(57)【要約】      （修正有）【課題】高血圧症、例えば肺動脈性肺高血圧症の処置のための方法および組成物の提供。【解決手段】GDF-15；TGFβ1；および／またはTGFβ3の阻害剤を対象に投与する段階を含む、方法。好ましくは、阻害剤が抗体試薬またはリガンドトラップである、方法。より好ましくは、リガンドトラップがTGFβ-1/3 GDF-15リガンドトラップである、方法。さらに好ましくは、リガンドトラップがTGFBRII-Fcである、方法。【選択図】図１０Ａ
2020125353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高血圧症または線維症の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、GDF-15；TGFβ1；および／またはTGFβ3の阻害剤を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
高血圧症が肺動脈性肺高血圧症 (PAH) である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) を有するか、または有すると診断された対象である、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
線維症が、
肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患
からなる群より選択される疾患または状態と関連した線維症である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、
肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患
からなる群より選択される疾患または状態を有するか、または有すると診断された対象である、請求項1または3記載の方法。
【請求項６】
阻害剤がTGFβ1を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
阻害剤がTGFβ3を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
阻害剤がTGFβ1およびTGFβ3を阻害する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
阻害剤がGDF15を阻害する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤がTGFβ1および／またはTGFβ3をさらに阻害する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤がGDF15に特異的である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤がTGFβ1に特異的である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
阻害剤がTGFβ3に特異的である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
阻害剤が抗体試薬またはリガンドトラップである、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
リガンドトラップがTGFβ-1/3 GDF-15リガンドトラップである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
リガンドトラップがTGFBRII-Fcである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、強皮症、またはPAHに付随する結合組織病 (APAH-CTD) を有する、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、対照と比べてGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇していると判定されている、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、PAHを有するが強皮症またはAPAH-CTDの症状を示していない対象におけるGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3の平均レベルと比べて、GDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇していると判定されている、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2014年8月1日に出願された米国仮特許出願第62/031,924号の恩典を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国立衛生研究所により付与された助成金第5 K08 HL079943 05号の下で、政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本明細書において記載される技術は、線維症および／または高血圧症、例えば肺動脈性肺高血圧症の処置に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
肺動脈性肺高血圧症を処置するためにTGF-βシグナル伝達阻害が試みられてきたが、既存の戦略（例えば、アクチビン／TGF-β I型キナーゼ受容体ALK4/ALK5/ALK7の阻害、または全TGFβリガンドの非選択的中和）は、出血性弁壊死、もしくは骨の石灰化および成熟の異常などの重篤な副作用、または皮膚の発疹および損傷、鼻出血、もしくは歯肉出血などの著しい副作用を誘発する。このシグナル伝達カスケードを調節するためのより特異的なアプローチは、高血圧症の有効でかつ安全な処置を可能にし得る。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書において記載されるように、本発明者らは、リガンドTGF-β1；TGF-β3、および／またはGDF15の集中的な阻害によるTGFβシグナル伝達の阻害が、アクチビン／TGF-βリガンドシグナル伝達受容体-リガンド相互作用の広範な阻害によって引き起こされる副作用を誘発することなく、肺動脈性肺高血圧症を処置し得ることを見出した。
【０００６】
1つの局面において、高血圧症または線維症の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法が本明細書において記載され、その方法は、GDF-15；TGFβ1；および／またはTGFβ3の阻害剤を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、高血圧症は肺動脈性肺高血圧症 (PAH) である。いくつかの態様において、対象は、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) を有するか、または有すると診断された対象である。いくつかの態様において、線維症は、肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患からなる群より選択される疾患または状態と関連した線維症である。いくつかの態様において、対象は、肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患からなる群より選択される疾患または状態を有するか、または有すると診断された対象である。
【０００７】
いくつかの態様において、阻害剤はTGFβ1を阻害する。いくつかの態様において、阻害剤はTGFβ3を阻害する。いくつかの態様において、阻害剤はTGFβ1およびTGFβ3を阻害する。いくつかの態様において、阻害剤はGDF15を阻害する。いくつかの態様において、阻害剤はTGFβ1および／またはTGFβ3をさらに阻害する。いくつかの態様において、阻害剤はGDF15に特異的である。いくつかの態様において、阻害剤はTGFβ1に特異的である。いくつかの態様において、阻害剤はTGFβ3に特異的である。
【０００８】
いくつかの態様において、阻害剤は抗体試薬またはリガンドトラップである。いくつかの態様において、リガンドトラップはTGFβ-1/3 GDF-15リガンドトラップである。いくつかの態様において、リガンドトラップはTGFBRII-Fcである。
【０００９】
いくつかの態様において、対象は、強皮症、またはPAHに付随する結合組織病 (APAH-CTD) を有する。いくつかの態様において、対象は、対照と比べてGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇していると判定されている。いくつかの態様において、対象は、PAHを有するが強皮症またはAPAH-CTDの症状を示していない対象におけるGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3の平均レベルと比べて、GDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇していると判定されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図1A〜1Hは、ラットにおけるモノクロタリン (MCT) 誘発性肺高血圧症が、PAI-1転写活性の上昇およびGDF15 mRNAレベルの上昇と関連していることを実証する。MCT (40 mg/kg SC) によるSprague Dawleyラットの処置後に、右室収縮期圧（RVSP、図1A）および右室肥大（RVH、図1B）の変化を様々な間隔で測定した。RVSPは右室カテーテル検査によって測定し、RVHは、左室および中隔（LV＋S）壁の合計に対する右室 (RV) 自由壁の重量比によって判定した（1時点につきn＝3）。MGT処置ラットの肺の定量的RT-PCRにより、PAI-1（図1C）およびTGFb1（図1D）転写活性の上昇によって反映される、TGF-βシグナル伝達の増加が明らかになった。ld1（図1E）およびBMPR2（図1F）mRNAレベルの低下により、BMPシグナル伝達活性の障害が示された。TGFb3の発現は、MGT処置ラットの肺において影響を受けないままであった（図1G）。GDF15レベルの上昇もまた、MGT処置ラットの肺において見出された。対照ラットと比較して*p＜0.05および**p＜0.01（図1H）。
【図１Ｂ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図１Ｃ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図１Ｄ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図１Ｅ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図１Ｆ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図１Ｇ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図１Ｈ】詳細は図1Aに記載の通り。
【図２】図2A〜2Dは、MGT処置ラットにおけるTGF-βおよびBMPシグナル伝達活性の変化と疾患重症度の変化との相関関係を実証する。PAI-1（図2A）のレベルの上昇は、RVSPに基づくPHの程度と直接相関した。対照的に、転写標的ld1（図2B）およびBmpr2（図2C）の発現の減少が認められ、そのレベルはいずれもRVSPと逆相関した。TGFb1の発現と実験的PAHの表現型との間に相関はない（図2D）。
【図３Ａ】図3A〜3Eは、インビトロにおいて、TGFBRII-FcがTGFβ1およびTGFβ3に対する選択リガンドトラップであるが、TGFβ2に対する選択的リガンドトラップではないことを実証する。TGFb1、2、および3は、ヒト肺動脈平滑筋細胞（PASMC、図3A）においてシグナル伝達を誘発し、ヒト肺微小血管内皮細胞（PMVEC、図3B）では実質的により低い程度にシグナル伝達を誘発した。培養した血管細胞から血清を取り除き、様々な濃度のBMP4、BMP9、TGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3と共に30分間インキュベートした。ウェスタンブロット（図3C）およびqPCR（図3D〜3E）を実施して、TGFBRII-Fcがインビトロでシグナル伝達活性に及ぼす影響を判定した。
【図３Ｂ】詳細は図3Aに記載の通り。
【図３Ｃ】詳細は図3Aに記載の通り。
【図３Ｄ】詳細は図3Aに記載の通り。
【図３Ｅ】詳細は図3Aに記載の通り。
【図４−１】図4A〜4Mは、TGFBRII-Fcが右室収縮期圧 (RVSP)、右室肥大、および血管リモデリングを軽減することを実証する。様々な用量のTGFBRII-Fc（15 mg/kg、1週間に2回）を伴うまたは伴わないMCTによる処置の3週間後に、ラットをペントバルビタールによる麻酔下でのカテーテル検査および気管内挿管によって盲検様式で解析して、RVSP（図4A）を判定し、安楽死させた。Fulton比（RV/(LV＋S)、図4B）の測定に基づき、RVHの程度を盲検様式で評価した。値は平均値±SEMとして表してある、n＝6〜8、対照ラットと比較して**p＜0.01および***p＜0.001。tgfb1（図4C）、pai1（図4D）、il6（図4E）、il1b（図4L）、およびicam（図4L）のmRNAレベルを決定した。値は平均値±SEMとして表してある、n＝3〜5、対照と比較して*p＜0.05および**p＜0.01。遠位細葉内血管（直径10〜50 (.lm）の筋性化 (muscularization) を定量し、非筋性の、部分的に筋性化した、および完全に（周囲に）筋性化した血管の割合を算出した（図4F）。TGFBRII-Fc処置（15 mg/kg、1週間に2回）は、完全に筋性化した血管の割合を有意に減少させ、かつ中膜肥厚 (medial wall thickness) 指数の減少傾向を引き起こした。値は平均値±SEMとして表してある、それぞれ6〜8匹のラットによる1処置群につきn＝89〜127本の血管、表示通りのp値。PHの確立後のTGFBRII-Fcによる処置は、PHおよび死亡率の部分的救済と関連している。MCT (40 mg/kg SC) による処置後、PHの確立後の17日目に開始する遅延様式で、ラットをTGFBRII-Fc（15 mg/kg、1週間に3回）で処置した。カプラン・マイヤー解析（図4G）により、媒体で処置したラットと比較して、TGFBRII-Fc処置群における生存率の改善が明らかになった（1群につきn＝18）。35日目における生存動物の中で、TGFBRII-Fcで処置した動物の間にRVSPの有意な低下があったが（図4H）、RVHの有意な差異はなかった 図4I）。示した値は平均値±SEMである、1群につきn＝8〜11、対照と比較して**p＜0.01。TGFBRII-Fc処置は、確立された表現型を有するラットにおいて肺血管リモデリングを軽減した（図4J）。TGFBRII-Fcは、完全に筋性化した血管（直径10〜50μm）の割合、および（外径−内径）／外径×100として算出される中膜肥厚を減少させた。それぞれ6〜8匹のラットによる1処置群につきn＝89〜127本の血管（図4J〜4K）。
【図４−２】詳細は図4-1に記載の通り。
【図４−３】詳細は図4-1に記載の通り。
【図４−４】詳細は図4-1に記載の通り。
