(57)【要約】【課題】単一エクソソームのＲＮＡを解析可能なＲＮＡ解析方法を提供する。【解決手段】（ａ）エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別する前記エクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する工程と、（ｂ）前記核酸の配列を解析する工程と、を含む、ＲＮＡの解析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する工程と、
（ｂ）前記核酸の配列を解析する工程と、
を含む、ＲＮＡの解析方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ識別配列が、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側のいずれか一方に位置する、請求項１に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ識別配列が、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側の両方に位置する、請求項１に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）が、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を結合させる工程と、
前記第１のアダプター核酸に、前記ＲＮＡを結合させる工程と、
前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる工程と、を含み、
前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方が、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する、
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項５】
前記第２のアダプター核酸が、前記ＲＮＡの５’末端側に結合される請求項４に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項６】
前記第１のアダプター核酸が、第１の前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する、請求項４又は５に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項７】
前記第２のアダプター核酸が、第２の前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する、請求項４から請求項６のいずれか一項に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）が、さらに、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記第１のＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、
を含む、請求項６に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）が、さらに、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記第２のＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、
を含む、請求項７に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）が、さらに、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記第１のＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記第２のＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、
を含む、請求項７に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項１１】
前記第１のアダプター核酸と前記ＲＮＡとの結合が、前記第１のアダプター核酸の５’末端と前記ＲＮＡの３’末端とを結合するものであり、前記第１のアダプター核酸の５’末端がアデニル化されている、請求項４から請求項１０のいずれか一項に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項１２】
前記エクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを捕捉するＲＮＡ捕捉配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記ＲＮＡ捕捉配列を介して、前記ＲＮＡを結合させる工程と、
前記ＲＮＡに、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する核酸を結合させる工程と、を含む、
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）が、さらに、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、
を含む、請求項１２に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）が、さらに、
担体に結合させた第３のアダプター核酸に、前記エクソソーム識別核酸を結合させて、前記担体上で前記エクソソーム識別核酸を増幅する工程を含み、
前記エクソソーム識別核酸は、前記第３のアダプター核酸の少なくとも一部に相補的な第２の相補配列をさらに有し、前記第２の相補配列を介して、前記第３のアダプター核酸に結合する、
請求項４から請求項１３のいずれか一項に記載のＲＮＡの解析方法。
【請求項１５】
エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸の作製方法であって、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を結合させる工程と、
前記第１のアダプター核酸に、前記ＲＮＡを結合させる工程と、
前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる工程と、を含み、
前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方が、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する、
核酸の作製方法。
【請求項１６】
エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸の作製方法であって、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡを捕捉するＲＮＡ捕捉配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記ＲＮＡ捕捉配列を介して、前記ＲＮＡを結合させる工程と、
前記ＲＮＡに、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する核酸を結合させる工程と、を含む、
核酸の作製方法。
【請求項１７】
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、
をさらに含む、請求項１５または請求項１６に記載の核酸の作製方法。
【請求項１８】
エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、
を備える核酸。
【請求項１９】
前記ＲＮＡ識別配列が、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側のいずれか一方に位置する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
前記ＲＮＡ識別配列が、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側の両方に位置する、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸の５’末端および３’末端の少なくとも一方に、さらに任意の配列を含む、請求項１８から請求項２０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２２】
エクソソームを識別するエクソソーム識別配列またはその相補配列を有するエクソソーム識別核酸と、
前記エクソソームに由来する個々のＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有するアダプター核酸と、
１個の液滴内に１個の担体と１個の前記エクソソームとを封入させる流路を有する流体デバイスと、
を備える、キット。
【請求項２３】
前記エクソソーム識別核酸の前記エクソソーム識別配列もしくはその相補配列、前記エクソソーム識別核酸に結合された前記ＲＮＡの配列もしくはその相補配列、および前記エクソソーム識別核酸もしくは前記ＲＮＡに結合された前記アダプター核酸の前記ＲＮＡ識別配列もしくはその相補配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット、
をさらに備える、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記キットが、第１のアダプター核酸と、第２のアダプター核酸と、を備え、
前記エクソソーム識別核酸が、さらに第１の相補配列を有し、
前記第１のアダプター核酸が、前記第１の相補配列に相補的な配列を有し、
前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方が、前記ＲＮＡ識別配列を有する、
請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記第１のアダプター核酸の５’末端がアデニル化されている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、および界面活性剤からなる群より選択される、少なくとも１種をさらに備える、請求項２２から請求項２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する核酸作製部と、
前記核酸の配列を解析する配列解析部と、
を備える、ＲＮＡ解析システム。
【請求項２８】
前記核酸作製部が、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列と第２の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸を１分子と、前記第２の相補配列に相補的な配列を有する第３のアダプター核酸を結合させた担体を１個と、プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、を１個の液滴内に封入する、第１の油中液滴作製部と、
前記エクソソーム識別核酸を、前記第２の相補配列を介して前記第３のアダプター核酸に結合させて、前記担体上で、前記エクソソーム識別核酸を増幅する、第１の核酸増幅部と、
前記担体上で増幅した前記エクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を、前記第１の相補配列を介して結合させる、第１のアダプター核酸結合部と、
前記第１のアダプター核酸を結合させた前記担体を１個と、前記エクソソームを１個と、ＲＮＡリガーゼと、界面活性剤と、を１個の液滴内に封入する、第２の油中液滴作製部と、
前記界面活性剤で前記エクソソームを破壊し、前記第１のアダプター核酸に、前記エクソソームから放出されたＲＮＡを結合させる、ＲＮＡ結合部と、
前記第１のアダプター核酸に結合させた前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる、第２のアダプター核酸結合部と、
前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する、第２の核酸増幅部と、
を備え、
前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方が、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する、
請求項２７に記載のＲＮＡ解析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの解析方法、核酸の作製方法、核酸、キット、およびＲＮＡ解析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
血中には様々な臓器（細胞種）から放出されたエクソソームが混在し、それぞれにｍｉＲＮＡが内包されているため、がん細胞から放出されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡのみを選択的に測定することができれば、高精度にがんの診断ができる可能性がある。
がん特異的なエクソソーム中のｍｉＲＮＡを定量する方法として、がん細胞の細胞膜上に特異的に発現する抗原を指標にエクソソームを収集し、内包されるｍｉＲＮＡを定量する方法が考えられている（特許文献１）。しかしながら、この方法では、一度の選別で基本的には１種類の抗原を指標として分離するため精度が低く、対象エクソソーム上の複数の抗原を指標にエクソソームを分離するには、その種類に応じて何度も選別作業を繰り返すことが必要となり、多くの時間と費用を要する。ここで、もしエクソソーム１個に内包されるｍｉＲＮＡの種類と量とを効率よく定量する手法が確立できれば、がん細胞由来のエクソソームに特有なｍｉＲＮＡプロファイルを持つエクソソームの数をカウントすることで、がんの有無や進行度、原発がんの種類を、高精度に診断できると期待される。
また、エクソソームには、ｍｉＲＮＡ以外にも、ｍＲＮＡ等の各種ＲＮＡ分子が内包されており、エクソソーム１個に内包されるこれらのＲＮＡの種類と量を解析することで、疾患診断等に有用な情報を得られる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０９９９２５号
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施態様は、（ａ）エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する工程と、（ｂ）前記核酸の配列を解析する工程と、を含む、ＲＮＡの解析方法である。
【０００５】
本発明の一実施態様は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸の作製方法であって、前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を結合させる工程と、前記第１のアダプター核酸に、前記ＲＮＡを結合させる工程と、前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる工程と、を含み、前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方が、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する、核酸の作製方法である。
【０００６】
本発明の一実施態様は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸の作製方法であって、前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡを捕捉するＲＮＡ捕捉配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記ＲＮＡ捕捉配列を介して、前記ＲＮＡを結合させる工程と、前記ＲＮＡに、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する核酸を結合させる工程と、を含む、核酸の作製方法である。
【０００７】
本発明の一実施態様は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡが由来する前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸である。
【０００８】
また、本発明の一実施態様は、エクソソームを識別するエクソソーム識別配列またはその相補配列を有するエクソソーム識別核酸と、前記エクソソームに由来する個々のＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有するアダプター核酸と、１個の液滴内に１個の担体と１個のエクソソームとを封入させる流路を有する流体デバイスと、を備える、キットである。
【０００９】
また、本発明の一実施態様は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する核酸作製部と、前記核酸の配列を解析する配列解析部と、を備える、ＲＮＡ解析システムである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図３】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図４】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図５】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図６】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図７】本発明の一実施態様にかかる核酸の一例を示す。
【図８】本発明の一実施態様にかかる核酸の一例を示す。
【図９】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図１０】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図１１】本発明の一実施態様にかかる核酸の一例を示す。
【図１２】本発明の一実施態様にかかる核酸の一例を示す。
【図１３】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図１４】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図１５】本発明の一実施態様にかかる核酸の一例を示す。
【図１６】本発明の一実施態様にかかる核酸の一例を示す。
【図１７】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図１８】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図１９】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２０】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２１】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２２】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２３】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２４】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２５】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡの解析方法の工程の一例を示す。
