(57)【要約】【課題】生存材料に十分好適であり、所望の拡散特性を提供し、取り扱いが容易な障壁材料を得ること。【解決手段】本開示は１つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートであって、ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するための少なくとも１つの障壁を含み、障壁が、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む細胞培養プレート、およびそれを調製するための方法に関する。本開示はまた、物質を検出するための方法にも関する。【選択図】図１７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートであって、前記ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するための少なくとも１つの障壁を含み、前記障壁がナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む、細胞培養プレート。
【請求項２】
前記障壁の壁の厚さが０．５〜２ｍｍの範囲である、請求項１に記載の細胞培養プレート。
【請求項３】
前記ナノフィブリルセルロースヒドロゲルが０．８〜２．５％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースを含む、請求項１または２に記載の細胞培養プレート。
【請求項４】
前記ナノフィブリルセルロースヒドロゲルが１．０〜２．１％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースを含む、請求項１または２に記載の細胞培養プレート。
【請求項５】
前記細胞培養プレートと前記ナノフィブリルセルロースヒドロゲルとの間に接着剤を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項６】
前記接着剤が、コラーゲンベースの接着剤、フィブリノーゲンベースの接着剤、ゼラチンベースの接着剤またはリシンベースの接着剤を含む、請求項５に記載の細胞培養プレート。
【請求項７】
前記少なくとも１つの障壁が、前記細胞培養ウェル上の少なくとも１つのエリアを取り囲んでいる、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項８】
前記ナノフィブリルセルロースが、水中に分散した場合、２２℃±１℃の水性培地中０．５重量％（ｗ／ｗ）の稠度で回転レオメーターによって決定された、１０００〜１０００００Ｐａ・ｓの範囲のゼロせん断粘度および１〜５０Ｐａの範囲の降伏応力を提供し、および／または前記ナノフィブリルセルロースが２００ｎｍ以下の平均原線維径を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項９】
前記ナノフィブリルセルロースが、水中に分散した場合、２２℃±１℃の水性培地中０．５重量％（ｗ／ｗ）の稠度で回転レオメーターによって決定された、５０００〜５００００Ｐａ・ｓの範囲のゼロせん断粘度および３〜１５Ｐａの範囲の降伏応力を提供し、および／または前記ナノフィブリルセルロースが２００ｎｍ以下の平均原線維径を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項１０】
前記ナノフィブリルセルロースが、未修飾ナノフィブリルセルロース、アニオン修飾ナノフィブリルセルロース、および酸化ナノフィブリルセルロースから選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項１１】
前記コンパートメントのうちの少なくとも１つが、前記障壁と比較して低濃度のゲルを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項１２】
前記コンパートメントのうちの少なくとも１つが、０．７％（ｗ／ｗ）以下の濃度のナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む、請求項１１に記載の細胞培養プレート。
【請求項１３】
前記ウェルが、１つのコンパートメント中に１種類の細胞を含み、任意選択で、少なくとも１つの他のコンパートメント中に同じおよび／または他の種類の細胞を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞培養プレート。
【請求項１４】
前記細胞が、肝細胞、内皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、腎細胞、免疫細胞、神経細胞、および幹細胞から選択される、請求項１３に記載の細胞培養プレート。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞培養プレートを調製するための方法であって、
−  １つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートを準備すること、
−  ナノフィブリルセルロースを含む水性分散体を準備すること、
−  前記ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するために、少なくとも１つの障壁を、前記ナノフィブリルセルロースから少なくとも１つの細胞培養ウェルに形成すること
を含む方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの障壁を形成することが、積層造形によって前記障壁を調製することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの障壁を提供する前に、前記１つまたは複数の細胞培養ウェルに接着剤をコーティングすることを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
物質を検出するための方法であって、
−  第１のコンパートメント中に第１の細胞を含む請求項１から１４のいずれか一項に記載の細胞培養プレートを提供することと、
−  別のコンパートメントから少なくとも１つの物質を検出すること
を含む方法。
【請求項１９】
−  目的の物質をコンパートメントに適用すること、
−  前記細胞が前記目的の物質と反応するのに十分な時間にわたって前記細胞をインキュベートすること、
−  別のコンパートメントから少なくとも１つの物質を検出すること
を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的の物質、前記細胞によって分泌された物質、前記目的の物質の反応産物、または他の物質から選択される前記少なくとも１つの物質の量を検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のコンパートメントから前記少なくとも１つの物質および／または前記細胞の反応を検出することも含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
検出された前記物質および／または前記細胞の反応に基づいて、前記細胞に対する前記物質の効果を評価することを含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
−  第２のコンパートメント中に第２の細胞を更に提供すること、
−  前記第２の細胞によっておよび／または前記第２の細胞の反応によって分泌された少なくとも１つの物質を、前記第２のコンパートメントから検出することと、
−  前記第２の細胞によっておよび／または前記第２の細胞の反応によって分泌され、検出された前記物質に基づいて、前記第１の細胞および／または前記第２の細胞に対する前記目的の物質の効果を評価すること
を含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の細胞および／または前記第２の細胞が、肝細胞、内皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、腎細胞、免疫細胞、神経細胞、および幹細胞から選択される、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、プレート上の細胞培養ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するナノフィブリルセルロース障壁を有する細胞培養プレート、およびそれを調製するための方法に関する。本開示はまた、物質を検出する方法および細胞に対する物質の効果を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ある特定の細胞培養法では、例えばペトリ皿またはマルチウェルプレートウェルなどの細胞培養エリアを、２つ以上のコンパートメントに分割することが必要な場合がある。エリアをコンパートメントに分割するために、障壁を提供してもよい。ある特定の薬剤は障壁を貫通することができるが、例えば細胞は貫通できないことが望ましい場合がある。
【０００３】
多孔質プラスチック挿入物を障壁として使用する場合がある。しかし、そのような挿入物は、生存細胞に完全に適合しないことがあり、孔を通過した薬剤の拡散が最適ではないことがある。生存材料に十分好適であり、所望の拡散特性を提供し、取り扱いが容易な障壁材料を得ることが望まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
概要
本発明では、細胞培養の用途において障壁特性を提供するためにナノフィブリルセルロースが理想的な材料であることが見出された。ナノフィブリルセルロースは、細胞が障壁を通過するのを阻止するが、小分子、更に細胞外小胞が通過するのを可能にする。その濃度および化学的形態を調整することによって、ナノフィブリルセルロースの障壁特性を制御することも可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、１つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートであって、ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するための少なくとも１つの障壁を含み、障壁がナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む、細胞培養プレートを提供する。
【０００６】
本開示は、細胞培養プレートを調製するための方法であって、
−  １つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートを準備すること、
−  ナノフィブリルセルロース、好ましくは０．８〜２．５％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースを含む水性分散体を準備すること、
−  ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するために、少なくとも１つの障壁を、ナノフィブリルセルロースから少なくとも１つの細胞培養ウェルに形成すること、
を含む方法も提供する。得られた細胞培養プレートは、本明細書において記載する細胞培養プレートのうちのいずれかであってもよい。
【０００７】
本開示は、物質を検出するための方法であって、
−  第１のコンパートメント中に第１の細胞を含む細胞培養プレートを提供することと、
−  別のコンパートメントから少なくとも１つの物質を検出すること
を含む方法も提供する。
【０００８】
主な実施形態は、独立請求項において特徴付けられる。さまざまな実施形態が従属請求項において開示される。特許請求の範囲および本明細書において挙げる実施形態および例は、特に明記しない限り、互いに自由に組み合わせることができる。
【０００９】
ヒドロゲルとして存在するナノフィブリルセルロースは、非毒性、生体適合性であり、生分解性でもある親水性マトリックスを提供する。マトリックスは、酵素的に、例えばセルラーゼを添加することによって分解されてもよい。他方、ヒドロゲルは、生理学的条件において安定であり、追加の薬剤を使用することによって架橋する必要はない。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの特性、例えば透過性は、ナノフィブリルセルロースの化学的および／または物理的性質を調整することによって制御してもよい。
【００１０】
ナノフィブリルセルロースを含むヒドロゲルのある特定の有利な特性としては、可撓性、弾性および再成形性（remouldability）がある。ヒドロゲルは、大量の水分を含み、分子に関して良好な透過性も示す。本実施形態のヒドロゲルは、高い水分保持能力および分子拡散特性速度も提供する。
【００１１】
本明細書において記載するナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、医学的および科学的用途において有用であり、ナノフィブリルセルロースを含む材料は生物と接触している。本明細書において記載するナノフィブリルセルロースを含む製品は、生物との生体適合性が高く、いくつかの有利な効果を提供する。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、非常に高い比表面積、したがって高い水分保持能力を有する非常に親水性の高いナノフィブリルセルロースを含むヒドロゲルは、細胞に対して適用した場合、細胞とナノフィブリルセルロースを含むヒドロゲルとの間に良好な湿潤環境を提供すると考えられる。ナノフィブリルセルロース中の大量の遊離ヒドロキシル基によって、ナノフィブリルセルロースと水分子との間に水素結合が形成され、ナノフィブリルセルロースのゲル形成、および高い水分保持能力を可能にする。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、大量の水分を含み、流体および／または薬剤の移動も可能にする。
【００１２】
ナノフィブリルセルロースは、細胞用のマトリックスとして使用してもよく、したがって細胞を保護する環境を提供し、その生存率を維持する助けとなる。ナノフィブリルセルロース材料の１つの利点は、セルロースナノファイバーのフィブリルネットワークの寸法が、コラーゲンナノファイバーの天然のＥＣＭネットワークに非常に近いことである。更に、セルロースナノファイバーは非動物性材料であり、そのため疾患が転移するリスクがない。本材料では、細胞用の透明で多孔質のマトリックスを得ることが可能であり、材料の取り扱いは代替物と比較して容易である。セルロースナノファイバーの蛍光バックグラウンドはごくわずかである。セルロースナノファイバーヒドロゲルは、３Ｄおよび２Ｄ細胞の保存または培養マトリックスとして使用するのに最適な弾性、剛性、せん断応力、機械的接着力および多孔率も有する。
【００１３】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲル障壁は、細胞が障壁を通過することを阻止するが、小さい物質を移動させることはできるために、細胞を研究するためのさまざまな方法において使用することができる。細胞型のうちの１つまたは複数は、それ自体のコンパートメント中で単離してもよく、細胞によって分泌されたおよび／またはそうでなければコンパートメント中に提供された１つまたは複数の薬剤は、同じコンパートメント中でまたは障壁の後ろにある別のコンパートメント中で研究してもよい。こうして、細胞との直接的な接触を排除することができる。例えば、薬剤、または第１の細胞によって分泌された薬剤、例えば代謝産物によって提供される、第２の細胞に対する効果を研究することが可能である。細胞が異なるコンパートメントにある場合、これらは互いに物理的に単離されており、直接、すなわち物理的に接触している状態で相互作用する細胞の影響を排除することができる。その結果、医学的および科学的研究において使用することができる製品を入手することが可能である。
【００１４】
ナノフィブリルセルロースは、従来のセルロースと異なる特殊なナノスケールの材料であり、そのため、従来の製品と異なる特性を示す材料および製品を調製することが可能である。そのような製品は、ヒドロゲル材料を所望の形態へ排出することができるデバイス、例えば積層造形、すなわち３Ｄ印刷を利用するデバイスを使用して調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】４８ウェルプレートの直線状壁の形状の障壁を示す図である。
【図２】６ウェルプレートの円形状の障壁を示す図である。上部障壁は１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ、ロット１１８７８で構築され、下部障壁は０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ、ロット１１８９８で構築される。色は細胞培養培地に由来する。
【図３】ＧｒｏｗＤｅｘ障壁で分割されたウェル中の０．２％トリパンブルーの分布を示す図である。
【図４】ウェルＡ１およびＢ１に構築された１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁ウェル、Ａ３およびＢ３に構築された０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す図である。
【図５】１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁に対して遊走するＮＲ８３８３細胞の１００倍の拡大図を示す図である。赤色矢印は障壁を指す。黒色矢印は、細胞が適用された障壁の内側（ＧｒｏｗＤｅｘ以外）を指す。
【図６】４００倍の拡大図を示す図である。左：１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁に向かって遊走するＮＲ８３８３細胞。右：ＧｒｏｗＤｅｘ障壁中のＮＲ８３８３細胞。
【図７】０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁に向かって遊走するＮＲ８３８３細胞を示す図である。黒色矢印は、細胞が適用された場合の障壁の内側（細胞はＧｒｏｗＤｅｘに付着していない）を指す。赤色矢印は障壁を指す。
【図８】１００倍の拡大図を示す図である。左：ピペットで移した場合の、０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の内側のＮＲ８３８３細胞（細胞はＧｒｏｗＤｅｘに付着していない）。右：０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁中のＮＲ８３８３細胞。
【図９】０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁（青色矢印）の外側におけるＮＲ８３８３細胞の１００倍の拡大図を示す図である。赤色矢印は障壁を指す。
【図１０】ヒトＢＪ線維芽細胞の生存率に対するセレギリンおよびパラセタモールの効果を示す図である。
【図１１】ナノフィブリルセルロース障壁で２つの等しいサイズのコンパートメントに分割されたウェルの概略図の例を示す図である。
【図１２】明るい色のＧｒｏｗＤｅｘを使用して調製した障壁を示す図である。右の列における３つの「ピンク色」の障壁：２．０％ＧｒｏｗＤｅｘ。左の２つの「ピンク色」の障壁：約１．７〜１．９％ＧｒｏｗＤｅｘ。ピンク色の培地を含まない２つのウェル（左上）：約１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ。
【図１３】障壁の左側で撮影されたＨｅｐａＲＧ細胞（左）および障壁の右側で撮影されたＢＪ線維芽細胞（右）を示す図である。
【図１４】ＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって２つのコンパートメントに分割された（２４ウェルプレート）ウェルのマルチポイント吸光度測定を示す図である。ＨｅｐａＲＧ細胞は左にあり、ＢＪ線維芽細胞は障壁の右側にある。
【図１５】２４ウェルプレートにおいて新しく調製したＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す図である。
【図１６】２４ウェルプレートにおいて新しく調製したＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す図である。
【図１７】２４ウェルプレートにおいて新しく調製したＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す図である。
【図１８】パラセタモール、またはＨｅｐａＲＧ順化パラセタモール曝露の、ヒトＢＪ線維芽細胞の生存率に対する直接的な影響を示す図である。各バーは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１２（対照）、Ｎ＝１８（５００μｇ／ｍｌパラセタモール）を表す。統計的差異はｔ−検定を使用して調べた（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）。
【図１９】１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（Ａ、Ｂ）および２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（Ｃ）を使用して印刷した不均等な障壁構築物を示す図である。
【図２０】最初に３Ｄ印刷をフィルム上に行ってから（上図）、マルチウェルプレートに移動したこと（下図）を示す図である。
【図２１】異なるビヒクルにおける障壁構築物の安定化を示す図である；（左から右へ）：１％ＣａＣｌ２  １時間、１％ＣａＣｌ２一晩、ＭＥＭ一晩、および乾燥処置一晩、次いで２％ＣａＣｌ２の添加。
【図２２】異なるコーティングを有する（およびコーティングなしの）ウェル上で異なるビヒクル中で維持された１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す図である（Ａ、Ｂ）。プレートを４５度に傾けた場合、フィブロネクチンコーティングおよび非コーティングウェル上に構築された障壁は滑り落ちる。ポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチン上の障壁はその場所に付着したままである（Ｃ）。
【図２３】異なるコーティング上に構築され、異なるビヒクル中で維持された２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ障壁を示す図である。
【図２４】１２ウェルプレート上に構築された、２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（上部画像）および１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（下部画像）からの障壁を示す図である。印刷プロトコールおよび印刷自体は成功した。
【図２５】２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（上部画像）および１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（下部画像）から２４ウェルプレート上に構築された障壁を示す図である。
【図２６Ａ】化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、１２ウェルプレートの４５０ｎｍにおける吸光度測定を示す図である。１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を表す。
【図２６Ｂ】化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、１２ウェルプレートの４５０ｎｍにおける吸光度測定を示す図である。２．０％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を表す。
【図２７】化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、２４ウェルプレートの４５０ｎｍにおける吸光度測定を示す図である。
【図２８】化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、２４ウェルプレートの４５０ｎｍにおける吸光度測定を示す図である。
【図２９】ＢＪ細胞を播種し、曝露する前（上部画像）、および曝露し、ＷＳＴ−１試薬を添加した後（下部画像）の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す図である。
【図３０】化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２時間インキュベートした後の、１２ウェルプレートの４５０ｎｍにおける吸光度測定を示す図である。
【図３１】ブランク：ＰＢＳ中の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁（左）、およびＭＥＭ中の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁（右）の４５０ｎｍにおける吸光度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本明細書において、百分率値は、特に明記されていない限り、重量（ｗ／ｗ）に基づいている。任意の数値範囲が提供される場合、その範囲は上限値および下限値も含む。「含む」というオープン用語は、「からなる」というクローズド用語も１つの選択肢として含む。
【００１７】
本明細書において記載する材料および製品は、医学的および／または科学的材料および製品、例えば生命科学材料および製品であってもよく、本明細書において記載するような生細胞および／または生物活性材料もしくは物質に関与する方法および用途において使用してもよい。材料または製品は、細胞培養、細胞保存および／または細胞研究材料もしくは製品であっても、これらに関連していてもよく、細胞が医学的または科学的目的で培養、保存、維持、輸送、提供、変性、試験、および／または使用される方法、または他の関連する適用可能な方法において使用してもよい。
【００１８】
本開示は１つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートを提供する。細胞培養プレートは、細胞を収容するための少なくとも１つの特定のエリア、例えばウェルまたは匹敵する構造を含む、任意の好適な細胞培養プレートまたは支持体であってもよい。細胞培養プレートの１つの例はペトリ皿であり、単に細胞培養皿とも称され、通常は円形の皿であり、細胞培養エリアを囲む縁が突出しており、そうしてウェルが形成されている。細胞培養プレートの別の例はマルチウェルプレートであり、マイクロプレート、マルチプレート、マイクロタイタープレート、マイクロウェルプレートまたはマルチウェルとも称され、平らなプレートであり、複数のウェル、例えば６、１２、２４、４８、９６、または３８４個のサンプルウェルを含み、例えば、２：３の長方形のマトリックスとして配列されている場合がある。１つのウェルが、数十ナノリットルから数ミリリットルの液体および／または他の適用可能な物質を保持することができる。細胞培養プレートは、例えば、インキュベートまたは細胞培養中のガス交換を可能にする、緩く取り外し可能なカバーを備えている場合がある。
