(57)【要約】【課題】アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートなどの1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する環状ジエン系化合物で汚染された土壌や水を浄化すること。【解決手段】ディルドリンなどの環状ジエン系化合物を９０％以上分解することができる新規なＭ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＤＤＦ株などのムコール属ラセモサス種に属する糸状菌およびこの分解菌を含む環状ジエン系化合物分解剤を得た。これらの分解菌や分解剤を用いて、環状ジエン系化合物で汚染された土壌や水を浄化する技術を提供する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ジエン系化合物の分解能を有するムコール属ラセモサス種の糸状菌を含んでなる環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項２】
環状ジエン系化合物が、1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する化合物である請求項１記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項３】
環状ジエン系化合物が、アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選択される少なくとも一の化合物である請求項１または請求項２に記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項４】
環状ジエン系化合物に対して脱塩素分解を行う請求項１〜請求項３何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項５】
環状ジエン系化合物の５０％以上を分解可能な請求項１〜請求項４何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項６】
ＤＤＴ及びＤＤＥの分解能を有する請求項１〜請求項５何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項７】
ムコール属ラセモサス種の糸状菌が、ムコールラセモサス  ＤＤＦ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７７５）、ＩＦＯ６７４５株、およびＮＢＲＣ４５８１株からなる群から選択される少なくとも一の菌株である請求項１〜請求項６何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項８】
前記ムコール属ラセモサス種の糸状菌の餌となるふすまや米ぬか等の基質に生育させたこの糸状菌をこの基質ごと含んでなる請求項１〜請求項７何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項９】
前記基質にさらに木質炭化素材等の多孔質材を混合してなる請求項８記載の環状ジエン系化合物分解剤。
【請求項１０】
アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選択される少なくとも一の化合物に例示される1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する環状ジエン系化合物の分解能を有するムコール属ラセモサス種の糸状菌である環状ジエン系化合物分解菌。
【請求項１１】
ＤＤＴ及びＤＤＥの分解能を有する請求項１０記載の環状ジエン系化合物分解菌。
【請求項１２】
ムコール属ラセモサス種の糸状菌が、そのＩＴＳ領域において、配列番号１で示す塩基配列を有する請求項１０または請求項１１記載の環状ジエン系化合物分解菌。
【請求項１３】
ムコール属ラセモサス種の糸状菌が、ムコールラセモサス  ＤＤＦ株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７７５）である請求項１０〜請求項１２何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解菌。
【請求項１４】
請求項１〜請求項９何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤または請求項１０〜請求項１３何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解菌を含有してなる汚染環境の浄化装置。
【請求項１５】
