(57)【要約】【課題】免疫反応場と検出場とをそれぞれ独立させることによって、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れた、表面プラズモンを利用したアッセイ法を提供すること。【解決手段】下記工程（ａ）〜（ｇ）を含むことを特徴とするアッセイ法。  工程（ａ）：リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、工程（ｂ）：粒子に、リガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、工程（ｃ）：粒子に、さらに基質を反応させ、消光剤が生成される工程、工程（ｄ）：消光剤を単離する工程、工程（ｅ）：プラズモン励起センサの該蛍光色素層表面に、消光剤を接触させる工程、工程（ｆ）：プラズモン励起センサにプリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および工程（ｇ）：得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｇ）を含むことを特徴とするアッセイ法。
工程（ａ）：リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られた粒子に、該リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られた粒子に、さらに基質を反応させ、消光剤が生成される工程、
工程（ｄ）：該工程（ｃ）を経て得られた消光剤を単離する工程、
工程（ｅ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該蛍光色素層表面に、該工程（ｄ）を経て得られた消光剤を接触させる工程、
工程（ｆ）：該工程（ｅ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｇ）：該工程（ｆ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【請求項２】
上記工程（ａ）〜（ｄ）の免疫反応場および、上記工程（ｅ）〜（ｇ）の検出場が、それぞれ独立している請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項３】
上記工程（ａ）に記載のリガンドが、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する１次抗体である請求項１または２に記載のアッセイ法。
【請求項４】
上記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液である請求項１〜３のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項５】
上記酵素が、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはグルコースオキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項６】
上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成される請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項７】
上記金属が、銀からなる請求項６に記載のアッセイ法。
【請求項８】
上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ4）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含む請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項９】
上記蛍光色素層が、上記スペーサ層の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に、蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を塗工することによって形成される請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項１０】
上記蛍光色素層が、上記スペーサ層の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に、シランカップリング剤を介して結合することによって形成される請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項１１】
少なくとも、上記工程（ｅ）を経て得られたプラズモン励起センサ、レーザ光の光源、光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍
光検出部を含み、請求項１に記載の工程（ｆ）に用いられることを特徴とする装置。
【請求項１２】
少なくとも、透明平面基板と上記金属薄膜と上記の誘電体からなるスペーサ層と上記蛍光色素層とを含むセンサ、上記酵素および基質を含み、請求項１〜１０のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンを利用したアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の原理に基づき、表面プラズモンを利用したアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
【０００３】
このようなＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサまたはバイオチップに関する例として、特許文献１には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いたリガンド（１次抗体）固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で、抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が示されている。
【０００４】
しかしながら、極微量アナライト(標的抗原など)の検出においては、アッセイで抗原に関係付けられるコンジュゲート中の蛍光色素量も極微量であり、このことが蛍光発生量のボトルネックとなるため、プラズモン電場増強を用いても蛍光シグナル量が上がらず、アッセイ感度の向上は難しい。
【０００５】
また、特許文献２では、センサ基板上でアポ酵素、ホロ酵素による反応と免疫反応とを複雑に組み合わせ、シグナル増幅および非特異反応低減を検討している。
【０００６】
しかしながら、このような測定系を成立させるためには、極めて精密な分子配向技術が前提となっていることから、免疫反応よりもアポ／ホロ酵素反応が優先的または支配的な場合、測定系そのものが成立しない危険性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許３２９４６０５号
【特許文献２】特開２００８−１３９２４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、免疫反応場と検出場とをそれぞれ独立させることによって、高感度かつ高精度であり、イムノアッセイに必要不可欠である特異性に優れた、表面プラズモンを利用したアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素により標識された２次抗体を用いることによって、免疫反応場と検出場とを完全に分離することができ、さらに
極微量の標的抗原であってもフォトン量に見合った蛍光発光と特異性とを両立できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｇ）を含むことを特徴とする。
【００１１】
工程（ａ）：リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られた粒子に、該リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られた粒子に、さらに基質を反応させ、消光剤が生成される工程、
工程（ｄ）：該工程（ｃ）を経て得られた消光剤を単離する工程、
