(57)【要約】【課題】脳梗塞の発症確度を予測する方法を提供する。【解決手段】脳梗塞未発症の被検者由来のサンプルにおけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型の有無を検出する検出ステップと、前記検出ステップにおける前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型の有無と、前記被験者の性別情報と、に基づいて当該被験者の脳梗塞発症確率が高い否かを判定する判定ステップと、を含む、脳梗塞発症リスクを予測する方法。ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型からなる、脳梗塞発症リスクを性別情報を利用して予測するための遺伝子マーカー。ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子がコードするポリペプチドからなる、脳梗塞発症リスクを性別情報を利用して予測するためのバイオマーカー。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳梗塞未発症の被検者由来のサンプルにおけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型の有無を検出する検出ステップと、
前記検出ステップにおける前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型の有無と、前記被験者の性別情報と、に基づいて当該被験者の脳梗塞発症確率が高い否かを判定する判定ステップと、
を含む、脳梗塞発症リスクを予測する方法。
【請求項２】
前記検出ステップにおいて、前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型が検出された場合、前記判定ステップにおいて、前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型を有しない者に比べて、当該被験者は脳梗塞発症のリスクが高いと判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出ステップにおいて、前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型が検出された場合、前記判定ステップにおいて、当該被験者の性別が女性の場合には男性の場合に比べて、当該被験者は脳梗塞発症のリスクがより高いと判定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型からなる、脳梗塞発症リスクを性別情報を利用して予測するための遺伝子マーカー。
【請求項５】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子がコードするポリペプチドからなる、脳梗塞発症リスクを性別情報を利用して予測するためのバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞の発症リスクや発症時期の予測、及びそれらの研究分野に属し、特に、脳梗塞発症リスク予測方法、及び性別情報を利用した脳梗塞発症リスク予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、もやもや病の感受性遺伝子であるＲＮＦ２１３遺伝子多型（ｃ．１４５７６Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｒ４８５９Ｋ，ｒｓ１１２７３５４３１）は、モヤモヤ病のみならず、片側モヤモヤ病やアテローム性動脈硬化の頭蓋内主幹動脈狭窄（頭蓋内狭窄）とも有意に関連することが開示されており、一方、前記ＲＮＦ２１３遺伝子多型は、頚部頸動脈狭窄、脳動脈瘤、脳内出血とは有意な関連は認められなかったことが開示されている。
【０００３】
なお、非特許文献１におけるＲＮＦ２１３遺伝子多型についての（ｃ．１４５７６Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｒ４８５９Ｋ，ｒｓ１１２７３５４３１）という表記は、東北大学グループによる命名に基づいている。本明細書においては、京都大学グループによる命名に基づいて、同一のＲＮＦ２１３遺伝子多型をｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型（ｃ．１４４２９Ｇ＞Ａ，ｒｓ１１２７３５４３１）又は単にｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型と表記する。両者は、アミノ酸の数え方の違いによるものであり、同一の多型である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「RNF213ともやもや症候群（RNF213 and Moyamoya syndrome）」，宮脇哲，Niche Neuro-Angiology Conference 2016，http://nnac.umin.jp/nnac/NNAC_2016_files/%E5%AE%AE%E8%84%87%E5%85%88%E7%94%9F.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、脳梗塞の発症確度を予測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
