(57)【要約】【課題】鰹節にアスペルギルス属に属する好乾性や耐乾性の限られた複数種類のカビが働いているところ、前記カビが近縁種であることに鑑み、近縁種間のカビであっても、カビの種を簡易迅速かつ正確に検出できる鰹節カビの種の検出方法を確立すること。【解決手段】（１）試料から鰹節カビを採取する工程と、（２）前記鰹節カビを培養する工程と、（３）培養後の前記鰹節カビを回収する工程と、（４）回収した前記鰹節カビからゲノムＤＮＡを抽出する工程と、（５）抽出した前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行いβ-チューブリン遺伝子断片を増幅する工程と、（６）前記遺伝子断片を増幅したＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供する工程と、を含むことを特徴とする、鰹節カビの種の検出方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）試料から鰹節カビを採取する工程と、
（２）前記鰹節カビを培養する工程と、
（３）培養後の前記鰹節カビを回収する工程と、
（４）回収した前記鰹節カビからゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
（５）抽出した前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行いβ-チューブリン遺伝子断片を増幅する工程と、
（６）前記遺伝子断片を増幅したＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供する工程と、
を含むことを特徴とする、鰹節カビの種の検出方法。
【請求項２】
前記工程（２）が、前記鰹節カビを固体培地で培養する工程であり、
前記固体培地の固化剤の凝固点が３０℃以下の範囲であり融点が６５℃以下の範囲であり、
前記工程（３）が、前記鰹節カビを加温して融解させた前記固体培地からろ過により回収する工程である、請求項１に記載の鰹節カビの種の検出方法。
【請求項３】
前記工程（５）が、配列表の配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列のプライマーを用いてβ-チューブリン遺伝子断片を増幅する工程である、請求項１又は２に記載の鰹節カビの種の検出方法。
【請求項４】
前記工程（６）における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドをマーカーのバンドと比較し、
前記マーカーがアスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）及びアスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの鰹節カビのβ-チューブリン遺伝子断片を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の鰹節カビの種の検出方法。
【請求項５】
前記工程（６）における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドを塩基配列解析し、
前記バンドのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に配列表の配列番号８及び配列番号９に示される塩基配列のプライマーを用いる、請求項１〜４のいずれかに記載の鰹節カビの種の検出方法。
【請求項６】
前記工程（６）における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドを濃度測定し、鰹節カビの種の存在比率を算出する請求項１〜５のいずれかに記載の鰹節カビの種の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鰹節カビの種の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鰹節の品質は、原料や製造工程の他、カビの種によって大きく異なることが知られているものの、品質管理は管理者の経験則に左右されることが多く、客観的な指標に基づく品質管理が望まれている。鰹節のカビ付け発酵現場において、鰹節カビを検査し、加工工程の進度を確認するとともに、品質管理を行うことが重要となっている。
カビの存在確認および種の検出方法として、例えば、以下の先行技術を挙げることができる。
【０００３】
まず、第一の先行技術として、１０日間前培養したカビを液体透過性フィルム上に接種した上、更に７日間個別に培養した後、カビの形態観察を行うことによりカビの種を同定する方法が存在する（特許文献１）。
しかし、第一の先行技術では、カビの分離には熟練した操作技術が必要であり、カビの形態観察によりカビの種を同定するには長年の経験が必要である。また、カビを個別に培養する必要があり、カビの培養から形態観察までの間に長い時間を要する。そのため、カビの種の簡易迅速な検出に適さない問題があった。
【０００４】
また、第二の先行技術として、好乾性カビ、耐乾性カビ及び好湿性カビを同じ培地で同時に培養し、培養した複数種類のカビの混合物から一括してＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いてカビの種を検出する方法が存在する（特許文献２）。
第二の先行技術によれば、培養した複数種類のカビの混合物は、液体窒素により凍結した後、ビーズとともに容器に入れられ、カビの細胞は振盪装置を用いて破砕される。また、破砕したカビの細胞からＤＮＡを抽出し、カビから抽出したＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を適用しＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅した上、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡチップ上のプローブにハイブリダイズさせるものである。
