(57)【要約】【課題】免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応等を利用した測定における、正確性が改善された測定方法及び測定試薬、並びに測定の正確性の改善方法を提供する。【解決手段】ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン。
【請求項２】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体。
【請求項３】
ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ペリオスチンのＲ４領域に結合する、請求項２又は請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項２〜請求項４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体である、請求項２〜請求項５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンの測定方法。
【請求項８】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、請求項７に記載のペリオスチンの測定方法。
【請求項９】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合する、請求項７又は請求項８に記載のペリオスチンの測定方法。
【請求項１０】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項７〜請求項９のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項７〜請求項１０のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
【請求項１２】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有することを特徴とする、ペリオスチンの測定試薬。
【請求項１３】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、請求項１２に記載のペリオスチンの測定試薬。
【請求項１４】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合する、請求項１２又は請求項１３に記載のペリオスチンの測定試薬。
【請求項１５】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項１２〜請求項１４のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１２〜請求項１５のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
【請求項１７】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチン測定の正確性の改善方法。
【請求項１８】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、請求項１７に記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
【請求項１９】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合する、請求項１７又は請求項１８のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
【請求項２０】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項１７〜請求項１９のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
【請求項２１】
モノクローナル抗体である、請求項１７〜請求項２０のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）と免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）との結合体並びに免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体、試料に含まれるペリオスチンの測定方法、ペリオスチンの測定試薬、及びペリオスチン測定の正確性の改善方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのＮ末端側よりＣ末端側にかけて順に、ＥＭＩ領域、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域及びＣ末端領域よりなるものであるが、本発明者の一人である出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることを見出して、アレルギー疾患の検査方法の発明を完成させた（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した（特許文献２参照。）。
更に、出原らは、ペリオスチンのＥＭＩ領域、Ｒ１領域、Ｒ２領域及びＲ３領域からなる群から選ばれる少なくとも一つの領域を検出することにより、肺線維症又は間質性肺炎を精度よく検査できることを見出した（特許文献３参照。）。
【０００３】
なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献４参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献５参照。）、ヒトペリオスチンに対して結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献６参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献７参照。）。
【０００４】
しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定においては、測定の正確性の改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２００６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０９／１４８１８４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第１３／０３５７９９号パンフレット
【特許文献４】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献５】特表２００２−５０２２５０号公報
【特許文献６】特表２００５−５０００５９号公報
【特許文献７】国際公開第０７／０７７９３４号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，９８〜１０４頁，２００６年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、その正確性は十分なものではなかった。
このため、試料に含まれるペリオスチンの測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、更なる正確性の改善が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの提供、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の提供、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応等を利用した測定における、正確性が改善された測定方法及び測定試薬を提供すること、並びに測定の正確性の改善方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、試料に含まれるペリオスチンの測定について検討を重ねたところ、ヒトの血液（血液、血清、血漿）中のペリオスチンの約９割が免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）と結合体を形成していて、残りの約１割が遊離状態のペリオスチンであることを初めて見出した。この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは疾患のマーカーとなる可能性がある。
そして、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンと、遊離のペリオスチンとを同程度の親和性で測定するには、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン。
（２）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体。
（３）  ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、前記（２）に記載の抗体。
（４）  ペリオスチンのＲ４領域に結合する、前記（２）又は（３）に記載の抗体。
（５）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記（２）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）  モノクローナル抗体である、前記（２）〜（５）のいずれかに記載の抗体。
（７）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンの測定方法。
（８）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、前記（７）に記載のペリオスチンの測定方法。
（９）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合する、前記（７）又は（８）に記載のペリオスチンの測定方法。
（１０）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記（７）〜（９）のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
（１１）  モノクローナル抗体である、前記（７）〜前記（１０）のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
（１２）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有することを特徴とする、ペリオスチンの測定試薬。
（１３）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、前記（１２）に記載のペリオスチンの測定試薬。
（１４）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合する、前記（１２）又は（１３）に記載のペリオスチンの測定試薬。
（１５）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
（１６）  モノクローナル抗体である、前記（１２）〜（１５）のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
（１７）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチン測定の正確性の改善方法。
（１８）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する、前記（１７）に記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
（１９）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合する、前記（１７）又は（１８）のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
（２０）  免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記（１７）〜（１９）のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
（２１）  モノクローナル抗体である、前記（１７）〜（２０）のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者らは、ヒト血液（血液、血清、血漿）中において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンを初めて見い出した。この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは疾患のマーカーとなる可能性がある。
【００１１】
そして、ヒト血液（血液、血清、血漿）中において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンと、遊離のペリオスチンとが混在することを初めて見い出した。
【００１２】
そして、本発明の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体、ペリオスチンの測定方法、ペリオスチンの測定試薬、ペリオスチン測定の正確性の改善方法は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンと、遊離のペリオスチンとを同程度の親和性で測定することができるものである。
これにより、試料中のペリオスチンを正確に測定することができる。
【００１３】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの調製及びその同定の方法を示したものである。
【００１５】
【図２】免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品のタンパク染色及びウエスタンブロッティングの写真を示したものである。
【００１６】
【図３】免疫沈降法による免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン精製品からのペリオスチン及び免疫グロブリンＡの残存率を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
〔１〕免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン
［１］総論
本発明者らは、ヒト血液（血液、血清、血漿）中において、ペリオスチン（分子量：約８０ＫＤａ）と免疫グロブリンＡ（分子量：約１６０ＫＤａ）との結合体を初めて見い出した。この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは疾患のマーカーとなる可能性がある。
【００１８】
そして、ヒト血液（血液、血清、血漿）中において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンと、遊離のペリオスチンとが混在することを初めて見い出した。
【００１９】
［２］免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの調製方法
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、ヒトの体液、臓器、又は組織等から調製して得ることができる。
【００２０】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、ヒトの血液、血清又は血漿から精製することが好ましく、ヒトの血清又は血漿から調製して得ることがより好ましい。
【００２１】
以下、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの調製方法の一つの例を記載する。
【００２２】
１．硫酸アンモニウム沈殿による粗精製品の取得
（１）  ヒト健常者のプール血清に、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を最終濃度５０ｍＭになるように加え、低温庫（５℃）にて撹拌する。
【００２３】
（２）  これを撹拌しながら、３０％飽和となるように硫酸アンモニウム（硫安）を少しずつ１５分間かけて加える。
【００２４】
（３）  硫酸アンモニウムを全部入れ終わってから３０分間撹拌を続ける。
【００２５】
（４）  反応後の血清を遠沈管に分取し、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心する。
【００２６】
（５）  遠心後の上清をビーカーに移し、低温庫（５℃）にて撹拌する。
【００２７】
（６）  撹拌しながら、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを少しずつ１５分かけて加える。
【００２８】
（７）  硫酸アンモニウムを全部入れ終わってから、３０分間撹拌を続ける。
【００２９】
（８）  反応後の血清を遠沈管に分取し、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心する。
【００３０】
（９）  遠心後の上清を完全に除去する。
【００３１】
（１０）  沈殿物が残留している遠沈管に、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１５ｍＬを入れ、沈殿物が浸かるようボトルを斜めに寝かせて、全量が溶解するまで緩やかに振盪する。
