(57)【要約】【課題】アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種することができる酵母の育種方法、アルコール発酵能が向上した酵母、及び前記酵母を用いた酒類の製造方法を提供すること。【解決手段】酵母をバフィロマイシンＡ１及び塩化カルシウムを含有する培地で培養し、バフィロマイシンＡ１に耐性を有する株を選択するバフィロマイシンＡ１耐性株選択工程と、前記バフィロマイシンＡ１耐性株のアルコール発酵能を分析するアルコール発酵能分析工程とを含み、アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種する酵母の育種方法などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母をバフィロマイシンＡ１及び塩化カルシウムを含有する培地で培養し、バフィロマイシンＡ１に耐性を有する株を選択するバフィロマイシンＡ１耐性株選択工程と、
前記バフィロマイシンＡ１耐性株のアルコール発酵能を分析するアルコール発酵能分析工程とを含み、
アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種することを特徴とする酵母の育種方法。
【請求項２】
育種された酵母を用いて製造した清酒の酸度が、親株を用いて製造した清酒の酸度と同等以下である請求項１に記載の酵母の育種方法。
【請求項３】
育種された酵母を用いて製造した清酒のアミノ酸度が、親株を用いて製造した清酒のアミノ酸度と同等以下である請求項１から２のいずれかに記載の酵母の育種方法。
【請求項４】
前記培地における、前記バフィロマイシンＡ１の濃度が２μＭ以上１５μＭ未満であり、前記塩化カルシウムの濃度が１５０ｍＭ以上である請求項１から３のいずれかに記載の酵母の育種方法。
【請求項５】
親株の酵母が、清酒酵母である請求項１から４のいずれかに記載の酵母の育種方法。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３４のサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＬ３８８株であることを特徴とする酵母。
【請求項７】
請求項６に記載の酵母を用いることを特徴とする酒類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種する酵母の育種方法、前記育種方法により育種された酵母、及び前記酵母を用いた酒類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒は、蒸した米、水、麹そして酵母を増殖させた酒母を原料に２０日間〜３０日間程度、醸造させることで製造される日本古来の伝統酒である。清酒の醸造において、醪中のエタノール濃度は約２０％にまで達すると言われている。高濃度のエタノール存在下では酵母の増殖が止まり、酵母の死滅・自己消化によって、アミノ酸度、酸度、着色などが進んで清酒の品質が劣化しやすくなるという問題があり、これまでに、種々の手法を用いて高い発酵能を有する酵母の育種方法が検討されている。
【０００３】
例えば、古くから実施されている方法として、エタノールにより強い耐性を示す株を取得する方法がある。前記エタノール耐性株を取得する方法によれば、醪末期の高エタノール環境下で死滅しない株を取得することができるものの、醪初期から発酵性が旺盛な株を取得することができないという問題がある。
【０００４】
また、本出願人によって、エルゴステロールの阻害薬であるクロトリマゾールに耐性を有する清酒酵母のクロトリマゾール耐性株から、高発酵性株を取得できることが見出されている（非特許文献１参照）。前記クロトリマゾール耐性株を取得する方法によれば、発酵力が高い株を取得することができるものの、前記株を用いて製造した清酒では、酸度が高くなる傾向がある。
【０００５】
したがって、酸度を増加させることなく、発酵初期から発酵性を向上させることができる酵母の育種方法は未だ提供されておらず、アルコール発酵能が向上した酵母を育種する新たな育種方法の開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】広畑  修二、渡辺  睦、西村  顕、近藤  恭一：  生物工学会誌、第７２巻、第４号、２８３−２８９（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種することができる酵母の育種方法、アルコール発酵能が向上した酵母、及び前記酵母を用いた酒類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、酵母をバフィロマイシンＡ１及び塩化カルシウムを含有する培地で培養し、バフィロマイシンＡ１に耐性を有する株を選択することで、アルコール発酵能が親株よりも向上した高アルコール発酵性株を高確率で取得できることを知見した。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  酵母をバフィロマイシンＡ１及び塩化カルシウムを含有する培地で培養し、バフィロマイシンＡ１に耐性を有する株を選択するバフィロマイシンＡ１耐性株選択工程と、
