(57)【要約】【課題】少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス性ペプチドを提供すること。【解決手段】本発明によって提供される抗ウイルス性ペプチドは、（１）水胞性口炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus：ＶＳＶ）のＧタンパク質のトランスメンブレン領域を構成するアミノ酸配列（ＴＭ配列）、または、該ＴＭ配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列；および（２）細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として機能するアミノ酸配列（ＣＰＰ配列）；をともに備え、総アミノ酸残基数が１００以下の合成ペプチドである。【選択図】図４
2020059662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制する合成ペプチドであって、
以下の（１）および（２）に示すアミノ酸配列：
（１）水胞性口炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus：ＶＳＶ）のＧ遺伝子にコードされる糖タンパク質（Ｇタンパク質）のトランスメンブレン領域を構成するアミノ酸配列（ＴＭ配列）、または、該ＴＭ配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列；および
（２）細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として機能するアミノ酸配列（ＣＰＰ配列）；
をともに備え、
総アミノ酸残基数が１００以下である、合成ペプチド。
【請求項２】
前記ＶＳＶのＧタンパク質のＴＭ配列が、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列である、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
前記ＣＰＰ配列が、ポリアルギニン、または、配列番号４〜２１のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列である、請求項１または２に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
前記ＣＰＰ配列が、前記ＶＳＶのＧタンパク質のＴＭ配列の、Ｎ末端側あるいはＣ末端側に直接的に、もしくは１個、２個または３個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して配置される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
配列番号２２〜２４のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス性組成物であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
薬学上許容され得る少なくとも１種の担体と、
を備える、抗ウイルス性組成物。
【請求項７】
少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制する方法であって、
インビトロにおいて、対象物に対して請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成ペプチドを少なくとも１回供給することを包含する、ウイルス増殖抑制方法。
【請求項８】
前記ウイルスが、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）である、請求項７に記載のウイルス増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種のウイルスに対して抗ウイルス活性を有する人為的に合成された抗ウイルス性ペプチドとその利用に関する。詳しくは、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）のいくつかのウイルス株に由来するトランスメンブレン（ＴＭ）ペプチドを構成するアミノ酸配列（以下「ＴＭ配列」ともいう。）と、膜透過性ペプチド配列とを備える人工ペプチドの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡウイルスであるラブドウイルス科（Rhabdoviridae）のベシクロウイルス属（Vesiculovirus）に属する水疱性口炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus：ＶＳＶ）は感染力が強く、家畜伝染病の一つである水疱性口炎を引き起こす病原ウイルスとして重要視されている。現在、ＶＳＶに対するワクチンはなく、感染動物に対する効果的な治療方法も確立していない。一方、ＶＳＶは、その高い増殖性やウイルス学上の特性から、様々な研究分野においてウイルスベクターとして利用されてきた。また、近年では、ウイルスの逆遺伝学（reverse genetics）の手法を利用して、あるウイルスの構造に、異なるウイルス種のタンパク質を発現する組み換え体ウイルスが作られ、ウイルスタンパク質の機能、宿主細胞との相互作用、病態発現メカニズム等を詳細に解析するツールとして利用されている。例えば、ＶＳＶの構造を有する組み換え体ウイルスは、ワクチンや疾患治療のツールとして利用され得る。
【０００３】
現状では、有効なワクチンや抗ウイルス剤がないために、治療が対症療法に限られるウイルス性疾患が多く存在している。あるいは、薬剤耐性ウイルスの出現により、既存の治療薬を選択できず、十分な治療が行えないケースもある。そのため、ウイルス性疾患に対して、作用機序や化学的特性の異なる抗ウイルス剤の開発が積極的に進められている。そのアプローチの一つには、ウイルスの感染・増殖を阻止あるいは低減させ得る天然由来あるいは人為的に作製された抗ウイルス性ペプチドの開発が進められている（例えば、特許文献１，２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２３０９０４号公報
