(57)【要約】【課題】光力学療法を使用する対象の標的細胞、例えば疾患細胞にアポトーシスを誘発するための小分子コンジュゲートに基づく改善された光増感性プローブを提供すること。【解決手段】本発明は、光力学療法を使用して患者の標的細胞を破壊するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどのフタロシアニン染料にコンジュゲートした小さな分子量（＜５０ｋＤａ）のタンパク質若しくはペプチド又は小分子ベースの光増感剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患又は病態を患っている対象において細胞毒性を誘発する方法であって：
（ａ）対象の細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどのフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な薬剤を該対象に投与し；そして、
（ｂ）細胞死を誘発するのに有効な量で適切な励起光を前記細胞に照射すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記疾患又は病態が、血管疾患、癌、細菌性バイオフィルムに起因する感染、抗生物質抵抗性創傷感染、光線性角化症、酒さ、にきび、乾癬から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血管疾患が滲出型加齢性黄斑変性症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、頭頚部癌、神経内分泌系の癌、皮膚癌、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、固形腫瘍を患っているか又は固形腫瘍を患っていた、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が固形腫瘍内又は対象の血中に存在している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記励起光が６６０〜７４０ｎｍの波長を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが、リガンド、ペプチド、小分子、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが約５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが約１０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドがＥＧＦである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、及びＳＯＲ−Ｃ２７から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記小分子が、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤が、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが放射性核種にコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブが、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選択されるメンバーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブがフルオロフォアにコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ａ）の投与が、治療的に有効な薬剤を対象の血中に注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（ｂ）の照射が、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
抗癌剤を対象に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
癌を患っている対象の固形腫瘍を処置する方法であって：
（ａ）固形腫瘍の細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを包含する治療的に有効な薬剤を対象に投与し、そして、
（ｂ）固形腫瘍のサイズを低減するのに有効な量で適切な励起光を固形腫瘍に照射すること、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記固形腫瘍が、乳房の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、肺の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、胃の腫瘍、膵臓の腫瘍、肝臓の腫瘍、膀胱の腫瘍、脳腫瘍、神経内分泌系の腫瘍、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記励起光が６６０〜７４０ｎｍの波長を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブが、リガンド、ペプチド、小分子、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブが約５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プローブが約１０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記リガンドがＥＧＦである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチドが、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、及びＳＯＲ−Ｃ２７から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記小分子が、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤が、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブが放射性核種にコンジュゲートされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プローブが、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選択されるメンバーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記プローブがフルオロフォアにコンジュゲートされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記照射が、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３７】
抗癌剤を対象に投与することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
対象の癌細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な組成物であって、ここで、該プローブが約５０ｋＤａ未満の分子量を有する組成物。
【請求項３９】
前記プローブが約１０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記プローブが、リガンド、ペプチド、小分子、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記リガンドがＥＧＦである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ペプチドが、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ペプチドが、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、及びＳＯＲ−Ｃ２７から成る群から選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
前記小分子が、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤が、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記プローブが放射性核種にコンジュゲートされる、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４７】
前記プローブが、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選択されるメンバーである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記プローブがフルオロフォアにコンジュゲートされる、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ペプチドはクロロトキシンである、請求項４０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年６月２日出願の米国仮特許出願第６２／００６，７９０号；；２０１４年６月２５日出願の米国仮特許出願第６２／０１７，１６５号；２０１４年１０月２１日出願の米国仮特許出願第６２／０６６，８０７号及び２０１４年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６２／０８２，０５２号の優先権を主張するものであり、そのすべての教示の全体を、あらゆる目的のために参照によって本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００２】
光力学療法は、体内で着目の細胞を破壊するために光増感剤及び照射光を使用する治療法である。該光増感剤は特異的な波長の光に晒されるとき、付近の細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／又は自食作用を誘発できる細胞傷害性の活性酸素種を生じる。
【０００３】
現在の光力学療法は、標的細胞に光増感剤を局在化させるための抗体又はそのフラグメントの使用に頼っている。しかしながら、光力学療法を使用する対象の標的細胞、例えば疾患細胞にアポトーシスを誘発するための小分子コンジュゲートに基づく改善された光増感性プローブを必要としている。本発明は、この需要を満たし、更に関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態において、本発明は、疾患又は病態を患っている対象において細胞毒性、例えばアポトーシスを誘発する方法を提供する。該方法は、（ａ）対象の細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどのフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な薬剤を対象に投与し；（ｂ）細胞死を誘発するのに有効な量で適切な励起光を細胞に照射することを含む。プローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸは式Ｉａの化合物である。
【０００５】
いくつかの態様において、疾患又は病態は、血管疾患、癌、細菌性バイオフィルムに起因する感染、抗生物質抵抗性創傷感染、光線性角化症、酒さ、にきび、及び乾癬から成る群から選択される。血管疾患は滲出型加齢性黄斑変性症である。場合によっては、癌は、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、気管支内癌、バレット食道における高度異形成、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、頭頚部癌、神経内分泌癌、皮膚癌、及びその組み合わせから成る群から選択される。
【０００６】
いくつかの態様において、対象は、固形腫瘍を患っているか又は固形腫瘍を患っていた。対象の細胞は、固形腫瘍内、又は対象の血中若しくは転移部位に存在し得る。
