(57)【要約】【課題】本発明は、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする、破骨細胞分化の抑制剤、閉経後骨粗鬆症予防・改善剤を提供することにある。【解決手段】本発明者らは、鋭意研究の結果、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸に破骨細胞分化を抑制する作用を見出し、本発明を完成するのに至った。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制剤。
【請求項２】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤。
【請求項３】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制作用を有するものであることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制用食品組成物。
【請求項４】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、閉経後骨粗鬆症の予防・改善作用を有するものであることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善用食品組成物。
【請求項５】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制されることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制剤。
【請求項６】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制されることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤。
【請求項７】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制され、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制作用を有するものであることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制用食品組成物。
【請求項８】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制され、閉経後骨粗鬆症の予防・改善作用を有するものであることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤および閉経後骨粗鬆症予防・改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は体を支える重要な器官であり、生命維持に必要なカルシウムなどの代謝器官でもある。骨は破骨細胞による骨の破壊と骨芽細胞による骨の形成のバランスにより恒常性が保たれており、そのバランスの崩壊が様々な骨の疾患の原因となる。骨の疾患に骨粗鬆症がある。骨粗鬆症は特発性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、退行性または老人性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症などに分類される。特発性骨粗鬆症は体内のホルモンやビタミンの量は正常で明らかな原因はないにもかかわらず、小児期や青年期に発症する。閉経後骨粗鬆症は、エストロゲンが減少し破骨細胞前駆体の動員および反応亢進をまねき、結果として骨吸収が増大する。退行性または老人性骨粗鬆症は、骨芽細胞の数の減少や活性低下と関連し、破骨細胞の活性亢進とは一次的に関連していない。カルシウムの吸収に必要なビタミンＤ合成の減少などが原因と考えられる。続発性骨粗鬆症は骨粗鬆症全体の５％未満とされており、その原因としては内分泌性疾患、薬物誘導などが挙げられる。
【０００３】
特に閉経後骨粗鬆症は高齢の女性に多い。破骨細胞前駆体の動員および反応亢進を招き、結果として骨吸収が増大する。
【０００４】
骨粗鬆症の予防、治療法としてはカルシウム、活性型ビタミンDの摂取、選択的エストロゲン受容体調整薬、ビスホスホネート、抗ＲＡＮＫＬ（Receptor activator of NF-κB ligand）抗体などの投与などが行われている。
【０００５】
さらに、ローヤルゼリーが骨芽細胞の分化マーカーであるプロコラーゲン１α１遺伝子の発現を高め、骨形成を促進させる作用も報告されている（特許文献１）。
また、ローヤルゼリーに含まれる１０−ヒドロキシ−２−デセン酸にエストロゲン作用を有することが知られている（特許文献２）。エストロゲン欠乏による骨粗鬆症の原因として、骨細胞などに由来するRANKLやOPG（オステオプロテゲリン）、Sema3Aがエストロゲンによって発現調節され、それらの適切な発現は骨量維持に関与するものと考えられるのに対し（非特許文献１）、本発明は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制されることによるもので作用機序はエストロゲン作用とは異なっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２９０８１３号公報
【特許文献２】特開２００６−６２９８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hayashi M, Nakashima T, Yoshimura N, Okamoto K, Tanaka S, Takayanagi H  Cell Metab. 29, 627-637, 2019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする、破骨細胞分化の抑制剤、閉経後骨粗鬆症予防・改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸に破骨細胞分化を抑制する作用を見出し、本発明を完成するのに至った。
すなわち、本発明は以下からなる：
１．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制剤。
２．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤。
