(57)【要約】      （修正有）【課題】患者における、Ｓ−アデノシルメチオニンのレベルの低下を伴う疾患の有無を検出する方法の提供。【解決手段】疾患の疑いのある、または疾患を有するリスクがある患者を同定するステップと、前記患者から生体サンプルを得るステップと、Ｓ−アデノシルメチオニンのハプテン類似体から誘導された抗体を用いて前記生物学的サンプル中のＳ−アデノシルメチオニンのレベルを決定するステップと、Ｓ−アデノシルメチオニンのレベルを疾患の有無と対応付けるステップと、を含む方法。本発明はまた、個体の健康状態の指標であるメチル化指数（体液中ＳＡＭ／ＳＡＨの比率）を算出するために使用されるＳＡＨを測定するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している哺乳動物における癌の治療を提供するための方法において、
（ａ）癌に罹患している前記哺乳動物の体液試料中のメチル化指数を測定するステップと、
（ｂ）前記メチル化指数を前記哺乳動物における疾患の進行度に対応付けるステップと、
（ｃ）（ｂ）の結果に基づいて、癌に罹患している前記哺乳動物を治療するための適切な癌治療プロトコルを選択するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記メチル化指数は、（ａ１）（ｉ）試料を採集すること；（ｉｉ）Ｓ−アデノシルメチオニンに特異的な抗体と前記試料とを混合すること；（ｉｉｉ）前記試料中に存在するＳ−アデノシルメチオニンと前記抗体との結合を検出すること；および（ｉｖ）前記試料中に存在するＳ−アデノシルメチオニンの量の尺度として、前記結合を定量化すること；を含む前記哺乳動物におけるＳ−アデノシルメチオニンの濃度を測定するステップと、（ａ２）本発明で開発されたイムノアッセイ法に基づいて、Ｓ−アデノシルホモシステインの濃度を測定するステップと、（ａ３）前記生物学的試料のメチル化指数を提供するため、（ａ１）／（ａ２）の比を算出するステップと、を含む方法で測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者の腫瘍を治療するための癌治療レジメンを決定するための方法であって、
（ａ）患者試料中のメチル化指数を測定するステップと、
（ｂ）前記指標のレベルが予測マーカーであるかどうかを判定するため、取得したメチル化指数のレベルをある対照メチル化指数と比較するステップと、
（ｃ）患者が応答性の患者または非応答性の患者のいずれかであることを示しているメチル化指数値に基づいて、腫瘍を治療するための癌治療レジメンを決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
ヒトにおける気分障害を治療するための方法であって、
（ａ）（ｉ）試料を採集すること；（ｉｉ）Ｓ−アデノシルメチオニンに特異的な抗体と前記試料とを混合すること；（ｉｉｉ）前記試料中に存在するＳ−アデノシルメチオニンと前記抗体との結合を検出すること；および（ｉｖ）前記試料中に存在するＳ−アデノシルメチオニンの量の尺度として、前記結合を定量化すること；を含む、前記ヒトのＳ−アデノシルメチオニンの濃度を測定するステップと、
（ｂ）ＳＡＭのレベルを前記気分障害と対応付けるステップと、
（ｃ）（ｂ）の対応付ける結果に基づいて、前記気分障害の治療に有効な薬物の有効量を決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記薬物は、フェネルジン、トラニルシプロミン、モクロベミド、イミプラミン、アミトリプチリン、デシプラミン、ノルトリプチリン、ドキセピン、プロトリプチリン、トリミプラミン、クロミプラミン、アモキサピン、フルオキセチン、セルトラリン、パロキセチン、シタロプラム、フルボキサミン、ベンラファキシン、マプロチリン、アモキサピンです、トラゾドン、ブプロピオン、デュロキセチン、エスシタロプラム、シタロプラム、ネファゾドン、ベンラファキシン、ミルナシプラン、レボキセチン、ミルタザピン、カバカバ、セントジョンズワート、Ｓ−アデノシルメチオニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ニューロキニン受容体拮抗剤、トリヨードサイロニン、神経ペプチド、神経ペプチド受容体を標的とする化合物、およびホルモンからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項６】
被験者の精神または神経変性疾患を診断するための、または精神または神経変性疾患に対する被験者の罹患性を予測するための方法であって、（ａ）対象から１つ以上の生物学的サンプルを採集するステップと、（ｂ）前記サンプルに関連するＳ−アデノシルメチオニンまたはメチル化指数のレベルを測定するステップと、（ｃ）（ｂ）で測定したバイオマーカーのレベルを、１つ以上の対照試料からのバイオマーカーのレベルと比較するステップと、を含み、１つ以上の対照サンプルと比べ、前記被験体からの試料（複数可）内の２つ以上のバイオマーカーが異常なレベルであることは、精神または神経変性疾患に対する被験者の罹患性を予測していることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記対照サンプルは、１人以上の、精神または神経変性疾患に罹患していないことが分かっている、または、ある特定の診断された精神または神経変性疾患に苦しんでいることが分かっている、個体に由来することを特徴とする方法。
【請求項８】
患者におけるＳ−アデノシルメチオニンのレベルの低下を伴う疾患の有無を検出する方法であって、前記疾患を持つ疑いがある、または該疾患を罹患するリスクがある患者を同定するステップと、前記患者から生体サンプルを得るステップと、Ｓ−アデノシルメチオニンのハプテン性の類似体から誘導された抗体を用い、前記生体サンプルにおけるＳ−アデノシルメチオニンのレベルを測定するステップと、Ｓ−アデノシルメチオニンのレベルを疾患の有無と対応付けるステップと、を含む方法。
【請求項９】
Ｓ−アデノシルメチオニン単独で、または、他の化学療法剤との組み合わせで、患者を治療する必要性を評価する方法であって、（ａ）そのような治療が必要と疑われる被験体から体液サンプルを収集するステップと、（ｂ）前記サンプにおけるＳ−アデノシルメチオニンのレベルを測定するステップと、（ｃ）Ｓ−アデノシルホモシステインのレベルを測定し、メチル化指数を計算するステップと、（ｄ）前記サンプルのメチル化指数と通常の標準のメチル化指数とを比較するステップと、（ｅ）前記メチル化指数はＳ−アデノシルメチオニン治療の必要性を示す正常範囲外にあるかどうかを判断するステップと、を含む方法。
【請求項１０】
哺乳動物の疾患への治療を個別化する方法であって、疾患を有する被験体からの体液のメチル化指数を測定するステップと、前記体液におけるメチル化指数のレベルに基づいて前記被験者に対して有効の可能性がある治療法を提案するステップと、を含む方法。
【請求項１１】
診断された患者における癌治療の有効性を監視するための方法であって、患者におけるメチル化指数のレベルをある第１時点で測定するステップと、患者をある癌治療法で治療するステップと、患者におけるメチル化指数のレベルをある第２の時点で測定するステップと、癌治療の有効性を判断するため、患者におけるメチル化指数の第１の時点でのレベル（複数可）と第２の時点でのレベルとを比較するステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、合衆国法典第３５編（すなわち米国特許法）の第１１９条に基づいて、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｏｆ  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｉｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（個別化医療と健康または癌の評価におけるＳ−アデノシルメチオニンのイムノアッセイ）」という表題の、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８０１，５４７号の優先権を主張する。この仮出願はその全体が参照することにより本書に援用される。
【０００２】
本発明は、概して、体液中Ｓ−アデノシルメチオニンのレベルを、たくさんの疾病のマーカーとして測定することに関する。
【０００３】
また、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンの類似体に対して作った抗体を利用して、体液中のＳ−アデノシルメチオニンのレベルを、たくさんの疾病のマーカーとして測定することに関する。
【０００４】
本発明は、体液中のＳ−アデノシルメチオニンのレベルを疾病のマーカーとして測定すること、前記レベルを疾患の進行に対応付けること、およびＳ−アデノシルメチオニンのレベルに基づいて適切な治療方法を決定することに関する。
【０００５】
本発明は、癌の診断、スクリーニング、早期発見に関し、癌およびその他の病理、生理プロセスの治療効果および再発を監視することにも応用可能である。
【０００６】
本発明は、ある標的特異性薬に対して患者が反応するかどうかを判断する標的特異性分析システムの開発にも関し、もっと詳細には、高度経済的な、診断法および治療薬が並行開発される時に相乗効果を与えるシステムに関する。
【０００７】
本発明はまた、疾患の進行と疾患の治療および治療への応答を関係付けるため、メチル化指数の測定を発見、スクリーニング、探索、識別、開発および／または評価するための方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、メチル化指数（文献によってメチル化状態とも呼ばれている。本出願ではメチル化指数がＳＡＭ／ＳＡＨを指す）を、癌、その他の疾患の発見、診断、および癌の進行状況の監視、および癌、その他の疾患の治療状況の監視のためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、システムおよびキットとしての利用にも関する。癌の進行は広範囲のＤＮＡの低メチル化、局所のＣｐＧの過剰メチル化、およびゲノム不安定化の漸進的な増加が特徴とする。低下したメチル化指数はグローバルなＤＮＡの低メチル化、およびゲノムの不安定化と相関する。そのため、それは健康状態および疾患の進行または段階を評価するのに役立つ優れたマーカーである。
【背景技術】
【０００９】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）は、生体のほぼすべての組織および液体に発見された。ＳＡＭは、トランスメチレーションと呼ばれるプロセスに重要な役割を果たしている。メチル化は、生活のあらゆる側面に関与している。ＳＡＭは、体内のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、および低分子における様々なメチル転移反応の主要な「メチル」供与体である。適切なＤＮＡメチル化は、正常な胚発生に必須である。メチルトランスフェラーゼ遺伝子のホモ接合欠失（ノックアウト）は致死的である（Ｐｅｇｇ，  Ａ．Ｅ．，  Ｆｅｉｔｈ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｆｏｎｇ，  Ｌ．Ｙ．，  Ｃｏｌｅｍａｎ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｏ’Ｂｒｉａｎ，  Ｔ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｓｈａｎｔｚ，  Ｌ．Ｍ．，  ２００３，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３１，  ３５６−３６０）。不適切なメチル化ＤＮＡは、多くの腫瘍で発見された。ＤＮＡメチル化パターンの変化は、癌遺伝子の発現を誘導するか、または腫瘍抑制遺伝子の発現をサイレンシングする。メチル欠損食事はげっ歯類で肝臓癌を促進することが示されている。
【００１０】
トランススルフレーションは、ＳＡＭがメチル基を寄付（トランスメチレーション）した後の残存構造、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）で始まる。ＳＡＨの加水分解でホモシステインが得られる。後者は順次にシスタチオニン、システイン、最終的には、肝細胞の酸化防止剤および救命解毒剤のグルタチオンに変換する。
【００１１】
