(57)【要約】【課題】親水性極性コアと低極性シェルとを有するナノ粒子のようなコポリマーを有する水溶性種を沈殿させるための「逆」沈殿経路を提供すること。【解決手段】これらのナノ粒子が凝集してより大きい微粒子およびモノリスを形成することにより、活性物質の持続かつ制御放出のための高ロード構築物（例えば、デポー）が提供される。本発明はまた、逆ナノ粒子の凝集体を含む微粒子であって、各逆ナノ粒子が、コポリマーの高極性領域を含むコアと、コポリマーの低極性領域を含むシェルとを含み、水溶性物質が前記コア内にある微粒子を提供し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性物質をカプセル化するための方法であって、
前記水溶性物質を第１の極性プロセス溶媒に溶解して水溶性物質溶液を形成すること、
コポリマーを第２の極性プロセス溶媒に溶解してコポリマー溶液を形成すること、
少なくとも１つのクラウダーを前記第１の極性プロセス溶液、前記第２の極性プロセス溶液および／または非プロセス溶媒に溶解すること、
前記水溶性物質溶液および前記コポリマー溶液と前記非プロセス溶媒とを連続的かつ迅速に混合して混合溶液を形成し、前記混合溶液から逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成すること、ならびに
前記逆ナノ粒子を凝集させ、微粒子またはより大きい構築物を形成して、前記水溶性物質をカプセル化すること
によって、前記逆ナノ粒子分散液を作製することを含み、
前記コポリマーが、少なくとも１つの高極性領域と、少なくとも１つの低極性領域とを含み、
前記非プロセス溶媒が、前記第１の極性プロセス溶媒よりも低極性であり、
前記非プロセス溶媒が、前記第２の極性プロセス溶媒よりも低極性であり、
前記逆ナノ粒子が、コアとシェルとを含み、
前記コアが、前記コポリマーの前記高極性領域と前記水溶性物質を含み、
前記シェルが前記コポリマーの前記低極性領域を含み、
前記クラウダーが、グリセロール、糖、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ポリアクリレート、シリコーンポリマー、ポリ（グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポロキサマー、プロピレングリコールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、および
前記混合が、前記混合溶液からの、前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒の２０容量％以下の相分離を引き起こす、方法。
【請求項２】
前記コポリマーが、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり、
前記コポリマーが形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し、
ブロックＡ、ＢおよびＣがそれぞれ、他のブロックと化学的に別個である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶性物質が、生物学的材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、サッカライド、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシン、エオシンＹ、タートラジン、金属キレート、ガドリニウムキレートおよびガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記コポリマーが、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、マルチブロックコポリマーおよび櫛形分岐コポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コポリマーの前記少なくとも１つの高極性領域が、少なくとも１つのアニオン性高極性領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアニオン性高極性領域が、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）または組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コポリマーの前記少なくとも１つの高極性領域が、少なくとも１つのカチオン性高極性領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのカチオン性高極性領域が、キトサン、ヒスタジン脂質、ヒスタミン、スペルマジン、ポリエチレンイミン、リジン、アルギニン、ヒスタジンアミノ酸または組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コポリマーの前記少なくとも１つの低極性領域が、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルまたは組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コポリマーの前記少なくとも１つの低極性領域が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、その塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体および組み合わせからなる部分から選択される少なくとも１つのグラフト化部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（乳酸）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（カプロラクトン）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（プロピレンスルフィド）ポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、水、アルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、グリコールエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）および組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、メタノール、ＤＭＳＯ、水および組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記非プロセス溶媒が、ハロアルカン、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトンおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記非プロセス溶媒が、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および組み合わせからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の極性プロセス溶媒が前記第２の極性プロセス溶媒と異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が混和性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、使用される前記第２の極性プロセス溶媒の容量に対する前記第１の極性プロセス溶媒の容量の比において完全に混和性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が混和性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が、使用される前記非プロセス溶媒の容量に対する前記第１の極性プロセス溶媒の容量の比において完全に混和性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が混和性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が、使用される前記非プロセス溶媒の容量に対する前記第２の極性プロセス溶媒の容量の比において完全に混和性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記非プロセス溶媒と連続的に混合するために第１の流れとして前記水溶性物質溶液を導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記非プロセス溶媒と連続的に混合するために第２の流れとして前記コポリマー溶液を導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の極性プロセス溶媒が前記第２の極性プロセス溶媒と同じである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記水溶性物質および前記コポリマーの両方を単一極性プロセス溶媒に溶解して単一溶液を形成し、前記単一溶液と前記非プロセス溶媒とを単一の流れとして連続的に混合し、前記逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成する前記混合溶液を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記コポリマー溶液と前記非プロセス溶媒との混合時間が、前記ナノ粒子の集合時間未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記水溶性物質および前記コポリマーが、前記混合溶液中で１０〜１０，０００の範囲の過飽和レベルを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
前記逆ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３３】
前記コポリマーの架橋によって前記逆ナノ粒子を安定化することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記コポリマーの前記高極性領域を架橋して、前記逆ナノ粒子の前記コアを安定化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記コポリマーの前記低極性領域を架橋して、前記逆ナノ粒子の前記シェルを安定化する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記逆ナノ粒子の集合の間に前記コポリマーを架橋する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記逆ナノ粒子の集合後に前記コポリマーを架橋する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記架橋が共有結合性架橋である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記架橋がジスルフィド結合形成である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記架橋が、非共有結合性、イオン性、キレート化、酸−塩基および／または水素結合架橋である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミンおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩および酢酸カルシウムからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が酢酸クロム（ＩＩＩ）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記水溶性物質がトブラマイシンを含み、前記トブラマイシンが前記コポリマーを架橋する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
前記架橋剤が、ポリクエン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、多価アニオンおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
前記逆ナノ粒子分散液が非極性溶媒相にあり、
極性外部相で前記非極性溶媒相を乳化し、前記非極性溶媒を除去して前記ナノ粒子を凝集させ、微粒子を形成することによって、前記逆ナノ粒子を凝集させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記非極性溶媒相に可溶性の化合物、脂質および／またはポリマーを、前記微粒子の形成を支援する接着分子として前記非極性相に組み込む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（チロシン）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物、脂質および／またはポリマーが親油性領域を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸の塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体および組み合わせからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
生体適合性物質で前記微粒子をコーティングする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記生体適合性物質を、前記乳化において使用した前記極性外部相に導入する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記生体適合性物質が、部分的に加水分解されたポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）のブロックコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（ブチレンオキシド）のブロックコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンスルフィド）のブロックコポリマー、脂質および組み合わせからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記生体適合性物質が、脂質ならびにポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクタム、ポリエステルおよび／またはポリラクチド−ｃｏ−グリコリドを含むブロックまたはグラフトコポリマーからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記生体適合性物質がポリ（プロピレンスルフィド）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記乳化の間に前記生体適合性物質を前記非極性溶媒相に添加し、凝集の間にそれが前記微粒子の表面に移動する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記逆ナノ粒子分散液を霧化すること、および固体、本質的には乾燥微粒子を形成するために噴霧乾燥工程の間に前記逆ナノ粒子分散液を乾燥させることによって、前記逆ナノ粒子を凝集させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
前記非極性溶媒相に可溶性の化合物、脂質および／またはポリマーを前記非極性相に組み込む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（チロシン）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物、脂質および／またはポリマーが親油性領域を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸の塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体および組み合わせからなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
噴霧乾燥前に前記逆ナノ粒子分散液に導入された生体適合性物質で前記凝集微粒子をコーティングする、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記生体適合性物質が、脂質、ならびにポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクタム、ポリ（プロピレンスルフィド）、ポリエステルおよび／またはポリラクチド−ｃｏ−グリコリドを含むブロックまたはグラフトコポリマーからなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記水溶性物質が、約１００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つのクラウダーが、グリセロール、エリスリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、アクリレート、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー；ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール；塩、緩衝液および組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
前記コポリマーが、約１，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する疎水性ブロックを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６７】
前記ナノ粒子が、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％の水溶性物質のローディングを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６８】
前記微粒子が、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％の水溶性物質のローディングを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６９】
逆ナノ粒子の凝集体を含む微粒子であって、
各逆ナノ粒子が、コポリマーの高極性領域を含むコアと、前記コポリマーの低極性領域を含むシェルとを含み、
水溶性物質が前記コア内にあり、
クラウダーが前記コア内にあり、
前記コポリマーが、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり、
前記コポリマーが形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し、
ブロックＡ、ＢおよびＣがそれぞれ、他のブロックと化学的に別個であり、
前記クラウダーが、グリセロール、糖、ポリサッカライド、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ポリアクリレート、シリコーンポリマー、ポリ（グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポロキサマー、プロピレングリコールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、微粒子。
【請求項７０】
前記逆ナノ粒子間のマトリックスに接着分子をさらに含む、請求項６９に記載の微粒子。
【請求項７１】
前記接着分子が、疎水性化合物、脂質および／または疎水性ポリマーからなる群より選択される、請求項７０に記載の微粒子。
【請求項７２】
前記接着分子が、前記コポリマーの低極性領域と化学的に同じである、請求項７０に記載の微粒子。
【請求項７３】
前記接着分子が、アニオン官能性またはカチオン官能性を有する両親媒性ポリマーである、請求項７０に記載の微粒子。
【請求項７４】
前記接着分子がポリエチレンオキシドを含まない、請求項７０に記載の微粒子。
【請求項７５】
前記コポリマーがブロックコポリマーであり、前記コポリマーの低極性領域が、１０００超、２０００、４０００、５０００、７５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００または１００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項６９に記載の微粒子。
【請求項７６】
前記シェルを含む前記コポリマーの前記低極性領域によって、前記微粒子からの前記水溶性物質の拡散速度を制御する、請求項６９に記載の微粒子。
【請求項７７】
ブロックＡが前記第２の極性プロセス溶媒に可溶性であり、前記非プロセス溶媒に可溶性であり、
ブロックＢが水に不溶性であり、前記非プロセス溶媒に可溶性であり、
ブロックＣが前記非プロセス溶媒に不溶性であり、および
前記水溶性物質溶液、コポリマー溶液および非プロセス溶媒の混合により、ブロックＣが沈殿する、請求項２に記載の方法。
【請求項７８】
ブロックＡがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、
ブロックＢが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリエステルからなる群より選択され、ならびに
ブロックＣが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記コアがブロックＣを含み、ならびに
前記シェルがブロックＡおよびブロックＢを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み、
ブロックＣが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択され、ならびに
前記架橋剤が金属カチオンである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記金属カチオンが、アルカリ土類、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、遷移金属、鉄および鉄（ＩＩＩ）からなる群より選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み、
ブロックＣがポリ（グルタミン酸）であり、および
前記架橋剤が鉄（ＩＩＩ）である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記逆ナノ粒子分散液を改質溶媒と組み合わせることをさらに含み、
ブロックＡが前記改質溶媒に可溶性であり、
ブロックＢが前記改質溶媒に不溶性であり、
前記改質溶媒との組み合わせ後に、前記逆ナノ粒子の前記コアがブロックＢおよびブロックＣを含み、前記逆ナノ粒子の前記シェルがブロックＡを含み、
前記逆ナノ粒子分散液を改質溶媒と組み合わせることが、前記水溶性物質溶液および前記コポリマー溶液と前記非プロセス溶媒とを連続的に混合して混合溶液を形成し、前記混合溶液から逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成することの後に生じる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
ブロックＡがポリ（エチレングリコール）ＰＥＧであり、
ブロックＢがポリ（乳酸）（ＰＬＡ）であり、および
前記改質溶媒が水である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記コポリマーがジブロックコポリマーであり、および
前記水溶性物質がポリサッカライドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８６】
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）であり、および
前記架橋剤がテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水を含み、
前記非プロセス溶媒がクロロホルムであり、ならびに
前記架橋剤を前記非プロセス溶媒に溶解する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記水溶性物質が、マルトデキストリン、デキストランおよび組み合わせからなる群より選択されるポリサッカライドを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の極性プロセス溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含み、および
前記第２の極性プロセス溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項９２】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記架橋剤が金属カチオンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項９３】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記架橋剤が鉄（ＩＩＩ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項９４】
前記コポリマーがポリ（グルタミン酸）−ｂ−ポリ（乳酸）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９５】
前記ナノ粒子を両親媒性ポリマーでコーティングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９６】
前記両親媒性ポリマーが、ポリスチレン−ブロック−ｐｏｌｙ（エチレンオキシド）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＯ）、ポリ（乳酸）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＯ）、ポリ（カプロラクトン）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯ）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＯ）からなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、疎水性コアを有する凝集したナノ粒子を含むマイクロ粒子を作製するプロセスに関する。本出願は、２０１５年１２月２２日に出願された米国仮出願番号第６２／３８７，０７５号の利益を主張しており、その明細書は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質およびペプチド治療薬は、医薬品市場における成長セグメントである。２００１年から２０１２年までの１１年間で、医薬生物製剤治療薬（生物製剤）の世界的規模の販売額は、３６０億ドルから１６３０億ドルへと３倍超になった。同じ期間において、上位１０個の市販の医薬品のうち、生物製剤によってもたらされた収入は、７％から７１％に増加した（（Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｇ
Ｐｈａｒｍａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ  Ｈａｖｅ  Ｇｒｏｗｎ  Ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ，Ｔｕｆｔｓ  ＣＳＤＤ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｒｅｐｏｒｔ．１５（２０１３）１）。それらの特異性は、それらを、癌およびＡＩＤＳを含む様々な疾患の処置のための理想的な治療薬にする。この特異性は、治療薬として使用するための生物製剤の強さである構造的複雑性と、それらを製剤化および送達しようとする挑戦との結果として生じたものである（Ｓ．Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｋｅ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１３（２０１４）６５５−６７２）。
【０００３】
ヒト化抗体は長期間循環し得るが、タンパク質およびペプチドは、腎クリアランスまたは酵素的分解によりわずか数分で血流から取り除かれ得る（Ａ．Ｋ．Ｓａｔｏ，Ｍ．Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｒ．Ｂ．Ｋｅｎｔ，Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｄ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２００６）６３８−６４２）。したがって、送達および延長放出は、ナノ粒子（ＮＰ）または微粒子（ＭＰ）への生物製剤のカプセル化を必要とし得る。ＮＰは、４００ｎｍ未満のサイズを有するもの（これは、それらを注射用製剤として有望なものにする）と定義され得、ＭＰは、それらがデポー送達に適切なものであるような１〜１０ミクロンを超えるサイズを有するものと定義され得る。ＮＰおよびＭＰの要件は、高ローディング、高いカプセル化効率、および生物製剤治療薬の適切な放出プロファイルである。これらの粒子は、通常、非経口で送達される。最近、生物製剤の経口送達において有望な進歩があったが、粘液層を通っておよびＧＩ（胃腸）管上皮層を越えてＮＰを移動させることの困難性のために、これは、非経口投与よりも開発されていない。しかしながら、ＮＰ製剤の原理は、経口または非経口ＮＰに等しく適用される。担体の例としては、水溶性ポリマーから構成されるヒドロゲル担体および疎水性または固体マトリックスから構成される非膨潤性担体が挙げられる。
用語「生物製剤」は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド抗生物質、タンパク質、および抗体を含む幅広い治療薬を包含し得る。例えば、ペプチドは、１〜４０のアミノ酸の配列を含み得る。この文書内における広い使用では、用語「生物製剤」はまた、本発明においても使用され得る色素および低分子サッカライドを含む任意の水溶性分子を指すために使用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｇ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ  Ｈａｖｅ  Ｇｒｏｗｎ  Ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ，Ｔｕｆｔｓ  ＣＳＤＤ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｒｅｐｏｒｔ．１５（２０１３）１）
【非特許文献２】Ｓ．Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｒｋｅ，Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１３（２０１４）６５５−６７２
【非特許文献３】Ａ．Ｋ．Ｓａｔｏ，Ｍ．Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｒ．Ｂ．Ｋｅｎｔ，Ｃ．Ｒ．Ｗｏｏｄ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２００６）６３８−６４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
制御された急速沈殿を使用して水溶性分子をカプセル化するための本発明の方法が提示される。ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、非生物治療薬、ポリサッカライドベースの治療薬（例えば、トブラマイシン）およびイメージング剤を含む水溶性分子は、コポリマー安定化剤によって保護されたナノ粒子に沈殿する。これらの粒子は、共有結合または非共有結合により安定化され得る。こうして作製された粒子は、第１の非極性溶媒相においてコロイドにより安定である。続いて、粒子は、微粒子と称されるナノ粒子の凝集体を作るような方法でプロセシングされ得る。微粒子は、１ミクロン〜１ｍｍまたは２ｍｍの重量平均サイズを有し得る。凝集プロセスは、元の安定な分散液を噴霧乾燥させて凝集を引き起こすことを含み得る。あるいは、凝集プロセスは、極性溶媒への乳化工程を含み得、続いて、非極性溶媒を除去して微粒子を凝固させることを含み得る。微粒子相互作用を最小化するために、乳化工程中に、分散剤が製剤に添加され得る。
【０００６】
この微粒子プロセスの発明は、微粒子を作製するための現在のプロセスの限界を克服する。これらのプロセスは、一般に、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳化プロセスに基づくものである。これらの方法では、本明細書に記載される可溶性物質の沈殿ではなく、前記物質は、非混和性外部非極性油相中で乳化した極性溶媒に可溶化される。次いで、この第１のエマルジョンは第２の極性水性相に分散され、非極性溶媒が除去される。エマルジョン工程における制御の欠如および内部可溶性液滴が流体であるという事実は、達成可能なローディングおよび微粒子への制御放出速度を制限し、一般に、ローディングは固体の１０ｗｔ％未満である。これらのプロセスおよびそれらの限界は、総説（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２１９（２０１５）５１９−５３５）（これは、その全体が組み込まれる）において考察されている。第２に、以前のｗ／ｏ／ｗプロセスは、放出を制御するために微粒子のマトリックス（これは、一般に、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸ポリマーである）に依拠していた。これらのコーティングの均一性の欠如はやはり、高い物質ローディングにおける放出制御を損なう。対照的に、本発明の各ナノ粒子をカプセル化する両親媒性コポリマーコーティング（例えば、シェルを形成する両親媒性コポリマーの（例えば、疎水性）部分）は、マトリックスではなく放出を主に制御し得る。それにより、各ナノ粒子からの放出速度のより正確な制御が可能になり、マトリックスまたは微量のマトリックス材料を添加せずに微粒子形成が可能になり、以前のｗ／ｏ／ｗ製剤で達成されたよりも高い物質ローディングが達成され得る。加えて、本発明における最初のナノ粒子形成工程は、微粒子全体への生物製剤の微細分散を可能にするが、これは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンプロセスでは達成困難であり、持続制御放出に重要であることが示されている。最大２５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６６ｗｔ％、７５ｗｔ％〜８０ｗｔ％のローディングは、制御放出プロファイルによって達成され得る。高ローディングと、バースト放出の欠如と、１ミクロン〜１ｍｍまたは２ｍｍの構成物からの微粒子の制御放出との組み合わせは、以前には不可能であった。
【０００７】
乾燥活性物質から微粒子を作製して２エマルジョン工程を回避する以前の試みは、論文（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２１９（２０１５）５１９−５３５）において概説されている。乾燥剤粉末をナノ粒子サイズまで減らすことはできないので、これらのアプローチは失敗する。したがって、微粒子を作製するためにこれらの粉末を用いたエマルジョン工程では、活性物質を高ローディングする製剤化を試みると、粒子接触は、パーコレーションおよび制御放出の欠如を引き起こす。
【０００８】
本発明では、最初に、生物製剤は、両親媒性ポリマーによって非極性有機溶媒中で立体的に安定化されたナノ粒子に製剤化される。ナノ粒子は、生物製剤と安定化ポリマーの親水性領域とを含有する親水性コアと、安定化ポリマーの疎水性領域から構成される疎水性シェルとから構成される。これらのナノ粒子は、両親媒性ポリマーでコーティングされ得るか、または微粒子もしくはより大きいモノリスにプロセシングされ得る。最終構築物の後プロセシングが行われ得る。これらのナノ粒子は、親水性コアと疎水性シェルとを有するので、それらは、「逆ナノ粒子」と称され得る（しかしながら、これらのナノ粒子は、単に「ナノ粒子」と称され得ることもある）。
【０００９】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法は、水溶性物質およびコポリマーを極性プロセス溶媒に溶解して、第１のプロセス溶液を形成することを含む。あるいは、水溶性物質を第１の極性プロセス溶媒に溶解して水溶性物質溶液を形成し得、コポリマーを第２の極性プロセス溶媒に溶解してコポリマー溶液を形成し得る。すなわち、本発明の方法は、水溶性物質を極性プロセス溶媒流に溶解し、コポリマーを別個の極性溶媒流に溶解することを含む。第１の極性プロセス溶媒および第２の極性プロセス溶媒は同じものであり得るか、または異なるものであり得る。第１のプロセス溶液（または水溶性物質溶液およびコポリマー溶液）を非プロセス溶媒と連続的に混合して、ナノ粒子（「逆ナノ粒子」）が集合および沈殿する混合溶液を形成し得る。上記のように、複数の極性プロセス溶液を非プロセス溶媒と連続的に混合し得る。コポリマーは、少なくとも１つの高極性領域と、少なくとも１つの低極性領域とを含み得る。非プロセス溶媒は、極性プロセス溶媒よりも低極性であるか、または低極性であり得る。ナノ粒子は、コアとシェルとを含み得る。コアは、コポリマーの高極性領域と、水溶性物質とを含み得る。シェルは、コポリマーの低極性領域を含み得る。混合は、極性プロセス溶媒の２０容量％以下の相分離を引き起こし得る。
【００１０】
本発明の方法では、水溶性物質は、生物製剤材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、サッカライド、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシンＹ、タートラジン、金属キレート、ガドリニウムキレート、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）または組み合わせであり得る。
【００１１】
例えば、コポリマーは、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、マルチブロックコポリマーまたは櫛形分岐コポリマーであり得る。例えば、コポリマーは、少なくとも１つの高極性の領域（より高い極性の領域）を含み得る。コポリマーの少なくとも１つの高極性領域は、少なくとも１つのアニオン性高極性領域を含み得る。例えば、このアニオン性高極性領域は、アニオン性残基（ユニットまたはモノマー）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）または組み合わせを含み得る。
【００１２】
例えば、コポリマーの少なくとも１つの高極性領域は、少なくとも１つのカチオン性高極性領域を含み得る。例えば、このカチオン性高極性領域は、キトサンポリマードメイン、ヒスタジン脂質、ヒスタミン、スペルマジン、ポリエチレンイミンまたは組み合わせなどのカチオン性残基を含み得る。
【００１３】
例えば、コポリマーは、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（プロピレンスルフィド）、ポリ無水物、脂質もしくはリン脂質グラフト化単位もしくはコレステロールグラフト化単位または組み合わせを含む少なくとも１つの低極性領域（より低い極性の領域）を含み得る。例えば、コポリマーは、ポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）であり得る。
【００１４】
本発明の方法では、極性プロセス溶媒は、水、アルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、グリコールエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）または組み合わせであり得る。グリコールエーテルとしては、エチレングリコールモノメチルエーテル（２−メトキシエタノール、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、エチレングリコールモノエチルエーテル（２−エトキシエタノール、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、エチレングリコールモノプロピルエーテル（２−プロポキシエタノール、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、エチレングリコールモノイソプロピルエーテル（２−イソプロポキシエタノール、（ＣＨ３）２ＣＨＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、エチレングリコールモノブチルエーテル（２−ブトキシエタノール、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、エチレングリコールモノフェニルエーテル（２−フェノキシエタノール、Ｃ６Ｈ５ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、エチレングリコールモノベンジルエーテル（２−ベンジルオキシエタノール、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、ジエチレングリコールモノメチルエーテル（２−（２−メトキシエトキシ）エタノール、メチルカルビトール、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、ＤＥＧモノブチルエーテル（２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、ブチルカルビトール、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、カルビトールセロソルブ、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）およびジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテル（２−（２−ブトキシエトキシ）エタノール、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法では、１つを超える使用される極性プロセス溶媒が存在し得る。
【００１６】
本発明の方法では、非プロセス溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトンまたは組み合わせであり得る。例えば、非プロセス溶媒は、クロロホルム、アセトンまたは組み合わせであり得る。例えば、極性プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、混和性であり得る。好ましい実施形態では、プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用される容量比で完全に混和性である。あるいは、別の実施形態では、プロセス溶媒は、非プロセス溶媒に実質的に可溶性であり、実質的に可溶性は、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用される容量比で、非プロセス溶媒中で混和性のプロセス溶媒の８０容量％を有することと定義される。
【００１７】
本発明の方法では、プロセス溶液と非プロセス溶媒との混合時間は、ナノ粒子の集合時間未満である。例えば、水溶性物質およびコポリマーは、溶液中で１０〜１０，０００の範囲の過飽和レベルを有し得る。例えば、ナノ粒子は、約４０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲のサイズを有し得る。例えば、ナノ粒子は、約４０ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲のサイズを有し得る。
【００１８】
本発明の方法は、コポリマーの架橋によってナノ粒子コアを安定化することを含む。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子の集合の間に架橋され得る。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子の集合後に架橋され得る。架橋は、共有結合性架橋であり得る。例えば、架橋は、ジスルフィド架橋であり得る。架橋は、米国特許出願第１３／９６９，４４９号Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｍａｙｅｒらに記載されているタイプの切断可能なエステル結合を含み得る。架橋は、非共有結合性架橋であり得る。例えば、架橋は、イオン性、キレート化、酸−塩基または水素結合架橋であり得る。
【００１９】
架橋剤を添加して、コポリマーを架橋し得る。例えば、架橋剤を添加して、アニオン官能性のコポリマーの部分を架橋し得る。例えば、架橋剤は、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミンまたは組み合わせであり得る。例えば、架橋剤は、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩、酢酸カルシウムまたは組み合わせであり得る。例えば、架橋剤は、酢酸クロム（ＩＩＩ）または別のクロム（ＩＩＩ）塩であり得る。例えば、水溶性物質はトブラマイシンを含み得、トブラマイシンはコポリマーを架橋し得る。他の生体適合性多カチオン性水溶性物質を架橋剤として使用して、例えばコポリマーのアニオン性セクションを架橋し得る。
【００２０】
極性物質がカチオン性官能基を含む場合、架橋は、ポリ−アニオン性成分の添加によって達成され得る。これらの例は、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、クエン酸、ポリクエン酸、アニオン性オリゴヌクレオチド、および多価アニオンである。
【００２１】
本発明の方法は、ナノ粒子を採取すること、およびそれらを微粒子または他のより大きい固体構築物に凝集させることを含む。本発明の方法では、微粒子および他のより大きい構築物は、凝集ナノ粒子のみからなる。本発明の方法では、微粒子および他のより大きい構築物は、ナノ粒子と、さらなる疎水性材料、例えば「接着分子」として作用する疎水性ポリマーとからなる。含まれ得る他の疎水性ポリマーの例としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリカプロラクトンが挙げられる。
【００２２】
本発明の方法では、微粒子は、エマルジョンプロセスを使用して作製される。例えば、ナノ粒子を、所望によりさらなる疎水性ポリマーと一緒に有機溶媒（例えば、非極性溶媒相）に懸濁し、次いで、懸濁液（逆ナノ粒子分散液）を水性連続相（例えば、極性外部相）中で乳化し得る。逆ナノ粒子分散液は、極性外部相中で非混和性または実質的に非混和性であり得る。極性外部相は、形成されるエマルジョン滴の合体を防止するために安定化ポリマーを含み得る。非極性溶媒相を除去してナノ粒子を凝集させ、微粒子を形成し得る。この例では、有機溶媒（非極性溶媒相）を除去すると、凝集ナノ粒子から構成される硬化微粒子が生成され得る。
【００２３】
本発明の方法では、微粒子は、噴霧乾燥工程を使用して作製される。例えば噴霧乾燥によって逆ナノ粒子分散液を空気（または別の気体）に霧化し、霧化逆ナノ粒子分散液を乾燥させて、本質的に乾燥性の固体であり得る微粒子を形成し得る。
【００２４】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、コポリマーは、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり得る。例えば、コポリマーは形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し得、ブロックＡ、ＢおよびＣはそれぞれ、他のブロックと化学的に別個であり得る。
【００２５】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、コポリマーは、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり得る。コポリマーは、形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し得る。例えば、ブロックＡは、第２の極性プロセス溶媒に可溶性であり得、非プロセス溶媒に可溶性であり得る。例えば、ブロックＢは、水に不溶性であり得、非プロセス溶媒に可溶性であり得る。例えば、ブロックＣは、非プロセス溶媒に不溶性であり得る。水溶性物質溶液、コポリマー溶液および非プロセス溶媒の混合により、ブロックＣは沈殿し得る。ブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり得、ブロックＢは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリエステルからなる群より選択され得、ブロックＣは、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択され得る。一実施形態では、コアは、ブロックＣを含み得、シェルは、ブロックＡおよびブロックＢを含み得る。
【００２６】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、前記方法は、架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み得る。ブロックＣは、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択され得る。架橋剤は、金属カチオンであり得る。金属カチオンは、アルカリ土類、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、遷移金属、鉄および鉄（ＩＩＩ）からなる群より選択され得る。
【００２７】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、前記方法は、架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み得る。例えば、ブロックＣは、ポリ（グルタミン酸）であり得、架橋剤は、鉄（ＩＩＩ）であり得る。
【００２８】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、前記方法は、逆ナノ粒子分散液を改質溶媒と組み合わせることを含み得る。ブロックＡは、改質溶媒に可溶性であり得、ブロックＢは、改質溶媒に不溶性であり得る。改質溶媒と組み合わせた後、逆ナノ粒子のコアは、ブロックＢおよびブロックＣを含み得、逆ナノ粒子のシェルは、ブロックＡを含み得る。一実施形態では、ブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）ＰＥＧであり得、ブロックＢは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）であり得、改質溶媒は、水であり得る。
【００２９】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、コポリマーは、ジブロックコポリマーであり得、水溶性物質は、ポリサッカライドを含み得る。
【００３０】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、コポリマーは、ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）であり得る。
【００３１】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、前記方法は、架橋剤を添加してコポリマーを架橋することをさらに含み得る。
【００３２】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、前記方法は、架橋剤を添加してコポリマーを架橋することをさらに含み得る。コポリマーは、ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）であり得、架橋剤は、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）であり得る。
【００３３】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、第１の極性プロセス溶媒および第２の極性プロセス溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水を含み得る。非プロセス溶媒は、クロロホルムであり得、架橋剤は、非プロセス溶媒に溶解され得る。水溶性物質は、マルトデキストリン、デキストランおよび組み合わせからなる群より選択されるポリサッカライドを含み得る。
【００３４】
水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、コポリマーは、ポリ（グルタミン酸）−ｂ−ポリ（乳酸）であり得る。水溶性物質をカプセル化するための本発明の方法では、コポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）−ｂ−ポリ（乳酸）であり得る。第１の極性プロセス溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含み得、第２の極性プロセス溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含み得る。架橋剤を添加してコポリマーを架橋し得る。架橋剤は、金属カチオンであり得る。例えば、架橋剤は、鉄（ＩＩＩ）であり得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