しかし、第二の先行技術では、複数種類のカビが近縁種でありＩＴＳ領域の塩基配列において高い相同性を有する場合、ＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅しても、カビの種の検出が困難であるところ、鰹節カビはアスペルギルス属に属する好乾性や耐乾性の限られた近縁種であり、第二の先行技術では鰹節カビの種の検出は困難であった。
また、第二の先行技術は、カビの細胞からＤＮＡを抽出するに際し、ビーズ破砕法を用いるものであるが、カビの細胞の破砕には振盪装置といった専用の装置が必要となる。カビの細胞を破砕しすぎるとＤＮＡの抽出が困難となり、液体窒素の取扱いも容易とはいえない。
【０００５】
また、第三の先行技術として、菌類の特異的な塩基配列部位をもとに、オリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、前記プライマーを用いて、菌類から抽出したＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を適用する方法が提案されている（特許文献３）。
第三の先行技術によれば、ＤＮＡのβ−チューブリン遺伝子を増幅した上、電気泳動によりアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）とアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ）とを検出することができる。
しかし、第三の先行技術では、電気泳動法は均一濃度のアガロースゲルを用いるものであり、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）とアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ）とのそれぞれの菌類に対応した前記プライマーを設計した上で、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）にはアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）に適したプライマーを用い、アスペルギルス・ウェスタジキアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ）にはアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ）に適したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を適用するため、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）とアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ）とを同時に検出することはできず、個別にしか検出できない。
また、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）とアスペルギルス・ウェスタジキアエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋｉａｅ）以外のアスペルギルス属のカビに前記プライマーを用いた場合、ＤＮＡのβ−チューブリン遺伝子を増幅することができるのか、不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献２】特開２００８−３５７７３号公報
【特許文献３】特開２０１５−１９５７７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、鰹節にアスペルギルス属に属する好乾性や耐乾性の限られた複数種類のカビが働いているところ、前記カビが近縁種であることに鑑み、近縁種間のカビであっても、カビの種を簡易迅速かつ正確に検出できる鰹節カビの種の検出方法を確立することにある。
なお、本発明の「アスペルギルス属」は、ユーロチウム属を包含する。狭義のアスペルギルス属は不完全世代の状態（アナモルフ）を指し狭義のアスペルギルス属の完全世代の状態（テレオモルフ）がユーロチウム属とされるところ、狭義のアスペルギルス属とユーロチウム属は生物種としては同一のものであり、命名法の趨勢に従い、両者の統一名としてアスペルギルス属を採用するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討した結果、ゲノムＤＮＡのβ−チューブリン遺伝子断片を増幅した上で、前記遺伝子断片を増幅したＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供する工程を含む鰹節カビの種の検出方法が、前記課題を解決することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］（１）試料から鰹節カビを採取する工程と、
（２）前記鰹節カビを培養する工程と、
（３）培養後の前記鰹節カビを回収する工程と、
（４）回収した前記鰹節カビからゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
（５）抽出した前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行いβ-チューブリン遺伝子断片を増幅する工程と、
（６）前記遺伝子断片を増幅したＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供する工程と、
を含むことを特徴とする、鰹節カビの種の検出方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明の一つは、
［２］前記工程（２）が、前記鰹節カビを固体培地で培養する工程であり、
前記固体培地の固化剤の凝固点が３０℃以下の範囲であり融点が６５℃以下の範囲であり、
