(57)【要約】      （修正有）【課題】人工関節を使用する関節置換外科の主な合併症の1つである個体がブドウ球菌に感染しているかどうかを血清学的に決定する方法を提供する。【解決手段】配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列（８０％以上の相同性）を含む少なくとも２つのタンパク質またはその断片に対して指向される抗体が個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することで、個体がブドウ球菌によって感染していることを推定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体がブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感染しているかどうかを決定する方法であって、
−配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つのタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定し、並びに
−個体がブドウ球菌によって感染していることをそこから推定する
ことを含む方法。
【請求項２】
配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質及び配列番号４を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質及び配列番号６を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質、及び配列番号４及び／又は配列番号６を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ブドウ球菌が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・カプラエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、又はスタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
個体が人工関節を移植されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
個体が、膝関節及び股関節からなる群から選択される人工関節を移植されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
生物学的試料が、血液試料、血清試料、血漿試料、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）試料、脳脊髄液試料、関節液試料、胸膜液試料、唾液試料、及び尿試料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２を含むタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することが
生物学的試料と、
−配列番号２を含むタンパク質；又は
−配列番号２と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む相同タンパク質；又は
−配列番号２を含む前記タンパク質の少なくとも１つの断片又は前記相同タンパク質の少なくとも１つの断片、ここで、前記断片は少なくとも１０個のアミノ酸である；
ただし、前記相同タンパク質及び前記少なくとも１つの断片は配列番号２を含むタンパク質に対して指向される少なくとも１つの抗体によって結合され得る
と接触させ；
配列番号２を含む前記タンパク質、前記相同タンパク質又は前記少なくとも１つの断片に結合される抗体を検出する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４を含むタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することが
生物学的試料と、
−配列番号４を含むタンパク質；又は
−配列番号４と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む相同タンパク質；又は
−配列番号４を含む前記タンパク質の少なくとも１つの断片又は前記相同タンパク質の少なくとも１つの断片、ここで、前記断片は少なくとも１０個のアミノ酸である；
ただし、前記相同タンパク質及び前記少なくとも１つの断片は配列番号２を含むタンパク質に対して指向される少なくとも１つの抗体によって結合され得る
と接触させ；
配列番号４を含む前記タンパク質、前記相同タンパク質又は前記少なくとも１つの断片に結合される抗体を検出する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号６を含むタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することが
生物学的試料と、
−配列番号６を含むタンパク質；又は
−配列番号６と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む相同タンパク質；又は
−配列番号６を含む前記タンパク質の少なくとも１つの断片又は前記相同タンパク質の少なくとも１つの断片、ここで、前記断片は少なくとも１０個のアミノ酸である；
ただし、前記相同タンパク質及び前記少なくとも１つの断片は配列番号２を含むタンパク質に対して指向される少なくとも１つの抗体によって結合され得る
と接触させ；