【図２６】本発明の一実施態様にかかるキットが備える流体デバイスの一例を示す。
【図２７】本発明の一実施態様にかかるキットが備える流体デバイスの一例を示す。
【図２８】本発明の一実施態様にかかるＲＮＡ解析システムの構成例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１２】
［ＲＮＡの解析方法］
一実施態様において、本発明は、（ａ）エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する工程と、（ｂ）前記核酸の配列を解析する工程と、を含む、ＲＮＡの解析方法を提供する。
【００１３】
本実施態様にかかるＲＮＡの解析方法は、エクソソームが内包するＲＮＡを解析するために用いることができる。本実施態様にかかるＲＮＡの解析方法によれば、エクソソームに内包されるＲＮＡを、エクソソーム毎に識別して、解析を行うことができる。本実施態様にかかるＲＮＡの解析方法は、例えば、血液試料中のエクソソームが内包するＲＮＡの解析に用いることができる。
本実施態様にかかるＲＮＡの解析方法により解析されるＲＮＡは、エクソソームに内包されるＲＮＡであれば、特に限定されず、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。一例として、ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。
【００１４】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する工程である。
【００１５】
「エクソソームに由来するＲＮＡ」とは、エクソソームに内包されていたＲＮＡをいう。エクソソームは、ｍｉＲＮＡ等の多数のＲＮＡ分子を内包している。「エクソソームに由来するＲＮＡ」は、エクソソームに内包されていた多数のＲＮＡ分子中の１分子のＲＮＡである。「エクソソームに由来するＲＮＡの配列」とは、エクソソームに内包されていたＲＮＡ１分子の配列をいう。本明細書において、「ＲＮＡの配列」と表記する場合、「エクソソームに由来するＲＮＡの配列」を指す。ＲＮＡの配列の相補配列とは、エクソソームに由来するＲＮＡの配列に相補的な配列をいう。「ＲＮＡの配列またはその相補配列」とは、エクソソームに由来する１分子のＲＮＡの配列および前記１分子のＲＮＡの相補配列のいずれかをいう。
「ＲＮＡが由来するエクソソーム」とは、前記ＲＮＡが内包されていたエクソソームをいう。
なお、本明細書において、核酸の構成要素を指す場合には、前記「エクソソームに由来するＲＮＡ」と区別するために、「リボ核酸」と表記する。
【００１６】
「エクソソーム識別配列」は、ＲＮＡが由来するエクソソームを識別するための配列である。エクソソーム識別配列は、原則として、エクソソームと１：１で対応している。したがって、同じエクソソームに由来するＲＮＡは、同じエクソソーム識別配列を有する。本工程で作製される核酸が、エクソソーム識別配列を有することにより、前記ＲＮＡが由来するエクソソーム毎に、核酸をグルーピングすることができる。
本明細書において、「原則として」と記載する場合、一部の例外を含み得ることを意味する。例えば、「原則として」と記載する場合、０〜５％程度の例外を含み得る。
【００１７】
「ＲＮＡ識別配列」は、前記ＲＮＡを１分子毎に識別するための配列（例、塩基配列）である。ＲＮＡ識別配列は、原則として、識別するＲＮＡ１分子と１：１で対応している。本工程で作製される核酸が、ＲＮＡ識別配列を有することにより、後述の工程（ｂ）において配列解析を行う際に、ＰＣＲ等により核酸を増幅した場合であっても、増幅効率等の違い等により生じる核酸存在量のずれをＲＮＡ識別配列に基づき補正することができる。
ＲＮＡ識別配列は、本工程で作製される核酸において、ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側のいずれに位置していてもよい。また、本工程で作製される核酸は、ＲＮＡ識別配列を１個有していてもよく、２個以上有していてもよい。核酸が、２個以上のＲＮＡ識別配列を有する場合、ＲＮＡ識別配列は、ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側の両方に位置していてもよい。例えば、ＲＮＡ識別配列を２個有する場合は、上記核酸は、第１のＲＮＡ識別配列と第２のＲＮＡ識別配列とを備える。
一例として、ＲＮＡ識別配列は、ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側に位置する。一例として、ＲＮＡ識別配列は、ＲＮＡの３’末端側に位置する。一例として、ＲＮＡ識別配列は、ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端側および３’末端側の両方に位置する。
【００１８】
本工程で作製される核酸は、一例として、５’末端側から順に、ＲＮＡ識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、およびエクソソーム識別配列が配置される。本工程で作製される核酸は、一例として、５’末端側から順に、ＲＮＡの配列またはその相補配列、ＲＮＡ識別配列、およびエクソソーム識別配列が配置される。本工程で作製される核酸は、一例として、５’末端側から順に、ＲＮＡ識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、ＲＮＡ識別配列、およびエクソソーム識別配列が配置される。本工程で作製される核酸は、一例として、３’末端側から順に、ＲＮＡ識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、およびエクソソーム識別配列が配置される。本工程で作製される核酸は、一例として、３’末端側から順に、ＲＮＡの配列またはその相補配列、ＲＮＡ識別配列、およびエクソソーム識別配列が配置される。本工程で作製される核酸は、一例として、３’末端側から順に、ＲＮＡ識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、ＲＮＡ識別配列、およびエクソソーム識別配列が配置される。
本工程で作製される核酸は、上記のような配列を有する一本鎖核酸であってもよく、前記一本鎖核酸に相補鎖が相補結合した二本鎖核酸であってもよい。
【００１９】
本工程で作製される核酸は、ＲＮＡの配列またはその相補配列、エクソソーム識別配列、ＲＮＡ識別配列に加えて、他の配列（例、塩基配列）を含んでいてもよい。他の配列は、一例として、エクソソーム識別配列とＲＮＡの配列またはその相補配列との間に位置する。他の配列は、一例として、ＲＮＡの配列またはその相補配列とＲＮＡ識別配列との間に位置する。他の配列は、一例として、エクソソーム識別配列とＲＮＡ識別配列との間に位置する。他の配列は、一例として、本工程で作製される核酸の３’末端領域に存在し、エクソソーム識別配列の３’末端に隣接して位置する。他の配列は、一例として、本工程で作製される核酸の５’末端領域に存在し、ＲＮＡ識別配列の５’末端に隣接して位置する。他の配列は、一例として、本工程で作製される核酸の５’末端領域に存在し、ＲＮＡの配列またはその相補配列の５’末端に隣接して位置する。他の配列は、一例として、本工程で作製される核酸の５’末端領域に存在し、エクソソーム識別配列の５’末端に隣接して位置する。他の配列は、一例として、本工程で作製される核酸３’末端領域に存在し、ＲＮＡ識別配列の３’末端に隣接して位置する。他の配列は、一例として、本工程で作製される核酸の３’末端領域に存在し、ＲＮＡの配列またはその相補配列の３’末端に隣接して位置する。
【００２０】
本工程で作製される核酸は、リボ核酸であってもよく、デオキシリボ核酸であってもよく、これらの混合物であってもよい。また、核酸は、天然の核酸に限定されず、ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）やＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。本工程で作製される核酸は、一例として、デオキシリボ核酸である。本工程で作製される核酸は、一例として、リボ核酸である。本工程で作製される核酸は、一例として、デオキシリボ核酸とリボ核酸の混合物である。
なお、本明細書において、「核酸」は、リボ核酸からなるもの、デオキシリボ核酸からなるもの、ならびにリボ核酸およびデオキシリボ核酸からなるものを包含する。さらに、「核酸」は、天然核酸からなるもの、人工核酸からなるもの、ならびに天然核酸および人工核酸からなるものを包含する。
【００２１】
≪第１実施形態≫
一実施形態において、本工程は、下記の工程を含むことができる：
エクソソーム識別配列またはその相補配列と後述の第１のアダプター核酸が結合する第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を結合させる工程（以下、「第１のアダプター核酸結合工程」という）；
前記第１のアダプター核酸に、ＲＮＡを結合させる工程（以下、「ＲＮＡ結合工程」という）；および
前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる工程（以下、「第２のアダプター核酸結合工程」という）。
前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方は、ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有している。
【００２２】
第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程は、いずれの順番で実施してもよい。一例として、第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程は、前記の順番で実施される。
【００２３】
以下、第１のアダプター核酸が有するＲＮＡ識別配列を「第１のＲＮＡ識別配列」、第２のアダプター核酸が有するＲＮＡ識別配列を「第２のＲＮＡ識別配列」と表記する。
第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有する場合、第１のアダプター核酸が第１のＲＮＡ識別配列を有する場合、および第１のアダプター核酸が第１のＲＮＡ識別配列を有し、且つ第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有する場合のそれぞれについて、本工程の具体例をさらに詳述する。
【００２４】
（１）第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有する場合
第２のアダプター核酸が、第２のＲＮＡ識別配列を有する場合の工程（ａ）の具体例について、図１〜８を参照して説明する。
【００２５】
（第１のアダプター核酸結合工程）
図２は、第１のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
・エクソソーム識別核酸
エクソソーム識別核酸１０は、エクソソーム識別配列１１および第１の相補配列１３を有している。なお、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１は、工程（ａ）により作製される核酸が有するエクソソーム識別配列と同じ配列か、またはその相補配列である。本明細書では、前記核酸が有するエクソソーム識別配列およびその相補配列をまとめて、「エクソソーム識別配列」と表記する。
【００２６】
図２の例では、エクソソーム識別核酸１０は、固相の担体の一例としてのビーズ１に結合した状態で準備されている。エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１は、原則として、ビーズ毎に異なっている。１個のビーズに結合するエクソソーム識別核酸１０は、全て同じエクソソーム識別配列１１を有している。
エクソソーム識別配列１１は、ビーズ１毎に異なる配列であればよく、例えばランダム配列により構成される。エクソソーム識別配列１１の長さは、例えば、解析対象の試料に含まれると予想されるエクソソームの量に応じて適宜設定することができる。エクソソーム識別配列１１の長さは、一例として５〜２０塩基であり、一例として７〜１５塩基であり、一例として８〜１２塩基である。
【００２７】
第１の相補配列１３は、第１のアダプター核酸２０と相補的に結合するための配列である。第１の相補配列１３は、第１のアダプター核酸２０とハイブリダイズ可能であればよく、配列の種類及び長さは特に限定されない。第１の相補配列１３の長さは、一例として１５〜７０塩基であり、一例として２０〜５０塩基であり、一例として２５〜４０塩基である。
エクソソーム識別核酸１０は、一例として、デオキシリボ核酸である。
【００２８】
エクソソーム識別核酸１０を結合させたビーズ１は、例えば、図１に例示する方法により調製することができる。図１の方法では、第３のアダプター核酸２を介して、ビーズ１にエクソソーム識別核酸１０を結合している。
図１の例では、ビーズ１には、複数の第３のアダプター核酸２が結合されている。ビーズ１への第３のアダプター核酸２の結合方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。一例として、アビジンまたはストレプトアビジン等のアビジン類でコーティングしたビーズ１に、ビオチン標識した第３のアダプター核酸２を結合させる方法が挙げられる。例えば、第３のアダプター核酸２の５’末端をビオチン標識することにより、前記５’末端標識ビオチンを介して、第３のアダプター核酸２がストレプトアビジン等でコーティングしたビーズ１に結合する。図１の例では、第３のアダプター核酸２の５’末端がビーズ１に結合している。
第３のアダプター核酸２を結合されたビーズ１は、１個ずつ、プライマー３およびＤＮＡポリメラーゼ４とともに、液滴５ａに封入される。液滴５ａは、一例として、水滴である。液滴５ａは、一例として、油中水型エマルション中の水滴である。１個の液滴５ａには、原則として、１個のビーズ１と、１種類のエクソソーム識別核酸１０と、プライマー３と、ＤＮＡポリメラーゼ４と、を封入されている。液滴５ａ中には、上記に加えて、ｄＮＴＰ等も封入される。
エクソソーム識別核酸１０は、第２の相補配列１２を有している。第２の相補配列１２は、第３のアダプター核酸２の少なくとも一部に相補的な配列である。液滴５ａ中で、エクソソーム識別核酸１０は、第２の相補配列１２を介して、第３のアダプター核酸２とハイブリダイズして結合する。
この状態で、第３のアダプター核酸２およびプライマー３をプライマーセットとしてエマルションＰＣＲ（ｅＰＣＲ）を行うことにより、ビーズ上に存在する大部分の第３のアダプター核酸２に、エクソソーム識別核酸１０を結合させることができる。このようにして、エクソソーム識別核酸１０を結合させたビーズ１を調製することができる。調製したビーズ１は、遠心分離等により液滴５ａから回収し、アルカリ変性処理等によりエクソソーム識別核酸１０を一本鎖化した後、第１のアダプター核酸結合工程に供することができる。
【００２９】
・第１のアダプター核酸
第１のアダプター核酸２０は、第１の相補配列１３に相補的な配列２２を有している。第１の相補配列に相補的な配列２２は、第１の相補配列１３と完全に相補的である必要はなく、第１の相補配列１３にハイブリダイズできる程度に相補的であればよい。
第１のアダプター核酸２０は、一例として、リボ核酸である。
一例として、第１のアダプター核酸２０の５’末端はアデニル化されている。５’末端のアデニル化は、例えば、市販のアデニル化キットを用いて行うことができる。第１のアダプター核酸２０の５’末端をアデニル化することにより、後述のＲＮＡ結合工程において、ＲＮＡ同士の結合より優先して、効率よく第１のアダプター核酸２０の５’末端にＲＮＡを結合させることができる。
【００３０】
エクソソーム識別核酸１０と、第１のアダプター核酸２０とを接触させて、ハイブリダイゼーション反応を行うことにより、エクソソーム識別核酸１０に、第１のアダプター核酸２０を結合させることができる。
【００３１】
したがって、工程（ａ）は、第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程に加えて、さらに、担体（例、ビーズ１）に結合させた第３のアダプター核酸に、エクソソーム識別核酸を結合させて、前記担体上で前記エクソソーム識別核酸を増幅する工程を含むことができる。この場合、エクソソーム識別核酸は、第３のアダプター核酸の少なくとも一部に相補的な第２の相補配列をさらに有し、前記第２の相補配列を介して、前記第３のアダプター核酸に結合する。
【００３２】
（ＲＮＡ結合工程）
図３、４は、ＲＮＡ結合工程を説明する図である。
上記第１のアダプター核酸結合工程で調製されたエクソソーム識別核酸１０および第１のアダプター核酸２０が結合されたビーズ１は、エクソソーム３０とともに、液滴５ｂに封入される。１個の液滴５ｂには、原則として、１個のビーズ１と、１個のエクソソーム３０とが封入される。液滴５ｂは、一例として、水滴である。液滴５ｂは、一例として、油中水型エマルション中の水滴である。
【００３３】
液滴５ｂ中には、さらに、界面活性剤６およびＲＮＡリガーゼ７が封入される。界面活性剤６は、エクソソーム３０を溶解して破壊するためのものである。界面活性剤６は、エクソソーム３０を溶解し、核酸を破壊しないものであれば、特に限定されない。界面活性剤６としては、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０）等が挙げられる。エクソソーム３０が界面活性剤６により破壊されることにより、エクソソーム３０に内包されていたＲＮＡ３１が液滴５ｂ中に放出される。
ＲＮＡリガーゼ７は、核酸同士のライゲーション反応を触媒し、第１のアダプター核酸２０とＲＮＡとを結合する。ＲＮＡリガーゼ７は、核酸のライゲーション反応を触媒するものであれば、特に限定されない。ＲＮＡリガーゼ７としては、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２欠損変異体が挙げられる。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２次欠損変異体は、核酸（デオキシリボ核酸またはリボ核酸）のアデニル化された５’末端と、リボ核酸の３’ヒドロキシ末端とのライゲーション反応を触媒するＲＮＡリガーゼである。そのため、第１のアダプター核酸２０の５’末端がアデニル化されている場合、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２次欠損変異体を用いることにより、ＲＮＡ３１を効率的に第１のアダプター核酸２０に結合させることができる。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２次欠損変異体としては、例えば、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  ２（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）（ＢｉｏＢｉｓｉｏｎ社製）等が利用可能である。
【００３４】
