(57)【要約】      （修正有）【課題】オベチコール酸の調製、使用および固体形態の提供。【解決手段】本発明は、オベチコール酸：2020125317.tif 000052またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体に関する。オベチコール酸は、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態、心臓血管疾患または胆汁うっ滞性肝臓疾患の治療または予防に有用であり、かつＨＤＬコレステロールを減少させ、哺乳動物においてトリグリセリドを低下させること、または線維症の阻害に、有用である。本発明はまた、オベチコール酸の結晶及び合成プロセスに関する。【選択図】図５
2020125317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の要旨
本発明は、ＦＸＲに対するアゴニストであるオベチコール酸（ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ
ａｃｉｄ）、オベチコール酸の調製のプロセス、オベチコール酸を含有する医薬製剤、およびその治療用途に関する。
【０００２】
【化１】
2020125317.tif 000003
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、約４．２°、約６．４°、約９．５°、約１２．５°、および約１６．７°の２θに固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃに関する。この結晶オベチコール酸形態Ｃは、図５に記載されるものと実質的に同様なＸ線回折パターンによって特徴付けられ、そしてさらに、約９８±２℃に吸熱点の値を有する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムによって特徴付けられる。
【０００４】
本発明は、結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【０００５】
本発明は、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（３α−ｈｙｄｒｏｘｙ−６α−ｅｔｈｙｌ−７−ｃｈｅｔｏ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、および結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【０００６】
本発明は、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（Ｅ−  ｏｒ  Ｅ／Ｚ−３α−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ−７−ｋｅｔｏ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程；ならびに結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【０００７】
本発明は、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（Ｅ−  or  Ｅ／Ｚ−３α−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ−７−ｋｅｔｏ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）をＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【０００８】
本発明は、３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３α，７−ｄｉｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙ−５β−ｃｈｏｌ−６−ｅｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【０００９】
本発明は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（３α−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｋｅｔｏ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程；３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１０】
本発明は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（３α−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｋｅｔｏ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程；３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程；３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程；３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１１】
本発明は、結晶オベチコール酸形態Ｃをオベチコール酸形態１に変換する工程が、結晶オベチコール酸形態ＣをＮａＯＨ水溶液に溶解させる工程、およびＨＣｌを添加する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１２】
本発明は、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程が、約８５℃〜約１１０℃の温度で塩基性水溶液中で行われる、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１３】
本発明は、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程が、約１００℃〜約１０５℃の温度および約４ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１４】
本発明は、Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程が、約２０℃〜約６０℃の温度で行われる、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１５】
本発明は、３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程が、極性非プロトン性溶媒中で約−５０℃〜約−７０℃の温度でＢＦ３の存在下で行われる、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１６】
本発明は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程が、極性非プロトン性溶媒中で約−１０℃〜約−３０℃の温度で行われる、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１７】
本発明は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程が、約３時間加熱され、そして反応混合物のｐＨが水性塩基性溶液で約６．５〜約８．０のｐＨ値に調整される、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００１８】
本発明は、約９８％より高い、約９８．５％より高い、約９９．０％より高い、または約９９．５％より高い力価を有する、オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体に関する。本発明は、本発明のプロセスにより製造されたオベチコール酸形態１および薬学的に許容されるキャリアを含有する、薬学的組成物に関する。
【００１９】
本発明は、有効量のオベチコール酸形態１を投与する工程を包含する、被験体において、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態を治療または予防する方法に関する。この疾患または状態は、胆道閉鎖症、胆汁うっ滞性肝臓疾患、慢性肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝臓疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、進行性線維症に起因する肝臓損傷、肝線維症、ならびに心臓血管疾患（アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症、および高脂質血症が含まれる）から選択される。本発明は、有効量のオベチコール酸形態１を投与する工程を包含する、被験体においてトリグリセリドを低下させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、１ｍｇ／ｍＬで、注入体積３μｌで注入された、実施例１の工程４における粗製化合物５のＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳクロマトグラムである。このクロマトグラムは、実施例２に記載される方法に従って得られる。
【図２】図２は、１ｍｇ／ｍＬで、注入体積２０μＬで注入された、実施例１の工程４における化合物５の精製された参照物質のＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳクロマトグラムである。このクロマトグラムは、実施例２に記載される方法に従って得られる。
【図３】図３は、ＨＰＬＣ法を使用した、実施例１の工程４における粗製化合物５のＵＶクロマトグラムである。このクロマトグラムは、実施例２に記載される方法に従って得られる。
【図４−１】図４Ａは、ＨＰＬＣ法によって純粋に単離された、実施例１の工程４における化合物５の大きい方のピークの画分（ＲＴ  ２９．０分）から得られた、ｍ／ｚ  ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの精密イオン追跡（ａｃｃｕｒａｔｅ  ｉｏｎ  ｔｒａｃｅ）である（実施例２を参照のこと）。図４Ｂは、ＨＰＬＣ法によって純粋に単離された、実施例１の工程４における化合物５の小さい方のピークの画分（ＲＴ  ２９．９分）から得られた、ｍ／ｚ  ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの精密イオン追跡である（実施例２を参照のこと）。
【図４−２】図４Ｃは、実施例１の工程４における粗製化合物５から得られた、ｍ／ｚ  ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの精密イオン追跡である（実施例２を参照のこと）。図４Ｄは、実施例１の工程４における化合物５の精製された参照物質から得られた、ｍ／ｚ  ８５０．６１９１４±３ｐｐｍの精密イオン追跡である（実施例２を参照のこと）。
【図５】図５は、結晶オベチコール酸形態ＣのＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例３を参照のこと）。
【図６】図６は、結晶オベチコール酸形態ＣのＴＧＡおよびＤＳＣの各サーモグラムを示す（実施例３を参照のこと）。
【図７】図７は、２５℃、１１０℃、および１２０℃における、結晶オベチコール酸のＶＴ−ＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例３を参照のこと）。
【図８Ａ】図８Ａは、結晶オベチコール酸形態ＣのＧＶＳ等温プロットである（実施例３を参照のこと）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、結晶オベチコール酸形態ＣのＧＶＳ速度論プロットである（実施例３を参照のこと）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＧＶＳ分析の前後の結晶オベチコール酸形態ＣのＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例３を参照のこと）。
【図９】図９は、４０℃／７５％ＲＨでの貯蔵の前後の結晶オベチコール酸形態ＣのＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例３を参照のこと）。
【図１０】図１０は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムである（実施例５を参照のこと）。
【図１１】図１１は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５および６のＸＲＰＤディフラクトグラフを示す（実施例５を参照のこと）。
【図１２】図１２は、ｄ６−ＤＭＳＯ中のオベチコール酸形態１のバッチ１のＮＭＲスペクトルである（実施例５を参照のこと）。
【図１３】図１３は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５および６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す（実施例５を参照のこと）。
【図１４】図１４は、オベチコール酸形態１の１３Ｃ  ＤＥＰＴＱ  ＮＭＲスペクトルの、領域１０ｐｐｍ〜７５ｐｐｍからの拡大である（実施例５を参照のこと）。
【図１５】図１５は、オベチコール酸形態１の、第四級炭素を抑制している１３ＣＤＥＰＴ１３５  ＮＭＲスペクトルの、領域０ｐｐｍ〜７５ｐｐｍからの拡大である（実施例５を参照のこと）。
【図１６】図１６は、オベチコール酸形態１の定量的１３Ｃ  ＮＭＲである（実施例５を参照のこと）。
【図１７】図１７は、図１６の３２．３ｐｐｍにおけるピークの拡大図である（実施例５を参照のこと）。
【図１８】図１８は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＦＴ−ＩＲスペクトルである（実施例５を参照のこと）。
【図１９】図１９は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＴＧＡおよびＤＳＣの各サーモグラムを示す（実施例５を参照のこと）。
【図２０】図２０は、オベチコール酸形態１のバッチ１の変調ＤＳＣサーモグラムを示す（実施例５を参照のこと）。
【図２１】図２１は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５、および６のＴＧＡ追跡を示す（実施例５を参照のこと）。
【図２２】図２２は、オベチコール酸形態１のバッチ１、２、３、４、５、および６のＤＳＣ追跡を示す（実施例５を参照のこと）。
【図２３Ａ】図２３Ａは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ１の写真である。図２３Ｂは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ２の写真である。図２３Ｃは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ３の写真である。図２３Ｄは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ４の写真である。図２３Ｅは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ５の写真である。図２３Ｆは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ６の写真である。
【図２３Ｂ】図２３Ａは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ１の写真である。図２３Ｂは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ２の写真である。図２３Ｃは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ３の写真である。図２３Ｄは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ４の写真である。図２３Ｅは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ５の写真である。図２３Ｆは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ６の写真である。
【図２３Ｃ】図２３Ａは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ１の写真である。図２３Ｂは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ２の写真である。図２３Ｃは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ３の写真である。図２３Ｄは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ４の写真である。図２３Ｅは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ５の写真である。図２３Ｆは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ６の写真である。
【図２３Ｄ】図２３Ａは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ１の写真である。図２３Ｂは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ２の写真である。図２３Ｃは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ３の写真である。図２３Ｄは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ４の写真である。図２３Ｅは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ５の写真である。図２３Ｆは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ６の写真である。
【図２３Ｅ】図２３Ａは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ１の写真である。図２３Ｂは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ２の写真である。図２３Ｃは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ３の写真である。図２３Ｄは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ４の写真である。図２３Ｅは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ５の写真である。図２３Ｆは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ６の写真である。
【図２３Ｆ】図２３Ａは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ１の写真である。図２３Ｂは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ２の写真である。図２３Ｃは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ３の写真である。図２３Ｄは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ４の写真である。図２３Ｅは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ５の写真である。図２３Ｆは、偏光顕微鏡下のオベチコール酸形態１のバッチ６の写真である。
【図２４】図２４は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＧＶＳ等温プロットを示す（実施例５を参照のこと）。
【図２５】図２５は、オベチコール酸形態１のバッチ１のＧＶＳ速度論プロットを示す（実施例５を参照のこと）。
【図２６】図２６は、ＧＶＳの前後のオベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例５を参照のこと）。
【図２７】図２７は、オベチコール酸形態１についての、３つの異なるメタノール／水の比におけるｐＫａの測定のグラフである（実施例５を参照のこと）。
【図２８】図２８は、オベチコール酸形態１についてのＹａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙプロットである（実施例５を参照のこと）。
【図２９】図２９は、オベチコール酸形態１についての、ｐＨに依存する種の分布を示すグラフである（実施例５を参照のこと）。
【図３０】図３０は、オベチコール酸形態１の電位差測定法により得られた差曲線を示すグラフである（実施例５を参照のこと）。
【図３１】図３１は、オベチコール酸形態１の親油性プロフィールを示す（実施例５を参照のこと）。
【図３２】図３２は、４０℃／７５％ＲＨでの貯蔵後のオベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例５を参照のこと）。
【図３３】図３３は、２５℃／９７％ＲＨでの貯蔵後のオベチコール酸形態１のバッチ１のＸＲＰＤディフラクトグラムを示す（実施例５を参照のこと）。
【図３４】図３４は、非水素原子についての異方性原子変位楕円体を５０％の確率水準で示す、結晶構造からのオベチコール酸形態Ｇの分子の図を示す（実施例６を参照のこと）。
【図３５】図３５は、オベチコール酸形態Ｇの結晶構造の分子間水素結合の図を示し、ここで水素結合は破線で示されている（実施例６を参照のこと）。
【図３６】図３６は、シミュレートされた粉末のパターン、実験によって収集された結晶のパターン、およびオベチコール酸形態Ｇの、ＸＲＰＤの重ね合わせを示す（実施例６を参照のこと）。
【図３７】図３７は、２０ｍｇ／ｋｇのオベチコール酸形態１および結晶形態Ｆの経口投与後の、時間に対する血漿中オベチコール酸プロフィールのグラフを示す（実施例７を参照のこと）。
【図３８】図３８は、投与後の異なる時間間隔における、オベチコール酸形態１および結晶形態Ｆのタウロ（ｔａｕｒｏ）結合体の血漿中濃度のグラフを示す（実施例７を参照のこと）。
【図３９】図３９は、形態１のＤＳＣ曲線を示す（実施例７を参照のこと）。
【図４０】図４０は、形態ＦのＤＳＣ曲線を示す（実施例７を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本願は、化学構造：
【００２２】
【化２】
2020125317.tif 000004
【００２３】
を有する、薬学的に活性な成分であるオベチコール酸（ＩＮＴ−７４７としても知られている）（実質的に純粋なオベチコール酸を含む）、結晶オベチコール酸を合成中間体として含むオベチコール酸の調製のためのプロセス、ならびに当該オベチコール酸を調製するプロセスにおいて、オベチコール酸および合成中間体の各々の存在および純度を確認するための分析方法に関する。本願はまた、オベチコール酸の薬学的組成物および製剤、ならびにこのような組成物の使用を記載する。
【００２４】
オベチコール酸を調製するプロセス
本願は、非常に純粋なオベチコール酸を調製するプロセスに関する。本願のプロセスを、スキーム１に示す。このプロセスは、６工程合成であり、その後に、非常に純粋なオベチコール酸を製造するための１回の精製工程が行われる。
【００２５】
【化３】
2020125317.tif 000005
【００２６】
本発明のプロセスはまた、化合物４および５の各々が、以下の化合物４Ａおよび５Ａの構造：
【００２７】
【化４】
2020125317.tif 000006
【００２８】
によって示されるようなＥ異性体とＺ異性体との混合物からなる、スキーム１によるプロセスを包含する。
【００２９】
１つの実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）のＥ／Ｚ異性体比は、約５０％であるか、約６０％より大きいか、約７０％より大きいか、約８０％より大きいか、約８３％より大きいか、約８５％より大きいか、約９０％より大きいか、約９３％より大きいか、約９５％より大きいか、または約９９％より大きい。１つの実施形態において、このＥ／Ｚ比は、ＨＰＬＣによって決定される。１つの実施形態において、この比は約８０％より大きい。１つの実施形態において、この比は約８３％より大きい。１つの実施形態において、この比は約８５％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９０％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９３％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９５％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９９％より大きい。
【００３０】
１つの実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）のＥ／Ｚ異性体比は、約５０％であるか、約６０％より大きいか、約７０％より大きいか、約８０％より大きいか、約８３％より大きいか、約８５％より大きいか、約９０％より大きいか、約９３％より大きいか、約９５％より大きいか、または約９９％より大きい。１つの実施形態において、このＥ／Ｚ比は、ＨＰＬＣによって決定される。１つの実施形態において、この比は約８０％より大きい。１つの実施形態において、この比は約８３％より大きい。１つの実施形態において、この比は約８５％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９０％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９３％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９５％より大きい。１つの実施形態において、この比は約９９％より大きい。
【００３１】
本願のプロセスは、当該技術分野において一度も報告されていない。このプロセスは、６工程合成であり、その後に、１回の精製工程が行われる。工程１は、メタノールを使用した、酸触媒および加熱の存在下での、７−ケトリトコール酸（７―ｋｅｔｏ  ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＫＬＣＡ）のＣ−２４カルボン酸のエステル化であり、メチルエステル化合物１を生成する。工程２は、強塩基を使用した化合物１からのシリルエノールエーテル形成であり、その後、クロロシランで処理して、化合物３を生成する。工程３は、シリルエノールエーテル化合物３とアセトアルデヒドとのアルドール縮合反応であり、化合物４（または化合物４Ａ）を生成する。工程４は、化合物４（または化合物４Ａ）のＣ−２４メチルエステルのエステル加水分解（すなわち、鹸化）であり、カルボン酸化合物５（または化合物５Ａ）を生成する。工程５は、化合物５（または化合物５Ａ）の６−エチリデン部分の水素化であり、その後、異性化が行われて、化合物６を生成する。工程６は、化合物６の７−ケト基の、７α−ヒドロキシ基への選択的還元であり、結晶オベチコール酸を生成する。工程７は、結晶オベチコール酸のオベチコール酸形態１への変換である。
【００３２】
本発明のプロセスは、このプロセスがオベチコール酸の結晶形態を合成中間体として利用する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明は、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、および
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明は、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明は、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明は、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明は、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明は、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成する工程、
Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明は、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成する工程、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成する工程、
Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、オベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明は、結晶オベチコール酸を使用してオベチコール酸形態１を調製するプロセスに関する。別の実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｃである。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸形態Ｃは、図５に記載されるものと同様なＸ線回折パターンによって特徴付けられる。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸形態Ｃは、酢酸ｎ−ブチルから結晶化および再結晶される。
【００４６】
工程１
工程１は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を形成することである。工程１の１つの実施形態において、この反応混合物は約３時間加熱され、そしてこの反応混合物のｐＨは、水性塩基性溶液で約６．５〜約８．０のｐＨ値に調整される。１つの実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の単離は、活性炭での処理をさらに包含する。１つの実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の単離は、活性炭での処理をさらに含まない。１つの実施形態において、活性炭での処理なしでの３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の単離は、より高い収率を与える。１つの実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（１）をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させることは、メタノール中で行われる。１つの実施形態において、上記塩基性溶液はＮａＯＨ水溶液である。１つの実施形態において、上記ｐＨ値は約７．０〜約７．５である。
【００４７】
