(57)【要約】【課題】異常Frizzled受容体発現又は活性が種々の障害に関与している。従って、１又は２以上のFrizzled受容体を標的化し、そして阻害する治療剤についての必要性がある。【解決手段】本発明は、１以上のFrizzled受容体に結合し、そして前記１以上のFrizzled受容体のＷｎｔタンパク質リガンドへの結合を阻止する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、及びそれを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、治療薬、診断薬及び予防薬としてのそのようなモノクローナル抗体の使用方法を提供する。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のFrizzled受容体に結合し、そして前記１以上のFrizzled受容体のＷｎｔタンパク質リガンドへの結合を阻止する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
１以上のFrizzled受容体に結合し、そして前記１以上のFrizzled受容体が、抗体の存在下で活性化されないよう、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下：
（ａ）配列番号３９２のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｌ１）領域；
（ｂ）配列番号３９３のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｌ２）領域；
（ｃ）図１Ｃに提示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｌ３）領域；
（ｄ）図１Ｃに提示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）領域；
（ｅ）図１Ｃに提示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）領域；及び
（ｆ）図１Ｃに提示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）領域、
を含む、請求項１又は２に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体がＩｇＧ１アイソタイプである、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸を含むＨ鎖可変配列、ここで１以上のＨ鎖ＣＤＲ配列が、図１Ｃに列挙されるＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及び／又はＣＤＲ  Ｈ３配列から選択される、対応するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及び／又はＣＤＲ  Ｈ３配列で置換され、及び配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸を含むＬ鎖可変配列、ここで１以上のＬ鎖ＣＤＲ３配列が、図１Ｃに列挙されるＣＤＲ  Ｌ３配列から選択される、対応するＣＤＲ  Ｌ３配列により置換される、を含む、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
１以上のFrizzled受容体と１以上のＷｎｔタンパク質リガンドとの間の相互作用を阻害する、請求項３に記載の抗体と同じエピトープに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する、請求項３に記載の抗体と同じエピトープに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下：
（ｃ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｌ３）領域；
（ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）領域；
（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）領域；及び
（ｆ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）領域、
をさらに含む、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下：
（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｌ３）領域；
（ｄ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）領域；
（ｅ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）領域；及び
（ｆ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）領域、
をさらに含む、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下：
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｌ３）領域；
（ｄ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）領域；
（ｅ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）領域；及び
（ｆ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）領域、
をさらに含む、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下：
（ｃ）配列番号７１のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｌ３）領域；
（ｄ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）領域；
（ｅ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）領域；及び
（ｆ）配列番号９４のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）領域、
をさらに含む、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、以下：
（ｃ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含む可変Ｌ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｌ３）領域；
（ｄ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）領域；
（ｅ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）領域；及び
（ｆ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む可変Ｈ鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）領域、
をさらに含む、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
対象における異常なFrizzled受容体発現又は活性に関連する疾患又は障害の症状を緩和する方法であって、請求項１〜１４の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、異常なFrizzled受容体発現又は活性に関連する疾患又は障害の症状を緩和するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記対象がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記異常なFrizzled受容体発現又は活性に関連する疾患又は障害が、癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胃腸（GI）癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、前立腺癌、黒色腫、白血病、及びウィルムス腫瘍から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記乳癌が三重陰性乳癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記異常なFrizzled受容体発現又は活性に関連する疾患又は障害が、骨障害である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記骨障害が、骨粗鬆症、変形性関節症及び慢性関節リウマチから選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年８月１４日に提出された米国特許仮出願第６１／８６５，６６８号に対する利益を主張し、その内容は参照により全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明は一般的に、１又は２以上のFrizzled受容体を認識する抗体、例えばモノクローナル抗体、及びそれらの抗−Frizzled抗体の治療剤としての使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Frizzled受容体は、Gタンパク質結合受容体の種類に属する。異常Frizzled受容体発現又は活性が種々の障害に関与している。従って、１又は２以上のFrizzled受容体を標的化し、そして阻害する治療剤についての必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、高親和性抗体、例えばFrizzled受容体又はFrizzled受容体の組合せ、例えばヒトFrizzled受容体又はヒトFrizzled受容体の組合せを認識するモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、Frizzled受容体のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）又はFrizzled受容体の組合せのＣＲＤに結合する。それらの抗体は、Frizzled受容体又はFrizzled受容体の組合せの１又は２以上の生物学的活性を変調し、例えば阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和するか又は他方では、干渉し、例えばＷｎｔシグナル伝達経路を活性化するＷｎｔタンパク質リガンドに結合することができる。
【０００５】
それらの抗体及びそれらの抗原結合フラグメントは、細胞表面上に発現される１又は２以上のFrizzled受容体に結合する。例えば、それらの抗体は、種々の癌細胞系上の１又は２以上のFrizzled受容体に結合し、そして癌幹細胞の増殖を阻害する。従って、抗体及びその抗原結合フラグメントは、癌、及びFrizzled受容体発現及び／又は活性が異常調節される他の疾患、例えば、非制限的例によれば、骨疾患、例えば骨粗鬆症、変形性関節症（ＯＡ）及び関節リウマチ（ＲＡ）の進行を治療し、遅延し、又はその症状を改善するのに有用である。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、癌、例えば、非制限的剤によれば、乳癌、例えば三重陰性乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胃腸（GI）癌、神経芽細胞腫、腎臓癌、前立腺癌、黒色腫、白血病、及び/又はウィルムス腫瘍の治療のために有用である。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、癌幹細胞に関連する癌の治療のために有用である。本発明のそれらの抗−Frizzled受容体抗体及びそのフラグメントは、癌細胞の生存性、移動性及び／又は浸潤性、例えば転移を変調し、例えば阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することにおいて有用である。いくつかの実施形態によれば、本発明のそれらの抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞及び／又は卵巣癌細胞の生存性、移動性及び／又は浸潤性、例えば転移性を変調し、例えば阻止し、阻害し、減じ、中和し、又は他方では干渉することにおいて有用である。
【０００６】
本発明の典型的な抗体フラグメントは、例えば図１Ｃに示され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を有するＦａｂフラグメントを含み、ここで可変Ｌ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｌ１又はＶＬ  ＣＤＲ１）は、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含み、そして可変Ｌ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｌ２又はＶＬ  ＣＤＲ２）は、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含む。本発明の典型的なモノクローナル抗体は、例えば図１Ａ及び１Ｂに示されるＬ鎖及びＨ鎖配列を有する抗体を含む。本発明の典型的なモノクローナル抗体は、例えば図１Ｃに示され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せを有するＩｇＧ抗体を含み、個々でＣＤＲ  Ｌ１はアミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含み、そしてＣＤＲ  Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体は、図１Ａ及び１Ｂに示されるＬ鎖配列を有する抗体と同じFrizzledエピトープに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであるか、又はその抗体フラグメントは、図１Ｃに示され、そして図１に示される配列によりコードされる配列を有するＦａｂフラグメントと同じFrizzledエピトープに結合するフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１又は２以上のFrizzled受容体と、１又は２以上のＷｎｔタンパク質リガンドとの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態によれば、抗体フラグメントは、図１Ａ及び１Ｂ示されるＬ鎖及びＨ鎖配列を有する抗体と同じFrizzledエピトープに結合する抗体のフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１又は２以上のFrizzled受容体と、１又は２以上のＷｎｔタンパク質リガンドとの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。それらの抗体は、集合的には、本明細書においては「抗−Frizzled受容体抗体（ant-Frizzled receptor antibodies）」として言及され、そしてそれらのフラグメントは、集合的には、本明細書においては「抗−Frizzled受容体抗体フラグメント（anti-frizzled receptor antibody fragments）」、として言及される。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上のFrizzled受容体を結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ab’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、scab、dＡb、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上のFrizzled受容体を結合する、そのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。それらの抗体は、１又は２以上のFrizzled受容体、好ましくは１又は２以上のヒトFrizzled受容体に対する特異性を示し、そしてそれらは、１又は２以上のFrizzled受容体、好ましくは１又は２以上のヒトFrizzled受容体の少なくとも１つの生物学的活性を、変調し、例えば阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することが示されている。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域、及び配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号３の核酸配列によりコードされるＨ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号１の核酸配列によりコードされるＬ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号３の核酸配列によりコードされるＨ鎖領域、及び配列番号１の核酸配列によりコードされるＬ鎖領域を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一である核酸配列によりコードされるＨ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一である核酸配列によりコードされるＬ鎖領域を含む。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一である核酸配列によりコードされるＨ鎖領域、及び配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一である核酸配列によりコードされるＬ鎖領域を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、３種のＨ鎖ＣＤＲを有するＨ鎖領域を含み、ここで可変Ｈ鎖（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｈ１）は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含み；ＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｈ２）は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含み；そしてＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ  Ｈ３）は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、３種のＨ鎖ＣＤＲを有するＨ鎖領域を含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸を含み；ＣＤＲ  Ｈ２は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸を含み；そしてＣＤＲ  Ｈ３は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、３種のＬ鎖ＣＤＲを有するＬ鎖領域を含み、ここで可変Ｌ鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１（ＣＤＲ  Ｌ１）は、配列番号３９２の配列を含み；ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号３９３のアミノ酸配列を含み、そしてＣＤＲ  Ｌ３は図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、３種のＬ鎖ＣＤＲを有するＬ鎖領域を含み、ここでＣＲＤ  Ｌ１は配列番号３９２の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含み；ＣＲＤ  Ｌ２は配列番号３９３の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含み、そしてＣＲＤ  Ｌ３は図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、３種のＨ鎖ＣＤＲ及び３種のＬ鎖ＣＤＲを有するＨ鎖領域を含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ  Ｈ２は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ  Ｈ３は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ  Ｌ１は、配列番号３９２のアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ  Ｌ２は、配列番号３９３のアミノ酸配列を含み；そしてＣＤＲ  Ｌ３は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、３種のＨ鎖ＣＤＲ及び３種のＬ鎖ＣＤＲを有するＨ鎖領域を含み、ここでＣＤＲ  Ｈ１は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸を含み；ＣＤＲ  Ｈ２は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸を含み；ＣＤＲ  Ｈ３は、図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸を含み；ＣＲＤ  Ｌ１は配列番号３９２の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含み；ＣＲＤ  Ｌ２は配列番号３９３の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含み、そしてＣＲＤ  Ｌ３は図１Ｃに示されるそれらから成る群から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨ鎖領域を含み、ここで１又は２以上のＨ鎖ＣＤＲ配列が、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択された、その対応するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及び／又はＣＤＲ  Ｈ３配列により置換される。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含み、ここでＣＤＲ  Ｌ３は、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択されたＣＤＲ  Ｌ３配列により置換される。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨ鎖領域（ここで、１又は２以上のＨ鎖ＣＤＲ配列が、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択された、その対応するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及び／又はＣＤＲ  Ｈ３配列により置換される）；及び配列番号２のアミノ酸配列を有するＬ鎖領域（ここで、ＣＤＲ  Ｌ３は、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択されたＣＤＲ  Ｌ３配列により置換される）を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域を含み、ここで１又は２以上のＨ鎖ＣＤＲ配列が、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択された、その対応するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及び／又はＣＤＲ  Ｈ３配列により置換される。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含み、ここでＣＤＲ  Ｌ３は、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択された、その対応するＣＤＲ  Ｌ３配列により置換される。いくつかの実施形態によれば、抗体及びその抗原結合フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＨ鎖領域を含み、ここで１又は２以上のＨ鎖ＣＤＲ配列が、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択された、その対応するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及び／又はＣＤＲ  Ｈ３配列により置換され；そして配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を有するＬ鎖領域を含み、ここでＣＤＲ  Ｌ３は、図１Ｃに列挙され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされるそれらから選択された、その対応するＣＤＲ  Ｌ３配列により置換される。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、典型的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含むＣＤＲ  Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含むＣＤＲ  Ｌ２、アミノ酸配列ＷＡＹＧＰＦ（配列番号５３）を含むＣＤＲ  Ｌ３、アミノ酸配列ＩＹＹＹＳＭ（配列番号５４）を含むＣＤＲ  Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＹＳＳＹＳＹＴＳ（配列番号１９）を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びアミノ酸配列ＳＳＰＧＡＤＹＧＬ（配列番号５５）を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む。この抗体は本明細書においては、Ｈ１０又はｍＡｂ＃１１１として言及され、それらは本開示を通して、交換可能的に使用される。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、典型的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含むＣＤＲ  Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含むＣＤＲ  Ｌ２、アミノ酸配列ＧＶＹＬＦ（配列番号１１２）を含むＣＤＲ  Ｌ３、アミノ酸配列ＩＹＳＳＳＩ（配列番号１１３）を含むＣＤＲ  Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＹＳＳＹＧＳＴＳ（配列番号１１４）を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びアミノ酸配列ＹＨＹＰＦＧＨＡＬ（配列番号１１５）を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む。この抗体は本明細書においては、Ｇ２又はｍＡｂ＃１４０として言及され、それらは本開示を通して、交換可能的に使用される。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、典型的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含むＣＤＲ  Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含むＣＤＲ  Ｌ２、アミノ酸配列ＹＹＨＰＩ（配列番号１５９）を含むＣＤＲ  Ｌ３、アミノ酸配列ＩＳＳＹＹＩ（配列番号１５０）を含むＣＤＲ  Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＹＰＹＹＳＳＴＹ（配列番号１６０）を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びアミノ酸配列ＶＶＶＹＧＡＭ（配列番号１６１）を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む。この抗体は本明細書においては、Ａ１又はｍＡｂ＃１０５として言及され、それらは本開示を通して、交換可能的に使用される。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、典型的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含むＣＤＲ  Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含むＣＤＲ  Ｌ２、アミノ酸配列ＳＳＹＳＬＩ（配列番号７１）を含むＣＤＲ  Ｌ３、アミノ酸配列ＬＳＹＹＳＭ（配列番号９３）を含むＣＤＲ  Ｈ１、アミノ酸配列ＳＩＹＰ８ＹＧＹＴＹ（配列番号８４）を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びアミノ酸配列ＰＳＰＧＳＹＨＧＭ（配列番号９４）を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む。この抗体は本明細書においては、Ｅ４又はｍＡｂ＃１０７として言及され、それらは本開示を通して、交換可能的に使用される。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、典型的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含むＣＤＲ  Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含むＣＤＲ  Ｌ２、アミノ酸配列ＹＷＹＧＶＡＰＩ（配列番号１３２）を含むＣＤＲ  Ｌ３、アミノ酸配列ＩＳＳＳＹＩ（配列番号１３３）を含むＣＤＲ  Ｈ１、アミノ酸配列ＹＩＹＳＳＹＧＳＴＹ（配列番号１３４）を含むＣＤＲ  Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＳＷＹＡＬ（配列番号１３５）を含むＣＤＲ  Ｈ３を含む。この抗体は本明細書においては、Ｈ１又はｍＡｂ＃１１２として言及され、それらは本開示を通して、交換可能的に使用される。
