(57)【要約】【課題】ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に簡便に形成する方法を提供する。【解決手段】ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法であって、前記光重合性脂質を含むベシクルを前記光重合性脂質の相転移温度よりも１０℃以上高い温度に加熱して機械的ストレスをかけ、前記相転移温度よりも５℃以上低い温度の支持体に適用することを特徴とする、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法であって、前記光重合性脂質を含むベシクルを前記光重合性脂質の相転移温度よりも１０℃以上高い温度に加熱して機械的ストレスをかけ、前記相転移温度よりも５℃以上低い温度の支持体に適用することを特徴とする、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法。
【請求項２】
ジアセチレン基を持つ光重合性脂質が、下記式
【化１】
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で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記気体的ストレスが超音波処理である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質がコレステロールを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜の一部に光を照射してジアセチレン基を持つ光重合性脂質を重合させることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベシクル融合法による脂質二分子膜の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、固体基板表面上に吸着した光重合性脂質二分子膜を光リソグラフィー技術でパターン化重合し、界面活性剤によるモノマー除去後に別の脂質二分子膜を組み込むことで、ポリマー脂質二分子膜と流動性を持った脂質二分子膜を組み合わせたハイブリッド膜を作製する技術を開発した（図1，特許文献1、非特許文献1）。このようなパターン
化人工生体膜は、生体分子を固定化し、生体膜機能を再現する新しいバイオチップ、バイオセンサーなどの材料となり得る可能性を持つ。
【０００３】
光重合性モノマーを基板上に二分子膜として累積する手法としては、Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer(LB/LS)法及びベシクル融合法がある(図２)。ベシクル融合法は、構造の柔軟性がある(柔らかい)脂質二分子膜の作製には適しており、同手法を用いて重合性脂質二分子膜を固体基板上に作製した例も報告されているが、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質のモノマーは、室温では固相状態である硬い脂質であるので、ベシクル融合法による膜形成が困難であり、これまでLB/LS法による脂質二分子膜の作製が行われてきた(非特許文献２)。しかし、LB/LS法には、作製に時間がかかる、膜の移し取りの際に欠陥が多く生じる、曲面への膜形成が不可能である、などの問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第4150793号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Morigaki, K., Baumgart, T., Offenhausser, A. & W., K. Patterning solid-supported lipid bilayer membranes by lithographic polymerization of a diacetylene lipid. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 40, 172-174 (2001).
【非特許文献２】Eric E. Ross, Lynn J. Rozanski, Tony Spratt, Sanchao Liu, David F. O'Brien, and S. Scott Saavedra, Planar supported lipid bilayer polymers formed by vesicle fusion. 1. Influence of diene monomer structure and polymerization method on film properties, Langmuir, 19, 1752-1765 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に簡便に形成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を、ベシクル融合法を用いて簡便に作製できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下のジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法を提供するものである。
項１．  ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法であって、前記光重合性脂質を含むベシクルを前記光重合性脂質の相転移温度よりも１０℃以上高い温度に加熱して機械的ストレスをかけ、前記相転移温度よりも５℃以上低い
温度の支持体に適用することを特徴とする、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に形成する方法。
項２．  ジアセチレン基を持つ光重合性脂質が、下記式
【０００９】
【化１】
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【００１０】
で表される化合物である、項１に記載の方法。
項３．  前記機械的ストレスが超音波処理である、項１に記載の方法。
