(57)【要約】【課題】消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供する。【解決手段】消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法であって、前記癌患者由来の生体試料中の、Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｋａｚａｌ  Ｔｙｐｅ  ４（ＳＰＩＮＫ４）遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ又は前記タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法の適用の有効性が低いことを示す、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法であって、
前記癌患者由来の生体試料中の、Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｋａｚａｌ  Ｔｙｐｅ  ４（ＳＰＩＮＫ４）遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定することを含み、
前記ｍＲＮＡ又は前記タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法の適用の有効性が低いことを示す、方法。
【請求項２】
前記生体試料が、腫瘍組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質に対する特異的結合物質を含む、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定するためのキット。
【請求項４】
ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤。
【請求項５】
請求項４に記載の消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、消化器癌治療用キット。
【請求項６】
消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下でＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性を測定すること、を含み、
前記プロテアーゼ活性が、前記被験物質の非存在下におけるＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性と比較して低下することが、前記被験物質が消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法に関する。より具体的には、本発明は、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定するためのキット、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤、消化器癌治療用キット、及び、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、癌細胞を認識するＴ細胞を誘導する癌免疫療法により、進行期の固形癌でも治癒が可能であることが示されている。癌免疫療法の一つが、抗ＰＤ−１抗体等の免疫チェックポイント阻害薬を用いた治療法であり、悪性黒色腫や肺癌をはじめとする多数の癌腫で明らかな臨床効果を示している。しかしながら、大腸癌等の消化器癌における免疫チェックポイント阻害薬の奏効率は極めて低いことが知られている。
【０００３】
ところで、Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｋａｚａｌ  Ｔｙｐｅ（ＳＰＩＮＫ）遺伝子ファミリーは、セリアック病という自己免疫疾患へのかかりやすさに関係している遺伝子であることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wapenaar M. C., et al., The SPINK gene family and celiac disease susceptibility, Immunogenetics, 59, 349-357, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する技術が求められている。しかしながら、非特許文献１には、ＳＰＩＮＫ遺伝子ファミリーと消化器癌との関連については一切記載されていない。本発明は、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法であって、前記癌患者由来の生体試料中の、Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  Ｋａｚａｌ  Ｔｙｐｅ  ４（ＳＰＩＮＫ４）遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ又は前記タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法の適用の有効性が低いことを示す、方法。
［２］前記生体試料が、腫瘍組織である、［１］に記載の方法。
［３］ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質に対する特異的結合物質を含む、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定するためのキット。
［４］ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤。
［５］［４］に記載の消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、消化器癌治療用キット。
