(57)【要約】【課題】薬物開発に関連する時間と資源の投資を減少させ、信頼できる結果を提供する、薬物候補をスクリーニングするのに適した細胞を提供する。【解決手段】本発明は、１種類以上の薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素を一過的に過剰発現する、薬物候補をスクリーニングするための凍結保存組換え細胞を開示する。そのような細胞が、薬物候補が、薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素の基質または阻害剤であるか否かをスクリーニングするプロセスを簡素化する費用効率の高い摂取できる製品を提供することが都合よい。【選択図】図１
2020110190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存された一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を調製する方法であって、
細胞に、薬物輸送タンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的にトランスフェクションして、一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を提供する工程、および
一過的なトランスフェクションの４８時間以内で前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を凍結保存する工程、
を含み、
前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞の集団が、前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を凍結保存する前に、検出可能なレベルで、前記薬物輸送タンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現し、
前記細胞の一過的なトランスフェクションが、エレクトロポレーションを含み、
前記１種類以上の遺伝子がＭＡＴＥ２Ｋであり、前記細胞がＨＥＫ２９３である、
方法。
【請求項２】
前記凍結保存前の検出可能なレベルが、前記薬物輸送タンパク質の特定の典型的基質に対しての該薬物輸送タンパク質の活性であり、
前記凍結保存前の検出可能なレベルが、少なくとも５の取り込み比である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凍結保存前の検出可能なレベルが、前記薬物輸送タンパク質の特定の典型的基質に対しての該薬物輸送タンパク質の活性であり、
前記凍結保存前の検出可能なレベルが、５〜２５の取り込み比である、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞の集団が、前記凍結保存からの解凍後に検出可能なレベルで、前記薬物輸送タンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現し、
前記凍結保存からの解凍後の前記検出可能なレベルが、前記薬物輸送タンパク質の特定の典型的基質に対しての前記薬物輸送タンパク質の活性であり、
前記凍結保存からの解凍後の前記検出可能なレベルが、少なくとも５の取り込み比である、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞が、一過的なトランスフェクション後約２４時間〜約４８時間で凍結保存される、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
凍結保存された一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を調製する方法であって、
細胞に、薬物輸送タンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的にトランスフェクションして、一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を提供する工程、および
トランスフェクションの４８時間以内で前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を凍結保存する工程、
を含み、
前記細胞の一過的なトランスフェクションが、エレクトロポレーションを含み、
前記１種類以上の遺伝子がＭＡＴＥ２Ｋであり、前記細胞がＨＥＫ２９３である、
方法。
【請求項７】
前記一過的にトランスフェクションされた組換え細胞が、トランスフェクション後３０分間〜２４時間で凍結保存される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法により調製される、凍結保存された一過的にトランスフェクションされた組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保存された組換え細胞であって、コード化されたタンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後のその細胞集団において検出できるように薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現する組換え細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物開発は、費用と時間がかかる事業であり、それには、薬物候補は、その市場における売買のための規制認可を受ける前に米国食品医薬品局および欧州医薬品庁などの政府系機関により確立された特定の基準を満たさなければならない。重要なことには、薬物候補をスクリーニングして、そのような薬物の吸収、分布、代謝および排泄、それらの毒性および薬物と薬物の相互作用に著しい効果を持つことができるために、いずれが、１種類以上の薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素の基質または阻害剤であるか否かを決定するために、アッセイが行われる。
【０００３】
薬物輸送タンパク質または薬物代謝酵素をコード化する遺伝子を安定に発現する細胞株がそのようなスクリーニングに使用されることがあるが、その凍結貯蔵物を生成し、維持するために、多大な時間と資源が必要である。それに加え、発現される組換えタンパク質のレベルは、通常はばらつきがあり（研究所による）、そのような細胞の継代による時間の経過で劣化するおよび／またはよりばらつくであろう。あるいは、薬物輸送タンパク質または薬物代謝酵素をコード化する遺伝子を安定か一時的かのいずれかで発現する、新しく平板培養された細胞が、そのようなスクリーニングに使用されることがある。しかしながら、新しく平板培養された細胞は、数日の限られた貯蔵寿命を有し、それらの生存率を維持する方法で出荷することが難しい。その上、安定な細胞株を生成するために、外来導入遺伝子が、細胞の宿主ゲノム中に実際に組み込まれ、細胞分裂周期中にそれと共に運ばれる。宿主細胞中の染色体への組み込みにより、宿主ゲノムの永久的な修飾がもたらされ、潜在的に、他の遺伝子の異常発現をもたらし、宿主の行動の予期せぬ変化および信頼できない実験結果を生じるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
それゆえ、薬物開発に関連する時間と資源の投資を減少させ、信頼できる結果を提供する、薬物候補をスクリーニングするのに適した細胞が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、信頼できる結果および素早い便宜を提供する、いずれが、１種類以上の薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素の基質または阻害剤であるか否かを決定するための、薬物候補をスクリーニングするのに適した凍結保存された組換え細胞を提供する。凍結保存後の組換え細胞の集団における活性のレベルが、新しくトランスフェクトされた細胞の活性レベルに匹敵することが望ましい。その上、凍結保存された組換え細胞は、バイアル内に容易にパッケージされ、ドライアイスまたはドライシッパー(dry shipper)と共に出荷され、受け取った際に液体窒素中において−１３５℃で都合よく貯蔵され、貯蔵寿命は数年である。それゆえ、そのような細胞は、エンドユーザに、実験の実施に便宜を与え、薬物候補をスクリーニングするための細胞株(cell stock)を作製および／または維持する上で時間と資源の投資を減少させる、摂取できる「解凍および使用」製品を提供する。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、薬物輸送タンパク質および薬物代謝酵素、またはそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコード化する、１種類以上の一過的に過剰発現される遺伝子を含む、凍結保存された組換え細胞であって、その薬物輸送タンパク質またはその薬物代謝酵素もしくはその組合せの活性が、凍結保存からの解凍後の凍結保存された組換え細胞の集団において検出可能である、組換え細胞を提供する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、薬物輸送タンパク質および薬物代謝酵素、またはそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現する、一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を調製する方法であって、細胞に、薬物輸送タンパク質または薬物代謝酵素をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的にトランスフェクションする工程、およびトランスフェクションの４８時間以内で一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を凍結保存する工程を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明のこれらと他の特徴は、以下の詳細な説明の研究により、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】懸濁液中で増殖したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ（ＦＳ２９３）細胞および２９３−Ｆ細胞に関する、細胞株、エレクトロポレーション（ＥＰ）後の細胞および凍結保存からの解凍後の細胞からの生存細胞の百分率のグラフ
