(57)【要約】【課題】膵臓癌治療のための方法及び組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、膵臓癌治療のための方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、ゲムシタビン及び／又は放射線治療と組み合わせた、特定のＡＴＲ阻害剤での、膵臓癌の治療に関する。本発明はまた、非小細胞肺癌治療のための方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線と組み合わせたＡＴＲ阻害剤での、非小細胞肺癌の治療に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＲ阻害剤など。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
膵臓癌は、１０番目に多い新生癌部位であり、癌関連死全体の６％を占める。５年生存率は５％未満である。
【０００２】
現在の治療には、化学療法（例えばゲムシタビン）及び／又は放射線治療、あるいは外科的除去の後の補助化学療法（例えばゲムシタビン）又は放射線治療が含まれる。ゲムシタビン治療による生存率は、５年生存率を１０％から２０％に増加させるが、膵臓癌治療のより良い療法に対して強いニーズが依然として存在する。
【０００３】
いくつかの治療薬で第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相治験が実施されているが、あまり有望な結果は得られていない。経口ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であるチピファルニブは、ゲムシタビンとの併用時に、全生存期間の顕著な改善は示していない。同様に、表皮成長因子受容体（ＥＧＲＦ）であるセツキシマブも、ゲムシタビンとの併用時に、全生存期間の顕著な改善は示していない。全生存期間のわずかな増加（６．２４か月対５．９１か月）のみが観察されている。
【０００４】
肺癌は２番目に多い癌形態であり、癌関連死亡率で筆頭の原因である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は肺癌で最も多い形態であり、全肺癌症例の約８５％を占める。多くの患者は、進展期ＩＩＩ期又はＩＶ期のＮＳＣＬＣを呈し、５年生存率はそれぞれ２４％及び４％である。来院時に進展した病状であることから、外科的切除はしばしば、選択肢とはならない。患者治療の大半は、化学療法及び／又は放射線治療を伴う。化学療法の選択は進展段階、患者の能力基準、及び地域的な好みによって大きく異なる。多くの場合、化学療法は、プラチナ製剤（例えばシスプラチン又はカルボプラチン）及び第２の細胞毒性薬（例えばゲムシタビン、エトポシド又はタキソテール）を含むダブレットに基づく。少数の患者に対して、例えばＡＬＫ及びＥＧＦＲなどの、突然変異又は異常調節された特定のタンパク質を標的とした薬剤（例えばクリゾチニブ、ゲフィニチブ及びエルロチニブ）による治療が含まれ得る。これらの標的治療のための患者は、遺伝子又はプロテオームマーカーに基づいて選択される。進行期ＮＳＣＬＣの臨床試験で数多くの薬剤の評価が行われているが、多くは化学療法ベースの治療に対してごくわずかしか効果を示しておらず、全生存期間中央値は典型的に１１か月未満である。
【０００５】
したがって、膵臓癌及び非小細胞肺癌の治療を改善するための新しい戦略の多大なニーズが存在する。
【０００６】
ＡＴＲ（「ＡＴＭ及びＲａｄ３関連」）キナーゼは、特定の形態のＤＮＡ損傷（例えば二重鎖破断及び複製ストレス）に対する細胞応答に関与するプロテインキナーゼである。ＡＴＲキナーゼはＡＴＭ（「血管拡張性失調症変異」）キナーゼ及び他の多数のタンパク質と協調して作用し、二重鎖ＤＮＡ破断及び複製ストレスに対する細胞の応答（一般にＤＮＡ損傷応答（「ＤＤＲ」）と呼ばれる）を調節する。ＤＤＲはＤＮＡ修復を刺激し、生存を促進し、細胞周期チェックポイントの活性化により細胞周期進行を失速させることで修復の時間を稼ぐ。ＤＤＲがない場合、細胞はＤＮＡ損傷に対してより敏感になり、ＤＮＡ複製などの内因性細胞プロセスや、癌治療に一般的に使用される外因性ＤＮＡ損傷剤によって生じるＤＮＡ疾患によって容易に細胞死する。
【０００７】
健康な細胞は、ＤＤＲキナーゼＡＴＲ及びＡＴＭを含むＤＮＡ修復用のさまざまなタンパク質の宿主に依存し得る。いくつかの場合において、これらのタンパク質は、機能的に冗長なＤＮＡ修復プロセスを活性化することによって、互いに補償することができる。一
方、多くの癌細胞はいくつかのＤＮＡ修復プロセス（例えばＡＴＭシグナリング）における欠陥を内包しており、よって、ＡＴＲを含む無傷の残存ＤＮＡ修復タンパク質に対してより大きな依存性を呈する。
【０００８】
加えて、多くの癌細胞は活性化された腫瘍遺伝子を発現しているか、あるいは主な腫瘍抑制遺伝子を欠いており、これによりこれらの癌細胞はＤＮＡ複製の調節不全フェーズの影響を受けやすく、これによってＤＮＡ損傷が起こる。ＡＴＲは、ＤＮＡ複製の妨害に応答するＤＤＲの重要な構成要素とされている。その結果、これらの癌細胞は、健康な細胞に比べ、生存するためにＡＴＲ活動により依存的になる。したがってＡＴＲ阻害剤は、単独使用で、又はＤＮＡ損傷剤と組み合わせて使用することによって、癌治療に有用であり得る。これは、多くの癌細胞にとって、健康な正常細胞にとってよりも、細胞生存のためにＤＮＡ修復メカニズムが重要であり、ＡＴＲ阻害剤はこのＤＮＡ修復メカニズムをシャットダウンするからである。
【０００９】
実際に、ＡＴＲ機能の妨害（例えば遺伝子欠損により）は、ＤＮＡ損傷剤の不在下と存在下の両方において、癌細胞の死を促進することが示されている。このことは、ＡＴＲ阻害剤が単独剤として、及び放射線療法又は遺伝子毒性化学療法に対する有効な増感剤としての両方において、有効であり得ることを示す。
【００１０】
更に、固形腫瘍はしばしば、低酸素（酸素レベルが低い）である領域を含む。これは、低酸素癌細胞が治療（特に顕著なのはＩＲ治療）に対して抵抗性であり、かつ非常に攻撃的であることが知られているため、大きな意味をもつ。この観察が生じる理由の１つは、ＤＤＲの構成要素が低酸素状態下で活性化され得ることであり、低酸素細胞は生存のためのＤＤＲに対する依存度が高いことが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これらのすべての理由から、膵臓癌治療、肺癌治療、及び低酸素と正常酸素両方の癌細胞に対して有効な薬剤の開発のため、効力がありかつ選択的なＡＴＲ阻害剤の開発のニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、膵臓癌及び非小細胞肺癌の治療のための、ＡＴＲ阻害剤の使用に関する。膵臓癌について、本発明は、ゲムシタビン及び／又は放射線治療と組み合わせたＡＴＲ阻害剤での、患者（例えばヒト）における膵臓癌の治療方法に関する。出願者らは、クローン原性アッセイ及びバイアビリティアッセイにおいて、膵臓癌細胞株（例えばＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２及びＰａｎｃ−１）並びに原発腫瘍株（例えばＰａｎｃ−Ｍ）に対する、ゲムシタビン及び／又は放射線治療にＡＴＲ阻害剤を組み合わせた場合の共力効果を示している。ＡＴＲ活性の妨害は、Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ  ３４５）のＤＮＡ損傷誘発リン酸化の評価、及び放射線照射後のＤＮＡ損傷病巣及びＲＡＤ５１病巣の評価によって測定された。
【００１３】
非小細胞肺癌について、本発明は、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線と組み合わせたＡＴＲ阻害剤での、非小細胞肺癌の治療方法に関する。出願者らは、３５のヒト肺癌細胞株パネルに対する生存性アッセイにおいて、シスプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、オキサリプラチン（oxaplatin）及びイリノテカンと組み合
わせたＡＴＲ阻害剤の共力効果を示し、並びに、シスプラチンと組み合わせた場合の、肺癌マウスモデルにおけるインビボ有効性を示している。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