アミノプロピル化も、ＳＡＭの脱炭酸で始まる別のプロセスである。脱炭酸したＳＡＭはその後、プトレシンと結合して、細胞の増殖、分化およびＤＮＡとＲＮＡの安定性に重要であるスペルミジンおよびスペルミンを生成する。さらに、ポリアミン合成の副生成物、メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）は、強力な鎮痛剤および抗炎症剤である。これは、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および線維筋痛症のＳＡＭを利用した治療で観察される臨床的利益に、少なくとも部分的に関与する。
【００１２】
ＳＡＭは免疫系において役割を果たし、細胞膜を維持し、セロトニン、メラトニン、およびドーパミンなどの脳内化学物質の合成および分解するのに役立つ。ビタミンＢ１２または葉酸のいずれかの欠損は、ＳＡＭのレベルを減少させることができる。ＳＡＭは、体内の活性酸素分子の損傷作用から身体を保護する酸化防止剤でもある。これらの反応性酸素分子は体内から、または環境汚染から来ることができ、老化のプロセスと変性疾患の発症における役割を果たしていると考えられています。一般的に、ＳＡＭは、体内の他のアミノ酸の機能のレベルを上昇させると考えられている。
【００１３】
さらなる背景として、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン分子はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンをメチルチオアデノシンおよびホモセリンに変換する酵素リアーゼの基質である。それはｔＲＮＡにアミノ酪酸鎖を与える供与体である。それは、ビオチンの生合成におけるアミノ酸鎖の供与体である。ＳＡＭ−ｅは、脱カルボキシル化の後、神経調節ポリアミンのスペルミジンおよびスペルミンの生合成のためのアミノプロピル基の供与体である。（Ｚａｐｐｉａら（１９７９）、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｃｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ｐａｇｅ  １，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｎ．Ｙ．））
【００１４】
ＳＡＭは既に肝疾患（Ｆｒｉｅｄｅｌ  Ｈ，  Ｇｏａ，  Ｋ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  Ｐ．，  （１９８９），  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｄｒｕｇｓ．  ３８，  ３８９−４１６）、関節炎（Ｄｉ  Ｐａｄｏｖａ  Ｃ，  （１９８７），  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅＳＡＭ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ８３，  （Ｓｕｐｐｌ．  ５），  ６−６５．）、およびうつ病（Ｋａｇａｎ，  Ｂ，  Ｓｕｌｔｚｅｒ  Ｄ．  Ｌ．，  Ｒｏｓｅｎｌｉｃｈｔ  Ｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ  Ｒ．  （１９９０），  Ｏｒａｌ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １４７，  ５９１−５９５．）の臨床治療に利用した。アルツハイマー病患者は、脳脊椎液のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンのレベルが減少した（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９０），  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５３，  １０９６−１０９８）。ある予備的研究では、ＳＡＭ−ｅは、アルツハイマー病患者の認知を改善することができた（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４），  Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｍｅｔｉｏｎｉｎｅ  （Ｓ-ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｉｎｉｎｅ）  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｄｒｕｇｓ  ４８，  １３７−１５２）。アルツハイマー病患者の脳中Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンのレベルも大幅に減少した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９６），  Ｂｒａｉｎ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ６７，  １３２８−１３３１）。パーキンソン病を有する患者はまた、有意にＳＡＭ−ｅの血中濃度が低下していることが示されている（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９７），  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ��−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １４５，  ５８０−５８５）。
【００１５】
抗悪性腫瘍薬のメトトレキサートで治療した患者におけるＳＡＭ−ｅのレベルが低減される。この薬物に関連する神経毒性は、ＳＡＭ−ｅの同時投与によって減弱することができる。（Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４），  Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ａｄｅｍｅｔｉｏｎｉｎｅ  （Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  Ｄｒｕｇｓ，  ４８  （２），  １３７−１５２）
【００１６】
ＳＡＭ−ｅの脳脊髄液レベルは、ＨＩＶ  ＡＩＤＳ痴呆コンプレックス／  ＨＩＶ脳症で調査し、非ＨＩＶ感染患者におけるよりも有意に低いことが見出されている（Ｋｅａｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１），  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｒａｉｎＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＨＩＶ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｌａｎｃｅｔ：  ３３７：９３５−９）。
【００１７】
Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚらは慢性的に投与したＳＡＭ−ｅは、抗酸化防御を強化することによって、脳内の酸化状態を変更できることを示している（Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ，  （２０００），  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｎ  ｂｒａｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ'ｓ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３６１：  ４７−５２．）。これは、肝臓と腎臓の組織においてＳＡＭ−ｅで得られた結果と類似している。したがって、ＳＡＭ−ｅは酸化防止剤として有用であろう。
【００１８】
肝疾患有り無し両方の患者への経口ＳＡＭ−ｅの投与は肝グルタチオンレベルの増加をもたらしている（Ｖｅｎｄｅｍｉａｌｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８９），  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｏｒａｌ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；  ２４：  ４０７−１５）。肝内胆汁うっ滞を罹患している患者へのＳＡＭ−ｅの経口投与は、そう痒症、ならびに胆汁うっ滞の生化学的マーカーの両方の改善を持っていた（Ｇｉｕｄｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｄｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  （ＳＡＭ−ｅ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．  ＩｎＭａｔｏ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｍａｄｒｉｄ：  ＣＳＩＣ  Ｐｒｅｓｓ；  １９９２  ｐｐ  ６７−７９）。一次線維筋痛症を患っている患者への経口ＳＡＭ−ｅの投与が短期の試用後に有意な改善をもたらした（Ｔａｖｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｉｎｅ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｍａｙｌｇｉａ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌ  ８３  （ｓｕｐｐｌ  ５Ａ），  ｐｐ  １０７−１１０，  １９８７．）。同様に、ＳＡＭ−ｅは変形性関節症の治療に使用されてきた。（Ｋｏｅｎｉｇ  Ｂ．  Ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  （ｔｗｏ  ｙｅａｒｓ）  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｗｉｔｈ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌ  ８３  （ｓｕｐｐｌ  ５Ａ），  Ｎｏｖ．  ２０，  １９８７  ｐｐ  ８９−９４）。
【００１９】
ＳＡＭ−ｅは基本的な代謝過程におけるその重要な機能により、多くの明らかに関係が持っていない臨床分野で有用である。その最も顕著な臨床用途の１つは、これまで、医学的に治療不可能なままであった、アルコール性肝硬変の治療である。マトらは、アルコール性肝硬変におけるＳＡＭ−ｅの経口投与が、プラセボ処置群と比較して、死亡および／または肝臓移植の総発生率を２９％から１２％に減少させた。（Ｍａｔｏ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９），  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ３０，  １０８１−１０８９．）
【００２０】
ＳＡＭ−ｅは、腫瘍壊死因子αによって引き起こされる損傷を減衰させ、また、細胞によって分泌する腫瘍壊死因子αの量を減少させることができる。したがって、この特定の炎症性因子が上昇した状況は、ＳＡＭ−ｅの投与から利益を得るであろう（Ｗａｔｓｏｎ  ＷＨ，  Ｚｈａｏ  Ｙ，  Ｃｈａｗｌａ  ＲＫ，  （１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  Ａｕｇ．  １５；  ３４２  （Ｐｔ  １）：  ２１−５．  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ）。ＳＡＭ−ｅはまた、強力な免疫抑制剤シクロスポリンＡの投与に関連する毒性を減少させる能力について研究されてきた。（Ｇａｌａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，  Ａｒｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，  ４０：３；  １５１−１６３，  １９９９．）
【００２１】
インビトロでヒト赤血球と一緒にインキュベートされたＳＡＭ−ｅは、細胞膜を貫通し、細胞内ＡＴＰを増加させ、したがって細胞の形状を復元した（Ｆｒｉｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  Ｄｒｕｇｓ  ３８  （３）：３８９−４１６，  １９８９）。
【００２２】