３．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制作用を有するものであることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制用食品組成物。
４．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、閉経後骨粗鬆症の予防・改善作用を有するものであることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善用食品組成物。
５．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制されることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制剤。
６．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制されることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤。
７．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制され、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制作用を有するものであることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制用食品組成物。
８．  １０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞のFFAR4に直接的に結合することで、NF-κBシグナルの活性化が抑制され、閉経後骨粗鬆症の予防・改善作用を有するものであることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善用食品組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、破骨細胞分化を抑制することにより、破骨細胞分化抑制剤、さらには閉経後骨粗鬆症予防・改善剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は卵巣摘出閉経後骨粗鬆症モデルマウスを用いて生ローヤルゼリーを経口ゾンデにて投与したμCT解析の結果を示す図である。
【図２】図２はHPLCによる生ローヤルゼリーから得られた精製画分の確認を示す図である。
【図３】図３はHPLCによる１０−ヒドロキシ−２−デセン酸の確認を示す図である。
【図４】図４はLC/MS分析の結果を示す図である。
【図５】図５はLC/MS分析の結果を示す図である。
【図６】図６はLC/MS分析の結果を示す図である。
【図７】図７はローヤルゼリー（ＲＪ）と１０−ヒドロキシ−２−デセン酸（１０Ｈ２ＤＡ）の破骨細胞分化抑制活性の比較を示す図である。
【図８】図８はFfar1、Ffar2、Ffar3、Ffar4、Gpr84のmRNAの発現を相対的に示す図である。
【図９】図９はレーポーターアッセイにおいて、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が濃度依存的にFfar4を活性化する結果を示す図である。
【図１０】図１０はFfar4をノックダウンしたときの破骨細胞分化を検討した結果を示す図である。
【図１１】図１１は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸の影響をWestern Blotによる分析の結果により示す図である。
【図１２】図１２はFfar4をノックダウンしたときの１０−ヒドロキシ−２−デセン酸の影響をWestern Blotによる分析の結果により示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、破骨細胞分化を抑制する関与成分として１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を見出した。さらに、閉経後骨粗鬆症は、破骨細胞前駆体の動員および反応亢進をまねき、結果として骨吸収が増大することで引き起こされる。そこで、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化を抑制することで、閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤としても用いることができる。
【００１３】
本発明の一態様は、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制剤に関する。本明細書において、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制を単に破骨細胞分化抑制ともいう。
本発明の別の態様は、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とする閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤に関する。
本発明の一態様は、食品組成物に関し、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制作用を有するものであることを特徴とする、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制用食品組成物に関する。また、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とし、閉経後骨粗鬆症の予防・改善作用を有するものであることを特徴とする、閉経後骨粗鬆症の予防・改善用食品組成物に関する。
【００１４】
本発明の剤は、有効成分である１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。
【００１５】
薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられる。具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加剤を用いてもよい。
【００１６】
