(57)【要約】【課題】簡便な手順でモノアシルグリセロールリパーゼを製造する方法の提供。【解決手段】枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌を培養してモノアシルグリセロールリパーゼを発現させることを含む、モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌を培養してモノアシルグリセロールリパーゼを発現させることを含む、モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法。
【請求項２】
培養物の上清から前記モノアシルグリセロールリパーゼを回収することをさらに含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記バチルス属菌に、前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが制御領域と作動可能に連結されている、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼである、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項８】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項９】
前記枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌が、枯草菌ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属菌である、請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１０】
前記バチルス属菌が、枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されたものである、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１２】
枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されており、かつモノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、組換えバチルス属菌。
【請求項１３】
前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが制御領域と作動可能に連結されている、請求項１２記載の組換えバチルス属菌。
【請求項１４】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼである、請求項１２又は１３記載の組換えバチルス属菌。
【請求項１５】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、バチルス属菌又はゲオバチルス属由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼである、請求項１４記載の組換えバチルス属菌。
【請求項１６】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌。
【請求項１７】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌。
【請求項１８】
枯草菌ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている、請求項１２〜１７のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌。
【請求項１９】
枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されている、請求項１８記載の組換えバチルス属菌。
【請求項２０】
前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１２〜１９のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌。
【請求項２１】
枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されたバチルス属菌に、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むことを含むか、又は、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込んだバチルス属菌において枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性を低減させることを含む、組換えバチルス属菌の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）は、乳化剤や抗菌剤等として食品、医薬品、化粧品等の分野に広く利用されている物質である。さらに近年、ＭＡＧが、食後の血中トリグリセリドの上昇抑制、食後血中インスリン上昇抑制、食後ＧＩＰ分泌抑制等の優れた生理活性を有することが見出されている。ＭＡＧは、化学的には、高温条件下、アルカリ触媒の存在下で脂肪酸とグリセリンとをエステル化する方法や、高温高圧条件下で油脂をグリセロリシスする方法などにより製造される。しかし、これらの方法では、高温処理や排水のための設備が必要である。一方、脂肪酸とグリセリンとをリパーゼの存在下で反応させるＭＡＧの生化学的な製造方法は、より穏和な条件下で利用可能な方法として注目されている（例えば特許文献１）。この方法で用いるリパーゼとしては、モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）などの脂肪酸モノグリセリド又は脂肪酸ジグリセリドを基質として認識するリパーゼが好ましい。
【０００３】
ＭＧＬＰについては、特許文献２に、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）Ｈ−２５７由来ＭＧＬＰであるＨ−２５７が開示されている。また、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２（非特許文献１）などのＨ−２５７リパーゼと近縁のＭＧＬＰが公知である。
【０００４】
バチルス属等の微生物由来ＭＧＬＰは、それを生産する微生物を培養し、次いで培養物からＭＧＬＰを抽出することによって製造することができる。さらに、特許文献３には、Ｈ−２５７リパーゼの遺伝子を導入した大腸菌株を培養し、培養物からＭＧＬＰを採取することにより、ＭＧＬＰを効率よく量産することができることが開示されている。しかしながら、従来の方法は、生産されたＭＧＬＰを回収するために培養した細胞を破砕する工程が必要であるため、手順が煩雑であった。
【０００５】
一方、目的タンパク質を高生産するよう改変された変異バチルス属菌が知られている。特許文献４には、菌体外プロテアーゼＡｐｒＥをコードするａｐｒＥ遺伝子が削除又は不活性化されており、かつバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換された組換え枯草菌を培養するタンパク質の製造方法が開示されている。特許文献５には、枯草菌のａｐｒＸ遺伝子と、枯草菌のａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選ばれる遺伝子とを欠失又は不活性化させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法が開示されている。特許文献６には、枯草菌１６８株からａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択される８つ以上のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた枯草菌変異株を用い、枯草菌エンドグルカナーゼ遺伝子ｂｇｌＣを発現させ、完全長ＢｇｌＣを枯草菌細胞外に分泌させることを特徴とする、ＢｇｌＣの製造法が開示されている。特許文献７には、不活性化されたａｐｒＥ、ｎｐｒＥ、ｅｐｒ、ｉｓｐＡ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ−ｙｂｊＦ及びｎｐｒＢ遺伝子を有し、かつシグナル配列とストレプトマイセス・スブチリシン阻害剤（ＳＳＩ）タンパク質の融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えバチルス属細胞を培養することを含むＳＳＩタンパク質を生産する方法が開示されている。特許文献８には、グルカノトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アスパラギナーゼ等の外来タンパク質を生産するための宿主細胞として、ＡｐｒＥ、Ｂｐｒ、Ｅｐｒ、Ｍｐｒ、ＮｐｒＥ、Ｖｐｒ及びＷｐｒＡからなる群から選択される１つまたは複数のプロテアーゼをコードする遺伝子を破壊したバチルス属宿主細胞を用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２２０２３６号公報
