(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護する作用を有し、アペリン受容体に対して高い選択性を有するアゴニストを含有する医薬組成物の提供。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物。2020059679.tif 000020（Ｒ１は炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状のアルキル基；Ｒ２〜Ｒ４は各々独立してＨ、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基；Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基）【選択図】図１４
2020059679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストであって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物：
【化１】
2020059679.tif 000017
（式（Ｉ）中、Ｒ１は炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状のアルキル基を、Ｒ２〜Ｒ４は各々独立して水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。）。
【請求項２】
糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストであって、下記一般式（II）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物：
【化２】
2020059679.tif 000018
（式（II）中、Ｒ１は炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状のアルキル基を、Ｒ３は水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。）。
【請求項３】
糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストであって、下記一般式（III）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物：
【化３】
2020059679.tif 000019
（式（III）中、Ｒ３は水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。）。
【請求項４】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、Ｒ２及びＲ４が水素原子、Ｒ３が水素原子、又は、メチル基、であることを特徴とする請求項１の医薬組成物。
【請求項５】
前記一般式（II）で表される化合物において、Ｒ１がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、Ｒ３が水素原子、又は、メチル基、であることを特徴とする請求項２の医薬組成物。
【請求項６】
ヒトを含む動物の末梢血管系に投与され、体循環を経て眼動脈経由で網膜に到達させるように用いられることを特徴とする請求項１〜５の何れかの医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病網膜症を予防若しくは治療するための、網膜神経細胞に対して神経保護作用を示すアペリン受容体（ＡＰＪ）アゴニストを含有する医薬組成物とその使用方法に関する。具体的には、糖尿病が原因で網膜神経細胞が変性し細胞死に至る病態の進行を抑制し、該神経細胞を保護するために有効である低分子化合物のアペリン受容体（ＡＰＪ）アゴニストとして作用する化合物を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本国内においては糖尿病患者総数の約15％が糖尿病網膜症にかかっていると推定され、国内では約140万人が対象と考えられる（OCULISTA  2013；8；1-5）。さらに別の報告によると、年間約３０００人が糖尿病網膜症による中途失明者になり（岡畑純江等、月間糖尿病  Vol.6  No.6(通巻64号)2014年7月号17ｐ）、成人の失明原因の主な原因となっている。中途失明は日常生活の質を極度に低下させることから、その防止は極めて重要な課題である。糖尿病網膜症は基本的には微小血管の破綻が原因と考えられている。糖尿病の罹患期間が長くなるに従い、網膜症の発症率が高くなることが知られており、血管壁が次第に薄くなり脆弱化が進行することで血液網膜関門の破綻が生じると硬性白斑が認められるようになる。こうした変化は血流障害を誘起し、血栓形成による微小血管の閉塞を来たすことが病態の進行が進むことが知られている。糖尿病網膜症の進行は一般に緩徐に進行し、初期にはこうした網膜の毛細血管が脆くなる単純網膜症の段階から、次いで血管の障害が次第に進行し増殖前網膜症を経て増殖網膜症の段階に至り、網膜剥離などを引き起こし多彩な症状を引き起こしながら網膜神経を破壊し、最後に失明に至ることが知られている。従って、網膜神経が損傷する段階若しくはその手前で網膜神経を保護する処置を行うことが出来れば、これによる失明は回避されると期待される。現状ではレーザー光凝固術による網膜および硝子体内に発生する新生血管の発生を防止する方法や、さらに病態が進行した場合には、硝子体手術が適用されるが、これらの方法では網膜神経が直接保護されるものでは無く、単に病態の進行を遅らせるに過ぎないことが指摘される。
【０００３】
糖尿病網膜症における網膜神経の変性にはＮＭＤＡ（Ｎ−メチル-Ｄ-アスパラギン酸）受容体を介した神経細胞死が関与していることが示唆され、非特許文献1ではＮＭＤＡを眼内に投与することで網膜神経節細胞およびアマクリン細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかにされた。非特許文献１において、神経細胞死は神経毒性を有するグルタミン酸により誘起され、興奮性刺激により放出されたグルタミン酸が神経細胞のグルタミン酸受容体を刺激することで細胞内に過剰のカルシウムが流入し、このことが神経細胞内のカルパインを活性化することで神経細胞死に繋がることが報告されている。このことからカルパイン阻害剤を網膜神経細胞内に導入出来れば、神経細胞死を抑制する可能性が挙げられる。例えば非特許文献２において、カルパイン阻害剤としてＳＮＪ−１９４５を投与することで神経細胞死が抑制できることが示されている。この場合、予めＳＮＪ−１９４５を投与した後にマウスの硝子体内へＮＭＤＡを注入していることから、実際の治療目的に照らし合わせると、神経細胞死が進行している段階でのＳＮＪ−１９４５の投与効果が示されておらず、慢性疾患である糖尿病網膜症の治療において、果たしてこうしたカルパイン阻害剤が有効であるか未だ不明である。非特許文献３においてはＳＮＪ−１９４５の繰り返し投与によってもその効果は必ずしも発揮されない可能性を示しており、未だ投与後の体内動態や蓄積性など不明な点が多く残されている。さらに、カルパインは体内の様々な器官において多様な機能を司っており、これまで少なくとも１５種類のカルパインがヒトの体内において機能していることが明らかにされているが、生理的機能が未だ解明されていない種も存在する。従ってカルパイン阻害剤を適用する際には、ターゲットとする特定のカルパインに対して選択的に作用する阻害剤を用いることが重要である。こうした観点からカルパイン阻害剤からのアプローチは有用である可能性が存在するものの解決すべき課題が多数残されていることが現状である。
【０００４】
糖尿病網膜症と並び失明に至る最も発生頻度の高い緑内障の予防、治療に関する研究も盛んに行われている。本発明者らはペプチドであるアペリンおよびアペリン受容体（ＡＰＪ）の中枢神経系における発現とその作用に関する研究を進め、マウスにおいてＡＰＪが網膜神経節細胞および内顆粒層に発現していることを見出している。緑内障による視神経の障害は視神経乳頭の陥没を伴うことが特徴である。視神経乳頭は網膜神経節細胞の神経軸索が集合し神経線維束となって篩状板を通過し、これ以降有髄線維束となって視交叉を経て後頭葉視覚中枢に達する。緑内障では篩状板が湾曲することで神経線維が絞扼され、神経細胞の活動を維持するための栄養因子などが途絶するため網膜神経節細胞のアポトーシスが引き起こされることが原因とされている。これに加えてグルタミン酸などの神経毒による障害も緑内障を悪化させる因子として挙げられる。本発明者らは、緑内障モデルとして、網膜にＮＭＤＡを作用させることで網膜神経細胞死が誘起されたマウスモデルにおいて、アペリンを硝子体内へ直接注入することで網膜神経節細胞とアマクリン細胞の双方のアポトーシスを抑制することを見出してきた（非特許文献４を参照）。
