(57)【要約】【課題】レポーター分子として使用されるレポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッキングするための方法及びシステムが提供される。【解決手段】非複製的形質導入粒子は、ウイルスで構成され、ウイルスの形質導入システム及び複製システムを利用することが可能である。レポーター核酸分子は、標的遺伝子又は標的細胞を検出するための、レポーター分子又は選択マーカー等のレポーター遺伝子を含む。非複製的形質導入粒子をレポーター分子として用いる、細胞及び標的核酸分子を検出するための方法及びシステムが提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞内への導入のための、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、破壊を包含する第一遺伝子を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該破壊が存在しない状態で、該第一遺伝子はパッケージング関連酵素活性の第一必須成分をコードし、且つ、第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該パッケージング関連酵素活性は該第一パッケージング開始部位を認識し、ここで、該破壊は該必須パッケージング関連酵素活性による第一パッケージング開始部位配列の認識を妨げ、そしてここで、該破壊は必須パッケージング関連酵素活性のレベルを低減する、及び
レポーター遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第一成分をコードする第二遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第二成分をコードする第三遺伝子とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二遺伝子は破壊されていない第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進するように構成されている、
を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
【請求項２】
前記バクテリオファージが、複数の破壊された遺伝子を含み、ここで、該破壊が存在しない状態で、それぞれがパッケージング関連酵素活性の必須成分をコードしている、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３】
前記バクテリオファージ上の複数の破壊された遺伝子がそれぞれ、レポーター核酸分子によってコードされた機能し得る、破壊されていない遺伝子によって補完される、請求項２に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４】
前記破壊が、欠失、挿入、突然変異、又は置換による、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５】
前記パッケージング関連酵素活性が、ターミナーゼ活性である、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６】
前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、それぞれターミナーゼ遺伝子である、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項７】
前記第二遺伝子がｐａｃＡ遺伝子であり、且つここで、前記第三遺伝子がｐａｃＢ遺伝子である、請求項６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項８】
前記レポーター核酸分子が配列番号１の配列を含む、請求項６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項９】
前記第二遺伝子がｔｅｒＡ遺伝子であり、且つ、前記第三遺伝子がｔｅｒＢ遺伝子である、請求項６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１０】
前記レポーター核酸分子が配列番号６の配列を含む、請求項６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１１】
前記第二遺伝子がｔｅｒＳ遺伝子であり、且つここで、前記第三遺伝子がｔｅｒＬ遺伝子である、請求項６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１２】
前記レポーター核酸分子が配列番号４の配列を含む、請求項６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１３】
前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、条件付きプロモーターに作動可能に連結される、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１４】
前記条件付きプロモーターが配列番号９の配列を含む、請求項１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１５】
前記条件付きプロモーターが、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである、請求項１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１６】
前記第二遺伝子又は第三遺伝子の発現が、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化の不存在下で阻害され、且つここで、該第二遺伝子又は第三遺伝子の発現が、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化時に活性化される、請求項１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１７】
前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、バクテリオファージゲノムの天然のターミナーゼ遺伝子であり、ここで、前記条件付きプロモーターがターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである、請求項１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１８】
前記バクテリオファージゲノムがレポーター遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１９】
前記バクテリオファージゲノムが抗生物質抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項１８に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子が検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする、請求項１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２１】
前記レポーター遺伝子が：発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される、請求項１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２２】
前記レポーター遺伝子がターミナーゼ遺伝子を破壊する、請求項１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２３】
前記抗生物質抵抗性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２４】
前記レポーター遺伝子が構成的プロモーターに作動可能に連結される、請求項１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２５】
前記構成的プロモーターがＰｂｌａｓｔである、請求項２４に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２６】
前記破壊が、選択マーカーをコードする遺伝子を伴った第一パッケージング開始部位配列への挿入又は置換を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２７】
前記選択マーカーをコードする遺伝子が、構成的プロモーターに作動可能に連結される、請求項２６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２８】
前記破壊が、検出可能マーカーをコードする遺伝子への第一パッケージング開始部位配列の挿入又は置換を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項２９】
前記検出可能マーカーをコードする遺伝子が：ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、及びｌｕｘＡＢから成る群から選択される、請求項２８に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３０】
前記検出可能マーカーをコードする遺伝子が、構成的プロモーターに作動可能に連結される、請求項２８又は２９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３１】
前記構成的プロモーターがＰｂｌａｓｔである、請求項３０に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３２】
前記第一遺伝子が、ｐａｃＡ遺伝子部位を含み、且つここで、破壊はｐａｃＡ遺伝子部位に挿入したｌｕｘＡＢ遺伝子及びｋａｎ遺伝子を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３３】
前記バクテリオファージゲノムが配列番号１２を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３４】
前記レポーター核酸分子が複製開始点を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３５】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、非複製的形質導入粒子内へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３６】
前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がコンカテマー接合部を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３７】
前記レプリコンが、腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶菌レプリコンである、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３８】
前記レプリコンが、Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３９】
前記レプリコンが配列番号２の配列を含む。、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４０】
前記レプリコンが、ｐＢＨＲ１レプリコン又はｐＢＨＲ１レプリコンの誘導体である、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４１】
前記レプリコンが配列番号３の配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４２】
前記レポーター核酸分子が配列番号４の配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４３】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、Ｓ．アウレウスｐＴ１８１プラスミド複製開始点に由来する、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４４】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが配列番号５の配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４５】
前記レポーター核酸分子が、配列番号６の配列を含む配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４６】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、エンテロコッカスｒｅｐＢプラスミド複製開始点に由来する、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４７】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが配列番号７の配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４８】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、エンテロコッカスｐＤＬ２７８プラスミド複製開始点に由来する、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４９】
前記核酸分子のレプリコンが配列番号８の配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５０】
前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がｐａｃ部位を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５１】
前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がｃｏｓ部位を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５２】
前記バクテリオファージゲノムが腸内細菌科バクテリオファージＰ１を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５３】
前記バクテリオファージゲノムが、Ｓ．アウレウスバクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５４】
前記バクテリオファージゲノムが、Ｅ．フェカリスバクテリオファージｐＥＦ１１を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５５】
前記細菌細胞がＥ．コリ細胞を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５６】
前記細菌細胞がＳ．アウレウス細胞を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５７】
前記細菌細胞がＥ．フェカリス細胞を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５８】
前記細菌細胞がグラム陰性細胞を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５９】
前記細菌細胞がグラム陽性細胞を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６０】
前記レポーター遺伝子が、検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６１】
前記レポーター遺伝子が、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６２】
前記レポーター核酸分子がアプタマーを含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６３】
前記レポーター核酸分子が、レポーター核酸分子中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６４】
前記核酸転写産物配列が、細胞転写産物に相補的である、請求項６３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６５】
前記核酸性転写産物がｃｉｓ−抑制配列を含む、請求項６３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６６】
前記レポーター核酸分子が、プロモーターに作動可能に連結される、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６７】
前記プロモーターが、細菌細胞内のレポーター核酸分子から発現されるレポーター分子の反応性に寄与するように選択される、請求項６６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６８】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、レポーター核酸分子のレプリカ中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６９】
非複製的形質導入内にレポーター核酸分子をパッケージする方法であって、請求項１〜６８のいずれか１項に記載の細菌細胞パッケージングシステムに、バクテリオファージゲノムの溶解期を誘導する条件を提供して、レポーター核酸分子をパックした非複製的形質導入粒子を生成し；そしてレポーター核酸分子を含む非複製的形質導入粒子を回収すること、を含む方法。
【請求項７０】
前記非複製的形質導入粒子が、複製されたバクテリオファージゲノムを含まない、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記非複製的形質導入粒子が、レポーター核酸分子での組み換えのためのバクテリオファージゲノムの一部を含み、ここで、該バクテリオファージゲノムの一部がレポーター遺伝子を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法によって精製されたレポーター核酸分子のレプリコンを含む非複製的形質導入粒子を含む組成物。
【請求項７３】
非複製的形質導入粒子内に核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、該細菌細胞が、第一パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はレポーターをコードする遺伝子によって破壊され、及び非複製的形質導入粒子内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする第二パッケージング開始部位配列を含むレポーター核酸分子、ここで、該レポーター核酸分子は、非複製的形質導入粒子内にパッケージされるように構成されたレプリコンを形成する、を含む細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項７４】
細胞内に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、第一ターミナーゼ遺伝子対を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一ターミナーゼ遺伝子対のうちの少なくとも１つを破壊し、破壊されたターミナーゼ遺伝子が機能しないようにし、及びレポーター遺伝子と、第一ターミナーゼ遺伝子対を補完する第二ターミナーゼ遺伝子対とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二ターミナーゼ遺伝子対のそれぞれに機能性があり、且つここで、該第二ターミナーゼ遺伝子対が、ＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする、を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
【請求項７５】
