(57)【要約】      （修正有）【課題】原発巣だけでなく転移巣、再発巣にも有効であり、様々ながん幹細胞に感受性の制癌剤を提供するための、制癌剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】以下の工程を含む、がん幹細胞に感受性を有する制癌剤のスクリーニング方法：工程１：多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる成分下で培養して誘導されたがん幹細胞、前記誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団或いは該細胞集団から分離されたがん幹細胞を免疫不全動物に移植して形成もしくは転移した悪性腫瘍からの初代培養、の少なくとも１種により各々異なるがん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団を得る工程（ｎは２以上の整数を示す）；工程２：工程１で誘導された、各々異なるがん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団を採取する工程；工程３：前記ｎ種類の細胞集団に候補物質を作用させる工程；及び工程４：複数の細胞集団に有効な候補物質をがん幹細胞に感受性の制癌剤として選択する工程。【選択図】図１
2020186999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、がん幹細胞に感受性を有する制癌剤のスクリーニング方法：
工程１：以下の(i)〜(iii)
(i) 多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養すること
(ii) 前記(i)で誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団或いは該細胞集団から分離されたがん幹細胞を免疫不全動物に移植して形成した悪性腫瘍から初代培養を行うこと
(iii) 前記(i)で誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団或いは該細胞集団から分離されたがん幹細胞を免疫不全動物に移植して転移した悪性腫瘍から初代培養を行うこと
の少なくとも１種により多能性幹細胞から各々異なるがん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団を誘導する工程（ｎは２以上の整数を示す）；
工程２：工程１で誘導された、各々異なるがん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団を採取する工程；
工程３：前記ｎ種類の細胞集団に候補物質を作用させる工程；及び
工程４：複数の細胞集団に有効な候補物質をがん幹細胞に感受性の制癌剤として選択する工程。
【請求項２】
がん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団が、前記(i)と、前記(ii)及び/又は前記(iii)により誘導されたものである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
がん幹細胞に感受性を有する制癌剤が、がんの原発巣、転移巣及び再発巣の全てにおいて有効である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
工程１における(i)多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下での培養を細胞内シグナル伝達経路阻害剤の存在下で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制癌剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
本明細書において、以下の略号を用いる。
miPS：マウスｉＰＳ細胞
CSC/CSCs：がん幹細胞
GFP：緑色蛍光タンパク質
【背景技術】
【０００３】
制癌剤の開発においてスクリーニングは最も重要な初期プロセスであるが、従来行われていたのは、「がんに由来する細胞株」を用い、候補物質としての制癌剤を当該細胞と接触させ、当該剤による細胞増殖抑制作用について調べる方法であった。
【０００４】
がん組織の中でも、がん幹細胞が転移や再発の大きな原因となっていることは広く知られるが、がん幹細胞は制癌剤や放射線に耐性をもつと考えられている。このがん幹細胞に効果的な薬剤あるいは治療方法を選択することが最も重要なことであるが、患者のがん組織からがん幹細胞を抽出して、制癌剤のスクリーニングに提供することは、組織中のがん幹細胞が僅少で、しかも患者により遺伝背景が異なること、腫瘍の部位が異なることを考えると現実的ではない。
【０００５】
また、現在認可されている制癌剤は、１種のみ又は２種もしくは３種の非常に少ない種類のがんに対する有効性が認められているだけであり、がん患者に最初に使用された制癌剤の有効性は必ずしも十分ではなく、しかも転移巣或いは再発巣に対する有効性は大きく低下するのが現状である。
【０００６】
特許文献１〜３は、iPS細胞をがん由来細胞の培養上清を含む培養液中で培養し、がん幹細胞に誘導し、得られたがん幹細胞を用いてがん治療薬をスクリーニングする方法を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2014-207889
【特許文献２】特開2014-207883
【特許文献３】再表2014/148562
