施形態１＞
以下の方法で得られたＭＳＣ幹細胞。
一、ドナースクリーニング
１、ドナーは、サンプル採取前の１か月以内に、エイズウィルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、トレポネーマパリダム（ＴＰ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢウイルス及び貪食Ｔ細胞ウイルス（ＨＬＴＶ）を含むが、これらに限定されない重症感染症検査のために採血し、７つの感染症検査のいずれかで、病原体を保有していることを示したドナー（以前にトレポネーマパリダムに感染したドナーを含む）が除外された。
【００３１】
２、ドナーは、サンプル採取前の１か月以内に、軟骨形成不全、先天性難聴、ビタミンＤ抵抗性くる病、フェニルケトン尿症、血友病、進行性筋ジストロフィー及びグルコース-６-リン酸脱水素酵素（Ｇ-６-ＰＤ）欠損症（ソラマメ中毒）を含むが、これらに限定されない重度の遺伝病の遺伝子検査のために採血した。この重度の遺伝病の遺伝子検査は、細胞培養用材料採取の重要なプロセスが追跡可能であることを確保するための重要な基礎となり、検査結果が陽性であるドナーは除外された。
【００３２】
３、ドナーはサンプル採取前の３か月以内に、感染地域を訪れたり滞在したりしたことがない。
上記のすべての条件を満たすものは適格ドナーである。
【００３３】
二、ＭＳＣｓの調製
１、サンプル採取
スクリーニングに合格したドナーとサンプル寄付契約を締結し、ドナーが満期妊娠後、帝王切開により生産を行った。胎盤と臍帯組織は、専用滅菌サンプリングバッグに詰められ、適量の冷蔵された組織保護液を注射してから密封され、４８時間以内に冷蔵輸送（２〜８℃）で実験室に届けた。輸送中にサンプリングバッグが破れないこと、バッグ内の液体が漏れていないこと、サンプルがＸ線やγ線などの高エネルギー放射線に被ばくしたことがないことを確保する。
【００３４】
上記のサンプルについて、帝王切開により臍帯を採取するのは非常に重要である。それは、自然分娩により採取された臍帯は、女性の産道を通過するときさまざまな微生物により汚染され、ＭＳＣｓの品質に悪影響を与えるためである。
【００３５】
２、サンプル調製
２.１  実験室に届けられたサンプルは、無菌の生物学的安全キャビネットで開かれ、事前に冷却された洗浄液で臍帯組織の血痕を洗浄した。
２.２  臍帯を２〜３ｃｍのものに切り、数回洗浄した。
２.３  組織鉗子で臍帯組織から動脈と静脈の血管を剥がし、臍帯からホウォートンゼリー組織を剥がし、事前に冷却された組織洗浄液に入れ、ホウォートンゼリー組織に表皮組織が混入できない。
【００３６】
三、ＭＳＣｓ培養
１、初代培養：
１.１  ホウォートンゼリー組織をすべて剥がした後、事前に冷却された組織保護液で数回洗浄し、５０ｍｌ遠心チューブに入れ、大きさが３×３×３ｍｍ3以下になるように組織を切った。
１.２  適量の無血清培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（友康生物社製ＭＳＣ幹細胞無血清専用培地）を細かく切り取った組織に加え、平均してＴ７５培養フラスコで接種し、各フラスコにそれぞれ１０ｍｌの培養液を加え、酸素濃度３〜１０％で３７℃の恒温二酸化炭素インキュベーターに入れ、酸素濃度５％の低酸素濃度下で培養することが好適である。
１.３  初代培養の組織は５日目に全部の培地を交換し、その後の３日目に半分の培地を交換した。通常、１０日目に組織ブロックから遊走する細胞が現れ、１５日目に細胞密度９０％に増殖し継代基準に達することができる。
【００３７】
２、継代培養：
２.１  継代する培養フラスコ内の専用培地を収集し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集し使用に備えた。
２.２  培養フラスコ内の初代細胞を生理食塩水で２回洗浄し、残留培地を除去した。
２.３  ３ｍｌの０.０５％トリプシンを加え細胞を消化し、培養フラスコを軽くたたいて壁に付着している細胞をすべて落とした。５ｍｌの遠心分離済みの専用培地を加えトリプシンの働きを止め、細胞を軽く吹き付けて単細胞懸濁液を得た。
２.４  細胞懸濁液を収集し、培養フラスコを生理食塩水で２回洗浄し、液体全体を収集し、１００μＭフィルターで消化されていない組織ブロックを除去した。
２.５  ろ過された単細胞懸濁液を１３００ｒｐｍ×６ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。
２.６  １５ｍｌの生理食塩水を細胞ペレットに加え細胞を再懸濁し、均一に混合した後、少量の液体を取り計数し、１３００ｒｐｍ×６ ｍｉｎで再度遠心分離し、上清を除去した。