脳梗塞は、アテローム血栓性脳梗塞（atherothrombotic brain infarction）、ラクナ梗塞（lacunar infarction）、及び、脳塞栓（embolism）の３種類に分類される。
【０００７】
本発明者らの検討により、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型とアテローム血栓性脳梗塞との間で有意に相関を有することがわかった。このことから、脳梗塞未発症の被検者由来のサンプルにおけるＲＮＦ２１３遺伝子多型の有無を検出することによって、当該被検者の脳梗塞の発症リスクや発症時期を予測する方法（あるいは補助的に予測する方法）が提供される。
【０００８】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  脳梗塞未発症の被検者由来のサンプルにおけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型の有無を検出する検出ステップと、
前記検出ステップにおける前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型の有無と、前記被験者の性別情報とに基づいて、当該被験者の脳梗塞発症確率が高いか否かを判定する判定ステップと、
を含む、脳梗塞未発症の被検者の脳梗塞発症リスクを予測する方法。
【０００９】
（２）  前記検出ステップにおいて、前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型が検出された場合、前記判定ステップにおいて、前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型を有しない者に比べて、当該被験者は脳梗塞発症のリスクが高いと判定する、上記（１）に記載の方法。
【００１０】
（３）  前記検出ステップにおいて、前記ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型が検出された場合、前記判定ステップにおいて、当該被験者の性別が女性の場合には男性の場合に比べて、当該被験者は脳梗塞発症のリスクがより高いと判定する、上記（１）又は（２）に記載の方法。
【００１１】
（４）  ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型からなる、脳梗塞発症リスクを性別情報を利用して予測するための遺伝子マーカー。
【００１２】
（５）  ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子がコードするポリペプチドからなる、脳梗塞発症リスクを性別情報を利用して予測するためのバイオマーカー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の知見により、脳梗塞未発症の被検者に対して、早期の段階から脳梗塞発症の予測や予防・対策を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１において、患者選択手順の流れ図を示す。
【図２】実施例１において、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の有無による脳卒中発症の平均年齢についての箱ひげ図である。
【図３】実施例１において、脳卒中サブタイプ間におけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型のキャリア頻度の性別特異的な差異の棒グラフである。左側の棒が男性であり、右側の棒が女性である。
【図４】実施例２において、患者選択手順の流れ図を示す。
【図５】ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率を示す円グラフであり、左が実施例２における全７０名の患者についての円グラフであり、右が既報告による一般集団についての円グラフである。
【図６】実施例２において、性別間でのＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率の違いを示す円グラフであり、左が男性（Ｎ＝４４）についての円グラフであり、右が女性（Ｎ−２６）についての円グラフである。
【図７】実施例２において、Ｍ１／Ａ１狭窄の有無によるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率の違いを示す円グラフであり、左が狭窄あり（Ｎ＝４８）についての円グラフであり、右が狭窄なし（Ｎ＝２２）についての円グラフである。
【図８】実施例２において、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型を有する代表症例（表６におけるＣａｓｅ６）の画像データである。（Ａ）はＭＲＩ拡散強調像であり、（Ｂ）はＭＲＡ画像であり、（Ｃ）は脳梗塞発症５年後のＭＲＡ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＲＮＦ２１３（Ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２１３）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００１２５６０７１．１）は、モヤモヤ病の疾患感受性遺伝子として近年に同定されたものであり、ヒト染色体領域１７ｑ２５．３に存在する。
