(57)【要約】      （修正有）【課題】有用且つ安全性の高いＮｒｆ２活性化剤を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制作用を有する美白・美肌剤を提供する。【解決手段】ボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及び含有するピラノクマリン化合物（式１）などを有効成分とする。2020132615.tif 000006（式中のＲ１はＣＨ３ＣＯ基、Ｒ２はＣＨ３ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ基（シス体、トランス体）、（ＣＨ３）２Ｃ＝ＣＨＣＯ基、（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２ＣＯ基、ＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ基による誘導体、またはＲ１がＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ基とＲ２がＣＨ３ＣＯ基からなる化合物。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ２活性化剤のチロシナーゼ活性阻害とメラニン産生抑制作用による美白・美肌剤
【請求項２】
ボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物のＮｒｆ２活性化剤によるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制作用による美白・美肌効果
【請求項３】
【化１】
2020132615.tif 000005
（式中のＲ１はＣＨ３ＣＯ基、Ｒ２はＣＨ３ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ基（シス体、トランス体）、（ＣＨ３）２Ｃ＝ＣＨＣＯ基、（ＣＨ３）２ＣＨ−ＣＨ２ＣＯ基、ＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ基による誘導体、またはＲ１がＣＨ３ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ基とＲ２がＣＨ３ＣＯ基からなる化合物）
【請求項４】
Ｎｒｆ２活性に伴うヘムオシゲナーゼ１（ＨＯ−１）によるヘム代謝物のビベルジン及びビリルビンなどによるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制作用
【請求項５】
請求項１、２、３及び４の何れか一項に記載のＮｒｆ２活性化剤及びヘム代謝物のビベルジン及びビリルビンなどによるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制による異常メラニン色素沈着によるしみやそばかすなどの肝斑、日光性色素班及びメラノーマ（黒色腫）の予防剤
【請求項６】
前記Ｎｒｆ２活性化剤が皮膚に外用または経口投与される、請求項１のＮｒｆ２活性化剤によるチロシナーゼ活性阻害作用とメラニン産生抑制による美白・美肌剤ないし２から３の何れか一項に記載のＮｒｆ２活性化剤と請求項１〜５に記載のＮｒｆ２活性化剤とその活性に伴うヘム代謝物のビベルジン及びビリルビンなどを含有する化粧品、医薬品または食品
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、化粧品分野、医薬品分野、健康食品分野及び機能性食品分野において安全性が高く、効果の高いＮｒｆ２活性化剤とそれを含むセリ科のカワラボウフウ属のボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及び含有するピラノクマリン化合物のＮｒｆ２活性化剤によるメラニン色素沈着によるしみやそばかすなどの肝斑と日光性色素斑予防による美白及び美肌効果とメラノーマ（黒色種）疾患予防に関する。
【背景技術】
【０００２】  我々好気生物は酸素の活用による高エネルギー獲得の一方で、生体内には酸化力の強い活性酸素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）や活性窒素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＮＳ）が生じる。この過剰なＲＯＳやＲＮＳによる細胞障害、あるいは生じた過酸化物は動脈硬化症、心筋梗塞、発癌など、様々な疾患の原因となる酸化ストレスの外的因子である（非特許文献１、２）。紫外線は皮膚に炎症を伴う酸化ストレスを与え、過剰なメラニン産生とそれによる色素沈着によるしみやそばかすの日光性色素斑と肝斑及び皮膚癌のメラノーマの原因となる（非特許文献３）。