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、原発巣だけでなく転移巣、再発巣にも有効であり、様々ながん幹細胞に感受性を有する制癌剤を提供するための、制癌剤のスクリーニング方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の制癌剤のスクリーニング方法を提供するものである。
項１．
以下の工程を含む、がん幹細胞に感受性を有する制癌剤のスクリーニング方法：
工程１：以下の(i)〜(iii)
(i) 多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養すること
(ii) 前記(i)で誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団或いは該細胞集団から分離されたがん幹細胞を免疫不全動物に移植して形成した悪性腫瘍から初代培養を行うこと
(iii) 前記(i)で誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団或いは該細胞集団から分離されたがん幹細胞を免疫不全動物に移植して転移した悪性腫瘍から初代培養を行うこと
の少なくとも１種により多能性幹細胞から各々異なるがん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団を誘導する工程（ｎは２以上の整数を示す）；
工程２：工程１で誘導された、各々異なるがん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団を採取する工程；
工程３：前記ｎ種類の細胞集団に候補物質を作用させる工程；及び
工程４：複数の細胞集団に有効な候補物質をがん幹細胞に感受性の制癌剤として選択する工程。
項２．
がん幹細胞を含むｎ種類の細胞集団が、前記(i)と、前記(ii)及び/又は前記(iii)により誘導されたものである、項１に記載のスクリーニング方法。
項３．
がん幹細胞に感受性を有する制癌剤が、がんの原発巣、転移巣及び再発巣の全てにおいて有効である、項１又は２に記載のスクリーニング方法。
項４．
工程１における(i)多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下での培養を細胞内シグナル伝達経路阻害剤の存在下で行うことを特徴とする、項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
iPS細胞などの多能性幹細胞から種々のがん幹細胞を含む細胞集団を作製することができ、これらが一様に同種の制癌剤に感受性を示すということは、同一の遺伝背景を持つ細胞は、異なるがん幹細胞の性質を持つ形になったとしても、すなわち腫瘍の臓器組織を問わずその中に存在するがん幹細胞は、同じ制癌剤で治療が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、マウスiPS由来のがん幹細胞(miPS-CSC)を用いて１９０種の候補物質をスクリーニングした手順を概略的に示す。miPS-LLCcm細胞：iPS細胞をルイス肺癌細胞(LLC)の培養液を用いて培養して得られたがん幹細胞（腺癌を形成）。miPS-LLCcm primary細胞：miPS-LLCcm細胞をヌードマウスに移植して形成した悪性腫瘍から初代培養を行って得られたがん幹細胞。miPS-LLCcmLMT細胞：miPS-LLCcm細胞をヌードマウスに移植して肺転移した悪性腫瘍から初代培養を行って得られたがん幹細胞。miPS-B16cm細胞：iPS細胞をB16メラノーマ細胞の培養液を用いて培養して得られたがん幹細胞。
【図２】各がん幹細胞を含む細胞集団にドキソルビシンを適用したときの結果。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のスクリーニング方法で得られるがん幹細胞に感受性の制癌剤は、多能性幹細胞と同一又は類似したジェノタイプを有するがん幹細胞に対し、広く有効である。したがって、がん幹細胞に「感受性」とは、程度に差はあるが、任意のがん幹細胞に有効であり、臨床的に問題となるがん、例えば、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆管癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、副腎癌、膀胱癌、脳腫瘍、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、骨肉種、横紋筋肉種などのがんに広く有効である。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法において、多能性幹細胞は、ｎ種類の各がん幹細胞を含む培養集団に誘導される。多能性幹細胞をがん細胞１の培地に含まれる培養成分の存在下で培養することで、がん幹細胞１を含む細胞集団１を調製することができ、多能性幹細胞をがん細胞２の培地に含まれる培養成分の存在下で培養することで、がん幹細胞２を含む細胞集団２を調製することができる。がん細胞の培地に含まれる培養成分としては、がん細胞の培地の培養上清を使用することが好ましい。がん細胞は、原発巣のがん細胞を用いてもよく、転移巣のがん細胞を用いてもよく、再発巣のがん細胞を用いてもよい。また、がん細胞株は初代培養がん細胞株であってもよく、安定がん細胞株であってもよい。がん細胞株は、フナコシ株式会社、コスモ・バイオ株式会社などから販売されている市販品を用いてもよく、理化学研究所 バイオリソース研究センター  細胞材料開発室(RIKEN BRC)、ATCC（American Type Culture Collection）などから入手することもできる。