(57)【要約】      （修正有）【課題】ASPH発現腫瘍のためのペプチドベースの免疫療法を提供する。【解決手段】治療的有効量の精製アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ（ASPH）ペプチドを含む組成物であって、該ペプチドが、長さが少なくとも7アミノ酸かつ完全長ASPHタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、かつ、HLAクラスIまたはクラスII拘束性エピトープ配列を含む、組成物。【選択図】図６
2020125325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量の精製アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ（ASPH）ペプチドを含む組成物であって、該ペプチドが、長さが少なくとも7アミノ酸かつ完全長ASPHタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、かつ、HLAクラスIまたはクラスII拘束性エピトープ配列を含む、組成物。
【請求項２】
ペプチドが、
2020125325.tif 000015
のHLAクラスII拘束性配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
ペプチドが、YPQSPRARY（SEQ ID NO:26）のHLAクラスI拘束性配列を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
ペプチドが、SEQ ID NO: 1〜45からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
薬学的担体、アジュバント、または他の共成分（co-ingredient）をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
請求項1に記載の組成物を含む、ワクチン。
【請求項７】
請求項1に記載の組成物を含む、細胞株。
【請求項８】
対象においてASPH発現腫瘍の成長を低減させるための方法であって、請求項1に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項９】
対象においてASPH発現腫瘍の発症を予防するための方法であって、ASPH発現腫瘍に罹患している対象を特定する工程、および請求項1に記載の組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
対象においてASPH発現腫瘍の転移を低減させるための方法であって、請求項1に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
腫瘍が、肝臓癌、胃腸癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、卵管癌、喉頭癌、肺癌、甲状腺癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、および脳腫瘍からなる群より選択される、請求項8、9、または10に記載の方法。
【請求項１２】
対象が、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはブタ対象である、請求項8、9、または10に記載の方法。
【請求項１３】
投与する工程の前に、同時に、またはその後に第2の療法をさらに含む、請求項8、9、または10に記載の方法。
【請求項１４】
追加の療法が、経動脈塞栓術（TAE）、経動脈化学塞栓術（TACE）、放射線塞栓術（RE）、および／または局所切除である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
患者由来の免疫細胞を、SEQ ID NO: 1〜45からなる群より選択されるペプチドと接触させる工程をさらに含み、選択されたペプチドが、HLAクラスIまたはクラスII拘束性T細胞応答を誘発することを特徴とする、請求項8、9、または10に記載の方法。
【請求項１６】
選択されたペプチドが、HLA-DRB1拘束性ASPH T細胞応答を誘発する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
T細胞応答が、DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、およびDRB1*1501からなる群より選択されるHLA-DRB1対立遺伝子の1つまたは複数に拘束される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
選択されたペプチドが、HLA-AまたはHLA-B拘束性ASPH T細胞応答を誘発する、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
T細胞応答が、A*0101、A*0201、A*0301、A*2402、B*0702、およびB*4403からなる群より選択される1つまたは複数のHLA-A対立遺伝子に拘束される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
T細胞応答が、B*0702、およびB*4403からなる群より選択される1つまたは複数のHLA-B対立遺伝子に拘束される、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年4月24日に出願された米国特許仮出願第61/983,874号の優先権を主張し、そのすべての内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦支援研究についての陳述
本発明は、NIH助成金CA-123544およびU19AI082642の下、米国政府の援助で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、癌のためのペプチドベースの免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
肝細胞癌（HCC）は、世界中の癌関連死の3番目に多い原因であり、非常に悪い予後および高率の死亡率を特徴とする1,2。利用可能な治療様式は、大部分は不十分である。現在、外科的切除術が最適な処置アプローチと考えられている。しかし、少しの割合の患者のみが処置に適格であるにすぎず、高い再発率が手術に続く3,4。したがって、新たな処置戦略の開発は、高い臨床上の優先事項である。
【０００５】
アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ（ASPH）は、アスパルチル-アスパラギニル-β-ヒドロキシラーゼとしても公知であり、a-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼファミリーに属する2型膜貫通タンパク質である5。それは、高度に保存されている酵素であり、ノッチ（Notch）およびノッチホモログを含むタンパク質の上皮成長因子様ドメインにおけるアスパルチル残基およびアスパラギニル残基のヒドロキシル化を触媒する6-8。ASPHは、正常肝組織と比較してHCCにおいて過剰発現しており；過剰発現は、細胞の運動性および浸潤の増大を特徴とする悪性表現型を生じる6,9。報告されているところによると、HCCにおけるASPH発現のレベルは、術後予後と有意に相関する10。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、癌と診断された患者の処置のための、化学療法に代わるものの長年にわたる問題に対して、解決策を提供する。
【０００７】
