(57)【要約】【課題】短時間で効率の良い分離を行うことができるクロマトグラフ方法であり、分離度の向上を達成する。【解決手段】インジェクタ（Ａ）、及び、分離カラム（Ｂ）を利用して行う分取液体クロマトグラフ方法であって、インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、溶媒の混合比を変化させながらクロマトグラフを行うものであり、溶媒混合比の変化は、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行い、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘとし、一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定して行う分取液体クロマトグラフ方法。【選択図】図２
2020125912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インジェクタ（Ａ）、及び、分離カラム（Ｂ）を利用して行う分取液体クロマトグラフ方法であって、
インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、
溶媒の混合比を変化させながらクロマトグラフを行うものであり、
溶媒混合比の変化は、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行い、
精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘとし、
一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定して行うことを特徴とする分取液体クロマトグラフ方法。
【請求項２】
Ｔの時点でインジェクタ（Ａ）に流入した溶媒は、ｔｘと略同一の時間にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に流入し始めるようにＴの最適値を設定する請求項１記載の分取液体クロマトグラフ方法。
【請求項３】
使用するカラムサイズに応じた、カラムの空容積に基づいてＴの最適値を設定する請求項１又は２記載の分取液体クロマトグラフ方法。
【請求項４】
使用するインジェクタサイズに応じて、インジェクタの空容積に基づいてＴを設定する請求項１，２又は３記載の分取液体クロマトグラフ方法。
【請求項５】
分取用液体クロマトグラフを行う前に、前記精製対象化合物ＸのＲｆ値を測定する工程を有する請求項１，２，３又は４記載の分取液体クロマトグラフ方法。
【請求項６】
精製対象化合物ＸのＲｆ値及びインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´に基づいてＴを決定する工程を有する請求項１，２，３，４又は５記載の分取液体クロマトグラフ方法。
【請求項７】
インジェクタ（Ａ）、分離カラム（Ｂ）、装置を制御するためのコンピュータ（Ｃ）及び、前記コンピュータ（Ｃ）によって制御される溶媒混合比制御手段（Ｄ）を備える分取用液体クロマトグラフ装置であって、
インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、
溶媒混合比制御手段（Ｄ）による混合比の変化においては、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行うよう制御するものであり、
当該制御においては、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘとし、
一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定して行うものであることを特徴とする分取用液体クロマトグラフ装置。
【請求項８】
Ｔの時点でインジェクタ（Ａ）に流入した溶媒は、ｔｘと略同一の時間にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に流入し始めるようにＴの最適値を設定する請求項７記載の分取用液体クロマトグラフ装置。
【請求項９】
使用するカラムサイズに応じた、カラムの空容積に基づいてＴの最適値を設定する請求項７又は８記載の分取用液体クロマトグラフ装置。
【請求項１０】
使用するインジェクタサイズに応じて、インジェクタの空容積に基づいてＴの最適値を設定する請求項７、８又は９記載の分取液体クロマトグラフ装置。
【請求項１１】
コンピュータ（Ｃ）は、精製対象化合物ＸのＲｆ値又は薄層クロマトグラフ結果を入力する入力手段を備える請求項７，８，９又は１０記載の分取用液体クロマトグラフ装置。
【請求項１２】
