(57)【要約】【課題】モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸エステル合成の反応効率の向上。【解決手段】モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸とアルコールとのエステル化反応において、反応液のｐＨを上昇させることを含む、脂肪酸エステルの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸とアルコールとのエステル化反応において、反応液のｐＨを上昇させることを含む、脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項２】
アルカリを含有する反応液中でモノアシルグリセロールリパーゼにより脂肪酸とアルコールをエステル化させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アルカリが水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及びアミン系塩基からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記反応液において、前記アルカリの初期濃度が０．００５〜１．３ｍｏｌ／ｇ−反応液であり、前記脂肪酸に対する該アルカリの初期濃度が０．０２〜５０％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記モノアシルグリセロールリパーゼがＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記モノアシルグリセロールリパーゼがバチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記モノアシルグリセロールリパーゼが、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記反応液中における前記脂肪酸とアルコールとのモル比が、それらの初期濃度に基づいて１：０．２〜５０である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記アルコールが多価アルコールである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪酸エステルがモノアシルグリセロールである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記脂肪酸が飽和又は不飽和の炭素数１０〜２２の直鎖脂肪酸である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）は、乳化剤や抗菌剤等として食品、医薬品、化粧品等の分野に広く利用されている物質である。さらに近年、ＭＡＧが、食後の血中トリグリセリドの上昇抑制、食後血中インスリン上昇抑制、食後ＧＩＰ分泌抑制等の優れた生理活性を有することが見出されている。ＭＡＧは、生化学的な方法では、脂肪酸とグリセリンとをリパーゼの存在下で反応させることで製造される(例えば特許文献１）。この方法で用いるリパーゼとしては、モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）などの脂肪酸モノグリセリド又は脂肪酸ジグリセリドを基質として認識するリパーゼが好ましい。ＭＧＬＰについては、特許文献２に、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）Ｈ−２５７由来部分グリセリドリパーゼであるＨ−２５７の固定化物が開示されている。非特許文献１には、Ｈ−２５７リパーゼと近縁のＭＧＬＰである、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２が開示されている。
【０００３】
リパーゼによる脂肪酸のエステル化においては、反応の至適ｐＨは３〜５程度であり、酵素の至適ｐＨとは異なる。その理由は、リパーゼがプロトン化した脂肪酸を基質とすることで、脂肪酸のｐＫａよりも低いｐＨで酵素反応がより進行するためであると考えられている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２２０２３６号公報
【特許文献２】特開２０１０−１８３８７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】PLoS ONE, 2013, 8(10):e76675
【非特許文献２】Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009, 59:220-224