例えば、肝細胞癌（HCC）は、高い再発率および有効な全身療法の不足により、悪い予後を有する。アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ（ASPH）は、HCCにおいて過剰発現し、悪性表現型を促進する、高度に保存されている膜貫通タンパク質である。本明細書に記載されている癌免疫療法のための方法は、腫瘍細胞を特異的に標的とする有効な免疫応答を誘導する。腫瘍関連抗原（TAA）に特異的なT細胞応答がしばしば観察されるが、TAAは、臨床転帰に影響を及ぼすほど十分に堅牢ではない。本発明は、改善されたASPHベースの免疫療法を提供する。特に、ASPHに由来するHLAクラスI拘束性ペプチドおよびクラスII拘束性ペプチドの両方が、HCCにおいてT細胞活性化を誘導した。ASPHペプチドは、ヒトPBMCの中でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の抗原特異的活性化を誘発し、ASPHが、HCC免疫療法に適するHLAクラスI拘束性エピトープおよびクラスII拘束性エピトープの両方を含有することを示した。
【０００８】
したがって、本発明は、治療的有効量の精製ASPHペプチドを含む組成物を含む。例えば、ペプチドは、長さが少なくとも7アミノ酸（例えば、少なくとも8アミノ酸または少なくとも9アミノ酸）かつ完全長ASPHタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、かつ、HLAクラスIまたはクラスII拘束性エピトープ配列を含む。配列は、好ましくは、完全長ASPHタンパク質の連続したアミノ酸である。例えば、ペプチドは、
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のHLAクラスII拘束性配列を含む。別の例において、ペプチドは、YPQSPRARY（SEQ ID NO:26）のHLAクラスI拘束性配列を含む。精製または単離されたワクチンペプチドは、天然に存在する完全長ASPHタンパク質において参照配列に隣接するアミノ酸を含有しない。参照配列は、SEQ ID番号によって同定される。
【０００９】
好ましい態様において、ワクチンは、少なくとも2種のペプチドを含有し、例えば、ワクチン組成物は、5、10、15、20種またはそれより多い、異なるASPHペプチドを含有する。例示的なワクチンは、本明細書において列挙および説明されるものから選択される、10〜15種の異なるペプチドを含有する。例えば、ASPHペプチド（またはペプチドの組み合わせ／混合物）は、SEQ ID NO: 1〜45からなる群より選択される。ASPHペプチドの「治療的有効量」とは、レシピエントにおいて免疫原性応答を誘導するのに有効な量である。いくつかの例において、免疫原性応答は、有害な健康への影響またはその合併症を含む、疾患または状態（ASPH発現腫瘍など）の徴候または症状を阻害（予防を含む）または改善するのに妥当である。体液性免疫または細胞媒介性免疫のいずれかまたは両方を、本明細書において開示されるASPHペプチド（例えば、免疫原性組成物における）によって誘導することができる。いくつかの例において、ワクチン組成物は、Treg細胞を刺激するアミノ酸配列を特徴とするペプチドを含まない。
【００１０】
ASPH発現腫瘍は、胃腸組織（例えば、食道、胃、結腸）、膵臓、肝臓（例えば、胆管細胞癌、肝細胞癌）、乳、前立腺、子宮頚、卵巣、卵管、喉頭、肺、甲状腺、胆嚢、腎臓、膀胱、および脳（例えば、神経膠芽腫）の腫瘍、ならびに下記の多数の他のものなどの、大部分の腫瘍タイプを含む。ASPH発現腫瘍は、正常組織と比較して増大したレベルのASPHを発現する原発腫瘍、およびそのようなASPH過剰発現原発腫瘍からの転移によって生じる腫瘍を含む。
【００１１】
本明細書に記載されている組成物を含むワクチンもまた、本発明内である。次いで、選択されたペプチド、ポリペプチド、核酸配列、またはそれらのペプチドの組み合わせが、ワクチン組成物において組み合わされる。適したワクチンは、好ましくは、1〜20種のペプチド、より好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種の異なるペプチド、さらに好ましい6、7、8、9、10、11、12、13、または14種の異なるペプチド、および最も好ましくは、12、13、または14種の異なるペプチドを含有する。あるいは、適したワクチンは、好ましくは、1〜20種の核酸配列、より好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20種の異なる核酸配列、さらに好ましい6、7、8、9、10、11、12、13、または14種の異なる核酸配列、および最も好ましくは、12、13、または14種の異なる核酸配列を含有することになる。
【００１２】
「ペプチド」という用語により、特定の長さは意味されない。例えば、ASPHペプチドは、長さが25アミノ酸未満、例えば、長さが25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、もしくは5アミノ酸未満、またはそれと同等である。例えば、ペプチドは、長さが7〜10アミノ酸の範囲、例えば、長さが少なくとも8アミノ酸、または長さが少なくとも9アミノ酸である。ASPHペプチドは、L-アミノ酸、D-アミノ酸、または両方の組み合わせのポリマーであることができる。
【００１３】
ワクチンは、予防用ワクチンまたは治療用ワクチンとして有用である。
【００１４】
本発明の任意のワクチン組成物は、薬学的担体、アジュバント、または他の共成分（co-ingredient）をさらに含み得る。アジュバントとは、免疫原性作用物質（本明細書において開示されるASPHペプチドなど）と組み合わせて使用される際に、結果として生じる免疫応答を強化する、またはさもなければ変更もしくは改変する化合物、組成物、または物質である。いくつかの例において、アジュバントは、免疫原性作用物質により対象において誘導される抗体のタイターまたはT細胞活性化のレベルを増大させる。別の例において、抗原性作用物質が、多価の抗原性作用物質である場合、アジュバントは、対象において誘導される抗体が特異的に結合する特定のエピトープ配列を変更する。
【００１５】
例示的なアジュバントは、フロイント不完全アジュバント（IFA）、フロイント完全アジュバント、B30-MDP、LA-15-PH、montanide、サポニン、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩（Amphogel, Wyeth Laboratories, Madison, N.J.）、ミョウバン、脂質、キーホールリンペットタンパク質、ヘモシアニン、MF59マイクロエマルジョン、マイコバクテリア抗原、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ポリアニオン、両親媒性物質、ISCOM（欧州特許第EP 109942号において開示されているものなどの、免疫刺激複合体）、植物油、Carbopol、酸化アルミニウム、油乳剤（Bayol FまたはMarcol 52など）、大腸菌（E. coli）易熱性毒素（LT）、コレラ毒素（CT）、セラミド、およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。周知であり、ヒト用途に適している代表的なアジュバントは、アルミニウム塩（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウムカリウム）、ならびにモノホスホリルリピドAを含む。
【００１６】
薬学的に許容されるビヒクルまたは担体は、溶媒、乳化剤、懸濁剤、分解物、結合剤、賦形剤、安定剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、潤滑剤、界面活性剤、アジュバント、または他の適したビヒクルを含むが、これらに限定されない。ワクチン組成物は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、注射、注入により、または摂取により投与する。例えば、ワクチンを、筋肉内に、皮下に、皮内に、および／または経口で投与する。
【００１７】
本明細書に記載されている1つまたは複数のASPHペプチドを発現する細胞株もまた、本発明内である。
【００１８】