ＳＡＭ−ｅは偏頭痛を患っている患者において研究し、有益であることが見出された（Ｆｒｉｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  Ｄｒｕｇｓ  ３８  （３）：  ３８９−４１６，  １９８９）。
【００２３】
ＳＡＭ−ｅは、末梢閉塞性動脈疾患を有する患者に投与され、主に赤血球変形能への影響を介して、血液の粘度を低下させることが示された。
【００２４】
ＳＡＭ−ｅは６０と８０％の純度の間で変化するＳＡＭ−ｅ製剤をもたらす発酵技術で商業的に入手可能である。（つまり、最終製品は６０〜８０％のアクティブな（Ｓ、Ｓ）−ＳＡＭ−ｅと２０〜４０％の非アクティブの（Ｒ、Ｓ）−ＳＡＭ−ｅを含めている。）（Ｇｒｏｓｓ，  Ａ．，  Ｇｅｒｅｓｈ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，  Ｇｍ  （１９８３）  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ８，  ４１５）。酵素的合成方法は、６０％を超える濃度で不活性な異性体を生じることが報告されている。（Ｍａｔｏｓ，  ＪＲ，  Ｒａｕｓｃｈｅｌ  ＦＭ，  Ｗｏｎｇ，  ＣＨ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９，  ３９−５２  （１９８７））。エナンチオマー分離技術がＳＡＭ−ｅの純粋な活性エナンチオマーを分離することが報告されている（Ｍａｔｏｓ，  ＪＲ，  Ｒａｕｓｃｈｅｌ  ＦＭ，  Ｗｏｎｇ，  ＣＨ．  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８７，  ９，  ３９−５２；  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｒａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８６，  ２５  ４４４４−４４４９；  Ｓｅｇａｌ  Ｄ  ａｎｄ  Ｅｉｃｈｌｅｒ  Ｄ，  Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ２−０−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｖｏｌ．  ２７５，  Ｎｏ．  ２，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，  ｐｐ．  ３３４−３４３，  １９８９）。非常に経済的なコストで大規模な商業生産規模での鏡像異性体を分離するための新しい分離技術が存在する。また、特別な立体選択的方法で生物学的に活性な鏡像異性体を合成することも考えられが、これは現在までに達成されていない。
【００２５】
デ・ラハーバは、硫黄がキラルであり、二つの可能なコンフィギュレーションのうちの一つだけが生物学的に合成され、使われることを初めて示した（Ｄｅ  ｌａ  Ｈａｂａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８１，  ３９７５−３９８０，  １９５９）。  ＲＮＡとＤＮＡのメチル化は正常な細胞成長に必須である。このメチル化は、ＳＡＭ−ｅを唯一または主要なメチルドナーとして使って、メチルトランスフェラーゼ酵素により行われる。セガールとアイヒラーは、酵素が結合した（Ｓ，Ｓ）−ＳＡＭ−ｅは生物学的不活発な（Ｒ，Ｓ）−ＳＡＭ−ｅより１０倍堅く、従って硫黄キラルセンターに斬新な結合の立体特異性を示した。他のメチルトランスフェラーゼは、（Ｒ，Ｓ）−ＳＡＭ−ｅを（Ｓ，Ｓ）−ＳＡＭ−ｅと同じ程度で結合することを報告され、従って、（Ｒ，Ｓ）−ＳＡＭ−ｅはその酵素の競合的抑制剤として作動するかもしれない。（Ｓｅｇａｌ  Ｄ  ａｎｄ  Ｅｉｃｈｌｅｒ  Ｄ，  Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ２−０−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｖｏｌ．  ２７５，  Ｎｏ．  ２，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ｐｐ．  ３３４−３４３，  １９８９；  Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ＲＴ  ａｎｄ  Ｗｕ  ＹＳ  ，  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｓｕｌｆｏｎｉｕｍ  Ｐｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９７６，  Ｖｏｌ  １９，  Ｎｏ．  ９，  １０９９−１１０３）
【００２６】
ＳＡＭ−ｅは（その光学的に純粋な鏡像異性体形態又は鏡像異性体またはラセミ混合物であれ）環境温度での安定性の面で一定の困難な問題があり、分子の分解で望ましくない分解生成物が生成する。その分子内部の不安定性は高温でも常温でも分子の不安定および破壊をもたらすので、ＳＡＭ−ｅ（およびその鏡像異性体）をさらに安定化しなければならない。したがって、ＳＡＭ−ｅは、新しい安定した塩を得るに向けおよび工業的規模で実現することができる製造方法の提供に向けの多くの特許の対象となった。本特許は、このようにＳＡＭ−ｅの鏡像異性体形態を安定化するため、既に先行技術に開示されたＳＡＭ−ｅの塩のいずれかを使用することを想定している。
【００２７】
臨床診断分野では近年、容易にかつ正確に測定できる興味のある材料の種類および測定する方法が多くなってきた。過去数十年にわたり、乱用薬物、または関心のある他の生体分子のような多数の物質についての検査が一般的になっている。近年では、抗原と抗体の相互作用に基づくイムノアッセイが広く、この目的のために検討されている。独特の特異性および抗体の高親和性に基づいて、イムノアッセイは、正確かつ精密に生物学的液体中に存在する非常に低い濃度の物質を定量することができる。
【００２８】
したがって、癌および他の疾患の検出、診断方法、および疾患進行の監視方法、ならびに癌および他の疾患のための種々の治療の進捗状況の監視方法の、バイオマーカーとしてのメチル化指数を定量することによる改善が必要である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡ法によって測定された２つのモノクローナル抗体のクローンの力価を示す。ｙ軸はＯＤ４５０の値を示し、ｘ軸は１μｇ／μＬで作った精製腹水の希釈度を示す。
【図２】図２は、異なる競合性の類似体およびＳＡＭを添加した結果を示し、クローン＃８４の 交叉反応は１．２５％未満で測定された。ｘ軸は使用したＳＡＭおよび類似体の一部の濃度を示し、それらの単位はｎＭである。
【図３】図３は、ＡｄａＭ−ＢＳＡでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、競合的ＥＬＩＳＡアッセイで観察されたＳＡＭ、ＳＡＨ、メチオニン、およびアデノシンの異なる抑制能力を示した。ｙ軸は、それぞれの（バックグラウンドを差し引いた後の）ＯＤ４５０値と空白対照の比、Ａ／Ａ０を示している。
【図４】図４は、ＳＡＭを定量化するためのＥＬＩＳＡ標準曲線である。ｘ軸は、ＳＡＭ濃度の対数値である。ｙ軸は、ロジット値である。
【図５】図５は、本発明で改良された、ハプテンの合成プロセスを示す。
【図６】図６は、メチオニン硫黄転移経路を示している。図内の略称は次である。ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸；ＭＳ：メチオニンシンターゼ；ＢＨＭＴ：ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ；ＭＡＴ：メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ；ＳＡＭ：Ｓ−アデノシルメチオニン；ＳＡＨ：Ｓ−アデノシルホモシステイン；ＳＡＨＨ：ＳＡＨ加水分解酵素；ＡＤＡ：アデノシンデアミナーゼ；ＡＫ：アデノシンキナーゼ；ＣＢＳ：シスタチオニンβ合成酵素。
【発明の概要】
【００３０】
本発明は、癌に罹患している哺乳動物における癌の治療を提供するため、以下のステップ：（ａ）癌に罹患している前記哺乳動物の体液試料中のメチル化指数を決定するステップ；（ｂ）前記メチル化指数を前記哺乳動物における疾患の進行に対応付けるステップ；および（ｃ）（ｂ）の結果に基づいて、癌に罹患している前記哺乳動物を治療するための適切な癌治療プロトコルを選択するステップを含む方法を提供する。
【００３１】
メチル化指数は、以下のステップ：（ａ１）前記哺乳動物のＳ−アデノシルメチオニンの濃度を測定するステップであって、（ｉ）サンプルを得る工程；（ｉｉ）Ｓ−アデノシルメチオニンの特異的な抗体と前記試料とを混合する工程；（ｉｉｉ）前記試料中のＳ−アデノシルメチオニンと前記抗体の結合を検出する工程；（ｉｖ）前記試料中のＳ-アデノシルメチオニンの含量の尺度として、前記結合を定量化する工程を含むステップ；（ａ２）公開された文献の手順に従って、Ｓ−アデノシルホモシステインの濃度を決定するステップ；および（ａ３）前記生物試料のメチル化指数を提供するため、（ａ１）／（ａ２）の比を算出するステップ；を含む方法により測定される。
【００３２】
本発明はまた、患者の腫瘍を治療するための癌治療レジメンを決定するため、以下のステップ：（ａ）患者試料におけるメチル化指数を決定するステップ；（ｂ）取得したメチル化指数のレベルと対照のメチル化指数とを比較し、前記メチル化指数のレベルが予測的マーカーであるかどうかを決定するステップ；および（ｃ）メチル化指数値に基づいて腫瘍を治療するための癌治療レジメンを決定するステップを含み、前記メチル化指数値は、患者が応答性の患者または非応答性の患者のいずれかであることを示していることを特徴とする方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、ヒトにおける気分障害を治療するための方法で、以下のステップ：（ａ）前記ヒトにおけるＳ−アデノシルメチオニンの濃度を測定するステップであって、（ｉ）サンプルを得る工程；（ｉｉ）前記試料とＳ−アデノシルメチオニンの特異的な抗体とを混合する工程；（ｉｉｉ）前記試料中のＳ−アデノシルメチオニンと前記抗体の結合を検出する工程；（ｉｖ）前記試料中のＳ−アデノシルメチオニンの含量の尺度として、前記結合を定量化する工程を含むステップ；（ｂ）ＳＡＭｅのレベルを気分障害と対応付けるステップ；および（ｃ）（ｂ）の対応付けの結果に基づいて、前記気分障害の治療に有効な薬物の有効な量を投与するステップを含む方法を目指す。
【００３４】
本発明はさらに、被験者における精神または神経変性障害を診断するため、またはその罹患性を予測するための、（ａ）被験者から１つ以上の生物学的サンプルを得るステップ；（ｂ）前記サンプルのＳ−アデノシルメチオニンのレベルまたはメチル化指数を測定するステップ；および（ｃ）（ｂ）で測定したバイオマーカーのレベルを１つ以上の対照試料の前記バイオマーカーのレベルと比較するステップ；を含み、１つ以上の対照試料と比べ、前記被験者からの試料（複数可）内の２つ以上のバイオマーカーが異常なレベルにあることは精神または神経変性疾患に対する被験者の罹患性を予測していることを特徴とする方法を提供する。
【００３５】
本発明は、また、患者にＳ−アデノシルメチオニンのレベル不足と関連する病気の有無を検出する方法と関し、以下のステップを含む：前記病気を持つ疑いがある、または前記病気を罹患するリスクがある患者を同定するステップ；前記患者から生体試料を得るステップ；Ｓ−アデノシルメチオニンのハプテン性類似体で免疫して生産した抗体を使って、前記生体試料のＳ−アデノシルメチオニンのレベルを測定するステップ；および、前記生体試料のＳ−アデノシルメチオニンのレベルを前記病気の有無と関係づけるステップ。
【００３６】
本発明はまた、Ｓ−アデノシルメチオニンを単独で、または、他の化学療法剤との組み合わせで、ある患者を治療する必要性を評価するための方法であって、以下のステップ：（ａ）そのような治療が必要と疑われる被験者から体液サンプルを収集するステップ；（ｂ）前記サンプル中のＳ−アデノシルメチオニンのレベルを測定するステップ；（ｃ）Ｓ−アデノシルホモシステインのレベルを測定し、メチル化指数を計算するステップ；（ｄ）前記サンプルのメチル化指数を通常の標準のそれと比較するステップ；および（ｅ）メチル化指数がＳ−アデノシルメチオニン治療の必要性を示唆している正常範囲外にあるかどうかを決定するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