【０００５】
アペリンは、Ｇタンパク質供役受容体であるＡＰＪのリガンドであり、アペリン−ＡＰＪシステムは、体内の様々な組織で発現しており、様々な生理学的プロセスの重要な調節因子として機能している。これまで主に血管系におけるアペリン−ＡＰＪシステムの役割に関して研究が進み、高血圧、心不全、アテローム性動脈硬化などの様々な病態の進行および抑制の両方に関与することが明らかにされてきた。アペリン−ＡＰＪシステムは心血管系の恒常性を維持するための強力な調節因子であることから、これらは心血管系疾患における重要な薬理的ターゲットでもある。アペリン−ＡＰＪシステムはこれ以外にも肝機能や腎機能の調整、体温調節、免疫性、グルコース代謝、血管新生、体液恒常性などにも深く関わっていることが知られている。
現在、臨床応用されている医薬品の多くがＧタンパク質共役受容体を標的にしていることから、アペリン−ＡＰＪシステムに対するアペリン類似化合物やアペリンと構造を異にするアゴニスト若しくはアンタゴニストは、新規な治療薬の開発に繋がる可能性が高く盛んに研究が行われている。
【０００６】
一方でアペリン及びＡＰＪの両方は中枢神経系においても発現が認められているが、その役割については未だ不明な点が多い。これまでに、アペリンは、グルタミン酸や虚血再灌流障害により誘発される神経細胞死に対して保護作用を有することが報告されている。本発明者らは神経細胞として特に視神経に着目し、失明に至る様々な疾患から視神経を保護するための薬理作用を有するペプチドの研究を進めてきた。本発明者らは非特許文献４において、成体マウスの網膜においてＡＰＪが網膜神経節細胞およびアマクリン細胞に発現していることや、緑内障モデルマウスの網膜神経細胞である網膜神経節細胞およびアマクリン細胞のアポトーシスに対してアペリンが顕著な保護作用を有することを開示した。このように本発明者らは緑内障モデルマウスにおいてアペリンによるＡＰＪの活性化が網膜神経細胞の保護に有効であることを見出してきた。本発明において解決しようとする課題は、緑内障に代わり糖尿病網膜症における網膜神経細胞の保護を可能とする手段を見出すことであるが、発生機序が緑内障と糖尿病網膜症では大きく異なり、緑内障においては視神経乳頭部における網膜神経節細胞からの神経軸索の絞扼による神経細胞障害からの保護であり、糖尿病網膜症では微小血管の脆弱化による血流障害からの神経細胞の保護が重要になる。緑内障におけるアペリン／ＡＰＪシステムの関わりを研究する中で、本発明者らは糖尿病網膜症における同システムの関与を追及する中で本発明の完成に至ったのである。
【０００７】
視細胞から伝達される光刺激シグナルは、光受容体である桿体および錐体の２種類の視細胞から双極細胞を介して介在ニューロンであるアマクリン細胞を経由し網膜神経節細胞に入り、ここから視神経乳頭に収束し、視交叉を経て後頭葉視覚中枢に達する。網膜神経節細胞は視覚を司る極めて重要な神経伝達の中継ポイントであり、さらに情報処理機能も備えているため、その障害は失明に直結する重大な問題となり得る。
【０００８】
糖尿病網膜症に対する治療方法として、レーザー光による網膜光凝固術や外科的手術がある。また、硝子体内の血管新生を抑制し病態の進行を抑制する手段として血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する中和抗体の硝子体内投与も行われているが、これらは病態の進行を抑制するのみで十分な治療方法として確立されたものではない。
【０００９】
先のカルパイン阻害剤からのアプローチとは対照的に、本発明者らは、緑内障モデルマウスにおいて、ＮＭＤＡとアペリンを同時投与した際に、緑内障における網膜神経細胞死が顕著に抑制されることをこれまで見出してきた。しかしながら硝子体への薬剤の直接投与は侵襲が大きく患者への負担が大であり、感染症などの問題もあるため、こうした方法は実際の治療方法に展開することは困難であると考えられる。
【００１０】
アペリンは７７残基のペプチド体から３６残基のペプチド（アペリン−３６）およびさらに分子量の低下した１３残基のアペリン−１３へと体内で処理され、これらがＡＰＪに対するリガンドとして作用することが知られている。こうしたアペリン自体を医薬組成物として利用することは、ペプチドとしての安定性やその製造方法、入手方法、価格等に問題があり、治療目的に利用するためには様々な問題があるのが現状である。これに対して様々な合成化合物のアペリン受容体（ＡＰＪ）アゴニストが報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）。特許文献１および特許文献２には、様々な構造を有するＡＰＪ受容体アゴニストが開示されているが、いずれもペプチド鎖を導入した複雑な構造を有する化合物であり、安定性や入手方法に関して問題がある。
【００１１】
糖尿病網膜症においては、網膜への血液供給が非常に重要な役割を果たしていると考えられる。網膜への血液の供給は実際二つのルートから行われており、両者の間の交通は存在しないと考えられている。即ち、心臓から頸動脈を経由して頭部に供給される動脈血は、内頸動脈を経て眼動脈に注がれ、これから網膜中心動脈を経由し網膜毛細血管から、網膜神経細胞に直接酸素および栄養素を供給する第１のルートと、網膜視細胞の網膜神経とは反対側の網膜色素上皮層に酸素及び栄養素を供給する毛様動脈を経由して脈絡膜毛細血管に到達する第２のルートの２つのルートがある。脈絡膜毛細血管は有窓血管で、脈絡膜実質中では血液成分は自由に交通しているが、網膜色素上皮層どうしはtight  junctionで接合しており隣接する視細胞との間には特に接着構造は有していない。両者は外血液網膜関門を構成し、これからの視細胞への血液成分の移動は困難かつ選択的であり、第２のルートからの薬物の送達は困難である。また、第１のルートの網膜中心動脈からの輸送についても内血液網膜関門が存在し、やはり様々な薬物に対するバリアとして機能している。
【００１２】
これらの血液関門により網膜神経細胞を保護するための様々な薬剤の送達が阻害される。アペリンを始め水溶性ペプチド類は血液関門を通過することが困難であり、さらに水溶性でイオン性の化合物の通過も一般的に困難である。また、薬剤の投与方法として経口投与は最も好ましい投与方法の一つであるが、消化管内での酵素分解や肝臓における代謝を受けやすく、さらに血漿中の様々の酵素による分解反応についても考慮する必要がある。したがって、薬剤として医薬組成物を検討する場合、それに含まれる成分の分解挙動や薬効成分の放出のタイミングおよび投与方法などについても考慮することが必須である。
【００１３】
こうした理由から、上述したアペリン受容体（ＡＰＪ）アゴニストとしては、血液網膜関門を通過できることに加えて、体内においてある程度の安定性を有することが必要である。特許文献１および特許文献２に示されるアペリン受容体アゴニストはいずれも血液網膜関門を通過できないため末梢血管系からの投入で網膜神経節細胞へ達することが出来なかった。
【００１４】
アペリン受容体（ＡＰＪ）は上述したように生体内において様々な働きを通して正常な生体機能を維持するための調節に大きく寄与しており、その選択的アゴニストとしてアペリンが存在するが、ＡＰＪのアゴニストとしてアペリン以外の分子を利用する場合、ＡＰＪに対する選択性が問題となる場合がある。ＡＰＪはアンジオテンシンＩＩ受容体ＡＴ１と相同性が高く、これ以外のＧタンパク質供役受容体との相同性も有している。従って、アペリン以外のアペリン受容体アゴニストは、これ以外のタンパク質に対してもアゴニストとして作用することで生体内において好ましくない副作用を及ぼす可能性がある。こうした理由から、ＡＰＪに対するアゴニストとしては選択性が高く、これ以外の相同性を有するタンパク質との相互作用ができるだけ少ないものを選択する必要がある。
【００１５】
したがって、糖尿病網膜症を予防若しくは治療するための網膜神経細胞を保護する作用を有するアペリンに代わる低分子化合物であるアペリン受容体（ＡＰＪ）に対して高い選択性を有するアゴニストを含有する医薬組成物と、末梢血管系からの投入で網膜神経節細胞へ達することのできる医薬組成物の使用方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表２０１６−５０４３３５号公報