第１のアダプター核酸２０に対するＲＮＡ３１の結合は、液滴５ｂ中で、界面活性剤６によりエクソソーム３０を溶解させてＲＮＡ３１を放出させた後、ＲＮＡリガーゼ７により第１のアダプター核酸２０とＲＮＡ３１とをライゲーションさせることより行うことができる。ライゲーション反応の条件は、ＲＮＡリガーゼの種類に応じて、適宜設定すればよい。例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２欠損変異体を用いる場合、反応条件としては、２５℃で４時間に次いで１６℃で一晩等が例示される。
【００３５】
このようにして、第１のアダプター核酸２０にＲＮＡ３１を結合させることができる。１個のビーズ１には、単一のエクソソーム３０から放出されたＲＮＡ３１−１〜ＲＮＡ３１−５が、エクソソーム識別核酸１０および第１のアダプター核酸２０を介して結合している。このようにして調製したビーズ１は、遠心分離等により液滴５ｂから回収し、第２のアダプター核酸結合工程に供することができる。
【００３６】
ＲＮＡ３１の数が、ビーズ１に結合する第１のアダプター核酸２０の数よりも少ない場合には、上記ライゲーション反応後、第１のアダプター核酸２０の一部は、ＲＮＡ３１が未結合のままの状態となる。この場合、液滴５ｂからビーズ１を回収した後、ＲＮＡ３１が結合していない第１のアダプター核酸２０のブロッキングを行ってもよい。ブロッキングは、例えば、５’末端がリン酸化されていないブロッキング用核酸を用いて行うことができる。例えば、ＲＮＡ３１が未結合である第１のアダプター核酸２０に、ＲＮＡリガーゼにより、ブロッキング用核酸を結合させることにより、ブロッキングを行うことができる。
【００３７】
（第２のアダプター核酸結合工程）
図５は、第２のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
【００３８】
・第２のアダプター核酸
第２のアダプター核酸４０は、第２のＲＮＡ識別配列４１を有している。なお、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１は、工程（ａ）により作製される核酸が有するＲＮＡ識別配列と同じ配列か、またはその相補配列である。本明細書では、前記核酸が有するＲＮＡ識別配列およびその相補配列をまとめて、「ＲＮＡ識別配列」と表記する。
【００３９】
第２のＲＮＡ識別配列４１は、ＲＮＡ３１毎に異なる配列であればよく、例えばランダム配列により構成される。第２のＲＮＡ識別配列４１の長さは、例えば、解析対象の試料に含まれると予想されるエクソソームに由来するＲＮＡの量に応じて適宜設定することができる。ＲＮＡ識別配列１１の長さは、一例として５〜３０塩基であり、一例として１０〜２５塩基であり、一例として１５〜２０塩基である。
一例として、第２のＲＮＡ識別配列４１は、第２のアダプター核酸４０の３’末端に配置されている。第２のＲＮＡ識別配列４１が、第２のアダプター核酸４０の３’末端に位置することにより、ＲＮＡ３１と第２のアダプター核酸４０とのライゲーション効率が高くなる。
第２のアダプター核酸４０は、一例として、リボ核酸である。
【００４０】
第２のアダプター核酸４０を、上記ＲＮＡ結合工程で調製された、エクソソーム識別核酸１０−第１のアダプター核酸２０−ＲＮＡ３１が結合されたビーズ１に接触させて、ＲＮＡ３１に第２のアダプター核酸４０を結合させる。ＲＮＡ３１と第２のアダプター核酸４０との結合は、ＲＮＡリガーゼにより行うことができる。一例として、ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼである。Ｔ４ＲＮＡリガーゼによるライゲーション反応の条件としては、上記と同様の条件が挙げられる。
【００４１】
（核酸増幅工程）
工程（ａ）は、上記第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程に加えて、任意に、エクソソーム識別配列１１と、第２のＲＮＡ識別配列４１と、ＲＮＡ３１の配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程（以下、「核酸増幅工程」という）を含んでいてもよい。一例として、核酸増幅工程は、第２のアダプター核酸結合工程の後に行われる。
【００４２】
図６は、核酸増幅工程を説明する図である。
第２のアダプター核酸結合工程の後、第１のアダプター核酸２０−ＲＮＡ３１−第２のアダプター核酸４０が結合された核酸は、エクソソーム識別核酸１０にハイブリダイズした状態となっている。この状態で、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うことにより、第１のアダプター核酸２０−ＲＮＡ３１−第２のアダプター核酸４０が逆転写されて、エクソソーム識別核酸１０の３’末端側に隣接して、第１のアダプター核酸２０の相補配列２０’−ＲＮＡ３１の相補配列３１’−第２のアダプター核酸４０の相補配列４０’からなる核酸（ｃＤＮＡ）が形成される。前記核酸は、エクソソーム識別配列１１、ＲＮＡ３１の相補配列３１’、および第２のＲＮＡ識別配列４１の相補配列４１’を有している。
逆転写反応の後、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列、ＲＮＡ３１またはその相補配列３１’、および第２のＲＮＡ識別配列４１またはその相補配列４１’を含む領域を、ＰＣＲ等により増幅してもよい。前記ＰＣＲに使用するプライマーは、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列、ＲＮＡ３１またはその相補配列３１’、および第２のＲＮＡ識別配列４１またはその相補配列４１’を含む領域を増幅できるものであれば、特に限定されない。
【００４３】
フォワードプライマーとしては、エクソソーム識別配列１１の５’末端側に位置する配列にアニーリングし得るプライマーを用いることができる。一例として、フォワードプライマーとしては、エクソソーム識別核酸１０の第２の相補配列１２、または第３のアダプター核酸２にアニーリングし得るプライマーが挙げられる。
リバースプライマーとしては、第２のＲＮＡ識別配列４１の５’末端側に位置する配列にアニーリングし得るプライマーを用いることができる。一例として、リバースプライマーとしては、第２のアダプター核酸４０における第２のＲＮＡ識別配列４１の５’末端側に位置する配列にアニーリングし得るプライマーが挙げられる。
【００４４】
上記組み合わせの他、フォワードプライマーとしては、第２のＲＮＡ識別配列４１の５’末端側に位置する配列にアニーリングし得るプライマーを用いることができる。一例として、フォワードプライマーとしては、第２のＲＮＡ識別核酸４０における第２のＲＮＡ識別配列４１の５’末端側に位置する配列にアニーリングし得るプライマーが挙げられる。
リバースプライマーとしては、エクソソーム識別配列１１の５’末端側に位置する配列にアニーリングし得るプライマーを用いることができる。一例として、フォワードプライマーとしては、エクソソーム識別核酸１０の第２の相補配列１２、または第３のアダプター核酸２にアニーリングし得るプライマーが挙げられる。
【００４５】
本実施形態において、工程（ａ）の後に得られる核酸の一例を図７および図８に示す。
図７は、１個のエクソソーム３０−１に由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉを含む核酸５１−１ａ〜５１−ｍａの一例である。核酸５１−１ａ〜５１−ｍａは、一例として、デオキシリボ核酸である。核酸５１−１ａ〜５１−ｍａは、エクソソーム識別配列１１として、共通のエクソソーム識別配列１１−１を有している。核酸５１−１ａ〜５１−ｍａは、さらに、第１のアダプター核酸２０の配列、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｉ、および第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍを有している。
図７中、ＲＮＡ３１−１と表示されるＲＮＡは、同じ種類のＲＮＡである。核酸５１−１ａ〜５１ｍａが含むＲＮＡ３１の種類及びそれらの存在比は、エクソソーム３０−１に内包されていたＲＮＡ３１の種類及びそれら存在比を反映している。そのため、エクソソーム識別配列１１−１を有する核酸５１−１ａ〜５１−ｍａにおいて、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｉの種類およびそれらの存在比を解析することにより、エクソソーム３０−１に内包されていたＲＮＡ３１−１〜３１−ｉの種類およびそれらの存在比を求めることができる。例えば、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｉの種類およびそれらの存在比の解析は、後述の工程（ｂ）における次世代シーケンサー等を用いて決定された核酸５１−１ａ〜５１−ｍａの塩基配列に基づいて、行うことができる。さらに、エクソソーム３０−１に内包されていたＲＮＡ３１−１〜３１−ｉには、１分子毎に、第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜１ｍのいずれか１つが付与されているため、第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜１ｍの存在比に基づいて、核酸増幅反応等によるＲＮＡ３１−１〜３１−ｉの存在比の変動を補正することができる。
【００４６】
図８は、図７のエクソソーム３０−１とは異なるエクソソーム３０−２に由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｊを含む核酸５２−１ａ〜５２−ｎａの一例である。核酸５２−１ａ〜５２−ｎａは、一例として、デオキシリボ核酸である。核酸５２−１ａ〜５２−ｎａは、エクソソーム識別配列１１として、共通のエクソソーム識別配列１１−２を有している。核酸５２−１ａ〜５２−ｎａは、さらに、第１のアダプター核酸２０の配列、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｊ、および第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎを有している。
エクソソーム識別配列１１−２を有する核酸５２−１ａ〜５２−ｎａにおいて、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの種類およびそれらの存在比を解析することにより、エクソソーム３０−２に内包されていたＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの種類およびそれらの存在比を求めることができる。さらに、エクソソーム３０−２に内包されていたＲＮＡ３１−１〜３１−ｊには、１分子毎に、第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜２ｎのいずれか１つが付与されているため、第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜２ｎの存在比に基づいて、核酸増幅反応等によるＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの存在比の変動を補正することができる。
【００４７】
図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図７および図８中、１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図７および図８中、２０で表される配列は、第１のアダプター核酸２０の相補配列であってもよい。図７および図８中、４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎで表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列であってもよい。
【００４８】
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２０として表される配列は、第１のアダプター核酸２０の相補配列であり、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列である。
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２０として表される配列は、第１のアダプター核酸２０と同じ配列であり、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎと同じ配列である。
【００４９】
上述の例では、第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程、の順で工程（ａ）を行う例について説明したが、これらの順番は、適宜変更することも可能である。一例として、第１のアダプター核酸結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程を行った後、ＲＮＡ結合工程を行ってもよい。この場合、ＲＮＡ結合工程において、エクソソーム識別核酸に結合している第１のアダプター核酸に、第２のアダプター核酸が結合しているＲＮＡが結合される。
【００５０】
（２）第１のアダプター核酸が第１のＲＮＡ識別配列を有する場合
第１のアダプター核酸が、第１のＲＮＡ識別配列を有する場合の工程（ａ）の具体例について、図９〜１２を参照して説明する。
【００５１】
（第１のアダプター核酸結合工程）
図９は、第１のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
第１のアダプター核酸２０は、第１の相補配列１３に相補的な配列２２に加えて、第１のＲＮＡ識別配列２１を有している。なお、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１は、工程（ａ）により作製される核酸が有するＲＮＡ識別配列と同じ配列か、またはその相補配列である。
一例として、第１のＲＮＡ識別配列２１は、第１の相補配列に相補的な配列２２の５’末端側に配置されている。第１のアダプター核酸２０は、第１のＲＮＡ識別配列２１および第１の相補配列に相補的な配列２２のみからなるものであってもよく、他の配列を含んでいてもよい。
【００５２】
第１のアダプター核酸結合工程は、第１のアダプター核酸２０が第１のＲＮＡ識別配列２１を有すること以外は、上記（１）における第１のアダプター核酸結合工程と同様に行うことができる。
【００５３】
（ＲＮＡ結合工程）
ＲＮＡ結合工程は、上記（１）におけるＲＮＡ結合工程と同様に行うことができる。
【００５４】
（第２のアダプター核酸結合工程）
図１０は、第２のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
本実施形態において、第２のアダプター核酸４０は、第２のＲＮＡ識別配列４１を有さない。第２のアダプター核酸４０は、核酸増幅工程におけるプライマーアニーリング領域を付与するために、ＲＮＡ３１に結合される。
【００５５】
第２のアダプター核酸結合工程は、第２のアダプター核酸４０が第２のＲＮＡ識別配列４１を有さないこと以外は、上記（１）における第２のアダプター核酸結合工程と同様に行うことができる。
【００５６】
第２のアダプター核酸結合工程の後は、任意に、核酸増幅工程を行ってもよい。本実施形態における核酸増幅工程は、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列と、第１のＲＮＡ識別配列２１またはその相補配列と、ＲＮＡ３１の配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程である。核酸増幅工程は、上記（１）における核酸増幅工程と同様に行うことができる。
【００５７】
本実施形態において、工程（ａ）の後に得られる核酸の一例を図１１および図１２に示す。
図１１は、エクソソーム３０−１に由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉを含む核酸５１−１ｂ〜５１−ｍｂの一例である。核酸５１−１ｂ〜５１−ｍｂは、第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍの代わりに、第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍを有すること以外は、図７における核酸５１−１ａ〜５１−ｍａと同様である。
【００５８】
図１２は、図１１のエクソソーム３０−１とは異なるエクソソーム３０−２に由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｊを含む核酸５２−１ｂ〜５２−ｎｂの一例である。核酸５２−１ｂ〜５２−ｍｂは、第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの代わりに、第１のＲＮＡ識別配列２１−２１〜２１−２ｎを有すること以外は、図８における核酸５１−１ａ〜５１−ｎａと同様である。
【００５９】
図１１および図１２中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊで表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図１１および図１２中、１１−１および１１−２で表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図１１および図１２中、２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎで表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であってもよい。
【００６０】
一例として、図１１および図１２中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であり、
４０として表される配列は、第２のアダプター核酸４０の相補配列である。
一例として、図１１および図１２中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎと同じ配列であり、
４０として表される配列は、第２のアダプター核酸４０と同じ配列である。
【００６１】
上述の例では、第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程、の順で工程（ａ）を行う例について説明したが、これらの順番は、適宜変更することも可能である。一例として、第１のアダプター核酸結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程を行った後、ＲＮＡ結合工程を行ってもよい。この場合、ＲＮＡ結合工程において、エクソソーム識別核酸に結合している第１のアダプター核酸に、第２のアダプター核酸が結合しているＲＮＡが結合される。
【００６２】
（３）第１のＲＮＡ識別配列および第２のＲＮＡ識別配列を有する場合
第１のアダプター核酸が第１のＲＮＡ識別配列を有し、且つ第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有する場合の工程（ａ）の具体例について、図１３〜１６を参照して説明する。
【００６３】
（第１のアダプター核酸結合工程）
図１３は、第１のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
第１のアダプター核酸２０は、第１の相補配列１３に相補的な配列２２に加えて、第１のＲＮＡ識別配列２１を有している。
第１のアダプター核酸結合工程は、上記（２）における第１のアダプター核酸結合工程と同様に行うことができる。
【００６４】
（ＲＮＡ結合工程）
ＲＮＡ結合工程は、上記（１）におけるＲＮＡ結合工程と同様に行うことができる。
【００６５】
（第２のアダプター核酸結合工程）
