【事件の表示】
　特許第６５５３１０４号発明「タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド」の特許異議申立事件について、次のとおり決定する。
【結　論】
　令和　２年　８月２４日付け訂正請求において、特許第６５５３１０４号の特許請求の範囲を訂正請求書に添付された訂正特許請求の範囲のとおり、訂正後の請求項７について訂正することを認める。
　特許第６５５３１０４号の請求項１ないし７に係る特許を維持する。
【理　由】
第１　手続の経緯
　特許第６５５３１０４号の請求項１〜７に係る特許についての出願は、平成２５年　３月　９日（パリ条約による優先権主張　２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　４月　２日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　５月１７日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　５月１７日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　７月　５日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　８月１０日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　９月　４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　１０月　３日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年　１０月１１日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国、２０１２年１２月１４日　（ＵＳ）アメリカ合衆国）を国際出願日とする特願２０１５−５０４５６３号の一部を平成２９年　２月　２日に新たな特許出願とされたものであって、令和　１年　７月１２日にその特許権の設定登録がされ、同年　７月３１日に特許掲載公報が発行された。その後、その請求項１〜７に係る特許について、令和　２年　１月１０日に特許異議申立人　亀崎伸宏により特許異議の申立てがされ、当審において同年　５月１９日付けで取消理由が通知され、その指定期間内である同年　８月２４日に意見書の提出及び訂正の請求があり、同年１０月１３日付けで特許法第１２０条の５第５項に規定された通知書を特許異議申立人に送付したところ、同年１１月１８日に特許異議申立人から意見書が提出されたものである。
第２　訂正の適否
１　訂正の内容
　令和　２年　８月２４日付け訂正請求（以下、「本件訂正請求」という。）による訂正の内容は、次のとおりである。
　特許請求の範囲の請求項７に、「より低いレベルの検出可能なＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αをもたらす」と記載されているのを、「より低いレベルの検出可能なＩＦＮ−αをもたらす」に訂正する。
２　訂正の目的の適否、特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否、新規事項追加の有無、独立特許要件
（１）訂正の目的の適否
　上記訂正事項は、訂正前の請求項７に、「ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−α」と択一的に記載されているのを、「ＩＦＮ−α」に限定するものであるから、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に規定する特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
（２）特許請求の範囲の実質上の拡張又は変更の存否
　上記訂正事項は、「ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−α」と択一的に記載されているのを、「ＩＦＮ−α」に限定するものであり、カテゴリーや対象、目的を変更するものではないから、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではなく、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第６項に適合するものである。
（３）新規事項追加の有無
　上記訂正事項は、「ＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−α」と択一的に記載されているのを、「ＩＦＮ−α」に限定するものであるから、願書に添付した明細書、特許請求の範囲又は図面に記載した範囲内の訂正であり、特許法第１２０条の５第９項で準用する第１２６条第５項に適合するものである。
３　まとめ
　以上のとおりであるから、本件訂正請求による訂正は、特許法第１２０条の５第２項ただし書第１号に掲げる事項を目的とするものであり、かつ、同条第９項において準用する同法第１２６条第５項及び第６項の規定に適合するので、訂正後の請求項７について訂正することを認める。
第３　訂正後の本件発明
　本件訂正請求により訂正された請求項１〜７に係る発明（以下、「本件発明１〜７」という。）は、その特許請求の範囲の請求項１〜７に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
「【請求項１】複数の脂質ナノ粒子を含む組成物であって、前記複数の脂質ナノ粒子はポリヌクレオチドを封入しており、前記ポリヌクレオチドは、
　（ａ）１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、
　（ｂ）コザック配列を含む５’ＵＴＲと、
　（ｃ）少なくとも１つの５’キャップ構造と、
　（ｄ）３’ＵＴＲと、
　（ｅ）結合ヌクレオシドの３’尾部配列とを含み、
　哺乳類細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させる組成物。
【請求項２】前記複数の脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール、およびリン脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】前記カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、またはＤＬｅｎＤＭＡである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】前記複数の脂質ナノ粒子は、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの平均粒径、０．０２〜０．２の平均ＰＤＩ、および１０〜２０の平均脂質：ポリヌクレオチド比（重量／重量）を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】前記結合ヌクレオシドの３’尾部配列は、１６０個のヌクレオチドのポリＡ尾部およびポリＡ〜Ｇ四重項のうちから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】前記少なくとも１つの５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンのうちから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】末梢血単核細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、ウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、より低いレベルの検出可能なＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αをもたらす、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。」
第４　取消理由通知に記載した取消理由について
１　取消理由の概要
　訂正前の請求項１〜７に係る特許に対して、当審が令和　２年　５月１９日付けで通知した取消理由の概要は、次のとおりである。
（１）本件特許明細書には、１−メチルーシュードウリジンを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジンを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、発現を増加させる例がいくつか記載されているが、シュードウリジンを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、低下した発現を示す例や同程度の発現を示す例が記載されている。
　具体的には、本件特許明細書の表１０４、１０６、１０９、１２２、１２４、１２９、１３７〜１３９には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジン修飾のみを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、発現を増加させる例が記載されているが、表１０７には、１−メチルーシュードウリジン修飾とシュードウリジン修飾が同程度の発現の例が、表１１１、１１３には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジン修飾のみを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、得られる翻訳産物の収率が低いことが、表１８０には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジン修飾のみを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、産生されるタンパク質が大幅に低下したことが記載されている。
　そして、本件特許明細書には、請求項１に記載の特徴（ａ）〜（ｅ）を有するポリヌクレオチドであれば、シュードウリジンを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、必ず発現を増加させることができるとの理論的根拠も示されておらず、また、そのことが本件出願時の技術常識であったとは認められない。
　ゆえに、本件発明１のポリヌクレオチドには無限に近い数のポリヌクレオチドが含まれ、その中には、シュードウリジンを含む対応のポリヌクレオチドよりも発現が増加しないかむしろ低下するポリヌクレオチドが相当の割合で含まれるが、それらの中から所望の発現量増加をもたらすポリヌクレオチドを選択し、それを封入した脂質ナノ粒子を含む組成物を得るためには、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を必要とするものと認められるから、請求項１〜７に係る発明について、発明の詳細な説明が当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているとは認められない。
　また、上記のような本件特許明細書の記載、及び、出願時の技術常識を考慮すると、請求項に係る発明の範囲まで、発明の詳細な説明に開示された内容を拡張ないし一般化できるとはいえないから、請求項１〜７に係る発明は、発明の詳細な説明に記載されたものとはいえない。
　したがって、請求項１〜７に係る特許は、特許法第３６条第４項第１号及び第６項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
（２）本件特許明細書の実施例６９の表１０５には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドを用いた場合のＴＮＦ−αの発現を調べた例が記載されているが、１−メチルーシュードウリジンの代わりにウリジンを含むポリヌクレオチドを用いた場合の例が記載されていないので、本件特許明細書の記載からでは、「末梢血単核細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、ウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、より低いレベルの検出可能なＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αをもたらす」ことを確認できない。
　そして、本件特許明細書には、請求項１に記載の特徴（ａ）〜（ｅ）を有するポリヌクレオチドであれば、ウリジンを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、必ずより低いレベルの検出可能なＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αをもたらすことができるとの理論的根拠も示されておらず、また、そのことが本件出願時の技術常識であったとは認められないから、請求項７に係る発明について、発明の詳細な説明が当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているとは認められない。
　また、上記のような本件特許明細書の記載、及び、出願時の技術常識を考慮すると、請求項に係る発明の範囲まで、発明の詳細な説明に開示された内容を拡張ないし一般化できるとはいえないから、請求項７に係る発明は、発明の詳細な説明に記載されたものとはいえない。
　したがって、請求項７に係る特許は、特許法第３６条第４項第１号及び第６項第１号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである。
２　当審の判断
（１）取消理由（１）について
