(57)【要約】【課題】核酸の長さが長い場合でも、簡便な操作で高効率に核酸を回収できる核酸の回収方法、前記回収方法に好適に用いられる核酸結合用担体及び核酸回収キットの提供。【解決手段】体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させて複合体を形成し、前記複合体から前記核酸を溶出させ、回収する、核酸の回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させて複合体を形成し、
前記複合体から前記核酸を溶出させ、回収する、核酸の回収方法。
【請求項２】
前記多孔質シリカ粒子の体積基準での粒度分布のＤ９０／Ｄ１０が１０以下である、請求項１に記載の核酸の回収方法。
【請求項３】
前記多孔質シリカ粒子の比表面積が８〜４００ｍ２／ｇである、請求項１または２に記載の核酸の回収方法。
【請求項４】
前記多孔質シリカ粒子のシリカ純度が９０質量％以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の回収方法。
【請求項５】
カオトロピック物質溶液の存在下で、前記多孔質シリカ粒子に前記核酸を吸着または結合させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の回収方法。
【請求項６】
前記複合体から前記核酸を溶出させる前に、前記複合体を洗浄する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸の回収方法。
【請求項７】
前記核酸の長さが１０５〜１０１１ｂｐである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸の回収方法。
【請求項８】
体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子からなる核酸結合用担体。
【請求項９】
体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子を収容した第１の容器と、
核酸を前記多孔質シリカ粒子に吸着または結合させる結合液を収容した第２の容器と、
を備える核酸回収キット。
【請求項１０】
前記結合液がカオトロピック物質溶液である、請求項９に記載の核酸回収キット。
【請求項１１】
前記多孔質シリカ粒子と前記核酸とが吸着または結合した複合体から前記核酸を溶出させる溶出液を収容した第３の容器をさらに備える、請求項９または１０に記載の核酸回収キット。
【請求項１２】
前記多孔質シリカ粒子と前記核酸とが吸着または結合した複合体を洗浄する洗浄液を収容した第４の容器をさらに備える、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸回収キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の回収方法、核酸結合用担体および核酸回収キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、感染症診断キットとしては、タンパク質（抗原、抗体等）を対象としたものが用いられている。しかし、インフルエンザ等の一部の感染症を除いて精度が低いこと、抗体を対象とする場合には過去の感染による偽陽性等の問題がある。そこで近年、核酸を対象とする感染症診断キットが検討されている。核酸を対象とすることで、精度の向上が期待される。
生物試料である検体には種々の成分が含まれており、診断を行うには検体から核酸を単離する必要がある。
【０００３】
生物試料から核酸を単離する方法として、シリカを含む担体に核酸を吸着または結合させ、洗浄により他の成分を除去した後、担体から核酸を溶出させる方法が知られている。この方法を利用した核酸精製キットは既に実用化されており、担体としてはシリカメンブレンが汎用されている（例えば非特許文献１〜３）。また、単離操作の簡便化、自動化のために、磁性体の表面を多孔質シリカで被覆した磁性シリカ粒子を担体として用いることが提案されている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−３００２６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「核酸精製キット」（カタログ）、［online］、日本ジェネティクス株式会社、［平成２９年６月２６日検索］、インターネット〈URL: http://www.sns-kk.co.jp/data/pdf/2012_6/2011769944.pdf〉
【非特許文献２】「ＤＮＡクリーンアップ」（カタログ）、［online］、タカラバイオ株式会社、［平成２９年６月２６日検索］、インターネット〈URL: http://www.takara-bio.co.jp/goods/catalog/pdf/mach2012_15-28.pdf〉
【非特許文献３】「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ」（カタログ）、［online］、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、［平成２９年６月２６日検索］、インターネット〈URL: http:www.mn-net.com/.../8/.../Genomic%20DNA/UM_gDNABlood.pdf〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来の核酸の単離方法は、核酸の抽出率が必ずしも高くなく、特に１０５ｂｐ以上の長さの核酸の場合、抽出できないか、抽出できても抽出率が低い課題があった。抽出率が低いと、高価な装置を用いて長時間の増幅処理を行う必要があり、実施できる施設が限定され、時間もかかる。