【図２】凍結保存からの解凍後の平板培養から４時間後（Ａ）、２４時間後（Ｂ）および４８時間後（Ｃ）のトランスフェクト細胞の画像
【図３】２４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆プレート内の（Ａ）ウェル当たり０．４×１０6の生存細胞および（Ｂ）ウェル当たり０．２×１０6の生存細胞で平板培養され、平板培養から２４時間後（凍結保存からの解凍後）の平板培養培地中で培養された、ｐＯＡＴＰ１Ｂ１発現プラスミドが導入された２９３−Ｆ細胞の画像
【図４】平板培養から２４時間後（凍結保存からの解凍後）の２４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆プレート内のウェル当たり０．４×１０6の細胞で平板培養された、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２Ｋ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、長いイソ型ＯＡＴ１（５６３のアミノ酸を有する全長ｃＤＮＡ；ここで「ＯＡＴ１長」と称される）、短いイソ型ＯＡＴ１（５５０のアミノ酸を有する、Ｃ末端５２２〜５３４で１３のアミノ酸を欠損している；ここで「ＯＡＴ１短」と称される）、ＯＡＴ３、およびｐＣＭＶベクターが導入された２９３−Ｆ細胞の画像
【図５】ＥＰから２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）の、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞の蛍光画像
【図６】様々な量のＤＮＡを使用した、接着ＨＥＫ２９３のＥＰ後の生存細胞の百分率のグラフ
【図７Ａ】ＥＰから４８時間後の様々な量のＤＮＡ（すなわち、０、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌのＯＡＴＰ２／ＯＡＴＰ１Ｂ１）が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞における様々なインキュベーション時間後のエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込み活性のグラフ
【図７Ｂ】ＥＰから９６時間後の様々な量のＤＮＡ（すなわち、０、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌのＯＡＴＰ２／ＯＡＴＰ１Ｂ１）が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞における様々なインキュベーション時間後のエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込み活性のグラフ
【図８】ＥＰから４８時間後の様々な量のＤＮＡ（すなわち、０、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌのＯＡＴＰ２／ＯＡＴＰ１Ｂ１）が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞における様々なインキュベーション時間後のエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込みの信号対雑音比のグラフ
【図９】小型のＥＰ装置（ＯＣ４００）を使用したＯＡＴＰ２／ＯＡＴＰ１Ｂ１、大型のＥＰ装置（ＣＬ２）を使用したＯＡＴＰ２／ＯＡＴＰ１Ｂ１、または空のベクター対照いずれかが導入された接着ＨＥＫ２９３細胞におけるエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込み活性のグラフ
【図１０】「対照」（すなわち、従来の脂質トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる））、またはＳＴＸ、ＭａｘＣｙｔｅ測定可能ＥＰ装置のいずれかを使用して、ＯＡＴＰ１Ｂ１遺伝子が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞における様々なインキュベーション時間後のエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込みの信号対雑音比のグラフ
【図１１】新しく平板培養された、または凍結保存からの解凍後に平板培養された、ＯＡＴＰ１Ｂ１が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞における様々なインキュベーション時間後のエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込みの信号対雑音比のグラフ
【図１２】ＭａｘＣｙｔｅ測定可能ＥＰ装置およびスケールアッププロセスを使用し、凍結保存、解凍、ポリ−Ｄ−リシンプレート上での平板培養および平板培養後の２４時間に亘るインキュベーションを行った後の、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａ（Ｇｅｎｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００６４４６．４）、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂ（Ｇｅｎｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ００６４４６．３）、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ｐＣＭＶベクター、長いイソ型ＯＡＴ１（５６３のアミノ酸を有する全長ｃＤＮＡ）、ＯＡＴ３、ＯＣＴ１またはＯＣＴ２が導入されたＨＥＫ２９３細胞の画像
【図１３Ａ】３μＭの濃度でのＰＡＨと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴ１またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｐ−アミノ馬尿酸（ＰＡＨ）（ＯＡＴ１の典型的基質）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１３Ｂ】それにより、５分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、３から２００μＭの範囲の濃度でのＰＡＨの取り込みが測定された反応速度アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１３Ｃ】それにより、ＯＡＴ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞が、５分間に亘り、１５μＭの濃度のＰＡＨおよび０〜３００μＭの範囲の濃度のプロベネシド（ＯＡＴ１阻害剤）と共にインキュベーションされた阻害アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＩＣ５０が、グラフ中に挿入として示されている。
【図１４Ａ】１μＭの濃度でのＥ３Ｓと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴ３またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるエストロン−３−硫酸（Ｅ３Ｓ）（ＯＡＴ３の典型的基質）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１４Ｂ】それにより、１分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．５から３２μＭの範囲の濃度でのＥ３Ｓの取り込みが測定された反応速度アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１４Ｃ】それにより、ＯＡＴ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞が、５分間に亘り、４μＭの濃度のＥ３Ｓおよび０〜３００μＭの範囲の濃度のプロベネシド（ＯＡＴ３阻害剤）と共にインキュベーションされた阻害アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＩＣ５０が、グラフ中に挿入として示されている。
【図１５Ａ】３１μＭの濃度でのＴＥＡと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＣＴ１またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＡ（ＯＣＴ１の典型的基質）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１５Ｂ】３．８μＭの濃度でのメトホルミンと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＣＴ１またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるメトホルミン（ＯＣＴ１の典型的基質）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１５Ｃ】それにより、１０分間のインキュベーション後のＯＣＴ１またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、１、１０および１００μＭの濃度でのＴＥＡの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１５Ｄ】それにより、１０分間のインキュベーション後のＯＣＴ１またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．１、１および１０μＭの濃度でのメトホルミンの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１５Ｅ】それにより、ＯＣＴ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞が、１０分間に亘り、０．１〜５００μＭの範囲の様々な濃度でのＴＥＡおよびＯＣＴ１阻害剤（キニジン、ベラパミルまたはデシニウム−２２）と共にインキュベーションされた、阻害アッセイの結果を示すグラフ
