(57)【要約】      （修正有）【課題】被験者の放射損傷と化学的損傷および関連疾患を予防、治療、改善及び／または解消する方法を提供する。【解決手段】プラスミノゲンまたはプラスミンの使用であって、さらに異なるタイプの放射損傷と化学的損傷の治療に対して新規な治療ストラテジーを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患を治療及び／または解消するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の放射損傷と化学的損傷およびその関連疾患の予防及び／または治療、改善および／または解消におけるプラスミノーゲンまたはプラスミンの使用に関するものであって、さらに異なるタイプの放射と化学的損傷の予防及び／または治療に対して全く新規な予防及び／または治療ストラテジーを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
放射損傷は、放射線の照射による生体組織の損傷である。一般的に、放射線は、天然または人工エネルギーによって生じる高エネルギー電磁波または高エネルギー粒子である。高線量の放射線の瞬時照射または低線量の放射線の長時間照射のいずれもが組織損傷を引き起こす可能性がある。化学的損傷は、化学物質が人体に接触したときに起こる局所的損傷または全身的損傷である。その損傷程度は、化学物質の性質、投与量、濃度、接触時間および面積、処理が適時且つ効果的であるか否かなどの要因に関係する。臨床的には、放射線療法または化学療法または両方の組み合わせを用いて腫瘍および癌患者を治療または改善するのが一般的である。その中で、放射線療法は通常、Ｘ線、γ線、中性子およびその他の放射線源を使用して癌細胞を殺し、または細胞内の遺伝物質を破壊する。化学療法は、細胞毒性薬を単独でまたは組み合わせて使用することによって癌細胞の複製または増殖を破壊する。ほとんどの癌患者は、一回または複数回の放射線治療、化学治療、または化学放射線治療を受けてから、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化障害、炎症、心臓毒性、腎毒性、肺線維症、静脈炎、神経系毒性、肝毒性などの重度の副作用を示す。そのため、化学療法および放射線療法の副作用からの予防及び保護は、癌患者にとって極めて重要である。
【０００３】
プラスミンは、プラスミノーゲン活性化システム（ＰＡシステム）の肝心な構成要素である。プラスミンは、フィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロテオグリカンを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のいくつかの成分を加水分解することができる広域スペクトルプロテアーゼである[1]。また、プラスミンは、いくつかのメタロプロテアーゼ前駆体（ｐｒо−ＭＭＰ）を活性化して活性を有するメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を形成することができる。そのため、プラスミンは、細胞外タンパク質の加水分解の重要な上流調節因子であると考えられている[2,3]。プラスミンは、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）という生理学的ＰＡによるプラスミノーゲンのタンパク質加水分解によって形成される。プラスミノーゲンは血漿およびその他の体液中の比較的高いレベルで存在するため、ＰＡシステムの調節は主にＰＡの合成および活性のレベルによって達成されると従来考えられている。ＰＡシステム成分の合成は、ホルモン、成長因子およびサイトカインなどの異なる要素によって厳密に調節される。さらに、プラスミンおよびＰＡに対する特定の生理学的阻害剤も存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２−アンチプラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ある細胞表面上に、直接に加水分解する活性を有するｕＰＡ特異的細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある[4,5]。
【０００４】
プラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）は単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである[6,7]。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである[8,9]。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解
していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす[10]。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同のクリングル環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見された一つのプラスミノゲンは３８ｋＤａのフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン（Angiostatin）と命名され、幾つかのプロテアーゼがプラスミノゲンを加水分解することにより生成される。
【０００５】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理学的血栓症を予防する鍵である[11]。プラスミンはまた、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカンおよびゼラチンを含むＥＣＭのいくつかの成分に対する基質特異性を有し、これはプラスミンがＥＣＭリモデリングにおいても重要な役割を果たすことを示す[7,12,13]。間接的に、プラスミンは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９を含む、一部のプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭの他の成分を分解することもできる。そのため、プラスミンは細胞外タンパク質加水分解の重要な上流調節因子の一つである可能性が示唆されている[14]。また、プラスミンはある種の潜在的形態の成長因子を活性化する能力を有する[15-17]。in vitroでは、プラスミンは補体系の成分を加水分解し、しかも走化性補体フラグメントを放出することもできる。
プラスミノーゲンまたはプラスミンが生体の放射および化学的損傷に対して顕著な治療効果を有し、しかも非常に安全であることを研究において意外に発見した。したがって、プラスミノーゲンまたはプラスミンの使用は、異なるタイプの放射と化学的損傷および関連疾患を治療するための新規な治療ストラテジーである。
【発明の概要】
【０００６】
一つの局面において、本発明は、プラスミノーゲンまたはプラスミンの被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患を治療及び／または解消するための薬物の調製における使用に係る。また、本発明は、プラスミノーゲンまたはプラスミンの被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷及び関連疾患を治療及び／または解消するための薬物の調製における使用に係る。一つの実施形態において、前記損傷は、骨髄造血系、皮膚、粘膜、免疫系および生殖系への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、放射線療法、化学療法または化学放射線療法による一般的な健康状況の低下、全身の副作用および局所的な副作用であり、急性副作用、長期的な副作用、および累積副作用を含む。一つの実施形態において、前記損傷の関連疾患は、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害を含む。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤および解毒剤を含む、一つまたは複数の他の薬
物または療法と組み合わせて投与されることができる。
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者はプラスミンまたはプラスミノゲンが不足している。具体的に、前記不足は先天的、継発的及び／または局所的である。
【０００７】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはその任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換変異体である：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２に示されたプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス/ラット、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示されるものである。
