(57)【要約】      （修正有）【課題】ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−特異的なヒト抗体を提供する。【解決手段】ＶＥＧＦは、発生過程の血管形成及び血管新生に決定的な役割をすることが知られている。ＶＥＧＦに特異的に結合するヒトから誘導された相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域（ＦＲ）で構成されたヒト抗体。ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体は、前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患の診断、疾患の分類、映像化、治療及び予後の判定などに使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５〜１７からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（以下、ＨＣＤＲ）１、配列番号１８〜３０からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３１〜４３からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、好ましくは、前記重鎖可変領域が、配列番号４４〜５６からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する前記重鎖可変領域を含む重鎖またはその断片；及び、
配列番号５７〜６９及び配列番号１３０〜配列番号１４２からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（以下、ＬＣＤＲ）１、配列番号７０〜８２及び配列番号１４３〜配列番号１５２からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２及び配列番号８３〜９３及び配列番号１５３〜配列番号１６４からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、好ましくは前記軽鎖可変領域が、配列番号９４〜１０６及び配列番号１６５〜配列番号１７８からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する前記軽鎖可変領域を含む軽鎖またはその断片を含むＶＥＧＦに特異的なヒト抗体。
【請求項２】
請求項１のヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１のヒト抗体の軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項３のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項４の発現ベクター及び／または請求項５の発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体。
【請求項７】
１）請求項６の形質転換体を培養する工程；及び  
２）前記培養液から請求項１のヒト抗体を精製する工程を含む、ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１のヒト抗体を含む製薬組成物。
【請求項９】
ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患、好ましくは、前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患が、癌、好ましくは前記癌が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される癌；または新生血管生成と係わる疾患、好ましくは前記新生血管生成と係わる疾患は、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、乾癬、増殖糖尿病網膜症及び糖尿病性黄斑浮腫からなる群から選択される疾患の予防及び治療に使用されることを特徴とする、請求項８に記載の製薬組成物。
【請求項１０】
化学的療法と並行して投与することを特徴とする、請求項８に記載の製薬組成物。
【請求項１１】
請求項１のヒト抗体、前記ヒト抗体の軽鎖または重鎖、またはその免疫学的に活性を有した断片及び放射線アイソトープを、好ましくは放射線アイソトープは、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１７７Ｌｕ及びこれらの混合物及び組合わせからなる群から選択されることを特徴とする放射線アイソトープを含む組成物。
【請求項１２】
ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患、好ましくは前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患が、癌、好ましくは前記癌が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される癌；または新生血管生成と係わる疾患、好ましくは前記新生血管生成と係わる疾患が、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、乾癬、増殖糖尿病網膜症及び糖尿病性黄斑浮腫からなる群から選択される疾患の放射線免疫治療用及び検出用に使用されることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記放射線アイソトープが、ヒト抗体と結合したりヒト抗体が結合された運搬体に含まれることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１１の組成物を癌細胞と接触する工程を含む試験管内のＶＥＧＦが過発現する癌、好ましくは前記ＶＥＧＦが過発現する前記癌が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される癌の免疫検出方法。
【請求項１５】
１）請求項１１の組成物の診断的有効量を個体に投与する工程；及び、
２）前記個体に対する検出映像、好ましくは前記検出映像が近赤外光イメージング、ＰＥＴ、ＭＲＩまたは超音波イメージングによって得られる検出映像を得る工程を含む生体内でＶＥＧＦが過発現する癌、好ましくは前記ＶＥＧＦが過発現する癌が、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される癌の映像化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−特異的なヒト抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＶＥＧＦは、発生過程の血管形成及び血管新生に決定的な役割をすることが知られていて（Ｓｏｋｅｒ  Ｓ等，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年，第８５巻，３５７−３６８頁）、ＶＥＧＦＲ１が血管内皮細胞の他に大腸癌、膵臓癌細胞にも過発現して直接的に腫瘍の進行、転移に関与することが報告されていて、ＶＥＧＦＲ１は、血管新生、腫瘍の成長と転移、炎症などにおいて重要な役割をすると見なされている（Ｗｅｙ  ＪＳ等，Ｃａｎｃｅｒ，２００５年，第１０４巻，４２７−４３８頁；Ｆａｎ  Ｆ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５年，第２４巻，２６４７−２６５３頁）。ＶＥＧＦは、腫瘍血管新生において最も重要な因子中の一つで、腎臓癌（Ｔｏｍｉｓａｗａ  Ｍ等，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ，１９９９年，第３５巻，１３３−１３７頁）、肺癌（Ｖｏｌｍ  Ｍ等，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９７年，第７４巻，６４−６８頁）、乳癌（Ｙｏｓｈｉｊｉ  Ｈ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６年，第５６巻，２０１３−２０１６頁）、卵巣癌（Ｓｏｗｔｅｒ  ＨＭ等，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９７年，第７７巻，６０７−６１４頁）など大部分の腫瘍組織で発現され、腫瘍細胞だけではなく腫瘍基質細胞でも分泌する。腫瘍の成長を阻害するために、ＶＥＧＦ拮抗剤を使用した試みとして、マウス抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体は、試験管で腫瘍細胞の成長には特別に影響を及ぼさない一方、癌動物モデルで腫瘍血管新生及び腫瘍成長を明白に阻害する効果を示した（Ｋｉｍ  ＫＪ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，第３６２巻，８４１−８４４頁；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ  Ｐ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６年，第５６巻，４０３２−４０３９頁）。
【０００３】
ＶＥＧＦが実際に腫瘍以外に多くの疾病とも関連性が高いという事実は、広く知られていて、これに対する治療剤開発も多角度に試みられている。代表的な例として、新生血管生成と係わる疾患である慢性関節リウマチ（ＲＡ）、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症及び乾癬などが挙げられ、ＶＥＧＦがこのような疾病に重要な要因として作用することが明らかにされている。ＲＡの場合、対照群の患者に比較してＲＡ患者の血清ＶＥＧＦの量が上昇することが確認された（Ｉｋｅｄａ  Ｍ等，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，２０００年，第１９１巻，４２６−３３頁）。また、糖尿病患者で血漿ＶＥＧＦが上昇するが、上昇した血糖が内皮に毒性影響を及ぼして高血糖性不完全低酸素状態を誘導する。これは、ＶＥＧＦ生成を誘導して糖尿病で内皮損傷と障害とが関係あることを示している（Ｌｉｍ  ＨＳ等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００４年，第２７巻，２９１８−２４頁）。また、網膜でＶＥＧＦの過度な分泌は、眼内新生血管、血腫を引き起こして視覚障害／盲目になる。増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）及び糖尿病性黄斑浮腫と関連した視力喪失を防止して、レーザー治療のような破壊的な治療と関連した副作用を避けるための努力として、ＶＥＧＦのすべての亜形に選択的に結合するヒト化されたモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体断片を使用する。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって生産された、ｒｈｕＦａｂ  Ｖ２と呼ばれるこの化合物は、現在臨床研究中であり、ＰＤＲまたは糖尿病性黄斑浮腫を防止するのに効果を示している（Ｈｅｉｅｒ  ＪＳ，Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２００２  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０−２３，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ）。
【０００４】
現在４０種以上の多様な血管新生抑制剤が、多様な種類の腫瘍に対して臨床開発が進行されている。ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体は、最も代表的な標的として、活性、信号伝達、生産を阻害する薬剤が含まれる。ＶＥＧＦ阻害剤では、抗体、水溶性ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦｔｒａｐ）などがある。腫瘍治療剤としての血管新生抑制剤では、ヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ；ＡｖａｓｔｉｎＴＭ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が、大規模の臨床試験で転移性大膓癌患者の生命延長の効果を示すことによって、２００４年２月にＦＤＡの承認を受けた。したがって、このような抗ＶＥＧＦヒトモノクローナル抗体の開発は、新生血管の治療を含めたそれと係わった多様な疾患の治療のための有望な候補物質として、副作用を極小化させて臨床及び前臨床に使用することができる長所を有していて、これを使用した多方面の治療剤開発が注目されているのは、当然である。
【０００５】
それで、本発明者等は、ＶＥＧＦに特異的に結合する１４種のヒト抗体を選別して、前記ヒト抗体が既存のヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるアバスチンと類似水準の結合能及び中和能を有し、マウスＶＥＧＦと交差反応性を示すことを確認して、本発明のヒト抗体が、ＶＥＧＦ過発現疾患の治療に効果的に使用できることを提示することにより本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体の重鎖またはその断片を暗号化するポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチド及びヒト重鎖の不変領域を含む発現ベクターを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体の軽鎖またはその断片を暗号化するポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチド及びヒト軽鎖の不変領域を含む発現ベクターを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体の軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体の重鎖またはその断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び軽鎖またはその断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを同時に宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記形質転換体を培養して、ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体を製造する方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明は、前記ヒト抗体を含む組成物を提供することである。
