(57)【要約】【課題】被観察物の透過率分布を高速に測定する。【解決手段】本発明の測定装置を例示する一態様は、被観察物（２５ａ）から暗視野画像及び明視野画像の双方を取得する観察手段（１１、１３、１５、１７）と、前記被観察物の散乱効率を示す情報を予め記憶する記憶手段と、前記観察手段が取得した暗視野画像及び明視野画像と、前記記憶手段が予め記憶した情報とに基づき、前記被観察物の透過率分布を算出する演算手段と、を備えたものである。【選択図】    図１
2010210506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被観察物から暗視野画像及び明視野画像の双方を取得する観察手段と、
前記被観察物の散乱効率を示す情報を予め記憶する記憶手段と、
前記観察手段が取得した暗視野画像及び明視野画像と、前記記憶手段が予め記憶した情報とに基づき、前記被観察物の透過率分布を算出する演算手段と、
を備えたことを特徴とする測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の測定装置において、
前記観察手段は、
明部と暗部とを交互に配置した面光源で前記被観察物を照明する照明光学系と、
前記面光源により照明された前記被観察物の画像を取得する撮像手段と、
前記面光源の明暗の位相を変化させながら前記撮像手段を繰り返し駆動する制御手段と、
前記撮像手段が取得した複数の画像の暗部に基づき前記被観察物の暗視野画像を取得すると共に、それら複数の画像の明部に基づき前記被観察物の明視野画像を取得する画像処理手段と、
を備えたことを特徴とする測定装置。
【請求項３】
請求項２に記載の測定装置において、
前記演算手段は、
前記被観察物の透過率分布を前記被観察物の厚さ分布に換算する
ことを特徴とする測定装置。
【請求項４】
請求項２に記載の測定装置において、
前記制御手段は、
前記面光源の明暗の位相が１周期分変化する期間に前記撮像手段を少なくとも３回駆動する
ことを特徴とする測定装置。
【請求項５】
被観察物から暗視野画像及び明視野画像の双方を取得する観察手順と、
前記被観察物の散乱効率を示す情報を予め記憶する記憶手順と、
前記観察手順で取得した暗視野画像及び明視野画像と、前記記憶手段が予め記憶した情報とに基づき、前記被観察物の透過率分布を算出する演算手順と、
を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の測定方法において、
前記観察手順は、
明部と暗部とを交互に配置した面光源で前記被観察物を照明する照明手順と、
前記面光源により照明された前記被観察物の画像を取得する撮像手順と、
前記面光源の明暗の位相を変化させながら前記撮像手順を繰り返し実行する制御手順と、
前記撮像手順で取得した複数の画像の暗部に基づき前記被観察物の暗視野画像を取得すると共に、それら複数の画像の明部に基づき前記被観察物の明視野画像を取得する画像処理手順と、
を含むことを特徴とする測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の測定方法において、
前記演算手順では、
前記被観察物の透過率分布を前記被観察物の厚さ分布に換算する
ことを特徴とする測定方法。
【請求項８】
請求項６に記載の測定方法において、
前記制御手順では、
前記面光源の明暗の位相が１周期分変化する期間に前記撮像手順を少なくとも３回実行する
ことを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無彩色細胞のコロニーなど、無色透明な物体（位相物体）の透過率分布を測定する測定装置及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
無染色細胞をシャーレで培養し、シャーレ内におけるコロニーの成長過程を観察する際には、位相物体を可視化することのできる観察装置が使用される。この種の観察装置の中で特に特許文献１に記載の観察装置は、視野が広く、コロニーの成長度を一望することができる点で有用性が高い。
【０００３】