対象においてASPH発現腫瘍の成長を低減させるための方法は、本発明の組成物（または本発明のワクチン）を対象に投与する工程を含む。ASPH発現腫瘍の成長は、そのような組成物またはワクチンの投与後に低減する。例えば、腫瘍成長、および／または腫瘍の質量もしくは負荷量は、いずれの処置もないものよりも、10％、20％、50％、75％、2倍、5倍、10倍、またはそれより多く低減する。方法は、ヒト患者などの哺乳動物対象由来のASPH発現腫瘍を低減させて除去するために使用される。組成物および方法はまた、伴侶動物および家畜、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはブタ対象における使用にも適している。
【００１９】
哺乳動物において腫瘍成長を阻害する方法は、ASPH発現腫瘍に罹患している対象を特定する工程、および本発明の組成物またはワクチンを対象に投与する工程によって実施される。哺乳動物において腫瘍の発症を予防する方法は、ASPH発現腫瘍を発症するリスクがある対象（癌の家族歴を有する人など）を特定する工程、および本発明の組成物またはワクチンを対象に投与する工程を含む。ASPH発現腫瘍の転移を予防する方法は、ASPH発現腫瘍に罹患している対象を特定する工程、および上記のような本発明の組成物またはワクチンを対象に投与する工程によって実施される。
【００２０】
処置される個々の患者または対象は、様々なクラスIIまたはクラスI HLA分子のそれらの発現パターンを判定することによって、特徴決定され得る。したがって、処置される個体を、そのHLA構成を評定するため、例えば、それらがどのHLA分子を発現しているかを判定するため、および／または、ペプチド、例えばSEQ ID NO: 1〜45のうちのどれが、HLA分子／候補ワクチンペプチドの結合または免疫細胞活性化によってワクチン組成物中に含まれるのに最も適しているかを判定するために、任意でスクリーニングする。したがって、方法は、SEQ ID NO: 1〜45からなる群由来の1つまたは複数のペプチドを選択する工程をさらに含み得る。患者由来の免疫細胞または免疫細胞の集団、例えば、PBMCまたは精製T細胞の集団を、精製ペプチドと接触させ、細胞の免疫活性化を判定する。あるいは、患者細胞（または患者が発現しているHLA分子）に対するペプチドの結合を、測定する。ワクチン調製物中への包含のために選択されたペプチドは、HLAクラスIまたはクラスII拘束性T細胞応答を誘発するものとして特徴決定される。例えば、選択されたペプチドは、HLA-DRB1拘束性ASPH T細胞応答を誘発し、例えば、T細胞応答は、DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、およびDRB1*1501からなる群より選択されるHLA-DRB1対立遺伝子の1つまたは複数に拘束される。あるいはまたは加えて、選択されたペプチドは、HLA-AまたはHLA-B拘束性ASPH T細胞応答を誘発する。例えば、T細胞応答は、A*0101、A*0201、A*0301、A*2402、B*0702、およびB*4403からなる群より選択される1つまたは複数のHLA-A対立遺伝子に拘束され、かつ／または、T細胞応答は、B*0702、およびB*4403からなる群より選択される1つまたは複数のHLA-B対立遺伝子に拘束される。いくつかの好ましい態様において、ワクチン組成物は、HLAクラスII拘束性であるペプチド（ヘルパーT細胞応答を誘発するため）、およびHLAクラスI拘束性であるペプチド（細胞傷害性T細胞応答を誘発するため）を含有する。
【００２１】
本明細書に記載されている任意の方法はまた、投与する工程の前に、同時に、またはその後に併用療法も含み得る。「併用療法」はまた、他の生物学的に活性を有する成分および追加の療法（例えば、手術または放射線処置）とさらに組み合わせて、上記のような治療剤（少なくとも1つのASPHペプチドを含む組成物またはワクチン）の投与も採用する。併用療法が追加の処置をさらに含む場合、追加の処置は、治療剤と追加の処置との組み合わせの共作用から有益な効果が達成される限り、任意の適した時に行われ得る。例えば、適切な場合、有益な効果は、追加の処置が、ことによると数日または数週でさえ治療剤の投与から時間的に離れている際にも、依然として達成される。例えば、追加の療法は、経動脈塞栓術（TAE）、経動脈化学塞栓術（TACE）、放射線塞栓術（RE）、および／または局所切除を含む。
【００２２】
本発明のポリペプチドおよび他の組成物は、精製される。例えば、実質的に純粋なASPHポリペプチドまたはそのバリアントは、好ましくは、ポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学的に合成することによって、取得される。ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の状態において付随している夾雑物（タンパク質および他の天然に存在する有機分子）から分離されている際に、実質的に純粋である。典型的に、ポリペプチドは、調製物中のタンパク質の少なくとも60重量％を占める際に、実質的に純粋である。好ましくは、調製物中のタンパク質は、少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、および最も好ましくは少なくとも99重量％がASPHである。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析によって測定される。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、真核生物由来であるが、大腸菌もしくは別の原核生物、またはポリペプチドが元々由来したもの以外の真核生物において産生された組み換えポリペプチドを含む。
【００２３】
いくつかの好ましい態様において、ワクチンペプチドは、完全長ASPHのカルボキシ末端部分に位置する連続したアミノ酸の配列を特徴とし、例えば、ペプチドは、HAAHの触媒ドメインを含有する領域（例えば、SEQ ID NO:46のアミノ酸650〜700）における、ASPH触媒ドメインの少なくとも7、8、または9個の連続したアミノ酸を含有する。別の例において、ワクチンペプチドは、完全長ASPHタンパク質のアミノ末端部分に位置する連続したアミノ酸の配列を特徴とする。
【００２４】
「含む（comprising）」という移行語は、「含む（including）」、「含有する」、または「特徴とする」と同義であり、包括的または非制限的であって、追加の列挙されていない要素または方法工程を排除しない。対照的に、「からなる」という移行句は、請求項において明記されていないいかなる要素、工程、または成分も排除する。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、特許請求される発明の明記された材料または工程「および基本的なかつ新規の特徴に物質的に影響を及ぼさないもの」に限定する。
【００２５】
[本発明1001]
治療的有効量の精製アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ（ASPH）ペプチドを含む組成物であって、該ペプチドが、長さが少なくとも7アミノ酸かつ完全長ASPHタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、かつ、HLAクラスIまたはクラスII拘束性エピトープ配列を含む、組成物。
[本発明1002]
ペプチドが、
2020125325.tif 000004
のHLAクラスII拘束性配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
ペプチドが、YPQSPRARY（SEQ ID NO:26）のHLAクラスI拘束性配列を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
ペプチドが、SEQ ID NO: 1〜45からなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
薬学的担体、アジュバント、または他の共成分（co-ingredient）をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
本発明1001の組成物を含む、ワクチン。
[本発明1007]
本発明1001の組成物を含む、細胞株。
[本発明1008]