２.７  無血清培地（抗生物質なし）を細胞ペレットに加え、５００ｍｌごとに細胞懸濁液を調製した。この細胞培養液は、友康生物社の間葉系幹細胞無血清専用培地でもよいし、アメリカンＧＩＢＣO社のＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０基礎培地をベースにサイトカインを加えた培地でもよい。細胞計数の結果により、１００００／ｃｍ2の密度でＴ１７５培養フラスコで接種し、酸素濃度３〜１０％で３７℃の恒温二酸化炭素インキュベーターに入れ、酸素濃度５％の低酸素濃度下で培養することが好適である。
２.８  細胞が細胞密度９０％（約３日）に増殖した後、再度継代培養し、Ｐ２継代まで継続的に培養した。
２.９   Ｐ３継代からＰ５継代まで、それぞれリグストラジン塩酸塩（ハルビン三聯薬業股分有限公司が準拠している国家規格の第２版増補、執行標準の国薬準字Ｈ２００４１１７５注射液、人体に直接注射可能）とシェンマイ注射液（雲南植物薬業有限公司が準拠している国家薬品規格（改訂）の公布文書ＷＳ３-Ｂ-３４２８-９８-２０１０、執行標準の国薬準字Ｚ６３０２１７２１、人体に直接注射可能）を加えた。上記のリグストラジン塩酸塩の濃度が４０〜８０Ｍｇ／Ｌであり、シェンマイ注射液の体積パーセンテージが０.５％である。２４時間培養し、培地を交換してからさらに１週間培養し、細胞が細胞密度８０〜９０％に増殖したとき細胞を収集し、消化後に収集された細胞を検査した。この手順で得られた生成物に病原体の生物学的検出を実施し、病原学的汚染を排除した。
【００３８】
次の３つのグループに分けられた。ａ．シェンマイ注射液のみを加えた。ｂ．リグストラジン塩酸塩のみを加えた。ｃ．両方を同時に加えて比較し、結果を図１-９に示した。上記の図面から、リグストラジン塩酸塩またはシェンマイ注射液のみを加えた後、細胞の集塊はある程度改善されたが、リグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を同時に加えることが最も効果的であることがわかった。
【００３９】
３、表現型検査：
３.１  上記の収集された細胞に表現型検査を実施し、ＣＤ３１、ＨＬＡ-ＤＲ、ＣＤ３４及びＣＤ４５が陰性で、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性である細胞は、適格な標的ＭＳＣ幹細胞である。
３.２  適格なＭＳＣ幹細胞を、計数の結果に従って、１×１０7 ／ｍｌの密度で専用凍結保存溶液に再懸濁した。凍結保存溶液に懸濁している単細胞を凍結保存用チューブ（１ｍｌ／本）に加えラベルを貼り付けた。ラベル情報は、細胞タイプ、細胞数、凍結保存世代、チューブあたりの凍結保存細胞数、凍結保存日などの情報を含むが、これらに限定されない。密封フィルムで凍結保存用チューブの口を密封し、プログラムフリーザーで-９０℃までゆっくりと冷却し、その後、直接-２０５℃〜-１８５℃（-１９６℃が好適である）の液体窒素で長期保存した。
【００４０】
四、品質管理
この実施形態の臍帯ＭＳＣ幹細胞のＭＳＣ品質管理は、２０１５年に中国食品医薬品監督管理局によって発行された「幹細胞製剤の品質管理及び臨床前研究に関するガイドライン（試行）」の幹細胞製剤の品質検査基準を参照した。
【００４１】
１、細胞同定と純度検出：細胞形態、多方向分化能、表面マーカー検出により培養された細胞がＭＳＣであるかどうかを同定し、そのうちＭＳＣの純度を検出した。そのうち、表面マーカーは、陽性の指標（＞ ９５％）：ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５と、陰性の指標（＜２％）：ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ-ＤＲ、多方向分化能を含む。
【００４２】
２、細胞増殖活性：細胞増殖活性はＣＣＫ８、細胞倍加時間、細胞周期、コロニー形成率、テロメラーゼ活性及びテロメアの長さにより、細胞増殖活性を検出し、β-ガラクトシダーゼにより、細胞老化特性を検出した。
【００４３】
３、細菌とマイコプラズマ検出：２０１５年版「中華人民共和国薬局方」の生物製剤の無菌性とマイコプラズマ検出規程を参照し、サンプルの細菌・真菌・マイコプラズマの汚染について検出を行った。
【００４４】
４、エンドトキシン検出：２０１５年版「中華人民共和国薬局方」のエンドトキシン検出規程を参照し、サンプルのエンドトキシン検出を行った。
【００４５】
