(57)【要約】【課題】            優れた、アルギナーゼ活性促進作用、免疫賦活作用、抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、及び痩身作用などを有する、アルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤を提供する。【解決手段】        キオン属植物の抽出物を含有するアルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キオン属植物抽出物を有効成分とするアルギナーゼ活性促進剤。
【請求項２】
キオン属植物抽出物を有効成分とする免疫賦活剤。
【請求項３】
キオン属植物抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項４】
キオン属植物抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項５】
キオン属植物抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項６】
キオン属植物抽出物を有効成分とする痩身剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高いアルギナーゼ活性促進果、免疫賦活効果、抗老化効果、美白効果、抗酸化効果、及び痩身効果を発揮するアルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴う皮膚の弾性低下やシミ及び肥満といった老化症状の要因として、細胞機能低下、コラーゲン等の細胞マトリックス成分の減少や変性、紫外線によるメラニン産生や色素沈着及び細胞の酸化傷害、脂肪の蓄積等が挙げられる。このような老化症状を防止・改善するために、従来様々な有効成分の検索及び配合検討がなされてきた。
アルギナーゼ活性促進剤としてはアンズ果汁（特許文献１）、細胞賦活剤としてはヒトリシズカ抽出物（特許文献２）、抗老化剤としては金時草抽出物（特許文献３）、美白剤としてはクルミの種皮抽出物（特許文献４）、抗酸化剤としてはコウヤマキ抽出物（特許文献５）、痩身剤としてはグリコーゲン（特許文献６）等が知られている。
なお、キオン属植物抽出物を有効成分とするアルギナーゼ活性促進剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤に関する先行技術は認められない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１４３６０８号公報
【特許文献２】特開２００８−０８８０７４号公報
【特許文献３】特開２００８−１７４４５９号公報
【特許文献４】開２００８−０８１４０８号公報
【特許文献５】特開２００８−０７４７４８号公報
【特許文献６】特開２００８−００１６７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来用いられているアルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤は、本質的な効果としては不十分な場合もあり、より優れた有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、天然由来で安全性が高く、効果のより優れたアルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、種々の天然物について検討を行った結果、キオン属植物の抽出物に優れた、アルギナーゼ活性促進作用、免疫賦活作用、抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、及び痩身作用を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、キオン属植物の抽出物を含有するアルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、優れた効果を有するアルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の原料として用いられる植物であるキク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）キオン属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）植物としては、ハンゴンソウ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃａｎｎａｂｉｆｏｌｉｕｓ  Ｌｅｓｓ．）、エゾオグルマ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｐｓｅｕｄｏａｒｎｉｃａ  Ｌｅｓｓ．）、キオン（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｎｅｍｏｒｅｎｓｉｓ  Ｌ．）、オカオグルマ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｓ  （Ｌ．）  Ｃｌａｉｒｖ．  ｓｕｂｓｐ．  ｆａｕｒｉｅｉ    （Ｌｅｖ．  ｅｔ  Ｖａｎｔ．）Ｋｉｔａｍ．  ;  Ｓｅｎｅｃｉｏ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｕｓ  ｖａｒ.  ｓｐａｔｈｕｌａｔｕｓ（Ｍｉｑ．）Ｈａｒａ  ;  Ｓｅｎｅｃｉｏ ｆａｕｒｉｅｉ  Ｌｅｖ．  ｅｔ  Ｖａｎｔ  ；  Ｓｅｎｅｃｉｏ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ｖａｒ．  ｓｐａｔｈｕｌａｔｕｓ  Ｍｉｑ．）、サワギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｎｉｋｏｅｎｓｉｓ  Ｍｉｑ．）、サワオグルマ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｐｉｅｒｏｔｉｉ  Ｍｉｑ．）、ノボロギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）、キバナコウリンカ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｆｕｒｕｓｅｉ  Ｋｉｔａｍ．）、ギンゲツ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｈａｗｏｒｔｈｉｉ  Ｓｃｈ．−Ｂｉｐ．）、コウリンカ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｆｌａｍｍｅｕｓ  Ｔｕｒｃｚ．  ｅｘ  ＤＣ．  ｓｕｂｓｐ．  ｇｌａｂｒｉｆｏｌｉｕｓ  （Ｃｕｆｏｄ．）  Ｋｉｔａｍ．）、コウリンギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ａｒｇｕｎｅｎｓｉｓ  Ｔｕｒｃｚ．）、シキンショウ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｒａｓｓｉｓｓｉｍｕｍ  Ｈｕｍｂ．）、シネラリア（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｒｕｅｎｔｕｓ  ＤＣ．）、シロタエギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｉｎｅｒａｒｉａ  ＤＣ．）、セネキオ・アンタンドロイ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ａｎｔａｎｄｏｒｏｉ  Ｓｃｏｔｔ−Ｅｌｌｉｏｔ）、セネキオ・エレガンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｓｏｎｄ．  ｅｘ  Ｈａｒｖ．）、セネキオ・オルビクラリス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｓｏｎｄ．  ｅｘ  Ｈａｒｖ．）、セネキオ・プラエコクス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｐｒａｅｃｏｘ  （Ｃａｖ．）  ＤＣ．）セネキオ・マクログロッスス・ウァリエガータ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｍａｃｒｏｇｌｏｓｓｕｓ  ＤＣ．  ｖａｒ．  ｖａｒｉｅｇａｔａ  Ｈｏｒｔ）、セネキオ・ラディカンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｒａｄｉｃａｎｓ  Ｓｃｈ．−Ｂｉｐ．）、セネキオ・ロンギフロルス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｓ  Ｓｃｈ．−Ｂｉｐ．）、タイキンギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｓｃａｎｄｅｎｓ  Ｂｕｃｈ．−Ｈａｍｉｌ．  ｅｘ  Ｄ．  Ｄｏｎ）、タカネコウリンカ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｔａｋｅｄａｎｕｓ  Ｋｉｔａｍ．）、タカネコウリンギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｆｌａｍｍｅｕｓ  Ｔｕｒｃｚ．  ｅｘ  ＤＣ．  ｓｕｂｓｐ．  Ｆｌａｍｍｅｕｓ）、テツシャクジョウ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｓｔａｐｅｌｉａｅｆｏｒｍｉｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、マンポウ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｒｅｐｅｎｓ  Ｊａｃｏｂｓ）、ミドリノスズ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｒｏｗｌｅｙａｎｕｓ  Ｊａｃｏｂｓ）、ミヤマオグルマ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｋａｗａｋａｍｉｉ  Ｍａｋｉｎｏ）、ヤコブボロギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｊａｃｏｂａｅａ  Ｌ．）、セネキオ・アウレウス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ａｕｒｅｕｓ  Ｌ．）、菊葉千里光（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｏｉｄ���ｓ  ＤＣ．）、ムラサキオグルマ（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｅｌｅｇａｎｓ  Ｌ．）、サワギク（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｎｉｋｏｎｅｎｓｉｓ  Ｍｉｑ．）、ｓｅｎｅｋｉｏ・オレラセア（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｃｒｅｖ．  ｅｔ  Ｌｅｍ．）、大白頂草（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｏｒｇｙｅｔｏｒｕｍ  Ｄｉｅｌｓ）、セネキア・プラティフィルス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌｕｓ  ＤＣ．）等が例示される。本発明においては、これらキオン属植物から１種又は２種以上を選択して用いるが、本発明の効果の点から、ハンゴンソウ、エゾオグルマから選択される１種又は２種を用いることが好ましい。
【０００８】
本発明におけるキオン属植物の抽出物には、キオン属植物の原体や乾燥物も抽出物に含まれるが、各種溶媒を用いて抽出した抽出物を用いることが好ましい。抽出には、キオン属植物の葉、花、種子、根、茎、芽などのいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、全草を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【０００９】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。
【００１０】
キオン属植物の抽出として特に好ましいのは、常温常圧下における低級アルコール水溶液（たとえば、メタノール水溶液又はエタノール水溶液、特には、エタノール水溶液）による抽出、高温（例えば５０〜２００℃、好ましくは、５０〜１５０℃、特には１２０℃）高圧化における水による抽出である。このような抽出を行うことで、アルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、又は痩身剤としての機能に優れた抽出物を効果的且つ確実に得ることができる。
【００１１】
キオン属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもでき、これらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理やカラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。キオン属植物の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶解して用いることもできる。
【００１２】
キオン属植物抽出物は、アルギナーゼ、特に表皮角化細胞に存在するアルギナーゼの活性を促進する作用を発揮し、アルギナーゼ活性促進剤として有用である。
【００１３】
キオン属植物抽出物は、免疫細胞賦活作用を有し、免疫賦活剤として有用である。
【００１４】
キオン属植物抽出物は、真皮線維芽細胞賦活作用、表皮角化細胞賦活作用、真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用を発揮し、抗老化剤として有用である。
【００１５】
キオン属植物抽出物は、メラニン産生抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用を発揮し、美白剤として有用である。
【００１６】
キオン属植物抽出物は、ＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用、ヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性作用を発揮し、抗酸化剤として有用である。
【００１７】
キオン属植物抽出物は、中性脂肪蓄積抑制作用を発揮し、痩身剤として有用である。
【００１８】
以下に、キオン属植物抽出物の製造例、各作用を評価するための試験について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
［ハンゴンソウ抽出物１］
ハンゴンソウの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、エタノール抽出物を得た。
【００２０】
［ハンゴンソウ抽出物２］
ハンゴンソウの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、熱水抽出物を得た。
【００２１】
［エゾオグルマ抽出物１］
エゾオグルマの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、エタノール抽出物を得た。
【００２２】
［エゾオグルマ抽出物２］
エゾオグルマの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、熱水抽出物を得た。
【００２３】
［エゾオグルマ抽出物３］
超臨界抽出装置に乾燥、粉砕したさせたエゾオグルマの全草を投入し、４０℃において１５ＭＰａの気圧下で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、超臨界抽出物を得た。
【００２４】
ハンゴウソウ抽出物１，２、エゾオグルマ抽出物１〜３を用いて、アルギナーゼ活性促進作用、免疫賦活作用、抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、又は痩身作用の評価を行った。なお各評価結果に記載した*及び**は、ｔ−検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**でそれぞれ表したものである。
【００２５】
［表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用］
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ細胞）を１ウェル当たり２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５質量％添加したものを用いた。２４時間後１．２ｍＭＣａＣｌ2を含む５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地によって、各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２若しくはエゾオグルマ抽出物２を含有するサンプル液に交換しさらに９日間培養した。培地は３日に１回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収（５７０ｎｍ）を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素Ｂ−テストワコーを用いて測定を行い、検量線を作成した。また、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を１００とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表１、２に示した通りであり、ハンゴウソウ抽出物２、エゾオグルマ抽出物２には、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。
【００２６】
【表１】
2010070456.tif 000002
【００２７】
【表２】
2010070456.tif 000003
【００２８】
［免疫細胞賦活作用（ヒト急性単球白血病細胞株を用いた細胞賦活作用）］
