(57)【要約】      （修正有）【課題】アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含むアネキシンA1のN末端領域の存在を検出するための試薬、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域の存在を検出する方法等を提供する。【解決手段】アネキシンＡ１のＮ末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記Ｎ末端領域が、１５アミノ酸残基からなるある特定のアミノ酸配列を含む領域である、モノクローナル抗体。該モノクローナル抗体は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８０１として寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であってよい。上記モノクローナル抗体は、腫瘍血管表面におけるアネキシンＡ１のＮ末端領域を、免疫染色によって検出する方法に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記N末端領域が、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む領域である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
受託番号NITE P-02801として寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項４】
受託番号NITE P-02801として受託されたハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含む、アネキシンA1のN末端領域の存在を検出するための試薬。
【請求項６】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含む、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを用いたがん治療の適用の可否を判定するための試薬。
【請求項７】
がんが固形がん又は液性がんである、請求項6に記載の試薬。
【請求項８】
腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域の存在を検出する方法であって、
（1）請求項1〜3のいずれか1項に記載のアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること
（2）前記試料中において、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域を、免疫染色によって検出すること
を含む、方法。
【請求項９】
アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを用いたがん治療の適用対象の選別を補助するための方法であって、
（1）請求項1〜3のいずれか1項に記載のアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること
（2）前記試料中において、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域を、免疫染色によって検出すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記対象由来の試料が、対象から生検により採取されたがん細胞を含む生検サンプルを用いて作製された組織切片である、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが固形がん又は液性がんである、請求項9又は10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してがん生物学の分野に関し、より詳細にはアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合する抗体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍の中でも髄膜腫や神経鞘腫など、髄膜や脳・脊髄神経から発生する腫瘍は多くが良性脳腫瘍であり、外科手術によって摘出できれば完全治癒が可能である。それに対して、神経膠腫（グリオーマ）を始めとする神経上皮性腫瘍は基本的に悪性脳腫瘍である。特にグレード4の膠芽腫（グリオブラストーマ）に至っては、頭開手術による摘出後、放射線療法と化学療法を行ったとしても、予後は極めて悪い（5年生存率は10%程度）。脳腫瘍に対して有効な化学療法が実施できていない大きな理由として、血液脳関門の存在が挙げられる。
【０００３】
これまでに本発明者らは、腫瘍血管特異的マーカー分子の中で最も特異性が高いことが知られているアネキシンA1（非特許文献1）のN末端領域に結合することによって、脳腫瘍に圧倒的高濃度で集積し、かつ積極的に血管内皮の壁を越えることができる悪性腫瘍血管標的ペプチド（IF7、dTIT7等）を開発し、そして該ペプチドを用いた悪性腫瘍血管特異的な抗がん剤デリバリーシステムも開発してきた。また、担癌マウスモデルに静脈注射した該ペプチドは悪性腫瘍血管に標的するので、アネキシンA1のN末端領域が、実際に悪性腫瘍血管内皮表面に発現していると考えられる。
【０００４】
最近の医療費高騰は患者の経済的負担に留まらず、我が国の国家財政破綻が危ぶまれるほどに緊迫しており、また海外の国民皆保険がない国においては、高価な医薬品は手の届かないものになり、想像を絶する医療格差を招きつつある。このような状況の中、本発明者らの開発したIF7やdTIT7及びこれらを用いた抗がん剤のデリバリーシステムは、効率よく血液-脳腫瘍関門を越えて脳腫瘍等で優れた治療効果を上げることができ、且つ安価であるため、世界規模での医療格差の是正などのために期待されている。
【０００５】
本発明者らの開発したIF7やｄTIT7を結合した抗がん剤が治療効果を発揮するには、IF7やｄTIT7の受容体であるアネキシンA1のN末端領域が血管内皮表面に存在する必要がある。そのため、脳腫瘍等に罹患する患者において、該IF7やｄTIT7を結合した抗がん剤を用いた治療等を実施する際、患者の身体的及び経済的負担の観点などから、事前に該腫瘍等組織の血管内皮表面にアネキシンA１のN末端領域が存在することを検出し得る診断薬が切望されている。
【０００６】
該腫瘍組織におけるアネキシンA1のN末端領域の存在の有無を検出する診断薬としては、免疫染色に使えるアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合する抗体が適しているが、本発明者らの知る限り、そのような抗体は市販されておらず、学術論文等において報告もされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Oh et al., Nature 429: 629-35, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含むアネキシンA1のN末端領域の存在を検出するための試薬、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域の存在を検出する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を見出し、そして該モノクローナル抗体が悪性脳腫瘍における免疫染色において血管内皮を陽性染色し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1]アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体。
[2]前記N末端領域が、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む領域である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
[3]受託番号NITE P-02801として寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
