(57)【要約】【課題】エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善に有効な素材、医薬又は食品を提供する。【解決手段】ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体を含有し、ノビレチンが非晶質の状態で分散してなるノビレチン含有固体分散体を有効成分とする、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体を含有し、ノビレチンが非晶質の状態で分散してなるノビレチン含有固体分散体を有効成分とする、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善剤。
【請求項２】
ノビレチン含有固体分散体が、ノビレチンがＸ線回折スペクトルから算出される結晶化度１０％以下の状態で分散してなる、請求項１記載の剤。
【請求項３】
ノビレチン含有固体分散体が、ノビレチン又はノビレチン含有物と、水溶性ヘスペリジン誘導体を混合した後、加熱して溶融させる工程と、溶融した溶融物を冷却し、固化させる工程を含む方法によって製造される、請求項１又は２記載の剤。
【請求項４】
水溶性ヘスペリジン誘導体がメチルヘスペリジンである請求項１〜３のいずれか１項記載の剤。
【請求項５】
固体分散体中のノビレチンの含有量が１０〜３０質量％である請求項１〜４のいずれか１項記載の剤。
【請求項６】
閉経後女性に対して適用される、請求項１〜５のいずれか１項記載の剤。
【請求項７】
認知機能障害が記憶力の低下又は空間認識力の低下である、請求項１〜６いずれか１項記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性は年齢が上昇するにつれて卵巣の機能が低下し、そのためにエストロゲンの分泌が大幅に減少する。卵巣の機能が完全に止まる閉経が現れた以後の時期を更年期と称されているが、女性に更年期が来ると、エストロゲンを始めとする女性ホルモンの生産が減少し、これにより種々の更年期症状が現れる。代表的な更年期症状としては、全身倦怠、疲労感、微熱感、頭重、頭痛、のぼせ、耳鳴り、しびれ感、動悸、四肢冷感等があるが、物忘れ等の記憶力障害が起こることも知られている（非特許文献１）。この記憶力障害は、エストロゲン量の低下に伴う、神経伝達物質の一つである亜鉛イオンの濃度調節機能の異常が一因であると考えられている。いわゆるアルツハイマー型の認知症における記憶力障害は、βアミロイドタンパク質の凝集・沈着と、それに伴う神経細胞の脱落などが原因と考えられており、両者は異なると考えられる。
【０００３】
更年期症状の改善には、不足している女性ホルモンを人為的に補うホルモン補充療法や、植物エストロゲンの一つといわれるイソフラボンを摂取することが知られているが、これらには、乳がんや子宮体がんの発症率が高くなるといった危険性も指摘されている。
【０００４】
一方、ノビレチンは、温州みかんやシークワーサー等の柑橘類に含まれるポリメトキシフラボノイドの一種であり、ＰＰＡＲ活性化作用、アディポネクチン分泌促進作用、神経突起伸長促進作用等、種々の生理活性があることが知られており、認知機能改善作用があることも報告されている（非特許文献２及び３）。
しかし、非特許文献２及び３では、ノビレチンの認知機能改善のメカニズムとして、アルツハイマー型認知症モデルにおける、ＡＭＰＡ受容体のリン酸化亢進を介した海馬グルタミン酸シナプス伝達の長期増強や、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化亢進に起因するｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）依存的な転写活性を上昇させることにより認知機能を改善するものであり、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害を改善できることは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｌ. Ｐｈａｒｍ. Ｂｕｌｌ．、２０１３、３６、１９９０−１９９５.
