(57)【要約】【課題】トラクション係数が大きい新規環化物及びその製造方法を提供すること。【解決手段】化学式（１）により表される新規環化物。ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（１）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法。化学式（１）により表される新規環化物は、例えば、トラクション油等として使用できる。【化１】2020023445.tif 000017【選択図】図３
2020023445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（１）により表される新規環化物。
【化１】
2020023445.tif 000013
【請求項２】
化学式（２）により表される新規環化物。
【化２】
2020023445.tif 000014
【請求項３】
ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（１）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法。
【化１】
2020023445.tif 000015
【請求項４】
ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（２）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法。
【化２】
2020023445.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は新規環化物及び新規環化物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ボトリオコッセンは、バイオ燃料等の様々な用途への利用が研究されている。ボトリオコッセンは、化学合成が困難な天然化合物である。非特許文献１には、ボトリオコッセンの合成に関する遺伝子を酵母に導入することによってボトリオコッセンを合成する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｔｏｍ  Ｄ．  Ｎｉｅｈａｕｓら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２２６０−１２２６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ボトリオコッセンのような化合物を、トラクション機構用のトラクション油として用いることが考えられる。従来のトラクション油よりも、トラクション係数がさらに大きいトラクション油が求められている。本開示は、トラクション係数が大きい新規環化物及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の一局面は、化学式（１）により表される新規環化物である。
【０００６】
【化１】
2020023445.tif 000003
本開示の一局面である新規環化物は、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きい。
【０００７】
本開示の別の局面は、化学式（２）により表される新規環化物である。
【０００８】
【化２】
2020023445.tif 000004
本開示の別の局面である新規環化物は、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きい。
【０００９】
本開示の別の局面は、ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（１）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法である。本開示の別の局面である新規環化物の製造方法によれば、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きい新規環化物を製造できる。
【００１０】
本開示の別の局面は、ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（２）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法である。本開示の別の局面である新規環化物の製造方法によれば、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きい新規環化物を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｎ−デカン及びブチルシクロヘキサンのトラクション係数を表すグラフである。
【図２】ｎ−トリデカン及び片環ノルボルナンのトラクション係数を表すグラフである。
【図３】化学式（１）により表される新規環化物のＮＭＲの測定結果を表す説明図である。
【図４】化学式（２）により表される新規環化物のＧＣ／ＭＳの測定結果を表す説明図である。
【図５】化学式（２）により表される新規環化物のＮＭＲの測定結果を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示の例示的な実施形態について図面を参照しながら説明する。
１．新規環化物
新規環化物として、化学式（１）〜（８）により表される新規環化物がある。
【００１３】
【化１】
2020023445.tif 000005
【００１４】
【化２】
2020023445.tif 000006
【００１５】
【化３】
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【００１６】
【化４】
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【００１７】
【化５】
2020023445.tif 000009
【００１８】
【化６】