【特許文献２】特開２０１０−１８３８７３号公報
【特許文献３】特開平５−１６８４６８号公報
【特許文献４】特開２００４−３１３１６９号公報
【特許文献５】特開２００６−１７４７０７号公報
【特許文献６】特開２０１２−１１５２１９号公報
【特許文献７】特表２０１１−５０８６１０号公報
【特許文献８】特表２０１６−５２１５７９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】PLoS ONE, 2013, 8(10):e76675
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、天然では非分泌型のモノアシルグリセロールリパーゼの生産において、分泌型プロテアーゼＡｐｒＥの活性が低減されたバチルス属菌を培養して該モノアシルグリセロールリパーゼを生産させることで、細胞を破砕する工程を行うことなく、生産されたモノアシルグリセロールリパーゼを培養上清から回収できることを見出した。
【００１０】
したがって、本発明は、枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌を培養してモノアシルグリセロールリパーゼを発現させることを含む、モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法を提供する。
また本発明は、枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されており、かつモノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、組換えバチルス属菌を提供する。
また本発明は、枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されたバチルス属菌に、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むことを含む、組換えバチルス属菌の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、天然では非分泌型のモノアシルグリセロールリパーゼを、微生物細胞外に分泌生産させて、培養後の細胞を破砕する工程を行うことなく培養上清から容易に回収できることができる。本発明によれば、簡便な手順でモノアシルグリセロールリパーゼを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各種遺伝子欠失組換え枯草菌株の９６時間培養後に得られた培養上清における相対リパーゼ活性。
【図２】各種遺伝子欠失組換え枯草菌株の９６時間培養後に得られた培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。矢印はＥｓｔＧｔＡ２のバンドを示す。
【図３】各種ＭＧＬＰを発現するａｐｒＥ欠失組換え枯草菌株の培養物の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。矢印は、左から、Ｈ−２５７、ｓｔＬＰ、ＣＩ２２０−６、ＣＩ２２０−１０、及びＣＩ２２０−１２のバンドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、ＢＳＯＲＦ  ＤＢに登録されている遺伝子番号を表す。
【００１４】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１６】
また本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１７】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【００１８】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【００１９】
本発明のモノアシルグリセロールリパーゼ（以下、ＭＧＬＰともいう）の製造方法は、特定の分泌型プロテアーゼ（細胞外プロテアーゼともいう）の活性が低減された微生物を培養して、モノアシルグリセロールリパーゼを発現させることを含む。
【００２０】
本発明でＭＧＬＰの製造に使用される微生物としては、枯草菌等のバチルス属（Bacillus）菌や、クロストリジウム属（Clostridium）菌、酵母などが挙げられ、このうちバチルス属菌が好ましい。さらに、全ゲノム情報が明らかにされている点、ゲノム工学技術が確立されている点、及びタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点などから、枯草菌又はその変異株がより好ましい。
【００２１】
本発明で用いる微生物において活性が低減される分泌型プロテアーゼとしては、枯草菌ＡｐｒＥ（以下、単にＡｐｒＥという）、及びこれに相当するプロテアーゼが挙げられる。ＡｐｒＥは、枯草菌遺伝子ａｐｒＥ（以下、単にａｐｒＥという）にコードされる、セリンアルカリプロテアーゼ（ズブチリシンＥ）である。ａｐｒＥは、ＢＳＯＲＦ  ＤＢでの遺伝子番号ＢＧ１０１９０で示される遺伝子である。
【００２２】
ＡｐｒＥに相当するプロテアーゼとしては、ＡｐｒＥとアミノ酸配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつＡｐｒＥと同等の機能を有するプロテアーゼが挙げられ、好ましくは、ａｐｒＥに相当する遺伝子にコードされる、アルカリ側に至適ｐＨを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチド（すなわちセリンアルカリプロテアーゼ）が挙げられる。本明細書において、ａｐｒＥに相当する遺伝子とは、ａｐｒＥとヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつアルカリ側に至適ｐＨを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をいう。ＡｐｒＥに相当するプロテアーゼの具体的な例としては、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）のｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｓ８、バチルス・ハロトレランス（Bacillus halotolerans）のｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｓ８、バチルス・テキレンシス（Bacillus tequilensis）のｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｓ８などが挙げられる。
【００２３】
本発明で用いる微生物は、ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性の低減に加えて、１種又は２種以上の他の本来のプロテアーゼの活性が低減されていてもよい。当該他の本来のプロテアーゼとしては、例えば枯草菌遺伝子ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ（以下、単にｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸという）、及びこれらに相当する遺伝子にコードされるプロテアーゼが挙げられる。ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼとあわせてこれらの他の本来のプロテアーゼの活性を低減させることにより、細胞外へのＭＧＬＰの放出が促進され、培養上清から回収されるＭＧＬＰの収量を向上させることができる。このような微生物の例としては、ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されており、さらにｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている微生物が挙げられる。ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸ、又は及びこれらに相当する遺伝子は、いずれか１つを欠失させればよいが、いずれか２種以上を組み合わせて欠失又は不活性化させてもよい。
【００２４】
ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸの遺伝子番号と、それらがコードするタンパク質の機能を表１に示す。ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸに相当する遺伝子としては、それぞれ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸと、ヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ（表１に記載される）同じ機能のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼや他の本来のプロテアーゼなどの微生物の標的タンパク質の活性の低減は、該微生物における該標的タンパク質の発現量を低減させることによって実現することができる。例えば、該微生物中の該標的タンパク質をコードする遺伝子（すなわち標的遺伝子、例えばａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子）を欠失又は不活性化させること、該標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを不活性化すること、又は該標的遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害することなどによって該標的タンパク質の発現を抑制することで、該標的タンパク質の活性を低減させることができる。あるいは、発現した該標的タンパク質の活性を低減させてもよい。
【００２７】
細胞中の標的遺伝子の欠失又は不活性化は、標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他のヌクレオチド配列と置き換えること、標的遺伝子の配列中に他のポリヌクレオチド断片を挿入すること、標的遺伝子の転写又は翻訳開始領域に変異を与えること、などによって実現することができる。好適には、標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化させる。より具体的な例としては、細胞のゲノム上の標的遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法、及び、細胞中の遺伝子にランダムな欠失又は不活性化変異を与えた後、標的タンパク質の発現量や活性評価、又は遺伝子解析を行って所望の変異を有する細胞を選択する方法が挙げられる。
【００２８】
標的遺伝子の特異的な欠失又は不活性化には、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、塩基置換や塩基挿入等によって不活性化変異を導入した標的遺伝子のＤＮＡ断片、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まないＤＮＡ断片を構築し、これを親微生物細胞内に組み込んで親微生物ゲノムの標的遺伝子を含む領域に相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失又は不活性化させることが可能である。あるいは、標的遺伝子の一部領域を含むＤＮＡ断片を有する組換えベクター（プラスミド等）を親微生物細胞内に組み込み、親微生物ゲノムの標的遺伝子の一部領域を相同組換えにより分断することによって、標的遺伝子を不活性化することも可能である。細胞中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化変異を導入した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。遺伝子の不活性化変異とは、サイレンス変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異等により、標的とする遺伝子が本来有する機能が失われる変異を意味する。例えば、不活性化変異を導入した遺伝子はタンパク質を発現しないか、又は本来の活性が損なわれたタンパク質を発現する。
【００２９】
不活性化変異を導入した標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を作製する方法としては、部位特異的変異導入が挙げられる。部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。例えば、導入すべきヌクレオチド変異を含む２組のプライマーを用いた標的遺伝子を鋳型とするＰＣＲにより、標的遺伝子を含む領域の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を作製し、次いでこれらをＳＯＥ−ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１−６８）により１つに連結することにより、所望の変異を含むＤＮＡ断片を構築することができる。あるいは、部位特異的変異導入には、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２−８８）、又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  II  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００３０】
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９−７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。鋳型とする標的遺伝子は、上述したＭＧＬＰの製造に使用される微生物から、常法により調製してもよく、又は化学合成してもよい。
【００３１】
ＤＮＡ断片やベクターを微生物細胞に導入するには、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な方法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５−１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５−１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）などが挙げられる。
【００３２】
標的遺伝子が欠失又は不活性化した細胞は、そのゲノム配列を確認することにより選択することができる。あるいは、標的タンパク質の発現量又は活性を指標に、標的遺伝子が欠失又は不活性化された細胞を選択することができる。
【００３３】
細胞中の標的遺伝子のｍＲＮＡを不活性化させる方法としては、ｓｉＲＮＡを用いた標的特異的なｍＲＮＡ阻害が挙げられる。発現した標的タンパク質の活性を低減させる方法としては、標的タンパク質の阻害剤を用いる方法などが挙げられる。
【００３４】
本発明のＭＧＬＰ製造に用いる微生物は、本来ＭＧＬＰの生産能を有する微生物であってもよく、又はＭＧＬＰ生産能を獲得もしくは向上させるように改変された微生物であってもよい。微生物のＭＧＬＰ生産能を獲得もしくは向上させる方法としては、目的のＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドを微生物に組み込む方法が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のＭＧＬＰ製造に用いる微生物は、製造すべき目的のＭＧＬＰをコードする外来ポリヌクレオチドが組み込まれた組換え微生物である。
【００３５】
本発明で製造されるＭＧＬＰの種類は、特に限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆａｍｉｌｙ ＸＶ（非特許文献１）に属するＭＧＬＰが好ましい例として挙げられる。より好ましい例としては、当該Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するバチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型ＭＧＬＰが挙げられる。該非分泌型ＭＧＬＰの好ましい例としては、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＮ９２２６８．１、配列番号１）、バチルス・エスピーＨ−２５７由来ＭＧＬＰであるＨ−２５７（ＰＤＢ：４ＫＥ８、配列番号２）が挙げられる。該非分泌型ＭＧＬＰの他の例としては、配列番号３のアミノ酸配列からなるゲオバチルス・ステアロサーモフィリス（Geobacillus stearothermophilus）由来ＭＧＬＰ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ_０５３４１４８６３．１、以下ｓｔＬＰと呼ぶ）、配列番号４のアミノ酸配列からなるバチルス・エスピーＦＪＡＴ−２９８１４由来ＭＧＬＰ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０６６３０６３１３．１、以下ＣＩ２２０−６と呼ぶ）、配列番号５のアミノ酸配列からなるバチルス・エスピーＥＢ０１由来ＭＧＬＰ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０４３９２０３７．１、以下ＣＩ２２０−１０と呼ぶ）、及び配列番号６のアミノ酸配列からなるバークホルデリア・シングラリス（Burkholderia singularis）由来ＭＧＬＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＳＭＦ９８８８７．１、以下ＣＩ２２０−１２と呼ぶ）が挙げられる。
