(57)【要約】【課題】限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するヒト化非ヒト動物を提供すること。【解決手段】限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、１つ以上のＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列とを有するマウス、胚、細胞および組織を提供する。様々な実施形態において、ヒト化内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を発現することができるマウスを記載する。単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを特徴とする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウス、胚、細胞および組織であって、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を発現することができるマウス、胚、細胞および組織も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスであって、
（ａ）単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒトゲノム配列であって、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されており、前記再構成されていないヒトゲノム配列の挿入は、内因性ＡＤＡＭ６タンパク質の機能を破壊し、前記内因性ＡＤＡＭ６機能の破壊は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する、ヒトゲノム配列と、
（ｂ）雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列であって、前記マウスが雄マウスである場合に前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質が発現され、それにより、前記雄マウスは妊性となる、核酸配列と
をその生殖細胞系ゲノムに有し、
前記マウスのＢ細胞は、抗原への曝露に対して抗体を発現し、各抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖と対になった２つの免疫グロブリン軽鎖を含み、各重鎖は、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと同一である、またはその体細胞超変異バージョンであるＶＨ遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変領域配列から発現されるヒト重鎖可変ドメインを含む、マウス。
【請求項２】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項５】
１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項５に記載のマウス。
【請求項７】
１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項８】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項５０に記載のマウス。
【請求項９】
雄マウスである、請求項１に記載のマウス。
【請求項１０】
請求項１に記載のマウスに由来する細胞または組織。
【請求項１１】
マウスＥＳ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において第一の改変を行う工程であって、前記第一の改変は、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子配列の挿入を含み、それにより、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含み、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されており、前記第一の改変は、内因性ＡＤＡＭ６タンパク質の機能を破壊し、前記内因性ＡＤＡＭ６機能の破壊は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する、工程と、
（ｂ）マウスＥＳ細胞のゲノムへのマウスＡＤＡＭ６配列の挿入を含む、第二の改変を行う工程であって、前記マウスＡＤＡＭ６配列は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、前記機能的マウスＡＤＡＭ６タンパク質が、雄マウスにおいて発現され、それにより、前記雄マウスは妊性となる、工程と
を含む、方法。
【請求項１２】
前記第一の改変は、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１つ以上の配列の、前記１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子配列による置換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の改変は、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一および第二の改変が同時に行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１６】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列を生成する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスを、目的の抗原で免疫する工程と、
（ｂ）前記マウスが前記目的の抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、
（ｃ）前記目的の抗原に結合する、前記マウス由来の抗体の重鎖可変ドメインをコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程と
を含む、方法。
【請求項１７】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）の前記抗原で免疫する工程が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または前記抗原を発現する細胞で行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
抗原に対して特異的な抗体を生成する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスを、前記抗原で免疫する工程と、
（ｂ）前記マウスから、前記抗原に対して特異的な抗体を産生する少なくとも１つの細胞を単離する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の抗体を産生する前記少なくとも１つの細胞を培養する工程と、
（ｄ）前記抗体を得る工程と
を含む、方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）の培養工程が、工程（ｂ）で得られた前記少なくとも１つの細胞から生成された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞に対して行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）で得られた前記少なくとも１つの細胞が、工程（ａ）の前記マウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ａ）の前記抗原で免疫する工程が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せ、または前記抗原を発現する細胞によって行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
ヒト抗原結合タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスを、目的の抗原で免疫する工程と、
（ｂ）前記マウスが前記抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、
（ｃ）前記マウスから、前記目的の抗原に特異的に結合する抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする重鎖可変領域の核酸配列を得る工程と
を含む、方法。
【請求項３７】
（ｄ）前記ヒト重鎖可変領域の核酸配列を、ヒト重鎖定常領域の核酸配列と連結する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ｅ）生体外の哺乳動物細胞株内で、前記ヒト重鎖可変領域の核酸配列および前記ヒト重鎖定常領域の核酸配列を含む抗体を発現させる工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ａ）の前記抗原で免疫する工程が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せ、または前記抗原を発現する細胞によって行われる、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
低減された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の複雑性を含む遺伝子操作非ヒト動物であって、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現することができる遺伝子操作非ヒト動物を提供する。限られた数の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントおよび／またはその変異体から抗体を発現する遺伝子操作非ヒト動物であって、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠くがＡＤＡＭ６機能を保持する遺伝子操作非ヒト動物、例えば、マウスを機能的ＡＤＡＭ６タンパク質作製不能にし、その結果、妊性を喪失させる内因性免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域遺伝子座の改変を含むマウスを記載する。遺伝子改変マウスは、限られた数のＶＨ遺伝子セグメント、例えば単一の免疫グロブリンＶＨセグメント、例えばヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを特徴とする免疫グロブリンＶＨ遺伝子座を含むマウスであって、ＡＤＡＭ６機能をさらに含むマウス、例えば、雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配列を含むマウスを記載する。
【０００２】
機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織であって、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織を記載する。さらに、上記マウス、細胞、胚および組織は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠くが、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列の存在を特徴とするＡＤＡＭ６機能を保持する。ヒト病原体などの病原体に結合するのに有用である抗体配列を、妊性の非ヒト動物において作製するための方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
非ヒト動物、例えばマウスは、抗体ベースのヒト治療薬において使用するための抗体配列を作製するための方法において有用なツールになるように遺伝子操作されてきた。ヒト化可変領域遺伝子座（例えば、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子ならびにＶＬおよびＪＬ遺伝子）を有するマウスは、抗体治療薬において使用するための同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖および軽鎖可変ドメインを生成するために使用される。同種の重鎖および軽鎖を有する完全ヒト抗体を生成するマウスは、当該技術分野において公知である。これらのマウスを作製する場合、ランダムに組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおいて発現する免疫グロブリンレパートリーとして機能するために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化する必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、幾つかの実験的障害、例えば、マウスが十分に多様な抗体レパートリーの産生を実行できなくなる、広範なリエンジニアリングフィックス（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｉｘｅｓ）の使用を必要とする、おそらくヒト要素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクローン選択過程を提供する、およびヒト治療薬の作製に真に有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様な集団の信頼できない源、をもたらす。
【０００４】
ヒト抗体治療薬は、選択された抗原に関して所望される特徴に基づき操作される。ヒト化マウスを選択抗原で免疫し、免疫したマウスを用いて、所望の結合特徴を有する高親和性の同種の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを同定するための抗体集団を生成する。内因性マウス遺伝子座において可変領域だけをヒト化させたヒト化マウスなど、一部のヒト化マウスは、特徴および数が野生型マウスのＢ細胞集団と類似するＢ細胞集団を生成する。結果として、多数の異なる免疫グロブリン再構成を反映する抗体をスクリーニングして、最も所望される特徴を有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを同定するためのこれらのマウスでは、極めて大きくかつ多様なＢ細胞集団が利用可能である。
【０００５】
しかし、すべての抗原が、可変（Ｖ）セグメントの広範な選択に由来する極めて多数の再構成を示す免疫応答を惹起するわけではない。すなわち、特定の抗原に対するヒト体液性免疫応答は見かけ上限定される。限定は、十分に高い親和性および特異性で特定の抗原に結合する特定のＶセグメントのみを発現するＢ細胞のクローン選択に反映される。一部のかかる抗原は、臨床的に有意義である、すなわち、それらの一部は、周知のヒト病原体である。ヒト免疫応答において発現されるＶセグメントは、その抗原に対するヒト抗体応答において観察されたことのないランダムに選択されたＶセグメントよりも、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントを組み合わせて、有用な高親和性抗体を生成する可能性が高いＶセグメントであるという仮説が提起されている。
【０００６】
ヒトと病原体との間の経験の千年間にわたる自然選択は、病原体を中和するためのその最も有効な武器をデザインするのに最も効率的な基礎または基盤（選択されたＶ遺伝子セグメント）を選択したと仮定されている。当該技術分野においては、上記で論じられた病原体のような抗原に結合し、および／またはこれらを中和する、優れた抗体が必要とされている。有用な配列を、多型および／または体細胞変異させた選択Ｖ遺伝子セグメントを含めた選択Ｖ遺伝子セグメントからより迅速に生成させること、および、その体細胞変異バージョンを含めた様々なＤおよびＪ遺伝子セグメントとのＶ遺伝子セグメントの再構成、特に、固有で有用なＣＤＲ３領域との再構成を有する有用なＢ細胞集団をより迅速に生成することが必要とされている。治療的に有用な抗体可変領域配列を、選択されたＶ遺伝子セグメントから、例えば、既存の改変動物において達成され得る数および多様性を増大させて生成させ、それと同時に、遺伝子改変に起因し得る有害な変化を低減または排除し得る改善された生物系、例えば、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）が必要とされている。限定された選択Ｖ遺伝子セグメントであって、特定のヒト病原体を含め、選択された抗原に対するヒト抗体ベースの治療剤の製造において有用な同種のヒト重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが含まれるがこれらに限定されないＶ遺伝子セグメントに由来する抗体の可変配列をクローン選択するために拘束された体液性免疫系を有するように操作された改善された生物系が必要とされている。当該技術分野においては、ヒト集団の負担となる病原体の排除を対象とするヒト抗体配列を含む免疫グロブリン配列を生成するのに有用な改良された遺伝子改変マウスを作製することが依然として必要とされている。
【０００７】
当該技術分野においては、単一のヒト可変遺伝子セグメントに由来する重鎖を含有する抗原特異的抗体を含め、ウイルス抗原、例えば、ＨＩＶおよびＨＣＶを中和することが可能な治療用抗体が必要とされている。また、単一のヒトＶＨセグメントに由来する重鎖であってＣＤＲ配列の多様なセットを有する重鎖（同種のヒト軽鎖と共に発現する重鎖を含む）のレパートリーを含む抗体を含め、ならびにヒトゲノム配列を非ヒト動物のゲノムに挿入することに起因する望ましくない効果の回復を含め、有用な抗体を作製するためのさらなる方法および非ヒト動物も必要とされている。例えば、ヒト治療薬の作製における使用のための体細胞変異した、およびクローン選択した免疫グロブリン可変ドメインを生成するための組成物および方法を含め、免疫グロブリンベースの結合タンパク質のＣＤＲを選択するための方法であって、それから選ぶための結合タンパク質の多様性を増強する、および免疫グロブリン可変ドメインの多様性を増強する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
限られた数の異なる重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ遺伝子、ＶＨ遺伝子、ＶＨ遺伝子セグメント、またはＶ遺伝子セグメント）、例えば、１つ以下、２つ以下、もしくは３つ以下の異なるＶ遺伝子を含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座、あるいは、例えば、単一のコピーもしくは複数コピーで存在し、および／または１つ以上の多型を含む、１つ以下のＶ遺伝子セグメントのファミリーメンバーを含む遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を提供し、様々な実施形態において、遺伝子座は、内因性機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列を欠く。
【０００９】
限定される重鎖Ｖ遺伝子レパートリー、例えば、単一のＶＨ遺伝子セグメントである重鎖Ｖ遺伝子レパートリー、または単一のＶＨ遺伝子セグメントの複数の多型変異体から選択される重鎖Ｖ遺伝子レパートリーに由来する重鎖可変ドメインをコードする遺伝子を再構成および形成することが可能な遺伝子座を提供し、ここで、様々な実施形態において、該遺伝子座は、内因性機能的ＡＤＡＭ６遺伝子またはその機能的断片を欠く。
【００１０】
内因性機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、ヒト免疫グロブリン配列、例えば、ヒトまたは（またはヒト／非ヒトキメラ）非ヒト免疫グロブリン定常配列に作動可能に連結された（かつ、例えば、Ｄセグメントおよび／またはＪセグメントと作動可能な連結にある）ヒトＶセグメントを含む遺伝子座を含む改変免疫グロブリン遺伝子座を提供する。単一のＶＨ遺伝子セグメントの複数コピーを含む改変遺伝子座であって、コピーのうちの１つ以上が多型変異体を含み、非ヒト動物において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を包含する改変遺伝子座を提供する。非ヒト免疫グロブリン定常配列、例えば、マウス、ラットまたはヒト配列に作動可能に連結された、１つ以上のＤセグメントおよび１つ以上のＪセグメントと作動可能に連結された単一のＶＨセグメントの複数コピーを含む改変遺伝子座を提供する。また、かかるヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物であって、野生型妊性を有する非ヒト動物も提供する。
【００１１】
Ｄ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結された単一のＶＨセグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座（例えば、導入遺伝子上の（ｏｎｅ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座、または内因性非ヒト動物重鎖可変遺伝子座における挿入もしくは置換としての免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座）を含む非ヒト動物を提供する。様々な実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物の上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座において、１つ以上のＤ遺伝子セグメントおよび／または１つ以上のＪ遺伝子セグメントに作動可能に連結されている。様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、改変重鎖遺伝子座を含む雄非ヒト動物において機能的なＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログをコードする異所性ヌクレオチド配列をさらに含む。様々な実施形態において、異所性ヌクレオチド配列は、上記単一のＶＨセグメント、Ｄ遺伝子セグメントまたはＪ遺伝子セグメントに隣接している。様々な実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物のゲノム内の非免疫グロブリン配列に隣接する。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記改変重鎖遺伝子座と異なる染色体上にある。
【００１２】
それらの免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性免疫グロブリンＶＨセグメント（例えば、すべての機能的セグメント、またはほぼすべての機能的セグメント）を欠失させるように改変され、非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座において、ＤセグメントおよびＪセグメントまたはＪセグメントに作動可能に連結されたヒトＶＨ１−６９セグメント（またはヒトＶＨ１−２セグメント）を含む非ヒト動物を提供する。かかる遺伝子座を含む非ヒト動物であって、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（複数可）を欠く非ヒト動物も提供する。
【００１３】
非ヒト動物においてヒト免疫グロブリン配列を作製するための方法を提供する。様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、単一のヒトＶセグメント、例えば、ＶＨ１−６９またはＶＨ１−２、ならびに１つ以上のＤセグメントおよびＪセグメントまたは１つ以上のＪセグメントから本質的になる免疫グロブリンＶ配列のレパートリーに由来する。非ヒト動物、非ヒト組織、および非ヒト細胞において、ヒト免疫グロブリン配列を作製するための方法であって、上記ヒト免疫グロブリン配列が病原体に結合する方法を提供する。
【００１４】
１つの態様では、非機能的内因性マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはＡＤＡＭ６遺伝子（例えば、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウトまたは内因性ＡＤＡＭ６遺伝子内での欠失）を生じさせる結果となる改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、齧歯動物ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む；特定の実施形態において、上記齧歯動物ＡＤＡＭ６タンパク質は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質である。
【００１５】
１つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。１つの実施形態において、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ６活性を低減させるかまたは除去する。１つの実施形態において、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ６活性を保持するまたは持続させる。
【００１６】
１つの態様では、Ｖセグメントの正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に関して限定された重鎖Ｖセグメントのレパートリーを含み、１つ以上のＤセグメントおよび１つ以上のＪセグメント、または１つ以上のＪセグメントを含む、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖Ｖセグメントは、ヒトセグメントである。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠く。１つの実施形態において、上記改変重鎖遺伝子座は、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座において上記Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントに隣接している。
【００１７】
１つの実施形態において、上記改変遺伝子座は、非ヒト遺伝子座である。１つの実施形態において、上記非ヒト遺伝子座は、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン配列で改変されている。１つの実施形態において、上記非ヒト遺伝子座は、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン配列と、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列とで改変されている。
【００１８】
１つの実施形態において、上記限定は、１つのＶセグメントファミリーメンバーに対するものである。１つの実施形態において、上記１つのＶセグメントファミリーメンバーは、２コピー以上で存在する。１つの実施形態において、上記１つのＶセグメントファミリーメンバーは、２つ以上の変異体（例えば、Ｖセグメントファミリーメンバーの２つ以上の多型形態）として存在する。１つの実施形態において、上記１つのＶセグメントは、ヒトＶセグメントファミリーメンバーである。１つの実施形態において、上記１つのＶセグメントファミリーメンバーは、その変異体に関してヒト集団内で観察される多数の変異体で存在する。１つの実施形態において、上記Ｖセグメントファミリーメンバーは、表１から選択される。１つの実施形態において、上記Ｖセグメントファミリーメンバーは、各Ｖセグメントについて、１つの対立遺伝子〜表１の右欄で示される数の対立遺伝子にわたる多数の対立遺伝子で示されるとおりの多数の変異体で存在する。
【００１９】
１つの態様では、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する；マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含むマウスも提供する。１つの実施形態において、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする上記内因性ヌクレオチド配列は、野生型マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子と比較して異所位置にある。
【００２０】
１つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための方法を提供する。
【００２１】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは、交配によって子孫を産生することができる。１つの実施形態において、上記雄マウスは、マウス子宮からマウス卵管を通って移行してマウス卵子を受精させることができる精子を産生できる。
【００２２】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは妊性の低減を示し、および該マウスは、その妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、雄マウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動してマウス卵子を受精させることができないことを特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、ｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減を全部または一部回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。
【００２３】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の、別の種（例えば、非マウス種）の限られた数、例えば、１つ以下、２つまたは３つの異なる重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、１つ以上の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび１つ以上の重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメントによる置換を含む。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、単一のオルソロガス免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＤＨ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪＨ遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の欠失を含み、該欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の不活性化を含み、上記欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果とならない。不活性化は、内因性遺伝子セグメントを含む抗体の重鎖をコードするように再構成するのが実質的にできない内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を生じさせる結果となる１つ以上の内因性遺伝子セグメントの置換または欠失を含み得る。不活性化は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードするように再構成するのを不可能にする他の改変を含み得、該改変は、内因性遺伝子セグメントの置換または欠失を含まない。例示的な改変としては、例えば、部位特異的な組換え部位の正確な配置を使用する分子技術（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ技術）によって媒介される染色体の逆位および／または転座が挙げられる。
【００２４】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、１つ以上の定常領域配列（例えば、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ遺伝子）に作動可能に連結された別の種（例えば、非マウス種）の限られた数の、例えば、１つ以下、２つまたは３つの異なる重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、１つ以上の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントおよび１つ以上の重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ断片の、上記マウスのゲノムへの挿入を含む。１つの実施形態において、上記ＤＮＡ断片は、抗体の重鎖をコードする配列を形成するように再構成を受けることができる。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、単一のオルソロガス免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＤＨ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪＨ遺伝子セグメントの、上記マウスのゲノムへの挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能的にする内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の欠失を含み、該欠失はさらに、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。
【００２５】
１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からのマウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは除去する改変を有する雄マウスが、内因性ＡＤＡＭ６機能の低減または除去に起因して、妊性低減（例えば、交配による子孫産生能力の高度低減）を示すまたは本質的に不妊性であるように、該改変を含み、さらに、異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む、マウスを提供する。１つの態様において、マウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは除去する改変は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変（例えば、挿入、欠失、置換など）である。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座である。
【００２６】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、マウスが、マウス子宮からマウス卵管を通って進んでマウス卵子を受精させることのできる精子を産生できないことまたは実質的に産生できないこと含む。特定の実施形態において、上記マウスの射精体積中の産生された精子細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、交尾後にｉｎ  ｖｉｖｏで卵管を通って進むことができず、マウス卵子を受精させることができない。
【００２７】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成できないことまたは実質的に形成できないことを含む。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雌マウスとの交尾によってマウス卵子を受精させることが実質的にできないことを含む。
【００２８】
１つの態様において、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能性を付与するタンパク質（またはタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列）を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは雄マウスであり、上記機能性は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスと比較して強化された妊性を含む。
【００２９】
１つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ、少なくとも１つのヒトＤＨおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、１つのヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記異所性タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、組織特異的発現と関連づけられる。１つの実施形態において、上記組織特異的発現は、生殖組織に存在する。１つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入されたゲノム配列によってコードされている。
【００３０】
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトまたはキメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラット軽鎖（例えば、ヒト可変、マウスまたはラット定常）とキメラヒト可変／マウスまたはラット定常重鎖とを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、転写活性プロモーター、例えばＲＯＳＡ２６プロモーター、に作動可能に連結されているキメラヒト可変／ラットまたはマウス定常軽鎖遺伝子を含む導入遺伝子を含む。さらなる特定の実施形態において、上記キメラヒト／マウスまたはラット軽鎖導入遺伝子は、上記マウスの生殖細胞系内に再構成ヒト軽鎖可変領域配列を含む。
【００３１】
１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にある。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ、少なくとも１つのヒトＤＨおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にある。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入された位置にある。
【００３２】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、マウスＡＤＡＭ６機能の喪失を補う異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスに、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含有する対応する野生型マウスに匹敵する子孫産生能力を付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成する能力を、上記マウスに付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記マウスに、マウス子宮からマウス卵管を通ってマウス卵子へと進んで該卵子を受精させる能力を付与する。
【００３３】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、同じ年齢および系統の野生型マウスが６ヶ月の期間に産生する同腹子の数の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の数の同腹子を産生する。
【００３４】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、６ヶ月に期間にわたって交配させたとき、実質的に同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で交配させた、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き該異所性ヌクレオチド配列を欠いている同じ年齢および同じまたは類似系統のマウスに比べて、少なくとも約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約４倍、約６倍、約７倍、約８倍または約１０以上後代を産生する。
【００３５】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、４または６ヶ月の交配期間中に、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無い、同じ期間交配させたマウスより、同腹子あたり平均少なくとも約２倍、３倍、４倍多い数の子を産生する。
【００３６】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは雄マウスであり、該雄マウスは、交尾後約５〜６時間の時点で卵管から回収したとき、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、１００倍、１１０倍または１２０倍以上である卵管移動を表わす精子を産生する。
【００３７】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、雌マウスと交尾させたとき、野生型マウスからの精子にほぼ等しい効率で約６時間以内に子宮を通り抜けて卵管に入って卵管を通り抜けることができる精子を産生する。
【００３８】
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、該機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて、匹敵する期間内に約１．５倍、約２倍、約３倍または約４倍以上の同腹子を産生する。
【００３９】
１つの態様では、免疫グロブリンタンパク質をコードする非マウス核酸配列をその生殖細胞系内に含むマウスを提供し、上記非マウス免疫グロブリン配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片の挿入を含む。１つの実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、単一のＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含む；１つの実施形態において、上記配列は、１つ以上のＶＬ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記単一のＶＨ、１つ以上のＤＨおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメント、または１つ以上のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、再構成されない。１つの実施形態において、上記単一のＶＨ、１つ以上のＤＨおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメント、または１つ以上のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、再構成される。１つの実施形態において、上記単一のＶＨ、１つ以上のＤＨおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメント、または１つ以上のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの再構成後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも２つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をＢ細胞内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を非Ｂ細胞内に含む。
【００４０】
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその機能的断片を内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、多型ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【００４１】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、単一の未改変内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇ）もしくは機能的断片を内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座に含む。
【００４２】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、ＡＤＡＭ６機能を付与するタンパク質をコードする異所性マウスＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
【００４３】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記内因性マウスＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所に近いマウスゲノム内の場所、例えば、Ｖ遺伝子セグメント配列の３’および最初のＤ遺伝子セグメントの５’にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記雄マウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’およびヒトＤＨ遺伝子セグメントの５’にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記雄マウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの５’にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記雄マウスは、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含むキメラ重鎖遺伝子座の５’にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記キメラ重鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記キメラ重鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【００４４】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、免疫グロブリン可変遺伝子セグメントまたは免疫グロブリン多様性遺伝子セグメントをコードする核酸配列の（ＡＤＡＭ６配列の転写方向に関して）上流、下流、または上流および下流に隣接するＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的である上記マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする上記配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント間にある；１つの実施形態において、上記マウスは、１つのヒトＶＨ遺伝子セグメントを含み、上記配列は、上記ＶＨ遺伝子セグメントの５’の位置にある；１つの実施形態において、上記配列は、上記ＶＨ遺伝子セグメントの３’の位置にある；１つの実施形態において、上記配列は、上記ＶＨ遺伝子セグメントと上記最初のＤＨ遺伝子セグメントとの間の位置にある。特定の実施形態において、上記ＤＨ遺伝子セグメントは、上記最初のＤＨ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスは、２つのＶＨ遺伝子セグメントを含み、上記配列は、上記２つのＶＨ遺伝子セグメント間の位置にある；１つの実施形態において、上記配列は、ＶＨ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントとの間の位置にある。特定の実施形態において、上記ＤＨ遺伝子セグメントは、上記最初のＤＨ遺伝子セグメントである。
【００４５】
１つの実施形態において、上記雄マウスは、野生型雄マウスと同じまたは実質的に同じ内因性免疫グロブリン遺伝子座内の位置にあるＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、抗体の重鎖をコードできない。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、それが抗体の重鎖をコードできないようにする上記雄マウスのゲノム内の場所に配置される。様々な実施形態において、上記雄マウスは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと同じ染色体上にあるＡＤＡＭ６配列を含み、上記ＡＤＡＭ６配列は、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
【００４６】
１つの態様では、非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子、または内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の欠失をその生殖細胞系内に含む雄マウスを提供し、該マウスの精子細胞は、雌マウスの卵管を通過することができ、卵子を受精させることができる。１つの実施形態において、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片の染色体外コピーを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、雄マウスにおいて機能的である異所性マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。
【００４７】
１つの態様において、内因性マウスＡＤＡＭ６機能を低減させる遺伝子改変を含むマウスであって、全部もしくは一部機能的である内因性未改変対立遺伝子（例えば、ヘテロ接合体）によってあるいは雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性配列からの発現によってもたらされる、少なくともいくらかのＡＤＡＭ６機能性を含むマウスを提供する。
【００４８】
１つの実施形態において、上記マウスは、機能的ＡＤＡＭ６を欠いている雄マウスと比較して、交配により子孫を産生する能力を雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６機能を含む。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、マウスＡＤＡＭ６またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列の存在によって付与される。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子によって付与され、該内因性免疫グロブリン遺伝子座は、抗体の重鎖をコードできない。雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６ホモログもしくはオルソログまたはその断片としては、十分な内因性マウスＡＤＡＭ６活性が無い雄マウスにおいて観察される子孫産生能力の喪失、例えば、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスにおいて観察される能力の喪失を全部または一部回復させるものが挙げられる。この意味で、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスには、内因性遺伝子座またはその断片を含むが機能的でない、すなわち、ＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）をまったく発現しない、または野生型雄マウスの本質的に正常な子孫産生能力を支持するのに不十分であるレベルでＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）を発現するマウスが含まれる。機能の喪失は、例えば、上記遺伝子座の構造遺伝子（すなわちＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域）の改変、または上記遺伝子座の調節領域（例えば、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子に対して５’のまたはＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域の３’の配列であって、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写、ＡＤＡＭ６  ＲＮＡの発現またはＡＤＡＭ６タンパク質の発現を全部または一部制御する配列）の改変に起因し得る。様々な実施形態において、雄マウスにおいて機能的であるオルソログもしくはホモログまたはその断片は、雄マウスの精子（または雄マウスの射精液中の大部分の精子細胞）がマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることを可能にするものである。
