(57)【要約】【課題】  光学顕微鏡観察しつつ細胞培養を可能とする細胞培養容器及びこれを用いた細胞培養方法の提供。【解決手段】  透明樹脂からなる内表面の少なくとも一部に細胞培養のための足場材料からなる皮膜を付与された細胞培養容器である。透明樹脂はポリスチレンであって、皮膜として純チタン又はチタン合金からなるアモルファス薄膜を２００ｎｍ以下の厚さで与えたことを特徴とする。これを用いた細胞培養方法は、上記の細胞培養容器を用いて、骨芽細胞又は間葉系細胞を外部から光学観察しつつ培養することを特徴とする。【選択図】  図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明樹脂からなる内表面の少なくとも一部に細胞培養のための足場材料からなる皮膜を付与された細胞培養容器であって、
前記透明樹脂はポリスチレンであって、前記皮膜として純チタン又はチタン合金からなるアモルファス薄膜を２００ｎｍ以下の厚さで与えたことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
前記皮膜はその表面に酸化チタンの薄膜を有することを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞培養容器を用いて、骨芽細胞又は間葉系細胞を外部から光学観察しつつ培養することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透明樹脂からなる内表面の少なくとも一部に細胞培養のための足場材料からなる皮膜を付与された細胞培養容器及びこれを用いた細胞培養方法に関し、特に、光学顕微鏡観察しつつ細胞培養を可能とする細胞培養容器及びこれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体から取り出した細胞を制御された環境下で育てる細胞培養は、各種研究用途から臨床段階の再生医療まで非常に広範な目的で行われている。ここで、骨芽細胞や臓器細胞は、人工的に培養しようとすると、固体表面に付着して足場を形成しつつ増殖することが知られている。そこで、かかる細胞培養には、ガラスや樹脂からなる容器の内表面の少なくとも一部に該細胞の培養に適した足場材料からなる皮膜を付与しこの上で所定の細胞の培養が行われる。
【０００３】
例えば、特許文献１では、高分子基材に珪素酸化物からなる薄膜を蒸着等により設けた細胞培養用基材を開示している。接着依存性動物細胞の培養については、ガラス、プラスチック製シャーレなどが用いられていることを述べた上で、培養後において写真を撮る場合に希望の大きさにカット出来るよう高分子基材を用い、その表面に所定の酸化物薄膜を与えることで細胞が分泌する生理活性蛋白質を効率的に増殖又は回収することができるとしている。合わせて、オートクレーブ滅菌が可能であること、化学的・生物学的に安定な基材であること、廉価な細胞培養用基材であること、取扱い易いこと、などの利点を挙げている。
【０００４】
また、特許文献２では、高分子基材にマグネシウム酸化物又は鉄酸化物からなる薄膜層を与えた細胞培養用基材を開示している。ここでは、透過式光学系顕微鏡で細胞の状態観察をできる透明性を有していることを条件に挙げており、詳細は不明だが、光透過性を得るべく、薄膜層を数百オングストローム程度で与えるとしている。
【０００５】
更に、特許文献３では、ガラス又は樹脂から成る基材の上に、細胞接着性に優れる酸化チタン薄膜を与えた細胞接着性基材を開示している。ここではチタン皮膜を薄くコーティングしその後、焼成して酸化チタン薄膜を得ているが、この薄膜の厚さを薄くすることで、培養した細胞等をそのまま顕微鏡等で観察することが可能であるとしている。なお、樹脂は、焼成工程に耐えるだけの耐熱性が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−６７６１８号公報
【特許文献２】特開平８−１１６９６３号公報
【特許文献３】特開２００２−２５３２０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記したように、透明樹脂からなる内表面の少なくとも一部に細胞培養のための足場材料からなる皮膜を付与された細胞培養容器が求められている。特に、骨芽細胞又は間葉系細胞では、透明樹脂は使い捨て用途に適するよう、汎用樹脂、一般的には、ポリスチレンが用いられる。一方、足場材料としての皮膜においては、この汎用樹脂との親和性が必要となり、光学顕微鏡観察できるような光学的な透明性も必要とされる。