【００１６】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列における７３０９７  Ｇ＞Ａの一塩基多型（ＳＮＰ；Single Nucleotide Polymorphism）である。ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋは、前記先行文献のようにモヤモヤ病感受性多型として知られている。
【００１７】
本発明者らの研究により、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型が、大動脈アテローム性動脈硬化症による虚血性脳卒中（すなわち、脳梗塞）のリスクを増加させることが判明した。本明細書中で、虚血性脳卒中とは、脳梗塞と同義である。
【００１８】
虚血性脳卒中は、近年の早期死の１つの原因であり、特にアジアにおける障害および早期死の主要な原因であるが、虚血性脳卒中と遺伝的相関は未知のままである。主に東アジアで確認される、脳血管疾患であるモヤモヤ病は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質２１３（ＲＮＦ２１３）という感受性遺伝子と関連しており、その調節不全はマウスの脳における脳灌流を損なう。本発明者らは、したがって、ＲＮＦ２１３は虚血性脳卒中においてより一般的な役割を果たすと仮説を立て、モヤモヤ病の最も一般的なリスクであるＲＮＦ２１３遺伝子のｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型と、虚血性脳卒中およびそのサブタイプとの関連を調べた。
【００１９】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子多型は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列における７３０９７  Ｇ＞Ａの一塩基多型（ＳＮＰ；Single Nucleotide Polymorphism）であり、脳梗塞発症リスクを予測するための、あるいは予測を補助するための遺伝子マーカーとなり得る。
【００２０】
配列番号２は、ミステリン遺伝子及びその周辺領域の遺伝子［ＦＬＪ３５２０、ＮＰＴＸ１、ＣＡＲＤ１４、及びＲａｐｔｏｒ（ＫＩＡＡ１３０３）］を含むヒト第１７番染色体ＤＮＡの部分ヌクレオチド配列であり、ＮＣＢＩに登録されているＣｏｎｔｉｇ  ＃ＮＴ０１０７８３．１５の第４３５６０００１〜４３７９５０００番目のヌクレオチドに相当する。
【００２１】
配列番号２で表されるヌクレオチド配列には、Ｇ又はＡである第７３０９７位のＳＮＰ（本明細書中７３０９７ Ｇ＞Ａと略記する）の他にも、
Ｔ又はＣである第４７６６位のＳＮＰ（４７６６ Ｔ＞Ｃ）、
Ｇ又はＡである第１２０７６４位のＳＮＰ（１２０７６４ Ｇ＞Ａ）、
Ｇ又はＡである第１５２９１７位のＳＮＰ（１５２９１７ Ｇ＞Ａ）、及び
Ｇ又はＡである第２３２１０２位のＳＮＰ（２３２１０２ Ｇ＞Ａ）も存在し得る。
【００２２】
なお、本明細書において、ＳＮＰの位置は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの位置を基準に記載する。例えば、「第７３０９７位のＳＮＰ」は、配列番号２で表されるヌクレオチド配列における第７３０９７位のヌクレオチドにおけるＳＮＰを意味する。「７３０９７ Ｇ＞Ａ」等と記載する場合、「＞」の記号の前にメジャーアレルの塩基（この場合Ｇ）を、後にマイナーアレルの塩基（この場合Ａ）を記載している。
【００２３】
また、本明細書においてヌクレオチド配列は、特にことわりのない限りＤＮＡの配列として記載するが、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に適宜読み替えるものとする。
【００２４】
本発明において、ポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるヌクレオチド配列の連続した部分配列又はその相補配列に加えて、任意の付加的配列を含んでいてもよい。
【００２５】
本発明において、ポリヌクレオチドは、好ましくは単離又は精製されている。
【００２６】
本発明の上記方法の検出工程では、被検者から採取された生体試料において、７３０９７ Ｇ＞ＡのＳＮＰを検出する。
【００２７】
ヒトの人種は、特に限定されないが、好ましくは東アジア人（イーストアジアン／モンゴロイド）である。
【００２８】
ここで、人種（ｒａｃｅ）は、ホモ・サピエンス種の中の、特定のサブグループとして区別可能な集団である。人種は、特有で、区別可能な、遺伝子の組合せを有し、その遺伝子の組合せによって作られる特徴（精神的、肉体的とも）によって同定される。同じ人種のメンバーは、共通の遺伝的祖先を共有し、その結果、類似の遺伝子組合せを共有するため、はっきり区別できる遺伝的特徴を共有している。
【００２９】
例えば、世界の主要な人類集団について、２３種類の遺伝子の情報に基づき、遺伝的近縁関係が調べられ、アフリカン（ネグロイド）、コーカソイド（白人）、オセアニアン（オーストラロイド）、イーストアジアン（モンゴロイド）及びネイティブアメリカンの５種に分類されている。
【００３０】
東アジア人とは、日本、朝鮮、中国、台湾及びモンゴルの人々のいずれかを起源に持つ人という意味である。東アジア人は、好ましくは、日本人、朝鮮人、又は中国人である。