【００４９】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン可変領域またはその機能的断片を発現する雄マウスは、雌マウスとの交配により子孫を産生する能力を該雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６活性を含み、１つの実施形態において、雌マウスと交配するとき、上記雄マウスは、１つまたは２つの内因性未改変ＡＤＡＭ６対立遺伝子を有するマウスの子孫産生能力の、１つの実施形態では少なくとも２５％、１つの実施形態では少なくとも３０％、１つの実施形態では少なくとも４０％、１つの実施形態では少なくとも５０％、１つの実施形態では少なくとも６０％、１つの実施形態では少なくとも７０％、１つの実施形態では少なくとも８０％、１つの実施形態では少なくとも９０％、および１つの実施形態では該マウスの子孫産生能力とほぼ同じである、子孫産生能力を示す。
【００５０】
１つの実施形態において、雄マウスは、該雄マウスからの精子細胞が雌マウス卵巣を通り抜けることおよびマウス卵子を受精させることを可能にするために十分なＡＤＡＭ６（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）を発現する。
【００５１】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能性は、マウス染色体配列に隣接する核酸配列によって付与される（例えば、上記核酸は、マウス染色体にランダムに組み込まれている；または例えば、上記核酸を特定の場所にターゲティングすることにより、例えば部位特異的リコンビナーゼ媒介（例えば、Ｃｒｅ媒介）挿入もしくは相同組換えにより、特定の場所に配置されている）。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は上記マウスの染色体とは異なる核酸上に存在する（例えば、上記ＡＤＡＭ６配列は、エピソーム上に、すなわち染色体外に、例えば、発現構築物、ベクター、ＹＡＣ、導入染色体などに存在する）。
【００５２】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該マウスは、免疫グロブリン重鎖配列の少なくとも一部分、例えば、ヒト配列の少なくとも一部分を発現し、該マウスは、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは根絶する。１つの実施形態では、上記マウスは、ＡＤＡＭ６活性をコードする両方の対立遺伝子が、不在であるように、または雄マウスにおいて正常交配を支持するように実質的に機能しないＡＤＡＭ６を発現するように、改変される。１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性核酸配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡＭ６活性を維持し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードできないようにする。特定の実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が抗体の重鎖をコードできないようにする染色体の逆位およびまたは転座を含む。
【００５３】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該改変は、該遺伝子座のＡＤＡＭ６配列から発現するＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは除去するものであり、および該マウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、異所性ＡＤＡＭ６配列によってコードされている。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から発現する。様々な実施形態において、上記マウスは、第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を低減させるまたは除去する第一の改変を含む第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子と、第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を実質的に低減させないまたは除去しない第二の改変を含む第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子とを含む。
【００５４】
１つの実施形態において、上記第二の改変は、最後のマウスＶ遺伝子グメントの（マウスＶ遺伝子セグメントの転写方向性に対して）３’にあり、およびマウス（またはキメラヒト／マウス）免疫グロブリン重鎖定常遺伝子またはその断片（例えば、ヒトおよび／またはマウス：ＣＨ１および／またはヒンジおよび／またはＣＨ２および／またはＣＨ３をコードする核酸配列）の（定常配列の転写方向性に対して）５’にある。
【００５５】
１つの実施形態において、上記改変は、第一のＡＤＡＭ６対立遺伝子をコードする第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ＡＤＡＭ６機能は、機能的ＡＤＡＭ６をコードする第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での内因性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じ、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態において、上記Ｖ、ＤおよびまたはＪ遺伝子セグメントの上記少なくとも１つの改変は、欠失、単一のヒトＶＨ、１つ以上のＤＨおよび／または１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントによる置換、ラクダ科動物ＶＨ（またはＶＨＨ）、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントによる置換、ヒト化またはラクダ化ＶＨ（またはＶＨＨ）、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントによる置換、重鎖配列の軽鎖配列による置換、ならびにその組み合わせである。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの改変は、上記重鎖遺伝子座における１つ以上のＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントの欠失ならびに１つ以上のＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメント）での置換である。
【００５６】
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子、および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座での異所性ＡＤＡＭ６発現の結果として生ずる。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、生殖組織において転写活性である。
【００５７】
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ＡＤＡＭ６機能は、上記第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じる。１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ＡＤＡＭ６機能は、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じる。
【００５８】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６のヘテロ接合またはホモ接合ノックアウトを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン配列またはラクダ科動物もしくはラクダ化ヒトもしくはマウス免疫グロブリン配列である、改変免疫グロブリン配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座に存在する。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にヒト重鎖可変遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変遺伝子配列は、上記内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性マウス重鎖可変遺伝子配列を置換する。
【００５９】
１つの態様では、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座から機能的内因性マウスＡＤＡＭ６を発現できないマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはその機能的断片をコードする異所性核酸配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、ＡＤＡＭ６ノックアウトに関してホモ接合性である雄マウスによって示される子孫産生能力の喪失をレスキューするタンパク質をコードする。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
【００６０】
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する異所性核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、内因性マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記内因性マウスＡＤＡＭ６配列は、野生型マウスにおける最も３’側の（ｔｈｅ  ３’−ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）と最も５’側の（ｔｈｅ  ５’−ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント（ＤＨ）との間にあるＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂコード配列を含む。
【００６１】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６ａもしくはその機能的断片をコードする配列、および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂもしくはその機能的断片をコードする配列を含み、該ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂまたはその機能的断片（単数もしくは複数）は、プロモーターに作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ヒトプロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、最も５’側のマウスＤＨ遺伝子セグメントに最も近い第一のＡＤＡＭ６遺伝子の第一コドンと、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間にある配列を含み、ここで、５’は、マウス免疫グロブリン遺伝子の転写方向に関して示される。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、上記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
【００６２】
１つの実施形態において、上記プロモーターは、誘導性プロモーターである。１つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、非生殖組織での発現を調節する。１つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、生殖組織での発現を調節する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片（単数もしくは複数）の発現は、生殖組織において誘導性プロモーターによって発生調節される。
【００６３】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂは、配列番号１のＡＤＡＭ６ａおよび／または配列番号２（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＡＤＡＭ６ｂから選択される。
【００６４】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号３のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号３の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号３の端にわたる（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上にわたる断片である。
【００６５】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号７３のプロモーターである。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号７３の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号７３の端にわたる核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上にわたる断片である。
【００６６】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号７７のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号７７の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号７７の端にわたる核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上にわたる断片である。
【００６７】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号３またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号３またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００６８】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号７３またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号７３またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００６９】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号７７またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号７７またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
【００７０】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマウスを提供する。
【００７１】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座ヌクレオチド配列の欠失を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含み、および上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にある、または該１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。
【００７２】
１つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＤＨ遺伝子遺伝子座における１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントでの、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメントの置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＪＨ遺伝子遺伝子座における１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントでの、１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメントの置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトＶＨ、１つ以上のヒトＤＨおよび１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントでの、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの置換ならびに内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子遺伝子座における置換を含み、この場合のマウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントの上流または５’に配置される。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントの下流または３’に配置される。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、存在する上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第一のヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間に配置される。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、および単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントＶＨ１−６９の下流かつヒト遺伝子セグメントＤＨ１−１の上流に配置されている。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、および単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントＶＨ１−２の下流かつヒト遺伝子セグメントＤＨ１−１の上流に配置されている。
【００７３】
特定の実施形態において、上記マウスは、単一のＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。
【００７４】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の導入遺伝子上に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの染色体外に存在する。
【００７５】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むマウスであって、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列を含むＢ細胞を発現するマウスを提供し、該Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする遺伝子をそのゲノム内（例えば、Ｂ細胞染色体上）に含む。１つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；マウス重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；ヒトまたはマウス軽鎖Ｖおよび／またはＪ配列を含む。１つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせからなる群より選択されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。
【００７６】
１つの態様では、マウスであって、機能的にサイレンシングされた内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子を含み、ＡＤＡＭ６機能が上記マウスにおいて保持されており、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入をさらに含み、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【００７７】
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的にサイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含み、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの、単一のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置換をさらに含み、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き、および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【００７８】
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠き、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列の機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスであって、異性のマウスと交配して、該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む後代を産生することができるマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは雄である。１つの実施形態において、上記マウスは雌である
【００７９】
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含み；該内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座に内因性機能的ＡＤＡＭ６配列を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
【００８０】
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、染色体外のものである。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の１つ以上の遺伝子座に組み込まれている。特定の実施形態において、上記１つ以上の遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座を含む。
【００８１】
１つの態様では、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖配列を改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。
【００８２】
１つの実施形態において、上記マウスは、一つのヒトＶ遺伝子セグメント、複数のＤ遺伝子セグメント、および複数のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、ヒトＤ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、ヒトＪ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒト化重鎖定常領域配列をさらに含み、該ヒト化は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列の置換を含む。特定の実施形態において、上記重鎖は、上記ヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪ遺伝子セグメント、ヒトＣＨ１配列、ヒトまたはマウスヒンジ配列、マウスＣＨ２配列、およびマウスＣＨ３配列に由来する。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスは、ヒト軽鎖定常配列をさらに含む。
【００８３】
１つの実施形態において、上記マウスは、５’および３’が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに隣接するＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖をコードできない。特定の実施形態において、上記マウスの上記ＡＤＡＭ６遺伝子は、野生型マウスの場合と同じ位置にあり、上記マウスの上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再構成できない。
【００８４】
１つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、（該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【００８５】
１つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、（該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）３’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【００８６】
１つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、（該Ｄ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【００８７】
１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、（該Ｊ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
【００８８】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写方向を基準して）最も５’側のＤ遺伝子セグメントの５’および単一のＶ遺伝子セグメントの３’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
【００８９】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の（Ｄ遺伝子セグメントの転写方向を基準して）最も５’側のＪ遺伝子セグメントの５’および最も３’側のＤ遺伝子セグメントの３’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
【００９０】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写方向を基準して）上記単一のヒトＶ遺伝子セグメントの５’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
【００９１】
１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片、マウスＡＤＡＭ６ａ配列またはその機能的断片、およびその組み合わせから選択される配列を含む。
【００９２】
１つの実施形態において、上記単一のヒトＶ遺伝子セグメントの上流（５’）または下流（３’）に位置するヌクレオチド配列は、該ヒトＶ遺伝子セグメントに対して反対の転写配向に配置されている。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、ＡＤＡＭ６ａ配列、続いてＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。
【００９３】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片に並置または隣接する単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【００９４】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片に並置または隣接するヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。
【００９５】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片に並置または隣接するヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【００９６】
１つの実施形態において、上記マウスは、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含み、上記マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに並置または隣接しており、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖をコードするように再構成できない。
【００９７】
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片である。
【００９８】
１つの態様では、非再構成Ｂ細胞系列のＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むが、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞内に該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含まないマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、再構成Ｂ細胞系列のものではないすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞に存在する；１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウスの生殖細胞系細胞には存在するが、再構成Ｂ細胞の染色体には存在しない。
【００９９】
１つの態様では、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞をはじめとするすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、上記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸上にある。１つの実施形態において、上記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸は、染色体である。１つの実施形態において、上記染色体は、野生型マウスにおいて見出される染色体であり、該染色体は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む。
【０１００】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログをそのゲノムに含むＢ細胞を含む、遺伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再構成できない内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は、異種プロモーターによって駆動される導入遺伝子上にある。特定の実施形態において、上記異種プロモーターは、非免疫グロブリンプロモーターである。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する。
【０１０１】
１つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の９０％以上は、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはそのホモログまたはその断片をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記マウスは雄マウスである。
【０１０２】
１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子を含むが第二の対立遺伝子を含まない。
【０１０３】
１つの態様では、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子における改変を含むマウスであって、上記改変が１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持するマウスを提供する。
【０１０４】
１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、少なくとも１つの重鎖対立遺伝子から、再構成内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できないようにし、少なくとも１つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子内にある内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持する。
【０１０５】
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子の少なくとも１つから、再構成内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。特定の実施形態において、上記マウスは、２つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子から、再構成内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。
【０１０６】
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性重鎖対立遺伝子から機能的重鎖を発現できず、および該マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（マウス重鎖遺伝子座の転写方向に関して）上流１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０Ｍｂｐ以内または１２０ｋｂ超にある機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０から１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。
【０１０７】
１つの態様では、１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子における改変を含むマウスを提供する。
【０１０８】
１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の少なくとも１つから、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できないようにする。特定の実施形態において、上記マウスは、上記内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子それぞれから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できない。
【０１０９】
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できず、および該マウスは、異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。
【０１１０】
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できず、および該マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（マウス重鎖遺伝子座の転写の方向に対して）上流１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０ｋｂ以内または１２０ｋｂ超にある異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０から１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。もう１つの特定の実施形態において、上記内因性９０から１００ｋｂ遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配列が、単一のヒトＶ遺伝子セグメントと最初のヒトＤ遺伝子セグメントとの間に配置されている。もう１つの特定の実施形態において、上記内因性９０から１００ｋｂ遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配列が、上記単一のヒトＶ遺伝子セグメントの５’または上流に配置されている。
【０１１１】
１つの態様では、２つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の欠失を含む、不妊性雄マウスを提供する。１つの態様では、雄性不妊形質の保有者である雌マウスであって、非機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子ノックアウトをその生殖細胞系に含む雌マウスを提供する。
【０１１２】
１つの態様では、抗体の重鎖をコードするように再構成できない内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびまたはＪ遺伝子セグメントを含むマウスであって、上記マウスのＢ細胞の大部分が機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含むマウスを提供する。
【０１１３】
１つの実施形態において、上記マウスは、抗体の機能的重鎖をコードするように再構成できないインタクトな内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、およびその組み合わせを含み、上記少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再構成できない。特定の実施形態において、上記マウスは、上記インタクトな内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント内にある機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む内因性重鎖遺伝子座を含み、上記内因性重鎖遺伝子座は、８９のＶ遺伝子セグメント、１３のＤ遺伝子セグメントおよび４のＪ遺伝子セグメントを含み、上記内因性重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再構成できず、上記ＡＤＡＭ６遺伝子座は、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
【０１１４】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントが無いマウスであって、該マウスのＢ細胞の大部分がＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含むマウスを提供する。
【０１１５】
１つの実施形態において、上記マウスには、２つ以上のＶ遺伝子セグメント、２つ以上のＤ遺伝子セグメント、２つ以上のＪ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが無い。１つの実施形態において、上記マウスには、少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、およびその組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが無い。１つの実施形態において、上記マウスには、約３メガ塩基の上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む染色体１２由来のゲノムＤＮＡ断片が無い。特定の実施形態において、上記マウスには、すべての機能的内因性重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントが無い。特定の実施形態において、上記マウスには、８９のＶＨ遺伝子セグメント、１３のＤＨ遺伝子セグメントおよび４つのＪＨ遺伝子セグメントが無い。
【０１１６】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを生殖細胞系に有し、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変が、１つ以上のマウス免疫グロブリン可変領域配列の、１つの非マウス免疫グロブリン可変領域配列による置換を含むものであるマウスであって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含むマウスを提供する。好ましい実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨおよびＪＨ配列ならびに少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のＶＨ配列は、非マウス免疫グロブリン重鎖配列によって置換されている。さらなる好ましい実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨ、ＪＨおよびすべてのＶＨ配列は、単一の非マウス免疫グロブリンＶ遺伝子セグメント配列、１つ以上のＤ遺伝子セグメント配列および１つ以上のＪ遺伝子セグメント配列によって置換されている。上記非マウス免疫グロブリン配列は、再構成されていない場合がある。好ましい実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全な非再構成ＤＨおよびＪＨ領域ならびに単一の非再構成ＶＨ配列を含む。さらなる好ましい実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、非マウス種の完全可変領域（すなわち、互いに結合して、重鎖可変領域をコードする配列を形成するＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメントを含有する再構成可変領域）を形成することができる。上記非マウス種は、ホモサピエンスである場合があり、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト配列である場合がある。
【０１１７】
１つの態様では、単一の機能的ヒトＶセグメントを含む重鎖免疫グロブリン遺伝子座を提供する。１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１およびＶＨ７−８１セグメントから選択される。１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、ＶＨ１−６９セグメントである；特定の実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、ヒト集団内で見出される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、または１３の多型形態で存在する。１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、ＶＨ１−２セグメントである；特定の実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、ヒト集団内で見出される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの多型形態で存在する。
【０１１８】
１つの実施形態において、上記重鎖免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の改変遺伝子座である。１つの実施形態において、上記改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の位置であって、対応する非改変非ヒト遺伝子座が野生型非ヒト動物において見出される位置に存在する。１つの実施形態において、上記改変非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の導入遺伝子上に存在する。
【０１１９】
１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ＶＨ１−６９遺伝子セグメントは、配列番号３７を含む。１つの実施形態において、上記ＶＨ１−６９遺伝子セグメントは、配列番号３７に由来する。１つの実施形態において、上記ＶＨ１−６９遺伝子セグメントは、配列番号３７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【０１２０】
１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝子セグメントは、配列番号３７のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１２１】
１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ＶＨ１−２遺伝子セグメントは、配列番号６３を含む。１つの実施形態において、上記ＶＨ１−２遺伝子セグメントは、配列番号６３に由来する。１つの実施形態において、上記ＶＨ１−２遺伝子セグメントは、配列番号６３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【０１２２】
１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶ遺伝子セグメントは、配列番号６３を含むヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１２３】
１つの実施形態において、上記単一の機能的ヒトＶセグメントは、１つ以上のＤセグメントおよび１つ以上のＪセグメント、または１つ以上のＪセグメントに作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記Ｖセグメント、ならびに１つ以上のＤセグメントおよび／またはＪセグメントは、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびその組み合わせから選択される。１つの実施形態において、上記ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその組み合わせは、各々非ヒト内因性定常配列である。１つの実施形態において、上記ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその組み合わせのうちの少なくとも１つは、ヒト配列である。特定の実施形態において、上記ＣＨ１および／またはヒンジは、ヒト配列である。
【０１２４】
１つの態様では、すべての機能的Ｖセグメントの、単一のヒトＶセグメントによる置換を含む改変内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、単一のヒトＶセグメント以外のＶセグメントに由来する重鎖可変遺伝子を形成するように再構成できない非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。
【０１２５】
１つの実施形態において、上記単一のヒトＶセグメントは、ＶＨ１−６９である。１つの実施形態において、上記単一のヒトＶセグメントは、ＶＨ１−２である。
【０１２６】
１つの実施形態において、上記遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＤＨセグメントまたは非ヒトＤＨセグメント、および１つのヒトＪＨセグメントまたは非ヒトＪＨセグメントを含む。特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントを含む。特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒトＪＨセグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記遺伝子座は、ヒトＶＨ１−６９、すべての機能的ヒトＤＨセグメント、およびすべての機能的ヒトＪＨセグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメント（またはヒトＶセグメントおよびヒトＪセグメント）は、内因性マウス重鎖遺伝子座において、マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記マウス重鎖遺伝子座は、マウス免疫グロブリン定常領域配列の野生型レパートリーを含む。
【０１２７】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、上記非ヒト動物の機能的免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントのみが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１およびＶＨ７−８１セグメントから選択される遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖Ｖ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記重鎖Ｖ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０１２８】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、単一の機能的ヒトＶＨセグメントを含み、上記単一の機能的ヒトＶＨセグメントを欠く再構成免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子を実質的に形成できない遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【０１２９】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、上記非ヒト動物において発現される免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１およびＶＨ７−８１遺伝子セグメントから選択されるヒトセグメントのうちの１つに由来する、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記ヒトセグメントは、ＶＨ１−６９セグメントである。１つの実施形態において、上記ヒトセグメントは、ＶＨ１−２セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスによって発現される免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、単一のＶセグメントファミリーメンバーに由来し、１つの実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖可変領域のみが、上記単一のＶセグメントファミリーメンバーの多型変異体に由来する。