図１４は、第２のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
第２のアダプター核酸４０は、第２のＲＮＡ識別配列４１を有している。
第２のアダプター核酸結合工程は、上記（１）における第２のアダプター核酸結合工程と同様に行うことができる。
【００６６】
第２のアダプター核酸結合工程の後は、任意に、核酸増幅工程を行ってもよい。本実施形態における核酸増幅工程は、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列と、第１のＲＮＡ識別配列２１またはその相補配列と、ＲＮＡ３１の配列またはその相補配列と、第２のＲＮＡ識別配列４１またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程である。核酸増幅工程は、上記（１）における核酸増幅工程と同様に行うことができる。
【００６７】
本実施形態において、工程（ａ）の後に得られる核酸の一例を図１５および図１６に示す。
図１５は、エクソソーム３０−１に由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉを含む核酸５１−１ｃ〜５１−ｍｃの一例である。核酸５１−１ｃ〜５１−ｍｃは、第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍに加えて、第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍを有すること以外は、図７における核酸５１−１ａ〜５１−ｍａと同様である。
【００６８】
図１６は、図１５のエクソソーム３０−１とは異なるエクソソーム３０−２に由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｊを含む核酸５２−１ｃ〜５２−ｎｃの一例である。核酸５２−１ｃ〜５２−ｍｃは、第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎに加えて、第１のＲＮＡ識別配列２１−２１〜２１−２ｎを有すること以外は、図８における核酸５１−１ａ〜５１−ｎａと同様である。
【００６９】
図１５および図１６中、３１−１〜３１−ｉおよびＲ３１−１〜３１−ｊで表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図１５および図１６中、１１−１および１１−２で表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図１５および図１６中、２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎで表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であってもよい。図１５および図１６中、４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎで表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列であってもよい。
【００７０】
一例として、図１５および図１６中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であり、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列である。
一例として、図１５および図１６中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎと同じ配列であり、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎと同じ配列である。
【００７１】
上述の例では、第１のアダプター核酸結合工程、ＲＮＡ結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程、の順で工程（ａ）を行う例について説明したが、これらの順番は、適宜変更することも可能である。一例として、第１のアダプター核酸結合工程、および第２のアダプター核酸結合工程を行った後、ＲＮＡ結合工程を行ってもよい。この場合、ＲＮＡ結合工程において、エクソソーム識別核酸に結合している第１のアダプター核酸に、第２のアダプター核酸が結合しているＲＮＡが結合される。
【００７２】
≪第２実施形態≫
一実施形態において、工程（ａ）は、下記の工程を含むことができる：
前記エクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを捕捉するＲＮＡ捕捉配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記ＲＮＡ捕捉配列を介して、前記ＲＮＡを結合させる工程（以下、「ＲＮＡ捕捉工程」）と、
前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる工程（「第２のアダプター核酸結合工程」という）。
前記第２のアダプター核酸は、第２のＲＮＡ識別配列を有している。
【００７３】
ＲＮＡ捕捉工程、および第２のアダプター核酸結合工程は、いずれの順番で実施してもよい。一例として、ＲＮＡ捕捉工程、および第２のアダプター核酸結合工程は、前記の順番で実施される。
「ＲＮＡ捕捉配列」は、エクソソームに由来するＲＮＡを結合して捕捉するための配列である。
本実施形態にかかる方法は、一例として、エクソソームに由来するＲＮＡに、ポリ（Ａ）などの所定の配列を付加することにより行うことができる。なお、エクソソームに由来するＲＮＡがあらかじめポリ（Ａ）などの所定の配列を有する場合には、前記所定の配列の付加を行う必要はない。ポリ（Ａ）を有するＲＮＡとしては、ｍＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ捕捉配列としては、一例として、前記所定の配列の相補配列が挙げられる。以下、一例として、所定の配列がポリ（Ａ）である場合について説明する。
【００７４】
（ＲＮＡ捕捉工程）
図１７は、本実施形態にかかる方法で用いるエクソソーム識別核酸１０の一例を示す図である。エクソソーム識別核酸１０は、エクソソーム識別配列１１に加えて、ＲＮＡ捕捉配列を有している。図１７の例では、エクソソーム識別核酸１０は、ＲＮＡ捕捉配列の一例として、ポリ（Ｔ）配列１４を有している。図１７の例では、エクソソーム識別核酸１０は、担体の一例としてのビーズ１に結合した状態で準備されている。
ポリ（Ｔ）配列１４を有するエクソソーム識別核酸１０の調製方法は、特に限定されない。一例として、前記第１実施形態の（１）で説明したように、ビーズ１に結合させた第３のアダプター核酸２に、エクソソーム識別核酸１０をハイブリダイズさせて、エマルションＰＣＲを行う際に、ポリ（Ｔ）配列またはポリ（Ａ）配列を有するプライマーを用いることにより、ポリ（Ｔ）配列１４を有するエクソソーム識別核酸１０を調製することができる。ポリ（Ｔ）配列またはポリ（Ａ）配列の長さは、特に限定されないが、例えば、１０〜５０残基程度とすることができる。
【００７５】
図１８、１９は、ＲＮＡ捕捉工程を説明する図である。
エクソソーム識別核酸１０が結合されたビーズ１は、エクソソーム３０とともに、液滴５ｂに封入される。１個の液滴５ｂには、原則として、１個のビーズ１と、１個のエクソソーム３０とが封入される。液滴５ｂは、一例として、水滴である。液滴５ｂは、一例として、油中水型エマルション中の水滴である。
【００７６】
液滴５ｂ中には、さらに、界面活性剤６、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ８、およびＡＴＰ等が封入される。エクソソーム３０が界面活性剤６により破壊されることにより、エクソソーム３０に内包されていたＲＮＡ３１が液滴５ｂ中に放出される。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ８は、ＲＮＡ３１にポリ（Ａ）配列３２を付加する酵素である。ポリ（Ａ）ポリメラーゼ８は、ＲＮＡのポリアデニル化反応を触媒するものであれば、特に限定されない。
【００７７】
ＲＮＡ３１に対するポリ（Ａ）配列３２の付加は、液滴５ｂ中で、界面活性剤６によりエクソソーム３０を溶解させてＲＮＡ３１を放出させた後、ＲＮＡ３１にポリ（Ａ）ポリメラーゼ８を作用させることにより行うことができる。ポリアデニル化反応の条件は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定すればよい。反応条件としては、例えば、３７℃で１時間等が例示される。
【００７８】
ポリ（Ａ）配列３２が付加されたＲＮＡ３１は、ポリ（Ａ）配列３２とエクソソーム識別核酸１０のポリ（Ｔ）配列１４とのハイブリダイゼーションを介して、エクソソーム識別核酸１０に結合する。
【００７９】
このようにして、エクソソーム識別核酸１０にＲＮＡ３１を結合させることができる。１個のビーズ１には、単一のエクソソーム３０から放出されたＲＮＡ３１−１〜ＲＮＡ３１−５が、エクソソーム識別核酸１０に結合している。このようにして調製したビーズ１は、遠心分離等により液滴５ｂから回収する。その後、適宜、未反応のエクソソーム識別核酸１０のブロッキングを行ってもよい。未反応のエクソソーム識別核酸１０のブロッキングは、上記第１実施形態における未反応の第１のアダプター核酸２０のブロッキングと同様に行うことができる。
【００８０】
一実施形態において、ＲＮＡ捕捉工程は、エクソソームに由来するＲＮＡに所定の配列を付加する工程と、エクソソーム識別配列と、前記所定の配列の相補配列であるＲＮＡ捕捉配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記ＲＮＡ捕捉配列を介して、前記ＲＮＡを結合させる工程と、を含む、ということもできる。
【００８１】
（第２のアダプター核酸結合工程）
図２０は、第２のアダプター核酸結合工程を説明する図である。
第２のアダプター核酸結合工程は、上記第１実施形態の（１）における第２のアダプター核酸結合工程と同様に行うことができる。本実施形態において、第２のアダプター核酸は、第２のＲＮＡ識別配列４１を有している。
【００８２】
上記ＲＮＡ捕捉工程で調製されたビーズ１において、ＲＮＡ３１は、エクソソーム識別核酸１０のポリ（Ｔ）配列１４と、ＲＮＡ３１に付加されたポリ（Ａ）配列３２とのハイブリダイゼーションを介して、エクソソーム識別核酸１０に結合している。この状態で、ＲＮＡ３１に第２のアダプター核酸４０を結合させる。ＲＮＡ３１と第２のアダプター核酸４０との結合は、上記第１実施形態の（１）と同様に行うことができる。
【００８３】
第２のアダプター核酸結合工程の後は、任意に、核酸増幅工程を行ってもよい。本実施形態における核酸増幅工程は、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列と、ＲＮＡ３１の配列またはその相補配列と、第２のＲＮＡ識別配列４１またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程である。核酸増幅工程は、上記第１実施形態の（１）における核酸増幅工程と同様に行うことができる。
【００８４】
図２１は、核酸結合工程を説明する図である。
第２のアダプター核酸結合工程の後、ＲＮＡ３１−第２のアダプター核酸４０が結合された核酸は、エクソソーム識別核酸１０にハイブリダイズした状態となっている。この状態で、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うことにより、ＲＮＡ３１−第２のアダプター核酸４０が逆転写されて、エクソソーム識別核酸１０の３’末端側に隣接して、ＲＮＡ３１の相補配列３１’−第２のアダプター核酸４０の相補配列４０’からなる核酸（ｃＤＮＡ）が形成される。前記核酸は、エクソソーム識別配列１１、ＲＮＡ３１の相補配列３１’、および第２のＲＮＡ識別配列４１の相補配列４１’を有している。
逆転写反応の後、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列、ＲＮＡ３１またはその相補配列３１’、および第２のＲＮＡ識別配列４１またはその相補配列４１’を含む領域を、ＰＣＲ等により増幅してもよい。前記ＰＣＲに使用するプライマーは、エクソソーム識別配列１１またはその相補配列、ＲＮＡ３１またはその相補配列３１’、および第２のＲＮＡ識別配列４１またはその相補配列４１’を含む領域を増幅できるものであれば、特に限定されず、上記第１実施形態の（１）で例示したものと同様のものが挙げられる。
【００８５】
本実施形態において、工程（ａ）の後に得られる核酸としては、図７および図８に示す核酸５１−１ａ〜５１−ｍａおよび核酸５２−１ａ〜５２−ｎａにおいて、第１のアダプター核酸２０の配列を有さないものが例示される。
当該核酸において、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図７および図８中、１１−１および１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図７および図８中、４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列であってもよい。
【００８６】
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２０として表される配列は、ＲＮＡ捕捉配列（ポリ（Ｔ）配列１４）に置き換えられ、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列である。
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２０として表される配列は、所定の配列（ポリ（Ａ）配列３２）に置き換えられ、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎと同じ配列である。
【００８７】
≪第３実施形態≫
第３実施形態は、上記第１の実施形態における第２のアダプター核酸結合工程を変形例により実施する実施形態である。第１のアダプター核酸結合工程およびＲＮＡ結合工程は、上記第１の実施形態と同様に行うことができる。
【００８８】
（第２のアダプター核酸結合工程の変形例）
図２２、２３は、第２のアダプター核酸結合工程の変形例を説明する図である。
ＲＮＡ結合工程後、第１のアダプター核酸２０にＲＮＡ３１が結合された核酸は、エクソソーム識別核酸１０にハイブリダイズした状態となっている。この状態で、ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を有する逆転写酵素を用いて逆転写反応を行う。これにより、第１のアダプター核酸２０−ＲＮＡ３１が逆転写されて、エクソソーム識別核酸１０の３’末端側に隣接して、第１のアダプター核酸２０の相補配列２０’−ＲＮＡ３１の相補配列３１’（第１のアダプター核酸−ＲＮＡのｃＤＮＡ）が形成される。逆転写酵素が、ＲＮＡ３１の５’末端に到達すると、そのＴｄＴ活性により、第１のアダプター核酸の相補配列２０’−ＲＮＡの相補配列３１’の３’末端に特定の短い配列（特定配列６２）（例、シトシン（Ｃ）に富んだ配列、２〜１０残基程度）を付加する（図２２）。
前記逆転写反応の反応液中に、特定配列６２に相補的な配列（特定相補配列４２）と第２のＲＮＡ識別配列４１とを有する第２のアダプター核酸４０を添加しておくと、特定相補配列４２と特定配列６２とがハイブリダイズし、逆転写酵素は、第２のアダプター核酸４０の５’末端まで逆転写反応を行い、特定配列６２に続いて第２のアダプター核酸４０の相補配列４０’（第２のアダプター核酸４０のｃＤＮＡ）が形成される（図２３）。このようにして、ＲＮＡ３１の相補配列３１’に、第２のアダプター核酸４０の相補配列４０’を結合させることができる。
【００８９】
逆転写反応の後、エクソソーム識別配列１１、ＲＮＡ３１、および第２のＲＮＡ識別配列４１を含む領域を、ＰＣＲ等により増幅してもよい。前記ＰＣＲに使用するプライマーは、上記第１実施形態で例示したものと同様のものを用いることができる。
【００９０】
本実施形態において、工程（ａ）の後に得られる核酸としては、図７および図８に示す核酸５１−１ａ〜５１−ｍａおよび核酸５２−１ａ〜５２−ｎａにおいて、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｉと第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍとの間、および、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎとの間に、特定相補配列４２を有するものが例示される。
【００９１】
当該核酸において、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図７および図８中、１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図７および図８中、２０の配列として表される配列は、第１のアダプター核酸２０の相補配列であってもよい。図７および図８中、４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列であってもよい。特定相補配列４２は、特定配列６２に置き換えられてもよい。
【００９２】
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２０として表される配列は、第１のアダプター核酸２０の相補配列であり、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４１−１１〜４１−１ｍとして表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列の間には、特定配列６２が配置され、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列である。
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２０として表される配列は、第１のアダプター核酸２０と同じ配列であり、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４１−１１〜４１−１ｍとして表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列の間には、特定相補配列４２が配置され、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎと同じ配列である。
【００９３】
上記の例では、上記第１実施形態の（１）に対応する実施形態について説明したが、第１実施形態の（２）および（３）に対応する実施形態についても同様に、第２のアダプター核酸結合工程を上記変形例により行うことができる。
【００９４】
第１実施形態の（２）に対応する実施形態において、第２のアダプター核酸結合工程を上記変形例により行う場合、工程（ａ）の後に得られる核酸としては、図１１および図１２に示す核酸５１−１ｂ〜５１−ｍｂおよび核酸５２−１ｂ〜５２−ｎｂにおいて、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｉと第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍとの間、および、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎとの間に、特定相補配列４２を有するものが例示される。
【００９５】