【０００７】
場合によっては、適切な励起光は６６０〜７４０ｎｍ、例えば６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、又は７４０ｎｍの波長を有する。
【０００８】
いくつかの態様において、プローブは、リガンド、ペプチド、小タンパク質、小分子、及びその組み合わせから成る群から選択される。場合によっては、プローブは約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。他の場合には、プローブは約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。リガンドはＥＧＦであってもよい。ペプチドは、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、ＲＧＤ、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、及びＳＯＲ−Ｃ２７から成る群から選択される。他の態様において、小分子は、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される。場合によっては、小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤は、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される。或いは、プローブは、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選ばれたメンバーであってもよい。場合によっては、プローブは、ペプチドリガンド、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）又はその誘導体である。
【０００９】
いくつかの態様において、プローブは放射性核種にコンジュゲートされるか又はその中に放射性核種を有する。プローブはまた、フルオロフォアにコンジュゲートされてもよい。
【００１０】
いくつかの態様において、ステップ（ａ）の投与は、治療的に有効な薬剤、プローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを対象の血中に注射することを含む。いくつかの態様において、ステップ（ｂ）の照射は、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することを含む。本明細書中に記載した方法はまた、抗癌剤を対象に投与することを含んでもよい。プローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸは式Ｉａの化合物である。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、癌を患っている対象の固形腫瘍を処置する方法を提供する。該方法は、（ａ）固形腫瘍の細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な薬剤を対象に投与し；（ｂ）固形腫瘍のサイズを低減するために有効な量で適切な励起光を該細胞に照射することを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、固形腫瘍は、乳房腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫瘍、膀胱腫瘍、脳腫瘍、神経内分泌腫瘍、及びその組み合わせから成る群から選択される。
【００１３】
いくつかの態様において、フタロシアニン染料はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸである。場合によっては、適切な励起光は６６０〜７４０ｎｍ、例えば６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、又は７４０ｎｍの波長を有する。
【００１４】
いくつかの態様において、プローブは、リガンド、ペプチド、小タンパク質、小分子、及びその組み合わせから成る群から選択される。場合によっては、プローブは約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。他の場合には、プローブは約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。リガンドはＥＧＦであってもよい。ペプチドは、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、及びＳＯＲ−Ｃ２７から成る群から選択される。他の態様において、小分子は、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される。場合によっては、小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤は、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される。或いは、プローブは、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選ばれたメンバーであってもよい。場合によっては、プローブは、ペプチドリガンド、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）又はその誘導体である。
【００１５】
その他の態様において、プローブは放射性核種にコンジュゲートされる。プローブはまた、フルオロフォアにコンジュゲートされてもよい。
【００１６】
いくつかの態様において、ステップ（ｂ）の照射は、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することを含む。本明細書中に記載した方法はまた、抗癌剤を対象に投与することを含んでもよい。
【００１７】
更に別の実施形態において、本発明は、対象の癌細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどのフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な組成物を提供し、ここで、該プローブは約５０ｋＤａ未満の分子量を有する。いくつかの態様において、プローブは約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００１８】
プローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸは式Ｉａの化合物である。  場合によっては、適切な励起光は６６０〜７４０ｎｍ、例えば６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、又は７４０ｎｍの波長を有する。
【００１９】
いくつかの態様において、プローブは、リガンド、ペプチド、小タンパク質、小分子、及びその組み合わせから成る群から選択される。リガンドはＥＧＦであってもよい。ペプチドは、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、及びＳＯＲ−Ｃ２７から成る群から選択される。他の態様において、小分子は、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される。場合によっては、小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤は、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される。或いは、プローブは、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選ばれたメンバーであってもよい。場合によっては、プローブは、ペプチドリガンド、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）又はその誘導体である。
【００２０】
いくつかの態様において、プローブは放射性核種にコンジュゲートされるか又はその中に放射性核種を有する。プローブはまた、フルオロフォアにコンジュゲートされてもよい。
【００２１】
本発明の他の対象、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図面によって当業者にとって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Castano et al., Nat Rev Cancer, 2006, 6(7):535-545によって提示された光力学療法の概略図を提供する。
【図２】図２は、３７℃のＰＢＳ中でのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの安定性を例証する。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートのシグナル強度に対するｐＨの影響を示す。図３Ａは、室温にてｐＨ２．１〜ｐＨ８におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの安定性を例証する。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートのシグナル強度に対するｐＨの影響を示す。図３Ｂは、３７℃にてｐＨ２〜ｐＨ８におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの安定性を例証する。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、１時間のインキュベーション後（図４Ａ）及び２．５時間のインキュベーション後（図４Ｂ）の、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に見られるものなどのタンパク質へのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの結合を示す。図４Ａでは、マーカーがオボアルブミンレーン内にあふれ出し、見てわかるマーカーラダーを生じた。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、１時間のインキュベーション後（図４Ａ）及び２．５時間のインキュベーション後（図４Ｂ）の、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）に見られるものなどのタンパク質へのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの結合を示す。図４Ａでは、マーカーがオボアルブミンレーン内にあふれ出し、見てわかるマーカーラダーを生じた。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦと共にインキュベートし、照射を受けたＡ４３１細胞における照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後の細胞膜の泡状突起（矢印）を示す。図５Ａ〜Ｃは３つの異なった細胞を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｃは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦと共にインキュベートし、照射を受けたＡ４３１細胞における照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後の細胞膜の泡状突起（矢印）を示す。図５Ａ〜Ｃは３つの異なった細胞を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦと共にインキュベートし、照射を受けたＡ４３１細胞における照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後の細胞膜の泡状突起（矢印）を示す。図５Ａ〜Ｃは３つの異なった細胞を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦとのインキュベーションと照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後のＡ４３１細胞の細胞生存率を示す。図６Ａは照射を受けていない対照Ａ４３１細胞を示す。