【０００３】  この酸化ストレスによる各種疾患予防に対応するため、生体内では抗酸化タンパク質のＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノン酸化還元酵素（ＮＱＯ１）、チオレドキシン、ヘムオシゲナーゼ１（ＨＯ−１）や解毒酵素のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等を発現させて防御する。これら酵素やタンパク質発現には、細胞質内でＫｅａｐ１と結合している転写因子のＮｒｆ２が、酸化ストレスや新電子性物質に応答し、Ｋｅａｐ１から解離して核内へ移行する。核内に移行したＮｒｆ−２は抗酸化応答配列（ＡＲＥ）に結合して、抗酸化タンパク質ＨＯ−１や解毒酵素を発現させることで細胞の保護、生存延命にはたらく（非特許文献４）。【０００４】  Ｎｒｆ２活性化剤を含むクコシ植物抽出物や（特許文献１）また、Ｎｒｆ２活性化剤としては、フラボノイドのヘスペリジン誘導体やセプトリンなどが報告されている（特許文献２、３）。【０００５】  該文献ではＮｒｆ２活性評価は活性に伴う抗酸化タンパク質などの発現レベルの実証には至っていない。また該文献３では海洋生物からの抽出、分離物でありその実用化には量的な課題が残る。【０００６】  発明者は、以上の問題を解決したＮｒｆ２活性化剤がボタンボウフウ抽出物及び含有するピラノクマリン化合物で解決されることを報告した（非特許文献５）。【０００７】  紫外線は皮膚に炎症を伴う酸化ストレスを与え、過剰なメラニン産生とそれによる色素沈着によるしみやそばかすの日光性色素斑と肝斑の原因及び皮膚癌のメラノーマの原因となる。メラニンはチロシンのチロシナーゼによる酸化重合で生成する。過剰なメラニン産生による色素沈着は、しみやそばかすの原因となり美肌を損なう。またその蓄積は、皮膚癌のメラノーマの原因となる。【０００８】  従来はこのしみやそばかすなどの軽減に、チロシナーゼ活性阻害やメラニン産生抑制を指標に天然から美白剤を探索（特許文献４）、あるいはインドール化合物などの合成を行ってきた（特許文献５）。しかしながら、実際には紫外線による酸化ストレスを伴う炎症及び過剰メラニンの蓄積を抑制する生体内制御機構による抑制ではない。そのため、単発的な酵素阻害によるもので、持続的予防効果という観点で課題が残る。【０００９】  本発明のＮｒｆ２活性化剤は、酸化ストレスに伴う炎症の抑制や過剰なメラニンの抑制を生体内から制御できるため、皮膚に安全で且つ持続的効果をもつ美白・美肌剤である。【００１０】  ボタンボウフウは長命草やサクナとも呼ばれ、風邪の予防や喘息、神経痛などの伝統的薬用食材として利用されてい���。最近の研究では、含有成分のピラノクマリン化合物（式１）は脂肪細胞に作用し、中性脂肪の合成を抑制する抗肥満作用が明らかにされている（非特許文献６）。このように本素材の使用の安全性については担保されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１２−２１１１０７号公開
【特許文献２】特開２０１１−２５６１２６号公開
【特許文献３】特許２０１６−１８３１１１号公開
【特許文献４】特許２０１６−１４１６５７号公開
【特許文献５】特許２０１８−１６８１４２号公開
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】谷口直之、遠藤猛、酸化ストレス・レドックスの生化学、２０００年
【非特許文献２】筒井裕之、医学のあゆみ、２１８巻、１号、２００６年
【非特許文献３】Ｎｏｒｄｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｉｇｍｅｎｔａｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．，ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００６年
【非特許文献４】Ｋａｓｐａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４７，１３０４−１３０９，２００９年
【非特許文献５】鈴木明香里、平良淳誠、荻貴之、日本薬学会１３８年会  要旨集、２０１８年
【非特許文献６】Ｎａｏｙｕｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ．２９，１９−２８，２０１７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】  本発明はボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及びを含有するピラノクマリン化合物を有効成分とする化粧品分野、医薬品分野、及び食品分野において、酸化ストレス低減効果のあるＮｒｆ２活性化剤及びヘムオシゲナーゼ１（ＨＯ−１）活性に伴うヘム代謝物によるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制作用のある、美白・美肌剤を提供する。【００１４】  表１にボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物より分離されたピラノクマリン化合物（式１）のＮｒｆ２活性化剤の略名を列記する。【００１５】