次式：
【表４】
2020059753.tif 000002
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、ゲムシタビン、放射線治療、又はゲムシタビンと放射線治療の両方を合わせたものから選択される別の癌治療と組み合わせて、患者に投与することにより、該患者体内の膵臓癌を治療する方法。
（項目２）
次式：
【表５】
2020059753.tif 000003
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、ゲムシタビン又は放射線治療から選択される癌治療と組み合わせて、患者に投与することにより、該患者体内の膵臓癌細胞の該癌治療に対する感受性を増感させる方法。
（項目３）
前記癌治療がゲムシタビンである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記癌治療が放射線治療である、項目１に記載の方法。
（項目５）
次式：
【表６】
2020059753.tif 000004
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、ゲムシタビン又は放射線治療から選択される癌治療と組み合わせて、患者に投与することにより、低酸素状態膵臓癌細胞を該癌治療に対して感作させる方法。
（項目６）
次式：
【表７】
2020059753.tif 000005
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、ゲムシタビン及び／又は放射線と組み合わせて患者に投与することを含む、膵臓癌細胞におけるＣｈｋ１（Ｓｅｒ  ３４５）のリン酸化を阻害する方法。
（項目７）
次式：
【表８】
2020059753.tif 000006
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、放射線治療と組み合わせて患者に投与することによる、低酸素状態膵臓癌細胞を放射線感作させる方法。
（項目８）
次式：
【表９】
2020059753.tif 000007
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、ゲムシタビンと組み合わせて患者に投与することによる、低酸素状態膵臓癌細胞を感作させる方法。
（項目９）
次式：
【表１０】
2020059753.tif 000008
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、化学放射線と組み合わせて患者に投与することにより、膵臓癌細胞を化学放射線に対して感作させる方法。
（項目１０）
前記化学療法がゲムシタビンである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
次式：
【表１１】
2020059753.tif 000009
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、放射線治療と組み合わせて患者に投与することにより、損傷誘発された細胞周期チェックポイントを妨害する方法。
（項目１２）
次式：
【表１２】
2020059753.tif 000010
から選択されるＡＴＲ阻害剤を、放射線治療と組み合わせて患者に投与することにより、膵臓癌細胞の相同組換えによるＤＮＡ損傷修復を阻害する方法。
（項目１３）
前記膵臓癌細胞が、ＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２又はＰａｎｃ−１から選択される膵臓細胞株から誘導される、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記膵臓癌細胞が、癌患者の体内にある、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。（項目１５）
前記化合物が患者に投与される、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記化合物が膵臓癌細胞に投与される、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
患者の体内の非小細胞肺癌を治療する方法であって、式８２１又は８２２：
【表１３】
2020059753.tif 000011
の化合物を、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線のうちの１つ以上の追加治療薬と組み合わせて該患者に投与することを含む、方法。
（項目１８）
式８２１又は８２２の化合物を、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線からなる癌治療と組み合わせて患者に投与することを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記癌治療がシスプラチン又はカルボプラチン及びエトポシドである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記癌治療がシスプラチン又はカルボプラチン及びエトポシド並びに電離放射線である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記癌治療が電離放射線である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記ＡＴＲ阻害剤が８２２である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】ＶＥ−８２１は膵臓癌細胞を放射線感作させる。  Ａ）Ｃｈｋ１阻害のウェスタンブロット解析。  細胞を１００ｎＭゲムシタビンで１時間処理し、１時間後に１μＭ  ＶＥ−８２１を加え、それから１時間後に細胞に照射（６Ｇｙ）を行った。実験の持続時間にわたって薬剤をそのままにし、照射から２時間後に細胞を溶解させ、ウェスタンブロット解析を行った。  Ｂ）ＶＥ−８２１は膵臓癌細胞を放射線感作させるが、正常な線維芽細胞は感作させない。  ＰＳＮ−１、Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ−２膵臓癌細胞株及びＭＲＣ５線維芽細胞を、複数の増加濃度のＶＥ−８２１で９６時間処理し、ＶＥ−８２１添加から１時間後に４Ｇｙ照射を併用し、又は併用なしであった。８日後に細胞バイアビリティを測定し、ＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化した。  Ｃ）ＶＥ−８２１のスケジューリングが放射線感受性に影響する。  ＰＳＮ−１細胞を、単一細胞として培養し、４Ｇｙ照射に対して異なる時点で１μＭ  ＶＥ−８２１で処理し、１０日後にコロニー形成を評価した。各処理スケジュールについて、照射されていない細胞の相対的培養効率を考慮に入れて、４Ｇｙでの生存割合を測定した。  Ｄ）ＡＴＲ阻害に応答した膵臓癌細胞のクローン原性生存。細胞の培養から４時間後、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理し、１時間経ってから照射を行った。７２時間後に薬剤を除去し、１０〜２１日後にコロニー形成能力を評価した。（ｎ＝３）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１（ＤＭＳＯ処理対照群と比較）。