但し、細胞のコロニーは、シャーレの底面に沿った方向だけでなく厚さ方向へも成長する。このようなコロニーの厚さ分布を測定するには、例えば特許文献２に記載の厚さ測定方法のように、被観察物の透過率分布を測定し、それを厚さ分布に換算することが考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１７８４２６号公報
【特許文献２】特開平１１−２３０８９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献２にも記載されているとおり、通常、透過率分布の測定では、被観察物をレーザ光でスキャンする必要があるので、非常に多くの時間を要する。
【０００６】
そこで本発明は、被観察物の透過率分布を高速に測定することのできる測定装置及び測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の測定装置を例示する一態様は、被観察物から暗視野画像及び明視野画像の双方を取得する観察手段と、前記被観察物の散乱効率を示す情報を予め記憶する記憶手段と、前記観察手段が取得した暗視野画像及び明視野画像と、前記記憶手段が予め記憶した情報とに基づき、前記被観察物の透過率分布を算出する演算手段と、を備えたものである。
【０００８】
また、本発明の測定方法を例示する一態様は、被観察物から暗視野画像及び明視野画像の双方を取得する観察手順と、前記被観察物の散乱効率を示す情報を予め記憶する記憶手順と、前記観察手順で取得した暗視野画像及び明視野画像と、前記記憶手段が予め記憶した情報とに基づき、前記被観察物の透過率分布を算出する演算手順と、を含むものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、被観察物の透過率分布を高速に測定することのできる測定装置及び測定方法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】測定装置の光学系部分を説明する図。
【図２】ストライプ画像Ｉの互いに隣接する明部及び暗部の輝度分布を示すグラフ。
【図３】コントローラの構成を示すブロック図。
【図４】ストライプ画像Ｉの暗部を説明する図。
【図５】ストライプ画像Ｉの明部を説明する図。
【図６】ＣＰＵ３７による予備測定のフローチャート。
【図７】ＣＰＵ３７による本測定のフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［実施形態］
以下、本発明の測定装置の実施形態を説明する。
【００１２】
先ず、測定装置の構成を説明する。
【００１３】
図１は、測定装置の光学系部分を説明する図である。図１に示すとおり、測定装置には、透過型液晶パネル１１と、透過型のステージ（標本台）１３と、結像光学系１５と、撮像素子１７とが備えられる。
【００１４】
ステージ１３には、サンプルとして、可視光に対して透明な培養容器であるシャーレ２５が載置される。シャーレ２５内は、可視光に対して透明な培養液２５ｂで満たされており、その培養液２５ｂの中で無染色細胞のコロニー２５ａが生息している。このコロニー２５ａが本実施形態の被観察物である。
【００１５】
透過型液晶パネル１１は、例えばバックライト付きの透過型液晶パネルであって、ステージ１３に載置されたシャーレ２５の全域を一括に照明することができる。透過型液晶パネル１１の発光パターンは、不図示のコントローラによって制御され、図１に示すとおり互いに等しい幅の帯状の暗部（非発光部１ｄ）及び帯状の明部（発光部１ｂ）を交互に配置したパターンに設定される。全ての非発光部１ｄの輝度は略均一であり、全ての発光部１ｂの輝度も略均一である。したがって、透過型液晶パネル１１は、ストライプ状の面光源としての機能を果たす。
【００１６】
結像光学系１５は、透過型液晶パネル１１から射出しシャーレ２５の全域を透過した光を捉え、撮像素子１７の撮像面上にシャーレ２５の全体像を形成する。結像光学系１５の物体側開口数ＮＡは十分に小さく（例えばＮＡ＝０．０１）、光軸に対する入射光の最大角度θは、ｓｉｎθ＝θとみなせるほど十分に小さい。
【００１７】
図１には描かれていないが、測定装置には焦点調節機構も備えられる。ユーザはその焦点調節機構を駆動することにより、結像光学系１５の焦点面をシャーレ２５の底面近傍に位置させる。この状態で、コロニー２５ａの観察が可能となる。
【００１８】