例えば、がん細胞が胃癌細胞株の場合、胃癌細胞株の培地に含まれる成分(例えば培養上清)を用いて多能性幹細胞を培養した場合、胃癌幹細胞を含む細胞集団が得られる。がん幹細胞自身はその可塑性から細胞の性質が環境に左右され易い。その結果、胃で生じたがん幹細胞は自己複製する一方で胃組織の中で影響を受けながら分化して生じる細胞が、胃癌組織を形成する。しかし、このがん幹細胞が肺へ転移すると肺組織の環境中でその影響を受けてがん組織を形成する。同一のがん幹細胞を元に形成したがんであっても、転移した組織の影響を受けながらがん組織を形成するので、がん組織としての形態は異なることになる。がん細胞の培地に含まれる成分(例えば培養上清)を用いて多能性幹細胞を培養して誘導したがん幹細胞を含む細胞集団(i)と、前記(i)で誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団をヌードマウスなどの免疫不全哺乳動物に移植して形成された悪性腫瘍から初代培養を行うことで誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団(ii)と、前記(i)で誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団をヌードマウスなどの免疫不全哺乳動物に移植して転移した悪性腫瘍から初代培養を行うことで誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団(iii)は、周囲の環境が異なることにより「がん幹細胞を含む細胞集団」としての性質が異なるものであるので、本発明では、これらは異なるものとして制癌剤のスクリーニングに利用する。
【００１４】
例えば、がん細胞株をｎ種類用意し、各がん細胞１〜ｎを培養し、各がん細胞１〜ｎの培地に含まれるｎ種類の培養成分（好ましくはｎ種類の培地の培養上清）を準備する。次に同じ多能性幹細胞を前記ｎ種類の培地の培養上清で各々培養することで、ｎ種類の各がん幹細胞１〜ｎを含む各細胞集団１〜ｎを調製することができる。
【００１５】
また、ｎ種類の各がん幹細胞１〜ｎを含む各培養集団１〜ｎのいずれかをヌードマウスなどの免疫不全動物に移植して形成もしくは転移した悪性腫瘍から初代培養を行って誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団を本発明のスクリーニング方法に使用することができる。免疫不全動物で形成もしくは転移した悪性腫瘍から初代培養を行って誘導されたがん幹細胞を含む細胞集団を用いることで、再発あるいは転移した癌により有効な制癌剤が選択されると期待される。
【００１６】
多能性幹細胞及びがん細胞は、いずれも哺乳類由来のものが挙げられ、多能性幹細胞とがん細胞の由来は同一であっても異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。特に好ましい実施形態では、多能性幹細胞とがん細胞は、いずれもヒト、マウス又はラット由来であることが好ましく、ヒト又はマウス由来がより好ましく、ヒト由来が最も好ましい。
【００１７】
がん細胞としては、臨床分離株を用いることもできるが、好ましくはがん細胞株を用いることができる。がん細胞株としては、乳癌細胞株、前立腺癌細胞株、大腸癌細胞株、腎臓癌細胞株、肝臓癌細胞株、肺癌細胞株、膵臓癌細胞株、白血病細胞株、膀胱癌細胞株、皮膚癌細胞株、胃癌細胞株、副腎がん細胞株、脳腫瘍細胞株、卵巣癌細胞株、子宮癌細胞株、骨肉種細胞株、横紋筋肉腫細胞株、頭頸部癌細胞株、子宮頸癌細胞株、食道癌細胞株、結腸癌細胞株、直腸癌細胞株、胆管癌細胞株、胆嚢癌細胞株、甲状腺癌細胞株、神経芽細胞腫細胞株、睾丸腫瘍細胞株、前立腺癌細胞株、陰茎癌細胞株、絨毛腫瘍細胞株、リンパ腫細胞株、組織球腫細胞株、悪性黒色腫細胞株、軟骨肉腫細胞株、脂肪肉腫細胞株、腎孟癌細胞株、線維肉腫細胞株、舌癌細胞株、Ewing肉腫細胞株、血管肉腫細胞株、上顎洞癌細胞株などが挙げられる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法で用いるがん幹細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞を、がん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養して得られたがん幹細胞を含む細胞集団をヌードマウスなどの免疫不全哺乳動物に移植し、形成された悪性腫瘍、或いは、前記がん幹細胞を含む細胞集団をヌードマウスなどの免疫不全哺乳動物に移植し、免疫不全哺乳動物において転移して形成された悪性腫瘍から分離したがん幹細胞を含む細胞集団を使用してもよい。免疫不全動物で形成された悪性腫瘍(原発巣又は転移巣)はがん幹細胞を含み、さらにがん細胞を含み得る。また、多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養すると、がん幹細胞を含む細胞集団が得られるが、この細胞集団は培養条件によってがん幹細胞から構成される場合もあり、がん幹細胞とがん細胞の両方を含む場合もある。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法では、多能性幹細胞を、がん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養して得られたがん幹細胞を含む細胞集団を複数作製し、これらの細胞集団を用いて本発明のスクリーニング方法を実施してもよく、多能性幹細胞を、がん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養して得られたがん幹細胞を免疫不全哺乳動物に移植し、移植場所もしくは転移により形成された悪性腫瘍から分離したがん幹細胞を含む細胞集団を複数作製し、免疫不全哺乳動物の悪性腫瘍由来のがん幹細胞を含む細胞集団のみを本発明のスクリーニング方法に使用してもよく、免疫不全哺乳動物に由来する細胞集団と免疫不全哺乳動物に由来しない細胞集団を組み合わせて本発明のスクリーニングに使用してもよい。免疫不全哺乳動物由来の幹細胞を含む細胞集団は、再発又は転移したがんに有効な制癌剤のスクリーニングに有効であり、多能性幹細胞を、がん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養して得られたがん幹細胞を含む細胞集団は原発巣に対する制癌剤のスクリーニングに有効である。したがって、本発明のスクリーニング方法では、これらを組み合わせることが好ましい。
