(57)【要約】【課題】一実施形態において、本発明は、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤を提供することを課題とする。【解決手段】一実施形態において、本発明は、MER受容体の阻害剤からなる、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
MER受容体の阻害剤からなる、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤。
【請求項２】
前記MER受容体の阻害剤が、（i）MER受容体を阻害し、TYRO3受容体及びAXL受容体を阻害しないか、又は（ii）MER受容体に加えてTYRO3受容体及び／又はAXL受容体を阻害する、請求項１に記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項３】
前記MER受容体の阻害剤が、低分子化合物又は抗体若しくは抗体断片である、請求項１又は２に記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項４】
前記MER受容体の阻害剤が、
【化１】
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で表される式を有する化合物である、請求項３に記載の治療及び／又は予防剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防剤を含む、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MER受容体の阻害剤からなる、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤、又は該治療及び／又は予防剤を含む、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防のための医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性呼吸窮迫症候群（ARDS）は、急性に発症する低酸素血症である（非特許文献1）。ARDSの原因として、肺胞領域の好中球主体の非特異的な過剰炎症反応とそれに伴う広範な肺損傷が挙げられる。ARDS発症後の死亡率は30％から58％と極めて高く、予後不良である。
【０００３】
世界50か国の集中治療室（ICU）における最新の疫学研究（LUNG-SAFE）では、ICU入室患者の10.4%がARDSを発症し、院内死亡率はおよそ40%であった。米国での統計では、人口10万人あたり年50〜80人程度、本邦では人口10万人あたり年6.1人であった。推定される本邦のARDS患者数は7320人とされる。また、造血器腫瘍の治療における骨髄抑制に起因する合併症としても、敗血症に続発するARDSは予後を左右する重要なものである。
【０００４】
ARDSに対する治療としては、呼吸不全に対する人工呼吸器管理が行われている。しかしながら、人工呼吸器管理は対症療法であり長期化することが多く、生命予後を改善する治療ではない。また、メチルプレドニゾロン、好中球エラスターゼ阻害薬などの薬物療法も行われるが、積極的に推奨するエビデンスに乏しく、ARDSの生命予後を改善できる薬剤ではない。以上の通り、これまでのところ、ARDSに対する有効な治療薬は、知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ranieri VM et al., JAMA, 307:2526-2533,2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、MER受容体の阻害剤が急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤となり得ることを見出し、本願発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、以下の実施形態を包含する。
（１）MER受容体の阻害剤からなる、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤。
（２）前記MER受容体の阻害剤が、（i）MER受容体を阻害し、TYRO3受容体及びAXL受容体を阻害しないか、又は（ii）MER受容体に加えてTYRO3受容体及び／又はAXL受容体を阻害する、（１）に記載の治療及び／又は予防剤。
（３）前記MER受容体の阻害剤が、低分子化合物又は抗体若しくは抗体断片である、（１）又は（２）に記載の治療及び／又は予防剤。
（４）前記MER受容体の阻害剤が、
【化１】
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で表される式を有する化合物である、（３）に記載の治療及び／又は予防剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の治療及び／又は予防剤を含む、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図1は、LPS吸引によって作製されたARDSモデルマウスの気管支肺洗浄液（A〜D）及び肺組織（E〜H）の観察結果を示す。図1A及びEは、陰性対照としての正常マウス、図1B及びFは、LPS吸引によって作製されたARDSモデルマウス、図C及びFは、UNC2250の静脈内投与を行ったARDSモデルマウス、図D及びHはUNC2250の静脈内投与を行った正常マウスの結果をそれぞれ示す。
【図２】図2は、LPS吸引によって作製されたARDSマウスモデルの気管支肺洗浄液（BAL）における、単核細胞（A）、好中球（B）、及び単球（C）の総数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤
一態様において、本発明は、MER受容体の阻害剤からなる、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤に関する。
【００１２】
本明細書において「急性呼吸窮迫症候群（Acute Respiratory Distress Syndrome、ARDS）」は、急性に発症した低酸素血症を指す。本明細書において、ARDSは、好ましくはRanieri VM. et al., JAMA., 2012, 20;307(23): pp. 2526-2533に記載された定義（以下、「Berlin定義」とも記載する）に従い、すなわち、ARDSは、好ましくは先行する基礎疾患及び／又は外傷をもち、胸部のX線写真上では両側性の肺浸潤影を認め、並びに／又はその原因が心不全、腎不全、及び血管内水分過剰のみでは説明できない病態であり得る。Berlin定義によれば、ARDSは、低酸素血症の程度（PaO2/FIO2（脈血酸素分圧／吸入気酸素分画））に応じて、以下の3つカテゴリー：軽症（200 mmHg＜PaO2/FIO2≦300 mmHg）、中等症（100 mmHg＜PaO2/FIO2≦200 mmHg）、及び重症（PaO2/FIO2≦100 mmHg）に分けられる。なお、本明細書において、ARDSは、従来の定義（American-European Consensus Conference；AECCに基づいて1994年にまとめられた定義）における急性肺障害（ALI）を包含する。
【００１３】
ARDSの発症原因となる病態としては、限定するものではないが、肺の直接損傷と間接損傷が挙げられる。肺の直接損傷には肺炎、胃内容物の吸引（誤嚥）、脂肪塞栓、有毒ガス等に起因する吸入障害、肺移植後等に生ずる再灌流肺水腫、溺水、放射線肺障害、及び肺挫傷が挙げられ、肺の間接損傷には、敗血症、外傷、高度の熱傷（例えばショックと大量輸血を伴う場合）、心肺バイパス術、薬物中毒（パラコート中毒等）、急性膵炎、自己免疫疾患、輸血関連急性肺損傷、及び（TRALI：輸血関連急性肺障害）が挙げられる（ARDS診療ガイドライン2016）。
【００１４】
本明細書において「MER受容体」とは、TAM（TYRO3/AXL/MER）受容体を構成する受容体チロシンキナーゼの一種を指す（Rachel M. A. Linger et al., Adv. Cancer Res. 2008, 100, pp.35-83）。TAM受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、保存された細胞内キナーゼドメインを含む。TAM受容体は、キナーゼドメイン中の保存された配列、及び細胞外領域の付着分子様ドメインの存在によって、他の受容体チロシンキナーゼと区別される。TAM受容体のリガンドとしては、ビタミンK依存性リガンドであるGas6及びProtein Sが挙げられる。
【００１５】
MER受容体、並びにTYRO3受容体及びAXL受容体の塩基配列及びアミノ酸配列は当業者には公知であり、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができる。例えば、ヒトMER受容体は、（i）配列番号1のアミノ酸配列、（ii）配列番号1のアミノ酸配列に対して70％以上、80%以上、85%以上、又は90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は（iii）配列番号1のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。また、ヒトMER受容体をコードするポリヌクレオチドは、（i）配列番号2の塩基配列、（ii）配列番号2の塩基配列に対して70％以上、80%以上、85%以上、又は90%以上の同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号2の塩基配列において1若しくは数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含んでよい。
【００１６】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。また、本明細書において、アミノ酸配列又は塩基配列に関する「１若しくは数個」の範囲は、1から10個、例えば1から7個、1から5個、1から4個、1から3個、又は1個若しくは2個である。
【００１７】
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、MER受容体の選択的阻害剤であってもよく、すなわち、MER受容体を阻害し、他のTAM（TYRO3/AXL/MER）受容体であるTYRO3受容体及びAXL受容体を阻害しない。ここで、TYRO3受容体及びAXL受容体を阻害しないとは、これらの受容体を完全に阻害しないことに加えて、実質的に阻害しないことを含む。本明細書において、「実質的に阻害しない」とは、TYRO3受容体及びAXL受容体に対する阻害活性が、MER受容体に対する阻害活性よりも顕著に低いことを意味し得る。例えばMER受容体に対する50%阻害濃度（IC50）は、TYRO3受容体及びAXL受容体に対するIC50と比較して、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、又は50倍以上低い値であり得る。
【００１８】
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、MER受容体に加えて他のTAM受容体、すなわちTYRO3受容体及び／又はAXL受容体を阻害するものであってもよい。
【００１９】