撮像素子１７は、その撮像面上に形成されたシャーレ２５の全体像を撮像し、画像を生成する。撮像素子１７のピクセル分解能（１ピクセル当たりの物体側距離）は、細胞１個分（例えば１０μｍ）より十分に大きいものとする。但し、コロニー２５ａの形状を観察可能とするために、ピクセル分解能は、コロニー２５ａのサイズよりは十分に小さいものとする。よって、例えば撮像素子１７のピクセル分解能は、２０μｍに設定される。なお、撮像素子１７が生成した画像は、不図示のコントローラへ取り込まれる。
【００１９】
ここで、透過型液晶パネル１１の発光パターンは前述したとおりストライプ状なので、撮像素子１７が生成する画像はストライプ画像Iとなる。
【００２０】
例えば、ストライプ画像Iの或る明部に位相物体の像が写っており、その隣の暗部に位相物体の像が写っていた場合、その明部及び暗部の輝度分布は、例えば図２のグラフのようになる。
【００２１】
図２の左側に示すとおり、ストライプ画像Iの明部では、位相物体の像ｗｂの輝度が相対的に低くなる。つまり、ストライプ画像Iの明部は、明るい背景中に暗い像の現れる明視野画像となる。この明視野画像は、被観察物（コロニー２５ａ）の厚さ分布測定に利用可能である（詳細は後述）。
【００２２】
一方、図２の右側に示すとおり、ストライプ画像Iの暗部では、位相物体の像ｗｄの輝度が相対的に高くなる。つまり、ストライプ画像Iの暗部は、暗い背景中に明るい像の現れる暗視野画像である。この暗視野画像は、被観察物（コロニー２５ａ）の形状観察と厚さ分布測定との双方に利用可能である。
【００２３】
なお、図２の中央に示すとおり、ストライプ画像Iの明暗の遷移部では、位相物体の像が不明確となるので、被観察物（コロニー２５ａ）の形状観察や厚さ分布測定には適さない。
【００２４】
そこで、本実施形態の測定装置は、前述した面光源の明暗の位相を１周期変化させながら３枚以上（例えば４枚）のストライプ画像Iを取得し、それらストライプ画像Iの暗部のうち遷移部から外れた有効部のみを切り出して繋ぎ合わせることで、シャーレ２５の全域の暗視野画像を取得する。また、本実施形態の測定装置は、それらストライプ画像Iの明部のうち遷移部から外れた有効部のみを切り出して繋ぎ合わせることで、シャーレ２５の全域の明視野画像を取得する。
【００２５】
図３は、コントローラの構成を示すブロック図である。コントローラは、撮像素子制御部３５、ステージ制御部２９、照明制御部３３、メモリ４１、ＣＰＵ３７、表示器２７、入力器２８を備える。
【００２６】
撮像素子制御部３５は、ＣＰＵ３７からの指示に応じて撮像素子１７を駆動し、撮像素子１７が取得したストライプ画像Iを取り込む。
【００２７】
照明制御部３３は、ＣＰＵ３７からの指示に応じて透過型液晶パネル１１へ駆動信号を与えることにより、前述した面光源の明暗の位相を変化させる。
【００２８】
メモリ４１は、ＣＰＵ３７の動作プログラムや、ＣＰＵ３７の動作中に必要となった情報などを格納する。メモリ４１に格納される情報には、後述する本測定に必要なパラメータ（Ｂ、Ｃ、Ｃ’の各値）などがある。これらＢ、Ｃ、Ｃ’の各値は、ＣＰＵ３７によって適宜に更新される。
【００２９】
入力器２８は、ユーザからの各種の指示をＣＰＵ３７へ入力する。入力器２８を介してユーザからＣＰＵ３７へと入力される指示には、後述する予備測定の開始指示や、後述する本測定の開始指示などがある。
【００３０】
ＣＰＵ３７は、メモリ４１に格納された動作プログラムに従い、撮像素子制御部３５、ステージ制御部２９、照明制御部３３を統括的に制御することにより、後述する予備測定や本測定を行う。
【００３１】
表示器２７は、ＣＰＵ３７からの指示に従って情報を表示する。表示器２７へ表示される情報には、予備測定や本測定でユーザへ通知する必要の生じた情報や、ＣＰＵ３７が本測定で取得した暗視野画像や厚さ分布などの情報がある。
【００３２】
次に、測定装置の原理を説明する。
【００３３】
図４は、ストライプ画像Iの暗部を説明する図である。説明では、暗部に写り込む被観察物（コロニー２５ａ）上の任意の点Ｐに着目し、その点Ｐに対応する画素の輝度Ｉｄａｒｋについて考える。この点Ｐは、非発光部１ｄに正対している。
【００３４】
先ず、点Ｐに関する各量を以下のとおり定義する。
【００３５】
ｚ：光軸方向における点Ｐの位置。