【図１−２】ＶＥ−８２１は膵臓癌細胞を放射線感作させる。  Ａ）Ｃｈｋ１阻害のウェスタンブロット解析。  細胞を１００ｎＭゲムシタビンで１時間処理し、１時間後に１μＭ  ＶＥ−８２１を加え、それから１時間後に細胞に照射（６Ｇｙ）を行った。実験の持続時間にわたって薬剤をそのままにし、照射から２時間後に細胞を溶解させ、ウェスタンブロット解析を行った。  Ｂ）ＶＥ−８２１は膵臓癌細胞を放射線感作させるが、正常な線維芽細胞は感作させない。  ＰＳＮ−１、Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ−２膵臓癌細胞株及びＭＲＣ５線維芽細胞を、複数の増加濃度のＶＥ−８２１で９６時間処理し、ＶＥ−８２１添加から１時間後に４Ｇｙ照射を併用し、又は併用なしであった。８日後に細胞バイアビリティを測定し、ＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化した。  Ｃ）ＶＥ−８２１のスケジューリングが放射線感受性に影響する。  ＰＳＮ−１細胞を、単一細胞として培養し、４Ｇｙ照射に対して異なる時点で１μＭ  ＶＥ−８２１で処理し、１０日後にコロニー形成を評価した。各処理スケジュールについて、照射されていない細胞の相対的培養効率を考慮に入れて、４Ｇｙでの生存割合を測定した。  Ｄ）ＡＴＲ阻害に応答した膵臓癌細胞のクローン原性生存。細胞の培養から４時間後、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理し、１時間経ってから照射を行った。７２時間後に薬剤を除去し、１０〜２１日後にコロニー形成能力を評価した。（ｎ＝３）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１（ＤＭＳＯ処理対照群と比較）。
【図２】ＶＥ−８２１は低酸素条件下で膵臓癌細胞を放射線感作させる。  Ａ）１μＭ  ＶＥ−８２１で処理し、低酸素条件下で照射した細胞のクローン原性生存曲線。培養された細胞を低酸素条件（０．５％  Ｏ２）に移し、６時間環境に慣らした。次にＶＥ−８２１（１μＭ）を加え、１時間後に照射し、７２時間置いてから培地を交換した。照射から１時間後に、細胞を正常酸素下に移した。  Ｂ）上述及び図１のように、有酸素及び低酸素（０．５％  Ｏ２）条件下において６Ｇｙで照射し、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した後の、クローン原性生存（ｎ＝３）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１（ＤＭＳＯ処理対照群と比較）。
【図３−１】ＶＥ−８２１は膵臓癌細胞をゲムシタビン治療に対して感作させる。  Ａ）ゲムシタビン及び１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した細胞のクローン原性生存。細胞を、複数の増加濃度のゲムシタビンで２４時間処理し、次に７２時間、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した。１０〜２１日後にコロニー形成能力を評価した。  Ｂ）低酸素条件下でのゲムシタビン処理細胞のクローン原性生存。培養された細胞を低酸素条件（０．５％  Ｏ２）に移し、６時間環境に慣らした。次に、細胞を、複数の増加濃度のゲムシタビンで２４時間処理し、次に７２時間、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した。ＶＥ−８２１添加から１時間後に、低酸素細胞を正常酸素条件下に移した。  Ｃ）上述のように、正常酸素条件及び低酸素条件（０．５％  Ｏ２）において２０ｎＭゲムシタビンとＶＥ−８２１で処理した後のクローン原性生存。  Ｄ）ゲムシタビン及び放射線照射で処理した細胞のクローン原性生存。ＰＳＮ−１及びＭｉａＰａＣａ−２細胞を、それぞれ５ｎＭ又は１０ｎＭゲムシタビンで２４時間処理し、次に培地を交換し、４Ｇｙ照射７２時間後の１時間前から１μＭ  ＶＥ−８２１が加えられた。１０〜２１日後にコロニー形成能力を評価した（ｎ＝３）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１（ＤＭＳＯ処理対照群と比較）。
【図３−２】ＶＥ−８２１は膵臓癌細胞をゲムシタビン治療に対して感作させる。  Ａ）ゲムシタビン及び１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した細胞のクローン原性生存。細胞を、複数の増加濃度のゲムシタビンで２４時間処理し、次に７２時間、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した。１０〜２１日後にコロニー形成能力を評価した。  Ｂ）低酸素条件下でのゲムシタビン処理細胞のクローン原性生存。培養された細胞を低酸素条件（０．５％  Ｏ２）に移し、６時間環境に慣らした。次に、細胞を、複数の増加濃度のゲムシタビンで２４時間処理し、次に７２時間、１μＭ  ＶＥ−８２１で処理した。ＶＥ−８２１添加から１時間後に、低酸素細胞を正常酸素条件下に移した。  Ｃ）上述のように、正常酸素条件及び低酸素条件（０．５％  Ｏ２）において２０ｎＭゲムシタビンとＶＥ−８２１で処理した後のクローン原性生存。  Ｄ）ゲムシタビン及び放射線照射で処理した細胞のクローン原性生存。ＰＳＮ−１及びＭｉａＰａＣａ−２細胞を、それぞれ５ｎＭ又は１０ｎＭゲムシタビンで２４時間処理し、次に培地を交換し、４Ｇｙ照射７２時間後の１時間前から１μＭ  ＶＥ−８２１が加えられた。１０〜２１日後にコロニー形成能力を評価した（ｎ＝３）。＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．０１；＊＊＊，Ｐ＜０．００１（ＤＭＳＯ処理対照群と比較）。
【図４】ＶＥ−８２１は、膵臓癌細胞における照射誘発細胞周期チェックポイントを動揺させる。  ６Ｇｙ照射の１時間前にＶＥ−８２１（１μＭ）を加え、実験時間の間、そのままにした。照射から１２時間又は２４時間後に、細胞を採取して（lifted）固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで細胞周期分布を解析した（ｎ＝３）。
【図５】ＶＥ−８２１は５３ＢＰ１及びγＨ２ＡＸフォーカス数を増加させ、ＲＡＤ５１フォーカス形成を減少させる。  細胞を、示されているように、６Ｇｙ照射に対してさまざまな時点において１μＭ  ＶＥ−８２１で処理し、照射から２４時間後に固定した。この後、細胞を（Ａ）γＨ２ＡＸフォーカス及び（Ｂ）５３ＢＰ１フォーカスについて染色し、それぞれ、細胞当たり７個及び５個を超えるフォーカスを備える細胞のパーセンテージを計った。（Ｃ）Ｒａｄ５１フォーカス形成を解析するため、照射後６時間で細胞を固定し、細胞当たり９個を超えるフォーカスを備える細胞のパーセンテージを計った。それぞれの画像を右に示す（ｎ＝３）。＊，Ｐ＜０．０５  補足図
【図５−１】補足図１  培養効率に対するＶＥ−８２１インキュベーション時間の影響。  ＰＳＮ−１細胞を単一細胞として培養し、さまざまな時間、１ｕＭ  ＶＥ−８２１で処理し、１０日後にコロニー形成を評価した。
【図５−２】補足図２  ＶＥ−８２１は、低酸素条件下で膵臓癌細胞内の照射誘発Ｇ２／Ｍチェックポイントを動揺させる。  細胞を低酸素（０．５％  Ｏ２）条件下で６時間、あらかじめインキュべーションし、１μＭ  ＶＥ−８２１を加え、１時間後に照射（６Ｇｙ）を行った。照射から１時間後に、細胞を正常酸素条件に移し、照射から１２又は２４時間後に細胞を採取して（lifted）固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで細胞周期分布を解析した（ｎ＝３）。
【図１Ｘ】化合物８２１、８２２、８２３、及び８２４により誘発された放射線感受性に関する用量反応関係。  複数の異なる増加濃度のＡＴＲ阻害剤で処理した後、６Ｇｙの放射線照射を行ったＨｅＬａ細胞で、小規模クローン原性生存アッセイを実施した。照射した細胞（ＳＦ  ６Ｇｙ、ピンク色の線）及び無照射の細胞（培養効率、ＰＥ；青色の線）の両方について、ＤＭＳＯ処理細胞に対するクローン原性生存の減少として、データがプロットされている。特定の薬剤濃度において、照射後の生存率の大きな減少と、それに伴う無照射の生存率の小さな減少として、高度に増加した放射線照射が見られる。
【図２Ｘ−１】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−２】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−３】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−４】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−５】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−６】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−７】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図２Ｘ−８】腫瘍細胞と正常細胞における放射線感受性の評価。  Ａ）放射線照射がない薬剤処理後のクローン原性生存。ＰＳＮ１及びＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、クローン原性生存を評価した。  Ｂ）化合物８２１、８２２、８２３及び８２４で前処理した後、放射線照射を行ったＰＳＮ１、ＭｉａＰａｃａ、及びＭＲＣ５細胞のクローン原性生存。細胞を低密度で培養し、指示されている薬剤で処理し、１時間後に放射線照射を行い、クローン原性生存を評価した。