【００３２】
（１１）  溶解液を全て混合し、その混合液を０．４５ｎｍ径のフィルターを用いてろ過し、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品を取得する。
【００３３】
２．免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品からのアルブミン及び免疫グロブリンＧの除去
【００３４】
硫酸アンモニウム沈殿により取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品中のアルブミン及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をＨｉＴｒａｐ  Ａｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎカラムを用いて除去した。
【００３５】
（１）  １ｍＬ用のＨｉＴｒａｐ  Ａｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎカラム［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］を２０ｍＬ以上のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
【００３６】
（２）  前記１の（１１）の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を、１ｍＬ／ｍｉｎ以下の流速で、前記（１）のカラムに通す。
【００３７】
（３）  前記（２）により採取した通過画分液を用いて、再度前記（２）の操作を行い、カラムを通過した液を回収し、アルブミン及び免疫グロブリンＧを除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品を取得する。
【００３８】
３．免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品からの非特異結合タンパク質の除去
【００３９】
非特異結合タンパク質は、コントロールラットＩｇＧ結合ビーズを用いて免疫沈降法により除去した。
【００４０】
（Ａ）コントロールラットＩｇＧ結合ビーズの作製
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  １ｍＬに対し、コントロールラットＩｇＧ１ｍｇの割合で結合させる。
【００４１】
（ａ）試薬
・カップリングバッファー：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）
・ブロッキングバッファー：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
・洗浄バッファーＡ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
・洗浄バッファーＢ：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０）
・検体希釈液：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼインナトリウム及び０．０９５％ＮａＮ３を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
【００４２】
（ｂ）操作
（１）  コントロールラットＩｇＧ溶液を限外ろ過フィルターを用いて前記（ａ）のカップリングバッファーに置換する。
【００４３】
（２）  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］のボトルをよく振ってビーズを均一に懸濁し、その懸濁液の２ｍＬを１５ｍＬチューブに分取する。
【００４４】
（３）  前記（２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００４５】
（４）  ビーズが残存しているチューブに１ｍＭ  ＨＣｌを１０ｍＬ加え、ＮＨＳ基を活性化させる。
【００４６】
（５）  前記（４）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００４７】
（６）  １ｍｇのコントロールラットＩｇＧ液をビーズが残存しているチューブに加え懸濁し、ローテーターにセットして、５℃で一晩回転を続け、コントロールラットＩｇＧをビーズに結合させる。
【００４８】
（７）  １５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００４９】
（８）  上清を除去した１５ｍＬチューブに、前記（ａ）のブロッキングバッファーを１０ｍＬ加え、懸濁し、ローテーターにセットして５℃で２時間回転し続け、コントロールラットＩｇＧが結合していない活性化ＮＨＳをブロッキングする。
【００５０】
（９）  前記（８）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００５１】
（１０）  洗浄バッファーＡの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁する。
【００５２】
（１１）  前記（１０）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００５３】
（１２）  洗浄バッファーＢの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁する。
【００５４】
（１３）  前記（１２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００５５】
（１４）  前記（１０）〜（１３）の操作を３回ずつ繰り返して行う。
【００５６】
（１５）  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁する。
【００５７】
（１６）  前記（１５）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００５８】
（１７）  前記（ａ）の検体希釈液の５ｍＬを加え、コントロールラットＩｇＧ結合ビーズ溶液を取得する。
【００５９】
（Ｂ）免疫沈降による非特異成分の除去
（１）  前記（Ａ）において作成したコントロールラットＩｇＧ結合ビーズ１ｍＬを新しい１５ｍＬチューブに分取し、更に前記２で取得したアルブミン及び免疫グロブリンＧを除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加える。
【００６０】
（２）  １５ｍＬチューブをローテーターにセットして５℃で一晩回転し続け、アルブミン及び免疫グロブリンＧを除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品に含まれている非特異結合タンパク質をビーズ表面及びビーズに結合しているラットＩｇＧに結合させる。
【００６１】
（３）  １５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清をビーズが混入しないように回収する。
【００６２】
（４）  回収液を０．４５ｎｍ径のフィルターを用いてろ過し、アルブミン、ＩｇＧ及び非特異成分を除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品を取得する。
【００６３】
４．粗精製品からの免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの取得
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）結合ビーズを用いて、免疫沈降法により取得する。
【００６４】
（Ａ）抗ペリオスチン抗体共有結合ビーズの作製
【００６５】
（１）  抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）溶液を、限外ろ過フィルターを用いて前記３の（Ａ）の（ａ）のカップリングバッファーに置換する。
【００６６】
（２）  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのボトルをよく振ってビーズを均一に懸濁し、その２ｍＬを１５ｍＬチューブに分取する。
【００６７】
（３）  前記（２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００６８】
（４）  ビーズが残存しているチューブに、１ｍＭ  ＨＣｌを１０ｍＬ加え、ＮＨＳ基を活性化させる。
【００６９】
（５）  前記（４）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００７０】
（６）  １ｍｇの抗ペリオスチン抗体液（ＳＳ１８Ａ）をビーズが残存しているチューブに加え懸濁し、ローテーターにセットして５℃で一晩回転し続け、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）をビーズに結合させる。
【００７１】
（７）  １５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００７２】
（８）  上清を除去した１５ｍＬチューブに前記３の（Ａ）の（ａ）のブロッキングバッファーを１０ｍＬ加え、懸濁し、ローテーターにセットして５℃で２時間回転し続け、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）が結合していない活性化ＮＨＳをブロッキングする。
【００７３】
（９）  前記（８）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００７４】
（１０）  前記３の（Ａ）の（ａ）の洗浄バッファーＡの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁する。
【００７５】
（１１）  前記（１０）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００７６】
（１２）  前記３の（Ａ）の（ａ）の洗浄バッファーＢの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁する。
【００７７】
（１３）  前記（１２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００７８】
（１４）  前記（１０）〜（１３）の操作を３回ずつ繰り返して行う。
【００７９】
（１５）  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁する。
【００８０】
（１６）  前記（１５）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００８１】
（１７）  前記３の（Ａ）の（ａ）の検体希釈液５ｍＬを加え、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）結合ビーズ溶液を取得する。
【００８２】
（Ｂ）免疫沈降による免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製
（１）  前記（Ａ）の（１７）で取得した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）結合ビーズ１ｍＬを、新しい１５ｍＬチューブに分取し、更に前記３の（Ｂ）の（４）において取得したアルブミン、ＩｇＧ及び非特異成分を除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加える。
【００８３】
（２）  １５ｍＬチューブをローテーターにセットして、５℃で一晩回転し続け、免疫グロブリンＡと結合しているペリオスチンをビーズに結合している抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）に結合させる。
【００８４】
（３）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去する。
【００８５】
（４）  残留したビーズを２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。
【００８６】
（５）  前記（４）のビーズに、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．７）の５ｍＬを加えて、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）に結合している免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンを溶出し回収する。
【００８７】
（６）  回収した溶出液に２．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０）を加えてｐＨを７．０〜７．２に中和する。
【００８８】
（７）  ０．４５ｎｍ径のフィルターを用いてろ過し、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を取得する。
【００８９】
（Ｃ）免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品の分離及び同定
前記（Ｂ）の（７）において取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。そのタンパク染色の結果から、前記精製品の純度は９０％であり、そのほとんど全てが免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンであることを確認した。
【００９０】
（Ｄ）免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン（２４０ＫＤａ）のウエスタンブロッティング
前記（Ｂ）の（７）において取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、ゲルをＰＶＤＦ膜へ転写し、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１７Ｂ）又は抗免疫グロブリンＡ抗体を用いて免疫染色を行う。その結果、非還元条件下において２４０ＫＤａにペリオスチン及び免疫グロブリンＡが検出された。
【００９１】
（Ｅ）２４０ＫＤａの精製品に含まれるタンパク質の同定
前記（Ｂ）の（７）において取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク染色で認められる２４０ＫＤａのバンドを切り出し、ＬＣ／ＭＳにてこのバンド中に含まれるタンパク質を同定する。検出されたタンパク質はペリオスチン及び免疫グロブリンＡに由来するペプチドのみであり、この２４０ＫＤａの複合体は免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンであることを確認した。
【００９２】
［３］免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン
本発明における、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、ペリオスチンと免疫グロブリンＡとが結合したものであれば、特に限定はない。
【００９３】
この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは疾患のマーカーとなる可能性がある。
【００９４】
〔２〕免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体
［１］総論
本発明における抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体である。
【００９５】
なお、本発明において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合することができる抗体であれば特に限定はない。
【００９６】
本発明における免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体としては、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができるので、好ましい。
【００９７】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【００９８】
更に、本発明における免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体としては、ペリオスチンのＲ４領域に結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、上記と同じ理由により、より好ましい。
【００９９】
この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体としては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
【０１００】
なお、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。
【０１０１】