【００３６】
ｘ：ストライプのピッチ方向における点Ｐの位置。
【００３７】
ｙ：ストライプのライン方向における点Ｐの位置。
【００３８】
Ｂ：被観察物（コロニー２５ａ）が存在しないときに発光部１ｂが輝度Ｉｄａｒｋに与える単位立体角当たりの信号量（シャーレ２５及び結像光学系１５における光損失も加味した値。）。
【００３９】
ωｉ：点Ｐへ向かう光線の入射角（ベクトル量）。
【００４０】
ωｆ：点Ｐから射出する光線の射出角（ベクトル量）。
【００４１】
Ω：発光部１ｂから点Ｐに向かう光線の立体角範囲。
【００４２】
Ωｉｎ：点Pから結像光学系１５の瞳内に向かう光線の立体角範囲。
【００４３】
ｈ：点Ｐにおける被観察物（コロニー２５ａ）の厚さ。
【００４４】
ｆ：被観察物（コロニー２５ａ）の内部へ入射してから点Ｐへ入射する入射光の到達率。
【００４５】
ｓ：点Ｐにおける被観察物（コロニー２５ａ）の散乱効率。
【００４６】
ｇ：点Ｐを射出してから被観察物（コロニー２５ａ）の外部へ射出する散乱光の到達率。
【００４７】
したがって、輝度Ｉｄａｒｋは、次式（１）で表される。
【００４８】
【数１】
2010210506.tif 000003
なお、ここでは、被観察物（コロニー２５ａ）で発生した散乱光が再度散乱を受けること（多重散乱）は無いものと仮定した。
【００４９】
ここで、被観察物（コロニー２５ａ）における散乱は、コロニー２５ａ内の個々の細胞の細胞膜や、細胞内の個々のオルガネラ（核、ミトコンドリア等）など、屈折率が不連続となった部分で発生する。そのため、式（１）では、散乱効率ｓを位置（ｘ、ｙ、ｚ）の関数で表した。
【００５０】
しかし、上述したとおり結像光学系１５の物体側開口数は十分に小さく、撮像素子１７のピクセル分解能はオルガネラよりも大きくなるので、散乱効率ｓは、被観察物（コロニー２５ａ）内で一様（つまりｘ、ｙ、ｚに依存しない）とみなしても問題ない。同様に、到達率ｆ、ｇについても被観察物（コロニー２５ａ）内で一様とみなしても問題ない。
【００５１】
さらに、点Ｐへ入射する光線及び点Ｐから射出する光線のうち、輝度Ｉｄａｒｋに寄与する光線は何れもｚ軸からの角度が十分小さいので、式（１）における積”ｆ・ｇ”は、ｚ軸からの角度がゼロである光線が厚さｈの被観察物（コロニー２５ａ）を通過したときの透過率、すなわち、点Ｐ（ｘ、ｙ）における被観察物（コロニー２５ａ）の透過率と等しいとみなせる。ここで、点Ｐの透過率は、被観察物（コロニー２５ａ）の吸収係数（減衰係数）をαとおくと、ｅｘｐ（−ｈα）で表される。
【００５２】
したがって、上式（１）は下式（２）のとおり簡略化される。
【００５３】
【数２】
2010210506.tif 000004
さらに、面光源の形状（ここではストライプ状）や結像光学系１５が不変であり、かつ被観察物（コロニー２５ａ）の種類も不変である限り、式（２）の積分記号以降は、定数Ｃで表現することができる。よって、式（２）は式（３）のとおり簡略化される。
【００５４】
【数３】
2010210506.tif 000005
図５は、ストライプ画像Ｉの明部を説明する図である。図５における点Ｐは、図４における点Ｐと同じである。但し、図５における点Ｐは、非発光部１ｄではなく発光部１ｂに正対する。なお、点Ｐに関する各量の定義は、前述したとおりであり、新たに以下の量を定義する。
【００５５】
Ωｏｕｔ：立体角範囲Ωから立体角範囲Ωｉｎを除いた立体角範囲。
【００５６】
したがって、輝度Ｉｂｒｉｇｈｔは、次式（４）で表される。
【００５７】
【数４】
2010210506.tif 000006
なお、ここでも、被観察物（コロニー２５ａ）で発生した散乱光が再度散乱を受けること（多重散乱）は無いものと仮定した。
【００５８】
式（４）の第一項は、被観察物（コロニー２５ａ）が存在しないときに輝度Ｉｄａｒｋに与えられる信号量（シャーレ２５及び結像光学系１５における光損失も加味した値。）であり、｛｝内の前半は、被観察物（コロニー２５ａ）で生じた散乱により結像光学系１５から外れることになった光量に相当し、｛｝内の後半は、被観察物（コロニー２５ａ）で生じた散乱により結像光学系１５に入射するようになった光量に相当する。
【００５９】