図１１および図１２中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊで表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図１１および図１２中、１１−１および１１−２で表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図１１および図１２中、２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎで表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であってもよい。特定相補配列４２は、特定配列６２に置き換えられてもよい。
【００９６】
一例として、図１１および図１２中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であり、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４０として表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４０として表される配列の間には、特定配列６２が配置され、
４０として表される配列は、第２のアダプター核酸４０の相補配列である。
一例として、図１１および図１２中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎと同じ配列であり、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４０として表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４０として表される配列の間には、特定相補配列４２が配置され、
４０として表される配列は、第２のアダプター核酸４０と同じ配列である。
【００９７】
第１実施形態の（３）に対応する実施形態において、第２のアダプター核酸結合工程を上記変形例により行う場合、工程（ａ）の後に得られる核酸としては、図１５および図１６に示す核酸５１−１ｃ〜５１−ｍｃおよび核酸５２−１ｃ〜５２−ｎｃにおいて、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｉと第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍとの間、および、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎとの間に、特定相補配列４２を有するものが例示される。
【００９８】
一例として、図１５および図１６中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎの相補配列であり、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４１−１１〜４１−１ｍとして表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列の間には、特定配列６２が配置され、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列である。
一例として、図１５および図１６中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎとして表される配列は、第１のアダプター核酸２０が有する第１のＲＮＡ識別配列２１−１１〜２１−１ｍおよび２１−１１〜２１−１ｎと同じ配列であり、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４１−１１〜４１−１ｍとして表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列の間には、特定相補配列４２が配置され、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎと同じ配列である。
【００９９】
≪第４実施形態≫
第４実施形態は、上記第２の実施形態における第２のアダプター核酸結合工程を、上記第２のアダプター核酸結合工程の変形例により実施する実施形態である。
【０１００】
（ＲＮＡ捕捉工程）
ＲＮＡ捕捉工程は、上記第２の実施形態と同様に行うことができる。
【０１０１】
（第２のアダプター核酸結合工程の変形例）
図２４、２５は、本実施形態における第２のアダプター核酸結合工程の変形例を説明する図である。第２のアダプター核酸結合工程の変形例は、第１のアダプター核酸２０を有さないこと以外は、上記第３実施形態と同様に行うことができる。
ＲＮＡ結合工程後、ポリ（Ａ）配列３２を有するＲＮＡ３１は、エクソソーム識別核酸１０にハイブリダイズした状態となっている。この状態で、ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を有する逆転写酵素を用いて逆転写反応を行う。これにより、ＲＮＡ３１が逆転写されて、エクソソーム識別核酸１０の３’末端側に隣接して、ＲＮＡ３１の相補配列３１’（ＲＮＡ３１のｃＤＮＡ）が形成される。逆転写酵素が、ＲＮＡ３１の５’末端に到達すると、そのＴｄＴ活性により、ＲＮＡの相補配列３１’の３’末端に特定配列６２を付加する（図２４）。
前記逆転写反応の反応液中に、特定相補配列４２と第２のＲＮＡ識別配列４１とを有する第２のアダプター核酸４０を添加しておくと、特定相補配列４２と特定配列６２とがハイブリダイズし、逆転写酵素は、第２のアダプター核酸４０の５’末端まで逆転写反応を行い、特定配列６２に続いて第２のアダプター核酸４０の相補配列４０’（第２のアダプター核酸４０のｃＤＮＡ）が形成される（図２５）。このようにして、ＲＮＡ３１の相補配列３１’に、第２のアダプター核酸４０の相補配列４０’を結合させることができる。
【０１０２】
逆転写反応の後、エクソソーム識別配列１１、ＲＮＡ３１、および第２のＲＮＡ識別配列４１を含む領域を、ＰＣＲ等により増幅してもよい。前記ＰＣＲに使用するプライマーは、上記第１実施形態で例示したものと同様のものを用いることができる。
【０１０３】
本実施形態において、工程（ａ）の後に得られる核酸としては、図７および図８に示す核酸５１−１ａ〜５１−ｍａおよび核酸５２−１ａ〜５２−ｎａにおいて、第１のアダプター核酸２０の配列を有さず、且つＲＮＡ３１−１〜３１−ｉと第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍとの間、および、ＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎとの間に、特定相補配列４２を有するものが例示される。
【０１０４】
当該核酸において、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉｍおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列は、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列であってもよい。図７および図８中、１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であってもよい。図７および図８中、４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列であってもよい。特定相補配列４２は、特定配列６２に置き換えられてもよい。
【０１０５】
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊの相補配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２と同じ配列であり、
２０として表される配列は、ＲＮＡ捕捉配列（ポリ（Ｔ）配列１４）に置き換えられ、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４１−１１〜４１−１ｍとして表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列の間には、特定配列６２が配置され、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎの相補配列である。
一例として、図７および図８中、３１−１〜３１−ｉおよび３１−１〜３１−ｊとして表される配列が、エクソソームに由来するＲＮＡ３１−１〜３１−ｉおよびＲＮＡ３１−１〜３１−ｊと同じ配列である場合、
１１−１および１１−２として表される配列は、エクソソーム識別核酸１０が有するエクソソーム識別配列１１−１およびエクソソーム識別配列１１−２の相補配列であり、
２０として表される配列は、所定の配列（ポリ（Ａ）配列３２）に置き換えられ、
３１−１〜３１−ｉとして表される配列および４１−１１〜４１−１ｍとして表される配列の間、並びに３１−１〜３１−ｊとして表される配列および４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列の間には、特定相補配列４２が配置され、
４１−１１〜４１−１ｍおよび４１−２１〜４１−２ｎとして表される配列は、第２のアダプター核酸４０が有する第２のＲＮＡ識別配列４１−１１〜４１−１ｍおよび第２のＲＮＡ識別配列４１−２１〜４１−２ｎと同じ配列である。
【０１０６】
上記の例では、エクソソーム識別核酸１０を結合させる担体としてビーズ１を例示したが、担体は、ビーズに限定されず、核酸を結合可能な粒子状の担体であれば、特に制限なく用いることができる。粒子状担体の例としては、例えば、ビーズ（磁気ビーズ、樹脂ビーズ等）、ハイドロゲル粒子（アルギン酸ナトリウムゲル、アガロースゲルなど）、金ナノ粒子等が挙げられる。粒子状担体の粒子径は、特に限定されないが、例えば、１〜２０μｍ程度が挙げられる。
【０１０７】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）は、工程（ａ）で作製された核酸の配列を解析する工程である。
【０１０８】
核酸配列の解析方法は、特に限定されず、公知の配列解析方法を用いることができる。例えば、配列解析方法としては、シーケンサーにより塩基配列を決定する方法、検出プローブを用いた核酸マイクロアレイを用いる方法等が挙げられる。
【０１０９】
一例として、配列解析方法は、シーケンサーにより塩基配列を決定する方法である。シーケンサーとしては、一例として、次世代シーケンサーが挙げられる。次世代シーケンサーを用いることにより、多数の核酸の塩基配列を高速で決定することができる。
塩基配列が決定された核酸は、共通のエクソソーム識別配列１１を有する核酸毎にグループ分けすることができる。次いで、各グループ内で、ＲＮＡの種類およびそれらの存在比を分析する。その際に、核酸増幅反応等により生じた存在比の変動は、第１のＲＮＡ識別配列２１および第２のＲＮＡ識別配列４１のいずれかまたは両方の配列情報に基づき、補正することができる。これにより、単一エクソソームに由来するＲＮＡの種類およびそれらの存在比に関する正確な情報を取得することができる。
【０１１０】
本実施態様にかかるＲＮＡの解析方法によれば、エクソソーム識別配列によりエクソソームを識別し、ＲＮＡ識別配列により核酸増幅反応等により生じるＲＮＡの存在比の変動を補正することができるため、エクソソーム毎にＲＮＡの種類およびその存在比を解析することができる。そのため、例えば、がん細胞等の異常細胞から放出された特定のエクソソームに由来するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を高感度に精度よく定量することができる。したがって、血液試料から、がん等の疾患を診断する方法に適用することができる。
【０１１１】
［核酸の作製方法］
一実施態様において、本発明は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別するエクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸の作製方法を提供する。
【０１１２】
一実施形態において、本実施態様にかかる核酸の作製方法は、エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を結合させる工程と、前記第１のアダプター核酸に、エクソソームに由来するＲＮＡを結合させる工程と、前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる工程と、を含む。前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方は、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する。
【０１１３】
本実施形態にかかる核酸の作製方法は、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第１実施形態または第３実施形態と同様に行うことができる。
本実施形態にかかる核酸の作製方法は、上記ＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第１実施形態または第３実施形態と同様に、エクソソーム識別配列またはその相補配列と、ＲＮＡ識別配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、をさらに含んでいてもよい。
本実施形態にかかる核酸の作製方法により作製される核酸は、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第１実施形態または第３実施形態で得られる核酸と同様である。
【０１１４】
一実施形態において、本実施態様にかかる核酸の作製方法は、エクソソーム識別配列と、エクソソームに由来するＲＮＡを捕捉するＲＮＡ捕捉配列とを有するエクソソーム識別核酸に、前記ＲＮＡ捕捉配列を介して、前記ＲＮＡを結合させる工程と、前記ＲＮＡに、前記ＲＮＡ識別配列を有する核酸を結合させる工程と、を含む。
【０１１５】
本実施態様にかかる核酸の作製方法は、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第２実施形態または第４実施形態と同様に行うことができる。本実施形態における「ＲＮＡ識別配列を有する核酸」は、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第２実施形態または第４実施形態における「第２のアダプター核酸」に該当する。
本実施形態にかかる核酸の作製方法は、上記ＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第２実施形態または第４実施形態と同様に、エクソソーム識別配列またはその相補配列と、ＲＮＡ識別配列その相補配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、を含む領域を増幅する工程、をさらに含んでいてもよい。
本実施形態にかかる核酸の作製方法により作製される核酸は、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法の工程（ａ）の第２実施形態または第４実施形態で得られる核酸と同様である。
【０１１６】
［核酸］
一実施態様において、本発明は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別する前記エクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を提供する。
【０１１７】
エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列、エクソソーム識別配列、およびＲＮＡ識別配列は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。ＲＮＡ識別配列は、ＲＮＡの５’末端側および３’末端側のいずれに位置していてもよく、ＲＮＡの５’末端側および３’末端側の両方に位置していてもよい。
【０１１８】
本実施態様にかかる核酸は、エクソソーム識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、およびＲＮＡ識別配列に加えて、さらに、５’末端および３’末端の少なくとも一方に任意の配列を含んでいてもよい。前記任意の配列は、核酸増幅反応におけるプライマーアニーリングサイトとして利用され得る。
【０１１９】
本実施態様にかかる核酸は、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法の工程（ａ）において作製される核酸と同様のものである。工程（ａ）は、第１〜第４実施形態のいずれの実施形態で行ったものであってもよい。
本実施態様にかかる核酸は、一例として、デオキシリボ核酸である。本実施態様にかかる核酸の具体例としては、図７に示される核酸５１−１ａ〜５ｍａ、図８に示される核酸５２−１ａ〜５２ｎａ、図１１に示される５１−１ｂ〜５１−ｍｂ、図１２に示される核酸５２−１ｂ〜５２ｎｂ、図１５に示される５１−１ｃ〜５１−ｍｃ、図１６に示される核酸５２−１ｃ〜５２ｎｃ等が挙げられる。また、前記の核酸において、ＲＮＡ３１もしくはその相補配列と第２のＲＮＡ識別配列４１もしくはその相補配列との間に、特定相補配列４２もしくは特定配列６２を有するものが例示される（前記工程（ａ）の第３実施形態で作製される核酸）。また、前記の核酸において、第１のアダプター核酸２０の配列を有さないものが挙げられる（前記工程（ａ）の第２実施形態および第４実施形態で作製される核酸）。
【０１２０】
本実施態様にかかる核酸の具体例を以下に例示する。
（例１）
５’側から３’側に向かって、エクソソーム識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、および第２のＲＮＡ識別配列が、この順で配置された核酸。前記エクソソーム識別配列の５’末端側には任意の配列を有していてもよい。前記第２のＲＮＡ識別配列の３’末端側には任意の配列を有していてもよい。前記エクソソーム識別配列と前記ＲＮＡの配列またはその相補配列との間には、任意の配列を有していてもよい。前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と第２のＲＮＡ識別配列との間には、任意の配列を有していてもよい。
【０１２１】
（例２）
５’側から３’側に向かって、エクソソーム識別配列、第１のＲＮＡ識別配列、およびＲＮＡの配列またはその相補配列が、この順で配置された核酸。前記エクソソーム識別配列の５’末端側には任意の配列を有していてもよい。前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の３’末端側には任意の配列を有していてもよい。前記エクソソーム識別配列と前記第１のＲＮＡ識別配列との間には、任意の配列を有していてもよい。前記第１のＲＮＡ識別配列と前記ＲＮＡの配列またはその相補配列との間には、任意の配列を有していてもよい。
【０１２２】
（例３）
５’側から３’側に向かって、エクソソーム識別配列、第１のＲＮＡ識別配列、ＲＮＡの配列またはその相補配列、および第２のＲＮＡ識別配列が、この順で配置された核酸。前記エクソソーム識別配列の５’末端側には任意の配列を有していてもよい。前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の３’末端側には任意の配列を有していてもよい。前記エクソソーム識別配列と前記第１のＲＮＡ識別配列との間には、任意の配列を有していてもよい。前記第１のＲＮＡ識別配列と前記ＲＮＡの配列またはその相補配列との間には、任意の配列を有していてもよい。前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と第２のＲＮＡ識別配列との間には、任意の配列を有していてもよい。