【００１４】
また、本発明は、前記ヒト抗体を含む製薬組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、薬学的に有効な量の前記ヒト抗体を個体に投与する工程を含む、ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患を治療する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体及び放射線アイソトープを含む組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、前記放射線アイソトープを含む組成物が癌細胞と接触する工程を含む、試験管内のＶＥＧＦが過発現する癌の免疫検出方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記放射線アイソトープを含む組成物の診断的有効量を個体に投与する工程を含む、生体内でＶＥＧＦが過発現する癌の映像化方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、前記放射線アイソトープを含む組成物を使用する、ＶＥＧＦが過発現する癌の生体内治療方法を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、前記放射線アイソトープを含む組成物を使用する、ＶＥＧＦが過発現する癌治療の予後評価方法を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、前記ヒト抗体を動物実験モデルに投与する工程を含む、前記ヒト抗体の副作用を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号５〜１７からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（以下、ＨＣＤＲ）１、配列番号１８〜３０からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３１〜４３からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む重鎖またはその断片；及び、
配列番号５７〜６９及び配列番号１３０〜配列番号１４２からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（以下、ＬＣＤＲ）１、配列番号７０〜８２及び配列番号１４３〜配列番号１５２からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２及び配列番号８３〜９３及び、配列番号１５３〜配列番号１６４からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖またはその断片を含むＶＥＧＦに特異的なヒト抗体を提供する。
【００２３】
また、本発明は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
また、本発明は、前記ヒト抗体の軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２５】
また、本発明は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記ヒト抗体の軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供する。
【００２７】
また、本発明は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを同時に宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供する。
【００２８】
また、本発明は、前記形質転換体を培養して、ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体を製造する方法を提供する。
【００２９】
また、本発明は、前記ヒト抗体を含む組成物を提供する。
【００３０】
また、本発明は、前記ヒト抗体を含む製薬組成物を提供する。
【００３１】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記ヒト抗体をＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患にかかった個体に投与する工程を含む、ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患を治療する方法を提供する。
【００３２】
また、本発明は、前記ヒト抗体、ヒト抗体の軽鎖または重鎖、またはその免疫学的に活性を有した断片及び放射線アイソトープを含む組成物を提供する。
【００３３】
また、本発明は、前記放射線アイソトープを含む組成物が癌細胞と接触する工程を含む、試験管内のＶＥＧＦが過発現する癌の免疫検出方法を提供する。
【００３４】
また、本発明は、１）前記放射線アイソトープを含む組成物の診断的有効量を個体に投与する工程；及び、
２）前記個体に対する検出映像を得る工程を含む、生体内でＶＥＧＦが過発現する癌の映像化方法を提供する。
【００３５】
また、本発明は、
１）前記放射線アイソトープを含む組成物を個体の静脈内に投与する工程；
２）前記工程１）の組成物を検出して腫瘍細胞を確認する工程；
３）工程２）で確認された腫瘍細胞を手術的切除によって除去する工程を含む、ＶＥＧＦが過発現する癌の生体内治療方法を提供する。
【００３６】
また、本発明は、
１）前記放射線アイソトープを含む組成物を腫瘍細胞が除去された患者の静脈内に投与する工程；
２）前記工程１）の組成物を検出して腫瘍細胞を確認する工程；
３）工程２）で腫瘍細胞が検出されなければ、腫瘍細胞がすべて除去されたと判断することを特徴とする、ＶＥＧＦが過発現する癌治療患者の予後評価方法を提供する。
【００３７】
同時に、本発明は、前記ヒト抗体をＶＥＧＦを過発現する疾患にかかった動物実験モデルに投与する工程を含む、前記ヒト抗体の副作用を測定する方法を提供する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のＶＥＧＦに特異的なヒト抗体は、前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患の診断、疾患の分類、映像化、治療及び予後判定などに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ｐＹＫ６０２−ＶＥＧＦベクターでのＶＥＧＦタンパク質発現をウエスタンブロットで確認した結果を示した図である。
【図２】ｐＹＫ６０２−ＶＥＧＦ、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦ及びｐＹＫ６０３−ＶＥＧＦベクターでのＶＥＧＦタンパク質発現をウエスタンブロットで比較した結果を示した図である。
【図３】ｐＹＫ６０３−ＶＥＧＦベクターでのＶＥＧＦタンパク質発現をウエスタンブロットで確認した結果を示した図である。
【図４】精製されたＶＥＧＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示した図である。
【図５】パンニング１〜３次でのファージ抗体探索結果を示した図である。
【図６】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の多様性をフィンガープリンティングを通じて確認した結果を示した図である。
【図７ａ】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の重鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【図７ｂ】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の重鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【図７ｃ】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の重鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【図８ａ】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の軽鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【図８ｂ】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の軽鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【図８ｃ】ＶＥＧＦに対するヒトＶＥＧＦモノクローナルファージ抗体の軽鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【図９ａ】ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体の結合特異性を比較した結果を示した図である：ａ：Ｃ５、Ｅ９、Ｆ６、Ｇ１２、Ａ４、Ｃ１１、及びＦ２。
【図９ｂ】ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体の結合特異性を比較した結果を示した図である：ｂ：Ｈ７、Ｇ９、Ｃ９、Ｂ１２、Ｆ９、Ｄ１２及びＣ１２。
【図１０】ＨＵＶＥＣ細胞でヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体の管形成を抑制する中和能を確認した結果を示した図である。
【図１１】ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体のｈＶＥＧＦとｍＶＥＧＦに対する交差反応性を測定した結果を示した図である。
【図１２ａ】ｐＮＡＴＡＢ  Ｈベクターの開列地図を示した図である。
【図１２ｂ】ｐＮＡＴＡＢ  Ｌベクターの開列地図を示した図である。
【図１３ａ】ｐＹＫ６０２ベクターの開列地図を示した図である。
【図１３ｂ】ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓベクターの開列地図を示した図である。
【図１３ｃ】ｐＹＫ６０３−Ｈｉｓベクターの開列地図を示した図である。
【図１４】パンニング１〜３次でのＬＣシャフリングライブラリファージ抗体探索結果を示した図である。
【図１５】ＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体の多様性をフィンガープリンティングを通じて確認した結果を示した図である。
【図１６】ＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体の軽鎖ＣＤＲで使用されているポリペプチドを分析した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明で使用した用語を説明する。
「可変領域」というのは、抗原と特異的に結合する機能を遂行しながら配列上の多くの変異を見せる抗体分子の部分を意味し、可変領域には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。前記ＣＤＲの間には、フレームワーク領域（ＦＲ）部分が存在して、ＣＤＲ環を支持する役割をする。
【００４１】
「相補性決定領域」は、抗原の認識に関与する環状の部位であり、この部位の配列が変わることによって抗体の抗原に対する特異性が決定される。
【００４２】
「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」は、ファージの外壁にペプチドを発現するファージライブラリから、標的分子（抗体、酵素、細胞表面レセプターなど）と結合する性質を有したペプチドを表面に発現しているファージのみを選択し出す過程を意味する。
【００４３】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００４４】
本発明は、配列番号５〜１７からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（以下、ＨＣＤＲ）１、配列番号１８〜３０からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２及び配列番号３１〜４３からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む重鎖またはその断片；及び、
配列番号５７〜６９及び配列番号１３０〜配列番号１４２からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（以下、ＬＣＤＲ）１、配列番号７０〜８２及び配列番号１４３〜配列番号１５２からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号８３〜９３及び配列番号１５３〜配列番号１６４からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖またはその断片を含むＶＥＧＦに特異的なヒト抗体を提供する。
【００４５】
好ましくは、前記重鎖可変領域は、配列番号４４〜５６からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域は、配列番号９４〜１０６及び配列番号１６５〜配列番号１７８からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有する。
【００４６】
前記抗体は、全長抗体形態であるのみならず、抗体分子の機能的な断片を含む。全体抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造で、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。抗体分子の機能的な断片というのは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、抗体断片の例としては、（ｉ）軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の不変領域（ＣＬ）及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）からなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ＥＳ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９年，第３４１巻，５４４−５４６頁］；（ｖ）分離したＣＤＲ領域；（ｖｉ）２個の連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが抗原結合部位を形成するよう結合させるペプチドリンカーによって結合された単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二重特異的な単一鎖Ｆｖニ量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）及び、（ｉｘ）遺伝子融合によって製作された多価または多重特異的断片であるディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）ＷＯ９４／１３８０４）などを含む。
