(57)【要約】【課題】  簡易な構造により、同じカメラで、細胞の蛍光画像と明視野画像の両方を取得できる共焦点顕微鏡装置を実現することを目的にする。【解決手段】  蛍光画像と明視野画像を取得する共焦点顕微鏡装置において、試料２からの光は対物レンズ６と結像レンズ２６ａ、２６ｂからなる第１の無限遠光学系の中に設置された第１の分離手段８０ａにより蛍光光と明視野光に分離され、リレーレンズ２９ａ、２９ｂ、２９ｃからなる第２の無限遠光学系の中に設置された合波手段８０ｂにより、ピンホールアレイディスク１６を通過した蛍光光が結像レンズ２６ｂからの明視野光と合波され、バンドパスフィルタ３０ａによりいずれかが選択されてカメラ３１ａに入射することを特徴とする。【選択図】図１
2010181688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転するピンホールアレイディスクを通過した励起光により走査され明視野照明が照射される試料から対物レンズを介して得られる光に基づいて蛍光画像と明視野画像を取得する共焦点顕微鏡装置において、
試料からの光を入射する第１の無限遠光学系と、
該第１の無限遠光学系の中に設置され、試料からの光を蛍光光と明視野光とに分離する第１の分離手段と、
該第１の分離手段から前記第１の無限遠光学系を介して出射される、明視野光と、前記ピンホールアレイディスクを介した蛍光光とが入射される第２の無限遠光学系と、
該第２の無限遠光学系の中に設置され、蛍光光と明視野光とを合波する合波手段と、
該合波手段から出射される蛍光光と明視野光のいずれかを出射する波長選択手段と、
該波長選択手段から出力される画像を前記第２の無限遠光学系を介して取得する第１のカメラと
を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第１の無限遠光学系は、
試料からの光を平行光とし前記第１の分離手段に出射する対物レンズと、
前記第１の分離手段から出射される蛍光光を収束し前記ピンホールアレイディスクに導く第１の結像レンズと、
前記第１の分離手段から出射される明視野光を収束し前記第２の無限遠光学系に導く第２の結像レンズと
を備えたことを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項３】
前記第２の無限遠光学系は、
前記ピンホールアレイディスクから出射される蛍光光を平行光とし前記合波手段に導く第１のリレーレンズと、
前記第２の結像レンズから出射される明視野光を平行光とし前記合波手段に導く第２のリレーレンズと、
前記第１の波長選択手段から出射された光を収束し前記第１のカメラに入射する第３のリレーレンズと
を備えたことを特徴とする請求項１または２記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項４】
前記励起光を透過し、前記ピンホールアレイディスクのピンホールを通過した蛍光信号を反射して前記第１のリレーレンズに導く第２の分離手段と、
前記第１の分離手段から出射される明視野光を反射し前記第２のリレーレンズに入射する反射ミラーと
を備えたことを特徴とする請求項３記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項５】
前記合波手段から出射される蛍光信号の一部を波長分離する第３の分離手段と、
該第３の分離手段から出射される蛍光信号を透過する第２の波長選択手段と、
該第２の波長選択手段から出射された光を収束する第４のリレーレンズと、
該第４のリレーレンズから出射された光を入射する第２のカメラと
を備えたことを特徴とする請求項３または４記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項６】
前記分離手段および前記合波手段としてダイクロイックミラーを用いたことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項７】
前記第１の分離手段および前記合波手段として同一の分光特性を持つダイクロイックミラーを用いたことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項８】
