(57)【要約】      （修正有）【課題】リン脂質安定化ペルフルオロブタンマイクロバブルを含む超音波造影剤前駆体の調製、並びに、キット及び超音波造影剤の調製方法。【解決手段】（ｉ）水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンマイクロバブルの水性懸濁液を提供する工程、（ｉｉ）バブルのサイズを２〜５μｍの範囲に調整する工程、（ｉｉｉ）懸濁液を無菌スクロース水溶液で希釈して、５〜２０％ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得る工程、（ｉｖ）組成物のアリコートをバイアルに計量分配して充填バイアルを得る工程、（ｖ）計量分配が終了した後、充填バイアルを−４０℃〜−７０℃の温度に冷却する工程、（ｖｉ）工程（ｉｖ）及び（ｖ）を繰り返す工程、（ｖｉｉ）冷却充填バイアルを凍結乾燥する工程、（ｖｉｉｉ）凍結乾燥バイアルのヘッドスペースガスをペルフルオロブタンでバックフィリングする工程、（ｉｘ）クロージャーで密封する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロース中の、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンのマ
イクロバブルの凍結乾燥組成物を含む超音波造影剤前駆体の調製方法であって、当該方法
が、
（ｉ）水溶液中の、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンマイ
クロバブルの水性懸濁液を提供する工程と、
（ｉｉ）マイクロバブルのサイズを２〜５μｍの範囲のメジアン径に調整する工程と、
（ｉｉｉ）サイズを調整した工程（ｉｉ）の懸濁液を無菌スクロース水溶液で希釈して、
５〜２０％  ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得る工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の組成物のアリコートをバイアルに計量分配して、充填バイアル
を得る工程と、
（ｖ）工程（ｉｖ）の計量分配が終了した後、５分未満の保持時間内に、各々の充填バイ
アルを−４０℃〜−７０℃の温度に冷却する工程と、
（ｖｉ）望ましい数の冷却された充填バイアルが得られるまで、必要に応じて工程（ｉｖ
）及び（ｖ）を繰り返す工程と、
（ｖｉｉ）工程（ｖ）及び（ｖｉ）の冷却された充填バイアルを凍結乾燥する工程と、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）の凍結乾燥バイアルのヘッドスペースガスをペルフルオロブ
タンでバックフィリングする工程と、
（ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）のバイアルをクロージャーで密封する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
凍結乾燥前駆体組成物が無菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉｉ）のスクロース濃度が８〜１２％  ｗ／ｖである、請求項１又は請求項２
記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉｉ）のサイズ調整が、
（ａ）１サイクル以上の浮選及び再懸濁、又は
（ｂ）分画遠心法、又は
（ｃ）それらの組合せ
によって実施される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉｉ）の後、分配工程（ｉｖ）に進む前に、サイズ分布及びマイクロバブル濃
度がチェックされる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｖ）において、複数のバイアルが並行して計量分配される、請求項１乃至請求
項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程（ｖ）において、複数の充填バイアルが並行して冷却される、請求項１乃至請求項
６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程（ｖ）の保持時間が３分未満である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の
方法。
【請求項９】
工程（ｖ）の保持時間が各充填バイアルについて同じである、請求項１乃至請求項８の
いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
無菌水性媒体中、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンのマ
イクロバブルの懸濁液を含む超音波造影剤の調製のためのキットの調製方法であって、
（ｉ）請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法を実施して、請求項１乃至請求項
３のいずれか１項記載の造影剤前駆体を含むバイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前駆体のバイアルを再構成するのに適した無菌水溶液の容器を提供
して造影剤を得る工程と
を含む、方法。
【請求項１１】
無菌水溶液が、１００μＭ未満の総濃度の遊離アルミニウム、バリウム、マグネシウム
、カルシウム及び亜鉛イオンを含む注射水である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
無菌水性媒体中、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンのマ
イクロバブルの懸濁液を含む超音波造影剤の調製方法であって、
（ｉ）請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法を実施して、請求項１乃至請求項
３のいずれか１項記載の造影剤前駆体を含むバイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前駆体のバイアルを無菌水溶液で再構成する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質安定化ペルフルオロブタンマイクロバブルを含む超音波造影剤前駆
体の調製方法に関する。この方法は商業規模の製造に適応でき、マイクロバブルのより一
貫したバイアル間収量及びサイズ分布を提供する。また、本発明の方法を用いてキット及
び超音波造影剤を調製する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ペルフルオロカーボン（例、ペルフルオロプロパン又はペルフルオロブタン）のリン脂
質安定化マイクロバブルに基づく超音波造影剤は、当技術分野で周知である［例えば、Ｗ
ｈｅａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２３