　本件特許明細書の表１０７には、１−メチルーシュードウリジン修飾とシュードウリジン修飾が同程度の発現の例が、表１１１、１１３には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジン修飾のみを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、得られる翻訳産物の収率が低いことが、表１８０には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジン修飾のみを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、産生されるタンパク質が大幅に低下したことが記載されており、また、特許異議申立人が提出した令和　２年１１月１８日付け意見書に添付された甲第４号証（国際公開第２０１２／０４５０７５号）には、１−メチルーシュードウリジン修飾がシュードウリジン修飾と比較してポリペプチドの発現を増加させない例（例３、図４Ｅ）が記載されている。
　しかしながら、本件特許明細書の表１０４、１０６、１０９、１２２、１２４、１２９、１３７〜１３９、１６３、１８３及び１８４には、１−メチルーシュードウリジン修飾のみを含むポリヌクレオチドが、シュードウリジン修飾のみを含む対応のポリヌクレオチドと比較して、発現を増加させる例が数多く記載されているから、本件発明の詳細な説明には、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが、哺乳類細胞に投与されると、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させることを当業者が容易に理解することができる程度に記載されているといえるので、本件発明１〜７は、発明の詳細な説明に記載されたものといえる。
　また、本件発明の詳細な説明には、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを製造する方法、該製造されたポリヌクレオチドについて、コードされたポリペプチドの発現量を調べる方法が具体的に記載されているから、当業者であれば、本件発明の詳細な説明の記載に従って、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを製造し、その中から、哺乳類細胞に投与されると、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させるポリヌクレオチドを取得することに、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められないから、本件発明１〜７について、発明の詳細な説明が当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
　したがって、本件発明の詳細な説明の記載は、取消理由（１）により特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできないし、また、本件特許請求の範囲の記載は、取消理由（１）により特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。
（２）取消理由（２）について
　本件特許明細書の実施例５７の表８０には、０％修飾のＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡ、すなわち修飾されていないウリジンを含むＧ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡを用いた場合の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＩＦＮ−αの発現を調べた実験結果が示されており、表８０に示された実験結果からすると、５−メチルシトシン（５ｍＣ）とシュードウリジンで完全に修飾した場合（１００％修飾）は、ＩＦＮ−α発現に関して、修飾されていないウリジンの場合（０％修飾）よりも発現量は低くなっているるものと認められる。
　一方、本件特許明細書の実施例６９の表１０５には、Ｇ−ＣＳＦ　ｍＲＮＡを１−メチル−シュードウリジンで完全に修飾した場合、５−メチルシトシン（５ｍＣ）とシュードウリジンで完全に修飾した場合の末梢血単核細胞内でのＩＦＮ−αの発現を調べた実験結果が示されており、表１０５に示された実験結果からすると、１−メチル−シュードウリジンのみで修飾した場合のＩＦＮ−α発現は、５−メチルシトシン（５ｍＣ）とシュードウリジンで修飾した場合のＩＦＮ−α発現よりも低くなっているから、表８０に示された実験結果を考慮すると、本件発明の詳細な説明には、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが、末梢血単核細胞に投与されると、ウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、より低いレベルの検出可能なＩＦＮ−αをもたらすことを当業者が容易に理解することができる程度に記載されているといえるので、本件発明７について、発明の詳細な説明が当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえ、また、本件発明７は、発明の詳細な説明に記載されたものといえる。
　なお、本件訂正請求により、訂正前の請求項７から「ＴＮＦ−α」は削除された。
　したがって、本件発明の詳細な説明の記載は、取消理由（２）により特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできないし、また、本件特許請求の範囲の記載は、取消理由（２）により特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。
第５　取消理由通知において採用しなかった特許異議申立理由について
１　特許異議申立理由の概要及び証拠方法
　特許異議申立人が、訂正前の請求項１〜７に係る特許に対して申し立てた特許異議申立理由の概要及び証拠方法は、次のとおりである。
（１）理由１：特許法第２９条第１項第３号
ア　甲第１号証に対する新規性欠如
　甲第１号証には、修飾されたｍＲＮＡを細胞に導入すること、修飾されたｍＲＮＡとして「シュードウリジン」修飾されたｍＲＮＡが記載されており（記載事項（甲１−１））、前記「シュードウリジン」が、１−メチルーシュードウリジンを指すこと（記載事項（甲１−７））、前記ＲＮＡが５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、コザック配列、キャップヌクレオチド、ポリＡ配列を含むことが記載されている（記載事項（甲１−３）、（甲１−６））。また、甲第１号証には、前記ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入されることが記載されている（記載事項（甲１−２）、（甲１−８）、（甲１−９））。
　そして、「哺乳類細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させる」という機能的特徴は、１−メチルーシュードウリジンの存在が本来的にもたらすものであるから、本件発明１〜２、５〜７は、甲第１号証に記載されたものであるから、本件特許発明１〜２、５〜７は、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものである。
イ　甲第２号証に対する新規性の欠如
　甲第２号証には、「シュードウリジン」を含むＲＮＡが記載されており（記載事項（甲２−１））、前記「シュードウリジン」が、１−メチルーシュードウリジンを指すこと（記載事項（甲２−５））、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、コザック配列、キャップヌクレオチド、ポリＡ配列を含むことが記載されている（記載事項（甲２−１０）、（甲２−３））。また、甲第２号証には、該ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入されることが記載されている（記載事項（甲２−１４）、（甲２−７）、（甲２−８）、（甲２−９）、（甲２−１１））。
　そして、「哺乳類細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させる」という機能的特徴は、１−メチルーシュードウリジンの存在が本来的にもたらすものであるから、本件発明１、７は、甲第２号証に記載されたものであるから、本件特許発明１、７は、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものである。
（２）理由２：特許法第２９条第２項
　ＲＮＡのような核酸を細胞内に導入する場合に、コードするポリペプチドの発現を高めることは当該技術分野における一般的な課題であるから、当業者は「Ｕ」ヌクレオチドを１−メチルーシュードウリジンに置換してｍＲＮＡを修飾することは、当業者が容易に想到し得ることである。
　また、甲第３号証には、哺乳動物細胞中にＲＮＡのような核酸を導入する手段として、陽イオン性脂質及び結合脂質を含む核酸粒子が記載されており（記載事項（甲３−１）、（甲３−６））、甲第１号証または甲第２号証に記載の組成物において、甲第３号証に記載されているような脂質ナノ粒子を複数用いることは、当業者が容易に想到し得ることである。
　したがって、本件発明１〜７は、甲第１号証または甲第２号証に記載された発明及び甲第３号証に記載された事項に基いて当業者が容易に想到し得たものであるから、本件発明１〜７は、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものである。
（３）理由３及び４：特許法第３６条第４項第１号及び特許法第３６条第６項第１号
ア　本件発明１のポリヌクレオチドは、そのオープンリーディングフレーム以外の領域は任意の種類の修飾もしくは非修飾ヌクレオチドから構成されることができるが、実際に技術的効果が本件発明１のこのような要件により達成されるかどうか、例えば上記領域が任意の数の５−メチルシトシンを含むことができるか等については、本件特許明細書からは不明であり、そのような修飾は発現における効果を変え得るから、上記領域において任意の修飾を有する膨大な数のポリヌクレオチドの中から、所望の発現量増加をもたらすポリヌクレオチドを選択し、それを封入した脂質ナノ粒子を含む組成物を得るためには、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を必要とする。
　したがって、本件発明の詳細な説明は、当業者が、本件発明１〜７の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載したものではなく、また、本件発明１〜７は、発明の詳細な説明に記載したものではない。
イ　本件発明１において、「哺乳類細胞」は具体的に特定されておらず、哺乳類細胞には数多くの種類の細胞が含まれるが、本件特許明細書の発明の詳細な説明には、一部の哺乳類細胞が記載されているだけで、いずれの哺乳類細胞であっても「コードされたポリペプチドの発現を増加させる」という特徴が達成されることは示されておらず、哺乳類細胞に核酸を導入した場合、コードされるタンパク質の発現が細胞の種類によって変動し得ることは、本願出願時の技術常識であるから、任意の哺乳類細胞に対して、所望の発現量増加をもたらすポリヌクレオチドを選択し、それを封入した脂質ナノ粒子を含む組成物を得るためには、当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤を必要とする。
　したがって、本件発明の詳細な説明は、当業者が、本件発明１〜７の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載したものではなく、また、本件発明１〜７は、発明の詳細な説明に記載したものではない。
（４）証拠方法
ア　甲第１号証：米国特許出願公開第２０１１／０１４３３９７号明細書
イ　甲第２号証：国際公開第２００７／０２４７０８号
ウ　甲第３号証：国際公開第２０１１／０００１０７号
２　甲号証の記載
　甲第１号証〜甲第３号証には、以下の事項が記載されている（英語で記載されているので、日本語訳で摘記する。）。
（１）甲第１号証：米国特許出願公開第２０１１／０１４３３９７号明細書
（甲１−１）「１．第一の分化した状態または表現型を呈するヒトまたは動物の細胞を、第二の分化した状態または表現型を呈する細胞へ再プログラム化するための方法であって、第一の分化した状態を呈する細胞に少なくとも１つの再プログラム化因子をコードする修飾されたｍＲＮＡ分子を含む精製されたＲＮＡ調製物を導入することと、該細胞が第二の分化した状態を呈する条件下で細胞を培養することとを含む、方法。
２．前記修飾されたｍＲＮＡ分子は、シュードウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを、その対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに含む、請求項１に記載の方法。」（請求項１〜２）
（甲１−２）「［００３４］しかしながら、本発明は、利用される形質移入方法の性質によって限定されない。実際、ｍＲＮＡ分子を細胞にインビトロまたはインビボで送達することのできる公知のまたは将来特定される任意の形質移入プロセスが熟慮され、これには、培養物中のまたは生命支持培地中の細胞が、単離された細胞または真核生物の組織もしくは臓器を含む細胞を含むのであろうと、該細胞に該ｍＲＮＡを送達する方法、あるいは、ヒト、動物、植物、または真菌などの生物体における細胞に該ｍＲＮＡをインビボで送達する方法が含まれる。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、脂質（例えば、リポソーム、ミセルなど）を含む。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、ナノ粒子またはナノチューブを含む。いくつかの実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性化合物（例えば、ポリエチレンイミン、またはＰＥＩ）を含む。いくつかの実施態様において、形質移入方法は、該ｍＲＮＡを細胞に（例えば、電気穿孔法によって）送達するために電流を用いる。いくつかの実施態様において、形質移入方法は、微粒子銃法を用いて、該ｍＲＮＡを細胞に送達する（例えば、「遺伝子銃」または「微粒子銃粒子送達システム」）。」（［００３４］）