【００１９】
細胞培養プレートは、さまざまな材料、例えばガラスまたはプラスチックから製造してもよい。最も一般的なものは、大部分の光学検出マイクロプレートに使用されるポリスチレンであるが、ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンおよび他の熱可塑性または熱硬化性ポリマーも使用してもよい。材料は、好ましくは透明であり、目視によって、またはプレート、特にマルチウェルプレートを光学的に読み取るための特定のデバイスを使用することによって、ウェルを目視検査することを可能にする。
【００２０】
ウェルのうちの１つまたは複数は、ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するための少なくとも１つの障壁を含み、障壁は、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む。コンパートメントは、好ましくは、細胞、液体、ゲル、懸濁液、分散体および／または類似のものを収容するように設計される。少なくとも１つのコンパートメントは、細胞を収容するように設計され、それは細胞を、コンパートメント中で適用、インキュベートおよび／または培養してもよいことを意味する場合がある。障壁の高さと、障壁、任意選択で他の障壁構造物、例えばウェル壁によって確定された面積とによって定義される、細胞、細胞懸濁液、液体または類似のものを含むことができるコンパートメントのサイズまたは容積は、本明細書において検討する行為、例えばインキュベート、培養、試験、および類似の行為を行うのに好適である。
【００２１】
障壁の特性、例えばある特定の物質、細胞小器官または細胞の透過性を制御し、調整するために、ナノフィブリルセルロースをある特定の百分率でおよび／またはある特定の化学的形態で提供することが必要となる場合がある。他の物質または添加物を含むことも、または障壁構造を特定の形態に形成することも可能である。ナノフィブリルセルロースは、障壁において唯一の有機、ポリマーまたはセルロース材料であってもよい。しかし、一部の例において、他の強化ポリマーまたは他の有機材料または化合物としては、例えば、障壁の乾燥物質の１〜５０％（ｗ／ｗ）、例えば、１〜２０％（ｗ／ｗ）または１〜１０％（ｗ／ｗ）の量の、例えば他の多糖、例えば、アルギネート、デンプン、グリコーゲン、非フィブリル化セルロースなどがあり得る。
【００２２】
ナノフィブリルセルロースは、化学的に修飾されていても、化学的に未修飾であってもよい。１つの実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、未修飾ナノフィブリルセルロース、アニオン修飾ナノフィブリルセルロース、および酸化ナノフィブリルセルロース、例えばＴＥＭＰＯ酸化ナノフィブリルセルロースから選択される。ナノフィブリルセルロースはまた、酵素的に修飾されていてもよい。好ましいナノフィブリルセルロースの形態の例としては、好ましくは木材セルロースから得られたアニオン性の化学的に未修飾のナノフィブリルセルロースがある。
【００２３】
障壁中のナノフィブリルセルロースの濃度は調整してもよく、０．８〜３．０％（ｗ／ｗ）の範囲であってもよい。１つの実施形態において、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、０．８〜２．５％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースを含む。１つの実施形態において、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、０．８〜２．１％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースを含む。試験では、１．０〜２．１％（ｗ／ｗ）、例えば１．４〜２．１％（ｗ／ｗ）または１．５〜２．０％（ｗ／ｗ）の濃度のナノフィブリルセルロースが、大部分の使用に関して好ましいことが見出された。そのような濃度によって、障壁がその形状および形態を維持するが、目的の物質も障壁を通して流動させることを確実にする。障壁中のナノフィブリルセルロースの濃度は、出発材料であるナノフィブリルヒドロゲル中の濃度と同じであってもよいが、形成された障壁中、特にすぐに使用することができる最終的な障壁中の濃度は、例えば、乾燥、取り扱いまたは他の理由のために高い可能性もある。
【００２４】
ナノフィブリルセルロースは、好適なフィブリル化度で提供してもよく、そのフィブリル化度は、例えば、材料のレオロジー特性、および／またはフィブリルまたはフィブリル束の直径によって特徴付けることができる。１つの実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも２０００ｍＰａ・ｓ、例えば少なくとも３０００ｍＰａ・ｓ、例えば、少なくとも１００００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。１つの実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２２℃±１℃の水性培地中、０．５％重量（ｗ／ｗ）の稠度で回転レオメーターによって決定された、１０００〜１０００００Ｐａ・ｓの範囲、例えば５０００〜５００００Ｐａ・ｓの範囲のゼロせん断粘度および１〜５０Ｐａの範囲、例えば３〜１５Ｐａの範囲の降伏応力を提供する。ナノフィブリルセルロースは、２００ｎｍ以下、例えば１〜２００ｎｍの範囲の平均原線維径を有していてもよい。本明細書において使用する「フィブリル」は、フィブリル束を含んでいてもよい。ナノフィブリルセルロースをそのような高フィブリル化度で使用すると、障壁の形成、また障壁の耐久性を促進する場合がある。高フィブリル化度は、特異的透過性特性に対する、かつヒドロゲルと細胞との相互作用に対する影響も有する。他の好適なレオロジー特性およびフィブリル化度を特徴付ける他の特徴は、本開示において開示する。
【００２５】
１つまたは複数の接着剤を含むことによって、ナノフィブリルセルロースゲルが細胞培養プレートの表面に付着するのを強化することも可能である。細胞培養プレートの表面またはウェルは、そのような接着剤でコーティングしても、そうでなければ処置してもよく、または接着剤を、ナノフィブリルセルロース上に適用しても、ナノフィブリルセルロースと混合してもよい。
【００２６】
１つの実施形態において、細胞培養プレートは、細胞培養プレートとナノフィブリルセルロースヒドロゲルとの間に接着剤を含む。接着剤は、例えば、コラーゲンベースの接着剤、フィブリノーゲンベースの接着剤、ゼラチンベースの接着剤またはリシンベースの接着剤、例えばこれらのポリマーであってもよい。試験では、ポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチン、またはこれらを含む接着剤が特に有効であることが認められた。
【００２７】
障壁は、直線または実質的な直線（図１１、１２、１５、１６、１７）、または１つもしくは複数の曲線を有する線として形成してもよく、直線は、細胞培養ウェルを２つ以上のコンパートメントに分割する。そのような場合では、直線は、ウェルの壁の１つの点から始まり、ウェルの壁の別の点で終わっていてもよい。しかしそのような場合では、障壁が壁に接触する点において障壁から漏出するリスクが存在する場合がある。
【００２８】
このリスクまたは問題を克服するために、障壁は、細胞培養ウェルの表面上の少なくとも１つのエリアを確定する形態に形成してもよく、すなわちナノフィブリルセルロース障壁単独でエリアの障壁を形成し、エリアを確定する。エリアは１つのコンパートメントを形成してもよく、別のコンパートメントは、定義されたエリアの外側に形成してもよい。障壁は、例えば、円、楕円、正方形、三角形、多角形の形態、または少なくとも１つのエリア、例えば不均等な円、楕円、正方形、三角形、多角形もしくは類似のものを取り囲む他の形態であってもよい。本明細書において使用する「円」という用語は、円状の形態または閉塞された形態または障壁と称される場合もある形態のうちのいずれかを一般的に指していてもよく、または円は、他の形態で置き換えられていてもよい。円状の障壁の例を図２および１９〜２５に示す。１つの実施形態において、少なくとも１つの障壁は、細胞培養ウェル上の少なくとも１つのエリアを取り囲んでいる。そのような障壁は、ウェルの壁に触れないように細胞培養ウェルに位置していてもよく、障壁は均一で、不連続な点を一切含まないため、特に壁に接合していないため、漏出問題がなくなる。そのような場合では、例えば、図２で示すように、障壁は、１つのエリアを取り囲む障壁の内側に１つのコンパートメントを形成し、別のコンパートメントは障壁の外側に形成され、細胞培養ウェルの壁に取り囲まれている。
【００２９】
障壁は、ウェルの底部から突出しているかまたは上昇しており、その結果、障壁の壁は高さおよび厚さを有する。障壁の高さは、障壁によって確定されたコンパートメント中で細胞、液体および他の材料を維持するように十分高くなくてはならない。ウェルの底部の表面から測定される障壁の高さは、少なくとも５０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも５００μｍ、または好ましくは少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍまたは少なくとも３ｍｍ、例えば、０．５〜６ｍｍ、０．５〜５ｍｍ、０．５〜３ｍｍ、１〜５ｍｍ、２〜５ｍｍ、１〜４または１〜３ｍｍであってもよい。障壁の高さおよび障壁によって確定された面積（コンパートメントの面積）は、コンパートメントの利用可能なまたは有用な容積を通常定義する。しかし、コンパートメントがゲルまたは類似の粘性材料または表面張力が高い材料で満たされる場合、材料をコンパートメントからあふれさせることなく、コンパートメントの容積よりも少し多く適用することが可能な場合もある。コンパートメントの容積は、例えば、５０〜５０００μｌの範囲であってもよく、通常ウェルのサイズ（また、プレート中のウェルの量）による。例えば、２４ウェルプレートに関しては、コンパートメントの容積は、５０〜３００μｌ、例えば５０〜２００μｌの範囲であってもよい。試験では、円状障壁の内側には約５０μｌの小さな容積を作成し、障壁の外側では約２００μｌの大きな容積を得た。しかし、コンパートメントの容積はまた、同じであっても、実質的に同じであってもよい。
【００３０】
障壁の壁の厚さ、すなわち垂直な障壁の厚さは、ウェル上に適用する場合、例えば、０．５〜２ｍｍの範囲、例えば０．５〜１．５ｍｍであってもよい。０．５を下回る壁の厚さは耐久性がない場合があり、崩壊することがある。他方、壁の厚さがあまりにも厚すぎると、所望の物質が壁を通って移動するのを不必要に減速するか、または更に阻止することがある。
【００３１】
液体、ゲル、懸濁液、分散体または他の適用可能な形態で存在していてもよい細胞および／または他の物質を、１つまたは複数のコンパートメントに適用してもよい。最初に、コンパートメントは、空であってもよく、すなわち物質を一切含んでおらず、および／または物質で満たされていないか、または液体、例えば、細胞培養培地または他の培地で部分的にまたは完全に満たされていてもよい。１つまたは複数のコンパートメントはまた、ゲル、例えばナノフィブリルセルロースヒドロゲル、寒天ゲルまたは他の好適なゲルで満たされていてもよく、そのゲルは、ヒドロゲルであってもよく、細胞を収容するように配置されていてもよく、異なる稠度、濃度および／または組成、例えば障壁と比較して低い濃度を有していてもよく、好ましくは障壁と接触していてもよい。コンパートメントのゲルの濃度は、例えば、１．５％（ｗ／ｗ）未満、１．２％（ｗ／ｗ）未満、１％（ｗ／ｗ）未満、０．８％（ｗ／ｗ）未満、０．７％（ｗ／ｗ）未満、０．６％（ｗ／ｗ）未満または０．５％（ｗ／ｗ）未満であってもよい。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、細胞培養材料として、例えば、２％（ｗ／ｗ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｗ）以下、または０．８％（ｗ／ｗ）以下、または０．７％（ｗ／ｗ）以下の稠度で使用することができる。細胞は、稠度が低いヒドロゲル中で培養してもよく、障壁の稠度が高い場合、細胞が障壁に侵入することができない。細胞培養ゲルでは、異なる条件、例えば細胞の培養を支持する条件であって、障壁中の条件とは異なる条件を提供することが可能である。コンパートメントのうちの１つまたは複数に障壁およびナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む細胞培養プレートを、製品として提供することができる。１つまたは複数のコンパートメント中に細胞をすでに含んでいることが更に可能であり、製品は細胞系と称される場合もある。
【００３２】
細胞は、前記ゲル中に提供してもよく、細胞含有ゲルをコンパートメントに適用する。あるいは、細胞を含まないゲルをコンパートメントに適用し、後で細胞をコンパートメントのゲル中に適用してもよい。細胞を収容するように設計されたゲルは、例えば、ピペット、シリンジまたは類似の塗布器を用いて細胞を適用するのに、任意選択でまたゲルを混合し、適用した細胞がゲル中に分布するのを促進するのに、十分に希釈してもよい。したがって、細胞含有製品または細胞不含製品のいずれかの異なる製品が調製され、および／または提供される場合がある。
【００３３】
１つの実施形態において、コンパートメントのうちの少なくとも１つは、障壁と比較してナノフィブリルセルロースが低濃度の、例えば０．７％（ｗ／ｗ）以下の濃度、例えば０．２〜０．７％（ｗ／ｗ）または０．２〜０．５％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースヒドロゲルを含む。このナノフィブリルセルロースは、化学的に修飾されていても、化学的に未修飾であってもよい。１つの例において、それは、アニオン修飾ナノフィブリルセルロース、例えば酸化ナノフィブリルセルロースである。
【００３４】
本開示はまた、本明細書において開示する細胞培養プレートを調製するための方法を提供する。本明細書において開示する１つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートを提供する。ナノフィブリルセルロースは、例えば、０．８〜２．５％（ｗ／ｗ）のナノフィブリルセルロースを含む水性分散体としておよび／またはヒドロゲルの形態で提供される。方法はまた、乾燥ナノフィブリルセルロースからまたは異なる稠度のナノフィブリルセルロースから水性分散体を形成することを含んでいてもよく、乾燥または希釈が必須の場合がある。その後、方法は、ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するために、少なくとも１つの細胞培養ウェル上に、ナノフィブリルセルロースから少なくとも１つの障壁を形成することを含む。ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、ノズル、シリンジ、針、ピペット、または類似の手段を使用することによって適用して、ヒドロゲルを排出するかもしくは提供し、適用されたヒドロゲルを、好ましくは、所望の構造および／または形態を有する障壁へと形成してもよい。障壁は、手動でまたは１つもしくは複数の製造デバイス、装置、機械、金型、および同様の装置を使用することによって形成してもよい。製造デバイスは、コンピューター制御され、コンピューターで実行された場合に、所望の障壁構造を形成するためのコンピューター可読の命令とともに提供されてもよい。例えば、障壁の形態または形状は、コンピュータープログラム、例えばコンピューター支援設計（ＣＡＤ）プログラムまたは類似のものを使用することによって設計してもよく、障壁構造を調製するための命令はプログラムから出力される。
【００３５】
１つの実施形態において、細胞培養プレートを調製するための方法は、少なくとも１つの障壁を提供する、例えば形成するかまたは適用する、前に、１つまたは複数の細胞培養ウェルに、好ましくはウェルの底部に接着剤をコーティングするかそうでなければ処置することを含む。接着は、少なくともウェルと障壁との間に適用してもよい。このことは、障壁が細胞ウェルに、特にウェルの底部にだけではなく、必要に応じてウェルの壁にも付着することを助ける場合がある。そのような接着層がないと、特に細胞培養プレートを移動させた、例えば傾けた場合、障壁はウェル中で移動するか、または放出される場合がある。好適な接着が適用された場合、取り扱い、例えば輸送および／または包装に耐える製品が得られる。
【００３６】
接着剤は、任意の好適なおよび適合する接着剤、好ましくは有機および／または生物学的薬剤、通常の高分子剤、例えばコラーゲンベースの、フィブリノーゲンベースの、ゼラチンベースのまたはリシンベースの接着剤であってもよい。試験において見出された好ましい接着剤はポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチンであった。
【００３７】
ナノフィブリルセルロースの均質性は、有用な障壁の形成において重要な役割を果たすことも認められた。障壁構造における部分的に不均等なエリアまたは層でさえ、構造全体を損なわせる場合がある。したがって、均質化ステップを提供することによってナノフィブリルセルロース材料を調製してから、最終的な使用、例えば３Ｄ印刷に材料を提供することが必要となる場合がある。均質化ステップは、非フィブリル化均質化、精製、分散または他の処置ステップであってもよく、好ましくはセルロースがナノフィブリルセルロースに分解した（フィブリル化の）後に行う。そのため、方法の１つの実施形態において、ナノフィブリルセルロースは、そのような非フィブリル化均質化ステップから得られる。
【００３８】
好適な液体、例えば保存流体もしくは培地および／または緩衝液、例えば、塩、例えば塩化物塩、例えば、塩化カルシウム、塩化ナトリウムまたは他の塩を例えば１〜２％（ｗ／ｗ）で含む液体、および任意選択で緩衝剤、保存剤および／または他の薬剤、例えば緩衝生理食塩水または細胞培養培地、例えばＰＤＳまたはＭＥＭのうちの１つまたは複数を、障壁を有するウェルに適用し、保存性を強化してもよい。障壁構造体は、前記液体中に保存し、個別の製品としても提供してもよい。液体を異なる液体、例えば細胞培養培地で交換してから使用してもよい。
【００３９】
ナノフィブリルセルロース
障壁を形成するための出発材料は、ナノセルロースとも称されるナノフィブリルセルロースであり、これはセルロース原材料由来の単離されたセルロースフィブリルまたはフィブリル束を指す。ナノフィブリルセルロースは、天然に豊富にある天然ポリマーをベースにしている。ナノフィブリルセルロースは、水中で粘性ヒドロゲルを形成する能力を有する。ナノフィブリルセルロースの製造技術は、線維状の原材料を崩壊させ、例えばパルプ線維の水性分散体を粉砕し、ナノフィブリル化セルロースを得ることに基づいていてもよい。粉砕または均質化プロセスの後、得られたナノフィブリルセルロース材料は、希薄な粘弾性ヒドロゲルである。
【００４０】
得られた材料は、比較的低濃度で通常存在し、崩壊条件に起因して水中で均質に分布する。出発材料は、０．２〜１０％（ｗ／ｗ）、例えば０．２〜５％（ｗ／ｗ）の濃度の水性ゲルであってもよい。ナノフィブリルセルロースは、線維状原材料を崩壊して直接得てもよい。市販されているナノフィブリルセルロースヒドロゲルの例はＵＰＭ製のＧｒｏｗＤｅｘ（登録商標）である。
【００４１】
そのナノスケール構造のため、ナノフィブリルセルロースは、従来のセルロースによって提供することができない機能性を有する特有の特性を可能にする。しかし、ナノスケール構造のため、ナノフィブリルセルロースは困難な材料でもある。例えば、ナノフィブリルセルロースは脱水または取り扱いが困難な場合がある。
【００４２】
ナノフィブリルセルロースは、植物由来のセルロース原材料から調製しても、またある特定の細菌発酵プロセス由来であってもよい。ナノフィブリルセルロースは、好ましくは植物材料から作製される。原材料は、セルロースを含む任意の植物材料に基づいていてもよい。１つの例において、フィブリルは、非実質性の植物材料から得られる。そのような場合では、フィブリルは二次細胞壁から得てもよい。そのようなセルロースフィブリルが豊富な１つの原料は木材線維である。ナノフィブリルセルロースは、化学パルプであってもよい木材由来線維状原材料を均質化することによって製造してもよい。セルロース線維は分解され、フィブリルを生成し、そのフィブリルは、平均径がたった数ナノメートルであり、大抵の場合２００ｎｍ以下であってもよく、水中でフィブリルの分散体となる。二次細胞壁に由来するフィブリルは、実質的に結晶質であり、結晶化度は少なくとも５５％である。そのようなフィブリルは、一次細胞壁に由来するフィブリルと異なる特性を有している場合があり、例えば、二次細胞壁に由来するフィブリルの脱水は、更に困難な場合がある。一般的に、一次細胞壁からのセルロース源、例えばテンサイ、ジャガイモの塊茎およびバナナの花軸では、マイクロフィブリルは、木材からのフィブリルよりも線維マトリックスから遊離させるのが容易であり、分解に必要なエネルギーが少ない。しかし、これらの材料は依然として多少不均質なままであり、大きなフィブリル束からなる。
【００４３】
非木材材料は、農業残渣、牧草、または他の植物物質、例えば、綿、コーン、小麦、オート麦、ライ麦、大麦、コメ、亜麻、麻、マニラ麻、サイザル麻、黄麻、ラミー、ケナフ、バガス、竹もしくはアシ由来の、わら、葉、樹皮、種子、外皮、花、野菜もしくは果実であってもよい。セルロース原材料は、セルロース産生微生物由来であってもよい。微生物は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属のもの、好ましくはアセトバクター属のもの、より好ましくはアセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍｏｒ）種またはアセトバクター・パスツリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）種のものであってもよい。
【００４４】
木材セルロースから得られたナノフィブリルセルロースは、本明細書において記載する医学的または科学的製品に好ましいことが見出された。木材セルロースは、大量に入手可能であり、木材セルロースのために開発された調製法は、製品に好適なナノフィブリル材料を製造することを可能にする。植物線維、特に木材線維をフィブリル化することによって得られたナノフィブリルセルロースは、微生物から得られたナノフィブリルセルロースと構造的に異なり、異なる特性を有する。例えば、細菌セルロースと比較して、ナノフィブリル化木材セルロースは、均質で、更に多孔質で、目の粗い材料であり、生細胞を伴う適用に有利である。細菌セルロースは、植物セルロースと同様のフィブリル化を行わずにそのままで通常使用し、したがって材料は、この点においても異なる。細菌セルロースは高密度材料である小さなスフェロイドを容易に形成し、その結果材料の構造は不連続であり、特に材料の均質性が必須である場合、生細胞に関連する用途においてそのような材料を使用することは望ましくない。
【００４５】
木材は、針葉樹木、例えばトウヒ、マツ、モミ、カラマツ、ベイマツまたはドクニンジン由来のもの、または広葉樹木、例えばカバノキ、アスペン、ポプラ、ハンノキ、ユーカリ、オーク、ブナノキまたはアカシア由来のもの、または針葉樹および広葉樹の混合物由来のものであってもよい。１つの例において、ナノフィブリルセルロースは、木材パルプから得られる。ナノフィブリルセルロースは、広葉樹パルプから得てもよい。１つの例において、広葉樹はカバノキである。ナノフィブリルセルロースは、針葉樹パルプから得てもよい。１つの例において前記木材パルプは、化学パルプである。化学パルプは、本明細書において開示する所望の製品であってもよい。化学パルプは純粋な材料であり、さまざまな用途において使用することができる。例えば、化学パルプには機械パルプに存在するピッチおよび樹脂酸がなく、より無菌であるかまたは容易に無菌にすることができる。更に、化学パルプはより可撓性があり、例えば、医学的および科学的材料において有利な特性を提供する。例えば、極めて均質なナノフィブリルセルロース材料は、過剰な加工を行わずにまたは特定の装置または面倒なプロセスステップを必要とせずに調製することができる。
【００４６】
セルロースフィブリルおよび／またはフィブリル束を含むナノフィブリルセルロースは、高アスペクト比（長さ／直径）によって特徴付けられる。ナノフィブリルセルロースの平均長（粒子、例えばフィブリルまたはフィブリル束の長さの中央値）は、１μｍを超えていてもよく、大抵の場合、５０μｍ以下である。エレメンタリーフィブリルが互いに完全に分離されていない場合、もつれたフィブリルは、平均全長、例えば、１〜１００μｍ、１〜５０μｍ、または１〜２０μｍの範囲を有していてもよい。しかし、ナノフィブリル材料が高度にフィブリル化されている場合、エレメンタリーフィブリルは、完全にまたはほぼ完全に分離されている場合があり、平均フィブリル長は短く、例えば１〜１０μｍまたは１〜５μｍの範囲である。これは、例えば化学的に、酵素的にまたは機械的に短縮されていないかまたは消化されていない天然グレードのフィブリルに特に当てはまる。しかし、高度に誘導体化されたナノフィブリルセルロースは、短い平均フィブリル長、例えば０．３〜５０μｍの範囲、例えば０．３〜２０μｍ、例えば０．５〜１０μｍまたは１〜１０μｍを有していてもよい。特に短縮されたフィブリル、例えば酵素的にまたは化学的に消化されたフィブリル、または機械的に処置された材料は、１μｍ未満、例えば０．１〜１μｍ、０．２〜０．８μｍまたは０．４〜０．６μｍの平均フィブリル長を有していてもよい。フィブリル長および／または直径は、例えばＣＲＹＯ−ＴＥＭ、ＳＥＭまたはＡＦＭ画像を使用して顕微鏡的に評価してもよい。
【００４７】
ナノフィブリルセルロースの平均直径（幅）は、高度にフィブリル化された材料に関しては、１μｍ未満、または５００ｎｍ以下、例えば１〜５００ｎｍの範囲であるが、好ましくは２００ｎｍ以下、更に１００ｎｍ以下または５０ｎｍ以下、例えば１〜２００ｎｍ、２〜２００ｎｍ、２〜１００ｎｍ、または２〜５０ｎｍ、更に２〜２０の範囲である。本明細書において開示する直径は、フィブリルおよび／またはフィブリル束を指していてもよい。最も小さいフィブリルは、エレメンタリーフィブリルのスケールであり、平均直径は、典型的には２〜１２ｎｍの範囲である。フィブリルの寸法およびサイズ分布は、精製方法および効率に依存する。高度に精製された天然ナノフィブリルセルロースの場合、フィブリル束を含むフィブリルの平均直径は、２〜２００ｎｍまたは５〜１００ｎｍの範囲、例えば、１０〜５０ｎｍの範囲であってもよい。ナノフィブリルセルロースは、大きな比表面積および水素結合を形成するための強い能力によって特徴付けられる。水性分散体では、ナノフィブリルセルロースは、典型的には、軽いまたは混濁したゲル状材料として認められる。線維原材料によって、植物、特に木材から得られたナノフィブリルセルロースは、少量の他の植物構成要素、特に木材構成要素、例えばヘミセルロースまたはリグニンも含んでいてもよい。量は植物原料による。
