(57)【要約】【課題】有機塩素化合物の好気での生分解処理方法、特に、有機塩素化合物と環状エーテル化合物とを生分解する生分解処理方法を提供する。【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株を用いる有機塩素化合物の生分解処理方法。【選択図】図１０
2020110788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株を、好気環境下で有機塩素化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする、有機塩素化合物の生分解処理方法。
【請求項２】
前記有機塩素化合物が、炭素原子数１〜３、塩素原子数１〜３であることを特徴とする請求項１に記載の生分解処理方法。
【請求項３】
前記有機塩素化合物が、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，３−ジクロロプロペン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレンの１種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の生分解処理方法。
【請求項４】
前記有機塩素化合物と、環状エーテル化合物とを処理することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生分解処理方法。
【請求項５】
前記環状エーテル化合物が、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、２−クロロメチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランの１種以上であることを特徴とする請求項４に記載の生分解処理方法。
【請求項６】
前記有機塩素化合物を含む汚染土壌に、前記Ｎ２３株を注入する工程、スパージング処理により酸素を供給する工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の生分解処理方法。
【請求項７】
地中から前記有機塩素化合物を含む汚染水を揚水する工程、該汚染水を前記Ｎ２３株を用いた標準活性汚泥法により処理する工程を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の生分解処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機塩素化合物の構成型１，４−ジオキサン分解菌Ｎ２３株を用いた生分解処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，１，１−トリクロロエタン（以下、１，１，１−ＴＣＡともいう）は、様々な有機化合物を溶解することができるため、溶剤、洗浄剤等として広く利用されていた。１，１，１−ＴＣＡは、オゾン層破壊物質の一つとされ、１９９５年に製造が禁止されたが、それ以前に製造されたＴＣＡによる汚染が問題となっている。また、主に、１，１，１−ＴＣＡが使用される前と１，１，１−ＴＣＡが禁止された後においては、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）が、溶剤、洗浄剤として使われているが、ＴＣＥによる汚染も１，１，１−ＴＣＡと同様に問題視されている。１，１，１−ＴＣＡ及びＴＣＥは、嫌気性環境下で微生物により、１，１−ジクロロエチレン（以下、１，１−ＤＣＥともいう）やクロロエチレン（以下、ＶＣともいう）等に脱塩素される場合がある。１，１−ＤＣＥ、ＶＣの水への溶解度は、１，１，１−ＴＣＡ（３００ｍｇ／Ｌ水）やＴＣＥ（１，２００ｍｇ／Ｌ水）より大きい（１，１−ＤＣＥ：２，５００ｍｇ／Ｌ水、ＶＣ：８，８００ｍｇ／Ｌ水）。すなわち、１，１，１−ＴＣＡ及びＴＣＥは、脱塩素されるに従って、地下水に溶解して拡散しやすくなるため、汚染範囲が拡大してしまう。
【０００３】
また、１，１，１−ＴＣＡやＴＣＥには、安定剤として、１，４−ジオキサン（以下、ジオキサンともいう）が２〜４％程度添加されていた。ジオキサンは、急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）が設けられている。ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。
そのため、１，１，１−ＴＣＡ、ＴＣＥの汚染サイトは、１，１，１−ＴＣＡ、ＴＣＥ、１，１−ＤＣＥ、ＶＣ等の有機塩素化合物、ジオキサンによる深刻な複合汚染が発生している場合がある。
【０００４】
また、１，１，２−トリクロロエタン（以下、１，１，２−ＴＣＡともいう）は、主に、１，１−ＤＣＥの原料として用いられており、その他の用途として塩素化ゴムの溶剤、油脂、ワックス、天然樹脂などの溶剤、アルカロイドの抽出剤がある。１，１，２−ＴＣＡは、急性毒性及び慢性毒性を持っており、水質汚濁に係る環境基準（０．００６ｍｇ／Ｌ）、地下水の水質汚濁に係る環境基準（０．００６ｍｇ／Ｌ）、土壌汚染に係る環境基準（０．００６ｍｇ／Ｌ）、土壌汚染対策法（土壌溶出量基準０．００６ｍｇ／Ｌ）が設けられている。１，１，２−ＴＣＡは、好気条件での生分解性はないとされている。一方で、嫌気条件では１，１，２−ＴＣＡは分解されるが、より毒性の強いＶＣをはじめ、１，２−ジクロロエタン、１，１−ＤＣＥ、シス−１，２−ジクロロエチレン（以下、シス−１，２−ＤＣＥともいう）等に変換されてしまう。