１つの実施形態において、このメチルアルコールは、メチル化剤として、かつ反応溶媒として働く。１つの実施形態において、生成物を含有する溶液は、活性炭で約３０分間処理され、そして濾過されて、炭素の固形物を除去される。１つの実施形態において、生成物を含有する溶液は、活性炭で処理されない。生成物を沈殿させるために、約５℃〜約２０℃の水および種晶用物質が添加される。別の実施形態において、この水は、約１０℃〜約１５℃である。１つの実施形態において、この生成物は遠心分離で単離され、そしてメタノールと水との混合物で洗浄される。１つの実施形態において、この湿った物質の水含有量は、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）によって定量される。１つの実施形態において、この物質は、次の工程で使用する前にタンブル乾燥機で乾燥される。１つの実施形態において、この物質は、次の工程で使用する前に乾燥させられない。
【００４８】
工程２
工程２は、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）を形成することである。１つの実施形態において、工程２は、極性非プロトン性溶媒中で約−１０℃〜約−３０℃の温度で行われる。１つの実施形態において、この極性非プロトン性溶媒は、テトラヒドロフランである。１つの実施形態において、この温度は、約−２０℃〜約−２５℃である。１つの実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）をＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させることは、約２時間撹拌される。
【００４９】
１つの実施形態において、化合物１は、不活性な条件下で反応容器に入れられる。別の実施形態において、残留する水およびメタノールは、約６５℃、かつ標準圧力での繰り返しの共沸蒸留によって除去される。別の実施形態において、ＴＨＦがその残渣に必要に応じて添加され、そして蒸留が約４回繰り返される。別の実施形態において、この蒸留は、約３回、約２回、または約１回繰り返される。１つの実施形態において、生成物を含有する残存溶液は、０．０５％以下の最終水含有量を示す（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定）。水は、この工程において後に添加されるクロロトリメチルシランを加水分解し得る。１つの実施形態において、生成物の溶液は、約−１０℃〜約−３０℃に予め冷却され、次いで、クロロトリメチルシランが添加される。別の実施形態において、この溶液は、約−２０℃〜約−２５℃に予め冷却される。１つの実施形態において、強塩基およびＴＨＦが、別の反応容器に入れられ、そして約−１０℃〜約−３０℃に冷却される。１つの実施形態において、この強塩基は、リチウムジイソプロピルアミドである。別の実施形態において、この反応容器は不活性であり、これは例えば、窒素またはアルゴンの雰囲気下である。別の実施形態において、塩基およびＴＨＦの溶液は、約−２０℃〜約−２５℃に冷却される。１つの実施形態において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル、ＴＨＦ、およびクロロトリメチルシランの乾燥した冷却溶液が、この塩基性溶液に約−１０℃〜約−３０℃で入れられる。別の実施形態において、この温度は約−２０℃〜約−２５℃である。１つの実施形態において、この反応混合物は、約２時間撹拌される。１つの実施形態において、後処理のために、この反応混合物は、予め冷却された酸性溶液に添加される。別の実施形態において、この酸性溶液は、クエン酸水溶液である。１つの実施形態において、この添加の後に、その水相が分離されて廃棄される。１つの実施形態において、その有機溶媒は、その有機相から、約５０℃で減圧蒸留によって除去される。１つの実施形態において、単離された残渣は、３α，７α−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）であり、次の工程で「そのまま」使用される。あるいは、化合物３は、工程３の前に精製され得る。
【００５０】
工程３
工程３は、３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）をＣＨ３ＣＨＯと反応させて３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）を形成することである。１つの実施形態において、工程３は、極性非プロトン性溶媒中で約−５０℃〜約−７０℃の温度で、ＢＦ３の存在下で行われる。１つの実施形態において、この極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタンである。１つの実施形態において、このＢＦ３は、アセトニトリル中１６重量％の溶液である。１つの実施形態において、この温度は約−６０℃〜約−６５℃である。
【００５１】
１つの実施形態において、極性非プロトン性溶媒中の化合物３が、不活性反応容器に入れられる。別の実施形態において、この極性非プロトン性溶媒は、先の工程からの残留溶媒（例えば、ＴＨＦ）である。１つの実施形態において、ＴＨＦは、残留する水およびジイソプロピルアミンの留去を助けるために添加される。約５０℃の最高温度において、極性非プロトン性溶媒の残留量は、減圧下で留去される。化合物３を含有する残渣中の水含有量は、０．５％以下に限られる（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定）。次いで、化合物３を含有する残渣は、極性非プロトン性溶媒に溶解され、そして約−５０℃〜約−７０℃に予め冷却される。この極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタンである。別の実施形態において、極性非プロトン性溶媒中の化合物３を含有する残渣は、約−６０℃〜約−６５℃に予め冷却される。アセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＨＯ）が添加される。極性非プロトン性溶媒と三フッ化ホウ素（ＢＦ３）との溶媒和錯体が、別の反応容器に入れられ、次いで約−５０℃〜約−７０℃に冷却される。別の実施形態において、この極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタンである。別の実施形態において、この三フッ化ホウ素溶媒和錯体は、三フッ化ホウ素アセトニトリル錯体である。このＢＦ３溶液の温度は、約−６０℃〜約−６５℃である。化合物３およびアセトアルデヒドを含有する溶液が、このＢＦ３溶液に約−６０℃〜約−６５℃で添加される。別の実施形態において、化合物３およびアセトアルデヒドを含有する溶液は、乾燥状態である。１つの実施形態において、この反応混合物は、約−６０℃〜約−６５℃で約２時間撹拌され、約２３℃〜約２８℃まで温められ、さらに約２時間撹拌され、そして加水分解／後処理のために約２℃〜約１０℃に冷却される。１つの実施形態において、添加および撹拌のための合計時間は、約４時間である。１つの実施形態において、後処理のために、この反応容器からの冷却された溶液は、予め冷却された水性塩基性溶液に添加される。別の実施形態において、この水性塩基性溶液は、約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）である。１つの実施形態において、相が分離され、そして（下の）有機層は、別の反応容器に移される。１つの実施形態において、この有機層から、溶媒が、可能な限り５０℃以下（ｎｏｔ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ（ＮＭＴ）５０℃）での蒸留によって除去される。１つの実施形態において、この残渣は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）、ならびに幾分残存しているアセトニトリルおよびジクロロメタンを含有する。工程４は、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）を形成してもよいことが理解される。工程３の生成物は、工程４に直接持ち越される。
【００５２】
工程４
工程４は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させてＥ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）を形成することである。１つの実施形態において、工程４の前に、工程３からの残渣は約４５℃〜約６０℃に加熱されて、残留量の溶媒が除去される。１つの実施形態において、この温度は約４９℃〜約５５℃である。１つの実施形態において、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）をＮａＯＨと反応させるエステル加水分解反応は、約２０℃〜約２５℃で、メタノール、水、およびＮａＯＨ溶液中で行われる。
【００５３】
１つの実施形態において、反応する３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）は、反応容器に入れられる。別の実施形態において、この反応容器は不活性であり、これは例えば、窒素またはアルゴンの雰囲気下である。ＮＭＴ  ５０℃の温度で、残留量の溶媒が減圧下で留去される。１つの実施形態において、この残渣は、約４５℃〜約６０℃まで加熱される。別の実施形態において、この残渣は、約４９℃〜約５５℃まで加熱される。別の実施形態において、工程３からの残渣（化合物４）は、メタノールおよび水および水性塩基性溶液に溶解される。別の実施形態において、この水性塩基性溶液は、約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）である。工程４のエステル加水分解反応は、約２０℃〜約６０℃で行われ、そしてこの加水分解反応が完了するまで撹拌される。１つの実施形態において、このエステル加水分解は、約２０℃〜約２５℃で行われる。この反応混合物のｐＨは、１２より高いことを確認するために、チェックされる。このｐＨが１２より低い場合、さらなるＮａＯＨが添加される。この反応混合物は水で希釈され、そしてその温度は約２０℃〜約３５℃に調整される。別の局面において、この反応混合物は水で希釈され、そしてその温度は、約２５℃〜約３５℃に調整される。１つの実施形態において、後処理のために、相が分離され、そして下の水層が別の反応容器に移され、そして有機層が廃棄される。化合物５は、この水相にある。１つの実施形態において、酢酸エチルおよび酸が、この化合物５を含有する水相に、この水層を激しく撹拌しながら添加された。別の実施形態において、この酸は、クエン酸水溶液である。１つの実施形態において、相が分離され、そして下の水層が廃棄される。化合物５はこの有機層にある。１つの実施形態において、酢酸エチルがこの有機層から留去され、また酢酸エチルで置換される。１つの実施形態において、この蒸留は、その留出物の水含有量がＮＭＴ  １％になるまで、または一定の沸点に達するまで、繰り返される。１つの実施形態において、この懸濁物は、約１０℃〜約３０℃に冷却され、そして単離され、そして酢酸エチルで洗浄される。別の実施形態において、化合物５を含有する得られた懸濁物は、約２０℃〜約２５℃に冷却される。１つの実施形態において、得られた生成物の乾燥は、減圧下（例えば、タンブル乾燥機）で約６０℃で行われる。
【００５４】
１つの実施形態において、粗製Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）は、エタノールを使用して結晶化される。１つの実施形態において、エタノールおよび粗製化合物５は、反応容器に入れられる。別の実施形態において、この反応容器は不活性である。１つの実施形態において、粗製化合物５を溶解させるために、この混合物は加熱還流される。１つの実施形態において、混合物は、制御された冷却傾斜で、約１５℃〜約２０℃まで冷却される。１つの実施形態において、結晶性の化合物５は、遠心分離を使用して単離され、次いで酢酸エチルで洗浄される。１つの実施形態において、結晶性の化合物５の乾燥は、減圧下（例えば、タンブル乾燥機）で約６０℃で行われる。精製された化合物５のアッセイ、純度、および水分を測定するために、サンプルが採取され得る。１つの実施形態において、精製された化合物５は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸のＥ異性体とＺ異性体との両方を含む。１つの実施形態において、Ｅ対Ｚの比は、約９９：１、約９８：２、約９５：５、約９０：１０、約８５：１５、約８０：２０、約７５：２５、約７０：３０、約６５：３５、約６０：４０、約５５：４５、または約５０：５０である。精製された化合物５の同定および特徴付けに関する全詳細については、実施例２を参照のこと。
【００５５】
工程４はまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物から出発して行われ得る。例えば、工程４は、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）を形成することである。１つの実施形態において、工程４の前に、工程３からの残渣は、約４５℃〜約６０℃に加熱されて、残留量の溶媒を除去される。１つの実施形態において、この温度は約４９℃〜約５５℃である。１つの実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）をＮａＯＨと反応させることが含まれるこのエステル加水分解反応は、約２０℃〜約２５℃で、メタノール、水、およびＮａＯＨ溶液中で行われる。１つの実施形態において、このＮａＯＨ溶液は５０重量％の水溶液である。
【００５６】
１つの実施形態において、反応するＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４Ａ）は、反応容器に入れられる。別の実施形態において、この反応容器は不活性であり、これは例えば、窒素またはアルゴンの雰囲気下である。ＮＭＴ５０℃の温度で、残留量の溶媒が減圧下で留去される。１つの実施形態において、この残渣は、約４５℃〜約６０℃まで加熱される。１つの実施形態において、この温度は約４９℃〜約５５℃である。１つの実施形態において、工程３からの残渣（化合物４Ａ）は、メタノールおよび水および水性塩基性溶液に溶解させられる。別の実施形態において、この水性塩基性溶液は、約５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）である。工程４のエステル加水分解反応は、約２０℃〜約６０℃で行われ、そしてこの加水分解反応が完了するまで撹拌される。１つの実施形態において、このエステル加水分解は、約２０℃〜約２５℃で行われる。この反応混合物のｐＨは、１２より高いことを確認するためにチェックされる。このｐＨが１２より低い場合、さらなるＮａＯＨが添加される。この反応混合物は水で希釈され、そしてその温度は、約２５℃〜約３５℃に調整される。１つの実施形態において、後処理のために、相が分離され、そして下の水層が別の反応容器に移され、そして有機層は廃棄される。化合物５Ａは、この水相にある。１つの実施形態において、酢酸エチルおよび酸が、この化合物５Ａを含有する水相に、この水層を激しく撹拌しながら添加された。別の実施形態において、この酸はクエン酸水溶液である。１つの実施形態において、相が分離され、そして下の水層が廃棄される。化合物５Ａは、その有機層にある。１つの実施形態において、酢酸エチルがこの有機層から留去され、また酢酸エチルで置換される。１つの実施形態において、この蒸留は、留出物の水含有量がＮＭＴ１％になるまで、または一定の沸点に達するまで、繰り返される。１つの実施形態において、この懸濁物は、約１０℃〜約３０℃に冷却され、そして単離され、そして酢酸エチルで洗浄される。別の実施形態において、この得られた化合物５Ａを含有する懸濁物は、約２０℃〜約２５℃に冷却される。１つの実施形態において、この得られた生成物の乾燥は、減圧下（例えば、タンブル乾燥機）で約６０℃で行われる。化合物５Ａは、精製せずに工程５に持ち越され得る。
【００５７】
１つの実施形態において、粗製Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）は、エタノールを使用して結晶化される。１つの実施形態において、エタノールおよび粗製化合物５Ａは、反応容器に入れられる。別の実施形態において、この反応容器は不活性である。１つの実施形態において、粗製化合物５Ａを溶解させるために、この混合物は加熱還流される。１つの実施形態において、混合物は、制御された冷却傾斜で、約１５℃〜約２０℃まで冷却される。１つの実施形態において、結晶性の化合物５Ａは、遠心分離を使用して単離され、次いで酢酸エチルで洗浄される。１つの実施形態において、結晶性の化合物５Ａの乾燥は、減圧下（例えば、タンブル乾燥機）で約６０℃で行われる。１つの実施形態において、工程４の単離された結晶性生成物は、化合物５である。
【００５８】
代替的工程４
化合物５は、代替的方法に従って調製され得る。１つの実施形態において、化合物４は、不活性反応容器に入れられる。約５０℃（最高）で、残留量の溶媒（例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン）は、減圧下で留去され得る。その残渣がメタノールに溶解され、そして冷却される。水道水および苛性ソーダ（５０重量％のＮａＯＨ）が添加される。１つの実施形態において、この反応混合物は、約２０℃〜約２５℃で約４時間撹拌される。この溶液は水道水で希釈され、そしてトルエンが添加される。撹拌後、相が分離され、そして下の水層が不活性反応容器に移される。その有機層は廃棄される。酢酸エチルエステルおよびクエン酸の溶液が、この水層を激しく撹拌する間に添加される。相が分離され、そして下の水層が廃棄される。その有機層は、不活性反応容器に移される。この有機層から酢酸エチルエステルが留去され、また酢酸エチルエステルで置換される。１つの実施形態において、この操作は、留出物の水含有量が約１％以下になるまで、または一定の沸点に達するまで、繰り返される。この懸濁物は、約２０℃〜約２５℃に冷却され、そして化合物５が単離され、そして不活性な条件で遠心分離しながら酢酸エチルエステルで洗浄される。乾燥は、タンブル乾燥機中減圧下で約６０℃で行われる。
【００５９】
この代替的工程４もまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物から出発して実施され得る。１つの実施形態において、化合物４Ａは、不活性反応容器に入れられる。約５０℃（最高）で、残留量の溶媒（例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン）が減圧下で留去され得る。その残渣がメタノールに溶解させられ、そして冷却される。水道水および苛性ソーダ（５０重量％のＮａＯＨ）が添加される。１つの実施形態において、この反応混合物は、約２０℃〜約２５℃で約４時間撹拌される。この溶液が水道水で希釈され、そしてトルエンが添加される。撹拌後、相が分離され、そして下の水層が不活性反応容器に移される。その有機層は廃棄される。酢酸エチルエステルおよびクエン酸の溶液が、この水層を激しく撹拌する間に添加される。相が分離され、そして下の水層が廃棄される。この有機層は、不活性反応容器に移される。この有機層から、酢酸エチルエステルが留去され、また酢酸エチルエステルで置換される。１つの実施形態において、この操作は、留出物の水含有量が約１％以下になるまで、または一定の沸点に達するまで、繰り返される。この懸濁物は、２０℃〜２５℃に冷却され、そして化合物５Ａが単離され、そして不活性な条件で遠心分離しながら酢酸エチルエステルで洗浄される。乾燥は、タンブル乾燥機中減圧下で約６０℃で行われる。
【００６０】
工程５
工程５は、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成することである。工程５は、１段階（水素化と異性化とを一緒に）で行われても、２段階（水素化の後に異性化）で行われてもよい。１つの実施形態において、工程５は、約９０℃〜約１１０℃の温度および約４ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる。１つの実施形態において、後処理中に、この反応混合物の有機相は、活性炭で処理される。１つの実施形態において、この圧力は約４．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒである。別の実施形態において、この圧力は約５ｂａｒである。１つの実施形態において、この水素化反応混合物は、約１時間撹拌されてもよい。１つの実施形態において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）とＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、約１００℃に加熱され、そして約２時間〜約５時間撹拌される。１つの実施形態において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）とＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、約１００℃に加熱され、そして約３時間撹拌される。
【００６１】
１つの実施形態において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）とＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、塩基性溶液の存在下で行われる。１つの実施形態において、この塩基性溶液は、５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）溶液である。この水素化反応の後に、この反応混合物は、約１００℃まで加熱され（Ｃ−６位に関するβ配置からα配置への異性化を行うため）、次いで約４０℃〜約５０℃に冷却される。後処理のために、Ｐｄ／Ｃが濾別される。１つの実施形態において、この濾液に、酢酸ｎ−ブチルおよび酸が添加される。別の実施形態において、この酸は塩酸（ＨＣｌ）である。この水相が分離され、そして酸性であることを確認するためにｐＨ値をチェックされた後に、廃棄される。生成物を含有する有機相は、活性炭で処理される。１つの実施形態において、この活性炭が濾別され、そして生成物を含有する得られた濾液が蒸留により濃縮され、そして得られた懸濁物が約１０℃〜約３０℃に冷却される。別の実施形態において、この懸濁物は、約１５℃〜約２０℃に冷却される。化合物６を含有する懸濁物が単離され、そして酢酸ｎ−ブチルで洗浄される。化合物６は、圧力濾過器を使用して濾過される。１つの実施形態において、乾燥は、圧力濾過器で減圧下約８０℃で行われる。
【００６２】
１つの実施形態において、工程５において、Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）、水、ＮａＯＨ溶液（例えば、５０重量％）、およびＰｄ／Ｃは、約５ｂａｒのＨ２ガスおよび約１００℃〜約１０５℃の温度で、Ｈ２の取り込みが止まるまで混合される。この反応混合物は約４０℃〜約５０℃に冷却され、そしてＰｄ／Ｃが濾別される。次いで、酢酸ｎ−ブチルおよびＨＣｌが、化合物６を含有する溶液に添加される。１つの実施形態において、その水相が分離され、そして廃棄される。化合物６を含有する有機相は、活性炭で処理される。その炭素が濾別され、そしてその濾液が別の反応容器に移され、そしてこの反応容器内で、この濾液は蒸留により体積を減少させられ、次いでこの懸濁物は、約５℃〜約２０℃に冷却される。１つの実施形態において、化合物６は濾過により単離され、そしてその濾液は、圧力濾過器で減圧下約８０℃で乾燥させられる。
【００６３】
工程５もまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物から出発して実施され得る。例えば、工程５は、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させ、そして加熱して、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）を形成することである。工程５は、１段階（水素化と異性化とを一緒に）で行われても、２段階（水素化、その後、異性化）で行われてもよい。１つの局面において、工程５は、約９０℃〜約１１０℃の温度および約４ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる。１つの実施形態において、後処理中に、この反応混合物の有機相は、活性炭で処理される。１つの実施形態において、この圧力は約４．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒである。別の実施形態において、この圧力は約５ｂａｒである。１つの実施形態において、この水素化反応混合物は、約１時間撹拌されてもよい。１つの実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）とＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、約１００℃に加熱され、そして約２時間〜約５時間撹拌される。１つの実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）とＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、約１００℃に加熱され、そして約３時間撹拌される。
【００６４】
１つの実施形態において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）とＰｄ／Ｃおよび水素ガスとの反応は、塩基性溶液の存在下で行われる。１つの実施形態において、この塩基性溶液は、５０重量％の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ；苛性ソーダ）溶液である。この水素化反応の後に、この反応混合物は、約１００℃まで加熱され（Ｃ−６位に関するβ配置からα配置への異性化を行うため）、次いで約４０℃〜約５０℃に冷却される。後処理のために、Ｐｄ／Ｃが濾別される。１つの実施形態において、この濾液に、酢酸ｎ−ブチルおよび酸が添加される。別の実施形態において、この酸は塩酸（ＨＣｌ）である。この水相が分離され、そして酸性であることを確認するためにｐＨ値をチェックされた後に、廃棄される。生成物を含有する有機相は、活性炭で処理される。１つの実施形態において、この活性炭が濾別され、そして生成物を含有する得られた濾液が蒸留により濃縮され、そして得られた懸濁物が約１０℃〜約３０℃に冷却される。別の実施形態において、この懸濁物は、約１５℃〜約２０℃に冷却される。化合物６を含有する懸濁物が単離され、そして酢酸ｎ−ブチルで洗浄される。化合物６は、圧力濾過器を使用して濾過される。１つの実施形態において、乾燥は、圧力濾過器で減圧下約８０℃で行われる。
【００６５】
１つの実施形態において、工程５において、Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５Ａ）、水、ＮａＯＨ溶液（例えば、５０重量％）、およびＰｄ／Ｃは、約５ｂａｒのＨ２ガスおよび約１００℃〜約１０５℃の温度で、Ｈ２の取り込みが止まるまで混合される。この反応混合物は、約４０℃〜約５０℃に冷却され、そしてＰｄ／Ｃが濾別される。次いで、酢酸ｎ−ブチルおよびＨＣｌが、化合物６を含有するこの溶液に添加される。１つの実施形態において、その水相が分離され、そして廃棄される。化合物６を含有する有機相は、活性炭で処理される。その炭素が濾別され、そしてその濾液が別の反応容器に移され、そしてこの反応容器内で、この濾液は蒸留により体積を減少させられ、次いでこの懸濁物は、約５℃〜約２０℃に冷却される。１つの実施形態において、化合物６は濾過により単離され、そしてその濾液は、圧力濾過器で減圧下約８０℃で乾燥させられる。
【００６６】
別の実施形態において、化合物６を調製するための、上記水素化／異性化の両反応は、２段階で（化合物５または化合物５Ａから出発して）行われる。最初に、水素化が約４ｂａｒ〜５ｂａｒで行われ、次いで第二に、この反応混合物は、約２０℃〜約４０℃に加熱される。この反応混合物を加熱することにより、６位のエチル基を所望のα配置に異性化させる。この反応混合物は、この異性化が完了するまで加熱される。
【００６７】
工程６
工程６は、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成することである。１つの実施形態において、工程６は、約８５℃〜約１１０℃の温度で塩基性水溶液中で行われる。１つの実施形態において、この温度は約９０℃〜約９５℃である。１つの実施形態において、この塩基性水溶液はＮａＯＨ水溶液である。１つの実施形態において、この塩基性水溶液は、５０重量％のＮａＯＨ溶液と水との混合物である。１つの実施形態において、化合物６とＮａＢＨ４との反応混合物は、約３時間〜約５時間撹拌された。別の実施形態において、反応混合物は、約４時間撹拌された。
【００６８】
後処理のために、この反応が完了した後に、この混合物を約８０℃に冷却し、そして冷却した反応容器に移す。１つの実施形態において、約２０℃〜約６０℃で、酢酸ｎ−ブチルおよび酸が添加される。１つの実施形態において、この温度は約４０℃〜約４５℃である。別の実施形態において、この酸はクエン酸である。この水相が分離され、そして酸性であることを確認するためにｐＨ値をチェックされた後に、廃棄される。生成物を含有する有機相が、蒸留により濃縮される。１つの実施形態において、酢酸ｎ−ブチルがこの残渣に添加され、そして再度留去される。１つの実施形態において、酢酸ｎ−ブチルがこの残渣に再度添加され、次いでゆっくりと冷却される。別の実施形態において、この残渣に、約５０℃で種晶を入れる。別の実施形態において、結晶化が起こった後に、この混合物は５２℃に加熱され、次いで約１５℃〜約２０℃までゆっくりと冷却される。別の実施形態において、この残渣は、約１５℃〜約２０℃に冷却される。１つの実施形態において、得られたオベチコール酸は、酢酸ｎ−ブチルで洗浄される。１つの実施形態において、このオベチコール酸は単離され、そして酢酸ｎ−ブチルで（例えば、圧力濾過器で）洗浄される。別の実施形態において、この圧力濾過器は不活性である。この結晶性の生成物は、減圧下約６０℃で乾燥させられる。１つの実施形態において、得られた結晶オベチコール酸は、有機溶媒（例えば、ヘプタン）から単離される。結晶オベチコール酸形態Ｃの同定および特徴付けに関する全詳細については、実施例３を参照のこと。
【００６９】
工程７
工程７は、結晶オベチコール酸形態Ｃのオベチコール酸形態１への変換である。１つの実施形態において、工程７は、結晶オベチコール酸形態ＣをＮａＯＨ水溶液に溶解させ、そしてＨＣｌを添加する工程を包含する。
【００７０】
１つの実施形態において、結晶オベチコール酸は、水と苛性ソーダとの溶液（５０重量％）に約２０℃〜約５０℃で溶解させられる。１つの実施形態において、この温度は約３０℃〜約４０℃である。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｃである。１つの実施形態において、この得られた結晶オベチコール酸形態Ｃの溶液は、希酸に約２０℃〜約５０℃で添加される。別の実施形態において、この温度は約３０℃〜約４０℃である。別の実施形態において、この酸は塩酸（例えば、３７％）である。１つの実施形態において、この３７％の塩酸溶液は、約１体積％未満まで水で希釈される。１つの実施形態において、この３７％の塩酸溶液は、約０．７体積％まで水で希釈される。１つの実施形態において、この希酸中の生成物の懸濁物は、約２０℃〜約５０℃で約３０分間撹拌される。別の実施形態において、この温度は約３０℃〜約４０℃である。１つの実施形態において、オベチコール酸形態１が単離され、そして水（例えば、圧力濾過器）でＮＭＴ約２０℃で洗浄される。１つの実施形態において、オベチコール酸形態１が単離され、そして水（例えば、圧力濾過器）でＮＭＴ約２０℃で洗浄される。別の実施形態において、この圧力濾過器は不活性である。この生成物は、圧力濾過器で減圧下ＮＭＴ約５０℃の温度で乾燥させられる。
