(57)【要約】      （修正有）【課題】改善された治療特性を有する抗ＨＥＲ２抗体の提供。【解決手段】一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体およびその組成物に関する。一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団、およびその組成物に関する。一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体および高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を作製および使用する方法に関する。一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ガラクトシル化されていることを特徴とする、抗ＨＥＲ２抗体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、全開示が本明細書に参照により全体として組み込まれる２０１３年２月１３日に出願された表題「Ｈｉｇｈｌｙ  Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の米国仮特許出願第６１／７６４，４８８号明細書の米国特許法第１１９条第（ｅ）項のもとの利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一部には、抗ＨＥＲ２抗体の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＥｒｂＢ２としても公知であり、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーである。ＨＥＲ２は、それ自体および上皮成長因子受容体のファミリーの他のメンバー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）とダイマー化し得る細胞膜結合受容体チロシンキナーゼである。次いで、ダイマー化は、種々の細胞内経路の活性化をもたらす。ＨＥＲ２は、種々の癌、例として、乳癌、卵巣癌、胃癌および子宮癌において過剰発現される癌遺伝子である。癌におけるＨＥＲ２過剰発現（「ＨＥＲ２＋」癌）は、不良予後を伴う。
【０００４】
ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の細胞外セグメントのドメインＩＶに結合するモノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の標的である。トラスツズマブは、ＦＤＡにより１９９８年に承認され、ＨＥＲ２＋乳癌およびＨＥＲ２＋胃癌の治療に使用されている。しかしながら、トラスツズマブは、ＨＥＲ２＋癌を有する多数の患者において治療的に有効でない。さらに、トラスツズマブによる治療は、心機能障害および追加の不所望な副作用を伴っている。従って、改善された治療特性を有する抗ＨＥＲ２抗体が望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体およびその組成物に関する。一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団、およびその組成物に関する。一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体および高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を作製および使用する方法に関する。一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。
【０００６】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化されている、抗ＨＥＲ２抗体を提供する。一部の実施形態において、抗体は、高フコシル化されている。一部の実施形態において、抗体は、モノガラクトシル化(mono-galactosylated)Ｎ−グリカンを含む。一部の実施形態において、抗体は、二ガラクトシル化(bi-galactosylated)Ｎ−グリカンを含む。一部の実施形態において、抗体の重鎖は配列番号１を含み、抗体の軽鎖は配列番号２を含む。一部の実施形態において、抗体はトラスツズマブである。一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物中で産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【０００７】
一態様において、本開示は、乳汁をさらに含む、本明細書に開示の抗体のいずれかの組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００８】
一態様において、本開示は、抗体の集団を含む組成物において、抗体が、抗ＨＥＲ２抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが少なくとも５０％である組成物を提供する。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも６０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも７０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも５０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも６０％である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団は、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団は、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルと、集団中の抗体のフコシル化のレベルとの比は、１．０から１．４の間である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、集団中の抗体の少なくとも２５％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、集団中の抗体の少なくとも２５％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号１を含み、抗体の軽鎖は、配列番号２を含む。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体はトラスツズマブである。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物中で産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。一部の実施形態において、組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００９】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
【００１０】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００１１】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、対象中のＨＥＲ２活性を抑制する能力を有する。
【００１２】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２に結合する能力を有する。
【００１３】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力を有する。
【００１４】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【００１５】
本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、乳腺上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して５０％以下である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、乳腺上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して３０％以下である。本明細書に提供される組成物のいずれかの一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、乳腺上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して１０％以下である。
【００１６】
一態様において、本開示は、抗体の集団を作製する方法において、抗体が、抗ＨＥＲ２抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも５０％である抗体の集団が産生されるように非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において抗体の集団を発現させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、培養物中に存在し、抗体をコードする配列を含む核酸によりトランスフェクトされる。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、抗体をコードする配列を含む核酸を乳腺中で発現するように操作された非ヒト哺乳動物中に存在する。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３および配列番号４を含む。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマの乳腺上皮細胞である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、ヤギ乳腺上皮細胞である。
【００１７】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体、抗体の集団、または組成物のいずれかを産生する乳腺上皮細胞を提供する。
【００１８】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の乳腺上皮細胞のいずれかを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００１９】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体、抗体の集団、または組成物のいずれかを、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、対象は、癌を有する。一部の実施形態において、癌は、ＨＥＲ２＋癌である。一部の実施形態において、ＨＥＲ２＋癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌または子宮癌である。
【００２０】
一態様において、本開示は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）上にグリカン構造を有するモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体を含むモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体組成物において、前記グリカン構造が、６０％を超えるガラクトース含有率を有する組成物を提供する。
【００２１】
図面を最初に記載する。図面は、例示的なものであり、本発明の実施可能性に要求されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヤギ＃２からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンの代表的なオリゴ糖シグネチャー（oligosaccharide signature）を示す（Ａ、Ｂ）。
【図２】泌乳７日目におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図３】泌乳１５日目におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図４】泌乳３０日目におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図５】種々の泌乳日におけるヤギ＃１からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図６】１回目の泌乳７日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンのオリゴ糖シグネチャーを示す。
【図７】１回目の泌乳７日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図８】１回目の泌乳１５、４９、８４、１１２日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化トラスツズマブ抗体の集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図９】泌乳７日目におけるヤギ＃３および泌乳３／４日目におけるヤギ＃４からの高ガラクトシル化トラスツズマブの集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図１０】泌乳３日目におけるヤギ＃５ならびに泌乳５、６、および７日目におけるヤギ６からの高ガラクトシル化トラスツズマブの集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図１１】２回目の泌乳８、１５、および２９日目におけるヤギ＃２からの高ガラクトシル化トラスツズマブの集団のＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図１２】市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブのＮ−グリカンオリゴ糖の割合のまとめを示す。
【図１３】１回目の泌乳（ＮＬ１）または２回目の泌乳（ＮＬ２）の種々の日数におけるヤギ＃２により産生されたトラスツズマブのシアル酸およびマンノース修飾ならびに優勢型を比較するまとめを示す。
【図１４】ヤギ＃１〜６中で産生されたトラスツズマブのシアル酸およびマンノース修飾ならびに優勢型のまとめを示す。
【図１５】トランスジェニック産生された(transgenically produced)トラスツズマブ抗体が、ＨＥＲ２を発現することが公知のＳＫ−ＢＲ−３細胞に結合することを示す。
【図１６】トランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体が、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブと比較して類似の、ＳＫ−ＢＲ−３細胞への結合親和性を有することを示す。
【図１７】トランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体が、ＮＫ細胞上で発現されたＣＤ１６と相互作用することを示す。
【図１８】トランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体が、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブと比較して向上した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することを示す。
【図１９】トランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体が、ＢＴ−４７４細胞の増殖を低減させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化されている、抗ＨＥＲ２抗体を提供する。抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２に結合し、抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする種々の癌（ＨＥＲ２＋癌）における治療剤として使用されている。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。
【００２４】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１からなる重鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。
【００２５】
トラスツズマブの重鎖は、配列番号１に提供される：
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
【００２６】
トラスツズマブの軽鎖は、配列番号２に提供される：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【００２７】
一部の実施形態において、本開示は、トラスツズマブの配列をベースとするが、バイオアベイラビリティ、安定性などに関する追加の有益な所望の特性を抗体に提供する突然変異を含む抗体を含むことをさらに認識すべきである。
【００２８】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化されている、抗ＨＥＲ２抗体を提供する。一部の実施形態において、本開示は、高フコシル化されている、抗ＨＥＲ２抗体を提供する。一部の実施形態において、本開示は、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている、抗ＨＥＲ２抗体を提供する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、１つ以上のモノガラクトシル化Ｎグリカンを含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００２９】
一態様において、本開示は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）上でグリカン構造を有し、前記グリカン構造が６０％を超えるガラクトース含有率を有する、モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体組成物を提供する。一実施形態において、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、精製されている。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を称する場合に使用される（例えば、明示的に参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に報告されているＥＵインデックス）。抗体中の典型的なグリコシル化残基位置は、ＥＵナンバリングシステムによる２９７位におけるアスパラギン（「Ａｓｎ２９７」）である。