前記ダイクロイックミラーの分光特性は長波長を反射し短波長を透過することを特徴とする請求項７記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項９】
前記ダイクロイックミラーの分光特性は短波長を反射し長波長を透過することを特徴とする請求項７記載の共焦点顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記波長選択手段としてバンドパスフィルタを用いたことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の共焦点顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、回転式のピンホールアレイディスクを用いた共焦点顕微鏡装置に関し、特に細胞の共焦点画像および明視野画像の両方を取得することのできる共焦点顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、注目する細胞内のターゲットに蛍光タンパクなどを融合し、共焦点顕微鏡装置により細胞断面の蛍光画像を取得することにより、ターゲットの動きや、量の増減を解析することが行われている。
【０００３】
しかし、蛍光画像のみだと、ターゲットの動きは明白となるが、これが細胞のどこにあるかは不明である。そこで、細胞全体の形態を観察するのに、明視野画像（一般的に位相差画像が多い）を取得する必要がある。すなわち、蛍光画像と明視野画像の両方を得ることによって、ターゲットが細胞のどの部分に位置するかを確認することができる。
【０００４】
図４は後述の特許文献１に記載された従来の共焦点顕微鏡装置を示す構成説明図である。
【０００５】
ウェルプレート１にあるアレイ状のウェル（穴）の１つにある試料２に対して、ハロゲンランプ（図示省略）から出る明視野照明光３を用いて照射する。照射された試料２は顕微鏡５の対物レンズ６によって明視野像を結ぶ。この像をレンズホルダ９に配置された変倍レンズ１０でカメラ１１に結像させる。変倍レンズ１０の倍率は縮小系をとるので、カメラ１１は試料の広い範囲を撮像した明視野像となる。
【０００６】
ここで、後述の共焦点画像の光路と分けるため、光路に配置された連結部材７内のダイクロイックミラー８を用いて、明視野像の光路を反射させる。ダイクロイックミラー８の波長特性としては、長波長の光を反射し、短波長の光を透過する特性が望ましい。例えば波長６８０ｎｍ以上の光を反射するダイクロイックミラーを用いれば、試料２からの蛍光信号は失われることなくダイクロイックミラー８を透過し、共焦点スキャナ１３及び分光光学ユニット２０で構成される共焦点の光学系に到達する。
【０００７】
一方、共焦点画像を得る光路では、共焦点スキャナ１３は連結部材７を介して顕微鏡５に接続されており、照明用平行励起光束１２（一点鎖線）はマイクロレンズアレイディスク（ＭＬディスクという）１４により個別の光束に集光され、分光特性を持つ平板ミラーからなる第１のダイクロイックミラー（ＤＭという）１５を透過後、ニポウディスク１６の個々のピンホールを通過し、連結部材７のダイクロイックミラー８を透過する。さらに、顕微鏡５の対物レンズ６により、ウェルプレート１に載置された試料２の各試料に集光され蛍光試薬を励起する。ＭＬディスク１４とニポウディスク１６は支軸１７を中心として回転する。
【０００８】
また、図４において、２０は共焦点スキャナ１３の共焦点画像取り出しポートに接続された分光光学ユニットである。この分光光学ユニット２０は、戻り光分離手段として平板ミラーからなるダイクロイックミラー２２、迷光除去手段として分光特性を持つバンドパスフィルタ２３ａ,２３ｂを備えている。
【０００９】
試料２の各試料は例えば蛍光試薬ＣＹ３及びＣＹ５を付加されており、各々の蛍光試薬が発した蛍光信号１８は再び対物レンズ６を通り、ニポウディスク１６の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号１８はダイクロイックミラー１５で反射され、リレーレンズ１９，レンズ２１ａ、バンドパスフィルタ２３ａ,２３ｂを介して、それぞれ選択された波長の共焦点光学像がカメラ２４ａ，２４ｂに結像される。