【００７１】
本願のプロセスは、オベチコール酸形態１の調製において、結晶性の中間体を利用する。この利用は、予期せずに、全体の調製および最終生成物の純度に、著しい改善をもたらした。具体的には、この合成の工程６は、オベチコール酸の新規な結晶形態を生成する。この結晶形態の生成は、実質的に純粋なオベチコール酸形態１をもたらす。
【００７２】
本願のプロセスは、先行技術に開示されるプロセスに対する改善である。オベチコール酸の調製は、米国特許出願公開第２００９／００６２５２６  Ａ１号（本明細書中で「’５２６号公開」と称される）、米国特許第７，１３８，３９０号（本明細書中で「’３９０号特許」と称される）、およびＷＯ２００６／１２２９７７（本明細書中で「’９７７号出願」と称される）に開示されている。
【００７３】
’３９０号特許におけるオベチコール酸を調製するプロセス（本明細書中で「’３９０のプロセス」と称される）を、スキーム３（Ｒはエチルである）に図示する：
【００７４】
【化５】
2020125317.tif 000007
【００７５】
このプロセスは数工程を含むものであるが、一連の重大な欠点を提示している。これらの工程の全てにおいて、反応生成物がクロマトグラフィーカラム（すなわち、工業スケールでは使用できない非常に高価な分離法）で精製される。さらに、工程２における反応収率が極めて低く（１２％〜１３％）、全体の収率をかなり低下させ、これは３．５％未満である。このプロセスはまた、ヘキサメチレンホスホンアミドを反応剤として使用し、これは、発がん性の試剤であることが公知である。
【００７６】
’９７７出願におけるオベチコール酸を調製するプロセスをスキーム４に図示する。
【００７７】
【化６】
2020125317.tif 000008
【００７８】
オベチコール酸を調製するための’９７７のプロセスは、８工程の合成プロセスであり、１回の精製工程（工程７）、およびその後のさらに２回の精製工程を包含する。’９７７のプロセスと本願のプロセスとの間には、著しい数の違いがある。以下の表Ａには、これらの２つのプロセス間の違いのうちの少なくとも数個を記載する：
【００７９】
【表１Ａ】
2020125317.tif 000009
【００８０】
’９７７のプロセスと比較した場合の本願のプロセスの違いは、そのプロセスの著しい複数の改善をもたらし、これには、スケールアップの最適化および安全性に関する改善、ならびに純度およびプロセス全体の改善が挙げられる。本願のプロセスにより製造されるオベチコール酸の純度は、実質的に純粋である。具体的には、本願のプロセスにより製造されるオベチコール酸は、先行技術のプロセス（’３９０のプロセスおよび’９７７のプロセスが挙げられる）によって製造されるオベチコール酸よりも著しく純粋である。例えば、本願のプロセスによって製造されたオベチコール酸と’９７７のプロセスによって製造されたオベチコール酸との、分析の証明書に提示される結果の比較を、以下の表Ｂに示す。不純物の百分率を、ＨＰＬＣ法を使用して決定した。
【００８１】
【表１Ｂ】
2020125317.tif 000010
【００８２】
不純物１は６−エチルウルソデオキシコール酸（６−ｅｔｈｙｌｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である。
不純物２は３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（３α−ｈｙｄｒｏｘｙ−６α−ｅｔｈｙｌ−７−ｃｈｅｔｏ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）である。
不純物３は６β−エチルケノデオキシコール酸（６β−ｅｔｈｙｌｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である。
不純物４は３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸（３α，７α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｅｔｈｙｌｉｄｅｎ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）である。
不純物５はケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である。
不純物６は３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸（３α（３α，７α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６α−ｅｔｈｙｌ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｙｌｏｘｙ）−７α−ｈｙｄｒｏｘｙ−６α−ｅｔｈｙｌ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）（６ＥＣＤＣＡ二量体）である。
ＮＭＴは「以下（ｎｏｔ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）」のことをいう。
【００８３】
合成中間体としての結晶オベチコール酸
オベチコール酸は現在、医薬品有効成分として、非結晶性固体として開発されている。オベチコール酸の開発を促進する目的で、初期の結晶化および多形の研究が、結晶形態が手に入れやすいか否か、そしてそうであれば、開発に適切であるか否かを決定する目的で、行われた。種々の溶媒中でのこの物質の挙動のより良い理解を与えるために設計された、予備的な溶解度スクリーニングの後に、この物質は、ゲルを形成する傾向を有し、そしておそらく結晶化し得ないと考えられた。次いで、広範な多形スクリーニングが行われ、可能な限り多くの関連する多形を同定および特徴付けする目的で、この物質を、より広範囲の溶媒および結晶化条件に曝（さら）した。このスクリーニング中に、５つの異なる固体形態が見出された。
【００８４】
オベチコール酸の３つの形態（Ａ、Ｃ、およびＤ）は、０．２５  モル当量（ｍｏｌ  ｅｑ）の水および様々な量のある範囲の有機溶媒を含む、混合水和物／溶媒和物であった。加熱すると、これらの固体は結晶性を失い、そして同時に溶媒を失い、そして不運なことに、これらの溶媒和形態は、それらの低い融解温度および高い溶媒含有量に起因して、医薬品成分としてのさらなる開発に不適切であった。この種の類似した「不適切な」形態が複数存在することもまた注目される。例えば、低融点の溶媒和形態および別の形態の単結晶が、後の実験において見出され、この別の形態の単結晶は、ＳＣＸＲＤ（単結晶Ｘ線回折）により、一水和物／アニソール溶媒和物であることが示された。
【００８５】
残りの２つの形態は、より高温で融解し、そして潜在的により有望であったが、これらのうちの一方（形態Ｇ）は、スケールアップすると再現性がなく、多くの試みにもかかわらず反復不可能であった。この形態を単独で生成することの困難は、この形態を開発に不適切にする。残りの非溶媒和形態Ｆは、再現性よく調製されたが、大規模な再結晶手順およびニトロメタンの使用を必要とする。ニトロメタンは、毒性溶媒であり、そしてアミン、アルカリ、強酸、または高温もしくは断熱圧縮により感作される場合に、爆発し得る。ニトロメタンの残留レベルに関する懸念により、形態Ｆもまた、開発に不適切であるとみなされた。
【００８６】
初期の結晶化および多形の研究の全体の結果は、この物質が種々の形態の結晶性物質を形成し得ることを明らかにしたが、これらの結晶性物質または結晶性形態のいずれも、開発に適切であるとはみなされなかった。
【００８７】
かなり後になって初めて、結晶オベチコール酸を本願のプロセスの最後から２番目の工程における中間体として生成することの重要性が発見された。結晶オベチコール酸は、本願のプロセスを使用して、大スケールで容易に単離され得る。この結晶オベチコール酸は、初期の結晶化および多形の研究から、形態Ｃと一致することが決定された。その形成、単離の容易さ、および本願のプロセスの工程７における合成中間体として生成された非常に純粋な結晶オベチコール酸は実際に、実質的に純粋なオベチコール酸の調製のために重要である。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明は、約４．２°、約６．４°、約９．５°、約１２．５°、および約１６．７°の２θに固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃに関する。１つの実施形態において、このＸ線回折パターンは、約４．２°、約６．４°、約９．５°、約１２．５°、約１２．６°、約１５．５°、約１５．８°、約１６．０°、約１６．７°および約１９．０°の２θに固有ピークを含む。１つの実施形態において、このＸ線回折パターンは、約４．２°、約６．４°、約８．３°、約９．５°、約１１．１°、約１２．２°、約１２．５°、約１２．６°、約１５．５°、約１５．８°、約１６．０°、約１６．３°、約１６．７°、約１８．６°および約１９．０°の２θに固有ピークを含む。１つの実施形態において、このＸ線回折パターンは、約４．２°、約６．４°、約８．３°、約９．５°、約１１．１°、約１２．２°、約１２．５°、約１２．６°、約１５．５°、約１５．８°、約１６．０°、約１６．３°、約１６．７°、約１７．０°、約１７．８°、約１８．６°、約１８．８°、約１９．０°、約２０．５°および約２０．９°の２θに固有ピークを含む。１つの実施形態において、本発明は、図５に記載されるものと実質的に同様なＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃに関する。１つの実施形態において、このＸ線回折パターンは、ＣｕＫα放射線を使用する回折計（４０ｋＶ，４０ｍＡ）で収集される。１つの実施形態において、このＸ線回折パターンは、約１２．０〜約１２．８および約１５．４〜約２１．０に固有ピークを含む。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２３ｅ機器によって測定される場合に、約９８±２℃に吸熱点の値を有する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃに関する。１つの実施形態において、この示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムは、Ｍｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２３ｅ機器によって測定される場合に、約９８±２℃に吸熱点の値を有する。
【００９０】
１つの実施形態において、本発明は、結晶オベチコール酸に関し、ここでこの結晶オベチコール酸は形態Ｃであり、そして約９０％より高い純度を有する。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸形態Ｃの純度は、ＨＰＬＣによって決定される。１つの実施形態において、本発明は、結晶オベチコール酸形態Ｃ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体に関する。１つの実施形態において、この溶媒和物は水和物である。１つの実施形態において、この純度は約９２％より高い。１つの実施形態において、この純度は約９４％より高い。１つの実施形態において、この純度は約９６％より高い。１つの実施形態において、この純度は約９８％より高い。１つの実施形態において、この純度は約９９％より高い。
【００９１】
１つの実施形態において、本発明は、結晶オベチコール酸に関し、ここでこの結晶オベチコール酸は形態Ｃであり、そして約９０％より高い力価を有する。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸形態Ｃの純度は、ＨＰＬＣおよび／または当該技術分野において公知である他の分析手順によって決定される。１つの実施形態において、本発明は、結晶オベチコール酸形態Ｃ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体に関する。１つの実施形態において、この溶媒和物は水和物である。１つの実施形態において、この力価は約９２％より高い。１つの実施形態において、この力価は約９４％より高い。１つの実施形態において、この力価は約９６％より高い。１つの実施形態において、この力価は約９８％より高い。１つの実施形態において、この力価は約９９％より高い。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明は、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される、合計約４％未満の１種または１種より多くの不純物を含有する、結晶オベチコール酸形態Ｃに関する。１つの実施形態において、合計の不純物は、約３．８％未満である。１つの実施形態において、合計の不純物は、約３．６％未満である。
【００９３】
本願の実施例３は、オベチコール酸のこの新規な結晶形態に関する完全な特性評価を提供する。
【００９４】
オベチコール酸の単結晶Ｘ線構造が得られ、そしてその絶対立体化学構造を決定した。例えば、結晶オベチコール酸形態Ｇの単結晶Ｘ線構造は、アセトニトリル溶液からのオベチコール酸の再結晶によって得られた結晶から決定し、該再結晶は、５℃まで０．１℃／分で冷却し、その後、ＲＴ／５０℃で８時間の成熟化のサイクルを１週間行った。
【００９５】
その構造は、斜方晶系の空間群Ｐ２１２１２１であり、そしてその非対称単位に１分子のオベチコール酸を含む。最終Ｒ１［Ｉ＞２σ（Ｉ）］＝３．２２％。この分子の絶対立体化学を、Ｆｌａｃｋパラメータ＝−０．０１（１３）を用いて以下に示すように決定した。この構造は、ディスオーダー（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を有さなかった。
【００９６】
【化７】
2020125317.tif 000011
【００９７】
結晶オベチコール酸形態Ｆとオベチコール酸形態１（非結晶性）を対比した生物学的利用率（Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）の研究を行った（実施例７）。この研究の結果は、固体のオベチコール酸の物理的状態が、被験体に経口投与される場合に、この分子の生物学的利用率に影響を及ぼし得ることを示す。固体のオベチコール酸形態１（非結晶性）および結晶形態Ｆの、経口投与後の血漿中動態ならびに腸吸収の効率および薬物動態を当該技術分野において公知である方法に従って評価した。本発明の実施例８は、オベチコール酸の形態１または形態Ｆの投与後の、時間に対するオベチコール酸の血漿中濃度のプロフィール、ｔｍａｘ、ＣｍａｘおよびＡＵＣを示す（図３７〜図３８を参照のこと）。結晶形態Ｆは、オベチコール酸形態１（非結晶性）より高い生物学的利用率を有する。この血漿中プロフィールは、形態Ｆがより効率的に吸収され（より高いＡＵＣ）、そして動態もより規則的でさえあることを示す。このことは、腸の内容物における薬物の最適な分布を反映する。
【００９８】
オベチコール酸形態１（非結晶性）の水への溶解度は、形態Ｆの水への溶解度よりわずかに高い。形態Ｆは、安定であるようである。なぜなら、熱重量分析（ＴＧＡ）が、研究された温度範囲内でいかなる重量減少も示さなかったからである。
【００９９】
実質的に純粋なオベチコール酸
本願は、実質的に純粋なオベチコール酸およびその薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはアミノ酸結合体：
【０１００】
【化８】
2020125317.tif 000012
【０１０１】
を提供する。
【０１０２】
薬学的に活性な成分であるオベチコール酸の他の名称は、ＩＮＴ−７４７，３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸（３α，７α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６α−ｅｔｈｙｌ−５β−ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ）、６α−エチル−ケノデオキシコール酸（６α−ｅｔｈｙｌ−ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、６−エチル−ＣＤＣＡ、６ＥＣＤＣＡ、およびコラン−２４−酸，６−エチル−３，７−ジヒドロキシ−，（３α，５β，６α，７α）−（ｃｈｏｌａｎ−２４−ｏｉｃ  ａｃｉｄ，６−ｅｔｈｙｌ−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−，（３α，５β，６α，７α）−）である。
【０１０３】
本願は、オベチコール酸形態１を含有する組成物、および安全かつオベチコール酸を大スケールで製造する、非常に純粋なオベチコール酸形態１の合成のプロセスを提供する。１つの局面において、オベチコール酸形態１は、市販規模のプロセスで製造される。用語「市販規模のプロセス」とは、少なくとも約１００グラムの単一バッチで実行されるプロセスをいう。１つの局面において、本願のプロセスは、オベチコール酸形態１を、高い収率で（＞８０％）、かつ不純物を制限して製造する。
【０１０４】
用語「純度」とは、本明細書中で使用される場合、ＨＰＬＣに基づくオベチコール酸の量をいう。純度は、化合物の「有機」純度に基づく。純度は、いかなる量の水、溶媒、金属、無機塩などの測定値も含まない。１つの局面において、オベチコール酸の純度は、ピーク下面積（ｔｈｅ  ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｐｅａｋ）を比較することによって、参照標準物質の純度と比較される。別の局面において、純度についての公知の標準物質は、オベチコール酸参照標準物質である。１つの局面において、オベチコール酸は、約９６％より高い純度を有する。１つの局面において、オベチコール酸は、約９８％より高い純度を有する。例えば、オベチコール酸形態１の純度は、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。例えば、オベチコール酸形態１の純度は、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の純度は、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の純度は、９８．５％、９９．０％、または９９．５％である。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明は、約９８％より高い純度を有するオベチコール酸に関する。１つの実施形態において、この純度は、ＨＰＬＣによって決定される。別の実施形態において、本発明は、オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体に関する。１つの実施形態において、この純度は約９８．５％より高い。１つの実施形態において、この純度は約９９．０％より高い。１つの実施形態において、この純度は約９９．５％より高い。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０６】
用語「力価」は、本明細書中で使用される場合、公知の標準物質の量に基づく、オベチコール酸の量の測定値（例えば、約９５％〜約１０２％の合格判定基準）である。力価は、水、溶媒、有機不純物、および無機不純物を含めた、全ての可能性のある不純物を考慮に入れる。１つの局面において、公知の標準物質はオベチコール酸である。１つの局面において、オベチコール酸は、約９６％より高い力価を有する。１つの局面において、オベチコール酸は、約９８％より高い力価を有する。１つの局面において、公知の標準物質はオベチコール酸である。別の局面において、力価は、１００％から、水、硫酸塩灰分、残留溶媒、ならびに他の不純物内容物（例えば、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸）の量を引いたものである。別の実施形態において、力価は、水、溶媒、金属、無機塩、および他の無機不純物または有機不純物に起因する不純物を考慮に入れる。例えば、オベチコール酸形態１の力価は、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。１つの局面において、オベチコール酸形態１の力価は、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の力価は、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。例えば、オベチコール酸の力価は、９８．５％、９９．０％、または９９．５％である。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０７】
１つの実施形態において、本発明は、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される、合計約２％未満の１種または１種より多くの不純物を含む、オベチコール酸に関する。１つの実施形態において、不純物の合計は、約１．５％未満である。１つの実施形態において、不純物の合計は、約１．４％未満である。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０８】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、約１０％未満の水、約９％未満の水、８％未満の水、７％未満の水、６％未満の水、５％未満の水、４％未満の水、３％未満の水、２％未満の水、または約１％未満の水を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約１．２％未満の水を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約１．０％未満の水を含む。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１０９】
別の実施形態において、オベチコール酸は、０．１５％以下（ＮＭＴ０．１５％）の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む。別の実施形態において、オベチコール酸は、合計約０．０７％未満の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、合計約０．０６％未満の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、合計約０．０５％未満の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１０】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、０．１５％以下（ＮＭＴ０．１５％）の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０７％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０６％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０５％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１１】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、０．１５％以下（ＮＭＴ０．１５％）の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０７％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０６％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０５％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１２】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、３％以下（ＮＭＴ３％）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約１％未満のＣＤＣＡを含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．５％未満のＣＤＣＡを含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．３％未満のＣＤＣＡを含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．２％未満のＣＤＣＡを含む。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１３】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、４％以下（ＮＭＴ４％）のＣＤＣＡおよび６−エチルウルソデオキシコール酸を含む。
【０１１４】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、１．５％以下（ＮＭＴ１．５％）の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約１％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０７％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０６％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、オベチコール酸は、約０．０５％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む。１つの実施形態において、このオベチコール酸は、オベチコール酸形態１である。
【０１１５】
経口製剤および投与
オベチコール酸は、経口投与に用いられるものである。１つの実施形態において、この製剤は、ＦＸＲにより媒介される疾患および状態の予防および治療のための、経口投与となる。１つの実施形態において、この製剤は、オベチコール酸形態１を含む。別の実施形態において、この製剤は、実質的に純粋なオベチコール酸を含む。
【０１１６】
経口投与に適した製剤は、各々が所定の量のオベチコール酸を含む個別の単位（例えば、錠剤、カプセル剤、カシェ剤（薬物を提示するために薬剤師によって使用されるウエハカプセル）、ロゼンジ）として；散剤または顆粒剤として；水性または非水性の液体中の液剤または懸濁剤として；あるいは水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンとして、提供され得る。
【０１１７】
本発明の製剤は、任意の適切な方法によって、典型的には、オベチコール酸を、液体もしくは微細に分割された固体キャリアまたはこれらの両方と、必要とされる割合で均一に密接に混合し、次いで必要であれば、得られた混合物を所望の形状に形成することによって、調製され得る。
【０１１８】
例えば、錠剤は、オベチコール酸の粉末または顆粒および１種または１種より多くの任意の成分（例えば、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、または界面活性分散剤）を含む密接な混合物を圧縮することによって、あるいは粉末化された活性成分と不活性液体希釈剤との密接な混合物を成形することによって、調製され得る。
【０１１９】
例えば、１個または１個より多くの錠剤が、被験体の体重（例えば、約３０ｋｇ〜約７０ｋｇのヒト）に基づく目標用量レベルに達するために投与され得る。
【０１２０】
１つの実施形態において、この被験体は小児であり、そしてこの製剤は、胆道閉鎖症を治療するために使用される。胆道閉鎖症（「肝外胆管減少症（ｅｘｔｒａｈｅｐａｔｉｃ
ｄｕｃｔｏｐｅｎｉａ）」および「進行性閉塞性胆管症」としても公知）は、肝臓の先天性または後天性の疾患であり、そして移植された肝臓同種移植片の慢性拒絶の主要な形態のうちの１つである。先天性の形態において、肝臓と小腸との間の総胆管が遮断されているかまたは存在しない。後天性の型は、最も頻繁には、自己免疫疾患の背景で起こり、そして移植された肝臓同種移植片の慢性拒絶の主要な形態のうちの１つである。
【０１２１】
胆道閉鎖症を罹患する乳児および小児は、進行性胆汁うっ滞を有し、全ての通常の随伴特徴、すなわち、黄疸、そう痒、成長の遅延を伴う吸収不良、脂溶性ビタミン欠乏症、高脂質血症、および最終的に、門脈圧亢進症を伴う肝硬変症を伴う。認識されない場合、その状態は、肝不全をもたらすが、核黄疸をもたらさない。なぜなら、肝臓は依然として、ビリルビンを結合することが可能であり、そして結合したビリルビンは、血液脳関門を通ることができないからである。この状態の原因は未解明である。唯一の有効な治療は、葛西手術などの特定の外科手術、または肝臓移植である。
【０１２２】
１つの実施形態において、ヒト小児が、葛西手術を施されている。この場合、葛西手術は、胆管を有さずに生まれたか、または誕生時に胆管が完全に遮断されていた場合、これらの小児に、機能的な胆管を効果的に与える。
【０１２３】
上記に具体的に述べた成分に加えて、本発明の経口製剤は、対象となる製剤の剤型を考慮して、薬学の当業者にとって公知である他の剤を含有し得る。適切な経口製剤は、矯味矯臭剤を含有し得る。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明は、オベチコール酸またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体の医薬製剤に関し、ここでオベチコール酸は、本発明のプロセスによって製造される（オベチコール酸形態１）。別の実施形態において、この製剤は経口投与される。
【０１２５】
１つの実施形態において、この製剤は錠剤の形態である。別の実施形態において、この製剤は、オベチコール酸に加え、微結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、コーティング材料、またはコロイド状二酸化ケイ素から選択される１つまたは１つより多くの成分を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１２６】
別の実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇのオベチコール酸を含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約５０ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約３０ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約４ｍｇ〜約２６ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約５ｍｇ〜約２５ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約２ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．２ｍｇ〜約１．８ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．３ｍｇ〜約１．７ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．５ｍｇを含有する。
