(57)【要約】【課題】本発明は、表皮のターンオーバーの過程である角層剥離において重要な役割を担うＫＬＫ１４に着目し、自然由来で過剰な活性変動を生じる可能性が少ない植物の抽出物を用いてＫＬＫ１４前駆体の遺伝子発現量を適度に高める効果に資する植物の抽出物を含有する製剤を提供することを目的とする。【解決手段】上記課題を解決するため、本発明のカリクレイン前駆体産生促進剤は、ガイヨウの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガイヨウの抽出物を有効成分として含有するカリクレイン１４前駆体産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カリクレイン１４（以下、ＫＬＫ１４と呼ぶ）の細胞遺伝子の発現を高める有効な植物由来の抽出物（エキス）を含む製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、その最下層の基底層から、有棘層、顆粒層、そして、最外層の角層に分類でき、各層で分化、機能を発揮することで皮膚の恒常性を維持している。特に、最外層の角層は、角層細胞同士がコルネオデスモゾームという構造体によって互いを強く接着しており、接着部位に囲まれた細胞間領域には細胞間脂質が存在し、角層構造全体でバリア機能を発揮している。そのコルネオデスモゾームは皮膚内のプロテアーゼ等の働きによって徐々に分解され、細胞間接着が弱くなり、最終的に角質細胞は自然に剥離し、脱落する。上記の過程を経る新陳代謝のことを皮膚（表皮）ターンオーバーという。
【０００３】
しかしながら、乾燥、紫外線、化学物質等の外的要因、生活習慣の乱れ、ストレス及び加齢などの内的要因により表皮のターンオーバーが乱れ、それによって、肌のくすみやごわつき、シミ等が出現することが知られている。また、角層は、ヒトの見た目にも大きな影響を示すことが知られている。例えば、角層のバリア機能が低下すると、皮膚が乾燥しやすく、そのため小じわが目立つようになり、角層のバリア機能が保持された皮膚と比較すると外観が老化したように見えることがある。
【０００４】
角層が機能を維持するためには一定の厚さが必要であり、そのためにはコルネオデスモゾームの分解過程が精密に制御される必要がある。例えば、その分解の過程が遅延した場合には、角層が肥厚して皮膚の質感の低下、くすみ等の皮膚色に関連した要素が変化して皮膚の老化が進んだような外観となる。一方で、分解が亢進した場合には、皮膚バリア機能が低下して乾燥しやすくなるだけでなく、外来因子の侵入等を介した炎症を引き起こしやすくなる。
【０００５】
セリンプロテアーゼであるカリクレイン５（以下、ＫＬＫ５と呼ぶ。）、カリクレイン７（以下、ＫＬＫ７と呼ぶ。）、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７両方の働きを補助する作用を有するとともに、これら２つのＫＬＫと同様の作用を示すＫＬＫ１４が、コルネオデスモソームの分解に関与することがＩｏａｎｎｉｓ  Ｐｒａｓｓａｓの論文（非特許文献１）により報告されている。これらのセリンプロテアーゼが、コルネオデスモソームの構成成分であるデスモグレイン１、コルネオデスモシンおよびデスモコリン１を分解し、角層を剥離させる。
【０００６】
これらのＫＬＫ５やＫＬＫ７、ＫＬＫ１４の産生量やその活性が低下すると角層剥離が円滑に進まず角層が肥厚すると考えられている。このため、ＫＬＫ５をはじめ、ＫＬＫ７に加えて、これら２つのＫＬＫの活性を補助しつつ同様の役割を担うＫＬＫ１４の産生を促進することは、角層肥厚に伴う見た目の皮膚老化等を軽減できる可能性がある。
【０００７】
本発明者らは、これまでに肌のくすみとＫＬＫ５の活性との間に有意な負の関係があることを明らかにした（非特許文献２）。すなわち、肌くすみが強い場合では肌のＫＬＫ５活性が低く、肌のくすみが弱い場合には肌のＫＬＫ５活性が高いことを新規に見出した。さらに、所定の化粧品製剤を連用使用することでＫＬＫ５活性を高め、肌くすみが低下することも報告した（非特許文献２）。しかしながら、ＫＬＫ７およびＫＬＫ１４の各活性の促進に関しては確認することができなかった。
【０００８】
ＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４の作用経路は以下の通りであることがＩｏａｎｎｉｓ  Ｐｒａｓｓａｓらの論文（非特許文献１）により報告されている。
ＫＬＫ５遺伝子の発現によりＫＬＫ５前駆体が産生され、そのＫＬＫ５前駆体が自己活性化によりＫＬＫ５となる。続いて、ＫＬＫ７遺伝子の発現により産生されたＫＬＫ７前駆体、及び、ＫＬＫ１４遺伝子の発現により産生されたＫＬＫ１４前駆体が、ＫＬＫ５によって活性化されて、活性型のＫＬＫ７及びＫＬＫ１４に変化するとされている。さらに、ＫＬＫ１４は、ＫＬＫ７と同様にコルネオデスモソーム分解作用に関わるとともに、正のフィードバックにより、ＫＬＫ５前駆体を活性型のＫＬＫ５へと促進させる作用を有するとされている。
【０００９】
しかし、非特許文献１に記載されたこのメカニズムは、人工的に作製されたＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１４を試験管の中において最適条件下で検討した結果に基づいたものである。さらに、ヒト皮膚においては、これらの酵素活性を抑制するインヒビターが共存するとともに、カルシウム濃度やｐＨ等も試験管の最適条件下とは異なるため、ヒト皮膚内において実際にどのようなメカニズムで作用しているのかについては、十分には明らかになっていない。
【００１０】