【０００８】
一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは外部使用、経口、全身または局所投与により投与される。一つの実施形態において、以下の経路により投与される：体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸引、髄腔内、局所注射、関節内注射または直腸投与。一つの実施形態において、前記投与方式は外部使用である。一つの実施形態において、前記局所投与は、損傷域において、プラスミノーゲンまたはプラスミンを直接に投与することによって予防及び／または治療を行う。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ2、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ2、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ2、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ2、１−２００ｍｇ／ｃｍ2、１−１００ｍｇ／ｃｍ2、１０−１００ｍｇ／ｃｍ2（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【０００９】
もう一つの局面において、本発明は、被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患の予防及び／または治療及び／または解消に用いられるプラスミノーゲンまたはプラスミン、及び被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患の予防及び／または治療及び／または解消に用いられる、プラスミノーゲンまたはプラスミンを含む薬物組成物に係る。また、本発明は、被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷及び関連疾患の予防及び／または治療及び／または解消に用いられるプラスミノーゲンまたはプラスミン、及び被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷及び関連疾患の治療及び／または解消に用いられる、プラスミノーゲンまた
はプラスミンを含む薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記損傷は、骨髄造血系、皮膚、粘膜、免疫系および生殖系への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、放射線療法、化学療法または化学放射線療法による一般的な健康状況の低下、全身の副作用および局所的な副作用であり、急性副作用、長期的な副作用、および累積副作用を含む。一つの実施形態において、前記損傷の関連疾患は、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害を含む。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤および解毒剤を含む、一つまたは複数の他の薬物または療法と組み合わせて投与されることができる。
【００１０】
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者はプラスミンまたはプラスミノゲンが不足している。具体的に、前記不足は先天的、継発的及び／または局所的である。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはその任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換変異体である：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２に示されたプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス/ラット、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示されるものである。
【００１１】
一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは外部使用、経口、全身または局所投与により投与される。一つの実施形態において、以下の経路により投与される：体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸引、髄腔内、局所注射、関節内注射または直腸投与。一つの実施形態において、前記投与方式は外部使用である。一つの実施形態において、前記局所投与は、損傷域において、プラスミノーゲンまたはプラスミンを直接に投与することによって予防及び／または治療を行う。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ
2、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ2、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ2、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ2、１−２００ｍｇ／ｃｍ2、１−１００ｍｇ／ｃｍ2、１０−１００ｍｇ／ｃｍ2（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００１２】
さらに一つの局面において、本発明は、被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患の予防及び／または治療及び／または解消に用いられる、プラスミノーゲンまたはプラスミンを含む製品またはキット、及び被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷及び関連疾患の予防及び／または治療及び／または解消に用いられる、プラスミノーゲンまたはプラスミンを含む製品またはキットに係る。一つの実施形態において、前記損傷は、骨髄造血系、皮膚、粘膜、免疫系および生殖系への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、放射線療法、化学療法または化学放射線療法による一般的な健康状況の低下、全身の副作用および局所的な副作用であり、急性副作用、長期的な副作用、および累積副作用を含む。一つの実施形態において、前記損傷の関連疾患は、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害を含む。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤および解毒剤を含む、一つまたは複数の他の薬物または療法とくみあわせて投与されることができる。
【００１３】
一つの実施形態において、前記製品またはキットはさらに一つまたは複数のその他の薬物を含有する容器を含む。前記キットはさらに、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンが前記損傷及び関連疾患の予防及び／または治療に用いられることができることを説明するプロトコルを含んでもよく、前記プロトコルはさらに、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンが他の薬物または療法を投与する前、それと同時、及び／または後に投与できることを説明することができる。
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者はプラスミンまたはプラスミノゲンが不足している。具体的に、前記不足は先天的、継発的及び／または局所的である。
【００１４】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つお実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはその任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換変異体である：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、
プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２に示されたプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス/ラット、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示されるものである。