【非特許文献２】日本薬理学雑誌、２０１５、１４５、２２９−２３３．
【非特許文献３】薬学雑誌、２０１５、１３５、４４９−４６４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善に有効な素材、医薬又は食品を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願人は、ノビレチン又はノビレチン含有物と、水溶性ヘスペリジン誘導体を含有し、ノビレチンが非晶質の状態で分散してなるノビレチン含有固体分散体が、ノビレチンの水への溶解性が極めて高く、動物の経口投与において、高い血中移行性、組織移行性を与えることを見出し、特許出願した（特許６３２２７５５号公報）。
本発明者らは、当該ノビレチン含有固体分散体について検討したところ、これがエストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の改善に有効であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体を含有し、ノビレチンが非晶質の状態で分散してなるノビレチン含有固体分散体を有効成分とする、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善剤、を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤は、女性の更年期を始めとする、エストロゲンの低下によって発生する認知機能の低下を効果的に改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ノビレチン含有製剤及び固体分散体の粉末Ｘ線回折の結果を示す図。
【図２】ノビレチン含有固体分散体の溶解性の経時追跡の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のノビレチン含有固体分散体において、「ノビレチン」とは、３’，４’，５，６，７，８−ヘキサメトキシフラボンであり、本発明においては、化学合成したもの、天然物から分離したもの、化学合成や天然物から分離した後に精製したもの、市販品等、何れのものも使用できる。ノビレチンの純度は特に限定されず、例えば、固体分散体とした際に所望の薬理効果が発揮できる程度の純度であればよい。例えば、柑橘類の果実や搾汁残渣を、メタノールやエタノール等のノビレチン可溶性の有機溶媒で抽出処理し、適宜分離・精製して得られる、ノビレチンを高含有率又は高含有量で含む「ノビレチン含有物」を用いることもできる。ノビレチン含有物としては、例えばノビレチンを高含有量で含むシークワーサーエキス（例えば「ＰＭＦ９０」＜株式会社沖縄リサーチセンター製、ノビレチン含有率約６０質量％＞等）が挙げられる。また、「ノビレチン含有物」中のノビレチンの含有量は、固体分散体中のノビレチン含有量を向上させる観点から、「ノビレチン含有物」中に２５〜９８質量％、更に３０〜９６質量％、更に４０〜９０質量％、更に５０〜８５質量％、更に５５〜７５質量％が好ましく、６０質量％が殊更に好ましい。
【００１２】
「水溶性ヘスペリジン誘導体」としては、ヘスペリジンを酵素又は化学処理することにより水溶性を高めたヘスペリジン類が挙げられ、例えばグルコシルヘスペリジン等のヘスペリジンの糖部分（ルチノース部分）に別の糖を結合させた糖転移ヘスペリジンやメチルヘスペリジンが挙げられる。このうち水溶性の点から、メチルヘスペリジン、グルコシルへスペリジンが好ましい。
「メチルヘスペリジン」としては、主に、カルコン型化合物（１）及びフラバノン型化合物（２）が含まれることが知られており、その構成成分として、例えば以下に示す構造のものが挙げられる。
【００１３】
【化１】
2020125246.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒは、水素原子もしくはメチル基を表す）
【００１５】
ここで、医薬品添加物及び食品添加物としてのメチルヘスペリジンは、主に、化合物（３）及び（４）の混合物として取り扱われている。
【００１６】
【化２】
2020125246.tif 000003
【００１７】
（式中、Ｇｌは、グルコース残基、Ｒｈは、ラムノース残基を表す。また、Ｇｌ−２は、グルコース残基の２位（(３−１)の場合、３位も含む）、Ｒｈ−２は、ラムノース残基の２位を表す。）
【００１８】
本発明において用いられるメチルヘスペリジンは、上記で示したカルコン型化合物（１）とフラバノン型化合物（２）の両方を含むものでもよいし、また、それぞれの片方のみを含むものでもよい。
本発明において、より好適なメチルヘスペリジンとしては、化合物（３）と化合物（４）の混合物が挙げられる。
【００１９】
メチルヘスペリジンは、公知の方法、例えば、ヘスペリジンを水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、そのアルカリ溶液に対応量のジメチル硫酸を作用させ、反応液を硫酸で中和し、ｎ−ブチルアルコールで抽出し、溶媒を留去したのち、イソプロピルアルコールで再結晶することにより製造できるが（崎浴、日本化學雑誌、７９、７３３−６（１９５８））、その製造法はこれに限るものではない。
メチルヘスペリジンとして市販のメチルヘスペリジン含有製剤を使用してもよく、例えば、「メチルヘスペリジン」（東京化成工業（株））、「ヘスペリジンメチルカルコン」（Ｓｉｇｍａ社）、「メチルヘスペリジン」（浜理薬品工業（株））、「メチルヘスペリジン」（昭和電工(株)）、「メチルヘスペリジン」（アルプス薬品工業(株)）が挙げられる。
【００２０】
また、グルコシルヘスペリジンとしては、例えばモノグルコシルヘスペリジン（「αＧヘスペリジン  ＰＡ−Ｔ」（東洋製糖（株））、「林原ヘスペリジン（登録商標）Ｓ」（林原株式会社）等が挙げられる。