【００３１】
当業者であれば、個人の身体的特徴、出身国、先祖の起源に関する情報等に基づいてその個人の人種を容易に特定することが可能である。
【００３２】
上記方法において用いられる生体由来試料としては、ゲノムＤＮＡを採取可能な任意の組織、細胞、体液等を使用することができるが、入手の容易性及び低侵襲性等の観点から、毛髪、爪、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清、唾液などが好ましく用いられる。
【００３３】
ＳＮＰの検出方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、シークエンス法、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法、ＲＮＡｓｅＡ切断法、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、primer extension法、インベーダー法などが使用できる。
【００３４】
また、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ遺伝子がコードするポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列における第４８１０番のアルギニンがリジンに置換されている）であり、脳梗塞発症リスクを予測するためのバイオマーカーとなり得る。
【００３５】
すなわち、上述のように、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０ＫのＳＮＰの変異は、ヒトミステリンの第４８１０番のアミノ酸置換（アルギニン→リジン）を伴うので、被験者から、ミステリンポリペプチドを単離し、その第４８１０番のアミノ酸を同定することによって、脳梗塞発症リスクを予測すること、あるいは予測するための補助が可能となる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
【００３７】
［実施例１：アテローム血栓性脳梗塞とＲＮＦ２１３ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型との関連］
脳卒中死亡率は過去数十年間で減少している1)が、脳卒中は世界的に見ても、早期死亡の第２の主要原因であり、身体障害の主要原因でもある2)。世界人口の３１％を占める東南アジアおよび東アジアでは、脳卒中が早期死亡の主要原因であり、脳卒中の発生率および罹患率は着実に増加している1,2)。疫学的研究は、脳卒中サブタイプの実質的な地理的差異および人種的差異を示唆している3,4)。心筋塞栓症は西欧諸国の虚血性脳卒中の一般的な病因学的サブタイプである5）。一方、頭蓋内動脈狭窄に起因する大動脈アテローム性動脈硬化症は、ほとんどのアジア諸国において主な病因である6)。環境リスク要因と遺伝的背景の違いが、アジアにおける大動脈アテローム性動脈硬化症の高い罹患率の主な理由であると考えられている。最近、大規模な多祖先ゲノムワイド関連メタアナリシスによって、脳卒中および脳卒中サブタイプに関連する３２遺伝子座が同定された7)。この研究では、約８００万の一塩基多型（ＳＮＰｓ）が検査された。しかし、この分析は、０．０１未満（＜０．０１）のマイナーアレル頻度（minor-allele frequency；ＭＡＦ）および虚血性脳卒中のアジア特異的な遺伝的決定因子が未知のままである、領域特異的な希少アレルを除外した。
【００３８】
１７ｑ２５．３上のリングフィンガータンパク質２１３遺伝子（ＲＮＦ２１３）は、モヤモヤ病の感受性遺伝子として同定されている8,9)。モヤモヤ病患者の８０％よりも多くについてＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型（ｃ．１４４２９Ｇ＞Ａ、ｒｓ１１２７３５４３１）が検出されたが、東アジアの健康被験者の対立遺伝子（アレル）キャリア頻度は約２％であった8,9)。ＲＮＦ２１３は、ＡＡＡ＋ＡＴＰａｓｅとＥ３リガーゼの両方として機能する５９１ｋＤａタンパク質12)をコードし、頭蓋内の閉塞性閉塞病変の発症および低下した脳血流への補償適応に関連している13,14)。最近、２つの個別のセンター研究が、頭蓋内内頸動脈狭窄または近位中大脳動脈狭窄を有する東アジア非モヤモヤ患者におけるＲＮＦ２１３   ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の高い頻度（２０〜２５％）を報告している10,15)。したがって、本発明者らは、この遺伝的変異がアジアにおける全体的な虚血性脳卒中と関連している可能性があると仮説を立てた。ここでは、国立循環器病研究センター(National Cerebral and Cardiovascular Center；ＮＣＶＣ)の研究に参加した急性虚血性脳卒中患者を分析し、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型と虚血性脳卒中およびそのサブタイプとの関連性を調べた。
【００３９】
（方法）
（研究デザインと参加者）
症例対照研究では、すべての患者の広範な臨床データおよび放射線データを含む国立循環器病研究センター(ＮＣＶＣ)の病院ベースの単一の集団（ＮＣＶＣバイオバンク）を使用した。書面による同意がすべての試験参加者から得られ、この研究は国立循環器病研究センター（ＮＣＶＣ）の倫理委員会によって承認された。
