(57)【要約】      （修正有）【課題】時間分解能を根本的に改善し、容易でかつ試料に関連した照射条件の変更を可能にする方法を提供する。【解決手段】少なくとも一つの光源の照射光ビームを用いて、試料を走査するための方法であって、第１照射条件の照射光ビームで試料の所望部分を走査して第１走査線２１を生じさせ、その後に第２照射条件の照射光ビームで前記所望部分を走査して第２走査線２２を生じさせる走査工程を、前記所望部分を変えながら複数工程繰り返して行い、取得した複数の第１走査線２１に基づいて第１表示２０ａを取得し、複数の第２走査線２２に基づいて第２表示２０ｂを取得する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの光源（１，２）の照射光ビーム（４）を用いて、試料（１１）を走査するための方法であって、
第１照射条件の照射光ビーム（４）で試料（１１）の所望部分を走査して第１走査線（２１）を生じさせ、その後に第２照射条件の照射光ビーム（４）で前記所望部分を走査して第２走査線（２２）を生じさせる走査工程を備え、
前記所望部分を変えながら前記走査工程を繰り返して行い、複数の第１走査線（２１）に基づいて第１表示（２０ａ）を取得し、複数の第２走査線（２２）に基づいて第２表示（２０ｂ）を取得すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１照射条件及び前記第２照射条件には波長と照射強度とが含まれること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１照射条件において、試料（１１）の中の関心領域の内側と外側とで照射条件を区別し、前記第２照射条件において、試料（１１）の中の関心領域の内側と外側とで照射条件を区別すること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１照射条件において、試料（１１）の中の関心領域の内側と外側とで照射条件を区別し、前記第２照射条件において、試料（１１）の中の関心領域の内側と外側とで照射条件を区別し、
前記第１照射条件及び前記第２照射条件には照射強度が含まれ、
前記第２照射条件における試料（１２）の中の関心領域の内側の照射強度を、前記第１照射条件における試料（１１）の中の関心領域の内側の照射強度よりも小さくすること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、高時間分解能による関心領域（ＲＯＩ）走査のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点走査顕微鏡法においては、試料は集束された光ビームで走査される。これは、一般には共焦点走査型顕微鏡ビーム光路中に配置された、二つの鏡の傾きを調整して達成される。それによって光ビームの焦点は焦点面内で移動し、光ビームの偏向方向は多くの場合互いに直交するように設定され、例えば、一つの鏡はビームをｘ方向に偏向し、もう一つの鏡は、ビームをｙ方向に偏向する。鏡の移動または傾けるのは、通常、検流計作動素子の補助で達成される。検流計作動素子に接続された特別な制御装置が、試料上での光ビーム位置信号を提供する。
【０００３】
特許文献１（ドイツ特許出願第１９８ ２９ ９８１号）は、少なくも二つの座標で、進路を変えられた顕微鏡ビーム光路において、異なったスペクトル領域を持つレーザ光を結合し、レーザ光を連続的に試験位置に向けることを含む方法を開示している。試験では、少なくとも一つの平面内で、場所毎に、また線毎にレーザ光が供給され、標本化された平面の画像が反射および／または放射光から成生される。スペクトルの組成および／またはレーザ光の強度は、走査が継続する中に変化し、少なくとも二つの隣接した試験点で、異なったスペクトル特性および／または異なった強度の光が供給される。前記方法を履行するレーザ走査顕微鏡に対して独立請求項が設けられている。上述の方法は走査方向および逆の走査方向について、同一強度を適用する。言い換えれば、関心ある領域は、ある走査方向および逆の走査方向に同一の波長および／または照射条件で照射される。関心ある領域に照射条件が及ぼす影響の検出は、連続するフレームでのみ検出可能である。ある生物学的プロセスにとっては、照射と検出との間の遅れは長すぎる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ドイツ特許出願第１９８ ２９ ９８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑み、時間分解能を根本的に改善し、容易でかつ試料に関連した照射条件の変更を可能にする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的は、請求項１で請求される方法により達成される。