【図１５Ｆ】それにより、ＯＣＴ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞が、１０分間に亘り、３．８μＭの濃度でのメトホルミンおよび４μＭから３ｍＭの範囲の様々な濃度でのＯＣＴ１阻害剤のシメチジンと共にインキュベーションされた、阻害アッセイの結果を示すグラフ
【図１６Ａ】３１μＭの濃度でのＴＥＡと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＣＴ２またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＡ（ＯＣＴ２の典型的基質）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１６Ｂ】３．８μＭの濃度でのメトホルミンと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＣＴ２またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるメトホルミン（ＯＣＴ２の典型的基質）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１６Ｃ】それにより、１０分間のインキュベーション後のＯＣＴ２またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、１、１０および１００μＭの濃度でのＴＥＡの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１６Ｄ】それにより、１０分間のインキュベーション後のＯＣＴ２またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．１、１および１０μＭの濃度でのメトホルミンの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１６Ｅ】それにより、ＯＣＴ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞が、１０分間に亘り、３．８μＭの濃度でのメトホルミンおよび４μＭから３ｍＭの範囲の濃度でのＯＣＴ２阻害剤であるシメチジンと共にインキュベーションされた、阻害アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＩＣ５０が、グラフ中に挿入として示されている。
【図１７Ａ】１μＭの濃度でのＥ１７βＧと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａまたはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるエストラジオール−１７β−グルクロニド（Ｅ１７βＧ）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１７Ｂ】１μＭの濃度でのＥ３Ｓと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａまたはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるエストロン−３−硫酸（Ｅ３Ｓ）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１７Ｃ】１μＭの濃度でのロスバスタチンと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａまたはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるロスバスタチン取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１７Ｄ】それにより、１分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．２５から４０μＭの範囲の濃度でのＥ１７βＧの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１７Ｅ】それにより、５分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．７８から５０μＭの範囲の濃度でのロスバスタチンの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１７Ｆ】それにより、５分間に亘る、０．０４から３０μＭの範囲の濃度での阻害剤シクロスポリンＡと共のインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、１μＭの濃度でのＥ１７βＧの取り込みが測定された阻害アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＩＣ５０が、グラフ中に挿入として示されている。
【図１８Ａ】１μＭの濃度でのＥ１７βＧと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂまたはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＥ１７βＧ取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１８Ｂ】１μＭの濃度でのＥ３Ｓと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂまたはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＥ３Ｓ取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１８Ｃ】１μＭの濃度でのロスバスタチンと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂまたはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるロスバスタチン取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１８Ｄ】それにより、１分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．２５から４０μＭの範囲の濃度でのＥ１７βＧの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１８Ｅ】それにより、５分間に亘る、０．０４から３０μＭの範囲の濃度での阻害剤シクロスポリンＡと共のインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、１μＭの濃度でのＥ１７βＧの取り込みが測定された阻害アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＩＣ５０が、グラフ中に挿入として示されている。
【図１９Ａ】１μＭの濃度でのＣＣＫ−８と共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ３またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるコレシストキニン（ＣＣＫ−８）取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１９Ｂ】１μＭの濃度でのＥ１７βＧと共の様々なインキュベーション時間（すなわち、１、２、５、１０および１５分）後のＯＡＴＰ１Ｂ３またはｐＣＭＶベクターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＥ１７βＧ取り込みの時間依存アッセイの結果を示すグラフ
【図１９Ｃ】それにより、１分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．５から２０μＭの範囲の濃度でのＣＣＫ−８の取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１９Ｄ】それにより、５分間に亘るインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、０．７８から５０μＭの範囲の濃度でのロスバスタチンの取り込みが測定された濃度依存アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＫｍおよびＶｍａｘが、グラフ中に挿入として示されている。
【図１９Ｅ】それにより、２分間に亘る、０．０４から３０μＭの範囲の濃度での阻害剤シクロスポリンＡと共のインキュベーション後のＯＡＴＰ１Ｂ３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において、１μＭの濃度でのＣＣＫ−８の取り込みが測定された阻害アッセイの結果を示すグラフ。Ｓｉｇｍａ−ｐｌｏｔを使用して計算された、ＩＣ５０が、グラフ中に挿入として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ここに用いたように、以下の用語は、下記に述べられる定義を有するものとする。
【００１１】
ここに用いたように、「細胞」という用語は、初代細胞並びに樹立細胞株の両方を含む（例えば、ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞ＭＤＣＫ細胞、ブタ腎臓上皮細胞ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞Ｃａｃｏ−２細胞およびチャイニーズハムスター肺線維芽Ｖ７９細胞）。
【００１２】
ここに用いたように、「薬物輸送タンパク質」という用語は、以下に限られないが、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体および溶質輸送担体（ＳＬＣ）トランスポーターを含む膜結合型輸送タンパク質を称する。
