(57)【要約】【課題】極早生イネを開発すること。【解決手段】イネ科植物の第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｅ１遺伝子および／またはｅ２遺伝子の存在を判別することを特徴とする、極早生イネの選抜方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネの第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｅ１遺伝子および／またはｅ２遺伝子の存在を判別することを特徴とする、極早生イネの選抜方法。
【請求項２】
イネの第７染色体の短腕末端からの距離６．８〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによってｅ１遺伝子の存在を判別することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
イネの第７染色体の短腕末端からの距離７．４〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによってｅ２遺伝子の存在を判別することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡマーカーがＲＭ２１２２４、Ｊ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡマーカーがＪ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上である、請求項２記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡマーカーがＪ１７５９およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
極早生イネの作成方法であって、
（ａ）極早生イネと、極早生でないイネとを交雑させて、雑種種子を作成すること、
（ｂ）該雑種種子を栽培して雑種イネ植物を作成すること、
（ｃ）請求項１〜７のいずれか１項記載の方法により、該雑種植物から、極早生イネを選抜すること
を含む方法。
【請求項９】
極早生でないイネが短稈イネまたは大粒イネである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
イネの第７染色体の短腕末端からの距離７．４〜８．３Ｍｂの領域に座乗する、極早生遺伝子ｅ２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極早生遺伝子ｅ１およびｅ２、および該遺伝子の存在を判別するためのＤＮＡマーカーを用いることを特徴とする極早生イネの選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、台風の発生数および上陸数の増加や豪雨等、甚大な自然災害が相次いでおり、農林水産物の被害が増加している。このような自然災害を回避するための対策の１つとして、植物工場における制御下の生産が考えられている。しかし、生育期間が長いイネでは植物工場生産のコストが水田作の約７倍かかり、実際的ではない。
【０００３】
一方、ライフサイクルの短い極早生品種として、コシヒカリのγ線照射で誘発された時無し性極早生変異体「関東７９号」が知られている。発明者の以前の研究では、関東７９号と原品種コシヒカリとの交雑Ｆ２、Ｆ３における遺伝解析によって、コシヒカリの遺伝的背景で１４日早生化させる劣性遺伝子が見出され、さらに、関東７９号と十石との交雑Ｆ２、Ｆ３における遺伝解析によって短稈遺伝子ｓｄ１と独立遺伝することが明らかにされた（例えば、非特許文献１、２）。しかし、該極早生遺伝子の詳細については解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】谷坂ら(1990) 水稲品種コシヒカリの半矮性突然変異系統北陸１００号および関東７９号の半矮性に関する遺伝子分析 人為突然変異の利用に関する育種学的研究XVIII．育種学雑誌 40/1:103-117
【非特許文献２】Tomita, M.（2009）Introgression of Green Revolution sd1 gene into isogenic genome of rice super cultivar Koshihikari to create novel semidwarf cultivar ‘Hikarishinseiki’ (Koshihikari-sd1), Field Crops Research 114/2:173-181
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