【００２５】
本発明はまた、本発明の抗−Frizzledモノクローナル抗体又はその免疫学的活性フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）を、治療又は改善が所望される対象に投与することにより、異常Frizzled受容体活性、異常Frizzled受容体発現及び／又は異常Ｗｎｔシグナル伝達に関連する１又は２以上の病変の症状の進行を治療し、防止し、遅延し、又は他方では、症状を改善するための方法も提供する。治療される対象は例えば、ヒトである。モノクローナル抗体は、病変に関連する症状を、治療し、阻止するか又は改善するのに十分な量で投与される。対象における病変を治療するか、又は防止するのに十分なモノクローナル抗体の量は、例えばＷｎｔタンパク質リガンドに結合するFrizzled受容体を阻害するか、低めるか又は他方では、拮抗するのに十分である量である。対象における病変を治療するか又は防止するのに十分なモノクローナル抗体の量は、例えばＷｎｔシグナル伝達を阻害するか、低めるか又は他方では、拮抗するのに十分である量である。
【００２６】
本発明の抗−Frizzled受容体抗体及び抗−Frizzled受容体抗体フラグメントを用いて治療され、そして／又は防止される病変は例えば、癌及び／又は骨疾患を包含する。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体フラグメント、及び担体を含むことができる。それらの医薬組成物は、キット、例えば診断キットに含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｆａｂ  Ｈ３のＨ鎖及びＬ鎖配列を示す一連の図である。例として、ＣＤＲ及び主鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列が示される。ＣＤＲは下線が引かれている。列挙されるＣＤＲのアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｆａｂ  Ｈ３のＨ鎖及びＬ鎖配列を示す一連の図である。例として、ＣＤＲ及び主鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列が示される。ＣＤＲは下線が引かれている。列挙されるＣＤＲのアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｃ−１】図１Ｃ−１は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｃ−２】図１Ｃ−２は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｃ−３】図１Ｃ−３は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｄ−１】図１Ｄ−１は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｄ−２】図１Ｄ−２は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｄ−３】図１Ｄ−３は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図１Ｄ−４】図１Ｄ−４は、ＣＤＲ（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）の配列を示す一連の表である。選択からのユニークＦａｂ配列が示されている。クローンファージが、ＥＬＩＳＡスクリーニングのために９６−ウェル培養ボックスにおいて増幅された。ラウンド２からの９５のクローン及びラウンド３からの９５のクローンが、ＦＺＤ７−ＣＤＲ−Ｆｃドメイン及び対照Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性についてスクリーンされた。ラウンド３からの９５ファージクローンのうち合計５７及びラウンド３からの９５のファージクローンのうち合計５９が３よりも大きなバックグラウンドに対するシグナルの比率を示した。ファージクローンが配列決定され、ＣＤＲ  Ｌ３、Ｈ１，Ｈ２及びＨ３組成が決定された。列挙されたアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ命名法により企画される場合、以下の位置である：ＣＤＲ Ｌ３ : １０７−１１６; ＣＤＲ ＨＩ : ３０−３９; ＣＤＲ Ｈ２: ５５−６６；ＣＤＲ Ｈ３ : １０７−１１５。
【図２Ａ−１】図２Ａ-１は、Ｆａｂ精製の要約を示す表である。ライブラリースクリーンから単離されたユニークＦａｂが、ＩＰＴＧ誘導性発現ベクター中にサブクローン化され、そして２５ｍｌの小規模培養下で発現された。一晩の培養ペレットの溶解物が、プロテインＡビーズ上でバッチ精製され、そして２回の連続溶出にゆだねられた。各溶出の収量及び合計Ｆａｂ収量が示される。
【図２Ａ−２】図２Ａ-２は、Ｆａｂ精製の要約を示す表である。ライブラリースクリーンから単離されたユニークＦａｂが、ＩＰＴＧ誘導性発現ベクター中にサブクローン化され、そして２５ｍｌの小規模培養下で発現された。一晩の培養ペレットの溶解物が、プロテインＡビーズ上でバッチ精製され、そして２回の連続溶出にゆだねられた。各溶出の収量及び合計Ｆａｂ収量が示される。
【図２Ｂ−１】図２Ｂ−１は、ＥＬＩＳＡにより測定された、精製されたＦＺＤ７−Ｆｃへの精製されたＦａｂの結合を示す表である。２．５ｍｌの細菌培養物から精製されたＦａｂが、ＦＺＤ７−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  systems）及びＦｃタンパク質への結合についてアッセイされた。ＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル）が、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌのタンパク質により４℃で一晩、被覆された。ウェルが室温で１時間、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳによりブロックされ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（洗浄緩衝液）により３度、洗浄され、そして次に、０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（希釈緩衝液）中、Ｆａｂの一次希釈溶液が示される濃度で添加された。Ｆａｂが室温で１時間インキュベートされ、ウェルが６度、洗浄され、そして抗−ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Sigma）が、希釈緩衝液中、１：５０００で添加された。二次抗体が室温で４５分間インキュベートされ、そしてウェルが６度、洗浄され、そして酸停止とＴＭＢ基質を用いて展開された。４５０ｎｍで吸光度が読み取られた。ｎ．ｔ．＝試験されなかった。
【図２Ｂ−２】図２Ｂ−２は、ＥＬＩＳＡにより測定された、精製されたＦＺＤ７−Ｆｃへの精製されたＦａｂの結合を示す表である。２．５ｍｌの細菌培養物から精製されたＦａｂが、ＦＺＤ７−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  systems）及びＦｃタンパク質への結合についてアッセイされた。ＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル）が、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌのタンパク質により４℃で一晩、被覆された。ウェルが室温で１時間、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳによりブロックされ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（洗浄緩衝液）により３度、洗浄され、そして次に、０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（希釈緩衝液）中、Ｆａｂの一次希釈溶液が示される濃度で添加された。Ｆａｂが室温で１時間インキュベートされ、ウェルが６度、洗浄され、そして抗−ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（Sigma）が、希釈緩衝液中、１：５０００で添加された。二次抗体が室温で４５分間インキュベートされ、そしてウェルが６度、洗浄され、そして酸停止とＴＭＢ基質を用いて展開された。４５０ｎｍで吸光度が読み取られた。ｎ．ｔ．＝試験されなかった。
【図３−１】図３−１は、ＦＺＤ７を発現する細胞への精製されたＦＡｂの結合を示す表である（フローサイトメトリー）。小規模Ｆａｂが、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞における過剰発現系への完全長ＦＺＣ７受容体の結合についてアッセイされた。並行して、Ｆａｂが、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞上で発現される内因性受容体への結合についてアッセイされた。細胞が、ＥＤＴＡ溶液を用いて収穫され、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ（染色緩衝液）中でブロックされ、そして氷上で３０分間、２００ｎＭのＦａｂにより染色された。細胞が、染色緩衝液により２度、洗浄され、そして抗−Ｆ（ａｂ′）2―ＡＰＣ二次抗体（Jackson Immuno)と共に１：１０００で、氷上で１５分間インキュベートされた。すべての抗体が染色緩衝液により希釈された。細胞が、染色緩衝液により３度、洗浄され、そして次に、フローサイトメトリーによる分析のために、１％パラホルムアルデヒドにより固定された。生存細胞集団が前方及び側方散乱プロフィールに基づいてゲート制御され、そして次に、陽性蛍光ゲートが、細胞に結合しなかった陰性対照Ｆａｂに対して設定された。陽性ゲート内の細胞集団の％が示される。
【図３−２】図３−２は、ＦＺＤ７を発現する細胞への精製されたＦＡｂの結合を示す表である（フローサイトメトリー）。小規模Ｆａｂが、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞における過剰発現系への完全長ＦＺＣ７受容体の結合についてアッセイされた。並行して、Ｆａｂが、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞上で発現される内因性受容体への結合についてアッセイされた。細胞が、ＥＤＴＡ溶液を用いて収穫され、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ（染色緩衝液）中でブロックされ、そして氷上で３０分間、２００ｎＭのＦａｂにより染色された。細胞が、染色緩衝液により２度、洗浄され、そして抗−Ｆ（ａｂ′）2―ＡＰＣ二次抗体（Jackson Immuno)と共に１：１０００で、氷上で１５分間インキュベートされた。すべての抗体が染色緩衝液により希釈された。細胞が、染色緩衝液により３度、洗浄され、そして次に、フローサイトメトリーによる分析のために、１％パラホルムアルデヒドにより固定された。生存細胞集団が前方及び側方散乱プロフィールに基づいてゲート制御され、そして次に、陽性蛍光ゲートが、細胞に結合しなかった陰性対照Ｆａｂに対して設定された。陽性ゲート内の細胞集団の％が示される。
【図４Ａ】図４Ａは、ＥＬＩＳＡにより決定されるファージ上に表されるＦａｂの結合特異性を示す表である。ファージ−Ｆａｂクローンが、ＦＺＤ  ＣＤＲ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Systems）への交差結合についてＥＬＩＳＡによりアッセイされた。ＥＬＩＳＡプレート（３８４ウェル）が、４℃で一晩、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌのタンパク質により被覆され、そして結合ファージが、抗−Ｍ１３−ＨＲＰ二時抗体を用いて決定された。ＥＬＩＳＡが、酸停止を伴って、ＴＭＢ基質により展開された。陽性結合結果（Ｆｃ対照タンパク質に対するバックグラウンドシグナル以上のＯＤ４５０）が、（＋）として示される。
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫染色により決定されるＦａｂの結合特異性を示す表である。ＦａｂがＧＰＩ−結合ＣＲＤドメインを安定して発現するＣＨＯ系上での免疫蛍光による交差による交差結合について評価された。＋：結合が検出される；−：結合が検出されなかった。
【図５】図５は、ＦＺＤ７  Ｆａｂクローンのエピトープ開始を検出する表（比較ＥＬＩＳＡアッセイ）である。Ｆｚｄ７−ＦｃがＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌ（３８４ウェルプレート）で一晩、４℃で被覆された。ウェルが０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにより室温で１時間、阻止され、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにより３度、洗浄され、そして次に、示されるＦａｂが、０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（希釈緩衝液）により１μＭに希釈され、そしてウェルに添加された。Ｆａｂが室温で１時間インキュベートされ、そして次に、１０μｌの示されるファージがウェルに添加された。添加されたファージは、３０ｍｌの一晩の培養物のＰＥＧ沈殿からであり、そして直線範囲内でＥＬＩＳＡシグナルを与えるよう前もって決定された濃度に、希釈緩衝液により希釈された。サンプルが室温で２０分間インキュベートされ、そして次に、ウェルが６度、洗浄された。抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（希釈緩衝液中、１：５０００）が、室温で４５分間、添加されて、そしてウェルが６度、洗浄され、そして酸停止を伴ってＴＭＢ基質により展開された。４５０ｎｍでの吸光度が読み取られた。Ｆａｂの存在下での各ファージクローンの％結合率が、Ｆｚｂ７−Ｆｃタンパク質を結合しない負の対照Ｆａｂを含むウェルのＡ４５０シグナルにより、ワンプルウェルのＡ４５０シグナルを割算することにより決定された。
【図６Ａ】図６Ａは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。親和性パラメーターが、表（図６Ａ）に要約されている。図６Ｂ−６Ｊは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｂは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｃは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｄは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｅ】図６Ｅは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｅは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｆ】図６Ｆは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｆは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｇ】図６Ｇは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｇは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｈ】図６Ｈは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｈは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｉ】図６Ｉは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｉは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図６Ｊ】図６Ｊは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を示す表及び一連のグラフである。図６Ｊは、ＳＰＲ測定値のヒストグラムを示している。
【図７】図７は、ＳＰＲにより測定された追加のＦＺＤのへの抗−ＦＺＤ７抗体の結合親和性を示す表である。Ｆｚｄ  ＣＤＲ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  systems）へのＦａｂパネルの結合親和性が、ＳＰＲにより評価された。ヒトドメインが、Ｆｚｄドメイン１、４、５、７及び８のために使用された。Ｆｚｄ２の場合、ヒトとの高い配列同一性を示すマウスドメインが使用された。「ｘ」は、抗原への正の結合性がＳＰＲにより観察されなかった場合を示す。
【図８】図８は、抗−ＦＺＤ７ＦａｂによるＷｎｔ５ａ結合の阻害を示すグラフである。Ｗｎｔ  ５ａ（Ｒ＆Ｄsystems）は、市販のキット（Thermo 21329 EZ-link NHS-PEG4- Biotin）を用いてビオチニル化され、そして過剰ビオチンが、３０００ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎフィルターを用いて、緩衝液交換により除去された。Ｆｚｄ７ｉ−Ｆｃが１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（希釈緩衝液）により希釈され、そして１％ＢＳＡにより前もってブロックされた９６ウェルＴＣプレートにおいて、所望するＦａｂ又は緩衝液サンプルと共に室温で１時間インキュベートされた。Ｆｃタンパク質を有する対照ウェルがまた含まれた。ビオチニル化されたｗｎｔ５ａがウェルに添加され、そしてプレートがさらに１時間インキュベートされた。緩衝液のみがビオチニル化されたｗｎｔ５ａの代わりに添加されている対照ウェルがまたインキュベートされた。ビオチニル化されたＷｎｔ５ａが１５０ｎｇ／μｌの最終濃度で添加され、Ｆａｂタンパク質が０．５μＭの最終濃度で添加され、そしてＦａｄ７−Ｆｃが、線状範囲内で吸光度読み取りを与えるよう前もって決定された最終濃度で添加された。ＦＡｂ  ＢＢ９及びＡＲ０７ｄが、他のタンパク質抗原のためのそれらの特異性を付与する負の対照サンプルとして含まれた。サンプルが、前もってブロックされたストレプタビジン被覆プレート（Ｒ＆Ｄ  systems）に移され、そして室温で１時間、捕捉された。ウェルが、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにより４℃、洗浄され、そして次に、抗−Ｆｃ−ＨＲＰ（希釈緩衝液において１：５０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）がウェルに、室温で４５分間、添加された。ウェルが４℃、洗浄され、そして酸停止を伴って、ＴＭＢ試薬により展開された。４５０ｎｍでの吸光度が読み取られ、そして％結合率が、緩衝液のみのウェルのＡ４５０により割算された、所望するＦａｂウェルのＡ４５０（×１００）として計算された。誤差バーは、３回の独立したＥＬＩＳＡ実験を表す。
【図９】図９は、Ｗｎｔ３ａ誘発された転写活性に対する抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの効果を示すグラフである。ＴＯＰ−ＦＬＡＳＨ受容体システム（ＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位がルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結されている）が、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞中に安定して導入された。４００ｎＭの最終濃度でのＦａｂが、Ｗｎｔ３ａならし培地及び適切な対照ウェルと共に１５時間インキュベートされた。ウェルが溶解され、そしてルシフェラーゼシグナルが読み取られた。誤差バーは、ｎ＝３を示す。
【図１０】図１０は、細胞表面上で発現されるＦＺＤ７  ＥＣＤへの抗−ＦＺＤ７  ＩｇＧの結合を示す一連のグラフである。抗−Ｆｚｄ７  ＩｇＧが、示される細胞系上で、２５ｎＭで、フローサイトメトリーにより染色された。ＩｇＧが、抗−Ｆ（ａｂ）2−ＦＩＴＣ標識された二次抗体（Jackson Immuno）を用いて検出され、ＰＦＡにより固定され、そして次に、データがＢＤ  facscalibur上で取得された。
【図１１】図１１は、Ｗｎｔ３ａ−誘発された転写に対する抗−ＦＺＤ７  ＩｇＧの効果を示す一連のグラフである。用量−依存性阻害曲線が示される。ＩＣ50値が示された。ＩｇＧ  Ｇ６に関しては、単一用量阻害のみが行われた。２００ｎＭで、ＩｇＧ  Ｇ６は＞７０％を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、抗−ＦＺＤ７モノクローナル抗体への５日間の暴露に続いての膵臓癌細胞系の増殖における用量依存性低下を示す一連のグラフ及び表である。図１２Ａは、ｍＡｂ  Ｈ１０（本明細書においては、またｍＡｂ＃１１１とも称す）又はＧ２（本明細書においては、またｍＡｂ＃１４０とも称す）の何れかへの５日間の暴露に続いてのＨＰＡＦII細胞の増殖における用量依存性低下を示す。１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｈ１０への暴露に続いて、それぞれ２４．４％及び３８．０％の増殖の低下が存在し；１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｇ２への暴露に続いて、それぞれ３０．４％及び４８．０％の増殖の低下が存在した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、抗−ＦＺＤ７モノクローナル抗体への５日間の暴露に続いての膵臓癌細胞系の増殖における用量依存性低下を示す一連のグラフ及び表である。図１２Ｂは、ｍＡｂ  Ｈ１０又はＧ２の何れかへの５日間の暴露に続いてのＩＭＭＰＣ２細胞の増殖における用量依存性低下を示す。１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｈ１０への暴露に続いて、それぞれ１４．１％及び１６．２％の増殖の低下が存在し；１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｇ２への暴露に続いて、それぞれ１５．７％及び１７．９％の増殖の低下が存在した。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、抗−ＦＺＤ７モノクローナル抗体への５日間の暴露に続いての膵臓癌細胞系の増殖における用量依存性低下を示す一連のグラフ及び表である。図１２Ｃは、ｍＡｂ  Ｈ１０又はＧ２の何れかへの５日間の暴露に続いてのＰＡＮＣ０８．１３細胞の増殖における用量依存性低下を示す。１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｈ１０への暴露に続いて、それぞれ０．１６％及び７．７％の増殖の低下が存在し；１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｇ２への暴露に続いて、それぞれ４．７％及び７．７％の増殖の低下が存在した。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、抗−ＦＺＤ７モノクローナル抗体への５日間の暴露に続いての膵臓癌細胞系の増殖における用量依存性低下を示す一連のグラフ及び表である。図１２Ｄは、ｍＡｂ  Ｈ１０又はＧ２の何れかへの５日間の暴露に続いてのＡＳＰＣ−１細胞の増殖における用量依存性低下を示す。１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｈ１０への暴露に続いて、それぞれ３７．５％又は４１．９％の増殖の低下が存在し；１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでのｍＡｂ  Ｇ２への暴露に続いて、それぞれ４２．３％及び４５．８％の増殖の低下が存在した。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、抗−ＦＺＤ７モノクローナル抗体への５日間の暴露に続いての膵臓癌細胞系の増殖における用量依存性低下を示す一連のグラフ及び表である。図１２Ｅは、抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂ  Ａ１（本明細書においては、またｍＡｂ＃１０５とも称す）、Ｅ４（本明細書においては、またｍＡｂ＃１０７とも称す）、Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）、Ｈ１（ｍＡｂ＃１１２）及びＧ２（ｍＡｂ＃１４０）への５日間の暴露に続いてのＣａｐａｎ−２細胞の増殖における用量依存性低下を示す。増殖の低減のレベルは、１８Ｒ５抗体への暴露の後に見出されるそれらの低減と同等であった。まとめると、１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌでの抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂの暴露が、３５％以上、Ｃａｐａｎ−２細胞の増殖の低減をもたらした。
【図１３Ａ】図１３Ａは、抗−ＦＺＤ７抗体、Ａ１（ｍＡｂ＃１０５）、Ｅ４（ｍＡｂ＃１０７）、Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）、Ｈ１（ｍＡｂ＃１１２）、Ｇ２（ｍＡｂ＃１４０）又は１８Ｒ５との５日間のインキュベーションに続いての癌細胞系ＡＰＳＣ−１の増殖の用量依存性応答を示す一連のグラフ及び表である。図１３Ａは、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌの濃度でのｍＡｂ  Ａ１（ｍＡｂ＃１０５）、Ｅ４（ｍＡｂ＃１０７）又はＨ１０（ｍＡｂ＃１１１）との５日間のインキュベーションに続いてのＡＳＰＣ−１細胞の増殖の用量依存性低下を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、抗−ＦＺＤ７抗体、Ａ１（ｍＡｂ＃１０５）、Ｅ４（ｍＡｂ＃１０７）、Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）、Ｈ１（ｍＡｂ＃１１２）、Ｇ２（ｍＡｂ＃１４０）又は１８Ｒ５との５日間のインキュベーションに続いての癌細胞系ＡＰＳＣ−１の増殖の用量依存性応答を示す一連のグラフ及び表である。図１３Ｂは、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌの濃度でのｍＡｂ  Ｈ１（ｍＡｂ＃１１２）、Ｇ２（ｍＡｂ＃１４０）又は１８Ｒ５との５日間のインキュベーションに続いてのＡＳＰＣ−１細胞の増殖の用量依存性低下を示す。
【図１４】図１４は、マウス異種移植腫瘍モデルへの抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂの投与に続いてのインビボ腫瘍増殖阻害を示すグラフ及び表である。３×１０6個のＡｓＰＣ１細胞が、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスの腫瘍に移植され、続いて、６日目から出発して、１週当たり２度、投与される、２０ｍｇ／ｋｇの抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂにより処理された。全ての試験された抗−ＦＺＤ７抗体（すなわち、ＡＯ１ (ｍＡｂ＃１０５)、Ｅ０４ (ｍＡｂ＃１０７)、 Ｈ１０ (ｍＡｂ＃１１１)、 Ｈ０１ (ｍＡｂ＃ｌ１２)、Ｇ０２ (ｍＡｂ＃１４０)）は、２５％−５０％の範囲の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）で抗−腫瘍活性を示した。
【図１５】図１５は、抗−ＦＺＤ７抗体、Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）及びＨ０１（ｍＡｂ＃１１２）の投与に続いてのインビボ用量依存性腫瘍増殖阻害を示すグラフ及び表である。３×１０6個のＡｓＰＣ１細胞がＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスの脇腹に移植され、続いて、週当たり２度、投与される、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇの濃度でのＨ０１（ｍＡｂ＃１１１）又はＨ０１（ｍＡｂ＃１１２）の何れかにより、移植の６日後に開始して、処理された。用量依存性腫瘍増殖阻害活性が、Ｈ０１（ｍＡｂ＃１１１）及びＨ０１（ｍＡｂ＃１１２）の両者で観察され、そしてそれぞれ、Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）については、３６．８−６５．８％の範囲、及びｍＡｂ  Ｈ０１（ｍＡｂ＃１１２）については、３５．４％−４４．７％の範囲の腫瘍体積の低減が存在した。
【図１６】図１６は、Ｃａｐａｎ−２異種移植マウスモデルにおける、抗−ＦＺＤ７抗体Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）の投与に続いての用量依存性腫瘍増殖阻害を示すグラフである。４×１０6個のＣａｐａｎ―２細胞が、Ｃ．Ｂ−１７−ＳＣＩＤマウスの脇腹に移植され、続いて合計１０用量、週当たり２度、投与される、５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇの何れかの濃度でのＨ１０（ｍＡｂ＃１１２）により、移植の６日後に処理された。２０ｍｇ／ｋｇの投与が、５２％の腫瘍体積の低減をもたらした。