【特許文献２】特表２０１７−５２３１２６号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Nakazawa T. et al., Calpain-mediated degradation of G-substrate plays a critical role in retinal excitotoxicity for amacrine cells. J. Neurosci. Res., 87(6): 1412-1423（2009）
【非特許文献２】Shimazawa M., et al., A Novel Calpain Inhibitor, ((1S)-1-((((1S)-1-Benzyl-3cyclopropylamino-2,3-di-oxopropyl)amino)carbonyl)-3methylbutyl)carbamic Acid 5-Methoxy-3-oxapentyl Ester (SNJ1945), Reduces Murine Retinal Cell Death In Vitro and In Vivo, J. Pharmacology and experimental therpeutics, 332:380−387 (2010)
【非特許文献３】Bains M., et al., Pharmacological analysis of the cortical neuronal cytoskeletal protective efficacy of the calpain inhibitor SNJ‐1945 in a mouse traumatic brain injury model, J Neurochemistry, 125(1):125-132 (2013)
【非特許文献４】Ishimaru Y.、et al., Apelin protects against NMDA-induced retinal neuronal death via an APJ receptor by activating Akt and ERK1/2, and suppressing TNF-a expression in mice, Journal of Pharmacological Sciences 133 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記状況に鑑みて、本発明は、糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護する作用を有し、低分子化合物として安定性があり、入手や取扱いが容易であり、アペリン受容体（ＡＰＪ）に対して高い選択性を有するアペリン受容体アゴニストを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を達成すべく、本発明の医薬組成物は、糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストであって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物である。ここで、下記式（Ｉ）中、Ｒ１は炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状のアルキル基を、Ｒ２〜Ｒ４は各々独立して水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。
なお、本明細書においてアペリン受容体アゴニストとは、アペリンと同様の作用を発揮する物質であるアペリン様薬剤と同意義で用いられており、アペリン受容体（ＡＰＪ）を介してアペリンと同様の作用を発揮する物質をいう。
【００２０】
【化１】
2020059679.tif 000003
【００２１】
また、本発明の医薬組成物は、糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストであって、下記一般式（II）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物であってもよい。ここで、下記式（II）中、Ｒ１は炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状のアルキル基を、Ｒ３は水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。
【００２２】
【化２】
2020059679.tif 000004
【００２３】
さらに、本発明の医薬組成物は、糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストであって、下記一般式（III）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物であってもよい。ここで、下記式（III）中、Ｒ３は水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。
【００２４】
【化３】
2020059679.tif 000005
【００２５】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、末梢血管系に投与され、体循環を経て眼動脈経由で網膜に到達させるように用いられる。ここで、末梢血管系は、具体的には、眼の血管以外の部分の末梢血管系を用いることができる。
本発明の医薬組成物は、ヒトやヒト以外の動物の末梢血管系に投与され、医薬組成物の有効成分のアペリン受容体アゴニストを、体循環を経て眼動脈経由で網膜に到達させることで糖尿病網膜症における網膜神経細胞死を抑制し、網膜神経細胞の保護を図る。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の医薬組成物によれば、網膜神経細胞を保護する作用を有し、低分子化合物として安定で入手が容易であり、アペリン受容体（ＡＰＪ）に対して高い選択性を有するアゴニストを含有し、末梢血管からの投与で網膜に到達することで糖尿病網膜症における網膜神経細胞死を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】暗順応下でマウスに１ミリ秒間、１．０×１０−3（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の強さの光をマウスに当てたときに得られる網膜電図
【図２】暗順応下でマウスに０．３ミリ秒間、３．０（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の強さの光をマウスに当てたときに得られる網膜電図
【図３】眼球パラフィン切片を抗Ｂｒｎ−３ａ抗体で染色した代表的な画像
【図４】（Ａ）は５週齢のＡｋｉｔａマウスおよびＷＴマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）または通常飼料（Ｎｏｒｍａｌ）を４週間摂取させた場合の網膜電図の推移を示すグラフ、（Ｂ）通常飼料または高脂肪食を ４週間摂取させたマウスの網膜切片におけるＢｒｎ−３ａ（網膜神経節細胞マーカー）陽性細胞数を示す図
【図５】Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下を示す図、（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）およびＡｋｉｔａマウスに通常飼料または高脂肪食を摂取させ、１週間ごとに視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）の変化を示す図、（Ｂ）網膜内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）の変化を示す図
【図６】Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取による網膜神経節細胞死に対するＭＬ２３３投与の影響を示す図、（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）摂取開始から４週間、ＡｋｉｔａマウスにＭＬ２３３またはＤＭＳＯを１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した際に、１週間ごとに網膜神経節細胞由来の電気信号の振幅の推移を示すグラフ、（Ｂ）高脂肪食（ＨＦＤ）摂取開始から４週間、ＡｋｉｔａマウスにＭＬ２３３またはＤＭＳＯを１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した際の４週間後のマウスの網膜切片におけるＢｒｎ−３ａ陽性細胞数を示す図
