(57)【要約】【課題】経口摂取された乳酸菌のパイエル板への到達性を高めるための乳酸菌のパイエル板到達性向上方法を提供する。【解決手段】経口摂取された乳酸菌のパイエル板への到達性を高めるための乳酸菌のパイエル板到達性向上方法において、乳酸菌の菌体培養液を乾燥菌体換算で０．０１質量％以上８８質量％未満となるように調製し、該菌体培養液に可溶性賦形剤を乾燥終濃度で１２質量％以上となるように添加し、該可溶性賦形剤を添加した菌体培養液を粉砕・分散した後、乾燥粉末化することにより、湿式によるレーザー回折散乱法により測定された菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下である乳酸菌末を得ることを特徴とする乳酸菌のパイエル板到達性向上方法を提供する【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口摂取された乳酸菌のパイエル板への到達性を高めるための乳酸菌のパイエル板到達性向上方法において、乳酸菌の菌体培養液を乾燥菌体換算で０．０１質量％以上８８質量％未満となるように調製し、該菌体培養液に可溶性賦形剤を乾燥終濃度で１２質量％以上となるように添加し、該可溶性賦形剤を添加した菌体培養液を粉砕・分散した後、乾燥粉末化することにより、湿式によるレーザー回折散乱法により測定された菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下である乳酸菌末を得ることを特徴とする乳酸菌のパイエル板到達性向上方法。
【請求項２】
前記粉砕・分散をミキサー又はホモゲナイザーを用いて行う、請求項１に記載の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法。
【請求項３】
前記乳酸菌は、ウイルス感染防御のために用いられるものである、請求項１又は２に記載の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法。
【請求項４】
前記乳酸菌は、免疫活性増強のために用いられるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法。
【請求項５】
前記乳酸菌は、ラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及びエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）からなる群から選択された１種又は２種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口摂取された乳酸菌のパイエル板への到達性を高めるための乳酸菌のパイエル板到達性向上方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願人は、ＩＬ−１２産生誘導能を有する乳酸菌の菌体に分散剤又は賦形剤を添加し、これを湿式分散処理して前記菌体の粒度を１ミクロン未満に粉砕・分散することで、前記菌体を前記分散剤又は賦形剤によって再凝集防止し、その状態で粉末化することを特徴とするＴｈ１誘導剤の製造方法を既に提案している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４６２１２１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
乳酸菌はパイエル板から取り込まれ免疫細胞に渡されることが知られているが、必ずしもすべての乳酸菌が取り込まれるわけではないことも知られている。
【０００５】
本発明の目的は、経口摂取された乳酸菌のパイエル板への到達性を高めるための乳酸菌のパイエル板到達性向上方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明者らは、種々研究した結果、乳酸菌の菌体培養液に可溶性賦形剤を添加して所定の調製をした後、該菌体培養液を粉砕・分散し、さらに乾燥粉末化することにより得られた乳酸菌末が、経口摂取された場合にパイエル板への到達性が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の一つは、経口摂取された乳酸菌のパイエル板への到達性を高めるための乳酸菌のパイエル板到達性向上方法において、乳酸菌の菌体培養液を乾燥菌体換算で０．０１質量％以上８８質量％未満となるように調製し、該菌体培養液に可溶性賦形剤を乾燥終濃度で１２質量％以上となるように添加し、該可溶性賦形剤を添加した菌体培養液を粉砕・分散した後、乾燥粉末化することにより、湿式によるレーザー回折散乱法により測定された菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下である乳酸菌末を得ることを特徴とする乳酸菌のパイエル板到達性向上方法を提供するものである。本発明の向上方法によれば、乳酸菌の菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下と小さいことにより、消化管粘膜面を覆っている粘液の網目構造をすり抜けて、パイエル板に到達することができる。そして、パイエル板上のＭ細胞から取り込まれ、その下層に待機する樹上細胞やマクロファージに捕捉されることで、これらの細胞がサイトカインを産生し、免疫反応を活性化することができる。
【０００８】
本発明において、前記粉砕・分散をミキサー又はホモゲナイザーを用いて行うことが好ましい。
【０００９】