【０００５】
１，１，１−ＴＣＡ、ＴＣＥ等の有機塩素化合物で汚染された汚染土壌を掘削しないで浄化する方法（原位置浄化）としては、（１）コンプレッサー等で空気を送り揮発させることで除去するスパージング処理。（２）過酸化水素と鉄分を添加してヒドロキシラジカルにより酸化分解させるフェントン法。（３）酸素や栄養剤を送り込んで土壌中の微生物を活性化させて浄化する生物処理（バイオレメディエーション）。等が挙げられる。これらの中では、スパージング処理が一般的であるが、有機塩素化合物は高濃度では揮発するが、低濃度となると揮発性が低下してしまう。
【０００６】
一方、１，４−ジオキサンは、上記した浄化方法で水中から除去することが困難であり、過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、処理の有効性が確認されている。しかし、非特許文献１には、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下することが報告されている。
【０００７】
有機塩素化合物とジオキサンの複合汚染において、有機塩素化合物とジオキサンとを同時に処理することは難しく、有機塩素化合物の処理後に、１，４−ジオキサンを処理する方法が用いられている。しかし、処理化合物ごとに異なる処理方法を採用することは、処理装置、オペレータ、薬品の種類等が増加するため高コストであり、また、処理工程の上流または下流でトラブルが起こると、全ての工程がストップしてしまう。そのため、有機塩素化合物とジオキサンを単一工程で除去可能な技術が求められている。
【０００８】
ここで、近年、ジオキサン分解菌を使ったジオキサンの生物処理の検討がされている。有機塩素化合物存在下でのジオキサン分解菌の働きについては、非特許文献２、３に、ジオキサン分解菌であるＣＢ１１９０株が、１，１−ＤＣＥ等の塩素化エチレンを分解できないこと、ＣＢ１１９０株によるジオキサンの分解が、１，１−ＤＣＥ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ、ＴＣＥ等の塩素化エチレンにより阻害されることが記載されている。そのため、ＣＢ１１９０株は、ジオキサンと塩素化エチレンの複合汚染に対して、塩素化エチレンを処理できないのはもちろんであるが、塩素化エチレンにより阻害されるためジオキサンを処理することもできない。
【０００９】
また、非特許文献４に、有機塩素化合物の分解菌が記載されているが、有機塩素化合物の分解菌は好気条件下では共代謝菌が多く、資化菌、特に、複数の有機塩素化合物を分解できる資化菌は、ほとんど報告されていない。有機塩素化合物による汚染浄化分野で研究されてきた菌は、ほぼ共代謝菌である。しかし、有機塩素化合物が低濃度だと、分解が思うように進まなかったり、トルエンやフェノールといった誘導物質自体が汚染の原因になるという問題がある。他にも有機塩素化合物（ＴＣＥやＤＣＥ）が誘導物質として作用する共代謝菌もいるが、この場合、有機塩素化合物濃度が低くなると、分解速度が低下し、基準値まで下がらない事がある。そのため、有機塩素化合物による汚染浄化は、好気ではなく、嫌気での処理に注目が集まっている。
【００１０】
本発明者らは、特許文献１において、構成型１，４−ジオキサン分解菌であるＮ２３株を報告している。Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型１，４−ジオキサン分解菌の中で、最も高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を示し、１，４−ジオキサンを始めとする環状エーテルの生分解に非常に有望である。
また、本発明者らは、特許文献２において、Ｎ２３株は、酸性環境下で活性がほとんど低下しないため、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下での有機化合物の生分解処理に用いることを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第６１１７４５０号公報
【特許文献２】特開２０１９−０００８３１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000.
【非特許文献２】Mahendra S., Grostern A., & Alvarez-Cohen L.:The impact of chlorinated solvent co-contaminants on the biodegradation kinetics of 1, 4-dioxane. Chemosphere, 91(1), pp 88-92, 2013.