工程（ｅ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該蛍光色素層表面に、該工程（ｄ）を経て得られた消光剤を接触させる工程、
工程（ｆ）：該工程（ｅ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｇ）：該工程（ｆ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【００１２】
上記工程（ａ）〜（ｄ）の免疫反応場および、上記工程（ｅ）〜（ｇ）の検出場は、それぞれ独立していることが好ましい。
【００１３】
上記工程（ａ）に記載のリガンドは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原を認識し結合する１次抗体であってもよい。
【００１４】
上記検体は、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であることが好ましい。
【００１５】
上記酵素は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼまたはグルコースオキシダーゼであることが好ましい。
【００１６】
上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることが好ましく、該金属は、銀からなることが特に好ましい。
【００１７】
上記誘電体は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ4）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００１８】
上記蛍光色素層は、上記スペーサ層の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に、蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を塗工することによって形成することもでき、
上記スペーサ層の、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に、シランカップリング剤を介して結合することによって形成することもできる。
【００１９】
本発明の装置は、少なくとも、上記工程（ｅ）を経て得られたプラズモン励起センサ、レーザ光の光源、光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、上記工程（ｆ）に用いられることを特徴とする。
【００２０】
本発明のキットは、少なくとも、透明平面基板と上記金属薄膜と上記の誘電体からなるスペーサ層と上記蛍光色素層とを含むセンサ、上記酵素および基質を含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
従来、極微量のアナライトを測定する超高感度な系において、表面プラズモンの電場増強（電場増強フォトン量の例）と微量な蛍光色素量（蛍光フォトン量の例）のミスマッチが起こり感度の限界が生じる。
【００２２】
それに対して、本発明のアッセイ法は、１リットル当り１０-18モル（１ａｍｏｌ/Ｌ）〜１０-12モル（１ｐｍｏｌ/Ｌ）レベルの濃度のアナライト（例えば、標的抗原）を含む検体から、高感度かつ高精度で該アナライトを検出できるプラズモン励起センサを提供することができる。
【００２３】
また、微量のアナライトを検出する際、従来のサンドイッチイムノアッセイ法では蛍光信号（蛍光シグナル）量が少なくシグナル変化量が劣化するが、本発明は、プラズモン励起センサ、およびリガンド（例えば、２次抗体）と消光剤を活性化する酵素とのコンジュゲートを用いて本発明のアッセイ法に適用した場合、標的抗原量と比例するのが消光剤であるためシグナル変化量が劣化しないプラズモン励起センサを提供することができる。
【００２４】
また、本発明は、消光剤の能力次第で蛍光信号量を調整できるため、本発明のアッセイ法が最適なシグナル変化量で実施可能なプラズモン励起センサを提供することができる。
【００２５】
さらに、本発明は、粒子の除去、すなわち免疫反応場と検出場との完全分離が可能であることから、免疫反応条件および検出条件の最適化をすることができ、散乱ノイズの影響を受けづらく、さらに、３つの感度増幅機構、すなわち免疫反応最適化、化学的増幅および物理的増幅を有するため、極めて高感度・高精度のアッセイ法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、免疫反応場において、「検体中に含有されるアナライト（標的抗原）」３を、「粒子」１の表面に固定化した「リガンドとしての１次抗体」２と、「酵素」７により標識された「リガンドとしての２次抗体」４とが結合し、さらに「消光剤基質」８を添加することによって、「消光剤」９が生成し、単離した「消光剤」９を、検出場である「その表面に金薄膜を形成された透明平面基板」５と、該金薄膜の、該基板５とは接していないもう一方の表面に形成した「蛍光色素層」６とを有する“プラズモン励起センサ”の該「蛍光色素層」６側の表面に接触させ、該基板５の、該金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し（図示せず）、該「蛍光色素層」６に含まれる蛍光色素が表面プラズモンによって励起され発光している、本発明のアッセイ法の模式図を示す。
【図２】図２は、工程（ａ）〜（ｃ）：免疫反応場である「試験管」１２中で、「検体中に含有されるアナライト（標的抗原）」３を、磁性を有する「粒子」１の表面に固定化した「リガンドとしての１次抗体」２と、「酵素」７により標識された「リガンドとしての２次抗体」４とが結合して、さらに消光剤基質（図示せず）を添加することによって、「消光剤」９が生成し；工程（ｄ）：「試験管」１２の外側から「磁石」１１を近づけることにより、「消光剤」９を単離し；工程（ｅ）および（ｆ）：検出場である「その表面に金薄膜を形成された透明平面基板」５と、該金薄膜の、該基板５とは接していないもう一方の表面に形成した「蛍光色素層」６とを有する“プラズモン励起センサ”の該「蛍光色素層」６側の表面に接触させ、該基板５の、該金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し（図示せず）、該「蛍光色素層」６に含まれる蛍光色素が表面プラズモンによって励起され発光している、本発明のアッセイ法の模式図を示す。
【図３】図３は、それぞれ実施例１，２および比較例１，２で得られたブランクシグナルおよびアッセイシグナルをグラフにしてまとめた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００２８】
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ａ）〜（ｇ）を含むことを特徴とするものであって、さらに洗浄工程を含むことが好ましい。
【００２９】
工程（ａ）：リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程、
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られた粒子に、該リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られた粒子に、さらに基質を反応させ、消光剤が生成される工程、
工程（ｄ）：該工程（ｃ）を経て得られた消光剤を単離する工程、
工程（ｅ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該薄膜表面に、該工程（ｄ）を経て得られた消光剤を接触させる工程、
工程（ｆ）：該工程（ｅ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｇ）：該工程（ｆ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【００３０】
なお、本発明のアッセイ法は、一定の温度を保ちながら実施することが好ましい。
【００３１】
［工程（ａ）］
工程（ａ）とは、リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる工程である。
