(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質を検出するための試験紙片の提供。【解決手段】試験紙片は、濾紙片、固定剤、増感剤及びテトラサイクリンバイオセンサー菌接種物を含み、前記試験紙は、市販の通常の濾紙をカットして形成され、前記テトラサイクリンバイオセンサー菌接種物は、ｐＭＴＬａｃＺプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株である。ｐＭＴＬａｃＺプラスミドは、独自に設計した合成プラスミドであり、様々なテトラサイクリン系抗生物質によって誘導され、ｐＭＴＬａｃＺプラスミドは、様々な濃度のテトラサイクリンの誘導下で様々な量のβ−ガラクトシダーゼを生成し、試験紙片上に固定されたＸ−ｇａｌ発色剤を分解でき、サンプル中のテトラサイクリン系抗生物質の濃度を視覚的に表示することができる。【選択図】図７
2020198879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
濾紙片、固定剤、増感剤、およびテトラサイクリンバイオセンサー菌接種物を含み、前記
テトラサイクリンバイオセンサー菌接種物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２
１／ｐＭＴＬａｃＺ株であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬ
ａｃＺ株が前記固定剤および前記増感剤によってラップされ前記濾紙片上に固定されるこ
とを特徴とするバイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物
質を検出する試験紙片。
【請求項２】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ株の調製方法であっ
て、
（1）ＰＣＲ法によりプラスミドｐＭＴｍＣｈｅｒｒｙからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｒｏｓｔｒｉ  ＲＳＴ１１：Ｔｎ９１６とトランスポゾンＴｎ１０上のテトラサイク
リン媒介調節システムのｐＭＴフラグメントの遺伝子シーケンスをクローニングするステ
ップ（1）と、
前記ｐＭＴプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケンス
は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示され：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１：ＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２：ＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧ、
（2）ＰＣＲ法によりｐＣＵ１９プラスミドからクローニングされたＬａｃＺ（３６８  
ｂｐ）レポーター遺伝子フラグメントの遺伝子シーケンス、およびプラスミドｐＭＴｍＣ
ｈｅｒｒｙからクローニングされたＴ７フラグメント（２２０  ｂｐ）の遺伝子シーケン
スを、ＬａｃＺおよびＴ７ターミネーターシーケンスとの結合・融合によりＬａｃＺ−Ｔ
７融合フラグメント（５６８  ｂｐ）を得るステップ（2）と、
前記ＬａｃＺプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケン
スは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３：ＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡ
ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４：ＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ
ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ、
前記Ｔ７プライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケンスは
、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５：ＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６：ＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡ
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ、
ＬａｃＺ−Ｔ７の融合に用いられるプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方
向プライマーシーケンスは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８に示
され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７：ＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８：ＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣ、
（3）前記のＬａｃＺ−Ｔ７およびｐＭＴを相同リコンビナーゼで接続し、ターゲットＤ
ＮＡを取得し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１コンピテントセルを前記タ
ーゲットＤＮＡに入れ、抗生物質を含まない無菌ＬＢ培地を加えてよく混ぜて復活し、異
なる体積の復活液を吸引し、Ａｍｐ抗生物質を含むＬＢ培地に均一に塗布し、プレートを
上下逆に３７℃のインキュベーターに入れ、一晩培養するするステップ（3）と、
（４）培地上のスポットを選び、無菌の１０  μＬピペットチップを使用して、アンピシ