【００３６】
本発明で製造されるＭＧＬＰのさらに好ましい例としては、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明で製造されるＭＧＬＰのより好ましい例としては、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３７】
なお本明細書において、「モノグリセリドリパーゼ活性」とは、トリアシルグリセロールをジアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性及びジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性に比較して、より選択的にモノアシルグリセロールをグリセリンと脂肪酸に分解する活性をいうか、又はグリセリンと脂肪酸との合成反応において、トリアシルグリセロール及びジアシルグリセロールに比較して、より選択的にモノアシルグリセロールを合成する活性をいう。
【００３８】
上記Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆａｍｉｌｙ ＸＶに属するＭＧＬＰは、非特許文献１に記載の通り、Ｌｉｐａｓｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.led.uni-stuttgart.de/]）におけるＦａｍｉｌｙ  ａｂＨ１１．０３と配列相同性の面で同等であることが提唱されている。したがって、本発明で製造されるＭＧＬＰの種類の別の好ましい例としては、当該Ｆａｍｉｌｙ  ａｂＨ１１．０３に属するＭＧＬＰが挙げられる。
【００３９】
本発明で用いる微生物に組み込まれる目的のＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドは、上述した本発明で製造されるＭＧＬＰをコードするものであればよい。必要に応じて、当該ポリヌクレオチドは、それを組み込んで発現させる細胞におけるコドン使用頻度にあわせてコドン至適化されている。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。例えば、枯草菌用にコドン至適化した配列番号１〜６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号７〜１２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４０】
好ましくは、該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子の転写又は翻訳に関わる制御領域と作動可能に連結されている。該制御領域としては、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が挙げられる。転写開始制御領域としては、プロモーター及び転写開始点が挙げられる。翻訳開始領域としては、リボソーム結合部位及び開始コドンが挙げられる。好ましくは、該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域からなる群より選択される１以上の領域と作動可能に連結されている。より好ましくは、該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されている。一方、該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌に関わる領域（例えば分泌シグナルペプチド）と連結されている必要はなく、好ましくは、該タンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない。
【００４１】
該制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ−６４株のセルラーゼ遺伝子（特開２０１１−１０３８７５公報）の制御領域、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）、などが挙げられるが、特に限定されない。該制御領域のより好ましい例として、該制御領域のより好ましい例として、バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域（配列番号７８）、バチルス・エスピーＫＳＭ−６４株のセルラーゼ遺伝子の制御領域（配列番号７９）が挙げられる。また、好ましい制御領域としては、配列番号７８又は７９と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ遺伝子の転写及び翻訳を制御する機能を有するヌクレオチド配列が挙げられる。該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドと制御領域との連結は、制限酵素法や、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ等により行うことができる。
【００４２】
該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドの微生物への組み込みには、該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチド、及び必要に応じてさらに制御領域を含むＤＮＡ断片又はベクターを構築し、これを微生物に組み込めばよい。ＤＮＡ断片やベクターを微生物細胞に導入する方法については、上述したとおりである。
【００４３】
該ベクターは、該ＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチド、及び必要に応じて制御領域を、常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより構築することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、好ましくは、本発明で用いる微生物内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは発現ベクターである。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【００４４】
本発明でＭＧＬＰの製造に使用される微生物を製造する場合、ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減された微生物に、目的のＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドを組み込んでもよく、又は、目的のＭＧＬＰをコードするポリヌクレオチドが組み込まれた微生物を、ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性を低減するよう改変してもよい。いずれの場合でも、ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されており、かつモノアシルグリセロールリパーゼをコードする外来ポリヌクレオチドが組み込まれている、本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００４５】
以上の手順で得られたＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減された微生物を培養して、ＭＧＬＰを発現させることにより、ＭＧＬＰを製造することができる。ＭＧＬＰ製造のための該微生物の培養は、該微生物の種や形質に応じて、当該分野の一般的な方法に従って行うことができる。例えば、該微生物がバチルス属菌である場合、その培養のための培地は、バチルス属菌の生育に必要な炭素源、及び無機窒素源もしくは有機窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、微生物の種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
【００４６】
本発明のＭＧＬＰの製造方法においては、微生物が発現したＭＧＬＰは、細胞外に放出される。したがって、培養物の上清から目的のＭＧＬＰを回収することができる。例えば、遠心分離やろ過などにより培養上清を集め、次いでタンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養上清から目的のＭＧＬＰを回収することができる。あるいは、回収又は濃縮した培養上清を、粗酵素液としてそのまま使用することができる。本発明の方法においては、培養した細胞破砕する工程を行うことなく、ＭＧＬＰを回収することができる。