【０１３０】
１つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変セグメント（Ｖκ）をさらに含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記１つ以上のＶκセグメントは、１つ以上のヒトＪセグメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記Ｊセグメントは、ヒトＪκセグメントである。もう１つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、免疫グロブリンλ軽鎖を発現しない。もう１つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、機能的ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も機能的内因性免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子座も含まない。
【０１３１】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスである。
【０１３２】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての機能的内因性Ｖκセグメントの、１つ以上の機能的ヒトＶκセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンＶκセグメントによるものである。
【０１３３】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンＪκ遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての機能的内因性非ヒト免疫グロブリンＪκセグメントの、１つ以上の機能的ヒト免疫グロブリンＪκセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンＪκセグメントによるものである。
【０１３４】
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のＶセグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記単一の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントは、ヒトＶＨ１−６９セグメントであり、上記非ヒト動物は、すべての機能的非ヒトＤＨセグメントの、すべての機能的ヒトＤＨセグメントによる置換をさらに含み、すべての機能的非ヒトＪＨセグメントの、すべての機能的ヒトＪＨセグメントによる置換をさらに含み、上記免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトＶＨ１−６９配列、ヒトＤＨ配列、ヒトＪＨ配列、およびマウス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構成する。
【０１３５】
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のＶセグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶセグメントのレパートリーを含む免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記単一の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントは、ヒトＶＨ１−２セグメントであり、上記非ヒト動物は、すべての機能的非ヒトＤＨセグメントの、すべての機能的ヒトＤＨセグメントによる置換をさらに含み、すべての機能的非ヒトＪＨセグメントの、すべての機能的ヒトＪＨセグメントによる置換をさらに含み、上記免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、内因性非ヒト定常領域の遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトＶＨ１−２配列、ヒトＤＨ配列、ヒトＪＨ配列、およびマウス定常領域配列を含む重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構成する。
【０１３６】
１つの実施形態において、上記再構成遺伝子を含むＢ細胞を提供する。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、対象となる抗原で免疫された記載されるマウスに由来し、上記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合する抗体をコードする。１つの実施形態において、上記対象となる抗原は、病原体である。特定の実施形態において、上記病原体は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域（例えば、ヒトκ軽鎖可変領域）を含む体細胞変異高親和性（例えば、約１０−９のＫＤ以下）抗体をコードする。
【０１３７】
１つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、１つ以上のヒトλ軽鎖可変（Ｖλ）セグメントを含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記１つ以上のヒトＶλセグメントは、１つ以上のヒトＪセグメントに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記Ｊセグメントは、ヒトＪλセグメントである。もう１つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、κ軽鎖を発現しない。もう１つの特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、機能的ヒトκ軽鎖可変遺伝子座も非ヒトκ軽鎖可変遺伝子座も含まない。
【０１３８】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、すべてのまたは実質的にすべての機能的非ヒト免疫グロブリンＶλセグメントの、１つ以上の機能的ヒト免疫グロブリンＶλセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンＶλセグメントによるものである。
【０１３９】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、すべてのまたは実質的にすべての機能的非ヒト免疫グロブリンＪλセグメントの、１つ以上の機能的ヒト免疫グロブリンＪλセグメントによる置換を含む。さらなる特定の実施形態において、上記置換は、すべてのまたは実質的にすべての機能的ヒト免疫グロブリンＪλセグメントによる置換である。
【０１４０】
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のＶＨセグメントのみを含む免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）領域遺伝子座を含み、上記単一のＶＨセグメントは、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはヒトＶＨ１−２セグメントであり、すべての機能的非ヒトＤＨセグメントの、すべての機能的ヒトＤＨセグメントによる置換をさらに含み、すべての機能的非ヒトＪＨセグメントの、すべての機能的ヒトＪＨセグメントによる置換をさらに含み、上記ＶＨ領域遺伝子座は、ヒト定常領域または非ヒト定常領域の遺伝子配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記定常領域の遺伝子配列は、非ヒト定常領域の遺伝子配列、例えば、内因性非ヒト定常遺伝子配列である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、上記非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、セグメントを、ヒトＶＨ１−６９配列（またはヒトＶＨ１−２配列）、ヒトＤＨ配列、ヒトＪＨ配列、および内因性非ヒト定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする遺伝子を形成するように再構成する。
【０１４１】
１つの実施形態において、上記再構成遺伝子を含むＢ細胞を提供する。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、対象となる抗原で免疫された記載される非ヒト動物に由来し、上記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合する抗体をコードする。１つの実施形態において、上記抗原は、リガンド、細胞表面受容体、および細胞内タンパク質から選択されるヒトタンパク質である。１つの実施形態において、上記対象となる抗原は、病原体である。特定の実施形態において、上記病原体は、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、およびヒト免疫不全ウイルスから選択される。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変領域（例えば、ヒトλ軽鎖可変領域）を含む体細胞変異高親和性（例えば、約１０−９ＫＤ以下）抗体をコードする。
【０１４２】
１つの態様では、限定された免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、導入遺伝子上にヒトＶＨ１−６９セグメント（またはヒトＶＨ１−２セグメント）を含み、上記ヒトＶＨ１−６９セグメントは、上記導入遺伝子上で、ヒトＤＨセグメントもしくは非ヒトＤＨセグメントおよび／またはヒトＪセグメントもしくは非ヒトＪセグメントに作動可能に連結され、上記導入遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子もしくは非ヒト定常領域遺伝子、またはキメラヒト／非ヒト定常領域（例えば、少なくとも１つの配列は、非ヒトの、例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ならびにＣＨ３および／またはヒンジから選択されるＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその組み合わせ）をさらに含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスまたはラットであり、上記非ヒトＤ遺伝子、非ヒトＪ遺伝子、および／または非ヒト定常領域遺伝子は、マウス遺伝子もしくはラット遺伝子またはキメラヒト／マウスもしくはラット遺伝子である。
【０１４３】
１つの実施形態において、上記導入遺伝子が、上記非ヒト動物において再構成免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺伝子を形成するように再構成するように、上記非ヒト動物は、１つ以上のヒト免疫グロブリンＶλセグメントおよびヒト免疫グロブリンＪλセグメント、または１つ以上のヒト免疫グロブリンＶκセグメントおよびヒト免疫グロブリンＪκセグメント、ならびにヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子またはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含む導入遺伝子を含む。
【０１４４】
特定の実施形態において、上記マウスが、導入遺伝子から、ＶＨ１−６９セグメント（またはＶＨ１−２セグメント）に由来する完全ヒト抗体を発現するように、上記非ヒト動物は、ヒトＶＨ１−６９セグメント（またはヒトＶＨ１−２セグメント）である単一のＶセグメント、１つ以上のヒトＤセグメント、１つ以上のヒトＪセグメント、および重鎖可変遺伝子座に作動可能に連結されたヒト定常遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を有する導入遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、機能的内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含まない。特定の実施形態において、上記非ヒト動物が内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を再構成して、再構成非ヒト抗体遺伝子を形成できないように、上記非ヒト動物は、内因性非ヒトＤＨセグメントおよび／または内因性非ヒトＪＨセグメントの欠失を含む非機能的内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性マウス重鎖定常領域に作動可能に連結されたスイッチ配列の欠失を含む。特定の実施形態において、上記スイッチ配列は、非ヒト（例えば、マウス）μスイッチ配列である。もう１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、免疫グロブリンκ遺伝子座および免疫グロブリンλ遺伝子座から選択される機能的内因性軽鎖可変遺伝子座の欠如をさらに含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物が、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖および／または内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を再構成して、再構成内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖および／または再構成内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子を形成できないように、上記非ヒト動物は、Ｊκ配列および／またはＪλ配列の欠失を含む。
【０１４５】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖の機能的ノックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列の欠失を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の機能的ノックアウトを結果としてもたらす、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列の欠失を含む。
【０１４６】
１つの態様では、１つ以下のヒトＶＨセグメントまたはその１つ以上の多型、１つ以上のＤセグメントのレパートリーから選択されるＤセグメント、および１つ以上のＪセグメントのレパートリーから選択されるＪセグメントに由来する免疫グロブリン重鎖可変レパートリーを含む齧歯動物であって、雄の齧歯動物において機能的である異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む齧歯動物を提供する。
【０１４７】
１つの実施形態において、上記ヒトＶＨセグメントは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０以上の多型変異体で存在し、各多型変異体が、１つ以上のＤセグメントのうちのいずれかおよび１つ以上のＪセグメントのうちのいずれかを有する再構成重鎖可変ドメインを再構成および形成できるように、多型変異体は、Ｄセグメントおよび／またはＪセグメントに作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。１つの実施形態において、上記Ｄセグメントのレパートリーは、２つ以上のＤセグメントを含む。１つの実施形態において、上記Ｊセグメントのレパートリーは、２つ以上のＪセグメントを含む。１つの実施形態において、上記Ｄセグメントおよび／またはＪセグメントは、ヒトセグメントである。１つの実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、同じ種の野生型齧歯動物のＡＤＡＭ６配列である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。１つの実施形態において、上記雄の齧歯動物において機能的である上記異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片は、上記改変免疫グロブリン重鎖可変レパートリーと同じ染色体上にある；１つの実施形態において、それは異なる染色体上にある。
【０１４８】
１つの態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨセグメントおよび／またはその多型変異体、ならびに１つ以上のＤＨ配列および１つ以上のＪ配列をコードする配列を含むヌクレオチド構築物であって、非ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座と相同な少なくとも１つのホモロジーアーム、またはリコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘ部位）を含む構築物を提供する。１つの実施形態において、上記Ｖセグメントは、ＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントである。
【０１４９】
１つの態様では、単一のヒト免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物であって、上記単一のＶＨセグメントがＶＨ１−６９（またはＶＨ１−２）セグメントである構築物を提供する。１つの実施形態において、上記構築物は、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む。１つの実施形態において、上記構築物は、ＶＨ１−６９（またはＶＨ１−２）セグメントの上流に第一のマウスホモロジーアーム、およびＶＨ１−６９（またはＶＨ１−２）セグメントの下流に第二のマウスホモロジーアームを含み、上記第一のマウスホモロジーアームは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域の直ぐ上流のマウス染色体の領域と相同であるが、機能的マウス免疫グロブリン重鎖可変セグメントを含まない。１つの実施形態において、上記構築物は、配列番号６を含む。１つの実施形態において、上記構築物は、配列番号７４を含む。１つの実施形態において、上記構築物は、配列番号７５を含む。１つの実施形態において、上記構築物は、配列番号７６を含む。
【０１５０】
１つの態様では、上記限定された単一のＶＨセグメントは、非ヒト動物内にあるか、または上記限定されたＶＨセグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり（例えば、本来の位置に（ｉｎ  ｓｉｔｕ）または導入遺伝子内）、上記非ヒト動物または非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）の遺伝子座または動物から選択される。特定の実施形態において、上記非ヒト動物または非ヒト遺伝子座は、マウスまたはラット遺伝子座である。
【０１５１】
１つの態様では、（ａ）ヒト可変領域遺伝子セグメントのヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列と（ｂ）マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードするヌクレオチド配列とを含むターゲティングベクターを提供する。
【０１５２】
１つの実施形態において、上記ターゲティングベクターは、上記マウスＡＤＡＭ６をコードする配列に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。
【０１５３】
１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を改変するためのヌクレオチド構築物であって、少なくとも１つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位と、マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列とを含む構築物を提供する。
【０１５４】
１つの態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含む核酸構築物を提供し、該上流ホモロジーアームは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、該下流ホモロジーアームは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む配列が、該上流ホモロジーアームと該下流ホモロジーアームとの間に配置されている。特定に実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする配列は、野生型マウスの場合に該マウスＡＤＡＭ６が連結されているマウスプロモーターに作動可能と連結されている。
【０１５５】
１つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変マウスから単離された細胞を提供する。１つの実施形態において、上記細胞はリンパ球である。１つの実施形態において、上記リンパ球はＢ細胞である。特定の実施形態において、上記Ｂ細胞は、異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログまたはホモログまたはその機能的断片をコードする配列を含み、上記Ｂ細胞は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖可変ドメインを発現する。
【０１５６】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来し、限定されたＶＨセグメントのレパートリー含む細胞または組織を提供する。１つの実施形態において、上記ＶＨセグメントのレパートリーは、単一のＶＨセグメントファミリーメンバーおよび／またはその多型変異体に限定される。特定の実施形態において、上記単一のＶＨセグメントは、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはヒトＶＨ１−２セグメントである。１つの実施形態において、上記細胞または組織は、上記非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。
【０１５７】
１つの実施形態において、上記細胞は、ＥＳ細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は、Ｂ細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は、生殖細胞である。
【０１５８】
１つの実施形態において、上記組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、および上皮組織から選択される。特定の実施形態において、上記組織は、生殖組織である。
【０１５９】
１つの実施形態において、本明細書に記載のマウスに由来する細胞および／または組織は、１つ以上のエクスビボアッセイにおいて使用するために単離される。様々な実施形態において、上記１つ以上のエクスビボアッセイとしては、物理特性、熱特性、電気特性、機械的な特性、または光学特性の測定、手術手順、異なる組織型の相互作用の測定、画像化技術による顕色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、またはその組み合わせが挙げられる。
【０１６０】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスである。
【０１６１】
１つの態様では、本明細書に記載の限定された重鎖ＶＨセグメントを含む非ヒト胚を提供する。１つの実施形態において、上記胚は、上記限定されたＶＨセグメントを含むＥＳドナー細胞と、宿主胚細胞とを含む。
【０１６２】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスである。
【０１６３】
１つの態様では、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の染色体またはその断片を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、核移植の結果としての染色体またはその断片を含む。
【０１６４】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する核を提供する。１つの実施形態において、上記核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞に由来する。
【０１６５】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する多能性細胞、人工多能性（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、または全能性細胞を提供する。特定の実施形態において、上記細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【０１６６】
１つの態様では、限定されたＶＨセグメントのレパートリーを含む非ヒト人工多能性細胞を提供する。１つの実施形態において、上記人工多能性細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する。
【０１６７】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスのリンパ球の配列を含むハイブリドーマを提供する。１つの実施形態において、上記リンパ球はＢ細胞である。
【０１６８】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマを提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウスまたはラットである。
【０１６９】
１つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む、ＥＳ細胞、多能性細胞および人工多能性（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞をはじめとする（しかしこれらに限定されない）マウス細胞およびマウス胚を提供する。ＸＸである細胞およびＸＹである細胞を提供する。本明細書に記載の改変、例えば、前核注入により細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。ウイルス導入ＡＤＡＭ６遺伝子を含む細胞、胚およびマウス、例えば、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む形質導入構築物を含む細胞、胚およびマウスも提供する。
【０１７０】
１つの態様では、遺伝子改変マウス細胞であって、再構成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む重鎖を発現できず、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む遺伝子改変マウス細胞を提供する。１つの実施形態において、上記細胞は、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入をさらに含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成の際にヒト可変領域を含む抗体の機能的重鎖をコードするような、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結された重鎖遺伝子セグメントである。
【０１７１】
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いている遺伝子改変マウス細胞であって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス細胞を提供する。１つの実施形態において、上記細胞は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変をさらに含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変は、マウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、マウスＤＨ遺伝子セグメントの欠失、マウスＪＨ遺伝子セグメントの欠失およびその組み合わせから選択される欠失を含む。特定の実施形態において、上記マウスは、１つ以上のマウス免疫グロブリンＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ配列の、ヒト免疫グロブリン配列による置換を含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、ヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ヒトＤＨ、ヒトＪＨ、ヒトＪＬおよびその組み合わせから選択される。
【０１７２】
１つの実施形態において、上記細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または人工多能性細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、マウスＥＳ細胞である。
【０１７３】
１つの態様では、再構成免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むマウスＢ細胞であって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を該Ｂ細胞の染色体上に含むＢ細胞を提供する。１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、上記核酸配列の２つの対立遺伝子を含む。
【０１７４】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に隣接する核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
【０１７５】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む核酸分子とは異なる核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
【０１７６】
１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、マウスまたはヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている再構成非マウス免疫グロブリン可変遺伝子配列を含み、ここで、Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む。
【０１７７】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成非ヒト免疫グロブリン可変遺伝子配列に対して最も近い遺伝子の遺伝子座にあるまたはその中にある核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
【０１７８】
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再構成非ヒト免疫グロブリン可変領域配列に隣接する核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
【０１７９】
１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列とを含む染色体を含む、マウス体細胞を提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記核酸は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の単一のコピーを含む。１つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む。特定の実施形態において、上記体細胞は、Ｂ細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、生殖細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、幹細胞である。
【０１８０】
１つの態様では、マウス生殖細胞であって、マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を該生殖細胞の染色体上に含み、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列が、野生型マウス生殖細胞の染色体内の位置とは異なる染色体内の位置にあるマウス生殖細胞を提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウス免疫グロブリン遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、上記マウス免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのマウス免疫グロブリン配列の、少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列による置換を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列である。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。
【０１８１】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体可変ドメイン配列を提供する。
【０１８２】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物に由来する配列を含む抗体可変ドメインを含むヒト治療薬を提供する。
【０１８３】
１つの態様では、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントに由来する抗体可変領域配列を非ヒト動物から得る方法であって、（ａ）非ヒト動物を対象となる抗原で免疫する工程であって、上記非ヒト動物が、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての非ヒト可変セグメントの、単一のヒト可変セグメントによる置換を含み、上記単一のヒト可変セグメントが、ＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントであり、上記非ヒト動物が、ヒトＶＨ１−６９セグメントまたはＶＨ１−２セグメントに由来しない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を実質的に形成できない工程と、（ｂ）上記非ヒト動物が上記対象となる抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、（ｃ）上記非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程であって、上記抗体が上記対象となる抗原に結合する工程とを含む方法を提供する。
【０１８４】
１つの実施形態において、上記単一のヒト可変セグメントは、ＶＨ１−６９セグメントである。
【０１８５】
１つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号３７に由来する。１つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号３７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。１つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号３７を含む。
【０１８６】
１つの実施形態において、上記単一のヒト可変セグメントは、ＶＨ１−２セグメントである。
【０１８７】
１つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号６３に由来する。１つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号６３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。１つの実施形態において、上記抗体可変領域配列は、配列番号６３を含む。
【０１８８】
１つの態様では、非ヒト動物において、ヒト抗体可変領域のレパートリーを生成するための方法であって、上記レパートリーの上記ヒト重鎖可変領域が、同じＶＨ遺伝子ファミリーメンバーならびに複数のＤＨセグメントのうちの１つおよび複数のＪＨセグメントのうちの１つに由来し、上記レパートリーが、単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリンのＦＲ１（フレームワーク１）配列、ＣＤＲ１配列、ＦＲ２配列、ＣＤＲ２配列、およびＦＲ３配列を有することを特徴とする方法を提供する。１つの実施形態において、上記レパートリーは、複数の異なるＣＤＲ３＋ＦＲ４配列を有することをさらに特徴とする。
【０１８９】
１つの実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子ファミリーは、ＶＨファミリー１、２、３、４、５、６、および７から選択される。特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子ファミリーは、ＶＨファミリー１である。１つの実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３から選択される。特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーは、ＶＨ１−６９である。
【０１９０】
１つの実施形態において、上記レパートリーは、ＶＨ１−６９セグメントに由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号３８に由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号３８の重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。
【０１９１】
１つの実施形態において、上記レパートリーは、ＶＨ１−２セグメントに由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号６４に由来する重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。特定の実施形態において、上記レパートリーは、配列番号６４の重鎖ＦＲ１配列、重鎖ＣＤＲ１配列、重鎖ＦＲ２配列、重鎖ＣＤＲ２配列、および重鎖ＦＲ３配列を含む。
【０１９２】
１つの態様では、非ヒト動物において、複数の異なるＣＤＲ３配列およびＦＲ４配列を生成するための方法であって、単一のＶＨセグメントファミリーメンバーに限定されたＶＨセグメントのレパートリーを有する免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座を含む非ヒト動物を、対象となる抗原に曝露する工程と、上記非ヒト動物が上記抗原に対する免疫応答を発生するようにする工程とを含み、上記免疫応答が、その重鎖可変ドメインの各々が上記単一のＶＨセグメントファミリーメンバーに由来するＢ細胞レパートリーであって、複数の異なるＣＤＲ３配列およびＦＲ４配列を含むＢ細胞レパートリーを生成する方法を提供する。
【０１９３】
１つの実施形態において、上記単一のＶＨセグメントファミリーメンバーは、ヒトのものである。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラット、およびウサギから選択される。１つの実施形態において、上記対象となる抗原は、リガンド、受容体、細胞内タンパク質、および分泌タンパク質から選択される。１つの実施形態において、上記対象となる抗原は、ヒト病原体である。
【０１９４】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【０１９５】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列を提供する。
【０１９６】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を提供する。
【０１９７】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物において作製される抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）を提供する。
【０１９８】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、該非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写に対して）上流の１つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントで置換する工程、および該非ヒト動物の該ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写に対して）下流の１つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントを、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントで置換する工程を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＤ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｊ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上の遺伝子セグメントは、単一のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪ遺伝子セグメントを含む。
【０１９９】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６遺伝子の上流および／または下流の上記１つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞中で置換して、遺伝子改変前駆細胞を形成し；該遺伝子改変前駆細胞を宿主に導入し；そして、該遺伝子改変前駆細胞を含む該宿主を妊娠させて、該遺伝子改変前駆細胞に由来するゲノムを含む非ヒト動物を形成する。１つの実施形態において、上記宿主は胚である。特定の実施形態において、上記宿主は、マウス前桑実胚（ｐｒｅ−ｍｏｒｕｌａ）（例えば８または４細胞期）、４倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から選択される。
【０２００】
１つの態様では、単一のＶセグメントファミリーメンバーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現するＢ細胞レパートリーを有する非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーにおいて発現される上記非ヒト動物免疫グロブリン重鎖可変ドメインの上記Ｂ細胞レパートリーのうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、同じＶセグメントファミリーメンバーに由来する。特定の実施形態において、上記割合は、少なくとも９０％である。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーは、末梢（血）Ｂ細胞から本質的になる。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーは、脾性Ｂ細胞から本質的になる。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーは、骨髄Ｂ細胞から本質的になる。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞レパートリーは、末梢Ｂ細胞、脾性Ｂ細胞、および骨髄Ｂ細胞から本質的になる。
【０２０１】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現する上記非ヒト動物のＢ細胞のうちの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％超または９０％超が、単一のＶＨ遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する上記非ヒト動物のＢ細胞のうちの少なくとも７５％は、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントファミリーメンバーに由来する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する。特定の実施形態において、上記割合は、少なくとも９０％である。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞のすべては、上記単一のＶＨ遺伝子ファミリーメンバーに由来する重鎖ドメインを発現する。
【０２０２】
１つの態様では、対象となる抗原による免疫に応答して抗原特異的Ｂ細胞集団を作製する遺伝子改変マウスであって、上記抗原特異的Ｂ細胞集団のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超が、同じＶＨ遺伝子セグメントにすべて由来する免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、上記抗原特異的Ｂ細胞集団のうちの少なくとも７５％は、同じＶＨ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現する。１つの実施形態において、上記抗原特異的Ｂ細胞のすべては、同じＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖を発現する。
【０２０３】
１つの態様では、限定されたＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、上記限定が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはＶＨ１−６９遺伝子セグメントに対するものであり、ＶＨ１−６９＊０１遺伝子セグメントと少なくとも約７５．５％、７６．５％、８６．７％、８７．８％、９４．９％、９６．９％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物を提供する。特定の実施形態において、上記限定されたレパートリーは、図７のＶＨ１−６９変異体のうちの１つ以上から選択される。
【０２０４】
１つの態様では、限定されたＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、上記限定が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントまたはＶＨ１−２遺伝子セグメントに対するものであり、ＶＨ１−２遺伝子セグメントと少なくとも約９４．９％、９５．９％、９６．９％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物を提供する。特定の実施形態において、上記限定されたレパートリーは、図１０のＶＨ１−２変異体のうちの１つ以上から選択される。
【０２０５】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。
【０２０６】
１つの態様では、限定されたヒトＶＨセグメントのレパートリーを含む非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブリン軽鎖可変セグメント遺伝子座をさらに含み、上記マウスにおいて発現されるκ軽鎖に対するλ軽鎖の比率が、野生型マウスにおける場合とほぼ同じである非ヒト動物を提供する。
【０２０７】
１つの態様では、単一のＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメント、および１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントの存在を特徴とする限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントが、多型ＶＨ遺伝子セグメントである非ヒト動物を提供する。
【０２０８】
１つの実施形態において、上記多型ＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト集団における高コピー数に関連するヒトＶＨ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２３、またはこれらの多型変異体から選択される。特定の実施形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−６９遺伝子セグメントである。もう１つの特定の実施形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０２０９】
１つの実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、またはキメラヒト／マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子である。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン定常遺伝子は、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３、およびその組み合わせから選択されるヒト配列を含む。１つの実施形態において、上記マウス定常遺伝子は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
【０２１０】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、Ｊ遺伝子セグメントおよび軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結されたヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントをさらに含む。特定の実施形態において、上記ＶＬ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメントは、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから選択される。１つの実施形態において、上記ＶＬ遺伝子セグメントおよび／またはＪ遺伝子セグメントは、ヒトκ遺伝子セグメントである。
【０２１１】
様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの欠失を含む。
【０２１２】
様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、不活性化内因性重鎖可変遺伝子遺伝子座を含む。様々な実施形態において、上記不活性化内因性重鎖可変遺伝子遺伝子座は、内因性重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されていない。
【０２１３】
１つの態様では、血清免疫グロブリンの発現を特徴とする非ヒト動物であって、上記血清免疫グロブリンのうちの８０％超が、ヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、上記ヒト重鎖可変ドメインが、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する非ヒト動物を提供する。
【０２１４】
１つの実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体である。１つの実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体である。
【０２１５】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体での置換をその生殖細胞系内に含む非ヒト動物を提供する。