【０１２３】
（例４）
前記例１の核酸において、前記エクソソーム識別配列と前記ＲＮＡの配列またはその相補配列との間に、所定の配列（例、ポリ（Ｔ）、１０〜５０残基程度）を含む任意の配列を有する核酸。
【０１２４】
（例５〜７）
前記例１、３、および４の各核酸において、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と前記第２のＲＮＡ識別配列との間に、ＴｄＴ活性により形成される特定配列（例、Ｃに富んだ短い配列（例えば、２〜１０残基））を含む任意の配列を有する核酸。
【０１２５】
（例８）
前記例２の核酸において、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列の３’末端側に、ＴｄＴ活性により形成される特定配列（例、Ｃに富んだ短い配列（例えば、３〜１０残基））を含む任意の配列を有する核酸。
【０１２６】
（例９〜１６）
前記例１〜８の各核酸の相補配列からなる核酸。
【０１２７】
前記例１〜８のいずれかの核酸と、その相補鎖からなる二本鎖核酸。
【０１２８】
［キット］
一実施態様において、本発明は、エクソソームを識別するエクソソーム識別配列を有するエクソソーム識別核酸と、前記エクソソームに由来する個々のＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列を有するアダプター核酸と、１個の液滴内に１個の粒子状担体と１個のエクソソームとを封入させる流路を有する流体デバイスと、を備える、キットを提供する。
【０１２９】
本実施態様にかかるキットは、上記実施態様にかかるＲＮＡの解析方法に使用することができる。上記実施態様にかかるＲＮＡの解析方法に必要な試薬およびデバイスをキット化することにより、容易に上記実施態様にかかるＲＮＡの解析方法を実施することができる。
【０１３０】
＜エクソソーム識別核酸＞
エクソソーム識別核酸は、エクソソームを識別するエクソソーム識別配列またはその相補配列を有する。一実施形態において、エクソソーム識別核酸は、エクソソーム識別配列またはその相補配列に加えて、第１の相補配列と、第２の相補配列１２とを有する。これらの配列およびエクソソーム識別核酸は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。エクソソーム識別核酸は、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
【０１３１】
＜アダプター核酸＞
アダプター核酸は、エクソソームに由来する個々のＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列またはその相補配列（以下、まとめて「ＲＮＡ識別配列」と記載する場合がある）を有する。アダプター核酸としては、第１のＲＮＡ識別配列を有する第１のアダプター核酸、および第２のＲＮＡ識別配列を有する第２のアダプター核酸が挙げられる。本実施態様にかかるキットが第１のＲＮＡ識別配列を有する第１のアダプター核酸を有する場合、本実施態様にかかるキットは、さらに第２のＲＮＡ識別配列を有さない第２のアダプター核酸を備えていてもよい。本実施態様にかかるキットが第２のＲＮＡ識別配列を有する第２のアダプター核酸を有する場合、本実施態様にかかるキットは、さらに第１のＲＮＡ識別配列を有さない第１のアダプター核酸を備えていてもよい。
【０１３２】
≪第１のアダプター核酸≫
第１のアダプター核酸は、前記エクソソーム識別配列が有する第１の相補配列に相補的な配列を有する。第１のアダプター核酸は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。第１のアダプター核酸は、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
第１のアダプター核酸は、第１のＲＮＡ識別配列を有していてもよく、有していなくてもよい。ただし、後述の第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有さない場合、第１のアダプター核酸は、第１のＲＮＡ識別配列を有する。第１のＲＮＡ識別配列は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。
一例として、第１のアダプター核酸の５’末端はアデニル化されていてもよい。第１のアダプター核酸の５’末端がアデニル化されていることにより、第１のアダプター核酸とＲＮＡとの結合を効率よく行うことができる。
【０１３３】
≪第２のアダプター核酸≫
第２のアダプター核酸は、本実施態様にかかるキットにより作製される核酸の増幅反応を行う際に、プライマーアニーリング領域を提供する。第２のアダプター核酸は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。第２のアダプター核酸は、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
第２のアダプター核酸は、第２のＲＮＡ識別配列を有していてもよく、有していなくてもよい。ただし、上述の第１のアダプター核酸が第１のＲＮＡ識別配列を有さない場合、第２のアダプター核酸は、第２のＲＮＡ識別配列を有する。第２のＲＮＡ識別配列は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有する場合、一例として、第２のＲＮＡ識別配列は、第２のアダプター核酸の３’末端に配置される。第２のＲＮＡ識別配列が、第２のアダプター核酸の３’末端に配置されることにより、第２のアダプター核酸とＲＮＡとの結合を効率よく行うことができる。
第２のアダプター核酸は、ＴｄＴ活性を有する逆転写酵素によりＤＮＡに付加される特定配列に相補的（特定相補配列）な配列を３’末端に有していてもよい。
【０１３４】
＜流体デバイス（第１の流体デバイス）＞
流体デバイスは、１個の液滴内に１個の担体と１個のエクソソームとを封入させる流路を有する流体デバイスである。１個の液滴内に１個の担体と１個のエクソソームとを封入可能なものであれば、流体デバイスの構造は特に限定されない。流体デバイスは、一例として、油中水滴を作製可能な流体デバイスであって、１個の水滴内に１個のビーズと１個のエクソソームとを封入可能な流体デバイスである。以下、後述の第２の流体デバイスと区別するため「第１の流体デバイス」ということがある。
【０１３５】
図２６は、第１の流体デバイスの具体例を示す図である。図２６に例示する流体デバイス１１０は、油溶液用インレット１１１、第１の水溶液用インレット１１２、第２の水溶液用インレット１１３、および油中水滴用アウトレット１１５を備えている。流体デバイス１１０は、さらに、油溶液用インレット１１１から供給された油溶液が流れる油溶液用流路１１６、第１の水溶液用インレット１１２から供給された水溶液が流れる第１の水溶液用流路１１７、第２の水溶液用インレット１１３から供給された水溶液が流れる第２の水溶液用流路１１８、油溶液用流路１１６と第１の水溶液用流路１１７と第２の水溶液用流路１１８との交差部１１４、ならびに交差部１１４で生成された油中水滴を油中水滴用アウトレット１１５に運搬する油中水滴用流路１１９を備えている。交差部１１４では、図２６ｂおよび図２６ｃに示すように、第１の水溶液用流路１１７、第２の水溶液用流路１１８および油中水滴用流路１１９の流路幅が狭窄している。この交差部１１４の構造により、第１の水溶液用流路１１７および第２の水溶液用流路１１８から供給される水溶液が、油溶液用流路１１６を流れる油溶液により分断されて、油中液滴（油中水滴）が形成される。
【０１３６】
流体デバイス１１０において、一例として、油溶液用流路１１６、第１の水溶液用流路１１７、第２の水溶液用流路１１８、および油中水滴用流路１１９の流路幅は６０μｍであり、狭窄部の幅は３０μｍであり、全流路の高さは５０μｍである。流路幅、狭窄部の幅、および流路の高さは、前記のものに限定されず、使用するビーズの大きさに応じて適宜設定可能である。例えば、流路の幅を４０〜１００μｍ、狭窄部の幅を１０〜５０μｍ、流路の高さを３０〜１００μｍ等とすることができる。
油溶液用インレット１１１から油溶液用流路１１６への出口付近には、油溶液用流路１１６の目詰まりを防ぐために、マイクロピラー等からなるフィルターが設置されていてもよい。第１の水溶液用インレット１１２から水溶液用流路１１７への出口付近には、水溶液用流路１１７の目詰まりを防ぐために、マイクロピラー等からなるフィルターが設置されていてもよい。第２の水溶液用インレット１１３から水溶液用流路１１８への出口付近には、水溶液用流路１１８の目詰まりを防ぐために、マイクロピラー等からなるフィルターが設置されていてもよい。
【０１３７】
上記のような構成を備える流体デバイス１１０の使用方法について説明する。以下の説明では、担体の一例としてビーズを用いているが、粒子状の固相担体であれば、他の担体でも同様に実施することができる。
【０１３８】
まず、油溶液用インレット１１１から油溶液を注入する。注入された油溶液は、油溶液用流路１１６に供給される。次いで、第１の水溶液用インレット１１２からビーズを含む水溶液を注入する。注入されたビーズ含有水溶液は水溶液用流路１１７に供給されて、交差部１１４で油溶液と交差する。また、第２の水溶液用インレット１１３からエクソソームを含む水溶液を注入する。注入されたエクソソーム含有水溶液は水溶液用流路１１８に供給されて、交差部１１４で油溶液と交差する。
交差部１１４では、第１の水溶液用流路１１７から供給されるビーズ含有水溶液と、第２の水溶液用流路１１８から供給されるエクソソーム含有水溶液とが合流し、油溶液用流路１１６から供給される油溶液により分断されて、油中水滴が生成される。この際に、油中水滴内に、一定の割合で、１個のビーズと１個のエクソソームとが封入される。
交差部１１４で生成された油中水滴は、油中水滴用流路１１９を通って油中水滴用アウトレット１１５に到達する。油中水滴用アウトレット１１５に到達した油中水滴は、マイクロピペット等により油中水滴用アウトレット１１５から回収することができる。
流体デバイス１１０には、図示しない動力源が接続されていてもよく、前記動力源により、油溶液用流路１１６、第１の水溶液用流路１１７、および第２の水溶液用流路１１８を流れる油溶液および水溶液の流れが制御されてもよい。
【０１３９】
上記において、ビーズ含有水溶液中のビーズ濃度が濃すぎると、１個の油中水滴に複数のビーズが封入される可能性があるため、５〜１５個程度の水滴に、１個の割合でビーズが封入される程度のビーズ濃度に設定してもよい。一例として、ビーズ濃度は、１０４〜１０６個／１００μＬ程度とすることができる。また、エクソソーム含有水溶液中のエクソソーム濃度が濃すぎると、１個の油中水滴に複数のエクソソームが封入される可能性があるため、５〜１５個程度の水滴に、１個の割合でエクソソームが封入される程度のエクソソーム濃度に設定してもよい。一例として、エクソソーム濃度は、１０４〜１０６個／１００μＬ程度とすることができる。
【０１４０】
また、ビーズ含有水溶液に、ビーズに加えて、適宜必要な試薬（例えば、界面活性剤、ＲＮＡリガーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤など）を添加しておくことにより、ビーズおよびエクソソームと共にこれらの試薬を水滴内に封入することができる。
【０１４１】
流体デバイス１１０の油溶液用インレット１１１には、あらかじめ予め油溶液が充填されていてもよい。第１の水溶液用インレット１１２には、エクソソーム識別核酸を結合させたビーズ、界面活性剤、ＲＮＡリガーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤等を含む水溶液が予め充填されていてもよい。
【０１４２】
＜他の構成＞
本実施形態のキットは、上記構成に加えて、任意に他の構成を備えていてもよい。他の構成としては、例えば、第２の流体デバイス、エクソソーム識別核酸の第２の相補配列に相補的な配列を有する第３のアダプター核酸を結合させた担体、プライマー等が挙げられる。
【０１４３】
（第２の流体デバイス）
第２の流体デバイスは、１個の液滴内に１個の担体を封入させる流路を有する流体デバイスである。１個の液滴内に１個の粒子状担体を封入可能なものであれば、流体デバイスの構造は特に限定されない。第１の流体デバイスは、一例として、油中水滴を作製可能な流体デバイスであって、１個の水滴内に１個の粒子状担体を封入可能な流体デバイスである。
【０１４４】
図２７は、第２の流体デバイスの具体例を示す図である。図２７に例示する流体デバイス１００は、油溶液用インレット１０１、水溶液用インレット１０２、および油中水滴用アウトレット１０４を備えている。流体デバイス１００は、さらに、油溶液用インレット１０１から供給された油溶液が流れる油溶液用流路１０５、水溶液用インレット１０２から供給された水溶液が流れる水溶液用流路１０６、油溶液用流路１０５と水溶液用流路１０６との交差部１０３、ならびに交差部１０３で生成された油中水滴を油中水滴用アウトレット１０４に運搬する油中水滴用流路１０７を備えている。交差部１０３では、図２７ｃに示すように、水溶液用流路１０６および油中水滴用流路１０７の流路幅が狭窄している。この交差部１０３の構造により、水溶液用流路１０６を流れる水溶液が、油溶液用流路１０５を流れる油溶液により分断されて、油中液滴（油中水滴）が形成される。
【０１４５】
流体デバイス１００において、一例として、油溶液用流路１０５、水溶液用流路１０６、および油中水滴用流路１０７の流路幅は１００μｍであり、狭窄部の幅は４０μｍであり、全流路の高さは５０μｍである。流路幅、狭窄部の幅、および流路の高さは、前記のものに限定されず、使用するビーズの大きさに応じて適宜設定可能である。例えば、流路の幅を５０〜３００μｍ、狭窄部の幅を２０〜８０μｍ、流路の高さを３０〜１００μｍ等とすることができる。
油溶液用インレット１０１から油溶液用流路１０５への出口付近には、油溶液用流路１０５の目詰まりを防ぐために、マイクロピラー等からなるフィルターが設置されていてもよい。水溶液用インレット１０２から水溶液用流路１０６への出口付近には、水溶液用流路１０６の目詰まりを防ぐために、マイクロピラー等からなるフィルターが設置されていてもよい。
【０１４６】
上記のような構成を備える流体デバイス１００の使用方法について説明する。以下の説明では、粒子状担体の一例としてビーズを用いているが、粒子状の固相担体であれば、他の担体でも同様に実施することができる。
【０１４７】
まず、油溶液用インレット１０１から油溶液を注入する。注入された油溶液は、油溶液用流路１０５に供給される。次いで、水溶液用インレット１０２から水溶液を注入する。注入された水溶液は水溶液用流路１０６に供給されて、交差部１０３で油溶液と交差する。この際に、水溶液用流路１０６から供給された水溶液が油溶液用流路１０５を流れる油溶液により分断されて、油中水滴が生成される。交差部１０３で生成された油中水滴は、油中水滴用流路１０７を通って油中水滴用アウトレット１０４に到達する。油中水滴用アウトレット１０４に到達した油中水滴は、マイクロピペット等により油中水滴用アウトレット１０４から回収することができる。
流体デバイス１００には、図示しない動力源が接続されていてもよく、前記動力源により、油溶液用流路１０５および水溶液用流路１０６を流れる油溶液および水溶液の流れが制御されてもよい。
【０１４８】
上記において、水溶液用インレット１０２に注入する水溶液にビーズを混合しておくことにより、交差部１０３で油中水滴が生成する際に、１個のビーズを１個の油中水滴に封入することができる。水溶液中のビーズ濃度が濃すぎると、１個の油中水滴に複数のビーズが封入される可能性があるため、５〜１５個程度の水滴に、１個の割合でビーズが封入される程度のビーズ濃度に設定してもよい。一例として、ビーズ濃度は、１０４〜１０６個／１００μＬ程度とすることができる。
【０１４９】
また、水溶液に、ビーズに加えて、適宜必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマーなど）を添加しておくことにより、ビーズと共にこれらの試薬を水滴内に封入することができる。
【０１５０】
流体デバイス１００の油溶液用インレット１０１には、あらかじめ予め油溶液が充填されていてもよい。水溶液用インレット１０２には、第３のアダプター核酸を結合させたビーズ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を含む水溶液が予め充填されていてもよい。
【０１５１】
（担体）
担体は、一例として、エクソソーム識別核酸の第２の相補配列に相補的な配列を有する第３のアダプター核酸を結合させた粒子状担体である。粒子状担体の例としては、例えば、ビーズ（磁気ビーズ、樹脂ビーズ等）、ハイドロゲル粒子（アルギン酸ナトリウムゲル、アガロースゲルなど）、金ナノ粒子等が挙げられる。粒子状担体の粒子径は、特に限定されないが、例えば、１〜２０μｍ程度が挙げられる。粒子状担体と第３のアダプター核酸との結合方法は、粒子状担体の種類に応じて、適宜選択することができる。一例として、アビジン−ビオチン結合を利用する方法、核酸をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、粒子状担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法、金-チオール結合を利用する方法等が挙げられる。第３のアダプター核酸は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様のものである。第３のアダプター核酸は、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
【０１５２】
（プライマー）
プライマーとしては、エクソソーム識別核酸のエクソソーム識別配列、前記エクソソーム識別核酸に結合されたエクソソームに由来するＲＮＡの配列もしくはその相補配列、および前記エクソソーム識別核酸もしくは前記ＲＮＡに結合されたアダプター核酸のＲＮＡ識別配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットを構成するプライマーが挙げられる。プライマーの具体例としては、下記第１のプライマー、第２のプライマー、および第３のプライマーが挙げられる。
【０１５３】
（第１のプライマー）
第１のプライマーは、エクソソーム識別核酸の第１の相補配列にアニーリングし得るプライマーである。第１のプライマーは、前記ビーズに結合する第３のアダプター核酸とともに、ビーズ上で、エクソソーム識別核酸を増幅するために用いられる。第１のプライマーは、第１の相補配列にアニーリングして、エクソソーム識別核酸を増幅し得るものであれば、特に限定されない。一例として、第１のプライマーは、エクソソームに由来するＲＮＡを捕捉するＲＮＡ捕捉配列またはその相補配列を有していてもよい。前記ＲＮＡ捕捉配列としては、ポリ（Ｔ）が挙げられる。第１のプライマーは、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
【０１５４】
（第２のプライマー）
第２のプライマーは、エクソソーム識別核酸の前記第２の相補配列または第３のアダプター核酸にアニーリングし得るプライマーである。第２のプライマーは、後述する第３のプライマーとともに、エクソソーム識別配列とＲＮＡとＲＮＡ識別配列とを含む領域を増幅するために用いられる。第２のプライマーは、エクソソーム識別核酸の前記第２の相補配列または第３のアダプター核酸にアニーリングして、エクソソーム識別配列とＲＮＡとＲＮＡ識別配列とを含む領域を増幅し得るものであれば、特に限定されない。第２のプライマーは、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