【００４７】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４８】
〔１〕枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌を培養してモノアシルグリセロールリパーゼを発現させることを含む、モノアシルグリセロールリパーゼの製造方法。
〔２〕好ましくは、培養物の上清から前記モノアシルグリセロールリパーゼを回収することをさらに含む、〔１〕記載の製造方法。
〔３〕好ましくは、前記バチルス属菌に、前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、〔１〕又は〔２〕記載の製造方法。
〔４〕前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが、
好ましくは、制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、タンパク質の分泌に関わる領域と連結されておらず、
より好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、
さらに好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、かつタンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない、
〔３〕記載の製造方法。
〔５〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の製造方法。
〔６〕好ましくは、前記枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減したバチルス属菌が、枯草菌ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されたバチルス属菌である、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の製造方法。
〔７〕好ましくは、前記ａｐｒＥに相当する遺伝子が、ａｐｒＥ（ＢＧ１０１９０）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつアルカリ側に至適ｐＨを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、〔６〕記載の製造方法。
〔８〕前記バチルス属菌が、好ましくは、枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されたものである、
〔６〕又は〔７〕記載の製造方法。
〔９〕好ましくは、前記枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸに相当する遺伝子が以下である、
ｅｐｒに相当する遺伝子：ｅｐｒ（ＢＧ１０５６１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
ｗｐｒＡに相当する遺伝子：ｗｐｒＡ（ＢＧ１１８４６）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体をコードする遺伝子；
ｍｐｒに相当する遺伝子：ｍｐｒ（ＢＧ１０６９０）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外金属プロテアーゼをコードする遺伝子；
ｎｐｒＢに相当する遺伝子：ｎｐｒＢ（ＢＧ１０６９１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外中性プロテアーゼＢをコードする遺伝子；
ｂｐｒに相当する遺伝子：ｂｐｒ（ＢＧ１０２３３）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつバシロペプチダーゼＦをコードする遺伝子；
ｎｐｒＥに相当する遺伝子：ｎｐｒＥ（ＢＧ１０４４８）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外中性金属プロテアーゼをコードする遺伝子；
ｖｐｒに相当する遺伝子：ｖｐｒ（ＢＧ１０５９１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
ａｐｒＸに相当する遺伝子：ａｐｒＸ（ＢＧ１２５６７）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ菌体内セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、
〔８〕記載の製造方法。
〔１０〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の製造方法。
【００４９】
〔１１〕枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されており、かつモノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが外来的に導入されている、組換えバチルス属菌。
〔１２〕前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが、
好ましくは、制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、タンパク質の分泌に関わる領域と連結されておらず、
より好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、
さらに好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、かつタンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない、
〔１１〕記載の組換えバチルス属菌。
〔１３〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔１１〕又は〔１２〕記載の組換えバチルス属菌。
〔１４〕好ましくは、枯草菌ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている、〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌。
〔１５〕好ましくは、前記ａｐｒＥに相当する遺伝子が、ａｐｒＥ（ＢＧ１０１９０）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつアルカリ側に至適ｐＨを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、〔１４〕記載の組換えバチルス属菌。
〔１６〕好ましくは、枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されている、
〔１４〕又は〔１５〕記載の組換えバチルス属菌。
〔１７〕好ましくは、前記枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸに相当する遺伝子が以下である、
ｅｐｒに相当する遺伝子：ｅｐｒ（ＢＧ１０５６１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
ｗｐｒＡに相当する遺伝子：ｗｐｒＡ（ＢＧ１１８４６）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体をコードする遺伝子；
ｍｐｒに相当する遺伝子：ｍｐｒ（ＢＧ１０６９０）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外金属プロテアーゼをコードする遺伝子；
ｎｐｒＢに相当する遺伝子：ｎｐｒＢ（ＢＧ１０６９１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外中性プロテアーゼＢをコードする遺伝子；
ｂｐｒに相当する遺伝子：ｂｐｒ（ＢＧ１０２３３）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつバシロペプチダーゼＦをコードする遺伝子；
ｎｐｒＥに相当する遺伝子：ｎｐｒＥ（ＢＧ１０４４８）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外中性金属プロテアーゼをコードする遺伝子；
ｖｐｒに相当する遺伝子：ｖｐｒ（ＢＧ１０５９１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
ａｐｒＸに相当する遺伝子：ａｐｒＸ（ＢＧ１２５６７）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ菌体内セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、