前記バフィロマイシンＡ１耐性株のアルコール発酵能を分析するアルコール発酵能分析工程とを含み、
アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種することを特徴とする酵母の育種方法である。
＜２＞  育種された酵母を用いて製造した清酒の酸度が、親株を用いて製造した清酒の酸度と同等以下である前記＜１＞に記載の酵母の育種方法である。
＜３＞  育種された酵母を用いて製造した清酒のアミノ酸度が、親株を用いて製造した清酒のアミノ酸度と同等以下である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の酵母の育種方法である。
＜４＞  前記培地における、前記バフィロマイシンＡ１の濃度が２μＭ以上１５μＭ未満であり、前記塩化カルシウムの濃度が１５０ｍＭ以上である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の酵母の育種方法である。
＜５＞  親株の酵母が、清酒酵母である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の酵母の育種方法である。
＜６＞  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３４のサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＬ３８８株であることを特徴とする酵母である。
＜７＞  前記＜６＞に記載の酵母を用いることを特徴とする酒類の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種することができる酵母の育種方法、アルコール発酵能が向上した酵母、及び前記酵母を用いた酒類の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、試験例１の各プレートで酵母を培養した結果を示す図である。
【図２】図２は、試験例３の発酵経過（ガス減量）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（酵母の育種方法）
本発明の酵母の育種方法は、アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を育種する方法であって、バフィロマイシンＡ１耐性株選択工程と、アルコール発酵能分析工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１３】
＜バフィロマイシンＡ１耐性株選択工程＞
前記バフィロマイシンＡ１耐性株選択工程は、酵母をバフィロマイシンＡ１及び塩化カルシウムを含有する培地で培養し、バフィロマイシンＡ１に耐性を有する株を選択する工程である。
【００１４】
＜＜酵母＞＞
前記酵母（以下、「親株」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母などが挙げられる。これらの中でも、清酒酵母が好ましい。
【００１５】
前記親株は、自然変異により得られたものを用いてもよいし、変異処理が施されたものを用いてもよい。
前記変異処理としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、紫外線照射、放射線照射等の物理的変異処理、エチルメタンスルホネートの添加、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジンの添加等の化学的変異処理などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
＜＜培地＞＞
前記培地は、バフィロマイシンＡ１と、塩化カルシウムとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００１７】
−バフィロマイシンＡ１−
前記バフィロマイシン（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）Ａ１は、液胞膜に存在するＡＴＰアーゼ活性阻害剤である。
前記バフィロマイシンＡ１は、市販品を使用することができる。
【００１８】
前記バフィロマイシンＡ１の前記培地中の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２μＭ以上１５μＭ未満が好ましく、２μＭ以上１０μＭ未満がより好ましく、２μＭ以上５μＭ未満が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、低コストで、効率良くバフィロマイシンＡ１耐性株を選択することができる点で、有利である。
【００１９】
−塩化カルシウム−
前記塩化カルシウムは、市販品を使用することができる。
