(57)【要約】【課題】野菜黒糖発酵液の発酵過程で出現する乳酸菌の微生物学的、生物化学的特徴を明らかにし、より良い免疫賦活剤、並びにこれを含む健康食品および医薬品等を提供する。【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１として寄託されているラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈの単離された菌株、この単離された菌株またはその培養物を含む組成物、上記の単離された菌株または組成物を有効成分として含むＩｇＡ産生促進剤、および、上記の単離された菌株または組成物を有効成分として含む免疫賦活剤が提供される。【選択図】図３
2020092704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１として寄託されているラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈの単離された菌株。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された菌株またはその培養物を含む組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された菌株または請求項２に記載の組成物を有効成分として含むＩｇＡ産生促進剤。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された菌株または請求項２に記載の組成物を有効成分として含む免疫賦活剤。
【請求項５】
飲食品、医薬品、外用剤または飼料の形態である請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
投与された対象者の粘膜免疫を賦活するための請求項２または５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された菌株を高糖濃度、かつＤ−フルクトースを含む培地に接種して培養するステップを含む免疫賦活剤の製造方法。
【請求項８】
前記菌株の加熱死菌体を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記菌株の加熱死菌体を含む請求項３に記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項１０】
前記菌株の菌体を、少なくとも７０℃で加熱処理する工程をさらに含む請求項７に記載の免疫賦活剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な乳酸菌株であるラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈおよびこれを含む免疫賦活剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
野菜や果物、海藻類などの原料を発酵、熟成させて作った酵素液を主原料とした健康飲料は、免疫力を高め、体調を整える効果があることが知られている。野菜黒糖発酵エキス（例えば、商品名「ジオリナ（登録商標）酵素」）は、含蜜糖、葉菜類、根菜類、黒糖、ガラクトオリゴ糖、茎菜類、イモ類、キノコ類、花菜類、コンブおよびワカメなどを原料として、複雑な微生物の集団により自然発酵することにより得られる酵素飲料である。この野菜黒糖発酵液の発酵過程で出現、消失する微生物叢は、自然発酵により乳酸菌が短期間で優勢になること、バッチごとの菌叢パターンが安定していること、乳酸菌の中でも菌種の入れ替わりがあることなどが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ところで、乳酸菌の免疫調節機能については、これまで様々な研究が行われてきた。例えば、植物由来のラクトバチルス属に属する乳酸菌等が、腸管免疫活性化作用やパイエル板細胞のＩｇＡ抗体産生促進作用を有すること（特許文献１）、ロイコノストック属に属する乳酸菌が、免疫（特に腸管免疫）賦活作用を有すること（特許文献２）、あじなれずしより分離したラクトバチラス・ブレビス及びラクトバチラス・カゼイの乳酸菌が、抗炎症・抗アレルギー作用を有すること（特許文献３）等が知られている。
【０００４】
上述したように、ある種の乳酸菌は、宿主の獲得免疫システムを活性化して腸管内へＩｇＡの分泌を促進するが、その一方で、これらの免疫賦活活性は、菌種が同一であっても菌株が違えばその効果も大きく異なる。その活性化メカニズムは、完全には明らかではないが、ＧＡＬＴと称される腸管関連リンパ組織、特に、パイエル板で産生されたＩｇＡが腸管内に分泌され、有害な細菌やウイルスと結合してその運動を妨げ、小腸上皮細胞への付着を阻害すると考えられている。また、腸内細菌叢が小腸上皮細胞に存在するトル様受容体（ＴＬＲ）や樹状細胞（ＤＣ）を介して様々なサイトカインを分泌し、粘膜固有層に存在するＩｇＡ産生Ｂ細胞を分化誘導するメカニズムも提案されている（例えば、非特許文献２、ＦＩＧ１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｉｏｕ  Ｔ−Ｙ，  Ｓｕｄａ  Ｗ，  Ｏｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｍ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ  （２０１７）  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｋｏｓｏ，  ａ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｕｇａｒ−ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８１（２）：４０３−４１０
【非特許文献２】Ｋａｍａｄａ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１３  Ｍａｙ；１３（５）：３２１−３５．
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３０８４１９号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１４／１２９５９９
【特許文献３】特開２０１３−１９３９９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