【０００８】
本発明は、以上のような状況に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、光学顕微鏡観察しつつ細胞培養を可能とする細胞培養容器及びこれを用いた細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明による細胞培養容器は、透明樹脂からなる内表面の少なくとも一部に細胞培養のための足場材料からなる皮膜を付与された細胞培養容器であって、前記透明樹脂はポリスチレンであって、前記皮膜として純チタン又はチタン合金からなるアモルファス薄膜を２００ｎｍ以下の厚さで与えたことを特徴とする。
【００１０】
かかる発明によれば、使い捨て用途に適するポリスチレンによる透明樹脂に親和性を有するとともに細胞接着性に優れる皮膜を足場材料として付与するとともに、光学的な透明性も有しており、光学顕微鏡観察しつつ細胞培養を可能とする。
【００１１】
上記した発明において、前記皮膜はその表面に酸化チタンの薄膜を有することを特徴としてもよい。かかる発明によれば、足場材料としてより細胞接着性に優れる皮膜を付与できる。
【００１２】
また、本発明による細胞培養方法は、上記した細胞培養容器を用いて、骨芽細胞又は間葉系細胞を外部から光学観察しつつ培養することを特徴とする。
【００１３】
かかる発明によれば、使い捨て用途に適するポリスチレンによる透明樹脂に親和性のある皮膜を足場材料として付与するとともに、外部からの光学顕微鏡観察をしながらの細胞培養を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】細胞培養試験における光学顕微鏡観察画像及び細胞の移動の軌跡の図である。
【図２】タイムラプラス動画から得たフレーム毎の細胞の移動速度の散布図である。
【図３】細胞の移動速度の頻度分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明による１つの実施例である細胞培養容器について説明する。
【００１６】
本実施例における細胞培養容器は、その基材として、骨芽細胞又は間葉系細胞の培養のため使い捨て用途に適する汎用樹脂を用いるとともに、外部から光学顕微鏡観察できるような光学的な透明性を有する透明樹脂を用いる。このような透明性を有する汎用樹脂としてはポリスチレンが適当である。
【００１７】
また、この細胞培養容器は、内表面の少なくとも一部に細胞培養のための足場材料として細胞接着性に優れるとともに光学的な透明性を維持できる皮膜であり、さらにはポリスチレンからなる基材に対する親和性を有する皮膜を備える。このような皮膜としては、純チタン又はチタン合金からなるアモルファス薄膜を２００ｎｍ以下、好ましくは５０ｎｍ以下の厚さで付与されたものとすることが適当である。このような焼成を必要としないチタンのアモルファスの皮膜は、細胞に対する親和性が高く、培養される細胞に優れた接着性を付与し得る。また、かかる皮膜は、その表面に酸化チタンの薄膜を有することが好ましく、これによって細胞の接着性をより優れるものとし得ると考えられる。
【００１８】
このような細胞培養容器を用いることで、骨芽細胞又は間葉系細胞を外部から光学観察しつつ培養することができる。
【００１９】
［細胞培養試験］
次に、上記した細胞培養容器を実際に作製して骨芽細胞の培養試験の結果について図１〜図３を用いて説明する。
【００２０】
細胞培養容器としては、直径６０ｍｍのポリスチレンディッシュを基材に用いた。ポリスチレンディッシュの内表面に純チタンをターゲットとするスパッタリングを５秒間行いチタンのアモルファス薄膜による皮膜を形成させた。皮膜の厚さは約４ｎｍであった。皮膜を形成されたポリスチレンディッシュ（Ｔｉディッシュ）は、ドライボックス内で約３か月間保管された後、７０％のエタノール水溶液に５分間浸漬されて、安全キャビネット内で紫外線を１時間照射されることで滅菌された。ここまでの処理において、チタンのアモルファス皮膜は大気に曝されてその表面を酸化され、酸化チタンの薄膜を形成しているものと考えられる。なお、比較例として、皮膜を形成させずに同様に滅菌したポリスチレンディッシュ（ＣＴＬディッシュ）も用意した。