水溶性物質をカプセル化するための方法であって、
前記水溶性物質を第１の極性プロセス溶媒に溶解して水溶性物質溶液を形成することによって、逆ナノ粒子分散液を作製すること、
コポリマーを第２の極性プロセス溶媒に溶解してコポリマー溶液を形成すること、
前記水溶性物質溶液および前記コポリマー溶液と非プロセス溶媒とを連続的に混合し、逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成する混合溶液を形成すること、ならびに
前記逆ナノ粒子を凝集させ、微粒子またはより大きい構築物を形成して、前記水溶性物質をカプセル化すること
を含み、
前記コポリマーが、少なくとも１つの高極性領域と、少なくとも１つの低極性領域とを含み、
前記非プロセス溶媒が、前記第１の極性プロセス溶媒よりも低極性であり、
前記非プロセス溶媒が、前記第２の極性プロセス溶媒よりも低極性であり、
前記逆ナノ粒子が、コアとシェルとを含み、
前記コアが、前記コポリマーの前記高極性領域と前記水溶性物質を含み、
前記シェルが前記コポリマーの前記低極性領域を含み、および
前記混合が、前記混合溶液からの、前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒の２０容量％以下の相分離を引き起こす、方法。
（項目２）
前記水溶性物質が、生物学的材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、サッカライド、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシン、エオシンＹ、タートラジン、金属キレート、ガドリニウムキレートおよびガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記コポリマーが、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、マルチブロックコポリマーおよび櫛形分岐コポリマーからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記コポリマーの前記少なくとも１つの高極性領域が、少なくとも１つのアニオン性高極性領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つのアニオン性高極性領域が、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）または組み合わせを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記コポリマーの前記少なくとも１つの高極性領域が、少なくとも１つのカチオン性高極性領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１つのカチオン性高極性領域が、キトサン、ヒスタジン脂質、ヒスタミン、スペルマジン、ポリエチレンイミン、リジン、アルギニン、ヒスタジンアミノ酸または組み合わせを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記コポリマーの前記少なくとも１つの低極性領域が、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルまたは組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記コポリマーの前記少なくとも１つの低極性領域が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、その塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体または組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（乳酸）である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（カプロラクトン）である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（プロピレンスルフィド）ポリマーである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、水、アルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、グリコールエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）および組み合わせからなる群より独立して選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、メタノール、ＤＭＳＯ、水および組み合わせからなる群より独立して選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記非プロセス溶媒が、ハロアルカン、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトンおよび組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。（項目１７）
前記非プロセス溶媒が、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の極性プロセス溶媒が前記第２の極性プロセス溶媒と異なる、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が混和性である、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、使用される前記第２の極性プロセス溶媒の容量に対する前記第１の極性プロセス溶媒の容量の比において完全に混和性である、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が混和性である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が、使用される前記非プロセス溶媒の容量に対する前記第１の極性プロセス溶媒の容量の比において完全に混和性である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記第２の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が混和性である、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記第２の極性プロセス溶媒および前記非プロセス溶媒が、使用される前記非プロセス溶媒の容量に対する前記第２の極性プロセス溶媒の容量の比において完全に混和性である、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記非プロセス溶媒と連続的に混合するために第１の流れとして前記水溶性物質溶液を導入する、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記非プロセス溶媒と連続的に混合するために第２の流れとして前記コポリマー溶液を導入する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の極性プロセス溶媒が前記第２の極性プロセス溶媒と同じである、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記水溶性物質および前記コポリマーの両方を単一極性プロセス溶媒に溶解して単一溶液を形成し、前記単一溶液と前記非プロセス溶媒とを単一の流れとして連続的に混合し、前記逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成する前記混合溶液を形成する、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記コポリマー溶液と前記非プロセス溶媒との混合時間が、前記ナノ粒子の集合時間未満である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記水溶性物質および前記コポリマーが、前記混合溶液中で１０〜１０，０００の範囲の過飽和レベルを有する、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記逆ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲のサイズを有する、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記コポリマーの架橋によって前記逆ナノ粒子を安定化することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記コポリマーの前記高極性領域を架橋して、前記逆ナノ粒子の前記コアを安定化する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記コポリマーの前記低極性領域を架橋して、前記逆ナノ粒子の前記シェルを安定化する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記逆ナノ粒子の集合の間に前記コポリマーを架橋する、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記逆ナノ粒子の集合後に前記コポリマーを架橋する、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記架橋が共有結合性架橋である、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
前記架橋がジスルフィド結合形成である、項目３２に記載の方法。
（項目３９）
前記架橋が、非共有結合性、イオン性、キレート化、酸−塩基および／または水素結合架橋である、項目３２に記載の方法。
（項目４０）
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミンおよび組み合わせからなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
（項目４１）
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩および酢酸カルシウムからなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
（項目４２）
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が酢酸クロム（ＩＩＩ）である、項目３２に記載の方法。
（項目４３）
前記水溶性物質がトブラマイシンを含み、前記トブラマイシンが前記コポリマーを架橋する、項目３２に記載の方法。
（項目４４）
前記架橋剤が、ポリクエン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、多価アニオンおよび組み合わせからなる群より選択される、項目３２に記載の方法。（項目４５）
前記逆ナノ粒子分散液が非極性溶媒相にあり、
極性外部相で前記非極性溶媒相を乳化し、前記非極性溶媒を除去して前記ナノ粒子を凝集させ、微粒子を形成することによって、前記逆ナノ粒子を凝集させる、項目１に記載の方法。
（項目４６）
前記非極性溶媒相に可溶性の化合物、脂質および／またはポリマーを、前記微粒子の形成を支援する接着分子として前記非極性相に組み込む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記非極性溶媒相に可溶性の前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（チロシン）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルおよび組み合わせからなる群より選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物、脂質および／またはポリマーが親油性領域を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸の塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体および組み合わせからなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
生体適合性物質で前記微粒子をコーティングする、項目４５に記載の方法。
（項目５１）
前記生体適合性物質を、前記乳化において使用した前記極性外部相に導入する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記生体適合性物質が、部分的に加水分解されたポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）のブロックコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（ブチレンオキシド）のブロックコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンスルフィド）のブロックコポリマー、脂質および組み合わせからなる群より選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記生体適合性物質が、脂質ならびにポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクタム、ポリエステルおよび／またはポリラクチド−ｃｏ−グリコリドを含むブロックまたはグラフトコポリマーからなる群より選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
前記生体適合性物質がポリ（プロピレンスルフィド）である、項目５０に記載の方法。（項目５５）
前記乳化の間に前記生体適合性物質を前記非極性溶媒相に添加し、凝集の間にそれが前記微粒子の表面に移動する、項目５０に記載の方法。
（項目５６）
前記逆ナノ粒子分散液を霧化すること、および固体、本質的には乾燥微粒子を形成するために噴霧乾燥工程の間に前記逆ナノ粒子分散液を乾燥させることによって、前記逆ナノ粒子を凝集させる、項目１に記載の方法。
（項目５７）
前記非極性溶媒相に可溶性の化合物、脂質および／またはポリマーを前記非極性相に組み込む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記非極性溶媒相に可溶性の前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（チロシン）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルおよび組み合わせからなる群より選択される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物、脂質および／またはポリマーが親油性領域を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物が、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸の塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体および組み合わせからなる群より選択される、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
噴霧乾燥前に前記逆ナノ粒子分散液に導入された生体適合性物質で前記凝集微粒子をコーティングする、項目５６に記載の方法。
（項目６２）
前記生体適合性物質が、脂質、ならびにポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクタム、ポリ（プロピレンスルフィド）、ポリエステルおよび／またはポリラクチド−ｃｏ−グリコリドを含むブロックまたはグラフトコポリマーからなる群より選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記水溶性物質が、約１００〜約１，０００，０００Ｄａの分子量を有する、項目１に記載の方法。
（項目６４）
少なくとも１つのクラウダーを前記第１の極性プロセス溶液、前記第２の極性プロセス溶液および／または前記非プロセス溶媒に溶解することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６５）
前記少なくとも１つのクラウダーが、グリセロール、エリスリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、アクリレート、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー；エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ソルケタール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジグライム、乳酸エチル、から選択される有機共溶媒；塩、緩衝液および組み合わせからなる群より選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記コポリマーが、約１，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する疎水性ブロックを含む、項目１に記載の方法。
（項目６７）
前記ナノ粒子が、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％の水溶性物質のローディングを有する、項目１に記載の方法。
（項目６８）
前記微粒子が、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％の水溶性物質のローディングを有する、項目１に記載の方法。
（項目６９）
逆ナノ粒子の凝集体を含む微粒子であって、
各逆ナノ粒子が、コポリマーの高極性領域を含むコアと、前記コポリマーの低極性領域を含むシェルとを含み、
水溶性物質が前記コア内にある、微粒子。
（項目７０）
前記逆ナノ粒子間のマトリックスに接着分子をさらに含む、項目６９に記載の微粒子。（項目７１）
前記接着分子が、疎水性化合物、脂質および／または疎水性ポリマーからなる群より選択される、項目７０に記載の微粒子。
（項目７２）
前記接着分子が、前記コポリマーの低極性領域と化学的に同じである、項目７０に記載の微粒子。
（項目７３）
前記接着分子が、アニオン官能性またはカチオン官能性を有する両親媒性ポリマーである、項目７０に記載の微粒子。
（項目７４）
前記接着分子がポリエチレンオキシドを含まない、項目７０に記載の微粒子。
（項目７５）
前記コポリマーがブロックコポリマーであり、前記ポリマーの低極性領域が、１０００超、２０００、４０００、５０００、７５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００または１００，０００Ｄａの分子量を有する、項目６９に記載の微粒子。
（項目７６）
前記シェルを含む前記コポリマーの前記低極性領域によって、前記微粒子からの前記水溶性物質の拡散速度を制御する、項目６９に記載の微粒子。
（項目７７）
前記コポリマーが、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり、
前記コポリマーが形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し、
ブロックＡ、ＢおよびＣがそれぞれ、他のブロックと化学的に別個である、項目１に記載の方法。
（項目７８）
前記コポリマーが、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり、
前記コポリマーが形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し、
ブロックＡが前記第２の極性プロセス溶媒に可溶性であり、前記非プロセス溶媒に可溶性であり、
ブロックＢが水に不溶性であり、前記非プロセス溶媒に可溶性であり、
ブロックＣが前記非プロセス溶媒に不溶性であり、および
前記水溶性物質溶液、コポリマー溶液および非プロセス溶媒の混合により、ブロックＣが沈殿する、項目１に記載の方法。
（項目７９）
ブロックＡがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、
ブロックＢが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリエステルからなる群より選択され、ならびに
ブロックＣが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記コアがブロックＣを含み、ならびに
前記シェルがブロックＡおよびブロックＢを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み、
ブロックＣが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択され、ならびに
前記架橋剤が金属カチオンである、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記金属カチオンが、アルカリ土類、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、遷移金属、鉄および鉄（ＩＩＩ）からなる群より選択される、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み、
ブロックＣがポリ（グルタミン酸）であり、および
前記架橋剤が鉄（ＩＩＩ）である、項目７８に記載の方法。
（項目８４）
前記逆ナノ粒子分散液を改質溶媒と組み合わせることをさらに含み、
ブロックＡが前記改質溶媒に可溶性であり、
ブロックＢが前記改質溶媒に不溶性であり、
前記改質溶媒との組み合わせ後に、前記逆ナノ粒子の前記コアがブロックＢおよびブロックＣを含み、前記逆ナノ粒子の前記シェルがブロックＡを含む、項目７８に記載の方法。（項目８５）
ブロックＡがポリ（エチレングリコール）ＰＥＧであり、
ブロックＢがポリ（乳酸）（ＰＬＡ）であり、および
前記改質溶媒が水である、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記コポリマーがジブロックコポリマーであり、および
前記水溶性物質がポリサッカライドを含む、項目１に記載の方法。
（項目８７）
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）である、項目１に記載の方法。
（項目８８）
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）であり、および
前記架橋剤がテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）である、項目１に記載の方法。
（項目９０）
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水を含み、
前記非プロセス溶媒がクロロホルムであり、ならびに
前記架橋剤を前記非プロセス溶媒に溶解する、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記水溶性物質が、マルトデキストリン、デキストランおよび組み合わせからなる群より選択されるポリサッカライドを含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記第１の極性プロセス溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含み、および
前記第２の極性プロセス溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む、項目１１に記載の方法。
（項目９３）
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記架橋剤が金属カチオンである、項目１１に記載の方法。
（項目９４）
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記架橋剤が鉄（ＩＩＩ）である、項目１１に記載の方法。
（項目９５）
前記コポリマーがポリ（グルタミン酸）−ｂ−ポリ（乳酸）である、項目１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明のナノ粒子および微粒子の生成における工程を示す。「逆」ナノ粒子２０１は、水溶性物質１０１を含む親水性コア３０１と、低極性シェル３０２とを有するナノ粒子に集合するコポリマー１０２から形成され得る。コアを架橋して、架橋コアを有する「逆」ナノ粒子を形成し得る２０３。「逆」ナノ粒子を微粒子に凝集させ得る４０２。あるいは、例えば、「接着分子」として作用するさらなるポリマーを含み得るさらなる疎水性マトリックス４０１と一緒に、「逆」ナノ粒子を微粒子に凝集させ得る４０３。
【００３６】
【図２ＡＢ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、フラッシュナノ沈殿プロセスにおけるパラメータの変動が、形成されるナノ粒子の直径を制御し得る方法を示す。
【図２ＣＤ】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、フラッシュナノ沈殿プロセスにおけるパラメータの変動が、形成されるナノ粒子の直径を制御し得る方法を示す。
【００３７】
【図３ＡＢ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、様々な水溶性物質をカプセル化する一連の形成されたナノ粒子の粒径分布を示す。
【図３ＣＤ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、様々な水溶性物質をカプセル化する一連の形成されたナノ粒子の粒径分布を示す。
【００３８】
【図４】図４は、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）中の非コーティング粒子、メタノール（ＭｅＯＨ）中の非コーティング粒子、および水中のコーティング粒子の粒径分布を示す。
【００３９】
【図５】図５は、７５ｗｔ％ＮＰ（ナノ粒子）を含有するＰＬＧＡ  ＭＰ（微粒子）の蛍光画像を示す。ＥｔＴＰ５（２，２，１０，１０−テトラエチル−６，１４−ビス（トリイソプロピルシリルエチニル）−１，３，９，１１−テトラオキサ−ジシクロペンタ［ｂ，ｍ］ペンタセン（ＥｔＴＰ−５））（赤色）は、ＰＢＡおよびＰＬＧＡと共局在する疎水性色素である。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、ＮＰのＰＡＡコアに結合しており、ＮＰがＭＰ全体に分布していることを示す。上の行は、１０倍レンズで撮影した広視野である（スケールバー：１００μｍ）。下の行は、４０倍レンズで撮影した単一の８０μｍ粒子の拡大である（スケールバー：７．５μｍ）。