細胞内に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、第一ターミナーゼ遺伝子対を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一ターミナーゼ遺伝子対のうちのたった１つを破壊し、破壊されたターミナーゼ遺伝子が機能しないようにし、及びレポーター遺伝子と、第一ターミナーゼ遺伝子を補完する第二ターミナーゼ遺伝子を含むレポーター核酸分子、ここで、該第二ターミナーゼ遺伝子に機能性があり、且つここで、該第二ターミナーゼ遺伝子が、ＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする、を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の標的遺伝子を検出するための、細胞内への非複製的形質導入レポーター分子のパッケージング及び送達のための方法及び組成物に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
【０００３】
本出願は、２０１４年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０４１，５３９号、及び２０１５年８月７日に出願された米国仮特許出願第６２／２０２，６５３号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の開示を参照により本明細書に援用する。
【０００４】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ書式で電子的に提出された、且つ、その全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。２０１５年８月２４日に作成された、前記ＡＳＣＩＩコピーは、29681PCT_CRF_SequenceListing.txtと名付けられ、サイズが３７，６４２バイトである。
【背景技術】
【０００５】
形質導入粒子は、細胞内に非ウイルス核酸を送達することが可能なウイルスに関連している。ウイルスに基づくレポーターシステムは、細胞の存在を検出するために用いられており、細胞からのレポーター分子の発現を可能とするのにウイルスの溶原期（lysogenic phase）に依存している。これらの、ウイルスに基づくレポーターシステムは、レポーター分子を発現し、標的細胞に検出可能なシグナルを放出させる複製可能な形質導入粒子を利用している。
【０００６】
しかし、ウイルスの溶菌サイクルは、ウイルスに基づくレポーターアッセイに有害であることが示されている。Carriere, C. et al., Conditionally replicating luciferase reporter phages: Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1997. 35(12): p. 3232-3239。Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、３０℃では抑制されるが３７℃では活性化される溶菌サイクルを有する、Ｍ．ツベルクロシス（M. tuberculosis）／バチルス・カルメット−ゲラン（bacillus Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）ルシフェラーゼレポーターファージを開発した。このシステムを用いることで、Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、抑制された溶菌サイクルを有するファージレポーターを使用するＢＣＧの検出を実証している。
【０００７】
しかし、バクテリオファージに基づくレポーターアッセイにおいて、バクテリオファージの複製機能を抑制（除去ではない）することに関連する不都合が存在する。第一に、バクテリオファージの複製機能の制御はアッセイ条件の限定を強いる。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらが使用したレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌サイクルは、前記ファージが非許容温度である３０℃で細胞に感染させるために使用された場合に抑制された。標的細菌の最適温度が３７℃であったという点で、この温度要求はレポーターアッセイに限定条件を課していた。これらの限定条件は最適なアッセイ遂行の妨げとなる。
【０００８】
さらに、ウイルスの複製機能は制御が困難である。ウイルスの複製は、形質導入粒子がレポーターシステムとして使用される際は抑制されるべきである。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらによる報告で、レポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌活性が除去ではなく削減された結果、アッセイにおけるルシフェラーゼシグナルの減少が起こった。Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、完全なファージによって発現される遺伝子及びアッセイの温度制限などの、レポーターシグナルの減少結果の考えられる原因を明らかにしたが、これらは全て、ファージレポーターの溶菌サイクルが除去されなかったということに由来している。
【０００９】
ファージの天然の溶原サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発的に溶菌活性を示すことが予測され得る。さらに、ファージの溶原サイクルに依存するアッセイは、同様のファージで既に溶原化された標的細胞からの重感染免疫、並びに入ってくるウイルス核酸を標的とすることでこれらのレポーターファージの宿主範囲を制限する自然発生的な宿主制限系を引き起こす傾向があり得る。
【００１０】
他の例では、形質導入粒子生成系は外来核酸分子をパッケージングするように設計されているが、形質導入粒子はしばしば、外来核酸分子と天然の子孫ウイルス核酸分子の組み合わせを含有する。前記天然ウイルスはアッセイ遂行の障害となる溶菌活性を示す可能性があり、形質導入粒子を精製するためには、前記ウイルスの溶菌活性は排除されなければならない。しかし、この精製は通常は不可能である。Reporter Plasmid Packaging System for Detection of Bacteriaという表題の米国特許出願公開第２００９／０１５５７６８Ａ号において、Ｓｃｈｏｌｌらはこのような形質導入粒子システムの開発について記載している。前記システムの産物は、レポーター形質導入粒子及び天然バクテリオファージの組み合わせである（前記参考文献における図８）。前記著者らは形質導入粒子及び天然バクテリオファージが超遠心によって分離可能であることを示しているが、この分離は、形質導入粒子及び天然ウイルスが超遠心による分離を可能にするであろう異なる密度を示すシステムにおいてのみ可能である。この特徴は前記参考文献に記載されるバクテリオファージＴ７に基づくパッケージングシステムによって示されるが、これは他のウイルスシステムに一般に適用可能な特徴ではない。ウイルスのパッケージング機構は、天然ウイルス及び形質導入粒子に超遠心で分離できない区別不能な密度を示させるであろう充満した（headful）パッケージングを示すことが一般的である。また、ウイルスのパッケージングシステムは、区別不能な密度を有する天然ウイルス及び形質導入粒子をもたらす、適切なウイルス構造構築に必要なものとして、最低限のパッケージングに依存している。
【００１１】
これらのことから、検出限界を増加させ偽陰性結果を生じさせることによりレポーターアッセイの遂行を制限し得る、ウイルスの溶菌機能からの有害作用、並びに、重感染免疫並びにウイルス核酸分子及びウイルス機能を標的とする宿主制限機構によって制限される可能性の影響を受けない、非複製的形質導入粒子が必要とされている。
【００１２】
形質導入粒子が設計された場合であっても、形質導入粒子を用いて細胞内の標的核酸分子の存在を検出及びレポートする方法には限界がある。いくつかの方法は、細胞の破壊、並びに可溶化液中の転写物を単離及び検出するための面倒な方法を必要とする。検出方法には、抗体、アプタマー、又は核酸プローブなどの標識プローブの使用が含まれる。標的遺伝子に対する標識プローブは、意図されない標的に対する非特異的結合をもたらすか、又は高い信号雑音比を有するシグナルを生じる可能性がある。従って、細胞内の内在核酸分子を検出及びレポートするための、特異的、効果的且つ正確な方法が必要とされる。
【００１３】
従って、細胞内のレポーター分子のパッケージング及び発現を可能とする非複製的形質導入粒子を生成し、一方で複製可能な子孫ウイルスを排除するための方法及びシステムが必要とされる。発現されたレポーター分子を用いて細胞内の分子を検出する効果的且つ正確な方法も必要とされる。
【発明の概要】
【００１４】
細菌細胞内への導入のための、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、（１）破壊を包含する第一遺伝子を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該破壊が存在しない状態で、該第一遺伝子はパッケージング関連酵素活性の第一必須成分をコードし、且つ、第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該パッケージング関連酵素活性は該第一パッケージング開始部位を認識し、ここで、該破壊は該必須パッケージング関連酵素活性による第一パッケージング開始部位配列の認識を妨げ、そしてここで、該破壊は必須パッケージング関連酵素活性のレベルを低減する、及び（２）レポーター遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第一成分をコードする第二遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第二成分をコードする第三遺伝子とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二遺伝子は破壊されていない第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進するように構成されている、を含む宿主細胞を含む上記パッケージングシステムが本明細書中に開示される。
【００１５】
ある実施形態において、バクテリオファージは複数の破壊された遺伝子を含み、ここで、該破壊が存在しない状態で、それぞれがパッケージング関連酵素活性の必須成分をコードしている。ある実施形態において、バクテリオファージ上の複数の破壊された遺伝子はそれぞれ、レポーター核酸分子によってコードされた機能し得る、破壊されていない遺伝子によって補完される。別の実施形態において、破壊は、欠失、挿入、突然変異、又は置換による。
【００１６】
別の実施形態において、レポーター核酸分子は、小ターミナーゼ遺伝子及び巨大ターミナーゼ遺伝子を含む。さらなる実施形態において、ターミナーゼ遺伝子は、腸内細菌科バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ遺伝子及びｐａｃＢ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、前記バクテリオファージ遺伝子の第二セットの少なくとも１つが、配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の配列を含む。ある実施形態において、ターミナーゼ遺伝子は、Ｓ．アウレウス（S. aureus）バクテリオファージφ１１又はφ８０α由来のｔｅｒＳ遺伝子及びｔｅｒＬ遺伝子を含む。別の実施形態において、ターミナーゼ遺伝子は、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）バクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＡ遺伝子及びｔｅｒＢ遺伝子を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、パッケージング関連酵素活性は、ターミナーゼ活性である。ある実施形態において、第二遺伝子及び第三遺伝子は、それぞれターミナーゼ遺伝子である。ある実施形態において、第二遺伝子はｐａｃＡ遺伝子であり、且つここで、第三遺伝子はｐａｃＢ遺伝子である。ある実施形態において、レポーター核酸分子は配列番号１の配列を含む。ある実施形態において、第二遺伝子はｔｅｒＡ遺伝子であり、第三遺伝子はｔｅｒＢ遺伝子である。ある実施形態において、レポーター核酸分子は配列番号６の配列を含む。ある実施形態において、第二遺伝子はｔｅｒＳ遺伝子であり、且つここで、第三遺伝子はｔｅｒＬ遺伝子である。ある実施形態において、レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、第二遺伝子及び第三遺伝子は、条件付きプロモーターに作動可能に連結される。ある実施形態において、条件付きプロモーターは配列番号９の配列を含む。ある実施形態において、条件付きプロモーターは、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである。いくつかの実施形態において、第二遺伝子又は第三遺伝子の発現は、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化の不存在下で阻害され、且つここで、第二遺伝子又は第三遺伝子の発現は、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化のときに活性化される。特定の実施形態において、第二遺伝子及び第三遺伝子は、バクテリオファージゲノムの天然のターミナーゼ遺伝子であり、ここで、条件付きプロモーターはターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージゲノムはレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージゲノムは抗生物質抵抗性遺伝子をさらに含む。ある実施形態において、レポーター遺伝子は検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする。ある実施形態において、レポーター遺伝子は：発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される。
ある実施形態において、レポーター遺伝子はターミナーゼ遺伝子を破壊する。特定の実施形態において、抗生物質抵抗性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は構成的プロモーターに作動可能に連結される。さらなる実施形態において、構成的プロモーターはＰｂｌａｓｔである。
【００２０】
ある実施形態において、破壊は、選択マーカーをコードする遺伝子を伴った第一パッケージング開始部位配列への挿入又は置換を含む。特定の実施形態において、選択マーカーをコードする遺伝子は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。ある実施形態において、破壊は、検出可能マーカーをコードする遺伝子への第一パッケージング開始部位配列の挿入又は置換を含む。ある実施形態において、検出可能マーカーをコードする遺伝子は：ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、及びｌｕｘＡＢから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、検出可能マーカーをコードする遺伝子は、構成的プロモーター、例えばＰｂｌａｓｔに作動可能に連結される。特定の実施形態において、第一遺伝子は、ｐａｃＡ遺伝子部位を含み、且つここで、破壊はｐａｃＡ遺伝子部位に挿入したｌｕｘＡＢ遺伝子及びｋａｎ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージゲノムは配列番号１２を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは、非複製的形質導入粒子内へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む。特定の実施形態において、破壊されていない第一パッケージング開始部位配列はコンカテマー接合部を含む。いくつかの実施形態において、レプリコンは、腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶菌レプリコンである。
【００２２】
ある実施形態において、レプリコンは、Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含む。ある実施形態において、レプリコンは配列番号２の配列を含む。ある実施形態において、レプリコンは、ｐＢＨＲ１レプリコン又はｐＢＨＲ１レプリコンの誘導体である。ある実施形態において、レプリコンは配列番号３の配列を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子は配列番号４の配列を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは、Ｓ．アウレウスｐＴ１８１プラスミド複製開始点に由来する。ある実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは配列番号５の配列を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子は、配列番号６の配列を含む配列を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは、エンテロコッカスｒｅｐＢプラスミド複製開始点に由来する。ある実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは配列番号７の配列を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは、エンテロコッカスｐＤＬ２７８プラスミド複製開始点に由来する。ある実施形態において、核酸分子のレプリコンは配列番号８の配列を含む。ある実施形態において、破壊されていない第一パッケージング開始部位配列はｐａｃ部位を含む。ある実施形態において、破壊されていない第一パッケージング開始部位配列はｃｏｓ部位を含む。
【００２３】
ある実施形態において、バクテリオファージゲノムは腸内細菌科バクテリオファージＰ１を含む。ある実施形態において、バクテリオファージゲノムは、Ｓ．アウレウスバクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１を含む。ある実施形態において、バクテリオファージゲノムは、Ｅ．フェカリスバクテリオファージｐＥＦ１１を含む。
【００２４】
ある実施形態において、細菌細胞はＥ．コリ（E. coli）細胞を含む。ある実施形態において、細菌細胞はＳ．アウレウス細胞を含む。ある実施形態において、細菌細胞はＥ．フェカリス細胞を含む。ある実施形態において、細菌細胞はグラム陰性細胞を含む。ある実施形態において、細菌細胞はグラム陽性細胞を含む。
【００２５】
ある実施形態において、レポーター遺伝子は、検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される。
【００２６】
ある実施形態において、レポーター核酸分子はアプタマーを含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子は、レポーター核酸分子中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む。
【００２７】
ある実施形態において、核酸転写産物配列は、細胞転写産物に相補的である。さらなる実施形態において、核酸性転写産物はｃｉｓ−抑制配列を含む。ある実施形態において、レポーター核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結される。さらなる実施形態において、プロモーターは、細菌細胞内のレポーター核酸分子から発現されるレポーター分子の反応性に寄与するように選択される。いくつかの実施形態において、レポーター核酸分子のレプリコンは、レポーター核酸分子のレプリカ中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む。
【００２８】
（１）本明細書中に開示した細菌細胞パッケージングシステムに、バクテリオファージゲノムの溶解期を誘導する条件を提供して、レポーター核酸分子をパックした非複製的形質導入粒子を生成し；そして（２）レポーター核酸分子を含む非複製的形質導入粒子を回収すること、を含む非複製的形質導入内にレポーター核酸分子をパッケージする方法もまた本明細書中に提供する。いくつかの実施形態において、非複製的形質導入粒子は、複製されたバクテリオファージゲノムを含まない。いくつかの実施形態において、非複製的形質導入粒子は、レポーター核酸分子での組み換えのためのバクテリオファージゲノムの一部を含み、ここで、該バクテリオファージゲノムの一部がレポーター遺伝子を含む。
【００２９】
