(57)【要約】      （修正有）【課題】取り扱い性に優れる新たな性質の繭糸及びその製造方法、並びに当該繭糸を生成する遺伝子組換えカイコを提供する。【解決手段】セリシンおよびフィブロインを含む繭糸であって、前記セリシンが実質的にセリシン３からなる、繭糸。セリシンプロモーターとある特定の配列の塩基配列とが作動可能に連結されたDNAを有する、遺伝子組換えカイコ。前記遺伝子組換えカイコを生育して、繭糸を分離する工程を含む、繭糸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリシンおよびフィブロインを含む繭糸であって、前記セリシンが実質的にセリシン３からなる、繭糸。
【請求項２】
セリシンプロモーターと配列番号１の塩基配列とが作動可能に連結されたDNAを有する、遺伝子組換えカイコ。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子組換えカイコを生育して、繭糸を分離する工程を含む、繭糸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、繭糸及びその製造方法、並びに当該繭糸を生成する遺伝子組換えカイコに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換えカイコを利用した、新しい性質の繭糸の生産が注目されている。
【０００３】
例えば、特許文献１では、モンシロチョウから得られるピエリシン１Ａ遺伝子を用いてカイコの後部絹糸腺を機能不全化することで、フィブロインフリーの純粋なセリシンからなる繭糸を得ることなどが本発明の発明者らから提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１８−７５６９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Otsuki, R., et al. Proceeding of National Academy of Science of United States of America Volume 114, 6740-6745, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、取り扱い性に優れる新たな性質の繭糸及びその製造方法、並びに当該繭糸を生成する遺伝子組換えカイコを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記［１］〜［３］に関する。
［１］セリシンおよびフィブロインを含む繭糸であって、前記セリシンが実質的にセリシン３からなる、繭糸。
［２］セリシンプロモーターと配列番号１の塩基配列とが作動可能に連結されたDNAを有する、遺伝子組換えカイコ。
［３］［２］に記載の遺伝子組換えカイコを生育して、繭糸を分離する工程を含む、繭糸の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、取り扱い性に優れる新たな性質の繭糸及びその製造方法、並びに当該繭糸を生成する遺伝子組換えカイコを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１の繭糸についてのSDS-PAGEの結果を示す。
【図２】高フィブロイン繭を作る遺伝子組換えカイコの作出に使用したドナープラスミド（pBacMCS[Ser1pro-H1/P1A/FLAG, 3xP3-EGFP]）の概要を示す。図中、黒矢印はピギーバックトランスポゾンの認識に重要な逆平行繰り返し配列、UASは酵母転写因子Gal4が結合するプロモーター配列、H1はサイポウイルス多角体のアルファヘリックス配列、EGFPはオワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質、3×P3はカイコの神経・目で発現するプロモーターを示す。
【図３】セリシン遺伝子の発現量解析（中部絹糸腺のqPCR）におけるセリシン１の発現量を示す。
【図４】セリシン遺伝子の発現量解析（中部絹糸腺のqPCR）におけるセリシン２の発現量を示す。
【図５】セリシン遺伝子の発現量解析（中部絹糸腺のqPCR）におけるセリシン３の発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
カイコが吐く繭糸の成分は、約７５％がフィブロイン、約２５％がセリシンである。繭糸の内部はフィブロイン、外側はセリシンで構成されている。繭から生糸を引く通常の製糸の工程では、まず繭を高温のお湯で煮る（煮繭）ことで、外側のセリシンを溶かすことが必要である。煮繭された繭は次に製糸機にかけられ、操糸を行うことができる。この操糸された糸は生糸と呼ばれ、まだこの段階ではかなりのセリシンが含まれている。最終的な絹製品を得るためにはこのセリシンをほぼ完全に除去することが必要で、アルカリ精練、酵素精練などの処理が行われる。ただし、セリシンを完全に除去（過精練）するとフィブロインはミクロフィブリル化し、毛羽立った状態になるため、最終の絹製品でもセリシンは一部残した状態である。
