(57)【要約】【課題】細胞または細胞の集団に送達される薬剤の量を増強し得る化合物および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、薬剤の細胞への移入を増強するための方法および組成物を提供する。薬剤は、ポリペプチド、遺伝子およびアンチセンス核酸のようなポリヌクレオチド、およびその他の分子を含み得る。いくつの実施態様では、薬剤は、細胞中に導入されるとき、細胞活性または細胞機能を調整し得る調整薬剤である。本発明の方法および組成物は、個々の細胞および組織または器官として存在する細胞中に薬剤を導入するために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、治療用およびその他の薬剤を細胞へ送達する分野に関する。遺伝子、ポリペプチドおよびその他の分子は、特に、本発明の組成物および方法を用いて送達され得る薬剤である。細胞は個々にか、または生物学的組織または器官として存在し得る。
【背景技術】
【０００２】
化合物の細胞中への送達は、多くの診断プロセスおよび治療プロセスの最初の重要な工程である。例えば、遺伝子治療は、核酸の細胞への送達を必要とする治療用およびその他の使用のための高度に約束されたツールである。例えば、遺伝子移入法を基にした新生物を処置する別個のアプローチが開発された。新生物形質転換および新生物進行を生じる規定された遺伝子座における特定の損傷を矯正する方法が開発されている（Ｓｐａｎｄｉｄｏｓら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：１５４３−１５５４（１９９０）；Ｂａｎｅｒｊｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６２９７−６３０４（１９９２））。優性オンコジーンの過剰発現は、形質転換遺伝子または遺伝子産物を阻害する技術を用いて検討され得る。腫瘍サプレッサー遺伝子機能の損失は、野生型腫瘍サプレッサー遺伝子機能を再構築する方法を用いてアプローチされ得る（Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１９６８−１９７３（１９９２））。変異補償を達成するためのこれらの方法の他に、腫瘍細胞を特異的かつ選択的に根絶する遺伝子技法が開発された。分子化学療法のこれらのアプローチは、新形成細胞における毒性遺伝子の特異的発現に依存する（Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０３：３５４−３５９（１９９３））。最後に、遺伝子移入法を用いて抗腫瘍免疫が達成されている。遺伝子免疫増強のこれらの方法は、遺伝子免疫調節の技法を用いて腫瘍の免疫認識を増強する。その結果として、種々の別個のアプローチが、癌の遺伝子治療を達成するために開発された。
【０００３】
膀胱の癌腫の症例では、高い変異の発生数が、ｐ５３およびＲＢのような腫瘍サプレッサー遺伝子で観察されている（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１３９３−１３９８（１９９２）；Ｃａｉｒｎｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６：２３０５−２３０９（１９９１））。腫瘍サプレッサー遺伝子のこのような遺伝子損傷について、新形成表現型の復帰は、対応する野生型腫瘍サプレッサー遺伝子の置換により示され得る（Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ、前出；Ｂａｎｅｒｊｅｅ、前出）。
【０００４】
膀胱の癌腫は、罹病率および死亡率の顕著な供給源を代表する。膀胱癌は、癌に関連する死亡率では、男性で１０番目および女性で１２番目のランクである（癌の事実および外観、Ａｍｅｒ．Ｃａｎ．Ｓｏｃ．５：１１（１９９５））。膀胱癌の処置に利用可能な治療は、アジュバント化学治療または免疫治療、表在性疾患の経尿道的切除、しばしば全身化学治療と組み合わされる根治的膀胱切除または放射線治療を含む。これらの治療オプションにもかかわらず、全体の生存は、認識され得るほどに変化しなかった（前出）。従って、新たな治療様式が、膀胱癌の処置のために開発されなければならない。
【０００５】
遺伝子治療戦略が、代替の治療アプローチとして開発された（例えば、Ｂｒｅｗｓｔｅｒら、Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ  ２５：１７７−１８２（１９９４）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：５２５７−５２６１（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：１８０−１９９（１９９２））。ヒトまたはその他の動物における癌およびその他の状態の成功する処置は、細胞に進入する治療薬剤の適切な量、および治療薬剤を摂取する標的細胞の十分に大きな比率に依存し得る。
【０００６】
多くの他の治療薬およびその他の調整薬剤は、ポリペプチドまたは、例えば、小分子である。ここで再び、標的細胞集団に到達する薬剤の量は、処置の効力に対して大きなインパクトを有し得る。従って、細胞または細胞の集団に送達される薬剤の量を増強し得る化合物および方法に対する必要性が存在する。
【０００７】
本発明は、このおよびその他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、薬剤の細胞への送達を増強し得る化合物を提供する。本発明の送達増強化合物は、代表的には式Ｉを有する：
【０００９】
【化２７】
2010070565.tif 000002
ここで：ｍおよびｎは同じかまたは異なり、そして各々は２−８の整数であり；Ｒはカチオン性基であるか、または
【００１０】
【化２８】
2010070565.tif 000003
であり、
Ｘ１は、コール酸基またはデオキシコール酸基であり；
そして、Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、コール酸基、デオキシコール酸基およびサッカリド基からなる群から選択され、
ここでＲが
【００１１】
【化３１】
2010070565.tif 000004
であるときＸ２およびＸ３の少なくとも１つがサッカリド基である。
【００１２】
本発明の好適な送達増強化合物のいくつかの例は、図２１に示されるような式ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶを有する化合物である。
【００１３】
いくつかの実施態様では、送達増強化合物は式ＩＩを有する：
【００１４】
【化３２】
2010070565.tif 000005
ここでＸ１およびＸ２はコール酸基およびデオキシコール酸基からなる群から選択され：
そしてＸ３はサッカリド基である。
【００１５】
本発明はまた、式Ｉの送達増強化合物を含む処方物中で、薬剤を細胞に投与することにより薬剤を送達する方法を提供する。
【００１６】
さらなる実施態様で、本発明は、薬剤を細胞に送達するための組成物を提供する。この組成物は、送達されるべき薬剤および式Ｉの送達増強化合物を含む。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、細胞に、式Ｉの化合物を含む緩衝液中に処方される治療的に有効な量の治療薬剤を投与することにより、膀胱癌を含む癌を処置する方法である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）細胞に薬剤を送達する方法であって、該薬剤を、該細胞に、式Ｉ：
【化１】
2010070565.tif 000006
ここで：ｍおよびｎは同じかまたは異なり、そして各々は２〜８の整数であり；Ｒはカチオン基であるか、または
【化２】
2010070565.tif 000007
であり、Ｘ１はコール酸基またはデオキシコール酸基であり；
Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、コール酸基、デオキシコール酸基およびサッカリド基からなる群から選択され、
ここで、Ｒが
【化５】
2010070565.tif 000008
であるとき、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つがサッカリド基である、
の送達増強化合物を含む組成物中で投与する工程を包含する、方法。
（項目２）前記送達増強薬剤の存在下で前記細胞に送達される薬剤の量が、該薬剤が該送達増強化合物の非存在下で投与されるときに該細胞に送達される該薬剤の量に比較して増加する、項目１に記載の方法。
（項目３）前記薬剤が治療用薬剤である、項目１に記載の方法。
（項目４）前記送達増強化合物の濃度が約０．００２〜約２ｍｇ／ｍｌである、項目１に記載の方法。
（項目５）前記送達増強化合物の濃度が約０．０２〜約２ｍｇ／ｍｌである、項目４に記載の方法。
（項目６）前記送達増強化合物の濃度が約０．２〜２ｍｇ／ｍｌである、項目５に記載の方法。
（項目７）前記細胞が組織として提供される、項目１に記載の方法。
（項目８）前記組織が器官である、項目１に記載の方法。
（項目９）前記投与が膀胱内投与による、項目１に記載の方法。
（項目１０）前記薬剤がタンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目１１）前記薬剤が遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目１２）前記遺伝子がベクター内で投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）前記ベクターがウイルスベクターである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）前記ウイルスベクターが、ウイルスベクターの約１×１０８粒子／ｍｌ〜約５×１０１１粒子／ｍｌを含む懸濁液として投与される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）前記懸濁液が、ウイルスベクターの約１×１０９粒子／ｍｌ〜約１×１０１１粒子／ｍｌを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）前記遺伝子が治療用遺伝子である、項目１１に記載の方法。
（項目１８）前記治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）前記腫瘍サプレッサー遺伝子がｐ５３である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）前記腫瘍サプレッサー遺伝子が網膜芽腫遺伝子である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）前記網膜芽腫腫瘍サプレッサー遺伝子が完全長ＲＢタンパク質をコードする、項目２０に記載の方法。
（項目２２）前記網膜芽腫腫瘍サプレッサー遺伝子がｐ５６ＲＢをコードする、項目２０に記載の方法。
（項目２３）前記細胞が癌細胞である、項目１７に記載の方法。
（項目２４）前記癌細胞が膀胱癌細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）前記癌細胞が組織として提供される、項目２３に記載の方法。
（項目２６）前記送達増強化合物が前記薬剤の投与前に投与される、項目１に記載の方法。
（項目２７）前記送達増強化合物が前記薬剤とともに投与される、項目１に記載の方法。
（項目２８）細胞に薬剤を送達するための組成物であって、該薬剤および式Ｉ：
【化６】
2010070565.tif 000009
ここで：ｍおよびｎは同じかまたは異なり、そして各々は２−８の整数であり；Ｒはカチオン基であるか、または
【化７】
2010070565.tif 000010
であり、Ｘ１はコール酸基またはデオキシコール酸基であり；
Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、コール酸基、デオキシコール酸基およびサッカリド基、からなる群から選択され、
ここで、Ｒが
【化１０】
2010070565.tif 000011
であるとき、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つがサッカリド基である、
の送達増強化合物を含む、組成物。
（項目２９）前記サッカリド基が１つ以上のペントースまたはヘキソース残基を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）前記サッカリド基が、ペントースモノサッカリド基、ヘキソースモノサッカリド基、ペントース−ペントースジサッカリド基、ヘキソース−ヘキソースジサッカリド基、ペントース−ヘキソースジサッカリド基、およびヘキソース−ペントースジサッカリド基からなる群が選択される、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）前記サッカリド基がトリサッカリドである、項目２８に記載の組成物。
（項目３２）前記送達増強化合物の濃度が約０．００２〜約２ｍｇ／ｍｌである、項目２８に記載の組成物。
（項目３３）前記送達増強化合物の濃度が約０．０２〜約２ｍｇ／ｍｌである、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）前記薬剤が細胞中に存在するとき該薬剤が該細胞中の生物学的プロセスを調整する、項目２８に記載の組成物。
（項目３５）前記生物学的プロセスが、細胞成長、分化、増殖、代謝経路、生合成経路、遺伝子発現、疾患関連プロセス、および免疫応答からなる群から選択される、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）前記薬剤がポリヌクレオチドを含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３７）前記ポリヌクレオチドが、アンチセンス核酸、三重鎖形成性核酸、およびポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸からなる群から選択される、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）前記遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子である、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）前記腫瘍サプレッサー遺伝子が、網膜芽腫遺伝子およびｐ５３遺伝子からなる群から選択される、項目３７に記載の組成物。
（項目４０）前記組成物がポリマーマトリックスをさらに含む、項目２８に記載の組成物。
（項目４１）前記組成物が粘接着剤をさらに含む、項目２８に記載の組成物。
（項目４２）式Ｉ：
【化１１】
2010070565.tif 000012
ここで：ｍおよびｎは同じかまたは異なり、そして各々は２−８の整数であり；Ｒはカチオン基であるか、または
【化１２】
2010070565.tif 000013
であり、Ｘ１はコール酸基またはデオキシコール酸基であり；
Ｘ２およびＸ３は、各々独立して、コール酸基、デオキシコール酸基およびサッカリド基、からなる群から選択され、
ここで、Ｒが
【化１５】
2010070565.tif 000014
であるとき、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つがサッカリド基である：
を有する、送達増強化合物。
（項目４３）Ｒが、ＮＭｅ３＋およびＮＨ３＋からなる群から選択されるカチオン基である、項目４２に記載の化合物。
（項目４４）前記サッカリド基が、１つ以上のペントースまたはヘキソース残基を含む、項目４２に記載の化合物。
（項目４５）前記サッカリド基が、ペントースモノサッカリド基、ヘキソースモノサッカリド基、ペントース−ペントースジサッカリド基、ヘキソース−ヘキソースジサッカリド基、ペントース−ヘキソースジサッカリド基、およびヘキソース−ペントースジサッカリド基からなる群が選択される、項目４４に記載の化合物。
（項目４６）前記サッカリド基が、３〜約８のモノサッカリド残基を含む、項目４２に記載の化合物。
（項目４７）前記サッカリド基がトリサッカリドである、項目４６に記載の化合物。
（項目４８）Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つがサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目４９）ｍおよびｎの各々が独立に２または３である、項目４２に記載の化合物。
（項目５０）Ｘ１およびＸ２が両方ともコール酸基であり、かつＸ３がサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目５１）前記サッカリド基がヘキソース−ヘキソースジサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目５２）ｍおよびｎが各々３であり、Ｘ１およびＸ２の両方がコール酸基であり、かつＸ３がヘキソースモノサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目５３）ｍおよびｎが各々３であり、Ｘ１およびＸ３の両方がコール酸基であり、かつＸ２がヘキソースモノサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目５４）ｍおよびｎが各々３であり、Ｘ１およびＸ２の両方がコール酸基であり、かつＸ３がヘキソース−ヘキソースジサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目５５）ｍおよびｎが各々３であり、Ｘ１およびＸ３の両方がコール酸基であり、かつＸ２がヘキソース−ヘキソースジサッカリド基である、項目４２に記載の化合物。
（項目５６）前記化合物が式ＩＩＩ：
【化２１】
2010070565.tif 000015
を有する、項目４２に記載の化合物。
（項目５７）前記化合物が式ＩＶ：
【化２２】
2010070565.tif 000016
を有する、項目４２に記載の化合物。
（項目５８）前記化合物が式Ｖ：
【化２３】
2010070565.tif 000017
を有する、項目４２に記載の化合物。
（項目５９）式ＩＩ：
【化２４】
2010070565.tif 000018