（１），５７−７２（２０１３）参照］。
【０００３】
国際公開第９７／２９７８２号は、室温で安定している超音波造影剤前駆体が、スクロ
ース、マルトース、トレハロース、ラフィノース又はスタキオース、好ましくはスクロー
スから選択される凍結乾燥安定剤の存在下でペルフルオロカーボンマイクロバブルを凍結
乾燥することによって調製することができることを教示する。
【０００４】
国際公開第９９／０３５５８号は、多分散混合物を形成する超音波造影ガスマイクロバ
ブルを選択して、より狭いサイズ分布（すなわち単分散）のマイクロバブルを得る方法を
開示する。記載される方法は、浮選及び再懸濁を伴う。
【０００５】
国際公開第９９／０８７１５号は、ガスを含む小胞（その膜は両親媒性の膜形成材料を
含む）の水性分散液を含む医薬組成物の調製のためのプロセスを開示し、プロセスは、
（ｉ）両親媒性の膜形成材料を含む混合物からガスを含む小胞の分散液を形成する工程と
、
（ｉｉ）ガスを含む小胞の分散液を凍結乾燥する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の凍結乾燥生成物を無菌水性液によって再構成して、ガスを含む
小胞の水性分散液を形成する工程と、
（ｉｖ）工程（ｉ）又は工程（ｉｉｉ）の水性分散液生成物或いは工程（ｉｉ）の凍結乾
燥生成物を処理して、実質的に凝集体を含まない、ガスを含む小胞の無菌水性分散液を形
成する工程と
を含む。
【０００６】
国際公開第９９／０８７１５号は、不必要な大型の種を形成するマイクロバブルの凝集
を抑制するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間の時間を最小限にするべきであると教示す
る。しかし、国際公開第９９／０８７１５号は、ガスを含む小胞が凍結乾燥の前にサイズ
制御されるべきであること、抗凍結剤／リオプロテクタントは凍結乾燥工程の前に使用さ
れなければならないか、又は、バッチ製造プロセスでは複数の個々のバイアルの中に計量
分配されなければならないことを教示していない。
【０００７】
欧州特許第１２２８７７０号は、凍結乾燥前駆体のバイアルがヘッドスペースガスを減
圧密封される、ガスマイクロバブルを含む凍結乾燥超音波造影剤を調製するためのプロセ
スを教示する。減圧は、前駆体バイアルの再構成後に形成される水性マイクロバブル組成
物中で粒度を制御するのを助けると言われている。
【０００８】
国際公開第２００４／０６９２８４号は、決められたサイズ分布のリン脂質安定化ガス
マイクロバブル超音波造影剤を得る問題に対処する。国際公開第２００４／０６９２８４
号は、凍結乾燥の前に、実質的に水不混和性の有機溶媒をマイクロバブル調製乳濁液で使
用するべきであることを教示する。国際公開第２００４／０６９２８４号は、凍結乾燥前
駆体の再構成によって得られるマイクロバブルは、直径が比較的小さく、サイズ分布が狭
いことを教示する。
【０００９】
Ｓｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．，３９６（１−２）、
３０−３８（２０１０）］は、リオプロテクタントをはじめとする賦形剤の凍結乾燥した
ペルフルオロプロパンマイクロバブル前駆体への効果を研究した。グルコースが最良のリ
オプロテクタントであり、その次が僅差でトレハロースであり、両方ともスクロース又は
マンニトールよりも優れていると結論付けた。
【００１０】
Ｆｅｓｈｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．，３２９，３
１６−３２４（２００９）］は、界面活性剤で被覆したマイクロバブルと対照的に、脂質
で被覆したマイクロバブルは遠心分離後も安定していること、及び脂質シェルは非常に粘
稠であってガスに比較的不浸透性であることを報告している。Ｆｅｓｈｉｔａｎ  ｅｔ  
ａｌは、４〜５μｍのサイズ範囲のペルフルオロブタンマイクロバブルは少なくとも２日
間安定していたが、２週間後にそれよりも小さいサイズのマイクロバブル（１〜２μｍ）
に崩壊する傾向があったことを報告している。
【００１１】
マイクロバブル濃度及びサイズ分布、収量並びに造影剤のその他の重要な特徴のバイア
ル間の変動を制御する、超音波凍結乾燥前駆体の調製方法がなお必要とされている。その
ような方法は、商業規模の製造に適応できる必要があり、均一なバイアル含量及び規制要
件（例、米国薬局方及びＩＣＨガイドライン）を満たす安全性プロフィールをもつ前駆体
生成物を生成する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９９／０８７１５号パンフレット
【発明の概要】
【００１３】
従来のマイクロバブル超音波造影剤の調製方法、例えば超音波処理、及び高剪断乳化な
どは、商業生産へのスケールアップ能力とともに、良好な収量及び低コスト生産を提供す
る。これらには、マイクロバブルのサイズ分布を制御することが困難であるという不利益
がある。より狭いサイズ分布をもつそのようなマイクロバブルの調製を許容する他の調製
技術が開発されているが、これらの代わりとなる方法は、収量が低いか、高額な装置を含
むか、又は商業的生産方法にスケールアップするまでに時間がかかりすぎる。
【００１４】
本発明は、商業規模の製造に従うが、マイクロバブル濃度、サイズ分布、収量及び造影
剤のその他の重要な特徴のバイアル間の変動を適切に制御もする方法を提供しようとする
ものである。
【００１５】
本発明者らは、マイクロバブル造影剤のバイアルの数千のバッチサイズの製造において
、変動性を制御するために２つの主要なパラメータ：（ａ）凍結乾燥の前のマイクロバブ
ルサイズ範囲；及び（ｂ）所与バイアルに計量分配された時からバイアルの内容物が−４
０〜−７０℃（「保持時間」）で凍結するまでの経過時間が重要であることを見出した。
【００１６】
本発明は、両方のパラメータを制御する方法を提供し、結果として生じる利点は、
（ｉ）各々のバイアル中のマイクロバブルの最適な収量及び濃度；
（ｉｉ）バイアル間の含有量の均一性の制御
である。
【００１７】
本発明の造影剤前駆体は、多価陽イオンに対して感受性が低いことも見出された。
【００１８】
理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、液体マトリックス（例、ス
クロース溶液）とガス入りマイクロバブルとの間の密度増加分が大きいことに起因して、
マイクロバブルが液体体積の上部に速やかに分離する傾向があると考える（「クリーミン
グ」）。上記の利益（ｉ）及び（ｉｉ）をもたらすために、最小限にし、制御する必要が
あるのがこのクリーミングである。表面層の高濃度のマイクロバブルが凍結乾燥中のケー
クの乾燥を損なう可能性があり、かつ／又は、高すぎる局所濃度がマイクロバブルの残存
率を激減させる可能性がある（マイクロバブルは最終スクロース構造の外部、すなわち完
全に埋め込まれたガスポケットよりも表面の孔に部分的に捕捉されるため）と考えられて
いる。
【００１９】