【図３Ｘ−１】放射線感受性に対する薬剤添加と除去のタイミングの依存性評価。  ＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、薬剤を、４Ｇｙの放射線処理に対してさまざまな時点で添加した（照射の１時間前、照射の５分後、照射の２時間又は４時間後）。また、さまざまな時点で除去した（照射の５分後、照射の１時間後、又は照射の１９時間後）。１４日後にクローン原性生存を評価した。ＤＭＳＯ処理細胞に比較した、４Ｇｙでの生存割合（上図）又は放射線感作のパーセンテージ（中図）として、結果が示されている。処理スケジュールの違いによって、培養効率において差は生じなかった（下図）。
【図３Ｘ−２】放射線感受性に対する薬剤添加と除去のタイミングの依存性評価。  ＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、薬剤を、４Ｇｙの放射線処理に対してさまざまな時点で添加した（照射の１時間前、照射の５分後、照射の２時間又は４時間後）。また、さまざまな時点で除去した（照射の５分後、照射の１時間後、又は照射の１９時間後）。１４日後にクローン原性生存を評価した。ＤＭＳＯ処理細胞に比較した、４Ｇｙでの生存割合（上図）又は放射線感作のパーセンテージ（中図）として、結果が示されている。処理スケジュールの違いによって、培養効率において差は生じなかった（下図）。
【図３Ｘ−３】放射線感受性に対する薬剤添加と除去のタイミングの依存性評価。  ＭｉａＰａｃａ細胞を低密度で培養し、薬剤を、４Ｇｙの放射線処理に対してさまざまな時点で添加した（照射の１時間前、照射の５分後、照射の２時間又は４時間後）。また、さまざまな時点で除去した（照射の５分後、照射の１時間後、又は照射の１９時間後）。１４日後にクローン原性生存を評価した。ＤＭＳＯ処理細胞に比較した、４Ｇｙでの生存割合（上図）又は放射線感作のパーセンテージ（中図）として、結果が示されている。処理スケジュールの違いによって、培養効率において差は生じなかった（下図）。
【図４Ｘ−１】化合物８２２処理及び放射線照射後のＤＮＡ損傷フォーカス解析。  Ａ）６Ｇｙでの放射線照射から２４時間後のｇＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１フォーカス、及び照射から６時間後のＲＡＤ５１フォーカスの評価。放射線照射の１時間前又は１時間後に、ＭｉａＰａｃａ細胞を８０ｎＭの化合物８２２で処理し、照射から５分後又は１時間後に薬剤を洗い流した。６時間後（ＲＡＤ５１フォーカス）又は２４時間後（ｇＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１フォーカス）に、細胞を固定した。特定の数を超えるフォーカスを含む細胞のパーセンテージを計った。  Ｂ）ＤＮＡ損傷フォーカスの経時変化。細胞をＡと同じく処理し、示されている時点で固定した後、ｇＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１及びＲＡＤ５１フォーカスの染色を行った。データは、特定の時点でのフォーカス平均数として（上図）、又は、特定の数を超えるフォーカスを含む細胞のパーセンテージとして（下図）、表わされている。
【図４Ｘ−２】化合物８２２処理及び放射線照射後のＤＮＡ損傷フォーカス解析。  Ａ）６Ｇｙでの放射線照射から２４時間後のｇＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１フォーカス、及び照射から６時間後のＲＡＤ５１フォーカスの評価。放射線照射の１時間前又は１時間後に、ＭｉａＰａｃａ細胞を８０ｎＭの化合物８２２で処理し、照射から５分後又は１時間後に薬剤を洗い流した。６時間後（ＲＡＤ５１フォーカス）又は２４時間後（ｇＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１フォーカス）に、細胞を固定した。特定の数を超えるフォーカスを含む細胞のパーセンテージを計った。  Ｂ）ＤＮＡ損傷フォーカスの経時変化。細胞をＡと同じく処理し、示されている時点で固定した後、ｇＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１及びＲＡＤ５１フォーカスの染色を行った。データは、特定の時点でのフォーカス平均数として（上図）、又は、特定の数を超えるフォーカスを含む細胞のパーセンテージとして（下図）、表わされている。
【図４Ｘ−３】化合物８２２処理及び放射線照射後のＤＮＡ損傷フォーカス解析。  Ａ）６Ｇｙでの放射線照射から２４時間後のｇＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１フォーカス、及び照射から６時間後のＲＡＤ５１フォーカスの評価。放射線照射の１時間前又は１時間後に、ＭｉａＰａｃａ細胞を８０ｎＭの化合物８２２で処理し、照射から５分後又は１時間後に薬剤を洗い流した。６時間後（ＲＡＤ５１フォーカス）又は２４時間後（ｇＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１フォーカス）に、細胞を固定した。特定の数を超えるフォーカスを含む細胞のパーセンテージを計った。  Ｂ）ＤＮＡ損傷フォーカスの経時変化。細胞をＡと同じく処理し、示されている時点で固定した後、ｇＨ２ＡＸ、５３ＢＰ１及びＲＡＤ５１フォーカスの染色を行った。データは、特定の時点でのフォーカス平均数として（上図）、又は、特定の数を超えるフォーカスを含む細胞のパーセンテージとして（下図）、表わされている。
【図５Ｘ−１】６Ｇｙ放射線照射後の化合物８２２処理細胞の細胞周期解析。  ＰＳＮ１細胞を、３つ同じものを用いたウェルで、４０ｎＭの化合物８２２で処理してから、１時間後に６Ｇｙで照射した。照射後のいくつかの時点で、細胞を採取して（lifted）固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで解析した。  Ａ）細胞周期ヒストグラムプロット。フィッティングされたピークは、Ｇ１フェーズは赤で着色、Ｓフェーズは灰色、Ｇ２／Ｍフェーズは緑色で示されている。各時点及び処理について、３つのウェルのうち１つが示されている。  Ｂ）平均細胞周期パーセンテージの経時変化。フィッティングされたヒストグラムプロット（ｎ＝３）と、対照処理群及び化合物８２２処理細胞についてのプロットから、細胞周期パーセンテージ値が得られた。
【図５Ｘ−２】６Ｇｙ放射線照射後の化合物８２２処理細胞の細胞周期解析。  ＰＳＮ１細胞を、３つ同じものを用いたウェルで、４０ｎＭの化合物８２２で処理してから、１時間後に６Ｇｙで照射した。照射後のいくつかの時点で、細胞を採取して（lifted）固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで解析した。  Ａ）細胞周期ヒストグラムプロット。フィッティングされたピークは、Ｇ１フェーズは赤で着色、Ｓフェーズは灰色、Ｇ２／Ｍフェーズは緑色で示されている。各時点及び処理について、３つのウェルのうち１つが示されている。  Ｂ）平均細胞周期パーセンテージの経時変化。フィッティングされたヒストグラムプロット（ｎ＝３）と、対照処理群及び化合物８２２処理細胞についてのプロットから、細胞周期パーセンテージ値が得られた。
【図６Ｘ】化合物８２２での、ＭｉａＰａＣａ腫瘍の体積の経時変化。
【図７Ｘ】化合物８２２での、ＰＳＮ−１腫瘍の体積の経時変化。
【図８Ｘ】化合物８２２での、ＰＳＮ−１腫瘍の体積の経時変化
【図１Ｙ】肺癌細胞スクリーニング：肺細胞バイアビリティアッセイにおいて、一連の肺癌細胞株にわたって、ＶＥ−８２２が化学毒との共力効果を示す。
