(57)【要約】【課題】炎症性腸疾患用のバイオマーカーの提供。【解決手段】本発明は、個体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを、全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより評価する方法を提供する。さらに、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクであると判定される個体におけるＩＢＤを治療するための方法、および個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するためのキットが提供される。患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイ、およびアレイを提供する方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法であって、前記個体から得られる全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、前記個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを確認することを含み、
ここで、前記２個以上の遺伝子が、
アレスチンドメイン含有４（ＡＲＲＤＣ４）；
グアニル酸結合タンパク質５（ＧＢＰ５）；
プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ  Ｇタンパク質共役、１４（Ｐ２ＲＹ１４）；
ヴォールトＲＮＡ１−１（ＶＴＲＮＡ１−１）；
インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１８ＲＡＰ）；
ハプトグロビン（ＨＰ）；
ｎｕｄｉｘ（ヌクレオシド二リン酸連結部分Ｘ）型モチーフ７（ＮＵＤＴ７）；
グランザイムＨ（ＧＺＭＨ）；
Ｔ細胞受容体γ定常２（ＴＲＧＣ２）；
レクチン、ガラクトシド結合様（ＬＧＡＬＳＬ）；
Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；
インターフェロン誘導タンパク質４４様（ＩＦＩ４４Ｌ）；
長い遺伝子間非タンパク質コードＲＮＡ１１３６（ＬＩＮＣ０１１３６）；
リンパ球抗原９６（ＬＹ９６）；
グランザイムＫ（ＧＺＭＫ）；および
Ｔ細胞受容体γ可変３（ＴＲＧＶ３）
からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
ＩＢＤ１表現型が、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴としている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体におけるＩＢＤの進行の前記リスクが、
ａ）前記選択遺伝子の前記測定された発現レベルを重み付けすること；
ｂ）前記リスクスコアを決定するために、ロジスティック回帰モデルを前記重み付けした発現レベルに適用すること、ここで、０．５未満のリスクスコアがＩＢＤの進行の低リスクを示し、かつ０．５未満のリスクスコアがＩＢＤの進行の高リスクを示す、および
ｃ）前記決定の結果をまとめた報告を作成すること、
によって前記患者におけるリスクスコアを計算することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２個以上の遺伝子の発現レベルが、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて測定される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記２個以上の遺伝子の発現レベルが、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記個体から得られる全血試料を準備すること；
（ｉｉ）前記全血試料からＲＮＡを抽出すること；
（ｉｉｉ）前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；および
（ｉｖ）前記２個以上の遺伝子の発現レベルを決定するため、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施すること、
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法における使用のための自己免疫性疾患の進行リスク評価システムであって、
ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現を測定するための１つまたは複数のツールと、ならびに
前記被験者の前記遺伝子発現データからＩＢＤの進行リスクスコアを計算するようにプログラムされたコンピュータと、を含む、システム。
【請求項８】
２個以上の遺伝子の前記発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により測定するための１つまたは複数のツールを含む、請求項７に記載の自己免疫性疾患の進行リスク評価システム。
【請求項９】
（ｉｉ）ＩＢＤに対する治療におけるステップ（ｉ）において、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体を選択することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉｉ）ステップ（ｉ）におけるＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体にＩＢＤに対する治療を施すことをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
個体におけるＩＢＤを治療するための方法であって、
（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである個体を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を用いて識別することと、
（ｉｉ）前記個体にＩＢＤに対する治療を施すことと、
を含む、方法。
【請求項１２】
ＩＢＤの進行について高リスクまたは低リスクであると判定される個体におけるＩＢＤを治療するための方法であって、
（ｉ）前記個体をＩＢＤ１（高リスクのＩＢＤの進行）またはＩＢＤ２（低リスクのＩＢＤの進行）として分類する試験結果をレビューすることと、
ここで、前記試験は、前記個体から得られる全血試料中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定し、
低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現が、前記個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有することを示し、かつ
高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の上方制御発現が、前記個体が低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有することを示す、
（ｉｉ）ＩＢＤにおけるＩＢＤ１またはＩＢＤ２表現型を有すると判定された前記個体を治療することと、
を含む、方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）が、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により２個以上の遺伝子の発現レベルを測定するための分析の結果を提供する試験を要求することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
個体が高リスクのＩＢＤ１表現型を有するかまたは低リスクのＩＢＤ２表現型を有するかを評価するためのキットであって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含み、
ＩＢＤ１表現型が、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴としており、かつ
ＩＢＤ２表現型が、ＩＢＤ１表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の上方制御発現を特徴としている、キット。
【請求項１５】
前記キットが、前記２個以上の遺伝子の発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、デジタルＰＣＲ、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により確認するための試薬を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記ＩＢＤが、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法、自己免疫性疾患の進行リスク評価システム、またはキット。
【請求項１７】
ＩＢＤ患者における低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力がある物質を同定するインビトロ方法であって、
（ｉ）目的の物質を用いる治療前にＩＢＤ患者から得られる全血試料、および（ｉｉ）目的の前記物質を用いる治療後に前記ＩＢＤ患者から得られる全血試料を準備することと、
ここで、前記ＩＢＤ患者は、請求項１〜４または１４のいずれか一項に記載の方法を用いて、高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有することが判定されている；
試料（ｉ）および（ｉｉ）中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することと、
を含み；
試料（ｉ）に対して試料（ｉｉ）中での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫのより低い発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３のより高い発現が、前記物質がＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があることを示す、方法。
【請求項１８】
ＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があるとして同定された物質を薬剤に配合することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
個体におけるＩＢＤを治療する能力がある物質を同定するインビトロ方法であって、
（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである個体を、請求項１〜６または１６のいずれか一項に記載の方法を用いて同定することと；
（ｉｉ）目的の前記物質を用いる治療後の前記個体におけるＩＢＤの進行の前記レベルを対照と比較することとを含み、ここで、前記対照と比べての前記個体におけるＩＢＤの進行のより低いレベルは、前記物質がＩＢＤを治療する能力があることを示す、方法。
【請求項２０】
ＩＢＤを治療する能力があるとして同定された物質を薬剤に配合することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する方法であって、
ａ）前記患者の全血試料からＲＮＡを準備することと；
ｂ）前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと；
ｃ）前記ｃＤＮＡの各一定分量を前記ｃＤＮＡの一定分量が患者試料ｃＤＮＡの一定分量として同定されるようにアレイ上に置くことと；
ｄ）ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上の遺伝子の各遺伝子における前記ｃＤＮＡの各一定分量に対してＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施し、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の産物を前記アレイ上に提供し、それにより本質的に前記３つ以上の遺伝子発現産物からなる患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供することと、
を含む、方法。
【請求項２２】
（ｅ）前記ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の産物を定量化するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＴ−ｑＰＣＲ産物が、前記ｃＤＮＡを前記３個以上の遺伝子の各々に特異的なプライマーセットと接触させることにより提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライマーセットが、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブプライマーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイであって、
患者試料ｃＤＮＡとして同定されたｃＤＮＡの各一定分量を含み、ここで前記アレイの３つ以上のｃＤＮＡの一定分量の各々が、前記ｃＤＮＡの一定分量中で選択遺伝子発現産物を増幅するための特異的なＲＴ−ｑＰＣＲプライマー対を含み、
ここで、前記アレイが、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、アレイ。
【請求項２６】
前記３個以上の遺伝子に特異的なＲＴ−ｑＰＣＲプローブをさらに含む、請求項２５に記載のアレイ。
【請求項２７】
患者の全血試料由来の定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する方法であって、
ａ）前記患者の全血試料からＲＮＡを準備することと；
ｂ）前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと；
ｃ）前記ｃＤＮＡの一定分量を前記ｃＤＮＡの一定分量が患者試料ｃＤＮＡの一定分量として同定されるようにアレイ上に置くことと；
ｄ）前記ｃＤＮＡの一定分量に対してＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施し、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の遺伝子発現産物を前記アレイ上に提供することと；
ｅ）ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる遺伝子の群から選択される３個以上の遺伝子の選択された各遺伝子における遺伝子発現産物の量を定量化することと、
を含み、それにより患者の全血試料由来の定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する、方法。
【請求項２８】
前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少なく；かつ
ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多い、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多く；かつ
ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少ない、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイであって、患者の全血試料の個別の定量化された遺伝子発現産物を含み、前記定量化された遺伝子発現産物が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上の遺伝子の増幅されたｃＤＮＡ産物からなる、アレイ。
【請求項３１】
前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少なく；かつ
ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多い、
請求項３０に記載のアレイ。
【請求項３２】
前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも多く；かつ
ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における対照よりも少ない、
請求項３０に記載のアレイ。
【請求項３３】
前記遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される、請求項２５に記載のアレイ。
【請求項３５】
前記遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される、請求項３０に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１６年７月５日に出願された英国特許出願第ＧＢ１６１１７３８．４号に対する優先権を主張し、その内容はその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、個体におけるクローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の進行を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法に関する。個体はさらに、任意選択的には、ＩＢＤに対する治療を受けてもよく、またはそのために選択されてもよく、ここでは治療は、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかに基づいて選択される。
【背景技術】
【０００３】
発明に対する背景
ＣＤにおける侵襲療法の早期導入が、標準のステップアップ手法と比べてより良好な転帰をもたらすことが確立されている(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)。特に、早期併用療法（アザチオプリンと組み合わせたインフリキシマブ；D’Haens et al., 2008）で治療された患者は、より長期間のステロイドを含まない寛解を経験し、粘膜治癒を達成し、最終的には外科的切除を回避する可能性はより高い(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)。しかし、この方法は、無視できない割合の患者が通常の治療手法であっても延長された寛解を得ていることになり(Jess et al., 2007)、ひいては併用療法を用いたそれら治療が彼らを不必要な副作用および毒性に曝露することになるので、すべての患者に適するのではない。この理由のため、予後を予測する能力は、ＣＤ、および一般にＩＢＤを有する患者に対する治療の改善に向けての主要なステップとなる(IBD Research Priority, 2015; Gerich et al., 2014)。
【０００４】
幾つかの異なる変数が、ＣＤにおける予後；つまり、臨床的因子、血清学的マーカー、および遺伝子変異体に関連している(Gerich et al., 2014; Billiet et al., 2014)。しかし、単独でまたは組み合わせて用いられるこれらのマーカーの予測力は、現状では制限されることが判明しており、診療所における日常使用に適するものはない(Loly et al., 2008; Markowitz et al., 2011 ; Ananthakrishnan et al., 2014)。結果として、ＣＤおよびＵＣを含むＩＢＤに対する信頼できる予後試験の開発は、未だ優先事項であり、現在では胃腸病学における未対処の最も重要な必要性の一つとして認識されている(IBD Research Priority, 2015)。
【０００５】
この目標を達成するため、遺伝子変異体は、安定であり、容易に測定され得、かつＣＤの遺伝的構造が少なくとも感度に関して既に広範に試験されていることから、有望な候補予後マーカーである(Jostins et al., 2012)。しかし、これまで発見された遺伝要因は、患者間でのＣＤの転帰において認められる表現型相違の５〜６％を説明し得るに過ぎない。この数字が増加するものとしても、能力が増強された試験にて他の転帰に関連する変異体が発見されるとき、単離の際、ＣＤ、一般にＩＢＤにおける転帰を正確に予測できるのにその遺伝要因が十分となる可能性は低いように思われる。これは、喫煙を含む環境要因がＩＢＤの自然経過において重要な役割を担うという概念に合致する(Kaser et al., 2010)。