【００４０】
（研究）
本研究の参加者は、大阪、関西地区の脳卒中および心血管疾患専門の６００床の第三次センターである国立循環器病研究センター（ＮＣＶＣ）で募集された。２０１２年６月から２０１７年５月に入院し、ＮＣＶＣで包括的同意書に署名した非心原性脳塞栓症（大動脈アテローム性動脈硬化症（large-artery atherosclerosis）、小血管閉塞症（small-vessel occlusion）など）の日本人患者３８３例を本研究に含めた。日本の厚生労働省のモヤモヤ病研究委員会の基準に基づき、心原性脳塞栓症cardioembolic stroke、確定的／おそらくモヤモヤ病と診断された患者は除外した17)。患者選択手順の流れ図は図１に詳述されている。
【００４１】
人口統計学的データ、アテローム硬化性危険因子、放射線学的所見、および病歴は、脳卒中患者の前向き研究で収集されたデータベース（prospectively-collected database）から得られた。脳卒中サブタイプは、急性脳卒中治療についてのＯｒｇ １０１７２基準［the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST) criteria］に従って分類された18)。脳血管病変は、磁気共鳴映像法（magnetic resonance imaging；MRI)およびＭＲ血管造影（MR angiography）、またはＣＴおよびＣＴ血管造影（CT angiography）によって同定された。前部循環狭窄（anterior circulation stenosis）は、Warfarin-Aspirin Symptomatic Intracranial Disease（ＷＡＳＩＤ）の研究基準19)に従い、頭蓋内内頸動脈（intracranial internal carotid artery）、中大脳動脈（middle cerebral artery）または前大脳動脈（anterior cerebral artery）で５０％を超える（＞５０％）の直径減少と定義された。同様に、後部循環狭窄（posterior circulation stenosis）は、頭蓋内、脊柱後、または後大脳動脈における上記の基準に従って定義された。
【００４２】
対照被験者は、２００７年から２０１５年の間に日本の関西地区で募集された。潜在的コントロール１，０２７人のうち、脳梗塞またはモヤモヤ病の病歴を有する１６人の被験者を除外した。最終的に１，０１１人のコントロール被験者が選択された。静脈血液サンプルを入院時に収集し、分析まで−８０℃で保存した。以前に記載されている8)ように、TaqMan SNP Assays（Applied Biosystems、Foster City、CA）および7300/7500 Real-Time PCR System（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いてｐ．Ｒ４８１０Ｋの遺伝子型決定を行った。
【００４３】
ＳＮＰジェノタイピングは、Illumina HumanOmniExpress BeadChipとHumanExome BeadChipとの組み合わせ分析、またはIllumina Human OmniExpressExome BeadChip分析を用いて、理化学研究所生命医科学研究センター（RIKEN Center for Integrative Medical Sciences）で実施した。ハプロタイプフェージング（Haplotype phasing）および遺伝子型帰属（genotype imputation）は、成功率およびHardy-Weinberg平衡試験を含む品質管理基準に合格した遺伝子型データを有するろ過サンプルを用いて実施した。帰属された対立遺伝子の投与量を用いてゲノムワイド関連解析［genome-wide association study (ＧＷＡＳ)］を実施し、加法的遺伝モデルを有するロジスティック回帰モデルに適合させた。本発明者らは、共変量として、１０の主成分、年齢、性別を取り入れた。詳細は先に記載されている7)。
【００４４】
（統計分析Statistical analysis）
連続変数は平均±ＳＤとして表し、スチューデントのｔ検定（Student’s t-test）を用いて比較した。カテゴリー変数は、数値とパーセンテージとして表現され、カイ２乗検定（chi-square test）と両側検定のフィッシャー正確検定（two-tailed Fisher’s exact test）を適宜用いて比較した。本発明者らは、ＲＮＦ２１３多型と虚血性脳卒中のリスクとの間の関連性を、ホモ接合体の数が不十分であるために本研究で優性モデルと仮定して試験した。本発明者らはまた、帰属法（imputation methods）を用いた検証研究（replication studies）と比較するために、メタアナリシスのためのロジスティック加法モデル（log-additive model）の下での関連性を調べた。複数のロジスティック回帰モデル（logistic regression model）を用いて、潜在的な交絡因子を同時に制御した後、各脳卒中サブタイプについてオッズ比（ＯＲ  Ｒａｔｉｏ）および９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を計算した。モデルで考慮された変数は、年齢（連続）、性別、高血圧、脂質異常血症、糖尿病および喫煙であった。全ての分析は、JMP Pro 12.2ソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary、NC）を用いて行った。