（甲１−３）「［００３６］本発明は、用いられるｍＲＮＡの特定の化学的形態に限定されないが、ある形態のｍＲＮＡは、より効率的な結果を生じ得る。しかしながら、いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、（例えば、シュードウリジン（Ψ）、５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される）少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを、対応する修飾されていない通常のヌクレオシドの少なくとも一部の替わりに含む（いくつかの好ましい実施態様において、実質的にすべての対応する修飾されていないＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴの通常のヌクレオシドの替わりに少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド）。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されている。いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製され、該方法は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（例えば、酵母ＲＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を用いてＩＶＴ ＲＮＡを接触させることを含む。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化される。ＲＮＡがポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、またはＤＮＡテンプレートのＩＶＴの間にポリアデニル化されるかどうかにかかわらず、いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、ポリＡ末端（例えば、５０〜２００ヌクレオチド、例えば、好ましくは１００〜２００、１５０〜２００ヌクレオチド、または１５０ヌクレオチド超を有するポリＡ末端）を含むが、いくつかの実施態様において、より長いまたはより短いポリＡ末端が用いられる。いくつかの実施態様において、本方法において用いられるｍＲＮＡがキャッピングされる。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、本方法において用いられるｍＲＮＡ分子は、キャッピング酵素系の存在下で、キャッピングされていない一次ＲＮＡをインキュベートすることによって、インビトロで合成される。いくつかの好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、キャッピング酵素反応において用いられる一次ＲＮＡは、合成されるべきＲＮＡをコードするＤＮＡ分子のインビトロでの転写（ＩＶＴ）によって合成される。合成されるべきＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有し、これに、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、そこから転写を開始する。また、ｍＲＮＡ分子がしばしば、翻訳開始コドンの前および翻訳されていない翻訳終止コドンの後に配置される異なる配列の領域を有することは、当該技術分野において公知である。それぞれ、５プライム非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３プライム非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と呼ばれるこれらの領域は、ｍＲＮＡの安定性、ｍＲＮＡの局在、およびそれらの結合したｍＲＮＡの翻訳効率に影響を及ぼし得る。アルファグロビンおよびベータグロビンについてのものなど、ある５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性およびｍＲＮＡの発現を改良することが公知である。したがって、いくつかの好ましい実施態様において、再プログラム化因子（例えば、ｉＰＳＣ誘導因子）をコードするｍＲＮＡは、該細胞においてより大きなｍＲＮＡ安定性およびより高いｍＲＮＡ発現を結果として生じる５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ（例えば、アルファグロビンまたはベータグロブンの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ、例えば、アフリカツメガエルまたはヒトのアルファグロブリンまたはベータグロブリンの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ、あるいは、例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ）を呈する。」（［００３６］）
（甲１−４）「［０１０９］「キャップ」または「キャップヌクレオチド」は、好適な反応条件下でキャッピング酵素系によって基質として用いられ、かつそれにより一次ＲＮＡ転写産物をもしくは５’−二リン酸を有するＲＮＡを含むキャッピングされていないＲＮＡの５’−端に結合するヌクレオシド−５’−三リン酸を意味する。そのように該ＲＮＡに結合するヌクレオチドは、本明細書で「キャップヌクレオチド」とも呼ばれる。「キャップヌクレオチド」は、その５’端を通じて一次ＲＮＡ転写産物の５’端に結合するグアニンヌクレオチドである。その５’端に結合したキャップヌクレオチドを有するＲＮＡは、「キャッピングされたＲＮＡ」または「キャッピングされたＲＮＡ転写産物」または「キャッピングされた転写産物」と呼ばれる。共通のキャップヌクレオシドは、７−メチルグアノシンまたはＮ７−メチルグアノシン（時々、「標準キャップ」と呼ばれる）であり、「ｍ７Ｇ」として指定された構造を有し、この場合、キャッピングされたＲＮＡまたは「ｍ７ＧキャッピングされたＲＮＡ」は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）として、またはより単純にはｍ７ＧｐｐｐＮ１（ｐＮ）ｘもしくはｍ７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｎとして指定された構造を有し、この中で、ｍ７Ｇは、７−メチルグアノシンキャップヌクレオシドを表し、ｐｐｐはキャップヌクレオシドの５’炭素と一次ＲＮＡ転写産物の第一のヌクレオチドの間の三リン酸架橋を表し、Ｎ１（ｐＮ）ｘ−ＯＨ（３’）は、一次ＲＮＡ転写産物を表し、このうち、Ｎ１は、最も５’のヌクレオチドであり、「ｐ」はリン酸基を表し、「Ｇ」は、グアノシンヌクレオシドを表し、「ｍ７」は、グアニンの７位におけるメチル基を表し、および「［５’］」は、「ｐ」がキャップヌクレオチドのリボースとｍＲＮＡ転写産物の第一のヌクレオシド（「Ｎ」）に結合する位置を示す。この「標準的なキャップ」に加えて、種々の他の天然および合成のキャップ類似体が、当該技術分野において公知である。いかなるキャップヌクレオチドを有するＲＮＡも、「キャッピングされたＲＮＡ」と呼ばれる。キャッピングされたＲＮＡは、生物試料から自然に生じることができ、または５’三リン酸基を有するＲＮＡの、もしくは５’二リン酸基を有するＲＮＡの、キャッピング酵素系（例えば、ワクシニアキャッピング酵素系または出芽酵母キャッピング酵素系）を用いたインビトロでのキャッピングによって得られることができる。あるいは、キャッピングされたＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡテンプレートのインビトロでの転写（ＩＶＴ）によって得られることができ、この中で、ＧＴＰに加えて、ＩＶＴ反応は、当該技術分野において公知の方法を用いて（例えば、ＡＭＰＬＩＣＡＰ（商標）Ｔ７キャッピングキットまたはＭＥＳＳＡＧＥＭＡＸ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ−ＣＡＰＰＥＤ ＭＥＳＳＡＧＥ転写キット、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、またはＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔを用いて）、ジヌクレオチドキャップアナログ（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップアナログ、またはＮ７−メチル、２’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡキャップアナログ、またはＮ７−メチル、３’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡキャップアナログ）も含有する。」（［０１０９］）
（甲１−５）「［０１１６］「修飾されたヌクレオチドでキャッピングされたＲＮＡ」は、キャッピング酵素系と修飾されたキャップヌクレオチドとを用いて合成された、キャッピングされたＲＮＡ分子であり、この中で、その５’末端におけるキャップヌクレオチドは、修飾されたキャップヌクレオチドを、またはジヌクレオチドキャップアナログがキャップヌクレオチドにおける化学的修飾を含有する修飾されたジヌクレオチドキャップアナログを含有するインビトロでの転写反応において同時転写的に合成されるキャッピングされたＲＮＡを含む。いくつかの実施態様において、修飾されたジヌクレオチドキャップアナログは、反逆方向キャップアナログまたはＡＲＣＡである（Grudzien et al. 2004, Jemielity et al. 2003, Grudzien-Nogalska et al. 2007, Peng et al. 2002, Stepinski et al. 2001）。」（［０１１６］）
（甲１−６）「［０１２１］「ｉＰＳ細胞誘導因子」または「ｉＰＳＣ誘導因子」は、単独で、または他の再プログラム化因子との組み合わせで用いて、体細胞からのｉＰＳ細胞の作製を生じるタンパク質、ポリペプチド、または他の生体分子である。ｉＰＳ細胞誘導因子の例には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８が挙げられる。ｉＰＳ細胞誘導因子には、完全長のポリペプチド配列またはその生物学的に活性のある断片が含まれる。同様に、ｉＰＳ細胞誘導因子をコードするｍＲＮＡは、完全長のポリペプチドまたはその生物学的に活性のある断片をコードし得る。例示的なｉＰＳ誘導因子についての配列をコードするｍＲＮＡを図２５（ＫＬＦ４およびＬＩＮ２８）、図２６（ｃＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ）、および図２７（ＯＣＴ４およびＳＯＸ２）において示す。ある実施態様において、本発明は、これらの図に示される配列または類似の配列を採用し、これには、これらのｍＲＮＡ配列に結合した、５’および３’ＵＴＲ配列、コザック配列、ＩＲＥＳ配列、キャップヌクレオチド、ならびに／または本明細書で説明される実験において用いられるポリ（Ａ）配列のいずれかを呈するオリゴリボヌクレオチド、あるいは当該技術分野で一般的に公知でありかつ細胞における個々のｍＲＮＡ分子の翻訳を最適化して、本明細書に説明される方法を達成するために細胞における該分子の安定性を改良する目的のために、これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に結合することによって、本明細書で用いられる配列の替わりに用いられることのできるオリゴリボヌクレオチドを追加的に含むｍＲＮＡ分子が含まれる。」（［０１２１］）
（甲１−７）「［０１４０］「シュードウリジン」は、別の実施態様において、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ１Ψ（１−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、Ψｍ（２’−Ｏ−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ３Ψ（３−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、さらに修飾されていないシュードウリジン部分を指す。別の実施態様において、該用語は、先のシュードウリジンのいずれかの一リン酸、二リン酸、または三リン酸を指す。別の実施態様において、該用語は、当該技術分野で公知の任意の他のシュードウリジンを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［０１４０］）
（甲１−８）「［０１７７］別の実施態様において、本発明の方法はさらに、接触の工程の前に、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を形質移入試薬と混合することを含む。別の実施態様において、本発明の方法はさらに、形質移入試薬とともにＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を投与することを含む。別の実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性脂質試薬である（実施例６）。」（［０１７７］）