【００１０】
上述の構成では、ニポウディスク４のピンホールが並んでいる平面と、試料２上の被観察平面と、カメラ２４ａ，２４ｂの受光面とは互いに光学的に共役な関係に配置してあるので、カメラ２４ａ，２４ｂには試料２の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。したがって、試料２の共焦点画像をカメラ２４ａ，２４ｂの受光面上に同時に形成することができるため、多数の被検査試料をマトリックス上に並べた試料２を顕微鏡と共焦点スキャナに対して相対的に移動させることにより、試料全数の任意の波長選択分離をした共焦点画像を高速に取り込むことができる。
【００１１】
上記カメラ１１による明視野像をもとに、試料（細胞）が適切な数量で存在する場所を特定して、共焦点光学系のカメラ２４ａ，２４ｂでこれらの試料を撮像できるようにウェルプレート１の位置を微調整することができる。
【００１２】
なお、従来技術では、２色の蛍光画像を同時に取得するために、カメラ２４ａと２４ｂの２台を使用するが、１色だけを取得する場合、カメラ２４ｂのみの構成となる。
【００１３】
このような共焦点顕微鏡装置の先行技術としては下記のような特許文献が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００８−０４５９８７２号公報
【特許文献２】実開平５−９６８１６号公報
【特許文献３】特開２００８−２４９９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、特許文献１では、図４で従来技術として示したように、細胞の蛍光画像と明視野画像を取得するのに別々のカメラを使用するため、顕微鏡装置としては大型になり、コストアップとなるという問題がある。
【００１６】
また、特許文献２では、第２の分岐光学系が着脱式のため、高速性の実現ができない。      
【００１７】
また、第２の分岐光学系の光学素子は顕微鏡の無限遠光学系の中ではなく、有限系の中に設置されているため、ゴースト像が生じる欠点を持つ。
【００１８】
また、特許文献３では、明視野光路が切替方式のため高速性の実現ができないことと、駆動系が必要であるため機構が複雑でコストアップになるという問題がある。
【００１９】
本発明は上記従来技術の課題を解決するためになされたもので、光学系の構成、および光学系に使用するダイクロイックミラーなどの光学素子を工夫して、簡易な構造により、同一のカメラで、細胞の蛍光画像と明視野画像の両方を取得できる共焦点顕微鏡装置を実現することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
回転するピンホールアレイディスクを通過した励起光により走査され明視野照明が照射される試料から対物レンズを介して得られる光に基づいて蛍光画像と明視野画像を取得する共焦点顕微鏡装置において、
試料からの光を入射する第１の無限遠光学系と、
該第１の無限遠光学系の中に設置され、試料からの光を蛍光光と明視野光とに分離する第１の分離手段と、
該第１の分離手段から前記第１の無限遠光学系を介して出射される、明視野光と、前記ピンホールアレイディスクを介した蛍光光とが入射される第２の無限遠光学系と、
該第２の無限遠光学系の中に設置され、蛍光光と明視野光とを合波する合波手段と、
該合波手段から出射される蛍光光と明視野光のいずれかを出射する波長選択手段と、
該波長選択手段から出力される画像を前記第２の無限遠光学系を介して取得する第１のカメラと
を備えたことを特徴とする。
【００２１】
請求項２記載の発明は、
請求項１記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記第１の無限遠光学系は、
試料からの光を平行光とし前記第１の分離手段に出射する対物レンズと、
前記第１の分離手段から出射される蛍光光を収束し前記ピンホールアレイディスクに導く第１の結像レンズと、
前記第１の分離手段から出射される明視野光を収束し前記第２の無限遠光学系に導く第２の結像レンズと