上のパネルは細胞の位相画像（ＤＩＣ画像）を表す。下のパネルは細胞の（７００ｎｍにおける）蛍光画像を表す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦとのインキュベーションと照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後のＡ４３１細胞の細胞生存率を示す。図６Ｂは照射を受けた対照Ａ４３１細胞を示す。上のパネルは細胞の位相画像（ＤＩＣ画像）を表す。下のパネルは細胞の（７００ｎｍにおける）蛍光画像を表す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦとのインキュベーションと照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後のＡ４３１細胞の細胞生存率を示す。図６Ｃは、照射なしでＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦと共にインキュベートされたＡ４３１細胞を示す。上のパネルは細胞の位相画像（ＤＩＣ画像）を表す。下のパネルは細胞の（７００ｎｍにおける）蛍光画像を表す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦとのインキュベーションと照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後のＡ４３１細胞の細胞生存率を示す。図６Ｄは、照射の２４時間後にＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦと共にインキュベートされたＡ４３１細胞を示す。上のパネルは細胞の位相画像（ＤＩＣ画像）を表す。下のパネルは細胞の（７００ｎｍにおける）蛍光画像を表す。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｂは、様々なＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸコンジュゲートとのインキュベーション及び照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後のＡ４３１細胞の細胞生存率を示す。図７ＡはＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブとインキュベートし、照射を受けたＡ４３１細胞を示す。照射後、細胞の６２％がネクローシスであった。上のパネルは細胞の位相画像（ＤＩＣ画像）を表す。下のパネルは細胞の（７００ｎｍにおける）蛍光画像を表す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、様々なＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸコンジュゲートとのインキュベーション及び照射（２４Ｊ／ｃｍ２）後のＡ４３１細胞の細胞生存率を示す。図７ＢはＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦとインキュベートし、照射を受けたＡ４３１細胞を示す。処置された細胞の３６％がネクローシスであった。上のパネルは細胞の位相画像（ＤＩＣ画像）を表す。下のパネルは細胞の（７００ｎｍにおける）蛍光画像を表す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、インビボにおけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのクリアランス及び生体分布を示す。図８Ａは、染料投与後５分から２４時間の範囲の時点におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを投与したヌードマウスの一連の背面図を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、インビボにおけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのクリアランス及び生体分布を示す。図８Ｂは、画像取り込み時点を通じた動物全体の総蛍光に関するプロットを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９ＢはインビボにおけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのクリアランス及び生体分布を示す。図９Ａは、染料投与後５分から２４時間の範囲の時点におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを投与したヌードマウスの一連の腹面図を示す。白い矢印は肝臓の位置を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９ＢはインビボにおけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのクリアランス及び生体分布を示す。図９Ｂは、画像取り込み時点を通じた動物全体の総蛍光に関するプロットを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを投与したヌードマウスから採取された臓器内の染料の存在を例証する。図１０Ａでは、肝臓と腎臓以外の臓器ではＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの注射後２４時間にてわずかか又はまったくシグナルが存在しないことが示された。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを投与したヌードマウスから採取された臓器内の染料の存在を例証する。図１０Ｂは、腎臓の端から端までの長軸方向のスライスを示す（４ｎｍｏｌｅの染料）。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを投与したヌードマウスから採取された臓器内の染料の存在を例証する。図１０Ｃは、注射後２４時間における様々な臓器で検出されたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのレベルのグラフを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｅは、照射あり又はなしにて適宜標識パニツムマブを与えた後の結果を示す。図１１Ａは、未標識パニツムマブを投与し、照射なしの細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像であり、中央の画像は７００ｎｍの画像であり、及び右側の画像は組合せた画像である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｅは、照射あり又はなしにて適宜標識パニツムマブを与えた後の結果を示す。図１１Ｂは、パニツムマブ−７００ＤＸを投与し、照射なしの細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像であり、中央の画像は７００ｎｍの画像であり、及び右側の画像は組合せた画像である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｅは、照射あり又はなしにて適宜標識パニツムマブを与えた後の結果を示す。図１１Ｃは、未標識パニツムマブを投与し、照射を受けた細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像であり、中央の画像は７００ｎｍの画像であり、及び右側の画像は組合せた画像である。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｅは、照射あり又はなしにて適宜標識パニツムマブを与えた後の結果を示す。図１１Ｄは、パニツムマブ−７００ＤＸを投与し、照射を受けた細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像であり、中央の画像は７００ｎｍの画像であり、及び右側の画像は組合せた画像である。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、生存率及び活力に関するいくつかの分析による処置後の細胞数と％ネクローシスの結果を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｄは、陽性対照、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブと比較した、ネクローシス及び細胞形態に対する照射あり又はなしでのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦの効果を示す。図１２Ａは対照及びプローブなしを示す。図１２Ａは、プローブを投与せず、照射を受けた陰性対照細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像を表し、右側の画像は７００ｎｍの画像を表す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｄは、陽性対照、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブと比較した、ネクローシス及び細胞形態に対する照射あり又はなしでのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦの効果を示す。図１２Ｂ〜１２Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブ（Ｐａｎ−７００ＤＸ）プローブ又はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦ（ＥＧＦ−７００ＤＸ）プローブを投与し、１０分間照射を受けた（３２Ｊ／ｃｍ２）細胞における細胞形態とＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの存在を示す。図１２Ｂは、ＥＧＦ−７００ＤＸが投与され、照射を受けなかった陰性対照細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像を表し、右側の画像は７００ｎｍの画像を表す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｄは、陽性対照、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブと比較した、ネクローシス及び細胞形態に対する照射あり又はなしでのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦの効果を示す。図１２Ｂ〜１２Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブ（Ｐａｎ−７００ＤＸ）プローブ又はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦ（ＥＧＦ−７００ＤＸ）プローブを投与し、１０分間照射を受けた（３２Ｊ／ｃｍ２）細胞における細胞形態とＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの存在を示す。図１２Ｃは、ＥＧＦ−７００ＤＸを受け、照射ありの細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像を表し、右側の画像は７００ｎｍの画像を表す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、陽性対照、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブと比較した、ネクローシス及び細胞形態に対する照射あり又はなしでのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦの効果を示す。図１２Ｂ〜１２Ｄは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブ（Ｐａｎ−７００ＤＸ）プローブ又はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦ（ＥＧＦ−７００ＤＸ）プローブを投与し、１０分間照射を受けた（３２Ｊ／ｃｍ２）細胞における細胞形態とＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの存在を示す。