コンピュータ（Ｃ）は、Ｒｆ値入力手段によって入力されたＲｆ値又は薄層クロマトグラフ結果及びインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´に基づいて、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘを算出する流入時間算出手段を備えるものである請求項７，８，９，１０又は１１記載の分取用液体クロマトグラフ装置。
【請求項１３】
インジェクタ（Ａ）、分離カラム（Ｂ）、装置を制御するためのコンピュータ（Ｃ）及び、前記コンピュータ（Ｃ）によって制御される溶媒混合比制御手段（Ｄ）を備える分取用液体クロマトグラフ装置を制御するためのプログラムであって、
インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、
溶媒混合比制御手段（Ｄ）による混合比の変化においては、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行うよう制御するものであり、
当該制御においては、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘ
一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定し、制御を行うものであることを特徴とする分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム。
【請求項１４】
Ｔの時点でインジェクタ（Ａ）に流入した溶媒は、ｔｘと略同一の時間にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に流入し始めるようにＴの最適値を設定する請求項１３記載の分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム。
【請求項１５】
使用するカラムサイズに応じた、カラムの空容積に基づいてＴの最適値を設定する請求項１３又は１４記載の分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム。
【請求項１６】
使用するインジェクタサイズに応じて、インジェクタの空容積に基づいてＴを設定する請求項１３，１４又は１５記載の分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム。
【請求項１７】
分取用液体クロマトグラフを行う前に、前記精製対象化合物ＸのＲｆ値を入力する手段を有する請求項１３，１４，１５又は１６記載の分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム。
【請求項１８】
精製対象化合物ＸのＲｆ値及びインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´に基づいてＴを決定する工程を有する請求項１３，１４，１５，１６又は１７記載の分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分取液体クロマトグラフ方法、分取用液体クロマトグラフ装置及び分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
分取用液体クロマトグラフ装置は、相違する化合物のカラム充填剤中の通過速度の差異を利用したクロマトグラフの原理によって、複数の成分が混在している溶液中の各成分を分離するための装置である。近年はこのような分取用液体クロマトグラフにおいても、機能が高度化・自動化しており、効率よい分取を図るための試みが多くなされている。
【０００３】
一般に、分取用液体クロマトグラフ装置においては、複数の成分が完全に分離できることと分離時間ができるだけ短いことが要求されることが多い。しかし、これらは本来相反する要求であり、完全な分離を行おうとすると分離時間が長くなる傾向がある。このため、これらの両方を満たす分離条件を見出すためには、分離条件についての詳細な検討が必要になる。
【０００４】
このような分取用液体クロマトグラフにおいては、一般に時間の経過とともに流入溶媒の溶媒混合比を変化させること（以下これを「グラジエント」と記載することがある）がしばしば行われる。
すなわち、最初の段階では分離能が高い組成の溶媒を使用し、時間の経過とともに、流出速度が速い溶媒組成へと混合比を変化させるものである。このようなグラジエントをどのようにして行うかは、短時間で効率よく分離を行うかという観点においては極めて重要な要素となる。しかし、このようなグラジエントの決定方法について充分な検討は行われていない。
【０００５】
特許文献１においては、インジェクタを使用した分取用液体クロマトグラフ装置が開示されている。更に、極性有機溶媒を使用した場合の極性有機溶媒トラップ体積を算出し、クロマトグラフィの条件を算出することが記載されている。しかし、このような方法において検討されているのは、極性有機溶媒をサンプルを溶解するための溶媒として使用した場合の補正のみであり、一般的な溶媒のグラジエント条件についての検討は行われていない。