【００４５】
確率値は両側であり、ｐ＜０．０５は有意であると考えられた。 メタアナリシスは、ｐ＜５ｘ１０-8がゲノム全体で有意であると考えられる逆分散固定効果モデル（inverse variance fixed effects model）を用いて、Review Manager（RevMan）5.3ソフトウェア（The Nordic Cochrane Center、Denmark、Copenhagen）で行った。
【００４６】
（結果）
本研究では、特に非心原性脳塞栓症脳卒中患者が登録された。上記包括的基準を満たした１，７７５人の非心原性脳塞栓症脳卒中患者のうち３８３人（２１．６％）がＮＣＶＣバイオバンクに参加することに合意し、本研究で分析した。ＮＣＶＣバイオバンクの参加者と非参加者の両方の患者の特徴は表１に示されている。また、本研究参加者のベースライン特性を表１に示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型は、非心原性脳塞栓症脳卒中患者の５．２％および健常対照者の２．１％に見出された（粗ＯＲ ２．６０,９５％ＣＩ １．３９−４．８５、ｐ＝０．００１９）。年齢、性別、およびアテローム性動脈硬化症の危険因子を調整した後、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型と非心原性脳塞栓症脳卒中（non-cardioembolic）との関連は有意なままであった（調整されたＯＲ ３．９０, ９５％ＣＩ １．６２−９．２４、ｐ＝０．００２６）。対照被験者と比較して、大動脈アテローム性動脈硬化症（large-artery atherosclerosis）は、多型と有意に関連していた（粗ＯＲ ５．１９, ９５％ＣＩ ２．５３−１０．６４、ｐ＝２．６ｘ１０-6、調整されたＯＲ １１．４５, ９５％ＣＩ ３．４６−３６．１７、ｐ＝０．０００１）（表２）。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の有無による脳卒中患者間の比較において、脳卒中発症の平均年齢は非キャリアよりもＲＮＦ２１３多型で１１歳低かった（５８．１±１５．５歳  対  ６９．１±１３．２歳、ｐ＝０．０００３）（図２）。図２は、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の有無による脳卒中発症の平均年齢についての箱ひげ図である。
【００５１】
脳卒中患者において、ＲＮＦ２１３多型キャリアは、非キャリアよりも、女性（５５．０％  対  ２７．３％、ｐ＝０．０１１）をより多く含み、頭蓋内前部循環狭窄（６０．０％  対  ２７．３％、ｐ＝０．００４）および大動脈アテローム性動脈硬化症（６５．０％  対  ３２．５％、ｐ＝０．０１２）のより高い頻度（frequency）を示した。頭蓋外内頸動脈（extracranial internal carotid artery）や後部循環狭窄（posterior circulation stenosis）の発生、及び、高血圧、糖尿病、脂質異常血症および喫煙発生率などの従来のアテローム性動脈硬化性危険因子は、多型キャリアと非キャリアの間で異ならなかった。以上の結果を表３にまとめて示す。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
さらに、各脳卒中サブタイプにおける性別により階層化されたＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型のキャリア頻度についての詳細を表４に示す。また、図３に、脳卒中サブタイプ間におけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型のキャリア頻度の性別特異的な差異を棒グラフに示す。左側の棒が男性であり、右側の棒が女性である。
【００５４】
【表４】
2020092660.tif 000006
【００５５】
表４に示すように、男性と女性いずれにおいても、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型は、全非心原性脳塞栓症脳卒中（all non-cardioembolic）と、アテローム性動脈硬化症（atherothrombotic）とそれぞれに有意に関連しており、より好ましくは、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型を有する女性と、全非心原性脳塞栓症脳卒中（調整されたＯＲ ９．８, ９５％ＣＩ ３．１−３０．９、ｐ＜０．００１）、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型とアテローム性動脈硬化症（atherothrombotic）（調整されたＯＲ ５８．０, ９５％ＣＩ １０．３−３２７．３、ｐ＜０．００１）との間にそれぞれ有意な相関が見られた。
【００５６】
以上のように、本研究により、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型のキャリアは、脳卒中発症の平均年齢は１１歳低かったことが明らかとなり、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型のキャリア頻度は、急性非心原性脳塞栓症脳卒中（acute non-cardioembolic stroke）患者において、特にアテローム血栓性脳梗塞（atherothrombotic brain infarction）の女性患者において、非常に高いことが明らかとなった。