本明細書中に開示された方法によって精製されたレポーター核酸分子のレプリコンを含む非複製的形質導入粒子を含む組成物もまた本明細書中に提供する。
【００３０】
非複製的形質導入粒子内に核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、（１）第一パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はレポーターをコードする遺伝子によって破壊され、及び（２）非複製的形質導入粒子内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする第二パッケージング開始部位配列を含むレポーター核酸分子、ここで、該レポーター核酸分子は、非複製的形質導入粒子内にパッケージされるように構成されたレプリコンを形成する、を含む該細菌細胞もまた本明細書中に提供する。
【００３１】
細胞内に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、（１）第一ターミナーゼ遺伝子対を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一ターミナーゼ遺伝子対のうちの少なくとも１つを破壊し、破壊されたターミナーゼ遺伝子が機能しないようにし、及び（２）レポーター遺伝子と、第一ターミナーゼ遺伝子対を補完する第二ターミナーゼ遺伝子対とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二ターミナーゼ遺伝子対のそれぞれに機能性があり、且つここで、該第二ターミナーゼ遺伝子対が、ＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする、を含む、宿主細胞を含む該パッケージングシステムもまた本明細書中に提供する。
【００３２】
細胞内に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、（１）第一ターミナーゼ遺伝子対を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一ターミナーゼ遺伝子対のうちのたった１つを破壊し、破壊されたターミナーゼ遺伝子が機能しないようにし、及び（２）レポーター遺伝子と、第一ターミナーゼ遺伝子を補完する第二ターミナーゼ遺伝子を含むレポーター核酸分子、ここで、該第二ターミナーゼ遺伝子に機能性があり、且つここで、該第二ターミナーゼ遺伝子が、ＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする、を含む、宿主細胞を含む該パッケージングシステムもまた本明細書中に提供する。
【００３３】
いくつかの非複製的形質導入粒子パッケージングシステムにおいて、プラスミドＤＮＡに再結合されたウイルスＤＮＡがパッケージされてもよい。斯かるシステムでは、パッケージングシステムによって作り出された溶解物は、（１）プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子、及び（２）ウイルスＤＮＡを保有する形質導入粒子の２種類の形質導入粒子を含有する。斯かるシステムでは、後者の種類の形質導入粒子は、標的細胞の検出のためのレポーターシステムとして溶解物を使用するとき、シグナル生成に寄与しない。このように、両方の種類の形質導入粒子がシグナルを生成することができるように、レポーター遺伝子がウイルスゲノム内に組み込まれた、改良された非複製的形質導入粒子に基づくレポーターシステムが本明細書中に開示されている。
【００３４】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付図面を考慮することによってより正確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ある実施形態に係る、対立遺伝子交換を用いたｐａｃＡ遺伝子内へのカナマイシン耐性遺伝子の挿入によるバクテリオファージＰ１におけるｐａｃＡ遺伝子破壊の一例を示している。
【００３６】
【図２】図２は、ある実施形態に係る、天然ｐａｃＡ遺伝子プロモーター制御下のｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子を保有する相補レポータープラスミドの模式図を示している。
【００３７】
【図３】図３は、破壊されたｐａｃＡを有するバクテリオファージＰ１を用いて溶原化されたＥ．コリ細胞を含むパッケージングシステムの設計及び機能の一例を示しており、該細胞はまた、ある実施形態に係る、ｐａｃＡ及びｐａｃＢを含有するプラスミドを保有する。
【００３８】
【図４】図４は、カナマイシン耐性遺伝子及び細菌ルシフェラーゼｌｕｘＡＢ遺伝子の挿入によって破壊が達成される、破壊されたｐａｃＡを有するバクテリオファージＰ１を用いて溶原化されたＥ．コリ細胞を含むパッケージングシステムの設計及び機能の一例を示しており、該細胞はまた、ある実施形態に係る、ｐａｃＡ及びｐａｃＢを含有するプラスミドを保有する。
【００３９】
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る、生細胞内での標的遺伝子プロモーターに対する誘導因子の検出にＮＲＴＰを用いるためのシステムを示している。
【００４０】
【図６】図６は、本発明の一実施形態に係る、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）（又はＥ．フェカリス（E. faecalis））内のバンコマイシン耐性（ｖａｎＡ）遺伝子のプロモーターの誘導因子ＶａｎＲを検出するために構築されたレポーター核酸分子（例えば、プラスミド）を含むレポーターシステムを示している。前記レポータープラスミドは、ｖａｎＡ遺伝子プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を保有している。
【００４１】
【図７】図７は、本発明の一実施形態に係る、Ｃ．ディフィシル（C. difficile）の毒素Ａ遺伝子及び毒素Ｂ遺伝子（それぞれｔｃｄＡ及びｔｃｄＢ）のプロモーターの誘導因子ＴｃｄＤを検出するために構築されたレポーター核酸分子を含むレポーターシステムを示している。前記レポーター核酸分子は、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。
【００４２】
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係る、Ｓ．アウレウスのプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）のプロモーターの誘導因子ＳａｒＳを検出するために構築されたレポーター核酸分子を含むレポーターシステムを示している。前記レポーター核酸分子は、ｓｐａ遺伝子プロモーター（Ｐspa）に作動可能に連結された細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢを含む。
【００４３】
【図９】図９は、標的転写物及びレポーター転写物のｃｉｓ−抑制配列の間の塩基対形成の略図を示している。
【００４４】
【図１０】図１０は、形質導入細胞のコロニーからの発光量（ＲＬＵ）の計測から得られたデータの表を示している。スペクチノマイシン（ＳｐｅｅＲ）に対して耐性である細胞がプラスミドＤＮＡによって形質導入されたのに対して、カナマイシン（ＫａｎＲ）に対して耐性である細胞はＰ１ ＤＮＡによって形質導入された。そのゲノム内に統合された、ｌｕｘＡＢを伴わないＰ１を含有する細胞（１５０５）から生じた溶解物を利用して得られたデータは、概して、発光しないＫａｎＲ形質導入体をもたらした一方で、そのゲノム内に統合された、ｌｕｘＡＢを伴ったＰ１を含有する細胞（１５２５）から生じた溶解物を利用して得られたデータは、発光するＫａｎＲ形質導入体をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
特許請求の範囲及び本明細書で使用される用語は、特に記載がない限り以下に記載される通りに定義される。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「レポーター核酸分子」は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を含むヌクレオチド配列を指す。レポーター核酸分子は天然分子又は人工分子又は合成分子であり得る。いくつかの実施形態において、レポーター核酸分子は、宿主細胞に対し外来性であり、プラスミド又はベクター等の外来核酸分子の一部として宿主細胞内に導入され得る。ある実施形態において、レポーター核酸分子は細胞内の標的遺伝子に相補的であり得る。他の実施形態において、前記レポーター核酸分子はレポーター分子（例えば、レポーター酵素、タンパク質）をコードするレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、レポーター核酸分子は「レポーター構築物」又は「核酸レポーター構築物」と称される。
【００４７】
「レポーター分子」又は「レポーター」は、生物に検出可能な表現型又は選択可能な表現型を与える分子（例えば、核酸又はタンパク質）を指す。検出可能な表現型は、例えば比色、蛍光又は発光であり得る。レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子をコードするレポーター遺伝子から発現され得る。レポーター分子は、細胞内への核酸分子又は外来配列（プラスミド）の取り込みの成否のマーカーとして使用され得る。レポーター分子はまた、本明細書に記載の標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子、又は細胞の存在を示すために使用され得る。あるいはレポーター分子は、アプタマー又はリボザイム等の核酸であり得る。
【００４８】
本発明のいくつかの態様では、レポーター核酸分子はプロモーターに作動可能に連結されている。本発明の他の態様では、プロモーターは、特定の細胞（例えば、特定の種）に存在し他の細胞には存在しないプロモーターの活性に基づくレポーターシステムの反応性及び交差反応性に寄与するために選択又は設計され得る。ある態様では、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。他の態様では、複製開始点の選択は、標的細胞内でのレポーター核酸分子の複製が、特定の細胞（例えば、特定の種）に存在し他の細胞には存在しない複製開始点の活性に基づくレポーターシグナル生成に寄与する、又はそれに必要である場合、レポーターシステムの反応性及び交差反応性に同様に寄与し得る。いくつかの実施形態において、レポーター核酸分子は、ウイルス複製の間に子孫ウイルス中にコンカテマーＤＮＡとしてパッケージングされることが可能なレプリコンを形成する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「標的転写物」は、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列の一部、又は標的細胞によって自然発生的に形成されるｍＲＮＡ分子（例えば、標的遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子）、及び一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを指す。標的転写物はまた、細胞転写物（cellular transcript）又は自然発生転写物（naturally occurring transcript）とも称され得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「転写物」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写された、ある長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されたｃＤＮＡ配列又は鋳型ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、タンパク質をコードしている場合もあるし、コードしていない場合もある。また、転写物は操作された核酸構築物からも転写され得る。
【００５１】
レポーター核酸分子由来の転写物は「レポーター転写物」と称され得る。レポーター転写物はレポーター配列及びｃｉｓ−抑制配列を含み得る。レポーター転写物は、転写物が二本鎖（例えば、分子間二本鎖領域）を形成する２つの領域を含むように、相補的な領域を形成する配列を有し得る。一方の領域は「ｃｉｓ−抑制配列」と称されることがあり、標的転写物及び／又はレポーター配列の一部又は全てに対して相補性を有する。転写物の第二の領域は「レポーター配列」と称され、ｃｉｓ−抑制配列に対して相補性を有し得る。相補性は、完全な相補性である場合もあるし、実質的な相補性である場合もある。ｃｉｓ−抑制配列がレポーター配列と一緒に存在する、及び／又はレポーター配列と結合すると、レポーター転写物内に高次構造が形成される場合があり、この高次構造によってレポーター分子のさらなる発現が阻止され得る。レポーター転写物は、互いに相補的であるレポーター転写物内領域が互いにハイブリダイズするように、ヘアピン構造等の二次構造を形成し得る。
【００５２】
「細胞内に導入する」とは、核酸分子又は外来配列（例えば、プラスミド、ベクター、構築物）への言及である場合、当業者によって理解される通り、細胞内への取り込み又は吸収を促進することを意味する。核酸構築物又は転写物の吸収又は取り込みは、助力のない拡散プロセスもしくは能動的な細胞プロセスを介して、又は補助的な作用剤もしくは装置によって（例えば、バクテリオファージ、ウイルス、及び形質導入粒子の使用を介して）、起こり得る。この用語の意味はインビトロにおける細胞に限定されず；核酸分子は、生体の一部である「細胞内に導入」されてもよい。そのような例では、細胞内への導入は生物への送達を含み得る。例えば、インビボにおける送達において、本発明の核酸分子、構築物又はベクターは、組織部位に注入されるか、又は全身投与され得る。インビトロにおける細胞内への導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクション等の当該技術分野において既知の方法を含む。さらなるアプローチが本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において公知である。
【００５３】
「形質導入粒子」は、細胞内に非ウイルス核酸分子を送達することが可能なウイルスを指す。前記ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルス等であり得る。
【００５４】
「非複製的形質導入粒子」は、細胞内に非ウイルス核酸分子を送達することが可能なウイルスを指すが、それ自身の複製されたウイルスゲノムを形質導入粒子内にパッケージングできない。前記ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルス等であり得る。
【００５５】
「プラスミド」は、細胞内の染色体ＤＮＡから物理的に分離され、前記染色体ＤＮＡとは独立して複製可能である、小型ＤＮＡ分子である。プラスミドは、小型の環状二本鎖ＤＮＡ分子として細菌内に存在するのが最も一般的であり、古細菌及び真核生物内に存在する場合もある。プラスミドは、適切な宿主内で自動的に複製可能であるレプリコンとみなされる。
【００５６】
「ベクター」は、外来遺伝物質を、それを複製及び／又は発現可能な別の細胞内に人工的に運ぶために、ビヒクルとして使用される核酸分子である。
【００５７】
「ウイルス」は、他の生物の生細胞の内側でのみ複製する小型の感染体である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られている）は２つ又は３つの部分：ｉ）遺伝情報を運ぶＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子でつくられる遺伝物質；ｉｉ）これらの遺伝子を保護するタンパク質外被；及び、場合によって、ｉｉｉ）タンパク質外皮を取り囲む脂質外被、を含む。
【００５８】
本明細書中に使用される場合、「相補体」という用語は、破壊された同一配列の存在下において破壊されていない配列を指すか、又は破壊された配列に対する破壊されていない配列の相関を指す。一実施形態において、相補体は、機能性であり且つ発現可能であり、そして、バクテリオファージ上で破壊前の破壊された遺伝子と同じ機能を有するタンパク質を発現する、細胞内のポリヌクレオチド上にコードされた遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、相補遺伝子は、破壊前の破壊されたバクテリオファージ遺伝子、すなわち、天然バクテリオファージ遺伝子に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、相補遺伝子は、破壊前の破壊されたバクテリオファージ遺伝子、すなわち、天然バクテリオファージ遺伝子と同一である。いくつかの実施形態において、相補遺伝子は、バクテリオファージから欠失されたポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、相補遺伝子は、プラスミド上のバクテリオファージのパッケージング機構をコードする遺伝子を指し、そして、同じ遺伝子がバクテリオファージにおいて破壊された。従って、プラスミドは、形質導入粒子内にポリヌクレオチドをパッケージングするのに必要なパッケージング機構を提供するための変異パッケージング機構遺伝子を伴ったバクテリオファージの存在下にあることが必要である。
【００５９】
本明細書中に使用される場合、「パッケージング関連酵素活性」という用語は、形質導入粒子内にポリヌクレオチドをパッケージングするためのパッケージング開始部位配列との相互作用に重要な１若しくは複数のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、一対のターミナーゼ遺伝子が斯かる相互作用に必要であり、ここで、各ターミナーゼがパッケージング関連酵素活性をコードする。いくつかの実施形態において、酵素活性は、Ｓ．アウレウスバクテリオファージφ１１又はφ８０α由来のｔｅｒＳ及び／又はｔｅｒＬ遺伝子、Ｅ．フェカリスバクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＡ及びｔｅｒＢ遺伝子、或いは腸内細菌科バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子によってコードされる。これらの実施形態において、ターミナーゼ遺伝子対のそれぞれがパッケージング関連酵素活性を発現し、両方の機能的バージョンがパッケージング開始部位を有するポリヌクレオチドのパッケージングのために必要である。いくつかの実施形態において、パッケージング関連酵素活性に関連している複数の遺伝子のうちの１つの遺伝子の破壊が、パッケージング関連酵素活性を除去する。いくつかの実施形態において、一対のターミナーゼ遺伝子の両方がバクテリオファージにおいて破壊される、従って、バクテリオファージにおいてパッケージング関連酵素活性をコードする遺伝子のセット全体を破壊する。
【００６０】
「ＭＲＳＡ」は、メチシリン耐性Ｓ．アウレウス（Staphylococcus aureus）を指す。
【００６１】
「ＭＳＳＡ」はメチシリン感受性Ｓ．アウレウスを指す。
【００６２】
用語「改善する」とは、その予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解、又は治癒を含む、病状（例えば、病状）の治療における治療上有益なあらゆる結果を指す。
【００６３】
用語「インサイチュ(in situ)」は、生体から分離されて増殖している（例えば、組織培養液内で増殖している）生細胞において起こるプロセスを指す。
【００６４】
用語「インビボ」は、生体内で起こるプロセスを指す。
【００６５】
本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、例えば、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタが挙げられる。
