(57)【要約】【課題】  抗体と特異的に結合可能なアフィニティリガンドを不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤であって、抗体の分取目的にも利用可能な、抗体吸着量の高い吸着剤を提供すること。【解決手段】  Ｆｃ結合性タンパク質を粒子径７μｍ以上２５μｍ以下の多孔質親水性ポリマー粒子に固定化して得られる抗体吸着剤、ならびに前記吸着剤を充填したカラムに平衡化緩衝液を通液してカラムを平衡化する工程と前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む抗体の分離法により、前記課題を解決する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤であって、不溶性担体が粒子径７μｍ以上２５μｍ以下の多孔質親水性ポリマー粒子である、前記吸着剤。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項２に記載の吸着剤。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＦｃＲ９のアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつＦｃＲ９のアミノ酸置換を保持し、かつ少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質（ｄ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質
【請求項４】
多孔質親水性ポリマーが、ポリメタクリレートである、請求項１から３のいずれかに記載の吸着剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の吸着剤を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、溶出液により溶出された抗体を含む画分を分取する工程をさらに含む、抗体医薬の製造方法。
【請求項７】
請求項５の方法により、糖鎖構造の違いによって抗体を分離する方法。
【請求項８】
糖鎖構造の違いが、末端のガラクトースの量の違いによる請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した抗体吸着剤、およびそれを用いた抗体分離法に関する。より詳しくは、本発明は、前記タンパク質を固定化させる担体を変更することで抗体吸着量が向上した吸着剤、およびそれを用いた抗体分離法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬品の糖鎖構造は薬効や安定性に大きく関与する。そのため、抗体医薬品を製造する際、糖鎖構造の制御は極めて重要である。
【０００３】
Ｆｃ結合性タンパク質のうちＦｃγＲＩＩＩａは、抗体（免疫グロブリン）の糖鎖構造を認識することが知られており、ＦｃγＲＩＩＩａをアフィニティリガンドとして不溶性担体に固定化した吸着剤を用いることで、抗体を糖鎖構造に基づき分離できる（特許文献１）。したがって、前記吸着剤は、抗体医薬品製造時の工程分析に有用である。また、ＦｃγＲＩＩＩａのうち細胞外領域（具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までの領域）中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、アフィニティリガンドとして必要な、熱安定性、酸安定性、アルカリ安定性を向上させている（特許文献１から３）。
【０００４】
しかしながら、ＦｃγＲＩＩＩａまたは前述したアミノ酸置換体を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を、糖鎖構造に基づく抗体の分取目的に適用しようとしたところ、抗体の吸着量が不十分であり、前記吸着剤を工業的な抗体医薬品の製造における抗体の分取目的に適用するのは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−０８６２１６号公報
【特許文献２】特開２０１６−１６９１９７号公報
【特許文献３】特開２０１７−１１８８７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、抗体と特異的に結合可能なアフィニティリガンドを不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤であって、抗体の分取目的にも利用可能な、抗体吸着量の高い吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、アフィニティリガンドであるＦｃ結合性タンパク質を固定化させる不溶性担体を最適化することで、従来よりも抗体吸着量が向上した抗体吸着剤を得ることができた。具体的には、従来の抗体吸着剤において不溶性担体として用いていた非多孔質粒子に替え、粒子径の小さな多孔質粒子を用いることで、非多孔質粒子を不溶性担体として用いたときと比較し抗体吸着量が向上した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の［１］から［８］に記載の態様を包含する。
【０００９】
［１］Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤であって、不溶性担体が粒子径７μｍ以上２５μｍ以下の多孔質親水性ポリマー粒子である、前記吸着剤。
【００１０】
［２］Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、［１］に記載の吸着剤。
【００１１】
［３］ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかに記載のタンパク質である、［２］に記載の吸着剤。
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＦｃＲ９のアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつＦｃＲ９のアミノ酸置換を保持し、かつ少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質（ｄ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を
有するタンパク質
［４］多孔質親水性ポリマーが、ポリメタクリレートである、［１］から［３］のいずれかに記載の吸着剤。
【００１２】
［５］［１］から［４］のいずれかに記載の吸着剤を充填したカラムに平衡化液を添加してカラムを平衡化する工程と、前記平衡化したカラムに抗体を含む溶液を添加して抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離法。
【００１３】
［６］［５］に記載の方法において、溶出液により溶出された抗体を含む画分を分取する工程をさらに含む、抗体医薬の製造方法。
【００１４】
［７］［５］の方法により、糖鎖構造の違いによって抗体を分離する方法。
【００１５】
［８］糖鎖構造の違いが、末端のガラクトースの量の違いによる［７］に記載の方法。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明において不溶性担体に固定化させるＦｃ結合性タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を有するタンパク質のことをいい、Ｆｃ受容体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇが例示できる。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体である場合の具体例としては、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ヒトＦｃＲｎがあげられる。特にヒトＦｃγＲＩＩＩａは、抗体が有する糖鎖構造を認識可能なヒトＦｃ受容体であり、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化した抗体分離剤は、抗体を糖鎖構造に基づき分離できる（特開２０１５−０８６２１６号公報、特許文献１）ことから、本発明において不溶性担体に固定化させるＦｃ結合性タンパク質として好ましい態様といえる。