（甲１−９）「［０２００］別の実施態様において、本発明のＲＮＡ分子またはリボヌクレオチド分子は、ナノ粒子に封入される。ナノ粒子封入のための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Bose S, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol. 78:8146. 2004)、Dong Y et al. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005)、Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171. 1998)、Sakuma SR et al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999)、Virovic L et al. Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005)、およびZimmermann E et al., Electrolyte-and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001）において説明される。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［０２００］）
（甲１−１０）「実施例５　修飾されたヌクレオシド用いたＲＮＡ分子のインビトロでの合成：材料および実験方法
［０２８２］インビトロで転写されるＲＮＡ
［０２８３］インビトロでの転写アッセイ（ＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅキットおよびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキット； Ａｍｂｉｏｎ，）を用いて、以下の長いＲＮＡを、説明される通りＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）によって生じた（Kariko et al, 1998, Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320-334）（注記：テンプレートの名称は、カッコの中に示されており、ＲＮＡの名称中の数は長さを指定する）：ＲＮＡ−１８６６（Ｎｄｅ Ｉで線形化されたｐＴＥＶｌｕｃ）は、ホタルルシフェラーゼをコードし、５０ｎｔ長のポリＡ末端である。ＲＮＡ−１５７１（Ｓｓｐ Ｉで線形化されたｐＳＶｒｅｎ）は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする。ＲＮＡ−７３０（Ｈｉｎｄ ＩＩＩで線形化されたｐＴ７Ｔ３Ｄ−ＭＡＲＴ−ｌ）は、ヒトメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−Ｉをコードする。ＲＮＡ−７１３（ＥｃｏＲ Ｉで線形化されたｐＴＩＴ３Ｄ−ＭＡＲＴ−ｌ）は、ＭＡＲＴ−１のアンチセンス配列に相応し、ＲＮＡ４９７（Ｂｇｌ ＩＩで線形化されたｐＣＭＶ−ｈＴＬＲ３）は、ｈＴＬＲ３の部分的５’断片をコードする。ＲＮＡ分子の配列は、以下のとおりである：
ＲＮＡ−Ｉ８６６：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号１）
ggaauucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuuaaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccauggaagacgccaaaaacauaaagaaaggcccggcgccauucuauccucuagaggauggaaccgcuggagagcaacugcauaaggcuaugaagagauacgcccugguuccuggaacaauugcuuuuacagaugcacauaucgaggugaacaucacguacgcggaauacuucgaaauguccguucgguuggcagaagcuaugaaacgauaugggcugaauacaaaucacagaaucgucguaugcagugaaaacucucuucaauucuuuaugccgguguugggcgcguuauuuaucggaguugcaguugcgcccgcgaacgacauuuauaaugaacgugaauugcucaacaguaugaacauuucgcagccuaccguaguguuuguuuccaaaaagggguugcaaaaaauuuugaacgugcaaaaaaaauuaccaauaauccagaaaauuauuaucauggauucuaaaacggauuaccagggauuucagucgauguacacguucgucacaucucaucuaccucccgguuuuaaugaauacgauuuuguaccagaguccuuugaucgugacaaaacaauugcacugauaaugaauuccucuggaucuacuggguuaccuaaggguguggcccuuccgcauagaacugccugcgucagauucucgcaugccagagauccuauuuuuggcaaucaaaucauuccggauacugcgauuuuaaguguuguuccauuccaucacgguuuuggaauguuuacuacacucggauauuugauauguggauuucgagucgucuuaauguauagauuugaagaagagcuguuuuuacgaucccuucaggauuacaaaauucaaagugcguugcuaguaccaacccuauuuucauucuucgccaaaagcacucugauugacaaauacgauuuaucuaauuuacacgaaauugcuucugggggcgcaccucuuucgaaagaagucggggaagcgguugcaaaacgcuuccaucuuccagggauacgacaaggauaugggcucacugagacuacaucagcuauucugauuacacccgagggggaugauaaaccgggcgcggucgguaaaguuguuccauuuuuugaagcgaagguuguggaucuggauaccgggaaaacgcugggcguuaaucagagaggcgaauuaugugucagaggaccuaugauuauguccgguuauguaaacaauccggaagcgaccaacgccuugauugacaaggauggauggcuacauucuggagacauagcuuacugggacgaagacgaacacuucuucauaguugaccgcuugaagucuuuaauuaaauacaaaggauaucagguggcccccgcugaauuggaaucgauauuguuacaacaccccaacaucuucgacgcgggcguggcaggucuucccgacgaugacgccggugaacuucccgccgccguuguuguuuuggagcacggaaagacgaugacggaaaaagagaucguggauuacguggccagucaaguaacaaccgcgaaaaaguugcgcggaggaguuguguuuguggacgaaguaccgaaaggucuuaccggaaaacucgacgcaagaaaaaucagagagauccucauaaaggccaagaagggcggaaaguccaaauuguaaaauguaacucuagaggauccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaca。
ＲＮＡ−１５７１：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号２）
ggcuagccaccaugacuucgaaaguuuaugauccagaacaaaggaaacggaugauaacugguccgcaguggugggccagauguaaacaaaugaauguucuugauucauuuauuaauuauuaugauucagaaaaacaugcagaaaaugcuguuauuuuuuuacaugguaacgcggccucuucuuauuuauggcgacauguugugccacauauugagccaguagcgcgguguauuauaccagaccuuauugguaugggcaaaucaggcaaaucugguaaugguucuuauagguuacuugaucauuacaaauaucuuacugcaugguuugaacuucuuaauuuaccaaagaagaucauuuuugucggccaugauuggggugcuuguuuggcauuucauuauagcuaugagcaucaagauaagaucaaagcaauaguucacgcugaaaguguaguagaugugauugaaucaugggaugaauggccugauauugaagaagauauugcguugaucaaaucugaagaaggagaaaaaaugguuuuggagaauaacuucuucguggaaaccauguugccaucaaaaaucaugagaaaguuagaaccagaagaauuugcagcauaucuugaaccauucaaagagaaaggugaaguucgucguccaacauuaucauggccucgugaaaucccguuaguaaaaggugguaaaccugacguuguacaaauuguuaggaauuauaaugcuuaucuacgugcaagugaugauuuaccaaaaauguuuauugaaucggacccaggauucuuuuccaaugcuauuguugaaggugccaagaaguuuccuaauacugaauuugucaaaguaaaaggucuucauuuuucgcaagaagaugcaccugaugaaaugggaaaauauaucaaaucguucguugagcgaguucucaaaaaugaacaaaugucgacgggggccccuaggaauuuuuuagggaagaucuggccuuccuacaagggaaggccagggaauuuucuucagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcuucaggucugggguagagacaacaacucccccucagaagcaggagccgauagacaaggaacuguauccuuuaacuucccucagaucacucuuuggcaacgaccccucgucacaauaaagauaggggggcaacuaaagggaucggccgcuucgagcagacaugauaagauacauugaugaguuuggacaaaccacaacuagaaugcagugaaaaaaaugcuuuauuugugaaauuugugaugcuauugcuuuauuuguaaccauuauaagcugcaauaaacaaguuaacaacaacaauugcauucauuuuauguuucagguucagggggaggugugggagguuuuuuaaagcaaguaaaaccucuacaaaugugguaaaaucgauaaguuuaaacagauccagguggcacuuuucggggaaaugugcgcggaaccccuauuuguuuauuuuucuaaauacauucaaauauguauccgcucaugagacaauaacccugauaaaugcuucaauaau。
ＲＮＡ−７３０：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号３）
Gggaauuuggcccucgaggccaagaauucggcacgaggcacgcggccagccagcagacagaggacucucauuaaggaagguguccugugcccugacccuacaagaugccaagagaagaugcucacuucaucuaugguuaccccaagaaggggcacggccacucuuacaccacggcugaagaggccgcugggaucggcauccugacagugauccugggagucuuacugcucaucggcuguugguauuguagaagacgaaauggauacagagccuugauggauaaaagucuucauguuggcacucaaugugccuuaacaagaagaugcccacaagaaggguuugaucaucgggacagcaaagugucucuucaagagaaaaacugugaaccugugguucccaaugcuccaccugcuuaugagaaacucucugcagaacagucaccaccaccuuauucaccuuaagagccagcgagacaccugagacaugcugaaauuauuucucucacacuuuugcuugaauuuaauacagacaucuaauguucuccuuuggaaugguguaggaaaaaugcaagccaucucuaauaauaagucaguguuaaaauuuuaguagguccgcuagcaguacuaaucaugugaggaaaugaugagaaauauuaaauugggaaaacuccaucaauaaauguugcaaugcaugauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacugcggccgca。
ＲＮＡ−７１３：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号４）