【００１３】
ここに用いたように、「薬物代謝酵素」という用語としては、以下に限られないが、シトクロム（ＣＹＰ）Ｐ４５０などのシトクロム；アルコール脱水素酵素、モノアミン酸化酵素およびアルデヒド・オキシダーゼなどのＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素および他の非ＣＹＰ薬物代謝酵素が挙げられる。
【００１４】
ここに用いたように、「検出可能」という用語は、薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素が導入された細胞中の選択されたプローブ基質の活性が、空のベクターが導入された細胞中の同じプローブ基質の活性よりも高いものとすることを意味する；活性の差が少なくとも５倍であることが望ましい。
【００１５】
ここに用いたように、輸送体の命名法における大文字の使用は、ヒトタンパク質／遺伝子、すなわち、ＭＲＰ２／ＡＢＣＣ２などを特定する；小文字は、前臨床（非ヒト哺乳類）種に由来する輸送体、すなわち、Ｍｒｐ２／Ａｂｃｃ２などを示す。別記しない限り、遺伝子は、任意の種（例えば、ヒトまたは他の哺乳類）に由来する。
【００１６】
ここに用いたように、「ＯＡＴＰ１Ｂ１」、「ＯＡＴＰ２」および「ＳＬＣＯ１Ｂ１」という用語は、交換可能であり、非ヒトタンパク質／遺伝子Ｏａｐ２に対応するヒトタンパク質／遺伝子を称する。別記しない限り、ＯＡＴＰ１Ｂ１への言及は、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂに対するものである。
【００１７】
ここに用いたように、「ＯＡＴ１」および「ＳＬＣ２２Ａ６」という用語は、交換可能であり、有機アニオン輸送体１を称する。別記しない限り、ＯＡＴ１への言及は、５６３のアミノ酸を有する全長のｃＤＮＡコード化（ここでは、「ＯＡＴ１長」とも称される）に対するものである。
【００１８】
例示のＡＢＣ輸送体としては、以下に限られないが、下記の表１に列挙されたものが挙げられる。
【００１９】
【表１】
2020110190.tif 000003
【００２０】
例示のＳＬＣ輸送体としては、以下に限られないが、下記の表２に列挙されたものが挙げられる。
【００２１】
【表２】
2020110190.tif 000004
【００２２】
試験した例示のＳＬＣ輸送体としては、以下に限られないが、下記の表３に列挙されたものが挙げられる。
【００２３】
【表３】
2020110190.tif 000005
【００２４】
本発明に使用するのに適した細胞としては、例えば、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ハムスターおよびブタなど）に由来するものなどの、哺乳類細胞が挙げられる。特定の実施の形態において、細胞は、肝細胞、または内皮細胞である。
【００２５】
遺伝子を細胞集団に導入するための遺伝子送達系が、当業者に公知である。ウイルスに基づく遺伝子送達方法を使用されることもあるが、安全性の懸念のために、細胞の特別な取扱が必要である。脂質に基づくトランスフェクション方法が使用されることがあり、脂質由来のトランスフェクション試薬は比較的費用がかかり、そのような方法は、大規模製造プロセスに適していない。その上、脂質に基づくトランスフェクション方法により、遺伝子送達効率が比較的低く、タンパク質発現が比較的遅延する（一般に、トランスフェクションの７２から９６時間後）（データは示さず）。エレクトロポレーション（ＥＰ）は、大規模製造プロセスに適しており、ウイルスに基づく遺伝子送達方法の安全性の問題が避けられるので、好ましい。さらに、ＥＰにより、遺伝子送達が比較的効率的になる。
【００２６】
細胞集団への遺伝子送達後、薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素をコード化する遺伝子は、それからコード化されたタンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後に検出可能であるように、過剰発現される。薬物候補は、それと共の組換え細胞のインキュベーションによって、どれが、過剰発現された遺伝子からコード化されたタンパク質の基質または阻害剤であるかを決定するために試験することができる。詳しくは、薬物候補が薬物輸送タンパク質および／または薬物代謝酵素の基質である場合、その薬物候補は影響を受ける。例えば、薬物候補が薬物輸送タンパク質の基質である場合、その薬物候補は、薬物輸送タンパク質を通じて組換え細胞中に、またはそこから移行される。しかしながら、その薬物候補が薬物輸送タンパク質の阻害剤である場合、その薬物候補は、薬物輸送タンパク質の基質の組換え細胞中へのまたはそこからの移行を阻害する。
【００２７】
あるいは、全細胞またはその細胞下分画（ミクロソーム／細胞質ゾル）を使用してアッセイを行っても差し支えない。
【００２８】
その上、本発明の組換え細胞に、特定のアッセイに望ましいように、一過的に過剰発現された遺伝子のＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡを導入して、その発現をノックダウン／ノックアウトしてもよい。初代細胞（例えば、肝細胞）に、任意のＡＢＣ輸送体、ＳＬＣ輸送体または任意の他の薬物代謝酵素に向けられたＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡを導入して、特定遺伝子の発現をノックダウン／ノックアウトしても差し支えない。
【００２９】
態様（１）において、本開示は、薬物輸送タンパク質および薬物代謝酵素、またはそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコード化する、１種類以上の一過的に過剰発現される遺伝子を含む、凍結保存された組換え細胞であって、その薬物輸送タンパク質またはその薬物代謝酵素もしくはその組合せの活性が、凍結保存からの解凍後の凍結保存された組換え細胞の集団において検出可能である、組換え細胞を提供する。
【００３０】
態様（２）において、本開示は、前記１種類以上の遺伝子が薬物代謝酵素をコード化する、態様（１）の発明を提供する。
【００３１】
態様（３）において、本開示は、薬物代謝酵素が、シトクロムＰ４５０、ＵＤＰ−グルクロン酸転写酵素、アルコール脱水素酵素、モノアミン酸化酵素およびアルデヒド・オキシダーゼからなる群より選択される、態様（２）の発明を提供する。
【００３２】
態様（４）において、本開示は、ＡＴＰ結合カセット輸送体および溶質輸送担体輸送タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現する、態様（１）の発明を提供する。
【００３３】
態様（５）において、本開示は、前記１種類以上の遺伝子が、ＭＤＲ１／Ｍｄｒ１ａ／Ｍｄｒ１ｂ、ＭＲＰ１／Ｍｒｐ１、ＭＲＰ２／Ｍｒｐ２、ＭＲＰ３／Ｍｒｐ３、ＭＲＰ４／Ｍｒｐ４、ＭＲＰ５／Ｍｒｐ５、ＭＲＰ６／Ｍｒｐ６、ＭＲＰ７／Ｍｒｐ７、ＭＲＰ８／Ｍｒｐ８、ＢＣＲＰ／Ｂｃｒｐ、ＢＳＥＰ／Ｂｓｅｐ、ＯＡＴＰ２／Ｏａｔｐ２、ＯＡＴＰ１Ｂ３／Ｏａｔｐ１ｂ３、ＯＡＴ１／Ｏａｔ１、ＯＡＴ２／Ｏａｔ２、ＯＡＴ３／Ｏａｔ３、ＯＡＴ４／Ｏａｔ４、ＯＣＴ１／Ｏｃｔ１、ＯＣＴ２／Ｏｃｔ２、ＯＡＴＰ１／Ｏａｔｐ１、ＰＥＰＴ１／Ｐｅｐｔ１、ＰＥＰＴ２／Ｐｅｐｔ２、ＯＣＴＮ１／Ｏｃｔｎ１、ＯＣＴＮ２／Ｏｃｔｎ２、ＭＡＴＥ１／Ｍａｔｅ１、ＭＡＴＥ２Ｋ／Ｍａｔｅ２、ＵＲＡＴ１／Ｕｒａｔ１、ＡＳＢＴ／Ａｓｂｔ、およびＮＴＣＰ／Ｎｔｃｐからなる群より選択される、態様（４）の発明を提供する。
【００３４】
態様（６）において、本開示は、前記１種類以上の遺伝子が、ＭＤＲ１／Ｍｄｒ１ａ／Ｍｄｒ１ｂ、ＭＲＰ１／Ｍｒｐ１、ＭＲＰ２／Ｍｒｐ２、ＭＲＰ３／Ｍｒｐ３、ＭＲＰ４／Ｍｒｐ４、ＭＲＰ５／Ｍｒｐ５、ＭＲＰ６／Ｍｒｐ６、ＭＲＰ７／Ｍｒｐ７、ＭＲＰ８／Ｍｒｐ８、ＢＣＲＰ／Ｂｃｒｐ、およびＢＳＥＰ／Ｂｓｅｐからなる群より選択されるＡＴＰ結合カセット輸送体であるタンパク質をコード化する、態様（４）の発明を提供する。
【００３５】
態様（７）において、本開示は、前記１種類以上の遺伝子が、ＯＡＴＰ２／Ｏａｔｐ２、ＯＡＴＰ１Ｂ３／Ｏａｔｐ１ｂ３、ＯＡＴ１／Ｏａｔ１、ＯＡＴ２／Ｏａｔ２、ＯＡＴ３／Ｏａｔ３、ＯＡＴ４／Ｏａｔ４、ＯＣＴ１／Ｏｃｔ１、ＯＣＴ２／Ｏｃｔ２、ＯＣＴ３／Ｏｃｔ３、ＯＡＴＰ１／Ｏａｔｐ１、ＰＥＰＴ１／Ｐｅｐｔ１、ＰＥＰＴ２／Ｐｅｐｔ２、ＯＣＴＮ１／Ｏｃｔｎ１、ＯＣＴＮ２／Ｏｃｔｎ２、ＭＡＴＥ１／Ｍａｔｅ１、ＭＡＴＥ２Ｋ／Ｍａｔｅ２、ＵＲＡＴ１／Ｕｒａｔ１、ＡＳＢＴ／Ａｓｂｔ、およびＮＴＣＰ／Ｎｔｃｐからなる群より選択される溶質輸送担体トランスポーターであるタンパク質をコード化する、態様（４）の発明を提供する。
【００３６】
態様（８）において、本開示は、前記１種類以上の遺伝子が、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａ、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２Ｋから選択される、態様（４）の発明を提供する。
【００３７】
態様（９）において、本開示は、前記１種類以上の遺伝子が、ヒトまたはマウス、ラット、テンジクネズミ、イヌ、およびサルから選択される動物種から個別に由来する、態様（１）の発明を提供する。
【００３８】
態様（１０）において、本開示は、前記細胞が哺乳類に由来する、態様（１）の発明を提供する。
【００３９】
態様（１１）において、本開示は、前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、Ｃａｃｏ−２細胞およびＶ７９細胞からなる群より選択される、態様（１０）の発明を提供する。
【００４０】
態様（１２）において、本開示は、前記哺乳類が、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス、ブタおよびハムスターからなる群より選択される、態様（１０）の発明を提供する。
【００４１】
態様（１３）において、本開示は、前記細胞が肝細胞を含む、態様（１）の発明を提供する。
【００４２】
態様（１４）において、本開示は、前記細胞が内皮細胞を含む、態様（１）の発明を提供する。