本発明は、様々な疾患を煩っている、それらの健康状態の評価が必要な患者におけるアッセイ、診断、治療および医学的評価を提供する。彼らの健康の状態は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳ-アデノシルホモシステインの正確な濃度を提供するアッセイを用いて、評価できる。上記分子の正確な測定を得られたら、人間の健康状態に関連する重要なパラメータであるメチル化指数の計算は可能になる。
【００３８】
本発明のアッセイは、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびその類似体の特異的な抗体を使用する。前記抗体は下式を有するＳ−アデノシルメチオニン・ハプテン、
【化１】
2020125294.tif 000002
その鏡像異性体、ジアステレオマー、鏡像異性的に富化された混合物、そのラセミ混合物、その同位体富化形態、結晶形態、非結晶形態、その非晶質形態、その荷電および非荷電形態、その溶媒和物、その代謝物、およびその塩などに、直接的にまたは間接的に結合された免疫原性物質を含む免疫原を宿主動物に接種するステップ；およびその後、該宿主動物から血清を採取するステップにより用意される。前記式中のＡは、以下からなる群から選択される：
【化２】
2020125294.tif 000003
ＭはＮ、Ｎ  ＋、Ｃ、Ｓ、Ｓ  ＋、セレン、セレン＋、およびＰからなる群から選択される；----は上記で定義されたグループのそれぞれのボンディング位置を表す；
Ｘは、独立して、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2ＮＨ2、ＯＨ、ＯＣＨ3ＮＨ2、ＳＨ、ＣＨＯ、およびＣＮからなる群から選択される；
Ｚは、独立して、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2ＮＨ2、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＳＨ、ＣＨＯ、およびＣＮからなる群から選択される；
ＢおよびＣは、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｄは、独立して、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群から選択される；
Ｙは、独立して、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2ＮＨ2、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＳＨ、ＣＨＯ、およびＣＮからなる群から選択される；
Ｗは、独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＣＨ3、ＣＮ、ＣＨＯ、およびその官能誘導体からなる群から選択される；
前記抗体は、共同所有の米国特許第８３４４１１５号に詳細に記載されている。前記特許は参照によりその全体が本書に援用される。
【００３９】
本発明は、また、共同所有の米国特許第８３４４１１５に記載されるような類似体を用いて、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳ−アデノシルホモシステインに対するマウス・モノクローナルおよびウサギ・ポリクローナル抗体、組換え、ヒト化およびキメラ抗体を提供する。
【００４０】
本発明はまた、ＳＡＭ治療および総体的健康評価の指導および開発などにおいて、モノクローナル抗ＳＡＭおよびＳＡＨ抗体を用いてメチル化指数とＳＡＭのレベルを測定するためのイムノアッセイを提供する。
【００４１】
本発明は、更に、本発明において測定されるメチル化指数を、所定の被験体または多い人口の総体的な健康状態のスクリーン・マーカーとして、使用することに関する。
【００４２】
本発明は、さらに、尿、血清、血漿、全血中のＳＡＭとＳＡＨレベルを測定するための迅速な信頼性の高い安価なイムノアッセイを提供する。半定量法は迅速テストストリップデバイスを使用して開発されている。本発明の実施形態では、膜を抗ＳＡＭ（または抗ＳＡＨ）抗体−色素（コロイド金）抱合体で予備浸漬する。二次抗体を対照ゾーンに固定化される。抗ＳＡＭ（または抗ＳＡＨ）抗体をテストゾーンに固定化される。試料は、膜に沿って移動する。ＳＡＭ（またはＳＡＨ）が存在する場合、抗原−抗体複合体が形成され、テストおよび対照ゾーンの両方の抗体に捕捉され、したがって、ピンク色は両方のゾーンに見られる。ＳＡＭ（またはＳＡＨ）が存在しない場合、抗体−色素複合体は対照ゾーンの二次抗体だけに捕捉され、したがって、ピンクのバンドが対照ゾーンだけに見られる。これはテストが正しく作用していることを示し、テストラインの結果が有効であると考えるべきである。標準液とサンプルを同時に実行し、テストゾーン信号の強度（陽性バンドの色と幅）を標準のものと比較し、ＳＡＭ（またはＳＡＨ）のおよその濃度を判断する。これはＳＡＭ（またはＳＡＨ）を半定量化する方法である。
【００４３】
上記と類似に競合イムノアッセイでは、テストゾーンは、ＳＡＭ（またはＳＡＨ）で固定されています。試料からのＳＡＭ（またはＳＡＨ）は、限られた量の抗体−色素複合体に対して、テストゾーンに固定化されたＳＡＭ（またはＳＡＨ）と競合する。試料からのＳＡＭ（またはＳＡＨ）が多いほど、テストゾーンのピンクラインは薄くなる。試料からのＳＡＭ（またはＳＡＨ）が非常に低いまたは無い時、テストおよび対照両方ゾーンから、２つの強いラインが生成する。
【００４４】
半定量的アッセイは、消費者や患者が疾患の治療としてＳＡＭ−ｅを取る前、ＳＡＭ−ｅで治療中、または治療を中止すべきかどうかを判断するために使用されるのが理想的である。
【００４５】
本発明はまた、哺乳動物の疾患への個別化医療の方法を提供する。この方法は、疾患を有する患者からの体液におけるメチル化指数を測定することを含む、前記体液におけるメチル化指数レベルに基づいて前記哺乳動物に有効の可能性がある治療法を提案する。
【００４６】
本発明はまた、癌と診断された患者における癌治療の有効性を監視するための方法であって、第１の時点での患者におけるメチル化指数レベルを測定するステップと、癌治療で患者を治療するステップと、第２の時点での患者におけるメチル化指数レベルを測定するステップと、癌治療の有効性を決定するために、第１の時点での対象におけるメチル化指数のレベル（複数可）と第２の時点でのレベルとを比較するステップと、を含む方法である。
【００４７】
また、本発明は癌に罹患している哺乳動物における癌の治療を提供するための方法を提供する。前記方法は以下のステップを含む：（ａ）癌に罹患している前記の哺乳動物の体液サンプルのメチル化指数を測定するステップ；（ｂ）前記メチル化指数を前記哺乳動物における疾患の進行と関連付けるステップ；および（ｃ）（ｂ）の結果に基づいて、癌に罹患している前記哺乳動物を治療するための適切な癌治療プロトコルを選択するステップ。この方法は、Ｉ期、又はＩＩ期、またはＩＩＩ期、またはＩＶ期の癌を有する患者から血液サンプルを採取するステップと、ＳＡＭとＳＡＨのレベルを測定するステップと、メチル化指数を計算するステップ、メチル化指数を癌のステージと関連付けるステップと、前記哺乳動物を治療するための適切な治療プロトコルを選択するステップと、を含む。
【００４８】
また、本発明は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ抑制剤が癌治療においての適応性と有効性を判断するのに有用である。メチル化指数は、特定の器官または組織において特定のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）抑制剤の機能の状況、範囲および特異性を評価する最適なツール又は手段である。従って、本発明の成果として開発された測定方法によるメチル化指数の測定は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ抑制剤の有効性の評価に使用することができる。
【００４９】
本発明はさらに以下のことを提供する。
１．指導されたＳＡＭ−ｅ治療
軽度から中度のうつ病、変形性関節症（非ステロイド性抗炎症薬よりも良い）、線維筋痛症の治療においてＳＡＭ−ｅが有効の研究とＳＡＭ−ｅが無効の研究の両方が報告されている。その最も可能性のある理由は、ほとんどの他の疾患や治療に似ている。すなわち、ある特定の患者は、他の患者と違って、ＳＡＭ−ｅを使用する良い候補ではない。患者が特定の薬を使用する良い候補であるかどうかを事前に確認するために、いくつかの測定を実行する必要がある。出願人は、疾患を治療するためＳＡＭ−ｅを使用する前に、血液または尿サンプル中のＳＡＭのレベルを測定することが望ましいことを発見した。
【００５０】
ＳＡＭ−ｅでの補助治療は、種々の疾患、例えば、肝障害、Ｂ１２または葉酸欠乏症、癌、レボドパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）を服用するパーキンソン病患者において、既に受け入れられている。その原因はこれらの疾患は体内のＳＡＭレベルを低下させる可能性がある。ＳＡＭのレベルが実際に減少しているかどうかを確認するために、最善の方法は、直接血漿中のＳＡＭのレベルを測定することである。ＳＡＭレベルは治療や病気そのものによる低下してしまう他の状況も存在する。治療薬中ＳＡＭ−ｅを含むかどうかに関わらず、ＳＡＭのレベルを監視することは治療の全体的な有効性を改善するのに非常に重要である。うつ病、変形性関節症、線維筋痛症、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、肝疾患、滑液包炎、腱炎、慢性腰痛、多発性硬化症、脊髄損傷、片頭痛、鉛中毒、および老化を遅くするなどの治療の最中に、ＳＡＭレベルが特定の許容レベルを下回る場合、ＳＡＭ−ｅを適切な投与量で補うことが全体的な治療に利益をもたらす。治療がまだ開始されていないケースについて、もしＳＡＭ不足が検出されたら、上記疾患のためＳＡＭ−ｅを静脈注射（ＩＶ）投与すれば、症状を素早く緩和するだろう。
【００５１】
一方、薬物または食品とＳＡＭｅの相互作用に関する情報は非常に有限で、より重要な精神と心血管系の副作用の危険性がないわけではないことから、消費者がプライマリ・ヘルスケア・プロバイダーと十分な議論が行われるまで、この栄養補助食品の監視されていない消費を避けるように指示する必要がある（Ｆｅｔｒｏｗ，  Ｃ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ３５  ｎｏ．  １１  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００１）：  １４１４−１４２５）。ＳＡＭｅを処方された抗うつ剤と一緒に服用することは、相当危険なセロトニン症候群を引き起こす可能性がある。米国特許第８３４４１１５号に説明したように、ＳＡＭのイムノアッセイは、臨床ラボや患者自身がＳＡＭのレベルを素早くに見つけるための最良の方法である。特許に記載のイムノアッセイは、高価な設備を用いることなく、簡単に敏感な、迅速である。アッセイの間で同等な結果が得られる。また、血漿中の正常なＳＡＭ濃度は、主に性別（通常、男性＞女性）、個人の体重に応じて、また、おそらく民族、食事、健康状態、薬を服用しているか否かにもよって、異なる。ゆえに、個別化された、指導のあるＳＡＭ−ｅの投与において、最良の治療結果を達成するために、ＳＡＭのレベルを監視することが重要である。
【００５２】
２．病気発展と予後におけるメチル化指数
メチル化指数はＳＡＭの濃度対ＳＡＨの濃度の比率として定義される。特定の状況下においては、ＳＡＭ自体のレベルの代わりに、メチル化指数を使用することが重要であり、より正確である。理由は、（１）ＳＡＨ＋はメチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）後のＳＡＭのメチル化反応の直接最終生成物である。メチオニン硫黄転移経路は図６に描かれている。他の酵素が一方通行であるのに対し、ＳＡＨＨは可逆酵素で、ＳＡＨＨ反応の平衡ダイナミクスはホモシステインの合成より、強いＳＡＨの合成に傾く（ＳＪ  Ｊａｍｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒｉ．１３２：２３６１Ｓ−２３６６Ｓ，  ２００２）。ＳＡＨの蓄積はメチルトランスフェラーゼの活性を抑制し、ゆえに、ＳＡＭのレベルを低下させる。細胞中のメチル基の唯一のドナーとして、ＳＡＭはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、リン脂質、神経伝達物質、ペプチド、ホルモン、などにメチル基を提供すると、ＳＡＨが生成される。したがって、ＳＡＭ／ＳＡＨは、メチル化反応をより高感度かつ正確に反映し、特にＳＡＭ変動が微妙な場合の、生体臓器中の重要な分子のメチル化状態／レベルの直接かつ正確な指標である。（２）ＳＡＭのレベルは、人種、性別、体重および食事などに応じて変化する。メチル化指数は、これらおよび他の要因に起因する変動を低減することができる。