【０１２７】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約１ｍｇのオベチコール酸、約１８０〜約１９０ｍｇの微結晶セルロース、約１０〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約５ｍｇ〜約１０ｍｇのコーティング材料を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１２８】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約１ｍｇのオベチコール酸、約１８５．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約８．０ｍｇのコーティング材料を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１２９】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約５ｍｇのオベチコール酸、約１７５〜約１９０ｍｇの微結晶セルロース、約１０〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約５ｍｇ〜約１０ｍｇのコーティング材料を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３０】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約５ｍｇのオベチコール酸、約１８１．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約８．０ｍｇのコーティング材料を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３１】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約１０ｍｇのオベチコール酸、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの微結晶セルロース、約１０ｍｇ〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１ｍｇ〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約５ｍｇ〜約１０ｍｇのコーティング材料を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３２】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約１０ｍｇのオベチコール酸、約１７６．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、および約８．０ｍｇのコーティング材料を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３３】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約２５ｍｇのオベチコール酸、約１５０ｍｇ〜約１６０ｍｇの微結晶セルロース、約１０ｍｇ〜約１５ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約１ｍｇ〜約３ｍｇのステアリン酸マグネシウム、約５〜約１０ｍｇのコーティング材料、および約１〜約１０ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３４】
１つの実施形態において、この製剤は、１個の錠剤あたり約１ｍｇ〜約２５ｍｇのオベチコール酸を含む。１つの実施形態において、この製剤は、約２５ｍｇのオベチコール酸、約１５７．０ｍｇの微結晶セルロース、約１２．０ｍｇのデンプングリコール酸ナトリウム、約２．０ｍｇのステアリン酸マグネシウム、約８．０ｍｇのコーティング材料、および約４．０ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素を含有する。１つの実施形態において、このコーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【０１３５】
本明細書中で使用される全ての百分率および比は、別段の記載がない限りは、重量基準である。二量体不純物の百分率は、典型的に、分析用ＨＰＬＣによって定量されるような、面積百分率基準である。
【０１３６】
本明細書全体にわたって、組成物が、特定の成分を有する、含む、または含有すると記載される場合、組成物はまた、記載される成分から本質的に構成されるか、または記載される成分から構成されることが概念に含まれる。同様に、方法またはプロセスが、特定のプロセス工程を有する、含む、または包含すると記載される場合、そのプロセスはまた、記載されるプロセス工程から本質的に構成されるか、または記載されるプロセス工程から構成される。さらに、工程の順序、または特定の行為を行う順序は、本発明が実施可能である限り、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２つまたは２つより多くの工程または行為は、同時に行われ得る。
【０１３７】
【表１Ｂ−２】
2020125317.tif 000013
【０１３８】
ＡＰＩ：医薬品有効成分
ＨＳＥ＝社内仕様書
ＵＳＰ−ＮＦ＝米国薬局方国民医薬品集
Ｐｈ  Ｅｕｒ＝欧州薬局方
ＪＰ＝日本薬局方
＊提示されたオベチコール酸の量は、ＡＰＩが無水物であり１００％純粋であると仮定している。実際の量は、使用される製剤原料ロットの力価に基づいて調整され、そしてこれに対応して、微結晶セルロースの量が減少される。
【０１３９】
１つの実施形態において、この錠剤は、黄色Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）を含有する。別の実施形態において、この錠剤は、白色Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）を含有する。別の実施形態において、この錠剤は、緑色Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）を含有する。
【０１４０】
薬学的組成物
オベチコール酸（オベチコール酸形態１、オベチコール酸の実質的に純粋な形態、およびオベチコール酸の結晶形態が含まれる）、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体は、種々の医療目的に有用である。オベチコール酸は、ＦＸＲにより媒介される疾患および状態の予防または治療の方法において使用され得る。１つの実施形態において、この疾患または状態は、胆道閉鎖症、胆汁うっ滞性肝臓疾患、慢性肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝臓疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、進行性線維症に起因する肝臓損傷、肝線維症、ならびに心臓血管疾患（アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症、および高脂質血症が含まれる）から選択される。１つの実施形態において、オベチコール酸形態１は、トリグリセリドを低下させる方法において使用され得る。１つの実施形態において、結晶オベチコール酸は、トリグリセリドを低下させる方法において使用され得る。オベチコール酸形態１または結晶オベチコール酸は、ＨＤＬを増大させ得る。オベチコール酸形態１または結晶オベチコール酸の他の効果としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＧＧＴの低下が挙げられる。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明は、オベチコール酸および薬学的に許容されるキャリアを含有する薬学的組成物に関し、ここでこのオベチコール酸は、本発明のプロセスによって製造される（例えば、オベチコール酸形態１）。１つの実施形態において、この薬学的組成物は、実質的に純粋なオベチコール酸および薬学的に許容されるキャリアからなる。別の実施形態において、この薬学的組成物は、結晶オベチコール酸および薬学的に許容されるキャリアからなる。別の実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｃである。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明は、被験体において、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態を治療または予防する方法に関し、この方法は、本発明のプロセスにより生成された有効量のオベチコール酸形態１またはその薬学的組成物を投与する工程を包含する。１つの実施形態において、本発明は、被験体において、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態を治療または予防する方法に関し、この方法は、本発明のプロセスにより製造された有効量の実質的に純粋なオベチコール酸またはその薬学的組成物を投与する工程を包含する。１つの実施形態において、本発明は、被験体において、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態を治療または予防する方法に関し、この方法は、有効量の結晶オベチコール酸またはその薬学的組成物を投与する工程を包含する。別の実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｃである。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ａである。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｃである。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｄである。１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｆは１つの実施形態において、この結晶オベチコール酸は形態Ｇである。
【０１４３】
別の実施形態において、この疾患または状態は、心臓血管疾患または胆汁うっ滞性肝臓疾患であり、そしてトリグリセリドを低下させるためである。別の実施形態において、この心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症である。別の実施形態において、この被験体は哺乳動物である。別の実施形態において、この哺乳動物はヒトである。
【０１４４】
別の実施形態において、化合物または薬学的組成物は、経口投与、非経口投与、または局所投与される。別の実施形態において、化合物または薬学的組成物は、経口投与される。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明は、胆汁うっ滞状態を罹患する被験体において、線維症を阻害する方法に関し、この方法は、この被験体に、有効量のオベチコール酸またはその薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここでオベチコール酸は、本発明のプロセスによって製造される。１つの実施形態において、本発明は、胆汁うっ滞状態を罹患しない被験体において、線維症を阻害する方法に関し、この方法は、この被験体に、有効量のオベチコール酸またはその薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここでオベチコール酸は、本発明のプロセスによって製造される。ある実施形態において、阻害されるべき線維症は、ＦＸＲが発現される器官において発症する。
【０１４６】
１つの実施形態において、この胆汁うっ滞状態は、アルカリホスファターゼ、７−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、および５’ヌクレオチダーゼの異常に上昇した血清レベルを有するとして定義される。別の実施形態において、この胆汁うっ滞状態はさらに、少なくとも１つの臨床症状を呈するとして定義される。別の実施形態において、この症状は、痒み（そう痒）である。別の実施形態において、線維症は、肝線維症、腎線維症、および腸線維症からなる群より選択される。別の実施形態において、この胆汁うっ滞状態は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、薬物性胆汁うっ滞、遺伝性胆汁うっ滞、および妊娠性肝内胆汁うっ滞からなる群より選択される。別の実施形態において、この被験体は、原発性の肝臓がんおよび胆管がん、転移性がん、敗血症、慢性完全非経口栄養法、嚢胞性線維症、ならびに肉芽腫性肝臓疾患からなる群より選択される疾患または状態に関連する胆汁うっ滞状態を罹患していない。
【０１４７】
別の実施形態において、この被験体は、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；寄生虫性肝臓疾患；移植後の細菌感染、ウイルス感染および真菌感染；アルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン（ｏｘｙｐｈｅｎｉｓｔａｔｉｎ）、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミド、またはアミオダロンにより誘導される肝臓疾患；自己免疫性肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ型、ＩＶ型、ＶＩ型、ＩＸ型およびＸ型の糖原病；α１−アンチトリプシン欠損症；ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症；果糖血症；ガラクトース血症；バッド−キアーリ症候群、静脈閉塞病、または門脈血栓症に関連する脈管障害；ならびに先天性肝線維症からなる群より選択される疾患に関連する肝線維症を有する。
【０１４８】
別の実施形態において、この被験体は、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射後発生性大腸炎、および微視的大腸炎からなる群より選択される疾患に関連する腸線維症を有する。
【０１４９】
別の実施形態において、この被験体は、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体炎、慢性間質性腎炎、および多嚢胞性腎疾患からなる群より選択される疾患に関連する腎線維症を有する。
【０１５０】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語が、ここにまとめられる。
【０１５１】
本明細書中で使用される場合、用語「オベチコール酸」または「ＯＣＡ」とは、化学構造：
【０１５２】
【化９】
2020125317.tif 000014
【０１５３】
を有する化合物をいう。オベチコール酸の他の化学名としては、３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸、６α−エチル−ケノデオキシコール酸、６−エチル−ＣＤＣＡ、６ＥＣＤＣＡ、コラン−２４−酸，６−エチル−３，７−ジヒドロキシ−，（３α，５β，６α，７α）−およびＩＮＴ−７４７が挙げられる。オベチコール酸についてのＣＡＳ登録番号は、４５９７８９−９９−２である。この用語は、オベチコール酸の全ての形態（例えば、非結晶性、結晶性および実質的に純粋）をいう。
【０１５４】
本明細書中で使用される場合、用語「結晶オベチコール酸」とは、化学構造：
【０１５５】
【化１０】
2020125317.tif 000015
【０１５６】
を有する化合物の任意の結晶形態をいう。結晶オベチコール酸とは、この化合物が三次元空間で特定の結晶充填配置をとって結晶化していること、または外部面平面（externalfaceplanes）を有する化合物を意味する。オベチコール酸（またはその薬学的に許容される塩、アミノ酸結合体、溶媒和物）の結晶形態は、異なる結晶充填配置をとって結晶化することがあり得、これらの全ては、オベチコール酸について同じ元素組成を有する。異なる結晶形態は通常、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度硬度、結晶の形状、光学特性および電子特性、安定性ならびに溶解度を有する。再結晶溶媒、結晶化の速度、保存温度、および他の要因が、１つの結晶形態を優勢に生じさせ得る。オベチコール酸の結晶は、異なる条件下（例えば、異なる溶媒、温度など）での結晶化によって、調製され得る。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、用語「結晶オベチコール酸形態Ｃ」とは、図５に記載されるものと実質的に同様なＸ線回折パターンを有するオベチコール酸の結晶形態、例えば、実施例３において特徴付けられるような結晶形態をいう。
【０１５８】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に純粋なオベチコール酸」とは、約９５％より高い力価を有するオベチコール酸をいう。オベチコール酸の力価は、オベチコール酸のサンプル中に存在する不純物（例えば、水、溶媒、ならびに他の有機不純物および無機不純物が含まれる）を考慮に入れる。別の実施形態において、力価についての公知の標準物質は、１００％オベチコール酸であり、そしてこの力価は、溶媒、水、ならびに他の有機不純物および無機不純物といった不純物の百分率を、この公知の標準物質の１００％から差し引くことによって決定される。１つの局面において、無機不純物としては、例えば、無機塩および硫酸塩灰分が含まれる。１つの局面において、有機不純物としては、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸，、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸が含まれる。不純物の量は、当該技術分野において公知である手順（例えば、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ）または米国薬局方もしくは欧州薬局方からの方法、あるいはこれらの方法のうちの２つまたは２つより多くの組み合わせによって決定され得る。
【０１５９】
本明細書中で使用される場合、用語「純度」とは、例えばＨＰＬＣから得られる、化合物の化学分析をいう。１つの実施形態において、ある化合物の純度は、参照標準物質（例えば、オベチコール酸）の純度と、比較のためのこれらそれぞれのピーク下面積を用いて、比較される。１つの実施形態において、純度は、サンプル中の有機不純物を考慮に入れる。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、用語「反応混合物」とは、一緒に混ぜ合わせられた１種または１種より多くの物質の混合物をいう。１つの実施形態において、物質の混合または混ぜ合わせることは、元の物質のうちの１つまたは１つより多くのものに化学変換または変化を引き起こす。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、用語「オベチコール酸形態１」とは、非結晶オベチコール酸をいう。１つの実施形態において、この形態のオベチコール酸は、合成中間体としての結晶オベチコール酸を介して製造される。例えば、この形態のオベチコール酸は、本願のプロセスによって、合成中間体としての結晶オベチコール酸形態Ｃを介して製造される。１つの実施形態において、オベチコール酸形態１は、薬学的に活性な成分として使用される形態である。さらなる詳細については実施例５を参照のこと。
【０１６２】
「治療する」は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす任意の効果（例えば、減少させる、低下させる、調節する、または排除する）を包含する。疾患状態を「治療する」または疾患状態の「治療」としては、疾患状態を阻害すること、すなわち、疾患状態またはその臨床症状の進行を止めること、あるいは疾患状態を軽減すること、すなわち、疾患状態またはその臨床症状の一時的または永続的な後退を引き起こすことが挙げられる。
【０１６３】
疾患状態を「予防する」ことは、疾患状態の臨床症状を、その疾患状態に曝される可能性があるか、または罹患しやすい状態にあるが、その疾患状態の症状を未だ経験せず、または示していない被験体において発症しないようにすることを包含する。
【０１６４】
「疾患状態」とは、任意の疾患、障害、状態、症状、または適応症を意味する。
【０１６５】
用語「有効量」とは、本明細書中で使用される場合、適切な用量での投与の際に、急性または慢性の治療効果を生じる、オベチコール酸（例えば、ＦＸＲ活性化リガンド）の量をいう。この効果としては、疾患／状態（例えば、肝臓、腎臓、または腸の線維症）および関連する合併症の症状、兆候および基礎にある病理の、検出可能な程度までの予防、矯正、阻害、または逆転が挙げられる。
【０１６６】
「治療有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物に投与される場合に、その疾患のそのような治療をもたらすために充分である、オベチコール酸の量を意味する。「治療有効量」は、オベチコール酸、疾患およびその重篤度、ならびに治療されるべき哺乳動物の年齢、体重などに依存して変わってくるであろう。
【０１６７】
治療有効量のオベチコール酸は、ヒトまたは動物への投与のために、薬学的に受容可能なキャリアと一緒に処方され得る。従って、オベチコール酸またはその製剤は、有効量の化合物を提供するために、例えば、経口経路、非経口経路、または局所経路で投与され得る。代替的な実施形態において、本発明に従って調製されたオベチコール酸は、医療デバイス（例えば、ステント）をコーティングまたは含浸するために使用され得る。
【０１６８】
「薬理効果」は、本明細書中で使用される場合、被験体において生じる、意図される治療目的を達成する効果を包含する。１つの実施形態において、薬理効果とは、治療される被験体の主要な適応症が、予防されるか、軽減されるか、または減少されることを意味する。例えば、薬理効果は、治療される被験体における主要な適応症の予防、軽減または減少をもたらすものである。別の実施形態において、薬理効果とは、治療される被験体の主要な適応症の障害または症状が、予防されるか、軽減されるか、または減少されることを意味する。例えば、薬理効果は、治療される被験体における主要な適応症の予防または減少をもたらすものである。
【０１６９】
本発明はまた、同位体標識されたオベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体を包含する。これらは、１個または１個より多くの原子が、天然に最も一般的に見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられているという事実以外は、本発明の式および以下に記載されるものと同一である。オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、フッ素の同位体（例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃおよび１８Ｆ）が挙げられる。
【０１７０】
上記同位体および／または他の原子の他の同位体を含む、オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体は、本発明の範囲内である。例えば３Ｈ、１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれている、同位体標識されたオベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体は、薬物および／または基質の組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化（すなわち３Ｈ）および炭素−１４（すなわち１４Ｃ）同位体は、それらの調製の容易さおよび検出可能性に起因して、特に好ましい。さらに、ジュウテリウム（すなわち２Ｈ）などの重い同位体での置換は、より大きい代謝安定性からもたらされる特定の治療上の利点（例えば、増大したインビボ半減期または減少した投薬量要求）を与え得、従って、いくつかの状況において好ましいことがあり得る。同位体標識されたオベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体は一般に、容易に入手可能な同位体標識された試薬を、同位体標識されていない試薬の代わりに用いて、本発明のスキームおよび／または実施例に開示される手順を行うことによって、調製され得る。１つの実施形態において、オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体は、同位体で標識されない。１つの実施形態において、ジュウテリウム化オベチコール酸は、生物学的分析アッセイのために有用である。別の実施形態において、オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体は、放射性標識化される。
【０１７１】
「幾何異性体」とは、二重結合の周りでの束縛回転の存在に起因する、ジアステレオマーを意味する。これらの立体配置は、それらの名称における接頭語シスおよびトランス、またはＺおよびＥによって区別される。これらの接頭語は、カーン−インゴールド−プレローグ（Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ）の規則に従って、これらの基がその分子の二重結合の同じ側にあるか反対側にあるかを示す。
【０１７２】
「溶媒和物」とは、化学量論量または非化学量論量の溶媒のいずれかを含む、溶媒付加形態を意味する。オベチコール酸は、結晶性の固体状態において、一定のモル比の溶媒分子を捕捉し、これによって溶媒和物を形成する傾向を有し得る。この溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、この溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコール和物である。水和物は、１分子または１分子より多くの水と、物質のうちの１つとの組み合わせによって形成され、ここで水は、その分子状態をＨ２Ｏとして維持され、このような組み合わせは、１種または１種より多くの水和物を形成し得る。さらに、本発明の化合物（例えば、化合物の塩）は、水和形態または非水和（無水）形態のいずれかで存在し得るか、あるいは他の溶媒分子との溶媒和物として存在し得る。水和物の非限定的な例としては、一水和物、二水和物などが挙げられる。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。
【０１７３】
「互変異性体」とは、それらの構造が原子配置について著しく異なるが、それらが容易な速い平衡状態で存在する、化合物をいう。オベチコール酸は、異なる互変異性体として描かれ得ることが理解されるべきである。オベチコール酸および本発明の合成中間体が互変異性形態を有する場合、全ての互変異性形態が本発明の範囲内であることが意図され、そしてオベチコール酸との命名がいずれの互変異性形態をも排除しないこともまた、理解されるべきである。オベチコール酸および本発明の合成中間体は、数種の互変異性形態（ケト−エノールが挙げられる）で存在し得る。例えば、ケト−エノール互変異性において、電子と水素原子との同時の移動が起こる。互変異性体は、溶液中で互変異性の一組の混合物として存在する。固体形態においては、通常、一方の互変異性体が優勢である。一方の互変異性体が記載され得るが、本発明は、本発明の化合物の全ての互変異性体を包含する。
【０１７４】
従って、不斉炭素原子から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）は、別段の記述がない限り、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。このような異性体は、古典的な分離技術によって、および立体化学的に制御された合成によって、実質的に純粋な形態で得られ得る。さらに、本願において議論される構造並びに他の化合物および部位もまた、その全ての互変異性体を包含する。アルケンは、適切である場合、Ｅ−配置またはＺ−配置のいずれかを含み得る。オベチコール酸および合成中間体は、立体異性形態で存在し得、従って、個々の立体異性体として、または混合物として、生成され得る。
【０１７５】
「薬学的組成物」とは、オベチコール酸を、被験体への投与に適切な形態で含有する製剤である。１つの実施形態において、薬学的組成物は、バルクであるか、または単位剤形である。投与の容易さまたは投薬量の均一性のために、組成物を単位剤形で処方することが有利であり得る。単位剤形とは、本明細書中で使用される場合、治療されるべき被験体のための統一された投薬量として適切な、物理的に個別の単位をいい、各単位が、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性薬剤を、必要な薬学的キャリアと合わせて含有する。本発明の投薬単位形態についての仕様は、活性薬剤の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにこのような活性薬剤を配合するための当該技術分野において固有の制限によって決定され、これらに直接依存する。
【０１７６】
単位剤形は、種々の形態（例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器のシングルポンプ、またはバイアルが挙げられる）の任意のものである。組成物の単位用量中のオベチコール酸（例えば、オベチコール酸、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはアミノ酸結合体の製剤）の量は、有効量であり、そして関連する特定の治療に応じて変えられる。当業者は、患者の年齢および状態に依存して、投薬量について慣用的な変更を行う必要が時々あることを理解する。投薬量はまた、投与経路に依存する。種々の経路が想定され、経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、頬、舌下、胸膜腔内、鞘内、および鼻内などが挙げられる。本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤形としては、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチおよび吸入剤が挙げられる。１つの実施形態において、オベチコール酸は、滅菌条件下で、薬学的に許容されるキャリアと、および必要とされる任意の防腐剤、緩衝剤、または推進剤と、混合される。
【０１７７】
用語「フラッシュドーズ（ｆｌａｓｈ  ｄｏｓｅ）」とは、急速に分散する剤形であるオベチコール酸製剤をいう。
【０１７８】
用語「即時放出」は、比較的短い時間（一般に、約６０分まで）の、剤形からのオベチコール酸の放出として定義される。用語「改変された放出」は、遅延された放出、延長された放出、およびパルス状放出を包含するように定義される。用語「パルス状放出」は、剤形からの薬物の連続した放出として定義される。用語「持続された放出」または「延長された放出」は、長期間にわたる、剤形からのオベチコール酸の連続的な放出として定義される。
【０１７９】