【００４３】
態様（１５）において、本開示は、前記タンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後の平板培養から少なくとも２４時間後に前記細胞の集団において検出可能である、態様（１）の発明を提供する。
【００４４】
態様（１６）において、本開示は、前記タンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後の平板培養から少なくとも４８時間後に前記細胞の集団において検出可能である、態様（１）の発明を提供する。
【００４５】
態様（１７）において、本開示は、前記タンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後の平板培養から少なくとも７２時間後に前記細胞の集団において検出可能である、態様（１）の発明を提供する。
【００４６】
別の態様（１８）において、本開示は、薬物輸送タンパク質および薬物代謝酵素からなる群より選択されるタンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現する、一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を調製する方法であって、細胞に、薬物輸送タンパク質または薬物代謝酵素をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的にトランスフェクションする工程、およびトランスフェクションの４８時間以内で一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を凍結保存する工程を含む方法を提供する。
【００４７】
態様（１９）において、本開示は、前記一過的にトランスフェクションする工程が、エレクトロポレーションを含む、態様（１８）の発明を提供する。
【実施例】
【００４８】
細胞を、細胞培養の標準的な無菌実施条件下で培養し、ＥＰを使用して一過的にトランスフェクションした。ＥＰ後、細胞を、凍結、解凍、および平板培養の前後の両方でタンパク質活性について検査した。下記に詳述するように、懸濁液中で培養した細胞および接着細胞培養の両方が、うまく一過的にトランスフェクションされ、凍結保存からの解凍後に組換えタンパク質の実質的な活性を示した。
【００４９】
懸濁液中で培養した細胞
手短に言うと、１日目に、「ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ」２９３細胞および２９３−Ｆ細胞の各々を、補充ＣＤ２９３培地（すなわち、４ｍＭのＬ−グルタミン（カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社のＧｉｂｃｏ（登録商標）、カタログ番号２５０３０−０８１から得られる）が補充されたＣＤ２９３培地（カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号１１９１３−０１９から得られる））または６ｍＭのＬ−グルタミンが補充された補充Ｅｘｃｅｌｌ（商標）２９３無血清培地（ミズーリ州、セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１４５７１Ｃから得られる）を使用して、０．７〜１．０×１０6細胞／ｍｌの密度で、適切なサイズの振盪フラスコ中に継代培養した。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（マサチューセッツ州、ロレンス所在のＮｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から得られる）を使用して、細胞生存率および細胞の数を決定した。
【００５０】
２日目に、細胞のＥＰを実施した。手短に言うと、細胞生存率および細胞の数の決定後、細胞を、５分間に亘り１００ｇで回転させることによって小さく丸め、その後、培地を吸引し、細胞を３０ｍｌのＥＰ緩衝液（メリーランド州、ゲイサーズバーグ所在のＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ社、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）、カタログ番号Ｂ２０１から得られる）中に再び懸濁させた。この細胞懸濁液を５０ｍＬのファルコン管に移し、上述したように小さく丸め、１００×１０6細胞／ｍｌに達するように適量のＥＰ緩衝液中に再び懸濁させた。これを細胞株として使用した。ＥＰに使用すべきＤＮＡは、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で滅菌水中に調製した。各サンプルについて、０．４ｍｌの細胞株およびＤＮＡを１．５ｍｌの滅菌エッペンドルフ型チューブに入れ、２００μｇ／ｍｌ（表４）または３００μｇ／ｍｌのＤＮＡ（表１０および表１１）の最終濃度およびサンプル当たり４０×１０6細胞の細胞密度にした。
【００５１】
【表４】
2020110190.tif 000006
【００５２】
サンプルをＯＣ−４００  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（メリーランド州、ゲイサーズバーグ所在のＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ社、「ＭａｘＣｙｔｅ」、カタログ番号ＯＣ−４００Ｒから得られる）に移し、その後、ＨＥＫ細胞のＥＰに関する製造業者の使用説明書に従った。ＥＰ後、細胞を注意深くピペットで取り出し、１２５ｍｌの振盪フラスコの底に移し、８％のＣＯ2と共に３７℃で２０分間に亘りインキュベーションし、その後、１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度に達するように、予め暖めた４０ｍｌのＣＤ２９３培地を振盪フラスコに加えた。細胞を３０分間に亘り３７℃および８％のＣＯ2でインキュベーションした。３０分間の回復後、細胞生存率および細胞密度を決定した。細胞の一部（すなわち、２０×１０6の細胞）を平板培養に使用し、残りを凍結保存したか、または細胞の全てを凍結保存した。組換え細胞は、トランスフェクションの４８時間以内に凍結保存され、凍結保存からの解凍後に検出可能なレベルで導入遺伝子からコード化されたタンパク質の活性を示すであろうと考えられる。
【００５３】
ＥＰ後の細胞の平板培養のために、２０×１０6の細胞を５分間に亘り１００ｇで回転させることによって小さく丸め、次いで、予め暖めた２０ｍｌの平板培養用培地（０．１ｍＭの非必須アミノ酸（カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号１１１４００５０から得られる）、１０％のＦＢＳ（ミズーリ州、セントルイス所在のＳｉｇｍａ社、ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１２０１６Ｃから得られる）が補充された、高グルコースのＤＭＥＭ（カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号１１９６５０９２から得られる））中に再び懸濁させた（１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度）。細胞を、０．２×１０6細胞／ウェルおよび０．４×１０6細胞／ウェルの密度で、ポリ−Ｄ−リシン被覆された２４ウェル組織培養プレートのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ（商標）（マサチューセッツ州、チュークスベリ所在のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から得られる）に入れ、取り込み活性への播種密度の影響を決定するように、８％のＣＯ2と共に３７℃でインキュベーションした。培地を４時間後に交換し、次いで、アッセイを行う日まで２４時間毎に交換した。４日目に、細胞を、下記に記載するように、ＯＡＴＰ１Ｂ１活性について試験した。
【００５４】
凍結保存のために、次いで、細胞を、１０×１０6細胞／ｍｌの密度で、新しく調製した氷のように冷たい凍結培地（９部が補充ＣＤ２９３培地であり、１部が、滅菌するためにシリンジ濾過したＤＭＳＯであった）中に再び懸濁させた。クライオチューブにこの細胞懸濁液１ｍｌを入れ、氷のように冷たいＭｒ  Ｆｒｏｓｔｙ凍結容器（Ｔｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から得られる）上に置き、これを−８０℃の冷凍庫に一晩貯蔵し、その後、それらのチューブを液体窒素中に移した。
【００５５】
凍結保存した細胞を、下記に記載するように、ＯＡＴＰ１Ｂ１活性について試験した。手短に言うと、１日目に、凍結保存した細胞を液体窒素からドライアイスに取り出し、次いで、約２分間に亘り３７℃の水浴中で解凍した。細胞を、約３７℃の温度に予め暖めた上述したような平板培養用培地１０ｍｌに移し、生存率と細胞密度を決定した。細胞を小さく丸め、１×１０6生存細胞／ｍｌの細胞密度で補充ＤＭＥＭ培地中に再び懸濁させた。細胞を、ＥＰ後の細胞の平板培養（凍結保存されていない）について先に記載したのと同じ様式で平板培養し、その平板培養の２４、４８および７２時間後に、ＯＡＴＰ１Ｂ１活性について試験した。
【００５６】
接着細胞培養