【０００６】
特許文献２においては、グラジエントカーブの決定方法が開示されている。しかし、ここではインジェクタを使用した場合のインジェクタとグラジエントの関係について検討することは行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−２１３７７７号公報
【特許文献２】特開２０００−３５６６２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の分取液体クロマトグラフ方法は、短時間で効率の良い分離を行うことができるクロマトグラフ方法であり、分離度の向上と分離時間の短縮という、本来両立しにくい目的を同時に達成することができるものである。
本発明の分取用液体クロマトグラフ装置及び分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、作業者が上述した分取液体クロマトグラフ方法を簡単に行うことができるよう、支援するための装置及びプログラムである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
インジェクタ（Ａ）、及び、分離カラム（Ｂ）を利用して行う分取液体クロマトグラフ方法であって、
インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、
溶媒の混合比を変化させながらクロマトグラフを行うものであり、
溶媒混合比の変化は、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行い、
精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘとし、
一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定して行うことを特徴とする分取液体クロマトグラフ方法である。
【００１０】
上記分取液体クロマトグラフ方法は、Ｔの時点でインジェクタ（Ａ）に流入した溶媒が、ｔｘと略同一の時間にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に流入し始めるようにＴの最適値を設定するものであってもよい。
上記分取液体クロマトグラフ方法は、使用するカラムサイズに応じた、カラムの空容積に基づいてＴの最適値を設定するものであってもよい。
【００１１】
上記分取液体クロマトグラフ方法は、使用するインジェクタサイズに応じて、インジェクタの空容積に基づいてＴを設定するものであってもよい。
上記分取液体クロマトグラフ方法は、分取用液体クロマトグラフを行う前に、前記精製対象化合物ＸのＲｆ値を測定する工程を有するものであってもよい。
上記分取液体クロマトグラフ方法は、精製対象化合物ＸのＲｆ値及びインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´に基づいてＴを決定する工程を有するものであってもよい。
【００１２】
本発明は、インジェクタ（Ａ）、分離カラム（Ｂ）、装置を制御するためのコンピュータ（Ｃ）及び、前記コンピュータ（Ｃ）によって制御される溶媒混合比制御手段（Ｄ）を備える分取用液体クロマトグラフ装置であって、
インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、
溶媒混合比制御手段（Ｄ）による混合比の変化においては、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行うよう制御するものであり、
当該制御においては、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘとし、
一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘ
となるようにＴを設定して行うものであることを特徴とする分取用液体クロマトグラフ装置でもある。
【００１３】
上記分取用液体クロマトグラフ装置は、Ｔの時点でインジェクタ（Ａ）に流入した溶媒は、ｔｘと略同一の時間にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に流入し始めるようにＴの最適値を設定するものであってもよい。
上記分取用液体クロマトグラフ装置は、使用するカラムサイズに応じた、カラムの空容積に基づいてＴの最適値を設定するものであってもよい。
【００１４】
上記分取用液体クロマトグラフ装置は、使用するインジェクタサイズに応じて、インジェクタの空容積に基づいてＴの最適値を設定するものであってもよい。