[4]受託番号NITE P-02801として受託されたハイブリドーマ。
[5][1]〜[3]のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体を含む、アネキシンA1のN末端領域の存在を検出するための試薬。
[6][1]〜[3]のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体を含む、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを用いたがん治療の適用の可否を判定するための試薬。
[7]がんが固形がん又は液性がんである、[6]に記載の試薬。
[8]腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域の存在を検出する方法であって、
（1）[1]〜[3]のいずれか1つに記載のアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること
（2）前記試料中において、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域を、免疫染色によって検出すること
を含む、方法。
[9]アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを用いたがん治療の適用対象の選別を補助するための方法であって、
（1）[1]〜[3]のいずれか1つに記載のアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること
（2）前記試料中において、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域を、免疫染色によって検出すること
を含む、方法。
[10]アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを用いたがんの治療方法であって、
（1）[1]〜[3]のいずれか1つに記載のアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること
（2）前記試料中において、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域を、免疫染色によって検出すること
（3）前記検出結果に基づいて、前記治療の適用対象を選別すること
（4）前記選別した対象に、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを投与すること
を含む、方法。
[11]前記対象由来の試料が、対象から生検により採取されたがん細胞を含む生検サンプルを用いて作製された組織切片である、[8]〜[10]のいずれか1つに記載の方法。
[12]前記がんが固形がん又は液性がんである、[9]〜[11]のいずれか1つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を含むアネキシンA1のN末端領域の存在を検出するための試薬、腫瘍血管表面におけるアネキシンA1のN末端領域の存在を検出する方法等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、ELISAによる抗MC16抗体（クローン31-8D）のヒト アネキシンA1に対する結合を測定した結果である。
【図２】図2は、ウェスタンブロットによる抗MC16抗体のヒト アネキシンA1とN末端ドメインを欠損したヒト アネキシンA1の変異体に対する結合を検出した結果である。
【図３】図3は、抗MC16抗体によるマウス血管内皮F2細胞の蛍光免疫染色イメージの結果である。
【図４】図4は、抗MC16抗体による膠芽腫組織の免疫染色の結果である（左：免疫染色、右：ヘマトキシリン‐エオシン染色）。
【図５】図5は、抗MC16抗体とInvitrogenから市販されている抗アネキシンA1抗体による様々な癌腫瘍組織（乳がん）の免疫染色の結果である。組織標本はBiomax社のmultiple cancer tissue micro arrayを使用した。
【図６】図6は、抗MC16抗体とInvitrogenから市販されている抗アネキシンA1抗体による様々な癌腫瘍組織（肺がん）の免疫染色の結果である。組織標本はBiomax社のmultiple cancer tissue micro arrayを使用した。
【図７】図7は、抗MC16抗体とInvitrogenから市販されている抗アネキシンA1抗体による様々な癌腫瘍組織（肝細胞がん）の免疫染色の結果である。組織標本はBiomax社のmultiple cancer tissue micro arrayを使用した。
【図８】図8は、抗MC16抗体とInvitrogenから市販されている抗アネキシンA1抗体による様々な癌腫瘍組織（卵巣がん）の免疫染色の結果である。組織標本はBiomax社のmultiple cancer tissue micro arrayを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
1. 本発明のモノクローナル抗体
本発明は、アネキシンA1（RefSeq No. NP_000691.1）（以下、「ANXA1」あるいは「Anxa1」と称する場合がある）のN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。該抗体は、具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列（MAMVSEFLKQAWFIE）を含む、アネキシンA1のN末端領域に存在するエピトープと特異的に結合する抗体である。該抗体は、IgG、IgA、IgM、IgD又はIgEのいずれの免疫グロブリンクラスに属するものであってもよいが、好ましくはIgGであり、より好ましくはIgG2bである。該抗体の具体例としては、後述する本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（クローン31-8D）が産生する抗体（マウスIgG2b）（以下、「抗MC16抗体」と称する場合がある）が挙げられる。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、（悪性）腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現するアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するため、アネキシンA1のN末端領域の存在の有無を検出するために適している。そのため、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とを含むコンジュゲート、該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含むがんの治療用組成物等を用いたがん治療を行う前に、対象が該治療の適用対象であるか否かを予測するためのコンパニオン診断に用いることができる。
【００１５】
本明細書において、対象とは、アネキシンA1を発現する任意の動物、特には哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類やウサギなどの実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンクなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１６】
2. 本発明のモノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体及びこれに類似する抗体は、自体公知の方法（ファージディスプレイ法、ハイブリドーマ法）により作製することができる。該抗体を細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から取得する場合、具体的には、例えば、まず免疫原性の抗原ペプチドを、マウス、ラット、ハムスターなどの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内、腹腔内等に1〜数回注射するか又は移植することにより免疫を施す。次に、該免疫した哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、該細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、該哺乳動物の免疫に用いた免疫原性の抗原ペプチドに対して特異的な親和性を示す抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
