(57)【要約】【課題】オキソ脂肪酸含有組成物を短時間で効率よく製造する方法等提供すること。【解決手段】還元剤の存在下、及び、溶存酸素濃度低減下で、脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを含む、オキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物の製造方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元剤の存在下、及び、溶存酸素濃度低減下で、脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを含む、オキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物の製造方法。
【請求項２】
還元剤が、アスコルビン酸及びその塩、イソアスコルビン酸及びその塩、並びにヨウ化カリウムから成る群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
脂肪酸が、不飽和脂肪酸であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、オキソ脂肪酸含有組成物。
【請求項５】
リノール酸からオキソ脂肪酸への変換率が６％（Ｗ／Ｗ）以上である、請求項４に記載のオキソ脂肪酸含有組成物。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のオキソ脂肪酸含有組成物を含む飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキソ脂肪酸組成物及び製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肉や乳製品などの動物性脂肪を多く摂る食事の欧米化や車社会による運動不足などが原因で、血中の中性脂肪の値が高くなる高中性脂肪血症、肝臓に脂肪が過剰に蓄積した脂肪肝、血糖値が高くなる糖尿病が増加しており、これらの疾病を予防するニーズが高まっている。
【０００３】
オキソ脂肪酸の一種である、９-オキソ-１０,１２-オクタデカジエン酸(９-ｏｘｏ-ＯＤＡ)や１３-オキソ-９,１１-オクタデカジエン酸(１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ)は、トマトやその加工品に微量に含まれる不飽和脂肪酸であり、脂肪肝や高中性脂肪血症などの脂質代謝異常の改善効果や血糖値の改善効果が報告され、注目されている（非特許文献１）。特に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡは、９-ｏｘｏ-ＯＤＡよりもその効果が高いとされている。しかしながら、トマト中の９-ｏｘｏ-ＯＤＡや１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの含量は低いことから（非特許文献２）、脂質代謝異常を改善するためには、トマトやその加工品を多量に摂取する必要がある。そこで９-ｏｘｏ-ＯＤＡや１３-ｏｘｏ-ＯＤＡを高含有する素材の調製方法が考えられている。
【０００４】
例えば、マンガン、亜鉛などの金属存在下、２０℃未満の温度（特許文献１の実施例では、５〜１５℃）で、リノール酸を含む原料にリポキシゲナーゼを含む酵素材料を作用させることによるオキソ脂肪酸の製造方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、該方法では、リノール酸からオキソ脂肪酸への変換率が約５％（Ｗ／Ｗ）であり反応効率が良くないこと、また、反応時間が８時間以上と長い等の問題点がある。
【０００５】
また、他の方法として、リノール酸又はリノール酸のエステル体を含む原料を糸状菌により発酵させることによるオキソ脂肪酸の製造方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、該方法では、発酵物中のオキソ脂肪酸含量が数ｎｇ／ｍｇと低いこと、また、発酵を行うため発酵時間が２４時間以上と長い等の問題点がある。
【０００６】
さらに、リノール酸などの不飽和脂肪酸と植物抽出物を反応させることによる、オキソ脂肪酸の製造方法が報告されている（特許文献３）。しかしながら、該方法では、不飽和脂肪酸の過酸化物やヒドロキシ誘導体の生成量は明らかにしているが、オキソ脂肪酸については、生成されている記載のみでリノール酸からオキソ脂肪酸への変換率については一切明記されていない。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１６−１７８９１３
【特許文献２】特許第６００８９８３号
【特許文献３】特開２０１７−２０９０５３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ,  Ｖｏｌ．７，（２０１２）,  ｅ３１３１７
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．８（２０１１）,  １６２１−１６２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、血中及び肝臓中の中性脂肪低下、血糖値の改善効果を有するオキソ脂肪酸及びオキソ脂肪酸含有組成物を短時間で効率よく製造する方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、還元剤の存在下、及び、溶存酸素濃度低減下で、リノール酸等の脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることにより、オキソ脂肪酸を短時間で効率よく製造する方法を初めて見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、還元剤の存在下、及び、溶存酸素濃度低減下で、脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを含む、オキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物の製造方法等に関する。
【００１２】
本発明は、以下の［１］〜［６］の態様に関する。