上記コンピュータ（Ｃ）は、精製対象化合物ＸのＲｆ値又は薄層クロマトグラフ結果を入力する入力手段を備えるものであってもよい。
上記コンピュータ（Ｃ）は、Ｒｆ値入力手段によって入力されたＲｆ値又は薄層クロマトグラフ結果及びインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´に基づいて、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘを算出する流入時間算出手段を備えるものであってもよい。
【００１５】
本発明は、インジェクタ（Ａ）、分離カラム（Ｂ）、装置を制御するためのコンピュータ（Ｃ）及び、前記コンピュータ（Ｃ）によって制御される溶媒混合比制御手段（Ｄ）を備える分取用液体クロマトグラフ装置を制御するためのプログラムであって、
インジェクタ（Ａ）の下流に分離カラム（Ｂ）を接続するものであり、
溶媒混合比制御手段（Ｄ）による混合比の変化においては、分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行うよう制御するものであり、
当該制御においては、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘ
一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定し、制御を行うものであることを特徴とする分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムでもある。
【００１６】
上記分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、Ｔの時点でインジェクタ（Ａ）に流入した溶媒は、ｔｘと略同一の時間にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に流入し始めるようにＴの最適値を設定するものであってもよい。
分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、使用するカラムサイズに応じた、カラムの空容積に基づいてＴの最適値を設定するものであってもよい。
【００１７】
上記分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、使用するインジェクタサイズに応じて、インジェクタの空容積に基づいてＴを設定するものであってもよい。
上記分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、分取用液体クロマトグラフを行う前に、前記精製対象化合物ＸのＲｆ値を入力する手段を有するものであってもよい。
上記分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、精製対象化合物ＸのＲｆ値及びインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´に基づいてＴを決定する工程を有するものであってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の分取液体クロマトグラフ方法によって、作業者は短時間で効率のよい分離を行うことができるものである。更に、本発明の分取用液体クロマトグラフ装置及び分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、作業者が効率のよい分離を行うことを支援することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の分取用クロマトグラフ装置の構成の一例を示す模式図である。
【図２】本発明のグラジエント方法の一例を示す模式図である。
【図３】薄層クロマトグラフィによってＲｆを測定する方法を説明するための模式図である。
【図４】実施例１のクロマトグラフの結果を示す図である。
【図５】比較例１のクロマトグラフの結果を示す図である。
【図６】実施例２のクロマトグラフの結果を示す図である。
【図７】比較例２のクロマトグラフの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、インジェクタ（Ａ）、及び、分離カラム（Ｂ）を利用して行う分取液体クロマトグラフ方法において、以下に具体的に詳述するような方法に従ったグラジエントを行うことに特徴を有するものである。すなわち、本発明者の検討により、溶媒混合比の変化について、特定の条件設定を行った場合に、高い精度で分離を行うことができることを見出すことによりによって本発明は完成されたものである。
【００２１】
より具体的には、溶媒混合比の変化について、以下の条件を満たすように行うものである。
（１）分離開始時点から一定時間Ｔの間は一定の混合比の溶媒を流入させ、一定時間Ｔ経過後に溶媒混合比を変化させながら分取用液体クロマトグラフを行う。