また、抗体産生細胞については、予め単離された脾細胞、リンパ球等に培養液中で免疫原性の抗原ペプチドを作用させて生じる抗体産生細胞も使用することができる。この場合にはヒト由来の抗体産生細胞も調製可能である。
【００１７】
免疫原性の抗原ペプチドは、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用することができる。また、免疫原性の抗原ペプチドは、アジュバントとともに投与してもよく、例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント（FCA又はFIA）と混和し、乳化して用いてもよい。さらに、免疫原性の抗原の免疫時には適当な担体を使用してもよい。特に分子量の小さいペプチドが免疫原性の抗原として用いられる場合には、該免疫原性の抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
後述する実施例では、ヒト アネキシンA1のN端から15番目までのアミノ酸配列（配列番号1：MAMVSEFLKQAWFIE）のC端にシステインを付加させた合成ペプチド（配列番号2：MAMVSEFLKQAWFIEC）（以下、「合成ペプチドMC16」又は単に「MC16」と称する場合がある）をウシ血清アルブミンに結合させた物質と、完全フロイントアジュバントを混和したものを免疫原性の抗原ペプチドとして用いた。
【００１８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製はケーラー及びミルシュタインの方法（Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1975）、及びその変法に従って行うことができる。即ち、本発明のモノクローナル抗体は、前述のごとく免疫された動物から取得される脾細胞、リンパ節細胞、末梢リンパ球、骨髄腫細胞、扁桃細胞等、好ましくは脾細胞に含まれる抗体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒトの骨髄腫細胞（ミエローマ）との融合により得られるハイブリドーマを培養することにより調製される。培養は、インビトロ又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹腔内等でのインビボで行うことができ、抗体はそれぞれ培養上清あるいは哺乳動物の腹水から取得することができる。
【００１９】
細胞融合に用いられる骨髄腫細胞としては、例えば、マウス由来ミエローマP3/X63-AG8、P3/NSI/1-Ag4-1、P3/X63-Ag8.U1、SP2/0-Ag14、F0或いはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag1.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GML500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或いはCEM-T15等が挙げられる。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えば、マイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫原性の抗原ペプチドに対する反応性を、例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、免疫染色法等によって測定することにより行うことができる。
【００２１】
後述する実施例に記載の通り、合成ペプチドMC16に高い反応性を示す抗体を産生したハイブリドーマを、限界希釈法によって細胞クローニングし、本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（クローン31-8D）として取得した。クローン31-8Dを平成30年12月5日に、受託番号NITE P-02801として独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  122号室）に寄託した。
【００２２】
モノクローナル抗体の単離精製は、上述のような方法によって製造される該抗体含有培養上清或いは腹水を、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、抗イムノグロブリンカラム又はプロテインAやプロテインGカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付すことにより行うことができる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、検出可能な標識で標識されていてもよい。標識には蛍光標識、低分子化合物による標識、ペプチドによる標識、酵素による標識等が挙げられる。また、本発明のモノクローナル抗体は、他の薬剤とともにコンジュゲートを形成していてもよい。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体は、上述の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得られたものであってもよい。例えば、本発明のハイブリドーマからクローニングされた、本発明のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、抗体として発現させたものを利用してもよい。抗体をコードする遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme, A. M.らEur. J. Biochem.（1990）192, 767-775を参照）。
【００２５】
例えば、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、該抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M.ら、Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P.ら、Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）などを用いることができる。抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5’- Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）及びPCRを用いた５’- RACE法（Frohman, M. A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.ら Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）を利用することができる。さらに、このようなcDNAの合成の過程において、cDNAの両末端に適切な制限酵素サイトを導入してもよい。
【００２６】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いで、ベクターDNAと作動可能に連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、自体公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認できる。
【００２７】