そして、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１０２】
［２］免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の調製方法
１．免疫原
本発明における免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
【０１０３】
なお、この免疫原が、ペリオスチンの一部である場合は、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてが好ましく、ペリオスチンのＲ４領域がより好ましい。
【０１０４】
前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、本発明における免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を取得することができる。
なお、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個、特別に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【０１０５】
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、本発明における免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個、特別に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
【０１０６】
前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜４個、特別に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
【０１０７】
なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
【０１０８】
例えば、ペリオスチンを取得する方法として、次の方法（“Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，１号，７１３〜７２３頁，２００６年発行”）等を挙げることができる。
（ａ）  まず、ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。
【０１０９】
（ｂ）  すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ[Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国）]を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。
【０１１０】
（ｃ）  Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ）[Ｑｉａｇｅｎ社（ドイツ国）]と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたペリオスチンタンパク質を取得する。
【０１１１】
また、ペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
すなわち、ペリオスチンのｃＤＮＡを、ＧＥＸ−ＫＧベクター（“ＫＬ．Ｇｕａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２巻，２６２〜２６７頁，１９９１年発行”）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてＧＳＴを切断し、ＧＳＴを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量（濃度）が明確となったペリオスチンを取得することができる。
【０１１２】
更に、ペリオスチンは、例えば、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。
【０１１３】
なお、ペリオスチンのＥＭＩ領域は、例えば、“Ｉ．Ｋｉｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，３号，２０２８〜２０３９頁，２０１０年発行”、又は“Ｔ．Ｍａｒｕｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，１７号，１３２９４〜１３３０３頁，２０１０年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
【０１１４】
また、ペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、又はＲ４領域はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
【０１１５】
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学  下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【０１１６】
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【０１１７】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【０１１８】
なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【０１１９】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【０１２０】
３．ポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の調製方法
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、以下の操作により調製することができる。
【０１２１】
このポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。
【０１２２】
前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体（キャリア）の結合物を、哺乳動物
（マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど）等に免疫する。
【０１２３】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
【０１２４】
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体と結合してしまうことにより、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
【０１２５】
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
【０１２６】
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【０１２７】
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【０１２８】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、２〜６回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。
【０１２９】
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
【０１３０】
なお、ここで得られたポリクローナル抗体は、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合することができるポリクローナル抗体（ポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体）と、ペリオスチンのＲ３領域及びＲ４領域のいずれにも結合しないポリクローナル抗体を含むものである。
【０１３１】
よって、例えば、分離のため、ペリオスチンのＲ３領域及びＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドをリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラム等に、得られたポリクローナル抗体を通し、接触させる。
【０１３２】
これにより、ポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、このカラム等のリガンド（ペリオスチンのＲ３領域及びＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチド）を介して固相に結合し、捕集される。
【０１３３】
これに対して、ペリオスチンのＲ３領域及びＲ４領域のいずれにも結合しないポリクローナル抗体は、このカラム等のリガンド（ペリオスチンのＲ３領域及びＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質及び／又はペプチド）に結合することなく、このカラム等を素通りする。
【０１３４】
このカラム等のリガンド（ペリオスチンのＲ３領域及びＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチド）に結合した、ポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を、塩濃度又はｐＨ等を変化させることによりリガンドから分離させ、これを捕集することにより、ポリクローナル抗体であるペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を取得することができる。
【０１３５】
なお、得られたポリクローナル抗体であるペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる抗体である。
【０１３６】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０１３７】
なお、また、得られたポリクローナル抗体は、ペリオスチンのＲ４領域に結合することができるポリクローナル抗体と、ペリオスチンのＲ４領域に結合しないポリクローナル抗体を含むものである。
【０１３８】
よって、例えば、分離のため、ペリオスチンのＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチドをリガンドとして固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーのカラム等に、得られたポリクローナル抗体を通し、接触させる。
【０１３９】
これにより、ポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、このカラム等のリガンド（ペリオスチンのＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチド）を介して固相に結合し、捕集される。
【０１４０】
これに対して、ペリオスチンのＲ４領域に結合しないポリクローナル抗体は、このカラム等のリガンド（ペリオスチンのＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質及び／又はペプチド）に結合することなく、このカラム等を素通りする。
【０１４１】
このカラム等のリガンド（ペリオスチンのＲ４領域のアミノ酸配列を含むタンパク質又はペプチド）に結合した、ポリクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を、塩濃度又はｐＨ等を変化させることによりリガンドから分離させ、これを捕集することにより、ポリクローナル抗体である、ペリオスチンのＲ４領域に結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を取得することができる。
【０１４２】
なお、得られたポリクローナル抗体であるペリオスチンのＲ４領域に結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる抗体である。
【０１４３】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０１４４】
ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
【０１４５】
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
【０１４６】
４．モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の調製方法
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、以下の操作により調製することができる。
【０１４７】
このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
【０１４８】
更に、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法（Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８巻，５５２〜５５４頁，１９９０年発行）を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。
【０１４９】
なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。
【０１５０】
（１）  まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
【０１５１】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
【０１５２】
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体と結合してしまうことにより、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
【０１５３】
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
【０１５４】
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【０１５５】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。
【０１５６】
（２）  初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【０１５７】
（３）  初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
【０１５８】
（４）  この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【０１５９】
（５）  この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）等を用いることができる。
【０１６０】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【０１６１】
（６）  このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又は他の動物（ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましい）のペリオスチンの全体長、Ｒ３領域及びＲ４領域、又はＲ４領域よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０１６２】
（７）  このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【０１６３】
（８）  このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を得ることもできる。
【０１６４】
（９）  このようにして得られた、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を得ることができる。
【０１６５】
なお、得られたモノクローナル抗体であるペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる抗体である。
【０１６６】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０１６７】
また、得られたモノクローナル抗体であるペリオスチンのＲ４領域に結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる抗体である。
【０１６８】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０１６９】
（１０）  なお、前記（６）の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又は他の動物のペリオスチンの全体長、Ｒ３領域及びＲ４領域、又はＲ４領域よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０１７０】