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼを用いた脂肪酸エステルの製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、モノアシルグリセロールリパーゼを用いた脂肪酸のエステル化の際に、反応液にアルカリを添加することによって、該エステル化反応の効率が向上することを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸とアルコールとのエステル化反応において、反応液のｐＨを上昇させることを含む、脂肪酸エステルの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、モノアシルグリセロールリパーゼによるモノアシルグリセロール等の脂肪酸エステル合成を亢進させることができる。従来、リパーゼによる脂肪酸のエステル化の反応挙動が脂肪酸のｐＫａに依存して酸性ｐＨでより向上することが報告されていた（非特許文献２参照）ことを踏まえると、本発明の脂肪酸エステルの製造方法によるアルカリ存在下での脂肪酸エステル合成の亢進は、極めて意外である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼを用いた脂肪酸エステルの製造方法を提供する。当該方法は、モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸とアルコールとのエステル化反応において、反応液のｐＨを上昇させることを含む。
【００１１】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１３】
本明細書において、「モノアシルグリセロールリパーゼ」（以下、ＭＧＬＰともいう）とは、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するリパーゼをいう。言い換えると、「モノアシルグリセロールリパーゼ」とは、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドをいう。本明細書において、「モノアシルグリセロールリパーゼ活性」とは、トリアシルグリセロールをジアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性及びジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性に比較して、より選択的にモノアシルグリセロールをグリセリンと脂肪酸に分解する活性をいうか、又はグリセリンと脂肪酸との合成反応において、トリアシルグリセロール及びジアシルグリセロールに比較して、より選択的にモノアシルグリセロールを合成する活性をいう。
【００１４】
本発明で製造されるＭＧＬＰの種類は、特に限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆａｍｉｌｙ ＸＶ（非特許文献１）に属するＭＧＬＰが好ましい例として挙げられる。より好ましい例としては、当該Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するバチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型ＭＧＬＰが挙げられる。該非分泌型ＭＧＬＰの好ましい例としては、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ： ＥＮ９２２６８．１、配列番号１）、バチルス・エスピーＨ−２５７由来ＭＧＬＰであるＨ−２５７（ＰＤＢ：４ＫＥ８、配列番号２）が挙げられる。該非分泌型ＭＧＬＰの他の例としては、配列番号３のアミノ酸配列からなるゲオバチルス・ステアロサーモフィリス（Geobacillus stearothermophilus）由来ＭＧＬＰ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ_０５３４１４８６３．１、以下ｓｔＬＰと呼ぶ）、配列番号４のアミノ酸配列からなるバチルス・エスピーＦＪＡＴ−２９８１４由来ＭＧＬＰ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０６６３０６３１３．１、以下ＣＩ２２０−６と呼ぶ）、配列番号５のアミノ酸配列からなるバチルス・エスピーＥＢ０１由来ＭＧＬＰ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０４３９２０３７．１、以下ＣＩ２２０−１０と呼ぶ）、及び配列番号６のアミノ酸配列からなるバークホルデリア・シングラリス（Burkholderia singularis）由来ＭＧＬＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＳＭＦ９８８８７．１、以下ＣＩ２２０−１２と呼ぶ）が挙げられる。
【００１５】
本発明で用いられるＭＧＬＰのさらに好ましい例としては、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明で用いられるＭＧＬＰのなお好ましい例としては、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明において、上記のＭＧＬＰは、いずれか１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
本発明において、エステル化反応に供される脂肪酸の種類は、特に限定されないが、好ましい例としては、飽和又は不飽和の直鎖脂肪酸が挙げられる。当該直鎖脂肪酸は、好ましくは中鎖脂肪酸又は長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素数１０〜２２の脂肪酸、さらに好ましくは炭素数１２〜１８の脂肪酸である。
【００１７】