【非特許文献３】Zhang S., Gedalanga P. B.& Mahendra S.: Biodegradation kinetics of 1, 4-dioxane in chlorinated solvent mixtures. Environmental science & technology, 50(17), pp 9599-9607, 2016
【非特許文献４】Dolinova I., Strojsova M., Cernik M., Nemecek J., Machackova J., Sevcu A.:Microbial degradation of chloroethenes: a review. Environmental Science and Pollution Research, 24(15), pp 13262-13283,2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
有機塩素化合物の好気での生分解処理方法、特に、有機塩素化合物と環状エーテル化合物とを生分解する生分解処理方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。
１．受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株を、好気環境下で有機塩素化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする、有機塩素化合物の生分解処理方法。
２．前記有機塩素化合物が、炭素原子数１〜３、塩素原子数１〜３であることを特徴とする１．に記載の生分解処理方法。
３．前記有機塩素化合物が、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，３−ジクロロプロペン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレンの１種以上であることを特徴とする１．または２．に記載の生分解処理方法。
４．前記有機塩素化合物と、環状エーテル化合物とを処理することを特徴とする１．〜３．のいずれかに記載の生分解処理方法。
５．前記環状エーテル化合物が、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、２−クロロメチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフランの１種以上であることを特徴とする４．に記載の生分解処理方法。
６．前記有機塩素化合物を含む汚染土壌に、前記Ｎ２３株を注入する工程、スパージング処理により酸素を供給する工程を含むことを特徴とする１．〜５．のいずれかに記載の生分解処理方法。
７．地中から前記有機塩素化合物を含む汚染水を揚水する工程、該汚染水を前記Ｎ２３株を用いた標準活性汚泥法により処理する工程を含むことを特徴とする１．〜６．のいずれかに記載の生分解処理方法。
【発明の効果】
【００１５】
Ｎ２３株により、有機塩素化合物を好気環境下で生分解処理することができる。特に、炭素原子数１〜３、塩素原子数１〜３の有機塩素化合物は、水への溶解度が大きいもの、毒性が高いものが多いが、Ｎ２３株により、低コストで高い効率で生分解処理することができる。
Ｎ２３株は、複数の有機塩素化合物を生分解することができ、また、事前に誘導物質による馴養が不要である。また、Ｎ２３株は、有機塩素化合物と環状エーテル化合物を同時に生分解することができる。そのため、本発明の生分解処理方法は、１，１，１−ＴＣＡの汚染サイト等、有機塩素化合物と環状エーテル化合物との複合汚染が広がっている汚染サイトに好適に用いることができる。
【００１６】
有機塩素化合物は、その種類により生分解性に差があるが、土壌へのスパージング処理および／または活性汚泥法における曝気処理と、Ｎ２３株による生分解を組み合わせることにより、複数種の有機塩素化合物、環状エーテル化合物を、効率的に同時に処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｎ２３株のＳＥＭ画像。
【図２】実験１における各条件の１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す図。
【図３】実験１における各条件の１，１−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図。
【図４】実験２における各条件の１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す図。
【図５】実験２における各条件のＤＣＭ濃度の経時変化を示す図。
【図６】実験３におけるシス−１，２−ＤＣＥ濃度の経時変化を示す図。
【図７】実験３におけるクロロエチレン濃度の経時変化を示す図。
【図８】実験４における塩素化エチレン類濃度の経時変化を示す図。
【図９】実験４における塩素化メタン、塩素化エタン類濃度の経時変化を示す図。
【図１０】実験５における有機塩素化合物及び１，４−ジオキサンの除去率を示す図。