【００４０】
【図６】図６は、トリブロックコポリマーを有する逆ナノ粒子分散液の形成を示す。
【００４１】
【図７】図７は、異なる疎水性ブロックサイズ（５ｋ  ＰＳ、１５ｋ  ＰＳおよび５２ｋ  ＰＳ）を有する３ｋ  ＭＤ（３２７５ｇ／ｍｏｌマルトデキストリン）ロード（カプセル化）逆ナノ粒子の放出速度に対する疎水性ブロックサイズの影響を示すグラフである。
【００４２】
【図８】図８Ａは、異なる架橋度を有する１ｋ  ＭＤ−ＡＭＣ（１０００ｇ／ｍｏｌ  ７−アミノ−４−メチルクマリンとコンジュゲートされたマルトデキストリン）ロード（カプセル化）逆ナノ粒子の放出速度に対する架橋度の影響を示すグラフである；ポリ（スチレン）−ｂ−ポリ（アクリル酸）から逆ナノ粒子を形成した（ポリ（スチレン）（ＰＳ）ブロックは、５０００ｇ／ｍｏｌ分子量であり、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）ブロックは、４８００ｇ／ｍｏｌ分子量である）。図８Ｂは、異なる架橋度を有する２０ｋ  Ｄｅｘ−ＡＭＣ（２０，０００ｇ／ｍｏｌ  ７−アミノ−４−メチルクマリンとコンジュゲートされたデキストラン）ロード（カプセル化）逆ナノ粒子の放出速度に対する架橋度の影響を示すグラフである；ポリ（スチレン）−ｂ−ポリ（アクリル酸）から逆ナノ粒子を形成した（ポリ（スチレン）（ＰＳ）ブロックは、５０００ｇ／ｍｏｌ分子量であり、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）ブロックは、４８００ｇ／ｍｏｌ分子量である）。図８Ａおよび８Ｂでは、「Ｅｑ」は、ＰＡＡブロック上の酸性基に対するＴＥＰＡクロスリンカーの当量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な説明
本発明の実施形態を以下で詳細に説明する。実施形態の説明では、明確性のために、特定の専門用語が用いられる。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の専門用語に限定されることを意図しない。当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、他の等価物を用いて他の方法を開発し得ると認識し得る。本明細書で引用されている参考文献はすべて、それぞれが個々に組み込まれているかのように、その全体が参照により組み込まれる。例えば、公開された国際公開第２０１５／２０００５４号（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３６０６０号、Ｐａｇｅｌｓら）および国際公開第２０１５／１３０８３５号（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１７５９０号、Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅら）はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
ペプチド、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む可溶性治療薬および生物製剤のカプセル化および送達は難題である。生物製剤は、低い安定性、迅速なクリアランス時間、免疫認識および高コストを示し得る。制御された方法で可溶性治療薬を放出することができるナノ粒子、微粒子およびより大きいモノリスであって、分解、クリアランスおよび免疫認識からそれらを保護するナノ粒子、微粒子およびより大きいモノリスが望まれる。現在のところ、生物製剤は、一般に注射によって送達されるので、制御放出は薬物の投与頻度を減少させ、患者のコンプライアンスを増加させ得る。
【００４５】
米国特許第８，１３７，６９９号に記載されている迅速な沈殿プロセスによって、ナノ粒子を作製することが可能となっている。しかしながら、これら以前の例は、混合すると水相から沈殿する疎水性コア材料を伴うものであった。プロセスを完全に逆転させ、しかも水溶性化合物を疎水性溶液中に沈殿させ得ることは予想外であった。極性成分が粒子のコアの内部に配向され、疎水性低極性成分が低極性溶液相に配向されて、安定な粒子（すなわち、「逆」ナノ粒子）が生じるという反対の方法において、コポリマーを使用し得ることは予想外であった。
【００４６】
本明細書では、特に区別が文脈上示されていない限り、用語「ナノ粒子」、「粒子」および「ナノ担体」は、互換的に使用される。親水性または高極性コアを有する本発明の粒子は、疎水性または低極性コアを有する粒子と対比するために、「逆粒子」と称されることがある。しかしながら、簡潔性のために、本発明の親水性または高極性コアを有する粒子について議論されていることが文脈上示されている場合には、これらは、単に「粒子」または「ナノ粒子」と称され得る。
【００４７】
ナノ粒子は、動的光散乱によって１０ｎｍ〜８００ｎｍ、例えば１０ｎｍ〜８００ｎｍであると決定される流体力学的質量平均直径を有する粒子である。微粒子はナノ粒子の凝集体であり、１ミクロン〜１または２ｍｍの平均サイズを有し得る。これらのより大きいサイズは、Ｍｉｅ散乱によってまたは顕微鏡画像から決定されなければならない。
【００４８】
すべての溶媒は、ある程度互いに混和性である。初期ナノ粒子沈殿プロセスでは、混和性溶媒が使用される。本明細書で言及される「混和性」溶媒は、ナノ粒子形成プロセスまたは微粒子プロセスにおいて使用される比で混合されると、主要相に溶解されない副相（例えば、極性プロセス溶媒）の容量の２０％以下を有する溶液を生成するものである。本明細書で言及される完全混和性溶媒は、ナノ粒子形成プロセスまたは微粒子プロセスにおいて使用される比で混合されると、相分離を伴わない溶液を生成するものである。非混和性エマルジョンプロセスが微粒子形成において用いられる場合、微粒子形成プロセスでは、非混和性溶媒が使用される。本明細書で言及される「非混和性」溶媒は、微粒子形成プロセスにおいて使用される容量比で混合されると、主要相への可溶化により副相の容量の２０％未満の減少をもたらすものである。
【００４９】
生物製剤の長期放出のための注射用ポリマーデポーの開発は、生物製剤の安定性、カプセル化効率、ローディングおよび放出プロファイル、ならびに製造の容易性および拡張性を最適化する複雑な工学的課題である。すなわち、生物製剤のための送達系は、生物製剤を保護し、その放出を延長し、そのクリアランス時間を短縮し、その投与頻度を減少させ、目的の組織をターゲティングすべきである。ヒドロゲルベースの送達系における水性プロセシング条件および疎水性界面の欠如は、それらをタンパク質安定性の維持のために適切なものにする。しかしながら、これらの系からの拡散制御放出は、数カ月またはそれよりも長い期間にわたって生物製剤を放出することができる分解性注射用ゲルを生成することを困難にする。疎水性足場は、より長期の放出に適合するが、製剤化方法は、ほとんどの大型タンパク質にとって過度に過酷なものであり得る。ナノ担体を形成するための二重エマルジョン方法では、別のパラメータに悪影響を及ぼさずに、ローディングを増加させ、カプセル化効率を増加させ、タンパク質の安定性を増加させ、または放出プロファイルを最適化することは困難である。新たな製剤化方法を設計するために、これらの制約を理解することが重要である。例えば、多孔性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）をポストローディングする新たに調査されたアプローチは、バースト放出中の微粒子表面の細孔の閉鎖に関する基礎研究と、ＰＬＧＡ壁からのタンパク質脱着が放出速度の制御において重要な役割を果たすという以前の観察結果とを利用する。最終的には、タンパク質およびペプチド治療薬は、それぞれが特定の物理的特徴およびプロセシングの必要性を有する広範な分子をカバーする；単一ポリマーデポーは、あらゆる生物製剤の送達に適切である可能性は低い。
【００５０】
ポリマー系からの物質、例えばタンパク質およびペプチド治療薬または他の生物製剤の送達は、モノリスからの放出または微粒子もしくはナノ粒子からの放出によるものであり得る。モノリスは、埋め込み可能な浸食性デバイスを含む。微粒子およびナノ粒子は、全身送達され得るか、または局所デポーで送達され得る。
【００５１】
ポリマー系からの治療薬の放出は、２つの方法の１つで制御され得る。第１の方法では、治療薬を足場のポリマー材料とコンジュゲートする。治療薬は、それが足場から切断されると放出される。これは、最も一般的には、ヒドロゲルを用いて行われる。コンジュゲーションは新たな化学結合の形成を伴うので、系はより厳格なＦＤＡ承認に供され、一般に望ましくない。第２の方法では、不溶性だが浸食性のマトリックス内に可溶性治療薬をカプセル化する。浸食性マトリックスは疎水性であり、疎水性有機溶媒でプロセシングされなければならない。治療薬に対する化学改変が存在しないので、この方法は好ましいものであり得る。
【００５２】
可溶性材料は、（１）有機溶媒中で、材料を足場材料（例えば、ＰＬＧＡ）と直接混合すること、または（２）エマルジョンを形成することによって、化学改変を伴わずにカプセル化され得る。方法（１）では、親水性材料は、多くの場合、有機溶媒中で凝集する。溶媒が除去されるにつれて、低ローディングであっても、これらの凝集体は、浸透経路を生成して、カプセル化材料の望ましくないバースト放出をもたらす。放出プロファイルを改善するために、プロセス（２）を使用し得る。可溶性材料は、疎水性足場材料を含有する外側非混和性有機溶媒にカプセル化された水相に含まれる。小分子またはポリマー界面活性剤を使用することによって、浸透を防止してエマルジョンを安定化する。エマルジョンプロセスはバッチで完了するが、これは、大規模生成に最適ではない。加えて、乳化プロセスに関与する高剪断速度は、タンパク質を変性させ、ＤＮＡを切断し得る。
【００５３】
有機溶媒の存在下または高剪断条件下における生物製剤のプロセシングは、変性および不可逆的凝集をもたらし、治療活性および潜在的な免疫原性の喪失をもたらす。プロセシング中に変性を回避して生物製剤の安定性を改善するための多くのアプローチが開発されている。１つの技術（米国特許出願公開第２０１２２３０９１３号）は、高容量比（約０．３）の「外因性クラウダー」、例えばトレハロースの存在下、緩衝水性環境において高タンパク質濃度で集合するタンパク質の調整可能かつ可逆的なナノクラスタの形成である。等電点で緩衝されると、低静電反発力およびクラウダー駆動タンパク質間誘引力は、希釈により活性モノマーに戻る１００ｎｍほどのタンパク質のナノクラスタをもたらす。高密度タンパク質相はネイティブ構造を安定化し、アンフォールディングの抑制により治療活性を保持する（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．（２０１２）１３５７−１３６９）。制御ｐＨ条件下では、塩の添加によって他のタンパク質高密度相（ゲル）が形成され、保存安定性を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｌｅｎｈｏｆｆ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｎｓｅ
ｐｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．（２０１３）３５８２−３５９１）。このような高密度相は、タンパク質を含有するプロセス流の操作中の安定性を改善するために使用され得る。
【００５４】
フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）は、疎水性コアと親水性安定化シェルとを有するナノ粒子（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｋら、ＡＩＣｈＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００３）４９：２２６４−２２８２）を作製する以前に特許されているプロセス（米国特許第８，１３７，６９９号（本明細書では、「‘６９９特許」）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）である。このプロセスは、疎水性材料の高ローディングを可能にし、ミセルサイズの安定化材料から最大数百ナノメートルのサイズの範囲の粒子を再現可能に生成し得る。現在のところ、ＦＮＰの使用は、高いｌｏｇＰ値を有する（疎水性）コア材料のカプセル化に限定されている。フラッシュナノ沈殿技術は、高いカプセル化効率および７５ｗｔ％を超えるローディングで、生物製剤をカプセル化し得る。
【００５５】
本発明の方法では、ＦＮＰは、ワクチンまたは他の免疫調節組成物として機能し得るか、またはその有効性を増強し得るナノ粒子を作製するために使用される。例えば、これらのナノ粒子は、ワクチン、アジュバントおよび／または他の薬剤を含み得る（ワクチン、アジュバントおよび他の薬剤の例は、公開された国際公開第２０１４／１６５６７９号（Ｓｏｓｉｎら）ならびに公開された米国特許出願公開第２０１０／０２３３２５１号（ｖｏｎ  Ａｄｒｉａｎら）および米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０１号（Ｂｒａｔｚｌｅｒら）（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にある）。
【００５６】
本発明の方法では、得られる粒子が、それらのコア中の親水性材料と、有機溶媒可溶性（低親水性）シェルとを含有するように、ポリマー保護コアシェルナノ粒子は、急速沈殿によって作製される。親水性コアと低親水性シェルとを有するこれらのナノ粒子は、疎水性コアと親水性シェルとを有する‘６９９特許のナノ粒子と対比して、「逆」ナノ粒子と称され得る。
【００５７】
これらの「逆」粒子は、粒子を共有結合または非共有結合により安定化し、安定化材料の第２のコーティングを添加することによって（多層ＦＮＰ）、および／またはそれらをより大きいモノリスもしくは微粒子に組み込むことによってプロセシングされ得る。
ナノ粒子の形成
フラッシュナノ沈殿プロセス
【００５８】
フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）プロセスを使用して、親水性コアおよび／またはカプセル化水溶性物質、例えば親水性ペプチドを有する「逆」粒子を作製し得る。プロセスは、図１に示されている。コポリマー１０２を少なくとも０．１重量％の濃度で極性プロセス溶媒に溶解して第１のプロセス溶液を形成し得るが、好ましくは、コポリマーの濃度は、少なくとも０．２重量％である。一実施形態では、コポリマーを約０．１ｗｔ％、０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％または２０ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％または４０ｗｔ％の範囲内の濃度で極性プロセス溶媒に溶解し得る。当業者であれば、プロセスの経済性などの要因が濃度の下限を制約し得、プロセス溶液の粘度または極性プロセス溶媒中のコポリマーの溶解限度などの要因が、濃度の上限に制約し得ることを認識し得る。例えば、第１のプロセス溶液の粘度が非プロセス溶媒のものよりもかなり高い場合、第１のプロセス溶液と非プロセス溶媒との混合は阻害され得る。当業者であれば、コポリマーの分子量およびコポリマーの組成などの要因は、粘度が過度に高くなる前に、ポリマー溶液で達成され得る最大濃度に影響を与え得ることを認識し得る。
【００５９】
コポリマーの例としては、限定されないが、同じコポリマー内に異なる溶媒溶解度を有する領域を含有するブロックコポリマー、グラフトコポリマーおよびランダムコポリマーが挙げられる。例えば、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）−ブロック−ポリ（アクリル酸）（ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ）ジブロックコポリマーを使用し得る。プロセス溶媒の例としては、限定されないが、水、アルコール、アセトン、アセトニトリル、グリコールエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミドおよびそれらの混合物が挙げられる。プロセス溶媒は、溶媒中のコポリマーの溶解特徴に応じて、コポリマーの溶解を促進するために加熱もしく加圧され得るか、またはその両方が行われ得る。
【００６０】
コポリマーを含有するプロセス溶媒を低極性非プロセス溶媒と微小混合１０３すると、コポリマーの領域または部分の異なる溶解度特徴が顕在化し、コポリマーの高極性部分はもはや可溶性状態で存在し得ず、「逆」ナノ粒子２０１が沈殿する。
【００６１】
一実施形態では、さらなる水溶性標的分子１０１、例えば親水性ペプチドをプロセス溶媒中のコポリマー１０２に添加し得る。コポリマーを用いてナノ粒子２０１を作製する際、さらなる標的分子１０１をナノ粒子内に組み込む。非プロセス溶媒に難溶性のさらなる標的分子１０１をコーティングし、カプセル化し、または微粒子コアとして閉じ込め、コポリマー１０２の保護コロイドによって立体的に安定化する。ナノ粒子は、非プロセス溶媒中で小さい安定なサイズを維持する。
【００６２】
（図１に示されていない）別の実施形態では、標的材料およびコポリマーを別個のプロセス溶媒流に溶解する。コポリマーを溶解するために使用されるプロセス溶媒および標的材料を溶解するために使用されるプロセス溶媒は同じものである必要はないが、同じものでもよい。例えば、標的材料（水溶性物質）を第１の極性プロセス溶媒に溶解して水溶性物質溶液を形成し得、コポリマーを第２の極性プロセス溶媒に溶解してコポリマー溶液を形成し得る。これらの流れ、水溶性物質溶液およびコポリマー溶液を非プロセス溶媒と混合（例えば、同時に混合）して、混合溶液を形成する。第１の極性プロセス溶媒および第２の極性プロセス溶媒は混和性であり得るか、またはそれらは、それらが混合される容量比で完全に混和性であり得る（すなわち、別の相が形成されない）。第１の極性プロセス溶媒および非プロセス溶媒は混和性であり得るか、またはそれらは、それらが混合される容量比で完全に混和性であり得る（すなわち、別の相が形成されない）。第２の極性プロセス溶媒および非プロセス溶媒は混和性であり得るか、またはそれらは、それらが混合される容量比で完全に混和性であり得る（すなわち、別の相が形成されない）。したがって、得られる混合溶液は単相のものであり得るか、または１つを超える相のものであり得る。別の実施形態では、標的材料およびコポリマーを単一プロセス溶媒流に溶解する。次いで、この流れを非プロセス溶媒と迅速に混合する。
【００６３】
プロセス溶液と非プロセス溶媒との激しい微小混合１０３は、任意の数の形状寸法で行われ得る。本質的な概念は、高速入口流が、乱流と、中心腔で起こる混合とを引き起こすことである。プロセス溶媒／非プロセス溶媒の混合時間は、ナノ粒子の集合時間よりも迅速である。限定されないが、２つのこのような形状寸法は、以前に記載および分析されている：拘束衝突噴流ミキサー（ＣＩＪ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｋ．，Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，Ｒ．Ｋ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｍｉｘｉｎｇ  ｉｎ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ  ｊｅｔｓ．ＡＩＣｈＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００３，４９，２２６４−２２８２；Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｆｏｘ，Ｒ．Ｏ．ＣＦＤ
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔｓ  ｒｅａｃｔｏｒ．ＡＩＣｈＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００６，５２，７３１−７４４）およびマルチインレットボルテックスミキサー（ＭＩＶＭ）（Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ，Ｒ．Ｋ．，Ｆｏｘ，Ｒ．Ｏ．Ｍｉｘｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｉｎｌｅｔ  ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒ（ＭＩＶＭ）ｆｏｒ  ｆｌａｓｈ  ｎａｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８，６３，２８２９−２８４２）。これらの例は、限定的または包括的ではなく例示的なものであることを意味する。
【００６４】
このプロセスに関与する速い混合および高いエネルギー散逸は、粒子の核生成および成長のためのタイムスケールよりも短い混合タイムスケールを提供し、他の技術によって提供されない活性物質のローディング含有量およびサイズ分布を有するナノ粒子の形成をもたらす。フラッシュナノ沈殿によってナノ粒子を形成する場合、混合は、例えば、凝集開始前にすべての成分が１０，０００ほどの高い過飽和レベルに到達することを可能にするほど十分速く行われる。過飽和レベルは、溶媒中の材料、例えばコポリマーの実際の濃度とその溶媒中におけるその材料の飽和濃度との比である。例えば、過飽和レベルは、少なくとも約１、３、１０、３０、１００、３００、１０００または３０００であり得、多くとも約３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１０，０００、３０，０００または１００，０００であり得る。標的材料の凝集のタイムスケールおよびコポリマーの自己集合は、バランスされる。したがって、標的材料およびポリマーは同時に沈殿し、緩徐溶媒交換ベースの広く使用されている技術（例えば、透析）で見られる少ない活性物質の組み込みおよび凝集の制限を克服する。フラッシュナノ沈殿プロセスは、本質的には、成分の化学的特異性に対して無反応であり、それを普遍的なナノ粒子形成技術にする。
【００６５】
このプロセスから得られるナノ粒子サイズは、それらの作製に使用される混合速度、プロセス溶媒中のコポリマーおよび標的分子の総質量濃度、プロセス溶媒および非プロセス溶媒、コポリマーと標的分子との比、ならびに非プロセス溶媒との混合時の標的分子およびコポリマーの不溶性部分の過飽和を制御することによって制御され得る。すなわち、ナノ粒子のサイズおよび粒径分布を制御するために使用され得るいくつかの「手段」がある。例えば、標的分子としてリゾチームを含む粒子の形成では、ナノ粒子の直径は、図２Ａに示されているように総質量濃度、図２Ｂに示されているように標的分子リゾチームの質量パーセント（リゾチーム＋コポリマーに対するリゾチームの質量パーセント）、図２Ｃに示されているように非プロセス溶媒（逆溶媒）中のアセトンの体積分率（アセトン＋クロロホルムに対するアセトンの分率）（アセトンは、親水性リゾチームに対してクロロホルムよりも貧溶媒である）、および図２Ｄに示されているように極性プロセス溶媒中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の水（Ｈ２Ｏ）の体積分率で変動し得る。この情報が得られた実験条件は、以下の表１に示されている。
【表１】
2020125363.tif 000002
【００６６】
理論に縛られるものではないが、例えば、総質量濃度が増加するにつれて（図２Ａ）、タンパク質凝集速度は、ポリマー自己集合の核生成速度よりも速く増大し得る。より低い質量割合のリゾチームでは、リゾチームの質量割合が増加するにつれて（図２Ｂ）、サイズは最初減少する。理論に縛られるものではないが、これは、より速い核生成速度のためであり得る（すなわち、核生成部位が多いほど、より多くの、しかしより小さい粒子が存在する）。あるいは、これは、ＰＡＡブロックのより良好なパッキングのためであり得る（すなわち、ＰＡＡの負電荷が反発し、水および／または他のコア材料がこの効果を遮蔽し得る）。より高い質量割合のリゾチームでは、リゾチームの質量割合が増加するにつれて、サイズが増加する。理論に縛られるものではないが、これは、高い割合では、大きい粒子は小さい粒子よりも高い体積対表面積比を有するので大きい粒子が形成するためであり得る。非プロセス溶媒（逆溶媒）中のアセトンの体積分率が増加するにつれて（図２Ｃ）、非プロセス溶媒は、より低極性になる。より低いアセトン濃度では、コポリマーの核生成速度が増加し、これが形成される粒子サイズを支配するので（すなわち、核生成部位が多いほど、より多くの、しかしより小さい粒子が形成される）、アセトン濃度が増加するにつれて、形成される粒子の直径は減少する。より高いアセトン濃度では、アセトン濃度が増加するにつれて、リゾチームタンパク質の凝集速度が増強され、これが形成される粒子サイズを支配する。水の体積分率が増加するにつれて（図２Ｄ）、プロセス溶媒は、より高極性になる。より低い水濃度では、水濃度が増加するにつれて、ナノ粒子サイズが減少するように、水が核生成部位として作用してナノ粒子のコアをより強固にパッキングするのを補助する。より高い水濃度では、水濃度が増加するにつれて、ナノ粒子サイズが増加するように、水がコアに統合される。
【００６７】
直径４０ｎｍほどの小さいナノ粒子は、５０％ローディング（ローディングは、水溶性物質＋コポリマーに対する水溶性物質の割合である）で得られ得る。安定なナノ粒子は、７５％ローディングで得られ得るが、ナノ粒子の直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定するには過度に大きくなった。
【００６８】
ナノ粒子は、標的材料が添加されていないプロセス溶媒に溶解するコポリマーから生成され得る。
【００６９】
本発明の方法を使用して、１５ｎｍ〜１０５００ｎｍの範囲内のサイズ、２０ｎｍ〜６０００ｎｍの範囲内のサイズ、２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内のサイズ、３５ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内のサイズまたは４０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内のサイズを有する粒子を作製し得る。サイズは、動的光散乱によって決定され得る。例えば、少なくとも約１５ｎｍ、２０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、４０００ｎｍまたは６０００ｎｍのサイズを有し、多くとも約２０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、４０００ｎｍ、６０００ｎｍまたは１０５００ｎｍのサイズを有する粒子を作製し得る。本明細書で報告および引用されるサイズは、２０００ｎｍ未満の粒子の場合にはＭａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒデコンボリューションプログラムによって決定した場合の、ならびに２０００ｎｍ超のサイズの場合には走査電子顕微鏡法または光学顕微鏡法およびＩｍａｇｅ  Ｊを使用した画像分析によって決定した場合の強度平均報告値である。他の強度加重デコンボリューション法を使用して、ナノ粒子サイズを決定し得る。