イネのライフサイクルを短縮して周年生産を可能にすれば、利用効率が上がり、コストが低減されて植物工場生産も可能になると考えられる。そこで、本発明は、極早生イネの開発を目指し、極早生遺伝子の解明を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のような状況下、本発明者は、まず、関東７９号由来の極早生遺伝子のマッピングを試みた。なお、本明細書では当該遺伝子を「ｅ１」と称する。すなわち、関東７９号と日本晴とを交雑し、Ｆ２で分離したｅ１ホモ型個体を用いて、ＤＮＡマーカーによるマッピングを行い、ｅ１がイネの第７染色体の短腕末端から６．６〜８．３Ｍｂの領域に座乗していることを明らかにした。
【０００７】
さらに、本発明者は、大粒品種「いのちの壱」からの極早生変異体「いのちの壱早生」とコシヒカリとを交雑し、極早生の性質を持つ雑種をコシヒカリへ戻し交雑して遺伝分析を行った。その結果、コシヒカリより約１０日早生の極早生群とコシヒカリ型の中生群が約１：３に分離したことから、いのちの壱早生由来の極早生を支配する１個の対立遺伝子座を見出し、「ｅ２」と命名した。さらに、ＤＮＡマーカーによるマッピングを行い、ｅ２がイネの第７染色体の短腕末端から７．４〜８．３Ｍｂの領域に座乗していることを明らかにした。かくして、本発明が完成した。なお、本明細書中において、極早生に関する対立遺伝子座ｅ１およびｅ２をそれぞれ、「ｅ１遺伝子」および「ｅ２遺伝子」または「極早生遺伝子ｅ１」および「極早生遺伝子ｅ２」とも称する。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］イネの第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｅ１遺伝子および／またはｅ２遺伝子の存在を判別することを特徴とする、極早生イネの選抜方法、
［２］イネの第７染色体の短腕末端からの距離６．８〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによってｅ１遺伝子の存在を判別することを特徴とする、［１］記載の方法、
［３］イネの第７染色体の短腕末端からの距離７．４〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによってｅ２遺伝子の存在を判別することを特徴とする、［１］記載の方法、
［４］ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法、
［５］ＤＮＡマーカーがＲＭ２１２２４、Ｊ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上である、［１］記載の方法、
［６］ＤＮＡマーカーがＪ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上である、［２］記載の方法、
［７］ＤＮＡマーカーがＪ１７５９およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上である、［３］記載の方法、
［８］極早生イネの作成方法であって、
（ａ）極早生イネと、極早生でないイネとを交雑させて、雑種種子を作成すること、
（ｂ）該雑種種子を栽培して雑種イネ植物を作成すること、
（ｃ）［１］〜［７］のいずれか１項記載の方法により、該雑種植物から、極早生イネを選抜すること
を含む方法、
［９］極早生でないイネが短稈イネまたは大粒イネである、［８］記載の方法、
［１０］イネの第７染色体の短腕末端からの距離７．４〜８．３Ｍｂの領域に座乗する、極早生遺伝子ｅ２
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、イネの第７染色体上にあるｅ１遺伝子およびｅ２遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーが同定される。該ＤＮＡマーカーを使用してｅ１遺伝子および／またはｅ２遺伝子の存在を判別することにより、極早生のイネ科植物を容易に選抜することができる。本発明によって、実際に試験個体を栽培し、評価する必要が大幅に減少し、種子や幼苗の時期においても標的遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを使用できるため、高い確率で標的遺伝子ｅ１および／またはｅ２を有する個体を選抜することができる。かくして、極早生化によってイネのライフサイクルを短縮すれば、植物工場生産が可能になり、大型台風や豪雨などの気象変動による被害を回避することができる。また、イネを極早生化することによって、最も暑い８月の登熟を避け、登熟障害を抑えることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、極早生遺伝子ｅ１と、第７染色体上にあるＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーとの連鎖状況を示す。