【図１１】実験６におけるＴＣＥ濃度の経時変化を示す図。（Ａ）初期ＴＣＥ濃度０．１ｍｇ／Ｌ、（Ｂ）初期ＴＣＥ濃度１ｍｇ／Ｌ、（Ｃ）初期ＴＣＥ濃度１０ｍｇ／Ｌ。
【図１２】実験７における各条件の１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す図。
【図１３】実験７における各条件のＴＣＥ濃度の経時変化を示す図。
【図１４】実験８における１，１，２−ＴＣＡ濃度の経時変化を示す図（Ａ：ネガティブコントロール、Ｂ：Ｎ２３株添加系）。
【図１５】実験９における１，４−ジオキサン濃度の経時変化を示す図（Ａ：ネガティブコントロール、Ｂ：Ｎ２３株添加系）。
【図１６】実験９における１，１，２−ＴＣＡ濃度の経時変化を示す図（Ａ：ネガティブコントロール、Ｂ：Ｎ２３株添加系）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「Ｎ２３株」
Ｎ２３株は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、２０１５年４月１０日付で国際寄託されている。Ｎ２３株のＳＥＭ画像を図１に示す。Ｎ２３株は、グラム染色性が陽性、カタラーゼ反応が陽性である。
【００１９】
Ｎ２３株は、これまでに報告されている構成型資化菌の中で最も高い１，４−ジオキサン最大比分解速度を有する構成型１，４−ジオキサン分解菌である（特許文献１）。
Ｎ２３株は、ジオキサンを極低濃度まで分解することができる、高濃度のジオキサンを処理することができる、予め馴養する必要がない、ジオキサンだけでなく、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、２−クロロメチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル化合物を効率よく分解することができる等、環状エーテル化合物の生分解処理に好適に利用することができる。
【００２０】
本発明者らは、Ｎ２３株によるジオキサン汚染土壌処理に際し、汚染土壌中に有機塩素化合物が存在していてもＮ２３株のジオキサン分解活性が低下しないことを発見した。本発明者らは、Ｎ２３株の有機塩素化合物の生分解性についてさらに研究を進めたところ、Ｎ２３株が、有機塩素化合物を好気環境下で、誘導物質による馴養をすることなく生分解できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３２として寄託されたＮ２３株を用いる、有機塩素化合物の生分解処理方法に関する。
【００２１】
「有機塩素化合物」
本発明においてＮ２３株を用いて生分解する有機塩素化合物としては、Ｎ２３株が生分解できる化合物であれば特に限定されず、また、２種以上の有機塩素化合物であってもよい。Ｎ２３株が生分解できる有機塩素化合物としては、例えば、炭素原子数１〜３、塩素原子数１〜３の有機塩素化合物が挙げられ、炭素原子数１〜３、塩素原子数１〜２の有機塩素化合物が好ましい。具体的には、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロエチレン（塩化ビニルモノマー）、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，３−ジクロロプロペン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレン等が挙げられる。これらの中で、特に、１，２−ジクロロプロパン、１，１，２−トリクロロエタンは、本発明者らが調査したところ、これまでに嫌気性微生物による生分解しか報告されておらず、１，２−ジクロロプロパンの好気性微生物による生分解は、Ｎ２３株が世界初の事例である。
【００２２】
「環状エーテル化合物」
Ｎ２３株は、環状エーテル化合物の有無に関わらず、有機塩素化合物を生分解することができる。そのため、Ｎ２３株は、有機塩素化合物のみの生分解処理、有機塩素化合物と環状エーテル化合物の両方の生分解処理に用いることができる。本発明において有機塩素化合物とともに生分解する環状エーテル化合物としては、Ｎ２３株が生分解できるものであれば特に限定されない。また、有機塩素化合物と環状エーテル化合物の両方を生分解する場合、有機塩素化合物、環状エーテル化合物のいずれか、または両方が、２種以上であってもよい。Ｎ２３株が生分解できる環状エーテル化合物としては、例えば、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、２−メチル−１，３−ジオキソラン、２−クロロメチル−１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラン等を挙げることができる。なお、複数の有機化合物を生分解する場合、Ｎ２３株は、炭素源として利用しやすいものから順に生分解するため、存在する有機化合物の種類や量により、各有機化合物の生分解終了までの時間は異なる。
【００２３】
「生分解処理」
本発明の有機塩素化合物の生分解処理方法は、Ｎ２３株を、好気環境下で有機塩素化合物と接触させる工程を含むことを特徴とする。本発明により生分解処理を行う処理対象は、有機塩素化合物を含むものであれば特に制限されないが、具体的には、不法廃棄現場等の汚染サイト、工場跡地、産業廃棄物処理場等の汚染土壌や、工場排水、一般下水、汚染サイト近辺の地下水等の汚染水等が挙げられる。また、処理対象は、有機塩素化合物と環状エーテル化合物の両方を含むものでもよい。