【００６６】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」の各々は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は本明細書では同義的に使用され、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシリボチミン）を指す。しかし、当然のことながら、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」は、以下にさらなる詳細がある改変ヌクレオチド、又は代替の置換部分も指し得る。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく他の部分によって置換され得ることを十分に理解している。例えば、限定はされないが、イノシンを塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。そのため、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列が本発明の実施形態である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「相補的」とは、第二ヌクレオチド配列に関連して第一ヌクレオチド配列を記載するのに用いられる場合、前記第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、ある特定の条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、前記第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの能力を指し、これは当業者によって理解される通りである。また相補的配列は、互いに結合しているものと記述され、結合親和性によって特徴付けられる。
【００６８】
例えば、第一ヌクレオチド配列は、前記２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ（例えば、アニーリング）する場合、第二ヌクレオチド配列に相補的であると記載され得る。ハイブリダイゼーション条件には、アニーリングステップ及び／又は洗浄ステップの、温度、イオン強度、ｐＨ、及び有機溶剤濃度が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件という用語は、その条件下では、第一ヌクレオチド配列がその標的配列（例えば、第二ヌクレオチド配列）に優先的にハイブリダイズし、他の配列にはより小さな程度にハイブリダイズする、又は全くハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は配列依存的であり、異なる環境パラメーターの下では異なる。一般的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、所定のイオン強度及びｐＨで、ヌクレオチド配列の熱融解温度（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔmは、第一ヌクレオチド配列の５０％が完全一致した標的配列にハイブリダイズする、（所定のイオン強度及びｐＨにおける）温度である。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、例えば、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. ("Tijssen")に記載されている。生物内で遭遇し得るような、生理的に適切な条件等の他の条件を適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に基づいて、２つの配列の相補性を試験するのに最も適した条件セットを決定することができる。
【００６９】
これは、第一ヌクレオチド配列及び第二ヌクレオチド配列の全長にわたる、第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基対形成を含む。このような配列は、本明細書では、互いに対して「完全に相補的」であると称され得る。しかし、本明細書において第一配列が第二配列に対し「実質的に相補的」であると称される場合、これら２つの配列は完全に相補的であってもよく、あるいは、それらの最終適用に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に一つ又は複数の、しかし通常は４つ、３つ又は２つ以下の不適正塩基対を形成してもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に一つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなさないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長のあるオリゴヌクレオチド及び２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドは短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡであっても、本明細書に記載される目的のために、「完全に相補的」と称され得る。
【００７０】
「相補的な」配列は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイズする能力に関する上記要求が満たすという条件で、非ワトソン・クリック塩基対並びに／又は非天然ヌクレオチド及び改変ヌクレオチドから形成される塩基対も含むか、又は全体的にそれらから形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対には、限定はされないが、Ｇ：Ｕ Ｗｏｂｂｌｅ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対形成が含まれる。
【００７１】
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」は、それらが使用される文脈から理解される通り、２本鎖ｄｓＲＮＡ間の塩基一致、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖及び標的配列間の塩基一致、一本鎖ＲＮＡ配列の相補鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列間の塩基一致に対して使用され得る。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「二本鎖構造」は、２本の逆平行の実質的に相補的な核酸配列を含む。核酸構築物内の相補的配列は、２つの転写物間で、転写物内の２つの領域間で、又は転写物と標的配列との間で、「二本鎖構造」を形成し得る。通常、各々の鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されているように、各々又は両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は改変ヌクレオチドも含み得る。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１本の巨大なＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、あるいは別々のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つの巨大分子の一部であり、それ故に、二本鎖構造を形成している一方の鎖の３’末端及びそれぞれ他の鎖の５’末端の間の中断のないヌクレオチド鎖によって連結されている場合、連結しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。前記２本の鎖が、二本鎖構造を形成している一方の鎖の３’末端及びそれぞれ他の鎖の５’末端の間の中断のないヌクレオチド鎖以外の手段で、共有結合的に連結されている場合、連結している構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ数のヌクレオチドを有していてもよいし、異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。塩基対の最大数は、二本鎖の最も短い鎖におけるヌクレオチドの数から、二本鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを引いたものとなる。通常、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対長又は２５〜３０塩基対長、又は１８〜２５塩基対長、又は１９〜２４塩基対長、又は１９〜２１塩基対長、又は１９塩基対長、２０塩基対長、又は２１塩基対長である。一実施形態において、二本鎖は１９塩基対長である。別の実施形態において、二本鎖は２１塩基対長である。２本の異なるｓｉＲＮＡが組み合わされて使用される場合、二本鎖の長さは同一になるか又は異なり得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「相補的領域」は、ある配列、例えば、本明細書で定義される標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補的領域が標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、存在する場合は、通常、１つ又は複数の末端領域、例えば、５’末端及び／又は３’末端の６、５、４、３、又は２ヌクレオチド以内に存在する。
【００７４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連における、用語「同一性」パーセントとは、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを用いて、又は目視検査によって測定され、最大一致となるように比較及びアラインメントされた場合に、特定の割合の同一ヌクレオチド又は同一アミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。適用に応じて、「同一性」パーセントは、比較されている配列のある領域にわたって（例えば、機能ドメインにわたって）存在していてもよいし、あるいは、比較される２本の配列の完全長にわたって存在していてもよい。
【００７５】
配列比較では典型的に、一方の配列は試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムが使用される場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは次に、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００７６】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ウィスコンシン・ジェネティック・ソフトウェアパッケージ（Wisconsin Genetics Software Package）（ジェネティック・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、マディソン、ウィスコンシン州））のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのコンピューター処理による実行によって、又は目視検査（一般的には、以下のAusubel et al.を参照）によって実行することができる。
【００７７】
配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)で記述されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公的に利用可能である。
【００７８】
用語「充分な量」は、所望の効果を生むのに充分な量（例えば、細胞から検出可能なシグナルを生み出すのに十分な量）を意味する。
【００７９】
用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療と見なされ得るため、治療有効量は「予防有効量」であり得る。
【００８０】
本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を含むことを注意しなければならない。
ＩＩ．ウイルスの溶原サイクル及び溶菌サイクル
【００８１】
ウイルスは宿主細胞内で溶原サイクル及び溶菌サイクルを起こす。溶原サイクルがとられた場合、ファージ染色体は、細菌の染色体内に組み込まれるか、又は宿主内で安定なプラスミドとして自身を確立させ、そこで長期間休止状態を維持し得る。溶原菌が誘導されると、ファージゲノムは細菌染色体から切除され、溶菌サイクルを開始し、その結果、細胞の溶解及びファージ粒子の放出が起こる。溶菌サイクルは、宿主の溶解によって放出される新しいファージ粒子の生産をもたらす。
【００８２】
ある特定の溶原ファージは溶菌活性を示すことがあり、溶菌活性の性質は宿主細菌によって異なり得る。この現象を説明するため、１０種のＭＲＳＡ臨床分離株に対する２種の溶原性Ｓ．アウレウスファージの溶菌活性をプラークアッセイにより調べた（表１）。ファージφ１１は１０種中１０種の臨床ＭＲＳＡ分離株に対し溶菌活性を示し、φ８０αは１０種中６種の臨床ＭＲＳＡ分離株に対し溶菌活性を示した。従って、ファージの天然の溶原サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発性に溶菌活性を示すこと予測することができる。
表１：１０種の臨床ＭＲＳＡ分離株に対するＳ．アウレウス溶原ファージφ１１及びφ８０αの溶解活性（文字「ｘ」で示される）
【表１】
2020198885.tif 000003
【００８３】
さらに、ファージに基づくレポーター等の、ウイルスに基づくレポーターアッセイは、宿主に基づくファージ耐性機構及びプロファージに由来するファージ耐性機構によって生じるファージ宿主範囲の限定による、反応性の限定（すなわち、分析包括性（analytical inclusivity））の影響を受け得る。これらの耐性機構は天然のファージ核酸を標的とし、その結果、ファージＤＮＡ及び機能の分解ないし阻害が起こり得る。このような耐性機構には、ファージＤＮＡを切断する制限系及びファージ由来転写物を阻害するＣＲＩＳＰＲ系が含まれる。
【００８４】
溶菌活性及びファージ耐性は共に、レポーターファージに基づくアッセイの妨げとなり得る。溶菌活性は、検出可能なシグナルを生み出す細胞の能力において細胞を破壊ないし阻害することにより、検出可能なシグナルの量を減少させる又は検出可能なシグナルの生成を妨げることで検出限界に影響を与えることによって、シグナルを阻害し得る。ファージ耐性機構は、ファージの宿主範囲を限定し、ファージに基づくレポーターの包括性を限定する可能性があり、同様に、検出可能なシグナルの量を減少させる又は検出可能なシグナルの生成を妨げることで検出限界に影響を与える。レポーターファージ内のファージＤＮＡの組込みによって生じる溶菌活性及びファージ耐性は共に、これらのファージレポーターを組み入れたアッセイにおいて、偽陰性結果をもたらし得る。
ＩＩＩ．非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を作製するための方法
非複製的形質導入粒子を作製するための破壊／相補性に基づく方法
【００８５】
ウイルス産生中にそこからゲノムパッケージングが開始される要素としてウイルスパッケージング機構によって認識されるウイルスゲノムの成分の破壊に基づく非複製的形質導入粒子パッケージングシステムが、本明細書中に開示されている。ある実施形態において、この破壊は、バクテリオファージからのパッケージング開始部位を破壊し、そしてまた、ターミナーゼ機能も破壊する。破壊された要素の例としては、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列及びｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列が挙げられる。一実施形態において、ファージ内のパッケージング開始部位配列が破壊されたとき、ファージは機能的なターミナーゼを産生することができない。一例では、ｐａｃ部位はｐａｃＡ遺伝子配列中にコードされ、そして、ターミナーゼ機能は機能的なＰａｃＡ及びＰａｃＢの両方を必要とする。実施形態において、プラスミドＤＮＡは、前記破壊されたターミナーゼを補完し、そして、プラスミドＤＮＡ上に認識可能なパッケージング開始部位を含むことによって、ファージキャプシド内にパッケージされる。バクテリオファージは、例えば腸内細菌科バクテリオファージＰ１若しくはφＥＦ１１、又はＳ．アウレウスバクテリオファージφ８０α若しくはバクテリオファージφ１１などの任意のバクテリオファージである。
【００８６】
パッケージング開始部位は、ウイルス産生に必須である遺伝子のコード領域中に見られることが多い。いくつかの実施形態において、バクテリオファージゲノムの領域は、パッケージング開始部位を破壊する挿入、置換、欠失、又は突然変異によって破壊される。これを達成する破壊の例としては、これだけに限定されるものではないが、例えば抗生物質抵抗性遺伝子の配列などの別の配列を有するパッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を置換する対立遺伝子交換事象、又は小ターミナーゼ遺伝子及び巨大ターミナーゼ遺伝子の完全な欠失が挙げられる。ターミナーゼ遺伝子ｐａｃＡ及びｐａｃＢを利用する一例では、ｐａｃＡはまた、ｐａｃＢ発現及び／又はＰａｃＡ及びＰａｃＢによって媒介される全体的なターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こす様式で破壊され得る。他の例としては、Ｓ．アウレウスバクテリオファージφ１１又はφ８０α由来のｔｅｒＳ及びｔｅｒＬ遺伝子、又はＥ．フェカリスバクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＳ及びｔｅｒＬ遺伝子も含み得るターミナーゼ遺伝子を挙げることもできる。ある実施形態において、ターミナーゼ遺伝子としては、配列番号１０、ｐａｃ部位を含む遺伝子配列の一部がカナマイシン耐性遺伝子によって置換されたＰ１ ｐａｃＡ遺伝子が挙げられる。図１は、対立遺伝子交換によるｐａｃＡ遺伝子内のカナマイシン耐性遺伝子の挿入によって、バクテリオファージＰ１内のｐａｃＡ遺伝子の破壊に関する一例を示している。
【００８７】
一例では、パッケージング開始部位が破壊された場合、細胞のゲノムは、ウイルスゲノムと共に溶原化される。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ．コリ細胞、Ｓ．アウレウス細胞、又はＥ．フェカリス細胞であり得る。細胞は、グラム陰性であっても、又はグラム陽性であってもよい。相補プラスミド（又はレポーター核酸分子）は、細胞内に導入され、そして、プラスミドＤＮＡは、バクテリオファージで破壊された少なくとも１つの遺伝子、並びにパッケージング開始部位配列、及び／又は適宜追加のバクテリオファージ遺伝子及びレポーター遺伝子を含み、そして該レポーター遺伝子は、検出可能マーカー及び／又は選択可能なマーカーをコードし得る。プラスミドは、国際出願番号第ＰＣＴ ＵＳ２０１４／０２６５３６号に見られる方法を使用して構築され得るものであり、該出願の全体を参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態において、パッケージング開始部位配列はｐａｃ部位又はｃｏｓ部位を含む。ある実施形態において、パッケージング開始部位配列は、配列番号１、配列番号４、又は配列番号６の配列を含む。プラスミドの１若しくは複数の遺伝子は、（パッケージングがバクテリオファージを誘発することによって開始されるとき、誘発され得る）誘導プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、小ターミナーゼ遺伝子又は巨大ターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである。ある実施形態において、天然プロモーターは、バクテリオファージによって制御されていてもよく、従って、パッケージング中に誘発される条件付きプロモーターとして効果的に作用し得る。ある実施形態において、プロモーターとしては、配列番号９の配列が挙げられる。
【００８８】
図２は、ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子を保有するプラスミドの図解を示している。図３は、破壊されたｐａｃＡ遺伝子を有するバクテリオファージＰ１を用いて溶原化されるＥ．コリ細胞で構成されたパッケージングシステムの設計及び機能の例を示している。細胞はまた、ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子を含むプラスミドも保有する。ある実施形態において、プラスミド内のｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子は、腸内細菌科バクテリオファージＰ１由来である。突然変異ウイルスが溶菌サイクルを経るとき、そのパッケージング開始部位及び非複製的形質導入粒子が複製プラスミドＤＮＡを保有しながら産生されるので、バクテリオファージゲノム又は（破壊された場合）相補プラスミドから生じるウイルスパッケージングタンパク質がパッケージングユニット内にプラスミドＤＮＡのレプリコンをパッケージする。
【００８９】
