(57)【要約】【課題】熟練した技術者の判断によらず、培養容器内で位置特異的に多能性幹細胞の分化状態を高感度で検出する方法および装置、ならびに多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置を提供すること。【解決手段】細胞培養容器において培養される多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する方法であって、多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器を準備し、前記流出口から細胞培養容器中の培養培地を流出させ、所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを共に測定し、  前記所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定することを含んでなる、方法を用いる。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器において培養される多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する方法であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填された一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器を準備し、
前記流出口から細胞培養容器中の培養培地を流出させ、所定流出量毎に培養培地の物性値と総流出量とを測定し、
前記所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記細胞培養容器が、容器本体と、該容器本体の一面に貼り付けられた平板とを備えた閉鎖系細胞培養容器である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の多能性幹細胞播種領域が、前記流路の底面上において流路に沿って並んで設けられている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地が、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための培養培地である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項５】
培地交換により前記流出口から細胞培養容器中の培養培地を流出させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項６】
前記培養培地の流出速度が一定である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項７】
次の培地交換まで使用される培養培地を前記流入口から流入させる、請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
次の培地交換まで使用される培養培地と、細胞培養容器中の培養培地との間にエアを介在させる、請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
培地交換の時間周期が２４〜４８時間である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項１０】
前記所定流出量毎の培養培地の物性値が、細胞外代謝物の含有量または光学的物性値である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項１１】
前記細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アンモニア、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３―ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、およびリボン酸からなる群から選択される少なくとも1つのものである、請求項１０に記載の判定方法。
【請求項１２】
前記光学的物性値が蛍光強度または蛍光指紋情報である、請求項９に記載の判定方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞の未分化状態の自動判定システム。
【請求項１７】
継代に必要な細胞を特定する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなる、多能性幹細胞の継代培養方法であって、継代に必要な細胞が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の判定方法により、未分化な細胞と判定された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の判定方法により、分化を開始した細胞と判定された多能性幹細胞である、方法。
【請求項１８】
細胞培養容器において培養される多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する装置であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器と、
前記流出口から流出する細胞培養容器中の培養培地を回収する回収部と、
所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを測定する分析測定部と、
前記所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する判定部と、
を備える、装置。
【請求項１９】
前記回収部がバイアル分注機構またはフローセルを備えている、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器に対してインキュベーション処理を行うインキュベーション部と、
前記インキュベーション処理の終了後に、前記培養容器に対して培地交換処理を行うことにより、前記細胞培養容器の流出口からインキュベーション処理済み培養培地を流出させる培地交換部と、
前記インキュベーション処理済み培養培地の、所定流出量毎に培養培地の物性値と総流出量とを繰り返し測定処理する分析測定部と、
前記インキュベーション処理、前記培地交換処理および前記測定処理が２回以上繰り返し行われるように、前記インキュベーション部、前記培地交換部および前記分析測定部の動作を制御する動作制御部と、
前記分析処理により得られた前記所定流出量毎の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する判定部
と、
を備える、細胞培養装置。
【請求項２１】
前記判定部で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去するための細胞除去処理を行う細胞除去部をさらに備える、請求項２０に記載の細胞培養装置。
【請求項２２】
多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養方法であって、
（ａ）多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器に対してインキュベーションを行う工程と、
（ｂ）工程（ａ）の終了後に、前記培養容器に対して培地交換処理を行うことにより、前記細胞培養容器の流出口からインキュベーション処理済み培養培地を流出させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で流出したインキュベーション処理済み培養培地の、所定流出量毎に培養培地の物性値と総流出量とを共に繰り返し測定処理する工程と、
（ｄ）工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）を２回以上繰り返し行う工程と、
（ｆ）前記分析処理により得られた前記所定流出量毎の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する工程と、
を含んでなる、細胞培養方法。
【請求項２３】
工程（ｆ）で得られた判定結果で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去する工程（ｇ）をさらに含む、請求項２２に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞が培養された培養培地を分析することにより、多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、あらゆる組織に分化しうるその分化多能性ゆえに、組織分化の研究、薬物試験および再生医療などの様々な分野で幅広く用いられている。特にｉＰＳ細胞の樹立以降、この分野における研究の発展は著しく、再生医療実現に向けた様々な取り組みが世界中でなされている。
【０００３】
ところで、多能性幹細胞は、分化しやすく、一度分化してしまうと多能性を失う可能性があるため、多能性幹細胞の培養は、多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら行う必要があり、未分化状態の維持は、多能性幹細胞の培養において最も重要な要素の一つであるといえる。
【０００４】
未分化状態を維持するためには、分化を阻害する薬剤の使用や、分化を開始した多能性幹細胞の除去などが行われる。多能性幹細胞の大量調製において、最も大きな障害となりうる問題の一つは、分化を開始した多能性幹細胞の除去である。分化を開始した細胞の除去が不十分な場合には、周囲の細胞の分化を誘導して培養細胞全体に悪影響を及ぼす可能性がある。しかし、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かの判断は、熟練した技術者によらなければ難しい。このようなことから、多能性幹細胞の大量調製には自ずと限界がある。そのため、少なくとも熟練した技術者の判断に依らずに多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを確認する方法の開発や、分化を開始した多能性幹細胞を自動判定できる方法の開発が望まれていた。
【０００５】
これまで、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを確認する方法としては、ｑＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法、フローサイトメトリー法が使用されている（非特許文献１）。しかし、ｑＲＴ−ＰＣＲ法や免疫染色法は、測定に際し細胞を破壊する必要がある。フローサイトメトリー法は、非破壊測定が可能であるが、細胞をシングルセルの状態で懸濁する必要があり、煩雑な操作を要する。
【０００６】
一方で、近年、細胞形態に現れないような初期の細胞の分化を、培地中のマーカー代謝物を指標として検出する培地成分分析技術が本発明者らにより報告されている。
特許文献１には、多能性幹細胞が培養された培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、多能性幹細胞の未分化状態を評価する工程を含んでなり、該細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである、多能性幹細胞の未分化状態の判定方法が開示されている。
【０００７】
特許文献２には、未分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞により分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定の指標物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する方法であて、指標物質が、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸及びリボン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴とする細胞分化状態の評価方法が開示されている。
【０００８】