【００３０】
本明細書に開示の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のいずれも、部分的または完全に精製されていてよいことを認識すべきである。
【００３１】
抗体は、Ｆｃ領域の重鎖中のＦｃ−γグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）においてＮ−グリカンによりグリコシル化していてよい。一般に、抗体は、２つの重鎖を含み、従って、各抗体は、２つのＦｃ−γＮ−グリカンを有し得る。種々のグリコシル化パターンは、Ｆｃγグリコシル化部位において観察されており、この部位において見出されるオリゴ糖としては、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）およびフコースが挙げられる。Ｆｃγグリコシル化部位において見出されるＮ−グリカンは、一般に、抗体のアスパラギンに結合している第１のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、第１のＧｌｃＮａｃに結合している第２のＧｌｃＮＡｃおよび第２のＧｌｃＮａｃに結合している第１のマンノースの非分枝鎖からなる共通のコア構造を有する。２つの追加のマンノースは、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−マンノース鎖の第１のマンノースに結合しており、コア構造を完了させ、追加のグリコシル化のための２つの「アーム」を提供する。さらに、フコース残基が、Ｎ−結合の第１のＧｌｃＮＡｃに結合していてよい。
【００３２】
２つのアームコア構造は、「アンテナ」とも称される。血漿抗体中で見出されるＮ−グリカンモチーフの「アーム」の最も一般的なタイプのグリコシル化は、複合型(complex type)のもの、すなわち、２つ以上のタイプの単糖からなるものである。このＮ−グリカンモチーフへの生合成経路において、いくつかのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼが、ＧｌｃＮＡｃ残基をグリカンコアのマンノースに結合させ、ガラクトース、シアル酸およびフコース残基によりそれをさらに伸長させることができる。このグリコシル化モチーフは、「複合型」構造と呼ばれる。
【００３３】
Ｎ−グリカンコア構造の「アーム」上で見出される第２のグリコシル化モチーフは、追加のマンノース（分枝鎖または非分枝鎖のいずれかとして結合している）を特徴とする「高マンノース」モチーフである。
【００３４】
第３のグリコシル化モチーフは、アームの一方が置換マンノースである一方、他方のアームが複合型である、ハイブリッド構造である。
【００３５】
本明細書において使用される「ガラクトシル化」抗体は、そのＮ−グリカンの１つの中に少なくとも１つのガラクトース単糖を有する任意の抗体を称する。ガラクトシル化抗体としては、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームのそれぞれの上に複合型モチーフをそれぞれ有する抗体、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームの一方のみの上に複合型モチーフを有する抗体、Ｎ−グリカンのアームのそれぞれの上に複合体タイプモチーフを有する１つのＮ−グリカンを有する抗体、およびＮ−グリカンモチーフのアームの一方のみの上に複合体タイプモチーフを有する１つのＮ−グリカンを有する抗体が挙げられる。少なくとも１つのガラクトース単糖を含む抗体としては、Ｎ−グリカン、例えば、Ｇ１（１つのガラクトース）、Ｇ１Ｆ（１つのガラクトース、１つのフコース）、Ｇ２（２つのガラクトース）およびＧ２Ｆ（２つのガラクトース、１つのフコース）を有する抗体が挙げられる。さらに、少なくとも１つのガラクトース単糖を含むＮ−グリカンは、シアリル化されていてもシアリル化されていなくてもよい。Ｎ−グリカンは、複合型グリカンモチーフの１つ以上のアーム中に追加のガラクトース残基、例えば、αＧａｌも含有していてもよく、４つのガラクトース部分を有するＮ−グリカンを潜在的にもたらすことをさらに認識すべきである。
【００３６】
本明細書において使用される「高ガラクトシル化」抗体は、Ｎ−グリカンモチーフ中に少なくとも２つのガラクトース単糖を含む抗体を称する。高ガラクトシル化抗体としては、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームのそれぞれの上に複合型モチーフをそれぞれ有する抗体、２つのＮ−グリカンがＮ−グリカンモチーフのアームの一方のみの上に複合体タイプモチーフを有する抗体、およびＮ−グリカンのアームのそれぞれの上に複合体タイプモチーフを有する１つのＮ−グリカンを有する抗体が挙げられる。従って、高ガラクトシル化抗体は、両方のＮ−グリカンがグリカンモチーフ中に１つのガラクトース（例えば、Ｇ１またはＧ１Ｆ）をそれぞれ含む抗体、グリカンモチーフ中に２つのガラクトース（例えば、Ｇ２またはＧ２Ｆ）を有する少なくとも１つのＮ−グリカンを含む抗体、およびグリカンモチーフ中に３または４つのガラクトース（例えば、（ｉ）Ｇ１グリカンモチーフを有する１つのＮ−グリカンおよびＧ２もしくはＧ２Ｆグリカンモチーフを有する１つのＮ−グリカンまたは（ｉｉ）Ｇ２もしくはＧ２Ｆを有する２つのＮ−グリカン）を有する抗体が挙げられる。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、グリカンモチーフ中に少なくとも３つのガラクトース単糖を含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、グリカンモチーフ中に少なくとも４つのガラクトース単糖を含む。
【００３７】
Ｎ−グリカンのグリコシル化パターンは、当技術分野において公知の種々の方法により測定することができる。例えば、タンパク質上の炭水化物を分析する方法が、米国特許出願公開第２００６／００５７６３８号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１２７９５０号明細書に記載されている。タンパク質上の炭水化物を分析する方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物中で産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００３９】
一部の実施形態において、高グリコシル化抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞において産生される。一部の実施形態において、抗体は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞において産生され、Ｎ−グリカン上のガラクトース基の数を増加させるように産生後に改変される（例えば、酵素、例えば、トランスフェラーゼの作用を介して）。
【００４０】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体を含む組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、高ガラクトシル化抗体を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００４１】
一態様において、本開示は、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）上にグリカン構造を有するモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体組成物を含む組成物において、モノクローナル抗体の前記グリカン構造が、６０％を超えるガラクトース含有率を有する組成物を提供する。一部の実施形態において、モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体組成物を含む組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体組成物を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００４２】
抗体の集団
一態様において、本開示は、抗体の集団を含む組成物において、抗体が、抗ＨＥＲ２抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも５０％である組成物を提供する。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも６０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも７０％である。一部の実施形態において、集団中の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも５０％である。一部の実施形態において、集団の抗体のフコシル化のレベルは、少なくとも６０％である。一部の実施形態において、集団は、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。一部の実施形態において、集団は、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルと、集団中の抗体のフコシル化のレベルとの比は、１．０から１．４の間である。一部の実施形態において、集団中の抗体の少なくとも２５％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、集団中の抗体の少なくとも２５％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００４３】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１からなる重鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団の抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。
【００４４】
Ｎ−グリカンの生合成は、タンパク質の場合のようにテンプレートにより調節されないが、主として細胞中の特異的なグリコシルトランスフェラーゼの発現および活性に依存する。従って、糖タンパク質、例えば、抗体Ｆｃドメインは、通常、同一タンパク質骨格上で異なるグリカンを担持する糖型の異種集団として存在する。
【００４５】
高ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体の集団は、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％のガラクトシル化である、抗体の集団である。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、少なくとも６０％である。
【００４６】
本明細書において使用されるガラクトシル化のレベルは、以下の式により決定される：
【００４７】
【数１】
2020125286.tif 000002
【００４８】
式中、
−  ｎは、クロマトグラム、例えば、順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ  ＨＰＬＣ）スペクトルの分析されたＮ−グリカンピークの数を表し、
−  「Ｇａｌの数」は、ピークに対応するグリカンのアンテナ上のガラクトースモチーフの数を表し、
−  「Ａの数」は、ピークに対応するグリカン型のアンテナ上のＮ−アセチルグルコサミンモチーフの数に対応し（コア構造の２つのＮ−アセチルグルコサミンモチーフを除く）、
−  「相対面積％」は、対応するピーク下面積の％に対応する。
【００４９】
抗体の集団中の抗体のガラクトシル化のレベルは、例えば、抗体からＮ−グリカンを遊離させ、クロマトグラム上でＮ−グリカンを分解し、特異的ピークに対応するＮ−グリカンのオリゴ糖モチーフを同定し、ピーク強度を決定し、データを上記に提供される式に適用することにより決定することができる（本明細書に提供される実験セクションも参照）。
【００５０】
ガラクトシル化されている抗ＨＥＲ２抗体としては、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンおよび二ガラクトシル化Ｎ−グリカンである抗体が挙げられる。
【００５１】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、シアリル化されていてもいなくてもよい、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％は、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体の少なくとも２５％がモノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００５２】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、シアリル化されていてもいなくてもよい、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体の少なくとも２５％が二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００５３】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、シアリル化されていてもいなくてもよい、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体、およびシアリル化されていてもいなくてもよい、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む抗体を含む。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で９９％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で９９％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。高ガラクトシル化されている抗体Ｎ−グリカンの集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンの少なくとも２５％が、モノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、抗体の少なくとも２５％が、二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む。
【００５４】
高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、集団は、高フコシル化されている抗体を含む。高フコシル化されている抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％のフコシル化である、抗体の集団である。高ガラクトシル化されている抗体の集団の一部の実施形態において、抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルは、少なくとも５０％である。
【００５５】
本明細書において使用されるフコシル化のレベルは、以下の式により決定される：
【００５６】
【数２】
2020125286.tif 000003
【００５７】
式中、
−  ｎは、クロマトグラム、例えば、順相高速液体クロマトグラフィー（ＮＰ  ＨＰＬＣ）スペクトルの分析されたＮ−グリカンピークの数を表し、
−  「フコースの数」は、ピークに対応するグリカン上のフコースモチーフの数を表し、
−  「相対面積％」は、フコースモチーフを含有する対応するピーク下面積の％に対応する。
【００５８】
フコシル化されている抗体としては、そのＮ−グリカンの１つの中に少なくとも１つのフコース単糖を有する抗体が挙げられる。フコシル化されている抗体としては、そのＮ−グリカンのそれぞれの中にフコース単糖を有する抗体を含む。
【００５９】
一部の実施形態において、本明細書に開示の抗ＨＥＲ２抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも５０％であり、集団中の抗体のフコシル化のレベルが少なくとも５０％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも５０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも６０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも７０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも８０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが少なくとも９０％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。一部の実施形態において、本明細書に開示の抗体の集団は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルが最大で１００％であり、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルが少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、最大で１００％である集団に関する。
【００６０】
一態様において、本開示は、Ｆｃγグリコシル化部位においてガラクトシル化されている集団中の抗体Ｎ−グリカンの割合と、Ｆｃγグリコシル化部位においてフコシル化されている集団中の抗体Ｎ−グリカンの割合との規定の比を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物に関する。一部の実施形態において、本開示は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルに対する、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルの比が、０．５から２．５の間、０．６から２．０の間、０．７から１．８の間、０．８から１．６の間、または１．０から１．４の間である、抗体の集団を含む組成物に関する。一部の実施形態において、本開示は、集団中の抗体Ｎ−グリカンのフコシル化のレベルに対する、集団中の抗体Ｎ−グリカンのガラクトシル化のレベルの比が、１．０から１．４の間、例えば、１．２である、抗体の集団を含む組成物に関する。