ここでも、面光源の形状（ここではストライプ状）や結像光学系１５が不変であり、かつ被観察物（コロニー２５ａ）の種類も不変である限り、式（４）の｛｝内は、定数Ｃ’で表現することができる。
【００６０】
したがって、上式（４）は下式（５）のとおり簡略化される。
【００６１】
【数５】
2010210506.tif 000007
そして、上述した式（３）と式（５）とに基づけば、式（６）が得られる。
【００６２】
【数６】
2010210506.tif 000008
この式（６）は、点Ｐにおける被観察物（コロニー２５ａ）の透過率ｅｘｐ（−ｈα）を導出するための式である。
【００６３】
したがって、本実施形態の測定装置は、点Ｐに関する２種類の輝度Ｉｄａｒｋ、Ｉｂｒｉｇｈｔの値を測定し、それらの値を式（６）に当てはめることで、点Ｐにおける被観察物（コロニー２５ａ）の透過率ｅｘｐ（−ｈα）の値を算出することができる。
【００６４】
さらに、本実施形態の測定装置は、式（６）で算出した透過率ｅｘｐ（−ｈα）の値と、輝度Ｉｄａｒｋの値とを式（３）に当てはめることで、点Ｐにおける被観察物（コロニー２５ａ）の厚さｈの値を算出することができる。
【００６５】
但し、透過率ｅｘｐ（−ｈα）の値や、厚さｈの値を算出するためには、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ωｉｎの各値は既知となっている必要がある。よって、本実施形態の測定装置は、本測定に先立ち予備測定を行う。
【００６６】
次に、測定装置による予備測定及び本測定を説明する。
【００６７】
予備測定及び本測定の条件は共通であり、例えば以下のとおりに設定される。
【００６８】
・面光源のストライプピッチ：２ｍｍ。
【００６９】
・発光部１ｂと非発光部１ｄとのｄｕｔｙ比：１：１。
【００７０】
・透過型液晶パネル１１からシャーレ２５までの距離：２５ｍｍ。
【００７１】
・結像光学系１５の焦点面：シャーレ２５の底面
・結像光学系１５の物体側開口数：０．０１
・撮像素子１７のピクセル分解能：物体側距離にして２０μｍ程度。
【００７２】
また、予備測定に当たり、以下の条件を満たすような予備測定用サンプルが用意される。
【００７３】
・αは、０である。
【００７４】
・ｈは、０である。
【００７５】
・Ｂが本測定用サンプルのそれと共通である。
【００７６】
なお、以上の条件を満たす予備測定用サンプルは、例えば、本測定用のシャーレ２５と同種のシャーレであって、本測定用の培養液２５ｂと同種の培養液で満たされ、コロニーが全く存在しないものである。よって、以下では、この予備測定用サンプルを、「無コロニーサンプル」と称す。
【００７７】
また、予備測定に当たり、以下の条件を満たすような予備測定サンプルも用意される。
・ｅｘｐ（−ｈα）は、１とみなせる。
・ｈが既知である。
・Ｃ、Ｃ’が本測定用サンプルのそれと共通である。
【００７８】
なお、以上の条件を満たす予備測定用サンプルは、例えば、本測定用のシャーレ２５と同種のシャーレであって、本測定用の培養液２５ｂと同じ培養液で満たされ、厚さが既知の薄いコロニー（例えば細胞１層分のコロニー）がサンプルの全域に形成されたものである。よって、以下では、この予備測定用サンプルを「薄コロニーサンプル」と称す。
【００７９】
図６は、ＣＰＵ３７による予備測定のフローチャートである。このフローは、ユーザからの予備測定の開始指示に従って開始される。以下、各ステップを順に説明する。
【００８０】
ステップＳ１１：ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルをステージ１３に載置するようユーザへ指示する。なお、ＣＰＵ３７からユーザへの指示は、表示器２７へ文字情報を表示することなどにより行われる。無コロニーサンプルがステージ１３へ載置された旨の通知をユーザから受け取ると、ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルのストライプ画像Ｉを１枚取得する。なお、ユーザからＣＰＵ３７への通知は、入力器２８を介して行われる。以下、本ステップで取得されたストライプ画像Ｉを「ストライプ画像Ｉ１」と称す。
【００８１】