【０２１６】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＬ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントによる置換をさらに含む。特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結された１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントをさらに含む。
【０２１７】
１つの態様では、少なくとも１つのヒト可変ドメイン／非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体を発現する非ヒト動物であって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から非ヒトＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、抗体の機能的重鎖をコードするように再構成できない。
【０２１８】
１つの態様では、少なくとも１つのヒト可変ドメイン／非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体を発現する非ヒト動物であって、免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座から非ヒトＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する非ヒト動物を提供する。
【０２１９】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、上記非ヒト動物のＢ細胞において発現され、該Ｂ細胞は、ヒト可変配列と非ヒト定常配列とを含む再構成免疫グロブリン配列を含む。
【０２２０】
１つの実施形態において、上記非ヒト定常配列は、齧歯動物配列である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０２２１】
１つの態様では、不妊性雄非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、ドナーＥＳ細胞の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にすること（または該対立遺伝子をノックアウトすること）、該ドナーＥＳ細胞を宿主胚に導入すること、代理母において該宿主胚を妊娠させること、および該ドナーＥＳ細胞に全部または一部由来する後代を該代理母に出産させることを含む。１つの実施形態において、上記方法は、後代を交配させて不妊性雄非ヒト動物を得ることをさらに含む。
【０２２２】
１つの態様では、対象となる遺伝子改変を有する非ヒト動物であって、不妊性である非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象となる遺伝子改変をゲノム内で行う工程；（ｂ）上記ゲノムを改変して、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子をノックアウトするか、または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にする工程；および（ｃ）上記ゲノムを非ヒト動物の作製に用いる工程を含む。様々な実施形態において、上記ゲノムは、ＥＳ細胞からのものであり、または核移植実験で使用される。
【０２２３】
１つの態様では、本明細書に記載のターゲティングベクター、ヌクレオチド構築物または細胞を使用して作製される非ヒト動物を提供する。
【０２２４】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物と、野生型非ヒト動物であるまたは遺伝子改変されている第二の非ヒト動物との交配の後代を提供する。
【０２２５】
１つの態様では、非ヒト免疫グロブリン重鎖配列の、１つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列による置換を含む非ヒト動物系統を維持するための方法を提供する。１つの実施形態において、上記１つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列である。
【０２２６】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物系統は、１つ以上の非ヒトＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび／または１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントをさらに含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、単一のヒトＶＨセグメント、少なくとも２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および少なくとも６のＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、単一のヒトＶＨセグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、非ヒト定常領域遺伝子である。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／もしくはＣＨ４またはその組み合わせから選択されるマウスまたはラット定常領域遺伝子配列を含む。様々な実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−６９またはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０２２７】
１つの実施形態において、上記方法は、上記非ヒト免疫グロブリン重鎖配列の置換に関してヘテロ接合性の雄非ヒト動物を産生する工程、および上記ヘテロ接合雄非ヒト動物を野生型雌非ヒト動物とまたはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌非ヒト動物と交配させる工程を含む。１つの実施形態において、上記方法は、ヘテロ接合雄と、野生型である雌またはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌とを繰り返し交配させることにより上記非ヒト動物系統を維持する工程を含む。
【０２２８】
１つの実施形態において、上記方法は、ヒト重鎖配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性の雄または雌非ヒト動物から細胞を得る工程と、これらの細胞をドナー細胞として、またはこれらの細胞からの核をドナー核として利用する工程と、上記細胞または核を使用する工程であって、宿主細胞を使用してならびに／または代理母において上記細胞および／もしくは核を妊娠させて遺伝子改変非ヒト動物を作製するする工程とを含む。
【０２２９】
１つの実施形態では、重鎖遺伝子座における置換に関してヘテロ接合性である雄非ヒト動物のみを雌非ヒト動物に交配させる。特定の実施形態において、上記雌非ヒト動物は、置換される重鎖遺伝子座に関してホモ接合性、ヘテロ接合性または野生型である。
【０２３０】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるλおよび／またはκ軽鎖可変配列の、異種免疫グロブリン軽鎖配列による置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記異種免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンλおよび／またはκ軽鎖可変配列である。
【０２３１】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に（非再構成配列については）作動可能に連結されているまたは（再構成配列については）融合されている、再構成または非再構成異種λまたはκ軽鎖配列（例えば、非再構成ＶＬおよび非再構成ＪＬ、または再構成ＶＬＪＬ）をコードする配列を含む。１つの実施形態において、上記異種λまたはκ軽鎖配列はヒトのものである。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、齧歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長類から選択される。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。１つの実施形態において、上記導入遺伝子は、上記軽鎖配列の発現を駆動する非免疫グロブリンプロモーターを含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、転写活性プロモーターである。特定の実施形態において、上記プロモーターは、ＲＯＳＡ２６プロモーターである。
【０２３２】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法を提供し、この方法は、第一の改変のために、非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む非ヒトヌクレオチド配列を上記動物のゲノムに挿入する工程であって、上記挿入が内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を維持する工程、その後、第二の改変のために、上記非ヒト動物の上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を非機能的にする工程を含む。１つの実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が機能的重鎖可変領域をコードするように再構成できないように、上記第一の改変は、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流において行われ、上記第二の改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を逆位させるように、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を転座させるように、または上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を作動可能な連結の外側に配置するように行われる。
【０２３３】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法を提供し、この方法は、非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと非ヒトＡＤＡＭ６（または雄非ヒト動物において機能的なそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）ヌクレオチド配列とを含む非ヒト動物ヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列で置換して、第一のキメラ遺伝子座を形成する工程、その後、非ヒトＡＤＡＭ６コード配列（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする配列）を含む配列を、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列に挿入して、第二のキメラ遺伝子座を形成する工程を含む。
【０２３４】
１つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されているヒトＶＨ遺伝子セグメントまたはヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。さらなる特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、マウスＣＨ２＋ＣＨ３配列と融合されているヒトＣＨ１配列、またはヒトＣＨ１およびヒトヒンジ配列を含む第三のキメラ遺伝子座に作動可能に連結されている。
【０２３５】
１つの態様では、妊性雄マウスを作製するための、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む異所性ヌクレオチド配列を含むマウスの使用を提供し、この使用は、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む上記異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠いているマウスと交配させること、および該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を有する後代を産生できる雌である後代を得ること、または該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を含む雄であって、野生型雄マウスによって示される妊性とほぼ同じである妊性を示す雄である後代を得ることを含む。
【０２３６】
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【０２３７】
１つの態様では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【０２３８】
１つの態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【０２３９】
１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【０２４０】
１つの態様では、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含有するファージライブラリーを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
【０２４１】
１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７および配列番号５９から選択される配列を含むヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに由来する。
【０２４２】
１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０および配列番号６２から選択される配列を含むヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに由来する。
【０２４３】
１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９および配列番号７１から選択される配列を含むヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントにすべて由来する。
【０２４４】
１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０および配列番号７２から選択される配列を含むヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに由来する。
【０２４５】
１つの態様では、ヒト抗体を作製するための可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスからリンパ球を単離すること、（ｃ）上記リンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できるリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記リンパ球からの１つ以上の可変領域核酸配列を増幅し、それによって可変領域配列を生成することを含む。
【０２４６】
１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの脾臓に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスのリンパ節に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの骨髄に由来する。
【０２４７】
１つの実施形態において、上記標識抗体は、蛍光団結合体化抗体である。１つの実施形態において、１つ以上の上記蛍光団結合体化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。
【０２４８】
１つの実施形態において、上記リンパ球は、Ｂ細胞である。
【０２４９】
１つの実施形態において、上記１つ以上の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態において、上記１つ以上の可変領域核酸配列は、軽鎖可変領域配列を含む。１つの特定の実施形態において、上記軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列である。１つの実施形態において、上記１つ以上の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を含む。
【０２５０】
１つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから脾臓を単離すること、（ｃ）上記脾臓からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
【０２５１】
１つの実施形態において、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから１つ以上のリンパ節を単離すること、（ｃ）上記１つ以上のリンパ節からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
【０２５２】
１つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから骨髄を単離すること、（ｃ）上記骨髄からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。様々な実施形態において、上記１つ以上の標識抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。
【０２５３】
様々な実施形態において、上記対象となる抗原は、例えば、ウイルス抗原を含め、ヒト被験体が罹患する病原体である。例示的なウイルス性病原体としては、例えば、主に、アデノウイルス科、細菌ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、およびトガウイルス科のものが挙げられる。かかる例示的なウイルスは典型的に、長さが２０〜３００ナノメートルの間の範囲にある。様々な実施形態において、上記対象となる抗原は、肝炎ウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶなど）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはインフルエンザウイルスから選択されるウイルス抗原である。
【０２５４】
様々な実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、増幅重鎖および軽鎖可変領域配列をヒト重鎖および軽鎖定常領域配列に融合させること、融合した重鎖および軽鎖配列を細胞において発現させること、および発現された重鎖および軽鎖配列を回収し、それによってヒト抗体を産生させることをさらに含む。
【０２５５】
様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧから選択される。様々な特定の実施形態において、上記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４またはその組み合わせを含む。様々な実施形態において、上記軽鎖定常領域は、免疫グロブリンκ定常領域である。様々な実施形態において、上記細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。特定の実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０２５６】
１つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラマウス−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラマウス−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程を含む。
【０２５７】
１つの実施形態において、上記逆キメラマウス−ヒト抗体は、マウス重鎖定常遺伝子またはラット重鎖定常遺伝子と融合されたヒト重鎖可変ドメイン、およびマウス軽鎖定常遺伝子またはラット軽鎖定常遺伝子またはヒト軽鎖定常遺伝子と融合されたヒト軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態において、上記ヒト重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する。
【０２５８】
１つの実施形態において、上記抗原に対して特異的な上記逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞の培養は、上記マウスから単離された少なくとも１つの細胞から産生された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞で行う。
【０２５９】
１つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体に由来する完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を産生させる工程、および該完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該完全ヒト抗体を得る工程を含む。
【０２６０】
様々な実施形態において、上記抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから単離される少なくとも１つの細胞は、脾細胞またはＢ細胞である。
【０２６１】
様々な実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体である。
【０２６２】
様々な実施形態において、上記抗体は、再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する重鎖可変ドメインを含む。
【０２６３】
様々な実施形態において、上記対象となる抗原での免疫を、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞を用いて行う。
【０２６４】
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態では、上記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。１つの実施形態では、上記マウスを使用して、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ：ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を作製する。
【０２６５】
１つの態様では、ヒト抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作非ヒト動物を、対象となる抗原に曝露する工程と、上記ヒト動物が上記抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、上記非ヒト動物から、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする重鎖可変ドメインの核酸配列を得る工程と、上記重鎖可変ドメインの核酸配列を、ヒト定常領域配列に融合する工程と、哺乳動物細胞内で、上記ヒト重鎖可変ドメイン配列および上記ヒト定常領域配列を含む抗体を発現させる工程とを含む方法を提供する。１つの実施形態において、上記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、必要に応じてその２つ以上の多型変異体で存在する単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントから本質的になるヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーであって、１つ以上のヒトＤセグメントおよび／またはヒトＪセグメントに作動可能に連結されたヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーを含む。１つの実施形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーは、内因性非ヒトＶＨ遺伝子セグメントの遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーは、内因性ＶＨ遺伝子セグメントの遺伝子座ではない遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントはヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメントと共に再構成して、ヒト配列および齧歯動物配列（例えば、マウス配列またはラット配列またはハムスター配列）から選択される定常領域配列に作動可能に連結された再構成ヒトＶＤＪ遺伝子を形成する。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびその組み合わせから選択される配列を含む；特定の実施形態において、上記定常領域配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。１つの実施形態において、上記ヒト可変ドメインおよび上記定常配列を、同じマウスから得られる同種のヒト軽鎖可変ドメイン（例えば、上記ヒト可変ドメイン配列と同じＢ細胞から得られる配列）と共に哺乳動物細胞内で発現させる；１つの実施形態において、次いで、上記マウスから得られるヒト軽鎖可変ドメインをコードする配列を、ヒト軽鎖定常配列をコードする配列と融合させ、上記軽鎖配列および上記重鎖配列を哺乳動物細胞内で発現させる。
【０２６６】
１つの態様では、対象となる抗原に結合する抗体重鎖可変ドメインを作製するための方法であって、単一の細胞内で、（ａ）本明細書に記載の免疫した非ヒト動物の第一のＶＨ配列であって、ＣＨ遺伝子配列と融合された第一のＶＨ配列、および（ｂ）本明細書に記載の免疫した非ヒト動物のＶＬ遺伝子配列であって、ヒトＣＬ遺伝子配列と融合されたＶＬ遺伝子配列を発現させる工程と；上記細胞を、抗体を発現させるのに十分な条件下で維持する工程と；上記抗体重鎖可変ドメインを単離する工程とを含む方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子配列は、第一のＶＨ配列と同種である。
【０２６７】
１つの実施形態において、上記細胞は、本明細書に記載の免疫した非ヒト動物の第二のＶＨ遺伝子配列を含み、上記第二のＶＨ遺伝子配列は、ＣＨ遺伝子配列と融合され、上記第一のＶＨ遺伝子配列は、第一のエピトープに特異的に結合するＶＨドメインをコードし、上記第二のＶＨ遺伝子配列は、第二のエピトープに特異的に結合するＶＨドメインをコードし、上記第一のエピトープと上記第二のエピトープとが同一でない。
【０２６８】
１つの実施形態において、上記定常領域配列は、すべてのヒト定常領域配列である。
【０２６９】
１つの態様では、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物のＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列を用いて二重特異性抗体を作製する工程を含む方法を提供する。
【０２７０】
１つの実施形態において、上記方法は、（ａ）対象となる抗原に曝露されて上記対象となる抗原に対する免疫応答を発生するようにされた非ヒト動物のクローン選択リンパ球を同定する工程であって、上記リンパ球が、上記対象となる抗原に特異的に結合する抗体を発現する工程と、（ｂ）上記リンパ球または上記抗体から、上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得る工程と、（ｃ）上記対象となる抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、上記二重特異性抗体の作製において使用する工程とを含む。特定の実施形態において、上記ヒト重鎖可変領域は、再構成ＶＨ１−２またはＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。
【０２７１】
１つの実施形態において、工程（ａ）〜（ｃ）を、１回目は、第一のヒト重鎖可変領域配列を生成するために、第一の対象となる抗原に対して実施し、工程（ａ）〜（ｃ）を、２回目は、第二のヒト重鎖可変領域配列を生成するために、第二の対象となる抗原に対して実施し、第一のヒト重鎖定常領域と融合された上記第一のヒト重鎖可変領域配列を発現させて、第一のヒト重鎖を形成し、第二のヒト重鎖定常領域と融合された上記第二のヒト重鎖可変領域配列を発現させて、第二のヒト重鎖を形成し、上記第一のヒト重鎖および上記第二のヒト重鎖を、再構成ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントから発現される単一のヒト軽鎖の存在下で発現させる。特定の実施形態において、上記単一のヒト軽鎖は、生殖細胞系配列を含む。
【０２７２】
１つの実施形態において、上記方法は、（ａ）第一の対象となる抗原に曝露された本明細書に記載の非ヒト動物のＢ細胞、および同じ非ヒト動物、または遺伝的に同じで第二の対象となる抗原に曝露された異なる非ヒト動物のＢ細胞から重鎖可変領域をクローニングする工程と、（ｂ）（ａ）の上記重鎖可変領域を、上記同じ重鎖定常領域および上記同じ軽鎖と共に細胞内で発現させて、二重特異性抗体を作製する工程とを含む。
【０２７３】
１つの態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得るための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ１−２、およびＶＨ１−６９から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２７４】
１つの態様では、ヒト重鎖可変ドメインをコードする細胞を得るための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ１−２、およびＶＨ１−６９から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２７５】
１つの態様において、ヒト抗体可変ドメインを作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの態様において、ヒト抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの実施形態において、上記ヒト抗体は、ヒト二重特異性抗体である。様々な実施形態において、上記可変ドメインおよび／または上記抗体は、ＶＨ１−２およびＶＨ１−６９から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２７６】
１つの態様において、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ１−２およびＶＨ１−６９から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【０２７７】
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列が無いマウスに異所性ＡＤＡＭ６配列を導入するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、本明細書に記載のマウスと、該機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列が無いマウスとを交配させることを含む。
【０２７８】
１つの態様では、異所性ＡＤＡＭ６配列を有するマウスを作製するための、本明細書に記載のマウスからの遺伝子材料の使用を提供する。１つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞の核を使用する核移植を含む。１つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞を、該細胞に由来する動物を産生するためにクローングすることを含む。１つの実施形態において、上記使用は、上記異所性ＡＤＡＭ６配列を含むマウスを作製するためのプロセスにおける、本明細書に記載のマウスの精子または卵子の利用を含む。
【０２７９】
１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む妊性雄マウスを作製するための方法であって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む第一のマウス生殖細胞を、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む第二のマウス生殖細胞で受精させる工程；受精細胞を形成する工程；上記受精細胞を胚へと発生させる工程；および代理母において上記胚を妊娠させてマウスを得る工程を含む方法を提供する。
【０２８０】
１つの実施形態において、上記受精は、雄マウスと雌マウスを交配させることによって達成される。１つの実施形態では、上記雌マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。１つの実施形態では、上記雄マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。
【０２８１】
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有するマウスの妊性を回復させるまたは強化するための、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用を提供し、この場合の改変は、内因性ＡＤＡＭ６機能を低減させるまたは除去する。
【０２８２】
１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの異所位置に組み込む。１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み込む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込む。
【０２８３】
１つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための、または薬物（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、医薬の上記可変配列は、多型ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、医薬の上記可変配列は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、医薬の上記可変配列は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【０２８４】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構築物を提供する。１つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３から選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。
【０２８５】
１つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインと同種のκ軽鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインと同種のκ軽鎖可変ドメインである。
【０２８６】
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸構築物を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。１つの実施形態において、上記可変ドメインは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、およびＶκ２−４０から選択される再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメインである。
【０２８７】
１つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
【０２８８】
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン可変ドメインを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態において、上記可変ドメインは、軽鎖可変ドメインである。１つの実施形態において、上記可変ドメインは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、およびＶκ２−４０から選択される再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むκ軽鎖可変ドメインである。
【０２８９】
１つの実施形態において、上記可変ドメインは、重鎖可変ドメインである。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記重鎖可変ドメインは、再構成ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
マウスであって、
（ａ）単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列；および
（ｂ）雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質をコードする配列であって、野生型マウスのＡＤＡＭ６遺伝子座とは異なる位置にある配列
をその生殖細胞系に有する、マウス。
（項目２）
前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが多型ＶＨ遺伝子セグメントである、項目１に記載のマウス。
（項目３）
前記ＡＤＡＭ６をコードする配列がマウス配列である、項目１に記載のマウス。
（項目４）
前記マウスゲノム配列が前記ヒトゲノム配列に並置または隣接している、項目１に記載のマウス。
（項目５）
前記ヒトゲノム配列および前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在する、項目１に記載のマウス。
（項目６）
前記ヒトゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在し、前記マウスゲノム配列が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座以外の該マウスゲノム内の位置に存在する、項目１に記載のマウス。
（項目７）
すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの欠失を含む、項目１に記載のマウス。
（項目８）
前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２３またはそれらの多型変異体から選択される、項目１に記載のマウス。
（項目９）
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントがＶＨ１−６９である、項目８に記載のマウス。
（項目１０）
前記ヒトＶＨ遺伝子セグメントがＶＨ１−２である、項目８に記載のマウス。
（項目１１）
前記単一のＶＨ遺伝子セグメントが、ヒト、マウスまたはキメラヒト／マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、項目１に記載のマウス。
（項目１２）
前記免疫グロブリン定常領域遺伝子がマウス定常領域遺伝子である、項目１１に記載のマウス。
（項目１３）
前記免疫グロブリン定常遺伝子が、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３およびそれらの組み合わせから選択されるヒト配列を含む、項目１１に記載のマウス。
（項目１４）
前記マウス定常遺伝子が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目１２に記載のマウス。
（項目１５）
前記ヒトゲノム配列が、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目１６）
前記ヒトゲノム配列が、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目１７）
１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、項目１、１５または１６に記載のマウス。
（項目１８）
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪκ遺伝子セグメントが内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、項目１７に記載のマウス。
（項目１９）
少なくとも１つのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結された少なくとも１つのヒトＶＨ遺伝子セグメントを含むマウスであって、異所性マウスＡＤＡＭ６配列を含む、マウス。
（項目２０）
前記核酸配列が異所位置に存在する、項目１９に記載のマウス。
（項目２１）
前記核酸配列が内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する、項目１９に記載のマウス。
（項目２２）
前記核酸配列がマウスゲノム内の内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に存在する、項目１９に記載のマウス。
（項目２３）
血清免疫グロブリンを発現するマウスであって、該マウスの該血清免疫グロブリンの８０％超がヒト重鎖可変ドメインおよび同種のヒト軽鎖可変ドメインを含み、該ヒト重鎖可変ドメインが、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体から本質的になるＶＨ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する、マウス。
（項目２４）
マウスであって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはその多型変異体による置換をその生殖細胞系に含む、マウス。
（項目２５）
マウスであって、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座において、すべてのまたは実質的にすべての内因性軽鎖Ｖ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントによる置換をさらに含む、項目２４に記載のマウス。
（項目２６）
前記ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントに作動可能に連結された１つ以上のヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントをさらに含む、項目２５に記載のマウス。
（項目２７）
項目１、１９、２３または２４に記載のマウスに由来する、細胞または組織。
（項目２８）
単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する重鎖を含むヒト抗体集団を作製するための方法であって、以下：
（ａ）項目１に記載のマウスを対象となる抗原で免疫する工程；
（ｂ）該マウスが該対象となる抗原に関して免疫応答を開始するようにする工程；および
（ｃ）該抗体が該対象となる抗原に結合する、該非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程
を含む、方法。
（項目２９）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号５を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が、配列番号６４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域配列が配列番号６４を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための方法であって、以下：
（ａ）雄マウスにおいて内因性マウスＡＤＡＭ６活性の低減または除去を結果としてもたらす、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一の改変を行う工程；および
（ｂ）該マウスに対してＡＤＡＭ６活性を回復させるための該マウスの第二の改変を行う工程
を含む、方法。
（項目３４）
工程（ｂ）の核酸配列が異所位置に存在する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第一の改変が、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の存在を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記第一の改変が、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の１つ以上の配列の、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列による置換を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記第一の改変が、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第一の改変が、内因性重鎖可変遺伝子配列の、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内のヒト重鎖可変遺伝子配列による置換を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
前記第一および前記第二の改変が同時に行われる、項目３３に記載の方法。
（項目４０）
抗原に対して特異的な抗体を産生させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）項目１に記載のマウスを該抗原で免疫する工程；
（ｂ）該抗原に対して特異的な抗体を産生する該マウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程；および
（ｃ）工程ｂ）の抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程
を含む、方法。
（項目４１）
工程（ｃ）における前記培養する工程が、工程（ｂ）において得た前記少なくとも１つの細胞から産生された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞で行われる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
工程（ｂ）において得られる前記少なくとも１つの細胞が、工程（ａ）からの前記マウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
工程（ａ）の前記抗原での免疫が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞で行われる、項目４０に記載の方法。
【０２９０】
特に明確な注記がない限り、または併用が文脈上明らかに禁止されていない限り、様々な態様および実施形態を併用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】図１は、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターを作製するために使用される、一連のターゲティング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
【０２９２】
【図２】図２は、単一のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、および６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターを作製するために使用される、一連のターゲティング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
【０２９３】
【図３】図３は、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、６のヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびマウスＡＤＡＭ６をコードする異所性ゲノム断片を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターを作製するために使用される、一連のターゲティング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
【０２９４】
【図４】図４は、単一のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ、６のヒトＪＨ遺伝子セグメント、およびマウスＡＤＡＭ６をコードする異所性ゲノム断片を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において含有する改変重鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターを作製するために使用される、一連のターゲティング工程および分子操作工程の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
【０２９５】
【図５】図５は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子について報告される１３の対立遺伝子の各々について、第二のエクソンのヌクレオチドアライメントを示す図である。小文字の塩基は、生殖細胞系の対立遺伝子間のヌクレオチド差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−６９＊０１（配列番号３７）；ＶＨ１−６９＊０２（配列番号３９）；ＶＨ１−６９＊０３（配列番号４１）；ＶＨ１−６９＊０４（配列番号４３）；ＶＨ１−６９＊０５（配列番号４５）；ＶＨ１−６９＊０６（配列番号４７）；ＶＨ１−６９＊０７（配列番号４９）；ＶＨ１−６９＊０８（配列番号５１）；ＶＨ１−６９＊０９（配列番号５３）；ＶＨ１−６９＊１０（配列番号５５）；ＶＨ１−６９＊１１（配列番号５７）；ＶＨ１−６９＊１２（配列番号５９）；ＶＨ１−６９＊１３（配列番号６１）。
【０２９６】
【図６】図６は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子について報告される１３の対立遺伝子の各々について、成熟重鎖可変遺伝子配列のタンパク質アライメントを示す図である。小文字のアミノ酸は、生殖細胞系の対立遺伝子間の差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−６９＊０１（配列番号３８）；ＶＨ１−６９＊０２（配列番号４０）；ＶＨ１−６９＊０３（配列番号４２）；ＶＨ１−６９＊０４（配列番号４４）；ＶＨ１−６９＊０５（配列番号４６）；ＶＨ１−６９＊０６（配列番号４８）；ＶＨ１−６９＊０７（配列番号５０）；ＶＨ１−６９＊０８（配列番号５２）；ＶＨ１−６９＊０９（配列番号５４）；ＶＨ１−６９＊１０（配列番号５６）；ＶＨ１−６９＊１１（配列番号５８）；ＶＨ１−６９＊１２（配列番号６０）；ＶＨ１−６９＊１３（配列番号６２）。
【０２９７】
【図７】図７は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子について報告される１３の対立遺伝子の各々について、成熟可変遺伝子のアラインメントされたタンパク質配列のための、同一性パーセント／類似性パーセントマトリクスを示す図である。ＶＨ１−６９の対立遺伝子間の同一性パーセントは、影を付したボックスの上方に示し、類似性パーセントは、影を付したボックスの下方に示す。同一性パーセントおよび類似性パーセントのスコアは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ（ｖ１．８３）アライメントツールによりスコア付けした。
【０２９８】