【００６１】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体の集団は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物中で産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００６２】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団は、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞において産生される。一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体の集団は、抗体の集団中のガラクトース基の数を増加させるように非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞以外の細胞中での産生後に改変される（例えば、酵素、例えば、トランスフェラーゼの作用を介して）。
【００６３】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体を含む組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００６４】
抗体の集団の作製
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも６０％）を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルのガラクトシル化を有する組成物を提供する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。本明細書において使用される、乳房上皮細胞において産生される抗体と比較して「細胞培養物中で産生される(produced in cell culture)」抗体は、乳房上皮細胞を除く標準的産生細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される抗体を称する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して５０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して３０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のガラクトシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のガラクトシル化のレベルと比較して１０％以下である。
【００６５】
一態様において、本開示は、高レベルのフコシル化（例えば、少なくとも６０％）を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルのフコシル化を有する組成物を提供する。本明細書において使用される、乳房上皮細胞において産生される抗体と比較した「細胞培養物中で産生される」抗体は、乳房上皮細胞を除く標準的な産生細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される抗体を称する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して５０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して３０％以下である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体のフコシル化のレベルは、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生される抗体のフコシル化のレベルと比較して１０％以下である。
【００６６】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化およびフコシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルのガラクトシル化およびフコシル化を有する組成物を提供する。
【００６７】
抗体
一部の実施形態において、用語「抗体」は、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を称する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに下位分類することができる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。一部の実施形態において、抗原は、ＨＥＲ２である。抗体の定常領域は、宿主組織または因子、例として、種々の免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。成熟機能抗体分子の形成は、２つのタンパク質が化学量論的量で発現され、適正な構成で自己集合する場合に達成することができる。
【００６８】
用語「抗体」は、その抗原結合断片を包含することも意味する。抗体および抗原結合断片を作製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）、およびＲｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、国際公開第２００６／０４０１５３号、国際公開第２００６／１２２７８６号、および国際公開第２００３／００２６０９号参照）。本明細書において使用される抗体の「抗原結合断片」は、抗原、例えば、ＨＥＲ２に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を称する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実行され得ることができることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片、ＶおよびＶＨの２つのドメインは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用し、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能とする合成リンカーによりそれらを連結させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、従来の手順、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ９８−１１８（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８３）に記載のタンパク質分解断片化手順を使用し、および当業者に公知の他の技術により得られる。断片は、インタクト抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００６９】
一部の実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものである。さらなる実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥからなる群から選択され、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの免疫グロブリン定常および／もしくは可変ドメインを有する。他の実施形態において、抗体は、二重特異性または多重特異性抗体である。代替的な実施形態によれば、本開示の抗体は、二重特異性抗体、または多重特異性抗体の形態になるように改変することができる。用語「二重特異性抗体(bispecific antibody)」は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し、またはそれらと相互作用する、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むものとする。用語「多重特異性抗体(multispecific antibody)」は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の構成成分に結合し、またはそれらと相互作用する、３つ以上の異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むものとする。従って、本開示は、限定されるものではないが、細胞表面抗原に、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体に指向される二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および他の多重特異性抗体を含む。用語「二重特異性抗体」は、ダイアボディをさらに含む。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、短すぎて同一鎖上でのそれら２つのドメイン間の対合を可能としないリンカーを使用し、それにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創成する二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｉｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【００７０】
用語「抗体」は、様々なタイプの抗体、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはそれらの混合物も包含する。
【００７１】
一部の実施形態において、抗体は、組換え抗体である。本明細書において使用される用語「組換え抗体」は、組換え手段により調製、発現、創成または単離される抗体、例えば、別種の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物から単離される抗体、宿主細胞中にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、または免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、創成もしくは単離される抗体を含むものとする。
【００７２】
さらに他の実施形態において、抗体は、キメラまたはヒト化抗体であり得る。本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ）抗体の一部とヒト抗体の一部とを組み合わせる抗体を称する。本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域を伴い、親抗体からの抗原結合ＣＤＲのみを保持する抗体を称する（Ｗａｌｄｍａｎｎ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５７参照）。ネズミ抗体の結合特異性を保持するこのようなキメラまたはヒト化抗体は、本開示による診断、予防または治療用途のためにインビボで投与した場合に低減した免疫原生を有することが予測される。
【００７３】
ある実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列(germline)免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むものとする。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入される突然変異）。ヒト抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスを使用して作製される。完全ヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することにより調製することもできる。例えば、内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６６９号明細書、米国特許第５，５９８，３６９号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、およびそれらに引用されている参照文献参照。これらの動物は、内因性（例えば、ネズミ）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子操作されている。動物は、それらの動物の免疫化が目的抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすようにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するようにさらに改変される。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化後、モノクローナル抗体が標準的なハイブリドーマ技術に従って調製される。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、従って、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しない。ヒト抗体は、本明細書に提供される抗体のいずれかと同様に、モノクローナル抗体であり得る。
【００７４】
一部の実施形態において、抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態において、完全長抗体は、重鎖および軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。一部の実施形態において、重鎖は、配列番号１を含み、軽鎖は、配列番号２を含む。一部の実施形態において、抗体はトラスツズマブである。
【００７５】
ＣＤＣ活性
一態様において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも６０％）を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物は、高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一態様において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物は、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物は、高い補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有し、高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００７６】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団および低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団は、同一抗原エピトープに指向される。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団および低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団は、同一の核酸によりコードされる。一部の実施形態において、核酸は、抗体トラスツズマブをコードする。
【００７７】
本明細書において使用される低レベルのガラクトシル化を有する（「低ガラクトース」である）抗体の集団は、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、０％までである抗体の集団を称する。
【００７８】
一部の実施形態において、高レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団のＣＤＣ活性は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、少なくとも１．２倍高く、少なくとも１．３倍高く、少なくとも１．４倍高く、少なくとも１．５倍高く、少なくとも１．６倍高く、少なくとも１．７倍高く、少なくとも１．８倍高く、少なくとも１．９倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、最大で少なくとも１００倍高く、またはそれより高い。
【００７９】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団は、高フコシル化されている（高レベルのフコシル化を有する）。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団は、低ガラクトースであり、低フコースである（低レベルのガラクトシル化およびフコシル化を有する）抗体の集団と比較して増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団および低ガラクトースであり、低フコースである抗体の集団は、同一の抗原エピトープに指向される。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団および低ガラクトースであり、低フコースである抗体の集団は、同一の核酸によりコードされる。一部の実施形態において、核酸は、抗体トラスツズマブをコードする。
【００８０】
本明細書において使用される、低フコースであり、または低レベルのフコシル化を有する抗体の集団は、集団中の抗体のフコシル化のレベルが５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、０％までである抗体の集団を称する。
【００８１】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、高フコシル化されている抗体の集団のＣＤＣ活性は、低ガラクトースであり、低フコースである抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、少なくとも１．２倍高く、少なくとも１．３倍高く、少なくとも１．４倍高く、少なくとも１．５倍高く、少なくとも１．６倍高く、少なくとも１．７倍高く、少なくとも１．８倍高く、少なくとも１．９倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、最大で少なくとも１００倍高く、またはそれより高い。
【００８２】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される高ガラクトシル化されている抗体の集団および乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、同一の核酸によりコードされ得る。一部の実施形態において、核酸は、抗体トラスツズマブをコードする。