【００１８】
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの一例として、以下の（ｉ）から（ｘｉｖ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ｉ）配列番号１に記載の天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、細胞外領域（図１ではＥＣ領域）の一部である、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質；
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、の相同性を有し、かつ少なくとも１７６番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基のうち、９箇所アミノ酸置換したポリペプチド）を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＦｃＲ９のアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、の相同性を有し、かつＦｃＲ９のアミノ酸置換を保持し、かつ少なくとも１９２番目のバリンがフェニルアラニンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｖｉｉｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基（配列番号３に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基のうち、１９２番目のバリンをフェニルアラニンにアミノ酸置換したポリペプチド）を少なくとも含むタンパク質；
（ｉｘ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換され、
かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｘ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換され、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；；
（ｘｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、の相同性を有し、かつ少なくとも１７６番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換され、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｘｉｉ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基（配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基のうち、３６箇所アミノ酸置換したポリペプチド）を少なくとも含み、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｘｉｉｉ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｘｉｖ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、の相同性を有し、かつＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換を保持し、かつ抗体結合活性を有するタンパク質。
【００１９】
なお前記（ｉ）から（ｘｉｖ）に記載のタンパク質は、いずれもヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１ではＥＣ領域）の一部またはそのアミノ酸置換体を少なくとも含んでいればよく、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞内領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。また天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ６６Ｈｉｓ（この表記は、配列番号１の６６番目（配列番号３では８２番目）のロイシンがヒスチジンにアミノ酸置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ６６Ａｒｇ、Ｇｌｙ１４７Ａｓｐ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じた変異体が知られているが、これらアミノ酸置換を前記（ｉｉ）から（ｖｉｉ）、（ｉｘ）から（ｘｉ）、（ｘｉｉｉ）および（ｘｉｖ）に記載のタンパク質に有してもよい。さらに前記（ｉｉ）から（ｖｉｉ）、（ｉｘ）から（ｘｉ）、（ｘｉｉｉ）および（ｘｉｖ）に記載のタンパク質において、「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜５０個、さらにより好ましくは１〜３０個、最も好ましくは１〜２０個または１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。
【００２０】
本発明において不溶性担体に固定化させるＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から目的の抗体を分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチド（例えば、配列番号１１に記載のアミノ酸配列の２００番目から２０８番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）を、Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらにＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００２１】
本発明の吸着剤は前述したＦｃ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体として、粒子径７μｍ以上２５μｍ以下の多孔質親水性ポリマー粒子を用いることを特徴としている。親水性ポリマーの一例としては、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子があげられる。なお粒子径は７μｍ以上２２μｍ以下が好ましく、７μｍ以上１８μｍ以下がより好ましく、７μｍ以上１５μｍ以下がさらに好ましく、８μｍ以上１２μｍ以下が特により好ましい。本発明において粒子径は、体積平均粒子径を意味し、具体的にはコールターカウンター（コールター社製）にて粒度分布を測定することにより求めた。
【００２２】
本明細書において多孔質粒子とは、表面にも孔があり中も空洞になっているスポンジ状のものを意味し、具体的には空孔率３０％から９５％の粒子のことをいい、空孔率５０％以上であると、より好ましい。本発明の粒子の空孔率は、以下の（ａ）から（ｅ）に記載の操作により測定されるものである。なお、当該測定方法は液体クロマトグラフィーの分野では多孔質粒子の空孔率測定法として一般的な方法である。
【００２３】
（ａ）本発明の多孔質粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填する。
【００２４】
（ｂ）水を溶出液として、前記カラムからの分子量２００万のブルーデキストランと塩化ナトリウムの溶出容積を測定する。
【００２５】