一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは外部使用、経口、全身または局所投与により投与される。一つの実施形態において、以下の経路により投与される：体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸引、髄腔内、局所注射、関節内注射または直腸投与。一つの実施形態において、前記投与方式は外部使用である。一つの実施形態において、前記局所投与は、損傷域において、プラスミノーゲンまたはプラスミンを直接に投与することによって予防及び／または治療を行う。
【００１５】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ2、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ2、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ2、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ2、１−２００ｍｇ／ｃｍ2、１−１００ｍｇ／ｃｍ2、１０−１００ｍｇ／ｃｍ2（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
本発明は、本発明に係る実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせた技術構成は、前記実施形態が単独且つ明確に開示されているように、本出願で明確に開示されている。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示されており、それぞれそのようなサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているようにである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「放射損傷」は、「輻射損傷」ともいい、放射線の照射による生体全身または局所器官、組織の損害（損傷）である。一般的に、放射線は、天然または人工エネルギーによって生じる高エネルギー電磁波または高エネルギー粒子である。高線量の放射線の瞬時照射または低線量の放射線の長時間照射のいずれもが器官、組織損傷を引き起こす可能性がある。「化学的損傷」は、化学物質が人体に接触したときに起こる局所的損害（損傷）または全身的損害（損傷）である。その損傷程度は、化学物質の性質、投与量、濃度、接触時間および面積、処理が適時且つ効果的であるか否かなどの要因に関係する。
放射損傷と化学的損傷は、生体器官、組織構造及び機能の損傷として現れることがあり、例えば、骨髄造血系の生理学的構造及び機能への損傷、皮膚、粘膜の生理学的構造及び機能への損傷、免疫系の生理学的構造及び機能への損傷および生殖系の生理学的構造及び機能の損傷への損傷がある。一つの実施形態において、前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体の生理学的構造及び機能への損傷を含む。前記損傷の関連疾患は、器官と組織の機能障害として現れ、例えば、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害がある。
【００１７】
「放射線療法」と「放射療法」を交換して使用することができる。化学薬物による治療は通常「化学療法」と略称される。「化学放射線療法」とは、放射線療法と化学療法との両者の組み合わせをいう。臨床的には、放射線療法または化学療法または両方の組み合わせを用いて腫瘍および癌患者を治療または改善するのが一般的である。その中で、放射線
療法は通常、Ｘ線、γ線、中性子およびその他の放射線源を使用して、癌細胞を殺し、または細胞内の遺伝物質を破壊する。化学療法は、細胞毒性薬を単独でまたは組み合わせて使用することによって癌細胞の複製または増殖を破壊する。正常細胞も放射線療法において損傷を受けてしまい、しかも自己修復することができない。放射線療法中に、皮膚刺激、治療域における脱毛、および骨髄損傷を含む副作用が起こり得る。
「化学療法」とは、細胞毒性薬を単独でまたは組み合わせて使用することによって癌細胞を殺すことをいう。放射線療法の場合と同様に、癌細胞は損傷を受けて最終的に死亡することがあるが、健康的な細胞は化学療法を受けた後の自己修復過程において影響される。細胞毒性薬は成長細胞の分化および増殖能力を妨害することにより作用する。したがって、癌細胞の他に、正常且つ迅速に分化し成長する細胞も影響を受ける。例えば、これらは骨髄の造血機能に影響を及ぼし、骨髄抑制を引き起こす可能性がある。また、消化管、口腔壁および生殖系の細胞に影響を与え、毛包を影響し、下痢、口腔痛および脱毛を引き起こす可能性がある。
【００１８】
「化学放射線療法の副作用」とは、治療中（急性副作用）、治療後数ヶ月または数年（長期的な副作用）、または反復治療後（累積副作用）のような通常異なる段階で現れる、化学放射線療法に伴う副作用を指す。その性質、重症度および副作用する時間の長さは、治療される器官、治療自体（放射線型、用量、等級、併用化学療法）および患者によられる。
ほとんどの副作用は予測または予期可能である。放射線療法の副作用は、通常、患者が治療を受ける局所域のみに限られる。現代の放射線療法の目標は、副作用を最小限に抑え、患者が避けられない副作用を理解し処理できるようにすることである。
骨髄抑制は、放射線療法と化学療法の多くの副作用の一つである。これによって、赤血球、白血球、血小板などの血液細胞の生成が減る。その結果、患者は貧血により疲労し、白血球減少により感染しやすくなり、血小板が減少するため、傷があると、打撲傷が起こりやすく、出血も多くなる。
【００１９】
「一般的な健康状況」とは、一つの健康の標準のことであり、体、関連する組織および器官は、活動的な疾病、不快や不安がない上で個体は飲食や話しができ、社交活動に参加でき、基本的なレクリエーションを満足させるのに役立つことをいう。一般的な健康の主な特徴は、身体上の健康と精神上の健康を含む。
【００２０】
「プラスミン」は、血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解産物およびＤ−二量体に加水分解することができる。
「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドの天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータにより、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００２１】
Ｇｌｕ−プラスミノゲンは天然のフルサイズのプラスミノゲンであり、７９１個のアミ
ノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）、該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず[18,19]、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり[19]、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており[20]、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し[21]、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００２２】
本発明の  「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノゲン」と「フィブリンプラスミノゲン」、「繊維タンパクプラスミノゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
循環過程において、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン質加水分解生成物及びＤ−二量体に加水分解して、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのＰａｐドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要な決定クラスターであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００２３】
“プラスミノゲン活性フラグメント”とはプラスミノゲンのタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成に係り、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの替わりとする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然該プラスミノゲン活性を有するタンパク質を含む。
現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノゲン活性