【図７】Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下に対するＭＬ２３３投与の影響を示す図、（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）摂取開始から４週間、ＡｋｉｔａマウスにＭＬ２３３またはＤＭＳＯを１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した際の１週間ごとの視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）の推移を示すグラフ、（Ｂ）網膜内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）の振幅の推移を示すグラフ
【図８】Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取による網膜神経節細胞死に対するアペリン遺伝子欠損の影響を示す図、（Ａ）野生型マウス、Ａｋｉｔａマウス、アペリン遺伝子欠損マウス、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａマウスに高脂肪食を摂取させ、１週間ごとに網膜神経節細胞由来の電気信号を記録し、振幅を測定した結果を示す図、（Ｂ）各マウスに高脂肪食を４週間摂取させたマウスの網膜切片におけるＢｒｎ−３ａ 陽性細胞数を示す図
【図９】Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下に対するアペリン遺伝子欠損の影響を示す図、（Ａ）野生型マウス、Ａｋｉｔａマウス、アペリン遺伝子欠損マウス、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａマウスに高脂肪食を摂取させ、１週間ごとに視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）の推移を示すグラフ、（Ｂ）網膜内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）の振幅の測定結果を示す図
【図１０】眼球パラフィン切片を抗ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体で染色した場合の画像
【図１１】ＮＭＤＡ硝子体投与による網膜神経節細胞死およびアマクリン細胞死に対するＭＬ２３３投与の影響を示す図、（Ａ）ＭＬ２３３またはＤＭＳＯをマウスの腹腔内に投与し、１時間後、ＮＭＤＡまたはｓａｌｉｎｅを硝子体内投与した際の、２４時間後のマウスの網膜切片における網膜神経節細胞層のｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞数を示す図、（Ｂ）内顆粒層のｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞数を示す図
【図１２】ＭＮＵ腹腔内投与による視細胞死の誘導を示す図、（Ａ）無処置またはＭＮＵ（３０ ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与２４時間後のマウスに３．０（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の光を照射し、得られた網膜電図、（Ｂ）無処置またはＭＮＵ（３０ ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与２４時間後のマウスの網膜切片をＴＵＮＥＬ染色した試料の光学顕微鏡写真
【図１３】ＭＮＵ腹腔内投与によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下に対するＭＬ２３３投与の影響を示す図、マウスにＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯをＭＮＵ投与２４時間前、１時間前およびＭＮＵ投与後２４時間毎に腹腔内投与した際の、（Ａ）ＭＮＵ投与前、（Ｂ）投与２４時間後、（Ｃ）４８時間後、および（Ｄ）７２時間後のマウスに３．０（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の光を照射したときの網膜電図
【図１４】ＭＮＵ腹腔内投与による外顆粒層のアポトーシスに対するＭＬ２３３投与の影響を示す図
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
下記の一般式（Ｉ）のアペリン受容体アゴニストについて説明する。上述したとおり、本明細書において、アペリン受容体アゴニストとは、アペリンと同様の作用を発揮する物質であるアペリン様薬剤と同意義で用いられており、アペリン受容体（ＡＰＪ）を介してアペリンと同様の作用を発揮する物質をいう。ここで、下記式（Ｉ）中、Ｒ１は炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状のアルキル基を、Ｒ２〜Ｒ４は各々独立して水素原子、又は、炭素数１〜６の直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基を、Ｒ５は置換可能なフェニル基又は含窒素複素環基をそれぞれ示す。
【００２９】
【化４】
2020059679.tif 000006
【００３０】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物については、Sanford-Burnham Medical Research Instituteが公開する“Functional agonists of the Apelin J (APJ) receptor”の表題のProbe Report（URL：www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK98921/を参照）において詳細に述べられている。上記一般式（Ｉ）で表される化合物の内で、アペリン受容体アゴニストとして好ましい例が挙げられている。一般式（Ｉ）がアペリン受容体（ＡＰＪ）の完全アゴニストとして機能するためには、特に、Ｒ１がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、Ｒ２及びＲ４が水素原子、Ｒ３が水素原子、又は、メチル基である場合が好ましい。
Ｒ２およびＲ１における選択肢からメチル基を削除しているのは、Ｒ２またはＲ１を小さな脂肪族炭化水素に置換すると、アペリン受容体アゴニストとしての活性が低下する傾向にあるからである。また、Ｒ３を大きな脂肪族炭化水素に置換する場合においても、アペリン受容体アゴニストとしての活性が低下する傾向にあるため、Ｒ３の置換基を水素原子またはメチル基に限定するものである。
同様の観点から、一般式（II）がアペリン受容体（ＡＰＪ）の完全アゴニストとして機能するためには、Ｒ１がイソプロピル基、シクロヘキシル基、又は、ターシャリーブチル基、Ｒ３が水素原子、又は、メチル基である場合が好ましい。
【００３１】
糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護する医薬組成物であって、アペリン受容体アゴニストを有効成分として含有する化合物１〜９について以下に説明する。化合物１〜９は、それぞれ下記化学式１〜９で表される。
化合物１は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にシクロヘキシル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５にフェニル基を導入した化合物である。
化合物２は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にイソプロピル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５にベンゾニトリルを導入した化合物である。
化合物３は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にイソプロピル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５に（４-トリフルオロメトキシ）フェニル基を導入した化合物である。
化合物４は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にターシャリーブチル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５にフェニル基を導入した化合物である。