通常モノクローナル抗体は免疫を施す哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明におけるモノクローナル抗体は、該糖鎖の構造差異により限定されるものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル抗体をも包含するものである。さらに、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を組み込まれたトランスジェニック動物から得られる組換えヒト型モノクローナル抗体、あるいはある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Fc）をヒト由来モノクローナル抗体のFc領域と組換えたキメラモノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合し得る相補性決定部位（CDR）以外の全領域をヒト由来モノクローナル抗体の対応領域と組換えたキメラモノクローナル抗体も本発明のモノクローナル抗体に包含される。
【００２８】
また、本発明の抗体には、前記のモノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体に加えて、これらの抗体の断片が含まれる。抗体の断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFab、Fab’、F(ab’)2、scAb、scFv又はscFv-Fc等を包含する。
【００２９】
これらの抗体断片は、自体公知の方法を用いて得ることができ、具体的には、本発明のモノクローナル抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。得られたフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体と同様にして抗原との反応性、特異性等を評価することができる。
【００３０】
また、当業者であれば、本発明の抗体又は断片と他のペプチドやタンパク質との融合抗体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体を作製することも可能である。融合に用いられる他のペプチドやタンパク質は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種tagペプチド、人工へリックスモチーフペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンSトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進し得るペプチド又はタンパク質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体の結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
【００３１】
3. 本発明の試薬
上述したように、本発明のモノクローナル抗体は（悪性）腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現するアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するため、悪性腫瘍標的活性のあるIF7やｄTIT7を用いた悪性腫瘍治療薬の受容体であるアネキシンA1のN末端領域の存在の有無を検出するために適している。従って、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を含む、アネキシンA1のN末端領域の存在を検出するための試薬も提供する。
【００３２】
また上述したように、本発明のモノクローナル抗体は、特定のがん治療の適用対象であるか否かを予測するためのコンパニオン診断に用いることができる。従って、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を含む、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲート、該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物等を用いたがん治療の適用の可否を判定するための試薬も提供する。
【００３３】
本明細書において、悪性腫瘍（がん）は任意の種類のがんであってよく、固形がん又は液性がんであってもよい。固形がんとしては、好ましくはアネキシンA1を細胞表面に発現する固形がん、従って血管新生する固形がんが挙げられる。固形がんとしては、例えば、脳・神経系のがん（例えば、脳腫瘍、脊髄腫瘍など）、頭頸部がん（例えば、喉頭がん、口腔がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がんなど）、消化器がん（例えば、胃がん、食道がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、胆道がん、膵臓がんなど）、泌尿器又は生殖器のがん（例えば、腎がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、腎盂および尿管がん、胆嚢がん、胆管がん、精巣がん、陰茎がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、卵管がんなど）、呼吸器系のがん（例えば、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、転移性肺がんを含む）、気管支がんなど）、乳がん、皮膚がん（例えば、悪性黒色腫など）、骨のがん（例えば、骨肉腫など）、筋肉のがん（例えば、横紋筋肉腫など）などが挙げられる。
【００３４】
液性がんとしては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群などが挙げられる。白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられる。悪性リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫に分類され、非ホジキンリンパ腫としては、B細胞性リンパ腫、成人T細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、MALTリンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫などが挙げられる。
【００３５】
本発明の試薬を用いたコンパニオン診断の結果として、対象に投与されるアネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤のコンジュゲートや該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物等は、後述するように、効率よく血液-脳腫瘍関門を越えることができるので、特に好ましい標的として脳腫瘍を挙げることができる。
【００３６】
脳腫瘍は、原発性脳腫瘍又は転移性脳腫瘍であってもよい。また、脳腫瘍は良性（例えば、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫など）又は悪性の脳腫瘍であってもよく、好ましくは悪性の脳腫瘍である。悪性の脳腫瘍としては、星細胞腫（アストロサイトーマ）、乏突起神経膠腫（オリゴデンドログリオーマ）などのグレード2の脳腫瘍、退形成性星細胞腫、退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫などのグレード3の脳腫瘍、膠芽腫（グリオブラストーマ）などのグレード4の脳腫瘍が挙げられる。
【００３７】