化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を転化し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、その後に分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行う。
【００２４】
オルソロジー（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）」とは異なる種どうしのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノゲンまたはプラスミンはヒト天然プラスミノゲンまたはプラスミンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノゲンまたはプラスミン活性を有するプラスミノゲンまたはプラスミン直系同源物または直系同系物である。
「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換変異体」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００２５】
「分離された」プラスミノゲンまたはプラスミンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノゲンまたはプラスミンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性で、該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンまたはプラスミンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンまたはプラスミンを含む。
【００２６】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体をいい、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種
性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムを含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【００２７】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、アミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂのアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂのあるアミノ酸配列と同一性を有する所定のアミノ酸配列Ａの占める％）は以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙ×１００
そのうちＸは配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００２８】
本文において使用されているように、用語の「治療」、「処理」及び「解消」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾病が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況である；  （ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害する；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させる。
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与され、疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現するプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００２９】
（本発明のプラスミノゲンまたはプラスミンの調製）
プラスミノゲンまたはプラスミンは自然界から分離及び精製され、さらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノゲンまたはプラスミンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは
、プラスミノゲンまたはプラスミンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ
ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖の機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産する。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。
【００３０】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、外部由来に期待のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）はクローンするプラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドの原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
【００３１】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母はアルコール脱水素酵素、イソ細胞色素Ｃ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターによって起動される。
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノゲンの発現および生成に用いることができる（例えばプラスミ
ノゲンをコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、ＲＮＡの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【００３２】
一旦合成（化学または組み換え方式）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノゲンまたはプラスミンを精製することができる。該プラスミノゲンまたはプラスミンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、プラスミノゲン以外の大分子などである。
【００３３】
（薬物配合剤）
必要とする純度のプラスミノゲンまたはプラスミンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の使用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンチルアルコール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤または解毒剤等である。
【００３４】
本発明のプラスミノゲンまたはプラスミンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に包まれることができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リ
ポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）。
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌ろ過膜でろ過することで容易に実現できる。
【００３５】
本発明のプラスミノゲンまたはプラスミンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過基質を含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγメチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に１００日間以上分子を放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現する。
【００３６】
（投与及び使用量）
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るｐＨ及び等張状態に調整する。
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【００３７】
医療関係者は各種臨床的要素により用量の案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノゲンの薬物