前記工程（３）が、前記鰹節カビを加温して融解させた前記固体培地からろ過により回収する工程である、前記［１］に記載の鰹節カビの種の検出方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明の一つは、
［３］前記工程（５）が、配列表の配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列のプライマーを用いてβ-チューブリン遺伝子断片を増幅する工程である、前記［１］又は［２］に記載の鰹節カビの種の検出方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明の一つは、
［４］前記工程（６）における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドをマーカーのバンドと比較し、
前記マーカーがアスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）及びアスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの鰹節カビのβ-チューブリン遺伝子断片を含む、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の鰹節カビの種の検出方法を提供するものである。
【００１３】
また、本発明の一つは、
［５］前記工程（６）における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドを塩基配列解析し、
前記バンドのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に配列表の配列番号８及び配列番号９に示される塩基配列のプライマーを用いる、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の鰹節カビの種の検出方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明の一つは、
［６］前記工程（６）における変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドを濃度測定し、鰹節カビの種の存在比率を算出する前記［１］〜［５］のいずれかに記載の鰹節カビの種の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の鰹節の種の検出方法によれば、ゲノムＤＮＡのβ−チューブリン遺伝子断片を増幅した上で、前記ＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供する工程を含むことにより、一括して培養した鰹節カビの種を同時に検出することができるため、鰹節に生息する複数種類のカビの近縁種を簡易迅速かつ正確に同定できる。
鰹節カビの近縁種を簡易迅速かつ正確に同定できるようになれば、鰹節の品質と鰹節カビの種の構成との関連性について解明が進み、客観的な指標に基づく鰹節の品質管理が実現できる。
【００１６】
また、鰹節カビを低融点の固化剤を使用した固体培地で培養し、前記鰹節カビを湯浴等により加温して融解させた前記固体培地からろ過により回収すれば、培養後の前記鰹節カビをコロニーから個別に採取する必要がなくなり、培養後の前記鰹節カビを効率的に回収することができる。
【００１７】
また、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離して形成されたバンドを濃度測定すれば、鰹節カビの種の存在比率を定量的に把握できる。
鰹節カビの種の存在比率を定量的に把握できるようになれば、鰹節の品質に鰹節カビの種の存在比率が与える影響についても解明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、鰹節カビを平板固体培地で培養したときのコロニーを示す図面代用写真である。
【図２】図２は、ゲノムＤＮＡを抽出後、電気泳動により前記ゲノムＤＮＡのサイズや量を確認したことを示す図面代用写真である。
【図３】図３は、アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）及びアスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列の一部を比較した図である。
【図４】図４は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されたβ-チューブリン遺伝子断片（約４００ｂｐ）を電気泳動によりＤＮＡのサイズや量を確認したことを示す図面代用写真である。
【図５】図５は、増幅後のβ-チューブリン遺伝子断片（約４００ｂｐ）を精製した上、電気泳動によりＤＮＡのサイズや量を確認したことを示す図面代用写真である。
【図６】図６は、増幅後のβ-チューブリン遺伝子断片を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離して形成された、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）及びアスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）の各バンドを示した図面代用写真である。
【図７】図７は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離して形成された、製造元及び購入時期の異なる鰹節のカビのバンドとマーカーのバンドとを比較したことを示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［鰹節カビの採取工程］
まず、鰹節カビを採取する工程について説明する。
カビ付け発酵中又は発酵終了後の鰹節を試料として用い、前記鰹節から鰹節カビを採取する。
前記鰹節カビの採取に際しては、前記鰹節の表面に存在する全ての菌糸体及び胞子を採取することが好ましい。