【００２０】
ｎは２以上の整数、好ましくは2〜10000、より好ましくは10〜1000、さらに好ましくは50〜100である。ｎが大きいほど、詳細なデータが得られるが、がん幹細胞を含む細胞集団の作製には時間がかかるため、ｎ数は目途を勘案して適宜設定すればよい。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法において、ｎ種類の過半数のがん幹細胞を含む細胞集団に対して相対的に強い制癌作用を示した候補物質を有効であると評価する。有効な制癌剤は、最も強力な制癌作用を有する１種類を選択してもよく、それに次ぐ２種又は３種の制癌剤を選択し、これらを併用してもよい。
【００２２】
制癌剤は、がん幹細胞を含む細胞集団の培養液に添加すればよい。培養液中の制癌剤の濃度は、好ましくは0.0001〜1μＭ程度、より好ましくは0.001〜0.2μＭ程度である。
【００２３】
多能性幹細胞をがん細胞の培地に含まれる培養成分の存在下で培養する工程において、細胞内シグナル伝達経路阻害剤を培地中に添加すると、がん幹細胞を作製するための培養期間が短縮されるので好ましい。
【００２４】
本明細書において、シグナル伝達経路阻害剤の標的となるシグナル伝達経路としては、ＭＥＫ、ＧＳＫ３、ＴＧＦβ、Kit、PDGFα/β、FLT3、BCR/ABL、p38-MAPK、ヘッジホッグ（Hedgehog）、Src、ABL1、VDAs、BCR/ABL、GLI1、PDGFR、VEGFR、FGFR、L-type Ca2+ channel activator1,2、Syk、RHO/ROCKが挙げられる。具体的には、以下のシグナル伝達経路阻害剤が挙げられる：
ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ダサチニブ(Dasatinib)、マサチニブ(Masitinib)、キザルチニブ(Quizartinib)、Alk5阻害剤II、バフェチニブ(Bafetinib) (INNO-406)、BIRB-796、CHIR99021、DCC-2036 (Rebastinib)、DMAXX (vadimezan)、Fingolimod (FTY720)、GZD824、イマチニブ（imatinib）、メシル酸イマチニブ、KAAD-Cycbpamine、PD0325901、ポナチニブ（ponatinib）、AG-013736、AST-487、BIBF-1120、BIBW-2992、BIO、BMS-540215、CHIR-258/TKI-258、CHIR-265/RAF-265、CI-1033、Danusertib (PHA-739358)、Degrasyn (WP1130)、Erlotinib、Forskolin、Gefitinib、HKI-272、Nilotinib、PD-173955、PTK-787、Saracatinib (AZD0530)、SC1(Pluripotin)、SGX-523、Sorafenib、SU-14813、Sunitinib、Wnt inhiitor iwp-2、Wnt inhiitor iwp-3、Wnt inhiitor iwp-4、AMG-706、Nibtinib (AMN-107)、Olaparib (AZD2281, Ku-0059436)、PD173034、R(+)Bay K8644、R406、チアゾビビン（Thiazovivin）など。前記シグナル伝達経路阻害剤の内、より好ましいシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ダサチニブ(Dasatinib)である。
【００２５】
本明細書において、多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞に分化し得る分化多能性を有する幹細胞をいう。
【００２６】
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）から得られるMuse細胞（Multi-lineage differentiating stress enduring cell）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたGS細胞も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるRx::GFP株（KhES-1由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
【００２７】
ES細胞の一つである核移植ES細胞（ntES細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
【００２８】
EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る(Cell, 70: 841-847, 1992)。
【００２９】