［１］還元剤の存在下、及び、溶存酸素濃度低減下で、脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを含む、オキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物の製造方法。
［２］還元剤が、アスコルビン酸及びその塩、イソアスコルビン酸及びその塩、並びにヨウ化カリウムから成る群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法。
［３］脂肪酸が、不飽和脂肪酸であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、オキソ脂肪酸含有組成物。
［５］リノール酸からオキソ脂肪酸への変換率が６％（Ｗ／Ｗ）以上である、［４］に記載のオキソ脂肪酸含有組成物。
［６］［４］又は［５］に記載のオキソ脂肪酸含有組成物を含む飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飼料。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の製造方法によって、短時間で効率よくリノール酸からオキソ脂肪酸へ変換することが可能となり、オキソ脂肪酸を高濃度で含有する組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明は、第一に、還元剤の存在下、及び、溶存酸素濃度低減下で、脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを含む、オキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物の製造方法に係る。
【００１５】
本発明で使用される脂肪酸は、リポキシゲナーゼが作用することによって、最終的にオキソ脂肪酸を産生させることのできる脂肪酸であればよく、特定の化合物に何ら限定されるものではない。例えば、リノール酸、α-リノレン酸、γ-リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。また、脂肪酸の形態は、遊離脂肪酸、エステル体、糖脂質等が挙げられる。また、その製造方法・過程は任意であり、例えば、トリグリセリド、リン脂質等にリパーゼを作用させ、遊離させた遊離脂肪酸や、大豆等の不飽和脂肪酸を含む原材料をＲｈｉｚｏｐｕｓ属等の麹菌で発酵させ、遊離させた遊離脂肪酸も使用できる。更に、脂肪酸は任意の成分を含む当業者に公知の適当な溶液として本発明方法の反応系に提供することが出来る。当該反応系で使用される反応液中の脂肪酸濃度は、リポキシゲナーゼ濃度、減圧度（反応開始時の溶存酸素濃度）、還元剤濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えば、反応液中のリノール酸等の脂肪酸の濃度は、０.１ｍｇ/ｍＬ以上、好ましくは０.２ｍｇ/ｍＬ以上、より好ましくは０.５ｍｇ/ｍＬ以上とすることができる。脂肪酸の添加方法は、反応開始時に一括添加しても良いが、一定時間に添加する逐次添加でもよい。尚、脂肪酸濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
【００１６】
本発明の製造方法で使用されるリポキシゲナーゼは、例えば、大豆、黒大豆、小豆、インゲン豆、ライマメ、エンドウ豆、キュウリ、ジャガイモ、西洋ワサビ、カブ等由来のリポキシゲナーゼ等の当業者に公知の任意のものが挙げられる。特に豆類のリポキシゲナーゼが望ましい。本発明で使用されるリポキシゲナーゼは、市販の精製酵素でもよいが、リポキシゲナーゼを含む大豆等に加水し、粉砕機等で破砕した破砕物や、その破砕物をろ過により固形分を取り除いた抽出物、さらには当該抽出物をカラムクロマトグラフィーにより精製を行い大豆等より単離したリポキシゲナーゼも使用することが出来る。更に、リポキシゲナーゼは適当な緩衝液等の当業者に公知の適当な溶液として反応系に提供することが出来る。当該反応に使用される反応液中のリポキシゲナーゼ濃度は、脂肪酸濃度、減圧度（反応開始時の溶存酸素濃度）、還元剤の濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。リポキシゲナーゼ濃度を高濃度にすることによって反応を短時間に完了させることが出来、逆に反応時間が長時間でも良い場合は、リポキシゲナーゼ濃度は低濃度で良い。例えば、反応液中の大豆由来のリポキシゲナーゼの濃度は、１，０００Ｕ/ｍＬ以上、好ましくは１，５００Ｕ/ｍＬ以上、より好ましくは３，０００Ｕ/ｍＬ以上、最も好ましくは５，０００Ｕ/ｍＬ以上とすることができる。また、リポキシゲナーゼ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
【００１７】
尚、リポキシゲナーゼの活性を示す１ユニット（Ｕ）とは、基質として１ｍＭのリノール酸を含む０．２ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）において、２５℃での分光光度計による２３４ｎｍの吸光度が０.００１／分の増加量を示すものと定義する。
【００１８】
本発明の製造方法で使用される還元剤は、本発明に所望の効果を損なわない限り、当業者に公知の任意の化合物、例えば、アスコルビン酸又はその塩、アスコルビン酸の構造異性体であるイソアスコルビン酸又はその塩、アスコルビン酸の誘導体であるアスコルビン酸２-リン酸、アスコルビン酸２-グルコシド、アスコルビン酸ステアリン酸エステル、アスコルビン酸パルミチン酸エステル等や、ヨウ化カリウム、ヨウ化水素、亜硫酸ナトリウム等、並びに、これら化合物の組み合わせから適宜選択されるが、特にアスコルビン酸又はその塩、イソアスコルビン酸又はその塩が望ましい。更に、還元剤は任意の成分を含む当業者に公知の適当な溶液として反応系に提供することが出来る。当該反応に使用される反応液中の還元剤濃度は、脂肪酸濃度、減圧度（反応開始時の溶存酸素濃度）、リポキシゲナーゼ濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。還元剤濃度を高濃度することによって反応を短時間に完了させることが出来、逆に反応時間が長時間でも良い場合は、還元剤濃度は低濃度で良い。尚、還元剤の濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。例えば、反応液中のアスコルビン酸等の濃度は、０.１ｍｇ/ｍＬ以上、好ましくは０.５ｍｇ/ｍＬ以上、より好ましくは１ｍｇ/ｍＬ以上、最も好ましくは２ｍｇ/ｍＬ以上とすることができる。より具体的には、反応液中の還元剤の濃度は、好ましくは、０.１〜１０ｍｇ/ｍＬ、より好ましくは、０.４〜８ｍｇ/ｍＬである。還元剤の添加方法は、反応開始時に一括添加しても良いが、一定時間に添加する逐次添加でもよい。