化合物５は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にイソプロピル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５に（４-トリフルオロメチル）フェニル基を導入した化合物である。
化合物６は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にシクロヘキシル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５に３-クロロフェニル基を導入した化合物である。
化合物７は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にシクロヘキシル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５に２，６-ジクロロフェニル基を導入した化合物である。
化合物８は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にイソプロピル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５に３-ピリジル基を導入した化合物である。
化合物９は、一般式（Ｉ）において、Ｒ１にシクロヘキシル基、Ｒ２に水素、Ｒ３にメチル基、Ｒ４に水素、Ｒ５に１-メチルイミダゾール-２-イルを導入した化合物である。
【００３２】
【化５】
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【００３３】
【化６】
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【００３４】
【化７】
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【００３５】
【化８】
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【００３６】
【化９】
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【００３７】
【化１０】
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【００３８】
【化１１】
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【００３９】
【化１２】
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【００４０】
【化１３】
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【００４１】
特に化学式１の化合物は、研究用試薬の商品名“ＭＬ２３３”として市販されており、容易に入手可能である（例えば、フナコシ株式会社より入手可）。ＭＬ２３３はヒト血漿中においてその大部分が血漿タンパクと結合しているにもかかわらず安定性が比較的低いことが知られている（上記Probe Report参照）。これは化合物の構造的特徴としてＮ−置換キノンイミンスルホン酸エステル構造の不安定性にも起因しており、これについてはフェニル基に置換する各種置換基の電子供与性あるいは電子吸引性効果による安定性への影響もあることから、必要とされる血中濃度を維持するために一般式（Ｉ）においてそれぞれの置換基を選択することにより、本発明の目的に合致するための最適化を行うことができる。
【００４２】
一般式（Ｉ）の化合物については、各種置換基の導入による構造とアゴニストとしての活性の関係がすでに報告されている。上記に例示した化学式１〜９の化合物１〜９は、いずれもアペリン受容体アゴニストとしての高い活性を示す。これらのアペリン受容体アゴニストとしての効果を示すＥＣ50（50％効果濃度）の値を下記表１に示す。さらに一般式（Ｉ）の化合物は、アペリン受容体（ＡＰＪ）と相同性の高い他のＧタンパク質供役受容体であるアンジオテンシンＩＩ受容体ＡＴ１との結合性の比較を行い、両者の比ＡＰＪ／ＡＴ１についても同じく下記表１に纏める。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
一般式（Ｉ）の化合物は、一般に水に対する溶解性が低いことから、これを含む医薬組成物を構成する場合に、水以外のアルコールや水混和性の有機溶剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの各種有機溶剤を添加して、一般式（Ｉ）の化合物の溶解性を高めた状態で使用することも出来る。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、治療有効量の一般式（Ｉ）の化合物、及び一般的には、許容される医薬担体、希釈剤、又は添加剤、例えば滅菌水、生理食塩水、静菌性食塩水、すなわち約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含有する食塩水、リン酸緩衝化食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液、グリセリン、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトールなどを含有する。さらには、水溶性高分子化合物として、各種セルロース誘導体、アルギン酸塩、カラギーナンなどの増粘性を付与するとともに消化管内における酵素分解を遅延させる効果を有する添加剤を含有することもできる。本発明の医薬組成物は、一般的に液剤又は懸濁剤である。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、筋内内投与、経肺投与、肺吸入により、及び／又は、徐放投与により投与される。本発明の医薬組成物は、経口又は皮下、さらに腹腔内に投与される。投与回数は、単回ではなく症状に応じて一日当たり１回から数回を継続的に繰り返し投与が行われる。この場合、皮下投与、特に腹腔内投与においては、一般式（Ｉ）の化合物は水溶性が低いことから皮下組織または腹腔内に比較的長く貯留されることから、本発明の医薬組成物が少しずつ末梢血管から吸収され、体循環や肝門脈経由で眼動脈に到達できるため好ましい。さらには、抗癌剤のパクリタキセルの腹腔内投与の場合のように、腹腔内にカテーテルを挿入し、これに接続する皮下に埋設したポートに体外から本発明の医薬組成物を投入する方法や、同様なカテーテルを利用して腹部にリザーバーを埋設してこれから医薬組成物を腹腔内に投入することが好ましい。
【００４７】
或いは、一般式（Ｉ）の化合物を含有するマイクロカプセルとして、例えば前立腺がんの化学療法に用いられる酢酸リュープロレリンを含有する「リュープリン」のように、生分解性ポリ乳酸・グリコール酸によってマイクロメーターサイズの徐放性剤としての利用も可能である。これを皮下、特に腹腔内に投与することで数か月間にわたり、一般式（Ｉ）の化合物を徐放することで末梢血管から吸収され頸動脈から眼動脈経由で網膜に到達し、網膜神経細胞の保護作用を有効に維持することが出来ることから極めて好ましく用いることができる。さらに、頸動脈から眼動脈に至る分岐点である内頚動脈付近において一般式（Ｉ）を含む本発明の医薬組成物を留置することも好ましく行うことが出来る。
【００４８】
糖尿病網膜症では網膜神経細胞のみならず視細胞への毛細血管からの栄養供給が阻害され視細胞の壊死を伴う場合がある。本発明の効果として、さらに一般式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を皮下組織あるいは腹腔内に投与した場合、末梢血管から吸収されて最終的に眼動脈に注がれ網膜に到達するが、後述する実施例において示すように、脈絡膜実質中経由で網膜色素上皮層を通過し視細胞に対する保護作用を認めたことから一般式（Ｉ）の化合物は網膜神経細胞のみならず視細胞自体の保護作用も併せて有することが確認され、本発明の医薬組成物による新たな効果として期待できる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は一般的に、容認できない副作用を引き起こすことなく、望ましい治療効果や予防効果を生じる投入量で用いることが必要である。典型的な投入量範囲は、１日あたり約０．００１ｍｇから１日あたり約１０ｍｇである。一般式（Ｉ）の化合物のそれぞれについての好ましい投入量範囲は、１日あたり約０．００１ｍｇから１日あたり約１０ｍｇであり、そして最も好ましい投入量範囲は、約０．００１ｍｇ／日から約１ｍｇ／日、特に約０．０１〜１ｍｇ／日である。
【００５０】