リン抗生物質を含むＬＢ培地およびアンピシリン、２０  ｍｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌおよびテ
トラサイクリン抗生物質を含むＬＢ培地にそれぞれ線を引いて、２つの培地で増殖し、ア
ンピシリン、２０  ｍｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌおよびテトラサイクリン抗生物質を含むＬＢ培
地で青い斑点を増殖させる株をスクリーニングし、プライマーＰＣＲを使用して組み換え
プラスミドを同定し、プラスミドのコアフラグメントが３５９０  ｂｐであることを確認
する、
同定に使用したプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケ
ンスは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９：ＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＧＧ、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０：ＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡ、
シーケンスを測定し、組み換えプラスミド株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ
２１／ｐＭＴＬａｃＺであることを確認するするステップ（4）と、を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラ
サイクリン系抗生物質を検出する試験紙片。
【請求項３】
前記固定剤は１０％ラクトースであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー
を使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質を検出する試験紙片。
【請求項４】
前記増感剤はポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の１／４  ＬＢ培地であることを特徴とする請求
項１に記載のバイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質
を検出する試験紙片。
【請求項５】
(ａ)濾紙片ベースを用意し、必要なサイズにカットすることと、
(ｂ)Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌および１０％ラ
クトースおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地を一定の割合で混合させることと、
(ｃ)Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌および１０％ラ
クトースおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地の混合物を試験紙ベース上に滴下することと、
(ｄ)試験紙を凍結乾燥機に入れ固定することと、を含む、ことを特徴とする請求項１から
４のいずれか１項に記載のバイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリ
ン系抗生物質を検出する試験紙片の調製方法。
【請求項６】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌および１０％ラ
クトースおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地の混合物の投与割合範囲は、３〜４ｍｇの菌粉
に対して１００μＬの１０％ラクトースおよびＰＭＢの１／４ＬＢ培地を混合することを
特徴とする請求項５に記載の調製方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥機での固定時間は４時間であることを特徴とする請求項５に記載の調製方法
。
【請求項８】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌試験紙を試験する１
００μＬの土壌抽出液および９００μＬのＬＢ培地の混合液に入れ、バイオセンサー試験
紙上の青の強度を検出することを特徴とする請求項１に記載の試験紙片を使用して土壌中
の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質の検出方法。
【請求項９】
初期発色および１．５時間後の色強度の比較により色強度を求め、該土壌中の６種類のテ
トラサイクリン系抗生物質の検出を実現することを特徴とする請求項８に記載の検出方法
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的分析および検出の技術分野に属し、特にバイオセンサーを使用して土
壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質を検出する試験紙片および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業化の進展や各種化学製品による土壌汚染の急激な発生に伴い、各種化学物質の数が急
増しており、人間の生活環境に大きな影響を与えており、環境汚染物質の増加の急性毒性
の解明が急務となっている。テトラサイクリン系薬物は、広域スペクトルで高効率の殺菌
効果と抗菌効果があり、ほとんどの薬や飼料添加物と混合することができ、家畜や家禽の
生産で広く使用されている。しかしながら、過度の使用は必然的に家畜や家禽の糞便に深
刻な薬物残留物を引き起こし、糞便を介して土壌環境に入り、人間の健康に危険な食品安
全の隠された危険の一つとなった。このため、世界中の国々がテトラサイクリン残留物の
検出に非常に懸念している。テトラサイクリン残留薬物の検出方法の中で、物理的および
化学的検出には、主に薄層クロマトグラフィーキャピラリー電気泳動、高速液体クロマト
グラフィー、化学発光、および液体クロマトグラフィー-質量分析などが含まれる。生物
学的検出法は、主に微生物学的方法とイムノアッセイなどに分けられる。しかしながら、