請求項１〜請求項９何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤、請求項１０〜請求項１３何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解菌、または請求項１４記載の汚染環境の浄化装置を用いてアルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選択される少なくとも一の化合物に例示される1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する環状ジエン系化合物を分解する環状ジエン系化合物の分解方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項９何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解剤または請求項１０〜請求項１３何れか１項記載の環状ジエン系化合物分解菌をアルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選択される少なくとも一の化合物に例示される1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する環状ジエン系化合物またはＤＤＴ若しくはＤＤＥで汚染された土壌やウリ科植物に接種する汚染物質の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ジエン系農薬、特にアルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシドなどから選ばれる少なくとも１種の化合物を分解する能力を有する糸状菌に分類される分解菌、より詳細にはムコール属ラセモサス種に属する分解菌に関する。そしてまた、この分解菌を用いた環状ジエン系化合物分解剤、汚染環境の浄化装置と、環状ジエン系化合物の分解方法および汚染土壌の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年に採択されたＰＯＰｓ条約により１９７０年代半ばに製造・使用が禁止された有機塩素系農薬６種類（ＤＤＴ、アルドリン（図１参照）、ディルドリン（図２参照）、エンドリン、ヘプタクロル（図３参照）、ヘキサクロロベンゼン）を含む１２物質がＰＯＰｓに指定され、各国は国際的枠組みの中でこれらの農薬に対する適正な管理・処理を進めることになった。
日本では、製造・使用禁止後、農薬メーカーや農協などにより容器ごとこれらの農薬が埋設処理されており、その後、埋設農薬を掘削・回収し、物理化学的な方法（高温焼却法、超臨界水酸化法、真空加熱法）で分解・無毒化されている。しかし長期埋設により容器が破損し、周辺土壌や地下水を低濃度で汚染している可能性が指摘されている。一方、東京都や山形県ではキュウリから残留基準を超えるディルドリンが検出されており、これらは３０年程前に施用されたドリン剤が農地土壌にサブｐｐｍレベルの低濃度で残留しているためと考えられる。
【０００３】
このような低濃度の有機化学物質で広範囲に汚染された土壌や地下水に対する浄化法に関しては、微生物等の生物機能（特に分解能）を利用する原位置バイオレメディエーションに期待が寄せられている。こうしたバイオレメディエーションには、栄養素や酸素等を汚染現場に供給し土着の分解菌を増殖・活性化させて浄化を行うバイオスティミュレーション法や、外来から特定の機能を有する微生物を導入するバイオオーギュメンテーション法が知られている。
【０００４】
ところがＰＯＰｓ指定された環状ジエン系農薬で汚染された土壌に対するバイオレメディエーション技術は停滞している。停滞の原因はこうした化合物に対する高い分解能を持つ微生物の単離が困難なことが考えられる。実際、アルドリンは微生物により比較的容易に酸化（エポキシ化）されディルドリンになるが、ディルドリンの土壌中の半減期は７年以上と安定で、土壌中にはディルドリンを分解できる微生物は殆ど存在しないと考えられる。
【０００５】
ディルドリン分解に関する研究もいくつか報告されてはいるものの、その分解の程度は限られたものである。例えば、ＭａｔｓｕｍｕｒａとＢｏｕｓｈは、糸状菌のトリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が（非特許文献１，２）、また、Ａｎｄｅｒｓｏｎは、ムコール  アルテルナンス（Ｍｕｃｏｒ  ａｌｔｅｒｎａｎｓ）が（非特許文献３）ディルドリンを分解することを報告したが、そこでは２０％ほどの分解しか示されていない。また、Ｗｅｄｅｒｍｅｙｅｒは、アエロバクター  アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）がディルドリンをアルドリンジオールに変換することを報告しているが、脱塩素までは示されていない（非特許文献４）。さらに、最近ではＭａｔｓｕｍｏｔｏらによってバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌やカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属菌がディルドリンを分解することを報告したが、その分解の程度は５０％ほどであり（非特許文献５）、ディルドリンの脱塩素分解の報告もない。Ｃｈａｃｋｏらは、ムコール  ラマニアヌス（Ｍｕｃｏｒ  ｒａｍａｎｎｉａｎｕｓ）を用いてディルドリンの分解を検討したが、分解は認められなかった（非特許文献６）。
【０００６】