組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量の日程表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において放射性と化学的損傷及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
【００３８】
（治療効力及び治療安全性）
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンまたはプラスミンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。そのうち前記治療効力を判断する方法は以下を含むが、これらに限られない：１）免疫系の回復に対する検査で、具体的には、例えば、白細胞、血小板数量の回復であり、被験者が本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンによる治療を受けた後、前記検査が正常値の範囲内に戻るまたは改善されることは予期され、例えば、白細胞は４〜１０×１０9／Ｌに戻り、血小板は１００〜３００×１０9／Ｌに戻る；２）食欲不振、吐き気嘔吐、下痢、便秘などの症状を含み、消化系の不良表現が改善される；３）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）などの肝機能、総ビリルビン値、腎機能などを含む、生体の各器官の機能が改善され、具体的には、被験者が本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンによる治療を受けた後、前記検査が正常値の範囲内に戻るまたは改善されることは予期され、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）：０〜４０μ／Ｌ、総ビリルビン：３．４〜２０．５μｍоｌ／Ｌである；４）静脈炎、潰瘍などその他の症状が改善される。また、本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミンを用いて被験者に対して治療を行う過程中及び治療後において、前記該治療案の安全性に対する判断に係り、被験者の血清半減期、治療半減期、半数中毒量（ＴＤ５０）、半数致死量（ＬＤ５０）に対して統計を行い、または治療過程中においてまたは治療後に発生する各種望ましくない事件例えばアレルギー反応に対して観察を行うことを含むが、これらに限られない。
【００３９】
（製品または薬物キット）
本発明の一つの実施形態は、放射損傷と化学的損傷および関連疾患の治療に用いられる本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含有する、製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲンまたはプラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは、前記組成物を本発明の前記放射損傷と化学的損傷及びその関連疾患の治療に用いられることを説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲンまたはプラスミン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを投与した後の体重の変化を示したものである。
【図２】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを１０日間投与した後の腎臓のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【図３】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを１０日間投与した後の腎臓のマクロファージマーカーＦ４／８０免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。
【図４】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを１０日間投与した後の十二指腸のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【図５】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを１０日間投与した後の十二指腸のマクロファージマーカーＦ４／８０免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。
【図６】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを１０日間投与した後の肝臓のマクロファージマーカーＦ４／８０免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。
【図７】５．０Ｇｙ  Ｘ線放射後のマウスに対してプラスミノーゲンを１、４、７、１４日投与した後の肝臓のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【図８】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の体重の変化を示したものである。
【図９】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の腎臓のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【図１０】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の腎臓のフィブリンの免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。
【図１１】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の腎臓のＢｃｌ−２免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。
【図１２】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の肝臓のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【図１３】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の肝臓のフィブリンの免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。
【図１４】１０ｍｇ／ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを７日投与した後の精巣および精巣上体のＨＥ染色の観察結果を示したものである。
【００４１】
＜実施例＞
材料及び方法：
【００４２】
放射線損傷モデル：
実験動物：７〜８週齢のＳＰＦレベル健康なオスＣ５７マウスを５．０Ｇｙにて照射した後に脾臓、肝臓、腎臓などの器官の病理学的変化を調べた。動物を７日間適応給餌した後、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群、単純照射群、およびプラスミノーゲン投与群である。
実験方法：線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙであり、準致死量照射であり、脾臓、肝臓、腎臓などの器官の組織病理学的変化、造血および免疫機能の研究およびフリーラジカルの検出に用い、ソーススキン距離１００ｃｍ、照射面積３０ｃｍ×３０ｃｍで、正常対照群に対して鉛ブロックを覆って保護した。照射後、
マウスが死亡するあるいは特定の時間で殺処分するまでに投与を行い、対照群に同じ体積の溶媒を投与した。照射されたマウスの全身状態を観察し、肝臓、腸組織、腎臓組織のＨＥ染色の組織病理学的変化およびＦ４／８０の免疫組織化学的染色を光学顕微鏡下で観察した。
【００４３】
観察指標：
１．肝臓、腸、腎臓の組織病理学的観察：
眼球を摘出して血を採取しマウスを殺処分した後脾臓肝臓、腸、腎臓組織を取り、１０％中性ホルマリンにて固定し、アルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹にし、パラフィンで包埋させ、パラフィン切片にし（切片の厚みは５μｍである）、通常ＨＥ染色の後、中性ゴムに封入し、各組織病理学的変化を顕微鏡下で観察した。
２．肝臓、腸、腎臓Ｆ４／８０免疫組織化学的染色の観察
肝臓、腸、腎臓をパラフィン切片にし（切片の厚みは５μｍである）、免疫組織化学的染色後、各組織における発現状況を顕微鏡下で観察した。
【００４４】
化学的損傷モデル：
実験動物：７〜８週齢のＳＰＦレベル健康なオスＣ５７マウスをアンチシスプラチンの毒性効果の観察に用い、動物を７日間適応給餌した後、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群、単純モデル群、およびプラスミノーゲン投与群である。