Ｎ２３株は、培養液からろ別した菌体、凍結保存した菌体、乾燥保存した菌体、凍結乾燥した菌体、Ｎ２３株を樹脂等に固定化した固定化担体、あるいは培養液やその濃縮液等のＮ２３株を含む懸濁液等の任意の形態で生分解処理に用いることができる。
【００２４】
Ｎ２３株による生分解処理時のｐＨは、Ｎ２３株が活動可能なｐＨであれば特に制限されないが、ｐＨ３．０以上５．５以下であることが好ましい。特許文献２に記載したように、Ｎ２３株は、酸性環境下であっても、ほとんど活動性が低下しない。それに対し、一般的な雑菌は、中性環境下が至適ｐＨであるため、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下では、活動が抑制される。そのため、ｐＨ３．０以上５．５以下の酸性環境下では、雑菌の繁殖（コンタミネーション）を抑制することができ、Ｎ２３株による生分解処理を効率的に行うことができる。
【００２５】
Ｎ２３株により、汚染土壌中の有機塩素化合物を生分解処理することができる。Ｎ２３株を用いた汚染土壌中の有機塩素化合物の生分解処理方法は特に制限されず、公知の方法を採用することができる。例えば、汚染土壌にＮ２３株を加えて混合撹拌する、汚染土壌中に懸濁液等の形態でＮ２３株を注入する等の方法を挙げることができる。汚染土壌にＮ２３株を注入する場合、Ｎ２３株は、好気性細菌であるため、Ｎ２３株を注入する工程、スパージングにより土壌中に酸素を供給する工程を含むことが好ましい。また、一般に土壌中には栄養素が不足しているため、汚染土壌中に炭素源、無機塩類等を注入する工程を含むことが好ましい。スパージングを行うことにより、土壌中の有機塩素化合物を揮発させて低濃度とすることができる。そして、スパージングでは取り除けない低濃度の有機塩素化合物をＮ２３株により生分解処理することができるため、浄化処理に必要な時間を短縮することができる。
【００２６】
Ｎ２３株により、汚染水中の有機塩素化合物を生分解処理することができる。Ｎ２３株を用いた汚染水中の有機塩素化合物の生分解処理方法は特に制限されず、公知の方法を採用することができる。例えば、標準活性汚泥法における処理方法を挙げることができる。標準活性汚泥法は、曝気槽に、固定化担体や懸濁液等の形態でＮ２３株を加えるだけで有機塩素化合物を処理することができるため、従来の標準活性汚泥法で用いられる設備をほとんどそのまま活用することができる。また、標準活性汚泥法における曝気により、汚染水中の有機塩素化合物を揮発させて取り除くことができる。
【００２７】
標準活性汚泥法における処理は、（１）汚染水のＮ２３株による生分解処理工程、（２）Ｎ２３株を含む活性汚泥や担体等を沈殿させ、処理後の上澄みを排水する排水工程、（３）新たな汚染水を投入する汚染水投入工程を、（１）→（２）→（３）→（１）→・・・と、この順で繰り返す、いわゆるフェッドバッチプロセス、上流での汚染水の投入と下流での処理水の排水とを同量で連続的に行う工程を有する連続プロセスのいずれの方法でも行うことができる。フェッドバッチプロセスは、曝気槽での初期有機化合物（汚染物）濃度が高いため、生分解処理速度を高く保つことができ、また、排水時にＮ２３株の流出が少なく、プロセスを繰り返す毎にＮ２３株量が増加して１回のプロセスに必要な時間を徐々に短くすることができる。
【００２８】
有機塩素化合物の中で、ジクロロメタン（１３，２００ｍｇ／Ｌ水）、１，２−ジクロロエタン（８，６００ｍｇ／Ｌ水）、クロロエチレン（８，８００ｍｇ／Ｌ水）、シス−１，２−ジクロロエチレン（５，１００ｍｇ／Ｌ水）、１，２−ジクロロプロパン（２，８００ｍｇ／Ｌ水）、１，３−ジクロロプロペン（２，０００ｍｇ／Ｌ水）は、水への溶解度が高い。また、エーテル結合による極性を有する環状エーテルは、水に易溶解性である。そのため、有機塩素化合物による汚染サイト、または、有機塩素化合物と環状エーテルによる汚染サイトでは、処理対象である有機化合物が地下水に溶解して汚染範囲が広範囲に亘る場合がある。汚染が広範囲に亘る場合は、汚染土壌へのＮ２３株の注入と、揚水した地下水（汚染水）の標準活性汚泥法による生分解処理の両方を行うことが、汚染の拡大を防ぎ、また、処理期間を短くすることができるため好ましい。この際、スパージングを行うことが、Ｎ２３株への酸素を供給するのみならず、水への溶解度が低く揮発性の高い有機塩素化合物を取り除くことができるため、好ましい。
【実施例】
【００２９】
「Ｎ２３株」
３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコにＭＧＹ培地（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：１０ｇ／Ｌ、グルコース：４ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：４ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３）を１００ｍＬ添加し、オートクレーブにて滅菌処理（１２１℃、１５分）を行った。その後、Ｎ２３株を一白金耳で植菌し、回転振盪培養（２８℃、１２０ｒｐｍ）を７日間行った（前々培養）。