本発明の乳酸菌は、ウイルス感染防御のために用いられることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の乳酸菌は、免疫活性増強のために用いられることが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明の乳酸菌は、ラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及びエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）からなる群から選択された１種又は２種以上であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の向上方法によれば、乳酸菌の菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下と小さいことにより、消化管粘膜面を覆っている粘液の網目構造をすり抜けて、パイエル板に到達することができる。そして、パイエル板上のＭ細胞から取り込まれ、その下層に待機する樹上細胞やマクロファージに捕捉されることで、これらの細胞がサイトカインを産生し、免疫反応を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】デキストリンの各添加量における、乳酸菌菌体粒子のメジアン径の測定結果を示す図表である。
【図２】デキストリンの各添加量（（Ａ）０質量％、（Ｂ）１０質量％、（Ｃ）１５質量％）における、乳酸菌菌体粒子の粒度分布（縦軸：相対粒子量（％）、横軸：粒子径（μｍ））を示す図表である。
【図３】デキストリンの各添加量（（Ｄ）２０質量％、（Ｅ）２５質量％、（Ｆ）５０質量％）における、乳酸菌菌体粒子の粒度分布を示す図表である。
【図４】（Ａ）乳酸菌分散型が粘液の網目構造をすり抜けてパイエル板に達している様子、（Ｂ）乳酸菌分散型がパイエル板上のＭ細胞に取り込まれている様子、（Ｃ）乳酸菌凝集型が粘液の網目構造をすり抜けられず、パイエル板に達していない様子を示す図表である。
【図５】免疫機能正常ＭＮＶマウスの糞便中のウイルス量の経時変化を示す図表である。
【図６】免疫機能低下ＭＮＶマウスの糞便中のウイルス量の経時変化を示す図表である。
【図７】免疫機能正常ＭＮＶマウス、及び免疫機能低下ＭＮＶマウスの中和抗体価を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法に用いる乳酸菌末の原料となる乳酸菌としては、特に限定されないが、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)等のラクトバチルス属に属する微生物、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属に属する微生物、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属に属する微生物、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属に属する微生物等が挙げられる。
【００１５】
上記乳酸菌の中でも、ラクトバチラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及びエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）からなる群から選択された１種又は２種以上であることが好ましい。
【００１６】
本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法に用いる乳酸菌末は、まず、上記乳酸菌の菌体培養液を乾燥菌体換算で０．０１質量％以上８８質量％未満となるように、好ましくは０．１質量％以上８０質量％未満となるように、より好ましくは１質量％以上５０質量％未満となるように調製する。
【００１７】
このように調製した菌体培養液に、可溶性賦形剤を乾燥終濃度で１２質量％以上となるように、好ましくは１３質量％以上となるように、より好ましくは１５質量％以上となるように添加する。可溶性賦形剤を１２質量％以上添加することで、後述する粉砕・分散する際の乳酸菌末の再凝集を防止することができる。
【００１８】
用いる可溶性賦形剤としては、特に限定されず、例えば、デキストリン；マルトデキストリン；キサンタンガム；ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、及びキシリトール等の糖アルコール類；デキストロース、フルクトース、グルコース、ラクトース、ショ糖等の糖類；アジピン酸、クエン酸、フマル酸、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、及び酒石酸等の有機酸類等が挙げられる。
【００１９】
次に、可溶性賦形剤を添加した菌体培養液を粉砕・分散する。粉砕・分散方法としては、攪拌、ミキサー、ホモゲナイザー、ボールミル、ビーズミル、ジェットミル、ジェネレーター等を用いた公知の手法が挙げられるが、ミキサー又はホモゲナイザーを用いて行うことが好ましい。
【００２０】
粉砕・分散した後、菌体培養液を乾燥粉末化する。乾燥粉末化方法としては、凍結乾燥、減圧噴霧乾燥等を用いた公知の手法が挙げられる。
【００２１】