野菜黒糖発酵液は、健康食品として摂取することにより健康増進機能を有することが知られているが、その有効成分については必ずしも明らかではない。本発明はこのような状況下においてなされたものであって、その目的とするところは、野菜黒糖発酵液の発酵過程で出現する乳酸菌の微生物学的、生物化学的特徴を明らかにし、より良い免疫賦活剤、並びにこれを含む健康食品および医薬品等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
野菜黒糖発酵液の発酵過程における微生物叢の推移を、次世代シーケンサを用いた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の読取り数に基づいて解析した結果、発酵７日後の培養液において、ラクトバチルス属に属する新規乳酸菌種が優勢となり、細菌叢の５０％以上を占めることを見出し、この新規乳酸菌を単離することによって本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の一実施形態において、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１として寄託されているラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈの単離された菌株が提供される。
本発明の他の実施形態はこの単離された菌株またはその培養物を含む組成物である。
さらに他の実施形態では、上記の単離された菌株または組成物を有効成分として含むＩｇＡ産生促進剤または免疫賦活剤である。これらの組成物は、飲食品、医薬品、外用剤または飼料の形態で利用され、これらを投与された対象者の粘膜免疫を賦活するために用いることが好ましい。
本発明の他の側面において、上記の単離された菌株を高糖濃度、かつＤ−フルクトースを含む培地に接種して培養するステップを含む免疫賦活剤の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規な乳酸菌株は、既存の乳酸菌やビフィズス菌と比較して優れたＩｇＡ産生促進効果を有し、腸管等の粘膜免疫を賦活化するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、種々の濃度の添加物を含むＭＲＳブロスを用いて培養した１０Ｈ株の増殖特性を示す。
【図２】図２は、１６Ｓ  ｒＲＮＡのゲノム塩基配列に基づく系統発生樹を表す。
【図３】図３は、１０Ｈ株を含む１６種類の乳酸菌およびビフィズス菌サンプルのＩｇＡ産生誘導活性を測定した結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、７０℃、３０分間処理した乳酸菌およびビフィズス菌サンプルについて測定したＩｇＡ産生誘導活性を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１００℃、３０分間処理した乳酸菌およびビフィズス菌サンプルについて測定したＩｇＡ産生誘導活性を示す。
【図５】図５は、１０Ｈ株の菌体粉末を摂取したマウスにおけるＩｇＡ産生量を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好適な実施形態について次の順序により説明する。
（Ｉ）新規乳酸菌
（ＩＩ）免疫賦活作用
（ＩＩＩ）各種組成物およびその用途
（ＩＶ）免疫賦活剤の製造方法
【００１３】
（Ｉ）新規乳酸菌
本発明の好ましい実施形態によれば、野菜黒糖発酵液から単離された新規な乳酸菌株およびその変異株が提供される。より好ましくは、商品名「ジオリナ（登録商標）酵素」の培養液から得られるラクトバチルス属に属する菌であり、さらに好ましくは、ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１）またはその変異株である。「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその主要な性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
【００１４】
なお、ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株は、平成３０年（２０１８年）１１月７日（原寄託日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、１２２号室）に寄託されている。受託番号は、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１である（以下、本菌株を「１０Ｈ株」と称する）。
【００１５】
（１０Ｈ株の表現型の特徴）
１０Ｈ株は、グラム陽性、カタラーゼ陰性の桿菌で、おおよそ０．７〜０．８×１．５〜２．２μｍの形態を示す。本菌株は好フルクトース増殖特性を有し、図１に示すように、Ｄ−フルクトースを添加しないＭＲＳ培地のみでは生育しない。１０Ｈ株の生育には少なくとも５％のＤ−フルクトースを必要とするが、その濃度を２０％まで上昇させても良好に生育可能である。Ｄ−フルクトースを５〜１０％添加したＭＲＳ寒天培地ではコロニーを形成するが、４％以下のＤ−フルクトース濃度ではほとんどコロニー形成が認められない。この性質は、本菌株が難培養菌株として、これまで通常の方法では単離できなかった原因であると考えられる。コロニーは、好気的、微好気的および嫌気的条件下で形成され、直径約１〜３ｍｍの白色または不透明の環状形態を示す。その他の菌学的特性は以下のとおりである。
【００１６】
生育ｐＨ：４．０〜７．０（至適ｐＨは６．５）
生育温度：１８〜３９℃（至適温度は２７℃）
ガス発生：有
ＮａＣｌ耐性：２％（ｗ／ｖ）以上で増殖抑制
【００１７】
糖代謝：
炭素源の利用可能性について、ビオメリュー社のＡＰＩ５０ＣＨＬキットを用いて調べたところ、１０Ｈ株はすべての炭素源の利用が認められなかった。そこで、２０種類の炭素源をそれぞれＭＲＳブロスに添加して２７℃で４８時間培養し、培養上清をＨＰＬＣで分析したところ、Ｄ−フルクトースおよびスクロースのみが利用されていた。１０Ｈ株は、Ｄ−フルクトースを代謝して乳酸および酢酸を産生したが、エタノールは産生しない。乳酸および酢酸の比率はおよそ３：２である。
【００１８】
酵素活性：
酵素活性は、ビオメリュー社の酵素活性研究用システム「アピザイム（ＡＰＩ  ＺＹＭ）」を用いて調べた。１０Ｈ株は、酸性フォスファターゼおよびナフトール−ＡＳ−ＢＩ−フォスフォヒドロラーゼの産生が認められ、アルカリフォスファターゼ、リパーゼ、ロイシンアリルアミダーゼおよびバリンアリルアミダーゼについて弱い活性を示す。
【００１９】
（化学分類学的特性）