薬理学的に許容される添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニトール、ソルビトール、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルメロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム-グリコール-スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン酸二アンモニウム、グリシン、オレンジ油等の矯味剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポビドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の剤の投与対象は、通常哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）である。
【００１８】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸はローヤルゼリー特有の成分であり、他の食品には存在しないことが知られている。ローヤルゼリーは若い働き蜂の咽頭腺により分泌される乳白色のペースト状物質であり、その成分は必須アミノ酸をはじめとするアミノ酸が豊富に含まれ良質なタンパク質を構成している。さらに、ビタミン類、ミネラル類、炭水化物などの微量成分を含んでいる。例えばビタミン類ではビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥなどが挙げられる。ミネラル類ではカリウム、マグネシウム、カルシウム、銅、鉄、リンなどがあげられる。炭水化物ではブドウ糖、果糖などが挙げられる。さらに、アセチルコリン様物質、有機酸、脂肪酸などが含まれている。
【００１９】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸は、その由来や製法に制限はなく、天然物であってもよく合成品であってもよい。さらに、分画などにより部分精製したものや高度に精製したものを使用してもよい。天然物としてはローヤルゼリーを用いることができ、生ローヤルゼリー、乾燥ローヤルゼリー、調整ローヤルゼリーなどを挙げることができる。また、ローヤルゼリーの原産国は例えば日本、中国、台湾、タイ、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカなどを挙げることができ、いずれの原産国のローヤルゼリーを用いてもよい。また、複数の原産国のローヤルゼリーを適宜混合して用いてもよい。
【００２０】
さらに、ローヤルゼリーは加熱、遠心分離、アルコール抽出、ろ過などの加工を行ったものであってもよい。
【００２１】
さらに、各種クロマトグラフィーを用いて１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を精製してもよい。精製方法としてはゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過などを挙げることができ、これら単独若しくは組み合わせることにより精製を行うことも可能である。
【００２２】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、種々な分子量のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体があり、分子量が約１万以下のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体が好ましい。イオン交換クロマトグラフィーに用いられているイオン交換基としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体などがあり、陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）などを例示することができる。また、陽イオン交換体としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基を例示することができる。疎水クロマトグラフィーに用いられる担体としてはブチル基（Ｂｕｔｙｌ基）、エチル基（Ｅｔｈｙｌ基）、フェニル基（Ｐｈｅｎｙｌ基）が結合した担体を例示することができる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としとはオクタデシル基（Ｃ１８）、オクタデシル基とはアルキル基の長さが異なるＣ３０、Ｃ８、Ｃ４などが結合した担体が例示される。順相クロマトグラフィーに用いられる担体としてはシリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミンなどが結合した担体が例示される。
【００２３】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸は塩であってもよく、その塩として、例えばナトリウム塩、カリウム塩及びマグネシウム塩等の金属塩並びにモノメチルアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩などを挙げることができる。
【００２４】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸に各種成分を添加することも可能である。各種成分としては、例えば糖、脂質、乳化剤、増粘剤、調味料、香料、酸味調整剤、保存料、果汁、香料、各種栄養成分などが挙げられ、本発明の効果を損なわない範囲で使用することができる。また、各種成分は単独で用いても良いし二種以上を混合して用いてもよい。例えば糖としては、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等を例示することができる。乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等を例示することができる。増粘剤としてはカラギーナン、アラビアガム、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム増粘剤澱粉、ジェランガム等を例示することができる。酸味調整剤としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、酒石酸等を例示することができる。保存料としては、安息香酸及びその塩、ソルビン酸及びその塩、パラベン、亜硫酸ナトリウム、ペクチン分解物、グリシン等を例示することができる。果汁としては、トマト果汁、梅果汁、リンゴ果汁、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等を例示することができる。香料としては、ハーブ、スパイスなどの香辛料、フルーツ系香料、バニラなどの香料等を例示することができる。この他、好ましい他の栄養成分として、ビタミンＤ等のビタミン類やカルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類等が挙げられる。