ここで、Ｘ１およびＸ２が、コール酸基およびデオキシコール酸基からなる群から選択され：
かつＸ３がサッカリド基である、送達増強化合物。
（項目６０）Ｘ１およびＸ２の両方がコール酸基であり、かつＸ３がグルコース基である、項目５９に記載の化合物。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、膀胱内投与後のラット膀胱上皮におけるアデノウイルス媒介遺伝子移入および発現に対する処方物の影響を示す。
【図２】図２は、膀胱内投与後の膀胱上皮細胞中のアデノウイルストランスジーン発現を示す。
【図３】図３は、膀胱内投与後のラット膀胱における用量依存性アデノウイルストランスジーン発現を示す。
【図４】図４は、膀胱内投与後のマウス膀胱における組換えアデノウイルストランスジーン発現の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を示す。
【図５】図５は、ウイルスの膀胱内投与後の、膀胱、腎臓、および肝臓組織における組換えアデノウイルストランスジーン発現の時間経過を示す。
【図６】図６は、膀胱内投与後の膀胱および腎臓ホモジネート中の組換えアデノウイルストランスジーンＤＮＡを示す。
【図７】図７は、ＢｉｇＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ，ビス−（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−コラミド（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）処方物を用いる膀胱上皮への遺伝子移入の改良を示す。
【図８】図８は、７ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ処方物中の異なる濃度の組換えアデノウイルスを用いる膀胱上皮への遺伝子移入の改良を示す。
【図９】図９は、エタノール（ＥＴＯＨ）またはＢｉｇ  ＣＨＡＰ処方物を用いることによる膀胱組織中の組換えアデノウイルストランスジーンの増強を示す。
【図１０】図１０は、４ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ処方物を用いる腫瘍への遺伝子移入を示す。
【図１１】図１１は、ブタ膀胱上皮へのトランスジーン移入を示す。
【図１２】図１２は、腫瘍組織中のｐ５３の発現を示す。
【図１３】図１３は、ラット回腸の粘膜への遺伝子移入を示す。
【図１４】図１４は、ラットからの膀胱切片の写真である。ここで、２つの供給源からのＢｉｇ  ＣＨＡＰの遺伝子移入を増強する能力が比較された。下の列における、上の列に比較したより強いＸｇａｌ染色は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）からのＢｉｇ  Ｃｈａｐに比較したＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７からのＢｉｇ  ＣＨＡＰによる遺伝子移入のより大きな増強を示した。
【図１５】図１５のＡおよびＢは、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７およびＳｉｇｍａからのＢｉｇ  ＣＨＡＰの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を示す。ＢＣ−Ｓｉｇｍａの試料からは１つの明瞭なバンドのみが展開されたが（図１５Ｂ）、ＢＣ−ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７の試料には３つのさらなるバンドが明瞭になった（図１５Ａ）。
【図１６】図１６は、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ不純物のＴＬＣを示す。レーンは以下のようにラベルされる：レーン１：Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）；レーン２：不純物Ｉ；レーン３：不純物ＩＩ；レーン４：不純物ＩＩおよびＩＩＩの混合物；レーン５：不純物ＩＩＩ；レーン６：純粋Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）；レーン７：Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）。
【図１７】図１７は、ラットからの膀胱切片の写真である。ここで、漸増濃度のＢｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）の遺伝子移入を増強する能力が、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）標準に対して比較された。より強いＸｇａｌ染色は、より高い濃度のＢｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）において増強した遺伝子移入を示した。
【図１８】図１８は、ラットからの膀胱切片の写真である。ここで、精製後のＢｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）およびＢｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）の遺伝子移入を増強する能力が、評価され、そしてコントロールとしてそれらの供給源からの精製されていないＢｉｇ  ＣＨＡＰに対して比較された。Ｘｇａｌ染色の強度は、いずれかの供給源由来のＢｉｇ  ＣＨＡＰがカラムクロマトグラフィーによって精製された後の遺伝子移入を増強する能力の減少を示した。
【図１９】図１９は、ラットからの膀胱切片の写真である。ここで、精製後のＢｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）およびＢｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）の遺伝子移入を増強する能力を評価し、そしてこれらの供給源からの非精製Ｂｉｇ  ＣＨＡＰと、ならびに不純物Ｉおよび不純物ＩＩと不純物ＩＩＩとの組み合わせと比較した。Ｘｇａｌ染色の強度は、６ｍｇ／ｍｌの不純物ＩＩと不純物ＩＩＩとの組み合わせを用いた遺伝子移入の増強を示した。
【図２０】図２０は、ラットからの膀胱切片の写真である。ここで、精製後のＢｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）の遺伝子移入を増強する能力を評価し、そして不純物ＩＩ、不純物ＩＩＩ、または不純物ＩＩの合成アナログで再構成された精製Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）と比較した。Ｘｇａｌ染色の強度は、精製Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）が再構成されたときの遺伝子移入の増強を示した。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）をコントロールとして含める。
【図２１】図２１は、Ｓｙｎ３およびＳｙｎ３の２つの水溶性アナログの構造を示す。２つのアナログ中で保存されているＳｙｎ３のドメインを「Ａ」として示す。アナログＡ−ＴＭＡおよびＡ−ＨＣｌは、Ｓｙｎ３のラクトース部分を塩化トリメチルアンモニウム（Ａ−ＴＭＡ）または塩化水素（Ａ−ＨＣｌ）で置換して得られた。
【図２２】図２２は、不純物１の構造、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図２３】図２３は、不純物２の構造、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図２４】図２４は、不純物３の構造、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図２５】図２５は、不純物２の合成経路を示す。
【図２６】図２６は、Ｓｙｎ３の合成経路を示す。Ｓｙｎ３合成の代替経路を図３４に示す。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｃは、Ｉ３Ａ（Ｓｙｎ３）がアデノウイルス媒介βガラクトシド発現を増強することを示す。高レベルの遺伝子移入が、７．８ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ中０．５ｍｇ／ｍｌでＩ３Ａを用いるときに得られた（図２７Ａ）。コントロールを比較のために示す：Ｉ３Ａなし（図２７Ｂ）、およびポジティブコントロールとしての７．８ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍロット番号６７９６９３（図２７Ｃ）。
【図２８】図２８Ａおよび図２８Ｂは、Ｉ３Ａ（Ｓｙｎ３）の遺伝子移入増強活性の滴定の結果を示す。３．９ｍＭのＢｉｇ  ＣＨＡＰ中の０．２５ｍｇ／ｍｌへのＩ３Ａの低減（図２８Ａ）はなお、７．８ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ中の０．５ｍｇ／ｍｌのＩ３Ａを用いたときに得られた遺伝子移入活性（図２８Ｂ）と比較してなお高レベルの遺伝子移入を生じた。固定のとき、０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｉ３Ａで処理した膀胱は、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｉ３Ａで処理した膀胱に比べより少ない炎症を有するようであった。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｂは、Ｉ３ＡおよびＳｙｎ３遺伝子移入活性の比較を示す。高レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性が、Ｉ３Ａを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０中１ｍｇ／ｍｌで用いて得られた（図２９Ａ）。ほぼ等しいレベルの遺伝子移入が、Ｓｙｎ３を０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０中の１ｍｇ／ｍｌで用いて得られた（図２９Ｂ）。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｄは、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０対７．８ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰにおけるＳｙｎ３遺伝子移入活性の比較を示す。０．１％Ｔｗｅｅｎ８０中１ｍｇ／ｍｌでＳｙｎ３を用いて（図３０Ａ）、７．８ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ中０．５ｍｇ／ｍＬでＳｙｎ３を用いたときに得られたレベル（図３０Ｃ）に匹敵したレベルの遺伝子移入を得た。０．１％Ｔｗｅｅｎ８０（図３０Ｂ）または７．８ｍＭ  ＢｉｇＣＨＡＰ（図３０Ｄ）のいずれかを用いるときのネガティブコントロール（Ｓｙｎ３なし）もまた示される。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｄは、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰおよびＴｗｅｅｎ８０界面活性剤中の同濃度でのＳｙｎ３遺伝子移入活性の比較を示す。Ｓｙｎ３を、７．８ｍＭ  ＢｉｇＣＨＡＰ中０．５ｍｇ／ｍｌで溶解したとき（図３１Ａ）、非常に高いレベルの遺伝子移入が得られた。これに対し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０中のＳｙｎ３の遺伝子移入活性（図３１Ｃ）は、β−ガラクトシダーゼ活性が欠如したより多くの領域とともにわずかに減少した。７．８ｍＭ  ＢｉｇＣＨＡＰ（図３１Ｂ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０（図３１Ｄ）の両方に対するネガティブコントロールもまた示す。
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｆは、Ｓｙｎ３投与後の浸潤の比較を示す。Ｓｙｎ３のより低い用量で、膀胱において比例的により低い浸潤が観察された。漸減濃度のＳｙｎ３を、ＢｉｇＣＨＡＰ（図３２Ａ、Ｂ）またはＴｗｅｅｎ８０（図３２Ｄ、Ｅ）のいずれかを用いたとき、膀胱のｒＡｄ感染において用いた。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（図３２Ｃ）またはＴｗｅｅｎ８０（図３２Ｆ）のいずれかとともに界面活性剤のみ（Ｓｙｎ３なし）で処理した膀胱もまた示される。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｄは、Ｓｙｎ３の投与が、細胞浸潤の誘導を生じることを示す投与を示す。ウイルスおよびＳｙｎ３の投与から得られる浸潤のレベル（図３３Ａ）を、Ｓｙｎ３単独から得られたレベル（図３３Ｂ）と比較したとき、Ｓｙｎ３投与が、浸潤の顕著な誘導を生じることが見出された。ウイルス単独（図３３Ｃ）またはウイルスなし／Ｓｙｎ３なしコントロール（図３３Ｄ）で処理した動物からの膀胱もまた示される。
【図３４】図３４は、Ｓｙｎ３の合成経路を示す。反応３をＤＭＦ中で２４時間行った後、産物をエバポレートして乾燥し、そしてＳｉＯ２上でＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６０：３５：５）を用いて精製した。
【図３５】図３５は、水溶液中で増加した溶解性を示す、Ｓｙｎ３のアナログであるＡ−ｔｍａおよびＡ−ＨＣｌを合成するために用いたプロトコルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（詳細な説明）
本発明は、上皮組織中に存在する細胞のような細胞への薬剤の輸送を増強する送達増強化合物および処方物を提供する。この化合物および処方物は、例えば、増殖または疾患状態に関連する細胞プロセスを調整し得、細胞に進入しおよび／または薬剤を取り込む組織または器官中の細胞の比率を増強する薬剤のような薬剤の量を増強し得る。本発明の送達増強化合物を用いる薬剤の細胞への送達方法もまた、提供される。
【００２０】
本発明の送達増強化合物および方法は、細胞への分子の送達を必要とする多くの適用に有用である。例えば、多くの疾患状態の診断および／または処置は、しばしば、疾患プロセスに関与する細胞への薬剤の進入を必要とする。別の例は、細胞培養物中または組換え生物中のいずれかの目的のタンパク質を産生するための組換えＤＮＡ技術の使用である。細胞中に化合物を導入することが所望される状況の多くのさらなる例は、当業者に公知である。本発明の化合物および方法は、目的薬剤の標的細胞または組織への増強した送達に起因してこれらの適用の各々の有効性を改善し得る。
【００２１】
（Ａ．送達増強化合物）
本発明は、目的の薬剤と処方されるとき、この薬剤の細胞への送達を増強する送達増強化合物を提供する。いくつかの実施態様では、細胞は、組織または器官中に存在する。「送達増強化合物」とは、細胞、組織または器官への薬剤の送達を増強する任意の化合物をいう。増強した送達が生じる機構の理解は、本発明の実施には必須ではないが、増強した送達が任意の種々の機構によって生じ得ることに注目すべきである。１つのそのような機構は、送達増強化合物による組織または器官の上皮表面上の保護グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層の破壊を含み得る。
【００２２】
送達増強化合物を含む処方物中の薬剤を細胞に投与することは、送達増強化合物の非存在下で投与されるときに細胞に送達される薬剤の量に対して、細胞に送達される薬剤の量の増強を生じさせる。本明細書で用いる「増強した送達」とは、各細胞に進入する薬剤のコピー数の増加、または、例えば組織または器官中の薬剤を取り込む細胞の比率の増加のいずれか、または両方をいう。好適な実施態様では、送達増強化合物は、送達増強化合物の非存在下で細胞に投与されるとき送達される薬剤の量に比較して、細胞または細胞の集団への薬剤の送達において、少なくとも約２０％の増加、より好ましくは少なくとも約５０％の増加、そして最も好ましくは少なくとも約１００％の増加を生じる。
【００２３】
特定の化合物または処方物が、治療用薬剤または診断薬剤のような薬剤の細胞への増強送達において有効であるか否かは、当業者に公知の種々の手段により測定し得る。例えば、検出試薬を、標的細胞に投与される送達増強処方物に含め得る。送達増強処方物で処理される細胞中に存在する検出試薬の量は、送達増強化合物を含まない処方物で処理した細胞中で検出された量と比較される。例として、目的の薬剤が、遺伝子または遺伝子を含むベクターである場合、発現が容易に検出可能なレポーター遺伝子を処方物中に含め得る。調整薬剤がポリペプチドである場合、送達増強化合物を、例えば、標識を送達増強処方物中に存在するポリペプチドに結合させ、そして処方物の投与の後標的細胞中に見出される標識の存在および量を検出することにより試験し得る。同様に、調整薬剤としてポリペプチドおよびポリヌクレオチド以外の分子が用いられるべき場合、分子を標識し得、そして標的細胞集団に進入する量の標識を検出し得る。
【００２４】
送達増強化合物の例は、界面活性剤、アルコール、グリコール、界面活性剤、胆汁酸塩、ヘパリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高浸透圧塩溶液、および酢酸塩を含むが、これらに限定されない。アルコールは、例えば、エタノール、Ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコールのような脂肪族アルコールを含む。グリコールは、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングルコール、およびグリセロールおよびチオグリセロールのようなその他の低分子量グリコールを含む。酢酸、グルコン酸、および酢酸ナトリウムのような酢酸塩は、送達増強化合物のさらなる例である。１Ｍ  ＮａＣｌのような高浸透圧塩溶液もまた、送達増強化合物の例である。界面活性剤の例は、ドデシル硫酸ナトウリム（ＳＤＳ）およびリゾレシチン、ポリソルベート８０、ノニルフェノキシ−ポリオキシエチレン、リゾホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール４００、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコールエーテル界面活性剤およびＤＭＳＯを含む。タウロコール酸、タウロ−デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸、および硝酸銀のようなその他の収斂剤のような胆汁酸塩もまた、プロタミン硫酸塩のような第４級アミンのようなヘパリンアンタゴニストが用いられ得るように、用いられ得る。例えば、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸のようなシクロオキシゲナーゼインヒビター、ならびにインドメタシン、ナプロキセン、およびジクロフェナックのような非ステロイド抗炎症性薬剤（ＮＳＡＩＤＳ）もまた適切である。
