(57)【要約】【課題】細菌集団中の標的細菌のDNAを選択的に増幅する方法を提供する。【解決手段】細菌集団のDNAを鋳型として、標的細菌と非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能な第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズする第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、標的細菌のDNAを選択的に増幅する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌集団中の標的細菌のDNAを選択的に増幅する方法であって、
下記工程（Ａ）：
（Ａ）前記細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、第１の増幅産物を生成する工程
を含み、
前記細菌集団が、前記標的細菌と非標的細菌を含み、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、前記標的細菌および前記非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１の増幅産物が、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の増幅産物である、方法。
【請求項２】
細菌集団中の標的細菌の情報を製造する方法であって、
下記工程（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）前記細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、第１の増幅産物を生成する工程；
（Ｂ）前記第１の増幅産物に基づいて前記標的細菌の情報を取得する工程
を含み、
前記細菌集団が、前記標的細菌と非標的細菌を含み、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、前記標的細菌および前記非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１の増幅産物が、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の増幅産物である、方法。
【請求項３】
前記情報が、前記第１の増幅産物の塩基配列、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の塩基配列、前記標的細菌の種類、前記細菌集団における前記標的細菌の存在の有無、および／または前記細菌集団における前記標的細菌の存在量に関する情報である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細菌集団中の標的細菌を検出する方法であって、
下記工程（Ａ）および（Ｃ）：
（Ａ）前記細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、第１の増幅産物を生成する工程；
（Ｃ）前記第１の増幅産物に基づいて前記標的細菌を検出する工程
を含み、
前記細菌集団が、前記標的細菌と非標的細菌を含み、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、前記標的細菌および前記非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１の増幅産物が、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の増幅産物である、方法。
【請求項５】
前記検出が、前記標的細菌の種類、前記細菌集団における前記標的細菌の存在の有無、および／または前記細菌集団における前記標的細菌の存在量の同定である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第３のオリゴヌクレオチドと前記第１または第２のオリゴヌクレオチドとの組み合わせが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の部分配列を増幅可能なプライマーセットである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（Ａ）において第２の増幅産物が生成され、且つ、該第２の増幅産物が、前記非標的細菌のDNAの前記部分配列の増幅産物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（Ｂ）または（Ｃ）が、前記第１の増幅産物を前記第２の増幅産物から分離した後に実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分離が、前記第１の増幅産物と前記第２の増幅産物の長さの違いに基づいて実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（Ｂ）または（Ｃ）が、前記第１の増幅産物の塩基配列解析により実施される、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的領域が、16S rDNA中の領域である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的領域が、16S rDNA中のV3およびV4領域を含む領域である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的細菌が、前記細菌集団におけるマイナー細菌である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記非標的細菌が、前記細菌集団におけるメジャー細菌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌集団が、ヒトの細菌叢である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌集団が、ヒトの腸内細菌叢である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記非標的細菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriales）目細菌、バクテロイデス（Bacteroidales）目細菌、および／またはフィルミキューテス（Firmicutes）門細菌である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌のDNAを選択的に増幅する方法およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌集団の構成は、例えば、ユニバーサルプライマーを用いて細菌集団中の細菌のDNAをPCR増幅し、増幅産物を次世代シーケンサで解析することにより迅速に同定することができる。しかしながら、次世代シーケンサにより一度に解析できるシーケンスリード数に制限があるため、単にユニバーサルプライマーを用いて細菌集団中の細菌のDNAをPCR増幅した場合、細菌集団中のマイナー細菌を次世代シーケンサで詳細に検出することは困難である。
【０００３】
ここで、ヒトの腸内細菌叢は約1013 cellsからなっているのに対し、次世代シーケンサであるMiSeq Systemにより一度に解析できるシーケンスリード数は1.5×107 readsである。よって、例えば、ヒトの腸内細菌叢中に1 cellのみ存在する細菌種をMiSeq Systemにより検出するためには、理論上、解析を約106回実施する必要がある。加えて、ヒトの腸内細菌叢中の細菌の存在比率はべき分布を示すことから（非特許文献１）、通常の解析手法でヒトの腸内細菌叢を解析してもほぼメジャー細菌しか検出できない懸念があった。
【０００４】
そのため、細菌集団中のマイナー細菌のDNAを選択的に増幅する技術が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Arumugam M et al., Enterotypes of the human gut microbiome. Nature. 2011 May 12;473(7346):174-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌のDNAを選択的に増幅する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、標的細菌と非標的細菌を含む細菌集団のDNAを鋳型としてユニバーサルプライマーを用いてPCRを実施する際に、ユニバーサルプライマーにより増幅される領域の内部配列にハイブリダイズする非標的細菌に特異的なプライマーを併用することにより標的細菌のDNAを選択的に増幅できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通り例示できる。
［１］
細菌集団中の標的細菌のDNAを選択的に増幅する方法であって、
下記工程（Ａ）：
（Ａ）前記細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、第１の増幅産物を生成する工程
を含み、
前記細菌集団が、前記標的細菌と非標的細菌を含み、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、前記標的細菌および前記非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１の増幅産物が、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の増幅産物である、方法。