【００２５】
本発明の破骨細胞分化抑制剤または閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤は食品、医薬品として供することもできる。食品の具体的形態としては、例えば、飲料類、菓子、キャンディ、ガム、パン、畜肉製品、乳製品、レトルト食品、即席食品、冷凍食品、ゼリー状食品、養蜂産品、漬物、調味料等を挙げることができる。これらの食品は、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメントなどとしても有用である。また、それらの食品としての形状としては、顆粒、粉末、タブレット、カプセル、チュアブル、ドリンク、ゼリー、ペースト、粒などを挙げることができる。
【００２６】
医薬品の具体的形態としては、粉末、錠剤、顆粒剤、丸剤、散剤、カプセル、液状、シロップ、ペースト、乳液などを挙げることができる。
【００２７】
また、本発明の破骨細胞分化抑制剤または閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤は、カルシウム、ビタミンD、エストロゲン等と一緒に摂ってもよい。
【実施例】
【００２８】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２９】
(破骨細胞分化抑制活性の測定法)
破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制活性測定は以下に示す方法で行った。
【００３０】
メスのC57BL/6Jの大腿骨と脛骨より骨髄細胞を採取し、10 ng/mlのM-CSF（Macrophage-colonystimulating factor）及び10% ウシ胎児血清を加えたaMEM(mMinimumessential medium, a modification)培地で2日培養し、骨髄由来単球マクロファージ前駆細胞(BMM;Bone mallow-derived monocyte/macrophage precursor cells)を作成した。これらの細胞にRANKLを12.5~50ng/mlになるように加えた培地にて３日間培養し、破骨細胞分化を行なった（破骨細胞分化培養）。なお、添加するRANKLは骨髄由来単球マクロファージ前駆細胞の分化の状態により12.5~50ng/mlの間で適宜調整した。被験物質はRANKLと同時に添加した。得られた細胞はPBSで洗浄後4%パラホルムアルデヒドにて15分間室温にて固定を行った。その後アセトン(50%)エタノール(50%)溶液を加え30秒静置した。TRAP（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）染色溶液(NaphatolAS-MX phosphate 0.1 mg/ml、N,N-Dimetylformamide 10 ml/ml、Fast redviolet LB salt 0.6 mg/ml、 TRAP Buffer(酢酸Na 5.44 g/l、酒石酸Na 10.5 g/l))で５分間静置し、TRAP染色を行なった。３核以上の細胞を破骨細細胞とし、一視野当たり３核以上の破骨細細胞数をカウントし破骨細胞分化抑制活性の評価を行なった。
【００３１】
（ローヤルゼリーの破骨細胞分化抑制活性の測定法）
生ローヤルゼリーについて以下に示す方法により、被験物質を作成し、破骨細胞分化抑制活性の測定を行った。DMSOジメチルスルホキシドに生ローヤルゼリーを溶解し、濃度200 mg/mlの溶液を得た。さらに遠心分離を行い固形成分を沈殿させ、上清を採取した。上清をAcrodisc DMSO safe filter(PALL)にて濾過滅菌を行い被験物質として、破骨細胞分化抑制活性の測定を行った。その結果、ローヤルゼリーについて破骨細胞分化抑制活性が確認された。
【００３２】
（動物試験）
骨におけるローヤルゼリーの作用を調べるために、卵巣摘出閉経後骨粗鬆症モデルマウスを用いて実験を行なった。具体的には、9週齢のC57BL/6Jマウスのメスに対して卵巣摘出（OVX）またはSham手術を行い、コントロール群には生理食塩水、テスト群には1.0 g/kg body weight体重の生ローヤルゼリーを経口ゾンデにて毎日投与した。４週間後にマウスを安楽殺し、大腿骨はμCT解析、脛骨は骨形態計測解析を行なった。μCT解析の結果より、OVX群よりも生ローヤルゼリー投与OVX群で骨量の減少が抑制された画像が得られた。骨量（Bone volume/Ttissuevolume (BV/TV)）はOVX群に対し生ローヤルゼリー投与OVX群では減少の抑制が認められた（図１）。また、海綿骨の指標である骨梁数TrabecularNumber(Tb. N)はOVXにより減少したが生ローヤルゼリー投与OVX群では減少の抑制が認められた。また、TrabecularSeparation(Tb. Sep)骨梁間隔とTrabecularSpacing (Tb. Spa)骨梁中心距離はOVX群ではSham群と比較して増加したが生ローヤルゼリー投与OVX群では増加の抑制が認められた。また、骨形態計測解析より、OsteoclastNumber/Bonesurface (N.Oc/BS) 破骨細胞数は生ローヤルゼリー投与OVX群、OVX群と比較して有意に減少しており、OsteoclastSurface/BoneSurface (Oc.S/BS),破骨細胞面、浸食面Eroded  Surface/Bone Surface (ES/BS)も同様の傾向が認められた。また、骨形成速度や骨芽細胞面BoneFormation Rate(BFR),Osteoblast Surface/Bone Surface (Ob.S/BS)などの骨芽細胞関連パラメータについては有意な変化は見られなかった。
【００３３】
以上のことから、ローヤルゼリーは破骨細胞分化もしくは機能を抑制し、OVXによる骨量の減少を抑制する効果を持つことが示唆された。
【００３４】
（ローヤルゼリーからの関与成分の分離・同定）
ローヤルゼリーに破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制活性及び卵巣摘出マウスによる骨量の減少を抑制する効果が確認されたので、ローヤルゼリーから破骨細胞分化抑制活性を示す関与成分の分離、同定を行った。