ディルドリンなどの環状ジエン系化合物は、脱塩素しなければ分解したといえども毒性は残存する場合があるため、無毒化するためには、脱塩素分解することが望まれる。しかしながら、報告されている環状ジエン系化合物分解菌に関しては、分子の左半分（炭化水素環部分）がエポキシ化されて代謝が止まる菌が殆どである。共通骨格の塩素置換基部分のＣをラベルした化合物を用いて分解試験を行ったところ、無機化率が殆どの分解菌で５％以下であることから、塩素置換基をアタックし、脱塩素分解できる分解菌は殆ど存在しないと考えられるのである。すなわち、現時点で環状ジエン系化合物で汚染された土壌に対するバイオスティミュレーション法やバイオオーギュメンテーション法を含めたバイオレメディエーション技術に使える分解菌は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Matsumura & Boush (1967), Science Vol. 156, 959-961頁
【非特許文献２】Matsumura & Boush (1968), JEE Vol. 61, 610-612頁
【非特許文献３】Anderson JPE, Lichtenstein EP, Whittingham WF (1970), JEE Vol. 63, 1595-1599頁
【非特許文献４】Wedemeyer G (1967), AEM Vol. 16, 661-662頁
【非特許文献５】Matsumoto E, Kawanaka Y, Yun S-J, Oyaizu H (2008), AMB, 1095-1103頁
【非特許文献６】Chacko CI, Lockwood JL, Zabik M (1966) Science Vol. 154, 893-895頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド（図４参照）などの環状ジエン系農薬に含まれる化合物を分解することができる分解菌と、この分解菌を用いてこれらの化合物を分解する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち本発明は、上記目的を達成すべく環状ジエン系化合物の分解能を有するムコール属ラセモサス種の糸状菌を含んでなる環状ジエン系化合物分解剤を提供する。
環状ジエン系化合物には、1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造（図５参照）を有する化合物を含み、より具体的には、アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選択される少なくとも一の化合物が挙げられる。
そして、こうした環状ジエン系化合物は脱塩素分解されることが好ましい。脱塩素分解することで環状ジエン系化合物の毒性を弱めることができる。
また、環状ジエン系化合物はその５０％以上を分解することが好ましく、６０％以上分解、８０％以上分解、９０％以上分解と、その数字が大きくなるほどより好ましい。５０％以上分解することができればその毒性を弱めることができ、６０％以上分解できればより効果的であり、８０％以上分解できればその物質の残留をほとんど無くすことができる。
さらに、この環状ジエン系化合物分解剤は、ＤＤＴ（ジクロロジフェニルトリクロロエタン）やＤＤＥ（ジクロロジフェニルジクロロエチレン）の分解能を有するものであることが好ましい。ＤＤＴはＰＯＰｓ指定された農薬であり、また、ＤＤＥはＤＤＴが土壌中などで分解されて生じる主な代謝物であり農耕地等に長期間残留する。環状ジエン系化合物分解剤がＤＤＴやＤＤＥ分解能をも有すれば、より効率的に汚染土壌や汚染水などの環境浄化を行うことができる。
【００１０】
環状ジエン系化合物分解剤は、ムコール属ラセモサス種の糸状菌を含んでなる。さらに具体的には、ＩＴＳ（Internal transcribed spacer）領域に配列番号１で示す塩基配列を有するムコール属ラセモサス種の糸状菌を含んでなるものとすることができる。そしてまた、ムコールラセモサス  ＤＤＦ（Ｍ．rａｃｅｍｏｓｕｓ ＤＤＦ）株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７７５）、ＩＦＯ６７４５株、およびＮＢＲＣ４５８１株からなる群から選択される少なくとも一の菌株を含んでなるものとすることができる。
環状ジエン系化合物分解菌が、ムコール属ラセモサス種の糸状菌であり、より詳細な一例は、ＩＴＳ領域に配列番号１で示す塩基配列を有するムコール属ラセモサス種の糸状菌であり、また、ムコールラセモサス ＤＤＦ株、ＩＦＯ６７４５株、およびＮＢＲＣ４５８１株からなる群から選択される少なくとも一の菌株であるので、ディルドリンやヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシドを９０％以上を分解することができ、環状ジエン系化合物を少なくとも５０％以上分解できる。また、ディルドリンを脱塩素分解することができる。
【００１１】
環状ジエン系化合物分解剤は、上記の環状ジエン系化合物分解菌を、その餌となるふすまや米ぬか等の基質に生育させ、その基質ごと含んでなるものとすることができる。環状ジエン系化合物分解菌は、環状ジエン系化合物分解菌を生育させた基質ごと含むため、高密度で、長期間、環状ジエン系化合物分解菌を生育させておくことができる。
また、こうした基質にさらに木質炭化素材等の多孔質材を混合してなる環状ジエン系化合物分解剤とすることができる。さらに多孔質材を混合しているため、より環状ジエン系化合物分解菌の保持に優れ、安定的に環状ジエン系化合物の分解を行うことができる。この環状ジエン系化合物分解剤は、バイオレメディエーション技術に利用でき、環状ジエン系化合物で汚染された土壌や水を浄化することができる。