【特許文献２】特開２００７−２３０９０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記各特許文献に記載されている抗ウイルス性ペプチドとは異なる構造のペプチドであって、自然界において抗ウイルス性ペプチドとして存在し機能しているペプチドとは異なる新たな人工の抗ウイルス性ペプチドを設計することを目的とする。また、本発明により設計された抗ウイルス性ペプチドを製造し、該ペプチドを主成分とする抗ウイルス性組成物（典型的には、薬学的組成物たる抗ウイルス剤あるいは研究用試薬）の提供を他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ＶＳＶのＧ遺伝子にコードされる糖タンパク質（以下「Ｇタンパク質」ともいう。）のアミノ酸配列に着目した。そして、驚くべきことに、当該Ｇタンパク質のＴＭ配列と、従来知られた細胞膜透過性ペプチド（cell penetrating peptide：ＣＰＰ）として機能するアミノ酸配列（以下「ＣＰＰ配列」ともいう。）とを組み合わせた合成ペプチドが、少なくとも１種のウイルスに対して優れた抗ウイルス活性（典型的には、ウイルスの増殖を抑制する活性、ウイルスの感染を阻害する活性など）を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、ここで開示される合成ペプチドは、少なくとも１種のウイルスに対して抗ウイルス活性を有する抗ウイルス性ペプチドである。
該ペプチドは、以下の（１）および（２）に示すアミノ酸配列：
（１）水胞性口炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus：ＶＳＶ）のＧ遺伝子にコードされる糖タンパク質（Ｇタンパク質）のトランスメンブレン領域を構成するアミノ酸配列（ＴＭ配列）、または、該ＴＭ配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列；および
（２）細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として機能するアミノ酸配列（ＣＰＰ配列）；
をともに備えることを特徴とする。
【０００８】
好ましい一態様では、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、総アミノ酸残基数が１００以下である。製造コスト、合成のし易さ、取扱い性の観点からは、総アミノ酸残基数が８０以下（例えば６０以下、より好ましくは５０以下、あるいは４０以下）であるものがさらに好ましい。
あるいは、上記（１）に示すアミノ酸配列と（２）に示すアミノ酸配列とを合わせたアミノ酸残基数が、抗ウイルス性ペプチド全体のアミノ酸残基数の８０％以上（より好ましくは９０％以上、例えば１００％）を占めるような合成ペプチドは、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドのうちの特に好適な一態様である。
【０００９】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの好適な他の一態様では、上記（１）のＴＭ配列が、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列であることを特徴とする。
また、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの好適な他の一態様では、上記（２）のＣＰＰとして機能するアミノ酸配列が、ポリアルギニン（特に限定しないが、典型的には、５個以上９個以下のアルギニン残基から構成される）、または、配列番号４〜２１のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
【００１０】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、上記（２）のＣＰＰ配列が、上記（１）のＴＭ配列の、Ｎ末端側あるいはＣ末端側に直接的に、もしくは１個、２個または３個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して配置されることが好ましい。
【００１１】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの好適な他の一態様では、配列番号２２〜２４のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチド（抗ウイルス性ペプチド）と、薬学上許容され得る少なくとも１種の担体とを備える、少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス性の組成物を提供する。
かかる組成物は、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを含むことにより、抗ウイルス剤としての利用、あるいは新たな抗ウイルス剤の開発のための研究材料として利用することができる。
【００１３】
また、本発明は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチド（抗ウイルス性ペプチド）を、対象物である細胞や組織等に対して（例えば生体外＝インビトロにおいて、あるいは、生体内＝インビボにおいて）、少なくとも１回供給することを特徴とする、少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制する方法を提供する。
かかる構成の方法では、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを対象物に供給することによって、少なくとも１種のウイルス（例えばＶＳＶ）の増殖を阻止もしくは抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、抗ウイルス性ペプチド無添加で１日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を示す光学顕微鏡写真である。
【図２】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、３種類の抗ウイルス性ペプチド（サンプル1、サンプル２、サンプル３）のいずれか１０μＭを添加して、あるいは、いずれも添加しないで１日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を示す光学顕微鏡写真である。具体的には、図２の上段左には、抗ウイルス性ペプチド無添加で培養した細胞の観察画像を示す。上段右には、上記サンプル１存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段左には、上記サンプル２存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段右には、上記サンプル３存在下で培養した細胞の観察画像を示す。
【図３】ＶＳＶ（１０２ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、上記３種類の抗ウイルス性ペプチドのいずれか５０μＭを添加して、あるいは、いずれも添加しないで１，２，３日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の培養上清中のウイルス量（Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０/ｍｌ）の経日的な変化を示すグラフである。