を備えたことを特徴とする。
【００２２】
請求項３記載の発明は、
請求項１または２記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記第２の無限遠光学系は、
前記ピンホールアレイディスクから出射される蛍光光を平行光とし前記合波手段に導く第１のリレーレンズと、
前記第２の結像レンズから出射される明視野光を平行光とし前記合波手段に導く第２のリレーレンズと、
前記第１の波長選択手段から出射された光を収束し前記第１のカメラに入射する第３のリレーレンズと
を備えたことを特徴とする。
【００２３】
請求項４記載の発明は、
請求項３記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記励起光を透過し、前記ピンホールアレイディスクのピンホールを通過した蛍光信号を反射して前記第１のリレーレンズに導く第２の分離手段と、
前記第１の分離手段から出射される明視野光を反射し前記第２のリレーレンズに入射する反射ミラーと
を備えたことを特徴とする。
【００２４】
請求項５記載の発明は、
請求項３または４記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記合波手段から出射される蛍光信号の一部を波長分離する第３の分離手段と、
該第３の分離手段から出射される蛍光信号を透過する第２の波長選択手段と、
該第２の波長選択手段から出射された光を収束する第４のリレーレンズと、
該第４のリレーレンズから出射された光を入射する第２のカメラと
を備えたことを特徴とする。
【００２５】
請求項６記載の発明は、
請求項１乃至５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記分離手段および前記合波手段としてダイクロイックミラーを用いたことを特徴とする。
【００２６】
請求項７記載の発明は、
請求項１乃至５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記第１の分離手段および前記合波手段として同一の分光特性を持つダイクロイックミラーを用いたことを特徴とする。
【００２７】
請求項８記載の発明は、
請求項７記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記ダイクロイックミラーの分光特性は長波長を反射し短波長を透過することを特徴とする。
【００２８】
請求項９記載の発明は、
請求項７記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記ダイクロイックミラーの分光特性は短波長を反射し長波長を透過することを特徴とする。
【００２９】
請求項１０記載の発明は、
請求項１乃至９のいずれかに記載の共焦点顕微鏡装置において、
前記波長選択手段としてバンドパスフィルタを用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば以下のような効果がある。
すなわち、明視野画像と蛍光画像を波長の帯域で分け、２つの波長の光路と光学素子を工夫することにより、１台のカメラで、明視野画像と蛍光画像の両方を取得することができる。
その結果、共焦点顕微鏡装置の構成を簡略化し、安価なコストで高機能の装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の実施の形態に係る共焦点顕微鏡装置の一実施例を示す構成説明図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る、共焦点顕微鏡装置の第２の実施例を示す構成説明図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る、共焦点顕微鏡装置の変形例を示す構成説明図である。
【図４】従来の共焦点顕微鏡装置を示す構成説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下本発明の実施の形態について図面を用いて詳細に説明する。
【００３３】