【００１１】
繭糸は、カイコの後部絹糸腺で分泌されたフィブロインが、中部絹糸腺で分泌されたセリシンに被覆され、前部絹糸腺を通って吐糸されて作られる。従って、特許文献１に記載された組織の機能不全化技術などを利用してカイコの中部絹糸腺を機能不全化すれば、セリシンを全く含まないフィブロインのみからなる繭糸が作られるか、あるいは吐糸できないものと考えられる。また、仮に、このようなフィブロインのみからなる繭糸が得られたとしても、そのような繭糸は過精練したものと同様であり、製糸には利用できないと考えられる。
【００１２】
しかしながら、本発明者らが、カイコの中部絹糸腺を機能不全化したところ、驚くべきことに、フィブロインと、セリシン１からセリシン３の内のセリシン３のみをわずかに含む繭糸が作られることが分かった。このメカニズムは定かではないが、中部絹糸腺のうち、セリシン１及びセリシン２の合成・分泌に関しては機能不全化されたが、セリシン３の合成・分泌に関しては完全には機能不全化されなかったためと推定される。また、さらに驚くべきことに、この中部絹糸腺を機能不全化して得られた繭糸のアミノ酸組成は、生糸からセリシンをほぼ完全に除いた丸練の生糸のアミノ酸組成と酷似していることが分かった。
【００１３】
本発明の繭糸（以下、「高フィブロイン繭」とも称する）は、セリシンおよびフィブロインを含む繭糸であって、前記セリシンが実質的にセリシン３からなるものである。セリシンには、セリシン１、セリシン２、セリシン３、セリシン４が存在すると言われているが、セリシン４については、その実体は明らかにされていない。本明細書において、「実質的にセリシン３からなる」とは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）において、泳動用色素がゲルの泳動末端側に到達した後ゲルをＣＢＢ染色したときに、目視により、セリシン３のバンドの存在を確認でき、且つ、セリシン１及びセリシン２のバンドの存在を確認できないことをいう。具体的には、図１のようなバンドが例示される。
【００１４】
本発明の繭糸において、フィブロインは、変異を導入したフィブロインや、他のタンパク質を融合したフィブロインであってもよい。例えば、蛍光タンパク質と融合させたフィブロイン、抗体タンパク質と融合させたフィブロインなどが挙げられる。
【００１５】
本発明の繭糸は、セリシン１及びセリシン２を実質的に含まないことから、一般的な繭糸と比べると、繭糸におけるフィブロインの割合が多いものである。具体的には、本発明の繭糸はセリシン３をわずかに含むため繭糸がフィブリル化しないが、実施例のアミノ酸分析で丸練の生糸と酷似したアミノ酸組成を示す程度にセリシン含有量が少なくフィブロイン量が高い繭糸である。
【００１６】
本発明の繭糸は、製糸における煮繭工程や精練工程をより緩やかな条件とすることができ、取り扱い性に優れるものである。
【００１７】
本発明のカイコとしては、セリシンプロモーターと配列番号１の塩基配列とが作動可能に連結されたDNAを有する遺伝子組換えカイコが好適に例示される。より具体的には実施例に記載したカイコが例示されるが、本発明は本態様に限定されるものではない。他の任意の方法でセリシン１及びセリシン２をノックアウトしたカイコを産生して、本発明のカイコとすることもできる。
【００１８】
セリシンプロモーターは、中部絹糸腺で選択的に発現されるものであり、セリシンプロモーターとしては、Ser1プロモーターなどが挙げられる。本発明においては、中部絹糸腺で選択的に発現されるプロモーターであれば、どのようなプロモーターでもセリシンプロモーターの代わりに使用することができる。
【００１９】
配列番号１の塩基配列は、ピエリシン１ＡのＡＤＰリボシル化ドメインをコードする塩基配列であり、そのアミノ酸配列は配列番号２に示す。このピエリシン１Ａは、組織の機能不全化を起こすことができるものであり、本態様においてはセリシンプロモーターと共にカイコの中部絹糸腺を選択的に機能不全化させることができる。本発明においては、機能不全化を起こすことができるポリペプチドをコードする塩基配列であれば、どのようなポリペプチドでも配列番号１の代わりに使用することができる。
【００２０】
遺伝子組換えカイコは、カイコに所望のＤＮＡを導入したカイコであり、その導入方法として種々の方法があり、受精卵の場合は、顕微注入法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２１】
本発明のカイコは、本発明の繭糸を生成することができる。
【００２２】