手短に言うと、ＨＥＫ２９３細胞を、１００：１：１：１：１０の比率で、カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号１１９６５１１８から得られるＤＭＥＭ（高グルコース）；カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号１５１４０−１２２から得られるペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００単位／ｍｌ）；カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号２５０３０−０８１から得られるＬ−グルタミン（２００ｍＭ）；カリフォルニア州、カールズバッド所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ社の「Ｇｉｂｃｏ」、カタログ番号１１３６０から得られるピルビン酸ナトリウム；ミズーリ州、セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ社から得られるＦＢＳを含有する平板培養用培地を使用して、５  Ｌａｙｅｒ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）（マサチューセッツ州、チュークスベリ所在のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から得られる）内で培養した。１日目に、ＥＰの約２４時間前に、ＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理し、細胞生存率および細胞の数を決定し、その後、細胞を、３０〜４０％のコンフルエンシーで新しい多層室フラスコに継代培養した。細胞を５％のＣＯ2と共に３７℃でインキュベーションした。
【００５７】
２日目に、細胞のＥＰを実施した。手短に言うと、細胞を収穫し、細胞生存率および細胞の数を決定し、その後、細胞を、５分間に亘り１００ｇで回転させることによって小さく丸め、培地を吸引した。細胞をＥＰ緩衝液中に再び懸濁させ、５分間に亘り１００ｇで回転させることによって小さく丸め、次いで、５０×１０6細胞／ｍｌに達するように適量のＥＰ緩衝液中に再び懸濁させた。これを細胞株として使用した。ＥＰに使用すべきＤＮＡは、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で滅菌水中に調製した。ＯＣ−４００  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用する各サンプルについて、０．４ｍｌの細胞株およびＤＮＡを１．５ｍｌの滅菌エッペンドルフ型チューブにいれ、図５〜９に示されるように、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌのＤＮＡの最終濃度およびサンプル当たり４０×１０6細胞の細胞密度にした。ＣＬ−２  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用する各サンプルについて、１０ｍｌの細胞株およびＤＮＡを５０ｍｌの滅菌円錐管に入れ、１００μｇ／ｍｌのＤＮＡの最終濃度にした。
【００５８】
サンプルをＯＣ−４００またはＣＬ−２  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（メリーランド州、ゲイサーズバーグ所在のＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ社、「ＭａｘＣｙｔｅ」、カタログ番号ＯＣ−４００ＲおよびＣＬ２−Ｒから得られる）に移し、その後、ＨＥＫ細胞のＥＰに関する製造業者の使用説明書に従った。ＥＰ後、細胞を注意深くピペットで取り出し、６ウェルの組織培養プレートに移し、５％のＣＯ2と共に３７℃で２０分間に亘りインキュベーションし、その後、細胞を取り出し、予め暖めた平板培養用培地を含有する５０ｍｌの円錐管に入れた。細胞生存率および細胞密度を決定した。細胞の一部（すなわち、２０×１０6の細胞）を平板培養に使用し、残りを凍結保存した。
【００５９】
ＥＰ後の細胞の平板培養のために、細胞を５分間に亘り１００ｇで回転させることによって小さく丸め、次いで、予め暖めた平板培養用培地中に再び懸濁させた（１×１０6細胞／ｍｌの細胞密度）。細胞を、０．４×１０6細胞／ウェルの密度で、２４ウェル組織培養プレート（ポリ−Ｄ−リシン被覆、「Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂｉｏｃｏａｔ」（マサチューセッツ州、チュークスベリ所在のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から得られる））に入れ、５％のＣＯ2と共に３７℃でインキュベーションした。培地を４時間後に交換し、次いで、アッセイを行う日まで２４時間毎に交換した。４日目と６日目に、細胞をＯＡＴＰ１Ｂ１活性について試験した。
【００６０】
凍結保存のために、次いで、細胞を、丸め、１０×１０6細胞／ｍｌの密度で、新しく調製した氷のように冷たい凍結培地（９部が平板培養用培地であり、１部が、滅菌するためにシリンジ濾過したＤＭＳＯであった）中に再び懸濁させた。クライオチューブにこの細胞懸濁液１ｍｌを入れ、氷のように冷たいＭｒ  Ｆｒｏｓｔｙ凍結容器（Ｔｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から得られる）上に置き、これを−８０℃の冷凍庫に一晩貯蔵し、その後、それらのチューブを液体窒素中に移した。
【００６１】
凍結保存した細胞を、ＯＡＴＰ１Ｂ１活性について試験した。特に、細胞を、ＥＰ後の細胞の平板培養（凍結保存されていない）について先に記載したのと同じ様式で平板培養し、その平板培養の４８時間後に、ＯＡＴＰ１Ｂ１活性について試験した（下記に記載するように）。
【００６２】
輸送体活性の試験
手短に言うと、基質溶液を、ｐＨ７．４のクレブス緩衝液(Krebs-Henseleit Buffer)（ミズーリ州、セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｋ３７５３から得られる）中の、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａおよびＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂについて、２μＭのエストラジオール−１７β−グルクロニド（９９％の低温Ｅ１７βＧおよび１％の［3Ｈ］−Ｅ１７βＧ）；ＯＡＴＰ１Ｂ３について、２μＭのＣＣＫ−８（９９％の低温ＣＣＫ−８および１％の［3Ｈ］−ＣＣＫ−８）；ＯＡＴ１短について、１μＭのパラ−アミノ馬尿酸（ＰＡＨ）（９０％の低温ＰＡＨおよび１０％の［3Ｈ］−ＰＡＨ）；ＯＡＴ１長について、１μＭまたは３μＭのパラ−アミノ馬尿酸（ＰＡＨ）（９０％の低温ＰＡＨおよび１０％の［3Ｈ］−ＰＡＨ）；ＯＡＴ３について、１μＭまたは２μＭのエストロン−３−硫酸（９９％の低温Ｅ３Ｓおよび１％の［3Ｈ］−Ｅ３Ｓ）；ＯＡＴ１およびＯＣＴ２について、３０μＭの臭化テトラエチルアンモニウム（１００％の［14Ｃ］−ＴＥＡ）；ＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２Ｋについて、１０μＭのメトホルミン（１００％の［14Ｃ］−メトホルミン）または１０μＭの臭化テトラエチルアンモニウム（１００％の［14Ｃ］−ＴＥＡ）を使用して調製し、少なくとも２０分間に亘り３７℃でインキュベーションした。培養培地を、試験すべき細胞から吸引し、細胞を、予め暖めたＫＨＢ緩衝液で３回洗浄した。その後、細胞を１０分間に亘り３７℃で取り込み緩衝液と共にインキュベーションした。ＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２Ｋについて、細胞を洗浄し、１０分間に亘り、２０ｍＭのＮＨ4Ｃｌを含有するＫＨＢ緩衝液と共にプレインキュベーションした。試験は、各ウェル中に０．３ｍｌの基質溶液を加えることによって開始し、３７℃で５分間に亘り、ＯＣＴ１およびＯＣＴ２のサンプルについては、１０分間に亘り、インキュベーションした。
【００６３】
細胞から基質溶液を吸引し、次いで、細胞を低温取り込み緩衝液で３回洗浄することによって、インキュベーション期間後に、反応を直ぐに停止させた。次いで、細胞を、振盪しながら、１５〜２０分間に亘り、溶解溶液（ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）緩衝液中の０．１％ｖ／ｖの１ＭのＮａＯＨを含む０．１％のＳＤＳ）と共にインキュベーションした。この基質溶液をトリチュレーションし、結果として得られた細胞溶解物０．４ｍｌを、シンチレーションカウンターによる分析のために、５ｍｌのシンチレーション液の入った５ｍｌのシンチレーション管に入れた。
【００６４】
図１に示されるように、細胞株のものと比べて、細胞生存率は、ＥＰ後に１〜５％低下した。その上、凍結保存後に、細胞生存率は、ＥＰ後のものに対して、さらに１０〜１５％低下した。それにもかかわらず、ＥＰおよび凍結保存からの解凍後でさえ、細胞生存率は７５％超である。
【００６５】
細胞形態および取り込み活性を、トランスフェクションが終わって３０分間の回復期間後および２４時間の回復期間後の凍結保存後に調査した。表５は、２４時間の回復期間の細胞形態および取り込み活性が、３０分間の回復と比べて、減少していることを示した。
【００６６】
【表５】
2020110190.tif 000007
【００６７】
凍結保存から解凍したトランスフェクト細胞の細胞形態およびコンフルエンシーを、２４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆Ｃｏｒｎｉｎｇ「Ｂｉｏｃｏａｔ」プレートにおけるウェル当たり０．４×１０6細胞の密度での平板培養から様々な期間の後で調査した。詳しくは、図２は、平板培養から４時間後、２４時間後および７２時間後に培養したＯＡＴＰ１Ｂ１が一過的に導入された細胞を示している。その上、これらの細胞の平板培養から２４時間後、４８時間後、および７２時間後での細胞コンフルエンシーが、下記の表６に記録されている。
【００６８】
【表６】
2020110190.tif 000008
【００６９】
ＥＰおよび凍結保存後、細胞がポリ−Ｄ−リシン被覆Ｃｏｒｎｉｎｇ「Ｂｉｏｃｏａｔ」上に単層を形成し、平板培養から２４時間後に８０〜９０％のコンフルエンシーを、平板培養から４８時間後に９０％〜１００％のコンフルエンシーを達成することが望ましい。
【００７０】
図４は、それぞれ、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２Ｋ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴ１長、ＯＡＴ１短、ＯＡＴ３、およびｐＣＭＶベクターが一過的に導入され、凍結保存からの解凍後の平板培養から２４時間後に培養された細胞を示している。
【００７１】
