(57)【要約】【課題】減少された不純物を伴う、改善された細胞培養プロダクトおよびプロセスを提供する。【解決手段】本発明は、ウイルス感染の治療または予防のためのワクチン製品に関する。さらに、細胞培養ワクチンの調製と関連する汚染物質を減少させる方法が提供される。残存機能性細胞培養物ＤＮＡは、ＤＮＡアルキル化剤、例えばβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解され、それによって、残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない、細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質を含むワクチンが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献およびオンライン情報は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、減少された不純物を伴う、改善された細胞培養プロダクトおよびプロセスを提供する。具体的には、本発明は、細胞培養で作製されたプロダクトと関連する残存しているいかなる残存機能性細胞培養物ＤＮＡをも分解する改善された方法を提供する。本発明によれば、残存機能性細胞培養物ＤＮＡは、ＤＮＡアルキル化剤、例えばβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される。このプロセスは、ワクチンおよび組換えタンパク質を含む一連の細胞培養プロダクトを処理するために使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスワクチンの商業的生産は、典型的に、抗原供給源として大量のウイルスを必要とする。ワクチン生産のための商業的量のウイルスは、細胞培養系における種ウイルスの培養および複製によって達成され得る。ウイルス複製に好適な細胞培養系としては、哺乳動物、鳥類または昆虫細胞が挙げられるが、哺乳動物細胞培養系が、ウイルスの抗原タンパク質の適切なグリコシル化および折り畳みを確実にするために、ウイルスワクチンについて特に好ましい。同様の理由のために、哺乳動物細胞培養系はまた、組換えタンパク質発現について好ましい。
【０００４】
それらの天然状態から未修飾である場合、細胞培養物は、制限された複製能力を有し、そしてその後、商業的ワクチンまたは組換えタンパク質に必要な量の材料を生産することについて実用的ではなくかつ不十分となる。したがって、製造目的のために、それらが分割し得る回数を増加するために、細胞を「持続的」または「不死化」細胞株となるように修飾することが好ましい。これらの修飾の多くは、発癌性細胞に関係するものと類似する機構を使用する。したがって、細胞培養プロセス由来のいかなる残存材料（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）をも、これらのシステムにおいて製造されたワクチンまたは組換えタンパク質プロダクトの最終製剤から除去されるという関心事が存在する。
【０００５】
残存宿主細胞ＤＮＡを除去する標準的な方法は、ＤＮアーゼ処理による。このタイプの簡便な方法は、特許文献１および特許文献２に開示されており、最初にＤＮアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））そして次いでカチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、２工程処理を含む。
この危険性を低下させるための現在の努力は、残存宿主細胞ＤＮＡの総濃度を低下させることに注目してきた。本発明の目的は、いかなる残存宿主細胞ＤＮＡの機能性をも排除することによって、さらに危険性を低下させることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第０８７０５０８号明細書
【特許文献２】米国特許第５９４８４１０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、減少された不純物を伴う、改善された細胞培養プロダクトおよびプロセスを提供する。具体的には、本発明は、細胞培養で作製されたプロダクトと関連する残存しているいかなる残存機能性細胞培養物ＤＮＡをも分解する改善された方法を提供する。本発明によれば、残存機能性細胞培養物ＤＮＡは、ＤＮＡアルキル化剤、例えばβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される。このプロセスは、ワクチンおよび組換えタンパク質を含む一連の細胞培養プロダクトを処理するために使用され得る。
【０００８】
本発明は、細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質を含むワクチンであって、該ワクチンが残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まないワクチンを含む。さらに、本発明は、細胞培養物中において発現された組換えタンパク質であって、最終組換えタンパク質製剤が残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない組換えタンパク質に関する。
【０００９】
いかなる残存宿主細胞ＤＮＡの機能性をも、ＤＮＡを十分に小さな部分へ切断するアルキル化剤でのＤＮＡの処理によって排除され得、その結果、機能性タンパク質をコードすること、ヒトレシピエントの染色体中へ導入されること、またはそうでなければレシピエントＤＮＡ複製機構によって認識されることが不可能となる。好ましくは、分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さは、５００塩基対未満である。より好ましくは、分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さは、２００塩基対未満である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質を含むワクチンであって、該ワクチンが残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない、ワクチン。
（項目２）
あらゆる残存細胞培養物ＤＮＡがアルキル化剤での処理によって分解される、項目１に記載のワクチン。
（項目３）
前記アルキル化剤がβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）である、項目２に記載のワクチン。
（項目４）
前記分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さが５００塩基対未満である、項目１に記載のワクチン。
（項目５）
前記分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さが２００塩基対未満である、項目１に記載のワクチン。
（項目６）
前記残存細胞培養物ＤＮＡが０．１％未満のβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される、項目３に記載のワクチン。
（項目７）
前記ワクチンが低下したレベルの凝集を示す、項目１に記載のワクチン。
（項目８）
細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質を含むワクチンであって、残存細胞培養物ＤＮＡの長さが５００塩基対未満である、ワクチン。
（項目９）
前記残存細胞培養物ＤＮＡがアルキル化剤での処理によって分解される、項目８に記載のワクチン。
（項目１０）
前記アルキル化剤がβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）である、項目９に記載のワクチン。
（項目１１）
前記残存細胞培養物ＤＮＡの長さが３００塩基対未満である、項目８に記載のワクチン。
（項目１２）
前記残存細胞培養物ＤＮＡの長さが２００塩基対未満である、項目８に記載のワクチン。
（項目１３）
前記残存細胞培養物ＤＮＡが０．１％未満のβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される、項目８に記載のワクチン。
（項目１４）
前記ワクチンが低下したレベルの凝集を示す、項目８に記載のワクチン。
（項目１５）
組み合わされた０．０１％未満の遊離プロピオン酸およびβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を含有する、項目１０に記載のワクチン。
（項目１６）
細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質を含むワクチンを調製する方法であって、以下：
（ｉ）残存機能性細胞培養物ＤＮＡを分解する工程；および
（ｉｉ）該免疫原性タンパク質を単離する工程
を包含する、方法。
（項目１７）
前記残存機能性細胞培養物ＤＮＡを分解する工程が、アルキル化剤での機能性細胞培養物ＤＮＡの処理を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記アルキル化剤がβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞培養物ＤＮＡが０．１％未満のβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ワクチンが低下したレベルの凝集を示す、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
工程（ｉｉ）が、ビリオンからＤＮＡを分離することを含む、項目１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、項目１または８に記載のワクチン。
（項目２３）
前記細胞培養物が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ．６細胞からなる群より選択される、項目１または８に記載のワクチン。
（項目２４）
細胞培養物中において発現された組換えタンパク質を含む製剤であって、該製剤が残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない、製剤。
（項目２５）
あらゆる残存細胞培養物ＤＮＡがアルキル化剤での処理によって分解されている、項目２４に記載の製剤。
（項目２６）
前記アルキル化剤がβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）である、項目２５に記載の製剤。
（項目２７）
前記分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さが５００塩基対未満である、項目２４に記載の製剤。
（項目２８）
前記分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さが２００塩基対未満である、項目２４に記載の製剤。
（項目２９）
前記残存細胞培養物ＤＮＡが０．１％未満のβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される、項目２６に記載の製剤。
（項目３０）
前記製剤が低下したレベルの凝集を示す、項目２４に記載の製剤。
（項目３１）
細胞培養物中において発現された組換えタンパク質を含む製剤であって、残存機能性細胞培養物ＤＮＡの長さが５００塩基対未満である、製剤。
（項目３２）
前記細胞培養物が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞からなる群より選択される、項目２４または３１に記載の製剤。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＭＤＣＫゲノム中の６個の名前が付けられた標的のＰＣＲ増幅の結果を示す。あるサンプルを、ＰＣＲ前に、１：１００００まで、記載されるように希釈した。
【図２】図２は、ＭＤＣＫゲノム中の６個の名前が付けられた標的のＰＣＲ増幅の結果を示す。あるサンプルを、ＰＣＲ前に、１：１００００まで、記載されるように希釈した。
【図３】図３は、ＭＤＣＫゲノム中のＳＩＮＥ配列のＰＣＲ増幅の結果を示す。図１および２におけるように、ＤＮＡを、時折、ＰＣＲ前に希釈した。下のパネルにおいて、図は、ＰＣＲにおけるＤＮＡの出発量である（ｆｇ）。
【図４】図４は、ＭＤＣＫ  ＤＮＡのサイズに対するＢＰＬ処理の効果を示す。ゲノムＤＮＡを、異なる温度で、そして異なる長さの時間の間、ＢＰＬと共にインキュベートした。
【図５】図５は類似の結果を示す。アガロースゲルをＳＹＢＲＧｏｌｄで染色した。
【図６】図６は、記載のサイズを有するマーカー（下の線）に対する残存ＤＮＡ（上の線）のキャピラリー電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
本発明は、減少された不純物を伴う、改善された細胞培養プロダクトおよびプロセスを提供する。具体的には、本発明は、細胞培養で作製されたプロダクトと関連する残存しているいかなる残存機能性細胞培養物ＤＮＡをも分解する改善された方法を提供する。本発明によれば、残存機能性細胞培養物ＤＮＡは、ＤＮＡアルキル化剤、例えばβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって分解される。このプロセスは、ワクチンおよび組換えタンパク質を含む一連の細胞培養プロダクトを処理するために使用され得る。
本発明は、細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質を含むワクチンであって、該ワクチンが残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まないワクチンを含む。さらに、本発明は、細胞培養物中において発現された組換えタンパク質であって、最終組換えタンパク質製剤が残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない組換えタンパク質に関する。
【００１２】
いかなる残存宿主細胞ＤＮＡの機能性をも、ＤＮＡを十分に小さな部分へ切断するアルキル化剤でのＤＮＡの処理によって排除され得、その結果、機能性タンパク質をコードすること、ヒトレシピエントの染色体中へ導入されること、またはそうでなければレシピエントＤＮＡ複製機構によって認識されることが不可能となる。分解された（非機能性）残存細胞培養物ＤＮＡの長さは、好ましくは、１０００塩基対未満である（例えば、１０００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、または５０塩基対未満）。好ましくは、分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さは、５００塩基対未満である。より好ましくは、分解された残存細胞培養物ＤＮＡの長さは、２００塩基対未満である。