【００４７】
本発明では、ＶＥＧＦに対するヒト抗体をファージディスプレイ技術を使用してｓｃＦｖ形態で得て、モノファージクローン形態でスクリーニングすることで、ＶＥＧＦに特異的な１４種のモノクローナルファージを得た。
【００４８】
本発明の具体的な実施例で組換え技術で得たＶＥＧＦ（図１〜図４参照）をモノクローナル抗体の製造に使用した。前記ＶＥＧＦを多様性を有したヒト由来ｓｃＦｖライブラリ細胞から製造したライブラリファージと反応してパンニングさせた後、ＶＥＧＦ抗原に強く結合するモノクローナルをスクリーニングした（表１、２及び図５参照）。前記選別されたモノクローナルをフィンガープリンティングで確認した後（図６参照）、それぞれの配列を分析して抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ部位を確認した（表５及び図７、８参照）。前記抗体と生殖系列抗体群の類似性をＮＣＢＩのＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラム（／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用して確認した結果（表６参照）、１４種のＶＥＧＦに特異的なファージ抗体を得た。前記選別されたモノクローナル抗体は、Ｇ１２＞Ｄ１２＞Ｅ９＞Ｆ６＞Ｈ７＞Ｃ５＞Ｂ１２＞Ｇ９＞Ｆ９＞Ｃ１１＞Ｆ２＞Ａ４＞Ｃ９＞Ｃ１２の順序でＶＥＧＦに対する結合能を示し（図９ａ及び図９ｂ参照）、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の毛細管類似管形成を顕著に抑制することが観察された（図１０参照）。また、アバスチンと似た中和能を示したＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体は、すべてマウスＶＥＧＦに対してヒトＶＥＧＦ程度の高い親和力を示して交差反応した（表８、表９及び図１１参照）。アバスチンは、マウスＶＥＧＦに対して全く交差反応しないので、前記アバスチンによる副作用のための動物実験研究が難しいことが報告されたが、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスと交差反応するので、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体が既存の抗癌剤であるアバスチンとエピトープの異なる確率が確実に高くなり、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスＶＥＧＦに対して高い交差反応を示すので、動物実験研究に容易いに使用できる。
【００４９】
前記アバスチンと似た中和能を示したＦ６及びＧ１２モノクローナル抗体を対象に、軽鎖がシャフリングしたライブラリファージを製造した。前記製造したライブラリファージとＶＥＧＦを反応させてパンニングさせた後、ＶＥＧＦ抗原に強く結合するモノクローナルをスクリーニングした（表１０、１１及び図１４参照）。前記選別されたモノクローナルをフィンガープリンティングで確認した後（図１５参照）、それぞれの配列を分析して抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ部位を確認し、ＬＣシャフリングして選別された抗体のＶＨのＣＤＲ領域が同一で、ＶＬのＣＤＲ領域を比較した（表１２及び図１６参照）。前記抗体と生殖系列抗体群の類似性を確認した結果（表１３参照）、１５種のＶＥＧＦに特異的なＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体を得て、これらのＶＥＧＦに対する結合能が確認された（表１４参照）。前記ＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体のヒトＶＥＧＦに対する結合能を確認した結果、２Ｃ１１、２Ｇ０３、２Ｃ０５及び２Ｆ１０を除外して、Ｆ６及びＧ１２と類似の程度の高い親和力を示した。
【００５０】
また、本発明は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００５１】
また、本発明は、前記ヒト抗体の軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００５２】
本発明の具体的な実施例で組換え技術によって得たＶＥＧＦを使用して、ＶＥＧＦ抗原に強く結合するモノクローンをスクリーニングした（表１、２及び図５参照）。前記選別されたモノクローンをフィンガープリンティングで確認した後（図６参照）、それぞれの配列を分析して抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ部位を確認した（表５及び図７、８参照）。前記抗体と生殖系列抗体群の類似性を確認した結果（表６参照）、１５種のＶＥＧＦに特異的なファージ抗体を得た。前記選別されたモノクローナル抗体のＶＥＧＦに対する結合能を測定し（図９ａ及び図９ｂ参照）、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の毛細管類似管形成を顕著に抑制することが観察された（図１０参照）。また、アバスチンと似た中和能を示したＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体は、すべてマウスＶＥＧＦとヒトＶＥＧＦに対して高い親和力を示して交差反応した（表８、表９及び図１１参照）。アバスチンは、マウスＶＥＧＦに対して全く交差反応しないので、前記アバスチンによる副作用のための動物実験研究が難しいことが知られているが、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスと交差反応するので、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体が既存の抗癌剤であるアバスチンとエピトープが異なる確率が確実に高くなった。本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスＶＥＧＦに対して高い交差反応を示すので、動物実験研究に容易に用いられる。
【００５３】
本発明のヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を暗号化するポリヌクレオチドは、コドンの縮退性によって、または前記ヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を発現させようとする生物で選好されるコドンを考慮して、コード領域から発現されるヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が成り立ち得、コード領域を除いた部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形または修飾が成り立ち得、そのような変形遺伝子も本発明の範囲に含まれることを当業者はよく理解することができるだろう。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、これと同等な活性を有するタンパク質をコードする限り、一つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組合わせによって変異することができ、これらも本発明の範囲に含まれる。このようなポリヌクレオチドの配列は、単鎖または二重鎖であり得、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であり得る。
【００５４】
前記発現ベクターの製作時には、前記ヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を生産しようとする宿主細胞の種類によってプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのような発現調節配列、膜標的化または分泌のための配列などを適切に選択して目的によって多様に組み合わせることができる。
【００５５】
本発明の発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。相応しい発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的によって多様に製造することができる。発現ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であり得る。前記シグナル配列には、宿主が大腸菌の場合には、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバシラス属の菌の場合には、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母の場合には、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列などが、宿主が動物細胞の場合には、インスリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを使用することができるが、これに制限されない。また発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができ、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。
【００５６】
また、本発明は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供する。
【００５７】
また、本発明は、前記ヒト抗体の軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供する。
【００５８】
また、本発明は、前記ヒト抗体の重鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び軽鎖またはその免疫学的に活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを同時に宿主細胞に導入してつくられた形質転換体を提供する。
【００５９】
本発明の具体的な実施例では、モノクローナルファージの軽鎖及び重鎖を暗号化する遺伝子を得てそれぞれベクターに連結した後、前記発現ベクターを同時に宿主細胞に導入して発現された全長ＩｇＧ形態のヒト抗体を確認した。前記ヒト抗体を得て、ＶＥＧＦに対する結合能（図９ａ及び図９ｂ参照）、中和能（図１０参照）及びマウス及びヒトＶＥＧＦに対する交差反応性（表８、表９及び図１１参照）を確認した。
【００６０】
本発明による前記発現ベクターを適切な宿主細胞、例えば、大腸菌または酵母細胞などに形質転換させた後、形質転換された宿主細胞を培養することで、本発明によるヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を大量生産することができる。宿主細胞の種類による適切な培養方法及び培地条件などは当該分野の通常の技術者に知られた公知技術から当業者が容易に選択することができる。前記宿主細胞は、大腸菌またはバシラス・サブティリスのような原核生物であり得る。また、サカロマイセスセルビシエのような酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞から由来した真核細胞であり得る。前記動物細胞は、自家または同種異系動物細胞であることがより好ましい。自家または同種異系動物細胞に導入してつくられた形質転換体は、個体に投与されて癌を治療する細胞治療などに使用され得る。前記宿主細胞への発現ベクター導入方法は、当業者に公知されたどの方法を使用してもかまわない。
【００６１】
また、本発明は、
１）前記形質転換体を培養する工程；及び
２）前記培養液から前記ヒト抗体を精製する工程を含む、ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体の製造方法を提供する。
【００６２】
前記培養培地としては、当業者に公知された培養培地の中から形質転換体に相応しい培地を選択して使用することが好ましい。前記抗体精製方法は、当業者に公知されたどんな精製方法も使用可能である。
【００６３】
本発明の具体的な実施例では、モノクローナルファージの軽鎖及び重鎖を暗号化する遺伝子を得てそれぞれベクターに連結した後、前記発現ベクターを同時に宿主細胞に導入して発現した全長ＩｇＧ形態のヒト抗体を確認した。前記ヒト抗体を得て、ＶＥＧＦに対する結合能（図９ａ及び図９ｂ参照）、中和能（図１０参照）及びマウス及びヒトＶＥＧＦに対する交差反応性（表８、表９及び図１１参照）を確認した。
【００６４】
また、本発明は、前記ヒト抗体を含む組成物を提供する。
【００６５】
また、本発明は、前記ヒト抗体を含む製薬組成物を提供する。
【００６６】
前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患は、癌または新生血管生成と係わる疾患である。前記癌は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択されたいずれかひとつであることが好ましいが、これに限定されず、ＶＥＧＦが過発現する癌はすべて可能である。また、前記新生血管生成と係わる疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、乾癬、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）及び糖尿病性黄斑浮腫などがある。
【００６７】
