(57)【要約】【課題】本発明は、培養液中にヒアルロン酸を高濃度に蓄積させ、効率よくヒアルロン酸を得ることを目的とする。【解決手段】乳酸菌を培養することにより多糖類を生産する方法において、ｐＨを４．３以下に調整した後に加熱処理した糖溶液を含む培地中で当該乳酸菌を培養する工程を含む方法。本発明によれば、培養液中に高濃度の多糖類を蓄積することができることから、より効率良く多糖類を生産することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨを４．３以下に調整した後に加熱処理した糖溶液を含む培地中で乳酸菌を培養することにより多糖類を生産する方法。
【請求項２】
糖がグルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、マルトースからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１記載の方法。
【請求項３】
乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌が、ヒアルロン酸生産能を有する微生物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓである請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓの微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は菌の体外に多糖類を生産することが知られており、菌の種類によって多種多様な多糖類を生産する。このような多糖類は、その物理化学的性質や生理機能から食品や化粧品、医療用途など幅広い用途で用いられることから、生産性を上げるための醗酵生産方法について研究が盛んになされている。
【０００３】
なかでも、ヒアルロン酸は、一定の品質の製品が容易に得られることから、醗酵法によって製造されている。その醗酵法において、効率よくヒアルロン酸を製造する方法がいくつか検討されている。例えば、界面活性剤を添加して培養する方法（特許文献１参照）、グルタミンやグルタミン酸を添加して培養する方法（非特許文献１参照）、ウリジンを添加して培養する方法（特許文献２参照）である。
いずれの方法を用いたとしても、微生物を培養するための培地は、コンタミネーションを防ぐためにも加熱殺菌しなければならない。その際に、培地組成に含まれる糖類の濃度が濃い場合は加熱により糖とアミノ酸が反応する褐変反応が生じ、ヒアルロン酸の生産が妨げられる。そこで、糖類の濃度が濃い場合は培地中の糖とその他の成分を別々に加熱殺菌して培養前に混合する必要がある。
しかしながら、糖のみの水溶液の加熱殺菌においても、糖濃度が濃い場合には加熱により糖が変性するため、微生物の生育阻害、ヒアルロン酸合成阻害が引き起こされ、培養中のヒアルロン酸を高濃度に蓄積することができない点が問題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２７６９７２号公報
【特許文献２】特開平６−３１９５８０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ  Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，１９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、培養液中に多糖類を高濃度に蓄積させ、効率よく多糖類を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、ｐＨを４以下に調整した後に加熱処理した糖溶液を含む培地中で乳酸菌を培養することにより多糖類を生産する方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、培養液中に高濃度の多糖類を蓄積することができ、より効率良く多糖類を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）乳酸菌及び乳酸菌由来の多糖類
本発明における乳酸菌とは、通常の培養により菌体外に多糖類を生産することができる乳酸菌のことである。当該乳酸菌は多糖生産能を有していれば種類は限定されない。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物等を挙げることができる。
乳酸菌の生産する乳酸菌由来の多糖類には、単一の糖からなるホモ多糖と、複数の単糖や単糖誘導体からなるヘテロ多糖がある。ホモ多糖には、グルコースからなるデキストラン、βグルカン、ムタン、アルテルナン；フルクトースからなるレバン、イヌリン；ガラクトースからなるガラクタン等が知られている。
デキストランを生産する乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｕｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、βグルカン生産乳酸菌としてＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｍｎｏｓｕｓ等、ムタン生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｕｓ等、アルテルナン生産菌としてＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、レバン生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ等、イヌリン生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎ等、ガラクタン生産乳酸菌としてＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ等が挙げられる。