（２）精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｘとし、一定時間Ｔの間に流入した一定比率の溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間ｔｙとしたとき、
ｔｙ≧ｔｘとなるようにＴを設定して行う。
【００２２】
換言すると、精製対象化合物Ｘがインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動するときと同時又はそれよりも遅く、一定時間Ｔの時点でインジェクタに流入した溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動するように、溶媒混合比を変化させて行うものである。
【００２３】
通常、分取用液体クロマトグラフィを行うに際して、グラジエントを行う場合、最初は、相対的に極性が低く分離能が高い溶媒を使用し、これを極性が高く分離能が低い溶媒との混合溶媒とするものである。最初に分離性能が高い溶媒を使用して対象化合物をある程度分離し、ある程度分離が終了した段階で分離能が高い溶媒を使用することで、流出までの時間を短くするものである。
【００２４】
このような分離を行う場合、初期段階で充分な分離を行う必要がある。このためには、上述した（２）の条件によるグラジエントを行うことが必要であることを見出すことによって、本発明は完成された。
【００２５】
溶離液の導入開始から一定時間経過後のｔｘにおいて、作業者が精度よく取得したいと考えている精製対象化合物Ｘ及びグラジエントを開始した時点の溶媒とが略同時にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）へと流入するようにグラジエント条件を設定することがより好ましい。このように、略同一とすれば、良好な分離精度を確保しつつ、最短時間での分離を完了させることができる点でも好ましい。
【００２６】
なお、ここで「略同一」とあるのは、上記ｔｘの時間に対して前後１０％の時間の差があってもよいことを意味する。すなわち、厳密に同一とすることは必ずしも必要とされず、若干のずれは許容されるものである。
【００２７】
本発明のクロマトグラフ方法においては、インジェクタ（Ａ）と分離カラム（Ｂ）とを用いるものである。
本発明においてインジェクタ（Ａ）は、充填剤が充填されたシリンダーを有し、充填剤として吸着能を有する乾燥充填剤を使用するものである。クロマトグラフにあたっては、このようなインジェクタ（Ａ）に分離対象サンプルを注入し、これを装置中に装着することで、サンプルを流路中に導入することができるものとすることができる。
【００２８】
上記乾燥充填剤は、溶媒を含まず乾燥した状態でシリンダー中に充填されたものであり、更に、乾燥した状態で試料溶液を導入するものである。乾燥した状態で試料液を導入し、その後、溶媒を導入することで、極性有機溶媒が効率よくインジェクターシリンダー中の充填剤に吸着される。
【００２９】
本発明においては、分離カラム（Ｂ）を使用する。このような分離カラム（Ｂ）は、一般的な分取用液体クロマトグラフ装置用に製造・販売されている一般的なものを使用することができる。分離カラム（Ｂ）も、充填剤が充填されたシリンダーを有し、充填剤として吸着能を有する乾燥充填剤を充填したものである。
【００３０】
本発明の分取液体クロマトグラフ方法に使用する装置の一例を示す模式図を図１に示した。なお、本発明の分取液体クロマトグラフ方法は、図１に示した装置を使用した方法に限定されるわけではなく、作業者がｔｘの算出、溶媒混合比の調製等を自ら行いながら行うものであっても差し支えない。
【００３１】
図１においては、インジェクタ（Ａ）は１２として示され、分離カラム（Ｂ）は１として示されている。
図中には、２種の有機溶媒３Ａ，３Ｂが示されている。これらの相違する有機溶媒の導入はポンプ１３によって制御され、必要に応じてコンピュータ５からの指示に応じ、所定の混合比の混合溶媒として流路中に導入される。
図１中において、流路はインジェクタ１２→分離カラム１→サンプル取得手段２へと形成されており、流入溶媒はこの流路に沿って流れていく。
【００３２】
分離対象サンプルは、複数の成分が含まれる混合溶液であり、このようなサンプルがインジェクタ（Ａ）１３中に導入される。この場合、インジェクタ（Ａ）はカートリッジ形態を有し、サンプルをシリンダー中に導入した後、流路中にセットして、その後、溶媒の流入を開始するものであることが好ましい。
【００３３】
分離カラム１から溶出した溶出液は、サンプル取得手段２によって、順次取得される。すなわち、流出時間ごとに試験管に取得されていく。
【００３４】