【００２１】
次いで、滅菌されたＴｉディッシュ及びＣＴＬディッシュにそれぞれ細胞を播種した。詳細には、骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に１０％血清（ＦＢＳ）ＭＥＭ  ａｌｐｈａ及び抗生物質としてペニシリンストレプトマイシンを１／１００量を加え、２．５×１０４［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］に調整した細胞懸濁液をＴｉディッシュ内のＴｉ皮膜上及びＣＴＬディッシュの内表面に２ｍｌ添加した。これにより播種細胞数は５．０×１０４［ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ］となった。
【００２２】
細胞の培養は６日間行った。その間、培養細胞モニタリング装置（ＣＣＭ−１．４ＸＹＺ／株式会社アステック製）を用いて、５分間隔で撮影した静止画像の群によるタイムラプラス動画を得た。なお、タイムラプラス動画の撮影は、細胞の播種の１時間後から開始し、播種後、約５４時間（６４２フレーム）まで継続させた。なお、細胞の培養及びタイムラプラス動画の撮影はＴｉディッシュ３個、ＣＴＬディッシュ３個の計６個のそれぞれについて行った。
【００２３】
撮影したタイムラプラス動画から、観察中に追跡続行の可能な細胞を各ディッシュにつき２つ選択し、それぞれの細胞の移動を追跡した。追跡続行の可能な細胞としては、途中で死なず、分裂してもどちらか一方が観察視野から外れないとともに細胞群に埋没することもなく、常に核の位置のわかるものを選択した。そして、核のほぼ中心を細胞の位置としてその移動を追跡した。
【００２４】
図１には、（ａ）Ｔｉディッシュ、及び、（ｂ）ＣＴＬディッシュにおいて追跡したうちのそれぞれ１つの細胞の移動の軌跡を１フレーム目の画像の上に示した。この追跡結果によると、両者とも分裂回数は３回であり、分裂前のＴ１、１回分裂後のＴ２、２回分裂後のＴ３、３回分裂後のＴ４に分けて移動の軌跡を示した。かかる移動の軌跡によれば、Ｔｉディッシュにおける細胞の方がＣＴＬディッシュにおける細胞に比べて長距離を移動した。なお、同図に示す通り、Ｔｉディッシュは外部から光学顕微鏡による観察を可能な程度に可視光の透過性を有する。
【００２５】
同様にして、細胞２個×Ｔｉディッシュ３個、細胞２個×ＣＴＬディッシュ３個の計１２個の細胞についての移動の軌跡を得た。得られた軌跡から、フレーム毎の各細胞の移動速度を得て、以下のように集計した。
【００２６】
図２には、フレーム毎の個々の細胞の移動速度を示した。同図に示すように、Ｔｉディッシュの細胞の方が、ＣＴＬディッシュの細胞に比べて移動速度が速いことが判る。なお、Ｔｉディッシュの細胞の平均移動速度は、ＣＴＬディッシュの細胞の平均移動速度の約２．５倍であった。
【００２７】
また、図３には、１フレーム毎の細胞の移動速度の頻度分布を示した。同図では、移動速度の最大値を０．０６μｍ／ｓとして整理しており、Ｔｉディッシュの細胞の方が、ＣＴＬディッシュの細胞に比べて移動速度を大とすることが顕著であった。
【００２８】
Ｔｉディッシュ、ＣＴＬディッシュの両者とも、上記した培養期間（６日間）の間にコンフルエントに達したが、Ｔｉディッシュの細胞の方が活発に動くことが観察された。つまり、上記の移動速度の結果と一致する。
【００２９】
以上のように、ポリスチレンディッシュにチタンのアモルファス薄膜による皮膜を形成させることで、光学顕微鏡観察しつつ細胞培養することを可能とする。特に、細胞の移動速度が高く、細胞の接着性に優れることが判る。
【００３０】
ここまで本発明による代表的実施例について説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではない。当業者であれば、添付した特許請求の範囲を逸脱することなく、種々の代替実施例を見出すことができるだろう。
【図１】
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【図２】
2020110078.tif 000004
【図３】
2020110078.tif 000005