【０００６】
遺伝子発現マーカーは、特に病因に関与する組織または細胞型において直接的に測定される場合、これらの制限を克服するためのより優れた候補であり得る(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011)。事実、遺伝子発現は、生物と外部環境との間の相互作用についてのさらなる情報を取得する一方で(Choi et al., 2007)、さらに個体の遺伝的背景の幾つかの局面を反映することがある。他方、遺伝子発現は通常、経時的に安定であると予想されず、特定の細胞集団を遺伝子発現レベルに影響することなく単離することは、技術的難題である(Lyons et al., 2007)。管理された研究環境以外では、これらの要因のすべては、臨床状況下で遺伝子発現マーカーの使用を制限する。
【０００７】
最近、ＩＢＤにおける予後を予測するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞内で検出可能である特徴的な遺伝子発現シグネチャーを用いることができることが報告されている(Lee et al., 2011)。特に、かかるシグネチャーは、ＣＤおよびＵＣ双方における異なる臨床経過に関連した２つの異なる患者群（ＩＢＤ１およびＩＢＤ２）を、診断時および治療前に識別することができた(Lee et al., 2011)。より正確には、標準のステップアップ手法(Peyrin-Biroulet et al., 2008)で管理されるとき、ＩＢＤ１群に属する者として分類された患者は、ＩＢＤ２群における患者よりも有意に高い治療拡大のリスクを一貫して示し(Lee et al., 2011)、それ故、これらの患者をより早い段階でより侵襲性の高い治療法で治療するための理論的根拠をもたらした(Lee et al., 2011)。
【０００８】
上記のシグネチャーは、３つの主な理由において、ＩＢＤにおける転帰の予測に向けた大きな進歩を表した(Friedman et al., 2011)。第１に、患者層間での転帰における差異は、以前に報告された予後マーカー(Gerich et al., 2014)と異なり、治療決定を導くのに潜在的に有用であることが十分に顕著である(Lee et al., 2011 ; Friedman et al., 2011)。第２に、重複するＣＤ８＋遺伝子発現シグネチャーは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびＡＮＣＡ関連脈管炎（ＡＡＶ）患者における疾患転帰を予測することが以前に報告され、それ故、共通の生物学的過程が異なる炎症性疾患の予後の基礎であり得るという仮説が示唆された(McKinney et al., 2010)。最後に、基礎をなす生物学的過程における部分的であるが説得力のある機構的説明が、最近、提起された(McKinney et al., 2015)。これらの最後の２つのポイントは特に重要である。事実、予後調査では、データ収集に時間および費用の双方を費やす場合の長期試験が必然的に必要になり、それ故、試験規模が制限される。結果として、患者の小コホートが基礎集団から十分な複雑性を得ることができるか否かや、提起された予後マーカーが確かに再現可能か否かについて疑念が残ることが多い。これを考慮すると、異なる疾患を有する患者の異なるコホートにわたる疾患転帰についての一貫性を信頼できる機構的洞察と併せて観察することにより、上記のＣＤ８＋Ｔ細胞遺伝子発現シグネチャーの再現性についての自信が大いに高まる(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011)。
【０００９】
しかし、患者を臨床状況下で層別化するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞遺伝子発現シグネチャーをルーチン的に用いることができる以前に、重要な課題が解決されないままである。現在、患者をＩＢＤ１／ＩＢＤ２群に割り当てるには、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＲＮＡの抽出が必要である(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011)。このステップでは、有望な予後試験に対しての複雑性がかなりの規模で加わり、それ故、その適応性が管理された研究環境下での少数の試料に制限されることが幾度も認められている(Friedman et al., 2011 ; Billiet et al., 2014。
【００１０】
反対に、容易にアクセス可能な生体試料、例えば全血においてＩＢＤ１／ＩＢＤ２サブグループを検出できる場合、その臨床的有用性や、潜在的には予後マーカーとしてのその適応性が大いに促進されることになる。さらに、一部の臨床試験の間、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞でなく全血試料がルーチン的に収集されていることから、これにより、患者層別化後の薬剤有効性を再評価するために過去のＩＢＤ薬試験を再分析する可能性が開かれることになる。
【００１１】
潜在的には有用であるのにもかかわらず、以前から精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞とは異なる試料中でのＩＢＤ１／ＩＢＤ２シグネチャーの検出が難題であると判明していることは注目されるべきである(Lee et al., 2011)。事実、ＩＢＤ(Lee et al., 2011)、ＳＬＥ、またはＡＡＶ(McKinney et al., 2010)における疾患転帰によって患者を層別化するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞から得られる遺伝子発現シグネチャーを使用できないことが幾度も認められた。これらの観察に一致して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の発現シグネチャーを発見するために最初に用いられた同じ目的変数なしのクラスタリング方法(Monti et al., 2003)を用いて、同じ予後シグネチャーを末梢血単核球（ＰＢＭＣ）において同定することはできなかった(McKinney et al., 2010; Lee et al., 2011)。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＢＭＣ集団の極小の変わりやすい画分を表すという事実に起因し得る(Lyons et al., 2007)。
【００１２】
さらに、予後シグネチャーがハイスループット遺伝子発現プロファイリング技術、例えばマイクロアレイを用いて発見され得る一方(Schena et al., 1995)、実行可能な予後試験では、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）などのより小規模な遺伝子発現プラットフォームに依存する必要がある(Freeman et al., 1999)。事実、異なる条件用に開発された現行の予後試験の大部分、例えばAlloMap、Oncotype DxおよびCorusCADがｑＰＣＲに基づく試験である一方(Micheel et al., 2012)、極小のより古い試験、例えばMammaPrintは、マイクロアレイに依存する(Micheel et al., 2012)。この理由から、ＩＢＤ１／ＩＢＤ２サブグループを再現するシグネチャーが全血中で発見できる場合、ｑＰＣＲによりそれを検出する可能性は、臨床状況下でのその適用にとって重要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、当該技術分野では、ｑＰＣＲなどの方法を用いて全血中で検出され得るＩＢＤ１／ＩＢＤ２遺伝子発現シグネチャーに対する需要が残る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の声明
本発明者は、意外にも、個体から得られる全血試料中の遺伝子発現を分析することにより、個体におけるＩＢＤ（例えば潰瘍性大腸炎またはクローン病）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するために使用可能な遺伝子発現シグネチャーを同定している。全血中のこれら遺伝子の発現は、例えばＲＴ−ｑＰＣＲにより測定され得る。詳細には、本発明者は、高リスク（ＩＢＤ１）表現型が、低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、全血中の遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴とすることを発見している。
【００１５】
したがって、一態様では、本発明は、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法であって、個体から得られる全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、前記個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを確立することを含み、ここで２個以上の遺伝子が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、ＧＺＭＫ、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される、方法を提供する。
【００１６】
一実施形態では、方法は、前記２個以上の遺伝子の発現レベルを、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を用いて測定することを含んでもよい。この場合、方法は、（ｉ）個体から得られる全血試料を提供することと；（ｉｉ）ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を全血試料から抽出することと；（ｉｉｉ）ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をｃＤＮＡに変換することと、（ｉｖ）ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実行し、２個以上の遺伝子の発現レベル測定することと、を含んでもよい。
【００１７】
本発明はまた、本発明の方法における使用が意図される自己免疫性疾患の進行リスクの評価システムであって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現を測定するための１つまたは複数のツール、ならびに被験者の遺伝子発現データからＩＢＤの進行リスクスコアを計算するようにプログラムされたコンピュータを含む、システムを提供する。
【００１８】
遺伝子の発現を測定するためのツールは、本明細書に記載の任意の技術、例えばＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析（direct multiplexed gene expression analysis）を用いて問題の遺伝子の発現レベルを確立するための試薬であってもよく、またはそれを含んでもよい。例えば、ツールは、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて問題の遺伝子の発現のレベルを確認することに適したプライマーであってもよく、またはそれを含んでもよい。好適なプライマーの設計は、ルーチン的であり、十分に当業者の能力の範囲内である。方法が多重遺伝子発現分析を含む場合、ツールは、問題の遺伝子の発現のレベルを確認するための蛍光プローブを追加的または代替的に含んでもよい。ツールはまた、ＲＮＡ抽出試薬および／またはＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写用の試薬であってもよく、またはそれを含んでもよい。ツールはまた、方法を実施するための１つ以上の物品および／または試薬、例えば緩衝液、および／または試験試料自体を入手するための手段、例えば試料を入手および／または単離するための手段、ならびに試料処理容器（一般に滅菌されているような部品）であってもよく、またはそれを含んでもよい。ＩＢＤの進行リスクスコアの計算は幾つかの方法で行われてもよく、例示的方法が以下に示される。
【００１９】
さらに提供される本発明は、個体におけるＩＢＤを治療する方法である。一実施形態では、方法は、（ｉ）本発明の方法を用いて個体をＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別することと、（ｉｉ）個体にＩＢＤに対する治療を施すことと、を含んでもよい。
【００２０】
他の実施形態では、方法は、（ｉ）個体から得られる全血試料中のＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを決定するための分析の結果を提供する試験を要求することと、（ｉｉ）ＩＢＤにおけるＩＢＤ１またはＩＢＤ２表現型を有することが判定された個体を治療することと、を含んでもよい。
【００２１】
また、提供されるのは、個体が高リスクのＩＢＤ１を有するかまたは低リスクのＩＢＤ２表現型を有するかを評価するためのキットであって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含む、キットである。
【００２２】
本発明はまた、ＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力がある物質を同定するインビトロ方法に関する。方法は、好ましくは、（ｉ）目的の物質を用いる治療前にＩＢＤ患者から得られる全血試料、および（ｉｉ）目的の物質を用いる治療後にＩＢＤ患者から得られる全血試料を提供することと；試料（ｉ）および（ｉｉ）中のＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することと、を含み、ここでＩＢＤ患者は、本発明の方法を用いて高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有すると判定されており、かつ試料（ｉ）中に対する試料（ｉｉ）中での遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫのより低い発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３のより高い発現は、物質がＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があることを示す。
【００２３】
本発明はさらに、個体におけるＩＢＤを治療する能力がある物質を同定するインビトロ方法に関する。方法は、好ましくは、（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである個体を本発明の方法を用いて識別することと；（ｉｉ）目的の物質を用いる治療後の個体におけるＩＢＤの進行のレベルを対照と比較することと、を含み、ここで個体におけるＩＢＤの進行の対照と比べてのより低いレベルは、物質がＩＢＤを治療する能力があることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な説明
【図１】元のＣＤ８Ｔ細胞に基づくＩＢＤ１／ＩＢＤ２群（左）と実施例１に記載の全血ｑＰＣＲ分類子を用いて予測されるＩＢＤ１／ＩＢＤ２群（右；分類子中に含まれる遺伝子の詳細については表１を参照）との間で治療拡大を含まない生存を比較したカプラン・マイヤープロットを示す。Ｏｂｓ：観察された元の群；ｐｒｅｄ：全血ｑＰＣＲデータを用いて予測された群；ｐ：ログランク検定Ｐ値。ＣＬ１およびＣＬ２は各々、ＩＢＤ１（高リスク）およびＩＢＤ２（低リスク）サブグループを指す。
【図２】ｑＰＣＲ分類子に従う、各患者がＩＢＤ１群に属することが予測される確率を示すプロットを示す（表１）。白点：ＩＢＤ１患者；黒点：ＩＢＤ２患者。
【図３】新規に診断されたＩＢＤ患者８５名の独立コホート（分類子中に含まれる遺伝子の詳細については表２を参照）における実施例２に記載の最適化された全血ｑＰＣＲ分類子を用いて予測されたＩＢＤ１／ＩＢＤ２群における治療拡大を含まない生存を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ｑＰＣＲ  ＰＡＸ１およびｑＰＣＲ  ＰＡＸ２は各々、サブグループＩＢＤ１およびＩＢＤ２を指す。サブグループＩＢＤ２に対するサブグループＩＢＤ１におけるハザード比は、図３に示される通り、３．５２であった。
【図４】国際公開第２０１０／０８４３１２号に記載の遺伝子発現シグネチャーを用いて予測されたＩＢＤ１／ＩＢＤ２群間で治療拡大を含まない生存を比較したカプラン・マイヤープロットを示す。ｐ：ログランク検定Ｐ値。ＣＬ１およびＣＬ２は各々、ＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループを指す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
上述のように、本発明者は、個体から得られる全血試料中の遺伝子発現を分析することにより、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するために使用可能な遺伝子発現シグネチャーを同定している。
【００２６】
詳細には、本発明者は、高リスク（ＩＢＤ１）表現型が、低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴とすることを発見している。これら遺伝子におけるＮＣＢＩ受入番号（およびＧＩ番号）は、下の表２に示される。
【００２７】
上で説明の通り、個体が高リスク（ＩＢＤ１）を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを評価するための方法が前述されているが、これらの方法は直接的に全血試料に適用できないばかりか、例えばＣＤ８  Ｔ細胞の血液試料からの単離を必要とし、それ故、それらの臨床適用性が著しく制限される。それに対し、本発明者によって同定される遺伝子発現シグネチャーは、全血試料中で検出され得、それ故、特定の細胞型を血液試料から単離する必要性がなくなり、この遺伝子発現シグネチャーを用いる診断方法の臨床的有用性が大いに高まる。特に、特定の細胞型を遺伝子発現分析前に単離する必要性を回避することにより、本発明の方法の技術的複雑性が低減されるとともに、前記方法を実施する上で時間が節約され、費用効果が高くなる。
【００２８】
したがって、本明細書で開示される方法、例えば個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することを含んでもよい。遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３は、本発明者によって同定されるとき、個体から得られる全血試料中での高リスク（ＩＢＤ１）または低リスク（ＩＢＤ２）表現型の存在を判定するためのトップ１６のマーカー遺伝子を表す。
【００２９】
前記遺伝子の２個以上の発現レベルを測定することは、単一遺伝子のみの発現レベルを測定するよりも強固であると予想される。例えば、２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することは、高リスク（ＩＢＤ１）または低リスク（ＩＢＤ２）表現型の存在、または不在の正確な判定を、例えば１個の遺伝子の発現レベルが測定不能である、または不正確である場合であっても可能にする。
【００３０】
例えば、本明細書で開示される方法は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、または１６個すべての遺伝子の発現レベルを測定することを含んでもよい。好ましくは、本明細書で開示される方法は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子の少なくとも５つの発現レベルを測定することを含む。
【００３１】
好ましい実施形態では、本明細書で開示されるような方法は、ＩＬ１８ＲＡＰおよびＴＲＧＣ２の発現レベルを測定することを含んでもよい。この実施形態では、方法は、任意選択的には、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、または１４個すべての遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。
【００３２】