上述したように、本発明においては溶媒についてグラジエントを行いつつ、分取用液体クロマトグラフを行う。典型的なグラジエントパターンを図２に示した。このようなグラジエントパターンは、一定時間（０〜Ｔの間）は、溶媒混合比を変化させずに溶媒を流入させた後、一定の割合で溶媒の混合比を変化させる。
【００３５】
このＴからポンプ１３によって、各溶媒の混合比を順次変化させながら溶媒の流入を行う。そして、このＴの時点でポンプから流入した混合溶媒は、一定時間経過後にインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）へと移動する。
【００３６】
一方、インジェクタに導入したサンプルは、インジェクタ内において、吸着性を有する充填剤と相互作用を生じながら、移動する。このため、溶媒の移動速度よりも遅い速度でインジェクタ中を移動する。
このため、いずれかの時点で後から導入された溶媒が先に導入されたサンプルに追いつくことになる。すなわち、図２に示したようなパターンでのグラジエントを行うと、Ｔの時点で導入された混合溶媒は、いずれかの時点で精製対象化合物Xに追いつくことになる。この追いつく時点をコントロールすることが本発明において重要となる。
【００３７】
本発明において、精製分離対象化合物Ｘとは、作業者が純度の高い化合物として取得したいと考えている目標化合物である。
研究室での一般的な化学実験においては、取得したいと考えている目的化合物が明確に存在しており、目的化合物を得るための化学反応を行い、その後に精製を行う場合がほとんどである。
よって、本発明の分取液体クロマトグラフ方法においては、すべての成分について精密な分離を行うことは必ずしも必要とされておらず、作業者が実験を行った際の目的化合物さえ精度よく分離できれば目的は達成されることになる。このように作業者が精度よく取得したいと考えている化合物を精製対象化合物Ｘとし、この化合物がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間をｔｘとして定義する。
【００３８】
更に、上述したＴの時点でインジェクタに導入された溶媒がインジェクタ（Ａ）から分離カラム（Ｂ）に移動する時間を本発明では、ｔｙとして定義する。上記溶媒は、インジェクタ中の固定相との相互作用を生じるものではないので、ｔｙは、液の流量とインジェクタの空容積との関係で決定される。本発明においては、これらの間に、ｔｙ≧ｔｘとの関係が成立することに特徴を有する。
【００３９】
以上のような本発明の分取用液体クロマトグラフを行うためには、分離対象サンプルに対応した適切なグラジエントパターンを作成することが好ましい。
より具体的には、一定の混合比から溶媒混合比を変化させるようにし始める時間Ｔをどのように設定するかが重要になる。
【００４０】
このようなＴの設定は、使用するカラムサイズや、インジェクタに応じて、設定を行うことが好ましい。すなわち、カラムの空容積やインジェクタの空容積は、ｔｙ、ｔｘと密接に関連する値となることから、これによって、所定のｔｙ、ｔｘとなるようにＴを設定することが好ましい。
【００４１】
本発明においては、分離対象サンプルに応じて上述したような目的を達成できるようなグラジエントパターンを作成し、これに基づいて溶媒混合比を制御するものである。
【００４２】
このような本発明におけるグラジエントパターンの作成においては、図２に示したＴをどのようにして決定するかが重要である。上述した本発明を実施するに当たっては、ｔｘ＝ｔｙとなるようなＴ（以下これをＴｓとする）を算出し、これに基づいて、グラジエントパターンにおけるＴを設定することが好ましい。すなわち、Ｔｓが明らかになっていれば、ｔｘｔｙ≧ｔｘとなるようなＴを選択することは容易である。
【００４３】
本発明においてこのようなＴｓの決定方法を特に限定するものではないが、具体的な方法としては、例えば、測定対象サンプルについて事前に薄層クロマトグラフ又はカラムクロマトグラフィを行うことでＲｆ値を得て、一方、各種サイズのインジェクタ中を１ＣＶ（インジェクタの空容積）の溶離液が流れるのに要する時間ｔ０´を測定しておき、これらに基づいて、Ｔｓを算出することができる。
【００４４】
以下に、このような計算方法の一例を示す。
本発明の好ましい態様において行う薄層クロマトグラフィは、その方法を特に限定されるものではなく、一般的な公知の方法で行うことができる。薄層クロマトグラフィの展開溶媒は、図２のグラジエントにおける時間＝０〜Ｔｓまでの間で使用される一定の溶媒混合比率Ｂ１の混合溶媒によって行うことが最も好ましい。
【００４５】
また、その他の混合比率にて薄層クロマトグラフィを行い、その結果に基づいて公知の計算式等を使用することによって、Ｂ１におけるＲｆ値を算出するものであってもよい。
【００４６】
図３に薄層クロマトグラフィを行った場合の模式図を示した。図３において精製対象化合物ＸのＲｆは、
Ｒｆ＝Ｌｓ／Ｌｏ
で算出される。いずれのスポットが精製対象化合物Ｘであるかの確認は、特に限定されず、公知の任意の方法によって行うことができる。