［２］
細菌集団中の標的細菌の情報を製造する方法であって、
下記工程（Ａ）および（Ｂ）：
（Ａ）前記細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、第１の増幅産物を生成する工程；
（Ｂ）前記第１の増幅産物に基づいて前記標的細菌の情報を取得する工程
を含み、
前記細菌集団が、前記標的細菌と非標的細菌を含み、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、前記標的細菌および前記非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１の増幅産物が、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の増幅産物である、方法。
［３］
前記情報が、前記第１の増幅産物の塩基配列、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の塩基配列、前記標的細菌の種類、前記細菌集団における前記標的細菌の存在の有無、および／または前記細菌集団における前記標的細菌の存在量に関する情報である、前記方法。
［４］
細菌集団中の標的細菌を検出する方法であって、
下記工程（Ａ）および（Ｃ）：
（Ａ）前記細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することにより、第１の増幅産物を生成する工程；
（Ｃ）前記第１の増幅産物に基づいて前記標的細菌を検出する工程
を含み、
前記細菌集団が、前記標的細菌と非標的細菌を含み、
前記第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが、前記標的細菌および前記非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、
前記第１の増幅産物が、前記標的細菌のDNAの前記標的領域の増幅産物である、方法。
［５］
前記検出が、前記標的細菌の種類、前記細菌集団における前記標的細菌の存在の有無、および／または前記細菌集団における前記標的細菌の存在量の同定である、前記方法。
［６］
前記第３のオリゴヌクレオチドと前記第１または第２のオリゴヌクレオチドとの組み合わせが、前記非標的細菌のDNAの前記標的領域の部分配列を増幅可能なプライマーセットである、前記方法。
［７］
前記工程（Ａ）において第２の増幅産物が生成され、且つ、該第２の増幅産物が、前記
非標的細菌のDNAの前記部分配列の増幅産物である、前記方法。
［８］
前記工程（Ｂ）または（Ｃ）が、前記第１の増幅産物を前記第２の増幅産物から分離した後に実施される、前記方法。
［９］
前記分離が、前記第１の増幅産物と前記第２の増幅産物の長さの違いに基づいて実施される、前記方法。
［１０］
前記工程（Ｂ）または（Ｃ）が、前記第１の増幅産物の塩基配列解析により実施される、前記方法。
［１１］
前記標的領域が、16S rDNA中の領域である、前記方法。
［１２］
前記標的領域が、16S rDNA中のV3およびV4領域を含む領域である、前記方法。
［１３］
前記標的細菌が、前記細菌集団におけるマイナー細菌である、前記方法。
［１４］
前記非標的細菌が、前記細菌集団におけるメジャー細菌である、前記方法。
［１５］
前記細菌集団が、ヒトの細菌叢である、前記方法。
［１６］
前記細菌集団が、ヒトの腸内細菌叢である、前記方法。
［１７］
前記非標的細菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriales）目細菌、バクテロイデス（Bacteroidales）目細菌、および／またはフィルミキューテス（Firmicutes）門細菌である、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌のDNAを選択的に増幅できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の方法は、細菌集団中の標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）を増幅する方法である。本発明の方法によれば、標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）が選択的に増幅されてよい。すなわち、本発明の方法は、具体的には、標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）を選択的に増幅する方法であってよい。本発明の方法によれば、標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅産物が生成する。すなわち、本発明の方法の一態様は、細菌集団中の標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅産物を製造する方法であってもよい。同増幅産物を「第１の増幅産物」ともいう。
【００１２】
本発明の方法は、下記工程（Ａ）を含む：
（Ａ）細菌集団のDNAを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で、鎖置換活性（strand displacement活性）を有しないDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施する工程。
【００１３】
工程（Ａ）により標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）が増幅される、すなわち、工程（Ａ）により第１の増幅産物が生成する。すなわち、工程（Ａ）は、具体的には、
上記のようにしてPCRを実施することにより標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）を増幅する工程であってもよい。また、工程（Ａ）は、具体的には、上記のようにしてPCRを実施することにより第１の増幅産物を生成する工程であってもよい。
【００１４】
「細菌集団」とは、２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせを意味してよい。細菌集団は、標的細菌および非標的細菌を含有する。細菌集団は、標的細菌と非標的細菌からなるものであってもよく、標的細菌および非標的細菌に加えて他の細菌（すなわち、標的細菌および非標的細菌以外の細菌）を含有していてもよい。標的細菌、非標的細菌、および他の細菌を総称して、「細菌集団中の細菌」ともいう。
【００１５】
細菌集団は、例えば、天然に存在するものであってもよく、人工的に構成されたものであってもよい。細菌集団としては、生物の細菌叢や、土壌や海洋等の環境サンプルの細菌叢が挙げられる。生物としては、動物や植物が挙げられる。動物としては、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類等の脊椎動物や、昆虫類等の無脊椎動物が挙げられる。哺乳類としては、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等のその他の各種哺乳類が挙げられる。動物としては、特にヒトが挙げられる。生物の細菌叢としては、腸内や口腔等の体内部位における細菌叢や、皮膚等の体外部位における細菌叢が挙げられる。細菌集団としては、細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌のDNAを選択的に増幅する観点から、特に、細菌の菌体数が多い又は細菌の種類数が多い細菌集団である、腸内細菌叢、口腔細菌叢、皮膚細菌叢、土壌細菌叢が挙げられ、さらに特には、腸内細菌叢が挙げられる。細菌集団として、さらに特には、ヒトの腸内細菌叢が挙げられる。
【００１６】
細菌（具体的には、標的細菌、非標的細菌、または他の細菌）としては、例えば、任意の区分に分類されるものを選択してよい。区分としては、分類学上の区分が挙げられる。分類学上の区分としては、門、綱、目、科、属、種、株、およびそれらの亜区分（亜種等）が挙げられる。選択した区分を「細菌の種類」とみなしてよい。また、選択した区分に分類される細菌全体を「１種類の細菌」とみなしてよい。すなわち、例えば、標的細菌として或る属の細菌を選択した場合、当該属を「標的細菌の種類」とみなしてよく、当該属に分類される細菌全体を「１種類の標的細菌」とみなしてよい。
【００１７】
標的細菌は、細菌集団中に存在する細菌であって、非標的細菌以外のものであれば、特に制限されない。標的細菌は、細菌集団の構成、非標的細菌の種類、本発明の方法の実施目的等の諸条件に応じて、適宜選択できる。標的細菌は、本発明の方法においてDNA（具体的にはDNAの標的領域）が選択的に増幅される細菌であってよい。標的細菌は、本発明の方法においてDNA（具体的にはDNAの標的領域）が増幅される細菌の内、非標的細菌以外のものであってもよい。標的細菌は、１種類の細菌からなるものであってもよく、２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせからなるものであってもよい。
【００１８】