【００２５】
送達増強化合物として機能し得る界面活性剤は、例えば、アニオン性、カチオン性、両イオン性、および非イオン性界面活性剤を含む。例示の界面活性剤は、タウロコール酸、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、セチルピリジウム、塩化ベナルコニウム、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ７３−１４界面活性剤、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオール］−１−プロパンスルホネート水和物、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ、デオキシＢｉｇ  ＣＨＡＰ、ＴＲＩＴＯＮ７−Ｘ−１００界面活性剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ７−Ｆ６８界面活性剤、ＴＷＥＥＮ  ２０界面活性剤、およびＴＷＥＥＮ７  ８０界面活性剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む。
【００２６】
薬剤が、例えば、核酸である、処方物のための好ましい送達増強化合物の１つの例は、コール酸誘導体であるＢｉｇ  ＣＨＡＰである（例えば、Ｈｅｌｅｎｉｕｓら（１９７９）「界面活性剤の性質」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第６６巻、７３４−７４９頁を参照のこと）。市販のＢｉｇ−ＣＨＡＰ調製物を含む核酸処方物に対する改良された遺伝子移入を容易にするために、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰの濃度は、その市販の供給源を基に変動し得る。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰがＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７から供給されるとき、２〜１０ミリモル濃度の範囲にある濃度が好ましい。より好ましくは４〜８ミリモル濃度である。最も好ましくは約７ミリモル濃度である。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰがＳｉｇｍａから供給されるとき、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰの濃度が、１５〜３５ミリモル濃度の範囲にあることが好ましい。より好ましくは２０〜３０ミリモル濃度である。最も好ましくは、約２５ミリモル濃度である。
【００２７】
さらなる実施態様では、本発明は、式Ｉをもつ送達増強化合物を提供する：
【００２８】
【化３４】
2010070565.tif 000019
式Ｉにおいて、ｍおよびｎは同じかまたは異なるかのいずれかであり得、そして各々は２〜８の整数である。好ましい実施態様では、ｍおよびｎは独立して各々２または３である。
【００２９】
好ましくは、式Ｉ中のＲは、以下の式を有するカチオン基または構造である
【００３０】
【化３５】
2010070565.tif 000020
適切なカチオン基は、化合物に正荷電を提供する任意の部分を含み得る。適切なカチオン基の例は、トリメチルアンモニウムおよびアンモニウムカチオンを含むがこれらに限定されない。
【００３１】
式Ｉ中のＸ１は、一般に、コール酸基またはデオキシコール酸基であり；
そしてＸ２およびＸ３は、それぞれ独立して、コール酸基、デオキシコール酸基およびサッカリド基からなる群から選択され、
Ｘ３が分子中に存在するとき、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つはサッカリド基である。
【００３２】
本発明の送達増強化合物において用いられ得るサッカリド基は、モノサッカリドであり得るか、またはホモオリゴサッカリドまたはヘテロオリゴサッカリドのいずれかで連結した１つを超えるモノサッカリドを含み得る。好ましいモノサッカリドは、ペントース残基および／またはヘキソース残基を含む。例えば、サッカリド基は、ペントースモノサッカリド基、ヘキソースモノサッカリド基、ペントース−ペントースジサッカリド基、ヘキソース−ヘキソースジサッカリド基、ペントース−ヘキソースジサッカリド基、およびヘキソース−ペントースジサッカリド基からなる群から選択され得る。Ｘ３について好ましいサッカリド基の１つはラクトースである。
【００３３】
いくつかの実施態様では、式Ｉの送達増強化合物は、３つ以上のモノサッカリドからなるサッカリド基としてＸ２および／またはＸ３を有する。好ましくは、サッカリド基は１〜８のモノサッカリド、より好ましくは、１〜４のモノサッカリド、および最も好ましくは、約２〜３のモノサッカリドを有する。例えば、トリサッカリドの使用は、増強した溶解度をもつ化合物を提供し得る。
【００３４】
本発明の適切な送達増強化合物の例は、Ｘ１およびＸ２が両方ともコール酸基であり、かつＸ３がサッカリドである式Ｉの化合物を含むが、これに限定されない。
【００３５】
他の実施態様は、例えば、Ｘ１およびＸ２の両方をデオキシコール酸基として、かつＸ３をサッカリド基として有する。好ましい化合物はまた、ｎが２または３であり、Ｘ１およびＸ２が両方ともコール酸基であり、かつＸ３がヘキソースモノサッカリド基である化合物；ｎが２または３であり、Ｘ１およびＸ３の両方がコール酸基であり、かつＸ２がヘキソースモノサッカリド基である化合物；およびｎが２または３であり、Ｘ１およびＸ２の両方がコール酸基であり、かつＸ３がヘキソース−ヘキソースジサッカリド基である化合物を含む。
【００３６】
ｎが２または３であり、Ｘ１およびＸ３が両方ともコール酸基であり、かつＸ２がヘキソース−ヘキソースジサッカリド基である化合物、または、ｎが２または３であり、Ｘ１およびＸ２が両方ともコール酸基であり、かつＸ３がヘキソース−ペントースジサッカリド基である化合物もまた適切である。
【００３７】
特にＸ３位でトリサッカリド基を有する式Ｉの化合物もまた好ましい。
【００３８】
本発明の好ましい送達増強化合物の１つの例は、図２１で示されるような式ＩＩＩを有するＳｙｎ３である。Ｓｙｎ３は、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰの市販の調製物中に見出された不純物の合成アナログである（実施例参照）。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰの不純物２および３もまた、送達増強化合物としての使用に、特に例えば、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰのような界面活性剤を含む可溶化緩衝液中に処方されるとき適切である。
【００３９】
いくつかの適用には、他の化合物と比較して、増強した水溶性および／または送達増強活性を示す送達増強化合物を用いることが所望される。このような化合物もまた、本発明により提供される。例えば、本発明は、Ｒがカチオン基である式Ｉを有する化合物を提供する。適切なカチオン基は、例えば、テトラメチルおよびアンモニウム部分、およびその塩を含む。このような化合物の例は、図２１に示されるようなＡ−ｔｍａ（式ＩＶ）およびＡ−ＨＣｌ（式Ｖ）を含む。改良された溶解度および／または送達増強活性を有する他の化合物は、式Ｉの化合物中のサッカリド基（単数または複数）がトリサッカリドまたはより長い化合物を含む。
【００４０】
いくつかの実施態様では、本発明の送達増強薬剤は式ＩＩを有し：
【００４１】
【化４５】
2010070565.tif 000021
ここで、Ｘ１およびＸ２は、コール酸基およびデオキシコール酸基からなる群から選択され；
かつＸ３は、サッカリド基である。適切なサッカリド基は、式Ｉの化合物について議論された上記の基を含む。適切な化合物の１つの例では、Ｘ１およびＸ２の両方が、コール酸基であり、かつＸ３がグルコース基である化合物を含むがこれに限定されない。
【００４２】
適切な化合物のさらなる例は、Ｘ１およびＸ２の両方がコール酸基またはデオキシコール酸基からなる群から選択され；
かつ、Ｘ３がラクトース基である化合物を含むがこれに限定されない。
【００４３】
本発明はまた、細胞に送達されるべき薬剤および送達増強化合物を含む処方物を提供する。処方物中の送達増強化合物の濃度は、用いられている特定の送達増強化合物、緩衝液、ｐＨ、標的組織または器官、および投与の様式のような多くの因子に依存する。送達増強化合物の濃度は、しばしば、１％〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは、１０％〜４０％（ｖ／ｖ）、そして最も好ましくは、１５％〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲にある。本発明の送達増強化合物は、本発明の処方物中、好ましくは、約０．００２〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌの範囲、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で用いられる。
【００４４】
代表的には、本発明の送達増強化合物は化合物が可溶である溶媒中に処方されるが、化合物が部分的に可溶化されるのみである処方物もまた好適である。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）は、これら化合物の適切な可溶化剤の１つの例であり、そしてその他は当業者に公知である。特定のさらなる賦形剤および添加剤が、種々の薬学的処方物のためにこれら薬剤の溶解性特徴を達成するために所望され得ることが認識される。例えば、界面活性剤、脂肪酸エステル、界面活性剤のような周知の可溶化剤は、使用される種々の溶媒における化合物の可溶化を容易にするように適切な濃度で添加され得る。処方物が界面活性剤を含む場合、患者に投与される最終処方物中の界面活性剤濃度は、好ましくは、約０．５−２×臨界ミセル化濃度（ＣＭＣ）である。適切な界面活性剤は上記列挙されたものを含む。適切な界面活性剤およびそれらの使用のための適切な濃度の同定は、本明細書に記載のように決定され得る。
【００４５】
Ｓｙｎ３および関連化合物のような化合物に対する好ましい可溶化剤の１つの例は、約０．０５％〜約０．３％濃度の、より好ましくは約０．１０％〜約０．１５％の濃度のＴｗｅｅｎ８０である。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰもまたＳｙｎ３および関連化合物のための好ましい可溶化剤である。
【００４６】
本発明の化合物は単独で、互いに組み合わせて、または別の送達増強薬剤と組み合わせて使用され得る。
【００４７】
（Ｂ．調整性薬剤）
本発明の送達増強化合物は、タンパク質、核酸、アンチセンスＲＮＡ、低分子等を含む薬剤の細胞への送達を増強するに有用である。例えば、送達増強化合物は、上皮膜を有する細胞を含む、任意の繊維または器官の部分である細胞へと薬剤を送達するのに有用である。
【００４８】
送達増強化合物を使用する送達に適切である薬剤の中で、本明細書中で使用される「調整性薬剤」とは、生物学的プロセスを調節し得る薬剤をいう。このようなプロセスは、例えば、細胞成長、分化、増殖（ガンのような新形成性障害を含む）、調節、代謝経路または生合成経路、遺伝子発現などを含む。調整性薬剤はまた、例えば免疫応答（自己免疫障害を含む）、細菌および真菌病原体による感染、ならびに調整性薬剤の導入により調節可能である任意の他の生物学的プロセスに影響し得る。
【００４９】
治療用薬剤は、送達増強薬剤を使用して送達し得る調整性薬剤の例である。このような薬剤は疾患に関連する細胞性プロセスを調整するのに有用である。本明細書中で使用される、用語「治療用薬剤」には、治療用タンパク質、治療用遺伝子、治療用遺伝子を含むベクター（プラスミドまたはウイルスベクター）、アンチセンス核酸または他の治療用核酸配列（例えば、三重鎖核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、用語「治療用遺伝子」とは、細胞中に導入されて治療効果を達成する核酸配列をいう。このような治療用遺伝子の例には、腫瘍サプレッサー遺伝子、自殺遺伝子、アンチセンス核酸分子、三重鎖形成核酸分子、サイトカイン（例えば、インターフェロンα、β、δおよびγであるが、これらに限定されない）をコードする遺伝子、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩＬ−１０）をコードする遺伝子、ならびにＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例において、治療用遺伝子は、天然に存在するか、または組換え的に改変されたウイルス中に存在し得る。自殺遺伝子は、その発現が細胞を外部因子による殺傷に対して感受性にさせるか、または、その発現が細胞において毒性状態を引き起こす核酸配列である。自殺遺伝子の周知の例には、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（例えば、Ｗｏｏら、米国特許第５，６３１，２３６号（１９９７年５月２０日発行）；Ｆｒｅｅｍａｎら、米国特許第５，６０１，８１８号（１９９７年２月１１日発行））があり、ここで、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与による選択的殺傷に対して感受性である。
【００５０】
アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチドの特定の配列に結合してタンパク質（疾患を引き起こすタンパク質を含む）の産生を阻害するように設計された、核酸の相補的オリゴヌクレオチド鎖である。特定のオンコジーンに結合するアンチセンス分子は、これらのガン発症因子の転写を阻害するために頻繁に使用される。これらの薬剤は単独で、または他の治療用遺伝子と組み合わせて使用され得る。
【００５１】
三重鎖形成核酸は遺伝子の転写を阻害するように設計された分子であり、例えば、疾患発症遺伝子を含む。一般的には、このことは三重鎖形成核酸の、標的遺伝子の転写制御配列への結合および標的遺伝子の転写の阻害により達成される。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合に起因する二本鎖ＤＮＡの主溝を認識し、そして結合する。三重鎖技術の使用の例には、前立腺ガン細胞における、アンドロゲンレセプターまたはインスリン様成長因子遺伝子の三重鎖技術を用いた標的化が含まれる。Ｂｏｕｌｉｋａｓら、Ｔ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７（３Ａ）：１４７１−１５０５（１９９７）。三重鎖核酸は、いくつかの例において変異誘発性であることが実証されており、そしてこのような分子が使用されて、治療様式で腫瘍サプレッサー遺伝子の誘導を導く内因性ＤＮＡ修復機構の応答を誘導し得、そして標的細胞においてアポトーシスを誘導するゲノム不安定性に寄与し得る。種々の三重鎖核化合物が現在研究中であり、そして科学文献において非常に良く報告されている。
【００５２】
「腫瘍サプレッサー遺伝子」とは、腫瘍の形成を抑制するポリペプチドをコードする遺伝子をいう。腫瘍サプレッサー遺伝子は、哺乳動物細胞において天然に存在する遺伝子であり、その欠損または不活化が腫瘍の発生についての必要条件であると考えられている。腫瘍サプレッサー遺伝子治療は、一般に、腫瘍サプレッサー遺伝子の、その遺伝子が存在しないか不活化されている細胞への再導入を試みる。本発明の実施に有用な腫瘍サプレッサー遺伝子の例には、ｐ５３、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ１６およびｐ２１を含む腫瘍サプレッサー遺伝子のＩＮＫ４ファミリーのメンバー、ならびにｐ５６Ｒｂ、ｐ９４Ｒｂ等のようなその治療的に有効なフラグメントが挙げられる。本発明の好ましい実施には、腫瘍サプレッサー遺伝子はＲｂ遺伝子およびｐ５３遺伝子、ならびにＲｂ５６のような、それらの機能的改変体をコードする核酸配列から選択される。本発明の最も好ましい実施において、腫瘍サプレッサー遺伝子はｐ５３である。
【００５３】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、送達増強化合物を含む緩衝液中に治療用薬剤の「治療的有効」量を含む。本発明で使用される「治療的有効」とは、疾患状態に関連する症状の予防、減少または治癒をいう。
【００５４】
送達増強薬剤およびこれらの薬剤を含む処方物はまた、目的の遺伝子の、細胞、特に器官または組織の細胞への送達を容易にするために使用され得る。これらの遺伝子は、例えば、商業目的について興味深いタンパク質をコードし得る。例として、薬剤および処方物を使用して、哺乳動物の乳房組織へ栄養的に重要なタンパク質（これは、次いで、哺乳動物によって産生される乳汁中に分泌される）をコードする遺伝子を送達し得る。このような薬剤および処方物の他の使用は当業者に明らかである。送達増強薬剤およびこのような薬剤を含む処方物はまた、診断用薬剤を、細胞、器官および組織に送達するために有用である。診断用薬剤の例には、細胞内で発現された場合に容易に検出可能であるタンパク質をコードするマーカー遺伝子（β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含むがこれらに限定されない）および標識された核酸プローブ（例えば、放射標識されたプローブ）が挙げられる。
【００５５】