【図５】図5A〜5Bは、PAHのマウスモデルにおけるTGFBRII-Fcの有効性を実証する。マウスをVEGFR遮断薬 (SUGEN) で処置し、3週間にわたり低酸素に曝露した。TGFBRII-Fc処置（15 mg/kg、1週間に3回）は、RVSPを低下させ（図5A）、かつ右室肥大を防いだ（図5B）。
【図６】図6A〜6Bは、トランスジェニックマウスを用いて、GDF15の病原的役割を確認することができることを実証する。GDF15ノックアウトマウスは、SUGEN／低酸素誘発性のPAHから保護される。表示の通り**p＜0.01および***p＜0.001。
【図７Ａ】図7A〜7Bは、肺血管平滑筋細胞におけるデータと一致して、GDF15がインビトロでヒト大動脈平滑筋細胞 (HASMC) において強力なTGFbシグナル伝達を誘導したことを実証する。陽性対照として、BMP4、TGFb1、およびTGFb2を使用した。
【図７Ｂ】詳細は図7Aに記載の通り。
【図８Ａ】図8A〜8Bは、HASMCにおいて、TGFb1およびTGFb3シグナル伝達を遮断する際のTGFBRII-Fcの選択性が確認されることを実証する。示されている通り*p＜0.05および**p＜0.01。
【図８Ｂ】詳細は図8Aに記載の通り。
【図９】微小血管内皮細胞 (HPMVEC) におけるデータと一致して、外因性のGDF15が、ヒト肺動脈内皮細胞 (HPAEC) においてTGFbシグナル伝達を誘導することができなかったことを実証する。
【図１０Ａ】図10A〜10Eは、低用量のTGFBRII-Fc（5 mg/kg、1週間に2回）が、MCT処置ラットにおいてRVSP（図10A）および右室肥大（図10B）を低減したことを実証する。注目すべきことに、低用量のTGFBRII-Fc処置は、MCTラットにおいて肺血管リモデリングを有意に防いだ（図10C〜10E）。
【図１０Ｂ】詳細は図10Aに記載の通り。
【図１０Ｃ】詳細は図10Aに記載の通り。
【図１０Ｄ】詳細は図10Aに記載の通り。
【図１０Ｅ】詳細は図10Aに記載の通り。
【図１１】MCTおよびTGFβRII-Fcによる処置後の、非筋性、部分的に筋性、または完全に筋性であった血管の割合のグラフを示す。
【図１２】MCTおよびTGFβRII-Fcによる処置後の、bmpr2、id1、tgfb2、tgfb3、il6、およびgdf15のmRNA発現のグラフを示す。
【図１３】図13A〜13Dは、TGFBRII-FcがTGFβ1誘導性およびTGFβ3誘導性シグナル伝達を選択的に阻害することを実証する。CAGA-Lucレポーター導入遺伝子を発現するHEK293細胞（図11A）およびBRE-Lucレポーター導入遺伝子を発現するC2C12細胞（図11B）を、TGFBRII-Fc (2000 ng/ml) と共に30分間インキュベートしてから、BMPまたはTGFβに一晩曝露した。ヒト肺動脈平滑筋細胞（HPASMC、c〜d）から血清を取り除いて一晩置き、TGFBRII-Fc (2000 ng/ml) で前処理し、その後BMP4 (10 ng/ml)、TGFβ1 (1 ng/ml)、TGFβ2 (1 ng/ml)、またはTGFβ3 (1 ng/ml) と共に30分間インキュベートし、Smads 1、2、および3のリン酸化に関する免疫ブロット（図11C）、ならびにTGFβ転写標的（PAI-1、図11D）により解析した。TGFBRII-Fcは、TGF-β1およびTGF-β3を介するシグナル伝達を阻害したが、TGFβ2を介するシグナル伝達は阻害しなかった。（示されている通り*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001）。
【図１４】TGFBRII-Fcが、TGFβ誘導性のSMC可塑性転換を妨げたことを実証する。HPASMCから血清を取り除いて一晩置き、次いでTGFBRII-Fc (2000 ng/ml) を伴うかまたは伴わずにTGFβ1 (1 ng/ml) に24時間曝露した。SMC収縮マーカーのmRNAレベルを調べた。データは平均値±SEMである、示されている通り*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。
【図１５】図15A〜15Eは、PAHの確立後のTGFBRII-Fcによる処置が、PAHおよび死亡率の部分的救済と関連していることを実証する。MCT処置後に、PAHの確立後の17日目に開始する遅延様式で、ラットにTGFBRII-Fc（15 mg/kg、1週間に3回）を投与した。TGFBRII-Fcによる遅延処置は、MCT処置ラットの肺組織において、TGFβ1、PAI-1、IL-6、IL1b、およびICAM-1の発現を減少させた、n＝3〜5（図15A〜15E）。
【図１６】図16A〜16Bは、PAHのマウスモデルにおけるTGFBRII-Fcの有効性を実証する。成体雄マウスをSUGENで処置し、3週間にわたり低酸素に曝露した。TGFBRII-Fc処置は、SUGEN-低酸素処置マウスの肺において、PAI-1 mRNAレベルの上方制御を妨げ（図16A）、TGFβ1 mRNAレベルの低減傾向を示した（図16B）（n＝6〜8）。スケールバー＝50μm。
【図１７】図17A〜17Bは、TGFBRII-Fcによる長期的処置が、硬化性リモデリングの証拠も変性性リモデリングの証拠もなく、僧帽弁構造の形態変化と関連していなかったことを実証する。媒体処置ラットおよびTGFBRII-Fc処置ラットにおける僧帽弁の組織学的検査、スケールバー＝500μm（図17A）。媒体処置ラットおよびTGFBRII-Fc処置ラットにおける、正常な僧帽弁逆流を示す心エコー図からの代表的な出力記録（図17B）。
【図１８】媒体処置またはTGFBRII-Fc処置を受ける対照ラットおよびMCTラットの体重を実証する。MCT（40 mg/kg SC ×1）で処置した成体雄SDラットに、TGFBRII-Fc（15 mg/kg IP、1週間に2回）または媒体を3週間にわたり投与した。TGFBRII-Fc処置は、ラットの体重に影響を及ぼさなかった。
【図１９】遅延TGFBRII-Fc処置を受けたMCTラットの体重を実証する。成体雄SDラットをMCT（40 mg/kg SC ×1）で処置し、18日間観察した後に、TGFBRII-Fc処置（15 mg/kg IP、1週間に3回）を行った。35日目に血行動態およびリモデリングを調べた。TGFBRII-Fc処置は、ラットの体重に影響を及ぼさなかった。
【図２０】図20A〜20Bは、成体雄C57 BL6/Jマウスを無作為に分け、3週間にわたり酸素正常状態、低酸素、またはSUGEN＋低酸素に供した実験を示す。RVSP (a) および右室肥大 (b) を測定し、酸素正常状態マウスと比較した（n＝5〜8、対照と比較して*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
本明細書において記載されるように、本発明者らは、組換えリガンドトラップ、TGFBRII-FcによるTGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15の阻害が、TGF-βシグナル伝達を減少させ、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) を改善することを発見した。受容体のリガンドを標的にするこのアプローチは、すべてのアクチビンおよびTGF-β受容体（すなわち、ALK4、ALK5、およびALK7）ならびに／または受容体のリガンドのすべてを標的にするよりも、受ける副作用および毒性が少ない。
【００１２】
1つの局面において、高血圧症または線維症の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法が本明細書において記載され、その方法は、GDF-15；TGFβ1；および／またはTGFβ3の阻害剤を対象に投与する段階を含む。
【００１３】
本明細書で用いられる場合、「HTN」または「高血圧」または「動脈性高血圧症」とも称される「高血圧症」とは、動脈の血圧が上昇している医学的状態を指す。これは、血管を通して血液を循環させるために、心臓を通常よりも激しく動かすことを必要とする。血圧は、拍動の間に心筋が収縮している（収縮期）かまたは弛緩している（拡張期）かに依拠し、それぞれ最高血圧および最低血圧に等しい2つの測定値、収縮期血圧および拡張期血圧によって要約される。安静時の正常血圧は、100〜140 mmHg収縮期血圧（上読み取り値）および60〜90 mmHg拡張期血圧（下読み取り値）の範囲内にある。それが持続的に140/90 mmHg以上である場合に、高血圧が存在すると言われる。高血圧症は、脳卒中、心筋梗塞（心臓発作）、心不全または慢性心不全 (CHF)、動脈の動脈瘤（例えば、大動脈瘤）、末梢動脈疾患の主要な危険因子であり、慢性腎疾患の原因である。動脈血圧の中等度の上昇でさえ、寿命の短縮と関連している。食事および生活様式の変更は、血圧調節を改善し、付随する健康合併症のリスクを減らすことができるが、生活様式の変更が無効であるかまたは不十分であることが判明している人々においては、薬物療法が必要である場合が多い。いくつかの態様において、高血圧症は肺動脈性肺高血圧症 (PAH) である。いくつかの態様において、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) を有するか、または有すると診断された対象である。1つの局面において、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法が本明細書において記載され、その方法は、TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15の阻害剤を対象に投与する段階を含む。本明細書で用いられる場合、「肺動脈性肺高血圧症」または「PAH」とは、肺動脈が異常に収縮している、肺高血圧症（例えば、肺の血管系における高血圧）の1つの型を指す。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「線維症」とは、器官または組織の正常な構成要素としてではなく、修復または反応過程としての線維組織の形成を指す。線維症は、いずれか特定の組織における正常な沈着を上回る線維芽細胞蓄積およびコラーゲン沈着を特徴とする。線維症は、炎症、刺激、または治癒の結果として起こり得る。いくつかの態様において、線維症は、肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患からなる群より選択される疾患または状態と関連した線維症である。いくつかの態様において、対象は、肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患からなる群より選択される疾患または状態を有するか、または有すると診断された対象である。
【００１５】
本明細書において記載される方法および組成物は、TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15の阻害剤に関する。本明細書で用いられる場合、「GDF-15」とは、トランスフォーミング増殖因子-βスーパーファミリーの増殖因子のメンバーである増殖分化因子15 (NCBI Gene ID No: 9518) を指す。GDF15は、TGFBRIIを含むTGFβスーパーファミリーI型受容体と結合することが知られている。GDF-15の配列は、いくつかの種、例えばヒトGDF-15（ポリペプチド配列：SEQ ID NO: 1、NCBI Ref Seq: NP_004855）に関して、当技術分野で公知である。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、「TGFβ1」とは、トランスフォーミング増殖因子-βスーパーファミリーの増殖因子のメンバーであるトランスフォーミング増殖因子β1 (NCBI Gene ID No: 7040) を指す。TGFβ1は、TGFBRIIを含むTGFβスーパーファミリーI型受容体と結合することが知られている。TGFβ1の配列は、いくつかの種、例えばヒトTGFβ1（ポリペプチド配列：SEQ ID NO: 2, NCBI Ref Seq: NP_000651）に関して、当技術分野で公知である。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、「TGFβ3」とは、トランスフォーミング増殖因子-βスーパーファミリーの増殖因子のメンバーであるトランスフォーミング増殖因子β3 (NCBI Gene ID No: 7043) を指す。TGFβ3は、TGFBRIIを含むTGFβスーパーファミリーI型受容体と結合することが知られている。TGFβ3の配列は、いくつかの種、例えばヒトTGFβ3（ポリペプチド配列：SEQ ID NO: 3, NCBI Ref Seq: NP_003032）に関して、当技術分野で公知である。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、「阻害剤」とは、標的とされる発現産物（例えば、標的をコードするmRNAまたは標的ポリペプチド）の発現および／または活性を、例えば少なくとも10％またはそれ以上、例えば10％もしくはそれ以上、50％もしくはそれ以上、70％もしくはそれ以上、80％もしくはそれ以上、90％もしくはそれ以上、95％もしくはそれ以上、または98％もしくはそれ以上、減少させ得る薬剤を指す。例えばTGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15の阻害剤の有効性、例えばTGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15のレベルおよび／または活性を低下させるその能力は、例えばTGFβ1、TGFβ3、および／もしくはGDF15の発現産物のレベル、ならびに／またはTGFβ1、TGFβ3、および／もしくはGDF15の活性を測定することによって決定することができる。所与のmRNAおよび／またはポリペプチドのレベルを測定する方法は当業者に公知であり、例えば、プライマーと共に定量的RT-PCRを用いてRNAのレベルを決定することができ、抗体（例えば抗TGFβ1抗体および／または抗TGFβ3抗体、例えばモノクローナル抗体1D11）と共にウェスタンブロッティングを用いてポリペプチドのレベルを決定することができる。TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15の活性は、当技術分野で公知であり、本明細書の他所に記載される方法を用いて、例えばTGFBRIIに結合しているTGFβ1、TGFβ3、および／もしくはGDF15のレベルを測定するか、または例えばPAI1 mRNAのレベルを検出することにより決定することができ、この場合、そのようなmRNAのレベルの低下は、TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15活性のレベルの低下を示す。いくつかの態様において、阻害剤は、阻害核酸；アプタマー；抗体試薬；抗体；または小分子であってよい。
【００１９】