「被験体」は、哺乳動物（例えば、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコ、および鳥類など）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、および家禽など）、ならびに実験室動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、および鳥類など））を包含する。１つの実施形態において、被験体はヒトである。１つの実施形態において、被験体はヒト小児（例えば、約３０ｋｇ〜約７０ｋｇ）である。１つの実施形態において、このヒト小児は葛西手術を受けており、ここで葛西手術は、胆管を有さずに生まれたか、または誕生時に完全に胆管が遮断されていた場合、これらの小児に、機能的な胆管を効果的に与える。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、語句「薬学的に許容される」とは、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、並びに他の問題及び合併症がなく、合理的なリスク対効果比に釣り合う、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適切な、化合物、物質、組成物、キャリアおよび／または剤形をいう。
【０１８１】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般的に安全であり、非毒性であり、そして生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない、薬学的組成物を調製する際に有用な賦形剤を意味し、そして獣医学用途およびヒト製薬学用途のために許容される賦形剤を包含する。「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書中および特許請求の範囲で使用される場合、１種のこのような賦形剤、および１種より多くのこのような賦形剤の、両方を包含する。
【０１８２】
オベチコール酸はいかなる製剤化もなしで直接投与することが可能であるが、オベチコール酸は通常、薬学的に許容される賦形剤およびオベチコール酸を含有する医薬製剤の形態で投与される。これらの製剤は、種々の経路（経口、頬、直腸、鼻内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、および鼻内が挙げられる）によって投与され得る。オベチコール酸の経口製剤は、本明細書中で、「経口製剤および投与」の表題の節の下にさらに記載されている。
【０１８３】
１つの実施形態において、オベチコール酸は、経皮投与され得る。経皮投与するためには、経皮送達デバイス（「パッチ」）が必要とされる。このような経皮パッチは、制御された量での、本発明の化合物の連続的または非連続的な注入を提供するために使用され得る。薬剤の送達のための経皮パッチの作製および使用は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号を参照のこと。このようなパッチは、医薬品の連続送達、パルス状送達、またはオンデマンド送達のために、作製され得る。
【０１８４】
本発明の１つの実施形態において、少なくとも前述のオベチコール酸を、頬投与および／もしくは舌下投与、または経鼻投与のために適合された製剤中に含有する、医薬製剤が提供される。この実施形態は、胃での複雑な要素（胃の系による初回通過代謝および／または肝臓の通過）を回避する様式での、オベチコール酸の投与を提供する。この投与経路はまた、吸収時間を短縮し得、治療効果のより急速な発生を提供し得る。本発明の化合物は、特に好ましい溶解度プロフィールを提供して、舌下／頬製剤を容易にし得る。このような製剤は、典型的には、充分な量の活性成分を舌下／頬の粘膜の制限された表面積に、この製剤がその表面積に接触している比較的短い時間で送達して、この活性成分の吸収を可能にするために、比較的高い濃度の活性成分を必要とする。従って、オベチコール酸の非常に高い活性は、その高い溶解度と組み合わさって、舌下／頬製剤への適合性を促進する。
【０１８５】
オベチコール酸は好ましくは、単位剤形に処方され、各投薬量が、約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約５０ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約３０ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約４ｍｇ〜約２６ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約５ｍｇ〜約２５ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約２ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．２ｍｇ〜約１．８ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．３ｍｇ〜約１．７ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．５ｍｇを含有する。用語「単位剤形」とは、ヒト被験体および他の哺乳動物のための統一された投薬量として適切な、物理的に個別の単位をいい、各単位が、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性物質を、上記のような適切な薬学的キャリアと合わせて含有する。
【０１８６】
オベチコール酸は一般に、広い投薬量範囲にわたって有効である。例えば、１日あたりの投薬量は通常、体重１ｋｇあたり約０．０００１〜約３０ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）の範囲内である。成人の治療において、単一用量または分割用量で１日あたり約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ（ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）の範囲が、特に好ましい。ある実施形態において、この製剤は、約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約５０ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約３０ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約４ｍｇ〜約２６ｍｇを含有する。別の実施形態において、この製剤は、約５ｍｇ〜約２５ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１ｍｇ〜約２ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．２ｍｇ〜約１．８ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．３ｍｇ〜約１．７ｍｇを含有する。１つの実施形態において、この製剤は、約１．５ｍｇを含有する。しかし、実際に投与されるオベチコール酸の量は、医師によって、関連する状況（治療される状態、選択される投与経路、投与されるオベチコール酸の形態、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重篤度が挙げられる）を考慮して決定され、従って、上記投薬範囲は、本発明の範囲をいかなる方法でも限定することを意図されないことが理解される。いくつかの例において、上記範囲の下限より低い投薬レベルでも十分以上であることがであり得、一方で、他の症例においては、もっとより多い投薬量が、いかなる有害な副作用も引き起こさずに使用され得る。ただし、このようなより多い用量は最初に、その日の全体にわたる投与のために、複数のより少ない用量に分割される。
【０１８７】
「本発明のプロセス」とは、本明細書中に記載されているようなオベチコール酸を調製する方法であって、結晶オベチコール酸を含む方法をいう。
【０１８８】
「線維症」とは、組織または器官における、過剰な線維性結合組織（例えば、瘢痕組織）の発生が関与する状態をいう。瘢痕組織のこのような発生は、疾患、外傷、および化学毒性などに起因して、器官の感染、炎症、または損傷に応答して起こり得る。線維症は、種々の異なる組織および器官（肝臓、腎臓、腸管、肺、心臓などが挙げられる）において発生し得る。
【０１８９】
用語「阻害する」または「阻害」とは、本明細書中で使用される場合、疾患または状態の発症または進行に対する、任意の検出可能な好ましい効果をいう。このような好ましい効果としては、その疾患または状態の少なくとも１つの症状または兆候の発生の遅延または防止、症状（単数もしくは複数）または兆候（単数もしくは複数）の軽減または逆転、および症状（単数もしくは複数）または兆候（単数もしくは複数）のさらなる悪化の遅延または防止が挙げられ得る。
【０１９０】
本明細書中で使用される場合、「胆汁うっ滞状態」とは、肝臓からの胆汁排出が損なわれている、もしくは遮断されている、任意の疾患または状態をいい、これは、肝臓または胆管のいずれにおいても起こり得る。肝内胆汁うっ滞および肝外胆汁うっ滞は、胆汁うっ滞状態の２つの種類である。肝内胆汁うっ滞（これは、肝臓の内側で起こる）は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、敗血症（全身性感染）、急性アルコール性肝炎、薬物毒性、完全非経口栄養法（静脈内供給される）、悪性疾患、嚢胞性線維症、および妊娠において最も一般的に見られる。肝外胆汁うっ滞（これは、肝臓の外側で起こる）は、胆管腫瘍、狭窄症、嚢腫、憩室、総胆管結石の形成、膵臓炎、膵臓の腫瘍または偽性嚢胞、および近くの器官の塊または腫瘍に起因する圧迫によって引き起こされ得る。
【０１９１】
胆汁うっ滞状態の臨床症状および兆候としては、痒み（そう痒）、疲労、皮膚または眼の黄疸、特定の食物を消化できないこと、悪心、嘔吐、灰白色の糞便、暗色の尿、および右上（四分円部）腹部痛が挙げられる。胆汁うっ滞状態を有する患者は、標準的な臨床検査のセット（患者の血流中のアルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、５’ヌクレオチダーゼ、ビリルビン、胆汁酸、およびコレステロールのレベルの測定を含む）に基づいて、診断および臨床的に観察され得る。一般に、患者は、診断マーカーであるアルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、および５’ヌクレオチダーゼの３つ全ての血清レベルが異常に上昇しているとみなされる場合に、胆汁うっ滞状態を有すると診断される。これらのマーカーの正常な血清中レベルは、検査室ごとに、および手順ごとに、試験プロトコルに依存してある程度変わり得る。従って、医師は、特定の検査室および検査手順に基づいて、これらのマーカーの各々について、どれが異常に上昇した血液中レベルであるかを決定し得る。例えば、胆汁うっ滞状態を罹患する患者は一般に、血液中で約１２５  ＩＵ／Ｌより高いアルカリホスファターゼ、約６５  ＩＵ／Ｌより高いＧＧＴ、および約１７  ＮＩＬより高い５’ヌクレオチダーゼを有する。血清マーカーのレベルの変動性に起因して、胆汁うっ滞状態は、これらの３つのマーカーの異常なレベルを根拠として加え、上記症状のうちの少なくとも１つ（例えば、痒み（そう痒））に基づいて、診断され得る。
【０１９２】
用語「器官」とは、細胞および組織からなり、そして生物において何らかの特定の機能を実施する、分化した構造体（心臓、肺、腎臓、肝臓などにおいて）をいう。この用語はまた、機能を実施するかまたは活動に協力する身体部分（例えば、視覚器を構成する眼および関連構造体）を包含する。用語「器官」はさらに、完全な構造体に発育することが潜在的に可能である、分化した細胞および組織の任意の部分構造体（例えば、肝葉または肝臓切片）を包含する。
【０１９３】
本明細書中で引用される全ての刊行物および特許文献は、各刊行物または文献が本明細書中に参考として援用されることが具体的かつ個々に示されているかのように、本明細書中に参考として援用される。刊行物および特許文献の引用は、それが妥当な先行技術であることの承認としては意図されず、その内容または日付に関するいかなる承認もなさない。本発明は、ここで文書による説明によって記載されたので、当業者は、本発明が種々の実施形態で実施され得ること、ならびに前記説明および以下の実施例が、説明の目的であって添付の特許請求の範囲の限定ではないことを、認識する。
【０１９４】
本明細書において、単数形は、その文脈がそうではないことを明白に示さない限り、複数形も包含する。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合、本明細書が支配する。
【０１９５】
本明細書中で使用される全ての百分率および比は、別段の記述がない限り、重量基準である。
【実施例】
【０１９６】
実施例１：オベチコール酸の合成
この合成手順において言及される化合物番号は、スキーム１およびこれらの工程の各々に対応する反応において見出される化合物番号をいう。
【０１９７】
工程１  −  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）の調製：
【０１９８】
【化１１】
2020125317.tif 000016
【０１９９】
反応１：７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）のＣ−２４カルボン酸のエステル化
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（ＫＬＣＡ；５００．０ｇ，１．２８ｍｏｌ）を、メチルアルコール（２５００ｍＬ）を使用して、酸触媒（硫酸，１．０ｍＬ）の存在下でエステル化し、そして６２℃〜６４℃まで約３時間加熱して、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（１）を得た。この反応において、メチルアルコールは、メチル化剤および反応溶媒として働く。後処理のために、そのｐＨ値を、水酸化ナトリウム溶液（２Ｎ）を用いてｐＨ７．０〜７．５に調整した。この溶液を活性炭（２５ｇ）で約３０分間処理し、そして濾過して固体炭素を除去した。あるいは、この溶液を活性炭で処理しなかった。生成物を沈殿させるために、１０℃〜１５℃の水（６２５ｍＬ）を１５分間かけて添加し、そして種晶用物質を添加した。この反応混合物を１０℃〜１５℃で１時間撹拌する。別の水（１８７５ｍＬ）を約２０〜２５分間かけて添加した。生成物の懸濁物を１０℃〜１５℃で３０分間撹拌した。この生成物を遠心分離で単離し、そしてメタノールと水との混合物（１：１，３５０ｍＬ）で洗浄した。この湿った物質の水含有量をＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）によって定量した。この物質をタンブル乾燥機中減圧下ＮＭＴ７０℃で乾燥させた。この物質はまた、乾燥させずとも次の工程で使用し得る。その収量（乾燥生成物に基づいた計算）は５０１．４ｇ（１．２４ｍｏｌ，９６．８％）である。
【０２００】
工程２  −  ３α，７α−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステル（３）の調製：
【０２０１】
【化１２】
2020125317.tif 000017
【０２０２】
反応２：７−ケトリトコール酸メチルエステルからのシリルエノールエーテル形成
残留する水およびメタノールを含む化合物１（６０．６９ｇ，１５０ｍｍｏｌ，乾燥物質として計算）を不活性な条件下で反応容器に入れ、そしてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ，３６３ｍＬ）に溶解させた。水およびメタノールを、約６５℃および標準圧力での繰り返しの共沸蒸留により除去した。必要に応じて、ＴＨＦをその残渣に添加し、そしてこの蒸留を約４回繰り返した。残りの溶液は、その最終水含有量が０．０５％以下（Ｋａｒｌ
Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定）でなければならない。この溶液を−２０℃〜−２５℃に予め冷却し、次いでクロロトリメチルシラン（７３．３３ｇ，６７５ｍｍｏｌ，４．５当量）を約３０分〜４５分で添加した。窒素雰囲気下で、リチウムジイソプロピルアミド（２８％のＬＤＡ溶液，９００ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（５０４ｍＬ）を別の不活性な条件の反応容器に入れ、そして−２０℃〜−２５℃に冷却した。化合物１、ＴＨＦ（８４ｍＬ）、およびクロロトリメチルシランの冷却された乾燥溶液を、−２０℃〜−２５℃のＬＤＡ溶液に注入した。次いで、この反応混合物を約２時間撹拌した。後処理のために、この反応混合物を、２℃〜８℃の予め冷却したクエン酸の水溶液（３００ｍＬ中３４．６ｇ）に添加した。この添加の後に、その水相を分離し、そして廃棄した。その有機相から、液体を最高５０℃での減圧蒸留により除去した。単離された残渣は、化合物３およびいくらかの残留溶媒を含有しており、これを次の工程に「そのまま」使用した。
【０２０３】
工程３  −  ３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステル（４）の調製：
【０２０４】
【化１３】
2020125317.tif 000018
【０２０５】
反応３：シリルエノールエーテルとアセトアルデヒドとのアルドール縮合
ＴＨＦ中の化合物３（１６４．６８ｇ，３００ｍｍｏｌ，乾燥物質として計算）の溶液を不活性な条件の反応容器に入れた。５０℃の最高温度で、残留量のＴＨＦを減圧留去した。その残渣の水含有量を、反応進行の目的で、０．５％以下に制限した（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈ  ｅｒ滴定）。次いで、その残渣をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させ、そして−６０℃〜−６５℃に予め冷却した。次いで、アセトアルデヒド（３３．８ｍＬ，６００ｍｍｏｌ）を添加した。窒素雰囲気下で、ジクロロメタン（７００ｍＬ）および三フッ化ホウ素（アセトニトリル中１６重量％の溶液，３１８ｇ，７５０ｍｍｏｌ）アセトニトリル錯体を別の反応容器に入れ、次いで−６０℃〜−６５℃に冷却した。−６０℃〜−６５℃で、化合物３の乾燥溶液を添加した。この反応混合物を−６０℃〜−６５℃で約２時間撹拌し、２３℃〜２８℃まで加熱し、さらに約３時間撹拌し、そして加水分解／後処理のために約２℃〜１０℃に冷却した。後処理のために、この反応器からの冷却溶液を、予め冷却した５０重量％の苛性ソーダの水溶液（４０ｍＬ）および６６０ｍＬの水に添加した。約１０分間の激しい撹拌の後に、相を分離し、そして（下の）有機層を別の反応容器に移した。この有機層から、溶媒をＮＭＴ５０℃での蒸留によって可能な限り除去した。その残渣（化合物４ならびにいくらか残っているアセトニトリルおよびジクロロメタンからなるもの）をドラムに送出した。化合物４Ａ（Ｅ／Ｚ−異性体の混合物）もまた、工程３について上に記載された手順によって調製され得る。
【０２０６】
工程４  −  ３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）の調製：
【０２０７】
【化１４】
2020125317.tif 000019
【０２０８】
反応４：Ｃ−２４エステルのけん化
化合物４（２５８．３７ｇ，６００ｍｍｏｌ，乾燥物質として計算）を不活性な条件の反応容器に入れた。ＮＭＴ５０℃の温度で、残留量の溶媒を減圧留去した。その残渣をメタノール（３６０ｍＬ）に溶解させ、そして水（５４ｍＬ）および苛性ソーダ５０重量％（５４ｍＬ）を添加した。この反応混合物を４９℃〜５３℃まで加熱し、そしてこの温度で少なくとも２時間撹拌した。この反応混合物のｐＨをチェックし、そして１２より高いことを確認した。このｐＨが１２より低い場合、さらなるＮａＯＨを添加し、そして２時間の反応時間を繰り返す。この溶液を水（１０００ｍＬ）で希釈し、そしてその温度を２５℃〜３５℃に調整した。後処理のために、反応混合物を少なくとも３０分間静置した。この相を分離し、そして下の水層を別の反応容器に移し、そしてその有機層を廃棄した。酢酸エチル（１４００ｍＬ）および水性クエン酸（４８０ｍＬ中２４４ｇ）を、この水層に激しく撹拌しながら添加した。この反応混合物を２５℃〜３５℃で１０分間撹拌した。相を分離し、そして下の水層を廃棄した。酢酸エチルをその有機層から留去し、また酢酸エチル（８００ｍＬ）で置換した。留出物の水含有量がＮＭＴ１％になるまで、または一定の沸点に達するまで、この操作を繰り返した。この懸濁物を２０℃〜２５℃に冷却し、３０分間撹拌し、次いで生成物を単離し、そして酢酸エチル（１００ｍＬ，３〜４回）で洗浄した。乾燥を、タンブル乾燥機中、減圧下、約６０℃で行った。その収量として、１１８．７１ｇ（ＫＬＣＡから４７．５％）の粗製化合物５を得た。化合物４Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）もまた、化合物５Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）を生成するための出発物質として使用され得る。
【０２０９】
次いで、粗製化合物５をエタノールを使用して結晶化させた。結晶化のための粗製化合物はまた、Ｅ／Ｚ異性体の混合物である化合物５Ａでもあり得る。エタノール（３９０〜５２０ｍＬ）および粗製化合物５（１３０ｇ）を不活性な条件の反応容器に入れた。粗製化合物５を溶解させるために、反応混合物を加熱還流させた。次いで、この反応混合物を、制御された冷却傾斜で１５℃〜２０℃まで、線形プロファイルにより、３〜５時間以内で冷却した。結晶性の化合物５Ａを遠心分離を使用して単離し、次いで酢酸エチル（５０〜１００ｍＬ，２回）で洗浄した。乾燥を、タンブル乾燥機中減圧下で約６０℃で行った。これは、８５．８ｇ（６６％）の収量をもたらす。サンプルを、精製した化合物５のアッセイ、純度、および水分を測定するために採取した。精製した化合物５は、３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸のＥ異性体である。精製した化合物５の同定および特徴付けに関する全詳細については、実施例２を参照のこと。精製した化合物５（Ｅ異性体）を単離することは、任意であり得る。Ｅ異性体とＺ異性体ととは、異なる溶解度を有する。Ｅ異性体は、可溶性が低く、結晶化するので、Ｚ異性体を洗浄により除去し得る。
【０２１０】
化合物５を調製する代替的方法は、以下のとおりである。化合物４（１１１．９６ｇ）を不活性な条件の反応容器に入れた。最高５０℃で、残留量の溶媒（例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン）を減圧留去した。その残渣をメタノール（１５６ｍＬ）に溶解させ、そして約１０℃に冷却した。水道水（２３．４ｍＬ）および苛性ソーダ５０％（２３．４ｍＬ）を添加した。この反応混合物を約２０℃〜約２５℃で約４時間撹拌した。この溶液を水道水（４３３ｍＬ）で希釈し、そしてトルエン（１４４ｍＬ）を添加した。撹拌後、相を分離し、そして下の水層を不活性な条件の反応容器に移した。その有機層を廃棄した。酢酸エチルエステル（６０７ｍＬ）およびクエン酸の溶液（２０８ｍＬの水中１０５．７ｇ）をその水層に、激しく撹拌しながら添加した。相を分離し、そして下の水層を廃棄した。その有機層を不活性な条件の反応容器に移した。この有機層から、酢酸エチルエステルを留去し、また酢酸エチルエステル（３４７ｍＬ）で置換した。１つの実施形態において、酢酸エチルエステル（１７３ｍＬ）を用いるこの操作を、留出物の水含有量が約１％以下になるまで、または一定の沸点に達するまで、繰り返した。この懸濁物を２０℃〜２５℃に冷却した。化合物５を単離し、そして不活性な条件の遠心分離により酢酸エチルエステルで洗浄した（４３ｍＬずつで３〜４回）。乾燥をタンブル乾燥機中、減圧下、約６０℃で行った（化合物１に基づいて６４．８％の収率）。化合物４Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）もまた、化合物５Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）を生成するために、工程４のための出発物質として使用し得る。
【０２１１】
工程５  −  ３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（６）の調製：
【０２１２】
【化１５】
2020125317.tif 000020
【０２１３】
反応５：６−エチリデン部分の水素化
精製した化合物５（１１０ｇ，２６４ｍｍｏｌ）、水（１１００ｍＬ）、５０％の苛性ソーダ溶液（３５．８ｍＬ，６８２ｍｍｏｌ）およびパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ，１１ｇ）の混合物を、水素化反応容器に入れた。その温度を２５℃〜３５℃に調整し、そしてこの反応容器を窒素（２ｂａｒ）で３回、次いで（１ｂａｒ）水素で３回放出置換した。これらの圧力値は、周囲圧力（＝０ｂａｒ）と相対的な値として与えられた。５ｂａｒの水素圧力を加え、そしてこの反応混合物を１００℃まで（α位の異性化のため）１．５時間にわたって加熱し、次いで４．５ｂａｒ〜５ｂａｒの水素圧力を維持しながら３時間撹拌した。次いで、この反応混合物を４０℃〜５０℃に冷却した。後処理のために、Ｐｄ／Ｃが濾別される。この濾液に、酢酸ｎ−ブチル（１３２０ｍＬ）および塩酸（６７．８ｍＬ，８１５ｍｍｏｌ，３７％）を添加した。その水相を分離し、そして廃棄した。その有機相を活性炭（５．５ｇ）で４０〜５０℃にて約１０分間処理した。この活性炭を濾別し、そしてその濾液を蒸留により濃縮し、そして得られた懸濁物を２〜３時間以内で１５℃〜２０℃に冷却した。沈殿した化合物６を単離し、そして酢酸ｎ−ブチル（１６０ｍＬ）で洗浄した。この生成物を圧力濾過器を使用して濾過した。乾燥を、圧力濾過器中、減圧下、約６０℃で行った。これは、８９．８ｇ（８１．２％）の化合物６をもたらす。化合物５Ａ（Ｅ／Ｚ異性体の混合物）を、化合物６を調製するために、工程５において使用し得る。
【０２１４】
工程６  −  ３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸（オベチコール酸）の調製：
【０２１５】
【化１６】
2020125317.tif 000021
【０２１６】
反応６：７−ケト基の７α−ヒドロキシ基への選択的還元
化合物６（８６ｇ，２０５．４ｍｍｏｌ）、水（６８８ｍＬ）および５０％の水酸化ナトリウム溶液（５６．４ｍＬ）の混合物を、５０重量％の水酸化ナトリウム溶液（１．５ｍＬ）と水（２０ｍＬ）との混合物中で、９０℃〜１０５℃にて、水素化ホウ素ナトリウム（７．７７ｇ，２０５．４ｍｍｏｌ）と反応させた。この反応混合物を加熱還流させ、そして少なくとも３時間撹拌した。後処理のために、この反応が完了した後に、この反応混合物を約８０℃に冷却し、そして冷却した反応容器に移した。３０℃〜５０℃で、酢酸ｎ−ブチル（８６０ｍＬ）および水（４９１ｍＬ）中のクエン酸（３２０．２ｇ，無水物）を添加した。その水相を分離し、そしてそれが酸性であることを確認するためにそのｐＨ値をチェックした後に、廃棄した。その有機相を移して蒸留した。その残渣を酢酸ｎ−ブチルで希釈する。そして１５℃〜２０℃にゆっくりと冷却し、そして粗製オベチコール酸を、遠心分離を使用して濾過した。この湿った生成物を酢酸ｎ−ブチルから結晶化させた。生成物であるオベチコール酸を単離し、そして不活性な条件の圧力濾過器内で酢酸ｎ−ブチルで洗浄した（４３ｍＬ，４回）。乾燥を、圧力濾過器中、減圧下、約８０℃で行った。これは、６７．３４ｇ（７７．９％）の結晶オベチコール酸をもたらした。結晶オベチコール酸の同定および特徴付けに関する全詳細については、実施例３を参照のこと。
【０２１７】
工程７  −  オベチコール酸形態１の調製：
【０２１８】
【化１７】
2020125317.tif 000022
【０２１９】
反応７：結晶オベチコール酸形態Ｃからのオベチコール酸形態１の調製
結晶オベチコール酸形態Ｃ（５８ｇ）を水（８７０ｍＬ）および苛性ソーダ溶液（５０％，８．７ｍＬ，１６６ｍｍｏｌ）に３０℃〜４０℃で溶解させた。この混合物を、全ての固体が溶解するまで撹拌した。その生成物を、以下の後処理を使用して沈殿させた。このオベチコール酸溶液を、フィルタを通して水（８７０ｍＬ）中に希釈された塩酸（３７％，１６．０５ｍＬ，１９３ｍｍｏｌ）に３０℃〜４０℃でゆっくりと添加した。この懸濁物を３０℃〜４０℃で約３０分間撹拌し、次いで２０℃以下（ＮＭＴ２０℃）に冷却した。その生成物を単離し、そして不活性な条件の圧力濾過器中で水を用いて洗浄した（４６５ｍＬ，６回）。乾燥を、圧力濾過器中、減圧下、ＮＭＴ５０℃の温度で行った。これは、５３．２ｇ（９１．７％）のオベチコール酸形態１をもたらした。
【０２２０】
実施例２：Ｅ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸（５）の特徴付け
化合物５は、本願のプロセスのための主要な中間体である。この化合物を酢酸エチルから単離し、次いでエタノールから結晶化させた。この非常に純粋な化合物５は、化合物６、ならびにその後の結晶オベチコール酸形態Ｃおよびオベチコール酸形態１（実質的に純粋なオベチコール酸を含む）の、効率的かつ高収率の製造を可能にする。
【０２２１】
実施例１の工程４からの化合物５の構造を、１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲ、および質量分析を使用して確認した。工程４からの粗製生成物は、ＬＣ／ＭＳ−カップリングによって品質管理方法１により生成されたＵＶクロマトグラムにおいて、保持時間（ＲＴ）２７．４５７分の主要な生成物、およびＲＴ  ２８．０７８分の少ない方の生成物をもたらした。これらの２つの生成物は、化合物５のＥ／Ｚ異性体である：
【０２２２】
【化１８】
2020125317.tif 000023
【０２２３】
これらの２つの異性体は、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、同じ精密質量および同じフラグメンテーションを示す。これらは、質量分析データによっては区別され得ない。
【０２２４】
Ｅ／Ｚ異性体ピークを単離するためのセミ分取的方法を使用して、Ｅ／Ｚ異性体の構造を、２段階のアプローチを使用して確認した。ＨＰＬＣ品質管理方法１は、不揮発性のリン酸緩衝液を使用しており、従って、不揮発性緩衝液を用いての直接のＬＣ／ＭＳカップリングは不可能であった。この方法を適合修正させるための予備的な試験は、ＵＰＬＣ法のみが、Ｅ／Ｚ異性体の充分な分離のために非常に高いプレート数を可能にすることを示した。この２段階アプローチは、以下の通りであった：工程Ａは、新たに開発したＵＰＬＣ／ＭＳ法を用いての２つのサンプル中のＥ／Ｚ異性体の同定であり、そして工程Ｂは、ＨＰＬＣ法２を用いてのＥ／Ｚ異性体ピークの画分の単離、およびその後のＵＰＬＣ／ＭＳ法１を用いての同定であった。この方法の実験の詳細は、以下の通りであった：
【０２２５】
【表１Ｃ】
2020125317.tif 000024
【０２２６】
これらの結果を図１および図２に示す。図１および図２は、高速ＵＰＬＣカラムで得られた、「粗製化合物５」（図１）および化合物５「精製された参照物質」（図２）についてのＵＰＬＣ  ＵＶ／ＭＳクロマトグラムである。図１について、これらのサンプルを１ｍｇ／ｍＬでＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  １：１に溶解させ；２００×２ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  Ｒ１２２；ＬＭＡ：Ｈ２Ｏ＋１０ｍＭ  ＡＦ＋０．１％ＨＦｏ；ＬＭＢ：ＡＣＮ；４５％−２０−６０％（１０）；０．４ｍＬ／ｍｉｎ；４０℃；ＵＶＡ＝２００ｎｍ；３μＬの注入体積であった。図２について、これらのサンプルを１ｍｇ／ｍｌでＡＣＮ／Ｈ２Ｏに溶解させ；２００×２ｍｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  Ｒ１２２；Ａ：１０ｍＭ  ＡＦ＋０．１％ＨＦｏ；Ｂ：ＡＣＮ；４５％−２０−６０％Ｂ（１０）；０．４ｍＬ／ｍｉｎ；２０μＬの注入体積であった。両方のサンプルにおいて、主要な成分（ＲＴ  ９．９２分）の分子量と少ない方の成分（ＲＴ  １０．７７分）の分子量とは、予測通りに同じであり、そしてこれらの２つの化合物の精密質量は、以下に示す、正イオン測定および負イオン測定の表Ｄおよび表Ｅのデータに示されるように、提供される構造と一致した：