【００３２】
（粒子）
「粒子」とは、本発明において、検体中に含有されるアナライトを検出するために使用される水不溶性の担体である。水不溶性の粒子を形成する材料は、水に不溶であればよい。なお、「水不溶性」とは、具体的に水、他のいかなる水溶液に溶解しない固相を意味する。粒子は、固定・分離などの用途に現在広く使用され、提案されている公知の支持体またはマトリックスのいずれであってもよい。
【００３３】
水不溶性の粒子を形成する材料としては、無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合物またはこれらを組み合わせた複合材料を含む。粒子の表面に固定化したリガンドが、検体中に含有されるアナライトを結合できるものであれば、粒子の材質・形状・サイズは特に限定されないが、好ましくは、リガンドの固定化量を多くする観点から、大きい表面積を与え得る材料である。
【００３４】
粒子として使用される材料は、特に限定されるものではないが、一般に、ポリスチレン
、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ラテックス等の合成有機高分子；ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化クロム等の無機物；またはステンレス、ジルコニア等の金属などであってもよい。また、これらの材料は、一般に多孔質性の不規則な表面を有し、例えば、繊維、ウェブ、焼結体、多孔体などであってもよい。
【００３５】
粒子の形状としては、例えば、球体状、楕円体状、錐体状、立方体状、直方体状などが挙げられる。これらのうち球体状の粒子は、製造が容易であり、使用時に粒子の回転撹拌が容易であることからも好ましい。
【００３６】
粒子のサイズ、すなわち平均粒子径としては、０.５〜１０μｍが好ましく、２〜６μ
ｍがより好ましい。平均粒子径が０.５μｍ未満であると、粒子が磁性粒子である場合、
充分な磁気応答性を発現せず、磁性粒子を分離するために相当に長い時間を要し、また分離するために極めて大きい磁力が必要となる。一方、平均粒子径が１０μｍを超えると、粒子が水溶液中で沈降しやすいものとなるため、検体を接触させる際に媒体を撹拌する操作が必要となる。また、粒子本体の表面積が小さくなるため、検体中に含有されるアナライトを捕捉することが困難となることがある。
【００３７】
その表面も含めた粒子全体が同一の材料から構成されている態様の他に、必要に応じて複数の素材から構成されるハイブリット体から構成されていてもよい。例えば、分析の自動化に対応することができるために、コア部分は酸化鉄、酸化クロム等の磁気応答性材料で作製され、その表面を有機合成ポリマーで被覆された複合ビーズなどが挙げられる。
【００３８】
このような「粒子」として、下記リガンドの表面固定化密度を容易に調節でき、Ｂ／Ｆ分離さらには固液分離が容易な観点から、磁性粒子が好ましく、図２に記載の工程（ｄ）のように、磁性粒子を磁石の磁力によって容易に（固液）分離・回収することができる点で、該磁性粒子は、常磁性体、強常磁性体または強磁性体などの磁性体を含有してなるものが好ましく、常磁性体および／または強常磁性体を含有してなるものがより好ましい。特に残留磁化がないかまたは少ない点で、強常磁性体を用いることが好ましい。
【００３９】
このような「磁性体」の具体例としては、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロム等の金属；コバルト・ニッケル・マンガン等の各種合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄が特に好ましい。なお、コバルトおよびニッケルは、ヒスチジンタグと親和性を有する。
【００４０】
粒子に用いられる「磁性体」は、小粒径の粒子よりなるビーズであって、優れた磁気分離性（すなわち、磁気によって短時間で分離する性能）を有し、かつ緩い上下震盪の操作によって再分散し得るものであることが好ましい。
【００４１】
磁性粒子における磁性体の含有割合は、非磁性体の有機物質などの含有割合が３０重量％以上であることから、７０重量％以下とされ、好ましくは２０〜７０重量％、より好ましくは３０〜７０重量％であることが望ましい。このような含有割合が２０重量％未満であると、充分な磁気応答性が発現されず、所要の磁力によって短時間で粒子を分離することが困難となることがある。一方、この含有割合が７０重量％を超えると、粒子本体表面に露出する磁性体の量が多くなるため、該磁性体の構成成分、例えば、鉄イオンなどの溶出が発生し、使用時に他の材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、粒子本体が脆くなって実用的な強度が得られないことがある。
【００４２】
このような磁性粒子として、市販品も用いることができ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ
シリーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製）などが挙げられる。
【００４３】
（リガンド）
「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などであれば、特に限定されない。
【００４４】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００４５】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
【００４６】
粒子表面へのリガンドの固定化方法としては、粒子表面末端官能基に応じた最適な架橋方法を選択することができる。また、粒子表面の性状によっては、表面に直接物理的に吸着させる方法も有効な手段として挙げられる。
【００４７】
（検体）
「検体」としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望する溶媒、緩衝液等によって適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独でも、２種併用してもよい。
【００４８】
（接触）
リガンドがその表面に固定化された粒子と、検体とを接触させる条件として、温度は、通常４〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃、時間としては、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００４９】
（洗浄工程）
洗浄工程は、下記工程（ｂ）の前および後に含まれることが好ましく、上記工程（ａ）で得られた粒子の表面および下記工程（ｂ）で得られた粒子の表面を洗浄する工程である。
【００５０】
該工程に使用される洗浄液としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１５０〜５００ｍＭ含有するものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものであってもよい。
【００５１】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られた粒子に、該工程（ａ）で用いたリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと酵素とのコンジュゲートを反応させる工程である。
【００５２】
（リガンド）
工程（ｂ）で用いる「リガンド」とは、上記工程（ａ）で用いるリガンドと同じであっても異なっていてもよい。ただし、粒子表面に固定化された「リガンド」（工程（ａ））が、モノクローナル抗体である場合、工程（ｂ）で用いられる「リガンド」は、工程（ａ）で用いた「リガンド」が認識する部位以外を認識することが好ましい。
【００５３】
（酵素）
「酵素」は、下記「基質」が（Ａ）保護基によってブロックされている消光剤基質の場合、酵素反応によって消光剤として活性化したり、（Ｂ）（Ａ）以外の「基質」の場合、酵素反応によりｐＨを低下させたりするために用いられる。
【００５４】
（Ａ）の酵素反応に用いる「酵素」としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
【００５５】