［６］消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性を測定すること、を含み、前記プロテアーゼ活性が、前記被験物質の非存在下におけるＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性と比較して低下することが、前記被験物質が消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤であることを示す、方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１の結果を示すグラフである。
【図２】実験例２の結果を示すグラフである。
【図３】実験例３の結果を示すグラフである。
【図４】実験例４の結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５の結果を示すグラフである。
【図６】実験例６における代表的な免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図７】実験例７の結果を示すグラフである。
【図８】実験例８の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法］
１実施形態において、本発明は、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法であって、前記癌患者由来の生体試料中の、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定することを含み、前記ｍＲＮＡ又は前記タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多いことが、前記癌患者への癌免疫療法の適用の有効性が低いことを示す、方法を提供する。
【００１０】
主要なＳＰＩＮＫ遺伝子ファミリーメンバー（ＳＰＩＮＫ１、２、４、５）は、上皮細胞や粘膜組織のタンパク質分解に対する保護に関わっている。なかでも、ＳＰＩＮＫ４タンパク質は、杯細胞、単球、中枢神経系で発現が認められるタンパク質であることが知られている。杯細胞とは、粘液分泌性の単細胞腺であり、腸絨毛において吸収上皮細胞間に、気道粘膜においては多列繊毛上皮間に散在している細胞である。
【００１１】
実施例において後述するように、発明者らは、ヒト及びマウスにおいて、癌細胞によるＳＰＩＮＫ４遺伝子又はタンパク質の発現が上昇すると、癌免疫療法の適用の有効性が低下することを明らかにした。
【００１２】
したがって、消化器癌患者由来の生体試料中の、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも多い場合、前記癌患者への癌免疫療法の適用の有効性が低いと判断することができる。消化器癌としては特に限定されないが、特に、大腸癌、胃癌等が挙げられる。
【００１３】
ヒトＳＰＩＮＫ４遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０１４４７１．３であり、ヒトＳＰＩＮＫ４タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０５５２８６．１である。また、マウスＳＰＩＮＫ４遺伝子のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０１１４６３．２であり、マウスＳＰＩＮＫ４タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０３５５９３．２である。
【００１４】
本実施形態の方法において、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質は、消化器癌患者（又は患畜）と同種であるｍＲＮＡ又はタンパク質を検出することが好ましく、ヒトの癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する場合には、ヒトＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はヒトＳＰＩＮＫ４タンパク質を検出することが好ましい。
【００１５】
本実施形態の方法において、生体試料としては腫瘍組織が好ましい。また、対照の生体試料としては、例えば、癌免疫療法の適用が有効であることが予め確認されている患者由来の腫瘍組織、健常者における前記腫瘍組織に対応する組織由来の試料等を用いることができる。
【００１６】
また、本実施形態の方法を実施するたびに対照の生体試料を用意する必要はなく、あらかじめ対照の生体試料中における、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定しておき、当該測定値を、癌患者由来の生体試料中における、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量と比較してもよい。
【００１７】
ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡの存在量の測定方法は特に限定されず、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＴ、ＤＮＡマイクロアレイ解析等により行うことができる。
【００１８】
また、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量の測定方法は特に限定されず、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローストリップ法、プロテインチップ等により行うことができる。
【００１９】