【００２１】
本発明の「ノビレチンを含有する固体分散体」は、ノビレチン又はノビレチン含有物と、水溶性ヘスペリジン誘導体を含有し、ノビレチンが非晶質の状態で分散してなるものである。
非晶質とは、分子配列に一定の規則性を欠いている状態である。非晶質（アモルファス）であることは、粉末Ｘ線回折によって確認され、その結晶化度が１０％以下、好ましくは５％以下であり、結晶化度が０％の完全な非晶質であることが殊更好ましい。
また、本発明の固体分散体は、粉末Ｘ線回折測定において、ノビレチンの結晶性回折ピークが検出されないのが好ましい。
【００２２】
ノビレチンの結晶化度は、以下の方法で算出できる。まず、Ｘ線回折法による回折強度値から、非干渉性散乱や格子の乱れ等の影響を考慮しないで、プロファイル・フィッティングの手法を用いて結晶性回折線と非晶ハローにピーク分離する。次に、そこで得られた各ピークの積分強度よりノビレチンの結晶化度を下記計算式〔１〕により算出する。
ノビレチンの結晶化度（％）＝［ΣＩα／（ΣＩα＋ΣＩａｍ）］×１００  〔１〕
［ΣＩαは、結晶性回折線の各ピークの積分強度の和、ΣＩａｍは、非晶部の回折線の各ピークの積分強度の和］
【００２３】
本発明のノビレチンを含有する固体分散体は、特許６３２２７５５号公報又は特願２０１８−０５４０５８に記載の方法によって製造することができる。
例えば、ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体を混合した後、加熱して溶融させる工程と、溶融した溶融物を冷却し、固化させることにより製造できる。また、必要であるならば、加熱溶融前のノビレチンと水溶性ヘスペリジン誘導体に各種可塑剤や高分子を混合することもできる。
ここで、ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体を混合する際、ノビレチンの含有量は、固体分散体中のノビレチンの含有量を高める点から、混合物中に１〜９０質量％、更に３〜７０質量％、更に４〜６０質量％、更に５〜５０質量％、更に６〜４５質量％、更に７．５〜４０質量％、更に１０〜３０質量％が好ましく、２５質量％が殊更好ましい。
【００２４】
水溶性ヘスペリジン誘導体の含有量は、１０〜９９質量％、更に２０〜９７質量％、更に２５〜９６質量％、更に３０〜９２．５％質量％、更に４５〜９０％質量％、更に６０〜８５質量％、更に６５〜８５質量％が好ましく、７５質量％が殊更好ましい。
【００２５】
本発明において、ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体を混合する際、水溶性ヘスペリジン誘導体に対するノビレチンの質量比［ノビレチン／水溶性ヘスペリジン誘導体］は、０．０１〜９が好ましく、０．０３〜４がより好ましく、０．０４〜１．５がより好ましく、更には０．０５〜１が、更には０．０６〜０．８が、更には０．０７５〜０．６７が、更には０．１〜０．４が好ましく、０．３３が殊更好ましい。
【００２６】
ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体の混合物には、可塑剤として糖や糖アルコールを含有させることができる。例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、マンノース、ラムノース、リボース、キシロース、トレハロース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、アラビノース、イノシトール、グルコサミン、スクラロース、ソルビトールが好ましい。
【００２７】
また、ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体の混合物には、コスト低減や溶解挙動の改善、また粉体物性の改善を目的として各種高分子を含有させることが出来る。例えば、アマシードガム、アラビアガム、アラビノガラクタン、ウェランガム、カシアガム、ガディガム、カードラン、カラギナン、キサンタンガム、キチン、キトサン、グァーガム、ジェランガム、シクロデキストリン、タマリンドシードガム、タラガム、トラガントガム、微結晶セルロース、微小繊維状セルロース、ナイシン、プルラン、ペクチン、マクロホモプシスガム、ラムザンガム、アセチル化アジピン酸架橋デンプン、アセチル化酸化デンプン、アセチル化リン酸架橋デンプン、アルギン酸及びその塩、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム、カゼイン及びその塩、カルボキシメチルセルロース及びその塩、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、リン酸架橋デンプン、リン酸化デンプンなど、多糖及びその誘導体やたんぱく質、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルポリピロリドンなどの合成高分子が好ましい。
【００２８】
ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体の混合物を加熱して溶融させる方法は、特に制限されず、公知の方法を適用できるが、混合物を攪拌しながら加熱溶融させることが好ましい。例えば、エクストルーダー、ニーダー等の混練機、押出機を用いることができる。また、リボンミキサー等の攪拌機を用いることができる。
なかでも、均一な組成の固体分散体を得る観点から、混練と加熱溶融を同時に行うことのできるスクリューを備えた押出機を用いるのが好ましい。
スクリューを備えた押出機を用いる際は、ノビレチン又はノビレチン含有物と水溶性ヘスペリジン誘導体の混合物、好ましくは当該混合物を粗粉砕したものを押出機に投入し、スクリューを回転させることにより、連続的に処理する方法が好ましい。