【００４８】
一般的に、セルロースナノ材料は、セルロースナノ材料に関する標準的な用語を提供するＴＡＰＰＩ  Ｗ１３０２１に従ってカテゴリーに分けてもよい。これら全ての材料がナノフィブリルセルロースというわけではない。２つの主なカテゴリーは「ナノ物体」および「ナノ構造化材料」である。ナノ構造化材料としては、直径が１０〜１２μｍ、長さ：直径比率（Ｌ／Ｄ）が２未満の「セルロース微結晶」（ときとしてＣＭＣと称される）、および直径が１０〜１００ｎｍであり、長さが０．５〜５０μｍの「セルロースマイクロフィブリル」がある。ナノ物体としては、「セルロースナノファイバー」があり、これは、直径が３〜１０ｎｍであり、Ｌ／Ｄが５を超える「セルロースナノ結晶」（ＣＮＣ）、および直径が５〜３０ｎｍであり、Ｌ／Ｄが５０を超える「セルロースナノフィブリル」（ＣＮＦまたはＮＦＣ）に分けることができる。
【００４９】
異なるグレードのナノフィブリルセルロースを、３つの主な特性である（ｉ）サイズ分布、長さおよび直径、（ｉｉ）化学的組成、および（ｉｉｉ）レオロジー特性に基づいてカテゴリー化してもよい。グレードを十分に説明するために、特性を並行して使用してもよい。異なるグレードの例としては、天然（または化学的に未修飾の）ＮＦＣ、酸化ＮＦＣ（高粘度）、酸化ＮＦＣ（低粘度）、カルボキシメチル化ＮＦＣおよびカチオン化ＮＦＣがある。これらの主なグレードの範囲内で、サブグレード、例えば、極めて十分なフィブリル化と中程度のフィブリル化、高度な置換と低度な置換、低粘度と高粘度なども存在する。フィブリル化技術および化学的プレ修飾はフィブリルサイズ分布に影響を与える。典型的には、非イオン性のグレードはフィブリルの平均直径が広範囲（例えば、１０〜１００ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）であり、同時に化学的に修飾されたグレードは非常に狭い範囲（例えば、２〜２０ｎｍの範囲）である。修飾グレードに関しては分布も狭い。ある特定の修飾、特にＴＥＭＰＯ酸化では、短いフィブリルが得られる。
【００５０】
原材料源、例えば広葉樹と針葉樹パルプによって、異なるポリサッカライド組成物が最終的なナノフィブリルセルロース製品に存在する。通常、非イオン性グレードは、漂白されたカバノキパルプから調製され、キシレン含有量が高い（２５重量％）。修飾グレードは、広葉樹または針葉樹パルプのいずれかから調製される。これらの修飾グレードでは、ヘミセルロースもセルロースドメインとともに修飾される。ほとんどの場合、修飾は均質ではなく、すなわち一部の部分は別の部分よりも多く修飾されている。したがって、修飾された製品は異なるポリサッカライド構造の複雑な混合物であるため、詳細な化学分析は通常は不可能である。
【００５１】
水性環境では、セルロースナノファイバーの分散体は、粘弾性ヒドロゲルネットワークを形成する。ゲルは、もつれたフィブリルを分散させ、水和させることによって、例えば０．０５〜０．２％（ｗ／ｗ）の比較的低濃度ですでに形成される。ＮＦＣヒドロゲルの粘弾性は、例えば動的振動レオロジー測定を用いて特徴付けることができる。
【００５２】
ナノフィブリルセルロースヒドロゲルは、特徴的なレオロジー特性を示す。例えば、これらはずり減粘性または擬塑性材料であり、チキソトロピー挙動の特殊な例として考えることができ、これはその粘度が、材料が変形する速度（または力）に依存することを意味する。回転レオメーターで粘度を測定した場合、ずり減粘性挙動は、せん断速度の増加に伴う粘度の低下として認められる。ヒドロゲルは、塑性挙動を示し、これは、材料が直ちに流動を開始する前に、ある特定のせん断応力（力）が必要であることを意味する。この臨界せん断応力は、降伏応力と称されることが多い。降伏応力は、応力制御型レオメーターを用いて測定された定常状態の流動曲線から決定することができる。粘度を、適用されたせん断応力の関数としてプロットした場合、臨界せん断応力を超えた後に粘度の劇的な低下が認められる。ゼロせん断粘度および降伏応力は、材料の懸濁力を説明するための最も重要なレオロジーパラメーターである。これらの２つのパラメーターは、異なるグレードを極めて明確に分け、したがってグレードの分類を可能にする。
【００５３】
フィブリルまたはフィブリル束の寸法は、例えば、原材料、分解方法および分解を行った回数に依存する。セルロース原材料の機械的分解は、任意の好適な装置、例えば、精製機、グラインダー、分散機、ホモジナイザー、コロイダー、摩擦グラインダー、ピンミル、ローター−ローターディスパゲーター（rotor-rotor dispergator）、超音波粉砕機、フリューダイザー、例えばマイクロフリューダイザー、マクロフリューダイザーまたはフリューダイザー型ホモジナイザーを用いて行ってもよい。分解処置は、水が線維間の結合の形成を阻止するよう十分に存在する条件で行う。
【００５４】
１つの例において、分解は、少なくとも１つのローター、ブレードまたは同様の可動機械的部材を有する分散機、例えば少なくとも２つのローターを有するローター−ローターディスパゲーターを使用することによって行う。ブレードが回転速度と半径（回転軸までの距離）によって決定される周速度とで反対方向に回転した場合、分散機では、分散体中の線維材料は、ローターのブレードまたはリブが反対方向から衝突することによって繰り返し衝撃を与えられる。線維材料は半径方向の外側へ移動するため、反対方向から速い周速度で次々と来るブレードの広い表面、すなわちリブ上で粉砕し、言い換えれば、反対方向から複数の連続的な衝撃を受ける。また、ブレードの広い表面、すなわちリブのエッジにおいて、エッジが、次のローターブレードの反対側のエッジとブレードギャップを形成すると、せん断力が生じ、これが線維の分解およびフィブリルの剥離の一因となる。衝撃頻度は、ローターの回転速度、ローターの数、各ローター内のブレードの数、およびデバイスを通過する分散体の流速によって決定される。
【００５５】
ローター−ローターディスパゲーターでは、線維材料は逆回転ローターを通過して、ローターの回転軸に対して半径方向で外側へ導入され、そのような方法で材料は、異なる逆回転ローターの効果によってせん断および衝撃力を繰り返し与えられ、それによって、付随してフィブリル化される。ローター−ローターディスパゲーターの１つの例は、Ａｔｒｅｘデバイスである。
【００５６】
崩壊に好適なデバイスの別の例は、ピンミル、例えばマルチペリフェラルピンミル（multi-peripheral pin mill）である。そのようなデバイスの１つの例は、ハウジングおよびその中に衝突面を備えた第１のローター；第１のローターと同心であり、衝突面を備えた第２のローターであって、第１のローターと反対方向に回転するように配置された第２のローター；または第１のローターと同心であり、衝突面を備えたステーターを含む。デバイスは、ハウジングと、ローターまたはローターおよびステーターの中心への開口部とにおける供給オリフィス、ならびにハウジング壁と、最外のローターまたはステーターの外面への開口部との上にある排出オリフィスを含む。
【００５７】
１つの例において、分解は、ホモジナイザーを使用することによって行う。ホモジナイザーでは、線維材料は、圧力効果によって均質化される。線維材料分散体のナノフィブリルセルロースへの均質化は、分散体の強制貫流によって生じ、材料がフィブリルに分解する。線維材料分散体は所与の圧力で狭い貫流ギャップを通過し、そこで分散体の直線速度が増加することによって分散体にせん断および衝撃力が与えられ、線維材料からフィブリルが除去される。線維断片は、フィブリル化ステップにおいてフィブリルへ分解する。
【００５８】
本明細書において使用する「フィブリル化」という用語は、セルロースフィブリルが線維または線維断片から分離される、粒子に適用される操作によって機械的に線維材料を分解させることを一般的に指す。操作は、粉砕すること、破砕もしくはせん断、もしくはこれらの組合せのようなさまざまな効果、または断片サイズを減少させる別の匹敵する動作に基づいていてもよい。「分解」または「分解処置」という表現は、「フィブリル化」と区別せずに使用してもよい。
【００５９】
フィブリル化が行われる線維材料分散体は、線維材料および水の混合物であり、本明細書において「パルプ」とも称される。線維材料分散体は、線維全体、そこから分離される一部（断片）、フィブリル束、または水と混合されたフィブリルを一般的に指していてもよく、典型的には、水性線維材料分散体は、そのような要素の混合物であり、構成要素間の比率は、加工の程度または処置段階、例えば、線維材料の同じバッチが処置を実行されるまたは「通過」する回数に依存する。
【００６０】
ナノフィブリルセルロースを特徴付ける１つの方法は、前記ナノフィブリルセルロースを含む水溶液の粘度を使用することである。粘度は、例えば、ブルックフィールド粘度またはゼロせん断粘度であってもよい。本明細書において記載する特定の粘度は、非ナノフィブリルセルロースからナノフィブリルセルロースを区別する。
【００６１】
１つの例において、ナノフィブリルセルロースの見かけの粘度は、ブルックフィールド粘度計（ブルックフィールド粘度）または別の匹敵する装置を用いて測定する。好適には、ベーンスピンドル（７３番）を使用する。見かけの粘度を測定するために入手可能ないくつかの市販のブルックフィールド粘度計が存在し、これらは全て同じ原理に基づいている。好適には、ＲＶＤＶスプリング（ブルックフィールドＲＶＤＶ−ＩＩＩ）を装置において使用する。ナノフィブリルセルロースのサンプルを水中で０．８重量％の濃度に希釈し、１０分間混合する。希釈したサンプル全体を２５０ｍｌのビーカーに加え、必要であれば加熱して温度を２０℃±１℃に調整し、混合する。低回転速度１０ｒｐｍを使用する。一般的にブルックフィールド粘度は、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定してもよい。
【００６２】
例えば、方法において出発材料として提供されるナノフィブリルセルロースは、水溶液として提供される粘度によって特徴付けてもよい。粘度は、例えば、ナノフィブリルセルロースのフィブリル化の程度を説明する。１つの例において、ナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも２０００ｍＰａ・ｓ、例えば少なくとも３０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。１つの例において、ナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも１００００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。１つの例において、ナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも１５０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。前記ナノフィブリルセルロースのブルックフィールド粘度の範囲の例としては、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、２０００〜２００００ｍＰａ・ｓ、３０００〜２００００ｍＰａ・ｓ、１００００〜２００００ｍＰａ・ｓ、１５０００〜２００００ｍＰａ・ｓ、２０００〜２５０００ｍＰａ・ｓ、３０００〜２５０００ｍＰａ・ｓ、１００００〜２５０００ｍＰａ・ｓ、１５０００〜２５０００ｍＰａ・ｓ、２０００〜３００００ｍＰａ・ｓ、３０００〜３００００ｍＰａ・ｓ、１００００〜３００００ｍＰａ・ｓ、および１５０００〜３００００ｍＰａ・ｓがある。
【００６３】
ナノフィブリルセルロースはまた、平均直径（または幅）によって、または粘度、例えばブルックフィールド粘度またはゼロせん断粘度とともに平均直径によって特徴付けてもよい。１つの例において、本明細書において記載する製品に使用するのに好適なナノフィブリルセルロースのフィブリルの平均直径の範囲は、１〜２００ｎｍ、または１〜１００ｎｍである。１つの例において、前記ナノフィブリルセルロースのフィブリルの平均直径の範囲は、１〜５０ｎｍ、例えば２〜２０ｎｍまたは５〜３０ｎｍである。１つの例において、前記ナノフィブリルセルロースのフィブリルの平均直径の範囲は、例えばＴＥＭＰＯ酸化ナノフィブリルセルロースの場合、２〜１５ｎｍである。
【００６４】
フィブリルの直径は、いくつかの技術を用いて、例えば顕微鏡によって決定してもよい。フィブリルの厚さおよび幅分布は、電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、例えば極低温透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）、または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）からの画像を画像分析することによって測定してもよい。一般的に、ＡＦＭおよびＴＥＭは、狭いフィブリル直径分布を有するナノフィブリルセルロースグレードに最適である。
【００６５】
ナノフィブリルセルロース分散体のレオメーター粘度は、直径３０ｍｍの円筒状サンプルカップ中に、狭い間隙のベーン外形（直径２８ｍｍ、長さ４２ｍｍ）を有する応力制御型回転レオメーター（ＡＲ−Ｇ２、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用い、２２℃で測定してもよい。サンプルをレオメーターに負荷した後、５分間静止させてから測定を開始する。定常状態粘度は、漸増するせん断応力（適用するトルクに比例する）を用いて測定し、せん断速度（角速度に比例する）を測定する。一定のせん断速度に到達した後にまたは２分の最大時間の後に、ある特定のせん断応力において報告される粘度（＝せん断応力／せん断速度）を記録する。せん断速度が１０００ｓ−１を超えたときに測定を終了する。この方法は、ゼロせん断粘度を決定するために使用してもよい。
【００６６】
１つの例において、例えば、方法において出発材料として提供されるナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２２℃±１℃の水性培地中０．５重量％（ｗ／ｗ）の稠度で回転レオメーターによって決定された、ゼロせん断粘度（小さなせん断応力で一定な粘度のプラトー）を１０００〜１０００００Ｐａ・ｓの範囲、例えば５０００〜５００００Ｐａ・ｓの範囲で、降伏応力（せん断流動化が始まったときのせん断応力）を１〜５０Ｐａの範囲で、例えば３〜１５Ｐａの範囲で提供する。そのようなナノフィブリルセルロースのフィブリルの平均直径は、２００ｎｍ以下、例えば１〜２００ｎｍの範囲であってもよい。
【００６７】
濁度は肉眼で一般的に見ることができない個々の粒子（懸濁または溶解した固形物の全て）によって引き起こされる流体の濁りまたはかすみである。濁度を測定するいくつかの実用的な方法が存在し、最も直接的なものは、水のサンプルカラムを通過したときの光の減衰（すなわち強度の減少）をいくつか測定することである。代替として使用されるジャクソンキャンドル法（単位：ジャクソン濁度単位またはＪＴＵ）は、それを通してキャンドルの炎が完全に見えなくなるのに必要な水のカラムの長さの実質的に逆数の測定値である。
【００６８】
濁度は、光学濁度測定器を使用して定量的に測定してもよい。濁度を定量的に測定するために利用可能ないくつかの市販の濁度計が存在する。この場合は、比濁法に基づいた方法を使用する。校正された比濁計からの濁度の単位は、比濁法濁度単位（ＮＴＵ）と称する。測定装置（比濁計）は、標準的な校正サンプルを用いて校正し、制御し、続いて希釈したＮＦＣサンプルの濁度を測定する。
【００６９】
１つの濁度測定方法において、ナノフィブリルセルロースサンプルは水で希釈し、前記ナノフィブリルセルロースのゲル化点未満に濃縮し、希釈したサンプルの濁度を測定する。ナノフィブリルセルロースサンプルの濁度が測定された前記濃度は０．１％である。５０ｍｌの測定容器を備えたＨＡＣＨ Ｐ２１００比濁計を使用して濁度を測定する。ナノフィブリルセルロースサンプルの乾燥物質を決定し、乾燥物質として算出したサンプル０．５ｇを測定容器に負荷し、水道水を５００ｇまで満たし、３０秒間振とうすることによって激しく混合する。直ちに水性混合物を５つの測定容器中に分割し、これらを比濁計に挿入する。各容器に対して測定を３回行う。平均値および標準偏差を、得られた結果から算出し、最終的な結果をＮＴＵ単位で得る。
【００７０】
ナノフィブリルセルロースを特徴付ける１つの方法は、粘度と濁度の両方を定義することである。小さなフィブリルは光をほとんど散乱させないために、低濁度は、フィブリルが小さなサイズ、例えば小さな直径であることを指す。一般的に、フィブリル化度が増加すると、粘度は増加し、同時に濁度は減少する。しかし、これが発生するのはある特定の点までである。フィブリル化が更に継続された場合、フィブリルは最終的に切断され始め、強力なネットワークをこれ以上形成することはできない。その結果、この点の後は濁度と粘度の両方が減少し始める。
【００７１】
１つの例において、水性培地中０．１％（ｗ／ｗ）の稠度で測定され、比濁法によって測定されたアニオン性ナノフィブリルセルロースの濁度は９０ＮＴＵよりも低く、例えば３から９０ＮＴＵ、例えば５から６０、例えば８〜４０である。１つの例において、２０℃±１℃、水性培地中０．１％（ｗ／ｗ）の稠度で測定し、比濁法によって測定した天然ナノフィブリルの濁度は、２００ＮＴＵを超えることさえあり、例えば１０から２２０ＮＴＵ、例えば２０から２００、例えば５０〜２００であってもよい。ナノフィブリルセルロースを特徴付けるために、これらの範囲は、ナノフィブリルセルロースの粘度の範囲、例えば水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも２０００ｍＰａ・ｓ、少なくとも３０００ｍＰａ・ｓ、少なくとも５０００ｍＰａ・ｓ、例えば少なくとも１００００ｍＰａ・ｓ、例えば少なくとも１５０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供するナノフィブリルセルロースと組み合わせてもよい。
【００７２】
ナノフィブリルセルロースは、非修飾ナノフィブリルセルロースであっても、それを含んでいてもよい。非修飾ナノフィブリルセルロースの水はけは、例えば、アニオン性グレードよりも著しく速い。非修飾ナノフィブリルセルロースは、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、２０００〜１００００ｍＰａ・ｓの範囲のブルックフィールド粘度を一般的に有する。ナノフィブリルセルロースは、電気伝導度滴定によって決定された好適なカルボン酸含有量、例えば０．６〜１．４ｍｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｇの範囲、例えば０．７〜１．２ｍｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｇの範囲、または０．７〜１．０ｍｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｇの範囲、または０．８〜１．２ｍｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｇを有することが好ましい。
【００７３】
分解した線維状セルロース原材料は、修飾された線維状原材料であってもよい。修飾された線維状原材料は、線維が処置によって影響を受け、セルロースナノ原線維が線維から更に容易に取り外せるようになった原材料を意味する。修飾は、液体中に懸濁液として存在する線維状セルロース原材料、すなわちパルプに対して通常行う。
【００７４】
線維に対する修飾処置は、化学的、酵素的または物理的であってもよい。化学的修飾では、セルロース分子の化学構造を、化学的反応（セルロースの「誘導体化」）によって変更し、好ましくはセルロース分子の長さは影響を受けないが、官能基がポリマーのβ−Ｄ−グルコピラノース単位に付加できるようにする。セルロースの化学的修飾はある特定の変換度で行われ、それは反応物の添加量および反応条件に依存し、概ねしてそれは完全ではなく、したがってセルロースはフィブリルとして固体形態のままであり、水に溶解しないことになる。物理的修飾では、アニオン性、カチオン性、または非イオン性物質または任意のこれらの組合せを、セルロース表面上に物理的に吸着させる。
【００７５】
線維中のセルロースは、特に修飾後にイオン的に帯電していてもよい。セルロースのイオン電荷は、線維の内部結合を弱め、後でナノフィブリルセルロースに分解するのを促進することになる。イオン電荷は、セルロースの化学的または物理的修飾によって達成してもよい。線維は、修飾後に、出発原材料と比較してアニオンまたはカチオン電荷が高くてもよい。アニオン電荷を作製するために最も一般的に使用される化学的修飾方法は酸化であり、ヒドロキシル基がアルデヒドおよびカルボキシル基に酸化され、スルホン化およびカルボキシメチル化が行われる。化学的修飾を導入する基、例えばナノフィブリルセルロースと生物活性分子との間の共有結合の形成に関与することができるカルボキシル基が望ましい場合がある。カチオン電荷は、第四級アンモニウム基などのカチオン性基をセルロースに付着させることによるカチオン化によって化学的に生成してもよい。
【００７６】
ナノフィブリルセルロースは、化学的に修飾されたナノフィブリルセルロース、例えばアニオン修飾ナノフィブリルセルロースまたはカチオン修飾ナノフィブリルセルロースを含んでいてもよい。１つの例において、ナノフィブリルセルロースは、アニオン修飾ナノフィブリルセルロースである。１つの例において、アニオン修飾ナノフィブリルセルロースは酸化ナノフィブリルセルロースである。１つの例において、アニオン修飾ナノフィブリルセルロースはスルホン化ナノフィブリルセルロースである。１つの例において、アニオン修飾ナノフィブリルセルロースはカルボキシメチル化ナノフィブリルセルロースである。セルロースのアニオン修飾で得られた材料は、アニオン性セルロースと称してもよく、アニオン性基、例えばカルボン酸基の量または割合が、非修飾材料と比較した場合に修飾によって増加する材料を指す。カルボン酸基の代わりにまたはそれに加えて、他のアニオン性基、例えばホスフェート基またはスルフェート基をセルロースに導入することも可能である。これらの基の含有量は、本明細書においてカルボン酸に関して開示するものと同じ範囲であってもよい。
【００７７】
セルロースは、酸化されていてもよい。セルロースの酸化では、セルロースの第１級ヒドロキシル基を、複素環式ニトロキシル化合物によって、例えばＮ−オキシル介在性触媒的酸化、例えば「ＴＥＭＰＯ」と一般的に称される２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル−１−オキシフリーラジカルを介して触媒的に酸化してもよい。セルロースβ−Ｄ−グルコピラノース単位の第１級ヒドロキシル基（Ｃ６−ヒドロキシル基）は、カルボン酸基に対して選択的に酸化される。一部のアルデヒド基も第１級ヒドロキシル基から形成する。酸化の程度が低いと十分なフィブリル化を効率的に行えず、酸化の程度が高いと、機械的破壊的処置後にセルロースが分解されるという発見に関して、セルロースは、酸化セルロース中のカルボン酸含有量が、電気伝導度滴定によって決定された、０．５〜２．０ｍｍｏｌ  ＣＯＯＨ／ｇパルプ、０．６〜１．４ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇパルプ、または０．８〜１．２ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇパルプの範囲、好ましくは１．０〜１．２ｍｍｏｌＣＯＯＨ／ｇパルプのレベルまで酸化してもよい。そうして得られた酸化セルロースの線維が水中で崩壊した場合、例えば幅３〜５ｎｍであり得る個別化されたセルロースフィブリルの安定な透明な分散体となる。出発培地として酸化パルプを用いると、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度で測定したブルックフィールド粘度が、少なくとも１００００ｍＰａ・ｓ、例えば、１００００〜３００００ｍＰａ・ｓの範囲のナノフィブリルセルロースを得ることが可能である。
【００７８】
本開示において触媒「ＴＥＭＰＯ」が述べられる場合はいつでも、「ＴＥＭＰＯ」が関与する全ての測定および操作は、ＴＥＭＰＯの任意の誘導体またはセルロース中のＣ６炭素のヒドロキシル基の酸化を選択的に触媒することができる任意の複素環式ニトロキシルラジカルに等しく、類似的に適用されることは明白である。
【００７９】
本明細書において開示するナノフィブリルセルロースの修飾は、本明細書において記載する他のフィブリルセルロースグレードにも適用してもよい。例えば、高度に精製されたセルロースまたはマイクロフィブリルセルロースも、同様に化学的にまたは酵素的に修飾してもよい。しかし、例えば、材料の最終的なフィブリル化の程度において違いが存在する。
【００８０】
１つの例において、そのような化学的に修飾されたナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも１００００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。１つの例において、そのような化学的に修飾されたナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも１５０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。１つの例において、そのような化学的に修飾されたナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも１８０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。使用するアニオン性ナノフィブリルセルロースの例のブルックフィールド粘度の範囲は、１３０００〜１５０００ｍＰａ・ｓまたは１８０００〜２００００ｍＰａ・ｓ、または更に最大２５０００ｍＰａ・ｓであり、フィブリル化の程度による。
【００８１】
１つの例において、ナノフィブリルセルロースはＴＥＭＰＯ酸化ナノフィブリルセルロースである。それは低濃度で高粘度、例えば２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも２００００ｍＰａ・ｓ、更に少なくとも２５０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。１つの例において、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、ＴＥＭＰＯ酸化ナノフィブリルセルロースのブルックフィールド粘度は、２００００〜３００００ｍＰａ・ｓ、例えば２５０００〜３００００ｍＰａ・ｓの範囲である。