【００５７】
結論として、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型は、非心原性脳塞栓症脳卒中（non-cardioembolic stroke）の遺伝的リスク因子であり、性別情報と組み合わせることでアテローム血栓性脳梗塞（atherothrombotic brain infarction）のより好ましい遺伝的リスク因子とできる。
【００５８】
［実施例２：頭蓋内動脈狭窄を伴う若年発症脳卒中とＲＮＦ２１３ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型との関連］
ＲＮＦ２１３はもやもや病の感受性遺伝子として同定され、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型は日本人のもやもや病患者の９０％以上が保有する。ＲＮＦ２１３は、血管内皮機能の調整や血管新生に重要な役割を演じていると考えられているが、もやもや病のような特異的な血管障害を引き起こす機序については十分に解明されていない。一方、最近、日本を含むアジアの健常成人でも２−３％にこの遺伝子多型が認められ、もやもや病と診断されていない頭蓋内動脈狭窄患者では２０−２５％が同様にこの遺伝子多型を保有することが報告されている。もやもや病以外の脳血管障害においてもこの遺伝子多型がリスク因子となり得ることが示唆されている。
【００５９】
本研究では６０歳未満の若年性脳梗塞患者におけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率を調査し、この遺伝子多型と若年性脳梗塞との関連を明らかにすることを目的とした。ここで、本明細書における「若年性脳梗塞」との用語のうち、「若年性」とは、一般的に年齢満60歳までの（６０歳の誕生日前）を意味する。
【００６０】
（研究デザインと対象者）
本研究は国立循環器病研究センター(ＮＣＶＣ)のバイオバンク登録患者を対象とした単一施設横断研究である。頭蓋内動脈狭窄（Intracranial Arterial Stenosis）を有し２０歳以上６０歳未満の非心原性脳梗塞（non-cardioembolic stroke）もしくは一過性脳虚血発作（ＴＩＡ：transient ischemic attacks）を発症した登録患者７０名を全て対象とした。心原性脳塞栓症（cardioembolic stroke）およびもやもや病（moyamoya disease）と診断された症例は除外した。書面による同意がすべての対象者から得られ、この研究は国立循環器病研究センター（ＮＣＶＣ）の倫理委員会によって承認された。
【００６１】
（選択基準）
対象者の選択基準は以下のとおりであった。
[1] 国立循環器病研究センター(ＮＣＶＣ)のバイオバンク事業に同意した患者。
[2] ２０歳以上６０歳未満で虚血性脳卒中もしくは一過性脳虚血発作を発症した患者。
[3] 以下の頭蓋内動脈の少なくとも１ヶ所に５０％（直径）以上の狭窄もしくは閉塞を有する患者。
【００６２】
頭蓋内内頚動脈（ＩＣＡ；intracranial internal carotid artery）、
中大脳動脈（middle cerebral artery）Ｍ１−２  ｓｅｇｍｅｎｔ、
前大脳動脈（anterior cerebral artery）Ａ１−２  ｓｅｇｍｅｎｔ、
後大脳動脈（posterior circulation stenosis）Ｐ１−２  ｓｅｇｍｅｎｔ、
脳底動脈。
【００６３】
（除外基準）
心原性脳塞栓症の患者、
もやもや病の患者。
【００６４】
患者選択手順の流れ図は図４に詳述されている。
【００６５】
（方法）
脳梗塞病サブタイプは、急性脳卒中治療についてのＯｒｇ １０１７２基準［the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST) criteria］に従って分類された。
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の有無と、動脈硬化危険因子、もやもや病の家族歴、及び頭蓋内狭窄の特徴を比較した。
静脈血液サンプルをＤＮＡサンプルとして用いて、ＤＮＡサンプルを匿名化した上で京都大学大学院環境衛生学分野にて、TaqMan SNP Assays（Applied Biosystems、Foster City、CA）および7300/7500 Real-Time PCR System（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用いてｐ．Ｒ４８１０Ｋの遺伝子型決定を行った。
【００６６】
（統計分析Statistical analysis）