本実施形態の方法において、癌免疫療法としては、免疫チェックポイント阻害薬の投与、サイトカイン療法、養子免疫療法、癌ワクチン療法等が挙げられる。養子免疫療法としては、体外で培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与する治療法、癌抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子導入Ｔ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）を投与する治療法、キメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を投与する治療法等が挙げられる。
【００２０】
免疫チェックポイント阻害薬としては、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体等が挙げられる。抗ＰＤ−１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、例えば、イピリムマブ等が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ等が挙げられる。
【００２１】
［消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定するためのキット］
１実施形態において、本発明は、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーセット、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質に対する特異的結合物質を含む、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定するためのキットを提供する。
【００２２】
本実施形態のキットにより、上述した、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する方法を実施することができる。
【００２３】
プライマーセットとしては、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。
【００２４】
また、プローブとしては、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
【００２５】
また、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。特異的結合物質は、ＳＰＩＮＫ４タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００２６】
［消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤］
１実施形態において、本発明は、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬を有効成分として含有する、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤を提供する。
【００２７】
実施例において後述するように、癌細胞におけるＳＰＩＮＫ４遺伝子又はタンパク質の発現を抑制することにより、癌免疫療法の有効性を向上することができる。したがって、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬を、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤の用途に用いることができる。
【００２８】
本実施形態の向上剤において、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬とは、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の機能を阻害する物質であれば特に限定されない。より具体的には、例えば、ＳＰＩＮＫ４遺伝子の転写又は翻訳を阻害する物質、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬等が挙げられる。ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬は低分子化合物であってもよい。
【００２９】
ＳＰＩＮＫ４遺伝子の転写又は翻訳を阻害する物質の具体例としては、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡに対する阻害性核酸が挙げられる。また、阻害性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。ヒトＳＰＩＮＫ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡの具体的な標的配列としては、例えば配列番号２〜４に示すものを例示することができる。
【００３０】
ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬としては、ＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性を阻害する物質等が挙げられる。
【００３１】
［消化器癌治療用キット］
１実施形態において、本発明は、上述した癌免疫療法の有効性の向上剤と、抗癌剤とを含む、消化器癌治療用キットを提供する。
【００３２】
消化器癌患者に、上述した癌免疫療法の有効性の向上剤と抗癌剤とを組み合わせて投与することにより、癌免疫療法の有効性（治療効果）を向上させることができる。ここで、癌免疫療法の有効性（治療効果）としては、腫瘍体積が縮小すること、生存期間が延長すること、無増悪生存率が上昇すること等が挙げられる。本実施形態のキットにおいて、癌免疫療法の有効性の向上剤と抗癌剤とは、別々に患者に投与してもよいし、混合して患者に投与してもよい。
【００３３】
抗癌剤としては、癌免疫療法に用いられる薬物等が挙げられ、例えば、免疫チェックポイント阻害薬、サイトカイン療法に用いられるサイトカイン、養子免疫療法に用いられる細胞、癌ワクチン療法に用いられるワクチン等が挙げられる。