本発明の具体的な実施例で、ＶＥＧＦに対する結合能を示した（図９ａ及び図９ｂ参照）ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、ヒト臍帯静脈内皮細胞株で、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の毛細管類似管形成を顕著に抑制することが観察された（図１０参照）。また、アバスチンと似た中和能を示すＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体は、すべて、マウスＶＥＧＦに対してヒトＶＥＧＦ程度の高い親和力を示して交差反応した（表８、表９及び図１１参照）。アバスチンは、マウスＶＥＧＦに対して全く交差反応しないので、前記アバスチンによる副作用のための動物実験研究が難しいことが知られていたが、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体はマウスと交差反応するので、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体が既存の抗癌剤であるアバスチンとエピトープの異なる確率が確実に高くなり、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスＶＥＧＦに対して高い交差反応を示すので、動物実験研究に容易に使用できる。それで、本発明のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦが過発現された疾患予防及び治療用組成物として有用に使用することができる。
【００６８】
本発明の製薬組成物は、前記ＶＥＧＦに特異的なヒト抗体または前記形質転換体を選択的に含むことができ、前記成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。また、本発明の製薬組成物投与のために、前記で記載した有効成分以外に、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。例えば、薬剤学的に許容可能な担体では、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール、リポソーム及びこれら成分中の一つ以上の成分を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液及び乳濁液などのような注射用剤形に製剤化することができ、標的細胞に特異的に作用するように標的細胞に特異的な抗体またはその他リガンドを前記の担体とともに結合させて使用することができる。同時に、当該技術分野の適正な方法またはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に記載された方法などを使用して各疾患または成分によって好ましく製剤化することができる。
【００６９】
本発明の製薬組成物は、非経口で投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式による。非経口投与用剤形に製剤化するためには、本発明の製薬組成物は、安定剤または緩衝剤とともに混合して溶液または懸濁液に製造し、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製剤化する。
【００７０】
本発明の製薬組成物は、投与経路によって多様な形態で製造することができる。例えば、本発明の製薬組成物は、注射用途に相応しい滅菌水溶液または分散液の形態に製造することができ、または凍結乾燥技術を使用してフリーズドライされた形態で製造することができる。フリーズドライされた製薬組成物は、典型的に約４℃で維持され、補助剤を含むか含まない安定化溶液、例えば、食塩水または／及びＨＥＰＥＳによって復元され得る。
【００７１】
本発明の方法を実施するにおいて、投与される製薬組成物の量に影響を及ぼす因子としては、これに限定されるものではないが、投与方式、投与頻度、治療が進行中の特定疾病、疾病の重症度、疾病の病歴、個体が異なる治療剤とともに協力治療法が進行中かどうか、及び治療が進行中の個体の年齢、身長、体重、健康、及び身体条件を含む。一般的に治療が進行中の患者の体重が増加するほど、本発明の製薬組成物をさらに多い量で投薬することが好ましい。
【００７２】
同時に、本発明の製薬組成物は、化学的療法と並行して投与することができる。
【００７３】
また、本発明は、薬学的に有効な量の前記ヒト抗体をＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患にかかった個体に投与する工程を含む、ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患を治療する方法を提供する。
【００７４】
前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患は、癌または新生血管生成と係わる疾患である。前記癌は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択されたいずれかひとつであることが好ましいが、これに限定されず、ＶＥＧＦが過発現する癌はすべて可能である。また、前記新生血管生成と係わる疾患には、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、乾癬、増殖糖尿病網膜症と糖尿病性黄斑浮腫などがある。
【００７５】
本発明の具体的な実施例で、ＶＥＧＦに対する結合能を示した（図９ａ及び図９ｂ参照）ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、ヒト臍帯静脈内皮細胞株で、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の毛細管類似管形成を顕著に抑制することが観察された（図１０参照）。また、アバスチンと似た中和能を示したＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体はすべて、マウスＶＥＧＦに対してヒトＶＥＧＦ程度の高い親和力を示して交差反応した（表８、表９及び図１１参照）。アバスチンは、マウスＶＥＧＦに対して全く交差反応しないので、前記アバスチンによる副作用のための動物実験研究が難しいことが知られているが、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスと交差反応するので、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体が既存の抗癌剤であるアバスチンとエピトープが異なる確率が明確に高くなり、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体は、マウスＶＥＧＦに対して高い交差反応を示すので、動物実験研究に容易に使用できる。それで、本発明のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦが過発現された疾患の予防及び治療に有用に使用することができる。
【００７６】
本発明が適用可能な個体は、脊椎動物で、哺乳動物が好ましく、さらに好ましいのは、ネズミ、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物で、最も好ましいのは、チンパンジー、ゴリラのような類人猿類の動物である。
【００７７】
本発明のヒト抗体の投与方法は、使用目的によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所などに投与する方法）で可能で、静脈投与が好ましい。場合によって固形癌に対する投与では、抗体の接近を早く容易にするために局所的な投与が好ましいこともある。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。１回の投与量は、約５〜５００ｍｇ／ｍ２の量で一単位または数単位で投与することができる。前記有効量は、前記患者を治療する医師の裁量によって調節することができる。
【００７８】
本発明のヒト抗体は、患者の治療のために単独または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤と並行して使用することができる。
【００７９】
また、本発明は、前記ヒト抗体、ヒト抗体の軽鎖または重鎖、またはその免疫学的に活性を有した断片及び放射線アイソトープを含む組成物を提供する。
【００８０】
前記組成物は、ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患の放射線免疫治療用及び検出用に有用に使用することができる。前記ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患は、癌または新生血管生成と係わる疾患である。前記癌は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択されたいずれかひとつであることが好ましいが、これに限定されず、ＶＥＧＦが過発現する癌はすべて可能である。また、前記新生血管生成と係わる疾患には、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、乾癬、増殖糖尿病網膜症と糖尿病性黄斑浮腫などがある。
【００８１】
本発明の具体的な実施例で、モノクローナルＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに対する高い結合能を示すことを確認した（図９ａ及び図９ｂ参照）。それで、本発明のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患の放射線免疫治療用及び放射線アイソトープを含む組成物として有用に使用することができる。
【００８２】
好ましい放射線アイソトープの例では、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１７７Ｌｕ及びこれらの混合物及び組合わせを含む。前記放射線アイソトープは、ヒト抗体と結合したりヒト抗体が結合した運搬体に含まれることを特徴とする。
【００８３】
また、本発明は、前記放射線アイソトープを含む組成物を癌細胞と接触する工程を含む、試験管内でＶＥＧＦが過発現する癌の免疫検出方法を提供する。
【００８４】
前記ＶＥＧＦが過発現する癌は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されず、ＶＥＧＦが過発現する癌はすべて可能である。
【００８５】
本発明の具体的な実施例で、モノクローナルＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに対する高い結合能を示すことを確認した（図９ａ及び図９ｂ参照）。それで、本発明のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦが過発現する放射線アイソトープを含む組成物として有用に使用することができる。
【００８６】
前記放射線アイソトープを含む組成物は、洗浄や複合体の分離などその後の工程を容易にするために、固形基質に結合することができる。固形基質は、例えば合成樹脂、ニトロセルロース、ガラス基板、金属基板、グラスファイバー、微細球体及びミクロビーズなどがある。また、前記合成樹脂には、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ及びナイロンなどがある。
【００８７】
また、癌細胞は、前記放射線アイソトープを含む組成物と接触の前に適当な程度に希釈することができる。
【００８８】
また、本発明は、１）前記放射線アイソトープを含む組成物の診断的有効量を個体に投与する工程；及び、
２）前記個体に対する検出映像を得る工程を含む、生体内でＶＥＧＦが過発現する癌の映像化方法を提供する。
【００８９】
前記ＶＥＧＦが過発現する癌は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されず、ＶＥＧＦが過発現する癌はすべて可能である。
【００９０】
本発明の具体的な実施例で、モノクローナルＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに対する高い結合能を示すことを確認した（図９ａ及び図９ｂ参照）。それで、本発明のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦが過発現する癌の映像化方法に有用に使用することができる。
【００９１】
前記検出映像は、近赤外光イメージング、ＰＥＴ、ＭＲＩまたは超音波イメージングによって得ることを特徴とする。
【００９２】
また、本発明は、
１）前記放射線アイソトープを含む組成物を個体の静脈内に投与する工程；
２）前記工程１）の組成物を検出して腫瘍細胞を確認する工程；
３）工程２）で確認された腫瘍細胞を手術的切除によって除去する工程を含む、ＶＥＧＦが過発現する癌の生体内治療方法を提供する。
【００９３】
前記ＶＥＧＦが過発現する癌は、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されず、ＶＥＧＦが過発現する癌はすべて可能である。
【００９４】
本発明の具体的な実施例として、ＶＥＧＦに対する結合能を示した（図９ａ及び図９ｂ参照）ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、ヒト臍帯静脈内皮細胞株で、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の毛細管類似管形成を顕著に抑制することが観察された（図１０参照）。また、アバスチンと似た中和能を示したＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体は、すべて、マウスＶＥＧＦに対してヒトＶＥＧＦ程度の高い親和力を示して交差反応した（表８、表９及び図１１参照）。アバスチンは、マウスＶＥＧＦに対して全く交差反応しないので、前記アバスチンによる副作用のための動物実験研究が難しいことが知られていたが、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体はマウスと交差反応するので、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体が既存の抗癌剤であるアバスチンとエピトープが異なる確率が明確に高くなり、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体はマウスＶＥＧＦに対して高い交差反応を示すので、動物実験研究に容易に使用できる。それで、本発明のモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦが過発現する癌予防及び治療に有用に使用することができる。
【００９５】
また、本発明は、
１）前記放射線アイソトープを含む組成物を腫瘍細胞が除去された患者の静脈内に投与する工程；
２）前記工程１）の組成物を検出して腫瘍細胞を確認する工程；
３）工程２）で腫瘍細胞が検出されなければ、腫瘍細胞がすべて除去されたと判断することを特徴とする、癌治療患者の予後評価方法を提供する。
【００９６】
同時に、本発明は、前記ヒト抗体を動物実験モデルに投与する工程を含む、前記ヒト抗体の副作用を測定する方法を提供する。
【００９７】
