(57)【要約】      （修正有）【課題】イムノグロブリンとの結合能の高いアフィニティークロマトグラフィーリガンド、及びそれを用いたイムノグロブリン精製効率の高いアフィニティークロマトグラフィー用担体の提供。【解決手段】リンカーで連結された２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインからなり、該リンカーが少なくとも１個のプロリンを含むポリペプチドからなる、タンパク質。及び固相担体に結合したタンパク質とを含む、アフィニティークロマトグラフィー用担体。前記リンカーが長さ８アミノ酸以上のポリペプチドからなり、Ｐｒｏ−Ｘａａ及びＸａａ−Ｐｒｏから選択されることが好ましいタンパク質。ＸａａがＰｒｏ以外のアミノ酸であることが好ましく、より好ましいのはＡｌａであるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーで連結された２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインを含み、該リンカーが少なくとも１個のプロリンを含むポリペプチドからなる、タンパク質。
【請求項２】
前記２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインが前記リンカーで直列に連結されている、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記リンカーが長さ８アミノ酸以上のポリペプチドからなる、請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
前記リンカーが、Ｐｒｏ−Ｘａａ及びＸａａ−Ｐｒｏからなる群より選択されるペプチド単位を合計で４個以上含む、請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
ＸａａがＰｒｏ以外のアミノ酸である、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
ＸａａがＡｌａである、請求項４記載のタンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが４個以上のＡｌａ−Ｐｒｏ単位からなる、請求項４記載のタンパク質。
【請求項８】
前記リンカーのＮ末端が前記２個以上のドメインのいずれか１つのＣ末端に結合し、かつ該リンカーのＣ末端が別のドメインのＮ末端に結合する、請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項９】
前記２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々が、プロテインＡもしくはプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体である、請求項１〜８のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々が、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ならびに配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインを３〜８個含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１２】
アフィニティークロマトグラフィーリガンドである、請求項１〜１１のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターを含むベクター形質転換体。
【請求項１６】
固相担体と、該固相担体に結合した請求項１〜１２のいずれか１項記載のタンパク質とを含む、アフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項１７】
請求項１６記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーリガンドおよびイムノグロブリンを単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーにおいては、分離すべき目的の物質と特異的に結合する物質（リガンド）を固定化した担体が使用される。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）及びその変異体は、イムノグロブリンに対して特異的に結合するタンパク質であり、代表的なアフィニティークロマトグラフィーリガンドの１つである。天然のＳｐＡには、イムノグロブリン結合ドメインとして、Ｎ末端から順にＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣの５つのドメインが含まれる。これらのドメイン、及びＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインは、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして一般的に使用されている。さらに、アフィニティークロマトグラフィー担体のイムノグロブリン結合能を高める目的で、上記ドメインを複数連結させたものをリガンドとして用いることも一般的である。
【０００３】
複数のタンパク質を人工的に連結させる場合、各タンパク質の間にスペーサー又はリンカーと呼ばれる短いペプチド配列を挿入することがある。スペーサー又はリンカーは、連結されたタンパク質複合体の立体構造や活性の維持のために使用される。非特許文献１には、インターフェロンγ（INF-γ）−gp120融合タンパク質において、２つのタンパク質の間に１０〜３４残基のアラニン−プロリンリンカーを挿入したこと、及び、該融合タンパク質のINF-γ活性は、リンカーの長さが短い場合には低いが、リンカー長が３４残基のときには本来の８８％まで上昇したことが記載されている。非特許文献２には、ヒト血清アルブミン−IFN-α2b融合タンパク質の２つのタンパク質の間にリンカーを挿入したことにより、融合タンパク質の収率や安定性が向上したこと、リンカーなしの融合タンパク質に比べて抗ウイルス活性が上昇していること、リンカーの長さは５残基で充分であったことが記載されている。特許文献１には、イムノグロブリンのＦｃ領域に結合するドメインを、ＧＧＳＧＧＳの繰り返し単位からなるリンカーで複数個連結させたタンパク質が、アフィニティ精製の際、中性域ではイムノグロブリンに対する結合性を維持し、弱酸性域ではイムノグロブリンを解離することができることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報第２０１５／０５０１５３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The Journal of Infectious Diseases, 2001, 184:1423-30
【非特許文献２】Protein Expression and Purification, 2008, 61:73-77
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アフィニティークロマトグラフィー担体上でのイムノグロブリン結合ドメイン数の増加は、それに比例した該担体のイムノグロブリン結合能又は精製効率の上昇には必ずしも結びついていなかった。これは、連結した複数のドメイン同士の干渉や、リガンドに結合したイムノグロブリンの影響で、ドメインとイムノグロブリンとの結合が阻害されることによるものと推測される。本発明は、イムノグロブリンとの結合能の高いアフィニティークロマトグラフィーリガンド、及びそれを用いたイムノグロブリン精製効率の高いアフィニティークロマトグラフィー用担体の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は以下を提供する。
〔１〕リンカーで連結された２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインを含み、該リンカーが少なくとも１個のプロリンを含むポリペプチドからなる、タンパク質。
〔２〕前記２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインが前記リンカーで直列に連結されている、〔１〕記載のタンパク質。
〔３〕前記リンカーが長さ８アミノ酸以上のポリペプチドからなる、〔１〕又は〔２〕記載のタンパク質。
〔４〕前記リンカーが、Ｐｒｏ−Ｘａａ及びＸａａ−Ｐｒｏからなる群より選択されるペプチド単位を合計で４個以上含む、〔３〕記載のタンパク質。