ある実施形態において、レプリコンは、腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶菌レプリコンである。レプリコンはまた、Ｓ．アウレウスｐＴ１８１プラスミド複製開始点由来であるか、エンテロコッカスｒｅｐＢプラスミド複製開始点由来であるか、又はエンテロコッカスｐＤＬ２７８プラスミド複製開始点由来のｐＢＨＲ１レプリコン又はｐＢＨＲ１レプリコンの誘導体であってもよい。別の実施形態において、レプリコンとしては、ｋｉｌＡ遺伝子のＣ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びインフレーム欠失を含む。レプリコンの一例は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、又は配列番号８の配列を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、破壊／相補性は、変異したウイルスＤＮＡと相補的な外来ＤＮＡとの間に相同性がないように設計されることが好ましい。これは、変異したウイルスＤＮＡと相補的外来ＤＮＡとの間の相同性の欠如により、ウイルスゲノム中へのパッキング配列の再導入をもたらし得る、この２つのＤＮＡ分子の間の相同組換えの可能性が回避されるためである。相同性の欠如を達成するための、１つの戦略は、ウイルスゲノムからパッケージング開始部位配列を含有する遺伝子全体（又は複数の遺伝子）を除去して、この遺伝子をウイルスから除去されたＤＮＡ配列のみを好ましくは含有する外来ＤＮＡ分子で補完するというものである。この戦略では、相補的ＤＮＡ分子はウイルスから除去された遺伝子を発現するように設計される。斯かるシステムの別の例は、ｐａｃ型ファージであるバクテリオファージφ８０αを用いて提供される。前記ファージゲノムが宿主細菌細胞内で溶原化され、このファージゲノムには、ｐａｃ型プロファージφ８０αのｐａｃ部位が除去された小ターミナーゼ遺伝子が含まれている。天然ｐａｃ部位を有する相補的小ターミナーゼ遺伝子を含むプラスミドが、細胞に形質転換される。溶原化されたプロファージの溶菌サイクルが誘導されると、バクテリオファージパッケージングシステムは、天然バクテリオファージＤＮＡをパッケージングするのではなく、プラスミドＤＮＡを子孫バクテリオファージ構造成分の中にパッケージングする。このことから、パッケージングシステムによって、プラスミドＤＮＡを有する非複製的形質導入粒子が生産される。
【００９１】
別の実施形態において、バクテリオファージゲノムの領域は、パッケージング開始部位を破壊する挿入によって破壊される。一実施形態において、破壊は、バクテリオファージゲノム中に組み込まれたレポーター遺伝子を含む。一実施形態において、破壊は、バクテリオファージゲノム中に組み込まれた耐性マーカー及びレポーター遺伝子を含む。一実施形態において、破壊は、レポーター遺伝子を用いてバクテリオファージゲノム上の配列を置換するか又は破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。一実施形態において、破壊は、耐性マーカー及びレポーター遺伝子を用いてバクテリオファージゲノム上の配列を置換するか又は破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。いくつかの実施形態において、耐性マーカー及び／又はレポーター遺伝子は、構成的プロモーターの制御下にある。
【００９２】
図４は、ｋａｎ及びｌｕｘＡＢ遺伝子がｐａｃ部位配列中に挿入されることで破壊されたｐａｃＡ遺伝子を有するバクテリオファージＰ１を含むＥ．コリ細胞から構成されたパッケージングシステムの設計及び機能の例を示している。図３のように、細胞はまた、ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子を含むプラスミドを保有する。従って、組み換えがバクテリオファージとプラスミドとの間に起こると、ＮＲＴＰを形成するようにＰ１キャプシド内に挿入された複製プラスミドは、レポーター遺伝子を含んだままである。
【００９３】
ある実施形態において、レポーター遺伝子は、検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする。さらなる実施形態において、前記レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される。ある実施形態において、レポーター遺伝子はｌｕｘＡである。いくつかの実施形態において、耐性マーカーは抗生物質抵抗性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、抵抗性マーカーはカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）である。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターはＰｂｌａｓｔを含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージゲノムの破壊は、パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を置換するか又は破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージゲノムの破壊は、構成的プロモーター（Ｐｂｌａｓｔ）の制御下のカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）及び細菌ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｘＡＢ）を用いたパッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を置換するか又は破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。一実施形態において、対立遺伝子交換は、図１で示されたものと類似した様式で達成され、ここで、レポーター又はレポーター及び耐性マーカーを転移させる。
【００９５】
ある実施形態において、バクテリオファージゲノム上の一対のターミナーゼ遺伝子、例えば、ｐａｃＡとｐａｃＢ、ｔｅｒＡとｔｅｒＢ、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬ）は、ターミナーゼ遺伝子のうちの１つの発現、及び／又はターミナーゼ遺伝子によって媒介される全体的なターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こす様式で破壊される。一実施形態において、ｐａｃＡ遺伝子座中に挿入されたｋａｎ及びｌｕｘＡＢを含む構築物は、配列番号１２に提示されている。一実施形態において、破壊されたバクテリオファージは、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子、例えばｐａｃＡとｐａｃＢ、ｔｅｒＡとｔｅｒＢ、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬを含むプラスミドを用いて補完される。一実施形態において、プラスミドは、破壊されたターミナーゼ遺伝子を有するバクテリオファージを用いて溶原化された細胞内に導入される。一実施形態において、細胞はＥ．コリ細胞である。一実施形態において、バクテリオファージは腸内細菌科バクテリオファージＰ１である。一実施形態において、プラスミド内のターミナーゼ遺伝子は、腸内細菌科バクテリオファージＰ１、すなわち、ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子由来である。突然変異ウイルスが溶菌サイクルを経るとき、そのパッケージング開始部位及び非複製的形質導入粒子が複製プラスミドＤＮＡを保有しながら産生されるので、バクテリオファージゲノム又は（破壊された場合）相補プラスミドから生じるウイルスパッケージングタンパク質がパッケージングユニット内にプラスミドＤＮＡのレプリコンをパッケージする。
【００９６】
これらの欠失／相補システムでは、（１）プラスミドＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子及び（２）Ｐ１ ＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子（後者がプラスミドＤＮＡとＰ１ ＤＮＡとの間の組み換えによって作製され得る）を含めた２種類の形質導入粒子が製造され得る。Ｐ１変異体がＰ１ゲノム内に挿入されたｌｕｘＡＢを含有していないある実施形態において、Ｐ１ ＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子は、これらの形質導入粒子が標的細胞内にＤＮＡを送達するとき、シグナル産生に寄与しない。しかし、Ｐ１変異体がＰ１ゲノム内に挿入されたｌｕｘＡＢを含有するある実施形態において、Ｐ１ ＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子は、これらの形質導入粒子が標的細胞内にＤＮＡを送達するとき、シグナル産生に寄与する。
【００９７】
このように、ｌｕｘＡＢ遺伝子がＰ１ゲノム内に挿入されるある実施形態は、改良された非複製的形質導入粒子レポーターシステムをもたらす。
【００９８】
ＩＶ．レポーター
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明のＮＲＴＰ及び構築物は、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、本発明のバクテリオファージはレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子はレポーター分子をコードし得、レポーター分子は検出可能マーカー又は選択マーカーであり得る。ある実施形態において、レポーター遺伝子は、細胞内で発現された際に検出可能なシグナルを生み出すレポーター分子をコードする。
【０１００】
ある実施形態において、レポーター分子は、蛍光レポーター分子、例えば、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙ、並びに近赤外蛍光タンパク質であり得る。
【０１０１】
他の実施形態において、レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ等）であり得る。レポーター分子には、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、比色検出に適した酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、免疫検出に適したタンパク質（例えば、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ））、アプタマーとして機能する、又は酵素活性を示す核酸（リボザイム）、又は選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ））が含まれ得る。当該技術分野において公知の他のレポーター分子をシグナル発生に用いることで、標的核酸又は標的細胞を検出することができる。
【０１０２】
他の態様では、レポーター分子は核酸分子を含む。いくつかの態様では、レポーター分子は、特異的な結合活性を有する、又は酵素活性を示すアプタマーである（例えば、アプタザイム（aptazyme）、ＤＮＡザイム、リボザイム）。
【０１０３】
レポーター及びレポーターアッセイは本明細書のセクションＶにさらに記述される。
ＮＲＴＰ及びレポーターアッセイ
誘導因子レポーターアッセイ
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本発明は、生細胞内の遺伝子プロモーターを標的とする外来性又は天然の誘導因子と共に使用するための、レポーター分子としてのＮＲＴＰの使用法を含む。本発明のＮＲＴＰは、セクションＩＩＩ及び下記の実施例１〜２に記載される方法を用いて操作することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、前記方法はＮＲＴＰをレポーターとして使用することを含み、前記ＮＲＴＰは、標的細胞内の標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子を含むＮＲＴＰが標的細胞内に導入されると、レポーター遺伝子の発現が、レポーター核酸分子内の標的遺伝子プロモーターの誘導を介して可能となる。
【０１０６】
図５は、２つの遺伝子、誘導因子（５０２）をコードする遺伝子及び標的遺伝子（５０３）を有する標的細胞のゲノム遺伝子座（５００）を示している。標的細胞の標的遺伝子のプロモーター（５０６）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（５０５）を誘導するレポーター核酸分子（５０４）も示されている。レポーター核酸分子（５０４）は、ＮＲＴＰを介して細胞内に導入され得る。天然細胞において、誘導因子遺伝子（５０２）が発現され誘導因子タンパク質（５０７）が産生されると、誘導因子タンパク質（５０７）は標的遺伝子に作動可能に連結された標的遺伝子プロモーター（５０６）を誘導することが可能であるため、標的遺伝子の発現及び標的遺伝子産物（５０８）の産生を引き起こす。
【０１０７】
レポーター核酸分子（５０４）が標的生物内に存在すると、誘導因子（５０７）はレポーター核酸分子（５０４）内に存在する標的遺伝子プロモーター（５０６）を誘導するも可能であるため、レポーター遺伝子（５０５）の発現を引き起こし、それにより、検出可能なシグナルを生み出すことが可能なレポーター分子（５０９）の産生がもたらされる。
【０１０８】
そのため、レポーター分子（５０９）からの検出可能なシグナルの生成は、標的細胞内の誘導因子タンパク質（５０７）の存在に基づいて、細胞の存在を示すものとなる。
ＶａｎＲレポーターシステム
【０１０９】
一実施形態において、レポーターシステムはレポーター核酸分子を含むＮＲＴＰ（例えば、プラスミド）を含む。レポーター核酸分子は、エンテロコッカス・フェシウム（又はＥ．フェカリス）内のバンコマイシン耐性（ｖａｎＡ）遺伝子のプロモーターの誘導因子であるＶａｎＲを検出するように構築され得る。レポータープラスミドは、ｖａｎＡ遺伝子プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を有する。
【０１１０】
図６はＶａｎＲレポーターシステムの設計及び機能を要約したものである。図６は、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）に存在し得るトランスポゾンＴｎ１５４６（６０１）の一領域を示している。Ｔｎ１５４６トランスポゾンは、ｖａｎＲ誘導因子遺伝子（６０２）及びｖａｎＡ標的遺伝子（６０３）を含み得る。ＮＲＴＰ内にパッケージングされ細胞内に導入され得るレポーター核酸分子（６０４）も図に示されている。レポーター核酸分子（６０４）は、ｖａｎＡ遺伝子を含むｖａｎＨＡＸオペロンの発現を制御するプロモーターＰH（６０６）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（６０５）を含む。天然細胞において、ｖａｎＲ遺伝子（６０２）が発現されＶａｎＲタンパク質（６０７）が産生されると、ＶａｎＲは、Ｔｎ１５４６トランスポゾン内のＰH（６０６）を誘導することが可能であるため、ｖａｎＡ遺伝子の発現を引き起こし、それによりＶａｎＡタンパク質（６０８）を産生する。レポーター核酸分子（６０３）（ベクター）が標的生物内に存在すると、ＶａｎＲは、レポーター核酸分子（６０３）内のＰH（６０６）を誘導することも可能であるため、レポーター分子（６０９）の発現を引き起こす。そのため、レポーター分子の産生は標的細胞内のＶａｎＲの存在を示すものとなる。
【０１１１】
ＶＲＥアッセイの開発に適したプロモーターの例としては、ｖａｎＡ遺伝子プロモーター及びｖａｎＢ遺伝子プロモーターが挙げられる。Arthur, M., et al., The VanS sensor negatively controls VanR-mediated transcriptional activation of glycopeptide resistance genes of Tn1546 and related elements in the absence of induction. J. Bacteriol., 1997. 179(1): p. 97-106。
ＴｃｄＤレポーターシステム
【０１１２】
このシステムの別の実施形態において、ＮＲＴＰを用いてレポーター核酸分子が細胞に導入される。レポーター核酸分子は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の毒素Ａ遺伝子及び毒素Ｂ遺伝子（それぞれ、ｔｃｄＡ及びｔｃｄＢ）のプロモーターの誘導因子であるＴｃｄＤを検出することを目的に構築され得る。レポーター核酸分子は、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。
【０１１３】
図７は、本発明の一実施形態に係る、ＴｃｄＤレポーターシステムの設計及び機能を要約したものである。図７は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）内に存在し得るトランスポゾンＰａＬｏｃ（７０１）の一領域を示している。ＰａＬｏｃトランスポゾンは、ｔｃｄＤ遺伝子（７０２）及びｔｃｄＡ標的遺伝子（７０３）を含有し得る。ＮＲＴＰを用いて細胞内に導入されるレポーター核酸分子（７０４）（例えば、ベクター）も図に示されている。レポーター核酸分子（７０４）は、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーター（ＰtcdA）（７０６）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（７０５）を含む。
【０１１４】
天然細胞において、ｔｃｄＤ遺伝子が発現されＴｃｄＤタンパク質（７０７）が産生されると、ＴｃｄＤは、ＰａＬｏｃトランスポゾン（７０１）内のＰtcdA（７０６）を誘導することが可能であるため、ｔｃｄＡ遺伝子（７０３）の発現を引き起こし、それにより毒素Ａタンパク質（７０８）を産生する。
【０１１５】
レポーター核酸分子（７０４）が標的生物内に存在すると、ＴｃｄＤは、レポーターベクター内のＰtcdA（７０６）を誘導することも可能であるため、レポーター分子（７０９）の発現を引き起こす。そのため、レポーター分子（７０９）の産生は標的細胞内のＴｃｄＤの存在を示すものとなる。
【０１１６】
クロストリジウム・ディフィシルアッセイの開発に適したプロモーターの例としては、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーター及びｔｃｄＢ遺伝子プロモーターが挙げられる。Karlsson, S., et al., Expression of Clostridium difficile Toxins A and B and Their Sigma Factor TcdD Is Controlled by Temperature. Infect. Immun., 2003. 71(4): p. 1784-1793。
【０１１７】
標的細胞及び誘導因子：標的細胞には、真核生物標的及び原核細胞標的並びに関連誘導因子が含まれ得る。
【０１１８】
ベクター送達系：組み換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、非生物学的システム又は生物学的システムによって実行され得る。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルス由来の形質導入粒子、及び接合を含むが、これらに限定はされない。
バクテリオファージに基づくＳａｒＳレポーターシステム
【０１１９】
本発明の別の実施形態において、レポーター核酸分子は、Ｓ．アウレウスにおけるプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）のプロモーターの誘導因子であるＳａｒＳを検出することを目的に構築される。レポーター核酸分子は、ＮＲＴＰ内で細胞に導入することができ、ｓｐａ遺伝子プロモーター（Ｐspa）に作動可能に連結された細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢを含む。レポーター核酸分子は、例えば、ＮＲＴＰを介してＳ．アウレウスに送達される。ＳａｒＳが細胞内に存在する場合、ＳａｒＳはｌｕｘＡＢ遺伝子の発現を誘導するため、発光シグナルを生み出すことが可能なルシフェラーゼ酵素が産生される。
【０１２０】