（Ｃ．遺伝子送達のためのベクター）
細胞に送達される薬剤が遺伝子である場合では、その遺伝子をベクター中に組み込み得る。このような目的に使用されるベクターの例には、標的細胞内で目的の遺伝子の発現を指向し得る発現プラスミドが挙げられる。他の例において、ベクターはウイルスベクター系であり、ここで目的の遺伝子は標的細胞をトランスフェクトし得るウイルスゲノムに組み込まれる。目的の遺伝子が標的細胞内での発現のために設計される場合、遺伝子は、所望の標的宿主細胞内での遺伝子の発現を指向し得る発現配列および制御配列に作動可能に連結され得る。それゆえ、適切な条件下において標的細胞内で遺伝子の発現を達成し得る。
【００５６】
本発明の実施に有用なウイルスベクター系には、例えば、天然に存在するまたは組換えウイルスベクター系が挙げられる。特定の適用に依存して、適切なウイルスベクターには複製コンピテント、複製欠損、および条件的に複製するウイルスベクター系が挙げられる。例えば、ウイルスベクターはヒトアデノウイルスまたはウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウスマイニュートウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルスおよびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスを含むがこれに限定されない）ならびにＭｏＭＬＶのゲノムに由来し得る。代表的には、目的の遺伝子はこのようなベクター中に挿入されて遺伝子構築物のパッケージングを可能にし、代表的には、ウイルスＤＮＡ、感受性宿主細胞の感染および目的の遺伝子の発現が付随する。好ましい組換えウイルスベクターはアデノウイルスベクター送達系であり、これは第ＩＸ遺伝子タンパク質の欠損を有する（国際特許出願ＷＯ９５／１１９８４を参照のこと、これは本明細書中で参考としてその全体が全ての目的のために援用される）。
【００５７】
本明細書中で使用される「組換え」とは、核酸およびこれらによってコードされるタンパク質をいい、ここで、核酸は組換えＤＮＡ技術（「遺伝子操作」とも称される）の方法によって構築される。
【００５８】
調整性遺伝子（例えば、送達増強薬剤を含む緩衝液中に処方される組換えウイルスベクター送達系におけるｐ５３遺伝子または網膜芽細胞腫腫瘍サプレッサー遺伝子）を含む薬学的組成物の治療的有効量は、本発明の教示に従って投与される。例えば、送達増強薬剤を含む緩衝液中に処方される組換えアデノウイルスベクター送達系における治療遺伝子の治療的有効量は、約１×１０８粒子／ｍｌ〜１×１０１２粒子／ｍｌ、より代表的には、約１×１０８粒子／ｍｌ〜５×１０１１粒子／ｍｌ、最も代表的には、約１×１０９粒子／ｍｌ〜１×１０１１粒子／ｍｌ（ＰＮ／ｍｌ）の範囲にある。
【００５９】
（Ｄ．遺伝送達系）
本明細書中で使用される場合、「遺伝子送達系」とは、標的細胞への薬剤の送達のための任意の手段をいう。薬剤は、次いで送達増強化合物を含む処方物を使用して細胞へと送達される遺伝子送達系に付随し得る。
【００６０】
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物または他の薬剤は、ＤＮＡ連結部分のような適切な連結部分を介して、容易にされた取り込み（例えば、被覆されたくぼみの陥入およびエンドソームのインターナリゼーション）のために細胞性レセプターリガンドへと連結される（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；ＷＯ９２／０６１８０）。例えば、遺伝子構築物はポリリジン部分を介してアシアロ−オロムコシド（ｏｒｏｍｕｃｏｃｉｄ）（これは肝細胞のアシアログリコプロテインレセプターについてのリガンドである）へと連結され得る。
【００６１】
同様に、遺伝子構築物のパッケージングのために使用されるウイルスエンベロープは、特定の細胞へのレセプター媒介性エンドサイトーシスを可能にするレセプターに特異的なレセプターリガンドまたは抗体の付加によって改変され得る（例えば、ＷＯ９３／２０２２１，ＷＯ９３／１４１８８，ＷＯ９４／０６９２３を参照のこと）。本発明のいくつかの実施態様において、本発明のＤＮＡ構築物はアデノウイルス粒子のようなウイルスタンパク質に連結されてエンドサイトーシスを容易にする（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：８８５０−８８５４（１９９１））。他の実施態様において、本発明の分子結合体は微小管インヒビター（ＷＯ／９４０６９２２）；インフルエンザウイルス凝血素模倣合成ペプチド（Ｐｌａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））；およびＳＶ４０  Ｔ抗原のような核局在化シグナル（ＷＯ９３／１９７６８）を含み得る。
【００６２】
本発明のいくつかの実施態様において、調整性薬剤はアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして提供され得る（例えば、Ｍｕｒａｙａｍａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７：１０９−１１４（１９９７）を参照のこと）。アンチセンス核酸をコードする遺伝子もまた、提供され得る；このような遺伝子は、当業者に公知の方法により、送達増強薬剤とともに処方され得、そして細胞中に導入され得る。例えば、アンチセンス核酸をコードする遺伝子をウイルスベクター中（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｊｉら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．４：１６７−１７３（１９９７）を参照のこと）中；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ｘｉａｏら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７５６：７６−８３（１９９７）を参照のこと）中または以下を含むがこれらに限定されない他の系中；ＨＶＪ（センダイウイルス）リポソーム遺伝子送達系（例えば、Ｋａｎｅｄａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１：２９９−３０８（１９９７）を参照のこと）；「ペプチドベクター」（例えば、Ｖｉｄａｌら、ＣＲ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ  ３２：２７９−２８７（１９９７）を参照のこと）；エピソームベクターまたはプラスミドベクター中の遺伝子として（例えば、Ｃｏｏｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：６４５０−６４５５（１９９７）、Ｙｅｗら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５７５−５８４（１９９７）を参照のこと）；ペプチド−ＤＮＡ凝集体中の遺伝子として（例えば、Ｎｉｉｄｏｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５３０７−１５３１２（１９９７）を参照のこと）；「裸のＤＮＡ」として（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および米国特許第５，５８９，４６６号を参照のこと）；脂質性ベクター系中で（例えば、Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１４：１７３−２０６（１９９７）を参照のこと）；ポリマーコートリポソーム（Ｍａｒｉｎら、１９９３年５月２５日に発行された、米国特許第５，２１３，８０４号；Ｗｏｏｄｌｅら、１９９１年５月７日に発行された米国特許第５，０１３，５５６号）；カチオン性リポソーム（Ｅｐａｎｄら、１９９４年２月１日に発行された米国特許第５，２８３，１８５号；Ｊｅｓｓｅｅ，Ｊ．Ａ．、１９９６年１１月２６日に発行された米国特許第５，５７８，４７５号；Ｒｏｓｅら、１９９４年１月１８日に発行された米国特許第５，２７９，８３３号；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、１９９４年８月２日に発行された米国特許第５，３３４，７６１号）；気体充填ミクロスフィア（Ｕｎｇｅｒら、１９９６年８月６日に発行された米国特許第５，５４２，９３５号）、リガンド標的化カプセル化高分子（Ｌｏｗら、１９９２年４月２８日に発行された米国特許第５，１０８，９２１号；Ｃｕｒｉｅｌら、１９９６年５月２８日に発行された米国特許第５，５２１，２９１号；Ｇｒｏｍａｎら、１９９６年９月１０日に発行された米国特許第５，５５４，３８６号；Ｗｕら、１９９２年１１月２４日に発行された米国特許第５，１６６，３２０号））に導入し得る。
【００６３】
（Ｅ．薬学的処方物）
薬学的目的のために使用される場合、本発明の処方物は送達増強化合物を含む緩衝液を含む。緩衝液は任意の薬学的に受容可能な緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水またはナトリウムリン酸塩／ナトリウム硫酸塩、Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水および例えばＧｏｏｄら（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５：４６７により記載されるような当業者に公知の他の緩衝液）であり得る。アデノウイルスベクター送達系中に含まれる調整性遺伝子を含む薬学的組成物中の緩衝液のｐＨは、例えば、代表的には６．４〜８．４、好ましくは、７〜７．５、および最も好ましくは７．２〜７．４の範囲である。
【００６４】
さらに、本発明の組成物は安定化剤、増強剤あるいは他の薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含み得る。薬学的に受容可能なキャリアーは生理学的に受容可能な化合物を含み得、これは、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター送達系を安定化するように作用する。生理学的に受容可能な化合物には、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられ得る。他の生理学的に受容可能な化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤または保存剤（これは微生物の増殖または活動を予防するのに特に有用である）が挙げられる。種々の保存剤が周知であり、そして、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、投与経路ならびに組換えアデノウイルスベクター送達系およびそこに含まれる特定の腫瘍サプレッサー遺伝子の特定の生理化学特性に依存して、薬学的に受容可能なキャリアの選択を知る。キャリア、安定化剤またはアジュバントの例は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．第１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９７５）（これは本明細書中に参考として援用される）に見いだされ得る。
【００６５】
（Ｆ．処方物の投与）
いくつかの実施態様において、送達増強化合物は、調整性薬剤が処方される緩衝液中に含まれる。送達増強化合物は、調整性薬剤の前、または調整性薬剤と同時に投与され得る。いくつかの実施態様において、送達増強化合物は、患者への投与の直前に調整性薬剤調製物を送達増強化合物処方物と混合することによって調整性薬剤とともに提供される。他の実施態様において、送達増強化合物および調整性薬剤は投与のために介護者へと単一のバイアル中に提供される。
【００６６】
送達増強薬剤をさらに含む緩衝液中に処方された組換えアデノウイルスベクター送達系中に含まれる、腫瘍サプレッサー遺伝子を含む薬学的組成物の場合では、薬学的組成物は、約５分〜３時間、好ましくは、約１０分〜１２０分、および最も好ましくは約１５分〜９０分の範囲の時間にわたって投与され得る。別の実施態様において、送達増強薬剤は、腫瘍サプレッサー遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター系の投与前に投与され得る。送達増強薬剤の前投与は、腫瘍サプレッサー遺伝子を含むアデノウイルスベクター送達系の投与前約３０秒〜１時間、好ましくは約１分〜１０分、および最も好ましくは約１分〜５分の範囲であり得る。
【００６７】
送達増強薬剤を含む緩衝液中に処方された調整性薬剤は、当業者に公知である任意の送達方法（例えば、腫瘍内または膀胱内投与）を使用して、ガン組織のような新形成性組織を含む任意の組織または器官へと送達され得る。組織および器官には、胃腸管、膀胱、気道および肺のような上皮膜を有する任意の組織または器官を含む。例には、膀胱および上部気道、外陰部、子宮頸管、膣、または気管支のガン腫；腹膜の局所的転移性腫瘍；気管支肺胞ガン腫；胸膜転移性ガン腫；口および扁桃のガン腫；鼻咽頭、鼻、喉頭、食道、胃、結腸および直腸、胆嚢または皮膚のガン腫；あるいは黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のいくつかの実施態様において、治療用薬剤は、粘膜用、局所用および／または頬処方物、特に、粘膜接着用ゲルおよび局所用ゲル処方物中に処方される。経皮送達のための例示的な透過増強化合物、ポリマー性マトリクスおよび粘膜接着性ゲル調製物は、米国特許第５，３４６，７０１号に開示される。このような処方物は、特に、口のガン、頭部および頚部ガン（例えば、気管支上皮のガン）皮膚ガン（例えば、黒色腫、基底および扁平上皮細胞ガン腫）、小腸粘膜のガン、膣粘膜、および子宮頚管ガンの処置のために有用である。
【００６９】
本発明のいくつかの実施態様において、治療用薬剤は、眼への投与のための眼用処方物中に処方される。このような処方物は、必要に応じてｐ５３の送達と組み合わせて、網膜芽細胞腫（ＲＢ）遺伝子の眼への送達に有用である。
【００７０】
（Ｇ．処置方法）
本発明の処方物は、代表的には、薬剤の細胞への移入を増強するために投与される。細胞は組織の一部（例えば、上皮膜）として、または単離された細胞（例えば、組織培養物中で）として、提供され得る。細胞はインビボ、エキソビボまたはインビトロで提供され得る。
【００７１】
送達増強化合物および調整性薬剤を含む処方物は、目的の組織へと、種々の方法によって、インビボまたはエキソビボで導入され得る。本発明のいくつかの実施態様において、調整性薬剤はマイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈澱、リポソーム融合または微粒子銃のような方法により細胞へと導入される。さらなる実施態様において、治療用薬剤は目的の組織により直接的に取り込まれる。
【００７２】
本発明のいくつかの実施態様において、本発明の組成物は患者から外植された細胞または組織へとエキソビボで投与され、次いで患者へと戻される。治療用遺伝子構築物のエキソビボ投与の例には、Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６（５）：１０９８−１１０３（１９９６）；Ｎｏｌｔａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（６）：２４１４−９（１９９６）；Ｋｏｃら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３（１）：４６−６５（１９９６）；Ｒａｐｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２２３（２）：１１６−２６（１９９６）；Ｄａｌｅｓａｎｄｒｏら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉ．Ｓｕｒｇ．，１１（２）４１６−２２（１９９６）；およびＭａｋａｒｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３（１）：４０２−６（１９９６）が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
（実施例）
以下の実施例は例示することを意図するが、本発明の範囲を制限することは意図しない。以下の実施例において、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「ｍｉｎ．」は分を意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、そして「ＰＮ」は粒子数を特定する。全ての温度は、特別に他に記載しない限り、摂氏温度である。
【００７４】
（実施例１）
（エタノールは膀胱中への遺伝子移入を改善する）
最初の実験は、ウイルス濃度、投与時間および用量の容量を含むいくつかの因子が、ラットへの静脈内投与後の膀胱上皮への遺伝子移入に影響を与え得ることを示した。染料の増加した透過が異なる溶媒の膀胱内投与により達成され得るので、アデノウイルス処方物の改変もまた、膀胱内でのアデノウイルストランスジーンの発現を増加させるための代替的ストラテジーとして調査された（Ｍｏｎｓｏｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  １４５：８４２−８４５（１９９１））。本発明の実験は、膀胱内でのアデノウイルストランスジーン発現を増加させるためのエタノールの使用に焦点を当てた。
【００７５】