本発明の試薬は、本発明のモノクローナル抗体のみからなるものであってもよいし、医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。医薬的に許容される担体としては、本発明の試薬を液剤として調製する場合、製剤素材として慣用されている各種担体、例えば、希釈剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤などを含んでいてもよい。さらに抗体の凝集を防ぐために、Tween20（登録商標）、Tween80（登録商標）などの界面活性剤を添加してもよい。希釈剤としては、水、生理用食塩水などが挙げられる。溶剤としては、水、生理用食塩水、エタノールなどが挙げられる。溶解補助剤としては、シクロデキストリン類などが挙げられる。懸濁化剤としては、アラビアゴム、カルメロースなどが挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩類、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物などが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。これらの担体の配合比は、当業者が適宜決定することができる。  
【００３８】
４．本発明の方法
上述したように、本発明のモノクローナル抗体は（悪性）腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現するアネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するため、アネキシンA1のN末端領域の存在の有無を検出するために適している。従って、本発明は、該モノクローナル抗体を用いた、腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現しているアネキシンA1（腫瘍血管表面におけるアネキシンA1）のN端領域の存在を検出する方法も提供する。
【００３９】
具体的には、本発明の方法は（1）本発明のアネキシンA1のN端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること、及び（2）前記試料中において、腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現しているアネキシンA1（腫瘍血管表面におけるアネキシンA1）のN端領域を、免疫染色によって検出することを含む。
【００４０】
また上述したように、本発明のモノクローナル抗体は、特定のがん治療の適用対象であるか否かを予測するためのコンパニオン診断に用いることができる。従って、本発明は、該モノクローナル抗体を用いた、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲート、該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物等を用いたがん治療の適用対象の選別方法あるいは選別を補助するための方法も提供する。さらに、本発明は、上記のように選別した対象に、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲート、該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物等を投与することにより実際にがん治療を行うことを含んでもよい。
【００４１】
具体的には、本発明の方法は（1）本発明のアネキシンA1のN端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と、対象由来の試料とを接触させること、及び（2）前記試料中において、腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現しているアネキシンA1（腫瘍血管表面におけるアネキシンA1）のN端領域を、免疫染色によって検出することを含む。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体を用いてアネキシンA1のN端領域の存在を検出する場合の測定手段は特に限定されないが、好ましくは、免疫染色法が用いられる。免疫染色法を用いた具体的手段としては、免疫組織化学染色（IHC）法、フローサイトメトリー解析、マスサイトメトリー解析などが挙げられる。
【００４３】
免疫組織化学染色は、自体公知の方法に従って行うことができ（例えば、改訂四版 渡辺・中根 酵素抗体法、発行：学際企画株式会社、編集：名倉宏、長村義之、堤寛、ISBN4-906514-73-X C304を参照）、好ましくは、酵素抗体法（Enzyme labeled antibody method）及び蛍光抗体法等が用いられる。
【００４４】
例えば、酵素抗体法では、酵素で標識した抗体により、アネキシンA1のN端領域を検出する。標識を直接行う場合と、二次抗体を用いて間接的に行う場合がある。検出感度を上げるために種々の改良がなされ、ビオチン−ストレプトアビジンを用いたABC法、チラミド（タイラマイド）を用いたチラミド法（TSA法、Tyramide Signal Amplification）などの改良法で、非常に高い感度を実現できる。
【００４５】
標識酵素は、ペルオキシダーゼ（HRP、horseradish peroxidase）及びアルカリホスファターゼ（AP、alkaline phosphatase）が汎用されており、本発明においても好適に使用することができる。
【００４６】
一般的なプロトコールとして、必要により脱パラフィン又は固定処理した細胞標本を準備し、必要により前処理（例えば、生体色素の脱色又は除去処理、ブロッキング処理）又は抗原賦活化（温浴、マイクロウェーブ処理、オートクレーブ処理、プロテアーゼ処理等）し、一次抗体と反応させ（例えば、4℃〜室温で0.5〜24時間）、反応終了後、細胞標本を洗浄し、二次抗体と反応させ（例えば、4℃〜室温で5〜120分）、反応終了後、細胞標本を洗浄する。次いで、ジアミノベンジジン（3,3-diaminobenzidine：DAB）などの発色基質を添加し、発色させる。顕微鏡での形態観察のために、さらにヘマトキシリン染色等の対比染色を行ってもよい。
【００４７】
また、上述の酵素抗体法での酵素標識に換えて、蛍光色素で標識した抗体を用いることで、蛍光抗体法として、アネキシンA1のN端領域を検出してもよい。蛍光抗体法においても、標識を直接行ってもよく、また二次抗体を用いて間接的に行ってもよい。
【００４８】
免疫染色された試料を、撮影装置を搭載した光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡（蛍光染色の場合）などを用いて撮像し、デジタル画像としてコンピュータに保存する。デジタル画像は二次元データであっても三次元データであってもよいが、本発明においては二次元データで十分に解析可能である。解析を行う前に、フィルタリングなどの画像処理を行ってもよい。
【００４９】
免疫染色された試料の画像解析は、使用する顕微鏡等に搭載されている画像解析用ソフトウエア、その他の市販のソフトウエアを用いて行うことができる。市販ソフトウエアの一例として、ScanScope（登録商標、Aperio社）が挙げられる。
【００５０】
免疫染色強度の分類は、免疫組織染色の病理専門医による標準的な判定基準に従うことができ、例えばスコア0（未検出）、スコア＋1（弱い）、スコア＋2（中程度）、及びスコア＋3（顕著）のように分類してもよい。また、例えば、スコア＋1以上の場合、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲート、該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物等を用いたがん治療の適用対象と判断してもよい。
【００５１】
本明細書において、対象由来の試料とは、本発明のアネキシンA1のN端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させて、アネキシンA1のN末端領域の存在の有無を検出することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは、対象から生検等により採取されたがん細胞を含む生検サンプルを用いて作製された組織切片であり、より好ましくは、パラフィン包埋された組織切片である。
【００５２】
本発明の方法において使用されるアネキシンA1のN末端領域に結合するペプチド（以下、「本発明の方法で使用されるペプチド」と称する場合がある）としては、例えば、下記（I）〜（III）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