標的細菌としては、細菌集団におけるマイナー細菌が挙げられる。「細菌集団におけるマイナー細菌」とは、細菌集団における存在率が低い細菌を意味してよい。「細菌集団における存在率が低い細菌」とは、例えば、細菌集団における存在率が、１０％以下、７％以下、５％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．２％以下、または０．１％以下である細菌を意味してよい。標的細菌は、細菌集団における存在率が非標的細菌よりも低い細菌であってもよい。「細菌集団における標的細菌の存在率」とは、細菌集団中の細菌の総菌数に対する標的細菌の菌数の比率を意味する。例えば、標的細菌として或る属の細菌を選択した場合、「細菌集団における標的細菌の存在率」とは、細菌集団中の細菌の総菌数に対する当該属の細菌の菌数の比率を意味する。標的細菌が２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせからなる場合、標的細菌についての説明は、当該２種類またはそれ以上の細菌に対してそれぞれ独立に適用できる。例えば、標的細菌が２種類また
はそれ以上の細菌の組み合わせからなる場合、細菌集団における当該２種類またはそれ以上の細菌の存在率は、それぞれ、上記例示した細菌集団における標的細菌の存在率の範囲であってもよい。
【００１９】
標的細菌として、具体的には、フソバクテリウム（Fusobacterium）属細菌、バイロフィラ（Bilophila）属細菌、デスルフォビブリオ（Desulfovibrio）属細菌が挙げられる。これらの細菌は、例えば、ヒト腸内細菌叢におけるマイナー細菌であってよい。
【００２０】
標的細菌は、未知の細菌であってもよく、既知の細菌であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。標的細菌は、特に、未知の細菌（例えば、１種類またはそれ以上の未知の細菌）を含む（例えば、からなる）ものであってもよい。「未知の細菌」とは、細菌集団中での存在が確認されていない細菌を意味してよい。「既知の細菌」とは、細菌集団中での存在が既知である細菌を意味してよい。未知の細菌は、新種の細菌等の新規な細菌であってもよく、そうでなくてもよい。未知の細菌は、特に、新種の細菌等の新規な細菌であってもよい。すなわち、標的細菌は、さらに特には、新規な細菌（例えば、１種類またはそれ以上の新規な細菌）を含む（例えば、からなる）ものであってもよい。標的細菌（特に、未知の細菌）は、例えば、通常の手法では細菌集団から検出されない細菌を含む（例えば、からなる）ものであってもよい。通常の手法としては、公知の菌叢解析手段等の、本発明の方法以外の菌叢解析手段が挙げられる。
【００２１】
非標的細菌は、細菌集団中に存在する細菌であって、標的細菌以外のものであれば、特に制限されない。非標的細菌は、細菌集団の構成、標的細菌の種類、本発明の方法の実施目的等の諸条件に応じて、適宜選択できる。非標的細菌は、本発明の方法においてDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅が阻害される細菌であってよい。非標的細菌は、１種類の細菌からなるものであってもよく、２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせからなるものであってもよい。
【００２２】
非標的細菌としては、細菌集団におけるメジャー細菌が挙げられる。「細菌集団におけるメジャー細菌」とは、細菌集団における存在率が高い細菌を意味してよい。「細菌集団における存在率が高い細菌」とは、例えば、細菌集団における存在率が、１％以上、２％以上、３％以上、５％以上、７％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、または５０％以上である細菌を意味してよい。非標的細菌は、細菌集団における存在率が標的細菌よりも高い細菌であってもよい。「細菌集団における非標的細菌の存在率」とは、細菌集団中の細菌の総菌数に対する非標的細菌の菌数の比率を意味する。例えば、非標的細菌として或る属の細菌を選択した場合、「細菌集団における非標的細菌の存在率」とは、細菌集団中の細菌の総菌数に対する当該属の細菌の菌数の比率を意味する。非標的細菌が２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせからなる場合、非標的細菌についての説明は、当該２種類またはそれ以上の細菌に対してそれぞれ独立に適用できる。例えば、非標的細菌が２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせからなる場合、細菌集団における当該２種類またはそれ以上の細菌の存在率は、それぞれ、上記例示した細菌集団における非標的細菌の存在率の範囲であってもよい。
【００２３】
非標的細菌として、具体的には、ビフィドバクテリウム（Bifidobacteriales）目細菌、バクテロイデス（Bacteroidales）目細菌、フィルミキューテス（Firmicutes）門細菌が挙げられる。これらの細菌は、例えば、ヒト腸内細菌叢におけるメジャー細菌であってよい。
【００２４】
なお、或る区分に分類される細菌の内、一部の細菌を非標的細菌として選択し、残部の細菌を標的細菌として選択してもよい。例えば、或る属に分類される細菌の内、一部の種を非標的細菌として選択し、残部の種（すなわち、当該一部の種以外の種）を標的細菌と
して選択してもよい。具体的には、例えば、Bifidobacterium属細菌の内、一部の種（例えばB. longumおよびB. infantis）を非標的細菌として選択し、残部の種（すなわち、当該一部の種（例えばB. longumおよびB. infantis）以外の種）を標的細菌として選択してもよい。
【００２５】
他の細菌は、細菌集団中に存在する細菌であって、標的細菌および非標的細菌以外のものであれば、特に制限されない。他の細菌は、１種類の細菌からなるものであってもよく、２種類またはそれ以上の細菌の組み合わせからなるものであってもよい。
【００２６】
本発明の方法は、予め選択した標的細菌について実施されてもよく、そうでなくてもよい。すなわち、特定の細菌を標的細菌として選択して本発明の方法を実施してよい。例えば、DNA（具体的にはDNAの標的領域）を選択的に増幅すべき細菌（例えばマイナー細菌）を標的細菌として選択して本発明の方法を実施してよい。あるいは、標的細菌を選択せずに本発明の方法を実施し、その結果に基づき標的細菌を選択してもよい。言い換えると、未知の標的細菌を想定して本発明の方法を実施してもよい。例えば、標的細菌を選択せずに本発明の方法を実施し、DNA（具体的にはDNAの標的領域）が選択的に増幅された細菌を標的細菌とみなしてもよい。また、例えば、標的細菌を選択せずに本発明の方法を実施し、DNA（具体的にはDNAの標的領域）が増幅された細菌の内、非標的細菌以外のものを標的細菌とみなしてもよい。なお、本発明の方法を実施した結果、予め選択した標的細菌に代えて、あるいは加えて、別の細菌が標的細菌として選択されてもよい。
【００２７】
本発明の方法は、予め選択した非標的細菌について実施される。すなわち、特定の細菌を非標的細菌として選択して本発明の方法を実施してよい。例えば、DNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅を阻害すべき細菌（例えばメジャー細菌）を非標的細菌として選択して本発明の方法を実施してよい。非標的細菌の選択にあたり、非標的細菌は、本発明の方法を実施できる程度に予め同定されていればよい。言い換えると、非標的細菌の選択にあたり、本発明の方法を実施できる程度に非標的細菌の情報が取得されていればよい。非標的細菌の選択にあたり、非標的細菌は、例えば、第３のオリゴヌクレオチドが設計できる程度に同定されていればよい。言い換えると、非標的細菌の選択にあたり、例えば、第３のオリゴヌクレオチドが設計できる程度に非標的細菌の情報が取得されていればよい。そのような情報としては、非標的細菌のDNAの塩基配列（例えば非標的細菌のDNAの標的領域の塩基配列）や非標的細菌の種類が挙げられる。非標的細菌の情報は、例えば、予め細菌集団を解析することにより取得することができる。細菌集団の解析手段は、特に制限されない。細菌集団は、例えば、公知の菌叢解析手段により解析することができる。細菌集団は、具体的には、例えば、第３のオリゴヌクレオチドの非存在下で本発明の方法を実施することにより解析することができる。
【００２８】
工程（Ａ）においては、第１〜第３のオリゴヌクレオチドが用いられる。具体的には、工程（Ａ）においては、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、第３のオリゴヌクレオチドの存在下でPCRが実施される。工程（Ａ）においては、さらに、他のオリゴヌクレオチドが用いられてもよい。すなわち、工程（Ａ）においては、第３のオリゴヌクレオチドと他のオリゴヌクレオチドの存在下でPCRが実施されてもよい。「第３のオリゴヌクレオチドの存在下でPCRが実施される」ことには、第３のオリゴヌクレオチドに加えて、他のオリゴヌクレオチドの存在下でPCRが実施される場合も包含される。他のオリゴヌクレオチドとしては、１種のオリゴヌクレオチドを用いてもよく、２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用いてもよい。他のオリゴヌクレオチドとしては、第４のオリゴヌクレオチドが挙げられる。すなわち、工程（Ａ）においては、例えば、第３と第４のオリゴヌクレオチドの存在下でPCRが実施されてもよい。
【００２９】
各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするDNAを、同オリゴヌクレオチドについての「対象DNA」ともいう。各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするDNAストランドを、同オリゴヌクレオチドについての「対象ストランド」ともいう。対象DNA（具体的には対象ストランド）における各オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする部位を「オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位」または単に「ハイブリダイズ部位」ともいう。各オリゴヌクレオチドにおける対象DNA（具体的には対象ストランド）とハイブリダイズする部位を「対象DNA（具体的には対象ストランド）とのハイブリダイズ部位」または単に「ハイブリダイズ部位」ともいう。