【００１３】
本明細書中において使用される場合、「機能性ＤＮＡ」または「機能性ＲＮＡ」への言及は、機能性タンパク質へ翻訳され得るかまたは哺乳動物染色体中へ導入され得るヌクレオチド配列を示す。一般的に、機能性タンパク質へ翻訳され得るヌクレオチド配列は、プロモーター領域、開始コドン、停止コドン、および機能性タンパク質についての内部コード配列を必要とする。アルキル化剤の添加により、ＤＮＡ損傷が生じる場合、これらの領域の多くが変更または破壊され、その結果、翻訳は、より長く前進し得る（ｃａｎ  ｌｏｎｇｅｒ  ｐｒｏｃｅｅｄ）か、または意図されるタンパク質のオリゴペプチドサブユニットを形成するように前進するのみである。
【００１４】
「分解された残存機能性細胞培養物ＤＮＡ」は、機能性タンパク質へ翻訳され得ないかまたは哺乳動物染色体中へ導入され得ない機能性ＤＮＡを指す。好ましくは、「分解された残存機能性ＤＮＡ」は、１０００塩基対未満、より好ましくは５００塩基対未満、なおより好ましくは２５０塩基対未満、そして最も好ましくは１００塩基対未満の長さを有する。分解された残存機能性ＤＮＡの長さは、ゲル電気泳動を含む、標準的な技術によって測定され得る。
【００１５】
本発明は、残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない、ワクチン組成物および組換えタンパク質製剤を提供する。本明細書中において使用される場合、残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まないは、２００塩基対未満の残存ＤＮＡフラグメントが０．５ｍｌ当たり１０ｎｇ未満で検出可能である組成物または製剤を指す。いかなる残存細胞培養物ＤＮＡのサイズもが、キャピラリーゲル電気泳動および核酸増幅技術を含む、標準的な技術によって測定され得る。
【００１６】
本発明におけるＢＰＬ等のアルキル化剤の使用は、凝集および汚染物質を減少させるというさらなる利点を提供する。減少された凝集物を含むワクチン製剤もまた、改善された免疫原性を有し得る。ワクチンの免疫原性は、特定のウイルスエピトープについての抗体の特異性に依拠する。タンパク質の表面が、望まれない分子によって結合されるかまたはマスクされるか、あるいは大きな高分子中における凝集によって隠される場合、前記エピトープは、あまり認識可能ではなくなり得、そしてしたがってワクチン中においてあまり有効ではなくなり得る。さらに、減少された凝集物を含むワクチン製剤は、さらなるプロセッシング利点を有し得る。精製プロセスは、予期されるタンパク質、例えば、インフルエンザワクチン中の血球凝集素およびノイラミニダーゼの単離に依拠する。タンパク質が凝集物または架橋の存在によって構造的に修飾される場合、それは、認識され得ず、そしてその後、カラムクロマトグラフィー、濾過、または遠心分離によって除去され得る。
【００１７】
アルキル化剤
本発明における使用のためのアルキル化剤としては、アルキル基を化合物中に導入する物質が挙げられる。好ましくは、アルキル化剤は、モノアルキル化剤、例えばＢＰＬである。ＢＰＬは、多くのワクチンの調製においてウイルス不活性化のために広く使用されるモノアルキル化剤である。ＢＰＬは、核酸を含む種々の生物学的分子と反応し、ここで、それは、アルキル化および脱プリン反応によって構造的修飾を引き起こす。ＢＰＬは、一般的に、下記の構造によって表される：
【００１８】
【化１】
2020023557.tif 000002
インビトロにおいて、ＢＰＬは、一般的に、求核置換反応に有利な条件下で（例えば、高熱、高ＢＰＬ濃度、および非プロトン性極性溶媒において）、高濃度で存在する求核試薬と反応し、官能化プロピオン酸、例えば、７−（２−カルボキシエチル）グアニンまたは１−（２−カルボキシエチル）デオキシアデノシンが形成される（スキーム１）。Ｂｏｕｔｗｅｌｌら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７５１−７６４；Ｐｅｒｒｉｎら，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２３（１９９５）２０７−２１１；Ｃｈｅｎら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２（２）（１９８１）７３−８０。
【００１９】
スキーム１（Ｃｈｅｎらより）：
【００２０】
【化２】
2020023557.tif 000003
ＤＮＡ塩基のこのような結合またはアルキル化は、塩基対置換、特に脱プリン反応、欠失、およびヌクレオシドの架橋を含む、多数の機構によって突然変異原性（ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ）を誘発する。ＢＰＬの高度の突然変異原性および反応性は、迅速なウイルスの死滅、および非発癌性副生成物への引き続いてのＤＮＡ分解に対応する。
【００２１】
いかなる残存機能性細胞培養物ＤＮＡをも、１％未満のＢＰＬ（例えば、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、または０．００５％未満）での処理によって分解される。好ましくは、残存機能性細胞培養物ＤＮＡは、０．１％〜０．０１％ＢＰＬでの処理によって分解される。
【００２２】
アルキル化剤は、好ましくは、緩衝化溶液へ添加され、そして該溶液のｐＨは、好ましくは５〜１０に維持される。より好ましくは、前記溶液のｐＨは６〜９に維持される。なおより好ましくは、前記溶液のｐＨは７〜８に維持される。
【００２３】
ある方法において、アルキル化剤は、２回以上添加される。例えば、１回目のＢＰＬ処理が行われ得、そして次いで２回目のＢＰＬ処理が行われ得る。１回目および２回目の処理の間に、アルキル化剤除去工程が存在し得るが、１回目の処理から残存するアルキル化剤を除去することなく、２回目の処理について、アルキル化剤が添加されてもよい。
【００２４】
好ましくは、アルキル化剤はまた、ワクチン中において使用されるウイルスについての不活性化剤として使用される。本発明のアルキル化剤は、タンパク質を他の材料（宿主細胞ＤＮＡを含む）へ架橋し得るホルムアルデヒド等の伝統的な不活性化剤と比べて好ましい。このような架橋は、凝集物（例えば、タンパク質−タンパク質集合体、ヌクレオチドコンビネーション、およびタンパク質−ヌクレオチドコンビネーション）の形成へ導き得る。アルキル化剤（例えば、ＢＰＬ）はウイルス不活性化についてこのような架橋機構に依拠しないので、ウイルス不活性化についてのこのようなアルキル化剤の使用は、ワクチン製品中における凝集物および他の不純物の形成を最小化する。このような凝集物は、他のタンパク質へイオン結合または共有結合されたタンパク質、他のヌクレオチドへイオン結合または共有結合されたタンパク質、および／または他のヌクレオチドへイオン結合または共有結合されたヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
本明細書中において使用される場合、「凝集」または「凝集物」への参照は、一緒に結合されてより大きな群または粒子を作製する個々の単位または粒子の塊または集まりを示す。凝集は、可能性のある凝集段階の前および後に、または凝集物破壊法（ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、洗剤処理による）の適用の前および後に、ゲル電気泳動（例えば、ラエムリシステム（Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ  ｓｙｓｔｅｍ））、クロマトグラフィー、溶液濁度、もしくは沈殿研究および当該分野において周知の他の方法によって、所望の成分の定量測定により、一般的に測定され得る。
【００２６】
アルキル化剤、特にＢＰＬでの処理は、種々の温度を有する相を含み得る。例えば、低温（例えば、２〜８℃の間、例えば約４℃）での第１相、およびより高い温度、典型的に第１相よりも少なくとも１０℃より高い温度（例えば、２５〜５０℃、例えば約３７℃）での第２相が存在し得る。この２相プロセスは、アルキル化剤が不活性化およびＤＮＡ分解の両方のために使用される場合、特に有用である。典型的なスキームにおいて、ウイルス不活性化は、低温相の間に生じ、そしてＤＮＡ分解は、高温相の間に生じる。下記により詳細に記載されるように、上昇された温度はまた、感熱性アルキル化剤の除去を促進し得る。
【００２７】
免疫原性タンパク質
本発明における使用に好適な免疫原性タンパク質は、ワクチンの標的である任意のウイルスから誘導され得る。免疫原性タンパク質は、不活性化（または死滅）ウイルス、弱毒化ウイルス、分割された（ｓｐｌｉｔ）ウイルス製剤、精製されたサブユニット製剤、ウイルスから単離、精製または誘導されるウイルスタンパク質、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）として製剤化され得る。
【００２８】
本発明の免疫原性タンパク質は、そのライフサイクルの少なくとも１段階の間にウイルスの表面上に露出されるエピトープを好ましくは含むウイルス抗原である。ウイルス抗原は、好ましくは、複数の血清型または分離株にわたって保存される。ウイルス抗原としては、下記に記載の１以上のウイルスから誘導される抗原ならびに下記に同定される特定の抗原例が挙げられる。ウイルスは、非エンベロープ型であり得、または好ましくはエンベロープ型であり得る。ウイルスは、好ましくはＲＮＡウイルスであり、そしてより好ましくはｓｓＲＮＡウイルスである。それらは、センス、または、好ましくはアンチセンスゲノムを有し得る。それらのゲノムは、非セグメント化であり得、または、好ましくはセグメント化であり得る。
【００２９】
オルトミクソウイルス：ウイルス抗原は、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ等の、オルトミクソウイルスから誘導され得る。オルトミクソウイルス抗原は、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１以上の転写酵素成分（ＰＢｌ、ＰＢ２およびＰＡ）を含む、１以上のウイルスタンパク質より選択され得る。好ましい抗原としては、ＨＡおよびＮＡが挙げられる。
【００３０】
インフルエンザ抗原は、インターパンデミック（アヌアル）インフルエンザ株（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ  （ａｎｎｕａｌ）  ｆｌｕ  ｓｔｒａｉｎｓ）から誘導され得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、パンデミック  パンデミック発生を引き起こす可能性を有する株から誘導され得る（即ち、現在広がっている株中の血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体において病原性でありかつヒトの集団において水平に感染する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性であるインフルエンザ株）。特定の季節およびワクチン中に含まれる抗原の性質に依存して、インフルエンザ抗原は、下記の１以上の血球凝集素サブタイプから誘導され得る：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６。
【００３１】
本発明のインフルエンザ抗原は、トリインフルエンザ株、特に、高病原性トリインフルエンザ株（ＨＰＡＩ）から誘導され得る。Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ（２００３）４７（３  Ｓｕｐｐｌ）：９７６−８１）。
【００３２】
インフルエンザウイルス抗原のさらなる詳細を、以下に与える。
【００３３】
パラミクソウイルス科ウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス科ウイルス、例えば、肺炎ウイルス属（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス属（ＰＩＶ）および麻疹ウイルス属（麻疹）から誘導され得る。
【００３４】
肺炎ウイルス属：ウイルス抗原は、肺炎ウイルス属、例えば、呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器性シンシチウムウイルス、マウス肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスから誘導され得る。好ましくは、肺炎ウイルス属はＲＳＶである。肺炎ウイルス属抗原は、下記を含む、１以上の下記のタンパク質から選択され得る：表面タンパク質融合（Ｆｕｓｉｏｎ）（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）および小疎水性タンパク質（Ｓｍａｌｌ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＳＨ）、基質タンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、ＰおよびＬ、ならびに非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２。好ましい肺炎ウイルス属抗原としては、Ｆ、ＧおよびＭが挙げられる。例えば、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；８５（Ｐｔ  １１）：３２２９）を参照のこと。肺炎ウイルス属抗原はまた、キメラウイルスにおいて製剤化され得るかまたはキメラウイルスから誘導され得る。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含み得る。
【００３５】
パラミクソウイルス属：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルスおよびニューカッスル病ウイルスから誘導され得る。好ましくは、パラミクソウイルスはＰＩＶまたはムンプスである。パラミクソウイルス抗原は、１以上の下記のタンパク質から選択され得る：血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１およびＦ２、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、ラージタンパク質（Ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｌ）、および基質タンパク質（Ｍ）。好ましいパラミクソウイルスタンパク質としては、ＨＮ、Ｆ１およびＦ２が挙げられる。パラミクソウイルス抗原はまた、キメラウイルスにおいて製剤化され得るかまたはキメラウイルスから誘導され得る。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含み得る。市販のムンプスワクチンとしては、一価形態であるかまたは麻疹および風疹ワクチンと組み合わされた、生弱毒化ムンプスウイルス（ＭＭＲ）が挙げられる。