〔５〕ＸａａがＰｒｏ以外のアミノ酸である、〔４〕記載のタンパク質。
〔６〕ＸａａがＡｌａである、〔４〕記載のタンパク質。
〔７〕前記リンカーが４個以上のＡｌａ−Ｐｒｏ単位からなる、〔４〕記載のタンパク質。
〔８〕前記リンカーのＮ末端が前記２個以上のドメインのいずれか１つのＣ末端に結合し、かつ該リンカーのＣ末端が別のドメインのＮ末端に結合する、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載のタンパク質。
〔９〕前記２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々が、プロテインＡもしくはプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体である、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載のタンパク質。
〔１０〕前記２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々が、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ならびに配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される、〔９〕記載のタンパク質。
〔１１〕前記イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインを３〜８個含む、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載のタンパク質。
〔１２〕アフィニティークロマトグラフィーリガンドである、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載のタンパク質。
〔１３〕〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１４〕〔１３〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１５〕〔１４〕記載のベクターを含むベクター形質転換体。
〔１６〕固相担体と、該固相担体に結合した〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載のタンパク質とを含む、アフィニティークロマトグラフィー用担体。
〔１７〕〔１６〕記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体においては、リガンド中のイムノグロブリン結合ドメイン間に特定のリンカーを介在させることで、リガンドのイムノグロブリン結合能を向上させ、アフィニティークロマトグラフィー用担体のイムノグロブリン精製効率を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、カーリンとアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）、またはＦＡＳＴＡ（Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410）。ＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とすることができる。また、ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【００１０】
本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１１】
本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２およびＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００１２】
本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）；及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。
【００１３】
本明細書において、プロテインＡとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡをいう。本明細書において、プロテインＬとは、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａによって生産される蛋白質の１種であるプロテインＬをいう。
【００１４】
本明細書において、「イムノグロブリンに親和性を示すドメイン」又は「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、タンパク質中に含まれる、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいう。本明細書における「イムノグロブリン結合」とは、好ましくはイムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域への結合、より好ましくは少なくともＦｃフラグメントへの結合をいう。
【００１５】
本明細書における「イムノグロブリンに親和性を示すドメイン」又は「イムノグロブリン結合ドメイン」の好ましい例としては、Ｆｃ結合性タンパク、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン、ならびにイムノグロブリン結合活性を有するそれらの変異体が挙げられる。このうち、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン、ならびにイムノグロブリン結合活性を有するそれらの変異体がより好ましい例として挙げられる。
【００１６】
当該プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、プロテインＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、及びＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが挙げられ、このうち、Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン及びＤドメインがより好ましい。プロテインＡのＡドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＡのＥドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＡのＢドメインは、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＡのＺドメインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＡのＣドメインは、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＡのＤドメインは、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる。
【００１７】
当該プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ  ３１２株が産生するプロテインＬのＢ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、及びＢ５ドメインや、Ｆ．ｍａｇｎａ  ３３１６株が産生するプロテインＬのＣ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、及びＣ４ドメインが挙げられ、このうち、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン及びＣ４ドメインがより好ましい。プロテインＬのＣ１ドメインは、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＣ２ドメインは、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＣ３ドメインは、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＣ４ドメインは、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＢ１ドメインは、配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＢ２ドメインは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＢ３ドメインは、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＢ４ドメインは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる。プロテインＬのＢ５ドメインは、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなる。