【００８２】
１つの例において、ナノフィブリルセルロースは、化学的に未修飾のナノフィブリルセルロースを含む。１つの例において、そのような化学的に未修飾のナノフィブリルセルロースは、水中に分散した場合、２０℃±１℃、０．８％（ｗ／ｗ）の稠度および１０ｒｐｍで測定した、少なくとも２０００ｍＰａ・ｓ、または少なくとも３０００ｍＰａ・ｓのブルックフィールド粘度を提供する。
【００８３】
製造プロセスを強化するかまたは製品の特性を改善もしくは調整するための補助剤が、ナノフィブリルセルロース分散体中に含まれていてもよい。そのような補助剤は、分散体の液体相に溶解性であっても、エマルションを形成しても、固形物であってもよい。補助剤は、ナノフィブリルセルロース分散体の製造中に原材料にすでに添加されていても、形成されたナノフィブリルセルロース分散体またはゲルに添加してもよい。補助剤は、例えば、含浸、噴霧、ディッピング、浸漬または類似の方法によって最終製品にも添加してもよい。補助剤は、ナノフィブリルセルロースに通常は共有結合せず、したがってナノセルロースマトリックスから放出可能な場合がある。そのような薬剤の制御および／または持続放出は、ＮＦＣをマトリックスとして使用した場合に得られることがある。補助剤の例としては、治療的（薬学的）薬剤、および製品の特性または活性薬剤の特性に影響を与える他の薬剤、例えば緩衝剤、界面活性剤、可塑剤、乳化剤または類似のものがある。１つの例において、分散体は、１つまたは複数の塩を含み、これは、最終製品の特性を強化するためにまたは製品からの水分除去を促進するために、製造プロセスにおいて添加する場合がある。塩の例としては、塩化物塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウムおよび塩化カリウムがある。塩は、分散体中に、乾燥物質の０．０１〜１．０％（ｗ／ｗ）の範囲の量で含まれていてもよい。最終製品は、塩化ナトリウムの溶液中に、例えば約０．９％塩化ナトリウムの水溶液中にディッピングまたは浸漬してもよい。最終製品中の所望の塩の含有量は、湿潤製品の容積の０．５〜１％の範囲、例えば約０．９％であってもよい。塩、緩衝剤および類似の薬剤は、生理学的条件を得るために提供してもよい。
【００８４】
多価カチオンは、ナノフィブリルセルロースの非共有的架橋を得るために含まれていてもよい。１つの例は、ナノフィブリルセルロース、特にアニオン修飾ナノフィブリルセルロース、および多価カチオン、例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム、金、白金およびチタンのカチオンから選択される多価金属カチオンを含むナノフィブリルセルロース製品を提供し、ナノフィブリルセルロースは多価カチオンによって架橋されている。多価カチオンの量は、０．１〜３％（ｗ／ｗ）、例えば０．１〜２％（ｗ／ｗ）の範囲であってもよく、これらの値はヒドロゲルの乾燥含有量から算出される。
【００８５】
１つの例は、そのようなヒドロゲルを調製するための方法であって、パルプを提供すること、ナノフィブリルセルロースが得られるまでパルプを分解させること、ナノフィブリルセルロースをヒドロゲルに形成することを含む方法を提供する。
【００８６】
ナノフィブリルセルロースは、所望のフィブリル化度にフィブリル化し、所望の水分含有量に調整するか、そうでなければ本明細書において記載する所望の特性を有するゲルが形成されるように修飾してもよい。１つの例において、ヒドロゲル中のナノフィブリルセルロースは、アニオン修飾ナノフィブリルセルロースである。
【００８７】
医学的または科学的ヒドロゲルとして使用されることになるヒドロゲルは、均質であることを必要とされる。その結果、ヒドロゲルを調製するための方法としては、ナノフィブリルセルロースを含むヒドロゲルを、好ましくは例えば本明細書において記載するものなどの均質化デバイスを用いて均質化することがあり得る。この好ましい非フィブリル化均質化ステップを用いて、ゲルから不連続なエリアを除去することが可能である。適用するために良好な特性を有する均質なゲルが得られる。ヒドロゲルは、例えば、熱および／または放射線を使用することによって、および／または無菌化剤、例えば抗菌剤を添加することによって更に無菌にしてもよい。
【００８８】
積層造形
１つの実施形態において、少なくとも１つの障壁を形成することは、積層造形によって障壁を調製することを含む。３Ｄ印刷とも称される積層造形は、材料をコンピューター制御下で接合させるかまたは固化させ、３次元物体を生成するプロセスである。これは、金型を用いずに行うことができる。材料は、例えば、材料を提供するかまたは排出するために１つまたは複数のノズルを使用することによって、層ごとに一緒に添加される場合がある。１つの例において、１回のアクションで円状または実質的に円状の障壁を形成することができるリングノズルを使用し、そのためノズルは、円を形成するために移動させる必要がない。積層造形を使用した場合、高品質で均一な材料を必要とする試験において使用することができる、良好な品質を有する均一な障壁を得ることが可能であった。
【００８９】
好ましくは、障壁において所望される稠度のナノフィブリルセルロースが製造デバイス、例えば３Ｄプリンターに提供される。ナノフィブリルセルロースは、０．８〜２．５％（ｗ／ｗ）または０．８〜２．１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する分散体またはヒドロゲルとして存在していても、または濃度は、更に低くても高くてもよく、容器中にまたは容器に、例えば、製造デバイスに取り付けられるように設計されていてもよいシリンジ、アンプル、瓶、管、カセットまたは類似のもの中にまたはそれらに提供される。しかし、特に積層造形では、ナノフィブリルセルロースヒドロゲルの稠度は、好ましくは１．０％（ｗ／ｗ）を超えなくては、例えば１．１〜２．５％（ｗ／ｗ）、１．１〜２．１％（ｗ／ｗ）、１．４〜２．１％（ｗ／ｗ）または１．５〜２．０％（ｗ／ｗ）でなくてはならないことが見出された。
【００９０】
ナノフィブリルセルロースを３Ｄ印刷する場合、プロセスは、従来の３Ｄ印刷方法とは異なる。セルロースは加熱した場合に融解せず、そのため印刷材料、例えばプラスチック、金属または類似のもののために使用する方法およびデバイスは、適用することができない場合がある。１つまたは複数のシリンジを利用してもよいシリンジベースのデバイスなどの特定の製造デバイスを使用する必要がある。そのようなデバイスは、液体、ペースト、ゲルまたはスラリーを操作し、プリントすることができ、そのためナノフィブリルセルロースヒドロゲル材料に好適である。製造デバイスは、デバイスを制御するように構成されている制御ユニットにおいて操作可能に格納されているソフトウェアを含んでいても、またはデバイスは、外部制御ユニット、例えばソフトウェアを含むコンピューターに接続してもよい。
【００９１】
ずり減粘性またはチキソトロピー材料としてのナノフィブリルセルロースは、積層造形において使用される従来の材料とは異なる方法で振る舞う。せん断力が材料に適用される場合、例えば、材料を混合し、圧力がかけられたおよび／またはノズルを強制的に通過した場合、ナノフィブリルセルロースゲルは、材料が標的へ流動するのを促進する流動化挙動を示す。しかし、材料が印刷されたか、そうでなければ製造デバイスから排出された場合、粘度は以前の高粘度の状態に戻ることになる。これは、所望の障壁構造を支持体に形成した場合に課題をもたらす場合があるが、３Ｄ印刷プロセスおよび所望の構造の成形性（formability）を促進する場合もある。例えば、ヒドロゲルのせん断流動化またはチキソトロピーは、それを鋳造することができ、所望の構造を形成することができる、材料に好適なオープンタイムをもたらす場合がある。通常は温度を制御する必要はなく、例えば、材料を、鋳造または硬化の目的で加熱および／または冷却する必要はないが、プロセスは室温または室内温度で行ってもよい。
【００９２】
障壁構造は、細胞培養プレートもしくはウェルであり得る支持体、または金属、プラスチックもしくは他の好適な材料であっても、もしくはプラスチック膜、紙または類似のものでコーティングされていてもよく、異なるもしくは個別の支持体上に、製造または印刷してもよい。したがって、特に、例えば本明細書において記載するエリアを取り囲むおよび／または定める構造の形態で、例えば環または円の形態でまたは類似のもので製造された最終的な障壁構造は、ウェルにおける最終的な位置上に直接形成しても、最終的な障壁構造を支持体から取り出し、ウェルに適用してもよい。３Ｄ印刷された最終的な障壁構造は、調製し、個別に保存してもよく、本明細書において開示する方法において細胞培養ウェルに適用するために提供してもよい。
【００９３】
排出した材料を乾燥することが必要となる場合があるため、方法は、乾燥ステップを含んでいてもよい。例えば、真空もしくは減圧下、および／または凍結および／または加熱を利用して、構造を形成し、および／またはそれを脱水してもよい。乾燥は最終的な構造のみに行っても、２回以上繰り返してもよい。１つを超える層を提供することによって積層造形を行う場合、材料を１０〜３０分、例えば約１５分乾燥してから、新規の層を適用することが必要となる場合がある。層を手動、例えばシリンジおよび注射針を使用することによって適用する場合、層を長時間、例えば３０〜６０分乾燥してから、新規の層を適用することが必要となる場合がある。
【００９４】
製造デバイスを排出する手段、例えばノズルまたは類似のものも重要な役割を果たす場合がある。排出デバイスの１つの例はシリンジであり、好ましくは新規のおよび未使用のシリンジを毎回使用しなくてはならないことが見出された。針、好ましくは金属針は、ノズルとして作動する場合がある。針は、注射針または類似のもの、例えば、１．１９４ｍｍの公称内径の約１６ゲージ針、または０．４１３ｍｍの内径の２２ゲージ針であってもよい。一般的にノズルは、０．２〜３．０ｍｍ、例えば０．２〜２．０ｍｍ、例えば０．２〜１．５ｍｍ、０．３〜２．０ｍｍ、０．４〜１．５ｍｍまたは０．４〜１．３ｍｍの範囲の内径を有していてもよい。注射針または類似のものは、例えば１４Ｇ〜２８Ｇ、例えば１６Ｇ〜２２Ｇの範囲のサイズを有していてもよい。
【００９５】
積層造形後、材料、すなわち障壁を、例えば少なくとも３０分間または少なくとも６０分間乾燥することが必要となる場合がある。障壁は、特に冷蔵温度、例えば１０℃未満、例えば２〜１０℃または４〜８℃で保存される場合、製造してから少なくとも２週間保存してもよい。
【００９６】
細胞培養プレートを積層造形によって調製するための方法は、
−  １つまたは複数の細胞培養ウェルを含む細胞培養プレートを提供すること、
−  ナノフィブリルセルロースの水性分散体を提供すること、
−  積層造形のための製造デバイスを提供すること、
−  ウェルを少なくとも２つのコンパートメントに分割するために、少なくとも１つの障壁を、製造デバイスを用いて、ナノフィブリルセルロースから少なくとも１つの細胞培養ウェルに形成することを含んでいてもよい。少なくとも１つの障壁を形成することは、１つまたは複数のステップにおいて、例えば２つ以上のステップにおいて行ってもよい。層または類似の部分構造を各ステップにおいて形成してもよい。ステップの間に、例えば、１０〜６０分、例えば１０〜３０分または１０〜２０分の休止および／または乾燥ステップが存在する場合がある。乾燥ステップは、ナノフィブリルセルロースの所望の稠度が得られるような方法でおよび／またはそのような時間で行ってもよい。得られた細胞培養プレートは、本明細書において記載する細胞培養プレートのうちのいずれかであってもよい。
【００９７】
本明細書において開示する細胞培養プレートは、医療製品であってもよい。「医学的」という用語は、製品、すなわち実施形態のＮＦＣを含む製品が、医学的目的または科学的目的、例えば、研究のために使用されるかまたはこれらに好適である製品または使用を指す。医療製品は、無菌であっても、例えば、温度、圧力、蒸気、化学物質、放射線またはこれらの組合せを使用することによって無菌化可能であってもよい。製品、好ましくは分子が付着したヒドロゲルは、例えば、オートクレーブ処置されていても、または高温を使用した他の方法を使用してもよく、この場合、製品は１００℃、例えば少なくとも１２１℃または１３４℃を超える高温に耐えるはずである。１つの例において、製品は、１２１℃で１５分間オートクレーブ処置される。医療製品は発熱物質不含であり、不所望のタンパク質残渣または類似のものを含まないことも望ましい。医療製品は、好ましくは、標的に対して非毒性である。ＵＶ無菌化またはガンマ放射線も使用してもよい。
【００９８】
本明細書において開示するおよび／または本明細書において開示する通りに調製された細胞培養プレートは、市販の製品、例えば包装された製品、特に包装された医療製品として提供してもよい。細胞培養プレートは、包装、例えば無菌包装で包装されていてもよく、または製品を包装内で無菌化してもよい。細胞培養プレートは、膜、フィルムまたは細胞培養ウェルを覆う他のカバーを含んでいてもよい。覆われたウェルは、室内条件から、例えば保存、輸送および取り扱い中に微生物、湿度、気体、粒子などから保護される。カバーは、好適な接着剤によって細胞培養プレートに付着したストリップとして提供しても、存在してもよい。ストリップは、取り外し可能であってもよく、例えば、それは、破るかまたは剥がし、細胞培養ウェルを露出させてもよく、そうしてプレートはすぐに使用される。細胞培養プレートは、例えば使用濃度で、あるいは乾燥したままで、本明細書において開示する障壁のみを含んでいてもよい。細胞培養プレート、またはウェルは、保護ガスを含んでいてもよい。細胞培養プレートはまた、ウェルおよび／またはコンパートメント中の保存溶液、培養培地および／またはゲルとともに提供してもよい。細胞培養プレートは、細胞を含まずにまたは細胞とともに提供してもよい。
【００９９】
細胞を研究するための方法
障壁を有する細胞培養プレートを、さまざまな科学的および医学的方法、例えば生存細胞が関与する方法において使用することができる。
【０１００】
細胞を研究するための方法および製品では、ある特定の種類の細胞が提供される。細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であっても、真核細胞であってもよい。真核細胞は、植物細胞、酵母細胞または動物細胞であってもよい。真核細胞の例としては、移植可能な細胞、例えば幹細胞がある。細胞は、動物細胞であってもヒト細胞であってもよい。本明細書において使用する「細胞」という用語はまた、１種類を超える細胞の混合物、多細胞構造、組織様構造および組織、ならびにこれらを含むまたはこれらに由来する構築物または材料を含んでいてもよい。多細胞および組織様の構造、構築物または材料としては、細胞ならびに他の生物学的材料および／または生物学的適合材料があり得、これらは所望の方法で配置された細胞を含んでいてもよい。そのような多細胞および組織様の構造または材料を使用することによって、例えば、心血管系、肝臓系、癌系または類似のものを研究および試験することができる生体系のモデルを生成し、提供することが可能である。
【０１０１】
細胞の具体例としては、幹細胞、未分化細胞、前駆細胞、ならびに完全に分化した細胞およびこれらの組合せがある。一部の例では、細胞は、角膜実質細胞、角化細胞、線維芽細胞、上皮細胞およびこれらの組合せからなる群から選択される細胞型を含む。一部の例では、細胞は、幹細胞、始原細胞、前駆細胞、結合組織細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、内皮細胞、線維芽細胞、角化細胞、平滑筋細胞、間質細胞、間葉細胞、免疫細胞、造血細胞、樹状細胞、毛包細胞およびこれらの組合せからなる群から選択される。細胞は、腫瘍または癌細胞、遺伝子改変細胞、例えばトランスジェニック細胞、シスジェニック細胞もしくはノックアウト細胞、または病原細胞であってもよい。そのような細胞は、例えば、薬物研究のためにまたは治療法において使用してもよい。特に幹細胞は、治療的用途、例えば、患者への提供において使用してもよい。
【０１０２】
１つの例において、細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の更なる例としては、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、サル細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ニワトリ細胞などがある。本方法および製品の利点は、哺乳動物細胞の研究に関して最もよく実証されているが、方法および製品はまた、他の細胞、例えば非哺乳動物真核細胞、酵母細胞、または原核細胞の研究に関しても使用してもよいことに留意されたい。
【０１０３】
細胞培養ウェルのうちの１つまたは複数は、本明細書において開示する障壁を含んでいてもよく、その結果、ウェルは、細胞および／または他の物質を収容するための少なくとも２つのコンパートメントを含んでいてもよい。例えば、１つまたは複数の種類の細胞を、コンパートメントに適用してもよい。１つの例において、ウェルにおける２つ以上のコンパートメントに適用される細胞は、同じ種類の細胞である。１つの例において、ウェルにおける２つ以上のコンパートメントに適用される細胞は、異なる種類の細胞であり、そのため各コンパートメントにおいて、異なる種類の細胞が存在していてもよく、または少なくとも１つのコンパートメント中に他のコンパートメントとは異なる種類の細胞が存在する。細胞型は、細胞の起源を指していてもよく、例えば、細胞は、異なる生物からのものであってもよく、および／または細胞は、異なる組織を表していてもよい。細胞はまた、正常または健常細胞であっても、腫瘍細胞、例えば癌細胞であってもよい。本実施形態の細胞培養ウェルまたはコンパートメントのうちの１つまたは複数において適用、インキュベート、培養および／または試験を行ってもよい細胞の例としては、肝細胞、例えば肝実質細胞、例えば、肝細胞癌細胞、内皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、腎細胞、免疫細胞、例えばマクロファージおよび単球、または神経細胞、例えば神経芽細胞腫細胞、幹細胞またはその他の好適な細胞がある。
【０１０４】
１つの例において、細胞は、幹細胞、例えば全能性、多能性、複能性、少能性または単能性幹細胞である。幹細胞は、細胞分裂を介してそれ自体を再生することができ、多系譜細胞に分化することができる細胞である。これらの細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および組織特異的または体性幹細胞とも称される成体幹細胞としてカテゴリー化してもよい。幹細胞は、ヒト幹細胞であってもよく、これは、非胚起源のもの、例えば成体幹細胞であってもよい。これらは、分化後に身体全体にわたって認められる未分化細胞である。これらは、例えば臓器再生を担い、多能性または複能性状態に分裂し、分化細胞系譜に分化することができる。幹細胞は、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２００８年２月７日；２巻（２号）：１１３〜７頁に記載されているような胚を破壊せずに生成されるヒト胚性幹細胞株であってもよい。幹細胞は、自家成体幹細胞の原料、例えば骨髄、脂肪組織、または血液から得てもよい。
【０１０５】
幹細胞の例としては、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ（登録商標））、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、および造血幹細胞がある。
【０１０６】
ヒト幹細胞の場合、細胞は、非胚細胞またはｈＥＳＣなどの細胞であってもよく、これらは胚を破壊せずに派生させることができる。ヒト胚性幹細胞の場合、細胞は寄託細胞株由来のものであるか、または未受精卵、すなわち「単為発生」卵からもしくは単為生殖活性化卵子から作製してもよく、そうしてヒト胚は破壊されない。
【０１０７】
１つの例において、細胞は間葉幹細胞（ＭＳＣ）である。間葉幹細胞（ＭＳＣ）は成体幹細胞であり、これは、ヒトおよび動物源から、例えば哺乳動物から単離することができる。間葉幹細胞は複能性間質細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞および脂肪細胞を含むさまざまな細胞型に分化することができる。間葉自体は胚結合組織であり、中胚葉由来であり、造血および結合組織に分化する。しかし間葉幹細胞造血細胞に分化しない。間葉幹細胞および骨髄間質細胞という用語は長年にわたって区別せずに使用されてきたが、どちらの用語も記述的ではない。間質細胞は結合組織細胞であり、支持構造を形成し、そこでは機能細胞が組織に常在する。これは、ＭＳＣの１つの機能に関する正確な説明であるが、用語では、組織の修復における比較的最近発見されたＭＳＣの役割を伝えることができない。用語は、他の非骨髄組織、例えば胎盤、臍帯血、脂肪組織、成体筋、角膜基質または乳児の乳歯の歯髄由来の複能性細胞を包含する。細胞に、臓器全体を再構築する能力はない。
【０１０８】
国際細胞治療学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）は、ＭＳＣを定義するための最小限の基準を提案している。これらの細胞は（ａ）プラスチック接着を示さなくてはならず、（ｂ）特定の一連の細胞表面マーカー、すなわち分化クラスター（ＣＤ）７３、Ｄ９０、ＣＤ１０５を有し、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびヒト白血球抗原−ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現がなく、（ｃ）脂肪細胞、軟骨細胞および骨芽細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化するための能力を有する。これらの特性は全てのＭＳＣに対して有効であるが、さまざまな組織起源から単離されたＭＳＣにおいていくつかの違いが存在する。ＭＳＣは胎児組織だけではなく、多くの成体組織においてほぼ例外なく存在する。ＭＳＣの効率的な母集団は骨髄からも報告されている。ＭＳＣの特性を示す細胞は、脂肪組織、羊水、羊膜、歯の組織、子宮内膜、肢芽、月経血、末梢血、胎盤および胎児膜、唾液腺、皮膚および包皮、羊膜下臍帯内膜（sub-amniotic umbilical cord lining membrane）、滑液ならびにホウォートンゼリーから単離されている。
【０１０９】
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）は、非常に高度な塑性を示し、実質的に全ての臓器において、骨髄において最も高密度で認められる。ｈＭＳＣは、適切に刺激した場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、および移植後ｉｎ  ｖｉｖｏで、間葉細胞への再生可能な原料としての役割を果たし、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格および心筋細胞、内皮細胞、および神経を含むいくつかの細胞系譜に分化する多能性能力を有する。
【０１１０】
１つの例において、細胞は多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）であり、骨髄、筋肉および脳から採取することができる原始的な細胞母集団に由来する。ＭＡＰＣは、間葉幹細胞よりも原始的な細胞母集団であり、胚性幹細胞の特性を模倣しながら、細胞療法において成体幹細胞の潜在力は依然として保持したままである。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＭＡＰＣは、脂質生成、骨形成、神経形成、肝形成、造血、筋形成、軟骨形成、上皮および内皮系譜への広範な分化の可能性が実証された。ＭＡＰＣの重要な特徴は、その表現型を損なうことなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで大きな増殖の可能性を示すことである。ＭＡＰＣは、さまざまな疾患、例えば虚血性脳卒中、移植片対宿主病、急性心筋梗塞、臓器移植、骨修復および骨髄異形成を処置するために使用してもよい。ＭＡＰＣはまた、骨形成を強化し、血管新生を促進し、免疫調節効果を有する。
【０１１１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）はある種の多能性幹細胞であり、成体細胞から直接生成することができる。それは事実上無制限に増殖することができ、神経、心臓、膵臓および肝細胞を含む他の全ての細胞型を身体にもたらす場合がある。人工多能性幹細胞は、成体組織に直接由来する場合があり、患者に合わせた様式で作製することができ、そのため、免疫拒絶のリスクなしで移植を提供することができる。ヒト人工多能性幹細胞は特別に興味深いものであり、例えば、ヒト線維芽細胞、角化細胞、末梢血細胞、腎上皮細胞または他の好適な細胞型から生成することができる。
【０１１２】
血液幹細胞とも称される造血幹細胞（ＨＳＣ）は、白血球、赤血球、および血小板を含む全ての型の血液細胞に発達できる細胞である。造血幹細胞は、末梢血および骨髄において認められる。ＨＳＣは血液細胞の骨髄系譜とリンパ系譜の両方をもたらす。骨髄系譜とリンパ系譜の両方が樹状細胞の形成に関与する。骨髄系細胞としては、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、および巨核球から血小板までがある。リンパ系細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞がある。造血幹細胞移植は、癌および他の免疫系障害の処置に使用することができる。
【０１１３】
本開示はまた、物質を検出するための方法であって、
−  第１のコンパートメント中に第１の細胞を含む、本明細書において開示する細胞培養プレートを提供することと、
−  別のコンパートメントから少なくとも１つの物質を検出すること
を含む方法を提供する。
【０１１４】
物質を検出するための方法は、細胞に対する目的の物質の効果を評価するために行う場合がある。物質を検出するための方法は、細胞によって分泌された物質を検出するための方法、細胞内の反応をもたらすことができる物質を同定するおよび／もしくは定量化するための方法、障壁を通過することができる物質を検出するための方法、または本明細書において開示する任意の適用可能な方法であってもよく、障壁は、細胞が通過するのを阻止するが、他の物質のうちの１つまたは複数を通過させるために使用することができる。一般的に検出は、同定すること、定量化すること、認定することなどを指していてもよく、検出された情報を分析することおよび／または結果を提供することもあり得、これらの行為は、コンピューター化された制御ユニットまたは類似のデバイスを使用することによって行ってもよい。
【０１１５】
本開示はまた、物質を検出するための方法、例えば細胞に対する目的の物質の効果を評価するための方法であって、
−  第１のコンパートメント中に第１の細胞を含む細胞培養プレートを提供すること、