しかしながら、細胞の分化状態を反映するマーカー代謝物は、培養容器内で容易に拡散して均一化することから、検出感度が低下したり、培養容器内における分化細胞の位置を特定して分化細胞のみを選択的に除去することが困難となる場合がある。したがって、培養容器内で位置特異的に細胞の分化状態を高感度で検出する方法の開発が依然として望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／０５２５５８号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１７／０６８８０１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nature Biotechnology 25, 803 - 816 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、熟練した技術者の判断によらず、培養容器内で位置特異的に多能性幹細胞の分化状態を高感度で検出する方法および装置、ならびに多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路を備えた細胞培養容器から培養培地を流出させ、所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを指標として分析を行ったところ、細胞培養容器内の多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定することが可能であることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）細胞培養容器において培養される多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する方法であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器を準備し、
前記流出口から細胞培養容器中の培養培地を流出させ、所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを測定し、
前記所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定すること
を含んでなる、方法。
（２）前記細胞培養容器が、容器本体と、該容器本体の一面に貼り付けられた平板とを備えた閉鎖系細胞培養容器である、（１）に記載の判定方法。
（３）複数の多能性幹細胞播種領域が、前記流路の底面上において流路に沿って並んで設けられている、（１）または（２）に記載の判定方法。
（４）前記培養培地が、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための培養培地である、（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法。
（５）培地交換により前記流出口から細胞培養容器中の培養培地を流出させる、（１）〜（４）のいずれかに記載の判定方法。
（６）前記培養培地の流出速度が一定である、（１）〜（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）次の培地交換まで使用される培養培地を前記流入口から流入させる、（６）に記載の判定方法。
（８）次の培地交換まで使用される培養培地と、細胞培養容器中の培養培地との間にエアを介在させる、（７）に記載の判定方法。
（９）培地交換の時間周期が２４〜４８時間である、（５）〜（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１０）前記所定流出量毎の培養培地の物性値が、細胞外代謝物の含有量または光学的物性値である、（１）〜（９）のいずれかに記載の判定方法。
（１１）前記細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アンモニア、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３―ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、およびリボン酸からなる群から選択される少なくとも1つのものである、（１０）に記載の判定方法。
（１２）前記光学的物性値が蛍光強度または蛍光指紋情報である、（９）に記載の判定方法。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
（１４）（１３）に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
（１５）（１３）に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
（１６）（１３）に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞の未分化状態の自動判定システム。
（１７）継代に必要な細胞を回収する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなる、多能性幹細胞の継代培養方法であって、継代に必要な細胞が、（１）〜（１２）のいずれかに記載の判定方法により、未分化な細胞と評価された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、（１）〜（１２）のいずれかに記載の判定方法により、分化を開始した細胞と評価された多能性幹細胞である、方法。
（１８）細胞培養容器において培養される多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する装置であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器と、
前記流出口から流出する細胞培養容器中の培養培地を回収する回収部と、
所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを共にする分析測定部と、
前記所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する判定部を
を備える、装置。
（１９）前記回収部がバイアル分注機構またはフローセルを備えている、（１８）に記載の装置。
（２０）多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器に対してインキュベーション処理を行うインキュベーション部と、
前記インキュベーション処理の終了後に、前記培養容器に対して培地交換処理を行うことにより、前記細胞培養容器の流出口からインキュベーション処理済み培養培地を流出させる培地交換部と、
前記インキュベーション処理済み培養培地の、所定流出量毎の物性値と総流出量とを共に測定処理する分析測定部と、
前記インキュベーション処理、前記培地交換処理および前記測定処理が２回以上繰り返し行われるように、前記インキュベーション部、前記培地交換部および前記分析測定部の動作を制御する動作制御部と、
前記分析処理により得られた前記所定流出量毎の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する判定部
と、
を備える、細胞培養装置。
（２１）前記判定部で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去するための細胞除去処理を行う細胞除去部をさらに備える、（２０）に記載の細胞培養装置。
（２２）多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養方法であって、
（ａ）多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器に対してインキュベーションを行う工程と、
（ｂ）工程（ａ）の終了後に、前記培養容器に対して培地交換処理を行うことにより、前記細胞培養容器の流出口からインキュベーション処理済み培養培地を流出させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で流出したインキュベーション処理済み培養培地の、所定流出量毎の物性値と総流出量とを共に測定処理する工程と、
（ｄ）工程（ａ）、工程（ｂ）および工程（ｃ）を２回以上繰り返し行う工程と、
（ｆ）前記分析処理により得られた前記所定流出量毎の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する工程と、
を含んでなる、細胞培養方法。
（２３）工程（ｆ）で得られた判定結果で得られた判定結果に基づいて、分化を開始した細胞を除去する工程（ｇ）をさらに含む、（２２）に記載の細胞培養方法。
【００１４】
本発明によれば、所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを指標として、細胞培養容器内の多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定することができる。
本発明によれば、多能性幹細胞の破壊を必要とせず、多能性幹細胞が培養された培養培地の所定流出量毎の物性値と総流出量の分析結果のみに基づいて評価することができる点で有利である。
【００１５】
また、培養培地の分析によれば、細胞を破壊し細胞内代謝物を測定するような方法と比較して大きく値が変動することがない。そして、所定流出量毎の物性値については、予め決定されたプログラムに従って、自動で取得、記録し、これを解析することができるから、多能性幹細胞の未分化状態の自動的な判断が可能になる。すなわち、培養培地の分析は全自動化が可能である点でさらに有利である。
【００１６】
本発明によれば、また、多能性幹細胞の未分化状態の判定は、特定の所定流出量毎の培養培地の物性値と総流出量に基づいて行うことができ、すなわち、予め決定された参照値（例えば、予め行った実験によって決定した基準値、蓄積されたデーターベース、および代謝シミュレーション等）と比較する必要がない点で有利である。
【００１７】
本発明によれば、さらに、多能性幹細胞の未分化状態の判定は、特定の所定流出量毎の培養培地の物性値と総流出量に基づいて迅速に行い、培養容器内の分化された細胞を効率的に特定、除去することができ、そうすると多能性幹細胞の品質の均一化も期待できる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】本発明の一実施形態において使用される培養容器の概略平面図である。
【図１Ｂ】図１ＡのＡ−Ａ線断面図である。
【図１Ｃ】図１ＡのＢ−Ｂ線断面図である。
【図１Ｄ】細胞播種時の図１ＡのＡ−Ａ線断面図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す概略図である。
【図３】細胞播種部の構成を示す概略平面図である。
【図４】インキュベーション部の構成を示す概略断面図である。
【図５】細胞形態観察部の構成を示す概略側面図である。
【図６Ａ】培地交換部の構成を示す概略平面図である。
【図６Ｂ】バイアル分注機構を備えた培地交換部の構成を示す概略平面図である。
【図６Ｃ】フローセルを備えた培地交換部の構成を示す概略平面図である。
【図７】細胞剥離部の構成を示す概略側面図である。
【図８】細胞回収部の構成を示す概略平面図である。
【図９】本発明の一実施形態に係る細胞培養装置が行う細胞培養処理手順を示すフローチャートである。
【図１０】実施例１において使用される一本鎖閉鎖系の細胞培養容器の写真である。
【図１１】光学顕微鏡による、播種後５日目（ｄａｙ５）の細胞形態の観察の結果を示す図であり、Ａは図１０に示される破線域（I）内の細胞形態像、Ｂは図１０に示される破線域（II）内の細胞形態像をそれぞれ示す。
【図１２Ａ】播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）の培養培地におけるＬＣ−ＭＳ分析により求められた乳酸（Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）の存在量を示す図である。
【図１２Ｂ】播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）の培養培地におけるＬＣ−ＭＳ分析により求められた分化マーカー（２−アミノアジピン酸）の存在量を示す図である。
【図１３】培地交換の際のエアプラグの有無が培地成分の拡散に及ぼす影響について確認した予備試験の結果を示す図である。