１０Ｈ株の細胞壁のアミノ酸組成は、主に、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アラニン（Ａｌａ）およびリジン（Ｌｙｓ）で構成されていた。メソ−ジアミノピメリン酸およびオルニチンのいずれも細胞壁のペプチドグリカンには存在せず、上記アミノ酸のモル比は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ／Ａｌａ／Ｌｙｓ＝１．０／１．９／４．１／１．１であった。これは、１０Ｈ株の細胞壁ペプチドグリカンが、Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｐ(Ａ４α)型であることを示唆する。なお、Ａ４α型は、ラクトバチルス属の細胞壁を構成するペプチドグリカンであることが報告されている。
【００２０】
１０Ｈ株で検出される主な脂肪酸は、Ｃ１６：０（３７．６％）、Ｃ１９：０シクロプロパン１１，１２（２８．７％）、Ｃ１９：０シクロプロパン９，１０（１４．３％）およびＣ１８：１ω９ｃ（１０．０％）であった。２次元高性能薄層クロマトグラフィーによる１０Ｈ株における極性脂質の主な成分は、リゾフォスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）および糖脂質であった。一般的に、ラクトバチルス属の仲間ではイソプレノイドキノンを欠損するといわれているが、１０Ｈ株からは、乾燥重量１ｇ当たり０．０００１〜０．０００４ｎｍｏｌという極めて少量のイソプレノイドキノンが見出された。１０Ｈ株において検出された主なキノンはメナキノン（ＭＫ）であり、ユビキノンやプラストキノンは検出されなかった。１０Ｈ株で検出された主なイソプレノイドキノンはＭＫ−７、ＭＫ−８、ＭＫ−９およびＭＫ−１０である。
【００２１】
（系統発生分析）
１０Ｈ株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、１４７４ｂｐの連続した配列であり、ＧｅｎＢａｎｋの受入番号ＬＣ３１８４８４として登録されている。この１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性をＢＬＡＳＴにより解析した結果、１０Ｈ株と最もよく似た菌株は、ラクトバチルス・クンケイ（Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ）ＹＨ−１５、ラクトバチルス・オーゼンシス（Ｌ．ｏｚｅｎｓｉｓ）Ｍｉｚｕ２−１およびラクトバチルス・アピノーラム（Ｌ．ａｐｉｎｏｒｕｍ）Ｆｈｏｎ１３Ｎであり、それぞれ、９５．５％、９５．４％および９５．３％の配列同一性を有する。これらの配列同一性は、原核生物の種の分化として推奨されている閾値である９８．６５％より有意に低い。最尤法（maximum-likelihood method）を用いて構築した系統発生樹によれば、１０Ｈ株は、上記３種の近縁種とともに１つの区別できる系統発生クラスターを形成する（図２参照）。
【００２２】
実施例３で解析した１０Ｈ株のドラフトゲノムには、ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）遺伝子がなく、３つの推定フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）遺伝子が見出される。この結果は、１０Ｈ株が、グルコースよりもフルクトース含有ＭＲＳブロス中で良く生育する理由の説明となる。また、ドラフトゲノム中にはスクロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．２６）の遺伝子が存在することから、１０Ｈ株はスクロースをエネルギー源として利用可能であると推測される。これらの結果は、４０質量％以上の高濃度スクロースが存在する発酵液中でも１０Ｈ株はよく増殖し、しかも優勢菌種となることを説明するものである。
【００２３】
さらに、１０Ｈ株のゲノムには、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと関連する少なくとも４つの遺伝子の存在が推定される。具体的には、タイプＩＩ−Ａ  ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｓｎ２（配列番号１および２）、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ２（配列番号３および４）、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ１（配列番号５および６）およびタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼＣａｓ９（配列番号７および８）などである。配列表の配列番号１〜８には、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌の免疫システムとして重要であり、かつゲノム編集ツールとしての利用可能性がある。また、これらのシステムにより合成された二本鎖ＲＮＡは、乳酸菌１０Ｈ株を摂取した生体内でＴＬＲ３を介した自然免疫賦活作用に関与しているかもしれない。
【００２４】
以上のような特性解析および分類学的解析に基づき、１０Ｈ株は新規な種であると結論付けられ、ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構のバイオテクノロジーセンターの行う生物遺伝資源寄託制度のもとで寄託されている（受託番号：ＮＢＲＣ１１３０６３）。その後、本菌株ＮＢＲＣ１１３０６３は、特許生物寄託センターに移管され、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１として寄託された。
また、本明細書に記載した新規乳酸菌の分類学的性質は、本発明者らにより公表された論文（Ｃｈｉｏｕ  Ｔ−Ｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（２０１８）、１１１：１１４９−１１５６）に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００２５】
（ＩＩ）免疫賦活作用
本明細書において、「免疫賦活剤」とは、ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１）の菌体またはその培養物を有効成分として含有する組成物であって、口腔、鼻腔、呼吸器官、消化管などの粘膜上皮におけるＩｇＡの分泌を促進し、宿主の免疫機構を賦活するために有効な組成物を意味する。本発明の免疫賦活剤は、以下に詳述するように、飲食品、医薬品、外用剤または飼料の形態等を含む。また、これらの中でも健康食品が好ましく、特に、免疫力が低下した対象者の健康を維持増進するための食品組成物が好ましい。