本発明の繭糸の製造方法としては、本発明のカイコを生育して、繭糸を分離する工程を含む製造態様が好適に例示されるが、本発明は本態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例等に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
高フィブロイン繭を産生する遺伝子組換えカイコの作出
以下に示す方法により、高フィブロイン繭を産生する遺伝子組換えカイコを作出した。
【００２５】
高フィブロイン繭を産生する遺伝子組換えカイコの作出において使用したプライマーの詳細を以下に示す。
Ser1 F: AGCGGTCAGAAACCTTGTTAACC（配列番号３）
Ser1 R: GCTTTTACGCTGAGCGCAGCCAACGCAATC（配列番号４）
Ser1 F Kpn I: TTTGGTACCAGCGGTCAGAAACCTTGTTAACC（配列番号５）
Ser1 R BamHI: TTTGGATCCGTTGGCGGTCTTTGGATCGCTTG（配列番号６）
Ser 1F in fusion: GTATGGCTGACCTAGAGCGGTCAGAAACCTTGTTAACCAATAGAG（配列番号７）
polyA in fusion: GCCTAGTAGACCTAGCACGCGCTTGAAAGGAGTGTGTAAATGGAC（配列番号８）
piggyBack right ITR 1: GCGTGAGTCAAAAGACGCATGAT（配列番号９）
piggyBack right ITR 2: ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA（配列番号１０）
piggyBack left ITR 1: CCTCGATATACAGACCGATAAAACAC（配列番号１１）
piggyBack left ITR 2: AACTTTTATGGCGCGCCATCGAAT（配列番号１２）
【００２６】
１．ベクター構築
プライマーSer1 Fと Ser1 RをDDBJのAB007831の配列を元に合成した。これらを用いて、カイコw1-pnd系統のゲノム配列を鋳型にPCR法を実施し、Ser １の５’上流（AB007831翻訳開始コドンの1塩基目を塩基番号+1とした場合の-1196〜-1）までのDNA断片を増幅した。このDNA断片を鋳型に、プライマーSer1 F Kpn IとSer1 R BamHIを用いてPCR法を実施し、増幅したDNA断片を制限酵素Kpn IとBamHIで消化した。この断片を、非特許文献１に記載したpIZ-FibHPro-H1/P1A269/FLAG をKpnIとBamHIで消化して線状化したベクターに連結した。ベクターの中で連結されたSer1プロモーター（-1196〜-1）と、元のベクター由来のサイポウイルスH1およびC末端にFLAGをつけたピエリシン１A（P1A：アミノ酸番号2-269、この塩基配列は配列番号１）融合配列と、インビトロジェンpIZ/V5-His由来のpolyA付加シグナルの部分を、プライマーSer 1F in fusionとpolyA in fusionを用いてPCR増幅した。このDNA断片を、非特許文献１にて引用したpBacMCS[UAS-SV40, 3xP3-EGFP]のBln Iサイトにin fusion 法により挿入し、pBacMCS[Ser1pro-H1/P1A/FLAG, 3xP3-EGFP]を得た（図２）。
【００２７】
２．カイコガ卵へのDNAマイクロインジェクション法と形質転換カイコのスクリーニング
pBacMCS[Ser1pro-H1/P1A/FLAG, 3xP3-EGFP]をドナープラスミドとした。Tamuraらの方法（Tamura et al.,2007 JIBS）で産卵後3-8時間のw1-pndの卵の胚発生域に、200μg/μLのドナープラスミドとピギーバック発現用ヘルパープラスミドを含むリン酸緩衝液（pH7.0）を、フェムトジェット装置（エッペンドルフ社製）を用いて注入した（G0世代）。G0世代どうしの交配で得られるG1世代卵の中で、気管形成期以降に神経においてEGFPを発現している個体を選抜した。
【００２８】
３．染色体における転移配列の検出
選抜したEGFP陽性個体を交配し、得られる子孫の中で特に強いEGFP蛍光の形質を持ち、高フィブロイン繭を作る系統を選抜した（G2世代）。このG2系統の絹糸腺からゲノムDNAを抽出し、制限酵素Sau3AIにより一晩処理して得られるDNA断片をDNAリガーゼを用いて自己環状化させた。これを鋳型に、piggyBack right ITR 1: 5’とpiggyBack right ITR 2: 3’の組み合わせ、またはpiggyBack left ITR 1: 5’とpiggyBack left ITR 2: 3’の組み合わせでPCR法を行い、得られた断片の配列を決定することにより、それぞれ転移配列の5’ ITRおよび3’ ITR周辺のカイコ染色体由来配列を決定した。この結果、第22番染色体に確かに転移配列が挿入されていることを確認した。この系統について、マーカーのEGFP蛍光の強さからホモ系統を選抜して、以後同系交配を繰り返すことにより、高フィブロイン繭を作る遺伝子組換えカイコを作出した。