実験方法：
シスプラチン群：シスプラチン注射剤を、生理食塩水を用いて質量濃度が１ｍｇ／ｍｌである水溶液に調製し、３．５ｍｌ／ｋｇ体重で腹腔注射により投与した。対照群のマウスに対して毎回同じ体積の生理食塩水を腹腔注射した。５日間連続的に投与してモデルを構築し、モデルを構築した後、治療群に１ｍｇ／匹でプラスミノーゲンを投与し、対照群とモデル群に同じ体積の溶媒を投与し、プラスミノーゲンを投与して７日目に動物を殺処分した。血と腎臓組織などをそれぞれ採取して指標検出を行った。
【００４５】
観察指標：
１． 体重変化曲線：毎日投与する前にマウスの体重を測定し、各群のマウスの体重の変化を観察した。
２． 腎臓係数：マウスを殺処分した直後に腎臓組織を採取して重量を測り、腎臓係数［腎臓係数Ｚ（臓器質量／体重）×１００％］を算出した。
３． 腎臓組織のＨＥ観察：１０％中性ホルマリンにて固定し、アルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹にし、パラフィンで包埋させ、パラフィン切片にし（切片の厚みは５μｍである）、通常ＨＥ染色の後、中性ゴムに封入し、各組織病理学的変化を顕微鏡下で観察した。
４． 動物の胸腺係数および脾臓係数：マウスを殺処分した直後に胸腺と脾臓を採取して重量を測り、胸腺係数と脾臓係数［臓器係数Ｚ（臓器質量／体重）×１００％］を算出した。
５． 精巣および精巣上体の重量：各群のマウスを殺処分した後、精巣と精巣上体を採取し、重量を測ってから統計分析をした。
６． 精巣組織の形態の観察：精巣組織を通常固定し、脱水させ、包埋、切片化した後、ＨＥ染色して精巣組織の形態変化を観察した。
【実施例１】
【００４６】
実施例１は、５．０Ｇｙ  Ｘ線照射後のマウスの体重に対するプラスミノゲンの影響に関するものである。
本実験において、６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用
いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で、投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。実験の第０、５、１２、２１日目にそれぞれマウスの体重を測定して記録した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノゲン投与群は、０、５、１２、２１日目の体重データ統計に明らかな差異がない（図１）。Ｘ線照射および投与処理はマウスの体重に対して影響がないことが示されている。
【実施例２】
【００４７】
実施例２は５．０Ｇｙ  Ｘ線照射後のマウスの腎臓に対するプラスミノゲンの保護作用に関するものである。
本実験において、６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。２１日目にマウスを殺処分して解剖し、腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２Ａ）において、糸球体萎縮（＊）、管状たんぱく質キャスト（矢じり）が観察されたが、プラスミノーゲン投与群（図２Ｂ）において、糸球体の毛細管内腔には閉塞がなく、バルーン管腔がはっきり見えた。プラスミノーゲン投与群の腎臓の損傷は、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに軽く、プラスミノゲンがＸ線照射による腎臓損傷の修復を促進できることは示されている。
【実施例３】
【００４８】
実施例３は、プラスミノゲンが５．０Ｇｙ  Ｘ線照射されたマウスの腎臓炎症の修復を促進することに関するものである。
本実験において、６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で、投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日
間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。２１日目にマウスを殺処分して解剖し、腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水した後にさらに１回水洗した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温にて２０分間冷却してから水でやさしく洗い流した。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％の正常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングする；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗マウスＦ４／８０抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水してから透徹にして封入させ、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
Ｆ４／８０はマクロファージマーカーであって、炎症反応の程度及び段階を示すことができる。その結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ａ）のマウスのマクロファージマーカーＦ４／８０の発現量は、プラスミノゲン投与群（図３Ｂ）より高く、これはプラスミノゲンを投与した後の動物の腎臓組織の炎症が顕著に減軽されていることを示している。定量分析の結果は、顕微鏡観察と一致し、しかも統計学的差異が顕著であり（図３Ｃ）、これは、プラスミノゲンがＸ線照射による腎臓の炎症の修復を促進できることを示している。
【実施例４】
【００４９】
実施例４は５．０Ｇｙ  Ｘ線照射後のマウスの十二指腸に対するプラスミノゲンの保護作用に関するものである。
本実験において、６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。２１日目にマウスを殺処分して解剖し、十二指腸を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の十二指腸組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４Ａ）において、局所腸粘膜上皮が剥離し、変性し壊死し、剥離したところの正常粘膜層の構造が消えたに対して、プラスミノーゲン投与群（図４Ｂ）において、赤く染色された屈折縞が見られ、粘膜上皮に杯細胞が見られ、絨毛の中心は固有層であり、その構造ははっきりしている。プラスミノーゲン投与群の十二指腸の損傷は、溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに軽く、プラスミノゲンがＸ線照射による十二指腸の損傷の修復を促進できることは示されている。
【実施例５】
【００５０】
実施例５はプラスミノゲンが５．０Ｇｙ  Ｘ線照射されたマウスの十二指腸炎症の修復を促進することに関するものである。
本実験において、６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。２１日目にマウスを殺処分して解剖し、十二指腸を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の十二指腸組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水した後にさらに１回水洗した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温にて２０分間冷却してから水でやさしく洗い流した。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％の正常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングする；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗マウスＦ４／８０抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水して透徹にしてから封入させ、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５Ａ）のマウスのＦ４／８０の発現量は、プラスミノゲン投与群（図５Ｂ）より明らかに高く、これはプラスミノゲンを投与した後の十二指腸の炎症が顕著に減軽されていることを示し、プラスミノゲンがＸ線照射による十二指腸の炎症の修復を促進できることを示している。
【実施例６】
【００５１】
実施例６はプラスミノゲンが５．０ＧｙＸ線照射によるマウスの肝臓の炎症の修復を促進することに関するものである。
本実験は６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。２１日目にマウスを殺処分して解剖して肝臓を取り、それから肝臓を１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定させた。固定後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いし