発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、スクロース中の、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化
したペルフルオロブタンのマイクロバブルの凍結乾燥組成物を含む超音波造影剤前駆体の
調製方法を提供し、方法は
（ｉ）水溶液中の、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンマイ
クロバブルの水性懸濁液を提供する工程と、
（ｉｉ）マイクロバブルのサイズを２〜５μｍの範囲のメジアン径に調整する工程と、
（ｉｉｉ）サイズを調整した工程（ｉｉ）の懸濁液を無菌スクロース水溶液で希釈して、
５〜２０％  ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得る工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の組成物のアリコートをバイアルに計量分配して、充填バイアル
を得る工程と、
（ｖ）工程（ｉｖ）の計量分配が終了した後、５分未満の保持時間内に、各々の充填バイ
アルを−４０℃〜−７０℃の温度に冷却する工程と、
（ｖｉ）望ましい数の冷却された充填バイアルが得られるまで、必要に応じて工程（ｉｖ
）及び（ｖ）を繰り返す工程と、
（ｖｉｉ）工程（ｖ）及び（ｖｉ）の冷却された充填バイアルを凍結乾燥する工程と、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉｉ）の凍結乾燥バイアルのヘッドスペースガスをペルフルオロ
ブタンでバックフィリングする工程と、
（ｉｘ）工程（ｖｉｉ）のバイアルをクロージャーで密封する工程と
を含む。
【００２０】
用語「造影剤」は、生体内医用イメージングの分野のその従来の意味を有し、目的の部
位又は器官において哺乳動物対象だけをイメージングすることによって得られる画像より
もはっきりした画像を得るのを助ける、哺乳動物への投与に適した形態の薬剤をさす。用
語「対象」とは、生体内の哺乳動物、好ましくは生体内のインタクトな哺乳動物の身体、
より好ましくは生きているヒト対象をさす。語句「哺乳動物への投与に適した形態の」と
は、無菌の、発熱物質を含まない、中毒作用又は有害作用を生じる化合物を含まない、生
体適合性のｐＨ（およそｐＨ４．０〜１０．５）で処方される組成物を意味する。そのよ
うな組成物は、生体内で塞栓を引き起こすリスクがあり得る微粒子を含まず、生物流体（
例、血液）と接触して沈殿が起こらないように処方されている。また、そのような組成物
は、生体適合性の賦形剤だけを含み、好ましくは等張性である。
【００２１】
その他の生体内造影剤と同様に、この造影剤は、イメージングされる哺乳動物への薬理
効果が最小であるように設計されている。好ましくは、造影剤は、専門家による医学専門
知識のもとで実施された場合に、哺乳動物の身体に最小限の侵襲で、すなわち哺乳動物の
対象への実質的な健康リスクなく投与されることができる。そのような最小限の侵襲性投
与は、好ましくは、局所又は全身麻酔薬を必要としない対象の末梢静脈への静脈内投与で
ある。
【００２２】
用語「マイクロバブル」は、生体内で超音波イメージングの分野のその従来の意味を有
し、直径が一般的に０．５〜１０μｍのガスマイクロバブルをさす。７μｍを超えるサイ
ズで、肺毛細管内で停留（塞栓形成）の実質的なリスクがある。そのようなマイクロバブ
ルはサイズが赤血球と類似している、それによってマイクロバブルは哺乳動物の身体中の
微小血管及び毛細管で同様の特徴を示すことができる［Ｓｉｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｕｂ
ｂｌｅ  Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１（１−２），３−１７（２００９）］。
【００２３】
本発明の適したマイクロバブルは、Ｓｉｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ（上記）に記載されるよう
に、リン脂質のシェル又はコーティング−特に、水素化卵ホスファチジルセリン（Ｈ−Ｅ
ＰＳ）中に存在するリン脂質によって安定化される。Ｈ−ＥＰＳ中に存在するリン脂質は
、主にホスファチジルセリン及びホスファチジン酸である［Ｈｖａｔｔｕｍ  ｅｔ  ａｌ
，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，４２，５０６−５１２（２００６）］。
【００２４】
ペルフルオロブタン（「ＰＦＢ」）はその標準的な化学的意味を有し、医学的に使用さ
れる状況でペルフルブタンとも呼ばれる。ペルフルオロ−ｎ−ブタンの化学式は、ＣＦ3
ＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3又はＣ4Ｆ10であり、沸点は−２．２℃である。市販のペルフルオロ−ｎ
−ブタンは、少量（一般に２〜４％）のペルフルオロ−ｉｓｏ−ブタン異性体、すなわち
、ＣＦ3ＣＦ（ＣＦ3）ＣＦ3を含む。
【００２５】
用語「水性懸濁液」とは、水及び／又は水混和性溶媒を含む水性溶媒中のマイクロバブ
ルの懸濁液をさす。水性溶媒は、好ましくは生体適合性担体である。用語「生体適合性担
体」とは、その組成物が生理学的に忍容性のあるような、すなわち、毒性又は過度の不快
感なく哺乳動物の身体に投与することができる流体、特に液体を意味する。生体適合性担
体は、適切には、無菌の発熱物質を含まない注射水などの注射可能な担体液体；生理食塩
水などの水溶液（有利には平衡させて、注射用最終生成物が等張性であるようにしてよい
）；生体適合性緩衝剤を含む緩衝水溶液（例、リン酸緩衝液）；１又は複数の等張化物質
（例、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖（例、グルコース又はスクロース
）、糖アルコール（例、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール（例、グリセロー
ル）、又はその他の非イオン性ポリオール材料（例、ポリエチレングリコール、プロピレ
ングリコール及び同類のもの）の水溶液である。好ましくは、生体適合性担体は、発熱物
質を含まない注射水、等張性の生理食塩水又はリン酸緩衝液である。従って、水性懸濁液
は、適切に水不混和性の有機溶媒を除外する。
【００２６】
用語「前駆体」とは、再構成によって望ましい超音波造影剤を容易に形成するように設
計された、造影剤の簡便な形態又はキット形態をさす。
【００２７】
用語「充填バイアル」とは、充填されたバイアル、つまりその中に組成物のアリコート
が計量分配されたバイアル、すなわち、計量分配バイアルをさす。バイアルは物理的に満
杯ではない、それはバイアルの容積が一般に１０ｍＬ、計量分配された容積が約２ｍＬと
なり、組成物の上方にヘッドスペースガスを残すためである。用語「ヘッドスペースガス
」は、その従来の意味を有し、凍結乾燥組成物の上のバイアル内部のガスをさす。
【００２８】
語句「保持時間」とは、充填後、すなわち工程（ｉｖ）の個々のバイアルの計量分配の