【００８３】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団のＣＤＣ活性は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、少なくとも１．２倍高く、少なくとも１．３倍高く、少なくとも１．４倍高く、少なくとも１．５倍高く、少なくとも１．６倍高く、少なくとも１．７倍高く、少なくとも１．８倍高く、少なくとも１．９倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも１０倍高く、最大で少なくとも１００倍高く、またはそれより高い。
【００８４】
一態様において、本明細書に開示の抗体の集団の組成物は、高い（補体依存性細胞傷害）ＣＤＣ活性を有する。抗体は、種々の機序を介して治療剤として作用することができ、その機序の１つはＣＤＣ活性を介する。標的細胞受容体に結合する一部の治療抗体は、補体経路のタンパク質にも結合し得る。補体タンパク質の結合は、補体カスケード（Ｃ１複合体活性化を介する）をもたらし、それが治療抗体が結合している細胞の細胞溶解および死滅を引き起こす「膜侵襲複合体」の形成を最終的にもたらす（例えば、Ｒｅｆｆ  Ｍ．Ｅ．Ｂｌｏｏｄ  １９９４，８３：４３５参照）。
【００８５】
一部の実施形態において、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する抗体の集団は、増加したレベルの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有さない抗体の集団と比較して多量の細胞溶解を誘導する抗体の集団である。ＣＤＣのレベルを測定する方法は、当技術分野において公知であり、細胞溶解の量の測定に基づくことが多い。ＣＤＣ活性を測定するための市販のキットは、例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入することができる。
【００８６】
ＡＤＣＣ活性
一態様において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも６０％）を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の実施形態において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する組成物を提供する。
【００８７】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団のＡＤＣＣ活性は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【００８８】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団のＡＤＣＣ活性は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【００８９】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【００９０】
一態様において、本明細書に開示の抗体の集団の組成物は、高いＡＤＣＣ活性を有する。抗体は、種々の機序を介して治療剤として作用することができ、その機序の１つはＡＤＣＣ活性を介する。標的細胞上の細胞受容体に結合し、Ｆｃグリコシル化部位を含む治療抗体は、Ｆｃ受容体にも結合することができ、Ｆｃ受容体を発現する細胞の標的細胞への係留をもたらす。抗体のＦｃ領域の結合の親和性は、一般に、Ｆｃグリコシル化部位のグリコシル化の性質に依存する。Ｆｃ受容体は、多数の免疫細胞、例として、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、およびマスト細胞上で見出される。Ｆｃ受容体への結合は、標的細胞を殺滅するためのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および食作用を誘導する免疫細胞をもたらす。一部の実施形態において、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体の集団は、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有さない抗体の集団と比較して増加したＣＤ１６発現細胞への結合を示す抗体の集団である。一部の実施形態において、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する抗体の集団は、増加したレベルの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有さない抗体の集団と比較して増加したＩＬ−２産生（例えば、ナチュラルキラー細胞中で）の誘導を示す抗体の集団である。ＡＤＣＣ活性を測定するための市販のキットは、例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入することができる。
【００９１】
抗ＨＥＲ２活性
一態様において、高レベルのガラクトシル化（例えば、少なくとも６０％）を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団は、低レベルのガラクトシル化を有する抗体の集団と比較して増加した、対象中のＨＥＲ２活性を抑制する能力を有する。一部の実施形態において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、対象中のＨＥＲ２活性を抑制する能力を有する組成物を提供する。
【００９２】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２に結合する能力を有する組成物を提供する。
【００９３】
一態様において、本開示は、高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を含む組成物において、抗体の集団が、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生され、抗体の集団が、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力を有する組成物を提供する。
【００９４】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２活性を抑制し、ＨＥＲ２に結合し、および／またはＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されている抗体の集団の増加した、ＨＥＲ２活性を抑制し、ＨＥＲ２に結合し、および／またはＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力は、低ガラクトースである抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【００９５】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２活性を抑制し、ＨＥＲ２に結合し、および／またはＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力を有する。一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団の増加した、ＨＥＲ２活性を抑制し、ＨＥＲ２に結合し、および／またはＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して少なくとも１．１倍高く、１．２倍高く、１．３倍高く、１．４倍高く、１．５倍高く、１．６倍高く、１．７倍高く、１．８倍高く、１．９倍高く、２倍高く、３倍高く、５倍高く、１０倍高く、１００倍高く、またはそれより高い。
【００９６】
一部の実施形態において、高ガラクトシル化されており、乳腺上皮細胞において産生される抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団と比較して増加した、ＨＥＲ２活性を抑制し、ＨＥＲ２に結合し、および／またはＨＥＲ２ダイマー化を抑制する能力を有する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生されたものではない抗体の集団は、細胞培養物中で産生される。
【００９７】
一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される抗ＨＥＲ２抗体の集団は、非乳腺上皮細胞により産生される抗体よりも、対象中のＨＥＲ２活性の抑制において優れている。対象中のＨＥＲ活性のレベルの測定は、例えば、抗体の集団を、ＨＥＲ２過剰発現を特徴とする疾患（例えば、ＨＥＲ２＋乳癌）を罹患する対象に投与することにより評価することができる。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される抗ＨＥＲ２抗体の集団は、非乳腺上皮細胞により産生される抗体よりも、ＨＥＲ２への結合において優れている。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞において産生される抗ＨＥＲ２抗体の集団は、非乳腺上皮細胞により産生される抗体よりも、ＨＥＲ２ダイマー化の抑制において優れている。ＨＥＲ２活性の抑制、ＨＥＲ２への結合のレベルおよびＨＥＲ２のダイマー化を測定するためのアッセイは、十分確立されている（例えば、Ｂｏｏｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ２１，Ｎｏ  ２（Ｊａｎｕａｒｙ  １５），２００３：ｐｐ２８３−２９０；Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．２００８  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；２４８（３）：９２５−９３５；ＤｅＦａｚｉｏ−Ｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１，１３：Ｒ４４参照）。
【００９８】
非ヒト乳腺上皮細胞およびトランスジェニック動物
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体または高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を産生する乳腺上皮細胞を提供する。
【００９９】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体または高レベルのガラクトシル化を有する抗ＨＥＲ２抗体の集団を産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【０１００】
一態様において、本開示は、グリコシル化抗体を産生する哺乳動物の乳房上皮細胞に関する。本明細書において、哺乳動物の乳房上皮細胞においてグリコシル化抗体を作製する方法が提供される。このことは、細胞培養物中で乳房上皮細胞を培養することにより達成することができる（インビトロまたはエクスビボ）。このことは、トランスジェニック動物中で達成することもできる（インビボ）。
【０１０１】
一部の実施形態において、哺乳動物の乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物中に存在する。一部の実施形態において、哺乳動物の乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物、例えば、マウスまたはヤギの乳汁中で組換え抗体を発現するように操作されている。このことを達成するため、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、ヤギβ−カゼイン調節エレメントの制御下であり得る。マウスおよびヤギ乳汁の両方における組換えタンパク質、例えば、抗体の発現は、既に確立されている（例えば、米国特許出願公開第２００８−０１１８５０１−Ａ１号明細書参照）。一部の実施形態において、発現は、乳汁タンパク質を産生する個々の乳管上皮細胞について最適化される。
【０１０２】
組換え抗体を産生し得るトランスジェニック動物は、当技術分野において公知の方法に従って作製することができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号明細書および米国特許出願公開第２００８−０１１８５０１−Ａ１号明細書参照）。トランスジェニック発現に好適な動物としては、限定されるものではないが、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマが挙げられる。好適な動物としては、ウシ属、ヤギ属、ヒツジ属およびイノシシ属も挙げられ、それらはそれぞれウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタ（または畜豚）の種々の種に関する。好適な動物としては、有蹄動物も挙げられる。本明細書において使用される「有蹄動物」は、有蹄の典型的には草食の四肢哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒツジ、畜豚、ヤギ、畜牛およびウマのものまたはそれらに関する。好適な動物としては、乳畜、例えば、ヤギおよび畜牛、またはマウスも挙げられる。一部の実施形態において、トランスジェニック発現に好適な動物はヤギである。
【０１０３】
一実施形態において、トランスジェニック動物は、目的構築物(construct)を含む初代細胞の作製とそれに続く除核卵母細胞中への初代細胞核の核移植により作製する。目的構築物を含む初代細胞は、初代細胞に目的抗体、例えば、トラスツズマブの重鎖および軽鎖のコード配列を含む単一構築物を注射もしくはトランスフェクトすることにより、または初代細胞に抗体、例えば、トラスツズマブの重鎖および軽鎖のコード配列を含む別個の構築物を同時トランスフェクションもしくは同時注入することにより作製する。次いで、これらの細胞を増殖させ、特徴付けして導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性(transgene structural integrity)および染色体組込み部位(chromosomal integration site)を評価する。次いで、所望の導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性および染色体組込み部位を有する細胞を核移植に使用してトランスジェニック動物を作製する。本明細書において使用される「核移植」は、ドナー細胞からの核を除核卵母細胞中に移植する、クローニングの方法を称する。
【０１０４】
哺乳動物の乳房上皮細胞において発現させるべき抗体のコード配列は、配列データベース、例えば、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋからの選択動物（例えば、ヒト、畜牛またはマウス）に由来するゲノム材料もしくは逆翻訳メッセンジャーＲＮＡのライブラリーをスクリーニングすることにより、または当技術分野において公知の方法、例えば、ペプチドマッピングを使用して抗体の配列を得ることにより得ることができる。配列は、適切なプラスミドベクター中にクローニングし、好適な宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅させることができる。本明細書において使用される「ベクター」は、異なる遺伝子環境間の輸送のためまたは宿主細胞での発現のために制限およびライゲーションによってその中に所望の配列を挿入することができる多数の核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミドおよびファージミドが挙げられる。クローニングベクターは、宿主細胞中で複製することができ、および１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに特徴とするものであり、そのエンドヌクレアーゼ制限部位でベクターを特定可能な様式で切断することができ、かつ新たな組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するようにその部位に所望のＤＮＡ配列をライゲーションさせることができる。発現ベクターは、その中に所望のＤＮＡ配列を、それが調節配列に作動可能に連結するように制限およびライゲーションにより挿入し、さらにそこでＲＮＡ転写物として発現させ得るものである。ベクターは、ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされ、またはされなかった細胞の同定における使用に好適な１つ以上のマーカー配列をさらに含有し得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野において公知の標準的アッセイにより検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされる細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響する遺伝子を挙げられる。
【０１０５】
抗体または目的抗体の重鎖および軽鎖のコード配列は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中でのコード配列の発現を可能とする制御配列に作動可能に結合させることができる。ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物をベクターの残部から切断、精製し、さらにトランスジェニック動物を作製するために使用することができる発現ベクター中に導入することができる。トランスジェニック動物は、そのゲノム中に組み込まれた所望のトランスジェニックタンパク質を有する。
【０１０６】
産生を、トランスジェニック動物の乳汁に方向付けるのに好適なＤＮＡ配列は、天然由来の乳汁タンパク質に由来する５’−プロモーター領域を担持し得る。このプロモーターは、結果的に、ホルモンおよび組織特異的因子の制御下であり、泌乳する乳房組織中で最も活性である。一部の実施形態において、使用されるプロモーターは、乳汁特異的プロモーターである。本明細書において使用される「乳汁特異的プロモーター」は、タンパク質を乳汁中に分泌する細胞（例えば、乳房上皮細胞）での遺伝子の発現を自然に導くプロモーターであり、例えば、カゼインプロモーター、例えば、α−カゼインプロモーター（例えば、αＳ−１カゼインプロモーターおよびαＳ２−カゼインプロモーター）、β−カゼインプロモーター（例えば、ヤギβカゼイン遺伝子プロモーター（ＤｉＴｕｌｌｉｏ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １０：７４−７７，１９９２）、γ−カゼインプロモーター、κ−カゼインプロモーター、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター（Ｇｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ５：１１８３−１１８７，１９８７）、β−ラクトグロブリンプロモーター（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ７：４８７−４９２，１９８９）およびα−ラクトアルブミンプロモーター（Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＳ．２９７：１３，１９９２）が挙げられる。乳房組織中で特異的に活性化されるプロモーター、例えば、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターなどもこの定義に含まれる。一部の実施形態において、プロモーターは、ヤギ属βカゼインプロモーターである。