図１２Ｄは、パニツムマブ−７００ＤＸを受け、照射ありの細胞を示す。左側の画像はＤＩＣ画像を表し、右側の画像は７００ｎｍの画像を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１３Ｆ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１３Ｇ】図１３Ａ〜１３Ｇは、照射前に標識することがどれくらい有効であったかを例証するために、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、照射後２時間、処置１（図１４Ａ）、３（図１４Ｂ）、５（図１４Ｃ）又は７（図１４Ｄ）を受けた細胞のＤＩＣ画像を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、照射後２時間、処置１（図１４Ａ）、３（図１４Ｂ）、５（図１４Ｃ）又は７（図１４Ｄ）を受けた細胞のＤＩＣ画像を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄは、照射後２時間、処置１（図１４Ａ）、３（図１４Ｂ）、５（図１４Ｃ）又は７（図１４Ｄ）を受けた細胞のＤＩＣ画像を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、照射後２時間、処置１（図１４Ａ）、３（図１４Ｂ）、５（図１４Ｃ）又は７（図１４Ｄ）を受けた細胞のＤＩＣ画像を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ａは陰性対照（ＮＣ）を表す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ｂは、１μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。図１５Ｃは、１μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けなかった細胞を示す。図１５Ｄは、０．５μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。図１５Ｅは、０．２５μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。図１５Ｆは、０．１μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。図１５Ｇは、カスパーゼ３／７のデータのグラフを提供する。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ｃは、１μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けなかった細胞を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ｄは、０．５μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ｅは、０．２５μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。
【図１５Ｆ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ｆは、０．１μＭのＥＧＦ−７００ＤＸで処置され、照射を受けた細胞を示す。
【図１５Ｇ】図１５Ａ〜１５Ｇは、様々な量（投薬量）のＥＧＦ−７００ＤＸプローブで処置された細胞のカスパーゼ３／７レベルのＦＡＣＳ分析を示す。図１５Ｇは、カスパーゼ３／７のデータのグラフを提供する。
【図１６】図１６は、一重項酸素の産生について評価された染料及びコンジュゲートプローブ（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレート（７００ＤＸ）、ＥＧＦ、ＲＧＤ、及びＩｇＧコンジュゲート）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
【００２４】
本発明は、血管疾患、癌、皮膚の病態、皮膚感染、及び細菌性バイオフィルムによる他の感染などの疾患又は病態を患っている対象において標的細胞の死滅を誘発するための組成物及び方法に関する。より特に、本発明は、特定の標的細胞のアポトーシス及び／又はネクローシスを促進するためにプローブ（例えば、生体分子）にコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）及び照射の使用を伴う。
ＩＩ．定義
【００２５】
本明細書中に使用される場合、次の用語は、別段の指定がない限り、それらが有すると見なされる意味を有する。
【００２６】
用語「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、本明細書中で使用される場合、１つのメンバーの態様だけでなく、２つ以上のメンバーの態様も含む。例えば、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段の明確な命令がない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は複数の斯かる細胞を含み、そして、「ｔｈｅ ａｇｅｎｔ（薬剤）」への言及は、当業者などに知られている１若しくは複数の薬剤への言及を含む。
【００２７】
用語「約（「about」及び「approximately」）」は、測定の性質又は精度を考慮して計測した数量に関する許容される程度の誤差を一般に意味するものとする。誤差の典型的で、代表的な程度は、所与の値又は値域の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、及びより好ましくは５％以内である。或いは、そして特に生物系では、用語「約（「about」及び「approximately」）」は、所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられた数量は、別段の明白な記述がない限り、大体であり、用語「約（「about」及び「approximately」）」は明確に記述されないときには、推測され得る。
【００２８】
「光力学療法」又は「ＰＤＴ」という用語は、その場で細胞傷害性の活性酸素種を発生し、そしてそれが細胞を不活化できる無毒性薬剤と光増感性照射の両方を用いた、細胞、組織又は臓器の非外科的な処置を含む。例えば、分子標的療法は、特定の細胞表面タンパク質を介して標的細胞に特異的に結合するプローブ（例えば、生体分子）にコンジュゲートした近赤外（ＮＩＲ）フタロシアニン染料、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸに基づく、標的特異的な光増感剤を利用し得る。ＰＤＴのほとんどの適用において、細胞毒性薬は、タイプＩ又はタイプＩＩ ＰＤＴ経路と呼ばれる２つの異なったプロセスのうちの１つによって作り出される。タイプＩはラジカルを発生し、タイプＩＩは一重項酸素を発生する。ラジカルと一重項酸素は共に組織の酸化破壊を引き起こす。
【００２９】
「細胞毒性」という用語は、細胞を毒素に晒すことによる細胞の死滅又はそのプロセスを含む。
【００３０】
「細胞毒性薬」という用語は、細胞機能を阻害又は予防する、及び／又は細胞死又は破壊を引き起こす物質を含む。限定されない細胞毒性薬は、その断片及び／又は異型を含めた、放射性同位体；化学療法薬又は薬剤（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びその断片；抗生物質；小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素を含む。
【００３１】
「癌」という用語は、無調節の細胞増殖を一般的に特徴とする哺乳動物の生理的状態を含む。癌の制限されることのない例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性リンパ腫が挙げられる。より特に斯かる癌の例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平細胞癌）、小細胞肺癌を含めた肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、消化器癌を含めた胃体又は胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓又は腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、並びに頭頚部癌が挙げられる。
【００３２】
「固形腫瘍」という用語は、良性でも悪性でも、通常包嚢を含まない細胞の異常な塊を指す。固形腫瘍の制限されることのない例としては、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられる。
【００３３】
「フタロシアニン染料」という用語は、タンパク質などのプローブにコンジュゲートするのに有用なシリコンフタロシアニン染料を含む。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのようなフタロシアニン染料の制限されることのない例は、例えば、米国特許第７，００５，５１８号に記載されており、その開示全体をあらゆる目的のために参照によって本明細書中に援用する。
【００３４】
用語「ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ」又は「ＩＲ７００」はフタロシアニン染料であり、そしてそれは、プローブにコンジュゲートされると、治療的に有効な薬剤になる。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ染料は、プローブへのコンジュゲートを可能にするＮＨＳエステル結合を有し得る。場合によっては、プローブは第一級アミン（例えば、アミノ基）を有し、ここで、７００ＤＸのＮＨＳエステルとプローブのアミノ基が反応してアミド結合を形成し、そして、プローブを７００ＤＸに連結して、治療的に有効な薬剤を形成する。ＮＨＳエステルＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸは、以下の構造を有する：
【００３５】
【化１】
2020125343.tif 000003
【００３６】
染料はＬＩ−ＣＯＲ（Lincoln, NE）から市販されている。アミノ反応性ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸは、比較的親水性の染料であり、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのＮＨＳエステルを使用してプローブと共有結合によりコンジュゲートし得る。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの他のバリエーションは、米国特許第７，００５，５１８号（参照により本明細書中に援用する）で開示され、それらも本発明で有用である。カルボキシレート誘導体は、以下の名称及び構造を有する：ケイ酸（５−），ビス［Ｎ−［３−［（ヒドロキシ−銅Ｏ）ジメチルシリル］プロピル］−３−スルホ−Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−１−プロパナミニウマート（４−）］［６−［［［３−［（２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン−イル−銅Ｎ２９、銅Ｎ３０、銅Ｎ３１、銅Ｎ３２）オキシ］プロポキシ］カルボニル］アミノ］ヘキサノアート（３−）］−，ナトリウム（１：５）ＣＡＳ登録番号：［1623074-46-3］：
【００３７】
【化２】
2020125343.tif 000004
【００３８】
「シアニン染料」という用語は、ポリメチン鎖などの不飽和架橋によってつなぎ合わせられた２つの置換又は非置換含窒素ヘテロ環を有する化合物を指す。ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷなどのシアニン染料の制限されることのない例は、例えば米国特許第６，９９５，２７４号；同第７，５０４，０８９号；同第７，５９７，８７８号；同第８，２２７，６２１号；同第８，３０３，９３６号に記載されており；その開示全体を、あらゆる目的のために参照によって本明細書中に援用する。