本発明において、エステル化反応に供されるアルコールの例としては、一価アルコール及び多価アルコールが挙げられるが、好ましくは多価アルコールである。多価アルコールとしては、例えばグリセリン、エリスリトール、スレイトール、キシリトール、ジグリセリン、トリグリセリン、ポリグリセリン、トリメチロールプロパン、ブタントリオール、ブタンジオールなどが挙げられ、好ましくはグリセリンが挙げられる。したがって、本発明で製造される脂肪酸エステルは、好ましくはアシルグリセロールであり、より好ましくはモノアシルグリセロールである。
【００１８】
本発明の方法において、該脂肪酸とアルコールとのエステル化反応のための反応液は、後述するｐＨ上昇のための処理（例えばアルカリの添加）を除いて、リパーゼによる脂肪酸エステルの生化学的合成に従来用いられている反応液の組成に従って調製することができる。本発明におけるＭＧＬＰによる脂肪酸とアルコールのエステル化反応において、反応液中における該ＭＧＬＰの初期濃度（該エステル化反応開始前の濃度）は、基質の量に依存して調整すればよく、特に限定されないが、好ましくは０．１〜１００ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ−反応液、より好ましくは０．５〜１００ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ−反応液、さらに好ましくは５〜２０ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ−反応液である。なお、タンパク質の濃度測定はＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて行い、検量線の作成にはアルブミンタンパク質を用いればよい。該反応液中における該脂肪酸の初期濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．１〜０．７５ｇ−脂肪酸／ｇ−反応液である。また、ＭＧＬＰは酵素固定化用担体に固定化して用いても良い。また、該反応液中における該アルコールの初期濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．１〜０．７５ｇ−アルコール／ｇ−反応液である。該反応液中における該脂肪酸とアルコールのモル比は、各々の初期濃度に基づいて、好ましくは１：０．２〜５０、より好ましくは１:１〜１０、さらに好ましくは１:１〜２である。該反応液中における初期水分量は、特に限定されないが、好ましくは０．２〜５０質量％、より好ましくは０．２〜２５質量％、さらに好ましくは０．２〜１０質量％である。
【００１９】
本発明による脂肪酸エステルの製造方法においては、該脂肪酸とアルコールとのエステル化反応のための反応液のｐＨを上昇させるために反応液にアルカリを添加する。したがって、本発明の脂肪酸エステルの製造方法は、好ましくは、アルカリを含有する反応液中でＭＧＬＰにより脂肪酸とアルコールをエステル化させることを含む。
【００２０】
当該反応液に含まれるアルカリとしては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、アミン系塩基などが挙げられる。該アミン系塩基としては、アンモニア、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどが挙げられる。これらのアルカリは、いずれか１種又は２種以上を組み合わせて用いることができるが、水酸化カリウムが好ましい。該反応液中における該アルカリの初期濃度は、好ましくは０．００５〜１．３ｍｏｌ／ｇ−反応液、より好ましくは０．０１〜０．６ｍｏｌ／ｇ−反応液、さらに好ましくは０．０２〜０．４ｍｏｌ／ｇ−反応液である。また脂肪酸に対する該アルカリの初期濃度は、好ましくは０．２〜５０％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）、より好ましくは０．４〜２５％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）、さらに好ましくは、０．９〜１５％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）である。
【００２１】
あるいは、当該反応液中における該アルカリの濃度は、好ましくは、該アルカリを含有する反応液を水で１００倍（質量比）に希釈した希釈液（以下、反応液の１００倍希釈液という）のｐＨが、該アルカリを含まない反応液に対して好ましくは０．５以上、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１．５〜３上昇する量である。好ましくは、本発明の方法に用いられる該アルカリを含有する反応液の１００倍希釈液のｐＨは、好ましくはｐＨ５．５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８．５である。反応液の１００倍希釈液のｐＨは、以下の手順で測定することができる：反応液と同濃度の脂肪酸、アルコール、及び必要に応じてアルカリが溶解した溶液を、該脂肪酸とアルコールの総質量に対して１００倍質量になるよう水で希釈する。得られた希釈液を、脂肪酸、アルコール及びアルカリが均一に溶解するよう充分に撹拌した後、遠心（１５００ｒｐｍ、５分）する。得られた上清のｐＨ（２５℃）をｐＨ電極を用いた測定法により測定する。ｐＨ測定には市販のｐＨメーター（例えば、卓上型ｐＨメーター  Ｆ−５２（ＨＯＲＩＢＡ））を使用することができる。
【００２２】