９匹の雌性ｂｕｆｆａｌｏラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）をイソフルランで麻酔し、そしてｌａｃＺ遺伝子をコードするヒト組換えアデノウイルス（ｒＡｄ−βｇａｌ）の単回膀胱内投与を与えた。ｌａｃＺ遺伝子を含むヒト組換えアデノウイルス（ｒＡｄ−βｇａｌ）ベクターは、Ｗｉｌｌｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１０７９−１０８８（１９９４）に記載される。点滴の前に、膀胱をＰＢＳでフラッシュし、そして空にした。次いで、ｒＡｄ−βｇａｌを希釈して、１．７×１０１１ＰＮ／ｍＬの最終濃度を、１）ＶＰＢＳ（ＰＢＳ中、２％（ｗ／ｖ）スクロースおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ）中に、２）３０％（ｖ／ｖ）エタノール中に、または３）５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中に達成し、そして２５０μＬ容量で点滴した（Ｎ＝３匹／グループ）。投与した物質を膀胱中に４５分間保持した。次いで膀胱をＰＢＳでフラッシュし、そして動物を手順から回復させた。投与の２日後、ラットを屠殺して、膀胱を採取し、固定し、そして器官全体をＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）溶液を用いて染色してレポーター遺伝子の移入を評価した。次いで、Ｘｇａｌ染色した組織をパラフィンに包埋し、切片化し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対染色した。β−ガラクトシダーゼによるＸｇａｌの加水分解は青色を生じ、これは表在性管腔膀胱上皮に局在した。
【００７６】
アデノウイルスベクターによる送達に続くトランスジーン発現を、ｒＡｄ−βｇａｌで処置した全ての動物から膀胱で検出したが、非処置コントロールでは検出しなかった。トランスジーン発現は、以前に発行されたＰＢＳ／スクロース処方物を用いた結果（Ｂａｓｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２：９７−１０４（１９９５））に類似した。きわめて対照的に、管腔上皮表面におけるβ−ガラクトシダーゼの発現は、３０％エタノールで希釈したｒＡｄ−βｇａｌを受けた動物で非常に増強された（図１）。図１に記載される膀胱標本を、包埋し、切片化し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対染色した。膀胱組織の組織学的評価は、エタノールをアデノウイルス処方物に添加した場合の、一過性の膀胱上皮の増加したβ−ガラクトシダーゼ発現を実証した（図２）。エタノールと保護的グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）層との上皮表面での相互作用は、トランスジーン発現において観察された増加についてのメカニズムを提供する。この層の破壊は、表面でのウイルス−細胞相互作用を容易にし得、そして潜在的に粘膜下への透過を増強し得る。
【００７７】
（実施例２）
（ラット膀胱における用量依存性トランスジーン発現）
別の実験において、１８匹の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをイソフルランで麻酔し、そして２２．５％（ｖ／ｖ）エタノール処方物中、２×１０７、２×１０８、２×１０９、２×１０１０および２×１０１１、ＰＮ／ｍＬの濃度で、ｒＡｄ−βｇａｌの単回０．５ｍｌ膀胱内大量投与を与えた。４５分のインキュベーション後、膀胱をＰＢＳでフラッシュし、そして動物を麻酔から回復させた。２日後、動物を屠殺して、膀胱を採取し、固定し、そして器官全体をＸｇａｌ溶液を用いて染色してアデノウイルストランスジーン発現を評価した。管腔膀胱上皮でのβ−ガラクトシダーゼ発現は、投与された組換えアデノウイルス濃度と相関した（図３）。２×１０１０または２×１０１１ＰＮ／ｍＬを受容した動物間では著しい差異は観察されず、このことはこのモデルにおけるトランスジーン発現の飽和を示唆する。点滴後に無効にされた用量の分析は、これらの高用量での投与物質の感染力価におけるほんの最小限の減少を示す。β−ガラクトシダーゼの発現は、より低い濃度で減少した。β−ガラクトシダーゼ発現の証拠は、１×１０７ＰＮ／ｍＬの濃度で投与された動物または非処置コントロール動物では検出されなかった。
【００７８】
（実施例３）
（マウス膀胱におけるＡＣＮＲＢ遺伝子移入）
ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してＲＢトランスジーンの発現を詳細に評価するパイロット研究を行った。この研究に使用した組換えアデノウイルスは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびｐＩＸタンパク質をコードするウイルス性初期領域１が欠損された血清型５ヒトアデノウイルスに基づいた。このアデノウイルスは、複製のために必要とされるＡｄ５  Ｅ１遺伝子産物を生成する２９３細胞で増殖するように制限されている。完全長または短縮型Ｒｂのいずれかをコードする移入プラスミドを、ｐＡＣＮから生成し（Ｗｉｌｌｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：１９１−１９７（１９９５））、次に組換えアデノウイルスを構築するのに使用した。完全長ＲＢ  ｃＤＮＡ（１〜９２８アミノ酸）（プラスミドｐＥＴＲｂｃから、２．８ＫｂのＸｂａ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩフラグメントとしてサブクローン化した）（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：１６０−１６２（１９９１））または短縮型フラグメント（３８１〜９２８アミノ酸）（１．７ｋｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ  ｃＤＮＡフラグメントとしてサブクローン化した）のいずれかを、プラスミドｐＡＣＮのＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびＡｄ２三分節リーダーｃＤＮＡの下流に配置した。続いて、これらのプラスミドを、Ｅｃｏ  ＲＩで線状化し、そして部分的Ｅ４欠失を含むＡｄ−ＲＢ５６（ＡＣＮ５６）を作製するための、Ｈ５ｉｌＥ４の単離したＣｌａＩ消化大型フラグメント（Ｈｅｍｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３２５８−３２６４（１９８８））、またはベクターのＥ３およびＥ４領域の両方の欠失を含むＡｄ−Ｒｂ１１０（ＡＣＮＲＢ）を作製するための、ｄｌ３２７（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８２３−３８２７（１９８９））とＨ５ｉｌＥ４とのハイブリッドウイルス由来の大型フラグメントのいずれかを用いて、同時トランスフェクト（ＣａＰＯ４、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）した。
【００７９】
８匹の雌性ＩＣＲマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をアベルチンで麻酔し、そしてそれぞれに（ＡＣＮＲＢ）の単回８０μｌ膀胱内投与を与えた。ＡＣＮＲＢ（４×１０１１ＰＮ／ｍＬ）を、ＰＢＳ溶液または３０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中に希釈し、そして調製した。ウイルスを膀胱中に４５分間保持した後、動物を手順から回復および放尿させた。ＡＣＮＲＢ投与の２日後または１４日後、マウスを屠殺し、そして各動物からの膀胱、肝臓および腎臓を採取し、ホモジナイズし、そして分析のために処理した（Ｎ＝２匹／グループ）。ＡＣＮＲＢに対して特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してトランスジーンの発現を決定した。より詳細には、ＡＣＮＲＢを同定し、そしてＣＭＶ配列の３‘末端からＲＢ配列の５’末端までの領域を増幅するためのプライマーを作成した。増幅（３０サイクル）の後、ＲＴ−ＰＣＲ産物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色し、そして写真をとった。ＶＰＢＳ中のＡＣＮＲＢでの処理後の非常に低い発現と比較して、３０％（ｖ／ｖ）エタノール中のＡＣＮＲＢでの処理後で増加したＡＣＮＲＢ発現を検出した。アッセイについてのポジティブコントロールは、ＡＣＮＲＢ感染５６３７ヒト膀胱がん細胞（コントロール）からのサンプルを含んだ。β−アクチンに特異的なプライマーを用いて増幅されたＡＣＮＲＢ感染動物からの膀胱ＲＮＡサンプルは、ＲＮＡの質についての内部コントロールを提供した。逆転写酵素（ＲＴ）を用いない非処置サンプルおよび膀胱サンプルは、ＤＮＡの夾雑についてのコントロールを提供した。投与の２日後、膀胱ホモジネート中のＡＣＮＲＢ発現のレベルを、３０％エタノール中に調製したＡＣＮＲＢを受けた動物から検出した（図４）。非膀胱組織中または投与１４日後に採取したサンプルにはいずれも発現の証拠は検出されなかった。
【００８０】
（実施例４）
（マウスへの膀胱内投与後の生体分布およびＡＣＮＲＢ発現の速度論）
膀胱内投与後の発現の時間経過を調査するために、４０匹の雌性マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をアベルチンで麻酔し、そしてＡＣＮＲＢ（２２％（ｖ／ｖ）エタノール中４×１０１０ＰＮ／ｍＬ）の単回８０μＬ大量投与を与えた。点滴物質を膀胱中に約４５分間保持し、そして動物を手順から回復させた。投与の１、２、３、４、５、６、７および１４日後、分析のためにマウス（Ｎ＝４／回）を屠殺した。膀胱、肝臓および腎臓を採取し、そして続いての分析のために液体窒素中ですぐに凍結した。ＡＣＮＲＢ発現の検出のために、組織サンプルをホモジナイズし、そして総ＲＮＡをＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ７を用いて抽出した。総ＲＮＡのアリコートを内因性ＲＢ発現からトランスジーン発現を区別するためにＡＣＮＲＢに特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲアッセイで増幅した。ＡＣＮＲＢ  ＤＮＡの検出のために、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を組織ホモジネートに対して使用した。ＲＴ−ＰＣＲ分析について上記のように、ＡＣＮＲＢに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００８１】
膀胱ホモジネート中におけるＡＣＮＲＢトランスジーン発現は１〜６日目に採取したサンプル中においてのみ検出され、これは時間とともに減少する内因性ｐ５３に関する発現を伴った（図５、上部パネル）。投与７日および１４日後に採取したサンプルからは発現を検出しなかった。興味深いことに、腎臓では１，２および３日目にＡＣＮＲＢ発現がいくらか検出されたが、肝臓では観察されなかった（図５、下方パネル）。
【００８２】
投与１４日後に採取したものを含めて、ＡＣＮＲＢを受けた動物全ての膀胱組織において、ＡＣＮＲＢ  ＤＮＡを検出した（図６、（左パネル））。腎臓ホモジネートからもまた、ＤＮＡを採取し、これはこの組織中で検出したＡＣＮＲＢ発現と一致した（図６、右パネル）。実験中に回収した肝臓サンプルにおいては、ＡＣＮＲＢ  ＤＮＡについての証拠は検出しなかった（データは示さず）。非処置動物由来のサンプル（Ｕ）および精製ＡＣＮＲＢ  ＤＮＡ（ＰＣ）を、それぞれ、ネガティブおよび２５ポジティブコントロールとして使用した。
【００８３】
組換えアデノウイルスの全身投与が、主に肝臓におけるトランスジーン発現を生じる（Ｌｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４０３−４０９（１９９３））ので、肝臓サンプルにおけるＡＣＮＲＢ  ＤＮＡおよび発現の非存在（図５および図６）は、膀胱内投与後のＡＣＮＲＢのごく微量の全身曝露を示唆する。尿管を介した逆流は、腎臓におけるＡＣＮＲＢの検出に寄与し得た。
【００８４】
上に提示したデータは、ＡＣＮＲＢの膀胱内投与後の齧歯類膀胱におけるトランスジーン発現を実証する。これらの研究は、さらに、膀胱上皮へのアデノウイルス媒介性遺伝子移入が、処方物中の送達増強薬剤（例えば、エタノール）の存在によって増強され得ることを示す。増加した遺伝子移入についての１つのメカニズムは、膀胱上皮表面における保護的グリコサミノグリカン層の破壊であり得る。２０〜３０％（ｖ／ｖ）エタノール処方物中のＡＣＮＲＢの単回膀胱内投与は、約１週間の間持続する、膀胱中でのトランスジーンの発現を生じる。逆行性尿管流入は、腎臓において検出されたＡＣＮＲＢの一過性発現についてのありそうな説明を提供する。肝臓におけるＡＣＮＲＢ発現およびＡＣＮＲＢ  ＤＮＡの非存在は、膀胱内投与後の制限された全身性曝露を示す。
【００８５】
（実施例５）
（界面活性剤処方物の使用）
遺伝子移入効率の損失を伴わずに副作用を最小化するために、他の賦形剤を試験した。界面活性剤は細胞膜と相互作用すること、および細胞にさらなる損傷を与えずに大きな孔を形成することが公知である。より毒性の少ない界面活性剤中に処方された組換えアデノウイルスの効率を、ラットおよびマウス遺伝子移入モデル中で研究した。
【００８６】
ｒＡｄ−βｇａｌを臨界ミセル濃度で異なる界面活性剤中に処方して、膀胱上皮への遺伝子移入の効率を評価した。雌性ラット（約２００ｇ  ｂ／ｗ、  Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）をイソフルランを用いて麻酔し、そして異なる界面活性剤処方物中でｒＡｄ−βｇａｌ（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）の単回膀胱内投与を与えた（表１を参照のこと）。点滴の前に、膀胱をＰＢＳでフラッシュし、次いで空にした。次いで、０．５ｍｌの容量でｒＡｄ−βｇａｌを点滴した。点滴した溶液を膀胱内に４５分間保持した。次いで膀胱をＰＢＳでフラッシュし、そして動物を手順から回復させた。投与の４８時間後、ラットを屠殺し、膀胱を採取およびホルマリン中で固定した。固定後、レポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）発現が存在する場合、青色に変化する色素（Ｘｇａｌ）に尿路上皮が曝されるように、長軸方向に膀胱を開いた。膀胱全体の管腔上皮表面を写真に撮り、青色染色：＋（最小染色）、＋＋（中程度の染色）、＋＋＋膀胱上皮表面全体を覆う強い染色を、スコア付けした。結果を表１に示す。アニオン性界面活性剤のいくつか（タウロデオキシコレート）、両性イオン性界面活性剤（ＣＨＡＰＳ、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ７）および非イオン性界面活性剤（Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）、ＴＲＩＴＯＮ７  Ｘ−１００）は、遺伝子移入を劇的に増強した。カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいくつか（ＰＬＵＲＯＮＩＣ７  Ｆ６８、ＴＷＥＥＮ７）は、同様の効果を有さなかった。遺伝子移入の改善は、しばしば、膀胱炎を伴った。両性イオン性界面活性剤は、膀胱結石形成を促進した。
【００８７】
エタノールを用いて観察される膀胱炎の可能性のある症状を、７ｍＭ  Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）（２×ＣＭＣ）または０．０５ｍＭ  ＴＲＩＴＯＮ７−Ｘ−１００界面活性剤（ＣＭＣ）処方物を使用してマウス中で評価した。処方物を８０μＬの容量で膀胱内に投与し、そして動物を７日間隔にわたり観察した。病理学的評価のために、屠殺後、膀胱をパラフィン包埋し、切片化し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。Ｂｉｇ  ＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）を用いて処理したマウスにおいて、膀胱組織中への微量のマクロファージ浸潤のみを観察した。マクロファージのより顕著な（微量〜中程度）浸潤は、ＴＲＩＴＯＮ７−Ｘ−１００界面活性剤により誘導された。きわめて対照的に、２２％エタノールで処置した動物において顕著な膀胱炎を検出した。
【００８８】
（実施例６）
（ＡＣＮＲＢの遺伝子移入）
レポーター遺伝子を用いる実験に加えて、異なる一連の研究を、ＡＣＮＲＢの遺伝子移入を詳細に評価するために行った。雌性のＩＣＲマウスをアベルチンで麻酔し、そして個々のマウスにＡＣＮＲＢの単回の８０μＬの膀胱内投与を受容させた。ＡＣＮＲＢ（４×１０１０ＰＮ／ｍＬ）を、ＶＰＢＳ、２２％（ｖ／ｖ）エタノール、または３ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）中で処方した。ウイルスを膀胱内で４５分間維持した後、動物を回復させた。マウスをＡＣＮＲＢの投与後４８時間で堵殺し、そして膀胱採取物を液体窒素中で凍結させた。トランスジーンの発現を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定した。組織を、ＲＮＡｓｅを含まない水中でリンスし、ホモジナイズし、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）中で消化し、そして全細胞のＲＮＡを抽出した。ＡＣＮＲＢを、ＡＣＮＲＢベクターのＣＭＶ領域中に配置した５’プライマーおよびＲｂゲノムの５’末端に配置した３’プライマーを使用してプローブした。ＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて行った。サイクル条件は、６５ＥＣで１０分間、５０℃で８分間、９５℃で５分間であった。３２サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間であった。３２回目のサイクルには、不完全なＤＮＡフラグメントの完全な伸張を確実にするために、７２℃で１０分間の伸張工程を含んだ。ＡＣＮＲＢ−ＲＮＡバンドを、エチジウムブロマイドを用いて染色した。エタノールまたはＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）処方物を用いて増強させた発現の結果を、図９に示す。
【００８９】
（実施例７）
（最小限度の（ｍｉｎｉｍａｌ）膀胱炎でＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）はトランスジーンの発現を増強する）
ＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）が最小膀胱炎で遺伝子移入を増強したので、この処方物をさらなる評価（上記のものと類似の研究における、濃度および用量依存性を含む）のために選択した。簡潔には、麻酔した雌性のラットにおいて、ｒＡｄ−βｇａｌ（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）を、膀胱内カテーテルを介して膀胱に投与した。ｒＡｄ−βｇａｌを、種々の濃度のＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）中で処方した。０．５ｍｌの容量を注射し、そして４５分間膀胱内に注入したまま維持した。動物を４８時間後に屠殺し、膀胱を、４％のホルマリン／グルタルアルデヒド中に固定し、縦に開き、そしてβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を、Ｘｇａｌ基質を使用して測定した。青色の染色の強度は、βｇａｌ−トランスジーンの発現と相関する。図７は、Ｘｇａｌ染色した膀胱の上皮表面を示す。結果は、上皮への遺伝子の移入の濃度依存性の増加を示す。３．５〜７ｍＭの濃度のＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）は、遺伝子の移入を有意に改善した。処方物のみ（図７、下のパネル）では、Ｘｇａｌ基質による青色を示さなかった。より高い濃度（１７．５）ｍＭでは、遺伝子移入または発現を著しくは改善しなかったが、試験した動物のいくつかにおいて膀胱炎を誘導した。
【００９０】
【表１】
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より高い組換えアデノウイルス濃度の影響もまた、試験した。簡潔には、麻酔した雌性ラットにおいて、７ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）中で処方した種々の濃度のｒＡｄ−βｇａｌを、膀胱内カテーテルを通じて膀胱内に投与した。動物を４８時間後に屠殺し、膀胱を４％のホルマリン／グルタルアルデヒド中に固定し、縦に開き、そしてＸｇａｌ染色した。図８は上皮への遺伝子移入の濃度依存性の増加を示す。１．３×１０１１ＰＮ／ｍｌの濃度で、最大の遺伝子移入を誘導した。より高い濃度（６．５×１０１１ＰＮ／ｍｌ）では、青色の染色を顕著には改善しなかった。より低い濃度のｒＡｄ−βＧａｌ（１．３×１０１０ＰＮ／ｍｌまたは１．３×１０９ＰＮ／ｍｌ）では、トランスジーンの発現は、用量依存的に低下した。３．５ｍＭと７ｍＭの処方物とを比較した場合、β−ガラクトシダーゼの発現は類似であったが、増強された影響は、７ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）処方物で処理した動物においては、より再現性があるようであった。
【００９１】
（実施例８）
（ＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）処方物での腫瘍におけるトランスジーンの発現）
インタクトな膀胱上皮を有する動物に対して、最初に研究が集中したので、移行性上皮ガンの動物モデルにおいて評価されたアデノウイルス媒介性の遺伝子移入もまた、研究された。腫瘍を、雄性のＦｉｓｈｅｒラットにおいて、６ヶ月間、飲料水中への０．０５％のＢＢＮの添加によって誘導した。４ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）またはＶＰＢＳ中に処方したｒＡｄ−βＧａｌ（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）を、直接的な注射によって４５分間膀胱内に注入した。β−ｇａｌの発現を、処置の４８時間後に評価した。腫瘍を有さない動物を使用する以前の実験と一致して、腫瘍組織への遺伝子の移入は、ＶＰＢＳ処方物と比較して、ＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）処方物を用いて改善された（図１０）。
【００９２】
ｐ５３遺伝子（ｒＡｄ−ｐ５３）（Ｗｉｌｌｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１０７９−１０８８（１９９４））を保有するｒＡｄの遺伝子移入もまた、膀胱ガンのこの動物モデルにおいて試験した。簡潔には、膀胱の腫瘍を、雌性のＦｉｓｈｅｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において、３ヶ月間、飲料水中への０．０５％のＢＢＮ（Ｎ−ブチル−Ｎ−Ｎ−（４−ヒドロキシブチル）ニトロソアミン）の添加によって誘導した。ｒＡｄ−ｐ５３（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）を、７ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）中に処方した。イソフルラン麻酔下で、カテーテル（２４Ｇ）を、投与のために膀胱に挿入した。ｒＡｄ−ｐ５３を、４５分間膀胱内に注入した。次いで、動物を、麻酔から回復させた。２４時間後、動物を屠殺し、そして膀胱をホルマリン中に固定した。パラフィン包埋および切片化後、ｐ５３の発現を、基質としてＡＥＣ（ＡＥＣ−キット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用するｐ５３ＥＳ−キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を使用して免疫組織化学によってアッセイした。組織を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。図１２は、増殖性の上皮の表面領域でのｐ５３遺伝子の発現（左側のパネル）を示し、そしてより高い倍率でのｐ５３の発現についての核染色（右側のパネル）を示す。未処理の動物に由来する腫瘍組織においては、染色は検出されなかった。
【００９３】
（実施例９）
（ＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）はブタの尿路上皮においてトランスジーンの発現を増強する）
臨床的な研究のために予想される容量をシミュレートするために、７ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）処方物を、ＳＰＲＩ  Ｄｒｕｇ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍとの、共同研究において常用的にカテーテルを通した成体のブタモデルにおいて試験した。ｒＡｄ−βｇａｌ（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）を、ＶＰＢＳまたは７ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）中で処方した。５０ｍｌの容量を、意識がある動物の膀胱中にカテーテルを介して注射した。注入物質を２時間維持した。動物を４８時間後に屠殺し、そして膀胱の中心の切片を回収し、そしてβ−ガラクトシダーゼの発現について染色した。遺伝子発現の強度における増加を、ＶＰＢＳ処理したブタと比較して、７ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）処理したブタにおいて観察した（図１１）。組織学的な評価は、ＢｉｇＣＨＡＰ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）を使用するいくつかの上皮層の形質導入を実証したが（左側のパネル）、ＶＰＢＳ緩衝液では表面の形質導入のみを示した（右側のパネル）。
【００９４】
（実施例１０）
（ラットにおける腸上皮への遺伝子移入）
Ｓａｎｄｂｅｒｇら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３２３−３２９（１９９４））の方法のわずかな改変を、遺伝子移入研究のためのラットの回腸セグメントを調製するために使用した。簡潔には、雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをイソフルランで麻酔した。腹腔を開き、そして最後のパイアー斑に由来するくちばし状の回腸セグメントを単離した。セグメント（約３ｃｍ）から、食物の残りを注意深く取り除き、そして両方の側部を、非外傷性の血管のクランプで閉じた。ｒＡｄ−βｇａｌ（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）、０．５ｍｌ容量を、２４Ｇ針を用いてセグメントに直接注射し、そして４５分間インキュベートした。ｒＡｄ−βｇａｌを、１０ｍＭのタウロデオキシコール酸（蒸留水中、濾過滅菌した）中で（処置群１）、またはＶＰＢＳ中で（処置群２）処方した。第３の処置群は、１０ｍＭのタウロデオキシコール酸で処置した動物を含んだ。その後、クランプを除去し、そして剖検時の認識のために両方の末端をゆるい絹糸での縫合で固定した。腹部の切開を閉じ、そして動物をそれらの籠の中で回復させた。動物を４８時間後に屠殺した。感染させたセグメントおよびコントロールセグメントを、器官全体のＸｇａｌ染色のための固定剤中に回収した。
【００９５】
結果を、図１３に示す。Ｘｇａｌの青色染色の程度は、回腸切片中でのトランスジーンの発現の証拠を実証した。増強された遺伝子移入は、界面活性処方物中で明らかであった（中央のパネル）。
【００９６】
（実施例１１）
（遺伝子移入に対するＢＩＧＣＨＡＰ中の不純物の影響）
（１．序論）
ＢｉｇＣＨＡＰ（ＢＣ）の別の市販の供給源を、ｒＡｄ（組換えアデノウイルス）媒介性の遺伝子移入および発現を増強する能力について、本質的には、実施例８に先に記載した方法に従って試験した。６ｍｇ／ｍｌの濃度でのより「純粋な」ＢＣ−Ｓｉｇｍａ（９８％純度；Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、１８２頁、＃Ｂ  ９５１８）がｒＡｄ媒介性の遺伝子移入を顕著には改善しなかったことを決定した（図１４、最上列）。対照的に、ＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃａｔａｌｏｇ  １９９６／９７、４３頁、＃２００９６５、９５％純度）は、同じ濃度で遺伝子の移入および発現を実質的に増強した（図１４、下列）。
【００９７】
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７およびＳｉｇｍａのＢＣをさらに、ＴＬＣによって分析し、そしてカラムクロマトグラフィーによって精製した。精製したＢＣおよび単離した不純物を、膀胱の上皮中でのｒＡｄ媒介性の遺伝子移入および発現を増強するそれらの能力について試験した。
【００９８】
以下により詳細に議論するように、３つの不純物をＢＣから単離した。不純物のうちの２つは、ｒＡｄ媒介性の遺伝子移入および発現の改善を実証した。市販のＢＣに加えて、両方の不純物が、局所的な遺伝子送達を改善するｒＡｄ処方物緩衝液にとって好ましい。
【００９９】
（２．薄層クロマトグラフィーによるＢｉｇＣＨＡＰの分析：）
ＢＣ（ＳｉｇｍａまたはＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）を、３／１のメタノール／水中に溶解させ、そしてＴＬＣを、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０、０．２５ｍｍ（ＥＭ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上で行った；移動相は以下から構成した：６／２．５／１．５の１−ブタノール／水／氷酢酸。クロマトグラムを、５／９５の硫酸／エタノール中の０．５ｇのチモールと加熱を用いて可視化した。図１５に示すように、わずかに１つの異なるバンドが、ＢＣ−Ｓｉｇｍａのサンプル（Ｂ）から生じ、一方、３つのさらなるバンドが、ＢＣ−ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７のサンプル中（Ａ）で明らかになった。
【０１００】
ＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）の不純物をさらに、カラムクロマトグラフィーによって単離し、そして薄層クロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０）によって、６／５／１のクロロホルム／メタノール／水の移動相を使用して分析した。結果を、図１６に示す（レーン１：ＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）；レーン２：不純物Ｉ；レーン３：不純物ＩＩ；レーン４：不純物ＩＩと不純物ＩＩＩとの混合物；レーン５：不純物ＩＩＩ；レーン６：ＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）純粋；レーン７：ＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７））。
【０１０１】
（３．漸増濃度のＢＣ（Ｓｉｇｍａ）は遺伝子移入を増強する。）
遺伝子移入の増強についてＢＣの不純物を試験するために、ｒＡｄ−βＧａｌ（１×１０１１ＰＮ／ｍｌ）を、漸増濃度のＢＣ（Ｓｉｇｍａ）中で処方し、そして上記のように動物において試験した。結果を、図１７に示す。より高い濃度（すなわち、２０ｍｇ／ｍｌ）のＳｉｇｍａ  ＢＣは、上皮での遺伝子発現を改善した（上段および中段のパネル）。対照的に、同様の遺伝子発現が、より低い濃度（６ｍｇ／ｍｌ、図１７、下段）でＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）によって誘導された。
【０１０２】
（４．カラムクロマトグラフィーによって精製したＢＣは遺伝子移入を増強しない。）
ｒＡｄ−βｇａｌを、両方のＢＣのカラムクロマトグラフィー精製した物質３０ｍｇ／ｍｌ中に処方し、そして膀胱の上皮への遺伝子移入を上記のように試験した。３０ｍｇ／ｍｌの濃度では、遺伝子移入および発現は、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７サンプルにおいてわずかに増強されただけであった（図１８、上段のパネル、右）。精製されたＳｉｇｍａ  ＢＣは全く影響を有さなかった（図１８、下段のパネル、左）。両方のＢＣ（ＳｉｇｍａおよびＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）の精製は、減少した遺伝子移入および発現を生じた。
【０１０３】
（５．不純物ＩＩと不純物ＩＩＩとの混合物は遺伝子移入を増強する。）
ＢＣ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７）の３つの不純物をＴＬＣによって検出し（図１５）、そして遺伝子移入研究のためにカラムクロマトグラフィーによって単離した。不純物Ｉ、および不純物ＩＩと不純物ＩＩＩとの混合物を、膀胱の上皮へのｒＡｄ媒介性遺伝子移入を改善することにおけるそれらの効率を試験するために、ＶＰＢＳ（０．６ｍｇ／ｍｌまたは６ｍｇ／ｍｌ）中に希釈した。不純物Ｉは、膀胱の上皮におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現の増加を導かなかったが、むしろ膀胱炎を生じた（図１９、下段のパネル、右）。ちょうど対照的に、不純物ＩＩと不純物ＩＩＩとの混合物は、用量依存的に遺伝子移入および発現を増強した（図１９、下段のパネル、左）。ポジティブコントロールの処方物（ＢＣ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７、上段のパネル、左）およびネガティブコントロールの処方物（ＢＣ−ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ７、カラムクロマトグラフィーで精製した、およびＢＣ−Ｓｉｇｍａ）を、６ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した（上段のパネル、右）。
【０１０４】
（６．ＢｉｇＣＨＡＰ中への不純物の再構成は遺伝子移入の増強を導く。）
この実験において、１０ｍｇ／ｍｌのＢＣ（Ｓｉｇｍａ、図２０、上段中央のパネル）を、不純物ＩＩＩ（上段右のパネル）、不純物ＩＩ（下段左のパネル）または不純物ＩＩＩの合成したアナログ（下段右のパネル）とともに再構成した。１×１０１１ＰＮ／ｍｌのｒＡｄ−βｇａｌを、上記のように薬物を加えた処方物中で調製し、そして膀胱内に投与した。図２０に示すように、改善されたレポーター遺伝子の発現（β−ガラクトシダーゼ）を、１０ｍｇ／ｍｌのＢｉｇＣＨＡＰ（Ｓｉｇｍａ）の濃度でＡを添加した物に類似の（Ａ  ｓｐｉｋｅｄ）ＢＣ（Ｓｉｇｍａ）処方物中に溶解させたｒＡｄを受容させた動物の膀胱の上皮において観察した。
【０１０５】
（実施例１２）
（３−アミノプロピル−３’−Ｎ−グルコンアミドプロピル−アミン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−３’−Ｎ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｎｅ）の合成）
（１．３’−Ｎ−グルコンアミドプロピル−３’’−Ｎ−コラミドプロピル−Ｎ−コラミド（３’−Ｎ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ−３’’−Ｎ−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ−Ｎ−ｃｈｏｌａｍｉｄｏ））
グルコノ−δ−ラクトン（０．１ｍｏｌ、１７．８ｇ）を、４００ｍｌの還流している無水メタノール中の０．１ｍｏｌ（１３．１）ｇのイミノビスプロピルアミンの溶液に対して小さい部分で添加する。２時間の還流後、溶液を氷上で１時間冷却させる。溶媒を乾燥によってエバポレートさせる。
【０１０６】
（２．３−アミノプロピル−３’−Ｎ−グルコンアミドプロピル−アミン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ−３’−Ｎ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｎｅ））
トリエチルアミン（０．２ｍｏｌ、２８ｍｌ）を、１リットルのフラスコ中の５００ｍｌの無水ＤＭＦ中に溶解させた０．２ｍｏｌ（８１．６ｇ）のコール酸の溶液に添加する。溶液を、氷−塩浴中で０ＥＣに冷却し、その後、０．２ｍｏｌ（２０ｇ）のイソブチルクロロホルメートを添加する。混合物を、氷−塩浴中で５分間立たせておく。その後、トリエチルアミンヒドロクロリド沈殿物を可視化する。反応によって、混合された無水物の中間体を得る。