（I）(X1)[D] P[D] (X2)[D]のアミノ酸配列（該配列中、X1はW又はFを示し、X2はS又はTを示す。）、
（II）P[D] T[D] (X)n F[D]のアミノ酸配列（該配列中、(X)nは互いに独立して選択されるn個の任意のアミノ酸を示し、nは0〜4の整数を示す。）、
（III）前記（I）又は（II）のいずれかのアミノ酸配列のRetro-inversoであるアミノ酸配列
が挙げられる。
【００５３】
また、本発明の方法で使用されるペプチドは、例えば、下記（i）〜（vii）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
（i）T[D] I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] M[D]のアミノ酸配列、
（ii）L[D] R[D] F[D] P[D] T[D] V[D] L[D]のアミノ酸配列、
（iii）L[D] L[D] S[D] W[D] P[D] S[D] A[D]のアミノ酸配列、
（iv）S[D] P[D] T[D] S[D] L[D] L[D] F[D]のアミノ酸配列、
（v）M[D] P[D] T[D] L[D] T[D] F[D] R[D]のアミノ酸配列、
（vi）前記(i)〜(v)のいずれかのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸の挿入、置換若しくは欠失、又はこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列、
（vii）前記(i)〜(vi)のいずれかのアミノ酸配列のRetro-inversoであるアミノ酸配列
が挙げられる。
【００５４】
本明細書において、鎖状ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド標記の慣例に従って左側がN末端側、右側がC末端側で記載される。また、アミノ酸配列中の直後に記号[D]を付した各アミノ酸記号は該アミノ酸のD体を示し、アミノ酸配列中の直後に記号[D]を付していない各アミノ酸記号は、文脈に反しない限り、該アミノ酸のL体を示す。
【００５５】
上記（I）のアミノ酸配列は、W[D] P[D] S[D]、W[D] P[D] T[D]、F[D] P[D] S[D]、又はF[D] P[D] T[D]のいずれであってもよい。
【００５６】
上記（II）のアミノ酸配列において、整数nは0〜4であり、好ましくは2〜3である。Xは互いに独立して選択される任意のアミノ酸であってもよい。
【００５７】
本発明の方法で使用されるペプチドは上記の（I）〜（III）及び（i）〜（vii）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであってもよいし、これらの配列のN末端側及び/又はC末端側に1つ以上のアミノ酸が付加されていてもよい。
【００５８】
本明細書において、本発明の方法で使用されるペプチドとは、2つ以上のアミノ酸がペプチド結合したものをいう。本発明のペプチドの長さは特に限定されないが、例えば、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、又は少なくとも15個のアミノ酸を含んでもよい。本発明の方法で使用されるペプチドは、50個まで、45個まで、40個まで、35個まで、30個まで、25個まで、20個まで、19個まで、18個まで、17個まで、16個まで、15個まで、14個まで、13個まで、12個まで、11個まで、10個まで、9個まで、8個まで、又は7個までのアミノ酸からなるものであってもよい。
【００５９】
本発明の方法で使用されるペプチドは、D型アミノ酸及びL型アミノ酸の組み合わせにより構成されていてもよい。また、本発明の方法で使用されるペプチドは、37 C.F.R. 1.821-1.822に言及されるものなどの、修飾（modified）又は異常（unusual）アミノ酸を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。
【００６０】
本発明の方法で使用されるペプチドのアミノ末端及び/又はカルボキシ末端は、改変されていてもよい。また、本発明の方法で使用されるペプチドは、N末端又はC末端以外においても種々の修飾を受けていてもよい。
【００６１】
上記（vi）のアミノ酸配列中の置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は当該技術分野においてよく知られている。例えば、保存的アミノ酸置換は、側鎖の性質が類似するアミノ酸の間の置換として定義することができる。
【００６２】
上記（vi）の配列は、上記（I）又は（II）の配列に包含されるものであってもよく、その場合、上記（vii）の配列は上記（III）の配列に包含されるものとなる。
【００６３】
ペプチドのRetro-inverso異性体は、元となるペプチドに対して、各アミノ酸残基のキラリティが反対であり（"inverso"）、且つアミノ酸配列の方向が反転している（"Retro"）ものをいう。Retro-inverso異性体は、元となるペプチドと類似の構造及び機能を示すことが知られている（例えば、Acc. Chem. Res., 1993, 26 (5), pp 266-273及びPLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80390）。
【００６４】
本発明の方法で使用されるペプチドは、上記（I）〜（III）及び（i）〜（vii）から選択される配列を2つ以上含んでいてもよい。本発明の方法で使用されるペプチドは、上記（I）〜（III）及び（i）〜（vii）のいずれかの配列のタンデムリピート（即ち、同一の配列部分が互いに直接的に連結された構造）を含んでもよい。また、本発明の方法で使用されるペプチドは、上記（I）〜（III）及び（i）〜（vii）の異なる2以上の配列が直接的に連結された構造を含んでもよい。具体的なリピート構造として、例えば、T[D] I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] M[D] - T[D] I[D] T[D] E[D] P[D] T[D] M[D]、及びT[D] I[D] T[D] - T[D] I[D] T[D]が挙げられる。あるいは、本発明の方法で使用されるペプチドは、デンドリマーにより多価ペプチドを構成していてもよい。
【００６５】
本発明の方法で使用されるペプチドは遊離体であってもよいし、塩の形態であってもよい。本発明の方法で使用されるペプチドの塩としては、医薬的に許容される酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸及びリン酸などの無機酸との塩、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸及びクエン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属との塩、カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、アンモニウム及びトリエチルアミンなどのアミン類との塩が挙げられる。
【００６６】
本発明の方法で使用されるペプチドは、ヒト アネキシンA1中の配列番号1 で示される1〜15番目のアミノ酸からなる領域、又はマウス アネキシンA１中の配列番号3（MAMVSEFLKQARFLE）で示される1〜15番目のアミノ酸からなる領域に結合し得る。本発明の方法で使用されるペプチドは、例えばマウス又はヒトのアネキシンA１との分子間相互作用をQCM（Quartz Crystal Microbalance）法を用いて測定したときに、好ましくは10-6M未満、より好ましくは10-7 M未満、更により好ましくは5 x 10-8 M未満の解離定数（Kd値）を有し得る。上記測定のために、ATGen社（Seongnam-si, South Korea）から市販されている346アミノ酸残基から構成されるヒト組換えアネキシンA1タンパク質を用いることができる。
【００６７】