【図２Ｙ】肺癌細胞スクリーニング：細胞バイアビリティアッセイにおいて、肺癌細胞株で、ＶＥ−８２２が化学毒との３倍を超える共力効果を示す。
【図３Ｙ】膵臓癌細胞スクリーニング：細胞バイアビリティアッセイにおいて、膵臓癌細胞株で、ＶＥ−８２２がシスプラチン及びゲムシタビンとの共力効果を示す。
【図４Ｙ】膵臓癌細胞スクリーニング：細胞バイアビリティアッセイにおいて、膵臓癌細胞株で、ＶＥ−８２２が化学毒との３倍を超える共力効果を示す。
【図５Ｙ】ＳＣＩＤマウスの原発性腺癌ＮＳＣＬＣ異種移植片における腫瘍体積及び体重に対する、ＶＥ−８２２及びシスプラチンの効果。
【図６Ｙ】ＰＳＮ１膵臓癌異種移植片を埋め込まれたマウスの腫瘍体積に対する、ゲムシタビン（１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑ３ｄ）と組み合わせてＶＥ−８２２をＰＯ、ｑ２ｄで、１０、３０又は６０ｍｇ／ｋｇ投与した場合の効果。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一態様は、ＡＴＲ阻害剤を、他の既知の膵臓癌治療と組み合わせて患者に投与することにより、患者の膵臓癌を治療するための方法を提供する。本発明の一態様には、ゲムシタビンと組み合わせてＡＴＲ阻害剤を投与することが含まれる。いくつかの実施形態において、膵臓癌は、ＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２又はＰａｎｃ−１の細胞株のうち１つを含む。別の一態様により、この癌は原発腫瘍株Ｐａｎｃ−Ｍを含む。
【００１６】
本発明の別の一態様は、ＡＴＲ阻害剤を、放射線治療と組み合わせて患者に投与することにより、患者の癌（例えば膵臓癌又は非小細胞肺癌）を治療するための方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の一態様は、ＡＴＲ阻害剤を、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び／又は電離放射線と組み合わせて患者に投与することにより、患者の非小細胞肺癌を治療するための方法を提供する。出願者らは、３５のヒト肺癌細胞株パネルに対する生存性アッセイにおいて、シスプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、オキサリプラチン及びイリノテカンと組み合わせたＡＴＲ阻害剤の共力効果を示し、並びに、シスプラチンと組み合わせた場合の、肺癌マウスモデルにおけるインビボ有効性を示している。本発明は更に、非小細胞肺癌治療のための、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び／又は電離放射線と組み合わせたＡＴＲ阻害剤の使用に関する。
【００１８】
ＡＴＲ阻害剤の例を下の表１に示す：
【００１９】
【表１】
2020059753.tif 000012
【００２０】
化合物８２１及び８２２を指す用語は、それぞれＶＥ−８２１及びＶＥ−８２２と互換可能である。
【００２１】
別の一態様は、１つ以上の癌治療と組み合わせて、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を、膵臓癌細胞に投与することにより、膵臓癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＴＲ阻害剤は化学放射線療法、化学療法、及び／又は放射線療法と併用される。当業者には理解されるように、化学放射線療法は、化学療法（例えばゲムシタビンなど）と放射線との両方を含む治療レジメンを指す。いくつかの実施形態において、化学療法はゲムシタビンである。
【００２２】
更に別の一態様は、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を癌治療と組み合わせて投与することにより、ゲムシタビン又は放射線療法から選択された癌治療に対する、膵臓癌細胞の感受性を増加させる方法を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、この癌治療はゲムシタビンである。いくつかの他の実施形態において、この癌治療は放射線療法である。更に別の一実施形態において、この癌治療は化学放射線療法である。
【００２４】
別の一態様は、膵臓癌細胞に対してゲムシタビン（例えば１００ｎＭ）及び／又は放射線（例えば６Ｇｙ）で治療した後、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することを含む、膵臓癌細胞におけるＣｈｋ１（Ｓｅｒ  ３４５）のリン酸化阻害の方法を提供する。
【００２５】
別の一態様は、放射線治療と組み合わせて、腫瘍細胞に対し、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することにより、低酸素ＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２又はＰａｎｃＭ腫瘍細胞を放射線増感する方法を提供する。
【００２６】
更に別の一態様は、ゲムシタビンと組み合わせて、腫瘍細胞に対し、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することにより、低酸素ＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２又はＰａｎｃＭ腫瘍細胞を感作する方法を提供する。
【００２７】
別の一態様は、化学放射線療法と組み合わせて、腫瘍細胞に対し、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することにより、ＰＳＮ−１及びＭｉａＰａＣａ−２腫瘍細胞を、化学放射線療法に対して感作させる方法を提供する。
【００２８】
別の一態様は、膵臓癌細胞に対する放射線治療と組み合わせて、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することにより、損傷誘発細胞周期チェックポイントを妨害する方法を提供する。
【００２９】
別の一態様は、化学放射線療法、化学療法、及び放射線療法のうち１つ以上と組み合わせて、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することにより、膵臓癌細胞中の相同組換えによるＤＮＡ損傷の修復を阻害する方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、化学療法はゲムシタビンである。
【００３１】
別の一態様は、ゲムシタビン及び放射線療法と組み合わせて、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を投与することにより、膵臓癌細胞中の相同組換えによるＤＮＡ損傷の修復を阻害する方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、膵臓癌細胞は、ＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２又はＰａｎｃ−１から選択される膵臓細胞株から誘導される。
【００３３】
いくつかの他の実施形態において、膵臓癌細胞は、癌患者体内にある。いくつかの他の実施形態において、この癌細胞は、腫瘍の一部である。
【００３４】
別の一実施形態は、ＡＴＲ阻害剤を、他の既知の非小細胞肺癌治療と組み合わせて患者に投与することにより、患者の非小細胞肺癌を治療するための方法を提供する。本発明の一態様は、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び／又は電離放射線と組み合わせて、ＡＴＲ阻害剤を患者に投与することを含む。
【００３５】
別の一態様は、１つ以上の癌治療と組み合わせて、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を、患者に投与することにより、非小細胞肺癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＴＲ阻害剤は化学放射線療法、化学療法、及び／又は放射線療法と併用される。当業者には理解されるように、化学放射線療法は、化学療法（例えばシスプラチン、カルボプラチン、又はエトポシドなど）と放射線との両方を含む治療レジメンを指す。いくつかの実施形態において、化学療法は、シスプラチン又はカルボプラチン、及びエトポシドを含む。