【００２０】
前記塩化カルシウムの前記培地中の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５０ｍＭ以上が好ましく、１５０ｍＭ以上３００ｍＭ以下がより好ましく、１５０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、バフィロマイシンＡ１の使用量を抑え、低コストで、効率良くバフィロマイシンＡ１耐性株を選択することができる点で、有利である。
【００２１】
前記培地中の前記バフィロマイシンＡ１の濃度と前記塩化カルシウムの濃度との組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した好ましい濃度を適宜組み合わせた態様などが挙げられる。
【００２２】
−その他の成分−
前記培地におけるその他の成分としては、特に制限はなく、一般に酵母の培養に用いられる成分を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大豆粉、小麦胚芽、押し麦、ペプトン、綿実粕、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等の窒素源；トマトペースト、グリセリン、デンプン、グルコース、ガラクトース、デキストリン、バクトソイトン等の炭水化物、脂肪等の炭素源；塩、炭酸カルシウム等の無機塩；金属塩などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記培地におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
前記培地としては、一般に酵母の培養に用いられる培地に、バフィロマイシンＡ１及び塩化カルシウムを添加したものを使用することもできる。
前記一般に酵母の培養に用いられる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地などが挙げられる。これらの中でも、ＳＤ培地が好ましい。
【００２４】
前記培地の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固体、液体などが挙げられる。
【００２５】
＜＜培養＞＞
前記培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０℃〜４０℃などが挙げられる。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日間〜１０日間などが挙げられる。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、振盪培養などが挙げられる。
【００２６】
前記バフィロマイシンＡ１耐性株選択工程では、前記培養で生育する株をバフィロマイシンＡ１耐性株として選択する。
【００２７】
＜アルコール発酵能分析工程＞
前記アルコール発酵能分析工程は、前記バフィロマイシンＡ１耐性株のアルコール発酵能を分析する工程である。
【００２８】
前記アルコール発酵能を分析する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、選択された前記バフィロマイシンＡ１耐性株を用いて清酒製造を小規模化したいわゆる小仕込み試験を行い、醪作り工程（発酵工程）におけるガス減量を測定し分析する方法、上槽した清酒のアルコール度数を測定し分析する方法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
前記小仕込み試験の規模、発酵の温度、期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、清酒製造の規模で分析を行ってもよい。
【００３０】
前記醪作り工程（発酵工程）におけるガス減量を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記バフィロマイシンＡ１耐性株を用いた場合のガス減量が親株を用いた場合よりも多い場合は、アルコール発酵能が親株よりも向上したと判断することができる。
【００３１】
前記上槽した清酒のアルコール度数を測定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記バフィロマイシンＡ１耐性株を用いた場合のアルコール度数が親株を用いた場合よりも高い場合は、アルコール発酵能が親株よりも向上したと判断することができる。
【００３２】
前記アルコール発酵能分析工程により、アルコール発酵能が親株よりも向上した酵母を選抜することができる。
【００３３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸度分析工程、アミノ酸度分析工程などが挙げられる。
【００３４】
＜＜酸度分析工程＞＞
前記酸度分析工程は、前記育種された酵母を用いて製造した清酒の酸度を分析する工程である。