カプセル化材料
【００７０】
カプセル化材料（標的分子）は、低極性非プロセス溶媒中で迅速に沈殿するほど十分に極性でなければならない。これらの基準を満たさない分子は、その水溶性および有機の非プロセス溶媒中で沈殿する傾向が増加するように化学的に改変され得る。カプセル化され得る生物製剤材料の例としては、限定されないが、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、サッカライド、ならびにこれらの誘導体、コンジュゲートおよび／またはアナログが挙げられる。例えば、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）をカプセル化し得る。小分子水溶性治療薬およびイメージング剤もカプセル化し得る。可溶性安定化剤は、その使用のためにまたはその後のプロセシング工程のために安定性を粒子に提供するために、粒子内にカプセル化され得る。また、これらの材料のいずれかを単一粒子内に共沈殿させ得る。ポストプロセシング中に安定性を粒子に添加する唯一の目的で、親水性材料をカプセル化し得る。例えば、１００〜１０，０００，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有する材料をカプセル化し得る。２５０〜１０，０００，０００Ｄａの分子量を有する材料をカプセル化し得る。１００〜１，０００，０００Ｄａの分子量を有する材料をカプセル化し得る。２５０〜１，０００，０００Ｄａの分子量を有する材料をカプセル化し得る。１００〜２００，０００Ｄａの分子量を有する材料をカプセル化し得る。
【００７１】
特定のカプセル化材料は、多官能性であり得る。例えば、トブラマイシンはカチオン性であり、それ自体がコポリマーで架橋され得る。同様に、複数のカチオン性残基を有する他のカチオン性活性材料は、アニオン性ポリマーブロックを架橋し得る。
【００７２】
カプセル化材料は、一定範囲のローディングで粒子中に組み込まれ得る。例えば、カプセル化材料の質量は、コポリマーの質量を超えるかまたはそれに等しいものであり得る。例えば、第１のプロセス溶液中のカプセル化材料の濃度は、約０．１ｗｔ％、０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％または２０ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％、０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％または４０ｗｔ％であり得る。
【００７３】
剪断応力または有機溶媒による変性に対して感受性の標的分子（限定されないが、ペプチドおよびタンパク質を含む）をカプセル化するために、それらを安定化し得る。非プロセス溶媒と連続的に混合する前に、プロセス溶媒中でナノクラスタなどのタンパク質高密度相を生成することによって、これを達成し得る。次いで、ＦＮＰプロセスを使用して、これらのナノクラスタをナノ粒子に組み込み得る。ナノクラスタの特徴は、溶媒、緩衝液の種類および濃度、外因性クラウダーの種類および濃度、ならびにタンパク質濃度の選択によって決定される。（米国特許出願公開第２０１２２３０９１３号）において、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらは、ナノクラスタ形成のための適切な条件を提供した。当業者であれば、引力および反発力がバランスされ、物理的または化学的安定性が悪影響を受けないように、タンパク質標的分子の物理的特性によって、最適なパラメータが決定されることを認識し得る。例えば、プロセス溶媒は、タンパク質変性をもたらさない限り、水またはジメチルスルホキシドなどの高誘電率極性溶媒であり得る。極性溶媒の場合、系が標的分子の等電点またはその近くになるように、緩衝液が選択され得る。当業者であれば、パラメータ選択は、標的ナノ粒子サイズおよびコストなどの設計検討事項も指針となることを認識し得る。例えば、タンパク質および外因性クラウダーの濃度は、フラッシュナノ沈殿によって生成されたナノ粒子を制御するナノクラスタサイズを決定する。（米国特許出願公開第２０１２２３０９１３号）において、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらは、ナノクラスタ形成のための適切なタンパク質および外因性クラウダーの濃度範囲ならびにタンパク質対外因性クラウダー比を提供した。所望のプロセス溶媒組成は、凍結乾燥タンパク質の再懸濁によって、または標的組成よりもより希釈された流れの遠心ろ過を介して得られ得る。
【００７４】
Ｊｏｈｎｓｔｏｎらは、グリセロール、エリスリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、エタノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ソルケタール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジグライム、乳酸エチル、から選択される有機共溶媒、塩、緩衝液またはそれらの組み合わせなどの適切な外因性クラウダーのリストを示している（米国特許出願公開第２０１２２３０９１３号）。あるいは単に、外因性クラウダーは、非プロセス溶媒との混合後に集合してナノ粒子のコアおよびシェルを形成するコポリマーであり得るか、またはこのコポリマーは、１つまたはそれを超えるさらなる外因性クラウダーと組み合わせて添加され得る。外因性クラウダーがプロセス溶媒および非プロセス溶媒の両方に可溶性であるように、それを選択し得る。あるいは、非プロセス溶媒に不溶性の外因性クラウダーであって、ナノ粒子コア（これは、タンパク質ナノクラスタの周囲で形成し、安定性をタンパク質に提供する）に沈殿する外因性クラウダーを選択し得る。ＦＮＰにおける流れの連続混合中に全体的なクラウダー濃度が変化しないように、外因性クラウダーを非プロセス溶媒に溶解し得る。
【００７５】
標的分子に対するコポリマーの質量比を調整し得る。これは、外因性クラウダーの効果を調節するため、またはナノ粒子の安定性およびサイズの制御のためであり得る。所望の初期および最終コポリマー濃度を得るために、コポリマーの溶解度制限は、ＣＩＪおよびＭＩＶＭを使用して多くの異なるプロセシング構成を決定し得る。コポリマーをナノクラスタプロセス流に完全に溶解し得る。コポリマーをナノクラスタプロセス流とは別個のプロセス流に完全に溶解し得る。これらのプロセス流は同じ極性溶媒であり得るか、または異なる溶媒であり得る。それらは等容量であり得るか、または異なるものであり得る。非常に高いタンパク質濃度でナノクラスタを生成する場合、コポリマープロセス流と比較して小さい容量のこのプロセス流を使用して、所望の質量比および最終組成を得ることができる。コポリマーをナノクラスタプロセス流に部分的に溶解し、上記別個のプロセス流に部分的に溶解し得る。
【００７６】
一実施形態では、非プロセス溶媒の導入前に、高密度相において標的分子を凝集させる。この実施形態では、プロセス溶媒中の高密度相において標的分子を凝集させ、分子的に溶解しない。標的分子を分子的に溶解する場合、核生成、成長およびコポリマー集合の時間スケールは重要であるが、この場合、ナノクラスタ解離の時間スケールが、これらのナノクラスタの表面上のコポリマーの集合よりも長くなり、ナノ粒子を形成および安定化するように系を設計しなければならない。例えば、より優れたナノクラスタ持続性を提供するために、市販のエステルまたはジスルフィド結合を使用して、タンパク質を可逆的に架橋し得る。また、これを行う際、制御放出プロファイルを操作するためのさらなる手段を提供し得る。
【００７７】
別の実施形態では、タンパク質高密度相は、混み合い効果により集合するナノクラスタから形成されるのではなく、クエン酸ナトリウムなどの適切な沈殿剤の添加によって形成される。
【００７８】
適切な極性プロセス溶媒の例としては、限定されないが、水、アルコール、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、アセトン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびそれらの混合物が挙げられる。プロセス溶媒（または複数の溶媒）は、以下のセクションで定義されるように、コポリマーが分子的に溶解するように選択される。タンパク質ナノクラスタを含有するプロセス溶媒は、それらの安定な形成を可能にしなければならず、生物製剤の変性をもたらしてはならない。
【００７９】
適切な非プロセス溶媒としては、限定されないが、クロロホルム、ジクロロメタン、アルカン、例えばヘキサン、エーテル、例えばジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトンおよびそれらの混合物が挙げられる。非プロセス溶媒は、コポリマーがタンパク質ナノクラスタ上に迅速に沈殿して安定なナノ粒子を形成するように選択される。
【００８０】
適切なコポリマーの特徴は、後のサブセクションに掲載されている。ナノ粒子は、後のセクションに記載されている様々な方法によって架橋され得る。
溶媒
【００８１】
ナノ粒子の形成は、１つまたはそれを超えるプロセス溶媒および非プロセス溶媒流を必要とする。プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、純粋な（すなわち、単一の）液体化合物または２つもしくはそれを超える純粋な液体化合物の混合物であり得る。流れの溶媒品質を補助する他の非液体化合物を添加し得、これも溶媒の一部とみなされる。例えば、界面活性剤、塩または共溶媒は溶媒に添加され、溶媒の一部とみなされ得る。これらの賦形剤化合物は、最終生成物の要件に応じて、最終ナノ粒子または微粒子構築物中に存在してもよいし、または存在しなくてもよい。
【００８２】
コポリマーを含有する極性プロセス溶媒は、コポリマーが分子的に溶解するように選択される。これは、プロセス溶媒がコポリマーのすべての部分を可溶化することを必要とする。存在する場合、カプセル化材料を含有するプロセス溶媒も、材料が分子的に溶解するように選択される。いくつかの場合では、ナノ粒子集合の前にナノクラスタが形成される場合、ナノクラスタを含有するプロセス溶媒は、クラスタが安定であり懸濁するように選択される。本発明のこの実施形態では、カプセル化すべき材料は、プロセス溶媒中に分子的に溶解しないであろう。これらのプロセス溶媒は同じであり得るが、必ずしも同じではなくてもよい。いくつかの場合では、コポリマーおよびカプセル化材料は両方とも、プロセス溶媒の単一溶液に溶解し得る。カプセル化すべき水溶性材料を溶解するために、プロセス溶媒は、非プロセス溶媒よりも高極性である。プロセス溶媒の例としては、限定されないが、水、アルコール、メタノール、エタノール、グリコールエーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、アセトン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびそれらの混合物が挙げられる。酸、塩基および塩は、コポリマーおよびカプセル化材料のプロセス溶媒への可溶化を補助するために使用され得る添加剤の数例である。タンパク質ナノクラスタを生成する場合、プロセス溶媒は、生物製剤の等電点まで緩衝され得る。ナノクラスタを形成してその安定性を維持するために、前記外因性クラウダーもプロセス溶媒に含められ得る。
【００８３】
コポリマーと、カプセル化すべき材料とを含有するプロセス溶媒の溶液は、非プロセス溶媒と混合される。非プロセス溶媒はコポリマーの局所分子環境を変化させ、ポリマーの高極性セクションの局所沈殿を引き起こすことができなければならない。非プロセス溶媒は、コポリマーの高極性セクションが迅速に沈殿し、コポリマーのより非極性の（低極性）セクションが依然として可溶化されているように選択される。したがって、コポリマーは、非プロセス溶媒中でミセルまたは他の構造体に自己集合する。非プロセス溶媒は、カプセル化すべき標的材料が最終混合物中で迅速に沈殿するように選択される。予形成タンパク質ナノクラスタを含有するプロセス流の場合、ナノクラスタが存続し、ナノ粒子のコアに局在するナノクラスタと共にコポリマーが集合するように、非プロセス溶媒が選択される。ほとんどの場合、プロセス溶媒および非プロセス溶媒は、最終組成で完全に混和性であることが好ましい。いくつかの場合では、プロセス溶媒の２０容量％以下が最終組成物中で相分離し得る。一般に、これは、相分離溶媒が粒子のコアに達し、肉眼で分離が見られない場合にのみ許容され得る。非プロセス溶媒としては、限定されないが、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサンなどのアルカン、ジエチルエーテルなどのエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトンおよびそれらの混合物が挙げられる。酸、塩基および塩は、カプセル化材料およびコポリマーのセクションの沈殿を補助するために使用され得る添加剤の数例である。溶媒の選択は、コポリマーおよびカプセル化材料の溶解度に基づいて行われる。一方の系のプロセス溶媒が別の系の非プロセス溶媒としてうまく機能し得ることに留意することが重要であるので、プロセス溶媒および非プロセス溶媒について上記に示されている例は、別個であるとみなされるべきではない。前記外因性クラウダーを非プロセス溶媒に溶解して、ＦＮＰ中のナノクラスタの安定性を維持し得る。
コポリマー
【００８４】
安定化ポリマーは、より非極性の（低極性）ブロックとカップリングした高極性ブロックのコポリマーであり得る。用語「ブロック」は、単一の分子組成を有する別個なドメインと解釈され得るか、またはそれは、主としてより高い極性の領域と他のより低い極性の領域とを有するポリマー鎖の領域を意味し得る。極性は、ポリマー主鎖を構成するモノマーまたは主要なポリマー主鎖に付着したグラフト化ペンダント基もしくは鎖によって付与され得る。例えば、コポリマーは、両親媒性であり得る（より非極性のブロックは、水溶性ではない）が、これは必要条件ではなく、ブロックの溶解度が非プロセス溶媒中で十分有意に異なる限り、コポリマーは完全に水溶性であり得るか、または完全に非水溶性であり得る。コポリマーは非プロセス溶媒中で自己集合するべきであり、高極性ブロックは沈殿し、より非極性のブロックは依然として可溶性である。粒子を作製するためにＦＮＰプロセスにおいて使用される場合、高極性ブロックは粒子のコアに達し、より非極性のブロックは、立体保護シェルを形成する。立体保護シェルは粒子の凝集を防止し、ポストプロセシング工程中のカプセル化材料の浸透を防止する。
【００８５】
開示されるプロセスによって形成されるナノ粒子は、グラフト、ブロックまたはランダムコポリマーを用いて形成され得る。例えば、これらのコポリマーは、約１０００ｇ／モル〜約１，０００，０００ｇ／モルまたは約３０００ｇ／モル〜約２５，０００ｇ／モルまたは少なくとも約２０００ｇ／モルの分子量を有し得る。
【００８６】
コポリマーは、異なる溶解度特徴を有する繰り返し単位またはブロックから構成される。典型的には、これらの繰り返し単位は、所定の特性のブロックを含む少なくとも２つのグループにある。合成方法に応じて、これらのブロックは、すべて同じ繰り返し単位のものであり得るか、またはブロック全体に分散した異なる繰り返し単位を含有し得るが、依然として極性部分とより非極性の部分とを有するコポリマーのブロックをもたらす。これらのブロックは、一連の２つのブロック（ジブロック）または３つのブロック（トリブロック）またはそれよりも多く（マルチブロック）に配列されて、ブロックコポリマーの主鎖を形成し得る。加えて、ポリマー鎖は、主鎖に共有結合により付着またはグラフト化された化学的部分を有し得る。このようなポリマーは、グラフトポリマーである。コポリマーを構成するブロック単位は一定間隔で存在し得るか、またはランダムに存在してランダムコポリマーを作製し得る。加えて、グラフト化側鎖は、ポリマー主鎖に沿って一定間隔で存在するか、またはランダムグラフト化コポリマーをランダムに作製し得る。グラフトポリマーでは、極性ブロックは、非極性ポリマー上にグラフト化され得る。より一般的には、非極性ブロックは、高極性ポリマー鎖上にグラフトされる。グラフトコポリマーでは、グラフト化部分の長さは、変動し得る。好ましくは、グラフト化セグメントは、長さが２〜２２のエチレン単位と同等である。コポリマーの少なくとも１つの低極性領域を作り出すグラフト化疎水基は、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、その塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体または組み合わせを含み得る。加えて、ポリマー主鎖のグラフト化は、溶媒和またはナノ粒子の安定化特性を増強するために有用であり得る。
【００８７】
本発明の組成物および方法において使用されるコポリマーは、少なくとも２つの繰り返し単位または少なくとも２５個のエチレン単位と同等の最小輪郭長を有するブロックから構成され得る。輪郭長はポリマー主鎖の線形和であり、その分子の寸法は、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｂｒａｎｄｒｕｐ，Ｅ．Ｈ．Ｉｍｍｅｒｇｕｔ，ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｇｒｕｌｋｅ，ａｓｓｏｃ．ｅｄ．Ａ．Ａｂｅ，Ｄ．Ｒ．Ｂｌｏｃｈ，１９９９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して概算され得る。
【００８８】
コポリマー中の適切な非極性ブロックの例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：アクリレート、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル（ＢＡ）、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチルおよびアクリル酸ｔ−ブチル；メタクリレート、例えばメタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチルおよびメタクリル酸イソブチル；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル、例えば酢酸ビニル、ビニルバーサテート、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、ビニルフェノールおよびビニルイミダゾール；アミノアルキル、例えばアミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレートおよびアミノアルキル（メタ）アクリルアミド；スチレン；酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）、乳酸、カプロラクトン、グリコール酸、ならびにこれらのコポリマー（一般に、Ｉｌｌｕｍ，Ｌ．，Ｄａｖｉｄｓ，Ｓ．Ｓ．（ｅｄｓ．）Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，１９８７；Ａｒｓｈａｄｙ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １７：１−２２，１９９１；Ｐｉｔｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒ．５９：１７３−１９６，１９９０；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４：１５５−０１８０，１９８６を参照のこと）；ポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づく疎水性ペプチドベースポリマーおよびコポリマー（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ，Ａら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２）５４：１６９−１９０）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（「ＥＶＡ」）コポリマー、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジエン（ポリブタジエン、ポリイソプレンおよびこれらのポリマーの水素化形態）、ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテルの無水マレイン酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン６，６）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル尿素）。例えば、ポリマーブロックとしては、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）またはポリ（プロピレンスルフィド）のコポリマーが挙げられ得る。生物学的に関連のない用途の場合、ポリマーブロックとしては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリレートおよびブタジエンが挙げられ得る。
【００８９】
ポリマーの非極性部分として作用するために十分な疎水性を有する天然産物としては：疎水性ビタミン（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＫおよびビタミンＡ）、カロテノイドおよびレチノール（例えば、ベータカロテン、アスタキサンチン、トランスおよびシスレチナール、レチノイン酸、葉酸、ジヒドロフォレート、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル）、コレカルシフェロール、カルシトリオール、ヒドロキシコレカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、アルファ−トコフェロール、酢酸アルファ−トコフェロール、ニコチン酸アルファトコフェロール、エストラジオール、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、その塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体またはそれらの混合物が挙げられる。例えば、天然産物は、活性種上のアミンおよびヒドロキシルに対する官能化を促進するコハク酸ビタミンＥとして容易に得られ得るビタミンＥである。
【００９０】
ブロックコポリマーである両親媒性ポリマー中の適切な極性ブロックの例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：カルボン酸、例えばアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸およびマレイン酸；ポリオキシエチレンまたはポリエチレンオキシド；ポリアクリルアミドおよびそのジメチルアミノエチルメタクリレートとのコポリマー、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびスチレンスルホネート、ポリビニルピロリドン、デンプンおよびデンプン誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体；ポリペプチド、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸；ポリヒアルロン酸、アルギン酸、ポリラクチド、ポリエチレンイミン、ポリイオネン、ポリアクリル酸およびポリイミノカルボキシレート、ゼラチンおよび不飽和エチレン系モノまたはジカルボン酸。アニオン性コポリマーを調製するために、アクリル酸、メタクリル酸および／またはポリアスパラギン酸ポリマーを使用し得る。カチオン性コポリマーを生成させるために、ＤＭＡＥＭＡ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリビニルピリジン（ＰＶＰ）および／またはジメチルアミノエチルアクリルアミド（ＤＭＡＭＡＭ）を使用し得る。適切な極性水溶性ポリマーのリストは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕｍｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｎｓ，Ｒ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（ｌ９８０）に見られ得る。
【００９１】
非極性および極性ポリマーの上記リストは、互いに排他的であるとみなされるべきではない。単一リスト内の所定の２つのポリマーのコポリマーは、このプロセスにおいて使用するために十分な、所定の非プロセス溶媒への溶解度の差を有し得る。実例として、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（アクリル酸）はいずれも、極性ポリマーのリストに示されている。しかしながら、ポリ（エチレンオキシド）は、クロロホルムおよびアセトンに可溶性であるが、ポリ（アクリル酸）は可溶性ではない。したがって、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（アクリル酸）とのコポリマーは、非プロセス溶媒としてクロロホルムまたはアセトンを用いるこのプロセスにおいて使用され得る。
【００９２】
例えば、ポリ無水物および／またはポリエステルは、ブロックコポリマーの極性ブロックおよび／または非極性ブロックを形成するために使用され得る。このようなポリ無水物および／またはポリエステルは生分解性であり得、アミノ酸に基づくものであり得る（すなわち、ポリ無水物および／またはポリエステルは、アミノ酸モノマーおよび他のモノマーから形成され得る）。アミノ酸は、天然に存在するタンパク質性アミノ酸、天然に存在する非タンパク性アミノ酸、および／または人工的に合成されたアミノ酸または組み合わせであり得る。アミノ酸は、Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸であり得る。例えば、アミノ酸は、さらなるカルボン酸基を含むように改変され得る。すなわち、モノマーとして機能するアミノ酸は、例えば、カルボン酸基を有する別の分子にアミノ酸をカップリングすることによって、またはアミノ基を介して別のアミノ酸にアミノ酸をカップリングすることによって形成されるジカルボン酸であり得る。例えば、モノマーとして機能するアミノ酸は、以下の構造の１つまたは組み合わせを含み得る：
ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｚ−Ｒ”−ＣＯＯ；
ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｚ−Ｒ”−Ｚ−ＮＲ’−ＣＯＯ；
ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｘ−ＮＲ’−Ｒ−ＣＯＯ；
ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｚ−Ｒ”−Ｒ−ＣＯＯ−Ｒ’”−Ｏ；
ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｚ−Ｒ”−Ｚ’ＮＲ’−ＣＯＯ−Ｒ’”−Ｏ；
ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｘ−ＮＲ’−Ｒ−ＣＯＯ−Ｒ’”−Ｏ（Ｒは、脂肪族、芳香族または複素環式アミノ酸残基であり、Ｒ’は、Ｈ、アルキル（例えば、１〜１０個の炭素を有する）または直接結合であり、Ｒ”およびＲ’”は、同じまたは異なる脂肪族、芳香族または複素環式残基であり、Ｚは、Ｃ＝Ｏ（例えば、アミド部分を形成する）、ＣＯＯ（例えば、ウレタン部分を形成する）、（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ”−（Ｃ＝Ｏ）（例えば、イミド、またはイミドを形成する）、ＣＯ−ＮＲ’（例えば、尿素を形成する）または＝Ｎ（例えば、アゾを形成する）であり、Ｘは、アゾ（Ｎ＝Ｎ）、尿素（ＮＲ’−ＣＯ−ＮＲ’）またはチオ尿素（ＮＲ’−ＣＳ−ＮＲ’）である）。ポリ無水物またはポリエステルセグメントは、異なる部分において異なる置換基を有し得、例えば、ＯＣ−Ｒ−ＮＲ’−Ｚ−Ｒ”−ＣＯＯ単位から形成されるセグメントは、１つまたはそれを超える単位についてはＣ＝ＯであるＺを有し得、１つまたはそれを超える他の単位についてはＣＯＯであるＺを有し得る。いくつかのポリ無水物およびポリエステルは、米国特許第４，９９９，４１７号（Ａ．Ｄｏｍｂ）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ナノ粒子のプロセシング
粒子の安定化
【００９３】
粒子が形成され、有機の非プロセス溶媒中で安定である。ほとんどの用途では、最終構築物は、設定された無視不可能な量の時間にわたって水性環境中で安定であることが必要とされる。粒子を水性環境にプロセシングするために、粒子の安定化が必要とされる。安定化なしの場合、粒子は、溶解し、凝集しおよび／または水溶性標的材料をコアから放出し得る。
【００９４】
本発明の一実施形態では、粒子のコアのセクションが安定化され得る。コアは、コポリマーおよびカプセル化材料の高極性セクションを指す。材料は、特に粒子の安定化目的でコアに組み込まれ得る。例えば、コア内のコポリマーの部分を架橋して２０３、架橋コアを有する粒子３０１を形成し得る。別の実施形態では、粒子のシェル３０２を安定化し得る。シェルは、非プロセス溶媒に可溶性のコポリマーのより非極性のセクションを指す。
【００９５】
安定化は、新たな共有結合の形成を伴い得る。例えば、粒子のコアのコポリマー（および、いくつかの場合では、カプセル化材料）は、新たな共有結合の形成によって架橋され得る。結合は、コポリマー上の基間に直接形成され得る。共有結合は、コア内のポリマーを架橋する特定の目的で架橋材料をコアに添加することによって形成され得る。架橋材料（安定化材料）は、ＦＮＰプロセス中に粒子のコアに添加され得る。例えば、架橋材料は、プロセス溶媒に含められ得る。別の例として、架橋材料は、非プロセス溶媒に含められ得る。
【００９６】
あるいは、架橋材料は、粒子の形成後に溶液に添加され得る。例えば、粒子を金属塩などの架橋材料と共に「インキュベート」し得、架橋材料は、例えばイオン性および／またはキレート化効果によってコポリマー、例えばＰＡＡの高極性部分と相互作用し得る。次いで、達成された架橋度は、コポリマーの高極性部分に対する良溶媒中に粒子を懸濁させることによって特性評価され得る。強固な（高密度の）架橋を有する粒子は、最小膨潤を示し得、親水性コア中への高レベルの金属分配およびポリマーの高極性部分との強い金属相互作用に関連し得る。緩い架橋を有する粒子は、高レベルの膨潤を示し得、親水性コア中への低レベルの金属分配およびポリマーの高極性部分との弱い金属相互作用に関連し得る。金属のコア中への分配が非常に低く、および／またはポリマーの高極性部分との金属の相互作用が非常に弱い場合、粒子は、溶媒中で分解および溶解し得る。
【００９７】
粒子の形成後に架橋材料を添加する場合、架橋は拡散制限され得、コアの外側層上で起こり得るに過ぎない。粒子の形成後に架橋材料を溶液に添加する場合、コアが溶媒で膨潤されるか、または架橋材料がコア全体に拡散するほど十分に小さい場合には、粒子はコア全体で架橋され得る。粒子のシェルは、新たな共有結合の形成によって架橋され得る。結合は、コポリマー上の基間で直接形成され得るか、またはさらなる架橋材料の添加によって形成され得る。
【００９８】
使用され得る共有結合的化学反応の例としては、限定されないが、カルボン酸のアルコールへのまたはカルボン酸のアミンへのカルボジイミドカップリング、活性化エステルのアルコールまたはアミンへのカップリング、マレイミド−チオール化学反応、マイケル付加、アジドアルキン「クリック」化学反応、ＵＶもしくは光活性化化学反応および／またはジスルフィド形成が挙げられる。
【００９９】
安定化は、非共有結合相互作用によって得られ得る。粒子のコアは、非共有結合相互作用によって架橋され得る。相互作用は、コポリマー上の基間の直接的なものであり得る。非共有結合相互作用は、コア中のポリマーを架橋するという特定の目的で架橋材料をコアに添加することによって形成され得る。この架橋材料は、ＦＮＰプロセス中に粒子のコアに添加され得る。あるいは、この架橋材料は、粒子の形成後に溶液に添加され得る。粒子の形成後に架橋材料を添加する場合、架橋は拡散制限され得、コアの外側層上で起こり得るに過ぎない。粒子の形成後に架橋材料を溶液に添加する場合、コアが溶媒で膨潤されるか、または架橋材料がコア全体に拡散するほど十分に小さい場合には、粒子はコア全体で架橋され得る。粒子のシェルは、非共有結合相互作用によって架橋され得る。相互作用は、コポリマー上の基間で直接形成され得るか、またはさらなる架橋材料の添加によって形成され得る。
【０１００】
使用され得る非共有結合相互作用の例としては、限定されないが、イオン性相互作用、酸−塩基相互作用、金属キレート化、ポリヒスチジンとニッケルなどの金属との間の相互作用および／または強い水素結合が挙げられる。非共有結合粒子安定化の例は、Ｃｒ（ＩＩＩ）を使用してナノ粒子のポリ（アクリル酸）コアを安定化するものである。例えば、酢酸クロム（ＩＩＩ）および／または臭化クロム（ＩＩＩ）を架橋材料として使用し得る。架橋は、リガンド交換によって進行し得る。使用される溶媒は、リガンドとして作用し得る。例えば、架橋塩におけるカチオンの相互作用は、塩のアニオンの場合よりも、コア内で架橋されるコポリマーの高極性部分の場合に強力であるはずである。
【０１０１】
非共有結合性架橋を誘導するために使用され得る他の架橋材料（架橋剤）としては、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、金属ハロゲン化物、遷移金属ハロゲン化物およびハロゲン化鉄が挙げられる。金属塩を使用し得る。使用され得るさらなる架橋材料は、金属酢酸塩、アルカリ土類酢酸塩、遷移金属酢酸塩および酢酸カルシウムである。所定のカチオン（例えば、金属）の架橋能力は、付随するアニオンに依存する。架橋材料、例えば塩の架橋能力は、使用されるプロセス溶媒および非プロセス溶媒に依存し得る。架橋材料としては、生物学的に興味深いまたは機能的または他有用な金属が挙げられ得る。例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）およびＺｎ（ＩＩ）カチオンは、生体適合性である。Ｇｄ（ＩＩＩ）（ガドリニウム（ＩＩＩ））は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において活性であるので、トレーサーとして有用であり得る。
【０１０２】
ナノ粒子の形成中に、例えばＦＮＰプロセス中に架橋を行うと良好に機能するいくつかの架橋材料としては、スペルミンなどのポリアミン、ならびに塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化鉄（ＩＩＩ）などの特定の塩化物塩が挙げられる。例えば、このような架橋材料は、ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡコポリマーと、プロセス溶媒としてメタノール、ジメチルスルホキシドおよび／または水と、非プロセス溶媒としてアセトンおよび／またはクロロホルムと共に使用され得る。架橋を行うためにいくらかの水をプロセス溶媒に含める必要があり得る。いくつかの系では、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびスペルミンは、弱いクロスリンカーとして作用し得る。塩化鉄（ＩＩＩ）などの鉄（ＩＩＩ）塩は、強い架橋を誘導し得る。
【０１０３】
複数の種類の安定化化学反応を所定の粒子内で用い得る。安定化は、コア内、シェル内、界面または所定の粒子内の複数の位置で起こり得る。
【０１０４】
多くの用途では、粒子の分解およびカプセル化材料の放出が必要とされる。使用される安定化化学反応の種類および架橋ネットワークの密度は、粒子の分解速度に影響を及ぼし得る。同様にまたはあるいは、使用される安定化化学反応の種類および架橋ネットワークの密度は、粒子のコアからのカプセル化材料の放出速度に影響を及ぼし得る。
【０１０５】
いくつかの用途では、カプセル化材料が化学的に改変されないことが必要とされる。これらの場合、非共有結合相互作用を使用して、粒子を安定化するべきである。しかしながら、共有結合性架橋は、その化学反応がコポリマーに対して特異的であり、カプセル化材料を改変しない限り、共有結合性架橋を使用し得る。
微粒子およびモノリスへの粒子の組み込み
【０１０６】
粒子は、微粒子またはより大きいモノリスに組み込まれ得る（例えば、図１の４０２または４０３）。疎水性ポリマーブロックは浸透を防止することができ、カプセル化材料の高ローディング、プロセシング中の安定化および制御放出を可能にする。両親媒性ポリマーの疎水性ブロックは、各親水性コアナノ粒子の周囲において均一な障壁層厚さを提供する。したがって、放出は、より均一な疎水性ブロック層によって制御される。様々な分子量の親水性ブロックをナノ粒子形成プロセスに組み込んで、異なる放出プロファイルを達成し得る。疎水性ブロックは、凝集して微粒子を形成する主なナノ粒子の高極性コアの周囲において凝縮する。この疎水性「シェル」は、主な制御放出を提供する。シェルは、安定化ポリマーの疎水性両親媒性部分の分子量および濃度によって決定される厚さを有する。ブロックコポリマーの場合、疎水性ブロックの分子量は、１０００、２０００、４０００、５０００、７５００または１０，０００ダルトン（Ｄａ）を超えるかまたはそれに等しいものであり得る。例えば、疎水性ブロックの分子量は、２０００、４０００、５０００、７５００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００または１，０００，０００Ｄａ未満またはそれに等しいものであり得る。凝集工程中に、添加の疎水性生体適合性ポリマーまたは疎水性化合物を添加して、放出速度をさらに調整し得る。
【０１０７】
縮合非極性疎水性両親媒性ポリマー成分によって提供されるこのシェルは、この開示されるプロセスと以前の持続性微粒子構築物との間の重大な差異である。以前のアプローチでは、放出を制御する障壁を提供するのは、連続マトリックス相である。従来の技術において親水性活性物質を取り囲むこのマトリックスの厚さは、微粒子サイズに対する親水性内包物の有限サイズによって厚さが変動する。これは、論文Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２１９  ５１９−５３５（２０１５）に記載されている。
【０１０８】
粒子が、粒子コアのための貧溶媒中でプロセシングされた疎水性足場に組み込まれている場合、粒子は、凝集工程前に、低極性ポリマーブロックによって安定化される。
【０１０９】
親水性活性化合物または生物製剤化合物は、疎水性プロセス溶媒中への最初のプロセシング工程により形成された粒子の内部に捕捉される。疎水性プロセス溶媒に可溶性の有機ポリマー（例えば、疎水性ポリマー）は、粒子分散液に添加され得る。添加され得るポリマーとしては、生体適合性および／または生分解性ポリマーが挙げられる。これらのポリマーの非限定的な例としては：アクリレート、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル（ＢＡ）、アクリル酸イソブチル、アクリル酸２−エチルおよびアクリル酸ｔ−ブチル；メタクリレート、例えばメタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチルおよびメタクリル酸イソブチルならびにこれらのアクリレートのコポリマー；アクリロニトリル；メタクリロニトリル；ビニル、例えば酢酸ビニル、ビニルバーサテート、プロピオン酸ビニル、ビニルホルムアミド、ビニルアセトアミド、ビニルピリジン、ビニルフェノールおよびビニルイミダゾール；アミノアルキル、例えばアミノアルキルアクリレート、アミノアルキルメタクリレートおよびアミノアルキル（メタ）アクリルアミド；スチレン；酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリ（Ｄ，Ｌラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（アルキルカーボネート）およびポリ（オルトエステル）、ポリエステル、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリジオキサノン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ（アミノ酸）ならびにこれらのコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリプロピレンスルフィド（一般に、Ｉｌｌｕｍ，Ｌ．，Ｄａｖｉｄｓ，Ｓ．Ｓ．（ｅｄｓ．）Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，１９８７；Ａｒｓｈａｄｙ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １７：１−２２，１９９１；Ｐｉｔｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒ．５９：１７３−１９６，１９９０；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４：１５５−０１８０，１９８６を参照のこと）；疎水性ペプチドベースのポリマーおよびポリ（Ｌ−アミノ酸）に基づくコポリマー（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ，Ａら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２）５４：１６９−１９０）、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（「ＥＶＡ」）コポリマー、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジエン（ポリブタジエン、ポリイソプレンおよびこれらのポリマーの水素化形態）、ビニルメチルエーテルおよび他のビニルエーテルの無水マレイン酸コポリマー、ポリアミド（ナイロン６，６）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ（エステル尿素）が挙げられる。ポリマーブロックの例としては、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（Ｌ−乳酸）オリゴマーおよびポリマー、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ無水物、ポリ（カプロラクトン）またはポリ（乳酸）のコポリマーが挙げられる。例えば、ポリスチレン、ポリアクリレートおよびブタジエンは、生物学的に関連しない（および生物学的に関連する）用途のためのポリマーブロックとして使用され得る。このような疎水性ポリマーは、逆ナノ粒子を微粒子に結合する接着分子として作用し得る。例えば、接着分子は、ナノ粒子のシェルを形成するコポリマーの低極性領域と化学的に同じものであり得る（または化学的に異なるものであり得る）。例えば、接着分子は、コポリマーの低極性領域と同じまたは類似の分子量（またはより大きい分子量もしくはより小さい分子量）を有し得る。接着分子は、水溶性物質の（微粒子からの）放出速度を改変するように作用し得る。
【０１１０】
例えば、疎水性プロセス溶媒に可溶性のポリ無水物ならびに／またはポリエステルならびに／またはポリ無水物−ポリエステルコポリマーならびに／またはポリ無水物および／もしくはポリエステルセグメントを含むコポリマーを粒子分散液に添加し得る。上記のように、このようなポリ無水物および／またはポリエステルは生分解性であり得、アミノ酸に基づくものであり得る（すなわち、ポリ無水物および／またはポリエステルは、アミノ酸モノマーおよび他のモノマーから形成され得る）。
【０１１１】
また、凝集工程の前に、疎水性化合物を非極性溶媒相に添加して、微粒子もしくはマトリックスの形成を支援し得、または活性物質の放出の制御を補助し得る。生物学的用途では、生体適合性化合物が望ましい場合がある。これらとしては、限定されないが、トコフェロール、トコフェロール誘導体、脂質、炭素数１２〜４０のアルコール、コレステロール、不飽和および／もしくは水素化脂肪酸、その塩、エステルもしくはアミド、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドもしくは脂肪酸トリグリセリド、ワックス、セラミド、コレステロール誘導体またはそれらの混合物が挙げられる。このような疎水性生体適合性化合物は、逆ナノ粒子または微粒子の表面に移動して、生体適合性層を形成し得る。非生物学的用途では、生体適合性にかかわらず、非極性溶媒相に可溶性の疎水性化合物が使用され得る。
【０１１２】
これらのポリマーまたはそれらの混合物の添加後、得られるポリマー含有疎水性有機溶液相中の分散生物製剤粒子は、当技術分野で周知の技術によって、所望の微粒子またはモノリスに形成され得る。これらとしては、Ｄｏｍｂ（米国特許第５，５７８，３２５号）またはＧｉｂｓｏｎ（米国特許第６，２９１，０１３号）に記載されているエマルジョン−ストリッピング技術、噴霧乾燥、または生物製剤などのカプセル化親水性活性剤を含有する固体マトリックスを形成するための成形が挙げられる。噴霧乾燥、皿乾燥または成形プロセスによってマトリックスを乾燥させて、カプセル化活性剤または生物製剤を含有する固体最終マトリックスを得ることができる。乾燥マトリックス相を粉砕または微粉化して、１ミクロンから１〜２ｍｍのサイズ範囲内の微粒子を作製し得る。次いで、マトリックス相の溶解、浸食または膨潤によって、放出を行う。このカプセル化および続くマトリックスの形成により、以前に文献に記載されている単純な二重エマルジョン技術で達成され得るよりもかなり高い親水性活性剤または生物製剤のローディングが可能である。従来の二重エマルジョン経路では、マトリックス製剤中活性剤の高ローディングでバースト放出が起こる。現在のプロセスは、活性物質の高ローディングを可能にする。１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％および８５ｗｔ％のローディングが最も望ましい。最初の２０分間で、バースト放出は、２５％未満に制限される。また、プロセスのカプセル化効率は比類なく高い。プロセスに供した元の活性物質に対する最終微粒子中の活性物質のパーセントとして定義されるカプセル化効率は、７５％超、８５％、９０％または９５％であり得る。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：粒子の集合および形態
親水性化合物を含有する粒子を生成するために、最初に、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）７．５ｋＤａ−ｂ−ポリ（アクリル酸）５．５ｋＤａ（ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ）および生物製剤を極性有機溶媒、例えばＤＭＳＯまたはメタノールに溶解した。ＦＮＰプロセスでは、ＣＩＪミキサーによって、この流れを低極性非プロセス溶媒、例えばクロロホルム（ＣＨＣｌ３）またはアセトンと迅速に混合した。この非溶媒は、生物製剤を沈殿させた。成長中の粒子表面上におけるＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡの親水性ＰＡＡブロックの自己集合によって、この沈殿を停止させた。非溶媒中で疎水性ＰＢＡブロックによって、最終粒子を立体的に安定化した。得られたナノ粒子は、コア−シェル構造を有していた。
【０１１４】
モデルタンパク質としてのリゾチーム（１４．３ｋＤａ）、環状ペプチド抗生物質バンコマイシン（１．４５ｋＤａ）、モデル７−アミノ酸長ペプチド（グリシン−アルギニン−ロイシン−グリシン−トリプトファン−セリン−フェニルアラニン（ＧＲＬＧＷＳＦ）、８２２Ｄａ）、色素エオシンＹ（６９２Ｄａ）およびタートラジン（５３４Ｄａ）、ＭＲＩ造影剤ガドペンテト酸（５４８Ｄａ）、アミノグリコシド抗生物質トブラマイシン（４６８Ｄａ）、グルタチオン（３０７Ｄａ）およびトリプトファン（２０４Ｄａ）を含む様々な分子量を有する各種モデル親水性物質に対して、このプロセスを適用した。各製剤化は、５０ｗｔ％の最小ローディングで低多分散度を有するナノ粒子をもたらした。
実施例２：ナノ粒子のローディングおよびサイズの制御
【０１１５】
コア材料の沈殿のタイムスケールおよびポリマー自己集合のタイムスケールによって、ＦＮＰで生成した粒子サイズを制御し得る。材料濃度によって、および非プロセス溶媒の選択によって、これらのタイムスケールを調節する。
【０１１６】
コア材料の割合の増加は、強いてより大きい粒子を形成した。リゾチームおよびバンコマイシンでは両方とも、最初は、生物製剤を添加すると、ブロックコポリマーのミセルサイズと比較して、粒子サイズが減少した。これは、コア材料の添加が、電荷遮蔽効果によりＰＡＡのより強固なパッキングを可能にするためであり得る。リゾチームおよびバンコマイシンの両方の非常に高いローディングが得られた。大きい沈殿物の形成を伴わずに、７５ｗｔ％もの高いリゾチームのローディングが得られたが、粒子は、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して分析するには過度に大きかった。最大９０ｗｔ％のバンコマイシンのローディングは安定な粒子をもたらし、８０ｗｔ％未満のローディングでは、１００ｎｍ未満の粒子が観察された。これらのローディングにより、その高い水溶性および低いクロロホルム溶解性にもかかわらず、バンコマイシンは、おそらくはその芳香族基によって、表面の安定化において役割を果たしたことが示された。
【０１１７】
粒子サイズに影響を及ぼすことが見出されたさらなるプロセス変数には、ＤＭＳＯ流中のポリマーおよび生物製剤の総質量濃度、クロロホルム流中のアセトンの体積分率ならびにＤＭＳＯ流中の水の体積分率が含まれた。ＤＭＳＯ流への５ｖｏｌ％水の添加は、５０％ロードリゾチーム粒子のサイズを１２５ｎｍから４５ｎｍに減少させた。適切な製剤化パラメータを用いて、５０ｗｔ％を超えるローディングおよび１００ｎｍ未満の直径を有するナノ粒子は、ＦＮＰプロセスによって容易に達成可能であった。生物製剤の可溶性が無視可能である非プロセス溶媒を選択することによって、粒子は、非常に高い（＞９０％）カプセル化効率を有し得る。
実施例３：さらなるプロセシングのためのナノ粒子の安定化
【０１１８】
水性環境中でナノ粒子を安定化し、プロセシング工程中のカプセル化材料の損失を減少させるために、ＰＡＡシェルを架橋してゲルを形成する方法を調査した。イオン性架橋は、カプセル化物質を共有結合により改変するリスクを減少させるので、これに注目した。多価金属カチオンまたはポリアミンのいずれかで、アニオン性ＰＡＡ側基を架橋し得る（Ｓ．Ｂｏｎｔｈａ，Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｔ．Ｋ．Ｂｒｏｎｉｃｈ，Ｐｏｌｙｍｅｒ
ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｏｎｉｃ  ｃｏｒｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１１４（２００６）１６３−１７４；Ｔ．Ｋ．Ｂｒｏｎｉｃｈ，Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｖ．Ａ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｋ．Ｙｕ，Ａ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｏｘｉｄｅ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  Ａｎｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎ−Ａｌｋｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．３０（１９９７）３５１９−３５２５；Ｔ．Ｋ．Ｂｒｏｎｉｃｈ，Ｐ．Ａ．Ｋｅｉｆｅｒ，Ｌ．Ｓ．Ｓｈｌｙａｋｈｔｅｎｋｏ，Ａ．Ｖ．Ｋａｂａｎｏｖ，Ｐｏｌｙｍｅｒ
Ｍｉｃｅｌｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｏｎｉｃ  Ｃｏｒｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（２００５）８２３６−８２３７；Ｒ．Ｔ．Ｐａｔｉｌ，Ｔ．Ｊ．Ｓｐｅａｋｅｒ，Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（１９９７）４６９−４７４）。Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋またはＦｅ３＋の塩化物塩を非プロセス溶媒流に含めることによって、ナノ粒子を成功裏に安定化した。２つの第１級アミンおよび２つの第２級アミンを含有するスペルミンならびに正電荷抗生物質トブラマイシンも粒子を安定化した。ＦＮＰプロセス後に、イオン性ゲル化剤をナノ粒子溶液に添加し得る。
【０１１９】