配列番号６を含む前記タンパク質、前記相同タンパク質又は前記少なくとも１つの断片に結合される抗体を検出する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
個体が抗生物質で治療中である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ブドウ球菌による感染を診断するためのキットであって、
−請求項１０に定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−請求項１１に定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−請求項１２に定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
のうちの少なくとも２つを含むキット。
【請求項１５】
個体がブドウ球菌によって感染しているかどうかを決定するための方法であって、
−配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つのタンパク質の特異的な捕捉リガンドと、個体の生物学的試料を接触させ；
−前記特異的な捕捉リガンドがそれぞれ抗原に結合されるかどうかを決定し；
−個体がブドウ球菌によって感染していることをそこから推定する
ことを含む方法。
【請求項１６】
ブドウ球菌による感染を診断するためのキットであって、
−配列番号２を含むタンパク質の特異的なリガンド；
−配列番号４を含むタンパク質の特異的なリガンド；及び
−配列番号６を含むタンパク質の特異的なリガンド
のうちの少なくとも２つを含むキット。
【請求項１７】
−請求項１０に定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−請求項１１に定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−請求項１２に定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
のうち少なくとも２つを含む医薬組成物であって、任意に医薬として許容される担体を伴う医薬組成物。
【請求項１８】
個体におけるブドウ球菌による感染を予防及び／又は治療するための方法であって、予防的及び／又は治療的に有効な量の
−請求項１０に定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−請求項１１に定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−請求項１２に定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
のうちの少なくとも２つを個体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ブドウ球菌感染の血清学的診断のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
現在、世界中で人工関節を使用している者が約１千万人おり、人工関節の外科手術の数は年ごとに増加し続けている。それは、主に、人口の高齢化、肥満の有病率の増加のためであり、関節が負担する過剰な体重をもたらす。
【０００３】
したがって、２０２０年までには、２５０万人の個体が人工関節を挿入し、又は今ある人工関節を置き換える手術を受けるであろう。さらにまた、若い患者（即ち、５０歳以下）においてされた最初の関節置換数の増加が観察される。
【０００４】
現在の数字は、約４３０，０００の全股関節及び膝置換が米国において毎年行われ、一方、約１３０，０００の全人工股関節置換術（ＴＨＲ）及び１００，０００の全人工膝関節置換術（ＴＫＲ）がフランスにおいて毎年移植されるか又は置換され、その場合、人工関節を使用する者が現在１００万人を超えていることを示す。
【０００５】
感染は、関節置換外科の主な合併症の１つのである。近年記録されているかなりの進展にも関わらず、人工関節の感染はまだ一般的であり、全人工股関節置換術では０．３％〜２％であり、全人工膝関節置換術では０．５％〜５％のあたりをさまよい、既存の人工関節を置換する場合に発生する感染が最大の比率である（外科手術後の３日〜２０年近くであり、関節置換の３カ月以内に起こるのは平均して２０％の感染である；３カ月〜２年で４０％が起こる；２年後に４０％が起こる）。これらの感染は、無視してもよい致死率（２．５％）、並びに高い罹患率と関連している。それらは、通常、１から複数回の追加の外科手術、及び長期間の抗生物質を必要とし、その結果、重大であり、多くの場合、長期の機能的障害をもたらす。最終的には、これらの合併症を管理する費用は非常に高く、人工関節の感染あたり約６０，０００ユーローと見積もられ、それによって、感染が起こった場合の人工関節の原価の４倍になり、例えば、感染した人工股関節については全費用として約８０，０００ユーローに達する。
【０００６】
５０％〜７５％の人工関節の感染は、ブドウ球菌ファミリー由来の細菌によって引き起こされ、ある場合には、他の種との感染が混在する。問題になっている２つの主な種は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））と表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）である。ブドウ球菌の人工関節感染は、多くの場合、休止状態である。ブドウ球菌は集合して、人工インプラントの表面にバイオフィルムを形成し、低代謝活性によって特徴付けられる静止状態で生存する。細菌の休止状態、並びにバイオフィルムの存在は、感染部位で炎症反応を顕著に減少させ、抗生物質の採用から細菌を保護する。