【００３９】
「赤外線蛍光染料」、「ＩＲ蛍光染料」又は「ＩＲ染料」という用語は、約６００〜１０００ｎｍの近赤外スペクトルに吸収及び発光波長を有する染料を指す。赤外線蛍光染料は近赤外（ＮＩＲ）蛍光画像システムを使用することで検出できる。
【００４０】
「プローブ」又は「生体分子」という用語は、生物系における使用のための天然又は合成分子を含む。好ましい生体分子としては、タンパク質、ペプチド、小分子、リガンド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、デオキシ核酸、ＤＮＡの断片、ＲＮＡの断片、ヌクレオチド三リン酸、アシクロターミネータ三リン酸、及びＰＮＡが挙げられる。
【００４１】
「コンジュゲートされる」、「連結される」、又は「標識された」という用語は、少なくとも１つの化学部分のタンパク質への、該部分を該タンパク質に共有結合を可能にする好適な架橋化剤による連結を指す。
【００４２】
「連結基」という用語は、別の材料（例えば、プローブ）上の官能基と化学的に反応できて、共有結合などの連結を形成する化合物上の部分を含む。例えば、R. Haughland, The Handbook-- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 9th Edition, Molecular Probes, Inc. (1992)を参照のこと。典型的に、連結基は、それぞれ求核試薬又は求電子試薬である対応する官能基への曝露によって共有結合を形成できる求電子試薬又は求核試薬である。或いは、連結基は、光励起性基であり、適切な波長の光を用いた照明後にだけ化学的に反応するようになる。典型的には、連結基を担持する染料と、染料とコンジュゲートされるべき材料「プローブ」との間のコンジュゲーション反応は、染料をプローブに取り付けて治療薬を形成するように新しい連結に組み込まれている連結基の１若しくは複数の原子をもたらす。
【００４３】
「リンカー」という用語は、染料をプローブに取り付ける原子結合を含む。
【００４４】
用語「処置する」及び「処置」は、治療療法及び予防薬又は予防措置の両方を指し、ここで、目的は、癌の増殖、発生又は転移などの望ましくない生理学的変化又は疾患の阻止又は減速（減少）することである。例えば、有益であるか又は所望の臨床結果としては、これだけに限定されるものではないが、検出可能であるか又は検出不可能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の状態安定化（すなわち、悪化しない）、疾病進行の遅延又は減速、疾患の状態の改善、及び寛解（部分的か、全体的かにかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けなかった場合の予想された生存と比較して生存を長引かせることも意味し得る。処置を必要としているヒトとしては、既に病状又は疾患を患っているヒト、並びに病状又は疾患を患う傾向があるか又は疑われヒト、或いは病状又は疾患が予防されるべきヒトが挙げられる。
【００４５】
「治療的有効量」という用語は、単独で又は（単数若しくは複数の）追加の治療薬（化学療法薬などの）と一緒に、斯かる組成物で処置されるべき対象又は細胞において所望の効果を達成するために十分な組成物の量を指す。治療薬又は組成物（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−プローブなど）の有効量は、これだけに限定されるものではないが、処置されるべき対象又は細胞、特定の治療薬、及び治療用組成物の投与の様式を含めたいくつかの要因に依存し得る。例えば、治療的有効量又は濃度は、進行（転移癌など）妨げる、進行を遅らせる、又は疾患の退縮を引き起こすのに十分であるか、或いは癌などの疾患によって引き起こされる症状を低減することができる。例えば、治療的有効量又は濃度は、循環腫瘍細胞を有している患者の生存期間を延長するのに十分である。
【００４６】
「対象」、「患者」、又は「個人」という用語は、一般的にヒトを指すが、例えば、他の霊長動物、齧歯動物、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ウマ科の動物、ヒツジ科の動物、ブタ科の動物などを含めた他の動物も指す。
ＩＩＩ．実施形態の詳細な説明
Ａ．プローブにコンジュゲートしたフタロシアニン染料
【００４７】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸプローブなどの標的化光増感剤が本明細書中に開示されている。前もって決定された標的細胞に特異的に結合する抗原、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、又は小分子などのあらゆる標的化部分が使用され得る。プローブは抗体の分子量より小さくてもよい。いくつかの態様において、プローブは約５０ｋＤａ未満、例えば約４９ｋＤａ、４５ｋＤａ、４−ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、２０ｋＤａ、１５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５ｋＤａ、１ｋＤａ、又は１ｋＤａ未満である。プローブは約１０ｋＤａ未満、例えば９ｋＤａ、８ｋＤａ、７ｋＤａ、６ｋＤａ、５ｋＤａ、４ｋＤａ、３ｋＤａ、２ｋＤａ、１ｋＤａ、又は１ｋＤａ未満である。
Ｂ．プローブ
【００４８】
本発明に有用な生体分子としては、標的細胞の細胞表面に結合する低分子量タンパク質、リガンド、ペプチド、環状ペプチド、小分子、及びその類似体が挙げられる。いくつかの態様において、生体分子は、ＥＧＦ、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、ソリシジン、ＳＯＲ−１３、ＳＯＲ−Ｃ２７、小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤、例えばパゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせ、小分子ＴＮＦ１Ｒ阻害剤、成長因子受容体阻害剤、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、Ｔｃ−ＮＴ−Ｘ１、その類似体又はその誘導体である。
１．リガンド
【００４９】
上皮増殖因子又はＥＧＦは、表皮及び表皮組織の成長、増殖及び分化における役割を有する５３アミノ酸のペプチドである。それは、その同族受容体であるＥＧＦ受容体に結合する。ヒトＥＧＦペプチドは、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１１３３又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００１１７１６０１、ＮＰ００１１７１６０２、及びＮＰ００１９５４に規定されている。ヒトＥＧＦ ｍＲＮＡ（コード）配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１１７８１３０、ＮＭ＿００１１７８１３１及びＮＭ＿００１９６３に規定されている。当業者は、ＥＧＦがプロ上皮増殖因子やウロガストロンとしても知られていること、及び切断されて上皮成長因子ペプチドを形成することを認識している。いくつかの態様において、本発明に使用されるＥＧＦペプチドリガンドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する（ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＲ）。
２．ペプチド
【００５０】
本発明に有用なプローブとしては、環状ペプチドが挙げられる。ペプチドは、ジスルフィドの形成、硫酸化物、及び特にＮ末端及びＣ末端又はアミノ酸側鎖のカルボキシル官能基とアミノ官能基との間のラクタム結合などの様々な方法で環化され得る。
【００５１】
環化は、当該技術分野で知られているいずれかの方法、例えば鎖内の様々な位置でのＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）の組み込みによるアミド結合の形成によって得ることができる（−ＣＯ−ＮＨ又は−ＮＨ−ＣＯ結合）。骨格対骨格の環化もまた、式Ｈ−Ｎ（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨ又はＨ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨ｛式中、ｎ＝１〜４であり、更に式中、Ｒはアミノ酸の任意の天然又は非天然側鎖である｝の改変アミノ酸の取り込みによって得ることもできる。環化はまた、２つのＣｙｓ残基の取り込みによるＳ−Ｓ結合の形成によって得ることもできる。追加の側鎖対側鎖の環化は、式−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−｛式中、ｎ＝１又は２である｝の相互作用結合の形成によって得られ、そしてそれは、例えば、Ｃｙｓ又はホモＣｙｓの取り込み、及びその遊離ＳＨ基と、例えば、ブロモアセチル化Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ又はＤａｐとの反応によって可能である。
【００５２】
用語「ＲＧＤ含有ペプチド」又は「ＲＧＤペプチド」は、本明細書中で互換的に使用され、ＲＧＤモチーフとも呼ばれるＲＧＤ配列を含むペプチドを意味する。用語「ＲＧＤペプチド模倣体」は、ＲＧＤモチーフを有するペプチドを模倣する化合物、特に非ペプチド化合物を指す。
【００５３】
ＲＧＤ含有ペプチドは、４〜１００、好ましくは５〜５０、５〜３０、５〜２０又はより好ましくは５〜１０個のアミノ酸残基で構成された直鎖又は環状ペプチドであってもよい。いくつかの態様において、ＲＧＤペプチドは、４、５、６、７、９又は２５、最も好ましくは５個のアミノ酸残基で構成される。「アミノ酸」という用語は、２０種類の天然に存在するアミノ酸、並びに非天然アミノ酸を含む。非天然アミノ酸の制限されることのない例としては、４−アミノブチル酸（Ａｂｕ）、２−アミノアジピン酸、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ヒドロキシリシン、ホモセリン、ホモバリン、ホモロイシン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環状メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体又はＯ−メチル−Ｔｙｒが挙げられる。或いは、アミノ酸としては、インビボにおいて翻訳後に生じる修飾などの改変アミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン、及びホスホトレオニン；Ｄ−修飾；ペプチド結合のＮ−アルキル化、好ましくはＮ−メチル化；アミノ末端基又はＬｙｓの遊離アミノ基のアシル化又はアルキル化；カルボキシ末端基又はＡｓｐ若しくはＧｌｕの遊離カルボキシ基のエステル化又はアミド化；並びにＳｅｒ又はＴｙｒのヒドロキシル基のエステル化又はエーテル化が挙げられる。また、アミノ酸とはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の両方を指す。
【００５４】
ＶＥＧＦ受容体阻害剤としては、これだけに限定されるものではないが、ＶＧ３Ｆ（例えばGoncalves et al, JPept Sci, 14(6):767-72, 2008を参照のこと）、ＶＥＧＦ−Ｐ３（ＮＣ）及びＶＥＧＦ−Ｐ３（ＣＹＣ）（例えばVicari et al, J Biol Chem, 286: 13612-13625, 2011を参照のこと）。
【００５５】
腫瘍壊死因子１の阻害剤（ＴＮＦＲ１）の例としては、これだけに限定されるものではないが、ＡＴＲＯＳＡＢ（例えばRichter et al, PloS One, 8(8): e72156, 2013 and Zettlitz et al, MAbs, 2(6):639-647, 2010を参照のこと）、ＩＺＩ−０６．１（例えばKontermann et al, J Immunother, 31(3):225-34, 2008を参照のこと）、抗−ＴＮＦＲ１拮抗薬、又は米国特許出願公開番号第２０１２／０１０７３３０号及び同第２０１２／０２１３７８７号で開示されたポリペプチド；ＷＰ９ＱＹなどの小型ペプチド（例えばＷＰ９ＱＹ（ＹＣＷＳＱＹＬＣＹ）（配列番号２）；例えばLohman and Isakson, The Faseb Journal, 28(1), Suppl. 669.8を参照のこと）などの抗体又はそのフラグメントが挙げられる。