【００５３】
癌が遺伝的な病因を持つだけでなく、エピジェネティック疾患と考えられている。ＤＮＡメチル化は、最も重要なエピジェネティック修飾の一つである。ますます多くの発見は一度無視されたエピジェネティックの多くの生命現象における影響の重要性を明らかにした。これは、癌におけるメチル化の影響は、我々が今日知っているものより、もっと重要かつ深刻であろうと示唆する。癌細胞におけるＤＮＡメチル化のレベルは、癌発生の異なる段階で変化する。癌において異常なＤＮＡメチル化は一般的に、ゲノム全域にわたるハイポメチル化と局所のハイパーメチル化の特別な形式で発生する。グローバルのＤＮＡハイポメチル化は、ｃ−ＪＵＮ、ｃ−ＭＹＣ、およびｃ−Ｈａ−Ｒａｓのような癌原遺伝子の活性化、およびゲノムの不安定性の生成と関連している。腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域に位置するＣｐＧアイランドのハイパーメチル化は転写サイレンシングとゲノムの不安定化を招く。ＣｐＧハイパーメチル化は、遺伝子の不活性化を引き起こす遺伝子突然変異の代替および／または相補的なメカニズムとして作用し、それは現在、発癌における重要な機構として認識されている。そのプロモーター領域に位置するＣｐＧアイランドのＣｐＧアイランドハイパーメチル化による腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３遺伝子）の不活性化は、癌の進行と予後不良に関連している。研究の結果は、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるメチル化パターンの治療および化学予防の両方においての有意性を確認し、効率的にＨＣＣの発症および進行を抑制するために、本研究で同定されたものを含む、分子標的を使用する可能性を開いた（Ｄｉｅｇｏ  Ｆ．  Ｃａｌｖｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７；１１７（９）：２７１３−２７２２．）。
【００５４】
ＤＮＡのメチル化のレベルを低下させる薬物−脱メチル化剤は、癌を治療するための有望な化学療法薬として、使用されており、さらに多くが検討されている（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  Ｍ．  “ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｓ．”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００５  Ｊａｎ；１７（１）：５５−６０．）。
【００５５】
本発明の文脈において、「癌」または「腫瘍」は、初期の腫瘍および任意の転移を含む、患者における任意の腫瘍性増殖を含むことが意図される。癌は、液体または固形腫瘍型であることができる。液性腫瘍は、血液学的起源の腫瘍、例えば、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、白血病（例えば、ワルデンシュトレーム症候群、慢性リンパ球性白血病、他の白血病）、およびリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）を含む。固形腫瘍は器官に由来し、例えば、肺、乳房、前立腺、卵巣、結腸、腎臓、および肝臓などの癌が含まれる。本明細書で使用される場合、腫瘍細胞を含む癌細胞は、異常な（増加した）速度で分裂する細胞をいう。癌細胞は、これらに限定されないが、扁平上皮癌、基底細胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、未分化癌、気管支癌、黒色腫、腎細胞癌、肝癌−肝細胞癌、胆管癌、乳頭癌、移行上皮癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、乳癌、消化管癌、結腸癌、膀胱癌、前立腺癌、および首と頭領域の扁平上皮癌などの癌腫；線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、腱肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫と中皮腫などの肉腫；骨髄腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、顆粒球性白血病、単球性白血病、リンパ性白血病）、およびリンパ腫（例えば、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、細網細胞肉腫、またはホジキン病）などの血液癌；そして、神経膠腫、髄膜腫、髄芽腫、神経鞘腫や上衣腫などの神経系の腫瘍を含む。
【００５６】
３．胚発生と人間の総体的な健康におけるメチル化指数
ＳＡＭおよびＳＡＨのレベルは、ＤＮＡのメチル化のレベルに影響を与えることによって、体細胞胚形成の制御に関与することができ、遺伝子の活性化における特異な変化を引き起こす可能性がある。ＳＡＭのレベルの上昇は、胚発生の進行と完全な胚の発育の前提条件である可能性がある（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃａｒｒｏｔ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．”  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９３，  Ｉｓｓｕｅ  １，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：  ９  ＯＣＴ  ２００８）。
【００５７】
一般的なヒトの健康評価およびスクリーニングにおけるメチル化指数
メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）は、ヒト疾患の発症に重要な役割を果たしている。統合失調症の原因に関連するドーパミン（ＤＡ）仮説は、統合失調症患者の活動しすぎるＤＡ経路を記述している。カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、中枢神経系におけるＤＡを減生する。ＣＯＭＴは、統合失調症の治療のための基礎を築く（Ｒｅｎｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  “Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃａｔｅｃｈｏｌ  ｏｒｔｈｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｄｒｅｎａｌ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．”  Ａｒｃｈ  Ｉｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  １９６０  Ｍａｙ；  ６８：５３４−７．）。人間の機能に重要な様々な物質に作用するＭＴは３０以上の異なる種類がある。
【００５８】
メチル化指数は、ヒトの総体的な健康の重要な指標／マーカー、「活力」インジケータ、または「ウェルネス」のマーカーと考えられている。
【００５９】
また、血漿中のＳＡＭの正常濃度は、性別（通常、男性＞女性）、個人の体重、そしておそらく民族／人種、および食事などに応じて、大幅に異なるように思われる。ＳＡＭとＳＡＨは代謝に密接に結びついているので、同様の依存性は、ＳＡＨ濃度にも存在する。［ＳＡＭは］と［ＳＡＨ］の比を利用することにより、これらの変数を排除または減少させることができる可能性がある。
【００６０】
心血管疾患、うつ病、がん、およびアルツハイマー病などの老化関連疾患へのＳＡＭとＳＡＨの関連は十分に立証されている。メチル化は主に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびヒストンのメチル化を介したて、胎児の成長に、分化に、タンパク質の発現のエピジェネティック制御に非常に重要である。Ｓ−アデノシルメチオニンおよびメチル化能力指数の評価は、「活力」インジケータまたは「ウェルネス」のマーカーとしての科学的根拠がある。
【００６１】
本発明は、以下を提供するため、特に重要である。
１．すべてのタイプのバイオサンプルのメチル化指数の直接、正確かつ定量的な測定。
２．すべてのタイプの研究室の設備でメチル化指数を直接、正確かつ定量的な測定。
３．総体的な健康状態の評価、癌予測と予後、すべての病気の（ＳＡＭ−ｅの有り無しでの）治療の評価に関してのメチル化指数の直接、正確かつ定量的な測定。
４．癌の鑑別診断に関してのメチル化指数の直接、正確かつ定量的な測定。
５．癌患者における化学療法耐性に関してのメチル化指数の直接、正確かつ定量的な測定。
６．胎児の発育、分化および老化プロセスの評価に関してのメチル化指数の直接、正確かつ定量的な測定。
７．クレーム１−６に説明した理由に関連して、消費者により便利に、簡単に使用するためのストライプや他のメディアでのメチル化指数の半定量的および定性的な免疫測定法。
８．様々な状況や病気のために店頭または処方されたＳＡＭｅを服用する消費者により便利に、簡単に使用するためのストライプや他のメディアでのＳＡＭの半定量的および定性的な免疫測定法。
９．消費者により簡便かつ簡単に使用するためのストライプや他のメディアでの尿と血液サンプルのＳＡＭの半定量的および定性的な免疫測定法。
１０．さまざまな理由や目的のためにＳＡＭ−ｅの指導下服用に関してのＳＡＭの定量分析。
【００６２】
また、本発明は、ＳＡＭ−ｅおよびＳＡＭ−ｅと複数の治療薬との組み合わせでの治療を提供する。本発明は、ＳＡＭ−ｅと他の治療法との組み合わせを意図している。
【００６３】
本発明はまた、ＳＡＭに対する抗体を作製するために使用されるアザアデノシル（デアミノ）メチオニン（Ａｚａａｄｅｎｏｓｙｌ（ｄｅａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）・ハプテンを製造するための改良した合成法を提供する。合成方法は、以下のスキーム１および図５に概説される。
【００６４】
【化３】
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【００６５】
本発明の方法を実施する際に、血液サンプルは、所定の疾患状態を有する患者から採取され、本発明の方法に従って生み出したＥＬＩＳＡ法および抗体を使用して、ＳＡＭとＳＡＨレベルについて分析される。ＥＬＩＳＡアッセイ・フォーマットは、次のとおりである。
【００６６】
フォーマット１：
（１）サンプルまたはキャリブレータ（複数可）、（２）抗体、（３）ハプテン−酵素抱合体、（４）二次抗体でコーティングされたストリップ／マイクロタイタープレート（二次抗体の例：ヤギ抗マウス抗体またはヤギ抗ウサギ抗体）、（５）洗浄溶液、（６）基質（複数可）、（７）停止試薬（「エンドポイント」モードが使用されている場合は随意で、「速度」モードに停止試薬の必要はない。）
【００６７】
フォーマット２：
（１）サンプルまたはキャリブレータ（複数可）、（２）抗体、（３）二次抗体−酵素抱合体、（４）免疫原（ハプテン−キャリアタンパク質）コーティングされたストリップ／マイクロタイタープレート、（５）洗浄溶液、（６）基質（複数可）、（７）停止試薬（「エンドポイント」モードが使用されている場合は随意で、「速度」モードに停止試薬の必要はない。）
【００６８】
フォーマット３：
（１）ある分子の２つの異なるエピトープに対する対になる二つの抗体、（２）サンプルまたはキャリブレータ（複数可）、（３）（１）の抗体の一つは酵素と抱合した。（４）洗浄溶液、（５）基質（複数可）。（６）停止試薬（「エンドポイント」モードが使用されている場合随意で、「速度」モードに停止試薬の必要はない。）
【００６９】
本発明は、また、ＳＡＭの免疫学的検出のため、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ検査）に基づいてのＳ−アデノシルメチオニンに対する抗体などを含まれている検査キットを提供する。ＥＬＩＳＡ検査キットは、上記のＥＬＩＳＡフォーマットのいずれかであることができる。例えば、以下の成分：（ａ）固相に結合された二次抗体；（ｂ）固定化されたハプテン、ハプテン誘導体、免疫原または類似体；（ｃ）固体又は溶解した形の酵素基質（複数可）；（ｄ）標識ハプテンまたはその誘導体（トレーサーまたは酵素）；（ｅ）緩衝および洗浄溶液；（ｆ）非特異的吸着および凝集などを防止するための添加剤；（ｇ）ピペット、インキュベーション容器、参照標準、較正曲線、およびカラーテーブル。