【００２０】
前記鰹節カビを採取する手段としては特に限定されないが、前記鰹節の表面から拭き取り紙を用いて除去したり、ブラシを用いて前記鰹節カビを払い落したりして、前記鰹節カビを採取することができる。
拭き取り紙は毛羽立ちや脱落繊維がないものが良い。
【００２１】
［鰹節カビの培養工程］
次に、鰹節カビを培養する工程について説明する。
採取した前記鰹節カビは培地に塗抹して培養する。
前記鰹節カビの培養に使用する前記培地に限定はなく、液体培地又は固体培地を使用することができるが、固体培地が好ましい。前記培地には公知の培地用成分を使用することができる。
例えば、培養に使用する炭素源としては、グルコース、マンノース、フラクトース、マンノース、リボース、キシロース等のアルドース類、グルコン酸、マンノン酸等のアルドン酸類、グルカル酸、マンナル酸等のアルダル酸類、ソルビトール、マンニトール等のアルジトール類、グルクロン酸、マンヌロン酸等のウロン酸類等、
植物、動物由来のでんぷん、抽出液等、
エタノール、グリセリン等の水酸基含有化合物等を挙げることができる。
また、培養に使用する窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を挙げることができる。
また、培養に使用するリン源としては、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。
また、培養に使用するカリウム源としては、塩化カリウム、硝酸カリウム等を挙げることができる。
【００２２】
前記炭素源、窒素源、リン源、カリウム源等は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００２３】
前記培地の固化剤としては、寒天、アガロース等を挙げることができる。
前記固化剤は、培養後の前記鰹節カビを効率よく回収するため、低融点のものが好ましく、凝固点が３０℃以下の範囲であり融点が６５℃以下の範囲であるものがより好ましい。
前記固化剤の含有量は、前記培地の合計重量が１００重量部の場合、１．４〜１．６重量部であることが好ましい。
【００２４】
前記培地の水分活性値は０．９０〜１．０の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．９３〜０．９７の範囲である。
前記培地の糖濃度は５〜５０％の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１５〜２０％の範囲である。
【００２５】
前記培地用成分として、必要に応じてｐＨを調整するための緩衝成分、ポリアクリル酸誘導体等のゲル化成分等を配合することができる。
【００２６】
前記鰹節カビを培養するときの条件は以下のとおりである。
【００２７】
前記鰹節カビの培養を行うときの温度は、１５〜５５℃の範囲であることが好ましく、より好ましくは２０〜４５℃の範囲であり、さらに好ましくは２８〜３０℃の範囲である。
前記鰹節カビの培養を行うときの時間は、６時間〜６０日の範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜３０日の範囲であり、さらに好ましくは３〜２０日の範囲である。
前記鰹節カビの培養を行うときのｐＨは、２〜８の範囲の範囲が好ましく、より好ましくは３〜７の範囲であり、さらに好ましくは５〜６の範囲である。
【００２８】
前記鰹節カビの培養の際に使用する水に特に限定はなく、イオン交換水、蒸留水、水道水、通常の水道水から塩素を除去した工業用水等が使用される。
【００２９】
［培養後の鰹節カビの回収工程］
次に、培養後の前記鰹節カビを回収する工程について説明する。
培養後の前記鰹節カビの回収する方法としては、例えば、ろ過、遠心分離等の方法を挙げることができる。
【００３０】
まず、前記鰹節カビの培養に使用した前記培地及び培養後の前記鰹節カビをガラスビーカー、フラスコ、試験管等の抽出用容器に分離することなく一括して投入する。前記抽出用容器に水を添加した後、前記抽出用容器を湯浴等により加温し、培地の寒天成分を融解させ液状の状態とした。
【００３１】
次に、ろ過による場合、吸引ろ過装置を用いて前記抽出容器内の液体をろ過することにより、融解した培地と培養後の前記鰹節カビとを分離し、培養後の前記鰹節カビを回収することができる。
ろ過に使用するろ紙に特に限定はなく、定性ろ過用のセルロースろ紙、ガラス繊維ろ紙等が使用される。
【００３２】
遠心分離による場合、遠心分離装置を用いて前記抽出容器内の液体を上清と沈殿とに分離し、沈殿を回収することにより培養後の前記鰹節カビを回収することができる。
【００３３】
回収した前記鰹節カビは水により洗浄することが好ましい。
【００３４】
［ゲノムＤＮＡの抽出工程］
次に、回収した前記鰹節カビを磨砕しゲノムＤＮＡを抽出する。
回収した前記鰹節カビからゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、例えば、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法、市販のＤＮＡ抽出キットを用いる方法などを挙げることができる。
【００３５】
［ＰＣＲによるβ-チューブリン遺伝子断片の増幅工程］
次に、抽出した前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、β-チューブリン遺伝子断片を増幅する工程について説明する。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、サーマルサイクラー等の公知の反応装置を使用することができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、市販のＤＮＡポリメラーゼを含むキット及びその使用説明書に従って行うことができる。
【００３６】
ＰＣＲ反応液には、前記ゲノムＤＮＡのβ-チューブリン遺伝子断片を増幅できるプライマーセットを加える。