【００１９】
本発明の製造方法に於いて「溶存酸素濃度低減」とは、反応開始時の反応液中の溶存酸素濃度が通常圧下の溶存酸素濃度に比べて低下している状態を意味する。かかる溶存酸素濃度は、オキソ脂肪酸が製造される範囲で任意に設定することができる。例えば、４〜１０ｐｐｍ、好ましくは、５〜８ｐｐｍ、より好ましくは、６〜７ｐｐｍである。尚、溶存酸素濃度の測定は、例えば、隔膜電極法、蛍光法、滴定法等の当業者に公知の任意の手段・方法で測定することが出来る。
【００２０】
このような「溶存酸素濃度低減」の状態は、本発明の製造方法に於ける反応系の圧力を当業者に公知の任意の方法で適当に調節（低下）することによって容易に達成することが出来る。例えば、上記のような溶存酸素濃度低減の状態は、反応系の圧力を、常圧（約０．１ＭＰａ（Ｇ）：８．３ｐｐｍ）に対して、−０.０２５〜−０.０９０ＭＰａ（Ｇ）、好ましくは、−０.０５０〜−０.０８５ＭＰａ（Ｇ）、より好ましくは、−０.０６０〜−０.０８０ＭＰａ（Ｇ）程度の減圧度とすることによって容易に得ることが出来る。
【００２１】
本発明の製造方法における反応温度及びｐＨは、オキソ脂肪酸が産生される任意の温度及びｐＨでよい。例えば、大豆由来のリポキシゲナーゼには、アイソザイムＬ-１、Ｌ-２、Ｌ-３があるが、Ｌ-１を使用する場合、反応温度０〜６０℃、好ましくは、１５〜４５℃、より好ましくは、２０〜３５℃、反応ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９が望ましく、Ｌ-２を使用する場合、反応温度０〜５０℃、好ましくは、１５〜４５℃、より好ましくは、２０〜３５℃、反応ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ７〜９が望ましく、Ｌ-３を使用する場合、反応温度０〜６０℃、好ましくは、１５〜４５℃、より好ましくは、２０〜３５℃、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９であることが望ましい。また、当該反応時間もオキソ脂肪酸が産生される任意の時間でよいが、好ましくは３０分程度、より好ましくは６０分程度、さらに好ましくは１２０分程度、最も好ましくは２４０分程度であることが望ましい。
【００２２】
本明細書中に特に記載されていない限り、本発明方法に於ける諸条件は当業者が適宜設定することが出来る。また、本発明方法の所望の結果が得られる限り、反応系（反応液）には、上記の各成分以外に、前記酵素等試薬成分の安定性を高める等の目的で、当業者に公知の任意の成分が含まれていても良い。
【００２３】
本発明方法で製造されたオキソ脂肪酸含有組成物に於いては、リノール酸からオキソ脂肪酸への変換率が６％（Ｗ／Ｗ）以上、更には、約２０％（Ｗ／Ｗ）程度迄高くすることが出来、オキソ脂肪酸を高濃度で含むことを特徴とする。該組成物はそのままの形態でも利用可能であるが、更に、当業者に公知の任意の方法・手段によって、含まれるオキソ脂肪酸を容易に単離・精製することが出来る。例えば、トリグリセリド等にリパーゼを作用させ遊離させた遊離脂肪酸の場合、ヘキサン、アセトン等で抽出後、溶媒を除去し得られる抽出液としても利用可能である。また、大豆を発酵させ、遊離させた遊離脂肪酸の場合、加熱殺菌、マイクロ波殺菌等を行ったもの、また、凍結乾燥、風乾等による乾燥品としたり、さらに粉砕後、粉末状にしたり、ペースト状にしたり、アルコール等による抽出を行って得られる抽出液としても利用可能である。さらに抽出液をクロマトグラフィー、分子蒸留、真空蒸留等によりオキソ脂肪酸を高度に精製した精製品としての利用も可能である。
【００２４】
本発明方法で製造されたオキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物を一成分として含む、任意の形態の飲食品を当業者に公知の任意の方法によって容易に製造することが出来る。例えば、かかるオキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物は、トマトジュース、野菜ジュース等の飲料、ゼリー、ビスケット、キャンディ、チョコレート等の菓子、ハンバーグ、コロッケ等の惣菜、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、トマトソース、ケチャップ、ドレッシング等の調味料のほか、タブレット、カプセル、顆粒等の保健機能食品、機能性食品、栄養補助食品などに含有させることができる。
【００２５】
更に、本発明方法で製造されたオキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物は、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飼料等の一成分として用いることもできる。形態としては、アンプル、カプセル、丸剤、錠剤、粉末、顆粒、固形、液剤、ゲル、エアロゾル等とすることができるほか、各種製品中に配合することができる。これら製品は当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来、賦形剤、結合剤、潤沢剤等を適宜配合することができる。
【００２６】
なお、該オキソ脂肪酸又はオキソ脂肪酸含有組成物の用途・利用方法に関しては、上記の事例になんら限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
（減圧度（反応開始時の溶存酸素濃度）の影響）