ヒト急性単球白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を１ウェル当り５．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量％のＦＢＳを添加したＲｐｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）を用いた。24時間後、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を２０ｎｇ／ｍＬとなるように細胞培養液に添加した。さらに２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地にて各濃度に調整したハンゴウソウ抽出物２若しくはエゾオグルマ抽出物２を含有するサンプル培養液に交換し、４８時間培養した。次に生細胞数測定試薬ＳＦ（同仁化学研究所）１／１０量を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を、上清を除いた細胞に添加し、２時間培養した。混合後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。抽出物無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて細胞賦活作用を算出した。その結果表３、４に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高い免疫賦活作用が認められた。
【００２９】
【表３】
2010070456.tif 000004
【００３０】
【表４】
2010070456.tif 000005
【００３１】
［ヒト真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表５に示す濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２若しくはエゾオグルマ抽出物１を含有する培養液に交換し、さらに４８時間培養した。次に４００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。線維芽細胞賦活作用は、抽出物無添加のブランクにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて評価を行った。その結果表５、６に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００３２】
【表５】
2010070456.tif 000006
【００３３】
【表６】
2010070456.tif 000007
【００３４】
［表皮角化細胞賦活作用］
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２を含有する培養液に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍｌとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果をハンゴンソウ抽出物２無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて評価を行った。その結果表７に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物には、高いヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。
【００３５】
【表７】
2010070456.tif 000008
【００３６】
［真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２若しくはエゾオグルマ抽出物２を含有する培養液に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲンの定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。評価結果を抽出物２無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を１００とした時の相対値にて評価を行った。その結果、表８、９に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高い真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用が認められた。
【００３７】
【表８】
2010070456.tif 000009
【００３８】
【表９】
2010070456.tif 000010
【００３９】
［ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、０．５重量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２又はエゾオグルマ抽出物３を含有する培養液に交換し、さらに３日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。抽出物無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にてヒアルロン酸産生促進作用の評価を行った。その結果表１０、１１に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００４０】
【表１０】
2010070456.tif 000011
【００４１】
【表１１】
2010070456.tif 000012
【００４２】
［ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用］
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り４．０×１０４個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１重量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭによって各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２又はエゾオグルマ抽出物２を含有する培養液に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素の溶出を防ぐため、ＡＴＰ分解酵素阻害剤（Ｃｅｌｌｓｔｅｉｎ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。ＡＴＰの定量にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製  ＡＴＰ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。抽出物無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生能を１００とした相対値にてヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用の評価を行った。その結果、表１２、１３に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用が認められた。
【００４３】
【表１２】
2010070456.tif 000013
【００４４】
【表１３】
2010070456.tif 000014
【００４５】
上述のごとくキオン属植物抽出物は、真皮線維芽細胞賦活作用、表皮角化細胞賦活作用、真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用を発揮し、抗老化剤として有用である。
【００４６】
［Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用］
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物１若しくはエゾオグルマ抽出物１を含有する培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５  ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記評価基準を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５％重量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０  ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５％重量ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定５及び判定１とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、５段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。その結果、表１４、１５に示したとおりハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）
【００４７】
【表１４】
2010070456.tif 000015