【図２】図２は、極早生遺伝子ｅ２と、第７染色体上にあるＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーとの連鎖状況を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、イネとしては、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．に属する種々の品種および系統を用いることができる。イネには、栽培種および野生種が含まれ、好ましくは栽培イネ、さらに好ましくはアジアイネ、特に好ましくは、ジャポニカ種のイネが使用される。
【００１２】
本発明において「極早生」とは、極早生の性質を有しないその原品種または極早生の性質を有しない交雑相手と比べて約１０日早くまたは１０日以上早く出穂することを意味する。例えば、栽培条件にもよるが、コシヒカリの遺伝的背景においてｅ１遺伝子をホモ型で有するイネ科植物は、コシヒカリよりも１０日以上早く、例えば約１４日早く出穂する。例えば、栽培条件にもよるが、コシヒカリの遺伝的背景においてｅ２遺伝子をホモ型で有するイネ科植物は、コシヒカリよりも約１０日早く出穂する。
【００１３】
ｅ１遺伝子は、コシヒカリのγ線照射で誘発された時無し性極早生変異体「関東７９号」において見出された極早生に関する遺伝子である。本発明においては、ｅ１の染色体位置を明らかにするために、日本晴と関東７９号を交雑し、Ｆ２で分離したｅ１ホモ型個体を用いて、全染色体を網羅する３１個のＳＳＲとの連鎖解析を行った。その結果、ｅ１遺伝子が第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜１８．９Ｍｂの領域に座乗していることが分かった。さらに３個のＳＮＰマーカーを用いて詳細な連鎖解析を行った結果、ｅ１遺伝子が第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に座乗していることが分かり、第７染色体短腕末端から６．８Ｍｂ付近でｅ１との最も強い連鎖が検出された。
【００１４】
ｅ２遺伝子は、「いのちの壱」の極早生変異体「いのちの壱早生」において見出された極早生に関する新規な遺伝子である。具体的には、コシヒカリといのちの壱早生を交雑し、交雑Ｆ２で分離したコシヒカリより１０日早く開花した最も早生（以後、極早生という）の個体を一回親、コシヒカリを反復親とする２回の戻し交雑を行い、コシヒカリに極早生形質を移入した同質遺伝子系統を育成するとともに、極早生に関する遺伝子解析を行った。その結果、ＢＣ１Ｆ２およびＢＣ２Ｆ２において極早生型：コシヒカリ型＝１：３に分離した。したがって、この極早生が１個の劣性極早生遺伝子によって支配されていることがわかった。この遺伝子を「ｅ２」と命名した。
【００１５】
ｅ１遺伝子とｅ２遺伝子の対立性を調べるため、「コシヒカリｅ１ｓｄ１系統」（関東７９号と十石との交雑により作出した極早生・短稈同質遺伝子系統）と、「コシヒカリｅ２系統」（コシヒカリといのちの壱早生の交雑Ｆ２で分離した極早生個体をコシヒカリに１回戻し交雑した、ｅ２ホモ型個体）とを検定交雑し、Ｆ２個体を得た。該検定交雑Ｆ２では、両親であるコシヒカリｅ１ｓｄ１系統およびコシヒカリｅ２系統の到穂日数が同程度であるのに対し（それぞれ、４７．８日および４９．０日）、両親よりかなり晩生で到穂日数がコシヒカリに相当する４３〜６０日に至る個体が現れた。すなわち、ｅ１とｅ２が非対立であることが分かった。
【００１６】
ｅ２の染色体位置を明らかにするために、日本晴またはコシヒカリといのちの壱早生を交雑し、Ｆ２で分離したｅ２ホモ型個体を用いて、全染色体を網羅する５３個のＳＳＲおよびＳＮＰマーカーとの連鎖解析を行った。その結果、ｅ２遺伝子は第７染色体短腕末端からの距離７．４〜８．３Ｍｂの領域に座乗していることが分かり、８．３Ｍｂ付近でｅ２との最も強い連鎖が検出された。
【００１７】
したがって、本発明は、イネの第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、ｅ１遺伝子および／またはｅ２遺伝子の存在を判別することを特徴とする、極早生イネの選抜方法（以下、「本発明の極早生イネの選抜方法」ともいう）を提供する。
【００１８】
「ＤＮＡマーカー」とは、遺伝分析のための目印（マーカー）として利用することができる、個体または系統によって塩基配列に違いが見られるＤＮＡ多型を意味し、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素ＤＮＡ断片長多型）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、ＳＳＲ（単純反復配列）、ＳＴＳ（配列タグ部位）、ＳＮＰ（一塩基多型）、ＲＡＰＤ（ランダム増幅断片多型）などの種類がある。本発明においては、ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される１以上のマーカーを使用してもよい。ＤＮＡマーカーは、例えば、公開データベースから検索することができる。例えば、ＳＮＰマーカーのデータベースとしては、Ｑ−ＴＡＲＯ（ＱＴＬ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｒｉｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ）データベース（http://qtaro.abr.affrc.go.jp/）等がある。