図８は、本発明の一実施形態に係る、ＳａｒＳレポーターシステム設計及び機能を要約したものである。図８は、ｓａｒＳ遺伝子（８０２）及びｓｐａ遺伝子（８０３）を含有するＳ．アウレウスゲノム（８０１）の一領域を示している。ＮＲＴＰによって細胞に送達され、ｓｐａ遺伝子（８０３）の発現を制御するプロモーターＰspa（８０６）に作動可能に連結されたｌｕｘＡＢレポーター遺伝子（８０５）を含む、レポーター核酸分子（例えば、ベクター）（８０４）も、図に示されている。
【０１２１】
天然細胞において、ｓａｒＳ遺伝子（８０２）が発現されＳａｒＳタンパク質（８０７）が産生されると、前記タンパク質は、Ｓ．アウレウスゲノムトランスポゾン内のＰspa（８０６）を誘導することが可能であるため、ｓｐａ遺伝子（８０３）の発現を引き起こし、プロテインＡ（８０８）を産生する。
【０１２２】
レポーター核酸分子（８０４）が標的生物内に存在すると、ＳａｒＳ（８０７）は、レポーター核酸分子（８０４）内のＰspa（８０６）を誘導することも可能であるため、ｌｕｘＡＢの発現を引き起こし、それにより、発光シグナルを生み出し得るルシフェラーゼ酵素（８０９）の産生をもたらす。そのため、ルシフェラーゼの産生は標的細胞内のＳａｒＳの存在を示すものとなる。
【０１２３】
本明細書中に記載したＮＲＴＰｓと共に使用するための他のレポーターシステムは、国際ＰＣＴ公開番号：ＷＯ２０１４／１６０４１８に記載されており、該公開の全体を参照により本明細書に援用する。
レポーター配列のシス抑制及び標的転写物の結合による立体構造変化の機構
【０１２４】
本発明で使用される一般機構は、２つの機構：（１）核酸分子の二次構造における立体構造変化、及び（２）切断事象をもたらし得る、分子間の核酸分子相互作用である。立体構造変化がレポーター転写物への標的転写物の結合によって誘導されるような、シス抑制された高次構造及び抑制解除された高次構造の間の立体構造変化を起こすことが可能な、レポーター転写物を設計するための方法が本明細書に記載される。
【０１２５】
上記のように、レポーター転写物は、レポーター配列を含み、レポーター遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）のシス抑制によってレポーター遺伝子配列の翻訳が阻止されるように設計され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、以下の手段が本発明のレポーター転写物を設計するために使用され得る。
【０１２７】
１）ＲＮＡ二次構造は、ニューヨーク州立大学オルバニー校のＴｈｅ ＲＮＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｒｔｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって維持されるサーバーで利用可能なＭｆｏｌｄ（Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)）（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）などの、二次構造プログラムを用いて計算される。
【０１２８】
２）分子間ＲＮＡ相互作用は、奈良先端科学技術大学院大学（ＮＡＩＳＴ）大学院情報科学研究科、慶応義塾大学生命情報学科、日本（http://rna.naist.jp/ractip/）によって維持されるサーバーで利用可能な、整数計画法（Integer Programming）を用いたＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用予測（ＲａｃｔＩＰ）等の、ソフトウェアプログラムを用いて計算される。
【０１２９】
３）ＲＮＡ二次構造は、ＲＮＡの二次構造の描画専用のＪａｖａ（登録商標）軽量アプレットである、ＲＮＡの可視化アプレット（Visualization Applet for RNA）（ＶＡＲＮＡ）（http://varna.lri.fr/）を用いて可視化される。
【０１３０】
標的転写物の二次構造は、Ｍｆｏｌｄによって算出される最も低いエネルギー配置に基づいて作製され、ＶＡＲＮＡによって可視化され得る。
【０１３１】
レポーター転写物への結合に理想的であり得る標的転写物内のｓｓＲＮＡ領域又は標的領域が同定され得る。いくつかの例では、標的転写物の二次構造は、レポーター配列の一部に結合し得るコンセンサス配列又はループ配列を含む。例えば、メチシリン耐性Ｓ．アウレウスのｍｅｃＡ転写物には、レポーター転写物のｃｉｓ−抑制配列への結合に使用され得るコンセンサスＹＵＮＲ配列（「ＵＵＧＧ」）を含む末端ループが存在する。標的転写物の二次構造の解析によって、ｃｉｓ−抑制配列への結合に適したものであり得る、これらの一つ又は複数のｓｓＲＮＡ領域が明らかとなり得る。この後、レポーター転写物のｃｉｓ−抑制配列が、これらの一つ又は複数のｓｓＲＮＡ領域へ結合するように設計され得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ｃｉｓ−抑制配列は、レポーター転写物内のレポーター配列のＲＢＳに結合し、レポーター転写物内でステムループ構造を形成することで、ｃｉｓ−抑制配列がレポーター配列のＲＢＳへのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止するように、設計され得る。ｃｉｓ−抑制配列が標的転写物のｓｓＲＮＡ領域に結合した後、レポーター配列のＲＢＳが露出され、レポーター配列の翻訳が開始され得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、レポーター転写物のｃｉｓ−抑制配列は、レポーター配列の５’末端に配置されるように設計され、レポーター配列内にステムループ構造を生むことで、レポーター配列のＲＢＳ配列が阻止されるように設計され得る。シス抑制するステムループ構造は、Ｍｆｏｌｄによって算出されるレポーター転写物の最も低いエネルギー配置に基づいて、ＲＢＳ配列をブロックするように設計され、ＶＡＲＮＡによって可視化され得る。標的転写物及びレポーター転写物のｃｉｓ−抑制配列の間の分子間相互作用の予測は、ＲａｃｔＩＰによって算出され、ＶＡＲＮＡによって可視化され得る。図９に示すように、標的転写物及びレポーター転写物のｃｉｓ−抑制配列の間の塩基対形成を可視化するための図が描画され得る。
【０１３４】
前記相互作用は、標的配列及びｃｉｓ−抑制配列において、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０以上のヌクレオチド間の塩基対形成を含み得る。２つの配列間の相補的結合は、完全に相補的、実質的に相補的、又は部分的に相補的であり得る。塩基対形成は、例えば、図９に示されるように、標的配列及びｃｉｓ−抑制配列内の連続したヌクレオチド配列又は領域に渡るものであり得る。
転写産物
【０１３５】
上記のように、転写物は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写されたある長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されたｃＤＮＡ配列又は鋳型ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、操作された核酸構築物から転写され得る。転写物は、それ自体の内部に相補性を有する領域を有することで、分子内二本鎖を形成し得る２つの領域を含み得る。一方の領域は、レポーター配列に結合しレポーター配列の翻訳を阻止する「ｃｉｓ−抑制配列」と称され得る。転写物の第二の領域は、検出可能マーカー又は選択マーカー等のレポーター分子をコードする「レポーター配列」と称される。
【０１３６】
本発明の転写物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長であり得る転写物配列であり得る。他の実施形態において、転写物は、少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００又はより多いヌクレオチド長であり得る。ｃｉｓ−抑制配列及びレポーター配列は同じ長さであっても異なる長さであってもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ｃｉｓ−抑制配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はより多いスペーサーヌクレオチドによってレポーター配列から隔てられる。
ベクター
【０１３８】
別の態様では、本発明の転写物（例えば、アンチセンス配列及びセンス配列）は、ＤＮＡベクター又はＲＮＡベクター内に挿入された転写単位から発現される（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al.、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１３、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１４、及びＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。これらの配列は、直鎖構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクター（例えば、バクテリオファージに基づくベクター）として導入され得、宿主ゲノム内に組み入れられ、宿主ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子として遺伝し得る。また転写物は、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能にするように構築され得る（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
【０１３９】
転写物配列は、発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｃｉｓ−抑制配列及びレポーター配列がリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復として発現されることで、転写物がステム構造及びループ構造を有する。
【０１４０】
組み換え発現ベクターが、本発明の転写物を発現するために使用され得る。組み換え発現ベクターは、一般的にはＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。転写物を発現するウイルスベクターは、限定はされないが、アデノ随伴ウイルス（総説として、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616)、Rosenfeld et al.(1991, Science 252:431-434)、及びRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155を参照）；又はアルファウイルス属、並びに当該技術分野において公知の他のウイルスに基づいて構築され得る。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多くの様々な細胞型（例えば、上皮細胞）にインビトロ及び／又はインビボで導入するために使用されている（例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第４，８６８，１１６号；同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０７１３６号；同第８９／０２４６８号；同第８９／０５３４５号；及び同第９２／０７５７３号を参照）。細胞のゲノム内に挿入された遺伝子を形質導入及び発現することが可能な組み換えレトロウイルスベクターは、組み換えレトロウイルスゲノムをＰＡ３１７及びＰｓｉ−ＣＲＩＰ等の適切なパッケージング細胞株に形質移入することによって作製され得る（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。組み換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）内の種々様々な細胞及び組織に感染させるために使用することができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、感染のために有糸分裂活性を有する細胞を必要としないという利点も有する。
【０１４１】
発現される転写物のためにコード配列を受け入れることが可能なあらゆるウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス、及び同種ものに由来するベクターが使用可能である。ウイルスベクターの向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質又は他の表面抗原でベクターを偽型することによって、又は必要に応じて、異なるウイルスキャプシドタンパク質を置換することによって、改変することができる。
【０１４２】
例えば、本発明で注目されるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ、及び同種のものに由来する表面タンパク質で偽型され得る。本発明で注目されるＡＡＶベクターは、様々なキャプシドタンパク質血清型を発現するように前記ベクターを操作することによって、様々な細胞を標的とするように作製することができる。様々なキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当該技術分野における技術の範囲内であり；例えば、Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801（この開示の全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１４３】
本発明での使用に適した組み換えウイルスベクターの選択、ベクター内に転写物を発現させるために核酸配列を挿入するための方法、及びウイルスベクターを目的細胞に送達する方法は、当該技術分野における技術の範囲内である。例えば、Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; and Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406（これらの開示の全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１４４】
ウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶに由来し得る。本発明において注目される転写物を発現するのに適したＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞内に送達するための方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載されている。本発明において注目される転写物を発現するのに適したＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞内に送達するための方法は、Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J.Virol, 70: 520-532; Samulski R et al.(1989), J.Virol. 63: 3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；同第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；及び同第ＷＯ９３／２４６４１号（これらの開示の全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
【０１４５】
本発明において注目されるＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター内の転写物発現を駆動するプロモーターは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、もしくは一般的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、又は、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要とされるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするという条件で、原核生物のプロモーター、例えばＴ７プロモーターであり得る。プロモーターはまた、導入遺伝子発現を膵臓に配向付け得る（例えば、the insulin regulatory sequence for pancreas(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515）を参照）。
【０１４６】
さらに、転写物の発現は、例えば、ある特定の生理的制御因子（例えば、循環グルコースレベル、又はホルモン）に感受性である制御配列等の、誘導可能な調節配列及び発現系を用いることによって、正確に制御され得る（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞又は哺乳動物における導入遺伝子発現の調節に適した、このような誘導可能な発現系は、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、及びイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による制御を含む。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の用途に応じて、適切な制御／プロモーター配列を選択することができる。
【０１４７】
一般的に、転写物分子を発現することが可能な組み換えベクターは下記のように送達され、標的細胞内に保持される。あるいは、転写物分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与することができる。発現された後、転写物は標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの機能又は発現を調節する。転写物発現ベクターの送達は、全身的、例えば、静脈内投与もしくは筋内投与、患者から外植された標的細胞への投与及びそれに続く患者への再導入、又は所望の標的細胞内への導入を可能にする他のあらゆる手段であり得る。
【０１４８】
転写物発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、陽イオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン）又は非陽イオン性脂質系担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞に形質移入される。１週間以上の期間に亘る単一のＰＲＯＣ遺伝子又は複数のＰＲＯＣ遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための多重脂質トランスフェクション（multiple lipid transfection）も、本発明に基づいて企図されている。宿主細胞内へのベクターの導入の成否は、種々の既知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性導入は、蛍光マーカー（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））等のレポーターによって示され得る。エキソビボにおける細胞の安定なトランスフェクションは、形質移入された細胞にハイグロマイシンＢ耐性等の特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬剤）に対する耐性を与えるマーカーを用いることで確実することができる。
【０１４９】
組み換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、非生物学的システム又は生物学的システムによって実行され得る。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルス由来の形質導入粒子、及び接合を含むが、これらに限定はされない。
転写物測定法のためのレポーター
【０１５０】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、レポーター配列（例えば、レポーター遺伝子配列）を含む。レポーター遺伝子は、細胞内で発現された際にシグナルを生み出すレポーター分子をコードしている。いくつかの実施形態において、レポーター分子は検出可能マーカー又は選択マーカーであり得る。ある実施形態において、レポーター分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等の蛍光レポーター分子であり得る。他の実施形態において、レポーター分子は化学発光タンパク質であり得る。