【図１４Ａ】実施例２のＡ群について、蛍光分光光度計により、播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）および６日目（ｄａｙ５）の細胞形態の観察の結果を示す写真である。
【図１４Ｂ】実施例２のＢ群について、光学顕微鏡により、播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）および６日目（ｄａｙ５）の細胞形態の観察の結果を示す写真である。
【図１５Ａ】実施例２のＡ群について、播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）および６日目（ｄａｙ５）の培養培地について、蛍光分光光度計を用いた３次元蛍光スペクトル測定を行った結果を示すグラフである。
【図１５Ｂ】実施例２のＢ群について、播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）および６日目（ｄａｙ５）の培養培地について、蛍光分光光度計を用いた３次元蛍光スペクトル測定を行った結果を示すグラフである。
【図１６】実施例２において、３次元蛍光スペクトル測定結果を入力データとして多変量解析（主成分分析）を行い、分化細胞または未分化細胞の判別を行った結果を示すグラフである。
【図１７】実施例２において、３次元蛍光スペクトル測定結果を入力データとして多変量解析（階層的クラスタリング）を行い、蛍光強度の挙動の類似する励起波長および蛍光波長の組み合わせの集まりとして分類した結果を示すグラフである。
【図１８】実施例２において、分化細胞と未分化細胞との間で大きな差異を示す、特徴的な蛍光強度の挙動を示すクラスターの平均相対蛍光強度を示すグラフである。
【発明の具体的な説明】
【００１９】
本発明において、「多能性幹細胞の未分化状態の判定」とは、対象とする多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定することを意味する。
【００２０】
本発明で用いられる「多能性幹細胞」は、三胚葉のいずれの由来の細胞にも分化する能力を有する細胞を意味する。本発明で用いられる多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、霊長類細胞や齧歯類細胞などの哺乳類の多能性幹細胞とすることができ、より好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはヤギの多能性幹細胞とすることができ、さらに好ましくは、ヒトの多能性幹細胞とすることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。従って、本発明で用いられる多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳類のＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類若しくは齧歯類などのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ若しくはヤギのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。本発明によれば、フィーダー細胞は用いても用いなくてもよい。
【００２１】
本発明で用いられる「培養培地」（単に「培地」ともいう）は、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための培養培地を意味する。このような培養培地としては、多能性幹細胞の未分化状態を維持できれば、特に制限無く用いることができる。本発明で用いられる培養培地は、特に限定されないが、好ましくは、多能性幹細胞を培養することができる培地に未分化維持に寄与する因子が添加された培養培地とすることができる。多能性幹細胞を培養することができる培地としては、多能性幹細胞を培養することができれば、特に制限無く用いることができ、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ-8（商標）培地、ＴｅＳＲ（商標）−Ｅ８（商標）培地、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地等が挙げられる。未分化維持に寄与する因子としては、例えば、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン等が挙げられる。なお、培養培地は、培養工程中、所定時間周期で新しい培養培地に交換されるものであるが、詳細については後述する。
【００２２】
本発明においては、多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填された一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器を準備する。まず、図１Ａ〜図１Ｄを参照して、本発明の一実施形態において使用される培養容器について説明する。図１Ａは、本発明の一実施形態において使用される培養容器の概略平面図であり、図１Ｂは、図１ＡのＡ−Ａ線断面図であり、図１Ｃは、図１ＡのＢ−Ｂ線断面図であり、１Ｄは細胞播種時の図１ＡのＡ−Ａ線断面図である。
【００２３】
本実施形態において使用される培養容器は、図１Ａ〜図１Ｃに示すように、閉鎖系の培養容器１０である。図１Ａ〜図１Ｃに示すように、培養容器１０は、凹状の流路１２を有する容器本体２１と、流路１２の開口部を封止する平板２２とを備える。容器本体２１および平板２２の材質としては、例えば、光透過性を有する合成樹脂（例えばポリスチレン）が使用される。容器本体２１および平板２２が光透過性を有することにより、培養容器１０中の細胞を外部から光学的に観察することができる。
【００２４】
図１Ａに示すように、培養容器１０は、容器本体２１は、液体が流入する流入口１１と、流入口１１から流入した液体が通過する流路１２と、流路１２を通過した液体が流出する流出口１３とを有する。流入口１１と流路１２と流出口１３とは、例えば射出成形により、一体に形成されている。
【００２５】
図１Ａに示すように、容器本体２１の流路１２は、平面視において蛇行する形状を有する。また、図１Ｂおよび図１Ｃに示すように、容器本体２１の流路１２は、容器本体２１の一方側に開口する凹部（溝部）として形成されている。
【００２６】
また、図１Ｄに示すように、細胞を播種する際、培養容器１０は不図示の反転機構により平板２２が下側になる状態とされる。そして、細胞含有懸濁液を培養容器１０の流路１２を通過させ、通過中に平板２２上に細胞３１を落下させることにより、細胞３１を直接播種する。
【００２７】
なお、容器２１では、平板２２に代えてまたは平板２２に加えて、流路１２の底面上または流路１２の壁面全体に細胞を播種することができる。図示しないが、例えば、流路１２の底面に細胞が播種される複数の細胞播種領域が、流路に沿って並んで設けられていてもよい。流路１２上の細胞播種領域の形状は、特に制限されず、細胞の種類および量等に応じて適宜設定してよく、窪み状、スポット状等にすることができる。かかる容器のさらなる詳細は、例えば、ＷＯ２０１５／１２５７４２に記載されている。
【００２８】
容器本体２１の流入口１１および流出口１３は、容器本体２１の同一側面に設けられているが、異なる側面に設けられていてもよい。流入口１１は、流路１２の一端に連通しており、流出口１３は流路１２の他端に連通している。図示されていないが、流入口１１および流出口１３には、シリンジの先端を挿入可能なスリット付のゴム栓、注射針を刺すことが可能な弾性膜、ルアーロック等の医療用に使用されている開閉弁を具備する構造が設けられていてもよい。これにより、液体の注入時および回収時において、外界からのコンタミネーションのリスクが軽減され得る。
【００２９】
平板２２は、適度なガス透過性を有するように薄く形成されていてよい。平板２２の厚みは、例えば５０μｍ〜２００μｍである。これにより、培養中の細胞に酸素ガス等のガスを供給することが容易である。なお、嫌気性の細胞を培養する場合には、平板２２は、ガス不透過性を有することが好ましく、この場合、平板３２の厚みは、例えば２０００μｍ〜３０００μｍである。
【００３０】
平板２２は、流路１２の開口部が封止されるように、流路１２の開口部が形成された容器本体３１の面全体に配置され、容器本体３１の壁部（流路１２を規定する壁部の端部）に貼り付けられて固定支持されている。本実施形態において、平板２２は、容器本体２１に接着剤で接着されているが、固定方法は接着剤に限定されず、例えば、熱融着、超音波融着等であってもよい。
【００３１】
培養容器１０は、次のようにして製造することができる。まず、平板２２が貼り付けられる前の容器本体２１の流路１２が形成された面を、Ｏ２プラズマ処理する。例えば、Ｏ２ガスを適当なワット数の電力によってプラズマ化し、Ｏ２プラズマを、容器本体２１の流路１２が形成された面に所定時間曝露する。次いで、容器本体２１の流路１２を細胞非接着コーティング液で処理する。例えば、流路１２内に細胞非接着コーティング液を流入させ、３７℃で所定時間静置する。その後、流路１２から細胞非接着コーティング液を流出させ、流路１２を滅菌水で洗浄する。次いで、容器本体２１の流路１２が形成された一面に、平板２２を貼り付ける。例えば、容器本体２１の壁部の端部に接着剤を塗布した後、平板２２を、容器本体２１上に、流路１２の開口部が覆われるように載置し、接着剤により接着する。次いで、接着剤を乾燥して固化させる。
【００３２】
培養容器１０を細胞培養に使用する前に、次の前処理を行うことが好ましい。まず、流入口１１から流路１２にＰＢＳ溶液を流入させ、流路１２をＰＢＳ溶液で満たす。これにより、流路１２から気泡が除かれる。次いで、平板２２のうち窪み２１と向かい合う部分に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を付着させる。例えば、流入口１１から流路１２にＥＣＭ溶液を流入させる。流路１２内のＰＢＳ溶液は、ＥＣＭ溶液により押し流されて流出口１３から流出する。流路１２がＥＣＭ溶液で満たされた状態を所定時間維持する。これにより、流路１２の細胞非接着コーティング液が塗布されていない部分、すなわち平板２２のうち流路１２の開口部に対応する領域全体に、ＥＣＭが付着する。ＥＣＭは、細胞培養の際、細胞の足場となる。
【００３３】
本発明においては、上記一本の流路を備えた細胞培養容器の流出口から培養培地を流出させる。
【００３４】
本発明においては、多能性幹細胞の培養工程中、所定時間周期で新しい培養培地に交換（培地交換）することにより細胞培養容器の流出口から培養培地を流出させることができる。したがって、本発明においては、細胞培養容器の流出口から使用済みの培養培地を流出させる際に、次の培地交換まで使用される培養培地を前記流入口から流入させてよい。
【００３５】
また、本発明においては、次の培地交換まで使用される培養培地と、培養容器内の使用済みの培養培地との間にはエアを介在させることが好ましい。このようにエアを介在させることにより、培養培地内の細胞外代謝物等の拡散を防止することができ、細胞の未分化状態を正確に判定する上で有利である。
【００３６】
多能性幹細胞の培養工程中、培地交換の時間周期は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、１２〜７２時間、好ましくは、２４〜４８時間とすることができる。
【００３７】
ここで、「培養工程中」とは、多能性幹細胞が、前記培養培地が添加された培養容器に播種され、培養された後、継代されるまでを意味する。多能性幹細胞は、培養工程中、培地交換が１〜５回行われるような密度で播種することができるが、好ましくは、２〜４回、より好ましくは３〜４回培地交換が行われるような密度で播種することができる。
【００３８】
その他の培養条件については、使用する多能性幹細胞の状態に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。
【００３９】
本発明においては、培養容器からの培養培地の流出速度は、例えば培地交換の際に培養容器への培養培地の流入速度を調節することにより当業者は適宜設定することができる。培養培地の流出速度は、簡便かつ正確な測定の観点からは、一定であることが好ましい。より具体的には、培養培地の流出速度は、好ましくは５〜２５ｍＬ／ｍｉｎであり、より好ましくは１０〜２０ｍＬ／ｍｉｎである。
【００４０】