スクリューを備えた押出機中で溶融した溶融物は、押出し、成形される。
【００２９】
加熱温度は、水溶性ヘスペリジン誘導体の軟化点以上であり、好ましくは水溶性ヘスペリジン誘導体の融点以上である。加熱温度は、９５〜２００℃、更に９５〜１８０℃、更に１００〜１８５℃、更に１００〜１６０℃、更に１０５〜１４０℃が好ましく、１３０℃が殊更好ましい。
【００３０】
加熱の時間は、水溶性ヘスペリジン誘導体とノビレチンの熱安定性と生産性の点から、水溶性ヘスペリジン誘導体が溶融する温度に達してから１〜３０分が好ましく、更に３〜１５分、更に５〜１０分が好ましく、１０分が殊更好ましい。
【００３１】
次いで、溶融物を冷却し、固化させる。斯かる処理によって、ノビレチンが非晶質化し、ノビレチンを非晶質の状態で含む固体分散体となる。
溶融物冷却時の冷媒温度は、水溶性ヘスペリジン誘導体が溶融する温度よりも低い温度であり、５０℃以下が好ましく、更に３０℃以下が好ましい。冷却方法は、例えば、固体分散体を５０℃以下、更に、３０℃以下、更に室温（２５℃）の雰囲気下におくことが好ましい。また、加熱処理後の固体分散体に冷風を吹き付けて急冷することが好ましい。
冷却により固化したノビレチン及び水溶性ヘスペリジン誘導体を含有する固体分散体は、任意の形、大きさに成形可能であり、例えばペレット状、顆粒状等が挙げられる。更に、必要に応じて粉砕してもよい。
【００３２】
斯くして得られるノビレチン含有固体分散体は、水への溶解性（初期溶解性、経時的溶解性）に極めて優れる。
【００３３】
なお、固体分散体中の水分含量は、微細化し易く、ハンドリング性が良好な点から、２０質量％以下、更に１０質量％以下、更に７質量％以下、更に５質量％以下が好ましい。
【００３４】
後記実施例に示すように、本発明のノビレチン含有固体分散体は、卵巣摘出雌性ラットにおいて、卵巣摘出に起因した空間認知能力及び学習能力（記憶・学習能力）の低下を抑制し、改善する作用を有する。
したがって、本発明のノビレチン含有固体分散体は、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善剤（「本発明の認知機能障害の予防又は改善剤」と略称する）となり得、またこれらを製造するために使用できる。
また、本発明のノビレチン含有固体分散体は、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害を予防又は改善するために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００３５】
本発明において、「認知機能」とは、判断、計算、理解、学習、思考、言語、空間認識、物体認識、及び記憶（短期記憶、長期記憶））などを含む脳の高次の機能を意味する。「認知機能障害」とは、当該認知機能が低下することを意味し、その予防又は改善とは、当該認知機能の低下を防止又は低下を抑制してその機能を維持若しくは向上させることを意味する。
本発明の認知機能には、記憶力が含まれるが、ここで、「記憶力」とは、過去の経験の内容を保持し、後でそれを思い出すことをいい、即時記憶、近時記憶、短期記憶、長期記憶等がある。ここで、即時記憶とは、情報を新しく覚えた直後に想起させることを言い、単語の復唱などの際に必要な記憶である。近時記憶とは、即時記憶よりも保持時間が長い記憶であり、例えば前日会った人の名前を思い出すことなど、情報を覚えてから思い起こすまでの間に、情報が一旦意識から消えることを特徴とする。短期記憶とは、保持時間が比較的短く、一度に保持される情報の容量の大きさにも限界がある記憶を言う。長期記憶とは、短期記憶の中でも忘れられずに長期間にわたって保持される記憶のことで、例えば幼いころの家族との思い出などが挙げられる。
【００３６】
本発明の認知機能障害は、女性の加齢・閉経に伴い発症する記憶障害であり、神経や血管の変性を伴なわずとも発症する点、重度の認知機能障害から軽度の記憶力低下、いわゆる「物忘れ」なども含まれる点、抑うつ症状などの心の不調を伴い得る点で、老人性認知症、アルツハイマー型認知症、脳血管性認知症等の認知症とは区別される。
【００３７】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤は、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品となり、また当該医薬品、医薬部外品、食品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
なお、当該食品には、エストロゲンの低下によって発生する認知機能障害の予防又は改善効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。
【００３８】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤を医薬品として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は経口投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のノビレチン含有固体分散体を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００３９】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤を食品として用いる場合、当該食品の形態は、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料などの各種食品組成物の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品は、本発明のノビレチン含有固体分散体を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００４０】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤におけるノビレチン含有固体分散体の含有量は、ノビレチンとして好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．