後から、充填バイアルの−４０〜−７０℃への冷却を開始するまでの遅延時間をさす。
【００２９】
第１の態様の方法の工程（ｉ）のマイクロバブル調製は、当分野で公知の多様な方法に
よって実施することができ、以下のものが挙げられる。
（ｉ）超音波処理；
（ｉｉ）高剪断乳化；
（ｉｉｉ）膜乳化；
（ｉｖ）同軸電気流体力学的微粒化（ＣＥＨＤＡ）；及び
（ｖ）マイクロ流体デバイス；
（ｖｉ）インクジェット印刷。
【００３０】
これらの方法は、Ｓｔｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ［Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，４，２３５０
−２３５９（２００８）］及びその中の参考文献に記載されている。マイクロバブル調製
方法のさらなる詳細は、Ｕｎｎｉｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ［Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔ
ｇｅｎｏｌ．，１９９（２），２９２−２９９（２０１２）］に記載されている。
【００３１】
インクジェット印刷は、Ｓｔｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ（上記）によって液体を充填した粒
子により適していることが報告されているので、本発明のＰＦＢマイクロバブルにはあま
り適していない。超音波処理はあまり好ましくない、それは、超音波処理が広範囲の気泡
サイズをもたらす傾向があり、マイクロ流体技術には商業的製造に適さない遅い生産速度
の問題があるためである［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．
，３９（５），８８２−８９２（２０１３）］。
【００３２】
本発明の好ましい製造方法は、好ましくはローター・ステーターミキサーを使用する高
剪断乳化である。それは、ローター・ステーターミキサーが、より大きなサイズ制御をも
たらし、大型のバッチ製造に適応でき、固定的なサイズ分布を提供するためである。マイ
クロバブルは、数秒間、ペルフルオロカーボン（ここではＰＦＢ）の存在下で無菌の発熱
物質を含まない脂質懸濁液をかき混ぜることによって形成される。実施例１は、ローター
・ステーターによるマイクロバブル調製方法を提供する。ローター・ステーターミキサー
は、Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ［Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，９０（３），
３２３−３２７（２０１２）及びＥｍｕｌｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔ
ａｂｉｌｉｔｙ［Ｔ．Ｆ．Ｔａｄｒｏｓ（Ｅｄ）、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ（２０１３）］（
特にＰａｃｅｋ  ｅｔ  ａｌによるＣｈａｐｔｅｒ  ５  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｉｎ  Ｒｏｔｏｒ−Ｓｔａｔｏｒ  Ｍｉｘｅｒｓ，ｐ．１２７−１６７を参照）に記載
されている。
【００３３】
第１の態様の方法の工程（ｉｉ）のマイクロバブルのサイズ調整は、当分野で公知の多
様な方法によって実施することができ、以下のものが挙げられる。
（ａ）１サイクル以上の浮選及び再懸濁、又は
（ｂ）分画遠心法、又は
（ｃ）粗大細孔によるクロスフロー濾過、又は
（ｄ）フィールドフロー分画。
【００３４】
浮選及び再懸濁は、Ｋｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ［Ｓｅｐａｒａｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，６
，２１９−２２６（１９９６）］、及び本発明の実施例２に記載されている。サイズ範囲
１〜２μｍ及び４〜５μｍの脂質でコーティングしたペルフルオロブタンマイクロバブル
の亜集団を分離及び単離する分画遠心法は、Ｆｅｓｈｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ［Ｊ．Ｃｏｌ
ｌ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．，３２９，３１６−３２４（２００９）］に記載されている
。
【００３５】
リン脂質安定化ペルフルオロブタンマイクロバブル、例えばＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）
剤などは、柔軟であって安定している。従って、それらはサイズ分布にあまり変化なく５
μｍフィルタを通過することができる［Ｓｏｎｔｕｍ，Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ
ｌ．，３４（５），８２４−８３３（２００８）］。このことと、そのような濾過が小さ
すぎるマイクロバブルを除去することができないという事実は、フィルタの通過が、それ
自体、本発明の工程（ｉｉ）のサイズ調整に適した方法でないことを意味する。
【００３６】
ある調製技法は、規定された狭いサイズ分布のマイクロバブルを提供することを目的と
する。そのような例では、第１の態様の方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、事実上同時に
実施される。それらの調製技法は、ＣＥＨＤＡ及びマイクロ流体デバイスである。従って
、代替実施形態では、第１の態様には、順次に実施するのとは対照的に、工程（ｉ）及び
（ｉｉ）を同時に実施する選択肢が含まれる。
【００３７】
語句「各々の充填バイアルを−４０℃〜−７０℃の温度に冷却する工程」は、バイアル
及び内容物の冷却をさす。バイアルの内容物の凍結も起こることになるが、ある程度の変
動を伴う。それは、一部のバイアルは凍結乾燥機の棚で過冷却される可能性があり、その
ためバイアルの内容物を冷凍する時間が長くかかるためである。
【００３８】
本発明の方法は、商業規模の生産、例えば、製造バッチにおいて１００，０００までの
、一般に約３５，０００〜４０，０００のバイアル数に特に適している。そのような大き
い規模の商業的製造では、バイアル間の一貫性、すなわち、バイアル間の変動を最小にす
ることが重要である。従って、工程（ｉｖ）で計量分配されるアリコートは、好ましくは
同じ体積であり、より好ましくは±３％の許容差内に制御される。
【００３９】
そのような多数のバイアルに関して、本発明者らは、マイクロバブルのサイズ分布、及
び凍結乾燥の前の保持時間を制御することが重要であることを見出した。工程（ｖ）に従
ってスクロース水溶液中で急速に凍結することは、バイアル間の内容物の均一性、特にμ
バブル濃度を制御するために重要であることが見出された。そのような急速な冷却は、当
分野で公知の方法、例えば、液体窒素浴に浸漬；有機溶媒／ドライアイス冷浴に浸漬；或