前記プライマーセットは、β‐チューブリン遺伝子領域の保存性の高い領域の塩基配列に基づいて設計する。
前記プライマーセットとしては、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示される塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセットを使用することができる（表１、配列表）。
【００３７】
【表１】
2020110091.tif 000003
【００３８】
すなわち、図３に示すとおり、β‐チューブリン遺伝子の領域を比較したところ、アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）では３００〜３３０ｂｐと７２０〜７６０ｂｐに、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）では２８０〜３１０ｂｐと６９０〜７３０ｂｐに、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）では２８０〜３１０ｂｐと７２０〜７５０ｂｐに、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）では２８０〜３１０ｂｐと７１０〜７４０ｂｐに、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）では７０〜１００ｂｐと４７０〜５００ｂｐに塩基配列の保存性が非常に高い部分が存在することを見いだした。
前記プライマーセットは近縁種間で高度に保存された塩基配列に基づいてβ‐チューブリン遺伝子の特定領域を増幅するために設計したものである。前記プライマーセットは図３の網掛けで示す領域にアニーリングする。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の条件は特に制限されず、反応装置ごとに最適な条件を定めればよいが、熱変性工程を９０〜１００℃で２０〜６０秒、アニーリング工程を５５〜６５℃で２０〜６０秒、鎖伸長工程を７０〜７４℃で２０〜６０秒行い、前記各工程を３０〜３５サイクル程度行うことにより、β-チューブリン遺伝子断片を検出可能な程度に増幅し、ＰＣＲ産物を得ることができる。
例えば、以下のように、前熱変性工程とポスト鎖伸長工程とを加え、下記（２）〜（４）の各工程を３５サイクル行えばよい。
（１）前熱変性工程：９８℃  ５分
（２）熱変性：９８℃  １０秒
（３）アニーリング工程：５９℃  ３０秒
（４）鎖伸長工程：７２℃  ３０秒
（５）ポスト鎖伸長工程：７２℃  ８分
【００４０】
［ＰＣＲ産物をＤＧＧＥに供する工程］
次に、前記ＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供する工程について説明する。
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）によれば、前記ＰＣＲ産物はその塩基配列やＧＣ含量の違いにより分離された上でバンドが形成されるため、塩基配列の部分的な違いを検出することができる。
【００４１】
まず、常法に従って、変性剤の濃度勾配を有するアクリルアミドゲルを作製する。
前記変性剤としては、例えば、尿素、ホルムアミド等を挙げることができる。
【００４２】
次に、前記ＰＣＲ産物を前記アクリルアミドゲルで電気泳動することにより分離する。
電気泳動は電気泳動装置付属の使用説明書に従って行うことができるが、アクリルアミドの濃度を８％に固定し、ホルムアミド及び尿素を含む変性剤の濃度を電気泳動方向に５％から３５％となるようポリアクリルアミドゲルを調製し、１×ＴＢＥ泳動用緩衝液を用いて前記ＰＣＲ産物を、泳動温度６０℃、電圧２００Ｖ、泳動時間３．５時間の条件下で、電気泳動に供することが好ましい。
また、変性剤の濃度勾配は、５％から３５％の範囲に限定されることはなく、適宜調整可能である。
電気泳動装置は日本エイドー社やバイオラド社などから購入可能である。
【００４３】
電気泳動に供した後、染色液を用いて染色し、ＵＶ光、ＬＥＤ光、青色光等で照射することにより、前記バンドを確認する。
前記染色液としては、例えば、エチジウムブロマイド溶液、アントシアン系色素溶液等を挙げることができる。
【００４４】
上述の各工程を経て、一括して培養した鰹節カビの種を同時に検出することができる。
【００４５】
［ＤＧＧＥにより分離して形成されたバンドとマーカーのバンドとの比較工程］
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により、前記ＰＣＲ産物はその塩基配列の部分的な違いにより分離された上で、バンドが形成される。前記バンドをマーカーのバンドと比較することにより、鰹節カビの種を同定する。
前記マーカーのバンドは、前記マーカーを前記ＰＣＲ産物とともに電気泳動に供することにより形成される。
【００４６】
前記マーカーは、既に塩基配列の分かっている鰹節カビのβ-チューブリン遺伝子断片を含むものであるが、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）及びアスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの鰹節カビのβ-チューブリン遺伝子断片を含むことができる。
アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）のβ−チューブリン遺伝子断片の塩基配列は配列番号３に示される塩基配列であり、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）のβ−チューブリン遺伝子断片の塩基配列は配列番号４に示される塩基配列であり、アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）のβ−チューブリン遺伝子断片の塩基配列は配列番号５に示される塩基配列であり、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）のβ−チューブリン遺伝子断片の塩基配列は配列番号６に示される塩基配列であり、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）のβ−チューブリン遺伝子断片の塩基配列は配列番号７示される塩基配列である。