た。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温にて２０分間冷却してから水でやさしく洗い流した。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲む。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＦ４／８０抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗った。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水してから透徹にして封入させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察した。
【００５２】
Ｆ４／８０免疫組織染色  （Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の効果が示すように、５．０ＧｙＸ線で照射してモデル構築した後の溶媒ＰＢＳ投与対照群（図６Ａ）のマウスファージマーカーＦ４／８０の発現量はプラスミノゲン群（図６Ｂ）より高く、これはプラスミノゲンを投与した後に、動物の肝臓組織の炎症が顕著に減軽されたことを示している。
【実施例７】
【００５３】
実施例７は５．０Ｇｙ  Ｘ線照射後のマウスの肝臓に対するプラスミノゲンの保護作用に関するものである。
本実験において、６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを２４匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群１２匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与した。プラスミノゲン投与群に対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群には同じ体積のＰＢＳを投与した。実験が開始した当日を０日目として体重測定して群分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１４日間である。照射後１、４、７、１４日目にそれぞれ三匹の動物を殺処分し、マウスの肝臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
その結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照群（図７ａ−ｄ）の１日目の肝臓について、肝細胞索は中央静脈を中心に放射状に周りに広がり、テクスチャが規則的であり、肝類洞壁が明晰であり、一部の肝細胞は変性し壊死し、細胞核が溶解し、サイトゾルが淡く染色された（↓）；４日目に肝類洞壁に軽度な炎症性細胞浸潤が見られ（▼）、肝類洞壁が狭窄した；７日目に肝細胞の壊死はさらに悪化し、且つ肝細胞は軽度な水様変性が起こり（矢じり）、サイトゾルが溶解し、肝細胞索に乱れが生じた；１４日目に肝臓はすでに大きく改善し、肝細胞索は規則的であり、肝類洞壁は明晰であったが、中央静脈付近の肝類洞壁に少量の炎症性細胞浸潤があった。
【００５４】
プラスミノーゲン投与群（図７ｅ−ｇ）の１日目の肝臓について、肝索は規則的であり、肝類洞壁は明晰であり、少量の肝細胞が壊死した（↓）；４日目に肝臓は中央静脈周りの肝細胞において軽度な水様変性が起こった（矢じり）；７日目から、肝臓病変が改善しはじめ、肝細胞索は中央静脈を中心に放射状に配列し、肝類洞壁は明晰である；１４日目にも肝臓が改善を引き続き示し、壊死は１日目と比べて明らかに減軽し、肝細胞索は７日
目と比べてより規則的である。
総じていえば、ＰＢＳ対照群では、１日目から７日目までに肝臓には進行性の損傷が示され、１４日目までに改善傾向が示される。これに対して、プラスミノーゲン投与群では、１日目から４日目までに肝臓には損傷の傾向があるが、７日目から肝臓は大幅に改善し始めた。これは、プラスミノゲンがＸ線照射による肝臓損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例８】
【００５５】
実施例８は、シスプラチン化学療法による損傷モデルマウスの体重に対するプラスミノーゲンの影響に関するものである。
本実験において、８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間であり、第０日目と第７日目に体重を測定した。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のマウスの体重は顕著に減り、しかも統計学的差異があるに対して、プラスミノーゲン投与群のマウスの体重は減ったが明らかではない（図８）。これは、プラスミノーゲンが動物の体重に対する化学療法薬物シスプラチンの影響を顕著に減軽できることを示している。
【実施例９】
【００５６】
実施例９は、プラスミノゲンのシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスの腎臓に対する保護作用に関するものである。
本実験において、８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日１ｍｇ／匹／日でプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間である。８日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
ＨＥの結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照群（図９Ａ）において、腎尿細管上皮細胞壊死が示され（矢じり）、炎症性細胞浸潤も伴われる（↓）に対して、プラスミノーゲン投与群（図９Ｂ）において、明らかな腎尿細管壊死はなく、少量の炎症性細胞浸潤だけが伴われる。これは、プラスミノーゲンが化学療法薬物シスプラチンによる腎臓損傷を減軽できることを示している。
【実施例１０】
【００５７】
実施例１０は、プラスミノゲンのシスプラチン化学療法損傷モデルマウスの腎臓のフィブリンの分解を促進することに関するものである。
本実験において、８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つ
の群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間である。８日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って１０％中性フルマリン固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で３０分間修復し、室温にて１０分間冷却してから水でやさしく洗い流した。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスフィブリン抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察した。
【００５８】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解されて損傷部位に沈着する[22-24]。そのため、損傷局所のフィブリンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。
その結果は以下のように示している。触媒ＰＢＳ投与対照群（図１０Ａ）におけるフィブリンの陽性着色は明らかにプラスミノゲン投与群（図１０Ｂ）より深い。これはプラスミノゲンが化学療法薬物シスプラチンによるフィブリンの沈着を顕著に減少させたことを示し、化学療法薬物シスプラチンによる腎臓損傷の修復に寄与できることを示している。
【実施例１１】
【００５９】
実施例１１は、プラスミノゲンのシスプラチン化学療法損傷モデルマウスの腎臓アポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２の発現を促進することに関するものである。
本実験において、８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間である。８日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って１０％中性フルマリン固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で３０分間修復し、室温にて１０分間冷却してから水でやさしく洗い流した。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後に、
ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察した。
【００６０】