【００２６】
また、「ＩｇＡ産生促進剤」とは、ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８１１）の菌体またはその培養物を有効成分として含有する組成物であって、ＩｇＡ産生細胞を多量に含むパイエル板細胞の培養液に添加して所定期間培養し、培養後の培養液中に分泌された分泌型ＩｇＡ量が添加しなかった場合より増加するような、ＩｇＡ産生誘導能を有するものをいう。ＩｇＡ産生促進剤は、ワクチンと共に投与することにより、ワクチン中に含まれる抗原に対応する抗体の産生を増強し、ワクチンの効果を増強することができ、またワクチンの副作用を抑える可能性が高い。すなわち、ワクチンが含む抗原に対する抗体の産生を増強し、防御免疫の誘導を良好にしてワクチンの効果を増強する。
【００２７】
（ＩＩＩ）各種組成物およびその用途
〔各種組成物〕
本実施形態の新規乳酸菌を飲食品、医薬品、外用剤（外用医薬品、化粧品等）、飼料等の各種組成物の形態で用いる場合、当該乳酸菌の菌体を、乳酸菌培養の常法に従って培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま用いることのみならず、当該培養・発酵液（培養上清）、その培養物の粗精製品あるいは精製品、それらの凍結乾燥品、或いは菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
【００２８】
また、菌体は生菌体のみならず、通常の一般的加熱滅菌操作によって滅菌されたものであってもよい。熱変性を受けやすいタンパク性成分や核酸などの乳酸菌に由来する免疫誘導活性は、７０℃、３０分の加熱処理によって低下するが、後述する実施例４の結果からも明らかなように、１０Ｈ株のＩｇＡ産生誘導活性は加熱処理によっても減衰しないことから、１０Ｈ株の産生する免疫増強成分は加熱耐性を有している。１０Ｈ株は高糖濃度（高浸透圧）という過酷な生育条件において生育することから、強固な細胞表層構造を有すると予想される。加熱処理は好ましくは７５℃で１分以上であり、より好ましくは８５℃、１分以上である。加熱処理された菌体であっても、ＩｇＡ産生誘導作用等による免疫賦活作用が期待できるだけでなく、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるため、それ以上形態変化を起こさない加熱滅菌した死菌体は好適に使用できる。なお、本実施形態の組成物は、１０Ｈ株を加熱滅菌した死菌体で含有させる場合、該組成物の製品化に当たっては、加熱、加圧またはエタノールや酸・アルカリによる処理等の条件を採用してもよい。好ましい実施形態において、本発明の組成物およびＩｇＡ産生促進剤は１０Ｈ株の加熱死菌体を含む。
【００２９】
上記培養液は、例えば実施例１に示すように、本実施形態の乳酸菌に適した培地、例えば、Ｄ−フルクトースを含むＭＲＳ培地等を用いて、１８〜３９℃で１６〜２８時間程度培養することにより得ることができる。培養菌体は培養後に、例えば培養液を３，０００回転／分、４℃、１０分間遠心分離して集菌することによって得ることができる。これらは常法に従い精製することができる。更に、該菌体は凍結乾燥あるいは噴霧乾燥することもできる。かくして得られる菌体は本発明組成物の有効成分として利用することができる。
【００３０】
本実施形態の組成物において、１０Ｈ株の菌体をそのまま用いることもできるが、適当な可食性担体（食品素材）、製薬上許容される担体を適宜配合して、後述するような飲食品、医薬品、外用剤、飼料等の形態に調製されるのが好ましい。
【００３１】
また、本実施形態の組成物中には、必要に応じて更に、１０Ｈ株の維持、増殖等に適した栄養成分の適量を含有させることができる。該栄養成分の具体例としては、微生物の培養のための培養培地に利用される、例えばグルコース、澱粉、蔗糖、乳糖、デキストリン、ソルビトール、フルクトース等の炭素源、例えば酵母エキス、ペプトン等の窒素源、ビタミン類、ミネラル類、微量金属元素、その他の栄養成分等の各成分を挙げることができる。ビタミン類としては、例えばビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等を例示できる。微量金属元素としては、例えば亜鉛、セレン等を例示できる。その他の栄養成分としては、例えば乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクチュロース、ラクチトール、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖等の各種オリゴ糖を例示できる。これらのオリゴ糖の配合量は、特に限定されるものではないが、通常本実施形態の組成物中に１〜３０重量％程度となる量範囲から選ばれるのが好ましい。
【００３２】
本実施形態の組成物中への１０Ｈ株の配合量は、一般には、組成物１００ｇ中に、菌数が１０８〜１０１１個前後（生菌数である必要はない。）となる量から適宜選択することができる。生菌数の測定は、菌培養用の寒天培地に希釈した試料を塗布して３０℃で培養を行い、生育したコロニー数を計測することにより算出する。この生菌数と濁度とは相関するため、予め生菌数と濁度との相関を求めておくと、生菌数の測定に代えて濁度を測定することによって上記生菌数を計数できる。上記１０Ｈ株の配合量は、上記量を目安として、調製される本実施形態の組成物の形態に応じて適宜変更することができる。
【００３３】
本実施形態の組成物は、ワクチンと共に、或いは組成物単独で使用される。ワクチンと共に用いる場合、当該組成物はワクチン投与の前後に投与し、効果を高めるワクチンの効果増強剤として利用することもできる。当該組成物の使用量は、使用したワクチンの種類及び品質、あるいは年齢、症状等によって異なるが、例えば、予防のために用いるには、成人１回につき固形分換算で０．０１〜１０ｇ程度が挙げられ、食前３０分位に１日３回服用するのが望ましい。また、健康食品としての使用時には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対し、固形分換算で０．１〜１００ｇ程度の範囲で用いることが適当である。
【００３４】
以下に、各組成物の形態について具体的に説明する
（飲食品）
本実施形態の組成物を飲食品とする場合は、例えば発酵乳、乳酸菌飲料、発酵野菜飲料、発酵果実飲料、発酵豆乳飲料等を挙げることができる。「発酵乳」とは、乳又は乳製品を乳酸菌、ビフィズス菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものをいう。従って該発酵乳には飲料形態と共にヨーグルト形態が包含される。また「乳酸菌飲料」とは、乳又は乳製品を乳酸菌、ビフィズス菌又は酵母で発酵させた糊状又は液状にしたものを主原料としてこれを水に薄めた飲料をいう。