【図４】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、上記３種類の抗ウイルス性ペプチドのいずれか５０μＭを添加して、あるいは、いずれも添加しないで１，２，３日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の培養上清中のウイルス量（Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０/ｍｌ）の経日的な変化を示すグラフである。
【図５】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、上記３種類の抗ウイルス性ペプチドのいずれか５０μＭを添加して、あるいは、いずれも添加しないで１日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を示す光学顕微鏡写真である。具体的には、図５の上段左には、抗ウイルス性ペプチド無添加で培養した細胞の観察画像を示す。上段右には、上記サンプル１存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段左には、上記サンプル２存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段右には、上記サンプル３存在下で培養した細胞の観察画像を示す。
【図６】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、上記サンプル３を５０μＭ添加して１日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を示す光学顕微鏡写真である。
【図７】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、上記３種類の抗ウイルス性ペプチドのいずれか５０μＭ添加して、あるいは、いずれも添加しないで２日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を示す光学顕微鏡写真である。具体的には、図７の上段左には、抗ウイルス性ペプチド無添加で培養した細胞の観察画像を示す。上段右には、上記サンプル１存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段左には、上記サンプル２存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段右には、上記サンプル３存在下で培養した細胞の観察画像を示す。
【図８】ＶＳＶ（１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌ）を接種後、上記３種類の抗ウイルス性ペプチドのいずれか５０μＭ添加して、あるいは、いずれも添加しないで３日間培養したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を示す光学顕微鏡写真である。具体的には、図８の上段左には、抗ウイルス性ペプチド無添加で培養した細胞の観察画像を示す。上段右には、上記サンプル１存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段左には、上記サンプル２存在下で培養した細胞の観察画像を示す。下段右には、上記サンプル３存在下で培養した細胞の観察画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ここで開示されるペプチドを成分とする抗ウイルス性組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、アミノ酸を１文字表記（但し配列表においては３文字表記）で表す。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００１６】
本明細書において「人為的に合成されたペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の系（例えば抗ウイルス剤を構成する組成物）の中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。ここで「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは８０以下、より好ましくは５０以下、例えば４０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
【００１７】
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば抗ウイルス活性や細胞膜透過性能）を損なうことなく、１個から数個（典型的には９個以下、好ましくは５個以下）のアミノ酸残基、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、あるいは、所定のアミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）したもしくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。
したがって、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの具体例には、後述する各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個、２個または３個のアミノ酸残基が置換（典型的には同類置換）、欠失または付加された改変アミノ酸配列であって当該配列番号のアミノ酸配列と同様に抗ウイルス活性を示す改変アミノ酸配列からなる合成ペプチドが包含される。
【００１８】
ここで開示される人為的に合成された抗ウイルス性ペプチドは、天然には存在しない短鎖のペプチドであり、上記２種のアミノ酸配列、即ち、
（１）Ｇタンパク質のＴＭ配列、または、上記のＴＭ配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列；
（２）ＣＰＰとして機能するアミノ酸配列（ＣＰＰ配列）；
をともに備えることで特徴付けられるペプチドである。
Ｇタンパク質は、膜貫通型のＩ型糖タンパク質であり、近年では「レトロウイルスベクター」におけるエンベロープを構成する糖タンパク質として利用されている。しかしながら、Ｇタンパク質のＴＭ領域が、抗ウイルス活性を有することは見出されておらず、かかるＴＭ領域のアミノ酸配列を合成し、該配列にＣＰＰを付加することにより、人為的に合成された抗ウイルス性ペプチドが得られることは、本願出願当時、全く想定されていないことであった。また、ＴＭ配列は、配列番号１から３に示すように、ＶＳＶの血清型により異なるが、いずれのＴＭ配列を有する合成ペプチドにも優れた抗ウイルス性が見出されることも、本願出願当時において、全く想定されていなかった。
【００１９】