【０１５１】
レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、比色検出に適した酵素、免疫検出に適したタンパク質、免疫検出に適したペプチド、又はアプタマーとして機能するもしくは酵素活性を示す核酸であり得る。
【０１５２】
選択マーカーはレポーターとしても使用され得る。選択マーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る。
【実施例】
【０１５３】
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は説明のみを目的として提供され、本発明の範囲をなんら限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する正確さを確実にする努力は為されているが、いくらかの実験誤差及び偏差は当然許容されるべきである。
【０１５４】
本発明の実施は、特に記載がない限り、当業者の技能の範囲内の、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の常法を使用する。このような技術は文献中で充分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。
実施例１：対立遺伝子交換に基づく破壊／相補性パッケージングシステム
【０１５５】
以下は、非複製的形質導入粒子を作製するための対立遺伝子交換に基づく破壊／相補性に基づくパッケージングシステムの設計及び構築の一例である。
【０１５６】
パッケージングシステムを開発するために使用された材料が以下に記載される。
【０１５７】
菌種：
・Ｎ１７０６、Ｅ．コリ Ｋ−１２ Ｐ１ ｃ１−１００ Ｔｎ９溶原菌
【０１５８】
ベクター：
・Ｙ１４４３９（ｐＢＨＲ１骨格）
【０１５９】
以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Ｎ．Ｂ．、受入番号で言及される配列は、本願の優先日としてデータベースに収載されるものである）又は配列番号は、ベクター骨格及びカセット配列に使用され得る：
・Ｘ０６７５８（細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡＢ）
・配列番号１（天然ｐａｃＡ遺伝子プロモーターを含む天然Ｐ１ ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子）
・配列番号２（Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコン）
・配列番号１１（ｌｕｘＡＢ発現を駆動するＰｂｌａｓｔプロモーター）
【０１６０】
ＮＩ７０６（ｐａｃＡ：：Ｋａｎ）ｐａｃＡ変異株、別名菌株１５０５の構築：ｐａｃＡ変異型配列の代表的な配列が配列番号１０に示されている。突然変異は、置換されることが望ましいｐａｃＡ遺伝子配列にそれら自体が隣接するｐａｃＡ遺伝子配列が隣接したカナマイシン耐性遺伝子から成る対立遺伝子交換基質を構築することによって達成される。対立遺伝子交換基質は、遺伝子合成と、その後のＮＩ７０６内の天然配列の置換、そして、対立遺伝子交換によるＫａｎ遺伝子の挿入によって作製できる。破壊がＤＮＡをパッケージする変異Ｐ１ファージの能力も破壊したことが測定された。変異ファージの誘導は、変異ファージに対して天然ファージを誘導することによって生じる細胞溶解物のプラークアッセイによりＰ１ファージ力価を比較することによって測定される、子孫ファージの排除をもたらした。さらに、ｐａｃＡ遺伝子を発現する相補プラスミドが、Ｐ１変異体溶原内に導入され、そして変異ファージが形質転換体から誘導されたとき、形質導入粒子は溶解物中から回収されず、ファージが、ｐａｃＡ遺伝子及びｐａｃ部位を補完したにもかかわらず、相補プラスミドをパッケージできなかったことが示唆された。
【０１６１】
相補プラスミドの構築：
相補プラスミドは、広範なグラム陰性活性を示すｐＢＨＲ１複製開始点、スペクチノマイシンに対する選択マーカー、天然ｐａｃＡ遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結された天然バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子、構成的ブラスティシリン（blasticillin）プロモーター（Ｐｂｌａｓｔ）に作動可能に連結されたアリイビブリオ・フィシェリ（Aliivibrio fischeri）由来のｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子、並びにＣ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコンを含有する。
【０１６２】
プラスミドは、天然源からのＰＣＲを介して、又は遺伝子合成及び従来の制限酵素に基づくクローニングもしくはギブソン構築（Gibson assembly）等の別の技術を介したベクター構築を介して、カセットを得ることを含む、当業者に公知の種々の方法で構築することができる。
【０１６３】
相補性に基づくパッケージングシステム：前記パッケージングシステムは、相補プラスミドで補完されたｐａｃＡ変異株１５０５を含む。当業者に公知である通り、このシステムを構築する方法は、相補プラスミドで１５０５を形質転換することによって達成され得る。相補プラスミドは、１０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンの存在下で形質転換体を増殖させることによって、形質転換１５０５の培養物内に維持され得る。
【０１６４】
プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子の作製：相補プラスミドを保有する非複製的形質導入粒子は、４２℃での熱誘導を介して１５０５形質転換体から作製され得る。４２℃でのインキュベーションはＰ１溶菌サイクルの誘導をもたらし、Ｐ１溶菌サイクルでは、プロファージが、ファージ構造要素を産生し、溶解性レプリコンによって形成された相補プラスミドコンカテマーＤＮＡを子孫ファージ粒子内にパッケージングする。ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子の両方がバクテリオファージゲノム中で破壊されたとき、形質導入粒子の産生をもたらさなかった、ｐａｃＡ遺伝子を発現しただけの相補プラスミドを使用した補完と異なって、ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子の両方を発現する相補プラスミドは、相補プラスミドの直鎖コンカテマーを保有するバクテリオファージＰ１粒子からそれぞれ成る、非複製的形質導入粒子を含有する細胞溶解物をもたらし、このことから、この相補プラスミドがパッケージングの破壊を首尾よく補完することを実証した。
実施例２：改良された対立遺伝子交換に基づく破壊／相補性パッケージングシステム
【０１６５】
ターミナーゼ遺伝子ｐａｃＡ及びｐａｃＢを含む腸内細菌科バクテリオファージＰ１を利用した実施例では、ｐａｃＡは、ｐａｃＢ発現も、及び／又はｐａｃＡ及びｐａｃＢによって媒介される全体的なターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こす様式で破壊される。ｋａｎ及びｌｕｘＡＢがｐａｃＡ遺伝子座中に挿入された最終的な構築物が、配列番号１２に含まれている。
【０１６６】
次に、ｐａｃＡＢを破壊したバクテリオファージゲノムを、図２に示したプラスミドを用いて補完した。図４は、破壊されたｐａｃＡ遺伝子を有するバクテリオファージＰ１で溶原化されたＥ．コリ細胞で構築されたパッケージングシステムの設計及び機能を示している。細胞はまた、ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子を含むプラスミドも含んでいた。この実施例では、プラスミド内のｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子を、腸内細菌科バクテリオファージＰ１から得た。突然変異ウイルスが溶菌サイクルにあるとき、そのパッケージング開始部位及び非複製的形質導入粒子が複製プラスミドＤＮＡを保有して産生されたので、ウイルスパッケージングタンパク質は相補プラスミドから産生され、そしてそれが、パッケージングユニット内にプラスミドＤＮＡのレプリコンをパッケージした。
【０１６７】
これらの欠失／相補システムでは、（１）プラスミドＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子及び（２）Ｐ１ ＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子（後者がプラスミドＤＮＡとＰ１ ＤＮＡとの間の組み換えによって作製され得る）を含めた２種類の形質導入粒子が作製された。Ｐ１変異体がｐａｃＡ遺伝子中に挿入されたｌｕｘＡＢを含有していなかったとき、Ｐ１ ＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子は、これらの形質導入粒子が標的細胞内にＤＮＡを送達するとき、シグナル産生に寄与しなかった。しかし、Ｐ１変異体がｐａｃＡ遺伝子中に挿入されたｌｕｘＡＢを含有したとき、Ｐ１ ＤＮＡを保有する非複製的形質導入粒子は、これらの形質導入粒子が標的細胞内にＤＮＡを送達するとき、シグナル産生に寄与した（図１０を参照のこと）。
【０１６８】
従って、我々がＰ１ゲノム内にｌｕｘＡＢ遺伝子を挿入し、そして、本明細書中に記載したＮＲＴＰ作出システムを該システムと組み合わせたときに、我々は、改良された非複製的形質導入粒子レポーターシステムを提供した。
【０１６９】
以下は、この実施例に記載の非複製的形質導入粒子を作製するための対立遺伝子交換に基づく破壊／相補性に基づくパッケージングシステムの設計及び構築の詳細を提供する。
【０１７０】
パッケージングシステムを開発するために使用された材料が以下に記載される。
【０１７１】
菌種：
・Ｎ１７０６、Ｅ．コリ Ｋ−１２ Ｐ１ ｃ１−１００ Ｔｎ９溶原菌
【０１７２】
ベクター：
・Ｙ１４４３９（ｐＢＨＲ１骨格）
【０１７３】
以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Ｎ．Ｂ．、受入番号で言及される配列は、本願の優先日としてデータベースに収載されるものである）又は配列番号は、ベクター骨格及びカセット配列に使用され得る：
・Ｘ０６７５８（細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡＢ）
・配列番号１（天然ｐａｃＡ遺伝子プロモーターを含む天然Ｐ１ ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子）
・配列番号２（Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコン）
・配列番号１１（ｌｕｘＡＢ発現を駆動するＰｂｌａｓｔプロモーター）
【０１７４】
ＮＩ７０６（ｐａｃＡ：：ＫａｎｌｕｘＡＢ）ｐａｃＡ変異株、別名菌株１５２５の構築を次のように実施した：
【０１７５】
変異ｐａｃＡ配列の代表的な配列が配列番号１２に示されている。配列番号１２に提示したｐａｃＡ変異型配列を、Ｐｂｌａｓｔプロモーターの制御下でカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）及びｌｕｘＡＢ遺伝子から成る対立遺伝子交換基質を構築し、そして、ｐａｃＡ遺伝子配列にそれら自体が隣接するｐａｃＡ遺伝子配列を隣接させることによって作製した。対立遺伝子交換基質を遺伝子合成によって作製した。次に、ＮＩ７０６内の天然ｐａｃＡ配列を、対立遺伝子交換によるＫａｎ遺伝子及びｌｕｘＡＢ遺伝子の挿入によって置換した。破壊がＤＮＡをパッケージする変異Ｐ１ファージの能力も破壊したことが測定された。変異ファージの誘導は、変異ファージに対して天然ファージを誘導することによって生じる細胞溶解物のプラークアッセイによりＰ１ファージ力価を比較することによって測定される、子孫ファージの排除をもたらした。
【０１７６】
相補プラスミドの構築：
相補プラスミドは、広範なグラム陰性活性を示すｐＢＨＲ１複製開始点、スペクチノマイシンに対する選択マーカー、天然ｐａｃＡ遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結された天然バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子、構成的ブラスティシリンプロモーター（Ｐｂｌａｓｔ）に作動可能に連結されたアリイビブリオ・フィシェリ由来のｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子、並びにＣ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコンを含有する。
【０１７７】
プラスミドは、天然源からのＰＣＲを介して、又は遺伝子合成及び従来の制限酵素に基づくクローニングもしくはギブソン構築などの別の技術を介したベクター構築を介して、カセットを得ることを含む、当業者に公知の種々の方法で構築することができる。
【０１７８】
相補性に基づくパッケージングシステム：前記パッケージングシステムは、相補プラスミドで補完されたｐａｃＡ変異株１５２５を含む。当業者に公知である通り、このシステムを構築する方法は、相補プラスミドで１５２５を形質転換することによって達成され得る。相補プラスミドは、１０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンの存在下で形質転換体を増殖させることによって、形質転換１５２５の培養物内に維持され得る。
【０１７９】
プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子の作製：相補プラスミドを保有する非複製的形質導入粒子は、４２℃での熱誘導を介して１５２５形質転換体から作製され得る。４２℃でのインキュベーションはＰ１溶菌サイクルの誘導をもたらし、Ｐ１溶菌サイクルでは、プロファージが、ファージ構造要素を産生し、溶解性レプリコンによって形成された相補プラスミドコンカテマーＤＮＡを子孫ファージ粒子内にパッケージングする。ｐａｃＡ及びｐａｃＢ遺伝子の両方を発現する相補プラスミドは、相補プラスミドの直鎖コンカテマーを保有するバクテリオファージＰ１粒子からそれぞれ成る、非複製的形質導入粒子を含有する細胞溶解物をもたらし、このことから、この相補プラスミドがパッケージングの破壊を首尾よく補完することを実証した。
【０１８０】
プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子に加えて、システムはＰ１ ＤＮＡを保有する形質導入粒子を生じた。Ｐ１ ＤＮＡを保有する形質導入粒子は、プラスミドＤＮＡとＰ１ ＤＮＡの間の組み換えによって生じる。Ｐ１ ＤＮＡを保有する形質導入粒子の存在を、このシステムからの溶解物に標的細胞を晒し、そしてカナマイシンを組み込んだ選択培地において繁殖する形質導入細胞の存在をスクリーニングすることによって評価し、その一方で、プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子を、スペクチノマイシン耐性に基づく同様の様式によって評価した。図１０は、形質導入細胞のコロニーからの発光量（ＲＬＵ）を計測することで得られたデータの表を示している。スペクチノマイシン（ＳｐｅｅＲ）に耐性であった細胞は、プラスミドＤＮＡによって形質導入されたのに対して、カナマイシン（ＫａｎＲ）に耐性であった細胞は、Ｐ１ ＤＮＡによって形質導入された。１５０５からのデータは、Ｐ１ゲノム内に挿入されたｌｕｘＡＢを有していないパッケージング株から得られたのに対し、１５２５からのデータは、Ｐ１ゲノム内に挿入されたｌｕｘＡＢを有するパッケージング株から得られた。データから見られるように、すべてのＳｐｅｅＲ形質導入体が発光するのに対して、ＫａｎＲ形質導入体のすべてが１５２５から形質導入されたものについてのみ発光した。
【０１８１】
このように、１５２５は、プラスミドＤＮＡ及びウイルスＤＮＡの両方を保有する形質導入粒子が発光可能である、改良された非複製的形質導入粒子に基づくレポーターシステムの典型である。
引用された参考文献
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23.  Samie Jaffrey, J.P., Coupled recognition/detection system for in vivo and in vitro use, 2010, Cornell University.
24.  Good, L., Translation repression by antisense sequences. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003. 60(5): p. 854-861.
25.  Sabine, B., Antisense-RNA regulation and RNA interference. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression, 2002. 1575(1-3): p. 15-25.
【配列表フリーテキスト】
【０１８２】
＞配列番号１  ｐａｃＡ及びｐａｃＢ（太字：プロモーター、下線：ｐａｃＡ、書式なし：ｐａｃＢ）
【化１】
2020198885.tif 000004
＞配列番号２  Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコン
【化２】
2020198885.tif 000005
＞配列番号３  ｐＢＨＲ１ ｒｅｐ（太字：ＯＲＦ）
【化３】
2020198885.tif 000006
＞配列番号４  φ８０α ｔｅｒＳ及びｔｅｒＬ遺伝子（太字：ｔｅｒＳ ＯＲＦ、下線：ｔｅｒＬ ＯＲＦ）
【化４】
2020198885.tif 000007
＞配列番号５ ｐＴ１８１
【化５−１】
2020198885.tif 000008
【化５−２】
2020198885.tif 000009
＞配列番号６  Ｅｆｌ１ ｔｅｒＡ及びｔｅｒＢ（太字：ｔｅｒＡ ＯＲＦ、下線：ｔｅｒＢ ＯＲＦ）
【化６】
2020198885.tif 000010
＞配列番号７  ｒｅｐＢ
【化７】
2020198885.tif 000011
＞配列番号８  ｐＤＬ２７８
【化８】
2020198885.tif 000012
＞配列番号９  ｎｉｓｉｎプロモーター
【化９】
2020198885.tif 000013
＞配列番号１０  ｋａｎＲ（書式なし：ｐａｃＡ遺伝子配列、下線：対立遺伝子交換基質内に含まれたｐａｃＡ遺伝子配列、太字：ｋａｎ遺伝子プロモーター、イタリック体：ｋａｎ遺伝子）を用いたｐａｃ部位及びｐａｃＡ遺伝子の破壊
【化１０】
2020198885.tif 000014
＞配列番号１１  Ｐｂｌａｓｔプロモーター
【化１１】
2020198885.tif 000015
＞配列番号１２  ｋａｎ遺伝子及びｌｕｘＡＢ遺伝子を挿入したＰ１ ｐａｃＡ遺伝子座（小文字は天然配列である、大文字は挿入配列である）
【化１２−１】
2020198885.tif 000016
【化１２−２】
2020198885.tif 000017
【図１】
2020198885.tif 000018
【図２】
2020198885.tif 000019
【図３】
2020198885.tif 000020
【図４】
2020198885.tif 000021
【図５】
2020198885.tif 000022
【図６】
2020198885.tif 000023
【図７】
2020198885.tif 000024
【図８】
2020198885.tif 000025
【図９】
2020198885.tif 000026
【図１０】
2020198885.tif 000027
【配列表】
2020198885000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月17日(2020.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
このように、１５２５は、プラスミドＤＮＡ及びウイルスＤＮＡの両方を保有する形質導入粒子が発光可能である、改良された非複製的形質導入粒子に基づくレポーターシステムの典型である。
引用された参考文献
1.  Michael G. Schmidt, D.A.S., Caroline Westwater, Joseph W. Dolan, Brian D. Hoel, Philip A. Werner, James S. Norris, Laura M. Kasman, Nucleic Acid Delivery and Expression, 2005.