（ｃ）前記カラムのカラム容積から操作（ｂ）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、ゲル容積を算出する。
【００２６】
（ｄ）操作（ｂ）で測定した塩化ナトリウムの溶出容積から、操作（ｂ）で測定した分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積を引くことにより、細孔容積を算出する。
【００２７】
（ｅ）操作（ｄ）で算出した細孔容積を操作（ｃ）で算出したゲル容積で除することにより、空孔率を算出する。
【００２８】
すなわち、塩化ナトリウムの溶出容積（Ｖｎ）、分子量２００万のブルーデキストランの溶出容積（Ｖｏ）及びカラム容積（Ｖｃ）を用い、以下に示した計算式から空孔率を算出することができる
空孔率（％）＝（（Ｖｎ−Ｖｏ）／（Ｖｃ−Ｖｏ））ｘ１００。
【００２９】
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、当該不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は、例えば適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製すればよい。
【００３０】
一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボニル−（６−アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
【００３１】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。
【００３２】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３３】
本発明の方法において用いられる多孔質親水性ポリマー粒子の好適な例としては、Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工社製）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（オルガノ社製）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（ＪＮ社製）、ＰＯＲＯＳ（ＴＨｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００３５】
前述した方法でＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化し得られた本発明の抗体吸着剤を用いて抗体を分離するには、当該抗体吸着剤を充填したカラムにポンプ等の送液手段を用いて平衡化液を添加することでカラムを平衡化し、前記送液手段で抗体を含む溶液を添加することで前記抗体吸着剤に抗体を特異的に吸着させた後、適切な溶出液を前記送液手段で添加することで前記吸着した抗体を溶出させればよい。なお本発明において抗体の分離とは、夾雑物を含む溶液からの抗体分離（夾雑物除去）に限らず、構造・性質・活性等に基づく抗体間での分離も含まれる。
【００３６】
前記平衡化液としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液が例示でき、さらに前記緩衝液に、１０ｍＭから１００ｍＭ（好ましくは４０ｍＭから６０ｍＭ）の塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。平衡化液のｐＨは、ｐＨ４．０から７．０までの範囲から、緩衝液成分、カラム形状、吸着剤のカラムへの充填圧力などを考慮し、適宜最適値を決定すればよい。
【００３７】
抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（Ｆｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、抗体吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。その緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、抗体が有する機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定すればよく、一例としてｐＨ２．５以上６．０以下、ｐＨ３．０以上５．０以下、ｐＨ３．０以上４．０以下、があげられる。
【００３８】
塩濃度の変化で抗体を溶出させる場合、高濃度の塩を含む緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に塩濃度を段階的に上昇させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で塩濃度を上昇させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば水溶性の塩として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウム濃度０Ｍから１Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させればよい。また、ｐＨ変化で抗体を溶出させる場合、平衡化緩衝液よりｐＨが低下した酸性緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に緩衝液のｐＨを段階的に低下させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で緩衝液のｐＨを低下させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば抗体が吸着する中性から弱酸性の緩衝液から抗体が溶離する酸性の緩衝液へと、リニアグラジエントで溶出させればよい。
【００３９】
前述した方法で溶出された、抗体が含まれる画分を分取することで当該抗体を得ることができる。分取は常法により行なってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、自動フラクションコレクター等により画分の分取をすることが挙げられる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤において、不溶性担体が粒子径７μｍ以上２５μｍ以下の多孔質親水性ポリマー粒子であることを特徴としている。本発明の吸着剤は、不溶性担体として非多孔質粒子を用いた従来の吸着剤と比較し、抗体吸着量が増加している。従って、本発明は工業的な抗体医薬品の製造における抗体の分取に有用である。
【００４１】
特にＦｃ結合性タンパク質として、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを用いた場合、これらタンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体分離剤は、糖鎖構造に基づく分離（特開２０１５−０８６２１６号公報）や、抗体依存性細胞傷害活性の強さに基づいた分離（特開２０１６−０２３１５２号公報）ができるため、特定の糖鎖構造を有した抗体や、抗体依存性細胞傷害活性の高い（または低い）抗体を、選択的かつ大量に調製できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。
【図２】実施例９の結果を示す溶出パターンである。
【図３】実施例１０の結果を示す溶出パターンである。
【図４】比較例３の結果を示す溶出パターンである。
【図５】比較例４の結果を示す溶出パターンである。
【図６】実施例１１の結果を示す溶出パターンである。
【図７】実施例１２の結果を示す溶出パターンである。
【図８】実施例１３の結果を示す溶出パターンである。
【図９】実施例１４の結果を示す溶出パターンである。
【図１０】実施例１５の結果を示す溶出パターンである。
【図１１】実施例１６の結果を示す溶出パターンである。