ヘテロ多糖は、単糖のグルコース、ガラクトース、ラムノース、フコース、糖誘導体であるＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸などが少なくとも２種類以上で構成されるユニットが連なったものである。
代表的なヘテロ多糖はN−アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなるヒアルロン酸、グルコースとガラクトースからなるケフィランが挙げられる。ヒアルロン酸生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等、ケフィラン生産乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ等が挙げられる。
ヘテロ多糖生産菌としてはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ等が挙げられる。
本明細書では、これらの多糖類のうち、代表してヒアルロン酸について述べる。
（２）ヒアルロン酸生産能を有する微生物
本発明では、ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい。ヒアルロン酸生産能を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物は、一般に牛鼻腔粘膜、牛眼球に存在していることが知られている。本発明ではそこから単離された微生物を利用することもできる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属しない微生物でも、通常の遺伝子工学的手法を用いてヒアルロン酸生産能を得た微生物も使用することができる。
【００１０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｓ等が挙げられる。その中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓがより好ましい。
【００１１】
さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の属する微生物等のヒアルロン酸生産能を有する微生物を、紫外線、ＮＴＧ（Ｎ‐メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸等で処理することにより、ヒアルロニダーゼ非生産菌や非溶血性菌に改良することがより好ましい。人体または動物に悪影響を及ぼす可能性が低くなるからである。
【００１２】
前記ヒアルロニダーゼ活性及び溶血性を欠損させた菌株としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓＮＨ−１３１（ＦＥＲＭ  Ｐ−７５８０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓＨＡ−１１６（ＡＴＣＣ３９９２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０５）が好ましく、その中でもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０５）が特に好ましい。
【００１３】
これらのうち、ＦＥＲＭ株については、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより入手可能である。また、ＡＴＣＣ株については、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【００１４】
（３）培地
培地は、上記微生物がヒアルロン酸を生産できる培地であれば限定されず、微生物の種類に応じた通常の培地を用いることができる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース等の単糖類、乳糖、スクロース、マルトース等の二糖類、オリゴ糖類等；窒素源としてポリペプトン、酵母エキス等の有機窒素源；アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸；ビタミン；無機塩類等；タンニン等のフェノール性水酸基を有するヒアルロニダーゼ阻害剤を含む（水に溶解した）培地を使用することができる。
【００１５】
当該培地は、加熱処理（加熱殺菌）を行った後に、微生物の培養に用いることができる。微生物がじゅうぶんに殺菌されれば、加熱条件は限定されない。例えば、１００〜１３０℃で５〜３０分間、より好ましくは１２１℃で１５〜３０分間という条件を挙げることができる。
＜糖溶液＞
本発明では、培地の炭素源として用いる糖類を、他の培地成分とは別に糖溶液として調製する。糖類としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース等の単糖類、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、オリゴ糖類などを使用することができる。これらの中でも、特にグルコース、フルクトースの使用が好ましい。
【００１６】