【０１５５】
（第３のプライマー）
第３のプライマーは、第２のアダプター核酸にアニーリングし得るプライマーである。第３のプライマーは、前述の第２のプライマーとともに、エクソソーム識別配列とＲＮＡとＲＮＡ識別配列とを含む領域を増幅するために用いられる。第３のプライマーは、第２のアダプター核酸にアニーリングして、エクソソーム識別配列とＲＮＡとＲＮＡ識別配列とを含む領域を増幅し得るものであれば、特に限定されない。第２のアダプター核酸が第２のＲＮＡ識別配列を有する場合、第３のプライマーは、第２のアダプター核酸において、第２のＲＮＡ識別配列の５’末端側にアニーリングするように設計される。第３のプライマーは、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成方法等により、合成することができる。
【０１５６】
本実施態様のキットは、上記の構成のほか、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＡＴＰおよび界面活性剤からなる群より選択される、少なくとも１種を備えていてもよい。これらの試薬は、上記実施態様にかかるＲＮＡの解析方法において使用することができる。
【０１５７】
本実施態様にかかるキットの構成例を以下に例示するが、これらに限定されない。
【０１５８】
（構成例１）
エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸、エクソソーム識別核酸を結合させた担体、第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸、第２のＲＡＮ識別配列またはその相補配列を有する第２のアダプター核酸、第２のプライマー、第３のプライマー、界面活性剤、ＲＮＡリガーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の流体デバイス。
【０１５９】
（構成例２）
エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸、エクソソーム識別核酸を結合させた担体、第１の相補配列に相補的な配列と第１のＲＮＡ識別配列またはその相補配列とを有する第１のアダプター核酸、第２のアダプター核酸、第２のプライマー、第３のプライマー、界面活性剤、ＲＮＡリガーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の流体デバイス。
【０１６０】
（構成例３）
エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸、エクソソーム識別核酸を結合させた担体、第１の相補配列に相補的な配列と第１のＲＮＡ識別配列またはその相補配列とを有する第１のアダプター核酸、第２のＲＮＡ識別配列を有する第２のアダプター核酸、第２のプライマー、第３のプライマー、界面活性剤、ＲＮＡリガーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の流体デバイス。
【０１６１】
（構成例４〜６）
上記構成例１〜３のそれぞれにおいて、エクソソーム識別核酸が第２の相補配列をさらに有し、エクソソーム識別核酸を結合させた担体に替えて、第３のアダプター核酸を結合させた担体、第１のプライマー、および第２の流体デバイスを備える構成。
【０１６２】
（構成例７〜１２）
上記構成例１〜６のそれぞれにおいて、逆転写酵素がＴｄＴ活性を有する逆転写酵素であり、第２のアダプター核酸がさらに前記ＴｄＴ活性により核酸に付加される特定配列に相補的な特定相補配列を有する構成。
【０１６３】
（構成例１３）
エクソソーム識別配列またはその相補配列を有するエクソソーム識別核酸、エクソソーム識別核酸を結合させた担体、第２のＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する第２のアダプター核酸、第２のプライマー、第３のプライマー、界面活性剤、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＲＮＡリガーゼ、逆転写酵素、ＡＴＰ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の流体デバイス。
【０１６４】
（構成例１４）
上記構成例１３において、エクソソーム識別核酸が第２の相補配列をさらに有し、エクソソーム識別核酸を結合させた担体に替えて、第３のアダプター核酸を結合させた担体、第１のプライマー、および第２の流体デバイスを備える構成。
【０１６５】
（構成例１５〜１６）
上記構成例１３〜１４のそれぞれにおいて、逆転写酵素がＴｄＴ活性を有する逆転写酵素であり、第２のアダプター核酸がさらに前記ＴｄＴ活性により核酸に付加される特定配列に相補的な特定相補配列を有する構成。ＲＮＡリガーゼは備えなくてもよい。
【０１６６】
本実施態様にかかるキットは、さらに、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、各種反応用のバッファー類、油溶液、核酸フリー精製水、使用説明書等を備えていてもよい。
【０１６７】
［ＲＮＡ解析システム］
一実施態様において、本発明は、エクソソームに由来するＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記エクソソームを識別する前記エクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を有する核酸を作製する核酸作製部と、前記核酸の配列を解析する配列解析部と、を備える、ＲＮＡ解析システムを提供する。
【０１６８】
一例として、前記核酸作製部は、前記エクソソーム識別配列またはその相補配列と第１の相補配列と第２の相補配列とを有するエクソソーム識別核酸を１分子と、前記第２の相補配列に相補的な配列を有する第３のアダプター核酸を結合させた担体を１個と、プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、を１個の液滴内に封入する、第１の油中液滴作製部と、前記エクソソーム識別核酸を、前記第２の相補配列を介して前記第３のアダプター核酸に結合させて、前記担体上で、前記エクソソーム識別核酸を増幅する、第１の核酸増幅部と、前記担体上で増幅した前記エクソソーム識別核酸に、前記第１の相補配列に相補的な配列を有する第１のアダプター核酸を、前記第１の相補配列を介して結合させる、第１のアダプター核酸結合部と、前記第１のアダプター核酸を結合させた前記担体を１個と、エクソソームを１個と、ＲＮＡリガーゼと、界面活性剤と、を１個の液滴内に封入する、第２の油中液滴作製部と、前記界面活性剤で前記エクソソームを破壊し、前記第１のアダプター核酸に、前記エクソソームから放出されたＲＮＡを結合させる、ＲＮＡ結合部と、前記第１のアダプター核酸に結合させた前記ＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる、第２のアダプター核酸結合部と、前記エクソソーム識別配列と、前記ＲＮＡの配列またはその相補配列と、前記ＲＮＡを識別するＲＮＡ識別配列と、を含む領域を増幅する、第２の核酸増幅部と、から構成される。前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方は、前記ＲＮＡ識別配列またはその相補配列を有する。
【０１６９】
図２８は、本実施態様にかかるＲＮＡ解析システムの構成例を示す図である。
図２８に示すＲＮＡ解析システム２００は、第１の油中液滴作製部の具体例として第１の油中水滴作製部２１０、第２の油中液滴作製部の具体例として第２の油中水滴作製部２４０を備えている。ＲＮＡ解析システム２００は、さらに、第１の核酸増幅部２２０と、第１のアダプター核酸結合部２３０と、ＲＮＡ結合部２５０と、第２のアダプター核酸結合部２６０と、第２の核酸増幅部２７０と、配列解析部２８０と、を備えている。ＲＮＡ解析システム２００は、さらに、任意の構成として、配列解析部２８０における解析結果を出力する出力部２９０、および解析結果を記憶する記憶部３００等を備えることができる。ＲＮＡ解析システム２００は、さらに、前記各部の動作を制御する制御部３１０、制御部３１０の制御に従い前記各部を駆動する駆動部３２０を備えることができる。駆動部３２０は、各部ごとに設置されていてもよい。以下の説明において、「エクソソーム識別配列」はその相補配列であってもよく、「ＲＮＡ識別配列」はその相補配列であってもよい。
【０１７０】
＜第１の油中水滴作製部＞
第１の油中水滴作製部２１０では、油中水滴が作製される。第１の油中水滴作製部２１０で作製される油中水滴には、エクソソーム識別核酸を１分子と、第３のアダプター核酸を結合させた担体（粒子状担体、例えばビーズ）を１個と、第１のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰとが封入される。エクソソーム識別核酸、第３のアダプター核酸を結合させた担体、第１のプライマーは、上記「［キット］」で説明したものと同様である。
第１の油中水滴作製部２１０は、一例として、上記「［キット］」で説明した第２の流体デバイスと同様の流路構成を備えることができる。油溶液用インレットから油溶液用流路に油溶液が供給されるとともに、水溶液用インレットから水溶液用流路に、エクソソーム識別核酸、第１のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等を含有する担体含有水溶液が供給されて、両流路の交差部で、原則として、１個の水滴に１個の担体が封入された油中水滴が形成される。油溶液および担体含有水溶液の流路への供給は、駆動部３２０により稼働するポンプ等により行われ、制御部３１０により制御される。
第１の油中水滴作製部２１０で作製された油中水滴は、流路等により第１の核酸増幅部２２０に運搬される。
【０１７１】
＜第１の核酸増幅部＞
第１の核酸増幅部２２０では、担体上で、エクソソーム識別核酸の核酸増幅反応を行う。第１の油中水滴作製部２１０で作製された油中水滴には、エクソソーム識別核酸を１分子と、第３のアダプター核酸を結合させた担体を１個と、が封入されており、エクソソーム識別核酸は、第２の相補配列を介して、第３のアダプター核酸に結合する。油中水滴中には、さらに、第１のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰとが封入されているため、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより、担体上で、エクソソーム識別核酸が増幅される。
第１の核酸増幅部２２０では、核酸増幅反応用の反応槽を備え、第１の油中水滴作製部２１０から運ばれた油中水滴は前記反応槽内に入れられる。反応槽は、加熱冷却機構を備え、制御部３１０により、熱変性、アニーリングおよび伸長反応の温度サイクルを繰り返すように制御される。前記温度サイクルを２０〜４０回程度繰り返した後、油中水滴は、流路等により第１のアダプター核酸結合部２３０に運搬される。
【０１７２】
＜第１のアダプター核酸結合部＞
第１のアダプター核酸結合部２３０では、担体上で増幅したエクソソーム識別核酸に、第１のアダプター核酸を結合させる。第１のアダプター核酸は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様である。第１のアダプター核酸は、エクソソーム識別核酸が有する第１の相補配列に相補的な配列を有しており、当該相補的な配列を介して、エクソソーム識別核酸に結合することができる。
第１のアダプター核酸結合部２３０は、一例として、遠心分離機構およびハイブリダイゼーション反応用の反応槽を備える。前記遠心分離機構は、駆動部３２０を介して制御部３１０により制御され、第１のアダプター核酸結合部２３０から運ばれた油中水滴を遠心分離して、担体を回収する。回収された担体は反応槽に入れられ、第１のアダプター核酸、ハイブリダイゼーションバッファー等が反応槽に投入される。反応槽は、加熱冷却機構を備え、熱変性温度に数分間制御された後、ハイブリダイゼーション反応温度（例、２０〜４０℃程度）となるように、制御部３１０により温度制御される。ハイブリダイゼーション反応後、担体は、流路等により第２の油中水滴作製部２４０に運搬される。
【０１７３】
＜第２の油中水滴作製部＞
第２の油中水滴作製部２４０では、油中水滴が作製される。第２の油中水滴作製部２４０で作製される油中水滴には、第１のアダプター核酸を結合させた担体を１個と、エクソソームを１個と、ＲＮＡリガーゼと、界面活性剤とが封入される。第１のアダプター核酸を結合させた担体、エクソソームは、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様である。ＲＮＡリガーゼおよび界面活性剤は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で例示したものを用いることができる。
第２の油中水滴作製部２４０は、一例として、上記「［キット］」で説明した第１の流体デバイスと同様の流路構成を備えることができる。第１のアダプター核酸結合部２３０から運ばれた担体は、第１の水溶液用インレットに運搬される間に、ＲＮＡリガーゼ、界面活性剤等を含む水溶液と混合されて、担体含有水溶液が調製される。前記担体含有水溶液は、第１の水溶液用インレットから第１の水溶液用流路に供給される。油溶液用インレットから油溶液用流路に油溶液が供給される。第２の水溶液用インレットから第２の水溶液用流路に、エクソソーム、ＲＮＡ分解酵素阻害剤等を含有するエクソソーム含有水溶液が供給される。これらの流路の交差部では、原則として、１個の水滴に１個の担体と１個のエクソソームが封入された油中水滴が形成される。油溶液、担体含有水溶液、およびエクソソーム含有水溶液の流路への供給は、駆動部３２０により稼働するポンプ等により行われ、制御部３１０により制御される。
第２の油中水滴作製部２４０で作製された油中水滴は、流路等によりＲＮＡ結合部２５０に運搬される。
【０１７４】
＜ＲＮＡ結合部＞
ＲＮＡ結合部２５０では、第２の油中水滴作製部２４０で作製された油中水滴中で、界面活性剤によりエクソソームを破壊する。次いで、ＲＮＡリガーゼにより、第１のアダプター核酸に、エクソソームから放出されたＲＮＡを結合させる。
ＲＮＡ結合部２５０では、ライゲーション反応用の反応槽を備え、第２の油中水滴作製部２４０から運ばれた油中水滴は前記反応槽内に入れられる。反応槽は、加熱冷却機構を備え、制御部３１０により、ライゲーション反応温度に制御される。ライゲーション反応後、油中水滴は、流路等により第２のアダプター核酸結合部２６０に運搬される。
【０１７５】
＜第２のアダプター核酸結合部＞
第２のアダプター核酸結合部２６０では、第１のアダプター核酸に結合させたＲＮＡに、第２のアダプター核酸を結合させる。第２のアダプター核酸は、上記「［ＲＮＡの解析方法］」で説明したものと同様である。
第２のアダプター核酸結合部２６０は、一例として、遠心分離機構およびライゲーション反応用の反応槽を備える。前記遠心分離機構は、駆動部３２０を介して制御部３１０により制御され、ＲＮＡ結合部２５０から運ばれた油中水滴を遠心分離して、担体を回収する。回収された担体は反応槽に入れられ、第２のアダプター核酸、ＲＮＡリガーゼ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、ライゲーションバッファー等が反応槽に投入される。反応槽は、加熱冷却機構を備え、ライゲーション反応温度となるように、制御部３１０により温度制御される。ライゲーション反応後、担体は、流路等により第２の核酸増幅部２７０に運搬される。
【０１７６】
＜第２の核酸増幅部＞
第２の核酸増幅部２７０では、エクソソーム識別配列と、ＲＮＡの配列またはその相補配列と、ＲＮＡ識別配列と、を含む領域が増幅される。ＲＮＡ識別配列は、前記第１のアダプター核酸および前記第２のアダプター核酸の少なくとも一方に含まれている。
第２の核酸増幅部２７０では、核酸増幅反応用の反応槽を備え、第２のアダプター核酸結合部２６０から運ばれた担体は前記反応槽内に入れられる。反応槽は、加熱冷却機構を備え、制御部３１０により、熱変性、アニーリングおよび伸長反応の温度サイクルを２０〜６０回程度繰り返すように制御される。第２の核酸増幅部２７０で増幅された核酸断片は、流路等により第２の核酸増幅部２７０に運搬される。
【０１７７】
＜配列解析部２８０＞
配列解析部２８０では、第２の核酸増幅部で増幅された核酸断片の配列解析が行われる。配列解析部２８０は、一例として、シーケンサーと同様の構成を備えている。配列解析部２８０は、ネットワークで接続されたシーケンサー（例えば、次世代シーケンサー）であってもよい。
配列解析部２８０は、さらに、エクソソーム識別配列に基づいて核酸配列をグループ分けし、核酸増幅反応等による増幅効率等の違い等により生じる核酸存在量のずれを補正するため、ＲＮＡ識別配列に基づいて前記グループ内でのＲＮＡの存在比の変動を補正し、前記グループ内でのＲＮＡ存在比を算出する演算機構を備えていてもよい。例えば、同一のＲＮＡ識別配列を有する核酸断片は、１分子のＲＮＡに由来するものとして、ＲＮＡ存在比をＲＮＡ識別配列で演算することにより、ＲＮＡの存在比を補正することができる。演算は、一例としてＲＮＡ存在比をＲＮＡ識別配列の存在比で割ることで行われる。
【０１７８】
＜動作例＞
上記のような構成を備えるＲＮＡ解析システム２００の動作について説明する。
まず、第１の油中水滴作製部２１０において、油中水滴が作製される。油中水滴１個には、１分子のエクソソーム識別核酸と、第３のアダプター核酸が結合された担体１個とが封入される。また、同時に、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ等が封入される。エクソソーム識別核酸は、第２の相補配列を介して、第３のアダプター核酸に結合する。
次に、第１の核酸増幅部２２０において、油中水滴中で、核酸増幅反応が行われる。これにより、担体上で、エクソソーム識別核酸が増幅され、エクソソーム識別核酸が結合した担体が作製される。
次に、第１のアダプター核酸結合部２３０において、油中水滴から担体が回収され、エクソソーム識別核酸に第１のアダプター核酸が結合される。第１のアダプター核酸は、エクソソーム識別核酸の第１の相補配列に相補的な配列を介して、エクソソーム識別核酸に結合する。
次に、第２の油中水滴作製部２４０において、第１のアダプター核酸を結合した担体１個と、エクソソーム１個とを含む油中水滴が作製される。油中水滴には、同時に、界面活性剤、ＲＮＡリガーゼが封入される。
次に、ＲＮＡ結合部２５０において、第２の油中水滴作製部２４０で作製された油中水滴中で、界面活性剤によりエクソソームが破壊され、エクソソームから放出される。次いで、ＲＮＡリガーゼにより、第１のアダプター核酸に、ＲＮＡが結合される。
次に、第２のアダプター核酸結合部２６０において、油中水滴から担体が回収され、ＲＮＡリガーゼによりＲＮＡに第２のアダプター核酸が結合される。
次に、第２の核酸増幅部２７０において、エクソソーム識別配列と、ＲＮＡと、ＲＮＡ識別配列と、を含む領域が増幅される。これにより、エクソソーム識別配列と、ＲＮＡと、ＲＮＡ識別配列と、を含む核酸が作製される。
次に、配列解析部２８０において、第２の核酸増幅部２７０で作製された核酸の配列解析が行われ、核酸の塩基配列が決定される。配列解析部２８０で決定された核酸の塩基配列は、一例として、出力部２９０から出力される。
【０１７９】
ＲＮＡ解析システム２００は、第１のアダプター核酸結合部２３０を備えない構成としてもよい。この場合、ＲＮＡ解析システム２００は、第１の核酸増幅部２２０において、エクソソーム識別核酸にポリ（Ｔ）配列等のＲＮＡ捕捉配列を付加してもよい。また、ＲＮＡ結合部２５０において、ポリ（Ａ）ポリメラーゼにより、エクソソームから放出されたＲＮＡをポリアデニル化してもよい。