本発明の方法において、該脂肪酸とアルコールとのエステル化反応の反応温度は、ＭＧＬＰの至適温度、該脂肪酸の融点などに応じて適宜調整すればよい。反応速度を向上する点、及び酵素の失活を抑制する点からは、反応温度は０〜１００℃が好ましく、１０〜８０℃がより好ましく、反応性の点から２０〜７０℃がさらに好ましい。該エステル化反応の反応時間は、反応液中の酵素や基質の量などに応じて適宜調整すればよいが、工業的な生産性の観点から、１〜２００時間が好ましく、２〜１５０時間がより好ましい。また反応効率の観点からは、反応液を撹拌しながら該エステル化反応を行うことが好ましい。また、適宜反応系の圧力の調整を行なってもよく、該圧力条件は、反応効率の観点から、１０〜１００００Ｐａが好ましく、１００〜１０００Ｐａがより好ましい。また、効率的にエステル化反応物を得る点から、反応生成水を反応系外に除去しながらエステル化反応が行われることが好ましい。例えば、ＭＧＬＰ製剤に含まれる水分を除き、実質的に無水条件下で反応が行われ、エステル化反応により生成した反応生成水は、減圧；ゼオライト、モレキュラーシーブス等の吸収剤の利用；反応槽中への乾燥した不活性ガスの通気等の方法により、系外に除去される。
【００２３】
当該反応液中に生成した脂肪酸エステルは、常法により分離又は精製することができる。該反応液から脂肪酸エステルを分離又は精製する手段としては、例えば、蒸留、溶媒抽出などが挙げられる。あるいは、生成した脂肪酸エステルを含む反応液を、そのまま脂肪酸エステル原料として各種用途に使用することができる。
【００２４】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００２５】
〔１〕モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸とアルコールとのエステル化反応において、反応液のｐＨを上昇させることを含む、脂肪酸エステルの製造方法。
〔２〕好ましくは、前記反応液のｐＨの上昇が、該反応液へのアルカリの添加により行われる、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、アルカリを含有する反応液中でモノアシルグリセロールリパーゼにより脂肪酸とアルコールをエステル化させることを含む、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記アルカリが、好ましくは水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及びアミン系塩基からなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくは水酸化カリウムである、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕前記反応液における前記アルカリの初期濃度が、好ましくは０．００５〜１．３ｍｏｌ／ｇ−反応液、より好ましくは０．０１〜０．６ｍｏｌ／ｇ−反応液、さらに好ましくは０．０２〜０．４ｍｏｌ／ｇ−反応液である、〔２〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記脂肪酸に対する前記アルカリの初期濃度が、好ましくは０．２〜５０％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）、より好ましくは０．４〜２５％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）、さらに好ましくは、０．９〜１５％（ｍｏｌ／脂肪酸−ｍｏｌ）である、〔２〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記反応液における前記アルカリの初期濃度が、好ましくは、該アルカリを含有する該反応液を水で１００倍に希釈した希釈液のｐＨが該アルカリを含まない該反応液に対して好ましくは０．５以上、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１．５〜３上昇する量である、〔２〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記アルカリを含有する前記反応液の１００倍希釈液が、好ましくはｐＨ５．５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８．５である、〔２〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記モノアシルグリセロールリパーゼが、
好ましくは、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属するモノアシルグリセロールリパーゼであり、
より好ましくは、該Ｆａｍｉｌｙ  ＸＶに属する、バチルス属菌又はゲオバチルス属菌由来の非分泌型モノアシルグリセロールリパーゼであり、
さらに好ましくは、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであるか、配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号３〜６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドであり、