〔１６〕記載の組換えバチルス属菌。
〔１８〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔１１〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌。
【００５０】
〔１９〕枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性が低減されたバチルス属菌に、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドを組み込むことを含むか、又は、モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが組み込まれたバチルス属菌において枯草菌ＡｐｒＥ又はこれに相当するプロテアーゼの活性を低減させることを含む、組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２０〕前記モノアシルグリセロールリパーゼをコードするポリヌクレオチドが、
好ましくは、制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、タンパク質の分泌に関わる領域と連結されておらず、
より好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、
さらに好ましくは、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域と作動可能に連結されており、かつタンパク質の分泌に関わる領域と連結されていない、
〔１９〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２１〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、前記モノアシルグリセロールリパーゼが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔１９〕又は〔２０〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２２〕好ましくは、枯草菌ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている、〔１９〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２３〕好ましくは、前記ａｐｒＥに相当する遺伝子が、ａｐｒＥ（ＢＧ１０１９０）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつアルカリ側に至適ｐＨを持つセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である、〔２２〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２４〕好ましくは、枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子がさらに欠失又は不活性化されている、
〔２２〕又は〔２３〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２５〕好ましくは、前記枯草菌ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸに相当する遺伝子が以下である、
ｅｐｒに相当する遺伝子：ｅｐｒ（ＢＧ１０５６１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
ｗｐｒＡに相当する遺伝子：ｗｐｒＡ（ＢＧ１１８４６）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体をコードする遺伝子；
ｍｐｒに相当する遺伝子：ｍｐｒ（ＢＧ１０６９０）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外金属プロテアーゼをコードする遺伝子；
ｎｐｒＢに相当する遺伝子：ｎｐｒＢ（ＢＧ１０６９１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外中性プロテアーゼＢをコードする遺伝子；
ｂｐｒに相当する遺伝子：ｂｐｒ（ＢＧ１０２３３）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつバシロペプチダーゼＦをコードする遺伝子；
ｎｐｒＥに相当する遺伝子：ｎｐｒＥ（ＢＧ１０４４８）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ細胞外中性金属プロテアーゼをコードする遺伝子；
ｖｐｒに相当する遺伝子：ｖｐｒ（ＢＧ１０５９１）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつマイナー細胞外セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
ａｐｒＸに相当する遺伝子：ａｐｒＸ（ＢＧ１２５６７）とヌクレオチド配列において少なくとも９０％の同一性を有し、かつ菌体内セリンプロテアーゼをコードする遺伝子、
〔２４〕記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
〔２６〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔１９〕〜〔２５〕のいずれか１項記載の組換えバチルス属菌の製造方法。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５２】
以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用して行った。宿主微生物へのプラスミドの導入は、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）にて行った。タンパク質生産のための組換え微生物の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、又は２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）を用いた。培養上清におけるリパーゼ活性の測定は、以下の手順で行った。
【００５３】
（リパーゼ活性測定方法）
適宜希釈した培養上清５μＬを９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに分注した。各ウェルに、さらに脱イオン水１８３μＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μＬ、及び基質溶液２μＬを分注し、反応を開始した。基質溶液には、４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｏｃｔａｎｏａｔｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を１００ｍＭ含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を用いた。４０℃にて１５分間反応させ、反応液の４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて測定した。１Ｕは４０℃で１分間に１μｍｏｌのｐＮＡを遊離する酵素量と定義した。
【００５４】
表２〜７に、以下の実施例で使用したプライマーの名称とヌクレオチド配列を示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
【表３】
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【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
【表６】
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【００６０】
【表７】
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【００６１】
実施例１  遺伝子欠失枯草菌株の構築
（１）ａｐｒＥ欠失株の構築
（遺伝子欠失用プラスミドの構築）