リポキシゲナーゼ溶液（大豆由来リポキシダーゼ  １９０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬに対し、リノール酸溶液（リノール酸（富士フィルム和光純薬製、一級試薬：純度８８％） ７０ｍｇにＴｗｅｅｎ２０  ７０ｍｇ及び、純水 ４ｍＬを加え混合した後、更に０.０１Ｍ水酸化カルシウム水溶液１３.７５ｍＬを加え、全量が２５ｍＬになるまで０.０５Ｍホウ酸緩衝液を加え混合調製した）２.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（７ｍｇ／ｍＬ）１５ｍＬを加え、各種減圧度（反応開始時の溶存酸素濃度）（常圧（８.３ｐｐｍ）、−０.０２５ＭＰａ（Ｇ）（７.９ｐｐｍ）、−０.０５０ＭＰａ（Ｇ）（７.３ｐｐｍ）、−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）（６.６ｐｐｍ）及び、−０.０９７ＭＰａ（Ｇ）（４.３ｐｐｍ））にて、３０℃・２時間反応させた。反応終了後、５Ｍ塩酸１０ｍＬを添加し反応を停止した。反応停止後、反応溶液を分液漏斗に入れ、ヘキサン／２−プロパノール（３：２）２０ｍＬを添加、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡを抽出し、同様な抽出操作を２回実施した。次いで反応溶液にヘキサン／２−プロパノール（７：２）２０ｍＬを添加し、再度、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡを抽出した。次に抽出溶液に対し、蒸留水４５ｍＬを添加し、水洗を行い、これを３回繰り返した。水洗後の抽出液は、減圧乾固し１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物である実施品１〜５を得た。
【実施例２】
【００２９】
（実施品１〜５の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例１で調製した実施品１〜５について、下記の条件で１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表1に示されるように、減圧度が高くなる（反応開始時の溶存酸素濃度が低くなる）と共に反応液中の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が増加し、特に減圧度が−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）（反応開始時の溶存酸素濃度６.６ｐｐｍ）の場合に最も１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。但し、減圧度が高すぎる（反応開始時の溶存酸素濃度が低すぎる）と、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量の低下が認められた。
【００３０】
＜１３-ＯＸＯ-ＯＤＡ分析方法＞
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８（ジーエルサイエンス製、４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
溶離液：０.１％ギ酸含有  ８０％アセトニトリル水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２７２ｎｍ
カラムオーブン温度：３０℃
インジェクション量：１０μＬ
分析時間：１５分
＜リノール酸からオキソ脂肪酸への変換率＞
リノール酸からオキソ脂肪酸の変換率は、以下の式から求めた。
（式）  リノール酸からオキソ脂肪酸の変換率（％）（Ｗ／Ｗ）＝
反応で産生されたオキソ脂肪酸量／反応で使用したリノール酸量×１００％
【００３１】
【表１】
2020092697.tif 000002
【実施例３】
【００３２】
（リポキシゲナーゼ添加量の影響）
各量のリポキシゲナーゼ（９５，０００ｕｎｉｔ、１９０，０００ｕｎｉｔ、３８０，０００ｕｎｉｔ、５７０，０００ｕｎｉｔ、９５０，０００ｕｎｉｔ）を含むリポキシゲナーゼ溶液３７．５ｍＬを用い、リノール酸溶液２.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（７ｍｇ／ｍＬ）１５ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃・２時間反応させた。反応後、実施例１と同様に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物を調製し、実施品６〜１０を得た。
【実施例４】
【００３３】
（実施品６〜１０の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例３で調製した実施品６〜１０について、実施例２と同様な条件にて１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表２に示されるように、反応液中のリポキシゲナーゼ濃度が高くなると共に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。
【００３４】
【表２】
2020092697.tif 000003
【実施例５】
【００３５】
（還元剤の影響）
各種還元剤（イソアスコルビン酸：１２９．６ｍｇ、アスコルビン酸：１０５ｍｇ、ヨウ化カリウム：１５０ｍｇ、システイン：１０５ｍｇ）を含む還元剤溶液１５ｍＬを用い、リポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬとリノール酸溶液２.５ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃・２時間反応させた。反応後、実施例１と同様に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物を調製し、実施品１１〜１４を得た。尚、反応液中の各還元剤の濃度は、夫々、２．４ｍｇ／ｍＬ、１．９ｍｇ／ｍＬ、２．７ｍｇ／ｍＬ、及び１．９ｍｇ／ｍＬであった。
【実施例６】
【００３６】