【００３６】
麻疹ウイルス属：ウイルス抗原は、麻疹ウイルス属、例えば、麻疹から誘導され得る。麻疹ウイルス属抗原は、１以上の下記のタンパク質から選択され得る：血球凝集素（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）ラージタンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼリンタンパク質（Ｐ）、および基質（Ｍ）。市販の麻疹ワクチンとしては、典型的にムンプスおよび風疹と組み合わされた、生弱毒化麻疹ウイルス（ＭＭＲ）が挙げられる。
【００３７】
ピコルナウイルス科のウイルス：ウイルス抗原は、ピコルナウイルス科のウイルス、例えば、エンテロウイルス属、ライノウイルス属、ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルスおよびアフトウイルス属から誘導され得る。エンテロウイルス属、例えば、ポリオウイルスから誘導される抗原が好ましい。
【００３８】
エンテロウイルス属：ウイルス抗原は、エンテロウイルス属、例えば、ポリオウイルス１、２または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス）１〜９、１１〜２７および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８〜７１から誘導され得る。好ましくは、エンテロウイルス属はポリオウイルスである。エンテロウイルス属抗原は、好ましくは、１以上の下記のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４から選択される。市販のポリオワクチンとしては、不活性化ポリオワクチン（ＩＰＶ）および経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）が挙げられる。
【００３９】
ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）：ウイルス抗原は、ヘパルナウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）から誘導され得る。市販のＨＡＶワクチンとしては、不活性化ＨＡＶワクチンが挙げられる。
【００４０】
トガウイルス科：ウイルス抗原は、トガウイルス科、例えば、ルビウイルス属、アルファウイルス属、またはアルテリウイルス属（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）から誘導され得る。ルビウイルス属、例えば風疹ウイルスから誘導される抗原が好ましい。トガウイルス抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−１、ＮＳＰＯ−２、ＮＳＰ−３またはＮＳＰ−４から選択され得る。トガウイルス抗原は、好ましくは、Ｅ１、Ｅ２またはＥ３から選択される。市販の風疹ワクチンとしては、典型的にムンプスおよび麻疹ワクチンと組み合わされた、生きている低温適応された（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）ウイルス（ＭＭＲ）が挙げられる。
【００４１】
フラビウイルス属：ウイルス抗原は、フラビウイルス属、例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、デング熱（１、２、３または４型）、黄熱、日本脳炎、西ナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポーワッサン脳炎から誘導され得る。フラビウイルス属抗原は、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ、Ｅ、ＮＳ−１、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５から選択され得る。フラビウイルス属抗原は、好ましくはＰｒＭ、ＭおよびＥから選択される。市販のＴＢＥワクチンとしては、不活性化ウイルスワクチンが挙げられる。
【００４２】
ペスチウイルス属：抗原は、ペスチウイルス属、例えば、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（Ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＢＤＶ）から誘導され得る。
【００４３】
ヘパドナウイルス：ウイルス抗原は、ヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスから誘導され得る。ヘパドナウイルス抗原は、表面抗原（Ｌ、ＭおよびＳ）、コア抗原（ＨＢｃ、ＨＢｅ）から選択され得る。市販のＨＢＶワクチンとしては、表面抗原Ｓタンパク質を含むサブユニットワクチンが挙げられる。
【００４４】
Ｃ型肝炎ウイルス：ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）から誘導され得る。ＨＣＶ抗原は、１以上のＥ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３４５ポリプロテイン、ＮＳ  ３４５−コアポリプロテイン、コア、および／または非構造領域由来のペプチド（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１）から選択され得る。
【００４５】
ラブドウイルス科のウイルス：ウイルス抗原は、ラブドウイルス科のウイルス、例えば、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス属（ＶＳＶ）から誘導され得る。ラブドウイルス抗原は、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、ラージタンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質（ＮＳ）から選択され得る。市販の狂犬病ウイルスワクチンは、ヒト二倍体細胞または胎仔アカゲザル肺細胞において増殖された死滅ウイルスを含む。
【００４６】
カリシウイルス科：ウイルス抗原は、カリシウイルス科、例えば、ノーウォークウイルス、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス（Ｓｎｏｗ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｒｕｓ）から誘導され得る。
【００４７】
コロナウイルス属：ウイルス抗原は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、鳥類伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）から誘導され得る。コロナウイルス抗原は、スパイク（ｓｐｉｋｅ）（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、基質（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、および血球凝集素−エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択され得る。好ましくは、コロナウイルス抗原は、ＳＡＲＳウイルスから誘導される。ＳＡＲＳウイルス抗原は、ＷＯ  ０４／９２３６０に記載されている。
【００４８】
レトロウイルス：ウイルス抗原は、レトロウイルス、例えば、オンコウイルス、レンチウイルスまたはスプマウイルスから誘導され得る。オンコウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２またはＨＴＬＶ−５から誘導され得る。レンチウイルス抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２から誘導され得る。レトロウイルス抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｖｐｒから選択され得る。ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ  ｖｐｕ、ミニタンパク質、（好ましくは、ｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖ欠失型（ｄｅｌｅｔｅ））から選択され得る。ＨＩＶ抗原は、１以上の下記の株から誘導され得る：ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４。
【００４９】
レオウイルス属：ウイルス抗原は、レオウイルス属、例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスから誘導され得る。レオウイルス属抗原は、構造タンパク質  λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、σ１、σ２、またはσ３、あるいは非構造タンパク質  σＮＳ、μＮＳ、またはσ１ｓから選択され得る。好ましいレオウイルス属抗原は、ロタウイルスから誘導され得る。ロタウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４（または切断産物ＶＰ５およびＶＰ８）、ＮＳＰ１、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ２、ＶＰ７、ＮＳＰ４，またはＮＳＰ５から選択され得る。好ましいロタウイルス抗原としては、ＶＰ４（または切断産物ＶＰ５およびＶＰ８）、およびＶＰ７が挙げられる。
【００５０】
パルボウイルス属：ウイルス抗原は、パルボウイルス属、例えば、パルボウイルスＢ１９から誘導され得る。パルボウイルス属抗原は、ＶＰ１、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−１およびＮＳ−２から選択され得る。好ましくは、パルボウイルス属抗原は、カプシドタンパク質ＶＰ−２である。
【００５１】
デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：ウイルス抗原は、ＨＤＶ、特にＨＤＶからのδ−抗原から誘導され得る（例えば、米国特許第５３７８８１４号を参照のこと）。
【００５２】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：ウイルス抗原は、ＨＥＶから誘導され得る。
【００５３】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）：ウイルス抗原は、ＨＧＶから誘導され得る。
【００５４】
ヒトヘルペスウイルス：ウイルス抗原は、ヒトヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）から誘導され得る。ヒトヘルペスウイルス抗原は、前初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）タンパク質（α）、初期タンパク質（β）、および後期タンパク質（γ）から選択され得る。ＨＳＶ抗原は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２株から誘導され得る。ＨＳＶ抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ、融合タンパク質（ｇＢ）、または免疫回避タンパク質（ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ｇＣ、ｇＥ、またはｇＩ）から選択され得る。ＶＺＶ抗原は、コア、ヌクレオカプシド、テグメント（ｔｅｇｕｍｅｎｔ）、またはエンベロープタンパク質から選択され得る。生弱毒化ＶＺＶワクチンは、市販されている。ＥＢＶ抗原は、初期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイルスカプシド抗原（ＶＣＡ）、および膜抗原（ＭＡ）の糖タンパク質から選択され得る。ＣＭＶ抗原は、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（例えば、ｇＢおよびｇＨ）、およびテグメントタンパク質から選択され得る。
【００５５】
パポバウイルス：抗原は、パポバウイルス、例えば、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス属から誘導され得る。パピローマウイルスとしては、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３および６５が挙げられる。好ましくは、ＨＰＶ抗原は、血清型６、１１、１６または１８から誘導される。ＨＰＶ抗原は、カプシドタンパク質（Ｌ１）および（Ｌ２）、またはＥ１−Ｅ７、またはそれらの融合物から選択され得る。ＨＰＶ抗原は、好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へ製剤化される。ポリオーマウイルス属ウイルスとしては、ＢＫウイルスおよびＪＫウイルスが挙げられる。ポリオーマウイルス属抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３から選択され得る。
【００５６】
Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第４版（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編  ２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第４版（Ｍｕｒｒａｙら編  ２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編  １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編  １９９１）に記載されるウイルス抗原がさらに提供され、これらは、本発明の組成物と共に考慮される。
【００５７】