これらの方法の中には、高価な機器や設備を必要とし、熟練した専門家が操作する必要が
あり、操作プロセスが複雑であり、時間がかかり、その適用範囲が制限され、普及して生
産に適用することが難しい。イムノアッセイ法は、半定量的および特定の定量的機能を備
えており、分析物の予備情報を提供でき、この方法は、高感度でシンプルな分析プロセス
を備え、土壌中のテトラサイクリンの含有量を検出するために優先的に開発する必要があ
る検出技術である。細菌バイオセンサーは、その独特の生理学的特性と最新の光電検出法
と完全に一致するという特性のため、多くの注目を集めている。
【０００３】
試験紙は、検出コストが低く、操作が簡単などの独自の特点を有するので、様々な分野で
広く応用され、例えば、ラボで使用されるｐＨ試験紙、ヨウ化カリウムでんぷん試験紙、
産業で使用される温度に敏感な試験紙、廃水検出試験紙、生活で使用される血糖試験紙な
どがある。試験紙を作成するための様々な材料および方法により、試験紙の検出分野およ
び検出感度も異なる。現在、全細胞バイオセンサーを使用してテストストリップを調製す
ることによって土壌中のテトラサイクリン抗生物質を評価する方法はない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、全細胞バイオセンサーを使用して土壌中のテトラサイクリン抗生物質を検出す
るための試験片を調製するギャップを埋め、全細胞バイオセンサーを使用して土壌中のテ
トラサイクリン系抗生物質を検出する試験紙片および検出方法を提供することを目的とす
る。
【０００５】
本発明の技術的解決策は以下の通りである。
濾紙片、固定剤、増感剤、およびテトラサイクリンバイオセンサー菌接種物を含み、前記
テトラサイクリンバイオセンサー菌接種物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２
１／ｐＭＴＬａｃＺ株であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬ
ａｃＺ株が前記固定剤および増感剤によってラップされ前記濾紙片上に固定されるバイオ
センサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質を検出する試験紙片
である。
【０００６】
さらに、上記解決策では、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬ
ａｃＺ株の調製方法は、以下のことを含む。
（１）ＰＣＲ法によりプラスミドｐＭＴｍＣｈｅｒｒｙからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｒｏｓｔｒｉ  ＲＳＴ１１：Ｔｎ９１６とトランスポゾンＴｎ１０上のテトラサイク
リン媒介調節システムのｐＭＴフラグメントの遺伝子シーケンスをクローニングし、
前記ｐＭＴプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケンス
は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示され：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１：ＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２：ＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧ、
表１  使用する株およびプラスミド
【０００７】
2020198879.tif 000003
【０００８】
（２）プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ｐＣＵ１９プラスミドか
らＬａｃＺ（３６８  ｂｐ）レポーター遺伝子フラグメントの遺伝子シーケンスをクロー
ニングし、アニーリング温度が６５℃であり、プラスミドｐＭＴｍＣｈｅｒｒｙからＴ７
フラグメント（２２０  ｂｐ）の遺伝子シーケンスをクローニングし、アニーリング温度
が６０℃であり、ＬａｃＺおよびＴ７ターミネーターシーケンスとの結合・融合によりＬ
ａｃＺ−Ｔ７融合フラグメント（５６８  ｂｐ）を得、プライマーを設計するときに、相
同フラグメントを添加する必要がある。
前記ＬａｃＺプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケン
スは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３：ＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡ
ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４：ＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ
ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ、
前記Ｔ７プライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケンスは
、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５：ＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６：ＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡ
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ、
ＬａｃＺ−Ｔ７の融合に用いられるプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方
向プライマーシーケンスは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８に示