【０１０７】
乳房上皮全体に亘りトランスジェニックタンパク質の分泌を乳汁中に向けるタンパク質リーダー配列の産生を導くＤＮＡ配列に、プロモーターを作動可能に結合させてもよい。本明細書において使用されるコード配列および調節配列（例えば、プロモーター）は、それらがコード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くように結合している場合、「作動可能に連結している」または「作動可能に結合している」ことになる。本明細書において使用される「リーダー配列」または「シグナル配列」は、タンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動可能に結合したときに分泌を導く。リーダー配列は、天然ヒトリーダー配列であっても、人工由来リーダーであってもよく、あるいは導入遺伝子コード配列の転写を導くために使用されるプロモーターと同一の遺伝子から得たものであっても、または例えば哺乳動物の乳房上皮細胞のような細胞から普通に分泌される別のタンパク質から得たものであってもよい。一部の実施形態において、３’−配列を付加してｍＲＮＡの安定性を改善することができ、その３’−配列は天然に分泌される乳汁タンパク質に由来するものであってよい。
【０１０８】
一部の実施形態において、核移植によるトランスジェニックヤギの作製において使用される構築物（例えば、トラスツズマブ抗体をコードする）を含有する初代細胞株を作製するため、重鎖および軽鎖構築物を初代ヤギ皮膚上皮細胞中にトランスフェクトすることができ、その細胞を拡大させ、さらに完全に特徴付けして、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性および染色体組込み部位を評価する。本明細書において使用される「核移植」は、ドナー細胞からの核を除核卵母細胞中に移植するクローニングの方法を称する。
【０１０９】
クローニングは、目的の抗体または他の遺伝子構築物をそれぞれ産生し得るトランスジェニック動物の多重性をもたらす。産生方法は、クローン動物およびその動物の子孫の使用を含む。クローニングは、胎児の核移植、核移植、組織および臓器移植、ならびにキメラ子孫の創成も包含する。クローニングプロセスの１つの工程は、目的導入遺伝子を含有する細胞、例えば、初代細胞のゲノムを除核卵母細胞中に移行させる工程を含む。本明細書において使用される「導入遺伝子（transgene）」は、細胞、またはその祖先中に人工的に挿入され、その細胞から発生する動物のゲノムの一部になる任意の核酸分子片を称する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して部分的もしくは全体的に外因性（すなわち、外来）である遺伝子を含んでいてよく、または動物の内因性遺伝子に対して同一性を有する遺伝子であってもよい。卵母細胞のための好適な哺乳動物供給源としては、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、非ヒト霊長類などが挙げられる。好ましくは、卵母細胞は、有蹄動物、最も好ましくは、ヤギまたは畜牛から得る。卵母細胞を単離する方法は、当技術分野において周知である。本質的には、このプロセスは、哺乳動物、例えば、ヤギの卵巣または生殖器官から卵母細胞を単離する工程を含む。有蹄動物卵母細胞の容易に利用可能な供給源は、ホルモン誘導される雌性動物からのものである。遺伝子操作、核移植およびクローニングのような技術の良好な使用のため、卵母細胞を、好ましくは、インビボで成熟させてから、その細胞を核移植のためのレシピエント細胞として使用することができ、それを精細胞により受精させて胚に発達させた。インビボで成熟された第２減数分裂中期の卵母細胞は、核移植技術において良好に使用されている。本質的には、成熟した第２減数分裂中期の卵母細胞は、非過排卵動物または過排卵動物のいずれかから、発情期の発生からまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンの注射から数時間後に外科的に回収する。
【０１１０】
一部の実施形態において、トランスジェニック動物（例えば、ヤギ）および乳房上皮細胞は、マイクロインジェクションを介して作製する。ヤギにおけるマイクロインジェクションは、例えば、米国特許第７，９２８，０６４号明細書に記載されている。手短に述べると、受精されたヤギ卵を、立体顕微鏡上でＰＢＳ卵管フラッシング液から回収し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中で洗浄する。前核が可視的であった場合、胚は、直ちにマイクロインジェクトすることができる。前核が可視的でない場合、前核が可視的になるまで胚を短期間培養のための培地中に配置することができる（Ｓｅｌｇｒａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９０．ｐ．１１９５−１２０５）。単細胞ヤギ胚を、ガラスくぼみスライド上で油下で培地の微液滴中に配置する。２つの可視的な前核を有する受精卵を、固定ステージを有する正立顕微鏡上でフレーム研磨保持マイクロピペット上で固定化することができる。前核に、微細ガラスマイクロニードルを使用して適切な抗体をコードする構築物を注射緩衝液中でマイクロインジェクトすることができる（Ｓｅｌｇｒａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９０．ｐ．１１９５−１２０５）。マイクロインジェクション後、生存胚を培養物中で配置し、レシピエント動物が胚移行のために調製されるまでインキュベートする（Ｓｅｌｇｒａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９０．ｐ．１１９５−１２０５）。
【０１１１】
従って、一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体または抗体の集団を産生する乳腺上皮細胞を提供する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む。一部の実施形態において、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸は連結している。「連結している(connected)」は、核酸が、例えば、同一のベクター内またはほぼ同一のゲノム位置内で物理的に結合していることを意味するために本明細書において使用される。一部の実施形態において、上記の乳房上皮細胞は、トランスジェニック非ヒト動物中に存在する。一部の実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである。
【０１１２】
トラスツズマブの重鎖をコードする核酸配列は、配列番号３に提供される：
ＡＴＧＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＧＡＴＡＧ。
【０１１３】
トラスツズマブの軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号４に提供される：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡ。
【０１１４】
別の態様において、本開示は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中で、核酸構築物によりコードされるトランスジェニック抗体を発現させる工程を含む、トランスジェニック抗体、およびその集団を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示の抗体を作製する方法は、
（ａ）非ヒト哺乳動物細胞を、抗ＨＥＲ２抗体をコードする導入遺伝子ＤＮＡ構築物によりトランスフェクトする工程；
（ｂ）前記抗ＨＥＲ２導入遺伝子ＤＮＡ構築物がゲノム中に挿入された細胞を選択する工程；および
（ｃ）第１の核移植手順を実施して抗ＨＥＲ２抗体についてヘテロ接合であり、それを乳汁中で発現し得る非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程
を含む。
【０１１５】
一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。
【０１１６】
一部の実施形態において、導入遺伝子ＤＮＡ構築物は、配列番号３および／または配列番号４を含む。一部の実施形態において、非ヒトトランスジェニック哺乳動物はヤギである。
【０１１７】
別の態様において、本開示は、
（ａ）抗ＨＥＲ２抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する工程、
（ｂ）抗ＨＥＲ２抗体を非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁中で発現させる工程；および
（ｃ）乳汁中で発現された抗ＨＥＲ２抗体を単離する工程
の方法を提供する。
【０１１８】
一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。
【０１１９】
乳腺中で発現される組換えタンパク質の量および質を予測するために使用されるツールの１つは、泌乳の誘導を介する（Ｅｂｅｒｔ  ＫＭ，１９９４）。誘導泌乳は、少なくとも１年後である妊娠から生じる最初の天然泌乳からではなく、トランスジェニック産生の初期からのタンパク質の発現および分析を可能とする。泌乳の誘導は、ホルモンにより、または手作業により行うことができる。
【０１２０】
一部の実施形態において、本明細書に提供されるグリコシル化抗体の組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、トランスジェニック動物の乳汁から抗体の集団を単離する工程を含む。トランスジェニック動物の乳汁から抗体を単離する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３１，Ｉｓｓｕｅｓ  １−２，１０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９９，Ｐａｇｅｓ  １４７−１５７に記載されている。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、所望量のガラクトシル化を有するグリコシル化抗体を精製する工程を含む。
【０１２１】
治療方法、医薬組成物、投与量、および投与
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体の組成物、高レベルのガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体を有する抗体の集団または高レベルのガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体を有する抗体の集団を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。一部の実施形態において、対象は、癌を有する。一部の実施形態において、対象は、ＨＥＲ２の過剰発現を特徴とする癌（ＨＥＲ２＋癌）を有する。癌のＨＥＲ２状態を決定する方法は当分野において定型的であり、例えば、２つのＦＤＡ承認の市販キットが利用可能である（Ｄａｋｏ製のＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）、およびＶｅｎｔａｎａ製の  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｈｅｒ−２）。一部の実施形態において、ＨＥＲ２＋癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌または子宮癌である。
【０１２２】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体の組成物、高レベルのガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体を有する抗体の集団または高レベルのガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体を有する抗体の集団を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。一部の実施形態において、対象は、乳癌、胆道癌；膀胱癌；脳癌、例として、膠芽細胞腫および髄芽腫；子宮頸癌；絨毛腫；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；血液腫瘍、例として、急性リンパ球性および骨髄性白血病；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；毛様細胞白血病；慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；上皮内腫瘍、例として、ボーエン病およびパジェット病；肝臓癌；肺癌；リンパ腫、例として、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫；神経芽細胞腫；口腔癌、例として、扁平上皮細胞癌；卵巣癌、例として、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるもの；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫、例として、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫；皮膚癌、例として、黒色腫、カポジ肉腫、好塩基球癌、および扁平上皮細胞癌；精巣癌、例として、生殖系腫瘍、例えば、精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛腫）、間質性腫瘍、および胚細胞腫瘍；甲状腺癌、例として、甲状腺腫および髄様癌；ならびに腎臓癌、例として、腺癌またはウィルムス腫瘍を有する。
【０１２３】
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体の組成物、高レベルのガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体を有する抗体の集団または高レベルのガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体を有する抗体の集団を含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブである。一部の実施形態において、方法は、抗ＨＥＲ２抗体に加えて化学療法剤を投与する工程をさらに含む。化学療法薬としては、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、非糖含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラギリン、メグルミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスチンおよびポリフェプロサン、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメトレキソール、グラモレク（Ｇｌａｍｏｌｅｃ）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、Ｈｙｃａｍｔｉｎ／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ／ミトロキサントロン、Ｍｅｔａｒｅｔ／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、Ｉｎｃｅｌ／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マーミスタット（Ｍａｒｍｉｓｔａｔ）、ＢＢ２５１６／マーミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、Ｌｅｍｏｎａｌ  ＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、Ｍｅｔａｓｔｒｏｎ／ストロンチウム誘導体、Ｔｅｍｏｄａｌ／テモゾロミド、Ｅｖａｃｅｔ／リポソーマルトキソルビシン、Ｙｅｗｔａｘａｎ／パクリタキセル、Ｔａｘｏｌ／パクリタキセル、Ｘｅｌｏｄａ／カペシタビン、Ｆｕｒｔｕｌｏｎ／ドキシフルリジン、Ｃｙｃｌｏｐａｘ／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵ増強剤、Ｃａｍｐｔｏ／レバミゾール、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ／イリノテカン、Ｔｕｍｏｄｅｘ／ラリトレキセド、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ／クラドリビン、Ｐａｘｅｘ／パクリタキセル、Ｄｏｘｉｌ／リポソーマルドキソルビシン、Ｃａｅｌｙｘ／リポソーマルドキソルビシン、Ｆｌｕｄａｒａ／フルダラビン、Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ／エピルビシン、ＤｅｐｏＣｙｔ、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタチン、Ｃａｅｔｙｘ／リポソーマルドキソルビシン、Ｇｅｍｚａｒ／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／ＡｎｏｒＭＥＤ、ＹＭ１１６、ヨウ素シード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８���９／デキシホスファミド、Ｉｆｅｓ／Ｍｅｓｎｅｘ／イホスファミド、Ｖｕｍｏｎ／テニポシド、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ／カルボプラチン、Ｐｌａｔｉｎｏｌ／シスプラチン、Ｖｅｐｅｓｉｄｅ／エトポシド、ＺＤ９３３１、Ｔａｘｏｔｅｒｅ／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソウレア、アルキル化剤、例えば、メルフェランおよびシクロホスファミド、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンＨＣＩ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα２ａ、α２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）ならびに硫酸ビンデシンが挙げられるが、限定されるものではない。