【図８】図８は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される５つの対立遺伝子の各々について、第二のエクソンのヌクレオチドアライメントを示す図である。小文字の塩基は、生殖細胞系の対立遺伝子間のヌクレオチド差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−２＊０１（配列番号６３）；ＶＨ１−２＊０２（配列番号６５）；ＶＨ１−２＊０３（配列番号６７）；ＶＨ１−２＊０４（配列番号６９）；ＶＨ１−２＊０５（配列番号７１）。
【０２９９】
【図９】図９は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される５つの対立遺伝子の各々について、成熟重鎖可変遺伝子配列のタンパク質アライメントを示す図である。小文字のアミノ酸は、生殖細胞系の対立遺伝子間の差違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の周りのボックスで示す。ダッシュは、適正な配列アライメントのための人為的ギャップを示す。ＶＨ１−２＊０１（配列番号６４）；ＶＨ１−２＊０２（配列番号６６）；ＶＨ１−２＊０３（配列番号６８）；ＶＨ１−２＊０４（配列番号７０）；ＶＨ１−２＊０５（配列番号７２）。
【０３００】
【図１０】図１０は、ヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される５つの対立遺伝子の各々について、成熟可変遺伝子のアラインメントされたタンパク質配列のための、同一性パーセント／類似性パーセントマトリクスを示す図である。ＶＨ１−２対立遺伝子間の同一性パーセントは、影を付したボックスの上方に示し、類似性パーセントは、影を付したボックスの下方に示す。同一性パーセントおよび類似性パーセントのスコアは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェア（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｖ１．８３）アライメントツールによりスコア付けした。
【発明を実施するための形態】
【０３０１】
詳細な説明
本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
【０３０２】
別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての用語および句は、その用語または句が用いられている文脈から相反することが明確に指摘されるまたは明確に分かる場合を除き、その用語および句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載するものに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、今は特定の方法および材料を記載する。
【０３０３】
遺伝子セグメントの量を指すために用いるときの句「実質的な」または「実質的に」（例えば、「実質的にすべての」Ｖ遺伝子セグメント）は、機能的遺伝子セグメントと非機能的遺伝子セグメントの両方を含み、および様々な実施形態において、例えば、すべての遺伝子セグメントの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上を含む；様々な実施形態において、「実質的にすべての」遺伝子セグメントは、例えば、機能的（すなわち、非偽遺伝子）遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。
【０３０４】
用語「置換」は、ゲノム内の配列を該ゲノム配列の遺伝子座において異種配列（例えば、マウスにおけるヒト配列）で置換するようなやり方でＤＮＡ配列を細胞のゲノムに配置する場合のものを含む。そのようにして配置されたＤＮＡは、そのようにして配置された配列を得るために使用した源ＤＮＡの一部である１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など）を含み得る。例えば、様々な実施形態において、上記置換は、そのように置かれた（ｐｌａｃｅｄ）ＤＮＡ配列（異種配列を含む）から遺伝子産物の産生をもたらす結果となる、異種配列に代えての内因性配列の置き換えであり、該内因性配列の発現ではない；上記置換は、内因性ゲノム配列の、該内因性ゲノム配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列による置換である（例えば、上記内因性ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードしており、上記ＤＮＡ断片は、一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードする）。様々な実施形態において、内因性遺伝子またはその断片は、対応するヒト遺伝子またはその断片で置換される。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置換される内因性遺伝子もしくは断片のオルソログである、置換される内因性遺伝子もしくは断片のホモログである、または置換される内因性遺伝子もしくは断片と構造および／もしくは機能の点で実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺伝子または断片である。
【０３０５】
遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよびノックアウト技術によって大きく向上され、これらの技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわらず、上記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するまたはそれらを作製するための不完全なプラットホームにならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト遺伝子の約９９％はマウスホモログを有する（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎら、２００２、Ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：５２０−５６２）が、可能性のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウスオルソログと交叉反応することができない、または不適切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、マウス遺伝子を除去して、対応するオルソロガスヒト遺伝子配列により置換することができる（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号および同第７，１０５，３４８号明細書）。最初、「ノックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化（ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」戦略によりマウス遺伝子をヒト化する努力は、上記内因性遺伝子の欠失（すなわち、ノックアウト）を保有するマウスとランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要とした（例えば、Ｂｒｉｌら、２００６、Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  Ａｒｇ（５９３）  ｔｏ  Ｃｙｓ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９５：３４１−３４７；Ｈｏｍａｎｉｃｓら、２００６、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｍａｐｌｅ  ｓｙｒｕｐ  ｕｒｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ７：３３；Ｊａｍｓａｉら、２００６、Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＢＡＣ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ／ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＨｂＥ／ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８８（３）：３０９−１５；Ｐａｎら、２００６、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｉｎ  ｐｒｅＴ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐｒｅＴＣＲ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎ  ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅＴＣＲ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ３ｇａｍｍａ−  ａｎｄ  ＣＤ３ｇａｍｍａｄｅｌｔａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：１７４１−１７５０参照）。しかし、これらの努力は、サイズ制限によって妨げられた；従来のノックアウト技術は、大きなマウ���遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で（すなわち内因性マウス遺伝子座で）ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。
【０３０６】
外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスの前駆体Ｂ細胞内で再構成する（Ａｌｔら、１９８５、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １：２３１−２３６）。この発見は、ヒト抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トランスジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に活用された（Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＹＡＣｓ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３−２１；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７、Ｆｒｏｍ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１１３４−１１４３）。マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、２０００、Ｄｏｕｂｌｅ  ｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ  ｍｉｃｅ：  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｋａｐｐａ  ｌｏｃｉ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７）。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した；それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした（Ｇｉｂｓｏｎら、２００６、Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：２９−３１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７；Ｋｉｍら、２００７、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４）：ｔｗｏ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｂｌｏｏｄ  １０９（１１）：４６５５−６２；Ｌｏｎｂｅｒｇ、２００５、Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１１１７−１１２５；Ｍａｋｅｒら、２００５、Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｓｔｕｄｙ、Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １２：１００５−１０１６；ＭｃＣｌｕｎｇら、２００６、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：８２１−８３１）。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたＢ細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。上記不全は、  ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現（Ｇａｒｒｅｔｔら、２００５、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｎｅａｒ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ３’ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ａｔ  ＣＴＣＦ  ｓｉｔｅｓ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：１５１１−１５２５；Ｍａｎｉｓら、２００３、Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’ＩｇＨ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９：７５３−７６０；Ｐａｗｌｉｔｚｋｙら、２００６、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ５’ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏ−Ｂ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＰＵ．１，  Ｐａｘ５，ａｎｄ  Ｅ２Ａ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：６８３９−６８５１）；  Ｂ細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のＢ細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用（Ｈｏｍｂａｃｈら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＭ  ｃｌａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：７６０−７６２）；および  親和性選択（Ｒａｏら、２００２、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｏｎ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：１８５９−１８６８）および免疫グロブリン血清濃度（Ｂｒａｍｂｅｌｌら、１９６４、Ａ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｇａｍｍａ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０３：１３５２−１３５４；Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９６、Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：５５１２−５５１６；Ｒａｏら、２００２；Ｈｊｅｌｍら、２００６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６４：１７７−１８４；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ、２００７、Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９６：１７９−２０４）を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスＦｃ受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのｉｎ  ｓｉｔｕヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」（すなわち、ヒトＶ：マウスＣ）抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。この方法を用いることにより、所望のキメラ遺伝子座の複雑性に基づいて、ヒト化遺伝子座の特定のバージョンを構築することができる。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。
【０３０７】
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における挿入または置換と共に、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子（例えば、キメラ免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子もしくは完全ヒト完全マウスなど）と共に、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における異種（例えば、別の種からの）免疫グロブリン配列による挿入または置換を含む遺伝子改変動物を作製することができる。上記異種免疫グロブリン重鎖配列が由来する種は多種多様であり得、免疫グロブリン軽鎖配列置換に利用される免疫グロブリン軽鎖配列、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子に関しても多種多様であり得る。例示的な異種免疫グロブリン重鎖配列としては、ヒト配列が挙げられる
【０３０８】
様々な実施形態において、免疫グロブリン可変領域核酸配列、例えば、Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントは、ヒトまたは非ヒト動物から得られる。Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントの供給に好適な非ヒト動物としては、例えば、硬骨魚、軟骨魚、例えばサメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、鳥類（例えば、ニワトリ）が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ラクダ、フェレットおよび齧歯動物および非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、マーモセット、アカゲザル、ヒヒ）が挙げられる。好適な非ヒト動物は、ラット、マウスおよびハムスターを含む齧歯動物のファミリーから選択される。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。この文脈から明白であるように、様々な非ヒト動物（例えば、サメ、エイ、哺乳類、例えば、ラクダ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット）を可変ドメインまたは可変領域遺伝子セグメントの源として使用することができる。
【０３０９】
上記文脈によると、非ヒト動物は、可変配列またはセグメントと併用される定常領域配列の源としても使用される。例えば、ヒトまたは非ヒト可変配列に作動可能に連結される導入遺伝子（例えば、齧歯動物、例えばマウスもしくはラットもしくはハムスター、定常配列に作動可能に連結されたヒトまたは非ヒト霊長類可変配列）において齧歯動物定常配列を使用することができる。したがって、様々な実施形態において、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメントを齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域遺伝子配列に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、上記ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメント（または１つ以上の再構成ＶＤＪもしくはＶＪ遺伝子）を、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子におけるマウス、ラットまたはハムスター定常領域遺伝子配列に作動可能に連結または融合させる。
【０３１０】
特定の実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ、１つ以上のＤＨおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントによる置換を含み、該単一のヒトＶＨ、１つ以上のＤＨおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結されているものであるマウスを提供し、この場合のマウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、マウスまたはラットまたはヒト定常領域に作動可能に連結された非再構成または再構成ヒトＶＬおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、多型遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントまたはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントである。
【０３１１】
子孫を産生するマウスの能力を維持しながら、限定されたヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖遺伝子座での、マウス生殖細胞系免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座のｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子置換、およびヒト生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座での、マウス生殖細胞系免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座のｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子置換のための方法を記載する。具体的には、上記マウス定常領域をインタクトで残しながら、６メガ塩基のマウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座の両方をヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖配列で正確に置換することを記載する。結果として、マウス定常領域を維持しながら、マウスの生殖細胞系免疫グロブリン可変レパートリーすべてがヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変配列で正確に置換されたマウスを生み出した。上記ヒト可変領域をマウス定常領域に連結させて、再構成して生理的に適切なレベルで発現するキメラヒト−マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現する抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、それらはヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。
【０３１２】
本明細書に記載の遺伝子改変マウスは、完全に機能的な体液性免疫系を示し、病原性抗原、例えばウイルス抗原と闘うために有効である薬学的に許容され得る抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための自然親和性成熟ヒト免疫グロブリン可変領域配列の豊富な供給源を提供する。
【０３１３】
マウスゲノム内の正確な位置（例えば、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座）におけるヒト免疫グロブリンの操作は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の分岐進化のため、一定の課題を提起し得る。例えば、免疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化または操作するとき、やはりヒト化マウスに異常を生じさせる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫産生能力の喪失を挙げることができる。様々な実施形態において、マウスゲノム内におけるヒト免疫グロブリン配列の操作は、改変マウス系統に無いと有害な内因性配列を維持する方法を含む。例示的な有害効果としては、改変系統の繁殖不能、必須遺伝子の機能喪失、ポリペプチドの発現不能などを挙げることができる。かかる有害効果は、上記マウスゲノムに行われる改変に直接的または間接的に関係する場合がある。
【０３１４】
免疫グロブリン遺伝子座がヒト化されたマウスにおいて観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部のアプローチでは遭遇しない、免疫グロブリン配列の直接置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置換されたマウスの繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的には、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座内にあるマウスＡＤＡＭ遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスに最適に存在する。
【０３１５】
すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座の転写制御領域を含め、ハイブリッド遺伝子座内の隣接するマウス配列はインタクト、かつ、機能的のままとしながら、６メガ塩基のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＶＨ−ＤＨ−ＪＨ）可変領域の、限定されたヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座による、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける正確な置換を実施した（図１および図８）。さらに、操作工程を実施して、野生型マウスと幾分同程度に交配して子孫を生む能力をマウスに付与するマウス配列を維持した（図９および図１０）。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：６５２−６５９参照）を用いて、キメラＢＡＣターゲティングベクターを介し、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６のヒトＪＨ遺伝子セグメントおよびマウスＡＤＡＭ６遺伝子を、マウスＥＳ細胞に導入した。
限定された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントを有するマウス
【０３１６】
限られた数のＶＨ遺伝子、および１つ以上のＤ遺伝子および１つ以上のＪ遺伝子を含む免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を、それらを作製する方法およびそれらを用いる方法と同様に、提供する。対象となる抗原で免疫されると、上記非ヒト動物は、予め限定された選択ＶＨ遺伝子またはＶＨ遺伝子のセット（例えば、予め選択されたＶＨ遺伝子およびその変異体）のみに由来する抗体の可変領域を有するＢ細胞集団を生成する。様々な実施形態において、ヒト重鎖可変ドメインであるヒト抗体可変ドメインを、同種のヒト軽鎖可変ドメインと共に発現するＢ細胞集団を生成する非ヒト動物を提供する。様々な実施形態において、上記非ヒト動物は、非再構成非ヒト可変領域配列の、非再構成ヒト可変領域配列による置換または挿入を含む改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座に由来するヒト重鎖可変遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを再構成する。
【０３１７】
免疫グロブリン遺伝子の組織化、構造、および機能についての初期の研究は、内因性遺伝子座を無能とし、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子、例えば、ヒト定常遺伝子と連結されたヒト重鎖遺伝子の部分的なレパートリーであって、ヒト軽鎖導入遺伝子の存在下または非存在下で、ゲノムにランダムに挿入されたレパートリーを有するトランスジェニック遺伝子座（ランダムに配置された）を有するように操作されたマウスについて部分的になされた。これらのマウスは、有用な高親和性抗体を作製するには何らかの点で最適に満たなかったが、免疫グロブリン遺伝子座についての特定の機能的な解析を容易とした。これらのマウスのうちの一部は、２つもしくは３つ程度、なおまたは単一の重鎖可変遺伝子だけという少数の重鎖可変遺伝子を有した。
【０３１８】
ランダムに挿入された導入遺伝子（および無能とした内因性免疫グロブリン遺伝子座）上のヒトμ定常遺伝子およびヒトγ１定常遺伝子と共に、単一のヒトＶＨ５−５１遺伝子および１０のヒトＤＨ遺伝子および６のヒトＪＨ遺伝子に由来する完全ヒト免疫グロブリン重鎖を発現するマウスが報告されている（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，２０００，Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨ  Ｉｓ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｏｓｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５）。これらのマウスの完全ヒト免疫グロブリン重鎖は大半が、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に由来する２つの完全マウスλ軽鎖だけのうちの１つ（Ｖλ１−Ｊλ１またはＶλ２−Ｊλ２のみ）と共に発現され、κ軽鎖を発現することができない（これらのマウスは、Ｉｇκ−／−である）。これらのマウスは、Ｂ細胞の発生および抗体の発現において重度に異常な機能不全を呈示する。報告によれば、Ｂ細胞数が野生型の５〜１０％であり、ＩｇＭレベルが野生型の５〜１０％であり、ＩｇＧ１レベルは野生型の０．１〜１％に過ぎない。観察されたＩｇＭレパートリーは、高度に限定された接合部の多様性を明らかにした。完全ヒト重鎖は、大部分が抗原をわたって同一のＣＤＲ３の長さ、抗原をわたって同じＪＨ（ＪＨ２）の使用、および最初の接合部のＱ残基を提示し、したがって、ＣＤＲ３の多様性のある程度の欠如を反映する。完全マウスλ軽鎖はほぼすべてが、Ｊλ１内に最初の接合部残基としてのＷ９６Ｌ置換を有した。報告によれば、マウスは、細菌性多糖に対するいかなる抗体を生成することもできない。ヒト可変ドメインをマウス軽鎖とカップリングさせるため、ヒト可変領域の有用性は、大きく制限される。
【０３１９】
単一のヒトＶＨ３−２３遺伝子だけ、ヒトＤＨ遺伝子およびヒトＪＨ遺伝子、およびマウス軽鎖遺伝子を有する他のマウスが報告されているが、これらは、ヒトＶＨドメインとマウスＶＬドメインとの誤対合の可能性（例えば、Ｍａｇｅｅｄら、２００１，Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅ  Ｖ３−２３  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ＶＨＣＤＲ３  ａｎｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１−５参照）に部分的に起因して、多様性の制限を呈示する（したがって、有用性の制限も呈示する）。同様に、ヒトμ定常遺伝子を含有する導入遺伝子内に、ヒトＤＨ遺伝子およびヒトＪＨ遺伝子と共に２つのＶＨ遺伝子（３−２３および６−１）を保有し（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９１，Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  １００ｋｂ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＨ  ｌｏｃｕｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３−１３２６）、マウス軽鎖を有するヒトＩｇＭ鎖においてそれらを発現するマウスは、誤対合によるレパートリーの制限を呈示し得る（Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ−Ｙｏｕｎｇら、２００３，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖ３−２３  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：４２０−４２５）。
【０３２０】
また、ゲノム内にランダムに挿入されたヒト導入遺伝子からＶＨが限定された完全ヒト重鎖を発現する他のトランスジェニックマウスであって、ランダムに挿入された完全ヒト導入遺伝子から発現するヒトλレパートリーが制限されたトランスジェニックマウスも報告されている（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２，Ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（２３）：６２８７−６２９５；Ｗａｇｎｅｒら、１９９４，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｉｎｉｌｏｃｉ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（８）：１３８９−１３９３参照）。しかし、マウスゲノムにランダムに組み込まれた導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現させ、内因性遺伝子座の損傷を含むトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較した免疫応答の実質的な差違であって、かかるマウスから得ることができる抗体可変ドメインの多様性に影響を及ぼす差違を呈示することが公知である。
【０３２１】
一部の実施形態において、ヒト抗体可変ドメインを、限定されたＶＨ遺伝子レパートリーならびに１つ以上のＤ遺伝子および１つ以上のＪ遺伝子から発現する、多様なＢ細胞集団を生成する有用な非ヒト動物は、十分に多様な再構成可変領域遺伝子レパートリーを生成することが可能であることが好ましい。様々な実施形態において、多様性は、接合部の多様性、体細胞超変異、およびＶＨ遺伝子配列内の多型的多様性（ＶＨ遺伝子が多型形態で存在する実施形態の場合）を包含する。組み合わせの（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）多様性は、ＶＨ遺伝子が複数の同種のヒト軽鎖可変ドメイン（様々な実施形態において、接合部の多様性および／または体細胞超変異を含む）のうちの１つと対合するときに生じる。
【０３２２】
様々な実施形態において、限定されたヒトＶＨ遺伝子レパートリーおよび完全または実質的に完全なヒトＶＬ遺伝子レパートリーを含む非ヒト動物は、接合部の多様性（例えば、ＶＤＪ、ＶＪ接合、Ｐ付加、Ｎ付加）、組み合わせの多様性（例えば、ＶＨが限定された同種のヒト重鎖、ヒト軽鎖）、および体細胞超変異など、多様性の様々な供給源を反映するＢ細胞集団を生成する。ＶＨレパートリーの、１つのヒトＶＨ遺伝子への限定を含む実施形態において、この１つのヒトＶＨ遺伝子は、２つ以上の変異体において存在し得る。様々な実施形態において、ＶＨ遺伝子の２つ以上の多型形態が存在することにより、Ｂ細胞集団の可変ドメインの多様性が富化される。
【０３２３】
遺伝子セグメント（例えば、Ｖ遺伝子）の生殖細胞系配列におけるバリエーションは、ヒトにおける抗体応答の多様性に寄与する。Ｖ遺伝子配列の差違に起因する多様性に対する相対的寄与は、Ｖ遺伝子間で変化する。多型の程度は、遺伝子ファミリーにわたって変化し、ヒト集団における近縁個体と非近縁個体とのＶＨハプロタイプの差違において観察されるさらなる多様性を生成することが可能な複数のハプロタイプ（共遺伝多型（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する配列のストレッチ）に反映される（例えば、Ｓｏｕｒｏｕｊｏｎら、１９８９，Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｈ  Ｃｈａｉｎ  Ｖ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＶＨＩＩＩ  Ｇｅｎｅ  Ｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３（２）：７０６−７１１参照）。特に、多型ヒトＶＨ遺伝子ファミリーに由来するデータに基づき、一部の研究者は、生殖細胞系におけるハプロタイプの多様性が、ヒト集団におけるＶＨ遺伝子の異質性に対する主要な寄与因子であり、これが、ヒト集団にわたる異なる生殖細胞系ＶＨ遺伝子の大きな多様性に反映されることを示唆している（Ｓａｓｓｏら、１９９０，Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＶＨ３  Ｇｅｎｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５（８）：２７５１−２７５７参照）。
【０３２４】
ヒト集団は、広範な多型に起因して、ＶＨ遺伝子レパートリーに対して、ハプロタイプの大きな多様性を提示するが、ヒト集団内で観察される高頻度の（すなわち、保存的な）対立遺伝子には、特定の多型が反映される（Ｓａｓｓｏら、１９９０）。ＶＨの多型は、２つの主要形態において記載され得る。第一の形態は、同じ遺伝子セグメントの対立遺伝子の間のヌクレオチド配列間における差違に関連する対立遺伝子バリエーションから生じるバリエーションである。第二の形態は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座において生じた多数の複製、挿入、および／または欠失から生じる。これは、複製により同一の遺伝子から派生するＶＨ遺伝子が、それらの各々の対立遺伝子と、１つ以上のヌクレオチド置換により異なる固有の状況を結果としてもたらしている。これはまた、重鎖遺伝子座におけるＶＨ遺伝子のコピー数にも直接影響する。
【０３２５】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ＶＨ遺伝子）の多型対立遺伝子は、大部分が遺伝子セグメントの挿入／欠失およびコーディング領域内の単一のヌクレオチド差違の結果であり、これらのいずれもが、免疫グロブリン分子に対して機能的結果を及ぼす潜在性を有する。表１は、ヒトＶＨ遺伝子ファミリーにより列挙される機能的ＶＨ遺伝子およびヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座における各ＶＨ遺伝子について同定された対立遺伝子の数を示す。多型ＶＨ遺伝子は、例えば、関節リウマチなど、特定の疾患に対する感受性に関与していることを示唆する知見も存在するが、他の場合には、ＶＨと疾患との連関がそれほど明瞭ではない。この多義性は、異なるヒト集団における様々な対立遺伝子のコピー数および存在に帰せられている。実際、幾つかのヒトＶＨ遺伝子（例えば、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３）は、コピー数の変動を示している。様々な実施形態において、限定されたＶＨレパートリーを有する本明細書に記載のヒト化マウスは、個別のＶＨファミリーメンバーの複数の多型変異体を含む（例えば、内因性マウス遺伝子座におけるすべてのまたは実質的にすべての機能的マウスＶＨセグメントを置換する、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、またはＶＨ３−２３の２つ以上の多型変異体）。特定の実施形態において、本明細書に記載のマウスの２つ以上の多型変異体は、表１の対応するＶＨファミリーメンバーについて示される数以下の数およびこの数を含めた数（例えば、ＶＨ１−６９には１３の変異体があり、ＶＨ１−２には５つの変異体があるなど）である。
【０３２６】
当該技術分野においては、特定のヒトＶＨ遺伝子の一般に観察される変異体が公知である。例えば、ＶＨ遺伝子座において最も複雑な多型のうちの１つは、ＶＨ１−６９遺伝子に属する。ヒトＶＨ１−６９遺伝子には、１３の対立遺伝子が報告されており（Ｓａｓｓｏら、１９９３，Ａ  ｆｅｔａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ１  ｇｅｎｅ  ｂｅｌｏｎｇｓ  ｔｏ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｓｅｔ  ｏｆ  ａｌｌｅｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９１：２３５８−２３６７；Ｓａｓｓｏら、１９９６，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  ｇｅｎｅ  ５１ｐ１  ｉｓ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９７（９）：２０７４−２０８０）、ヒトＶＨ１−６９遺伝子は、ＶＨ１−６９遺伝子の複製を保有する少なくとも３つのハプロタイプであって、所与の遺伝子座においてこのＶＨ遺伝子の複数コピーを結果としてもたらすハプロタイプで存在する。これらの多型対立遺伝子は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に差違を包含し、これは、抗原の特異性に劇的に影響し得る。表２は、ヒトＶＨ１−６９およびヒトＶＨ１−２遺伝子について報告される対立遺伝子ならびに成熟重鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配列の配列番号を示す。
【０３２７】
ＶＨ１−６９遺伝子の代表的なゲノムＤＮＡ配列および全長タンパク質配列を、それぞれ、配列番号４および配列番号５に示す。図５および図６はそれぞれ、ＶＨ１−６９について報告される１３の対立遺伝子のＤＮＡアライメントおよびタンパク質アライメントを示す。ＶＨ１−２遺伝子の代表的なＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、それぞれ、配列番号６３および配列番号６４に示す。図８および図９はそれぞれ、ＶＨ１−２について報告される５つの対立遺伝子のＤＮＡアライメントおよびタンパク質アライメントを示す。図７および図１０はそれぞれ、ヒトＶＨ１−６９について報告される１３の対立遺伝子およびヒトＶＨ１−２について報告される５つの対立遺伝子に対応する、アラインメントされたタンパク質配列についての同一性／類似性のパーセントマトリクスを示す。様々な実施形態において、本発明の改変遺伝子座は、表１から選択される２コピー以上の数で存在するＶＨ遺伝子を含み、コピー数は、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。１つの実施形態において、本発明の改変遺伝子座は、表２から選択される２コピー以上の数で存在するＶＨ１−６９またはＶＨ１−２遺伝子を含み、コピー数は、表１に示される対立遺伝子の数以下のコピー数および表１に示される対立遺伝子の数を含めたコピー数を包含する。
【表１−１】
2020110187.tif 000002
【表１−２】
2020110187.tif 000003
【表２】
2020110187.tif 000004
抗原依存性重鎖可変遺伝子の使用
【０３２８】
ＶＨ遺伝子の抗原依存性の優先的使用を、臨床的に有意義な抗原を標的とするヒト治療剤を開発するのに利用することができる。特定のＶＨ遺伝子を用いて抗体可変ドメインレパートリーを生成することができれば、ヒト治療剤において用いるための高親和性の抗体可変ドメインの探索に大きな利点をもたらすことができる。ナイーブマウスおよび抗体可変ドメインにおけるヒトＶＨ遺伝子の使用についての研究は、大半の重鎖可変ドメインが、特定の単一のＶＨ遺伝子にも、主として用いられるＶＨ遺伝子にも由来しないことを明らかにする。他方、特定の抗原に対する抗体応答についての研究は、場合によって、特定の抗体応答は、免疫後のＢ細胞レパートリーにおける特定のＶＨ遺伝子の偏った使用を提示することを明らかにする。
【０３２９】
ヒトＶＨレパートリーは、極めて多様であるが、ＶＨ遺伝子のランダムな選択を仮定するある推定値によれば、所与の任意のＶＨ遺伝子使用の予測される頻度は、約２％である（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９０−２０２）。しかし、ヒトの末梢Ｂ細胞におけるＶＨの使用は、偏ったものである。一研究では、機能的Ｖ遺伝子の存在度は、ＶＨ３＞ＶＨ４＞ＶＨ１＞ＶＨ２＞ＶＨ５＞ＶＨ６というパターンに従った（Ｄａｖｉｄｋｏｖａら、１９９７，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ＶＨ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：６２−７３）。初期の一研究では、ＶＨ３ファミリーの使用頻度が約０．６５であるのに対し、ＶＨ１ファミリーの使用頻度は約０．１５であることが推定され、これらの観察および他の観察は、ヒトＶＨレパートリーの生殖細胞系の複雑性は、正常の生殖細胞系ＶＨレパートリーを有するヒトの末梢Ｂ細胞区画では正確には反映されないという、マウスにおいて観察される状況（すなわち、ＶＨ遺伝子発現は非確率論的であるという状況）と類似する状況を示唆する（Ｚｏｕａｌｉ  ａｎｄ  Ｔｈｅｓｅ，１９９１，Ｐｒｏｂｉｎｇ  ＶＨ  Ｇｅｎｅ−Ｆａｍｉｌｙ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（８）：２８５５−２８６４）。一報告によれば、ヒトにおけるＶＨ遺伝子使用は、最大から最小の順にＶＨ３＞ＶＨ４＞ＶＨ１＞ＶＨ５＞ＶＨ２＞ＶＨ６であり、末梢Ｂ細胞における再構成は、ＶＨ３ファミリーの使用は、生殖細胞系ＶＨ３遺伝子の相対数に基づき予測される使用より高度であることを明らかにする（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５）。別の報告によれば、ヒトにおけるＶＨ使用は、ヨウシュヤマゴボウのマイトジェンにより活性化させた末梢の小型免疫応答性Ｂ細胞の解析（Ｄａｖｉｄｋｏｖａら、１９９７，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ＶＨ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：６２−７３）に基づくパターンＶＨ３＞ＶＨ５＞ＶＨ２＞ＶＨ１＞ＶＨ４＞ＶＨ６に従う。一報告は、最も高頻度で用いられるＶＨ３ファミリーメンバーの中には、３−２３、３−３０、および３−５４があることを主張している（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５）。ＶＨ４ファミリーでは、メンバー４−５９および４−４ｂ（同上）のほか、４−３９および４−３４が比較的高頻度であることが見出された（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｃｋら、１９９７，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＶＨ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９（１０）：２４８８−２５０１）。他の報告は、活性化した重鎖レパートリーが、ＶＨ５の高度な発現およびＶＨ３の低度な発現を利するように偏っていることを仮定している（Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ−Ｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ，２００２，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７：１３６−１４４）。他の研究は、成人ヒトレパートリーにおいて最も一般的に用いられるＶＨ遺伝子が、ＶＨ４−５９に続いて、ＶＨ３−２３およびＶＨ３−４８であることを主張している（Ａｒｎａｏｕｔら、２００１，Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｅａｖｙ−Ｃｈａｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（８）：１０８）。使用についての研究は、比較的小さな試料数に基づき、したがって、大きな分散を呈示するが、まとめると、研究は、Ｖ遺伝子の発現が、純粋に確率論的ではないことを示唆する。実際、特定の抗原による研究は、ある場合には、発現の状況は、特定の使用には全く不利であり、他の使用には有利であることを確立している。
【０３３０】
徐々に、特定の抗原に応答して生成したヒト重鎖可変ドメインについて観察されるレパートリーは、高度に限定されることが明らかとなった。一部の抗原は、有効な中和抗体は１つのＶＨ遺伝子のみに本質的に由来するという意味で、ほとんどもっぱらある特定のＶＨ遺伝子のみを有する中和抗体と会合する。臨床的に重要な多数のヒト病原体についても同じことが当てはまる。
【０３３１】
ＶＨ１−６９に由来する重鎖は、治療的に有意義である多様な抗原特異的抗体レパートリーにおいて観察されている。例えば、ＶＨ１−６９は、アトピー性疾患を有する幼齢小児における末梢血リンパ球のＩｇＥレパートリーの重鎖転写物において高頻度で観察された（Ｂａｎｄｏら、２００４，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨε  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ＰＢＬ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＶＨ１−６９  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｅｅ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９４：９９−１０６）。Ｂ細胞リンパ腫ではまた、高度の体細胞超変異を有するＶＨ１−６９に由来する重鎖が生じる（Ｐｅｒｅｚら、２００９，Ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＶＨ１−６９  ａｎｄ  ＶＨ４−５９  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １６２：６１１−６１８）一方、血液障害を有する患者における自己抗体の中では、本質的に生殖細胞系配列を有する（すなわち、体細胞超変異がわずかである〜体細胞超変異がみられない）一部のＶＨ１−６９に由来する重鎖が観察されている（Ｐｏｓら、２００８，ＶＨ１−６９  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄｓ  ＡＤＡＭＴＳ１３  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７：４２１−４２８）。
【０３３２】