【図１７】図１７は、ＨＰＡＦII異種移植マウスモデルにおける、抗−ＦＺＤ７抗体Ｈ１０（ｍＡｂ＃１１１）の投与に続いての用量依存性腫瘍増殖阻害を示すグラフである。３×１０6個のＨＰＡＦII細胞が、Ｃ．Ｂ−１７−ＳＣＩＤマウスの脇腹に移植され、続いて、合計８用量、投与される、５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇの何れかの濃度でのＨ１０（ｍＡｂ＃１１１）により、４．５週間、移植の６日後、週２度、処理された。２０ｍｇ／ｋｇの投与が、９４％の腫瘍体積の低減をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、高親和性抗体、例えば１又は２以上のFrizzled受容体を認識するモノクローナル抗体を提供する。Frizzled受容体は、種々の生物学的工程、例えば成長、細胞増殖、分化、生存及び移動、並びに多くの病的状態、例えば癌に関与している、重要な種類のＧタンパク質結合された受容体である。本明細書において提供される抗体は、Frizzled受容体又はFrizzled受容体の組合せに結合し、リガンドＷｎｔ結合を阻止し、そしてFrizzled受容体媒介性シグナル伝達を調節する。従って、それらの抗体は、Frizzled受容体が脱調節されている癌及び他の疾患の処置のための治療可能性を有する。
【００３０】
Frizzled受容体は、多くの重要な生物学的工程、例えば成長、細胞増殖、生存、移動及び幹細胞維持に関与している。それらの受容体及びそれらのリガンド、Ｗｎｔタンパク質の異常発現及びシグナル伝達が、多くの癌、例えば結腸癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌に関与している。しばしば、複数のＷｎｔリガンド及び／又はFrizzled受容体がアップレギュレートされ、そして腫瘍形成を駆動する異常シグナル伝達を導く。従って、複数のFrizzled受容体の阻害が、増強された抗癌効果を達成するために使用され得る。さらに、Frizzled受容体はまた、癌幹細胞、すなわち薬物耐性、腫瘍再発及び転移を担当していると思われる小集団癌細胞にも関与している。従って、Frizzled受容体に対する拮抗性抗体が、癌幹細胞を標的化し、そして種々のタイプの癌を治療するために使用され得る。例えば、本明細書に提供されるＦＺＤ７に対する拮抗性抗体は、ＦＺＤ７を発現し、そしてＦＺＤ７に依存する癌を治療するために有用である。それらの抗体はまた、追加のＦＺＤ受容体にも結合するので、それらの抗体は、他のFrizzled受容体を発現し、そして依存する癌を治療するために使用され得る。
【００３１】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞表面受容体を通して細胞の外部から細胞の内部にシグナルを通過させるタンパク質から製造されるシグナルトランスダクション経路のグループである。次の３種のＷｎｔシグナル伝達経路が特徴づけられている：標準的Ｗｎｔ経路、非標準的平面内細胞極性経路、及び非標準的Ｗｎｔ／カルシウム経路。すべての３種のＷｎｔシグナル伝達経路は、細胞内の乱れたタンパク質に対して生物学的シグナルを通過させる、Frizzled受容体へのＷｎｔ−タンパク質リガンドの結合により活性化される。標準的Ｗｎｔ経路は、伝達転写の調節を導き、非標準的平面内細胞極性経路は、細胞の形状を担当している骨格を調節し、そして非標準的Ｗｎｔ／カルシウム経路は細胞内のカルシウムを調節する。
【００３２】
本発明の抗体は、１又は２以上のFrizzled受容体とＷｎｔタンパク質リガンドとの間の相互作用を調節する。Frizzled受容体は、Frizzled−１ (ＦＺＤ１)、Frizzled−２（ＦＺＤ２）、Frizzled−３（ＦＺＤ３）、Frizzled−４（ＦＺＤ４）、Frizzled−５（ＦＺＤ５）、Frizzled−６（ＦＺＤ６）、Frizzled−８（ＦＺＤ８）、Frizzled−９（ＦＺＤ９）及び Frizzled−１０（ＦＺＤ １０）から選択されたFrizzled受容体を包含する。Ｗｎｔタンパク質リガンドは、ヒトＷｎｔタンパク質、例えばＷｎｔｌ、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、ＷｎｔＳＡ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、 Ｗｎｔ７Ａ、 Ｗｎｔ７Ｂ、 Ｗｎｔ８Ａ、 Ｗｎｔ８Ｂ、 Ｗｎｔ９Ａ、 Ｗｎｔ９Ｂ、 ＷｎｔｌＯＡ、 Ｗｎｔｌ.０Ｂ、 Ｗｒｎｔｌ １及び Ｗｎｔｌ ６から選択されたヒトＷｎｔタンパク質を包含する。抗−Frizzled抗体は、Ｗｎｔタンパク質リガンドへの結合を阻害するか、又は他方では、拮抗し、そしてＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を調節する。例えば、抗−Frizzled抗体は、Ｗｎｔタンパク質リガンドへの結合を阻害するか、又は他方では拮抗し、そして標準的Ｗｎｔ経路、非標準的平面内細胞極性経路、及び非標準的Ｗｎｔ／カルシウム経路を通してシグナル伝達の活性化を調節する。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、抗体は、ＦＺＤ７のシステインに富んでいるドメイン（ＣＲＤ）を結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１（ＦＺＤ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２（ＦＺＤ２）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ −３（ＦＺＤ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４ （ＦＺＤ４）、 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５ （ＦＺＤ５）、 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６ （ＦＺＤ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７ （ＦＺＤ７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ （ＦＺＤ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９ （ＦＺＤ９） 及びＦｒｉｚｚｌed-10 (ＦＺＤ １０)から選択された１又は２以上のFrizzled受容体を結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、ＦＺＤｌ、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９ 及びＦＺＤ１０から選択された複数のFrizzled受容体を結合する。例えば、いくつかの実施形態によれば、抗体は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、又は少なくとも９又はそれ以上のFrizzled受容体を結合する。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、抗体は、Frizzled受容体のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）を結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、ＦＺＤｌ、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９ 及びＦＺＤ１０から選択された１又は２以上のFrizzled受容体のシステインに富むドメインを結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、ＦＺＤｌ、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９ 及びＦＺＤ１０から選択された複数のFrizzled受容体のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）を結合する。例えば、いくつかの実施形態によれば、抗体は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、又は少なくとも９又はそれ以上のFrizzled受容体を結合する。それらの抗体は、１又は２以上のFrizzled受容体の１又は２以上の生物学的活性を、調節でき、例えば阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、抗体は、本明細書においてはFrizzled−７及び／又はＦＺＤ７とも呼ばれるFrizzled−７受容体を結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体はヒトＦＺＤ７を結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、ＦＺＤｌ、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９ 及びＦＺＤ１０から選択された１又は２以上のFrizzled受容体と組合して、ＦＺＤ７を結合する。いくつかの実施形態によれば、抗体は、ヒトＦＺＤｌ、ヒトＦＺＤ２、ヒトＦＺＤ３、ヒトＦＺＤ４、ヒトＦＺＤ５、ヒトＦＺＤ６、ヒトＦＺＤ７、ヒトＦＺＤ８、ヒトＦＺＤ９ 及びヒトＦＺＤ１０から選択された１又は２以上のヒトFrizzled受容体と組合して、ヒトＦＺＤ７を結合する。
【００３６】
本発明の抗体は、≦１μＭ、例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ及びより好ましくは≦１ｎＭの平衡結合定数（Ｋｄ）を伴って、１又は２以上のFrizzled受容体上のエピトープ、例えばヒトＦＺＤ７上のエピトープに結合する。例えば、本明細書において提供される抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、図６及び／又は図７に示される範囲でＫｄを示す。
【００３７】
本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、１又は２以上のFrizzled受容体の少なくとも１つの機能的活性を、調節し、阻止し、減じ、拮抗し、中和するか、又は他方では、干渉するよう作用する。例えば、抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントは、Ｗｎｔタンパク質リガンドへの１又は２以上のFrizzled受容体の結合を、部分的に又は完全に調節し、阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和するか、又は他方では、干渉することにより、Frizzled機能的活性を、完全に又は部分的に阻害する。例えば、抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントは、１又は２以上のFrizzled受容体の活性化を、部分的に又は完全に調節し、阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和するか、又は他方では、干渉することにより、Frizzled機能的活性を、完全に又は部分的に阻害する。
【００３８】
抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントは、抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントの存在下での機能的活性のレベルが抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントとの相互作用、例えばそれとの結合の不在下での機能的活性のレベルに比べて、少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、低められる場合、１又は２以上のFrizzled受容体の少なくとも１つの機能的活性を完全に阻止すると考えられる。抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントは、抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントの存在下での機能的活性のレベルが抗−Frizzled受容体抗体及び／又は抗−Frizzled受容体抗体フラグメントとの相互作用、例えばそれとの結合の不在下での機能的活性のレベルに比べて、少なくとも５０％、例えば５５％、６０％、７５％、８０％、８５％又は９０％、低められる場合、１又は２以上のFrizzled受容体の少なくとも１つの機能的活性を部分的に阻止すると考えられる。
【００３９】
定義
特にことわらない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者により通常、理解される意味を有するであろう。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は、複数形も含み、そして複数形の用語は単数形も含むであろう。一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して及びそれらの技法に関連して使用される命名法は、当業界において良く知られており、そして通常使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に関しては、標準技法が使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の仕様に従って、又は当核技術分野において通常に達成されるようにして、又は本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技法及び手順は、一般的に、当業界において良く知られている従来の技法に従って、及び本明細書を通して引用され、そして議論される種々の一般的な及びより具体的な参考文献に記載されるようにして実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、及び医薬品及び製薬化学に関連して使用される命名法、及びそれらの実験手順及び技法は、良く知られており、そして一般的に当業界において使用される。化学合成、化学分析、医薬製剤、製剤化及び送達、及び患者の治療についての標準技法が用いられる。
【００４０】
本発明に従って使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。「特異的に結合する（specifically bind）」又は「〜と免疫反応する（immunoreacts with）」、又は「〜に対して指図された（directed against）」とは、抗体が所望の抗原の１又は２以上の抗原決定基と反応し、そして他のポリペプチドとは反応しないか、又はより低い親和性（Ｋd＞１０-6）で結合することを意味する。抗体とは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ(ドメイン抗体)、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ及びＦａｂ発現ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００４２】
基本的抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「Ｌ鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「Ｈ鎖」（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する約１００−１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部分は、エフェクター機能を主に担当する不変領域を定義する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関し、それらは分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる。特定のクラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、及び他のものを有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖は、κ鎖又はλ鎖であり得る。
【００４３】
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」(ｍＡｂ)又は「モノクローナル抗体組成物（monoclonal antibody composition）」とは、本明細書において使用される場合、ユニークＬ鎖遺伝子生成物及びユニークＨ鎖遺伝子生成物から成る抗体分子の１つの分子種のみを含み抗体分子集団を言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団の分子全てにおいて同一である。ＭＡｂは、それに対するユニーク結合親和性により特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００４４】
一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関し、それらは分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる。特定のクラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、及び他のものを有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖は、κ鎖又はλ鎖であり得る。
【００４５】
用語「抗原−結合部位（antigen-binding site）」又は「結合部分（binding portion）」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を言及する。抗原結合部位は、Ｈ鎖（Ｈ）及びＬ鎖（Ｌ）のＮ−末端可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域（hyperrariable regions）」として言及される、Ｈ及びＬ鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「骨格領域（framework regions）」又はＦＲとして知られている、より保存されたフランキングストレッチ間に介在する。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリンにおける超可変領域間に天然において見出され、そしてその領域に隣接して存在するアミノ酸配列を言及する。抗体分子においては、Ｌ鎖の３つの超可変領域及びＨ鎖の３つの超可変領域が、抗原−結合表面を形成するために、立体空間でお互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合される抗原の立体表面に相補的であり、そしてＨ鎖及びＬ鎖の個々の３つの超可変領域は、「相補性−決定領域（Complementarity-determining regions）」又は「ＣＤＲ」として言及される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))又は Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ（epitope）」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は通常、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学的活性表面基から成り、そして通常、特異的立体構造特性、及び特異的電荷特性を有する。抗体は、解離定数が≦１μＭである場合、例えば、≦１００ｎＭ、好ましくは、≦１０ｎＭ及びより好ましくは、≦１ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合（specific binding）」、「免疫学的結合（immunological binding）」及び「免疫学的結合性質（immunological binding properties）」とは、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を言及する。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表され得、ここでより小さなＫｄがより高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合性質は、当業界において良く知られている方法を用いて定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度の測定を必要とし、ここでそれらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性及び両方向にその速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数（on rate constant）」 (Ｋon)及び「オフ速度定数（「off rate constant」）(Ｋoff)の両者は、濃度、及び会合及び解離の実際の速度の計算により決定され得る。（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Ｋoff/Ｋonの比率は、親和性に関係しないすべてのパラメーターの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋdに等しい。（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、当業者に知られているアッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ又は類似するアッセイにより測定される場合、平衡結合定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、好ましくは、≦１００ｎＭ、より好ましくは、≦１０ｎＭ、及び最も好ましくは、≦１００ｐＭ−約１ｐＭである場合、Frizzled受容体に対して特異的に結合すると言われる。
【００４８】
用語「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源により、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然で見出される、ポリヌクレオチドのすべて又は一部に関連せず、（２）それが天然において連結されないポリヌクレオチドに操作可能的に連結されるか、又は（３）大きな配列の一部として、天然において存在しない。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４で示されるＨ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、例えば配列番号３の核酸分子、及び配列番号２で示されるＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、例えば配列番号１の核酸分子を含む。
【００４９】
本明細書において言及される用語「単離されたタンパク質（isolated protein）」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源又はそれらのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源又は誘導源により、「単離されたタンパク質」は、（１）天然において見出されるタンパク質とは関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により発現されるか、又は（４）天然において存在しない。
【００５０】
用語「ポリペプチド（polypeptide）」とは、天然タンパク質フラグメント又はポリペプチドの配列の類似体を言及するための遺伝子用語として、本明細書において使用される。従って、天然タンパク質フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明のポリペプチドは、配列番号４で表わされるＨ鎖免疫グロブリン分子、及び配列番号２で表わされるＬ鎖免疫グロブリン分子、並びに、Ｌ鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパＬ鎖免疫グロブリンと共に、Ｈ鎖免疫グロブリン分子を含む組合せにより形成される抗体分子を含み、そして逆もまた同様に、及びそれらのフラグメント及び類似体も含む。
【００５１】
本明細書において使用される、用語「天然に存在する（naturally-occurring）」とは、目的に適用される場合、目的が天然において見出され得る事実を意味する。例えば、天然源から単離され得る生物（ウィルスを含む）に存在し、そして実験室においてヒトにより意図的に修飾されておらず、又は他方では、天然に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を挙げることができる。
【００５２】
用語「操作可能的に連結される（operably linked）」とは、本明細書において使用される場合、そのように記載される成分の位置が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「操作可能的に連結される」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような手段で連結される。
【００５３】
用語「制御配列（control sequence）」とは、本明細書において使用される場合、連結されるコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすのに必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、そのような制御配列は一般的に、真核生物では、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、一般的に、そのような制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセッシングのために必須であるすべての成分を、少なくとも含むよう意図され、そしてまた、その存在が好都合である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含むことができる。用語「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１０個の長さの塩基のヌクレオチドのポリマー、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド、又は何れかのタイプのヌクレオチドの修飾形を意味する。この用語は、単鎖及び二本鎖形のＤＮＡを包含する。
【００５４】
本明細書において言及される用語、「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在し、そして天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結される、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００個又はそれよりも少ない長さの塩基を一般的に含むポリヌクレオチドポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０−６０個の長さの塩基、及び最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０−４０個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、プローブについては一本鎖であるが、但しオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異体の構成への使用に関しては、二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスの何れかのオリゴヌクレオチドである。
【００５５】
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「修飾されたヌクレオチド（modified nucleotides）」は、修飾されたか又は置換された糖基等を有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド結合（oligonucleotide linkages）」は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロンミデート及び同様のものを包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. 米国特許第5,151,510号; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望には、検出のための標識を含むことができる。
【００５６】
用語「選択的にハイブリダイズする（selectively hybridize）」とは、本明細書において使用される場合、検出的に及び特異的に結合することを意味する。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びそれらのフラグメントは、非特異的核酸への検出可能な結合の相当量を最少にするハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高い堅縮条件が、当業界において知られているように、及び本明細書において論じられるように、選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。一般的に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びフラグメントと、目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、そしてより典型的には、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％及び１００％の上昇する相同性を有する。２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的又は完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、８５％の相同性とは、アミノ酸の８５％が、それらの２つの配列が最大一致のために整列される場合、同一であることを意味する。ギャップ（一致される２つの配列の何れかにおいて）は、５又はそれ以下の最大一致ギャップ長において許容され、そして２又はそれ以下のギャップ長がより好ましい。他方では及び好ましくは、２つのタンパク質配列（又は少なくとも３０個の長さのアミノ酸の配列に由来するポリペプチド配列）は、この用語は本明細書において使用されるように、それらが成熟データマトリックス及び６又はそれ以上のギャップペナルティイーでのプログラムＡＬＩＧＮを用いて、５（標準偏差単位で）のアラインメント評点を有する場合、相同である。Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10を参照のこと。２つの配列又はその一部は、より好ましくは、それらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列される場合、５０％以上か又は５０％、同一である場合、相同である。用語「〜に対応する（corresponds to）」とは、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべて又は一部に対して相同であるか（すなわち、同一であるが、厳密に進化的には関連しない）、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列に対して同一であることを意味する。対照的に、用語「〜に対して相補的（complementary to）」とは、本明細書において使用される場合、その相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべて又は一部に対して相同であることを意味する。説明すると、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００５７】