項４．  前記脂質がコレステロールを含む、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．  ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜の一部に光を照射してジアセチレン基を持つ光重合性脂質を重合させることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、以下の効果が得られる。
(1)ジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を支持体上に容易かつ短時間
で作製することができる。
(2) 脂質二分子膜を支持体上に形成したときの欠陥が少ない。
(3)硬い脂質であるジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を曲率を有す
る支持体表面に形成することができる。
(4)インクジェットなどの塗布機構を用いて脂質二分子膜を支持体上に形成することがで
きる。
(5)複数種の脂質もしくは界面活性剤を混合して塗布し、膜構造を制御することが可能で
ある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】パターン化ハイブリッド膜形成手法の概念図。（Ａ）基板上に重合性脂質（モノマー）の二分子膜を吸着させる(LB/LS法)。（Ｂ）光重合。この際マスクによって膜の一部を光反応から保護する。（Ｃ）光重合反応から保護されたモノマー分子を界面活性剤もしくは有機溶媒によって基板上から除去する。（Ｄ）流動性を持った新しい脂質二分子膜の導入。
【図２】LB/LS法による固体支持体上におけるジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜の作製。
【図３】ベシクル融合法による固体支持体上におけるジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜の作製。
【図４】LB/LS法およびベシクル融合法により作製したポリマー脂質二分子膜の傾向顕微鏡写真。（A）LB/LS法、（B）ベシクル融合法、（C）ベシクル融合法(コレステロールをDiynePCに５％添加)。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明では、図３に示すようにジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含むベシクルを形成して支持体上に適用し（A）、基板とベシクルとの相互作用によりベシクル構造が自発
的に部分的に破壊し（B）、脂質二分子膜を形成し（C）、この操作を繰り返すことにより連続したジアセチレン基を持つ光重合性脂質を含む脂質二分子膜を形成する（D）。
【００１４】
ジアセチレン基を有する光重合性脂質としては、例えば下記のDiynePCが例示できる。
【００１５】
【化２】
2010163471.tif 000004
【００１６】
上記式のDiynePCにおいて、ジアセチレン基は炭化水素鎖の中央に位置するが、このジ
アセチレン基は炭化水素鎖のいずれの位置にあってもよく、例えばいずれかの末端側に存在していてもよい。ジアセチレン基は炭素数１０〜３０、好ましくは１４〜２８、より好ましくは１８〜２６の脂肪酸に組み込まれ、この脂肪酸が２個グリセロール基とエステルを形成してジアセチレン基を持つ光重合性脂質となる。親水性部位としては、リン酸にエステル結合したコリン基が想定されるが、コリン基の代わりにエタノールアミン基など他の親水性部位を含んでいても良い。
【００１７】
本発明で用いる脂質二分子膜は、上記のジアセチレン基を有する重合性脂質が主成分となるものであるが、脂質二分子膜の重合を可能にする範囲で、他の脂質を含んでいてもよい。このような脂質としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ステロイドなどが例示される。
【００１８】
本発明のベシクルには、コレステロールを配合することが、均一かつ欠陥の少ない脂質膜を形成するために好ましい。コレステロールの配合量としては、３０質量％以下、例えば１〜２０質量％、特に３〜１０質量％が挙げられる。コレステロールは、基板表面における脂質膜形成、および重合性脂質の重合後の界面活性剤処理により膜から除去される。
【００１９】
脂質二分子膜は、通常二分子膜が使用されるが単分子膜を使用することもできる。
【００２０】
脂質二分子膜に組み込むことができる生体材料としては、蛋白質、多糖、糖タンパク、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの高分子、あるいはペプチド、ステロイド、リン脂質、スフィンゴ脂質などの分子量２０００以下の低分子物質が例示される。
【００２１】
ジアセチレン基を持つ光重合性脂質の重合の反応式を以下に示す。
【００２２】
【化３】
2010163471.tif 000005
【００２３】
上記のように、重合は、ジアセチレン基が隣接した状態で起こるため、光重合性脂質に組み込まれる２つのジアセチレン基含有脂肪酸は同一のものであるか、少なくともジアセチレン基は隣接する位置に存在することが好ましい。
【００２４】
本発明において、機械的ストレスとは、相転移温度以上において液晶状態にある脂質二分子膜を破砕しベシクルサイズを数十ナノメートルにするものであればよく、例えば超音波処理、ホモジナイズ、撹拌、振盪、高圧または低圧濾過などが挙げられ、好ましくは超音波処理が挙げられる。
【００２５】
本発明では、ベシクルを含む溶液をジアセチレン基を持つ光重合性脂質のガラス転移点より１０℃以上高い温度に加熱する。この加熱は、光重合性脂質を含む脂質二分子膜を液晶状態にし、数十ナノメートルのサイズに機械的に破砕した後、基板表面においてベシクル融合を自発的に起こさせるために必要である。例えば上記DiynePCのガラス転移点は３
８℃であるので、加熱は４８℃以上、好ましくは５０℃以上で行う。
【００２６】
支持体としては、ガラス、プラスチック、セラミック、金属などが挙げられ、その形状は平板であっても曲線状であってもよい。支持体の温度は、ジアセチレン基を持つ光重合性脂質のポリマーのガラス転移点より５℃以上低くする。例えば上記DiynePCの脂質二分
子膜のガラス転移点は３８℃であるので、基板の温度は３３℃以下、好ましくは１０℃以下とする。ガラス転移点はジアセチレン基を持つ光重合性脂質により異なるため、脂質に応じて好ましい温度が用いられる。