【０２２７】
【表１Ｄ】
2020125317.tif 000025
【０２２８】
【表１Ｅ】
2020125317.tif 000026
【０２２９】
品質管理ＨＰＬＣ法２の移植性を確実にするために、元の分離を、規定された条件下で正確に繰り返した。大きい方のピークおよび小さい方のピークを、セミ分取して単離した。捕集された画分の印を付けた部分を含む、得られたＵＶクロマトグラムを、図３に示す。図３は、ＨＰＬＣ法２；１２５×４ｍｍ  Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  ＳＴＡＲ  Ｃ１８  ５μｍ  ＡＧ；ＬＭＡ：Ｈ２Ｏ  ｐＨ２．６ｍｉｔ  Ｈ３ＰＯ４；ＬＭＢ：ＡＣＮ；３０％
Ｂ−１０−３５％−３０−６０％−１−９０％（９）；１ｍＬ／ｍｉｎ；３５℃；ＵＶＡ＝２００ｎｍ；ｏｈｎｅ  ＭＳ；２５ｍＬを使用した、粗製化合物５のＵＶクロマトグラムである。その後、単離した画分を、新たに開発したＵＰＬＣ／ＭＳ法で別々に分析した。精密イオン追跡の評価のために、８５０．６１９１４±３ｐｐｍの準分子イオン［２Ｍ＋ＮＨ４］を使用した。大きい方のピークの画分、小さい方のピークの画分、およびこれらの２つのサンプルの、得られたクロマトグラムを図４（Ａ〜Ｄ）に示す。このＭＳ研究は、品質管理方法２によってＲＴ  ２７．４５７分およびＲＴ  ２８．０７８分において生成された２つのピークは、式Ｃ２６Ｈ４０Ｏ４を有する２つの異性体であることを示した。この式は、Ｅ／Ｚ異性体について推定される構造と一致する。従って、ＵＰＬＣ−ＭＳ法の開発は、３α−ヒドロキシ−エチリデン−７−ケト−５β−コール−２４酸のＥ／Ｚ異性体が、高い分解能でクロマトグラフィーにより分離可能であることを示した。ＦＲ−ＩＣＲ質量分析計からの精密なＭＳデータは、Ｅ／Ｚ異性体について推定される構造と一致する。両方の異性体について、同じ式Ｃ２６Ｈ４０Ｏ４が誘導された。
【０２３０】
ＨＰＬＣ法２でのＥ／Ｚ異性体ピークのセミ分取による単離、およびその後の、ＵＰＬＣ−ＭＳ法での同定によって、本発明者らは、品質管理方法２によって生成される２つのピーク（ＲＴ  ２７．４５７分およびＲＴ  ２８．０７８分、図１を参照のこと）が、式Ｃ２６Ｈ４０Ｏ４を有する２つの異性体であることを示し得る。この式は、Ｅ／Ｚ異性体の推定される構造と一致する。以下に記載されるＮＭＲの結果と組み合わせて、次の帰属が得られた：ＲＴ  ２７．４５７分はＥ異性体に帰属し、そしてＲＴ  ２８．０７８分はＺ異性体に帰属する。
【０２３１】
３α−ヒドロキシ−エチリデン−７−ケト−５β−コール−２４酸のＥ異性体についての１Ｈシフトおよび１３Ｃシフトの帰属を以下に示す。シフトを、「Ｌ．Ｂｅｔｔａｒｅｌｌｏら，ＩＩ  Ｆａｒｍａｃｏ  ５５（２０００），５１−５５（物質３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸）に従って評価した。
【０２３２】
【化１９】
2020125317.tif 000027
【０２３３】
【表１Ｆ】
2020125317.tif 000028
【０２３４】
【表１Ｇ】
2020125317.tif 000029
【０２３５】
Ｓ＝一重線
Ｄ＝二重線
Ｔ＝三重線
Ｑ＝四重線
Ｍ＝多重線
ＤＤ＝二重線の二重線
ＤＴ＝三重線の二重線。
【０２３６】
実施例３：結晶オベチコール酸形態Ｃの特徴付け
スキーム１および実施例１の工程６からの生成物の固体状態での全ての特徴付けは、オベチコール酸が結晶性であることを示した。この結晶形態は、形態Ｃの標識を付けられる。以下は、結晶オベチコール酸形態Ｃの特徴付けを要約する表である：
【０２３７】
【表１Ｇ−２】
2020125317.tif 000030
【０２３８】
熱分析
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）データを、３４位置のオートサンプラーを備え付けたＭｅｔｔｌｅｒ  ＤＳＣ  ８２３ｅで収集した。この機器を、エネルギーおよび温度について、認証されたインジウムを使用して較正した。典型的には、ピンホール付きアルミニウム皿中の０．５〜１ｍｇの各サンプルを、１０℃・ｍｉｎ−１で２５℃から３５０℃まで加熱した。５０ｍｌ・ｍｉｎ−１での窒素パージをこのサンプル上に維持した。機器の制御およびデータ分析のソフトウェアは、ＳＴＡＲｅ  ｖ  ９．２０であった。
【０２３９】
ＴＧＡ（熱重量分析）データを、３４位置のオートサンプラーを備え付けたＭｅｔｔｌｅｒ  ＴＧＡ／ＳＤＴＡ  ８５１ｅで収集した。この機器を、認証されたインジウムを使用して温度較正した。典型的には、５〜１０ｍｇの各サンプルを、予め秤量したアルミニウムるつぼに入れ、そして１０℃・ｍｉｎ−１で周囲温度から３００℃まで加熱した。５０ｍｌ・ｍｉｎ−１での窒素パージを、このサンプル上で維持した。機器の制御およびデータ分析のソフトウェアは、ＳＴＡＲｅ  ｖ  ９．２０であった。
【０２４０】
２段階の重量減少が、結晶オベチコール酸形態ＣのＴＧＡによって観察された。１段階目は、室温（ｒ．ｔ．）と８５℃との間で起こり（０．４１％）、そして２段階目は、８５℃〜１１５℃の間で起こった（４．１０％）。１段階目の重量減少は、水の損失に起因し得、そして２段階目は、残った水の損失（水は約１．２％の重量減少を担う）および結合したヘプタンの損失（約３．４％の重量減少）に起因し得る。結晶オベチコール酸形態Ｃは、０．１５モル〜０．２モルの間の溶媒（ヘプタン）を含み、これは約１．５重量％（０．３モル）であった。結晶オベチコール酸形態ＣのＤＳＣサーモグラムは、１回の吸熱を含んだ。これは非常に鋭く、そして９８℃周辺での開始を有した。図６を参照のこと。異なる溶媒は、異なる沸点を有するので、ＤＳＣおよびＴＧＡの実験において異なる温度で蒸発する。
【０２４１】
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ
Ｘ線粉末回折パターンを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ回折計で、Ｃｕ  Ｋα放射線（４０ｋＶ，４０ｍＡ）、自動サンプル位置設定のための自動ＸＹＺステージレーザービデオ顕微鏡、およびＨｉＳｔａｒ二次元領域検出器を使用して収集した。Ｘ線光学部品は、０．３ｍｍのピンホールコリメータに連結された、単一Ｇｏｅｂｅｌ多層ミラーから構成された。毎週の性能チェックを、認証標準品であるＮＩＳＴ  １９７６コランダム（平板）を使用して行った。
【０２４２】
ビームの発散（すなわち、サンプル上のＸ線ビームの有効サイズ）は、約４ｍｍであった。θ−θ連続走査モードを、２０ｃｍのサンプル−検出器間距離で使用した。これは、３．２°〜２９．７°の有効２θ範囲を与える。典型的には、サンプルをＸ線ビームに１２０秒間曝露した。データ収集のために使用したソフトウェアは、ＧＡＤＤＳ  ｆｏｒ  ＷＮＴ  ４．１．１６であり、そしてデータを、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ
９．０．０．２またはｖ  １３．０．０．２を使用して分析および表示した。
【０２４３】
周囲条件：周囲条件下で実施されるサンプルを、平板標本として、受け取ったままの状態の粉末を粉砕せずに使用して調製した。約１〜２ｍｇのサンプルをスライドガラスに軽く押し付けて、平坦な表面を得た。
【０２４４】
非周囲条件：非周囲条件下で実施されるサンプルを、熱伝導性化合物と一緒にシリコンウエハ上に設置した。次いで、このサンプルを、約１０℃・ｍｉｎ−１で適切な温度まで加熱し、その後、約１分間等温に保持し、その後、データ収集を開始した。
【０２４５】
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ／Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００
Ｘ線粉末回折パターンを、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計で、Ｃｕ  Ｋα放射線（４０ｋＶ，４０ｍＡ）、θ−θゴニオメーター、Ｖ２０の発散および受容スリット、黒鉛二次モノクロメーターならびにシンチレーションカウンターを使用して収集した。この機器は、認証されたコランダム標準物質（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して性能をチェックする。データ収集のために使用したソフトウェアは、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ
Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．３．１であり、そしてデータを、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ  １１，０．０．２またはｖ  １３．０．０．２を使用して分析および表示した。
【０２４６】
サンプルを、周囲条件下で平板標本として、受け取ったままの状態の粉末を使用して実施した。約２０ｍｇのサンプルを、研磨したゼロバックグラウンド（５１０）シリコンウエハ内に切り開かれた空洞にゆるやかに詰めた。このサンプルを、分析中、それ自身の面内で回転させた。このデータ収集の詳細は、以下のとおりである：
・角度範囲：２〜４２°２θ
・ステップサイズ：０．０５°２θ
・収集時間：４ｓ・ステップ−１
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ
Ｘ線粉末回折パターンを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８回折計で、Ｃｕ  Ｋα放射線（４０ｋＶ，４０ｍＡ）、θ−２θゴニオメーターならびにＶ４の発散および受容スリット、ＧｅモノクロメーターおよびＬｙｎｘｅｙｅ検出器を使用して収集した。この機器を、認証されたコランダム標準物質（ＮＩＳＴ  １９７６）を使用して性能をチェックする。データ収集のために使用したソフトウェアは、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ  ２．５．０であり、そしてデータを、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ  １１．０．０．２またはｖ  １３．０．０．２を使用して分析および表示した。
【０２４７】
サンプルを、周囲条件下で平板標本として、受け取ったままの状態の粉末を使用して実施した。約５ｍｇのサンプルを、研磨したゼロバックグラウンド（５１０）シリコンウエハ内に切り開かれた空洞にゆるやかに詰めた。このサンプルを、分析中、それ自身の面内で回転させた。このデータ収集の詳細は、以下のとおりである：
・角度範囲：２〜４２°２θ
・ステップサイズ：０．０５°２θ
・収集時間：０．５ｓ・ステップ−１
本発明のプロセスの工程６から単離された粉末のＸＲＰＤを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅで収集した。図５を参照のこと。このＸ線ディフラクトグラムに対応するデータを以下の表に与える。データ収集のために使用したソフトウェアは、Ｄｉｆｆ  ｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＸＲＤ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ｖ２．６．１であり、そしてデータを、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶＡ  ｖ１３．０．０．２またはｖ１５．０．０．０を使用して分析および表示した。サンプルを、周囲条件下で平板標本として、受け取ったままの状態の粉末を使用して実施した。サンプルを、研磨したゼロバックグラウンド（５１０）シリコンウエハ内に切り開かれた空洞にゆるやかに詰めた。このサンプルを、分析中、それ自身の面内で回転させた。このデータ収集の詳細は、以下のとおりである：
・角度範囲：２〜４２°２θ
・ステップサイズ：０．０５°２θ
・収集時間：０．５ｓ・ステップ−１
【０２４８】
【表１Ｈ】
2020125317.tif 000031
【０２４９】
ＶＴ−ＸＲＰＤ（可変温度Ｘ線回折）は、ＤＳＣサーモグラムに見られる吸熱が、サンプルの脱溶媒和に対応することを明らかにした。なぜなら、加熱の際に形態変化が観察されなかったからである。温度差が、ＤＳＣデータとＶＴ−ＸＲＰＤデータとの間に存在する。なぜなら、ＶＴ−ＸＲＰＤ実験を、サンプルを露出して大きい空間内で行ったのに対し、ＤＳＣ実験を、限定された閉じた空間内で行ったからである。この差は約２０℃であり、サンプルがＤＳＣ実験においてずっとより低い温度で融解した理由、およびサンプルがＶＴ−ＸＲＰＤ実験において１１０℃で依然として結晶性を示した理由を説明している。ＶＴ−ＸＲＰＤは、物質から溶媒を乾燥させることにより結晶性の損失がもたらされたことを示す。このことは、この物質が溶媒和形態であることに一致する。図７を参照のこと。
【０２５０】
水蒸気吸着重量測定（Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ｖａｐｏｕｒ  Ｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＧＶＳ）
吸着等温曲線を、ＤＶＳ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアｖ  １．０．０．３０によって制御されるＳＭＳ  ＤＶＳ固有吸湿分析装置（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｌｙｚｅｒ）を使用して得た。このサンプルの温度を、機器の制御によって２５℃に維持した。湿度を、２００ｍｌ・ｍｉｎ−１の合計流量の乾燥窒素と湿潤窒素との混合気流によって、制御した。相対湿度を、サンプルの近くに配置した較正済みＲｏｔｒｏｎｉｃプローブ（１．０〜１００％ＲＨのダイナミックレンジ）によって測定した。％ＲＨ（相対湿度）の関数としてのサンプルの重量変化（質量緩和）を、微量天秤（精度±０．００５ｍｇ）によって常にモニターした。
【０２５１】
５〜２０ｍｇのサンプルを周囲条件下で、風袋を秤量したメッシュステンレス鋼バスケットに入れた。サンプルを、４０％ＲＨおよび２５℃（典型的な室内条件）で装填および脱装填した。吸湿等温実験を、以下に概説するように行った（２回の走査が完全な１サイクルを与える）。標準等温実験を、２５℃で１０％ＲＨ間隔で、０．５〜９０％ＲＨの範囲にわたって行った。データ分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで、ＤＶＳ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  ｖ６．０．０．７を使用して取り組まれた。ＳＭＳ  ＤＶＳ固有実験のための方法パラメータは、以下のとおりである：
【０２５２】
【表１Ｈ−２】
2020125317.tif 000032
【０２５３】
サンプルを、この等温実験の完了後に回収し、そしてＸＲＰＤによって再度分析した。
【０２５４】
結晶オベチコール酸形態Ｃの分析は、このサンプルがわずかに吸湿性であることを示した。なぜなら、１．１８％の質量増加が０〜９０％ＲＨで認められたからである。この水の取り込みは、この分析全体にわたって一定であり、そして全ての段階について平衡に達していた。この曲線のヒステリシスは小さく、このことは、このサンプルが取り込んだ水を容易に失うことを示す。ＧＶＳ分析後のＸＲＰＤ分析は、このサンプルが変化していないことを示した。図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃを参照のこと。
【０２５５】
Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定（ＫＦ）による水の定量
各サンプルの水含有量を、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＬ３９  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒで、Ｈｙｄｒａｎａｌ  Ｃｏｕｌｏｍａｔ  ＡＧ試薬およびアルゴンパージを使用して測定した。秤量した固体サンプルを、白金ＴＧＡ皿の上の容器に導入し、この容器をｓｕｂａ  ｓｅａｌに接続して水の侵入を防いだ。１回の滴定あたり約１０ｍｇのサンプルを使用し、そして二重の測定を行った。
【０２５６】
Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ分析は、結晶オベチコール酸形態Ｃが１．５％の水を含むことを示した。これは、約０．３モルの水に相当する。
【０２５７】
４０℃および７５％ＲＨでの１週間の安定性
４０℃および７５％ＲＨ（相対湿度）でのオベチコール酸の安定性を、以下のように決定した。オベチコール酸のサンプルを湿度チャンバに４０℃／７５％ＲＨで１週間貯蔵した。サンプルをＸＲＰＤによって再度分析して、変化していないことが判明した。
【０２５８】
固体状態の研究は、比較的多量の有機溶媒の存在が、オベチコール酸形態Ｃを結晶化させるために必要であることを示した。オベチコール酸形態１のサンプルが貯蔵中に自発的に結晶化して結晶オベチコール酸形態Ｃを形成することは、まずありえない。
【０２５９】
実施例４：オベチコール酸錠剤処方
以下の表は、オベチコール酸錠剤の定量的組成を示す。５ｍｇ、１０ｍｇ、および２５ｍｇの製剤を、フェーズ３の臨床試験物質として使用してきた。
【０２６０】
【表１Ｉ】
2020125317.tif 000033
【０２６１】
ＡＰＩ：医薬品有効成分
ＨＳＥ＝社内仕様書
ＵＳＰ−ＮＦ＝米国薬局方国民医薬品集
Ｐｈ  Ｅｕｒ＝欧州薬局方
ＪＰ＝日本薬局方
＊提示されたオベチコール酸の量は、ＡＰＩが無水物であり１００％純粋であると仮定している。実際の量は、使用される製剤原料ロットの力価に基づいて調整され、そしてこれに対応して、微結晶セルロースの量が減少される。
【０２６２】
実施例５：オベチコール酸形態１の特徴付け
オベチコール酸形態１とは、オベチコール酸の非結晶形態をいう。この形態のオベチコール酸は、合成中間体としての結晶オベチコール酸を介して製造され得る。オベチコール酸形態１は、薬学的に活性な成分として使用され得る。オベチコール酸形態１を、以下のように特徴付けおよび分析した。
【０２６３】
オベチコール酸形態１のバッチ１を、以下の技術を使用して特徴付けた：結晶性についてのＸ線粉末回折（ＸＰＲＤ）による評価、１Ｈおよび１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）、光学的評価（例えば、粒子の形状／サイズ）、熱特性（例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および熱重量分析（ＴＧＡ））、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）による水の定量、４０℃および７５％ＲＨでの貯蔵ならびに２週間後のＸＲＰＤによる再分析、電位差測定法によるｐＫａ、電位差測定法によるＬｏｇ  Ｐ／Ｄ（オクタノール／水）、ならびに水蒸気吸着重量測定（ＧＶＳ；例えば、ＸＲＰＤによって収集された固体の分析による完全な吸着−脱着サイクル）を使用する水分に対する安定性。オベチコール酸形態１の他の５つのバッチ（例えば、バッチ２、３、４、５、および６）についてもまた、以下の技術を使用して特徴付けおよび比較を行った：ＸＲＰＤによる評価および主要バッチ１のパターンとの比較、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲ、光学的評価（例えば、粒子の形状／サイズ）、熱特性（例えば、ＤＳＣ、ＴＧＡ、およびホットステージ顕微鏡法）、ならびにＫＦによる水の定量。
【０２６４】
Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析
Ｘ線粉末回折パターンを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｃ２  ＧＡＤＤＳ回折計で、Ｃｕ  Ｋα放射線（４０ｋＶ，４０ｍＡ）、自動サンプル位置設定のための自動ＸＹＺステージレーザービデオ顕微鏡、およびＨｉＳｔａｒ二次元領域検出器を使用して収集した。Ｘ線光学部品は、０．３ｍｍのピンホールコリメータに連結された、単一Ｇｏｅｂｅｌ多層ミラーから構成される。ビームの発散（すなわち、サンプル上のＸ線ビームの有効サイズ）は、約４ｍｍであった。θ−θ連続走査モードを、２０ｃｍのサンプル−検出器間距離で使用した。これは、３．２°〜２９．７°の有効２θ範囲を与える。典型的には、サンプルをＸ線ビームに１２０秒間曝露した。データ収集のために使用したソフトウェアは、ＧＡＤＤＳ  ｆｏｒ  ＷＮＴ  ４．１．１６であり、そしてデータを、Ｄｉｆｆｒａｃ  Ｐｌｕｓ  ＥＶ  Ａ  ｖ  ９．０．０．２またはｖ  １３．０．０．２を使用して分析および表示した。
【０２６５】
周囲条件下で実施されるサンプルを、平板標本として、受け取ったままの状態の粉末を粉砕せずに使用して調製した。約１〜２ｍｇのサンプルをシリコンウエハに軽く押し付けて、平坦な表面を得た。ディフラクトグラムは、オベチコール酸形態１が非結晶性であることを示す（図１０および図１１を参照のこと）。
【０２６６】
ＮＭＲ特徴付け
ＮＭＲスペクトルを、ＤＲＸ４００コンソールにより制御される、オートサンプラーを備え付けたＢｒｕｋｅｒ  ４００  ＭＨｚ機器で収集した。自動化された実験結果を、標準Ｂｒｕｋｅｒ装填実験を使用してＴｏｐｓｐｉｎ  ｖ  １．３（パッチレベル８）で実行するＩＣＯＮ  ＮＭＲ  ｖ４．０．４（ｂｕｉｌｄ  １）を使用して取得した。非ルーチン分光法について、データをＴｏｐｓｐｉｎ単独の使用により取得した。他に記載されない限り、サンプルをｄ６−ＤＭＳＯ中で調製した。オフライン分析を、ＡＣＤ  ＳｐｅｃＭａｎａｇｅｒ  ｖ  ９．０９（ｂｕｉｌｄ  ７７０３）を使用して実施した。
【０２６７】
図１２は、バッチ１についての１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。バッチ２〜６の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルもまた記録し、そしてバッチ１のスペクトルと比較した。図１３を参照のこと。これらのスペクトルは全て類似したものであるが、水の含量が異なる。いくらかの差が、０．７５ｐｐｍ〜２ｐｐｍの多数のプロトン群の積分において見られ、ここではピークが重なっており、別々に積分することができない。表Ｊは、０．７５〜２ｐｐｍの領域の変化を考慮に入れて、バッチ１〜６のスペクトルにおいて積分されたプロトンの総数を示す。
【０２６８】
【表１Ｊ】
2020125317.tif 000034
【０２６９】
カルボン酸のプロトンを除外したので、プロトンの数は４３であるはずであるが、実際には、これらの６つのスペクトルの間で、４０個から４３個で変動する。しかし、この変動が生じる領域（０．７５〜２ｐｐｍ）はかなり広く、そしてベースラインの質にも起因して、この積分値を信頼することはできない。
【０２７０】
これらのスペクトルが完全には帰属されず、そして積分が変動したので、バッチ２の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを記録した。図１４は、ＤＥＰＴＱスペクトルを示す。ここでＣＨ２および第四級炭素のピークは上向きであり、一方で、ＣＨ３基およびＣＨ基は下向きである。１３本の下向きのピークが存在し、これらは、９個のＣＨ基および４個のＣＨ３基に対応する。これは、その構造と一致する。カルボン酸の炭素のピークは、１７５ｐｐｍに見られた。関心のある領域を明瞭にするために、このピークをこの拡大図から除いた。しかし、上向きのピークが１１本しか存在しないが、これは１２本存在するべきである。なぜなら、１０個のＣＨ２基および２個の第四級炭素が（カルボニルを除いて）この分子に存在するからである。１個の炭素は、別のシグナルと重なっているようである。従って、第四級炭素のシグナルを抑制してＤＥＰＴ１３５スペクトルを収集し、これにより、重なるシグナルが第四級であるか否かを示すことができた。図１５を参照のこと。ＤＥＰＴ１３５スペクトルとＤＥＰＴＱスペクトルとの比較は、１本の（４２．５ｐｐｍの）ピークが消失することを示す。２個の第四級炭素がこの分子には存在し、これらは、消失する２本のピークに対応するはずである。従って、重なる炭素のシグナルは、第四級のシグナルである。
【０２７１】
さらに、炭素の緩和時間を決定するための実験を行って、失われた第四級炭素シグナルがどこで別の炭素シグナルと重なっているかを決定した。図１６を参照のこと。この１３Ｃスペクトルは、積分されたピークを含む。これは、３２．３ｐｐｍのピークが２個の炭素から成ることを示した。３２．３ｐｐｍのピークの拡大図について、図１７を参照のこと。従って、２６個の炭素がここで、積分によって（カルボン酸を含めて）説明され、これは、その構造と一致する。
【０２７２】
ＡＴＲによるＦＴ−ＩＲ
データを、ユニバーサルＡＴＲサンプリングアクセサリを取り付けたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅで収集した。これらのデータを、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ
ｖ５．０．１ソフトウェアを使用して収集および分析した。図１８を参照のこと。
【０２７３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および熱重量分析（ＴＧＡ）による熱分析
ＤＳＣデータを、５０位置のオートサンプラーを備え付けたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ２０００で収集した。この機器を、エネルギーおよび温度較正について、認証されたインジウムを使用して較正した。典型的には、ピンホール付きアルミニウム皿中の０．５〜３ｍｇの各サンプルを、１０℃・ｍｉｎ−１で２５℃から３００℃まで加熱した。５０ｍｌ・ｍｉｎ−１での窒素パージをこのサンプル上に維持した。機器制御ソフトウェアは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｆｏｒ  Ｑ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｖ２．８．０．３９２およびＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｖ４．８．３であり、そしてデータを、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ４．３Ａを使用して分析した。変調ＤＳＣのために、サンプルを先と同様に調製し、そして皿を２℃・ｍｉｎ−１で２５℃から２００℃まで加熱した。変調条件は、０．２０℃の振幅および４０ｓの周期性であった。サンプリング間隔は１ｓｅｃ／ｐｔであった。
【０２７４】
ＴＧＡデータを、１６位置のオートサンプラーを備え付けたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｑ５００  ＴＧＡで収集した。この機器を、認証されたアルメルを使用して温度較正した。典型的には、５〜１０ｍｇの各サンプルを、予め風袋重量を秤量した白金るつぼおよびアルミニウムＤＳＣ皿に入れ、そして１０℃・ｍｉｎ−１で周囲温度から３５０℃まで加熱した。６０ｍｌ・ｍｉｎ−１での窒素パージを、このサンプル上で維持した。機器の制御のソフトウェアは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｆｏｒ  Ｑ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｖ２．８．０．３９２およびＴｈｅｒｍａｌ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｖ４．８．３であった。
【０２７５】
バッチ１の熱分析を、ＤＳＣおよびＴＧＡによって実施した。ＴＧＡ追跡（図１９を参照のこと）は、周囲温度と１２１℃との間で１．７％の重量減少を示し、これはおそらく、水の損失である。ＤＳＣ追跡（図１９を参照のこと）は、幅広い低温での吸熱を示し、これはおそらく、水の損失に対応し、その後、９４℃で開始する小さい吸熱がある。
【０２７６】
この第二の吸熱は、ガラス転移を示しているかもしれなかったので、変調ＤＳＣによってさらに研究した（図２０を参照のこと）。この技術は、可逆事象（例えば、ガラス転移）を非可逆事象（例えば、溶媒の損失または結晶形態の融解）と区別することを可能にする。変調ＤＳＣにおける可逆的熱流の追跡は、ガラス転移を、変曲点（Ｔｇ）を９５℃に有する一つの段として表す。これは、ガラス転移としては高いので、形態１が安定であることを示唆する。非可逆的熱流追跡の８９℃に開始を有する小さい吸熱は、ガラス転移温度でのこのバルク物質の分子緩和に相当する。
【０２７７】
ＤＳＣ追跡（図１９を参照のこと）は、分解が２２０℃のあたりで開始することを示す。これはまた、下方向に湾曲するＴＧＡ追跡に対応する。
【０２７８】
バッチ１、２、３、４、５、および６のＴＧＡ追跡は、類似した形状である（図２１）。周囲温度と１２０℃との間で測定される重量減少を表Ｋに示す。これらは、ＮＭＲによって観察される変動した水の量と一致する。これらの量を、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）水分滴定によってさらに定量した。ＦＫによる水定量を参照のこと。
【０２７９】
【表１Ｋ】
2020125317.tif 000035
【０２８０】
図２２は、比較のために、６つのバッチのＤＳＣ追跡を示す。これらの追跡は類似したものでであり、ＤＳＣおよびＴＧＡのセクションに見られるように、幅広い低温での様々なサイズの吸熱（変動する水の量と一致する）が存在し、その後、ガラス転移温度のあたりに小さい吸熱が存在する。これらの結果を表Ｌに要約する。
【０２８１】
【表１Ｌ】
2020125317.tif 000036
【０２８２】
偏光顕微鏡（ＰＬＭ）
サンプルを、Ｌｅｉｃａ  ＬＭ／ＤＭ偏光顕微鏡で、画像捕捉のためにデジタルビデオカメラを用いて研究した。少量の各サンプルをスライドガラス上に置き、個々の粒子を可能な限り分離してシリコーン油中に標本化し、そしてカバーガラスで覆った。。サンプルを、適切な倍率で、λ着色フィルタにカップリングした部分偏光で観察した。
【０２８３】
図２３Ａ〜図２３Ｆは、バッチ１、２、３、４、５、および６が、小さい不規則な粒子の大きく硬い凝集物からなる物質であることを示す。バッチ１、２、３、４、５、および６は全て類似して見える。複屈折は、面偏光下では観察されなかった。このことは、この物質が非結晶性であることと一致する。粒子サイズは、１μｍ〜３μｍより小さい範囲である。これらの粒子の小さいサイズは、これらが非常に迅速に沈殿したことを示唆する。
【０２８４】
水蒸気吸着重量測定（ＧＶＳ）
吸着等温曲線を、ＳＭＳ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアによって制御されるＳＭＳ  ＤＶＳ固有吸湿分析装置を使用して得た。このサンプルの温度を、機器の制御によって２５℃に維持した。湿度を、２００ｍｌ・ｍｉｎ−１の合計流量の乾燥窒素と湿潤窒素との混合気流によって、制御した。相対湿度を、サンプルの近くに配置した較正済みＲｏｔｒｏｎｉｃプローブ（１．０〜１００％ＲＨのダイナミックレンジ）によって測定した。％ＲＨの関数としてのサンプルの重量変化（質量緩和）を、微量天秤（精度±０．００５ｍｇ）によって常にモニターした。