従って、ＫＬＫ５の活性促進剤を用いることによってＫＬＫ５の活性が促進されることは既に知られている（非特許文献２）ものの、ヒト皮膚において、ＫＬＫ５の活性促進が、ＫＬＫ７およびＫＬＫ１４の活性を促進し、デスモグレイン１、コルネオデスモシンおよびデスモコリン１などの分解を促進し、過角化を改善させるのか否かは定かではない。
【００１１】
ところで、ＫＬＫ７は、カスパーゼ１４の前駆体を活性型に変換促進する作用があり、これによりフィラグリンの一部分解が進み天然保湿因子であるＮＭＦ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）が増加し、皮膚の保湿能が高まる可能性が示唆されている（非特許文献３）。
【００１２】
すなわち、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４の産生及び活性が低下すると角質細胞の重層化が進み、その脱落が円滑に進まないため角層が肥厚して皮膚の質感の低下、くすみ等の皮膚色に関連した要素が変化して皮膚の老化が進んだような外観となるだけでなく、角層の水分量が低下する可能性がある。このため、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、加えてＫＬＫ５の活性を補助する役割を担い、コルネオデスモゾームの分解にも関与するＫＬＫ１４の産生及び活性を促進することは、表皮の正常なターンオーバーを補助促進させるとともに、角層水分量を増加させるためにも重要と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２０１７−１６０１８６号公報
【特許文献２】特許５４３１６３５号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐｒａｓｓａｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ. １４（３）：１８３−２０２，２０１５
【非特許文献２】ＩＦＳＣＣ２０１６国際大会ポスターＮｏ．２００
【非特許文献３】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７（３９）：３２８２５−３４，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、先行研究によりＫＬＫ５の活性には変化が見られたが、上記非特許文献１のメカニズム通りに作用した場合、ＫＬＫ５の増加によって活性が変動することを見込まれているＫＬＫ７及びＫＬＫ１４に活性の変動が見られなかった。
【００１６】
特許文献１には、エイジツ、ヨモギ、紅茶より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分とすることによって、カリクレイン関連ペプチターゼ、ＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの産生を促進し、コルネオデスモソーム分解を正常化し、ひいては角化を正常化する製剤を得ることが記載されている。しかしながら、当該文献には、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７に加えてそのインヒビターであるＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの遺伝子発現量についても促進効果が記述されている。そのため、そもそもコルネオデスモソーム分解の正常化が可能か否かは定かではない。また、ＫＬＫ１４に関する検討はなされていない。
【００１７】
特許文献２には、尿素化合物を含有し、落屑に関連したプロテアーゼを促進することにより、自然な落屑工程を刺激する、皮膚または粘膜の落屑を刺激する落屑刺激剤が開示されており、前期尿素化合物により促進されるプロテアーゼとしてＫＬＫ１４が挙げられている。しかしながら、当該文献においては、植物由来の抽出物が解決手段として用いられておらず、また、ＫＬＫ遺伝子や遺伝子発現の増強等に関する記載はない。
【００１８】
上記特許文献１をはじめとして、当該分野において、従来植物由来の抽出物を用いてＫＬＫ５又はＫＬＫ７の遺伝子発現量や酵素活性を増加させることに関する多くの成果報告がなされてきた。しかし、特許文献２のようにＫＬＫ１４の促進に関して記載されている場合であっても、ＫＬＫ１４の遺伝子や遺伝子発現の増強等に関する記載はないなど、表皮のターンオーバーを促進するための重要な因子であるＫＬＫ１４に着目した研究は多くはなされていない。
【００１９】
本発明は、表皮ターンオーバーの過程である角層細胞の剥離において重要な役割を担うＫＬＫ１４に着目し、自然由来で過剰な活性変動を生じさせる可能性が少ない植物由来の抽出物を用いて、ＫＬＫ１４前駆体の遺伝子発現を適度に高める効果に資する植物由来の抽出物を含有する製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決するため、本発明のカリクレイン１４前駆体産生促進剤は、ガイヨウの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の製剤によれば、ガイヨウ抽出物が表皮角化細胞のＫＬＫ１４遺伝子発現量を有意に高める効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ガイヨウ抽出物による表皮角化細胞のＫＬＫ１４遺伝子発現量促進作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ガイヨウ（艾葉）は、キク科の多年草であるヨモギまたはヤマヨモギの葉や枝先を乾燥したものである。温裏、止血、止痛の効能があり、従来から、食欲不振や冷えによる腹痛、出血、流産の予防などに用いられている。