【００３５】
他の飲食品形態の例としては、漬物、味噌、発酵茶、バン等の発酵食品、離乳食、粉ミルク、ベビーフード等の乳児用食品、発泡製剤、ガム、グミ、プディング等の菓子類、麺類、カプセル、顆粒、粉末、錠剤等の栄養補助食品等、前記発酵乳及び乳酸菌飲料以外の乳製品等を挙げることができる。とりわけ、加熱によっても機能性が保持される免疫増強成分を含むことから、加熱工程が必要とされる加工食品の形態が好ましい。特に好ましい形態としては、衛生管理上、加熱調理が必要な加工食品であり、例えば、介護食品などが挙げられる。本実施形態の飲食品は、食中毒予防に有効な７５℃の加熱によっても安定な免疫増強剤、特に、ＩｇＡ産生促進剤および免疫賦活剤を提供することができる。
【００３６】
また、本発明の飲食品には、感染防御、下痢の予防等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した、特定保健用食品、健康食品等の機能性食品が包含される。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味し、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられる。
【００３７】
（医薬品）
本実施形態の組成物を医薬品とする場合は、１０Ｈ株と共に製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて、一般的な医薬組成物の形態に調製されて実用される。該製剤担体としては、通常、この分野で使用されることの知られている充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００３８】
医薬組成物の投与単位形態としては、各種の形態が選択できるが、好適には経口投与用製剤、外用投与製剤が挙げられる。 経口投与製剤の代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられる。
【００３９】
錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセル ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭 酸カルシウム等の崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールな どの滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００４０】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００４１】
更に、医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させることもできる。
【００４２】
上記医薬組成物の投与方法は特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。また、その投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常有効成分である１０Ｈ株の菌体量が１日当り体重１ｋｇ当り約０．５〜２０ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜４回に分けてヒトに投与することができる。
【００４３】
（外用剤）
本実施形態の組成物を化粧品、外用医薬品、医薬部外品等の外用剤組成物とする場合は、１０Ｈ株と共に、製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて、一般的な外用剤組成物の形態に調製されて実用される。
【００４４】
かかる製剤担体としては、例えば、グリセリン、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、ヘパリン等の保湿剤；ＰＡＢＡ誘導体（パラアミノ安息香酸、エスカロール５０７等）、桂皮酸誘導体（ネオヘリオパン、パルソールＭＣＸ、サンガードＢ等）、サリチル酸誘導体（オクチルサリチレート等）、ベンゾフェノン誘導体（ＡＳＬ−２４、ＡＳＬ−２４Ｓ等）、ジベンゾイルメタン誘導体（パルソールＡ、パルソールＤＡＭ等）、複素環誘導体（チヌビン系等）、酸化チタン等の紫外線吸収剤・散乱剤；エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、リンゴ酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤；サリチル酸、イオウ、カフェイン、タンニン等の皮脂抑制剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン等の殺菌・消毒剤；塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸、グアイアズレン、アズレン、アラントイン、ヒノキチオール、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸等の抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（Ｂ１，Ｂ２，Ｂ６，Ｂ１２，Ｂ１５）、葉酸、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＤ群（Ｄ２，Ｄ３）、ビタミンＥ、ユビキノン類、ビタミンＫ（Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３，Ｋ４）等のビタミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、グリシン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アルギニン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸及びその誘導体；レチノール、酢酸トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出液等の美白剤；ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；塩化亜鉛、硫酸亜鉛、石炭酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の収斂剤；グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール等の糖類；甘草、カミツレ、マロニエ、ユキノシタ、芍薬、カリン、オウゴン、オウバク、オウレン、ジュウヤク、イチョウ葉等の各種植物エキス等の他、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色素等が挙げられる。