本発明の方法で使用されるペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチド若しくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は自体公知の方法により保護基を脱離することにより目的とするペプチドを製造することができる。
【００６８】
このようにして得られたペプチドは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体又は他の塩に変換することができる。
【００６９】
本発明の方法において使用される抗がん剤とは、悪性腫瘍（がん）の増殖を抑えることを目的とした薬剤をいう。抗がん剤の作用機序は特に限定されない。抗がん剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管阻害剤、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬などであってよい。本発明のコンジュゲートは、2つ以上の同一又は異なる抗がん剤を含んでいてもよい。
【００７０】
代謝拮抗剤は、例えば、葉酸代謝拮抗薬、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬（DHFR阻害薬）、ピリミジン代謝阻害薬、チミジル酸シンターゼ阻害薬、プリン代謝阻害薬、IMPDH阻害薬、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、L-アスパラギナーゼなどであってもよい。代謝拮抗剤の具体例としては、エノシタビン（サンラビン）、カペシタビン（ゼローダ）、カルモフール（ミフロール）、クラドリビン（ロイスタチン）、ゲムシタビン（ジェムザール）、シタラビン（キロサイド）、シタラビンオクホスファート（スタラシド）、テガフール（アチロン、アフトフール、テフシール、フトラフール、ルナシンほか）、テガフール・ウラシル（ユーエフティ）、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（TS-1:ティーエスワン）、ドキシフルリジン（フルツロン）、ネララビン（アラノンジー）、ヒドロキシカルバミド（ハイドレア）、フルオロウラシル（5-FU、カルゾナール、ベンナン、ルナコール、ルナボン）、フルダラビン（フルダラ）、ペメトレキセド（アリムタ）、ペントスタチン（コホリン）、メルカプトプリン（ロイケリン）、メトトレキサート（メソトレキセート）などが挙げられる。
【００７１】
アルキル化剤の具体例としては、シクロホスファミド（エンドキサン）、イホスファミド（イホマイド）、メルファラン（アルケラン）、ブスルファン、チオテパ（テスパミン）などのナイトロジェンマスタード系アルキル化剤、ニムスチン（ニドラン）、ラニムスチン（サイメリン）、ダカルバシン（ダカルバシン）、プロカルバシン（塩酸プロカルバシン）、テモゾロマイド（テモダール）、カルムスチン（ギリアデル）、ストレプトゾトシン（ザノサー）、ベンダムスチン（トレアキシン）などのニトロソウレア系アルキル化剤などが挙げられる。
【００７２】
抗がん性抗生物質の具体例としては、アクチノマイシンD（コスメゲン）、アクラルビシン（アクラシノン）、アムルビシン（カルセド）、イダルビシン（イダマイシン）、エピルビシン（エピルビシン塩酸塩、ファモルビシン）、ジノスタチンスチマラマー（スマンクス）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアシン）、ピラルビシン（ピノルビン、テラルビシン）、ブレオマイシン（ブレオ）、ペプロマイシン（ペプレオ）、マイトマイシンC（マイトマイシン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、リポソーマルドキソルビシン（ドキシル）などが挙げられる。
【００７３】
微小管阻害剤は、例えば、ビンブラスチン（エクザール）やビンクリスチン（オンコビン）、ビンデシン（フォルデシン）などのビンカアルカロイド系微小管重合阻害薬、パクリタキセル（タキソール）やドセタキセル（タキソテール）などのタキサン系微小管脱重合阻害薬などが挙げられる。
【００７４】
白金製剤としては、例えば、オキサリプラチン（エルプラット）、カルボプラチン（カルボプラチン、カルボメルク、パラプラチン）、シスプラチン（アイエーコール、コナブリ、シスプラチンなど）、ネダプラチン（アクプラ）などが挙げられる。
【００７５】
トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、カンプトテシン及びその誘導体（例えば、イリノテカン（カンプト）、ノギテカン（ハイカムチン）、SN-38など）などのI型トポイソメラーゼ阻害剤; ドキソルビシン（アドリアシン）などのアントラサイクリン系薬物、エトポシド（ラステッド、ベプシド）などのエピポドフィロトキシン系薬物、レボフロキサシン（クラビット）やシプロフロキサシン（シプロキサン）などのキノロン系薬物などのII型トポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。
【００７６】
分子標的薬としては、例えば、レゴラフェニブ（スチバーガ）、セツキシマブ（アービタックス）、パニツムマブ（ベクティビックス）、ラムシルマブ（サイラムザ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、アファチニブ（ジオトリフ）、クリゾチニブ（ザーコリ）、アレクチニブ（アレセンサ）、セリチニブ、レンバチニブ（レンビマ）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ラパチニブ（タイケルブ）、ペルツズマブ（パージェタ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブ（インライタ）、パゾパニブ（ヴォトリエント）、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ、イピリムマブ（ヤーボイ）、ベムラフェニブ（ゼルボラフ）、エベロリムス（アフィニトール）、テムシロリムス（トーリセル）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、ゲルダナマイシンなどが挙げられる。
【００７７】
抗がん剤はまた、抗血管新生剤であってもよい。抗血管新生剤は、血管内皮成長因子（VEGF）若しくは他の血管新生因子、又はこれらの受容体を阻害するものであり得る。抗血管新生剤の具体例としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、メタスタチン、抗VEGF抗体（例えば、アバスチン）、VEGFR-2インヒビター（例えば、SU5416、SU6668）などが挙げられる。
【００７８】
本発明の方法で使用されるコンジュゲートにおけるアネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと1つ以上の抗がん剤との間の結合の様式は特に限定されない。結合は、直接的なものであってもよいし、又はリンカーなどを介した間接的なものであってもよい。結合は、共有結合、非共有結合、又はこれらの組み合わせによるものであってもよい。1つ以上の抗がん剤は、直接的又は間接的に、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドのN末端、C末端、又はそれ以外の位置において結合していてもよい。ペプチドと抗がん剤との連結は当該技術分野において周知であり、本発明のコンジュゲートにおいても、該結合は任意の公知の手段によるものであってよい。
【００７９】
本発明の方法で使用されるコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供され得る。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含し得る。これらは、自体公知の方法に従って調製できる。
【００８０】
経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤若しくは賦形剤を含有していても良い。
【００８１】
なお前記した組成物は、上記コンジュゲートとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００８２】