【０００７】
請求項１に係る方法は、
少なくとも一つの光源（１，２）の照射光ビーム（４）を用いて、試料（１１）を走査するための方法であって、
第１照射条件の照射光ビーム（４）で試料（１１）の所望部分を走査して第１走査線（２１）を生じさせ、その後に第２照射条件の照射光ビーム（４）で前記所望部分を走査して第２走査線（２２）を生じさせる走査工程を備え、
前記所望部分を変えながら前記走査工程を繰り返して行い、複数の第１走査線（２１）に基づいて第１表示（２０ａ）を取得し、複数の第２走査線（２２）に基づいて第２表示（２０ｂ）を取得する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明に従う方法を実施するための、本発明に従う装置の概略図である。
【図２】二つの関心ある領域をその中に囲む走査される枠の概略図である。
【図３】第１および第２の表示がディスプレイに同時に示される、走査枠に適用された走査方法の概略図である。
【図４】第１および第２の表示がディスプレイに同時に示される、走査枠に適用されたもっと早い走査方法を示す、他の概略図である。
【図５】一方向とその逆方向に、選択された強度を適用した関心領域、およびバックグラウンドに対する二つ枠の表示を示す概略図である。
【図６】一方向とその逆方向に、選択された強度を適用した関心領域、およびバックグラウンドに対する二つ枠表示の、他の実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の教示するところを有利に実施し、発展させる様々な方法がある。添付の図面を参照されたい。
【００１０】
図１は、試料１１を光ビーム４で走査するための装置を示す。光ビーム４は、少なくとも第１および第２の光源１および２の光を組み合わせて、発生できよう。第１および第２の光源は、波長が異なり、レーザで構成される。第２の光源は多重線レーザである。ビーム結合器３は、二つの個々の光源１および２から光ビーム４を発生するように、第１および第２光源１および２に対して配置されている。この実施形態では、光ビームは音響光学調整可能フィルタ（ＡＯＴＦ）５を通過する。ＡＯＴＦは、試料を走査する装置である共焦点走査顕微鏡の利用者に対し、光ビーム４の各波長当たりの種々の強度を、選択することを可能にする。ＡＯＴＦ５は、それ自身が制御装置１３に接続されている、高周波駆動装置６に接続されている。ビームダンプ７は、試料１１の研究にそれ以上必要でない、光ビーム４の偏向光４ａを除去するために配置される。光ビーム４の通過光４ｂは、ビームスプリッタ８に到達し、そこから走査装置９に偏向される。走査装置９は光ビーム４ｂを顕微鏡光学系すなわち対物レンズ１０を通し、試料１１に導く。試料１１で発生する蛍光は対物レンズ１０を通過し、走査装置９に達する。走査装置９から、蛍光はビームスプリッタ８を通過し、少なくとも一つの検出器１２に到達する。制御装置１３は、走査装置９にも接続されている。制御装置１３は、画像信号表示のためのデイスプレイ１５を自身有する、コンピュータおよび／または利用者インタフェースに接続される。さらに、検出器１２によって発生される電気信号も、コンピュータ１４に送信される。デイスプレイ１５上に画像を形成するには、走査装置９，検出器１２および制御装置１３からの信号を考慮して達成される。
【００１１】
図２は、走査枠２０が、その中に第１および第２の関心領域２４および２５を囲む、走査すべき走査枠２０の概略図である。試料１１の走査枠２０についての走査パターン２３は、ｘ方向に［矢印ｘで示される］開始される。走査装置９は走査パターン２３を逆にするように（ｘ方向の逆）、構成されている。走査パターン２３は、一つおきの線２３ａが同じ方向を向くように、枠２０にわたって複数の線２３ａを定める。一つの線２３ａから次への切り替えは、ｙ方向（矢印ｙで示される）に走査枠２０の外側でなさる。本発明の一つの実施形態に従うと、関心のある第１領域２４と交わる走査パターン２３は、ｘ方向へ向かう第１走査線２１を定め、第１波長λ1を持つ光が適用され、そしてｘ方向と逆方向の交点は、第２走査線２２を定め、第２波長λ2を持つ光が適用される。同じことが走査パターン２３と第２関心領域２５の交差にも当てはまる。種々の波長を連係して適用することは、制御装置１３によって達成される。制御装置１３はＡＯＴＦ（示されず）に接続され、走査装置９に従うビーム位置に関する情報を用いて、波長λ1と波長λ2の間の切り替えは容易にすることができる。走査パターン２３と利用者が選んだ関心領域との交差と、切り替えは同期する。