本発明においては、培養容器から流出する培養培地について所定流出量毎の物性値を指標として、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定することができる。ここで、「所定流出量」は、分析精度に応じて当業者が適宜設定してよいが、好ましくは０．２〜２ｍＬであり、より好ましくは０．５〜１．５ｍＬである。
【００４１】
また、本発明においては、細胞培養容器の流出口から流出する培養培地について、所定流出量毎に物性値と総流出量とを測定する。本発明においては、後述のとおり、所定流出量毎の培養培地の物性値は多能性幹細胞の分化状態の指標として使用され、培養培地の総流出量は、多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定する指標として使用される。「所定流出量」は、特に限定されないが、精密な培養培地の測定の観点からは、１５〜４５ｍＬであり、より好ましくは２０〜３５ｍＬであり、さらに好ましくは２０〜２５ｍＬである。
【００４２】
本発明において、「所定流出量毎に」培養培地の物性値を測定する手法は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、公知の分注バイアル機構等を用いて所定流出量毎に培養培地をフラクション化し、得られるフラクション（バイアル）を経時的に測定に供する手法や、フローセル等を用いて所定流出量毎に測定を連続して実施する手法等が挙げられる。
【００４３】
本発明において、培養培地の「物性値」とは、多能性幹細胞の分化状態の指標となる培養培地の性質であれば特に限定されず、好ましくは、多能性幹細胞の分化状態の指標となる細胞外代謝物の含有量または光学的物性値とされる。
【００４４】
本発明において、「細胞外代謝物」とは、細胞培養の結果、細胞外（培養培地中）に存在する代謝物を意味し、具体的には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アンモニア、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３―ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、およびリボン酸からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００４５】
培養培地における細胞外代謝物の測定手段としては、特に制限無く、細胞外代謝物の種類、性質に応じて選択することができる。測定手段としては、例えば、酵素電極法、比色法、ガスクロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ質量分析、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析等が挙げられる。好ましくは、―ＬＣ−ＭＳ等の市販の分析機器を使用することができる。
【００４６】
本発明において、「光学的物性値」とは、培養培地の光学的な現象に対する物性値を意味し、例えば、特定の波長の光における反射率、吸収率、吸光度、屈性率、蛍光強度等が挙げられるが、迅速かつ高感度な測定の観点からは蛍光強度が好ましい。
【００４７】
培養培地における光学的物性値の測定手段としては、光学的物性値に応じた従来公知の一般的な光学計測装置（蛍光分光光度計、紫外可視分光光度計、近赤外分光光度計、赤外分光光度計、ラマン分光光度計）が挙げられる。
【００４８】
本発明においては、上述のようにして得られる所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定する。
【００４９】
多能性幹細胞の未分化状態の判定は、上記測定により得られる培養培地の物性値が基準物性値と比較してどの程度変動しているかを分析し、変動度が基準範囲内にあるとき、当該細胞は未分化状態であると判定し、変動度が基準範囲外であるとき、当該細胞は未分化状態でないと判定することができる。
【００５０】
例えば、多能性幹細胞の未分化状態の判定は、上記培養培地の物性値と、当該物性値について予め設定される閾値とを比較し、細胞が分化すると培養培地の物性値が上昇する場合、上記測定により得られる培養培地の物性値が閾値よりも高い場合には、細胞は分化状態にあると判定することができる。より具体的には、多能性幹細胞の未分化状態の判定のため閾値および判定手法は、例えば、特許文献１および特許文献２の記載に準じて設定することができる。
【００５１】
また、培養培地の物性値が光学的物性値である場合、多能性幹細胞の未分化状態の判定のため、例えば、多変量分析を用いて分化細胞を峻別することができる。多変量解析には、（１）教師なし（パターン認識）と、（２）教師ありとがある。（１）教師なしには、主成分分析、クラスター分析等がある。（２）教師ありには、（２−１）判別分析、（２−２）回帰分析等がある。
【００５２】
特に後述する実施例２に記載のように培養培地の物性値として特に蛍光強度を用いる場合、励起光をある波長範囲内で掃引しながら測定対象物に照射し、測定対象物から発せられた様々な波長の蛍光を検出することで、３次元蛍光スペクトル（励起蛍光マトリクス（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ：ＥＥＭ）または蛍光指紋とも呼ばれる）を得ることができる。３次元蛍光スペクトルは、測定対象物に照射する励起波長、測定対象物から発する蛍光波長、測定対象物の蛍光強度の３軸からなる３次元データの等高線状のグラフとなる。
【００５３】
さらに、３次元蛍光スペクトルは、横軸を蛍光波長、縦軸を励起波長として各ポイントの蛍光強度を等高線プロットすることにより、図１５Ａおよび図１５Ｂに示される通り、平面的に表すことができる。蛍光指紋は、測定対象物に対し蛍光染色等の前処理をせずにキャラクタリゼーションが可能であること、操作が容易で短時間で測定できること、さらに吸光度に比べ感度が高いこと、非破壊で測定が可能であること等の利点を有する。このように、３次元蛍光スペクトルは、３次元の膨大な情報を有する成分固有の蛍光情報であるため、測定者は、３次元蛍光スペクトルを利用することで、成分の識別が可能であり、かつ、非破壊での計測が可能となる。実施例２に示される通り、上述のような３次元蛍光スペクトル情報に多変量分析を適用することで、未分化細胞と分化細胞を判別することができる。さらに、多変量解析により特徴的な励起波長と蛍光波長の組み合わせを特定することで、励起光および蛍光の波長掃引が不要になることから、例えば蛍光分光光度計と分光フローセルとを組み合わせることで培養培地の回収と蛍光強度計測を同時に行うことも可能になり、ひいては、分化細胞を効率的かつ迅速に検出することが可能となる。
【００５４】
また、本発明において、培養培地の「総流出量」は、培養培地容器の流出口から容器内の流路の多能性幹細胞の存在する位置までの内容積に対応していることから、多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を特定する指標となる。したがって、本発明においては、培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定することができる。培養培地の「総流出量」の決定方法は、特に限定されず、例えば、分注バイアル機構を用いる場合には分注したフラクション（バイアル）中の培養培地の総体積により算出することができる。また、フローセルを用いる場合にはフローセルを通過する培養培地の流速に測定時間を乗じることにより算出することができる。
【００５５】
多能性幹細胞の未分化状態を判定する判定手段は、分析測定手段により得られた分析結果に基づいて培養培地の物性値を求め、多能性幹細胞の未分化状態を判定することができれば、特に制限無く用いることができる。例えば、コンピュータ等を用いることにより自動化することができる。
【００５６】
本発明において、判定の精度をより高めるために、多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法を併用することができる。当該方法は、特開２０１４−１８１８４号公報の記載に従って実行することができる。
【００５７】
本発明において、判定の精度をより高めるために、細胞形態観察を併用することもできる。
【００５８】
本発明によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果に基づいて多能性幹細胞の未分化状態を評価することは、コンピュータ等により全行程を自動化することができる。従って、本発明の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。具体的には、本発明によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果を得る工程と、分析結果に基づいて多能性幹細胞の未分化状態を自動判定する工程とをコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。本発明によればまた、本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。本発明によればさらに、本発明のプログラムをその内部記録装置に記録したコンピュータまたは本発明のコンピュータを備えた多能性幹細胞の未分化状態の評価のための自動判定システムが提供される。
【００５９】
本発明のプログラムは、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に記録し、コンピュータに読み込ませて実行させてもよい。記録媒体は、磁気ディスクや光ディスク等の着脱可能なものに限定されず、ハードディスク装置やメモリなどの固定型の記録媒体でもよい。また、本発明のプログラムを、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して頒布してもよい。さらに、同プログラムを暗号化したり、変調をかけたり、圧縮した状態で、インターネット等の有線回線や無線回線を介して、あるいは記録媒体に収納して頒布してもよい。
【００６０】
本発明の判定方法によれば、多能性幹細胞を破壊せずにその未分化状態を判定することができ、該方法により、未分化の細胞と判定されれば、培養を継続し、一方で、分化を開始した細胞と判定されれば、除去することができる。よって、本発明による判定方法は、多能性幹細胞の継代培養方法に適用することができる。
【００６１】
本発明の継代培養方法において、本発明の判定方法により分化を開始した細胞と判定された細胞は、培養および／または継代に不要な細胞として除去することができる。ここで、不要な細胞の除去は、培養中に行うこともできるし、あるいは、継代の際に行うこともできる。不要な細胞の除去は、また、培養培地の分析を行うという本発明の特徴から、培養容器中において位置特異的に好適に行われる。培養容器中における位置特異的な細胞の剥離・除去は、例えば、ＷＯ2015/058841号公報の記載に基づき実施することができる。
【００６２】
本発明の継代培養方法の一態様としては、以下の工程：
（ｉ）一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器に多能性幹細胞を播種する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で播種された多能性幹細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の培養中、培地交換毎に細胞培養容器の流出口から培養培地を流出させ、所定流出量毎に培養培地の物性値と総流出量とを測定する工程； 
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定する工程；
（ｖ−１）工程（ｉｖ）で分化を開始したと判定された多能性幹細胞を除去する工程；および
（ｖ−２）工程（ｉｖ）で未分化状態であると判定された多能性幹細胞を培養容器から剥離し、別の培養容器に播種する工程
を含んでなり、工程（ｉ）〜（ｖ）を適宜繰り返す方法である。
【００６３】
該態様において、多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）に基づいて、多能性幹細胞のコロニーの良否を評価する方法を併用することができる。該方法を併用する場合は、工程（ｉｖ）で行われる評価とは独立して多能性幹細胞のコロニーの良否を評価し、コロニーを選択・剥離除去することができる。