さらなる好ましい実施形態では、本明細書で開示されるような方法は、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＴＲＧＣ２およびＴＲＧＶ３の発現レベルを測定することを含んでもよい。この実施形態では、方法は、任意選択的には、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、およびＬＹ９６からなる群から選択される１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、または１３個すべての遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含んでもよい。
【００３３】
一態様では、本発明は、個体から得られる全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを確認することにより、個体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法に関し、ここで２個以上の遺伝子は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される。本発明の方法は、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現によるＩＢＤ１表現型の特徴づけをさらに含んでもよい。本発明の方法は、個体におけるＩＢＤの進行のリスクを、ａ）選択遺伝子の測定された発現レベルを重み付けすること；ｂ）リスクスコアを決定するために、ロジスティック回帰モデルを重み付けた発現レベルに適用することであって、０．５未満のリスクスコアはＩＢＤの進行が低リスクであることを示し、０．５未満のリスクスコアはＩＢＤの進行が高リスクであることを示す、適用すること；およびｃ）その決定の結果をまとめた報告を作成することにより、患者におけるリスクスコアを計算することによって判定することをさらに含んでもよい。
【００３４】
本発明の特定の態様では、方法は、ＩＢＤに対する治療のため、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体を選択することを含んでもよい。本発明の方法は、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体にＩＢＤに対する治療を施すことをさらに含んでもよい。
【００３５】
本発明の特定の態様では、２個以上の遺伝子の発現レベルは、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて測定される。
【００３６】
本発明の特定の態様では、方法は、（ｉ）個体から得られる全血試料を提供することと；（ｉｉ）全血試料からＲＮＡを抽出することと；（ｉｉｉ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと；（ｉｖ）２個以上の遺伝子の発現レベルを測定するため、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施することと、を含む。
【００３７】
特定の態様では、本発明は、個体におけるＩＢＤを治療するための方法であって、（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである個体を識別することと、（ｉｉ）個体にＩＢＤに対する治療を施すことと、を含む、方法に関する。
【００３８】
本発明の他の態様は、本発明の方法における使用のための自己免疫性疾患の進行リスクの評価システムであって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現を測定するための１つまたは複数のツール、ならびに被験者の遺伝子発現データからＩＢＤの進行リスクスコアを計算するようにプログラムされたコンピュータを含む、システムを含む。システムは、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により、２個以上の遺伝子の発現を測定するための１つまたは複数のツールを含んでもよい。
【００３９】
特定の態様では、本発明は、ＩＢＤの進行について高リスクまたは低リスクであると判定される個体におけるＩＢＤを治療するための方法であって、（ｉ）前記個体をＩＢＤ１（高リスクのＩＢＤの進行）またはＩＢＤ２（低リスクのＩＢＤの進行）として分類する試験結果をレビューすることであって、試験は２個以上の遺伝子の発現レベルを測定し、２個以上の遺伝子は、個体から得られる全血試料中のＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択され、かつ低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現が、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有することを示し、かつ高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する個体におけるこれら遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の上方制御発現が、個体が低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有することを示す、レビューすることと、（ｉｉ）ＩＢＤにおけるＩＢＤ１またはＩＢＤ２表現型を有すると判定された個体を治療することと、を含む、方法に関する。方法は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により、２個以上の遺伝子の発現レベルを測定するための分析の結果を提供する試験を要求することをさらに含んでもよい。
【００４０】
特定の態様では、本発明は、個体が高リスクのＩＢＤ１表現型を有するかまたは低リスクのＩＢＤ２表現型を有するかを評価するためのキットであって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含み、ここでＩＢＤ１表現型が、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴とし、かつＩＢＤ２表現型が、ＩＢＤ１表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の上方制御発現を特徴とする、キットに関する。キットは、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、デジタルＰＣＲ、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により、２個以上の遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含んでもよい。
【００４１】
発明の特定の態様では、ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病である。
【００４２】
特定の態様では、本発明は、ＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力がある物質を同定するインビトロ方法であって、（ｉ）目的の物質を用いる治療前にＩＢＤ患者から得られる全血試料、および（ｉｉ）目的の物質を用いる治療後にＩＢＤ患者から得られる全血試料を提供することであって、ＩＢＤ患者は、高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有することが判定されている、提供することと；試料（ｉ）および（ｉｉ）中のＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することと、を含み、、試料（ｉ）に対する試料（ｉｉ）中の遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫのより低い発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３のより高い発現が、物質がＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があることを示す、方法に関する。方法は、ＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があるとして同定された物質を薬剤に配合することをさらに含んでもよい。
【００４３】
特定の態様では、本発明は、個体におけるＩＢＤを治療する能力がある物質を同定するインビトロ方法であって、（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである個体を識別することと；（ｉｉ）目的の物質を用いる治療後の個体におけるＩＢＤの進行のレベルを対照と比較することであって、対照と比べての個体におけるＩＢＤの進行のより低いレベルが、物質がＩＢＤを治療する能力があることを示す、比較することと、を含む、方法に関する。方法は、ＩＢＤを治療する能力があるとして同定された物質を薬剤に配合することをさらに含んでもよい。
【００４４】
特定の態様では、本発明は、患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する方法であって、ａ）前記患者の全血試料由来のＲＮＡを提供することと；ｂ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと；ｃ）ｃＤＮＡの一定分量が患者試料ｃＤＮＡの一定分量として同定されるように、ｃＤＮＡの各一定分量をアレイ上に置くことと；ｄ）ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上の遺伝子の各遺伝子におけるｃＤＮＡの各一定分量に対してＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施し、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の産物をアレイ上に提供することにより、本質的に３つ以上の遺伝子発現産物からなる患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供することと、を含む、方法に関する。方法は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の産物を定量化するステップをさらに含んでもよい。ＲＴ−ｑＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡを３個以上の遺伝子の各々に特異的なプライマーセットと接触させることにより得てもよい。プライマーセットは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブプライマーを含んでもよい。一部の実施形態では、遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１個６は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される。
【００４５】
特定の態様では、本発明は、患者の全血試料由来の患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイであって、患者試料ｃＤＮＡとして同定されたｃＤＮＡの各一定分量を含み、ここでアレイの３つ以上のｃＤＮＡの一定分量の各々が、ｃＤＮＡの一定分量中で選択遺伝子発現産物を増幅するための特異的なＲＴ−ｑＰＣＲプライマー対を含み、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上の遺伝子に特異的なプライマー対を含む、アレイに関する。アレイは、遺伝子の３個以上に特異的なＲＴ−ｑＰＣＲプローブをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される。
【００４６】
特定の態様では、本発明は、患者の全血試料由来の定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供する方法であって、ａ）患者の全血試料由来のＲＮＡを提供することと；ｂ）前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと；ｃ）ｃＤＮＡの一定分量が患者試料ｃＤＮＡの一定分量として同定されるように、前記ｃＤＮＡの一定分量をアレイ上に置くことと；ｄ）前記ｃＤＮＡの一定分量に対してＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を実施し、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは全トランスクリプトームショットガン配列決定の遺伝子発現産物をアレイ上に提供することと；ｅ）ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる遺伝子の群から選択される３個以上の遺伝子の選択された各遺伝子における遺伝子発現産物の量を定量化し、それにより患者の全血試料由来の定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイを提供することと、を含む、方法に関する。方法の特定の態様では、アレイ上の選択された各遺伝子発現産物においては、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量は、遺伝子における対照よりも少なく；かつＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量は、遺伝子における対照よりも多い。方法の別の態様では、アレイ上の選択された各遺伝子発現産物においては、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量は、遺伝子における対照よりも多く；かつＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量は、遺伝子における対照よりも少ない。一部の実施形態では、遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される。
【００４７】
特定の態様では、本発明は、定量化された患者識別化選択遺伝子の発現産物のアレイであって、患者の全血試料の個別の定量化された遺伝子発現産物を含み、ここで定量化された遺伝子発現産物が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個以上の遺伝子の増幅されたｃＤＮＡ産物からなる、アレイに関する。一部の実施形態では、アレイ上の選択された各遺伝子発現産物においては、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量は、遺伝子における対照よりも少なく；かつＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量は、遺伝子における対照よりも多い。一部の実施形態では、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量は、遺伝子における対照よりも多く；かつＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量は、遺伝子における対照よりも少ない。一部の実施形態では、遺伝子の４個、５個、１３個、１４個、または１６個は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される。
【００４８】
本明細書で用いられるとき、用語「アレイ」または「パネル」は、実験操作の過程の中で個別の核酸メンバーの同定および定量を可能にする様式で、１つ以上の容器、基板、または固体支持体の内部に含有される、またはそれらに固定される、核酸分子のプールを意味するように定義される。容器、基板、または固体支持体の非限定例として、反応チューブのシリーズ、マイクロアレイ、マルチウェルプレート（例えば、１６ウェル、３２ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、および１５３６ウェルプレート）、マイクロ流体デバイス、および当該技術分野で周知のその他の容器、基板、または固体支持体が挙げられる。
【００４９】
本明細書で用いられるとき、「患者識別化」は、個別患者の出身、起源、または由来がマークされるか、ラベルされるか、コードされるか、または、その他として表示されることを意味するように定義される。非限定例として、患者の名前、患者の社会保障番号、バーコード、患者番号、コード、記号、または他の好適な固有識別子が挙げられる。
【００５０】
本明細書で用いられるとき、「遺伝子発現産物」は、特定遺伝子の転写から生成される核酸を意味するように定義される。遺伝子発現産物の非限定例として、ｍＲＮＡ転写物、前記ｍＲＮＡから作出または誘導されるｃＤＮＡおよびｃＤＮＡ断片、前記ｍＲＮＡまたは前記ｃＤＮＡおよびｃＤＮＡ断片から作出または誘導されるＤＮＡまたはＤＮＡ断片が挙げられる。遺伝子発現産物の非限定例として、ｍＲＮＡ、逆転写により前記ｍＲＮＡから作出されるｃＤＮＡおよびそのｃＤＮＡ断片、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および当該技術分野で周知の他の核酸増幅技術を用いる増幅により生成された前記ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそのｃＤＮＡ断片から作出または誘導されるＤＮＡが挙げられる。
【００５１】
本明細書で用いられるとき、「本質的に〜からなる」は、請求される方法、アッセイ、または生成物の結果、成果、または読み取りに実質的に影響しない他の要素または生成物を任意選択的に含むことを意味するように定義される。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、「定量化される」は、患者から得られる試料の遺伝子発現産物の測定量を意味するように定義される。患者から誘導または入手される試料中に存在する遺伝子発現産物の量を測定する非限定的な好適な方法は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、全トランスクリプトームショットガン配列決定、直接多重遺伝子発現解析、および当該技術分野で周知のその他の方法を含む。
【００５３】
本明細書で用いられるとき、「プライマー対」は、特定のｃＤＮＡもしくはＤＮＡ配列、またはその断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する能力がある、フォワードおよびリバースプライマーまたはオリゴヌクレオチドからなる、２つのプライマーまたはオリゴヌクレオチドを意味するように定義される。
【００５４】
本明細書で用いられるとき、「プライマーセット」は、１つ以上の特定のｃＤＮＡもしくはＤＮＡ配列、またはその断片をＰＣＲにより増幅する能力がある、１つ以上のプライマー対を意味するように定義される。
【００５５】
本明細書で用いられるとき、「重度疾患経過」は、ＩＢＤの再発間の比較的短い期間および／またはＩＢＤ疾患の再発率の経時的増加を有するＩＢＤ患者の症状を意味するように定義される。ＩＢＤの再発は、Harvey Bradshaw（疾患活動性）指数＞５；および（ｉ）＞１０ｍｇ／ｌのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル、（ｉｉ）＞２００μｇ／ｇのカルプロテクチンレベル、または（ｉｉｉ）疾患活動性の内視鏡的証拠によって特徴づけられる。
【００５６】
本明細書で用いられるとき、「軽度疾患経過」は、ＩＢＤの再発間の比較的長い期間および／または経時的に増加しないＩＢＤ疾患の再発率を有するＩＢＤ患者の症状を意味するように定義される。ＩＢＤの再発は、Harvey Bradshaw（疾患活動性）指数＞５；および（ｉ）＞１０ｍｇ／ｌのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル、（ｉｉ）＞２００μｇ／ｇのカルプロテクチンレベル、または（ｉｉｉ）疾患活動性の内視鏡的証拠によって特徴づけられる。
【００５７】
高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する、ひいてはＩＢＤの進行が高リスクである個体は、低リスクのＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現によって特徴づけられる。
【００５８】