【００１８】
当該プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの変異体の例としては、配列番号１〜６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、当該プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの変異体の例としては、配列番号３〜６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。当該プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインの変異体の例としては、配列番号７〜１５のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、当該プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインの変異体の例としては、配列番号７〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００１９】
上記イムノグロブリン結合ドメインの変異体は、該ドメインのアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失の手段としては、上記ドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段が挙げられる。
【００２０】
１．アフィニティークロマトグラフィーリガンド用タンパク質
一実施形態において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして機能するタンパク質を提供する。当該本発明のタンパク質は、リンカーで連結された２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインを含む。該ドメインを連結する該リンカーは、少なくとも１個のプロリンを含むペプチドリンカーである。
【００２１】
本発明のタンパク質に含まれるリンカーは、そのＮ末端が、本発明のタンパク質を構成する該２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインのうちのいずれか１つと結合しており、かつそのＣ末端は、別のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインと結合している。該リンカーが結合する該ドメイン上の位置は特に限定されない。また、該ドメイン１個に対して結合する該リンカーの個数も特に限定されない。したがって、本発明のタンパク質は、該２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインが、該リンカーで直列に連結された構造を有していてもよく、又は該リンカーで並列に連結された構造を有していてもよい。
【００２２】
より好ましくは、本発明のタンパク質に含まれるリンカーは、そのＮ末端が、本発明のタンパク質を構成する該２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインのうちのいずれか１つのＣ末端と結合しており、かつそのＣ末端は、そのＮ末端が結合しているドメインとは別のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインのＮ末端と結合している。好ましくは、本発明のタンパク質の基本構造は、このドメイン−リンカー単位の繰り返しからなる。結果、本発明のタンパク質は、好ましくは、２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインが該リンカーを介して直列に連結された構造を有する。
【００２３】
好ましくは、本発明のタンパク質に含まれるリンカーは、長さ８アミノ酸以上のポリペプチドからなるポリペプチドリンカーである。より好ましくは、該リンカーの長さは１０アミノ酸以上であり、さらに好ましくは１２アミノ酸以上である。該リンカーの長さの上限は、好ましくは５０アミノ酸以下、より好ましくは３０アミノ酸以下、さらに好ましくは２０アミノ酸以下、さらに好ましくは１８アミノ酸以下である。好適には、該リンカーの長さは８〜５０アミノ酸、好ましくは８〜３０アミノ酸、より好ましくは１０〜３０アミノ酸、さらに好ましくは８〜２０アミノ酸、さらに好ましくは１０〜２０アミノ酸、さらに好ましくは１０〜１８アミノ酸、さらに好ましくは１２〜２０アミノ酸、さらに好ましくは１２〜１８アミノ酸である。
【００２４】
本発明のタンパク質に含まれるリンカーは、少なくとも１個のプロリンを含み、好ましくは２個以上のプロリンを含み、より好ましくは４個以上のプロリンを含み、さらに好ましくはＰｒｏ−Ｘａａ及びＸａａ−Ｐｒｏからなる群より選択されるペプチド単位を合計で４個以上含む。該リンカーに含まれるＸａａは、Ｐｒｏを含む任意のアミノ酸であればよいが、好ましくはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸（すなわちＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ）であり、より好ましくはＡｌａである。さらに好ましくは、該リンカーは、Ｐｒｏ−Ａｌａ及びＡｌａ−Ｐｒｏからなる群より選択されるペプチド単位を合計で４個以上含む。さらに好ましくは、該リンカーは、４個以上のＡｌａ−Ｐｒｏ単位からなる。さらに好ましくは、該リンカーは（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎからなり、ここでｎは、４〜２５、好ましくは４〜１５、より好ましくは５〜１５、さらに好ましくは４〜１０、さらに好ましくは５〜１０、さらに好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜１０、さらに好ましくは６〜９である。
【００２５】
本発明のタンパク質に含まれるリンカーの数は、１個以上であればよく、ドメイン数に応じて変化する。典型的には、本発明のタンパク質に含まれるリンカーの数は、該タンパク質中のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの数より１つ少ない。本発明のタンパク質が２個以上のリンカーを含む場合、各々のリンカーのアミノ酸配列又はその長さは、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、該各々のリンカーのアミノ酸配列及び長さは同一である。
【００２６】
本発明のタンパク質は、イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインを２個以上、好ましくは２〜１２個、より好ましくは３〜８個含む。本発明のタンパク質に含まれる該２個以上のイムノグロブリン結合ドメインの各々は、同一のドメインでも異なるドメインであってもよいが、好ましくは同一のドメインである。
【００２７】