【００３４】
免疫チェックポイント阻害薬としては上述したものと同様であり、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ等が挙げられる。サイトカイン療法に用いられるサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−２、ＩＦＮ−γ等が挙げられる。養子免疫療法に用いられる細胞としては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）、キメラ抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）等が挙げられる。癌ワクチン療法に用いられるワクチンとしては、ペプチドワクチン、樹状細胞ワクチン等が挙げられる。
【００３５】
［消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性を測定すること、を含み、前記プロテアーゼ活性が、前記被験物質の非存在下におけるＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性と比較して低下することが、前記被験物質が消化器癌患者への癌免疫療法の有効性の向上剤であることを示す、方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法により、消化器患者に対する癌免疫療法の有効性の向上剤をスクリーニングすることができる。
【００３６】
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００３７】
まず、被験物質の存在下で、ＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性を測定する。本工程は、精製されたＳＰＩＮＫ４タンパク質を用いて試験管内で実施してもよいし、ＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入した細胞等を用いて実施してもよい。
【００３８】
ＳＰＩＮＫ４のプロテアーゼ活性は、例えば、ＳＰＩＮＫ４タンパク質と、ＳＰＩＮＫ４のプロテアーゼ活性により分解されると蛍光を発するペプチド基質を反応させること等により測定することができる。その結果、被験物質の存在下におけるＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性が、被験物質の非存在下におけるＳＰＩＮＫ４タンパク質のプロテアーゼ活性と比較して低下した場合、当該被験物質は癌免疫療法の有効性の向上剤又はその候補である。
【００３９】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、消化器癌患者由来の生体試料中の、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定することと、前記ｍＲＮＡ又は前記タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量と同等以下である場合に、前記癌患者に癌免疫療法を適用することと、を含む、消化器癌の治療方法を提供する。
【００４０】
１実施形態において、本発明は、消化器癌患者由来の生体試料中の、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のｍＲＮＡ又はＳＰＩＮＫ４タンパク質の存在量を測定することと、前記ｍＲＮＡ又は前記タンパク質の存在量が、対照の生体試料中における存在量よりも高い場合に、前記癌患者に、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬及び抗癌剤を投与することと、を含む、癌の治療方法を提供する。
【００４１】
１実施形態において、本発明は、消化器癌の治療のためのＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬を提供する。
【００４２】
１実施形態において、本発明は、消化器癌の治療薬を製造するためのＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬の使用を提供する。
【００４３】
これらの各実施形態において、生体試料、対照、癌免疫療法、抗癌剤、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の阻害薬については上述したものと同様である。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
［実験例１］
（種々のヒト癌組織におけるＳＰＩＮＫ４の発現量の検討）
公開データベースＯｎｃｏｍｉｎｅ（https://www.oncomine.org/）を用いて、各癌組織でのＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現量を比較した。図１は解析結果を示すグラフである。図１中、横軸は、Ｓｐｉｎｋ４が各々の癌種において、それ以外の他の癌種と比べて発現量が何倍であったか（相対値）を示す。
【００４６】
その結果、大腸癌、胃癌等の消化器癌において、ＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現量が高い症例が存在することが明らかとなった。
【００４７】
［実験例２］
（癌細胞におけるＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現とＴ細胞による殺傷の検討１）
癌抗原であるＭＡＲＴ−１に特異的なＴ細胞レセプター遺伝子を強制発現した抗腫瘍Ｔ細胞と、ＭＡＲＴ−１のエピトープペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））をパルスした大腸癌細胞株を共培養し、Ｔ細胞によって殺傷された大腸癌細胞の割合を測定した。
【００４８】