対象においてASPH発現腫瘍の成長を低減させるための方法であって、本発明1001の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1009]
対象においてASPH発現腫瘍の発症を予防するための方法であって、ASPH発現腫瘍に罹患している対象を特定する工程、および本発明1001の組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1010]
対象においてASPH発現腫瘍の転移を低減させるための方法であって、本発明1001の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1011]
腫瘍が、肝臓癌、胃腸癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、卵管癌、喉頭癌、肺癌、甲状腺癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、および脳腫瘍からなる群より選択される、本発明1008、1009、または1010の方法。
[本発明1012]
対象が、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはブタ対象である、本発明1008、1009、または1010の方法。
[本発明1013]
投与する工程の前に、同時に、またはその後に第2の療法をさらに含む、本発明1008、1009、または1010の方法。
[本発明1014]
追加の療法が、経動脈塞栓術（TAE）、経動脈化学塞栓術（TACE）、放射線塞栓術（RE）、および／または局所切除である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
患者由来の免疫細胞を、SEQ ID NO: 1〜45からなる群より選択されるペプチドと接触させる工程をさらに含み、選択されたペプチドが、HLAクラスIまたはクラスII拘束性T細胞応答を誘発することを特徴とする、本発明1008、1009、または1010の方法。
[本発明1016]
選択されたペプチドが、HLA-DRB1拘束性ASPH T細胞応答を誘発する、本発明1015の方法。
[本発明1017]
T細胞応答が、DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、およびDRB1*1501からなる群より選択されるHLA-DRB1対立遺伝子の1つまたは複数に拘束される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
選択されたペプチドが、HLA-AまたはHLA-B拘束性ASPH T細胞応答を誘発する、本発明1015の方法。
[本発明1019]
T細胞応答が、A*0101、A*0201、A*0301、A*2402、B*0702、およびB*4403からなる群より選択される1つまたは複数のHLA-A対立遺伝子に拘束される、本発明1018の方法。
[本発明1020]
T細胞応答が、B*0702、およびB*4403からなる群より選択される1つまたは複数のHLA-B対立遺伝子に拘束される、本発明1018の方法。
本発明の他の特徴および利点が、以下のその好ましい態様の説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適した方法および材料を下記に説明する。本明細書において引用されるすべての公表された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用されるアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBIの提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用されるすべての他の公表された参照文献、文書、原稿、および科学文献は、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、本明細書が、定義を含めて支配することになる。加えて、材料、方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図1Aおよび図1Cはヒストグラムであり、図1Bおよび図1Dはドットプロットである。HCC患者におけるASPH特異的T細胞応答。CD25を枯渇化させた、または枯渇化させていない、HCC患者（HCC #1〜5）のPBMCから精製した汎T細胞を、組み換えASPH、AFP、または抗原なし（対照）を負荷した単球由来のDCと共培養した。8日のインキュベーション後に、T細胞を収集し、同じ抗原を負荷したDCとの共培養によって再刺激した。CD4＋T細胞の応答を、CD154＋、IFN-γ＋、およびIFN-γ＋CD154＋細胞のパーセンテージを定量することによって評定した（A：代表的なフローサイトメトリー解析；B：5人のHCC患者の解析の概要）。CD8＋CTLの応答を、CD137＋およびIFN-γ＋細胞のパーセンテージを定量することによって評定した（C：代表的なフローサイトメトリー解析、D：5人のHCC患者における解析の概要）。ASPH試料における応答細胞のパーセンテージは、AFP試料または抗原対象において見出されるパーセンテージよりも有意に大きく、p＜0.05（BおよびD）；Treg細胞を枯渇化させたASPH試料および枯渇化させていないASPH試料は、互いに有意に異なっている、p＜0.05（B）。
【図１Ｂ】図１の続きである。
【図１Ｃ】図１の続きである。
【図１Ｄ】図１の続きである。
【図２】棒グラフである。予測されるASPH免疫コンセンサス配列に対する健常ドナーの応答。健常ドナー（HD #1〜5）から単離したPBMCを、表Iにおける一覧にしたがって列挙した単一のHLA-DRB1拘束性ASPHペプチド（10μg/ml）と培養した。細胞を2週間後に収集し、ペプチド特異的応答を、標準的なIFN-γELISpotアッセイによって定量した。値を、三つ組みの測定の平均±SDとして表す。点線は、対照（0.1％ DMSO）のレベルに相当する。*対照よりも有意に大きい、p＜0.05。
【図３】図3Aはヒストグラムであり、図3Bおよび図3Cは棒グラフであり、図3Dは折れ線グラフである。ASPHペプチド特異的T細胞応答の特徴決定。患者HD #1から取得したPBMCを、示されているASPHペプチドと培養した。2週間のインキュベーション後に、細胞を収集し、対応するペプチドと20時間再培養して、その後解析を行った。p52反応性のPBMCを染色して、IFN-γ＋CD4＋T細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリー解析により決定した（A）。フローサイトメトリー解析により評価したCD154発現CD4＋T細胞のパーセンテージを、表Iにしたがって列記したASPHペプチドに対する細胞の応答の測定単位として決定した（B）。結果は、三つ組みの測定の平均±SDであり；点線は、対照（0.1％ DMSO）値に相当する。*対照よりも有意に大きい、p＜0.05。列記したペプチドと2週間培養したPBMCを、処置しないか、または抗HLA-A、B、Cもしくは抗HLA-DRと1時間前処置し；次いで、同じ対応するペプチド（10μg/ml）を添加して、5日後に収集した培養上清中のIFN-γを、ELISAによって定量した（C）。結果は、三つ組みの測定の平均±SDである。*抗体なしまたは抗HLA-A、B、C処置よりも有意に小さい；p＜0.05。ASPHペプチド特異的細胞の免疫応答についてのペプチド滴定アッセイ（D）。列挙したASPHペプチドと2週間培養したPBMCを、収集して、増大する濃度の同じペプチドと再インキュベートした。5日後に収集した培養上清中のIFN-γを、標準的なELISAによって定量した。
【図４Ａ】図4Aおよび図4Bは棒グラフである。HCC患者はASPHペプチドに対して応答する。7人のHCC患者（HCC #6〜12）から取得したPBMCを、患者のHLAバックグラウンド（括弧中に示す）と適合性であり、表Iおよび表II にしたがって列挙したHLA-DRB1拘束性（A）またはHLA-クラスI拘束性（B）のASPHペプチドと、2週間培養した。ペプチド特異的T細胞認識を、IFN-γELISpotアッセイによって評定した。値は、三つ組みの測定の平均±SDである。点線は、対照（0.1％ DMSO）のレベルに相当する。*対照よりも有意に大きい、p＜0.05。