次の用語は、複数のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列間の配列関係を説明するために使用される：「参照配列（reference sequence）」、「比較窓（comparison window）」、及び「実質的な同一性（substantial identity）」。「参照配列」は、参照配列が例えば、配列列挙に与えられる完全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメントとして、大きな配列のサブセットであり得るか、又は完全ｃＤＮＡ又は遺伝子配列を含むことができる、配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。一般的に、参照配列は、少なくとも１８個の長さのヌクレオチド、又は６個の長さのアミノ酸、頻繁には、少なくとも２４個の長さのヌクレオチド又は８個の長さのアミノ酸、及びしばしば、少なくとも４８個の長さのヌクレオチド又は１６個の長さのアミノ酸である。２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列は、それぞれ、（１）それらの２つの分子間で類似する配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の一部）を含み、そして（２）２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列間で相違する配列を、さらに含むことができるので、２つの（又はそれ以上）分子間の配列比較は典型的には、配列類似性の局部領域を同定し、そして比較するために、「比較窓」に対して２つの分子の配列を比較することにより実施される。「比較窓」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１８の連続ヌクレオチド位置又は６個のアミノ酸の概念的セグメントを意味し、ここでポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が少なくとも１８個の連続ヌクレオチドは６個のアミノ酸配列の参照配列に比較され得、そして比較窓中のポリヌクレオチド配列の一部は、それら２つの配列の最適な整列のために、参照配列（付加又は欠失を含まない）に比較される場合、２０％又はそれ以下の付加、欠失、置換、及び同様のもの（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較窓を整列するための配列の最適な整列は、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needieman and Wunsch J . Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アルゴリズムにより、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci, (U.S.A.) 85:2444 (1988)の類似性検索法により、それらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0におけるGAP, BESTFIT, FASTA, 及びTFASTA, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, 又は MacVectorソフトウェアパッケージ）により、又は検査により実施され得、そして種々の方法により生成される最良のアルゴリズム（すなわち、比較窓に対する相同性の最高百分率をもたらす）が選択される。
【００５８】
用語「配列同一性（sequence identity）」とは、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列が、比較窓に対して同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチド、又は残基対残基に基いて）ことを意味する。用語「配列同一性の百分率（percentage of sequence identity）」は、比較窓に対して、２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ又はＩ）又は残基が、一致される位置の数を得るために、両配列において存在する位置の数を決定し、比較窓（すなわち、窓サイズ）における位置の合計数により、一致される位置の数を割算し、そしてその結果に１００を乗算することにより計算され、配列同一性の百分率が得られる。用語「実質的な同一性（substantial identity）」とは、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特性を示し、ここでポリヌクレオチド又はアミノ酸は、少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置の比較窓、時折、少なくとも２４−４８個のヌクレオチド（８−１６個のアミノ酸）位置の比較窓に対して参照配列を比較して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９０−９５％の配列同一性、より通常には、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、ここで配列同一性の百分率は、比較窓に対して参照配列の合計２０％又はそれ以下である欠失又は付加を含むことができる配列に、参照配列を比較することにより計算される。参照配列は、大きな配列のサブセットであり得る。
【００５９】
本明細書において使用される場合、２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、慣用的用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸、非天然アミノ酸、例えばα−置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、次のものを包含する：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、δ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似するアミノ酸、及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書において使用されるポリペプチド表記においては標準の使用法及び慣習によれば、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
【００６０】
同様に、特にことわらない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５′末端であり、そして二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５′方向として言及される。新生ＲＮＡ転写体の５′から３′への付加の方向は、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖との転写方向配列と称され、そしてＲＮＡ転写体の５′から５′末端への方向は、「上流配列（upstream sequences）」、すなわちＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域と称され、そしてＲＮＡ転写体の３′から３′末端への方向は、「下流配列（downstream sequences）」と称される。
【００６１】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性（substantial identity）」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップウェイト（default gap weights）を用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性、及び最も好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【００６２】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
【００６３】
保存性アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループは、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸グループは、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループは、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノグループは、リシン、アルギニン及びヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸グループは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存性アミノ酸置換グループは次の通りである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミン。
【００６４】
本明細書において論じられる場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における小さな変動が、本発明により包含されるよう意図され、但しアミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、９０％、９５％、及び最も好ましくは、９９％、維持されるべきである。特に、保存性アミノ酸置換が意図される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じるものである。遺伝子的にコードされるアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニンヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり；そして（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリン及びトレオニンを包含する。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。アミノ酸の他のファミリーは、次のものを包含する：（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーである、セリン及びトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；及び（iv）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの単離された置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるトレオニン、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似する置換が、特に、その置換が骨格部位内にアミノ酸を含まない場合、その得られる分子の結合又は性質に対して主要な影響を与えないであろうことを予測するのは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは、本明細書において詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又は類似体は、当業者により容易に調製され得る。いくつかの実施形態によれば、フラグメント又は類似体のアミノ−及びカルボキシ−末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。構造及び機能ドメインは、公的又は独自の配列データベースに、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を比較することにより、同定され得る。好ましくは、コンピューター化された比較方法が、既知構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質立体構造ドメインを同定するために使用され得る。既知の三次元構造に折りたたむタンパク質を同定する方法は知られている（Bowie et al. Science 253:164 (1991)）。従って、前述の例は、当業者が本発明に従って構造的及び機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフ及び構造コンホメーションを認識できることを示す。
【００６５】
好ましくは、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低め、（２）酸化に対する感受性を低め、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、そして（５）そのような類似体の他の物理化学的マタハ機能的性質を付与するか、又は修飾するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存性アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において（分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）、行われ得る。保存性アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変えるべきではない（例えば、アミノ酸置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊するか又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を分裂する傾向があるべきではない）。当技術分野で認識されるポリペプチドの二次及び三次構造の例は、タンパク質、構造及び分子の原則（Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)）；タンパク質構造の紹介（C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)）；及びThornton et al. Nature 354:105 (1991)に記載されている。
【００６６】
用語「ポリペプチドフラグメント（polypeptide fragment）」とは、本明細書において使用される場合、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するが、しかし残るアミノ酸配列が、例えば完全な長さのｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列におけるその対応する位置と同一である、ポリペプチドを意味する。フラグメントは典型的には、少なくとも５、６、８又は１０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも１４個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態によれば、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常、少なくとも５０個の長さのアミノ酸、及びいくつかの実施形態によれば、７０個の長さのアミノ酸である。用語「類似体（analog）」とは、本明細書において使用される場合、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、そして適切な結合条件下で１又は２以上のFrizzled受容体に対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対して保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、そしてしばしば、完全な長さの天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【００６７】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの性質に類似する性質を有する非ペプチド薬剤として製薬業界において通常、使用される。それらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（peptide mimetics）」又は「ペプチド模倣物（peptidemimetics）」とも呼ばれる。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)。そのような化合物はしばしば、コンピューター化された分子モデリングの助けにより開発される。治療的有用なペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物が、同等の治療又は予防効果を生成するために使用され得る。一般的に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的性質又は薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に構造的に類似するが、しかし当業界において良く知られている方法により、−ＣＨ2ＮＨ−，−ＣＨ2Ｓ−、ＣＨ2−ＣＨ２−，−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ2−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−及び−ＣＨ2ＳＯ2−から成る群から選択された結合により、任意に置換される１又は２以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１又は２以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸（Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）による体系的置換が、より安定したペプチドを生成するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変動を含む制約されたペプチドが、当業界において知られている方法（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992)）により；例えばペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成できる内部システイン残基を付加することにより、生成され得る。
【００６８】
用語「剤（agent）」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生体材料から製造される抽出物を示すために、本明細書において使用される。
【００６９】
本明細書において使用される場合、用語「標識（label）」又は「標識された（labeled）」とは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、又はマーキングされたアビジン（例えば、光学的又は比色法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組込みを意味する。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法が当業界において知られており、そして使用され得る。ポリペプチドのための標識の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＴＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの実施形態によれば、標識は、潜在的な立体障害を低めるために、種々の長さのスペーサーアームにより結合される。用語「薬剤又は薬物（pharmaceutical agent or drug）」とは、本明細書において使用される場合、患者に正しく投与される場合、所望の治療効果を誘発できる化合物又は組成物を意味する。
【００７０】
用語「抗腫瘍剤（antineoplastic agent）」とは、ヒトにおける腫瘍、特に悪性（癌性）病変、例えば癌腫、肉腫、リンパ腫又は白血病の発生又は進行を阻害する機能的性質を有する剤を言及する。転移の阻害は、時折、抗腫瘍剤の性質である。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な（substantially pure）」とは、目的種が存在する主要種であり（すなわち、モル基準で、組成物中のいずれか他の個々の種よりも豊富である）、そして実質的に精製された画分が組成物であり、ここで、目的種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を占めることを意味する。
【００７２】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物の存在するすべての高分子種の約８０％以上、いくつかの実施形態によれば、約８５％、９０％及び９９％以上を占めるであろう。最も好ましくは、目的種は、本質的に均質に精製され（組成物中の汚染種は、従来の検出法によっては検出され得ない）、ここで組成物は単一の高分子種から本質的に成る。
【００７３】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))により例示されるように、当業界における従来の用法に従って使用される。
【００７４】
抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメント
モノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントは、Frizzled機能及び／又はFrizzled活性化を阻害する能力を有する。阻害は例えば、本明細書に記載される材料及び方法を用いて、決定される。
【００７５】
本発明の典型的な抗体フラグメントは、例えば図１Ｃに示され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされる配列を有するＦａｂフラグメントを包含し、ここで可変Ｌ鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ  Ｌ１又はＶＬ  ＣＤＲ１）はアミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含み、そして可変Ｌ鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ  Ｌ２又はＶＬ  ＣＤＲ２）はアミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するアミノ酸は、E.A. Kabat et al. (Kabat, EA, et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Sendees, US Government Printing Office (1991 )を参照のこと)により定義される通りである。本発明の典型的なモノクローナル抗体は、例えば、図１Ａ及び１Ｂに示されるＬ鎖及びＨ鎖針悦を有する抗体を含む。本発明の典型的なモノクローナル抗体は、図１Ｃに示され、そして図１Ｄに示される配列によりコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せを有する抗体を含み、ここでＣＤＲ  Ｌ１はアミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含み、そしてＣＤＲ  Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含む。他方では、モノクローナル抗体は、それらの抗体又は抗体フラグメントと同じFrissledエピトープに結合する抗体である。
【００７６】
当業者は、抗−Frizzled受容体抗体（例えば、モノクローナル抗体）が、前者が後者のコラーゲンへの結合を防止するかどうかを確認することにより、本発明の抗体又は抗体フラグメントと同じ特異性を有するかどうかを、過度の実験を行うことなく、決定することが可能であることを認識するであろう。本発明のモノクローナル抗体による結合の低下により示されるように、試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競争する場合、それらの２種のモノクローナル抗体は、同じが、又は密接に関連するエピトープに結合する。
【００７７】
モノクローナル抗体が本発明の抗体又は抗体フラグメントの特異性を有するかどうかを決定するための他の方法は、可溶性Frizzled受容体タンパク質と共に、本発明のモノクローナル抗体をプレインキュベートし、そして次に、試験されるモノクローナル抗体が、１又は２以上のFrizzled受容体を結合するその能力において阻害されるかどうかを決定するために、試験されるモノクローナル抗体を添加することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、ほぼ確実に、それは本発明のモノクローナル抗体と同じか、又は機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
【００７８】
モノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントのスクリーニングはまた、例えば１又は２以上のFrizzled受容体と、Ｗｎｔタンパク質リガンドとの間の結合を測定し、そして試験モノクローナル抗体が、Frizzled受容体と、Ｗｎｔタンパク質リガンドとの間の結合を調節し、阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することができるかどうかを決定することにより実施され得る。
【００７９】
当業界内で知られている種々の方法が、１又は２以上のFrizzled受容体、又はその誘導体、フラグメント、類似体、相同体又は直系体（orthologs）に対して向けられたモノクローナル抗体の生成のために使用され得る（例えば、引用により本明細書に組込まれる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1 988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む、Ｌ鎖及びＨ鎖の両鎖の全配列がヒト遺伝子からである抗体である。そのような抗体は、本明細書においては、「ヒト抗体」又は「完全なヒト抗体」と称する。ヒトモノクローナル抗体は、例えば下記に提供される実施例に記載される方法を用いて、調製される。ヒトモノクローナル抗体はまた、トリオーマ技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと）；及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることにより（Cote, et al, 1 983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照のこと）、又はインビトロでエプスタイン・バーウィルスによりヒトＢ−細胞を形質転換することにより（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）、生成され得る。
【００８０】
抗体は、良く知られている技法、例えば主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する、プロテインＡ又はプロテインＧを用いての親和性クロマトグラフィーにより精製される。続いて、又は他方では、求められる免疫グロブリンの標的である特定の抗原又はそのエピトープがカラム上に固定され、免疫親和性クロマトグラフィーにより、免疫特異的抗体が精製される。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により論じられている。
【００８１】
本発明の抗体及びフラグメントは、モノクローナル抗体である。Frizzled受容体活性、発現及び／又はＷｎｔシグナル伝達を調節し、阻止、阻害し、減じ、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉するモノクローナル抗体は、膜結合された及び／又は可溶性Frizzled受容体、例えばネズミ、ラット又はヒトFrizzled受容体又はその免疫原性フラグメント、誘導体又は変異体により動物を免疫化することにより生成される。他方では、動物が、Frizzled受容体をコードする核酸分子を含むベクターによりトランスフェクトされた細胞により免疫化され、ここでベクターが発現され、そしてトランスフェクトされた細胞の表面に結合される。他方では、抗体は、１又は２以上のFrizzled受容体への結合のための抗体又は抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。このライブラリーは、例えば、アセンブリーされたファージ粒子の表面上に発現されるバクテリオファージコートタンパク質、及びファージ粒子内に含まれるコードＤＮＡ配列へのタンパク質又はペプチド融合体（すなわち、「ファージディスプレイライブラリー」）として、バクテリオファージにおいて調製される。次に、骨髄腫／Ｂ細胞融合体に起因するハイブリドーマが、１又は２以上のFrizzled受容体に対する反応性についてスクリーニングされる。