前記動物実験モデルは、ＶＥＧＦが過発現して惹起される疾患にかかった動物が好ましい。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。
【００９９】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【０１００】
＜実施例１＞ＶＥＧＦ抗原タンパク質製造
＜１−１＞ＶＥＧＦ遺伝子クローニング
＜１−１−１＞ＹＫ６０２を使用してクローニング
韓国生命工学研究院ヒト遺伝体機能研究産業団のＫＵＧＩ（Ｋｏｒｅａｎ  ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）からヒトＶＥＧＦ遺伝子を含んでいるプラスミド（ＵＧ−００３６−Ｄ１２）の分譲を受けた。前記プラスミドを鋳型ＤＮＡにして、前記ＶＥＧＦのドメインのみを発現させるために正方向プライマー（配列番号１：５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴ−３’）及び逆方向プライマー（配列番号２：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡ−３’）を使用して遺伝子を下記の条件で増幅した後、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで処理した後、リガーゼを使用してｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）ベクター（Ｖ８００２０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）にサブクローニングした。ＰＣＲ条件は、全体反応液が５０μｌの時、鋳型は５００ｎｇになるように入れて、９４℃で５分、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒で、２５サイクル、７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ産物を得た。
【０１０１】
前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＥＧＦを鋳型ＤＮＡにして、正方向プライマー（配列番号３：５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧ−３’）及び逆方向プライマー（配列番号４：５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡ−３’）を使用して遺伝子を下記条件で増幅した後、ＳｆｉＩで処理した後、リガーゼを使用してｐＹＫ６０２ベクター（図１３ａ）にサブクローニングした。ＰＣＲ条件は、全体反応液が５０μｌの時、鋳型は１００ｎｇになるように入れて、９４℃で５分、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分で、２５サイクル、７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ産物を得た。併せて、前記サブクローニングしたｐＹＫ６０２−ＶＥＧＦベクターの塩基配列を確認した。
【０１０２】
＜１−１−２＞ｐＹＫ６０２−ＨｉｓとｐＹＫ６０３を使用してクローニング
実施例１−１−１と同一な方法でｐｃＤＮＡ３．１−ＶＥＧＦを鋳型にして、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ（図１３ｂ）とｐＹＫ６０３ベクター（図１３ｃ）にＶＥＧＦをサブクローニングした。併せて、前記サブクローニングしたｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦとｐＹＫ６０３−ＶＥＧＦベクターの塩基配列を確認した。
【０１０３】
＜１−２＞ＶＥＧＦタンパク質発現及び精製
＜１−２−１＞ｐＹＫ６０２を使用してＶＥＧＦ発現確認
まず、１５０ｍｍの皿１０枚に５×１０６２９３Ｅ細胞を敷いた後、翌日前記サブクローニングしたｐＹＫ６０２−ＶＥＧＦベクター１０μｇをＰＥＩ（２３９６６：Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，米国）を処理して形質転換した。翌日成長培地（無血清ＤＭＥＭ）に交換した後、二日ごとに上澄み液を得て、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ウエスタンブロットで確認した。
【０１０４】
具体的に、前記１回目から７回目まで継代培養の上澄み液ＶＥＧＦ２０μｌがローディングされた１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル２枚を１００Ｖで２時間位電気泳動した後、ＮＣ膜（ＨＡＴＦ０００１０：ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）に８５Ｖで２時間伝達した。以後、膜を４％スキムミルクｉｎ  ＴＢＳＴで４℃で一晩中遮断した。以後、商業的に購買した抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（０．８ｍｇ／ｍｌ；製品番号３１４１３：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉ，米国）を４％スキムミルクｉｎ  ＴＢＳＴに１：４０００に希釈して常温で１時間反応させた。ＴＢＳＴで１０分に一回ずつ５回洗浄した後、現像（１２１４５：Ｉｎｔｒｏｎ，米国）してタンパク質の発現量を比較した。
【０１０５】
その結果、図１に示したように、ＶＥＧＦは７回目の継代培養まで発現し、全般的にＶＥＧＦの発現量は、あまり多くなく、２回目及び３回目で発現量が多かった。
【０１０６】
また、前記上澄み液をプロテインＡカラム（１７−１２７９−０３：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）を使用して１．５ｍｌ／分の速度で精製した後、０．２５ｍｇ／ｍｌのタンパク質を得て、これをＰＢＳに透析した後、沈殿物が生じることを確認した。
【０１０７】
それで、相対的に沈澱が少なく生成されるｐＹＫ６０２−ＨｉｓとｐＹＫ６０３ベクターに再サブクローニングした。
【０１０８】
＜１−２−２＞ｐＹＫ６０２−ＨｉｓとｐＹＫ６０３を使用してＶＥＧＦ発現確認
サブクローニングされたｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦとｐＹＫ６０３−ＶＥＧＦベクターを実施例１−２−１の方法で形質導入した後、何回も継代培養しながら上澄み液を得た。
【０１０９】
ｐＹＫ６０２−ＶＥＧＦ、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦ及びｐＹＫ６０３−ＶＥＧＦベクターの１次及び２次継代培養上澄み液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ウエスタンブロットで確認した。また、沈殿物生成も確認した。
【０１１０】
その結果、図２に示したように、ｐＹＫ６０２−ＶＥＧＦとｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦベクターは、発現量が類似で相対的な沈殿物形成も少なく、ｐＹＫ６０３−ＶＥＧＦベクターでは、相対的にそれより発現量が少なく示された。
【０１１１】
それで、最終的にｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦベクターを使用してＶＥＧＦを発現させて精製した。
【０１１２】
＜１−２−３＞ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦベクター発現確認
１５０ｍｍの皿１０枚に５×１０６２９３Ｅ細胞を敷いて、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＥＧＦベクターを形質導入した後、継代培養しながら１〜７次継代培養の上澄み液３００ｍｌを得た。前記上澄み液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ウエスタンブロットで確認した。
【０１１３】
その結果、図３に示したように、２及び３次上澄み液で発現量が最も多かった。
【０１１４】
＜１−２−４＞ＶＥＧＦタンパク質発現及び精製
前記２及び３次上澄み液を５０ｍｌに濃縮した後、３００ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ結合緩衝溶液（Ｑｉａｇｅｎ，米国）に交換した後、再び５０ｍｌに濃縮した。前記濃縮液にＮｉ−ＮＴＡビーズ（１０２４４７３，Ｑｉａｇｅｎ，米国）を添加して４℃で２時間結合した後、洗浄して溶離した。
【０１１５】
前記溶離液をメンブレイン（１０Ｋ，１３２５７４：ＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ，米国）に入れた後、４℃で４ｌのＰＢＳ溶液に４時間以上緩衝溶液を代えた後、再びあらかじめ冷やしておいた４ｌのＰＢＳ溶液に入れて一晩中透析して緩衝溶液を交換した。一晩中透析した後、ｅ−チューブに移して、ブラッドフォード方法でタンパク質濃度を測定した後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した（図４）。
【０１１６】
その結果、６００μｇのＶＥＧＦタンパク質を得た。
【０１１７】
＜実施例２＞ライブラリファージの製造
多様性を有したヒト由来ｓｃＦｖライブラリ細胞２．７×１０１０を２×ＹＴ  ＣＭ［トリプトン（ＣＯＮＤＡ，１６１２．００）１７ｇ、酵母エキス（ＣＯＮＤＡ，１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（ｓｉｇｍａ，Ｓ７６５３−５Ｋｇ）５ｇ、クロラムフェニコール（ｓｉｇｍａ，Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ）］、２％グルコース（ｓｉｇｍａ，Ｇ５４００）及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｓｉｇｍａ，Ｍ２３９３）を含む培地（３ｌ）で３７℃で２〜３時間培養した後（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）、ヘルパーファージを感染させて２×ＹＴＣＭＫ［２×ＹＴ  ＣＭ、カナマイシン（ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）］培地に３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後、上澄み液に４％ＰＥＧ（Ｆｌｕｋａ，８１２５３）６０００と３％ＮａＣｌ（ｓｉｇｍａ，Ｓ７６５３）を添加してよく溶解した後、氷で１時間反応させた。再び、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後、ペレットにＰＢＳを添加して溶解した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）してライブラリファージを含む上澄み液を新しいチューブに入れて４℃で保管した。
【０１１８】
＜実施例３＞モノクローナル抗体の製造
＜３−１＞パンニング（Ｐａｎｎｉｎｇ）過程
実施例１で得た精製されたＶＥＧＦ抗原５０μｇをＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂチューブ（Ｎｕｎｃ４７０３１９）に４ｍｌのコーティング緩衝溶液［Ｎａ２ＣＯ３（ｓｉｇｍａ，Ｓ７７９５）１．５９ｇ、ＮａＨＣＯ３（ｓｉｇｍａ，Ｓ８８７５）２．９３ｇ、ＮａＮ３（ｓｉｇｍａ，Ｓ２００２）、０．２ｇ］で４℃で１６時間程度ローテイターでコーティングした後、室温で２時間ＰＢＳに溶解してスキムミルク［（ＢＤ，２３２１００）−４％ｉｎ  １ＸＰＢＳ］を使用してイムノチューブ位置で遮断した。免疫チューブに実施例２で製造したライブラリファージ２ｍｌを添加して室温で２時間反応させ、ＰＢＳＴ（０．０５％）で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージだけ１００ｍＭ  ＴＥＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−０８８６）に溶離して、溶出したファージを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ，ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，２００２４９）に感染させて増幅した。最初のパンニングで増幅されたファージをＰＢＳＴ洗浄回数のみ増やして（２次：１３回、３次：２３回）同一な方法で２次及び３次パンニングを行なった。
【０１１９】
その結果、表１に示したように、２次から抗原に対するファージのコロニー力価が１０００倍以上増幅されることを確認した。
【０１２０】
【表１】
2010131009.tif 000002
【０１２１】
＜３−２＞ファージＥＬＩＳＡによるファージ抗体探索
＜３−２−１＞パンニング結果確認
１次から３次までパンニングして氷らせておいた細胞貯蔵品を５ｍｌの２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地にＯＤ６００＝０．１になるように入れた後、３７℃で２〜３時間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）培養した。以後、Ｍ１ヘルパーファージを感染させて２×ＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。ここで、ＶＥＧＦと関係ない発生過程に関連あるＷＷ４５抗原に特異的に結合する、本発明の実施例どおりつくられた単一ファージ抗体（＃３９）を対照群に使用した。培養細胞を遠心分離した後（４５００ｒｐｍ、１５分、４℃）上澄み液（１次〜３次パンニングｐｏｌｙ  ｓｃＦｖ−ファージ）を新しいチューブに移した。９６ウェル免疫プレート（ＮＵＮＣ  ４３９４５４）にＶＥＧＦ抗原をウェル当り１００ｎｇずつ４℃で１６時間程度コーティング緩衝溶液で処理してコーティングした後、ＰＢＳに溶解したスキムミルク（４％）を使用して各ウェルを遮断した。ウェルごとにＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗った後、１次〜３次パンニングｐｏｌｙ  ｓｃＦＶ−ファージを各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。再び、ウェルごとにＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌを使用して、４回洗浄した後、二次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ２７−９４２１−０１）を１：２０００に希釈して室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗浄した後、ＯＰＤ精製（Ｓｉｇｍａｐ  ８７８７−ＴＡＢ）をＰＣ緩衝溶液［Ｃ６Ｈ８Ｏ７．Ｈ２Ｏ（ｓｉｇｍａ，Ｃ０７０６）５．１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（ｓｉｇｍａ，Ｓ７９０７）７．３ｇ］に溶解した基質溶液を作ってウェル当り１００μｌずつ入れて１０分間発色させた後、４９０ｎｍで吸光度を分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ，米国）で測定した。