【０００７】
人工関節感染は、現在、本質的には２つの異なるストラテジーに従って管理され、すなわち、人工関節の予防のための外科的デブリドマン（洗浄−創傷清拭）、又は人工関節の置換である。
【０００８】
適切な長期の抗生物質と組み合わせた、人工関節を移動させる（生理学的血清及び創傷殺菌剤を用いて洗い流す）ことなしに、外科的洗浄−創傷清拭は、感染が汚染後の初期（２週間未満）に検出され、人工関節が損なわれていない場合に要求される。このストラテジーは、最大効率とリスク比を提供する。
【０００９】
実際に、初期の検出が達成することができない場合、１工程又は２工程置換法のいずれかによって、人工関節を置換することが必要である。人工関節の１工程置換は、長期の入院（６週から１年）を要する２工程置換よりも少ない負担な医療介入であるが、後者よりも効果が小さい。人工関節の置換は、人工関節感染を引き起こすか又は引き起こす可能性のある微生物（単数又は複数）に対して指向される抗生物質処置と組み合わせられる。人工関節感染に対する外科的介入は、６５歳の患者における０．４〜１．２％、８０歳を超える患者における２〜７％の致死率と関係がある。再発する感染のリスクは、人工関節に対する繰り返しの介入後は高い状態であり、位置、病変の重傷度及び使用される外科的治療のタイプに従って平均して１０〜４０％の範囲である。
【００１０】
したがって、人工関節感染の管理に関しては、できるだけ迅速に感染の診断を確立し、原因菌を決定することが最も重要なことである。
【００１１】
これに関連して、臨床症状は、感染を究明するのにとても十分である。非常に大部分の症例では、症状は、単に問題を臨床医に警告し、診断に必要とされる追加の試験を開始する。
【００１２】
種々の方法は、人工関節感染の診断の確立、並びに原因物質を特定するために現在使用されている。
【００１３】
このようにして、炎症バイオマーカー、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び赤血球沈降速度（ＥＳＲ）は、人工関節感染の診断に有用である。しかしながら、これらの技術は、十分な感受性及び特異性を有さない。その上、陽性ＣＲＰレベルは、生検を除かない。それは、外科的処置を受けている１０〜１５％の患者は、正常なＣＲＰレベルを有するためである。従って、これらのバイオマーカーをアッセイすることは大部分の外科医によって指示されるが、これは、大部分、血清学的マーカーを利用する、他の感度がよく、特異的な試験の不存在について、習慣に起因しているようである。
【００１４】
また、医学画像技術が使用される。しかしながら、放射線学的診断は、特異的には十分ではなく、感染の後期に代表的な兆候、例えば、人工器官の弛緩、小結節または嚢胞の存在などを示すだけである。シンチグラフィーは、最も頻繁にガリウムとともに使用され、診断に有用であり得るが、多くの場合、解明することが困難であり、それにより感染の遅い検出をもたらす。磁気共鳴画像及びコンピューター断層撮影スキャンは、通常、人工関節自体の存在による人為的な影響のために軽視される。
【００１５】
また、外科的処置中に得られた試料の組織学的分析が行われる。８０％を超える感受性（すなわち、感染した試料を検出する能力）、及び９０％を超える特異性（すなわち、感染していない試料を検出する能力）で感染が診断され得るが、このコースは、生検試料を必要とする。その上、サンプリング部位に依存して、大幅なバリエーションが、得られた結果において観察される場合がある。
【００１６】
例えば、人工関節感染の診断における金標準は細菌学的分析を残し、それは、関連する試料から、感染部位の感染している細菌の同定及び培養を伴う。細菌学的分析は、一般に、外科的処置中に採取された５個の試料のうちの少なくとも２つが黄色ブドウ球菌について陽性であり、５つの試料のうち３つが他のブドウ球菌について陽性である場合に有意であると考えられる。また、例えば、局所麻酔下での超音波支援の針吸引、又は一般的な麻酔下での処置室のおける画像支援のコア針によって、外科的処置前に得られる試料に基づく診断を実行することができる。
【００１７】
しかしながら、いくつかの周知な欠点は、細菌学的な分析に関連している。
【００１８】
まず第一に、処置前の試料又はその後培養のための吸引液を得ることは、通常、一般的麻酔下で実行される外科的手法を必要とする侵襲的治療法である。第２に、特異性は、多くの場合、不十分であり、それは、汚染微生物が、特に凝固酵素にネガティブなブドウ球菌の場合において単離され得るからである。さらに、陽性の結果は、抗生物質による処置の開始により妨げられることができる。第３に、試料を培養し、培養物からの結果を解釈するための標準化された技術が確立されていない（例えば、少なくとも３の個別の陽性試料の閾値が優れた特異性を提供するが（９９．６％）、時折、感受性の損失（６５％）に達成される）。最後ではないが、特に、この方法は時間がかかり、それは、結果を得るためには４８時間から２週間を超えて必要だからである。
【００１９】
細菌学的な分析に関連した欠点を克服するために、特に、結果を得るために必要とされる長時間に関して、抗ブドウ球菌抗体の検出に基づく血清学的アプローチを使用することが示唆されている。
【００２０】
