(57)【要約】【課題】本発明は、ＢＳＴ１又はＣＤ３８が、新たなＮＡＤ合成経路として作用することを見出した。ＢＳＴ１又はＣＤ３８を指標とするスクリーニング方法により、ＮＡＲの合成を介したＮＡＤ合成を調整する物質のスクリーニングができることを見出し、本発明を完成させた。【解決手段】本件発明の課題を解決する手段は、ＢＳＴ１又はＣＤ３８活性を指標とした、ＮＡＲ合成調整物質のスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＳＴ１又はＣＤ３８活性を指標とした、ＮＡＲ合成調整物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＮＡＲ合成調整物質を含み、ニコチンアミドリボシド及びニコチン酸を基質とし、ＢＳＴ１又はＣＤ３８と反応させる工程、
ＮＡＲの合成速度を測定する工程、
ＮＡＲの合成速度を調整することができる物質を選択する工程
を含む、請求項１のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＳＴ１又はＣＤ３８の活性調整を指標とした、体内のＮＡＲ（ニコチン酸リボシド）又はＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を増加させる薬剤、食品素材等のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の細胞内で酸化還元反応の補酵素として機能するＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は、生物の代謝経路で重要な働きを持っている。また、ＮＡＤ＋は老化・寿命関連因子であるSirtuin（サーチュイン）の基質であり、ＮＡＤ＋の細胞内濃度がSirtuinの活性を制御していると報告されている。細胞内ＮＡＤ＋濃度は、年齢とともに減少するといわれ、加齢に伴う細胞内NAD+濃度の低下が、Sirtuinの活性低下やミトコンドリア呼吸鎖などにおける酸化還元反応の低下をもたらし、加齢に伴う身体的機能の低下に繋がっていると考えられる。そのため、細胞内NAD+濃度の低下を予防することが健康維持に重要な役割を担うと考えられている（特許文献１）。
【０００３】
しかし、ＮＡＤ＋を経口摂取しても体内には、吸収されないことが知られている。そこで、近年では、ＮＡＤ＋の前駆体である、β―ＮＭＮ（β―ニコチンアミドモノヌクレオチド）やＮＲ（ニコチンアミドリボシド）は、体内に吸収されることが知られているため、体内のＮＡＤ量を増加させる素材として、ＮＭＮやＮＲが健康素材等として注目されている（非特許文献１、２）。
【０００４】
一方で、哺乳類におけるＮＡＤ合成経路としては、ＮＭＮからＮＡＤが合成される経路（Salvage経路）（非特許文献１）とは別に、トリプトファンやニコチン酸からＮＡＤが新合成される経路（de novo経路）があることが知られている。ＮＡＤの合成経路は、組織や細胞の種類、もしくは発達時期によりSalvage経路、de novo経路を使い分けていると考えられている（非特許文献３）。さらに、加齢や炎症に伴いSalvage経路とde novo経路との間で、ＮＡＤ合成のスイッチングが起こっている可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５０１３４３
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Imai  S.  Pharmacol  Res.  2010  Jul;  62(1):  42-47.
【非特許文献２】Cell Metab. 2018 Mar 6;27(3):513-528
【非特許文献３】Yaku K. et al. Ageing Res Rev. 47: 1-17. (2018)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、Salvage経路とde novo経路を繋ぐ、新たなＮＡＤ合成経路として、ＮＡＲ（ニコチン酸リボシド）を介する経路を同定した。この経路においてＢＳＴ１、ＣＤ３８が、ＮＲからＮＡＲを合成することを見出した。しかし、ＢＳＴ１、ＣＤ３８の生体内での活性は強くないため、ＮＲを投与してもその一部しかＮＡＲには変換されない。そこで、当該酵素を活性する物質を見出すことで、ＮＲを摂取した場合であっても、ＢＳＴ１又はＣＤ３８の活性で、ＮＡＲを合成するため、ＮＲやＮＭＮを摂取した場合と異なる経路でＮＡＤを合成することが可能になる。そのため、本発明では、ＮＡＲの合成を介したＮＡＤ合成を調整する物質のスクリーニング方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＢＳＴ１又はＣＤ３８が、新たなＮＡＤ合成経路として作用することを見出した。ＢＳＴ１又はＣＤ３８を指標とするスクリーニング方法により、ＮＡＲの合成を介したＮＡＤ合成を調整する物質のスクリーニングができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は以下のような発明である。
（１）ＢＳＴ１又はＣＤ３８活性を指標とした、ＮＡＲ合成調整物質のスクリーニング方法。
（２）
ＮＡＲ合成調整物質を含み、ニコチンアミドリボシド及びニコチン酸を基質とし、ＢＳＴ１又はＣＤ３８と反応させる工程、
ＮＡＲの合成速度を測定する工程、
ＮＡＲの合成速度を調整することができる物質を選択する工程
を含む、前記（１）のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、ＮＡＤの合成を調整する物質をスクリーニングすることができ、Salvage経路とは別経路である、de novo経路によるＮＡＤ＋合成を促進等の調整物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＮＡＤ合成経路