本発明における使用に好適な免疫原性タンパク質は、呼吸器疾患を引き起こすウイルスから誘導され得る。このような呼吸器抗原の例としては、オルトミクソウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス属（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス属（ＰＩＶ）、麻疹ウイルス属（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ、およびコロナウイルス属（ＳＡＲＳ）等の呼吸器系ウイルスから誘導されるタンパク質が挙げられる。インフルエンザウイルスから誘導される免疫原性タンパク質が、特に好ましい。
【００５８】
本発明の組成物は、小児被験者における使用に好適な１以上の免疫原性タンパク質を含み得る。小児被験者は、典型的に、約３歳未満、または約２歳未満、または約１歳未満である。小児抗原は、６ヶ月、１、２または３年にわたって複数回投与され得る。小児抗原は、小児集団を標的化し得るウイルスおよび／または小児集団が感染しやすいウイルスから誘導され得る。小児ウイルス抗原としては、オルトミクソウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス属（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス属（ＰＩＶおよびムンプス）、麻疹ウイルス属（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス属（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス属（ＳＡＲＳ）、および水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の１以上から誘導される抗原が挙げられる。
【００５９】
本発明の組成物は、高齢のまたは免疫無防備状態の個人における使用に好適な１以上の免疫原性タンパク質を含み得る。このような個人は、標的化抗原に対するそれらの免疫応答を改善するために、より高用量でまたはアジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）製剤で、より頻繁にワクチン接種される必要があり得る。高齢のまたは免疫無防備状態の個人における使用について標的化され得る抗原としては、下記のウイルスの１以上から誘導された抗原が挙げられる：オルトミクソウイルス（インフルエンザ）、肺炎ウイルス属（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス属（ＰＩＶおよびムンプス）、麻疹ウイルス属（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス属（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス属（ＳＡＲＳ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）。
【００６０】
ウイルスを増殖した後、アルキル化剤が、精製されたビリオンに対して、例えば、浄化された（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ）細胞培養物中に存在するビリオンに対して、またはこのような浄化された細胞培養物から精製されたビリオンに対して、使用され得る。本発明の方法は、浄化、次いで該浄化された細胞培養物からのビリオンの精製（例えば、クロマトグラフィーによる）によって、細胞性材料を除去することを含み得る。アルキル化剤は、この様式で精製されたビリオンに対して、または限外濾過／ダイアフィルトレーションのさらなる任意の工程後に、使用され得る。好ましい方法は、感染された細胞培養物の浄化された上澄みに対してではなく、このような浄化された上澄みから精製されたビリオンに対して、アルキル化剤を使用する（Ｍｏｒｇｅａｕｘら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：８２−９０を参照のこと）。
【００６１】
アルキル化剤は、好ましくは、内毒素除去工程が行われた後に使用される。
【００６２】
方法工程
本発明のワクチン組成物は、免疫原性タンパク質の単離および残存機能性宿主細胞ＤＮＡの分解によって調製され得る。同様に、組換えタンパク質製剤は、組換えタンパク質の単離または精製および残存機能性宿主細胞ＤＮＡの分解によって調製され得る。これらの工程は、連続的にまたは同時に行われ得る。残存機能性細胞培養物ＤＮＡを分解する工程は、アルキル化剤（例えば、ＢＰＬ）の添加によって行われる。
【００６３】
アルキル化剤およびあらゆる残存副生成物は、ワクチンまたは組換えタンパク質の最終製剤の前に、好ましくは除去される。好ましくは、ワクチン組成物または組換えタンパク質製剤は、組み合わされた０．１％未満の遊離プロピオン酸およびＢＰＬを含有する（例えば、０．１％、０．０５％、０．０２５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、または０．０１％未満）。好ましくは、最終ワクチン組成物または組換えタンパク質製剤は、０．０１％未満のＢＰＬを含有する。
【００６４】
ＢＰＬは、好都合なことに、加熱し、非毒性β−ヒドロキシプロピオン酸への加水分解を引き起こすことによって除去され得る。加水分解のために必要とされる時間の長さは、ＢＰＬの総量および温度に依存する。温度が高いほどより迅速な加水分解が提供されるが、温度は、活性タンパク質様成分に損傷を与えるほど高く上昇されるべきではない。下記に記載されるように、２〜２．５時間約３７℃への加熱が、ＢＰＬを除去するために好適である。
【００６５】
ＤＮＡの処理後、残存ＤＮＡプロダクトは、最終免疫原性または組換え組成物中に保持され得る。しかし、より好ましくは、それらは、所望の成分から分離され、例えば、ビリオン／タンパク質から分離される。この様式での分離は、ＤＮＡ分解産物を部分的または全体的に除去し得、そして好ましくは、＞２００ｂｐであるいかなる分解されたＤＮＡをも除去する。したがって、本発明の方法は、ビリオンからＤＮＡを分離する工程を含み得る。この分離工程は、例えば、１以上の限外濾過、超遠心分離（勾配超遠心分離を含む）、ウイスルコアペレット化および上澄み分別、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、例えばアニオン交換）、吸着等を含み得る。
【００６６】
全体的に、したがって、方法は、残存ＤＮＡの長さを分解するためのアルキル化剤での処理、および残存ＤＮＡを除去するための後の精製（分解されたＤＮＡの除去を含む）を含み得る。
【００６７】
細胞培養物
本発明のワクチンは、細胞培養物において増殖されるウイルスから調製される。さらに、本発明は、細胞培養物中において発現された組換えタンパク質の製剤を含む。哺乳動物細胞培養物が、ウイルス複製および組換えタンパク質発現の両方について好ましい。
【００６８】
多数の哺乳動物細胞株が、当該分野において公知であり、そして以下から誘導される細胞株を含む：ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、サル）細胞（例えば、例えばＷＯ０１／３８３６２、ＷＯ０１／４１８１４、ＷＯ０２／４０６６５、ＷＯ２００４／０５６９７９、およびＷＯ２００５／０８０５５６（参照によりそれらの全体が本明細書中において組み込まれる）に記載され、ならびにＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託される、ＰＥＲ．Ｃ６細胞）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、胎仔アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、ヒト胚腎臓細胞（せん断された（ｓｈｅａｒｅｄ）アデノウイルスタイプ５ＤＮＡによって典型的に形質転換された、２９３細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ  ３３０１６、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９（ＷＯ  ９７／３７０００およびＷＯ  ９７／３７００１に記載される））、ネコ、およびげっ歯類（例えば、ハムスター細胞、例えばＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）；そして、例えば成体、新生児、胎児、胚を含む、広範囲の発達段階から得られ得る。
【００６９】
好適なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞株におけるような腎細胞である。好適なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株におけるような腎細胞である。したがって、好適な細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８等。哺乳動物細胞の使用は、ワクチンにニワトリＤＮＡ、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）等の物質が含まれ得ず、それによってアレルゲン性を減少させることを意味する。
【００７０】
特定の実施形態において、細胞は、不死化される（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞；ＥＣＡＣＣ  ９６０２２９４０）。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞が使用され、そして以下の非限定的な細胞タイプの１以上から選択および／または誘導され得る：線維芽細胞（例えば、皮膚、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠動脈、肺動脈、脈管、皮膚微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳房細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、脈管、大動脈、冠動脈、動脈、子宮、気管支、頚部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経細胞（例えば、星状細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎臓または腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格筋、平滑筋、気管支）、肝細胞、網膜細胞または網膜芽細胞、肺細胞、および間質細胞。
【００７１】
ＷＯ９７／３７０００およびＷＯ９７／３７００１は、懸濁液および無血清培地において増殖し得かつウイルス（特に、インフルエンザウイルス）の産生および複製に有用である、動物細胞および細胞株の産生を記載している。さらなる詳細は、ＷＯ０３／０２３０２１およびＷＯ０３／０２３０２５に与えられる。
【００７２】
インフルエンザウイルスを増殖するための好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓由来の、ＭＤＣＫ細胞；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来の、Ｖｅｒｏ細胞；またはヒト胚網膜芽細胞由来の、ＰＥＲ．Ｃ６細胞。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションから、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で種々の異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、そしてそれは、カタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００７３】
インフルエンザウイルスを増殖するために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。オリジナルのＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の誘導体もまた使用され得る。例えば、ＷＯ９７／３７０００は、懸濁培養における増殖に適応されたＭＤＣＫ細胞株を開示している（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された、「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）。同様に、ＥＰ−Ａ−１２６０５８１（ＷＯ  ０１／６４８４６）は、無血清培養における懸濁液において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株を開示している（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された、「Ｂ−７０２」）。ＷＯ２００６／０７１５６３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示している。ＷＯ２００５／１１３７５８は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対して高感受性を有するＭＤＣＫ細胞株を開示している。これらのＭＤＣＫ細胞株のいずれもが使用され得る。
【００７４】
懸濁液中のＭＤＣＫ細胞培養物および付着培養物（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の操作は、ＷＯ９７／３７０００、ＷＯ９７／３７００１、ＷＯ０３／０２３０２１、およびＷＯ０３／０２３０２５に記載されている。特に、ＷＯ  ０３／０２３０２１およびＷＯ  ０３／０２３０２５は、無血清培地、化学的に規定された培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）、および無タンパク質培地における実験および商業規模細胞培養容量のＭＤＣＫ懸濁細胞を記載している。各参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【００７５】
哺乳動物供給源の代替物として、本発明における使用のための細胞株は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラまたはキジ等の鳥類供給源から誘導され得る。鳥類細胞株は、胚、幼鳥および成体を含む種々の発達段階から誘導され得る。好ましくは、細胞株は、胚細胞、例えば胚線維芽細胞、生殖細胞、または個々の器官（ニューロン、脳、網膜、腎臓、肝臓、心臓、筋肉を含む）、または胚を保護する胚外組織および膜から誘導される。鳥類細胞株の例としては、鳥類胚幹細胞（ＷＯ０１／８５９３８およびＷＯ０３／０７６６０１）およびアヒル網膜細胞（ＷＯ２００５／０４２７２８）が挙げられる。好適な鳥類胚幹細胞としては、ニワトリ胚幹細胞から誘導されたＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４が挙げられる（ＷＯ２００６／１０８８４６）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）もまた使用され得る。これらの鳥類細胞は、インフルエンザウイルスを増殖するために特に好適である。