【０１２４】
一態様において、本開示は、ある量の抗体または抗体の集団および薬学的に許容可能なビヒクル、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、乳汁を含む。
【０１２５】
一態様において、本開示は、対象に、対象が有し、または有するリスクのある疾患を治療するために有効な量で提供される組成物を投与する工程を含む、対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、対象は、ヒトである。別の実施形態において、対象は、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは霊長類である。
【０１２６】
治療が必要とされる対象に治療有効量の本明細書に提供される抗体を投与する工程を含む実施形態によれば、「治療有効」または「治療するために有効な量」は、病状を阻害し、または反転させるため（例えば、癌を治療するため）に必要とされる抗体または組成物の量を示す。治療有効量の決定は、具体的には、医薬品の毒性および効力のような因子に依存する。これらの因子は、他の因子、例えば、効能、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、副作用の重症度および好ましい投与方式に応じて異なる。毒性は、当技術分野において周知の方法を使用して測定することができる。効力は、同一の指針を利用して測定することができる。効力は、例えば、癌の進行の減少により計測することができる。従って、薬学的有効量は、毒性学的に耐性であり、さらには有効であると臨床医により判断される量である。
【０１２７】
投与量は、投与方式に応じて局所または全身の所望の薬物（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）レベルを達成するように適切に調整することができる。このような用量において対象における応答が不十分な事象において、さらに高い用量（または異なるより局所的な送達経路により有効なより高い用量）を患者耐性が許容する程度で用いることができる。１日当たりの複数回投与が、抗体の適切な全身レベルを達成するために考慮される。適切な全身レベルは、例えば、薬物の患者のピークまたは持続血漿レベルの計測により測定することができる。「用量」および「投与量」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１２８】
一部の実施形態において、対象に投与される抗体または医薬組成物の量は、１週間当たり５０から５００ｍｇ／ｋｇ、１００から４００ｍｇ／ｋｇ、または２００から３００ｍｇ／ｋｇである。一実施形態において、対象に投与される抗体または医薬組成物の量は、１週間当たり２５０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、４００ｍｇ／ｋｇの初回用量を第１週に対象に投与し、次いで翌週にその対象に２５０ｍｇ／ｋｇを投与する。一部の実施形態において、投与速度は、１０ｍｇ／分未満である。一部の実施形態において、対象への抗体または医薬組成物の投与は、別の治療剤による治療の少なくとも１時間前に行う。一部の実施形態において、前治療は、抗体または医薬組成物の投与前に施す。
【０１２９】
一部の実施形態において、提供される組成物は、インビボ用途に用いられる。意図されるインビボの投与方式に応じて、使用される組成物は、固体、半固体または液体の剤形、例えば、錠剤、ピル剤、散剤、カプセル剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、懸濁液などであり得る。好ましくは、組成物は、正確な投与量の単回投与に好適な単位剤形で投与する。組成物は、所望される配合物に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物を配合するために一般に使用される水系ビヒクルとして定義される薬学的に許容可能な担体または希釈剤も含み得る。希釈剤は、目的ヒト組換えタンパク質の生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストローズ溶液、およびハンクス液である。同一の希釈剤を使用して凍結乾燥された目的組換えタンパク質を再構成することができる。さらに、医薬組成物は、他の薬剤、医薬剤、担体、助剤、非毒性、非治療、非免疫原性安定剤なども含み得る。このような希釈剤または担体の有効量は、構成成分の溶解度、生物学的活性などに関して薬学的に許容可能な配合物を得るために有効な量である。一部の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、無菌である。
【０１３０】
インビボ治療の間における投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸経路を含む、任意数の経路によるものであってよい。嚢内、静脈内、および腹腔内の投与経路を用いることもできる。当業者は、投与経路が治療すべき疾患に応じて変動することを認識する。例えば、本明細書の組成物または抗体は、経口、非経口または局所投与を介して対象に投与することができる。一実施形態において、本明細書の組成物または抗体は、静脈内注入により投与さえる。
【０１３１】
組成物は、それを全身送達することが望まれる場合、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射のための配合物は、単位剤形で、例えば、アンプル中または複数回投与容器(multi-dose containers)中で、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、油または水性ビヒクル中の懸濁液、液剤またはエマルションなどのような形態であってよく、配合剤、例えば、懸濁化剤、可溶化剤および／または分散剤を含有し得る。
【０１３２】
非経口投与のための医薬組成物としては、水溶性形態の活性組成物の水溶液が挙げられる。さらに、活性組成物の懸濁液を、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。場合により、懸濁液は、高濃縮溶液の調製を可能とするために好適な安定剤または組成物の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。あるいは、活性組成物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための、粉末の形態であり得る。
【０１３３】
経口投与に関して、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段により調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当技術分野において周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁液の形態であってよく、またはそれは水もしくは他の好適なビヒクルを使用前に用いる構成のための乾燥製品として提供することができる。このような液体製剤は、薬学的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル−またはソルビン酸）を用いて従来の手段により調製することができる。製剤は適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。１つまたは複数の構成成分は、抗体の経口送達が有効になるように化学修飾することができる。一般に、考えられる化学修飾は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流中への取り込みを可能とする少なくとも１つの分子の抗体への付着である。抗体の全体的な安定性の増加および体内の循環時間の増加も望まれる。このような分子の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８１，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９。使用することができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。上記の医薬使用にはポリエチレングリコール分子が好ましい。経口組成物に関して、放出位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、または大腸であり得る。当業者は、胃中で溶解しないが、材料を十二指腸または腸中の他の場所で放出する利用可能な配合物を有する。好ましくは、放出は、抗体の保護により、または例えば腸での放出のように胃環境を越えての生物活性材料の放出により、胃環境の有害な影響を回避する。
【０１３４】
口腔内投与(buccal administration)に関して、組成物は、従来の様式で配合される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１３５】
吸入投与に関して、本開示により使用される組成物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用する加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧による提供の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するようにバルブを設置することにより決定され得る。例えば、組成物と、例えばラクトースおよびデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または吹付器(insufflator)で使用されるゼラチン等のカプセル剤およびカートリッジを形成することができる。
【０１３６】
本明細書において、肺送達も考慮される。組成物は、吸入している間に哺乳動物の肺に吸入送達され、肺上皮内層を超えて血流に浸透する。限定はされないが、ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器等の、治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械的装置が、本開示の実施における使用のために考えられ、当業者はその全てに精通している。
【０１３７】
本明細書に開示の医薬組成物の鼻腔送達も考慮される。鼻腔送達は、肺における治療薬の堆積を必要とせずに、治療薬を鼻腔に投与した直後、本開示の医薬組成物の血流への通過を可能とする。鼻腔送達用の配合物としては、デキストランまたはシクロデキストランを有するものが挙げられる。
【０１３８】
組成物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または滞留浣腸剤のような直腸または膣組成物に配合することもできる。
【０１３９】
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相担体または賦形剤も含み得る。このような担体または賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４０】
好適な液体または固体医薬製剤形は、例えば、吸入用の水溶液もしくは生理食塩水溶液であり、マイクロカプセル化されており、渦巻型化(encochleated)されており、微細金粒子上にコーティングされており、リポソーム中に含有されており、霧状化されており、エアロゾルであり、皮膚中への移植のためのペレットであり、または皮膚を切創可能な鋭利器具上で乾燥している。医薬組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルション、懸濁液、クリーム剤、点滴剤または活性化合物の持続性放出を備える製剤も挙げられ、この製剤中で、上記のとおり、賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤または安定剤が習慣的に使用される。医薬組成物は、種々の薬物送達系における使用に好適である。薬物送達に関する方法の簡単な概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０参照。
【０１４１】
抗体および場合により他の治療剤は、それ自体で（無希釈で）または薬学的に許容可能な塩の形態で投与することができる。医薬として使用される場合、塩は薬学的に許容可能でなければならないが、薬学的に許容可能でない塩を都合よく使用して薬学的に許容可能なその塩を調製することができる。このような塩としては、限定されるものではないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製することができる。
【０１４２】
好適な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０１４３】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に含まれる有効量の抗体および場合により治療剤を含有する。薬学的に許容可能な担体という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適である、１つ以上の適合性の固体または液体増量剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体という用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされる天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に害する相互作用が存在しないような様式で、本開示の組成物と、および互いに混合され得る。
【０１４４】
治療剤、例として、具体的には、限定されるものではないが、抗体は、粒子で提供することができる。本明細書において使用される粒子は、全体または一部において抗体または抗体とともに投与される他の治療剤からなり得るナノまたはマイクロ粒子（または一部の例においてはこれよりも大きい）を意味する。粒子は、治療剤に加え、製薬および医学分野において定型的に使用されるそれらの材料のいずれか、例として、限定されるものではないが浸食性、非浸食性、生体分解性、もしくは非生体分解性材料またはそれらの組合せを含み得る。粒子は、抗体を溶液中でまたは半固体状態で含有するマイクロカプセルであり得る。粒子は、実質的に任意の形状であり得る。
【０１４５】
抗体の作製方法
一態様において、本開示は、高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体および高レベルのガラクトシル化抗体を有する集団を作製する方法を提供する。
【０１４６】
一態様において、本開示は、抗体の集団を作製する方法において、抗体が、抗ＨＥＲ２抗体であり、集団中の抗体のガラクトシル化のレベルが、少なくとも７０％である抗体の集団が産生されるように非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において抗体の集団を発現させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、培養されており(in culture)、抗体をコードする配列を含む核酸によりトランスフェクトされる。一部の実施形態において、核酸は、配列番号３および配列番号４を含む。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、抗体をコードする配列を含む核酸を乳腺中で発現するように操作された非ヒト哺乳動物中に存在する。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマの乳腺上皮細胞である。一部の実施形態において、乳腺上皮細胞はヤギ乳腺上皮細胞である。
【０１４７】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体または高レベルのガラクトシル化抗体を有する集団を発現する乳腺上皮細胞を提供する。
【０１４８】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の高ガラクトシル化抗ＨＥＲ２抗体または高レベルのガラクトシル化抗体を有する集団を発現する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【０１４９】
一態様において、本開示は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中で核酸構築物によりコードされるグリコシル化抗体を発現させる工程を含む、グリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団を作製する方法を提供する。一実施形態において、哺乳動物の乳房上皮細胞は、乳汁中で抗体を発現するように操作された非ヒト哺乳動物のものであり得る。さらに別の実施形態において、哺乳動物の乳房上皮細胞は、培養されている哺乳動物の乳房上皮細胞である。
【０１５０】
別の実施形態において、方法は、
（ａ）抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する工程、
（ｂ）抗体を非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁中で発現させる工程；
（ｃ）乳汁中で発現された抗体を単離する工程；および
（ｄ）単離された抗体上のガラクトースの存在を検出する工程
を含む。
【０１５１】
さらに別の実施形態において、方法は、産生されるグリコシル化抗体の集団が規定の割合のガラクトシル化（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれより高い）を含むように乳腺上皮細胞においてグリコシル化抗体の集団を産生させる工程を含む。一部の実施形態において、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。一部の実施形態において、グリコシル化抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、この方法は、インビトロで実施する。他の実施形態において、この方法は、インビボで、例えば、トランスジェニックヤギの乳腺中で実施する。
【０１５２】