大腸癌細胞株としては、ヒト大腸癌細胞株であるｃｏｌｏ２０１細胞を使用した。また、比較のために、ｃｏｌｏ２０１細胞にＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入してＳＰＩＮＫ４を強制発現させた細胞についても同様の検討を行った。
【００４９】
図２は、結果を示すグラフである。図２中、横軸は共培養時のＴ細胞（Ｅ）と癌細胞（Ｔ）の比を示し、縦軸は、Ｔ細胞によって殺傷された大腸癌細胞の割合を示す。また、「ｃｏｌｏ２０１−ＳＰＩＮＫ４」はＳＰＩＮＫ４を強制発現したｃｏｌｏ２０１細胞の結果であることを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００５で有意差があったことを示す。
【００５０】
その結果、ｃｏｌｏ２０１細胞と比較して、ＳＰＩＮＫ４強制発現細胞はＴ細胞の攻撃に対して耐性となったことが明らかとなった。この結果は、ＳＰＩＮＫ４遺伝子又はタンパク質の発現が上昇した癌細胞は、癌免疫療法の適用の有効性が低いことを示すものである。
【００５１】
［実験例３］
（癌細胞におけるＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現とＴ細胞による殺傷の検討２）
癌抗原であるＭＡＲＴ−１に特異的なＴ細胞レセプター遺伝子を強制発現した抗腫瘍Ｔ細胞と、ＭＡＲＴ−１のエピトープペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））をパルスした大腸癌細胞株を共培養し、Ｔ細胞によって殺傷された大腸癌細胞の割合を測定した。
【００５２】
大腸癌細胞株としては、ＳＰＩＮＫ４陽性のヒト大腸癌細胞株であるＨＴ２９にＨＬＡ−Ａ２を強制発現させたＨＴ２９−Ａ２細胞を使用した。また、比較のために、ＳＰＩＮＫ４遺伝子を、配列番号２に示す塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＳＰＩＮＫ４＃１」という場合がある。）でノックアウトしたＨＴ２９−Ａ２細胞株、配列番号３に示す塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＳＰＩＮＫ４＃２」という場合がある。）でノックアウトしたＨＴ２９−Ａ２細胞株についても同様の検討を行った。
【００５３】
図３は、結果を示すグラフである。図３中、横軸は共培養時のＴ細胞（Ｅ）と癌細胞（Ｔ）の比を示し、縦軸は、Ｔ細胞によって殺傷された大腸癌細胞の割合（％）を示す。また、「ＨＴ２９−Ａ２」はＨＴ２９−Ａ２細胞の結果であることを示し、「＃１」はｓｉＳＰＩＮＫ４＃１でＳＰＩＮＫ４遺伝子をノックアウトしたＨＴ２９−Ａ２細胞株の結果であることを示し、「＃２」はｓｉＳＰＩＮＫ４＃２でＳＰＩＮＫ４遺伝子をノックアウトしたＨＴ２９−Ａ２細胞株の結果であることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があったことを示す。
【００５４】
その結果、ＨＴ２９−Ａ２細胞と比較して、ＳＰＩＮＫ４遺伝子のノックアウト株は、Ｔ細胞の攻撃に対し感受性が上昇したことが明らかとなった。この結果は、ＳＰＩＮＫ４遺伝子又はタンパク質の発現を低下させることにより、癌細胞に対する癌免疫療法の適用の有効性を向上させることができることを示すものである。
【００５５】
［実験例４］
（癌細胞におけるＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現とパーフォリン及びグランザイムＢの影響の検討）
ヒト大腸癌細胞株であるＤＬＤ−１細胞にＳＰＩＮＫ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入し、パーフォリン及びグランザイムＢの影響を検討した。なお、パーフォリン及びグランザイムＢは、細胞傷害性Ｔ細胞やナチュラルキラーＴ細胞が分泌し、細胞傷害活性を発現する因子であることが知られている。
【００５６】
ｓｉＲＮＡとしては、ｓｉＳＰＩＮＫ４＃１（標的配列を配列番号２に示す。）、ｓｉＳＰＩＮＫ４＃２（標的配列を配列番号３に示す。）、ｓｉＳＰＩＮＫ４＃３（標的配列を配列番号４に示す。）を使用した。また、対照として、スクランブルＲＮＡを導入した細胞についても同様の検討を行った。
【００５７】
図４は、結果を示すグラフである。図４中、「ｓｃｒ」はスクランブルＲＮＡを導入した細胞の結果であることを示し、「ｓｉＳＰＩＮＫ４＃１」はｓｉＳＰＩＮＫ４＃１を導入した細胞の結果であることを示し、「ｓｉＳＰＩＮＫ４＃２」はｓｉＳＰＩＮＫ４＃２を導入した細胞の結果であることを示し、「ｓｉＳＰＩＮＫ４＃３」はｓｉＳＰＩＮＫ４＃３を導入した細胞の結果であることを示す。また、ＳＰＩＮＫ４の発現が「＋」であるものは、スクランブルＲＮＡを導入した細胞の結果であることを示し、ＳＰＩＮＫ４の発現が「−」であるものは、ＳＰＩＮＫ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果であることを示す。また、パーフォリンが「＋」であるものは、培地中にパーフォリンを添加した結果であることを示し、パーフォリンが「−」であるものは、培地中にパーフォリンを添加しなかった結果であることを示す。また、グランザイムＢが「＋」であるものは、培地中にグランザイムＢを添加した結果であることを示し、グランザイムＢが「−」であるものは、培地中にグランザイムＢを添加しなかった結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があったことを示す。
【００５８】
その結果、ＳＰＩＮＫ４遺伝子をノックダウンするとパーフォリン及びグランザイムＢによる細胞死が誘導されたことが明らかとなった。この結果は、ＳＰＩＮＫ４遺伝子又はタンパク質の発現を低下させることにより、癌細胞に対する癌免疫療法の適用の有効性を向上させることができることを更に支持するものである。
【００５９】
［実験例５］