さらに好ましくは、配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号１及び２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなり、かつモノグリセリドリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドである、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の製造方法。
〔１０〕前記反応液中における前記モノアシルグリセロールリパーゼの初期濃度が、好ましくは０．１〜１００ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ−反応液、より好ましくは０．５〜１００ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ−反応液、さらに好ましくは５〜２０ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ−反応液である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕好ましくは、前記反応液中における前記脂肪酸の初期濃度が０．１〜０．７５−脂肪酸／ｇ−反応液である、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕好ましくは、前記反応液中における前記アルコールの初期濃度が０．１〜０．７５−アルコール／ｇ−反応液である、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕前記反応液中における前記脂肪酸とアルコールとのモル比が、それらの初期濃度に基づいて、好ましくは１：０．２〜５０、より好ましくは１:１〜１０、さらに好ましくは１:１〜２である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕前記アルコールが、好ましくは一価アルコール又は多価アルコールであり、より好ましくは多価アルコールであり、
該多価アルコールが、好ましくはグリセリン、エリスリトール、スレイトール、キシリトール、ジグリセリン、トリグリセリン、ポリグリセリン、トリメチロールプロパン、ブタントリオール、及びブタンジオールからなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくはグリセリンである、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記脂肪酸エステルがモノアシルグリセロールである、〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記脂肪酸が飽和又は不飽和の直鎖脂肪酸であり、該直鎖脂肪酸が、好ましくは中鎖脂肪酸又は長鎖脂肪酸、より好ましくは炭素数８〜２２の脂肪酸、さらに好ましくは炭素数１２〜１８の脂肪酸である、〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
〔１７〕前記エステル化反応の反応温度が、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは１０〜８０℃、さらに好ましくは２０〜７０℃である、〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の方法。
〔１８〕前記エステル化反応液中における初期水分量が、好ましくは０．２〜５０質量％、より好ましくは０．２〜２５質量％、さらに好ましくは０．２〜１０質量％である、〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
〔１９〕前記エステル化反応における圧力条件が、好ましくは１０〜１００００Ｐａ、より好ましくは１００〜１０００Ｐａである、〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。反応は、９８℃で１分間、続いて〔９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１分間〕を３０サイクル行なった。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用して行った。宿主微生物へのプラスミドの導入は、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）にて行った。タンパク質生産のための組換え微生物の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、又は２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）を用いた。表１に、以下の実施例で使用したプライマーの名称とヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
【表１】
2020092614.tif 000002
【００２９】
実施例１  モノアシルグリセロールリパーゼの調製
モノアシルグリセロールリパーゼであるＥｓｔＧｔＡ２、Ｈ−２５７、ｓｔＬＰ、ＣＩ２２０−６、ＣＩ２２０−１０、及びＣＩ２２０−１２（配列番号１〜６）を発現する組換え枯草菌株を構築した。
【００３０】
（１）ＥｓｔＧｔＡ２発現用プラスミドの構築