このようにして、抗αトキシン（又はアルファ抗ブドウ球菌溶解素）、抗αリビトールテイコ酸及び抗カプセル抗体を検出するための試験は、黄色ブドウ球菌による全身感染症について示唆されている（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１：１１１−１１９；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３：５３０−５３３）。しかしながら、これらの試験は、不十分な感受性及び特異性のために断念された。さらに、種々のブドウ球菌タンパク質抗原の使用は、ブドウ球菌抗原に指向される抗体を検出するために示唆されている（ＷＯ２００６／００５８２５、ＵＳ５，７００，９２８、ＦＲ２９０８８９０）。それにも関わらず、これらのマーカーは、それ自体で、十分な感受性及び特異性を提供しない。したがって、ブドウ球菌感染症を診断するために有用な血清学的方法がなおも実施されるべきである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、本発明者らによって、生物学的試料中の抗ブドウ球菌抗体の効果的な検出を提供するためのブドウ球菌タンパク質マーカー（又は抗原）の特定の組み合わせの予期せぬ同定から生じている。
【００２２】
このようにして、本発明は、個体がブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感染しているかどうかを決定するための血清学的方法、特にインビトロの血清学的方法であって、
−配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つのタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定し、並びに
−個体がブドウ球菌によって感染していることをそこから推定する
ことを含む方法に関する。
【００２３】
本発明の態様では、上記で定義される血清学的方法は、配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質及び配列番号４及び／又は配列番号６を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む。
【００２４】
本発明の別の態様では、上記で定義される血清学的方法は、配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質及び配列番号４を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む。
【００２５】
本発明の別の態様では、上記で定義される血清学的方法は、配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質及び配列番号６を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【００２６】
本発明の更なる態様では、上記で定義される血清学的方法は、配列番号２を含む少なくとも１つのタンパク質、配列番号４を含む少なくとも１つのタンパク質、及び配列番号６を含む少なくとも１つのタンパク質に対して指向される抗体が、個体の生物学的試料に存在するかどうかを決定することを含む。
【００２７】
また、本発明は、ブドウ球菌による感染を診断するための血清学的キットであって、
−上記で定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
のうちの少なくとも２つを含む。
【００２８】
本発明の態様では、上記で定義される血清学的キットは、
−上記で定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
を含む。
【００２９】
また、本発明は、個体がブドウ球菌に感染しているかどうかを決定するための抗原性方法、特にインビトロの抗原性方法に関し、
−配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つのタンパク質の特異的な捕捉リガンドと、個体の生物学的試料を接触させ；
−前記特異的な捕捉リガンドがそれぞれ抗原に結合されるかどうかを決定し；
−個体がブドウ球菌によって感染していることをそこから推定する
ことを含む方法。
【００３０】
本発明の態様では、上記に定義される抗原性方法は、配列番号２及び配列番号４及び／又は配列番号６の特異的な捕捉リガンドと接触させることを含む。
【００３１】
また、本発明は、個体がブドウ球菌に感染しているかどうかを決定するために、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つのタンパク質の特異的なリガンドの使用、特にインビトロでの使用に関する。
【００３２】
上記で定義される使用の態様では、本発明は、配列番号２及び配列番号４及び／又は配列番号６の特異的なリガンドの使用に関する。
【００３３】
また、本発明は、ブドウ球菌による感染を診断するための抗原性キットは、
−配列番号２を含むタンパク質の特異的なリガンド；
−配列番号４を含むタンパク質の特異的なリガンド；及び
−配列番号６を含むタンパク質の特異的なリガンド
のうちの少なくとも２つを含む。
【００３４】
本発明の態様では、上記で定義される抗原性キットは、
−配列番号２を含むタンパク質の特異的なリガンド；
−配列番号４を含むタンパク質の特異的なリガンド；及び／又は
−配列番号６を含むタンパク質の特異的なリガンド
を含む。
【００３５】
また、本発明は、個体におけるブドウ球菌による感染の予防及び／又は治療のための医薬組成物、特に使用のための医薬組成物に関し、
−上記で定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；及び
−上記で定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
のうち少なくとも２つを含み、任意に医薬として許容される担体を伴う。
【００３６】
本発明の態様では、上記で定義される医薬組成物は、