前記酸度は、国税庁所定分析法にしたがって分析することができる。
【００３５】
本発明の酵母の育種方法により育種された酵母は、前記酵母を用いて製造した清酒の酸度が、親株を用いて製造した清酒の酸度と同等以下であることが、良好な品質の清酒とすることができる点で、好ましい。
【００３６】
＜＜アミノ酸度分析工程＞＞
前記アミノ酸度分析工程は、前記育種された酵母を用いて製造した清酒のアミノ酸度を分析する工程である。
前記アミノ酸度は、国税庁所定分析法にしたがって分析することができる。
【００３７】
本発明の酵母の育種方法により育種された酵母は、前記酵母を用いて製造した清酒のアミノ酸度が、親株を用いて製造した清酒のアミノ酸度と同等以下であることが、良好な品質の清酒とすることができる点で、好ましい。
【００３８】
本発明の酵母の育種方法によれば、親株よりもアルコール発酵能が向上した株を高確率で取得することができる。また、前記育種された酵母を用いて製造した清酒の酸度及びアミノ酸度が、親株を用いて製造した清酒の酸度及びアミノ酸度と比べて同等又はそれ以下である酵母を育種することもできる。
本発明において、前記「酸度又はアミノ酸度が同等」とは、親株を用いて製造した清酒の酸度又はアミノ酸度の値の±５％以内の値であることをいう。
【００３９】
（酵母）
本発明の酵母は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３４のサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＬ３８８株であり、上記した本発明の酵母の育種方法により、育種することができる。前記ＨＬ３８８株は、高発酵性を有する。また、前記株を用いて清酒を製造すると、酸度及びアミノ酸度が良好な清酒とすることができる。
【００４０】
前記ＨＬ３８８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託申請し、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３４として、２０１８年１２月４日に受託されている。
【００４１】
（酒類の製造方法）
本発明の酒類の製造方法は、上記した本発明の酵母を用いる以外は、通常の酒類の製造方法を目的に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
＜酒類＞
前記酒類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、清酒、焼酎、ビール、ワインなどが挙げられる。これらの中でも、清酒が好ましい。
【００４３】
本発明の酒類の製造方法によれば、上記した本発明の酵母を用いるので、優れた品質の酒類を製造することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、試験例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００４５】
（試験例１）
ＳＤ培地（酵母ニトロゲンベース０．１７質量％、硫酸アンモニウム０．５質量％、グルコース２質量％）に、アガー３質量％と、表１に記載の成分を表１に記載の濃度となるように添加して、各プレートを作製した。
【００４６】
【表１】
2020110054.tif 000002
【００４７】
親株として、清酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａ及びＢ（白鶴酒造株式会社保有）それぞれをＳＤ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。その培養液を集菌及び洗菌した後、ＯＤ６００＝１．０となるように滅菌水で希釈し、菌液とした。
前記菌液を更に１０倍、１００倍、１，０００倍に希釈し、前記各プレートに５μＬスポット後、３０℃で３日間培養した。
【００４８】
結果を図１に示す。図１の結果から、ＳＤ培地にバフィロマイシンＡ１のみを添加した条件で耐性株を取得するためには、培地中のバフィロマイシンＡ１の濃度を１５μＭ以上にする必要があることがわかった。一方、バフィロマイシンＡ１と塩化カルシウムとを併用することで、バフィロマイシンＡ１の濃度が低濃度であっても酵母が全く生育できないことが確認でき（試験例１−４）、塩化カルシウムを併用することで効率良くバフィロマイシンＡ１耐性株を取得することが可能であることを確認した。
【００４９】
（試験例２）
＜バフィロマイシンＡ１耐性株の取得＞
前記清酒酵母ＢをＹＰＤ液体培地に植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液を集菌及び洗菌し、０．９質量％ＫＣｌ  ４０ｍＬに懸濁後、菌液をシャーレに移し、スターラーで撹拌しながら紫外線を２分間照射した。ＹＰＤ  １ｍＭが入った試験管１０本の中に前記菌液をそれぞれ１ｍＬ添加し、暗室で２日間静置培養した。