〔３〕ペリオスチンの測定方法
１．総論
本発明のペリオスチンの測定方法は、ペリオスチンの測定方法であって、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とするものである。これにより、試料中に含まれるペリオスチンの存在又は存在量を測定することができる。
【０１７１】
本発明のペリオスチンの測定方法においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合するものであることが好ましい。
【０１７２】
その理由は、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができるからである。
【０１７３】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０１７４】
上記と同じ理由により、本発明のペリオスチンの測定方法においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合するものであることがより好ましい。
【０１７５】
本発明のペリオスチンの測定方法においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるものが、試料中のペリオスチンを正確に測定することができるため好ましい。
【０１７６】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０１７７】
本発明のペリオスチンの測定方法においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１７８】
なお、本発明のペリオスチンの測定方法において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、少なくともこれらの抗体のいずれか一方が免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体であれば足りる。
【０１７９】
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体の少なくともいずれか一方が、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体であればよい。
【０１８０】
ところで、前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
【０１８１】
なお、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の詳細については、前記の「〔２〕免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」の項に記載した通りである。
【０１８２】
なお、本発明のペリオスチンの測定方法は、測定の正確性を改善することができるものであり、疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において好適である。
【０１８３】
２．抗原抗体反応を利用した測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法は、試料に含まれるペリオスチンを抗原抗体反応を利用して測定する測定方法であって、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とするものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【０１８４】
このペリオスチンを抗原抗体反応を利用して測定する測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法等を挙げることができる。
【０１８５】
そして、本発明のペリオスチンの測定方法における測定には、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定方法における測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【０１８６】
３．試料
本発明における試料としては、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
【０１８７】
なお、測定に用いる試料の形態は、液体であることが好ましいので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料としてもよい。
【０１８８】
また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。
【０１８９】
また、試料は、その測定の前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
例えば、試料を免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲にあることが好ましい。
【０１９０】
また、試料が血液（全血）である場合、この全血試料を、水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球を破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。
【０１９１】
４．測定対象物質
本発明において、測定対象物質はペリオスチンである。
このペリオスチンには、ペリオスチンの一量体、ペリオスチンの二量体、三量体、四量体、・・・などのペリオスチンの多量体、又はペリオスチンの分解物（例えば、分子量約４０ＫＤａのペリオスチンの分解物など）等が含まれるが、いずれも本発明における測定対象物質となるものである。
【０１９２】
なお、本発明者らは、ヒトの血液（血液、血清、血漿）中のペリオスチンの約９割が免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）と結合体を形成していて、残りの約１割が遊離状態のペリオスチンであることを初めて見出した。
【０１９３】
本発明のペリオスチンの測定方法においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンも、遊離のペリオスチンも、いずれも本発明における測定対象物質となるものである。
【０１９４】
５．標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施するときには、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体の少なくともいずれか一方が、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体であればよい。
【０１９５】
この標識抗体を用いた免疫学的測定方法において用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
なお、前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗体を固相担体に固定化することができる。
【０１９６】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【０１９７】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１９８】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【０１９９】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【０２００】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【０２０１】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を形成させる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。
【０２０２】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。
【０２０３】
６．凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
【０２０４】
また、前記の凝集反応法により測定を行う場合、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【０２０５】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固相担体に固定化させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
【０２０６】
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固相担体に固定化させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【０２０７】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
【０２０８】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【０２０９】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０２１０】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【０２１１】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【０２１２】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【０２１３】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０２１４】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０２１５】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体、又は試料と「固相担体に固定化させた免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０２１６】
測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬、又は「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「水系溶媒」を含有する測定試薬等を調製し、準備する。
【０２１７】
次に、例えば、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」と試料とを接触させる。
【０２１８】
これにより、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」の「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。
【０２１９】
そして、これより生成した、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」（免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体＝固相担体＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕−〔免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体＝固相担体＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体＝固相担体＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体〕−〔ペリオスチン〕…）を測定する。
【０２２０】
この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。
【０２２１】
そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。
【０２２２】
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
【０２２３】
なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
【０２２４】
また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【０２２５】
なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。
【０２２６】
（１）  まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：
緩衝液（水系溶媒）
第２試薬：
「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液
【０２２７】
（２）  血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
【０２２８】
（３）  一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分以上、かつ１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、かつ５分以下の一定時間であることがより好ましい。
【０２２９】
試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。
【０２３０】
そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体＝ラテックス粒子＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体＝ラテックス粒子＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。
【０２３１】
（４）  そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。
【０２３２】
（５）  そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。
【０２３３】
７．測定時の他の成分
本発明のペリオスチンの測定方法においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜ｐＨ１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０２３４】
また、本発明のペリオスチンの測定方法においては、前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体、前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化した固相担体、及び／又は前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜用いてもよい。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０２３５】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０２３６】
〔４〕ペリオスチンの測定試薬
１．総論
本発明のペリオスチンの測定試薬は、ペリオスチンの測定試薬であって、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有することを特徴とするものである。これにより、試料中に含まれるペリオスチンの存在又は存在量を測定することができる。
【０２３７】
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合するものであることが好ましい。
【０２３８】
その理由は、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるため、これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができるからである。
【０２３９】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０２４０】
上記と同じ理由により、本発明のペリオスチンの測定試薬においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのＲ４領域に結合するものであることがより好ましい。
【０２４１】
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができるものが、試料中のペリオスチンを正確に測定することができるため好ましい。
【０２４２】
なお、ここで「同程度」とは、好ましくは６倍以内を、より好ましくは5倍以内を、更に好ましくは４倍以内を、特に好ましくは３倍以内を、そして特別に好ましくは２倍以内を意味する。
【０２４３】