いくつかの態様において、阻害剤は抗体試薬であってよい。いくつかの態様において、阻害剤はリガンドトラップであってよい。本明細書で用いられる場合、「リガンドトラップ」とは、標的分子（例えば、TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15）と結合するタンパク質の少なくとも一部を含む、操作されたポリペプチドを指す。標的分子と結合するタンパク質の一部は、例えば、受容体の細胞外ドメイン、受容体の可溶型、受容体の結合ドメイン等であってよい。いくつかの態様において、リガンドトラップは、Ig定常ドメイン、例えばIgG定常ドメイン（例えば、IgG1）および／またはヒトIg定常ドメインを含む第2ドメインをさらに含み得る。第2ドメインは、例えばリガンドトラップの半減期を改善し得る。いくつかの態様において、リガンドトラップは、TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15リガンドトラップであってよい。いくつかの態様において、リガンドトラップは、GDF-15ならびにTGFβ1および／またはTGFβ3リガンドトラップであってよい。いくつかの態様において、リガンドトラップはTGFβ-1/3 GDF-15リガンドトラップであってよく、例えばそれは全3つのリガンドに結合し得る。いくつかの態様において、リガンドトラップはTGFBRII-Fcであってよい。本明細書で用いられる場合、「TGFBRII-Fc」とは、TGFBRIIの細胞外ドメインおよび／またはTGFBRIIの可溶性デコイ受容体を含むリガンドトラップを指す。いくつかの態様において、TGFBRII-Fcは商業的に購入することができる（例えば、Cat No. 341-BR、1003-RT、1600-R2、または532-R2；R&D Systems；Minneapolis, MN）。TGFBRII-Fcはまた、Acceleron (Cambridge, MA) から入手することもできる。いくつかの態様において、TGFBRII-Fcは、SEQ ID NO: 4のアミノ酸23〜159、23〜184、24〜159、24〜184、23〜176、24〜176、73〜159、73〜184、73〜176を含み得る。
【００２０】
いくつかの態様において、阻害剤はGDF-15に特異的である。いくつかの態様において、阻害剤は半選択的であり、例えばそれは付加的なTGFBR1リガンドに対して阻害効果を有するが、すべてのTGFβリガンドに対して阻害効果を有するわけではない。いくつかの態様において、阻害剤は、GDF-15に加えてTGFβ1（例えば、NCBI Gene ID: 7040）および／またはTGFβ3（例えば、NCBI Gene ID: 7043）を阻害し得る。
【００２１】
TGF-β1/3、GDF-15リガンドトラップであるTGFBRII-Fcを用いるGDF-15の拮抗作用が、2つの動物モデルにおいて肺動脈性肺高血圧症 (PAH) を改善することが、本明細書において実証される。GDF-15を欠いているノックアウトマウスは、肺動脈性肺高血圧症の発症から比較的保護される。PAHの治療法としてのTGF-βシグナル伝達を阻害するための以前のアプローチは、TGFβ I型受容体キナーゼALK5を阻害することにより、または汎 (pan) TGF-β抗体を用いて全TGF-βリガンドを中和することにより、全TGF-βリガンドを阻害する戦略を使用した。動物モデルでは有効であったものの、これらの戦略は、出血性弁壊死、ならびにこれらのTGF-βリガンドのうちのいくつかの構成的機能に起因する骨の石灰化および成熟の異常を含む様々な毒性により制限されてきた。
【００２２】
本明細書において記載されるように、TGFBRII-Fcを用いるTGF-βリガンド1および3の半選択的阻害は、なお有効であり、かつ良好に許容される。TGFβ1、TGFβ3、および／またはGDF15は、本明細書において、この治療法の潜在的に重要な標的であると同定される。さらに、本明細書は、GDF-15の遺伝子破壊がPAHを有意に軽減すること、およびGDF-15に対する有効な中和抗体がPAHを軽減することを示した。
【００２３】
GDF-15に特異的なヒト化またはヒト由来モノクローナル抗体を、様々な型の肺動脈性肺高血圧症を有する患者に定期的に投与することが可能である。PAHの特定の病因、すなわち強皮症、または結合組織病に伴うPAH (APAH-CTD) を有するある特定の患者は、特により高レベルのGDF-15を有することが公知であり、中和抗体を用いる処置からよりも多くの恩恵を受ける。
【００２４】
様々な態様において、本発明は、患者に投与された場合にGDF-15を阻害する抗体、ペプチド、および核酸、ならびにそれらを使用する方法を提供する。そのようなGDF-15阻害は、患者における状態を処置する目的で患者において行われ得る。状態は肺動脈性肺高血圧症であってよいが、これに限定されない。
【００２５】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、GDF-15阻害剤を用いて、高血圧症（例えば、PAH）を有するかまたは有すると診断された対象を処置することに関する。高血圧症を有する対象は、高血圧症を診断する現行方法を用いて医師により同定され得る。これらの状態を特徴づけ、かつ診断に役立つ高血圧症の症状および／または合併症は、当技術分野で周知であり、これには頭痛、回転性めまい (verigo)、耳鳴、浮動性めまい、または失神が含まれるが、これらに限定されない。例えば高血圧症の診断に役立ち得る検査には血圧測定が含まれるが、これに限定されない。高血圧症の家族歴もまた、対象が高血圧症を有する可能性が高いかどうかを判定するのに、または高血圧症の診断を下すのに役立ち得る。
【００２６】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法に従って処置される対象は、強皮症、またはPAHに付随する結合組織病 (APAH-CTD) を有する、および／または有すると診断された対象であってよい。
【００２７】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法に従って処置される対象は、対照と比べてGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇している、および／または上昇していると判定された対象であってよい。いくつかの態様において、GDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルの上昇は、循環GDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルの上昇であってよい。いくつかの態様において、対照は、健常対象および／または健常対象の集団のGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルであってよい。いくつかの態様において、対照は、PAHを有するが強皮症またはAPAH-CTDの症状を示していない対象および／または対象の集団におけるGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルであってよい。
【００２８】
本明細書において記載される組成物および方法は、高血圧症、例えばPAHを有するかまたは有すると診断された対象に施すことができる。いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、高血圧症、例えばPAHの症状を軽減するために、本明細書において記載される組成物、例えばGDF-15阻害剤の有効量を対象に投与する段階を含む。本明細書で用いられる場合、「高血圧症の症状を軽減すること」とは、高血圧症に伴う任意の状態または症状を改善することである。同等の未処置対照と比較して、そのような低減は、任意の標準的な技法により測定して、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％、またはそれ以上である。本明細書において記載される組成物を対象に投与するための種々の手段が、当業者に公知である。そのような方法には、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経肺、皮膚、局所、または注射投与が含まれ得るが、これらに限定されない。投与は局所的または全身的であってよい。
【００２９】
本明細書で用いられる「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要とされるGDF-15阻害剤の量を指し、所望の効果を提供するための薬理学的組成物の十分量に関する。「治療有効量」という用語はしたがって、典型的な対象に投与された場合に、特定の降圧作用を提供するのに十分であるGDF-15阻害剤の量を指す。様々な文脈において本明細書で用いられる有効量には、疾患の症状の発症を遅延させるため、疾患の症状の経過を変更する（例えば、これに限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）ため、または疾患の症状を逆行させるために十分な量もまた含まれる。したがって、正確な「有効量」を明記することは一般的に実用的ではない。しかしながら、任意の所与の症例に関して、適切な「有効量」は、単なるルーチンの実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００３０】
有効量、毒性、および治療有効性は、例えばLD50（集団の50％に対して致死的な用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定することができる。投与量は、用いられる剤形および使用される投与経路に応じて変動し得る。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、用量は、細胞培養物または適切な動物モデルにおいて決定されたIC50（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する、GDF-15阻害剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて設定することもできる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えばとりわけ血圧に関するアッセイによってモニターすることができる。投与量は医師により決定することができ、必要に応じて、観察される処置の効果を適合させるように調整することができる。
【００３１】
いくつかの態様において、本明細書において記載される技術は、本明細書において記載されるGDF-15阻害剤、および任意に薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。いくつかの態様において、薬学的組成物の有効成分は、本明細書において記載されるGDF-15阻害剤を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物の有効成分は、本質的に、本明細書において記載されるGDF-15阻害剤からなる。いくつかの態様において、薬学的組成物の有効成分は、本明細書において記載されるGDF-15阻害剤からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒、および／または分散媒が含まれる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野で周知である。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの非限定的な例には、(1) 糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなど；(2) デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；(3) セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロースなど；(4) 粉末トラガカントゴム；(5) 麦芽；(6) ゼラチン；(7) 潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなど；(8) 賦形剤、例えばカカオ脂および坐剤ろうなど；(9) 油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油など；(10) グリコール、例えばプロピレングリコールなど；(11) ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール (PEG) など；(12) エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；(13) 寒天；(14) 緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；(15) アルギン酸；(16) 発熱物質不含水；(17) 等張生理食塩水；(18) リンゲル液；(19) エチルアルコール；(20) pH緩衝溶液；(21) ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物；(22) 増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸など；(23) 血清成分、例えば、血清アルブミン、HDL、およびLDLなど；(22) C2〜C12アルコール、例えばエタノールなど；ならびに (23) 薬学的製剤において使用されるその他の非毒性適合性物質が含まれる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、香料剤、保存剤、および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等などの用語は、本明細書において互換的に用いられる。いくつかの態様において、担体は、活性薬剤、例えば本明細書において記載されるGDF-15阻害剤の分解を阻害する。
【００３２】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるGDF-15阻害剤を含む薬学的組成物は、非経口剤形であってよい。非経口剤形の投与は典型的に、混入物に対する患者の自然防御を回避するため、非経口剤形は、無菌であるか、または患者に投与する前に滅菌可能であることが好ましい。非経口剤形の例には、いつでも注射できる状態にある溶液、注射のために薬学的に許容される媒体中にいつでも溶解または懸濁できる状態にある乾燥製品、いつでも注射できる状態にある懸濁液、および乳濁液が含まれるが、これらに限定されない。加えて、DUROS（登録商標）型剤形および過量放出 (dose-dumping) を含むが、これらに限定されない、制御放出性非経口剤形を、患者への投与のために調製することもできる。
【００３３】
本明細書において記載されるGDF-15阻害剤の非経口剤形を提供するために使用され得る適切な媒体は、当業者に周知である。その例には、非限定的に、滅菌水；注射用水USP；生理食塩水溶液；グルコース溶液；水性媒体、例えば、これらに限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸リンゲル注射液など；水混和性媒体、例えば、これらに限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなど；ならびに非水性媒体、例えば、これらに限定されないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなど、が含まれる。本明細書において開示される阻害剤の薬学的に許容される塩の溶解度を変更または改変する化合物を、従来の非経口剤形および制御放出性非経口剤形を含む、本開示の非経口剤形中に組み込むこともできる。
【００３４】