好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、プロテインＡもしくはプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体である。より好ましくは、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン及びＤドメイン、プロテインＬのＣ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、及びＣ４ドメイン、ならびにそれらの変異体からなる群より選択される。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ならびに配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ただし配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌを有する、ポリペプチドである。別の好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ただし配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを有する、ポリペプチドである。さらに好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドのＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ただし配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列の３位に相当する位置と４位に相当する位置との間に１アミノ酸が挿入されている、ポリペプチドである。該挿入されるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択され、好ましくはＬｅｕである。さらに好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ３Ｋ４＿ｉｎｓＬ変異体である。さらに好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号３〜１０のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドのＶａｌ１／Ａｌａ２９／Ｎ３Ｋ４＿ｉｎｓＬ変異体である。さらに好ましい実施形態において、当該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインの各々は、配列番号１６からなるポリペプチドである。
【００３１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、[（Ｐ−Ｌ）ｍ−Ｐ]で示されるポリペプチドを含む：Ｐは、上述したイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインであり、好ましくは配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである；Ｌは、少なくとも１個のプロリンを含むペプチドリンカーであり、好ましくは、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）ｎ〔ｎは、４〜２５、好ましくは４〜１５、より好ましくは５〜１５、さらに好ましくは４〜１０、さらに好ましくは５〜１０、さらに好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜１０、さらに好ましくは６〜９〕で示される配列からなるポリペプチドである；ｍは１以上、好ましくは１〜１１、より好ましくは２〜７である。
【００３２】
一実施形態において、本発明のタンパク質は、上記リンカーと２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメインとからなり、好ましくは、上記[（Ｐ−Ｌ）ｍ−Ｐ]で示されるポリペプチドからなる。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、上記リンカーと２個以上のイムノグロブリンに対する親和性を有するドメイン、好ましくは該[（Ｐ−Ｌ）ｍ−Ｐ]で示されるポリペプチド、に加えて、固相担体との結合のためのリンカーをさらに含んでいてもよい。例えば、該本発明のタンパク質と固相担体との結合のための１つ以上のリンカーのそれぞれが、該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインにおける任意の位置に結合されていればよい。該本発明のタンパク質と固相担体との結合のためのリンカーは、該イムノグロブリンに対する親和性を有するドメインのＣ末端もしくはＮ末端に結合されていてもよく、又は末端残基ではないアミノ酸残基に結合されてもよい。好ましくは、該本発明のタンパク質と固相担体との結合のためのリンカーは、該[（Ｐ−Ｌ）ｍ−Ｐ]で示されるポリペプチドのアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端に結合される。あるいは、該固相担体との結合のための１つ以上のリンカーのそれぞれが、該[（Ｐ−Ｌ）ｍ−Ｐ]で示されるポリペプチドのアミノ酸配列の両末端に各々結合されてもよく、又は、該固相担体との結合のためのリンカーは末端残基ではないアミノ酸残基に結合されてもよい。該本発明のタンパク質と固相担体との結合のためのリンカーの例としては、１個以上２０個以下のＧｌｙが挙げられる。
【００３３】
本発明のタンパク質の好ましい例としては、配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。しかしながら、本発明のタンパク質の好ましい例は、これらに限定されない。
【００３４】
２．アフィニティークロマトグラフィーリガンド用タンパク質の製造
本発明のタンパク質は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、本発明のタンパク質は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。すなわち、上記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質リガンドを大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、ほ乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した組換え体（細菌等）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
【００３５】
したがって、本発明はまた、上記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）、それを含むベクター、及びそれらを含む形質転換体を提供する。
【００３６】
３．アフィニティークロマトグラフィー用担体
本発明のアフィニティークロマトグラフィーリガンド用タンパク質を固相担体に固定化することによって、アフィニティークロマトグラフィー用担体を製造することができる。
【００３７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体に含まれる固相担体の形状としては、粒子の形態であることができ、かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、該形態中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床および流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、当該担体は充填剤である。あるいは、担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。
【００３８】
一実施形態において、当該固相担体は、好ましくは２０〜２００μｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは２０〜１００μｍ、さらに好ましくは３０〜８０μｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５０〜２００μｍ、さらに好ましくは６０〜１５０μｍの粒径を有する。粒径が２０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が２００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティークロマトグラフィー用担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本明細書における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒径である。
【００３９】
一実施形態において、当該固相担体は、好ましくは、多孔質であり、５０〜１５０ｍ２／ｇ、より好ましくは、８０〜１３０ｍ２／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ２／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ２／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。なお、本明細書における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