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０２４４】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、少なくともこれらの抗体のいずれか一方が免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体であれば足りる。
【０２４５】
例えば、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体の少なくともいずれか一方が、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体であればよい。
【０２４６】
ところで、前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを含有させてもよい。
【０２４７】
なお、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の詳細については、前記の「〔２〕免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」の項に記載した通りである。
【０２４８】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定の正確性を改善することができるものであり、疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において好適である。
【０２４９】
２．試料
本発明における試料については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「３．試料」に記載した通りである。
【０２５０】
３．測定対象物質
本発明における測定対象物質については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「４．測定対象物質」に記載した通りである。
【０２５１】
４．抗原抗体反応を利用した測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬は、試料に含まれるペリオスチンを抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬であって、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有するものであれば、特にそのペリオスチン測定の測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【０２５２】
本発明のペリオスチンの測定試薬の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法等を挙げることができる。
【０２５３】
そして、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【０２５４】
本発明のペリオスチンの測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。
この場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、その一つの測定試薬に含有される。
【０２５５】
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。
この場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
【０２５６】
例えば、本発明のペリオスチンの測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
【０２５７】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
【０２５８】
この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
【０２５９】
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０２６０】
また、本発明のペリオスチンの測定試薬には、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
【０２６１】
なお、これらを本発明のペリオスチンの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０２６２】
そして、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０２６３】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。
【０２６４】
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【０２６５】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、水系溶媒を含有する第１試薬と、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有する第２試薬とを含む、ペリオスチンの測定試薬であってもよい。
【０２６６】
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定試薬キットであることが好ましい。
【０２６７】
５．標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体の少なくともいずれか一方の抗体が免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
【０２６８】
なお、標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする本発明のペリオスチンの測定試薬に関し、その標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の詳細については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「５．標識抗体を用いた免疫学的測定方法」に記載した通りである。
【０２６９】
６．凝集反応法による免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
【０２７０】
また、前記の凝集反応法を測定原理とする場合、本発明のペリオスチンの測定試薬は、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」又は「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する。
【０２７１】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」又は「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」は、第２試薬に含有させることが好ましい。
【０２７２】
そして、本発明のペリオスチンの測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」又は「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する試薬以外の試薬、すなわち、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」も「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」も含有しない試薬は、例えば前記の水系溶媒を含有する試薬等であってよい。
【０２７３】
なお、例えば、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【０２７４】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料に含まれるペリオスチンの濃度、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【０２７５】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【０２７６】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０２７７】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０２７８】
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、水系溶媒を含有する第１試薬と、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体を含有する第２試薬とを含む、ペリオスチンの測定試薬であってもよい。
【０２７９】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬においては、固相担体がラテックス粒子であることが好ましい。
【０２８０】
なお、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法を測定原理とする本発明のペリオスチンの測定試薬に関し、その抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法の詳細については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「６．凝集反応法による免疫学的測定方法」に記載した通りである。
【０２８１】
〔５〕ペリオスチン測定の正確性の改善方法
１．総論
本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法は、ペリオスチンの測定において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とするものである。
【０２８２】
この本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法は、ペリオスチンの測定において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることにより、ペリオスチン測定の正確性を改善することができる方法である。
【０２８３】
なお、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法において、「ペリオスチンの測定」とは、ペリオスチンについて、その存在を見出すこと、又はその存在量を見出すことをいう。
【０２８４】
なお、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法において、試料に含まれるペリオスチンを測定するのに、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれか一方が免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体であれば足りる。
【０２８５】
例えば、このペリオスチンの測定が、酵素標識抗体と固相化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法による場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固相化抗体の少なくともいずれか一方が、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
【０２８６】
ところで、前記の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
【０２８７】
なお、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体の詳細については、前記の「〔２〕免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体」の項に記載した通りである。
【０２８８】
なお、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法は、ペリオスチン測定の正確性を改善することができるものであり、疾患の罹患の有無又はその程度（病状等）の検査のための測定において好適である。
【０２８９】
２．試料
本発明における試料については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「３．試料」に記載した通りである。
【０２９０】
３．測定対象物質
本発明における測定対象物質については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「４．測定対象物質」に記載した通りである。
【０２９１】
４．抗原抗体反応を利用した測定
本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法としては、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を使用するものが好ましいが、この免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【０２９２】
本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法等を挙げることができる。
【０２９３】
そして、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【０２９４】
本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定は、一つの測定試薬のみを使用するもの（１試薬法、又は１ステップ法）であってよい。
この場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、その一つの測定試薬に含有される。
【０２９５】
また、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定は、二つ以上の測定試薬を使用するもの（多試薬法、又は多ステップ法）であってもよい。
この場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
【０２９６】
例えば、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬を使用するものである場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
【０２９７】
なお、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定に使用する溶媒としては、前記の各種の水系溶媒を用いることができる。
【０２９８】
なお、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定に関し、標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の詳細については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「５．標識抗体を用いた免疫学的測定方法」に記載した通りである。
【０２９９】
また、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定に関し、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法の詳細については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「６．凝集反応法による免疫学的測定方法」に記載した通りである。
【０３００】
そして、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定に関し、「測定時の他の成分」の詳細については、前記「〔３〕ペリオスチンの測定方法」の「７．測定時の他の成分」に記載した通りである。
【実施例】
【０３０１】
以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等により限定されるものではない。
【０３０２】
〔参考例１〕（ペリオスチンの調製）
ペリオスチンを調製した。
【０３０３】
（１）ペリオスチンの調製
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列、アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。
【０３０４】
具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド[Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国）]にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとした。
【０３０５】
次に、Ｓ２細胞にこのｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ[Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国）]を公知の方法で共導入し、形質転換した。
【０３０６】
次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。
【０３０７】