一部の実施形態において、上記の方法は、泌乳を誘導する工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、方法は、追加の単離および／または精製工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、方法は、得られた抗体のグリコシル化パターンを、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生された抗体と比較する工程をさらに含む。さらなる実施形態において、方法は、得られた抗体のグリコシル化パターンを、非乳房上皮細胞により産生された抗体と比較する工程をさらに含む。このような細胞は、細胞培養物の細胞であり得る。一部の実施形態において、グリコシル化パターンは、抗体または抗体の集団上に存在するガラクトースの量である。一部の実施形態において、方法は、グリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトシル化の割合を、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生されたグリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトシル化の割合と比較する工程をさらに含む。抗体のグリコシル化パターンを評価するための実験的技術は、当業者に公知のものまたは本明細書に提供されるもの、例えば、以下の実施例に提供されるもののいずれかであり得る。このような方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析、タンデム質量分析、およびウエスタンブロット分析が挙げられる。
【０１５３】
抗体は、一部の実施形態において、本明細書に提供されるとおり産生されるトランスジェニック動物の乳汁から、または前記トランスジェニック動物の子孫から抗体を回収することにより得ることができる。一部の実施形態において、トランスジェニック哺乳動物により産生される抗体は、産生される乳汁１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルにおいて産生される。有利には、本発明による方法は、乳汁１リットル当たり少なくとも４グラムの産生を可能とする。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、１リットル当たり少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０グラムの産生を可能とする。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、１リットル当たり少なくとも６０グラムの産生を可能とし得る。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、１リットル当たり少なくとも７０グラムの産生を可能とし得る。
【０１５４】
特に本明細書に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って実施する。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。本開示の方法および技術は、特に明記のない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の方法および本明細書にわたり引用および考察される種々の一般およびより具体的な参照文献に記載の方法に従って実施する。
【０１５５】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明し、これらは決してさらに限定するものと解釈すべきでない。本出願にわたり引用される参照文献（文献の参照文献、登録特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）の全ての内容全体は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５６】
材料および方法
トラスツズマブを産生するトランスジェニックヤギの作製
トラスツズマブ抗体をコードする核酸配列をゲノム中に含むトランスジェニックヤギを作製した。トラスツズマブを産生するヤギは、慣習的なマイクロインジェクション技術を使用して作製した（例えば、米国特許第７，９２８，０６４号明細書参照）。重鎖および軽鎖（配列番号３および配列番号４）をコードするｃＤＮＡを、βカゼイン発現ベクターとライゲーションさせて構築物ＢＣ２６０１ＨＣおよびＢＣ２６０２ＬＣを得た。これらのプラスミドにおいて、トラスツズマブをコードする核酸配列は、ヤギの乳腺中でのトラスツズマブの発現を容易にするプロモーターの制御下である。原核生物配列を除去し、ＤＮＡをヤギの着床前胚中にマイクロインジェクトした。次いで、これらの胚を偽妊娠雌に移植した。得られた後代を導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。両方の鎖を担持したものをトランスジェニックファウンダーとして同定した。
【０１５７】
週齢が適切になったとき、ファウンダー動物を交配させた。妊娠および分娩後、それらを搾乳した。時間過程は、分娩後の泌乳開始日である（例えば、７日目）。トラスツズマブ抗体は、それぞれの時点において乳汁から精製し、本明細書に記載のとおり特徴付けした。
【０１５８】
実施例１
トランスジェニック産生されたトラスツズマブ
トランスジェニックヤギの乳汁中で産生されたトラスツズマブ抗体のグリコシル化パターンを、抗体からＮ−グリカンを放出させ、放出されたオリゴ糖をカラム上で流すことにより決定した（「オリゴ糖シグネチャー」）。
【０１５９】
図１〜４および６は、ヤギ＃１（図２〜４）およびヤギ＃２（図１および６）からのトランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖を示す。単糖基を以下に示す：
黒色四角：Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）
三角：フコース
灰色円：マンノース
白色円：ガラクトース
灰色菱形：Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）：シアル酸
白色菱形：Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）：シアル酸。
【０１６０】
図１は、ヤギ＃２の乳汁中で産生されたトランスジェニックトラスツズマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖の代表的なクロマトグラムを示す。図１は、産生された主要なＮ−グリカンオリゴ糖（図１Ａにおいて２１個、図１Ｂにおいて２０個）のうち、１４個が少なくとも１つのガラクトースをＮ−グリカン鎖中に有し、７つのオリゴ糖が２つのガラクトースを有することを示す。オリゴ糖の６つが、純粋にオリゴマンノースである。図１は、産生された主要なオリゴ糖のうち９つがフコシル化されていることも示す。
【０１６１】
図２〜４は、泌乳７日後（図２）、泌乳１５日後（図３）、および泌乳３０日後（図４）後に回収されたヤギ＃１の乳汁中のトランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖のクロマトグラムを示す。
【０１６２】
ヤギ＃１の乳汁中で産生されたトラスツズマブ抗体から単離された全てのＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を、図５に示す。図５は、全体的なモノガラクトシル化の割合、二ガラクトシル化の割合、総ガラクトシル化（モノガラクトシル化＋二ガラクトシル化）の割合、上記に提供される式に従って算出されたガラクトシル化の割合、上記に提供される式に従って算出されたフコシル化の割合、ヤギ＃１中で産生されたトラスツズマブ抗体のガラクトシル化とフコシル化との比の一覧も示す。結果を以下の表１にもまとめる。
【０１６３】
【表１】
2020125286.tif 000004
【０１６４】
図６は、泌乳７日目において回収されたヤギ＃２の乳汁中のトランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体から放出されたＮ−グリカンオリゴ糖のクロマトグラムを示す。
【０１６５】
泌乳７日目におけるヤギ＃２の乳汁中で産生されたトラスツズマブ抗体から単離された全てのＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を、図７に示す。図７は、全体的なモノガラクトシル化の割合、二ガラクトシル化の割合、総ガラクトシル化（モノガラクトシル化＋二ガラクトシル化）の割合、上記に提供される式に従って算出されたガラクトシル化の割合、上記に提供される式に従って算出されたフコシル化の割合、泌乳７日目におけるヤギ＃２中で産生されたトラスツズマブ抗体のガラクトシル化とフコシル化との比の一覧も示す。図８は、泌乳１５、４９、８４、および１１２日目におけるヤギ＃２の乳汁中で産生されたトラスツズマブ抗体から単離された異なるＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を提示する。結果を以下の表２にもまとめる。
【０１６６】
【表２】
2020125286.tif 000005
【０１６７】
実施例２
追加の動物におけるトランスジェニック産生されたトラスツズマブのグリコシル化分析
泌乳７日目におけるヤギ＃３および泌乳３／４日目におけるヤギ＃４の乳汁からのトランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体中に存在する異なるＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を図９に示し、以下の表３にもまとめる。
【０１６８】
【表３】
2020125286.tif 000006
【０１６９】
泌乳３日目におけるヤギ＃５ならびに泌乳５、６、および７日目におけるヤギ＃６の乳汁からのトランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体中に存在する異なるＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を図１０に示し、以下の表４にもまとめる。
【０１７０】
【表４】
2020125286.tif 000007
【０１７１】
２回目の泌乳の８、１５、および２９日目におけるヤギ＃２の乳汁からのトランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体中に存在する異なるＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を図１１に示し、以下の表５にもまとめる。
【０１７２】
【表５】
2020125286.tif 000008
【０１７３】
市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブ中に存在する異なるＮ−グリカンオリゴ糖の相対割合を図１２に示し、以下の表６にもまとめる。
【０１７４】
【表６】
2020125286.tif 000009
【０１７５】
図１３は、１回目の泌乳（ＮＬ１）および２回目の泌乳（ＮＬ２）の種々の日数におけるヤギ＃２により産生されたトラスツズマブのシアル酸およびマンノース修飾ならびに優勢型を比較するまとめを示す。
【０１７６】
図１４は、ヤギ＃１〜６中で産生されたトラスツズマブのシアル酸およびマンノース修飾ならびに優勢型のまとめを示す。
【０１７７】
実施例３
トランスジェニック産生されたトラスツズマブの特徴付け
ヤギ乳汁中で産生されたトランスジェニック産生されたトラスツズマブの機能特性を、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブと比較した。ＨＥＲ２発現細胞株、ＮＫ細胞上のＣＤ１６およびＣ１ｑについての結合親和性を定量した。さらに、これらの抗体を、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によるＨＥＲ２発現細胞株の溶解を誘導するそれらの能力、ならびに細胞増殖を阻害するそれらの能力について評価した。
【０１７８】
ＨＥＲ２発現ＳＫ−ＢＲ−３細胞株上の抗原認識は、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢおよび市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブ（Ｒｏｃｈｅ）について同一のオーダー（任意解離定数Ｋｄ、２〜６μｇ／ｍｌ）であった。トランスジェニック産生されたトラスツズマブ抗体は、ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６受容体に結合し、ＩＣ５０値はバッチＡについて３０μｇ／ｍｌであり、バッチＢについて２５μｇ／ｍｌであった。比較において、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブについてＩＣ５０は３７μｇ／ｍｌであり、トランスジェニック産生されたトラスツズマブの結合が市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブのＩＣ５０の範囲内であることを示した。同様に、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）によるＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解を誘導する試験抗体のそれぞれの能力は、同等であった。
【０１７９】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を媒介する試験抗体のそれぞれの能力は、同等であった。市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブ、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡおよびバッチＢは、それぞれ、ＢＴ−４７４細胞に対して５５、５５および５０％の増殖阻害を誘導した。
【０１８０】
材料および方法
ＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ−３細胞株への結合アッセイ
試薬
−  抗ＨＥＲ２抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ
−  標的細胞
・ＳＫ−ＢＲ−３細胞。
【０１８１】
方法
２×１０５個の細胞を、１００μｌの抗ＨＥＲ２抗体（１０μｇ／ｍｌ）と４℃において３０分間インキュベートした。洗浄後、ヒト化ＨＥＲ２ｍＡｂ抗体をフィコエリスリン結合ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（１００μｌの１：１００の希釈物）により検出し、４℃において３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析した。
【０１８２】
相対解離定数（Ｋｄ）−細胞表面抗原への抗体結合の決定
試薬
−  抗ＨＥＲ２抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ。
【０１８３】
方法
２×１０５個の細胞を、様々な濃度（０から５０μｇ／ｍｌ、最終濃度）の１００μｌのＡｌｅｘａ４８８結合抗ＨＥＲ２抗体と４℃において３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ５００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）により分析した。
【０１８４】
最大結合（Ｂｍａｘ）および任意解離定数（Ｋｄ）値を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。μｇ／ｍｌで表現される任意Ｋｄは、一般にｎＭで表現される真の親和性値を表さないが、試験抗体間の指標を与える。
【０１８５】
ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６との相互作用を定量するためのアッセイ
試薬
−  抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ
−  末梢血から抽出された健常ドナーからのＮＫエフェクター細胞をネガティブディプリーション（negative depletion）（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）により精製した。
−  標的細胞
・ＳＫ−ＢＲ−３細胞。
【０１８６】
方法
ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６へのｍＡｂ結合を、抗ＣＤ１６抗体（３Ｇ８クローン）を用いる競合アッセイを使用して計測した。
【０１８７】
健常ドナーの末梢血からネガティブディプリーション（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）により精製されたＮＫ細胞を、変動濃度（０から８３μｇ／ｍｌ）の抗ＨＥＲ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはトランスジェニック産生されたトラスツズマブ）と、固定濃度のＰＥにコンジュゲートしている抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８（３Ｇ８−ＰＥ）とインキュベートした。洗浄後、ＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体に結合した３Ｇ８−ＰＥをフローサイトメトリーにより評価した。観察された平均蛍光値（ＭＦＩ）を結合パーセントとして表現し、１００％は試験抗体の添加なしで観察された値であり、従って、最大３Ｇ８結合に対応し、０％は、３Ｇ８−ＰＥ抗体の不存在下のＭＦＩに対応する。３Ｇ８結合の５０％阻害を誘導するために要求される抗体濃度ＩＣ５０を、それぞれの試験抗体についてＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０１８８】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
試薬
−  抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ
・「抗ｉｄ  ＦＶＩＩＩ（抗体）」とも称される、抗イディオタイプＦＶＩＩＩ（ラットハイブリドーマＹＢ２／０により産生されたキメラ抗第ＶＩＩＩ因子抗体）。
−  エフェクター細胞：
・末梢血から抽出された健常ドナーからのＮＫエフェクター細胞を、ネガティブディプリーション（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）により精製した。
−  標的細胞：
・ＳＫ−ＢＲ−３細胞。
【０１８９】
方法
ＳＫ−ＢＲ−３標的細胞を、Ｅ／Ｔ：１０／１でＮＫ細胞および増加濃度の抗ＨＥＲ２抗体を有する９６ウェルプレート中でプレーティングした。
【０１９０】