【００１２】
本発明はまた、上記環状ジエン系化合物分解剤または環状ジエン系化合物分解菌を含有してなる汚染環境の浄化装置を提供する。
上記環状ジエン系化合物分解剤または環状ジエン系化合物分解菌を含有してなる汚染環境の浄化装置によれば、環状ジエン系化合物で汚染された土壌や水を浄化することができる。
【００１３】
さらに本発明は、環状ジエン系化合物分解剤、環状ジエン系化合物分解菌、そしてそれらを含有してなる汚染環境の浄化装置を用いてアルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選択される少なくとも一の化合物に例示される1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する環状ジエン系化合物を分解する環状ジエン系化合物の分解方法を提供する。
環状ジエン系化合物分解剤、環状ジエン系化合物分解菌、そしてそれらを含有してなる汚染環境の浄化装置を環状ジエン系化合物と接触させて、その環状ジエン系化合物を分解し、土壌や地下水など環状ジエン系化合物に汚染された環境を浄化することができる。
【００１４】
加えて環状ジエン系化合物分解菌や環状ジエン系化合物分解剤を環状ジエン系化合物で汚染された土壌に接種する汚染物質の浄化方法を提供する。環状ジエン系化合物分解菌や環状ジエン系化合物分解剤を環状ジエン系化合物で汚染された土壌に接種することで汚染土壌を浄化することができる。
また、環状ジエン系化合物分解菌や環状ジエン系化合物分解剤を環状ジエン系化合物で汚染されたウリ科植物に接種する汚染物質の浄化方法を提供する。環状ジエン系化合物分解菌や環状ジエン系化合物分解剤を環状ジエン系化合物で汚染されたウリ科植物に接種し接触させることで、環状ジエン系化合物を分解しそのウリ科植物を原料とした肥料を製造することも可能となる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の環状ジエン系化合物分解菌および環状ジエン系化合物分解剤によれば、環状ジエン系農薬であるアルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートなどの1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する化合物を分解することができる。
【００１６】
さらに、本発明の環状ジエン系化合物の分解方法や汚染土壌の浄化方法によれば、汚染土壌や汚染水などの環境中に含まれる環状ジエン系化合物を分解してそれらの汚染環境を浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】アルドリンの化学式である。
【図２】ディルドリンの化学式である。
【図３】ヘプタクロルの化学式である。
【図４】ヘプタクロルエポキシドの化学式である。
【図５】1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を示す化学式である。
【図６】ムコールラセモサス ＤＤＦ株の塩基配列をもとにした分子系統樹を示す説明図である。
【図７】ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるディルドリン分解を示すグラフである。
【図８】ラセモサス種に属する３菌株によるディルドリン分解を示すグラフである。
【図９】ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるヘプタクロルエポキシド分解を示すグラフである。
【図１０】ムコールラセモサス ＤＤＦ株による種々の環状ジエン系化合物の分解を示すグラフである。
【図１１】ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるＤＤＴ分解を示すグラフである。
【図１２】ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるＤＤＥ分解を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の環状ジエン系化合物分解菌や環状ジエン系化合物分解剤、それらを用いた汚染環境の浄化装置や、環状ジエン系化合物の分解方法、汚染土壌などの環境の浄化方法について以下に詳細に説明する。
【００１９】
環状ジエン系化合物分解菌：
本発明者らは、エンドスルファン連用土壌から単離したムコール属の糸状菌が環状ジエン系農薬であるディルドリンの分解能を有することを見出した。ところで、エンドスルファンは、ＰＯＰｓに指定されてはいない。しかしながら、ＰＯＰｓに指定されたエンドリンにその性状や特徴などが類似しているため、エンドスルファン連用土壌には、エンドリンやディルドリン等の図５に示す1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する環状ジエン系化合物を分解できる分解菌が生息している可能性があると考えたことに基づく。所望の分解菌が生息する土壌としては、エンドスルファン連用土壌の他、環状ジエン系化合物を連用した土壌が考えられる。
【００２０】