００５％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上、更に好ましくは０．１質量％以上であり、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下、より好ましくは２質量％以下、更に好ましくは１質量％以下であり、また好ましくは０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％、より好ましくは０．０５〜２質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％、である。
【００４１】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人（体重６０Ｋｇ）１人当たり、ノビレチンとして、１日あたり、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上であり、更に好ましくは３０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは２００ｍｇ以下、より好ましくは１５０ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下、更に好ましくは５０ｍｇ以下である。また、１日あたり好ましくは１〜２００ｍｇ、より好ましくは５〜１５０ｍｇ、より好ましくは１０〜１００ｍｇ、更に好ましくは３０〜５０ｍｇである。
【００４２】
本発明の認知機能障害の予防又は改善剤の対象者としては、更年期の女性、すなわち閉経後の女性を始めとする、エストロゲンの低下によって記憶・学習の能力が低下したヒト、認知機能の維持・向上を望む更年期の女性が好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４４】
製造例１  ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤及び固体分散体の調製
ＰＭＦ９０（株式会社沖縄リサーチセンター製）及び、メチルヘスペリジン（浜理薬品工業株式会社製）をそれぞれ２５質量％、７５質量％の割合で混合し、ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤を得た。
ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤を２軸のエクストルーダー（ＨＡＡＫＥ社製）を用いて、加熱温度：１６０℃、加熱時間：１０分、スクリューの回転数：８０ｒ／ｍｉｎの条件で処理し、２５℃の冷風を吹き付けて５分で２５℃まで冷却を行って（冷却速度：０．５２℃／ｓ）、固体分散体を調製した。このとき、押出機の内部での閉塞はみられず、固体分散体の成形体の排出は良好であった。
【００４５】
参考例
製造例１で得られた固体分散体を乳鉢で粉砕し、粉末Ｘ線回折、経時的な溶解度の評価、Ｃａｃｏ−２細胞膜透過性評価に供した。
（１）Ｘ線回折分析
Ｘ線回折強度は、株式会社リガク製の「ＭｉｎｉＦｌｅｘＩＩ」を用いて、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ、管電圧：３０ｋＶ、管電流：１５ｍＡ、測定範囲：回折角：５〜４０°、Ｘ線スキャンスピード：１０°／ｍｉｎの条件で測定した。測定用試料は、面積４００ｍｍ２×厚さ０．５ｍｍのペレットを圧縮して作製した。
【００４６】
（２）経時的な溶解性の評価
５０ｍＬのスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．２、褐色）に、イオン交換水を３０ｍＬ加えた後、固体分散体１００ｍｇ（ノビレチン１５ｍｇ含有）添加、２ｃｍスターラーチップを用いて５００ｒｐｍで攪拌した。攪拌開始を０分とし、攪拌６時間までの間、適宜その一部を０．４５μｍセルロースアセテートフィルターでろ過し、下記に示す方法によりノビレチン溶解量を定量した。
〔ノビレチンの定量〕
アジレント・テクノロジー株式会社製高速液体クロマトグラフを用い、化学物質評価研究機構製カラムＬ−Ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ―２  （４．６ｍｍφ×５０ｍｍ、２μｍ）を装着し、カラム温度４０℃でグラジエント法により行った。
試料注入量は１０μＬ、移動相Ａ液は０．１重量％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液はアセトニトリルとし、１．０ｍＬ／分で送液した。グラジエント条件は以下のとおりである。
時間（分）          Ａ液（％）    Ｂ液（％）
０                  ９９            １
１                  ９９            １
４                    ５          ９５
５                    ５          ９５
５．０１            ９９            １
６                  ９９            １
検出は、波長３２０ｎｍの吸光度により定量した。
【００４７】
（３）Ｃａｃｏ−２細胞膜透過性評価
Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト大腸癌由来上皮細胞、ＤＳファーマバイオケミカル社より入手）を３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養にはＣａｃｏ−２細胞分化培地セット（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、及びバイオコートフィブリラーコラーゲンＨＴＳマルチウェルインサート（２４ウェル、膜孔１μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いた。ＭＩＴＯ＋ＴＭシーラム・エクステンダーを添加したシーディング基本培地にＣａｃｏ−２細胞を懸濁してインサート上部（頂端膜側）に播種し、インサート下部（基底膜側）にも同培地を添加した。２４時間のＣａｃｏ−２細胞培養後に、前記シーディング基本培地をＭＩＴＯ＋ＴＭシーラム・エクステンダーを添加したＥｎｔｅｒｏ―ＳＴＩＭ腸上皮分化培地に交換した。その後、さらに４８時間前記細胞を培養し、小腸上皮細胞シート様に分化させた。
腸管のタイトジャンクションの形成を確認するため、ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤及び固体分散体の小腸上皮の透過促進試験直前にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値を測定し、規定値（３５０Ω・ｃｍ２）以上のＣａｃｏ−２細胞を用いた。
評価サンプルの調製は以下の通り行った。２０ｍＬのスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．２、褐色）に、ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１０ｍＭ  ＭＥＳ、５ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  グルタミン、１ｍＭ  アスコルビン酸を添加しｐＨ６．０に調製）を６ｍＬ加えた後、ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤及び固体分散体４０ｍｇ（ＰＭＦ９０  １０ｍｇ含有）添加し、２ｃｍスターラーチップを用いて３００ｒｐｍで１０分間攪拌した。攪拌後、０．４５μｍセルロースアセテートフィルターでろ過した溶液ＨＢＳＳで３０倍に希釈した溶液を評価サンプルとして用いた。
ＴＥＥＲ測定による細胞選別後、インサート上部及び下部をＨＢＳＳで置換して２回洗浄した。その後、インサート上部には、前記方法で調製したＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤及び固体分散体の希釈液を添加した。インサート下部には、ＨＢＳＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  グルタミン、ｐＨ７．４）を添加した。そしてＣａｃｏ−２細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養した。
その後、インサート下部のＨＢＳＳを回収し、下記の方法で小腸上皮を透過したノビレチンを、液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により定量した。
【００４８】
（４）ＬＤＨ活性測定試験による細胞生存率評価
（３）のインサート上部のＨＢＳＳを回収し、下記の方法で、細胞膜を構成するＣａｃｏ−２細胞から放出された溶液中のＬＤＨ(Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ)活性測定から求まる、各評価サンプルの細胞傷害性から細胞生存率を評価した。
細胞傷害性の評価は、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ(Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ製)を用い、所定の方法により行った。評価終了後のインサート上部の試験溶液をサンプルとし、含有ＬＤＨにより産生されるホルマザン量（４９０ｎｍの吸光強度から定量）からＬＤＨ活性を算出した。なお、細胞生存率算出に当たり、Ｃａｃｏ−２細胞膜透過性評価（試験例１）のサンプルとして１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のＨＢＳＳ溶液を用いた際の、評価終了後のインサート上部の試験溶液でのＬＤＨ活性を生存率０％に相当する値とした。そして、下記式により、ＬＤＨ活性の変化倍率を算出した。
（算出式）
細胞生存率（％）＝（１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ  ＨＢＳＳ溶液 評価終了後のインサート上部の試験溶液でのＬＤＨ活性−各サンプル 評価終了後のインサート上部の試験溶液のＬＤＨ活性）÷（１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ  ＨＢＳＳ溶液 評価終了後のインサート上部の試験溶液でのＬＤＨ活性）×１００
算出式により求まる細胞生存率の結果の平均値及び標準誤差（Ｎ＝３―４）を表１に示す。
【００４９】
＜結果＞
（１）粉末Ｘ線回折
ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤と固体分散体の粉末Ｘ線回折を図１に示す。ＰＭＦ９０中の成分由来の回折ピークが消失していることから、本固体分散体中でノビレチンなどのＰＭＦ９０由来成分が非晶質化していることが確認され、本固体分散体の結晶化度は０％であると見積もられた。
【００５０】
（２）経時的な溶解性の評価
ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤と固体分散体のノビレチンの溶解濃度を測定した。結果の例として、ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体のノビレチンの溶解濃度を図２に示す。溶解濃度の指標として、攪拌開始６時間後までの曲線下面積（溶解度ＡＵＣ、横軸：時間（単位＝分）、縦軸：溶解濃度（単位＝ｐｐｍ））の値を表１に示す。ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体では、ノビレチンの溶解度ＡＵＣが１．７９×１０５ｐｐｍ・ｍｉｎであった。ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤と比較して、極めて高い溶解濃度を長時間維持することが示された。
【００５１】
（３）Ｃａｃｏ−２細胞膜透過性評価
結果を表１に示す。ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体試験時のインサート上部評価開始時ノビレチン濃度は６６μＭであった。インサート下部評価終了時ノビレチン濃度３．００±０．１４μＭであった。いずれも、ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤よりも高いことが判った。ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体の高いノビレチン溶解性に起因する膜透過量の向上が確認された。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
実施例１  卵巣摘出雌性ラットに対するノビレチンの認知機能改善能評価
（１）動物
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（雌性、８週齢）を日本エスエルシー株式会社より購入した。試験群は、無処置かつ通常食（ＭＦ、オリエンタル酵母株式会社製）摂餌群、卵巣摘出施術かつ通常食摂餌群、卵巣摘出施術かつＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤含有食（前記通常食中にＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤０．５重量％配合、ノビレチン０．０７５重量％含有）摂餌群と卵巣摘出施術かつＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体製剤含有食（前記通常食中にＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体０．５重量％配合、ノビレチン０．０７５重量％含有）摂餌群の４群とした。試験群一群当たりの動物数は、本試験系で統計的有意を得るのに必要と考えられた１１匹とした。
購入したＷｉｓｔａｒ系ラットは、２週間以上の環境馴化を行った後、卵巣摘出施術群の施術を行った。その４日後を摂餌開始日とし、上記４群の飼育を８８日間行った。なお、各群のラット１匹の、一日当たりの摂餌量に有意差は無かった。
【００５４】
（２）モリス水迷路試験
上記４群の被験動物について、摂餌８７日目、空間認知能力及び学習能力を評価可能なモリス水迷路試験を実施した。景色が変わらないように周囲を囲った直径１５０ｃｍ×深さ５７ｃｍの円形プールに、任意の箇所の水底に直径１０ｃｍの円柱状の透明なアクリル製プラットフォームを設置し、プラットフォーム上における水深が２ｃｍとなるように水を張った。試験では、マウスをプール内の所定の箇所から水に入れ、プラットフォームに到達するまでの時間（逃避時間）を最大４０秒まで計測した。本実験を１トライアルとし、トライアル間の休憩を１分間として、１日４トライアルを実施した。得られた結果について、実施例、比較例各群の逃避時間の平均値、標準誤差について、１ｗａｙ  ＡＮＯＶＡにより検定し、有意差の有無を判断した。
【００５５】
（３）結果  
卵巣摘出施術かつＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体製剤含有食摂餌群（本発明製剤摂取群）のモリス水迷路試験の結果は、逃避時間が８．５±２．０秒であった（表２、実施例１）。
一方、無処置かつ通常食摂餌群（ポジティブコントロール群）のモリス水迷路試験の結果は、逃避時間が９．２±５．３秒であった（表２、比較例１）。
また、卵巣摘出施術かつ通常食摂餌群（ネガティブコントロール群）に対して、モリス水迷路試験の結果は、逃避時間が１８．０±１５．１秒であった（表２、比較例２）。比較例１の結果に対する１ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定の結果、ｐ＜０．０５であり、卵巣摘出施術により有意に認知機能が低下したことが判った（表２）。
また、卵巣摘出施術かつＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ混合製剤含有食摂餌群のモリス水迷路試験の結果は、逃避時間が１０．１±５．５秒であった（表２、比較例３）。
【００５６】
表２に示すとおり、本発明製剤摂取群のモリス水迷路試験による逃避時間は、比較例２の結果に対する１ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定の結果、ｐ＜０．０５であり、卵巣摘出施術により有意に低下した認知機能を、ＰＭＦ９０−ＭｅＨｅｓ固体分散体摂食が改善したことが判った。
【００５７】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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