【０１２２】
その結果、図５に示したように、ＶＥＧＦ抗原に対する結合能が２次ポリクローナルｓｃＦｖ−ファージプールから増強して、２次に結合能が飽和状態に至り、タグされたＨｉｓに対する値は、相対的に低かった。
【０１２３】
＜３−２−２＞モノクローナル抗体選別
前記結合能が大きいポリクローナルファージ抗体群（３次パンニング）で得たコロニーを２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地１ｍｌを含んだ９６ディープウェルプレート（バイオニア９００３０）で、３７℃で１６時間培養した。培養した細胞のＯＤ６００値が０．１になるように１００〜２００μｌを取って１ｍｌの２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に希釈した後、９６ディープウェルプレートで３７℃でＯＤ６００値が０．５〜０．７になるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージをＭＯＩ値が１：２０になるように感染させた後、２×ＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後、上澄み液を取って４％ＰＥＧ６０００と３％ＮａＣｌを添加してよく溶解した後、氷で１時間反応させた。再び遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後、ペレットにＰＢＳを添加して溶解した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して上澄み液を取って新しいチューブに移して、３次パンニングして得たモノクローナルｓｃＦｖファージを４℃で保管した。
【０１２４】
以後、９６ウェル免疫プレートにＶＥＧＦ抗原をウェル当り１００ｎｇずつ入れて、４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶解したスキムミルク（４％）を使用して各ウェルを遮断した。ウェルごとにＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌを使用して洗浄した後、３次パンニングして得たモノクローナルｓｃＦｖファージを各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。再び、ウェルごとにＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌを使用して４回洗った後、２次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈して室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗浄した後、発色させて吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１２５】
その結果、抗原ＶＥＧＦに対する結合能が、１．５以上の５０個のモノクローナルファージ（表２で強調したもの）を選別した。
【０１２６】
【表２】
2010131009.tif 000003
【０１２７】
＜３−３＞モノクローナルファージ分類及び検査
＜３−３−１＞フィンガープリンティングによる検証
１次選別されたモノクローナル５０個のモノクローナル細胞１μｌとＴａｑ．ＤＮＡポリメラーゼ（ゼンダックス５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、５０ｐ／μｌの正方向プライマー（ｐｅｌＢ５、配列番号１２５：５’−ＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＧ−３’）及び逆方向プライマー（ｃｌａ３、配列番号１２６：５’−ＣＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣ−３’）０．２μｌ、１０×緩衝溶液３μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ０．６μｌ、蒸留水２４．８μｌを混合して、コロニーＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行なった。ＰＣＲプログラムの条件を、下記表３に示す。
【０１２８】
【表３】
2010131009.tif 000004
【０１２９】
前記コロニーＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル（Ｓｅａｋｅｍ  ＬＥ，ＣＡＭＥＲＥＳ  ５０００４）で確認し、ＢｓｔＮＩ（Ｒｏｃｈｅ１１２８８０７５００１，１０Ｕ／μｌ）０．２μｌを加えて、３７℃で２〜３時間反応させた。反応条件は、下記の表４のとおりである。前記切断した産物を８％ＤＮＡポリアクリルアミドゲルで確認した。
【０１３０】
【表４】
2010131009.tif 000005
【０１３１】
前記コロニーＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル（Ｓｅａｋｅｍ  ＬＥ，ＣＡＭＥＲＥＳ  ５０００４）で確認し、ＢｓｔＮＩ（Ｒｏｃｈｅ１１２８８０７５００１，１０Ｕ／μｌ）０．２μｌを取って、３７℃で２〜３時間反応させた。反応条件は、下記の表５のとおりである。前記切断した産物を８％ＤＮＡポリアクリルアミドゲルで確認した。
【０１３２】
その結果、図６に示したように、ＢｓｔＮＩによって切られられたモノクローナルファージ抗体の断片に対して多様性が確認された。
【０１３３】
＜３−３−２＞塩基配列分析による検証
前記５０種のモノクローナルファージを２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地（５ｍｌ）に３７℃で１６時間培養した。培養したモノクローンからＤＮＡ精製キット（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ５１１２）を使用してＤＮＡを得た後、配列番号１２５のｐｅｌＢ５プライマーを使用した配列分析を依頼した（ソルジェント、韓国）。
【０１３４】
その結果、表５、図７及び図８に示されたように、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ領域を確認した。
【０１３５】
これら抗体と生殖細胞系列抗体群の類似性をＮＣＢＩのＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラム（／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用して調査した結果、１４種のＶＥＧＦに特異的なファージ抗体を得て、それを下記表６に整理して提示した。特に、重鎖の場合、ヒト生殖細胞系列配列と８９．９％から約９６％までの相同性を示し、軽鎖の場合は８９．２％から約９７％の相同性を示した。また、それぞれのヒト抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３で使用されているポリペプチドを分析して、互いに配列が異なることを確認した。
【０１３６】
【表５−１】
2010131009.tif 000006
【表５−２】
2010131009.tif 000007
【０１３７】
【表６】
2010131009.tif 000008
【０１３８】
＜実施例４＞ＶＥＧＦに対するヒト抗体の特性分析
＜４−１＞結合能測定
ＶＥＧＦに対する実施例３で選別された１４種のモノクローナルファージ抗体の結合能を測定するため、実施例３−２の方法で結合能をそれぞれ測定した。
【０１３９】
その結果、図９ａ及び図９ｂに示したように、前記１４種のモノクローナルファージ抗体の結合能順位は、Ｇ１２＞Ｄ１２＞Ｅ９＞Ｆ６＞Ｈ７＞Ｃ５＞Ｂ１２＞Ｇ９＞Ｆ９＞Ｃ１１＞Ｆ２＞Ａ４＞Ｃ９＞Ｃ１２だった。
【０１４０】
＜４−２＞全長ＩｇＧ変換分析
ＶＥＧＦに対するモノクローナルファージ抗体をファージでＩｇＧ全長ベクターに転換するために、重鎖はモノクローナルＤＮＡ１μｌと１０ｐｍｏｌｅ／μｌ表７の重鎖正方向プライマーと重鎖逆方向プライマー、１０×バッファー５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌ、ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素（ソルジェント、２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、蒸留水を混合してコロニーＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行なった。また、軽鎖も表７の軽鎖正方向及び逆方向プライマーを使用して同一な方法でコロニーＰＣＲを行なった。
【０１４１】
【表７−１】
2010131009.tif 000009
【表７−２】
2010131009.tif 000010
【表７−３】
2010131009.tif 000011
【０１４２】
ＰＣＲの結果得られた重鎖遺伝子をＤＮＡゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、ｐＮＡＴＡＢ  Ｈベクター（図１２ａ）１μｌ（１０ｎｇ）、重鎖（１００〜２００ｎｇ）１５μｌ、１０×バッファーファー２μｌ、リガーゼ（１Ｕ／μｌ）１μｌ、蒸留水を混合して室温で１〜２時間放置して前記ベクターと連結した。前記ベクターを形質転換用細胞（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）とともに氷に３０分放置した後、４２℃で９０秒間熱衝撃を与えて形質導入した。再び氷に５分間放置した後、ＬＢ培地１ｍｌを注入して１時間３７℃で培養した。ＬＢ  Ａｍｐ固体培地に塗抹した後、３７℃で１６時間培養した。単一コロニーをＬＢ  Ａｍｐ液体培地５ｍｌに接種して、３７℃で１６時間培養した。前記培養液からＤＮＡ−ｐｒｅｐ．キット（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出した。
【０１４３】
また、軽鎖は、ｐＮＡＴＡＢ  Ｌベクター（図１２ｂ）を使用して前記と同じ方法で  ＤＮＡを抽出した。
【０１４４】
前記得られたＤＮＡのＣＭＶ−ｐｒｏＦプライマー（配列番号１２７：ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＴＧ）を使用した塩基配列分析を依頼した（ソルジェント）。
【０１４５】
その結果、全長ＩｇＧに転換したＶＥＧＦに対する１４個のクローンファージの重鎖と軽鎖の配列が、ファージ抗体の配列と一致することを確認した。
【０１４６】
＜４−３＞全長ＩｇＧの検証
２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＰＥＩ４０μｇと全長形態抗体重鎖ＤＮＡ１０μｇ、軽鎖ＤＮＡ１０μｇを入れて、共同形質感染をして得られた上澄み液をウエスタンブロットで確認した。対照群には、正常ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を使用した。
【０１４７】
その結果、対照群と比較して成功的に全長ＩｇＧ形態に転換されたことを確認した。
【０１４８】
＜４−４＞管形成抑制分析を通じた抗−ＶＥＧＦ抗体の中和能確認
約８０％コンフルエンス状態のヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣ細胞（Ｃ２５１７Ａ：Ｌｏｎｚａ）の単一細胞層を１％ＦＢＳを添加したＥＢＭ−２（ＣＣ３１５６、Ｃａｍｂｒｅｘ）培地に交替して３７℃／５％ＣＯ２培養器で４時間栄養飢餓状態にした。以後、細胞をトリプシンで集めて３×１０５／ｍｌで栄養飢餓培地に懸濁した。細胞懸濁液１００μｌと精製された本発明のヒトＶＥＧＦＡｂ溶液１５０μｌ（ＶＥＧＦ  Ａｂは栄養飢餓培地に希釈して４μｇ／ｍｌの濃度で処理）、陰性対照群に正常ヒトＩｇＧを４μｇ／ｍｌの濃度で処理または陽性対照群にアバスチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を４μｇ／ｍｌの濃度で処理して３７℃で一時間事前インキュベーションした。事前インキュベーションをする途中に２４ウェルプレートに氷で冷やしたマトリゲル（３５４２３０：ＢＤ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ，米国）を２００μｌずつ入れて３７℃／５％ＣＯ２培養器で３０分間ホモゲナイジングした。反応が終わった細胞とＡｂの混合物に組換えヒトＶＥＧＦを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マトリゲル上に入れて、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。１６時間培養した後、管形成を測定するために３．７％パラホルムアルデヒド５００μｌを入れて３０分間室温で固定した。次に、０．０１％クリスタルバイオレット／１００ｍＭ  ＮａＢｏｒａｔｅ  ５００μｌで３０分間染色し、乾燥させて１００倍率の顕微鏡で管の形成程度を観察した。
【０１４９】
その結果、図１０に示したように、精製されたＶＥＧＦＡｂは、陽性対照群より明らかな管形成抑制を示した。
【０１５０】
Ｅ９、Ｆ６、Ｇ１２及びＣ５の４種類の抗体の中で、Ｃ５を除く３種類の抗体はすべて、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の毛細管類似管形成を顕著に抑制することが観察され、これにより、本発明のＶＥＧＦに対するヒト抗体の中和能を確認できた。
【０１５１】
＜４−５＞抗−ＶＥＧＦ抗体のマウスでの交差反応確認
また、各抗体がヒトＶＥＧＦだけでなくマウスＶＥＧＦに対して交差反応するかどうかを調べるため、ＥＬＩＳＡを行なった。
【０１５２】