【００４５】
外用剤組成物の具体例としては、化粧用クリーム類、乳液、化粧水、パック剤、スキンミルク（乳剤）、ジェル剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメークアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディリンス、石鹸、クレンジングフォーム、軟膏、貼付剤、ゼリー剤、エアゾール剤等を挙げることができる。
【００４６】
（飼料）
本実施形態の組成物を飼料とする場合は、例えば、鶏の非抗生剤投与時期、豚、牛等の離乳期における感染症予防用として、経口投与用製剤形態（水溶液、乳化液、顆粒、粉末、カプセル、錠剤等）を挙げることができる。
【００４７】
（ＩＶ）免疫賦活剤の製造方法
本発明の他の実施形態では、ラクトバチルス・コーソイ１０Ｈ株を、高糖濃度、かつＤ−フルクトースを含む培地に接種して培養するステップを含む免疫賦活剤の製造方法が提供される。本実施形態において、「高糖濃度」とは、糖濃度を高くした培地を用いて培養することを意味し、例えば、グルコース、フルクトース、マンノースなどの単糖、ショ糖、ラクトースなどの二糖、オリゴ糖、多糖類、糖アルコール類などの糖溶液の添加により調整することができる。高糖濃度培地とは、通常の培養培地の浸透圧よりも高い浸透圧を有する培地である。高糖濃度培地は、例えば、添加する糖類の最終濃度が少なくとも１０質量％、好ましくは１０〜４０質量％であり、４０質量％以上の糖濃度でも生育可能である。さらに、１０Ｈ株の炭素源としてＤ−フルクトースを５〜２０質量％、好ましくは５〜１０質量％含む培地である。Ｄ−フルクトースは、単糖として添加されるだけでなく、ショ糖やオリゴ糖あるいは多糖類（野菜やキノコなどを含む）として添加された培地成分が培養中に分解されて供給されてもよい。従って、高糖濃度の培地としては、Ｄ−フルクトース（果糖）をその構成成分として含むショ糖や、黒砂糖または黒糖などの天然物由来の糖類が好ましい。かかる高糖濃度、かつＤ−フルクトースを含む培地で培養することにより、他の乳酸菌株等の存在下においても、１０Ｈ株を優勢菌株として生育させることができる。
【００４８】
本実施形態の免疫賦活剤の製造方法は、１０Ｈ株の菌体を、少なくとも７０℃で加熱処理する工程をさらに含むことが好ましい。
【００４９】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００５０】
［実施例１］１０Ｈ株の単離と培養条件
ラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株は、日本国長野県佐久市のアルソア佐久ファクトリィで製造された野菜黒糖発酵液から得られた。この発酵液には、黒砂糖（１０重量％）、ガラクトオリゴ糖（７重量％）および赤砂糖（３３重量％）を含む、重量換算で約５０％以上の糖が存在していた。限界希釈法（Ｂｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９３、Ｓｉｍｕ  ａｎｄ  Ｈａｇｓｔｒｏｍ  ２００４）を参考に、ポリスチレン製９６ウェルマイクロタイタープレートを用いた方法に改変し、この菌株を単離した。
【００５１】
以下の組成を有するラクトバチリＭＲＳブロス（ディフコラボラトリ社製）；
Ｐｒｏｔｅｏｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｎｏ．３    １０ｇ／Ｌ
Ｂｅｅｆ  ｅｘｔｒａｃｔ                      １０ｇ／Ｌ
Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ                      ５ｇ／Ｌ
Ｄｅｘｔｒｏｓｅ                              ２０ｇ／Ｌ
Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０                    １ｇ／Ｌ
クエン酸アンモニウム                            ２ｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム                                  ５ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム                            ０．１ｇ／Ｌ
硫酸マンガン                              ０．０５ｇ／Ｌ
リン酸二カリウム                                ２ｇ／Ｌ
を用いて発酵液を１０００倍希釈したものを出発試料とした。マイクロタイタープレートにて、２倍階段希釈（２０〜２１８倍）した後、各ウェルを滅菌した５０容量％の酵素液で満たした。このマイクロタイタープレートは、静置培養のため３０℃にて大気圧中で静置した。５日後、１つのウェルに存在する１つのコロニーを抜き取り、１０％（ｗ／ｖ）Ｄ−フルクトースを追加したＭＲＳブロス中に継代培養した。１０％（ｗ／ｖ）Ｄ−フルクトースを追加したラクトバチリＭＲＳ寒天（ディフコラボラトリ社）を用いたペトリ皿中でコロニー形成を観察した。単離された菌株が純粋であることを確認し、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク中に懸濁し−８０℃で保存した。
【００５２】
［実施例２］１０Ｈ株の増殖特性
１０Ｈ株の増殖特性を調べるため、ＭＲＳブロスのみ、ＭＲＳブロスにＤ−フルクトースを５％、１０％、１５％または２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加したもの、またはピルビン酸を０．５容量％の濃度で添加したＭＲＳブロスを用いて、３０℃で培養を行った。０〜１１０時間の間に、６６０ｎｍの波長における培養液の吸光度（ＯＤ６６０）を、ＪＡＳＣＯ社製、Ｖ−７３０ＵＶ−可視スペクトロフォトメーターを用いて測定した結果を図１に示す。図１に示したように、１０Ｈ株は、ＭＲＳブロスのみおよび０．５％ピルビン酸を添加したＭＲＳブロスではほとんど増殖しなかったが、５％〜２０％のＤ−フルクトースを添加したＭＲＳブロス中で良く増殖した。