GDF-15阻害剤を含む薬学的組成物はまた、経口投与に適するように、例えば、これらに限定されないが、錠剤（非限定的に分割錠およびコーティング錠を含む）、丸剤、カプレット剤、カプセル剤、チュアブル錠、粉末小包、カシェ剤、トローチ剤、ウエハー剤、エアロゾルスプレーなどの個別剤形、またはこれらに限定されないが、シロップ剤、エリキシル剤、水性液体、非水性液体、水中油型乳剤、もしくは油中水型乳濁液中の溶液もしくは懸濁液などの液体として、製剤化することもできる。そのような組成物は、開示される化合物の薬学的に許容される塩の所定量を含み、当業者に周知である薬学の方法によって調製することができる。一般的に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005) を参照されたい。
【００３５】
従来の剤形は一般に、製剤からの迅速なまたは即時の薬物放出を提供する。薬物の薬理学および薬物動態学に応じて、従来の剤形の使用により、患者の血液および他の組織中の薬物の濃度は大幅に変動し得る。これらの変動は、投与頻度、作用の発現、有効性の持続期間、治療域の血中レベルの維持、毒性、副作用等のいくつかのパラメータに影響を及ぼし得る。有利なことには、制御放出製剤を用いて、薬物の作用の発現、作用の持続期間、治療域内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、制御放出性または持続放出性の剤形または製剤を用いて、薬物の過少投与（すなわち、最低治療レベルを下回る）および薬物の毒性レベルの超過の両方によって生じ得る、潜在的な有害作用および安全上の問題を最小限にすると同時に、薬物の最大有効性が達成されることを確実にすることができる。いくつかの態様では、GDF-15阻害剤を徐放製剤中に含めて投与することができる。
【００３６】
制御放出性の薬学的製品は、その非制御放出性の対応物によって達成されるものと比べて薬物療法を改善するという共通の目的を有する。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出調製物の使用は、最小限の薬物物質を用いて最小限の期間で状態を治癒させるかまたは制御することを特徴とする。制御放出製剤の利点には、1) 薬物の活性延長; 2) 投薬頻度の低減; 3) 患者のコンプライアンス増大; 4) 合計薬物の使用減少; 5) 局所または全身副作用の低減; 6) 薬物蓄積の最小化; 7) 血中レベルの変動低減; 8) 処置の有効性の改善; 9) 薬物活性の増強または消失の低減; および10) 疾患または状態の制御速度の改善が含まれる。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
【００３７】
大部分の制御放出製剤は、所望の治療効果を即座に生じる量の薬物（有効成分）を初めに放出し、そして次第にかつ持続的に、治療効果または予防効果のこのレベルを長期間にわたって維持するための他の量の薬物を放出するように設計される。体内で薬物のこの一定レベルを維持するために、薬物は、代謝されて体内から排出される薬物の量を置き換える速度で、剤形から放出されなければならない。有効成分の制御放出は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理学的条件、または化合物を含むがこれらに限定されない、様々な条件によって刺激され得る。
【００３８】
種々の公知の制御放出性または持続放出性の剤形、製剤、および装置が、本開示の塩および組成物と共に使用するために適合化され得る。その例には、米国特許第3,845,770号；第3,916,899号；第3,536,809号；第3,598,123号；第4,008,719号；第5674,533号；第5,059,595号；第5,591,767号；第5,120,548号；第5,073,543号；第5,639,476号；第5,354,556号；第5,733,566号；および第6,365,185 B1号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない；これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。これらの剤形を使用して、所望の放出特性を様々な比率で提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム（OROS（登録商標）（Alza Corporation、Mountain View, Calif. USA）など）、またはそれらの組み合わせを用いて、1つまたは複数の有効成分の遅延放出または制御放出を提供することができる。
【００３９】
本明細書において記載される方法は、例えば併用療法の一部として、第2の薬剤および／または処置を対象に施す段階をさらに含み得る。第2の薬剤および／または処置の非限定的な例には、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ジルチアゼム、およびジヒドロピリジン）、アンジオテンシン変換酵素阻害薬 (ACE-I)（例えば、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、およびベナゼプリル）、ARB（カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタン）、チアジド系利尿薬、β遮断薬（例えば、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、ネビボロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、およびチモロール）、およびα遮断薬（例えば、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンザミン、プラゾシン、テラゾシン、およびトラゾリン）が含まれ得る。
【００４０】
ある特定の態様においては、本明細書において記載されるGDF-15阻害剤を含む組成物の有効用量を、患者に1回投与することができる。ある特定の態様においては、GDF-15阻害剤を含む組成物の有効用量を、患者に繰り返し投与することができる。全身投与の場合、例えば0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、またはそれ以上のような、GDF-15阻害剤を含む組成物の治療量を、患者に投与することができる。
【００４１】
いくつかの態様においては、最初の処置計画の後、処置をより低頻度で施すことができる。例えば、2週間に1回の処置を3ヶ月間行った後、1ヶ月に1回の処置を、例えば6ヶ月間もしくは1年間またはそれ以上にわたって繰り返すことができる。本明細書において記載される方法による処置は、状態のマーカーまたは症状のレベル、例えば血圧を、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはそれ以上低下させ得る。
【００４２】
本明細書において記載される組成物の投与量は、医師により決定することができ、必要に応じて、観察される処置の効果を適合させるように調整することができる。処置の持続期間および頻度に関して、処置が治療効果をもたらしている時点を判定するため、および投与量を増やすかもしくは減らすか、投与頻度を増やすかもしくは減らすか、処置を中止するかどうか、処置を再開するかどうか、または処置計画に対して他の変更を行うかどうかを判定するために、対象をモニターすることは、熟練の臨床医にとって典型的なことである。投薬スケジュールは、有効成分に対する対象の感受性などのいくつかの臨床学的因子に応じて、1週間に1回から1日に1回まで変動し得る。活性化の所望の用量または量は、1回で投与するか、または分割用量 (subdose)、例えば2つ〜4つの分割用量に分けて投与することができ、一定期間にわたって、例えば1日を通して適切な間隔で、または他の適切なスケジュールで投与することができる。いくつかの態様において、投与は長期的であってよく、例えば、1つまたは複数の用量および／または処置を数週間または数ヶ月間にわたって毎日行うことができる。投薬および／または処置スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、もしくは6ヶ月、またはそれ以上の期間にわたって、1日1回、1日2回、1日3回、もしくは1日4回、またはそれ以上の回数、投与することである。GDF-15阻害剤を含む組成物は、5分、10分、15分、20分、または25分間などの、一定期間にわたって投与することができる。
【００４３】
本明細書において記載される方法による、GDF-15阻害剤の投与の投与量範囲は、例えば、阻害剤の形態、その効力、および本明細書において記載される状態の症状、マーカー、または指標がどの程度まで低減することが望ましいか、例えば血圧に関して望まれる低下率に依存する。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別によって異なり、当業者によって決定され得る。投与量はまた、任意の合併症が生じた場合に、個々の医師によって調整され得る。
【００４４】
GDF-15阻害剤の、例えば本明細書において記載される状態の処置における有効性、または本明細書において記載される応答（例えば、血圧低下）を誘発する有効性は、熟練の臨床医によって決定され得る。しかしながら、本明細書において記載される状態の兆候または症状の1つまたは複数が有益な様式で変化する、他の臨床的に許容される症状が改善されるか、もしくはさらには好転する、または所望の応答が、例えば本明細書において記載される方法による処置後に少なくとも10％誘発される場合、処置は、本明細書において用いられる意味で「有効な処置」と見なされる。有効性は、例えば、本明細書において記載される方法によって処置される状態のマーカー、指標、症状、および／もしくは発生率、または適切な任意の他の測定可能なパラメータ、例えば血圧を測定することによって、評価することができる。有効性はまた、入院によって評価される個体の悪化または医学的介入の必要性の欠如（すなわち、疾患の進行が停止すること）によって、測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、および／または本明細書において記載されている。処置は、個体または動物（いくつかの非限定的な例には、ヒトまたは動物が含まれる）における疾患の任意の処置を含み、(1) 疾患を阻害すること、例えば、症状（例えば、疼痛または炎症）の悪化を防ぐこと；または (2) 疾患の重症度を緩和すること、例えば、症状の退行を引き起こすことを含む。疾患の処置のための有効量とは、それを必要とする対象に投与された場合に、その疾患に対して、本明細書において定義される意味での有効な処置をもたらすのに十分な量を意味する。薬剤の有効性は、状態の身体的指標または所望の応答（例えば、血圧）を評価することによって、決定され得る。そのようなパラメータのいずれか1つまたはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、投与および／または処置の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書において記載される状態の動物モデルにおいて、例えばPAHのマウスモデルの処置において評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、処置の有効性は、マーカー、例えば血圧の統計的に有意な変化が認められる場合に証明される。
【００４５】
所与の用量のGDF-15阻害剤を評価できるようにするインビトロアッセイおよび動物モデルアッセイが、本明細書において提供される。非限定的な例として、ある用量のGDF-15阻害剤の効果は、細胞を阻害剤と接触させ、例えばPAI1および／またはIL6の発現を測定することにより評価することができ、この場合、そのようなレベルの低下はGDF-15の阻害を示す。
【００４６】
所与の投与量組み合わせの有効性はまた、動物モデル、例えば高血圧症のマウスモデルにおいて評価することもできる。例えば、マウスをモノクロタリン (MCT) で処置して肺高血圧症を誘発し、次いでGDF-15阻害剤で処置することができる。右室カテーテル検査により右室収縮期圧 (RVSP) を測定することができ、左室および中隔（LV＋S）壁の合計に対する右室 (RV) 自由壁の重量比によって、右室肥大 (RVH) を判定することができる。肺組織切片をα平滑筋アクチンおよびフォン・ヴィレブランド因子で染色して、それぞれ血管平滑筋血管および内皮を同定することができる。
【００４７】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に記載のない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語および語句は以下に提供される意味を含む。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の態様の記載を助けるために提供するものであって、主張する本発明を限定することは意図されない。特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されている意味と同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と本明細書において提供されるその定義との間に明白な矛盾が存在する場合、本明細書内で提供される定義が優先する。 
【００４８】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここに集めている。
【００４９】
「減少する」、「低下した」、「低下」、または「阻害する」という用語はすべて、統計的に有意な量の減少を意味するように本明細書において用いられる。いくつかの態様において、「低下する」、「低下」または「減少する」または「阻害する」は典型的に、参照レベル（例えば、所与の処置がない場合）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書で用いられる場合、「低下」または「阻害」は、参照レベルと比較した場合の完全な阻害または低下を包含しない。「完全な阻害」とは、参照レベルと比較した場合の100％の阻害である。減少は好ましくは、所与の障害をもたない個体の正常範囲内として許容されるレベルまで下がることであってよい。
【００５０】
「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語すべて、統計的に有意な量の増加を意味するように本明細書において用いられる。いくつかの態様において、「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％の増加、または最大100％およびそれを含む増加、または10〜100％の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比較して少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、または2倍〜10倍もしくはそれ以上の間の任意の増加を意味し得る。マーカーまたは症状との関連において、「増加する」は、そのようなレベルの統計的に有意な増加である。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、「対象」はヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ科の種、例えば家ネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥科の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズ、およびサケが含まれる。いくつかの態様において、対象は哺乳類、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」、および「対象」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５２】