エンドスルファン連用土壌から採取した菌体の培養は、これらの菌体が生育できる条件で、環状ジエン系化合物を含有する材料と接触させることにより行うことができる。これらの菌体が生育できる条件としては、例えば、後述するＰＤＡ培地やＭａｒｔｉｎ培地、改変ツァペック培地などが例示できるが、これらの培地以外でも例えばグルコースなどのエネルギー源が存在する培地が挙げられる。
環状ジエン系化合物を含有する材料には、環状ジエン系化合物を含有する農薬、環状ジエン系化合物を含有する土壌や地下水などが挙げられる。
環状ジエン系化合物分解菌の単離は、エンドスルファン連用土壌等を希釈した懸濁液をＭａｒｔｉｎ培地等に塗抹し、出現したコロニーの色と形態とを判別し、さらにそれぞれ分解試験に供して分解菌の特定を行う。
【００２１】
環状ジエン系化合物分解菌には遺伝子組み換え技術を利用して得た環状ジエン系化合物に対する分解能の増強された分解菌や新たに作出された分解菌を利用することもできるが、環状ジエン系化合物連用土壌から得られた分解菌が好ましい。環状ジエン系化合物連用土壌から得られた分解菌は土壌に生息する分解菌であり、遺伝子組み換え技術を利用して得た分解菌と比較して安全性に対する問題が少ないからである。
【００２２】
こうした分解菌は、環状ジエン系化合物に対する分解能を有するムコール属の糸状菌、より詳細にはムコール属ラセモサス種に属する分解菌である。このムコール属ラセモサス種に属する分解菌には、エンドスルファン連用土壌から単離したムコール属ラセモサス種に属する糸状菌が含まれる。ムコール属ラセモサス種に属する菌株には、発明者らがエンドスルファン連用土壌から単離した新規菌株であるムコールラセモサス  ＤＤＦ株や、菌株保存機関から取得したＩＦＯ６７４５株やＮＢＲＣ４５８１株が挙げられる。
【００２３】
ムコールラセモサス ＤＤＦ株はそのＩＴＳ領域の塩基配列が、BLAST検索でムコール属ラセモサス種（アクセションナンバー：FJ228217）と比較して１００％の相同性（４７１／４７１）を示した。
このムコールラセモサス  ＤＤＦ株のＩＴＳ領域中の塩基配列（５’−３’）を配列番号１として配列表に示す。ムコールラセモサス  ＤＤＦ株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７７５」として寄託されている。この菌株の塩基配列を用いた分子系統樹を図６に示す。
なお、ＩＦＯ６７４５株のＩＴＳ領域中の塩基配列（５’−３’）を配列番号２として配列表に示す。さらに、ＮＢＲＣ４５８１株のＩＴＳ領域中の塩基配列（５’−３’）を配列番号３として配列表に示す。
【００２４】
ムコールラセモサス ＤＤＦ株は、次の菌学的特徴を有している。
(1)形態的性状；  液体培地中および寒天培地上で分岐を有する基生菌糸に加え、気中菌糸が発達し、胞子嚢を多数形成する。胞子嚢胞子は円形で、その中に数十個の胞子の含有が認められる。 また、胞子のう柄先端には瓢箪型の柱軸が確認できる。
(2)培養性状；  各種栄養寒天培地において、３日間で９センチシャーレを菌糸が覆うほど生育は早い。可溶性色素の分泌は見られないが、気中菌糸に胞子嚢が形成されると、淡い黄色味を帯びてくる。また、１か月以上の長期培養にともない、接合胞子が多数形成され暗黒色を帯びてくるのが認められる。
【００２５】
また、ＩＦＯ６７４５株の菌学的特徴もムコールラセモサス ＤＤＦ株と同様であり、次のとおりである。
(1)形態的性状；  液体培地中および寒天培地上で分岐を有する基生菌糸に加え、気中菌糸が発達し、胞子嚢を多数形成する。胞子嚢胞子は円形で、その中に数十個の胞子の含有が認められる。また、胞子のう柄先端には瓢箪型の柱軸が確認できる。
(2)培養性状；  各種栄養寒天培地において、３日間で９センチシャーレを菌糸が覆うほど生育は早い。可溶性色素の分泌は見られないが、気中菌糸に胞子嚢が形成されると、淡い黄色味を帯びてくる。
【００２６】
さらに、ＮＢＲＣ４５８１株の菌学的特徴もムコールラセモサス ＤＤＦ株と同様であり、次のとおりである。
(1)形態的性状；  液体培地中および寒天培地上で分岐を有する基生菌糸に加え、気中菌糸が発達し、胞子嚢を多数形成する。胞子嚢胞子は円形で、その中に数十個の胞子の含有が認められる。また、胞子のう柄先端には瓢箪型の柱軸が確認できる。
(2)培養性状；  各種栄養寒天培地において、３日間で９センチシャーレを菌糸が覆うほど生育は早い。可溶性色素の分泌は見られないが、気中菌糸に胞子嚢が形成されると、淡い黄色味を帯びてくる。
【００２７】
分解する対象となる環状ジエン系化合物は、それらの中でも1,2,3,4,7,7-ヘキサクロロビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-エン構造を有する化合物が挙げられ、より具体的な化合物としては、アルドリン、ディルドリン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、エンドリン、エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートからなる群から選ばれる少なくとも一の化合物である。
【００２８】
環状ジエン系化合物の分解は、それら化合物の９０％以上を分解することが好ましく、脱塩素分解することがさらに好ましい。９０％以上分解すればほとんどその化合物を消失させることができるからであり、脱塩素分解すればその化合物に基づく毒性を弱めることができるからである。