そして、このＣ末端に６個のヒスチジンが結合したＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
【０３０８】
次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ）[Ｑｉａｇｅｎ社（ドイツ国）]と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのＤＮＡの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。
【０３０９】
〔実施例１〕（免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの調製）
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、健常者（Ｎ＝２２）のプール血清（３００ｍＬ）を用いて調製した。
図１に示した方法により、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの調製及びその同定を行った。
【０３１０】
１．硫酸アンモニウム沈殿による粗精製品の取得
（１）  ヒト健常者のプール血清３００ｍＬをビーカーに移し、スターラーバーを入れ、１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を最終濃度が５０ｍＭになるように加え、低温庫（５℃）にて撹拌した。
【０３１１】
（２）  これを撹拌しながら、３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを少しずつ１５分間かけて加えた。
【０３１２】
（３）  硫酸アンモニウムを全部入れ終わってから、３０分間撹拌を続けた。
【０３１３】
（４）  反応後の血清を遠沈管に分取し、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。
【０３１４】
（５）  遠心後の上清をビーカーに移し、低温庫（５℃）にて撹拌した。
【０３１５】
（６）  撹拌しながら、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを少しずつ１５分間かけて加えた。
【０３１６】
（７）  硫酸アンモニウムを全部入れ終わってから、３０分間撹拌を続けた。
【０３１７】
（８）  反応後の血清を遠沈管に分取し、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。
【０３１８】
（９）  遠心後の上清を完全に除去した。
【０３１９】
（１０）  沈殿物が残留している遠沈管に、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１５ｍＬを入れ、沈殿物が浸かるようボトルを斜めに寝かせて、全量が溶解するまで緩やかに振盪した。
【０３２０】
（１１）  溶解液を全て混合し、その混合液を０．４５ｎｍ径のフィルターを用いてろ過し、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品を取得した。
【０３２１】
２．免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品からのアルブミン及び免疫グロブリンＧの除去
【０３２２】
硫酸アンモニウム沈殿により取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品中のアルブミン及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）をＨｉＴｒａｐ  Ａｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎカラムを用いて除去した。
【０３２３】
（１）  １ｍＬ用のＨｉＴｒａｐ  Ａｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎカラム［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］を２０ｍＬ以上のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
【０３２４】
（２）  前記１の（１１）の免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を、１ｍＬ／ｍｉｎ以下の流速で、前記（１）のカラムに通した。
【０３２５】
（３）  前記（２）により採取した通過画分液を用いて、再度前記（２）の操作を行い、カラムを通過した液を回収し、アルブミン及び免疫グロブリンＧを除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品を取得した。
【０３２６】
３．免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品からの非特異結合タンパク質の除去
【０３２７】
非特異結合タンパク質は、コントロールラットＩｇＧ結合ビーズを用いて免疫沈降法により除去した。
【０３２８】
（Ａ）コントロールラットＩｇＧ結合ビーズの作製
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  １ｍＬに対し、コントロールラットＩｇＧ１ｍｇの割合で結合させた。
【０３２９】
（ａ）試薬
・カップリングバッファー：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）
・ブロッキングバッファー：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
・洗浄バッファーＡ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
・洗浄バッファーＢ：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０）
・検体希釈液：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼインナトリウム及び０．０９５％ＮａＮ３を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
【０３３０】
（ｂ）操作
（１）  コントロールラットＩｇＧ溶液を限外ろ過フィルターを用いて前記（ａ）のカップリングバッファーに置換した。
【０３３１】
（２）  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］のボトルをよく振ってビーズを均一に懸濁し、その懸濁液の２ｍＬを１５ｍＬチューブに分取した。
【０３３２】
（３）  前記（２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３３３】
（４）  ビーズが残存しているチューブに１ｍＭ  ＨＣｌを１０ｍＬ加え、ＮＨＳ基を活性化させた。
【０３３４】
（５）  前記（４）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３３５】
（６）  １ｍｇのコントロールラットＩｇＧ液を１ｍＬのビーズが残存しているチューブに加え懸濁し、ローテーターにセットして、５℃で一晩回転を続け、コントロールラットＩｇＧをビーズに結合させた。
【０３３６】
（７）  １５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３３７】
（８）  上清を除去した１５ｍＬチューブに、前記（ａ）のブロッキングバッファーを１０ｍＬ加え、懸濁し、ローテーターにセットして５℃で２時間回転し続け、コントロールラットＩｇＧが結合していない活性化ＮＨＳをブロッキングした。
【０３３８】
（９）  前記（８）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３３９】
（１０）  洗浄バッファーＡの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０３４０】
（１１）  前記（１０）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３４１】
（１２）  洗浄バッファーＢの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０３４２】
（１３）  前記（１２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３４３】
（１４）  前記（１０）〜（１３）の操作を３回ずつ繰り返して行った。
【０３４４】
（１５）  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０３４５】
（１６）  前記（１５）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３４６】
（１７）  前記（ａ）の検体希釈液の５ｍＬを加え、コントロールラットＩｇＧ結合ビーズ溶液を取得した。
【０３４７】
（Ｂ）免疫沈降による非特異成分の除去
（１）  前記（Ａ）において作成したコントロールラットＩｇＧ結合ビーズ１ｍＬを新しい１５ｍＬチューブに分取し、更に前記２で取得したアルブミン及び免疫グロブリンＧを除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加えた。
【０３４８】
（２）  １５ｍＬチューブをローテーターにセットして５℃で一晩回転し続け、アルブミン及び免疫グロブリンＧを除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品に含まれている非特異結合タンパク質をビーズ表面及びビーズに結合しているラットＩｇＧに結合させた。
【０３４９】
（３）  １５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清をビーズが混入しないように回収した。
【０３５０】
（４）  回収液を０．４５ｎｍ径のフィルターを用いてろ過し、アルブミン、ＩｇＧ及び非特異成分を除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品を取得した。
【０３５１】
４．粗精製品からの免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの取得
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）結合ビーズを用いて、免疫沈降法により取得する。
【０３５２】
（Ａ）抗ペリオスチン抗体共有結合ビーズの作製
【０３５３】
（１）  Ｆ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）の溶液を、限外ろ過フィルターを用いて前記３の（Ａ）の（ａ）のカップリングバッファーに置換した。
【０３５４】
（２）  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのボトルをよく振ってビーズを均一に懸濁し、その２ｍＬを１５ｍＬチューブに分取した。
【０３５５】
（３）  前記（２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３５６】
（４）  ビーズが残存しているチューブに、１ｍＭ  ＨＣｌを１０ｍＬ加え、ＮＨＳ基を活性化させた。
【０３５７】
（５）  前記（４）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３５８】
（６）  １ｍｇのＦ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）の溶液を１ｍＬのビーズが残存しているチューブに加え懸濁し、ローテーターにセットして５℃で一晩回転し続け、Ｆ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）をビーズに結合させた。
【０３５９】
（７）  １５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３６０】
（８）  上清を除去した１５ｍＬチューブに前記３の（Ａ）の（ａ）のブロッキングバッファーを１０ｍＬ加え、懸濁し、ローテーターにセットして５℃で２時間回転し続け、Ｆ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）が結合していない活性化ＮＨＳをブロッキングした。
【０３６１】
（９）  前記（８）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３６２】
（１０）  前記３の（Ａ）の（ａ）の洗浄バッファーＡの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０３６３】
（１１）  前記（１０）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３６４】
（１２）  前記３の（Ａ）の（ａ）の洗浄バッファーＢの１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０３６５】
（１３）  前記（１２）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３６６】
（１４）  前記（１０）〜（１３）の操作を３回ずつ繰り返して行った。
【０３６７】
（１５）  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０３６８】
（１６）  前記（１５）の１５ｍＬチューブを３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３６９】
（１７）  前記３の（Ａ）の（ａ）の検体希釈液５ｍＬを加え、Ｆ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）結合ビーズ溶液を取得した。
【０３７０】
（Ｂ）免疫沈降による免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製
（１）  前記（Ａ）の（１７）で取得したＦ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）結合ビーズ１ｍＬを、新しい１５ｍＬチューブに分取し、更に前記３の（Ｂ）の（４）において取得したアルブミン、ＩｇＧ及び非特異成分を除去した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加えた。
【０３７１】
（２）  １５ｍＬチューブをローテーターにセットして、５℃で一晩回転し続け、免疫グロブリンＡと結合しているペリオスチンをビーズに結合しているＦ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）に結合させた。
【０３７２】
（３）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０３７３】
（４）  残留したビーズを２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
【０３７４】
（５）  前記（４）のビーズに、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．７）の５ｍＬを加えて、Ｆ（ａｂ’）2化した抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）に結合している免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンを溶出し回収した。
【０３７５】
（６）  回収した溶出液に２．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１０．０）を加えてｐＨを７．０〜７．２に中和した。
【０３７６】
（７）  ０．４５ｎｍ径のフィルターを用いてろ過し、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を取得した。
【０３７７】
表１に示すようにプール血清から一連の工程を経てペリオスチン精製品を取得した。
この回収率は元のペリオスチン量に対して約８０％であり、十分な回収率を示した。
【０３７８】
【表１】
2020186175.tif 000002
【０３７９】
（Ｃ）免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品の分離及び同定
前記（Ｂ）の（７）において取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
このＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク染色の結果を図２に示した。
このタンパク染色の結果から、前記精製品の純度は９０％であり、そのほとんど全てが免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンであることを確認した。
【０３８０】
（Ｄ）免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン（２４０ＫＤａ）のウエスタンブロッティング
前記（Ｂ）の（７）において取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