され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７：ＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８：ＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣ、
【０００９】
（３）前記のＬａｃＺ−Ｔ７およびｐＭＴを相同リコンビナーゼで接続し、遺伝子フラグ
メントをＰＣＲ管に入れ、ピペットで静かにピペッティングして混合し、すべての液体を
低速で遠心管の底まで遠心する。キャリアには１０−１００  ｎｇを使用する。キャリア
とインサートフラグメントのモル比は１：１〜１：１０である。複数のフラグメントを接
続する場合、各フラグメントの固モル比は１：１である。
ｐｍｏｌｓ=  (質量ｎｇ×１０００)／(フラグメント長さｂｐ×６５０ｄａｌｔｏｎｓ)
、
混合液を５０℃で１５分間反応させる。複数のフラグメントクローニングの場合、反応時
間を延長できるが、総時間は６０分を超えないようにする必要がある。
１００μＬの融解したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１コンピテントセルを
氷浴で取り、ターゲットＤＮＡ（プラスミドまたは使用、ライゲーション生成物）を加え
、静かに混合し、氷上で25分間放置する。ウォーターバスで42°Cで30〜45秒間ヒートシ
ョックを行い、すぐに氷浴に移して2分間放置する。５００μＬの抗生物質を含まない無
菌ＬＢ培地を遠心管に加え、混合して、３７℃、２００ｒｐｍで１時間復活する。様々な
体積の復活液を吸引し、Ａｍｐ抗生物質を含むＬＢ培地に均一に塗布し、プレートを上下
逆に３７℃のインキュベーターに入れ、一晩培養する。
【００１０】
（４）培地上のスポットを選び、無菌の１０μＬピペットチップを使用して、アンピシリ
ン抗生物質を含むＬＢ培地およびアンピシリン、２０  ｍｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌおよびテト
ラサイクリン抗生物質を含むＬＢ培地にそれぞれ線を引いて、２つの培地で増殖し、アン
ピシリン、２０ｍｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌおよびテトラサイクリン抗生物質を含むＬＢ培地で
青い斑点を増殖させる株をスクリーニングし、プライマーＰＣＲを使用して組み換えプラ
スミドを同定し、アニーリング温度が５３℃であり、プラスミドのコアフラグメントが３
５９０ｂｐであることを確認する。
同定に使用したプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケ
ンスは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９：ＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＧＧ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０：ＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡ、
シーケンスを測定し、組み換えプラスミド株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ
２１／ｐＭＴＬａｃＺであることを確認する。
【００１１】
さらに、上記解決策では、前記固定剤は１０％ラクトースである。
【００１２】
さらに、上記解決策では、前記増感剤はＰＭＢの１／４ＬＢ培地である。
【００１３】
本発明は、上記試験紙片の調製方法をさらに提供し、この方法は、
(ａ)濾紙片ベースを用意し、必要なサイズ、好ましくはｌｃｍ×４ｃｍにカットすること
と、
(ｂ)Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌および１０％ラ
クトースおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地を一定の割合で混合させることと、
(ｃ)Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌および１０％ラ
クトースおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地の混合物を試験紙ベース上に滴下することと、
(ｄ)試験紙を凍結乾燥機に入れ固定することと、を含む。
さらに、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ細菌および
１０％ラクトースおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地の混合物の投与割合範囲は、３〜４ｍ
ｇの菌粉に対して１００μＬの１０％ラクトースおよびＰＭＢの１／４ＬＢ培地を混合す
る。
【００１４】
さらに、前記凍結乾燥機での固定時間は４時間である。
【００１５】
本発明は、上記試験紙片を使用して土壌中のテトラサイクリン系抗生物質を検出する方法
をさらに提供する。
測定する１００μＬの土壌抽出液および９００μＬのＬＢ培地の混合液を復活し（約１３
−１８分）、復活した後、前記試験紙に入れ、試験紙上の青の強度を検出する。
さらに、初期の発色および１．５時間後の色強度の比較により、色強度を得、該土壤の６
種類のテトラサイクリン系抗生物質の検出を実現する。
さらに、選択可能に、
ポータブル測色計を使用して青色の強度を検出する。
【００１６】
従来技術と比較すると、本発明の有益な効果は以下の通りである。
（１）本発明のｐＭＴＬａｃＺプラスミドは、様々なテトラサイクリン系抗生物質によっ
て誘導できる、発明者が独自に設計した合成プラスミドであり、ｐＭＴＬａｃＺプラスミ
ドは、異なる濃度のテトラサイクリンの誘導下で異なる量のβ−ガラクトシダーゼを生成
し、試験紙片上に固定されたＸ−ｇａｌ発色剤を分解でき、サンプル中のテトラサイクリ
ン系抗生物質の濃度を直観的に示す。
（２）本発明の試験紙片は、有機化学試薬を導入することなく、土壤中の６種類のテトラ
サイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クロルテトラサイ
クリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンおよびメトキシテトラサイクリン）の含有量
を同時に効果的に検出できる。
（３）本発明の検出方法は、単純、高速、直観的、正確で、持ち運びが容易で、環境に優
しく、適用範囲が広く、コストが低く、普及および使用が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】遺伝子フラグメントのゲル電気泳動図であり、そのうち、図ａは組み換えプラスミドで使用される遺伝子フラグメントであり、図ｂは組み換えプラスミド確認フラグメントである。
【図２】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ菌の発色原理および効果であり、そのうち、図ａは組み換えプラスミド発色原理であり、図ｂはｘ−ｇａｌ化学反応であり、図ｃは発色結果図である。
【図３】ｐＭＴＬａｃＺプラスミド遺伝子マップである。
【図４】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ菌の試験紙の調製流れである。
【図５】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ菌の試験紙により６種類のテトラサイクリン系抗生物質を検出するカラーカードである。
【図６】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ菌の試験紙により土壤の６種類のテトラサイクリン系抗生物質を検出する図である。
【図７】本発明の検出方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ株の調製：
（１）プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してプラスミドｐＭＴｍＣｈｅ
ｒｒｙからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｏｓｔｒｉ  ＲＳＴ１１：Ｔｎ９１６およ
びトランスポゾンＴｎ１０上のテトラサイクリン媒介調節システムのｐＭＴフラグメント
（５２５６  ｂｐ）の遺伝子シーケンスをクローニングし、アニーリング温度は５５℃で
ある（図１）。使用するプラスミドは表１に示される。
表１  使用する株およびプラスミド
【００１９】
2020198879.tif 000004
【００２０】
前記ｐＭＴプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケンス
は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１：ＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２：ＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧ
【００２１】
（２）プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ｐＣＵ１９プラスミドか
らＬａｃＺ（３６８  ｂｐ）レポーター遺伝子フラグメントの遺伝子シーケンスをクロー
ニングし、アニーリング温度が６５℃であり、プラスミドｐＭＴｍＣｈｅｒｒｙからＴ７
フラグメント（２２０  ｂｐ）の遺伝子シーケンスをクローニングし、アニーリング温度
が６０℃であり、ＬａｃＺおよびＴ７ターミネーターシーケンスとの結合・融合によりＬ
ａｃＺ−Ｔ７融合フラグメント（５６８  ｂｐ）を得、プライマーを設計するときに、相
同フラグメントを添加する必要がある（図１）。
【００２２】
前記ＬａｃＺプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケン
スは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３：ＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡ
ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４：ＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ
ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧ、
前記Ｔ７プライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケンスは
、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５：ＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６：ＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡ
ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ、
融合ＬａｃＺ−Ｔ７所用プライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマ
ーシーケンスは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７：ＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８：ＴＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣ、
【００２３】
（３）前記のＬａｃＺ−Ｔ７およびｐＭＴを相同リコンビナーゼで接続し、遺伝子フラグ
メントをＰＣＲ管に入れ、ピペットで静かにピペッティングして混合し、すべての液体を
低速で遠心管の底まで遠心する。キャリアには１０−１００  ｎｇを使用する。キャリア
とインサートフラグメントのモル比は１：１〜１：１０である。複数のフラグメントを接
続する場合、各フラグメントの固モル比は１：１である。
ｐｍｏｌｓ=  (質量ｎｇ×１０００)／(フラグメント長さｂｐ×６５０ｄａｌｔｏｎｓ)
、
混合液を５０℃で１５分間反応させる。複数のフラグメントクローニングの場合、反応時