ＥｓｔＧｔＡ２（配列番号１）をコードする、枯草菌用にコドン至適化した遺伝子（配列番号７）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミド（ＥｓｔＧｔＡ２−ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型とし、表１に示すプライマーＥｓｔＧｔＡ２−Ｆ及びプライマーＥｓｔＧｔＡ２−Ｒ（配列番号１３及び１４）を用いてＰＣＲを行った。同様に、ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｆ及びｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｒ（配列番号１５及び１６）を使用してＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。得られた両断片を適量混合し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法を用いてプラスミド（ｐＨＹ−ＥｓｔＧｔＡ２）を合成した。該Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いてＥＣＯＳTMＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０−０６２３６）を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収し、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドｐＨＹ−ＥｓｔＧｔＡ２を抽出した。
【００３１】
（２）その他ＭＧＬＰ発現用プラスミドの構築
Ｈ−２５７、ｓｔＬＰ、ＣＩ２２０−６、ＣＩ２２０−１０及びＣＩ２２０−１２（配列番号２〜６）を各々コードする、枯草菌用にコドン至適化した遺伝子（配列番号８〜１２）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミド（Ｈ−２５７−ｐＵＣ５７、ｓｔＬＰ−ｐＵＣ５７、ＣＩ２２０−６−ｐＵＣ５７、ＣＩ２２０−１０−ｐＵＣ５７、及びＣＩ２２０−１２−ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型として、表１に示すプライマーペアＨ２５７−Ｆ／Ｒ（配列番号１７及び１８）、ｓｔＬＰ−Ｆ／Ｒ（配列番号１９及び２０）、ＣＩ２２０−６−Ｆ／Ｒ（配列番号２１及び２２）、ＣＩ２２０−１０−Ｆ／Ｒ（配列番号２３及び２４）、及びＣＩ２２０−１２−Ｆ／Ｒ（配列番号２５及び２６）をそれぞれ用いてＰＣＲを行った。同様に、プラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｆ及びｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｒ（配列番号１５及び１６）を使用してＰＣＲ反応を行った。次いで（１）と同様の手順で、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ処理し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法を用いてプラスミド（ｐＨＹ−Ｈ−２５７、ｐＨＹ−ｓｔＬＰ、ｐＨＹ−ＣＩ２２０−６、ｐＨＹ−ＣＩ２２０−１０、及びｐＨＹ−ＣＩ２２０−１２）を合成した。
【００３２】
（３）ＭＧＬＰ発現組換え枯草菌株の作製
上記（１）及び（２）で得られた各ＭＧＬＰをコードするプラスミド（ｐＨＹ−ＥｓｔＧｔＡ２、ｐＨＹ−Ｈ−２５７、ｐＨＹ−ｓｔＬＰ、ｐＨＹ−ＣＩ２２０−６、ｐＨＹ−ＣＩ２２０−１０、及びｐＨＹ−ＣＩ２２０−１２）を、各々、プロテアーゼ遺伝子９重欠失枯草菌株（Ｋａｏ９株；プロテアーゼ遺伝子aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXが欠失した株、特開２００６−１７４７０７）に導入し、各ＭＧＬＰを発現する組換え枯草菌株を得た。
【００３３】
（４）ＭＧＬＰ生産
（３）で得られた組換え枯草菌株を３ｍＬ／大試験管（φ１８×１８０ｍｍ）中のＬＢ培地で３０℃、１５時間、２５０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培養液０．０２ｍＬを２０ｍＬ／５００ｍＬ容ヒダ付三角フラスコ（バイオット）の２×Ｌ−マルトース培地に接種し、３０℃で９６時間、２１０ｒｐｍで振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分）し、得られた上清からフィルター（０．４５μｍ、ＰＶＤＦ、メルクミリポア製）によって菌体を除いた。残った上清をビバスピン２０（ザルトリウス）にて濃縮後、エコノパック（登録商標）１０ＤＧ脱塩カラム（バイオラッド）を用いて５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へと置換した。得られた溶液を６０℃で１０分間加熱処理することで枯草菌宿主由来のリパーゼを不活化し、遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分）により凝集物を除去した。遠心後の上清を分取し、これを酵素液として用いた。酵素濃度はＱｕｉｃｋ  ＳｔａｒｔTM  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １×  Ｄｙｅ  Ｒａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。アルブミンタンパク質溶液を用いて作成した検量線により酵素濃度を測定した。