−  目的の物質をコンパートメントに、例えば第１のコンパートメントに適用すること、
−  細胞が目的の物質と反応するのに十分な時間にわたって細胞をインキュベートすることと、
−  別のコンパートメントから少なくとも１つの物質を検出すること、例えば、少なくとも１つの物質、例えば目的の物質、細胞によって分泌された物質、目的の物質の反応産物、または他の物質の量を検出し、少なくとも１つの物質および／または第１のコンパートメントからの細胞の反応も任意選択で検出することと、
−  検出された物質および／または細胞の反応に基づいて、細胞に対する物質の効果を評価すること
を含む方法を提供する。目的の物質を、第１のコンパートメントではなく別のコンパートメント、例えば第２のコンパートメントに適用した場合、方法は、目的の物質を、障壁を通して第１のコンパートメントに拡散させることを含んでいてもよい。少なくとも１つの物質は、第１の細胞が位置するコンパートメントではなく別のコンパートメントから検出してもよく、および／または少なくとも１つの物質は、目的の物質が適用されたコンパートメントではなく別のコンパートメントから検出してもよい。一般的に、１つまたは複数の物質は、１つまたは複数のコンパートメントから検出してもよい。１つの例において、検出される物質のうちの１つまたは複数は、物質が、細胞培養プレート内の少なくとも１つの障壁を通過した後に、前記通過した物質に対する反応として分泌される。
【０１１６】
一般的に、本明細書において使用する「分泌」は、細胞からの物質の任意の放出を含むなどと広範に考えることができる。分泌は、細胞の通常の分泌機序を指していてもよく、１つまたは複数の物質は、例えば本明細書において開示する目的の物質などの化学的物質、環境または条件の変化、または機械的刺激、電気的刺激、放射線、光またはこれらの組合せであってもよい刺激に対する応答として、細胞外空間またはマトリックスへ、細胞によって、例えば、ポロソーム（porosomes）を介して分泌される。分泌はまた、排泄を含んでいてもよい。分泌された物質の例としては、タンパク質、酵素、ホルモン、毒素、および細胞シグナル伝達化合物がある。分泌はまた、他のある種の行為を含んでいてもよく、例えば細胞が破壊されたか、そうでなければ弱められたか、またはこれらの透過性が調整された場合、例えば、溶解、機械的または他の破壊によって、例えば、細胞を完全にまたは部分的に破壊し、物質、細胞小器官、細胞質などの放出をもたらす超音波または他の類似の行為を使用することによって得られた場合、１つまたは複数の物質が細胞から得られる。細胞の破片は障壁に貫通することはできないが、一部の他の物質は貫通することになり、そうして検出および／または他の反応または細胞を干渉する場合がある１つまたは複数の目的の物質を、他の材料から分離することが可能である。そのような場合では、方法は、１つのコンパートメント中において細胞を破壊することを含んでいてもよい。
【０１１７】
１つの例は、物質を検出するための方法、例えば細胞に対する目的の物質の効果を評価するための方法であって、
−  第１のコンパートメント中に第１の細胞を含む細胞培養プレートを提供すること、
−  目的の物質を第１のコンパートメントに適用すること、
−  細胞が目的の物質と反応するのに十分な時間にわたって細胞をインキュベートすること、
−  別のコンパートメントから少なくとも１つの物質を検出することと、
−  検出された物質および／または細胞の反応に基づいて、細胞に対する物質の効果を評価すること
を含む方法を提供する。
【０１１８】
少なくとも１つの物質を検出することは、少なくとも１つの物質の量を検出すること、および／または少なくとも１つの物質の存在を検出することを含んでいてもよい。
【０１１９】
検出される少なくとも１つの物質は、目的の物質、好ましくは目的の物質に対する反応として細胞によって分泌された物質、例えば、細胞によってまたは細胞によって分泌された物質によって代謝された目的の物質の反応産物、または他の物質であってもよい。細胞によって分泌された物質は、好ましくは目的の物質に対する、または目的の物質に対する反応として別の細胞によって分泌された異なる物質に対する反応として分泌される。
【０１２０】
目的の物質は、試薬、医薬、または医薬もしくは他の反応性分子として作動するその能力に関して試験される分子であってもよい。したがって、目的の物質は、疑似物質、医薬、試薬または類似の化合物であってもよい。目的の物質はまた、１つもしくは複数の試薬、または細胞培養培地のｐＨ、栄養素含有量、塩含有量および／もしくは他の条件の調整に好適な他の化合物を含んでいてもよく、そのような条件における変化を刺激として使用してもよい。
【０１２１】
方法はまた、少なくとも前述のような物質、および／または第１のコンパートメントからの細胞の反応を検出することを含んでいてもよい。細胞の反応としては、細胞によって分泌された１つまたは複数の物質、細胞からもしくはコンパートメントから検出された酵素活性、細胞の外観、代謝もしくは他の特徴の変化、または類似のものがあり得る。例えば、コンパートメントは、視覚的に、例えばカメラまたは他の光学デバイスまたは細胞および／もしくはコンパートメントの視覚的特性において１つまたは複数の変化を検出する視覚的検出手段を使用することによってモニターしてもよい。方法は、細胞培養プレートにおける１つまたは複数のコンパートメントをモニターし、１つまたは複数のコンパートメントから１つまたは複数の画像を得るために配置され、１つまたは複数の画像を保存および／または分析し、細胞および／またはコンパートメントの外観における変化を検出するために配置された制御ユニットに接続された、イメージングデバイス、例えばカメラまたは他の好適なデバイスを提供することを含んでいてもよい。１つまたは複数の画像は、動画、すなわちビデオまたは複数の連続的な静止画像を指していてもよい。本明細書において開示する検出方法および手段は、細胞生存率を検出するために使用してもよい。
【０１２２】
コンパートメントは、化学的にモニターしてもよく、それには、１つまたは複数の検出手段を一般的に使用することによって、１つまたは複数の化学物質すなわち物質をコンパートメントから検出することが含まれる。１つまたは複数のコンパートメントから１つまたは複数の物質を検出することは、１つまたは複数のコンパートメントから、例えばコンパートメント中に含まれる培地から１つまたは複数のサンプルを得ることと、１つまたは複数の好適なプローブ、テストストリップ、または特定の物質を検出するために配置された他の検出手段を使用することによって、特定の物質を検出するためにおよび／または特定の物質に匹敵する検出可能な反応をもたらすために配置された１つまたは複数の好適な指標を使用することによって、サンプルを分析することと、反応、例えば呈色反応、酵素反応、電気化学反応または類似の反応、好ましくは、自動手段、例えば１つまたは複数のプローブ、検出器、イメージングデバイスまたは検出された反応を分析するために配置された制御ユニットに接続された他の好適な電子的手段を使用することによって、検出および／または定量化することができる反応を検出することと、好ましくは、物質の存在および／または効果を示す１つまたは複数の結果を出力することとを含んでいてもよい。
【０１２３】
方法は、
−  第２のコンパートメント中に第２の細胞を提供すること、
−  第２の細胞によっておよび／または第２の細胞の反応によって分泌された少なくとも１つの物質を第２のコンパートメントから検出することと、
−  第２の細胞によっておよび／または第２の細胞の反応によって分泌され、検出された物質に基づいて、第１の細胞および／または第２の細胞に対する目的の物質の効果を評価すること
を更に含んでいてもよい。第２の細胞の反応としては、第２の細胞の、第１の細胞によって分泌された物質に対する任意の反応があり得る。
【０１２４】
１つの実施形態において、ウェルは、１つのコンパートメント中に１種類の細胞を、任意選択で、少なくとも１つの他のコンパートメント中に同じおよび／または他の種類の細胞、例えば肝細胞、例えば肝実質細胞、例えば、肝細胞癌細胞、内皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、腎細胞、免疫細胞、例えばマクロファージおよび単球、または神経細胞、例えば神経芽細胞腫細胞、および幹細胞から選択される細胞を含む。そのような配置は、代謝産物および／または細胞によって分泌された他の物質を試験またはモニタリングするための方法において使用してもよく、別のコンパートメントに位置する細胞および／または他の物質を用いて更に試験してもよい。このように、障壁を貫通または通過できないため第１のコンパートメントの細胞はコンパートメント中に残るが、好ましくは細胞によって分泌された代謝産物または他の物質のみが、障壁を通過し、第２のまたは更なるコンパートメントに侵入することができ、それがコンパートメントの細胞と接触し、細胞に影響を与え、および／またはそれを検出することができる。
【０１２５】
１つの例は、第１の細胞によって分泌された物質を研究するための方法であって
−  第１のコンパートメント中に第１の細胞を含む細胞培養プレートを提供すること、
−  第１の細胞から物質、例えば代謝産物の分泌をもたらす化合物を第１のコンパートメントに適用すること、
−  細胞を、物質が分泌され、障壁を通過して拡散することを可能にするのに十分な時間にわたってインキュベートすること、
−  第２のコンパートメントからの物質を研究すること
を含む方法を提供する。第２のまたは更なるコンパートメントは、細胞、例えば第２のまたは更なる種類の細胞を含んでいてもよい。物質を研究することとしては、第２の細胞に対する物質の効果を研究すること、物質または別の物質、例えば第１の物質に対する応答として第２のまたは更なる細胞によって分泌された物質の反応速度論を研究することがあり得る。
【０１２６】
１つの例は、第１の細胞によって分泌された物質の第２の細胞に対する効果を評価するための方法であって、
−  細胞培養ウェルの第１のコンパートメント中に第１の細胞を、第２のコンパートメント中に第２の細胞を含む細胞培養プレートを提供すること、
−  第１の細胞から物質、例えば代謝産物の分泌をもたらす化合物を第１のコンパートメントに適用すること、
−  細胞を、物質が分泌され障壁を通過して拡散することを可能にするのに十分な時間にわたってインキュベートすること、
−  第２のコンパートメントの第２の細胞に対する物質の効果を分析し、物質の効果を評価すること
を含む方法を提供する。
【０１２７】
本明細書において使用する第１の細胞は、第１の種類の複数の細胞を指していてもよい。同様に、本明細書において使用する第２の細胞は、第２の種類の複数の細胞を指していてもよい。方法は、細胞培養プレートを提供することと、第１の細胞を提供することと、第１の細胞を第１のコンパートメントに適用すること、および／または細胞培養プレートを提供することと、第２の細胞を提供することと、第２の細胞を第２のコンパートメントに適用することとを最初に含んでいてもよい。細胞、および任意選択で任意の細胞培養培地または他の材料を含む細胞培養プレートは、細胞系と称される場合もある。
【０１２８】
ナノフィブリルセルロース障壁は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系に肝代謝を追加するための特に効率的なツールであったことが実験において見出された。化学物質は、肝実質細胞コンパートメントに適用してもよく、肝実質細胞が化学物質を代謝してから、それが障壁を通過して別のコンパートメントの線維芽細胞に侵入することができる。最終的に、細胞生存率は、例えば、自動細胞培養および分析システム、例えばＣｅｉｉ−ＩＱを使用することによって障壁の両側で分析することができる。市販の製品を入手ために、障壁の構築は障壁のサイズとして規格化する必要があり、異なるコンパートメントの表面積は一定でなくてはならない。
【０１２９】
障壁は、神経移動試験においてもツールとして使用することができる。神経細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）は障壁を通過せず、障壁は、規格化された方法で除去することができたことが見出された。その結果、障壁系は、神経移動試験（発達神経毒性）において使用される可能性を有する。障壁は、本明細書において記載する通りに構築し、例えばピンセットによって除去することができる。
【０１３０】
ＨｅｐａＲＧ細胞の代わりに、（凍結保存された）ヒト初代肝実質細胞を使用することができ、その代謝活性は凍結直後が最高であり、培養に数日を必要としない。
【０１３１】
本開示はまた、すなわち細胞培養法または細胞を培養することを含む方法において細胞を培養するための、本明細書において開示する細胞培養プレートの使用を提供する。
【０１３２】
本開示はまた、物質を検出するための方法における、または本明細書において開示するような物質の効果を評価するための方法における、本明細書において開示する細胞培養プレートの使用を提供する。
【実施例】
【０１３３】
実施例
実施例１：化学物質は透過させるが細胞は透過させない生物学的障壁としてのナノフィブリルセルロース
本研究の目的は、ナノフィブリルセルロースゲルが、障壁を通した細胞の通過を阻止するが、化学化合物の通過を可能にするであろう障壁を構築するために使用することができるかどうかを調べることであった。ＧｒｏｗＤｅｘ（商標）をナノフィブリルセルロースとして使用した。
【０１３４】
材料
試験系
・ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ＊、＃ＨＢ−８０６５（商標））
最終的機密報告書
ＦＩＣＡＭ  ＣＴ００６５／４６（１６）
・ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２２６６（商標））
・ラット肺胞マクロファージＮＲ８３８３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２１９２（商標））
細胞培養用ＧｒｏｗＤｅｘ（商標）ヒドロゲル
・ＧｒｏｗＤｅｘ、０．６５％（ＵＰＭ、ロット１１８９８）トライアル１〜３
・Ｇｒｏｗ−Ｄｅｘ、０．６５％、アニオン性、（ＵＰＭ、ロット１１７８２）トライアル４
・ＧｒｏｗＤｅｘ（細胞培養用ヒドロゲル）、１．５％、（ＵＰＭ、ロット１１８７８）トライアル１〜３、５
・ＧｒｏｗＤｅｘ（細胞培養用ヒドロゲル）、１．５％、（ＵＰＭ、ロット１１９１１）トライアル４
試薬
・ＨｅｐＧ２細胞培養培地、ＦＩＣＡＭのロットＨｅｐＧ２／ＣＴ００６５−２／ＭＨ／１／１２０２１７
・ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養培地、ＦＩＣＡＭのロットＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＣＴ００６５−４／ＭＨ／１／１２０２１７
・ＮＲ８３８３細胞培養培地、ＦＩＣＡＭのロットＮＲ８３８３／ＣＴ００６５／ＭＶ／１／２４０４１７
・ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１２６０４、ロット１６６４９４０）
・等張溶液中の０．２％トリパンブルー、ＦＩＣＡＭのロット０．２％ＴＢ／ＳＬ／１７／３１０５１８
・ＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ＃ＢＥ１７−５１３Ｆ、ロット５ＭＢ１７８）
・フルオレセイン（Ｓｉｇｍａ＃６３７２、ロット６７４３４０６）
・フィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｆ３８７９）
・ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｌ６０２６、ロットＳＬＢＦ８７２４Ｖ）。
・クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のセルラーゼ（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ１１８４、ロットＳＬＢＰ８４４０Ｖ）
装置
・細胞培養インキュベーター（３７℃、５．０％ＣＯ２）（Ｅｓｃｏ  ＣＬＳ  ＣｅｉＳａｆｅ  ＣＯ２）
・ポジティブディスプレイスメント式ピペット（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）
・倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｐｒｉｍｏｖｅｒｔ＋Ａｘｉｏｃａｍ  ＥＲｅ  ５ｓ）＋デジタルカメラ
・９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）
研究の概要
本研究では、４つの異なるＧｒｏｗＤｅｘロット（および２つの密度）を使用し、円状と直線状の両方の壁の形状の障壁を構築し、細胞培養ウェルを２つの異なるコンパートメントに分割した。障壁を６ウェルプレート（円状障壁）、ならびに２４ウェルおよび４８ウェルプレート（直線状壁の障壁）中に構築した。細胞の通過を阻止するための障壁の特性を、３つの異なる細胞型；肝芽腫ＨｅｐＧ２細胞、神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＮＲ８３８３マクロファージを使用して試験した。化学物質を通過させるための障壁の特性を、直接的な方法と間接的な方法の両方を使用して試験した。トライアル１〜５は、ある特定のトライアルで得られた結果および経験を後続のトライアルで利用したため、年代順で示す。第７章では、最も重要な発見および結論を要約する。
【０１３５】
実験手順および結果
トライアル番号１：ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の構築
ＧｒｏｗＤｅｘ：０．６５％、ロット１１８９８、ＧｒｏｗＤｅｘ１．５％、ロット１１８７８
手順
６ウェルプレートならびに２４および４８ウェルプレート中に障壁を構築するために、複数の試みを行った。２４および４８ウェルプレートでは、ウェルを、直線状壁の障壁構造を使用して２つの部分に分割した（図１）。６ウェルプレートでは、円状構造を構築した（図２）。一部の障壁は、接着剤として特定のフィブリノーゲンベースのコーティングを使用して構築した。障壁を構築する助けとするために、障壁の形状を、最初にマルチウェルプレートの底部に描いた。
【０１３６】
結果
０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ、ロット１１８９８は、障壁を構築するのに好適ではなかったと思われた。ゲルは、ウェルの底部に広がり、障壁として機能するのに十分高いであろう壁を構築することができなかった。代わりに１．５％ＧｒｏｗＤｅｘを用いると、円状と直線状の両方の壁の形状の障壁を構築することが可能であった。
【０１３７】
トライアル番号２：ＳＨ−ＳＹ５ＹおよびＨｅｐＧ２細胞の障壁を通した通過
ＧｒｏｗＤｅｘ１．５％、ロット１１８７８
手順
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞：直線状壁の形状のＧｒｏｗＤｅｘ障壁を、図１で示すように４８ウェルプレート中に構築した。障壁構築物を、ラミナーフード中、蓋を開けた状態で１時間乾燥した。細胞培養培地５０μｌ中の３２５  ０００ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、障壁の左側にピペットで移した。翌日、細胞培養培地を障壁の両側へ添加した。培地を徐々に添加し、培地が障壁を超えて流動するのを阻止した。細胞を最大２週間増殖させた。新鮮培地を週に２回添加した。
【０１３８】
ＨｅｐＧ２細胞：円形状のＧｒｏｗＤｅｘ障壁を、図２で示すように６ウェルプレート中に構築した。障壁をラミナーフード中、蓋を開けた状態で１時間乾燥した。細胞培養培地５０μｌ中の１  ０７  ５００ＨｅｐＧ２細胞を障壁の内側に添加した。翌日、細胞培養培地を障壁の両側へ添加した。培地を徐々に添加し、培地が障壁を超えて流動するのを阻止した。細胞を最大２週間増殖させた。新鮮培地を週に２回添加した。
【０１３９】
結果
ＳＨ−ＳＹ５ＹおよびＨｅｐＧ２細胞母集団は増殖し、そのコンパートメントを満たしたが、障壁は通過しなかった。
【０１４０】
トライアル番号３：化学物質の障壁を通した通過
ＧｒｏｗＤｅｘ１．５％、ロット１１８７８
手順
障壁を６ウェル（円形状の障壁）および２４ウェル（直線状壁の形状の障壁）プレート中で調製し、一晩乾燥した。障壁は、溶液がそれを超えて通過し、混合するのを阻止するのに十分高かった。全ての通過および混合は、障壁を通して生じる必要があった。
【０１４１】
化学物質に対する障壁透過性を、０．２％トリパンブルーを使用した目視検査によって、１ｍｇ／ｍｌフルオレセイン溶液を使用した定量測定によって、および毒性化合物であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用した間接的な方法によって試験した。
【０１４２】
手順
０．２％トリパンブルー透過性
１ウェル当たりダルベッコＰＢＳ４００μｌを２４ウェルプレートへ添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を湿潤させた。ＤＰＢＳを除去し、障壁の左側を０．２％トリパンブルー１００μｌで、障壁の右側を等量のＤＰＢＳで置き換えた。溶液が障壁を超えないことを確実にした。
【０１４３】
１ｍｇ／ｍｌフルオレセイン透過性
２４ウェルプレート中に構築した障壁を、上記で説明したように最初にＤＰＢＳを用いて湿潤させた。次いでＤＰＢＳを除去し、１ｍｇ／ｍｌフルオレセイン１００μｌを障壁の左側へ添加し、ＤＰＢＳ１００μｌを障壁の右側へ添加した。フルオレセイン溶液を添加してから１時間、３時間および３日後に、サンプル５０μｌを障壁の両側から９６ウェルプレートに収集し、５１５ｎｍにおける吸光度を読み取った。また、１ｍｇ／ｍｌフルオレセインのサンプル５０μｌを測定した。これは、添加時の障壁の左側における吸光度を表していた。
【０１４４】
ＳＤＳ透過性
ＳＤＳは、全ての細胞型に対して毒性であることが既知の洗浄剤である。この試験の目的は、１つのコンパートメントのみに添加されたＳＤＳが、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を通過し、したがって、両方のコンパートメントにおける細胞を殺傷することができるかどうかを調べることであった。円形状の障壁を６ウェルプレート中に、直線状壁の形状の障壁を２４ウェルプレート中に調製した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、２４ウェルプレートの障壁の両側のその通常の細胞培養培地中に３２５  ０００細胞／５０μｌの密度で播種した。ＨｅｐＧ２細胞を、６ウェルプレートの障壁の円の内側とその外側の両方に１０７  ５００細胞／５０μｌの密度で播種した。翌日、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＳＤＳ原液を調製し、細胞をそれに曝露した。
【０１４５】
２４ウェルプレート上で増殖したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞：０．４ｍｇ／ｍｌ  ＳＤＳ溶液１００μｌを障壁の左側にピペットで移した。ＳＤＳを含まない培地１００μｌを障壁の右側にピペットで移した。
【０１４６】
２４ウェルプレート上で増殖したＨｅｐＧ２細胞：０．４ｍｇ／ｍｌ  ＳＤＳ溶液４００μｌを円の内側にピペットで移し、ＳＤＳを含まない培地４００μｌを円の外側にピペットで移した。
【０１４７】
細胞を、細胞培養インキュベーター中で４８時間インキュベートした。細胞生存率を顕微鏡的に観察した。
【０１４８】
結果
０．２％トリパンブルー透過性
６時間後、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁は青色の大部分を吸収していた。翌日、色は障壁の両側で均一に分布した。図３は、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁で分割されたウェル中の０．２％トリパンブルーの分布を示す。
【０１４９】
フルオレセイン透過性
吸光度測定によって、障壁の左側に添加したフルオレセインはＧｒｏｗＤｅｘ障壁を透過したことが示された。１時間後、フルオレセインの４７％が左側で回収され、約１０％が右側で回収された。２時間後、５２％が左側で回収され、３５％が右側で回収された。３日後、５０％が左側で回収され、４０％が右側で回収された。回収されなかったフルオレセインはおそらくＧｒｏｗＤｅｘ障壁中に存在した。全般的に、結果によって、フルオレセインが添加してから数時間以内に障壁を透過することが示される。
【０１５０】
ドデシル硫酸ナトリウム透過性
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ−細胞：ＳＤＳを添加してから２４時間後に、障壁の左側における全てのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は死滅した。右側では、細胞は障壁の隣で死滅したが、ウェル全体では死滅しなかった。ＳＤＳを添加してから４８時間後、全ての細胞は両方のコンパートメントにおいて死滅した。同様に、添加してから２４時間後、全てのＨｅｐＧ２細胞はＧｒｏｗＤｅｘ円の内側で死滅し、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の隣の円の外側でも死滅した。４８時間後、ほぼ全てのＨｅｐＧ２細胞（約９５％）は円の外側でも死滅した。
【０１５１】
これは、ＳＤＳは障壁を透過することができるという間接的な証拠である。
トライアル番号４：ＮＲ８３８３マクロファージの障壁を通した通過
ＧｒｏｗＤｅｘ１．５％、ロット１１９１１、ＧｒｏｗＤｅｘ０．６５％（アニオン性）、ロット１１７８２
手順
円形状の障壁を６ウェルプレート上に以下の通りに調製した。ウェルＡ１およびＢ１では、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（ロット１１９１１）を使用した。ウェルＡ３および８３では、０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ（ロット１１７８２）を使用した（図４）。各障壁を３×２５０μｌ＝７５０μｌのＧｒｏｗＤｅｘを使用して構築した。障壁は１．５％ＧＤで０．６５％ＧＤよりも容易に構築された。後者は拡散する傾向があった。障壁をピペットで移した後、ラミナーフード中、蓋を開けた状態で乾燥した。
【０１５２】
３００００個のＮＲ８３８３マクロファージ５０μｌを円の中央に添加し、３０分間付着させた。次いで細胞培養培地１５０μｌを円の内側におよび３００μｌを円の外側に添加した。培地を徐々に添加し、障壁を超えないことを確実にした。細胞培養物を維持し、３日間撮影した。新鮮培地を障壁の内側と外側の両方で毎日置き換えた。
【０１５３】
結果