【００５６】
ＴＮＦＲ１選択的アンタゴニストは、Ｒ１ａｎｔＴＮＦ又はＰＥＧ−Ｒ１ａｎｔＴＮＦなどのＴＮＦ−α変異体であってもよい（例えばそれぞれShibata et al., Cytokine, 44(2):229-233, 2008及びKitagaki et al., J Altheroscler Thromb, 19(l):36-46, 2012を参照のこと）。
【００５７】
ＹＣ−２７は、前立腺特異的膜抗原特異的（ＰＳＭＡ特異的）小分子である。ＰＳＭＡは、葉酸ヒドロラーゼＩ又はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩとしても知られている。例えば米国特許出願公開番号第２０１２／０００９１２１号及びChen et al., Biochem Biophys Res Commun, 390(3):624-629, 2009及びKovar et al., Prostate Cancer, 2014, 文献ID 104248, 10頁を参照のこと。
【００５８】
血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）は、ＣＮＳ、消化管、呼吸官及び泌尿生殖管、外分泌腺、甲状腺、及び副腎の神経細胞体内に位置している脳／消化管ホルモンである。ヒトＶＩＰペプチドは、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１２８２又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００３３７２及びＮＰ９１９４１６に規定されている。ヒトＶＩＰ ｍＲＮＡ（コード）配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００３３８１及びＮＭ＿１９４４３５に規定されている。当業者は、ＶＩＰが血管作用性腸ポリペプチドとしても知られていること、並びに該ペプチドが三本鎖、例えば腸管ペプチドＰＨＶ−４２（ペプチドヒスチジンバリン４２）、腸管ペプチドＰＨＭ−２７（ペプチドヒスチジンメチオニンアミド２７）、及び長さが２７アミノ酸の血管作動性小腸ペプチドに切断されることを認識している。いくつかの態様において、本発明に使用される血管作動性小腸ペプチドは、配列番号３（ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ）のアミノ酸配列を有する。ＶＩＰ類似体としては、［Ｌｙｓ１５，Ａｒｇ１６，Ｌｅｕ２７］−ＶＩＰ／ＧＲＦ、ＲＯ２５−１５５３、１８Ｆ標識Ａｒｇ１５−Ａｒｇ２１−ＶＩＰが挙げられる。
【００５９】
ガストリン放出ペプチド又はＧＲＰは、その１４８個のアミノ酸から成るプレプロタンパク質からシグナルペプチドの切断後に１０個のアミノ酸から成るニューロメジンＣと共に作り出される神経ペプチドである。ガストリン放出ペプチドは、ガストリン放出を刺激することを含めた胃腸及び中枢神経系の多数の機能を調整している。ヒトＧＲＰペプチドは、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０７４９２又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００１０１２５３０に規定されている。ヒトＧＲＰ ｍＲＮＡ（コード）配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１０１２５１２に規定されている。
【００６０】
ニューロテンシン又はＮＴＳは、ニューロテンシン／ニューロメジンＮ前駆体の切断後に作り出される１３個のアミノ酸から成る神経ペプチドである。ニューロテンシンは、平滑筋の収縮を含めた中枢神経系の多数の機能を調節している。ヒトニューロテンシンペプチドは、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ３０９９０又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００６１７４に規定されている。ヒトニューロテンシン ｍＲＮＡ（コード）配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００６１８３に規定されている。
【００６１】
ＡＨ１１１５８５又はフルシクラチドは、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）トリペプチドを含む小さい環状ペプチドである。それはαＶβ３及びαＶβ５インテグリンに特異的に結合する。
【００６２】
シレンギチドは、αＶβ３及びαＶβ５インテグリンの小さい環状ＲＧＤペプチド（例えば、シクロ（ＲＧＤｆＶ））阻害剤である。シレンギチドの化学構造は、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）又はシクロ（Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｄ−ファニルアラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル）である。
【００６３】
シクロ（ＲＧＤｆＫ）又はｃ（ＲＧＤｆＫ）は、アミノ酸構造シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）又は化学構造２−［（２Ｓ，５Ｒ，８Ｓ，１１Ｓ）−８−（４−アミノブチル）−５−ベンジル−１１−［３−（ジアミノメチリデンアミノ）プロピル］−３，６，９，１２，１５−ペンタオキソ−１，４，７，１０，１３−ペンタザシクロペンタデカ−２−イル］酢酸を有するシクロペンタペプチドである。
【００６４】
ＦＰＰＲＧＤ２は、反復シクロペンタペプチド（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ユニットがグルタマートによって接続されているペグ化二量体ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラート）ペプチドである。該ペプチドはαＶβ３インテグリンに特異的に結合する。
【００６５】
ボンベシンは、配列番号４（Ｐｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２）に規定されるアミノ酸配列を有する１４個のアミノ酸のペプチドである。ボンベシンペプチドの類似体としては、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ］ボンベシン及びｄ−Ｔｙｒ６，β−Ａｌａ１１，Ｐｈｅ１３，Ｎｌｅ１４］−ボンベシンが挙げられる。
【００６６】
小分子ＰＫ−１１１９５は、末梢ベンゾジアゼピン受容体に選択的に結合するイソキノリンカルボキサミドである。ＰＫ−１１１９５はＧＡＢＡ−Ａ拮抗薬として機能し得る。当業者は、ＰＫ−１１１９５が１−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−メチルプロピル）−１−イソキノリンカルボキサミドとしても知られていることを認識する。
【００６７】
サブスタンスＰは、タキキニン神経ペプチドファミリーに属するウンデカペプチドである。ヒトプロタキキニン−１プロタンパク質は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ２０３６６又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３１７３、ＮＰ＿０５４７０２、ＮＰ＿０５４７０３、及びＮＰ＿０５４７０４に規定されている。ヒトプロタキキニン−１ ｍＲＮＡ（コード）配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１８２、ＮＭ＿０１３９９６、ＮＭ＿０１３９９７、及びＮＭ＿０１３９９８に規定されている。当業者は、プロタキキニン−１が切断されて、サブスタンスＰ、ニューロキニンＡ、ニューロメジンＬ、サブスタンスＫ、及び神経ペプチドＫを含めた５つのペプチドを形成することを認識する。サブスタンスＰのアミノ酸配列は、配列番号５（ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ）に規定されている。
【００６８】
オステオネクチンやＢＭ−４０としても知られている酸性の、システインが豊富な分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）は、非構造性マトリックス細胞３２ｋＤａ糖タンパク質である。該タンパク質は、浸潤型乳癌、低酸素症、ＨＩＦ２αなどの酸性マーカー及び胎児軟骨細胞発現遺伝子１を発現する癌細胞、肝細胞癌腫、胃癌、前立腺癌の骨転移、、癌組織の低酸素及び酸性、膀胱癌、並びに肺癌を同定するのに使用され得る。ヒトＳＰＡＲＣプレタンパク質は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０９４８６又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００３１０９に規定されている。ヒトＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡ（コード）配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００３１１８に規定されている。ＳＰＡＲＣタンパク質は、切断されて、配列番号６（ＣＦＧＩＫＱＫＤＩＤＫＤＬＶＩ）に規定されるアミノ酸配列を有するＳＰＡＲＣペプチドを形成する。
【００６９】
ソマトスタチンは、内分泌系を調整し得るペプチドホルモンである。該ペプチドは環状テトラデカペプチドであり得る。ソマトスタチンペプチドは、プレプロタンパク質の１４個のアミノ酸のペプチドと２８個のアミノ酸のペプチドへの代替切断によって作り出される。ヒトソマトスタチンプレタンパク質は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ６１２７８又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ００１０３９に規定されている。ヒトソマトスタチン ｍＲＮＡ（コード）配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００１０４８に規定されている。当業者は、ソマトスタチンが成長ホルモン放出抑制因子、成長ホルモン抑制ホルモン、ＧＨＩＨ、成長ホルモン放出抑制因子、ＳＲＩＦ、ソマトトロピン放出抑制ホルモン、ＳＲＩＨ、ソマトスタチン−２８又はソマトスタチン−１４としても知られていることを認識する。ソマトスタチン類似体としては、これだけに限定されるものではないが、オクトレオチド、ランレオチド、バプレオチド、オクタペプチドＢＩＭ２３０１４（ＳＲランレオチド）、緩効形態のオクトレオチド（Sandostatin LAR）、ＳＯＭ２３０（Novartis, Basel）、ＢＩＭ２３２４４は（Biomeasure, Milford, MA）が挙げられる。１２５Ｉ又は１２３Ｉ［Ｔｙｒ３］オクトレオチド、１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−［ｄ＝Ｐｈｅ１］オクトレオチド（オクトレオスキャン）、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ランレオチド、９９ｍＴｃ−Ｐ８２９、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−Ｔｙｒ３−オクトレオチド（９０Ｙ−ＤＯＴＡＴＯＣ）、及びＤＯＴＡ−［１−ＮａＩ３］−オクトレオチド（ＤＯＴＡＮＯＣ）などの放射性標識ソマトスタチンペプチドも本発明で有用である。
【００７０】