【図１２】実施例１７の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【図１３】実施例１８の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【図１４】実施例１９の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【図１５】実施例２０の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【図１６】実施例２１の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【図１７】実施例２２の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【図１８】実施例２３の結果を示す各抗体医薬品に含まれる糖鎖構造の割合である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１  ＦｃＲ９アミノ酸置換体の作製
ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号３）に対し、１９２番目のバリン（配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａでは１７６番目のバリンに相当）をフェニルアラニンにアミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆを作製した。
【００４５】
具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号）から、ＰＣＲを用いて前記アミノ酸置換を有したポリヌクレオチドを作製し、当該ポリヌクレオチドを発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーション後、当該ライゲーション産物で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することで、ＦｃＲ９＿Ｆを発現する形質転換体を得た。なおＦｃＲ９（配列番号３）は、配列番号２に示す天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目（配列番号１では２７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、４５番目（配列番号１では２９番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、５１番目（配列番号１では３５番目に相当）のチロシンをアスパラギンに、６４番目（配列番号１では４８番目に相当）のグルタミンをアルギニンに、９１番目（配列番号１では７５番目に相当）のフェニルアラニンをロイシンに、１０８番目（配列番号１では９２番目に相当）のアスパラギンをセリンに、１３３番目（配列番号１では１１７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、１３７番目（配列番号１では１２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、および１８７番目（配列番号１では１７１番目に相当）のフェニルアラニンをセリンに、それぞれアミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質である。本明細書では、前記ＦｃＲ９（配列番号３）が天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号２）に対して保有する前記９箇所のアミノ酸置換を、「ＦｃＲ９のアミノ酸置換」と称することがある。
【００４６】
ＦｃＲ９＿Ｆのアミノ酸配列を配列番号５に、ＦｃＲ９＿Ｆをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に、それぞれ示す。配列番号５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）であり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９＿Ｆのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００４７】
実施例２  システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含む発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ９＿Ｆを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号７（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号８（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ−ＰｅｌＢＶ３にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
【００５０】
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを得た。
【００５１】
（４）ｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号９（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号１０（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて行なった。
【００５２】
発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２にそれぞれ示す。なお配列番号１１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであって、ただし６番目のプロリンをセリンにアミノ酸置換したオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆのアミノ酸配列（配列番号５の３３番目から２０８番目までの領域）であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
【００５３】
実施例３  ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓの調製
（１）実施例２で作製したＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【００５４】
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
【００５５】
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
【００５６】
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
【００５７】
（５）回収した菌体を２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
【００５８】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（８ｍＭリン酸二水素ナトリウム、１２ｍＭリン酸水素二ナトリウム）（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速５ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
【００５９】
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア製）９０ｍＬを充填したＸＫ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性にした。
【００６０】
前記精製により、高純度のＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを約２０ｍｇ得た。
【００６１】