さらに、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルス抗原に対する中和抗体であって、生殖細胞系のＶＨ１−６９に由来する配列および／または体細胞変異させたＶＨ１−６９に由来する配列を使用する中和抗体も見出されている（Ｍｉｋｌｏｓら、２０００，Ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  ｇｅｎｅｓ  ｓｈｏｗ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖ１−６９  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ＣＤＲ３  ｆｅａｔｕｒｅｓ，Ｂｌｏｏｄ  ９５（１２）：３８７８−３８８４；Ｋｕｎｅｒｔら、２００４，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ４Ｅ１０，ａｎ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０（７）：７５５−７６２；Ｃｈａｎら、２００１，ＶＨ１−６９  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅ２  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  ９７（４）：１０２３−１０２６；Ｃａｒｂｏｎａｒｉら、２００５，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｈｅ  ｕｎｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＶＨ１−６９−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ：Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７４：６５３２−６５３９；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｅｓｅ，２００９，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ？，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６（３）：２３３−２３４；Ｓｕｉら、２００９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６（３）：２６５−２７３；Ｍａｒａｓｃａら、２００１，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＶＨ１−６９  ａｎｄ  ＶＨ４−３４  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｎｏｄａｌ  Ｍａｒｇｉｎａｌ  Ｚｏｎｅ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔ��ｏｌ．１５９（１）：２５３−２６１）。
【０３３３】
ＶＨ使用の偏向はまた、ヒトにおけるｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈｉｂ  ＰＳ）に対する体液性免疫応答においても観察される。研究は、ＶＨＩＩＩファミリー（ＶＨＩＩＩｂサブファミリー、特に、ＶＨ９．１）が、多様なＤ遺伝子およびＪ遺伝子と共に、Ｈｉｂ  ＰＳに対するヒト体液性応答をもっぱら特徴づけることを示唆する（Ａｄｄｅｒｓｏｎら、１９９１，Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｉｇ  Ｈ  Ｃｈａｉｎ  Ｖ  Ｇｅｎｅ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｔｙｐｅ  ｂ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（５）：１６６７−１６７４；Ａｄｄｅｒｓｏｎら、１９９３，Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  Ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  ＶＤＪ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｔｙｐｅ  ｂ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２７３４−２７４３）。ヒトＪＨ遺伝子もまた、偏向性の使用を提示し、ＪＨ４およびＪＨ６は、ヒトの末梢Ｂ細胞中の約３８〜４１％で観察されている（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋら、１９９５）。
【０３３４】
ＨＩＶ−１に感染したヒトにおけるＶＨ使用は、ＶＨ３使用に対して不利に偏向し、ＶＨ１およびＶＨ４遺伝子ファミリーに有利である（Ｗｉｓｎｅｗｓｋｉら、１９９６，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ＨＩＶ−１  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ＆Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｏｌｏｇｙ  １１（１）：３１−３８）。しかし、罹患した患者に由来する骨髄のｃＤＮＡ解析は、機能的Ｂ細胞レパートリーでは発現しない有意なＶＨ３使用を明らかにし、そこでは、ＶＨ３使用を反映するＦａｂが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効なＨＩＶ−１の中和を呈示した（同上）。ＨＩＶ−１感染に対する体液性免疫応答はおそらくＶＨにおける限定に起因して減衰するので、本明細書に記載の改変非ヒト動物（ＨＩＶ−１により感染可能でない）は、本明細書に記載の遺伝子改変動物において存在する特定のＶＨ遺伝子に由来するが、罹患したヒトの限定されたレパートリーにおいて観察されるＶＨ遺伝子とは異なるＶＨ遺伝子に由来する中和抗体ドメインを生成するのに有用となり得ることを仮定し得る。
【０３３５】
したがって、例えば、ＨＩＶ−１で免疫された、ＶＨが限定されたマウス（例えば、ＶＨ３ファミリーメンバーおよびその（１つ以上の）多型に限定されたマウス）において、高親和性ヒト抗体可変ドメインを生成することができれば、かかる免疫したマウスの限定された（例えば、ＶＨ３ファミリーメンバーまたはその（１つ以上の）変異体に限定された）レパートリーを徹底的に発掘することにより、ＨＩＶ−１を中和する有効なヒト治療剤をデザインするための豊富な資源を提供し得る。
【０３３６】
ヒト抗体応答の、特定の病原体への限定は、抗体の可変領域であって、病原体に対する高親和性の中和抗体をデザインするための足がかりとして機能し得る可変領域を、罹患したヒトから得る可能性を低減し得る。例えば、ＨＩＶ−１感染に対するヒト免疫応答は、ＨＩＶ−１感染を通じて、かつ、ＡＩＤＳへの進行においてクローン的に限定される（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９３，Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ＡＩＤＳ：ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３２７−３３４；Ｗｉｓｎｅｗｓｋｉら、１９９６）。さらに、ＶＨ遺伝子は一般に、個体においてすべての多型形態では存在せず、特定の集団内の特定の個体が１つの変異体を保有するのに対し、他の集団内の個体は異なる変異体を保有する。したがって、様々な実施形態において、単一のＶＨ遺伝子およびその変異体に限定された生物系が利用可能であれば、限定されたＶＨ遺伝子に基づき抗体の可変領域（例えば、ヒト重鎖および軽鎖の同種のドメイン）を生成するための、これまで利用されなかった多様性の供給源がもたらされる。
【０３３７】
限定されたＶＨ遺伝子セグメントを使用してヒト重鎖可変領域を発現する遺伝子改変マウスは、接合部が多様であり、組み合わせが多様であり、体細胞変異させた、高親和性ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の比較的大きなレパートリーを、他の点では限定されたレパートリーから生成するのに有用である。この場合、限定されたレパートリーは、予め選択されたＶ遺伝子以外のいかなるＶ遺伝子に由来する再構成重鎖遺伝子も形成できないマウスを結果としてもたらす、生殖細胞系遺伝子の所定の制限を指す。予め選択されたＶ遺伝子は使用するが、予め選択されたＤ遺伝子および／またはＪ遺伝子は使用しない実施形態において、レパートリーは、Ｖ遺伝子の正体に関しては限定されるが、Ｄ遺伝子および／またはＪ遺伝子の正体に関しては限定されない。予め選択されたＶ遺伝子（ならびに任意の予め選択されたＤ遺伝子および／またはＪ遺伝子）の正体は、いかなる特定のＶ遺伝子にも制限されない。
【０３３８】
マウスが、単一のＶＨ遺伝子（単一のセグメントまたは変異体のセットとして存在する）を、多様なヒトＤおよびＪ遺伝子セグメント（例えば、ＤＨセグメントおよびＪＨセグメント）と共に再構成するように、マウスをデザインすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、接合部多様性／組み合わせ多様性／体細胞超変異の並べ替え機構であって、結果として得られる再構成重鎖可変領域配列（場合によって、例えば、Ｖ／Ｄ／ＪまたはＶ／Ｊ）における変異を繰り返すのに用いられ得る並べ替え機構がもたらされる。かかるマウスでは、単一の予め選択されたＶＨ遺伝子（またはその変異体）に基づくクローン選択工程を行って、対象となる抗原に結合する適切な可変領域を選択する。マウスのクローン選択成分は、単一の予め選択されたＶＨ遺伝子セグメントに基づく選択に使われる（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）ため、バックグラウンドノイズは大部分が根絶される。ＶＨ遺伝子セグメントを慎重に選択することにより、クローン的に選択される比較的多数の抗原特異的抗体を、Ｖセグメントの多様性が大きなマウスによる場合より短い期間でスクリーニングすることができる。
【０３３９】
様々な実施形態において、マウスを予め選択して単一のＶセグメントに限定することにより、Ｖ／Ｄ／Ｊ接合部を、Ｄ領域およびＪ領域で組み換えるためのＶセグメントが単一ではなくて最高４０以上あるマウスにおいて観察される速度より速い速度で並べ替えるための系がもたらされる。他のＶセグメントを除去することにより、遺伝子座は、予め選択されたＶセグメントに対して、他のＶセグメントを除去しない場合に観察されるＶ／Ｄ／Ｊの組み合わせより多くのＶ／Ｄ／Ｊの組み合わせを形成するように解放される。予め選択されたＶの、複数のＤセグメントのうちの１つおよび複数のＪセグメントのうちの１つによる組換えから生じる転写物数が増大すると、これらの転写物は、プレＢ細胞の形態にあるクローン選択系に供給され、このため、クローン選択系は、予め選択されたＶ領域を発現するＢ細胞の循環に使われる。このようにして、予め選択されたＶセグメントに由来するＶ領域であって、所与の時間量において他の形で可能となるより固有性の高い領域を、生物体を介してスクリーニングすることができる。
【０３４０】
様々な態様では、予め選択されたＶ領域についての、接合部におけるＶ／Ｄ組換えの多様性を増強するマウスが記載される。なぜなら、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座のすべてのまたは実質的にすべての組換えは、かかるマウスにおいて配置される、予め選択されたＶセグメントおよびＤセグメントおよびＪセグメントの組換えであるためであるしたがって、マウスは、ベースのＶＨ遺伝子レパートリーまたは限定されたＶＨ遺伝子レパートリーを用いて、ＣＤＲ３セグメントの多様性を生成するための方法をもたらす。
マウスＡＤＡＭ６のゲノムの場所および機能
【０３４１】
いずれかの機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力が無い雄マウスは、驚くべきことに、交配して子孫を産生する該マウスの能力の欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントをヒト可変領域遺伝子セグメントで置換することによって機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力が無い。ＡＤＡＭ６遺伝子座が、ＤＨ遺伝子セグメントの上流にあるＶＨ遺伝子セグメント遺伝子座の３’末端の近位の、上記内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このＡＤＡＭ６機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス重鎖可変配列の、限定されたヒト重鎖可変配列による置換に関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該限定されたヒト重鎖配列に関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、頻度が低く、サイズが小さい。その代り、上記限定されたヒト重鎖配列に関してヘテロ接合性の雄を用いて、上記置換に関してホモ接合性の雌と交配させて、上記限定されたヒト重鎖可変配列に関してヘテロ接合性の後代を産生し、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させる。上記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおいて機能的ＡＤＡＭ６タンパク質が存在しないことによると本発明者らは決定した。
【０３４２】
様々な態様において、損傷した（すなわち、非機能的またはわずかに機能的な）ＡＤＡＭ６遺伝子を含む雄マウスは、妊性の低減または除去を示す。マウス（および他の齧歯動物）ではＡＤＡＭ６遺伝子が免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあるため、本発明者らは、ヒト化された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを繁殖させるために、または該マウスの系統を作り、維持するために、様々な改変交配または繁殖スキームを利用することを決定した。ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性の雄マウスの低い妊性または不妊性は、マウス系統のかかる改変の維持を困難にする。様々な実施形態において、上記系統の維持は、上記ヒト化重鎖遺伝子座に関してホモ接合性の雄マウスによって示される不妊問題の回避を含む。
【０３４３】
１つの態様では、本明細書に記載のマウスの系統を維持するための方法を提供する。マウスの上記系統は、異所性ＡＤＡＭ６配列を含む必要がなく、様々な実施形態において、マウスの上記系統は、ＡＤＡＭ６のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【０３４４】
上記マウス系統は、雄マウスにおいて妊性の低減または喪失を生じさせる結果となる内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む。１つの実施形態において、上記改変は、ＡＤＡＭ６遺伝子の調節領域および／またはコーディング領域の欠失を含む。特定の実施形態において、上記改変は、その改変を含む雄マウスの妊性を低減させるまたは除去する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（調節領域および／またはコーディング領域）の改変を含む；特定の実施形態において、上記改変は、その改変に関してホモ接合性である雄マウスの妊性を低減させるまたは除去する。
【０３４５】
１つの実施形態において、上記マウス系統は、ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）または欠失に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【０３４６】
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから細胞を単離すること、および宿主胚において上記ドナー細胞を用いること、および代理母において上記宿主胚およびドナー細胞を妊娠させること、および上記遺伝子改変を含む後代を上記代理母から得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、ＥＳ細胞である。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、多能性細胞、例えば導入多能性細胞である。
【０３４７】
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから、上記改変を含む核酸配列を単離すること、および上記核酸配列を宿主核に導入すること、および好適な動物において上記核酸配列および上記宿主核を含む細胞を妊娠させることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記核酸配列を宿主卵母細胞の胚に導入する。
【０３４８】
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから核を単離すること、および上記核を宿主細胞に導入すること、および好適な動物において上記核および宿主細胞を妊娠させて、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。
【０３４９】
１つの実施形態では、上記遺伝子改変を含む雄マウスからの精液を用いる、雌マウス（野生型、上記改変に関してホモ接合性、または上記改変に関してヘテロ接合性）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を用いることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である。１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してホモ接合性である。
【０３５０】
１つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄マウスを雌マウスと交配させて、上記遺伝子改変を含む後代を得ること、上記遺伝子改変を含む雄および雌後代を同定すること、および上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄を、野生型である、上記遺伝子改変に関してホモ接合性であるまたはヘテロ接合性である雌との交配に用いて、上記遺伝子改変を含む後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雄と、野生型雌、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性の雌とを交配させる工程を繰り返して、上記マウス系統での上記遺伝子改変を維持する。
【０３５１】
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖配列による置換を含むマウス系統を維持するための方法であって、上記マウス系統を交配させて、ヘテロ接合型雄マウスを産生する工程を含み、上記ヘテロ接合性雄マウスを交配させて、上記系統において上記遺伝子改変を維持する方法を提供する。特定の実施形態において、上記系統は、ホモ接合性雄と野生型雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性の雌とのいずれの交配によっても維持されない。
【０３５２】
上記ＡＤＡＭ６タンパク質は、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＡＤＡＭ）タンパク質ファミリーのメンバーであり、これは、細胞接着をはじめとする多様な機能を有するタンパク質のラージファミリーである。ＡＤＡＭファミリーの一部のメンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、ＡＤＡＭ２は、精子−卵子相互作用に関与するタンパク質ファーティリンのサブユニットをコードする。ＡＤＡＭ３、すなわちシリテスチンは、透明帯への精子の結合に必要であるようである。ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６は、マウス精子細胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座においてヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ１−２とＶＨ６−１の間で通常見出されるヒトカウンターパート遺伝子（ヒトＡＤＡＭ６）は、偽遺伝子であるようである。マウスには２つのＡＤＡＭ６遺伝子−ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ−があり、これらは、マウスＶＨ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域において見出され、上記マウスにおいて、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子およびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子は、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントのものとは反対の転写配向に配向する。マウスの場合、正常な受精には機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座が明らかに要求される。そこで、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が欠けているまたは非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する雄マウスにおいて示される大幅に低減された受精を補うまたはレスキューすることができる、ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を指す。
【０３５３】
ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする、マウスにおける上記遺伝子間配列の位置が、内因性マウス重鎖を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせる。ＶＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、またはＤＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、結果として得られるマウスは重度の妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の改変に起因するＡＤＡＭ６活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損をレスキューするマウスＡＤＡＭ６ａ、マウスＡＤＡＭ６ｂ、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードするものである。あるいは、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座に隣接する内因性免疫グロブリン重鎖配列が機能的内因性重鎖可変領域をコードするように再構成できないようにしながら、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を保持する適切な方法を用いることができる。例示的な代替方法は、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を配置するマウス染色体の大部分が、内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結された機能的重鎖可変領域をコードするように再構成できないように、それらを操作することを含む。様々な実施形態において、上記方法は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含有するマウス染色体断片の逆位および／または転座を含む。
【０３５４】
妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を任意の好適な位置に配置することができる。上記配列を上記遺伝子間領域に配置することができ、またはゲノム内の任意の好適な位置に（すなわち、異所的に）配置することができる。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド配列を、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入することができる。１つの実施形態では、上記配列をエピソームで、すなわちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持することができる。好適な位置としては、転写許容性または活性である位置、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、１９９７、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：３７８９−３７９４）、ＢＴ−５遺伝子座（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５−４７）またはＯｃｔ４遺伝子座（Ｗａｌｌａｃｅら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１４５５−１４６４）が挙げられる。転写活性遺伝子座へのヌクレオチド配列のターゲティングは、例えば米国特許第７，４７３，５５７号明細書に記載されている。
【０３５５】
あるいは、妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を誘導性プロモーターとカップリングさせて、適切な細胞および／または組織、例えば生殖組織、での最適な発現を促進することができる。例示的誘導性プロモーターとしては、物理的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および／または化学的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、ＩＰＴＧもしくはテトラサイクリン）が挙げられる。
【０３５６】
さらに、上記ヌクレオチド配列の発現を他の遺伝子に関連づけて、特定の発生段階または特定の組織内での発現を実現することができる。かかる発現は、上記ヌクレオチド配列を、特定の発生段階で発現する遺伝子のプロモーターと作動可能に連結させることによって実現することができる。例えば、宿主種のゲノムへと工学的に作製された１つの種からの免疫グロブリン配列を、その宿主種からのＣＤ１９遺伝子（Ｂ細胞特異的遺伝子）のプロモーター配列と作動可能に連結させる。免疫グロブリンが発現する正確な発生段階でのＢ細胞特異的発現が実現される。
【０３５７】
挿入されたヌクレオチド配列の頑強な発現を実現するためのさらにもう１つの方法は、構成的プロモーターの利用である。例示的構成的プロモーターとしては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫおよびＣＡＧＧが挙げられる。同様に、所望のヌクレオチド配列を選択された構成的プロモーターと作動可能に連結させ、それにより、該ヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質（単数または複数）の高い発現レベルが得られる。
【０３５８】
用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への転位または配置（例えば、核酸配列の、該核酸配列が野生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置への配置）を含むことを意図したものである。様々な実施形態において、この用語は、その対象がその正常なまたは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例えば、「．．．をコードする異所性ヌクレオチド配列」という句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌクレオチド配列を指す。例えば、マウスＡＤＡＭ６タンパク質（または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることがある。かかる場合、野生型マウスにおける位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に上記配列を配置することにより、マウス配列の新規配列接合部を生み出すこととなる。マウスＡＤＡＭ６の機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６−／−マウスにおいて観察される妊性喪失（例えば、交配により子孫を産生する雄マウスの能力の喪失）のレスキューをもたらす配列である。機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６ａのアミノ酸配列に対しておよび／またはＡＤＡＭ６ｂのアミノ酸配列に対して少なくとも約８９％以上の同一性、例えば９９％以下の同一性を有するタンパク質、ならびにＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂの欠失またはノックアウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配する能力を補うまたはレスキューすることができるタンパク質を含む。
【０３５９】
上記異所位置は、（例えば、マウスＡＤＡＭ６配列を含有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように）どこでもよく、または例えば、野生型マウスにおける（例えば、改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座内だがその天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメント間、またはマウスＶ−Ｄ遺伝子間配列内の異なる位置における）その場所に近い（しかし、正確に同じではない）位置であってもよい。異所性配置の一例は、上記周囲の内因性重鎖遺伝子セグメントが、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再構成できるようにしながら、野生型マウスにおいて上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内に通常見出される位置を維持することである。この例では、例えば、上記可変領域遺伝子座に隣接する位置に配置された操作された部位特異的組換え部位を使用して、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含有する染色体断片の逆位によって、これを達成することができる。したがって、組換えの際に、上記内因性重鎖可変領域遺伝子座を上記内因性重鎖定常領域遺伝子から遠距離に配置することにより、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードする再構成を防止する。本開示を読むことにより、および／または当該技術分野において公知の方法と組み合わせて、当業者であれば、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を維持しながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の機能的サイレンシングを達成する他の例示的な方法が明らかである。上記内因性重鎖遺伝子座のかかる配置により、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子は維持され、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は機能的にサイレンシングされる。
【０３６０】
異所性配置の別の例は、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座内への配置である。例えば、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換であって、内因性ＡＤＡＭ６配列を除去する置換を含むマウスを、マウスＡＤＡＭ６配列が、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある遺伝子間配列内に配置されるように操作することができる。異所性配置の別の例は、上記マウスＡＤＡＭ６配列が、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントに対して（単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントの転写方向に対して）５’の位置にある配置である。上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに対する５’の位置は、上記ヒトＶＨ遺伝子セグメントに対して、例えば数百塩基対〜数ｋｂにごく接近しているか、または例えば数ｋｂ〜数百ｋｂもしくはさらにメガ塩基以上離れている場合がある。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内にまたはそれに隣接してまたはさらにそれと同じ染色体上に（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列を生じさせることとなり、このヒト遺伝子配列内へのマウスＡＤＡＭ６配列の（異所性）配置は、マウスＡＤＡＭ６配列の位置（すなわち、Ｖ−Ｄ遺伝子間領域内）に近い場合がある。マウスの生殖細胞系内のヒト遺伝子配列（例えば、免疫グロブリン遺伝子配列）内にまたは該ヒト遺伝子配列に隣接した（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列の接合により作られる、結果として生ずる配列接合部は、野生型マウスのゲノム内の同じまたは同様の位置と比較して新しいものになる。
【０３６１】
様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログが無い非ヒト動物を提供し、この欠如が該非ヒト動物を不妊性にするか、該非ヒト動物の妊性を実質的に低減させる。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログ欠如は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因する。妊性の実質的低減は、例えば、妊性（例えば、交配頻度、同腹子あたりの子、１年あたりの同腹子、など）の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはそれより多くの低減である。様々な実施形態では、非ヒト動物の雄において機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を上記非ヒト動物に補充し、この補充されたＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片により、妊性低減の全部または実質的部分がレスキューされる。妊性の実質的部分のレスキューは、例えば、上記非ヒト動物が、非改変（すなわち、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログへの改変を有さない動物）重鎖遺伝子座と比較して少なくとも７０％、８０％または９０％またはそれより多い妊性を示すような妊性の回復である。
【０３６２】
様々な実施形態において、上記遺伝子改変動物（すなわち、例えば免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因して、機能的ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログが無い動物）に付与する配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログから選択される。例えば、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、１つの実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子の付加によってレスキューされる。１つの実施形態において、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、マウス、例えば齧歯動物、に対して近縁の種、例えば、異なる系統または種のマウス、任意の種のラット、齧歯動物、のオルソログまたはホモログを付加することによってレスキューされ、この場合、上記マウスのオルソログまたはホモログの付加により、ＡＤＡＭ６機能の喪失またはＡＤＡＭ６遺伝子の喪失に起因する妊性の喪失がレスキューされる。他の種からのオルソログおよびホモログは、様々な実施形態において系統発生的に関連した種から選択され、および様々な実施形態において、約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上または９７％以上である内因性ＡＤＡＭ６（またはオルソログ）との同一性パーセントを示し、およびＡＤＡＭ６に関連したまたは（非マウスの場合は）ＡＤＡＭ６オルソログに関連した妊性喪失をレスキューする。例えば、ＡＤＡＭ６機能が無い遺伝子改変雄ラット（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域で置換された内因性免疫グロブリン重鎖可変領域を有するラット、またはラット免疫グロブリン重鎖領域のノックアウトを有するラット）の場合、そのラットの妊性の喪失は、ラットＡＤＡＭ６の付加によって、または一部の実施形態ではラットＡＤＡＭ６のオルソログ（例えば、別のラット系統もしくは種からの、または１つの実施形態ではマウスからの、ＡＤＡＭ６オルソログ）の付加によってレスキューされる。
【０３６３】
このように、様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログ）をコードする核酸配列、または該核酸配列と作動可能に連結された調節領域の改変に起因して妊性を示さないまたは妊性の低減を示す遺伝子改変動物は、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列を含み、この場合、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列は、同じ種の異なる系統からのものであるか、系統発生的に類縁の種からのものである。様々な実施形態において、上記補足性核酸配列は、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片である。様々な実施形態において、上記補足性ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、妊性の欠陥を有する遺伝子改変動物に近縁である非ヒト動物からのものである。例えば、上記遺伝子改変動物が特定の系統のマウスである場合、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片を、別の系統のマウスから得ることができ、類縁種のマウスから得ることができる。１つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物が齧歯目（ｏｒｄｅｒ  Ｒｏｄｅｎｔｉａ）のものである場合、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の別の動物からのものである。１つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物は、ネズミ亜目（ｓｕｂｏｒｄｅｒ  Ｍｙｏｍｏｒｏｐｈａ）（例えば、トビネズミ（ｊｅｒｂｏａｓ）、ジャンピングマウス（ｊｕｍｐｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、カンガルーハムスター、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウスおよびラット（ｔｒｕｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タケネズミ、モグラネズミ）のものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択される。
【０３６４】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、トビネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ）からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｍｕｒｏｉｄｅａ）からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ上科からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、トビネズミ上科からのものである。
【０３６５】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は齧歯動物である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科内の異なる種からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ）およびメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミおよびモグラネズミ）から選択される科からのものであり；および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、同じ科の異なる種から選択される。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、アレチネズミ、トゲマウス、またはタテガミネズミから選択される種からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーからのものであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科の異なる種からのものである。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、ネズミ科のマウスであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科のラット、アレチネズミ、トゲマウスまたはタテガミネズミからのものである。
【０３６６】
様々な実施形態において、１つの科の中の齧歯動物の１つ以上の齧歯動物ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログが無い同じ科（例えば、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）；ネズミ科（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ））の遺伝子改変齧歯動物に妊性を回復させる。
【０３６７】
様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６オルソログ、ホモログおよびその断片を、該オルソログ、ホモログまたは断片が、ＡＤＡＭ６活性が無い遺伝子改変雄非ヒト動物（例えば、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログのノックアウトを含む齧歯動物、例えばマウスまたはラット）に妊性を回復させるかどうか確認することにより、機能性について評価する。様々な実施形態において、機能性は、内因性ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログが無い遺伝子改変動物の精子の、遺伝子改変動物の同じ種の卵管を移動して卵子を受精させる能力と定義される。
【０３６８】
様々な態様において、マウスＡＤＡＭ６（例えば、雄マウスにおいて機能的であるそのオルソログまたはホモログまたは断片）に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または置換を含むマウスを作製することができる。上記異所性ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異なる種、例えば異なる齧歯動物種、のＡＤＡＭ６ホモログまたはオルソログ（またはその断片）であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加、および／または同腹子あたりの子の数の増加、および／またはマウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させる雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド配列が挙げられる。
【０３６９】
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質と少なくとも８９％から９９％同一である（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａまたはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％から９９％同一である）ホモログまたはオルソログである。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ａと少なくとも８９％同一のタンパク質、マウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％同一のタンパク質、およびその組み合わせから独立して選択される１つ以上のタンパク質をコードする。１つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるまたはマウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと約８９％以上同一であるように改変されているラット、ハムスター、マウス、またはモルモットタンパク質である。１つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるか、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０３７０】
ヒト化重鎖マウスにおける異所性ＡＤＡＭ６
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。ＢＡＣ工学は、マウスＥＳ細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。
【０３７１】
ヒト抗体を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、損なわれたＢ細胞発生を提示する。この損なわれた発生は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様々な相違に起因し得る。
【０３７２】
ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウスプレＢ細胞受容体またはＢ細部受容体と最適に相互作用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスＦｃ受容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウスは、ヒトＦｃ受容体との１対１の対応を提示しないＦｃ受容体を発現する。結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型Ｂ細胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まない、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座制御要素を含まない。
【０３７３】
完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再構成できないほど無能化されている限り、たとえＢ細胞発生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができる。
【０３７４】
ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざるを得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト可変／マウス定常重鎖（軽鎖ではなく）が形成される結果をもたらすには好ましいものではない。この機序により、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソタイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタイプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスでの過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容易に分かるが、この現象はＢ細胞発生のレスキューにやはり不十分であり、Ｂ細胞発生は明らかに害されたままである。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランススイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する；おそらく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイプスイッチに（それとは異なるにせよ）用いられる内因性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがって、完全ヒト抗体を作製するように工学的に作製されたマウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するためにトランススイッチ機序を選択する場合であっても、その戦略は、正常Ｂ細胞発生のレスキューにやはり不十分である。
【０３７５】
抗体ベースのヒト治療薬、例えば抗病原体抗体の作製における主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識し、望ましい親和性で、通常は−常にではないが−高い親和性で、そのエピトープに結合する有用な可変ドメインを同定することである。マウス免疫グロブリン重鎖可変領域の、内因性マウス遺伝子座における限られた数のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントでの正確な置換を含有する本明細書に記載のマウスは、ほぼ野生型のＢ細胞発生を示し、免疫に応答して生成される可変領域は完全にヒトのものであり、上記重鎖は単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する。したがって、かかるマウスは、所与の抗原、例えば、病原性ウイルスへの結合に特異的に指向性を有する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のパネルを作製するためのプラットホームを提供する。
【０３７６】
本明細書に記載のマウスは、内因性遺伝子座におけるマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）の生殖細胞系可変遺伝子遺伝子座の、限定されたヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座での、および免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の、等価のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座での正確な大規模置換を含有する。この正確な置換により、結果として、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する重鎖および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。マウスＶＨ−ＤＨ−ＪＨおよびＶκ−Ｊκセグメントの正確な置換は、隣接するマウス配列をインタクトなままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に残す。上記マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生はいかなる重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると上記マウスにおいてヒト重鎖ＣＤＲの体細胞変異パネルが産生される。