【００８２】
モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ方法、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載される方法を用いて調製される。ハイブリドーマ方法においては、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物が、典型的には、免疫化剤により免疫化され、その免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体を生成するか、又は生成できるリンパ球が誘発される。他方では、リンパ球は、インビトロで、免疫化され得る。
【００８３】
免疫化剤は、典型的には、タンパク質抗原、そのフラグメント、又はその融合タンパク質を含むであろう。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、何れの末梢血リンパ球でも使用されるか、又はヒト哺乳類源が所望される場合、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次に、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、不死化細胞系により融合される（Coding, Monoclonal Antibodies : Principle and Practice. Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞系は通常、形質転換された哺乳類細胞、特に齧歯類、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞が、融合されていない不死化細胞の増殖又は生存を阻害する、１又は２以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地において培養され得る。例えば、親細胞が酵素ピポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の増殖を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう（「ＨＡＴ培地」）。
【００８４】
好ましい不死化細胞系は、効果的に融合し、選択された抗体生成細胞による抗体の安定した高レベル発現を支持し、そして培地、例えばＨＡＴ培地に対して敏感であるそれらの細胞系である。より好ましい不死化細胞系は、Salk Institute Ceil Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得られるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系もまた、モノクローナル抗体の生成のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133 :3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)を参照のこと）。
【００８５】
次に、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地が、抗原に対して指図されるモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱、又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。そのような技法及びアッセイは、当業界においては知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は例えば、Munson and Pollard, Anal Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析により決定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療的適用においては、標的抗原に対して、高い程度の特異性及び高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【００８６】
所望するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが制限希釈方法によりサブクローン化され、そして標準方法により増殖され得る（Coding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice. Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照のきと）。この目的のための適切な培養培地は、例えばダルベッコ変性イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。他方では、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類動物において腹水としてインビボで増殖され得る。
【００８７】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製方法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は親和性クロマトグラフィーにより、培養培地又は腹水から単離されるか、又は精製され得る。
【００８８】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるそれらの方法によっても製造され得る。モノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて（例えば、ネズミ抗体のＨ及びＬ鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離され、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として作用する。単離されるとすぐに、ＤＮＡが発現ベクター中に配置され、次にこれが、宿主細胞、例えば免疫グロブリンタンパク質を生成しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。ＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列の代わりに、ヒトＨ鎖及びＬ鎖不変ドメインのためのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, Nature 368, 812- 13 (1994)を参照のこと）、又は非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列のすべて又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、修飾され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の不変ドメインにより置換され得るか、又は本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインにより置換され、キメラ性二価抗体が創造され得る。
【００８９】
ヒト抗体及び抗体のヒト化
モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、完全ヒト抗体又はヒト化抗体を包含する。それらの抗体は、投与される免疫グロブリンに対してヒトによる免疫反応を係合しないで、ヒトへの投与のために適切である。
【００９０】
抗−Frizzled受容体抗体又はフラグメントは例えば、下記に提供される実施例に記載される方法を用いて生成される。
【００９１】
いくつかの方法においては、抗−Frizzled受容体抗体又はフラグメントは、例えばヒト配列のみを含む抗体を用いるファージディスプレイ方法を用いて開発される。そのようなアプローチは、当業界において、例えば引用により本明細書に組込まれる国際公開第９２／０１０４７号及び米国特許第６，５２１，４０４号において良く知られている。このアプローチにおいては、ランダム対のＬ鎖及びＨ鎖を担持するファージの組合せライブラリーが、天然源又は組換え源のFrizzled受容体又はそのフラグメントを用いてスクリーニングされる。別のアプローチにおいては、抗体又はフラグメントが、少なくとも１つの段階がヒトFrizzled受容体タンパク質により、トランスジェニック非ヒト動物を免疫化することを包含する方法により生成され得る。このアプローチにおいては、この異種非ヒト動物の内因性Ｈ鎖及び／又はκＬ鎖遺伝子座のいくつかが無効にされており、そして抗原に応答して免疫グロブリンをコードする遺伝子を生成するのに必要な再配置することができない。さらに、少なくとも１つのヒトＨ鎖遺伝子座及び少なくとも１つのヒトＬ鎖遺伝子座が動物中に安定してトランスフェクトされた。従って、投与される抗原に応答して、ヒト遺伝子座は、その抗原に対して免疫特異的なヒト可変領域をコードする遺伝子を提供するのに再配置する。従って、免疫化に基づいて、ゼノマウスは、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生成する。
【００９２】
異種非ヒト動物を生成するための種々の技法は、当業界において良く知られている。例えば、引用により、その全体を本明細書に組込まれる米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号を参照のこと。この一般的な方法は、１９９４年に公開されたように、最初のXenoMouse（登録商標）株の生成に関連して実証されている。引用により、その全体を本明細書に組込まれるGreen et al. Nature Genetics 7: 13 -21 ( 1994)を参照のこと。また、米国特許第６，１６２，９６３号、 第６，１５０，５８４号、 第６，１ １４，５９８号、 第６，０７５, １８１号 及び第 ５，９３９，５９８号、及び日本特許第 ３ ０６８ １８０ Ｂ２号、第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号及び第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号 、及び欧州特許第０ ４６３ １５１ Ｂ ｌ 号、及び国際特許出願番号第ＷＯ ９４/０２６０２号、第ＷＯ ９６/３４０９６号、第ＷＯ ９８/２４８９３号、 第ＷＯ ００/７６３１０号、及び関連するファミリーメンバーを参照のこと。
【００９３】
別のアプローチにおいては、「ミニ遺伝子座（minilocus）」が利用されており、ここで外因性Ｉｇ遺伝子座が、Ｉｇ遺伝子座からの断片（個々の遺伝子）の包含を介して模倣されている。従って、１又は２以上のＶＨ遺伝子、１又は２以上のＤH遺伝子、１又は２以上のＪH遺伝子、ｍｕ不変領域及び第二不変領域（このまし句は、γ不変領域）が、動物への挿入のためのコンストラクトに形成される。例えば、米国特許第５，５４５，８０６号; 第５，５４５，８０７号; 第５，５９１，６６９号; 第５，６１２，２０５号; 第５，６２５，８２５号; 第５，６２５，１２６号; 第５，６３３，４２５号; 第５，６４３，７６３号; 第５，６６１，０１６号; 第５，７２１，３６７号; 第５，７７０，４２９号; 第５，７８９，２１５号; 第５，７８９，６５０号; 第５，８１４，３１８号; 第５，８７７, ３９７号; 第５，８７４，２９９号; 第６，０２３，０１０号; 及び 第６，２５５，４５８号; 及び欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂｌ号 ;及び国際特許出願番号第ＷＯ ９２/０３９１８号； 第ＷＯ ９２/２２６４５号；第ＷＯ ９２/２２６４７号； 第ＷＯ ９２/２２６７０号；第ＷＯ ９３/１２２２７号；第ＷＯ ９４/００５６９号；第ＷＯ ９４/２５５８５号； 第ＷＯ ９６/１４４３６号； 第ＷＯ ９７/１３８５２号及び第ＷＯ ９８/２４８８４号及び関連するファミリーメンバーを参照のこと。
【００９４】
微小細胞融合を介して、染色体の大きな断片又は全染色体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成がまた、実証されている。欧州特許出願番号第７７３２８８号及び第８４３９６１号を参照のこと。
【００９５】
ヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が、キメラ又は他方では、ヒト化抗体を調製するために業界を先導して来た。キメラ抗体はヒト不変領域及び免疫可変領域を有するが、特定のヒト抗−キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が特に、抗体の慢性的又は複数回用量利用下で観察されるであろうことが予測される。従って、ＨＡＭＡ又はＨＡＣＡ応答の懸念及び／又は影響を弱めるか又は他方では軽減するために、１又は２以上のFrizzled受容体に対して十分なヒト抗体を提供することが所望される。
【００９６】
低められて免疫原性を有する抗体の生成もまた、適切なライブラリーを用いて、ヒト化、キメラ化及びディスプレイ技法を介して達成される。ネズミ抗体又は他の種からの抗体がまた、当業界において知られている技法を用いて、ヒト化又は霊長類化され得ることは理解されるであろう。例えば、Winter and Harris Immunol Today 14:43 46 ( 1993)及び Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125 -168 (1992)を参照のこと。目的の抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン及び／又は骨格ドメインを、その対応するヒト配列により置換するために組換えＤＮＡ技法により操作され得る（国際公開第９２１０２１９０ 号、及び米国特許第５，５３０，１０１号; 第５，５８５，０８９号; 第５，６９３，７６１号; 第５，６９３，７９２号; 第 ５，７１４，３５０号; 及び 第５，７７７，０８５号を参照のこと）。また、キメラ性免疫グロブリン遺伝子の構成のためへのＩｇ  ｃＤＮＡの使用は、当業界において知られている（Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) 及びJ. Immunol. 139:3521 (1987)）。ｍＲＮＡは、ハイブリドーマ又は抗体を生成する他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを生成するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応により増幅され得る（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号）。他方では、ライブラリーが製造され、そしてスクリーンされ、目的の配列が単離される。次に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列が、ヒト不変域配列に融合される。ヒト不変領域の配列は、Kabat et al. (1991 ) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、既知クローンから容易に利用できる。アイソタイプの選択は、所望するエフェクター機能、例えば補体結合、又は抗体依存性細胞毒性における活性により導かれるであろう。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。ヒトＬ鎖不変領域（κ又はλ）が使用され得る。次に、キメラ性ヒト化抗体は、従来の方法により発現される。
【００９７】
抗体フラグメント、例えばＦｖ，Ｆ（ａｂ′）2及びＦａｂは、例えばプロテアーゼ又は化学的切断による、損なわれていないタンパク質の切断により生成され得る。他方では、切断された遺伝子が企画される。例えば、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子が、Ｈ鎖のＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域、続いて、切断された分子を生成するために、翻訳停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００９８】
Ｈ及びＬ  Ｊ領域のコンセンサス配列は、ヒトＣ領域セグメントへのＶ領域セグメントの続く連結のためにＪ領域中に有用な制限部位を導入するためのプライマーとしての使用のためのオリゴヌクレオチドを企画するために使用され得る。Ｃ領域ｃＤＮＡは、ヒト配列における類似する位置に制限部位を配置するために部位特異的突然変異誘発により修飾され得る。
【００９９】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウィルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソーム及び同様のものを包含する。便利なベクターは、任意のＶＨ又はＶＬ配列が容易に挿入され、そして発現され得るよう操作される適切な制限部位と共に、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。そのようなベクターにおいては、スプライシングが通常、挿入されたＪ領域におけるスプライスドナー部位と、ヒトＣ領域に先行するスプライス受容体部位との間で、及びまた、ヒトＣＨエクソン内に存在するスプライス領域で生じる。ポリアデニル化及び転写停止は、コード領域の下流の天然の染色体部位で生じる。得られるキメラ抗体は、任意の強いプロモーター、例えばレトロウィルスＬＴＲ、例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Okayama et al. Mol. Cell Bio. 3:280 (1983)）、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（Gorman et al. P.N.A.S, 79:6777 (1982)）、及びモロニーマウス白血病ウィルスＬＴＲ（Grosschedl et al. Cell 41 :885 (1985)）に連結され得る。また、理解されるように、天然のＩｇプロモーター及び同様のものが使用され得る。
【０１００】
さらに、ヒト抗体、又は他の種からの抗体は、ディスプレイタイプ技法、例えばファージディスプレイ、レトロウィルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び他の技法（但し、それらだけには限定されない）を通して、当業界において良く知られている技法を用いて生成され得、そして得られる分子は、当業界において良く知られている技術である、追加の成熟、例えば親和性成熟にゆだねられ得る。Wright el al. Crit, Reviews in Immunol 12125-168 (1992)、 Hanes and Pluckthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (リボソームディスプレイ)、Parmley and Smith Gene 73 :305-318 ( 1988) (ファージディスプレイ)、Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21 : 1081- 1085 (1993), Hoganboom et al Immunol Reviews 130:43-68 (1992), Chiswefl and MeCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)及び米国特許第5,733,743号。ディスプレイ技法がヒトでない抗体を生成するために使用される場合、そのような抗体は上記のようにしてヒト化され得る。
【０１０１】
それらの技法を用いて、抗体は、Frizzled受容体−発現細胞、可溶性形の１又は２以上のFrizzled受容体又はその組合せ、そのエピトープ又はペプチド、及び発現ライブラリーに生成され得（例えば、米国特許第５，７０３、０．５７号を参照のこと）、その後、本明細書に記載される活性について、上記のようにしてスクリーンされ得る。
【０１０２】
本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、上記一本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターにより発現され得る。
【０１０３】
それらは、ベクター、リポソーム、裸ＤＮＡ、アジュバント支援ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテル、等を包含することができる。ベクターは、標的化部分（例えば、細胞受容体に対するリガンド）及び核酸結合部分（例えば、ポリリシン）を有する、国際公開第９３／６４７０１号に記載されるような化学的接合体、ウィルスベクター（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡウィルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に対して特異的な抗体）及び核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質である、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０号（国際公開第９５／２２６１８号）に記載されるような融合タンパク質、プラスミド、ファージ、等を包含する。ベクターは、染色体、非染色体性又は合成性であり得る。
【０１０４】
好ましいベクターは、ウィルスベクター、融合タンパク質及び化学的接合体を包含する。レトロウィルスベクターは、モロニーマウス白血病ウィルスを包含する。ＤＮＡウィルスベクターが好ましい。それらのベクターは、ポックスベクター、例えばオルトポックス又はアビポックスベクター、ヘルペスウィルスベクター、例えば単純ヘルペスＩウィルス（ＨＳＶ）ベクター（Gelier, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al, in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. L et al, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 1 149 (1990)を参照のこと）、アデノウィルスベクター（LeGal LaSalle et al, Science, 259:988 (1993); Davidson, et al, Nat. Genet 3:219 (1993): Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)を参照のこと）、及びアデノ関連ウィルスベクター（Kaplitt, M. G. et al, Nat. Genet. 8: 148 ( 1994)を参照のこと）を包含する。
【０１０５】
ポックスウィルスベクターは、遺伝子を、細胞の細胞質に導入する。アビポックスウィルスは、核酸の短期発現のみをもたらす。アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター及び単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を神経細胞中に導入するために好ましい。アデノウィルスベクターは、アデノ関連ウィルス（約４ヶ月）よりも短い期間発現（約２ヶ月）をもたらし、これはＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞及び処理される条件に依存するであろう。導入は、標準技法、例えば感染、トランスフェクション、トランスダクション又は形質転換によってであり得る。遺伝子導入のモードの例は、例えば、裸ＤＮＡ、ＣａＰＯ4沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション及びウィルスベクターを包含する。
【０１０６】
ベクターは、何れか所望の標的細胞を実質的に標的化するために使用され得る。例えば、定位注入が、ベクター（例えば、アデノウィルス、ＨＳＡ）を、所望する位置に向けるために使用され得る。さらに、粒子は、ミニポンプ注入システム、例えばSynchroMed注入システムを用いて、脳室内（ｉｃｖ）注入により送達され得る。対流と呼ばれる、大流動に基く方法はまた、脳の拡張領域への大きな分子の送達で有効であることが分かっており、そして標的細胞へのベクターの送達においても有用である。（Bobo et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91 :2076-2080 ( 1994); Morrison et al, Am. J. Physiol 266:292-305 (1994)を参照のこと）。使用され得る他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内及び皮下注入、及び経口投与又は他の既知投与路を包含する。
【０１０７】
それらのベクターは、種々の方法で使用され得る大量の抗体を発現するために使用され得る。例えば、サンプル中の１又は２以上のFrizzled受容体の存在を検出するのに使用される。抗体はまた、Frizzled受容体関連活性に結合し、そして破壊しようとするためにも使用され得る。
【０１０８】
技法が、本発明の抗原性タンパク質に対して特異的な一本鎖抗体の生成のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法が、タンパク質、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は相同体に対して所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速且つ効果的な同定を可能にする、Ｆａｂ発現ライブラリー（例えば、Huse, et aｌ., 1989 Science 246: 1275-1281を参照のこと）の構成のために適合され得る。タンパク質抗原に対するアイソタイプを含む次のような抗体フラグメントが、当業界において知られている技法により生成されるが、但しそれらだけには限定されない：（ｉ）Ｆ（ａｂ′）2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成され；（ｉｉ）Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され；（ｉｉｉ）Ｆａｂフラグメントは、ペプシン及び還元剤による抗体分子の処理により生成され；そして（ｉｖ）Ｆｖフラグメントは、当業界において知られている技法により生成される。
【０１０９】
本発明はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）2抗体−Frizzled受容体抗体フラグメント、一本鎖抗−Frizzled受容体抗体、二重特異的抗−Frizzled受容体抗体、及びヘテロ接合抗−Frizzled受容体抗体を包含する。
【０１１０】
二重特異的抗体は、少なくとも２種の異なった抗原に対する結合特異性を有する抗体である。本発明の場合、結合特異性の１つは、Frizzled受容体又はFrizzled受容体の組合せに対してである。第２の結合標的は、何れか他の抗原であり、そして好都合には、細胞表面タンパク質又は受容体、又は受容体サブユニットである。
【０１１１】
二重特異的抗体の製造方法は、当業界において知られている。従来、二重特異的抗体の組換え生成は、２種の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の同時発現に基かれ、ここで２種のＨ鎖は異なった特異性を有する（Milstein and Cuelio, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンＨ及びＬ鎖のランダム組合せのために、それらのハイブリドーマ（クワドローマ）は、１０種の異なった抗体分子の可能性ある混合物を生成し、それらのうち、１つのみが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製は通常、親和性クロマトグラフィー工程により達成される。類似する方法は、１９９３年５月１３日に公開された国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al, EMBO I, 10:3655-3659 ( 1991)に開示されている。
【０１１２】
所望する結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン不変ドメイン配列に融合され得る。ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンＨ鎖不変ドメインとの融合体が好ましい。融合体の少なくとも１つに存在するＬ鎖結合のために必要な部位を含む第１Ｈ鎖不変領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖融合体及び所望には、免疫グロブリンＬ鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクター中に挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の生成についてのさらなる詳細については、例えばSures et al, Methods in Enzymology, 121 :210 (1986)を参照のこと。
【０１１３】
国際公開第９６／２７０１１号に記載される別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面が、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大にするよう構築され得る。好ましい界面は、抗体不変ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法においては、第１抗体分子の界面からの１又は２以上のアミノ酸側鎖が、大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）により置換される。大きな側鎖と同一であるか又は類似する相補的「キャビティ（cavities）」が、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）により置換することにより、第二抗体分子の界面上に創造される。これは、他の所望しない最終生成物、例えばホモダマーに対してヘテロダイマーの収量を高めるための機構を提供する。