Gggaauaagcuugcggccgcaguuuuuuuuuuuuuuuuuuuuaucaugcauugcaacauuuauugauggaguuuucccaauuuaauauuucucaucauuuccucacaugauuaguacugcuagcggaccuacuaaaauuuuaacacugacuuauuauuagagauggcuugcauuuuuccuacaccauuccaaaggagaacauuagaugucuguauaaauucaagcaaaagugugagagaaauaauuucagcaugucucaggugucucgcuggcucuuaaggugaauaaggugguggugacuguucugcagagaguuucucauaagcagguggagcauugggaaccacagguucacaguuuuucucuugaagagacacuuugcugucccgaugaucaaacccuucuugugggcaucuucuuguuaaggcacauugagugccaacaugaagacuuuuauccaucaaggcucuguauccauuucgucuucuacaauaccaacagccgaugagcaguaagacucccaggaucacugucaggaugccgaucccagcggccucuucagccgugguguaagaguggccgugccccuucuugggguaaccauagaugaagugagcaucuucucuuggcaucuuguagggucagggcacaggacaccuuccuuaaugagaguccucugucugcuggcuggccgcgugccucgugccgaauu。
ＲＮＡ−４９７：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（配列番号５）
Gggagacccaagcuggcuagcagucauccaacagaaucaugagacagacuuugccuuguaucuacuuuugggggggccuuuugcccuuugggaugcugugugcauccuccaccaccaagugcacuguuagccaugaaguugcugacugcagccaccugaaguugacucagguacccgaugaucuacccacaaacauaacaguguugaaccuuacccauaaucaacucagaagauuaccagccgccaacuucacaagguauagccagcuaacuagcuuggauguaggauuuaacaccaucucaaaacuggagccagaauugugccagaaacuucccauguuaaaaguuuugaaccuccagcacaaugagcuaucucaacuuucugauaaaaccuuugccuucugcacgaauuugacugaacuccaucucauguccaacucaauccagaaaauuaaaaauaaucccuuugucaagcagaagaauuuaaucacauua。
［０２８４］修飾されたＲＮＡを得るために、転写反応を、塩基性ＮＴＰのうちの１（または２）と、修飾されたヌクレオチド５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２−チオウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、またはシュードウリジンの対応する三リン酸誘導体（複数可）との置き換えで組み立てた（ＴｒｉＬｉｎｋ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。各転写反応において、４のヌクレオチドすべてまたはそれらの誘導体は、７．５ミリモル濃度（ｍＭ）の濃度で存在した。選択された実験において、示されるように、６ｍＭのｍ７ＧｐｐｐＧキャップアナログ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）もキャッピングされたＲＮＡを得るために含まれた。ＯＲＮ５およびＯＲＮ６を、ＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチドテンプレートおよびＴ７ ＲＮＡＰ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キット， Ａｍｂｉｏｎ）を用いて生じた。
結果
［０２８５］免疫原性に及ぼすヌクレオシド修飾の効果をさらに試験するために、インビトロでの系を、シュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを用いたＲＮＡ分子を製造するために開発した。４つのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）のうちの１つまたは２つを、対応するヌクレオシド修飾されたＮＴＰと置換するインビトロでの転写反応を実施した。長さ０．７〜１．９ｋｂに及びかつ修飾されたヌクレオシドのうちの０、１つ、または２つの種類のいずれかを含有する異なる一次配列を有するいくつかのＲＮＡセットを転写した。修飾されたＲＮＡは、変性ゲル電気泳動法における該ＲＮＡの移動度に関して該ＲＮＡの修飾されていない対応物とは区別できず、該ＲＮＡが、無傷であり、それ以外は修飾されていないことを示した（図７のＡ）。この手順は、Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３ファージポリメラーゼのうちのいずれかと効率よく作用し、それゆえ、広範な種々のＲＮＡポリメラーゼに汎化可能である。
［０２８６］これらの発見は、修飾されたヌクレオシドを用いたＲＮＡ分子の製造のための新規のインビトロでの系を提供する。」（［０２８２］〜［０２８６］、実施例５）
（甲１−１１）「実施例３４　ＲＮＡ免疫原性および翻訳効率に及ぼす追加的なヌクレオシド修飾の効果の試験
［０３７８］追加のヌクレオシド修飾を、実施例５および１０において先に説明された方法を用いて、インビトロで転写されるＲＮＡへと導入し、免疫原性翻訳効率に及ぼすその効果を、実施例４〜１１および１２〜１８においてそれぞれ説明される通り試験する。ある追加的な修飾は、免疫原性を低下させ、翻訳を亢進することが見いだされている。これらの修飾は、本発明の方法および組成物の追加的な実施態様である。
［０３７９］試験される修飾には、例えば、ｍ１Ａ、ｍ２Ａ、Ａｍ、ｍｓ２ｍ６Ａ、ｉ６Ａ、ｍｓ２ｉ６Ａ、ｉｏ６Ａ、ｍｓ２ｉ０６Ａ、ｇ６Ａ、ｔ６Ａ、ｍｓ２ｔ６Ａ、ｍ６ｔ６Ａ、ｈｎ６Ａ、ｍｓ２ｈｎ６Ａ、Ａｒ（ｐ）、Ｉ、ｍ１Ｉ、ｍ１Ｉｍ、ｍ３Ｃ、Ｃｍ、Ｓ２Ｃ、ａｃ４Ｃ、ｆ５ｃ、ｍ５Ｃｍ、ａｃ４Ｃｍ、ｋ２ｃ、ｍ１Ｇ、ｍ２Ｇ、ｍ７Ｇ、Ｇｍ、ｍ２２Ｇ、ｍ２Ｇｍ、ｍ２２Ｇｍ、Ｇｒ（ｐ）、ｙＷ、ｏ２ｙＷ、ＯＨｙＷ、ＯＨｙＷ＊、ｉｍＧ、ｍｉｍＧ、Ｑ、ｏＱ、ｇａｌＱ、ｍａｎＱ、ｐｒｅＱ０、ｐｒｅＱ１、Ｇ＋、Ｄ、ｍ５Ｕｍ’、ｍ１Ψ、Ψｍ、Ｓ４Ｕ、・ｍ５ｓ２Ｕ’、Ｓ２Ｕｍ、’ａｃｐ３Ｕ・、ｈｏ５ｕ．、ｍｏ５Ｕ・、ｃｍｏ５Ｕ・、ｍｃｍｏ５Ｕ、ｃｈｍ５Ｕ、ｍｃｈｍ５Ｕ・、ｍｃｍ５Ｕ、ｍｃｍ５Ｕｍ、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ、ｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍｎｍ５Ｕ、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ、ｎｃｍ５Ｕ、ｎｃｍ５Ｕｍ、ｃｍｎｍ５Ｕ、ｃｍｎｍ５Ｕｍ、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍ６２Ａ、Ｉｍ、ｍ４Ｃ、ｍ４Ｃｍ、ｈｍ５Ｃ、ｍ３Ｕ、ｍ１ａｃｐ３Ψ、ｃｍ５Ｕ、ｍ６Ａｍ、ｍ６２Ａｍ、ｍ２，７Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ、ｍ３Ｕｍ、ｍ５Ｄ、ｍ３Ψ、ｆ５Ｃｍ、ｍ１Ｇｍ、ｍ１Ａｍ、τｍ５Ｕ、τｍ５ｓ２Ｕ、ｉｍＧ−１４、ｉｍＧ２、およびａｃ６Ａが含まれる。」（［０３７８］〜［０３７９］、実施例３４）
（２）甲第２号証：国際公開第２００７／０２４７０８号
（甲２−１）「［００１］本発明は、シュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含む、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子、それらを含む遺伝子療法ベクター、それらの合成方法、ならびに遺伝子置換、遺伝子療法、遺伝子転写サイレンシング、および治療用タンパク質の該分子を含む組織へのインビボでの送達のための方法も提供する。本発明は、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、およびポリリボヌクレオチド分子の免疫原性を低下させる方法も提供する。」（［００１］）
（甲２−２）「［００７］別の実施態様において、本発明は、シュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで転写されるＲＮＡ分子を提供する。別の実施態様において、本発明は、シュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを含むインビトロで合成されたオリゴリボヌクレオチドを提供し、この中で、修飾されたヌクレオシドは、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕである。」（［００７］）
（甲２−３）「［００５１］別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、ポリ−Ａ末端を含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、ポリーＡ末端を含まない。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［００５１］）
（甲２−４）「［００５２］別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子はさらに、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップを含む。別の実施態様において、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子は、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップを含まない。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［００５２］）
（甲２−５）「［００５６］「シュードウリジン」は、別の実施態様において、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ１Ψ（１−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、Ψｍ（２’−Ｏ−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、ｍ３Ψ（３−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施態様において、該用語は、さらに修飾されていないシュードウリジン部分を指す。別の実施態様において、該用語は、先のシュードウリジンのいずれかの一リン酸、二リン酸、または三リン酸を指す。別の実施態様において、該用語は、当該技術分野で公知の任意の他のシュードウリジンを指す。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［００５６］）
（甲２−６）「［００７０］他の実施態様において、修飾されたヌクレオシドは、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２メチルアデノシン）、Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）、ｍｓｚｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）、ｍ１Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）、Ｃｍ（２’−Ｏ−メチルシチジン）、Ｓ２Ｃ（２チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５−ホルミルシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）、Ｑ（ケウオシン）、ｏＱ（エポキシケウオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル−ケウオシン）、ｍａｎＱ（マンノシルケウオシン）、ｐｒｅＱ０（７−シアノ−７−デアザグアノシン）、ｐｒｅＱ１（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）、Ｇ＋（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）、Ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５メチルアミノメチル−２−チオウリジン）、ｍｎｍｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−−メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）、Ｉｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’−Ｏジメチルアデノシン）、ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン）、ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）、ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）、ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）、ｍ１Ａｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン）、τｍ５Ｕ（５−タウリノメチルウリジン）、τｍ５ｓ２Ｕ（５−タウリノメチル−２−チオウリジン）、ｉｍＧ−１４（４−デメチルワイオシン）、ｉｍＧ２（イソワイオシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）である。各可能性は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［００７０］）