MER受容体の阻害剤は、MER受容体タンパク質の活性、例えばチロシンキナーゼ活性を阻害するものであってもよいし、MER受容体遺伝子の発現を阻害又は抑制するものであってもよい。MER受容体の阻害活性の有無は、MER受容体チロシンキナーゼの下流のシグナリング経路、これによって生ずる反応（例えば、遺伝子又はタンパク質（例えばサイトカイン）の発現の増減）、又はMER受容体遺伝子の発現量を測定することによって容易に調べることができる。同様に、TYRO3受容体及びAXL受容体の活性阻害は、これらの受容体タンパク質の活性を阻害するものであってもよいし、これら受容体遺伝子の発現を阻害又は抑制するものであってもよい。また、TYRO3受容体及びAXL受容体の阻害活性の有無は、これらチロシンキナーゼの下流のシグナリング経路、これによって生ずる反応、又はこれら受容体遺伝子の発現量を測定することによって容易に調べることができる。
【００２０】
一実施形態において、「MER受容体の阻害剤」は、低分子化合物、抗体、アプタマー、RNAi分子、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される1以上の成分である。MER受容体の阻害剤を構成し得る各成分について、以下に記載する。
【００２１】
（１）低分子化合物
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、低分子化合物を含む、又はこれからなる。MER受容体の阻害剤となり得る低分子化合物としては、公知のものを使用することができ、例えば特表2017-513942に記載の化合物を使用することができる。
【００２２】
用い得る低分子化合物の例として、限定するものではないが、例えば以下の化合物：
【化２】
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の化学式で表されるUNC2250；
【化３】
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の化学式で表されるUNC2881；
【化４】
2020186187.tif 000006
の式で表されるLCD1267；
【化５】
2020186187.tif 000007
の式で表されるRXDX-106；及びONO-7475が挙げられる。なお、上記UNC2250及びUNC2881はMER受容体の選択的阻害剤であり得、LCD1267及びRXDX-106はMER受容体、TYRO3受容体及びAXL受容体の阻害剤であり得、ONO-7475はMER受容体及びAXL受容体の阻害剤であり得る。
【００２３】
（２）抗体
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、抗MER受容体抗体を含む、又はこれからなる。抗体は、哺乳動物及び鳥を含めた任意の動物由来（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はヒト等由来）であり得る。
【００２４】
本発明において使用され得る抗体は、特に限定されないが、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
【００２５】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、単一免疫グロブリンのクローン群をいう。モノクローナル抗体を構成する各免疫グロブリンは、共通するフレームワーク領域及び共通する相補性決定領域を含み、同一抗原の同一エピトープを認識し、それに結合することができる。モノクローナル抗体は、単一細胞由来のハイブリドーマから得ることができる。
【００２６】
本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、同一抗原の異なるエピトープを認識し結合する複数種の免疫グロブリン群をいう。ポリクローナル抗体は、標的分子を抗原として動物に免疫後、その動物の血清から得ることができる。
【００２７】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子には、IgG、IgM、IgA、IgE、及びIgDの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであってもよい。好ましくはIgGである。
【００２８】
MER受容体を認識して結合し、その活性を阻害するポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する方法は、MER受容体タンパク質又はその断片を抗原として当該分野で公知の抗体作製方法に準じて行えばよい。抗体はまた、製造業者から市販のものを得て用いてもよい。
【００２９】
本明細書において「抗体断片」とは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の部分断片であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有し、かつMER受容体の阻害活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、抗原結合部位を少なくとも1つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも1組のVLとVHを有するポリペプチド鎖、又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Fab、F(ab')2、Fab'等が挙げられる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原である標的分子と特異的に結合する能力を有している。
【００３０】
（３）アプタマー
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、MER受容体に結合するアプタマーを含む、又はこれからなる。本明細書において、「アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、及び三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合する能力を持つリガンド分子をいう。
【００３１】