本明細書における「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（1）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（2）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc (Stem Cells, 2013;31:458-466)を挙げることが出来る。
【００３０】
iPS細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell, 2006, 126(4), pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872；Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106）。
【００３１】
iPS細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013,341, pp. 651-654）。
【００３２】
また、株化されたiPS細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01細胞、Ff-I14細胞及びQHJI01s04細胞が、京都大学より入手可能である。
【００３３】
iPS細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球(PBMC)やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
【００３４】
本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又はiPS細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。
【００３５】
本発明における「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
【００３６】
本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト又はマウス多能性幹細胞、更に好ましくはヒト又はマウス人工多能性幹細胞（iPS細胞）又はヒト又はマウス胚性幹細胞（ES細胞）である。
【００３７】
がん幹細胞は、浮遊培養で調製してもよく、接着培養で調製してもよい。
【００３８】
本明細書における「浮遊培養」とは、細胞または細胞の凝集体が培地に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞-基質間結合（cell-substratum junction）が形成されることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
【００３９】
浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
【００４０】
細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1％以上、好ましくは3％以上、より好ましくは5％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
【００４１】
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿(ディッシュ)、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ、三角フラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
【００４２】
接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養器が挙げられる。
【００４３】
本明細書においてがん細胞の培養に用いられる「培地」は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。「基礎培地」としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。培地は、血清培地であってもよく、無血清培地であってもよい。
【００４４】
本明細書における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００４５】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製；現ThermoFisher：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2サプリメント（Life Technologies社製）、ITSサプリメント（Life Technologies社製）が挙げられる。
【００４６】
浮遊培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００４７】
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のKSR（ライフテクノロジー（Life Technologies）社製）を適量（例えば、約0.5％から約30％、好ましくは約1％から約20％）添加した無血清培地（例えば、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、Chemically-defined Lipid concentrated、及び450μM 1-モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。
【００４８】