【０２８５】
典型的には、５〜２０ｍｇのサンプルを周囲条件下で、風袋を秤量したメッシュステンレス鋼バスケットに入れた。サンプルを、４０％ＲＨおよび２５℃（典型的な室内条件）で装填および脱装填した。吸湿等温実験を、以下に概説するように行った（２回の走査が完全な１サイクルを与える）。標準等温実験を、２５℃で１０％ＲＨ間隔で、０．５〜９０％ＲＨの範囲にわたって行った。
【０２８６】
【表１Ｍ】
2020125317.tif 000037
【０２８７】
水蒸気吸着重量測定（ＧＶＳ）の等温曲線をバッチ１について２５℃で得た。これを図２４に示す。このサンプルは、中程度に吸湿性であるようであり、０から９０％の相対湿度（ＲＨ）で３．８％の総重量変化を有する。そのヒステリシス（吸着曲線と脱着曲線との間の面積）は小さく、このことはその固体が吸着した水を非常に容易に放出することを示す。水和物の形成は観察されない。実験全体の後に、有意な重量変化は存在しなかった（０．３％）。
【０２８８】
ＧＶＳの速度論プロット（図２５）は、水の吸着が主として非常に高い湿度で起こり、そして脱着は非常に低い湿度で起こったことを示す。吸着段階において、このサンプルは８０％ＲＨまで非常に急速に平衡に達し、そして９０％ＲＨで平衡化するにはより長い時間がかかった。脱着において、その質量は全ての段階で安定化した。
【０２８９】
ＧＶＳの完了後、サンプルを回収してＸＲＰＤにより再度分析し、これは、この物質がまだ非結晶性のままであることを示した（図２６）。
【０２９０】
Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）による水の定量
各サンプルの水含有量を、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＬ３９  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｅｒで、Ｈｙｄｒａｎａｌ  Ｃｏｕｌｏｍａｔ  ＡＧ試薬およびアルゴンパージを使用して測定した。秤量した固体サンプルを、白金ＴＧＡ皿の上の容器に導入し、この容器をｓｕｂａ  ｓｅａｌに接続して水の侵入を防いだ。１回の滴定あたり約１０ｍｇのサンプルを使用し、そして二連の測定を行った。
【０２９１】
電量Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒによる水分の滴定は、２．４重量％の水という結果を与えた。これは、ＴＧＡによって観察された重量減少よりわずかに高い。このことは、いくらかの水が加熱に際してこの物質から放出されるのではなく、おそらく、これらの２つの技術についての異なる実験手順に起因することを意味し得る。
【０２９２】
各バッチの水含有量を、電量Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒによって決定した。表Ｎは、これらの結果を示し、そしてこれらを、以前に得られたＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ結果およびＴＧＡによって観察された重量減少と比較している。３つ全ての分析において傾向が同じであるので、データは矛盾しない。以前に得られたＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒデータは、ここで得られた結果より低い水の量を示す。このことは、この物質が吸湿性であるが、いくつかのサンプルは他のサンプルより多くの水を取り込んだことと一致する。ＴＧＡ重量減少は、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定によって得られた結果より一貫して低い。このことは、いくらかの水がこの物質中に捕捉されたままであって加熱の際に放出されるのではなく、これもまた実験手順に起因し得ることを意味し得る。
【０２９３】
【表１Ｎ】
2020125317.tif 000038
【０２９４】
ｐＫａの測定および予測
ｐＫａ測定データを、Ｄ−ＰＡＳアタッチメントを備えたＳｉｒｉｕｓ  ＧｌｐＫａ機器で収集した。測定を２５℃で、水溶液中でＵＶにより、およびメタノール水混合物中で電位差測定法により、行った。滴定媒質を、０．１５ＭのＫＣｌ（ａｑ）でイオン強度調整（ＩＳＡ）した。メタノール水混合物中で見出された値を、Ｙａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ外挿法によって、０％の共溶媒に対して補正した。これらのデータを、Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏソフトウェアｖ１．０を使用して改良した。ｐＫａ値の予測を、ＡＣＤ  ｐＫａ予測ソフトウェアｖ９を使用して行った。
【０２９５】
【化２０】
2020125317.tif 000039
【０２９６】
オベチコール酸のｐＫａを、電位差測定法によって、メタノールを共溶媒として使用して測定し（図２７）、そしてＹａｓｕｄａ−Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ外挿法を使用して、０％の共溶媒に対して外挿した（図２８）。ｐＫａは、所定のｐＨにおけるその化合物の中性型と電離型との割合の決定を可能にする。図２９は、ｐＨに依存する種の分布を示す。
【０２９７】
Ｌｏｇ  Ｐの決定
データを、Ｓｉｒｉｕｓ  ＧｌｐＫａ機器での電位差滴定によって、３種類の比率のオクタノール：イオン強度調整（ＩＳＡ）水を使用して収集し、Ｌｏｇ  Ｐ、Ｌｏｇ  Ｐｉｏｎ、およびＬｏｇ  Ｄの各値を生成した。これらのデータを、Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏソフトウェアｖ１．０を使用して改良した。Ｌｏｇ  Ｐ値の予測は、ＡＣＤ  ｖ９およびＳｙｒａｃｕｓｅ  ＫＯＷＷＩＮ  ｖ１．６７ソフトウェアを使用して行った。
【０２９８】
【表１Ｏ】
2020125317.tif 000040
【０２９９】
ＬｏｇＰをＡＣＤソフトウェアを使用して予測し、そして電位差測定法によって測定した。３回の滴定を、３種類の比率の異なるオクタノール／ＩＳＡ水で実施して、図３０にプロットした差曲線を得た。黒色の曲線は、純粋な水でのｐＫａ滴定であり、そして３つの色付きの曲線は、オクタノール／ＩＳＡ水の３種類の比率に対応する。ｐＫａのシフトは、ＬｏｇＰの決定を可能にする。
【０３００】
親油性曲線（ｐＨの関数としてのｌｏｇＤ）を図３１に示す。Ｌｏｇ  Ｄは、分布係数であり、特定のｐＨにおいて存在する全ての種の合わせた親油性を表す。ＬｏｇＰは、化合物定数であり、純粋な中性種の分配係数に対応する。一方で、ＬｏｇＰｉｏｎは、純粋な電離種の定数である。ＬｏｇＰおよびＬｏｇＰｉｏｎは、親油性曲線から、Ｙ軸と、それぞれ、ｐＨスケールの開始の接線（分子が純粋にその中性型にあるとき）、およびｐＨスケールの終了の接線（分子が完全に電離したとき）との交点として決定され得る。
【０３０１】
４０℃および７５％ＲＨ、ならびに２５℃および９７％ＲＨでの２週間の安定性バッチ１のサンプルを、固体形態の加速安定性試験において、４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で貯蔵した。別のサンプルを、２５℃および９７％の相対湿度で貯蔵して、非常に高い湿度の影響をチェックした。両方のサンプルを、５日後および２週間後に、ＸＲＰＤによって再度分析した。両方のサンプルは、２週間まで、これらの２つの貯蔵条件下で非結晶性のままであった。このことは、形態１がこれらの条件下で安定であることを示す。図３２および図３３を参照のこと。
【０３０２】
分析した６つのバッチは全て、非結晶性であった。ガラス転移温度を、９５℃で変調ＤＳＣ実験を用いて測定した。これらの６つのバッチは、使用した全ての分析技術において非常に類似しているようであり、これらの間の唯一の違いは、水含有量であり、これはＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定によれば、１．９％から２．８％の変動があった。熱分析は、水の変動量を示し、そして１７５〜２２０℃のあたりで分解の開始を示した。測定されたｐＫａは４．８２であり、そしてＬｏｇＰは５．５４であった。顕微鏡評価は、非常に小さい不規則な粒子の大きな硬い凝集物を示した。
【０３０３】
安定性試験は、加速条件下（４０℃／７５％ＲＨ）においても、あるいは高湿度（２５℃／９７％ＲＨ）においても、この物質が２週間後に依然として非結晶性であることを示した。水蒸気吸着重量測定（ＧＶＳ）の分析は、この物質が中程度にのみ吸湿性であり、０から９０％の相対湿度（ＲＨ）で３．８％の総重量増加を有することを示した。ＧＶＳでは水和物形成は観察されなかった。ＧＶＳの後にＸＲＰＤによって再度分析されたサンプルは依然として非結晶性であった。高いガラス転移温度および安定性試験の結果は、この非結晶形態が安定であることを示唆する。
【０３０４】
実施例６：単結晶Ｘ線構造および絶対立体化学
オベチコール酸の単結晶Ｘ線構造を、０．１℃／ｍｉｎで５℃までの冷却、その後、ＲＴ／５０℃で８ｈ成熟化するサイクルを１週間行った後に、アセトニトリル溶液からのオベチコール酸の再結晶から得た結晶から決定した（図３４を参照のこと）。この構造は、形態Ｇと一致し、そしてシミュレートしたＸＲＰＤパターンを、この物質についての参照パターンとして作製した。形態Ｇは、オベチコール酸の、例えばアセトニトリル中の溶液を冷却することによって調製され得る。
【０３０５】
その構造は、斜方晶系の空間群Ｐ２１２１２１であり、１分子のオベチコール酸をその非対称単位に含む。最終Ｒ１［Ｉ＞２σ（Ｉ）］＝３．２２％。この結晶は、近似寸法０．４×０．４×０．３ｍｍのプリズムモルフォロジーを示した。この分子の絶対立体化学を、Ｆｌａｃｋパラメータ＝−０．０１（１３）を用いて、キラル中心Ｃ５、Ｃ９、Ｃ１０およびＣ１４においてＳ、そしてキラル中心Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１３、Ｃ１７およびＣ２２においてＲと決定した。キラル中心Ｃ５、Ｃ９、Ｃ１０およびＣ１４がＲ配置であり、そしてキラル中心Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１３、Ｃ１７およびＣ２２がＳ配置である、逆の構造については、Ｆｌａｃｋパラメータ＝１．０１（１３）であり、上記帰属を確認した。
【０３０６】
全体として、この構造は、力強いデータセットを有し、ディスオーダーを有さなかった。
【０３０７】
【化２１】
2020125317.tif 000041
【０３０８】
立体化学を帰属するために使用したソフトウェア（ＰＬＡＴＯＮ）は、キラル中心（Ｃ８）をＲ立体中心と決定し、一方で、（Ｃ８）についてのＡＣＤソフトウェア（およびカーン−インゴールド−プレローグ）による帰属は、Ｓである。しかし、Ｂ／Ｃ環系についてのトランスの環接合部の帰属は、その結晶構造から絶対的に定義される。
【０３０９】
Ｂｉｊｖｏｅｔ差に関してＢａｙｅｓｉａｎ統計を使用する絶対構造の決定（Ｈｏｏｆｔら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．，（２００８），４１，９６−１０３）は、正しいものとして提示される場合の絶対構造の確率が１．０００であり、一方で、ラセミ体の対または誤りである絶対配置の確率がそれぞれ０．０００および０．０００であることを明らかにする。Ｆｌａｃｋの等式およびその不確実性は、このプログラムによって−０．０１９（１７）であると計算される。
【０３１０】
オベチコール酸の構造は、１個の５員環および３個の六員環を含み、これらは互いに縮環している。この５員環（Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６およびＣ１７））に関する配座解析は、この環についての最近接パッカリング記述子（ｔｈｅ  ｃｌｏｓｅｓｔ  ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）が半いす（ｈａｌｆ−ｃｈａｉｒ）であることを明らかにする。これらの３個の６員環（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ１０）；（Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＣ１０）ならびに（Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３およびＣ１４）に関する配座解析は、この環についての近接パッカリング記述子がいす（ｃｈａｉｒ）であることを明らかにする。
【０３１１】
２つの特有の分子間水素結合が、この結晶構造において観察される。オベチコール酸の各分子は、対称関係にある異なる２分子のオベチコール酸への水素結合を形成し、酸素Ｏ１およびＯ４がそれぞれ、アクセプターとして働く酸素Ｏ３およびＯ１へのドナーとして働く。Ｏ１−Ｈ１Ｃ−−−Ｏ３［Ｄ…Ａ＝２．７４１９（１２）Å］およびＯ４−Ｈ４Ｃ−−−Ｏ１［Ｄ…Ａ＝２．６０５３（１３）Å（図３５を参照のこと）。これらの相互作用は、複雑な三次元の水素結合したネットワークをもたらす。最終差フーリエマップは、それぞれ０．４０２ｅÅ−３および−０．１７６ｅÅ−３の最大電子密度および最小電子密度を示す。
【０３１２】
この構造について計算したＸＲＰＤパターンと実験バッチとの重ね合わせは、この結晶がこの実験バルクと一致し、そしてオベチコール酸形態Ｇであることを示す（図３６を参照のこと）。
【０３１３】
【表１】
2020125317.tif 000042
【０３１４】
【表２】
2020125317.tif 000043
【０３１５】
実施例７：オベチコール酸形態１（非結晶性）と結晶（形態Ｆ）形態との間の生物学的利用率の差
固体オベチコール酸の物理的状態は、被験体（例えば、ラット）に経口投与される場合の、この分子の生物学的利用率に影響を与え得る。以下に記載される研究を行って、単回の経口投与後の血漿中動態および腸吸収の効率、ならびにオベチコール酸の固体の非結晶形態および結晶形態の薬物動態を評価した。オベチコール酸形態１（非結晶性）または形態Ｆの投与後の、時間に対するオベチコール酸の血漿中濃度のプロフィール、ｔｍａｘ、ＣｍａｘおよびＡＵＣを、比較した（図３７〜図３８を参照のこと）。
【０３１６】
オベチコール酸形態１（非結晶性）および形態Ｆをラットに投与し、そして各動物において、血液を、少なくとも３時間にわたって異なる期間で採集した。オベチコール酸の各形態について６匹の動物を用いて研究した。
【０３１７】
実験プロトコル：
使用した試験物質は、オベチコール酸形態１（非結晶性）および結晶形態Ｆであった。形態Ｆは、アセトニトリルまたはニトロメタンからの成熟によって調製され得る。処方物を、水中でｐＨ４の懸濁物として調製した。研究モデルは、約２２５〜約２５０ｇの成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。１回の投薬経路あたり６匹の動物を使用した。投薬量は、ＰＯ  ２０ｍｇ／ｋｇ／５ｍＬである。これらの動物を一晩絶食させ、その後、オベチコール酸の処方物で処置した。経口投与を、経胃強制給餌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｇａｖａｇｅ）によって行った。
【０３１８】
１日目に、動物に、左頸静脈に埋め込まれるカニューレ（ＳＯＰ  ＶＩＶＯ／ＳＡＦ６）を取り付け、麻酔をイソフルランによって得た。実験を、外科手術からの回復の１日後に開始した。約５００μＬの血液（２５０μＬの血漿）を、カニューレを介してヘパリン処理した注射器（ヘパリンＮａ）内に採取し、そして氷／水浴中のマイクロチューブに速やかに集めた。１時間以内に、サンプルを１００００×ｇで５分間、４℃にて、遠心分離した。血漿をマイクロチューブに速やかに移し、そして−２０℃で貯蔵した。血液のサンプルを、投与の３０分後、１時間後、１．３時間後、２時間後、および３時間後に集めた。血漿サンプルを、ＨＰＬＣ−ＥＳ／ＭＳ／ＭＳ定量法を使用して分析した。薬物動態研究を、ノンコンパートメント解析法(ｎｏｎ-ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ)を
使用して実施した。
【０３１９】
結果：
２種類の固体形態について、２０ｍｇ／Ｋｇ  体重（ｂ．ｗ）の単回用量を経口投与した後のオベチコール酸の平均血漿中濃度を、図３７に報告する。これらの値は、各処方物についての６セットの実験の平均である。標準偏差をこのグラフ中に報告する。
【０３２０】
結晶形態の投与後、１．５時間後にＣｍａｘに達し、そして血漿中オベチコール酸濃度は、１つの極大値を有する通常の動態に従い、そして３時間後、この量はＣｍａｘのほぼ半分である。
【０３２１】
オベチコール酸形態１（非結晶性）の投与後の動態プロフィールについては、形態１は、結晶形態Ｆとは異なる。初期の血漿中濃度のピークは３０分後に得られ、そして２番目のピークが２時間後に得られる。６匹のラットにおけるデータの変動は非常に低く、そしてこの挙動は、結晶形態のものとは統計学的に異なる。研究がなされた３時間でのＡＵＣは、この結晶形態に関して、より大きい。この動態は、オベチコール酸が、３時間後にも依然として血漿中に存在することを示唆する。オベチコール酸の肝臓の通過は、肝臓代謝産物であるタウロ結合体（この結合体は、胆汁中に分泌され、そして腸肝循環において蓄積する）を生成することが、以前に実証されている。従って、タウロ結合体の測定は、肝臓を通るオベチコール酸の量を決定するために使用され得る。タウロ結合体生成の速度が図３８に報告されており、これは、結晶形態の投与後に、タウロ結合体生成がより速く、そしてより高い濃度が達成されることを示す。
【０３２２】
融点およびガラス転移
オベチコール酸形態１（非結晶性）（すなわち、形態１）および結晶形態Ｆの融点を、通常の方法を使用して測定した。ケノデオキシコール酸およびウルソデオキシコール酸の融点を、参照化合物として測定した。測定は三連で実施した。結晶形態について、その固体から液体の状態への転移は、融点（Ｔｍ）として規定され、一方で、非結晶形態については、ガラス転移温度（Ｔｇ）として規定される。表に、セ氏の℃とケルビン°Ｋとの両方で表された測定値を報告する。
【０３２３】
【表３】
2020125317.tif 000044
【０３２４】
結果：
ＣＤＣＡおよびＵＤＣＡについて得られた値は、以前に報告された値と一致し、ここでＵＤＣＡの融点は、ＣＤＣＡの融点より高い。形態１のガラス転移温度Ｔｇ（１０２〜１１２℃）は、形態Ｆの融点Ｔｍ（１２０〜１２４℃）より低い。この観察されたパターンは、２つの固体形態が比較される場合の、以前の報告データと一致する。形態Ｆは、より高い温度（２３５〜２３７℃）に、さらなる転移を有する。
【０３２５】
最高融点温度とガラス転移温度（ケルビンで表される場合）との間の比は、他の薬物および他の胆汁酸と非常に類似している（Ｊ．Ｋｅｒｃら．Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５（２４８）８１−９５）。
【０３２６】
示差走査熱量測定分析
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を行って、オベチコール酸の結晶形態および非結晶形態の融点および物理的状態をよりよく規定した。使用した器具は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣモデル８２１ｅであった。それぞれ約４〜５ｍｇの形態１および形態Ｆをこの分析に供した。これらの化合物を、１０℃／ｍｉｎの加熱速度で３０〜３００℃の温度範囲に曝露した。
【０３２７】
図３９は、オベチコール酸結晶形態Ｆについて得られたＤＳＣ曲線を示す。１２０．０４℃における１つの吸熱転移が検出され、これは、この化合物の融点に対応する。この結果をまた、ホットステージ顕微鏡法（ＨＳＭ）によって確認した。３０°〜２４０℃の範囲で、観察された固−液転移は、１２２〜１２４℃においてであった。このＤＳＣ追跡において、形態Ｆについて得られたピークの形状および強度は、結晶形態によって示される典型的な挙動と一致する。しかし、ピークの幅がやや広い。これは、均質ではない結晶に起因し得る。熱重量分析（ＴＧＡ）は、３０〜３００℃の温度範囲において、いかなる重量減少も示さなかった。
【０３２８】
図４０は、オベチコール酸非結晶形態１について得られたＤＳＣ曲線を示す。７９．９５℃において１つの吸熱転移が観察された。ピークの形状および強度は、非結晶性の化合物について予期される挙動と一致する。これらの物質について、固−液転移（ガラス転移）のために必要とされるエネルギーは、結晶化合物よりも低い。このサーモグラムは、３０〜３００℃の温度範囲において、いかなる重量減少も示さなかった。
【０３２９】
水への溶解度
オベチコール酸形態１（非結晶性）（すなわち、形態１）および結晶形態Ｆの水への溶解度を、当該分野において公知である手順に従って測定した。要約すれば、固体を低ｐＨ（ＨＣｌ  ０．１ｍｏｌ／Ｌ）の水に懸濁させ、そして２５℃で１週間、わずかに撹拌しながら平衡化させた。この飽和溶液を濾過し、そして溶液中の化合物の濃度をＨＰＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。
【０３３０】
結果：
【０３３１】
【表４】
2020125317.tif 000045
【０３３２】
形態１は、形態Ｆについての９．１μｍｏｌ／Ｌに対して、より高い溶解度１７．９μｍｏｌ／Ｌを提示する。
【０３３３】
オベチコール酸の生物学的利用率データでは、結晶形態Ｆは、オベチコール酸形態１（非結晶性）よりも高い。形態１の方が投与後、より初期に血漿中濃度ピークがあるにもかかわらず、これらの血漿中プロフィールは、形態Ｆの方が、より効率的に吸収され（より大きいＡＵＣ）、そしてその動態はより規則的でさえあり、腸の内容物における薬物の最適な分布を反映することを示す。形態１は、この初期のピークを示し、次いで、より後の第二のピークを示し、そのＣｍａｘは、形態ＦのＣｍａｘより低い。
【０３３４】
形態１の水への溶解度は、形態Ｆの水への溶解度より高い。形態Ｆは、安定であるようである。なぜなら、熱重量分析（ＴＧＡ）は、研究した温度範囲においていかなる重量減少も示さなかったからである。
【０３３５】
これらの結果によれば、形態Ｆは、経口投与される場合、腸によってより効率的に吸収され、そして肝臓によってより効率的に取り込まれるようである。主要な肝臓代謝産物であるタウロ結合体の形成の速度は、形態１と比較して、形態Ｆについてはほぼ２倍である。このことは、腸肝循環におけるより効率的な輸送および蓄積、ならびにその３時間後の血漿中濃度を示唆する。
【０３３６】
実施例８：放射標識されたオベチコール酸の調製
放射標識されたオベチコール酸を、以下のスキームに従って調製した。
【０３３７】
スキーム５
【０３３８】
【化２２】
2020125317.tif 000046
【０３３９】
ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣ１３溶液およびＭｅＯＤ−ｄ４溶液中で、外径（ｏ.d.）
５ｍｍのチューブ（Ｎｏｒｅｌｌ，Ｉｎｃ．５０７−ＨＰ）内で３０℃で記録し、そしてＶａｒｉａｎ  ＶＮＭＲＳ−４００で、１Ｈについて４００ＭＨｚで収集した。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ＝０．００ｐｐｍ）に相対的であり、ｐｐｍで表される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを、ＥＳＴ（−）電離モードで作動するＡｃｃｅｌａ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔで、イオントラップ質量分析計で測定した。ＨＰＬ  Ｃを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ（カラム：Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ
Ｃ８，２５０×４．６ｍｍ，５μｍ，４０℃）で、ラインβ−Ｒａｍで測定した。比活性を、ＬＳＡ（液体シンチレーション分析器，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２９００ＴＲ）で測定した。
【０３４０】
化合物２Ｘの調製
【０３４１】
【化２３】
2020125317.tif 000047
【０３４２】
ジイソプロピルアミン（１．５９ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（６．０ｍＬ）中の溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（６．３０ｍＬ，２．５Ｍ，１５．８ｍｍｏｌ）を−２０℃で添加した。この反応混合物を−２０℃で１時間撹拌した後に、−７８℃に冷却し、そしてＴＭＳＣ１（１．７２ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）を添加し、その後、乾燥ＴＨＦ（６．０ｍＬ）中の化合物１Ｘ（３．００ｇ，６．２９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を−７８℃で１時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３の添加によりクエンチし、そして室温で３０分間撹拌した。その有機層を分離し、そして減圧濃縮して、化合物２Ｘ（３．２９ｇ，９５％）を得、そしてさらに精製せずに次の工程に使用した。
【０３４３】
化合物３Ｘの調製
【０３４４】
【化２４】
2020125317.tif 000048
【０３４５】
トルエン（１．０ｍＬ）中の［１−１４Ｃ］アセトアルデヒド（３３０ｍＣｉ，５．６３ｍｉｎｏｌ）（［１４Ｃ］ＢａＣＯ３（ＳＡ＝５８．６ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）から調製）およびＤＣＭ（２．０ｍＬ）中のアセトアルデヒド（１３０ｍｇ，２．９５ｍｍｏｌ）を−７８℃で混合し、次いで化合物２Ｘ（３．２９ｇ，６．００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１３．０ｍＬ）中の溶液に移し、その後、ＢＦ３・ＯＥｔ２（１．０５ｇ，７．４０ｍｍｏｌ）を−７８℃で添加した。この反応混合物を、−７８℃で１時間撹拌した後に、３５℃まで温め、そして上記温度で１時間撹拌した。この反応を水（１０ｍＬ）の添加によりクエンチし、その水層をＤＣＭで抽出し、合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧濃縮し、その残渣をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜３：１）により精製して、化合物３Ｘ（１０２ｍＣｉ，３１％，ＳＡＷ  ３７．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣ１３，  Ｖａｒｉａｎ，  ４００  ＭＨｚ）：  ８  ０．６５  （３Ｈ，  ｓ）；  ０．９３  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．０  Ｈｚ），  １．０１  （３Ｈ，  ｓ），  １．０６−１．４９  （１２Ｈ，  ｍ），  １．６２−２．０４  （７Ｈ，  ｍ），  １．６９  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．８  Ｈｚ），  ２．１８−２．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３２−２．４３  （２Ｈ，  ｍ），  ２．５８  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝  １２．８，  ４．０  Ｈｚ），  ３．６２−３．７０  （１Ｈ，  ｍ），
３．６７  （３Ｈ，  ｓ），  ６．１８  （１Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝  ６．８  Ｈｚ）。
【０３４６】
化合物４Ｘの調製
【０３４７】
【化２５】
2020125317.tif 000049
【０３４８】
化合物３Ｘ（１０２ｍＣｉ，２．７５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（６．０ｍＬ）中の溶液に、Ｈ２Ｏ（３．０ｍＬ）中のＮａＯＨ（２２０ｍｇ，５．５０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この反応混合物を４５℃で１時間撹拌した後に、室温に冷却し、ＭｅＯＨを減圧下で除去し、そしてＨ２Ｏ（１２ｍＬ）で希釈した。その水層をＨ３ＰＯ４で酸性にし、ＤＣＭで抽出し、そしてその有機層を減圧濃縮した。その残渣をＥｔ２Ｏに懸濁させ、そしてその沈殿物を濾過により集めて、化合物４Ｘ（８６．３ｍＣｉ，８５％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣＩ３，  Ｖａｒｉａｎ，  ４００  ＭＨｚ）；  ８  ０．６３  （３Ｈ，  ｓ），  ０．９２  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．０  Ｈｚ），  ０．９９  （３Ｈ，  ｓ），  １．０４−１．５０  （１３Ｈ，  ｍ），  １．６１−２．０１  （７Ｈ，  ｍ），  １．６７  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ７．２  Ｈｚ），  ２．２１−２．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３５−２．４１  （２Ｈ，  ｍ），  ２．５６  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝  １２．８，  ４．０  Ｈｚ），  ３．５８−３．６９  （１Ｈ，  ｍ），
６．１６  （１Ｈ，  ｑ，Ｊ＝  ７．２  Ｈｚ）。
【０３４９】
化合物５Ｘの調製
【０３５０】
【化２６】
2020125317.tif 000050
【０３５１】
化合物４Ｘ（８６．３ｍＣｉ，２．３５ｍｍｏｌ）と５％−Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）とのａｑ．０．５Ｍ  ＮａＯＨ（１０ｍＬ，５．０ｍｍｏｌ）中の混合物を、Ｈ２雰囲気下（バルーン）室温で１０時間撹拌し、次いで１００℃で１４時間撹拌した。その触媒を濾過により除去し、水で洗浄し、そしてその濾液をＨ３ＰＯ４で酸性にした。その沈殿物を濾過により集め、その固体をＥｔＯＡｃに溶解させ、ブライン（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、ＳｉＯ２のショートパッドで濾過し、そして減圧中で濃縮した。残渣の固体をＥｔＯＡｃで再結晶して、化合物５Ｘ（６７．７ｍＣｉ，７８％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＭｅＯＤ−ｄ４，  Ｖａｒｉａｎ，  ４００  ＭＨｚ）：  ８  ０．７１  （３１１，  ｓ），  ０．７５−０．８４  （１Ｈ，  ｍ），  ０．８１  （３Ｈ，
ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ），  ０．９２−１．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ０．９６  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝  ６．４  Ｈｚ），  １．０６−１．３８  （７Ｈ，  ｍ），  １．２５  （３Ｈ，  ｓ），  １．４１−１．９６  （１２１１，  ｍ），  ２．０１−２．０５  （１Ｈ，  ｍ），  ２．１１−２．２４  （２Ｈ，  ｍ），  ２．３０−２．３７  （１Ｈ，  ｍ），  ２．５０  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝  １１．４  Ｈｚ），  ２．８０−２．８５  （１Ｈ，  ｍ），  ３．４２−３．４９  （１Ｈ，  ｍ）。