上記の非経口用又は経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。ペプチド又はコンジュゲートの含有量としては、投薬単位剤形当たり通常1〜500mg、とりわけ注射剤では1〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記ペプチド又はコンジュゲートが含有されていることが好ましい。
【００８３】
本発明の方法で使用されるコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む組成物の投与量は、投与目的、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なり、当業者により適宜設定することができる。
【実施例】
【００８４】
以下に実施例などを挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例などにより限定されるものではない。
【００８５】
実施例１（マウスモノクローナル抗体の作製）
（1）免疫原の作成
合成ペプチドMC16のC末端のシステイン（Cys）を、二価反応性試薬を用いてキャリアタンパク質（BSA）に結合させて免疫原を作製した。
（2）スクリーニング用HRP標識体の作製
合成ペプチドMC16のC末端のCysを、二価反応性試薬を用いて西洋わさび由来ベルオキシダーゼ（HRP)に結合させてスクリーニング用HRP標識体を作製した。
【００８６】
（3）免疫
上記（1）で作製した免疫原性を持つ抗原を、FCAと混和して乳化させ、Balb/cマウス1匹に対して、計算上200μgを尾根部筋肉内に注射（免疫）した（合計3匹）。初回の抗体活性測定の結果を踏まえ、さらに同じ抗原を、FIAと混和して乳化させ、2週間間隔で2回、マウス1匹に対して、計算上50μgを皮下に注射（追加免疫）した。2回の追加免疫後の抗体活性測定の結果を踏まえ、マウスの腹腔に最終免疫（マウス1匹に対して計算上100μg）を実施した。
【００８７】
（4）試血及び抗体活性測定
初回及び追加免疫から一定期間経過した後、マウスより試血して、合成MC16ペプチドをプラスチックプレートに結合させたELISAにより、抗体活性の測定を実施した。その結果から、細胞融合を実施するマウスを選択した。
（5）リンパ球及び抗血清の採取
最終免疫より3日後に脾臓を採取し、リンパ球を分離した後、−80℃で凍結保存した。同時に、採血を実施し、血清を分離した後、−40℃で凍結保存した。得られた抗血清を、スクリーニング時の陽性コントロールとして用いた。
【００８８】
（6）細胞融合〜培養
上記（5）で得られたリンパ球とマウスミエローマを、50%ポリエチレングリコールの存在下で細胞融合を実施した。融合細胞（ハイブリドーマ）を、HAT培地に分散させ、96ウェルマイクロプレート4枚に分注し、37℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。細胞融合から6日間にHT培地に交換し、さらに培養を続けた。
【００８９】
（7）一次スクリーニング〜培養
細胞融合から9日後、96ウェルマイクロプレートの各ウェルから培養上清をサンプリングし、培養上清のMC16に対する反応を、合成MC16ペプチドをプラスチックプレートに結合させたELISAで測定し、一次スクリーニングを実施した。
（8）二次スクリーニング及び細胞の凍結保存
24ウェルマイクロプレートに移して3日間拡大培養させた後、マイクロプレートの各ウェルから培養上清をサンプリングし、上記と同様のELISAにより、二次スクリーニングを実施し、選択されたウェルの細胞の凍結保存を実施した。
【００９０】
（9）抗体活性測定
2回目の追加免疫から2週間後、試血で得られた抗血清について、上記と同様のELISAにより、抗体活性を測定した。その結果、免疫したすべてのマウスで目的の抗原に対する抗体活性が確認され、細胞融合の実施に十分であると判断された。
【００９１】
（10）一次スクリーニング
上記と同様のELISAを実施し、目的の特異性を示す40個のクローンを選択し、拡大培養した。
（11）二次スクリーニング及び細胞の凍結保存
上記と同様のELISAを実施した結果、多数の陽性クローンが得られた。該陽性クローンうち、18クローンの細胞を凍結保存した。
【００９２】
実施例2（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（クローン31-8D）の選択）
実施例1にて作製したクローンから反応性の高いクローンを6個選び、培養マウス血管内皮細胞の免疫染色で最も優れた結果を与えたクローン(#31-8D, マウス IgG2b)を選択した。
【００９３】
実施例3（クローン31-8Dが生産する抗体（抗MC16抗体）の結合アッセイ）
抗MC16抗体のANXA1タンパク質に対する結合性を確認するためにプレートアッセイを行った。具体的には、全長ヒトANXA1タンパク質を組み換えDNAを用いたバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で作製し、該作製したANXA1タンパク質をELISAプラスチックウェルに付着させた。コントロール培地（細胞培養用の培養液）、コントロールIgG（mouse IgG2b）、プロテイン Aカラムで精製した抗MC16抗体をそれぞれ反応させた後、HRP-anti-mouse IgGを反応させパーオキシダーゼの酵素活性を、パーオキシダーゼの基質を用いた発色で定量した。また、抗MC16抗体の特異性について、ウェスタンブロッティングを用いて確認した。
【００９４】
上記アッセイの結果、クローン31-8Dが生産する抗体（抗MC16抗体）は、全長ヒト アネキシンA1と結合するが、N末端ドメイン（N末端の9アミノ酸）を欠損したアネキシンA1とは結合しないことを、ELISA（図1）及びウェスタンブロット（図2右）により確認した。
一方、ウサギの抗アネキシンA1抗体（Invitrogen）は、全長ヒト アネキシンA1及びN末端ドメイン（N末端の9アミノ酸）を欠損したアネキシンA1の両方に結合した（図2）。
【００９５】
実施例4（蛍光免疫染色の検討）
マウス血管内皮細胞F2を単層培養し、マウスメラノーマB16細胞でマウスの皮下に形成した腫瘍の抽出液を加え２日間培養した。F2細胞の表面を抗MC16抗体と反応させた後、蛍光標識した二次抗体で反応させた。
マウス血管内皮F2細胞の蛍光免疫染色イメージの結果から分かるように、本発明の抗MC16抗体がマウスのAnxa1タンパク質にも結合する事が強く示唆された。また、B16腫瘍抽出液にはF2細胞表面にアネキシンA1のN末端ドメインを発現誘導する活性物質が含まれている可能性があることも示唆された（図3）。
【００９６】
実施例5（抗体パーオキシダーゼ染色）
膠芽腫を持った患者から採取した腫瘍組織のパラフィン包埋組織切片を、抗MC16抗体を用いたパーオキシダーゼ法で免疫染色した。その結果、抗MC16抗体が、腫瘍内の血管内皮細胞を陽性に染色することを確認した（図4左）。図4右は、ヘマトキシリン−エオシン染色である。
【００９７】
実施例6（抗体パーオキシダーゼ染色）
前立腺がん腫瘍組織のパラフィン包埋組織切片を、抗MC16抗体とInvitrogenから市販のウサギanti-ANXA1抗体を用いたパーオキシダーゼ法で免疫染色した。その結果、両抗体とも腫瘍血管を陽性に染色したが、抗MC16抗体の染色結果はバックグラウンドも低く優れている事が判明した（図5〜8）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明のモノクローナル抗体は、アネキシンA1のN末端領域に特異的に結合するため、腫瘍等組織の血管内皮表面におけるアネキシンA1のN末端領域の存在の有無を検出することができ、従って、例えば、アネキシンA1のN末端領域に結合するペプチドと抗がん剤とのコンジュゲートを用いたがん治療の適用対象の選別等を行うために利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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