【０００７】
本発明の目的は、核酸の長さが長い場合でも、簡便な操作で高効率に核酸を回収できる核酸の回収方法、前記回収方法に好適に用いられる核酸結合用担体及び核酸回収キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の〔１〕〜〔１２〕の構成を有する、核酸の回収方法、核酸結合用担体および核酸回収キットを提供する。
〔１〕体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させて複合体を形成し、
前記複合体から前記核酸を溶出させ、回収する、核酸の回収方法。
〔２〕前記多孔質シリカ粒子の体積基準での粒度分布のＤ９０／Ｄ１０が１０以下である、核酸の〔１〕の回収方法。
〔３〕前記多孔質シリカ粒子の比表面積が８〜４００ｍ２／ｇである、〔１〕または〔２〕の核酸の回収方法。
〔４〕前記多孔質シリカ粒子のシリカ純度が９０質量％以上である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの核酸の回収方法。
〔５〕カオトロピック物質溶液の存在下で、前記多孔質シリカ粒子に前記核酸を吸着または結合させる、〔１〕〜〔４〕のいずれかの核酸の回収方法。
〔６〕前記複合体から前記核酸を溶出させる前に、前記複合体を洗浄する、〔１〕〜〔５〕のいずれかの核酸の回収方法。
〔７〕前記核酸の長さが１０５〜１０１１ｂｐである、〔１〕〜〔６〕のいずれかの核酸の回収方法。
〔８〕体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子からなる核酸結合用担体。
〔９〕体積基準での粒度分布のＤ５０が６〜５０μｍであり、水銀ポロシメータによる細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、水銀ポロシメータによる平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子を収容した第１の容器と、
核酸を前記多孔質シリカ粒子に吸着または結合させる結合液を収容した第２の容器と、
を備える核酸回収キット。
〔１０〕前記結合液がカオトロピック物質溶液である、〔９〕の核酸回収キット。
〔１１〕前記多孔質シリカ粒子と前記核酸とが吸着または結合した複合体から前記核酸を溶出させる溶出液を収容した第３の容器をさらに備える、〔９〕または〔１０〕の核酸回収キット。
〔１２〕前記多孔質シリカ粒子と前記核酸とが吸着または結合した複合体を洗浄する洗浄液を収容した第４の容器をさらに備える、〔９〕〜〔１１〕のいずれかの核酸回収キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の核酸の回収方法によれば、核酸の長さが長い場合でも、簡便な操作で高効率に核酸を回収できる。
本発明の核酸結合用担体及び核酸回収キットはそれぞれ、前記回収方法に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】例１〜１５における多孔質シリカ粒子のＤ５０とＤＮＡ回収率との関係を示すグラフである。
【図２】例１〜１５における多孔質シリカ粒子のＤ９０／Ｄ１０とＤＮＡ回収率との関係を示すグラフである。
【図３】例１〜１５における多孔質シリカ粒子の細孔容積とＤＮＡ回収率との関係を示すグラフである。
【図４】例１〜１５における多孔質シリカ粒子の平均細孔径とＤＮＡ回収率との関係を示すグラフである。
【図５】例１〜１５における多孔質シリカ粒子の比表面積（ＳＳＡ）とＤＮＡ回収率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書における以下の用語の意味は、以下の通りである。
「Ｄ５０」は、体積基準での粒度分布の全体積を１００％とした累積体積分布曲線において５０％となる点の粒子径、すなわち体積基準累積５０％径である。
「Ｄ１０」は、体積基準での粒度分布の全体積を１００％とした累積体積分布曲線において１０％となる点の粒子径、すなわち体積基準累積１０％径である。
「Ｄ９０」は、体積基準での粒度分布の全体積を１００％とした累積体積分布曲線において９０％となる点の粒子径、すなわち体積基準累積９０％径である。
「体積基準での粒度分布」は、レーザー散乱粒度分布測定装置（たとえば、レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置等）で測定した頻度分布および累積体積分布曲線から求められる。測定は、粉末を水媒体中に超音波処理等で充分に分散させて行われる。
「細孔容積」は、水銀ポロシメータを用いて測定した細孔容積である。吸着等温線の測定では、吸着ガスとして窒素ガスを用いる。
「平均細孔径」は、水銀ポロシメータを用いて測定した平均細孔径である。吸着等温線の測定では、吸着ガスとして窒素ガスを用いる。
水銀ポロシメータによる細孔容積または平均細孔径の測定において、水銀の物性値には接触角１４０°、表面張力４８０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ、密度１３．５３３５ｇ／ｍＬを用いる。測定条件は圧力５０ｍｍＨｇ、真空引き時間５分、注入圧力１．４９ｐｓｉ、平衡時間１０秒とする。