最近、アペリン受容体アゴニストの例として様々な化合物が合成され、それらの特性が検討されている。例えば、特開２０１７−０６１５４６号公報に示されるトリアゾール誘導体、特表２０１７−５２３１２６号に示されるピラゾール誘導体、特表２０１８−５１６９２８号に記載されるヒドロキシピリジン誘導体などが挙げられる。これらはアペリン受容体アゴニストとして作用するが、本発明の目的とする医薬組成物として用いるには、血液網膜関門透過性やＡＰＪに対する選択性に劣ることから、本発明の一般式（Ｉ）の化合物とともに用いることが可能である場合もあるが、これらをそれぞれ単独で用いても本発明の目的とする効果、すなわち、網膜神経細胞の保護効果は得られなかった。
【００５１】
以下実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中の百分率は断りのない限り質量基準である。
【実施例１】
【００５２】
本実施例では、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取による網膜神経細胞死に対するＭＬ２３３の保護効果について説明する。
【００５３】
（実験動物および飼料）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系を遺伝子背景にもつ糖尿病モデルマウスであるＡｋｉｔａマウスおよび野生型（ＷＴ）マウスは、日本ＳＬＣ株式会社から購入した。アペリン遺伝子欠損（ＫＯ）マウスは、武田薬品工業株式会社から入手した。アペリンＫＯマウスとＡｋｉｔａマウスを掛け合わせて、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａマウスを作製した。実験には、全て雄性マウスを用いた。マウスは透明ケージ（２４×１７×１２ ｃｍ）で飼育し、室温は２２±１℃、照明時間は１日１２時間とする飼育条件下で、餌と水を自由に摂取させた。高脂肪食としてＱｕｉｃｋ  ｆａｔ（日本クレア株式会社）を、通常飼料としてＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社）を使用した。実験動物の飼育、実験等はすべて「日本薬理学会指針」に従って計画し、実施した。
【００５４】
（網膜電図検査）
１２時間以上暗順応させたマウスを暗室内で抱水クロラール（５００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により麻酔後、ベノキシール点眼液０．４％（オキシブプロカイン塩酸塩４ｍｇ／ｍＬ；参天製薬株式会社）により角膜表面を麻酔し、ミドリンＰ点眼液（トロピカミド５ｍｇ／ｍＬ、フェニレフリン塩酸塩５ｍｇ／ｍＬ；参天製薬株式会社）により散瞳させた。網膜電位の変化を記録するため、マウスの角膜上にコンタクトレンズ型関電極（Ｍａｙｏ）を装着し、マウス口内に不関電極を挿入した。アース（接地電極）をマウス尾部に装着し、白色ＬＥＤ光源を備えた半球ドーム（小動物用全視野光刺激装置；Ｍａｙｏ）内にマウスを静置した。網膜神経節細胞由来の電気信号（暗順応閾値反応；ＳＴＲ）を惹起させるため、１ミリ秒間、１．０×１０−3（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の強さの光をマウスに当てた。５秒間隔で８回測定し、得られた結果を平均した。この条件でみられる代表的な網膜電図を図１に示す。また、視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）および網膜内顆粒層に細胞体が存在する介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）を惹起させるため、０．３ミリ秒間、３．０（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の強さの光をマウスに当てた。３０秒間隔で４回光を当て、得られた結果を平均した。この条件でみられる代表的な網膜電図を図２に示す。測定結果の記録および加算平均処理は、ＰｏｗｅｒＬａｂデータ収集・解析システム（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。ＳＴＲは、網膜電図における基準値から最大値までを測定し、その振幅を数値化した。ａ−ｗａｖｅは、網膜電図における基準値からトラフ値までを、ｂ−ｗａｖｅは、トラフ値から最大値までを測定し、その振幅を数値化した。
【００５５】
（免疫組織化学染色）
マウスを麻酔し、開腹および開胸後、左心室から生理食塩水を灌流し脱血した。続いて、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により灌流固定を行い、眼球を摘出した。摘出した眼球を４℃にて２４時間４％ＰＦＡ中で浸漬固定した。眼球を超純水により洗浄し、４℃にて２４時間Ｚｉｎｃ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で浸漬固定した。眼球をパラフィン包埋後、５μｍの厚さに薄切し、スライドグラス上にて一晩乾燥させた。眼球切片をキシレンで脱パラフィン後、エタノール及び水道水により親水化し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）中でマイクロウェーブ照射により抗原を賦活化し（沸騰後５００Ｗで１０分間煮沸し２０分間放冷×２回）、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び０．５％ ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ））で室温にて３０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。マウス抗Ｂｒｎ−３ａ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．；ｓｃ−８４２９）をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈し、４℃で一晩、眼球切片と反応させた。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＴＢＳで洗浄後、ビオチン標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ；Ｅ０４３３）をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５００倍希釈し、室温で１時間、眼球切片と反応させた。洗浄後、ＦＩＴＣ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；５５４０６０）をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５００倍希釈し、室温で１時間、眼球切片と反応させた。洗浄後、眼球切片をカバーグラスと封入材Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いて封入し、蛍光顕微鏡ＡＺ１００（Ｎｉｋｏｎ）にて観察した。代表的な染色画像を図３に示す。図３は眼球パラフィン切片を抗Ｂｒｎ−３ａ抗体で染色した代表的な画像を示す。
【００５６】
（薬物投与）
アペリン受容体アゴニストであるＭＬ２３３（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。２５μＬマイクロシリンジ（伊藤製作所）を用いて、ＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）を１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した。対照群には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を同スケジュールにて腹腔内に投与した。
【００５７】
（統計解析）
統計解析は、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを行い、ｐｏｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔとして、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ‘ｓ  ｔｅｓｔを行った。この検定により、ｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
【００５８】
（実験結果）