【００６４】
該態様において、細胞形態観察を併用することができる。該観察を併用する場合は、工程（ｉｖ）で行われる判定とは独立して多能性幹細胞の細胞形態を観察し、細胞を選択・剥離除去することができる。
【００６５】
本発明によれば、細胞培養容器において培養される多能性幹細胞の未分化状態を位置特異的に判定する装置であって、
多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器と、
前記流出口から流出する細胞培養容器中の培養培地を回収する回収部と、
所定流出量毎の培養培地の物性値と培養培地の総流出量とを測定する分析測定部と、
前記所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定し、かつ前記培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の前記細胞培養容器の流路上の位置を判定する判定部
を備える、装置が提供される。
【００６６】
本発明の装置における、回収部、分析測定部および判定部を構成する具体的な手段については上述した通りである。
【００６７】
以下、図面を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置について説明する。
【００６８】
次に、図２を参照して、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置について説明する。当該細胞培養装置においては、図１Ａ〜図１Ｃに示されるような、多能性幹細胞が培養されかつ培養培地が充填される一本の流路と、該流路の両端に配置された流入口および流出口とを備えた細胞培養容器が用いられる。図２は、本発明の一実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す概略図である。図２において、配線の接続は実線で示されており、容器が搬送される流れは破線で示されている。
【００６９】
本実施形態に係る細胞培養装置１００は、多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養装置である。細胞培養装置１００は、において、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを位置特異的に判定しながら（必要に応じて、当該判定で特定された、分化を開始した細胞を除去しながら）多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を未分化状態で培養することができる。
【００７０】
図２に示すように、細胞培養装置１００は、細胞処理部２００と、制御部３００と、入力部４１０と、出力部４２０と、記憶部４３０と、報知部４４０とを備える。
【００７１】
細胞処理部２００は、容器または容器中の細胞もしくは培地に対して各種処理を行う操作部である、容器搬入出部２１０と、細胞播種部２２０と、インキュベーション部２３０と、細胞形態観察部２４０と、培地交換部２５０と、細胞剥離部２６０と、細胞回収部２７０と、容器搬送部２８０とを備える。さらに、細胞処理部２００は、培地分析処理を行う第１培地分析部２９１および第２培地分析部２９２を備える。なお、本発明の細胞培養装置において、細胞形態観察部２４０は、細胞の未分化状態をより正確に確認する観点から設置しており、細胞形態観察部を備えない態様も本発明には包含される。
【００７２】
細胞処理部２００は、容器搬入出部２１０による細胞搬入処理および細胞搬出処理、細胞播種部２２０による細胞播種処理、インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理、細胞形態観察部２４０による細胞形態観察処理、培地交換部２５０による培地交換処理、細胞剥離部２６０による細胞剥離処理、細胞回収部２７０による細胞回収処理、第１培地分析部２９１および第２培地分析部２９２による培地分析処理等を含む、細胞を所望の状態で培養するための一連の処理を行う。
【００７３】
容器搬入出部２１０は、細胞搬入処理および細胞搬出処理を行う。細胞搬入処理において、容器搬入出部２１０は、培養容器１０に播種すべき細胞が収容された容器を、細胞培養装置１００の外部から搬入する。細胞搬出処理において、容器搬入出部２１０は、細胞処理部２における処理が完了した培養容器１０または細胞処理部２００における処理が中止された培養容器１０を細胞培養装置１００の外部へ搬出する。
【００７４】
細胞播種部２２０は、培養容器１０に対して細胞播種処理を行う。細胞播種処理において、細胞播種部２２０は、細胞培養に使用されていない新しい培養容器１０に細胞を播種する。この際、培養容器１０には、細胞とともに培地も収容される。培養容器１０に播種される細胞は、未分化状態の多能性幹細胞である。
【００７５】
細胞播種部２２０の構成例を図３に示す。図３に示すように、細胞播種部２２０は、細胞懸濁液調製部２２１と、細胞懸濁液調製部２２１から供給流路２２２を通じて供給された細胞懸濁液を貯留する細胞供給用タンク２２３と、一端が培養容器１０の流入口１１に連結可能であり、他端が細胞供給用タンク２２３に連結された流入管路２２４と、流入管路２２４に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２２５と、細胞回収用タンク２２６と、一端が培養容器１０の流出口１３に連結可能であり、他端が細胞回収用タンク２２６に連結された流出管路２２７と、流出管路２２７に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２２８とを備える。
【００７６】
細胞懸濁液調製部２２１は、培養容器１０に播種すべき細胞（未分化状態の多能性幹細胞）が収容された容器から、セルピッカー等により細胞を採取し、採取した細胞から細胞懸濁液を調製し、調製した細胞懸濁液を供給流路２２２から細胞供給用タンク２２３へ供給する。
【００７７】
細胞播種部２２０は、細胞供給用タンク２２３に貯留されている細胞懸濁液を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２２４を通じて、培養容器１０に供給する。また、細胞播種部２２０は、培養容器１０の流出口１３から流出する細胞懸濁液を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２２７を通じて、細胞回収用タンク２２６で回収する。
【００７８】
インキュベーション部２３０は、未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を行う。インキュベーション処理において、インキュベーション部２３０は、培養容器１０を細胞培養に適した環境に置き、培養容器１０中の細胞を生育および増殖させる。
【００７９】
インキュベーション部２３０によるインキュベーション処理は、培地単位で行われる。したがって、ある培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理と、当該培地と交換された新しい培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理とは、別のインキュベーション処理である。ある培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理は、インキュベーション処理の開始からインキュベーション処理の終了まで行われる。インキュベーション処理は、連続的に行われてもよいし、断続的に行われてもよい。例えば、インキュベーション処理の開始からインキュベーション処理の終了までの間を通じて、ある培地が収容された培養容器１０をインキュベーション部２３０内に保持し、培養容器１０に対するインキュベーション処理を連続的に行ってもよい。また、インキュベーション処理の開始後、培養容器１０に対してインキュベーション処理以外の処理（例えば、細胞形態観察処理、細胞剥離処理）を行うためにインキュベーション処理を中断し、当該処理の終了後、培地交換処理を行うことなく、インキュベーション処理を再開してもよい。「インキュベーション処理の開始」には、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する場合に加えて、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理の開始後、培養容器１０に対してインキュベーション処理以外の処理（例えば、細胞形態観察処理、細胞剥離処理）を行うためにインキュベーション処理を中断し、当該処理の終了後、培地交換処理を行うことなく、インキュベーション処理を再開する場合も含まれる。「インキュベーション処理の終了」は、ある培地が収容された培養容器１０に対するインキュベーション処理がもはや行われないことを意味する。インキュベーション処理の開始後、培養容器１０に対してインキュベーション処理以外の処理（例えば、細胞形態観察処理、細胞剥離処理）を行うためにインキュベーション処理を中断し、当該処理の終了後、培地交換処理を行うことなく、インキュベーション処理を再開する場合、インキュベーション処理の中断は、インキュベーション処理の終了に該当しない。インキュベーション処理は、例えば、ある培地が収容された培養容器１０に対して所定時間（例えば、２４時間）行われた場合（すなわち、同一培地で所定時間インキュベーション処理が行われた場合）に終了する。
【００８０】
インキュベーション部２３０の構成例を図４に示す。図４に示すように、インキュベーション部２３０は、１または２以上の培養容器１０を収容可能な容器収容部２３１と、１または２以上の培養容器１０が載置される載置部２３２と、容器収容部２３１の内部雰囲気を細胞培養に適した環境に維持する環境調整部２３３とを有する。環境調整部２３３は、容器収容部２３１の内部雰囲気を細胞培養に適した条件（例えば、温度３７℃、湿度９０％、ＣＯ２濃度５％）に調整することができる。
【００８１】
細胞形態観察部２４０は、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を行う。細胞形態観察処理において、細胞形態観察部２４０は、培養容器１０中の細胞の形態を観察し、観察結果として観察画像を取得する。
【００８２】
細胞形態観察処理が行われる培養容器１０は、インキュベーション処理の開始後のいずれかの時点の培養容器１０である。「インキュベーション処理の開始後のいずれかの時点」には、インキュベーション処理の中断後のいずれかの時点およびインキュベーション処理の終了後のいずれかの時点が含まれる。インキュベーション処理と、インキュベーション処理の終了後の培地交換処理とが２回以上繰り返し行われる場合、細胞形態観察処理が行われる培養容器１０は、インキュベーション処理済み培地が収容された培養容器１０（すなわち、インキュベーション処理の開始後であって培地交換処理の前の培養容器１０）であってもよいし、インキュベーション処理が行われていない新鮮な培地が収容された培養容器１０（すなわち、培地交換処理の後であってインキュベーション処理の開始前の培養容器１０）であってもよい。
【００８３】
細胞形態観察部２４０は、培養容器１０に対して細胞形態観察処理を行う。細胞形態観察部２４０は、例えば、培養容器１０中の細胞の形態を観察するための電子カメラモジュールである。細胞形態観察部２４０の構成例を図５に示す。図５に示すように、細胞形態観察部２４０は、透過型顕微鏡（例えば位相差顕微鏡）を介して培養容器１０中の細胞の形態を撮像するミクロ観察系の撮像部２４１と、培養容器１０中の細胞全体を俯瞰的に撮像するマクロ観察系の撮像部２４２と、ミクロ観察系およびマクロ観察系の撮像部２４１および２４２で撮像された画像を処理して、細胞の状態を判定するための画像データを作成する画像処理部２４３とを備える。画像処理部２４３は、例えば、多能性幹細胞が形成するコロニーの画像の微分フィルタ処理画像（微分画像）を作成する。画像処理部２４３で作成された画像データは、観察時刻と対応付けられて記憶部４３０に記憶される。
【００８４】