図１は本発明の実施の形態に係る共焦点顕微鏡装置の一実施例の核心となる、光学系の構成を示す構成説明図である。図４と同一要素には同一記号を付して重複する説明は省略する。
【００３４】
図１において、ダイクロイックミラー８０ａは、第１の分離手段を構成し、試料２から対物レンズ６を介して入射される平行光に含まれる長波長の明視野光を反射し、短波長の蛍光を透過することにより、明視野光路と蛍光光路とに波長分離する。例えば、波長４００ｎｍ〜７００ｎｍを蛍光画像の領域とし、７００ｎｍ〜７５０ｎｍを明視野画像の領域とする場合は、ダイクロイックミラー８０ａは、波長７００ｎｍ以上の光を反射し、波長７００ｎｍ以下の光を透過する分光特性を持つ。
【００３５】
第１の結像レンズ２６ａは、ダイクロイックミラー８０ａを透過した蛍光光１８からなる平行光束を収束して共焦点スキャナ１３のピンホールアレイディスク（ニポウディスク）１６に導く。
【００３６】
ダイクロイックミラー１５は、第２の分離手段を構成し、レーザ光源（図示せず）からの励起光束１２を透過するとともに、ピンホールアレイディスク１６のピンホールを通過した蛍光信号１８を反射して第１のリレーレンズ２９ａに導く。
【００３７】
第１のリレーレンズ２９ａは、ピンホールアレイディスク１６から出射されダイクロイックミラー１５で反射された蛍光光を平行光束にする。
【００３８】
第２の結像レンズ２６ｂは、ダイクロイックミラー８０ａで反射された明視野光を収束する。
【００３９】
反射ミラー２７は、第２の結像レンズ２６ｂから出射された明視野光を反射して第２のリレーレンズ２９ｂに導く。
【００４０】
第２のリレーレンズ２９ｂは、反射ミラー２７で反射された明視野光を平行光にする。
【００４１】
ダイクロイックミラー８０ｂは、合波手段を構成し、第２のリレーレンズ２９ｂから出射された明視野光と第１のリレーレンズ２９ａから出射された蛍光光とを合波する。ここで、８０ｂにダイクロイックミラー８０ａと全く同一の分光特性を持たせることにより、部品の共通化を図ることができる。
【００４２】
バンドパスフィルタ３０ａは、第１の波長選択手段を構成し、ダイクロイックミラー８０ｂから出射される蛍光信号または明視野信号光のいずれか一方を透過し、他方を遮断する。ここで、バンドパスフィルタ３０ａは回転するフィルタホイール（図示なし）に装着され、明視野画像を取得する場合、７００ｎｍ〜７５０ｎｍの帯域のみを透過する特性を持ち、蛍光画像を取得する場合、それぞれの蛍光スペクトルに合った波長帯域を透過する特性を持つ。
【００４３】
第３のリレーレンズ２９ｃは、バンドパスフィルタ３０ａから出射された平行光を収束する。
【００４４】
第１のカメラ３１ａは、第３のリレーレンズ２９ｃで収束された光を入射する。
【００４５】
なお、上記でダイクロイックミラー８０ａと８０ｂは全く同一の分光特性を持ち、長波長を反射し短波長を透過するが、部品の種類を最小限にするのが目的なので、必ずしも全く同じ特性を持たなくてもよい。
【００４６】
また、第１のダイクロイックミラー８０ａは対物レンズ６と結像レンズ２６ａ、２６ｂから構成される第１の無限遠光学系の中に設置される。
また、第２のダイクロイックミラー８０ｂ、及びバンドパスフィルタ３０ａはリレーレンズ対２９ａと２９ｃ及び２９ｂと２９ｃから構成される第２の無限遠光学系の中に設置される。
【００４７】
ここで、無限遠光学系とはテレセントリック光学系とも呼ばれ、入射瞳または射出瞳が光学系の焦点面にある光学系のことをいう。すなわち、対物レンズ６と結像レンズ２６ａの間、および対物レンズ６と結像レンズ２６ｂの間はテレセントリック光学系を構成する。リレーレンズ２９ａと２９ｃの間、リレーレンズ２９ｂと２９ｃの間も同様にテレセントリック光学系を構成する。
【００４８】
また、光学系にあるレンズ、ミラー、フィルタなど個々の光学素子の設置、固定、交換の方法は一般的な方法によって行われるものとし、ここでは説明を省略する。
【００４９】
図１の装置における明視野画像と蛍光画像の取得のための動作についてそれぞれ以下に説明する。
【００５０】
まず、明視野画像の取得について説明する。
【００５１】
ウェルプレート１に配置された細胞などの試料２に対して、明視野光源（図示なし）から発する明視野照明３を照射すると、明視野信号光４が得られる。この信号光は対物レンズ６によって集光され、ダイクロイックミラー８０ａによって反射されて明視野光路に導かれる。