５週齢のＡｋｉｔａマウスおよびＷＴマウスに高脂肪食または通常飼料を４週間摂取させ、経時的に網膜電図を記録した。図４（Ａ）は５週齢のＡｋｉｔａマウスおよびＷＴマウスに高脂肪食（ＨＦＤ）または通常飼料（Ｎｏｒｍａｌ）を４週間摂取させた場合の網膜電図の推移を示す。１週間ごとに網膜神経節細胞由来の電気信号（ＳＴＲ）を記録し、振幅を測定した （ｎ＝４）。＊＊ｐ＜０．０１を表す。その結果、Ａｋｉｔａマウスにおいて高脂肪食摂取３週後から網膜神経節細胞由来の電気信号の減弱化がみられた。図４（Ｂ）は、通常飼料（Ｎｏｒｍａｌ）または高脂肪食（ＨＦＤ）を 4 週間摂取させたマウスの網膜切片におけるＢｒｎ−３ａ（網膜神経節細胞マーカー）陽性細胞数を示す。陽性細胞数のカウントはｎ＝４でおこなった。結果は、平均値±標準誤差で示した。図中において、＊＊ｐ＜０．０１、††ｐ＜０．０１を表す。高脂肪食を４週間摂取させたＡｋｉｔａマウスの網膜における、網膜神経節細胞マーカーであるＢｒｎ−３ａの陽性細胞数の減少がみられた。
【００５９】
さらに視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）および内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）についても調査した。図５は、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下を表す。図５（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）およびＡｋｉｔａマウスに通常飼料（Ｎｏｒｍａｌ）または高脂肪食（ＨＦＤ）を摂取させ、１週間ごとに視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）の変化を表し、図５（Ｂ）は網膜内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）の変化を表す。いずれの場合も、ｎ＝４について振幅を測定した。図中、＊＊ｐ＜０．０１を表す。Ａｋｉｔａマウスにおいて高脂肪食摂取３週後より低下が認められた。
【００６０】
この高脂肪食摂取によるＡｋｉｔａマウスにおける網膜神経細胞死に対するアペリン受容体アゴニストの保護作用を検討するため、高脂肪食摂取開始から、ＭＬ２３３を１週間に３回、１日おきに腹腔内投与した。その結果、ＭＬ２３３の溶解に用いたＤＭＳＯを腹腔内投与したＡｋｉｔａマウスでは、高脂肪食摂取による網膜神経節細胞の活動電位の低下および網膜神経節細胞の減少に対してなんら影響がみられなかったが、ＭＬ２３３を投与したＡｋｉｔａマウスでは、高脂肪食摂取による網膜神経節細胞の活動電位の低下と網膜神経節細胞数の減少がほとんどみられなかった。図６は、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取による網膜神経節細胞死に対するＭＬ２３３投与の影響を示す。図６（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）摂取開始から４週間、ＡｋｉｔａマウスにＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯを１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した際に、１週間ごとに網膜神経節細胞由来の電気信号（ＳＴＲ）を記録し、振幅を測定した（ｎ＝３）。図中、＊＊ｐ＜０．０１。図６（Ｂ）高脂肪食（ＨＦＤ）摂取開始から４週間、ＡｋｉｔａマウスにＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯを１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した。４週間後のマウスの網膜切片におけるＢｒｎ−３ａ陽性細胞数をカウントした（n＝３）。結果は、平均値±標準誤差で示す。図中、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１を表す。
【００６１】
同様に、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下もＭＬ２３３の投与によりほとんど生じなかった。図７は、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下に対するＭＬ２３３投与の影響を表す。図７（Ａ）高脂肪食（ＨＦＤ）摂取開始から４週間、ＡｋｉｔａマウスにＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯを１週間に３回、１日おきに１回腹腔内投与した。１週間ごとに視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）。図７（Ｂ）網膜内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）を記録し、振幅を測定した （ｎ＝３）。図中、＊＊ｐ＜０．０１を表す。
【００６２】
次に、高脂肪食摂取によるＡｋｉｔａマウスにおける網膜神経細胞死に対してアペリン−ＡＰＪシステムが保護作用を有するか否かを明らかにするため、アペリン遺伝子を欠損させた（ＫＯ）Ａｋｉｔａマウスを用いて検討を行った。図８は、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取による網膜神経節細胞死に対するアペリン遺伝子欠損の影響を表す。図８（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）、Ａｋｉｔａマウス、アペリン遺伝子欠損（ＫＯ）マウス、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａ（Ａｋｉｔａ−ＫＯ）マウスに高脂肪食を摂取させ、１週間ごとに網膜神経節細胞由来の電気信号（ＳＴＲ）を記録し、振幅を測定した（ｎ＝３）結果を表す。図中、＊＊ｐ＜０．０１を表す。その結果、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａマウスでは、高脂肪食摂取開始２週間後から網膜神経節細胞由来の電気信号の減弱化がみられた。図８（Ｂ）は、各マウスに高脂肪食を４週間摂取させたマウスの網膜切片におけるＢｒｎ−３ａ 陽性細胞数をカウントした（ｎ＝３）結果を表す。結果は、平均値±標準誤差で示した。図中、＊ｐ＜０．０５を表す。その結果、高脂肪食を４週間摂取させたアペリンＫＯ−Ａｋｉｔａマウスの網膜におけるＢｒｎ−３ａ陽性細胞数は、高脂肪食を４週間摂取させたＡｋｉｔａマウスのＢｒｎ−３ａ陽性細胞数よりも有意に少なかった。
【００６３】
また、ａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅについても同様に、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａマウスでは、高脂肪食摂取開始２週間後から低下が認められた。図９は、Ａｋｉｔａマウスにおける高脂肪食摂取によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下に対するアペリン遺伝子欠損の影響を示す。図９（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）、Ａｋｉｔａマウス、アペリン遺伝子欠損（ＫＯ）マウス、アペリンＫＯ−Ａｋｉｔａ（Ａｋｉｔａ−ＫＯ）マウスに高脂肪食を摂取させ、１週間ごとに視細胞由来の電気信号（ａ−ｗａｖｅ）の推移。図９（Ｂ）網膜内顆粒層の介在神経細胞等由来の電気信号（ｂ−ｗａｖｅ）の振幅をｎ＝３について測定した結果を表す。図中、＊＊ｐ＜０．０１を表す。
【実施例２】
【００６４】
本実施例では、糖尿病網膜症による網膜神経細胞死モデルとしてのＮＭＤＡによる網膜神経節細胞およびアマクリン細胞の細胞死に対するＭＬ２３３の保護作用について説明する。
【００６５】
（実験動物）
実施例１において用いたマウスに替えて、本実施例では８週齢の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）を実験に用いた。マウス以外の条件は、実施例１と同様に実験を行った。
【００６６】
（薬物投与）
ＭＬ２３３の溶解および投与量は、実施例１と同様に行った。ＮＭＤＡ（ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の硝子体内投与は、３３Ｇ針を装着した５μＬシリンジ（伊藤製作所）を用いて実体顕微鏡下で行った。ＮＭＤＡを滅菌生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）で１０ｍＭになるように溶解し、この溶液をマウスの硝子体内に１μＬ（１０ｎｍｏｌ）投与した。対側眼には、Ｓａｌｉｎｅを投与した。硝子体内投与は、ＭＬ２３３またはＤＭＳＯの腹腔内投与１時間後に行った。