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【００１９】
【化７】
2020023445.tif 000011
【００２０】
【化８】
2020023445.tif 000012
化学式（１）〜（８）により表される新規環化物は、例えば、トラクション油等として使用できる。
【００２１】
２．新規環化物の製造方法
化学式（１）〜（８）により表される新規環化物は、例えば、ボトリオコッセンを原料とし、ＳＨＣ（スクアレンホペンサイクラーゼ、Squalene hopene cyclase）酵素を用いて製造することができる。  
３．新規環化物が奏する効果
化学式（１）〜（８）により表される新規環化物は、環状構造を有することにより、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きくなる。環状構造を有することにより、トラクション係数が大きくなることは、以下の試験結果による裏付けられる。
【００２２】
ｎ−デカン、ブチルシクロヘキサン、ｎ−トリデカン、及び片環ノルボルナンについて、トラクション係数を測定した。ｎ−デカンとブチルシクロヘキサンとを対比すると、１分子当たりの炭素数は同じである。ｎ−デカンは環状構造を有さず、ブチルシクロヘキサンは環状構造を有する。
【００２３】
ｎ−トリデカンと片環ノルボルナンとを対比すると、１分子当たりの炭素数は同じである。ｎ−トリデカンは環状構造を有さず、片環ノルボルナンは環状構造を有する。トラクション係数の測定条件は以下のとおりとした。
【００２４】
温度：２５℃
周速：０．５ｍ／ｓ
すべり率：１５％
荷重：３０Ｎ
面圧：１．１ＧＰａ
測定結果を図１及び図２に示す。図１に示すように、ブチルシクロヘキサンのトラクション係数は、ｎ−デカンのトラクション係数の３．８倍であった。また、図２に示すように、片環ノルボルナンのトラクション係数は、ｎ−トリデカンのトラクション係数の２．４倍であった。
【００２５】
この実験結果から、環状構造を有する化学式（１）〜（８）により表される新規環化物をトラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きくなることが確認できた。
４．実施例
（４−１）新規環化物の製造
以下の方法で新規環化物を製造した。
【００２６】
Ａ．ＳＨＣ発現大腸菌の作成  
A.acidocaldarius由来のＳＨＣの塩基配列は、Ochsらによって１９９２年に報告されている。ＳＨＣの塩基配列は、Genbank AB007002に登録されている。A.acidocaldariusからＳＨＣ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いた増幅によって単離した。単離したＳＨＣ遺伝子を、発現ベクターpET3aに挿入した。この発現ベクターpET3aを、大腸菌BL21(DE3)へ形質転換することで、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を作成した。
【００２７】
Ｂ．ＳＨＣ発現大腸菌の培養
（ｂ−１）純水を用い、LB培地を調製した。LB培地は、１％のハイポリペプトン(日本製薬製)と、０．５％のイーストエキストラクト(関東科学製)と、０．５％のNaClとを含む。
【００２８】
（ｂ−２）前記（ｂ−１）で調製したLB培地を、１２１℃で２０分間滅菌した。
（ｂ−３）LB培地が十分に冷めてから、クリーンベンチ内で、濃度５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリン酸ナトリウム溶液をLB培地に加えた。アンピシリン酸ナトリウム溶液の添加量は、LB培地５００ｍＬにつき、５００μＬとした。以上の工程により調製された培地を、本培養培地とした。
【００２９】
（ｂ−４）濃度５０ｍｇ／ＬのLB+アンピシリン５ｍＬを、クリーンベンチ内で１５ｍＬチューブに入れた。
（ｂ−５）さらに、１５ｍＬチューブに、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))の２０％グリセロースストックを５０μＬ加えた。その後、３７℃の下、１５０ｒｐｍの条件で４時間振盪培養した。振盪培養後の培地を、以下では前培養液とする。
【００３０】
（ｂ−６）前記（ｂ−１）〜（ｂ−３）で調製した本培養培地に、前培養液２．５ｍＬを加えた。その後、３０℃の下、２０時間振盪培養した。
Ｃ．酵素液の調製
（ｃ−１）前記（ｂ−６）の後、本培養培地から、遠心により、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を集菌した。遠心の条件は、６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
（ｃ−２）集菌したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))に、50mM Tris-HCl(pH 7.5)を加え懸濁した。50mM Tris-HCl(pH 7.5)の添加量は、本培養培地５００ｍＬにつき３０ｍＬとした。
【００３１】
（ｃ−３）前記（ｃ−２）で生じた懸濁液を５０ｍＬチューブに移した。その後、６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で遠心し、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を集菌した。
（ｃ−４）前記（ｃ−２）及び前記（ｃ−３）をもう一度繰り返した。
【００３２】
（ｃ−５）集菌したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))に、1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)を加えた。添加量は、本培養培地５００ｍＬにつき５ｍＬとした。
（ｃ−６）前記（ｃ−５）の後、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を、使用するまで−８０℃で保存した。