同様に、低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する、ひいてはＩＢＤの進行が低リスク個体は、高リスクのＩＢＤ１表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の上方制御発現によって特徴づけられる。
【００５９】
遺伝子の上方制御または下方制御発現は各々、前記遺伝子の有意に上方制御された、または有意に下方制御された発現のレベルを指してもよい。個体が問題の遺伝子の上方制御された発現のレベルを有するかまたは下方制御された発現のレベルを有するかは、任意の便宜的手段により判定されてもよく、多くの好適な技術は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される。
【００６０】
大部分のバイオマーカーの場合のように、予測の正確性は、絶対的でない可能性がある。したがって、個体は、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクのいずれかであるものとして分類される。このリスクは、幾つかの方法で表されてもよい。
【００６１】
例えば、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかは、ハザード比の観点で表されてもよい。ここでハザード比は、高リスク（ＩＢＤ１）または低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体におけるＩＢＤの進行の瞬時確率を表す。あるいは、ＩＢＤの進行のリスクは、ハザード比（ＨＲ）の観点で表されてもよく、ここでハザード比は、低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体に対する、高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する個体において生じるＩＢＤの進行の確率を表す。
【００６２】
本発明者は、高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する個体が、低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体と比べて、ＩＢＤの進行の確率に関して３．５２のハザード比を有したことを示している（実施例３および図３を参照）。
【００６３】
したがって、好ましい実施形態では、ＩＢＤの進行が高リスクである個体は、ＩＢＤの進行が低リスクである個体のハザード比よりも少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、または少なくとも３．５倍高いＩＢＤの進行に対するハザード比を有してもよい。同様に、ＩＢＤの進行が低リスクである個体は、ＩＢＤの進行が高リスクである個体のハザード比よりも少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、または少なくとも３．５倍低いＩＢＤの進行に対するハザード比を有してもよい。したがって、ＩＢＤの進行が高リスクである個体は、ＩＢＤの進行が低リスクである個体と比べて、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、または少なくとも３．５のＩＢＤの進行に対するハザード比を有してもよい。より好ましくは、ＩＢＤの進行が高リスクである個体は、ＩＢＤの進行が低リスクである個体のハザード比よりも少なくとも３．５倍高いＩＢＤの進行に対するハザード比を有する、すなわち、ＩＢＤの進行が低リスクである個体に対して、ＩＢＤの進行に対する少なくとも３．５のハザード比を有し、ＩＢＤの進行が低リスクである個体は、ＩＢＤの進行が高リスクである個体のハザード比よりも少なくとも３．５倍低いＩＢＤの進行に対するハザード比を有する。
【００６４】
あるいは、ＩＢＤの進行が高リスクである個体は、ＩＢＤの進行を経験する可能性が、ＩＢＤの進行が低リスクである個体よりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、または少なくとも３．５倍高くてもよい。同様に、ＩＢＤの進行が低リスクである個体は、ＩＢＤの進行を経験する可能性が、ＩＢＤの進行が高リスクである個体よりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも２．８倍、少なくとも２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．１倍、少なくとも３．２倍、少なくとも３．３倍、少なくとも３．４倍、または少なくとも３．５倍低くてもよい。ＩＢＤの進行の可能性は、１年間、２年間、３年間、４年間または５年間にわたるＩＢＤの進行の可能性を指してもよい。
【００６５】
したがって、ＩＢＤの進行が高リスクである個体は、ＩＢＤの進行が低リスクである個体よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、または少なくとも３５０％高いＩＢＤの進行の確率を有してもよい。同様に、ＩＢＤの進行が低リスクである個体は、ＩＢＤの進行が高リスクである個体よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、または少なくとも３５０％低いＩＢＤの進行の確率を有してもよい。ＩＢＤの進行の確率は、１年間、２年間、３年間、４年間または５年間にわたるＩＢＤの進行の確率を指してもよい。
【００６６】
個体から得られる試料（すなわち試験試料）中のＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するか（本明細書中でＩＢＤの進行リスクスコアとも称される）を確認するために用いられてもよい好適な方法が数多く存在し、ここで試料は、好ましくは全血試料である。
【００６７】
例えば、個体から得られる試料中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現のレベルは、問題の遺伝子の発現を高リスク（ＩＢＤ１）または低リスク（ＩＢＤ２）表現型と関連付けたデータコレクションと比較されてもよい。好ましい実施形態では、個体から得られる試料中のＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現のレベルは、高リスク（ＩＢＤ１）または低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有することが知られる個体から得られる問題の遺伝子についての発現データと比較され、前記比較から、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかが評価される。比較では、線形回帰モデルを用いてもよい。
【００６８】
あるいは、個体から得られる試料中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現のレベルは、ＩＢＤを有することが知られた個体から得られる問題の遺伝子についての遺伝子発現データに基づく計算モデル、ならびに好適な機械学習技術（ロジスティック回帰、サポートベクターマシン、または決定木に基づく方法）の使用を通じて、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを確認するため、用いられてもよい。例えば、計算モデルは、高リスク（ＩＢＤ１）または低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有することが知られた個体から得られる問題の遺伝子についての遺伝子発現データに基づいてもよい。あるいは、計算モデルは、ＩＢＤを有することが知られ、かつＩＢＤの進行を経ているかまたは経ていないことが知られた個体から得られる問題の遺伝子についての遺伝子発現データに基づいてもよい。
【００６９】
さらなる例では、好ましくは個体から得られる全血試料（すなわち試験試料）である試料中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現のレベルは、問題の各遺伝子における閾値レベルと比較されてもよい。遺伝子における好適な閾値レベルは、患者の別々の予後サブグループＩＢＤ１およびＩＢＤ２への最大分離を可能にする最適な発現閾値を確認するため、例えばｑＰＣＲ発現データおよび機械学習方法（ロジスティック回帰、サポートベクターマシン、または決定木に基づく方法など）を用いて決定され得る。したがって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現のレベルと問題の遺伝子の各々における閾値レベルとの比較は、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを示し得る。
【００７０】
あるいは、個体群から得られる試料中の問題の遺伝子（すなわち、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子）の各々の発現レベル中央値は、対照値として用いられてもよく、ここで群は、ＩＢＤの進行を有しない個体、好ましくは少なくとも１００、少なくとも５０、または少なくとも１０の個体からなった。この場合、個体から得られる全血試料中の、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、もしくはＧＺＭＫの発現レベル中央値を上回ること、または遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、もしくはＴＲＧＶ３の発現レベル中央値未満が、高リスク（ＩＢＤ１）表現型の存在を示し得る一方で、個体から得られる全血試料中の、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、もしくはＧＺＭＫの発現レベル中央値以下、または遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、もしくはＴＲＧＶ３の発現レベル中央値以上は、低リスク（ＩＢＤ２）表現型の存在を示し得る。
【００７１】
さらにその他として、個体、好ましくは、少なくとも１００、少なくとも５０、または少なくとも１０の個体の群から得られる試料中の問題の遺伝子の各々の発現レベル中央値は、対照として用いられてもよく、ここで群はＩＢＤの進行を有する個体からなった。この場合、個体から得られる全血試料中の、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、もしくはＧＺＭＫの発現レベル中央値以上、または遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、もしくはＴＲＧＶ３の発現レベル中央値以下が、高リスク（ＩＢＤ１）表現型の存在を示し得る一方で、個体から得られる全血試料中の、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、もしくはＧＺＭＫの発現レベル中央値未満、または遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、もしくはＴＲＧＶ３の発現レベル中央値超は、低リスク（ＩＢＤ２）表現型の存在を示し得る。
【００７２】
さらにその他として、個体、好ましくは、少なくとも１００、少なくとも５０、または少なくとも１０の個体の群から得られる試料中の問題の遺伝子の各々の発現レベル中央値は、対照として用いられてもよく、ここで群は、ＩＢＤの進行を有する個体およびＩＢＤの進行を有しない個体を含んだ。好ましくは、群は、ＩＢＤの進行を有する個体およびＩＢＤの進行を有しない個体を等しい数、または本質的に等しい数で含んだ。この場合、個体から得られる全血試料中の、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、もしくはＧＺＭＫの発現レベル中央値超、または遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、もしくはＴＲＧＶ３の発現レベル中央値未満が、高リスク（ＩＢＤ１）表現型の存在を示し得る一方で、個体から得られる全血試料中の、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、もしくはＧＺＭＫの発現レベル中央値未満、または遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、もしくはＴＲＧＶ３の発現レベル中央値超は、低リスク（ＩＢＤ２）表現型の存在を示し得る。
【００７３】
遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の発現のレベルは、任意の便宜的手段により測定されてもよく、多数の好適な技術は当該技術分野で公知である。例えば、好適な技術は、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定(RNA-SEQ)、直接多重遺伝子発現解析、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、プロテインチップ、フローサイトメトリー（FlowRNAとも称されるＲＮＡ用のFlow-FISHなど）、質量分析、ウエスタンブロッティング、およびノーザンブロッティングを含む。したがって、本発明の方法は、個体から得られる全血試料を、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、直接多重遺伝子発現解析、ＥＬＩＳＡ、プロテインチップ、フローサイトメトリー、質量分析、またはウエスタンブロッティングを用いて、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定するのに適した試薬、例えば、前記遺伝子の２個以上の発現レベルを測定するのに適した１つまたは複数の試薬と接触させることを含んでもよい。例えば、試薬は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または全トランスクリプトームショットガン配列決定を用いて前記遺伝子の１つ以上の発現レベルを測定するのに適した核酸プライマーの１つまたは複数のペアであってもよい。あるいは、試薬は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングを用いて前記１個以上の遺伝子の発現レベルを測定するのに適した抗体であってもよい。好ましくは、前記遺伝子の発現のレベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて測定される。最も好ましくは、前記遺伝子の発現のレベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定される。
【００７４】
ＲＴ−ｑＰＣＲは、標的ＤＮＡ分子の増幅および同時定量化を可能にする。ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて遺伝子発現レベルを分析するため、全血試料の全ｍＲＮＡはまず、単離され、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写されてもよい。例えば、ｍＲＮＡレベルは、例えば、ABI PRISM 7900HT機器上でのTaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)を用いて、製造業者の使用説明書に従って測定され得る。次に、転写物存在量が検量線との比較により計算され得る。
【００７５】
デジタルＰＣＲは、絶対的定量化および希少な対立遺伝子検出のための、通常のリアルタイム定量ＰＣＲに対する代替的方法を提供する、核酸の検出および定量化に対する新しい手法である。デジタルＰＣＲは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの試料を多数の個別のパラレルＰＣＲ反応物に分割することによって動作し；これらの反応物の一部が標的分子を含有する（陽性）一方で、それ以外は含有しない（陰性）。単一分子は、百万倍以上増幅され得る。増幅の間、配列特異的標的を検出するため、色素標識プローブを用いたTaqMan（登録商標）化学が用いられる。標的配列が存在しないとき、シグナルは蓄積しない。ＰＣＲ分析後、試料中の標的分子の数の絶対数を得るため、陰性反応物の画分が用いられ、標準または内因性対照は必要でない。ナノ流体チップの使用により、数千のＰＣＲ反応を並行的に実行するための便宜的かつ直接的な機構が提供される。各ウェルは、試料、マスターミックス、およびTaqMan（登録商標）アッセイ試薬の混合物が負荷され、個別に分析され、エンドポイントシグナルの存在（陽性）または不在（陰性）が検出される。標的配列の２個以上の分子を受けている可能性があるウェルを説明するため、補正因子がポアソンモデルを用いて適用される。
【００７６】
RNA-SEQでは、所与の時点での生体試料中のＲＮＡの検出および定量化を意図した次世代配列決定（ＮＧＳ）が用いられる。ＲＮＡライブラリーが調製、転写、断片化、配列決定、再構成され、配列または目的の配列が定量化される。
【００７７】
NanoString技術では、多種タイプの標的核酸分子に直接的にハイブリダイズし得る固有の色分けされた分子バーコードが用いられ、ｑＰＣＲと同等の感度を有する、最大８００個の遺伝子の発現レベルを同時に分析するための費用効果の高い方法が提供される。
【００７８】
ＲＮＡ用のFlow-FISHでは、蛍光標識ＲＮＡオリゴを用いて試料中の標的ｍＲＮＡの存在量を測定するため、フローサイトメトリーが用いられる。この技術は、例えば、Porichis et al. , Nat Comm (2014) 5:5641に記載されている。この技術の利点は、試料中に存在する細胞を分離する必要なしにそれが使用可能である点である。
【００７９】
マイクロアレイは、２つの試料中の遺伝子発現の比較を可能にする。最初に全ＲＮＡが、例えばTrizolまたはRNeasy mini kit(Qiagen)を用いて、例えばＰＢＭＣまたは全血から単離される。次に、単離された全ＲＮＡが、逆転写酵素およびポリＴプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡに逆転写され、例えばＣｙ３−またはＣｙ５−ｄＣＴＰを用いて標識される。次に、適切なＣｙ３−およびＣｙ５−標識試料がプールされ、好適な遺伝子を表すプローブおよび対照特徴からなるカスタムスポットオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、例えば(Willcocks et al., J Exp Med 205, 1573- 82, 2008)に記載のマイクロアレイにハイブリダイズされる。試料は、プールされたＰＢＭＣまたは全血試料に由来する共通の参照ＲＮＡに対して、色素交換法を用いて、二通りにハイブリダイズされてもよい。ハイブリダイゼーション後、アレイは洗浄され、例えばAgilent G2565Bスキャナーでスキャンされる。上記ステップに対する好適な代替物は、当該技術分野で周知であり、当業者にとって明白となる。次に、得られる生のマイクロアレイデータは、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の相対的発現を測定するための好適な方法を適用可能であれば用いて分析され得る。
【００８０】
酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）は、試料中に存在するタンパク質の相対量の検出を可能にする。試料はまず、固体支持体、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートに、直接的に、または目的のタンパク質に特異的な抗体を介して固定化される。固定化後、抗原は、標的タンパク質に特異的な抗体を用いて検出される。標的タンパク質を検出するために用いられる一次抗体のいずれかは、検出できるように標識されてもよく、または一次抗体は、好適に標識された二次抗体を用いて検出され得る。例えば、抗体は、抗体をレポーター酵素にコンジュゲートすることにより標識されてもよい。この場合、プレートは、可視シグナルを生成するための好適な酵素基質を添加することにより展開される。シグナルの強度は、試料中に存在する標的タンパク質の量に依存する。
【００８１】
プロテインアレイまたはプロテインマイクロアレイとも称されるプロテインチップは、試料中に存在するタンパク質の相対量の検出を可能にする。異なる捕獲分子が、チップに固定されてもよい。例として、抗体、抗原、酵素基質、ヌクレオチドおよび他のタンパク質が挙げられる。プロテインチップはまた、広範なタンパク質に結合する分子を含有し得る。プロテインチップは当該技術分野で周知であり、多種のプロテインチップが市販されている。
【００８２】