３：１の酸性基対鉄比で含まれる塩化鉄ＩＩＩは、特に有効な架橋剤であった。５０ｗｔ％バンコマイシンをロードして鉄で架橋した粒子は、ＣＨＣｌ３中の７２ｎｍからメタノール（これは、非架橋ナノ粒子を溶解する）中の７９ｎｍに最小限に膨潤した。最小膨潤により、カプセル化生物製剤の放出を遅延させるために必要な小さいメッシュサイズが示された。例えば、メタノール中の最小膨潤は、強固な架橋を示した。鉄は、ナノ粒子のＴＥＭイメージングを可能にするほど十分な電子コントラストを提供した。２０〜４０ｎｍの粒子コアのＴＥＭ顕微鏡写真により、ＰＢＡシェルが測定に含まれていたためにより大きいサイズが示されたＤＬＳデータが裏付けられた。
実施例４：様々なカプセル化材料を用いて形成したナノ粒子
【０１２０】
以前に記載されている拘束衝突噴流ミキサー（ＣＩＪ）を使用したフラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）を使用して、カプセル化親水性モデル活性医薬品（ＡＰＩ）を有するナノ粒子（ＮＰ）を作製した。一般に、安定化ポリマー（ＰＢＡ−ｂ−ＰＡＡ）およびＡＰＩを、典型的にはＭｅＯＨまたはＤＭＳＯからなる高極性有機溶媒に溶解した。この流れを、等しい流量で、典型的にはＣＨＣｌ３またはアセトンからなる等しい体積流のより非極性の逆溶媒と迅速に混合した。最終ナノ粒子溶液が９０ｖｏｌ％逆溶媒となるように、ＣＩＪの出口流を逆溶媒の撹拌浴に収集した。
【０１２１】
架橋ＮＰのために、電荷比（ＰＡＡ上の酸性基と架橋剤の正電荷との比）が１：１となるように、架橋剤を逆溶媒流に含めた。
【０１２２】
親水性コアを有するナノ粒子（「逆」ナノ粒子）を形成し、小分子タートラジン、エオシンＹおよびガドリニウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）をカプセル化した。これらのカプセル化材料を用いて形成した一連の粒子の粒径分布は、図３Ａに示されている。
【０１２３】
親水性コアを有するナノ粒子を形成し、生物製剤抗生物質トブラマイシンおよびバンコマイシンをカプセル化した。これらのカプセル化材料を用いて形成した一連の粒子の粒径分布は、図３Ｂに示されている。
【０１２４】
親水性コアを有するナノ粒子を形成し、小分子生物製剤グルタチオンおよびトリプトファンをカプセル化した。これらのカプセル化材料を用いて形成した一連の粒子の粒径分布は、図３Ｃに示されている。
【０１２５】
親水性コアを有するナノ粒子を形成し、より大きい生物製剤リゾチームおよび「ペプチドＩ」（グリシン−アルギニン−ロイシン−グリシン−トリプトファン−セリン−フェニルアラニン（ＧＲＬＧＷＳＦ））をカプセル化した。これらのカプセル化材料を用いて形成した一連の粒子の粒径分布は、図３Ｄに示されている。
【０１２６】
上記カプセル化系に使用した実験条件は、以下の表２に示されている。
【表２−１】
2020125363.tif 000003
【表２−２】
2020125363.tif 000004
【０１２７】
これらのカプセル化材料のうち、最小カプセル化分子は１８６Ｄａの分子量を有しており、最大カプセル化分子はほぼ二桁大きい分子量（１４ｋＤａ）を有していたが、これは、このプロセスの汎用性を実証している。カプセル化粒子はまた広範な電荷を有しており、例えば、タートラジンは負に帯電しているのに対して、トブラマイシンは正に帯電している。
【０１２８】
当業者であれば、材料をカプセル化するための系を最適化して、最良の極性プロセス溶媒（例えば、ＤＭＳＯ対ＭｅＯＨ、場合により添加剤を含む）、非プロセス溶媒（逆溶媒）（例えば、アセトン、ＣＨＣｌ３、トルエンまたはＤＣＭ）、ポリマー／コア材料比および／または溶媒流の含水量を決定し得ることを認識するであろう。
実施例５：ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子
ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（１２ｋＤａ−ｂ−３ｋＤａ）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解した。塩基性酢酸クロムを９０ｍｇ／ｍＬの質量濃度でメタノールに溶解した。容量で１部のポリマー溶液対１部のクロム溶液で、溶液を混合した。混合物を調製した直後に、携帯用拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサーによって、クロロホルム流に対して１：１でそれを混合した。最終溶媒組成が容量で１部のメタノール対９部のクロロホルムとなるように、ＣＩＪミキサーの流出液をクロロホルムの急速撹拌浴に収集した。粒子を４日間混合して、クロムカチオンによるポリ（アクリル酸）の架橋を可能にした。得られた粒子はクロロホルム中で１３５ｎｍであり、多分散度指数（ＰＤＩ）は０．１未満であった。メタノール中で膨潤すると、得られた粒子は１９０ｎｍであり、ＰＤＩは０．１未満であった。通常の分析モードでＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して動的光散乱によって、粒子直径を測定した。
実施例６：グルタチオンを有するＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子
【０１２９】
ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（１２ｋＤａ−ｂ−３ｋＤａ）を４０ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解した。還元グルタチオン（ＧＳＨ）を２０ｍｇ／ｍＬの質量濃度で水およびメタノールの１：４混合物（容量対容量）に溶解した。塩基性酢酸クロムを９０ｍｇ／ｍＬの質量濃度でメタノールに溶解した。容量で１部のポリマー溶液対１部のクロム溶液対２部のグルタチオン溶液で、溶液を混合した。混合物を調製した直後に、携帯用拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサーによって、クロロホルム流に対して１：１でそれを混合した。最終溶媒組成が容量で１部の水対９部のメタノール対９０部のクロロホルムとなるように、ＣＩＪミキサーの流出液をクロロホルムの急速撹拌浴に収集した。粒子を４日間混合して、クロムカチオンによるポリ（アクリル酸）の架橋を可能にした。得られた粒子はクロロホルム中で１１０ｎｍであり、ＰＤＩは０．１未満であった。メタノール中で膨潤すると、得られた粒子は１３０ｎｍであり、ＰＤＩは０．１未満であった。通常の分析モードでＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して動的光散乱によって、粒子直径を測定した。
実施例７：グルタチオンを有するＰＡＡ−ｂ−ＰＥＧナノ粒子
【０１３０】
ポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）（５ｋＤａ−ｂ−５ｋＤａ）を４０ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解した。還元グルタチオンを２０ｍｇ／ｍＬの質量濃度で水およびメタノールの１：４混合物（容量対容量）に溶解した。塩基性酢酸クロムを５６ｍｇ／ｍＬの質量濃度でメタノールに溶解した。容量で１部のポリマー溶液対１部のクロム溶液対２部のグルタチオン溶液で、溶液を混合した。混合物を調製した直後に、携帯用拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサーによって、クロロホルム流に対して１：１でそれを混合した。最終溶媒組成が容量で１部の水対９部のメタノール対９０部のクロロホルムとなるように、ＣＩＪミキサーの流出液をクロロホルムの急速撹拌浴に収集した。粒子を４日間混合して、クロムカチオンによるポリ（アクリル酸）の架橋を可能にした。粒子をアセトンで希釈し、溶液から１５０００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをアセトンに再懸濁した。再び、粒子を溶液から１５０００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを脱イオン水に再懸濁した。通常の分析モードでＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して動的光散乱によって測定したところ、得られた粒子は直径２４５ｎｍであり、ＰＤＩは０．３５またはそれ未満であった。
実施例８：ヨウ化プロピジウムを有するＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子
【０１３１】
ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ（７．５ｋＤａ−ｂ−５．５ｋＤａ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、１０ｍｇ／ｍＬポリマーおよび０．１ｍｇ／ｍＬ  ＰＩの濃度で、５ｖｏｌ％水を含有するＭｅＯＨに溶解した。Ｆｅ３＋とＰＡＡモノマーとの最終比が１：３となるように、この流れ（５００μＬ）を、ＣＩＪミキサーによって、ＭｅＯＨに溶解した６００μＬのクロロホルムおよび５０μＬのＦｅＣｌ３からなる流れと迅速に混合した。ＣＩＪミキサーから排出されたこの流れを４．５ｍＬのクロロホルムに収集した。得られた約１００ｎｍの粒子は、クロロホルムおよびメタノール中で安定であったが、これは、鉄がＰＡＡコアを架橋したことを示している。その吸光度のシフトに基づいて、ＰＩは、ＰＡＡに結合すると決定された。
実施例９：ヨウ化プロピジウムを有するＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡナノ粒子のＰＬＧＡ微粒子への組み込み
【０１３２】
ロータリーエバポレーターによって、上記実施例８のナノ粒子を約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。２０倍容量の過剰な室温ヘキサン中で、濃縮粒子を沈殿させ、遠心分離によって溶液から取り出した。５ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡおよび０．１４ｍｇ／ｍＬ  ＥｔＴＰ５と一緒に、この粒子をＤＣＭに再懸濁して１５ｍｇ／ｍＬの濃度にした（ＰＬＧＡ＋ＰＢＡである全疎水性ポリマー含有量に対して１ｗｔ％）。１ｗｔ％ＰＶＡおよび４０ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する３ｍＬのＭＱ溶液に、５０μＬのＤＣＭ相を添加し、ＨＣｌを使用してこれをｐＨ２に調整した。バイアルを手動で穏やかに混合してエマルジョンを形成し、４０℃、３４０トルで５分間、続いて２００トルで１０分間および８０トルで４５分間ロータリーエバポレーションすることによってＤＣＭを取り出した。
【０１３３】
ＭＰ合成後、Ｌｉｅｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡を用いて、粒子をイメージングした。乾燥１０倍および４０倍レンズを使用して中央平面（落射蛍光モード）に焦点を合わせながら、大きいピンホールで粒子をイメージングした。６３３ｎｍソリッドステートラインでＥｔＴＰ５を励起し、６６０〜７８０ｎｍから発光を収集した。５４３ｎｍソリッドステートラインでＰＩを励起し、５６０〜６６０ｎｍから発光を収集した。２つの色素を励起し、別個にイメージングし、これらの画像を重ね合わせて、重ね合わせ画像にした。これらの画像は、図５に示されている。
実施例１０：トリブロックコポリマーを用いた逆ナノ粒子分散体の形成
【０１３４】
トリブロックコポリマーを用いて、逆ナノ粒子を形成し得る。トリブロックコポリマーは、Ａ−Ｂ−Ｃの順序で、化学的に別個な３つのブロックからなり得る。ブロックＡは、水および低極性有機溶媒に可溶性であり得る。例えば、ブロックＡは、水および非プロセス溶媒に可溶性であり得る。例えば、ブロックＡは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり得る。ブロックＢは、水に不溶性であり得、非プロセス溶媒に可溶性であり得る。例えば、ブロックＢは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）であり得る。ブロックＣは、非プロセス溶媒に不溶性であり得、プロセス溶媒および非プロセス溶媒を混合すると沈殿し得る。例えば、ブロックＣは、ポリ（アクリル酸）、ポリ（グルタミン酸）またはポリ（アスパラギン酸）であり得る。
【０１３５】
トリブロックコポリマーをプロセス溶媒に溶解し得る。カプセル化すべき水溶性材料もプロセス溶媒に溶解し得る。例えば、フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）技術を使用して、このプロセス溶媒流を非プロセス溶媒と迅速に混合し得る。この溶媒混合物では、カプセル化のための水溶性材料が沈殿する。この混合溶液混合物では、トリブロックコポリマーのブロックＣは沈殿するが、しかしながら、ブロックＡおよびＢは依然として可溶性である。ブロックＣおよび水溶性カプセル化材料は粒子のコアを形成し、ブロックＡおよびＢは混合溶液中でシェルを形成する。
【０１３６】
ブロックＢまたはＣを安定化し得る。例えば、ブロックＣがポリ（アスパラギン酸）、ポリ（アクリル酸）またはポリ（グルタミン酸）である場合、金属カチオンを使用してコアを安定化し得る。例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）カチオンを使用して、ポリ（グルタミン酸）を架橋し得る。
【０１３７】
ナノ粒子の形成後、ナノ粒子を別の溶媒（改質溶媒）にプロセシングし得る。この改質溶媒では、ブロックＡは可溶性であるが、しかしながら、ブロックＢは不溶性である。ブロックＣは、改質溶媒に可溶性または不溶性であり得る。例えば、ブロックＢがＰＬＡであり、ブロックＡがＰＥＧである場合、改質溶媒は水であり得る。改質溶媒では、ブロックＡは粒子の周囲に溶媒和シェルを形成し、ブロックＢおよびＣはコアを形成する。
実施例１１：ワクチンとしての逆ナノ粒子
【０１３８】
フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）プロセスを使用して、ワクチン、グリココンジュゲートワクチンおよびアレルギー処置のための脱感作剤などの免疫調節組成物として有用な粒子、例えば逆ナノ粒子および微粒子を生成し得る。例えば、このような免疫調節組成物は、感染性疾患（真菌、細菌、ウイルス、蠕虫ならびに他の単細胞および多細胞病原体によって誘導される疾患を含む）、癌、アレルギー、例えばアレルギー性喘息、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、免疫抑制（例えば、移植拒絶、中毒性物質に対する免疫化、および毒素に対する免疫化を予防するため）の予防または処置において使用され得る。
【０１３９】
４００ｎｍ未満のサイズのナノ粒子を生成する二重コーティングプロセスによってワクチンおよびアレルギー脱感作粒子を作製し得るか、またはそれらを凝集させて注射デポー製剤を作製し得る。
【０１４０】
ＦＮＰで形成されたワクチン構築物は、いかなるワクチン成分の共有結合的改変も伴わずに、単一工程でアセンブルし得る。広範囲の免疫刺激を与えるために、多くの異なるグリカンをナノ粒子コアに導入し得る。細菌タンパク質毒素などのタンパク質をナノ粒子コアに組み込み得る。例えば、ＦＮＰの急速沈殿工程では、完全ＣＲＭ１９７タンパク質（ポリサッカライドおよびハプテンを免疫原性にするための担体タンパク質として有用なジフテリア毒素の非毒性突然変異体）をナノ粒子コアに化学量論的に組み込み得、複雑かつ制御困難であり得る共有結合反応の必要性を回避し得る。したがって、ＦＮＰは、多価ワクチンの組成物を形成および保証するためのフレキシブルな経路を提供する。カプセル化タンパク質は、変性状態または天然状態であり得る。ワクチンナノ粒子およびその内容物は、マクロファージおよび他の免疫系細胞によってプロセシングされ得る。
【０１４１】
逆ナノ粒子を使用して、免疫応答を刺激する材料、例えば抗原をカプセル化（ローディング）し得、このような材料を免疫系の細胞に提示し得る。例えば、このような細胞は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞を含み得る。ナノ粒子は、免疫調節剤、免疫刺激剤および／または標的剤を含み得る。例えば、免疫調節剤は免疫応答を誘導し得るか、または発現されると免疫応答を誘導するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり得る。免疫調節剤は、抗原であり得る。免疫刺激剤は、例えば、調節性Ｔ細胞を刺激することによって免疫系を刺激し得る。標的剤は、細胞、組織、器官または細胞下構造の種類に関連する標的を認識し得る。食品の成分、化学物質、薬物、例えば抗生物質、ふけ、動物および植物タンパク質、動物毒、胞子および花粉を含む広範囲の抗原またはアレルゲンがある。
【０１４２】
アジュバントによって、ワクチンの活性を増強し得る。アジュバントは、抗原をトラップしてその徐放を提供することによって機能し得るか、または患者の体の免疫応答を増幅する刺激物として機能し得る。アジュバントは、無機材料、例えばミョウバンまたは水酸化アルミニウム、または有機材料、例えば鉱油であり得る。アジュバントは、合成材料または天然に存在する化合物、例えばスクアレン、細菌毒素、例えばテタノスパスミンもしくは誘導体またはオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であり得る。アジュバントは、親水性、疎水性または両親媒性であり得る。
【０１４３】
例えば、免疫調節組成物として機能する逆ナノ粒子は、免疫調節剤、免疫刺激剤または標的剤、例えばタンパク質、炭水化物、グリコシド、糖タンパク質、核酸、核タンパク質、脂質、糖脂質、リポポリサッカライド、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、細菌性ポリサッカライド、または高移動度群タンパク質（例えば、ＨＭＧＢ−１））、死生物、不活性化生物または弱毒化生物（例えば、細菌）またはウイルス、生物（例えば、細菌）またはウイルスの一部、例えばタンパク質コートを含み得る。例えば、免疫調節剤は親水性であり得、逆ナノ粒子のコアの内部に組み込まれ得る。別の例として、免疫調節剤は両親媒性であり得、コアの内部に部分的に組み込まれ得、逆ナノ粒子のシェルの内部に部分的に組み込まれ得る。または、免疫調節剤は疎水性であり得、逆ナノ粒子のシェルの内部に組み込まれ得る。逆ナノ粒子は、１種類を超える免疫調節剤を組み込み得る。例えば、遅延放出のために、疎水性標的剤を逆ナノ粒子のシェルに組み込み、親水性免疫調節剤または免疫刺激剤、例えば親水性タンパク質を逆ナノ粒子のコアのコア内に隔離することが有用であり得る。薬剤の隔離の組み込みは、非共有結合相互作用、例えば水素結合または静電相互作用の結果であり得る。
【０１４４】
逆ナノ粒子は、それが二官能性または多官能性を有するように、材料または化合物を組み込み得る。例えば、逆ナノ粒子は、バクテリアまたは細菌のクラスに対する免疫応答を刺激するための免疫調節剤（例えば、ポリサッカライド）と、例えば腸チフスの予防および／または処置のための抗生物質薬（例えば、シプロフロキサシン）との両方を含み得る。例えば、逆ナノ粒子は、免疫調節剤（例えば、ウイルスタンパク質）と、例えばＢ型肝炎の予防および／または処置のための抗ウイルス薬（例えば、ラミブジン）との両方を含み得る。
【０１４５】
免疫調節組成物またはワクチンとして機能する逆ナノ粒子は、生体適合性もしくは生分解性ポリマー、例えばポリカプロラクトン、または天然に存在するかもしくは天然に存在する化合物に由来するモノマー単位から形成されるポリマー、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）またはポリ（アミノ酸）、例えばポリ（グルタミン酸）およびポリ（アスパラギン酸）を含み得る。このような生分解性ポリマーのコポリマー、例えばポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）および生分解性ポリマーと非生分解性ポリマーとのコポリマーを使用し得る。
【０１４６】
逆ナノ粒子のシェルを架橋して、安定性を増強し、シェルまたはコアに組み込まれた薬剤の放出を制御し得る。
【０１４７】
例えば、肺炎球菌ワクチン、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫応答を刺激する莢膜ポリサッカライドに共有結合された免疫原性ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７を有するコンジュゲートワクチンを、実施例１０のトリブロックコポリマーと一緒に、水などの極性プロセス溶媒に添加して、水溶性ワクチン−トリブロックコポリマー溶液を形成し得る。例えば、トリブロックコポリマーは、ＰＥＧ（ブロックＡ）−ｂ−ＰＬＧＡ（ブロックＢ）−ｂ−ポリ（アスパラギン酸）（ブロックＣ）であり得る。非プロセス溶媒は、それに添加されて非プロセス溶液を形成する疎水性（または低親水性）アジュバント、例えばスクアレンを有し得る。次いで、フラッシュナノ沈殿（ＦＮＰ）技術によって、水溶性ワクチン−トリブロックコポリマー溶液を非プロセス溶液と迅速に混合し得る。形成された逆ナノ粒子は、ブロックＣ（ポリ（アスパラギン酸））セグメントによって形成された親水性コアにコンジュゲートワクチンを隔離し得、ブロックＢ−ブロックＡ（ＰＬＧＡ−ｂ−ポリ（アスパラギン酸））セグメントによって形成された低親水性シェルにスクアレンアジュバントを隔離し得る。
実施例１２：ポリサッカライドをカプセル化するポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）逆ナノ粒子を用いた放出アッセイ
【０１４８】
１０００ｇ／ｍｏｌ（「１ｋ」）および３２７５ｇ／ｍｏｌ（「３ｋ」）の平均分子量を有するマルトデキストリン（ＭＤ）ならびに２０，０００ｇ／ｍｏｌ（「２０ｋ」）のデキストラン（Ｄｅｘ）を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによって媒介される還元的アミノ化によって７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）にコンジュゲートした。核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、構造およびコンジュゲーションの程度を確認した。表１に要約されているように、ポリサッカライドを、ポリ（アクリル酸）４．８ｋ−ｂ−ポリ（スチレン）５ｋ（ＰＡＡ−ｂ−ＰＳ）と共にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／水流に溶解した。ポリ（アクリル酸）上の荷電基に対して０．５当量の架橋剤（テトラエチレンペンタミン、ＴＥＰＡ）をクロロホルム流に溶解した。急速微小混合によってポリサッカライドの沈殿およびＰＡＡブロックの崩壊を引き起こす拘束衝突噴流（ＣＩＪ）ミキサーを用いて、逆ナノ粒子（ＮＰ）を生成した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳを使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって、ＮＰの粒子サイズの特性評価を行った。ジメチルスルホキシドでナノ粒子流を希釈することによって、相関関数強度およびＮＰサイズ変化に基づいてＤＬＳによって、架橋度も評価した。
【０１４９】
また、重量１５ｋおよび５２ｋの異なるポリスチレンブロックサイズで、ポリサッカライドをカプセル化した。製剤は、例として提供されている表３に掲載されているものに限定されない。３ｋ  ＭＤの場合、ローディングは４０％〜９５％で変動し、安定な粒子は４０％〜８０％で形成した（ポリサッカライド／固体総重量）。ＤＭＳＯ流では、水含有量は０％〜１０％で変動し、総質量濃度は７ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで変動した。さらなる組成物は、調整可能なサイズのＮＰを生成するであろう。
【０１５０】
半飽和ブライン溶液を使用して非カプセル化ポリサッカライドを抽出することにより、表３の製剤のカプセル化効率（カプセル化した質量／添加した生物製剤の総質量）を決定することができた。すべてについて、カプセル化効率は９７％超であった。この優れた性能は、クロロホルムへの糖の溶解度が低いことに起因する。表３に要約されているように、すべてのサンプルが０．２未満の多分散度を有しているが、これは、多分散度が低いことを示している。
【０１５１】
表３：蛍光性ポリサッカライドの逆ＮＰの要約。ポリサッカライドの濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。
【表３】
2020125363.tif 000005
【０１５２】
抽出ベースのアッセイを使用して、逆ＮＰからの放出速度に対する製剤化パラメータの影響を評価した。このプロセスは、インビボで観察される放出についての情報を提供しないが、所定の放出速度を標的とする製剤を設計するための洞察を提供する。この実験では、逆ＮＰをクロロホルム層に保持し、ロータリーミキサーでブライン層と連続的に接触させた。ブライン相中のポリサッカライド濃度をＡＭＣの蛍光によってモニタリングして、ＮＰコアからの損失率を追跡した。ＰＳ−ｂ−ＰＡＡを安定化しない対照実験は、非カプセル化ポリサッカライドがブライン相に直ぐに局在することを示している。したがって、モデル生物製剤の分配率の変動は、ＮＰ製剤化によるものである。クロロホルムへの溶解度およびミキサーホールドアップに対する損失を説明するために、以下の放出値は、ブライン相における対照実験濃度に対して正規化されている。
【０１５３】
図７は、より大きいＰＳブロックサイズが３ｋ  ＭＤ−ＡＭＣの放出速度を遅延させることを示している。すべての生物製剤サイズについて、同じことが当てはまる。より大きいＰＳ層は、水界面からの立体障害を維持するのを支援し、ポリサッカライドの拡散に対してより大きい抵抗を与えるので、これは予想されるはずである。しかしながら、１５ｋ超のＰＳブロックでは、放出プロファイルの延長に対する分子量の増加の利益はほとんどない。
【０１５４】
図８Ａは、異なる架橋度を有する１ｋ  ＭＤ−ＡＭＣ（１０００ｇ／ｍｏｌ  ７−アミノ−４−メチルクマリンとコンジュゲートされたマルトデキストリン）ロード（カプセル化）逆ナノ粒子の放出速度に対する架橋度の影響を示す；ポリ（スチレン）−ｂ−ポリ（アクリル酸）から逆ナノ粒子を形成した（ポリ（スチレン）（ＰＳ）ブロックは、５０００ｇ／ｍｏｌ分子量であり、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）ブロックは、４８００ｇ／ｍｏｌ分子量である）。図８Ｂは、異なる架橋度を有する２０ｋ  Ｄｅｘ−ＡＭＣ（２０，０００ｇ／ｍｏｌ  ７−アミノ−４−メチルクマリンとコンジュゲートされたデキストラン）ロード（カプセル化）逆ナノ粒子の放出速度に対する架橋度の影響を示す；ポリ（スチレン）−ｂ−ポリ（アクリル酸）から逆ナノ粒子を形成した（ポリ（スチレン）（ＰＳ）ブロックは、５０００ｇ／ｍｏｌ分子量であり、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）ブロックは、４８００ｇ／ｍｏｌ分子量である）。図８Ａおよび８Ｂでは、「Ｅｑ」は、ＰＡＡブロック上の酸性基に対するＴＥＰＡクロスリンカーの当量を表す。架橋度は、最大モデル生物製剤（図８Ａ）については放出速度に対して影響を有するが、最小のもの（図８Ｂ）については影響を有しないことが見出された。これは、コアからの拡散制御放出を示唆しており、速度は、メッシュサイズが拡散種サイズに近づく場合にのみ減少する。ポリサッカライドの分子量の関数としての放出速度も研究した。全体的としては、２０ｋ  Ｄｅｘ−ＡＭＣについて、最も遅い放出が見られる。しかしながら、１ｋ  ＭＤ−ＡＭＣの速度は、３ｋ  ＭＤ−ＡＭＣよりも遅い。これは、１ｋポリサッカライドの質量当たりの電荷が３ｋポリサッカライドよりも高いことに起因し得る。（フルオロフォアに対する第２級アミンリンカーによる）より高い電荷は、ＰＡＡコアとのより大きい電荷間相互作用およびより遅い放出をもたらすであろう。