５、外因性病原因子検出：エイズウィルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、トレポネーマパリダム（ＴＰ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢウイルス及び貪食Ｔ細胞ウイルス（ＨＬＴＶ）などのドナー由来の重症感染症について、病原体ＤＮＡ検査を実施した。狂牛病、口蹄疫などのウシ由来の特定のウイルス検査を行った。豚パルボウイルスなどの豚由来の特定のウイルス検査を行った。
【００４６】
６、異常免疫反応：ＭＳＣから、人体の総リンパ球と特定のリンパ球サブセット（ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞を含む）の増殖及び関連するサイトカイン（ＩＮＦ-γ、ＴＮＦ-α、ＩＬ-４、ＩＬ-６、ＩＬ-１０などを含む）の分泌に対する影響を検出した。
【００４７】
７、腫瘍原性試験：大量のＭＳＣを免疫不全動物に移植することにより、腫瘍形成を観察し、細胞の腫瘍原性を検出した。
【００４８】
８、添加成分の残留含有量検出：最終生成物にある、調製中の幹細胞製剤の安全性に影響する残留成分（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、特定のサイトカイン、フェノールレッドなどを含む）の残留量を検出した。
【００４９】
＜実施形態２＞
以下の方法で得られたＭＳＣｓ幹細胞注射液。
１、準備：
１.１  恒温水槽で再加熱し、水温を３７℃で安定させた。
１.２  ３０分早めに生物学的安全キャビネットのＵＶ消毒と換気を行った。
１.３  蘇生した細胞数に応じて生理食塩水を調製し、遠沈管に入れ、生理食塩水の量を凍結保存溶液全体の１０倍以上にした。
【００５０】
２、情報確認
あらかじめ定められた要件に従って、液体窒素タンクから凍結保存細胞を取り出し、念のため細胞の種類、細胞コード、細胞数、細胞の世代などの重要な情報を注意深く確認した。
【００５１】
３、直ちに液体窒素タンクから取り出した凍結保存細胞を再加熱された恒温水槽に入れ、凍結保存溶液が完全に溶けるまで２分間蘇生させ、絶えず振って凍結保存用チューブの口が恒温水槽内の水に触れないようにした。
【００５２】
４、蘇生後、凍結保存用チューブを取り出し、７５％アルコールでチューブ本体を拭き取り、生物学的安全キャビネットに移した。
【００５３】
５、凍結保存用チューブ内の細胞懸濁液全体を生理食塩水を入れた遠沈管に吸引し、生理食塩水でチューブ内面を２〜３回洗浄し、液体全体を遠沈管に移して均一に混合した。
【００５４】
６、細胞懸濁液を１３００ｒｐｍ×６ ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去し、細胞を新鮮な生理食塩水に再懸濁して再度遠心分離し、３回繰り返し洗浄した。
【００５５】
７、洗浄終了後、生理食塩水１００ｍｌを加え、複合製剤として調製された。
各複合製剤にそれぞれ低酸素ＭＳＣｓの細胞が（０.５〜１.５）×１０9個含まれ、各複合製剤の前記生理食塩水にそれぞれ１０〜２０ＵＭの低分子量ヘパリンナトリウムが含まれ、各複合製剤にそれぞれ１８種のＬ-複合アミノ酸が含まれている。
前記複合アミノ酸注射液は１８種のアミノ酸で構成され、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-リジン、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-メチオニン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-セリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン、Ｌ-バリン、Ｌ-グリシン、Ｌ-アラニンを含み、１００ｍｌの複合アミノ酸注射液あたり１０±２ｇのアミノ酸を含む。（前記複合アミノ酸は、複合アミノ酸注射液１８ＡＡ-IIIであり、市販で入手可能）
細胞を再懸濁し、集塊した細胞を４０μＭフィルターで除去し、単細胞懸濁液を得た。
【００５６】
８、少しの細胞懸濁液を取りカウントし、細胞の総数と細胞生存率を算出し、細胞数と生存率が所定の要件以上であることを確保する。
【００５７】
９、細胞懸濁液を専用細胞注射用バッグ（ボトル）に入れ完全に密封し、細胞懸濁液を注射用バッグに入れる前にサンプルを採取しエンドトキシン検出を行い、それぞれ１ｍｌのサンプルを保存した。
【００５８】
１０、カブトガニ試薬ゲル法標準操作手順により注射用細胞懸濁液のエンドトキシン含有量を測定し、２０１５年版「中華人民共和国薬局方」により、細胞懸濁液のエンドトキシン含有量は０.５ＥＵ／ｍｌ未満である必要がある。
【００５９】
１１、エンドトキシン検出に合格した製品は出荷が認められ、そうでない場合、製品を集めて廃棄し、その原因を調べた。