１６時間のインキュベーション後、抗ＨＥＲ２抗体により誘導された標的細胞溶解を、溶解した標的細胞から上清中に放出された細胞内酵素の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによりクロマトグラフィー計測した（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【０１９１】
分析
溶解パーセントは、以下の式に従って算出した：
溶解％＝［（ＥＲ−ＳＲ）／（１００−ＳＲ）］−［（ＮＣ−ＳＲ）／（１００−ＳＲ）］
式中、ＥＲおよびＳＲは、それぞれ、実験および自然ＬＤＨ放出を表し；ＮＣは、天然細胞傷害を表す。
【０１９２】
結果（溶解％）を、抗体濃度（０〜５０００ｎｇ／ｍｌ）の関数として表現する。最大溶解の割合Ｅｍａｘ、および最大溶解の５０％を誘導する抗体の量ＥＣ５０を、ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して算出した。
【０１９３】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
試薬
−  抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ
・抗ｉｄ  ＦＶＩＩＩ抗体
−  標的細胞：
・ＳＫ−ＢＲ−３細胞。
【０１９４】
方法
標的細胞を、増加濃度の抗ＨＥＲ２抗体（０から２５０００ｎｇ／ｍｌ）と、補体源としての幼齢ウサギ血清の存在下でインキュベートした（１／１０に希釈）。３７℃における１時間のインキュベーション後、溶解した標的細胞により上清中に放出されたＬＤＨの量をフローサイトメトリー（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により計測し、それを使用して試験抗体により媒介されるＣＤＣ活性の割合を算出した。
【０１９５】
分析
溶解パーセントは、以下の式に従って算出した：＝
溶解％＝ＥＲ−ＳＡ
ＥＲ：実験的応答
ＳＡ：標的細胞を、抗体なしで補体の存在下でインキュベートした場合に得られた自然活性。
【０１９６】
結果を抗体濃度の関数として溶解のパーセントとして表現する。
【０１９７】
Ｃ１ｑ結合アッセイ
試薬
−  抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）：
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ
・抗ｉｄ  ＦＶＩＩＩ抗体
−  Ｃ１ｑ（Ｓｉｇｍａ）
−  ポリクローナルウサギ抗ヒトＣ１ｑ（ＤＡＫＯ）
−  ポリクローナルブタ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）
−  ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）（Ｓｉｇｍａ）
−  ＰＢＳ中１％ＳＤＳ（Ｆｌｕｋａ）。
【０１９８】
方法
手短に述べると、増加濃度（０から１０μｇ／ｍｌ）の抗体抗ＨＥＲ２を、９６ウェルプレート中で４℃において一晩コーティングした。ＰＢＴ（ＰＢＳ、ＢＳＡ１％、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０５％）による１時間の飽和後、ヒトＣ１ｑを２μｇ／ｍｌに希釈し、添加し、室温において１時間インキュベートした。次いで、結合したＣ１ｑを、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣ１ｑ抗体の適用とそれに続くセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしているポリクローナルブタ抗ウサギＩｇＧの適用により認識した。基質ＡＢＴＳを添加し、ペルオキシダーゼとの反応後、青緑色の反応生成物を形成させ、それを波長４０５ｎｍにおいて読み取った。反応をウェル中の基質と等しい容量の１％のＳＤＳの容量の添加により停止させた。
【０１９９】
細胞増殖アッセイ
試薬
−  抗体：
・Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ
・トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ
・抗ｉｄ  ＦＶＩＩＩ抗体
−  標的細胞：
・ＢＴ−４７４細胞。
【０２００】
方法
標的細胞を９６ウェルプレート中で１×１０４個の細胞／ウェルにおいてプレーティングし、増加濃度の抗ＨＥＲ２抗体（０から１００μｇ／ｍｌ）と３７℃において７２時間培養した。全ての希釈を培養培地中で実施した（最終容量１００μＬ／ウェル）。
【０２０１】
ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩ（ｔｏｐｏＩ）を阻害する細胞傷害キノリンアルカロイドのカンプトテシン（１μｇ／ｍｌ）を、同一条件における細胞増殖の阻害の陽性対照として使用した。
【０２０２】
分析
細胞増殖を、生細胞の数の測定を可能とする比色法「Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」（ＰＲＯＭＥＧＡ）により３日目に計測した。手短に述べると、ＭＴＳ基質を細胞により着色ホルマザンに生体内還元させる。波長４９０ｎｍにおける吸光度により計測されたホルマザン生成物の量は、培養物中の生細胞の数に正比例する。
【０２０３】
２０μｌのＭＴＳを各ウェルに添加した。規定の細胞株の代謝に従って２時間インキュベートした後、吸光度を波長４９０ｎｍにおいて９６ウェルプレートリーダー中で記録した。結果を細胞増殖の割合または増殖の阻害の割合として表現し、１００％は、抗体なしの標的細胞増殖に対応する。
【０２０４】
結果
ＨＥＲ２発現細胞株への結合
図１５に提示されるとおり、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブならびにトランスジェニック産生されたトラスツズマブＡおよびＢの２つのバッチの両方が、白色で示される陰性対照と比較してＨＥＲ２を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞株を認識し、それに結合した。
【０２０５】
相対Ｋｄの決定
４回の独立した結合アッセイを実施し、アッセイの平均を図１６に提示し、対応するデータを表７および８に提示する。ＳＫ−ＢＲ−３細胞により発現された膜ＨＥＲ２への抗ＨＥＲ２抗体の結合を、各試験抗体濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ）についての蛍光強度の平均（ＭＦＩ）として表現する。任意Ｋｄは、真の親和性値（ｎＭ）を表さないが、試験抗体間の同等の指標を与える。表７に提示されるとおり、平均任意Ｋｄ（プラトー値の５０％を与える濃度）は、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢおよび市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブについてそれぞれ６．１６μｇ／ｍｌ、３．９９μｇ／ｍｌおよび１．９５μｇ／ｍｌである。ＨｅｒｃｅｐｔｉｎのＩｇＧ含有率を決定せず、それはＫｄ決定に影響し得るため、それらの実験は、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブおよびトランスジェニック産生されたトラスツズマブがＨＥＲ２発現細胞に同様に結合することを示す。
【０２０６】
【表７】
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【０２０７】
４回の実験の平均から導いた結果を、それぞれＭＦＩおよびμｇ／ｍｌとして表現する。
【０２０８】
【表８】
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【０２０９】
ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６との相互作用
ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６に結合する各抗ＨＥＲ２抗体の能力を、３Ｇ８−ＰＥｍＡｂを使用する競合アッセイにおいて試験した。図１７は、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡおよびトランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢについての競合ＣＤ１６結合データを提示し、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を、増加量の抗ＨＥＲ２抗体と、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ１６＋３Ｇ８ｍＡｂと一緒にインキュベートした。３Ｇ８結合の割合を、材料および方法セクションに記載のとおり算出した。３Ｇ８−ＰＥｍＡｂの結合を５０％だけ低減させるために要求されるｍＡｂの量は、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡおよびトランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢについてそれぞれ３７、３０および２５μｇ／ｍｌであった（図１７、表９）。トランスジェニック産生されたトラスツズマブのＣＤ１６への結合は、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の結合と類似する。
【０２１０】
【表９】
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【０２１１】
【表１０】
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【０２１２】
ＡＤＣＣ評価
図１８に提示されるとおり、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡおよびトランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢにより誘導されたＳＫ−ＢＲ−３細胞の最大溶解は、それぞれ６４、７１、および６８％であった。データを３回の独立実験の平均として提示し、細胞溶解の割合を抗体濃度（０〜５０００ｎｇ／ｍｌ）の関数として表現する。最大有効濃度の半分のＥＣ５０値は、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡおよびトランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢ抗体について、それぞれ０．５７、０．２８、および０．３６ｎｇ／ｍｌであった（表１１）。これらのデータは、３つの試験抗ＨＥＲ２抗体についてのＡＤＣＣ活性が、ＮＫ細胞により発現されたＣＤ１６の結合と極めて類似することを示した。抗Ｉｄ  ＦＶＩＩＩ抗体を陰性対照として使用し、有意な細胞溶解を媒介しない。
【０２１３】
【表１１】
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【０２１４】
【表１２】
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【０２１５】
ＣＤＣ評価
抗ＨＥＲ２抗体により媒介されたＳＫ−ＢＲ−３細胞に対するＣＤＣ活性を評価した。結果は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）またはトランスジェニック産生されたトラスツズマブにより誘導されたＣＤＣ活性が類似することを示す。
【０２１６】
Ｃ１ｑ結合
トランスジェニック産生されたトラスツズマブおよび市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブのＣ１ｑに結合する能力を、ＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、表１３に提示されるとおり、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブおよびトランスジェニック産生されたトラスツズマブがヒトＣ１ｑに結合することを示す。
【０２１７】
【表１３】
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【０２１８】
細胞増殖アッセイ
抗ＨＥＲ２抗体を、ＢＴ−４７４細胞の増殖を阻害するその能力について評価した。標的細胞増殖のパーセントを、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体または陰性対照抗体（抗ｉｄ  ＦＶＩＩＩ）の存在下で７２時間後に計測し、３回のアッセイの平均として提示した。１００％の値は、抗体なしで得られた細胞増殖の量に対応する。データを図１９および表１４に提示する。
【０２１９】
陰性対照抗体（抗ｉｄ  ＦＶＩＩＩ）は、ＢＴ−４７４細胞増殖の１０％未満の阻害を誘導した。対照的に、ＢＴ−４７４細胞と、市販Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／トラスツズマブ、トランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＡ、およびトランスジェニック産生されたトラスツズマブバッチＢとのインキュベーションは、それぞれ５５、５５、および５０％の増殖阻害をもたらした。
【０２２０】
【表１４】
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【０２２１】
他の実施形態
本明細書に開示の特性の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示のそれぞれの特性は、同一、等価、または類似の目的に役立つ代替特性により置き換えることができる。従って、特に明示的に記載のない限り、開示のそれぞれの特性は、包括的な一連の等価または類似特性の一例にすぎない。
【０２２２】
上記の詳細な説明から、当業者は本発明の不可欠な特徴を、その趣旨および範囲から逸脱せずに容易に確認することができ、本発明の種々の変更および改変を、種々の使用法および条件に適応させることができる。従って、他の実施形態も特許請求の範囲内に存在する。本発明の他のいくつかの実施形態例を以下に示す。
（１）抗ＨＥＲ２抗体であって、
該抗体が抗体の集団に含まれ、該抗体の集団中の前記抗体のガラクトシル化レベルが少なくとも６０％であり、かつ
前記抗体の集団中の前記抗体が、配列番号１で示される重鎖および配列番号２で示される軽鎖を含む、抗ＨＥＲ２抗体。
（２）前記集団中の前記抗体のフコシル化レベルが少なくとも５０％である、（１）に記載の抗体。
（３）モノガラクトシル化Ｎ−グリカンおよび／または二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む、（１）または（２）に記載の抗体。
（４）前記抗体がトラスツズマブである、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生されたものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）トランスジェニック非ヒト哺乳動物中で産生されたものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体。
（７）前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである、（５）または（６）に記載の抗体。
（８）前記非ヒト哺乳動物がヤギである、（７）に記載の抗体。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
（１０）抗体の集団を含む組成物であって、
前記抗体が抗ＨＥＲ２抗体であり、
前記集団中の前記抗体のガラクトシル化レベルが少なくとも６０％であり、かつ
前記抗体の集団中の前記抗体が、配列番号１で示される重鎖および配列番号２で示される軽鎖を含む、組成物。
（１１）抗体の集団を含む組成物であって、
前記抗体の集団中の前記抗体がトランスジェニック非ヒト哺乳動物中で産生された抗ＨＥＲ２抗体であり、
前記集団中の前記抗体のガラクトシル化レベルが少なくとも６０％であり、かつ
前記抗体の集団中の前記抗体が、配列番号１で示される重鎖および配列番号２で示される軽鎖を含む抗体と同じ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列と、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列とを含む、組成物。
（１２）前記集団中の前記抗体のフコシル化レベルが少なくとも５０％である、（１０）または（１１）に記載の組成物。
（１３）前記集団中の前記抗体のフコシル化レベルに対する、前記集団中の前記抗体のガラクトシル化レベルの比が、１．０から１．４の間である、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の組成物。
（１４）前記集団中の前記抗体の少なくとも２５％が二ガラクトシル化Ｎ−グリカンを含み、かつ前記集団中の前記抗体の少なくとも２５％がモノガラクトシル化Ｎ−グリカンを含む、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の組成物。
（１５）前記抗体がトラスツズマブである、（１０）〜（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１６）前記抗体が、非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞において産生されたものである、（１０）〜（１５）のいずれかに記載の組成物。
（１７）癌を有する対象に投与される、（９）〜（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１８）抗体の集団を作製する方法であって、
抗体の集団が産生されるように非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において抗体の集団を発現させる工程を含み、
前記抗体が抗ＨＥＲ２抗体であり、
前記集団中の前記抗体のガラクトシル化レベルが少なくとも６０％であり、かつ
前記抗体の集団中の前記抗体が、配列番号１で示される重鎖および配列番号２で示される軽鎖を含む、方法。
（１９）（１）〜（８）のいずれかに記載の抗体または（９）〜（１７）のいずれかに記載の組成物の抗体の集団を産生する、乳腺上皮細胞。
（２０）（１９）に記載の乳腺上皮細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020125286.tif 000027
【図１１】
2020125286.tif 000028
【図１２】
2020125286.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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