いは凍結乾燥装置内の低温の棚又は環境などによって実施することができる。
【００４０】
商業的なバッチサイズのそのような状況では、全ての計量分配され／充填されたバイア
ルがその後凍結するまで、全てのバイアルが充填されるまで段階的に進めて待つことは実
施可能でないことが分かった。このことは、一度単離されると、脂質でコーティングされ
たＰＦＢマイクロバブルは２日以上安定しているという従来の見識と矛盾する［Ｆｅｓｈ
ｉｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．，３２９，３１６−３２
４（２００９）］。従って、本発明者らは、バッチの均一性を制御するために、以下の重
要なパラメータ：
（ｉ）凍結乾燥の前のマイクロバブルメジアン径；及び
（ｉｉ）「保持時間」−これは５分未満、好ましくは３分未満の期間に最小化されるべき
である−
が２つとも制御されねばならないことを見出した。
【００４１】
さらなる詳細は、裏付けとなる実施例及び図面（下記）に示される。
【００４２】
工程（ｖｉ）において、「望ましい数」とは、造影剤前駆体の特定の製造バッチにおけ
るバイアルの総数をさす。従って、工程（ｖｉ）は、工程（ｖ）の保持時間制限を実現す
る必要性が、所与バッチサイズのバイアルに関して、全バッチのバイアルが充填され冷却
されて、工程（ｖｉｉ）に従って凍結乾燥する準備ができている状態まで、多くの計量分
配及び凍結の繰り返しサイクルが必要となりうることを意味する状況を包含するものであ
る。
【００４３】
用語「含んでいる」又は「含む」は、本願を通じてその従来の意味を有し、薬剤又は組
成物は列挙される本質的な特徴又は成分を有していなければならないが、それに加えて他
の本質的な特徴又は成分が存在していてもよいことを意味する。用語「含んでいる」には
、組成物が列挙した成分を含み、その他の特徴又は成分は存在しないことを意味する「か
ら本質的になる」が好ましいサブセットとして含まれる。
【００４４】
バックフィリング工程（ｖｉｉｉ）では、ヘッドスペースガスは、ほぼ気圧まで、好ま
しくは、当技術分野で公知のように、バイアルに栓をするのを容易にする気圧の少し下ま
で充填される。
【００４５】
好ましい実施形態
第１の態様の方法は、１４〜１８μｌ／ｍＬの範囲のミクロスフェア濃度、及び２．７
〜３．５μｍの範囲のマイクロバブルのサイズ分布（メジアン径）を提供する。
【００４６】
第１の態様の方法では、工程（ｖ）の保持時間は、好ましくは３分未満である。工程（
ｖ）の保持時間は、好ましくは、充填バイアルにつき１．０〜２．７５分の時間範囲内に
なるように制御される。
【００４７】
第１の態様の方法では、凍結乾燥前駆体組成物は、好ましくは無菌である。
【００４８】
第１の態様の方法では、バッチサイズは、好ましくは造影剤前駆体を充填するバイアル
が５００〜８０，０００本、より好ましくは１，０００〜５０，０００本、最も好ましく
は５，０００〜４５，０００本の範囲内である。バイアルが約３５，０００〜４０，００
０本のバッチサイズが理想である。
【００４９】
工程（ｖ）において、充填したバイアルを冷却する温度は、好ましくは約−６０℃であ
る。急速冷却は、好ましくは、中の棚が−６０℃に予冷される凍結乾燥装置に挿入するこ
とによって実現される。
【００５０】
第１の態様の方法では、工程（ｉｉｉ）のスクロース濃度は、好ましくは８〜１２％  
ｗ／ｖ、より好ましくは約１０％  ｗ／ｖ、最も好ましくは９２ｍｇ／ｍＬである。スク
ロースは、リオプロテクタント／抗凍結剤として作用し、脂質安定化ＰＦＢマイクロバブ
ルが前駆体の凍結乾燥スクロースに閉じ込められているマトリックスを形成することが示
されている、そのため、マイクロバブルのサイズ及び濃度はあらかじめ決められていて、
最終使用者によって採用される再構成手順による影響を受けない。従って、前駆体バイア
ルを適した水性媒体で再構成すると、スクロースは溶けてリン脂質安定化ＰＦＢマイクロ
バブルを放出する［Ｓｏｎｔｕｍ，Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４（５），
８２４−８３３（２００８）］。糖をリオプロテクタント又は抗凍結剤として使用するこ
とは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔ．，３９６，３０−３８（２０１０）］及びその中の参考文献に記載され
ている。
【００５１】
第１の態様の方法では、工程（ｉｉ）のサイズ調整は、好ましくは、
（ａ）１サイクル以上の浮選及び再懸濁、又は
（ｂ）分画遠心法、又は
（ｃ）それらの組合せ
によって実施される。
【００５２】
第１の態様の方法では、工程（ｉｉｉ）の後、サイズ分布及びマイクロバブル濃度が適
していることをチェックし、その後に分配工程（ｉｖ）及びその後の凍結乾燥に進むこと
が好ましい。従って、不適切な材料を計量分配及び凍結乾燥する時間及び費用を避けるた
めに、合否判定基準はその段階で重要である。
【００５３】
第１の態様の方法の工程（ｉｖ）では、複数のバイアルは、好ましくは並行して、すな
わち同時に計量分配される。工程（ｖ）では、複数の充填バイアルは、好ましくは並行し
て、すなわち同時に冷却される。当業者は、利用可能な計量分配装置（特に、同時計量分
配に利用可能なディスペンサーアームの数）、凍結乾燥装置のサイズ及びバイアル当たり
の計量分配時間に基づいてここで適した数を選ぶことができる。従って、本特許請求の範
囲に従ってバイアル当たりの計量分配時間及び最大保持時間を知ることによって、当業者
は、工程（ｖ）の冷却をバッチの範囲内のバイアルのサブセットに実施せねばならない
時までにどのくらいのバイアルを充填することができるかを容易に解明することができる
。好ましくは、各群の充填バイアルは、所望の温度（例えば、−６０℃）に維持された凍
結乾燥装置（例えば、凍結乾燥機内の棚）に進行的に装填され、バッチ全体が凍結乾燥装
置に挿入されるまでその温度で維持される。好ましい実施形態では、４本の充填針がディ
スペンサーから使用されるので、４本のバイアルは同時に充填される。７０本のバイアル
のサブグループは、このように充填された後、−６０℃に予冷された凍結乾燥機に挿入さ
れる。
【００５４】
本発明の好ましい超音波造影剤及び前駆体は、Ｓｏｎｔｕｍ［Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ
．Ｂｉｏｌ．，３４（５），８２４−８３３（２００８）］に記載されるように、以前か
らＮＣ１００１００として公知のＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）（ＧＥヘルスケアＡＳ）であ
る。
【００５５】
第１の態様の方法での使用に適したバイアル及びクロージャーは医薬品等級であり、凍
結乾燥に適し、広く市販されている。平底のバイアルを使用することが、バイアルと凍結
乾燥機の棚との間の熱伝達を増やすので好ましい。クロージャーは、好ましくは凍結乾燥
に適し、バイアルから蒸気を逃がすように設計されている（凍結乾燥機を開けて中身を取