間を延長できるが、総時間は６０分を超えないようにする必要がある。
１００μＬの融解したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１コンピテントセルを
氷浴で取り、ターゲットＤＮＡ（プラスミドまたは使用、ライゲーション生成物）を加え
、静かに混合し、氷上で25分間放置する。ウォーターバスで42°Cで30〜45秒間ヒートシ
ョックを行い、すぐに氷浴に移して2分間放置する。５００μＬの抗生物質を含まない無
菌ＬＢ培地を遠心管に加え、混合して、３７℃、２００ｒｐｍで１時間復活する。様々な
体積の復活液を吸引し、Ａｍｐ抗生物質を含むＬＢ培地に均一に塗布し、プレートを上下
逆に３７℃のインキュベーターに入れ、一晩培養する。
【００２４】
（４）培地上のスポットを選び、無菌の１０μＬピペットチップを使用して、アンピシリ
ン抗生物質を含むＬＢ培地およびアンピシリン、２０  ｍｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌおよびテト
ラサイクリン抗生物質を含むＬＢ培地にそれぞれ線を引いて、２つの培地で増殖し、アン
ピシリン、２０ｍｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌおよびテトラサイクリン抗生物質を含むＬＢ培地で
青い斑点を増殖させる株をスクリーニングし、プライマーＰＣＲを使用して組み換えプラ
スミドを同定し、アニーリング温度が５３℃であり、プラスミドのコアフラグメントが３
５９０ｂｐであることを確認する（図１）。
【００２５】
同定に使用したプライマーの順方向プライマーシーケンスおよび逆方向プライマーシーケ
ンスは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０に示され、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９：ＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＧＧ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０：ＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡ、
シーケンスを測定し、組み換えプラスミド株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ
２１／ｐＭＴＬａｃＺであることを確認する。ｐＭＴＬａｃＺプラスミドマップは図３に
示される。
【００２６】
２、試験紙の調製：
上記株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺを１００  ｍｇ／
Ｌのアンピシリン抗生物質を含むＬＢ培地に接種し、バイオセンサー細胞を３７℃でＬＢ
培地に約４−５時間培養し、１５０ｒ／分で激しく振動し、ＯＤ６００  ｎｍが０．４５
０−０．５００である。４０００ｇで１０  分遠心し細菌細胞を収集し、１０％ラクトー
スおよびＰＭＢの１／４  ＬＢ培地に加えて復活する。バイオセンサーの細胞懸濁液（５
０μＬ）を濾紙片（１ｃｍ×４ｃｍ）に滴下し、室温で１０分間風乾した後、凍結乾燥す
る。紙テープを−２０℃で保管される（図４）。
【００２７】
テトラサイクリンカラーカードの調製：
土壤の６種類のテトラサイクリンを検出する場合、テトラサイクリンカラーカードが必要
であり、黄褐色の土壌を例にとると、土壌の物理的および化学的特性が表2に示されてい
る。土壌抽出液は、土壌と25 mmol/L EDTAを1：1の比率で1時間浸出することによって得
られ、土壌抽出液を使用して異なる濃度（25、50、75、100、250、500、750、1000、2500
、5000、7500、および10000μg/ L）のテトラサイクリン溶液を調製し、土壌の抽出可能
な状態をシミュレートする。バイオセンサー細菌が固定された試験紙を異なる濃度のテト
ラサイクリン溶液土壤抽出液で測定し、カメラで発色写真を取得し、コンピューターに転
送してＩｍａｇｅＪソフトウェアにより発色強度を取得する（図５）。
【００２８】
テトラサイクリン検出：
復活したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ菌試験紙を測定
する土壌抽出液に入れ、１５０分間反応した直後発光量を読み取り、そしてＸ−ｇａｌを
滴下して150分間待ち、バイオセンサーと土壌抽出液のテトラサイクリン系抗生物質の反
応が完了した後、再び発色を読み取り、構築されたテトラサイクリンカラーカードの色度
で算出し、該土壌抽出液のテトラサイクリンの含有量を評価する（図７）。この新規な試
験紙の正確性および信頼性を証明するために、25 mmol/L EDTAを使用して土壤にそれぞれ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ｐＭＴＬａｃＺ菌試験紙のテストを実施
した。その結果、該試験紙の結果が安定し再現性があることを示した。したがって、この
方法は信頼性よく実現可能性があり、実用的な価値がある（図６）。
表２  試験する土壌の物理的および化学的特性
【００２９】
2020198879.tif 000005
【００３０】
上記の実施例の説明は、本発明の方法およびその精神を理解するためのものである。当業
者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、本発明をいくつかの改良および修正を
加えて実施することもでき、これらの改良および修正はすべて本発明の保護範囲に含まれ
ることは言うまでもない。
［配列表］
【００３１】
SEQUENCE LISTING
<110>  南京▲農業▼大学
<120>  バイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗生物質を検
出する試験紙片および方法
<130>  無
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(19)
<223>実験の要求に応じて設計し、pMTプライマーとしてのＦ−プライマー