【０３７７】
本明細書に記載のマウスは、重鎖およびκ軽鎖についての免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウスにおいて同様に再構成するので実現可能であるのだが、その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけではない――明らかにそれらはそうではない。しかし、その遺伝子座は、すべてのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３００万塩基対の連続するマウス配列を、限定されたヒト重鎖遺伝子座を含有する連続するヒトゲノム配列で置換することによって重鎖可変遺伝子遺伝子座におけるヒト化を達成することができるほどに類似する。
【０３７８】
一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置換（例えば、マウスＣＨ１配列の、ヒトＣＨ１での置換、およびマウスＣＬ配列の、ヒトＣＬ配列による置換）により、結果として、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトＦａｂの作製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメント再構成、正常な体細胞超変異頻度および正常なクラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウスと区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスにヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーが無い場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのＢ細胞発生段階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これらのマウスを免疫することにより、多種多様な重鎖ＣＤＲおよび軽鎖可変遺伝子セグメントの使用を示す頑強な体液性応答が得られる。
【０３７９】
マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置換により、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再構成し、超変異し、正常にクラススイッチするため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニングして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において）融合させ、その結果、全部がヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得ることができる。
【０３８０】
リコンビニアリング法による大規模ヒト化を用いてマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を改変して、マウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む３メガ塩基以下のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む限定されたヒト重鎖遺伝子座を含有するヒトゲノム配列で正確に置換した。本質的にすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方を含むヒトゲノムの二分の一メガ塩基以下のセグメントを使用して、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の３メガ塩基セグメントを置換した。
【０３８１】
かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間で通常は見出される内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の機能性の低減または除去をもたらし得る。ヒト重鎖レパートリーの最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの一方または両方を限定されたヒト重鎖遺伝子座の構築に使用すると、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子であるように見える偽遺伝子を含有する遺伝子間領域がこれらのＶＨ遺伝子セグメント間、すなわち、ヒトＶＨ１−２とＶＨ１−６との間に存在する。しかし、このヒト遺伝子間配列を含む雄マウスは、妊性の低減を示す（米国特許出願第１３／４０４，０７５号参照）。
【０３８２】
上記の限定されたヒト重鎖および等価のヒトκ軽鎖遺伝子座を含み、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示すマウスを記載する。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトＶＨ１−６９とヒトＤＨ１−１との間に配置されたマウスＡＤＡＭ６ａ配列および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトＶＨ１−６９とヒトＤＨ１−１のと間に配置された配列番号７７である。配列番号７７のＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周囲のヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して逆である。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの上流（または５’）に配置されたマウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはマウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座におけるヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの上流（または５’）に配置された配列番号７３である。配列番号７３のＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周囲のヒト遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント）の転写方向に関して逆である。
【０３８３】
本明細書における例は、示されるヒト遺伝子セグメント間に異所性配列を配置することによる妊性のレスキューを示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝子座への（またはさらには染色体外に）異所性配列の配置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想されることは、当業者であれば認める。
【０３８４】
マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスを補足する現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＡＤＡＭ６破壊改変を含む非常に多数のマウスを本発明の組成物および方法でレスキューすることができる。したがって、本発明は、内因性ＡＤＡＭ６機能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変を有するマウスを含む。一部の（非限定的）例を本明細書に提供する。記載するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに加えて、ＡＤＡＭ６に関する組成物および方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を多種多様な方法で改変するときに用いることができる。
【０３８５】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つのＶＨ遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスであって、ＣＨ１領域および／またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、（ａ）ヒトＶＨ−マウスＣＨ１−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＨ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；および（ｃ）ヒトＶＨ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３から選択される免疫グロブリン鎖の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する。
【０３８６】
１つの態様では、１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ、ｍＤＨおよび／またはｍＪＨ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶＨ、ｈＤＨおよび／またはｈＪＨ）での置換を有するマウスであって、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκおよび／またはｍＪκ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよび／またはｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の上流（または５’）（例えば、ヒトＶＨ１−２またはＶＨ１−６９遺伝子セグメントの上流）に配置する。
【０３８７】
１つの態様では、１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ、ｍＤＨおよび／またはｍＪＨ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶＨ、ｈＤＨおよび／またはｈＪＨ）での置換を有するマウスであって、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκおよび／またはｍＪκ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよび／またはｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列内（例えば、ヒトＶＨ１−６９またはヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントとの間）に配置する。
【０３８８】
１つの実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも８９のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１３のＤＨ遺伝子セグメント、少なくとも４のＪＨ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の限られた数の（例えば、１つ、２つまたは３つの）ＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２７のＤＨ遺伝子セグメント、少なくとも６のＪＨ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。特定の実施形態において、上記限られた数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは１つである。
【０３８９】
１つの実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基のマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも１３７のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約二分の一メガ塩基のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の（免疫グロブリンκ定常領域に関して）近位リピートを含む。１つの実施形態において、上記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも４０のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。
【０３９０】
１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列を２つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの間に配置する。特定の実施形態において、上記２つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列をヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントとヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントとの間に配置する。１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列をヒトＶＨ１２遺伝子セグメントとヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントとの間に配置する。１つの実施形態において、そのように改変されたマウスは、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの置換、および少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５のヒトＪκ遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントの置換を含む。
【０３９１】
１つの態様において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくはその機能的断片）は、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再構成できない内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座に存在するマウス遺伝子セグメントの中央に存在する。１つの実施形態において、上記内因性マウス重鎖遺伝子座は、少なくとも１つ、かつ８９以下のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪＨ遺伝子セグメント、およびその組み合わせを含む。様々な実施形態において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくはその機能的断片）は、上記マウスにおいて機能的である１つ以上のＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、上記１つ以上のＡＤＡＭ６タンパク質は、配列番号１、配列番号２および／またはその組み合わせを含む。
【０３９２】
１つの態様において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、内因性マウス遺伝子セグメントを置換するヒト遺伝子セグメントの中央に存在する。１つの実施形態において、少なくとも８９のマウスＶＨ遺伝子セグメントを除去し、１つ、２つまたは３つのヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換し、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端に直ぐ隣接して存在するか、２つのヒトＶＨ遺伝子セグメント間に存在する。１つの実施形態において、少なくとも８９のマウスＶＨ遺伝子セグメントを除去し、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換し、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端に直ぐ隣接して存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約２０キロ塩基（ｋｂ）から約４０キロ塩基（ｋｂ）以内のＶＨ遺伝子セグメントの３’に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約２９ｋｂから約３１ｋｂ以内のＶＨ遺伝子セグメントの３’に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約３０ｋｂ以内に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約３０，１８４ｂｐ以内に存在する。
【０３９３】
特定の実施形態において、上記置換は、ヒト遺伝子セグメントＶＨ１−６９およびＤＨ１−１を含み、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、該ＶＨ１−６９遺伝子セグメントの下流かつ該ＤＨ１−１遺伝子セグメントの上流に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントとヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントとの間に存在し、この場合、該マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の５’末端は、該ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントの３’末端から約２５８ｂｐであり、および該ＡＤＡＭ６遺伝子座の３’末端は、該ヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントの約３，２６３ｂｐ５’側に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号３またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号７３またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号７７またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒト遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＨ１−６９−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＤＨ１−１。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、ヒト遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに対して５’またはその上流に存在する。
【０３９４】
特定の実施形態において、上記置換は、ヒト遺伝子セグメントＶＨ１−２およびＤＨ１−１を含み、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、該ＶＨ１−２遺伝子セグメントの上流かつ該ＤＨ１−１遺伝子セグメントの上流に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントとヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントの上流または５’に存在し、この場合、該マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の５’末端は、該ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの５’末端から約３２，８３３ｂｐであり、および該ＡＤＡＭ６遺伝子座の３’末端は、該ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントの５’末端から約１８，０７８ｂｐである。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号３またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号７３またはその断片を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号７７またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒト遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶＨ１−２−ヒトＤＨ１−１。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、ヒト遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに対して３’またはその下流に存在する。
【０３９５】
同様に、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを置換する、上記１つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメント（例えば、ＶκまたはＶλセグメント）で改変されるマウスは、上に記載したように、例えばマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくはその機能的断片を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターを利用することにより、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を維持するように改変することができ、あるいは２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント間に、またはヒトＶＬ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖλ＋ｍ／ｈＤＨ）もしくはＪ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖκ＋ＪＨ）に位置する異所配列で損傷マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を置換するように改変することができる。１つの実施形態において、上記置換は、２つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み、および上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはその機能的断片は、２つの最も３’側のＶＬ遺伝子セグメント間に存在する。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＬ３’−１−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶＬ３’。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に存在する。最も５’側のＤＨセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうとこのとおりであるはずである。
【０３９６】
１つの態様では、１つ以上の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの置換を有する、および少なくとも１つの内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。かかるマウスにおいて、上記内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの改変は、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントではなく、最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの１つ以上についての改変を含み得、この場合、上記１つ以上の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの改変が、上記内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を破壊しないようにまたは非機能的にしないように注意する。例えば、１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つのヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含み、および上記マウスは、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメントおよび機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む。
【０３９７】
もう１つの実施形態において、上記マウスは、最も３’側の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの改変、および１つ以上の内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントの改変を含み、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が機能的なままである程度まで該内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改変を二工程で行う：（１）上流ホモロジーアームと、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは部分を含む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベクターを利用して、最も３’側の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを１つのヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換する工程；（２）次に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターで内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントを置換する工程。
【０３９８】
様々な態様において、改変が内因性マウスＡＤＡＭ６の機能を破壊する場合、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は有用である。内因性マウスＡＤＡＭ６機能を破壊する確率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うとき、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしくは一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が（例えば、ＶκもしくはＶλ配列で）置換されている免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するときに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。
【０３９９】
マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列またはマウスＡＤＡＭ６タンパク質の妊性の恩恵をもたらす実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする異所性配列を含有するマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、かかるマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を破壊する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の改変を含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一部分の欠失または置換を、他の改変にかかわらず有するマウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。
【０４００】
一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス、齧歯動物または他のＡＤＡＭ６遺伝子（またはオルソログもしくはホモログもしくは断片）と１つ以上のヒト免疫グロブリン可変および／または定常領域遺伝子セグメントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。様々な実施形態において、マウスにおいて機能的である他のＡＤＡＭ６遺伝子オルソログまたはホモログまたは断片は、ウシ、イヌ、霊長類、ウサギまたは他の非ヒト配列を含み得る。
【０４０１】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つのヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントによる置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＪＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する。
【０４０２】
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ１ヌクレオチド配列の、ヒトＣＨ１ヌクレオチド配列による置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジヌクレオチド配列による置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座（ＶＬおよびＪＬ）の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列による置換をさらに含む。特定の実施形態において、上記ＶＬ、ＪＬおよびＣＬは、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトＣＨ１配列と融合したマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３免疫グロブリン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺伝子座が再構成して、（ａ）ヒト可変領域、ヒトＣＨ１領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３領域を有する重鎖と、（ｂ）ヒト可変ドメインおよびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子を形成する。
【０４０３】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントによる置換と、必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはヒトＪＨ遺伝子セグメントによる置換と、または必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する。
【０４０４】
１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のＶＬ、１つ以上のＤＨ、および１つ以上のＪ遺伝子セグメント（例えば、ＪκまたはＪλ）での置換を含み、これらの遺伝子セグメントは、内因性マウスヒンジ領域に作動可能に連結されており、該マウスは、転写方向に５’から３’へと、ヒトＶＬ−ヒトまたはマウスＤＨ−ヒトまたはマウスＪ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３を含有する再構成免疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪκ領域である。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪＨ領域である。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪλ領域である。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ領域は、ヒトＶλ領域およびヒトＶκ領域から選択される。
【０４０５】
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスまたはヒト定常領域と、ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪκ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪκに由来する可変領域とを有する、単一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、列挙したＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間でのまたは列挙したＶおよびＪ遺伝子セグメント間での生産的再構成の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変する。
【０４０６】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントによる置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスであって、ＣＨ１および／またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。
【０４０７】
１つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ１ドメインをコードする配列が無い。１つの実施形態において、上記マウスにはヒンジ領域をコードする配列が無い。１つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列が無い。
【０４０８】
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ３ドメインに結合しているマウスＣＨ２ドメインに融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（λまたはκ）を含む結合タンパク質を発現する
【０４０９】
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントによる置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのマウスＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントによる置換とを含むマウスを提供する。
【０４１０】
１つの実施形態において、上記マウスは、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ１およびヒンジ領域、またはＣＨ１領域およびヒンジ領域およびＣＨ２領域をコードする免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。
【０４１１】
１つの実施形態において、上記マウスは、以下のものから選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する：（ａ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ１−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＬ−マウスヒンジ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３；（ｃ）ヒトＶＬ−マウスＣＨ２−マウスＣＨ３。
【０４１２】
１つの態様では、無能化または欠失された内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスであって、ヒトまたはマウスまたはヒト／マウスもしくは他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、組み込まれた導入遺伝子上に存在し、該導入遺伝子は、マウスゲノムにランダムに組み込まれている。１つの実施形態において、上記核酸配列は、野生型マウスでは見出さないエピソーム（例えば、染色体）上にある。
【０４１３】
１つの実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖遺伝子座から選択される。特定の実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性κ軽鎖遺伝子座および無能化されたλ軽鎖遺伝子座を含み、この場合のマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインを含む抗体を発現する。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインは、ヒトκ軽鎖ドメインおよびヒトλ軽鎖ドメインから選択される。
【０４１４】
１つの態様では、キメラ抗体を発現する遺伝子改変動物であって、該遺伝子改変動物において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する遺伝子改変動物を提供する。
【０４１５】
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物はマウスであり、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、該遺伝子改変動物とは異なる系統であるマウス系統からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物（例えば、ハムスター、新世界ラットまたはマウス、ハタネズミ）であり、および上記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、ネズミ科の齧歯動物（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ科の齧歯動物であり、上記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、キヌゲネズミ科の齧歯動物からのものである。
【０４１６】
１つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと齧歯動物の定常領域配列とを含む。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物およびネズミ科の齧歯動物から選択される。特定の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、マウスである。特定の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、ラットである。１つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと、マウスまたはラットから選択される動物からの定常ドメインとを含む；特定の実施形態において、上記マウスまたはラットは、キヌゲネズミ科およびネズミ科から選択される。１つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインと、ヒト軽鎖可変ドメインと、マウスおよびラットから選択される齧歯動物由来の定常領域配列とを含み、この場合のヒト重鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖は同種のものである。特定の実施形態において、同種のものとしては、ヒト重鎖およびヒト軽鎖可変ドメインが、該ヒト軽鎖可変ドメインと該ヒト重鎖可変ドメインを一緒に発現してその可変ドメインを個々のＢ細胞の表面に一緒に提示する単一Ｂ細胞からのものである、同種のものが挙げられる。
【０４１７】
１つの実施形態において、上記キメラ抗体を免疫グロブリン遺伝子座から発現させる。１つの実施形態において、上記キメラ抗体の重鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現させる。１つの実施形態において、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現させる。１つの実施形態において、上記キメラ抗体の重鎖可変ドメインおよび／または上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の、動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列）から発現させる。１つの実施形態において、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の、動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列）から発現させる。
【０４１８】
特定の実施形態において、上記導入遺伝子を転写活性遺伝子座、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、例えばネズミ（例えばマウス）ＲＯＳＡ２６遺伝子座から発現させる。
【０４１９】
１つの態様では、非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座が非ヒトＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、非ヒト動物を提供する。
【０４２０】
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウスＡＤＡＭ６配列とオルソロガスおよび／または相同性である配列であり、そのオルソログまたはホモログは、非ヒト動物において機能的である。
【０４２１】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される齧歯動物である。
【０４２２】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウス、ラットおよびハムスターから選択される非ヒト動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるマウス種、ラットおよびハムスターから選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はラットであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるラット種、マウスおよびハムスターから選択される齧歯動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はハムスターであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるハムスター種、マウスおよびラットから選択される齧歯動物からのものである。
【０４２３】
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、ネズミ亜目からのものであり、上記ＡＤＡＭ６配列は、トビネズミ上科の齧歯動物およびネズミ上科の齧歯動物から選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のマウスであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科のマウスまたはラットまたはハムスターからのものである。
【０４２４】
１つの実施形態において、上記ヒト化重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上のヒト、キメラおよび／または齧歯動物（例えば、マウスもしくはラット）定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はマウスである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はラットである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はハムスターである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３配列を含む。
【０４２５】
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列に隣接する。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列内に位置する。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントを含む。
【０４２６】
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントに並置されている。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、２つのＶ遺伝子セグメント間に位置する。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間に並置されている。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間に位置する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間に並置されている。
【０４２７】
１つの態様では、免疫グロブリン遺伝子座からヒトＶＬドメインと同種のヒトＶＨドメインを発現するＢ細胞を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、該免疫グロブリン遺伝子座から非免疫グロブリン非ヒトタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、ＡＤＡＭタンパク質である。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片である。
【０４２８】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記ネズミ上科の齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。
【０４２９】
１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、齧歯動物タンパク質である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０４３０】
１つの実施形態において、上記ヒトＶＨおよびＶＬドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に直接またはリンカーによって結合する。特定の実施形態において、上記定常ドメイン配列は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬドメインは、ＶκまたはＶλドメインから選択される。
【０４３１】
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、その生殖細胞系にヒト免疫グロブリン配列を含み、雄非ヒト動物の精子がｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥を特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記ｉｎ  ｖｉｖｏ移動欠陥は、上記雄非ヒト動物の精子が同じ種の雌非ヒト動物の子宮から卵管を通って移動することができないことを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物には、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列が無い。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂタンパク質またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０４３２】
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする非ヒト配列に隣接するヒト免疫グロブリン配列を含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
【０４３３】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、単一のＶＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、単一のＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含む。
【０４３４】
１つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、天然ヒトレパートリーにおける多型に関連づけられた単一のＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０またはＶＨ３−２３から選択される。もう１つの特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２である。もう１つの特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−６９である。
【０４３５】
１つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、天然ヒトレパートリーにおける複数のコピー数に関連づけられた単一のＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０またはＶＨ３−２３から選択される。もう１つの特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−２である。もう１つの特定の実施形態において、上記単一のＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−６９である。
【０４３６】
様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６−１、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ２−５、ＶＨ３−７、ＶＨ１−８、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ１−２４、ＶＨ２−２６、ＶＨ４−２８、ＶＨ３−３０、ＶＨ４−３１、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３４、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ４−３９、ＶＨ３−４３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ５−５１、ＶＨ３−５３、ＶＨ１−５８、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３およびＶＨ３−７４から選択される。
【０４３７】
様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは表１から選択され、５つ以上の対立遺伝子によって天然ヒトレパートリーで表される。特定の実施形態において、上記ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−６４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１およびＶＨ７−４−１から選択される。