【００３６】
更に別の一態様は、１つ以上の癌治療と組み合わせて、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を患者に投与することにより、シスプラチン又はカルボプラチン、及びエトポシド、及び電離放射線から選択される癌治療に対する、非小細胞肺癌細胞の感受性を高める方法を提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、この癌治療はシスプラチン又はカルボプラチンである。いくつかの他の実施形態において、この癌治療は放射線療法である。更に別の一実施形態において、この癌治療はエトポシドである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、この癌治療は、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線の組み合わせである。いくつかの実施形態において、この癌治療はシスプラチン又はカルボプラチン、及びエトポシドである。いくつかの実施形態において、この癌治療は、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線である。更にいくつかの実施形態において、この癌治療は、シスプラチン又はカルボプラチン、及び電離放射線である。
【００３９】
別の一態様は、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤を患者に投与することを含む
、非小細胞肺癌におけるＣｈｋ１（Ｓｅｒ  ３４５）のリン酸化を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＴＲ阻害剤は、ゲムシタビン（例えば１００ｎＭ）、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、電離放射線又は放射線（例えば６Ｇｙ）と組み合わせて、非小細胞肺癌細胞に投与される。
【００４０】
いくつかの他の実施形態において、この非小細胞肺癌細胞は、癌患者体内にある。
【００４１】
いくつかの実施形態において、このＡＴＲ阻害剤は次のものである：
【００４２】
【表２】
2020059753.tif 000013
【００４３】
いくつかの他の実施形態において、このＡＴＲ阻害剤は次のものである：
【００４４】
【表３】
2020059753.tif 000014
【００４５】
使用
別の一態様は、膵臓癌を治療するための、ゲムシタビン及び放射線治療と組み合わせた、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤の使用を提供する。
【００４６】
別の一態様は、非小細胞肺癌を治療するための、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線と組み合わせた、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤の使用を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、このＡＴＲ阻害剤は化合物ＶＥ−８２１である。いくつかの他の実施形態において、このＡＴＲ阻害剤は化合物ＶＥ−８２２である。
【００４８】
薬剤の製造
別の一態様は、膵臓癌を治療する薬剤を製造するための、ゲムシタビン及び放射線治療と組み合わせた、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤の使用を提供する。
【００４９】
別の一態様は、非小細胞肺癌を治療する薬剤を製造するための、シスプラチン又はカルボプラチン、エトポシド、及び電離放射線と組み合わせた、表１の化合物から選択されるＡＴＲ阻害剤の使用を提供する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、このＡＴＲ阻害剤は化合物ＶＥ−８２１である。いくつかの他の実施形態において、このＡＴＲ阻害剤は化合物ＶＥ−８２２である。
【実施例】
【００５１】
実施例はあくまで説明目的のためのものであり、いかなる面でも本発明の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。
【００５２】
細胞バイアビリティアッセイ
ＭｉａＰａＣａ−２、ＰＳＮ−１、Ｐａｎｃ１及びＭＲＣ５細胞（５×１０４）を９６ウェルプレートで培養し、４時間後、複数の増加濃度のＶＥ−８２１で処理し、１時間後、単回照射量６Ｇｙで照射した。照射から９６時間後に培地を交換し、この時点で、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ（レサズリン基質、ＳＩＧＭＡ）を用いて測定した。細胞を増殖させ、８日目に、これらの異なる治療条件について細胞バイアビリティを再び解析した。細胞バイアビリティ及び生存割合を、無治療（対照）群に対して正規化した。
【００５３】
クローン原性生存アッセイ
対数増殖期細胞を、有酸素条件（２１％  Ｏ２）又は低酸素条件（０．５％  Ｏ２）で、ＩｎＶｉｖｏ２  ３００チャンバ（Ｒｕｓｋｉｎｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＫ）を使用し、６ウェル組織培養皿で３つ同じものを用いて培養した。細胞を６時間インキュベーションしてから、緊密に密閉したチャンバを用い、有酸素又は低酸素下で放射線照射した。標的Ｏ２レベルが、ガス注入６時間以内に達成され、照射の間維持された。これはＯｘｙＬｉｔｅ酸素プローブ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ）で確認された。低酸素下で照射された細胞は、照射から１時間後、正常酸素状態に曝された。基準として、照射（６Ｇｙ）の１時間前にＶＥ−８２１（１μＭ）を加え、照射から７２時間後に洗い流した。化学療法実験として、細胞を最初に、複数の増加濃度のゲムシタビン（５、１０及び２０ｎＭ）に２４時間曝してから、ＶＥ−８２１（１μＭ）を追加し、更に７２時間置いた。ＶＥ−８２１及びゲムシタビンと放射線照射の３重組み合わせの効果も調べた。細胞を１０〜２１日間インキュベーションしてから、コロニーを０．５％クリスタルバイオレットで染色し、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔ自動コロニーカウンター（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ）で計数した。クローン原性生存を計算し、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ
４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ）でフィッティングした。
【００５４】
ウェスタンブロット
ＭｉａＰａＣａ−２及びＰＳＮ−１細胞を、ゲムシタビン及び／又は１μＭ  ＶＥ−８２１薬剤に１時間曝してから、単回照射量６Ｇｙで照射した。照射から２時間後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解させてから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び免疫ブロット法を行った。化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びフィルム露光を使用して、抗体結合を検出した。露光したフィルムをデジタル化し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔを用いて画像をまとめた。
【００５５】
核内フォーカス解析
９６ウェルプレートで成長させた細胞を、１μＭ  ＶＥ−８２１薬剤で１時間処理してから、６Ｇｙ照射を行い、複数の時点で３％ホルムアルデヒドで固定した。次に、細胞を、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎと１％  ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含んだＰＢＳで透過処理（pearmeabalised）及びブロックした。細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュべーションし、