コレシストキニンは、胃腸系において脂肪及びタンパク質の消化を調整するペプチドホルモンである。コレシストキニンペプチドは、コレシストキニンプロタンパク質、プレプロコレシストキニンの代替切断によって作り出される。コレシストキニンペプチドとしては、コレシストキニン−５８、ホレシストキニン−５８デスノノペプチド（desnonopeptide）、コレシストキニン−３９、コレシストキニン−３３、コレシストキニン−２５、コレシストキニン−１８、コレシストキニン−１２、コレシストキニン−８、コレシストキニン−７、コレシストキニン−５が挙げられる。ヒトコレシストキニンプレタンパク質は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０６３０７又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ０００７２０に規定されている。ヒトコレシストキニン ｍＲＮＡ（コード）配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００７２９に規定されている。いくつかの態様において、コレシストキニンペプチドは、１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−［Ａ−Ａｓｐ２６，Ｎｌｅ２８，３１］ＣＣＫである。
【００７１】
グルカゴン様ペプチド１又はＧＬＰ−１は、腸上皮内分泌細胞で合成されるペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１は、プログルカゴンの代替切断によって作り出され、ＧＬＰ−１（アミノ酸７〜３６にまたがる）アミドとＧＬＰ−１（アミノ酸７〜３７にまたがる）としての２つの形態が見つかっている。
【００７２】
ニューロペプチドＹ又はＮＰＹは、脳及び不随意神経系において神経伝達物質として機能する３６個のアミノ酸の神経ペプチドである。ヒトニューロペプチドＹは、例えばＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１３０３又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ０００８９６に規定されている。ヒトニューロペプチドＹ ｍＲＮＡ（コード）配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００９０５に規定されている。ＮＰＹは、Ｙ１及びＹ２拮抗薬を含めたＮＰＹ類似体を含み得る。
【００７３】
オクトレオチド又はＳａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（登録商標）は、ジスルフィド架橋有するオクタペプチドである。それは、薬理学的にソマトスタチンを模倣し得る。オクトレオチドのアミノ酸配列は、配列番号７（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＯＨ）に規定されている。
【００７４】
エンドトレオチド、ＤＯＴＡ０−Ｐｈｅ１−Ｔｙｒ３又はＤＯＴＡ−ＴＯＣはソマトスタチン受容体に選択的に結合し得る小分子である。
【００７５】
ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、ＤＯＴＡＴＡＴＥ又はＤＯＴＡ−オクトレオテート（octerotate）は、酸ＤＯＴＡ及び（Ｔｙｒ３）−オクトレオテートのアミドである。ＴＡＴＥ−ＤＯＴＡはソマトスタチン受容体に選択的に結合し得る。
【００７６】
エキセンジン−４は、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）受容体の作動薬として作用し得るペプチドホルモンである。エキセンジン−４はインシュリン分泌を促進し得る。合成エキセンジン−４としては、３９個のアミノ酸のペプチドであるエクセナチドが挙げられる。エキセンジン−４のアミノ酸配列は、配列番号８（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２）に規定されている。
【００７７】
ソリシジンは５４個のアミノ酸のペプチドである。ＳＯＲ−Ｃ１３及びＳＯＲ−Ｃ２７は、ソリシジンのＣ末端から誘導される。それらはカルシウムイオン流れ込みチャンネル、ＴＲＰＶチャンネルの高親和性拮抗薬である。ＳＯＲ−Ｃ１３及びＳＯＲ−Ｃ２７は、結腸、前立腺、及び甲状腺の腫瘍、白血病、並びにリンパ腫を標的とする。ＳＯＲ−Ｃ１３のアミノ酸配列は、配列番号９（ＫＥＦＬＨＰＳＫＶＤＬＰＲ）に規定されている。ＳＯＲ−Ｃ１３のアミノ酸配列は、配列番号１０（ＥＧＫＬＳＳＮＤＴＥＧＧＬＣＫＥＦＬＨＰＳＫＶＤＬＰＲ）に規定されている。ソリシジンのアミノ酸配列は、配列番号１１（ＤＣＳＱＤＣＡＡＣＳＩＬＡＲＰＡＥＬＮＴＥＴＣＩＬＥＣＥＧＫＬＳＳＮＤＴＥＧＧＬＣＫＥＦＬＨＰＳＫＶＤＬＰＲ）に規定されている。
３．小分子
【００７８】
小分子ＶＥＧＦ受容体阻害剤の制限されることのない例としては、パゾパニブ（ＧＷ７８６０３４Ｂ；Glaxo SmithKline）、ＧＷ６５４６５２（Glaxo SmithKline）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６；Sugen）、アキシチニブ（ＩＮＬＹＴＡ（登録商標）、Pfizer）、カボザンチニブ（ＣＯＭＴＲＩＱ（商標）、ＸＬ１８４、Exelixis）、アフリベルセプト（Sanofi-Aventis）；ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４；Bristol-Myers Squibb）、チボザニブ（ＡＶ−６５１；AVEO Pharmaceuticals）、ラムシルマブ（ＣＹＲＡＭＺＡ（商標）；Eli Lilly and Company）、モテサニブ（Takeda Pharmaceutical Company Limited）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４；Bayer Schering and Novartis）、及びセジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１、AstraZeneca）が挙げられる。
【００７９】
いくつかの態様において、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識プローブはまた、放射性核種にもコンジュゲートされ得る。有用な放射性核種としては、これだけに限定されるものではないが、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕなどのγ放射体、９０Ｙ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕなどのβ放射体、及び１１１Ｉｎのオージェ電子が挙げられる。
【００８０】
いくつかの態様において、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識プローブは更にフルオロフォアにコンジュゲートされる。好適なフルオロフォアとしては、これだけに限定されるものではないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−（ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸塩；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリン及び誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルコールアリン（trifluoromethylcouluarin）（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオチアネートフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオチアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオチアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ｄジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオチアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアネート；、エリスロシン及び誘導体：エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオロセイン及び誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロサニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒデド；ピレン及び誘導体：ピレン、酪酸ピレン、スクシンイミジル１−酪酸ピレン；酪酸エステル量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ．ＴＭ．ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミン及び誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢ塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチアシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（ＴｅｘａｓＲｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチアシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロソール酸；テルビウムキレート誘導体；オレゴングリーン；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００；ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ；ＬａＪｏｌｌａＢｌｕｅ；フタロシアニン；ナフタロシアニンＡＴＴ０６４７；及びＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＬＴが挙げられる。
Ｃ．生体分子プローブへのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのコンジュゲート
【００８１】
プローブ（例えば、ペプチド）は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ（LI-COR, Lincoln, NE）などのフタロシアニン染料にコンジュゲートされ得る。いくつかの態様において、プローブは、製造業者のプロトコール及びキットに従ってＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸで標識される。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−コンジュゲートを作製する方法の詳細な説明は、例えば、Kovar et al, Biochemistry-Faculty Publications, 2007, paper 9；Mitsunaga et al., Nature Medicine, 2011, 17: 1685-1691；Peng et al., Proceedings of SPIE, 2006, 6097；米国特許第７，００５，５１８号及び同第８，５２４，２３９号；並びに米国特許出願公開番号２０１３／０３３６９９５に見ることができ、それぞれの開示全体をあらゆる目的のために本明細書中に援用する。
【００８２】
様々なタイプのプローブに染料を連結する方法は、当該技術分野で周知されている。例えば、オリゴヌクレオチド標識手順の十分な総説のために、R. Haugland in Excited States of Biopolvmers, Steiner ed., Plenum Press (1983)、Fluorogenic Probe Design and Synthesis: A Technical Guide, PE Applied Biosystems (1996)及びG. T. Herman, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)を参照のこと。
【００８３】
リンカーを有するＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸが式Ｉで以下に示されている：