−上記で定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；及び／又は
−上記で定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
を含む。
【００３７】
また、本発明は、個体におけるブドウ球菌による感染の予防及び／又は治療のための方法に関し、
−上記で定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；及び
−上記で定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
のうち少なくとも２つの予防的及び／又は治療的に有効な量を個体に投与することを含む。
【００３８】
本発明の態様では、上記で定義される予防及び／又は治療方法は、
−上記で定義される、配列番号２を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；
−上記で定義される、配列番号４を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片；及び／又は
−上記で定義される、配列番号６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、又はその断片
の予防的及び／又は治療的に有効な量を個体に投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書において意図されるように、用語「ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）」、「ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）」、又は「ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃａｌ）」とは、ブドウ球菌属の細菌（単数又は複数）を意味する。好ましくは、本発明のブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・カプラエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｒａｅ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、又はスタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）である。
【００４０】
本明細書において意図されるように、用語「感染した」とは、上記で定義されるブドウ球菌を担持する個体を意味する。好ましくは、感染した個体は、ブドウ球菌の繁殖が起こっている１又はいくつかの部位で寄生させている。ブドウ球菌による感染は、多くの場合、内部組織と、ブドウ球菌によって汚染された異物との接触の結果として、特に病因環境において起こる。従って、本明細書において意図されるように、感染は、好ましくは、個体への人工物、例えば、顕著には膝関節及び股関節からなる群から選択される人工関節の移植から生じる。
【００４１】
本明細書において意図されるように、用語「生物学的試料」には、特に本発明に係るプロセス及び方法における使用に適したものとする、採取された試料、及び種々の処置に供された試料の両方が含まれる。本発明の「生物学的試料」は、抗体を内部に有する傾向にあるいずれかのタイプであり得るが、しかしながら、生物学的試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）試料、脳脊髄液試料、関節液試料、胸膜液試料、唾液試料、及び尿試料からなる群から選択されることが好ましい。
【００４２】
本明細書において意図されるように、表現「個体がブドウ球菌によって感染しているかどうかを決定すること」には、個体におけるブドウ球菌による感染の診断を確立すること又はそれを診断することを包含する。また、人工器官の移植、洗浄又は置換のための外科手術を受けた個体を追跡することを包含する。さらに、特に抗ブドウ球菌処置の枠内でブドウ球菌による感染の発生を追跡することを包含する。従って、個体は、抗生物質によって処置されていることが好ましい。
【００４３】
配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも２つのタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料中に存在するかどうかを決定することは、当業者に周知な種々の方法によって実行可能である。しかしながら、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６を含むタンパク質に対して指向される抗体が個体の生物学的試料中に存在するかどうかを決定することは、以下：
●生物学的試料と：
−配列番号２、４、若しくは６を含むタンパク質；又は
−配列番号２、４、若しくは６と少なくとも８０％の同一性を共有する配列を含む相同なタンパク質；又は
−配列番号２、４、若しくは６を含む前記タンパク質の少なくとも１つの断片、又は前記相同なタンパク質の断片
ただし、前記相同なタンパク質及び前記少なくとも１つの断片が、配列番号２、４、又は６を含むタンパク質に対して指向される少なくとも１つの抗体によって結合可能である
と接触させること；
●配列番号２、４、若しくは６を含む前記タンパク質、前記相同なタンパク質、又は前記少なくとも１つの断片に結合する検出抗体、好ましくはＩｇＧ
を含む。
【００４４】