好ましくは、対象は哺乳類である。哺乳類はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類を、高血圧症の動物モデルとなる対象として、有利に用いることができる。対象は雄性または雌性であってよい。
【００５３】
対象は、以前に、処置を必要とする状態（例えば、高血圧症）またはそのような状態に関連する1つもしくは複数の合併症と診断されるか、またはそれに罹患しているもしくはそれを有すると同定され、かつ任意に高血圧症または高血圧症に関連する1つもしくは複数の合併症のための処置を既に受けた対象であってよい。あるいは、対象はまた、高血圧症または高血圧症に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていない対象であってもよい。例えば、対象は、高血圧症または高血圧症に関連する1つもしくは複数の合併症の1つまたは複数の危険因子を示す対象、あるいは危険因子を示さない対象であってよい。
【００５４】
特定の状態のための処置を「必要とする対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、またはその状態を発症するリスクのある対象であってよい。
【００５５】
「薬剤」という用語は一般に、通常存在しないか、または細胞、組織、もしくは対象に投与されるレベルで存在しない任意の実体を指す。薬剤は、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド；ポリペプチド；小分子；および抗体またはその抗原結合断片を含む群より選択され得る。ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAであってよく、一本鎖または二本鎖であってよく、例えばポリペプチドをコードする核酸および核酸類似体を含む群より選択され得る。ポリペプチドは、関心対象の機能を保持する天然ポリペプチド、突然変異ポリペプチド、またはそれらの断片であってよいが、これらに限定されない。薬剤のさらなる例には、核酸アプタマー、ペプチド-核酸 (PNA)、ロックド核酸 (LNA)、有機または無機小分子；糖類；オリゴ糖；多糖；生体高分子、ペプチド模倣体；核酸類似体および誘導体；細菌、植物、真菌、または哺乳類の細胞もしくは組織などの生体物質から作製された抽出物、ならびに天然または合成組成物が含まれるが、これらに限定されない。薬剤は培地に適用することができ、薬剤はそこで細胞と接触し、その効果を誘導する。あるいは、薬剤は、薬剤をコードする核酸配列の細胞への導入、ならびにその転写による細胞内での核酸および／またはタンパク質環境刺激の生成の結果として、細胞内にあってもよい。いくつかの態様において、薬剤は、非限定的に、合成および天然の非タンパク質性実体を含む、任意の化学物質、実体、または部分である。ある特定の態様において、薬剤は、例えば、マクロライド、レプトマイシン、および関連する天然物、またはそれらの類似体を含む、非置換または置換のアルキル、芳香族、またはヘテロ環部分より選択される化学部分を有する小分子である。薬剤は、所望の活性および／もしくは特性を有することが公知であってよく、または多様な化合物のライブラリーから選択され得る。本明細書で用いられる場合、「小分子」という用語は、「天然物様」である化合物を指し得るが、「小分子」という用語は、「天然物様」化合物に限定されない。むしろ、小分子は典型的に、いくつかの炭素-炭素結合を含み、かつ約50ダルトン超であるが約5000ダルトン (5 kD) 未満である分子量を有することを特徴とする。好ましくは、小分子は、3 kD未満、さらにより好ましくは2 kD未満、および最も好ましくは1 kD未満の分子量を有する。場合によっては、小分子が700ダルトン以下の分子量を有することが好ましい。
【００５６】
いくつかの態様において、所与のポリペプチドの阻害剤は、そのポリペプチドに特異的な抗体試薬であってよい。本明細書で用いられる場合、「抗体」とは、抗体を天然に産生する任意の種に由来するか、または組換えDNA技術によって作出されるかにかかわらず；血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、または細菌から単離されるかどうかにかかわらず、IgG、IgM、IgA、IgD、もしくはIgE分子、またはそれらの抗原特異的な抗体断片（これらに限定されないが、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合scfv、ダイアボディを含む）を指す。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「抗原」とは、抗体薬剤上の結合部位が結合する分子である。典型的には、抗原は、抗体リガンドと結合し、インビボで抗体応答を引き起こすことができる。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、もしくは他の分子、またはそれらの一部であってよい。「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子によって、およびより具体的には、該分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを指す。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつ所与の抗原と特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重 (H) 鎖可変領域（本明細書においてVHと略される）および軽 (L) 鎖可変領域（本明細書においてVLと略される）を含み得る。別の例において、抗体は、2つの重 (H) 鎖可変領域および2つの軽 (L) 鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、ならびにドメイン抗体 (dAb) 断片（例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照されたい；これは全体として参照により本明細書に組み入れられる））も包含する。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM (ならびにそれらのサブタイプおよび組み合わせ)の構造的特徴を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）、ならびに霊長類化抗体を含む任意の供給源に由来し得る。抗体には、ミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体等もまた含まれる。
【００５９】
VH領域およびVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)と称される、より保存された領域が散在している、「相補性決定領域」(「CDR」)と称される超可変領域にさらに細分され得る。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、正確に定義されている（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照されたい；これらは全体として参照により本明細書に組み入れられる）。各VHおよびVLは典型的に、以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、3つのCDRおよび4つのFRから構成される。
【００６０】
「抗原結合断片」または「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持している、全長抗体の1つまたは複数の断片を指すために用いられる。全長抗体の「抗原結合断片」という用語の中に包含される結合断片の例には、(i) Fab断片、すなわちVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片；(ii) F(ab')2断片、すなわちヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片；(iii) VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片；(iv) 抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片、(v) VHドメインまたはVLドメインからなるdAb断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546；これは全体として参照により本明細書に組み入れられる）；ならびに (vi) 特異的な抗原結合の機能性を保持している、単離された相補性決定領域 (CDR) が含まれる。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「特異的結合」という用語は、第1実体が、非標的である第3実体に結合するよりも高い特異性および親和性で第2標的実体に結合する、2つの分子、化合物、細胞、および/または粒子間の化学的相互作用を指す。いくつかの態様において、特異的結合とは、第1実体の、第3非標的実体に対する親和性よりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、またはそれより高い、第2標的実体に対する親和性を指し得る。所与の標的に特異的な試薬とは、利用されるアッセイの条件下で標的に対する特異的結合を示すものである。
【００６２】
加えて、および本明細書において記載されるように、組換えヒト化抗体を、ヒトでの治療のために、機能的活性を維持しながら、潜在的免疫原性を減少させるようにさらに最適化することができる。この点において、機能的活性とは、本明細書において記載される組換え抗体またはその抗体試薬に関連する1つまたは複数の公知の機能的活性を示すことができるポリペプチドを意味する。そのような機能的活性には、例えば、例えばGDF-15に結合する能力が含まれる。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられて、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結されている一連のアミノ酸残基を表す。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）およびアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きいポリペプチドに関して用いられる場合が多いのに対して、「ペプチド」という用語は、小さいポリペプチドに関して用いられる場合が多いが、当技術分野におけるこれらの用語の用法は重複する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片を指す場合、本明細書において互換的に用いられる。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然タンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述のものの他の等価物、変種、断片、および類似体が含まれる。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそれらの類似体の単位を組み込んだ任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAの1つの核酸鎖であってよい。あるいは、一本鎖核酸は、任意の二本鎖DNAに由来しない一本鎖核酸であってもよい。1つの局面において、核酸はDNAであってよい。別の局面において、核酸はRNAであってよい。適切な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適切な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「処置する」、「処置」、「処置すること」、または「改善」という用語は、その目的が、疾患または障害、例えば高血圧症と関連した状態の進行または重症度を逆行させる、軽減する、改善する、阻害する、遅らせる、または阻止することである、治療的処置を指す。「処置すること」という用語は、高血圧症と関連した状態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減することまたは軽減することを含む。処置は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減する場合に、「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止する場合に、処置は「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置を行わなかった場合に予想されるものと比較した、症状の進行または悪化の中断、または少なくとも緩徐化も含む。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の改善もしくは緩和、寛解（部分的かまたは全体的かを問わない）、および／または死亡率の低下が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「処置」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの解放（緩和処置を含む）を提供することも含む。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば製薬業界において通常用いられる担体と組み合わされた活性薬剤を指す。「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合いながら、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において用いられる。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「投与すること」という用語は、薬剤を所望の部位に少なくとも部分的に送達する方法または経路によって、本明細書において開示される化合物を対象に挿入することを指す。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。
【００６８】
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に2標準偏差 (2SD) またはそれ以上の差異を意味する。
【００６９】
操作実施例以外において、または別に指示される場合を除き、本明細書において用いられる成分の数量または反応条件を表すすべての数値は、いかなる場合にも「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。「約」という用語は、割合と関連して用いられる場合、±1％を意味し得る。