なお、各Ｇタンパク質のアミノ酸配列情報は、種々の公的な国際機関の知識ベース（データベース）にアクセスすることにより容易に取得することができる。例えば、Universal Protein Resource (UniProt)のデータベース(UniProtKB)において登録されているこれらの糖タンパク質の全アミノ酸配列情報ならびにＴＭ領域のアミノ酸配列の情報を、誰でも容易に得ることができる。
【００２０】
特に限定するものではないが、配列番号１〜３は、上記Ｇタンパク質のＴＭ配列の好適例を示す。具体的には以下のとおりである。
配列番号１は、単離された１種のＶＳＶ（Vesicular stomatitis Piry virus）のＧタンパク質に含まれる計１９アミノ酸残基からなるＴＭ配列である（UniProtKB - Q85213）。
配列番号２は、単離された１種のＶＳＶ（Vesicular stomatitis Indiana virus）のＧタンパク質に含まれる計２１アミノ酸残基からなるＴＭ配列である（UniProtKB - P05322）。
配列番号３は、単離された１種のＶＳＶ（Vesicular stomatitis New Jersey virus）のＧタンパク質に含まれる計２１アミノ酸残基からなるＴＭ配列である（UniProtKB - P04882）。
【００２１】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを構築するために使用されるＣＰＰとして機能するアミノ酸配列として、従来公知の種々のＣＰＰを採用することができる。例えば、３個以上、好ましくは５個以上であって１１個以下、好ましくは９個以下のアルギニン残基からなる、いわゆるポリアルギニン（Ｒｎ）は、ここで用いられるＣＰＰとして好適である。その他、公知である種々のＣＰＰを採用することができる。
【００２２】
特に限定するものではないが、配列番号４〜２１にＣＰＰの好適例を示す。具体的には、以下のとおりである。
配列番号４のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳ（核小体局在シグナル：Nucleolar localization signal）に対応する。
配列番号５のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の１種（ＡｐＬＬＰ）由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号６のアミノ酸配列は、ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス  タイプ１）のタンパク質（γ（１）３４．５）由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号７のアミノ酸配列は、ＨＩＣ（human I-mfa domain-containing protein）のｐ４０タンパク質由来の合計１９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号８のアミノ酸配列は、ＭＤＶ（Ｍａｒｅｋ病ウイルス）のＭＥＱタンパク質由来の合計１６アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号９のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計１７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１０のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１１のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってｐ５３腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するＭＤＭ２由来の合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１２のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるＧＧＮＮＶα由来の合計９アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１３のアミノ酸配列は、ＮＦ−κＢ誘導性キナーゼ（ＮＩＫ）由来の合計７アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１４のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計１５アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１５のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるｐ１２０由来の合計１８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１６のアミノ酸配列は、ＨＶＳ（ヘルペスウイルスsaimiri）のＯＲＦ５７タンパク質由来の合計１４アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１７のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１８のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号１９のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計９アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号２０のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号２１のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１８アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
これらのうち、特にＮｏＬＳやＴＡＴに関連するアミノ酸配列（またはその改変アミノ酸配列）が好ましい。例えば、配列番号１７や配列番号１８に示すようなＮｏＬＳ関連のＣＰＰ配列、あるいは配列番号１９〜２１のＴＡＴやＡＮＴ関連のＣＰＰ配列は、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを構築するために好適に用いることができる。
【００２３】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）は、上記（１）に示すアミノ酸配列（以下「（１）抗ウイルス性ＴＭ配列」と総称する。）、および、上記（２）に示すアミノ酸配列（以下「（２）ＣＰＰ配列」と総称する。）を備えておればよく、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列と（２）ＣＰＰ配列のいずれが相対的にＮ末端側（Ｃ末端側）に配置されていてもよい。