【図２】本件発明のスクリーニングで利用される反応
【図３】ＢＳＴ１を使用し、ＮＲとＮＡからＮＡＲを合成した時のクロマトグラフ
【図４】ＮＡＲの生成量
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ＢＳＴ１、又はＣＤ３８の活性、特にＮＡＲの生成速度を指標として、ＢＳＴ１又はＣＤ３８の活性調整物質をスクリーニングすることができる。
【００１３】
ＢＳＴ１（骨髄ストローマ細胞抗原１（bone marrow stromal antigen-1：BST1））とは、 CD157分子とも呼ばれ、ＮＡＤ分解酵素／  ＡＤＰリボース環化酵素ファミリーに属する（特開２０１６−１４９９８８）。この分子ファミリーには後述のＣＤ３８分子も含まれている。ＢＳＴ１とＣＤ３８はアミノ酸配列の上で３６％の類似性をもっており、ともにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(nicotinamide adenine dinucleotide: NAD)を代謝する細胞外酵素（ectoenzyme）としての働きを持つことが知られている。
【００１４】
ＣＤ３８とは、前述のＢＳＴ１と同じファミリーに属し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(nicotinamide adenine dinucleotide: NAD)を代謝する細胞外酵素（ectoenzyme）としての働きを持つことが知られている。
【００１５】
ＢＳＴ１、又はＣＤ３８を用いて、ＮＲとＮＡを反応させることで、ＮＡＲを製造することができることを本発明者らは見出している。ＢＳＴ１とＣＤ３８のいずれを用いることで、ＮＡＲを合成することができるが、ＮＡＲ合成活性の強い、ＢＳＴ１を用いることが好ましい。
【００１６】
ＢＳＴ１、ＣＤ３８は、当業者において、製造、入手できるいずれのものでもよい。一例としては、リコンビナントタンパク質を製造する方法がある。例えば、ＢＳＴ１をコードする遺伝子を含む発現ベクターに組み込む。ベクターは、導入される宿主細胞に応じて、当業者が適宜選択できるものでよい。ベクターの宿主細胞への導入方法も任意である。通常は、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インジェクションなどを用いる。宿主細胞も任意であり、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、サル腎臓細胞（ＨｅＬａ細胞）、ＣＯＳ細胞など動物細胞があげられる。これらの動物細胞以外の酵母、麹、大腸菌、昆虫細胞、植物細胞などを用いて、製造することもできる。市販のＢＳＴ１、ＣＤ３８を利用しても良い。
【００１７】
ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）とニコチン酸（ＮＡ）存在下に、ＢＳＴ１又はＣＤ３８を作用させることにより、ＮＡＲが合成されるため、ＮＡＲ合成速度から、ＢＡＴ１又はＣＤ３８の活性を指標とする。
【００１８】
反応に用いるＮＲとＮＡは、起源に制限なく使用できる。例えば、微生物、酵母等の天然物からの抽出物、合成品などを利用することができる。これら抽出物、合成品、精製した精製品、他の成分を含む組成物であっても良い。
【００１９】
当該反応は、base exchange反応であり、通常の反応条件で行うことができ、特に制限はない。反応条件は、当業者が適宜選択できる反応条件で良い。通常は、ＮＲ、ＮＡをイオン交換水、精製水、蒸留水、又は緩衝液などに溶解する。溶解濃度は、任意であるが、ＮＲは、通常は、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、ＮＡは、０．０５ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。当該溶液にＢＳＴ１又はＣＤ３８を添加する。ＢＳＴ１等の濃度は、当業者が適宜選択できる濃度で反応する。大腸菌等から製造する場合は、ＢＳＴ１等を精製してもよいが、たんぱく質の粗精製品を用いても良い。市販のＢＳＴ１等を使用する場合は、精製品を使用してよく、粗製品でもよい。例えば、市販の精製ＢＳＴ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を利用する場合は、基質となるＮＲ等の濃度により、異なるが、前記の濃度であれば、０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは、１〜５μｇ／ｍｌ添加する。
【００２０】
ＮＡＲの生成速度測定工程は、以下のように測定する。
前記までの反応生成物である。ＮＡＲを定量することにより、測定する。定量方法に制限はないが、高速液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）を使用し、多重反応モニタリング法（ＭＲＭ：Multiple monitoring reaction）で測定する。ＨＰＬＣの条件については、ＮＡＲを検出できる条件を選択したカラムに応じて、当業者が適宜選択できる条件で良い。
【００２１】
ＮＡＲの生成速度は、ＮＡＲの生成量を測定する必要がある。ＮＡＲの生成量は、標品を用いて絶対量を計算して、ＢＳＴ１の活性度を測定しても良い。また、絶対量ではなく、ＢＳＴ１等の活性調整候補物質を添加しないでＮＡＲを生成した条件を基準としても良い。
【００２２】
ＮＡＲの生成速度は、具体的には、以下のように測定する。