本明細書において、「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００４９】
iPS細胞等の多能性幹細胞の培地としては、市販品を用いてもよく、例えばマウス胎児由来線維芽細胞（MEF）をフィーダー細胞として，ウシ血清または代替血清であるKnockOutTM Serum Replacement（KSR）とLIF又はFGF-2（basic FGF）などを添加した培地を用いてもよい。また、フィーダー細胞を用いず、マトリジェル（マウス肉腫由来基底膜マトリックス）とフィーダー細胞のコンディションメディウムを使用してもよい。
【００５０】
がん幹細胞の製造工程において、がん細胞の培地に含まれる培養成分(例えばがん細胞の培養上清)と多能性幹細胞の培地は任意の割合で混合すればよく、好ましくは1：1で混合することが望ましい。
【００５１】
本明細書において、「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。
【００５２】
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
【００５３】
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
【００５４】
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
【００５５】
本発明の好ましい１つの実施形態では、がん幹細胞を含む細胞集団は、細胞内シグナル伝達経路阻害剤及びがん細胞の培養上清の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含む方法により製造される。
【００５６】
多能性幹細胞を用いたがん幹細胞の製造方法は、細胞内シグナル伝達経路阻害剤を培養液に添加する以外は、後述するとおり、がん細胞の培養上清の存在下で４週間かけてがん幹細胞に変換する従来法と同様に実施することができる。多能性幹細胞からがん幹細胞を誘導する培養期間は、好ましくは２週間以内、より好ましくは１週間以内である。１週間の培養により多能性幹細胞からがん幹細胞を含む細胞集団を十分な割合で得ることができる。
【００５７】
多能性幹細胞の培養は、フィーダー細胞の存在下で実施してもよいしフィーダー細胞フリーの条件下で実施してもよい。
【００５８】
培地中の細胞内シグナル伝達経路阻害剤の濃度は、前記阻害剤の種類にもよるが、好ましくは0.05〜100μM程度、より好ましくは0.5〜10μM程度である。
【００５９】
がん幹細胞の製造のための多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養の何れの条件で行われてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
【００６０】
接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されないが、細胞接着性の培養器が好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の内部表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には前述した培養器の内部表面がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。また、正電荷処理等の表面加工された培養器を使用することもできる。好ましくは、ゼラチンが挙げられる。
【００６１】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤を培地に添加することで、多能性幹細胞からがん幹細胞を誘導する培養期間は、好ましくは２週間以内、より好ましくは１週間以内である。１週間の培養により多能性幹細胞からがん幹細胞を含む細胞集団を十分な割合で得ることができる。
【００６２】
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
【００６３】
多能性幹細胞の濃度は、がん幹細胞が効率的に産生されるものであればよく、特に限定されないが、例えば、96穴マイクロウェルプレートを用いて多能性幹細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1×103から約1×106細胞、好ましくは約3×103から約1×105細胞が挙げられる。
【００６４】
培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の30〜90％程度、例えば40〜60％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の30〜90％、例えば40〜60％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
【００６５】
培地交換を行う場合、細胞内シグナル伝達経路阻害剤は、培地交換の前後で大きく変わらないことが望ましい。細胞内シグナル伝達経路阻害剤は、新しい培地に加えておいてもよく、培地交換後に最終濃度を計算して必要な量の細胞内シグナル伝達経路阻害剤を添加してもよい。
【００６６】
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルマイクロピペットを使ってもよい。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかし、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
（１）使用した細胞