【図４Ｂ】図４の続きである。
【図５】図5Aおよび図5Bはヒストグラムである。健常血液ドナーのASPHタンパク質特異的T細胞応答。HD #1のPBMCから精製した汎T細胞を、組み換えASPHまたはAFPを負荷したか、または負荷していない（対照）単球由来のDCと共培養した。8日のインキュベーション後に、T細胞を収集し、同じ抗原を負荷したDCの新鮮な集団との培養によって再刺激した。CD4＋T細胞の応答を、全CD4＋T細胞集団内のCD154＋、IFN-γ＋、およびIFN-γ＋CD154＋細胞のパーセンテージを定量することによって評定した（A）。CD8＋CTLの応答を、全CD8＋T細胞集団内のCD137＋およびIFN-γ＋細胞のパーセンテージを定量することによって評定した（B）。ゲートをかけた区域中の細胞のパーセンテージを示す。
【図６】棒グラフである。HLA-DRB1拘束性ASPHペプチドに対する健常ドナー（HD）およびHCC患者（HCC）の応答の概要および比較。それぞれ、図2および図4Aの下の、15種の個々のHLA-DRB1拘束性ペプチドに対する5人の健常ドナー（#1〜5）および6人のHCC患者（#7〜12）の応答（IFN-γスポット／106 PBMC）を、組み合わせて平均した；バックグラウンドであるDMSO対照を差し引いた。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
ASPHの個々の精製したHLAクラスIおよびIIペプチドは、ヒトのペプチド特異的なCD4+ヘルパーT細胞応答およびCD8+細胞傷害性T細胞応答を誘導した。ASPHは、肝細胞癌、胆管癌、膵臓腫瘍、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、および胃癌などの多くの固形腫瘍上で高発現しているため、これらのペプチドは、ASPH発現癌に対して宿主免疫応答を誘導するためのワクチンに有用である。本発明は、ASPH発現腫瘍を阻害または低減させるための、ASPHペプチドベースの予防用および治療用ワクチンを含む。
【００２８】
本発明の前に、ASPHに対するヒト細胞傷害性CD8＋Tリンパ球（CTL）の応答は知られていなかった。本明細書に記載されているデータは、完全長ASPHが、HCC患者から取得したCTLおよびCD4＋ヘルパーT細胞の有意な活性化を誘導したことを、最初に実証した。次に、免疫情報科学ツールを使用して、ASPH中に含有される15種のHLA-DRB1拘束性免疫原性コンセンサス配列（ICS、各々が複数のエピトープから構成される）を決定した。これらのICSをペプチドとして合成して、複数のHLA-DRB1対立遺伝子に結合するそれらの能力を決定した。30種のHLAクラスI拘束性ASPHエピトープもまた、決定して合成した。その後、各々のHLAクラスIおよびクラスII拘束性ペプチドを評定して、HCC患者に対して免疫原性であることを実証した。これらの解析の結果は、HCC免疫療法のためのASPHエピトープベースのワクチンの開発をもたらした。
【００２９】
HCCは、高い再発率および有効な全身療法の不足のために、悪い予後を有する。ASPHは、HCCにおいて過剰発現し、悪性表現型を促進する、高度に保存されている膜貫通タンパク質である。ASPH負荷樹状細胞（DC）での免疫化は、マウスHCCモデルにおいて抗腫瘍効果を有する。さらに、ASPHは、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の培養物において抗原特異的CD4+T細胞の有意な増大を誘導し、HCCに対するASPHベースの免疫療法の有用性を示す。
【００３０】
HCC患者のPBMCから生成した単球由来のDCに、ASPHを負荷した。ヘルパーCD4＋T細胞およびCD8＋細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を、DCと共インキュベートした。その後、T細胞活性化をフローサイトメトリー解析により評定した。免疫情報科学ツールを使用して、HLAクラスIおよびクラスII拘束性のASPH配列を決定し、対応するペプチドを合成した。ヒトPBMCの培養物における各ペプチドの免疫原性を、IFN-γ酵素結合免疫スポットアッセイによって決定した。
【００３１】
ASPH負荷DCは、HCC患者に由来するPBMC集団内に含有されるCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の両方を活性化した。さらに、HLAクラスI拘束性ASPHペプチドおよびクラスII拘束性ASPHペプチドは、PBMC培養物において有意に免疫原性であった。ASPHに由来するHLAクラスI拘束性ペプチドおよびクラスII拘束性ペプチドの両方が、HCCにおいてT細胞活性化を誘導した。これらの結果は、HCCおよび他のASPH過剰発現腫瘍に対するASPHペプチドベースの治療用ワクチンの効力を示す。
【００３２】
ASPHペプチド
ASPHワクチンペプチドは、ヒトHLA分子に結合して、ASPH特異的抗腫瘍免疫応答を刺激し、それにより、腫瘍負荷量／腫瘍質量を低減させ、転移を低減させ、かつASPH発現腫瘍に罹患している患者に対して臨床的有益性を与える。HLA分子に対するペプチドの結合を測定するための方法、例えば、Parker et al., 1994, Journal of Immunology 152:163が、当技術分野において周知である。T細胞媒介性免疫応答、例えば、CD8+細胞傷害性T細胞および／またはヘルパーCD4+ T細胞の活性化を測定するための方法、例えば、免疫刺激ASPHペプチド抗原に応答した分泌免疫活性化マーカーおよび／または細胞表面活性化マーカーの検出もまた、当技術分野において周知である。例示的なプロトコルを、本明細書に記載する。
【００３３】
抗原性機能を保つペプチドバリアントもまた、本発明内である。例えば、バリアントは、配列における特定の位置に他のアミノ酸によって置換されているアミノ酸残基を含有し得るし、または、ペプチドがASPH特異的抗腫瘍免疫応答（例えば、ASPH特異的T細胞の活性化）を刺激する機能を保持するという条件で、参照ペプチドの2つの残基の間の追加的な1つまたは複数の残基、ならびに、参照配列からの1つまたは複数の残基の欠失を含み得る。そのようなペプチドバリアントは、完全長配列と、少なくとも約71％〜75％のアミノ酸配列同一性；少なくとも約76％〜79％のアミノ酸配列同一性；少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約81％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％のアミノ酸配列同一性、および少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有することになる。
【００３４】
いくつかの例において、バリアントは保存的置換を含有する。保存的置換を、下記の表に示す。1つのクラスのアミノ酸が同じタイプの別のアミノ酸で置き換えられる保存的置換は、置換が化合物の生物学的活性を物質的に変更しない限り、本発明の範囲内に入る。
2020125325.tif 000005
【００３５】
本発明のポリペプチドは、インビトロで合成することができるか、またはポリヌクレオチド配列から組み換えで発現することができるかのいずれかである。本発明のポリペプチドは、ポリペプチド化学を用いてインビトロで容易に合成することができる。例えば、ポリペプチド合成を、Rainin Symphony Peptide Synthesizer、Advanced Chemtech Peptide Synthesizer、Argonaut Parallel Synthesis System、またはApplied Biosystems Peptide Synthesizerなどの自動ポリペプチド合成機を用いて、固相支持体上で段階的様式において実施することができる。ペプチド合成機の機器は、Fmoc化学をHOBt/HBTU/DIEA活性化と組み合わせて、固相ペプチド合成を行う。