【００２９】
実施例１
上記で作出された遺伝子組換えカイコを人工飼料で生育し、熟蚕期に入った5齢幼虫を新聞紙に包み、室温で静置し、5日後に繭を回収して、実施例１の繭糸を得た。
【００３０】
高フィブロイン繭におけるセリシン３タンパク質バンドの検出
実施例１の繭糸について、タンパク質をSDS-PAGE（５〜２０％グラジエントゲル）で分離し、CBB染色液でゲルを染色した（図１）。図１の四角の白線枠内に検出されるタンパク質バンドのゲルを切り出した。ゲル断片の脱色・洗浄後トリプシン処理（35℃20時間）を行い、脱塩・濃縮後、LC-MS/MS分析を行った。HPLC（Easy-nLC 1200（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）による液体クロマトグラフィー）により分取されたペプチド試料を、質量分析装置（Q Exactive PLUS装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製））で分析した。この分析結果とNCBI ゲノムデータベースと対比させ、質量が該当するタンパク質を見出した。この結果、枠内のタンパク質として、セリシン３とフィブロイン重鎖が検出された。したがって、実施例１の繭糸は、フィブロインとセリシン３が含まれた繭であることが示された。
【００３１】
セリシン遺伝子の発現量解析（中部絹糸腺のqPCR）
野生型（w1-pnd系統）と高フィブロイン繭産生カイコ系統の中部絹糸腺を各日齢に摘出し、トライゾル法でRNAを抽出した。これをインビトロジェン社のSuperscript III one step RT-PCR system with platinum taqの酵素反応により、セリシン１（Ser 1）、セリシン２（Ser 2）、及びセリシン３（Ser 3）のmRNAの発現を解析した。リボソーム RNA量を用いてサンプルの標準化を行った。結果を図３〜５に示す。図３〜５の各日付において、左側が野生型（w1-pnd系統）における発現量を示し、右側が高フィブロイン繭産生カイコ系統における発現量を示す。図３〜５から分かるように、高フィブロイン繭産生カイコ系統において、セリシン１及びセリシン２は産生されておらず、一方、セリシン３は、発現していることがわかった。
【００３２】
セリシン遺伝子の発現量解析において使用したプライマーの詳細を以下に示す。
18S rRNA-1: CGATCCGCCGACGTTACTACA（配列番号１３）
18S rRNA-2: GTCGGGCCTGGTGGTGAGATTT（配列番号１４）
P1A269-1: CCATCTGGAAATGGTTTGG（配列番号１５）
P1A269-2: TGTATGGTGGTGCAGGTGAG（配列番号１６）
Ser1-F: CAAAGACCGCCAACATGCGT（配列番号１７）
Ser1-R: CACTGCTAGCTGCATTGTACTTTCG（配列番号１８）
Ser2-F: CGGCTGACTACCAAACCAAA（配列番号１９）
Ser2-R: CCGAGAGTTGCTGCCCTTAC（配列番号２０）
Ser3-F: CCAGAGCCAGTCATACAACAAAG（配列番号２１）
Ser3-R: TGTCGTCGGAATTCTACACCA（配列番号２２）
【００３３】
アミノ酸分析
実施例１の繭糸と、野生型（w1-pnd系統）が産生した繭糸を生糸（丸練）にしたものについて、6M 塩酸中で110℃、22時間の処理で得られるアミノ酸を、Shom-pack Amino-Na(島津製作所社製)装置とISC-30/S0504 Na アンモニウムトラップカラム（島津製作所社製）によるHPLCで分離し、溶出されたアミノ酸をアミノ酸分析キットOPA試薬（島津製作所社製）と反応させた後、分光蛍光検出器（島津製作所社製）により分析した。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
表１から分かるように、実施例１の繭糸のアミノ酸組成は、生糸（丸練）のアミノ酸組成と酷似していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の繭糸は、製糸分野において取り扱い性に優れる新たな性質の繭糸として有用なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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