（大腸癌組織におけるＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現と予後との関連性の検討）
公開データベースであるＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を用いて大腸癌患者の予後解析を行った。具体的には、ＣＤ８遺伝子及びＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現量に基づいて、各大腸癌患者を（ｉ）ＣＤ８遺伝子高発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子低発現群、（ｉｉ）ＣＤ８遺伝子高発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子高発現群、（ｉｉｉ）ＣＤ８遺伝子低発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子低発現群、（ｉｖ）ＣＤ８遺伝子低発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子高発現群、の４群に分け、予後解析を行った。
【００６０】
ＴＣＧＡでは、マイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ、ＭＳＩ）による癌の分類もなされており、マイクロサテライト不安定性が高いＭＳＩ−Ｈｉｇｈ、マイクロサテライト不安定性が低いＭＳＩ−Ｌｏｗ、マイクロサテライトが安定であるＭＳＳ（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｔａｂｌｅ）の三段階に分類されている。
【００６１】
図５（ａ）及び（ｂ）は、ＭＳＩ−Ｈｉｇｈを除いたステージＩＩ及びＩＩＩの大腸癌患者の予後解析の結果を示すグラフである。図５（ａ）はＣＤ８遺伝子高発現群の結果であり、図５（ｂ）はＣＤ８遺伝子低発現群の結果である。図５（ａ）及び（ｂ）中、「ＣＤ８ＨｉＳＰＩＮＫ４Ｌｏ」はＣＤ８遺伝子高発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子低発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８ＨｉＳＰＩＮＫ４Ｈｉ」はＣＤ８遺伝子高発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８ＬｏＳＰＩＮＫ４Ｌｏ」はＣＤ８遺伝子低発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子低発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８ＬｏＳＰＩＮＫ４Ｈｉ」はＣＤ８遺伝子低発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子高発現群の結果であることを示す。また、「Ｎ．Ｓ．」は有意差が存在しないことを示す。
【００６２】
その結果、ＣＤ８遺伝子高発現群において、ＳＰＩＮＫ４遺伝子低発現群とＳＰＩＮＫ４遺伝子高発現群の予後に有意差が認められ、ＣＤ８遺伝子高発現、ＳＰＩＮＫ４遺伝子低発現群の予後が最も良好であることが明らかとなった（ｐ＝０．０１９７）。
【００６３】
［実験例６］
（大腸癌組織におけるＳＰＩＮＫ４タンパク質の発現の検討）
大腸癌患者由来の大腸癌組織の切片を免疫染色し、ＳＰＩＮＫ４タンパク質の発現を検討した。図６は代表的な免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。倍率は１０倍である。図６中、黒矢印は胚細胞様細胞においてＳＰＩＮＫ４タンパク質が高発現している領域を示す。また、白抜きの矢印は胚細胞様細胞ではない細胞においてＳＰＩＮＫ４タンパク質が低発現している領域を示す。ＳＰＩＮＫ４の発現パターンには、主にこれらの２種類が存在することが明らかとなった。
【００６４】
［実験例７］
（抗ＰＤ−１抗体療法の有効性の検討）
マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６にマウスＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを遺伝子導入し、安定過剰発現細胞株を得た。
【００６５】
続いて、野生型のＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部位に、ＳＰＩＮＫ４遺伝子を過剰発現させたＣＴ２６細胞株を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。また、比較のために、野生型のＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部位に、ＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入していないＣＴ２６細胞株を移植し、腫瘍の体積を経時的に測定した。
【００６６】
また、細胞移植から６日目、９日目、１３日目、１６日目、２０日目に、各マウスに抗ＰＤ−１抗体２００μｇ／マウスを腹腔内投与した。また、比較のために、抗ＰＤ−１抗体の代わりにアイソタイプコントロール抗体２００μｇ／マウスを腹腔内投与した群も用意した。
【００６７】
図７は、各群のマウスの腫瘍の体積の経時変化を示すグラフである（ｎ＝６）。図７中、「ＭＯＣＫ」はＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入していないＣＴ２６細胞株を移植したマウスの結果であることを示し、「ＳＰＩＮＫ４」はＳＰＩＮＫ４遺伝子を過剰発現させたＣＴ２６細胞株を移植したマウスの結果であることを示し、「アイソタイプ抗体」は、アイソタイプコントロール抗体を投与したマウスの結果であることを示し、「抗ＰＤ−１抗体」は抗ＰＤ−１抗体を投与したマウスの結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があったことを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があったことを示す。
