(57)【要約】【課題】動脈硬化関連疾患を判定する技術を提供する。【解決手段】Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質の、動脈硬化関連疾患を判定するためのマーカーとしての使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質の、動脈硬化関連疾患を判定するためのマーカーとしての使用。
【請求項２】
ＧＰＮＭＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
ＧＰＮＭＢタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、動脈硬化関連疾患判定用キット。
【請求項３】
生体試料中の、ＧＰＮＭＢ遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記ＧＰＮＭＢ遺伝子又は前記ＧＰＮＭＢタンパク質の発現量の上昇が動脈硬化関連疾患に罹患していることを示す、動脈硬化関連疾患を判定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化関連疾患を判定するためのマーカー及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化マーカーとして、テロメアの短縮や老化関連酸性β−ガラクトシダーゼの発現上昇等が知られている（例えば、非特許文献１、２を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Goldstein S., Replicative senescence: the human fibroblast comes of age., Science, 249 (4973), 1129-1133, 1990.
【非特許文献２】Dimri G. P., A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92 (20), 9363-9367, 1995.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、テロメアの短縮やβガラクトシダーゼの発現上昇を伴わない老化も存在する。したがって、新たな老化マーカーの探索が不可欠である。そこで、本発明は、新たな老化マーカーを提供することを目的とする。本マーカーは、動脈硬化関連疾患を判定するためのマーカーであるということができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の態様を含む。
（１）Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質からなる老化マーカー。
（２）ＧＰＮＭＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＧＰＮＭＢタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、老化判定用キット。
（３）生体試料中の、ＧＰＮＭＢ遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記ＧＰＮＭＢ遺伝子又は前記ＧＰＮＭＢタンパク質の発現量が老化の進行度に対応する、老化判定方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、新たな老化マーカーを提供することができる。本マーカーは、動脈硬化関連疾患を判定するためのマーカーであるということができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実験例２の結果を示すグラフである。
【図２】実験例３の結果を示すグラフである。
【図３】実験例４の結果を示すグラフである。
【図４】実験例５の結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示す写真である。倍率は４００倍である。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例７の結果を示すグラフである。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、実験例８の結果を示すグラフである。
【図８】実験例９の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［老化マーカー］
１実施形態において、本発明は、ＧＰＮＭＢ遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質からなる老化マーカーを提供する。
【０００９】
実施例において後述するように、発明者らは、老化を誘導した血管内皮細胞で発現が上昇する遺伝子を探索し、ＧＰＮＭＢ遺伝子を見出した。そして、老化した細胞において、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現及びＧＰＮＭＢタンパク質の発現が上昇することを確認した。係る知見から、ＧＰＮＭＢ遺伝子及びＧＰＮＭＢタンパク質を老化マーカーとして用いることができる。
【００１０】
ヒトＧＰＮＭＢ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００１００５３４０である。また、マウスＧＰＮＭＢ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿０５３１１０である。配列番号１にヒトＧＰＮＭＢのｃＤＮＡの塩基配列を示す。ＧＰＮＭＢは、１回膜貫通型のタンパク質であり、一部は切断され、血液中に分泌されることが知られている。
【００１１】
実施例において後述するように、発明者らは、細胞の継代数が上昇するのに伴い、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量も上昇することを明らかにした。係る知見から、ＧＰＮＭＢ遺伝子及びＧＰＮＭＢタンパク質は、老化の進行度を示すマーカーであるということもできる。
【００１２】
［老化判定用キット］