【００２７】
得られた脂質二分子膜は、常法に従い光照射してパターン化されたポリマーを形成することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１
1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine （以下DiynePC と略す）を約10mg丸底フラスコに計量する。超純水を加え3mMの濃度にする。液体窒素と湯浴60℃
に交互に5回入れる（freeze&thaw）。溶解した状態のDiynePCを撹拌し、プラスチックチ
ップに600マイクロリットル計量する。超音波攪拌装置（プローブ型）で30sec×2回超音
波破砕する。インターバルは20secとする。ソニケーション後は60℃湯浴に入れておく。
ベシクル融合を行う基板材料としては、洗浄されたシリコンウェーハーが例としてあげられる。基板を冷却するため、氷浴を用意しその上にシャーレを置く。シャーレが氷水にしっかり漬かっている事を確認する。氷浴内の水がシャーレ内に入らないよう注意する。基板はシャーレ内に入れる前にUV／OZONEクリーナーにて洗浄すると良い。湯浴内のDiynePC懸濁液を50マイクロリットル計り、冷却した基板表面に塗布する。基板のサイズにより、場所をずらして塗布を繰り返す（基板表面温度の上昇をさけるため、約１分間のインターバルを設けることが好ましい）。１分間のインキュベーション後に超純水で基板をリンス
し、基板表面に付着していない脂質膜を除去する。
基板表面に付着したDiynePC二分子膜は、常に水溶液中に保たれる。脂質膜の光重合を行
うにあたり、溶液中の酸素を除くために不活性ガス（アルゴンもしくは窒素）をパージした水溶液をポンプにより循環する。充分に脱気が行われた後に紫外光照射を300 nm 以下
の波長に強い輝線を持つ深紫外光露光ランプを用いて行う。その際、干渉フィルターもしくはレーザー用干渉ミラーを用いて光化学反応に最も有効である250 nm 付近の光を選択
的に照射する。また、特定のパターンを転写するためには、基板を脂質膜が上面になるようにして水平に置きその上にマスクをのせる。なお、この段階においても膜およびマスクは水溶液中にある。また、露光中は振動をできるだけ少なくするためにポンプを停止する。紫外光照射時間を変えることにより膜に照射される光量を制御する。
【００２９】
光重合に好適な条件の例
温度    ：    室温
照射波長：深紫外用光源 USHIO UVE-502SD を用い、300 nm以下の紫外光を照射した。
照射光強度：   10 mW/cm2 (254 nm)
照射時間：    ５００  秒
照射光強度（照射光量）：  照射光量 5.0 J/cm2
以上の過程により、図４（Ｂ）に示されるポリマー脂質二分子膜が形成された。
【００３０】
実施例２
DiynePCおよびコレステロール混合膜の作製：
DiynePCを13.7mg、コレステロールを2.9mg同一の丸底フラスコに計量する。丸底フラスコにクロロホルムを約2mL加え、DiynePCおよびコレステロールを均一に溶解し混合する。クロロホルムを除去するため、窒素を約１５分間吹きつけ、その後真空デシケーターで４時間乾燥する。その後、超純水を加え脂質を水和する（DiynePCおよびコレステロールの最
終濃度は3mMと0.15mM：コレステロールは、DiynePCの５％）。丸底フラスコを液体窒素と湯浴60℃に交互に5回入れる（freeze&thaw）。溶解した状態のDiynePCを撹拌し、プラス
チックチップに600マイクロリットル計量する。超音波攪拌装置（プローブ型）で30sec×2回超音波破砕する。インターバルは20secとする。ソニケーション後は60℃湯浴に入れておく。
ベシクル融合を行う基板材料としては、洗浄されたシリコンウェーハーが例としてあげられる。基板を冷却するため、氷浴を用意しその上にシャーレを置く。シャーレが氷水にしっかり漬かっている事を確認する。氷浴内の水がシャーレ内に入らないよう注意する。基板はシャーレ内に入れる前にUV／OZONEクリーナーにて洗浄すると良い。湯浴内のDiynePC懸濁液を50マイクロリットル計り、冷却した基板表面に塗布する。基板のサイズにより、場所をずらして塗布を繰り返す（基板表面温度の上昇をさけるため、約１分間のインターバルを設けることが好ましい）。１分間のインキュベーション後に超純水で基板をリンスし、基板表面に付着していない脂質膜を除去する。
基板表面に付着したDiynePC二分子膜は、常に水溶液中に保たれる。脂質膜の光重合を行
うにあたり、溶液中の酸素を除くために不活性ガス（アルゴンもしくは窒素）をパージした水溶液をポンプにより循環する。充分に脱気が行われた後に紫外光照射を300 nm 以下
の波長に強い輝線を持つ深紫外光露光ランプを用いて行う。その際、干渉フィルターもしくはレーザー用干渉ミラーを用いて光化学反応に最も有効である250 nm 付近の光を選択
的に照射する。また、特定のパターンを転写するためには、基板を脂質膜が上面になるようにして水平に置きその上にマスクをのせる。なお、この段階においても膜およびマスクは水溶液中にある。また、露光中は振動をできるだけ少なくするためにポンプを停止する。紫外光照射時間を変えることにより膜に照射される光量を制御する。
【００３１】
光重合に好適な条件の例
温度    ：    室温
照射波長：深紫外用光源 USHIO UVE-502SD を用い、300 nm以下の紫外光を照射した。
照射光強度：   10 mW/cm2 (254 nm)
照射時間：    ５００  秒
照射光強度（照射光量）：  照射光量 5.0 J/cm2
以上の過程により、図４（Ｃ）に示されるポリマー脂質二分子膜が形成された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、以下の応用が考えられる。
・脂質二分子膜に膜蛋白を固定化して、創薬スクリーニングに用いる。
・ポリマー脂質二分子膜表面に生体分子を結合させて、非特異的吸着を抑制させることにより、臨床検査などに用いる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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