【００７０】
ＳＡＭおよびＳＡＨのレベルが決定されると、メチル化指数を計算し、個体の健康状態を判断するために応用する。
【００７１】
１１の健康な個体からの測定値に基づいて、一般的には、ＳＡＭの平均レベルが約１４７±１６ｎＭで、ＳＡＨレベルは２９±１１ｎＭでした。メチル化指数は５＋１でした。通常メチル化指数が４以上である。
【００７２】
がん患者のＳＡＭの平均レベルは、１０３±５２ｎＭでした。
【００７３】
アテローム性動脈硬化症の患者さんにＳＡＭの平均レベルは１１３±１５ｎＭでした。ＳＡＨに対するウサギモノクローナル抗体を用いてのＳＡＨ定量ＥＬＩＳＡの予備的な結果は、実質的により高いＳＡＨのレベルを示した。したがって、ＳＡＭ／ＳＡＨは、アテローム性動脈硬化症の患者において有意に低減された。
【００７４】
肝疾患の患者の血漿中のＳＡＭの（２６サンプルからの）平均レベルは４５±８ｎＭで、正常な人よりはるかに低い。
【００７５】
ＳＡＭとＳＡＨレベルの比を算出し、メチル化指数と呼ぶ。これは、ＳＡＭまたはＳＡＨのいずれかの単一の値と比べ、一般的な健康、病気の状態、発展および予後を評価するためのより正確かつ説得力のある尺度である。通常、メチル化指数は＞４である。いくつかの病理学的な状況では、ＳＡＭのレベルを減少し、ＳＡＨレベルを増加させるため、これは４未満、またはさらに１未満までに下がる。次に、減少したメチル化指数は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ホルモン、神経伝達物質、などの多くの重要な分子のメチル化プロセスに影響を与える。
【００７６】
メチル化指数は、化学療法プロトコルを決定するために使用される。有意に減少したメチル化指数レベルを有する癌患者は、より積極的なプロトコルを用いて治療されている。メチル化指数は各患者に適切な治療を選択するために、癌の病期と対応付けている。
【実施例】
【００７７】
（発明を実施するための形態）
以下の実施例は、本発明の方法および治療組成物の有用性を実証することを意図しており、いずれにせよ本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
［実施例１］
ＳＡＭとＳＡＨに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の生成
【００７８】
試薬と略称：
ＡｄａＭ：アザアデノシル（デアミノ）メチオニン、
ＡＳＡＭ：アザ−ＳＡＭ、または窒素（Ｎ）−アデノシルメチオニン、
ＢｇＧ：ウシガンマグロブリン
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＢＴＧ：ウシサイログロブリン
ＣＳＡＭ：炭素（Ｃ）−アデノシルメチオニンまたはＳ−６−メチル−６−デアミノシネフンギン
ｄａＨ：デアミノ−５−アデノシルホモシステイン
ｄａＨＳＯ：ｄａＨスルホキシド
ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＥＤＡＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検定法
ＧＡＭプレート／ストリップ：ヤギ抗マウスＩｇＧ被覆したマイクロプレートまたはストリップ
ＧＡＲプレート／ストリップ：ヤギ抗ウサギＩｇＧ被覆したマイクロプレートまたはストリップ
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＢ：インキュベーションバッファー
ＫＬＨ：Ｋｅｈｏ  ｌｉｍｐｅｔ  ヘモシアニン
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＲＴ：保持時間（ＨＰＬＣ用）、または室温
ＳＡＨ：Ｓ−アデノシルホモシステイン
ＳＡＭ：Ｓ−アデノシルメチオニン
【００７９】
１．ＡｄａＭ−ＮＨＳの調製：一晩真空乾燥したＡｄａＭ（１５．１ｍｇ、約０．０４１ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、２１．７ｍｇ（０．１０７ｍｍｏｌ）のＤＣＣと、７．２ｍｇ（０．０６１ｍｍｏｌ）のＮＨＳとを、添加した。固体塊は、真空ラインに放置し、３〜４時間乾燥した。約１．５ｍＬの乾燥ＤＭＦを窒素雰囲気下でフラスコに添加し、次いでフラスコを密封した。この溶液を室温で一晩撹拌した。（１０％メタノールを含むジクロロメタン溶液での）ＴＬＣ分析で、ＮＨＳエステルの形成を示した。
【００８０】
２．ＡｄａＭ−ＢＳＡの調製：５９．８ｍｇのＢＳＡを量り分け、丸底フラスコに入れ、５ｍＬの新たに調製した１００ｍＭのｐＨ８．２５のリン酸ナトリウム溶液を追加した。そのＢＳＡ溶液を４℃の水浴中に置いて激しく撹拌する。上記のように用意されたＡｄａＭ−ＮＨＳを数分ごとに１０μＬアリコートでゆっくり添加した。合計１５０μＬを加えた後、このコンジュゲート混合物は旋転する曇状となった。溶解を助けるためにＤＭＳＯ溶液を１ｍＬ添加した。また５０μＬのＡｄａＭ−ＮＨＳをＤＭＦ中に添加すると、混合物は再び濁った。その後、ＡｄａＭ−ＮＨＳを１０μＬの５回加えたごとに、５分間の水浴超音波を適用した。ＤＭＦに合計ＡｄａＭ−ＮＨＳ１５０μＬを添加した後、混合物を２０分間の超音波で処理した。抱合体に如何なるハプテンも含まないことを確保するために、プールをＰＢＳ（１．５リットル×４）に対して２日間透析した。コンジュゲートの最終容量は約３６ｍＬで、ＢＳＡ濃度は推定１．６６ｍｇ／ｍＬである。
【００８１】
３．ＡｄａＭ−ＫＬＨの調製：上記の方法を用いて、１７．５ｍｇのＫＬＨ、１５．１ｍｇのＡｄａＭを量り分ける。透析後の最終容量は２９．５ｍＬで、濃度は０．６ｍｇ／ｍＬである。
【００８２】
４．ＡｄａＭ−ＰＬＬの調製：４．７２ｍｇのＡｄａＭを１ｍＬのＤＭＦに溶解し、６．５ｍｇのＥＤＣ．ＨＣｌと４．０ｍｇのＮＨＳを添加し、次いで、混合物を十分に密封し、室温の暗所で一晩中撹拌した。１．５ｍｇのＰＬＬを量り分け、１ｍＬのｐＨ８．２の１０ｍＭのＰＢＳで溶解した。活性化されたＡｄａＭはその後ＰＬＬ溶液にゆっくりと添加し、混合物を暗所で一晩放置した。その反応混合物をｐＨ７．３の１０ｍＭのＰＢＳで４８時間透析した。透析後の最終容量は３．５ｍＬで、１．４ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【００８３】
５．ＳＡＨ−ＢＳＡの調製：３．８ｍｇのＳＡＨ（Ｓｉｇｍａ）を１．５ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、１０ｍｇのＥＤＣ．ＨＣｌと４．５ｍｇのＮＨＳを添加し、混合物を十分に封止し、室温の暗所で２４時間撹拌しました。１２．９ｍｇのＢＳＡを量り分け、２ｍＬの１０ｍＭのｐＨ７．８のＰＢＳで溶解した。ＳＡＨ溶液をＢＳＡ溶液にゆっくりと添加し、混合物を撹拌とともに４℃暗所で一晩放置した。反応混合物を１０ｍＭのｐＨ７．３のＰＢＳで７２時間透析した。透析後の最終容量は８．４ｍＬで、１．４ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【００８４】
６．ＳＡＨ−ＰＬＬの調製：ＳＡＨ１．５ｍｇを１ｍＬのＤＭＦに溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ４ｍｇとＮＨＳ２ｍｇを加え、次いで混合物をよく密封し、室温暗所で一晩撹拌した。１．５ｍｇのＰＬＬを量り分け、４．７ｍＬの５０ｍＭのｐＨ９．６のＰＢＳで溶解した。その後、活性化されたＳＡＨをＰＬＬ溶液にゆっくりと添加し、混合物を暗所で一晩放置した。その反応混合物を１０ｍＭのｐＨ７．３のＰＢＳで４８時間透析した。透析後の最終容量は７．０ｍＬで、０．９３ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【００８５】
７．ＳＡＭとＳＡＨに対するモノクローナル抗体を生成するための一般手順：
マウス・モノクローナル生成はＫｏｌｈｅｒ氏とＭｉｌｓｔｅｉｎ氏の先駆的な仕事で開発された手順（Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５−４９７，  １９７５）に基づいての一般的な方法である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、モノクローナル抗体の免疫化および腹水の生成に使用した。複数部位に皮下注射（１ｍＬの総体積）で免疫を行った。最初の注射は完全フロイントアジュバントとＡｄａＭ−ＢＳＡの１：１の混合物、およびＰＢＳ中に乳化したＡｄａＭ−ＫＬＨコンジュゲートソリューションを使用する。その後の注射は不完全フロイントアジュバントを使用する。
【００８６】
免疫した動物から定期的に血液を採取し、細胞を遠心分離により除去した。その後、このようにして得られた抗血清の免疫応答および抗体力価を検査した。用途により、抗体を直接使用することができる。必要に応じて、それらはさらに、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムまたはプロテインＡカラム・クロマトグラフィーなどを用いて、免疫グロブリンレベルに精製することができる。
【００８７】
モノクローナル抗体については、そのクローンが得られた後、腹水生産のために、それを宿主に注入することができる。次いで、プロテインＡ親和性カラムにより腹水から抗体を精製した。また、抗体を生成するために、中空繊維法でハイブリドーマ・クローンを培養することができる。
【００８８】
マウスは、実験終了する３日前に、静脈注射で免疫原（刺激）を与えた。マウスの脾臓を回収し、フレンチプレスで均質化した。脾臓細胞を骨髄腫ＮＳ−１細胞と５：１の比で融合させた。融合した細胞懸濁液は、その後、９６ウェルマイクロタイタープレート上に播種した。ハイブリドーマを１８％ウシ胎児血清、ＨＡＴおよびＨＴサプリメントで強化されたＲＰＭＩ１６４０で成長させ、スクリーニングした。ＡｄａＭ−ＰＬＬ抱合体に陽性なクローンをさらなる研究のために選択した。最終的な選択は、アッセイの表現および 交叉反応性・プロフィールに基づいた。選択されたクローンは、その後、腹水を生成するためにマウスに注射した。
【００８９】
シリアルスクリーニングおよび選択によって、私たちはより良い特異性がある、他の類似体と交差反応の少ないいくつかのクローンを同定した。２つのモノクローナル抗体の力価を検査し、結果を図１に示した。
【００９０】
８．ＳＡＭとＳＡＨに対するウサギのポリクローナル抗体
ニュージーランドホワイト・ウサギをポリクローナル抗体の生成のために使用した。免疫を、複数部位に皮下注射（１ｍＬの総体積）で行った。免疫方法は、モノクローナル生成のためにマウスを免疫した場合と同じである。回収した前、ウサギ抗血清を検査した。その力価は、抗ＳＡＭも、抗ＳＡＨ血清も１：１２０００を超えた。
［実施例２］
抗体特異性
【００９１】
さらに、クローンの特異性を検査する。クローン＃８４の交差反応が非常に低くて、＜１．２５％である（図２を参照）。 交叉反応に使用される三つの類似体はＳＡＨ、メチオニンおよびアデノシンである。競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＳＡＭより約８０倍高い用量の類似体を使用した。ＳＡＨ、メチオニンおよびアデノシンの１０μＭの投与量で、コーティングされた抗原との競合が発生しなかった。しかし、３つの類似体に抑制は見られなかった一方、類似体よりはるかに低い投与量でＳＡＭを添加した場合、抑制は明らかに示した。図２から理解し得るように、ＳＡＭによる抑制は、この実験で見られた約４０％より、簡単に高くなることができる。
【００９２】
クローン＃１１８のＳＡＨ、メチオニンおよびアデノシンとの交差反応も非常に低い（図３）。競合ＥＬＩＳＡにおいて、同じ投与量のＳＡＭ、ＳＡＨ、メチオニンおよびアデノシンを使用した。結果として、遊離ＳＡＭはＡｄａＭ−コーティングされたマイクロタイタープレートにモノクローナル抗ＳＡＭ抗体の結合を大きく抑制したが、ＳＡＨ、メチオニン、およびアデノシンはしなかった。
［実施例３］
競合ＥＬＩＳＡアッセイ
【００９３】
試薬：