【００３３】
（ｃ−７）前記（ｃ−６）で保存したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を、氷水中で融解した。
（ｃ−８）前記（ｃ−７）で融解したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))に対し、1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)を加えた。1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)の添加量は、本培養培地５００ｍＬにつき２０ｍＬとした。前記（ｃ−５）での1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)の添加量と、この（ｃ−８）での1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)の添加量との合計は、本培養培地５００ｍＬにつき２５ｍＬとなった。その後、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を含む液を懸濁した。
【００３４】
（ｃ−９）前記（ｃ−８）で得られた懸濁液を、スターラーで混和し続け、氷上で冷却しながら、超音波破砕機を用いて、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を破砕した。超音波破砕機の条件は、出力１、５０％であった。超音波破砕機による処理時間は、懸濁液５０ｍＬ当たり６０分間であった。
【００３５】
（ｃ−１０）前記（ｃ−９）の処理の後、懸濁液を、１２０００ｒｐｍ、２０分間、４℃の条件で遠心し、上清を回収した。回収した上清を酵素液とした。酵素液はＳＨＣ酵素を含む。
（ｃ−１１）使用するまで、酵素液を−８０℃で保存した。
【００３６】
Ｄ．ボトリオコッセンの可溶化
（ｄ−１）炭素数３０のボトリオコッセンを用意した。ボトリオコッセンは天然物であってもよいし、合成されたものであってもよい。ボトリオコッセンを合成する方法として、例えば、以下の文献に開示されている方法がある。
（文献）Ｔｏｍ  Ｄ．  Ｎｉｅｈａｕｓら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２２６０−１２２６５
この文献に記載の方法では、ボトリオコッセンの合成に関する遺伝子を酵母に導入することによって、ボトリオコッセンを合成する。具体的には、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する酵素をコードするプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子と、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する酵素をコードするボトリオコッセン合成酵素遺伝子と、を酵母に導入している。
【００３７】
プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子としては、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌｉｋｅ  １遺伝子を用いている。ボトリオコッセン合成酵素遺伝子としては、ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌｉｋｅ  ３遺伝子を用いている。
【００３８】
（ｄ−２）０．５ｍｇのボトリオコッセンと、２０ｍｇのTritonX-100とを試験管に入れた。次に、２ｍＬのアセトンを試験管に加えた。
（ｄ−３）試験管にアルミホイルで蓋をし、１０分間超音波処理をした。
【００３９】
（ｄ−４）Ｎ２ガスを用いて試験管中の溶媒を飛ばした。その後、穴を開けたアルミホイルで試験管に蓋をし、３０分間真空乾燥した。その後、再度、Ｎ２ガスを用いて試験管中の溶媒を飛ばした。
【００４０】
（ｄ−５）試験管に１ｍＬの蒸留水を加えた。その後、２０分間超音波処理を行った。以上の工程により、ボトリオコッセンが可溶化した。以上の工程により得られた液を、可溶化済み基質液とする。
【００４１】
Ｅ．酵素反応
（ｅ−１）１ｍＬの可溶化済み基質液と、５ｍＬの酵素液と、２ｍＬのクエン酸バッファーとを混合した。混合により生じた液を反応液とする。クエン酸バッファーの濃度は０．５Ｍである。クエン酸バッファーのｐＨは６．０である。
【００４２】
（ｅ−２）反応液において、６０℃の下、７２時間以上、反応を進行させた。反応のとき、振とう恒温器を用い、７０ｒｐｍで反応液を攪拌した。
（ｅ−３）９．６ｍＬの１５％KOH/MeOHを反応液に添加し、よく混合した。１５％KOH/MeOHとは、メタノールに水酸化カリウムを溶解した溶液である。１５％KOH/MeOHにおける水酸化カリウムの濃度は１５質量％である。１５％KOH/MeOHの添加量は、反応液の１．２倍量である。
【００４３】
（ｅ−４）前記（ｅ−３）の後、反応液を３０分間以上湯煎した。このとき、反応が停止し、けん化した。
Ｆ．酵素反応物の抽出
（ｆ−１）前記（ｅ−４）で得られた、反応停止した反応液８ｍＬを５０ｍＬチューブに移した。その後、１６ｍＬのヘキサンを５０ｍＬチューブに加えた。ヘキサンの添加量は、反応液の２倍量である。
【００４４】
（ｆ−２）５０ｍＬチューブを１０秒間程度ボルテックスした。その後、５０ｍＬチューブの内容物が２層に分離するまで、５０ｍＬチューブを静置した。なお、２層に分離しにくい場合は、少量のアセトンを５０ｍＬチューブにさらに加える。
【００４５】
（ｆ−３）５０ｍＬチューブの内容物のうち、分離した上層を、先端が尖っているナスフラスコに回収した。
（ｆ−４）前記（ｆ−１）〜前記（ｆ−３）の工程をさらに２回繰り返した。その結果、ナスフラスコに、酵素反応物を含む抽出液が得られた。
【００４６】