このようにして得られた、本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法に用いる乳酸菌末の、湿式のレーザー回析錯乱法により測定された菌体粒子のメジアン径は１．０μｍ以下であり、好ましくは０．９μｍ以下であり、より好ましくは０．８μｍ以下である。菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下と小さいことにより、消化管粘膜面を覆っている粘液の網目構造をすり抜けて、パイエル板に到達することができる。そして、パイエル板上のＭ細胞から取り込まれ、その下層に待機する樹上細胞やマクロファージに捕捉されることで、これらの細胞がサイトカインを産生し、免疫反応を活性化することができる。
【００２２】
なお、本明細書において、「菌体粒子のメジアン径が１．０μｍ以下である」とは、菌体粒子の粒径が、小さい側からの体積累積が５０％に相当する粒径が１．０μｍ以下であることを指す。
【００２３】
菌体粒子のメジアン径は、以下に記載の条件における湿式によるレーザー回折散乱法により測定される。具体的には、（株）島津製作所製の粒度分布測定装置ＳＡＬＤ−３１００を用いて常法により、詳細には、フローセルを使用し、水を測定溶媒とし、屈折率が１．５５−０．００ｉ、測定吸光度範囲の最大値を０．２、最小値を０．０２とした条件で、測定したものにより得られる。
【００２４】
本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法で得られた乳酸菌は、ウイルス感染防御のために用いることができる。ウイルスは特に限定されないが、例えば、ロタウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、アイチウイルス、パレコウイルス等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法により得られた乳酸菌は、免疫活性増強のために用いることができる。本発明の方法により得られた乳酸菌は、経口摂取した際のパイエル板の到達性が向上しているので、摂取することにより、樹状細胞やマクロファージが活性化され免疫活性が増強して、生体防御力が高まり種々の病気の予防が可能となる。
【００２６】
本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法により得られた乳酸菌は、そのままでも製品とすることができるが、風味を上げたり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることもできる。
【００２７】
乳酸菌に添加、配合される成分としては、各種糖質や乳化剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等が挙げられる。
【００２８】
また、フレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２９】
以上説明した乳酸菌は、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。
【００３０】
本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法によって得られた乳酸菌は、医薬的に受容な塩、賦形剤、保存剤、着色剤、矯味剤等とともに、医薬品あるいは食品の製造分野において公知の方法によって、飲料、顆粒、錠剤、カプセル剤等の種々の形態で使用することができる。
【００３１】
また、上記乳酸菌は、健康食品に利用することができる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味し、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられる。
【００３２】
本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法によって得られた乳酸菌の服用量は、乳酸菌末の品質や、対象者の年齢、症状等によって異なる。例えば、ウイルス感染等の病気の予防や、免疫力向上のために用いるには、成人１回につき固形分換算で０．００１〜１０ｇ程度が挙げられ、毎日服用するのが望ましい。また、健康食品としての使用時には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対し、固形分換算で０．０１〜１００ｇ程度の範囲で用いることが適当である。
【００３３】
さらに、本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法によって得られた乳酸菌は、ローション（化粧水）、化粧用クリーム類、乳液、化粧水、パック剤、スキンミルク（乳剤）、ジェル剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメークアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディリンス、石鹸、クレンジングフォーム、軟膏、貼付剤、ゼリー剤、エアゾール剤等種々の製品形態で皮膚外用剤に利用することもできる。
【００３４】
また、本発明の乳酸菌のパイエル板到達性向上方法における乳酸菌には、下記に示されるような化粧品、医薬部外品、医薬品において通常用いられる各種成分や添加剤を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３５】