ステップＳ１２：ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルの代わりに薄コロニーサンプルをステージ１３に載置するようユーザへ指示すると共に、その薄コロニーの厚さｈの値を入力するようユーザへ指示する。薄コロニーサンプルがステージ１３へ載置された旨の通知と、薄コロニーの厚さｈの値とをユーザから受け取ると、ＣＰＵ３７は、薄コロニーサンプルのストライプ画像Ｉを１枚取得すると共に、薄コロニーの厚さｈの値をメモリ４１へ書き込む。以下、本ステップで取得されたストライプ画像Ｉを「ストライプ画像Ｉ２１」と称す。
【００８２】
ステップＳ１３：ＣＰＵ３７は、面光源の明暗の位相を１／２ピッチ分（すなわちπ）だけシフトさせる。
【００８３】
ステップＳ１４：ＣＰＵ３７は、この状態における薄コロニーサンプルのストライプ画像Ｉを１枚取得する。以下、本ステップで取得されたストライプ画像Ｉを「ストライプ画像I２２」と称す。なお、このストライプ画像Ｉ２２と先に取得したストライプ画像Ｉ２１との間では、明暗の位置が反転している。
【００８４】
ステップＳ１５：ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルのストライプ画像Ｉ１のうち、シャーレ像内に位置する任意の明部の有効部（遷移部から外れた部分）の輝度Ｉｂｒｉｇｈｔの値を参照する。これによって、コロニー以外の物体（シャーレ２５、培養液２５ｂ、結像光学系１５など）がストライプ画像Ｉの明部に与える信号量が既知となる。
【００８５】
そして、ＣＰＵ３７は、参照した輝度Ｉｂｒｉｇｈｔの値と、無コロニーサンプルの上述した条件（α＝０、ｈ＝０）とを式（５）へ当てはめることにより、Ｂの値を算出する。なお、式（５）におけるΩｉｎの値は、例えば測定装置の光学設計データなどから予め既知となっているものとする。
【００８６】
また、ＣＰＵ３７は、薄コロニーサンプルのストライプ画像Ｉ２１のうち、シャーレ像内に位置する任意の明部の有効部（遷移部から外れた部分）の輝度Ｉｂｒｉｇｈｔの値を参照すると共に、薄コロニーサンプルのストライプ画像Ｉ２２のうち、その明部と同じ画素座標に位置する暗部の有効部（遷移部から外れた部分）の輝度Ｉｄａｒｋの値を参照する。これによって、薄コロニーがストライプ画像Ｉの明部に与える信号量と、薄コロニーがストライプ画像Ｉの暗部に与える信号量とが既知となる。
【００８７】
そして、ＣＰＵ３７は、参照した輝度Ｉｂｒｉｇｈｔの値と、参照した輝度Ｉｄａｒｋの値と、薄コロニーサンプルの上述した条件（ｅ−ｈα＝１）と、薄コロニーの厚さｈの値（メモリ４１に格納）とを式（３）、（５）へ当てはめることにより、Ｃ、Ｃ’の各値を算出する。
【００８８】
その後、ＣＰＵ３７は、本ステップで算出されたＢ、Ｃ、Ｃ’の各値をメモリ４１へ書き込む。なお、その時点で既にメモリ４１にＢ、Ｃ、Ｃ’が書き込まれていた場合には、本ステップによりＢ、Ｃ、Ｃ’の値が更新される（以上、ステップＳ１５）。
【００８９】
ここで、メモリ４１に書き込まれたＣ、Ｃ’の値は、被観察物（コロニー２５ａ）の散乱効率を反映した値であるので、測定装置の光学配置とサンプル種類との組み合わせが変更されない限り、更新する必要はない。
【００９０】
一方、メモリ４１に書き込まれたＢの値は、面光源の輝度を示す値であるので、面光源の輝度の変動を考慮するならば、適宜に更新される必要がある。そこで以下では、Ｂの値が所定期間毎に更新されるものとする。
【００９１】
図７は、ＣＰＵ３７による本測定のフローチャートである。このフローは、ユーザからの本測定の開始指示に従って開始される。以下、各ステップを順に説明する。
【００９２】
ステップＳ２０：ＣＰＵ３７は、Ｂの値の前回の更新時から所定期間が経過したか否かを判別し、経過していた場合にはステップＳ２１へ移行し、経過していなかった場合にはステップＳ２３へ移行する。
【００９３】
ステップＳ２１：ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルをステージ１３に載置するようユーザへ指示する。その後、無コロニーサンプルがステージ１３へ載置された旨の通知をユーザから受け取ると、ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルのストライプ画像Ｉ（すなわち、ストライプ画像Ｉ１）を取得する。なお、本ステップＳ２１の動作は、前述したステップＳ１１の動作と同じである。