二つの９６ウェル免疫プレートに、組換えヒトＶＥＧＦ（２９３−ＶＥ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，米国）と組換えマウスＶＥＧＦ（４９３−ＭＶ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，米国）タンパク質をウェル当り５０ｎｇずつ４℃で１６時間程度コーティング緩衝溶液でコーティングした後、ＰＢＳに溶解したスキムミルク（４％）を使用して各ウェルを遮断した。ウェルごとにＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌを加えて洗った後、アバスチンを対照群にしてＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体を３３３ｎＭから１／３ずつ順次に希釈して二つの抗原がコーティングされたプレート各々のウェルに同時に１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。再びウェルごとに、ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌを加えて４回洗った後、二次抗体である抗−ヒトＦｃ−ＨＲＰを１：３０００に希釈して室温で３０分間反応させた。ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）０．２ｍｌで洗った後にＯＰＤ錠をＰＣ緩衝溶液に入れて基質溶液を作り、ウェル当り１００μｌずつ入れて５分間発色させた後、吸光度４９０ｎｍで分光光度計で測定した。
【０１５３】
ＥＬＩＳＡ結果は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒ．４  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＡ  ９２０３７：Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，米国）を使用して分析した。
【０１５４】
その結果、図１０でアバスチンと似た中和能を示したＥ９、Ｆ６及びＧ１２モノクローナル抗体はすべて、マウスＶＥＧＦに対してヒトＶＥＧＦ程度の高い親和力を示さして交差反応した（表８、表９及び図１１）。また、最大の中和能を示したＦ６抗体は、一貫性をもってアバスチンより約２倍も低いＫＤ値を示した。このことから、本発明のＶＥＧＦ中和ヒト抗体が既存の抗癌剤であるアバスチンとエピトープの異なる確率が確実に高くなった。
【０１５５】
【表８】
2010131009.tif 000012
【０１５６】
【表９】
2010131009.tif 000013
【０１５７】
＜実施例５＞ＶＥＧＦＦ６及びＧ１２モノクローナル抗体のＬＣシャフリング遂行
＜５−１＞ＬＣシャフリングライブラリの製造
実施例３で得た、モノクローナルＦ６とＧ１２のｓｃＦｖ−ファージで重鎖部分をＳｆｉＩを５０℃で処理して２時間ごとにＳｆｉＩを追加して３回繰り返した後、ゲル溶離した。また、ライブラリプラスミドであるｐＹＧ１００をＳｆｉＩで５０℃で４時間処理した後、もう一度処理して一晩中制限して、ゲル溶離した。前記切られたモノクローナルＦ６とＧ１２の重鎖断片とベクターの濃度を測定した後、ベクター：重鎖断片＝１：５のモル濃度で全体１μｇ／１００μｌに合わせて、１０ユニットリガーゼで２〜４時間程度室温で連結させた。連結された産物をエチルアルコールで濃縮した後、蒸留水に溶解した連結された産物２０μｌをＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞１×１０９個／１００μｌに電気穿孔法で形質導入した。３７℃で一晩中培養した後、１５％グリセロール２ＸＹＴ  ５００μｌに入れて−７０℃で保管し、力価測定の結果、２．１×１０６多様性が示された。
【０１５８】
＜５−２＞ＬＣシャフリングライブラリファージの製造
実施例５−１で製造した、多様性を有したヒト由来ＶＥＧＦＦ６  ＆ Ｇ１２  ＬＣシャフリングｓｃＦｖライブラリ細胞２．１×１０６を対象に、実施例２と同一な方法でライブラリファージを製造した。
【０１５９】
＜５−３＞ＬＣシャフリングモノクローナル抗体の製造
実施例１で得た精製されたＶＥＧＦ抗原５０μｇと実施例５−２で製造したライブラリファージ２ｍｌを使用して、実施例３と同一な方法でファージパンニング、パンニング結果の確認、モノクローナル抗体選別及びモノクローナルファージ分類及び検査を行なった。
【０１６０】
パンニング結果、表１０に示したように、１次から力価が高く示され、２次で抗原に対するファージのコロニー力価が、５倍以上増幅することを確認した。
【０１６１】
【表１０】
2010131009.tif 000014
【０１６２】
また、パンニング結果をＥＬＩＳＡで確認した結果、図１４に示したように、ＶＥＧＦ抗原に対する結合能が、ＬＣシャフリングしたポリクローナルｓｃＦｖ−ファージプール（ｐｏｏｌｓ）から増強して１次に結合能が飽和状態に至り、テグされたＨｉｓに対する値は、相対的に低かった。
【０１６３】
また、モノクローナル抗体選別の結果、ＶＥＧＦ抗原に対する結合能が２．０以上の  ６１個のモノクローナルファージ（表１１で強調したもの）を選別した。ここで、ＬＣシャフリングに使用したＦ６とＧ１２を陽性対照群に使用した。
【０１６４】
【表１１】
2010131009.tif 000015
【０１６５】
また、フィンガープリンティングによる検証の結果、図１５に示したように、ＢｓｔＮＩによって切られたモノクローナルファージ抗体の断片に対して多様性が確認された。
【０１６６】
同時に、塩基配列分析による検証結果、表１２に示したように、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ領域を確認した。前記選別された抗体と生殖細胞系列抗体群の類似性を調査した結果、Ｆ６と同一なＨＣを有しＬＣのみ異なる１２種のＶＥＧＦに特異的なファージ抗体を得、Ｇ１２と同一なＨＣを有しＬＣのみ異なる３種のＶＥＧＦに特異的なファージ抗体を得た（表１３）。特に、軽鎖の場合、９０．１％で約９４．４％の相同性を示した。また、各々のヒト抗体の軽鎖のＣＤＲ１、２、３で使用されているポリペプチドを分析し、互いに配列が異なることを確認した。図１６では、ＬＣシャフリングして選別された抗体のＶＨのＣＤＲ領域が同一で、ＶＬのＣＤＲ領域を比較した。
【０１６７】
【表１２−１】
2010131009.tif 000016
【表１２−２】
2010131009.tif 000017
【０１６８】
【表１３】
2010131009.tif 000018
【０１６９】
＜実施例６＞ＬＣシャフリングヒト抗体の特性分析
＜６−１＞結合能測定
実施例５−３で選別されたＬＣシャフリングモノクローナル抗体を対象に、実施例４−１と同一な方法で結合能を測定した。その結果、表１４に示したように、前記１５種のＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体の抗原に対する結合能が確認された。
【０１７０】
【表１４】
2010131009.tif 000019
【０１７１】
＜６−２＞全長ＩｇＧ変換分析
実施例５−３で選別されたＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体をＩｇＧ全長ベクターに転換するため、表１５のプライマー対を使用して実施例４−２と同一な方法でコロニーＰＣＲを遂行することで、重鎖はｐＮＡＴＡＢ  Ｈベクター（図１２ａ）、軽鎖はｐＮＡＴＡＢ  Ｌベクター（図１２ｂ）に連結した。前記ベクターからＤＮＡを抽出して、塩基配列分析を依頼した結果、全長ＩｇＧに転換したＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体に対する１５個のクローンファージの重鎖と軽鎖の配列がファージ抗体の配列と一致することを確認した。
【０１７２】
【表１５−１】
2010131009.tif 000020
【表１５−２】
2010131009.tif 000021
【表１５−３】
2010131009.tif 000022
【０１７３】
＜６−３＞抗−ＶＥＧＦ抗体の結合能確認
また、各ＬＣシャフリングモノクローナルファージ抗体が、Ｆ６とＧ１２と比較してＶＥＧＦに対する結合能を確認するために、実施例４−５と同一な方法でＥＬＩＳＡを行なった。
【０１７４】
その結果、表１６に示したように、２Ｃ１１、２Ｇ０３、２Ｃ０５及び２Ｆ１０の場合のみ結合程度が非常に弱く、残りは陽性対照群と類似の程度の高い親和力を示した。
【０１７５】
【表１６】
2010131009.tif 000023
【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列番号１：ＶＥＧＦ  フォワードプライマー
配列番号２：ＶＥＧＦ  リバースプライマー
配列番号３：ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＥＧＦ  フォワードプライマー
配列番号４：ｐｃＤＮＡ３．１−ＶＥＧＦ  リバースプライマー
配列番号５：Ａ４ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号６：Ｂ１２ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号７：Ｃ１１ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号８：Ｃ１２ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号９：Ｃ５ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１０：Ｃ９ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１１：Ｄ１２ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２：Ｅ９ ＆ Ｆ６ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３：Ｆ２ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４：Ｆ９ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５：Ｇ１２ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１６：Ｇ９ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７：Ｈ７ ＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８：Ａ４ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９：Ｂ１２ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２０：Ｃ１１ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２１：Ｃ１２ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２２：Ｃ５ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２３：Ｃ９ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２４：Ｄ１２ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２５：Ｅ９ ＆ Ｆ６ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２６：Ｆ２ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７：Ｆ９ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２８：Ｇ１２ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２９：Ｇ９ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３０：Ｈ７ ＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３１：Ａ４ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３２：Ｂ１２ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３３：Ｃ１１ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３４：Ｃ１２ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３５：Ｃ５ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３５：Ｃ９ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３７：Ｄ１２ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３８：Ｅ９ ＆ Ｆ６ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号３９：Ｆ２ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号４０：Ｆ９ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号４１：Ｇ１２ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号４２：Ｇ９ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号４３：Ｈ７ ＨＣ−ＣＤＲ３
配列番号４４：ＶＥＧＦ Ａ４  重鎖
配列番号４５：ＶＥＧＦ Ｂ１２  重鎖
配列番号４６：ＶＥＧＦ Ｃ１１  重鎖
配列番号４７：ＶＥＧＦ Ｃ１２  重鎖
配列番号４８：ＶＥＧＦ Ｃ５  重鎖
配列番号４９：ＶＥＧＦ Ｃ９  重鎖
配列番号５０：ＶＥＧＦ  Ｄ１２  重鎖
配列番号５１：ＶＥＧＦ Ｅ９ ＆ ＶＥＧＦ Ｆ６  重鎖
配列番号５２：ＶＥＧＦ Ｆ２  重鎖
配列番号５３：ＶＥＧＦ Ｆ９  重鎖
配列番号５４：ＶＥＧＦ Ｇ１２  重鎖
配列番号５５：ＶＥＧＦ Ｇ９  重鎖
配列番号５６：ＶＥＧＦ Ｈ７  重鎖