【００３５】
生ローヤルゼリーに４倍量のメタノールを加え撹拌後、−２０℃で一晩放置した。一晩放置後、９，２００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清（Ａ）と沈殿物を得た。沈殿物にさらに同量のメタノールを加え、撹拌後、−２０℃で２時間放置した。２時間放置後、９，２００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清（Ｂ）と沈殿物を得た。上清（Ａ）と上清（Ｂ）を混合し、孔径０．４５μｍのフィルター（50CP045AS  アドバンテック東洋）でろ過を行い、脱タンパク質画分とした。脱タンパク質画分をロータリーエバポレータ―により溶媒及び水を飛ばした後、残留物を酢酸エチル及び精製水で溶解し、該酢酸エチル及び該精製水で分液を行った。酢酸エチル層に破骨細胞分化抑制活性が確認されたので、酢酸エチル層をプールした。酢酸エチル層をロータリーエバポレータ―により溶媒を飛ばした後、残留物をクロロホルムで溶解し、クロロホルムで平衡化したシリカゲルカラム（ID20×200mm シリカゲル60  63−200μｍ メルク）にアプライした。クロロホルムで洗浄後、１０％メタノールを含有するクロロホルムで分画し、破骨細胞分化抑制活性が確認された画分をプールし、シリカゲル画分とした。シリカゲル画分をロータリーエバポレータ―により溶媒を飛ばした後、残留物をメタノールで溶解し、精製水でメタノール濃度が５０％になるように調整し、５０％メタノールで平衡化したBiotage SNAPS 30g Column Ultra C18（Biotage）にアプライした。５０％メタノールで分画し、破骨細胞分化抑制活性が確認された画分をプールし、SNAPS画分とした。SNAPS画分をロータリーエバポレータ―により溶媒及び水を飛ばした後、残留物をメタノールで溶解し、精製水でメタノール濃度が４０％になるように調整し、４０％メタノールで平衡化したCOSMOSIL Packed Column 5C18−AR−II（10ID×250mm ナカライテスク）にアプライした。４０％メタノールで分画し、破骨細胞分化抑制活性が確認された画分をプールし、ＡＲＩＩ画分とした。ＡＲＩＩ画分をエバポレータ及び吹付式試験管濃縮装置で蒸発乾固させたものを精製画分とした。
【００３６】
HPLCによる精製画分の確認
HPLC (High Performance liquid chromatography)による分析
精製画分及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸をそれぞれメタノールで溶解し、Chromasterシステム（日立ハイテクサイエンス）で制御するCOSMOSILPacked Column5C18-AR-II(4.6ID×150mm)で分析を行った。溶出溶媒は5.9mmo/L H3PO4及び5.0mmol/L NaH2PO4を含む50%メタノールを用いてイソクラティックにより分析を行った。カラム温度は40℃に維持した。カラム流出物は、210nmで検出した。その結果、精製画分及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸の保持時間が6.5分とほぼ一致し、精製画分は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸と推定された（図２、３）。
【００３７】
LC/MS分析
精製画分は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸と推定されたので、精製画分及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸をそれぞれメタノールで溶解し、LC/MSにより比較を行った。LC/MS分析はAcquity UPLCシステム（Waters） 及びXevo QTof MSシステム（Waters）を用いて行った。Acquity UPLC HSST3カラム（2.1ID×100mm 1.8μm,Waters）をAcquity UPLCシステムで制御した。溶出溶媒は（Ａ）0.1%酢酸、（Ｂ）メタノールとした。分離はA99.5%・B0.5%からA0%・B100%の20分間の直線濃度勾配、次に、B100%を5分間維持することにより行った。流速は0.4mL/minに制御し、カラム温度は40℃に維持した。
【００３８】
Xevo QTof MSシステムによる質量分析は以下の条件で行った;
モード: ネガィブモード
イオン化法: ESI, Capillary voltage: 3.0KV
Cone voltage: 15V
質量範囲: m/z 50〜1000
【００３９】
LC/MS分析の結果、精製画分及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸について保持時間が10.7分にそれぞれ単一のピークが確認された（図４）。さらに、保持時間10.7分のMSスペクトルを確認したところ、m/z185.11と質量も一致していることが確認された（図５）。さらに、m/z185.11についてコリジョンエネルギーを10〜25eVに変化させ、生成したフラグメントを積算して比較を行ったところフラクメンテーションパターンが精製画分と１０−ヒドロキシ−２−デセン酸で一致し（図６）、精製画分は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸と推定された。
【００４０】
（ローヤルゼリーと１０−ヒドロキシ−２−デセン酸の破骨細胞分化抑制活性の比較）
生ローヤルゼリーをメタノールで0.25mg/mL、0.5mg/mLになるように調製し、遠心分離を行い上清を得た。その時の上清の１０−ヒドロキシ−２−デセン酸濃度は、それぞれ25μM、50μMであったので１０−ヒドロキシ−２−デセン酸をメタノールで溶解し、25μM、50μMになるように調製し、破骨細胞分化抑制活性を比較した。その結果、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸と生ローヤルゼリーの破骨細胞分化抑制活性はほぼ同じであり、生ローヤルゼリーに含まれる関与成分の主成分は１０−ヒドロキシ−２−デセン酸と推定された（図７）。
【００４１】
（１０−ヒドロキシ−２−デセン酸のレセプターの検討）
本実施例に示す(破骨細胞分化抑制活性の測定方法)に従い、骨髄由来単球マクロファージ前駆細胞(BMM)及び破骨細胞(Osteoclast)を得た。
【００４２】