実施例４  ＦｃＲ３６ｉアミノ酸置換体の作製
配列番号２に示す天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質に対し、３６箇所のアミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３６ｉを作製した。ＦｃＲ３６ｉは、配列番号２に示す天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、３７番目（配列番号１では２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、３９番目（配列番号１では２３番目に相当）のロイシンをメチオニンに、４３番目（配列番号１では２７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、４５番目（配列番号１では２９番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、４９番目（配列番号１では３３番目に相当）のグルタミンをプロリンに、５１番目（配列番号１では３５番目に相当）のチロシンをアスパラギンに、５６番目（配列番号１では４０番目に相当）のリジンをグルタミンに、６４番目（配列番号１では４８番目に相当）のグルタミンをアルギニンに、６７番目（配列番号１では５１番目に相当）のチロシンをヒスチジンに、７０番目（配列番号１では５４番目に相当）のグルタミン酸のアスパラギン酸に、７２番目（配列番号１では５６番目に相当）のアスパラギンをアスパラギン酸に、８１番目（配列番号１では６５番目に相当）のセリンをアルギニンに、８４番目（配列番号１では６８番目に相当）のセリンをプロリンに、９０番目（配列番号１では７４番目に相当）のチロシンをフェニルアラニンに、９１番目（配列番号１では７５番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、９４番目（配列番号１では７８番目に相当）のアラニンをセリンに、９６番目（配列番号１では８０番目に相当）のスレオニンをセリンに、１０８番目（配列番号１では９２番目に相当）のアスパラギンをセリンに、１３３番目（配列番号１では１１７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、１３５番目（配列番号１では１１９番目に相当）のリジンをバリンに、１３７番目（配列番号１では１２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、１３８番目（配列番号１では１２２番目に相当）のアスパラギン酸をグルタミン酸に、１４８番目（配列番号１では１３２番目に相当）のリジンをアルギニン  に、１５６番目（配列番号１では１４０番目に相当）のスレオニンをメチオニンに、１５７番目（配列番号１では１４１番目に相当）のチロシンをフェニルアラニンに、１６３番目（配列番号１では１４７番目に相当）のグリシンをバリンに、１７４番目（配列番号１では１５８番目に相当）のチロシンをバリンに、１８１番目（配列番号１では１６５番目に相当）のリジンをグルタミン酸に、１８７番目（配列番号１では１７１番目に相当）のフェニルアラニンをセリンに、１９２番目（配列番号１では１７６番目に相当）のバリンをイソロイシンに、１９４番目（配列番号１では１７８番目に相当）のセリンをアルギニンに、１９６番目（配列番号１では１８０番目に相当）のアスパラギンをリジンに、２００番目（配列番号１では１８４番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、２０１番目（配列番号１では１８５番目に相当）のスレオニンをアラニンに、２０３番目（配列番号１では１８７番目に相当）のアスパラギンをアスパラギン酸に、２０６番目（配列番号１では１９０番目に相当）のイソロイシンをバリンに、それぞれアミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質である。本明細書では、前記の特定位置の３６箇所のアミノ酸置換を「ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸置換」と称することがある。
【００６２】
ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列を配列番号１３に、ＦｃＲ３６ｉをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に、それぞれ示す。ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１４）に制限酵素（ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）サイトを結合させたポリヌクレオチド配列を全合成（ファスマック社）により作製し、常法により制限酵素処理後、ｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーション後、当該ライゲーション産物で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換することで、ＦｃＲ３６ｉを発現する形質転換体を得た。当該形質転換体から発現ベクターを抽出することで、ＦｃＲ３６ｉ発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ３６ｉを得た。配列番号１３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）であり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００６３】
実施例５  システインタグを付加した本発明のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ）の作製
（１）実施例４で作製したＦｃＲ３６ｉ（配列番号１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）を含む発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ３６ｉを鋳型として、実施例２（１）と同様の方法でＰＣＲを実施した。なお、ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号１５（５’−  ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＴＴＡＴＣＣＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣ−３’）および配列番号１６（５’−  ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００６４】
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、実施例２（２）および（３）と同様の方法で、発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓおよびＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を得た。
【００６５】
（３）実施例２（４）と同様の方法で、ｐＴｒｃ−ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓヌクレオチド配列の解析を行った。
【００６６】
発現ベクターｐＴｒｃ−ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８にそれぞれ示す。
【００６７】
なお配列番号１７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであって、ただし６番目のプロリンをセリンにアミノ酸置換したオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号１３の３３番目から２０８番目までの領域）であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