Ｂｃｌ−２は細胞アポトーシス抑制タンパク質であり、アポトーシス刺激因子により発現を低くする[25,26]。その結果は以下のように示している。触媒ＰＢＳ投与対照群（図１１Ａ）の腎臓組織におけるＢｃｌ−２の陽性着色は明らかにプラスミノゲン投与群（図１１Ｂ）より淡い。これはプラスミノゲンが化学療法薬物シスプラチンによる腎臓組織におけるアポトーシス抑制タンパク質Ｂｃｌ−２の発現を顕著に向上させることができ、腎臓組織の細胞アポトーシスの抑制に寄与できることを示している。
【実施例１２】
【００６１】
実施例１２は、プラスミノゲンのシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスの肝臓に対する保護作用に関するものである。
本実験において、８〜９週齢のＣ５７マウスを１０匹取り、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間であった。８日目にマウスを殺処分して肝臓を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
【００６２】
ＨＥの結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１２Ａ）において、肝臓は中央静脈が拡張し、内皮細胞が壊死し、周りは軽度な炎症性細胞浸潤があり、大きい炎症性病巣も見られ（↓）、肝細胞は点状に壊死し、細胞核が破裂し、サイトゾルが淡く染色され、肝細胞索に乱れが生じる。これに対して、プラスミノーゲン投与群（図１２Ｂ）において、肝臓の肝細胞索は中央静脈を中心に周りに発散し、肝類洞壁は明晰であり、サイトゾルは赤に染色され、肝細胞壊死および炎症性細胞浸潤は明らかに減軽している。これは、プラスミノーゲンが化学療法薬物シスプラチンによる肝臓損傷を顕著に減軽できることを示している。
【実施例１３】
【００６３】
実施例１３は、プラスミノゲンのシスプラチン化学療法損傷モデルマウスの肝臓のフィブリンの分解を促進することに関するものである。
本実験において、８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目
からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間であった。８日目にマウスを殺処分し、肝臓を取って１０％中性フルマリン固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で３０分間修復し、室温にて１０分間冷却してから水でやさしく洗い流した。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスフィブリン抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察した。
【００６４】
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解されて損傷部位に沈着する[22-24]。そのため、損傷局所のフィブリンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。
その結果は以下のように示している。触媒ＰＢＳ投与対照群（図１３Ａ）の肝臓組織におけるフィブリンの陽性着色は明らかにプラスミノゲン投与群（図１３Ｂ）より深い。これはプラスミノゲンがフィブリンの沈着を顕著に減少させることができ、化学療法薬物シスプラチンによる肝臓損傷の修復に寄与できることを示している。
【実施例１４】
【００６５】
実施例１４は、プラスミノゲンがシスプラチン処理によるマウスの生殖器官への毒性を低下させることに関するものである。
本実験において、８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群５匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群は同じ体積のＰＢＳを投与した。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間であった。８日目にマウスを殺処分して精巣と精巣上体を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した。固定した後の精巣と精巣上体組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察した。
【００６６】
その結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照群において、精巣上体の輸精管（図１４Ａ）中の精子の数が減少し、しかも精巣上体組織の複数箇所壊死が伴われ、精子の数はプラスミノーゲン投与群より明らかに減少し、精巣（図１４Ｃ）間質に複数箇所壊死（）が見られる。溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群において、精巣上体の輸精管（図１４Ｂ）中の精子の数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、精巣間質（図１４Ｄ）の壊死病巣（単一箇所の壊死病巣）も明らかに減少する。これは、
プラスミノゲンが化学療法薬物シスプラチンによる生殖器官への毒性を低下できることを示している。
【００６７】
以上詳述した種々の実施形態から、少なくとも以下の技術思想が把握される。
（１）  被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患を治療及び／または解消するための方法。
（２）  被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷及び関連疾患を治療及び／または解消するための方法。
（３）  前記損傷は、骨髄造血系、皮膚、粘膜、免疫系および生殖系への損傷を含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体への損傷を含む、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）  前記損傷は、放射線療法、化学療法または化学放射線療法による一般的な健康状況の低下、全身の副作用および局所的な副作用であり、急性副作用、長期的な副作用、および累積副作用を含む、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）  前記損傷の関連疾患は、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害を含む、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）  前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するものである、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）  前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。（９）  前記プラスミノーゲンは、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤および解毒剤を含む、一つまたは複数の他の薬物または療法と組み合わせて投与されることができる、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）  有効使用量のプラスミノーゲンを含有する容器、および被験者の放射損傷と化学的損傷および関連疾患の治療および／または解消に前記製品を投与することを指導するプロトコルを含む、被験者の放射損傷と化学的損傷および関連疾患を治療および／または解消するための製品。
（１１）  有効使用量のプラスミノーゲンを含有する容器、および被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷および関連疾患の治療および／または解消に前記製品を投与することを指導するプロトコルを含む、被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷および関連疾患を治療および／または解消するための製品。
（１２）  さらに一つまたは複数のその他の薬物を含有する容器を含む、（１０）または（１１）に記載の製品。
（１３）  前記その他の薬物は、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤、解毒剤である、（１２）に記載の製品。
（１４）  前記プロトコルはさらに、前記プラスミノゲンが前記その他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できることを説明している、（１３）または（１４）に記載の製品。
【００６８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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