【００３０】
第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、標的細菌および非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能なプライマーセットである。第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせは、さらに、他の細菌のDNAの標的領域を増幅可能であってもよい。言い換えると、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、細菌（すなわち、標的細菌、非標的細菌、および任意で他の細菌；以下、特記しない限り、第１および第２のオリゴヌクレオチドの説明において同じ）のDNAの標的領域の両末端領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってよい。第１および第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするDNAストランドを、それぞれ、「第１のストランド」および「第２のストランド」ともいう。すなわち、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、具体的には、それぞれ、細菌のDNAの第１および第２のストランドの標的領域の３’末端領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってよい。当該３’末端領域は、それぞれ、第１および第２のストランドにおける「第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位」とみなしてよい。第１および第２のストランドにおける「第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位」とは、具体的には、それぞれ、第１および第２のストランドにおける、第１および第２のオリゴヌクレオチドの３’末端の塩基とハイブリダイズする塩基から３’末端の塩基までの領域を意味してよい。
【００３１】
第１および第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第１および第２のストランドとのハイブリダイズ部位を含んでいてよい。第１および第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、第１および第２のストランドとのハイブリダイズ部位からなるものであってもよく、他の部位を含んでいてもよい。他の部位としては、標的細菌および非標的細菌のDNAの標的領域とハイブリダイズしない部位が挙げられる。第１および第２のオリゴヌクレオチドにおいては、それぞれ、その全体または３’末端領域が第１および第２のストランドとのハイブリダイズ部位を構成していてよい。第１および第２のオリゴヌクレオチドにおける「第１および第２のストランドとのハイブリダイズ部位」とは、具体的には、それぞれ、第１および第２のオリゴヌクレオチドにおける、３’末端の塩基から第１および第２のストランドの標的領域の３’末端の塩基とハイブリダイズする塩基までの領域を意味してよい。
【００３２】
第１および第２のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位は、それぞれ、例えば、第１および第２のストランドにおける第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位の塩基配列に対する相補配列からなるもの、または該相補配列に対し高い配列同一性を有する塩基配列からなるものであってよい。「高い配列同一性」とは、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の配列同一性を意味してよい。配列同一性は、例えば、BLAST等のアラインメントプログラムにより算出することができる。第１または第２のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の塩基配列として、具体的には、例えば、配列番号１または２に記載の塩基配列や、該塩基配列に対し高い配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００３３】
第１および第２のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、所望の態様でハイブリダイズが起こる限り、特に制限されない。第１および第２のオリゴヌクレオ
チドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、それぞれ、例えば、１５残基以上、２０残基以上、２５残基以上、３０残基以上、３５残基以上、または４０残基以上であってもよく、５０残基以下、４５残基以下、４０残基以下、３５残基以下、３０残基以下、２５残基以下、または２０残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。第１および第２のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、それぞれ、例えば、１５〜５０残基、２５〜４５残基、または３０〜４０残基であってもよい。第１および第２のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、それぞれ、第１および第２のストランドにおける第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位の長さと同義であってよい。
【００３４】
第１および第２のオリゴヌクレオチドの長さは、それぞれ、例えば、１５残基以上、２０残基以上、２５残基以上、３０残基以上、３５残基以上、または４０残基以上であってもよく、５０残基以下、４５残基以下、４０残基以下、３５残基以下、３０残基以下、２５残基以下、または２０残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。第１および第２のオリゴヌクレオチドの長さは、それぞれ、例えば、１５〜５０残基、２５〜４５残基、または３０〜４０残基であってもよい。
【００３５】
第１および第２のオリゴヌクレオチドは、例えば、ユニバーサルプライマーを設計する公知の手法により設計することができる。第１および第２のオリゴヌクレオチドは、例えば、標的細菌、非標的細菌、および／または既知の各種細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の塩基配列に基づいて設計することができる。標的細菌が未知である場合であっても、例えば、非標的細菌および／または既知の各種細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の塩基配列に基づいてユニバーサルプライマーとして設計された第１および第２のオリゴヌクレオチドを用いることにより、標的細菌および非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）を増幅することができると期待される。第１および第２のオリゴヌクレオチドは、具体的には、例えば、細菌のDNA中の細菌間で保存性の高い領域にハイブリダイズするように設計することができる。細菌のDNA中の細菌間で保存性の高い領域としては、16S
rDNA中の可変領域間の領域が挙げられる。
【００３６】
第１および第２のオリゴヌクレオチドは、例えば、細菌全体に対するユニバーサルプライマーとして設計することができる。あるいは、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、例えば、特定の区分の細菌に対するユニバーサルプライマーとして設計することができる。すなわち、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも標的細菌および非標的細菌の両方に共通する区分の細菌に対するユニバーサルプライマーとして設計することができる。例えば、或る属に分類される細菌の内、一部の種を非標的細菌として選択し、残部の種（すなわち、当該一部の種以外の種）を標的細菌として選択する場合、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、当該属の細菌に対するユニバーサルプライマーとして設計することができる。具体的には、例えば、Bifidobacterium属細菌の内、特定の種を非標的細菌として選択し、残部の種（すなわち、当該特定の種以外の種）を標的細菌として選択する場合、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、Bifidobacterium属細菌に対するユニバーサルプライマーとして設計することができる。
【００３７】
なお、後述の通り、第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせによる非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅は、第３のオリゴヌクレオチドによって阻害されてよい。よって、「第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせが非標的細菌のDNAの標的領域を増幅可能」とは、第３のオリゴヌクレオチドの非存在下で非標的細菌のDNAの標的領域を第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせにより増幅できることで足り、第３のオリゴヌクレオチドの存在下で非標的細菌のDNAの標的領域を第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせにより増幅できることを要しない。