【表１】
2020132615.tif 000002
【課題を解決するための手段】
【００１６】  本発明ではボタンボウフウ（長命草、サクナ）抽出物及びを含有するピラノクマリン化合物を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤によるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制作用による美白・美肌剤を提供する。本発明の要旨は、以下の通りである。【００１７】  本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ボタンボウフウ抽出物及びを含有するピラノクマリン化合物のＮｒｆ２活性化剤の酸化ストレス軽減によるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生の抑制をすることで、しみやそばかすなどを軽減することによる美白及び美肌効果、また過剰メラニン蓄積による皮膚癌メラノーマを予防できることを見出した。作用機序は、Ｎｒｆ２活性化作用に伴う抗酸化タンパク質ＨＯ−１の活性に伴うヘム代謝物によるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制作用の効果によるもので、Ｎｒｆ２活性化剤の全てが同様の効果を有する。【００１８】  すなわち、本発明の様態においては、下記の１〜３の酸化ストレス低減効果のあるＮｒｆ２活性化剤によるチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制による日光性色素斑、肝斑予防剤及びメラノーマ予防剤を提供することである。
１．Ｎｒｆ２活性化剤を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制による美白・美肌剤。
２．Ｎｒｆ２活性化剤を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制剤を含有する植物による化粧品、医薬品及び食品原料
３．また、前記チロシナーゼ活性阻害及びメラニン産生抑制剤が皮膚外用、あるいは経口投与の上記の何れかに記載の日光性色素斑や肝斑によるしみやそばかすに予防効果のある化粧品や食品及び炎症による皮膚疾患やメラノーマを予防できる医薬品を提供する。
【発明の効果】
【００１９】  本発明に用いるボタンボウフウ抽出物に含有するピラノクマリン化合物（式１）は、ボタンボウフウの他にも該剤を含むすべての植物が抽出物原料となる。また、原料そのままでも、化粧品原料や食品素材として用いることができる。本発明におけるＮｒｆ２活性化剤によるメラニン産生抑制剤は、化粧品原料、食品素材及び医薬品の１種以上に含有され、水溶液、乳化液、水分分散、ペースト、ゲル状、あるいは、乾燥物形態の粉末、顆粒状、正型体状等でもよい。また、このＮｒｆ２活性化による美白・美肌剤を含有する化粧品及び食品は、公知の加工法で製造できる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】実施例
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】細胞培養
Ｂ１６Ｆ１メラノサイト細胞は，ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清，１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）を用いて，インキュベータ（５％ＣＯ２，３７℃）で培養した．
【実施例２】
【００２２】メラニン産生抑制試験
Ｂ１６Ｆ１メラノサイトは、ＤＭＥＭ培地（１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、１００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）にて継代培養する。メラニン産生抑制試験は、細胞を１２穴プレート（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に１ｍｌずつまき、ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）で２４時間培養した。培養上清を交換後、培養細胞に試料を添加して２４時間培養した。培養細胞はトリプリシン処理で剥離し、遠心後に培養上清を除去、ＰＢＳで２回遠心洗浄を行い、細胞ペレットを得る。細胞ペレットは１日風乾後にメラニンを１Ｎ  ＮａＯＨで抽出する。抽出液を９６穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定する。この時、試料の色による吸収波長に影響のある場合には、適時、試料に適切な有機溶媒で遠心、洗浄後に測定をした。各試料のメラニン産生抑制率（％）は、試料未添加細胞（Ａ）のコントロール１００％に対する試料添加細胞（Ｂ）のメラニン産生抑制率から算出した（式（１））。