即ち、グリセリン、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、ヘパリン等の保湿剤；ＰＡＢＡ誘導体（パラアミノ安息香酸、エスカロール５０７等）、桂皮酸誘導体（ネオヘリオパン、パルソールＭＣＸ、サンガードＢ等）、サリチル酸誘導体（オクチルサリチレート等）、ベンゾフェノン誘導体（ＡＳＬ−２４、ＡＳＬ−２４Ｓ等）、ジベンゾイルメタン誘導体（パルソールＡ、パルソールＤＡＭ等）、複素環誘導体（チヌビン系等）、酸化チタン等の紫外線吸収剤・散乱剤；エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、リンゴ酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤；サリチル酸、イオウ、カフェイン、タンニン等の皮脂抑制剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン等の殺菌・消毒剤；塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸、グアイアズレン、アズレン、アラントイン、ヒノキチオール、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸等の抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（Ｂ1，Ｂ2，Ｂ6，Ｂ12，Ｂ15）、葉酸、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＤ群（Ｄ2，Ｄ3）、ビタミンＥ、ユビキノン類、ビタミンＫ（Ｋ1，Ｋ2，Ｋ3，Ｋ4）等のビタミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、グリシン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アルギニン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸及びその誘導体；レチノール、酢酸トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出液等の美白剤；ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；塩化亜鉛、硫酸亜鉛、石炭酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の収斂剤；グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール等の糖類；甘草、カミツレ、マロニエ、ユキノシタ、芍薬、カリン、オウゴン、オウバク、オウレン、ジュウヤク、イチョウ葉等の各種植物エキス等の他、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色素等を適宜配合することができる。
【実施例】
【００３６】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３７】
＜Ｉ．乳酸菌末の調製＞
１．凝集型の乳酸菌末
乳酸菌Enterococcus faecalis菌株を公知の方法で培養した。当該培養液（乾燥乳酸菌濃度５〜１０質量％）を、凍結乾燥させた（以下、乳酸菌凝集型という）。
【００３８】
２．分散型の乳酸菌末
乳酸菌Enterococcus faecalis菌株を公知の方法で培養した。当該培養液（乾燥菌体換算で５〜１０質量％）に１０、１５、２０、２５、５０質量％（乾燥終濃度）になるようにデキストリンを添加し、ホモジナイズして菌体を十分に分散させた後、凍結乾燥させた（以下、乳酸菌分散型という）。
【００３９】
＜ＩＩ．粒度分布の測定＞
上記で得られた乳酸菌凝集型と、乳酸菌分散型を、乾燥菌体換算で１０ｍｇ／ｍＬになるように精製水に懸濁した。懸濁液中の乳酸菌末の粒度分布を、レーザー回折式粒度分布測定装置ＳＡＬＤ−３１００（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。具体的には、フローセルを使用し、水を測定溶媒とし、屈折率が１．５０−０．００ｉ、測定回数を２、平均回数を６４、測定吸光度範囲の最大値を０．２、最小値を０．０２として、サンプル溶液を測定範囲に達するまで添加して測定した。メジアン径の測定結果を表１と図１に、粒度分布を図２，３に示す。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１に示すように、乳酸菌凝集型においては、メジアン径が２９．５５６μｍであった。また、デキストリンを１０質量％添加して菌体を分散させた乳酸菌分散型においては、メジアン径が１．２３３μｍであった。一方、デキストリンを１５質量％以上添加して菌体を分散させた乳酸菌分散型においては、メジアン径が０．７９６μｍ以下であり、乳酸菌凝集型に比べて顕著に小さい値であった。
【００４２】
＜ＩＩＩ．消化管内の観察＞
１．方法
マウスにＣｙ３で蛍光染色した乳酸菌凝集型（上記Ｉで調製）と乳酸菌分散型（上記Ｉで調製、デキストリン５０質量％）を摂取させ、小腸パイエル板付近に存在する乳酸菌を蛍光顕微鏡で観察し、パイエル板内部は共焦点レーザー顕微鏡を用い観察した。撮影は株式会社アイカムの協力を得て実施した。
【００４３】
２．結果及び考察
乳酸菌分散型は、菌体が１個１個分散化し、且つ粒子径が１．０μｍ以下と小さいので、消化管粘膜面をすり抜けて、パイエル板に到達していることがわかった(図４（Ａ）矢印)。そしてパイエル板上のＭ細胞から取り込まれ(図４（Ｂ）矢印)、その下層に待機する樹状細胞やマクロファージに捕捉され、これらの細胞がサイトカインを産生し、免疫反応を活性化することができることがわかった。
【００４４】