配列番号２、４、及び６を含むタンパク質、それに相同なタンパク質、及びそれらの断片は、２０個の天然アミノ酸から選択されるアミノ酸のインビボ、エクスビボ、若しくはインビトロ重合から得られるポリペプチド鎖として、又は修飾されたポリペプチド鎖として存在し得る。本明細書において意図されるように、インビボ又はエクスビボ重合は、顕著には、組換え手段による生産を包含する。インビトロ重合は、インビトロでの翻訳又は化学合成による生産を包含する。ポリペプチドが修飾される場合、ポリペプチド鎖のインビボ、エクスビボ若しくはインビトロ重合中の非天然アミノ酸の使用、又は重合後の修飾に起因することができる。ポリペプチド鎖は、同一の又は異なった修飾によって１回又は複数回修飾され得る。修飾は、ポリペプチド鎖のいずれの場所であってもよく、顕著には、ペプチド骨格、アミノ酸の横方向の基、又はポリペプチド鎖のＮ末端若しくはＣ末端の先端であってもよい。修飾は、顕著には、アシル化、特にアセチル化、パルミトイル化、グリピエーション、プレニル化、及びミリストイル化を包含する。ＡＤＰリボシル化、アミド化、脂質の共有結合、例えばホスファチジルイノシトール、フラビン、ヘム、又はヌクレオチド、共有若しくは非共有架橋、環化、ジスルフィド架橋酸化及び還元、メチル化及び脱メチル化、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ化、酸化、リン酸化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸の添加、例えばアルギニン化、又はポリペプチドの添加、例えばユビキチニル化を包含する。
【００４５】
さらに、組換え手段によって得られる場合、配列番号２、４、及び６を含むタンパク質のポリペプチド鎖、それに相同なタンパク質、及びそれらの断片はまた、タンパク質精製に有用な配列、例えばピリヒスチジンタグ、及び場合により、これらのタグの切断を可能にする配列、例えばプロテアーゼ切断部位を含んでもよい。
【００４６】
好ましくは、配列番号２、４、及び６を含むタンパク質は、３５０、４００、５００、又は最大１０００個のアミノ酸を含む。より好ましくは、配列番号２、４、及び６を含むタンパク質は、それぞれ、配列番号２又は配列番号９、配列番号４又は配列番号１０、及び配列番号６又は配列番号１１からなる。
【００４７】
好ましくは、配列番号２、４、及び６を含むタンパク質は、それぞれ、配列番号１、３、及び５を含む核酸によってコードされる。
【００４８】
同一性％は、当業者に周知な方法によって計算可能である。好ましくは、同一性％は、配列番号２、４、又は６のアミノ酸の総数で割った、配列番号２、４、又は６と相同なタンパク質の配列の最適な対アライメント（すなわち、同一アミノ酸の数を最少にするアライメント）に対して得られる同一アミノ酸の数に関する。アライメントは、手動で、又はＥＭＢＯＳＳ−Ｎｅｅｄｌｅプログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）などのコンピュータプログラムを用いて行うことができる。好ましくは、同一性％は、少なくとも８５％であり、より好ましくは少なくとも９０％であり、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００４９】
本発明に係る「断片」は、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を含む、配列番号２、４、又は６の任意の部分に関する。好ましくは、断片は、少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは３０個のアミノ酸、最も好ましくは４０個のアミノ酸を含む。また、好ましくは、断片は、最大１００個のアミノ酸、より好ましくは最大８０個のアミノ酸、最も好ましくは最大６０個のアミノ酸を含む。
【００５０】
本明細書において意図されるように、上記で定義される相同なタンパク質、及び上記で定義される少なくとも１つの断片は、配列番号２、４、又は６を含むタンパク質に対して指向される少なくとも１つの抗体によって結合され得る。換言すれば、上記で定義される相同なタンパク質、及び上記で定義される少なくとも１つの断片は、配列番号２、４、又は６を含むタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む。従って、上記で定義される相同なタンパク質、及び上記で定義される少なくとも１つの断片は、それらが同条件で測定される、配列番号２、４、又は６を含むタンパク質によって提供される感受性の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を提供するようなものであるべきである。
【００５１】
本明細書において意図されるように、用語「感受性」は、ブドウ球菌、好ましくは黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌によって感染された個体の割合として定義され、例えば血清試料などの生物学的試料は、配列番号２、４、又は６を含むタンパク質に対して指向される抗体を含むことを決定される。抗体によって与えられる感受性の決定は、当業者に周知な種々の方法に従って、及び顕著には、以下の実施例１に説明されるように実施することが可能である。
【００５２】
好ましくは、上記で定義される血清学的方法において、抗体を決定することは、抗体の特異的な検出リガンドを用いて行うことができる。
【００５３】
本明細書において意図されるように、「リガンド」は、抗体又は抗原などの標的に特異的に結合する傾向にある化合物である。リガンドは、いずれのタイプであってもよいが、抗体、アプタマー、又はファージディスプレイによって得られるペプチドであることが好ましい。