ウエスタンブロッティングもまた、試料中に存在するタンパク質の相対量の測定を可能にする。試料中に存在するタンパク質はまず、ゲル電気泳動を用いて分離される。次に、タンパク質は、膜、例えばニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜に移され、標的タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて検出される。多種の抗体が市販されており、所与の標的タンパク質に対する抗体を作製するための方法もまた、当該技術分野で十分に確立されている。検出を可能にするため、目的のタンパク質に特異的な抗体、または好適な二次抗体が、例えば、比色分析反応を駆動し、適切な基質に曝露されるときに発色する、レポーター酵素に連結されてもよい。他のレポーター酵素は、適切な基質とともに提供されるときに化学発光を生じる西洋わさびペルオキシダーゼを含む。抗体はまた、好適な放射性または蛍光標識で標識されてもよい。用いられる標識に依存し、タンパク質レベルは、デンシトメトリー、分光光度法、写真フィルム、Ｘ線フィルム、または光センサーを用いて測定されてもよい。
【００８３】
フローサイトメトリーは、被験者から得られる例えばＰＢＭＣ中または全血試料中に存在するタンパク質の相対量の測定を可能にする。フローサイトメトリーはまた、細胞表面上での目的のタンパク質の発現のレベルを検出または測定するために用いることができる。フローサイトメトリーを用いてのタンパク質および細胞の検出は通常、最初に蛍光標識を目的のタンパク質または細胞に付着させることを含む。蛍光標識は、例えば目的のタンパク質または細胞に特異的な蛍光標識抗体であってもよい。多種の抗体が市販されており、目的のタンパク質に特異的な抗体を作製するための方法もまた、当該技術分野で十分に確立されている。
【００８４】
質量分析、例えばマトリックス支援レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析は、例えばペプチド質量フィンガープリンティングを用いて、個体から得られる試料中に存在するタンパク質の同定を可能にする。質量分析前、試料中に存在するタンパク質は、ゲル電気泳動、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、または二次元ゲル電気泳動を用いて単離されてもよい。
【００８５】
さらに開示されるのは、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかもしくは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかの評価における使用、または個体から得られる全血試料中に高リスク（ＩＢＤ１）表現型が存在するかもしくは低リスク（ＩＢＤ２）表現型が存在するかの評価が意図されるキットである。キットは、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含んでもよい。これら遺伝子におけるＮＣＢＩ受入番号（およびＧＩ番号）は、表２に示される。キットは、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子の３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、または１６個すべての発現レベルを確認するための試薬を含んでもよい。好ましくは、キットは、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子の少なくとも５個の発現レベルを確認するための試薬を含む。
【００８６】
好ましい実施形態では、キットは、ＩＬ１８ＲＡＰおよびＴＲＧＣ２の発現レベルを確認するための試薬、また任意選択的には、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、または１４個すべての遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含む。
【００８７】
さらなる好ましい実施形態では、キットは、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＴＲＧＣ２およびＴＲＧＶ３の発現レベルを確認するための試薬、また任意選択的には、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、およびＬＹ９６からなる群から選択される１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、または１３個すべての遺伝子の発現レベルを確認するための試薬を含む。
【００８８】
例えば、試薬は、本明細書に記載の任意の技術、例えばＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて、問題の遺伝子の発現を確認するのに適した試薬であってもよい。例えば、キットは、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて、問題の遺伝子の発現のレベルを確認するのに適したプライマーを含んでもよい。好適なプライマーの設計は、ルーチン的であり、十分に当業者の能力の範囲内である。直接多重遺伝子発現解析用のキットは、問題の遺伝子の発現のレベルを確認するための蛍光プローブを追加的または代替的に含んでもよい。
【００８９】
検出試薬に加えて、キットはまた、ＲＮＡ抽出試薬および／またはＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写用の試薬を含んでもよい。
【００９０】
キットはまた、方法を実施するための１つ以上の物品および／または試薬、例えば緩衝液、および／または試験試料自体を入手するための手段、例えば試料を入手および／または単離するための手段、ならびに試料処理容器（一般に滅菌されているような部品）を含んでもよい。キットは、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかもしくは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するか、または全血試料中に高リスク（ＩＢＤ１）表現型が存在するかもしくは低リスク（ＩＢＤ２）表現型が存在するかを評価するための方法におけるキットの使用説明書を含んでもよい。
【００９１】
本発明の主な利点は、個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを評価するため、本発明者によって同定された遺伝子の発現レベルが個体から得られる全血試料中で測定可能である点である。したがって、本発明との関連で参照される試料は、好ましくは全血試料である。全血試料、末梢血試料、および末梢全血試料という用語は、本明細書中で交換可能に用いられる。全血試料は、個体から得られる血液、例えば末梢血の、その成分すべてを伴う試料を指す。したがって、用語「全血試料」は、本明細書で用いられるとき、先行技術の方法において用いられる、（ａ）全血から単離された特定の血液細胞型、例えば単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または単離されたＴ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞の試料を包含しない。全血試料は、試料収集後のプロセシング、例えば細胞溶解および／または全血試料中のＲＮＡ分解を阻害するための１つ以上の酵素阻害剤の添加が施されてもよい。
【００９２】
本発明は、個体から得られる（例えばＰＢＭＣ試料よりはむしろ）全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法を対象とするが、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するため、個体から得られるＰＢＭＣ試料中でのＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルの測定を同様に用いることができることが予想される。しかし、これは請求されない。
【００９３】
用語「個体」は、ヒト個体を指す。個体はまた、患者すなわちヒト患者と称されてもよい。本発明との関連で、個体は、文脈上特に断りのない限り、ＩＢＤを有する。好ましくは、個体は、ＩＢＤと診断されている。ＩＢＤが重度の症状（再発）の期間および寛解の期間によって特徴づけられるとき、個体は、ＩＢＤの再発を経験する過程であり得る、またはＩＢＤから寛解中であり得る。
【００９４】
ＩＢＤは、腸の炎症によって特徴づけられる状態群を指す。ＩＢＤの症状は、腹痛、再発性または血性下痢、食欲不振および体重減少、疲労（ｔｉｒｅｄｎｅｓｓ）および疲労（ｆａｔｉｇｕｅ）、ならびに貧血を含み得る。ＩＢＤの２つの主なタイプが、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）である。他のタイプは、コラーゲン大腸炎およびリンパ球性大腸炎を含む。ＵＣおよびクローン病は、英国単独で３００．０００を超える人々を冒す。潰瘍性大腸炎は主に結腸および直腸を冒す一方で、クローン病は小腸および大腸を冒し、口、食道、胃および肛門も冒し得る。ＵＣおよびクローン病は、重度の症状（疾患再発）の期間および寛解の期間によって特徴づけられる慢性状態である。いずれの疾患にも治療法はないが、抗炎症および免疫抑制療法、ならびに手術を含む治療は利用可能である。
【００９５】
「ＩＢＤの進行」は、個体における疾患の初期症状後のＩＢＤの進行を指す。ＵＣおよびクローン病を含むＩＢＤは、疾患の再発(relapses)によって特徴づけられる。これらの再発(relapses)はまた、再発(flare-ups)と称される。したがって、ＩＢＤの進行は、疾患の初期症状後のＩＢＤの再発(relapses)、または再発(flare-ups)を指してもよい。特に、ＩＢＤの進行は、疾患の初期症状後のＩＢＤの高頻度の再発(relapses)、または再発(flare-ups)を指してもよい。本発明者は、実施例３におけるＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに属するとして識別された個体が、疾患の初期症状後の１２か月の期間にわたり、各々、平均０．６６および０．３４のＩＢＤの再発(relapses)、または再発(flare-ups)を有することを見出した。したがって、高頻度の再発(relapses)、または再発(flare-ups)は、疾患の初期症状後の１２か月の期間にわたる、または疾患の初期症状の１２か月以内の、平均０．５以上、または０．６以上、好ましくは平均０．６以上の再発(relapses)、または再発(flare-ups)を指してもよい。再発(relapse)または再発(flare-up)は、治療の増強、例えば、免疫抑制もしくは抗炎症療法または手術の増強を必要とする事象であってもよい。治療の増強に対するかかる必要性はまた、治療拡大と称されてもよい。再発(relapse)または再発(flare-up)は、未治療で放置される場合、または不適切に治療される場合、腸の損傷または破壊を生じ得る。したがって、ＩＢＤの進行の高リスクは、個体が初期症状後に疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)を経験することになる高リスク、特に個体が疾患の初期症状後の１２か月の期間にわたり平均で０．６以上の疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)を経験することになる高リスクを指してもよい一方で、ＩＢＤの進行の低リスクは、個体が初期症状後に疾患の再発(relapses)または再発(flares)を経験することになる低リスク、特に個体が疾患の初期症状後の１２か月の期間にわたり平均で０．６以上の疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)を経験することになる低リスクを指してもよい。
【００９６】
疾患の再発(relapse)または再発(flare-up)の診断は、熟練した施術者の能力の範囲内に十分に含まれる。例えば、個体におけるＩＢＤの再発(relapse)または再発(flare-up)は、Harvey Bradshaw（疾患活動性）指数＞５；および（ｉ）＞１０ｍｇ／ｌのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル、（ｉｉ）＞２００μｇ／ｇのカルプロテクチンレベル、または（ｉｉｉ）疾患活動性の内視鏡的証拠；および疾患の以前の再発(flare-up)後に得られた寛解を有する個体によって特徴づけられてもよい。ＣＲＰは、肝臓により生成される炎症の血液マーカーである。炎症性事象の間、レベルが上昇する。ＣＲＰレベルが通常、個体から得られる血液試料中で測定される一方で、カルプロテクチンレベルは通常、便試料中で測定される。
【００９７】
Harvey Bradshaw（疾患活動性）指数では通常、以下のパラメータ：
（ｉ）一般的な健康問題（０＝非常に良い、１＝平均を若干下回る、２＝不良、３＝非常に良くない、４＝ひどい）
（ｉｉ）腹痛（０＝なし、１＝軽度、２＝中等度、３＝重度）
（ｉｉｉ）１日当たりの液体便の回数
（ｉｖ）腹部腫瘤（０＝なし、１＝疑わしい、２＝確実、３＝圧痛あり）
（ｖ）合併症の存在（各合併症について１ポイントの存在を伴う）：関節痛、ぶどう膜炎、結節性紅斑、アフタ性潰瘍、壊疽性膿皮症、裂肛、新しい瘻孔、膿瘍
が測定される。
【００９８】
Harvey Bradshaw指数スコア＞５は、軽度から重度の疾患の存在を示す。
【００９９】
ＩＢＤに対する公知の治療は、抗炎症療法、免疫抑制療法、および手術を含む。抗炎症療法の例として、ステロイド（コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロン、またはブデソニド）、および／またはメサラジンを用いる治療が挙げられる。免疫抑制療法の例として、ＴＮＦα阻害剤（インフリキシマブなど）、アザチオプリン、メトトレキサート、および／または６−メルカプトプリンを用いる治療が挙げられる。
【０１００】
治療は、（維持療法とも称される）疾患の管理が意図される進行中の疾患の治療、および疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)の治療を指してもよい。
【０１０１】
標準の「ステップアップ」治療は、専ら進行中の疾患の再発(flare-ups)または疾患の初期治療への不応答に応じての拡大治療を含む。例えば、（診断が下される時の）疾患の初期再発であれば、抗炎症ステロイド、例えばプレドニゾロン、または抗炎症薬、例えばメサラジン（例えばＵＣにおける）を用いて治療されることになるが、維持療法であれば開始されないことになる。その後に再発が生じる場合、この治療は反復されることになり、次に維持療法（例えば、アザチオプリン、メトトレキサート、または６−メルカプトプリンを用いる治療）も加わることになる。この維持療法にもかかわらず疾患の再発が続いた場合、次により強力な維持療法、例えばＴＮＦα阻害剤（インフリキシマブまたはアダリムマブ）を用いる治療が加わることになる。この治療方法は、専ら不適切に制御された疾患に応じて治療を拡大することにより過剰治療を防止するが、最終的には疾患の制御時に有効でない治療が試されることから、さらなる進行性疾患を有する患者を実質的な疾患関連合併症に曝露するというリスクがある。
【０１０２】
既に上で説明されたように、ＩＢＤにおける侵襲療法の早期導入が、標準のステップアップ手法と比べて、より良好な転帰をもたらすことが見出されている。具体的には、活動性クローン病を有する大部分の患者が、コルチコステロイドを用いて初期治療される。この手法は通常、症状を制御するが、多くの患者は、コルチコステロイドに対して耐性または依存性を示すようになり、コルチコステロイドへの曝露延長は、死亡率のリスク増加に関連する。インフリキシマブおよびアザチオプリンを用いての組み合わされた免疫抑制療法の早期利用と通常の疾患管理との比較により、クローン病であると最近診断されていた患者における寛解を誘導し、コルチコステロイド使用を低減するため、組み合わされた免疫抑制療法が通常の疾患管理よりも有効であることが示された。したがって、より集約的な治療を疾患経過における早期に開始することで、ＩＢＤを有する患者において、より良好な転帰をもたらすことができた(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)。特に、早期の組み合わせ免疫抑制療法で治療されたクローン病患者(D’Haens et al., 2008)は、より長期間のステロイドを含まない寛解を経験し、粘膜治癒を達成し、最終的には外科的切除を回避する可能性がより高い(D’Haens et al., 2008; Colombel et al., 2010)。しかし、この方法は、ある割合の患者が通常のコルチコステロイド治療であっても延長された寛解を得ていることになり(Jess et al., 2007)、ひいては組み合わせ免疫抑制療法を用いたそれらの治療により、彼らが不必要な副作用および毒性に曝露されることになることから、すべてのクローン病患者に適することはない。
【０１０３】
本発明者によって同定された全血遺伝子分類子は、クローン病および潰瘍性大腸炎を含むＩＢＤにおける疾患経過を予測する。具体的には、ＩＢＤ１サブグループにおける患者は、疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)を実質的により高い発生率で有し、（ＩＢＤ２群における患者と比べて）より早期の治療拡大だけでなく、フォローアップの単位期間当たりのさらなる治療拡大に対する需要をもたらす。疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)のこのパターンは、かなり高い罹患率に関連し、それ故、ＩＢＤ１サブグループにおける患者は、早期侵襲療法、例えばＴＮＦα阻害剤の使用から利益を得る可能性が最も高い。
【０１０４】
したがって、ＩＢＤの進行が高リスクであると識別された患者は、疾患経過における通常の早期投与よりも一層の侵襲療法、例えば、患者が、診断時、ＴＮＦα阻害剤、例えばインフリキシマブをアザチオプリン、メトトレキサートまたは６−メルカプトプリンと併用して治療され、その後の再発(relapses)または再発(flare-ups)が、抗炎症性ステロイド、例えばプレドニゾロンの追加投与で治療され、ＴＮＦα阻害剤の投与が増加され、または例えば抗インテグリン抗体を用いて治療される場合の「トップダウン」手法で治療されてもよい。
【０１０５】
それ故、ＩＢＤの進行が高リスクである者として識別された個体の場合、治療は、より高頻度もしくはより侵襲性である疾患の治療計画、または通常はＩＢＤの維持段階中に投与されない疾患の治療計画で、治療対象の個体を治療すること、または選択することを含んでもよい。より高頻度もしくはより侵襲性である疾患の治療計画は、通常はＩＢＤの維持段階中に投与される治療よりも頻繁または集約的である疾患の治療計画を指してもよい。より侵襲性である疾患の治療計画の例が、例えば診断時、１つ以上の免疫抑制剤を用いる治療、例えば、ＴＮＦα阻害剤、例えばインフリキシマブを、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、またはメトトレキサートと併用する治療である。
【０１０６】
ＩＢＤの進行が低リスクである者として識別された個体の場合、治療は、上記の標準のステップアップ治療手法を用いて治療すること、またはそれによる治療のための個体を選択することを含んでもよい。標準のステップアップ手法は、かかる患者の不必要な過剰治療を回避する。したがって、ＩＢＤの進行が低リスクである者として識別された個体は、疾患の初期症状時、炎症性ステロイド、例えばプレドニゾロン、または抗炎症薬、例えばメサラジンを用いて治療されてもよく、またはそれによる治療のために選択されてもよい。疾患のその後の再発(relapse)、または再発(flare-up)は、炎症性ステロイド、例えばプレドニゾロン、または抗炎症薬、例えばメサラジンを、維持療法の実施、例えばアザチオプリン、メトトレキサート、または６−メルカプトプリンを用いる治療と組み合わせて用いて治療されてもよい。さらに、疾患の再発(relapses)、または再発(flare-ups)は、炎症性ステロイド、例えばプレドニゾロン、または抗炎症薬、例えばメサラジンを、維持療法としてのＴＮＦα阻害剤（インフリキシマブまたはアダリムマブなど）の投与と組み合わせて用いて治療されてもよい。
【０１０７】
本発明の方法は、１以上の個体から得られる全血試料の使用を含み、それ故にインビトロ方法である。
【０１０８】