培養後、ＭＧＹ培地に植え継ぎ、同様の条件にて培養を行った（前培養）。
前培養にて得られた培養液を遠心分離によって集菌・回収し、無機塩培地（組成：１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、ｐＨ：７．３）を加えて、菌体の洗浄を行った。洗浄後の菌体を、無機塩培地で懸濁したものを植菌液とした。
【００３０】
「分析方法」
・濃度測定
１，４−ジオキサン及び有機塩素化合物は、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー質量分析装置（島津製作所社製、ＧＣ／ＭＳ  ＱＰ−２０１０  ｐｌｕｓ）を用いてＪＩＳ  Ｋ０１２５に準じて行った。
【００３１】
・菌体濃度
Ｎ２３株の菌体タンパク濃度は、既報（Meyers et al., Novel method for rapid measurement of growth of mycobacteria in detergent-free media, J. Clin. Microbiol.,36 (9) 2752〜2754 (1998)）に準じて測定した。
Ｎ２３株の乾燥菌体重量及び微生物濃度は、ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｂ（粒子保持能  １．０μｍ、Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて試料をろ過し、１０５℃にて２時間乾燥した後の重量から、ろ過前のフィルター重量を差し引いて求めた。
【００３２】
「実験１」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：５００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、１，４−ジオキサン（１．０ｍｇ／Ｌ）、１，１−ＤＣＥ（１．０、５．０、１０．０ｍｇ／Ｌ）、無機塩培地を条件毎に合計で２４ｍＬとなるように添加した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った（Ｎ＝２）。
実験は下記５つの条件を用意して行った。
条件１：Ｎ２３株及び１，１−ＤＣＥを加えない（コントロール）
条件２：１，１−ＤＣＥを加えない（ポジティブコントロール）
条件３：１，１−ＤＣＥ濃度が１．０ｍｇ／Ｌ
条件４：１，１−ＤＣＥ濃度が５．０ｍｇ／Ｌ
条件５：１，１−ＤＣＥ濃度が１０．０ｍｇ／Ｌ
【００３３】
培養開始３日後、４日後、５日後にサンプリングを行い、溶液中の１，１−ＤＣＥ、１，４−ジオキサン濃度を測定した。
各条件の１，４−ジオキサン濃度及び１，１−ＤＣＥ濃度の経時変化を図２、３に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００３４】
Ｎ２３株が、１，１−ＤＣＥを生分解できることが確かめられた。
Ｎ２３株は、ＣＢ１１９０株ではジオキサン分解を最も強く阻害する１，１−ＤＣＥの存在下でも、１，４−ジオキサンが分解できることが確かめられ、さらに、ジオキサンよりも先に１，１−ＤＣＥを分解することが確認できた。１，１−ＤＣＥ濃度が５．０ｍｇ／Ｌ以下程度であれば、１，４−ジオキサンを問題なく環境基準値まで分解すると共に１，１−ＤＣＥも分解できることが確認できた。
【００３５】
「実験２」
１，１−ＤＣＥをジクロロメタン（ＤＣＭ）とした以外は、実験１と同様にして下記５つの条件を用意して行った。
条件６  ：Ｎ２３株及びＤＣＭを加えない（コントロール）
条件７  ：ＤＣＭを加えない（ポジティブコントロール）
条件８  ：ＤＣＭ濃度が１．０ｍｇ／Ｌ
条件９  ：ＤＣＭ濃度が５．０ｍｇ／Ｌ
条件１０：ＤＣＭ濃度が１０．０ｍｇ／Ｌ
培養開始１日後、４日後、７日後にサンプリングを行い、溶液中のＤＣＭ、１，４−ジオキサン濃度を測定した。
各条件の１，４−ジオキサン濃度及びＤＣＭ濃度の経時変化を図４、５に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００３６】
Ｎ２３株が、ＤＣＭを生分解できることが確かめられた。
また、Ｎ２３株は、ＤＣＭの存在下でも、１，４−ジオキサンが分解できることが確かめられたが、ＤＣＭよりもジオキサンを先に分解することが確認できた。ＤＣＭ濃度が１０．０ｍｇ／Ｌ以下程度であれば、１，４−ジオキサンを問題なく環境基準値まで分解できることが確かめられたが、本条件では、ＤＣＭ濃度が５．０ｍｇ／Ｌ以上では、ＤＣＭを環境基準値まで分解できなかった。
【００３７】
「実験３」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：１５０ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、シス−１，２−ＤＣＥ（１０ｍｇ／Ｌ）あるいはクロロエチレン（２ｍｇ／Ｌ）、無機塩培地を合計で４０ｍＬとなるように添加した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った（Ｎ＝２）。実験は菌を入れた条件と入れていない条件（コントロール）の２通り実施した。