【００７０】
本明細書で用いられる場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本方法または組成物に必須である組成物、方法、およびその各成分に関連して用いられるが、必須であるか否かにかかわらず、明記されていない要素の包含も受け入れる。
【００７１】
「からなる」という用語は、本態様のその説明において列挙されていないいかなる要素も除外した、本明細書において記載される組成物、方法、およびその各成分を指す。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「本質的に〜からなる」という用語は、所与の態様に必要とされる要素を指す。本用語は、その態様の基本的でかつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を容認する。
【００７３】
単数形の用語「1つの (a)」、「1つの (an)」および「その」は、文脈が明確に他のことを示していない限り、複数形の指示対象も含む。同様に、「または」という語は、文脈が明確に他のことを示していない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書において記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。「例えば (e.g.)」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書において用いられる。したがって、「例えば (e.g.)」という略語は、「例えば (for example)」という用語と同義である。
【００７４】
本明細書において特に定義されない限り、本出願と関連して用いられる科学および技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって共通に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬等に限定されず、したがって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を説明する目的のために過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition、Merck Sharp & Dohme Corp刊行、2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine、Blackwell Science Ltd.刊行、1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊行、1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann、Elsevier刊行、2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin's Genes XI、Jones & Bartlett Publishers刊行、2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737) の中に見出すことができ、その内容はすべて、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００７５】
他の用語は、本発明の様々な局面の説明の中で本明細書において定義される。
【００７６】
本出願を通して引用されている、参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含むすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書において記載される技術と関連して使用され得る、そのような出版物中に記載された方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの出版物は、本出願の出願日よりも前にそれらが開示されたというだけの理由で提供される。この点に関するいかなるものも、本発明者らが、先行発明または任意の他の理由でそのような開示を先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきでない。日付に関するすべての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は、本出願人に利用可能な情報に基づいており、日付の正確さまたはこれらの文書の内容に関していかなる承認も構成しない。
【００７７】
本開示の態様の説明は、包括的であること、または開示された正確な形態に本開示を限定することは意図されない。本開示の具体的な態様および本開示に対する例が、例示目的で本明細書において記載されているが、関連する技術分野の当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な等価の修正が可能である。例えば、方法の段階または機能は所与の順序で提示されるが、代替的な態様が異なる順序で機能を果たすこともあり、または機能は実質的に同時に果たされることもある。本明細書において提供される本開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書において記載される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面を、必要ならば、上記の参考文献および出願の組成物、機能、および概念を採用するように修正して、本開示のなおさらなる態様を提供することができる。さらに、生物学的な機能等価性の考慮により、種類または量の点で生物学的または化学的な作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造にいくらかの変化を加えることができる。これらのおよびその他の変更を、詳細な説明に照らして本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００７８】
前述の態様のいずれかの具体的要素は、他の態様における要素と組み合わせるか、またはそれと置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の態様に関連した利点が、これらの態様との関連で記載されているが、他の態様もまたそのような利点を示す場合があり、必ずしもすべての態様が、本開示の範囲内に入るようにそのような利点を示す必要はない。
【００７９】
本明細書において記載される技術を以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例は決してさらなる限定として解釈されるべきではない。
【００８０】
本明細書において記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号付き項のいずれかに従って規定され得る。
1.  高血圧症または線維症の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、GDF-15；TGFβ1；および／またはTGFβ3の阻害剤を対象に投与する段階を含む、方法。
2.  高血圧症が肺動脈性肺高血圧症 (PAH) である、項目1の方法。
3.  対象が、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) を有するか、または有すると診断された対象である、項目1〜2のいずれかの方法。
4.  線維症が、
肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患
からなる群より選択される疾患または状態と関連した線維症である、項目1の方法。
5.  対象が、
肺気腫；COPD；間質性肺疾患および肺線維症；特発性肺線維症；強皮症肺疾患；間質性血管疾患または肺血管疾患；ブレオマイシン誘発性肺損傷；化学療法薬（メトトレキサート、シクロホスファミド）または他の毒素への曝露に起因する肺線維症；未熟児と関連した慢性肺疾患、別名気管支肺異形成症；抗不整脈薬（例えば、アミオダロン）への曝露と関連した肺線維症または間質性肺疾患；ならびにアスベスト、シリカ、または粒子への曝露と関連した間質性肺疾患
からなる群より選択される疾患または状態を有するか、または有すると診断された対象である、項目1または3の方法。
6.  阻害剤がTGFβ1を阻害する、項目1〜5のいずれかの方法。
7.  阻害剤がTGFβ3を阻害する、項目1〜5のいずれかの方法。
8.  阻害剤がTGFβ1およびTGFβ3を阻害する、項目1〜7のいずれかの方法。
9.  阻害剤がGDF15を阻害する、項目1〜8のいずれかの方法。
10.  阻害剤がTGFβ1および／またはTGFβ3をさらに阻害する、項目9の方法。
11.  阻害剤がGDF15に特異的である、項目1〜5のいずれかの方法。
12.  阻害剤がTGFβ1に特異的である、項目1〜5のいずれかの方法。
13.  阻害剤がTGFβ3に特異的である、項目1〜5のいずれかの方法。
14.  阻害剤が抗体試薬またはリガンドトラップである、項目1〜13のいずれかの方法。
15.  リガンドトラップがTGFβ-1/3 GDF-15リガンドトラップである、項目14の方法。
16.  リガンドトラップがTGFBRII-Fcである、項目15の方法。
17.  対象が、強皮症、またはPAHに付随する結合組織病 (APAH-CTD) を有する、項目1〜16のいずれかの方法。
18.  対象が、対照と比べてGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇していると判定されている、項目1〜17のいずれかの方法。
19.  対象が、PAHを有するが強皮症またはAPAH-CTDの症状を示していない対象におけるGDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3の平均レベルと比べて、GDF-15、TGFβ1、および／またはTGFβ3のレベルが上昇していると判定されている、項目18の方法。
【実施例】
【００８１】
実施例1
ラットをモノクロタリン (MCT) で処置することにより、肺高血圧症を誘発した。MCT (40 mg/kg SC) によるSprague Dawleyラットの処置後に、右室収縮期圧（RVSP、図1A）および右室肥大（RVH、図1B）の変化を様々な間隔で測定した。RVSPは右室カテーテル検査によって測定し、RVHは、左室および中隔（LV＋S）壁の合計に対する右室 (RV) 自由壁の重量比によって判定した（1時点につきn＝3）。MGT処置ラットの肺の定量的RT-PCRにより、PAI-1（図1C）およびTGFb1（図1D）転写活性の上昇によって反映される、TGF-βシグナル伝達の増加が明らかになった。ld1（図1E）およびBMPR2（図1F）mRNAレベルの低下により、BMPシグナル伝達活性の障害が示された。TGFb3の発現は、MGT処置ラットの肺において影響を受けないままであった（図1G）。GDF15レベルは、MGT処置ラットの肺において上昇した（図1H）。対照ラットと比較して*p＜0.05および**p＜0.01。
【００８２】
実験的PAHの新規な病原標的を同定するための偏りのないアプローチとして、RNA-Seqを使用した。GDF15は、MCT処置ラットの肺において、TGFbスーパーファミリーの中で最も上方制御されるリガンドである（表1）。
【００８３】
PAI-1（図2A）のレベルの上昇は、RVSPに基づくPHの程度と直接相関した。対照的に、転写標的ld1（図2B）およびBmpr2（図2C）の発現の減少が認められ、そのレベルはいずれもRVSPと逆相関した。TGFb1の発現と実験的PAHの表現型との間に相関はない。GDF15タンパク質発現は、MGT処置ラットの肺において、肺血管系の内皮およびCD68陽性細胞に共局在化した（データは示さず）。
【００８４】
外因性のGDF15は、ヒト肺動脈平滑筋細胞（PASMC、図3A）において強力なTGFbシグナル伝達活性を誘発したが、ヒト肺微小血管内皮細胞（PMVEC、図3B）ではそのようなことはなかった。培養した血管細胞から血清を取り除き、様々な濃度のBMP4、BMP9、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、およびGDF15リガンドと共に30分間インキュベートした。
【００８５】
ウェスタンブロット（図3C）およびqPCR（図3Dおよび3E）を実施して、TGFBRII-Fcがインビトロでシグナル伝達活性を調節する影響を判定した。TGFBRII-Fcは、インビトロにおいて、TGFβ1、TGFβ3、およびGDF15に対する選択的リガンドトラップであることが見出された。
【００８６】
TGFBRII-Fcは、右室収縮期圧 (RVSP)、右室肥大、および血管リモデリングを軽減する。
様々な用量のTGFBRII-Fc（15 mg/kg、1週間に2回）を伴うまたは伴わないMCTによる処置の3週間後に、ラットをペントバルビタールによる麻酔下でのカテーテル検査および気管内挿管によって盲検様式で解析して、RVSP（図4A）を判定し、安楽死させた。Fulton比（RV/(LV＋S)、図4B）の測定に基づき、RVHの程度を盲検様式で評価した。値は平均値±SEMとして表してある、n＝6〜8、対照ラットと比較して**p＜0.01および***p＜0.001。tgfb1（図4C）、pai1（図4D）、およびil6（図4E）のmRNAレベルを決定した。値は平均値±SEMとして表してある、n＝3〜5、対照と比較して*p＜0.05および**p＜0.01。肺組織切片をα平滑筋アクチンおよびフォン・ヴィレブランド因子で染色して、それぞれ血管平滑筋血管および内皮を同定した（データは示さず）。遠位細葉内血管（直径10〜50 (.lm）の筋性化を定量し、非筋性の、部分的に筋性化した、および完全に（周囲に）筋性化した血管の割合を算出した（図4F）。TGFBRII-Fc処置（15 mg/kg、1週間に2回）は、完全に筋性化した血管の割合を有意に減少させ、かつ中膜肥厚指数の減少傾向を引き起こした。値は平均値±SEMとして表してある、それぞれ6〜8匹のラットによる1処置群につきn＝89〜127本の血管、表示通りのp値。PHの確立後のTGFBRII-Fcによる処置は、PHおよび死亡率の部分的救済と関連している。MCT (40 mg/kg SC) による処置後、PHの確立後の17日目に開始する遅延様式で、ラットをTGFBRII-Fc（15 mg/kg、1週間に3回）で処置した。カプラン・マイヤー解析（図4G）により、媒体で処置したラットと比較して、TGFBRII-Fc処置群における生存率の改善が明らかになった（1群につきn＝18）。35日目における生存動物の中で、TGFBRII-Fcで処置した動物の間にRVSPの有意な低下があったが（図4H）、RVHの有意な差異はなかった U）。示した値は平均値±SEMである、1群につきn＝8〜11、対照と比較して**p＜0.01。TGFBRII-Fc処置は、確立された表現型を有するラットにおいて肺血管リモデリングを軽減した。
【００８７】
PAHのマウスモデルにおけるTGFBRII-Fcの有効性
マウスをVEGFR遮断薬 (SUGEN) で処置し、3週間にわたり低酸素に曝露した。TGFBRII-Fc処置（15 mg/kg、1週間に3回）は、RVSPを低下させ、かつ右室肥大を防いだ（図5A〜5B）。
【００８８】
トランスジェニックマウスを用いて、GDF15の病原的役割を確認する。