【０１１４】
二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ′）2二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体の生成のための技法は、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を用いて調製され得る。Brennan et al., Science ２２９：８１（１９８５）は、損なわれていない抗体がＦ（ａｂ′）2フラグメントを生成するためにタンパク質分解的に切断される手順を記載している。それらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を妨げるためにジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次に、生成されるＦａｂ′フラグメントが、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。次に、Ｆａｂ′−ＴＮＢ誘導体の１つが、メルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ′−チオールに再転換され、そして等モル量の他のＦａｂ′−ＴＮＢ誘導体と共に混合され、二重特異的抗体が形成される。生成される二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための剤として使用され得る。
【０１１５】
さらに、ＦＡｂ′フラグメントは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接、回収され、そして二重特異的抗体を形成するために、化学的にカップリングされ得る。Shaiaby et al., J. Exp. Med, 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ′）2分子の生成を記載している。各Ｆａｂ′フラグメントは、Ｅ．コリから別々に分泌され、そして二重特異的抗体を形成するために、インビトロで指図された化学的カップリングにゆだねられた。このようにして形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２受容体及び正常ヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合することができ、そしてヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１１６】
組換え細胞培養物から直接的に、二重特異的抗体フラグメントを製造し、そして単離するための種々の技法がまた記載されている。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成されて来た（Kostelny et al., J. Immunol 148(5): 1547-1553 (1992)）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２種の異なった抗体のＦａｂ部分に連結された。抗体穂もダイマーが、モノマーを形成するために、ヒンジ領域で還元され、そして次に、抗体へテロダイマーを形成するために、再酸化された。この方法はまた、抗体ホモダイマーの生成のためにも利用され得る。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載される「ダイアボディー（diabody）」技法は、二重特異的抗体フラグメントを製造するための別の機構を提供して来た。このフラグメントは、同じ鎖上の２種のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより、Ｌ鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されるＨ鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成され、それにより、２種の抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異的フラグメントの別の製造方法がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１１７】
複数の原子価を有する抗体が企画される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
【０１１８】
典型的な二重特異的抗体は、２種の異なったエピトープに結合することができ、少なくともその１つは、本発明のタンパク質抗原に起因する。他方では、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームが、特定抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中するよう、白血球上のトリガー分子、例えばＴ−細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）、ＩｇＧのためのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃｙＲＩ （ＣＤ６４）、 ＦｃｙＲＩＩ （ＣＤ３２） 及び ＦｃｙＲＩＨ （ＣＤ １６）に結合するアームとも組合わされ得る。二重特異的抗体はまた、特定抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を導くために使用され得る。それらの抗体は、抗原結合アーム、及び細胞毒性剤、又は放射性核腫キレート剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡを結合するアームを有する。別の目的の二重特異的抗体は、本明細書に記載されるタンパク質抗原を結合し、そしてさらに、組織因子（ＴＦ）を結合する。
【０１１９】
ヘテロ接合抗体はまた、本発明の範囲内にある。ヘテロ接合抗体は、２種の共有結合された抗体から構成される。例えば、そのような抗体は、所望しない細胞に免疫系細胞を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）、及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号；第９２／２００３７３号；欧州特許第０３０８９号を参照のこと）、提案されて来た。合成タンパク質化学においては公知の方法、例えば架橋剤を包含するそれらの方法を用いて、インビトロで調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒性は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することにより構成され得る。このための適切な試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート及び米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるそれらを包含する。
【０１２０】
異常Frizzled受容体活性化及び／又は活性に関連する疾患及び障害の治療における抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが所望される。例えば、システイン残基がＦｃ領域中に導入され、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にされる。このようにして生成されたヘテロダイマー抗体は、改善された内在化能力及び／又は高められた補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する。（Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) 及び Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと）。他方では、二重Ｆｃ領域を有し、そしてそれにより、増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有することができる抗体が、構築され得る。（Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照のこと）。
【０１２１】
本発明はまた、細胞毒性剤、例えばトキシン（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性トキシン、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（すなわち、放射性接合体）に接合される抗体を含む免疫接合体にも関する。
【０１２２】
使用され得る酵素的活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰII及びＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤー（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロトン、サポナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種が放射性接合された抗体の生成のために利用できる。例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、及び186Ｒｅを挙げることができる。
【０１２３】
抗体及び細胞毒性剤の接合体は、種々の二官能タンパク質−カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス(p−アジドベンゾイル) ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（p−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）を用いて製造される。例えば、リシン免疫毒素がVitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載のようにして調製され得る。14Ｃ−標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の接合のための典型的なキレート剤である。（国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。
【０１２４】
当業者は、多くの種類の可能性ある部分が、得られる抗体及びその抗原結合フラグメントにカップリングされ得ることを認識するであろう（例えば、“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと、この全内容は、引用により本明細書に組込まれる）。
【０１２５】
カップリングは、抗体及び他の部分がそれらのそれぞれの活性をできるだけ長く保持するよう、２つの分子を結合するであろう任意の化学反応により達成される。この結合は、多くの化学機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合及び錯体形成を包含することができる。しかしながら、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的縮合により又は外部架橋分子の取り組みにより達成され得る。多くの二価又は多価結合剤が、タンパク質分子、例えば本発明の抗体を、他の分子にカップリングすることにおいて有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを包含することができる。この列挙は、当業界において知られている種々の種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である。（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 及び Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。
【０１２６】
好ましいリンカーは、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体にカップリングされる、ハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照のこと。特に適切なリンカーは、次のものを包含する：（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩；ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Pierce Chem. Co., カタログ番号(21558G)）；（ii）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. カタログ番号21651G）；（iii）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート(Pierce Chem. Co., カタログ番号 #216510)；（iv）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］−ヘキサノエート（Pierce Chem. Co. カタログ番号2165-G）；及び（ｖ）ＥＤＣに接合されるスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド）（Pierce Chem. Co., カタログ番号#24510）。
【０１２７】
上記に記載されるリンカーは、異なった属性を有する成分を含み、従って、異なった物理−化学性質を有する接合体を導く。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ−ＮＨＳエステルよりも、より安定性である。ＮＨＳ−エステル含有リンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも低い安定性である。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体的ヒンダードジスルフィド結合を含み、そして増強された安定性を有する接合体を形成することができる。ジスルフィド結合は一般的に、ジスルフィド結合はインビトロでも切断され、低い利用可能な接合体をもたらすので、他の結合よりも低い安定性である。スルホ−ＮＨＳは特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強することができる。カルボジイミドカップリング（例えば、ＥＤＣ）は、スルホ−ＮＨＳと組合して使用される場合、カルボジイミドカップリング反応のみよりも、加水分解に対してより耐性であるエステルを形成する。
【０１２８】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界において知られている方法、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号 及び米国特許第4,544,545号に記載される方法により調製される。向上された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１２９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発方法により生成され得る。リポソームは、所望する直径を有するリポソームを生成するために、定義された孔サイズのフィルターを通して押出される。本発明の抗体のＦａｂ′フラグメントは、ジスルフィド−交換反応を介して、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるリポソームに結合され得る。
【０１３０】
Frizzled受容体に対する抗体の使用
本発明に従っての治療実態の投与が、改善された伝達、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されるであろうことは理解されるであろう。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に知られている処方に見出され得る：Blaug, Seymour による、Remington’s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), 特に 、Chapter 87。それらの製剤は例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン又はアニオン性）含有小胞（例えば、リポフェクチン（登録商標））、ＤＮＡ接合体、無水吸収性ペースト、水中油及び油中水エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及び半固体混合物含有カーボワックスを包含する。前述の混合物の何れでも、本発明に従っての治療及び療法において適切であるが、但し、製剤中の活性成分は、製剤により不活性化されず、そして製剤は投与経路と生理学的に適合し、且つ許容できるべきである。また、薬剤師に良く知られている、製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報については、またBaldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)及びこそこにおける引用文献を参照のこと。
【０１３１】
１つの実施形態によれば、本発明のモノクローナル抗体を含む、抗体及びその抗原結合フラグメントは、治療剤として使用され得る。そのような剤は一般的に、対象における異常Frizzled受容体活性及び／又は活性化に関連する疾患又は病状を診断し、予後し、モニターし、治療し、緩和し、そして／又は防止するために使用されるであろう。治療法は、標準方法を用いて、異常Frizzled受容体活性に関連する疾患又は障害、例えば癌又は炎症障害を有する（又は発症する危険性がある）対象、例えばヒト患者を同定することにより実施される。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性及び親和性を有する製剤が対象に投与され、そして一般的に、標的とのその結合により影響を及ぼすであろう。抗体の投与は、標的（例えば、１又は２以上のFrizzled受容体）の機能を抑制するか、阻害するか、又は干渉することができる。抗体の投与は、天然において結合する内因性リガンド（例えば、コラーゲン）による標的（例えば、１又は２以上のFrizzled受容体）の結合を抑制し、阻害し又は干渉することができる。抗体の投与は、１又は２以上のFrizzled受容体の１又は２以上の生物学的活性を調節し、阻止し、阻害し、減じ、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することができる。
【０１３２】
異常Frizzled受容体活性、活性化、発現及び／又はＷｎｔシグナル伝達に関連する疾患又は障害は、癌及び炎症性障害を包含する。
【０１３３】
治療的有効量の本発明の抗体とは、一般的に、治療目的を達成するのに必要な量に関する。上述のように、これは、抗体と、特定の場合、標的の機能を妨害するその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与される必要がある量は、さらに、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、そしてまた、投与される抗体が、それが投与される他の対象の自由体積から枯渇される速度に依存するであろう。本発明の抗体又は抗体フラグメントの治療的有効用量の通常の範囲は、非制限的例によれば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与頻度は例えば、週２度〜週１度であり得る。
【０１３４】
治療の有効性は、特定の癌及び／又は炎症関連障害を診断するか又は治療するための何れか既知の方法に対応して決定される。癌及び／又は炎症関連障害の１又は２以上の症状の軽減は、抗体が臨床的有益性を与えることを示唆する。
【０１３５】
所望する特異性を有する抗体のスクリーニング方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当技術分野で知られている他の免疫学的媒介技術を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１３６】
別の実施形態によれば、１又は２以上のFrizzled受容体に対して向けられる抗体及びフラグメントは、１又は２以上のFrizzled受容体の局在化及び／又は定量化に関して当核分野で公知の方法に（例えば、適切な生理学的サンプル内の１又は２以上のFrizzled受容体のレベルの測定への使用のために、診断方法への使用のために、タンパク質のイメージングへの使用のために、及び同様のために）、使用され得る。所定の実施形態によれば、１又は２以上のFrizzled受容体に対して特異的な抗体、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は相同体（抗体由来の抗原結合ドメインを含む）は、薬理学的活性化合物（この後、「治療薬」とも称する）として利用される。
【０１３７】
別の実施形態によれば、１又は２以上のFrizzled受容体に対して特異的な抗体又はフラグメントは、標準技法、例えば免疫親和性、クロマトグラフィー又は免疫沈澱により、Frizzled受容体ペプチドを単離するために使用され得る。１又は２以上のFrizzled受容体に対して向けられた抗体（又はそのフラグメント）は、所定の治療計画の効率を決定するために、臨床学的試験手順の一部として組織におけるタンパク質レベルをモニターするために、診断的に使用される。検出は、検出可能物質への抗体のカップリング（すなわち、物理的結合）により促進され得る。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子族複合体、蛍光物質、発光物質、発光物質、及び放射性物質を包含する。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを包含し；適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジンアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを包含し；発光物質の例は、ルミノールを包含し；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを包含し；そして適切な放射性物質の例は、125Ｉ、131Ｉ，35Ｓは又は3Ｈを包含する。
【０１３８】
さらなる別の実施形態によれば、複数の標的を指図された多重特異的抗体及び/又は多重特異的活性化可能抗体は、サンプルにおける１又は２以上の標的（又はそのフラグメント）の存在を検出するための剤として使用され得る。いくつかの実施形態によれば、前記抗体は、検出可能標識を含む。抗体はポリクローナル又はいくつかの実施形態によれば、モノクローナルである。損なわれていない抗体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、又はＦ（ａｂ）2）が使用される。プローブ又は抗体に関しての用語「標識された」とは、プローブ又は抗体に検出可能物質をカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブ又は抗体の直接的標識化、及び直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識化を包含することが意図される。関接的標識化の例は、蛍光標識された二次抗体を用いての一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプタビジンにより検出され得るよう、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識化を包含する。用語「生物学的サンプル」とは、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体を包含することが意図される。従って、血液、及び血液の画分又は成分、例えば血清、血漿又はリンパは、用語「生物学的サンプル」の使用法内に含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロで及びインビボで生物学的サンプルにおける分析物ｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、分析物ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技法は、ノーザンハイブリダイゼーション及び現場ハイブリダイゼーションを包含する。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスターンプロット、免疫沈降、及び免疫蛍光を包含する。ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技法は、サザンハイブリダイゼーションを包含する。イムノアッセイを行うための手順は、例えば“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996;及び“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載される。さらに、分析タンパク質の検出のためのインビボ技法は、標識された抗−分析タンパク質抗体を、対象中に導入することを包含する。例えば、抗体は、対象におけるその存在及び位置が標準のイメージング技法により検出され得る放射性マーカーにより標識され得る。
【０１３９】
抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントの治療投与及び製剤化
本発明の抗体（また、本明細書においては、「活性化合物」と称する）、及びその誘導体、フラグメント、類似体及び相同体が、投与のために適切な医薬組成物中に組込まれ得る。そのような組成物の調製に包含される原理及び考慮、並びに成分の選択の手引きは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994;及び Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０１４０】
そのような組成物は典型的には、前記抗体、及び医薬的に許容できる担体を含む。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合する最小阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子が企画され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成され得、そして／又は組換えＤＮＡ技法により生成され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、用語「医薬的に許容できる担体（pharmaceutically acceptable carrier）」とは、医薬投与と適合できる、何れか及びすべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び同様のものを含むことが意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組込まれる、この分解においては標準的参考テキストであるRemington’s Pharmaceutical Scienceの最新版に記載される。そのような担体又は希釈剤の適切な例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。リポソーム及び非水性媒体、例えば固定油がまた使用され得る。医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、当業界においては良く知られている。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物へのその使用が企画される。
【０１４２】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌であるべきである、これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるよう製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を包含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒; 抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン; 酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、硝酸塩又はリン酸塩、及び張性の調整のための薬、例えば塩化ナトリウム及びデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス又はプラスチックから製造される複数回投与バイアルに封入され得る。
【０１４４】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性）又は分散液、及び無菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）(BASF, Parsippany, N.J.)、又はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を包含する。すべての場合、組成物は、容易な注射針通過まで無菌で且つ流体であるべきである。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定すべきであり、そして微生物、例えば細菌及び菌類の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば水エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール及び同様のもの）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばコーチング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含むことが適切であろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