【００９４】
ステップＳ２２：ＣＰＵ３７は、無コロニーサンプルのストライプ画像Ｉ１のうち、シャーレ像内に位置する任意の明部の有効部（遷移部から外れた部分）の輝度Ｉｂｒｉｇｈｔの値を参照し、その輝度Ｉｂｒｉｇｈｔの値と、無コロニーサンプルの条件（α＝０、ｈ＝０）とを式（５）へ当てはめることにより、Ｂの値を算出する。そして、ＣＰＵ３７は、本ステップで算出したＢの値をメモリ４１へ書き込むことにより、Ｂの値を更新する。なお、本ステップＳ２２のＢの更新処理は、前述したステップＳ２５におけるＢの更新処理と同じである。
【００９５】
ステップＳ２３：ＣＰＵ３７は、本測定用サンプルをステージ１３に載置するようユーザへ指示する。その後、本測定用サンプルがステージ１３へ載置された旨の通知をユーザから受け取ると、ＣＰＵ３７は、本測定用サンプルのストライプ画像Ｉを１枚取得する。以下、本ステップで取得したストライプ画像Ｉを「ストライプ画像Ｉ３」と称す。
【００９６】
ステップＳ２４：ＣＰＵ３７は、ステップＳ２３によるストライプ画像Ｉ３の取得回数が所定回数に達したか否かを判別し、達していなかった場合にはステップＳ２５へ移行し、達していた場合にはステップＳ２６へ移行する。ここでは、本ステップの判別基準となる所定回数を「４」とする。
【００９７】
ステップＳ２５：ＣＰＵ３７は、面光源の位相を１／４ピッチ分（つまりπ／２）だけシフトさせてからステップＳ２３へ戻る。
【００９８】
ステップＳ２６：ＣＰＵ３７は、ステップＳ２３〜Ｓ２５のループで取得された４枚のストライプ画像Ｉ３の各々から暗部のみを切り出して繋ぎ合わせることにより本測定用サンプルの全体の暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）を作成する。また、ＣＰＵ３７は、それら４枚のストライプ画像Ｉ３の各々から明部のみを切り出して繋ぎ合わせることにより本測定用サンプルの全体の明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）を作成する。
【００９９】
なお、上記ステップＳ２５における位相シフト量は１／４ピッチ分であったので、本ステップにおける切り出し領域の幅も、１／４ピッチ分とされる。したがって、個々のストライプ画像Ｉ３のうち明暗の遷移部から外れた有効部のみが明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）及び暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）へ反映される。
【０１００】
ステップＳ２７：ＣＰＵ３７は、現時点でメモリ４１に格納されているＢ、Ｃ、Ｃ’の値を式（６）へ当てはめることにより、透過率ｅｘｐ（−ｈα）の算出式を取得する。なお、式（６）におけるΩｉｎの値は、例えば測定装置の光学設計データなどから予め既知となっているものとする。
【０１０１】
そして、ＣＰＵ３７は、ステップＳ２６で作成した暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）の或る画素の輝度Ｉｄａｒｋと、ステップＳ２６で作成した明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）の同じ画素の輝度Ｉｄａｒｋとをその算出式へ当てはめることにより、被観察物（コロニー２５ａ）のうちその画素に対応する部分の透過率ｅｘｐ（−ｈα）の値を算出する。そして、ＣＰＵ３７は、この算出を少なくともシャーレ像内に位置する全ての画素に関して行うことにより、本測定用サンプルにおける被観察物（コロニー２５ａ）の透過率分布ｅ−ｈα（ｘ、ｙ）を算出する。
【０１０２】
ステップＳ２８：ＣＰＵ３７は、ステップＳ２７で算出した透過率分布ｅ−ｈα（ｘ、ｙ）のうち、或る画素の透過率ｅ−ｈαの値を式（３）へ当てはめることにより、被観察物（コロニー２５ａ）のうちその画素に対応する部分の厚さｈを算出する。そして、ＣＰＵ３７は、この算出を全ての画素に関して行うことにより、本測定用サンプルにおける被観察物（コロニー２５ａ）の厚さ分布ｈ（ｘ、ｙ）を算出する。
【０１０３】