「比表面積」は、ＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ，Ｅｍｍｅｔ，Ｔｅｌｌｅｒ）法によって吸着等温線から求めた比表面積である。吸着等温線の測定では、吸着ガスとして窒素ガスを用いる。
「シリカ純度」は、多孔質シリカ粒子の総質量に対するシリカ（ＳｉＯ２）の質量の割合である。シリカ純度は、外原規２００６「無水ケイ酸」定量法により測定される。
数値範囲を示す「〜」は、その前後に記載された数値を下限値および上限値として含むことを意味する。
【００１２】
〔核酸の回収方法〕
本発明の核酸の回収方法は、以下の結合工程および回収工程を有する。結合工程の後、回収工程の前に、以下の洗浄工程をさらに有することができる。
結合工程：Ｄ５０が６〜５０μｍであり、細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させて複合体を形成する工程。
洗浄工程：前記複合体を洗浄する工程。
溶出工程：前記複合体から核酸を溶出させ、回収する工程。
【００１３】
（多孔質シリカ粒子）
本発明の核酸の回収方法において多孔質シリカ粒子は、核酸結合用担体として用いられる。多孔質シリカ粒子はシリカを含む。また、多孔質シリカ粒子の表面にはシリカが存在している。多孔質シリカ粒子は、シリカ以外の他の成分をさらに含んでもよい。
【００１４】
多孔質シリカ粒子のシリカ純度は、９０質量％以上が好ましく、９５質量％以上がより好ましく、９８質量％以上が特に好ましい。シリカ純度の上限は特に限定されず、１００質量％であってもよい。
特許文献１に記載された発明のように、他の成分が多孔質シリカ粒子に含まれる場合、核酸の回収時に多孔質シリカ粒子から他の成分が溶出して測定に悪影響を及ぼすことがある。また、磁性体の表面を多孔質シリカで被覆した磁性シリカ粒子は、原料や製造にコストがかかり、高価である。
シリカ純度が前記下限値以上であれば、核酸の回収時に多孔質シリカ粒子から他の成分が溶出したとしても測定に悪影響を及ぼしにくく、また安価である。
多孔質シリカ粒子は、コスト、耐薬性の点から、磁性シリカ粒子ではないことが好ましい。例えば粒子全体が多孔質シリカからなる粒子であってよい。
【００１５】
多孔質シリカ粒子の体積基準での粒度分布において、Ｄ５０は６〜５０μｍであり、６〜４５μｍが好ましく、７〜３０μｍが特に好ましい。Ｄ５０が前記範囲内であれば、核酸回収効率が優れる。
Ｄ９０／Ｄ１０は、１０以下が好ましく、８以下がより好ましく、６以下が特に好ましい。Ｄ９０／Ｄ１０が前記上限値以下であれば、核酸回収効率がより優れる。Ｄ９０／Ｄ１０の下限は特に限定されず、例えば１であってよい。
Ｄ９０は、例えば１０〜１００μｍであってよい。
Ｄ１０は、例えば１〜５０μｍであってよい。
【００１６】
多孔質シリカ粒子の細孔容積は、０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、０．６〜４ｃｍ３／ｇが好ましく、０．６〜２．５ｃｍ３／ｇが特に好ましい。細孔容積が前記下限値以上であれば、核酸回収効率が優れる。細孔容積が前記上限値以下であれば、洗浄性が優れる。
【００１７】
多孔質シリカ粒子の平均細孔径は、２００〜５０００Åであり、２００〜４００Åが好ましく、２００〜２５００Åが特に好ましい。平均細孔径が前記下限値以上上限値以下であれば、核酸回収効率が優れる。
【００１８】
多孔質シリカ粒子の比表面積は、８〜４００ｍ２／ｇが好ましく、８〜３５０ｍ２／ｇがより好ましく、８〜３００ｍ２／ｇが特に好ましい。比表面積が前記下限値以上であれば、核酸回収効率がより優れる。比表面積が前記上限値以下であれば、洗浄性が優れる。
【００１９】
多孔質シリカ粒子は、市販の多孔質シリカ粒子のなかから所望の特性（Ｄ５０、細孔容積、平均細孔径等）を満たすものを適宜選択して用いることができる。
【００２０】
（核酸）
核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）の総称である。
多孔質シリカ粒子に吸着させる核酸としては、特に限定されず、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、それらの混合物であってもよい。ＤＮＡおよびＲＮＡそれぞれの種類や構造は特に限定されない。例えばＤＮＡは１本鎖ＤＮＡであってもよく２本鎖ＤＮＡであってもよい。
核酸は、真核生物（動物、植物、昆虫、線虫、酵母、カビ等）由来の核酸であってもよく、原核生物（大腸菌、枯草菌、ラン藻、マイコプラズマ等のバクテリア）由来の核酸であってもよく、無生物（ウイルス、葉緑体、ミトコンドリア等）由来の核酸であってもよい。
【００２１】
核酸の長さは、典型的には、１０〜１０１１ｂｐであり、１０５〜１０１１ｂｐが好ましく、１０５〜１０９ｂｐが特に好ましい。
従来のシリカメンブレンを用いた核酸精製キットで対象とされる核酸の長さは通常１０６ｂｐ以下である。核酸の長さが長くなるにつれて、特に１０５ｂｐ以上になると、回収効率が低くなる。これは、核酸の長さが長くなるにつれて、核酸が担体に強固に吸着し、溶出しにくくなるためと考えられる。