【００１９】
本発明において使用される「イネの第７染色体の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカー」は、例えば、以下のような方法によって見出すことができる。ｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を有する系統とｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を持たない系統との交雑Ｆ２を展開し、ｅ１ｅ１ホモ型またはｅ２ｅ２ホモ型Ｆ２個体から得たゲノムＤＮＡに対し、特異的なパターンを示すイネの第７染色体上の短腕末端からの距離６．６〜８．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを見出す。さらに、該特異的なパターンを示したＤＮＡマーカーについて、組換え価を求め、低い組換え価、例えば組換え価３０％、好ましくは２０％、より好ましくは１０％以内でｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子と連鎖しているものＤＮＡマーカーとして用いてもよい。なお、組換え価は以下の式によって求められる。
組換え価（％）＝（組換え型配偶子数／全配偶子数）×１００
【００２０】
またさらに、該特異的なパターンを示したＤＮＡマーカーについて、戻し交雑によりゲノム置換率を求め、低い置換率、例えば５０％以下の置換率のものをＤＮＡマーカーとして用いてもよい。例えば、ｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を持たない系統へのゲノム置換率が５０％以下の遺伝子または染色体部位がＤＮＡマーカーとして用いられる。
【００２１】
上記のｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を有する系統としては、例えば、関東７９号、いのちの壱早生、関東７９号またはいのちの壱早生の交雑植物、あるいは関東７９号またはいのちの壱早生を祖先にもつ植物を用いることができる。上記のｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を持たない系統としては、限定するものではないが、例えば、コシヒカリ、日本晴等を用いることができる。
【００２２】
本発明において使用されるＤＮＡマーカーは、イネの第７染色体の短腕末端からの距離が約６．６〜８．３Ｍｂの領域にあるマーカーである。例えば、第７染色体の短腕末端からの距離が約６．６〜８．３Ｍｂ、好ましくは約６．８〜８．３Ｍｂの領域にあるＤＮＡマーカーを用いてｅ１遺伝子の存在を判別してもよい。例えば、第７染色体の短腕末端からの距離が約７．４〜８．３Ｍｂの領域にあるＤＮＡマーカーを用いてｅ２遺伝子の存在を判別してもよい。
【００２３】
本発明において用いられるＤＮＡマーカーの例としては、限定するものではないが、ＲＭ２１２２４、Ｊ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３が挙げられる。ＲＭ２１２２４はＳＳＲマーカーである。Ｊ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３は各々、イネの第７染色体の短腕末端から６．８Ｍｂ、７．４Ｍｂ、および８．３Ｍｂの距離にあるＳＮＰマーカーである。本発明においては、好ましくは、ＲＭ２１２２４、Ｊ１７５３、Ｊ１７５９、およびＪ１７６３からなる群から選択される１つ以上のＤＮＡマーカーが用いられる。
【００２４】
本発明において、「検出」とは、上記ＤＮＡマーカーを検出するための当該分野で常套の方法を用いて実施すればよく、使用されるＤＮＡマーカーの種類に応じて当業者が適当に選択することができる。例えば、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、ＡＦＬＰ法などが挙げられる。
【００２５】
ＳＳＲマーカーの場合は、例えば、各ＳＳＲに特異的なプライマーを用いて、検体から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の長さを検出することにより、検体が目的遺伝子を有するかを判断することができる。
【００２６】