培地交換部２５０は、培養容器１０に対して培地交換処理を行う。培地交換処理において、培地交換部２５０は、培養容器１０中の培地を新しい培地と交換する。インキュベーション処理の終了後に培地交換処理が行われる場合、新しい培地と交換される培養容器１０中の培地は、インキュベーション処理済み培地（以下「使用済み培地」ともいう）である。培地交換処理の後であってインキュベーション処理の開始前に培地交換処理が行われる場合、新しい培地と交換される培養容器１０中の培地は、インキュベーション処理されていない培地である。細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、細胞剥離処理において培養容器１０から剥離された不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞）は、培地交換処理において培養容器１０から除去される。したがって、細胞剥離処理後に培地交換処理が行われる場合、培地交換部２５０は、細胞剥離部２６０とともに、培養容器１０から不要な細胞を除去する細胞除去処理を行う細胞除去部として機能する。
【００８５】
培地交換部２５０の構成例を図６Ａに示す。図６Ａに示すように、培地交換部２５０は、インキュベーション処理に使用されていない新鮮な培地を貯留する培地供給用タンク２５１と、一端が培養容器１０の流入口１１に連結可能であり、他端が培地供給用タンク２５１に連結された流入管路２５２と、流入管路２５２に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２５３と、培地回収機構２５４と、一端が培養容器１０の流出口１３に連結可能であり、他端が培地回収機構２５４に連結された流出管路２５５と、流出管路２５５に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２５６とを備える。
【００８６】
培地交換部２５０は、培地供給用タンク２５１に貯留されている新鮮な培地を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２５２を通じて、培養容器１０に供給する。培養容器１０に新鮮な培地が供給されると、培養容器１０中の古い培地（例えば、インキュベーション処理済み培地）は、培養容器１０の流出口１３から流出する。培地交換部２５０は、培養容器１０の流出口１３から流出する培地（例えば、インキュベーション処理済み培地）を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２５５を通じて、培地回収機構２５４で回収する。
【００８７】
培地回収機構２５４は、所定流量毎に古い培地を回収する機能を有しており、バイアル分注機構またはフローセルを用いて構成してもよい。図６Ｂでは、培地交換部２５０は、培地回収機構２５４としてバイアル分注機構２５４ａを備えている。また、培養培地の分析測定の精度の向上等の観点から、バイアル分注機構２５４ａと、流量調整器２５６との間には、フィルタ２５７を設けている。図示しないが、バイアル分注機構は、第１培地分析部を構成する分析装置（例えば、蛍光分光光度計等の分光光度計、液体クロマトグラフ質量分析器等の代謝物分析装置、ｐＨ／ｐＯ２／ｐＣＯ２計、タンパク質分析装置等）に接続することができる。
【００８８】
また、図６Ｃでは、培地交換部２５０は、培地回収機構２５４としてフローセル２５４ｂを備えている。培地交換部２５０は、培養培地の分析測定の精度の向上等の観点から、フローセル２５４ｂと、流量調整器２５６との間には、フィルタ２５７を設けており、さらに、フローセル２５４ｂを通過した培養培地を排出できるようにドレイン２５８が設けられている。図示しないが、フローセル２５４ｂには、第１培地分析部を構成する迅速計測が可能な分析装置（例えば、蛍光分光光度計、紫外可視分光光度計、近赤外分光光度計、電気伝導度計等）に接続することができる。
【００８９】
培地交換部２５０で回収されたインキュベーション処理済み培地は、第１培地分析部２９１および第２培地分析部２９２で分析される。第１培地分析部２９１は、培地交換部２５０で回収されたインキュベーション処理済み培地の所定流量毎の物性値を分析および算出する第１培地分析処理を行う。第２培地分析部２９２は、インキュベーション処理済み培地の総流量を分析および算出する第２培地分析処理を行う。
【００９０】
細胞剥離部２６０は、培養容器１０に対して細胞剥離処理を行う。細胞剥離処理において、細胞剥離部２６０は、培養容器１０中の不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞）を選択的に剥離する。剥離すべき細胞およびその培養容器中の位置は、第２培地分析部において計測されるインキュベーション処理済み培地の総流量に基づいて特定される。
【００９１】
細胞剥離部２６０の構成例を図７に示す。図７に示すように、細胞剥離部２６０は、培養容器１０に可視光を照射する光源２６１と、光を収束させるためのレンズ等の収光部２６２と、光源２６１から収光部２６２に光を供給する光ファイバー２６３とを有する。細胞剥離部２６０は、剥離すべき細胞に可視光を照射することにより、培養容器１０から目的の細胞を選択的に剥離することができる。光源２６１は、例えば、４００〜５００ｎｍの波長の光を照射する光源であり、好ましくはレーザー光源またはＬＥＤ光源（例えば、４０５ｎｍ、４２０ｎｍまたは４５０ｎｍの波長の光を照射するレーザー光源またはＬＥＤ光源）である。光源２６１の出力は、特に限定されないが、例えば、細胞の剥離に必要とされる光照射量を短期間（例えば、１０分以内）で与えるという観点では、１００ｍＷ以上の出力を有することが好ましい。
【００９２】
本実施形態では、光を利用して細胞剥離処理を行うが、超音波を利用して細胞剥離処理を行うことも可能である。超音波を利用する場合、細胞剥離部２６０は、上下方向（所定方向）に超音波振動する振動子を有する超音波プローブを備える。この場合、細胞剥離部２６０は、培養容器１０の平板３２の裏面から、剥離すべき細胞が位置する箇所に超音波振動する振動子を接触させることにより、培養容器１０から目的の細胞を選択的に剥離することができる。培養容器１０から選択的に剥離された細胞は、培地交換の際に古い培地とともに排出される。
【００９３】
細胞回収部２７０は、培養容器１０に対して細胞回収処理を行う。細胞回収処理において、細胞回収部２７０は、培養容器１０中の細胞を培養容器１０から剥離させ、回収する。
【００９４】
細胞回収部２７０の構成例を図８に示す。図８に示すように、細胞回収部２７０は、剥離剤溶液を貯留する剥離剤溶液供給用タンク２７１ａと、新鮮な培地を貯留する培地供給用タンク２７１ｂと、一端が培養容器１０の流入口１１に連結可能であり、他端が剥離剤溶液供給用タンク２７１ａおよび培地供給用タンク２７１ｂに連結された流入管路２７２と、流入管路２７２に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２７３と、剥離剤溶液回収用タンク２７４ａと、細胞回収用タンク２７４ｂと、一端が培養容器１０の流出口１３に連結可能であり、他端が剥離剤溶液回収用タンク２７４ａおよび細胞回収用タンク２７４ｂに連結された流出管路２７５と、流出管路２７５に介設されたバルブ、ポンプ等の流量調整器２７６とを有する。培養容器１０に供給すべき液体（剥離剤溶液または新鮮な培地）は、流量調整器２７３が有する切換弁によって選択される。培養容器１０から回収される液体（剥離剤溶液または細胞含有培地）は、流量調整器２７６が有する切換弁によって選択される。
【００９５】
細胞回収部２７０は、剥離剤溶液供給用タンク２７１ａに貯留されている剥離剤溶液を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２７２を通じて、培養容器１０に供給する。培養容器１０に剥離剤溶液が供給されると、培養容器１０中の細胞は培養容器１０から剥離される。細胞回収部２７０は、培養容器１０の流出口１３から流出する剥離剤溶液を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２７５を通じて、剥離剤溶液回収用タンク２７４ａで回収する。その後、細胞回収部２７０は、培地供給用タンク２７１ｂに貯留されている新鮮な培地を、培養容器１０の流入口１１に連結された流入管路２７２を通じて、培養容器１０に供給する。培養容器１０に新鮮な培地が供給されると、剥離された細胞は、新鮮な培地により押し流されて、新鮮な培地とともに流出口１３から流出する。細胞回収部２７０は、培養容器１０の流出口１３から流出する細胞含有培地を、培養容器１０の流出口１３に連結された流出管路２７５を通じて、細胞回収用タンク２７４ｂで回収する。
【００９６】
容器搬送部２８０は、細胞処理部２００内で培養容器１０等の容器を搬送し、ある操作部と別の操作部との間で培養容器１０等の容器の受け渡しを行う。容器搬送部２８０は、所定方向に延在する搬送路と、搬送路に設けられた搬送アームとを有する。各操作部は搬送路に隣接して設けられており、搬送アームは、ある操作部の内部にアクセスして当該操作部から容器を搬出し、搬出した容器を搬送路に沿って搬送し、別の操作部の内部にアクセスして当該別の操作部へ容器を搬入することができる。搬送アームは、例えば、容器を保持する保持機構を備え、水平方向および鉛直方向への移動並びに鉛直軸を中心とする旋回が可能となるように構成される。
【００９７】
制御部３００は、細胞培養装置１００の動作を統括的に制御するとともに、細胞培養装置１００における各処理を培養容器単位で管理するコンピュータである。制御部３００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等から構成され、記憶部４３０に記憶されている各種データ、各種プログラム等に基づいて、各種処理を行う。この際、制御部３００は、動作制御部３１０、第１判定部３２０、第２判定部３３０または観察条件調整部３４０として機能する。
【００９８】
動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている処理スケジュールに従って、各種操作部を制御し、各種処理を実行する。例えば、動作制御部３１０は、ある培地が収容された培養容器１０に対して、インキュベーション処理、培地交換処理および第１培地分析処理が２回以上繰り返し行われるように、インキュベーション部２３０、培地交換部２５０および第１培地分析部２９１の動作を制御する。例えば、ある培地が収容された培養容器１０に対して、インキュベーション処理、培地交換処理および第１培地分析処理がｋ回（ｋは２以上の整数である）繰り返し行われる場合、１回目のインキュベーション処理、１回目の培地交換処理、１回目の第１培地分析処理、２回目のインキュベーション処理、２回目の培地交換処理、２回目の第１培地分析処理、・・・・、ｋ回目のインキュベーション処理、ｋ回目の培地交換処理、ｋ回目の第１培地分析処理が順次行われる。
【００９９】
第１判定部３２０は、所定流出量毎の培養培地の物性値に基づき多能性幹細胞の未分化状態を判定するための第１判定処理を行う。
【０１００】
第２判定部３３０は、培養培地の総流出量に基づき前記未分化状態の判定された多能性幹細胞の細胞培養容器の流路上の位置を判定するための第２判定処理を行う。
【０１０１】
観察条件調整部３４０は、第１判定処理および第２判定処理で得られた判定結果に基づいて、細胞形態観察処理における観察条件を調整する。例えば、第１判定処理および第２判定処理において、培養容器１０中の特定の位置の細胞が未分化状態であると判定された場合、観察条件調整部３４０は、次回の細胞形態観察処理における観察感度を向上させるために、観察倍率、観察回数、観察ポイント数等を増加させる。
【０１０２】
入力部４１０は、例えば、オペレータが操作するキーボード、マウス等のポインティングデバイスから構成され、オペレータからの指示（例えば、処理の開始指示、処理結果の表示指示等）、各処理に必要なデータの入力等の各種操作信号を入力する。入力されたデータは、制御部３００により記憶部４３０に記憶される。
【０１０３】
出力部４２０は、例えば、ディスプレイ等から構成され、各種手段によって取得または分析された結果（例えば、観察画像等の観察結果、細胞外代謝物の変動値またはその経時的変化等の分析結果）を出力する。
【０１０４】
記憶部４３０は、例えば、ＲＡＭ、ハードディスク等のストレージから構成され、各種データ、各種プログラム等を記憶する。記憶部４３０には、例えば、培養容器の属性情報（例えば、細胞の種類、培地の種類、継代の履歴等）と、インキュベーション処理条件（例えば、温度等）、インキュベーション処理スケジュール（例えば、インキュベーション処理の開始時刻、終了時刻等）、細胞培養培地からの培養培地の流出条件（例えば、流出速度、流出時期、流出期間等）、細胞形態観察条件（例えば、観察のインターバル、観察倍率、観察回数、観察ポイント数、撮像条件等）、各種判定を行うときの判定条件（例えば、基準範囲）等の情報が記憶されている。