り出すまでバイアルに栓をすることを可能にする）ものを選択する。
【００５６】
スクロースも市販されており、医薬品等級を使用する。医薬品ＧＭＰ等級のペルフルオ
ロブタンは、Ｆ２ケミカルズ社より入手することができる。Ｈ−ＥＰＳは、兵庫県尼崎市
、日油株式会社（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より市販されている。
【００５７】
第２の態様では、本発明は、無菌水性媒体中、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化
したペルフルオロブタンのマイクロバブルの懸濁液を含む超音波造影剤の調製のためのキ
ットの調製方法を提供し、それは、
（ｉ）第１の態様の方法を実施して、第１の態様に定義される造影剤前駆体を含むバイア
ルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前駆体のバイアルを再構成するのに適した無菌水溶液の容器を提供
して造影剤を得る工程と
を含む。
【００５８】
第１の態様の方法の好ましい実施形態、及び第２の態様のキット調製方法の前駆体は、
第１の態様（上記）に記載される通りである。
【００５９】
用語「キット」は、本明細書では、生体内イメージングの分野のその従来の意味を有し
、目的の造影剤を哺乳動物投与に適した形態で調製するための全ての必要な成分（上に定
義される通り）を供給された、造影剤自体、又はその前駆体をさす。そのようなキットは
、臨床医が、目的の哺乳動物対象をイメージングするのに適した転機及び時期に造影剤を
調製することができるように、数週間又は数カ月の使用に適した貯蔵寿命を有するよう設
計されている。一度調製すると、造影剤自体の使用に適した貯蔵寿命はずっと短いので、
このことは一般的に臨床医にとってより便利である。キットを備えているということは、
臨床医が２４時間、７日、必要な時はいつでも造影剤を入手できることを意味する。キッ
トには、キット及びその構成部品を定める「パッケージ・リーフレット」が適切に含まれ
、患者の安全情報とともにキットの使用法の詳細、及び商業供給業者の詳細が得られる。
そのようなキットは、一般に超音波造影剤を提供するよう設計された商品の好ましい形式
を代表する。
【００６０】
第２の態様の工程（ｉｉ）の無菌水溶液は、好ましくは、上に定義されるような「生体
適合性担体」である。より好ましくは、それは注射用滅菌水である。最も好ましくは、無
菌水溶液の遊離（すなわち、キレート化していない）アルミニウム、バリウム、マグネシ
ウム、カルシウム及び亜鉛イオンの総濃度は、１００μｍ未満、理想的には５０μｍ未満
である。
【００６１】
第２の態様のキットは、好ましくはＣｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔ（登録商標）スパイク（
Ｃｏｄａｎ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ、ドイツ）などのベントフィルタ（５μｍ）スパイクをさら
に含む。キットは、スパイクによって水溶液で再構成され、それに続いて約１分間手で混
合して乳状の均質な分散系を得る。次に、対象をイメージングするための造影剤の用量を
フィルタスパイクを通してシリンジに引き入れる。「スパイク」の役割は、外来粒子又は
凝集塊を除去することである（そうでなければ、バイアル内部の分散系は不透明なため、
それらを外観検査で検出することは困難である）。
【００６２】
第３の態様では、本発明は、無菌水性媒体中、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化
したペルフルオロブタンのマイクロバブルの懸濁液を含む超音波造影剤の調製方法を提供
し、それは、
（ｉ）第１の態様の方法を実施して、第１の態様に定義される造影剤前駆体を含むバイア
ルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前駆体のバイアルを無菌水溶液で再構成する工程と
を含む。
【００６３】
第１の態様の方法の好ましい実施形態、及び第２の態様の造影剤調製方法の前駆体は、
第１の態様（上記）に記載される通りである。第３の態様の方法は、好ましくは第２の態
様のキットの調製方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】前駆体のバイアル中のマイクロバブルの含有量への保持時間の効果（３分未満の保持時間にバイアルに存在するマイクロバブルの平均レベルの百分率として表す）を示す図である。バイアルあたりのマイクロバブルの収量は、約２０分の保持時間での初期値の約８５％に減少し、６０分の保持時間での初期値のわずか約７５％に減少した。
【図２】前駆体バイアルのＵｏＣへの保持時間の効果を示す図である；個々のバイアル値は群平均の百分率で表される。保持時間範囲が長くなるほど、バイアルあたりのマイクロバブルの多様性は大きくなる。従って、相対標準偏差（ＲＳＤ）で表される、マイクロバブルの収量の全範囲は、３分未満の保持時間で１５％から、２０分未満で２２％を経て、６０分未満で２９％にも増加した。水平の点線は、ＵｏＣに対する薬局方要件をバッチ平均から個々の単位の最大許容偏差；±２５％として示す。記したように、３分未満の保持時間範囲で、全てのバイアルはこれらの要件内にある。２０分の保持時間範囲でさえも、２０本のバイアル中５本が薬局方の設定した要件から外れる。６０分の保持時間範囲では、試験した３９本のバイアル中１１本が要件から外れる。
【００６５】
組合せて、図１及び２は、収量を最適化するための、かつ、ＵｏＣ（バイアル間の分散
）に対する規制要件に従う製品を製造するための、短い保持時間、及び充填と凍結乾燥と
の間の狭い保持時間の分散の重要性を示す。
【図３】マイクロバブルサイズ（μｍで表される直径）の浮選速度への影響を示す図である。プロットは、１ｇ／ｍｌの密度増分及び１ｍＰａ  ｓの粘度についてストークス方程式に基づいて計算される。特に、凍結乾燥中の充填高さは一般に１ｃｍであり、懸濁液中の全ての５μｍマイクロバブルは、従って約１２分で液体マトリックスの上部に分離されている。
【図４】凍結乾燥の前のマイクロバブルのサイズと比較したマイクロバブルの損失率に関するデータを示す図である。結果は、２７のバッチの各々に対して、凍結乾燥前後の１０本バイアルの分析から得た。図３及び４は、ともに、大型のマイクロバブルの方がずっと急速にクリーム状になり、そのためにマイクロバブルの収量の損失を招くことを示す。その結果として、前駆体のバイアル中のＵｏＣは、小型のマイクロバブルよりも凍結乾燥前の大型のマイクロバブルの存在に対して感受性が高い。図４はまた、２．５μｍのバブルの約４０％から３．７μｍのバブルの８０％に損失が増加することも示す。図３及び４はともに、なぜ第１の態様の方法の工程（ｉｉ）の凍結乾燥前のサイズ調整が重要であるかを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明は、下に詳述される限定されない実施例によって説明される。実施例１は、ロー