【００４７】
［ＤＧＧＥにより分離して形成されたバンドの塩基配列とデータベースとの比較工程］
上述のとおり、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により、前記ＰＣＲ産物はその塩基配列の部分的な違いにより分離された上で、バンドが形成される。前記バンドを切り出し、塩基配列を解析することにより、鰹節カビの種を同定することもできる。
【００４８】
電気泳動後のゲルから前記バンドを切り出し、ゲノムＤＮＡを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、前記ゲノムＤＮＡのβ-チューブリン遺伝子断片を増幅し、ＰＣＲ産物を得る。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の条件は特に制限されず、反応装置ごとに最適な条件を定めればよい。
【００４９】
ＰＣＲ反応液には、前記ゲノムＤＮＡのβ-チューブリン遺伝子断片を増幅できるプライマーセットを加える。前記プライマーセットも、近縁種間で高度に保存されたβ‐チューブリン遺伝子の塩基配列に基づいて設計したものである。
前記プライマーセットによれば、ＧＣクランプを塩基配列の片側の末端に付加することができる。
前記プライマーセットとしては、配列番号８に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるリバースプライマーを含むプライマーセットを使用することができる（表１、配列表）。
【００５０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い前記ＰＣＲ産物を得た後、ＤＮＡシークエンサーを用いて前記ＰＣＲ産物の塩基配列を解析する。
前記ＰＣＲ産物の塩基配列をデータベース（ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)と比較することにより、鰹節カビの種を同定することができる。
【００５１】
［ＤＧＧＥにより分離して形成されたバンドの濃度測定工程］
上述のとおり、前記ＰＣＲ産物は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により、その塩基配列の部分的な違いにより分離された上で、バンドが形成される。
前記バンドは鰹節カビの量に応じて色調の濃淡が変化するところ、前記バンドの濃度を測定することにより、前記バンドに対応する鰹節カビの種の存在比率を算出することができる。
前記バンドの濃度を測定する方法としては、例えば、前記バンドを撮影した画像をコンピュータに読み込み、画像処理を行う方法が挙げられる。
【００５２】
以下、実施例に基づき本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない
【実施例１】
【００５３】
鰹の枯節の表面からキンバリー・クラーク社製のキムワイプ（登録商標）を用いて鰹節カビを２０ｍｇ採取した。
【００５４】
採取した前記鰹節カビに滅菌水１ｍｌを加え懸濁した。懸濁液をＭＹ２０培地（水分活性：０．９５）に塗抹した上、３０℃で７日間培養すると、形状や色調の異なる糸状菌を得ることができた（図１）。
表２は前記ＭＹ２０培地の組成を示したものである。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
培養後の前記鰹節カビは、前記培地から分離せずに、前記培地ごと５００ｍｌガラスビーカーに一括して投入した。
前記ガラスビーカーに脱イオン水１００ｍｌを添加した後、前記ガラスビーカーを１００℃の湯浴中に入れて５分間加温した。
前記培地の寒天成分が融解し液状の状態となるので、定性ろ過用のセルロースろ紙（粒子保持能：１１μｍ）をセットした吸引ろ過装置を用いることにより、融解した前記培地と培養後の前記鰹節カビとを分離し、培養後の前記鰹節カビを回収した。
回収した培養後の前記鰹節カビは脱イオン水により洗浄した。
【００５７】
回収した前記鰹節カビ１００ｍｇからＤＮＡ抽出キットを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを抽出には、キアゲン社製のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いた。
図２は、前記ゲノムＤＮＡを抽出後、１％アガロースゲルに電気泳動し、ＤＮＡのサイズや量を確認した結果を示したものである。
図２におけるレーンＭは分子量マーカーであり、ナカライテスク社製の１ｋｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｏｎｅである。
また、レーン１〜２は前記ゲノムＤＮＡ１μｌ又は５μｌを電気泳動した各サンプルの結果である。
【００５８】
抽出した前記ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、β-チューブリン遺伝子断片を増幅し、ＰＣＲ産物を得た。反応装置としては、タカラバイオ社製のＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈを使用した。
表３はＰＣＲ反応液の組成を示したものである。
ＰＣＲ用酵素としては、タカラバイオ社製のＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒを用いた。Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒには表１のＰｒｉｍｅｒ１を用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒには表１のＰｒｉｍｅｒ２を用いた。