【００３６】
核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列をアラインメントして、必要な場合、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、関心対象の配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。％核酸配列同一性を決定する目的のアラインメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の技能内である種々のやり方で達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができる。
【実施例】
【００３７】
以下の材料および方法を使用して、本明細書に記載されている日付を生成した。
【００３８】
組み換えASPHおよびASPHペプチド
完全長ヒトASPH（参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号S83325；バージョン：S83325.1）を、pcDNAベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）のEcoRI部位中にクローニングした。組み換えタンパク質を、製造業者の説明書にしたがって、バキュロウイルスシステム（Invitrogen）において産生した11, 12。
【００３９】
SEQ ID NO: 46 ヒトASPHアミノ酸配列
2020125325.tif 000006
Hisモチーフに下線を引いている；触媒ドメイン内の保存された配列を、太字により示す。ASPHに関する追加の情報は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,783,758号において見出される。
【００４０】
SEQ ID NO: 47 ヒトASPH cDNA配列（GENBANKアクセッション番号S83325；開始メチオニンをコードするコドンに下線を引いている）。
2020125325.tif 000007
【００４１】
ASPH ICSを決定した13,14。タンパク質全体を、オーバーラップする9merのフレームに解剖し、各フレームを、ヒト集団におけるMHC多様性の＞95％に相当する8種の一般的なHLA-DRB1対立遺伝子のパネル（DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、およびDRB1*1501）に結合するその潜在能力について、EpiMatrixを用いて評定した15。HLA-DRB1拘束性ICSを、潜在的に免疫原性の9 merを18〜25アミノ酸のストレッチにアセンブルすることによってエピトープ密度を最大化するアルゴリズムであるEpiAssemblerを用いて構築した16。加えて、すべての解剖した9 merを、ヒト集団の95％を上回ってカバーする6種の一般的なクラスI「スーパータイプ」対立遺伝子のパネル；A*0101、A*0201、A*0301、A*2402、B*0702、およびB*4403に結合するその潜在能力についてスコア化した17。これらの予測に基づいて、FMOC化学を用いてペプチド配列を合成し、HPLC（21st Century Biochemicals, Marlboro, MA）により＞85％に精製して；各々を100％ DMSOに溶解し（100μg/μl）、-80℃で保存した。HLA-DRB1拘束性ペプチドおよびHLAクラスI拘束性ペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ、表Iおよび表IIに示す。
【００４２】
健常血液ドナーおよびHCC患者
血液試料を、12人のHCC患者（HCC #1〜12）および5人の健常血液ドナー（HD #1〜5）から取得した。末梢血単核細胞（PBMC）を、公知の方法を用いてHCC患者の全血から精製した11。各試料から抽出したDNAに対するHLAタイピングを、公知の方法を用いて行った。
【００４３】
使用した、非特定化した全血白血球低減フィルター（血液フィルター；Sepacell RZ-2000, Baxter Healthcare Corporation, Irvine CA）を、健常ボランティアによりインフォームドコンセントとともに寄付された血液に由来するPBMCの供給源とした。PBMCを、Meyerらの方法にしたがってフィルターを逆流させることによって回収し、公知の方法を用いてFicoll-Paque Plus（1.077; Pharmacia, Uppsala, Sweden）勾配上での遠心分離によって精製した18,19。
【００４４】
DCの生成
DCを、公知の方法を用いて生成した11,20。単球を、抗CD14マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いてPBMCから単離し、ヒトGM-CSF（R&D Systems, Minneapolis, MN）およびIL-4（R&D Systems）を補給したX-VIVO 15培地（Lonza, Walkerville, MD）中で5日間培養した。ASPH（1μg/ml）を5日目に添加した。次の日に、TNF-α（R＆D Systems）を添加してDC成熟を刺激し、細胞をさらに48時間インキュベートした。α-フェトプロテイン（AFP；Zynaxis Cell Science, Malvern, PA）とまたは単独でインキュベートしたDCを、対照とした。成熟したエピトープ発現DCを、インキュベーション期間の終わりに収集して、記載した実験において使用した。
【００４５】
エピトープ特異的T細胞の誘導
エピトープ特異的T細胞を、公知の方法にしたがって誘導した21。簡潔に言うと、丸底96ウェルプレートにおいて、2.5×105 PBMC／200μlの1 mM  L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および50 U/ml組み換えヒトIL-2（R&D Systems）を補給したX-VIVO 15培地を、10μg/mlの個々のペプチドと2週間培養した。成熟DCを抗原提示細胞として使用した際は、T細胞を、Pan T Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec）を用いたネガティブセレクションによってPBMCから単離した。示されている場合は、制御性T(reg)細胞を、抗CD25マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）の添加によって除去した。Treg細胞を枯渇化させたかまたは枯渇化させていないTリンパ球（2.4×106個）を、8日間、関連抗原を負荷した4×104個の成熟DCとともに24ウェルプレートにおいて共培養した11。
【００４６】
T細胞応答の遮断
ASPHペプチド依存性T細胞活性化に対するHLA分子の寄与を実証するために、細胞を、解析の前に、HLAクラスIに特異的な抗体（クローンW6/32；BioLegend, San Diego, CA）またはHLA-DRに特異的な抗体（クローンL432；BioLegend）（15μg/ml）と1時間、37℃でインキュベートした。
【００４７】
フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析を実施した11。細胞内サイトカイン染色を行って、T細胞活性化を評定した。以下の決定基に特異的な、コンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体を使用した：CD4（クローンOKT4；BioLegend, San Diego, CA）、CD8a（クローンRPA-T8；BioLegend）、CD137（クローン4B4-1；BD Biosciences, San Diego, CA）、CD154（クローンTRAP1；BD Biosciences）、およびIFN-γ（クローンB27；BD Biosciences）。適切なアイソタイプ対照を、各解析に含めた。
【００４８】
酵素結合免疫スポットアッセイ