GDF15ノックアウトマウスは、SUGEN／低酸素誘発性のPAHから保護される（図6A〜6D）。表示の通り**p＜0.01および***p＜0.001。
【００８９】
肺血管平滑筋細胞におけるデータと一致して、GDF15は、インビトロでヒト大動脈平滑筋細胞 (HASMC) において強力なTGFbシグナル伝達を誘導した。陽性対照として、BMP4、TGFb1、およびTGFb2を使用した（図7A〜7B）。
【００９０】
HASMCにおいて、TGFb1、TGFb3、およびGDF15誘導性のシグナル伝達を遮断する際のTGFBRII-Fcの選択性が確認された（図8A〜8B）。示されている通り*p＜0.05および**p＜0.01。
【００９１】
微小血管内皮細胞 (HPMVEC) におけるデータと一致して、外因性のGDF15は、ヒト肺動脈内皮細胞 (HPAEC) においてTGFbシグナル伝達を誘導することができなかった（図7）。
【００９２】
低用量のTGFBRII-Fc（5 mg/kg、1週間に2回）は、MGT処置ラットにおいて、RVSP（図10A）および右室肥大（図10B）の低減傾向を示した。注目すべきことに、低用量のTGFBRII-Fc処置は、MGTラットにおいて肺血管リモデリングを有意に防いだ。
【００９３】
（表１）実験的PAHの新規な病原標的を同定するための偏りのないアプローチとして、RNA-Seqを使用する。GDF15は、MCT処置ラットの肺において、TGFbスーパーファミリーの中で最も上方制御されるリガンドである。
2020125353.tif 000003
【００９４】
実施例2：選択的TGF-βリガンドトラップは肺動脈性肺高血圧症を改善する
トランスフォーミング増殖因子-β (TGF-β) リガンドは、発生および組織恒常性、転写プログラムを調節するためのI型およびII型セリン・スレオニンキナーゼ受容体を介したシグナル伝達の重要な調節因子として働く。過剰なTGF-βシグナル伝達ならびに関連する転写およびリモデリング活性は、免疫組織学的研究および遺伝子発現研究、ならびにTGF-β I型受容体 (ALK5) 阻害剤が実験的PAHを軽減する能力に基づき、肺動脈性肺高血圧症 (PAH) の病因と関係づけられている。しかしながら、TGF-βリガンドの広範な阻害と関連した心血管および全身の毒性により、治療可能性は制限されている。本研究において、本発明者らは、選択的TGF-β1/3リガンドトラップ、TGFBRII-Fcが、実験的PAHおよび肺血管リモデリングに影響を及ぼし得るかどうかを調べた。TGFBRII-Fcによる処置は、モノクロタリン処置ラットおよびSUGEN-低酸素処置マウスにおいて、SMAD2リン酸化を軽減し、TGF-β転写標的PAI-1の発現を正常化し、かつPAHおよび肺血管リモデリングを軽減した。確立されたPAHを有するモノクロタリン処置ラットへのTGFBRII-Fcの投与は、肺動脈圧、生存率、およびリモデリングを改善した。重要なことには、TGFBRII-Fc処置に付随して、心構造の異常も弁の異常も認められなかった。まとめると、本発明者らのデータは、選択的TGF-βリガンドトラップが、TGFβ媒介性の肺血管リモデリングおよびPHを是正するための有効でかつ許容可能な戦略であり得ることを示している。
【００９５】
肺動脈性肺高血圧症 (PAH) は、進行性肺血管障害によって駆動される肺血管抵抗 (PVR) および動脈圧の上昇を特徴とする、非常に病的な状態であり、これは右室肥大 (RVH) ならびにしばしば右室不全および死を引き起こす1, 2。PAHの肺血管病変には、中膜肥厚、過剰増殖性の筋線維芽細胞および内皮細胞系譜からなる新生内膜閉塞性病変、ならびに本疾患に特徴的である多チャネル化 (multichanneled) 叢状病変が含まれる。特発型および遺伝型のPAHは、血管内皮および平滑筋ならびに他の組織の細胞生理学における多くの重要な機能を有するトランスフォーミング増殖因子-β (TGF-β) シグナル伝達ファミリーのメンバーである5〜8骨形成タンパク質 (BMP) II型受容体 (BMPRII) をコードするBMPR2におけるヘテロ接合変異と関連している3, 4。TGF-βシグナル伝達ファミリーは、BMP、TGF-β、アクチビン、および増殖分化因子 (GDF) をはじめとする、30種を超えるリガンドを含み、これらはそれぞれ、血管恒常性および疾患に潜在的に重要に寄与する多機能性サイトカインとして働く9〜11。
【００９６】
PAHに関連したBMPR2の変異は、BMPシグナル伝達機能の喪失をもたらすものの、ヒトIPAH由来の肺組織がTGF-β経路の活性増強を特徴とすることが長い間観察されてきた12。実際に、低酸素、モノクロタリン誘発性損傷、または住血吸虫症による感染症によって誘発されたものを含む、肺高血圧症の複数の動物モデルは、TGF-βリガンド発現および下流の転写活性の上昇という類似の証拠を示した13〜16。これらのモデルにおけるTGF-βシグナル伝達の増強は、平滑筋肥大、血管周囲線維化、および細胞外基質リモデリングを伴うPAHと関連しており、これらはいずれも、近縁の相同的なアクチビンおよびNodal受容体ALK4およびALK7もまた阻害する、TGF-β I型受容体キナーゼALK5の薬理学的阻害剤によって改善することができた13, 17。しかしながら、この戦略の治療可能性を制限するのは、小分子によるALK4/5/7の強力な阻害が、出血性弁壊死という形態の顕著な心血管毒性、ならびに若年動物の大腿脛骨関節における骨端軟骨肥大および異形成を引き起こすという知見であった18。TGF-βリガンドTGF-β1、2、および3を認識する中和モノクローナル抗体、1D11もまた、ラットにおけるPAHのモノクロタリンモデルにおいて肺高血圧症を軽減し得ることが示された1, 19。しかしながら、ヒトにおける同様の汎TGF-β中和抗体、フレソリムマブの使用は、皮膚の発疹および損傷、鼻出血、歯肉出血、ならびに倦怠感を含む、用量依存性の副作用と関連していた20。TGF-βファミリーの個々のリガンドのうちのいずれかが、これらの作用の主な原因となり得るのかどうかは、現在のところ不明である。本研究において、本発明者らは、組換えTGFBRII-Fc細胞外ドメイン融合タンパク質を用いて、肺血管リモデリングにおける選択的TGF-βリガンド-遮断の効果を判定しようとした。このリガンドトラップはTGFβ1およびβ3と結合するが、TGFBRIII（ベータグリカン）との相互作用を必要とするTGF-β2とは結合しない。本明細書において記載されるように、そのような戦略は、心臓弁形態形成での、ならびに種々の組織における内皮間葉転換および上皮間葉転換の調節でのその必須の役割に関して、TGF-βリガンドの中で特有であることが公知であるTGF-β2の阻害に起因する毒性障害を招くことなく、動物モデルにおいて肺血管リモデリングおよびPAHの局面を改善することができる21〜29。
【００９７】
材料および方法
細胞培養
ヒト肺動脈平滑筋細胞 (HPASMC) はLonza (CC-2581) から購入し、市販の増殖因子 (CC-3182) を補充したSmGM-2培地中で維持した。CAGA-Luc細胞およびBRE-Luc細胞は、10％ FBSを補充したDMEM中で維持した。細胞は、実験刺激の前に静止状態を達成するため、増殖補助剤なしで0.5％ FBSと共にインキュベートした。注記がある場合には、静止細胞を、実験刺激の前にTGFBRII-Fc (2000 ng/ml) で30分間処理した。
【００９８】
実験的PAHモデル
成体雄Sprague-Dawleyラット（150〜170 g）および雄C57BL/6Jマウス（20〜25 g）は、Charles River Laboratoryから購入した。すべての実験および外科的プロトコールは、Harvard動物実験委員会 (Institutional Animal Care and Use Committee) によって承認された。動物は、12時間の明暗サイクルで24℃にて収容した。食糧および水は自由に利用できた。PAHを誘発するために、ラットにモノクロタリン（MCT、40 mg/kg、Oakwood）の単回皮下注射を行った。マウスには、3週間にわたり、N2ガスの注入による制御チャンバー（FIO2＝10％、BioSpherics）内で常圧低酸素に曝露させながら、VEGF受容体遮断薬（SU5416、20 mg/kg）の週に1度の皮下注射を3回連続して行った。
【００９９】
MCT処置ラットにおける予防
MCTの投与後24時間の時点で、ラットをTGFBRII-Fc（5または15 mg/kg、1週間に2回）または媒体を投与する群に無作為に分けた。ラットを21日間処置した。14日目に、心室機能およびRVリモデリングを心エコー図検査によって調べた。21日目に、ラットを侵襲的血行動態およびRVH測定に供した。
【０１００】
MCT処置ラットにおける救済
確立されたPAHを逆行させるTGFBRII-Fcの能力を試験するために、ラットを、MCT曝露後の18日目に開始して無作為に選択して、TGFBRII-Fc（15mg/kg、1週間に3回）または媒体を投与した。35日目に血行動態およびRVHを調べた。
【０１０１】
SUGEN／低酸素マウスにおける予防
PAHの誘発後24時間の時点で、マウスを無作為に分け、TGFBRII-Fc（15 mg/kg、1週間に3回）を投与した。21日目に、マウスを血行動態およびRVH測定に供した。
【０１０２】
LVおよびRV機能の心エコーによる評価
MCTの投与後14日目に、ラットを1.5％イソフルランで麻酔し、仰臥位に保った。VisualSonics小動物用高周波数超音波プローブを用いて、肺血流加速、右室の機能および肥大、ならびに左室機能を検出した。僧帽弁および三尖弁を横断するドップラーを行って、TGFBRII-Fc処置が弁逆流または弁の構造異常を引き起こすかどうかを判定した。
【０１０３】
侵襲的血行動態測定および右室肥大の評価
特定の時点において、ラットをペントバルビタール (50μg/kg i.p.) で麻酔し、気管内に挿管した。以前に記載されているように19、齧歯類用人工呼吸器（TV＝8 ml/kg、f＝80/分）を用いてラットを機械的に換気し、RV尖部を通した液体充填カテーテルを用いて圧の侵襲的動態測定を行った。肺にPBSを灌流し、RNAおよびタンパク質の抽出用に、1つの右葉を切除し瞬間凍結した。肺動脈内へ、その後気管内へ、1分間にわたり肺に1％パラホルムアルデヒド (PFA) をさらに灌流した。左葉をパラフィンに包埋した。RVHの程度を評価するために、心臓を摘出し、RV自由壁を左室＋中隔（LV＋S）から解離し、別々に計量した。RVHの程度を、RV/(LV＋S) 比から判定した。LVおよび中隔壁の残りの部分をOCTに包埋し、切片を作製した。H&E染色を行って、僧帽弁の構造を調べた。
【０１０４】
肺組織における血管リモデリングおよびp-Smad 2の定量
肺血管リモデリングの程度を判定するために、肺組織切片を平滑筋α-アクチンおよびフォン・ヴィレブランド因子で染色した。遠位細葉内血管（直径10〜50μm）の筋性化を、非筋性、部分的に筋性化している、および完全に筋性化しているとして盲検様式でスコア化し、全血管に対する割合として表した。完全に筋性化した細葉内血管に関して、式：中膜肥厚‐（外径−内径）／外径×100に基づいて、中膜肥厚を算出した。凍結切片化した肺組織 (10μm) におけるSmad2タンパク質のリン酸化は、免疫蛍光染色によって調べた。
【０１０５】
発現試験
凍結した肺試料をホモジナイズし、TRIZOL試薬を用いて全RNAを抽出した。記載されているように、逆転写および定量的PCRを行った。関心対象の各遺伝子の発現の相対レベルは、Ct法により決定し、β-アクチンの発現に対する比率として表した。
【０１０６】
試薬
組換えTGFBRIIは、CHO細胞においてIgG Fcドメインとの融合タンパク質 (TGFBRII-Fc) として発現させ、以前に記載されているように精製した。リン酸化 (p-) Smad3 (p-Smad3)、p-Smad1/5、p-Smad2、および全Smad3に対する一次抗体は、 Cell Signalingから購入した。平滑筋α-アクチンおよびフォン・ヴィレブランド因子に対する一次抗体は、それぞれSigmaおよびDakoから購入した。組換えTGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、およびBMP4は、R&Dから購入した。
【０１０７】
統計解析
侵襲的血行動態圧測定ならびにRVHおよび肺血管リモデリングの評価の定量的解析は、一貫して処置群に関して盲検様式で行い、すべての動物および組織試料の正体は、データ収集に関与しない人によってマスクされた。データは平均値±測定の標準誤差 (SEM) として提示し、スチューデントt検定を多重検定のためのボンフェローニ補正と共に、またはANOVAを用いて、群間で比較した。P＜0.05を統計的に有意であると見なした。
【０１０８】
結果
TGFBRII-Fcは、TGFβ II型受容体のリガンド結合ドメインからなる組換え融合タンパク質である。TGFBRII-Fcは、CAGA-Lucレポーター細胞株によって測定されるTGF-β転写活性を誘導する上で、TGFβ1および3の活性を選択的に阻害したが、TGF-β2の活性は抑制することができないか、または中程度に増強した（図13A）。対照的に、TGFBRII-Fcによる処理は、BRE-Lucレポーター株においてBMP媒介性の転写活性を阻害せず、実際にこのアッセイにおいていくつかのリガンドの活性を増強した（図13B）。これらの結果は、TGF-βリガンドのサブセットに対するこのリガンドトラップの選択的活性と一致し、TGF-βシグナル伝達の抑制がBMPおよびTGF-β2シグナル伝達の増強をもたらし得るフィードバック機構を示唆した。一貫して、TGFBRII-Fcは、培養ヒト肺動脈平滑筋細胞 (HPASMC) において、TGFβ2誘導性のシグナル伝達に影響を及ぼすことなく、TGFβ1誘導性およびTGFβ3誘導性のSmad 2/3リン酸化を妨げた（図13C）。一貫して、TGFBRII-Fcは、HPASMCにおいてTGFβ1誘導性のシグナル伝達を妨げた。HPASMCをTGF-β1で刺激した場合、qRT-PCRによって測定される、カルデスモン、スムーセリン、および特にカルポニンなどの平滑筋収縮表現型遺伝子の発現が増強され、これらのすべてがTGFBRII-Fcによる細胞の同時処理によって強く阻害された（図14）。まとめると、TGFBRII-Fcは、TGF-β1およびβ3の強力なアンタゴニストであり、インビトロにおいて血管平滑筋細胞に対するそれらの作用を無効にすることができると考えられた。
【０１０９】
PAHのラットMCT誘発性モデルにおいて、本発明者らは、以前の報告と一致して30、PAHの発症が、TGFβ媒介性シグナル伝達および転写の顕著な増加と共に、全肺におけるBMPR2/BMP媒介性シグナル伝達および遺伝子転写の減少と関連していることを確認した。MCTに供されたラットは、MCT処置後3週間以内に時間依存的様式で発達する、右室収縮期圧 (RVSP) の上昇、および右室肥大 (RVH) と一致するFulton比の上昇を示した。MCT曝露は、以前に報告された通り、Pai1およびTgfb1 mRNAレベルの漸進的上昇を引き起こした。その一方で、MCTで処置したラットでは、Bmpr2およびId1 mRNAの発現が減少した。Tgfb1およびPai1発現によって評価されるTGFβシグナル伝達活性の上昇は、RVSPおよびFulton比によって測定される疾患重症度と直接相関し、Bmpr2およびId1発現によって評価されるBMPシグナル伝達活性の障害も直接相関した。
【０１１０】