【０１４５】
無菌注射用溶液は、適切な溶媒中、必要とされる量での活性成分を、上記に列挙される成分の１つ又は組み合わせと共に組込むことにより、必要な場合、続いて、濾過減菌により調整され得る。一般的に、分散液は、基本的分散媒及び上記の列挙されるそれらからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を組込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分及びその前もって減菌濾過された溶液からの任意の追加の所望する成分を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１４６】
経口組成物は一般的に不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮され得る。経口治療投与のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用される。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用のための液体担体を用いて調製され得、ここで液体担体中の化合物は、経口適用され、そしてスウィッシュされ、そして吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬的に適合できる結合剤、及び／又はアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分の何れか、又は類似する性質の化合物を含むことができる：結合剤、例えば微晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はSterotes；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料。
【０１４７】
吸入による投与のためには、化合物は、適切な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧された容器又はディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾル噴霧の形で送達される。
【０１４８】
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであっても良い。経粘膜又は経皮投与のためには、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般的に当業界において知られており、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー又は坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当業界において一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル又はクリーム中に配合される。
【０１４９】
化合物はまた、直腸送達のために、坐剤（例えば、従来の製剤基材、例えばココアバター及び他のグリセリドを含む）又は保持浣腸の形で調製され得る。
【０１５０】
１つの実施形態によれば、活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体、例えば持続／制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムを用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。
【０１５１】
例えば、活性成分は、例えばコアセルベーション技法により、又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマイクロエマルジョン中、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入され得る。
【０１５２】
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここで前記マトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタノートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−クリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能マイクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸は１００日間にわたって分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。
【０１５３】
材料はまた、Alza Corporation 及びNova Pharmaceuticals, Incから市販されている。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染された細胞に標的化されたリポソームを含む）がまた、医薬的に許容される担体として使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
【０１５４】
投与の容易性及び投与量の均一性のための単位剤形で経口又は非経口組成物を製剤化することが特に好都合である。単位剤形とは、本明細書において使用される場合、治療される対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望する治療効果を生成するよう計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物のユニーク特徴及び達成されるべき特定の治療効果、及び個体の治療のためのそのような活性化合物を配合する技術的に固有の制限により決定され、そしてそれらに直接的に依存する。
【０１５５】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含まれる。
【０１５６】
製剤はまた、治療される特定の徴候のために必要な場合、お互い悪影響を与えない補完的活性を有する、複数の活性化合物を含むことができる。他方では、又はさらに、組成物は、その機能を増強する剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含むことができる。そのような分子は、意図される目的のために効果的である量で、組み合わせて適切に存在する。
【０１５７】
１つの実施形態によれば、活性化合物は、併用治療で投与され、すなわち病理学的状態又は障害、例えば自己免疫疾患及び炎症疾患の治療のために有用である他の剤と組合される。用語「組合して（comination in）」とは、剤が実質的に同時に、すなわち同時に又は連続的に与えられることを意味する。連続的に与えられる場合、第２化合物の投与の開始で、２種の化合物のうち第１の化合物は、治療の部位で、効果的濃度でまだ検出できる。
【０１５８】
例えば、併用療法は、１又は２以上の追加の治療剤、例えば下記により詳細に記載されるように、１又は２以上のサイトカイン及び成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、抗−腫瘍剤、及び/又は細胞毒性又は細胞増殖抑制剤と共に同時製剤化され、そして／又は同時投与される１又は２以上の抗体及びその抗原結合フラグメントを含むことができる。そのような併用治療法は、好都合には、低い用量の投与される治療剤を利用し、従って、種々の単独療法に関連する可能な毒性又は合併症を回避する。
【０１５９】
本発明の抗体と組合して使用される好ましい治療剤は、炎症応答における異なった段階で干渉するそれらの剤である。１つの実施形態によれば、本明細書に記載される１又は２以上の抗体は、以下のものと同時製剤化され、そして／又は同時投与され得る：１又は２以上の追加の剤、例えば他のサイトカイン又は成長因子アンタゴニスト（例えば、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合体）；又は他の標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、他のサイトカイン又は成長因子、又は他の細胞表面因子に結合する抗体）；及び抗−炎症性サイトカイン、又はそのアゴニスト。
【０１６０】
他の治療剤の企画及び生成
本発明によれば、及びFrizzled受容体に関して、本明細書において生成され、そして特徴づけられる抗体の活性に基いて、抗体部分を越えたほかの治療様式の企画が促進される。そのような様式は、光度な抗体治療薬、例えば二重特異的抗体、免疫毒性、及び放射性標識された治療薬、ペプチド治療薬の生成、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス治療薬及び小分子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６１】
例えば、二重特異的抗体に関連して、次のものを含む二重特異的抗体が生成され得る：（ｉ）２種の抗体−１つは、１又は２以上のFrizzled受容体に対して特異性を有し、そして別の１つは、一緒に接合される第２分子に対して特異性を有し、（ii）１又は２以上のFrizzled受容体に対して特異的な１つの鎖、及び第２分子に対して特異的な第２鎖を有する単一抗体、又は（iii）１又は２以上のFrizzled受容体及び第２分子に対する特異性を有する単一鎖抗体。そのような二重特異的抗体は、良く知られている技法を用いて生成される。（i）及び（iii）に関連しては、例えばFanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) 及び Wright et al. Grit, Reviews in Immunol 12125-168 ( 1992)を、及び（iii）に関連しては、例えばTraunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)を参照のこと。
【０１６２】
免疫毒性に関連して、抗体は、当業界において良く知られている技法を用いて、免疫毒素として作用するよう修飾され得る。例えば、Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)を参照のこと。米国特許第５，１９４，４９４号も参照のこと。放射性標識された抗体の調製に関連して、そのような修飾された抗体はまた、当業界において良く知られている技法を用いて、容易に調製され得る。例えば、Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))を参照のこと。また、米国特許第４，６８１，５８１号、 第４，７３５，２１０号, 第５, １０１，８２７号, 第５, １０２，９９０号(ＲＥ ３５，５００), 第５，６４８，４７１号及び 第５，６９７，９０２号も参照のこと。各免疫毒素及び放射標識された分子は、１又は２以上のFrizzled受容体を発現する細胞を死滅する可能性が高いであろう。
【０１６３】
治療用ペプチドの生成に関しては、１又は２以上のFrizzled受容体及びそれに対する抗体、例えば抗体及びその抗原結合フラグメント、又はペプチドライブラリーのスクリーニングに関連する構造的情報を利用して、１又は２以上のFrizzled受容体に対して向けられる治療用ペプチドが生成され得る。ペプチド治療薬の企画及びスクリーニングは、Houghten et al. Bioiechniques 13:412-421 ( 1992), Houghten PNAS USA 82:5131 -5135 (1985), Pinalla et al. Bioiechniques 13:901-905 ( 1992), Blake and Litzi -Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)により論じられている。免疫毒素及び放射性標識された分子もまた、抗体に関連して上記に論じられたようにペプチド部分に関連して、類似する態様で調製され得る。Frizzled受容体分子（又は、形式、例えばスプライス変異体又は別の形式）が疾患工程下で機能的に活性であると仮定すると、従来の技法を通して、遺伝子及びアンチセンス治療剤を企画することがまた可能であろう。そのような様式は、１又は２以上のFrizzled受容体の機能を調節するために利用され得る。それに関連して、本発明の抗体は、それに関連する機能的アッセイの企画及び使用を促進する。アンチセンス治療薬についての企画及び戦略が、国際特許出願番号ＷＯ９４／２９４４４号に、詳細に論じられてる。遺伝子療法についての企画及び戦略は良く知られている。しかしながら、特に、細胞内抗体を包含する遺伝子治療技法の使用は、特に好都合であることが分かっている。例えばChen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) 及び Marasco Gene Therapy 4: 11-15 (1997)を参照のこと。遺伝子療法に関する一般的企画及び考慮もまた、国際特許出願番号ＷＯ９７／３８１３７号に論じられている。
【０１６４】
１又は２以上の標的化Frizzled受容体分子の構造、及び本発明の他の分子、例えば抗体及びその抗原結合フラグメント、及び他のものとのその／それらの相互作用から収集される知識は、追加の治療様式を合理的に企画するために利用され得る。これに関して、合理的薬物企画技法、例えばＸ−線結晶学、コンピューター支援（又は助力）分子モデリング（ＣＡＭＭ）、定量的又は定性的構造活性相関（ＱＳＡＲ）及び類似する技法が、創薬の努力を集中するために利用され得る。合理的企画は、１又は２以上のFrizzled受容体の活性を修飾するか又は調節するために使用され得る分子又はその特定形と相互作用することができるタンパク質又は合成構造体の予測を可能にする。そのような構造体は、化学的に合成され得るか、又は生物系において発現され得る。このアプローチは、Capsey el al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drags (Stockton Press, NY (1988)に再考されている。さらに、組合せライブラリーが企画され、そして合成され、そしてスクリーニングプログラム、例えば高出力スクリーニング取り組みに使用され得る。
【０１６５】
スクリーニング方法
本発明は、１又は２以上のFrizzled受容体のＷｎｔタンパク質リガンドへの結合、及び／又はFrizzled活性化を調節するか、又は他方では干渉するモジュレーター、すなわち候補体又は試験化合物又は剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣体又は他の薬物）、又はＷｎｔシグナル伝達機能を調節するか又は他方では、干渉する候補体又は試験化合物又は剤を同定するための方法（また、本明細書においては、「スクリーニング  アッセイ」とも称する）を提供する。異常Frizzled受容体活性、活性化、発現及び／又はリン酸化に関連する障害を治療するのに有用な化合物を同定するための方法もまた提供される。本発明はまた、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物も包含する。
【０１６６】
１つの実施形態によれば、本発明は、１又は２以上のFrizzled受容体の機能を調節する候補体又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当業界において知られている以下の組合せライブラリー方法における多くのアプローチの何れかを用いて得られる：生物学的ライブラリー；空間的アドレス可能な平行固相又は溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「ワン−ビーズワン−化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー方法；及び親和性クロマトグラフィー選択を用いての合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーを制限するが、ところが他の４種のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用できる（例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照のこと）。
【０１６７】
「小分子（small molecule）」とは、本明細書において使用される場合、約５ｋＤ以下及び最も好ましくは、約４ｋＤ以下の分子量を有する組成物を意味する。小分子は、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質又は他の有機又は無機分子であり得る。化学的及び／又は生物学的混合物、例えば菌類、細菌又は藻類抽出物のライブラリーは、当業界においては知られており、そして本発明のアッセイの何れかによりスクリーニングされ得る。
【０１６８】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当業界において、例えばDeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb, et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 1 1422; Zuckermann, et al, 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261 : 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Tnt. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 ; 及びGallop, et al, 1994. J. Med. Chem. 37: 1233に見出され得る。
【０１６９】
化合物のライブラリーは、溶液に (例えばHoughten, 1992. Biotechniques 13: 412-421を参照のこと)、又はビーズ状に (Lam, 1991. Nature 354: 82.-84を参照のこと)、チップ上に(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556を参照のこと)、細菌 (米国特許第 ５，２２３，４０９号を参照のこと)、胞子 (米国特許第５，２３３，４０９号を参照のこと)、 プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869を参照のこと)又はファージ上に(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382: Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301 -310; 及び米国特許第５，２３３，４０９号を参照のこと)に存在することができる。
【０１７０】
１つの実施形態によれば、候補体化合物は、抗体−抗原複合体に導入され、そして候補体化合物が抗体−抗原複合体を破壊するかどうかを決定し、ここでこの複合体の破壊が、候補体化合物が１又は２以上のFrizzled受容体の機能、及び／又は１又は２以上のFrizzled受容体と、Ｗｎｔタンパク質リガントとの間の相互作用を調節することを示唆する。
【０１７１】
抗体−抗原複合体に干渉するか又は破壊する試験化合物の能力の決定は、例えば試験化合物を、放射性同位体又は酵素標識によりカップリングすることにより達成され得、結果的に、抗原又はその生物学的活性部分への試験化合物の結合が複合体における標識された化合物を検出することにより決定され得る。例えば、試験化合物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は3Ｈにより、直接的に又は間接的に標識され得、そして放射性同位体が電波放射の直接的計数により、又はシミュレーション計数により検出され得る。他方では、試験化合物は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼにより酵素的に標識され、そして酵素標識は、適切な基質の生成物への転換の決定により検出され得る。
【０１７２】
１つの実施形態によれば、アッセイは、抗体−抗原複合体と試験化合物とを接触し、そして抗原と相互作用するか又は他方では、既存の抗体−抗原複合体を破壊する試験化合物の能力を決定することを包含する。この実施形態によれば、抗原と相互作用し、そして／又は抗体−抗原複合体を破壊する試験化合物の能力の決定は、抗体に比較して、抗原又はその生物学的活性部分に選択的に結合する試験化合物の能力の決定を包含する。
【０１７３】
別の実施形態によれば、アッセイは、抗体−抗原複合体と試験化合物とを接触し、そして抗体−抗原複合体を調節する試験化合物の能力を決定することを包含する。抗体―抗原複合体を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば試験化合物の存在下で、抗体に結合するか又は抗体と相互作用する抗原の能力を決定することにより達成され得る。
【０１７４】
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、細胞に基づくアッセイ又は無細胞アッセイとして実施され得る。本発明の無細胞アッセイは、１又は２以上のFrizzled受容体及びそのフラグメントの可溶形又は膜結合形の何れかの使用に適している。膜結合形の１又は２以上のFrizzled受容体を含む無細胞アッセイの場合、膜結合形のタンパク質が溶液に維持されるよう溶解剤を用いることが所望される。そのような溶解剤の例は、非イオン性界面活性剤、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Triton（登録商標）Ｘ−１００、Triton（登録商標）Ｘ−１１４、Thesit（登録商標）、イソトリデシル（エチレングリコールエーテル）n、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）を包含する。
【０１７５】
複数の実施形態によれば、候補体化合物の導入に続いて、１又は両非複合形からの複合形の分離を促進し、そしてアッセイの自動化に対応するよう、抗体又は抗原の何れかを固定することが所望される。候補体化合物の存在及び不在下で抗体−抗原複合体の観察が、反応体を含むために適切な何れかの容器においてなされる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管及びマイクロ遠心分離管を包含する。１つの実施形態によれば、１又は両タンパク質のマトリックスへの結合を可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供される。例えば、ＧＳＴ−抗体融合タンパク質又はＧＳＴ−抗原融合タンパク質が、グルタチオンセファロースビース（Sigma Chemical, St. Louis, MO）又はグルタチオン誘導されたマイクロタイタープレート上に吸着され、次に、試験化合物と共に組合わされ、そしてその混合物が、複合体形成を誘導する条件下で（例えば、塩及びｐＨのための生理学的条件下で）インキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルが洗浄され、任意の末結合化合物が除去され、ビーズの場合、マトリックスが固定され、複合体が直接的に又は間接的に決定される。他方では、複合体は、マトリックスから解離され、そして抗体−抗原複合体形成のレベルが、標準技法を用いて決定され得る。
【０１７６】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技法もまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用され得る。例えば、抗体（例えば、本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメント）又は抗原（例えば、１又は２以上のFrizzled受容体）の何れかが、ビオチン及びストレプタビジンの接合を利用して固定され得る。ビオチニル化された抗体又は抗原分子が、当業界において良く知られている技法（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, III.）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、そしてストレプタビジン被覆された９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定され得る。他方では、目的の抗体又は抗原と反応性であるが、しかし目的の抗体−抗原複合体の形成に干渉しない他の抗体が、プレートのウェルに誘導体化され、そして末結合抗体又は抗原が抗体接合によりウェルに捕捉される。そのような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ−固定複合体についての上記それらの方法の他に、抗体又は抗原と反応性のそのような他の抗体を用いての複合体の免疫検出を包含する。
【０１７７】
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイの何れかにより同定される新規剤、及び本明細書に記載されるような治療のためへのその使用にも関する。
【０１７８】
診断及び予防製剤
本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、診断及び予防製剤に使用される。１つの実施形態によれば、本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、１又は２以上の前述の疾患、例えば癌及び/又は炎症性疾患を発症する危険性がある患者に投与される。１又は２以上の障害に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的または生化学マーカーを用いて決定され得る。
【０１７９】
抗体及びその抗原結合フラグメントはまた、患者サンプルにおける１又は２以上のFrizzled受容体の検出においても有用であり、そして従って、診断剤としても有用である。例えば本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、患者サンプルにおけるFrizzled受容体レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用され得る。
【０１８０】
１つの実施形態によれば、本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントは、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された抗体は、試験サンプルに存在することができる任意のFrizzled受容体のための捕捉抗体として作用する。固定された抗体と患者サンプルとの接触の前、固体支持体は、分析物の非特異的吸着を妨げるために、ブロッキング剤、例えば乳タンパク質により洗浄され、そして処理される。
【０１８１】
続いて、ウェルが、抗原を含む疑いのある試験サンプルにより、又は標準量の抗原を含む溶液により処理される。そのようなサンプルは、例えば病理診断であると思われる循環抗原のレベルを有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準を洗い流した後、固体支持体が、検出的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中のFrizzled受容体抗原の濃度が、標準サンプルから開発される標準曲線との比較により決定される。
【０１８２】
インビトロ診断アッセイにおいて本発明の抗−Frizzled受容体抗体及びフラグメントを用いて得られる結果に基づいて、Frizzled受容体抗原の発現レベルに基づいて患者における疾患（例えば、癌又は炎症性疾患に関連する臨床学的指標）を分類することが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関して、血液サンプルが、疾患の進行での種々の段階で、及び／又は、疾患の治療処理における種々の点で、診断される対象から採取される。進行又は治療の各段階のために統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階で特徴的であると思われる抗原の濃度範囲が指定される。
【０１８３】
本明細書において引用されるすべての出版物及び特許文献は、そのような各出版物又は文書が具体的且つ個別に参照により本明細書に組込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組込まれる。出版物及び特許文献の引用は、何れか関連先行技術であり、それが内容又は日付に関する承認を構成するものではありません。本発明は現在、書面による説明により記載されて来たが、当業者は、本発明が様々な実施形態され得、そして前述の記載及び下記実施例が例示の目的であって、特許請求の範囲を制限するものではないことを理解するであろう。
【実施例】
【０１８４】
実施される実験及び得られる結果を包含する次の実施例は、単なる例示目的であって、本発明を制限するものではない。
【０１８５】
実施例１：材料及び方法
ファージディスプレイ選択：ファージディスプレイ選択を、Sachdev S. Sidhu and Frederic A, FeHouse. "Synthetic therapeutic antibodies." Nat Chern Biol. 2(12)(2006):682-8により記載される手順に従って、組換えヒトＦＺＤ７細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Systems）に対して実施した。
【０１８６】