【００４７】
まず、クロマトグラフィにおいては、流速ｖ（体積／時間）で溶離液を流すものとする。インジェクタを１ＣＶ（インジェクタの空容積）の溶離液が流れるのに要する時間を１ｔ０´とする。
上記定義から、
１ＣＶ＝ｖｔ０´
である。
【００４８】
上述した方法で測定したＲｆについて、サンプル自体の移動速度を体積で表しｖ´（体積／時間）とすると、
ｖ´＝Ｒｆｖ
である。
また、サンプルがインジェクタを通過するには、ＣＶ／Ｒｆの体積の溶離液を流す必要がある。
【００４９】
今、時間Ｔｓの間送液した場合、サンプルの移動位置体積Ｖは、
Ｖ＝ｖ´Ｔｓ
＝ｖＴｓＲｆ
である。
【００５０】
時間Ｔｓ送液後にグラジエントをスタートする場合、サンプルは更に体積Ｖ（すなわち、インジェクタ中のサンプルより上の部分に残存している溶離液の体積）の溶液を受ける。
サンプルにグラジエントが到達したときの時間Ｔ´とすると、Ｔ´においてサンプルが受けた溶離液溶液のＷは、
Ｗ＝ｖＴｓ＋Ｖ
＝ｖｔ＋ＲｆｖＴｓ
＝（１＋Ｒｆ）ｖＴｓ
となる。
一方、Ｗ＝ＣＶ／Ｒｆの時のサンプルは、インジェクタを通過し、分離カラムに乗っている。よって、
Ｗ＝（１＋Ｒｆ）ｖＴｓ＝ＣＶ／Ｒｆ＝ｖｔ０´／Ｒｆ
の関係式が成立する。
よって、
Ｔｓ＝ｔ０´／（Ｒｆ（１＋Ｒｆ））
の関係となる。
【００５１】
上記関係式にもとづいて、ＲｆからＴｓを算出することができる。
例えば、Ｒｆ＝０．２であれば、上記式より、
Ｔｓ＝４．２ｔ０´
を算出することができ、ｔ０´を明らかにすれば、上記式によって、本発明を実行することができる。
【００５２】
また、上記ｔ０´は、インジェクタの空容積と密接に関連する値であることから、使用するインジェクタの空容積に応じて、上述したようにＴｓを算出し、最適なグラジエント条件を見出すことができる。
【００５３】
本発明の分取用液体クロマトグラフ装置は、上述したようなクロマトグラフの実行を支援するために必要な機能を備えたものである。すなわち、インジェクタ（Ａ）、分離カラム（Ｂ）、装置を制御するためのコンピュータ（Ｃ）及び、上記コンピュータ（Ｃ）によって制御される溶媒混合比制御手段（Ｄ）を備えるものであり、このコンピュータ（Ｃ）において、上述したような溶媒混合比の制御を行う機能を付与するものである。
【００５４】
このような装置を使用することによって、コンピュータによる自動計算・自動管理を行うことで簡便に少ない労力で上述した分取液体クロマトグラフ方法を実施することができる。このような分取用液体クロマトグラフ装置も本発明の一つである。
【００５５】
このような分取用液体クロマトグラフ装置は、コンピュータ５によって制御される。すなわち、本発明の特徴である溶媒混合比（すなわち、図１中の３Ａ、３Ｂの２種の溶媒の混合比）をコンピュータによって制御するものである。
【００５６】
コンピュータによる上述したような分取用液体クロマトグラフ装置の制御は、一般的なプログラミングによって行うことができる。このようなプログラムは、パーソナルコンピュータ等に保存して行うものであってもよいし、サーバーに保存してインターネットを経由して制御を行うものであってもよい。
【００５７】
更に、本発明の分取用液体クロマトグラフ装置は、分離対象サンプルのＲｆ値又は薄層クロマトグラフ結果を入力する入力手段を備えるものであることが好ましい。上述したように、本発明においては、Ｔの決定に際して、Ｒｆ値を使用して算出する方法が好ましい。よって、このような方法に従ってＴ値を算出するには、Ｒｆ値又は薄層クロマトグラフ結果を入力することが好ましい。薄層クロマトグラフ結果を入力すれば、そこからＲｆ値を容易に算出することができる。このため、薄層クロマトグラフ結果の入力手段を有する場合には、当該結果からＲｆ値を算出するＲｆ値算出手段も併せて備えるものであることが好ましい。
【００５８】
このようなＲｆ値の入力方法は特に限定されず、公知の任意の方法を使用することができる。例えば、Ｒｆ値を算出した後でＲｆ値を入力する方法、薄層クロマトグラフ板の写真撮影やスキャニング等の方法で画像を取得し画像解析によってＲｆ値を算出する方法、手入力によって薄層クロマトグラフ板の画像を入力しその結果に基づいてＲｆ値を算出する方法等を挙げることができる。
【００５９】
更に、分取用液体クロマトグラフ装置における溶媒混合比制御手段（Ｄ）の制御は、上述したような方法によってＴを決定し、決定されたＴに基づいてポンプの動作を制御し、２種の溶媒の混合比をコントロールするものであることが好ましい。
【００６０】
本発明の分取用液体クロマトグラフ装置の制御用プログラムは、分取用液体クロマトグラフ装置における制御を行うためのプログラムである。
すなわち、上述したような本発明の分取用液体クロマトグラフの実施をするにあたっては、コンピュータによって、必要な計算及び装置の制御を行うことが好ましい。このような制御を行うための必要な要件を備えたプログラムもまた、本発明の一つである。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