ステップＳ２９：ＣＰＵ３７は、ステップＳ２６で作成した暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）と、ステップＳ２８で算出した厚さ分布ｈ（ｘ、ｙ）とを表示器２７へ表示し、フローを終了する。
【０１０４】
以上、本実施形態の測定装置は、本測定用サンプルの全域における被観察物（コロニー２５ａ）の透過率分布ｅ−ｈα（ｘ、ｙ）を、本測定用サンプルの暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）と、本測定用サンプルの明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）と、メモリ４１に予め格納された、被観察物（コロニー２５ａ）の散乱効率の情報（Ｃ、Ｃ’）とに基づき算出する。
【０１０５】
また、本実施形態の測定装置は、暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）及び明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）の作成に必要な４枚のストライプ画像Ｉ３を撮像素子１７により取得するので、本測定用サンプルをビームでスキャンする必要は無い。
【０１０６】
したがって、本実施形態の測定装置は、本測定用サンプルをビームでスキャンする場合と比較して、透過率分布ｅ−ｈα（ｘ、ｙ）を高速に測定することができる。
【０１０７】
また、本実施形態の測定装置は、暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）及び明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）の双方を共通の光学系（ストライプ状の面光源、結像光学系、撮像素子）で取得するので、効率的である。
【０１０８】
また、本実施形態の測定装置は、本測定用サンプルのストライプ画像Ｉ３を３枚以上取得し、個々のストライプ画像Ｉ３の有効部のみを暗視野画像Ｉｄａｒｋ（ｘ、ｙ）及び明視野画像Ｉｂｒｉｇｈｔ（ｘ、ｙ）の作成に使用するので、ノイズの影響を受けにくい。
［実施形態の補足］
なお、上述した実施形態では、Ｂの値の更新を所定期間毎に行ったが、面光源の輝度を監視し、その輝度が一定以上変化する毎に行ってもよい。
【０１０９】
また、上述した実施形態では、サンプルの全域に亘りＢが共通であるとの前提で測定を行ったが、サンプル上の位置によりＢが異なるとの前提で測定を行ってもよい。
【０１１０】
また、上述した実施形態のステップＳ２３〜Ｓ２５では、本測定用サンプルから取得されるストライプ画像の枚数を４としたが、３以上の他の数にしてもよい。なお、取得枚数をｎとした場合、各回の位相シフト量は、１／ｎピッチ分（つまり２π／ｎ）となり、ステップＳ２６における切り出し領域の幅も、１／ｎピッチ分となる。
【０１１１】
また、上述した実施形態の予備測定では、薄コロニーサンプルから取得されるストライプ画像Ｉ２の枚数を２としたが、１としてもよい。但し、その場合、薄コロニーがストライプ画像の明部に与える信号量と、薄コロニーがストライプ画像の暗部に与える信号量との双方を１枚のストライプ画像Ｉ２の互いに異なる画素座標から取得しなければならないので、薄コロニーの厚さは、完全に均一化されている必要がある。
【０１１２】
また、上述した実施形態の予備測定では、無コロニーサンプルと薄コロニーサンプルとの２つの予備測定用サンプルを使用したが、サンプルの全域に亘りＢが共通であるとの前提で測定を行うのであれば、無コロニー領域と薄コロニー領域とを有した１つの予備測定用サンプルを使用してもよい。その場合、コロニー以外の物体がストライプ画像の明部に与える信号量と、薄コロニーがストライプ画像の明部及び暗部に与える信号量との双方を、同一のストライプ画像の互いに異なる領域から取得することになる。
【符号の説明】
【０１１３】
１７…撮像素子、１５…結像光学系、１１…透過型液晶パネル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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