その後、前記菌液を、アガー３質量％、バフィロマイシンＡ１  ２μＭ、及び塩化カルシウム２００ｍＭを含有するＳＤ培地のプレートに塗布し、５日間３０℃にて培養を行い、バフィロマイシンＡ１耐性株を４８株取得した。
【００５０】
＜バフィロマイシンＡ１耐性株の発酵特性の確認＞
バフィロマイシンＡ１耐性株として取得した前記４８株と、親株として用いた前記清酒酵母ＢのそれぞれをＹＰＤ液体培地２ｍＬに植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。その培養液を集菌及び洗菌し、総米５０ｇの小仕込み試験に供した。仕込み配合を表２に示す。１２℃で発酵させ、上槽後、国税庁所定分析法にしたがって、一般分析を実施した。上槽時のガス（ＣＯ２）減量を測定した結果を表３に示す。
【００５１】
【表２】
2020110054.tif 000003
【００５２】
【表３】
2020110054.tif 000004
【００５３】
表３中、親株を用いた場合の上槽時のガス減量は、１８．０ｇであった。一方、バフィロマイシンＡ１耐性株として取得した前記４８株のうち３２株では、上槽時のガス減量が親株を用いた場合よりも多く、これらの株の発酵性が親株よりも向上していることが確認できた。
【００５４】
前記親株を用いて製造した製成酒、及び発酵性が親株よりも向上していた前記３２株を用いて製造した製成酒について、国税庁所定分析法にしたがって、酸度とアミノ酸度を測定した。結果を表４（酸度）及び表５（アミノ酸度）に示す。
【００５５】
【表４】
2020110054.tif 000005
【００５６】
【表５】
2020110054.tif 000006
【００５７】
表４及び表５中、親株を用いて製造した製成酒の酸度は２．８ｍＬであり、アミノ酸度は３．２ｍＬであった。表４及び表５の結果から、発酵性が親株よりも向上していた前記３２株を用いて製造した製成酒では、酸度が親株を用いた場合と同等又は低減していた。これまで一般的に、発酵性が向上した株は酸度が増加する傾向があるといわれてきたが、これらの株では酸度が親株と同等又は低減していた。また、醪末期の高アルコール条件においては、酵母が死滅することにより製成酒中のアミノ酸度が増加する傾向があるが、これらの株では、アミノ酸度も親株を用いた場合と同等又は低減していた。
【００５８】
したがって、酵母にバフィロマイシンＡ１耐性を付与すると、高頻度で発酵能が向上すること、醸造特性においては酸度及びアミノ酸度が親株と同等又は低減する傾向があり、良好な醸造特性が得られることを見出した。
更に、バフィロマイシンＡ１を単独で用いた場合には、耐性株を取得するために大量の使用が必要であったが、培地中にカルシウムイオンを含有させることで、微量のバフィロマイシンＡ１の使用でバフィロマイシンＡ１耐性株を取得することができ、低コストでバフィロマイシンＡ１耐性株の取得が可能であることも見出した。
【００５９】
（試験例３）
前記試験例２において使用した親株と、発酵性が親株よりも向上していた前記３２株の中で、醸造特性がより良好な４株（以下、「Ｎｏ．１〜４」と称する。）を選抜し、総米４００ｇの小仕込み試験に供し、詳細に醸造特性を試験した。仕込み配合を表６に示す。１２℃で発酵させ、上槽後、国税庁所定分析法にしたがって、一般分析値（日本酒度、アルコール度数、酸度、及びアミノ酸度）を分析した結果を表７に示す。また、ガス（ＣＯ２）減量（発酵経過）を測定した結果を図２に示す。
なお、前記Ｎｏ．１〜４株の前記試験例２における酸度とアミノ酸度は、以下のとおりであった。
・  Ｎｏ．１株  ：  酸度  ２．６ｍＬ、アミノ酸度  ２．８ｍＬ
・  Ｎｏ．２株  ：  酸度  ２．７ｍＬ、アミノ酸度  ２．９ｍＬ
・  Ｎｏ．３株  ：  酸度  ２．４ｍＬ、アミノ酸度  ２．８ｍＬ
・  Ｎｏ．４株  ：  酸度  ２．７ｍＬ、アミノ酸度  ２．６ｍＬ
【００６０】
【表６】
2020110054.tif 000007
【００６１】
【表７】
2020110054.tif 000008
【００６２】
図２及び表７の結果から、Ｎｏ．１〜４株全てにおいて、アルコール度数が親株よりも増加しており、発酵性が向上したことを確認した。また、Ｎｏ．１〜４株を用いた場合の製成酒の酸度及びアミノ酸度は、親株と同等又は低減していることを確認した。Ｎｏ．１〜４株の中でも、Ｎｏ．４株は、Ｎｏ．１〜３株と比較して、顕著にアルコール度数が増加しており、酸度及びアミノ酸度も親株と比較して顕著に減少しており、優れた株であることを確認した。
【００６３】
前記Ｎｏ．４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託申請し、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３４として、２０１８年１２月４日に受託された。
【受託番号】
【００６４】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８３４
【図１】
2020110054.tif 000009
【図２】
2020110054.tif 000010