その後、ゲルをＰＶＤＦ膜へ転写し、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１９Ｃ）又は抗免疫グロブリンＡ抗体を用いて免疫染色を行った。
このウエスタンブロッティングの結果も図２に示した。
その結果、非還元条件下において２４０ＫＤａにペリオスチン及び免疫グロブリンＡが検出された。
【０３８１】
（Ｅ）２４０ＫＤａの精製品に含まれるタンパク質の同定
前記（Ｂ）の（７）において取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク染色で認められる２４０ＫＤａのバンドを切り出し、液体クロマトグラフィー−質量分析法にてこのバンド中に含まれるタンパク質を同定した。
検出されたタンパク質は、ペリオスチン及び免疫グロブリンＡに由来するペプチドのみであり、この２４０ＫＤａの複合体は免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンであることを確認した。
【０３８２】
〔実施例２〕（液体クロマトグラフィー−質量分析法による免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの同定）
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン（２４０ＫＤａ）中のタンパク質を、以下の手順に従って、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）を用いて同定した。
【０３８３】
１．試料の前処理
（１）  前記実施例１で取得した、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン（２４０ＫＤａ）の精製品に、終濃度で２０ｍＭになるように１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液を添加し、９５ ℃で１０ 分間加温した。
【０３８４】
（２）  続いて、終濃度で５０ｍＭになるように、５５０ｍＭヨードアセトアミド溶液を添加し、遮光下の室温で３０分間静置した。
【０３８５】
（３）  総タンパク質量に対して約５０分の１重量となるようにトリプシンを添加し、３７ ℃で一晩加温した後、終濃度が１％になるようにトリフルオロ酢酸を添加した。
【０３８６】
（４）  ＧＬ−Ｔｉｐ  ＳＤＢ−ＳＣＸ［ジーエルサイエンス社（日本国）］を用いて、脱塩及び陽イオン交換樹脂による分画を行い、分画物を測定用試料とした。
【０３８７】
２．液体クロマトグラフィー測定
（１）  前記１で調製した精製試料から抽出されたペプチドを、液体クロマトグラフィーシステム  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣ［島津製作所社（日本国）］を用いて分析した。
【０３８８】
（２）  このシステムでは、サンプルをＧＬ−Ｔｉｐ ＳＤＢ−ＳＣＸ［ジーエルサイエンス社（日本国）］で脱塩し、次いでＩｎｅｒｔｓｉｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、４．０μｍ）で分離した。
【０３８９】
（３）  移動相として、移動相Ａ（ＨＰＬＣグレードの０．１％ギ酸水溶液）と移動相Ｂ（０．１％ギ酸アセトニトリル）を選択した。
【０３９０】
（４）  １０μＬの精製試料をカラムに注入し、以下の勾配速度を用いて０．４ｍＬ／分の流速で分離した。 
移動相Ａ：移動相Ｂ ＝ ９９．５：０．５（０分）→  移動相Ａ：移動相Ｂ ＝ ５０：５０（７０分）→  移動相Ａ：移動相Ｂ ＝ ０：１００（７５分）→  移動相Ａ：移動相Ｂ ＝ ０：１００（８０分）
【０３９１】
３．質量分析測定
（１）  質量分析は、Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００＋システム（ｍ／ｚ１００−２０００［ＡＢ  ＳＣＩＥＸ社（米国）］を、液体クロマトグラフィーシステムに接続し実施した。
【０３９２】
（２）  エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）−正イオンモードで測定した。
【０３９３】
（３）  得られたペプチドに対して、ＭａｘＱｕａｎｔパッケージを用いてヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを用いてタンパク質を同定した。
【０３９４】
４．測定結果
液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）による測定の結果、複数のペプチド由来のピークが得られた。
ペプチドの質量情報を基にタンパク質検索を行った結果、ペリオスチン及び免疫グロブリンＡに由来するタンパク質のみが検出された。
これを表２に示す。
【０３９５】
【表２】
2020186175.tif 000003
【０３９６】
よって、前記実施例１で取得した、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン（２４０ＫＤａ）は、確かに免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンであることが確かめられた。
【０３９７】
〔実施例３〕（表面プラズモン共鳴法を用いた抗体親和性の検証）
各抗ペリオスチンモノクローナル抗体の遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンそれぞれに対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ−１００［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］を用いて、表面プラズモン共鳴法により検証した。
【０３９８】
１．抗体
この検証には、表３に示した１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を用いた。
【０３９９】
【表３】
2020186175.tif 000004
【０４００】
２．方法
前記１の１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体の遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンそれぞれに対する親和性を以下に示す方法で測定した。
【０４０１】
（１）  遊離ペリオスチンは、リコンビナントペリオスチンモノマー［公知の文献（Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行等）の記載に従い、ペリオスチンのＣ末端領域のエクソン１７、エクソン１８及びエクソン２１を欠くペリオスチンであって、そのＣ末端に６個のヒスチジン残基が結合したペリオスチン］を用いた。
また、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、前記実施例１で取得したものを用いた。
【０４０２】
（２）  全ての結合試験は、２５℃で、泳動緩衝液［０．０５％Ｔｗｅｅｎ − ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）］中で実施した。
【０４０３】
（３）  前記リコンビナントペリオスチンモノマー又は免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンを泳動緩衝液で希釈し、２倍希釈系列の抗原を調製した。
【０４０４】
（４）  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ｋｉｔ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（英国）］を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップの表面上にウサギ抗マウスポリクローナル抗体（マウス抗体だけではなく、ラット抗体とも結合することができる）［捕捉抗体］をアミンカップリング法により固定した。
【０４０５】
（５）  続いて、前記１の１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体のそれぞれを、５μＬ／分の流速で１分間注入し、チップ表面上の捕捉抗体に結合させた。
【０４０６】
（６）  次に、異なる濃度の抗原（前記リコンビナントペリオスチンモノマー又は免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン）を３０μＬ／分の流速で２分間注入し、前記１の１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体に対する抗原の結合をそれぞれ測定した。
【０４０７】
（７）  続いて、結合した抗原（前記リコンビナントペリオスチンモノマー又は免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン）の抗体（前記１の１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体）からの解離をそれぞれ３分間観察した。
【０４０８】
（８）  操作（６）及び（７）で得られたデータから、シングルサイクル法を用いてセンサーグラムを作成した。
【０４０９】
（９）  得られたデータの解析は、解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン２．０．２）を使用して実施した。
【０４１０】
（１０）  速度論的パラメータは１：１結合モデルを用いて算出し、結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）並びに解離定数（ＫＤ）を計算した。
【０４１１】
３．測定結果
前記１の１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体の遊離ペリオスチン（リコンビナントペリオスチンモノマー）又は免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対する結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）並びに解離定数（ＫＤ）を表４に示した。
【０４１２】
【表４】
2020186175.tif 000005
【０４１３】
更に、遊離ペリオスチンと免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対する親和性の差を比較するために、以下の計算式により、前記１の１３種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体の結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）並びに解離定数（ＫＤ）の結合力比を算出し、表５に示した。
【０４１４】
結合速度定数結合力比＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対する結合速度定数／遊離ペリオスチンに対する結合速度定数
【０４１５】
解離速度定数結合力比＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対する解離速度定数／遊離ペリオスチンに対する解離速度定数
【０４１６】
アフィニティー結合力比＝免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対する解離定数／遊離ペリオスチンに対する解離定数
【０４１７】
【表５】
2020186175.tif 000006
【０４１８】
なお、結合速度定数は、値が大きくなるほど親和性が強いことを示す。
【０４１９】
解離速度定数は、値が小さくなるほど親和性が強いことを示す。
【０４２０】
解離定数（アフィニティー）は、値が小さくなるほど親和性が強いことを示す。
【０４２１】
遊離ペリオスチンと免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対する抗体のアフィニティー結合力比では、ペリオスチンのＲ４領域を認識するＳＳ１７Ｂ抗体、ＳＳ１９Ａ抗体、及びＳＳ２６Ｃ抗体のいずれもが２．０以下の値となり、これらの抗ペリオスチンモノクローナル抗体は遊離ペリオスチンと免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対して同程度の親和性を有していることが示された。
【０４２２】
〔実施例４〕（遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに対するＥＬＩＳＡ測定）
抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）［Ｒ１領域を認識］、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１７Ｂ）［Ｒ４領域を認識］、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１９Ａ）［Ｒ４領域を認識］、及び抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１６Ａ）［Ｒ３領域を認識］をそれぞれ固相化したペリオスチン測定ＥＬＩＳＡキットを各々作製し、遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンを測定した。
【０４２３】
測定値を比較することで２つの試料の反応性の違いを評価した。
【０４２４】
１．測定試料
（ａ）試料１：前記実施例１で取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン
（ｂ）試料２：前記（ａ）の試料１に終濃度１ｍＭになるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて還元して作製した、前記試料１と同濃度の遊離ペリオスチン
【０４２５】
２．測定
（ａ）従来発明による測定［ＳＳ１８Ａ×ＳＳ１９Ｃ］
（１）  抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）［ペリオスチンのＲ１領域を認識し結合する抗体］を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）［１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）］により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８時間静置し、抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
【０４２６】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェル中に、ブロッキング液［０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔トリス緩衝液〕（ｐＨ８．０）］を２５０μＬ注入し、４℃で１８時間静置した。
【０４２７】
（３）  次に、前記のマイクロタイタープレートの各ウェルを洗浄液［０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］で３回洗浄した。
【０４２８】
（４）  次に、前記試料１及び試料２を、検体希釈液[０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔トリス緩衝液〕（ｐＨ８．０）]で５００倍に希釈した後、その１００μＬを前記抗体固相化マイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８時間静置し、反応を行わせた。
【０４２９】
（５）  次に、前記のマイクロタイタープレートの各ウェルを、前記の洗浄液で５回ずつ洗浄した。
【０４３０】
（６）  次に、ＰＯＤ標識した抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｃ）［ペリオスチンのＲ２領域を認識し結合する抗体］を、標識抗体希釈液[０．５％のカゼイン、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔トリス緩衝液〕（ｐＨ８．０）]で２００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。
【０４３１】
（７）  次に、前記のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で５回ずつ洗浄した。
【０４３２】
（８）  次に、ＰＯＤの基質液[０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液]の１００μＬを、前記のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１５分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
【０４３３】
（９）  その後、前記（８）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。
【０４３４】
（１０）  次に、分光光度計を用いて、前記（９）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０４３５】