【０３５２】
［エチル−１−１４Ｃ］オベチコール酸の調製
【０３５３】
【化２７】
2020125317.tif 000051
【０３５４】
化合物５Ｘ（６７．７ｍＣｉ，１．８３ｍｍｏｌ）のａｑ．２Ｍ  ＮａＯＨ（４．５０ｍＬ，９．００ｍｍｏｌ）中の溶液に、ＮａＢＨ４（４１６ｍｇ，１１．０ｍｍｏｌ）の１１２０（２．０ｍｌ）中の溶液を８０℃で添加した。この反応混合物を１００℃で２時間撹拌した後に、水（６．０ｍＬ）を室温で添加し、そしてＨ３ＰＯ４で酸性にした。その水層をＤＣＭで抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ＳｉＯ２のショートパッドで濾過し、そして減圧濃縮した。その残渣をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１〜１：３）により精製して、生成物（４４．０ｍＣｉ，６５％）を白色固体として得た。この生成物（４４．０ｍＣｉ，１．１９ｍｍｏｌ）およびオベチコール酸（１２０ｍｇ，０．２８５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）に溶解させ、この溶液を５０℃で２時間撹拌し、次いで減圧濃縮した。その残渣の油状物をＥｔ２Ｏに懸濁させ、その沈殿物を濾過により集めて、［エチル−１−１４Ｃ］オベチコール酸（５６０ｍｇ，３８．５ｍＣｉ，ＳＡ＝２９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  Ｖａｒｉａｎ，  ４００  ＭＨｚ）：  ８  ０．６６  （３Ｈ，  ｓ），  ０．８８  （３１１，  ｓ），  ０．９３  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝
７．２  Ｈｚ），  ０．９３  （３Ｈ，  ｄ，  Ｉ  ＝  ６．４  Ｈｚ），  ０．９６−１．０４  （１Ｈ，  ｍ），  １．０８−１．５２  （１４Ｈ，  ｍ），  １．５１−１．６０  （１０１１，  ｍ），  ２．２２−２．３０  （１１１，  ｍ），  ２．３６−２．４４  （１Ｈ，  ｍ），  ３．３８−３．４５  （１１１，  ｍ），  ３．７１  （ＩＨ，  ｓ）。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  （ＭＳ：  ＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ）：  ＭＳ  Ｃａｌｃｄ．：  ４２１．５６；  ＭＳ  Ｆｏｕｎｄ：  ４２１．０７  ［Ｍ−Ｈ］−。
Ｒａｄｉｏ  ＴＬＣ：シリカ６０  Ｆ２５４のＴＬＣプレート、および移動相はＥｔＯＡ
ｃである。放射化学的純度は９８．９０％であり、Ｒｆ＝０．６７５。
ＨＰＬＣ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ）：移動相；アセトニトリル：５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝３）：ＭｅＯＨ＝４５０：４５０：１００。放射化学的純度は９８．１９％（β−ｒａｍ）であり、Ｒｔ＝２０．００ｍｉｎ。
【０３５５】
［エチル−１−１４Ｃ］オベチコール酸は、ＬＳＣにより２９ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性で、１４Ｃ１Ｃ２５Ｈ４４Ｏ４の分子式および４２１．４６の分子量を有する。本発明は、以下をも提供する。
（１）  約４．２°、約６．４°、約９．５°、約１２．５°、および約１６．７°の２θに固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（２）  図５に記載されるものと実質的に同様なＸ線回折パターンによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（３）  約４．２°、約６．４°、約９．５°、約１２．５°、約１２．６°、約１５．５°、約１５．８°、約１６．０°、約１６．７°および約１９．０°の２θに固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる、項目１に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（４）  約４．２°、約６．４°、約８．３°、約９．５°、約１１．１°、約１２．２°、約１２．５°、約１２．６°、約１５．５°、約１５．８°、約１６．０°、約１６．３°、約１６．７°、約１８．６°および約１９．０°の２θに固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる、項目１または項目３に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（５）  約４．２°、約６．４°、約８．３°、約９．５°、約１１．１°、約１２．２°、約１２．５°、約１２．６°、約１５．５°、約１５．８°、約１６．０°、約１６．３°、約１６．７°、約１７．０°、約１７．８°、約１８．６°、約１８．８°、約１９．０°、約２０．５°および約２０．９°の２θに固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる、項目１または項目３〜４のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（６）  前記Ｘ線回折パターンが、Ｃｕ  Ｋα放射線を使用する回折計で収集される、項目１〜５のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（７）  約１２．０〜約１２．８、および約１５．４〜約２１．０に固有ピークを含むＸ線回折パターンによって特徴付けられる、項目１〜６のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（８）  約９８±２℃に吸熱点の値を有する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムによって特徴付けられる結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９）  約９８±２℃に吸熱点の値を有する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムによってさらに特徴付けられる、項目１〜８のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（１０）  合成中間体としてのオベチコール酸の結晶形態を含む、オベチコール酸形態１を調製するためのプロセス。
（１１）  結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程を包含する、オベチコール酸形態１を調製するためのプロセス。
（１２）  ３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、および
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、項目１１に記載のプロセス。
（１３）  Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、項目１１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
（１４）  ３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程，
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、項目１１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
（１５）  ３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させて３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程、
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、項目１１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
（１６）  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程、
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、項目１１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
（１７）３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程、
３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程、
３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程、
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程、
３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程、ならびに
結晶オベチコール酸をオベチコール酸形態１に変換する工程
を包含する、項目１１〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
（１８）  前記結晶オベチコール酸が形態Ｃである、項目１０〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（１９）  結晶オベチコール酸形態Ｃが、図５に記載されるものと同様なＸ線回折パターンによって特徴付けられる、項目１８に記載のプロセス。
（２０）  前記結晶オベチコール酸形態Ｃが酢酸ｎ−ブチルから結晶化される、項目１８または１９のいずれか１項に記載のプロセス。
（２１）  結晶オベチコール酸形態Ｃをオベチコール酸形態１に変換する工程が、結晶オベチコール酸形態ＣをＮａＯＨ水溶液に溶解させる工程、およびＨＣｌを添加する工程を包含する、項目１１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（２２）  単離された結晶オベチコール酸形態Ｃを、減圧下約８０℃で乾燥させる、項目２１に記載のプロセス。
（２３）  ３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＮａＢＨ４と反応させて結晶オベチコール酸を形成する工程が、約８５℃〜約１１０℃の温度で塩基性水溶液中で行われる、項目１２〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（２４）  前記温度が約９０℃〜約１０５℃である、項目２３に記載のプロセス。
（２５）  前記塩基性水溶液がＮａＯＨ水溶液である、項目２３〜２４のいずれか１項に記載のプロセス。
（２６）  前記塩基性水溶液が、５０重量％のＮａＯＨ溶液と水との混合物である、項目２５のいずれか１項に記載のプロセス。
（２７）  Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２
４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させて３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程が、約２０℃〜約４０℃の温度および約４ｂａｒ〜約５ｂａｒの圧力で行われる、項目１３〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。（２８）  反応混合物の有機相が活性炭で処理される、項目２７に記載のプロセス。
（２９）  前記温度が約２５℃〜約３５℃である、項目２７〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
（３０）  前記圧力が約４．５ｂａｒ〜約５．５ｂａｒである、項目２７〜２９のいずれか１項に記載のプロセス。
（３１）  水素化反応混合物を約１時間撹拌することが許容される、項目２７〜３０のいずれか１項に記載のプロセス。
（３２）  Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させる工程が、約１００℃に加熱され、そして約２時間〜約５時間撹拌される、項目２７〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
（３３）  Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＰｄ／Ｃおよび水素ガスと反応させる工程が、約１００℃に加熱され、そして約３時間撹拌される、項目２７〜３２のいずれか１項に記載のプロセス。
（３４）  Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を形成する工程が、約２０℃〜約６０℃の温度で行われる、項目１４〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（３５）  前記温度が約２０℃〜約２５℃である、項目３４に記載のプロセス。
（３６）  Ｅ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＮａＯＨと反応させる工程が、メタノール、水、およびＮａＯＨ溶液中で行われる、項目３４〜３５のいずれか１項に記載のプロセス。
（３７）  前記ＮａＯＨ溶液が５０重量％の水溶液である、項目３４〜３６のいずれか１項に記載のプロセス。
（３８）  ３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルをＣＨ３ＣＨＯと反応させてＥ−またはＥ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程が、極性非プロトン性溶媒中で、約−５０℃〜約−７０℃の温度で、ＢＦ３の存在下で行われる、項目１５〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（３９）  前記極性非プロトン性溶媒がジクロロメタンである、項目３８に記載のプロセス。
（４０）前記ＢＦ３が、アセトニトリル中１６重量％の溶液である、項目３８〜３９のいずれか１項に記載のプロセス。
（４１）  前記温度が約−６０℃〜約−６５℃である、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の
プロセス。
（４２）  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させて３α，７−ジトリメチルシリルオキシ−５β−コラ−６−エン−２４−酸メチルエステルを形成する工程が、極性非プロトン性溶媒中で約−１０℃〜約−３０℃の温度で行われる、項目１６〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
（４３）  前記極性非プロトン性溶媒がテトラヒドロフランである、項目４２に記載のプロセス。
（４４）  前記温度が約−２０℃〜約−２５℃である、項目４２〜４３のいずれか１項に記載のプロセス。
（４５）  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルをＬｉ［Ｎ（ＣＨ（ＣＨ３）２）２］およびＳｉ（ＣＨ３）３Ｃｌと反応させる工程が約２時間撹拌される、項目４２〜４４のいずれか１項に記載のプロセス。
（４６）  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させて３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルを形成する工程が、約３時間加熱され、そして反応混合物のｐＨが、水性塩基性溶液で約６．５〜約８．０のｐＨ値に調整される、項目１７に記載のプロセス。
（４７）  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸メチルエステルの単離が、活性炭の添加をさらに包含する、項目４６に記載のプロセス。
（４８）  ３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン−２４−酸をＣＨ３ＯＨおよびＨ２ＳＯ４と反応させる工程がメタノール中で行われる、項目４６〜４７のいずれか１項に記載のプロセス。
（４９）  前記塩基性溶液がＮａＯＨ水溶液である、項目４６〜４８のいずれか１項に記載のプロセス。
（５０）  前記ｐＨが約７．０〜約７．５である、項目４６〜４９のいずれか１項に記載のプロセス。
（５１）  項目１０〜５０のいずれか１項に記載のプロセスによって生成された化合物Ｅ／Ｚ−３α−ヒドロキシ−６−エチリデン−７−ケト−５β−コラン−２４−酸であって、そのＥ／Ｚ異性体比が、約５０％より大きいか、約６０％より大きいか、約７０％より大きいか、約８０％より大きいか、約８３％より大きいか、約８５％より大きいか、約９０％より大きいか、約９３％より大きいか、約９５％より大きいか、または約９９％より大きい、化合物。
（５２）  前記Ｅ／Ｚ比がＨＰＬＣによって決定される、項目５１に記載の化合物。
（５３）  前記比が約８０％より大きい、項目５１〜５２のいずれか１項に記載の化合物。
（５４）  前記比が約８３％より大きい、項目５１〜５３のいずれか１項に記載の化合物。
（５５）  前記比が約８５％より大きい、項目５１〜５４のいずれか１項に記載の化合物。
（５６）  前記比が約９０％より大きい、項目５１〜５５のいずれか１項に記載の化合物。
（５７）  前記比が約９３％より大きい、項目５１〜５６のいずれか１項に記載の化合物。
（５８）  前記比が約９５％より大きい、項目５１〜５７のいずれか１項に記載の化合物。
（５９）前記比が約９９％より大きい、項目５１〜５８のいずれか１項に記載の化合物。（６０）  約９８％より大きい力価を有する、オベチコール酸、またはその薬学的に受容可能な塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体。
（６１）  前記オベチコール酸が約９８％より大きい力価を有する、項目６０に記載のオベチコール酸。
（６２）  前記オベチコール酸の力価が、水、硫酸灰分、残留溶媒、および他の有機不純物の量を引くことによって決定されている、項目６０に記載のオベチコール酸。
（６３）  約９８．５％より大きい力価を有する、項目６１〜６２のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（６４）  約９９．０％より大きい力価を有する、項目６１〜６３のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（６５）  約９９．５％より大きい力価を有する、項目６１〜６４のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（６６）  前記オベチコール酸が、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される、合計約２％未満の１種または１種より多くの不純物を含む、項目６１〜６５のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（６７）  前記オベチコール酸が、合計約１．５％未満の不純物を含む、項目６６に記載のオベチコール酸。
（６８）  前記オベチコール酸形態１が、合計約１．４％未満の不純物を含む、項目６６〜６７のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（６９）  前記オベチコール酸が、約１．２％未満の水を含む、項目６６〜６８のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７０）  前記オベチコール酸が、約１．０％未満の水を含む、項目６６〜６９のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７１）  前記オベチコール酸が、合計約０．１５％未満の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜７０のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７２）  前記オベチコール酸が、合計約０．０６％未満の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜７１のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７３）  前記オベチコール酸が、合計約０．０５％未満の６−エチルウルソデオキシコール酸および３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜７２のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７４）  前記オベチコール酸が、約０．１５％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜７３のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７５）  前記オベチコール酸が、約０．０６％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜７４のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７６）  前記オベチコール酸が、約０．０５％未満の３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜７５のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７７）  前記オベチコール酸が、約０．１５％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む、項目６６〜７６のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７８）  前記オベチコール酸が、約０．０６％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む、項目６６〜７７のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（７９）  前記オベチコール酸が、約０．０５％未満の６β−エチルケノデオキシコール酸を含む、項目６６〜７８のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８０）  前記オベチコール酸が、約３％未満のケノデオキシコール酸を含む、項目６６〜７９のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８１）  前記オベチコール酸が、約１％未満のケノデオキシコール酸を含む、項目６６〜８０のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８２）  前記オベチコール酸が、約０．２％未満のケノデオキシコール酸を含む、項目６６〜８１のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８３）  前記オベチコール酸が、約０．１５％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜８２のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８４）  前記オベチコール酸が、約０．０６％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜８３のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８５）  前記オベチコール酸が、約０．０５％未満の３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸を含む、項目６６〜８４のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８６）  前記オベチコール酸がオベチコール酸形態１である、項目６１〜８５のいずれか１項に記載のオベチコール酸。
（８７）  結晶オベチコール酸、またはその薬学的に受容可能な塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体であって、前記結晶オベチコール酸が形態Ｃである、結晶オベチコール酸、またはその薬学的に受容可能な塩、溶媒和物もしくはアミノ酸結合体。
（８８）  前記結晶オベチコール酸が、約９０％より大きい力価を有する、項目８７に記載の結晶オベチコール酸。
（８９）  前記オベチコール酸形態Ｃの力価が、水、硫酸塩灰分、残留溶媒、および他の有機不純物の量を引くことによって決定されている、項目８８に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９０）  前記溶媒和物が水和物である、項目８７に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。（９１）  約９２％より大きい力価を有する、項目８８〜９０のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９２）  約９４％より大きい力価を有する、項目８８〜９１のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９３）  約９６％より大きい力価を有する、項目８８〜９２のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９４）  約９８％より大きい力価を有する、項目８８〜９３のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９５）  約９９％より大きい力価を有する、項目８８〜９４のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９６）  前記結晶オベチコール酸形態Ｃが、６−エチルウルソデオキシコール酸、３α−ヒドロキシ−６α−エチル−７−ケト−５β−コラン−２４−酸、６β−エチルケノデオキシコール酸、３α，７α−ジヒドロキシ−６−エチリデン−５β−コラン−２４−酸、ケノデオキシコール酸、および３α（３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−オイルオキシ）−７α−ヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸から選択される、合計約４％未満の１種または１種より多くの不純物を含む、項目８７〜９５のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９７）  前記不純物の合計が、約３．８％未満である、項目９６に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９８）  前記不純物の合計が、約３．６％未満である、項目９６〜９７のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸形態Ｃ。
（９９）  項目１０〜５０のいずれか１項に記載のプロセスにより製造されたオベチコール酸形態１、および薬学的に許容されるキャリアを含有する、薬学的組成物。
（１００）  結晶オベチコール酸および薬学的に許容されるキャリアを含有する薬学的組成物。
（１０１）前記結晶オベチコール酸が形態Ｃである、項目１００に記載の薬学的組成物。（１０２）  被験体において、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態を治療または予防する方法であって、有効量の、項目６０〜８６のいずれか１項に記載のオベチコール酸形態１、または項目１０〜５０のいずれか１項に記載のプロセスにより製造されたオベチコール酸形態１、または項目９９に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。（１０３）  被験体において、ＦＸＲにより媒介される疾患または状態を治療または予防する方法であって、有効量の、項目１〜９もしくは８７〜９８のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸、または項目１００〜１０１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（１０４）  前記疾患または前記状態が、胆道閉鎖症、胆汁うっ滞性肝臓疾患、慢性肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝臓疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、進行性線維症に起因する肝臓損傷、肝線維症、ならびにアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症、および高脂質血症を含む心臓血管疾患から選択される、項目１０２〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
（１０５）  被験体においてトリグリセリドを低下させるための方法であって、有効量の、項目６０〜８６のいずれか１項に記載のオベチコール酸形態１、または項目１０〜５０のいずれか１項に記載のプロセスにより製造されたオベチコール酸形態１、または項目９９に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（１０６）  被験体においてトリグリセリドを低下させるための方法であって、有効量の、項目１〜９もしくは８７〜９８のいずれか１項に記載の結晶オベチコール酸、または項目１００〜１０１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
【図１】
2020125317.tif 000053
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
2020125317.tif 000059
【図７】
2020125317.tif 000060
【図８Ａ】
2020125317.tif 000061
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020125317.tif 000070
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
2020125317.tif 000078
【図２３Ｂ】
2020125317.tif 000079
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【外国語明細書】
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