（実施品１１〜１４の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例５で調製した実施品１１〜１４について、実施例２と同様な条件にて１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表３に示されるように、各種還元剤により１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生が認められた。特に還元剤にアスコルビン酸とイソアスコルビン酸を使用した場合、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量がよくなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。また、還元剤にヨウ化カリウムを使用した場合、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡと共に９-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生が認められた。
【００３７】
【表３】
2020092697.tif 000004
【実施例７】
【００３８】
（アスコルビン酸添加量の影響）
各量のアスコルビン酸（２６．３ｍｇ、５２．５ｍｇ、１０５ｍｇ、２１０ｍｇ、４２０ｍｇ）を含むアスコルビン酸溶液１５ｍＬを用い、リポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬとリノール酸溶液２.５ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃・２時間反応させた。反応後、実施例１と同様に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物を調製し、実施品１５〜１９を得た。
【実施例８】
【００３９】
（実施品１５〜１９の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例７で調製した実施品１５〜１９について、実施例２と同様な条件にて１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表４に示されるように、反応液中のアスコルビン酸濃度を高くすることによって１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が増加し、特にアスコルビン酸濃度が１．９１ｍｇ／ｍＬの場合に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が最も多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。
【００４０】
【表４】
2020092697.tif 000005
【実施例９】
【００４１】
（リノール酸及び、アスコルビン酸添加方法の影響）
リポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬを用い、リノール酸溶液２.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（１０５ｍｇ）１５ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃、４時間で反応させて、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物である実施品２０を得た。また、リポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬを用い、リノール酸溶液２.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（２１ｍｇ）１１ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃で反応させた後、更に、反応３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後に、アスコルビン酸溶液（２１ｍｇ）１ｍＬを順次追加し、同様に減圧下で４時間反応させて、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物である実施品２１を得た。さらにリポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬを用い、リノール酸溶液（１.４ｍｇ）０.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（１０５ｍｇ）１３ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃で反応させた後、更に、反応３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後に、リノール酸溶液（１.４ｍｇ）１ｍＬを順次追加し、同様に減圧下で４時間反応させて、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物である実施品２２を得た。
【実施例１０】
【００４２】
（実施品２０〜２２の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例９で調製した実施品２０〜２２について、実施例２と同様な条件にて１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表５に示されるように、アスコルビン酸を反応開始時に一括添加した場合と一定時間に逐次添加した場合のリノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率は同等であり、アスコルビン酸は、反応開始時に一括添加しても、一定時間に逐次添加してもよいことが認められた。また、リノール酸を反応開始時に一括添加した場合と一定時間に逐次添加した場合のリノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率についても同等であり、リノール酸は、反応開始時に一括添加しても、一定時間に逐次添加してもよいことが認められた。
【００４３】
【表５】
2020092697.tif 000006
【実施例１１】
【００４４】
（酵素処理時間の影響）