ＳＮＰマーカーの場合は、例えば、ＳＮＰアレルごとに特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、該プローブの末端をＳＮＰアレルごとに異なる蛍光色素およびクエンチャーで修飾し、該プローブより外側に設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により検出することができる。該プライマーの伸長反応によってプローブが分解されて、蛍光色素とクエンチャーが離れることにより発せられる蛍光を測定することにより、アレル特異的な蛍光の増幅曲線を得、検体がどのＳＮＰアレルを持つかを判断することができる。蛍光色素としては、限定するものではないが、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ等が使用される。アレル特異的なプローブ、およびプライマーは、検体のゲノム情報に基づいて、当業者が適宜設計することができる。
【００２７】
本発明の極早生イネの選抜方法は、例えば、新規の極早生イネを作出するための育種方法に利用される。かかる育種方法としては、当該分野で既知の一般的な方法が挙げられ、例えば、ｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を有する品種と他の品種を交雑させることを特徴とする方法が挙げられる。したがって、本発明は、さらに、極早生イネの作成方法であって、
（ａ）極早生の形質を有するイネと、極早生の形質を有しないイネとを交雑させて、雑種種子を作成すること、
（ｂ）該雑種種子を栽培して雑種イネ植物を作成すること、および
（ｃ）本発明の極早生イネの選抜方法により、該雑種植物から、極早生イネを選抜すること、
を含む方法（以下、「本発明の極早生イネの作成方法」ともいう）を提供する。
【００２８】
本発明の極早生イネの作成方法において、極早生の形質を有するイネとしては、例えば、関東７９号、いのちの壱早生、関東７９号またはいのちの壱早生の交雑植物、あるいは関東７９号またはいのちの壱早生を祖先にもつ植物を用いることができる。極早生の形質を有しないイネとしては、例えば、ｅ１遺伝子およびｅ２遺伝子を持たない品種が用いられる。ｅ１遺伝子およびｅ２遺伝子を持たない品種としては、限定するものではないが、例えば、コシヒカリ、日本晴等が挙げられる。また、ｅ１遺伝子およびｅ２遺伝子を持たない品種は、ｓｄ１、ｄ６０等の短稈遺伝子を有する短稈イネや、Ｇｇ等の大粒遺伝子を有する大粒イネであってもよい。
【００２９】
本発明の極早生イネの作成方法の具体例としては、
（ａ’）極早生の形質を有するイネと、極早生の形質を有しないイネとを交雑させて、Ｆ１を作成すること、
（ｂ’）Ｆ１と前記極早生の形質を有しないイネとを交雑させること、
（ｃ’）本発明の極早生イネの選抜方法により、該雑種植物から、極早生イネを選抜すること、および
（ｄ’）工程（ｃ’）によって選抜された植物と、前記極早生の形質を有しないイネとを交雑させること
を含む方法が挙げられる。上記工程（ｃ’）および（ｄ’）は繰り返してもよい。
【００３０】
本発明の極早生イネの作成方法の別の具体例としては、
（ａ’’）極早生の形質を有するイネと、極早生の形質を有しないイネとを交雑させて、Ｆ１を作成すること、
（ｂ’’）Ｆ１を同系交配させてＦ２を作成すること、および
（ｃ’’）本発明の極早生イネの選抜方法により、該雑種植物から、極早生イネ植物を選抜すること
を含む方法が挙げられる。上記工程（ｂ’’）および（ｃ’’）は繰り返してもよい。
【００３１】
本発明の極早生イネの作成方法では、ｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを利用するので、所望の植物を高い確率で、かつ、容易に選抜することができる。また、このようなＤＮＡマーカーを用いた育種では、比較的少ない個体数を栽培すればよく、また、種子や幼苗という早い時期においても選抜できるため、効率がよい。
【００３２】
本発明は、さらに、新規の極早生遺伝子ｅ２を提供する。ｅ１遺伝子またはｅ２遺伝子を用いれば、極早生イネの選抜、育種を可能とするだけでなく、イネに直接導入して新規な極早生品種を開発することも可能となる。
【実施例】
【００３３】
実施例１：極早生遺伝子ｅ１のマッピング
関東７９号と日本晴を交雑し、交雑Ｆ２ ３１３個体において、出穂日が関東７９号の出穂期の平均値付近に分布する極早生群と、出穂日がそれより遅い中生群が出現し、６５極早生型（ｅ１ホモ型）：２４８中生型（Ｅ１ホモ＋Ｅ１ｅ１型）≒１：３に分離した（χ２＝２．９９１，  ０．０５＜Ｐ＜０．１０）。該Ｆ２で分離した出穂期が関東７９号型のｅ１ホモ型３９個体を供試して、関東７９号／日本晴間で多型を示し、かつ、イネの全染色体を網羅するように選んだ３１個のＳＳＲマーカーを用いて、ｅ１との連鎖解析を行った。
【００３４】