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示すａｐｒＥｆｗ１とａｐｒＥＵｐｒ（配列番号２７及び２８）、及びａｐｒＥＤＮｆとａｐｒＥｒｖ−ｒｅｐＵ（配列番号２９及び３０）の各プライマーセットを用いて、ゲノム上のａｐｒＥ遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ａ）、及び下流に隣接する０．５ｋｂ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。別途、プラスミドｐＣ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５０（２），８１５，１９８２）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８６，１５：９３−１０３）由来のｒｅｐＵ遺伝子のプロモーター領域（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８９，１７：４４１０）を連結した１．２ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。断片（Ｃ）の調製では、まず、ｒｅｐＵｆｗとｒｅｐＵｒ−Ｃｍ（配列番号３２及び３３、表３）のプライマーセット及び鋳型としてプラスミドｐＵＢ１１０を用いて、ｒｅｐＵ遺伝子プロモーター領域を含む０．４ｋｂ断片（Ｄ）を調製した。さらにＣｍＵｆ−ｒｅｐとＣｍｒｖ１（配列番号３４及び３５、表３）のプライマーセット及び鋳型としてプラスミドｐＣ１９４を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む０．８ｋｂ断片（Ｅ）調製した。次いで、断片（Ｄ）と（Ｅ）の混合物を鋳型とし、プライマーｒｅｐＵｆｗとＣｍｒｖ１を用いたＳＯＥ−ＰＣＲにより断片（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）断片の混合物を鋳型とし、プライマーａｐｒＥｆｗ２とＣｍｒｖ２（配列番号３１及び３６、表３）を用いたＳＯＥ−ＰＣＲによって、（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順に断片を結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片の末端を平滑化及び５’−リン酸化し、プラスミドｐＵＣ１１８（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５３：３−１１）のＳｍａＩ制限酵素部位に挿入してａｐｒＥ遺伝子欠失用プラスミドｐＵＣ１１８−ＣｍｒΔａｐｒＥを構築した。
【００６２】
（遺伝子欠失株の構築）
構築したプラスミドｐＵＣ１１８−ＣｍｒΔａｐｒＥをコンピテントセル形質転換法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３，１９２５−１９３７）によって枯草菌変異株ｔｒｐＣ２（ｔｒｐＣ２株）に導入した。ａｐｒＥ遺伝子上流領域又は下流領域の相当する領域間での１重交差の相同組換えによりプラスミドとゲノムＤＮＡとが融合した形質転換株を、クロラムフェニコール耐性を指標に取得した。得られた形質転換株をＬＢ培地に接種し、３７℃にて２時間培養後、再度コンピテンス誘導操作を行い、導入したプラスミドとゲノム上に重複して存在するａｐｒＥ遺伝子上流領域又は下流領域の間におけるゲノム内相同組換えを誘導した。プラスミド導入の際と異なる領域で相同組換えが起こった場合、ａｐｒＥ遺伝子、及びプラスミドに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠失する。
【００６３】
次に、クロラムフェニコール感受性株の存在比率を高める為、以下の要領でアンピシリン濃縮操作を行なった。コンピテントセル誘導後の培養液を、終濃度５ｐｐｍのクロラムフェニコール及び終濃度１００ｐｐｍのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地１ｍＬに６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６００）が０．００３になるように接種した。３７℃にて５時間培養後、１０，０００ｐｐｍのアンピシリンナトリウム水溶液を１０μＬ添加してさらに３時間培養した。培養終了後、２％塩化ナトリウム水溶液にて菌体を遠心洗浄した後、１ｍＬの２％塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、懸濁液１００μＬをＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて約１５時間インキュベーションし、生育した菌株のうち、プラスミド領域の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となったものを選抜した。選抜した菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーａｐｒＥｆｗ２とａｐｒＥｒｖ−ｒｅｐＵ（配列番号３１及び３０、表３）を用いたＰＣＲを行なうことによりａｐｒＥ遺伝子欠失を確認して、ａｐｒＥ遺伝子欠失株ｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＥを取得した。
【００６４】
（２）ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ又はｖｐｒ欠失株の構築
（１）と同様の操作を繰り返すことにより、ｔｒｐＣ２株からｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、及びｖｐｒの各遺伝子を欠失させた遺伝子欠失株ｔｒｐＣ２／Δｅｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｗｐｒＡ、ｔｒｐＣ２／Δｍｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｎｐｒＢ、ｔｒｐＣ２／Δｂｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｎｐｒＥ、及びｔｒｐＣ２／Δｖｐｒを取得した。各欠失株の作製に用いたプライマーの配列を表４〜５に、また各プライマーと（１）で用いたａｐｒＥ遺伝子欠失用プライマーとの対応を表６に示す。
【００６５】
（３）ａｐｒＸ欠失株の構築
二重交差法によりａｐｒＸ遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されたａｐｒＸ遺伝子欠失株を構築した。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７に示すａｐｒＸ＋５ＦとａｐｒＸ＋５６３Ｒ（配列番号７２及び７３）、及びａｐｒＸ＋７７５ＦとａｐｒＸ＋１３２０Ｒ（配列番号７４及び７５）の各プライマーセットを用いて、ゲノム上のａｐｒＸ遺伝子の上流を含む５’末端側の５５８ｂｐ断片（Ｆ）、及び３’末端側の５４５ｂｐ断片（Ｇ）をそれぞれ調製した。別途、プラスミドｐＤＧ１７２７（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，１９９５）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断点に挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅＳＰＲを構築した。ｐＢｌｕｅＳＰＲのＤＮＡを鋳型とし、ＰＢ−Ｍ１３−２０とＰＢ−Ｍ１３Ｒｅｖ（配列番号７６及び７７、表７）のプライマーセットを用いてスペクチノマイシン耐性遺伝子領域（Ｈ）を増幅した。（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）断片の混合物を鋳型とし、ａｐｒＸ＋５ＦとａｐｒＸ＋１３２０Ｒ（配列番号７２及び７５、表７）のプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法により、（Ｅ）（Ｈ）（Ｇ）の順に結合したＤＮＡ断片を調製した。調製したＤＮＡ断片を用い、コンピテントセル形質転換法によるｔｒｐＣ２株の形質転換を行い、次いでスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってａｐｒＸ遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認して、ａｐｒＸ遺伝子欠失株ｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＸを取得した。
【００６６】
実施例２  各種遺伝子欠失株のＭＧＬＰ生産性比較
（１）ＥｓｔＧｔＡ２発現組換え枯草菌株の構築