ＩＢ：１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、０．１％トゥイーン２０、０．１％プロクリン、ｐＨ７．４。サンプル：（ａ）ＳＡＭトルエンスルホナート（トシラート）二硫酸塩（Ｓｉｇｍａ社）；（ｂ）ＳＡＨナトリウム（分子量４０６．３９）；（ｃ）アデノシン（Ｓｉｇｍａ社）；（ｄ）メチオニン（Ｓｉｇｍａ社）。ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＥａｒｔｈＯｘ、サンフランシスコ、ＣＡ）。ＨＲＰ基質：単一試薬基質溶液ＮｅＡ-Ｂｌｕｅテトラメチルベンジジン基質。抗原希釈緩衝液：０．５％ＢＳＡを含むＩＢ。コーティング緩衝液：５０ｍＭの炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６。洗浄バッファー：ＰＢＳ、ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０。
【００９４】
（１）ＡｄａＭ−ＢＳＡコートしたマイクロプレートをブロットし、デカントし、その後、競合的ＳＡＭ、ＳＡＨ、メチオニン、及びアデノシンを、４０μＬの抗原希釈緩衝液にて添加した。０．０２５μｇ／ｍＬの精製ＳＡＭに対するモノクローナル抗体４４μＬとＩＢ＋トリス緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）１６μＬを加え、一緒に３７℃で１〜２時間インキュベートした。
（２）マイクロタイタープレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、吸い取り乾燥した。
（３）次いでに、各ウェルに、適切に希釈したＨＲＰヤギ抗マウス抗体を１００μＬ添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。
（４）その後、アッセイ混合物をデカントし、洗浄し、吸い取り乾燥した。
（６）各ウェルにＨＲＰ基質を１００μＬ／ウェルを添加し、１０〜１５分間インキュベートした。
（７）５０μＬ／ウェルの２Ｎ硫酸で基質反応を停止する。
（８）ＯＤ４５０を記録した。
【００９５】
生体試料中のＳＡＭを定量するために、競合ＥＬＩＳＡを開発した。
競合ＥＬＩＳＡでのＳＡＭとＳＡＨの競合ＥＬＩＳＡの標準曲線は、図４に示されている。
ロジットは、Ｌｎ（Ａ／Ａ０）／（１−Ａ／Ａ０）で定義され、Ａはサンプルまたは標準のＯＤ４５０値で、Ａ０が対照ウェルのＯＤ４５０値である。負のロジット値は、Ａ／Ａ０が５０％未満で、抑制率（１−Ａ／Ａ０）が５０％以上であることを示し、異常な状況で、正常に評価されるべきではない。
【００９６】
標準物１２．６０ｍｇを正確に秤量し、少量のＤＭＦに溶解し、次いで２５０ｍＬのフラスコで０．１ｍＭのＨＣｌに十分に溶解させた。それから、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、０．６２５μｇ／ｍＬ、０．３１２５μｇ／ｍＬ、および０．１５６２５μｇ／ｍＬの標準溶液を、それぞれ１００ｍＬのフラスコで作った。
【００９７】
［実施例４］
ＨＲＰ抱合モノクローナル抗体＃８４を作成した。別のモノクローナル抗体クローンはクローン＃８４と対になって、ＳＡＭのレベルを定量化するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを実現する。
【００９８】
［実施例５］
（血液サンプルの採取手順）
血液サンプルは、同意を得た正常のヒト及び患者から採集した。末梢静脈血をＥＤＴＡチューブに採取した。試験管を直ちに４℃で冷却し、採血後３０分以内に２０００ｇ以上で１０分間遠心分離し、血漿を得た。ＳＡＭとＳＡＨを測定するサンプルに、１００μＬ血漿に対して約１０μＬの１Ｎ酢酸を加えた。プラズマは、測定に使用されるか、または将来の使用のために−７０℃下で凍結した。血漿を除去した後の全血細胞のアリコートも、ＳＡＭとＳＡＨを測定するために、またはＤＮＡを作るために用意した。いくつかの状況では、白血球を全血細胞から単離し、将来ＤＮＡを抽出するために凍結した。
【００９９】
［実施例６］
前述したように、通常の体格がある、年齢が２０〜５０歳の正常のアジア男性と女性１１人からの血液のＳＡＭとＳＡＨサンプルを直接競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。ＳＡＭの平均値は１４７±１６ｎＭで、ＳＡＨは２９±１１ｎＭで、メチル化指数は約５±１であった。より多くのサンプルを収集している。イムノアッセイによって検出されたＳＡＭとＳＡＨ値は、人種、年齢、性別、体重、食事、ライフスタイルなどに着目した血漿中ＳＡＭとＳＡＨレベルに関する大規模研究を行うために使用される予定である。ＳＡＭ／ＳＡＨに関する大規模疫学研究を実行し、以下および本発明の本文に記載した様々な疾患の状況と比較した後、メチル化指数は真新しい総体的ヘルスインディケーターとして使用される可能性がある。
【０１００】
［実施例７］
血液サンプルは、化学療法のために入院した癌患者から得た。サンプルは、ＳＡＭおよびＳＡＨレベルについて直接競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。がん患者の１２サンプルからのＳＡＭの平均レベルは１０３±５２ｎＭで、ＳＡＨレベルが２５０±９０ｎＭであった。平均メチル化指数は０．５未満であった。人間のメチル化指数およびそれと異なるレベルの癌の様々な側面との関係の完全なプロファイルを生成するために、診断内容、症状、癌の段階、進行、治療、再発および予後情報を含むより多くのサンプルや観測が行われている。血液サンプルは、また、化学療法前および後の他のタイプの癌の様々な患者から採取している。ＤＮＡメチル化レベルは、同様に、白血球から測定される。癌患者からの特定のＤＮＡメチル化の障害とメチル化指数またはグローバルＤＮＡメチル化との関係は、健康の状態および治療プロトコルにさらに影響を与えることが期待される。
【０１０１】
［実施例８］
血漿は、アテローム性動脈硬化症の障害および心臓発作（集中治療室の患者）を有する患者から得られ、次いで、（市販のＥＬＩＳＡキットを使用して）直接競合ＥＬＩＳＡアッセイおよびホモシステインで、ＳＡＭ／ＳＡＨを分析した。このような患者１０例の血液サンプルから、検出されたＳＡＭの平均レベルは１１３±１５ｎＭで、ＳＡＨは６８０±２５８ｎＭであった。ウサギモノクローナルＳＡＨに対する抗体（ａｂ１１１９０３、ａｂｃａｍ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いたＳＡＨ定量的ＥＬＩＳＡの予備的結果は、心臓発作患者のレベルが有意な増加を示した。冠動脈、脳、および末梢血管のアテローム性動脈硬化症を持つ患者においてのＳＡＭ／ＳＡＨの有意の減少、およびそれと心血管死亡率の予測因子として考えられていたホモシステインのレベルとの関係を示すために、より多くのデータが生成されている。心臓発作の予後およびその治療効果の評価において、ＳＡＭ／ＳＡＨはホモシステインよりも良いかつ直接的な指標である可能性がある。
【０１０２】
［実施例９］
伝染性肝炎（何人かは、胆汁うっ滞など胆汁の問題も付随した）、肝硬変、線維症などの肝臓障害を有する患者から血液サンプルを採集し、その後、直接競合ＥＬＩＳＡでＳＡＭとＳＡＨレベルについて分析した。２６サンプルからの血漿中のＳＡＭの平均レベルは４５±８ｎＭであった。肝疾患におけるＳＡＭのレベルは、正常な人よりもはるかに低かった。ＳＡＨレベルは、しかし、普通の人より高くて、３４２±１２９ｎＭであった。メチル化率は約０．１３であった。
【０１０３】
［実施例１０］
うつ病と診断された患者から血液サンプルを得た、その後、次のようにＳＡＭについて分析した。
【０１０４】
明らかな臓器損害または疾患のないうつ病患者らの血液サンプルを第二湘雅医科大学病院精神健康医学研究所から、いくつかの臓器疾患が伴ううつ病患者らの血液サンプルを第二寧波病院神経科およびリハビリテーション科から、それぞれ採集した。我々は、特にうつ病の治療の前と後にＳＡＭ−ｅまたは他の薬を服用するうつ病患者のＳＡＭとＳＡＨのレベルを比較した。１０サンプルから、ＳＡＭのレベルは２０±１８ｎＭで、ＳＡＨは３４０±１８０ｎＭであった。メチル化指数は約０．０６４であった。
【０１０５】
ＳＡＭまたはメチル化指数は、うつ病の個別化治療するための良い指標となり、予後予測にも助ける可能性がある。定性的および半定量的ＳＡＭの迅速なテストストリップはＳＡＭ−ｅまたは他の抗うつ薬を服用するかどうかを判断する必要がある患者の利用できる便利な選択肢である。これは患者に最もっとも適切な薬の選択を指導するのに役立つ。
【０１０６】
［実施例１１］
血液サンプルは、パーキンソン病を有する患者から採集した後、次のようにＳＡＭについて分析した。
【０１０７】
第２寧波病院神経科・リハビリテーション科からパーキンソン病と診断された患者の血液サンプルはこの研究に含まれる。血漿中のＳＡＭとＳＡＨのレベルは、本発明で開発されたイムノアッセイを用いて測定する。
【０１０８】
［実施例１２］
血液サンプルは、関節リウマチおよび多発性硬化症を有する患者から得られ後、下記のようにＳＡＭを分析した。
【０１０９】
第２寧波病院の神経科とリハビリテーション科から変形性関節症の疾患または多発性硬化症と診断されている患者の血液サンプルはこの研究に含まれる。血漿中のＳＡＭとＳＡＨのレベルは、上述のようにイムノアッセイを用いて測定される。研究は、ＳＡＭまたはメチル化指数は変形性関節症および多発性硬化症によってどのように変化するかについて行われる。ＳＡＭおよびＳＡＨのレベルは、変形性関節症および多発性硬化症の処置前後にＳＡＭ−ｅまたは他の薬を服用する骨関節炎および多発性硬化症患者の間で比較する。ＳＡＭまたはメチル化指数が変形性関節症および多発性硬化症の個別化治療するための良い指標で、予後予測にも助ける。定性的および半定量的ＳＡＭの迅速なテストストリップは、変形性関節症および多発性硬化症の症状を治すために、ＳＡＭ−ｅまたは他の薬を服用するかどうかを決定する必要がある患者が利用できる便利な選択肢である。これは患者に最もっとも適切な薬の選択を指導するのに役立つ。
【０１１０】
［実施例１３］
実施例６〜１２で使用したサンプルのメチル化指数は次のように測定した。
本発明で開発された免疫アッセイを使用して、ＳＡＭとＳＡＨを同時に測定する。ＳＡＭとＳＡＨのレベルの比を算出し、メチル化指数と呼ぶ。これは、ＳＡＭまたはＳＡＨのいずれかの単一値より、総体的な健康、病気の状態、発展および予後を評価するためのより正確かつ説得力のある尺度である。通常、メチル化指数は＞４である。いくつかの病理学的な状況では、ＳＡＭのレベルの減少およびＳＡＨレベルの増加で、これは、４未満、またはさらに１未満になる。次に、減少メチル化指数は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ホルモン、神経伝達物質、などの多くの重要な分子のメチル化プロセスに影響を与える。
【０１１１】
［実施例１４］
化合物１：２'，３'−Ｏ−イソプロピリデンアデノシン（２５ｇ、８２ｍｍｏｌ、１当量）と乾燥ピリジン（２０ｍＬ）を、磁気攪拌棒と共に、５０ｍＬの一口丸底フラスコに入れ、窒素雰囲気下に置いた。次いで、フラスコを激しく撹拌しながらヒートガンで加熱した。約５分後、すべての固体が溶解した。溶液になったら、混合物を氷水浴で冷却し、２０分間撹拌した。塩化トシルを固体として、顕著な発熱を防ぐため、８回に分けて、１時間かけて加えた。混合物を５日間０℃で維持した。反応をＴＬＣによって完了したら、混合物を１０ｍＬのＨ2Ｏおよび酢酸エチル３０ｍＬで希釈した。混合物を分液漏斗に移し、３ＮのＨＣｌを１０ｍＬ加えた。層を分離し、有機層を過剰の塩酸ピリジニウムを除去するため、２００ｍＬの水で５回洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、次いで、残渣をジクロロメタン１００ｍＬで溶解した。これは、添加漏斗を介して、ゆっくりと、ヘプタン（１．１２Ｌ）の撹拌溶液に添加した。灰白色の沈殿物を濾過して分離し、純粋な生成物３１．１ｇを生成した。これは質量分析および１Ｈ  ＮＭＲによって確認した。
【０１１２】
［実施例１５］
化合物２：化合物１（３２．２ｇ、７０ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌棒と一緒に３００ｍＬ密封チューブに添加した。２ＭメチルアミンＴＨＦ溶液約２００ｍＬをこのチューブに注ぎ、チューブを密封した。容器は５０℃のオイルバスに浸漬して、２日間攪拌した。反応容器をオイルバスから取り出し、次いで、氷水浴中に入れ、３０分間攪拌した。キャップを除去し、過剰のメチルアミンは、穏やかな窒素注入で吹き出された。残渣を丸底フラスコに移し、減圧下で濃縮した。ガム状残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（５％メタノールＤＣＭ溶液）で精製し、３．５１ｇの化合物２を得た。その構造は、１Ｈ  ＮＭＲによって確認した。
【０１１３】
［実施例１６］