【００６７】
（免疫組織化学染色）
本実施例では、一次抗体としてマウス抗ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＭＡＢ１５６８）を用いた以外は実施例１と同様に行った。代表的な染色像を図１０に示す。図１０は、眼球パラフィン切片を抗ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体で染色した代表的な画像を示す。
【００６８】
（実験結果）
網膜において、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に特異的に結合するＮＭＤＡに感受性の高い神経細胞として、網膜神経節細胞およびアマクリン細胞が知られている。また、網膜神経節細胞層におけるｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞は網膜神経節細胞であること、また、内顆粒層におけるｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞はアマクリン細胞であることが知られている。ＮＭＤＡ硝子体内投与２４時間後の網膜におけるｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞数について検討行った結果、ＮＭＤＡ投与２４時間後の網膜では、網膜神経節細胞層および内顆粒層におけるｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞数の著明な減少がみられた。この減少は、ＮＭＤＡ硝子体内投与１時間前にＭＬ２３３を腹腔内投与することにより有意に抑制された。図１１は、ＮＭＤＡ硝子体投与による網膜神経節細胞死およびアマクリン細胞死に対するＭＬ２３３投与の影響を表す。図１１（Ａ）ＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯをマウスの腹腔内に投与し、１時間後、ＮＭＤＡ（１０ｎｍｏｌ）またはｓａｌｉｎｅを硝子体内投与した際の、２４時間後のマウスの網膜切片における網膜神経節細胞層のｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞数。図１１（Ｂ）内顆粒層のｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性細胞数を表す（ｎ＝３）。結果は、平均値±標準誤差で示した。図中、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１を表す。
【実施例３】
【００６９】
本実施例では、糖尿病網膜症による視細胞死モデルとしてＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＭＮＵ）誘発視細胞死に対するＭＬ２３３の保護作用について説明する。
【００７０】
（実験動物）
実施例２と同様に８週齢の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）を実験に用いた。マウス以外の条件は、実施例１と同様に実験を行った。
【００７１】
（薬物投与）
ＭＬ２３３の溶解および投与量は、実施例１と同様に実施した。ＭＮＵは、１．５ｍｇ／ｍＬになるように滅菌水で溶解し、３０ｍｇ／ｋｇで単回腹腔内投与した。ＭＬ２３３は、ＭＮＵ腹腔内投与２４時間前、１時間前およびＭＮＵ投与後２４時間毎に腹腔内投与した。
【００７２】
（網膜電図検査）
実施例１と同様にして行った。
【００７３】
（免疫組織化学染色）
ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）染色について説明する。
アポトーシス細胞を検出するＴＵＮＥＬ染色は、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｗａｋｏ）を用いて、添付文書に記載されている方法に従って実施した。眼球パラフィン切片作製の工程は、実施例１と同様に行った。
【００７４】
（統計解析）
統計解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行った。この検定により、ｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
【００７５】
（実験結果）
ＭＮＵ腹腔内投与による視細胞死について検討するため、ＭＮＵ投与２４時間後に網膜電図を解析した。図１２にはＭＮＵ腹腔内投与による視細胞死の誘導を示す。図１２（Ａ）無処置またはＭＮＵ（３０ ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与２４時間後のマウスに３．０ ｃｄ・ｓ/ｍ２の光を照射し、得られた網膜電図を示す。図１２（Ｂ）無処置またはＭＮＵ（３０ ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与２４時間後のマウスの網膜切片をＴＵＮＥＬ染色し、アポトーシス細胞を検出した。濃茶色に染色されているものが陽性細胞を示す。その結果、図１２（Ａ）に示すように、ＭＮＵ投与前と比較して、ＭＮＵ投与２４時間後の網膜では、視細胞由来の反応であるａ−ｗａｖｅの明らかな低下が認められ、それに伴い視細胞からの信号を受け取って反応する神経細胞等の信号であるｂ−ｗａｖｅの低下も認められた。また、図１２（Ｂ）に示すように、ＭＮＵ投与２４時間後の網膜において、視細胞の細胞体が存在する外顆粒層において、アポトーシス細胞が検出された。
【００７６】
このＭＮＵ投与による視細胞死に対するＭＬ２３３の保護作用を検討するため、ＭＮＵ投与２４時間前および１時間前にＭＬ２３３またはＤＭＳＯを腹腔内投与し、ＭＮＵ投与２４時間後に網膜電図を解析した。図１３は、ＭＮＵ腹腔内投与によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下に対するＭＬ２３３投与の影響を示す。マウスにＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯをＭＮＵ投与２４時間前、１時間前およびＭＮＵ投与後２４時間毎に腹腔内投与した。図１３（Ａ）ＭＮＵ投与前、図１３（Ｂ）投与２４時間後、図１３（Ｃ）４８時間後および図１３（Ｄ）７２時間後のマウスに、３．０（ｃｄ・ｓ／ｍ２）の光を照射したときの代表的な網膜電図を示した。その結果、図１３（Ｂ）に示すように、ＤＭＳＯを前投与したマウスと比較して、ＭＬ２３３を前投与したマウスの網膜では、ＭＮＵ投与によるａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下が抑制された。その後、図１３（Ｂ）（Ｃ）に示すように、さらに２４時間毎にＭＬ２３３またはＤＭＳＯを腹腔内投与し網膜電図を解析した結果、ＤＭＳＯ投与マウスでは、ａ−ｗａｖｅおよびｂ−ｗａｖｅの低下が顕著にみられたが、ＭＬ２３３投与したマウスでは、それらの低下が抑制された。また、図１４に示すように、ＭＮＵ投与２４時間後にみられる外顆粒層のアポトーシス細胞数は、ＤＭＳＯを前投与したマウスと比較して、ＭＬ２３３を前投与したマウスにおいて有意に減少した。図１４には、ＭＮＵ腹腔内投与による外顆粒層のアポトーシスに対するＭＬ２３３投与の影響を示したのである。ＭＮＵ投与２４時間前および１時間前にＭＬ２３３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＤＭＳＯを腹腔内投与した。ＭＮＵ投与２４時間後のマウスの網膜切片の外顆粒層におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数を計測した（ｎ＝３）。結果は、平均値±標準誤差で示し、図中、＊ｐ＜０．０５を表す。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の医薬組成物は、網膜神経保護作用および視細胞に対する保護作用を有することから、糖尿病網膜症において害される網膜神経細胞を保護するアペリン受容体アゴニストとしての使用が期待される。他にも緑内障や網膜色素変性症など様々な網膜神経および視細胞の変性に係る疾患の予防薬および治療薬に利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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