【００７６】
昆虫細胞発現系、例えば、バキュロウイルス組換え発現系は、当業者に公知であり、そして、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／挿入細胞発現系についての材料および方法は、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ製の、キット形態で市販されている。バキュロウイルス発現ベクターと共の使用のための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００７７】
タンパク質の組換え発現もまた、大腸菌、枯草菌、および連鎖球菌種等の細菌宿主中において行われ得る。タンパク質の組換え発現に好適な酵母宿主としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【００７８】
上記細胞タイプについての培養条件は、種々の刊行物に十分に記載されており、あるいは、培養培地、補充物および条件は、例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）のカタログおよびさらなる文献に記載されるように、商業的に購入され得る。
【００７９】
ある実施形態において、本明細書中に記載される本方法において使用される宿主細胞は、無血清および／または無タンパク質培地中において培養される。培地は、ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物が存在しない本明細書の文脈において、無血清培地と呼ばれる。無タンパク質は、細胞の増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質の排除を伴って生じるが、トリプシンまたはウイルス増殖に必要であり得る他のプロテアーゼ等のタンパク質を必要に応じて含み得る、培養物を意味すると理解される。このような培養物中において増殖する細胞は、それら自体、タンパク質を天然に含有し得る。
【００８０】
公知の無血清培地としては、Ｉｓｃｏｖｅ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。通常の血清含有培地としては、イーグル基本培地（ＢＭＥ）または最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭもしくはＥＤＭ）が挙げられ、これらは、通常、１０％までのウシ胎仔血清または類似の添加物と共に使用される。必要に応じて、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭもしくはＥＤＭ）は、血清含有補充物なしで使用され得る。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような無タンパク質培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような化学的に規定される培地、およびＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、ＰｅｐｔｉｃａｓｅもしくはＨｙＰｅｐＴＭ（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）マイトジェンペプチドまたはラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏおよび他の製造業者）もまた、当該分野において十分に公知である。植物加水分解物に基づく培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染性因子での汚染が排除され得るという特別な利点を有する。
【００８１】
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値等）は、本発明に従って使用される細胞株の適合性に起因して非常に広範囲にわたって可変であり、そして特定のウイルス増殖条件または組換え発現詳細の要件に適応され得る。
【００８２】
細胞は、種々の様式で、例えば、懸濁液中、付着培養物（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）中、マイクロキャリア上において、増殖され得る。
【００８３】
細胞は、ウイルス複製の間３７℃未満で（例えば、３０〜３６℃）増殖され得る（ＷＯ９７／３７００１）。
【００８４】
培養細胞物中においてウイルスを増殖させるための方法は、一般的に、培養される株を培養された細胞に接種する工程、例えばウイルス力価または抗原発現によって測定されるような、ウイルス増殖について望まれる時間の間（例えば、接種後２４〜１６８時間）、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を含む。前記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルス（ＰＦＵもしくはＴＣＩＤ５０によって測定される）対細胞比で接種され得る。ウイルスは、細胞の懸濁液へ添加されるかまたは細胞の単層へ適用され得、そしてウイルスは、少なくとも６０分しかし通常は３００分未満の間、好ましくは９０〜２４０分間、２５℃〜４０℃で、好ましくは２８℃〜３７℃で、細胞上に吸着される。
【００８５】
前記感染された細胞培養物（例えば、単層）は、収穫される培養上澄みのウイルス含有量を増加するために、凍結−解凍によってまたは酵素作用によって除去され得る。次いで、収穫された流体は、不活性化されるかまたは凍結保存される。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染の多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で、感染され得る。なおより好ましくは、細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で感染される。感染された細胞は、感染後３０〜６０時間で収穫され得る。好ましくは、細胞は、感染後３４〜４８時間で収穫される。なおより好ましくは、細胞は、感染後３８〜４０時間で収穫される。プロテアーゼ（典型的に、トリプシン）は、一般的に、細胞培養の間に添加され、ウイルス放出を可能にし、そして該プロテアーゼは、培養の間の任意の好適な段階で添加され得る。
【００８６】
本発明のワクチン組成物は、一般的に、サブ−ビリオン形態、例えば分割されたウイルス（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｕｓ）の形態（ここで、ウイルス脂質エンベロープが溶解または破壊されている）で、または１以上の精製されたウイルスタンパク質の形態で、製剤化される。ワクチン組成物は、患者において免疫学的応答を生じさせるに十分な量の抗原を含有する。
【００８７】
インフルエンザウイルス等のウイルスを分割する（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）方法は、当該分野において周知であり、例えば、ＷＯ０２／２８４２２、ＷＯ０２／０６７９８３、ＷＯ０２／０７４３３６、ＷＯ０１／２１１５１等を参照のこと。ウイルスの分割は、破壊濃度の分割剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で、感染性（野生型または弱毒化）または非感染性（例えば、不活性化）に関わらず、全ウイルスを破壊またはフラグメント化することによって行われる。分割剤としては、典型的に親水性頭部へ結合された疎水性尾部を有する、脂質膜を破壊しそして溶解し得る薬剤が一般的に挙げられる。最も好ましい分割剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である。分割のさらなる詳細は、インフルエンザウイルスの文脈において下記に与えられる。
【００８８】
破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化を生じさせ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ  ｓｕｇａｒｓ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル等である。
【００８９】
ウイルスから個々のタンパク質を精製する方法は、周知であり、そして、例えば、濾過、クロマトグラフィー、遠心分離工程および中空糸溶出を含む。１実施形態において、タンパク質は、イオン交換樹脂によって精製される。
【００９０】
さらなる代替物として、ワクチンは、全ウイルス、例えば、生弱毒化全ウイルス、または好ましくは、不活性化全ウイルスを含み得る。哺乳動物細胞に感染するそれらの能力を破壊するためにウイルスを不活性化または死滅する方法は、当該分野において公知である。このような方法は、化学的および物理的手段の両方を含む。ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、有効量の１以上の下記の薬剤での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、ＢＰＬ、またはＵＶ光。不活性化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）またはそれらの任意の組み合わせでの処理が挙げられる。例えばバイナリーエチルアミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アセチルエチレンイミン、またはガンマ線照射等の、ウイルス不活性化の他の方法が、当該分野において公知である。好ましくは、ウイルスは、ＢＰＬで不活性化される。
【００９１】
薬学的組成物
本発明の組成物は、薬学的に許容される。それらは、通常、抗原に加えて、成分を含み、例えば、それらは、典型的に、１以上の薬学的担体および／または賦形剤を含む。このような成分の完全な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００；第２０版，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）において入手可能である。
【００９２】
組成物は、一般的に、水性形態である。
【００９３】
組成物は、１以上の保存剤、例えば、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールを含み得る。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含むべきでなく（即ち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメサール−フリーであることが好ましい（Ｂａｎｚｈｏｆｆ（２０００）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７１：９１−９６；ＷＯ０２／０９７０７２）。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【００９４】
例えば張度を制御するために、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム（無水）（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が挙げられる。
【００９５】
組成物は、一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、そしてより好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。
【００９６】
組成物は、１以上の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含有する）；またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、典型的に、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【００９７】
組成物のｐＨは、一般的に５．０〜８．１、そしてより典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５である。したがって、本発明の方法は、包装前に、バルクワクチン（ｂｕｌｋ  ｖａｃｃｉｎｅ）のｐＨを調節する工程を含み得る。
【００９８】
組成物は、好ましくは、無菌性である。組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量当たり＜１  ＥＵ（内毒素単位、標準測定値）、そして好ましくは１用量当たり＜０．１  ＥＵを含有する。組成物は、好ましくは、グルテンを含有しない。
【００９９】
本発明の組成物は、洗剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含み得る。洗剤は、微量でのみ存在し得る。
【０１００】
組成物は、単回免疫のための材料を含んでもよく、または複数回免疫のための材料（即ち、「多用量」キット）を含んでもよい。保存剤を含めることは、多用量アレンジメントにおいて有用である。多用量組成物中に保存剤を含めることの代替として（または含めることに加えて）、組成物は、材料の除去のための無菌アダプター（ａｓｅｐｔｉｃ  ａｄａｐｔｏｒ）を有する容器中に含められ得る。
【０１０１】
ワクチンは、典型的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半分の用量（即ち、約０．２５ｍｌ）が小児へ投与され得る。
【０１０２】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃で保存される。それらは、凍結されるべきでない。それらは、理想的には、直射日光外に維持されるべきである。
【０１０３】
治療方法、およびワクチンの投与
本発明の組成物は、動物（および、特に、ヒト）患者への投与に好適であり、そして本発明は、本発明の組成物を患者へ投与する工程を含む、患者における免疫応答を引き起こす方法を提供する。