β−ガラクトシダーゼは、消光剤基質としてＴＧ−βＧａｌからβＧａｌを脱離させる反応を触媒する。また、β−グルコシダーゼは、消光剤基質としてＴＧ−βＧｌｕからβＧｌｕを脱離させる反応を触媒する。なお、遊離のＴＧは励起波長が４９０ｎｍであり、蛍光波長が４７５ｎｍ〜４９５ｎｍの蛍光色素とＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ；蛍光共鳴エネルギー移動）を起こすので、テルビウム（Ｔｂ）キレートの蛍光（蛍光波長：４９５ｎｍ）あるいは強化シアン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）（蛍光波長：４７５ｎｍ）などの蛍光を消光することができる。
【００５６】
アルカリフォスファターゼは、基質であるＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質が強い蛍光物質を生成する反応を触媒する。ここで生成した励起波長４８２ｎｍの蛍光物質ＢＢＴ（２’−［２−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｙｌ］−６’−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）は上述のＴＧと同様、テルビウム（Ｔｂ）キレートまたは強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）とＦＲＥＴを起こし、それぞれ消光することができる。
【００５７】
（Ｂ）の酵素反応に用いる「酵素」としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（以下「ＧＯＤ」とも記す。）、などが挙げられる。
【００５８】
ＧＯＤは、グルコースを基質とする酵素反応（下記反応式を参照）により、グルコノラクトンと過酸化水素とを生成する。なお、水分に溶解した過酸化水素によってその水分のｐＨが低下するにともない、蛍光色素として用いている２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧの蛍光強度が小さくなる。
【００５９】
【化１】
2010181323.tif 000002
【００６０】
（Ａ）、（Ｂ）ともに、これらの酵素は１種単独で用いることもでき、また２種以上併
用することもできる。
【００６１】
（リガンドと酵素とのコンジュゲート）
「リガンドと酵素とのコンジュゲート」とは、酵素により標識されたリガンドのことである。リガンドに酵素を標識する方法としては、例えば、まず酵素が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基とリガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有するリガンドおよび酵素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有するリガンドおよび酵素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有するリガンドおよび酵素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された酵素とストレプトアビジン化されたリガンドとを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００６２】
このように作製された「酵素により標識されたリガンド」の濃度は、０．００１〜１０，０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１，０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００６３】
反応条件として温度および時間は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同じであってもよい。
【００６４】
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られた粒子に、さらに基質を反応させ、消光剤が生成される工程である。
【００６５】
（基質）
「基質」は、上述のとおり、（Ａ）の場合：保護基によってブロックされている消光剤基質、および（Ｂ）の場合：（Ａ）以外の「基質」が挙げられる。
【００６６】
（Ａ）の消光剤基質としては、例えば、ＴＧ−βＧａｌ、ＴＧ−βＧｌｕ、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質などが挙げられる。
【００６７】
ＴＧ−βＧａｌおよびＴＧ−βＧｌｕは、蛍光色素であるＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ）に、それぞれ保護基としてβ−ガラクトースおよびβ−グルコース１分子が付加されており、この状態では蛍光はほとんど観察されないが、それぞれβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコシダーゼにより保護基が脱離することによって強い蛍光を発するようになる。
【００６８】
なお、ＴＧは、本発明において、下記式（ｉ）で表される２−Ｍｅ  ＴＧや、下記式（ｉｉ）で表される２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧなども包含する。
【００６９】
【化２】
2010181323.tif 000003
【００７０】
ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質は、ｐＨ９．５の溶液中で弱い蛍光を発するが、アルカリフォスファターゼによる酵素反応の結果、強い蛍光を発するようになる。
【００７１】
（Ｂ）の「基質」は、例えば、グルコースオキシダーゼの基質となるグルコースおよび酸素などが挙げられる。
【００７２】
本発明において、酵素、基質および下記「蛍光色素」の好ましい組み合わせとして、表１に示すものが挙げられる。
【００７３】
【表１】
2010181323.tif 000004
【００７４】
このような消光剤基質の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００７５】
（消光剤）
「消光剤」は、上述のリガンドに標識された酵素と、上記「基質」とが反応し、生成したものであって、（Ａ）の場合：例えば、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ）、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質などが挙げられ、（Ｂ）の場合：例えば、過酸化水素、などが挙げられる。
【００７６】
なお、（Ａ）の場合：ＴＧまたはＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質は、蛍光色素として用いているテルビウム（Ｔｂ）とＦＲＥＴを起し、テルビウム（Ｔｂ）の蛍光（蛍光波長：４９５ｎｍ）を消光することができ、（Ｂ）の場合：水分に溶解した過酸化水素がその水分のｐＨを低下させることによって、蛍光色素として用いている２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧを消光することができる。
【００７７】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）を経て得られた消光剤を単離する工程である。
【００７８】
消光剤を単離する方法としては、例えば、粒子が磁性粒子である場合は、磁力または遠心分離により、消光剤が含まれる溶液と粒子とを固液分離する方法が挙げられ、粒子が焼結体、多孔体または基板などの場合は、固液分離の方法を用いずに消光剤が含まれる溶液と粒子とを単離することができる。
【００７９】
［工程（ｅ）］
工程（ｅ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された「誘電体からなるスペーサ層」と、該スペーサ層の、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された「蛍光色素層」とを少なくとも有する“プラズモン励起センサ”の、該薄膜表面に、該工程（ｄ）を経て得られた消光剤を接触させる工程である。