【０１８０】
ＲＮＡ解析システム２００は、第２のアダプター核酸結合部２６０において、ＴｄＴ活性を有する逆転写酵素により、逆転写反応を行ってもよい。また、第２のアダプター核酸として、前記特定配列に相補的な配列を有するものを用いてもよい。
【０１８１】
本実施態様にかかるＲＮＡ解析システムは、上記実施態様にかかるＲＮＡの解析方法を実施するために使用することができる。また、本実施態様にかかるＲＮＡ解析システムは、上記説明した実施形態に限定されず、上記実施態様にかかるＲＮＡ解析方法を実施するための構成を適宜備えることができる。
また、上記した本実施形態によれば、エクソソーム識別配列によって識別された単一エクソソームに内包されるＲＮＡの種類及び存在量を解析することができる。
【０１８２】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【０１８３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１８４】
実施例に記載のＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴヌクレオチド配列を表１に示す。表中、下線、波線、二重線、イタリックで示した配列がそれぞれ相補的に結合する。Ｂａｒｃｏｄｅ−３にはエクソソームを識別するためのエクソソーム識別配列（ランダム配列）が、ＲＮａｄｐ３にはＲＮＡの分子数をカウントするためのＲＮＡ識別配列（ランダム配列）が、それぞれ付与されている（Kivioja, T. et al., Nat. Methods 9, 72-74 (2011).; Macosko, E. et al., Cell 161, 1202-1214 (2015).）。また、ＲＮａｄｐ３およびＲＮａｄｐ４中のランダム配列は、ｍｉＲＮＡとのライゲーション効率を増大させる効果がある（Zhuang, F., et al., Nucleic Acids Res. 40, e54 (2012).）。
【０１８５】
【表１】
2020198831.tif 000002
【０１８６】
［実施例１］
（１）プライマーを提示したビーズの調製
ストレプトアビジンが固定化された直径１０μｍのポリスチレンビーズ（ＳｕｐｅｒＡｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１５０  μＬを１．５ｍＬチューブに取り、遠心した（１５，０００ｇ、２分）。溶液を丁寧に除いた後、１×Ｂ  and  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を１５０μＬ加えて懸濁し、遠心した（１５，０００ｇ，２分）。この操作を３回繰り返し、ビーズを洗浄した。これに、５’末端にＤｕａｌ  ｂｉｏｔｉｎが付与されたＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｓｐｒ−Ｐ４−５’ｂｉｏ：配列番号１；プライマー）溶液（１０μＭ  ｉｎ  １×Ｂ  and  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ）を１２０μＬ加え、室温で２０分混合し、両者を結合させた。その後、遠心（１５，０００  ｇ，２分）を行って溶液を取り除き、１×Ｂ  and  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒを１５０μＬ加えて懸濁、遠心した（１５，０００ｇ，２分）。この操作を３回繰り返し、未結合のプライマーを除去した。最後に、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を１００μＬ加えてビーズを懸濁した。これを１０，０００倍希釈した溶液を１μＬカバーガラス上に滴下して乾燥させた後、顕微鏡観察を行い、ビーズの濃度を決定した。
【０１８７】
（２）エマルジョンＰＣＲを利用したエクソソーム識別配列を有するＤＮＡビーズの調製
表２に示す組成の水溶液を調製し、図２７に示す流体デバイスを用いて、直径４０μｍの油中水滴を作製した。油溶液は、４．５％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ８０、０．４５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むミネラルオイルを用いた。
【０１８８】
【表２】
2020198831.tif 000003
【０１８９】
作製した油中水滴をＰＣＲチューブに回収し、ＰＣＲを行った。反応は前処理（９４℃，２分）の後、変性（９４℃，１５秒）、アニーリング（５１．６℃，３０秒）および伸長（６８℃，１５秒）を１サイクルとし、４０サイクル行った。
【０１９０】
（３）ＤＮＡビーズの回収
反応後、油中水滴を１．５ｍＬチューブに移し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを１５０μＬ添加後、遠心を行った（１７，４００ｇ，３分，４℃）。上層および中間層を除去した後、下層に１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒを１５０μＬ添加し、油中水滴を破壊した。懸濁後、遠心を行い（１７，４００ｇ，３分，４℃）、ビーズを沈殿させた。溶液を除去した後、ビーズにエタノール１５０μＬを加えて懸濁し、遠心を行った（１７，４００ｇ，３分，４℃）。この操作を３回繰り返した。また１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒを用いて、同様の洗浄操作を３回繰り返した。最後に、ビーズを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。
【０１９１】
（４）ビーズ上のＤＮＡの一本鎖化
（３）で得られたビーズ溶液を遠心し、溶液を取り除き、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＳＳＣ溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ７．０））を添加した。再び遠心を行って溶液を除去した後、ビーズをアルカリ変性溶液（０．１５Ｎ  ＮａＯＨ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２）２０μＬに懸濁し、室温で１５分放置した。続いてアルカリ洗浄溶液（０．１Ｎ  ＮａＯＨ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２）５０μＬでビーズを洗浄し、１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒ（１００μＬ）を用いた洗浄を３回行った。最後に３０μＬの１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒにビーズを懸濁し、４℃で保管した。
【０１９２】
（５）第１のアダプター核酸のアデニル化
５’ＤＮＡ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用い、第１のアダプター核酸（ＲＮａｄｐ３：配列番号５；５’末端がリン酸化されている）の５’末端をアデニル化した。表３に、その反応溶液の組成を示す。
【０１９３】
【表３】
2020198831.tif 000004
【０１９４】
反応溶液は６５℃で１時間インキュベートした後、熱処理（８５℃，５分）を行い、反応を停止させた。この溶液を、尿素を用いた変性ポリアクリルアミドゲル（１５％）を用いた電気泳動に供した。アデニル化されたＲＮａｄｐ３（５’ＡｐｐＲＮａｄｐ３）に由来するバンドを切り出し、ＺＲ  ｓｍａｌｌ−ＲＮＡＴＭ  ＰＡＧＥ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製した。
【０１９５】
（６）第１のアダプター核酸のハイブリダイゼーション
（４）で得られたビーズ溶液を遠心して溶液を取り除いた後、ビーズを１μＭ  ５’ＡｐｐＲＮａｄｐ３を含むＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）２０μＬに懸濁した。これを９５℃で２分処理した後、１５秒で１℃ずつ、２５℃まで温度を下げ、ビーズ上に提示されたＤＮＡ鎖に５’ＡｐｐＲＮａｄｐ３をハイブリダイゼーションさせた。その後、遠心して溶液を除去し、１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ添加した。この操作を３回繰り返し、ハイブリダイゼーションしていない５’ＡｐｐＲＮａｄｐ３を除去した。最後に、ビーズを３０μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに懸濁した。
【０１９６】
（７）ｍｉＲＮＡのライゲーション
まず、表４に示す組成の水溶液１、および表５に示す組成の水溶液２を調製した。次に、図２６に示す流体デバイスを用い、水溶液１および水溶液２を等量ずつ直径４０μｍの油中水滴に封入した。油溶液には、Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ  １（５％（ｗ／ｗ）ｉｎ  ＮｏｖｅｃＴＭ  ７５００；Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を用いた。
【０１９７】
【表４】
2020198831.tif 000005
【０１９８】
【表５】
2020198831.tif 000006
【０１９９】
作製した油中水滴をＰＣＲチューブに回収し、２５℃で４時間、その後１６℃で一晩インキュベートし、ｍｉＲＮＡを５’ＡｐｐＲＮａｄｐ３にライゲーションした。
【０２００】
（８）油中水滴からのビーズ回収
油中水滴に静電気除去ピストル（ＺＥＲＯＳＴＡＴ  ３；ＭＩＬＴＹ）を照射し、破壊した（Karbaschi, M. et al., Biomicrofluidics 11, 044107 (2017).）。得られた水相（ビーズを含む）を１．５ｍＬチューブに移し、１００μＬの１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒでビーズを３回洗浄した。
【０２０１】
（９）未反応の第１のアダプター核酸のブロッキング
（８）で得られたビーズ溶液を遠心し、溶液を取り除いた。これに表６の組成の溶液を添加することで、未反応の５’ＡｐｐＲＮａｄｐ３の５’末端にＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＮａｄｐ２：配列番号１５）をライゲーションした。
【０２０２】
【表６】
2020198831.tif 000007
【０２０３】
ライゲーションは２５℃で３時間行い、ビーズを１００μＬの１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。
【０２０４】
（１０）第２のアダプター核酸のライゲーション
（９）で得られたビーズ溶液を遠心し、溶液を取り除いた。これに表７に示す組成の溶液を添加して、ビーズ上に捕捉されたｍｉＲＮＡに第２のアダプター核酸（ＲＮａｄｐ４：配列番号１６）をライゲーションさせた。ライゲーションには、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いた。
【０２０５】
【表７】
2020198831.tif 000008
【０２０６】
ライゲーションは、２５℃で４時間、その後１６℃で一晩インキュベートすることで行った。
【０２０７】
（１１）逆転写反応
（１０）で得られたビーズ溶液を遠心し、溶液を取り除いた。これに表８に示す組成の溶液を添加し、ビーズ上に捕捉されたＲＮＡの逆転写反応を行った。逆転写反応には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ）を用いた。
【０２０８】
【表８】
2020198831.tif 000009
【０２０９】
逆転写反応を４２℃で１時間行った後、熱処理（７０℃，１５分）により逆転写酵素を失活させた。その後、ビーズを１００μＬの１×Ｂ  ａｎｄ  Ｗ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した。
【０２１０】
（１２）ＰＣＲ・シークエンス解析
（１１）で得られたビーズ溶液を遠心し、溶液を取り除いた。これに表９に示す組成の溶液を添加し、逆転写反応産物をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いた。
【０２１１】
【表９】
2020198831.tif 000010
【０２１２】
ＰＣＲ反応は、前処理（９４℃，２分）の後、変性（９４℃，１５秒）、アニーリング（５１．６℃，３０秒）および伸長（６８℃，１５秒）を１サイクルとし、３０サイクル行った。アガロース電気泳動により増幅の確認を行った。ｍｉＲＮＡ配列を有する増幅産物のバンドを切り出し、次世代シークエンサー（ＩｏｎＰＧＭ）を用いて配列解析を行った。その結果、添加した９種類のｍｉＲＮＡ全てを検出することができた。
【０２１３】
［実施例２］
（１）プライマーを提示したビーズの調製
プライマーを提示したビーズの調製は、上記実施例１の（１）と同様に行う。
【０２１４】
（２）エマルジョンＰＣＲを利用したエクソソーム識別配列とポリＴ配列を有するＤＮＡビーズの調製
表１０に示す組成の水溶液を調製し、図２７に示す流体デバイスを用いて、直径４０μｍの油中水滴を作製する。油溶液は、４．５％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ８０、０．４５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むミネラルオイルを用いる。
【０２１５】
【表１０】
2020198831.tif 000011
【０２１６】
作製した油中液滴をＰＣＲチューブに回収し、ＰＣＲを行う。反応は前処理（９４℃，２分）の後、変性（９４℃，１５秒）、アニーリング（５１．６℃，３０秒）および伸長（６８℃，１５秒）を１サイクルとし、４０サイクル行う。
【０２１７】
（３）
ＤＮＡビーズの回収は、上記実施例１の（３）と同様に行う。
【０２１８】
（４）ビーズ上のＤＮＡの一本鎖化
ビーズ上のＤＮＡの一本化は、上記実施例１の（４）と同様に行う。
【０２１９】
（５）ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーション
表１１、１２に示す組成の水溶液を調製する。次に、図２６に示すマイクロ流体デバイスを用い、水溶液１および２を等量ずつ直径４０μｍの油中水滴に封入する。ｍｉＲＮＡのポリアデニル化反応には、ｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙ（Ａ）  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔａｉｌｉｎｇ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を用いる。油溶液は、Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ  １（５％（ｗ／ｗ）ｉｎ  ＮｏｖｅｃＴＭ  ７５００）を用いる。
【０２２０】
【表１１】
2020198831.tif 000012
【０２２１】
【表１２】
2020198831.tif 000013
【０２２２】
作製した油中水滴をＰＣＲチューブに回収し、３７℃で１時間、その後６５℃で５分インキュベートし、ｍｉＲＮＡを一本鎖ＤＮＡ上にハイブリダイゼーションさせる。
【０２２３】
（６）油中水滴からのビーズ回収〜ＰＣＲ・シークエンス解析
油中水滴からのビーズ回収からＰＣＲ・シークエンス解析までの操作は、上記実施例１の（８）〜（１２）と同様に行う。
【０２２４】
［実施例３］
（１）プライマーを提示したビーズの調製〜第２のアダプター核酸のライゲーション
ライマーを提示したビーズの調製から第２のアダプター核酸のライゲーションまでの操作は、上記実施例１の（１）〜（１０）と同様に行う。
【０２２５】
（２）逆転写反応・テンプレートスイッチングによるアダプターの付加
（１）で得られたビーズ溶液を遠心し、溶液を取り除く。これに表１３に示す組成の溶液を添加し、ビーズ上に捕捉されたＲＮＡの逆転写反応を行うとともに、アダプターを付加する。逆転写反応には、Ｍａｘｉｍａ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる。
【０２２６】
【表１３】
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【０２２７】
ビーズを室温で３０分、４２℃で９０分インキュベーションした後、熱処理（８５℃，５分）により逆転写酵素を失活させる。その後、ビーズを１００μＬの１×Ｂ＆Ｗ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄する。
【０２２８】
（３）ＰＣＲ・シークエンス解析
ＰＣＲ・シークエンス解析は、上記実施例１の（１２）と同様に行う。
【０２２９】
［実施例４］
（１）プライマーを提示したビーズの調製〜ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーション
プライマーを提示したビーズの調製からｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションまでの操作は、上記実施例２の（１）〜（５）と同様に行う。
【０２３０】
（２）油中水滴からのビーズ回収〜第２のアダプター核酸のライゲーション
油中水滴からのビーズ回収〜第２のアダプター核酸のライゲーションまでの操作は、上記実施例１の（８）〜（１０）と同様に行う。
【０２３１】
（３）逆転写反応・テンプレートスイッチングによるアダプターの付加
逆転写反応・テンプレートスイッチングによるアダプターの付加は、上記実施例３の（２）と同様に行う。
【０２３２】
（４）ＰＣＲ・シークエンス解析
ＰＣＲ・シークエンス解析は、上記実施例１の（１２）と同様に行う。
【符号の説明】
【０２３３】
１…ビーズ、２…第３のアダプター核酸、３…プライマー、４…ＤＮＡポリメラーゼ、６…界面活性剤、７…ＲＮＡリガーゼ、８…ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、１０…エクソソーム識別核酸、１１…エクソソーム識別配列、１２…第２の相補配列、１３…第１の相補配列、１４…ポリ（Ｔ）配列、２０…第１のアダプター核酸、２１…第１のＲＮＡ識別配列、２２…第１の相補配列に相補的な配列、３０…エクソソーム、３１…ＲＮＡ、３２…ポリ（Ａ）配列、４０…第２のアダプター核酸、４１…第２のＲＮＡ識別配列、４２…特定相補配列、６１…第１のアダプター核酸−ＲＮＡの相補配列、６２…特定配列、６３…第２のアダプター核酸の相補配列、１００…第２の流体デバイス、１０１…油溶液用インレット、１０２…水溶液用インレット、１０３…交差部、１０４…油中水滴用アウトレット、１０５…油溶液用流路、１０６…水溶液用流路、１０７…油中水滴用流路、１１０…第１の流体デバイス、１１１…油溶液用インレット、１１２…第１の水溶液用インレット、１１３…第２の水溶液用インレット、１１４…交差部、１１５…油中水滴用アウトレット、１１６…油溶液用流路、１１７…第１の水溶液用流路、１１８…第２の水溶液用流路、１１９…油中水滴用流路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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