【００２９】
環状ジエン系化合物分解剤：
環状ジエン系化合物分解菌は、一般的な土壌で生育できると考えられるが、環状ジエン系化合物を効果的に土壌中で分解するためには、こうした分解菌を高密度で長期間存在させるため、分解菌の餌となる基質とともに分解菌があることが好ましい。その基質としては、ふすまや米ぬか、ビールかす、コーヒーかす、油かすなどが好ましい。また、ピーナッツ殻やおが屑、かんな屑、木材チップ、バーク、やし殻、もみ殻なども基質としうると考えられる。こうした基質は分解菌を保持する担体としても機能する。
【００３０】
すなわち、環状ジエン系化合物分解剤は、環状ジエン系化合物分解菌を基質と分離して、分解菌だけで環状ジエン系化合物分解剤とする場合の他、基質とともに生育させた環状ジエン系化合物分解菌を基質ごと含めたものとすることができる。
基質を含む環状ジエン系化合物分解剤には、木質炭化素材のような多数の細孔、高い吸着係数を有する多孔質材を基質に混ぜ込むことでより効果的な環状ジエン系化合物分解剤を製造することができる。多孔質材は基質を兼ねるものであっても良い。
汚染土壌への適用は、基質と環状ジエン系化合物分解菌を別々に土壌に投入する方法よりも、基質とともに生育させた環状ジエン系化合物分解菌を基質とともに土壌に投入することで汚染土壌を浄化することが好ましい。
【００３１】
汚染環境の浄化装置：
環状ジエン系化合物分解剤を通気性のある筐体内に詰め込むなどして環状ジエン系化合物分解剤の集積層を形成すれば簡単にバイオリアクターとして、環状ジエン系化合物の分解除去装置とすることができる。
該装置に環状ジエン系化合物で汚染された土壌を混入し水を還流させることでその土壌を浄化することもできる。また、該装置に環状ジエン系化合物で汚染された水を還流させることで、この汚染水を浄化することができる。
あるいはまた、該装置を、生活排水路、水田地帯の農業排水路、ゴルフ場の排水路などの水路の一部に設けることにより、水中に溶解、分散した環状ジエン系化合物を分解除去し、汚染環境を浄化する汚染環境の浄化装置として利用することができる。
【００３２】
環状ジエン系化合物分解材を用いた汚染物質の浄化方法：
環状ジエン系化合物分解剤を用いて、環状ジエン系化合物によって汚染された物質を浄化するには次のような方法がある。
汚染土壌における環状ジエン系化合物の除去に関しては、環状ジエン系化合物分解剤を汚染土壌中に埋設して混和する。土壌中に埋設しておくことで、既に土壌中に含まれている環状ジエン系化合物は分解菌によって分解される。この方法によれば、土壌中の環状ジエン系化合物が地下水に混入することを避けることができ、地下水汚染の防止を図ることが可能となる。
この技術の応用として、環状ジエン系化合物の存在する表層及び下層土壌への混入、ゴルフ場のグリーン面の下層土壌への混入、産業破棄物処理場の下層土壌への混入、工場等における有機廃液置き場の下層土壌への混入などが挙げられ、こうした応用により環状ジエン系化合物を処理することができる。
【００３３】
また、環状ジエン系化合物分解剤を環状ジエン系化合物に汚染されたウリ科植物に対して接種することで、このウリ科植物中の環状ジエン系化合物を分解、無毒化することができる。無毒化されたウリ科植物は、肥料などとして利用することが可能になる。
ウリ科植物には、キュウリやスイカ、カボチャ、ヘチマ、メロン、などが挙げられる。
【実施例】
【００３４】
＜実験例１＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株の単離（１）；ディルドリン分解能を有する候補となる菌株の取得]
エンドスルファン連用土壌０．５ｇを４．５ｍＬの滅菌水で希釈し、１０２，１０３オーダーの土壌希釈液（土壌懸濁液）を作成した。こうして得られた土壌希釈液０．１ｍＬをＭａｒｔｉｎ培地に塗抹し、２５℃で培養した。出現した糸状菌のコロニーの色と形態とを目視で判別し、その一つ一つを、別に新しく作成したＰＤＡ培地に移植して２５℃で培養した。こうして、ディルドリン分解能を有する分解菌の候補となる３６菌株の糸状菌を単離した。
【００３５】
上述のＭａｒｔｉｎ培地の組成を次に示す。
Ｍａｒｔｉｎ培地（１Ｌあたり）
ペプトン：              ５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４：          １ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：  ０．５ｇ
グルコース：          １０ｇ
ローズベンガル：        ０．０３３ｇ
寒天：                ２０ｇ
クロラムフェニコール：  ０．２５ｇ
超純水：                残部
【００３６】
なお、移植先の培地を、Ｍａｒｔｉｎ培地に代えてＰＤＡ培地とした理由は、Ｍａｒｔｉｎ培地には菌糸の伸長抑制剤が含まれているのに対し、ＰＤＡ培地は伸長抑制剤が含まれていないからである。
ＰＤＡ培地の組成を次に示す。
ＰＤＡ培地（１Ｌあたり）
ポテト浸出液末：        ４．０ｇ
グルコース：          ２０．０ｇ
寒天：                １５．０ｇ