実施例１で作製した遺伝子欠失株にモノアシルグリセロールリパーゼＥｓｔＧｔＡ２（配列番号１）をコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌株を構築した。枯草菌用にコドン至適化したＥｓｔＧｔＡ２をコードする遺伝子（配列番号７）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミド（ＥｓｔＧｔＡ２−ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。これを鋳型とし、プライマーＥｓｔＧｔＡ２−Ｆ及びプライマーＥｓｔＧｔＡ２−Ｒ（配列番号１３及び１４、表２）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。同様に、ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｆ及びｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｒ（配列番号１５及び１６、表２）を使用してＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。得られた両断片を適量混合し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法を用いてプラスミドを合成した（ｐＨＹ−ＥｓｔＧｔＡ２）。この際、セルラーゼＳ２３７の制御領域（転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を含む領域、配列番号７８）とＥｓｔＧｔＡ２の遺伝子が作動可能に連結するように設計した。得られたプラスミドをプロトプラスト形質転換法にてｔｒｐＣ２株（対照）、及び実施例１で作製した遺伝子欠失株ｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＥ、ｔｒｐＣ２／Δｅｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｗｐｒＡ、ｔｒｐＣ２／Δｍｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｎｐｒＢ、ｔｒｐＣ２／Δｂｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｎｐｒＥ、ｔｒｐＣ２／Δｖｐｒ、及びｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＸに導入した。
【００６７】
（２）ＭＧＬＰ生産性比較
（１）で得られた組換え枯草菌株を３ｍＬ／大試験管（φ１８×１８０ｍｍ）のＬＢ培地で３０℃、１５時間、２５０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培養液０．０２ｍＬを２０ｍＬ／５００ｍＬ容ヒダ付三角フラスコ（バイオット）の２×Ｌ−マルトース培地に接種し、３０℃で９６時間、２１０ｒｐｍで振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分）し、得られた上清からフィルター（０．４５μｍ、ＰＶＤＦ、メルクミリポア製）によって菌体を除き、残った培養上清のリパーゼ活性を測定した。またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、培養上清におけるＥｓｔＧｔＡ２の蓄積を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、タンパク質のバンドはＢｉｏ−Ｓａｆｅ  ＣＢＢ  Ｇ−２５０ステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて確認した。
【００６８】
図１は、各組換え枯草菌株の９６時間培養後に得られた培養上清におけるリパーゼ活性を示す。図中、横軸は組換え枯草菌株の宿主（ｔｒｐＣ２、ｔｒｐＣ２／Δｅｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｗｐｒＡ、ｔｒｐＣ２／Δｍｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｎｐｒＢ、ｔｒｐＣ２／Δｂｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔｎｐｒＥ、ｔｒｐＣ２／Δｖｐｒ、ｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＥ、ｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＸ）を示し、縦軸は各株についての培養上清中のリパーゼ活性を示す。リパーゼ活性値はｔｐｒＣ２株についての活性を１００％とした相対活性で示している。ａｐｒＥ欠失株で培養上清中のリパーゼ活性が顕著に向上した。図２は、各組換え枯草菌株についての９６時間培養後の培養上清でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。各レーンは組換え枯草菌株の欠失遺伝子で表示されている。ａｐｒＥ欠失株では培養上清中にＥｓｔＧｔＡ２が蓄積されていた一方、他の欠失株では、培養上清中におけるＥｓｔＧｔＡ２の蓄積が確認できなかった。以上の結果から、ａｐｒＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を欠失又は不活化した株を用いることで、本来菌体内酵素であるモノアシルグリセロールリパーゼＥｓｔＧｔＡ２を細胞外に分泌させて、培養上清中から回収することができることが分かった。
【００６９】
実施例３  ａｐｒＥ欠失株による各種ＭＧＬＰ生産性
（１）ＭＧＬＰ発現組換え枯草菌株の構築
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するＭＧＬＰであるＨ−２５７、ｓｔＬＰ、ＣＩ２２０−６、ＣＩ２２０−１０、及びＣＩ２２０−１２（配列番号２〜６）を発現する組換え枯草菌株を構築した。枯草菌用にコドン至適化した各ＭＧＬＰをコードする遺伝子（配列番号８〜１２）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミド（Ｈ−２５７−ｐＵＣ５７、ｓｔＬＰ−ｐＵＣ５７、ＣＩ２２０−６−ｐＵＣ５７、ＣＩ２２０−１０−ｐＵＣ５７、及びＣＩ２２０−１２−ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型として、表２に示すプライマーペアＨ２５７−Ｆ／Ｒ（配列番号１７及び１８）、ｓｔＬＰ−Ｆ／Ｒ（配列番号１９及び２０）、ＣＩ２２０−６−Ｆ／Ｒ（配列番号２１及び２２）、ＣＩ２２０−１０−Ｆ／Ｒ（配列番号２３及び２４）、及びＣＩ２２０−１２−Ｆ／Ｒ（配列番号２５及び２６）をそれぞれ用いてＰＣＲを行った。同様に、プラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｆ及びｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｒ（配列番号１５及び１６）を使用してＰＣＲ反応を行った。実施例２（１）と同様に、ＰＣＲ産物のＤｐｎＩ処理し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法を用いてプラスミドを合成し（ｐＨＹ−Ｈ−２５７、ｐＨＹ−ｓｔＬＰ、ｐＨＹ−ＣＩ２２０−６、ｐＨＹ−ＣＩ２２０−１０、及びｐＨＹ−ＣＩ２２０−１２）、得られたプラスミドをプロトプラスト形質転換法にてｔｒｐＣ２株及びｔｒｐＣ２／ΔａｐｒＥ株に導入した。
【００７０】
（２）ａｐｒＥ欠失組換え枯草菌株のＭＧＬＰ生産性
（１）で得られた組換え枯草菌株を１ｍＬのＬＢ培地で一夜、３０℃で振盪培養した。得られた培養液０．００３ｍＬを３ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、実施例２（２）と同様の手順で、培養上清を分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより菌体外に生産されたＭＧＬＰの量を確認した。タンパク質のバンドはミニプロティアンＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により確認した。
【００７１】
図３は、各組換え枯草菌株についての７２時間培養後の培養上清におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。各レーンは組換え枯草菌株の欠失遺伝子及び発現させたＭＧＬＰの種類で表示されている。発現させたいずれのＭＧＬＰ（Ｈ−２５７、ｓｔＬＰ、ＣＩ２２０−６、ＣＩ２２０−１０、及びＣＩ２２０−１２）も、ａｐｒＥ欠失株の培養上清中に蓄積されていた一方、ｔｒｐＣ２株の培養上清中ではいずれのＭＧＬＰの蓄積も確認できなかった。以上の結果から、ａｐｒＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を欠失又は不活化した株を用いることで、菌体内酵素である各種ＭＧＬＰを細胞外に分泌させて、培養上清中から回収することができること分かった。
【００７２】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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