（１）抗ウイルス性ＴＭ配列と（２）ＣＰＰ配列とが、直接的に配置されていることが好ましい。具体的な一態様では、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列と（２）ＣＰＰ配列との間に、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないことが好ましい。あるいは他の一態様では、上記二つの配列が、１０個以下（より好ましくは５個以下、例えば１個、２個または３個のアミノ酸残基）のアミノ酸残基からなるリンカーを介して配置されることが好ましい。
【００２４】
また、少なくとも１種のウイルスの増殖を抑制し得る抗ウイルス活性を失わない限りにおいて、抗ウイルス性ペプチドは、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列と（２）ＣＰＰ配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、８０以下が好ましく、７０以下、あるいは６０以下（例えば２５±２から５０±２程度のペプチド鎖）が好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に抗ウイルス性ペプチドを提供することができる。特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状またはへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。
【００２５】
合成したペプチド全体のアミノ酸残基数に対する（１）抗ウイルス性ＴＭ配列と（２）ＣＰＰ配列を合わせたアミノ酸残基数の占める割合は、抗ウイルス性活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね８０％以上が望ましく、９０％以上が好ましい。なお、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、抗ウイルス活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部または全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【００２６】
好ましくは、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
ある一態様では、ここに開示される抗ウイルス性ペプチドのＣ末端部分をＣＰＰ配列が構成するとき、抗ウイルス性ＴＭ配列のＣ末端アミノ酸残基がアミド化される。一方、好適な他の一態様では、抗ウイルス性ペプチドのＣ末端部分をＣＰＰ配列が構成するとき、ＣＰＰ配列のＣ末端アミノ酸残基をアミド化し、該抗ウイルス性ペプチドの安定化を図る。
【００２７】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法または液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）あるいはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００２８】
あるいは、遺伝子工学的手法に基づいて抗ウイルス性ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する抗ウイルス性ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞または該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の抗ウイルス性ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法および構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００２９】
あるいは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち抗ウイルス性ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
【００３０】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、抗ウイルス性ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中でまたは無細胞タンパク質合成システムにて、抗ウイルス性ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【００３１】
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、少なくとも１種のウイルス（例えば、ＶＳＶ）に対し、高い抗ウイルス活性を有する。例えば、この種のウイルスの感染症の治療や予防、例えば口腔内洗浄（うがい）や目の洗浄、または器具の洗浄等の目的に用いられ得る。
なお、抗ウイルス性組成物（抗ウイルス剤）に含有される抗ウイルス性ペプチドは、抗ウイルス活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸または有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。あるいは、抗ウイルス活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。したがって、本明細書および特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
【００３２】
ここで開示される抗ウイルス性組成物は、有効成分である抗ウイルス性ペプチドの抗ウイルス活性を失わない限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド系医薬において一般的に使用される担体を適用し得る。
ここで開示される抗ウイルス性組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。あるいはリポソームであってもよい。また、抗ウイルス性組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
抗ウイルス性組成物（抗ウイルス性剤）の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、抗ウイルス性ペプチド（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の組成物（薬剤）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００３３】