【００５３】
［実施例３］系統発生分析
単離したラクトバチルス・コーソイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ）１０Ｈ株の培養菌体から常法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅シーケンシングにより、アプライドバイオシステムズ社の３１３０ジェネティックアナライザを用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定した。近縁菌株との１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性に基づき、最尤法（maximum-likelihood method）を用いて系統発生樹を構築した。その結果を図２に示す。５０％以上のブートストラップ値を分岐点に示した。また、ＧｅｎＢａｎｋの受入番号をカッコ内に示す。
【００５４】
１０Ｈ株のドラフトゲノムシークエンスは、常法によりＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭシステムを用いて解析した。その結果、ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は３０．５％であり、６７のコンティグを整列して１３７６個のＣＤＳ、１つのｔｍＲＮＡ、３つのｒＲＮＡ遺伝子、５６個のｔＲＮＡ遺伝子および１つの反復配列領域を注釈づけた。１０Ｈ株と、ラクトバチルス・クンケイ（Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ）ＹＨ−１５株およびラクトバチルス・アピノーラム（Ｌ．ａｐｉｎｏｒｕｍ）Ｆｈｏｎ１３Ｎ株とのＡＮＩ値（相同値）は、ＮＣＢＩから取得したゲノムシークエンスとＯｒｔｈｏＡＮＩｕを用いて推定した。ラクトバチルス属の異なる種を同定するために、ｐｈｅＳおよびｒｐｏＡ遺伝子の部分配列が１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の代替手段として用いられている（Ｎａｓｅｒら、２００７）。そこで、ラクトバチルス・クンケイ（Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ）ＹＨ−１５株およびラクトバチルス・アピノーラム（Ｌ．ａｐｉｎｏｒｕｍ）Ｆｈｏｎ１３Ｎ株の遺伝子配列をＮＣＢＩから取得し、それら同士およびそれらと１０Ｈ株との塩基配列の同一性をそれぞれ比較した。その結果を以下の表１に示す。
【００５５】
【表１】
2020092704.tif 000003
【００５６】
これらの結果より、ｐｈｅＳおよびｒｐｏＡのいずれの遺伝子についてもラクトバチルス・クンケイＹＨ−１５株とラクトバチルス・アピノーラムＦｈｏｎ１３Ｎ株との配列相同性は、１０Ｈ株とそれらとの相同性よりも高いことが分かった。１０Ｈ株とラクトバチルス・クンケイＹＨ−１５株とのＡＮＩ値は７４．４６％と計算され、一方、１０Ｈ株とラクトバチルス・アピノーラムＦｈｏｎ１３Ｎ株とのＡＮＩ値は７３．３１％と計算された。これらの値は、種の境界として設定されたＡＮＩ値（９５〜９６％）よりも低いことから、１０Ｈ株は、ラクトバチルス・クンケイ（Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ）、ラクトバチルス・アピノーラム（Ｌ．ａｐｉｎｏｒｕｍ）およびラクトバチルス・オーゼンシス（Ｌ．ｏｚｅｎｓｉｓ）とは異なる種に属すると結論付けられた。
【００５７】
［実施例４］供試菌サンプルのＩｇＡ産生誘導活性の測定
（パイエル板細胞の調製）
６週齢オスＢＡＬＢ／ｃＡ  マウス（ＣＲＥＡ  Ｊａｐａｎより購入）をＡＩＮ−７６Ａ  ＤＩＥＴ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓより購入）にて１週間飼育した後、炭酸ガスにて安楽死させ、パイエル板を摘出した。ＲＰＭＩ１０培地［ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５５μｍｏｌ／ｌの２−メルカプトエタノールおよび１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）］にてパイエル板を洗浄後、２５ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および１ｍｍｏｌ／ｌのジチオスレイトールを加えたＲＰＭＩ１０培地にて４５分、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。再度ＲＰＭＩ１０培地で洗浄した後、４００Ｕ／ｍｌのタイプIコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）と、３０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ）とを加えたＲＰＭＩ１０培地にて５０分、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。反応液を４５μｍフィルターにて濾過し、ＲＰＭＩ１０培地に置換後、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに細胞数を調製した。
【００５８】
（供試菌液の調製）
ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて供試菌を一晩３０℃で静置培養し、生理食塩水に置換後、吸光度（ＯＤ６００）を０．０２に調整した。必要により７０℃または１００℃で３０分間、加熱処理を行った。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ  ｓｐ．ｎｏｖ．は研究室保管株を用いた。