【００５４】
本明細書において意図されるように、「抗体」は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、又はラクダ種などの任意のタイプに属する抗体に関する。また、抗体は、キメラ抗体、すなわち、異種由来の部分を含む抗体を含んでもよい。好ましいキメラ抗体は、いわゆる「ヒト化」抗体であり、そこでは、定常部分（ＣＨ及びＣＬ）は、ヒト起源であり、可変部分（ＶＨ及びＶＬ）は別の種、例えばマウス起源である。本発明の抗体は、当業者に周知の方法、例えば動物免疫によって、又は組換え若しくは合成法によって生産することができる。さらに、本発明に係る「抗体」は、前記抗体の抗原結合部位の少なくとも１つ、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ断片、並びにラクダ一本鎖抗体を含む抗体断片を包含する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、特に一特異的ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体であってもよい。
【００５５】
「アプタマー」は、当業者に周知である。アプタマーは、ヌクレオチド、特にリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又は標的に特異的に結合することができるペプチド種（ｎａｔｕｒｅ）、特にタンパク質標的の化合物である。ヌクレオチド種のアプタマー及びその生産は、特に、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８−２２及びＢｏｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−６に記載されている。ペプチド種のアプタマー及びその生産は、特に、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．７８：４２６−３０に記載されている。
【００５６】
「ファージディスプレイ」は、バクテリオファージのキャプシドに発現し、キャプシドをコード遺伝子に挿入された核酸配列にコードされるポリペプチドリガンドを選択するための技術を指す。この方法は、当業者に周知であり、特に、Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されている。好ましくは、ファージディスプレイによって得ることができるポリペプチドは、ｓｃＦｖ型のポリペプチド（一般鎖可変断片）である。この技術は、特に、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５に記載されている。
【００５７】
用語「特異的」は、理断度の認識、又は第１の標的、例えば抗原若しくは抗体に対するリガンドの結合を指す場合、リガンドが、第１の標的を構造的に似ていない別の標的と実質的に相互作用することなしに、第１の標的と相互作用することを意味する。
【００５８】
上記で定義される抗原性方法では、捕捉リガンドが抗原にそれぞれ結合するかどうかを決定することは、前記抗原に特異的であり、前記捕捉リガンドの認識部位よりも別の結合部位（すなわち、エピトープ）の認識による前記抗原に好ましくは結合する検出リガンドを用いて実行することができる。
【００５９】
好ましくは、本発明に係る「検出リガンド」は標識される。用語「標識された」とは、直接標識、及び間接標識（例えば、それ自体が直接的に標識される他のリガンドによる、又は排他的ではないが、標識されたアビジン−ビオチン対などの標識された「アフィニティー対」の試薬を用いることによって）の両方を指す。
【００６０】
当業者に明確となるであろうが、上記で定義される血清学的方法において、配列番号２、４、若しくは６を含むタンパク質、相同名タンパク質又は断片は、捕捉抗原として使用可能である。
【００６１】
捕捉抗原又はリガンド及び検出リガンドを使用する方法は、当業者に周知であり、種々の周知なフォーマットに従って、例えば固相又は均質層において、１又は２工程で、サンドイッチ法によって、又は競合法によって実施することができる。
【００６２】
好ましくは、捕捉抗原又はリガンドは、固相上に固相化される。固相の非制限的な例として、マイクロプレート、特に特定のポリスチレンマイクロプレート、固体の任意の常磁性粒子又はビーズ、あるいは、ポリスチレン若しくはポリプロピレン試験管、ガラス、プラスチック又はシリコンチップなどを使用することができる。
【００６３】
本明細書に記載される配列の概要：
【００６４】
【表１】
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【００６５】
実施例
実施例１
患者から得られた血清試料は、本発明に係るブドウ球菌抗原の組み合わせを用いてアッセイされた。
【００６６】
１．材料及び方法
表皮ブドウ球菌に感染した人工器官を有する患者由来の１１又は１５血清、及び黄色ブドウ球菌に感染した人工器官を有する患者由来の１２又は１３血清を使用し、健常な個体由来の４７対照血清と比較した。個体の感染状態の決定は細菌学的分析によって行った。
【００６７】
抗原２Ｂ６（配列番号９）、７Ｂ３（配列番号１０）、５Ｇ１（配列番号１１）、及び７Ａ７（配列番号１２）は、大腸菌に組換え的に生産され、通常の方法に従って精製され、例えばＬａｖａｌｌｉｅ（１９９５）“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”．Ｕｎｉｔ  ５．１．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９５）“Ｓｔｒａｔｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｕｎｉｔ  １．２．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。