【００３４】
（５）乾燥酵素の調製
（４）で得られた酵素液２００μＬを１．５ｍＬチューブに分取し、氷冷したアセトン１ｍＬを添加した。ボルテックス後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×１０分）により酵素を沈殿させた。アセトンを除去した後、窒素ガスを吹き付けて完全にアセトンを除去し、乾燥酵素を得た。
【００３５】
実施例２  モノアシルグリセロールリパーゼによる脂肪酸エステル化
（１）方法
（機器）
反応槽にはケミストプラザＣＰ−１０００（柴田化学）を用いた。リップ付試験管、試験管用キャップ、及び十字撹拌子は、ＣＰ−１０００用の付属品を用いた。
【００３６】
（エステル化反応）
リップ付試験管（φ１５×１０５ｍｍ）に十字型撹拌子を入れ、グリセリン及び脂肪酸を添加し、次いで実施例１で調製した乾燥酵素又は酵素液、及びアルカリ水溶液を添加した。試験管のキャップを閉めて反応槽にセットし、反応液を８００ｒｐｍで撹拌しながら、所定の温度及び時間でエステル化反応を進めた。
【００３７】
（脂肪酸エステルの分析）
エステル化反応後の反応液約１０μＬを試験管に分取し、クロロホルム１ｍＬ、メタノール１ｍＬ、及び脱イオン水１ｍＬを添加して撹拌し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）した。有機層（下層）をねじ口試験管に回収し、窒素ガスで乾固した。得られた乾固物にＴＭＳＩ−Ｈ（ジーエルサイエンス）を添加し、８０℃で１０分間反応させた。反応物にヘキサン１ｍＬ、飽和ＮａＣｌ溶液１ｍＬ添加して撹拌し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）した後、ヘキサン層（上層）を回収することで、脂肪酸グリセリドのトリメチルシリル誘導体を得た。得られたトリメチルシリル誘導体を、下記に示す条件下でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：（Ａｇｉｌｅｎｔ）
キャピラリーカラム：ＤＢ１−Ｍ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：ヘリウム
カラム内流量：０．２５ｍＬ／分
昇温プログラム：８０℃（１分）→２０℃／分→３４０℃（１０分）
注入口：スプリット注入（スプリット比：５０：１）
検出器温度：３４０℃
検出器：ＦＩＤ
【００３８】
（エステル化率の計算）
ＧＣ分析で検出された遊離脂肪酸（ＦＡ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、及びトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のピークエリアに基づいて、下記の式に従って反応液のエステル化率及びＭＡＧ選択率を計算した。
エステル化率（％）＝（ＭＡＧ＋ＤＡＧ＋ＴＡＧ）／（ＦＡ＋ＭＡＧ＋ＤＡＧ＋ＴＡＧ）×１００
ＭＡＧ選択率（％）＝ＭＡＧ／（ＭＡＧ＋ＤＡＧ＋ＴＡＧ）×１００
【００３９】
（反応液のｐＨ測定）
十字型撹拌子を入れたリップ付試験管（φ１５×１０５ｍｍ）にグリセリン、脂肪酸及び水酸化カリウムを添加し、ＣＰ−１０００にセットして所定温度、８００ｒｐｍで充分に撹拌した。撹拌した溶液の一部を１．５ｍＬチューブに一部分取し、質量を測定した。該溶液を、ＭｉｌｌｉＱ水で１００倍質量になるよう希釈した。希釈液を所定温度、８００ｒｐｍで充分に撹拌した後、遠心（１５００ｒｐｍ、５分）した。得られた上清（２５℃）のｐＨをｐＨメーター（卓上型ｐＨメーター  Ｆ−５２；ＨＯＲＩＢＡ）にて測定した。
【００４０】
（２）ＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成に対するアルカリ（ＫＯＨ）の影響
アルカリ水溶液には８Ｎ  ＫＯＨ水溶液を用いた。脂肪酸にはオレイン酸を用いた。（１）に記載した手順に従って、グリセリン０．０９ｇ及びオレイン酸０．２５ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝１：１）を含む試験管に、８Ｎ  ＫＯＨを２、８、又は１６μＬ添加し、次いで実施例１で調製したＥｓｔＧｔＡ２の乾燥酵素を３．５ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ添加して反応液を調製した（反応液中のＫＯＨ最終濃度０．０４４、０．１８及び０．３６ｍｏｌ／ｇ）。コントロールとしてＫＯＨ非添加の反応液を調製した。該反応液を、（１）に記載した手順に従って５０℃、８００ｒｐｍで９時間反応させ、次いでエステル化率を測定した。結果を表２に示す。ＫＯＨ存在下でＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成が大きく亢進した。
【００４１】
【表２】
2020092614.tif 000003
【００４２】
（３）ＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成に対するアルカリ（アンモニア水）の影響