ＰＢＳで洗った後、蛍光ラベルされた二次抗体と共にインキュベーションした後（followedgy）、ＰＢＳで洗い、ＤＡＰＩで核染色した。画像を撮影し、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００自動落射蛍光顕微鏡及び解析ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ（Cahlfont）Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）を使用してフォーカスを定量化した。
【００５６】
細胞周期解析
６ウェルディッシュで成長させた細胞を、１μＭ  ＶＥ−８２１薬剤で処理し、１時間後、６Ｇｙ照射を行った。細胞を６時間インキュベーションしてから、緊密に密閉したチャンバを用い、有酸素条件下（２１％  Ｏ２）又は無酸素条件下（０．５％  Ｏ２）で放射線照射した。複数の時点で、細胞をトリプシンで採取し（lifted）、７０％エタノールで固定し、４℃で保存した。細胞をヨウ化プロピジウム（２００μｇ／ｍＬのＲＮＡアーゼを含むＰＢＳ中、５０μｇ／ｍＬ）と共に１時間室温でインキュベーションし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。細胞周期フェーズを、ＭｏｄＦｉｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて定量化した。
【００５７】
肺癌細胞スクリーニングのための細胞播種と化合物添加
全細胞株を、３８４ウェルの不透明底部アッセイプレート中、１０％  ＦＢＳを含む組織培地３０μＬの中に播種した。播種密度は、核細胞株の対数増殖速度に基づいた。２４時間後、化合物のストック溶液を各ウェルに加え、５種類の濃度のＶＥ−８２２及び６種類の濃度の化学毒からなるマトリックスを形成した。各ウェルは、単剤のみ、又は両薬剤の組み合わせのいずれかを含む。ＶＥ−８２２の最終濃度範囲は２５ｎＭ〜２μＭであった。化学毒の濃度範囲は次の通りであった：エトポシド、１０ｎＭ〜１０μＭ；ゲムシタビン、０．１６ｎＭ〜１６０ｎＭ；シスプラチン、２０ｎＭ〜２０μＭ；オキサリプラチン、４０ｎＭ〜４０μＭ；イリノテカン（ＳＮ−３８）、０．１２ｎＭ〜１２０ｎＭ。細胞は次に、５％  ＣＯ２及び湿度９５％の雰囲気下、３７℃で９６時間インキュベーションした。
【００５８】
膵臓癌細胞スクリーニングのための細胞播種と化合物添加
全細胞株を、３８４ウェルの不透明底部プレート中、１０％  ＦＢＳを含む組織培地３０μＬの中に播種した。播種密度は、核細胞株の対数増殖速度に基づいた。２４時間後、化合物のストック溶液を各ウェルに加え、９種類の濃度のＶＥ−８２２及び７種類の濃度のゲムシタビン及びシスプラチンからなるマトリックスを形成した。各ウェルは、単剤のみ、又は両薬剤の組み合わせのいずれかを含む。最終濃度範囲は次の通りであった：ＶＥ−８２２、０．３ｎＭ〜２μＭ；ゲムシタビン、０．３ｎＭ〜０．２２μＭ；シスプラチン、３０ｎＭ〜２０μＭ。細胞は次に、５％  ＣＯ２及び湿度９５％の雰囲気下、３７℃で９６時間インキュベーションした。
【００５９】
細胞バイアビリティアッセイ
このアッセイは、代謝的に活性な細胞に存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養中の生存細胞の数を測定するものである。
【００６０】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ））をメーカーの指示に従って調製し、化合物添加（２５μＬ／ウェル）から９６時間後、細胞バイアビリティを測定した。ルミネセンス信号をＰＨＥＲＡＳｔａｒＦＳ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ（Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ））自動プレートリーダーで測定した。全細胞株について、２つ同じものを用いてスクリーニングを行った。
【００６１】
各アッセイプレートについて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）ルミネセンスの
未加工値を、陰性対照ＤＭＳＯ処理サンプルについて、平均ＣＴＧ値に対して正規化した。化学毒単独のＩＣ５０値は、化学毒化合物単独で処理したサンプルについて、ＤＭＳＯ正規化細胞生存値を用いて計算された。ＶＥ−８２２存在下の細胞生存割合を決定するには、生のＣＴＧ値を、化学毒化合物なしで同じ濃度のＶＥ−８２２に曝されたサンプルについて、平均ＣＴＧ値に対し正規化した。ＶＥ−８２２処理された化学毒ＩＣ５０値は、所与の濃度のＶＥ−８２２で、化学毒で処理された全サンプルについて、ＶＥ−８２２正規化細胞生存値を用いて計算された。ＶＥ−８２２と化学毒との間の強い共力効果を識別するには、ＩＣ５０の低下として３倍以上であることが用いられた。
【００６２】
原発性腺癌ＮＳＣＬＣ異種移植片モデル
低分化型腺癌の患者から、腫瘍組織が切除された。この腫瘍組織を、ＳＣＩＤマウスの横腹皮下に埋め込み、２回継代してから、化合物試験を行った。化合物試験では、２代目腫瘍組織をＳＣＩＤマウスの横腹皮下に埋め込み、腫瘍を体積約２００ｍｍ３まで成長させた。シスプラチンは、単剤を週１回、２週間にわたって、腹腔内に１又は３ｍｇ／ｋｇ投与した（ｉｐ、ｑ７ｄ、毎週２日目）。ＶＥ−８２２は、溶液単剤として６０ｍｇ／ｋｇを、毎週の周期で４連続日ずつ経口投与した（ｑｄ４、毎週１、２、３及び４日目）。２つの併用群は、単剤群と同じスケジュールで、シスプラチン１又は３ｍｇ／ｋｇに加えＶＥ−８２２を６０ｍｇ／ｋｇ経口で投与された。対照群は、賦形剤のみを投与された（水中１０％ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、経口、ｑｄ４）。すべての薬剤投与は２８日目に停止された。賦形剤群、シスプラチン群（１ｍｇ／ｋｇ）及びＶＥ−８２２群（６０ｍｇ／ｋｇ）を犠牲にし、残りは更に４０日間モニターして、腫瘍の再成長を評価した。
【００６３】
ＰＳＮ１膵臓癌異種移植片モデル
ＰＳＮ１細胞（マウス当たり細胞１×１０６個）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マウス当たり１００μＬ）中の混合物として、メスのＭＦ１ヌードマウスの横腹に埋め込み、腫瘍を体積約２００ｍｍ３まで成長させてから、化合物の投与を行った。ゲムシタビン単剤を、０．５％メチルセルロース水溶液中１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に、３日ごとに１回（ｉｐ、ｑ３ｄ）、最高１０サイクル投与した。ＶＥ−８２２は、水中０．５％メチルセルロース中の懸濁液として、単剤で１０、３０又は６０ｍｇ／ｋｇのいずれかを１日おきに２８日間経口投与した（ｐｏ、ｑ２ｄ）。３つの併用群は、ゲムシタビン１５ｍｇ／ｋｇに加え、ＶＥ−８２２を１０、３０又は６０ｍｇ／ｋｇのいずれかの経口投与を、単剤群と同じスケジュールで投与された。対照群は、賦形剤のみを投与された（０．５％メチルセルロース、ｉｐ、ｑ３ｄ）。すべての薬剤投与は３０日目に停止された。賦形剤群とＶＥ−８２２群は腫瘍の体積が過剰になったため、１３日目で犠牲になった。
【００６４】
結果
化合物ＶＥ−８２１及びＶＥ−８２２は膵臓癌細胞を放射線治療に対して感作させる
化合物ＶＥ−８２１は、ゲムシタビン（１００ｎＭ）、照射（６Ｇｙ）又は両方での治療後、Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ  ３４５）のリン酸化を阻害している（図１Ａを参照）。化合物ＶＥ−８２１は、膵臓癌細胞を放射線に対して感作させるが、正常細胞に対しては感作させていない。化合物ＶＥ−８２１の存在下で細胞が照射されると、生存割合の減少が観察され、この放射線感作効果は、照射後の薬剤インキュベーション時間が延長されると増加した（図１Ｃを参照）。
【００６５】