<400>  1
tcgtgccagc tgcattaat                                                    19
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(25)
<223>実験の要求に応じて設計し、pMTプライマーとしてのＲ−プライマー
<400>  2
ttcacttttc tctatcactg atagg                                             25
<210>  3
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(45)
<223>実験の要求に応じて設計し、LacZプライマーとしてのＦ−プライマー
<400>  3
ctatcagtga tagagaaaag tgaaatgacc atgattacgc caagc                       45
<210>  4
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(39)
<223>実験の要求に応じて設計し、LacZプライマーとしてのＲ−プライマー
<400>  4
gtggcagcag cctaggttaa ctatgcggca tcagagcag                              39
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(18)
<223>実験の要求に応じて設計し、T7プライマーとしてのＦ−プライマー
<400>  5
ttaacctagg ctgctgcc                                                     18
<210>  6
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(45)
<223>実験の要求に応じて設計し、T7プライマーとしてのＲ−プライマー
<400>  6
tcattaatgc agctggcacg atttcacaca ggaaacagct atgac                       45
<210>  7
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(24)
<223>実験の要求に応じて設計し、融合LacZ-T7プライマーとしてのＦ−プライマー
<400>  7
ctatcagtga tagagaaaag tgaa                                              24
<210>  8
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(19)
<223>実験の要求に応じて設計し、融合LacZ-T7プライマーとしてのＲ−プライマー
<400>  8
tcattaatgc agctggcac                                                    19
<210>  9
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(20)
<223>実験の要求に応じて設計し、鑑定用プライマーとしてのＦ−プライマー
<400>  9
actgtcaatt tgatagcggg                                                   20
<210>  10
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Abies alba
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(19)
<223>実験の要求に応じて設計し、鑑定用プライマーとしてのＲ−プライマー
<400>  10
attaatgcag ctggcacga                                                    19
【図１】
2020198879.tif 000006
【図２】
2020198879.tif 000007
【図３】
2020198879.tif 000008
【図４】
2020198879.tif 000009
【図５】
2020198879.tif 000010
【図６】
2020198879.tif 000011
【図７】
2020198879.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月2日(2020.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
濾紙片、１０％ラクトース、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の１／４ＬＢ培地、およびテトラ
サイクリンバイオセンサー菌接種物を含み、前記テトラサイクリンバイオセンサー菌接種
物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／図３に示されるプラスミド株であり
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／図３に示されるプラスミド株が前記１
０％ラクトースおよび前記ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の１／４ＬＢ培地によってラップさ
れ前記濾紙片上に固定されるバイオセンサーを使用して土壌中の抽出可能なテトラサイク
リン系抗生物質を検出する試験紙片を使用して土壌中の抽出可能なテトラサイクリン系抗
生物質の検出方法であって、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／図３に示されるプラスミド細菌試験紙を
試験する１００μＬの土壌抽出液および９００μＬのＬＢ培地の混合液に入れ、バイオセ
ンサー試験紙上の青の強度を検出することを特徴とする抽出可能なテトラサイクリン系抗
生物質の検出方法。