【００４０】
一実施形態において、当該固相担体は、好ましくは、１００〜１４００ｎｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１００〜４００ｎｍ、さらに好ましくは２００〜３００ｎｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５００〜１４００ｎｍ、さらに好ましくは８００〜１２００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１４００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。なお、本明細書における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
【００４１】
当該固相担体が上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間および粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
【００４２】
当該固相担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、外表面に（および存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（−ＯＨ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（−ＣＯＮＨ２、またはＮ置換型）、アミノ基（−ＮＨ２、または置換型）、またはオリゴもしくはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。一実施形態において、該ポリマーは、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール系等の合成ポリマーであり得、好ましくは、多官能（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の多官能モノマーで架橋された共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３），３７１−３７４に記載の方法を参照されたい）。あるいは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーはデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。あるいは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
【００４３】
一実施形態において、当該固相担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、２０〜５０質量％の架橋性ビニル単量体と３〜８０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体、２０〜８０質量％のジオール基含有ビニル単量体との共重合体を含有し、粒径が２０〜８０μｍであり、比表面積が５０〜１５０ｍ２／ｇであり、体積平均細孔径が１００〜４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
【００４４】
なお、当該固相担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは、１．３〜７．０ｍＬ／ｇ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１．３〜２．５ｍＬ／ｇ、担体が多糖の場合、より好ましくは３．０〜６．０ｍＬ／ｇである。
【００４５】
当該固相担体へのリガンド（すなわち本発明のタンパク質）の結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法；アミノ基又はカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基又はアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法；水酸基を有する担体を用い、臭化シアン等のハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法；担体の水酸基をトシル化又はトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法；ビスエポキシド、エピクロロヒドリン等によりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基、水酸基又はチオール基と反応させる方法；エポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基又、水酸基又はチオール基と反応させる方法、などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを結合させる方法が望ましい。
【００４６】
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸又はアルカリにより、加熱又は室温で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミン等のアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。より好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノール等よりも毒性が低く、またチオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなる、といった利点を有する。
【００４７】
好ましくは、当該固相担体と本発明のタンパク質は、上述した本発明のタンパク質と固相担体との結合のためのリンカーを介して結合される。好ましくは、該リンカーは、上述したように本発明のタンパク質に含まれており、該リンカー部分が該固相担体と反応することで、該固相担体と本発明のタンパク質が結合される。あるいは、該固相担体に予め結合された該リンカーに、本発明のタンパク質を結合させることもできる。
【００４８】
当該本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、イムノグロブリン結合能の高いリガンドを有しているため、イムノグロブリン動的結合容量（ＤＢＣ）及びリガンド利用効率が高い。
【００４９】
４．イムノグロブリンを単離する方法
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、本発明のアフィニティークロマトグラフィーリガンド用タンパク質を固定化したアフィニティークロマトグラフィー用担体に、イムノグロブリンを含有する試料を通液し、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、および、該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）を含む。
【００５０】
当該第一の工程では、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を充填したカラム等にイムノグロブリンを含有する試料を、リガンド（本発明のタンパク質）にイムノグロブリンが吸着する条件にて流す。この第一の工程では、試料中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されずカラムを通過する。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
【００５１】
当該第二の工程では、ｐＨ２〜５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着されたイムノグロブリンを溶出させる。この溶出液を回収することで、試料からイムノグロブリンを単離することができる。
【００５２】
本発明のイムノグロブリン単離方法の一実施形態において、単離すべきイムノグロブリンは、抗体又はそれを含む医薬であり得る。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、目的とする抗体医薬を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述したイムノグロブリン単離方法の手順と同様である。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