ヒトIFN-γ酵素結合免疫スポット（ELISpot）アッセイを、本発明者らが以前に記載したように、eBioscience（San Diego, CA）から購入したキットを用いて行い、T細胞免疫反応性を決定した21。細胞（5×104／ウェル）を、抗IFN-γ捕捉抗体でプレコーティングしたELISpotプレート（Millipore, Bedford, MA）に添加して、ペプチド（10μg/ml）と20時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ビオチン化IFN-γ検出抗体、次いでアビジン-HRPと連続的にインキュベートした。プレートを、基質である3-アミノ-9-エチルカルバゾールを添加することによって顕色させ、スポット／ウェルの数を、CTL-免疫スポットS5 UV分析器（Cellular Technology Limited, Shaker Heights, OH）を用いて定量した。
【００４９】
酵素結合免疫吸着アッセイ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を、ヒトIFN-γELISAキット（eBioscience）を用いて行って、細胞培養上清中のIFN-γを定量した11。
【００５０】
統計解析
データを、平均±SDとして表す。群間の差を、χ2-検定、フィッシャーの正確検定、またはマン・ホイットニーU検定によって評価した。p値＜0.05を、統計学的に有意であるとみなした。データ解析を、StatView（バージョン5.0；SAS Institute Inc., Cary, NC）を用いて行った。
【００５１】
ASPHに対するHCC患者の免疫原性応答
HCC患者に由来するPBMC集団中に含有される、CD8＋CTLおよびヘルパーCD4＋T細胞を活性化するASPHの能力を判定するために、実験を企画した。ASPH特異的T細胞活性化を評定するための実験手順を、健常ドナーに由来するPBMCを用いて最適化した11。汎T細胞を、自己のASPHパルスDCと共培養し；AFPパルスDCまたは非パルスDCと共インキュベートしたT細胞を、対照とした。8日の培養後に、T細胞を収集し、新しく調製した、同じ抗原をあらかじめ負荷したDCと再インキュベートして；抗原特異的T細胞活性化をフローサイトメトリー解析により評定した。IFN-γに加えて、CD154およびCD137の発現を、それぞれ、CD4＋T細胞およびCD8＋CTLの抗原特異的活性化についての代理マーカーとして使用した22,23。これらの実験により、CD4＋T細胞およびCTLの両方のASPHに応答する活性化における、AFPまたは抗原なしと比較した有意な増大が明らかになった（図5Aおよび図5B）。さらに、それらにより、ASPHでの免疫化が、HCC患者におけるタンパク質特異的CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を活性化するという前提が支持される。
【００５２】
同じ実験アプローチを用いて、ASPH特異的T細胞活性化を、表3に特徴を述べる5人のHCC患者（HCC #1〜5）に由来するPBMCにおいて評定した。図1Aおよび図1Bに示すように、ASPHパルスDCでのインキュベーションにより、AFPパルスDCまたは非パルスDCでのインキュベーションと比較して、CD4＋CD154＋およびCD4＋IFN-γ＋T細胞の有意な増大が結果としてもたらされた。IFN-γおよびCD154の両方を発現するCD4＋T細胞もまた、有意に増大された。加えて、CD137およびIFN-γを発現するCD8＋CTLのパーセンテージは、AFPパルスDCまたは非パルスDCを含有した共培養物と比較して、ASPHパルスDCを含有した共培養物において有意に高かった（図1Cおよび図1D）。共培養の前の抗CD25マイクロビーズを用いたTreg細胞枯渇化により、ASPH特異的T細胞活性化が増強された20。HCC患者に由来するPBMCの中でのCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞のASPH特異的活性化を実証するこれらの結果により、ASPH過剰発現腫瘍のためのHCC免疫療法における精製ASPHペプチドの使用が支持される。
【００５３】
HLA-DRB1拘束性ASPHペプチド配列の予測および検証
精製ASPHペプチドの実証された免疫原性により、ASPHエピトープベースの抗腫瘍ワクチンの開発がもたらされる。MHCクラスII拘束性（CD4＋）T細胞およびMHCクラスI拘束性（CD8＋）T細胞の両方を、好ましくは、持続性抗腫瘍免疫のために使用する24,25。最初に、複数のエピトープから構成され、完全長ヒトASPHをカバーするHLA-DRB1拘束性ICSを、生命情報科学ツールを用いて決定し、構築した13,14。ヒト集団の＞95％に相当する複数のHLA-DRB1対立遺伝子に各々が結合することができる、15種の雑多なISCを合成した（表I）15。
【００５４】
これらの予測されるASPHエピトープ（ICS）の妥当性は、5人の健常血液ドナー（HD #1〜5）に由来するPBMC集団内に含有されたナイーブT細胞の応答を誘導するその能力を実証することによって、証明された。各ドナーから取得したPBMCを、96ウェル丸底プレート中の複数のウェルに移して、単一のASPHペプチド配列と培養した。2週間後に、各配列のペプチド特異的応答を誘導する能力を、IFN-γELISpotアッセイにより評定した。図2に示すように、各ペプチド配列は、任意の単一配列に対する応答がドナーの間で変動していたが、IFN-γ産生細胞の統計学的に有意な増大を誘導した。これらのICSは雑多であり、複数のHLA-DRB1対立遺伝子に結合するが、ドナーのMHCバックグラウンドにおける差が、この変動した応答に寄与する可能性が高い。しかし、著しく、すべてのASPHペプチドが、少なくとも1人の健常血液ドナーにおいて免疫原性を呈し、p322（ID#4、表I）は、すべての5人のドナーに対して免疫原性であった。p581（ID#11、表I）もまた、好ましいペプチドとして出現した。
【００５５】
IFN-γ産生細胞を定量および特徴決定するために、p52（ID#1、表I）による誘導後のHD #1に由来するPBMCを染色して、フローサイトメトリー解析により評定した。予測されるように、本質的にすべてのHLA-DRB1拘束性、p52反応性のIFN-γ産生細胞がCD4を発現していた（図3A）。加えて、CD154発現を、各ASPHペプチドとのインキュベーション後のCD4＋T細胞活性化の測定単位として評価した（図3B）。CD154発現のパターンは、上記で示されたIFN-γELISpotデータと一致した。HLA遮断実験により、ASPHペプチド誘導性IFN-γ産生のHLA-DRB1発現への依存性が確認された。ASPHペプチド応答性細胞によるIFN-γ産生は、抗HLA-DR抗体の存在によって有意に抑止されたが、抗HLA-クラスI抗体の存在によっては抑止されなかった（図3C）。滴定実験によって、ASPHペプチド刺激後のIFN-γ産生の用量依存性増大が明らかになった（図3D）。合わせて、これらの結果は、ASPHペプチドによって誘導されるHLA-DR拘束性の用量依存性CD4＋T細胞応答を立証する。IL-4産生は、ASPHペプチド配列のいずれとのインキュベーション後にも観察されず、これらの配列がTh1様CD4＋T細胞応答を誘導したことを示した。
【００５６】
HCC患者におけるASPHペプチド特異的T細胞活性化
健常血液ドナーのHLA-DRB1拘束性のASPH ICS特異的T細胞応答を実証する結果に基づいて、7人のHCC患者（HCC #6〜12）に由来するCD4＋T細胞の同じペプチドに対する応答を評定した。個々のペプチドに対する応答は、患者の間で変動していたが、各々のHLAクラスII拘束性ペプチド配列は、IFN-γ産生細胞の統計学的に有意の増大を誘導した（図4A）。ペプチドのいずれも、HCC患者#6において有意な応答を誘発しなかった。しかし、すべての予測されたASPHペプチドは、少なくとも1人のHCC患者において免疫原性を呈し、上記で示された健常血液ドナーにおいて見出されたものと同様のパターンであった。
【００５７】