図１に示した装置を使用して、分取用液体クロマトグラフを行った。分離対象サンプルは、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチルとｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルの混合物のジクロロメタン溶液を使用した。
また、分離カラム（Ｂ）通過後のサンプルについて、紫外線吸収検出器によるによる検出を行った。
【００６２】
分離に際しては、溶離液としてヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒を使用した。分離開始の最初の段階においては、ヘキサン／酢酸エチル＝８３／１７の混合比率の溶離液を使用し、一定時間経過後に徐々に酢酸エチルの比率を増加させた。この比率の変化パターンは、すべての実施例比較例で同一とし、最終的にヘキサン／酢酸エチル＝６２：２８となるよう、一定割合で溶媒混合比率を変化させた。
【００６３】
上記分取液体クロマトグラフを行う前にヘキサン／酢酸エチル＝８３／１７の混合溶媒として、シリカによる薄層クロマトグラフィを行った。その結果、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチルはＲｆ０．２２であり、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルはＲｆ０．２０であった。このＲｆ値と使用するインジェクタのｔ０´に基づいてＴを算出した。なお、このＴの算出においては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルを化合物Ｘとした。
【００６４】
なお、分取液体クロマトグラフに際しては、溶媒中に若干量のトルエンを添加して行った。トルエンは充填剤に吸着されない成分であり、流入開始時点での溶媒の位置を示すインジケータとして添加したものである。
【００６５】
（実施例１）
インジェクタ中にサンプルを注入し、これを使用した図１の装置によって分取用液体クロマトグラフを行った。
そして、上述した化合物ＸのＲｆ値、溶媒のインジェクタの通過時間に基づいて、上述した方法によって算出したｔｙ＝ｔｘとなるようなＴ（４．１６分）に基づいて、グラジエントを行って分取液体クロマトグラフを行った。
グラジエント状態及び検出器によって分離状況を確認した結果を図４に示した。これによって良好な分離を図ることができ、かつ、短時間で分離が完了していることが明らかである。
【００６６】
（比較例１）
Ｔ＝０とした以外は、完全に実施例１と同様の方法で分取液体クロマトグラフを行った。グラジエント状態及び検出器によって分離状況を確認した結果を図５に示した。この結果を実施例１と対比すると、２つのピークが重なりを生じており、分離が完全に行われていないことが明らかである。
【００６７】
（実施例２）
Ｔを１１分とした以外は、完全に実施例１と同様の方法で分取液体クロマトグラフを行った。グラジエント状態及び検出器によって分離状況を確認した結果を図６に示した。この結果によっても、良好な分離を図ることができた。但し、実施例１と対比すると、２つのピーク分離しているものの、ピークがブローディングを生じており、長時間にわたってサンプルを溶解した溶離液が流出し続ける。
このため、クロマトグラフの時間が長くなってしまい、更に、流出液の濃縮に要する時間も長くなってしまった。
【００６８】
（比較例２）
インジェクタを使用しない以外は、実施例１と完全に同一の方法で分取液体クロマトグラフを行った。グラジエント状態及び検出器によって分離状況を確認した結果を図７に示した。この結果を実施例１と対比すると、２つのピークが重なりを生じており、分離が完全に行われていないことが明らかである。
【００６９】
以上の実施例及び比較例の結果から、本発明の方法に従ってクロマトグラフを行うと、最適な分離条件で分離を行うことができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の分取液体クロマトグラフ方法、分取用液体クロマトグラフ装置及び分取用液体クロマトグラフ装置制御用プログラムは、化学分野の研究室における混合物の分離操作において好適に使用することができる。
【符号の説明】
【００７１】
１  カラム
２  フラクションコレクタ
５  制御装置
１１  溶離液
１２  インジェクタ
１３  ポンプ
２１  化合物Ｘのスポット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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