糖溶液の濃度は特に限定されるものではないが、１０〜５０質量％の糖溶液を作製して加熱殺菌を行った後、糖以外の培地成分を溶解した培地に添加することにより、最終的に糖の濃度が１〜１０質量％になるように調製すればよい（終濃度）。より好ましくは３０質量%濃度の糖溶液を加熱殺菌し、終濃度４〜６質量％となるよう調製して培養培地とする。
【００１７】
本発明における糖溶液は、５N水酸化ナトリウム、５N硫酸を用いて、ｐＨを４．３以下、好ましくは０．１〜４．３、より好ましくは１〜４に調整した後に加熱殺菌する。糖溶液を当該ｐHに調整してから加熱殺菌することにより、糖溶液の加熱による変性を抑制することができ、微生物によるヒアルロン酸の生産が促進される。
【００１８】
糖溶液の加熱条件は、微生物がじゅうぶんに殺菌されれば限定されない。例えば、１００〜１３０℃で１０〜３０分間、より好ましくは１２１℃で１５〜３０分間という条件を挙げることができる。加熱殺菌された糖溶液は、糖以外の成分の殺菌された培地中に添加すればよい。
（４）培養
培養条件は、上記微生物がヒアルロン酸を生産できる条件であれば限定されず、微生物の種類に応じた通常の培養条件を用いることができる。通常、ｐＨを４〜８、好ましくは７〜７．５、温度を３０℃〜３７℃、好ましくは、３３℃〜３７℃に制御して行うことが好ましい。
【００１９】
本発明における培養方法としては、特に限定されるものではないが、回分培養とする方法と、連続培養とする方法、流加培養とする方法の何れも可能である。
【００２０】
また、前記培養は、通常、前培養を行った後に本培養を行う。前培養の条件としては、グルコース、フルクトース等の炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩類を含む培地中で、ｐＨを４〜８、温度を３０〜３７℃に制御して好気的に培養することが好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例、比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
実施例１〜４
ポリペプトン（和光純薬工業株式会社製）１．５質量％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．５質量％、リン酸第二カリウム０．２質量％、硫酸マグネシウム７水塩０．１質量％、塩化カルシウム０．００５質量％、グルタミン酸ナトリウム０．１質量％、アデカノールＬ６１（消泡剤  旭電化工業製）の組成からなる培地（ｐＨ７．０）を３Ｌのジャーファメンターに１．６Ｌ添加した後、当該培地を殺菌した。
【００２３】
一方、グルコースは１２０ｇを水０．４Lに溶解させた後、５N硫酸を用いてｐＨをそれぞれ１．０（実施例１）、２．０（実施例２）、３．０（実施例３）、４．０（実施例４）に調整した。得られた糖溶液を１２１℃で２０分加熱殺菌し、上記殺菌済みの培地に添加した。
糖溶液添加済みの上記培地２Lに、前培養したStreptococcus zooepidemicusＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）を１％接種し、１２％水酸化ナトリウム水溶液にて培養液のｐＨを７．４に制御しながら３７℃で２３時間通気攪拌培養を行った（本培養）。
【００２４】
なお、前培養は、グルコース０．２質量％、ポリペプトン２．０質量％、酵母エキス０．５質量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５質量％の組成からなる培地（ｐＨ７．０）を綿栓付き５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ添加し、加熱殺菌後、同一組成の寒天プレート上に形成したコロニーを一白菌耳植菌し、３０℃で１８時間培養した。
【００２５】
培養終了後における培養液中のヒアルロン酸含量は、カルバゾール硫酸法にて測定した。分析結果は表１に示す。ｐＨを４．３以下にして滅菌した糖溶液を使用した場合には、大量のヒアルロン酸が蓄積された。
＜カルバゾール硫酸法＞
培養液を０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液で２０倍に希釈し、その２ｍｌにエタノールを１０ｍｌ加えて攪拌することによりヒアルロン酸を析出させる。遠心分離し、上清を取り除いた後の沈殿に再び０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を１０ｍｌ加えてヒアルロン酸含有液を作成する。
Ａ液（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ０．９５ｇをＨ２ＳＯ４  １００ｍｌで溶解したもの）５ｍｌを試験管に取り、上記のヒアルロン酸含有液１ｍｌを加えて１００℃で１０分湯浴する。室温まで水冷した後に、Ｂ液（カルバゾール０．１２５ｇをエタノール１００ｍｌに溶解したもの）０．２ｍｌを加えて１００℃で１５分湯浴する。室温まで冷却した後に、５３０ｎｍの波長における吸光度を測定してヒアルロン酸含有液中のグルクロン酸量を測定することでヒアルロン酸量を算出する。
【００２６】
比較例１〜３
グルコース１２０ｇを水０．４Lに溶解した後に、ｐＨを４．５（比較例１）、５．０（比較例２）、７．０（比較例３）に調整し（糖溶液）、１２１℃２０分加熱殺菌して培養開始前にその他の培地に添加した以外は、実施例１と同様の操作を行った。ヒアルロン酸含量の分析結果は、併せて表１に示す。
【００２７】
ｐＨを４．５以上にして滅菌した糖溶液を使用した場合は、ヒアルロン酸の蓄積が非常に少なかった。
【００２８】
【表１】
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