本明細書で使用する核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いた試験管内選別法が挙げられる。SELEX法では、例えば、まずRNAアプタマーを分離する場合であれば、ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択する。回収したRNA分子をRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、選択されたRNA分子の増幅産物を得て、それを次のラウンドのRNAプールにする。この一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNA分子を選択する方法である。一方、SELEX法で、DNAアプタマーを分離する場合も、回収したDNA分子を増幅する際にRT-PCR反応を経る必要がない点を除き、RNAアプタマーを分離する場合と基本手順は同じである。
【００３２】
SELEX法において、ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲であってよい。標的分子への特異性を高めるためには、予め標的分子に類似する分子とRNAプール又はRNAプールとを混合し、標的分子に類似する分子と結合しなかったRNA分子又はDNA分子からなるプールを用いればよい。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92：11509-11513）に準じて行えばよい。
【００３３】
（４）RNAi分子
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、RNAi分子を含む、又はこれからなる。本明細書において「RNAi分子」とは、生体内においてRNAi（RNA干渉：RNA interference）を誘導し、標的とする遺伝子転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができるRNA分子をいう（Fire A. et al．，1998，Nature，391, 806-811）。
【００３４】
RNAi分子の例として、siRNA又はshRNAが挙げられる。本明細書において、「siRNA」（低分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の一部に相当する塩基配列を有するセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。本明細書において「shRNA」（short hairpin RNA）とは、適当な配列を有する短いスペーサー配列によって上記のsiRNA又は成熟型二本鎖miRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖が連結された一本鎖RNAをいう。つまり、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサー配列がループ構造を形成することによって、分子全体としてヘアピン型のステム−ループ構造を形成している。siRNA若しくはshRNAは、例えばTAM受容体をコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者であれば容易に設計することができる。RNAi分子は、ベクターに導入して被験者に投与することもできる。
【００３５】
（５）アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態において、MER受容体の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、又はこれからなる。本明細書において「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的転写産物(例えばTAM受容体をコードする遺伝子等の標的遺伝子の転写産物)の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な(すなわち、相補的な)塩基配列を含み、標的転写産物にアンチセンス効果をもたらすことができる、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【００３６】
「アンチセンス効果」とは、標的転写産物(RNAセンス鎖)と、転写産物等の部分配列に相補的で、かつアンチセンス効果を引き起こすように設計された鎖(例えばDNA鎖)との、ハイブリダイゼーションの結果として生じる、標的転写産物の発現調節を意味する。標的転写産物の発現調節は、標的遺伝子の発現または標的転写産物のレベル(発現量)を抑制又は低下させること、翻訳の阻害又はスプライシング機能改変効果、例えばエクソンスキッピング、及び、転写産物の分解を含む。当業者であれば、標的遺伝子、例えばTAM受容体をコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを容易に設計することができる。
【００３７】
２．医薬組成物
一態様において、本発明は、本明細書に記載のMER受容体の阻害剤、又は急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤を含む、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防のための組成物、例えば医薬組成物に関する。本発明の組成物は、本明細書に記載のMER受容体の阻害剤、又は急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤から実質的になるものであってもよい。
【００３８】
本発明の組成物に含まれるMER受容体の阻害剤の量（例えば治療及び／又は予防有効量）は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、本発明の組成物に含まれるMER受容体の阻害剤の量は、限定するものではないが、例えば組成物が投与される被験体の体重1kg当たり、0.001〜100.0mg、0.010〜10mg、例えば0.010〜1.0mg又は0.010〜0.1mgであってよい。