培養開始０日後、１日後、２日後、３日後、４日後、７日後にサンプリングを行い、溶液中のシス−１，２−ＤＣＥあるいはクロロエチレン（ＶＣＭ）濃度を測定した。
１，４−ジオキサン濃度及びＤＣＭ濃度の経時変化を図６、７に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００３８】
Ｎ２３株は、ジオキサンの非存在下で、シス−１，２−ＤＣＥ、ＶＣＭを分解できることが確認できた。すなわち、Ｎ２３株は、ジオキサン等を誘導物質として馴養することなく、有機塩素化合物を分解できることが確かめられた。
【００３９】
「実験４」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：５００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、ＶＯＣ（１，１−ＤＣＥ、シス−１，２−ＤＣＥ、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ＤＣＭ、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタンの７物質を各１ｍｇ／Ｌ）、無機塩培地を合計で２４ｍＬとなるように添加した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った（Ｎ＝２）。
培養開始０日後、１日後、３日後、７日後にサンプリングを行い、溶液中のＶＯＣの各濃度を測定した。
各有機塩素化合物濃度の経時変化を図８、９に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００４０】
Ｎ２３株が、複数種の有機塩素化合物を同時に分解できることが確かめられた。特に、炭素原子数１〜３、塩素原子数１〜２の有機塩素化合物である１，１−ＤＣＥ、シス−１，２−ＤＣＥ、ＤＣＭ、１，２−ジクロロエタンに対して優れた生分解性を示した。
【００４１】
「実験５」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：１０００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、１，４−ジオキサン（添加濃度１ｍｇ／Ｌ）、ＶＯＣ（クロロエチレン、１，１−ＤＣＥ、シス−１，２−ＤＣＥ、ＤＣＭ、１，２−ジクロロエタン、１，２−ジクロロプロパン、１，３−ジクロロプロペンの７物質を各１ｍｇ／Ｌ）、無機塩培地を条件毎に合計で３０ｍＬとなるように添加した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った（Ｎ＝２）。条件は、菌を添加しない系（ｃｏｎｔｒｏｌ）と菌を添加した系（１０００ｐｐｍ）を用意した。
培養開始０日後、４日後にサンプリングを行い、溶液中の１，４−ジオキサン及びＶＯＣの各濃度を測定した。
図１０に０日目に対する４日目の各物質の除去率を示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００４２】
Ｎ２３株が１，４−ジオキサンと複数種の有機塩素化合物を同時に分解できることが確かめられた。また、シス−１，２−ＤＣＥ、１，２−ジクロロプロパン以外の有機塩素化合物は環境基準値以下まで低減された。
ｃｏｎｔｒｏｌにおいて、０日目と４日目で大きく濃度が変化した物質が見られるが、これは０日目のサンプリングの際に、一部の物質では気相と液相の平衡移動が完了する前に採取した影響であると考えられる。特に、１，１−ＤＣＥは初期の添加濃度が高くなってしまったことも除去率が高い原因であると考えられる。また、１，３−ジクロロプロペンは加水分解される特徴を持っているため、ｃｏｎｔｒｏｌでも大きく除去されたと思われる。
【００４３】
「実験６」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：５００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、ＴＣＥ（０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌの３条件）、無機塩培地を合計で５０ｍＬとなるように添加した。また、それぞれについてＮ２３株を含まないネガティブコントロールを調製した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った（Ｎ＝２）。
培養開始０日後、１日後、２日後、７日後、１４日後、２１日後にサンプリングを行い、溶液中のＴＣＥ濃度を測定した。
ＴＣＥ濃度の経時変化を図１１に示す。（Ａ）が初期ＴＣＥ濃度０．１ｍｇ／Ｌ、（Ｂ）が初期ＴＣＥ濃度１ｍｇ／Ｌ、（Ｃ）が初期ＴＣＥ濃度１０ｍｇ／Ｌである。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００４４】