【００３８】
第３のオリゴヌクレオチドは、非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。第３のオリゴヌクレオチドによって、第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせによる非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅が阻害されてよい。第３のオリゴヌクレオチドは、非標的細菌のDNAのいずれのストランドにハイブリダイズしてもよい。「標的領域の内部配列」とは、標的領域中の第１および第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部位以外の領域、すなわち、標的領域から第１および第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部位を除いた残部の領域を意味する。「非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド」とは、非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列にはハイブリダイズするが、標的細菌のDNAの標的領域の内部配列には実質的にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味してよい。「非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド」とは、具体的には、非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列中のいずれかの部位にはハイブリダイズするが、標的細菌のDNAの標的領域の内部配列中のいずれの部位にも実質的にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味してよい。第３のオリゴヌクレオチドとしては、非標的細菌のDNAのいずれかのストランドの標的領域の内部配列中のいずれかの部位に対して高い配列同一性を有し、且つ、標的細菌のDNAのいずれのストランドの標的領域の内部配列中のいずれの部位に対しても低い配列同一性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。「高い配列同一性」とは、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の配列同一性を意味してよい。「低い配列同一性」とは、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、または２０％以下の配列同一性を意味してよい。配列同一性は、例えば、BLAST等のアラインメントプログラムにより算出することができる。
【００３９】
第３のオリゴヌクレオチドは、第１または第２のストランドとのハイブリダイズ部位を含んでいてよい。第３のオリゴヌクレオチドは、第１または第２のストランドとのハイブリダイズ部位からなるものであってもよく、他の部位を含んでいてもよい。他の部位としては、標的細菌および非標的細菌のDNAの標的領域とハイブリダイズしない部位が挙げられる。第３のオリゴヌクレオチドにおける第１または第２のストランドとのハイブリダイズ部位の位置は特に制限されない。第３のオリゴヌクレオチドにおいては、例えば、その全体、内部領域、５’末端領域、または３’末端領域が第１または第２のストランドとのハイブリダイズ部位を構成していてよい。第３のオリゴヌクレオチドにおいては、特に、その全体または３’末端領域が第１または第２のストランドとのハイブリダイズ部位を構成していてよい。
【００４０】
第３のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位は、例えば、第１または第２のストランドにおける第３のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位の塩基配列に対する相補配列からなるもの、または該相補配列に対し高い配列同一性を有する塩基配列からなるものであってよい。「高い配列同一性」とは、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の配列同一性を意味してよい。配列同一性は、例えば、BLAST等のアラインメントプログラムにより算出することができる。
【００４１】
第３のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、所望の態様でハイブリダイズが起こる限り、特に制限されない。第３のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、例えば、１５残基以上、２０残基以上、２５残基以上、３０残基以上、３５残基以上、または４０残基以上であってもよく、５０残基以下、４５残基以下、４０残基以下、３５残基以下、３０残基以下、２５残基以下、または２０残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。第３のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、例えば、１５〜４０残基、１５〜３０残基、または１５〜２５残基であってもよい。第３のオリゴヌクレオチドにおけるハイブリダイズ部位の長さは、第１または第２のストランドにおける第３のオリゴヌクレオチドとのハ
イブリダイズ部位の長さと同義であってよい。
【００４２】
第３のオリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１５残基以上、２０残基以上、２５残基以上、３０残基以上、３５残基以上、または４０残基以上であってもよく、５０残基以下、４５残基以下、４０残基以下、３５残基以下、３０残基以下、２５残基以下、または２０残基以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。第３のオリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１５〜５０残基、２５〜４５残基、または３０〜４０残基であってもよい。
【００４３】
第３のオリゴヌクレオチドは、プライマーとして機能してもよく、しなくてもよい。第３のオリゴヌクレオチドは、例えば、他のオリゴヌクレオチドとの組み合わせにより非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域の部分配列）を増幅できるように設計されていてもよい。すなわち、第３のオリゴヌクレオチドと他のオリゴヌクレオチドとの組み合わせは、非標的細菌のDNAの標的領域の部分配列を増幅可能なプライマーセットであってもよい。他のオリゴヌクレオチドとしては、第１および第２のオリゴヌクレオチドが挙げられる。すなわち、第３のオリゴヌクレオチドが第１のストランドにハイブリダイズする場合、第３および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせがプライマーセットとして機能してもよい。あるいは、第３のオリゴヌクレオチドが第２のストランドにハイブリダイズする場合、第３および第１のオリゴヌクレオチドの組み合わせがプライマーセットとして機能してもよい。また、第４のオリゴヌクレオチドが併用される場合、他のオリゴヌクレオチドとしては、第４のオリゴヌクレオチドも挙げられる。第３および第４のオリゴヌクレオチドの組み合わせがプライマーセットとして機能する場合、第３および第４のオリゴヌクレオチドは対象DNAのそれぞれ別のストランドにハイブリダイズする。
【００４４】
第３のオリゴヌクレオチドは、例えば、特異的プライマーや特異的プローブを設計する公知の手法により設計することができる。第３のオリゴヌクレオチドは、例えば、非標的細菌および既知の各種細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の塩基配列に基づいて設計することができる。標的細菌が未知である場合であっても、例えば、非標的細菌および既知の各種細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の塩基配列に基づいて非標的細菌に特異的に設計された第３のオリゴヌクレオチドを用いることにより、非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅を選択的に阻害できると期待される。第３のオリゴヌクレオチドは、具体的には、例えば、非標的細菌のDNA中の細菌間で保存性の低い領域にハイブリダイズするように設計することができる。非標的細菌のDNA中の細菌間で保存性の低い領域としては、16S rDNA中の可変領域が挙げられる。
【００４５】