図５に示されるように、接着ＨＥＫ２９３細胞中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現は、ＤＮＡの濃度の増加と共に増加した。その上、ＧＦＰ発現は、２４時間の時点と比べて４８時間の時点で増加した。詳しくは、ＥＰによるＧＦＰトランスフェクション効率は、２００μｇ／ｍｌのＤＮＡにより２４時間で１００％の蛍光細胞染色を達成し、１００μｇ／ｍｌのＤＮＡにより、４８時間で１００％の蛍光細胞染色を達成した。それゆえ、トランスフェクト細胞におけるＧＦＰタンパク質発現レベルは、ＤＮＡ濃度の増加により増加し、また２４時間に対して４８時間で増加した。
【００７２】
ＥＰ後の様々な時点で、ＯＡＴＰ１Ｂ１（ｐＯＡＴＰ１Ｂ１）および対照ベクター（ｐＣＭＶ）が導入された、懸濁培養された２９３細胞の取り込み活性を試験した。手短に言うと、トランスフェクト細胞を、ＥＰ後または凍結保存からの解凍後、２４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆Ｃｏｒｎｉｎｇ「Ｂｉｏｃｏａｔ」プレートにおいて０．４×１０6細胞／ウェルの密度で平板培養した。下記の表７に詳述するように、平板培養後の様々な時点で、新しく平板培養された細胞（「新鮮」）および凍結保存細胞（「凍結」）の両方において、プローブ基質であるエストラジオール−１７β−グルクロニドを使用して、ＯＡＴＰ１Ｂ１取り込み活性および取り込み比を決定した。
【００７３】
【表７】
2020110190.tif 000009
【００７４】
凍結保存からの解凍後のトランスフェクト細胞におけるＯＡＴＰ１Ｂ１取り込み活性および取り込み比は、新しく平板培養されたトランスフェクト細胞のものと一致する。２９３−ＦおよびＦＳ２９３の両方の細胞種類において、最高の取り込み活性および取り込み比は、平板培養から２４時間後に観察される。
【００７５】
トランスフェクト細胞（ＦＳ２９３または２９３−Ｆ）の形態および細胞コンフルエンシーを、凍結保存からの解凍後に、０．４×１０6細胞／ウェルまたは０．２×１０6細胞／ウェルのいずれかの平板培養密度で２４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆Ｃｏｒｎｉｎｇ「Ｂｉｏｃｏａｔ」プレートにおいて、平板培養から２４時間後、４８時間後および７２時間後に調査した。平板培養から２４時間後の細胞コンフルエンシーが、下記の表８に纏められている。４８時間後および７２時間後の細胞コンフルエンシーは、２４時間後に達成されたものと似ている（データは示さず）。その上、図３は、凍結保存からの解凍後の平板培養から２４時間後の（Ａ）０．４×１０6細胞／ウェルおよび（Ｂ）０．２×１０6細胞／ウェルで平板培養された、それぞれ、９０〜９５％および６０〜７０％のコンフルエンシーのトランスフェクト細胞の画像を与えている。
【００７６】
【表８】
2020110190.tif 000010
【００７７】
最適なアッセイ性能について、０．４×１０6の密度での細胞の平板培養が、より高い細胞コンフルエンシーおよびより高い取り込み活性を達成するので、０．２×１０6のものより好ましい。
【００７８】
【表９】
2020110190.tif 000011
【００７９】
ＥＰ後、トリパンブルーおよび血球計またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）を使用して調査した。
【００８０】
図６に示されるように、接着ＨＥＫ２９３細胞を使用した場合、ＥＰ後の細胞生存率は、ＥＰに使用したＤＮＡの量が増加すると共に低下した。それにもかかわらず、ｐＯＡＴＰ１Ｂ１のトランスフェクション後の細胞生存率は、８９％から７７％に及び、空のベクターのトランスフェクション後の細胞生存率は９０％であった。
【００８１】
図７に示されるように、接着ＨＥＫ２９３細胞を使用した場合、新しく平板培養した一時的トランスフェクト接着ＨＥＫ２９３細胞におけるエストラジオール−１７β−グルクロニドのＯＡＴＰ１Ｂ１媒介取り込みは、時間依存性である。特に、取り込み活性および取り込み比は、ＥＰに使用されたＤＮＡの量の増加と共に増加した。しかしながら、エストラジオール−１７β−グルクロニドのＯＡＴＰ１Ｂ１媒介取り込みは、４８時間の時点と比べて９６時間の時点で減少した。さらに、図８に示されるように、エストラジオール−１７β−グルクロニドの信号対雑音比（すなわち、取り込み比）は、ＥＰから４８時間後の空のベクターに対する、ＯＡＴＰ１Ｂ１が導入された接着ＨＥＫ２９３細胞において、ＤＮＡの量およびアッセイのインキュベーション時間の増加と共に増加した。
【００８２】
図９に示されるように、接着ＨＥＫ２９３細胞を使用した場合、小型ＥＰ装置および大型ＥＰ装置を使用した、ＯＡＴＰ１Ｂ１一時的発現ＨＥＫ２９３細胞におけるエストラジオール−１７β−グルクロニドの取り込みは、取り込み活性および信号対雑音比（すなわち、取り込み比）の両方に差がない。実験に、１００μｇ／ｍｌのＤＮＡを使用した。
【００８３】
図１０に示されるように、接着ＨＥＫ２９３細胞を使用した場合、従来の脂質トランスフェクション試薬（対照：「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から得られる）およびメリーランド州、ゲイサーズバーグ所在のＭａｘＣｙｔｅ  Ｉｎｃ社のＳＴＸを使用したＥＰを使用してトランスフェクションした細胞の間で、ＯＡＴＰ１Ｂ１取り込み活性が比べられている。特に、ＥＰを使用してトランスフェクションした細胞は、脂質トランスフェクション試薬によりトランスフェクションした細胞と比べて、著しく大きい信号対雑音比となった。
【００８４】
図１１に示されるように、接着ＨＥＫ２９３細胞を使用した場合、新しく平板培養されたＥＰトランスフェクト細胞および凍結保存からの解凍後の細胞の両方におけるＯＡＴＰ１Ｂ１取り込み活性は、検出可能であった。
【００８５】
ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａ、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴ１長、ＯＡＴ１短、ＯＡＴ３、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２Ｋまたは対照ベクター（ｐＣＭＶ）が導入された懸濁培養された２９３細胞の取り込み活性を、凍結保存からの解凍後の平板培養から２４時間後に試験した。手短に言うと、トランスフェクト細胞を、ＥＰ後であって、凍結保存からの解凍後の２４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆Ｃｏｒｎｉｎｇ「Ｂｉｏｃｏａｔ」プレートにおいて０．４×１０6細胞／ウェルの密度で平板培養した。下記の表１０に詳述するように、平板培養から２４時間後に示されたプローブ基質を使用して、ＳＬＣ輸送体取り込み活性および取り込み比を決定した。
【００８６】
【表１０】
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【００８７】
上記の表１０に反映されるように、組換え細胞は、特定の典型的基質に対して強力な取り込み活性を示し、その各々は１０を超える取り込み比を有した。特に、５を超える取り込み比は、成功したプロセスを示す。
【００８８】
表１１に反映されるように、凍結保存した組換え細胞に関する解凍後の生存率は、９０％超であると決定された。
【００８９】
【表１１】
2020110190.tif 000013
【００９０】
これらの組換え細胞の各々、並びに対照ベクター（ｐＣＭＶ）を、平板培養から２４時間後（凍結保存後）に調査した。平板培養から２４時間後のこれらの細胞の各々のコンフルエンシーは、下記の表１２に反映されるように、８５％以上であった。
【００９１】
【表１２】
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【００９２】
図１２に示されるように、８種類の凍結保存した組換え細胞の各々が、解凍、ポリ−Ｄ−リシンプレート上での平板培養および平板培養後の２４時間の亘るインキュベーション後に、密集単層を形成した。
【００９３】
図１３〜１９および表１３〜１４に示されるように、輸送タンパク質を発現する、凍結保存した組換え細胞において調査した速度論的プロファイルおよび阻害プロファイルは、報告された値と一致した。詳しくは、図１３Ａ〜１３Ｃに示されるように、ＯＡＴ１を発現する組換え細胞によるＰＡＨ取り込みの速度論およびそのプロベネシドの阻害プロファイルは、報告された値と一致している。図１４Ａ〜１４Ｃに示されるように、ＯＡＴ３を発現する組換え細胞によるＥ３Ｓ取り込みの速度論およびそのプロベネシドの阻害プロファイルは、報告された値と一致している。図１５Ａ〜１５Ｆに示されるように、ＯＣＴ１を発現する組換え細胞によるＴＥＡおよびメトホルミン取り込みの速度論並びにその阻害プロファイルは、報告された値と一致している。図１６Ａ〜１６Ｅに示されるように、ＯＣＴ２を発現する組換え細胞によるＴＥＡおよびメトホルミン取り込みの速度論並びに阻害プロファイルは、報告された値と一致している。図１７Ａ〜１７Ｆに示されるように、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａを発現する組換え細胞によるＥ１７βＧ、Ｅ３Ｓおよびロスバスタチン取り込みの速度論並びにシクロスポリンＡによるＥ１７βＧ取り込みの阻害プロファイルは、報告された値と一致している。図１８Ａ〜１８Ｅに示されるように、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂを発現する組換え細胞によるＥ１７βＧ、Ｅ３Ｓおよびロスバスタチン取り込みの速度論並びにシクロスポリンＡによるＥ１７βＧ取り込みの阻害プロファイルは、報告された値と一致している。図１９Ａ〜１９Ｅおよび表１３〜１４に示されるように、ＯＡＴＰ１Ｂ３を発現する組換え細胞によるＣＣＫ−８、Ｅ１７βＧおよびロスバスタチン取り込みの速度論並びにシクロスポリンＡによるＣＣＫ−８取り込みの阻害プロファイルは、報告された値と一致している。
【００９４】
【表１３】
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【００９５】
【表１４】
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【００９６】