Ｎ２３株は、分解速度は遅いものの、ジオキサンの非存在下で、ＴＣＥを分解できることが確認できた。すなわち、Ｎ２３株は、ジオキサン等を誘導物質として馴養することなく、ＴＣＥを分解できることが確かめられた。
【００４５】
「実験７」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：５００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、１，４−ジオキサン（１０ｍｇ／Ｌ）、ＴＣＥ（０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌの３条件）、無機塩培地を合計で５０ｍＬとなるように添加した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った。
実験は下記５つの条件を用意して行った。
条件１１：Ｎ２３株及びジオキサンを加えない（コントロール）
条件１２：ＴＣＥを加えない（ポジティブコントロール）
条件１３：ＴＣＥ濃度が０．１ｍｇ／Ｌ、ジオキサン濃度が１０ｍｇ／Ｌ
条件１４：ＴＣＥ濃度が１ｍｇ／Ｌ、ジオキサン濃度が１０ｍｇ／Ｌ
条件１５：ＴＣＥ濃度が１０ｍｇ／Ｌ、ジオキサン濃度が１０ｍｇ／Ｌ
【００４６】
培養開始１日後、２日後、５日後、７日後にサンプリングを行い、溶液中のＴＣＥ、１，４−ジオキサン濃度を測定した。
各条件の１，４−ジオキサン濃度及びＴＣＥ濃度の経時変化を、それぞれ図１２、１３に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００４７】
Ｎ２３株が、ジオキサン存在下でも、ＴＣＥを分解できることが確認できた。また、Ｎ２３株が、ＴＣＥとジオキサンとを同時に分解できることが確認できた。
【００４８】
「実験８」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：５００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、１，１，２−ＴＣＡ（０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌの３条件）、無機塩培地を合計で５０ｍＬとなるように添加した。また、それぞれについてＮ２３株を含まないネガティブコントロールを調製した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った（Ｎ＝２）。
培養開始５日後にサンプリングを行い、溶液中の１，１，２−ＴＣＡ濃度を測定した。
ＴＣＥ濃度の経時変化を図１４に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００４９】
ネガティブコントロールでは、１，１，２−ＴＣＡ濃度に変化はなかった（図１４Ａ）。一方、Ｎ２３株を加えた系では、初期１，１，２−ＴＣＡ添加濃度０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌでは、５日目までに検出下限値以下まで減少し、初期１，１，２−ＴＣＡ濃度１０ｍｇ／Ｌの系でも、減少傾向が確認できた（図１４Ｂ）。
【００５０】
「実験９」
１２０ｍｌ容のバイアル瓶にＮ２３株（菌体濃度：５００ｍｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ）、１，４−ジオキサン（１０ｍｇ／Ｌ）、１，１，２−ＴＣＥ（０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌの３条件）、無機塩培地を合計で５０ｍＬとなるように添加した。その後、ブチルゴム栓で密栓し３０℃、１２０ｒｐｍの条件で振盪しながら試験を行った。条件は、１）Ｎ２３株無し（ネガティブコントロール）、２）Ｎ２３株ありの２条件を作成した。各条件、２連で試験を行い、１，４−ジオキサン、１，１，２−ＴＣＡ濃度を測定した。
【００５１】
培養開始１日後、２日後、５日後、７日後にサンプリングを行い、溶液中の１，４−ジオキサン、１，１，２−ＴＣＡの濃度を測定した。
各条件の１，４−ジオキサン濃度及び１，１，２−ＴＣＡ濃度の経時変化を、それぞれ図１５、１６に示す。なお、数値は２連の平均値を用いている。
【００５２】
ネガティブコントロールではいずれの物質も濃度変化はなかった（図１５Ａ、図１６Ａ）。
Ｎ２３株を添加した系は、１，１，２−ＴＣＡの初期濃度０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌの条件では、１，４−ジオキサン、１，１，２−ＴＣＡともに３日目までに検出下限値まで減少した。１，１，２−ＴＣＡの初期濃度１０ｍｇ／Ｌの条件では、１，４−ジオキサンは７日目までに検出下限値まで減少した。一方、１，１，２−ＴＣＡは７日目時点においても高い濃度で残存したが、ネガティブコントロールと比較して減少傾向が確認できた（図１５Ｂ、図１６Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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