第４のオリゴヌクレオチドは、非標的細菌のDNAの標的領域の内部配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。第４のオリゴヌクレオチドによって、第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせによる非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅が阻害されてよい。第４のオリゴヌクレオチドは、例えば、第３のオリゴヌクレオチドとの組み合わせにより非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域の部分配列）を増幅できるように設計されていてもよい。第４のオリゴヌクレオチドは、例えば、非標的細菌の一部または全部に対して用いられてよい。その他、第４のオリゴヌクレオチドの構成については、例えば、第３のオリゴヌクレオチドの構成についての説明を準用できる。
【００４６】
各オリゴヌクレオチドは、例えば、DNAであってもよく、RNAであってもよく、DNAとRNAのキメラ配列であってもよい。各オリゴヌクレオチドは、特に、DNAであってよい。なお、RNAにおける「U」塩基とDNAにおける「T」塩基は、配列同一性の算出の際に同一塩基とみなしてよい。
【００４７】
各オリゴヌクレオチドとしては、１種のオリゴヌクレオチドを用いてもよく、２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用いてもよい。各オリゴヌクレオチドの種類数は、例えば、標的細菌および非標的細菌の種類や種類数等の諸条件に応じて、適宜設定することができる。例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチドとしては、典型的には、それぞれ、１種のオリゴヌクレオチドを用いてよい。また、例えば、第３および第４のオリゴヌクレオチドとしては、典型的には、それぞれ、１種類の非標的細菌に対して１種のオリゴヌクレオチドを用いてよい。あるいは、例えば、第３および第４のオリゴヌクレオチドとしては、それぞれ、１種類の非標的細菌に対して２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いてもよい。具体的には、例えば、Firmicutes門細菌に特異的な第３のオリゴヌクレオチドとして、実施例に記載したような２種のプライマー等の、２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてもよい。
【００４８】
標的領域は、上記のようなオリゴヌクレオチドを設計できる限り、特に制限されない。標的領域としては、例えば、標的細菌のDNAの標的領域を、非標的細菌および／または他の細菌のDNAの標的領域と区別可能な領域を選択することができる。標的領域としては、特に、標的細菌のDNAの標的領域を、非標的細菌および他の細菌のDNAの標的領域と区別可能な領域を選択することができる。なお、「標的細菌のDNAの標的領域を、非標的細菌および／または他の細菌のDNAの標的領域と区別可能」とは、標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物を、非標的細菌および／または他の細菌のDNAの標的領域の増幅産物と区別可能であることと同義であってよい。標的細菌のDNAの標的領域と非標的細菌および／または他の細菌のDNAの標的領域は、例えば、塩基配列に基づき区別可能であってよい。標的細菌および非標的細菌のDNAの標的領域においては、その両末端領域が第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位を構成する。具体的には、標的細菌および非標的細菌のDNAの第１および第２のストランドの標的領域においては、その３’末端領域が第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位を構成する。他の細菌のDNAの標的領域においては、その両末端領域が第１および第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部位を構成していてもよく、いなくてもよい。非標的細菌のDNAの標的領域は、その内部に第３のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位を有する。すなわち、非標的細菌のDNAの第１または第２のストランドの標的領域の内部配列は、第３のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位を有する。
【００４９】
標的領域としては、16S rDNA中の領域が挙げられる。なお、16S rDNAは、16S rRNAをコードするDNAであり、正式名称を「16S rRNA遺伝子」と呼ぶものである。16S rDNA中の領域としては、可変領域を含む領域が挙げられる。16S rDNA中の領域として、具体的には、可変領域を含む領域であって、且つ両末端に保存領域を有する領域が挙げられる。16S rDNA中の可変領域としては、V1〜V9領域が挙げられる。16S rDNA中の可変領域としては、特に、V3およびV4領域が挙げられる。16S rDNA中の保存領域としては、V1〜V9領域間の領域が挙げられる。16S rDNA中の保存領域としては、特に、V2およびV3領域間の領域（「V2-3間保存領域」ともいう）や、V4およびV5領域間の領域（「V4-5間保存領域」ともいう）が挙げられる。第１および第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位は、例えば、16S rDNA中の保存領域中に配置してよい。第３のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズ部位は、例えば、16S rDNA中の可変領域中に配置してよい。具体的には、例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部位を16S rDNA中のV2-3間保存領域およびV4-5間保存領域にそれぞれ配置し、第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部位を16S rDNA中のV3またはV4領域に配置してもよい。
【００５０】
細菌集団のDNAは、PCRの鋳型として利用可能な態様であれば特に制限されない。細菌集団のDNAとしては、例えば、細菌集団のDNAの精製品を用いてもよく、細菌集団のDNAを含有する素材を用いてもよい。すなわち、例えば、細菌集団を含むサンプルをそのまま、あるいは適宜DNA抽出等のDNAを回収する処理に供してから、PCRに供してよい。細菌集団を
含むサンプルとしては、上記例示したような細菌集団に対応するサンプルが挙げられる。例えば、腸内細菌叢の解析には、糞便またはそれから得られたDNAを鋳型として用いてよい。また、細菌集団のDNAとしては、cDNAも挙げられる。cDNAは、細菌集団のRNAを鋳型とする逆転写PCR（RT-PCR）により調製することができる。例えば、16S rDNAは、細菌集団の16S rRNAを鋳型とする逆転写PCR（RT-PCR）により、cDNAとして調製することができる。
【００５１】
工程（Ａ）においては、鎖置換活性（strand displacement活性）を有しないDNAポリメラーゼを用いてPCRが実施される。DNAポリメラーゼは、鎖置換活性を有しない限り、特に制限されない。鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いることにより、第１の増幅産物を選択的に生成することができる。具体的には、鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いることにより、非標的細菌のDNAの標的領域の増幅を第３のオリゴヌクレオチドによって効率的に阻害でき、以て第１の増幅産物を選択的に生成することができると期待される。鎖置換活性は、例えば、常法により測定することができる。鎖置換活性は、具体的には、例えば、RCA（Rolling Circle Amplification）法により測定することができる。すなわち、RCA法において増幅産物の継続的な生成が認められない場合に、DNAポリメラーゼが鎖置換活性を有しないと判断できる。鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼとして、具体的には、PrimeSTAR(R) Max DNA Polymeraseが挙げられる。
【００５２】
PCRの条件は、上記オリゴヌクレオチド（すなわち第１〜３のオリゴヌクレオチドおよび任意で他のオリゴヌクレオチド）および鎖置換活性（strand displacement活性）を有しないDNAポリメラーゼを用いること以外は、特に制限されない。PCRは、上記オリゴヌクレオチドおよび鎖置換活性を有しないDNAポリメラーゼを用いること以外は、例えば、通常のPCRの条件で実施することができる。例えば、PCRに使用される成分の使用量は、通常のPCRにおける同成分の使用量の範囲に設定してよい。具体的には、例えば、細菌集団のDNAおよび各オリゴヌクレオチドの使用量は、それぞれ、通常のPCRにおける鋳型DNAおよび各プライマーの使用量の範囲に設定してよい。各オリゴヌクレオチドの使用量は、具体的には、例えば、反応液中での各オリゴヌクレオチドの濃度に換算して、0.1〜1 μMであってもよい。
【００５３】
工程（Ａ）においては、第１の増幅産物のみが生成してもよく、第１の増幅産物に加えて他の増幅産物が生成してもよい。他の増幅産物としては、非標的細菌のDNAの標的領域の部分配列の増幅産物が挙げられる。非標的細菌のDNAの標的領域の部分配列の増幅産物を「第２の増幅産物」ともいう。他の増幅産物としては、非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物や、他の細菌（すなわち、標的細菌および非標的細菌以外の細菌）のDNAの標的領域の増幅産物も挙げられる。非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成量は、第３のオリゴヌクレオチドの非共存下でPCRを実施する場合と比較して、低減されていてよい。