１実施形態において、本発明は、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＧＰＮＭＢタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、老化判定用キットを提供する。
【００１３】
プライマーセットとしては、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。例えば、ヒトＧＰＮＭＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号２に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号３に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーのセット等が挙げられる。
【００１４】
ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブとしては、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
【００１５】
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にＧＰＮＭＢタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。
【００１６】
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
【００１７】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。ＧＰＮＭＢタンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、ＧＰＮＭＢタンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００１８】
特異的結合物質は、ＧＰＮＭＢタンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００１９】
本実施形態の老化判定用キットを用いて、生体試料中のＧＰＮＭＢ遺伝子の発現又はタンパク質の発現を検出することができる。ＧＰＮＭＢ遺伝子又はタンパク質の発現が検出されることは、対象組織又は細胞が老化していることを示す。
【００２０】
生体試料としては、血清、血漿、末梢白血球、組織、尿等が挙げられる。生体試料が、末梢白血球、組織等である場合、本実施形態の老化判定用キットは、上記のプライマーセット、上記のプローブ、上記の特異的結合物質のいずれであってもよい。また、生体試料が血清、血漿、尿等である場合、本実施形態の老化判定用キットは、上記の特異的結合物質を備えるものであることが好ましい。
【００２１】
ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現又はタンパク質の発現の検出は定量的であってもよい。実施例において後述するように、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量又はタンパク質の発現量の高さは老化の進行度と対応する。したがって、本実施形態の老化判定用キットを用いることにより、生体試料が由来する個体又は生体試料中の組織若しくは細胞の老化の進行度を判定することができる。
【００２２】
［老化判定方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中の、ＧＰＮＭＢ遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記ＧＰＮＭＢ遺伝子又は前記ＧＰＮＭＢタンパク質の発現量が老化の進行度に対応する、老化判定方法を提供する。
【００２３】
生体試料は、上述したものと同様である。ＧＰＮＭＢ遺伝子又はＧＰＮＭＢタンパク質の発現量の定量方法としては、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ；ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを固定したマイクロアレイによる遺伝子発現解析；ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いたノーザンブロッティング；ＧＰＮＭＢタンパク質に対する特異的結合物質を用いたウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等が挙げられる。
【００２４】
実施例において後述するように、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量又はタンパク質の発現量の高さは、細胞の老化の進行度と対応する。すなわち、細胞の老化が進行するほど、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量又はタンパク質の発現量が上昇する。したがって、本実施形態の老化判定用キットを用いることにより、生体試料が由来する個体又は生体試料中の組織若しくは細胞の老化の進行度を判定することができる。
【００２５】
老化の進行度を判定する場合には、老化の進行度が予めわかっている標準を設けてもよい。このような標準としては、例えば、継代数が分かっている細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実験例１］
（老化マーカーの探索）
発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ解析により、老化を誘導した血管内皮細胞で発現が上昇する遺伝子を探索した。その結果、ＧＰＮＭＢ遺伝子を見出した。
【００２８】
［実験例２］