アルカリ水溶液には１０％アンモニア水を用いた。脂肪酸にはオレイン酸を用いた。（１）に記載した手順に従って、グリセリン０．０９ｇ及びオレイン酸０．２５ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝１：１）を含む試験管に、１０％アンモニア水を１０、又は２０μＬ添加し、次いで実施例１で調製したＥｓｔＧｔＡ２の乾燥酵素を３．６ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ添加して反応液を調製した（反応液中のアンモニア最終濃度、０．１７及び０．３３ｍｏｌ／ｇ）。該反応液を、（１）に記載した手順に従って６５℃、８００ｒｐｍで７時間反応させ、次いでエステル化率を測定した。結果を表３に示す。アンモニア水存在下でＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成が大きく亢進した。
【００４３】
【表３】
2020092614.tif 000004
【００４４】
（４）アルカリ存在下での脂肪酸エステル合成に対するグリセリン：脂肪酸比の影響
アルカリ水溶液には８Ｎ  ＫＯＨ水溶液を用いた。脂肪酸にはオレイン酸を用いた。（１）に記載した手順に従って、グリセリン０．２７ｇ及びパルミチン酸０．２３ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝３：１）、又はグリセリン０．４５ｇ及びパルミチン酸０．２３ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝５：１）を含む試験管に、８Ｎ  ＫＯＨを８μＬ添加し、次いで実施例１で調製したＥｓｔＧｔａ２の乾燥酵素を２ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ添加して反応液を調製した。コントロールとしてＫＯＨ非添加の反応液を調製した。該反応液を、（１）に記載した手順に従って６５℃、８００ｒｐｍで２４時間反応させ、次いでエステル化率を測定した。結果を表４に示す。グリセリンと脂肪酸の比率が異なる場合にも、アルカリ存在下でのＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成の亢進が見られた。
【００４５】
【表４】
2020092614.tif 000005
【００４６】
（５）アルカリ存在下での各種ＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成
アルカリ水溶液には８Ｎ  ＫＯＨ水溶液を用いた。脂肪酸にはパルミチン酸を用いた。（１）に記載した手順に従って、グリセリン０．０９ｇ及びパルミチン酸０．２３ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝１：１）を含む試験管に、８Ｎ  ＫＯＨを８又は２０μＬ添加し、次いで実施例１で調製したＨ−２５７の乾燥酵素を２．５ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ添加して反応液を調製した。コントロールとしてＫＯＨ非添加の反応液を調製した。該反応液を、（１）に記載した手順に従って６５℃、８００ｒｐｍで２４時間反応させ、次いでエステル化率を測定した。結果を表５に示す。
【００４７】
同様の手順で、酵素としてｓｔＬＰ、ＣＩ２２０−６、ＣＩ２２０−１０、及びＣＩ２２０−１２の乾燥酵素２．５ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ、ならびにアルカリとして８Ｎ  ＫＯＨを８又は２４μＬを含む反応液を調製し、該反応液を５０℃、８００ｒｐｍで２４時間反応させ、エステル化率を測定した。結果を表５に示す。いずれのＭＧＬＰについても、アルカリ存在下では脂肪酸エステル合成が大きく亢進した。
【００４８】
【表５】
2020092614.tif 000006
【００４９】
（６）アルカリによる反応液ｐＨの上昇
グリセリン０．１１ｇとオレイン酸０．２５ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝１．２：１）を含む溶液、及びこれに８Ｎ  ＫＯＨを１、２、８、１６μＬ添加した溶液のｐＨを、（１）に記載した方法に従って測定した。結果を表６に示す。ＫＯＨを添加することにより反応液のｐＨが上昇することが示された。
【００５０】
【表６】
2020092614.tif 000007
【００５１】
（７）水分含量の影響
アルカリ水溶液には８Ｎ  ＫＯＨ水溶液を用いた。脂肪酸にはオレイン酸を用いた。（１）に記載した手順に従って、グリセリン０．１１ｇ及びオレイン酸０．２５ｇ（グリセリン：脂肪酸のモル比＝１．２：１）を含む試験管に、８Ｎ  ＫＯＨを８μＬ添加し、次いでＭｉｌｌｉＱ水を８、３０、６０μＬ添加（水分含量６、１３及び２１質量％）し、次いで実施例１で調製したＥｓｔＧｔＡ２の乾燥酵素を６ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ添加して反応液を調製した。該反応液を、（１）に記載した手順に従って６５℃、８００ｒｐｍで４時間反応させ、次いでエステル化率を測定した。結果を表７に示す。反応液の水分含量が低い方が、ＫＯＨ存在下でＭＧＬＰによる脂肪酸エステル合成が亢進した。ただし、水分含量が高い場合でも反応が可能であった。
【００５２】
【表７】
2020092614.tif 000008
【００５３】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【配列表】
2020092614000001.app