（ｆ−５）抽出液の溶媒をエバポレーターで飛ばした。ナスフラスコには酵素反応物が残った。
（ｆ−６）酵素反応物を、少量のヘキサン／酢酸エチル混合液で希釈した。ヘキサン／酢酸エチル混合液における、ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は、１００：２０である。
【００４７】
（ｆ−７）短いパスツールピペットの先端に少量の脱脂綿を詰めた。紙製のウエスをひも状にし、パスツールピペットの外周面に巻きつけた。パスツールピペットのうち、先端を含む一部を試験管に差し込んだ。このとき、パスツールピペットの外周面に巻きつけた紙製のウエスが試験管の開口端に当接し、パスツールピペットは、それ以上試験管内に進入しない。その結果、パスツールピペットは、試験管に引っ掛った状態となった。パスツールピペットの先端と、試験管の底とは離間した状態になった。
【００４８】
空気を除いたシリカゲルを、ヘキサン／酢酸エチル混合液で懸濁した懸濁液を、パスツールピペットの半分程度まで詰めた。その結果、シリカゲルカラムが得られた。シリカゲルは、富士シリシア化学製のCHROMATOREX BW-200である。ヘキサン／酢酸エチル混合液における、ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は１００：２０である。
【００４９】
ヘキサン／酢酸エチル混合液を、パスツールピペットの最上部まで入れ、パスツールピペットの壁面に付着するシリカゲルを落とした。以降、精製が終了するまで、シリカゲルカラムが乾かないようにした。
【００５０】
（ｆ−８）前記（ｆ−６）で得られた希釈液を、シリカゲルカラムにアプライした。このとき、シリカゲルが舞わないように慎重にアプライした。
（ｆ−９）前記（ｆ−６）で得られた希釈液が入っていたナスフラスコにパスツールピペットでひと吸い程度のヘキサン／酢酸エチル混合液を加え、ナスフラスコの内部をよく洗った。その後、洗液をシリカゲルカラムにアプライした。
【００５１】
（ｆ−１０）前記（ｆ−９）の工程をさらに２回行った。
（ｆ−１１）アプライした液の液面がシリカゲル層の上端まで下降する直前に、ヘキサン／酢酸エチル混合液をシリカゲルカラムにアプライした。このとき、ヘキサン／酢酸エチル混合液の液面がパスツールピペットの最上部に達するようにした。
【００５２】
（ｆ−１２）前記（ｆ−１１）の工程をさらに２回繰り返し、酵素反応物を含む溶液をシリカゲルカラムから溶出させた。
（４−２）新規環化物の分析方法
前記（ｆ−１２）で得られた、酵素反応物を含む溶液から溶媒を除去した。その結果、約６０ｍｇの油状成分を得た。
【００５３】
次に、６０ｍｇの油状成分を、１０ｍＬのMeOH/IPA混合溶液で希釈した。MeOH/IPA混合溶液において、メタノールとイソプロピルアルコールとの体積比は１：１である。
次に、希釈した油状成分をＨＰＬＣに注入し、分離操作を行った。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
【００５４】
カラム:YMC-Actus ProC18 RS ２５０ｍｍ×３０ｍｍ
移動相:メタノールとイソプロピルアルコールとを体積比で８２：１８の比率で含む混合溶液
流速:１５ｍＬ／ｍｉｎ
検出:ＵＶ(検出波長:２１０ｎｍ）
次に、分離した成分を、ＧＣ／ＭＳにより同定した。使用した装置は、ガスクロマトグラフ‐飛行時間型質量分析JMS-T200GCAccuTOFGCxである。測定条件は以下のとおりである。
【００５５】
サンプルの条件：ヘキサン溶液
ＧＣの条件
・GCカラム:DB-5MS UI, 15m x 0.25mm, 0.1μm
・オーブン温度:120℃→ 40℃/min → 300℃(15min)
・注入口:250℃,Split 1:5（EI）、Splitless（FI）
・He流量:1.1mL/min (Constant flow)
EI 条件
・イオン化法:EI+
・イオン化電圧/電流:70eV/ 300μA 
・イオン源温度:250℃
MS条件
・質量範囲:m/z35-800
・スペクトル記録間隔:0.4sec
FI 条件
・イオン化法:FI+
・カソード電圧:-10kV
・エミッタ焼き出し:30mA/30msec
また、分離した成分を、ＮＭＲにより分析した。使用した測定装置は、Bruker DPX400である。測定溶媒は重ベンゼンである。
【００５６】
（４−３）新規環化物の分析結果
分離した成分の一つのＮＭＲの結果を図３に示す。この成分は、化学式（１）により表される新規環化物である。図３には、化学式（１）により表される新規環化物を構成する各原子のピークを示す。
【００５７】
また、分離した別の成分のＧＣ／ＭＳの結果を図４に示し、ＮＭＲの結果を図５に示す。この成分は、化学式（２）により表される成分である。図５には、化学式（５）により表される新規環化物を構成する各原子のピークを示す。
【００５８】
また、酵素反応物には、化学式（３）〜（８）で表される新規環化物も含まれると推測される。
５．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
【００５９】
（１）化学式（１）〜（８）により表される新規環化物は、トラクション油以外の用途に用いてもよい。他の用途として、例えば、飼料添加物、食品添加物等が挙げられる。
（２）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言から特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本開示の実施形態である。
【００６０】
（３）上述した新規環化物の他、当該新規環化物を成分とする組成物、当該新規環化物を含むトラクション油等、種々の形態で本開示を実現することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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