（老化細胞ではＧＰＮＭＢのｍＲＮＡの発現量が上昇した）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を第４継代から第９継代まで培養し、各継代数の細胞におけるＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲにより定量した。ＧＰＮＭＢ遺伝子増幅用プライマーとしては、センスプライマーとして配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーを用い、アンチセンスプライマーとして、配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。
【００２９】
図１は、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量の定量結果を示すグラフである。その結果、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量は、細胞の継代が進むほど、すなわち細胞の老化が進むほど上昇することが明らかになった。
【００３０】
この結果は、ＧＰＮＭＢ遺伝子が老化マーカーであることを示す。また、ＧＰＮＭＢ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、老化の進行に対応して上昇することから、ＧＰＮＭＢ遺伝子は老化の進行度を示すマーカーであるともいえる。
【００３１】
［実験例３］
（老化細胞ではＧＰＮＭＢタンパク質の発現量が上昇した）
第７継代、第１１継代及び第１２継代のＨＵＶＥＣ細胞におけるＧＰＮＭＢタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。ＧＰＮＭＢタンパク質の検出には、抗ＧＰＮＭＢ抗体（型式「Ａｂ９８８５６」、Ａｂｃａｍ社）を使用した。
【００３２】
また、ＧＰＮＭＢタンパク質と共に、ｐ５３、ｐ２１及びｐ１６タンパク質の発現量も測定した。また、対照としてβアクチンの発現量を測定した。なお、老化細胞では、Ｇ１期の不可逆的な増殖停止が認められることが知られている。そして、老化細胞では、細胞周期の進行を阻害するｐ１６、ｐ５３及びこれらのターゲットである転写因子ｐ２１の発現が上昇することが知られている。すなわち、ｐ５３、ｐ２１及びｐ１６タンパク質は、老化マーカーであるといえる。
【００３３】
ｐ５３タンパク質の検出には、抗ｐ５３抗体（型式「ｓｃ−１２６」、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を使用した。ｐ２１タンパク質の検出には、抗ｐ２１抗体（型式「ＯＰ−６４」、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用した。ｐ１６タンパク質の検出には、抗ｐ１６抗体（型式「５１−１３２５ＧＲ」、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を使用した。βアクチンの検出には、抗βアクチン抗体（型式「＃４９７０」、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を使用した。
【００３４】
図２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１は第７継代の細胞の結果であり、レーン２は第１１継代の細胞の結果であり、レーン３は第１２継代の細胞の結果である。その結果、第７継代の若い細胞と比較して、第１１継代及び第１２継代の老化細胞では、ＧＰＮＭＢタンパク質の発現量の上昇が認められた。ｐ５３、ｐ２１及びｐ１６タンパク質においても、同様の傾向が認められた。この結果は、ＧＰＮＭＢタンパク質が老化マーカーであることを示す。
【００３５】
［実験例４］
（ＧＰＮＭＢ遺伝子のノックダウンにより細胞増殖速度が低下した）
ＨＵＶＥＣに、レトロウイルスを用いてＧＰＮＭＢ特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）を導入し、ＧＰＮＭＢの発現をノックダウンした細胞を用意した（ＧＰＮＭＢ抑制群）。対照として未処理のＨＵＶＥＣを用いた（対照群）。使用したＧＰＮＭＢ特異的ｓｈＲＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。
【００３６】
ＧＰＮＭＢ抑制群及び対照群の各細胞を培養し、細胞増殖（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）を測定した。図３は、細胞増殖を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＧＰＮＭＢ抑制群の細胞は細胞増殖速度が低下することが明らかとなった。
【００３７】
［実験例５］
（ＧＰＮＭＢ遺伝子のノックダウンにより既知老化マーカーの発現量が上昇した）
実験例２と同様にして、実験例４で使用した対照群及びＧＰＮＭＢ抑制群の細胞中のＧＰＮＭＢタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。また、ｐ５３、ｐ２１及びβアクチンの発現量も測定した。図４は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。レーン１及び２は対照群の結果であり、レーン３及び４はＧＰＮＭＢ抑制群の結果である。
【００３８】
その結果、ＧＰＮＭＢ抑制群の細胞中では、ＧＰＮＭＢタンパク質の発現量が低下していることが確認された。また、ＧＰＮＭＢ抑制群の細胞中では、老化マーカーであるｐ５３及びｐ２１の発現量の上昇が確認された。
【００３９】
実験例４及び５の結果より、ＧＰＮＭＢ遺伝子のノックダウンにより、内皮細胞の老化が促進されることが示された。
【００４０】
［実験例６］
（ＧＰＮＭＢ遺伝子のノックダウンにより細胞中の活性酸素種が上昇した）
実験例４で使用した対照群及びＧＰＮＭＢ抑制群の細胞中の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）を検出した。まず、対照群及びＧＰＮＭＢ抑制群の細胞をパラホルムアルデヒド固定した。続いて、ジヒドロエチジウム染色により活性酸素種を検出した。また、同時にＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色により細胞の核を染色した。
【００４１】