【００８０】
なお、このような“プラズモン励起センサ”は、例えば、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製のＢｉａｃｏｒｅシステムに用いられるセンサーチップなどのように基板と金薄膜とを有するもの、さらに該金薄膜にスペーサ層を形成したものも包含する。
【００８１】
（透明平面基板）
本発明で用いられる透明平面基板としては、ガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００８２】
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ＳＣＨＯＴＴ  ＡＧ社製のＢＫ７（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）およびＬａＳＦＮ９（屈折率〔ｎｄ〕1.８５）、（株）住田光
学ガラス製のＫ−ＰＳＦｎ３（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、Ｋ−ＬａＳＦｎ１７（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）およびＫ−ＬａＳＦｎ２２（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ１０（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００８３】
透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００８４】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００８５】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製のＰＤＣ２００）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００８６】
（金属薄膜）
上記「透明平面基板」の一方の表面に形成された金属薄膜としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００８７】
なお、上記「透明平面基板」としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００８８】
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。
【００８９】
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００９０】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００９１】
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００９２】
（誘電体からなるスペーサ層）
「誘電体からなるスペーサ層」は、上記「金属薄膜」による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、該金属薄膜の、上記「透明平面基板」と接していないもう一方の表面に形成したものであって、該誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできるが、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００９３】
該スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、３０ｎｍ以下が好ましく、１０〜２０ｎｍがより好ましい。また、電場増強の観点からは、２００ｎｍ〜１ｍｍが好ましく、電場増強効果の安定性の観点からは、４００〜１,６０
０ｎｍが好ましい。本発明のプラズモン励起センサが、今後、大量生産される際、該センサが有するスペーサ層の厚さが変動することが想定され、特に４００ｎｍ以上の厚さを有すると共鳴角の変動が一層大きくなる可能性があるため、測定の安定性を確保する目的から、該スペーサ層の厚さとして、特に１０〜２０ｎｍが好ましい。
【００９４】
該スペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００９５】
（蛍光色素層）
「蛍光色素層」とは、上記「誘電体からなるスペーサ層」の、上記「金属薄膜」とは接していないもう一方の表面に、蛍光色素を固定化した層であって、（Ｉ）蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を該スペーサ層上に塗工することによって形成することもでき、（ＩＩ）シランカップリング剤を介して、蛍光色素を該スペーサ層上に結合することによって形成することもできる。
【００９６】
（Ｉ）の場合、蛍光色素とポリマーとは化学的結合をしていても、していなくてもよく、また（Ｉ’）重合性基を有するシランカップリング剤を上記スペーサ層に結合させて、他の重合性モノマー、蛍光色素および重合開始剤を加えて共重合させることにより蛍光色素とポリマーとを含有する組成物を形成することもできる。
【００９７】
（ＩＩ）の場合、アミノ基またはカルボキシル基を有するシランカップリング剤と、それらの基と反応して共有結合する基を有するリガンドとを結合することによって、蛍光色素を上記スペーサ層に固定化することができる。
【００９８】
このように、蛍光色素とポリマーとを含有してなる層を形成する（Ｉ）の場合は、固定化できる蛍光色素量が多く、得られる層の強度が高いことから好ましい。
【００９９】
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【０１００】
本発明で用いられる「蛍光色素」としては、例えば、テルビウム（Ｔｂ）キレート（蛍光波長：４９０ｎｍ）、ＥＣＦＰタンパク質（蛍光波長：４７５ｎｍ）、下記式で表される２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧ、２−ＯＭｅ−５−Ｍｅ  ＴＧ、２−ＯＭｅ  ＴＧ、などが挙げられる。
【０１０１】
このような蛍光色素は、水溶性が高いものが多く、これら蛍光色素を蛍光色素層としてポリマー中に分子間相互作用で固定化するためには、蛍光色素が有するカルボキシル基に、疎水性の芳香族環が有するアミノ基やアルコールを反応させて水に不要性の構造にするか、または疎水性ポリマーと蛍光色素の活性エステルとの反応によって化学的に結合する必要がある。ポリマーと蛍光色素とが化学的な結合を有しない場合、ポリマーの溶解パラメータに近い構造となるように蛍光色素を修飾することが好ましい。
【０１０２】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【０１０３】
「ポリマー」としては、例えば、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン-アクリレート、ポリスチレン、ポリビニルブチラール、ポリエステルなどが挙げられ
る。これらのうち、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリビニルブチラールは、蛍光色素との相溶性に優れ、非特異的な吸着（例えば、蛋白質（アルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン）、脂質、糖類（グルコース））を抑制することができるため好適である。
【０１０４】
「組成物」は、蛍光色素およびポリマー以外に、溶媒、必要に応じて酸化防止剤などの添加剤も含有することができる。
【０１０５】