本発明の回収方法では、長さが１０５ｂｐ以上の核酸であっても優れた回収効率で回収できる。そのため、核酸の長さが１０５ｂｐ以上である場合に特に本発明の有用性が高い。核酸の長さが１０１１ｂｐ以下であれば、核酸回収効率がより優れる。
なお、天然に存在する長さ１０５〜１０１１ｂｐの核酸はＤＮＡである。
【００２２】
（結合工程）
結合工程では、多孔質シリカ粒子に核酸を結合（吸着）させて複合体を形成する。
結合工程は、担体として前記多孔質シリカ粒子を用いる以外は、公知の方法を利用して実施できる。
多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させる方法の一例として、核酸を含む試料と、結合液とを混合して第１混合液を得て、前記第１混合液と多孔質シリカ粒子とを接触させる方法が挙げられる。
【００２３】
核酸を含む試料としては通常、生物試料が用いられる。生物試料としては、例えば血液、血清、穿刺液、気道ぬぐい液、尿、糞便、膿、毛髪、爪等が挙げられる。
【００２４】
結合液は、核酸を前記多孔質シリカ粒子に吸着または結合させる作用を有する液である。結合液の作用により、試料中の核酸が多孔質シリカ粒子に結合する。
結合液としては、典型的には、カオトロピック物質溶液が用いられる。したがって、結合工程では、典型的には、カオトロピック物質溶液の存在下で多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させる。
【００２５】
カオトロピック物質は、水等の溶媒中でカオトロピックイオンを生成する。カオトロピックイオンの作用によって、核酸とシリカとが結合しやすくなる。また、カオトロピックイオンは、タンパク質や核酸の一次構造を変えることなく二次、三次、四次構造を変えることができる。そのため、生物試料とカオトロピック物質溶液とを混合することで、生物試料中の核酸を含む細胞等を破壊し、核酸を溶離させることができる。したがって、カオトロピック物質溶液は、生物試料中の細胞等から核酸を溶離させる溶離液としても機能する。
【００２６】
カオトロピック物質としては、例えば、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿素等が挙げられる。カオトロピック物質は１種を単独で用いてもよく２種以上を併用してもよい。これらのうち、カオトロピック効果の強さ、リボヌクレアーゼ等の核酸分解酵素に対する阻害効果の大きさから、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩が好ましい。
【００２７】
結合液のカオトロピック物質濃度は、充分なカオトロピック効果が得られればよく、カオトロピック物質に応じて適宜設定される。通常１．０〜８．０Ｍであり、カオトロピック物質がグアニジン塩酸塩である場合は、４．０〜７．５Ｍが好ましく、カオトロピック物質がグアニジンチオシアン酸塩である場合には、３．０〜５．５Ｍが好ましい。
【００２８】
結合液は、緩衝剤を含むことが好ましい。緩衝剤としては、一般に使用されるものであってよく、特に限定されないが、中性付近、すなわちｐＨ５．０〜９．０において緩衝能を有するものが好ましく、例えば、トリス−塩酸緩衝液、ＴＥ緩衝液（トリスおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有）、四ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
結合液の緩衝剤濃度は、固形分換算で、１〜５００ｍＭが好ましい。
結合液のｐＨは、６．０〜９．０が好ましい。ｐＨは、２５℃における値である。
【００２９】
結合液は、細胞膜の破壊、細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で、界面活性剤をさらに含んでもよい。界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであってよく、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤（例えばトリトン系界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ系界面活性剤）等の非イオン界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰イオン界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤は１種を単独で用いてもよく２種以上を併用してもよい。これらのうち、
結合液の界面活性剤濃度は、例えば非イオン界面活性剤の場合は、１〜５００ｍＭが好ましい。
【００３０】
結合液は、試料中に含まれるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを変性、失活させる目的で、還元剤をさらに含んでもよい。還元剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであってよく、特に限定されないが、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等が挙げられる。
【００３１】
試料と結合液とを混合する際、アルコールをさらに混合してもよい。アルコールによって、核酸の不溶化を促進することができる。アルコールとしては、例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられる。