【００６８】
抗原は、製造業者の指示に従って、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて、ＭｉｃｒｏＰｌｅｘ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））の表面カルボキシル基に共有結合させた。２５μｇを５，０００，０００個のマイクロスフェアに結合させるために使用した。
【００６９】
血清抗体の検出は、製造業者の指示に従って行われた。要約すると、抗原を結合させたマイクロスフェアをマルチウェルプレートに添加し、抗体−抗原の複合体が形成されるのに十分な時間、種々の血清と接触させた。未反応の血清を捨て、プレートを洗浄後、フィコエリトリン標識した抗ＩｇＧ抗体をマイクロスフェアに添加した。抗体−抗原複合体はさらに、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アナライザーを用いて、各血清について平均蛍光強度（ＭＦＩ）について決定することによって暴露された。
【００７０】
各血清学的アッセイのカットオフ値は、その値が最大効率を得るように、臨床研究所規格委員会（ＮＣＣＬＳ）からの１９９５年１２月のＧＰ１０−Ａガイドラインに記載されるように受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって決定された。この効率は、アッセイされた試料の総数による、血清学的アッセイを用いて得られる、真の陽性試料と真の陰性試料の合計の比率として定義される。真の陽性及び陰性試料は、それぞれ、本発明の血清学的アッセイ及び細菌学的アッセイの両方を用いて、陽性及び陰性であるように決定される。次に、試料は、抗体の力価が規定のカットオフ値を超える場合に陽性であると考えられた。
【００７１】
抗原の組み合わせは、上記で指示されるように、ＲＯＣ曲線分析によってカットオフ値を設定する前に、識別関数分析によって分析された。
【００７２】
２．結果
【００７３】
【表２】
2010210621.tif 000003
【００７４】
２Ｂ６及び７Ａ７抗原は、個々に、黄色ブドウ球菌に感染した患者を同じ率（すなわち、４２％）で検出することができた。しかしながら、感受性において１６％の増加を可能にするため、２Ｂ６−７Ｂ３の組み合わせだけが対象となることが示される（黄色ブドウ球菌陽性患者の６７％が７Ｂ３単独で検出され、これに対して、同患者の８３％が７Ｂ３−２Ｂ６の組み合わせで検出される）。対照的に、７Ａ７−７Ｂ３の組み合わせは、７Ｂ３単独よりも小さい感受性を与えるので、いずれの対象ともならないようである。
【００７５】
対照的に、個体の感受性を考慮して、抗原の組み合わせの感受性、特に感受性の増加を予測することは困難であると考える。さらに、２Ｂ６−７Ｂ３の組み合わせは、ブドウ球菌による感染の検出についての予期せぬ診断可能性を示す。
【００７６】
【表３】
2010210621.tif 000004
【００７７】
このアッセイでは、２Ｂ６抗原は、黄色ブドウ球菌に感染した患者を検出するために、７Ａ７抗原よりも効果が小さいように見える（２Ｂ６については３１％対７Ａ７については３８％）。しかしながら、２Ｂ６−５Ｇ１の組み合わせは、７Ａ７−５Ｇ１の組み合わせよりも良好な感受性を示す。このようにして、７７％の黄色ブドウ球菌に感染した患者は、２Ｂ６−５Ｇ１の組み合わせによって検出され、それにより、５Ｇ１単独と比較して、感受性において８％増加を示す。対照的に、５Ｇ１−７Ａ７の組み合わせは、感受性において増加を示さない。
【００７８】
対照的に、２Ｂ６−５Ｇ１は、ブドウ球菌による感染の検出に予想外に十分に適切であるように見える。
【００７９】
実施例２
ブドウ球菌によって感染した患者であって、抗生物療法を受けている患者の血清学的状態は、本発明の５Ｇ１−２Ｂ６の組み合わせを用いて監視された。
【００８０】
１．材料及び方法
表皮ブドウ球菌又は黄色ブドウ球菌で感染した人工器官を担持する８人の患者由来の１１６血清の全部を使用した。各患者については２つの血清を分析した。第１の血清（血清１）は、感染した人工器官を洗浄することを目的した外科手術の過程中に患者から得られた。第２の血清は、抗生物質による３カ月の処置後に得られた。
【００８１】
血清抗体の検出は、実施例１に示されるように行った。
【００８２】
次に、感染した患者の抗原応答は、（ＭＦＩ血清２−ＭＦＩ血清１）／ＭＦＩ血清１の比を計算することによって決定され、ここで、ＭＦＩは、各血清について得られた平均蛍光強度を表す。負の変化は、効果的な抗生物療法を指示する。
【００８３】
２．結果
表３は、抗生物質による３カ月の処置後、表皮ブドウ球菌又は黄色ブドウ球菌によって感染した患者の抗原応答の変化を示す。
【００８４】
【表４】
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【００８５】
各患者について、変化の割合が各々の抗原単独よりも重要であるため、この組み合わせの使用は有利であり、それにより、感受性の増大を示すことを見ることができる。ある種の患者では、組み合わせによって得られた変化の割合は、予期せぬように、各抗原の変化の割合を足したことによって期待されるよりも重要であり、相乗効果を示す。
【配列表】
2010210621000001.app
【外国語明細書】
2010210621000001.pdf