【００６８】
実施例６  ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの調製
実施例５で作製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を用いたこと以外は、実施例３（１）から（７）と同様の方法により行い、高純度のＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを約２０ｍｇ得た。
【００６９】
実施例７  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）を固定化した多孔質親水性ポリマー粒子（本発明の抗体吸着剤）による抗体吸着量の測定
（１）粒子径１０μｍの多孔質親水性ポリマー粒子表面に存在する水酸基をヨードアセチル基で活性化後、当該活性化ゲルに実施例３で調製したＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓを反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。
【００７０】
（２）（１）で作製した固定化ゲル１ｍＬに対し５０％スラリーとなるよう、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）を添加した。
【００７１】
（３）作製したスラリーを均一化後、当該スラリー１００μＬ（固定化ゲルとしては５
０μＬ）をスピンカラム（コスモスピンフィルターＨ  ０．４５μｍ、ナカライテスク製）へ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心することで、サクションドライゲルを調製した。
【００７２】
（４）サクションドライゲルにＰＢＳを１５０μＬ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。本操作を３回繰り返すことでゲルを洗浄した。
【００７３】
（５）洗浄後のゲルにＰＢＳを１５０μＬおよび人免疫グロブリン（グロブリン筋注１５００ｍｇ／１０ｍＬ「ＪＢ」、日本血液製剤機構製）を順次添加し、２５℃にて２時間撹拌することで、ゲルに免疫グロブリン（抗体）を吸着させた。
【００７４】
（６）（５）の吸着操作後、スピンカラムを３０００ｒｐｍで１分間遠心することによ
り未吸着の抗体を含んだ溶液とゲルを分離した。
【００７５】
（７）ゲルにＰＢＳを１５０μＬ添加し、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。本操作を
３回繰り返すことでゲルを洗浄した。
【００７６】
（８）ゲルに５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１５０μＬ添加し、３０００ｒ
ｐｍで１分間遠心した。本操作を３回繰り返すことでゲルに吸着した抗体を溶出した。溶
出液の吸光度を測定することで抗体の濃度を算出し、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルへの抗体の
吸着量を求めた。
【００７７】
結果を表２に示す。固定化ゲル１ｇに対する抗体の吸着量は９．４ｍｇであった。
【００７８】
【表２】
2020125280.tif 000004
【００７９】
実施例８  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ３６ｉ）を固定化した多孔質親水性ポリマー粒子（本発明の抗体吸着剤）による抗体吸着量の測定
（１）実施例６で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを用いたこと以外は実施例７（１）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。
【００８０】
（２）（１）で作製したＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、実施例７（２）から（８）と同様の方法によりＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルへの抗体の吸着量を求めた。
【００８１】
結果を表２に示す。固定化ゲル１ｇに対する抗体の吸着量は１０．７ｍｇであった。
【００８２】
比較例１  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ９＿Ｆ）を固定化した非多孔質親水性ポリマ
ー粒子による抗体吸着量の測定
（１）粒子径５．８μｍの非多孔質親水性ポリマー粒子を用いたこと以外は、実施例７（１）と同様の方法によりＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。
【００８３】
（２）（１）で作製した固定化ゲルを用いて、実施例７（２）から（８）に記載と同様な方法により、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルへの抗体吸着量を求めた。
【００８４】
結果を表２に示す。固定化ゲル１ｇに対する抗体の吸着量は１ｍｇ以下と、実施例７で作製した固定化ゲルと比較し低かった。実施例７および比較例１の結果より、Ｆｃ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体として、粒子径５．８μｍの非多孔質親水性ポリマー
粒子（比較例１）よりも粒子径１０μｍの多孔質親水性ポリマー粒子（実施例７、本発明の一態様）を用いたほうが、抗体吸着量が高いことがわかる。
【００８５】
比較例２  Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ３６ｉ）を固定化した非多孔質親水性ポリマー粒子による抗体吸着量の測定
（１）実施例６で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを用いたこと以外は、比較例１（１）と同様の方法によりＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。
【００８６】
（２）（１）で作製した固定化ゲルを用いて、実施例７（２）から（８）と同様な方法により、固定化ゲルへの抗体吸着量を求めた。
【００８７】
結果を表２に示す。固定化ゲル１ｇに対する抗体の吸着量は１ｍｇ以下と、実施例８で作製した固定化ゲルと比較し低かった。実施例７および比較例１の結果と同様に、実施例８および比較例２の結果より、Ｆｃ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体として、粒子径５．８μｍの非多孔質親水性ポリマー粒子（比較例２）よりも粒子径１０μｍの多孔質親水性ポリマー粒子（実施例８、本発明の一態様）を用いたほうが、抗体吸着量が高いことがわかる。
【００８８】
実施例９  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（リツキサン（登録商標））分離
（１）実施例７（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル３．３ｍＬをステンレスカラム（東ソー製、内径７．５ｍｍ）に充填し、当該カラムをＨＰＬＣ装置（ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ、ＧＥヘルスケア製）に接続後、ｐＨ５．８の５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＡ）を用いて平衡化した。
【００８９】
（２）（１）の平衡化に用いた緩衝液で濃度調製した１ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて５ｍＬアプライし、前記抗体を固定化ゲルに吸着させた。
【００９０】