本発明は、個体から得られる全血試料中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することを含むインビトロ方法を提供する。
【０１０９】
本発明の方法は、個体におけるＩＢＤを治療する能力がある物質を同定するための方法における適用、例えば臨床試験が見出されることが予想される。かかる方法において用いられる個体は、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクであり得、好ましくは、個体はＩＢＤの進行が高リスクである。ＩＢＤの進行が高リスクである個体は、ＩＢＤの進行が低リスクである個体よりも頻繁な疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)を経験することが予想され、それ故、例えばかかる再発(flare-ups)または再発(relapses)の頻度および／または重症度を低下させる場合に、推定上の治療の有効性を評価することが容易になる。
【０１１０】
個体におけるＩＢＤを治療する能力がある物質を同定する方法、好ましくはインビトロ方法は、
（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくはＩＢＤの進行が高リスクである個体を本発明の方法を用いて識別することと；
（ｉｉ）目的の物質を用いた治療を受けている個体におけるＩＢＤの進行のレベルを対照と比較することと、を含んでもよい。個体におけるＩＢＤの進行の対照と比べてより低いレベルは、物質がＩＢＤを治療する能力があることを示す。ＩＢＤの進行のより低いレベルは、ＩＢＤの再発(flare-ups)または再発(relapses)の頻度および／または重症度における対照と比べての低下を指してもよい。方法は、上記方法におけるステップ（ｉ）の後およびステップ（ｉｉ）の前に個体に目的の物質を用いた治療を施すステップをさらに含んでもよい。対照は、目的の物質を用いて治療されていない、例えば本発明の方法を用いてＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくは高リスクであると識別された、個体または個体群において認められるＩＢＤの進行のレベルであってもよい。
【０１１１】
したがって、個体におけるＩＢＤを治療する能力がある物質を同定する方法は、
（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくはＩＢＤの進行が高リスクである第１の個体を本発明の方法を用いて識別することと；
（ｉｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスク、好ましくはＩＢＤの進行が高リスクである第２の個体を本発明の方法を用いて識別することと；
（ｉｉｉ）第１の個体におけるＩＢＤの進行のレベルを第２の個体におけるＩＢＤの進行のレベルと比較することと、を含んでもよく、ここで第１の個体は目的の物質を用いた治療を受けており、かつ第１の個体におけるＩＢＤの進行の第２の個体と比べてより低いレベルは、物質がＩＢＤを治療する能力があることを示す。方法は、任意選択的には、ステップ（ｉ）の後であるがステップ（ｉｉｉ）の前に第１の個体を目的の物質を用いて治療するステップをさらに含んでもよい。
【０１１２】
本発明の方法はまた、ＩＢＤ患者における低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力がある物質を同定するための方法における適用が見出されることが予想される。かかる方法において用いられる患者は、ＩＢＤの進行が高リスクである。詳細には、本発明は、ＩＢＤ患者における低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力がある物質を同定する方法、好ましくはインビトロ方法であって、
（ｉ）目的の物質を用いる治療前にＩＢＤ患者から得られる全血試料、および（ｉｉ）目的の物質を用いる治療後にＩＢＤ患者から得られる全血試料を提供することであって、ＩＢＤ患者は本発明に従う方法を用いて高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有することが判定されている、提供することと；
試料（ｉ）および（ｉｉ）中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することと、を含み、
試料（ｉ）に対する試料（ｉｉ）中の遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫのより低い発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３のより高い発現が、物質がＩＢＤ患者において低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があることを示す、方法を提供する。
【０１１３】
ＩＢＤを治療するかまたはＩＢＤ患者における低リスク（ＩＢＤ２）表現型を誘導する能力があるとして同定された物質はさらに、薬剤に配合されてもよい。物質に加えて、かかる薬剤は、例えば、薬学的に許容できる賦形剤を含んでもよい。
【０１１４】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の実験的例証を含む本開示を仮定すれば、当業者にとって明らかになるであろう。
【０１１５】
本明細書中に記述されるすべての文書は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１１６】
「および／または」は、本明細書で用いられるとき、２つの具体的特徴または成分の各々の他方の有無と無関係の具体的開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、あたかも各々が個別に本明細書中に示されるように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢ、の各々の具体的開示として解釈されるべきである。
【０１１７】
特に文脈上指示されない限り、上で示される特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されず、記述されるすべての態様および実施形態に等しく適用される。
【０１１８】
本発明の特定の態様および実施形態は、例として、上記図面を参照して、ここで例示されることになる。
【実施例】
【０１１９】
実施例
実施例１−全血中のＩＢＤ１／ＩＢＤ２遺伝子シグネチャーの同定
材料および方法
遺伝子発現プロファイリングのための患者動員
活動性クローン病（ＣＤ）（ｎ＝３９）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（ｎ＝３０）を有する患者６９名を治療開始前にリクルートし、その後、(Lee et al., 2011)に既に記載のようにフォローアップデータを収集した。この作業のための倫理的承認は、Cambridgeshire Regional Ethics Committee (REC08/H0306/21)から得た。すべての参加者が、書面でのインフォームドコンセントを提出した。
【０１２０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞試料
(Lyons et al., 2007)に記載の方法に従い、ＣＤ８＋Ｔ細胞を患者６９名から得た血液試料から陽性選択し、(Lee et al., 2011)に既に記載のように、RNEasy Mini Kits (Qiagen)を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡを抽出した。
【０１２１】
全血試料
直ぐにＲＮＡを固定するため、全血２．５ｍｌを患者６９名からRNeasy miniまたはPAXgene Blood RNA Tube IVD (Qiagen)へ収集した(Rainen et al., 2002)。収集した試料を、製造業者の使用説明書に従って貯蔵し、その後、PAXgene Blood RNA Kit IVD (Qiagen)を用いてＲＮＡを抽出した。
【０１２２】
ＲＮＡの定量化
ＲＮＡの量および質を各々、Nanodrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)およびAgilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies)を用いて判定した。
【０１２３】
全血遺伝子発現プロファイリング
２００ｎｇの全ＲＮＡを、Affymetrix Human Gene ST 1.0マイクロアレイ（ＣＤ８＋ＲＮＡ試料）またはAffymetrix Human Gene ST 2.0（全血ＲＮＡ試料）上で処理およびハイブリダイズし、次に製造業者の使用説明書に従って洗浄およびスキャンした。
【０１２４】
マイクロアレイデータの処理
マイクロアレイの生データは、BioConductor (Huber et al., 2015)におけるpreprocessCoreパッケージ(Bolstad, 2013)を用いてＲで処理した。つまり、生データは、表4.1に報告されたコードを用いて、バックグラウンド補正、分位正規化、および要約を行った。潜在的な異常値の存在は、パッケージarrayQualityMetricsを用いて評価した(Kauffmann et al., 2009)。バッチ補正をComBatを用いて実施した(Johnson et al., 2007)。重要なことに、一個抜き交差検証により汎化誤差推定値における任意の下向きバイアスを回避するため、個体試料のＩＢＤ１／ＩＢＤ２メンバーシップについての知識をバッチ補正手順に組み込まなかった。（試料の少なくとも７５％においてｌｏｇ２発現シグナル＞７．０を示すプローブセットとして定義した）発現された転写物を検出するプローブセットのみを保持した。未発現のプローブセットおよびアノテーションのないプローブセットをデータセットから除去し、全血遺伝子発現データセットとして、１２，８７４のプローブセットが残った。
【０１２５】
定量ＰＣＲ
候補遺伝子および３個の参照遺伝子におけるｍＲＮＡのレベルを、Roche LightCycler 480リアルタイムＰＣＲ機器上でTaqMan Expression Assays (Life Technologies)を用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。プレート内およびプレート間の変動を最小化するため、ＰＣＲ条件を最適化した。転写物の存在量を、ΔΔＣＴ法(Livak et al., 2001)を用いて計算した。健常者の全血から抽出したプールＲＮＡに由来するｃＤＮＡ試料を各プレートに加え、標準物質として用いた。各測定を３回反復し、３回の技術的反復の中央値を最終分析に用いた。
【０１２６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞遺伝子発現データに基づくＩＢＤ１／ＩＢＤ２患者の分類
ＩＢＤ１（予後不良）またはＩＢＤ２（良好な予後）状態を患者６９名に割り当てるため、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞試料からの正規化した発現データを、本発明者の既存のＩＢＤ患者コホートからのデータとマージした。次に、Lee et al., 2011に記載のように、マージしたデータセットのコンセンサスクラスタリングを用いて、コホートを２つの以前に識別された予後群に層別化した。
【０１２７】
ＩＢＤ１サブグループ内の患者は、（ＩＢＤ２群における患者と比べて）疾患の再発(relapses)または再発(flare-ups)の実質的により高い発生率を有し、これは治療拡大に対するより早期の要求だけでなく、フォローアップの単位期間当たりのさらなる治療拡大に対する要求によって特徴づけられる。
【０１２８】
全血遺伝子発現データに基づくＩＢＤ１／ＩＢＤ２患者の分類
並行して、ＩＢＤ患者６９名からの全血遺伝子発現データのデータセットもまた作成した。患者を２つの予後群（ＩＢＤ１およびＩＢＤ２）に全血遺伝子発現データに基づいて層別化するのに必要な幾つかの遺伝子を、適応的エラスティックネット型正則化を伴うロジスティック回帰モデルを全血遺伝子発現データセットに適用することにより選択した。選択された候補遺伝子および幾つかの密接に相関する遺伝子は、リアルタイムＰＣＲ分析を用いる試験の対象とした。１０の不変参照遺伝子と一緒に各候補遺伝子に対して、TaqManリアルタイムＰＣＲアッセイを実施した。エラスティックネット型正則化回帰モデルをリアルタイムＰＣＲデータに適用し、１５個の遺伝子からなる最適なモデルを同定し、それはＩＢＤ患者６９名のコホートを２つの元の予後群ＩＢＤ１およびＩＢＤ２に層別化することができた（ＰＰＶ＝０．８７、ＮＰＶ＝０．９４、感度０．９４、特異度０．８５；図１および２）。ＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループはまた、拡大を含まない生存（Ｐ＝０．００７４）および幾つかの経時的拡大（Ｐ＝０．０００３、治療拡大の平均数：１．６２（ＩＢＤ１）、０．７０（ＩＢＤ２）の双方の観点で、疾患経過と等価な関連性があることを示した。１５個の遺伝子を表１に列挙する。
【０１２９】
【表１】
2020198884.tif 000002
【０１３０】
実施例２−ＲＴ−ｑＰＣＲ分析における全血分類子の最適化
実施例１で同定した遺伝子をリアルタイムｑＰＣＲアッセイ展開の対象とし、全血分類子の最終内容物（１６個の有益な遺伝子および２個の参照遺伝子）を最適化し、完了させた。この分類子の一部を形成する有益な遺伝子を下の表２に列挙する。
【０１３１】
ＲＴ−ｑＰＣＲなどの方法により全血中で検出可能であることを通じての、この全血遺伝子分類子を用いての患者の層別化は、例えば国際公開第２０１０／０８４３１２号に記載のように、遺伝子発現を測定する前に特定細胞型の単離を必要とする試験よりも簡素化され、かつ費用効果が高くなる。
【０１３２】
さらに、全血遺伝子分類子は、ＩＢＤの管理における大きな改善を直接的にもたらすこと；侵襲性疾患を有する患者が診断から適切に強力な治療を受けることを可能にする一方、無痛性疾患を有する患者が不要な免疫抑制のリスクおよび副作用に曝露されないことを保証することを含む、広範囲なヘルスケアベネフィットを有することが予想される。これは、治療毒性を最小化し、疾患合併症および医療費を低減することにより、臨床成績を改善することが予想される。全血遺伝子分類子はまた、疾患再発の可能性に基づく臨床試験用の患者の予備選択を容易にし、それにより再発の予防または治療の試験にて必要とされる患者の数を２〜３倍低減することが予想される。
【０１３３】
【表２】
2020198884.tif 000003
【０１３４】
実施例３−ｑＰＣＲに基づく全血アッセイの独立検証
次に、実施例２で同定された１６の遺伝子分類子の予後性能の独立検証を、英国周辺の４つの施設(Cambridge, Nottingham, Exeter,およびLondon)からの８５の新規に診断されたＩＢＤ患者の第２の独立コホートを用いて実施した。実施例２で展開したｑＰＣＲに基づく試験を用いた全血遺伝子発現の分析により、３．５２のＩＢＤ１／ＩＢＤ２ハザード比を有する発見コホートにおいて認められる予後層別化が再現された（９５パーセント信頼区間［ＣＩ］：１．８４〜６．７６、Ｐ＝０．０００２、図３）。この性能は、既存の遺伝子発現に基づくインビトロ診断検査の場合に匹敵する。例えば、Oncotype DX（乳がん再発を予測する遺伝子発現診断）におけるハザード比は２．８１である（９５％ＣＩ：１．７０  ４．６４）(Paik et al., NEJM, 2004)。
【０１３５】
実施例４-最小の遺伝子分類子
患者を２つの予後群ＩＢＤ１およびＩＢＤ２に層別化するのに必要である、実施例２で展開した最適化された全血分類子の遺伝子の最小数を判定するため、本発明者は、実施例２で同定した１６個の遺伝子のあらゆる可能な組み合わせについて徹底的な計算分析を実施し、ＩＢＤ患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに正確に層別化するのに使用可能な遺伝子の最小数を判定した。
【０１３６】
ｎ個の遺伝子の各々の可能な組み合わせにおいて（１＜＝ｎ＜＝１６の場合）、Ｌ２正規化ロジスティック回帰モデルを、関連のｑＰＣＲ遺伝子発現データにフィッティングし、各モデルにおける関連の予測性能を、実施例１で既に述べたように評価した。
【０１３７】
下の表３に列挙する結果は、ＩＢＤ患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに正確に層別化するため、実施例２で同定した最適化された１６遺伝子全血分類子から選択されるわずか２個の遺伝子からの全血遺伝子発現データを用いることができたことを示す。具体的には、ＩＢＤ患者から得た全血試料中の遺伝子ＩＬ１８ＲＡＰおよびＴＲＧＣ２の発現を測定することは、患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに０．７１の正確度（感度：０．７３；特異度：０．６９；ＰＰＶ：０．６９；ＮＰＶ：０．７４）で層別化するのに十分であった。
【０１３８】
同様に、実施例２で展開した最適化された全血分類子から選択される３個の遺伝子における全血遺伝子発現データは、ＩＢＤ患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに正確に層別化するのに適することが示された。例えば、ＩＢＤ患者から得た全血試料中の遺伝子ＩＬ１８ＲＡＰ、ＴＲＧＣ２およびＴＲＧＶ３の発現を測定することは、患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに０．７４の正確度（感度：０．７４；特異度：０．７４；ＰＰＶ：０．７４；ＮＰＶ：０．７４）で層別化するのに十分であった。
【０１３９】
表２に列挙する遺伝子からの４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個および１５個の遺伝子の組み合わせは、同様に試験したところ、表３に示す通り、ＩＢＤ患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに０．７以上の正確度で層別化するのに適することが見出された。
【０１４０】
表３が報告するのは、試験した遺伝子の各番号における、ＩＢＤ患者のＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループへの最適な層別化をもたらした遺伝子の組み合わせに限ることは注目する必要がある。例えば、ＩＢＤ患者のＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループへの最適な層別化を可能にする４個の遺伝子の組み合わせのみを表３に示す。しかし、実施例２で同定した１６遺伝子分類子から選択される４個の遺伝子の他の組み合わせもまた、ＩＢＤ患者をＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに０．７以上の正確度で層別化するのに適した。
【０１４１】
ＩＢＤ患者から得た全血試料中の１６個の遺伝子すべての発現を測定することにより、患者がＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループに０．９７１の正確度（ＰＰＶ＝１．０００；ＮＰＶ＝０．９４１；感度：０．９４６；および特異度：１．０００）で層別化された。
【０１４２】
【表３】
2020198884.tif 000004
【０１４３】
比較実施例５
本発明者は、実施例１に既に記載のように、以前に国際公開第２０１０／０８４３１２号に記載された遺伝子発現シグネチャーが、全血遺伝子発現データに基づき、患者を高リスクＩＢＤ１および低リスクＩＢＤ２サブグループに正確に層別化する能力を試験した。全血中の、国際公開第２０１０／０８４３１２号の表１または２に開示される遺伝子、すなわち国際公開第２０１０／０８４３１２号に記載の遺伝子ＫＡＴ２Ｂ、ＡＮＫＲＤ３２およびＺＮＦ２６、またはＩＴＧＡ２、ＰＴＰＮ２２およびＮＯＴＣＨ１の発現を測定することにより、当該グラフを下回ることが報告されたログランク検定Ｐ値によって示される通り、ＩＢＤ患者のＩＢＤ１およびＩＢＤ２サブグループへの正確な分類が得られなかった（図４を参照）。これらの結果は、国際公開第２０１０／０８４３１２号に開示される遺伝子シグネチャーが、遺伝子発現を全血中で測定するとき、個体におけるＩＢＤの進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価するために適さないことを示す。
【０１４４】
実施例６−３、４、５、１３、１４、および１６遺伝子モデルを用いた患者分類