【００１２】
図３は、第１表示２０ａと第２表示２０ｂがディスプレイ１５上に同時に示される本発明の実施形態を示す。第１表示２０ａは、第１パラメータ設定２６で構成される第１照射条件で生成される。第２表示２０ｂは、第２パラメータ設定２７で構成される第２照射条件で生成される。第１表示２０ａの走査枠２０にわたる矢印は、走査枠２０に適用された走査パターン２３の、実質的に平行な部分を表す。図４に示される第２の実施形態に対しても同じことが云える。ディスプレイ上の第１表示２０ａは、矢印で示されるように、試料を線毎に走査することによって得られる。第２表示２０ｂは、走査点が第１表示２０ａの走査パターン２３の上を、実質的に動き返すことで得られる。言い換えれば、走査点は実質的には図３で矢印で示される線に沿って、動き返すのである。走査点が動き返す間、試料１１に当たる光の強度は相当に減少し、レーザは待機モードに切り替えられるか、またはレーザ光が完全に阻止される。それから線（一つの矢印で定められる）が再び走査され、得られるデータは、ディスプレイ１５上の第２表示２０ｂとなる。第１表示２０ａを得るための走査は、第２表示２０ｂのための走査とは異なった照射条件で実行される。パラメータの設定は波長、強度または類似のものから成る。第１表示２０ａにおいて、矢印が第１および第２関心領域２４および２５と交差すると、複数の第１走査線２１が生ずる。第２表示２０ｂにおいて、矢印が第１および第２関心領域２４および２５と交差すると、複数の第２走査線２２が生ずる。第１走査線２１に沿った照射条件は、第２走査線２２の照射条件とは異なる。本発明のもっと複雑な実施形態では、第１関心領域２４に於ける第１走査線２１の照射条件は、第２関心領域２５に於ける照射条件とは異なる。
【００１３】
図４は、第１表示２０ａのほか第２表示２０ｂもまたディスプレイに示される、本発明の別の実施形態を示す。第１表示２０ａは、第１パラメータ設定２６で構成される、第１照射条件によって得られる。第２表示２０ｂは、第２パラメータ設定２７で構成される、第２照射条件によって得られる。図３に関しての相違点は、第１表示２０ａのためのデータサンプリングは第２表示２０ｂのためのデータサンプリングと反対方向に起こることである。ディスプレイ上の第１表示２０ａは、矢印で示されるように、線毎に試料を走査して得られる。第２表示２０ｂは、第１表示２０ａの走査パターン上を実質的に動かし返して得られる。走査点を動かし返す間、試料１１を照らす異なった照射条件で、データが収集される。それから走査点は次の線に切り替えられ、第１表示２０ａに対するデータサンプリングが再開する。上記サンプリングは、枠全体が走査されるまで継続される。
【００１４】
本発明の別の実際的な実施形態が、図５に示される。走査枠２０の二つの表示が、ディスプレイ１５に並べて表示される。第１表示２０ａは第１および第２の関心領域２４および２５が、１００％のレーザ強度で走査される状況を示す。第１および第２の関心領域２４および２５の外側のエリアは、レーザ強度を減らして走査される。第１および第２の関心領域２４および２５と、バックグラウンドに対しても適用されるレーザ強度のパーセンテージは、どのような適切な組み合わせでも選べることを、理解されたい。図５および図６に示される実施形態は、種々の可能な実施形態から選んだものと見なし、本発明を制限するものと見なしてはならない。第１の表示では、レーザの強度は５％に減少されている。示唆される強度を矢印ｘの方向の走査パターン２３に対して適用する。第２の表示２０ｂは、第１および第２の関心領域２４と２５のほか、バックグラウンドに対しても矢印ｘ方向と逆の走査線に対して適用された、強度の例を示す。第１と第２の関心領域およびバックグラウンドは、利用できるレーザ強度の５％の強度で走査される。ＡＯＴＦ５を用いると、ある波長のレーザ強度を種々のレベルに切り替えることが可能である。ＡＯＴＦ５は、走査装置９から得られる位置情報に従って、駆動される。減少したレーザ強度を走査方向と反対に走査線の試料に適用する利点は、漂白作用が起こらないことである。第２表示２０ｂは、単に試料１１に於けるプロセス情報を読み出し、表示することである。第１および第２関心領域２４および２５は１００％強度のレーザに曝されるので、第１および第２関心領域２４および２５では漂白が起こる。矢印ｘの反対方向の走査パターン２３からの情報は、第１および第２関心領域２４および２５に漂白はどんな効果を及ぼしたかである。この情報は第２表示２０ｂに表示される。
【００１５】