本実施例では、以下の表１に示すがん幹細胞（miPS-LLCcm、miPS-LLCcm primary、miPS-LLCcm LMT、miPS-LLC ev、miPS-LLC evPT、miPS-LLC evDT、miPS-P19cm、miPS-B16cm、miPS-MC.E12co）を下記の論文に従い調製し、使用した。
論文：Matsuda.S et al, Cancer stem cells maintain a hierarchy of differentiation by creating their niche, International Journal of Cancer, Online 3 Dec 2013
【００６８】
【表１】
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【００６９】
（２）本発明でスクリーニングされる制癌剤の候補物質
表２に示す190種類の化合物を制癌剤の候補物質として用いて、本発明の制癌剤のスクリーニング方法を適用してスクリーニングを行った。190種類の化合物を表２に示す。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
（３）miPS-CSCs（miPS-LLCcm、miPS-LLCcm primary、miPS-LLCcm LMT、miPS-LLC ev、miPS-LLC evPT、miPS-LLC evDT、miPS-P19cm、miPS-B16cm、miPS-MC.E12co）の培養
miPS-CSCsは、以下の表３の成分を含む培地（miPS-CSC培地）、ゼラチンコートした接着培地用ディッシュ(φ100mm,TPP)を用い、37℃、5%CO2条件下で培養した。細胞がディッシュの７割程度になるとPBS2mlで２回洗浄し、0.025%トリプシンEDTA500μlでディッシュからはがして15ml遠心チューブに回収し、1500gで5分間遠心した。遠心後上清を取り除き、miPS-CSC培地1mlで希釈・懸濁し継代を行った。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
（４）miPS-CSC bulk 培養コンディションメディウム（CM）の調製(図1)
miPS-CSC細胞をコンフルエント状態まで培養した後、無血清培地（血清不含miPS-CSC培地、表２の培地組成よりLIF、FBSをのぞき、DMEMにて容量を調整した）に交換し20時間培養した。20時間後、培養上清を回収し、2000gで15分間遠心し、0.20μmフィルター（Biotech）で濾過を行い培地から細胞を完全に除去しこれをCMとして回収した。なお、回収の際に死細胞を含めた全細胞数を測定した。CMは1mlあたり1×106個の細胞由来となるように無血清培地で希釈した。CMと無血清培地を１：１で混ぜFBSを終濃度15%で加えたものを作成し、がん幹細胞を濃縮する際に使用した。
【００７６】
（５）Puromycinを用いたがん幹細胞の濃縮(図1)
miPS-CSCs 培地で各細胞を１週間ほど培養し細胞をコンフルエントになった後に、1 μg/mlの濃度になるようにPuromycinを添加しmiPS-CSCs 培地で毎日培地交換を行い約1週間(1回以上の継代を含む)培養した。
【００７７】
（６）制癌剤の候補物質のスクリーニング
miPS-LLCcm、miPS-LLCcm primary、miPS-LLCcmLMT、miPS-B16cmを用いて制癌剤の候補物質のスクリーニングを本発明の制癌剤のスクリーニング方法により行った。ゼラチンコートディッシュを用いてpuromycin添加によりがん幹細胞を濃縮した後、ゼラチンコートした96 well プレートに細胞を10000 cells/wellで100 μlずつ播種した。24時間培養後、表2に示す190種の候補物質を終濃度1 μMになるよう10 μlずつ加えた。その後48時間培養したのち、MTT  assayを行い、細胞生存度を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、ダウノルビシンが最も強い制癌活性を示し、次いでドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣの順に制癌活性を示した。本実施例の結果から、細胞生存率が２０％以下であるダウノルビシンとドキソルビシンが選択され、特にドキソルビシンが選択される。
【００７８】
４種のがん幹細胞（miPS-LLCcm、miPS-LLCcm primary、miPS-LLCcmLMT、miPS-B16cm）を各々含む４種の細胞集団に最も強い制癌活性を示したドキソルビシンについて、その他のがん幹細胞｛（miPS-LLCev細胞：iPS細胞をルイス肺癌細胞のエキソソームを用いて培養して得られたがん幹細胞（脂肪肉腫形成）。miPS-LLCevPT細胞：miPS-LLCev細胞をヌードマウスに移植して形成した悪性腫瘍から初代培養を行って得られたがん幹細胞。miPS-LLCevDT細胞：miPS-LLCev細胞をヌードマウスに移植して腹膜播種した悪性腫瘍から初代培養を行って得られたがん幹細胞。miPS-P19cm細胞：iPS細胞をP19テラトカルシノーマ細胞の培養液を用いて培養して得られたがん幹細胞。miPS-MC.E12co細胞：iPS細胞をMC.E12乳癌細胞と共培養して得られたがん幹細胞。）｝を評価すると、がん幹細胞は性質を異にしていても、同様に高い感受性（IC50＝5〜20nM）を示すことがわかった（図2）。
【図１】
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【図２】
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