「溶媒」としては、揮発性が高ければ特に限定されず、例えば、含ハロゲン系炭化水素類（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、テトラフルオロプロパン等）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ターシャリブタノール、テトラフルオロプロパノール）、芳香族類（例えば、トルエン、キシレン等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル等）、エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、グリコール類（例えば、エチレングリコール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）などが挙げられる。これらのうち、用いられるポリマーの溶解安定性の観点から、芳香族類、含ハロゲン系炭化水素類、エステル類、ケトン類が好ましい。
【０１０６】
「酸化防止剤」としては、例えば、ペンタエリスリチルテトラキス［３−(３，５−ジ
−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)］プロピオネート、２，６−ジ−ｔ−ブチル−
４−メチルフェノール、２，２’−ジオキシ−３，３’−ジ−ｔ−ブチル−５，５’−ジメチルジフェニルメタン、テトラキス［メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−
ヒドロキシフェニル）プロピオネート］メタンなどが挙げられる。
【０１０７】
組成物の総量（１００重量％）に対して、蛍光色素は１〜７５重量％が好ましく、３０〜７０重量％がより好ましく、ポリマーは２５〜９９重量％が好ましく、７０〜３０重量％がより好ましい。蛍光色素およびポリマーが上記含有量であると、消光の効率が良好である。
【０１０８】
また、溶媒は、組成物１００重量部に対して、１００〜１,０００重量部が好ましく、
１００〜５００重量部がより好ましい。添加剤は、組成物１００重量部に対して、０．１〜１０重量部が好ましく、１〜５重量部がより好ましい。溶媒または添加剤が上記配合量であると、塗布性が良く、蛍光量子収率の低下を起さないため好適である。
【０１０９】
「塗工」する方法としては、特に限定されないが、例えば、スピンコート法、ワイヤーコート法、バーコート法、ロールコート法、ブレードコート法、カーテンコート法、スクリーン印刷法などで塗布後、通常２０〜１００℃で、５〜３０分間乾燥させる。
【０１１０】
（接触）
このような「プラズモン励起センサ」の該スペーサ層側表面に、上記工程（ｄ）を経て得られた消光剤を接触させる方法としては、該消光剤を含有した溶液の滴下、吹付、塗布などの方法が挙げられる。また、プラズモン励起センサ上に下記のような「流路」を構成し、該消光剤を含有した溶液をプラズモン励起センサ表面に接触させるような方法も挙げられる。
【０１１１】
「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【０１１２】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【０１１３】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【０１１４】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【０１１５】
工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、または別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、蛍光色素層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【０１１６】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１１７】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【０１１８】
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【０１１９】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
【０１２０】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎ
である。
【０１２１】
［工程（ｆ）］
工程（ｆ）とは、上記工程（ｅ）で得られたプラズモン励起センサに、上記「透明平面基板」の、上記「金属薄膜」を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１２２】
レーザ光は、光学フィルタおよび偏光フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１２３】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、基板となるガラスの屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、銀では約４０〜１００倍の増加量となる。
【０１２４】
蛍光色素は光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１２５】
「レーザ光」としては、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好ましい。
【０１２６】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が上記「透明平面基板」と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１２７】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
【０１２８】
「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節す
ることを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１２９】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【０１３０】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１３１】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（（株）ニコン製またはオリンパス（株）製）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１３２】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１３３】
［工程（ｇ）］
工程（ｇ）とは、上記工程（ｆ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
【０１３４】
より具体的には、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１３５】
（アナライト）
「アナライト」としては、上記「蛍光色素層」に固定化されたリガンドを特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【０１３６】
（アッセイシグナル変化量）
さらに、工程（ｇ）は、上記工程（ｄ）の前に測定したシグナルを“ブランクシグナル”、としたとき、下記式で表されるアッセイシグナル変化量を算出することができる。
【０１３７】
シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜
＜装置＞
本発明の装置は、少なくとも、上記工程（ｅ）を経て得られたプラズモン励起センサ、レーザ光の光源、光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよび表面プラズモン励起増強蛍光検出部を含み、上記工程（ｆ）に用いられることを特徴とするもので
ある。
【０１３８】
すなわち、本発明の装置は、上記プラズモン励起センサを用いて、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
【０１３９】