本発明者らは、TGFBRII-FcはインビボにおいてTGFβ1/3シグナル伝達活性を阻害するための選択的リガンドトラップとして働き、実験的PAHにおいて疾患進行を調節し得るという仮説を試験した。低用量のTGFBRII-Fc（5 mg/kg、1週間に2回）による処置は、RVSP、RVH、および肺末梢血管の筋性化の有意でない低減傾向を示したが、MCT誘発性の肺動脈性肺高血圧症の後の中膜肥厚指数を有意に減少させた。TGFBRII-Fcの高用量投与計画（15 mg/kg、1週間に2回）は、RVSP（46.72±4.68対32.99±2.08 mmHg）およびRVH（0.52±0.04対0.41±0.02）を有意に低下させた。この投与計画下でのTGFBRII-Fc処置は、MCTラットにおいて血管リモデリングを効果的に防いだ（図4A〜4M）。TGFBRII-Fcを投与されたMCT処置ラットは、全肺抽出物においてPai1のmRNAレベルの低下を示し、予想外にTgfb1のレベル低下も示した（図4A〜4M）。MCT処置ラットにおけるBmpr2およびId1のmRNAレベルの低下は、TGFBRII-Fc処置に影響を受けなかった。本発明者らはまた、TGFBRII-Fc処置が、MCTラットの肺においてIl6、Il1b、およびIcam（図4A〜4M）mRNAレベルを低下させることを見出した。TGF-βシグナル伝達活性の増強と一致して、ラットのMCT処置は、主に血管細胞の核におけるマウスの肺切片の免疫組織化学的検査によって検出される、リン酸化SMAD2の発現増加と関連していた。TGFBRII-Fcによる処置は、リン酸化SMAD2のこのレベル上昇を軽減した（データは示さず）。
【０１１１】
心エコー評価はRVHの別の測定値を提供し、TGFBRII-Fcによる処置が、14日目のMCTラットで観察されるRV自由壁厚の増加を軽減することを示した（0.77±0.15対0.59±0.11 mm、p＜0.05）。本発明者らはまた、MCTラットにおいて肺血流加速時間 (PAT) の減少を観察し（19.83±2.60対32.64±2.16 ms、p＜0.05）、これはTGFBRII-Fc処置に影響を受けなかった。心エコーMモードおよび2D評価は、正常ラットまたはMCT処置ラットにおいて、TGFBRII-Fc投与の結果としての弁機能障害の証拠も弁変性の証拠も明らかにしなかった。重要なことには、TGFBRII-Fcによる処置はまた、硬化性リモデリングの証拠も変性性リモデリングの証拠もなく、僧帽弁構造の形態変化と関連していなかった（図17A〜17B）。正常ラットまたはMCT処置ラットでのTGFBRII-Fcによる処置により、媒体処置で見られる正常な体重増加は変化しなかった（図18および19）。
【０１１２】
本発明者らは、MCTモデルにおいて、確立されたPAHに影響を及ぼすTGFBRII-Fcの能力を試験した。MCT曝露後の18日目にTGFBRII-Fcによる処置（15mg/kg、1週間に3回）を開始し、35日目に血行動態およびRVHを測定した。この遅延様式で投与した場合、TGFBRII-Fcは、確立されたPAHを有するMCT処置ラットにおいて生存率を改善し、RVSP（43.18±3.46対33.29±0.77 mmHg、p＜0.01）および血管リモデリング (p＜0.05) を低減した。しかしながら、RVHは、TGFBRII-Fcの遅延処置に影響を受けなかった（0.44±0.03対0.42±0.02）。注目すべきは、この様式で処置した救済コホートにおける血管リモデリングの改善は、予防コホートで観察された場合よりも明白であった。この観察は、予防研究で用いられたものよりも高用量のTGFBRII-Fcを用いてなされ、これにより、血管リモデリングにおけるこのリガンドトラップの治療可能性が用量感受性であり、その投与量を最適な効果に対して用量設定することにより治療可能性を最大化できることが示唆された。本発明者らはまた、TGFBRII-Fc処置が、MCTラットの肺においてTgfb1（図15A）、Pai1（図15B）、Il6（図15C）、Il1b（図15D）、およびIcam（図15E）のmRNA発現を減少させることを見出した。確立されたPAHを有するMCT処置ラットをTGFBRII-Fcで処置した場合、主に血管細胞の核において観察されるリン酸化SMAD2の減少が観察された（データは示さず）。
【０１１３】
本発明者らは次に、SUGEN／低酸素モデルにおいてTGFBRII-Fcの有効性を調べた。マウスをVEGFR阻害剤SU5416で処置し、3週間にわたる慢性低酸素に曝露して、PAHの機構的に異なる補完的なモデルを提供した。SUGENおよび低酸素の組み合わせ処置は、低酸素にのみ曝露したマウスの表現型よりもはるかに強力でかつ一貫した表現型を誘発した（図20A〜20B）。TGFBRII-Fcによる予防的処置は、SUGEN／低酸素処置マウスにおいて、RVSP（43.38±5.66対35.42±5.85 mmHg、p＜0.05）およびRVH（0.29±0.01対0.24±0.02、p＜0.05）を有意に低減した。TGFBRII-Fc処置は、SUGEN／低酸素処置マウスの肺において血管リモデリングを軽減した（データは示さず）。本発明者らはまた、TGFBRII-Fc処置が、SUGEN／低酸素マウスの肺において、Tgfb1の上方制御を逆行させる傾向を示し（図16A）、Pai1 mRNAレベルを有意に低下させること見出した（図16B）。
【０１１４】
考察
肺血管の機能および疾患におけるTGFβシグナル伝達の公知の重要性、ならびにこれらのリガンドの構造的および機能的多様性に基づいて、本発明者らは、TGFβシグナル伝達の選択的阻害が、実験的肺高血圧症および肺血管リモデリングを軽減し得るかどうかを判定しようとした。本発明者らは、組換えTGFBRII-Fc融合タンパク質を、内皮間葉転換、細胞外基質リモデリング、および心臓弁形成の重要な調節因子であるTGFβ2のシグナル伝達に影響を及ぼさない、TGFβ1およびTGFβ3リガンドシグナル伝達の強力な阻害剤として特徴づけた25, 27。この活性と一致して、TGFBRII-Fcは、TGFβ1およびTGFβ3を介する標準的なSMAD2/3シグナル伝達を遮断し、インビトロにおいて肺動脈平滑筋細胞の合成表現型から収縮表現型へのTGFβ1媒介性転換を妨げた31, 32。本発明者らは、TGFβ1/3が、PAHで見られる肺血管リモデリングを媒介する主な原因であると仮定し、PAHの2つの異なるモデルにおいて、TGFBRII-Fc処置が過剰なTGFβシグナル伝達活性を是正し、肺血管リモデリング、肺高血圧症、および右室肥大を軽減することを見出した。重要なことには、TGFBRII-Fcは、モノクロタリンで以前に処置されたラットにおいて、確立されたPAHおよびRVHの進行を妨げるばかりでなく、ラットの生存度も同様に改善した。これらの目下のデータは、TGFβリガンドのサブセットの選択的阻害がPAHを軽減し、それもPAHの機構的に異なるモデルにおいて軽減するという、非選択的アプローチよりも許容可能である可能性が高い戦略を用いての最初の実証である。
【０１１５】
TGFβファミリーのシグナル伝達分子は、TGFβ1〜3に加えて、BMP、アクチビン、インヒビン、増殖分化因子 (GDF)、Lefty、Nodal、および抗ミュラー管ホルモンを含む、多くの異なる細胞型の分化、増殖、遊走、および生存を調節する、35種を超える多機能性サイトカインの構造的に多様なセットを表す。TGFβ型リガンドは、胚形成の間の多くの過程を組織化し、血管疾患および線維性疾患で見られる病態生理学的リモデリングにおいて決定的な役割を果たし、その役割は、治療適用のためのそれらの遮断に対する驚異的な関心を引き起こした20, 33〜37。TGFβシグナル伝達の非選択的遮断は、ラットにおけるモノクロタリン誘発性PAHに有益であることが示されてきた。小分子阻害剤IN-1333、SD-208、およびSB-525334は、その称するところでは、そのI型受容体ALK5の活性を介するTGFβシグナル伝達を阻害することにより、モノクロタリン誘発性PAHを軽減する13, 17, 30。しかしながら、これらの分子はいずれも、近縁のI型受容体ALK4およびALK7に対して強力な活性を示し38〜40、TGFβ1〜3のみならず、その機能が血管系においてTGFβと調和し得るかまたは調和し得ないアクチビン、GDF、およびNodalを含む潜在的に20種の他のリガンドの活性に影響を及ぼす。さらに、これらの強力なTGFβ阻害剤は、潜在的にそれらの選択性の欠如に起因して、動物において出血性弁壊死を引き起こす、クラス全体の作用を有するようであり18、ヒトでの使用に関する課題を提示した。汎TGFβ1〜3中和抗体1D11もまた、モノクロタリン誘発性PAHを軽減する上で有効であった [20, 39]。
【０１１６】
TGFBRII-Fcの投与は、処置動物 対 未処置動物の心エコー解析および組織学的解析に基づいて、心臓弁の機能にも構造にも影響を及ぼさなかった。非選択的戦略の許容性における限界の可能性にもかかわらず。肺血管リモデリングを改善するためのこれらの異なる戦略の一致は、PAHにおけるこのシグナル伝達軸の役割の強力な証拠であるが、この概念を臨床的に進めるにはいくつかの制限が存在していた。
【０１１７】
このような以前の研究の顕著な制限は、モノクロタリン誘発性PAHの1つの前臨床モデルに依存した。ラットにおけるMCT誘発性PAHの肺は、本発明者らが今回の研究において見出した通り、TGF-βシグナル伝達および線維化促進転写活性の増大、BMPR2発現および下流のBMPシグナル伝達活性の抑制という分子シグニチャー30、ならびにびまん性炎症および肺損傷の証拠41を有し、そのためこの肺はTGFβリガンド遮断の影響を特に受けやすくなり得る。MCT-PAHの分子プロファイルは、ヒトPAH疾患のいくつかの型のものと似ているが、TGFβ拮抗作用の効果が他のモデルに一般化できるか否かを知ることは有益である。本発明者らは、マウスにおけるPAHの機構的に異なるSUGEN-低酸素誘発性モデルでTGFBRII-Fcの影響を調べた際に、他の研究者らによって最近検証されたように42, 43、Pai1などのTGFβ転写標的の発現が、MCT処置ラットで見られる程度ほどではないが増加していることを見出した。それにもかかわらず、TGFBRII-Fcによるこれらの動物の処置もまた、PA圧およびRV肥大を改善することが認められた。
【０１１８】
ALK5に対する小分子阻害剤の臨床展開は、毒性によって制限されてきた。TGFβ2シグナル伝達は、種々の組織における内皮間葉転換および上皮間葉転換の調節でのその中心的役割と一致して、心臓弁形態形成に必須である21〜29。天然のTGF-β II型受容体は、III型共受容体ベータグリカンの非存在下ではTGFβ2シグナルを伝達しないという概念と一致して44〜46、可溶性TGFBRII-Fcは、インビトロにおいてTGFβ2誘導性シグナル伝達に影響を及ぼさず、またPAHを軽減するのに十分な用量でマウスおよびラットに長期的に投与した場合に、TGFBRII-Fcは、心臓弁の構造にも機能にもいかなる観察可能な変化も引き起こさず、または非選択的TGFβ拮抗作用で以前に観察された死亡率のいかなる増加も引き起こさなかった。反対に、TGFBRII-Fcによる処置は良好に許容され、救済研究においてエンドポイントしての死亡率を改善した。
【０１１９】
PAHは、複数の細胞型を含む肺血管リモデリングによって引き起こされる。Thomasおよび同僚らによる観察と一致して、本発明者らは、MCTラットの肺において単核細胞に共局在化するホスホ-Smad2染色の増加を認めた17。MCT-ラットの罹患肺に浸潤したCD68陽性細胞がTGF-β1の過剰産生に寄与することもまた示された30。理論によって制限されることは望まないが、まとめると、これらのデータは、実験的PAHにおいて、浸潤細胞が、過剰なTGF-βシグナル伝達活性に関与する主な細胞型であり得ることを示唆している。本発明者らのデータは、TGFβ1がインビトロにおいてSMC表現型を調節し、この過程がTGFBRII-Fcによって逆行することを示した。
【０１２０】
可溶性TGF-β II型受容体がTGF-β1/3に対する選択的リガンドトラップとして働いて、血管リモデリングを軽減し、かつ血管損傷と同時に起こる、および確立された疾患におけるPAHを改善することを示すデータを、本明細書において提供する。以前のアプローチとは異なり、この選択的リガンドトラップの投与は、心臓弁の毒性も他の毒性も引き起こさなかった。したがって、特定のTGF-βリガンドの選択的リガンドトラップは、ヒトPAHを処置するための有効でかつ許容可能なアプローチであり得る。
【０１２１】
参考文献
2020125353.tif 000004
2020125353.tif 000005
2020125353.tif 000006
2020125353.tif 000007
2020125353.tif 000008
【０１２２】
2020125353.tif 000009
2020125353.tif 000010
【図１Ａ】
2020125353.tif 000011
【図１Ｂ】
2020125353.tif 000012
【図１Ｃ】
2020125353.tif 000013
【図１Ｄ】
2020125353.tif 000014
【図１Ｅ】
2020125353.tif 000015
【図１Ｆ】
2020125353.tif 000016
【図１Ｇ】
2020125353.tif 000017
【図１Ｈ】
2020125353.tif 000018
【図２】
2020125353.tif 000019
【図３Ａ】
2020125353.tif 000020
【図３Ｂ】
2020125353.tif 000021
【図３Ｃ】
2020125353.tif 000022
【図３Ｄ】
2020125353.tif 000023
【図３Ｅ】
2020125353.tif 000024
【図４−１】
2020125353.tif 000025
【図４−２】
2020125353.tif 000026
【図４−３】
2020125353.tif 000027
【図４−４】
2020125353.tif 000028
【図５】
2020125353.tif 000029
【図６】
2020125353.tif 000030
【図７Ａ】
2020125353.tif 000031
【図７Ｂ】
2020125353.tif 000032
【図８Ａ】
2020125353.tif 000033
【図８Ｂ】
2020125353.tif 000034
【図９】
2020125353.tif 000035
【図１０Ａ】
2020125353.tif 000036
【図１０Ｂ】
2020125353.tif 000037
【図１０Ｃ】
2020125353.tif 000038
【図１０Ｄ】
2020125353.tif 000039
【図１０Ｅ】
2020125353.tif 000040
【図１１】
2020125353.tif 000041
【図１２】
2020125353.tif 000042
【図１３】
2020125353.tif 000043
【図１４】
2020125353.tif 000044
【図１５】
2020125353.tif 000045
【図１６】
2020125353.tif 000046
【図１７】
2020125353.tif 000047
【図１８】
2020125353.tif 000048
【図１９】
2020125353.tif 000049
【図２０】
2020125353.tif 000050
【配列表】
2020125353000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。