ター・ステーター混合を用いる、Ｈ−ＥＰＳによって安定化されたＰＦＢマイクロバブル
の調製を提供する。実施例２は、浮選を用いる、実施例１のマイクロバブルのサイズ調整
の方法を提供する。実施例３は、ＰＦＢマイクロバブルの収量及びＵｏＣへの保持時間の
効果についての詳細を提供する。保持時間に対するマイクロバブル濃度の結果は図１に示
され、保持時間範囲に対するＵｏＣの結果は図２に示される。組合せて、図１及び２は、
収量を最適化するための、かつ、ＵｏＣ（バイアル間の分散）に関する規制要件に従う製
品を製造するための、短い保持時間、及び充填と凍結乾燥との間の狭い保持時間の分散の
重要性を示す。
【００６７】
実施例４は、凍結乾燥中の損失へのマイクロバブルサイズの効果を示す。直径に対する
マイクロバブル浮選速度の結果は図３に示され、マイクロバブル直径に対する凍結乾燥中
の損失の結果は図４に示される。組合せて、図３及び４は、浮選速度と、続いて起こるマ
イクロバブルサイズの増加に伴う凍結乾燥中の損失の増加へのマイクロバブルサイズの影
響を示し、従って、損失を最小限に抑え、ＵｏＣの要件を満たすための、凍結乾燥の前の
サイズ調整工程の重要性を示す。
【００６８】
略語
ＦＤ：凍結乾燥。
【００６９】
ＧＭＰ：医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準；
Ｈ−ＥＰＳ：水素化卵ホスファチジルセリン；
ＩＣＨ：医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議；
ｉ．ｖ．：静脈内；
Ｍｉｎ：分；
ＰＡ：ホスファチジン酸；
ＰＦＢ：ペルフルオロブタン；
ＰＳ：ホスファチジルセリン；
Ｒｐｍ：毎分回転数；
ＵｏＣ：内容物の均一性；
ＷＦＩ：注射水。
【００７０】
実施例１：ローター・ステーター混合によるペルフルオロブタンマイクロバブル分散系
の調製。
【００７１】
Ｈ−ＥＰＳ（５００．４ｍｇ）を、５．４％（ｗ／ｗ）のプロピレングリコール及びグ
リセロール（３：１０  ｗ／ｗ）の混合物を含有する５〜１００ｍＬの水に添加した。混
合物を振盪し、８０℃まで５分間加熱し、室温に放冷し、再び振盪し、使用の前に一晩放
置した。
【００７２】
得られる溶液の一部（５０ｍＬ）をコニカルネックを備えた丸底フラスコに移した。フ
ラスコは、２５℃に維持された水浴に接続された温度制御用の入口及び出口を有するガラ
スジャケットを装備していた。ローター・ステーター混合シャフトを溶液に入れ、ガス漏
れを防ぐために、ネックの壁面と混合シャフトとの間の空間を、ガス含有量の調整及び圧
力制御のためのガス入口／出口接続部が取り付けられた、特別に設計された金属プラグで
密封した。ガス出口を真空ポンプに接続し、溶液を１分間脱気した。次に、ペルフルオロ
−ｎ−ブタンガスの雰囲気をガス入口を通じて適用した。溶液を２３，０００ｒｐｍで１
０分間均質化し、開口部が液体表面よりもわずかに上になるようにローター・ステーター
混合シャフトを保持した。白色の乳状の分散系が得られ、それを密封可能な容器に移し、
ペルフルオロ−ｎ−ブタンでフラッシした。次に、分散系を分液漏斗に移して１２，００
０ｒｐｍで３０分間遠心し、上部にマイクロバブルの乳状の層と濁った下澄を得た。下澄
を除去し、水と入れ替えた。次に、遠心分離を２回、ただし今回は１２，０００ｒｐｍで
１５分間、繰り返した。最後の遠心分離の後、上清を１０％（ｗ／ｗ）スクロースと交換
した。
【００７３】
実施例２：浮選によるペルフルオロブタンマイクロバブルのサイズ調整。
【００７４】
全高８０ｃｍ及び内径８２ｃｍの円筒形平底ガラス分離チャンバは、機械的撹拌ブレー
ドを装備していた。チャンバに、６ｃｍの高さまで、実施例１に従って調製したマイクロ
バブル懸濁液（３２リットル）を充填した。懸濁液を、０〜１５ｒｐｍの変化する速度で
、完全な混合を得るために交互方向に２分間ゆっくりと撹拌した。懸濁液を２００分間静
置して沈降させ、底部の５ｃｍの層を底部の３つの出口から保持槽に排出させた。接続さ
れたレーザー式サイズ判定装置が、特定の粒度が現れた時を示し、出口を閉じた。注射水
（ＷＦＩ）を分離チャンバに６ｃｍの高さまで充填し、撹拌、沈降及び排水のサイクルを
繰り返した。
【００７５】
各サイクル後に確保しておいた粒子懸濁液のアリコートを、コールターカウンター測定
によってサイズ分布について試験した。１１サイクルで２μｍよりも大きい粒子を確保し
た後、さらにサイクルを実施して、下層を受入れ槽に収集し、上層を処分することによっ
て、サイズが４μｍよりも大きい粒子を除去した。沈降時間は、この段階のこれらのサイ
クルに対して１２０分であった。各サイクルの後、受入れ槽の内容物を分離チャンバに戻
し、ＷＦＩを６ｃｍの高さまで添加した。
【００７６】
過小粒子を除去するための合計１１サイクル、及びその後の過大粒子を除去するための
８サイクルの後、コールターカウンター測定により、粒子の８９％が２〜４μｍの間のサ
イズを有していたことが分かった。
【００７７】
同じ装置及び材料を使用して、望ましいサイズ限界よりも小さい粒子を除去する２００
分の分離サイクルを５回、その後、望ましいサイズ限界よりも小さい粒子を除去する１５
０分の分離サイクルを８回、その後、望ましいサイズ限界よりも大きい粒子を除去する１
００分の分離サイクルを８回行って、粒子数の９２％が２．５〜４．５μｍの間であり、
７２％が３．０〜４．０μｍの間である狭い画分を得た。
【００７８】
実施例３：収量及びＵｏＣへの保持時間の効果−凍結乾燥し、サイズを調整したＰＦＢ
マイクロバブルの製造。
【００７９】
５００ｍｌ  Ｈ−ＥＰＳＮａ分散系の部分を、１．５％（ｗ／ｗ）プロピレングリコー
ル及び５．１％（ｗ／ｗ）グリセロールのＷＦＩ中８５％溶液を、２．５ｇのＨ−ＥＰＳ
Ｎａに添加し、その後８０℃水浴中で加熱しながら５分間振盪することによって調製した
。混合物を撹拌せずに室温で一晩放置した。体積を調整して最終濃度を５ｍｇ／ｍｌ  Ｈ
−ＥＰＳＮａとした。リン脂質懸濁液をオートクレーブし（Ｆ０１５）、４℃で貯蔵した
。
【００８０】
安定化ＰＦＢマイクロバブルは、以下の条件下：ＰＦＢ流４５ｍｌ／分、Ｈ−ＥＰＳＮ
ａ分散系の流れ１５ｍｌ／分、周波数２０．０００Ｈｚ、及び温度３３℃で連続超音波処
理システムによってＰＦＢガスとともにＨ−ＥＰＳＮａ懸濁液をポンピングすることによ
って調製した。得られる安定化ＰＦＢマイクロバブルの分散系を、下に記載されるサイズ
調整工程用に設計された槽に回収した。
【００８１】
ＷＦＩ（１ｋｇ）を分散系（２．２ｋｇ）に添加した。分散系を振盪し、マイクロバブ
ルを３時間２０分間浮遊させた後、１８３０ｇの下澄（廃棄物）を注意深く底から除去し
、１８３０ｇのＷＦＩと交換した。分散系を振盪し、さらに３時間２０分間放置した後、
１８３０ｇの廃棄物を除去した。この手順を、合計８×１８３０ｇの廃棄物が除去される
まで繰り返した。マイクロバブルサイズを最適化した分散系を、２０％スクロース及びＷ
ＦＩを添加することによって、最終濃度を３．０４％（ｖ／ｖ）のマイクロバブル及び１
００ｍｇ／ｍｌのスクロースに調整した。この分散系は、充填の間じゅう２００ｒｐｍで