各種酵素処理時間（０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間）にて、リポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)に溶解）３７．５ｍＬとリノール酸溶液２.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（７ｍｇ／ｍＬ）１５ｍＬを加え、減圧度−０．０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃で反応させた。反応後、実施例１と同様に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物を調製し、実施品２３〜２８を得た。
【実施例１２】
【００４５】
（実施品２３〜２８の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例１１で調製した実施品２３〜２８について、実施例２と同様な条件にて１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表６に示されるように、反応時間が長くなると共に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量がよく、特に酵素処理時間が４時間の場合に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が最も多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。
【００４６】
【表６】
2020092697.tif 000007
【実施例１３】
【００４７】
（酵素反応温度の影響）
各種酵素反応温度（１８℃、２３℃、３０℃）にて、リポキシゲナーゼ溶液（リポキシダーゼ  ３８０，０００ｕｎｉｔ（東京化成製）を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８)  に溶解）３７．５ｍＬを用い、リノール酸溶液２.５ｍＬとアスコルビン酸溶液（２１ｍｇ）１１ｍＬを加え、減圧度−０.０７５ＭＰａ（Ｇ）にて、３０℃で反応させた。反応３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後に、アスコルビン酸溶液（２１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え、同様に減圧下で４時間反応した。反応後、実施例１と同様に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡ含有組成物を調製し、実施品２９〜３１を得た。
【実施例１４】
【００４８】
（実施品２９〜３１の１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量）
実施例１３で調製した実施品２９〜３１について、実施例２と同様な条件にて１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの分析を行った。その結果、表７に示されるように、反応温度が高くなると共に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量がよく、特に酵素反応温度が２３℃の場合に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が最も多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。
【００４９】
【表７】
2020092697.tif 000008
【００５０】
本発明では、減圧度（反応開始時の溶存酸素濃度）の影響を調べた結果、実施例２で示されたように、一定の範囲で減圧度が高くなる（反応開始時の溶存酸素濃度が低くなる）と共に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が増加し、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。また、リポキシゲナーゼ添加濃度の影響を調べた結果、実施例４で示されたように、反応液中のリポキシゲナーゼ濃度が高くなると共に、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。また、還元剤による影響を調べた結果、実施例６及び８で示されたように、反応液中にアスコルビン酸等の還元剤を存在させると、１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量が多くなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。更にリノール酸及び、アスコルビン酸の添加方法の影響を調べた結果、実施例１０で示されたように、リノール酸やアスコルビン酸は、反応開始時に一括添加しても、一定時間に逐次添加してもよいことが認められた。
【００５１】
反応時間（酵素処理時間）の影響を調べた結果、実施例１２で示されたように、反応時間が長くなると共に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量がよくなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。即ち、特許文献１に示されるような従来技術では、反応時間が８時間以上でリノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率を、約５％（Ｗ／Ｗ）までしか高めることができなかったが、本発明方法では、リノール酸からオキソ脂肪酸への変換率を、反応時間０.５時間で約８％（Ｗ／Ｗ）まで、反応時間１時間で１０％以上（Ｗ／Ｗ）まで高めることができた。また、反応温度（酵素反応温度）の影響を調べた結果、実施例１４で示されたように、反応温度が高くなると共に１３-ｏｘｏ-ＯＤＡの産生量がよくなり、リノール酸から１３-ｏｘｏ-ＯＤＡへの変換率が高くなることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明方法で製造されるオキソ脂肪酸又はそれを有効成分として含むオキソ脂肪酸含有組成物は、血中及び肝臓中の中性脂肪低下、血糖値の改善効果等を奏し、該組成物は生活習慣病改善に有用である。