本発明の別の実際的な実施形態が図６に示される。第１表示２０ａでは、第１関心領域２４は１００％のレーザ強度で照射され、第２関心領域２５は７５％の強度で照射される状況を示す。第１および第２の関心領域２４と２５の外側のエリアは、減少したレーザ強度で照射される。レーザ強度は５％に減少される。図６に示される強度は、矢印ｘの方向に走査パターン２３に対して適用される。第２の表示２０ｂは、第１および第２の関心領域２４と２５、およびバックグラウンドについても同様に、矢印ｘと反対の方向の走査線に対し、適用された強度の例を示す。第１および第２の関心領域２４と２５は、０％のレーザ強度で走査される。バックグラウンドは、利用できるレーザ強度の５％の強度で走査される。ＡＯＴＦ５を用いると、ある波長のレーザ強度を種々のレベルに切り替えることが可能である。ＡＯＴＦは、走査装置９から得られる位置情報に従って、駆動される。減少したおよび／または可変なレーザ強度を試料の関心の異なった領域に適用する利点は、試料において特別な効果を検出するための最善の照射が、素早くかつ容易に決定されることである。
【００１６】
（発明の効果）
本願の請求項１に係る方法は、少なくとも一つの光源の照射光ビームを用いて、試料を走査するための方法であって、試料の走査枠において、少なくとも一つの関心領域（ＲＯＩ）を定義するステップと、走査パターンと少なくとも一つの関心領域との交差によって、第１の複数の第１走査線および第２の複数の第２走査線を提供するステップと、少なくとも一つの関心領域の第１走査線において、第１の照射条件で試料を照射し、関心領域の外側の試料の領域は第２の照射条件で照射されるステップと、少なくとも一つの関心領域の第２走査線において、第３の照射条件で試料を照射し、関心領域の外側の試料の領域は第４の照射条件で照射されるステップと、を含んでいるので、この発明によると、本願の目的、すなわち、時間分解能を根本的に改善し、容易でかつ試料に関連した照射条件の変更を可能にする方法を提供することができる。
【００１７】
本発明による第１の実施形態の利点は、複数の第１走査線が実質的に複数の第２走査線に重なり、第１走査線と第２走査線の走査方向が、同じ方向を向いていることである。他の実施形態では、複数の第１走査線は複数の第２走査線に実質的に平行であって、第１走査線と第２走査線の走査方向は、互いに反対である。
【００１８】
第１照射条件と第３照射条件は異なり、また第２照射条件および第４照射条件からも異なっているが、後の両者は同じである。上記文脈による照射条件は、波長λによって定義される。第１および第３の照射条件は第１波長λ1で定義され、第２および第４の照射条件は第２波長λ2によって定義される。ＡＯＦＴ、ＥＯＭ（電気的光学変調器）、またはＡＯＭ（音響的光学変調器）、が二つの波長間を切り替えるのに使用される。切り替えは、試料の走査枠内での走査光ビーム位置に依存する。
【００１９】
照射条件調整のための手段は、ＡＯＴＦまたはＡＯＭであって、一つの特定の波長に対して、複数の強度レベル間で照射条件を切り替える。別の実施形態では、第１照射条件は第１照射強度レベルによって定義され、第２照射条件は第２照射強度レベルによって定義され、第３照射条件は第３照射強度レベルによって定義され、そして第４照射条件は第４照射強度レベルによって定義される。
【００２０】
組み合わせると、枠のバックグラウンドは、波長と照射強度レベルが関心ある領域内の波長と照射強度レベルと異なったもので、照射されるであろう。例えばバックグラウンドは５％の照射強度レベルで４８８ｎｍの波長で照射される。関心ある領域は、１００％の照射強度でＵＶの波長で照射される。さらに、複数の関心ある領域が、全て異なった照射条件に従うように定め得るであろう。
【００２１】
本発明の方法は、早い生物学的過程の生起、例えば分子の拡散、生きている細胞間の交信、生理学的パラメータの決定、および膜電位、ＰＨレベル、カルシウムレベルまたは篭型化合物の解放の決定に、特に適している。
【符号の説明】
【００２２】
１ 光源、 ２ 光源、 ３ ビーム結合器、 ４ 光ビーム、 ４ａ 偏向光、 ４ｂ 通過光 ５ 音響光学調整可能フィルタ（ＡＯＴＦ ）、 ６ 高周波駆動装置、 ７
ビームダンプ、 ８ ビームスプリッタ、 ９ 走査装置、１０ 対物レンズ、 １１ 試料、 １２ 検出器、 １３ 制御装置、 １４ コンピュータ、 １５ デイスプレ、
２０ 走査枠、 ２０ａ 第１表示、 ２０ｂ 第２表示、 ２１ 第１走査線、 ２２ 第２走査線、 ２３ 走査パターン、 ２３ａ 走査線、 ２４ 第１関心領域、 ２５
第２関心領域、 ２６ 第１パラメータ設定、 ２７ 第２パラメータ設定
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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