【０１０５】
報知部４４０は、例えば、培養容器１０中の細胞が不良な状態（例えば、分化を開始した状態）であると判定されたときに、警告を外部に出力する。例えば、報知部４４０は、出力部４２０に警告表示を出力する。
【０１０６】
以下、図９を参照して、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の一実施形態について説明する。図９は、細胞培養装置１００が行う細胞培養処理手順の第１実施形態を示すフローチャートである。
【０１０７】
オペレータからの開始指示が入力部４１０から入力されると、動作制御部３１０は、容器搬入出部２１０を制御して、細胞搬入処理を実行する（ステップＳ５０１）。細胞搬入処理では、培養すべき細胞（未分化状態の多能性幹細胞）が収容された容器が、細胞培養装置１００の外部から容器搬入出部２１０へ搬入される。
【０１０８】
ステップＳ５０１の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、容器搬入出部２１０へ搬入された容器を容器搬入出部２１０から細胞播種部２２０へ搬送し、次いで、細胞播種部２２０を制御して、細胞播種処理を実行する（ステップＳ５０２）。細胞播種処理では、培養すべき細胞（未分化状態の多能性幹細胞）が、細胞培養に使用されていない新しい培養容器１０に播種される。この際、培養容器１０には、細胞とともにインキュベーション処理に使用されていない新鮮な培地が収容される。
【０１０９】
ステップＳ５０２の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、未分化状態の多能性幹細胞および新鮮な培地が収容された培養容器１０を細胞播種部２２０からインキュベーション部２３０へ搬送し、次いで、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対してインキュベーション処理を開始する（ステップＳ５０３）。動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されているインキュベーション処理条件を参照し、細胞培養に適した所定条件下でインキュベーション処理が実現されるように、インキュベーション部２３０を制御する。インキュベーション処理では、培養容器１０が細胞培養に適した環境下に置かれ、培養容器１０中の細胞が生育および増殖する。
【０１１０】
ステップＳ５０３の後、動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されているインキュベーション処理スケジュールを参照し、現時点が培地交換時刻であるか否かを判定する（ステップＳ５０４）。培地交換時刻は、例えば、インキュベーション処理の開始後、所定時間（例えば、２４時間）が経過した時点である。
【０１１１】
動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻でないと判定した場合（Ｎｏ側）、インキュベーション処理を続行する。動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻であると判定するまで、インキュベーション処理を続行する。
【０１１２】
動作制御部３１０は、現時点が培地交換時刻であると判定した場合（Ｙｅｓ側）、インキュベーション処理を終了し（ステップＳ５０５）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０をインキュベーション部２３０から培地交換部２５０へ搬送し、培地交換処理（ステップＳ５０６）に移行する。
【０１１３】
動作制御部３１０は、培養容器１０を培地交換部２５０へ搬送した後、培地交換部２５０を制御して、培養容器１０に対して培地交換処理を実行する（ステップＳ５０６）。培地交換処理において、培養容器１０中のインキュベーション処理済み培地は、インキュベーション処理に使用されていない新鮮な培地と交換される。
【０１１４】
ステップＳ５０６の後、動作制御部３１０は、第１培地分析部２９１を制御して、培地交換処理で培地から流出するインキュベーション処理済み培地の所定流量毎の物性値を測定する第１培地分析処理を実行する。また、動作制御部３１０は、第２培地分析部２９２を制御して、培地交換処理で培地から流出するインキュベーション処理済み培地の総流量を分析および算出する第２培地分析処理を実行する（ステップＳ５０７）。
【０１１５】
ステップＳ５０６の後、動作制御部３１０は、第１判定部３２０を制御して、第１培地分析部２９１によって算出された所定流出量毎の培養培地の物性値に基づいて培養容器１０の多能性幹細胞の未分化状態を判定し、さらに、第２判定部３３０を制御して、第２培地分析部２９２によって算出された培養培地の総流出量に基づいて未分化状態の判定された多能性幹細胞の培養容器１０の流路上の位置を判定する（ステップＳ５０８）。例えば、第１判定部３２０は、取得した所定流出量毎の培養培地の物性値に基づいて、当該物性値が基準物性値と比較してどの程度変動しているかを分析し、変動度が基準範囲内にあるとき、当該細胞は未分化状態であると判定し、変動度が基準範囲外であるとき、当該細胞は未分化状態でないと判定することができる。また、第２判定部３３０は、第１判定部３２０が不要な細胞（例えば、分化を開始した細胞、成長状態が不良な細胞等）が存在すると判定した場合、不要な細胞が存在する容器中の位置を特定し、その位置情報を記憶部４３０に記憶させることができる。
【０１１６】
ステップＳ５０８において、第１判定部３２０が、不要な細胞が存在すると判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０から細胞剥離部２６０へ搬送し、次いで、細胞剥離部２６０を制御して、培養容器１０に対して細胞剥離処理を実行する（ステップＳ５０９）。動作制御部３１０は、記憶部４３０に記憶されている不要な細胞の位置情報に基づいて、不要な細胞を選択的に剥離する。細胞剥離処理で剥離された細胞は、培地中に浮遊した状態にあり、培地交換処理の際に古い培地とともに除去される。
【０１１７】
ステップＳ５０８において、第１判定部３２０が、不要な細胞が存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を細胞回収部２７０へ搬送し、細胞回収処理（ステップＳ５１０）に移行する。
【０１１８】
また、ステップＳ５０８において、第１判定部３２０が、不要な細胞が存在しないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、培養容器１０が培養終了条件を満たすか否かをさらに判定するステップを実行してもよい。培養終了条件としては、例えば、培養容器１０中の細胞数が閾値以上であること（コンフルエント状態またはそれに近い状態）、インキュベーション処理が所定時間行われたこと等が挙げられる。培養容器１０中の細胞数を培養終了条件とする場合、動作制御部３１０は、細胞形態観察処理部２４０で取得された観察画像および／またはその処理画像に基づいて、培養容器１０中の細胞数を分析する。
【０１１９】
培養容器１０が培養終了条件を満たさないと判定した場合（Ｎｏ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０からインキュベーション部２３０へ搬送し、インキュベーション部２３０を制御して、培養容器１０に対してインキュベーション処理を再開する（ステップＳ５０３）。動作制御部３１０は、培養容器１０が培養終了条件を満たすと判定するまで、ステップＳ５０３〜ステップＳ５０９の一連の処理を繰り返し実行することができる。
【０１２０】
培養容器１０が培養終了条件を満たすと判定した場合（Ｙｅｓ側）、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０を培地交換部２５０から細胞回収部２７０へ搬送し、次いで、細胞回収部２７０を制御して、培養容器１０に対して細胞回収処理を実行する（ステップＳ５１０）。細胞回収処理では、培養容器１０から細胞が回収され、別の容器に収容される。
【０１２１】
ステップＳ５１０の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０から回収された細胞が収容された容器を細胞回収部２７０から容器搬入出部２１０へ搬送し、次いで、容器搬入出部２１０を制御して、容器を細胞処理装置１００の外部へ搬出する（ステップＳ５１１）。
【０１２２】
ステップＳ５１１の後、動作制御部３１０は、容器搬送部２８０を制御して、培養容器１０から回収された細胞が収容された容器を細胞回収部２７０から細胞播種部２２０へ搬送し、次いで、細胞播種部２２０を制御して、容器中の細胞を新しい培養容器１０に播種し、継代培養処理を実行してもよい。この場合、細胞播種処理後の処理は上記と同様に行われる。
【実施例】
【０１２３】
以下に、具体的な実施例に則して本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例の特定の態様により制限されると理解されるべきではない。本発明には、実施例に開示された発明のあらゆる改変や変更が含まれると理解されるべきである。
【０１２４】
実施例１：多能性幹細胞の未分化状態と培養培地成分との関係についての検討
本実施例では、多能性幹細胞の未分化状態を評価するための培地解析方法について検討した。
【０１２５】
（細胞培養容器の準備）
本実施例では、図１Ａ〜図１Ｃに準じて、図１０の写真に示される一本鎖閉鎖系の細胞培養容器を用いた。当該細胞培養容器の詳細は以下の通りであった。
細胞培養容器全体の寸法；２７．６ｍｍ×８５．４ｍｍ×１０ｍｍ
通路１２の幅；２．５ｍｍ
通路１２のアスペクト比−幅：高さ：通路長さ＝３：４：１８００
細胞播種領域２０ａのピッチ（中心間隔）；３ｍｍ
細胞播種領域２０ａの縁の間隔；０．１ｍｍ
細胞播種領域２０ａの内側の表面粗さＲａ；０．１５
細胞播種領域２０ａの外側の表面粗さＲａ；０．７
細胞播種領域の窪み： なし
平板３２の厚み；５０μｍ
容器本体の材料；ポリスチレン
平板の材料； ポリスチレン
接着方法： 超音波溶着
流入口１１および流出口１３には、シリンジの先端を挿入可能なスリット付のゴム栓を設置した。
【０１２６】
（細胞培養および培養培地の回収）
以下の実験では、多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人  先端医療振興財団  細胞評価グループ  川真田研究室による樹立株）を用い、ＥＣＭとしてビトロネクチン−Ｎ（Ｇｉｂｃｏ社製、製品番号：Ａ１４７００）を用いた。
また、未分化維持培養培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８培地（Ｇｉｂｃｏ社製、製品番号：Ａ１５１７００１）を用いた。
また、分化誘導因子含有培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８培地に外胚葉への分化誘導因子であるＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社製、製品番号：１９２−１６５４１）およびＮｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、製品番号：１２０−１０Ｃ）がそれぞれ５×１０−６ｍｏｌ／Ｌおよび５００×１０−９ｍｏｌ／Ｌとなるように添加された培養培地を用いた。
【０１２７】
未分化維持培養培地に、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ社、製品番号：２５１−００５１４）が１×１０６ｍｏｌ／Ｌになるよう添加された培地を用いて細胞密度が１００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２になるようｉＰＳ細胞をシングルセルで細胞培養容器中に播種し（播種後０日（ｄａｙ０））、播種後５日目（ｄａｙ５）まで培養を行った。培地交換については、播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）に、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない未分化維持培養培地を用いて全量交換（１８ｍＬ）した。なお、播種後１日目（ｄａｙ１）以降の培地交換の際には、図１０の破線域（I）内に外胚葉分化細胞が形成されかつ破線域（II）内に未分化細胞が形成されることを期待して分化誘導因子を細胞培養容器中に加える処理を行った。具体的には、未分化維持培養培地を用いた培地交換処理後、流出口から、分化誘導因子含有培地を４ｍＬ送液し次いで未分化維持培養培地を２ｍＬ送液した。