【００５２】
ダイクロイックミラー８０ａによって反射された明視野信号光４は第２の結像レンズ２６ｂによって収束され、反射ミラー２７で反射された後、結像面２８ｂに像を結ぶ。ここで、反射ミラー２７を用いて明視野信号４の進行方向を変えるのは、明視野信号４を蛍光信号の光路に混合するためである。
【００５３】
結像面２８ｂにある明視野画像は、リレーレンズ２９ｂで平行光となり、ダイクロイックミラー８０ｂで反射され、バンドパスフィルタ３０ａを透過してリレーレンズ２９ｃにより収束し、第１のカメラ３１ａに入射する。明視野画像を取得する場合、バンドパスフィルタ３０ａは７００ｎｍ〜７５０ｎｍの帯域のみを透過する特性が選択されている。ここで、光学素子８０ｂと３０ａはテレセントリックなリレーレンズ２９ｂと２９ｃの間に設置されているので、光学素子の表面で発生する光の多重反射によってゴースト像が生じることがない。これは、テレセントリックなリレーレンズの間で光の多重反射によって生じる平行光はリレーレンズを介して１点に収束するからである。
【００５４】
次に、蛍光画像の取得について説明する。
【００５５】
図１のように、ウェルプレート１に設置された細胞などの試料２に対して、複数の波長を混合したレーザ光源（図示なし）から出る励起光束１２を用いて照射する。レーザ光源（図示なし）から出た励起光束１２は、マイクロレンズアレイディスク１４で集光され、ダイクロイックミラー１５を透過し、ニポウディスク１６のピンホールを通過し、結像レンズ２６ａによって平行光となり、ダイクロイックミラー８０ａを透過し、対物レンズ６で収束され、試料２に照射される。
【００５６】
照射された試料２から発生した蛍光信号１８は、対物レンズ６によって集光され、平行光となってダイクロイックミラー８０ａを透過し、結像レンズ２６ａによって収束されて結像面２８ａに蛍光像を結ぶ。マイクロレンズ付きピンホールアレイディスク１６はピンホール面が前記結像面２８ａに一致するように配置されているので、蛍光像は共焦点像となる。共焦点像は、ダイクロイックミラー１５によって反射され、テレセントリックなリレーレンズ系２９ａと２９ｃによってカメラ３１ａに結像される。このとき、ダイクロイックミラー８０ｂは前述の通り蛍光の波長を透過し、バンドパスフィルタ３０ａはフィルタホイールにより特性を切り替えられて、励起光束の波長に対応した蛍光の波長帯域のみを透過する。
【００５７】
上記で画像を取得する際、蛍光画像を取得する場合には励起光束のみを投入し、明視野画像を取得する場合には明視野照明のみを投入する。時分割的に明視野画像と蛍光画像の２種類の画像を取得した後、画像処理装置などを用いて両者の重ね合わせを行う。
【００５８】
上記のような共焦点顕微鏡装置によれば、明視野画像と蛍光画像を波長の帯域で分け、２つの波長の光路と光学素子を工夫することにより、１台のカメラで明視野画像と蛍光画像の両方を取得することができる。その結果、共焦点顕微鏡装置の構成を簡略化し、安価なコストで高機能の装置を実現することができる。
【００５９】
また、無限遠光学系を用いているので、レンズの間に挿入する光学素子の拡張性を高くすることができるという利点がある。
【００６０】
なお、多色の蛍光を取得する場合、励起波長を順次切替え、それに対応してバンドパスフィルタ３０ａを切替えて、複数種類の蛍光画像を時分割で取得してもよい。この場合、通常は試料ごとに複数の画像を取得する。
【００６１】
図２は本発明の実施の形態に係る、共焦点顕微鏡装置の第２の実施例で、図１のテレセントリックなリレーレンズの間にダイクロイックミラーを設置し、２色の蛍光画像を同時に取得することができるようにしたものを示す構成説明図である。図１と同一要素には同一記号を付して重複する説明は省略する。
【００６２】
第２図において、ダイクロイックミラー３２は、ダイクロイックミラー８０ｂから出射される蛍光信号の一部を反射して波長分離する第３の分離手段を構成する。バンドパスフィルタ３０ｂは、ダイクロイックミラー３２で反射された蛍光信号を透過する第２の波長選択手段を構成する。リレーレンズ２９ｄはバンドパスフィルタ３０ｂから出射された蛍光光を収束する第４のリレーレンズを構成する。カメラ３１ｂは、リレーレンズの２９ｄから出射された光を入射する第２のカメラを構成する。