化合物３：アミン２（５．０ｇ、１５．６ｍｍｏｌ、１当量）を５００ｍＬの一口丸底フラスコに入れた。乾燥アセトニトリル１５０ｍＬを添加した後、ジイソプロピルエチルアミン（２．１ｇ、１６．３８ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加え、３５℃で３０分間攪拌した。ブロモブチラート（２．５５ｇ、１４．１ｍｍｏｌ、０．９当量）をシリンジで滴入した後、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（２８８ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）を加えた。混合物を５日間４０℃で撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、８２％の収率で所望の生成物５．３６ｇをフラッシュクロマトグラフィー（５％メタノールＤＣＭ溶液）で精製した。
【０１１４】
［実施例１７］
化合物４：メチルエステル３（７．７６ｇ、１８．４ｍｍｏｌ、１当量）を２５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、１５ｍＬメタノールと１５ｍＬＨ2Ｏで溶解させ、１０分間撹拌した。固体の水酸化リチウム（１．５５ｇ、３６．８ｍｍｏｌ、２当量）を加え、混合物を約２時間（出発物質の完全な消失をＴＬＣおよびＬＣＭＳで示すまで）撹拌した。粗混合物を乾燥するまで濃縮し、さらに精製することなく次のステップに移した。
【０１１５】
［実施例１８］
化合物５：約７ｇの粗製したリチウム塩４を１５０ｍＬの３Ｎ  ＨＣｌに溶解し、室温で４時間（出発物質がＴＬＣおよびＬＣＭＳに完全消失したまで）撹拌した。粗製の混合物を濾紙で濾過し、次いで減圧下で濃縮乾固した。４０％メタノール水の勾配で生成物を溶出する１２０ｇ逆相カラムで、５分画に粗製の残渣を精製した。精製した分画をプールし、次いで高真空下、４０℃で、乾燥するまで濃縮した。製品は、放置すると茶色の油に戻る、茶色の泡状物質であった。生成物をＨＰＬＣ、マススペクトル、および１Ｈ  ＮＭＲにより確認した。次に、純度（ＨＰＬＣ）９９．５５％の生成物４．８ｇを分割し、メタノールと水の１：１混合物を有する九つのバイアルに移した。各サンプルは、その後、質量が一定になるまで、高真空下４０℃で濃縮乾燥した。
【０１１６】
［実施例１９］
１期の癌を有する患者を検査し、それらのＳＡＭレベルとＳＡＨレベルを測定し、メチル化指数を算出する。メチル化指数が２未満の患者は、化学療法を受けながら、一日一回のＳＡＭ服用を開始する。
【０１１７】
［実施例２０］
尿サンプル（もし尿はその中のいくつかの特別な成分で正常に使用できない、または尿中のＳＡＭ濃度が低すぎる場合は、血液サンプル）のメチル化指数は、うつ病治療を個別化するための良い方法である。ＳＡＭｅ治療のプロトコルは、下記のような実施が可能である。
【０１１８】
成人患者について、気分や他の健康問題の重症度に応じて、多くのレジメンを使用されている。例えば、
【０１１９】
毎日８００−１６００ｍｇのＳＡＭｅを、最大６週間まで経口投与したことがある。
毎日２００から４００ｍｇのＳＡＭｅを静脈注射又は筋肉注射で、最大８週間与えたことがある。
毎日１０００−１６００ｍｇの用量を１５日間から６週間まで、内服したことがある。
毎日１５０〜４００ｍｇの用量を３−４週間ＩＶで投与するのは、最も一般的である。
毎日４００ｍｇのｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ安定塩（ＳＡＭｅ）（Ｋｎｏｌｌ  Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ  Ｓ．ｐ．Ａ．，  Ｌｉｓｃａｔｅ，  Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）を、筋肉内に注入したことがある。
７５〜２００ｍｇ用量のＳＡＭ−ｅを筋肉内に１４−３０日間注入したことがある。
治療の最初の３日間にＳＡＭｅ２００〜４００ｍｇの用量を２５０ｍＬの生理食塩水に溶解してＩＶで与えられた後、ＳＡＭｅを毎日４００ｍｇで４−１４日間服用したことがある。
【０１２０】
高い用量（毎日４００ｍｇより多い）を服用する患者のＳＡＭｅ投与量をタイムリー調整するために、３〜５日間ごとに一回で、本発明で開発されたメチル化指数ＥＬＩＳＡキットを使用してメチル化指数を測定してください。メチル化指数の増加が速すぎる（２回測定の間に５倍、または０．５の増加がある、または患者がＳＡＭｅの使用と関連する明らかな症状を感じた）場合、特に高血圧や他の心血管障害を有する患者に対して、投与量を減らすことをお勧めする。ハイリスクグループは、ＳＡＭ投与の安全性を確保し、その副作用を回避するために、毎日メチル化指数をテストさせ、またはＳＡＭとＳＡＨの迅速検査キットを使用して血液や尿中のＳＡＭとＳＡＨのレベルを定性的または半定量的に毎日テストするべきである。
【０１２１】
ＳＡＭ−ｅを毎日４００ｍｇより少ない用量を経口服用する患者は、その投与量は患者に適切かどうか、またはいつ薬の服用を中止するかを判断するために、必要な時に、または簡単に週に１回のペースで、メチル化指数、または少なくともＳＡＭをテストしてもらおう。
【０１２２】
メチル化指数が正常に戻って、１週間または２週間で安定化されるまで、ＳＡＭの投与を停止しないでください。
【０１２３】
正常または正常に近いメチル化指数を持っているうつ病患者は、ＳＡＭｅを治療の第一選択としないでください。その代わりに、他のタイプの抗うつ薬を使用してください。しかし、それでも、メチル化指数は、他の治療の有効性を監視するための優れたマーカーであり得る。メチル化指数を定期的にテストしてもらうことは、治療を停止することができるときを決定するためにも重要である。
［実施例２１］
【０１２４】
尿サンプル（もし尿はその中のいくつかの特別な成分で正常に使用できない、または尿中のＳＡＭの濃度が低すぎる場合は、代わりに血液サンプル）のメチル化指数測定は、肝臓および／または胆汁うっ滞治療を個別化するための良い方法である。ＳＡＭｅ治療のプロトコルは、次のようになれる。
【０１２５】
成人患者に対して、肝臓および／または胆汁うっ滞、および他の健康上の問題の重症度に応じて、多くのレジメンが使用されている。例えば、
ＳＡＭｅを毎日１，６００ｍｇ、２週間服用したことがある。
ＳＡＭｅを毎日１，０００ｍｇ、静脈（ＩＶ）内に４週間注入したことがある。
妊娠中の胆汁の流れの問題を治療するために、Ｔｒａｎｓｍｅｔｉｌ(R)５００ｍｇ、毎日２回ゆっくり注入によって１４日間与えた後、出産するまでまたはその後も、ＳＡＭｅを５００ｍｇ一日二回、口より服用したことがある。ＳＡＭｙｒ(R)６００ｍｇを、口より単独で服用したことがある。
ＳＡＭｙｒ(R)の１，８００ｍｇの用量は、毎日ベータアドレナリン作動薬と一緒に口から服用したことがある。
５００ｍｇの用量は、一日二回口から服用したことがある。
与えたことのあるＳＡＭｅ用量は以下のとおりである。出産まで毎日１，０００ｍｇを筋肉に注入、２０日間毎日２００または８００ｍｇを静脈注射（ＩＶ）で投与、出産まで毎日８００ｍｇを２回に分けてＩＶで投与、８００ｍｇをＩＶで投与。２０日間毎日８００ｍｇを３時間以上かけてＩＶで投与。二硫酸−ｐ−トルエンスルホン酸の安定塩（ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓ．ｐ．Ａ，  Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）を毎日８００ｍｇ、ＩＶで投与したことがある。
【０１２６】
より高い（毎日６００ｍｇより多い）用量を取る患者のＳＡＭｅの投与量を適時に調整するために、本発明で開発されたメチル化指数ＥＬＩＳＡキットを使用して、３日ごとに１回のメチル化指数測定をしてください。メチル化指数の増加が速すぎる（２回測定の間に５倍またはある一定の値の増加があり、患者はＳＡＭｅの使用に付随した明らかな症状を感じた）場合、特に高血圧や他の心血管障害を有する患者に対して、投与量を減らすことをお勧めする。ハイリスクグループは、ＳＡＭの投与の安全性を確保し、その副作用を回避するために、メチル化指数を毎日テストさせてもらい、またはＳＡＭとＳＡＨ迅速検査のキットを使用して血液や尿中のＳＡＭとＳＡＨのレベルを定性的または半定量的に毎日テストすべきである。
【０１２７】
ＳＡＭ−ｅを６００ｍｇより少ない用量を毎日経口服用する患者は、その投与量は患者に適切かどうか、またはいつ薬の服用を中止するかを判断するために、必要な時にまたは簡単に週に１回のペースで、テストメチル化指数、または少なくともＳＡＭをテストしてもらおう。
【０１２８】
メチル化指数が正常に戻って、さらに１週間または２週間で安定化されるまで、ＳＡＭの投与を停止しないでください。
【０１２９】
本出願に引用された全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの引用文献を含む、それらの全体が引用を通じて本書に援用される。
【０１３０】
本発明の多くの実施形態は、上記に開示され、現在の好ましい実施形態を含んでいるが、本開示の範囲内および添付の特許請求の範囲内に、他の多くの実施形態および変形が可能である。したがって、提供される好ましい実施形態および実施例の詳細は、限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で使用される用語は、限定ではなく単に説明的であること、および、特許請求される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、種々の変更、多数の等価物がなされ得ることを、理解されたいである。
【図１】
2020125294.tif 000005
【図２】
2020125294.tif 000006
【図３】
2020125294.tif 000007
【図４】
2020125294.tif 000008
【図５】
2020125294.tif 000009
【図６】
2020125294.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月2日(2020.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物であって、
【化１】
2020125294.tif 000011
前記化合物はＨＰＬＣの測定により、９９．５５％の純度を有する化合物。
【請求項２】
以下の式を有する化合物。
【化２】
2020125294.tif 000012
【請求項３】
請求項１に記載の化合物をハプテンとして用いて作られた、Ｓ−アデノシルメチオニンに特異的な抗体。
【請求項４】
Ｓ−アデノシルメチオニンに対して実質的な選択的な反応性を有し、Ｓ−アデノシルホモシステインとの交差反応性は１．２５％以下で、アデノシンとの交差反応性は１．２５％以下で、Ｌ−メチオニンとの交差反応性は１．２５％以下であり、以下の化学構造を有するハプテンから誘導された抗体であって、
【化３】
2020125294.tif 000013
前記化合物はＨＰＬＣの測定により、９９．５５％の純度を有する、抗体。
【請求項５】
酵素、化学発光物質、蛍光分子、ビオチンまたは放射性標識に抱合された、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を含む抱合体であって、前記化合物は担体に抱合され、前記担体は、ポリマー担体、タンパク質担体および酵素担体からなる群より選択される抱合体。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物、または請求項６に記載の抱合体、または請求項３もしくは４に記載の抗体を含み、イムノクロマトグラフィーに基づく、均一系イムノアッセイまたは乾式のテストストリップ。
【請求項８】
Ｓ−アデノシルメチオニンに特異的な抗体を製造する方法であって、以下の式を有する化合物を調製すること、および前記化合物をハプテンとして使用して抗体を製造することを含み、
【化４】
2020125294.tif 000014
前記化合物はＨＰＬＣの測定により、９９．５５％の純度を有する、方法。
【請求項９】
以下の合成ステップによりアザデアミノ−ＳＡＭを製造する方法。
【化５】
2020125294.tif 000015
【請求項１０】
以下の合成ステップによりアザデアミノ−ＳＡＭ（ＡｄａＭ）を製造する方法において、
【化６】
2020125294.tif 000016
以下のステップを含む改良。
【化７】
2020125294.tif 000017
【外国語明細書】
2020125294000001.pdf
2020125294000002.pdf
2020125294000003.pdf
2020125294000004.pdf