【０４３８】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含み、該ヒトＶＨ遺伝子セグメントはマウスＣＨ領域遺伝子に作動可能に連結されているので、該マウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントを再構成し、およびヒトＶＨドメインとマウスＣＨとを含む逆キメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。１つの実施形態において、非再構成マウスＶＨ遺伝子セグメントの９０〜１００％が、１つの非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換されている。特定の実施形態において、上記内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、１つの非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ２−２６遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ２−７０遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、上記置換は、非再構成ヒトＶＨ３−２３遺伝子セグメントでのものである。
【０４３９】
１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのマウスＤＨおよびＪＨセグメントの、少なくとも１つの非再構成ヒトＤＨセグメントおよび少なくとも１つの非再構成ヒトＪＨセグメントによる置換を含む。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの非再構成ヒトＤＨセグメントは、１−１、１−７、１−２６、２−８、２−１５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、７−２７およびその組み合わせから選択される。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの非再構成ヒトＪＨセグメントは、１、２、３、４、５、６およびその組み合わせから選択される。
【０４４０】
様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラットまたはキメラヒト／ハムスター、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。１つの実施形態において、上記定常領域は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。様々な実施形態において、上記定常領域は、少なくともＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【０４４１】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり、この非重鎖遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非重鎖遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。
【０４４２】
様々な態様において、上記非ヒト動物は、該非ヒト動物の生殖細胞系にヒト免疫グロブリン軽鎖配列（例えば、１つ以上の非再構成軽鎖ＶおよびＪ配列、または１つ以上の再構成ＶＪ配列）をさらに含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン軽鎖配列は、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＶＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＶＬ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＬ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも１６のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも３０のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも４０のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト／齧歯動物、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスまたはラット定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスκ定常（ｍＣκ）領域またはラットκ定常（ｒＣκ）領域である。
【０４４３】
１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、少なくとも６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントによる置換を含む。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくとも１６のヒトＶκ遺伝子セグメント（ヒトＶκ）および少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくとも３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態において、上記少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントは、２、３、４または５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
【０４４４】
１つの実施形態において、上記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５およびＶκ１−６を含む。１つの実施形態において、上記Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５およびＶκ１−１６を含む。１つの実施形態において、上記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９およびＶκ２−３０を含む。１つの実施形態において、上記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９およびＶκ２−４０を含む。
【０４４５】
特定の実施形態において、上記Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１からＶκ２−４０までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続したヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、上記Ｊκ遺伝子セグメントは、Ｊκ１からＪκ５までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続した遺伝子セグメントを含む。
【０４４６】
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、転写活性である非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。
【０４４７】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞において、コードされている１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含むヒト抗体を作製する方法を提供する。
【０４４８】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞において、コードされている１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、本明細書に記載の非ヒト動物を、ヒト可変ドメインを含む抗体に曝露することを含む方法を提供する。１つの実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。１つの実施形態において、上記抗体は、ヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
【０４４９】
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、ＶＨ６−１、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ２−５、ＶＨ３−７、ＶＨ１−８、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ１−２４、ＶＨ２−２６、ＶＨ４−２８、ＶＨ３−３０、ＶＨ４−３１、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３４、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ４−３９、ＶＨ３−４３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ５−５１、ＶＨ３−５３、ＶＨ１−５８、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３およびＶＨ３−７４から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
【０４５０】
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−６４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１およびＶＨ７−４−１から選択される再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
【０４５１】
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９およびＶκ２−４０から選択される再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
【０４５２】
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、再構成ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
【０４５３】
特定の実施形態において、上記抗イディオタイプ抗体は、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ３−３２、Ｖλ２−３３、Ｖλ２−３４、Ｖλ１−３６、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ５−４８、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５０、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ１０−５４、Ｖλ１１−５５、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１およびＶλ４−６９から選択される再構成ヒトＶλ遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる。
【０４５４】
１つの実施形態において、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のＤＨ遺伝子セグメントおよび６のＪＨ遺伝子セグメントを含む限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物の細胞において、コードされている１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体であって、再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、上記非ヒト動物を、上記再構成ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含む抗体に曝露すること、および上記非ヒト動物から上記抗イディオタイプ抗体を単離することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２およびヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントから選択される。
【０４５５】
１つの実施形態において、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のＤＨ遺伝子セグメントおよび６のＪＨ遺伝子セグメントを含む限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物の細胞において、コードされている１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含む抗イディオタイプ抗体であって、再構成ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含むヒト軽鎖可変ドメインに対して特異的であるか、またはこれに結合することができる抗イディオタイプ抗体を作製する方法であって、上記非ヒト動物を、上記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む抗体に曝露すること、および上記非ヒト動物から上記抗体を単離することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、上記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１−２およびヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントから選択される。
【０４５６】
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された１つ以上の可変領域核酸配列に由来する抗体または抗体断片を含むポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは抗体である。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、重鎖のみの抗体である。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、一本鎖可変断片（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【０４５７】
１つの態様では、抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。様々な実施形態において、上記抗体は、上記非ヒト動物から単離された１つ以上の可変領域核酸配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。
【実施例】
【０４５８】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製および使用の仕方を当業者に説明するために提供するものであり、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を制限することを意図したものではない。別の指示が無い限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または大気圧近くである。
実施例１
限定されたヒト化ＩｇＨ遺伝子座の構築
【０４５９】
すべてのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントの上流にある単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する、固有に操作されたヒト重鎖遺伝子座を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを用いる相同組換えにより構築することができる。かかる免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築に用いられる例示的なヒトＶＨ遺伝子セグメントとしては、コピー数の変動に関連づけられた多型ＶＨ遺伝子セグメントおよび／またはＶＨ遺伝子セグメント、例えばＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０およびＶＨ３−２３などが挙げられる。数個のターゲティング構築物を使用して単一のＶＨを含有する重鎖遺伝子座を作るために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を用いることができる（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら、２００３，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（６）：６５２−６５９参照）。
【０４６０】
ヒトＶＨ１−６９の限定されたＩｇＨ遺伝子座の例示的な構築戦略（図１）。第一の工程では、ＶＨ１−６９、上流選択カセット（例えば、ハイグロマイシン）、および５’マウスホモロジーアームを含む複数の遠位側（５’）ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する改変ヒトＢＡＣを、やはり改変組換えシグナル配列を含有する第二の選択カセット（例えば、スペクチノマイシン）による相同組換えによってターゲティングした（工程１、図１）。この改変組換えシグナル配列（ＲＳＳ）により、ヒトＶＨ１−６９遺伝子の３’ＲＳＳ領域内に２つの点変異（ＴからＡへの変異およびＧからＡへの変異）を導入し、ＲＳＳ九量体を最適なコンセンサス配列に変化させた。したがって、工程１の結果、改変３’ＲＳＳ、ＲＳＳの約１８０ｂｐ下流の固有ＡｓｉＳＩ制限部位、およびスペクチノマイシンカセットを有するヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片が得られた。
【０４６１】
工程２には、Ｆｒｔ部位が隣接するネオマイシン（Ｎｅｏ）カセットを使用して、選択カセット（ハイグロマイシン）およびさらに上流（５’）ヒトＶＨ遺伝子セグメントを欠失させることが含まれていた。相同組換えによってヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントに対して５’にこの改変をターゲティングして、ヒトＶＨ１−６９の約８．２ｋｂのプロモーター領域および５’マウスホモロジーアームをインタクトにした。
【０４６２】
工程３には、固有操作制限部位（例えば、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＡｓｉＳＩ）が隣接する別の選択カセット（スペクチノマイシン）を相同組換えによってターゲティングして、最初の３つの機能的ヒトＶＨ遺伝子セグメントならびにすべてのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片にすることが含まれていた（図１）。ヒトゲノム断片は、ネオマイシンカセットによる相同組換えによって予めターゲティングされ、３’イントロンエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の５’および３’にマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアームおよび３’ホモロジーアームを含有していた。この改変により、５’マウスゲノム配列およびヒトＶＨ遺伝子セグメントを欠失させ、ヒトＤＨ１−１遺伝子セグメントの上流の約３．３ｋｂのＶＨ−ＤＨ遺伝子間領域、ヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントのすべて、ならびに３’イントロンエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含有する３’マウスゲノム断片がもたらされた（図１）。
【０４６３】
固有制限部位（上記）を使用して工程２および工程３からの２つの改変ＢＡＣを切断し、続いてライゲーションすることによって工程４を行い、最終ターゲティング構築物を得た。ＥＳ細胞内にヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、すべてのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座を作るための最終ターゲティング構築物は、５’から３’に向けて、内因性重鎖遺伝子座の上流に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、約８．２ｋｂのヒトＶＨ１−６９プロモーター、改変３’ＲＳＳを有するヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、６のヒトＪＨセグメント、ならびに３’イントロンエンハンサーおよびＩｇＭ遺伝子を含むマウスＪＨ遺伝子セグメントの下流の約８ｋｂのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアームを含有していた（図１）。
【０４６４】
ヒトＶＨ１−２の限定されたＩｇＨ遺伝子座の例示的な構築戦略（図２）。同様に、他の多型ＶＨ遺伝子セグメントをマウス重鎖定常領域との関連で使用して、限られた数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の免疫グロブリン重鎖Ｖセグメントを有する一連のマウスであって、上記ＶセグメントがＶ遺伝子ファミリーメンバーの多型変異体であるマウスを構築する。例示的な多型ＶＨ遺伝子セグメントは、例えば、ＶＨ１−２、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、およびＶＨ３−２３を含めたヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する。かかるヒトＶＨ遺伝子セグメントは、例えば、公開されたデータベース上で利用可能な配列を用いてｄｅ  ｎｏｖｏ合成（例えば、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）により得られる。したがって、一部の実施形態において、各ＶＨ遺伝子をコードするＤＮＡ断片は、本明細書に記載のターゲティングベクターへの組み込みとは独立に生成される。このように、マウス重鎖定常領域との関連では、限られた数のＶＨ遺伝子セグメントを含む複数の改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を操作する。ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を作るための例示的なターゲティング戦略を図２に示す。
【０４６５】
簡単に言うと、３つのヒトＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ６−１、ＶＨ１−２、ＶＨ１−３）、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する改変ヒトＢＡＣクローン（２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，０７５号参照）を用いて、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を作る。この改変ＢＡＣクローンは、上記のヒト重鎖遺伝子セグメントを、マウスイントロンエンハンサーおよびＩｇＭ定常領域と機能的に連結する。限定されたヒトＶＨ１−２ベースの重鎖遺伝子座は、上記の改変ヒトＢＡＣクローンを用いて２回の相同組換えにより達成する。第一の相同組換えでは、改変ヒトＢＡＣクローン内の２０５ｂｐのヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント（エクソン１内のＶＨ６−１開始コドンの約１０ｂｐ上流（５’）からエクソン２の開始部の約６３ｂｐ下流（３’）まで）を、固有ＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位が隣接するスペクチノマイシン（ａａｄＡ）カセットを用いて細菌性相同組換えにより欠失させる（図２、ＢＨＲ１）。これにより、限定された重鎖遺伝子座内の他のヒト遺伝子セグメントを破壊せずに、続いてａａｄＡカセットを除去することが可能となる。第二の相同組換えでは、ヒトＶＨ１−３遺伝子セグメントの全体およびこの遺伝子セグメントの約６０ｂｐ下流（３’）を含む改変ヒトＢＡＣクローンの５’末端を、隣接する５’ＡｓｉＳＩ制限部位および３’ＡｓｃＩ制限部位を含有するハイグロマイシンカセットを用いて相同組換えにより欠失させる（図２、ＢＨＲ２）。上記の通り、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントに隣接する２つのヒトＶＨ遺伝子セグメントの欠失を含め、最終ターゲティングベクターの確認後に、スペクチノマイシンカセットを必要に応じて除去する（図２、下）。例示的なヒトＶＨ１−２ターゲティングベクターを配列番号７５に示す。
【０４６６】
限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座において多型ＶＨ遺伝子セグメントを使用することは、抗体、抗体集団、および単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する多様なＣＤＲを有する重鎖を有する抗体を発現するＢ細胞集団を生成するための新規アプローチの代表的なものである。宿主動物の体細胞超変異機構を、再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと組み合わせて共に利用することにより、遺伝子改変動物の免疫レパートリーを拡張し、ヒト病原体に対して特異的な中和抗体を作製するためのプラットホームとして特に有用なヒト治療薬を作製するための次世代プラットホームとしてのそれらの有用性を増強する固有の重鎖および固有のＶＨ／ＶＬ対の操作がもたらされる。
【０４６７】
最終的な所望の遺伝子座構造に基づいて、所望のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有するヒトＢＡＣクローンを使用して、他のヒトＶＨ遺伝子セグメントの１つを同様に置換することができる。したがって、さらなる多型ＶＨ遺伝子セグメントおよび／または他の多型ＶＨ遺伝子セグメントをマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組み込むための上記戦略を用いることにより、別の方法では宿主免疫系を有効に回避し得るヒト病原体を中和するのに用いられる新規抗体レパートリーの生成が可能となる。
【０４６８】
上記ターゲティングＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用いて、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（上掲）により８細胞期のマウス胚に導入する。マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、すべてのヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスは、ネオマイシンカセット、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびにヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメント内の領域、ならびに内因性重鎖配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上掲）の変法を用いて遺伝子型解析により同定する。表３は、単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する限定された重鎖遺伝子座を保有するマウスを確認するために用いられるプライマーおよびプローブを示す。
【０４６９】
ターゲティングベクターにより導入されるＦｒｔを組み込んだあらゆるネオマイシンカセットであって、例えば、ＥＳ細胞期でも胚でも除去されない該ネオマイシンカセットを除去するために、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する操作された重鎖遺伝子座を保有するマウスを、ＦＬＰｅ欠失マウス系統へと繁殖させることができる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら、（２０００）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｅｌｅｔｅｒ  ｍｉｃｅ  ｓｈｏｗ  ｔｈａｔ  ＦＬＰｅ  ｉｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：１３９−１４０参照）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
【０４７０】
子を遺伝子型解析し、免疫グロブリン重鎖レパートリーを特徴づけるために、内因性マウス免疫グロブリン定常遺伝子に作動可能に連結された単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、すべてのヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を選択する。
【表３】
2020110187.tif 000005
実施例２
限定されたヒト化ＩｇＨ遺伝子座へのＡＤＡＭ遺伝子のリエンジニアリング
【０４７１】
内因性可変領域遺伝子セグメント（ＶＤＪ）が置換および／または欠失されたヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の発現を欠く。特に、かかるヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む雄マウスは、妊性の低減を示す。したがって、通常の交配法を使用して改変マウス系統を持続させるために、ヒト化（しかし制限的）重鎖遺伝子座を有するマウスにＡＤＡＭ６発現能をリエンジニアリングした。
【０４７２】
ヒトＶＨ１−６９の限定されたＩｇＨ遺伝子座へのＡＤＡＭ６遺伝子のリエンジニアリング（図３）。すべてのヒトＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの上流にある単一のヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメントを含有する限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ（配列番号７７）をコードするゲノム断片を含有するように、ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して相同組換えによってリエンジニアリングした。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（上掲）によって、マウスおよびヒト配列を含有するＢＡＣ  ＤＮＡの改変を含む一連の６の工程（これにより、マウス重鎖定常領域およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子に隣接する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティングベクターが得られた）において、これを達成した。
【０４７３】
第一に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子周囲の独自位置の制限部位に様々な選択カセットをもたらす一連の３回の細菌性相同組換えによって、単一のＶＨ遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座への挿入のために、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードするマウスゲノム断片を調製した（図３、工程１〜３）。第一の工程では、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一部を含有するマウスＢＡＣ  ＤＮＡを、組換え部位に隣接するネオマイシンカセット（固有ＡｓｉＳＩ制限部位を含有するようにこれを操作したもの）でターゲティングした。次いで、第二の工程では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子およびネオマイシンカセットを含有する改変マウス断片をターゲティングして、マウスＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを欠失させ、選択遺伝子の５’に位置する固有ＡｓｃＩ制限部位を含有するスペクチノマイシンカセットでそれらを置換した。第三の工程では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子とスペクチノマイシンカセットとの間に位置するネオマイシンカセットを含有する二重改変マウス断片をターゲティングして、ネオマイシンカセットをハイグロマイシンカセットに交換した。単一のＶＨ遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座に適合性ゲノム断片をライゲーションすることによって、ＡＤＡＭ６遺伝子を含有する改変マウスゲノム断片を挿入することができるように、これを行った。
【０４７４】
工程４では、ヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒト化重鎖遺伝子座を、それぞれカセットの５’および３’の場所に固有Ｉ−ＣｅｕＩおよびＡｓｃＩ制限部位を含有するスペクチノマイシンカセットによる細菌性相同組換えによって別々にターゲティングした（図３、左上）。この工程の後、限定されたヒト化重鎖遺伝子座、ネオマイシンおよびスペクチノマイシンカセットを含有する改変ゲノム断片、ならびにＡＤＡＭ６遺伝子、ハイグロマイシンおよびスペクチノマイシンカセットを含有する改変マウス断片をＩ−ＣｅｕＩおよびＡｓｃＩ制限酵素で別々に消化して、ライゲーション用の改変ゲノム断片を作った（図３、中央）。工程５では、消化した適切なゲノム断片を精製および共にライゲーションして、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、６のヒトＪＨ遺伝子セグメント、ならびにネオマイシンおよびハイグロマイシン耐性を有するＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする組み込まれたマウスゲノム断片を含有するリエンジニアリングヒト化重鎖遺伝子座を得た。最後の工程（工程６）では、ＡｓｉＳＩ消化によってハイグロマイシンカセットを欠失させ、続いて適合性末端を再ライゲーション（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）した。
【０４７５】
この工程により、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を限定されたヒト化重鎖遺伝子座に再挿入するための最終ターゲティングベクターであって、５’から３’に向けて、内因性重鎖遺伝子座の上流に約２０ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、約８．２ｋｂのヒトＶＨ１−６９プロモーター、改変３’ＲＳＳを有するヒトＶＨ１−６９遺伝子セグメント、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子（配列番号７７）を含む約１７７１１ｂｐのマウスゲノム配列を含有するマウスゲノム断片、２７のヒトＤＨおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するヒトゲノム断片、ならびにイントロンエンハンサーおよびＩｇＭ定常領域遺伝子を含む内因性重鎖遺伝子座の下流に約８ｋｂのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアームを含有する最終ターゲティングベクターを生産した（ヒトＶＨ１−６９／Ａ６ターゲティングベクター、配列番号７４；図３、下）。
【０４７６】
ヒトＶＨ１−２の限定されたＩｇＨ遺伝子座へのＡＤＡＭ６遺伝子のリエンジニアリング（図４）。
【０４７７】
すべてのヒトＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの上流にある単一のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメントを含有する限定された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ（配列番号７３）をコードするゲノム断片を含有するように、ＢＡＣ  ＤＮＡを使用して相同組換えによってリエンジニアリングする。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（上掲）によって、マウスおよびヒト配列を含有するＢＡＣ  ＤＮＡの改変を含む一連の工程（これにより、マウス重鎖定常領域およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子に隣接する限定されたヒト化重鎖遺伝子座を含有する最終ターゲティングベクターが得られた）において、これを達成した。
【０４７８】
ハイグロマイシンカセットが５’に隣接しスペクチノマイシンカセットが３’に隣接する単一のヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、６のヒトＪＨ遺伝子セグメント、マウス重鎖イントロンエンハンサー、およびマウスＩｇＭ定常領域を含有する改変ヒトＢＡＣクローン（実施例１において上記）を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードするゲノム断片を含有するように改変した。これは、本明細書ではオリゴ媒介等温アセンブリ（ｏｌｉｇｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）と称される改良等温ＤＮＡアセンブリ法によって達成されるが、この方法は、Ｇｉｂｓｏｎら、（２００９，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６（５）：３４３−３４５）に記載されている方法に基づくものである。この改良法は、ライゲーションされる断片間の配列同一性を必要としない。代わりに、２つの断片を結合する働きをするオリゴによって配列同一性が付与される。さらに、上記オリゴは、上記断片の一方の末端に配列同一性を与える鋳型として働く。延長された断片により、第二の断片とのハイブリダイゼーションが可能になる。具体的には、オリゴ媒介等温アセンブリを用いて、２０ｋｂの遠位マウスＩｇＨホモロジーアーム、マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子、Ｆｒｔ部位が隣接するネオマイシンカセット、およびマウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ断片でハイグロマイシンカセットを置換した。
【０４７９】
簡単に言うと、限定されたヒトＶＨ１−２重鎖遺伝子座を含有する改変ヒトＢＡＣクローン（図４、左上）をＡｓｉＳＩおよびＡｓｃＩで消化してハイグロマイシンカセットを除去し、マウスＡＤＡＭ６遺伝子を含有する改変マウスＢＡＣ（図４、右上）をＮｏｔＩおよびＡｓｃＩで消化して、５’マウスアームを含有する断片を除去し、ネオマイシンカセットに隣接するマウスＡＤＡＭ６遺伝子を放出させる。続いて、消化した２つのＢＡＣ断片を５’および３’結合（ｊｏｉｎｅｒ）オリゴヌクレオチドと共に混合し、アセンブリ反応混合物（Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５％ＰＥＧ８０００（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＮＡＤ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）中、５０℃で１時間インキュベートする。５’結合オリゴは、ヒトＶＨ１−２を含有する改変ヒトＢＡＣクローンのＡｓｉＳＩ部位の５’配列と３８ｂｐのオーバーラップを含有し、ＡＤＡＭ６遺伝子を含有する改変マウスＢＡＣクローンのＮｏｔＩ部位および隣接３’配列と３０ｂｐのオーバーラップを含有する。３’結合オリゴは、ＡＤＡＭ６遺伝子、ＡｓｃＩ部位を含有する改変マウスＢＡＣクローンのＡｓｃＩ部位の５’配列と２６ｂｐのオーバーラップを含有し、ヒトＶＨ１−２を含有する改変ヒトＢＡＣクローンのＡｓｃＩ部位の３’配列と３５ｂｐのオーバーラップを含有する。アセンブリ反応物を大腸菌にトランスフォームし、カナマイシンおよびスペクチノマイシン選択を用いて正しい生成物を選択する。最終ターゲティングベクターを作るために、スペクチノマイシンカセットをＰＩ−ＳｃｅＩ消化によって除去し、続いて再ライゲーションする。
【０４８０】
最終ターゲティングベクターは、５’から３’に向けて、２０ｋｂの遠位マウスＩｇＨホモロジーアーム、マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、約１８ｋｂのヒトゲノム断片、ヒトＶＨ１−２遺伝子セグメント、約４６．６ｋｂのヒトゲノム断片、不活性化ヒトＶＨ６−１遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、６のヒトＪＨ遺伝子セグメント、ならびにマウスＩｇＨイントロンエンハンサーおよびＩｇＭ定常領域を含有する８ｋｂの３’マウスホモロジーアームを含有する（配列番号７６）。
【０４８１】
各最終ターゲティングベクター（上記）を使用して、欠失した内因性遺伝子座を含有するマウスＥＳ細胞をエレクトロポレートして、限定されたヒト化重鎖遺伝子座内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む、異所に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：５’ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９（１）：４３−４８）によって同定した。
【０４８２】
上に記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスの操作方法（例えば、米国特許第７，６５９８，４４２号、同第７，５７６，２５９号および同第７，２９４，７５４号参照）により８細胞期マウス胚に導入した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む限られた数のヒト遺伝子セグメントおよび異所性マウスゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスを、上記限定されたヒト化重鎖遺伝子座およびヒト重鎖配列内のマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）の改良法を用いる遺伝子型解析によって同定した。
【０４８３】
子を遺伝子型解析し、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有する限定されたヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子発現および妊性を特徴づけるために選択する。
【図１】
2020110187.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020110187.tif 000012
【図８】
2020110187.tif 000013
【図９】
2020110187.tif 000014
【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月22日(2020.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスであって、
（ａ）単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒトゲノム配列であって、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されており、前記再構成されていないヒトゲノム配列の挿入は、内因性ＡＤＡＭ６タンパク質の機能を破壊し、前記内因性ＡＤＡＭ６機能の破壊は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する、ヒトゲノム配列と、
（ｂ）雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列であって、前記マウスが雄マウスである場合に前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質が発現され、それにより、前記雄マウスは妊性となる、核酸配列と
をその生殖細胞系ゲノムに有し、
前記マウスのＢ細胞は、抗原への曝露に対して抗体を発現し、各抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖と対になった２つの免疫グロブリン軽鎖を含み、各重鎖は、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントと同一である、またはその体細胞超変異バージョンであるＶＨ遺伝子セグメントを含むヒト重鎖可変領域配列から発現されるヒト重鎖可変ドメインを含む、マウス。
【請求項２】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項５】
１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項５に記載のマウス。
【請求項７】
１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項８】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項７に記載のマウス。
【請求項９】
雄マウスである、請求項１に記載のマウス。
【請求項１０】
請求項１に記載のマウスに由来する細胞または組織。
【請求項１１】
マウスＥＳ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において第一の改変を行う工程であって、前記第一の改変は、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子配列の挿入を含み、それにより、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントを含み、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されており、前記第一の改変は、内因性ＡＤＡＭ６タンパク質の機能を破壊し、前記内因性ＡＤＡＭ６機能の破壊は、雄マウスにおける妊性の低減に関連する、工程と、
（ｂ）マウスＥＳ細胞のゲノムへのマウスＡＤＡＭ６配列の挿入を含む、第二の改変を行う工程であって、前記マウスＡＤＡＭ６配列は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、前記機能的マウスＡＤＡＭ６タンパク質が、雄マウスにおいて発現され、それにより、前記雄マウスは妊性となる、工程と
を含む、方法。
【請求項１２】
前記第一の改変は、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における１つ以上の配列の、前記１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子配列による置換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の改変は、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一および第二の改変が同時に行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１６】
ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列を生成する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスを、目的の抗原で免疫する工程と、
（ｂ）前記マウスが前記目的の抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、
（ｃ）前記目的の抗原に結合する、前記マウス由来の抗体の重鎖可変ドメインをコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列を同定または単離する工程と
を含む、方法。
【請求項１７】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）の前記抗原で免疫する工程が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または前記抗原を発現する細胞で行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
抗原に対して特異的な抗体を生成する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスを、前記抗原で免疫する工程と、
（ｂ）前記マウスから、前記抗原に対して特異的な抗体を産生する少なくとも１つの細胞を単離する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の抗体を産生する前記少なくとも１つの細胞を培養する工程と、
（ｄ）前記抗体を得る工程と
を含む、方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）の培養工程が、工程（ｂ）で得られた前記少なくとも１つの細胞から生成された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞に対して行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）で得られた前記少なくとも１つの細胞が、工程（ａ）の前記マウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ａ）の前記抗原で免疫する工程が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せ、または前記抗原を発現する細胞によって行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
ヒト抗原結合タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のマウスを、目的の抗原で免疫する工程と、
（ｂ）前記マウスが前記抗原に対する免疫応答を開始するようにする工程と、
（ｃ）前記マウスから、前記目的の抗原に特異的に結合する抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードする重鎖可変領域の核酸配列を得る工程と
を含む、方法。
【請求項３７】
（ｄ）前記ヒト重鎖可変領域の核酸配列を、ヒト重鎖定常領域の核酸配列と連結する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ｅ）生体外の哺乳動物細胞株内で、前記ヒト重鎖可変領域の核酸配列および前記ヒト重鎖定常領域の核酸配列を含む抗体を発現させる工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記単一のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０−３、ＶＨ３−３０−５、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−４、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０−１、ＶＨ４−３０−２、ＶＨ４−３０−４、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−４−１、ＶＨ７−８１またはその多型変異体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記マウスの内因性ＶＨ遺伝子セグメントが、再構成できない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムにおける前記再構成されていないヒトゲノム配列が、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記マウスの前記生殖細胞系ゲノムが、１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントが、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ａ）の前記抗原で免疫する工程が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せ、または前記抗原を発現する細胞によって行われる、請求項３６に記載の方法。