ここで開示される抗ウイルス性組成物（抗ウイルス剤）は、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、比較的高い濃度のカチオン、塩類（例えば塩化ナトリウム）あるいは血清のような有機物が存在する系においても抗ウイルス活性を維持し得る。したがって、ここで開示される抗ウイルス性組成物は、カチオン、塩類や血清等が存在する系（場）での使用に好適である。例えば、本発明によって提供される抗ウイルス性組成物は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内への注射あるいは灌腸によって患者に投与することができる。
あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、衛生陶器表面の洗浄目的に使用する場合は、比較的多量（例えば１〜１００ｍｇ／ｍＬ）の抗ウイルス性ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、あるいは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等と同じ形態、使用方法を適用することができる。
【００３４】
また、抗ウイルス性ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、抗ウイルス性ペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、あるいはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る抗ウイルス性ペプチドを発現させることが可能である。したがって、本発明の抗ウイルス性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、ウイルス感染を予防しまたは治療する薬剤として有用である。
【００３５】
近年の遺伝子工学の分野においては、細胞や組織、あるいは臓器に標的の遺伝子を導入するためのウイルスベクターとして、組み換え体ＶＳＶを使用することがある。また、他のウイルス種（例えばレトロウイルス）のウイルスタンパク質の機能解析を行うために、ＶＳＶのＧタンパク質を組み込んだシュードタイプウイルス（pseudo type virus）を使用することがある。例えば後述する実施例に示すように、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを適当な濃度で培養液中に含有することによって、培養中の臓器、組織、細胞等への望ましくないウイルス感染を防止する、あるいは宿主中でのウイルス増殖を抑制することができる。
【００３６】
また、ワクチンや抗ウイルス治療薬の開発には、病原ウイルスの詳細な情報が必要である。例えば後述する実施例によると、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを、ＶＳＶの感染・増殖機構を解析する研究ツールとして応用し得る。
さらに、家畜の飼養環境の管理、品質管理には、家畜の疾病予防や治療（例えばワクチンや抗ウイルス治療薬）が不可欠であるとともに、疾病を引き起こす病原体の正確な情報を把握する必要がある。ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、それ自体が抗ＶＳＶ剤の有望なシーズとなり得るため、家畜のウイルス感染予防、家畜間の感染拡大防止、さらには家畜と濃厚接触し得る畜産関係者や獣医師などの感染予防や治療法の確立が期待できる。
【００３７】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００３８】
【表１】
2020059662.tif 000003
【００３９】
＜試験例１：ペプチドの合成およびペプチド含有培地の調製＞
表１に示す計３種のペプチドを市販のペプチド合成機を用いて製造した。具体的には次のとおりである。
サンプル１は、配列番号２２に示され、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列として配列番号１に示すアミノ酸配列（ＶＳＶ Piry strainのG proteinのＴＭ配列）を使用し、そのＣ末端側に（２）ＣＰＰ配列として配列番号１７のアミノ酸配列（ＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ）を含む合成ペプチドである。
サンプル２は、配列番号２３に示され、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列として配列番号２に示すアミノ酸配列（ＶＳＶ Indiana strainのG proteinのＴＭ配列）を使用し、そのＣ末端側に（２）ＣＰＰ配列として配列番号１７のアミノ酸配列（ＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ）を含む合成ペプチドである。
サンプル３は、配列番号２４に示され、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列として配列番号３に示すアミノ酸配列（ＶＳＶ New Jersey strainのG proteinのＴＭ配列）を使用し、そのＣ末端側に（２）ＣＰＰ配列として配列番号１７のアミノ酸配列（ＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ）を含む合成ペプチドである。
【００４０】
上記サンプル１〜３のペプチドはいずれも市販のペプチド合成機を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。試験に供された全ての合成ペプチドにおいて、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ２）されている。
合成した各サンプルのペプチドは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶かし、各サンプルペプチドのストック液（濃度２．５ｍＭ）を調製した。
【００４１】
＜試験例２：各合成ペプチドの抗ウイルス活性の評価試験＞
本試験に使用した細胞とウイルスの詳細は、次の通りである。
アフリカミドリザル腎臓上皮Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞の培養には、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％のＦＣＳを含むＬ−グルタミン含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を使用した。