【０１０４】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１０５】
本発明はまた、患者における免疫応答を引き起こすための医薬の製造における、細胞培養物において増殖されたウイルスから誘導された免疫原性タンパク質の使用を提供し、ここで、該ワクチンは、残存機能性細胞培養物ＤＮＡを実質的に含まない。
【０１０６】
これらの方法および使用によって引き起こされる免疫応答は、一般的に、抗体応答、好ましくは保護的抗体応答を含む。ウイルスワクチン接種後の、抗体応答、中和能力および保護を評価するための方法は、当該分野において周知である。例えば、インフルエンザウイルスについて、ヒト研究は、ＨＡに対する抗体力価は保護と関連することを示した（約３０〜４０の血清サンプル血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染からの約５０％保護を提供する）［Ｐｏｔｔｅｒ  ＆  Ｏｘｆｏｒｄ（１９７９）Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ  ３５：６９−７５］。
【０１０７】
本発明の組成物は、種々の様式で投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、（例えば、腕または脚中への）筋内注射によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内、経口、皮内、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）等が挙げられる。
【０１０８】
本発明に従って調製されたワクチンは、小児および成人の両方を治療するために使用され得る。患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、若者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍部および軍関係者、妊婦、慢性的な病人、免疫不全の患者、ワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス性化合物（例えば、インフルエンザについてオセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を参照のこと）を摂取した患者、卵アレルギーを有する人、海外へ旅行する人であってもよい。しかし、ワクチンは、これらの群についてのみに好適ではなく、そして集団においてより一般的に使用され得る。
【０１０９】
治療は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによってであり得る。複数回用量は、プライマリー（ｐｒｉｍａｒｙ）免疫スケジュールおよび／またはブースター（ｂｏｏｓｔｅｒ）免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同一または異なる経路、例えば、非経口プライムおよび経粘膜ブースト、経粘膜プライムおよび非経口ブースト等によって与えられ得る。２回以上の用量（典型的に２回用量）の投与が、免疫学的にナイーブな（ｎａｉｖｅ）患者において特に有用である。複数回用量は、典型的に、少なくとも１週間間隔で（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間等）投与される。
【０１１０】
本発明によって作製されたワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医療相談または訪問の間に）、例えば、細菌ワクチン、例えばジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）インフルエンザ菌ｂ型ワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、肺炎球菌結合型ワクチン（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）等と実質的に同時に、患者に投与され得る。
【０１１１】
同様に、本発明のワクチンは、ワクチンのウイルスに対して有効な抗ウイルス化合物と実質的に同時に（例えば、医療専門家への同一の医療相談または訪問の間に）、患者へ投与され得る。例えば、ワクチンがインフルエンザワクチンである場合、前記化合物は、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）であり得る。これらの抗ウイルス剤としては、それらのエステル（例えば、エチルエステル）およびそれらの塩（例えば、リン酸塩）を含む、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキサン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎ）−２−エノニックアシッド（ｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。インフルエンザに対して有効な好ましい抗ウイルス剤は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知の、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）である。
【０１１２】
宿主細胞ＤＮＡ
残存宿主細胞ＤＮＡの測定は、当業者の通常の能力内である。本発明の組成物中の残存ＤＮＡの総量は、好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ未満、例えば、≦１０ｎｇ／ｍｌ、≦５ｎｇ／ｍｌ、≦１ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｐｇ／ｍｌ、≦１０ｐｇ／ｍｌ等である。上述されるように、このＤＮＡの実質的に全てが、好ましくは、５００塩基対未満の長さである。
【０１１３】
ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、典型的に、公認されたアッセイである（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ＣＤＥＲ）  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （ＣＶＭ）．  Ｍａｙ  ２００１；  Ｌｕｎｄｂｌａｄ  （２００１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１９５−１９７）。公認されたアッセイの性能特徴は、数学的および定量化可能な用語で記載され得、そしてエラーのその可能性のある供給源が同定された。アッセイは、一般的に、精度、正確さ、特異性等の特徴について試験された。アッセイが（例えば、既知の標準量の宿主細胞ＤＮＡに対して）較正されそして試験されると、定量ＤＮＡ測定が規定通りに行われ得る。ＤＮＡ定量についての３つの原理技術が使用され得る：ハイブリダイゼーション法、例えば、サザンブロットまたはスロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔｓ）（Ｊｉら（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３２：１１６２−７）；免疫学的決定法、例えば、ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステム（Ｂｒｉｇｇｓ（１９９１）Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５：７−１２．；および定量ＰＣＲ（Ｌａｈｉｊａｎｉら（１９９８）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１１７３−８０）。これらの方法は全て当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、問題の宿主細胞、例えば、ハイブリダイゼーションについてのプローブの選択、増幅についてのプライマーおよび／またはプローブの選択等に依存し得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルのトータルＤＮＡについての定量アッセイであり、そして生物薬剤中のコンタミＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されてきた（Ｂｒｉｇｇｓ（１９９１）、上記参照）。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的形成を含む。全てのアッセイ成分は、前記製造業者から入手可能な完全なトータルＤＮＡアッセイキット中に含まれる。種々の商業製造業者が、残存宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量ＰＣＲアッセイ、例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等を提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ汚染を測定することについてのトータルＤＮＡ  ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムおよび化学発光ハイブリダイゼーションアッセイの比較が、Ｌｏｋｔｅｆｆら（２００１）
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．２９：１２３−３２に見られ得る。
【０１１４】
これら種々の分析方法はまた、残存宿主細胞ＤＮＡの長さを測定するために使用され得る。上述されるように、残存宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、アルキル化剤での処理後、好ましくは５００塩基対未満であり、または２００塩基対未満でさえある。
【０１１５】
イヌ細胞（特に、例えば、ＭＤＣＫ細胞）に関して、ゲノムの分析は、＜５００ｂｐ長の１３個のコード配列、＜２００ｂｐの３個の配列、および＜１００ｂｐの１個の配列を明らかとする。したがって、＜２００ｂｐへのＤＮＡのフラグメント化は、実質的に全てのコード配列を除去し、そしていかなるフラグメントもがその長さぐらいの３つの遺伝子（即ち：８１ｂｐのセクレチン；１０８ｂｐのＰＹＹ；および１３５ｂｐのオステオカルシン）の１つに実際に対応するということは全くありそうにない。
【０１１６】
アジュバント
本発明の組成物は、該組成物を受容する患者において誘発される免疫応答（液性および／または細胞性）を増強するように機能し得る、アジュバントを含み得る。ウイルスワクチンと共のアジュバントの使用は、例えば、肝炎ワクチン、ポリオワクチン等において、周知である。ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザワクチンは、水中油型エマルジョンアジュバントを含む。
【０１１７】
本発明と共に使用され得るアジュバントとしては、アルミニウム塩、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、サポニン、リピドＡアナログ（例えば、３ｄＭＰＬ）、および水中油型エマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他のアジュバントは、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）およびＯ’Ｈａｇａｎ（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ４２  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｓｅｒｉｅｓ，ＩＳＢＮ：１−５９２５９−０８３−７）において、より詳細に開示されている。
【０１１８】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣習的であり、しかし、どちらも存在する実際の化合物の正確な記載でないので、便宜上にのみ使用される（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎの第９章を参照のこと）。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントのいずれも使用し得る。これらの塩への吸着が好ましい。
【０１１９】
アジュバント活性を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、周知である。それらは、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへリン酸結合によって結合された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）、ＴｐＧモチーフ、オリゴ−ｄＴ配列、オリゴ−ｄＣ配列、二本鎖ＲＮＡ、パリンドローム配列、ポリ（ｄＧ）配列等を含有し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、そして１００個未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１２０】
サポニン（Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎの第２２章）は、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根においてそして花においてさえ見られる、ステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の異種グループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａモリナツリー（Ｍｏｌｉｎａ  ｔｒｅｅ）の樹皮由来のサポニンが、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンアジュバント製剤としては、精製された製剤、例えばＱＳ２１、ならびに液体製剤、例えばＩＳＣＯＭが挙げられる。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されており、そしてこれらの技術を使用して特定の精製された分画（ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む）が同定された。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の製造方法は、米国特許第５０５７５４０号に開示されている。サポニン製剤はまた、ステロール、例えばコレステロールを含み得る（ＷＯ９６／３３７３９）。サポニンおよびコレステロールの組み合わせは、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）、ＩＳＣＯＭ、と呼ばれる独特な粒子を形成するために使用され得、これはまた、典型的にリン脂質を含む。