【００６８】
その結果、ＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入していないＣＴ２６細胞株を移植したマウスでは、抗ＰＤ−１抗体の投与により腫瘍体積の増加が有意に抑制された。これに対し、ＳＰＩＮＫ４遺伝子を過剰発現させたＣＴ２６細胞株を移植したマウスでは、抗ＰＤ−１抗体の投与による腫瘍体積の増加の抑制が認められなくなり、抗ＰＤ−１抗体療法に対して不適応になったことが明らかとなった。
【００６９】
［実験例８］
（細胞傷害性Ｔ細胞の検討）
実験例７で作製した担癌マウス（細胞移植から２７日目）より、腫瘍組織を摘出した。続いて、各マウスから腫瘍組織を摘出し、はさみで切り刻んだ後、コラゲナーゼ溶液２０ｍＬ中に入れ、３７℃で３０分間振盪した。コラゲナーゼ溶液は、ＲＰＭＩ１６４０に、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ及び３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを添加したものであった。その後、ＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した。
【００７０】
続いて、得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞（１×１０６個）のそれぞれを、野生型健常マウスより採取し、３２Ｇｙの放射線照射処理した脾臓細胞（１×１０７個）と混合し、腫瘍抗原ｇｐ７０ペプチド（マウス白血病ウイルスＭｕＬＶ  ｅｎｖ  ｇｐ７０の第４２３〜４３１番目のアミノ酸からなるペプチド：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ、配列番号５）（１．０μｇ／ｍＬ）、ヒトインターロイキン（ＩＬ）−２（２０Ｕ／ｍＬ）、マウスＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中、４８ウェルプレート（１ｍＬ／ウェル）で、２日間培養した。
【００７１】
続いて、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｌｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＳ）を用いてＴ細胞を回収した。続いて、回収したＴ細胞（１．８×１０４個）を、マウス肉腫由来の細胞であるＭｅｔｈ−Ａ細胞（１×１０５個）と終濃度１μｇ／ｍＬのｇｐ７０ペプチドの存在下、９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、各群３ウェルずつ混合培養し、培養２４時間後の培養上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００７２】
また、比較のために、ｇｐ７０ペプチドの代わりに無関係のβ−ｇａｌペプチド（β−ガラクトシダーゼの第８７６〜８８４番目のアミノ酸からなるペプチド：ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ、配列番号６）（１．０μｇ／ｍＬ）を接触させた群も用意した。
【００７３】
腫瘍組織中に癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在した場合、癌抗原ペプチドを接触させることによりＩＦＮ−γが産生される。
【００７４】
図８は、ＩＦＮ−γの産生量を定量した結果を示すグラフである。図８中、「ＭＯＣＫ」はＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入していないＣＴ２６細胞を移植したマウス由来の腫瘍組織の結果であることを示し、「ＳＰＩＮＫ４」はＳＰＩＮＫ４遺伝子を過剰発現させたＣＴ２６細胞を移植したマウス由来の腫瘍組織の結果であることを示し、「ｇｐ７０」はｇｐ７０ペプチドを接触させた結果であることを示し、「β−ｇａｌ」はβ−ｇａｌペプチドを接触させた結果であることを示す。また、また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があったことを示し、「ｎ．ｓ．」は、有意差が認められなかったことを示す。
【００７５】
その結果、ＳＰＩＮＫ４遺伝子の発現ベクターを導入していないＣＴ２６細胞を移植したマウス由来の腫瘍組織には、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在することが明らかとなった。これに対し、ＳＰＩＮＫ４遺伝子を過剰発現させたＣＴ２６細胞を移植したマウス由来の腫瘍組織には、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在が明確には認められなかった。
【００７６】
この結果は、癌細胞がＳＰＩＮＫ４遺伝子を過剰発現すると、腫瘍組織において、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の数が減少することを示す。この結果は、ＳＰＩＮＫ４遺伝子又はタンパク質の発現が上昇した癌細胞は、癌免疫療法の適用の有効性が低いこと、ＳＰＩＮＫ４を阻害できれば治療効果の向上が見込まれることを更に支持するものである。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明によれば、消化器癌患者への癌免疫療法の適用の有効性を判定する新たな技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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