連続変数は平均±ＳＤとして表し、スチューデントのｔ検定（Student’s t-test）を用いて比較した。カテゴリー変数は、数値とパーセンテージとして表現され、カイ２乗検定（chi-square test）と両側検定のフィッシャー正確検定（two-tailed Fisher’s exact test）を用いて比較した。各脳卒中サブタイプについてオッズ比（ＯＲ  Ｒａｔｉｏ）および９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を計算した。モデルで考慮された変数は、年齢（連続）、性別、高血圧、脂質異常血症、２型糖尿病、及び喫煙習慣であった。全ての分析は、JMP version 11.2.0 ソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary、NC）を用いて行った。確率値は両側であり、ｐ＜０．０５は有意であると考えられた。
【００６７】
（結果）
全７０名の患者背景とＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型との関連を表５に示す。表５において、カテゴリ変数は、患者数（％）で示す。ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型キャリア患者１７名の特徴を表６に示す。
【００６８】
【表５】
2020092660.tif 000007
【００６９】
【表６】
2020092660.tif 000008
【００７０】
表６における表記は以下を意味している。
Bil; bilateral
Rt; right
Lt; left
UE; undetermined etiology
LAA; large artery atherosclerosis
【００７１】
図５は、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率を示す円グラフであり、左が本研究の全７０名の患者についての円グラフであり、右が既報告による一般集団についての円グラフである。
【００７２】
図６は、本研究における性別間でのＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率の違いを示す円グラフであり、左が男性（Ｎ＝４４）についての円グラフであり、右が女性（Ｎ−２６）についての円グラフである。
【００７３】
図７は、本研究におけるＭ１／Ａ１狭窄の有無によるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率の違いを示す円グラフであり、左が狭窄あり（Ｎ＝４８）についての円グラフであり、右が狭窄なし（Ｎ＝２２）についての円グラフである。
【００７４】
図８は、本研究におけるＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型を有する代表症例（表６におけるＣａｓｅ６）の画像データである。（Ａ）は、ＭＲＩ拡散強調像であり、左中大脳動脈領域に散在する高信号域が認められる。（Ｂ）は、ＭＲＡ画像であり、左Ｍ１ｓｅｇｍｅｎｔに中等度狭窄が認められる。（Ｃ）は、脳梗塞発症５年後のＭＲＡ画像であり、左Ｍ１ｓｅｇｍｅｎｔの狭窄進行が認められる。
【００７５】
ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型は１７名（２４％）の患者で認められ，女性に多かった(女性３８％ vs 男性１６％，ＯＲ ３．３，９５％ＣＩ １．１−１０．２，ｐ＝０．０４５)。中大脳動脈近位部（Ｍ１）もしくは前大脳動脈近位部（Ａ１）に狭窄を有する患者のうち３５％にこの遺伝子多型が見られた（ＯＲ ２５．０，９５％ＣＩ １．４−４３７．８，ｐ＜０．０１）。Ｍ１／Ａ１狭窄を複数有する患者では５６％がこの多型を保有していた（ＯＲ ５．１，９５％ＣＩ １．２−２１．９，ｐ＝０．０３３）。
【００７６】
（考察）
本研究は、前方循環系の脳動脈狭窄、特にＭ１もしくはＡ１狭窄を有する患者においてＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型の保有率が高いことを示した。高齢者と比較して血管リスクが少ない若年患者において高いｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型保有率を認め、ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型が脳梗塞発症と関連する可能性がある。また、頭蓋内前方・後方循環、遠位部の狭窄まで対象とした本研究において、Ｍ１／Ａ１狭窄を有する患者に多く本遺伝子多型を認め、本遺伝子多型と、頭蓋内狭窄部位との関連が明らかとなった。
【００７７】
（結論）
上記のことから、ＲＮＦ２１３  ｐ．Ｒ４８１０Ｋ多型は、前方循環系の脳動脈狭窄、特にＭ１もしくはＡ１狭窄を伴う若年発症非心原性脳梗塞患者と相関を有することがわかる。
【００７８】
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【図１】
2020092660.tif 000009
【図２】
2020092660.tif 000010
【図３】
2020092660.tif 000011
【図４】
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【図５】
2020092660.tif 000013
【図６】
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【図７】
2020092660.tif 000015
【図８】
2020092660.tif 000016
【配列表】
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