【０１２１】
３ｄＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されたアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースレス（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）突然変異体から調製され、そしてリピドＡと化学的に類似しているが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠いている。３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって異なる（例えば、異なる長さのものであり得る、３、４、５または６個のアシル鎖を有する）、関連する分子の混合物の形態をとり得る。
【０１２２】
アジュバント活性を有する種々の水中油型エマルジョンが公知である。それらは、典型的に、少なくとも１つのオイルおよび少なくとも１つの界面活性剤を含み、オイルおよび界面活性剤は生分解性（代謝性）かつ生体適合性である。前記エマルジョン中の油滴は、一般的に、サブミクロン直径を有し、これらの小さなサイズはマイクロフルイダイザーで達成され、安定なエマルジョンを提供する。濾過滅菌へ供され得るので、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【０１２３】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
●スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５のサブミクロンエマルジョン。体積での前記エマルジョンの組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０、および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５であり得る。重量表現では、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５となる。このアジュバントは、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎの第１０章およびＯ’Ｈａｇａｎの第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【０１２４】
●スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルジョン。前記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。それはまた、Ｓｐａｎ  ８５（例えば１％で）および／またはレシチンを含み得る。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロール、および０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ  ８０を有し得、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１であり、何故ならば、これがより安定なエマルジョンを提供するためである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ  ８０は、約５：２の体積比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ  ８０を溶解して２％溶液を提供し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次いで該混合物をマイクロフルイダイズすることによって、作製され得る。得られるエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有する、サブミクロン油滴を有し得る。
【０１２５】
●スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。前記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る。前記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有し得る。
【０１２６】
●ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。前記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌ  コハク酸α−トコフェロール）の質量比で、これら３成分を含み得、そしてこれらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいかなる寄与をも含むべきである。前記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。前記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る。水相はリン酸緩衝液を含有し得る。
【０１２７】
インフルエンザワクチン
本発明は、インフルエンザウイルスワクチンを調製するために特に好適である。種々の形態のインフルエンザウイルスワクチンが、現在入手可能である；例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ（Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第４版，２００４，ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０）の第１７および１８章を参照のこと。それらは、一般的に、生ウイルスまたは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「分割された」ビリオン、または精製された表面抗原（血球凝集素を含む）に基づき得る。インフルエンザ抗原はまた、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）（核酸フリーのウイルス様リポソーム粒子）の形態で提示され得る。組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞株中）から精製された抗原もまた使用され得る。
【０１２８】
ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、有効量の１以上の下記の薬剤での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはそれらの組み合わせ。例えばＵＶ光またはガンマ線照射等の、ウイルス不活性化の非化学的方法が、当該分野において公知である。
【０１２９】
ビリオンは、種々の方法によって、ウイルス含有流体から収穫され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、任意の希釈後、ダイアフィルトレーションによって、精製され得る。
【０１３０】
分割されたビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割プロセスを含む、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム等）で処理しサブビリオン調製物を作製することによって得られる。インフルエンザウイルスを分割する（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）方法は、当該分野、例えば、ＷＯ０２／２８４２２、ＷＯ０２／０６７９８３、ＷＯ０２／０７４３３６、ＷＯ０１／２１１５１、ＷＯ０２／０９７０７２、ＷＯ２００５／１１３７５６等において、周知である。ウイルスを分割することは、典型的に、破壊濃度の分割剤で、感染性または非感染性に関わらず、全ウイルスを破壊またはフラグメント化することによって行われる。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化を生じさせ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル等である。１つの有用な分割手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、そして分割は、初期ビリオン精製の間に（例えば、スクロース密度勾配溶液中において）生じ得る。したがって、分割プロセスは、ビリオン含有材料の浄化（非ビリオン材料を除去するため）、収穫されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着等の吸着方法を使用する）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程における分割剤を使用してのビリオンの分割（例えば、デオキシコール酸ナトリウム等の分割剤を含有するスクロース勾配を使用する）、ならびに次いで望まれない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。分割されたビリオンは、有用には（ｕｓｅｆｕｌｌｙ）、リン酸ナトリウム緩衝化された等張の塩化ナトリウム溶液中に再懸濁され得る。
【０１３１】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原血球凝集素を、および、典型的にはノイラミニダーゼも含む。精製された形態のこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。
【０１３２】
ワクチン中における使用のためのインフルエンザウイルス株は、季節ごとに変化する。現在のインターパンデミック（ｉｎｔｅｒ−ｐａｎｄｅｍｉｃ）期間において、ワクチンは、典型的に、２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）ならびに１つのインフルエンザＢ株を含み、そして三価ワクチンが典型的である。本発明はまた、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株（特に、インフルエンザＡウイルスのもの）等の、パンデミック株（即ち、ワクチン受容者および一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）由来のＨＡを使用し得、そしてパンデミック株についてのインフルエンザワクチンは、一価であってもよく、またはパンデミック株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節およびワクチン中に含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、１以上のインフルエンザＡウイルス血球凝集素サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６から保護し得る。
【０１３３】
インターパンデミック株に対して免疫化するために好適であるように、本発明の組成物は、特に、パンデミック株に対して免疫化するために有用である。パンデミック発生を引き起こす可能性をそれに与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）それは、現在広まっているヒト株中の血球凝集素と比較して新しい血球凝集素、即ち、１０年間にわたってヒト集団において明白でなかったか（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団において以前には全く見られず（例えば、トリ集団においてのみ一般的に見出されていた、Ｈ５、Ｈ６またはＨ９）、その結果、ヒト集団が該株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであるものを含有する；（ｂ）それは、ヒト集団において水平に感染され得る；そして（ｃ）それは、ヒトに対して病原性である。Ｈ５血球凝集素タイプを有するウイルスが、Ｈ５Ｎ１株等のパンデミックインフルエンザに対して免疫化するために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の新たな潜在的にパンデミックな株が挙げられる。Ｈ５サブタイプ内で、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に入り得（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（２００５）  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １１（１０）：１５１５−２１）、クレード１および３が特に関連する。抗原が有用に組成物中に含まれ得る他の株は、耐性パンデミック株を含む、抗ウイルス療法に対して耐性である（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビルに対して耐性である）株である。
【０１３４】
本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む、１以上（例えば、１、２、３、４またはそれを超えて）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。２つのインフルエンザＡウイルス株および１つのインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、三価ワクチンが好ましい。
【０１３５】
インフルエンザウイルスは、再集合体株（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎ）であり得、そして逆遺伝学技術によって得られたかもしれない。したがって、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１以上のＲＮＡセグメントを含み得る（典型的に、Ａ／ＰＲ／８／３４由来の６つのセグメント、ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株由来であり、即ち、６：２再集合体）。それはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の、またはワクチン調製についての再集合体ウイルスを作製するために有用な任意の他のウイルス株由来の、１以上のＲＮＡセグメントを含み得る。典型的に、本発明は、ヒト−ヒト感染し得る株から保護し、そしてしたがって、該株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。それは、トリインフルエンザウイルスに由来したＮＳセグメントを含み得る。