CD8＋、およびCD4＋のT細胞は、抗腫瘍免疫に必要とされる。そのように、HLAクラスI拘束性ASPH由来エピトープもまた決定し、30種のHLA-A拘束性ペプチドおよびHLA-B拘束性ペプチドを合成した（表II ）。HCC患者に由来するCD8＋CTLの、それらのHLAクラスI対立遺伝子と適合性のペプチドに対する応答を、その後評定した。組織不適合性のために、この解析にHCC患者#8を含めることが妨げられた。HLA-DRB1により拘束されているものの場合には、個々のペプチドに対する応答は実質的に患者の間で変動していたが、すべてのHLAクラスI拘束性ペプチドは、IFN-γ産生細胞の有意な増大を誘導した（図4B）。例えば、HCC患者#6は、11種のHLA-A*01/*03拘束性ペプチドおよび5種のHLA-B*07拘束性ペプチドのパネルの間でいずれのペプチドに対しても有意な応答を呈することができなかった。他方で、HCC患者#12は、当該患者のHLAバックグラウンドと適合性のペプチドの85％に応答した。ASPH 371が、好ましいクラスI拘束性ペプチドであると決定された。
【００５８】
HCC患者における免疫原性ASPHエピトープ
癌免疫療法の目標は、腫瘍細胞を特異的に標的とする有効な免疫応答を誘導することである26。成功は、腫瘍組織において独自に過剰発現しており、腫瘍を有する宿主において特異的な免疫応答を誘発する腫瘍関連抗原（TAA）の存在に基づいている。今までに、いくつかのHCC関連TAA：AFP、グリピカン-3、およびNY-ESO-1が、特定されている27-30。しかし、これらのTAAに特異的なT細胞応答は、しばしば観察されるが、臨床転帰に影響を及ぼすほど十分に堅牢ではない。これらの不満足な転帰に寄与する要因は複雑であり、さらなる探究を必要とするが、1つの要因は、減少したCD4＋ヘルパーT細胞応答であるように見える。活性化されたCD4＋T細胞およびCD8＋CTLの両方が、持続性抗腫瘍応答を維持するために必要とされる24,25。
【００５９】
ASPHは、ヒトPBMCの中でCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の抗原特異的活性化を誘発することが、ここで見出され、ASPHが、HCC免疫療法に有用となるHLAクラスI拘束性エピトープおよびクラスII拘束性エピトープの両方を所有することを示す。そのようなアプローチは、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の堅牢な応答を誘発することができる精製ペプチド（エピトープ）の組み合わせからなる、HCCのためのエピトープベースのワクチンを利用する。この目的に向かって、免疫情報科学ツールを使用して、30種のASPH由来のHLAクラスI拘束性エピトープおよび15種のクラスII拘束性エピトープを特定した。これらのエピトープは、7人のHCC患者のうちの6人によるCD8＋CTLおよびCD4＋T細胞の両方の応答を誘導し、これらの選択されたASPHペプチドがHCC免疫療法に通用であることを示した。著しく、1人の患者（HCC #6）は、当該患者のHLAバックグラウンドと適合性のエピトープのいずれにも応答することができず、当該患者は良好な候補者ではないことを示唆した。個々の患者のそのような応答プロファイルは、個人向けの処置レジメン、例えば、ペプチド（SEQ ID NO: 1〜45）のうちのどれが特定の患者用のワクチンにおけるペプチドの組み合わせに最も適しているかを判定するための、ワクチン接種に先立つ患者のプレスクリーニングのための基礎を提供する。
【００６０】
標的に対して理想的なTAAを選択することに加えて、抗腫瘍免疫を最適化する戦略は、癌細胞の免疫認識からの逃避を阻止するアプローチを組み入れる。癌細胞の逃避の根底にある機構、例えば、細胞表面阻害分子、ならびに、Tregおよび骨髄由来サプレッサー細胞を含む免疫調節細胞が、報告されている31-34。知見により、CD25＋Treg細胞枯渇化後の、ASPHに対するT細胞応答の増強が実証された。さらに、ASPH負荷DCでの免疫化後のマウスモデルにおいて、残存腫瘍細胞は依然として細胞表面ASPHを発現しており、免疫療法を逃避する腫瘍細胞の存在を暗示した12。従って、他のアプローチ（例えば、Treg細胞機能のアンタゴナイズ）と組み合わせてASPHベースの免疫療法を用いる併用療法戦略が、免疫逃避を回避して、臨床転帰の成功を達成する35。例えば、低用量のシクロホスファミドは、報告されているところによると、重要な機能的マーカー：フォークヘッドボックスP3およびグルココルチコイド誘導性TNF受容体関連タンパク質の発現を抑制することにより、Treg細胞の数および阻害活性を減少させる36。腫瘍を有するマウスモデルにおいて、シクロホスファミド処置は、Treg細胞機能を抑制し、免疫応答および腫瘍撲滅を強化した37。同様に、ソラフェニブ（進行したHCCを有する患者を処置するために使用される多標的の抗血管形成チロシンキナーゼ阻害剤）は、確立された同所移植HCCを有するマウスにおいてTreg細胞機能を低減させ、抗腫瘍免疫を増強した38。任意で、これらの作用物質を、ワクチンペプチドに対する補助療法として使用する。
【００６１】
経動脈塞栓術または局所切除療法などの他の処置選択肢が、ASPHベースのHCC免疫療法を強化するのに有用である。例えば、経動脈塞栓術は、腫瘍壊死を直接誘導しただけではなく、T細胞媒介性の免疫応答も増大した39。高周波HCC切除は、ペプチド特異的CTLを誘導した40。ASPHベースの免疫療法を、追加のアプローチと組み合わせて、HCCを処置し、ペプチドエピトープベースの療法の可能な臨床効果を強化することができる。
【００６２】
結果により、Treg細胞は、ASPHタンパク質配列全体によって活性化される、小さな成分のT細胞集団を含むことが示される。全タンパク質ベースのワクチンに対する、ペプチドベースのワクチンの主要な利点は、Treg細胞エピトープを容易に特定して、除外できることである。
【００６３】
本明細書において報告されるデータにより、ASPHが、抗原特異的なCD4＋T細胞およびCD8＋CTLの活性化を誘発すること、ならびに、ASPH由来のHLAクラスIおよびクラスII拘束性の精製ペプチドが、HCC患者に由来するCD4＋T細胞およびCD8＋CTLを活性化することが実証された。健常ドナーおよびHCC患者の、HLA-DRB1拘束性ASPHペプチドに対する平均の応答（それぞれ、図2および図4Aに示されている）を、図6において要約して比較する。健常ドナー（HD）の場合には、ナイーブT細胞が、誘導される抗原特異的T細胞の大多数に相当する。しかし、HCC患者において、それは、ナイーブ細胞と以前に感作された細胞の両方の組み合わせであり得る。ASPHの免疫原性、その組織特異性、および腫瘍進行との関連を考慮すると、ASPHペプチドベースのワクチン接種は、改善されたHCC処置、および、異常な、例えばASPHの過剰発現を特徴とする他の腫瘍タイプの処置に相当する。ASPHの過剰発現とは、対象由来の組織または細胞のASPHの発現レベルが、健常対象または癌を有さない対象由来の組織または細胞のASPHの発現レベルよりも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、またはそれより多いことを指す。
【００６４】
（表Ｉ）予測されるHLA-DRB1拘束性ASPH免疫原性コンセンサス配列
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ASPH、アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ；AA、アミノ酸
【００６５】
（表ＩＩ）予測されるHLAクラスI拘束性ASPHペプチド配列
2020125325.tif 000009
ASPH、アスパラギン酸-β-ヒドロキシラーゼ；AA、アミノ酸
【００６６】
（表３）HCC患者の特徴
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ND、未決定：W、高分化型；M、中等度分化型；HCV、C型肝炎ウイルス
【００６７】
参照文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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