「装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。なお、検体液、洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１４０】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１４１】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
【０１４２】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【０１４３】
＜キット＞
本発明のキットは、少なくとも、透明平面基板と上記金属薄膜と上記の誘電体からなるスペーサ層と上記蛍光色素層とを含むセンサ、上記酵素および基質を含み、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであって、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、１次抗体、抗原などのリガンド、検体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１４４】
例えば、本発明のキットと、検体として血液、血漿または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１４５】
このような「キット」としては、具体的に、透明平面基板の一方の表面に金属薄膜を形成したプラズモン励起センサ；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。
【０１４６】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１４７】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【０１４８】
［作製例１］（２次抗体とβ−ガラクトシダーゼとのコンジュゲートの作製）
β−ガラクトシダーゼを、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に固定化した。
【０１４９】
具体的には、酵素のカルボキシル基と抗体のアミノ基とをアミノカップリング法により固定化した。
【０１５０】
［作製例２］（２次抗体とグルコースオキシダーゼとのコンジュゲートの作製）
グルコースオキシダーゼを、作製例１と同様の方法で抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に固定化した。
【０１５１】
［作製例３］（アルカリフォスファダーゼ標識２次抗体の作製）
２次抗体として抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）を、ビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
【０１５２】
まず、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識アルカリフォスファダーゼ（ＡＬＰ）（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ（ＫＰＬ社製））溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。
【０１５３】
次に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、アルカリフォスファダーゼ標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１５４】
［作製例４］（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
まず、ビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。
【０１５５】
次に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１５６】
［実施例１］
(プラズマ励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．５２、厚さ１ｍｍで外形が２０ｍｍ×２０ｍｍのガラス製の透明平面基板（ＳＣＨＯＴＴ  ＡＧ社製のＢＫ７）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさら銀薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ、銀薄膜の厚さは４５ｎｍであった。
【０１５７】
銀薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは
、１５ｎｍであった。
【０１５８】
該スペーサ層の、銀薄膜とは接していない片面に対して、蛍光色素としてテルビウム（Ｔｂ）キレート５重量部、ポリマーとして積水化学工業（株）製のＢＬ−Ｓ（ポリビニルブチラール）５重量部、および溶媒としてメチルエチルケトン２５重量部を含有する組成物をスピンコータ法により塗布し、暗所にて５０℃で１０分間乾燥させ、溶媒を揮散させた。得られた蛍光色素層の厚さは１０ｎｍであった。
【０１５９】
（アッセイ法の実施）
工程（ａ）として、まず抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所から入手）を１次抗体として用いて、磁性粒子であるＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製）に固定化した。その固定化方法は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに添付のプロトコールに準じた。
【０１６０】
抗ＡＦＰモノクローナル抗体がその表面に固定化された磁性粒子（０．０１５重量％のＴＢＳ溶液に調製）１００μＬに、標的抗原としてＡＦＰ（１ｎｇ／ｍＬのＴＢＳ溶液に調製）を含有する検体を接触させ、１０分間反応させた。
【０１６１】
洗浄工程として、上記工程（ａ）を経て得られた粒子を磁石により集めることで固液分離し、該工程（ａ）を経た反応溶液の液体のみを廃棄した。残存した該粒子に対して、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ３００μＬを分注し、１分間攪拌した後に該粒
子を磁石により集めた。このような洗浄工程を３回繰り返した。
工程（ｂ）として、上記洗浄工程を経て得られた粒子に、作製例１で得られた、β−ガラクトシダーゼ標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬに調製したＴＢＳ
溶液）を２００μＬ添加し、１０分間反応させた。
【０１６２】
洗浄工程として、上記工程（ｂ）を経て得られた粒子を磁石により集めることで固液分離し、該工程（ｂ）を経た反応溶液の液体のみを廃棄した。残存した該粒子に対し、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ３００μＬを分注し、１分間攪拌した後に粒子を
磁石により集めた。このような洗浄工程を３回繰り返した。
【０１６３】
工程（ｃ）として、上記洗浄工程を経て得られた粒子に、ＴＢＳで調整した酵素消光基質溶液（ＴＧ−bＧａｌ）１００μＬを分注し、攪拌後、５分間反応させた。
【０１６４】
工程（ｄ）として、上記工程（ｃ）を経て得られた反応溶液を、磁石により粒子を集めることで固液分離を行い、蛍光色素消光溶液として単離した。
【０１６５】
工程（ｅ）として、上記工程（ｄ）を経て得られた蛍光色素消光溶液を、上記(プラズ
マ励起センサの作製)で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた
。
【０１６６】
工程（ｆ）として、上記工程（ｅ）で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、銀薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（３４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。
【０１６７】
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。