（甲２−７）「［００８４］本明細書に提供されるいくつかの発現研究において、翻訳を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）と複合体形成したＲＮＡから測定し、マウスの尾静脈に注射した。脾臓溶解産物において、シュードウリジン修飾したＲＮＡは、修飾されていないＲＮＡよりも優位に効率的に翻訳された（図１２Ｂ）。本明細書で利用される条件下で、本発明の形質移入ベースの方法の効率は、形質移入試薬が組織に浸透する能力と相関しており、該効果が脾細胞においてなぜ最も顕著であったかについての説明を提供する。脾臓血流は開放系であり、血液含有量は、リンパ球系細胞を含む赤脾髄要素および白脾髄要素と直接接触する。」（［００８４］）
（甲２−８）「［００９４］別の実施態様において、本発明の方法はさらに、接触の工程の前に、ＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を形質移入試薬と混合することを含む。別の実施態様において、本発明の方法はさらに、形質移入試薬とともにＲＮＡ分子、オリゴリボヌクレオチド分子、またはポリリボヌクレオチド分子を投与することを含む。別の実施態様において、形質移入試薬は、陽イオン性脂質試薬である（実施例３）。」（［００９４］）
（甲２−９）「［００１１８］別の実施態様において、本発明のＲＮＡ分子またはリボヌクレオチド分子は、ナノ粒子に封入される。ナノ粒子封入のための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Bose S, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol. 78:8146. 2004)、Dong Y et al. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005)、Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171. 1998)、Sakuma SR et al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999)、Virovic L et al. Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005)、およびZimmermann E et al., Electrolyte-and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001）において説明される。各方法は、本発明の個別の実施態様を表す。」（［００１１８］）
（甲２−１０）「実施例２：修飾されたヌクレオシド用いたＲＮＡ分子のインビトロでの合成：材料および実験方法
インビトロで転写されるＲＮＡ
［００１８７］インビトロでの転写アッセイ（ＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅキットおよびＭｅｇａＳｃｒｉｐｔキット； Ａｍｂｉｏｎ，）を用いて、以下の長いＲＮＡを、説明される通りＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）によって生じた（Kariko et al, 1998, Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320-334）（注記：テンプレートの名称は、カッコの中に示されており、ＲＮＡの名称中の数は長さを指定する）：ＲＮＡ−１８６６（Ｎｄｅ Ｉで線形化されたｐＴＥＶｌｕｃ）は、ホタルルシフェラーゼをコードし、５０ｎｔ長のポリＡ末端である。ＲＮＡ−１５７１（Ｓｓｐ Ｉで線形化されたｐＳＶｒｅｎ）は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする。ＲＮＡ−７３０（Ｈｉｎｄ ＩＩＩで線形化されたｐＴ７Ｔ３Ｄ−ＭＡＲＴ−ｌ）は、ヒトメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−Ｉをコードする。ＲＮＡ−７１３（ＥｃｏＲ Ｉで線形化されたｐＴＩＴ３Ｄ−ＭＡＲＴ−ｌ）は、ＭＡＲＴ−１のアンチセンス配列に相応し、ＲＮＡ４９７（Ｂｇｌ ＩＩで線形化されたｐＣＭＶ−ｈＴＬＲ３）は、ｈＴＬＲ３の部分的５’断片をコードする。ＲＮＡ分子の配列は、以下のとおりである：
［００１８８］ＲＮＡ−Ｉ８６６：
ggaauucucaacacaacauauacaaaacaaacgaaucucaagcaaucaagcauucuacuucuauugcagcaauuuaaaucauuucuuuuaaagcaaaagcaauuuucugaaaauuuucaccauuuacgaacgauagccauggaagacgccaaaaacauaaagaaaggcccggcgccauucuauccucuagaggauggaaccgcuggagagcaacugcauaaggcuaugaagagauacgcccugguuccuggaacaauugcuuuuacagaugcacauaucgaggugaacaucacguacgcggaauacuucgaaauguccguucgguuggcagaagcuaugaaacgauaugggcugaauacaaaucacagaaucgucguaugcagugaaaacucucuucaauucuuuaugccgguguugggcgcguuauuuaucggaguugcaguugcgcccgcgaacgacauuuauaaugaacgugaauugcucaacaguaugaacauuucgcagccuaccguaguguuuguuuccaaaaagggguugcaaaaaauuuugaacgugcaaaaaaaauuaccaauaauccagaaaauuauuaucauggauucuaaaacggauuaccagggauuucagucgauguacacguucgucacaucucaucuaccucccgguuuuaaugaauacgauuuuguaccagaguccuuugaucgugacaaaacaauugcacugauaaugaauuccucuggaucuacuggguuaccuaaggguguggcccuuccgcauagaacugccugcgucagauucucgcaugccagagauccuauuuuuggcaaucaaaucauuccggauacugcgauuuuaaguguuguuccauuccaucacgguuuuggaauguuuacuacacucggauauuugauauguggauuucgagucgucuuaauguauagauuugaagaagagcuguuuuuacgaucccuucaggauuacaaaauucaaagugcguugcuaguaccaacccuauuuucauucuucgccaaaagcacucugauugacaaauacgauuuaucuaauuuacacgaaauugcuucugggggcgcaccucuuucgaaagaagucggggaagcgguugcaaaacgcuuccaucuuccagggauacgacaaggauaugggcucacugagacuacaucagcuauucugauuacacccgagggggaugauaaaccgggcgcggucgguaaaguuguuccauuuuuugaagcgaagguuguggaucuggauaccgggaaaacgcugggcguuaaucagagaggcgaauuaugugucagaggaccuaugauuauguccgguuauguaaacaauccggaagcgaccaacgccuugauugacaaggauggauggcuacauucuggagacauagcuuacugggacgaagacgaacacuucuucauaguugaccgcuugaagucuuuaauuaaauacaaaggauaucagguggcccccgcugaauuggaaucgauauuguuacaacaccccaacaucuucgacgcgggcguggcaggucuucccgacgaugacgccggugaacuucccgccgccguuguuguuuuggagcacggaaagacgaugacggaaaaagagaucguggauuacguggccagucaaguaacaaccgcgaaaaaguugcgcggaggaguuguguuuguggacgaaguaccgaaaggucuuaccggaaaacucgacgcaagaaaaaucagagagauccucauaaaggccaagaagggcggaaaguccaaauuguaaaauguaacucuagaggauccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaca（配列番号１）。
［００１８９］ＲＮＡ−１５７１：
ggcuagccaccaugacuucgaaaguuuaugauccagaacaaaggaaacggaugauaacugguccgcaguggugggccagauguaaacaaaugaauguucuugauucauuuauuaauuauuaugauucagaaaaacaugcagaaaaugcuguuauuuuuuuacaugguaacgcggccucuucuuauuuauggcgacauguugugccacauauugagccaguagcgcgguguauuauaccagaccuuauugguaugggcaaaucaggcaaaucugguaaugguucuuauagguuacuugaucauuacaaauaucuuacugcaugguuugaacuucuuaauuuaccaaagaagaucauuuuugucggccaugauuggggugcuuguuuggcauuucauuauagcuaugagcaucaagauaagaucaaagcaauaguucacgcugaaaguguaguagaugugauugaaucaugggaugaauggccugauauugaagaagauauugcguugaucaaaucugaagaaggagaaaaaaugguuuuggagaauaacuucuucguggaaaccauguugccaucaaaaaucaugagaaaguuagaaccagaagaauuugcagcauaucuugaaccauucaaagagaaaggugaaguucgucguccaacauuaucauggccucgugaaaucccguuaguaaaaggugguaaaccugacguuguacaaauuguuaggaauuauaaugcuuaucuacgugcaagugaugauuuaccaaaaauguuuauugaaucggacccaggauucuuuuccaaugcuauuguugaaggugccaagaaguuuccuaauacugaauuugucaaaguaaaaggucuucauuuuucgcaagaagaugcaccugaugaaaugggaaaauauaucaaaucguucguugagcgaguucucaaaaaugaacaaaugucgacgggggccccuaggaauuuuuuagggaagaucuggccuuccuacaagggaaggccagggaauuuucuucagagcagaccagagccaacagccccaccagaagagagcuucaggucugggguagagacaacaacucccccucagaagcaggagccgauagacaaggaacuguauccuuuaacuucccucagaucacucuuuggcaacgaccccucgucacaauaaagauaggggggcaacuaaagggaucggccgcuucgagcagacaugauaagauacauugaugaguuuggacaaaccacaacuagaaugcagugaaaaaaaugcuuuauuugugaaauuugugaugcuauugcuuuauuuguaaccauuauaagcugcaauaaacaaguuaacaacaacaauugcauucauuuuauguuucagguucagggggaggugugggagguuuuuuaaagcaaguaaaaccucuacaaaugugguaaaaucgauaaguuuaaacagauccagguggcacuuuucggggaaaugugcgcggaaccccuauuuguuuauuuuucuaaauacauucaaauauguauccgcucaugagacaauaacccugauaaaugcuucaauaau（配列番号２）。
［００１９０］ＲＮＡ−７３０：
Gggaauuuggcccucgaggccaagaauucggcacgaggcacgcggccagccagcagacagaggacucucauuaaggaagguguccugugcccugacccuacaagaugccaagagaagaugcucacuucaucuaugguuaccccaagaaggggcacggccacucuuacaccacggcugaagaggccgcugggaucggcauccugacagugauccugggagucuuacugcucaucggcuguugguauuguagaagacgaaauggauacagagccuugauggauaaaagucuucauguuggcacucaaugugccuuaacaagaagaugcccacaagaaggguuugaucaucgggacagcaaagugucucuucaagagaaaaacugugaaccugugguucccaaugcuccaccugcuuaugagaaacucucugcagaacagucaccaccaccuuauucaccuuaagagccagcgagacaccugagacaugcugaaauuauuucucucacacuuuugcuugaauuuaauacagacaucuaauguucuccuuuggaaugguguaggaaaaaugcaagccaucucuaauaauaagucaguguuaaaauuuuaguagguccgcuagcaguacuaaucaugugaggaaaugaugagaaauauuaaauugggaaaacuccaucaauaaauguugcaaugcaugauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacugcggccgca（配列番号３）。