【００６３】
第２図の装置の動作を以下に説明する。
【００６４】
ダイクロイックミラー８０ｂから出射された蛍光信号は、ダイクロイックミラー３２の分光特性により、長波長の蛍光が透過され、短波長の蛍光が反射される。
【００６５】
一例として、ダイクロイックミラー３２がｍＲＦＰの蛍光を透過し、ＧＦＰの蛍光を反射する場合は、励起光束として４７３ｎｍと５６１ｎｍの２波長のレーザが同時に励起され、バンドパスフィルタ３０ａ、３０ｂがそれぞれｍＲＦＰ、ＧＦＰの蛍光を透過する。その結果、ｍＲＦＰの蛍光画像がカメラ３１ａから取得され、ＧＦＰの蛍光画像がカメラ３１ｂから取得されるので、２色の蛍光画像を同時に取得することができる。
【００６６】
図２の共焦点顕微鏡装置によれば、試料の動きが速い場合にも２色の蛍光画像間の同時性が保証される。
【００６７】
なお、図２の装置でバンドパスフィルタ３０ａ、３０ｂとして、それぞれ複数の波帯のフィルタをフィルタホイールに装着したものとすれば、さらに多数の蛍光画像を得ることができる。
【００６８】
図３は本発明の実施の形態に係る、共焦点顕微鏡装置の変形例で、明視野光路と蛍光光路を分けるダイクロイックミラーの分光特性を第１図と逆にしたものを示す構成説明図である。図１と同一要素には同一記号を付して重複する説明は省略する。
【００６９】
図３の装置では、ダイクロイックミラー１８０ａ、１８０ｂの分光特性として、短波長の光を反射し、長波長の光を透過するように構成している。分光特性の一例として、４００ｎｍ〜７００ｎｍの光を反射し、７００ｎｍ〜７５０ｎｍの光を透過するものが挙げられる。
【００７０】
図３の装置の動作について、図１の動作と異なる部分を中心に以下に説明する。他の動作は図１の場合と同じである。
【００７１】
結像レンズ２６ａを出た励起光束１２はダイクロイックミラー１８０ａで反射され、対物レンズ６に入射する。対物レンズ６から出射された蛍光信号１８はダイクロイックミラー１８０ａで反射され、結像レンズ２６ａに入射する。結像レンズ２６ａで収束された蛍光光はダイクロイックミラー１５で反射された後リレーレンズ２９ａに入射し、リレーレンズ２９ａから出射された蛍光信号１８はダイクロイックミラー１８０ｂで反射され、バンドパスフィルタ３０ａに入射する。
【００７２】
また、対物レンズ６から出射された明視野信号光４は、ダイクロイックミラー１８０ａを透過し、結像レンズ２６ｂにより結合面１２８ｂに像を結んだ後、反射ミラー２７で反射されリレーレンズ２９ｂに導かれる。リレーレンズ２９ｂから出射された明視野信号光４は、ダイクロイックミラー１８０ｂを透過してバンドパスフィルタ３０ａに入射する。
【００７３】
図３の共焦点顕微鏡装置は、図１の場合と同様な効果を発生する。
【００７４】
なお、図１の場合と同様に複数種類の蛍光画像を時分割で取得してもよい。
【００７５】
また、第２図と同様に要素を追加して２色の蛍光画像を同時に取得してもよい。
【００７６】
また、本発明は、上記実施例や変形例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。
【符号の説明】
【００７７】
２  試料
３  明視野照明
４  明視野信号光
６  対物レンズ
１２  励起光
１５  第２の分離手段
１６  ピンホールアレイディスク
１８  蛍光信号
２６ａ  第１の結像レンズ
２６ｂ  第２の結像レンズ
２７  反射ミラー
２９ａ  第１のリレーレンズ
２９ｂ  第２のリレーレンズ
２９ｃ  第３のリレーレンズ
２９ｄ  第４のリレーレンズ
３０ａ  第１の波長選択手段
３０ｂ  第２の波長選択手段
３１ａ  第１のカメラ
３１ｂ  第２のカメラ
３２  第３の分離手段
８０ａ  第１の分離手段
８０ｂ  合波手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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