【００５９】
【表３】
2020110091.tif 000005
【００６０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）終了後、前記ＰＣＲ産物をカラム（ジーエルサイエンス社製、商品名：ＭｏｎｏＦａｓ  ＤＮＡ精製キット１）を用いて精製した。
図４及び５は、前記ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルに電気泳動し、ＤＮＡのサイズや量を確認した結果を示したものである。
図４及び５におけるレーンＭは分子量マーカーであり、ナカライテスク社製の１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｏｎｅである。
また、各レーンは前記ＰＣＲ産物を電気泳動した各サンプルの結果である。
図４及び５によりβ-チューブリン遺伝子断片を増幅できたことが分かる。
【００６１】
前記ＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供しバンドを形成する。
まず、日本エイドー社製のゲル作製槽（商品名：グラジエントメーカー、型式：ＮＡ−１６１３Ａ）を用いて、５％変性剤溶液及び３５％変性剤溶液を混合しながらガラスプレートに重層することで５％から３５％の勾配をつけたポリアクリルアミドゲルを作製した。
表４は変性剤溶液の組成を示したものである。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
次に、日本エイドー社製の電気泳動装置（商品名：ＤＧＧＥ２連ミニゲル電気泳動装置、型式：ＮＢ−１４９１）を用いて前記ＰＣＲ産物１０μｌを前記ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供した。ポンプには東京理化器械社製の定量送液ポンプ（型式：ＭＰ−１０００）を用い、恒温槽には東京理化器械社製の投込み式恒温水槽（型式：ＮＴＴ−２２００）を用い、電源には日本エイドー社製の電源装置（型式：ＮＣ−１０１０）を用いた。
電気泳動に際しては、１×ＴＢＥ泳動用緩衝液を用い、泳動条件は泳動温度６０℃、電圧２００Ｖ、泳動時間３．５時間とした。
【００６４】
電気泳動に供した後、日本ジェネティクス社製の染色液（商品名：ミドリグリーンアドバンス）を含む１×ＴＢＥに３０分間浸漬し染色した上で日本ジェネティクス社製のゲル撮影装置（商品名：ＦＡＳ−ＬＥＤ  ＢＯＸ）を用い、分離されたバンドを確認した。
結果を図６に示す。
図６に示すとおり、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）及びアスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）の各バンドが確認でき、本発明の鰹節の種の検出方法によれば、一括して培養した鰹節カビの種を同時に検出することができた。
【実施例２】
【００６５】
実施例２では、製造元及び購入時期が異なる鰹節（鹿児島県枕崎市産又は同県山川町産）を実施例１の場合と全く同じ操作をした上で形成したバンドとマーカーのバンドとを比較した。
レーンＭ１は、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）及びアスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）のβ-チューブリン遺伝子断片を含むマーカーを電気泳動に供したものである。
レーンＭ２は、アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）及びアスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）のβ-チューブリン遺伝子断片を含むマーカーを電気泳動に供したものである。
結果を図７に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の鰹節の種の検出方法によれば、一括して培養した鰹節カビの種を同時に検出できるため、鰹節に生息する複数種類のカビの近縁種を簡易迅速かつ正確に同定できる。
そのため、鰹節の品質と鰹節カビの種の構成との関連性について解明が進み、客観的な指標に基づく鰹節の品質管理が実現でき、香りや栄養価などに優れた付加価値の高い枯節の製造が可能となる。
また、本発明は、鰹節カビに限られず、食品製造、臨床、文化財などにおける好乾性や耐乾性のカビの検査に広く応用が可能である。
【符号の説明】
【００６７】
（ａ）  アスペルギルス・アムステロダミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）
（ｒ）  アスペルギルス・ルバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｕｂｅｒ）
（ｃ）  アスペルギルス・シバリエリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）
（ｓ）  アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉｉ）
（ｐ）  アスペルギルス・シュードグラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｇｌａｕｃｕｓ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
2020110091.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
2020110091.tif 000012
【図７】
2020110091.tif 000013
【配列表】
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