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16.  Maiques, E., et al., Role of Staphylococcal Phage and SaPI Integrase in Intra- and Interspecies SaPI Transfer. J. Bacteriol., 2007. 189(15): p. 5608-5616.
17.  Frees, D., et al., Clp ATPases are required for stress tolerance, intracellular replication and biofilm formation in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology, 2004. 54(5): p. 1445-1462.
18.  Arnaud, M., A. Chastanet, and M. Debarbouille, New Vector for Efficient Allelic Replacement in Naturally Nontransformable, Low-GC-Content, Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 2004. 70(11): p. 6887-6891.
19.  Tormo, M.A., et al., Staphylococcus aureus Pathogenicity Island DNA Is Packaged in Particles Composed of Phage Proteins. J. Bacteriol., 2008. 190(7): p. 2434-2440.
20.  Arthur, M., et al., The VanS sensor negatively controls VanR-mediated transcriptional activation of glycopeptide resistance genes of Tn1546 and related elements in the absence of induction. J. Bacteriol., 1997. 179(1): p. 97-106.
21.  Karlsson, S., et al., Expression of Clostridium difficile Toxins A and B and Their Sigma Factor TcdD Is Controlled by Temperature. Infect. Immun., 2003. 71(4): p. 1784-1793.
22.  Daniel Sobek, J.R., Enzyme detection system with caged substrates, 2007, Zymera, Inc.
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24.  Good, L., Translation repression by antisense sequences. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003. 60(5): p. 854-861.
25.  Sabine, B., Antisense-RNA regulation and RNA interference. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression, 2002. 1575(1-3): p. 15-25.
［１］  細菌細胞内への導入のための、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、破壊を包含する第一遺伝子を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該破壊が存在しない状態で、該第一遺伝子はパッケージング関連酵素活性の第一必須成分をコードし、且つ、第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該パッケージング関連酵素活性は該第一パッケージング開始部位を認識し、ここで、該破壊は該必須パッケージング関連酵素活性による第一パッケージング開始部位配列の認識を妨げ、そしてここで、該破壊は必須パッケージング関連酵素活性のレベルを低減する、及び
レポーター遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第一成分をコードする第二遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第二成分をコードする第三遺伝子とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二遺伝子は破壊されていない第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進するように構成されている、
を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
［２］  前記バクテリオファージが、複数の破壊された遺伝子を含み、ここで、該破壊が存在しない状態で、それぞれがパッケージング関連酵素活性の必須成分をコードしている、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３］  前記バクテリオファージ上の複数の破壊された遺伝子がそれぞれ、レポーター核酸分子によってコードされた機能し得る、破壊されていない遺伝子によって補完される、項目２に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４］  前記破壊が、欠失、挿入、突然変異、又は置換による、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５］  前記パッケージング関連酵素活性が、ターミナーゼ活性である、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６］  前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、それぞれターミナーゼ遺伝子である、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［７］  前記第二遺伝子がｐａｃＡ遺伝子であり、且つここで、前記第三遺伝子がｐａｃＢ遺伝子である、項目６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［８］  前記レポーター核酸分子が配列番号１の配列を含む、項目６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［９］  前記第二遺伝子がｔｅｒＡ遺伝子であり、且つ、前記第三遺伝子がｔｅｒＢ遺伝子である、項目６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１０］  前記レポーター核酸分子が配列番号６の配列を含む、項目６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１１］  前記第二遺伝子がｔｅｒＳ遺伝子であり、且つここで、前記第三遺伝子がｔｅｒＬ遺伝子である、項目６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１２］  前記レポーター核酸分子が配列番号４の配列を含む、項目６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１３］  前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、条件付きプロモーターに作動可能に連結される、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１４］  前記条件付きプロモーターが配列番号９の配列を含む、項目１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１５］  前記条件付きプロモーターが、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである、項目１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１６］  前記第二遺伝子又は第三遺伝子の発現が、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化の不存在下で阻害され、且つここで、該第二遺伝子又は第三遺伝子の発現が、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化時に活性化される、項目１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１７］  前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、バクテリオファージゲノムの天然のターミナーゼ遺伝子であり、ここで、前記条件付きプロモーターがターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである、項目１３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１８］  前記バクテリオファージゲノムがレポーター遺伝子を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［１９］  前記バクテリオファージゲノムが抗生物質抵抗性遺伝子をさらに含む、項目１８に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２０］  前記レポーター遺伝子が検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする、項目１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２１］  前記レポーター遺伝子が：発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される、項目１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２２］  前記レポーター遺伝子がターミナーゼ遺伝子を破壊する、項目１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２３］  前記抗生物質抵抗性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、項目１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２４］  前記レポーター遺伝子が構成的プロモーターに作動可能に連結される、項目１８又は１９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２５］  前記構成的プロモーターがＰｂｌａｓｔである、項目２４に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２６］  前記破壊が、選択マーカーをコードする遺伝子を伴った第一パッケージング開始部位配列への挿入又は置換を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２７］  前記選択マーカーをコードする遺伝子が、構成的プロモーターに作動可能に連結される、項目２６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２８］  前記破壊が、検出可能マーカーをコードする遺伝子への第一パッケージング開始部位配列の挿入又は置換を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［２９］  前記検出可能マーカーをコードする遺伝子が：ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、及びｌｕｘＡＢから成る群から選択される、項目２８に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３０］  前記検出可能マーカーをコードする遺伝子が、構成的プロモーターに作動可能に連結される、項目２８又は２９に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３１］  前記構成的プロモーターがＰｂｌａｓｔである、項目３０に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３２］  前記第一遺伝子が、ｐａｃＡ遺伝子部位を含み、且つここで、破壊はｐａｃＡ遺伝子部位に挿入したｌｕｘＡＢ遺伝子及びｋａｎ遺伝子を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３３］  前記バクテリオファージゲノムが配列番号１２を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３４］  前記レポーター核酸分子が複製開始点を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３５］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが、非複製的形質導入粒子内へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３６］  前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がコンカテマー接合部を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３７］  前記レプリコンが、腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶菌レプリコンである、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３８］  前記レプリコンが、Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［３９］  前記レプリコンが配列番号２の配列を含む。、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４０］  前記レプリコンが、ｐＢＨＲ１レプリコン又はｐＢＨＲ１レプリコンの誘導体である、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４１］  前記レプリコンが配列番号３の配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４２］  前記レポーター核酸分子が配列番号４の配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４３］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが、Ｓ．アウレウスｐＴ１８１プラスミド複製開始点に由来する、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４４］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが配列番号５の配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４５］  前記レポーター核酸分子が、配列番号６の配列を含む配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４６］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが、エンテロコッカスｒｅｐＢプラスミド複製開始点に由来する、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４７］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが配列番号７の配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４８］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが、エンテロコッカスｐＤＬ２７８プラスミド複製開始点に由来する、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［４９］  前記核酸分子のレプリコンが配列番号８の配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５０］  前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がｐａｃ部位を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５１］  前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がｃｏｓ部位を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５２］  前記バクテリオファージゲノムが腸内細菌科バクテリオファージＰ１を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５３］  前記バクテリオファージゲノムが、Ｓ．アウレウスバクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５４］  前記バクテリオファージゲノムが、Ｅ．フェカリスバクテリオファージｐＥＦ１１を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５５］  前記細菌細胞がＥ．コリ細胞を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５６］  前記細菌細胞がＳ．アウレウス細胞を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５７］  前記細菌細胞がＥ．フェカリス細胞を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５８］  前記細菌細胞がグラム陰性細胞を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［５９］  前記細菌細胞がグラム陽性細胞を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６０］  前記レポーター遺伝子が、検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６１］  前記レポーター遺伝子が、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｅ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓ−タグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から成る群から選択される、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６２］  前記レポーター核酸分子がアプタマーを含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６３］  前記レポーター核酸分子が、レポーター核酸分子中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６４］  前記核酸転写産物配列が、細胞転写産物に相補的である、項目６３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６５］  前記核酸性転写産物がｃｉｓ−抑制配列を含む、項目６３に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６６］  前記レポーター核酸分子が、プロモーターに作動可能に連結される、項目１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６７］  前記プロモーターが、細菌細胞内のレポーター核酸分子から発現されるレポーター分子の反応性に寄与するように選択される、項目６６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６８］  前記レポーター核酸分子のレプリコンが、レポーター核酸分子のレプリカ中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む、項目１〜６７のいずれか１項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
［６９］  非複製的形質導入内にレポーター核酸分子をパッケージする方法であって、項目１〜６８のいずれか１項に記載の細菌細胞パッケージングシステムに、バクテリオファージゲノムの溶解期を誘導する条件を提供して、レポーター核酸分子をパックした非複製的形質導入粒子を生成し；そしてレポーター核酸分子を含む非複製的形質導入粒子を回収すること、を含む方法。
［７０］  前記非複製的形質導入粒子が、複製されたバクテリオファージゲノムを含まない、項目６９に記載の方法。
［７１］  前記非複製的形質導入粒子が、レポーター核酸分子での組み換えのためのバクテリオファージゲノムの一部を含み、ここで、該バクテリオファージゲノムの一部がレポーター遺伝子を含む、項目６９に記載の方法。
［７２］  項目６９〜７１のいずれか１項に記載の方法によって精製されたレポーター核酸分子のレプリコンを含む非複製的形質導入粒子を含む組成物。
［７３］  非複製的形質導入粒子内に核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、該細菌細胞が、第一パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はレポーターをコードする遺伝子によって破壊され、及び非複製的形質導入粒子内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする第二パッケージング開始部位配列を含むレポーター核酸分子、ここで、該レポーター核酸分子は、非複製的形質導入粒子内にパッケージされるように構成されたレプリコンを形成する、を含む細菌細胞パッケージングシステム。
［７４］  細胞内に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、第一ターミナーゼ遺伝子対を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一ターミナーゼ遺伝子対のうちの少なくとも１つを破壊し、破壊されたターミナーゼ遺伝子が機能しないようにし、及びレポーター遺伝子と、第一ターミナーゼ遺伝子対を補完する第二ターミナーゼ遺伝子対とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二ターミナーゼ遺伝子対のそれぞれに機能性があり、且つここで、該第二ターミナーゼ遺伝子対が、ＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする、を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
［７５］  細胞内に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にレポーター核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、第一ターミナーゼ遺伝子対を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該第一ターミナーゼ遺伝子対のうちのたった１つを破壊し、破壊されたターミナーゼ遺伝子が機能しないようにし、及びレポーター遺伝子と、第一ターミナーゼ遺伝子を補完する第二ターミナーゼ遺伝子を含むレポーター核酸分子、ここで、該第二ターミナーゼ遺伝子に機能性があり、且つここで、該第二ターミナーゼ遺伝子が、ＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを容易にする、を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞内への導入のための、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）内にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、破壊を包含する第一遺伝子を含むバクテリオファージゲノム、ここで、該破壊が存在しない状態で、該第一遺伝子はパッケージング関連酵素活性の第一必須成分をコードし、且つ、第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該パッケージング関連酵素活性は該第一パッケージング開始部位を認識し、ここで、該破壊は必須パッケージング関連酵素活性による第一パッケージング開始部位配列の認識を妨げ、そしてここで、該破壊は必須パッケージング関連酵素活性のレベルを低減する、及び
レポーター遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第一成分をコードする第二遺伝子と、必須パッケージング関連酵素活性の第二成分をコードする第三遺伝子とを含むレポーター核酸分子、ここで、該第二遺伝子は破壊されていない第一パッケージング開始部位配列を含み、ここで、該第一パッケージング開始部位配列はＮＲＴＰ内へのレポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進するように構成されている、
を含む宿主細胞を含むパッケージングシステム。
【請求項２】
前記バクテリオファージゲノムが、複数の破壊された遺伝子を含み、ここで、該破壊が存在しない状態で、それぞれがパッケージング関連酵素活性の必須成分をコードし、そして前記バクテリオファージゲノム上の複数の破壊された遺伝子がそれぞれ、レポーター核酸分子によってコードされた機能的な破壊されていない遺伝子によって補完される、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項３】
前記破壊が、欠失、挿入、突然変異、又は置換による、請求項１又は２に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項４】
前記パッケージング関連酵素活性が、ターミナーゼ活性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項５】
前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、それぞれターミナーゼ遺伝子であり、そして前記第二遺伝子及び第三遺伝子が、条件付きプロモーターに作動可能に連結される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項６】
前記条件付きプロモーターが、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子の天然プロモーターである、請求項５に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項７】
前記第二遺伝子又は第三遺伝子の発現が、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化の不存在下で阻害され、且つここで、該第二遺伝子又は第三遺伝子の発現が、バクテリオファージの溶菌サイクルの活性化時に活性化される、請求項５又は６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項８】
前記バクテリオファージゲノムが、検出可能なマーカー又は選択可能なマーカーをコードするレポーター遺伝子を含み、ここで当該レポーター遺伝子が構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項９】
前記破壊が、選択マーカーをコードする遺伝子を伴った第一パッケージング開始部位配列への挿入又は置換を含み、そして選択可能なマーカーが、構成的プロモーターに作動可能に結合されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１０】
前記破壊が、検出可能マーカーをコードする遺伝子への第一パッケージング開始部位配列の挿入又は置換を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１１】
前記レポーター核酸分子が複製開始点を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１２】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、非複製的形質導入粒子内へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１３】
前記破壊されていない第一パッケージング開始部位配列がコンカテマー接合部を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１４】
前記レポーター核酸分子が、レポーター核酸分子中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１５】
前記レポーター核酸分子のレプリコンが、レポーター核酸分子のレプリカ中の第二配列に相補的な核酸転写産物配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
【請求項１６】
非複製的形質導入粒子内にレポーター核酸分子をパッケージする方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細菌細胞パッケージングシステムに、バクテリオファージゲノムの溶解期を誘導する条件を提供して、レポーター核酸分子をパックした非複製的形質導入粒子を生成し；そしてレポーター核酸分子を含む非複製的形質導入粒子を回収すること、を含む方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって生成されたレポーター核酸分子のレプリコンを含む非複製的形質導入粒子を含む組成物。
【外国語明細書】
2020198885000001.pdf