【００４８】
【表１５】
2010070456.tif 000016
【００４９】
［ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用］
正常ヒト表皮メラニン細胞を１ウェル当り３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＭｅｄｉｕｍ  ２５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４Ｓによって各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２若しくはエゾオグルマ抽出物３を含有する培養液に交換し、さらに４８時間培養した。次に１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するリン酸緩衝液７５μＬに交換し、細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる５０μＬの０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、３７℃で２時間静置した。基質添加直後と反応終了時の４０５  ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量
＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）−２．１６６｝／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果は抽出物無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較した。表１６、１７に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
【００５０】
【表１６】
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【００５１】
【表１７】
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【００５２】
上述したとおり、キオン属植物抽出物は、メラニン産生抑制作用、チロシナーゼ活性阻害作用を発揮し、美白剤として有用である。
【００５３】
［ＤＰＰＨラジカル消去作用］
５０重量％エタノールによって各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物１若しくはエゾオグルマ抽出物２を含有する溶液１００μＬに、０．２ｍＭ  １，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液１００μＬを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて１０分間静置し、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時の、ＤＰＰＨラジカル消去率を次式により算出した。その結果、表１８、１９に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。
消去率（％）＝｛１  −（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
【００５４】
【表１８】
2010070456.tif 000019
【００５５】
【表１９】
2010070456.tif 000020
【００５６】
[ＳＯＤ様活性の評価（スーパーオキサイドアニオン消去作用）]
０．２５ｍＭ  ＷＳＴ−１及び  １ｍＭ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液  ７５μＬに、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液にて表９に示した濃度に調整したハンゴンソウ抽出物１若しくはエゾオグルマ抽出物２を含有する溶液２５μＬを添加した。さらに、Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ２５μＬ（０．００７５  Ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃にて１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率を次式により算出した。その結果、表２０、２１に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。
消去率（％）＝｛１  −（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
【００５７】
【表２０】
2010070456.tif 000021
【００５８】
【表２１】
2010070456.tif 000022
【００５９】
［ヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性の評価］
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１０質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２若しくはエゾオグルマそう抽出物２を含有する培養液に交換し、さらに２４時間培養した。任意濃度のｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加したＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液に交換し、２時間培養した。さらに、１５０μｇ／ｍＬニュートラルレッドを含有するＰＢＳ（−）に交換し、３７℃にて２時間培養した。次に１容量％酢酸を含む５０容量％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取りこまれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ無添加のコントロールにおける細胞生存率を１００としたときの相対値にて評価した。その結果、表２２、２３に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性作用が認められた。
【００６０】
【表２２】
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【００６１】
【表２３】
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【００６２】
上述したとおり、キオン属植物抽出物は、ＤＰＰＨラジカル消去作用、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用、ヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性作用を発揮し、抗酸化剤として有用である。
【００６３】
［ヒト前駆脂肪細胞中性脂肪蓄積抑制作用］
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ  ＨＰＲＡＤ−ＳＱを１ウェル当り５．０×１０３個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％  ＦＢＳ，  ２  ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，  １００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，  １００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。４８時間培養後、各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物２を添加したＰＧＭ分化用培地（１０  μｇ／ｍＬインシュリン，  １  μＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，  ２００μＭ  Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，  ５００μＭ  Ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０容量％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、０．５ｗ／ｖ％オイルレッド溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄後、メタノールを添加し、色素を抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用を評価した。結果は抽出物無添加のコントロールにおける中性脂肪蓄積量を１００とした時の相対値にて評価した。その結果、表２４に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物は、高い中性脂肪蓄積抑制作用を示した。
【００６４】
【表２４】
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