連続的にかき混ぜられ、２ｇ（１．９〜２．１ｇ）を１００ｒｐｍのポンプ速度を用いて
１０ｍｌバイアルに充填された。充填重量を１５〜２０分おきに記録した。トレイにバイ
アルを装填し（トレイあたり１３０〜１４０本のバイアル）、凍結乾燥機に運び、予冷し
た棚（実際の温度は−５８℃）に置いた。
【００８２】
各バイアルについて、充填から凍結乾燥機に挿入するまでの時間（保持時間）を記録し
た。サンプル群を、凍結乾燥機の予冷棚（−５８℃）に装填する前に、３分未満、２０分
及び６０分保持した。各群から１０本のバイアルがサンプリングされた。凍結乾燥の終了
後、栓をする前にＰＦＢをバイアルのヘッドスペースに添加した。
【００８３】
マイクロバブルのサイズ分布及び体積濃度を、コールター計数によって測定した。
【００８４】
実施例４：凍結乾燥中の損失（収量）へのマイクロバブルサイズの効果
凍結乾燥し、２７バッチのサイズを調整したＰＦＢマイクロバブルの製造を、ローター
・ステーター混合及び浮選の原理（装置及び生産設定だけがわずかに異なるが実施例１及
び２に詳述される通り）による、凍結乾燥の前のサイズの調節を用いて実施した。これら
のバッチ全てに関して、充填バイアルを凍結乾燥機に装填する前の保持時間は２０分まで
であった。
【００８５】
分析用のサンプル。
【００８６】
２７バッチの各々について、凍結乾燥前の１０本のバイアル及び凍結乾燥後の１０本の
バイアルを、コールター計数によって、マイクロバブル含有量及びサイズ分布について分
析した。従って、凍結乾燥中のマイクロバブル濃度の低下を凍結乾燥前の含有量と比較し
て計算した。
【００８７】
浮選速度の計算。
【００８８】
直径に対するマイクロバブルの水中浮選速度を、ストークス方程式：
ｖ＝６＊１０4＊（２＊ρ＊ｇ＊ｒ2）／（９＊η）
に基づいて計算した。
【００８９】
式中、ｖは、浮選速度（ｍｍ／分）であり、ρは、密度増分（１０００ｋｇ／ｍ3に設
定）であり、ｇは、重力定数（９．８ｍ／ｓ2）であり、ｒは、泡半径（メートル）であ
り、ηは粘度（１ｍＰａ  ｓに設定）である。
【図１】
2020059712.tif 000002
【図２】
2020059712.tif 000003
【図３】
2020059712.tif 000004
【図４】
2020059712.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月10日(2019.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載された発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
式中、ｖは、浮選速度（ｍｍ／分）であり、ρは、密度増分（１０００ｋｇ／ｍ3に設定）であり、ｇは、重力定数（９．８ｍ／ｓ2）であり、ｒは、泡半径（メートル）であり、ηは粘度（１ｍＰａ  ｓに設定）である。
本発明は、下記の態様も含む。
＜１＞
スクロース中の、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンのマ
イクロバブルの凍結乾燥組成物を含む超音波造影剤前駆体の調製方法であって、当該方法
が、
（ｉ）水溶液中の、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンマイ
クロバブルの水性懸濁液を提供する工程と、
（ｉｉ）マイクロバブルのサイズを２〜５μｍの範囲のメジアン径に調整する工程と、
（ｉｉｉ）サイズを調整した工程（ｉｉ）の懸濁液を無菌スクロース水溶液で希釈して、
５〜２０％  ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得る工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の組成物のアリコートをバイアルに計量分配して、充填バイアル
を得る工程と、
（ｖ）工程（ｉｖ）の計量分配が終了した後、５分未満の保持時間内に、各々の充填バイ
アルを−４０℃〜−７０℃の温度に冷却する工程と、
（ｖｉ）望ましい数の冷却された充填バイアルが得られるまで、必要に応じて工程（ｉｖ
）及び（ｖ）を繰り返す工程と、
（ｖｉｉ）工程（ｖ）及び（ｖｉ）の冷却された充填バイアルを凍結乾燥する工程と、
（ｖｉｉｉ）工程（ｖｉｉ）の凍結乾燥バイアルのヘッドスペースガスをペルフルオロブ
タンでバックフィリングする工程と、
（ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）のバイアルをクロージャーで密封する工程と
を含む、方法。
＜２＞
凍結乾燥前駆体組成物が無菌である、＜１＞記載の方法。
＜３＞
工程（ｉｉｉ）のスクロース濃度が８〜１２％  ｗ／ｖである、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞
工程（ｉｉ）のサイズ調整が、
（ａ）１サイクル以上の浮選及び再懸濁、又は
（ｂ）分画遠心法、又は
（ｃ）それらの組合せ
によって実施される、＜１＞乃至＜３＞のいずれか記載の方法。
＜５＞
工程（ｉｉｉ）の後、分配工程（ｉｖ）に進む前に、サイズ分布及びマイクロバブル濃
度がチェックされる、＜１＞乃至＜４＞のいずれか記載の方法。
＜６＞
工程（ｉｖ）において、複数のバイアルが並行して計量分配される、＜１＞乃至＜５＞のいずれか記載の方法。
＜７＞
工程（ｖ）において、複数の充填バイアルが並行して冷却される、＜１＞乃至＜６＞のいずれか記載の方法。
＜８＞
工程（ｖ）の保持時間が３分未満である、＜１＞乃至＜７＞のいずれか記載の方法。
＜９＞
工程（ｖ）の保持時間が各充填バイアルについて同じである、＜１＞乃至＜８＞のいずれか記載の方法。
＜１０＞
無菌水性媒体中、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンのマ
イクロバブルの懸濁液を含む超音波造影剤の調製のためのキットの調製方法であって、
（ｉ）＜１＞乃至＜９＞のいずれか記載の方法を実施して、＜１＞乃至＜３＞のいずれか記載の造影剤前駆体を含むバイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前駆体のバイアルを再構成するのに適した無菌水溶液の容器を提供
して造影剤を得る工程と
を含む、方法。
＜１１＞
無菌水溶液が、１００μＭ未満の総濃度の遊離アルミニウム、バリウム、マグネシウム
、カルシウム及び亜鉛イオンを含む注射水である、＜１０＞記載の方法。
＜１２＞
無菌水性媒体中、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化したペルフルオロブタンのマ
イクロバブルの懸濁液を含む超音波造影剤の調製方法であって、
（ｉ）＜１＞乃至＜９＞のいずれか記載の方法を実施して、＜１＞乃至＜３＞のいずれか記載の造影剤前駆体を含むバイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前駆体のバイアルを無菌水溶液で再構成する工程と
を含む、方法。
【外国語明細書】
2020059712000001.pdf