BMM、Osteoclastについて以下に示す方法により、RT-PCR(リアルタイム-PCR)を行ったところ、図８に示すようにFfar1、Ffar2、Ffar3、Gpr84のmRNAの発現はBMMと比較して減少していたが、Ffar4のmRNAの発現は増加しており、FFAR4は10-ヒドロキシ-2-デセン酸のレセプターとして機能する可能性が導かれた。
【００４３】
なお、RT-PCRは以下の方法により測定を行った。
BMM、OsteoclastについてNIPPON GENE社のISOGENを用いてRNAを抽出し、抽出された0.5 μgのtotalRNAをThermo Fisher Scientific社のSuperscriptIII reverse transcriptaseを用いてcDNAの合成を行った。次にcDNAについてリアルタイムPCR解析システムとしてBio-Rad社のCFX384 Touch、リアルタイムPCR用試薬としてTOYOBO社のSYBR Green Realtime PCR Master Mixを用いてRT-PCRを行った。なお、プライマーは表１に示すものを用い、Gapdhを用いて補正を行った。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸のFFAR4を介した作用を調べるために、FFAR4 (GPR120) Reporter Assay Kit (Cayman Chemical)を用いて、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸とFFAR4との親和性を検討した。その結果、図９に示すように１０−ヒドロキシ−２−デセン酸との親和性が確認され、EC50は1.025mMであった。なお、FFAR4 (GPR120) Reporter Assay Kitは添付のマニュアルに従い操作を行った。
【００４６】
製品プロトコールに従ってレンチウイルスベクターを作成し、BMMsに24時間感染させた後、RANKLと１０−ヒドロキシ−２−デセン酸で刺激を行い、Ffar4をターゲットとしたshRNA(短鎖ヘアピンRNA)レンチウイルスベクターによりノックダウンを行った(Kim Y, Hayashi M, Ono T, Yoda T, Takayanagi H, Nakashima T., Mod Rheumatol. 2020 Jan;30(1):85-92.)。その際のノックダウン効率は9割程度であった。
図１０に示すようにFfar4をノックダウンしていないControlでは１０−ヒドロキシ−２−デセン酸により、破骨細胞分化は抑制されているのに対し、Ffrar4をノックダウンしたshFfar4では１０−ヒドロキシ−２−デセン酸により、破骨細胞分化は抑制されなかった。これらの結果より、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸のレセプターはFFAR4と推定された。
【００４７】
１０−ヒドロキシ−２−デセン酸の存在・非存在下で破骨細胞分化培養を行い、血清スタベーションを6時間行った後、RANKL・１０−ヒドロキシ−２−デセン酸刺激を行った。その際、0、5、20分で細胞を採取し、Western Blot分析を行った。その結果、図１１に示すようにControl（１０−ヒドロキシ−２−デセン酸非存在下）ではIκBαのバンドはしだいに薄くなりIκBαは分解され、１０Ｈ２ＤＡ（１０−ヒドロキシ−２−デセン酸存在下）ではIκBαのバンドの変化はなく、IκBαは分解されていないものと考えられた。
【００４８】
なお、Western Blot分析は以下の方法により行った。
得られた細胞は冷PBSで洗浄し、Roche Bioscience社のComplete protease inhibitor cocktailを含むリシスバッファー及びRoche Bioscience社のPhosSTOPを用いて氷上で10分反応させ細胞の溶解を行った。溶解物は15,000rpm・10分遠心分離を行い清浄化した。抽出されたタンパク質はSDS-PAGEを行い、PVDF膜(Millipore)に転写した。転写されたPVDF膜はBlocking One P またはBullet Blocking One(ナカライテスク)でブロッキングを行い室温で2時間一次抗体と反応させ続いて2次抗体と反応させた。バンドはChemi-Lumi One Ultra(ナカライテスク)で可視化を行った。なお、一次抗体についてphospho-IκBα(p-IκBα)、IκBαに対する抗体はCell Signaling Technology、β-actinに対する抗体はSigma-Aldrichより購入した。
コントロール(TurboGFP positive control vector)、ノックダウンベクター(shFfar4)をBMMsにそれぞれ24時間感染させた後、破骨細胞分化培養を行った。血清スタベーションを6時間行った後、RANKL・１０−ヒドロキシ−２−デセン酸刺激を行った。その際、0、5、20分で細胞を採取し、Western Blot分析を行った。その結果、コントロールではIκBαのバンドの変化はなく、IκBαは分解されていないものと考えられた。一方、ノックダウンベクター(shFfar4)はIκBαのバンドは薄くなりIκBαは分解されているもの考えられた。なお、Western Blot分析は本段落に示す方法と同様に行った。
【００４９】
（作用機序の考察）
RANKL による破骨細胞分化の調節はRANKにRANKLが結合するとIKK複合体が活性化され、活性化したIKK複合体により、IκBαがリン酸化・分解されることでNF-κBは核内に移行し、破骨細胞分化が誘導される。一方、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸がFFAR4に結合するとIKK複合体の活性化が抑制され、IκBαのリン酸化・分解が抑えられた。また、Ffar4のノックダウンを行なったshFfar4群では１０−ヒドロキシ−２−デセン酸によるIκBαのリン酸化・分解の抑制が減弱した。このことから１０−ヒドロキシ−２−デセン酸はNF-κB経路を抑制することにより、破骨細胞分化抑制がなされると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化抑制剤、閉経後骨粗鬆症の予防・改善剤を提供することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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