【００５４】
第１の増幅産物は、標的細菌のDNAの増幅産物である。第１の増幅産物は、具体的には、標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物である。第１の増幅産物は、第１および第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせによる増幅産物であってよい。
【００５５】
第２の増幅産物は、非標的細菌のDNAの増幅産物である。第２の増幅産物は、具体的には、非標的細菌のDNAの標的領域の部分配列の増幅産物である。第２の増幅産物は、第３のオリゴヌクレオチドと他のオリゴヌクレオチドの組み合わせによる増幅産物であってよい。標的領域の部分配列は、標的領域の一方または両方の端が短縮されたものであってよい。標的領域の部分配列は、特に、標的領域の一方の端が短縮されたものであってよい。例えば、第３のオリゴヌクレオチドと第１または第２のオリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーセットとして用いることにより、標的領域の一方の端が短縮された部分配列
が増幅してよい。また、例えば、第３のオリゴヌクレオチドと第４のオリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーセットとして用いることにより、標的領域の両方の端が短縮された部分配列が増幅してよい。
【００５６】
工程（Ａ）においては、細菌集団中の標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）が選択的に増幅されてよい。「標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）が選択的に増幅される」とは、第１の増幅産物の生成が向上することを意味してよい。第１の増幅産物の生成は、具体的には、第３のオリゴヌクレオチドの非存在下で工程（Ａ）（すなわちPCR）を実施する場合と比較して、向上してよい。第１の増幅産物の生成の向上としては、第１の増幅産物の生成の絶対量または相対量の向上が挙げられる。第１の増幅産物の生成の相対量としては、工程（Ａ）において生成した細菌の標的領域の増幅産物の総量に対する第１の増幅産物の量の比率が挙げられる。また、第１の増幅産物の生成の相対量としては、工程（Ａ）において生成した非標的細菌の標的領域の増幅産物の量に対する第１の増幅産物の量の比率も挙げられる。標的細菌のDNAの選択的増幅は、特に、非標的細菌のDNAの標的領域の増幅が阻害されることによるものであってよい。すなわち、本発明の方法の一態様は、細菌集団のDNAの増幅の際に非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅を阻害する方法であってもよい。
【００５７】
工程（Ａ）においては、細菌集団中の非標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅が阻害されてよい。「標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）の増幅が阻害される」とは、非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成が低下することを意味してよい。非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成は、具体的には、第３のオリゴヌクレオチドの非存在下で工程（Ａ）（すなわちPCR）を実施する場合と比較して、低下してよい。非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成の低下としては、非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成の絶対量または相対量の低下が挙げられる。非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成の相対量としては、工程（Ａ）において生成した細菌の標的領域の増幅産物の総量に対する非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の量の比率が挙げられる。非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の生成の相対量としては、工程（Ａ）において生成した第１の増幅産物の量に対する非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物の量の比率も挙げられる。
【００５８】
増幅した標的細菌のDNA（第１の増幅産物）は、適宜利用することができる。
【００５９】
例えば、増幅した標的細菌のDNA（第１の増幅産物）に基づいて、標的細菌の情報を取得することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、細菌集団中の標的細菌の情報を製造する方法であってもよい。
【００６０】
すなわち、本発明の方法（例えば細菌集団中の標的細菌の情報を製造する方法）は、さらに、下記工程（Ｂ）を含んでいてもよい：
（Ｂ）前記第１の増幅産物に基づいて前記標的細菌の情報を取得する工程。
【００６１】
具体的には、第１の増幅産物を解析することにより、標的細菌の情報を取得することができる。すなわち、工程（Ｂ）は、具体的には、第１の増幅産物を解析することにより標的細菌の情報を取得する工程であってよい。工程（Ａ）において第１の増幅産物に加えて他の増幅産物が生成する場合、第１の増幅産物に加えて、他の増幅産物も解析されてよい。例えば、第１の増幅産物に加えて、非標的細菌および／または他の細菌のDNAの標的領域の増幅産物が解析されてよい。工程（Ａ）において第１の増幅産物に加えて他の増幅産物が生成する場合、いずれの増幅産物が第１の増幅産物であるかは、本発明の方法の実施態様に応じて適宜決定できる。すなわち、例えば、予め選択した標的細菌の標的領域の増幅産物に該当する増幅産物を第１の増幅産物とみなしてよい。あるいは、例えば、非標的
細菌のDNAの標的領域の増幅産物に該当しない増幅産物を第１の増幅産物とみなしてもよい。あるいは、例えば、非標的細菌および他の細菌のDNAの標的領域の増幅産物に該当しない増幅産物を第１の増幅産物とみなしてもよい。典型的には、非標的細菌のDNAの標的領域の増幅産物以外の細菌のDNAの標的領域の増幅産物は、全て第１の増幅産物とみなしてもよい。
【００６２】
取得される情報は、標的細菌に関するものであれば特に制限されない。標的細菌の情報としては、第１の増幅産物の塩基配列、標的細菌のDNAの標的領域の塩基配列、標的細菌の種類、細菌集団における標的細菌の存在の有無、細菌集団における標的細菌の存在量に関する情報が挙げられる。
【００６３】
第１の増幅産物の解析手段は、所望の情報が得られる限り、特に制限されない。第１の増幅産物の解析は、例えば、公知の手段により実施することができる。第１の増幅産物の解析は、特に、塩基配列解析により実施することができる。また、塩基配列解析の結果に基づいてさらにデータ解析を実施することができる。すなわち、工程（Ｂ）は、例えば、第１の増幅産物について塩基配列解析する工程を含んでいてもよく、さらに塩基配列解析の結果に基づいてデータ解析する工程を含んでいてもよい。例えば、第１の増幅産物の塩基配列を解析することにより、第１の増幅産物の塩基配列を決定することができ、以て、標的細菌のDNAの標的領域の塩基配列を決定することができる。また、例えば、第１の増幅産物の塩基配列に基づいて標的細菌の種類を同定することができる。また、例えば、第１の増幅産物の有無に基づいて、細菌集団における標的細菌の存在の有無を同定することができる。すなわち、第１の増幅産物が生成した場合、細菌集団中に標的細菌が存在すると判断できる。また、第１の増幅産物の量に基づいて、細菌集団における標的細菌の存在量を同定することができる。すなわち、例えば、第１の増幅産物の生成の相対量に基づいて、細菌集団における標的細菌の存在量を同定することができる。第１の増幅産物の生成の相対量としては、工程（Ａ）において生成した細菌の標的領域の増幅産物の総量に対する第１の増幅産物の量の比率が挙げられる。また、第１の増幅産物の生成の相対量としては、工程（Ａ）において生成した非標的細菌の標的領域の増幅産物の量に対する第１の増幅産物の量の比率も挙げられる。塩基配列解析およびその後のデータ解析は、例えば、MiSeq System等の次世代シーケンサにより実施することができる。
【００６４】
工程（Ａ）において第２の増幅産物が生成する場合、第１の増幅産物の解析は、第１の増幅産物を第２の増幅産物から分離した後に実施してもよく、そうでなくてもよい。工程（Ａ）において第２の増幅産物が生成する場合、第１の増幅産物の解析は、特に、第１の増幅産物を第２の増幅産物から分離した後に実施してよい。分離手段は、第１の増幅産物と第２の増幅産物を所望の程度に分離することができるものであれば特に制限されない。分離手段としては、第１の増幅産物と第２の増幅産物の長さの違いに基づく分離、塩基配列の違いに基づく分離、アフィニティ精製による分離が挙げられる。長さの違いに基づく分離としては、アガロースゲル電気泳動等の電気泳動による分離や、ゲル濾過等のクロマトグラフィーによる分離が挙げられる。塩基配列の違いに基づく分離としては、DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）による分離が挙げられる。アフィニティ精製による分離としては、ビオチン標識を利用した分離が挙げられる。すなわち、例えば、第３または第４のオリゴヌクレオチドをビオチン標識することにより、第２の増幅産物をアビジンまたはストレプトアビジンに結合して除去することができる。