【００２４】
本発明者らは、表皮ターンオーバーに関与するＫＬＫ５の活性に関する研究に続いて、ＫＬＫ１４に着目し、その遺伝子および酵素活性を高める有用な植物由来の抽出物を探索するため、植物由来の抽出物を約１００種類収集しスクリーニングを実施した。その際、ＫＬＫ遺伝子が挙動変化を示したガイヨウの抽出物に着目し、ガイヨウ抽出物にＫＬＫ１４遺伝子の発現を高める作用があるか否かについて確認した。
【００２５】
本発明を実施するための形態において使用するガイヨウ抽出物の調製方法の一例を以下に示す。自然由来の原料としてガイヨウの葉を使用し、風乾後に必要に応じて切断、粉砕、する。抽出溶媒には、低級アルコール類、多価アルコール又はその誘電体、ケトン類、エステル類、エーテル類などでもよく、これに限定されない。また、これらの混合溶媒でもよい。
【００２６】
抽出は、抽出溶媒にガイヨウの原料を含浸させることで行う浸漬法などの常法によって行うことができる。その他の例として蒸留法、圧搾法や超臨界抽出法を挙げることができる。抽出の際の温度や圧力は各々の抽出方法によって設定された最適な条件を選択することができる。
【００２７】
今回の確認試験には、化粧品や医薬部外品などへの速やかな適用を考慮して、抽出溶媒及び調製溶媒として皮膚刺激性が低い多価アルコール類である１，３−ブチレングリコール溶液を用いた。ガイヨウ抽出液は、抽出工程の後調整溶媒を加え、適宜ろ過工程を実施して得られたものである。ガイヨウ抽出液におけるガイヨウ抽出物の実配合量は２．００％である。上記は配合の一例である。
【００２８】
（表皮角化細胞遺伝子発現量の変動確認試験）
（試験方法）
（１）増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅにＥＧＦをはじめ各種細胞増殖因子を添加して一定濃度にしたもの）で懸濁した一定数の表皮角化細胞（ＰＳＶＫ１細胞）を１２ウェル培養プレートに播種した。（２）７２時間後、表皮角化細胞が約９５％程度のコンフルエントになったことを確認して、表皮角化細胞の増殖を低下させ分化（角化）状態に切り替えていくために表皮角化細胞の培地を基礎培地（各種増殖因子が入っていないＥｐｉＬｉｆｅ）に置換した。（３）２４時間後、前述のガイヨウ抽出液に基礎培地を加えて作製した０．２％溶液及び０．３％溶液を表皮角化細胞に添加した。（４）添加４８時間後に表皮角化細胞の遺伝子を回収し、ＲＴ−ｑＰＣＲ（半定量的逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）によってＫＬＫ１４の遺伝子発現量を測定した。発現量の補正をするため、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量も同様に測定した。
【００２９】
（試験結果）
ガイヨウ抽出物による表皮角化細胞のＫＬＫ１４遺伝子発現量の変動確認試験の結果を図１に示す。ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、ＫＬＫ１４遺伝子発現量は、ガイヨウ抽出物０．２％溶液を添加した細胞では、ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（非添加）と比較して有意な増加（ｐ＝０．０４５＜０．０５）が認められ、０．３％溶液添加においても、有意な増加（ｐ＝０．０１１＜０．０５）が認められた。したがって、ガイヨウ抽出物による有意なＫＬＫ１４遺伝子発現量の増加作用が認められ、ＫＬＫ１４前駆体の産生を促進する効果が確認できた。
【００３０】
以上より、ガイヨウ抽出物には、ＫＬＫ１４前駆体の産生を促進する効果があることが確認された。
【実施例１】
【００３１】
したがって、ガイヨウ抽出物を皮膚用の医薬品、医薬部外品、化粧品類に加えてＫＬＫ１４前駆体の産生を促進することができる。具体例として、化粧水、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、毛髪用シャンプー、石けん等の清浄用化粧料、育毛剤、さらには浴剤等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明にかかるカリクレイン１４前駆体産生促進剤に、例えば、油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、乳化剤又は乳化助剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料、その他の生理活性成分等を必要に応じて適宜配合することができる。さらに、本発明にかかるカリクレイン１４前駆体産生促進剤の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分を配合することもできる。
【００３３】
本発明にかかるカリクレイン１４前駆体産生促進剤におけるガイヨウ抽出物の含有量は、固形分換算で０．００１〜０．０５質量％であり、好ましくは０．００２〜０．０１質量％である。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明に係る植物由来の抽出物によるＫＬＫ１４前駆体産生促進剤によれば、ＫＬＫ１４の前駆体の遺伝子発現量を適度に高める効果に資する植物の抽出物を含有する各種製剤の提供が可能である。よって、当該製剤の使用により、表皮のターンオーバーが適度に促進される効果が期待される。
【図１】
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