Ｆ２で分離した出穂期が関東７９号型のｅ１ホモ型３９個体の葉から、常法にしたがいゲノムＤＮＡを抽出した。簡単に言うと、−８０℃で保存しておいた葉をセラミックビーズ（ＹＴＺビーズ）が入った２ｍｌ粉砕専用チューブ（ＣＫ２８）に入れ、液体窒素に浸漬して１分間凍結した。ビーズ式高速細胞破砕装置（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４，ｂｅｒｔｉｎ）で、５０００ｒｐｍで２０秒回転させた後、取り出して再び液体窒素に浸漬凍結し、もう一度５０００ｒｐｍで２０秒間回転させて葉を粉砕した。粉砕した葉に２×ＣＴＡＢを５００μＬ注入し、５５℃の恒温槽で３０分間インキュベートした。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を５００μＬ注入し、１５分間振とうさせた後、５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心し、上澄みをオートクレーブで滅菌済みの１．５ｍｌチューブに分取した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．８）を５０μＬ、およびイソプロパノールを５００μＬ加え、ＤＮＡを凝集させた。これを５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心して沈殿させ、上澄みを捨てて、７０％エタノールを３００μＬ入れ、５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心した。遠心後、上澄みを捨て、風乾させ、滅菌ミリＱ水１００μＬでＤＮＡを溶かし、ＤＮＡを抽出した。
【００３５】
抽出した各Ｆ２植物体由来のＤＮＡサンプルを鋳型にして、表１の組成でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは、９５℃２分間で熱変性させた後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング５０℃３０秒、伸長反応７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１００Ｖで４５分間電気泳動した。
【００３６】
【表１】
2020198830.tif 000002
【００３７】
【表２】
2020198830.tif 000003
【００３８】
その結果、第７染色体上のＳＳＲマーカーとの連鎖が認められ、ｅ１が第７染色体上に座乗することが分かった。そこで、さらに、ｅ１との有意な連鎖が検出された第７染色体の短腕末端から６．６〜１８．９Ｍｂ領域において、関東７９号／日本晴間で多型を示す３個のＳＮＰマーカーを用いて詳細な連鎖解析を行った。
【００３９】
ＳＮＰマーカーは、アレルごとにＦＡＭおよびＨＥＸで標識したＴａｑＭａｎプローブを設計して、ＴａｑＭａｎプローブ法によって検出した。第７染色体短腕末端からの距離６．８Ｍｂ、７．４Ｍｂおよび８．３Ｍｂに位置し、関東７９号と日本晴間で多型を示す３か所のＳＮＰ［Ｊ１７５３（６．８Ｍｂ）、Ｊ１７５９（７．４Ｍｂ）、Ｊ１７６３（８．３Ｍｂ）］について、１塩基だけが異なるＳＮＰアレルにそれぞれ特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、それぞれ異なる蛍光色素ＦＡＭおよびＨＥＸで標識した（表３−１）。こうして作製されたＴａｑＭａｎプローブは、それより外側に設計したプライマー（表３−２）の伸長反応によって分解されて、蛍光色素とクエンチャー（ＢＨＱ−１）が離れると発光する。このアレル特異的な蛍光の増幅曲線によってどちらのＳＮＰアレルを持つかを判断した。
【００４０】
【表３−１】
2020198830.tif 000004
表中、一塩基多型を下線で示す。
【００４１】
【表３−２】
2020198830.tif 000005
【００４２】
上記の抽出したＤＮＡサンプルを用いて、ＳＮＰ解析を行った。ＳＮＰ解析は、ＳＳｏ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）１０μＬ、フォワードプライマー１μＬ、リバースプライマー１μＬ、プローブＦＡＭ０．４μＬ、プローブＨＥＸ０．４μＬ、ＤＮＡサンプル２μＬ（１００ｎｇ）、滅菌水５．２μＬを含む反応液で、９５℃３分間熱変性させた後、９５℃１５秒、６４．２℃３０秒で４０サイクルのＰＣＲ反応を行い、蛍光を検出した。
【００４３】
第７染色体上の各ＤＮＡマーカーとｅ１遺伝子との組換え価を算出したところ、短腕末端から４．１Ｍｂ地点のＲＭ８０１０で２３．０％、６．６Ｍｂ地点のＲＭ２１２２４で６．４％、６．８Ｍｂ地点のＪ１７５３で３．８％、７．４Ｍｂ地点のＪ１７５９で５．１％、８．３Ｍｂ地点のＪ１７６３で５．１％、１８．９Ｍｂ地点のＲＭ３３００で２７．２％となった（図１）。したがって、ｅ１遺伝子を第７染色体上にマッピングすることができ、ｅ１遺伝子は、第７染色体短腕末端から６．６Ｍｂ〜８．３Ｍｂの領域にあるＤＮＡマーカーと連鎖することがわかった。特に、第７染色体短腕末端から６．８Ｍｂ地点でｅ１遺伝子との最も強い連鎖が検出された。