超純粋：                残部
【００３７】
＜実験例２＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株の単離（２）；ディルドリン分解菌ムコールラセモサス ＤＤＦ株の特定]
上記各ＰＤＡ培地から得られた３６菌株の中からディルドリン分解能を有する分解菌を特定した。
上記３６菌株をそれぞれ以下の改変ツァペック培地に接種し、暗所２５℃で１週間前培養した後、５ｍｇ／Ｌとなるようにディルドリンを添加し、さらに２週間培養した。培養終了後、アセトニトリル１５ｍＬを添加し、菌体ごとホモジナイズした。３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離後、上清をヘキサンに転溶し、ＧＣ／ＥＣＤにてディルドリン濃度を測定し、また、イオンクロマトグラフィーで培養ろ液中の塩素イオン濃度を測定した。その結果、上記３６菌株中、１菌株でディルドリンの分解が認められた。
この菌株の塩基配列（ＩＴＳ領域）は、ムコール属ラセモサス種の塩基配列と１００％の相同性を示した。ムコールラセモサス  ＤＤＦ株のＩＴＳ領域の塩基配列（５’−３’）を配列番号１として配列表に示す。この新規菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに「Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ ＤＤＦ」として受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７７５」で寄託されている。
【００３８】
なお、ＰＤＡ培地から改変ツァペック培地に代えて接種したのは、ＰＤＡ培地はジャガイモ浸出液と天然成分を基調とした培地であるため、成分やその濃度を変更できず分解試験には適さないからである。そのため、合成培地である改変ツァペック培地を用いて分解試験を行った。
改変ツァペック培地の組成は次のとおりである。
改変ツァペック培地（１Ｌあたり）
グルコース：            １０ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：    ０．５ｇ
ＮａＮＯ３：              ２ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ：           １ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：    ０．０１ｇ
Ｙｅａｓｔ：              ０．５ｇ
超純水：                  残部
【００３９】
＜実験例３：図７＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるディルドリンの分解試験]
上述の改変ツァペック培地１０ｍＬを１００ｍＬ容蓋付き三角フラスコに入れ、１２１℃で１０分間オートクレーブ処理を行った。一方、予めシャーレに培養したムコールラセモサス ＤＤＦ株を直径６ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、そのディスクを一つこの改変ツァペック培地に入れた。このとき、アセトンに溶かしたディルドリン溶液を５ｍｇ／Ｌとなるように添加した。そして、暗所２５℃で１０日間培養した。培養液は経日的にサンプリングし、ＧＣ／ＥＣＤでディルドリン濃度を求め、イオンクロマトで塩素イオン濃度をそれぞれ求めた。また、ディルドリン測定時にホモジナイズし遠心した菌体を吸引ろ過し、７０℃の乾燥機で乾燥させ、乾燥菌体重量を求めた。その結果を図７の折れ線グラフに示す。
【００４０】
図７のグラフの左側縦軸には培養液中の塩素イオン濃度とディルドリン濃度（μＭ）を、右側縦軸には乾燥菌体重量（ｇ）を、横軸は培養時間（日）をそれぞれ表す。
図７で示されるように、培養７日目にはディルドリンが５９％分解し、１０日間の培養でほぼ１００％のディルドリンがなくなり、塩素イオンが２５μＭ検出された。これにより、ディルドリン１分子から２塩素が脱離していることが示唆された。
【００４１】
＜実験例４；図８＞
[ラセモサス種に属するムコールラセモサス ＤＤＦ株以外の菌株のディルドリンの分解試験]
菌株保存機関（独立行政法人  製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より購入したムコール属ラセモサス種に属する次の２株：ＩＦＯ６７４５株およびＮＢＲＣ４５８１株を用いて、実験例３で示したムコールラセモサス ＤＤＦ株によるディルドリンの分解試験と同じディルドリンの分解試験を行った。ムコールラセモサス ＤＤＦ株の分解試験と併せて、その結果を図８の棒グラフで示す。
【００４２】
図８では、ディルドリンが当初１５μＭあったものが１０日間の培養で、コントロールを除き、検出されなかったことを示す。また、コントロールでは塩素イオンは当初より検出されなかったが、ムコール属ラセモサス種に属する３菌株ではいずれの菌株についても、１０日間の培養で当初検出されなかった塩素イオンが検出されたことを示している。なお、コントロールは生きた菌体を接種する代わりに死菌体を添加したものである。