細胞を播種してから２日後に、細胞は円の中央にほぼ存在せず（細胞を播種した場合）、細胞の大部分は、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁に向かって遊走したために、障壁構築物はマクロファージを引き寄せるように思われた。３日目に、細胞は障壁の最も内側のゾーンに位置していた。効果は、両方の障壁構築物（０．６５％および１．５％）で同じであった（図５〜８）。
【０１５４】
細胞は１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を通過せず、むしろ境界（内側）に沿って集合した（図６および７）。
【０１５５】
０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁は、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘよりも細胞にアクセスしやすいように見え、３日後、細胞は、０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の外側に存在することが認められた（図９）。これは、構築物が１．５％ＧｒｏｗＤｅｘと比較してかなり拡散したために、障壁の物理的な崩壊、および／または細胞および培地が障壁を超えて通過したことに起因する可能性がある。
【０１５６】
トライアル番号５：セルラーゼ処置
手順
実験終了時に、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を除去するためのトライアルを、セルラーゼ処置を用いて行った。１０ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌセルラーゼ溶液を調製し、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を含有するウェルをセルラーゼ溶液で満たした。プレートを、細胞培養インキュベーター中で２４時間インキュベートした。
【０１５７】
結果
セルラーゼ溶液は、障壁を２４時間以内に破壊しなかった。
【０１５８】
結論
生物学的障壁はＧｒｏｗＤｅｘで構築することができるか？
・１．５％ＧｒｏｗＤｅｘの１１８７８および１１９１１の両方のロットは、障壁を構築するために使用することができる。代わりに、０．６５％ＧｒｏｗＤｅｘ（１１７８２および１１８９８の両方のロット）の組成物は、完全なままで残り、構造を保存することになる障壁を構築するためには拡散しすぎた。ヒドロゲルは、ウェルの底部に広がる傾向があった。
・円状障壁は、６ウェルプレートで最も機能し、直線状壁の形状の障壁は、２４および４８ウェルプレートで最も機能した。プラスチック壁とＧｒｏｗＤｅｘ障壁との間に（漏出する可能性がある）接合が存在しなかったために、円状障壁は構築するのが容易であった。
・障壁を１時間乾燥してから細胞を播種すると、障壁が安定化するように思われた。障壁が長時間、すなわち一晩乾燥した場合、使用する１時間前に湿潤する必要があった。そうでなければ、障壁が細胞から全ての培地を素早く吸収したために、細胞を播種することは困難であった。
【０１５９】
細胞は障壁を通過するか？
・１．５％ＧｒｏｗＤｅｘで構築された障壁は、細胞を通過させなかった：ＨｅｐＧ２およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、それらを適用した場合に、コンパートメント中に留まり、増殖した。マクロファージは１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁も通過しなかったが、ゲルを「異物」として認識し、アメーバ状の動きでそこに向かって移動し、そのゲルを飲み込み始めたように見えた。形態は、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁にアプローチしたとき、およびＧｒｏｗＤｅｘゲルに侵入したときに、（円の中央において）円形の明白な細胞から突起が伸長している細胞へ変化した。
・細胞の播種は、細胞を小容量の培地に最初に適用し、障壁との接触を避け、３０分の付着時間の後、更に培地を添加した場合に最も機能した。
【０１６０】
化学物質は障壁を通過するか？
・１．５％ＧｒｏｗＤｅｘで構築された障壁は、直接的な方法と間接的な方法の両方で示されるように化学物質を通過させる。
【０１６１】
障壁は安定で、商業的に実現可能であるか？
・非コーティングマルチウェルプレート上に調製した１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁は、１週間安定であった。その後、それらは外れ始めた。フィブリノーゲンベースのコーティングでコーティング（「接着」）されたマルチウェルプレート上で調製した障壁は、最大３週間安定であった。
【０１６２】
追加の結果
・１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を、セルラーゼ処置を用いて除去するためのトライアルは成功しなかった。しかし、障壁は、ピンセットを用いて完全に除去することができた。
【０１６３】
実施例２：薬物の代謝依存的毒性を調べるための、ナノフィブリルセルロース障壁によって分離されたＨｅｐａＲＧ細胞およびＢＪ線維芽細胞の同時培養
肝実質細胞は身体における主な代謝構成要素である。物質自体に毒性（代謝なしで）があるかどうかまたは物質が反応性および毒性中間体に代謝されるかどうかを見出すために、全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は肝代謝を伴う試験と伴わない試験を含むべきである。代謝誘発性毒性を研究するために、研究者は「順化培地」を使用することが多く；肝実質細胞を最初に化学物質で処置し、次いでこの「順化」培地を標的の細胞上に移す。しかし、これは面倒であり、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況を模倣していない。したがって、肝実質細胞および標的の細胞の非毒性同時培養を同時に行うことが必要とされる。
【０１６４】
本研究の目的は、薬物代謝が細胞毒性評価に含まれ、薬物代謝構成要素（肝実質細胞）が標的ＢＪ細胞からＧｒｏｗＤｅｘで構築される障壁によって分離された試験モデルを開発することであった。障壁は、化学物質は通過させるが、細胞を通過させない（本発明者らの以前の実験では、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘを、そのような特徴を有する障壁を構築するために使用できることが示された）。被験化合物を肝実質細胞コンパートメント中に添加し、曝露後のＢＪ細胞および肝実質細胞の生存率を測定した。
【０１６５】
材料
試験系
ＡＴＣＣ（ＦＩＣＡＭのロット１−ＢＪ／１３）から購入したヒト線維芽細胞ＢＪ（カタログ番号ＨＢ−８０６５）、およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入したＨｅｐａＲＧ細胞（＃ＨＰＲＧＣ１０、ロット１９１９３３２、分析の証明書に関する付属書類１を参照のこと）を本研究において使用した。
【０１６６】
細胞培養用ＧｒｏｗＤｅｘヒドロゲル
・ＧｒｏｗＤｅｘ、１．５％ロット１１９９２３９１７ｈ
・ＧｒｏｗＤｅｘ、２．０％ロット１１９６９４１１７
試薬
・ＢＪ細胞培養培地（１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ）、ＦＩＣＡＭのロット  ＢＪ−ｔｅｓｔ２／ＶＭ００１３／ＭＰＥ／１／０８０３１８、ＢＪ−ｔｅｓｔ２／ＶＭ００１４／ＭＰＥ／１／１６０４１８、ＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＰＥ／２／１９０３２０１８、ＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＶ／３／２７０３１８、ＢＪ／ＣＴ００６５／ＭＰＥ／３／０７０６１８、ＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＨ／４／２８０４１８、ＢＪ／ＣＴ００９２／ＭＰＥ／２／０３０６１８、５％ＦＢＳ／ＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＶ／１／２７０３１８、５％ＦＢＳ／ＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＨ／２／２９０４１８、ＢＪ／ＣＴ００６５／９／ＭＶ／２／２００５１８、ＢＪ／ＣＴ００６５／１３／ＭＶ／１／１１０７１８
・ＢＪ化学物質希釈培地（１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ−グルタミン、２００ＩＵ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭＥＭ）ＦＩＣＡＭのロットａＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＶ／１／２７０３１８、ａＢＪ／ＣＴ００６５／８／ＭＨ／２／２９０４１８
・ＴｒｙｐｌｅＥｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１２６０４、ロット１８９７１８２）
・等張溶液中の０．２％トリパンブルー、ＦＩＣＡＭのロット０．２％ＴＢ／ＨＭａ／１９／１００４１８
・ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を含むＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃３２５５１、ロット１９０８８３５）
・ＨｅｐａＲＧ（登録商標）Ｔｈａｗｉｎｇ／Ｐｌａｔｉｎｇ／Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＨＰＲＧ６７０、ロット１９１９４７８）
・ＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ＃ＨＰＲＧ６３０、ロット１９１２３７６）
・ＷＳＴ−１（Ｔａｋａｒａ＃ＭＫ４００、ロットＡＨ８Ｐ００１）
・２４ウェルプレート（コーティングなし）
試験項目
試験項目を表１に示す。供給業者はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈであった。
【０１６７】
【表１】
2020198876.tif 000003
【０１６８】
装置
・Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
・ポジティブディスプレイスメント式ピペット
実験
概要
実施した実験を、実験１、２、３および４として本明細書において示す。実験１では、パラセタモールおよびセレギリンのＢＪ線維芽細胞自体に対する毒性を調べた。実験２および３では、ＢＪ線維芽細胞を、ＨｅｐａＲＧ細胞を介してパラセタモールおよびセレギリンに曝露した。実験４はＨｅｐａＲＧ細胞の代謝能力の評価を記載する。
【０１６９】
実験用の培養細胞
ヒトＢＪ線維芽細胞の培養は、毎回実験の１〜２週間前に開始した。ＢＪ細胞培養培地（所定の細胞培養培地）をＳＯＰ／Ｍ／０００１−２．２に従って調製し、細胞はＳＯＰ／Ｍ／００７４−１．０に従って培養した。ＢＪ細胞を少なくとも２回継代培養してから実験で播種した。ＨｅｐａＲＧ培地の調製およびＨｅｐａＲＧ細胞の培養は、製造業者の指示書に従って厳密に行った。
【０１７０】
細胞生存率／細胞毒性アッセイ
細胞生存率／細胞毒性は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して毎回調べた。アッセイ原理は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素による、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の有色染料への変換に基づいている。可溶性塩を培地に放出する。所与の期間内に、反応によって色の変化が生じ、これは所与の培養物中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼの量に直接比例する。結果的に、アッセイによって、細胞の正味の代謝活性が実際に測定される。理論上は、これは細胞数を反映し、細胞が多いほど、試薬を還元するために利用可能なデヒドロゲナーゼが多くなる。
【０１７１】
実験１（セレギリンおよびパラセタモールのＢＪに対する毒性）
目的
実験１の目的は、パラセタモールおよびセレギリンのＢＪ線維芽細胞に対する毒性を調べることであり、したがって、ＨｅｐａＲＧ処置は行わなかった。
【０１７２】
手順
ＢＪ細胞の播種
ＢＪ細胞懸濁液を、ＢＪ細胞培養培地中４００００細胞／ｍｌの密度で調製した。この懸濁液１００μｌを９６ウェルプレートにピペットで移し、１ウェル当たり４０００細胞を得た。
【０１７３】
セレギリンおよびパラセタモール希釈液の調製
セレギリンおよびパラセタモール希釈液を、使用日に調製した。最初に、１ｍｇ／ｍｌの原液を両方の薬物から調製し、次いで２００および２０μｇ／ｍｌの希釈液をパラセタモール原液から、２００、２０、１０、５および２μｇ／ｍｌの希釈液をセレギリン原液から調製した。原液および希釈液をＢＪ化学物質希釈培地で調製した。ＢＪ線維芽細胞に対するセレギリン毒性の以前のデータが存在しないために、セレギリンの毒性をパラセタモールよりも広範囲に研究した。代わりに、ヒトＢＪ線維芽細胞に対するパラセタモール毒性は広く研究されている。
【０１７４】
曝露
ＢＪ細胞培養培地を廃棄し、プレートを無菌タオルで慎重に吸い取ることによって、細胞から除去した。直ちに、ＢＪ細胞培養培地５０μｌを、次いで試験項目希釈液（セレギリンまたはパラセタモール）５０μｌまたはビヒクル対照５０μｌを全てのウェルへ添加した。したがってウェル中の最終的な薬物濃度は、５００、１００、１０、２．５および１μｇ／ｍｌであった。ＢＪ化学物質希釈培地をビヒクル対照として使用した。各プレート上に各６つの同様の濃度およびビヒクル対照を有する２つの同様の９６ウェルプレートを、両方の薬物に対して調製した。一方のプレートを３時間インキュベートし、他方を２０時間インキュベートした。
【０１７５】
細胞毒性／生存率アッセイ
３時間または２０時間インキュベートした後、ＷＳＴ−１試薬１０μｌをウェル中に添加した。プレートを２時間インキュベートし、その後、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０１７６】
データの取り扱い
ブランク値（薬物を含む全ての試薬を含有するが、細胞は含有しない）を吸光度データから差し引いた。結果を、未処置（ビヒクル）の対照と比較した場合の生存可能な細胞の百分率として得た。未処置の対照と処置された細胞との間の統計的差異をｔ−検定（ＳｉｇｍａＰｉｏｔ）を使用して評価した。
【０１７７】
結果
セレギリンおよびパラセタモールのヒトＢＪ線維芽細胞の生存率に対する効果を図１に示す。最も高いセレギリン濃度である５００μｇ／ｍｌは、ＢＪ細胞の生存率を、３時間と２０時間の両方の曝露において約１０％減少させた。最も低いセレギリン濃度では、ＢＪ線維芽細胞の生存率を約１０％増加させた。パラセタモールは、ＢＪ線維芽細胞の生存率を減少させなかったが、最も高いパラセタモール濃度である５００μｇ／ｍｌは、３時間の曝露においてＢＪ細胞の生存率を約９％増加させた。
【０１７８】
結論
ＢＪ線維芽細胞単一培養物をセレギリンおよびパラセタモールに曝露し、これらの薬物自体はＢＪ線維芽細胞に対して毒性がないことが示された。これらの結果は、ＢＪ線維芽細胞の同時培養およびＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって分離された代謝肝実質細胞を使用したセレギリンおよびパラセタモールの代謝依存的毒性を調べることになっていた更なる実験のためのベースを与えた。セレギリンおよびパラセタモールのヒトＢＪ線維芽細胞の生存率に対する効果を図１０に示す。各バーは、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝６〜１２を表す。統計的差異はｔ−検定を使用して調べた（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ）。
【０１７９】
実験２（ＨｅｐａＲＧ細胞を介して曝露した場合のセレギリンのＢＪに対する毒性）
目的
実験２の目的は、提案された試験方法、すなわち、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって分離された２４ウェルプレートのウェル中でのＨｅｐａＲＧ細胞（代謝構成要素）およびＢＪ線維芽細胞（標的の細胞）の同時培養が、薬物の代謝依存的毒性を認識するために使用できるかどうかを調べることであった。肝代謝を介してより毒性を示すようになることが既知であるセレギリンを被験化合物として使用した。それをＨｅｐａＲＧ細胞に投薬し、ＨｅｐａＲＧおよびＢＪ細胞の生存率を３時間後に測定した。
【０１８０】
手順
ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の調製
１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ
２４ウェルプレートのウェルを２つの等しいサイズのコンパートメントに分割するためにＧｒｏｗＤｅｘ障壁を図１１で示すように調製した（灰色のエリアはＧｒｏｗＤｅｘ障壁を表す）。
【０１８１】
２つの異なる方法を使用し、障壁を調製した。
１）ＧｒｏｗＤｅｘ２５０μｌを、（ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して）ウェルにピペットで移し、障壁の第１の層を構築し、障壁を、蓋を閉めて室温で１時間乾燥した。次いでＧｒｏｗＤｅｘの第２の層を、第１の層の上にピペットで移した。８つの障壁を、この方法を使用して調製した。２）ＧｒｏｗＤｅｘ２５０μｌ＋２５０μｌを、層の間を乾燥せずにウェルへ添加した（上部写真を参照のこと）。４つの障壁を、この方法を使用して調製した。
【０１８２】
障壁の構築後、これらを、蓋を外し、室温のラミナーフード中で１時間乾燥した。その後、プレートをパラフィルムで密封し、冷蔵庫（約＋４℃）に移動させ、翌日の実験に使用した。
【０１８３】
２．０％ＧｒｏｗＤｅｘ
透明の２．０％ＧｒｏｗＤｅｘも障壁を構築するために使用した。障壁を、上述の（１）の通りに構築した。しかし２．０％のこのＧｒｏｗＤｅｘはあまりにも剛性であり、「丸石（boulders）および気泡」がない障壁を構築することは不可能であった。この組成物は、培地と細胞の両方を一方の側から他方へ通過させ、その結果、意図する目的を果たさなかった。剛性を低下させるために、２．０％ゲルを、以下の通りに水で徐々に希釈した：
２．０％ＧｒｏｗＤｅｘ  １ｍｌ当たりＨ２Ｏ  ５０μｌを添加した→約１．９％ＧｒｏｗＤｅｘ
Ｈ２Ｏ  １００μｌを追加→約１．７％ＧｒｏｗＤｅｘ
Ｈ２Ｏ  ２００μｌを追加→約１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ
希釈の間、ＧｒｏｗＤｅｘを、ピペットチップを用いて混合した。
【０１８４】
２．０％ＧｒｏｗＤｅｘを希釈すると、より均質な構造を有する障壁を構築するための助けとなった。他方、障壁は、「目が粗く」、培地をウェルへ添加した場合に溶解するように思われた。したがって、これらの障壁は、実験に使用することができず、透明な２．０％ＧｒｏｗＤｅｘを用いた更なるトライアルは行わなかった。図１２は、明るい色のＧｒｏｗＤｅｘを使用して調製した障壁を示す。３つの「ピンク色」の右の列の障壁：２．０％ＧｒｏｗＤｅｘ。２つの「ピンク色」の左の障壁：約１．７〜１．９％ＧｒｏｗＤｅｘ。ピンク色の培地を含まない２つのウェル（左上）：約１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ。
【０１８５】
ＢＪ細胞の播種
翌日、障壁を１時間湿潤させてから、ＢＪ細胞培養培地２００μｌを障壁の両側に添加することによってＢＪ細胞を播種した。
【０１８６】
ＢＪ細胞懸濁液を４００００細胞／ｍｌ  ＢＪ細胞培養培地の密度で調製した。培地を障壁の右側から除去し、ＢＪ懸濁液１５０μｌで置き換え、１ウェル当たり６０００ＢＪ細胞を得た。プレートを優しく回転し、細胞を均一に分布させた。次いでＢＪ細胞培養培地５０μｌを細胞の上に慎重に添加し、障壁を超えた培地の流動がないことを確実にした。
【０１８７】
翌日ＨｅｐａＲＧ細胞を播種する前に、ＢＪ細胞の培地を交換した：
古い培地を慎重にピペットで移すことによって除去し、５％ＦＢＳが添加されたＢＪ細胞培養培地２００μｌで置き換えた。
【０１８８】
ＨｅｐａＲＧ細胞の播種
翌日ＢＪ細胞を播種した後、ウェルを顕微鏡下で観察した。障壁の右側に播種したＢＪが障壁の左側にも認められたために、１２個の障壁のうちの４個は漏出していたことに留意されたい。実験を継続したが、この時点ではいずれのウェルも除外しなかった。
【０１８９】
ＨｅｐａＲＧ懸濁液を、２００万ＨｅｐａＲＧ細胞／ｍｌ  ＨｅｐａＲＧ（登録商標）Ｔｈａｗｉｎｇ／Ｐｌａｔｉｎｇ／Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ６７０の密度で調製した。培地を障壁の左側から除去し、次いでＨｅｐａＲＧ懸濁液２００μｌ、すなわち４０００００細胞を各ウェルへ添加した。
【０１９０】
プレートを前後左右の様式で優しく回転し、細胞分布の均質性を視覚的に確実にした（図１３）。プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、細胞を４時間回復させてから曝露した。
【０１９１】
セレギリン希釈液の調製
セレギリン希釈液を使用日に調製した。最初に、１ｍｇ／ｍｌセレギリン原液をＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地で調製した。次いで２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌセレギリン希釈液を原液およびＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地を使用して調製した。ＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地単独は、ビヒクル対照として機能した。
【０１９２】
曝露
培地をＨｅｐａＲＧ細胞から慎重に除去し（障壁の左側）、１ウェル当たり１００μｌ／ウェルのＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地で置き換えた。これを、１つのウェルで一度に行った。
【０１９３】
培地を全てのウェルに対して交換した後、セレギリン希釈液およびビヒクル対照１００μｌをＨｅｐａＲＧ細胞上に添加した。したがって、最終的なセレギリン濃度は、使用した希釈液の濃度の０．５倍、すなわち１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌであった。細胞を３時間インキュベートしてからＷＳＴ−１アッセイを行った。
【０１９４】
細胞毒性／生存率アッセイ（ＷＳＴ−１）
３時間インキュベートした後、ＷＳＴ−１試薬２０μｌを障壁の両側へ添加した。プレートを１時間インキュベートした。吸光度を、マルチポイント測定プログラムを使用して読み取り、障壁の両側からの３９点の吸光度を測定した。図１４を参照されたい。
【０１９５】
データの取り扱い
平均吸光度を各ウェルおよび障壁の両側に関して個別に算出した。データの許容性に対する決定は、各ウェルに関して個々に行った。障壁が適切に機能した、すなわち４５０ｎｍにおけるＨｅｐａＲＧおよびＢＪの吸光度の比率が２．０を超えたという条件で、ウェルのデータは許容された。
【０１９６】
上記に基づいて、１２個のウェルのうち６個のウェルが許容され、これらの６個のウェルの吸光度データを結果の算出において使用した。図１５は、その構築直後の障壁を示す。表２は、細胞を播種し、セレギリンに曝露した後の２４ウェルプレートの立体配置を示す。算出から除外されたウェルは網掛け部分である。
【０１９７】
【表２】
2020198876.tif 000004
【０１９８】
結果
表３は、ＨｅｐａＲＧ細胞を介してＢＪ細胞に３時間曝露した場合のセレギリンのＨｅｐａＲＧおよびＢＪ細胞生存率に対する効果を要約する。セレギリンの最も低い濃度、すなわち１および５μｇ／ｍｌは、ＨｅｐａＲＧとＢＪの両方の生存率を増加させるように思われた。最も高い濃度の１０μｇ／ｍｌは、ＨｅｐａＲＧおよびＢＪの生存率をそれぞれ約５％および約２５％減少させた。
【０１９９】
表３。３時間曝露した後のセレギリンのＢＪおよびＨｅｐａＲＧの細胞生存率に対する効果。データは、４５０ｎｍにおける吸光度を表す。ＨｅｐａＲＧおよびＢＪ細胞をＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって分離した。セレギリンの添加は毎回ＨｅｐａＲＧ細胞を介して行った。結果は、１回の処置当たり１〜３ウェルからのものである。吸光度の読み取りを、マルチポイント測定を使用して行い、３９点を障壁の両側から測定した。
【０２００】
【表３】
2020198876.tif 000005
【０２０１】
結論
ＷＳＴ−１は細胞生存率の指標としてミトコンドリア活性を測定するため、最も低いセレギリン濃度がホルメシス、すなわち、ＨｅｐａＲＧとＢＪ細胞の両方の代謝活性化をもたらすように思われる（同様のことが実験１においてＢＪ細胞で認められた）。しかし、最も高い濃度である１０μｇ／ｍｌは、ＢＪ生存率を２５％減少させた。これはＨｅｐａＲＧ細胞によってセレギリンから産生された毒性代謝産物におそらく起因していた。これは、ＨｅｐａＲＧ処置を伴わないセレギリンは、ＢＪ細胞生存率を減少させなかったために、実験１からの支持を得る。
【０２０２】
実験３（ＨｅｐａＲＧ細胞を介して曝露した場合のパラセタモールのＢＪ細胞に対する毒性）
目的
実験３の目的は、主に実験２と同様であり、すなわち、提案された試験モデル、すなわちＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって分離された２４ウェルプレートのウェル中の同時培養ＨｅｐａＲＧ細胞（代謝構成要素）およびＢＪ線維芽細胞（標的の細胞）が、標的の細胞に対する代謝依存的毒性を認識するために使用することができるかどうか調べることである。実験２との違いは以下の点である
・パラセタモールを被験化合物として使用した
・最も低いＧｒｏｗＤｅｘ障壁を構築し、その安定性を改善し、障壁の各側の容積を２００μｌから１５０μｌに減少させた
・ウェル中のＢＪ細胞の量は実験２におけるものよりも多かった
・曝露時間は４および２０時間であった
手順
ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の調製
２４ウェルプレートのウェルを２つの「等しいサイズの」コンパートメントに分割するためにＧｒｏｗＤｅｘ障壁を以下の通りに調製した。ＧｒｏｗＤｅｘ２５０μｌを（ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して）ウェルにピペットで移し、障壁の第１の層を構築した。障壁をラミナーフード中で１時間、蓋を開けた状態で乾燥した。次いで、第２の層を第１の層の上にピペットで移した。ＧｒｏｗＤｅｘ（ロット１１９９２）の組成物は目が粗くなってきており、それをペトリ皿上で気泡の形成を避け、慎重に数回混合した。