対象ウイルスはＶＳＶであり、そのウイルス力価（感染価）は、公知の一般的なプラークアッセイ法に基づいて測定した。
【００４２】
試験例２の詳細は、以下のとおりである。
まず、あらかじめ用意しておいたＶＳＶを適宜希釈し、感染価が１０２ＰＦＵ／ｍＬまたは１０３ＰＦＵ／ｍＬであるウイルス懸濁液を調製した。ウイルス液の希釈には、２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを使用した。
あらかじめ市販の６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏ Ｅ６細胞に、各ウェル当たりＰＢＳ１ｍＬで洗浄したのち、各ウェル１ｍＬの上記感染価のウイルスを接種した。つまり、１ウェル当たりの接種ウイルス量は１０２ＰＦＵあるいは１０３ＰＦＵであった。ウイルスを接種して１時間ほど３７℃にてインキュベートし、その後、各ウェルから接種したウイルス懸濁液を除去し、ＰＢＳとＤＭＥＭで各ウェルを１回ずつ洗浄した。
次いで、各ウェルに、上記調製したいずれかのサンプルペプチドを含有する、２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを、各ウェル２ｍＬ供給し、３７℃で培養した。サンプルペプチドの濃度は１０μＭであり、実験コントロールには、ＤＭＳＯを、サンプルペプチド調製液に含有される溶媒と等量になるように添加した２％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを使用した。
【００４３】
培養を開始してから１日目の培養上清を採取し、ウイルスを感染していないＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を用いて公知の一般的なＴＣＩＤ５０法により、培養上清中のウイルス感染価を、ウイルス量として算出した。結果を表２，３と図１，２に示す。表中で、Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの数値として示される。この値が低いほど、培養上清中の感染性ウイルス粒子が少ないことを示している。
【００４４】
【表２】
2020059662.tif 000004
【００４５】
【表３】
2020059662.tif 000005
【００４６】
表２，３はそれぞれ、１０２ＰＦＵ／ｗｅｌｌ、１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌのＶＳＶを接種して１日培養した後の、培養上清中のウイルス量である。表２に示すウイルス感染価の対数値から明らかなように、サンプルペプチド１〜３いずれにも、上記２点の接種量におけるＶＳＶに対し、著しい増殖抑制効果（抗ウイルス性）が確認された。
図１，２は、１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌのＶＳＶ接種後培養１日目の細胞の顕微鏡観察像である。ここに示されるように、サンプルペプチド未処理のコントロール（図１，２）では、観察視野内の細胞がほとんど死細胞であった。一方、サンプルペプチド存在下の培養では、一部細胞の脱落は認められたが、観察視野の広範囲でＶｅｒｏ  Ｅ６細胞のモノレイヤー（生細胞）が観察された（図２）。
【００４７】
＜試験例３：各合成ペプチドの抗ウイルス活性のタイムコース評価試験＞
サンプルペプチドの濃度を５０μＭとし、培養上清の採取を、１，２，３日目に行った以外は試験例２と条件を同様にして、試験例３を行った。結果を図３〜８に示す。なお、５０μＭのサンプルペプチドは、３日間の培養においても、ＶＳＶ非感染Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞に対する細胞毒性は認められなかった。
【００４８】
図３、４は、ＶＳＶの接種をそれぞれ１０２ＰＦＵ／ｗｅｌｌあるいは１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌで行った場合の、培養上清中のウイルス量の経日的な変化を表すグラフである。両図に示されるとおり、サンプルペプチド１〜３は、ウイルス接種後培養３日間、コントロールと比較して、ウイルス増殖性が有意に低かった。
【００４９】
図５は、１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌのＶＳＶ接種後培養１日目の細胞の顕微鏡観察像である。コントロール細胞は、ほとんどすべて死滅したが、サンプルペプチド処理細胞のモノレイヤーは広範囲で維持されていた。また、サンプルペプチド処理細胞には、ウイルス感染による細胞変性効果（ＣＰＥ：cytopathic effect）が一部認められるものの、この時点における細胞の脱落は観察されなかった。図６に、サンプルペプチド３で処理した細胞のＣＰＥ部分の拡大観察像を示す。画像の中心にはＶＳＶの感染による変性した細胞塊が観察されたが、その辺縁の細胞は正常な形態しており、観察視野内の９０％以上が生細胞のモノレイヤーで占められていた。
図７，８はそれぞれ、１０３ＰＦＵ／ｗｅｌｌのＶＳＶ接種後培養２，３日後の顕微鏡観察像である。サンプルペプチド存在下の培養では、この時点においても観察視野の広範囲に生細胞のモノレイヤーが観察された。
【００５０】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
例えば、本実施例では、（１）抗ウイルス性ＴＭ配列として配列番号１〜３に示すものを採用しているが、それらの改変配列を採用してもよい。また、本実施例では、（２）ＣＰＰ配列として配列番号１７に示すものを採用しているが、他の既知の（２）ＣＰＰ配列（例えば配列番号４〜２１に示すもの）、あるいはその改変配列を採用してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
上述したように、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドによると、ウイルスの増殖を抑制する（またはウイルス感染の拡大を防止する）ことができる。このため、本発明によって提供される抗ウイルス性ペプチドを使用することによって、少なくとも一種のウイルスの増殖抑制効果を有する抗ウイルス性組成物（抗ウイルス剤）を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１〜２４    合成ペプチド
【図１】
2020059662.tif 000006
【図２】
2020059662.tif 000007
【図３】
2020059662.tif 000008
【図４】
2020059662.tif 000009
【図５】
2020059662.tif 000010
【図６】
2020059662.tif 000011
【図７】
2020059662.tif 000012
【図８】
2020059662.tif 000013
【配列表】
2020059662000001.app