結合液に予めアルコールを含有させてもよい。
【００３２】
試料および結合液とともにアルコールを混合する場合、試料および結合液と混合するアルコールの量は、例えば、第１混合液中のアルコールの含有量が、試料に対して１０〜９０質量％となる量であってよい。
混合時の温度条件は、例えば４〜８０℃であってよい。
混合時間は、混合方法によっても異なるが、例えば０．１〜６０分間であってよい。
【００３３】
第１混合液と多孔質シリカ粒子とを接触させる前に、第１混合液に対し、核酸以外の成分（固形の夾雑物等）の低減等のために、遠心分離等の前処理を行ってもよい。遠心分離の条件は、例えば１００〜２００００ｒｐｍで０．１〜６０分間であってよい。
【００３４】
第１混合液と多孔質シリカ粒子との接触方法としては、例えば、（１）第１混合液と多孔質シリカ粒子とを混合して第２混合液を得て、第２混合液から多孔質シリカ粒子（すなわち複合体）を回収する方法、（２）多孔質シリカ粒子が容器外に流出しないように保持された通液可能な容器（例えばカラム等）に第１混合液を通液する方法等が挙げられる。
第１混合液と多孔質シリカ粒子とを接触させる際の温度条件は、例えば４〜８０℃であってよい。第１混合液と多孔質シリカ粒子との接触時間は、例えば０．１〜６０分間であってよい。
【００３５】
（１）の方法において、第１混合液と混合する多孔質シリカ粒子の量は、例えば第１混合液１００質量部に対して２〜２００質量部であってよい。
第１混合液と多孔質シリカ粒子とを混合した時点から、多孔質シリカ粒子を第２混合液から回収するまでの時間が接触時間に相当する。この間、第２混合液に対し、撹拌等を行ってもよい。
第２混合液から多孔質シリカ粒子を回収する方法としては、遠心分離、ろ過等の各種の固液分離方法を利用できる。一例として、フィルタによって上下に区画された容器の上部に第２混合液を入れ、遠心、吸引等により通液させ、フィルタ上に残った多孔質シリカ粒子を回収する方法が挙げられる。
【００３６】
（２）の方法は、例えば、前記容器に第１混合液を入れ、任意の時間（接触時間）保持した後、容器から排出する方法であってよい。
容器に入れる第１混合液の量は、例えば多孔質シリカ粒子１００質量部に対し、５０〜５０００質量部であってよい。
第１混合液を容器内に保持している間に、撹拌等を行ってもよい。
第１混合液を容器から排出させる方法としては、特に限定されず、例えば遠心、吸引、等が挙げられる。
【００３７】
（洗浄工程）
洗浄工程では、結合工程で得た、多孔質シリカ粒子と核酸とが吸着または結合した複合体を洗浄する。
複合体には核酸以外の成分（タンパク質、糖類、脂質等）が付着していることがある。複合体を洗浄することで、核酸以外の成分を低減できる。
洗浄を行う回数は１回でもよく２回以上でもよい。
【００３８】
洗浄に用いる洗浄液としては、複合体から核酸を溶出させず、かつ核酸以外の成分の脱離を促進できるものであれば特に限定されない。洗浄液の例としては、例えば、カオトロピック物質溶液、アルコールおよびその水溶液等が挙げられる。
カオトロピック物質溶液としては、前述の結合液で挙げたものと同様であってよく、例えば４．０〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液が挙げられる。カオトロピック物質溶液は、緩衝剤、緩界面活性剤、還元剤等を含んでいてもよい。
アルコールとしては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が好ましく、エタノールが特に好ましい。
アルコールまたはその水溶液のアルコール濃度は、４０〜１００質量％が好ましく、６０〜１００質量％がより好ましい。アルコール濃度が前記下限値以上であれば、核酸が溶出しにくい。
【００３９】
洗浄液として、カオトロピック物質溶液と、アルコールまたはその水溶液とを併用してもよい。例えばカオトロピック物質溶液による洗浄を行った後に、アルコールまたはその水溶液による洗浄を行ってもよい。
洗浄液として、アルコール濃度が互いに異なる２種以上のアルコールまたはその水溶液を併用してもよい。
【００４０】
複合体の洗浄方法としては、特に限定されない。例えば、（１’）結合工程で前記（１）の方法で回収した複合体と洗浄液とを混合して第３混合液を得て、第３混合液から複合体を回収する方法、（２’）結合工程で前記（２）の方法で第１混合液を排出した後の容器に洗浄液を通液する方法等が挙げられる。
洗浄時の温度条件は、例えば４〜８０℃であってよい。
１回の洗浄時間は、例えば０．１〜６０分間であってよい。
【００４１】
（１’）の方法において、１回の洗浄で複合体と混合する洗浄液の量は、例えば複合体１００質量部に対して１０〜１００００質量部であってよい。
複合体と洗浄液とを混合した時点から、複合体を第３混合液から回収するまでの時間が洗浄時間に相当する。この間、第２混合液に対し、撹拌等を行ってもよい。
第３混合液から複合体を回収する方法としては、第２混合液から多孔質シリカ粒子を回収する方法と同様の方法が挙げられる。
【００４２】
（２’）の方法は、例えば、前記容器に洗浄液を入れ、任意の時間（洗浄時間）保持した後、容器から排出する方法であってよい。
容器に入れる洗浄液の量は、例えば複合体１００質量部に対し、１０〜１００００質量部であってよい。
洗浄液を容器内に保持している間に、撹拌等を行ってもよい。
洗浄液を容器から排出させる方法としては、容器から第１混合液を排出させる方法と同様が挙げられる。
【００４３】