Ｆａｂ発現及び精製：ＩＰＴＧ−誘発性発現プラスミドを、ＢＬ２１細菌細胞におけるＦａｂの生成のために使用した。手短には、２５ｍｌの一晩の細菌培養物を、１Ｌの２ＹＴ培地に戻し希釈した。Ｏ．Ｄ＝１で、細胞を、１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧにより誘発した。４時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離により集め、そしてペレットを−２０℃で凍結した。次の日、ペレットを、４０ｍｌの溶解緩衝液（１％ Triton X-100、 ２ ｍＭ のＭｇＣｌ2、０．２ ｍＭ のＰＭＳＦ、０．１％ （ｗ/ｖ）リゾチーム及びlμl のベンゾナーゼ(２．５ Ｕ/ｍｌ)）に、溶解の前、４℃で１時間、再懸濁した。Ｆａｂ含有上清液を、１１０００ＲＰＭでの４５分間の遠心分離により細胞残骸から分離した。Ｆａｂを、４０ｍｌのＦａｂ溶液当たり１ｍｌのビーズ体積を用いて、セファロースＡビーズにより４℃で１時間、捕捉した。ビーズを２５ｍｌのカラム（Ｂｉｏｒａｄ）に集め、続いて、３×１０ｍｌのＰＢＳにより洗浄した。Ｆａｂを、８ｍｌの溶離緩衝液（５０ｍＭ の ＮａＨ2ＰＯ4 、ｌＯＯｍＭの Ｈ3ＰＯ4、１４０ｍＭ のＮａＣｌ、 ｐＨ ２．８）により溶出し、そして２００ｍＭの最終濃度で、トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０により中和した。ＰＢＳ緩衝液交換を、標準透析を用いて行った。
【０１８７】
ＩｇＧ発現及び精製：ＩｇＧを、２９３Ｆ細胞において発現し、そして従来の方法に従ってならし培地から精製した。手短には、Ｌ鎖又はＨ鎖をコードする、等量のＤＮＡコンストラクトを、２９３Ｆ細胞中に同時トランスフェクトした。細胞培養ならし培地を、トランスフェクションの１２０−１４５時間後、収穫した。適切な量のプロテインＡビーズを、ならし培地に添加し、そして室温で１−２時間、混合した。上背液を除き、そしてビーズを、ＰＢＳにより３度、洗浄し、そして次に、ＩｇＧを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）により溶出し、そして中和緩衝液（１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）により中和した。次に、精製されたＩｇＧを透析し、そして緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１８８】
ＥＬＩＳＡアッセイ：Ｆａｂの結合を、１００ｎＭのＦＺＤ７抗原及びＦｃ対照タンパク質を、ＲＴで１時間、固定し、続いて、６０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ溶液中、１時間のブロッキング行程により評価した（詳細には、Sachdev S. Sidhu and Frederic A. Feliouse. "Synthetic therapeutic antibodies." Nat Chem Biol. 2( 12)(2006):682-8を参照のこと）。ブロッキングの後、１００ｎＭのＦａｂを、各細胞に添加し、３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液により６度、洗浄し、そして抗−ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（１：５０００の希釈度）により検出した。
【０１８９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いての親和性測定：動態分析のために、ＦＡｂタンパク質を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した。結合動態を、Ｆａｂにより飽和される場合、約１００の応答単位を生成するために十分な密度でＧＬＣチップ上に固定される抗原と共にＰＲＯＴＥＯＮ（ＢｉｏＲＡＤ）を用いて、表面プラズモン共鳴により決定した。次に、ＰＢＳを、１０分間、１００μｌ／分で注射し、解離を観察した。結合応答を、ブランク流動細胞上の応答を差し引くことにより補正した。動態分析のために、Ｋon及びＫoffのグローバルフィッティングの１：１Langmuirモデルを用いた。Ｋｄ値を、Ｋon及びＫoffの比率から決定した。
【０１９０】
エピトープビニング：手短には、１００ｎＭの固定された抗原を、５００ｎＭの精製されたＦＡｂと共に１時間、プレインキュベートした。抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂ分子を担持する、新しく調製されたファージを、抗原−Ｆａｂ複合体を含むウェルに添加した。オーバーラップするファージ−Ｆａｂ−抗原相互作用を阻止するＦＡｂを、一緒にグループ分けした。詳細には、Sachdev S. Sidhu and Frederic A. Feliouse, "Synthetic therapeutic antibodies," Nat Chem Biol. 2(12)(2006):682-8を参照のこと。
【０１９１】
フローサイトメトリーによる細胞表面結合：細胞を、ＥＤＴＡ溶液により集め、そしてＰＢＳにより１度、洗浄し、アリコートを、サンプル当たり０．２〜１×１０6個の細胞にし；細胞を、氷上で６０分間、試験される抗体（１００μｌのＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ中、サンプル当たり１μｇのａｂ）と共にインキュベートし；次に細胞を、１ｍｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡにより２度、洗浄し、そしてＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに希釈された、１００μｌのヤギ抗−ヒトＦａｂ−４８８と共に暗室においてＲＴで１５−３０分間インキュベートした。次に、細胞を、１ｍｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡにより２度、洗浄し、その後、濾過された０．２−０．５ｍｌの４％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。細胞サンプルを、すぐにＦＡＣＳ分析にゆだねるか、又は後での分析のために４℃で維持した。二次Ａｂは次のものを使用した：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗−ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−５４６−０９７）１：１０００のＥＤＴＡ溶液（付着細胞を離すための）：０．１５ｇの二ナトリウムＥＤＴＡ（１ｍＭ）、４．０ｇのＮａＣｌ、０．２８ｇの炭酸水素ナトリウム、０．５ｇのデキストロース（Ｄ−グルコース）、０．２ｇのＫＣｌ、５００ｍｌの二重蒸留水に溶解された。
【０１９２】
TopFlashレポーターアッセイ：TopFlash  β−カテニン−依存性ルシフェラーゼレポーター（ホタルルシフェラーゼ）及びウミシイタケルシファラーゼを含むレンチウィルスを用いて、安定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨＥＫ２９３Ｔ Ｗｎｔ−レポーター系を確立した。処理の２４時間前、細胞を、５００μlの最終体積において、５０％集密度で２４ウェルプレート上に播種した。次の日、培地の半分を、２５０μlのＷｎｔ３a、又はＬ細胞からの対照ならし培地により置換し、そしてＦａｂ又はＩｇＧを、所望する濃度で添加した。次に、細胞を、Envision多標識プレートリーダー（Perkin-Elmer）を用いて、二重ルシフェラーゼプロトコル（Promega）に従って、刺激の１５時間後、アッセイした。
【０１９３】
免疫蛍光染色：ｍｙｃ標識に融合されるＦＺＤレポーターのＣＲＤ及びＧＰＩアンカー配列を含むレンチウィルスを用いて、安定したＣＨＯ細胞を確立した。ＣＨＯ安定細胞系又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、カバースリップ上に播種し、そして２００ｎＭのＦａｂ又はＩｇＧ、又は抗−ｃＭｙｃ（SantaCruz）の１：２００希釈溶液の存在下で、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐにおいて４℃で１時間インキュベートした。細胞を、３．７％パラホルムアルデヒドにおいて１５分間、固定し、そして１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）により、３０分間ブロックし、そして室温で６０分間、二次抗−Ｆａｂ４８８Alexa Fluor (Jackson)又は抗−兎４８８Alexa Fluor (Molecular Probc)、及び０．１％ＮＤＳと共にインキュベートした。カバースリップに、ＤＡＰＩを含むVectashieid (Vector Laboratories Inc)を取り付け、そしてNikon Eclipse 80i 又はLSM 700 (Zeiss)により画像化した。
【０１９４】
細胞増殖を測定するためのスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ：癌細胞を、次の密度で９６ウェルプレートにプレートした：１８００／ウェルでのＡＳＰＣ１、１５００/ウェルでのＨＰＡＦII、３０００／ウェルでのＣＡＰＡＮ２及び６００／ウェルでのＩＭＩＭＰＣ２。細胞を一晩、培養し、続いて、合計体積１００μｌの培養培地下で細胞に抗−ＦＺＤ７  ＩｇＧを添加し、そしてインキュベーターに５日間、維持した。続いて、細胞を、培養培地を軽く吸引することにより、現場固定し、続いて５０μｌの氷冷却された１０％ＴＡＣ（トリクロロ酢酸）を、各ウェルに添加し、そして４℃で３０−６０分間インキュベートした。
【０１９５】
プレートを、水道水により５度、洗浄し、そして５分間、空気乾燥した。続いて、１％酢酸中、０．４％スルホローダミンＢ溶液５０μｌを、各ウェルに添加し、そして染色のために室温で３０分間インキュベートした。染色に続いて、プレートを、新たに製造された１％酢酸により４度、洗浄し、末結合色素を除去し、そして次に、５分間、空気乾燥した。染色物を、ウェル当たり１００μｌの１０ｍＭのトリス（ｐＨ１０．５）により溶解した。次に、プレートを、オービタル回転器上に５分間、配置し、その後、吸光度を５７０ｎｍで読み取った。
【０１９６】
細胞培養：ヒト膵臓腺癌細胞系ＡｓＰＣ−１、ＣＡＰＡＮ２及びＨＰＡＦIIを、American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)から購入した。ＡｓＰＣ−１細胞を、１０％ＦＣＳ（Life Technologies, Grand Island, NY, USA, カタログ番号: 12483-020）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 15140-122）により補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: A10491-01）において、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気下で、３７℃で維持した。
【０１９７】
ＣＡＰＡＮ２細胞を、１０％ＦＣＳ（Life Technologies, Grand Island, NY, USA, カタログ番号: 12483-020）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 15140-122）により補充されたＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地(Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 16600)において、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気下で、３７℃で維持した。
【０１９８】
ＨＰＡＦII細胞を、１０％ＦＣＳ（Life Technologies, Grand Island, NY, USA, カタログ番号: 12483-020）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 15140-122）により補充されたＥＭＥＭ培地(Wisent Inc., St- Bruno, QC, Canada, カタログ番号: 320-026-CL)において、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気下で、３７℃で維持した。
【０１９９】
細胞を、MycoAlert（登録商標）マイコプラズマ検出キット (Lonza, Rockland, ME, USA. カタログ番号: LT07-318)により定期的に試験することにより、マイコプラズマを有さないことを確かめた。
【０２００】
試験抗体（インビボ実験のための）：５種の組換え抗−Frizzled７抗体（ＦＺＤ７  Ａｂ）を、それらの実験で試験した。それらの抗体は、Ａｌ (ｍＡｂ＃１０５)、Ｅ４ (ｍＡｂ＃１０７)、 Ｈ１０ (ｍＡｂ＃ｌ ｌ ｌ)、 ＨＩ (ｍＡｂ＃１１２)及びＧ２ (ｍＡｂ＃１４０)であった。各抗体を、ビヒクル緩衝液により、その原液濃度から用量濃度（１．３３ｍｇ／ｍｌ−１５ｍｌ／ｋｇの用量体積で２０ｍｇ／ｋｇに等しい）まで希釈した。ビヒクル緩衝液は、５％ｄ−（＋）−トレハロース二水和物（Bioshop, Burlington, ON, Canada. カタログ番号: TRE222）を含むＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない、Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 14190- 144）であった。
【０２０１】
用量応答研究のために、２種の抗−Frizzled７抗体（ＦＺＤ７  Ａｂ）、Ａｂ１１１及びＡｂ１１２を、それらの実験において３種の異なった用量レベル（５０、２０及び５ｍｇ／ｋｇ）により試験した。各抗体を、ビヒクル緩衝液により、その原液濃度から用量濃度（３．３３、１．３３及び０．３３ｍｇ／ｍｌ−１５ｍｌ／ｋｇの用量体積でそれぞれ５０、２０及び５ｍｇ／ｋｇに等しい）まで希釈した。ビヒクル緩衝液は、５％ｄ−（＋）−トレハロース二水和物（Bioshop, Burlington, ON, Canada. カタログ番号: TRE222）を含むＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない、Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 14190- 144）であった。
【０２０２】
ＣＡＰＡＮ２及びＨＰＡＦII異種移植モデルでの試験のために、抗−Frizzled７抗体（ＦＺＤ７  Ａｂ）、Ａｂ１１１を、それらの実験において２種の異なった用量レベル（２０及び５ｍｇ／ｋｇ）により試験した。抗体を、ビヒクル緩衝液により、その原液濃度から用量濃度（１．３３及び０．３３ｍｇ／ｍｌ−１５ｍｌ／ｋｇの用量体積でそれぞれ２０及び５ｍｇ／ｋｇに等しい）まで希釈した。ビヒクル緩衝液は、５％ｄ−（＋）−トレハロース二水和物（Bioshop, Burlington, ON, Canada. カタログ番号: TRE222）を含むＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない、Life Technologies, Grand Island, NY, USA. カタログ番号: 14190- 144）であった。
【０２０３】
実施例２：Frizzled受容体に対するＦａｂの選択、生成及び特徴化
「ライブラリーＦ」として言及される合成Ｆａｂファージディスプレイライブラリーを用いて、Frizzled受容体に対する抗体を生成した。ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合される組換えFrizzled受容体７（ＦＺＤ７）システインに富むドメイン（ＣＲＤ）を抗原として用いて、ライブラリーＦによる４回の連続的選択を実施し、そしてＦＺＤ７−ＣＲＤ−Ｆｅに対して特異的に結合するが、しかしＦｃ対照に対して結合しない複数ファージＦａｂクローンを同定した（材料及び方法を参照のこと）。
【０２０４】
ライブラリーＦは、前に記載されたライブラリーと同様にして構成される単一フレームワークのヒトＦａｂライブラリーである。（例えば、Fellouse FA, Pal G, "Methods for the Construction of Phage-Displayed Libraries" in Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. Boca Raton: CRC Press (2005);及びFellouse FA et al. "High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries.” J Mol Biol 373 (2007): 924-940を参照のこと）。
【０２０５】
ライブラリーＦは、単一のヒトＦａｂフレームワークのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２，ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３における位置中に縮重コドンを導入することにより構成されたＦａｂ−ファージライブラリーである。ライブラリーＦ中のＣＤＲ−Ｌ３及び／又はＣＤＲ−Ｈ３のループ長は、下記表に示されるように、変化することができる。このライブラリーにおいては、ＣＤＲ−Ｌ１は、アミノ酸配列ＳＶＳＳＡ（配列番号３９２）を含み、そしてＣＤＲ−Ｌ２は、アミノ酸配列ＳＡＳＳＬＹＳ（配列番号３９３）を含む。ライブラリーは、３×１０10のユニーククローンの合計多様性を有し、そしてライブラリー企画の詳細は下記表１に示され、ここでＣＤＲ−Ｌ３及びＣＤＲ−Ｈ３領域中の陰影部分は、示されるように、すべての可能性ある種々の長さのランダムループにより置換された位置を示す。
【０２０６】
【表１】
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【０２０７】
それらのクローンの配列決定及び配列分析は、ユニーク配列を有する３６１のＦａｂクローンの同定につながった（図１）。次に、それらのクローンを、ＩＰＴＧ−誘発性Ｅ．コリ発現ベクター中にクリーン化し、そしてＦａｂタンパク質を発現し、そして精製した（図２Ａ）。それらの精製された抗−ＦＺＤ７  ＦａｂはＦＺＤ７−ＣＲＤ−Ｆｃに結合するが、しかしＦｃ対照に対しては結合しないことが確認された（図２Ｂ）。
【０２０８】
細胞上に発現されるＦＺＤ７への精製されたＦａｂの結合を試験した。それらのＦaｂが細胞上に発現されるＦＺＤ７受容体を認識するかどうかを見るために、フローサイトメトリー分析を実施した。ＦＡｂ  Ａ２、Ａ１２，Ｃ３，Ｅ３及びＥ７を除くＦａｂは、ＦＺＤ７を発現することが知られている細胞、及びＦＺＤ７を過剰発現するよう構築された同じ細胞に結合した（図３）。フローサイトメトリーアッセイにおいて良好な結合性を示したＦａｂを選択し、そしてさらなる分析のために精製した。
【０２０９】
Ｆａｂファージクローンの結合特異性を試験した。それらのＦａｂクローンがまた、他のFrizzled受容体に結合したかどうかを決定するために、ファージ結合ＥＬＩＳＡアッセイを、精製されたＦＺＤ  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて行った。この分析は、ＦＺＤ７の他に、ＦＡｂファージクローンがまた、他のFrizzled受容体に結合したことを示した（図４Ａ）。それらのＦａｂの結合特異性を、個々のＦＺＤ  ＥＣＤを過剰発現する細胞を用いて、免疫蛍光染色により決定した。Ｆａｂ  Ａ１、Ｄ１０、Ｅ４、Ｇ２、Ｈ３及びＨ１０は、同じ結合特異性プロフィールを共有し、これは、Ｆａｂ  Ｅ８、Ｇ６又はＨ１のそれらの特異性プロフィールとは異なる。
【０２１０】
次に、抗−ＦＺＤ  Ｆａｂのエピトープビニングを実施した。抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂが抗原ＦＺＤ７上の結合部位を共有するかどうかを学ぶために、競争ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、精製されたＦａｂが抗原（ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ）への結合のためのＦａｂファージクローンと競争するかどうかを決定した。それらの実験は、Ｆａｂがそれ自身の対応するファージクローンと効果的に競争することを示した（図５）。さらに、Ｆａｂ  Ｇ６、Ｈ１、Ａ１及びＥ４は、すべての他のＦａｂファージクローンの結合を効果的にブロックし、そしてＦａｂ  Ｄ１０のみが、ＦａｂファージクローンＥ８の結合を効果的にブロックし（図５）、このことは、それらのＦａｂがＦＺＤ７上のオーバーラップする結合部位を共有することを示唆する。
【０２１１】
次に、抗−ＦＺＤ７  Ｆａｂの親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。ＳＰＲを用いて、ＦＺＤへのＦＺＤ７  Ｆａｂの結合親和性を決定した。ＳＰＲにより得られる結合親和性を要約する図６は、ＦＺＤ７についてのそれらのＦａｂの親和性値は０．４−９ｎＭの範囲であったことを示す。追加のＦＺＤのサブセットについての結合親和性もまた得られた（図７）。
【０２１２】
Ｗｎｔリガンド結合及びリガンド−誘発性転写に対する抗−ＦＺＤ  Ｆａｂの効果を分析した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＦａｂがＦＺＤ７へのＷｎｔリガンド結合をブロックできたかどうかを直接的に決定した。図８に示されるように、Ｆａｂ  Ａｌ、ＤＩＧ、Ｅ４、Ｇ２、Ｈ３、ＨＩＯ、Ｇ６又は ＨＩは、リガンドＷｎｔ  ５ａ結合を効果的に阻害した。しかし、Ｆａｂ  Ｅ８は、ＦＺＤ７へのＷｎｔ５ａの結合をブロックしなかった。Ｆａｂ  Ａ １、Ｇ２、ＨＩ、Ｈ３、Ｈ１０ 及びＥ４は、ＰＢＳ対照に比較して、７０％以上、３ａ−誘発された転写活性を阻害した（図９）。
【０２１３】
リガンドＷｎｔ３ａ−誘発された転写活性に対する抗−ＦＺＤ  ｍＡｂ（ＩｇＧ）の効果をまた分析した。抗−ＦＺＤ  Ｆａｂを、ＩｇＧ１として完全長抗体に転換し、そしてｍＡｂを発現し、そして哺乳類細胞から精製した。続いて、精製された抗体を、生化学的及び生物学的特性評価研究のために使用した。
【０２１４】
第１に、ＦＺＤ７へのそれらのｍＡｂの結合親和性を、ＳＰＲ方法を用いて決定した（材料及び方法を参照のこと）。図７に示されるように、ＫＤ値は、０．１−１．５ｎＭの範囲であることが推定された。第２に、抗体を、フローサイトメトリー分析により試験し、それらのｍＡｂが細胞上に発現されるＦＺＤ７に結合するかどうかを決定した。抗体は、ＣＨＯ細胞よりも良好に、ＦＺＤ７−過剰発現ＣＨＯ細胞に結合することが示され、このことは、抗体が細胞上に発現されたＦＺＤ７を認識したことを示唆する。
【０２１５】
抗−ＦＺＤ７抗体をまた、リガンド（Ｗｎｔ３ａ）−依存性転写レポーターアッセイにより試験し、それらがＷｎｔリガンド及びＦＺＤ７により介在されるシグナルトランスダクションを、ブロックしたかどうかを確認した。図１１に示されるように、ＩｇＧ  Ａｌ、Ｇ２、ＨＩ、Ｈ３、Ｅ４、Ｄ１０、Ｈ１０及びＥ８は、用量依存性態様で、Ｗｎｔ  ３ａ−誘発された転写活性を阻害した。ＩＣ50値は、２ｎＭ−１２５ｎＭの範囲であることが推定された（図１１）。
【０２１６】
実施例３：抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂの投与に続く腫瘍応答のインビトロ評価
ヒト膵臓癌細胞系ＡＳＰＣｌ 、ＨＰＡＦII、ＣＡＰＡ ２ 及び ＩＭＭＩＰＣ２を用いて、抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂによる処理に続いて、癌細胞増殖の応答を評価した。それらの研究のために、膵臓細胞系を、次の密度で９６ウェルプレートにプレートした：ＡＳＰＣ１細胞を、１８００個の細胞／ウェルでプレートし、ＨＰＡＦII細胞を、１５００個の細胞／ウェルでプレートし、ＣＡＰＡＮ２細胞を、３０００個の細胞／ウェルでプレートし、そしてＩＭＭＩＰＣ２細胞を、６００個の細胞／ウェルでプレートした。一晩の培養期間に続いて、抗−ＦＺＤ７ ｍＡｂ(Ｈ１０ (ｍＡｂ＃ｌ１１)、Ｇ２ (ｍＡｂ＃１４０)、Ａｌ (ｍＡｂ＃１０５)、Ｅ４ （ｍＡｂ＃１０７）、又は１８Ｒ５)、又は負の対照として、ヒトγグロブリンを、５日間、細胞に添加した。
【０２１７】
癌細胞増殖における用量依存性応答をまた、抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂの投与に続いて、癌細胞系ＨＰＡＦＩＩ、ＩＭＭＰＣ２、ＰＡＮＣ０８．１３及びＡＳＰＣｌについて示した。１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのｍＡｂ  Ｈ１０又はＧ２のいずれかによる５日間の処理に続いて、ＨＰＡＦＩＩ、ＩＭＭＰＣ２及びＰＡＮＣ０８．１３についての細胞増殖において用量依存応答が存在した。（図１２Ａ−１２Ｄを参照のこと）。抗−ＦＺＤ７ 抗体Ａ１(ｍＡｂ＃１０５)、Ｅ４（ｍＡｂ＃１０７）、Ｈ１０（ｍＡｂ＃ｌｌｌ）、Ｈ１（ｍＡｂ＃１１２）、Ｇ２（ｍＡｂ＃１４０）及び１８Ｒ５はまた、Ｃａｐａｎ−２細胞の細胞増殖の低下において用量依存性応答を有することを示された。（図１２Ｅを参照のこと）。
【０２１８】
ＡＳＰＣ−１細胞を用いてのインビトロ実験に関しては、培養培地に添加される抗体の濃度は、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌであった。細胞増殖の用量依存性阻害が、ｍＡｂ  Ａ１、Ｅ４及びＨ１について示された。（図１３Ａ及び１３Ｂを参照のこと）。
【０２１９】
実施例４：抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂの投与に続く腫瘍応答のインビボ評価
生後５〜６週の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（ Taconic Farms, German town, NY, USA）は、３種の膵臓細胞系ＡｓＰＣＩ、ＣＡＰＡＮ２ 又は ＨＰＡＦＩＩの１つの移植片を受け、続いて、抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂを投与し、ｍＡｂ処理に対する応答を評価した。インビボ作業及び結果の詳細な説明については下記参照のこと。
【０２２０】
ＡｓＰＣＩ移植片：Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスは、１００μｌのＤＰＢＳ中、３百個のＡｓＰＣ１細胞を右脇腹に注射され、６日間の休止期間が続き、１８４．９ｍｍ3の平均腫瘍体積の形成を可能にした。合計６の実験グループが存在し、各グループは９匹のマウスを含んだ。抗−ＦＺＤ７抗体、Ａｌ （ｍＡｂ＃１０５）、Ｅ４ （ｍＡｂ＃１０７）、 Ｈ１０ （ｍＡｂ＃ｌ１１ ）、Ｈ０１ （ｍＡｂ＃ｌ １２）、 Ｇ２ （ｍＡｂ＃１４０）又は ビヒクル対照 (１００μｌの ＤＰＢＳ)を、２０ｍｇ／ｋｇの濃度で、合計５週間、週当たり２度、ＩＰを介して投与した。すべての抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂは、５週の投与計画の後、腫瘍体積の著しい低下をもたらし、その範囲は２５．６％の低下（ｍＡｂ  Ａ１の投与に続いて）〜５０．８％の低下（ｍＡｂ  Ｈ１０の投与に続いて）であった。（図１４を参照のこと）。
【０２２１】
ＡｓＰＣ１マウス異種移植体における用量依存性応答をまた、ｍＡｂ１１１（また、本明細書においては、Ｈ１０とも称する）及びｍＡＢ１１２（また、本明細書においては、Ｈ１とも称する）により評価した。マウス異種移植片受容体は、６日間の腫瘍増殖（平均体積＝１９３．６ｍｍ3）に続いて、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ又はビヒクルのみ（ＤＰＢＳ）の対照により、合計４週間、週当たり２度、処理を開始した。それらの実験のために、合計８のグループが存在し、各グループは９匹の動物を含み、但しＤＰＢＳ対照グループは、８匹の動物を含む。処理に続いて、腫瘍体積の用量依存性低下が存在し、ｍＡｂ１１１の投与に続いて、５ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍体積の３６．３％の低下〜５０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍体積の６５．８％の低下が存在し；ｍＡｂ１１２による処理に続いて、３５．４％（５ｍｇ／ｋｇの用量）〜４４．７％（５０ｍｇ／ｋｇの用量）の範囲の腫瘍体積の低下が存在した。
【０２２２】
ＣＡＰＡＮ２移植体：Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスは、４百個のＡｓＰＣ１細胞を右脇腹に注射され、６日間の休止期間が続き、２０３．６ｍｍ3の平均腫瘍体積の形成を可能にした。それらの実験については、抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂ、ｍＡｂ１１１を、５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ、又は対照としてのビヒクルのみ（ＤＰＢＳ）の何れかの投与量でＩＰを介して投与した。投与計画は、合計５週間、週当たり２度の投与であった。マウスは３つのグループにランダムに分配され、各グループは１０匹の動物を含んだ。ｍＡｂ１１１の投与は、５週間の処理に続いて、５２％の腫瘍体積の低下をもたらした。（図１６を参照のこと）。
【０２２３】
ＨＰＡＦII移植体：Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスは、４百個のＡｓＰＣ１細胞を右脇腹に注射され、７日間の休止期間が続き、１９１．５ｍｍ3の平均腫瘍体積の形成を可能にした。それらの実験については、抗−ＦＺＤ７  ｍＡｂ、ｍＡｂ１１１を、５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ、又は対照としてのビヒクルのみ（ＤＰＢＳ）の何れかの投与量でＩＰを介して投与した。投与計画は、合計４．５週間、週当たり２度の投与であった。マウスは３つのグループにランダムに分配され、各グループは１０匹の動物を含んだ。ｍＡｂ１１１の投与は、５週間の処理に続いて、９４．１％の腫瘍体積の低下をもたらした。（図１７を参照のこと）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｃ−３】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｄ−３】
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【図１Ｄ−４】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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