化合物ＶＥ−８２１は、低酸素条件下で腫瘍ＰＳＮ−１、ＭｉａＰａＣａ−２及びＰａｎｃＭ細胞を放射線感作させている（図２Ａ〜Ｂを参照）。化合物ＶＥ−８２１は更に、正常酸素下と低酸素下の癌細胞をゲムシタビンに対して感作させている（図３Ｂ〜Ｃを参照）。化合物ＶＥ−８２１は、ＰＳＮ−１及びＭｉａＰａＣａ−２の両方の癌細胞において化学放射線療法の効果を強化している（図３Ｄを参照）。化合物ＶＥ−８２１は、損傷誘発細胞周期チェックポイントを妨害している（補足図２を参照）。化合物ＶＥ−８２１
は、相同組換えによるＤＮＡ損傷修復を阻害している（図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃを参照）。
【００６６】
化合物８２１及び８２２の結果は図１Ｘ〜８Ｘ及び１Ｙ〜６Ｙに示されている。ＶＥ−８２１及びＶＥ−８２２は、癌細胞を放射線治療に対して感作させている（図１Ｘ〜５Ｘを参照）。
【００６７】
ＶＥ−８２２は、異種移植片モデルにおいて、癌治療の抗腫瘍効果を強化している
ＶＥ−８２２は、ＭｉａＰａＣａ膵臓癌異種移植片モデル（図６Ｘを参照）、及びＰＳＮ−１膵臓癌異種移植片モデル（図７Ｘ及び８Ｘを参照）において、電離放射線の抗腫瘍効果を強化している。
【００６８】
ＶＥ−８２２は、原発性腺癌ＮＳＣＬＣ異種移植片におけるシスプラチンの抗腫瘍効果を強化している。図５Ｙは、ＳＣＩＤマウスの原発性腺癌ＮＳＣＬＣ異種移植片における腫瘍体積及び体重に対する、ＶＥ−８２２及びシスプラチンの効果を示す。データは平均±ｓｅｍ、ｎ＝９〜１０である。黒塗り潰しの丸は賦形剤処理；赤塗り潰しの菱形は、シスプラチン処理（１ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ）；青塗り潰しの菱形は、シスプラチン処理（３ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ）；緑塗り潰しの正方形はＶＥ−８２２処理（６０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ４）；緑の中空三角形はシスプラチン（１ｍｇ／ｋｇ）及びＶＥ−８２２（６０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ４）；青の中空三角形はシスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ）及びＶＥ−８２２（６０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ４）である（図５Ｙを参照）。
【００６９】
ＶＥ−８２２は更に、ＰＳＮ１膵臓癌異種移植片モデルにおいてゲムシタビンの抗腫瘍効果を強化している。図６Ｙは、ＰＳＮ１膵臓癌異種移植片を埋め込まれたマウスの腫瘍体積に対する、ゲムシタビン（１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑ３ｄ）と組み合わせてＶＥ−８２２をＰＯ、ｑ２ｄで、１０、３０又は６０ｍｇ／ｋｇ投与した場合の効果を示す。示されているデータは腫瘍平均体積±ＳＥＭである（各群ｎ＝８）。赤塗り潰しの丸はＶＥ−８２２処理；黒塗り潰しの正方形は賦形剤処理；緑塗り潰しの丸はゲムシタビン処理；青塗り潰しの丸はゲムシタビンとＶＥ−８２２（１０ｍｇ／ｋｇ）処理；赤塗り潰しの丸はゲムシタビンとＶＥ−８２２（３０ｍｇ／ｋｇ）処理；ピンク塗り潰しの丸はゲムシタビンとＶＥ−８２２（６０ｍｇ／ｋｇ）処理である。
【００７０】
ＶＥ−８２２は一連の肺癌細胞株にわたって化学毒との共力効果を示す
ヒートマップは、９６時間ＶＥ−８２２と併用したときに達成された各化学毒のＩＣ５０における最大シフトを表わしている。色は、ＩＣ５０のシフト範囲で、−１０（拮抗、青）〜１０（共力、赤）を表わす（図１Ｙを参照）。ＶＥ−８２２は、肺癌細胞株において、シスプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、オキサリプラチン（oxaplatin）及びイ
リノテカンとの共力効果が３倍を超えることを示している（図２Ｙを参照）。
【００７１】
ＶＥ−８２２は、膵臓癌細胞株においてシスプラチン及びゲムシタビンとの共力効果を示す。
ヒートマップは、９６時間ＶＥ−８２２と併用したときに達成された各化学毒のＩＣ５０における最大シフトを表わしている。色は、ＩＣ５０のシフト範囲で、−１０（拮抗、青）〜１０（共力、赤）を表わす（図３Ｙを参照）。
【００７２】
本発明の数多くの実施形態について記述してきたが、本発明の化合物、方法、及びプロセスを利用する他の実施形態を提供するために、これらの基本的な例を変化させることができるのは明らかである。よって、本発明の範囲は、本明細書で例として提示されている特定の実施形態によってではなく、添付の請求項によって定義されるものであることが理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図１Ｘ】
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【図２Ｘ−１】
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【図２Ｘ−２】
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【図２Ｘ−３】
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【図２Ｘ−４】
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【図２Ｘ−５】
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【図２Ｘ−６】
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【図２Ｘ−７】
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【図２Ｘ−８】
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【図３Ｘ−１】
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【図３Ｘ−２】
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【図３Ｘ−３】
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【図４Ｘ−１】
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【図４Ｘ−２】
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【図４Ｘ−３】
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【図５Ｘ−１】
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【図５Ｘ−２】
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【図６Ｘ】
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【図７Ｘ】
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【図８Ｘ】
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【図１Ｙ】
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【図２Ｙ】
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【図３Ｙ】
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【図４Ｙ】
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【図５Ｙ】
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【図６Ｙ】
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【外国語明細書】
2020059753000001.pdf