【００６０】
１２、サンプルとして保存される細胞懸濁液はラベルを貼り付け、-２０℃で少なくとも１年間保存する。ラベル情報は、製品番号、細胞の種類、細胞番号、製造日及び責任者を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
１３、出荷が認められた製品は、品質担当者が製品情報を慎重に確認した後、冷蔵下（２〜８℃）で４時間以内に実験室から注射場所まで輸送し、輸送中の細胞懸濁液がＸ線またはγ線に被ばくしてはならない。
【００６２】
＜実施形態３＞
心筋梗塞の治療におけるＭＳＣｓ幹細胞注射液の応用。
本発明の臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ製剤は用途が広く、現在、実施形態１のＭＳＣｓを実施形態２に示す複合製剤に調製し、心筋梗塞患者の治療に適用することでその効果を観察している。
【００６３】
一、顕微鏡下で末梢血細胞の形態を観察した。
１、方法
対照群（ＭＳＣ幹細胞培養時に、リグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液を加えなかった）と投与群（実施形態２の複合製剤）の被験者の末梢血を顕微鏡で観察した。
【００６４】
２、結果
結果を図１０〜１１に示し、図１０は対照群の被験者の末梢血を示し、図１１は投与群の被験者の末梢血を示した。図１０から、対照群では、被験者の末梢血に細胞の接着・集塊、赤血球連銭形成、細胞塊塞栓が発生したことがわかった。図１１から、血行を促進し淤血を解消し、気を益し陰虚を解消するという効果のあるリグストラジン塩酸塩とシェンマイ注射液で培養されたＭＳＣ幹細胞製剤を使用すると、被験者の赤血球形態が正常であり、集塊が発生しなかったことがはっきりとわかった。
【００６５】
上記の結果から、本発明のＭＳＣｓ幹細胞製剤を注射し３０分経過した後、被験者の血液中の赤血球が正常に分離されていることが明らかであり（図１１）、「気は血の帥であり、血は気の母である」という漢方医理論に沿った。漢方医理論により、気が滞りなく通じると、血行が良く、気が滞っていると、淤血が発生する。心筋梗塞や淤血は、必ず気が通らないことにつながるため、心筋梗塞の治療に、血行を促進し淤血を解消するという特性を持つ漢方薬のセンキュウの有効成分であるリグストラジン塩酸塩を加えた他、心気を益すオタネニンジン、免疫力を高め陰虚を解消するという特性を持つバクモンドウ製剤のシェンマイ注射液を加えて気と血液循環を促進し、より良い効果が得られた。
【００６６】
二、臨床効果
上記の製剤は、仏山地域で心筋梗塞や重度の冠動脈疾患の数十例に使用されており、代表的な症例は２００１年に発病した以来今まで生き残った。その症例は以下の通りである。
【００６７】
麦さん、男性、４７歳、７日間の胸部圧迫感で入院し、心臓造影によると、左冠動脈の前下行枝の中間部で約８０％〜９０％狭窄を認め、右冠動脈の中間部で約８０％〜９０％狭窄を認めた。次のように診断される。１．潜在性冠状動脈性心疾患  三枝病変  ２、高尿酸血症  さらなる冠動脈インターベンションが提案される。患者と家族がそれを拒否し、その後他人からの紹介で、患者は出願人のところで上記の製剤を７〜１５日の間隔で４回連続に静脈内注射を行った。患者は症状や不快感なしに今まで生き残り、２０１８年８月南方医科大学順徳病院での再検査により、右冠動脈の中間部で約６０％〜７０％狭窄を認め、左前下行枝の中間部で約７０％〜８５％狭窄を認め、回旋枝の遠位部で陳旧性閉塞を認め、大幅に改善した。
【００６８】
上記の実施形態における技術的特徴は任意に組み合わせることができ、説明を簡潔にするために、上記の実施形態における技術的特徴の可能なすべての組み合わせについて説明されていないが、これらの技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、本明細書に記載された範囲と見なされるべきである。
【００６９】
上記の実施形態は、本発明のいくつかの実施方法を示すだけであり、それらの説明が具体的かつ詳細であるが、本発明の特許の範囲を限定するものとして理解することができない。当業者にとって、本発明の概念から逸脱することなく、本発明の保護範囲に属するいくつかの変形や改善を行うことができることに留意されたい。したがって、本発明特許の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に従うものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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