洗浄後、必要に応じて、複合体を乾燥させてもよい。
乾燥方法としては、例えば恒温槽等が挙げられる。
乾燥条件は、例えば３０〜８０℃で０．１〜３０００分間であってよい。
【００４４】
（溶出工程）
溶出工程では、結合工程後又は洗浄工程後の複合体から核酸を溶出させ、核酸を回収する。
溶出を行う回数は１回でもよく２回以上でもよい。
【００４５】
溶出工程は、公知の方法を利用して実施できる。例えば、複合体と溶出液とを接触させ、その後、溶出液を回収する方法が挙げられる。
溶出液は、多孔質シリカ粒子に吸着または結合した核酸を溶出させる作用を有する液である。溶出液の作用によって、複合体から核酸が溶出し、核酸を含む溶出液が得られる。
溶出液としては、例えば、水、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸塩、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）等が挙げられる。
【００４６】
複合体と溶出液とを接触させ、その後、溶出液を回収する方法としては、特に限定されない。例えば、（１”）結合工程で前記（１）の方法で回収した複合体または洗浄工程で前記（１”）の方法で洗浄した複合体と、溶出液とを混合して第４混合液を得て、第４混合液から、核酸を溶出させた複合体（すなわち多孔質シリカ粒子）を除去する方法、（２”）結合工程で前記（２）の方法で第１混合液を排出した後の容器または洗浄工程で前記（２”）の方法で洗浄液を排出した後の容器に、溶出液を通液する方法等が挙げられる。
複合体と溶出液との接触時の温度条件は、例えば４〜８０℃であってよい。複合体と溶出液との接触時間は、例えば０．１〜６０分間であってよい。
【００４７】
（１”）の方法において、複合体と混合する溶出液の量は、例えば複合体１００質量部に対して１０〜１００００質量部であってよい。
複合体と溶出液とを混合した時点から、多孔質シリカ粒子を第４混合液から回収するまでの時間が接触時間に相当する。この間、第４混合液に対し、撹拌等を行ってもよい。
第４混合液から多孔質シリカ粒子を除去する方法としては、遠心分離、ろ過等の各種の固液分離方法を利用できる。
【００４８】
（２”）の方法は、例えば、前記容器に溶出液を入れ、任意の時間（接触時間）保持した後、容器から排出する方法であってよい。
容器に入れる溶出液の量は、例えば複合体１００質量部に対し、１０〜１００００であってよい。
溶出液を容器内に保持している間に、撹拌等を行ってもよい。
溶出液を容器から排出させる方法としては、容器から第１混合液を排出させる方法と同様の方法が挙げられる。
【００４９】
本発明の核酸の回収方法にあっては、核酸結合用担体として、Ｄ５０が６〜５０μｍであり、細孔容積が０．６〜５ｃｍ３／ｇであり、平均細孔径が２００〜５０００Åである多孔質シリカ粒子を用いているため、核酸の長さが長い場合でも、高効率に核酸を回収できる。また、多孔質シリカ粒子に核酸を吸着または結合させ、溶出させるだけで核酸を回収でき、操作が簡便である。
前記多孔質シリカ粒子にあっては、Ｄ５０、細孔容積および平均細孔径が前記範囲内であることで、結合工程での多孔質シリカ粒子への核酸の吸着または結合効率、および溶出工程での複合体からの核酸の溶出効率が共に優れるため、核酸を高効率に回収できる。
吸着または結合効率が高い理由としては、多孔質シリカ粒子の表面に開口した細孔に核酸の一部が嵌まりやすいことが考えられる。溶出効率が高い理由としては、多孔質シリカ粒子の表面に開口した細孔によって核酸との接触面積が相対的に少なくなっていること、個々の細孔が複数箇所に開口していることで、細孔に嵌まった核酸が脱離する際に細孔内から溶出液が回り込み、核酸が脱離しやすいこと等が考えられる。
【００５０】
〔核酸回収キット〕
本発明の核酸回収キットは、上述した多孔質シリカ粒子を収容した第１の容器と、核酸を前記多孔質シリカ粒子に吸着または結合させる結合液を収容した第２の容器と、を備える。
本発明の核酸回収キットは、必要に応じて、前記多孔質シリカ粒子と前記核酸とが吸着または結合した複合体から前記核酸を溶出させる溶出液を収容した第３の容器をさらに備えていてもよい。
本発明の核酸回収キットは、必要に応じて、前記多孔質シリカ粒子と前記核酸とが吸着または結合した複合体を洗浄する洗浄液を収容した第４の容器をさらに備えていてもよい。
【００５１】
本発明の核酸回収キットは、上述した本発明の核酸の回収方法に用いることができる。例えば第１の容器に収容された多孔質シリカ粒子と、第２の容器に収容された結合液とを用いて、結合工程を実施できる。
第３の容器をさらに備えている場合は、第３の容器に収容された溶出液を用いて、溶出工程をさらに実施できる。
第４の容器をさらに備えている場合は、第４の容器に収容された洗浄液を用いて、洗浄工程をさらに実施できる。
【００５２】
第１の容器に収容された多孔質シリカ粒子を結合工程で用いる際には、多孔質シリカ粒子を第１の容器から取り出し、別の容器で結合工程を行うようにしてもよく、多孔質シリカ粒子を第１の容器内に収容したまま、第１の容器内で結合工程を行うようにしてもよい。
【００５３】
第２の容器に収容された結合液としては、結合工程で挙げた結合液が挙げられ、カオトロピック物質溶液が好ましい。
第２の容器に収容された結合液を結合工程で用いる際には、水等の溶媒で希釈してもよい。
【００５４】
第３の容器に収容された溶出液としては、溶出工程で挙げた溶出液が挙げられる。