図５（ａ）及び（ｂ）は染色結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図５（ａ）は対照群の細胞の結果であり、図５（ｂ）はＧＰＮＭＢ抑制群の細胞の結果である。その結果、ＧＰＮＭＢ抑制群の細胞では、活性酸素種が増加していることが明らかとなった。この結果は、ＧＰＮＭＢタンパク質が、活性酸素種を低減させる機能を有することを示す。
【００４２】
［実験例７］
（肥満モデルマウスではＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇した）
４週齢から８週間、通常食（ＣＥ−２）を与えたマウス（対照群）及び高脂肪食（ＨＦＤ）を与えたマウス（肥満食群）を用意した。各マウスから動脈組織及び肺内皮細胞を採取し、実験例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行い、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量を定量した。動脈組織としては下行大動脈を用いた。また、肺内皮細胞としては、肺組織から抗ＣＤ３１抗体（型式「５５３３６９」、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び磁気ビーズを用いて分離したＣＤ３１陽性細胞を用いた。
【００４３】
図６（ａ）及び（ｂ）はＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量の定量結果を示すグラフである。図６（ａ）は動脈組織の結果を示し、図６（ｂ）は内皮細胞の結果を示す。その結果、肥満食群のマウスの動脈組織及び肺内皮細胞では、対照群と比較してＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇していることが明らかとなった。この結果は、肥満ストレスにより血管のＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇することを示す。
【００４４】
［実験例８］
（動脈硬化モデルマウスではＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇した）
２２週齢の動脈硬化モデルマウス（ＡｐｏＥノックアウトマウス）（動脈硬化群）及び通常マウス（対照群）から、動脈、肺内皮細胞及び心臓内皮細胞を採取し、実験例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行い、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量を定量した。動脈組織としては下行大動脈を用いた。また、肺内皮細胞、心臓内皮細胞としては、それぞれ肺組織並びに心臓組織から、抗ＣＤ３１抗体（型式「５５３３６９」、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び磁気ビーズを用いて分離したＣＤ３１陽性細胞を用いた。
【００４５】
図７（ａ）〜（ｃ）は、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量の定量結果を示すグラフである。図７（ａ）は動脈組織の結果を示し、図７（ｂ）は肺内皮細胞の結果を示し、図７（ｃ）は心臓内皮細胞の結果を示す。その結果、動脈硬化群のマウスの動脈組織、肺内皮細胞及び心臓内皮細胞では、対照群と比較してＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇していることが明らかとなった。この結果は、動脈硬化モデルマウスで血管のＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇することを示す。
【００４６】
［実験例９］
（動脈硬化関連疾患の患者の白血球でＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇した）
健常人（ｎ＝３２）、冠動脈疾患の患者（ｎ＝２９）及び閉塞性動脈硬化症の患者（ｎ＝１１）から末梢白血球を採取し、実験例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行い、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量を定量した。健常人、冠動脈疾患の患者及び閉塞性動脈硬化症の患者の年齢は６６．３３±１２．１１（平均値±標準偏差）であった。
【００４７】
図８は、ＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量の定量結果を示すグラフである。その結果、冠動脈疾患の患者及び閉塞性動脈硬化症の患者では、健常人と比較してＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇していることが明らかとなった。この結果は、動脈硬化疾患で、末梢白血球のＧＰＮＭＢ遺伝子の発現量が上昇することを示す。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、新たな老化マーカーを提供することができる。ＧＰＮＭＢ遺伝子又はタンパク質の発現量は老化に伴い上昇するため、ヒトでＧＰＮＭＢ遺伝子又はタンパク質の発現量が上昇することは、実年齢に見合わず老化が進行しているか、老化関連疾患の合併を意味する可能性が高い。健康診断、人間ドック等で血液又は尿サンプルからＧＰＮＭＢの発現レベルを評価することは、個体老化の程度を評価、積極的リハビリテーションの介入、老化関連疾患の積極的二次スクリーニングを行うべき集団の選出等に有用である。本マーカーは、動脈硬化関連疾患を判定するためのマーカーであるということができる。
【図１】
2020110181.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020110181.tif 000007
【図７】
2020110181.tif 000008
【図８】
2020110181.tif 000009
【配列表】
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