【０１０７】
別の２リットルのフラスコ中で、０．１ｍｏｌ（３０．９ｇ）の３’−Ｎ−グルコンアミドプロピル−３’’−Ｎ−コラミドプロピル−Ｎ−コラミドを、５００ｍｌのＤＭＦ中に４０〜６０ＥＣまで穏やかに暖めることによって溶解させる。この溶液を、濁りが生じる直前まで約１０ＥＣの氷−塩浴中で迅速に冷却させる。混合した無水物の中間体を、ＤＭＦ中の３’−Ｎ−グルコンアミドプロピル−３’’−Ｎ−コラミドプロピル−Ｎ−コラミドの溶液中に濾過する。トリエチルアミンヒドロクロリド沈殿物を濾過によって取り除く。その後、溶液を２４時間冷却しながら攪拌する。ＤＭＦを減圧および加熱下でのエバポレートによって除去し、そして粗混合物を、移動相として６５／５／１のクロロホルム／メタノール／水を用いるシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーに供する。純粋な画分を回収し、そして減圧によって溶媒をエバポレートさせる。この反応によって、約２７ｇ（２５％）の生成物を得る。
【０１０８】
生成物の質量スペクトル分析によって以下のピークを生じた：３３７．２、３９４．２、４１２．２、５０３．８、６８２．４、７００．５、７５５．１、８０１．１、８２３．１、９１２．３、１０５４．８、１０７４．７、１０９０．６、１１１２．４、１１１９．３。
【０１０９】
（実施例１３）
（ＢｉｇＣＨＡＰ中のトランスフェクション増強成分の特徴付けおよび合成。）
実施例１１に示すように、ＢｉｇＣＨＡＰ中に存在する不純物が、遺伝子移入を増強するように作用する。この実施例では、これらの化合物のさらなる特徴付けおよび合成を記載する。
【０１１０】
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＢｉｇＣＨＡＰを、生物学的試験および構造的分析のための本質的に純粋な不純物「１」、「２」、および「３」を得るために、カラムクロマトグラフィーによって分画した。不純物１を、最初の実験において観察した膀胱の刺激に起因して、生物学的活性については試験しなかった。不純物２および３が水にあまり可溶性ではないので、これらを、６ｍｇ／ｍｌのＳｉｇｍａ  ＢｉｇＣＨＡＰと、０．１２および１．２ｍｇ／ｍｌのレベルで混合し、そしてこれらが遺伝子移入を増強することを見出した（６ｍｇ／ｍｌ用量のＳｉｇｍａ  ＢｉｇＣＨＡＰのみでは遺伝子移入を増強しない）。
【０１１１】
不純物１、２、および３の構造を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＮＭＲ分析によって決定した。図２２は、不純物１の構造、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。不純物２の構造、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２３に、そして不純物３の構造、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、および１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２４に示す。ＢｉｇＣＨＡＰのスペクトルに対するこれらのスペクトルの比較によって、これらの不純物が、ＢｉｇＣＨＡＰに分解物としてというよりもむしろ、ＢｉｇＣＨＡＰを合成するために使用したプロセスによって生じることを実証する。
【０１１２】
粗Ｓｉｇｍａ  ＢｉｇＣＨＡＰが、２６ｍｇ／ｍｌの濃度で使用された場合に、遺伝子移入を増強することを見出した。極微量のレベルの不純物がＳｉｇｍａ  ＢｉｇＣＨＡＰ中に存在するかどうかを決定するために、１ｍｇをシリカゲルプレート上にアプライした。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＢｉｇＣＨＡＰ中に不純物２とともに移動する不純物を観察した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＮＭＲによって、この不純物がＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＢｉｇＣＨＡＰ中の不純物２と同じ構造を有する事を確認した。数グラムのＳｉｇｍａ  ＢｉｇＣＨＡＰをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって分画し、そして不純物を含有する画分を合わせ、濃縮し、そしてＴＬＣによって分析した。不純物２および３を含むいくつかの不純物が、この極微量の不純物を富化した画分中で明らかであった。
【０１１３】
（不純物２の合成）
不純物２を以下のように合成した（図２５を参照のこと）。最初に、図２５に示すように、化合物ＩＩＩを２００ｍｌの還流メタノール中に１．７８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のグルコノラクトンを溶解させ、そして４．２ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）のＮ−３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン（Ｎ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｅｎｅ）を添加することによって合成した。還流を、２時間継続した。次いで、メタノールを回転式エバポレーター上でエバポレートさせ、そして得られる油を、白色の固形物が形成されるまでクロロホルムを用いて細かく砕いた。白色の固形物を濾過し、クロロホルムで洗浄し、そして吸引によって乾燥させて２．１ｇの生成物（純粋ではない化合物ＩＩＩ）を得た。
【０１１４】
化合物ＩＶを、加熱および攪拌しながら４０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に０．６５ｇ（１．６ｍｍｏｌ）のコール酸を溶解させることによって合成した。次いで、この溶液を、攪拌を維持しながら氷浴中で冷却した。次いで、トリエチルアミン（０．２２３ｍｌ（１．６ｍｍｏｌ））を添加し、続いて０．２０８ｍｌ（１．６ｍｍｏｌ）のイソブチルクロロホルメートを添加した。攪拌を１０分間続けた場合、化合物ＩＶを溶液中に残しながら、白色の沈殿物を形成した。
【０１１５】
不純物２（図２５の化合物Ｖ）を合成するために、０．５ｇ（１．６ｍｍｏｌ）の化合物ＩＩＩを５５℃で攪拌することによって１００ｍｌのジメチルスルホキシド中に溶解させた。化合物ＩＶを含有する懸濁物をこの溶液中に濾過し、そして得られる溶液を室温で一晩攪拌した。水の添加、およびメチレンクロリドまたはメチレンクロリド／メタノールでの抽出による、生成物からのジメチルスルホキシドの分離（反応混合物の半分を使用する）の試みは、成功しなかった。反応混合物の他方の半分をほとんどのジメチルスルホキシドを除去するために減圧下で蒸留した。残査を、溶出剤としてメタノール／クロロホルム（４０／６０）を使用して、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラムから溶出した画分の分析を、クロロホルム／メタノール／水（６／５／１）から構成される移動相を使用してシリカゲル薄相クロマトグラフィーによって行い、そして硫酸エタノール（ｅｔｈａｎｏｌｉｃ  ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）を噴霧した後の焦げによって可視化した。最も純粋な生成物を含有する画分を合わせ、エバポレートさせて乾燥させ、そしてヘキサンを用いて細かく砕いて、明るい黄褐色の固体を生じた。これを濾過し、そしてヘキサンで洗浄した。生成物の１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、示した構造と一致した。
【０１１６】
この化合物の生物学的な評価は、水におけるその可溶性の欠失によっていくらか妨げられた。しかし、化合物が完全には溶解していない場合もなお、膀胱への遺伝子の移入は、不完全に溶解した化合物によって増強された。ＢｉｇＣＨＡＰ中の不純物２の処方は、例えば、細胞への遺伝子移入を増強するために有効である処方物を生じた。
【０１１７】
（Ｓｙｎ３（不純物３のアナログ）の合成）
不純物３が不純物２よりも極性であり、従ってより水に可溶であるので、この化合物の合成を試みた。精製したＢｉｇＣＨＡＰを、コール酸の混合した無水物（イソブチルクロロホルメートとコール酸とを反応させることによって形成した）と反応させた。この反応によって、少量でそして多数の生成物を生じ、このようにして不純物３のアナログを合成した。このアナログ（不純物３のものと類似の極性を有する）を、「Ｓｙｎ３」と呼んだ。
【０１１８】
（第１部：化合物ＩＩＩの合成）
Ｓｙｎ３の合成のスキームを、図２６に示す。ラクトビオン酸（ＩＩ）のラクトンを、１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）のラクトビオン酸（Ｉ）を５０ｍｌのメタノール中に溶解させ、回転式エバポレーター上でエバポレートさせて乾燥させ、そしてこのプロセスを６回繰り返すことによって合成した。化合物ＩＩＩを得るために、得られた残査（ＩＩ）を５０ｍｌのイソプロパノール中で５０℃に加熱することによって溶解させた。この溶液に、１．２ｍｌ（８．４ｍｍｏｌ）のＮ−３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンを添加した。温度を、１００℃まで上昇させ、そして溶液を３時間攪拌した。溶媒を回転式エバポレーションによって除去し、そして得られる残査を数回クロロホルムで洗浄して、過剰の未反応のＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンを除去した。残っている残査（ＩＩＩ）を、以下で第３部において使用した。
【０１１９】
（第２部：化合物ＩＶの合成）
化合物ＩＶを、２．２８ｇのコール酸（５．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で６０℃に加熱して溶解させることによって合成した。トリエチルアミン（０．７８ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ））を添加し、そして溶液を氷浴中で冷却した。次いで、イソブチルクロロホルメート（０．７３ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ）を添加し、そして１０分間、攪拌を連続しながら、白色の沈殿物を形成した。
【０１２０】
（第３部：Ｓｙｎ３（化合物Ｖ）の合成）
化合物ＩＩＩを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、氷浴中で冷却し、そして攪拌した、化合物ＩＶの合成によって得られる懸濁物を、化合物ＩＩＩを含有する溶液中に濾過した。得られる溶液を室温で６時間攪拌した。溶媒を、高真空度の回転式エバポレーションを使用して除去し、そして残査を、１００ｍｌのクロロホルム／メタノール（５０／５０）中に溶解した。２５ｍｌのこの溶液を、溶出溶媒としてクロロホルム／メタノール（６０／４０）を使用してシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラムから溶出される画分の分析を、クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム（１００／８０／１０／５）から構成される移動相を使用するシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって行った。化合物を、硫酸エタノールを噴霧した後の焦げによって可視化した。生成物を含有する画分を合わせ、そしてフラッシュクロマトグラフィーおよび溶出溶媒としてのクロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム（１００／８０／１０／５）を使用して再度精製した。生成物を含有する画分を合わせ、そして白色の粉末にエバポレートさせた（３００ｍｇの化合物Ｖ）。生成物の１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、示される構造と一致した。
【０１２１】
水中での溶解を１０ｍｇ／ｍｌで試みた場合にＳｙｎ３はゲルを形成し、そして１ｍｇ／ｍｌではベシクルを形成するようであった。しかし、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中での１ｍｇ／ｍｌでは、Ｓｙｎ３の透明な溶液が得られた。この処方物が、遺伝子移入を増強することを見出した。Ｔｗｅｅｎ８０のみでは、試験した場合には、遺伝子移入に対して全く影響を有さなかった。
【０１２２】
不純物２または３を添加した精製したＢｉｇＣＨＡＰは、遺伝子移入の有効なエンハンサーである。合成の不純物２のみおよび不純物３の合成のアナログ（Ｓｙｎ３）のみは、遺伝子移入を増強し得る。従って、ＢｉｇＣＨＡＰと不純物との間の相乗的な関係は、遺伝子移入の増強には必要ではない。ＢｉｇＣＨＡＰは高度に水に可溶性であり、そして不純物およびそれらのアナログを溶液中にもたらす（おそらく、混合したミセルとして）ことにおいて有効であり、従って、活性な不純物および／またはアナログのためのビヒクルとして作用する。
【０１２３】
不純物２は遺伝子移入を増強することにおいて有効である一方で、これは、水溶液中でその安定性が制限されているのが、これはＢｉｇＣＨＡＰのような適切な可溶化剤中で処方した場合に有用である。不純物２とは対照的に、Ｓｙｎ３は、例えば０．１％のＴｗｅｅｎ８０および本明細書中で記載されるような他の水溶液中で１ｍｇ／ｍｌで容易に可溶化される。従って、この化合物は、遺伝子移入の増強試薬として特に有用である。
【０１２４】
（実施例１４）
（膀胱への遺伝子移入を増強する合成の不純物３アナログ（Ｓｙｎ３）の効率）
この実施例は、不純物３のＳｙｎ３アナログが膀胱への遺伝子移入を増強することにおいて有効であることを実証する。
【０１２５】
（方法：）
（１．Ｓｙｎ３の溶解）
Ｓｙｎ３の最初の試験は、これが、緩衝化した生理食塩水またはｄＨ２Ｏのいずれかにおいてもそれほど高度に可溶性ではないことを示した。しかし、Ｓｙｎ３が界面活性剤ＢｉｇＣＨＡＰ、および界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０（ＢｉｇＣＨＡＰ中への溶解と比較していくらかより困難ではあるが）中にかなり容易に溶解することを見出した。より高い濃度のＢｉｇＣＨＡＰ溶液を、溶解され得るより大量のＳｙｎ３の溶解のために使用した。５ｍｇ／ｍｌまでのＳｙｎ３が１５ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中に溶解することを見出した。
【０１２６】
Ｔｗｅｅｎ８０中のＳｙｎ３を使用する以下の研究のために、Ｓｙｎ３の１００ｍｇ／ｍｌの溶液を、１０％のＴｗｅｅｎ８０中に調製した。このストック溶液をｄＨ２Ｏ中に希釈（１：１００）して、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中の最終濃度１ｍｇ／ｍｌのＳｙｎ３を得た。
【０１２７】
表ＩＩは、インビボでの試験のために選択したＳｙｎ３の濃度をまとめる：
【０１２８】
【表２】
2010070565.tif 000023
（２．インビボ試験）
Ｓｙｎ３の遺伝子移入活性を、上記の界面活性溶液の１つ中で送達されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するアデノウイルスの投与後に見出される、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルを決定することによってインビボで試験した。この手順において、雌性のＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにカテーテルを通し、そしてＳｙｎ３を上記の濃度の１つで含有するＢｉｇＣＨＡＰまたはＴｗｅｅｎ８０のいずれか中に１：１０で希釈したアデノウイルスを４５分間で投与した。ウイルスの除去および膀胱の洗い流した後、動物を回復させた。４８時間後に動物を屠殺し、それらの膀胱を固定し、そしてβ−ｇａｌの発現について染色した。写真撮影後、膀胱を切片化および組織学的試験のためにパラフィン中に包埋した。
【０１２９】
（結果：）
（１．ＢｉｇＣＨＡＰ中のＳｙｎ３の遺伝子移入活性）
Ｓｙｎ３を、７．８ＭＭのＢｉｇＣＨＡＰ中で０．５ｍｇ／ｍｌで試験した。この濃度では、Ｓｙｎ３は比較的容易に溶解し、そして滅菌濾過が可能であった（０．２Φｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター；Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。最初の実験は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＢｉｇＣＨＡＰ、ロット＃  Ｂ１９５４６を利用したが、後の実験では、Ｓｉｇｍａ  ＢｉｇＣＨＡＰロット＃３７Ｈ５０２３を利用した。ＢｉｇＣＨＡＰのいずれのストックも、使用した濃度で、単独で実験遺伝子移入活性を有する。ポジティブコントロールとして、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍロット＃６７９７９３をｒＡｄ送達のための処方物として利用した。ＢｉｇＣＨＡＰのこの特定のロットを、同定し、そしてそれからＳｙｎ３が作成された活性な不純物を含有するとして同定した。図２７に見られるように、Ｓｙｎ３（Ｉ３Ａ）が、７．８ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の単独でのウイルスの投与と比較して、遺伝子移入およびβ−ｇａｌ発現を非常に増強することを見出した。
【０１３０】
より低いＳｙｎ３の濃度がより高い濃度での遺伝子移入の増強と同様の有効性であることを検証するかどうか決定するために、Ｓｙｎ３を、３．９ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中で０．２５ｍｇ／ｍｌで投与した（図２８Ａ）。非常に高レベルの遺伝子移入を得たが、０．５ｍｇ／ｍｌでＳｙｎ３を用いた場合に見られる高さほど一様には高くなかった（図２８Ｂ）。
【０１３１】
（２．Ｔｗｅｅｎ８０中のＩ３Ａ／Ｓｙｎ３の遺伝子移入活性）