第３の容器に収容された溶出液を溶出工程で用いる際には、水等の溶媒で希釈してもよい。
【００５５】
第４の容器に収容された洗浄液としては、洗浄工程で挙げた洗浄液が挙げられる。
第４の容器に収容された洗浄液を洗浄工程で用いる際には、水等の溶媒で希釈してもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。「％」は、特に規定のない場合、「質量％」を示す。
後述する例１〜１６のうち、例１〜１０は実施例であり、他の例は比較例である。
各例で使用した評価方法および材料を以下に示す。
【００５７】
〔評価方法〕
（粒度分布）
多孔質シリカ粒子を超音波処理によって水に充分に分散させ、レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置（日機装社製、ＭＴ−３３００ＥＸ）により測定を行い、頻度分布および累積体積分布曲線を得ることで体積基準の粒度分布を得た。得られた累積体積分布曲線からＤ１０、Ｄ５０、Ｄ９０、Ｄ９０／Ｄ１０を求めた。
【００５８】
（比表面積）
細孔分布測定装置（ｍｉｒｏｍｅｔｒｉｃｓ社製、３ＦＬＥＸ）にて、吸着ガスとして窒素ガスを用いて、吸着等温線を測定した。
細孔分布測定装置に付属の解析ソフトウェアを用い、吸着等温線における相対圧力Ｐ／Ｐ０が０．０５〜０．３０の１０点からＢＥＴ法によって比表面積を求めた。
【００５９】
（水銀ポロシメータ）
水銀ポロシメータ（ｍｉｒｏｍｅｔｒｉｃｓ社製、ＡｕｔｏＰｏｒｅ  ＩＶ９５００）を用いて細孔容積および平均細孔径の測定を行った。
水銀の物性値には接触角１４０°、表面張力４８０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ、密度１３．５３３５ｇ／ｍＬを用いた。測定条件は圧力５０ｍｍＨｇ、真空引き時間５分、注入圧力１．４９ｐｓｉ、平衡時間１０秒とした。
【００６０】
〔材料〕
多孔質シリカ粒子１：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：Ｌ−５２。
多孔質シリカ粒子２：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：ＥＰ−ＤＭ−１０−１０００ＡＷ。
多孔質シリカ粒子３：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：ＥＰ−ＤＭ−１０−７００ＡＷ。
多孔質シリカ粒子４：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：ＥＰ−ＤＭ−２０−１０００ＡＷ。
多孔質シリカ粒子５：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：Ｌ−２０３。
多孔質シリカ粒子６：大阪ソーダ社製、型番：ＳＰ−１０００−１０。
多孔質シリカ粒子７：大阪ソーダ社製、型番：ＳＰ−１０００−２０。
多孔質シリカ粒子８：大阪ソーダ社製、型番：ＳＰ−２０００−２０。
多孔質シリカ粒子９：富士シリシア社製、型番：ＳＭＢ１０００−１０。
多孔質シリカ粒子１０：富士シリシア社製、型番：ＳＭＢ１０００−２０。
多孔質シリカ粒子１１：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：ＥＰ−ＤＦ−５−１０００ＡＷ２。
多孔質シリカ粒子１２：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：ＮＰ−２００。
多孔質シリカ粒子１３：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：Ｄ−７５−１０００ＡＷ。
多孔質シリカ粒子１４：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：Ｄ−１５０−１０００ＡＷ。
多孔質シリカ粒子１５：ＡＧＣエスアイテック社製、型番：Ｄ−２５０−１０００ＡＷ。
【００６１】
結合液：核酸抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、品名：ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ｔｉｓｕｅ  ｋｉｔ）に付属の吸着バッファー（組成：５０ｍＭトリス−塩酸塩、５．０Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．２％ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニレンエーテル）。
洗浄液１：前記核酸抽出キットに付属の洗浄バッファー１。
洗浄液２：前記核酸抽出キットに付属の洗浄バッファー２。
溶出液：前記核酸抽出キットに付属の溶出バッファー。
ヒトゲノム溶液：プロメガ社製、製品名ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｇ３０４１、長さおよそ３×１０９塩基対のＤＮＡを含有、ＤＮＡ濃度２００μｇ／ｍＬ。
大腸菌ゲノム溶液：シグマアルドリッチ社製、製品名ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて大腸菌ＤＨ５αの培養液を処理して調整した、長さおよそ４．６５×１０６塩基対のＤＮＡを含有、ＤＮＡ濃度５０μg／ｍＬ。
【００６２】