2020132615.tif 000003
図１にボタンボウフウ抽出物によるメラニン産生抑制の活性を示した。濃度依存的にメラニン産生を抑制した。また、その含有するＮｒｆ２活性物質であるピラノクマリン化合物（表１）のプテリキシンも同様にメラニン産生抑制を示した（図２）。Ｎｒｆ２活性化剤は、抗酸化タンパク質ＨＯ−１を発現させる。その結果、ＨＯ−１活性に伴うヘム代謝物（ビリルビン）によるメラニン産生抑制の活性を認めた（図３）。
【実施例３】
【００２３】チロシナーゼ阻害活性試験
試料のチロシナーゼ活性阻害評価は、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−チロシン溶液（１００μｌ）と試料（２μｌ）及び精製水（８８μｌ）を含むＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液（ｐＨ６．８，１００μｌ）試験液を、３７℃で１０分間のプレインキュベーションを行った。この試験液にチロシナーゼ（１５３０Ｕ／ｍｌ、１０μｌ）を添加して、３７℃で３０分間反応させた。反応後に、波長４５０ｎｍの吸光度（Ａ１）をマイクロプレートリーダーで測定した。試験はＬ−チロシン無添加（Ａ２）、試料無添加（Ｂ１）及び試料とＬ−チロシン無添加（Ｂ２）についても同一の処理及び測定を行い、式（１）から試料のチロシナーゼ活性阻害率（％）を算出した。
2020132615.tif 000004
図４にボタンボウフウ抽出物によるチロシナーゼ活性阻害の結果を示した。濃度依存的にチロシナーゼ活性を抑制した。また、Ｎｒｆ２活性物質（表１）の活性に伴うＨＯ−１の発現に伴い産生するヘム代謝産物のビリルビンは、時間経過で活性化するチロシナーゼ活性を抑制した（図５）。
【実施例４】
【００２４】ＨＯ−１タンパク質の発現試験
Ｂ１６Ｆ１メラノサイト（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は２４時間の前培養を行い、表１より選択した試験化合物（最終濃度（μＭ）２５，５０，１００）を添加して、２４時培養した。回収した培養細胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で各々のタンパク質を分離し、ウエスタンブロット分析法でＨＯ−１とβ−Ａｃｔｉｎ（発現コントロールのハウスキーピングタンパク質）の検出を行った。図６（ａ）にＮｒｆ２活性化剤（プテリキシン）のＨＯ−１タンパク発現のウエスタンブロットの結果を示した。各々の発現量（ＨＯ−１／β−Ａｃｔｉｎ）を試験化合物未処理（コントロール）の１００％に対する発現率として算出した（図６（ｂ））。本結果より、メラノサイトにいてＮｒｆ２活性化剤は、濃度依存でＨＯ−１を発現させた。以上の結果より、ボタンボウフウ抽出物及びその含有するＮｒｆ２活性化剤は（表１）は抗酸化タンパク質ＨＯ−１を発現させることで、酸化ストレス軽減に伴う、メラニン産生を抑制していることが示された。一方、メラニン産生抑制剤と知られるコウジ酸はＨＯ−１を発現させないことから、Ｎｒｆ２活性化剤のメラニン産生抑制機構とは異なることが示された【００２５】
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ボタンボウフウ抽出物によるメラニン産生抑制の活性を示す。
【図２】Ｎｒｆ２活性化剤（プテリキシン）によるメラニン産生抑制の活性を示す。
【図３】ＨＯ−１のヘム代謝物（ビリルビン）によるメラニン産生抑制の活性を示す。
【図４】ボタンボウフウ抽出物によるチロシナーゼ活性の阻害を示す。
【図５】Ｎｒｆ２活性化剤（プテリキシン）によるチロシナーゼ活性の阻害を示す。
【図６】Ｎｒｆ２活性化剤（プテリキシン）によるＨＯ−１タンパク発現（ａ）とその発現活性率（ｂ）を示す。
【産業上の利用可能性】
【００２７】  本発明によれば、化粧品分野、医薬品分野、一般食品分野及び機能性食品分野に、ボタンボウフウ抽出物及び、その有効成分のピラノクマリン化合物などのＮｒｆ２活性化剤を有効成分として利用すれば、紫外線などの酸化ストレスによる皮膚障害を予防でき、しみやそばかすなどの肝斑や日光性色素肝斑を予防できる美白・美肌剤及びメラノーマ（黒色腫）の予防剤として活用できる。
【図１】
2020132615.tif 000007
【図２】
2020132615.tif 000008
【図３】
2020132615.tif 000009
【図４】
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【図５】
2020132615.tif 000011
【図６】
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