工程（ｇ）として、上記工程（ｆ）で得られた測定結果から、アッセイシグナル変化量を以下の式で評価した。
【０１６８】
シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜
得られた結果を、表２および図３に示す。
【０１６９】
[実施例２]
(プラズマ励起センサの作製)
蛍光色素をテルビウムキレートの代わりに、２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧを用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【０１７０】
（アッセイ法の実施）
作製例２で得られた２次抗体、酵素消光基質溶液としてグルコースおよび酸素を、さらに励起波長４９０ｎｍのレーザ光を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【０１７１】
得られた結果を、表２および図３に示す。
【０１７２】
［比較例１］
(プラズマ励起センサの作製)
屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ  １０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
【０１７３】
このようにして得られた基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。
【０１７４】
ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。
【０１７５】
（アッセイ法の実施）
工程（ａ）として、まず抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所から入手）を１次抗体として用いて、磁性粒子であるＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ社製）に固定化した。その固定化方法は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに添付のプロトコールに準じた。
【０１７６】
抗ＡＦＰモノクローナル抗体がその表面に固定化された磁性粒子（０．０１５重量％のＴＢＳ溶液に調製）１００μＬに、標的抗原としてＡＦＰ（１ｎｇ／ｍＬのＴＢＳ溶液に調製）を含有する検体を接触させ、１０分間反応させた。
【０１７７】
洗浄工程として、上記工程（ａ）を経て得られた粒子を磁石により集めることで固液分離し、該工程（ａ）を経た反応溶液の液体のみを廃棄した。残存した該粒子に対して、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ３００μＬを分注し、１分間攪拌した後に該粒
子を磁石により集めた。このような洗浄工程を３回繰り返した。
【０１７８】
工程（ｂ）として、上記洗浄工程を経て得られた粒子に、作製例3で得られた、アルカ
リフォスファダーゼ標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬに調製した
ＴＢＳ溶液）を２００μＬ添加し、１０分間反応させた。
【０１７９】
洗浄工程として、上記工程（ｂ）を経て得られた粒子を磁石により集めることで固液分離し、該工程（ｂ）を経た反応溶液の液体のみを廃棄した。残存した該粒子に対し、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ３００μＬを分注し、１分間攪拌した後に粒子を
磁石により集めた。このような洗浄工程を３回繰り返した。
【０１８０】
工程（ｃ）として、上記洗浄工程を経て得られた粒子に、ＴＢＳで調製した酵素蛍光基質溶液（１,３−ｄｉｃｌｏｒｏ−９,９−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｃｒｉｄｉｎｅ−２−ｏｎｅ−７−ｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＤＡＯ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製））１００μＬを分注し、攪拌後、５分間反応させた。
【０１８１】
工程（ｄ）として、上記工程（ｃ）を経て得られた反応溶液を、磁石により粒子を集めることで固液分離を行い、蛍光色素溶液として単離した。
【０１８２】
工程（ｅ）として、上記工程（ｄ）を経て得られた蛍光色素溶液を、作製例１で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた。
【０１８３】
工程（ｆ）として、上記工程（ｅ）で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。
【０１８４】
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。
工程（ｇ）として、上記工程（ｆ）で得られた測定結果から、シグナル変化量を以下の式で算出した。
【０１８５】
シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランクシグナル）｜
得られた結果を、表２および図３に示す。
【０１８６】
［比較例２］
(プラズマ励起センサの作製)
比較例１と同様にして作製した。
【０１８７】
（アッセイ法の実施）
得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。
【０１８８】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ
上に１次抗体を固相化した。なお、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。
【０１８９】
送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。
【０１９０】
Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによ
って洗浄した。
【０１９１】
作製例４で作製したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、２０分間
循環させた。
【０１９２】
その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として２０分間循環させる
ことによって洗浄した。
【０１９３】
ＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイシグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをブランクシグナルとした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイシグナル変化量を算出することで評価した。
【０１９４】
得られた結果を、表２および図３に示す。
【０１９５】
【表２】
2010181323.tif 000005
【０１９６】
本発明のプラズモン励起センサ上では基盤に蛍光色素層を形成しているため、ブランク状態で極めて高い蛍光シグナルが得られており、比較例２の従来の蛍光標識ＳＰＦＳ測定と較べて、桁違いの極めて高感度な測定が可能であることがわかった。さらに、比較例１の蛍光色素酵素増幅系の場合と較べて、高い蛍光シグナルの領域において、高いシグナル
変化量を達成できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明のアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【符号の説明】
【０１９８】
１・・・粒子
２・・・リガンドとしての１次抗体
３・・・検体中に含有されるアナライト（標的抗原）
４・・・リガンドとしての２次抗体
５・・・その表面に金薄膜を形成された透明平面基板
６・・・蛍光色素層
７・・・酵素
８・・・消光剤基質
９・・・消光剤
１０・・・表面プラズモンにより励起された蛍光
１１・・・磁石
１２・・・試験管
【図３】
2010181323.tif 000006
【図１】
2010181323.tif 000007
【図２】
2010181323.tif 000008