【０２０３】
全部で２０個の障壁を調製した。障壁の構築後、それらを室温で蓋を閉めて一晩乾燥した（これは、プレートを冷蔵庫で一晩保存した点が実験２と異なっていた）。
【０２０４】
ＢＪ細胞の播種
翌日２０個の障壁のうちの６個を崩壊し、除外した。１４個の使用可能な障壁を、ＢＪ細胞培養２００μｌを障壁の両側に添加することによって湿潤させた。プレートを、細胞培養インキュベーター中で１時間インキュベートした。
【０２０５】
ＢＪ細胞懸濁液を７００００細胞／ｍｌ  ＢＪ細胞培養培地の密度で調製し、この懸濁液１５０μｌを障壁の右側にピペットで移し、１ウェル当たり１０５００細胞を得た。
【０２０６】
翌日ＨｅｐａＲＧ細胞を播種する前に、ＢＪ細胞の培地を、古い培地を慎重に除去し、それを、５％ＦＢＳが添加されたＢＪ細胞培養培地１５０μｌで置き換えることによって交換した。
【０２０７】
ＨｅｐａＲＧ細胞の播種
ＨｅｐａＲＧ懸濁液を２百万ＨｅｐａＲＧ細胞／ｍｌ  ＨｅｐａＲＧ（登録商標）Ｔｈａｗｉｎｇ／Ｐｌａｔｉｎｇ／Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ６７０の密度で調製した。培地を障壁の左側から除去した。ＨｅｐａＲＧ懸濁液１５０μｌ、すなわち３０００００個の細胞を各ウェルへ添加した。プレートを、前後左右の様式で徐々に撹拌し、細胞分布の均質性を視覚的に確実にした。プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、細胞を４時間回復させてから曝露した。
【０２０８】
パラセタモール希釈液の調製
パラセタモール希釈液を、使用日に調製した。最初に、１ｍｇ／ｍｌのパラセタモール原液をＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地で調製した。次いで５００μｇ／ｍｌ希釈液を原液およびＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地を使用して調製した。ＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地単独はビヒクル対照として機能した。
【０２０９】
曝露
培地をＨｅｐａＲＧ細胞（障壁の左側）から慎重に除去し、１ウェル当たり７５μｌ／ウェルのＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地で置き換えた。これを、１つのウェルで一度に行った。培地を全てのウェルに対して交換した後、パラセタモール希釈液およびビヒクル対照７５μｌをＨｅｐａＲＧ細胞の上に添加した。したがって最終的なパラセタモール濃度は、使用した希釈濃度の０．５倍、すなわち５００μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌであった。細胞を４時間および２０時間インキュベートしてから、ＷＳＴ−１アッセイを行った。
【０２１０】
細胞毒性／生存率アッセイ（ＷＳＴ−１）
インキュベート後、ＷＳＴ−１試薬１５μｌを障壁の両側へ添加した。プレートを、４時間の曝露で１時間、２０時間の曝露で２時間インキュベートした。吸光度を、マルチポイント測定を使用して読み取った。
【０２１１】
データの取り扱い
結果は、実験２で記載するように算出した。６個のウェル（障壁）のうち４個が、４時間の曝露で合否基準に合格し（図１６）、８個のウェル（障壁）のうちの４個が、２０時間の曝露で合否基準に合格した（図１７）。
【０２１２】
表４は、細胞を播種し、パラセタモールに４時間曝露した後の図１６による２４ウェルプレートの立体配置を示す。計算から除外されたウェルは網掛け部分である。
【０２１３】
【表４】
2020198876.tif 000006
【０２１４】
表５は、細胞を播種し、パラセタモールに２０時間曝露した後の、図１７による２４ウェルプレートの立体配置を示す。計算から除外されたウェルは網掛け部分である。
【０２１５】
【表５】
2020198876.tif 000007
【０２１６】
結果
表６および７は、ＨｅｐａＲＧ細胞を介してＢＪ細胞に４時間（表６）、および２０時間（表７）曝露した場合の、パラセタモールのＨｅｐａＲＧおよびＢＪの細胞生存率に対する効果を要約する。５００μｇ／ｍｌでの短時間の曝露は細胞生存率に影響を与えなかったが、２５０μｇ／ｍｌのパラセタモールはＨｅｐａＲＧの生存率を約１５％減少させ、ＢＪ細胞生存率を約４０％増加させるように思われた。長時間の曝露では、パラセタモールは、２５０μｇ／ｍｌでＢＪ生存率を約３０％増加させ、最も高い濃度でＨｅｐａＲＧを約１０％減少させた。
【０２１７】
表６〜７。４時間の曝露（表６）、および２０時間の曝露（表ＩＶ）後の、パラセタモールのＢＪおよびＨｅｐａＲＧの細胞生存率に対する効果。データは４５０ｎｍにおける吸光度を表す。ＨｅｐａＲＧおよびＢＪ細胞はＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって分離された。パラセタモールの投薬は毎回ＨｅｐａＲＧ細胞を介して行った。結果は、１回の処置当たり１〜２ウェルからのものである。吸光度の読み取りは、３９点を障壁の両側から測定したマルチポイント測定を使用して行った。
【０２１８】
【表６】
2020198876.tif 000008
【０２１９】
【表７】
2020198876.tif 000009
【０２２０】
実験４（ＨｅｐａＲＧ細胞の代謝活性）
目的
例えＨｅｐａＲＧ細胞が、ＣＹＰ誘導および薬物代謝（ＥＵＲＬＥＣＶＡＭ２０１２）を研究するための良好なモデルと考えられるとしても、実験３の後では、予想されるパラセタモールの代謝依存的毒性が実証できなかったために、ＨｅｐａＲＧ細胞の代謝活性は疑わしいものであった。その結果、実験は、代謝依存的毒性を調べるために以前に開発された方法を使用して行い、肝実質細胞順化曝露培地と非順化培地の両方を使用し、ＢＪ細胞を処置した。
【０２２１】
手順
ＢＪ線維芽細胞の播種
ＢＪ細胞懸濁液をＢＪ細胞培養培地中４００００細胞／ｍｌの密度で調製した。この懸濁液１００μｌを９６ウェルプレートにピペットで移し、１ウェル当たり４０００個細胞を得た。
【０２２２】
ＨｅｐａＲＧ細胞の播種
実験３からのＨｅｐａＲＧ細胞を２５ｃｍ２の細胞培養フラスコに播種し、１週間培養した。培地（ＨｅｐａＲＧ誘導培地）を週に２回交換した。
【０２２３】
パラセタモールのＨｅｐａＲＧ細胞を用いた順化
培地を（２５ｃｍ２フラスコ中で増殖した）ＨｅｐａＲＧ細胞から除去し、ＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地２．５ｍｌで置き換えた。次いでＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地で調製した１ｍｇ／ｍｌのパラセタモール２．５ｍｌをフラスコへ添加した（最終的なパラセタモール濃度５００μｇ／ｍｌ）。ＨｅｐａＲＧ細胞をパラセタモールと２０時間インキュベートした。
【０２２４】
ＢＪ細胞をパラセタモール自体、およびＨｅｐａＲＧ処置パラセタモールに曝露する。
培地をＢＪ細胞から除去し、ＢＪ化学物質希釈培地中の５００μｇ／ｍｌパラセタモールでまたはＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ−培地中の５００μｇ／ｍｌ  ＨｅｐａＲＧ順化パラセタモールで置き換えた。ＢＪ化学物質希釈培地およびＨｅｐａＲＧ  ＴＯＸ培地はビヒクル対照として機能する。全ての処置は、１６平行ウェルで試験を行った。曝露時間は２４時間であった。
【０２２５】
細胞毒性／生存率アッセイ
曝露後、ＷＳＴ−１試薬１０μｌをウェルへ添加した。プレートを２時間インキュベートし、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０２２６】
データの取り扱い
ブランク値（薬物を含む全ての試薬を含むが、細胞は含まない）を吸光度データから差し引いた。結果を、未処置（ビヒクル）の対照と比較した場合の、生存可能な細胞の百分率として得た。未処置の対照と処置された細胞との間の統計的差異を、ｔ−検定（ＳｉｇｍａＰｉｏｔ）を使用して評価した。
【０２２７】
結果
ＨｅｐａＲＧ処置は、ＢＪ線維芽細胞生存率に対する影響が小さい。図１８は、ヒトＢＪ線維芽細胞の生存率に対する、直接的なパラセタモールまたはＨｅｐａＲＧ順化パラセタモール曝露の影響を示す。
【０２２８】
結論
ＨｅｐａＲＧ細胞は、パラセタモールを、ＢＪ細胞に対して毒性だったことになる代謝産物に変換しなかった。したがって、パラセタモールはＨｅｐａＲＧ細胞によって代謝されなかったことが結論付けられる。
【０２２９】
考察
障壁構築物
ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を構築するためのいくつかの試みが存在する。全ての成功した取り組みおよびさほど成功していない取り組みに基づいて、以下の点が結論付けられた。
【０２３０】
耐久性のある障壁を構築する助けとなる場合がある以下の観察を行った：
・１．５％ＧｒｏｗＤｅｘを使用する。明るい色のＧｒｏｗＤｅｘは使用してはいけない。
・ＧｒｏｗＤｅｘを管またはシリンジから直接ピペットで移してはいけない。代わりに、ゲルをペトリ皿に取り、慎重に混合し、気泡の形成を避ける。障壁をピペットで移した場合に組成物が極めて均質であることが非常に重要である。
・２つの層（２４ウェルプレートでは２×２５０μｌ）から障壁を調製し、第１の層を０．５〜１．０時間、蓋を開けた状態でラミナーフード（ＲＴ）中で乾燥してから、第２の層を添加する（障壁全体を一度に構築した場合、その後２４時間以内に崩壊する）。
・第２の層を０．５〜１．０時間、蓋を開けた状態でラミナーフード（ＲＴ）中で乾燥する。
・低く幅が広い障壁は、高く幅が狭いものよりも耐久性がある。両方とも調製することが可能であるが、幅が狭い障壁は、その後２４時間以内に崩壊する傾向がある。
・障壁を機械的に、例えばスパーテルを使用して固定しようとしないようにする。それは魅力的であるが、障壁のウェルへの接着力を低下させ、細胞漏出のリスクを増加させる。
・障壁は室温で一晩、蓋を閉めて保存する。
・細胞の播種において使用することになる同じ培地を用いて１時間湿潤させてから使用する。
【０２３１】
障壁の約５０％が漏出した場合（ＨｅｐａＲＧ：ＢＪ吸光度比率に関する基準に基づく）、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁をウェルの表面に接着するための最良の方法が存在するはずである。コラーゲン−コーティングはまだ試しておらず、ウェルの他の表面処置もまだ試していなかった。
【０２３２】
ＨｅｐａＲＧ細胞の代謝活性
製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によれば、凍結保存されたＨｅｐａＲＧ（商標）細胞は、解凍および平板培養の後の最初の２４時間の間、ＣＹＰ活性を高レベルで保持し、次いでこれらの活性は減少し、同時に細胞は単層を再構築し、次いで活性は、培養の４日目に戻り、７〜１０日目にピークに達する。したがって、実験を最初の２４時間で行ったために、ＨｅｐａＲＧ細胞の適切な代謝活性が期待された。例えＨｅｐａＲＧ処置後にＢＪ細胞に対するセレギリン毒性が増加したとしても、パラセタモールは更なる毒性化合物に代謝されなかった。これらは、凍結保存されたＨｅｐａＲＧ細胞の代謝活性は、培養１０日後に実際にピークに達するが、最初の２４時間以内では、ＣＹＰ３Ａ４を除く大部分のＣＹＰ酵素の活性は低いことを示した。パラセタモール代謝においてＣＹＰ３Ａ４の役割は論議の余地があり、パラセタモール代謝においてＣＹＰ３Ａ４は顕著に寄与しないことから主な役割を担うことまでの範囲の研究結果を伴う。代わりにセレギリン代謝においてＣＹＰ２Ｂ６は主要な役割を果たし、同時にＣＹＰ３Ａ４は重要ではない。
【０２３３】
障壁の裏側で１０日間ＨｅｐａＲＧ培養を維持することは課題であろう。その結果、現在はこのモデルにおいて使用する最良の選択は、ヒト凍結保存肝実質細胞または初代肝実質細胞であることになり、直ちに使用することができ、使用するべきである。個別に同意される場合、ＦＩＣＡＭが協力的にこれらの試験を行う。
【０２３４】
曝露時間
３〜４時間の曝露時間をセレギリンおよびパラセタモールに対して使用し、また２０時間の曝露をパラセタモールに対して使用した。薬物代謝は数時間のうちに生じ、３時間がセレギリンを毒性代謝産物に変換するのに実際に十分な長さであった。長いインキュベート時間は必要ではなく、標的の細胞に対する代謝依存的毒性を測定するために使用するべきではない。
【０２３５】
結論
・予備試験法のプロトコール、すなわちＧｒｏｗＤｅｘ障壁によって分離された２４ウェルプレートのウェル中でＨｅｐａＲＧ細胞（代謝構成要素）およびＢＪ線維芽細胞（標的の細胞）を同時培養し、ＨｅｐａＲＧを介して被験化合物を添加するプロトコールを開発した。
【０２３６】
試験法を使用すると、セレギリンの代謝依存的毒性を実証することが可能であった。しかし、パラセタモールの代謝依存的毒性を実証することは不可能であった。
・その酵素活性が、解凍直後に十分高くならないように思われるため、ＨｅｐａＲＧは、この試験モデルにおいて使用するべき最良の代謝構成要素ではない。他方、１ロットのみが本研究において使用され、ロット間に変動がある場合がある。
・障壁の成功率は約５０％であった。
【０２３７】
実施例３：３Ｄプリンターを用いたナノフィブリルセルロース障壁の構築
本研究の目的は、３Ｄプリンターを使用し、ナノフィブリルセルロース障壁を構築することができるかどうかを調べることであった。第２の目標は、障壁の特性：障壁は異なるコンパートメント中に分離された細胞を維持するが、栄養素および化学物質を一方の細胞コンパートメントから他方へ通過させるかを調べることであった。ＧｒｏｗＤｅｘ（商標）をナノフィブリルセルロースとして使用した。
【０２３８】
以前の実験では、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘは、障壁を手動で構築するために使用することができる点が示された。しかし、これらの障壁の成功率（障壁の漏出／密閉に関する）は約５０％であった。３Ｄプリンターを利用すると、自動化の利点およびより均一な障壁の製造が手動での適用と比較して得られるであろう。
【０２３９】
材料
試験系
ＡＴＣＣ（ＦＩＣＡＭのロット１−ＢＪ／１３）から購入したヒト線維芽細胞ＢＪ（カタログ番号ＨＢ−８０６５）を本研究において使用した。
【０２４０】
細胞培養用ＧｒｏｗＤｅｘヒドロゲル
・ＧｒｏｗＤｅｘＴ、１．０％（アニオン性）
・ＧｒｏｗＤｅｘ、１．５％（化学的に未修飾）
・ＧｒｏｗＤｅｘＴ、２．０％（アニオン性）
ＧｒｏｗＤｅｘは、シリンジ中に包装されたＵＰＭから得た。詳細には、ロットなどは付属書類１を参照されたい。
【０２４１】
試薬、溶液および材料
・ゼラチン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ１８９０、ロットＳＬＢＸ２９７３）、ＦＩＣＡＭのロット２％ゼラチン／ＭＰＥ／１／１１０３１９
・０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ６４０７、ロット０９０Ｍ８７０７Ｖ）
・フィブロネクチン（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、＃Ｃ−４３０５０、ロット４３９Ｐ１２１）
・ｄＨ２Ｏ（Ｇｉｂｃｏ＃１５２３０、ロット１６４１９２９、１８１４１３３、１８９５７９１）
・ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ＃１７−５１６Ｆ、ロット７０８８３３）
・塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、＃７９３６３９、ロットＭＫＣＧ４７１１）
・ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃２１０９０、ロット１９４４３４４）
・ＢＪ細胞培養培地、ＦＩＣＡＭのロットＢＪ／ＣＴ００９７／ＭＰＥ／１／２０１１１８、ＢＪ／ＣＴ００９７／ＭＰＥ／２／３０１１１８、ＢＪ／ＣＴ００９７／ＭＰＥ／３／０４０１１９、ＢＪ／ＣＴ００９７／ＭＰＥ／４／１３０１１９、ＢＪ／ＣＴ００９７／３／ＭＰＥ／１／１３０３１９
・０．２％トリパンブルー、ＦＩＣＡＭのロット０．２％ＴＢ／ＨＭ／２０／１００４１９
・アミトリプチリン塩酸塩（ＣＡＳ１５１−２１−３）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ８４０４、ロットＢＣＢＮ３１５８Ｖ）
・ＳＤＳ（ＣＡＳ５４９−１８−８）（Ｓｉｇｍａ＃Ｌ６０２６、ロットＳＬＢＶ９８８０）
・ＷＳＴ−１（Ｔａｋａｒａ＃ＭＫ４００、ロットＡＨＸＰ００１）
・２４ウェルプレート
・１２ウェルプレート
・１６Ｇ金属針、ＢＤ  ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＧｌｉｄｅ、ＲＥＦ３０１６９２
・プラスチックルアーチップ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  Ｌｔｄ：２５Ｇ＃ＡＤ２５ＴＴロット４５０２０６３−３０；２２Ｇ＃ＡＤ２２ＴＴロット４５０２００４−４６；１８Ｇ＃ＡＤ１８ＴＴロット４５０２３３５−９）
装置
・Ｆａｂ＠ｈｏｍｅ  ｖ１  ３Ｄプリンター
・倒立光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ｐｒｉｍｏｖｅｒｔ＋Ａｘｉｏｃａｍ  ＥＲｃ  ５ｓ）＋デジタルカメラ
・プレートリーダー
実験手順
本研究を２つの部分に分割した
１）第１の部分では、プロトコールを作成し、ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の３Ｄ印刷用に最適化した。障壁の下のコーティングの効果、および障壁の安定性を試験した。
２）第２の部分では、障壁の特性の予備調査を、ＢＪ細胞およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および参照化学物質としてアミトリプチリン塩酸塩を使用して行い、障壁が異なるコンパートメント中に分離された細胞を維持するが、栄養素および化学物質を一方のコンパートメントから他方へ通過させるかどうかを見出した。アミトリプチリンは三環式化合物、具体的にはジベンゾシクロヘプタジエン３−（１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ、ｄ］シクロヘプテン−５−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミンであり、その化学構造に結合している側鎖とともに融合した３つの環を有する。
【０２４２】
３Ｄプリンターを使用した円状障壁の１２および２４ウェルプレートへの構築
３Ｄ印刷に関するプロトコールの作成
目的
本研究の第１の部分の目的は、マルチウェルプレートのウェル上へのＧｒｏｗＤｅｘの印刷用に３Ｄプリンターを最適化することであった。以下の問題が考えられた
１．ＧｒｏｗＤｅｘシリンジの３Ｄプリンターへの適用
２．ＧｒｏｗＤｅｘ濃度ごとの最適なプリンターパラメーターの発見
３．最適なＧｒｏｗＤｅｘ濃度
４．１２および２４ウェルフォーマットへの適用可能性
ＧｒｏｗＤｅｘシリンジの３Ｄプリンターへの適用
５〜１０ｍｌのＧｒｏｗＤｅｘシリンジの３Ｄ印刷への直接的な実行可能性を調べた。ＧｒｏｗＤｅｘを供給するシリンジであるＢｒａｕｎ  Ｏｍｎｉｆｉｘは、３Ｄプリンターのホルダーに取り付けられるように改良する必要がある。そうするために、その伸ばした位置にあるプランジャーを数ミリメートル引き上げ、次いで、シリンジの最上部を揃えてナイフを用いて切断した。次いでプランジャーを、ゲルがチップを通って流動し始めるまで押し下げた。この後、プリンターをセットし、その独自のメカニズムを用いてプランジャーを押した。
【０２４３】
次に、異なるシリンジチップおよび針を試験した。１つの本質的な問題である強力な固定メカニズムがなければシリンジヘッドとチップとの間に重大な漏出があったことが明白になってきた。解決策は、ルアー固定メカニズムを有するチップを得ることであった。異なる針ゲージサイズ（金属１６Ｇ、プラスチック２５、２２、１８Ｇ）も試験した。金属１６Ｇが、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘと２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴの両方に適用するために最良の選択のように思われた。ゲルはチップから不均等に出てくるために、プラスチックゲージならびに金属ゲージは機能しなかった。
【０２４４】
目詰まりおよびヒドロゲル中の気泡またはシリンジプランジャーの硬さによって、不均等な印刷および低品質の障壁が生じる（図１９）。これらの問題を克服するために、シリンジがすでに先に開封されていた場合はヒドロゲルを新しいシリンジに移した。これは助けとなったが、その後未開封のシリンジのプランジャーでさえときとして硬く思われた。したがって、シリンジがすでに開封されていたかどうかにかかわらず、ヒドロゲルを新しいシリンジに移すべきである。図１９Ａ〜Ｃは、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（Ａ、Ｂ）および２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（Ｃ）を使用して印刷した不均等な障壁構築物を示す。
【０２４５】
濃度ごとの最適なプリンターパラメーターの発見
印刷プロトコールを最適化してから、マルチウェルプレート上への印刷を開始した（図２０）。異なるウェルプレートおよびヒドロゲル濃度、最適パラメーターはわずかに異なっており、表８を参照されたい。
【０２４６】
【表８】
2020198876.tif 000010
【０２４７】
障壁の印刷に関しては、ウェルの光造形法（ｓｔｌ）画像を、ＣＡＤプログラムを使用して調製した。１２ウェルプレートに関しては、１１ｍｍの横断面、１．５ｍｍの壁の厚さおよび５ｍｍの高さの円状障壁を描き、２４ウェルプレートに関しては、９ｍｍの横断面、０．５ｍｍの壁の厚さおよび５ｍｍの高さをそれぞれ描いた。１回の印刷ごとに、２個のヒドロゲル環を（その間を乾燥せずに）並べて印刷した。次の回では、２個の環を最初の２個の環などの上に印刷した。全部で４回、８個の環を印刷し、１個の障壁環を構築した。プレート全体に第１の層を最初に印刷し、次いで印刷を第１のウェルから再び開始し、第２の層などを添加した。印刷中の層の増分を、チップが前の層に触れることができるように設定した。それによって障壁は更に均一になり（それによって壁に起こり得る欠陥、例えば隙間が平滑になり）、また障壁の壁が多少広く／厚くなった。壁の厚さは、壁を安定化する方法に影響を与えており、非常に薄い壁はより簡単に崩壊する傾向がある。
【０２４８】
また、前述のように他の安定化測定を行い、ならびに障壁が下層から外れるのを阻止するためにコーティングを行った。図２０は、最初の３Ｄ印刷をフィルム上に行ってから（上図）マルチウェルプレートに移動した（下図）ことを示す。
【０２４９】
最適なヒドロゲル濃度
円状障壁を、１．５％と２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴの両方を使用して印刷した。１．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴを印刷する試みを行ったが、それは成功しなかった。１．０％ＧｒｏｗＤｅｘは印刷するにはあまりにも目が粗く、得られた障壁はよい形状ではなかった。最初の失敗に終わったトライアル（５回目、２０１８年１２月）後、１．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴを３Ｄ印刷においてもはや使用することはなかった。結論として、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘと２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴの両方を使用し、３Ｄプリンターを用いて障壁を構築することができる。
【０２５０】
１２および２４ウェルフォーマットへの適用可能性
１２ウェルプレートと２４ウェルプレートの両方の上に印刷することは可能であり、両方の種類のウェルプレートを細胞用途において使用することができる（障壁の内側および外側に細胞のための解放された空間が存在する）。技術的な詳細は表９に要約する。３Ｄ印刷に関して最適化されたプロトコールを付属書類２として添付する。
【０２５１】
【表９】
2020198876.tif 000011
【０２５２】
研究のこの部分の目的は、安定化させるには、すなわち、障壁の形状を維持するには何が最良の方法かを調べることであった。
【０２５３】
手順
１２ウェルプレートに印刷される１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を安定化させるための異なるビヒクル（保存流体）を試験した（写真３）：
・１％塩化カルシウム中１時間、２ｍｌ／ウェル、次いで一晩乾燥。
・１％塩化カルシウム中一晩、２ｍｌ／ウェル
・ＭＥＭ中一晩、２ｍｌ／ウェル
・一晩乾燥、次いで２％塩化カルシウム中、２ｍｌ／ウェル
４℃で一晩インキュベートを行った。表１０は１２ウェルプレート割付け：異なるビヒクルにおける１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁の安定化を表す。
【０２５４】
【表１０】
2020198876.tif 000012
【０２５５】
結果および結論
障壁構造は、全ての被検ビヒクル、すなわち１％塩化カルシウムおよびＭＥＭにおいて完全なままであったが、障壁は移動し、すなわちそれらはウェルの底部に付着していなかった。
【０２５６】
図２１は、異なるビヒクル；（左から右へ）：１％塩化カルシウム１時間、１％塩化カルシウム一晩、ＭＥＭ一晩、および乾燥処置一晩、次いで２％塩化カルシウムの添加における障壁構築物の安定化を示す。
【０２５７】
コーティング
研究のこの部分の目的は、障壁（１．５％および２．０％）がウェルの底部に付着したままとなるであろう条件を見出すことであった。
【０２５８】
手順および結果
障壁をウェルの底部に付着させるために、ウェルをコーティングしてから３Ｄ印刷を行った。以下の通り、ポリ−Ｄ−リシン、ゼラチンおよびフィブロネクチンをコーティング材料として使用した。
【０２５９】
ポリ−Ｄ−リシン
１ウェル（１２ウェルプレート）当たり０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リシン（ＰＢＳ中）３００μｌをピペットで移した。プレートを室温で５分間インキュベートした。残ったポリ−Ｄ−リシン溶液をウェルから除去し、ウェルを蒸留水ですすぎ、２時間乾燥した。
【０２６０】
ゼラチン