中和した反応サンプルを超純水で100倍希釈した後、測定に供する。BST１又はCD38の活性は反応産物であるNARの生成量を用いて計算する。NARの定量は、高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）を使いMRM法で測定できる。HPLC （Agilent社 1290HPLC）の条件は、Waters社のAtlantis T3 Column (2.1 × 150 mm, particle size of 3 μm)のカラムにて、mobile phase A (5 mM ammonium formate in water) and mobile phase B (100% of methanol) at a flow rate of 150 μL/min. The programmed mobile phase gradient was as follows: 0-10 min, 0-70% B; 10-15 min, 70% B; 1520 min, 0% B. の条件で分離した。NARの保持時間は約4.1分であった。質量分析計（Agilent 社6460トリプル四重極質量分析計）のMRM条件はd4-NAR（260＞128）、NR（255＞123）を用いた。クロマト面積はMass Hunter Quantitative software (Agilent社)を用いて計算し、濃度既知のd4-NAR標品を用いた標準直線から、絶対量を計算した。酵素活性は、使用したリコンビナントタンパク質の量、反応時間からNAR生成速度（mol/mg/min）で求める。
【００２３】
ＢＳＴ１等の調整候補物質は、本発明に記載のＮＡＲ生成反応中に添加する。調整候補物質を添加したことにより、ＮＡＲ生成速度が上昇、下降により、ＢＳＴ１調整物質を得ることができる。
【００２４】
調整酵素物質としては、任意のライブラリーに属する薬剤を使用することができる。ライブラリーとしては、微生物、植物等の抽出物ライブラリー、医薬品ライブラリー、有機化合物ライブラリーなどを使用することができる。
【００２５】
本発明の方法により、スクリーニングされた調整物質は、任意の組成物として使用できる。例えば、食品素材、サプリメント、医薬品等に配合して使用することができる。調整物質が配合された食品等は、ＮＡＤ増加素材として、ＮＡＤの増加に伴う種々の効果を享受することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これに限定されない。
【００２７】
BST1リコンビナントタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号4710-AC-0150）、もしくはCD38リコンビナントタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号4947-AC-010）を2μg/mlの濃度で使用し、25 mM Tris-HCl pH7.4、0.2 mM NR、1 mM d-4 NA (Toronto Research Chemicals、カタログ番号N429253)（すべて最終濃度）にて、25℃で反応させた。0-30分の反応時間の後、2倍量の0.5N過塩素酸を加えて反応を停止させ、されに等量の１Mギ酸アンモニウムを加え中和した。
【００２８】
（測定条件）
中和した反応サンプルを超純水で100倍希釈した後、測定に供した。BST１又はCD38の活性は反応産物であるNARの生成量を用いて計算した。NARの定量は、高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）を使いMRM（Multiple monitoring reaction）法で測定した。HPLC （Agilent社 1290HPLC）の条件は、Waters社のAtlantis T3 Column (2.1 × 150 mm, particle size of 3 μm)のカラムにて、mobile phase A (5 mM ammonium formate in water) and mobile phase B (100% of methanol) at a flow rate of 150 μL/min. The programmed mobile phase gradient was as follows: 0-10 min, 0-70% B; 10-15 min, 70% B; 15-20 min, 0% B. の条件で分離した。NARの保持時間は約4.1分であった。質量分析計（Agilent 社6460トリプル四重極質量分析計）のMRM条件はd4-NAR（260＞128）、NR（255＞123）を用いた。クロマト面積はMass Hunter Quantitative software (Agilent社)を用いて計算し、濃度既知のd4-NAR標品を用いた標準直線から、絶対量を計算した。
ＮＡＲは、経時的に、増加した（図４）。
【００２９】
（ＢＳＴ１活性調整候補物質のスクリーニング）
前記と同様の条件で、ＮＡＲ生成反応を行った。生成反応の際、無添加区、ＢＳＴ１活性調整候補物質添加区を設ける。前記と同様に、経時的なＮＡＲの生成量を求め、酵素活性は、使用したリコンビナントタンパク質の量、反応時間からNAR生成速度（mol/mg/min）で求める。無添加区と調整候補物質添加区で生成速度を比較する。比較した結果、生成速度変化によって、ＢＳＴ１の活性を調整しているかを判断する。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
ＢＳＴ１の活性を調節する物質は、個体に投与した際に効率よくＮＡＲを合成することが期待される。またＮＲの投与を併用することで、Ｓａｌｖａｇｅ経路とｄｅ  ｎｏｖｏ経路の両方を活性化し、単独ではあまり効率よくＮＡＤを上昇させられない組織などでもＮＡＤ濃度を上げることができる。ＮＡＤレベルを上げることにより抗老化作用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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