（１１）  次に、ペリオスチン濃度既知の標準試料について、前記（１）〜（１０）の測定操作の通り操作を行って、「ペリオスチン濃度−吸光度」の標準曲線（検量線）を作成した。
【０４３６】
（１２）  前記（１０）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度を、前記（１１）において作成した「ペリオスチン濃度−吸光度」の標準曲線（検量線）に当てはめ、前記１の（ａ）の試料１及び前記１の（ｂ）の試料２に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
【０４３７】
（ｂ）本発明による測定［ＳＳ１７Ｂ×ＳＳ１９Ｃ］
前記（ａ）の（１）における抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）［ペリオスチンのＲ１領域を認識し結合する抗体］を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）［ペリオスチンのＲ４領域を認識し結合する抗体］に替えること以外は、前記（ａ）の（１）〜（１２）の測定操作の通り操作を行って、前記１の（ａ）の試料１及び前記１の（ｂ）の試料２に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
【０４３８】
（ｃ）本発明による測定［ＳＳ１９Ａ×ＳＳ１９Ｃ］
前記（ａ）の（１）における抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）［ペリオスチンのＲ１領域を認識し結合する抗体］を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ａ）［ペリオスチンのＲ４領域を認識し結合する抗体］に替えること以外は、前記（ａ）の（１）〜（１２）の測定操作の通り操作を行って、前記１の（ａ）の試料１及び前記１の（ｂ）の試料２に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
【０４３９】
（ｄ）本発明による測定［ＳＳ１６Ａ×ＳＳ１９Ｃ］
前記（ａ）の（１）における抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）［ペリオスチンのＲ１領域を認識し結合する抗体］を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１６Ａ）［ペリオスチンのＲ３領域を認識し結合する抗体］に替えること以外は、前記（ａ）の（１）〜（１２）の測定操作の通り操作を行って、前記１の（ａ）の試料１及び前記１の（ｂ）の試料２に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
【０４４０】
３．測定結果
測定結果を表６に示した。
【０４４１】
【表６】
2020186175.tif 000007
【０４４２】
前記２の（ａ）における従来発明による測定［ＳＳ１８Ａ×ＳＳ１９Ｃ］の場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの測定値を遊離ペリオスチンの測定値で除した値の比率は２０％であった。
【０４４３】
これに対して、前記２の（ｂ）における本発明による測定［ＳＳ１７Ｂ×ＳＳ１９Ｃ］の場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの測定値を遊離ペリオスチンの測定値で除した値の比率は１０２％であった。
【０４４４】
また、前記２の（ｃ）における本発明による測定［ＳＳ１９Ａ×ＳＳ１９Ｃ］の場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの測定値を遊離ペリオスチンの測定値で除した値の比率は９９％であった。
【０４４５】
更に、前記２の（ｃ）における本発明による測定［ＳＳ１６Ａ×ＳＳ１９Ｃ］の場合、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの測定値を遊離ペリオスチンの測定値で除した値の比率は１１０％であった。
【０４４６】
これらのことより、ペリオスチンのＲ３領域からＲ４領域にかけてのいずれかに結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができることが確かめられた。
これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる。
【０４４７】
また更に、ペリオスチンのＲ４領域に結合する免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができることが確かめられた。
これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる。
【０４４８】
〔実施例５〕（ペリオスチンと免疫グロブリンＡとの結合様式の検証）
免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンにおけるペリオスチンと免疫グロブリンＡとの結合様式を検証した。
【０４４９】
抗原特異抗体又はジャカリンを結合させたビーズを用いた免疫沈降法により、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンのペリオスチン及び免疫グロブリンＡを吸収させた。
【０４５０】
その上清中に残存するペリオスチン及び免疫グロブリンＡ量から回収率を算出し、結合様式を検証した。
【０４５１】
各種抗原特異抗体結合ビーズは下記の方法により調製した。
また、ジャカリン結合ビーズはＰｉｅｒｃｅ  Ｊａｃａｌｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ[Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）]を用いた。  
【０４５２】
１．各種抗原特異抗体共有結合ビーズの作製
（１）  抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）溶液、抗ペリオスチンモノマー抗体（ＳＳ１９Ｄ）溶液、抗免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体溶液[Ａｂｃａｍ社（英国）]、抗免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体溶液[Ａｂｃａｍ社（英国）]、及び抗免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体溶液[Ａｂｃａｍ社（英国）]を、限外ろ過フィルターを用いてカップリングバッファー[０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）]に置換した。
【０４５３】
（２）  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのボトルをよく振ってビーズを均一に懸濁し、その１ｍＬを１５ｍＬチューブに分取した。
【０４５４】
（３）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４５５】
（４）  ビーズが残存しているチューブに１ｍＭ  ＨＣｌを１０ｍＬ加え、ＮＨＳ基を活性化させた。
【０４５６】
（５）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４５７】
（６）  ０．５ｍｇの抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）溶液、抗ペリオスチンモノマー抗体（ＳＳ１９Ｄ）溶液、抗免疫グロブリンＧ抗体溶液、抗免疫グロブリンＭ抗体溶液、及び抗免疫グロブリンＡ抗体溶液をそれぞれ個別に、０．５ｍＬのビーズが残存しているチューブに加え懸濁し、ローテーターにセットして５℃で一晩回転し、各抗体をそれぞれビーズに結合させた。
【０４５８】
（７）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４５９】
（８）  上清を除去した１５ｍＬチューブにブロッキングバッファー[０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）]を１０ｍＬ加え、懸濁し、ローテーターにセットして５℃で２時間回転し、抗体が結合していない活性化ＮＨＳをブロッキングした。
【０４６０】
（９）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４６１】
（１０）  洗浄バッファーＡ[０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）]の１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０４６２】
（１１）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４６３】
（１２）  洗浄バッファーＢ[０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０）]の１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０４６４】
（１３）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４６５】
（１４）  前記の手順（１０）〜（１３）の操作を、３回ずつ繰り返し行った。
【０４６６】
（１５）  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬを、上清を除去した１５ｍＬチューブに加え、ビーズを再懸濁した。
【０４６７】
（１６）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清を除去した。
【０４６８】
（１７）  １５ｍＬチューブに検体希釈液[１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼインナトリウム及び０．０９５％ＮａＮ３を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）]の５ｍＬを加え、抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）、抗ペリオスチンモノマー抗体（ＳＳ１９Ｄ）、抗免疫グロブリンＧ抗体、抗免疫グロブリンＭ抗体、及び抗免疫グロブリンＡ抗体がそれぞれ結合した抗体結合ビーズを各々取得した。
【０４６９】
２．免疫沈降
（１）  １ｍＬの検体希釈液[１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼインナトリウム及び０．０９５％ＮａＮ３を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）]を、１．５ｍＬマイクロテストチューブに分注した。
【０４７０】
（２）  ６．８μｇ／ｍＬの免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン溶液１００μＬを前記（１）の１．５ｍＬのチューブに加えた。
【０４７１】
（３）  前記１で作製した抗体結合ビーズ、又はジャッカリン結合ビーズの１００μＬを、前記（２）のチューブにぞれぞれ個別に加えた。
【０４７２】
（４）  前記（３）のチューブをローテーターにセットして、５℃で一晩回転し続け、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンと前記の各種抗体とをそれぞれ反応させた。
【０４７３】
（５）  １５ｍＬチューブを３０００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、遠心後の上清をビーズが混入しないように回収した。
【０４７４】
（６）  回収した上清中のペリオスチン及び免疫グロブリンＡ濃度を、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【０４７５】
３．ＥＬＩＳＡ測定
免疫沈降処理前後の上清中のペリオスチン濃度は、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ）[シノテスト社（日本国）]を用いて測定した。
【０４７６】
また、免疫グロブリンＡ濃度は、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ[Ａｂｃａｍ社（英国）]を用いて測定した。
【０４７７】
４．回収率の算出
免疫沈降後のペリオスチン濃度又は免疫グロブリンＡ濃度を、免疫沈降前のペリオスチン濃度又は免疫グロブリンＡ濃度でそれぞれ除することで、特異抗体による回収率を算出した。
【０４７８】
５．測定結果
それぞれの特異抗体によって結合した、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの回収率を図３に示す。
【０４７９】
抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）により、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンからペリオスチンは完全に除去された。
また、免疫グロブリンＡも８０％以上が除去されたことから、ペリオスチンは免疫グロブリンＡと結合していることが確認された。
【０４８０】
抗ペリオスチンモノマー抗体（ＳＳ１９Ｄ）は、ペリオスチンモノマーのみに反応する抗体である。
この抗体を用いた場合は、ペリオスチン及び免疫グロブリンＡともに回収率が低かった。
【０４８１】
抗免疫グロブリンＧ抗体や抗免疫グロブリンＭ抗体を用いた場合は、ペリオスチン及び免疫グロブリンＡともに回収されないことから、免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチン中に免疫グロブリンＧや免疫グロブリンＭは存在しないことを確認した。
【０４８２】
抗免疫グロブリンＡ抗体を用いた場合、ペリオスチン及び免疫グロブリンＡともに８０％以上が回収できることが分かった。
【０４８３】
また、ＩｇＡ１を特異的に認識することが出来るジャカリンを用いた場合は、抗免疫グロブリンＡ抗体による回収率とほぼ同等であった。
【０４８４】
以上のことから、前記実施例１で取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンは、そのほとんどがペリオスチンと免疫グロブリンＡとの結合体であり、免疫グロブリンＡのサブクラスはＩｇＡ１である。
【０４８５】
また、前記実施例１で取得した免疫グロブリンＡに結合しているペリオスチンの分子量（２４０ＫＤａ）から鑑みて、この結合体中のペリオスチン（約８０ＫＤａ）と免疫グロブリンＡ（約１６０ＫＤａ）との結合比率は１：１と考えられた。
【受託番号】
【０４８６】
「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」のモノクローナル抗体産生細胞株であるＳＳ１７Ｂ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９４０」として２０１９年５月８日付けにて受領されている。
【０４８７】
「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ａ）」のモノクローナル抗体産生細胞株であるＳＳ１９Ａ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９４１」として２０１９年５月８日付けにて受領されている。
【０４８８】
「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２６Ｃ）」のモノクローナル抗体産生細胞株であるＳＳ２６Ｃ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９４２」として２０１９年５月８日付けにて受領されている。
【０４８９】
「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２７Ｄ）」のモノクローナル抗体産生細胞株であるＳＳ２７Ｄ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２９４３」として２０１９年５月８日付けにて受領されている。
【０４９０】
「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１６Ａ）」のモノクローナル抗体産生細胞株であるＳＳ１６Ａ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２８１」として２０１２年３月１６日付けにて寄託されている。この「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１６Ａ）」のモノクローナル抗体産生細胞株であるＳＳ１６Ａ株については、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に対し、２０１２年７月１９日付けにて国内寄託から国際寄託への移管の申請を行い、国際寄託に移管された。［移管日：２０１２年７月１９日］（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２８１）
【図１】
2020186175.tif 000008
【図２】
2020186175.tif 000009
【図３】
2020186175.tif 000010