本発明の方法は、患者を高または低リスクのＩＢＤの進行を有する患者に層別化し、ＲＮＡ材料の安定性を促進する捕集管内の全血としてわずか２．５ｍｌの収集を必要とし、（ＲＮＡが室温で最大３日間安定性を維持することから）国際的に公開してもよい。アッセイでは、４８時間以内に迅速な結果が戻され、治療開始前の患者診断用に定量ＲＴ−ＰＣＲを通じて遺伝子発現を測定する。
【０１４５】
各ＲＴ−ＰＣＲの測定結果は、転帰予測（高／低リスクのＩＢＤの進行）を、高および低リスク転帰群間での３．５の検証されたオッズ比で戻すような具体的な重み付けを適用するためのアルゴリズムに依存する。
【０１４６】
３、４、５、１３、１４、および１６遺伝子モデルを用いた患者分類
それらの考えられる疾患経過を判定するため、患者４２９名および４８３名が、血液試料をPAXGene（登録商標）Blood RNAチューブに提供した。ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成後、１６個の有益な遺伝子（ＡＲＲＤＣ４、ＦＣＲＬ５、ＧＢＰ５、ＧＺＭＨ、ＧＺＭＫ、ＨＰ、ＩＦＩ４４Ｌ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＬＧＡＬＳＬ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、ＮＵＤＴ７、Ｐ２ＲＹ１４、ＴＲＧＣ２、ＴＲＧＶ３およびＶＴＲＮＡ１−１）および２個の参照遺伝子（ＲＮＡ１８Ｓ５およびＣＤＶ３）の発現レベルを、Roche Lightcycler 480を用いる定量ＰＣＲにより測定した（Ｃｔ、表４）。生データを、２個の参照遺伝子の平均値を有益な遺伝子各々から減ずることにより正規化し（ｄＣｔ、表４）、次に平均中心化により標準化した（ｄＣｔ’、表４）。
【０１４７】
【表４】
2020198884.tif 000005
【０１４８】
軽度疾患（低リスクのＩＢＤの進行）を経験するいずれかの患者の、確率（Ｐ）として表されるリスクスコアは、以下のロジスティック回帰モデルを、標準化された遺伝子発現データに、３遺伝子モデル（方程式（１））、４遺伝子モデル（方程式（２））、５遺伝子モデル（方程式（３））、１３遺伝子モデル（方程式（４））、１４遺伝子モデル（方程式（５））、および１６遺伝子モデル（方程式（６））を用いて適用することにより判定することができる。
Ｌｏｇｉｔ（Ｐｓｅｖｅｒｅ）＝β０＋β１（ＩＬ１８ＲＡＰ）＋β２（ＴＲＧＣ２）＋β３（ＴＲＧＶ３）  （１）
Ｌｏｇｉｔ（Ｐｓｅｖｅｒｅ）＝β０＋β１（ＩＬ１８ＲＡＰ）＋β２（ＬＩＮＣ０１１３６）＋β３（ＴＲＧＣ２）＋β４（ＶＴＲＮＡ１−１）  （２）
Ｌｏｇｉｔ（Ｐｓｅｖｅｒｅ）＝β０＋β１（ＩＬ１８ＲＡＰ）＋β２（ＬＩＮＣ０１１３６）＋β３（ＴＲＧＣ２）＋β４（ＴＲＧＶ３）＋β５（ＶＴＲＮＡ１−１）  （３）
Ｌｏｇｉｔ（Ｐｓｅｖｅｒｅ）＝β０＋β１（ＡＲＲＤＣ４）＋β２（ＦＣＲＬ５）＋β３（ＧＢＰ５）＋β４（ＧＺＭＨ）＋β５（ΗΡ）＋β６（ＩＦＩ４４Ｌ）＋β７（ＩＬ１８ＲＡＰ）＋β８（ＬＧＡＬＳＬ）＋β９（ＬＩＮＣ０１１３６）＋β１０（ＬＹ９６）＋β１１（Ｐ２ＲＹ１４）＋β１２（ＴＲＧＶ３）＋β１３（ＶＴＲＮＡ１−１）  （４）
Ｌｏｇｉｔ（Ｐｓｅｖｅｒｅ）＝β０＋β１（ＦＣＲＬ５）＋β３（ＧＢＰ５）＋β４（ＧＺＭＫ）＋β５（ΗΡ）＋β６（ＩＦＩ４４Ｌ）＋β７（ＩＬ１８ＲＡＰ）＋β８（ＬＧＡＬＳＬ）＋β９（ＬＩＮＣ０１１３６）＋β１０（ＬＹ９６）＋β１１（ＮＵＤＴ７）＋β１２（Ｐ２ＲＹ１４）＋β１３（ＴＲＧＣ２）＋β１４（ＴＲＧＶ３）  （５）
Ｌｏｇｉｔ（Ｐｓｅｖｅｒｅ）＝β０＋β１（ＡＲＲＤＣ４）＋β２（ＦＣＲＬ５）＋β３（ＧＢＰ５）＋β４（ＧＺＭＨ）＋β５（ＧＺＭＫ）＋β６（ΗΡ）＋β７（ＩＦＩ４４Ｌ）＋β８（ＩＬ１８ＲＡＰ）＋β９（ＬＧＡＬＳＬ）＋β１０（ＬＩＮＣ０１１３６）＋β１１（ＬＹ９６）＋β１２（ＮＵＤＴ７）＋β１３（Ｐ２ＲＹ１４）＋β１４（ＴＲＧＣ２）＋β１５（ＴＲＧＶ３）＋β１６（ＶＴＲＮＡ１−１）  （６）
【０１４９】
次に、−６０〜６０、−３０〜３０、または−１０〜１０の範囲の個別重み付けを、モデルにおける各遺伝子に対する標準化された遺伝子発現データに適用する。各アッセイに対する個別重み付け（β）は、表５に示す通りである。
【０１５０】
【表５】
2020198884.tif 000006
【０１５１】
３遺伝子モデル
再編成方程式（１）重度疾患経過に従う患者４２９名の確率は、
【数１】
2020198884.tif 000007
によって与えられる。
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．２４
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４２９名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者４８３名においては：
【数２】
2020198884.tif 000008
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．４５
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４８３名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
【０１５２】
４遺伝子モデル
再編成方程式（２）重度疾患経過に従う患者４２９名の確率は、
【数３】
2020198884.tif 000009
によって与えられる。
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．１３
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４２９名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者４８３名においては：
【数４】
2020198884.tif 000010
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．７３
Ｐｓｅｖｅｒｅ＞０．５であることから、患者４８３名は重度疾患経過に従うことが予測される。
【０１５３】
５遺伝子モデル
再編成方程式（３）重度疾患経過に従う患者４２９名の確率は、
【数５】
2020198884.tif 000011
によって与えられる。
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．３５
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４２９名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者４８３名においては：
【数６】
2020198884.tif 000012
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．５５
Ｐｓｅｖｅｒｅ＞０．５であることから、患者４８３名は重度疾患経過（高リスクのＩＢＤ進行）に従うことが予測される。
【０１５４】
１３遺伝子モデル
再編成方程式（４）重度疾患経過に従う患者４２９名の確率は、
【数７】
2020198884.tif 000013
によって与えられる。
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．０５８
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４２９名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者４８３名においては：
【数８】
2020198884.tif 000014
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝１
Ｐｓｅｖｅｒｅ＞０．５であることから、患者４８３名は重度疾患経過（高リスクのＩＢＤ進行）に従うことが予測される。
【０１５５】
１４遺伝子モデル
再編成方程式（５）重度疾患経過に従う患者４２９名の確率は、
【数９】
2020198884.tif 000015
によって与えられる。
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．２０１
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４２９名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者４８３名においては：
【数１０】
2020198884.tif 000016
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．９８
Ｐｓｅｖｅｒｅ＞０．５であることから、患者４８３名は重度疾患経過（高リスクのＩＢＤ進行）に従うことが予測される。
【０１５６】
１６遺伝子モデル
再編成方程式（６）重度疾患経過に従う患者４２９名の確率は、
【数１１】
2020198884.tif 000017
によって与えられる。
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝０．００８
Ｐｓｅｖｅｒｅ＜０．５であることから、患者４２９名は軽度疾患経過に従うことが予測される。
同様に、患者４８３名においては：
【数１２】
2020198884.tif 000018
Ｐｓｅｖｅｒｅ＝１
Ｐｓｅｖｅｒｅ＞０．５であることから、患者４８３名は重度疾患経過に従うことが予測される。
【０１５７】
上の非限定例では、本発明の一実施形態を、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個、４個、５個、１３個、１４個、および１６個の遺伝子に適用する場合を例示する。しかし、方法は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個の遺伝子に、当業者により容易に適応することができる。
【０１５８】
方法
ＲＮＡ抽出
被験者から得た血液試料を、PAXgene（登録商標）チューブ（PAXgene Blood RNA Kit、カタログ番号７６２１６４、BD Biosciences, San Jose, CA）内、室温（１５〜２５℃）で３時間インキュベートする。次に、試料を含有するチューブを４，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をチューブからデカントし、廃棄する。上清のデカンテーション後、新しい二次的なBD Hemogard（商標）(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)クロージャを用いて、チューブを閉じる。次に、ペレットが見かけ上溶解するまでチューブをボルテックスし、４，０００×ｇで１０分間遠心分離する。遠心分離後、全上清を、ピペットを用いて除去および廃棄する。次に、再懸濁緩衝液BR1(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)３５０μｌを添加し、ペレットが見かけ上溶解するまでチューブをボルテックスする。次に、結合緩衝液BR2（PAXgene Blood RNAＭＤｘキット、BD Biosciences, San Jose, CA）３００μｌおよびプロテイナーゼＫ４０μｌが個別に添加された１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに試料をピペッティングする。次に、チューブを５秒間ボルテックスし、シェーカー−インキュベーターを１０００ｒｐｍで用いて、５５℃で１０分間インキュベートする。インキュベーション後、マイクロ遠心チューブからの可溶化液を、２ｍｌの処理チューブ内に置いたPAXgene（登録商標）Shredderスピンカラム（ライラック）(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)に直接ピペッティングし、１５，０００×ｇで３分間遠心分離した。次に、フロースルー画分の全上清を、新しい１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに、処理チューブ内のペレットを妨げることなく慎重にピペッティングする。９６〜１００％エタノール３５０μｌを上清に添加し、２秒間ボルテックスし、５００×ｇで１秒間遠心分離し、チューブ蓋内部からの液滴を除去する。試料７００μｌを、２ｍｌの処理チューブ内に置いたPAXgene（登録商標）RNAスピンカラム（赤）(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)にピペッティングし、１５，０００×ｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。残存試料を、PAXgene（登録商標）RNAスピンカラム(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)にピペッティングし、１５，０００×ｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。洗浄緩衝液ＢＲ３の３５０μｌを、PAXgene（登録商標）RNAスピンカラムにピペッティングし、１５，０００×ｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。
【０１５９】
別々の１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ内で、デオキシリボヌクレアーゼＩインキュベーション混合物を、デオキシリボヌクレアーゼＩ溶液(PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)１０μｌを緩衝液RDD (PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)７０μｌと混合することによって作製する。次に、デオキシリボヌクレアーゼＩインキュベーション混合物８０μｌを、PAXgene（登録商標）RNAスピンカラム膜上に直接的に添加し、室温（２０〜３０℃）で１５分間インキュベートする。緩衝液BR3の３５０μｌを、PAXgene（登録商標）RNAスピンカラムにピペッティングし、１５，０００×ｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。洗浄緩衝液BR4 (PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)５００μｌをPAXgene（登録商標）RNAスピンカラムにピペッティングし、１５，０００ｇで１分間遠心分離する。スピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブ内に置き、フロースルーを含有する古い処理チューブを廃棄する。緩衝液ＢＲ４の５００μｌを、PAXgene（登録商標）RNAスピンカラムにピペッティングし、１５，０００ｇで３分間遠心分離する。スピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブ内に置き、１５，０００×ｇで１分間遠心分離する。PAXgene（登録商標）RNAスピンカラムを１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブ内に置き、溶出緩衝液BR5 (PAXgene Blood RNA Kit、BD Biosciences, San Jose, CA)４０μｌを、PAXgene RNAスピンカラム膜上に直接的にピペッティングし、１５，０００×ｇで１分間遠心分離し、ＲＮＡを溶出する。溶出緩衝液ＢＲ５の４０μｌおよび同じマイクロ遠心チューブを用いて溶出ステップを反復する。溶出液のＲＮＡ試料を６５℃で５分間インキュベートし、直ぐに氷上でＲＮＡ試料を冷却する。
【０１６０】
ＲＮＡ定量化
即用可能なAgilent RNA 6000 gel-dye mixチューブ（Agilent RNA 6000 Nano Kit、カタログ番号5067-1511、Agilent, Santa Clara, CA）の一定分量を１３，０００×ｇで１０分間回転させ、次にgel-dye mixを室温（１５〜２５℃）で３０分間、平衡化しておく。新しいRNA Nano chip（Agilent RNA 6000 Nano Kit、カタログ番号5067-1511、Agilent, Santa Clara, CA）を即用可能なチッププライミングステーション（カタログ番号5065- 4401、Agilent, Santa Clara, CA）上に置く。gel-dye mixの９μｌを「Ｇ」というマークのウェルの底部にピペッティングする。チッププライミングステーションでは、プランジャー１ｍｌに位置づけ、チッププライミングステーションを閉じる。正確に３０秒間待機し、次にプランジャーをクリップリリース機構でリリースし、プランジャーが少なくとも０．３ｍｌのマークまで戻ることを目視検査する。５秒間待機し、次にプランジャーを１ｍｌの位置まで徐々に引き戻す。チッププライミングステーションを開き、gel-dye mixの９μｌを反応ウェルの各々にピペッティングする。即用可能なAgilent RNA 6000 Ladder（カタログ番号5067-1529、Agilent, Santa Clara, CA）の一定分量を氷上に１５分間置いて完全解凍させ、次に７０℃で２分間インキュベートする。Agilent RNA 6000 Ladderの１μｌを、ラダー記号をマークしたウェルにピペッティングする。Agilent RNA 6000 Nano marker（Agilent RNA 6000 Nano Kit、カタログ番号5067-1511、Agilent, Santa Clara, CA）５μｌを、ラダー記号をマークしたウェルおよび反応ウェルの各々にピペッティングする。ＲＮＡ試料１μｌをRNA Nano chipの左上ウェルにピペッティングする。RNA Nano chipを水平に２４００ｒｐｍで６０秒間ボルテックスする。チップをAgilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Santa Clara, CA)の容器に慎重に入れ、蓋を閉じ、チップを動作させる。動作の完了後、ＲＮＡの完全性を点検し、ＲＩＮ＞７の場合、ｃＤＮＡ合成を処理する前、Nanodrop分光光度計を用いてＲＮＡを定量化する。
【０１６１】
ｃＤＮＡ合成
標識した０．２ｍｌの薄壁内で氷上チューブを以下と組み合わせ、混合物を作出する（表６）。
【０１６２】
【表６】
2020198884.tif 000019
【０１６３】
各試料において、調製した混合物１０μｌを、１５ｎｇ／μｌに希釈したＲＮＡ試料１０μｌ（１５０ｎｇのＲＮＡ）に添加する。参照ＲＮＡにおいて、（２．）で調製したｃＤＮＡ合成混合物２５μｌを、１５ｎｇ／μｌに希釈した参照ＲＮＡ２５μｌ（３７５ｎｇ）に添加する。緩やかに混合し、チューブをサーモサイクラー(Eppendorf MasterCycler Nexus SX1 , SKU # 8125-30-1030, Eppendorf AG, Germany)内に置く。２５℃で１０分間インキュベートする。４２℃で６０分間インキュベートする。８５℃で５分間反応を終了させる。それを４℃に冷やす。ｑＰＣＲの前に、チューブを短時間遠心分離し、チューブの底部で内容物を収集し、ｃＤＮＡ試料を−２０℃で貯蔵する。
【０１６４】
ｑＰＣＲ
解凍したｃＤＮＡ試料を再懸濁し、緩やかにボルテックスし、次に短時間遠心分離し、チューブの底部で液体を収集する。各試料において、内容物を標識した０．５ｍｌのチューブに移し、ヌクレアーゼを含まない水３８０μｌを添加することにより、２０倍に希釈する。参照ｃＤＮＡにおいて、内容物を標識した０．５ｍｌのチューブに移し、ヌクレアーゼを含まない水２００μｌを添加することにより、５倍に希釈する。
【０１６５】
各アッセイにおいて、標識したヌクレアーゼを含まない１．５ｍｌのチューブ内で、分析対象のｃＤＮＡ試料の数に応じて以下の成分を組み合わせる（表７）。
【０１６６】
【表７】
2020198884.tif 000020
【０１６７】
以下の例示的なＲＴ−ｑＰＣＲプライマー（表８）を用いてもよい。しかし、当業者は、例示的な本ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを実施するため、他の好適なプライマーを容易に設計することができる。
【０１６８】
【表８】
2020198884.tif 000021
【０１６９】
【表９】
2020198884.tif 000022
【０１７０】