一方、乳酸菌凝集型は、菌体が大きな菌塊となっているので、粘液の網目構造をすり抜けられず(図４（Ｃ）矢印)、パイエル板に達することなく、腸管を単に通過するだけで、本来の乳酸菌の効果が低減すると考えられることがわかった。
【００４５】
＜ＩＶ．マウスノロウイルス（ＭＮＶ）感染実験＞
１．材料
ウイルス株及び宿主細胞には下記のものを用いた。
・ウイルス：マウスノロウイルス  S7-PP3株
・宿主細胞：RAW264.7細胞（マウスマクロファージ様細胞）
（増殖培地＝１０％牛胎児血清加ダルベッコＭＥＭ培地）
【００４６】
２．方法
（１）BALB/cマウス（６週齢、雌）を、免疫機能正常群（5-fluorouracil（5-FU）非処理群）と免疫機能低下群（5-FU（0.25 mg/day/mouse）処理群）の２群に分け、１日おきにウイルス接種７日前から２１日後まで皮下注射した（両群ともｎ＝３）（表２）。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
（２）ＭＮＶ（1 x 106 PFU/0.2 ml/mouse）を経口接種させた。
【００４９】
（３）乳酸菌凝集型（上記Ｉで調製）又は乳酸菌分散型（上記Ｉで調製、デキストリン５０質量％）は、ウイルス接種７日前から２１日後まで経口投与した（１日２回、９時、１８時）。
【００５０】
（４）８時間後、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２１日後に、１匹ずつ糞便を５ｍＬチューブに回収した（マウスを空の飼育用ケージに１５〜３０分間入れる）。
【００５１】
（５）糞便中のウイルス量を次の方法で測定した（プラークアッセイ法）。糞便１ｍｇ当たりＰＢＳ  １０μＬを加え、超音波処理して均一に分散させ、遠心後、上清をＰＢＳで１０、１００、１０００倍希釈した。２４穴プレートに培養しておいたRAW 264.7細胞に上記の各希釈液を加え感染させた。その後、１．５％SeaPlaque agarose加ＤＭＥＭ培地を重層し、３７℃で培養した。２日後に、ニュートラルレッド液を重層して細胞を染色後、顕微鏡下でプラーク数を測定した。
【００５２】
（６）血清中の中和抗体価を次の方法で測定した。感染２１日後に、全採血し遠心して血清を分離後、ＰＢＳで１０、５０、２００、１０００、５０００倍希釈した。ウイルス１００μＬを上記希釈液１００μＬと混合し（対照として、血清の代わりにＰＢＳを加える）、２４穴プレートに単層状に培養したRAW 264.7細胞に加え室温で感染させた。１．５％ SeaPlaque agarose加ＤＭＥＭ培地を重層し、３７℃で培養した。２日後に、ニュートラルレッド液を重層して細胞を染色後、顕微鏡下でプラーク数を測定した。対照のプラーク数を１００％とした時の各希釈液のプラーク数の％を計算し、プラーク形成を５０％阻害する血清希釈倍数をグラフ上で求めそれを中和抗体価とした。
【００５３】
３．結果及び考察
２１日間の観察中、5-FUの処理を受けたマウスの一部には軽度の軟便がみられたが、マウスには体重の減少等は認められず全例生存した。
【００５４】
（１）糞便中のウイルス量（図５，６）
免疫機能正常マウス（5-FU非処理）（図５）：対照群では、感染１日後にウイルス量が最大となり、その後漸減し、１８日後には検出されなくなった。乳酸菌分散型投与群では、１日後のウイルス量が対照群の４０％にまで減少し、乳酸菌凝集型投与群では５０％にまで減少し、その後も一貫して低値であった。１２日後までのウイルス量は、乳酸菌分散型投与群の方が乳酸菌凝集型投与群よりも少なくなっていて、両投与群とも感染１６日後に、糞便中のウイルスが消失した。
【００５５】
免疫機能低下マウス（5-FU処理）（図６）：5-FU処理によって、ウイルス排泄量が多くなり、排出期間も長期化した。特に、対照群では、２１日後にもまだウイルスが検出された。乳酸菌投与によってウイルス量は２１日間にわたって減少した。乳酸菌分散型投与群では、乳酸菌凝集型投与群に比べて、糞便中のウイルス量が感染１４日後までの期間中、少なくなっていた。両投与群とも、１８日後にはウイルスは検出されなくなった。
【００５６】
従って、乳酸菌の投与によって、腸管内でのウイルス増殖が抑制され、早期にウイルス排泄が停止した。その効果は分散型の乳酸菌の方が高いと考えられる。
【００５７】
（２）中和抗体価
感染３週間後に、ＭＮＶの中和抗体の量を測定した（表３、図７）。
【００５８】
免疫機能正常マウス（5-FU非処理）：乳酸菌分散型投与群及び乳酸菌凝集型投与群では、対照群に比べて抗体価が有意に（p<0.05）に上昇した。分散型の方が、凝集型に比べて高い値となった。
【００５９】
免疫機能低下マウス（5-FU処理）：いずれの投与群でも、対応する5-FU非処理群に比べて、抗体価は低下した。しかし、両乳酸菌投与群は、非処理対照群と同等かそれ以上の高い抗体価を維持した。乳酸菌分散型投与群と乳酸菌凝集型投与群はいずれも、対照群に比べて有意に（p<0.05）高い抗体価を示し、分散型投与群の抗体価の方が、凝集型投与群よりも高い傾向がみられた。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
以上の結果から、乳酸菌投与による抗体量の増加が、腸管内でのウイルス増殖抑制をもたらしたと推察され、分散型の乳酸菌が、凝集型の乳酸菌に比べて免疫刺激効果が高いと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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