【００６５】
取得した情報は、それ自体を適宜提供できる。また、取得した情報に基づいて標的細菌を検出してもよい。
【００６６】
また、例えば、増幅した標的細菌のDNA（第１の増幅産物）に基づいて、標的細菌を検
出することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、細菌集団中の標的細菌を検出する方法であってもよい。
【００６７】
すなわち、本発明の方法（例えば細菌集団中の標的細菌を検出する方法）は、さらに、下記工程（Ｃ）を含んでいてもよい：
（Ｃ）前記第１の増幅産物に基づいて前記標的細菌を検出する工程。
【００６８】
具体的には、第１の増幅産物を解析することにより、標的細菌を検出することができる。すなわち、工程（Ｃ）は、具体的には、第１の増幅産物を解析することにより標的細菌を検出する工程であってよい。工程（Ｃ）における第１の増幅産物の解析については、工程（Ｂ）における第１の増幅産物の解析についての記載を準用できる。
【００６９】
検出としては、標的細菌の種類の同定、細菌集団における標的細菌の存在の有無の同定、細菌集団における標的細菌の存在量の同定が挙げられる。細菌集団における標的細菌の存在の有無または存在量の同定は、種類の同定を伴ってもよく、伴わなくてもよい。すなわち、細菌集団における標的細菌の存在の有無または存在量の同定は、例えば、特定の種類の標的細菌の有無または存在量の同定であってもよく、特定の標的領域（例えば、特定の塩基配列を含む標的領域）を有する標的細菌の有無または存在量の同定であってもよい。
【００７０】
本発明の方法によれば、細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌のDNA（具体的にはDNAの標的領域）を選択的に増幅することができ、本発明の方法の一態様においては、細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌の情報を効率的に取得すること、および／または細菌集団中のマイナー細菌等の標的細菌を効率的に検出することができる。そのため、本発明の方法は、例えば、生物の細菌叢における、薬剤等の刺激に対する生物の応答の有無または程度と相関する細菌の効率的な検出に有効であり得る。また、本発明の方法は、例えば、生物の細菌叢全体に影響を与える細菌の効率的な検出に有効であり得る。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７２】
2名の日本人（50歳女性１名および成人１名）から提供された糞便からDNAを以下の方法で抽出した。糞便20mg程度を測りとり、500μlの抽出用バッファー（Tris-HCｌ(pH8.0), EDTA, NaCl, 界面活性剤）（クラボウ社製）に懸濁後、0.1mm径のガラスビーズ300mgと混合した。その後、FastPrep FP 100A（フナコシ社製）にてパワーレベル５での45秒の破砕処理、5分間の氷上静置を6回繰り返した。続いて、14,000gで5分間遠心し、200μlの上清を取得した。上清に150μlのプロテアーゼ溶解試薬（Tris-HCl (ｐH8.0)）（クラボウ社製）および150μlの抽出用バッファーを加えて混合した。混合液をDNA自動分離装置 GENE
PREP STAR PI-480（クラボウ社製）に供してDNAの抽出および精製を行い、DNA溶液を得た。
【００７３】
次に、細菌の16S rRNA遺伝子（16S rDNA）の第３〜４可変領域（V3〜V4領域）を増幅するための1stプライマーセット（配列番号１と２）と、配列番号２のプライマーとの組み合わせでBifidobacteriales目、Bacteroidales目、Firmicutes門の第３〜４可変領域の部分配列を特異的に増幅するためのプライマー（Bifidobacteriales目について配列番号３、Bacteroidales目について配列番号４、Firmicutes門について配列番号５と６）、次世代シーケンサMiseq（イルミナ社製）を用いて解析するために必要な2ndプライマーセット（配列番号７と８）を設計し、Life Technologies社のオリゴプライマー作成サービスによりそれらのプライマーを合成した。2ndプライマーセットは、アダプター領域と、１度
の解析で複数サンプルを処理するためのインデックス領域を含む。
【００７４】
鋳型DNA溶液、1stプライマーセット、Bifidobacteriales目、Bacteroidales目、およびFirmicutes門の特異的プライマーを含む総液量25μlの反応液をPrimeSTAR(R) Max DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いて調製した。Veriti 200（Life Technologies社製）により、９４℃３分の後、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル、および７２℃１０分のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにてMupid-exU（タカラバイオ社製）を用いて電気泳動を行った後、ゲル染色色素SYBER gold（サーモフィッシャー社製）を用いて染色した。その後Densitograph（アトー社製）を用いバンドパターンを確認し、16SrRNA遺伝子の第３〜４可変領域の増幅産物に相当するバンド部分のゲルを切り出した。切り出されたゲルより、NucleoSpin(R) Gel and PCR Clean-up（タカラバイオ社製）を用いてPCR産物の抽出および精製を行った。対照として、Bifidobacteriales目、Bacteroidales目、およびFirmicutes門の特異的プライマーを含まないこと以外は上記と同一組成の反応液を用いて同様の実験を実施した。
【００７５】
続いて、得られたＰＣＲ精製産物1μlを鋳型とし、2ndプライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲを実施した。ただし、ＰＣＲのサイクル数は３０サイクルではなく８サイクルとした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認後、QIAquick 96 PCR Purification Kit（キアゲン社製）にて精製を行い、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit（Life Technologies社製）にて濃度を測定した。同濃度のDNA溶液を混合したものをMiseq v2 Reagent kit（イルミナ社製）に供し、Miseqにてシークエンス解析を実施した。
【００７６】
得られたペアエンド配列をQIIME2 software (ver 2017.10)( https://qiime2.org/) に取り込み後、DADA2 (https://benjjneb.github.io/dada2/index.html)を用いてクオリティのコントロール、ペアリードの接続、およびノイズの除去を行い、代表配列（OTU）を得た。得られたOTUをGreengenes database 13_10 (http://greengenes.secondgenome.com/downloads/database/13_8)に対して配列相同性検索を行い、各OUTに対応する門、綱、目、科、属、および種を特定し、糞便の細菌叢の構成を解析した。
【００７７】
50歳日本人女性の結果を表１に示す。従来の手法（特異的プライマー未使用）では、Bifidobacteriales目、Bacteroidales目、Firmicutes門以外のマイナー細菌群について検出されたOTU数が13 OTUsであったのに対して、本手法（特異的プライマー使用）では18 OTUsであり、すなわち特異的プライマーの使用によりマイナー細菌群の検出OTU数が増加した。また、総リード数に占めるマイナー細菌群の割合についても特異的プライマーの使用により約4%から約64%に増加しており、すなわち、特異的プライマーの使用によるマイナーな種の検出感度の向上が確認された。
【００７８】
【表１】
2020191833.tif 000002
【００７９】
成人日本人の結果を表２に示す。従来の手法（特異的プライマー未使用）では、Bifidobacteriales目、Bacteroidales目、Firmicutes門以外のマイナー細菌群について検出されたOTU数が2 OTUsであったのに対して、本手法（特異的プライマー使用）では9 OTUsであり、すなわち特異的プライマーの使用によりマイナー細菌群の検出OTU数が増加した。また、総リード数に占めるマイナー細菌群の割合についても特異的プライマーの使用により約2%から約23%に増加しており、すなわち、特異的プライマーの使用によるマイナーな種の検出感度の向上が確認された。
【００８０】
【表２】
2020191833.tif 000003
【００８１】
このように、細菌集団のDNAを鋳型としてユニバーサルプライマーを用いてPCRを実施する際に、ユニバーサルプライマーにより増幅される領域の内部配列にハイブリダイズするメジャー細菌に特異的なプライマーを併用することによりマイナー細菌のDNAを選択的に増幅できることが明らかとなった。
【００８２】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜８：プライマー
【配列表】
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