［００１９１］ＲＮＡ−７１３
Gggaauaagcuugcggccgcaguuuuuuuuuuuuuuuuuuuuaucaugcauugcaacauuuauugauggaguuuucccaauuuaauauuucucaucauuuccucacaugauuaguacugcuagcggaccuacuaaaauuuuaacacugacuuauuauuagagauggcuugcauuuuuccuacaccauuccaaaggagaacauuagaugucuguauaaauucaagcaaaagugugagagaaauaauuucagcaugucucaggugucucgcuggcucuuaaggugaauaaggugguggugacuguucugcagagaguuucucauaagcagguggagcauugggaaccacagguucacaguuuuucucuugaagagacacuuugcugucccgaugaucaaacccuucuugugggcaucuucuuguuaaggcacauugagugccaacaugaagacuuuuauccaucaaggcucuguauccauuucgucuucuacaauaccaacagccgaugagcaguaagacucccaggaucacugucaggaugccgaucccagcggccucuucagccgugguguaagaguggccgugccccuucuugggguaaccauagaugaagugagcaucuucucuuggcaucuuguagggucagggcacaggacaccuuccuuaaugagaguccucugucugcuggcuggccgcgugccucgugccgaauu（配列番号４）。
［００１９２］ＲＮＡ−４９７：
Gggagacccaagcuggcuagcagucauccaacagaaucaugagacagacuuugccuuguaucuacuuuugggggggccuuuugcccuuugggaugcugugugcauccuccaccaccaagugcacuguuagccaugaaguugcugacugcagccaccugaaguugacucagguacccgaugaucuacccacaaacauaacaguguugaaccuuacccauaaucaacucagaagauuaccagccgccaacuucacaagguauagccagcuaacuagcuuggauguaggauuuaacaccaucucaaaacuggagccagaauugugccagaaacuucccauguuaaaaguuuugaaccuccagcacaaugagcuaucucaacuuucugauaaaaccuuugccuucugcacgaauuugacugaacuccaucucauguccaacucaauccagaaaauuaaaaauaaucccuuugucaagcagaagaauuuaaucacauua（配列番号５）。
［００１９３］修飾されたＲＮＡを得るために、転写反応を、塩基性ＮＴＰのうちの１（または２）と、修飾されたヌクレオチド５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、２−チオウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、またはシュードウリジンの対応する三リン酸誘導体（複数可）との置き換えで組み立てた（ＴｒｉＬｉｎｋ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。各転写反応において、４のヌクレオチドすべてまたはそれらの誘導体は、７．５ミリモル濃度（ｍＭ）の濃度で存在した。選択された実験において、示されるように、６ｍＭのｍ７ＧｐｐｐＧキャップアナログ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）もキャッピングされたＲＮＡを得るために含まれた。ＯＲＮ５およびＯＲＮ６を、ＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチドテンプレートおよびＴ７ ＲＮＡＰ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キット， Ａｍｂｉｏｎ）を用いて生じた。
結果
［００１９４］免疫原性に及ぼすヌクレオシド修飾の効果をさらに試験するために、インビトロでの系を、シュードウリジンまたは修飾されたヌクレオシドを用いたＲＮＡ分子を製造するために開発した。４つのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）のうちの１つまたは２つを、対応するヌクレオシド修飾されたＮＴＰと置換するインビトロでの転写反応を実施した。長さ０．７〜１．９ｋｂに及びかつ修飾されたヌクレオシドのうちの０、１つ、または２つの種類のいずれかを含有する異なる一次配列を有するいくつかのＲＮＡセットを転写した。修飾されたＲＮＡは、変性ゲル電気泳動法における該ＲＮＡの移動度に関して該ＲＮＡの修飾されていない対応物とは区別できず、該ＲＮＡが、無傷であり、それ以外は修飾されていないことを示した（図２のＡ）。この手順は、Ｔ７、ＳＰ６、およびＴ３ファージポリメラーゼのうちのいずれかと効率よく作用し、それゆえ、広範な種々のＲＮＡポリメラーゼに汎化可能である。
［００１９５］これらの発見は、修飾されたヌクレオシドを用いたＲＮＡ分子の製造のための新規のインビトロでの系を提供する。」（［００１８７］〜［００１９５］、実施例２）
（甲２−１１）「実施例２１：ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡ送達方法のさらなる改良
ナノ粒子複合体形成
［００２６９］ポリマーおよびΨｍＲＮＡ溶液を混合して、複合体を形成する。種々の製剤条件を試験し最適化する：（１）２２ｎｍ未満のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）／ｍＲＮＡ複合体を、２５容積のｍＲＮＡを水中の１容積のＰＥＩに、１５分間混合せずに添加することによって作製する。（２）１２×１５０ｎｍの平均寸法を有する桿状ポリ−Ｌ−リシン−ポリエチレングリコール（ＰＬＬ−ＰＥＧ）を、９容積のｍＲＮＡを、酢酸対イオン緩衝液における１容積のＣＫ３０−ＰＥＧ１０ｋにボルテックスをかけながらの緩徐な添加によって合成する。（３）生分解性遺伝子担体ポリマーの合成のために、無水ポリアスパラギン酸コエチレングリコール（ＰＡＥ）を、無水Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）無水Ｌ−アスパラギン酸およびエチレングリコールの開環重縮合によって合成する。次に、アスパラギン酸の枝分かれしたアミンを脱保護し、塩化水素による酸性化によってプロトン化し、ｍＲＮＡと縮合する。（４）ナノ粒子の最後の発生のために、酢酸アンモニウムとしての一定分量のストックのＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ（１．２５ｍＬ；６．４ｍｇ／ｍＬ）をシリコン処理したエッペンドルフチューブに加える。次に、ｍＲＮＡをＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ（１１．２５ｍＬの無ＲＮａｓｅＨ２Ｏにおける２．５ｍｇ）に１〜２分間かけて緩徐に添加する。１５分後、無ＲＮａｓｅＨ２Ｏにおいて１：２に希釈する。
気管内送達
［００２７０］マウスを麻酔チャンバーにおける３％ハロタン（７０％Ｎ２Ｏ＋３０％Ｏ２）で麻酔し、鼻用円錐体を用いて操作の間、１％ハロタン（７０％Ｎ２Ｏ＋３０％Ｏ２）で維持する。気管を露出させ、５０μＬのｍＲＮＡ複合体を１５０μの気体とともに肺へと気管を通じて、２７Ｇ１／２’’針を有する２５０μＬのハミルトン注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）を用いて注入する。
結果
［００２７１］気管内（ｉ．ｔ．）経路を介して投与されるΨｍＲＮＡの送達および発現の効率性を改良するために、ΨｍＲＮＡをナノ粒子に封入する。ナノ粒子包装は、ポリ−Ｌ−リシンおよびポリエチレングリコールを含む化学物質を用いて、（例えば）ＤＮＡを濃縮し、核膜孔よりも小さな粒子へと該ＤＮＡを封入することを包含する。ＲＮＡを４の異なるナノ粒子製剤（ＰＥＩ、ＰＬＬ、ＰＡＥ、およびＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）へと包装し、ΨｍＲＮＡ送達の効率性を、ルシフェラーゼをコードするΨｍＲＮＡと比較し、（Ｌｕｃ−ΨｍＲＮＡ）と比較する。送達動態および用量反応を次に、ＥＰＯ−ΨｍＲＮＡを用いて特徴づける。」（［００２６９］〜［００２７１］、実施例２１）
（甲２−１２）「実施例３１：ＲＮＡ免疫原性および翻訳効率に及ぼす追加的なヌクレオシド修飾の効果の試験
［００２９０］追加のヌクレオシド修飾を、実施例２および１７おいて先に説明された方法を用いて、インビトロで転写されるＲＮＡへと導入し、免疫原性翻訳効率に及ぼすその効果を、実施例１〜８および９〜１５においてそれぞれ説明される通り試験する。ある追加的な修飾は、免疫原性を低下させ、翻訳を亢進することが見いだされている。これらの修飾は、本発明の方法および組成物の追加的な実施態様である。
［００２９１］試験される修飾には、例えば、ｍ１Ａ、ｍ２Ａ、Ａｍ、ｍｓ２ｍ６Ａ、ｉ６Ａ、ｍｓ２ｉ６Ａ、ｉｏ６Ａ、ｍｓ２ｉ０６Ａ、ｇ６Ａ、ｔ６Ａ、ｍｓ２ｔ６Ａ、ｍ６ｔ６Ａ、ｈｎ６Ａ、ｍｓ２ｈｎ６Ａ、Ａｒ（ｐ）、Ｉ、ｍ１Ｉ、ｍ１Ｉｍ、ｍ３Ｃ、Ｃｍ、Ｓ２Ｃ、ａｃ４Ｃ、ｆ５ｃ、ｍ５Ｃｍ、ａｃ４Ｃｍ、ｋ２ｃ、ｍ１Ｇ、ｍ２Ｇ、ｍ７Ｇ、Ｇｍ、ｍ２２Ｇ、ｍ２Ｇｍ、ｍ２２Ｇｍ、Ｇｒ（ｐ）、ｙＷ、ｏ２ｙＷ、ＯＨｙＷ、ＯＨｙＷ＊、ｉｍＧ、ｍｉｍＧ、Ｑ、ｏＱ、ｇａｌＱ、ｍａｎＱ、ｐｒｅＱ０、ｐｒｅＱ１、Ｇ＋、Ｄ、ｍ５Ｕｍ’、ｍ１Ψ、Ψｍ、Ｓ４Ｕ、・ｍ５ｓ２Ｕ’、Ｓ２Ｕｍ、’ａｃｐ３Ｕ・、ｈｏ５ｕ．、ｍｏ５Ｕ・、ｃｍｏ５Ｕ・、ｍｃｍｏ５Ｕ、ｃｈｍ５Ｕ、ｍｃｈｍ５Ｕ・、ｍｃｍ５Ｕ、ｍｃｍ５Ｕｍ、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ、ｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍｎｍ５Ｕ、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ、ｎｃｍ５Ｕ、ｎｃｍ５Ｕｍ、ｃｍｎｍ５Ｕ、ｃｍｎｍ５Ｕｍ、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ、ｍ６２Ａ、Ｉｍ、ｍ４Ｃ、ｍ４Ｃｍ、ｈｍ５Ｃ、ｍ３Ｕ、ｍ１ａｃｐ３Ψ、ｃｍ５Ｕ、ｍ６Ａｍ、ｍ６２Ａｍ、ｍ２，７Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ、ｍ３Ｕｍ、ｍ５Ｄ、ｍ３Ψ、ｆ５Ｃｍ、ｍ１Ｇｍ、ｍ１Ａｍ、τｍ５Ｕ、τｍ５ｓ２Ｕ、ｉｍＧ−１４、ｉｍＧ２、およびａｃ６Ａが含まれる。」
（［００２９０］〜［００２９１］、実施例３１）
（甲２−１３）「２．ポリＡテールをさらに含む、請求項１に記載のメッセンジャーＲＮＡ。」（請求項２）
（甲２−１４）「７．前記メッセンジャーＲＮＡがナノ粒子に封入されている、請求項１に記載のメッセンジャーＲＮＡ。」（請求項７）
（３）甲第３号証：国際公開第２０１１／０００１０７号
（甲３−１）「１．以下を含む、核酸−脂質粒子：
　（ａ）核酸；
　（ｂ）該粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を構成する陽イオン性脂質；
　（ｃ）該粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を構成する非陽イオン性脂質；および
　（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する結合脂質。
２．前記核酸が、干渉ＲＮＡを含む、請求項１記載の核酸−脂質粒子。」（請求項１〜２）
（甲３−２）「５．前記ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの一つまたは複数が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項３記載の核酸−脂質粒子。」（請求項５）
（甲３−３）「２７．前記陽イオン性脂質が、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの混合物を含む、請求項１〜２６のいずれか一項記載の核酸−脂質粒子。」（請求項２７）
（甲３−４）「２９．前記非陽イオン性脂質が、リン脂質である、請求項１〜２７のいずれか一項記載の核酸−脂質粒子。
３０．前記非陽イオン性脂質が、リン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含む、請求項１〜２７のいずれか一項記載の核酸−脂質粒子。」（請求項２９〜３０）
（甲３−５）「３７．粒子の凝集を阻害する前記結合脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質コンジュゲートを含む、請求項１〜３６のいずれか一項記載の核酸−脂質粒子。」（請求項３７）
（甲３−６）「４６．前記核酸が、前記核酸−脂質粒子に完全に封入されている、請求項１記載の核酸−脂質粒子。
４７．請求項１記載の核酸−脂質粒子および薬学的に許容されうる担体を含む、薬学的組成物。
４８．細胞を請求項１〜４６のいずれか一項記載の核酸−脂質粒子と接触させる工程を含む、該細胞に核酸を導入するための方法。
４９．前記細胞が固形腫瘍中にある、請求項４８記載の方法。
５０．前記固形腫瘍が哺乳動物中にある、請求項４９記載の方法。」（請求項４６〜５０）
（甲３−７）「本発明の脂質粒子（例えばＳＮＡＬＰ）は、典型的には約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。加えて核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２０２５号および同第２００７００４２０３１号に開示されており、それらの開示は、全ての目的のために全体として本明細書に参照により組み入れられる。」（［００６３］）