実施例１３：逆ナノ粒子のためのポリ（乳酸）−ｂ−ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（乳酸）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）ブロックコポリマーの合成
【０１５５】
生体適合性および生分解性安定化ポリマーは、本発明の生物医学的用途において有用である。このようなポリマーの例は、ポリ（乳酸）−ｂ−ポリ（アスパラギン酸）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＡｓｐＡ）である。このポリマーのブロックは両方とも、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含むプロセス溶媒に可溶性である。ジクロロメタンおよびクロロホルムを含む非プロセス溶媒は、ＰＡｓｐＡブロックを選択的に沈殿させ、ＰＬＡブロックの溶解性を維持する。ＰＡｓｐＡ上の酸性基は官能性を提供し、これを介して、水性媒体中へのさらなるプロセシングのために粒子を安定化し得る。例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）などの金属カチオンを用いて、ＰＡｓｐＡを架橋し得る。以下のように、ＰＬＡ−ｂ−ＰＡｓｐＡジブロックコポリマーを調製した。
【化１】
2020125363.tif 000006
【０１５６】
ラクチド（１７．３ミリモル）およびＮ−Ｂｏｃ−エタノールアミン（０．４５ミリモル）を乾燥丸底フラスコ中に計量し、高減圧下で１２時間乾燥させた。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．４５ミリモル）を別のフラスコ中に計量し、高減圧下で１２時間乾燥させた。乾燥クロロホルムを各フラスコに添加し、ＤＭＡＰをラクチドフラスコにカニューレ挿入して、１．５Ｍのラクチド濃度でＰＬＡ重合を開始させた（工程１、スキーム１）。重合は、６０℃で３日間進行した。得られた約５ｋＤａポリマーを過剰な氷冷イソプロピルアルコール中に沈殿させ、続いて、ドライアイス冷却メタノール中にさらに２回沈殿させた。得られた精製ポリマーを高減圧下で一晩乾燥させた。
【０１５７】
ＨＯ−ＰＬＡ−Ｂｏｃの得られたヒドロキシル末端を安息香酸無水物でキャッピングした（工程２、スキーム１）。３モル当量のＤＭＡＰ、５モル当量のトリメチルアミンおよび５モル当量の無水安息香酸を含む乾燥ジクロロメタンに、ＨＯ−ＰＬＡ−Ｂｏｃを５０ｍＭのポリマー濃度で溶解した。反応を室温で１２時間行い、続いて、氷冷イソプロピルアルコール中に沈殿させ、続いて、ドライアイス冷却メタノール中にさらに２回沈殿させた。得られたＨＯ−ＰＬＡ−Ｂｏｃポリマーを高減圧下で一晩乾燥させた。
【０１５８】
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して、Ｂｚｌ−ＰＬＡ−ＢｏｃポリマーのＢＯＣ基を切断した（工程３、スキーム１）。ポリマーを乾燥させ、乾燥ジクロロメタンに溶解し、次いで、最終溶液が１５ｖｏｌ％ＴＦＡおよび１０ｍＭポリマーとなるようにＴＦＡを添加した。反応を４時間進行させ、次いで、冷ヘキサン中に沈殿させて、ＴＦＡを除去した。次いで、１０モル当量のトリメチルアミンを含むジクロロメタンにポリマーを再溶解し、３０分間混合して、脱保護アミンをそのＴＦＡ塩形態からその遊離塩基形態にした。Ｂｚｌ−ＰＬＡ−ＮＨ２ポリマーをドライアイス冷却イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中に２回沈殿させ、高減圧下で一晩乾燥させた。
【０１５９】
マクロ開始剤としてＢｚｌ−ＰＬＡ−ＮＨ２を使用して、ジブロックコポリマーの第２のブロックを成長させた（工程４ａ、スキーム１）。マクロ開始剤（０．０２ミリモル）およびアスパラギン酸のＯ−Ｂｚｌ保護Ｎ−カルボキシ無水物モノマー（０．８７ミリモル）を、５ｍＭの開始剤濃度で乾燥クロロホルムに溶解した。重合を４０℃で２４時間進行させ、その後、等容量の濃ＨＢｒ酢酸溶液を添加して、ＰＡｓｐＡ側鎖からＯ−Ｂｌｚ基を除去した（工程４ｂ、スキーム１）。脱保護を室温で１時間行い、その後、ポリマーを冷ジエチルエーテル中に３回沈殿させた。得られたＰＬＡ５ｋＤａ−ｂ−ＰＡｓｐＡ５ｋＤａポリマーを高減圧下で一晩乾燥させた。
【０１６０】
この合成スキームは、様々な分子量を有するポリマーの生成に適用することができ、本明細書に記載される５ｋＤａブロック分子量に限定されない。加えて、アスパラギン酸モノマーの代わりにグルタミン酸のＯ−Ｂｚｌ保護Ｎ−カルボキシ無水物モノマーを用いて、ポリ（乳酸）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＧｌｕＡ）を得ることができる。ナノ粒子プロセスでは、ＰＬＡ−ｂ−ＰＡｓｐＡと同様に、ＰＬＡ−ｂ−ＰＧｌｕＡを使用し得る。
【０１６１】
本明細書に例示および記載される実施形態は、本発明を実施し使用するために、本発明者らが知る最良の方法を当業者に教示することのみを意図したものである。本明細書に記載されるいかなる事項も本発明の範囲を限定するとみなされないものとする。提示されている実施例はすべて代表例であり、限定するものではない。本発明の上記実施形態は、上記教示に照らして当業者によって、認められる程度に本発明から逸脱せずに改変または変更し得る。したがって、本発明は、特許請求の範囲およびそれに等価なものの範囲内で、具体的に記載されているものとは異なって実施し得ると理解すべきである。
【図１】
2020125363.tif 000007
【図２ＡＢ】
2020125363.tif 000008
【図２ＣＤ】
2020125363.tif 000009
【図３ＡＢ】
2020125363.tif 000010
【図３ＣＤ】
2020125363.tif 000011
【図４】
2020125363.tif 000012
【図５】
2020125363.tif 000013
【図６】
2020125363.tif 000014
【図７】
2020125363.tif 000015
【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月29日(2020.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性物質をカプセル化するための方法であって、
前記水溶性物質を第１の極性プロセス溶媒に溶解して水溶性物質溶液を形成すること、
コポリマーを第２の極性プロセス溶媒に溶解してコポリマー溶液を形成すること、
少なくとも１つのクラウダーを前記第１の極性プロセス溶液、前記第２の極性プロセス溶液および／または非プロセス溶媒に溶解すること、
前記水溶性物質溶液および前記コポリマー溶液と前記非プロセス溶媒とを連続的かつ迅速に混合して混合溶液を形成し、前記混合溶液から逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成すること、ならびに
前記逆ナノ粒子を凝集させ、微粒子またはより大きい構築物を形成して、前記水溶性物質をカプセル化すること
によって、前記逆ナノ粒子分散液を作製することを含み、
前記コポリマーが、少なくとも１つの高極性領域と、少なくとも１つの低極性領域とを含み、
前記非プロセス溶媒が、前記第１の極性プロセス溶媒よりも低極性であり、
前記非プロセス溶媒が、前記第２の極性プロセス溶媒よりも低極性であり、
前記逆ナノ粒子が、コアとシェルとを含み、
前記コアが、前記コポリマーの前記高極性領域と前記水溶性物質を含み、
前記シェルが前記コポリマーの前記低極性領域を含み、
前記クラウダーが、グリセロール、糖、ポリサッカライド、エリスリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アクリレート、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、、塩、緩衝液および組み合わせからなる群から選択され、および
前記混合が、前記混合溶液からの、前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒の２０容量％以下の相分離を引き起こす、方法。
【請求項２】
前記クラウダーが、糖、ポリサッカライド、マルトデキストリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリアクリレート、ポリアクリル酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）および組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コポリマーが、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり、
前記コポリマーが形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し、
ブロックＡ、ＢおよびＣがそれぞれ、他のブロックと化学的に別個である、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶性物質が、生物学的材料、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、サッカライド、グルタチオン、トリプトファン、リゾチーム、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、小分子治療薬、トブラマイシン、バンコマイシン、イメージング剤、エオシン、エオシンＹ、タートラジン、金属キレート、ガドリニウムキレートおよびガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＧＤ−ＤＴＰＡ）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記コポリマーの前記少なくとも１つの高極性領域が、少なくとも１つのアニオン性高極性領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアニオン性高極性領域が、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ヒアルロン酸、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）または組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コポリマーの前記少なくとも１つの低極性領域が、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルまたは組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ブロック−ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＡＡ−ｂ−ＰＢＡ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（乳酸）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記コポリマーがポリ（アスパラギン酸）−ブロック−ポリ（カプロラクトン）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、水、アルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、グリコールエーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）および組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記非プロセス溶媒が、ハロアルカン、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジクロロメタン、アルカン、ヘキサン、エーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン、アセトンおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の極性プロセス溶媒が前記第２の極性プロセス溶媒と同じである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶性物質および前記コポリマーの両方を単一極性プロセス溶媒に溶解して単一溶液を形成し、前記単一溶液と前記非プロセス溶媒とを単一の流れとして連続的に混合し、前記逆ナノ粒子が集合して逆ナノ粒子分散液を形成する前記混合溶液を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記コポリマー溶液と前記非プロセス溶媒との混合時間が、前記ナノ粒子の集合時間未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶性物質および前記コポリマーが、前記混合溶液中で１０〜１０，０００の範囲の過飽和レベルを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記逆ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記コポリマーの架橋によって前記逆ナノ粒子を安定化することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記コポリマーの前記高極性領域を架橋して、前記逆ナノ粒子の前記コアを安定化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記コポリマーの前記低極性領域を架橋して、前記逆ナノ粒子の前記シェルを安定化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記逆ナノ粒子の集合の間に前記コポリマーを架橋する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記架橋が共有結合性架橋である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記架橋が、非共有結合性、イオン性、キレート化、酸−塩基および／または水素結合架橋である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が、アルカリ土類ハロゲン化物、ハロゲン化マグネシウム、塩化マグネシウム、ハロゲン化カルシウム、塩化カルシウム、遷移金属ハロゲン化物、ハロゲン化鉄、塩化鉄（ＩＩＩ）、スペルミンおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
架橋剤を添加してアニオン官能性の前記コポリマーの部分を架橋し、前記架橋剤が酢酸クロム（ＩＩＩ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記架橋剤が、ポリクエン酸、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、多価アニオンおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記逆ナノ粒子分散液が非極性溶媒相にあり、
極性外部相で前記非極性溶媒相を乳化し、前記非極性溶媒を除去して前記ナノ粒子を凝集させ、微粒子を形成することによって、前記逆ナノ粒子を凝集させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記非極性溶媒相に可溶性の化合物、脂質および／またはポリマーを、前記微粒子の形成を支援する接着分子として前記非極性相に組み込む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（チロシン）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物、脂質および／またはポリマーが親油性領域を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
生体適合性物質で前記微粒子をコーティングする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記生体適合性物質が、部分的に加水分解されたポリビニルアルコールからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体適合性物質が、部分的に加水分解されたポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンオキシド）のブロックコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（ブチレンオキシド）のブロックコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）−ｂ−ポリ（プロピレンスルフィド）のブロックコポリマー、脂質および組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体適合性物質が、脂質ならびにポリ（エチレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリカプロラクタム、ポリエステルおよび／またはポリラクチド−ｃｏ−グリコリドを含むブロックまたはグラフトコポリマーからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記逆ナノ粒子分散液を霧化すること、および固体、本質的には乾燥微粒子を形成するために噴霧乾燥工程の間に前記逆ナノ粒子分散液を乾燥させることによって、前記逆ナノ粒子を凝集させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３６】
前記非極性溶媒相に可溶性の化合物、脂質および／またはポリマーを前記非極性相に組み込む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記ポリマーが、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）（ＰＢＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（チロシン）、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリエステルおよび組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記非極性溶媒相に可溶性の前記化合物、脂質および／またはポリマーが親油性領域を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
噴霧乾燥前に前記逆ナノ粒子分散液に導入された生体適合性物質で前記凝集微粒子をコーティングする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記コポリマーが、約１，０００Ｄａ〜約６０，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する疎水性ブロックを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノ粒子が、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％の水溶性物質のローディングを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記微粒子が、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、４５ｗｔ％、５０ｗｔ％、６５ｗｔ％、７５ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％の水溶性物質のローディングを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
逆ナノ粒子の凝集体を含む微粒子であって、
各逆ナノ粒子が、コポリマーの高極性領域を含むコアと、前記コポリマーの低極性領域を含むシェルとを含み、
水溶性物質が前記コア内にあり、
クラウダーが前記コア内にあり、
前記クラウダーが、グリセロール、糖、ポリサッカライド、エリスリトール、アラビノース、キシロース、リボース、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、マルトース、グルコース、マンノース、トレハロース、スクロース、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アクリレート、カルボマー１３４２、グルコースポリマー、シリコーンポリマー、ポリジメチルシロキサン、カルボキシメチルセルロース、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ乳酸、デキストラン、ポロキサマー、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３３５０、プロピレングリコール、、塩、緩衝液および組み合わせせからなる群から選択される、微粒子。
【請求項４４】
前記クラウダーが、糖、ポリサッカライド、マルトデキストリン、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリアクリレート、ポリアクリル酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４３に記載の微粒子。
【請求項４５】
前記コポリマーが、ブロックＡ、ＢおよびＣを含むトリブロックコポリマーであり、
前記コポリマーが形態Ａ−Ｂ−Ｃを有し、
ブロックＡ、ＢおよびＣがそれぞれ、他のブロックと化学的に別個である、
請求項４３または４４に記載の微粒子。
【請求項４６】
前記逆ナノ粒子間のマトリックスに接着分子をさらに含み、前記接着分子が、疎水性化合物、脂質および／または疎水性ポリマーからなる群より選択される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項４７】
前記シェルを含む前記コポリマーの前記低極性領域によって、前記微粒子からの前記水溶性物質の拡散速度を制御する、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項４８】
ブロックＡがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であり、
ブロックＢが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリエステルからなる群より選択され、ならびに
ブロックＣが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項４９】
架橋剤を添加してブロックＣを架橋することをさらに含み、
ブロックＣが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）からなる群より選択され、ならびに
前記架橋剤が金属カチオンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５０】
ブロックＡがポリ（エチレングリコール）ＰＥＧであり、
ブロックＢがポリ（乳酸）（ＰＬＡ）であり、および
前記改質溶媒が水である、請求項３に記載の方法。
【請求項５１】
前記コポリマーがジブロックコポリマーであり、および
前記水溶性物質がポリサッカライドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５２】
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５３】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記コポリマーがポリ（アクリル酸）−ｂ−ポリ（スチレン）であり、および
前記架橋剤がテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の極性プロセス溶媒および前記第２の極性プロセス溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水を含み、
前記非プロセス溶媒がクロロホルムであり、ならびに
前記架橋剤を前記非プロセス溶媒に溶解する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記水溶性物質が、マルトデキストリン、デキストランおよび組み合わせからなる群より選択されるポリサッカライドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記架橋剤が金属カチオンである、請求項９に記載の方法。
【請求項５８】
架橋剤を添加して前記コポリマーを架橋することをさらに含み、
前記架橋剤が鉄（ＩＩＩ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項５９】
前記コポリマーがポリ（グルタミン酸）−ｂ−ポリ（乳酸）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６０】
前記ナノ粒子を両親媒性ポリマーでコーティングすることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６１】
前記両親媒性ポリマーが、ポリスチレン−ブロック−ｐｏｌｙ（エチレンオキシド）（ＰＳ−ｂ−ＰＥＯ）、ポリ（乳酸）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＯ）、ポリ（カプロラクトン）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯ）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＯ）からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【外国語明細書】
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