Ｔｗｅｅｎ８０中のＩ３Ａの最初の試験を、０．４％のＴｗｅｅｎ８０中の１ｍｇ／ｍｌのＩ３Ａを使用して開始した。しかし、この濃度のＴｗｅｅｎを使用した場合には、遺伝子移入はほとんど得られなかった（データは示さない）。高濃度のＴｗｅｅｎ８０が、Ｉ３Ａの膜中への分配およびウイルスの侵入の許容から隔離することが仮定されているので、Ｉ３Ａの濃度を１ｍｇ／ｍｌに維持しながらＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．１％まで低下させた。Ｓｙｎ３の２つの異なる調製物を、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中の１ｍｇ／ｍｌでのそれらの遺伝子移入活性について試験した。この濃度では、第１のロット（Ｉ３Ａ）（図２９Ａ）またはＳｙｎ３の第２のロット（図２９Ｂ）のいずれを使用した場合でも、非常に高いレベルの遺伝子移入が見られた。Ｓｙｎ３の第２のロットはまた、７．８ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の０．５ｍｇ／ｍｌで非常に高いレベルの遺伝子移入活性を実証した。従って、全てのその後の実験を、Ｉ３Ａの代わりにＳｙｎ３を使用して行った。
【０１３２】
ＢｉｇＣＨＡＰ（７．８ｍＭ中の０．５ｍｇ／ｍｌ）中のＳｙｎ３の遺伝子移入活性を、Ｔｗｅｅｎ８０中のその活性（０．１％Ｔｗｅｅｎ８０中の１ｍｇ／ｍｌ）と比較した。両方の処方物が、ＢｉｇＣＨＡＰ中のＳｙｎ３を用いて見られる、おそらくわずかにより大きい移入を伴う、ほぼ等レベルの遺伝子移入の増強を有することを見出した（それぞれ、図３０Ａおよび図３０Ｃ）。β−ガラクトシダーゼアッセイがそれほど高度には定量的ではないので、小さな差異を見分けることが困難である。しかし、７．８ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の０．５ｍｇ／ｍｌのＳｙｎ３で処置した膀胱は、一貫して、最も高いレベルのβ−ガラクトシダーゼ発現を有した。Ｓｙｎ３は、Ｔｗｅｅｎ８０へはそれほど容易には溶解しないが、いずれの界面活性剤中でも遺伝子移入を増加する。
【０１３３】
ＢｉｇＣＨＡＰ中のＳｙｎ３の濃度が、Ｔｗｅｅｎ中の濃度の２倍であったので、次に、Ｓｙｎ３を、これらの２つの界面活性剤中の同じ濃度でその遺伝子移入活性について試験した。０．５ｍｇ／ｍｌでは、Ｓｙｎ３は、０．０５％のＴｗｅｅｎ８０中でＳｙｎ３を使用して得られたものよりも、７．８ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中でより良好な遺伝子移入を生じるようであった（図３１Ａ）。Ｓｙｎ３を０．０５％のＴｗｅｅｎ８０中で０．５ｍｇ／ｍｌで使用した場合、これらは、Ｓｙｎ３／（Ｉ３Ａ）の濃度を３．９ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の０．２５ｍｇ／ｍｌまで減少させた場合に観察されるものと類似の、β−ガラクトシダーゼ発現を欠いているより多くの領域が存在するようであった（図２８Ａ）。このことは、ＢｉｇＣＨＡＰ対Ｔｗｅｅｎ８０中の、Ｓｙｎ３の遺伝子移入活性におけるいくつかの差異が、おそらくＳｙｎ３が溶解される界面活性剤に由来する影響の一部に起因することを示唆する。
【０１３４】
（３．Ｓｙｎ３で処置した膀胱の組織学的実験）
Ｓｙｎ３−ｒＡｄ（β−Ｇａｌ）で処置した動物に由来する膀胱を、ウイルス感染のレベル、および膀胱の尿路上皮へのウイルスの侵入の程度を決定するための組織学的試験のために調製した。いずれの界面活性剤中でもＳｙｎ３の濃度の低下が、それに伴うβ−Ｇａｌ発現の低下を生じた（図３２Ａ〜Ｆ）。７．８ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の０．５ｍｇ／ｍｌでのＳｙｎ３の投与によって生じるβ−ガラクトシダーゼの発現が、Ｔｗｅｅｎ８０を用いる場合よりもわずかにより大きかったが（図３２Ａ対図３２Ｄ）、Ｓｙｎ３のこの濃度が、膀胱への浸潤の大量の補充を代表的に生じることに注目した（図３２Ａ）。
【０１３５】
β−ガラクトシダーゼの発現および浸潤のレベルが、Ｓｙｎ３がＴｗｅｅｎ８０中で１ｍｇ／ｍｌである膀胱においてよりも、Ｓｙｎ３をＢｉｇＣＨＡＰ中で０．５ｍｇ／ｍｌで使用した膀胱においてより高かったので、このことは、浸潤が、ｒＡｄがＢｉｇＣＨＡＰ中で投与される場合に生じるウイルスの侵入および発現における増加に起因したことを示唆する。Ｓｙｎ３が浸潤の補充において有し得る寄与を識別するために、Ｓｙｎ３およびウイルスに対して暴露した膀胱の切片を、Ｓｙｎ３のみに対して暴露した膀胱の切片と比較した（それぞれ、図３３Ａおよび図３３Ｂ）。Ｓｙｎ３を単独で投与する場合、有意な量の浸潤が見られ、Ｓｙｎ３およびウイルスをともに用いて見られたよりもわずかに少ないだけである。Ｓｙｎ３を伴わずに投与したウイルスは、感染および浸潤の極端に低いレベルを生じ（図３３Ｃ）、一方、ネガティブコントロール（ウイルスなし、Ｓｙｎ３なし）は浸潤を示さなかった（図３３Ｄ）。
【０１３６】
（４．溶液中でのＳｙｎ３の安定性）
Ｓｙｎ３は、ＢｉｇＣＨＡＰ界面活性剤中に溶解した場合に非常に安定である。Ｓｙｎ３をＢｉｇＣＨＡＰ中に、０．２５ｍｇ／ｍｌまたは０．５ｍｇ／ｍｌのいずれかで溶解した場合、これは、室温で保存した場合でさえ、延長された期間（３０日以上）、その遺伝子移入活性を保持した。Ｓｙｎ３を、１０％のＴｗｅｅｎ８０中に１００ｍｇ／ｍｌで溶解した場合、これは、４ＥＣで維持した場合に、少なくとも１週間安定であった。しかし、室温でこの高い濃度（１００ｍｇ／ｍｌ）で放置した場合は、これは、２４時間以内に凝固する。０．１％のＴｗｅｅｎ８０中に１ｍｇ／ｍｌに希釈したＳｙｎ３は、少なくとも３０日間（試験した最も長い期間）安定である。
【０１３７】
（考察）
Ｓｙｎ３の遺伝子移入活性は、７．８ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の０．５ｍｇ／ｍｌで極端に高いようである。しかし、より高い濃度での副作用の可能性に起因して、より低い濃度のＳｙｎ３（例えば、３．９ｍＭのＢｉｇＣＨＡＰ中の０．２５ｍｇ／ｍｌ）が好ましい。Ｓｙｎ３はまた、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中の１ｍｇ／ｍｌで一貫して高いレベルの遺伝子移入を実証した。これらの研究の結果に基づくと、遺伝子移入剤としての使用のためのＳｙｎ３の１つの特に適切な処方物は、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中の１ｍｇ／ｍｌである。
【０１３８】
（実施例１５）
（Ｓｙｎ３の臨床的処方物）
この実施例は、例示の目的のために、ウイルスベクターの送達のための臨床的な処方物としての使用に適切な、Ｓｙｎ３の処方物の１つの例を提供する。この処方物はまた、他の送達増強化合物について使用され得る；本明細書中で記載されているような多くの他の処方物もまた、Ｓｙｎ３および他の化合物との使用に適切である。
【０１３９】
Ｓｙｎ３ストック溶液を、１０％のＴｗｅｅｎ８０中に１００ｍｇ／ｍｌでＳｙｎ３を溶解させることによって調製した。次いで、このストック溶液を、水中にＴｒｉｓ（１．７ｍｇ／ｍｌ）、リン酸ナトリウム（一ナトリウム、二水和物、１．７ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（２０ｍｇ／ｍｌ）、塩化マグネシウム（六水和物、０．４ｍｇ／ｍｌ）、およびグリセロール（１００ｍｇ／ｍｌ）を含有する水溶性の緩衝液を使用して、６ｍｇ／ｍｌのＳｙｎ３濃度に希釈した。
【０１４０】
この溶液を、０．１％のＴｗｅｅｎ８０中に１ｍｇ／ｍｌのＳｙｎ３を含むウイルス溶液を得るために、ウイルスベクターを含有する溶液を用いて希釈した。この溶液は、遺伝子移入を増強することにおいて有効であった。
【０１４１】
（実施例１６）
（水中で増加した安定性を有するＳｙｎ３アナログの合成）
Ｓｙｎ３は、インビボで高い遺伝子移入増強活性を実証したが、これは、水溶液中には比較的不溶性であり、そして完全な溶解のためには界面活性剤の存在を必要とする。さらに、Ｓｙｎ３は、１０％のＴｗｅｅｎ８０中への完全な溶解のために数時間を要し、この試薬の臨床的な使用をさらに複雑にする。これらの困難を解決するために、水溶液中でより大きな可溶性を有する２つのＳｙｎ３アナログを合成した。Ｓｙｎ３のラクトース部分の除去、および続くメチル化または生じるアミンの還元によって、それぞれ、Ａ−トリメチルアンモニウムクロリド（Ａ−ｔｍａ）およびＡ−ヒドロクロリド（Ａ−ＨＣｌ）として知られる、２つの新規の化合物を合成した。ここで、Ａは、両方の分子に共通のＳｙｎ３の保存された領域を示す（図２１を参照のこと）。これらの２つの陽イオン性化合物をさらに、溶解を容易にするためにそれらの塩化物塩に中和した。
【０１４２】
Ａ−ＴＭＡを、図３５に示すように合成した。簡潔には、ＤＭＦ（３０ｍＬ、０℃）中のコール酸（ＣＡ）（２．０ｇ、５ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ３Ｎ（０．７２ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）で処理し、次いで、注意深くイソブチルクロロホルメート（０．６７ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を３日間攪拌し、そして１つの化合物を得た。これを、ＳｉＯ２上で、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（６：１から４：１）を用いて溶出して容易に精製した。室温で３０分後、ＤＭＦ（４ｍＬ）中のアミン（Ｊ−２／５５）（５２２ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。アミンを、Ｈａｎ，Ｙ−ＰおよびＨａｎｇ，Ｈ−Ｓ、Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（１９９４）１５：１０２５−１０２７に従って合成した。１．８ｇの得られる化合物Ｊ−２／５Ｃ（ＢＯＣ−Ａ）を得、７２％の収率を生じた。
【０１４３】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のアミン（２５０ｍｇ、６１／１１、０．２７ｍｍｏｌ）を、Ｈｕｎｇｓ塩基（ジイソプロピルエチルアミン）（２００μＬ、１．１５ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（７５μＬ、１．２ｍｍｏｌ）で処理した。ＴＬＣは、主要な１つの化合物および２つの不純物を示した。反応混合物を減圧下で濃縮し、シリカカラム上にアプライし、そしてＭｅＣＮ／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（４：１：１）で溶出した。中央の画分を組み合わせ、そしてＤｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８−２００陽イオン交換樹脂のＮａ＋形態のイオン交換クロマトグラフィーに供し、そして１：１の０．５ＭのＮａＣｌ／ＭｅＯＨで溶出した。最も純粋な画分をＬＨ−２０親油性Ｓｅｐｈａｄｅｘ上で脱塩し、そして凍結乾燥させて純粋なトリメチルアンモニウムクロリド（Ｊ−２／９０（Ａ−ｔｍａ））を得た。８２ｍｇの生じた化合物を得、３２％の収率を生じた。
【０１４４】
Ａ−ＨＣｌを得るために、ＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中のＢＯＣ−Ａ（１．０ｇ、１ｍｍｏｌ）を、０℃にてＭｅＯＨ中のＡｃＣｌの溶液（２０ｍＬ中に２ｍＬ）で処理した。反応系を、ゆっくりと室温にした。３時間後のＴＬＣは、出発物質を全く示さなかった。エバポレーション（ＥｔＯＨ／トルエンで）後、残査をＤｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８−２００イオン交換カラムのＮａ＋形態にアプライした。しかし、生成物はまっすぐに素通りした。０．５ＭのＮａＣｌでの溶出によっては、さらなる物質を全く生じなかった。ＳｉＯ２上でのフラッシュクロマトグラフィーは、成功した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ；６０：３５：５）が、生成物は２つのバンドにおいて溶出されたと思われた。ＮＭＲは、後期および初期の画分が同じであることを示した。６５０ｍｇの得られる化合物Ａ−ＨＣｌを得、６５％の収率を生じた。塩基処理（−Ｏｍｅまたは樹脂）が生成物のＴＬＣの挙動を変更し得ることに注目した。
【０１４５】
（実施例１７）
（Ａ−ｔｍａおよびＡ−ＨＣｌはインビボでの遺伝子移入を増強する。）
この実施例は、化合物Ａ−ｔｍａおよびＡ−ＨＣｌがインビボでの遺伝子移入活性を有することを実証する。
【０１４６】
（方法：）
（１．投与のために溶液の調製）
１ｍｇ／ｍｌの濃度を、両方の化合物の最初の試験のために選択した。これらの化合物のそれぞれについての遺伝子移入活性の決定のために、Ｓｙｎ３アナログ／ウイルス／緩衝液の投与後に得られるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを、ウイルス／緩衝液のみを使用した場合の活性と比較した。
【０１４７】
Ａ−ＴＭＡの溶液を、１０ｍｌのダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳ中に１０ｍｇのＡ−ＴＭＡを溶解させることによって調製した。グリセロールを、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を提供するように添加した。全ての溶液を、使用する前に滅菌濾過した（０．２Фｍ、Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター）。ウイルス（ＢＧＣＧ  ７０ＡＡＢ）を、投与の前に、このＡ−ＴＭＡ溶液か、またはダルベッコのＰＢＳ−グリセロール中のいずれかに１：１０で希釈した。
【０１４８】
Ａ−ＨＣｌは、生理食塩水には完全には溶解しないので、そしてｄＨ２Ｏへの溶解がｐＨが４．７である溶液を生じるので、Ｔｒｉｓ緩衝化溶液を組成が以下の通りであるＡ−ＨＣｌの溶解のために選択した：
溶解緩衝液（緩衝液Ｄ）
２．８ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５
１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２％  スクロース
１０ｍｇ／ｍｌ  グリセロール
最終ｐＨ６．５
１０ｍｇのＡ−ＨＣｌをこの緩衝液中に溶解させ、そして使用の前に滅菌濾過した（０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター）。ウイルス（ＢＧＣＧ  ７０ＡＡＢ）を、投与の前にこの溶液中に１：１０に希釈した。比較のために、Ａ−ＨＣｌを伴わずにこの緩衝液中に希釈したウイルスもまた試験した。
【０１４９】
（２．インビボでの投与）
雌性のＨＳＤラットを、イソフルランを使用して麻酔した。このラットにＫ−Ｙゼリーを用いて滑らかにしたＰＥ５０チューブを使用して膀胱内に経尿道カテーテルを挿入した。逆もれを防ぐために、外尿道に結さつを設置した。必要であれば、尿を除去し、そして膀胱を０．５ｍｌのＰＢＳで洗い流し、そして空にした。ｒＡｄを所望の濃度（１：１０）に希釈し、そして４５分間で注ぎ込んだ。容量の戻りに気を付けながら用量物質を除去した。膀胱を、０．５ｍｌのＰＢＳで洗い流し、そして空にした。結さつおよびカテーテルを除去し、そして動物を籠の中で回復させた。
【０１５０】
４８時間後、動物を屠殺し、そしてそれらの膀胱の膨張を、１時間、０．５ｍｌの固定剤で固定した。次いで、膀胱を一晩リンスし、そして全器官のＸ−ｇａｌ染色を行った。
【０１５１】
（結果：）
２つの化合物の両方が、コントロールと比較して増強された遺伝子移入活性を生じた。遺伝子移入活性のレベルを、表ＩＩＩにまとめる。遺伝子移入活性の相対的なレベルを示す：遺伝子移入活性の最も高いレベルを、「＋＋＋＋」で示し、そして低いレベルを「＋」で示す（移入活性がないことを０で示す）。
【０１５２】
【表３】
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（考察：）
２つの化合物Ａ−ｔｍａおよびＡ−ＨＣｌの両方が、コントロールによって得られる活性のレベルを有意に超える遺伝子移入活性を示した。これらのレベルは、Ｔｗｅｅｎ８０中のＳｙｎ３を使用して得られるレベルよりも低いが、これらは、Ａ−ｔｍａおよびＡ−ＨＣｌのような水性ベースのトランスフェクション増強剤を使用する遺伝子移入の増強が可能であることを示す。Ｓｙｎ３のラクトース部分が無水コハク酸部分で置き換えられている化合物Ａ−ＳＣは、遺伝子移入増強化合物としては有効ではなかった。この化合物は、コントロールと同等のレベルの遺伝子移入活性を生じた（データは示さない）。表ＩＶは、１ｍｇ／ｍｌのＳｙｎ３の遺伝子移入活性と比較した、これらの化合物を使用する遺伝子移入の結果をまとめる。
【０１５３】
【表４】
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両方の化合物がｄＨ２Ｏ中ではるかに高い可溶性を有することが見出されているので（５ｍｇ／ｍｌまで）、これらのアナログの濃度を増加させることは、おそらく、インビボでのなおより大きい遺伝子移入活性を生じる。
【０１５４】
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、詳細にそして個々に参考として援用されることが示されるかのように、それらの全体において本明細書中で参考として援用される。
【０１５５】
本発明にかかわる当業者に明らかであるように、本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、上記に詳細に開示される実施態様以外の形態の実施態様であり得る。従って、上記に記載されている本発明の特定の実施態様は、例示と考えられ、そして限定的ではない。本発明の範囲は、上記の記載に含まれる実施例に限定されるよりもむしろ、添付の請求の範囲に示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図２９】
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