チップカラム：２本のピペットチップ（ＢｉｏＰｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、品名：Ｐｉｐｅｔｔｅ  ｔｉｐ  １２５０μｌ）をそれぞれ周方向に沿って２つに切断し、ピペットチップの先端を含む部分（以下、部分Ａともいう。）と、ピペットチップの後端を含む部分（以下、部分Ｂともいう。）とを得た。このとき、２本のピペットチップそれぞれの切断位置（先端から切断位置までの距離）を変えた。ピペットチップは、先端に向かって直径が小さくなっているため、２つのピペットチップそれぞれの切断位置における内径は異なっている。
２本のピペットチップそれぞれから得た２つの部分Ａのうち長さが長い方（切断位置の内径が大きい方）の部分Ａの後端の開口を、孔径１μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルタで覆った。その状態で部分Ａを先端側から、２つの部分Ｂのうち長さが長い方（切断位置の内径が小さい方）の部分Ｂの後端の開口からその内側に挿入し、部分Ａの後端部分およびフィルタの外縁部分が部分Ｂの先端部分に係止された状態とした。これをチップカラムとして用いた。
【００６３】
〔例１〜１５〕
試料としてヒトゲノム溶液または大腸菌ゲノム溶液を使用し、以下の手順で試料からの核酸の回収を行い、核酸（ＤＮＡ）の回収率を求めた。結果を表１に示す。
まず、容量１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、試料２２０μＬ、結合液２００μＬおよび１００％エタノール２００μＬを加え、混合して第１混合液を得た。
次に、第１混合液６２０μＬに表１に示す多孔質シリカ粒子２０ｍｇを加え、混合して第２混合液を得た。
次に、第２混合液の全量をチップカラムに移し、遠心分離機を使用して３５００ｒｐｍ、２分間、２０℃の条件で遠心分離することにより、多孔質シリカ粒子をチップカラムのフィルタ上に集めた。
次に、ろ過液を捨て、チップカラムに洗浄液１の５００μＬを加え、前記と同様の条件で遠心分離した。次に、ろ過液を捨て、チップカラムに洗浄液２の５００μＬを加え、前記と同様の条件で遠心分離した。その後、ろ過液を捨て、３５００ｒｐｍ、７分間、２０℃の条件で遠心分離した。
次に、前記チップカラムに溶出液の２００μＬを加え、１分間放置したのち、３５００ｒｐｍ、２分間、２０℃の条件で遠心分離した。得られたろ過液を核酸抽出液とした。
【００６４】
核酸抽出液中のＤＮＡ濃度を、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＱｕｂｉｔ  ａｓｓａｙを用いて、そのプロトコルに従って測定した。具体的には核酸抽出液の１μＬに対してＷｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの １９９μＬを加え、２〜３秒間ボルテックスし、室温で２分間反応させたのち、Ｑｕｂｉｔ  ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒにてＤＮＡ濃度を測定した。
測定されたＤＮＡ濃度から、核酸抽出液中のＤＮＡの質量Ｗ１（ｇ）を算出した。この値と、用いた試料（２２０μＬ）中のＤＮＡの質量Ｗ２（ｇ）から、以下の式によりＤＮＡ回収率を求めた。
ＤＮＡ回収率（％）＝Ｗ１／Ｗ２×１００
【００６５】
〔例１６〕
試料としてヒトゲノム溶液または大腸菌ゲノム溶液を使用し、シリカメンブレンを備えた市販の核酸抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、品名：ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ｔｉｓｕｅ  ｋｉｔ、）を用いて、そのプロトコルに従って核酸を抽出し、核酸抽出液を得た。
得られた核酸抽出液について、例１〜１５と同様にしてＤＮＡ回収率を、以下の手順で試料からの核酸の回収を行い、核酸（ＤＮＡ）の回収率を求めた。結果を表１に示す。
【００６６】
例１〜１５で用いた多孔質シリカ粒子のＤ１０、Ｄ５０、Ｄ９０、Ｄ９０／Ｄ１０、シリカ（ＳｉＯ２）純度、比表面積、細孔容積、平均細孔径を表１に示す。なお、シリカ純度については、多孔質シリカ粒子２〜４、１１〜１２のみ測定したが、他の多孔質シリカ粒子のシリカ純度もいずれも９８質量％以上とみられる。
また、例１〜１５における、ヒトゲノム溶液を試料としたときのＤＮＡ回収率を縦軸に、多孔質シリカ粒子のＤ５０、Ｄ９０／Ｄ１０、細孔容積、平均細孔径または比表面積（ＳＳＡ）を横軸にとったグラフを図１〜５に示す。各グラフにおいて、例１〜１０の結果は実施例として、例１１〜１５の結果は比較例として示した。
【００６７】
【表１】
2020191784.tif 000002
【００６８】
例１〜１０では、高効率に核酸を回収できた。
一方、例１１では、多孔質シリカ粒子のＤ５０が６μｍ未満であるため、核酸回収効率が劣っていた。例１２では、多孔質シリカ粒子の細孔容積が０．６ｃｍ３／ｇ未満、平均細孔径が２００Å未満であるため、核酸回収効率が劣っていた。例１３〜１５では、多孔質シリカ粒子のＤ５０が５０μｍ超であるため、核酸回収効率が劣っていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2020191784.tif 000006
【図５】
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