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ（ＪＣＭ１１９４）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ（ＪＣＭ１１９２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ（ＪＣＭ１０６０２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（ＪＣＭ１２７５）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ（ＪＣＭ１２０５）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ（ＪＣＭ１２００）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｏｎｇｕｍ（ＪＣＭ１２１７）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＪＣＭ１２２２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＪＣＭ１１４９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＪＣＭ２０１２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ＪＣＭ１１３４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（ＪＣＭ１１１２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ（ＪＣＭ１１３１）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ（ＪＣＭ５８０５）は、ＲＩＫＥＮ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ）より購入した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入した。
【００５９】
（ＩｇＡの測定）
調製したパイエル板細胞１００μｌと供試菌液１００μｌを９６−ｗｅｌｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で５日間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で共培養した。遠心後、得られた培養上清中のＩｇＡ量を、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  （Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。
【００６０】
その結果を表２および図３に示す。１０Ｈ株には、非常に高いＩｇＡ産生誘導活性が認められた。その活性は、今回比較に用いた他の１５種類のいずれの供試菌よりも高いものであった。
【００６１】
【表２】
2020092704.tif 000004
【００６２】
続いて、７０℃で３０分間、加熱処理を行った供試菌サンプルを用いて同様の試験を行った結果を以下の表３および図４Ａに示す。
【表３】
2020092704.tif 000005
【００６３】
また、１００℃で３０分間、加熱処理を行った供試菌サンプルを用いて同様の試験を行った結果を以下の表４および図４Ｂに示す。なお、有意差検定は、ｓａｌｉｎｅを対照群とし、対照群との群間比較をＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定により行った。危険率５％未満を＊、１％未満を＊＊、０．１％未満を＊＊＊と表し有意とした。
【００６４】
【表４】
2020092704.tif 000006
【００６５】
これらの結果より、１０Ｈ株は７０℃、３０分の加熱による免疫誘導活性の低下は認められなかった。１００℃、３０分の加熱でも、約７５％の活性が保持された。また７０℃、１００℃ともに、今回比較に用いたいずれの菌よりも、高い活性を有していた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｓｏｉ  １０Ｈ株は、耐熱性の高い免疫賦活剤として期待できる。
【００６６】
［実施例５］マウス腸管内におけるＩｇＡ産生促進作用の確認
（乳酸菌粉末の調製）
実施例４と同様の方法で培養した乳酸菌１０Ｈ株の培養液を遠心分離して集菌後、生理食塩水で２回洗浄した。これに、得られた菌体ペレットの２倍重量の１０％（ｗ／ｖ）スクロース液を添加して凍結乾燥後、乳鉢で粉末化したものを生菌粉末とした（１０．７×１０９ｃｆｕ／ｇ）。死菌粉末は、１０％（ｗ／ｖ）スクロース液添加前に７０℃、３０分間の熱処理を行った。
【００６７】
（マウスの飼育）
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（６週齢、オス、日本クレア社）を購入後３週間、ＡＩＮ−７６（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ）と水を自由摂取させ予備飼育を行った。５匹ずつ、コントロール群、生菌投与群、死菌投与群に群分けを行った。余った１匹のマウスはコントロール群に加えた。個別にゲージで飼育し、コントロール群にはＡＩＮ−７６を、乳酸菌投与群にはＡＩＮ−７６に乳酸菌粉末を０．３８％添加した餌をそれぞれ与え、２４日間飼育した。乳酸菌粉末入りの餌を与え始めた日を０日とし、適時体重、餌摂取量および糞中ＩｇＡを測定した。
【００６８】
（糞中ＩｇＡの測定）
乳酸菌粉末を摂取させてから０日目、１０日、２４日目の糞を回収し、凍結乾燥した。それぞれの糞重量を測定したのち、乳鉢を用いてそれぞれの糞を粉末にし、１０  ｍｇ／２００ｍＬ濃度で抽出バッファー［ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＭｉｎｉＴＭ  （プロテアーゼインヒビターカクテル錠、Ｒｏｃｈｅ社）１タブレットをＰＢＳ１０ｍＬに溶解］に懸濁した。ボルテックスでよく攪拌し、氷上で３０分間放置した後、遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）、上清を回収した。上清中のＩｇＡ量は、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、製品プロトコールに従って測定した。
【００６９】
その結果を以下の表５および図５に示す。マウス糞中のＩｇＡ量は、乳酸菌粉末を接種させた群では生菌および死菌のいずれの場合も飼育日数の経過とともに増加し、飼育２４日後のＩｇＡ量はコントロール群に比べて有意に高かった。これらの結果より、乳酸菌１０Ｈ株粉末を摂取したマウスでは、腸管内におけるＩｇＡの産生が促進されることが示唆された。
【００７０】
【表５】
2020092704.tif 000007
【図１】
2020092704.tif 000008
【図２】
2020092704.tif 000009
【図３】
2020092704.tif 000010
【図４Ａ】
2020092704.tif 000011
【図４Ｂ】
2020092704.tif 000012
【図５】
2020092704.tif 000013
【配列表】
2020092704000001.app