（甲３−８）「本発明の脂質粒子は、典型的には、活性剤または治療剤、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を阻害する結合脂質を含む。いくつかの態様では、活性剤または治療剤は、脂質粒子中の活性剤または治療剤が水溶液中で例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる酵素的分解に耐性であるように、脂質粒子の脂質成分内に完全に封入される。他の態様では、本明細書記載の脂質粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒である。本発明の脂質粒子は、典型的には、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または約７０〜約９０ｎｍの平均直径を有する。本発明の脂質粒子は、また典型的には、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約２５：１、約３：１〜約２０：１、約５：１〜約１５：１、または約５：１〜約１０：１の脂質：治療剤（例えば脂質：核酸）比（質量／質量比）を有する。」（［０１９９］）
３　当審の判断
（１）理由１：特許法第２９条第１項第３号
ア　甲第１号証に対する新規性欠如
　甲第１号証には、ｍＲＮＡの修飾基の列挙記載の中に１−メチル−シュードウリジンが含まれている記載があるにとどまり、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが、哺乳類細胞に投与されると、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させることは記載も示唆もされていない。
　また、実施例５（記載事項（甲１−１０））は、１−メチル−シュードウリジンを含むポリヌクレオチドを合成した実施例ではなく、また、実施例３４（記載事項（甲１−１１））は、多数のヌクレオシド修飾の１つとして、１−メチル−シュードウリジンが記載されているにすぎず、しかも、「・・・試験する。・・・ことが見いだされている。」と記載されているように、実際にこれらのヌクレオシド修飾を含むポリヌクレオチドを製造したデータを伴うものではなく、コードされたポリペプチドの発現を増加させることなどは把握し得ないから、本件発明１が、甲第１号証に発明として記載されているとはいえない。
　したがって、本件発明１は、甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない、ということはできない。本件発明２、５〜７は、本件発明１を更に特定するものであるから、同様である。
イ　甲第２号証に対する新規性の欠如
　甲第２号証には、ｍＲＮＡの修飾基の列挙記載の中に１−メチル−シュードウリジンが含まれている記載があるにとどまり、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが、哺乳類細胞に投与されると、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させることは記載も示唆もされていない。
　また、実施例２（記載事項（甲２−１０））は、１−メチル−シュードウリジンを含むポリヌクレオチドを合成した実施例ではなく、また、実施例３１（記載事項（甲２−１２））は、多数のヌクレオシド修飾の１つとして、１−メチル−シュードウリジンが記載されているにすぎず、しかも、「・・・試験する。・・・ことが見いだされている。」と記載されているように、実際にこれらのヌクレオシド修飾を含むポリヌクレオチドを製造したデータを伴うものではなく、コードされたポリペプチドの発現を増加させることなどは把握し得ないから、本件発明１が、甲第２号証に発明として記載されているとはいえない。
　したがって、本件発明１は、甲第２号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない、ということはできない。本件発明７は、本件発明１を更に特定するものであるから、同様である。
（２）理由２：特許法第２９条第２項
　ＲＮＡのような核酸を細胞内に導入する場合に、コードするポリペプチドの発現を高めることは当該技術分野における一般的な課題であったとしても、甲第１号証または甲第２号証の記載から、ウリジンを１−メチルーシュードウリジンに置換してｍＲＮＡを修飾することにより、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが、哺乳類細胞に投与されると、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させることは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。
　また、甲第３号証には、哺乳動物細胞中にＲＮＡのような核酸を導入する手段として、陽イオン性脂質及び結合脂質を含む核酸粒子が記載されているにとどまり、甲第３号証の記載事項を参照しても、甲第１号証または甲第２号証の記載に基づき、ウリジンを１−メチルーシュードウリジンに置換してｍＲＮＡを修飾することにより、１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドが、哺乳類細胞に投与されると、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させることは、当業者が容易に想到し得ることとはいえない。
　したがって、本件発明１〜７は、甲第１号証または甲第２号証に記載された発明及び甲第３号証に記載された事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、ということはできない。
（３）理由３及び４：特許法第３６条第４項第１号及び特許法第３６条第６項第１号
ア　理由アについて
　本件発明の詳細な説明の記載及び本願出願時の技術常識から、当業者であれば、オープンリーディングフレーム以外の領域を、修飾されていないヌクレオチドで構成することも可能であり、その場合にはポリペプチド発現における１−メチルーシュードウリジンの効果を著しく損なう蓋然性は低いことを理解することができ、また、本件発明の詳細な説明（段落【０２３６】〜【０２３７】）には、オープンリーディングフレーム以外の領域を、修飾ヌクレオチドで構成することが記載されているが、当業者であれば、本件発明の詳細な説明の記載及び本願出願時の技術常識から、ポリペプチド発現における１−メチルーシュードウリジンの効果を損なわない範囲内で、オープンリーディングフレーム以外の領域を構成するヌクレオチドを適宜定めることができるから、本件発明１〜７について、発明の詳細な説明が当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえ、また、本件発明１〜７は、発明の詳細な説明に記載されたものといえる。
　したがって、本件発明の詳細な説明の記載は、理由アにより特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできないし、また、本件特許請求の範囲の記載は、理由アにより特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。
イ　理由イについて
　本件発明の詳細な説明の記載には、哺乳類細胞として、「細胞は、哺乳類細胞、細菌性細胞、植物、微生物、藻類および真菌細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシ細胞等であるが、これらに限定されない、哺乳類細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＫＥＫ  ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ、Ｃａｃｏ−２、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、Ｋ５６２、ジャーカット、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ−Ｓ、Ｈｕｖｅｃ、ＣＶ−１、Ｈｕｈ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ−９０、ＭＣＦ−７、Ｕ−２０Ｓ、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＳＦ９、ＳＦ２１、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない株化細胞に由来し得る。・・・・・・本発明の方法によってトランスフェクトされる一次および二次細胞を多様な組織から得ることができ、培養下で維持され得るすべての細胞型を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明の方法によってトランスフェクトされ得る一次および二次細胞には、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。また、一次細胞を同種または別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の供与体から得ることもできる。」と記載されている（【０８２６】〜【０８２８】）ように、哺乳類細胞として様々な細胞が挙げられることが記載されており、また、１−メチルーシュードウリジンを含むポリヌクレオチドを導入した哺乳類細胞として、末梢血単核細胞（実施例６９）、ＨｅＬａ細胞（実施例６９、８１、９０、１１９、１２０）、マウス（実施例７０、９１、１０５）、等の複数の哺乳類細胞が具体的に記載されているから、本件発明の詳細な説明の記載は、具体的に記載されている哺乳類細胞以外の哺乳類細胞についても、同様の結果が得られることを当業者が容易に理解することができる程度に記載されているといえるので、本件発明１〜７について、発明の詳細な説明が当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえ、また、本件発明１〜７は、発明の詳細な説明に記載されたものといえる。
　したがって、本件発明の詳細な説明の記載は、理由イにより特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできないし、また、本件特許請求の範囲の記載は、理由イにより特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない、とすることはできない。
第６　むすび
　以上のとおりであるから、取消理由で通知した理由及び特許異議申立の理由によっては、本件特許発明１〜７に係る特許を取り消すことはできない。また、他に本件特許発明１〜７に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
令和３年２月１０日（２０２１．２．１０）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
複数の脂質ナノ粒子を含む組成物であって、前記複数の脂質ナノ粒子はポリヌクレオチドを封入しており、前記ポリヌクレオチドは、
　（ａ）１−メチル−シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンからなり、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、
　（ｂ）コザック配列を含む５’ＵＴＲと、
　（ｃ）少なくとも１つの５’キャップ構造と、
　（ｄ）３’ＵＴＲと、
　（ｅ）結合ヌクレオシドの３’尾部配列とを含み、
　哺乳類細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、シュードウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、コードされたポリペプチドの発現を増加させる組成物。
　【請求項２】
前記複数の脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール、およびリン脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
　【請求項３】
前記カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＳＤＭＡ、またはＤＬｅｎＤＭＡである、請求項２に記載の組成物。
　【請求項４】
前記複数の脂質ナノ粒子は、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの平均粒径、０．０２〜０．２の平均ＰＤＩ、および１０〜２０の平均脂質：ポリヌクレオチド比（重量／重量）を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
　【請求項５】
前記結合ヌクレオシドの３’尾部配列は、１６０個のヌクレオチドのポリＡ尾部およびポリＡ〜Ｇ四重項のうちから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
　【請求項６】
前記少なくとも１つの５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンのうちから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
　【請求項７】
末梢血単核細胞に投与されると、前記ポリヌクレオチドは、ウリジン、シチジン、アデノシンおよびグアノシンを含むヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する対応するポリヌクレオチドに対して、より低いレベルの検出可能なＩＦＮ−
αを