【００５４】
参考例１  多孔質粒子の合成
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、及び亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
（２）グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１２．００ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２４．４３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
（３）該水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に該単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温した。内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加した。
（４）得られた反応液を、８６℃に温度を維持しながら、３時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、ろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子（ＰＢ）分散液を得た。
【００５５】
比較例１  組換えリガンドタンパク質：ＩｇＧＢＰ０の作製
配列番号１６で示されるアミノ酸配列の繰り返しを含む、配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる組換えリガンドタンパク質ＩｇＧＢＰ０をコードするプラスミドを調製した。このプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ製）を形質転換した。得られた組換え体を、吸光度（ＯＤ６００）が約１０に到達するまで３７℃でインキュベートし、その後、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（和光純薬工業製）を添加し、さらに５時間３７℃でインキュベートして、組換えタンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を遠心分離により回収し、ｐＨ８．５のトリス緩衝液中に分散させた。これにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、大腸菌を破壊した。得られた菌体破壊液から、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＢｉｏＰｒｏＳ７５、ＹＭＣ製）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（ＢｉｏＰｒｏＱ７５、ＹＭＣ製）によって組換えタンパク質を精製した。精製したタンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液に対してＴａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎにより、濃縮・脱塩した。得られた組換えリガンドタンパク質の理論分子量［Ｄａ］をＥｘＰＡＳｙ（［web.expasy.org/protparam/］）を用いて求めた。また、該組換えリガンドタンパク質の純度及び分子量は、ＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定した。
【００５６】
実施例１〜２  組換えリガンドタンパク質：ＩｇＧＢＰ１及びＩｇＧＢＰ２の作製
配列番号１７に示すアミノ酸配列からなる組換えリガンドタンパク質ＩｇＧＢＰ１をコードするプラスミド、及び配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる組換えリガンドタンパク質ＩｇＧＢＰ２をコードするプラスミドを調製した。これらのプラスミドを用いて、比較例１と同様の手順で組換えリガンドタンパク質を調製した。ＩｇＧＢＰ１と２は、それぞれ表１に示すドメイン間リンカーで連結された配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む。得られた組換えリガンドタンパク質の理論分子量、純度、測定分子量は比較例１と同様に測定した。
【００５７】
比較例１及び実施例１〜２の組換えリガンドタンパク質のＬＣ純度及び分子量を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2020198783.tif 000002
【００５９】
試験例１
（１）リガンドタンパク質固定化多孔質粒子の調製
参考例１で取得した多孔質粒子ＰＢに対して、粒子１ｇあたりのリガンドタンパク質量が０．１５ｇになるように、１．２Ｍ硫酸ナトリウム／０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．８）を含む液に実施例１〜２又は比較例１のリガンドタンパク質とＰＢを混和し、２５℃で５時間振盪して、リガンドタンパク質固定化多孔質粒子（ＩｇＧＢＰ０／ＰＢ、ＩｇＧＢＰ１／ＰＢ、及びＩｇＧＢＰ２／ＰＢ）を得た。これら粒子に残存するエポキシ基をチオグリセロールを用いてブロッキングした。その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ及び０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）を用いて粒子を洗浄し、最終的にＰＢＳに懸濁した。
【００６０】
（２）リガンド結合量の測定
１ｍｇのＩｇＧＢＰ０／ＰＢを含む１５０μＬの懸濁液について、ＢＣＡ  Ａｓｓａｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、粒子に結合したリガンドタンパク質の量を測定した。同様の手順で、ＩｇＧＢＰ１／ＰＢ及びＩｇＧＢＰ２／ＰＢにおける粒子に対するリガンドタンパク質の結合量を測定した。
【００６１】
（３）ＩｇＧ動的結合容量（ＤＢＣ）の測定
ＩｇＧＢＰ０／ＢＰを内径０．５ｃｍのカラムにベッド高２０ｃｍまで充填した。カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化した後、ヒトポリクローナルＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を、線流速３００ｃｍ／時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧ濃度が１０％ブレークスルー（破過）のときのヒトポリクローナルＩｇＧ吸着量と担体体積から動的結合容量（ＤＢＣ）を求めた。同様の手順で、ＩｇＧＢＰ１／ＰＢ及びＩｇＧＢＰ２／ＰＢのＤＢＣを求めた。さらに各粒子について、ＤＢＣをリガンド結合量で除し、得られた値の比較例１の値に対する相対値（％）を求め、リガンド利用効率を算出した。
【００６２】
表２に示すとおり、実施例１又は２のドメイン間リンカーを含むリガンドタンパク質であるＩｇＧＢＰ１又は２が固定化された粒子は、比較例１のリンカーを含まないリガンドタンパク質であるＩｇＧＢＰ０が固定化された粒子に比べて、ＤＢＣ及びリガンド利用効率が向上していた。さらに実施例１と２の比較から、ドメイン間リンカーの長さが長くなるとリガンド利用効率がより上昇する傾向にあることが分かった。
【００６３】
【表２】
2020198783.tif 000003
【００６４】
本発明の実施形態に係る説明は以上である。しかしながら、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明のさらなる種々の変形が可能である。また本発明は、上記で説明した実施形態の構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、上記で説明した実施形態の構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、上記で説明した実施形態の構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、上記で説明した実施形態の構成に公知技術を付加した構成を含む。
【配列表】
2020198783000001.app