チューブをキャップし、数回反転させて混合する。短時間遠心分離し、チューブの底部における反応混合物を収集する。下のプロトコルは、１６個遺伝子の発現レベルを２つの参照対照とともに測定する、患者４名からのｃＤＮＡ試料に対して実行したアッセイを例示する。しかし、アッセイは、１つ以上のｃＤＮＡ試料に対して実施することができ、１６個の遺伝子の２個以上の遺伝子の発現レベルを１つ以上の参照対照を用いて測定するように、当業者により容易に設計することができる。以下のように、各ｃＤＮＡ鋳型４μｌを標識した３８４ウェルプレートのウェルにピペッティングする。
ａ．参照ｃＤＮＡ（ＣＤＶ３およびＲＮＡ８５Ｓ５）ウェルＡ１〜Ｃ６
ｂ．ｃＤＮＡ試料＃１ウェルＤ１〜Ｆ６
ｃ．ｃＤＮＡ試料＃２ウェルＧ１〜Ｉ６
ｄ．ｃＤＮＡ試料＃３ウェルＪ１〜Ｌ６
ｅ．ｃＤＮＡ試料＃４ウェルＭ１〜Ｏ６
【０１７１】
ヌクレアーゼを含まない水４を各番号の鋳型対照ウェル（ウェルＰ１〜Ｐ１８）にピペッティングする。
【０１７２】
各TaqMan遺伝子発現アッセイ１６μｌを以下のウェルに添加する。
ａ．アッセイ１：ウェルＡ１〜Ａ３、Ｄ１〜Ｄ３、Ｇ１〜Ｇ３、Ｊ１〜Ｊ３、Ｍ１〜Ｍ３、Ｐ１
ｂ．アッセイ２：ウェルＡ４〜Ａ６、Ｄ４〜Ｄ６、Ｇ４〜Ｇ６、Ｊ４〜Ｊ６、Ｍ４〜Ｍ６、Ｐ２
ｃ．アッセイ３：ウェルＡ７〜Ａ９、Ｄ７〜Ｄ９、Ｇ７〜Ｇ９、Ｊ７〜Ｊ９、Ｍ７〜Ｍ９、Ｐ３
ｄ．アッセイ４：ウェルＡ１０〜Ａ１２、Ｄ１０〜Ｄ１２、Ｇ１０〜Ｇ１２、Ｊ１０〜Ｊ１２、Ｍ１０〜Ｍ１２、Ｐ４
ｅ．アッセイ５：ウェルＡ１３〜Ａ１５、Ｄ１３〜Ｄ１５、Ｇ１３〜Ｇ１５、Ｊ１３〜Ｊ１５、Ｍ１３〜Ｍ１５、Ｐ５
ｆ．アッセイ６：ウェルＡ１６〜Ａ１８、Ｄ１６〜Ｄ１８、Ｇ１６〜Ｇ１８、Ｊ１６〜Ｊ１８、Ｍ１６〜Ｍ１８、Ｐ６
ｇ．アッセイ７：ウェルＡ１９〜Ａ２１、Ｄ１９〜Ｄ２１、Ｇ１９〜Ｇ２１、Ｊ１９〜Ｊ２１、Ｍ１９〜Ｍ２１、Ｐ７
ｈ．アッセイ８：ウェルＡ２２〜Ａ２４、Ｄ２２〜Ｄ２４、Ｇ２２〜Ｇ２４、Ｊ２２〜Ｊ２４、Ｍ２２〜Ｍ２４、Ｐ８
ｉ．アッセイ９：ウェルＢ１〜Ｂ３、Ｅ１〜Ｅ３、Ｈ１〜Ｈ３、Ｋ１〜Ｋ３、Ｎ１〜Ｎ３、Ｐ９
ｊ．アッセイ１０：ウェルＢ４〜Ｂ６、Ｅ４〜Ｅ６、Ｈ４〜Ｈ６、Ｋ４〜Ｋ６、Ｎ４〜Ｎ６、Ｐ１０
ｋ．アッセイ１１：ウェルＢ７〜Ｂ９、Ｅ７〜Ｅ９、Ｈ７〜Ｈ９、Ｋ７〜Ｋ９、Ｎ７〜Ｎ９、Ｐ１１
ｌ．アッセイ１２：ウェルＢ１０〜Ｂ１２、Ｅ１０〜Ｅ１２、Ｈ１０〜Ｈ１２、Ｋ１０〜Ｋ１２、Ｎ１０〜Ｎ１２、Ｐ１２
ｍ．アッセイ１３：ウェルＢ１３〜Ｂ１５、Ｅ１３〜Ｅ１５、Ｈ１３〜Ｈ１５、Ｋ１３〜Ｋ１５、Ｎ１３〜Ｎ１５、Ｐ１３
ｎ．アッセイ１４：ウェルＢ１６〜Ｂ１８、Ｅ１６〜Ｅ１８、Ｈ１６〜Ｈ１８、Ｋ１６〜Ｋ１８、Ｎ１６〜Ｎ１８、Ｐ１４
ｏ．アッセイ１５：ウェルＢ１９〜Ｂ２１、Ｅ１９〜Ｅ２１、Ｈ１９〜Ｈ２１、Ｋ１９〜Ｋ２１、Ｎ１９〜Ｎ２１、Ｐ１５
ｐ．アッセイ１６：ウェルＢ２２〜Ｂ２４、Ｅ２２〜Ｅ２４、Ｈ２２〜Ｈ２４、Ｋ２２〜Ｋ２４、Ｎ２２〜Ｎ２４、Ｐ１６
ｑ．アッセイ１７：ウェルＣ１〜Ｃ３、Ｆ１〜Ｆ３、Ｉ１〜Ｉ３、Ｌ１〜Ｌ３、Ｏ１〜Ｏ３、Ｐ１７
ｒ．アッセイ１８：ウェルＣ４〜Ｃ６、Ｆ４〜Ｆ６、Ｉ４〜Ｉ６、Ｌ４〜Ｌ６、Ｏ４〜Ｏ６、Ｐ１８
【０１７３】
３８４ウェルプレートをシーリングホイル(カタログ番号04729757001、Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)で密封する。プレートを短時間遠心分離し、ウェルの内容物を混合し、プレートをサーマルサイクラー(Roche LightCycler480 II, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)に負荷する。Dual Color Hydrolysis Probe/UPL Probeに対して検出フォーマットを選択し、ｑＰＣＲプログラムを、以下に従って７０サイクル間で設定し、アッセイを実行する。
ａ．９５℃で１０分間
ｂ．９５℃で１０秒間
ｃ．６０℃で１分間
ｄ．４０℃で３０秒間
【０１７４】
参考文献
本明細書中に記載のすべての文書は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
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【図１】
2020198884.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月7日(2020.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法であって、前記個体から得られた全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより、前記個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを確認することを含み、ここで、前記個体が、高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する場合にはＩＢＤの進行が高リスクとされ、低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する場合にはＩＢＤの進行が低リスクとされ、前記２個以上の遺伝子が、
アレスチンドメイン含有４（ＡＲＲＤＣ４）；
グアニル酸結合タンパク質５（ＧＢＰ５）；
プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ  Ｇタンパク質共役、１４（Ｐ２ＲＹ１４）；
ヴォールトＲＮＡ１−１（ＶＴＲＮＡ１−１）；
インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１８ＲＡＰ）；
ハプトグロビン（ＨＰ）；
ｎｕｄｉｘ（ヌクレオシド二リン酸連結部分Ｘ）型モチーフ７（ＮＵＤＴ７）；
グランザイムＨ（ＧＺＭＨ）；
Ｔ細胞受容体γ定常２（ＴＲＧＣ２）；
レクチン、ガラクトシド結合様（ＬＧＡＬＳＬ）；
Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；
インターフェロン誘導タンパク質４４様（ＩＦＩ４４Ｌ）；
長い遺伝子間非タンパク質コードＲＮＡ１１３６（ＬＩＮＣ０１１３６）；
リンパ球抗原９６（ＬＹ９６）；
グランザイムＫ（ＧＺＭＫ）；および
Ｔ細胞受容体γ可変３（ＴＲＧＶ３）
からなる群から選択され、
ＩＢＤ１表現型が、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴としている、方法。
【請求項２】
前記２個以上の遺伝子の発現レベルが、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２個以上の遺伝子の発現レベルが、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記個体から得られた全血試料を準備すること；
（ｉｉ）前記全血試料からＲＮＡを抽出すること；
（ｉｉｉ）前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；および
（ｉｖ）前記２個以上の遺伝子の発現レベルを決定するため、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析を実施すること、
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記個体におけるＩＢＤの進行の前記リスクが、前記患者におけるリスクスコアを計算することにより決定され、前記リスクコアの計算が、
ａ）前記選択された遺伝子の前記測定された発現レベルを重み付けすること；
ｂ）前記リスクスコアを決定するために、ロジスティック回帰モデルを前記重み付けした発現レベルに適用すること、ここで、０．５未満のリスクスコアがＩＢＤの進行の低リスクを示し、かつ０．５超のリスクスコアがＩＢＤの進行の高リスクを示す、および
ｃ）前記決定の結果をまとめた報告を作成すること、
によって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法における使用のための炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行リスク評価システムであって、
ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現を測定するための１つまたは複数のツールと、ならびに
前記被験者の前記遺伝子発現データからＩＢＤの進行リスクスコアを計算するようにプログラムされたコンピュータと、を含む、システム。
【請求項７】
２個以上の遺伝子の前記発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により測定するための１つまたは複数のツールを含む、請求項６に記載の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行リスク評価システム。
【請求項８】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のために、ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである者として識別された個体を選択するその後のステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
個体におけるＩＢＤを治療するための方法で使用するための抗炎症薬または免疫抑制剤であって、
（ｉ）ＩＢＤの進行が高リスクまたは低リスクである個体を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法を用いて識別することと、
（ｉｉ）前記個体にＩＢＤに対する治療を、前記抗炎症薬または免疫抑制剤を投与することにより施すことと、
を含む、方法。
【請求項１０】
ＩＢＤの進行について高リスクまたは低リスクであると判定される個体におけるＩＢＤを治療するための方法で使用するための抗炎症薬または免疫抑制剤であって、
（ｉ）前記個体をＩＢＤ１（高リスクのＩＢＤの進行）またはＩＢＤ２（低リスクのＩＢＤの進行）として分類する試験結果をレビューすることと、
ここで、前記試験は、前記個体から得られる全血試料中の、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の発現レベルを測定し、
低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現が、前記個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有することを示し、かつ
高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の上方制御発現が、前記個体が低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有することを示す、
（ｉｉ）ＩＢＤにおけるＩＢＤ１またはＩＢＤ２表現型を有すると判定された前記個体を、前記抗炎症薬または免疫抑制剤により治療することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉ）が、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により２個以上の遺伝子の発現レベルを測定するための分析の結果を提供する試験を要求することを含む、請求項１０に記載の抗炎症薬または免疫抑制剤。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉ）が、前記個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有すると決定された場合に当該個体を前記免疫抑制剤により治療するか、または、前記個体が低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有すると決定された場合に当該個体を前記抗炎症薬により治療することを含む、請求項１０又は１１に記載の抗炎症薬または免疫抑制剤。
【請求項１３】
ステップ（ｉｉ）が、
ステップ（ｉ）において、ＩＢＤの進行が低リスクであるとして識別された個体にＩＢＤのための前記抗炎症薬による治療に施すか、
ステップ（ｉ）において、ＩＢＤの進行が高リスクであるとして識別された個体にＩＢＤのための前記免疫抑制剤による治療に施すこと、
を含む、請求項９に記載の抗炎症薬または免疫抑制剤。
【請求項１４】
前記抗炎症薬が抗炎症性ステロイドであり、又は前記免疫抑制剤がＴＮＦα阻害剤である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の抗炎症薬または免疫抑制剤。
【請求項１５】
個体が高リスクのＩＢＤ１表現型を有するかまたは低リスクのＩＢＤ２表現型を有するかを評価するためのキットであって、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される２個以上の遺伝子の全血試料中での発現レベルを確認するための試薬を含み、
ＩＢＤ１表現型が、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現を特徴としており、かつ
ＩＢＤ２表現型が、ＩＢＤ１表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの下方制御発現、ならびに、ＩＢＤ１表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およＴＲＧＶ３の上方制御発現を特徴としている、キット。
【請求項１６】
前記キットが、前記２個以上の遺伝子の発現レベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析、デジタルＰＣＲ、全トランスクリプトームショットガン配列決定、または直接多重遺伝子発現解析により確認するための試薬を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＩＢＤが、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病である、請求項１〜５及び８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＢＤが、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病である、請求項６又は７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記ＩＢＤが、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病である、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項２０】
炎症性腸疾患を示している患者の全血試料由来の患者が識別された、選択された遺伝子の発現産物のアレイ上で遺伝子発現産物を定量化する方法であって、
ａ）前記患者の全血試料からＲＮＡを準備することと；
ｂ）前記ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと；
ｃ）前記ｃＤＮＡの各一定分量を前記ｃＤＮＡの一定分量が患者試料ｃＤＮＡの一定分量として同定されるようにアレイ上に置くことと；
ｄ）ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される３個、４個、又はそれ以上、あるいは１６個の遺伝子の各遺伝子における前記ｃＤＮＡの各一定分量に対してＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または配列決定を実施し、ＲＴ−ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲまたは配列決定された産物を前記アレイ上に提供し、それにより前記３個、４個、又はそれ以上、あるいは１６個の遺伝子発現産物を含む、患者が識別された、選択された遺伝子の発現産物のアレイを提供することと；及び
ｅ）前記３個、４個、又はそれ以上、あるいは１６個の遺伝子の各選択された遺伝子についての遺伝子発現産物の量を、各選択された遺伝子についての対照との比較で定量するステップと、を含み、
ここで、各選択された遺伝子についての対照が、ＩＢＤの進行を有すると診断された患者群における前記遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルの中央値である、方法。
【請求項２１】
前記ＲＴ−ｑＰＣＲ産物が、前記ｃＤＮＡを前記３個、４個、又はそれ以上、あるいは１６個の遺伝子の各々に特異的なプライマーセットと接触させることにより提供され、前記プライマーセットが、任意選択的に、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
前記個体が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における前記対照よりも少ない場合にＩＢＤの進行が低リスクであるとして識別され；そして
前記個体が、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子発現産物の量が、前記遺伝子における前記対照よりも多い場合にＩＢＤの進行が低リスクであるとして識別される、
請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アレイ上の選択された各遺伝子発現産物について、
前記個体が、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫからなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における前記対照以上である場合にＩＢＤの進行が高リスクであるとして識別され；そして
前記個体が、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される遺伝子における遺伝子産物の量が、前記遺伝子における前記対照以下である場合にＩＢＤの進行が高リスクであるとして識別される、
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＩＢＤの進行を有すると診断された前記患者群が、
前記疾患の初期症状からの１２か月の期間にわたる平均０．５以上の再発(relapses)；
ＩＢＤ２群における患者との比較でのフォローアップの単位期間当たりのさらなる治療拡大；及び
ＩＢＤの維持段階中に投与される治療より、より高頻度もしくはより侵襲性である疾患の治療計画、
から成る群から選択される１又は複数の指標を経験した患者群である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
一態様では、本発明は、個体から得られる全血試料中の２個以上の遺伝子の発現レベルを測定することにより個体が高リスク（ＩＢＤ１）表現型を有するかまたは低リスク（ＩＢＤ２）表現型を有するかを確認することにより、個体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の進行が高リスクであるかまたは低リスクであるかを評価する方法に関し、ここで２個以上の遺伝子は、ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、ＧＺＭＫ、ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３からなる群から選択される。本発明の方法は、ＩＢＤ２表現型を有する個体における以下の遺伝子の発現のレベルとの比較での、遺伝子ＡＲＲＤＣ４、ＧＢＰ５、Ｐ２ＲＹ１４、ＶＴＲＮＡ１−１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＨＰ、ＮＵＤＴ７、ＧＺＭＨ、ＴＲＧＣ２、およびＧＺＭＫの上方制御発現、ならびに遺伝子ＬＧＡＬＳＬ、ＦＣＲＬ５、ＩＦＩ４４Ｌ、ＬＩＮＣ０１１３６、ＬＹ９６、およびＴＲＧＶ３の下方制御発現によるＩＢＤ１表現型の特徴づけをさらに含んでもよい。本発明の方法は、個体におけるＩＢＤの進行のリスクを、ａ）選択遺伝子の測定された発現レベルを重み付けすること；ｂ）リスクスコアを決定するために、ロジスティック回帰モデルを重み付けた発現レベルに適用することであって、０．５未満のリスクスコアはＩＢＤの進行が低リスクであることを示し、０．５超のリスクスコアはＩＢＤの進行が高リスクであることを示す、適用すること；およびｃ）その決定の結果をまとめた報告を作成することにより、患者におけるリスクスコアを計算することによって判定することをさらに含んでもよい。
【外国語明細書】
2020198884000001.pdf