先に記載した実施の形態に、その広い発明の概念から逸脱せずに、変更を行えることが当業者に認識されるであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施の形態に制限されず、付随の特許請求の範囲により定義される、本発明の精神および範囲内にある改変を網羅することが意図されているのが理解されよう。
【００９７】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００９８】
実施形態１
薬物輸送タンパク質および薬物代謝酵素、またはそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコード化する、１種類以上の一過的に過剰発現される遺伝子を含む、凍結保存された組換え細胞であって、前記薬物輸送タンパク質または前記薬物代謝酵素もしくはその組合せの活性が、凍結保存からの解凍後の該凍結保存された組換え細胞の集団において検出可能である、組換え細胞。
【００９９】
実施形態２
前記１種類以上の遺伝子が薬物代謝酵素をコード化する、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１００】
実施形態３
前記薬物代謝酵素が、シトクロムＰ４５０、ＵＤＰ−グルクロン酸転写酵素、アルコール脱水素酵素、モノアミン酸化酵素およびアルデヒド・オキシダーゼからなる群より選択される、実施形態２記載の組換え細胞。
【０１０１】
実施形態４
ＡＴＰ結合カセット輸送体および溶質輸送担体輸送タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現する、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１０２】
実施形態５
前記１種類以上の遺伝子が、ＭＤＲ１／Ｍｄｒ１ａ／Ｍｄｒ１ｂ、ＭＲＰ１／Ｍｒｐ１、ＭＲＰ２／Ｍｒｐ２、ＭＲＰ３／Ｍｒｐ３、ＭＲＰ４／Ｍｒｐ４、ＭＲＰ５／Ｍｒｐ５、ＭＲＰ６／Ｍｒｐ６、ＭＲＰ７／Ｍｒｐ７、ＭＲＰ８／Ｍｒｐ８、ＢＣＲＰ／Ｂｃｒｐ、ＢＳＥＰ／Ｂｓｅｐ、ＯＡＴＰ２／Ｏａｔｐ２、ＯＡＴＰ１Ｂ３／Ｏａｔｐ１ｂ３、ＯＡＴ１／Ｏａｔ１、ＯＡＴ２／Ｏａｔ２、ＯＡＴ３／Ｏａｔ３、ＯＡＴ４／Ｏａｔ４、ＯＣＴ１／Ｏｃｔ１、ＯＣＴ２／Ｏｃｔ２、ＯＡＴＰ１／Ｏａｔｐ１、ＰＥＰＴ１／Ｐｅｐｔ１、ＰＥＰＴ２／Ｐｅｐｔ２、ＯＣＴＮ１／Ｏｃｔｎ１、ＯＣＴＮ２／Ｏｃｔｎ２、ＭＡＴＥ１／Ｍａｔｅ１、ＭＡＴＥ２Ｋ／Ｍａｔｅ２、ＵＲＡＴ１／Ｕｒａｔ１、ＡＳＢＴ／Ａｓｂｔ、およびＮＴＣＰ／Ｎｔｃｐからなる群より選択される、実施形態４記載の組換え細胞。
【０１０３】
実施形態６
前記１種類以上の遺伝子が、ＭＤＲ１／Ｍｄｒ１ａ／Ｍｄｒ１ｂ、ＭＲＰ１／Ｍｒｐ１、ＭＲＰ２／Ｍｒｐ２、ＭＲＰ３／Ｍｒｐ３、ＭＲＰ４／Ｍｒｐ４、ＭＲＰ５／Ｍｒｐ５、ＭＲＰ６／Ｍｒｐ６、ＭＲＰ７／Ｍｒｐ７、ＭＲＰ８／Ｍｒｐ８、ＢＣＲＰ／Ｂｃｒｐ、およびＢＳＥＰ／Ｂｓｅｐからなる群より選択されるＡＴＰ結合カセット輸送体であるタンパク質をコード化する、実施形態４記載の組換え細胞。
【０１０４】
実施形態７
前記１種類以上の遺伝子が、ＯＡＴＰ２／Ｏａｔｐ２、ＯＡＴＰ１Ｂ３／Ｏａｔｐ１ｂ３、ＯＡＴ１／Ｏａｔ１、ＯＡＴ２／Ｏａｔ２、ＯＡＴ３／Ｏａｔ３、ＯＡＴ４／Ｏａｔ４、ＯＣＴ１／Ｏｃｔ１、ＯＣＴ２／Ｏｃｔ２、ＯＣＴ３／Ｏｃｔ３、ＯＡＴＰ１／Ｏａｔｐ１、ＰＥＰＴ１／Ｐｅｐｔ１、ＰＥＰＴ２／Ｐｅｐｔ２、ＯＣＴＮ１／Ｏｃｔｎ１、ＯＣＴＮ２／Ｏｃｔｎ２、ＭＡＴＥ１／Ｍａｔｅ１、ＭＡＴＥ２Ｋ／Ｍａｔｅ２、ＵＲＡＴ１／Ｕｒａｔ１、ＡＳＢＴ／Ａｓｂｔ、およびＮＴＣＰ／Ｎｔｃｐからなる群より選択される溶質輸送担体トランスポーターであるタンパク質をコード化する、実施形態４記載の組換え細胞。
【０１０５】
実施形態８
前記１種類以上の遺伝子が、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ａ、ＯＡＴＰ１Ｂ１＊１ｂ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２Ｋから選択される、実施形態４記載の組換え細胞。
【０１０６】
実施形態９
前記１種類以上の遺伝子が、ヒトまたはマウス、ラット、テンジクネズミ、イヌ、およびサルから選択される動物種から個別に由来する、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１０７】
実施形態１０
前記細胞が哺乳類に由来する、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１０８】
実施形態１１
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、Ｃａｃｏ−２細胞およびＶ７９細胞からなる群より選択される、実施形態１０記載の組換え細胞。
【０１０９】
実施形態１２
前記哺乳類が、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス、ブタおよびハムスターからなる群より選択される、実施形態１０記載の組換え細胞。
【０１１０】
実施形態１３
前記細胞が肝細胞を含む、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１１１】
実施形態１４
前記細胞が内皮細胞を含む、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１１２】
実施形態１５
前記タンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後の平板培養から少なくとも２４時間後に前記細胞の集団において検出可能である、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１１３】
実施形態１６
前記タンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後の平板培養から少なくとも４８時間後に前記細胞の集団において検出可能である、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１１４】
実施形態１７
前記タンパク質の活性が、凍結保存からの解凍後の平板培養から少なくとも７２時間後に前記細胞の集団において検出可能である、実施形態１記載の組換え細胞。
【０１１５】
実施形態１８
薬物輸送タンパク質および薬物代謝酵素からなる群より選択されるタンパク質をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的に過剰発現する、一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を調製する方法であって、細胞に、薬物輸送タンパク質または薬物代謝酵素をコード化する１種類以上の遺伝子を一過的にトランスフェクションする工程、およびトランスフェクションの４８時間以内で一過的にトランスフェクションされた組換え細胞を凍結保存する工程を含む方法。
【０１１６】
実施形態１９
前記一過的にトランスフェクションする工程が、エレクトロポレーションを含む、実施形態１８記載の方法。
【図１】
2020110190.tif 000017
【図２】
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【図３】
2020110190.tif 000019
【図４】
2020110190.tif 000020
【図５】
2020110190.tif 000021
【図６】
2020110190.tif 000022
【図７Ａ】
2020110190.tif 000023
【図７Ｂ】
2020110190.tif 000024
【図８】
2020110190.tif 000025
【図９】
2020110190.tif 000026
【図１０】
2020110190.tif 000027
【図１１】
2020110190.tif 000028
【図１２】
2020110190.tif 000029
【図１３Ａ】
2020110190.tif 000030
【図１３Ｂ】
2020110190.tif 000031
【図１３Ｃ】
2020110190.tif 000032
【図１４Ａ】
2020110190.tif 000033
【図１４Ｂ】
2020110190.tif 000034
【図１４Ｃ】
2020110190.tif 000035
【図１５Ａ】
2020110190.tif 000036
【図１５Ｂ】
2020110190.tif 000037
【図１５Ｃ】
2020110190.tif 000038
【図１５Ｄ】
2020110190.tif 000039
【図１５Ｅ】
2020110190.tif 000040
【図１５Ｆ】
2020110190.tif 000041
【図１６Ａ】
2020110190.tif 000042
【図１６Ｂ】
2020110190.tif 000043
【図１６Ｃ】
2020110190.tif 000044
【図１６Ｄ】
2020110190.tif 000045
【図１６Ｅ】
2020110190.tif 000046
【図１７Ａ】
2020110190.tif 000047
【図１７Ｂ】
2020110190.tif 000048
【図１７Ｃ】
2020110190.tif 000049
【図１７Ｄ】
2020110190.tif 000050
【図１７Ｅ】
2020110190.tif 000051
【図１７Ｆ】
2020110190.tif 000052
【図１８Ａ】
2020110190.tif 000053
【図１８Ｂ】
2020110190.tif 000054
【図１８Ｃ】
2020110190.tif 000055
【図１８Ｄ】
2020110190.tif 000056
【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
2020110190.tif 000058
【図１９Ｂ】
2020110190.tif 000059
【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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