【００４４】
実施例２：極早生遺伝子ｅ２の検出
（１）いのちの壱早生の遺伝子解析
コシヒカリといのちの壱早生を交雑し、交雑Ｆ２で分離したコシヒカリより１０日早生の個体を一回親にして、コシヒカリを反復親とする戻し交雑を行った。その結果、ＢＣ１Ｆ２およびＢＣ２Ｆ２において、コシヒカリより１０日早生の極早生群とコシヒカリ型の中生群がそれぞれ、１８極早生型：７９中生型≒１：３および１６極早生型：５６中生型≒１：３の２頂性に分離した。したがって、いのちの壱早生の極早生が１個の極早生遺伝子に支配されていることがわかった。この遺伝子をｅ２と名付けた。
【００４５】
（２）ｅ２とｅ１との対立性検定
関東７９号に由来し、１４日早生化させる極早生遺伝子ｅ１といのちの壱早生の極早生遺伝子ｅ２との対立性を調べるため、ｅ１を持つコシヒカリの同質遺伝子系統「コシヒカリｅ１ｓｄ１」と、コシヒカリ×いのちの壱早生の交雑Ｆ２で分離した極早生型個体を一回親にしてコシヒカリを反復親とする戻し交雑ＢＣ１Ｆ２で分離したｅ２ホモ型個体「コシヒカリｅ２系統」との交雑Ｆ２を供試した。コシヒカリｅ１ｓｄ１は、非特許文献２に記載のとおりに育成した。
【００４６】
簡単に言うと、短稈遺伝子ｓｄ１を持つコシヒカリの同質遺伝子系統（コシヒカリｓｄ１）を育成する過程で、関東７９号×十石の交雑Ｆ２  １００個体から個体別の次代Ｆ３系統を育成し、出穂期が関東７９号型の極早生、コシヒカリ型の中生でそれぞれ固定するとともに、稈長については十石由来のｓｄ１ホモ型で固定した系統を獲得した。このうち、コシヒカリｓｄ１×関東７９号のＦ３で固定したｅ１ｓｄ１ホモ型個体を一回親、コシヒカリを反復親とする戻し交雑ＢＣ１Ｆ２において、極早生型（ｅ１ホモ型）：中生型（Ｅ１ホモ＋Ｅ１ｅ１型）≒１：３に分離し、かつ極早生群、中生群において短稈型（ｓｄ１ホモ型）：長稈型（Ｓｄ１ホモ＋Ｓｄ１ｓｄ１型）≒１：３に分離した。以上のようにして、コシヒカリより１０日早生で３０ｃｍ短稈化した極早生・短稈同質遺伝子系統「コシヒカリｅ１ｓｄ１」を育成した。
【００４７】
上記コシヒカリｅ１ｓｄ１系統とコシヒカリｅ２系統との検定交雑Ｆ２では、その両親の平均到穂日数がそれぞれ４７．８日（コシヒカリｅ１ｓｄ１系統）および４９．０日（コシヒカリｅ２系統）と同程度であったのに対し、４３日から両親より晩生で６０日に至る個体が現れた。したがって、ｅ１とｅ２が非対立であることが分かった。すなわち、両親の遺伝子型がｅ１ｅ１Ｅ２Ｅ２およびＥ１Ｅ１ｅ２ｅ２であるため、Ｆ２で両遺伝子座で優性アレルを持つ遺伝子型が晩生となって２頂性に１３早生（１ｅ１ｅ１（１Ｅ２Ｅ２：２Ｅ２ｅ２：１ｅ２ｅ２）：（１Ｅ１Ｅ１：２Ｅ１ｅ１）１ｅ２ｅ２：（１Ｅ１Ｅ１：２Ｅ１ｅ１）２Ｅ２ｅ２）：３晩生（１Ｅ１Ｅ１Ｅ２Ｅ２：２Ｅ１ｅ１Ｅ２Ｅ２）に分離した。
【００４８】
（３）極早生遺伝子ｅ２のマッピング
日本晴といのちの壱早生との交雑Ｆ２ １５９個体において、４２早生型：１１７中生型≒１：３の２頂性に分離した。該日本晴×いのちの壱早生のＦ２、ならびにコシヒカリ×いのちの壱早生Ｆ２、およびコシヒカリ／（コシヒカリ／いのちの壱早生Ｆ２）ＢＣ１Ｆ２で分離したｅ２ホモ型極早生個体を供試して、イネの全染色体を網羅する５１個のＳＳＲ、ＳＮＰマーカーとｅ２との連鎖解析を行った。ＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーの検出は、実施例１と同様の方法で行った。ＳＮＰマーカーの検出に用いたＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーもまた、実施例１の表３−１および表３−２に示すとおりである。
【００４９】
その結果、第７染色体上のＤＮＡマーカーとの連鎖が認められ、ｅ２が第７染色体上に座乗することが分かった。第７染色体上の各ＤＮＡマーカーとｅ２遺伝子との組換え価を算出したところ、短腕末端から４．１Ｍｂ地点のＲＭ８０１０で１５．０％、６．８Ｍｂ地点のＪ１７５３で８．３％、７．４Ｍｂ地点のＪ１７５９で５．０％、８．３Ｍｂ地点のＪ１７６３で５．０％、１８．９Ｍｂ地点のＲＭ３３００で３２．８％となった（図２）。したがって、第７染色体短腕末端から７．４Ｍｂ〜８．３Ｍｂの領域にｅ２が座乗することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、極早生遺伝子ｅ１およびｅ２に密接に連鎖していて選抜効率が高いＤＮＡマーカーを開発し、ｅ１遺伝子および／またはｅ２遺伝子のマーカー選抜による極早生イネの開発法を提供する。したがって、本発明は、農業分野、特にイネ科植物の品種改良の分野において利用可能である
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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