配列番号５７：Ａ４ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号５８：Ｂ１２ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号５９：Ｃ１１ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６０：Ｃ１２ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６１：Ｃ５ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６２：Ｃ９ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６３：Ｄ１２ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６４：Ｅ９ ＆ Ｆ６ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６５：Ｆ２ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６６：Ｆ９ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７：Ｇ１２， ２Ａ０９ ＆ ２Ｅ１１ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６８：Ｇ９ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６９：Ｈ７ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号７０：Ａ４ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７１：Ｂ１２ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７２：Ｃ１１ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７３：Ｃ１２ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７４：Ｃ５ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７５：Ｃ９ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７６：Ｄ１２ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７７：Ｅ９ ＆ Ｆ６ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７８：Ｆ２ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号７９：Ｆ９ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８０：Ｇ１２， ２Ｅ１１， ２Ｇ０４ ＆ ２Ｇ１２ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８１：Ｇ９ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８２：Ｈ７ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８３：Ａ４ ＆ Ｈ７ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号８４：Ｂ１２ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号８５：Ｃ１１ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号８６：Ｃ１２ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号８７：Ｃ５ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号８８：Ｃ９ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号８９：Ｄ１２ ＆ Ｆ２ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号９０：Ｅ９ ＆ Ｆ６ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号９１：Ｆ９ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号９２：Ｇ１２ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号９３：Ｇ９ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号９４：ＶＥＧＦ Ａ４  軽鎖
配列番号９５：ＶＥＧＦ Ｂ１２  軽鎖
配列番号９６：ＶＥＧＦ Ｃ１１  軽鎖
配列番号９７：ＶＥＧＦ Ｃ１２  軽鎖
配列番号９８：ＶＥＧＦ Ｃ５  軽鎖
配列番号９９：ＶＥＧＦ Ｃ９  軽鎖
配列番号１００：ＶＥＧＦ Ｄ１２  軽鎖
配列番号１０１：ＶＥＧＦ Ｅ９ ＆ ＶＥＧＦ Ｆ６  軽鎖
配列番号１０２：ＶＥＧＦ Ｆ２  軽鎖
配列番号１０３：ＶＥＧＦ Ｆ９  軽鎖
配列番号１０４：ＶＥＧＦ Ｇ１２  軽鎖
配列番号１０５：ＶＥＧＦ Ｇ９  軽鎖
配列番号１０６：ＶＥＧＦ Ｈ７  軽鎖
配列番号１０７：ＮＡＴＶＨ７−１
配列番号１０８：ＮＡＴＶＨ３−１
配列番号１０９：ＮＡＴＶＨ１−２
配列番号１１０：ＮＡＴＶＨ２−１
配列番号１１１：ＮＡＴＶＨ３−２
配列番号１１２：ＮＡＴＶＨ１−１
配列番号１１３：ＮＡＴＶＨ７−２
配列番号１１４：ＮＡＴＪＨ−ＡＬＬ
配列番号１１５：ＮＡＴＶＫ１−１
配列番号１１６：ＮＡＴＶＬ１０
配列番号１１７：ＮＡＴＶＬ２
配列番号１１８：ＮＡＴＶＬ９
配列番号１１９：ＮＡＴＪＫ−Ｒ７
配列番号１２０：ＮＡＴＪＫ−Ｒ１
配列番号１２１：ＮＡＴＪＫ−Ｒ２
配列番号１２２：ＮＡＴＪＬ１−Ｒ
配列番号１２３：ＮＡＴＪＫ−Ｒ５
配列番号１２４：ＮＡＴＪＬ２−Ｒ
配列番号１２５：ｐｅｌＢ５プライマー
配列番号１２６：ｃｌａ３プライマー
配列番号１２７：ＣＭＶ−ｐｒｏＦプライマー
配列番号１２８：ＮＡＴＶＨ７−３
配列番号１２９：ＮＡＴＪＫ−Ｒ３
配列番号１３０：２Ｂ０５ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３１：２Ｃ１１ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３２：２Ｄ１０ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３３：２Ｆ０１ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３４：２Ｇ０３ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３５：２Ｇ０４ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３５：２Ｇ１２ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３７：２Ｈ０７ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３８：２Ｈ０８ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３９：２Ｈ０９ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４０：２Ｃ０５ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４１：２Ｆ０９ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４２：１Ｆ１０ ＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４３：２Ａ０９ ＆ ２Ｈ０７ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４４：２Ｂ０５ ＆ ２Ｇ０３ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４５：２Ｃ１１ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４６：２Ｄ１０ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４７：２Ｆ０１ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４８：２Ｈ０８ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４９：２Ｈ０９ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５０：２Ｃ０５ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５１：２Ｆ０９ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５２：１Ｆ１０ ＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３：２Ａ０９ ＆ ２Ｄ１０ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１５４：２Ｂ０５ ＆ ２Ｇ１２ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１５５：２Ｃ１１ ＆ ２Ｇ０３ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１５６：２Ｅ１１ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１５７：２Ｆ０１ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１５８：２Ｇ０４ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１５９：２Ｈ０７ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１６０：２Ｈ０８ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１６１：２Ｈ０９ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１６２：２Ｃ０５ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１６３：２Ｆ０９ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１６４：１Ｆ１０ ＬＣ−ＣＤＲ３
配列番号１６５：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ａ０９  軽鎖
配列番号１６６：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｂ０５  軽鎖
配列番号１６７：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｃ１１ ＆ ２Ｇ０３  軽鎖
配列番号１６８：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｄ１０  軽鎖
配列番号１６９：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｅ１１  軽鎖
配列番号１７０：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｆ０１  軽鎖
配列番号１７１：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｇ０４  軽鎖
配列番号１７２：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｇ１２  軽鎖
配列番号１７３：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｈ０７  軽鎖
配列番号１７４：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｈ０８  軽鎖
配列番号１７５：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｈ０９  軽鎖
配列番号１７６：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｃ０５  軽鎖
配列番号１７７：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  ２Ｆ０９  軽鎖
配列番号１７８：ＶＥＧＦ ＬＣ シャッフリング  １Ｆ１０  軽鎖
配列番号１７９：ＮＡＴＶＨ２−３
配列番号１８０：ＮＡＴＶＬ１３
配列番号１８１：ＮＡＴＶＫ３
配列番号１８２：ＮＡＴＶＬ１３
配列番号１８３：ＮＡＴＶＫ１−１
配列番号１８４：ＮＡＴＶＬ１２
配列番号１８５：ＮＡＴＶＬ１３
配列番号１８６：ＮＡＴＪＬ１−Ｒ
配列番号１８７：ＮＡＴＪＫ−Ｒ２
配列番号１８８：ＮＡＴＪＬ１−Ｒ
配列番号１８９：ＮＡＴＪＬ１−Ｒ
配列番号１９０：ＮＡＴＪＫ−Ｒ２
配列番号１９１：ＮＡＴＪＬ５−Ｒ
【図１】
2010131009.tif 000024
【図２】
2010131009.tif 000025
【図３】
2010131009.tif 000026
【図４】
2010131009.tif 000027
【図５】
2010131009.tif 000028
【図６】
2010131009.tif 000029
【図７ａ】
2010131009.tif 000030
【図７ｂ】
2010131009.tif 000031
【図７ｃ】
2010131009.tif 000032
【図８ａ】
2010131009.tif 000033
【図８ｂ】
2010131009.tif 000034
【図８ｃ】
2010131009.tif 000035
【図９ａ】
2010131009.tif 000036
【図９ｂ】
2010131009.tif 000037
【図１０】
2010131009.tif 000038
【図１１】
2010131009.tif 000039
【図１２ａ】
2010131009.tif 000040
【図１２ｂ】
2010131009.tif 000041
【図１３ａ】
2010131009.tif 000042
【図１３ｂ】
2010131009.tif 000043
【図１３ｃ】
2010131009.tif 000044
【図１４】
2010131009.tif 000045
【図１５】
2010131009.tif 000046
【図１６】
2010131009.tif 000047
【配列表】
2010131009000001.app