【０１２８】
播種後５日目（ｄａｙ５）の細胞形態の観察を、ＣＣＤ付き光学顕微鏡（オリンパス社製、製品番号：ＩＸ８１およびＤＰ７２）を用いて行った。光学顕微鏡による破線域（I）内（総送液量４．５ｍＬ付近）の細胞形態像（Ａ）および破線域（II）内（総送液量１１．５ｍＬ付近）の細胞形態像（Ｂ）は図１１Ａおよび図１１Ｂに示される通りである。破線域（I）の細胞形態像および破線域（II）の細胞形態像との形態的な相違は確認されなかった。
【０１２９】
１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）培地交換時には、流入口から１ｍＬのエアプラグを挿入した後に新たな培地を送液し、使用済みの培地を逐次的に一定量（１ｍＬ）ずつ送液してバイアルに回収し、ＬＣ−ＭＳ分析（ＬＣＭＳ８０５０およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ  細胞培養プロファイリング、島津製作所製）により乳酸および２−アミノアジピン酸の存在量を測定した。また、なお、乳酸は細胞数と相関が高いことが知られており、２−アミノアジピン酸は外胚葉分化マーカーとして知られている。
【０１３０】
結果は、図１２Ａおよび図１２Ｂに示される通りであった。
細胞数と相関の高い乳酸の存在量は、試験中ほぼ一定である一方で、破線域（I）内（総送液量４．５ｍＬ付近）では、外胚葉分化マーカーである２−アミノアジピン酸の存在量は上昇していた。細胞形態では検知されなかった容器内に局所的に存在する分化細胞を高感度で検出された。
【０１３１】
参考例：培地成分の拡散とエアプラグとの関係についての検討
エアプラグが、培地を回収時の培地内成分の拡散にどの程度影響するかについて確認することを目的として、純水に着色料（メチレンブルー）を吸光度が１付近となるように添加された着色水を用いて以下の予備試験１および２を行った。
予備試験１では、着色水の充填された細胞培養容器に、流入口からエアプラグ１ｍＬを挿入し、次に着色料を含まない純水を送液し、流出口から逐次的に一定量（４ｍＬ）ずつバイアルに培地を回収し、紫外可視分光光度計による吸光度測定より培地中の着色料の相対濃度を確認した。
また、予備試験２では、エアプラグを挿入しない以外、予備試験２と同様に着色料の相対濃度を確認した。
【０１３２】
結果は、図１３に示される通りであった。
予備試験１（エアプラグあり）では着色料の相対濃度は総送液量にかかわらずほぼ一定であったに対し、予備試験２（エアプラグなし）では総送液量が高くなるほど培地中の着色濃度は低下する傾向が確認された。
【０１３３】
実施例２：多能性幹細胞の未分化状態と培養培地成分との関係についての検討２
ヒトｉＰＳ細胞を、以下の２つの条件で培養し、分化状態の異なる２つの細胞群（Ａ群、Ｂ群）を準備した。なお、いずれの群についても、ＥＣＭとしてビトロネクチン−Ｎ（Ｇｉｂｃｏ社製、製品番号：Ａ１４７００１）を用いた。また、未分化維持培地としては、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８（Ｇｉｂｃｏ社製、製品番号：Ａ１５１７００１）を用いた。
Ａ群：未分化維持培養培地にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ社、製品番号：２５１−００５１４）が１×１０６ｍｏｌ／Ｌになるよう添加された培地を用いてｉＰＳ細胞をシングルセルで播種し（播種後０日（ｄａｙ０））、播種後１日目（ｄａｙ１）以降はＲＯＣＫ阻害剤を含まない未分化維持培養培地を用いて培養。
Ｂ群：未分化維持培養培地にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ社、製品番号：２５１−００５１４）が１×１０６ｍｏｌ／Ｌになるよう添加された培地を用いて細胞密度が１００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２になるようｉＰＳ細胞をシングルセルで播種し（播種後０日（ｄａｙ０））、播種後１日目（ｄａｙ１）からは、未分化維持培地に分化誘導因子であるＢＭＰ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製、製品番号：１２０−０５）が４０×１０−９ｍｏｌ／Ｌとなるように添加された培養培地を用いて培養。
【０１３４】
Ａ群、Ｂ群のいずれも、マルチウェルプレート（６ウェル）（ＢＤ社製、製品番号：３５３０４６）を用いて播種後６日目（ｄａｙ６）まで培養を行った。培地交換については、播種後１日目（ｄａｙ１）、２日目（ｄａｙ２）、３日目（ｄａｙ３）、４日目（ｄａｙ４）、５日目（ｄａｙ５）、および６日目（ｄａｙ６）に、全量交換（４ｍＬ）し、使用済み培地を回収した。
【０１３５】
（細胞形態の観察）
播種後１日目（ｄａｙ１；ｄ１）、２日目（ｄａｙ２；ｄ２）、３日目（ｄａｙ３；ｄ３）、４日目（ｄａｙ４；ｄ４）、５日目（ｄａｙ５；ｄ５）および６日目（ｄａｙ６；ｄ６）の細胞形態の観察を、実施例１と同様、ＣＣＤ付き光学顕微鏡（オリンパス社製、製品番号：ＩＸ８１およびＤＰ７２）を用いて行った。
【０１３６】
Ａ群およびＢ群の結果はそれぞれ、図１４Ａおよび図１４Ｂに示される通りであった。Ａ群では細胞が緻密に集合したコロニーあるいは海島構造を形成しており、一つ一つの細胞が小さい。これは未分化細胞に特徴的な細胞形態である。よってＡ群は、未分化の細胞であることが確認された。一方、Ｂ群では細胞密度が疎で、一つ一つの細胞が大きい。これは分化細胞に特徴的な細胞形態である。よって、Ｂ群は分化を開始した細胞であることが確認された。
【０１３７】
また、１日目（ｄａｙ１；ｄ１）、２日目（ｄａｙ２；ｄ２）、３日目（ｄａｙ３；ｄ３）、４日目（ｄａｙ４；ｄ４）、５日目（ｄａｙ５；ｄ５）および６日目（ｄａｙ６；ｄ６）の培地交換時に得られた使用済みの培地について、蛍光分光光度計（Ｆ７０００、日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて３次元蛍光スペクトル測定を行い、励起波長（Ｅｘ）と蛍光波長（Ｅｍ）とをそれぞれ掃引して蛍光強度をマッピングした。
【０１３８】
ここで、測定条件は、以下の通りである。
温度：２３〜２５℃
励起波長：２１０〜３８０ｎｍ、間隔４ｎｍ
蛍光波長：２７０〜５５０ｎｍ、間隔２ｎｍ
スキャンスピード：２４００ｎｍ／ｍｉｎ
励起側スリット：５ｎｍ
蛍光側スリット：５ｎｍ
ホトマル電圧：４００Ｖ
【０１３９】
Ａ群およびＢ群について得られた３次元蛍光スペクトルはそれぞれ、図１５Ａおよび図１５Ｂに示される通りであった。
【０１４０】
次に、得られた３次元蛍光スペクトルに対して、Ｒ （ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．２）を用いて多変量解析（主成分分析および階層的クラスタリング）を行い、分化細胞と未分化細胞の判別、および分化細胞または未分化細胞に特徴的な蛍光強度の挙動を示すＥｘ―Ｅｍの組み合わせの抽出を行った。具体的には、Ａ群およびＢ群のｄ２からｄ６までの３次元蛍光スペクトルデータを入力データとして主成分分析を行い、得られる主成分スコアを用い分化細胞と未分化細胞の判別を行った。また、Ａ群およびＢ群のｄ２からｄ６までの３次元蛍光スペクトルデータを入力データとして階層的クラスタリングを行い、蛍光強度の挙動の類似するＥｘ−Ｅｍの組み合わせの集まり（以下クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）と呼称する）として分類・可視化することで、分化細胞または未分化細胞に特徴的なＥｘ―Ｅｍの組み合わせの抽出を行った。
【０１４１】
上記主成分分析の結果、図１６に示される通り、２日目（ｄａｙ２）より初期の分化細胞が検出された。
【０１４２】
また、階層的クラスタリングによる分類結果を図１７に示す。全５０個のクラスターのなかでも、分化細胞と未分化細胞との間で大きな差異を示す、特徴的な蛍光強度の挙動を示すクラスターの平均相対蛍光強度を図１８に示す。図１７および図１８の結果に基づいて、未分化細胞または分化細胞で特徴的な挙動を示すＥｘ−Ｅｍの組み合わせを抽出した。その結果、３日目（ｄａｙ３）以降であれば、少なくとも特定のＥｘ−Ｅｍにおける蛍光強度（例えばｃｌｕｓｔｅｒ−３１に分類される、Ｅｘ＝３６０nm、Ｅｍ＝４５０nm）をモニタするのみで分化細胞を検出可能であることが確認された。この結果から、培地に対する特定のＥｘ−Ｅｍにおける蛍光強度を、例えばフローセルを有する蛍光分光光度計で使用済み培地の回収と同時に連続測定することにより、迅速に分化細胞および未分化細胞を検出しうることが確認された。
【符号の説明】
【０１４３】
１０  培養容器
１１  流入口
１２  流路
１３  流出口
２１  容器本体
２２  平板
３１  細胞
１００  細胞培養装置
２００  細胞処理部
２１０  容器搬入出部
２２０  細胞播種部
２２１  細胞懸濁液調製部
２２２  供給流路
２２３  細胞供給用タンク
２２４  流入管路
２２５  流量調整器
２２６  細胞回収用タンク
２２７  流出管路
２２８  流量調整器
２３０  インキュベーション部
２３１  容器収容部
２３２  載置部
２３３  環境調整部
２４０  細胞形態観察部
２４１  ミクロ観察系の撮像部
２４２  マクロ観察系の撮像部
２４３  画像処理部
２５０  培地交換部
２５１  培地供給用タンク
２５２  流入管路
２５３  流量調整器
２５４  培地回収機構
２５４ａ  バイアル分注機構
２５４ｂ  フローセル
２５５  流出管路
２５６  流量調整器
２５７  フィルタ
２５８  ドレイン
２６０  細胞剥離部
２６１  光源
２６２  収光部
２６３  光ファイバー
２７０  細胞回収部
２７１ａ  剥離剤溶液供給用タンク
２７１ｂ  培地供給用タンク
２７２  流入管路
２７３  流量調整器
２７４ａ  剥離剤溶液回収用タンク
２７４ｂ  細胞回収用タンク
２７５  流出管路
２７６  流量調整器
２８０  容器搬送部
２９１  第１培地分析部
２９２  第２培地分析部
３００  制御部
３１０  動作制御部
３２０  第１判定部
３３０  第２判定部
３４０  観察条件調整部
４１０  入力部
４２０  出力部
４３０  記憶部
４４０  報知部
【図１Ａ】
2020191783.tif 000003
【図１Ｂ】
2020191783.tif 000004
【図１Ｃ】
2020191783.tif 000005
【図１Ｄ】
2020191783.tif 000006
【図２】
2020191783.tif 000007
【図３】
2020191783.tif 000008
【図４】
2020191783.tif 000009
【図５】
2020191783.tif 000010
【図６Ａ】
2020191783.tif 000011
【図６Ｂ】
2020191783.tif 000012
【図６Ｃ】
2020191783.tif 000013
【図７】
2020191783.tif 000014
【図８】
2020191783.tif 000015
【図９】
2020191783.tif 000016
【図１０】
2020191783.tif 000017
【図１１】
2020191783.tif 000018
【図１２Ａ】
2020191783.tif 000019
【図１２Ｂ】
2020191783.tif 000020
【図１３】
2020191783.tif 000021
【図１４Ａ】
2020191783.tif 000022
【図１４Ｂ】
2020191783.tif 000023
【図１５Ａ】
2020191783.tif 000024
【図１５Ｂ】
2020191783.tif 000025
【図１６】
2020191783.tif 000026
【図１７】
2020191783.tif 000027
【図１８】
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