（３）流速０．５ｍＬ／ｍｉｎのまま（１）の平衡化に用いた緩衝液で３０分洗浄後、ｐＨ４．３６の５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＢ）によるｐＨグラジエント（４０分でｐＨ４．４の５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＢ）が１００％となる
グラジエント）で、固定化ゲルに吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
【００９１】
溶出パターンを図２に示す。３つのピークに分かれた状態で抗体が溶出された。これまでに、ＦｃγＲＩＩＩａをアフィニティリガンドとして不溶性担体に固定化した吸着剤を用いることで、抗体を糖鎖構造に基づき分離できることが示されており（特許文献１）、本結果より本発明の分離剤が糖鎖構造の違いに基づく抗体分離ができることを確認した。また、図２に示す４つのフラクションＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣおよびＦｒＤを分取し、糖鎖構造解析（実施例１７）に用いた。
【００９２】
実施例１０  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ３６ｉ、粒子径１０μｍ）による抗体（リツキサン）分離
実施例８（１）で作製したＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
【００９３】
溶出パターンを図３に示す。３つのピークに分かれた状態で抗体が溶出されており、本発明の分離剤が糖鎖構造の違いに基づく抗体分離ができることを確認した。
【００９４】
比較例３  Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径３０から６０μｍ）による抗体（リツキサン）分離
（１）粒子径３０から６０μｍの多孔質親水性ポリマー粒子を用いたこと以外は実施例７（１）と同様の方法によりＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。
【００９５】
（２）（１）で作製した固定化ゲルを用いて、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
【００９６】
溶出パターンを図４に示す。抗体は分離せず１つのピークとして溶出されたことから、粒子径が３０から６０μｍの多孔質親水性ポリマー（比較例３）よりも、粒子径が１０μ
ｍの多孔質親水性ポリマー（実施例９、本発明の一態様）を使用したほうが、分離能が高いことがわかる。
【００９７】
比較例４  Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（ＦｃＲ３６ｉ、粒子径３０から６０μｍ）による抗体（リツキサン）分離
（１）実施例６で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを用いたこと以外は比較例３（１）と同様の方法によりＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。
【００９８】
（２）（１）で作製した固定化ゲルを用いて、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
【００９９】
溶出パターンを図５に示す。比較例３の結果と同様に、抗体は分離せず１つのピークとして溶出されたことから、粒子径が３０から６０μｍの多孔質親水性ポリマー（比較例４）よりも、粒子径が１０μｍの多孔質親水性ポリマー（実施例１０、本発明の一態様）を使用したほうが、分離能が高いことがわかる。
【０１００】
実施例１１  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（アービタックス（登録商標））分離
抗体としてアービタックス（メルクセローノ製）を用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
溶出パターンを図６に示す。重なり合ったおよそ３つのピークに抗体を分離した。
また、図６に示す３つのフラクションＦｒＥ、ＦｒＦおよびＦｒＧを分取し、糖鎖構造解析（実施例１８）に用いた。
【０１０１】
実施例１２  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（ハーセプチン（登録商標））分離
抗体としてハーセプチン（ロシュ製）を用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
溶出パターンを図７に示す。３つのピークに抗体を分離した。
また、図７に示す３つのフラクションＦｒＨ、ＦｒＩおよびＦｒＪを分取し、糖鎖構造解析（実施例１９）に用いた。
【０１０２】
実施例１３  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（カドサイラ（登録商標））分離
抗体としてカドサイラ（ロシュ製）を用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
溶出パターンを図８に示す。抗体は１つの大きなブロードなピークとして溶出された。
また、図８に示す３つのフラクションＦｒＫ、ＦｒＬおよびＦｒＭを分取し、糖鎖構造解析（実施例２０）に用いた。
【０１０３】
実施例１４  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（アバスチン（登録商標））分離
抗体としてアバスチン（ロシュ製）を用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
溶出パターンを図９に示す。抗体は大きな１つのピークとそのピークと重なった２つのピークとして溶出された。
また、図９に示す３つのフラクションＦｒＮ、ＦｒＯおよびＦｒＰを分取し、糖鎖構造解析（実施例２１）に用いた。
【０１０４】
実施例１５  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（ヒュミラ（登録商標））分離
抗体としてヒュミラ（アッヴィ合同製）を用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
溶出パターンを図１０に示す。抗体は大きな１つのピークとそのピークと重なった２つのピークとして溶出された。
また、図１０に示す４つのフラクションＦｒＱ、ＦｒＲ、ＦｒＳおよびＦｒＴを分取し、糖鎖構造解析（実施例２２）に用いた。
【０１０５】
実施例１６  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）による抗体（アクテムラ（登録商標））分離
抗体としてアクテムラ（ロシュ製）を用いたこと以外は、実施例９（１）から（３）と同様の方法で抗体を分離した。
溶出パターンを図１１に示す。抗体は重なり合った３つのピークとして溶出された。
また、図１１に示す３つのフラクションＦｒＵ、ＦｒＶおよびＦｒＷを分取し、糖鎖構造解析（実施例２３）に用いた。
【０１０６】
実施例９、実施例１１から１６より、本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）により、様々な種類の抗体医薬品を分離できることを示した。また、抗体医薬品の種類によって、抗体医薬品の分離のパターンが異なることがわかった。
【０１０７】
実施例１７  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（リツキサン）
（１）実施例９で分取した図２のＦｒＡ、ＦｒＢ、ＦｒＣおよびＦｒＤにそれぞれ含まれる抗体を１００℃、１０分の熱処理により変性後、グリコアミダーゼＡ／ペプシンおよびプロナーゼで順次処理し、ゲルろ過法による精製操作を経て糖鎖画分を取得した。
【０１０８】
（２）（１）で得られた糖鎖をエバポレーターにて濃縮・乾燥後、酢酸溶媒下、２−アミノピリジン、次いでジメチルアミンボランを順次作用させて蛍光ラベル化糖鎖とし、ゲルろ過法により精製した。
【０１０９】