【０１３６】
ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチン中の主な免疫原であり、そしてワクチン用量は、典型的にＳＲＩＤによって測定される、ＨＡレベルを参照することによって、標準化される。存在するワクチンは、典型的に、１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、より低い用量が、例えば、小児について、またはパンデミック状況において、またはアジュバントを使用する場合、使用され得る。より高い用量（例えば、３×または９×用量）と同様に、１／２（即ち、１株当たり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８等の分割用量が使用されてきた。しかし、ワクチンは、１インフルエンザ株当たり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等を含み得る。特定の用量としては、例えば、１株当たり、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５等が挙げられる。
【０１３７】
生ワクチンについて、投薬は、ＨＡ含有量よりはむしろメジアン組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして１株当たり１０６〜１０８（好ましくは、１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【０１３８】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルス中において見られる天然ＨＡであってもよく、または修飾されていてもよい。例えば、トリ種においてウイルスを非常に病原性にする決定基（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の切断部位の周りのハイパーベーシック（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ）領域）を除去するために、ＨＡを修飾することが公知である。
【０１３９】
ビリオン含有組成物を処理し（例えば、ＢＰＬで）宿主細胞ＤＮＡを分解した後、分解産物は、好ましくは、例えばアニオン交換クロマトグラフィーによって、ビリオンから除去される。インフルエンザウイルスが特定の株について精製されると、それは、例えば上述の三価ワクチンを作製するために、他の株由来のウイルスと混合され得る。ウイルスを混合しそして多価混合物由来のＤＮＡを分解することよりはむしろ、各株を別個に処理しそして一価のバルクを混合して最終の多価混合物を得ることが好ましい。
【０１４０】
一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなってもよく、または追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０１４１】
用語「実質的に」は「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１４２】
数値ｘに関連して用語「約」は、例えば、ｘ＋１０％を意味する。
【０１４３】
用語「単離された」および「精製された」によって、少なくとも５０％純粋、より好ましくは６０％純粋（大抵の分割されたワクチンと同様に（ａｓ  ｗｉｔｈ））、より好ましくは７０％純粋、または８０％純粋、または９０％純粋、または９５％純粋、または９９％を超える純粋が意味される。
【０１４４】
特に記載されない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が互いに混合され得、そして次いで該混合物が、第３の成分等と混合され得る。
【０１４５】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養において使用される場合、それらは、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、そして特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない、供給源から得られるべきである。全体的に、動物由来の材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【０１４６】
化合物が組成物の一部として身体へ投与される場合、その化合物は、代わりに好適なプロドラッグによって置き換えられ得る。
【０１４７】
細胞基質が再集合または逆遺伝子学手順について使用される場合、それは、例えばＰｈ  Ｅｕｒ  一般章５．２．３におけるように、好ましくは、ヒトワクチン製造における使用について認可されたものである。
【実施例】
【０１４８】
発明を実施するための形態
インフルエンザウイルス（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）；Ｂ／江蘇（Ｊｉａｎｇｓｕ）／１０／２００３；Ａ／ワイオミング／３／２００３（Ｈ３Ｎ２））を、ＷＯ９７／３７０００、ＷＯ０３／２３０２５およびＷＯ０４／９２３６０の教示に従って、懸濁培養中においてＭＤＣＫ細胞において増殖した。最終培養培地を浄化し、ビリオンが得られ、次いでこれをクロマトグラフィーおよび限外濾過／ダイアフィルトレーションに供した。得られた材料中のビリオンを、β−プロピオラクトンを使用して不活性化した（最終濃度０．０５％  ｖ／ｖ；２〜８℃で１６〜２０時間インキュベートし、そして次いで３７℃で２〜２．５時間インキュベートすることによって加水分解した）。次いで、ＣＴＡＢを使用してビリオンを分割し、そして種々のさらなる処理工程によって、精製された表面抗原を含有する最終一価バルクワクチンが得られた。
【０１４９】
製造プロセスの３段階で、ＭＤＣＫ  ＤＮＡをキャラクタライズし、その量、サイズ、および完全性を評価した：（Ａ）限外濾過／ダイフィルトレーション工程後；（Ｂ）β−プロピオラクトン処理後；および（Ｃ）最終一価バルク中。キャピラリーゲル電気泳動および核酸増幅を使用して、あらゆる残存ゲノムＤＮＡのサイズ、完全性および生物学的活性を研究した。
【０１５０】
サイズ測定
上述されるように、残存宿主細胞ＤＮＡのサイズを、段階（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）において、キャピラリーゲル電気泳動によって分析した。分析を５つの別個のウイルス培養物について行った。
【０１５１】
５００μｌのサンプルを、これらの３つの時点で除去し、そして５６℃で１６〜２２時間１０μｌのプロテイナーゼＫで処理し、続いて、製造業者の指示書に従ってＤＮＡ抽出キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でトータルＤＮＡ抽出を行った。ＤＮＡを、２０℃の一定温度で、Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ  分子キャラクタライゼーションシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）における電気泳動のために５００μｌの超純水中に再懸濁した。７２〜１３５３ｂｐの、１１個の分子サイズマーカーを使用した。この方法について核酸検出限界（ＤＬ）は、０．７ｐｇ／ｍｌであった。
【０１５２】
サイズマーカーおよびＤＮＡバンドの相対密度に基づいて、ＤＮＡフラグメントの分布およびサイズを測定し、そして＜２００ｂｐから＞１０００ｂｐまでの範囲の４つの異なるサイズカテゴリーへ帰属した。図６は、段階（Ｃ）サンプルのキャピラリー電気泳動を示す。分析は、このサンプル中の全ての検出可能な残存ＤＮＡが、実質的に２００ｂｐ未満の長さであることを示している。
【０１５３】
前記５つの培養物からの平均結果を、下記の表に示す：
【０１５４】
【化３】
2020023557.tif 000004
したがって、ＢＰＬ処理は、ＤＮＡ量の約１０倍減少を引き起こすだけでなく、長い配列から＜２００ｂｐの小さいフラグメントへ分布をシフトする。クロマトグラフィーおよび限外濾過工程を含む、工程（Ｂ）と（Ｃ）との間の、さらなる処理は、トータルＤＮＡレベルをさらに約７０倍低下させ、そして≧２００ｂｐの全ての検出可能なＤＮＡを除去した。
【０１５５】
ＤＮＡ増幅
新生物性細胞形質転換は、しばしば修飾されたプロトオンコジーンおよび／または修飾された腫瘍抑制遺伝子と関連する現象である。いくつかのこのようなイヌ遺伝子由来の配列を、ＢＰＬ処理前および後に、即ち、時点（Ａ）および（Ｂ）において、ＰＣＲによって分析した。さらに、非感染ＭＤＣＫ細胞由来のＤＮＡを処理し、そして試験した。試験したプロトオンコジーンは、以下であった：Ｈ−ｒａｓおよびｃ−ｍｙｃ。試験した腫瘍抑制遺伝子は、以下であった：ｐ５３；ｐ２１／ｗａｆ−ｌ；およびＰＴＥＮ。さらに、反復ＳＩＮＥ配列をＰＣＲによって分析した。ＳＩＮＥについての高コピー数は、高感度な検出を促進する。
【０１５６】
全てのサンプルに、サンプル調製およびＰＣＲの品質をモニタリングするために、外部コントロールＤＮＡ（ｐＵＣ１９フラグメント）をスパイクした。全ての実験において、スパイクコントロール（ｓｐｉｋｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の一定の増幅が観察され、このことは、ＰＣＲ混合物中に存在する残存加水分解ＢＰＬおよび副産物がアッセイに対する阻害効果を有さず、かつ、サンプル調製およびＰＣＲの十分な品質を確実にしたことを示している。ＰＣＲ産物が検出され得なくなるまで、サンプルを増幅前に１０倍段階希釈し、それによってＤＮＡレベルのログ減少（ｌｏｇ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を示す。ＰＣＲアッセイについての検出限界は、５５ｐｇである。
【０１５７】
ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。図１は、非感染ＭＤＣＫ細胞において得られた結果を示し、そして図２は、ウイルス培養の間に得られた結果を示す。６つの分析した遺伝子は全て、ＢＰＬ処理前に強い増幅シグナルを示したが、ＢＰＬへの暴露後にシグナル強度が減少した。全ての試験した製造ロットにおいて、残存ＭＤＣＫゲノムＤＮＡは、ＢＰＬ暴露後に少なくとも２ログ値（ｌｏｇ  ｖａｌｕｅ）低下した。
【０１５８】
図２は、さらなる精製前の、段階（Ｂ）での結果を示しているので、結果は、最終バルクワクチン中に存在するＤＮＡを過剰提示している（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）。しかし、ＳＩＮＥ配列を使用する場合の感度に起因して、ＰＣＲはまた、段階（Ｃ）で、最終一価バルク中において、可能性があった。この分析の結果は図３に示される。（Ａ）および（Ｂ）におけるＤＮＡ増幅は、ＳＩＮＥ領域について比較的類似し、このことは、ＢＰＬはより小さなＤＮＡ配列に対してあまり活性ではないことを示している。しかし、これらの小さな配列についてさえ、分析したサンプルの全てについて、増幅シグナルの顕著な減少が存在した。サンプル回収時点（Ｂ）および（Ｃ）のＰＣＲシグナル強度の比較は、中間精製工程に起因する残存ＤＮＡの減少を反映する。
【０１５９】
遺伝子に基づく分析から推定して、そしてＳＩＮＥに基づく分析に直接基づいて、１用量当たり＜１ｎｇの、そしてしばしば１用量当たり＜１００ｐｇの、トータルＤＮＡレベルが、最終ワクチン中において予想される。
【０１６０】
温度
ウイルス不活性化の間のＢＰＬ処理は、２つの独立した工程を有した：（１）２〜８℃でビリオン含有混合物へＢＰＬを添加し；次いで（２）温度を３７℃へ上げ、ＢＰＬを加水分解する。ＭＤＣＫ  ＤＮＡ不活性化およびフラグメント化に対する前記２つのＢＰＬ工程の効果を研究した。
【０１６１】
非感染ＭＤＣＫ細胞由来の精製されたゲノムＤＮＡを、２〜８℃で１６時間、または３７℃もしくは５０℃で６．５時間まで、最終濃度の０．０５％（ｖ／ｖ）ＢＰＬで処理した。ＤＮＡのフラグメント化を後でチェックし、そして結果を図４に示す。これらの実験は、細胞ＤＮＡに対するＢＰＬの活性を明らかにするが、非感染細胞は、ウイルス増殖後のＭＤＣＫの状態を反映せず、何故ならば、細胞ＤＮＡは、アポトーシスに起因して既に高度にフラグメント化されているためである。
【０１６２】
２〜８℃で、アガロースゲル上の未処理ＤＮＡおよび処理済みＤＮＡの差異は、無視可能であり、このことは、ＢＰＬによるＤＮＡフラグメント化は、これらの条件下での間、実質的に生じ得ないことを示している。対照的に、ＤＮＡは、３７℃および５０℃の両方で非常に修飾され、より高い温度は促進された反応速度論へ導く。未処理細胞由来のＤＮＡは、分解産物の薄い汚れを伴って、アガロースゲルにおいて比較的明確なバンドを示した（図５、レーン３）。しかし、３７℃での短時間のＢＰＬインキュベーション後、ＭＤＣＫ  ＤＮＡはゲルスロットから下へ汚れ（ｓｍｅａｒｅｄ  ｄｏｗｎ）、そしてバンドシグナル強度は減少した（図５、レーン２）。より長いインキュベーション期間は、大きなゲノムＤＮＡ分子の消滅およびＭＤＣＫ  ＤＮＡの増強されたフラグメント化を生じさせた。
さらなる実験において、ＢＰＬを、先ず、４℃で１６時間細胞と共にインキュベートした。第１集団において、温度を２時間３７℃へ上昇させ；第２集団において、ＢＰＬを遠心濾過機によって除去し、そして次いで温度を上昇させた。遥かに低い（＞２ログより低い）残存ＤＮＡレベルが、第１集団において見られた。
したがって、ＢＰＬ処理の間に観察されるＤＮＡフラグメント化は、２〜８℃でのウイルス不活性化工程の間よりはむしろ、３７℃でのＢＰＬ加水分解工程の間に主に生じるようである。
【０１６３】
本発明は一例としてのみ記載されており、そして本発明の範囲および精神内に留まりながら修飾が成され得ることが、理解される。
【図１】
2020023557.tif 000005
【図２】
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【図３】
2020023557.tif 000007
【図４】
2020023557.tif 000008
【図５】
2020023557.tif 000009
【図６】
2020023557.tif 000010
【外国語明細書】
2020023557000001.pdf