即ち、ＩＦＯ６７４５株やＮＢＲＣ４５８１株でもムコールラセモサス ＤＤＦ株と同様に、培養１０日目でディルドリンの９０％以上が分解した。しかし、分解菌ごとに生じた塩素イオン濃度に差が生じており、脱塩素分解の程度に差があることが示唆された。
【００４３】
＜実験例５：図９＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるヘプタクロルエポキシド分解試験]
実験例３において、ディルドリン溶液を１５μＭ添加した操作に代えて、ヘプタクロルエポキシド溶液を１３μＭ添加した操作を行う以外は、実験例３と同じ操作を行って、ムコールラセモサス ＤＤＦ株についてヘプタクロルエポキシド分解試験を行った。その結果を図９に示す。
図９では、ヘプタクロルエポキシドが当初１３μＭあったものが１０日間の培養で、コントロールを除き、０．８μＭに減少したことを示す。また、１０日間の培養でも塩素イオンが検出されなかったことを示す。
この結果から、ムコールラセモサス ＤＤＦ株は、ヘプタクロルエポキシドも９０％以上分解することを確認できた。しかしながら、ヘプタクロルエポキシドの脱塩素までは確認できなかった。
【００４４】
＜実験例６：図１０＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株による種々の環状ジエン系農薬（ディルドリンやヘプタクロルエポキシド以外）の分解試験]
実験例３や実験例５において、ディルドリン溶液１５μＭやヘプタクロルエポキシド溶液１３μＭを添加した操作に代えて、ヘプタクロル溶液やα−エンドスルファン溶液、β−エンドスルファン溶液、エンドスルファンスルフェート溶液をそれぞれ所定量添加した操作を行い、１０日間〜１４日間培養した以外は、実験例３や実験例５と同じ操作を行って、ムコールラセモサス ＤＤＦ株についてヘプタクロルやα−エンドスルファン、β−エンドスルファン、エンドスルファンスルフェートのそれぞれの分解試験を行った。その結果を図１０に示す。
図１０では、当初ヘプタクロルが１３．３μＭ、ヘプタクロルエポキシドが１３．０μＭあったものが１０日間の培養でヘプタクロルは０．７５μＭ、ヘプタクロルエポキシドは０．８４μＭと、ともに１μＭ以下にまで減少し、また、当初α−エンドスルファンが１６．５μＭ、β−エンドスルファンが１６．３μＭ、エンドスルファンスルフェートが１７．１μＭあったものが１４日間の培養でそれぞれ２．５２μＭ、６．５８μＭ、８．２１μＭに減少したことを示す。コントロールは生きた菌体を接種する代わりに死菌体を添加したものである。
即ち、図１０で示されるように、ムコールラセモサス ＤＤＦ株は、ヘプタクロルやヘプタクロルエポキシドを９０％以上分解し、α−エンドスルファンを８０％以上、β−エンドスルファンを６０％以上、エンドスルファンスルフェートを５０％以上分解することを確認できた。 
【００４５】
＜実験例７：図１１＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるＤＤＴの分解試験]
実験例３において、ディルドリン溶液１５μＭを添加した操作に代えて、ＤＤＴを１２．８μＭ添加して培養した以外は、実験例３と同じ操作を行ってムコールラセモサス ＤＤＦ株についてＤＤＴの分解試験を行った。その結果を図１１に示す。
図１１では、ＤＤＴが当初１２．８μＭあったものが１０日間の培養後は１．７６μＭとなったことを示す。コントロールは生きた菌体を接種する代わりに死菌体を添加したものである。本実験例では、コントロールにおいてもＤＤＴ濃度が減少しているが、その理由は当初添加したＤＤＴの一部が死菌体に吸着されてしまい回収できなかったことによる。
図１１で示されるように、ムコールラセモサス ＤＤＦ株の添加によりコントロールに比較してＤＤＴ濃度が減少しており、ムコールラセモサス ＤＤＦ株はＤＤＴの４５．９％を分解したことを確認した。
また、本実験による１０日間培養後のＤＤＴ分解により、ＤＤＥは検出されず、脱塩素は確認することができた。
【００４６】
＜実験例８：図１２＞
[ムコールラセモサス ＤＤＦ株によるＤＤＥの分解試験]
実験例３において、ディルドリン溶液１５μＭを添加した操作に代えて、ＤＤＥを１５．７μＭ添加して培養した以外は、実験例３と同じ操作を行ってムコールラセモサス ＤＤＦ株についてＤＤＥの分解試験を行った。その結果を図１２に示す。
図１２では、ＤＤＥが当初１５．７μＭあったものが１０日間の培養後は３．２８μＭになったことを示す。コントロールは生きた菌体を接種する代わりに死菌体を添加したものである。本実験例でも、コントロールにおいてＤＤＥ濃度が減少しているが、その理由は当初添加したＤＤＥの一部が死菌体に吸着されてしまい回収できなかったことによる。
図１２で示されるように、ムコールラセモサス ＤＤＦ株の添加によりコントロールに比較してＤＤＥ濃度が減少しており、ムコールラセモサス ＤＤＦ株はＤＤＥの５１．６％を分解したことを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2010252673.tif 000013
【図９】
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【配列表】
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