（３）（２）で得られた蛍光ラベル化糖鎖を陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ、φ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ：東ソー製）にて、中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分に分離した。
【０１１０】
（４）（３）で得られた中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分をＯＤＳカラムを用いて、個々の糖鎖に単離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により単離した糖鎖の分子量情報を取得後、ＯＤＳカラムクロマトグラフのリテンションタイムと照らし合わせて糖鎖構造を帰属した。
【０１１１】
帰属した糖鎖構造の結果を図１２および表３、糖鎖構造の概略図を表４に示す。ＦｒＡに含まれる抗体と比較してＦｒＤに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１１２】
【表３】
2020125280.tif 000005
【０１１３】
【表４】
2020125280.tif 000006
【０１１４】
実施例１８  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（アービタックス）
実施例１１で分取した図６のＦｒＥ、ＦｒＦおよびＦｒＧにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１７の（１）から（４）と同様の方法で糖鎖構造の解析を行った。
帰属した糖鎖構造の結果を図１３および表５に示す。ＦｒＥに含まれる抗体と比較してＦｒＧに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１１５】
【表５】
2020125280.tif 000007
【０１１６】
実施例１９  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（ハーセプチン）
実施例１２で分取した図７のＦｒＨ、ＦｒＩおよびＦｒＪにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１７の（１）から（４）と同様の方法で糖鎖構造の解析を行った。
帰属した糖鎖構造の結果を図１４および表６に示す。ＦｒＨに含まれる抗体と比較してＦｒＪに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１１７】
【表６】
2020125280.tif 000008
【０１１８】
実施例２０  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（カドサイラ）
実施例１３で分取した図８のＦｒＫ、ＦｒＬおよびＦｒＭにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１７の（１）から（４）と同様の方法で糖鎖構造の解析を行った。
帰属した糖鎖構造の結果を図１５および表７に示す。ＦｒＫに含まれる抗体と比較してＦｒＭに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１Ｆａ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１１９】
【表７】
2020125280.tif 000009
【０１２０】
実施例２１  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（アバスチン）
実施例１４で分取した図９のＦｒＮ、ＦｒＯおよびＦｒＰにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１７の（１）から（４）と同様の方法で糖鎖構造の解析を行った。
帰属した糖鎖構造の結果を図１６および表８に示す。ＦｒＮに含まれる抗体と比較してＦｒＰに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１２１】
【表８】
2020125280.tif 000010
【０１２２】
実施例２２  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（ヒュミラ）
実施例１５で分取した図１０のＦｒＱ、ＦｒＲ、ＦｒＳおよびＦｒＴにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１７の（１）から（４）と同様の方法で糖鎖構造の解析を行った。
【０１２３】
帰属した糖鎖構造の結果を図１７および表９に示す。ＦｒＱ、ＦｒＲに含まれる抗体と比較してＦｒＰに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１２４】
【表９】
2020125280.tif 000011
【０１２５】
実施例２３  本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）を用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析（アクテムラ）
実施例１６で分取した図１１のＦｒＵ、ＦｒＶおよびＦｒＷにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１７の（１）から（４）と同様の方法で糖鎖構造の解析を行った。
帰属した糖鎖構造の結果を図１８および表１０に示す。ＦｒＵに含まれる抗体と比較してＦｒＷに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１Ｆａ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。
【０１２６】
【表１０】
2020125280.tif 000012
【０１２７】
実施例１７から２３より、本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）により分離した抗体医薬品の糖鎖構造を解析した結果、早く溶出された抗体の糖鎖よりも遅く溶出された抗体の糖鎖の方が、末端にガラクトースを含む糖鎖構造の割合が高いことが分かった。
【０１２８】
このことより、末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ９＿Ｆと強く結合し、Ｆｃ９＿Ｆ固定化ゲルで分離した際に遅い溶出時間で溶出され（すなわち、低いｐＨにて溶出される）、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ９＿Ｆとの結合が弱いこと、および本発明の抗体吸着剤（ＦｃＲ９＿Ｆ、粒子径１０μｍ）で分離する際に早く溶出される（すなわち、高いｐＨにて溶出される）ことがわかる。
【図１】
2020125280.tif 000013
【図２】
2020125280.tif 000014
【図３】
2020125280.tif 000015
【図４】
2020125280.tif 000016
【図５】
2020125280.tif 000017
【図６】
2020125280.tif 000018
【図７】
2020125280.tif 000019
【図８】
2020125280.tif 000020
【図９】
2020125280.tif 000021
【図１０】
2020125280.tif 000022
【図１１】
2020125280.tif 000023
【図１２】
2020125280.tif 000024
【図１３】
2020125280.tif 000025
【図１４】
2020125280.tif 000026
【図１５】
2020125280.tif 000027
【図１６】
2020125280.tif 000028
【図１７】
2020125280.tif 000029
【図１８】
2020125280.tif 000030
【配列表】
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