１ウェル（１２ウェルプレート）当たり０．２％ゼラチン（蒸留水で調製した）３００μｌをピペットで移した。ウェルを室温で２時間乾燥した。残ったゼラチン溶液を除去した。
【０２６１】
フィブロネクチン：
１ウェル（１２ウェルプレート）当たり１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン１ｍｌをピペットで移し、２時間乾燥した。残ったフィブロネクチン溶液を除去した。
【０２６２】
１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ
１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を、異なるコーティング（ポリ−Ｄ−リシン、ゼラチンまたはフィブロネクチン、およびコーティングなし）を有する１２ウェルプレートの底部に印刷した。印刷が終了してから１時間後、１ウェル当たり１％ＣａＣｌ２またはＭＥＭ  ２ｍｌをウェルへ添加した。最下列を乾燥した。
【０２６３】
翌日全ての障壁がそれらの形状を維持していたが、ポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチンコーティング上の障壁のみが底部に付着していた。図２２は、異なるコーティングを有する（およびコーティングなしの）ウェル上の、異なるビヒクル中で維持された１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す（Ａ、Ｂ）。フィブロネクチンコーティングおよび非コーティングウェル上に構築された障壁は、プレートを４５度に傾けた場合、滑り落ちた。ポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチン上の障壁はその場所に付着したままである（Ｃ）。
【０２６４】
２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ
０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチンが、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘに対して最も機能したコーティングであったために（以前の章を参照のこと）、これらのコーティング（およびフィブロネクチンなし）を２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴに使用した。
【０２６５】
翌日、全ての障壁がそれらの形状を維持し、ポリ−Ｄ−リシンおよびゼラチンコーティングウェルの底部に付着した。図２３は、異なるコーティング上に構築され、異なるビヒクル中で維持された２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ障壁を示す。
【０２６６】
結論
ポリ−Ｄ−リシンは、障壁をウェルの底部に付着させるために最高のコーティング材料として機能した。したがって、それを今後の実験用に選択した。ゼラチンコーティングも、障壁を底部に付着させたが、本発明者らの以前の実験によれば（本明細書において報告していない）、細胞はゼラチンコーティングに沿って移動する場合があり、その後（それを通過して細胞が移動するのを阻止するための）障壁の意図を低減させることになる。
【０２６７】
障壁の特性：ＢＪ細胞および異なる参照化学物質を使用した漏出試験
試験１
３Ｄ印刷されたＧｒｏｗＤｅｘ障壁が、その使用目的、すなわち障壁を通過して細胞が移動するのを阻止するが、化学物質は通過させるのに好適かどうかを調べた。これを試験するために、ＢＪ細胞を障壁の外側に播種し、ＢＪ細胞に対して毒性であることが既知の化学物質（ＳＤＳおよび塩酸アミトリプチリン）を障壁の内側に適用した。２４時間インキュベートした後、細胞が障壁の外側に残ったままであったかどうか、障壁の中央に添加された化学物質が、障壁の外側の細胞を殺傷したかどうかを顕微鏡的に評価した。細胞生存率の定量化に関しては、ＷＳＴ−１アッセイを使用した。以前に手動で構築した障壁を用いて順調に使用したために、ＷＳＴ−１アッセイを選択した。
【０２６８】
手順
コーティング
２個の１２ウェルプレートおよび２個の２４ウェルプレートを、０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リシンで、１ウェル当たり０．３ｍｌを１２ウェルプレートに、１ウェル当たり０．１５ｍｌを２４ウェルプレートにコーティングした。プレートを室温で５分間インキュベートした。次いで、ポリ−Ｄ−リシン溶液を除去し、プレートを無菌蒸留水ですすぎ、室温で２時間乾燥した。
【０２６９】
障壁の構築
２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（ロット１２０６６４６１８ｔ）を有する１２ウェルプレートを２０１９年２月１日に、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（ロット１２００７４４１８ｇ）を有する１２ウェルプレートを２０１９年２月５日に調製した。
【０２７０】
１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（ロット１２００６１５１８９）、および２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（ロット１２０６６４６１８Ｔ）障壁を有する２４ウェルプレートを２０１９年２月５日に調製した。各障壁は印刷された４個のＧｒｏｗＤｅｘ層からなる。３Ｄ印刷に関する更なる詳細に関しては、付属書類１を参照されたい。
【０２７１】
１２ウェルプレートの印刷は、視覚的に判断した場合は成功であった。図２４は、１２ウェルプレート上に構築された２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（上部画像）および１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（下部画像）からの障壁を示す。印刷プロトコールおよび印刷自体は成功した。
【０２７２】
２４ウェルプレートに印刷する場合、ヒドロゲルシリンジ（１．５％と２．０％の両方）のシリンジプランジャーは硬くなり（例えシリンジがすでに開封されていたとしても）、印刷中にヒドロゲルを新しいシリンジに移した。これによって２４ウェルプレート上の障壁の品質が損なわれた。障壁のうちの多くが崩壊し、漏出し、試験において使用されなかった（図２５）。この発見に基づいて、シリンジがすでに開封されていたかどうかにかかわらず、ＧｒｏｗＤｅｘを新規の十分機能するシリンジに毎回移すことが必要とされる点が結論付けられた。
【０２７３】
図２５は、２４ウェルプレート上に構築された２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ（上部画像）および１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ（下部画像）からの障壁を示す。３Ｄ印刷中は、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘと２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴの両方のシリンジプランジャーが硬くなり、印刷中に、ヒドロゲルを新しいシリンジに移動させなければならなかった。結果的に、障壁のうちの多くが崩壊しおよび／または漏出した。
【０２７４】
構築後、障壁を１時間室温で乾燥し、その後それらをＭＥＭで覆った。プレートを、パラフィルムを用いて密封し、使用するまで４℃で保存した。
【０２７５】
細胞の播種（２０１９年２月１３日）
１２ウェルプレート：ＢＪ懸濁液（１０００００細胞／ｍｌ）４００μｌを障壁の外側に播種し（全部で４００００ＢＪ細胞）、ＢＪ細胞培養培地１００μｌをピペットで障壁の内側に移した。
【０２７６】
２４ウェルプレート：ＢＪ懸濁液（１０００００細胞／ｍｌ）２００μｌを障壁の外側に播種し（全部で２００００ＢＪ細胞）、ＢＪ細胞培養培地５０μｌをピペットで障壁の内側に移した。
【０２７７】
ＢＪ細胞密度を、ＦＩＣＡＭの所定の細胞毒性試験において使用されるＢＪ細胞密度と一致するように選択した（障壁を除く）。
【０２７８】
曝露
化学物質希釈液の調製
ＳＤＳ：０．８ｍｇ／ｍｌ  ＳＤＳ原液を、５％ＦＢＳを含むＢＪ細胞培養培地で調製した。原液を１：１０に希釈し、８０μｇ／ｍｌ  ＳＤＳ希釈液を生成した。８０μｇ／ｍｌ  ＳＤＳ希釈液を１：２に更に希釈し、４０μｇ／ｍｌ希釈液を生成した。これらのＳＤＳ希釈液、すなわち８０μｇ／ｍｌ（Ｃ１）および４０μｇ／ｍｌ（Ｃ２）を曝露において使用した。
【０２７９】
アミトリプチリン：２ｍｇ／ｍｌ原液を、５％ＦＢＳを含むＢＪ細胞培養培地で調製した。原液を１：１００に希釈し、２０μｇ／ｍｌ希釈液を生成した。２０μｇ／ｍｌ希釈液を１：２に更に希釈し、１０μｇ／ｍｌ希釈液を生成した。これらのアミトリプチリン希釈液、すなわち２０μｇ／ｍｌ（Ｃ１）および１０μｇ／ｍｌ（Ｃ２）を曝露において使用した。
【０２８０】
化学物質の濃度を、（障壁なしで得られた）以前の細胞毒性データに基づいて選択し、アミトリプチリン塩酸塩に関するＩＣ５０は１２μｇ／ｍｌであり、ＳＤＳに関しては４７μｇ／ｍｌであった。目的は、細胞の約半分を殺傷することが予想される濃度、およびそれよりも２倍高い濃度を使用することによって用量依存的効果を検出することであった。
【０２８１】
添加
１２ウェルプレート：培地を障壁の内側と外側の両方から慎重に除去した。５％ＦＢＳを含むＢＪ細胞培養培地４００μｌをピペットで、（細胞を前日に播種していた）障壁の外側に移した。化学物質希釈液（ＳＤＳまたはアミトリプチリン）１００μｌをピペットで障壁の内側に移した。
【０２８２】
２４ウェルプレート：培地を障壁の内側と外側の両方から慎重に除去した。５％ＦＢＳを含むＢＪ細胞培養培地２００μｌをピペットで、（細胞を前日に播種していた）障壁の外側に移した。化学物質希釈液（ＳＤＳまたはアミトリプチリン）５０μｌをピペットで障壁の内側に移した。
【０２８３】
曝露時間は２４時間であった。
ＷＳＴ−１アッセイ
２４時間曝露後、ＷＳＴ−１アッセイを行った。
【０２８４】
１２ウェルプレート：ＷＳＴ−１試薬１０μｌをピペットで障壁の内側に、１００μｌを障壁の外側に移した。
【０２８５】
２４ウェルプレート：ＷＳＴ−１試薬５μｌを障壁の内側に、２０μｌを障壁の外側に添加した。
【０２８６】
プレートを２．５時間インキュベートしてから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度を、マルチポイント測定を使用して、２４ウェルプレートでは１ウェル当たり４９点の読み取り、１２ウェルプレートでは１ウェル当たり８１点の読み取りで測定した。
【０２８７】
結果
・顕微鏡的評価によれば、細胞は、予想通り、障壁の外側に残ったままであった（失敗した障壁は、開始時にすでに除外されており、細胞はそれに播種されなかったことに留意されたい）。
・アミトリプチリン塩酸塩およびＳＤＳは細胞に対して毒性はなく：形態的相違点は（目視検査によって）検出されず、化学物質で処置された細胞と未処置の細胞との間の（ＷＳＴ−アッセイによる）細胞生存率において相違点もなかった。手動で調製したＧｒｏｗＤｅｘ障壁を使用した以前の実験では細胞を播種し、化学物質を障壁の別側に添加した場合、化学物質が毒性をもたらしたため（ＦＩＣＡＭ２０１８）、このことは予想外であった。３Ｄ印刷された障壁は化学物質の通過を阻止し、したがって手動で調製したものとは異なることは明白である。
・結果によって、「ヒートマップ」可視化において認められるように、障壁自体が４５０ｎｍの光を吸収することが示される（図２６、２７および２８）。
・それを使用する２週間前に調製した１２ウェルプレート上の障壁は適切に機能した。言い換えれば、障壁は、適切なビヒクル中、パラフィルムを用いて密封し、４℃で保存した場合、少なくとも２週間使用可能なままである。
【０２８８】
表１１は、細胞を播種し、アミトリプチリン（Ａｍｉ）およびＳＤＳに曝露した後の１２ウェルプレートの割付けを表す。２つのＶＣウェルは、これらのウェル中の細胞数が（手違いによって）他のウェルよりも少なかったため、括弧内にある。
【０２８９】
【表１１】
2020198876.tif 000013
【０２９０】
図２６は、化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、４５０ｎｍにおける１２ウェルプレートの吸光度測定を示す。吸光度は「ヒートマップ」として視覚化し、暗い色の強度は吸光度に直接比例する。図２６Ａは１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を表し、図２６Ｂは２．０％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を表す。
【０２９１】
表１２は、細胞を播種し、アミトリプチリンおよびＳＤＳに曝露した後の、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を有する２４ウェルプレートの割付けを表す。良好な品質の障壁のみを使用し、取り消し線は失敗した障壁を表す。
【０２９２】
【表１２】
2020198876.tif 000014
【０２９３】
図２７は、化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、４５０ｎｍにおける２４ウェルプレートの吸光度測定を示す。吸光度は「ヒートマップ」として視覚化し、赤色の強度は吸光度に直接比例する。
【０２９４】
表１３は、細胞を播種し、アミトリプチリンおよびＳＤＳに曝露した後の、２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴ障壁を有する２４ウェルプレートの割付けを表す。良好な品質の障壁のみを使用し、取り消し線は失敗した障壁を表す。
【０２９５】
【表１３】
2020198876.tif 000015
【０２９６】
図２８は、化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２．５時間インキュベートした後の、４５０ｎｍにおける２４ウェルプレートの吸光度測定を示す。吸光度は「ヒートマップ」として視覚化し、赤色の強度は吸光度に直接比例する。
【０２９７】
試験２
試験２の目的は、以下であった。
１）細胞がＧｒｏｗＤｅｘ障壁を通過しないことを確認すること
２）薬物がＧｒｏｗＤｅｘ障壁を実際に通過しないかどうかを見出すこと
３）障壁で観察された吸光度が高い理由を見出すこと。
【０２９８】
この目的のために、
・試験１において使用した４００００細胞／ウェルから２００００細胞／ウェルへ細胞数を減少させた。
・アミトリプチリン濃度を、試験１において使用される１０および２０μｇ／ｍｌから１００および２００μｇ／ｍｌへ、ＳＤＳ濃度を試験１において使用される４０および８０μｇ／ｍｌから１００および２００μｇ／ｍｌへ増加させた。
［細胞数を減少させ、化学物質の濃度を増加させることによって、試験の感受性を高め、細胞に対してより（測定可能な／目に見える）影響を得ることを期待するのが目的であった］。
・以下のブランクが含まれる：
ポリ−Ｄ−リシンコーティングウェル上、ＢＪ細胞培養培地およびＷＳＴ−１中だが、細胞不含の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁
ＭＥＭ中、コーティングなし、細胞不含の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁
ＰＢＳ中、コーティングなし、細胞不含の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁
・更に、マルチポイント吸光度の読み取りにおける１ウェル当たりの測定値の数を１ウェル当たり８１点から２２５点の読み取りへ増加させ、ウェルのより高密度な範囲を得た。
【０２９９】
１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を有する１つの１２ウェルプレートを調製した。
手順
障壁の構築（２０１９年２月１９日、ロット１１９５２）
４層からなる１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を、１２ウェルプレート上に印刷した。３Ｄ印刷に関する更なる詳細に関しては、付属書類１を参照されたい。構築後、障壁を室温で１時間乾燥し、その後、それらをＭＥＭで覆った。プレートを、パラフィルムを用いて密封し、使用するまで４℃で保存した。
【０３００】
細胞の播種
障壁を構築した翌日、ＢＪ線維芽細胞を播種し、ＢＪ懸濁液（５００００細胞／ｍｌ）４００μｌを障壁の外側に播種し（→全部で２００００ＢＪ細胞）、ＢＪ細胞培養培地１００μｌをピペットで障壁の内側に移した。細胞を２４時間増殖させてから曝露した。
【０３０１】
曝露
化学物質希釈液の調製
２．０ｍｇ／ｍｌの原液を、５％ＦＢＳを含むＢＪ細胞培養培地中のアミトリプチリンとＳＤＳの両方から調製した。原液を最初に１：１０に希釈し、２００μｌ／ｍｌの化学物質希釈液を得た。２００μｇ／ｍｌの化学物質希釈液を１：２に更に希釈し、１００μｇ／ｍｌの化学物質希釈液を得た。これらの希釈液、すなわち２００および１００μｇ／ｍｌを曝露において使用した。
【０３０２】
添加
培地を障壁の内側と外側の両方から慎重に除去した。５％ＦＢＳを含むＢＪ細胞培養培地４００μｌをピペットで、（細胞を前日に播種していた）障壁の外側に移した。化学物質希釈液（ＳＤＳまたはアミトリプチリン）１００μｌをピペットで障壁の内側に移した。曝露時間は２４時間であった。
【０３０３】
ブランク
ＢＪ細胞培養培地およびＷＳＴ−１中だが、細胞不含のポリ−Ｄ−リシンコーティングウェルＧｒｏｗＤｅｘ障壁（表１５および図３０）
ＭＥＭ中、コーティングなし、細胞不含のＧｒｏｗＤｅｘ障壁（図３１）
ＰＢＳ中、コーティングなし、細胞不含のＧｒｏｗＤｅｘ障壁（図３１）
ＷＳＴ−１  アッセイ
化学物質に２４時間曝露した後、ＷＳＴ−１試薬１０μｌをピペットで障壁の内側に、１００μｌを障壁の外側に移した。３０分間、１．５時間および２．０時間プレートをインキュベートしてから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。１ウェル当たり２２５点の読み取りでマルチポイント測定を使用して吸光度を測定した。
【０３０４】
データ取り扱い
異なる処置後の細胞生存率を定量化するための試みにおいて、平均±ＳＴＤＥＶ吸光度を、ウェルの外縁の隣で測定された２列の吸光度を使用して算出した。このエリアを障壁の外側と想定した。
【０３０５】
結果
・顕微鏡的評価によって、ＢＪ線維芽細胞はＧｒｏｗＤｅｘ障壁を通過しなかったが、それらが播種された外側に残ったままであったことが示された。
・そのＩＣ５０が、障壁なしでＢＪ細胞に添加された場合に１２μｇ／ｍｌであるアミトリプチリンは、ＢＪ生存率において用量依存的減少（表１４）、すなわち２００μｇ／ｍｌの曝露で１６％の減少、および１００μｇ／ｍｌの曝露で１０％の減少をもたらした。これは、細胞およびアミトリプチリンが障壁の別側に適用された場合に、アミトリプチリンは障壁に貫通することができるという証拠であった。しかし、２４時間の曝露は、全てのアミトリプチリンを２つのコンパートメント間で「平衡化する」のに十分かどうか、またはより多くの時間が必要であったであろうかどうかは知られていない。障壁自体がアミトリプチリンに結合し、したがってその毒性を減少させるかどうかも知られていない。
【０３０６】
【表１４】
2020198876.tif 000016
【０３０７】
・試験１と同様に、最も高い吸光度を障壁領域において測定した（図３０）。最初に、ＧｒｏｗＤｅｘの吸光度はごくわずかであろうことが予想されたために、これは障壁に蓄積した細胞またはホルマザン（ＷＳＴ−１代謝産物）によって引き起こされたことが想定された（手動で調製した障壁を用いた以前の実験では、これが事実であった）。しかし、試験２における細胞数は、試験１における細胞数の半分であり、更に試験２における吸光度は試験１におけるものよりも高かったことは論理的ではない。
・ブランクの測定；ＢＪ細胞培養培地＋ＷＳＴ−１中だが、細胞不含のＧｒｏｗＤｅｘ障壁（表１５、図２９〜３０）およびＭＥＭまたはＰＢＳ中、細胞不含、ＷＳＴ−１不含のＧｒｏｗＤｅｘ障壁（図３１）で全ての吸光度が得られ、これは、ＢＪ細胞もＷＳＴ−１代謝産物もこれらの吸光度の原因ではなく、代わりに、これらは障壁構造自体によって引き起こされることを意味する。この吸光度は、ゲルが粒子から構成されるために、誘発された不特定の散乱、すなわち光学密度、ＯＤに起因するはずである。その結果、吸光度は、全ての波長において高い。ＷＳＴ−１測定における撹乱を克服する１つの方法は、ＷＳＴ−１が吸収しない（５５０ｎｍを超える）波長において基準測定を使用することである。全てのスポットをマッピングすることによって、吸光度が実際はＷＳＴ−１からのものである場所を見ることが可能である。
【０３０８】
【表１５】
2020198876.tif 000017
【０３０９】
図２９は、ＢＪ細胞を播種し、曝露する前の（上部画像）、および曝露し、ＷＳＴ−１試薬を添加した後の（下部画像）１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁を示す。
【０３１０】
図３０は、化学物質に２４時間曝露し、ＷＳＴ−１と２時間インキュベートした後の４５０ｎｍにおける１２ウェルプレートの吸光度測定を示す。吸光度は「ヒートマップ」として視覚化し、赤色の強度は吸光度に直接比例する。
【０３１１】
図３１は、ブランク：ＰＢＳ中の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁（左）、およびＭＥＭ中の１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁（右）の４５０ｎｍにおける吸光度を示す。吸光度は「ヒートマップ」として視覚化し、赤色の強度は吸光度に直接比例する。
【０３１２】
結論
本研究の成果は以下であった。
・３Ｄプリンターを使用し、１．５％ＧｒｏｗＤｅｘと２．０％ＧｒｏｗＤｅｘＴの両方の円状障壁を、１２ウェルプレートと２４ウェルプレートの両方に構築することができる。以下の問題を考慮しなくてはならない：
ヒドロゲルが均質であることが重要である。不均質なゲルは、不均等で実用にならない障壁をもたらす。不均質性は、例えば、密封不良、開封および同じシリンジの再使用、気泡を生成する混合などに起因するヒドロゲルの部分的な乾燥をもたらす場合がある。１つの不均等なヒドロゲル層が障壁全体を損なわせる。
【０３１３】
ウェルの底部に付着した障壁を維持するために、ウェルは前もってコーティングしなければならない。試したコーティング材料の中でも、ポリ−Ｄ−リシンが最も機能した。
【０３１４】
構築後、障壁は、例えば最小必須培地またはＰＢＳで覆い、パラフィルムを用いて密封し、冷蔵庫で少なくとも２週間保存することができた。
【０３１５】
ＧｒｏｗＤｅｘの印刷に関するプロトコールは付属書類２として添付する。プロトコールは、３Ｄプリンターの種類ごとに調整しなくてはならない。
・障壁の特性
障壁はその元のコンパートメントにおいて細胞を維持し、漏出は、障壁にも障壁の経路にも存在しなかった
どの程度およびどれくらいのタイムラインで化学物質が障壁を通過するかは不明なままであった。３Ｄ印刷された障壁は、手動で作成した障壁とは異なって構築され（付属書類３を参照のこと）、したがって、その構造は異なり、手動で作成する障壁用に最適化されたタイムライン（主に曝露時間）は、３Ｄ印刷する障壁に最適ではない場合があり、３Ｄ印刷する障壁に個別に最適化しなくてはならないことが想定される。
【０３１６】
障壁構築物単独では、バックグラウンドの吸収が高く、それに対処する必要がある。この吸光度は、ゲルが粒子から構成されるために、誘発された不特定の散乱、すなわち、光学密度、ＯＤに起因するはずである。その結果、吸光度は、全ての波長（４００〜６００ｎｍ）において高い。ＷＳＴ−１測定における撹乱を克服する１つの方法は、ＷＳＴ−１が吸収しない（５５０ｎｍを超える）波長において基準測定を使用することである。全てのスポットをマッピングすることによって、吸光度が実際はＷＳＴ−１からのものである場所を見ることが可能である。
【０３１７】
付属書類
付属書類１：ＧｒｏｗＤｅｘの３Ｄ印刷
【０３１８】
【表１６−１】
2020198876.tif 000018
【０３１９】
【表１６−２】
2020198876.tif 000019
【０３２０】
【表１６−３】
2020198876.tif 000020
【０３２１】
【表１６−４】
2020198876.tif 000021
【０３２２】
【表１６−５】
2020198876.tif 000022
【０３２３】
付属書類２：３Ｄ印刷プロトコール（Ｆａｂ＠ｈｏｍｅ３Ｄプリンターの最適化）
１．ＧｒｏｗＤｅｘを新しいシリンジに移す（プランジャーが自由に動くことを試験する）
２．プランジャーを数ｍｍ引き上げ、次いでプランジャーをカットし、シリンジの最上部を揃える
３．１６Ｇ金属針状とルアーロックをシリンジに付着させる
４．ゲルが自由に流動を開始するまでプランジャーを押し下げる
５．シリンジをプリンターホルダーに付着させる
６．プリンターの初期化プロトコール（ホーム、スタートおよびセーフポジションの設定）を行う
７．プリンターパラメーターをウェルプレートサイズおよびＧｒｏｗＤｅｘ濃度に従って設定する：
【０３２４】
【表１７】
2020198876.tif 000023
【０３２５】
８．ポリ−Ｄ−リシンでコーティングされた適切な無菌マルチウェルプレートをプリンターのスタンドに置く
９．シリンジチップを移動させ、開始位置にセットする
１０．印刷することになる障壁のｓｔｌ画像をプリンターソフトウェアに読み込む。画像ｓｔｌ（光造形法）ファイルとして画像を保存することができる任意の３ｄイメージングソフトウェアを使用してもよい。
１１．印刷を開始し、プロセスをモニターする（特に２４ウェルプレートでは移動限界は近接している）
１２．印刷が終了した後、障壁を１時間乾燥する。
１３．ＰＢＳまたはＭＥＭをウェルに添加する。障壁は、ＰＢＳまたはＭＥＭ中、４℃で少なくとも２週間維持することができる。
付属書類３：手動で作製された１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁と３Ｄ印刷された１．５％ＧｒｏｗＤｅｘ障壁との間の相違点
【０３２６】
【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2020198876.tif 000049
【図２６Ａ】
2020198876.tif 000050
【図２６Ｂ】
2020198876.tif 000051
【図２７】
2020198876.tif 000052
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2020198876.tif 000055
【図３１】
2020198876.tif 000056
【外国語明細書】
2020198876000001.pdf