【００３９】
本発明の組成物は、上記阻害剤に加えて、他の成分、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、安定化剤、滑沢剤、希釈剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、及び香料等を含んでもよい。
【００４０】
本発明の組成物は、常法により製剤化され得る。製剤化は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
【００４１】
投与形態は特に制限されず、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、及びエリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、及び軟膏剤等の非経口剤として投与され得る。
【００４２】
本発明の阻害剤又は組成物が投与され得る被験体としては、限定されるものではないが、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、例えばヒト又はマウス、好ましくはヒトである。
【００４３】
本明細書に記載のMER受容体の阻害剤又は組成物の投与量、投与間隔、及び投与期間は、当業者であれば、被験体の性別、体重、年齢、並びに疾患等の経過及び症状等の種々の要因を考慮して適宜定めることができる。例えば、阻害剤又は組成物の投与量は、0.001〜100.0mg/kg体重、0.010〜10mg/kg体重、好ましくは0.010〜1.0mg/kg体重、又は0.010〜0.1mg/kg体重であってよい。また、投与回数は、限定するものではないが、1日3回、1日2回、1日1回、2日に1回、3日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1カ月に1回等であってよい。また、投与期間は、限定するものではないが、1日、2日、3日、1週間、2週間、1カ月、半年、一年、又はそれ以上であってよい。
【００４４】
３．他の態様
一態様において、本発明は、本明細書に記載のMER受容体の阻害剤、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤、又は組成物を被験体に投与することを含む、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防方法に関する。
【００４５】
一態様において、本発明は、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防における使用のための、本明細書に記載のMER受容体の阻害剤、急性呼吸窮迫症候群の治療及び／又は予防剤、又は組成物に関する。
【００４６】
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１：ARDSモデルマウスにおけるMER受容体阻害剤の効果の検討＞
（方法）
C57BL/6マウスに大腸菌O55:B5由来リポポリサッカライド（LPS, Sigma-Aldrich, L2880）5 mg/kgを鼻腔から肺内に吸引させ、ARDSモデルを作製した。LPS吸引後1日において、マウスは著明な活動性低下、食欲低下、及び全身の強い皮膚発赤を認めたことから、敗血症及びARDSを発症している可能性が高いと判断された。
【００４８】
LPS吸引後1日に選択的Mer受容体阻害剤であるUNC2250（Axon Medchem LLC, VA, USA）3mg/kgを尾静脈より静脈内投与した。LPS吸引の3日後にマウスの肺胞洗浄液を採取し、肺胞内に増加している有核細胞数とその血球分画を、血球観察に習熟した研究者2名が顕微鏡にて目視計測した。肺胞内洗浄液の採取方法は、次のとおりである。マウス頸部を皮下切開し気管を露出させた後に、カニューレ（BD InsyteTM, IF381823）をマウス気管内に留置した。その後、マウス気管内に生理食塩水0.6 ｍLを注入した後吸引した。同様の操作を3回繰り返し肺胞内洗浄液を得た。その後マウスを屠殺し、肺組織を採取しホルマリン固定した。パラフィン包埋後切片を作製しヘマトキシリン・エオジン染色を用いて病理組織学的に観察した。
【００４９】
（結果）
図1に、LPS吸引によって作製されたARDSモデルマウスの気管支肺洗浄液（A〜D）及び肺組織（E〜H）の観察結果を示す。LPS吸引によって作製されたARDSモデルマウスでは、血栓を伴う広範な肺障害と肺胞内細胞浸潤の顕著な増加が認められた（図1B、F）。ARDSマウスモデルにおいて、UNC2250の静脈内投与は、重度の肺障害と肺胞内浸潤細胞の増加を著明に抑えた（図1C、G）。なお、陰性対照としての正常マウス（1図A、E）、及び正常マウスにUNC2250静脈内投与を行った群（図1D、H）では、肺障害及び肺胞内浸潤細胞の増加は認められなかった。
【００５０】
図2に、LPS吸引によって作製されたARDSマウスモデルの気管支肺洗浄液（BAL）における、単核細胞（A）、好中球（B）、及び単球（C）の総数を示す。LPS吸引によって作製されたARDSマウスモデルでは、肺胞内細胞浸潤の顕著な増加が認められた（図2A）。肺胞内浸潤細胞の細胞分画を検討したところ、好中球及び単球が明らかに増加していた（図2B、C）。一方、ARDSマウスにMER受容体阻害剤UNC2250静脈内投与をしたところ、肺胞内浸潤細胞（好中球及び単球）の増加が顕著に抑制された（図2A-C）。
【図１】
2020186187.tif 000009
【図２】
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【配列表】
2020186187000001.app