【００８４】
【化３】
2020125343.tif 000005
【００８５】
特定の態様において、Ｑはプローブへの付加のための反応基を含む。好ましくは、Ｑはプローブ上のカルボキシル基、アミン、又はチオール基と反応させる反応基を含む。好適な反応基としては、これだけに限定されるものではないが、活性化エステル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、適宜置換されたアミン、無水物、カルボン酸、カルボジイミド、ヒドロキシル、ヨードアセトアミド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ＮＨＳエステル、ホスホロアミダイト、スルホン酸エステル、チオール、又はチオシアネートが挙げられる（以下の表１を参照のこと）。
【００８６】
式Ｉでは、Ｌは直接的な連結又は共有結合から選択され、ここで、該共有結合は、  Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏから選択される１〜６０個の原子を有する直鎖若しくは分岐、環状若しくは複素環式、飽和若しくは不飽和であり、ここで、Ｌは、（該１〜６０個の原子に加えて）原子価を充填するように追加の水素原子を有し、ここで、該連結は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルバマート、ウレア、チオウレア、オキシ又はアミド結合の任意の組み合わせ、又は一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又はリン−酸素、リン−硫黄、窒素−窒素、窒素−酸素、若しくは窒素−プラチナ結合；又は芳香族若しくは複素芳香族結合を含む。特定の場合には、Ｌは、末端アミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を含み、そして、−Ｌ−ＮＨ２、−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ−、又は−Ｌ−ＳＨ−と表される。
【００８７】
リンカー「Ｌ−Ｑ」は、ホスホロアミダイト基、ＮＨＳエステル、活性カルボン酸、チオシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、及びヨードアセトアミドを含み得る。
【００８８】
特定の態様において、リンカーＬは−（ＣＨ２）ｎ−基を含み、式中、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくは、ｎは１〜４又は１、２、３、４、若しくは５などの１〜５の整数であり、そして、Ｌ−Ｑは、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、又はＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ又はＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨである。
【００８９】
一態様において、式ＩではＬ−Ｑは、以下に示した−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ−スクシンイミジルである：
【００９０】
【化４】
2020125343.tif 000006
【００９１】
特定の場合には、染料は第一級アミンを有するプローブと反応して、安定したアミド結合を生じる。他の態様において、マレイミドとチオールは、一緒に反応して、チオエーテルを生じ得る。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを生じる。いずれかの誘導体を提供するプローブにコンジュゲートされ得る反応部分が、本明細書中に利用され得る。当該技術分野で知られているように、遊離アミノ基、遊離カルボン酸基、又は遊離スルフヒドリル基を含む残基が、タンパク質コンジュゲート形成のために有用な反応基を提供する。例えば、遊離アミノ基は、タンパク質上の利用可能なカルボキシ残基へのグルタルアルデヒド架橋又はカルボジイミド架橋を介してタンパク質にコンジュゲートされ得る。同様に、遊離スルフヒドリル基を有するリンカーは、例えばスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を使用した、タンパク質のマレイミド活性化、次いで、スルフヒドリル基への連結を介してタンパク質にコンジュゲートされ得る。
【００９２】
アミン含有プローブ分子への付加のためのカルボン酸基を有する染料を連結するとき、カルボン酸は最初に、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又は混成無水物を形成するように、活性試薬を使用してより反応性の形態に変換される。アミン含有プローブを得られた活性化された酸で処理して、アミド連鎖を形成する。当業者は、二者択一的に、ＮＨＳエステルがプローブ上に存在し得るか、アミンが染料上に存在し得ることを認識する。
【００９３】
他の態様において、リンカーは、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ポリウレタンのブロックコポリマー、及びＰＥＧ−ポリプロピレンから成る群から選択されるメンバーである。更に他の態様において、リンカーは、多糖、ポリペプチド、オリゴ糖、高分子、コポリマー、及びオリゴヌクレオチドから成る群から選択されるメンバーである。
【００９４】
リンカーＬは、以下の式を有し：
−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−
式中、Ｘ１は、二価のラジカル、直接的な連結、酸素、適宜置換された窒素、及び硫黄から成る群から選択されるメンバーであり；Ｙ１は、直接的な連結及びヘテロ原子が適宜差し込まれたＣ１−Ｃ１０アルキレンから成る群から選択されるメンバーであり；及びＸ２は、二価のラジカル、直接的な連結、酸素、適宜置換された窒素、及び硫黄から成る群から選択されるメンバーである。
【００９５】
好ましくは、Ｘ１及びＸ２の二価のラジカルは、直接的な連結、適宜置換されたアルキレン、適宜置換されたアルキレンオキシカルボニル、適宜置換されたアルキレンカルバモイル、適宜置換されたアルキレンスルホニル、適宜置換されたアルキレンスルホニルカルバモイル、適宜置換されたアリーレン、適宜置換されたアリーレンスルホニル、適宜置換されたアリーレンオキシカルボニル、適宜置換されたアリーレンカルバモイル、適宜置換されたアリーレンスルホニルカルバモイル、適宜置換されたカルボキシアルキル、適宜置換カルバモイル、適宜置換されたカルボニル、適宜置換されたヘテロアリーレン、適宜置換されたヘテロアリーレンオキシカルボニル、適宜置換されたヘテロアリーレンカルバモイル、適宜置換されたヘテロアリーレンスルホニルカルバモイル、適宜置換されたスルホニルカルバモイル、適宜置換されたチオカルボニル、適宜置換されたスルホニル、及び適宜置換されたスルフィニルからそれぞれ独立に選択される。
【００９６】
或いは、リンカーは−（ＣＨ２）ｒ−であり、式中、ｒは１〜５０の整数である。
【００９７】
式Ｉの反応性Ｑ基は、プローブ上の相補的基と反応する式Ｉａの化合物を形成する：
【００９８】
【化５】
2020125343.tif 000007
【００９９】
式Ｉａでは、式Ｉの反応性Ｑ基は、プローブ上の相補的基と反応して、共有結合Ｑ１を形成する。次に、プローブはリンカーに共有結合により付加される。
【０１００】
一態様において、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸは上述のとおりＮＨＳエステルを有し、プローブはアミンを有し、反応してアミドを形成する：
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−プローブ
【０１０１】
プローブに染料を付加するのに有用な反応性官能基の選択された例を表Ｉに示し、ここで、結合はプローブと染料（例えば、検出薬又は光増感剤）の反応から生じる。当業者は本発明に使用するのに好適な他の結合を知る。
【０１０２】
【表１】
2020125343.tif 000008
【０１０３】
＊当該技術分野で理解されるように、活性化エステルは一般に式−ＣＯＭを有しており、式中のＭは良好な脱離基（例えば、スクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ３Ｏ２ＳＯ３Ｈ）、−１−オキシベンゾトリアゾリル（−ＯＣ６Ｈ４Ｎ３）；４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル；又は、アリールオキシ基又は活性化アリールエステルを形成するために用いられる電子吸引性置換基（例えばニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、若しくはトリフルオロメチル、又はその組み合わせなど）によって１若しくは複数回置換されているアリールオキシ；或いはカルボジイミドによって活性化されて無水物又は混成無水物−ＯＣＯＲａ又はＯＣＮＲａＮＨＲｂを形成するカルボン酸｛式中、Ｒａ及びＲｂは、同じであっても異なっていてもよく、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、又はＣ１−Ｃ６アルコキシ；又はシクロヘキシル、３−ジメチルアミノプロピル、若しくはＮ−モルホリノエチルである｝である。＊＊アシルアジドはまた、イソシアネートに再配列されることもできる。
【０１０４】
いくつかの態様において、リンカーとプローブの間の共有結合Ｑ１（列「Ｃ」）は、直接的な結合、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、オキシム結合、リン酸エステル結合、スルホンアミド結合、チオエーテル結合、チオウレア結合、及びウレア結合から成る群から選択される。代替の実施形態において、「Ａ」の反応性官能基はプローブ上に存在し、そして、相補的官能基「Ｂ」は染料上に存在する。
【０１０５】
他の態様において、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ染料はクリック化学反応によってプローブ又は生体分子に連結される。クリック化学反応は、アジドとアルキンとの銅接触環付加などの簡単で、強力な反応を使用して分子間連結を作り出す。クリック化学反応の総説に関して、例えばKolb, H. C; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. 2001, 40, 2004を参照のこと。
【０１０６】
より大きい分子又は構造物を作るための２つの断片の接続（又は連結）は、Sharpless et ah, Angew. Chem., Int. Ed. 40: 2004 (2001)によって記載された、いわゆるクリック化学反応を用いることが多い。この用語は、アジドやアセチレンなどの２つの異なった反応物の間の１組の二分子反応を説明するのに使用される。三重結合へのアジドの１，３−双極環付加における１，２，３−トリアゾールの形成は知られているが、アセチレン−アジド環付加の活性化エネルギーが比較的高いので、周囲条件下では反応が遅い。
【０１０７】
アルキンとアジドの反応の有用性はＣｕ（Ｉ）触媒作用の発見によって拡大した。触媒量の第１銅塩の存在下での末端アセチレンへのアジドの１，３−環付加は、有機又は水性溶液中において室温にて容易である。
【０１０８】
Bertozziらに対する米国特許第７，８０７，６１９号は、改変シクロアルキン化合物と、生体分子を改変する際の斯かる化合物の利用方法を教示している。Bertozziらは生理的条件下で実施し得る環付加反応について教示している。その中に開示されるように、改変シクロアルキンを標的生体分子上のアジド部分と反応させ、そして、共有結合により改変された生体分子を作り出す。
Ｄ．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識生体分子プローブの治療的使用
【０１０９】
更に他の態様において、本発明は、対象の標的細胞、組織、及び臓器の光力学療法（ＰＤＴ）のための方法及び化合物を提供する。場合によっては、標的細胞は、固形腫瘍の細胞である。他の場合には、標的細胞は対象の血管内に位置している。ＰＤＴは、様々な癌、並びに疾患組織及び臓器で使用され得るツーステップ処置プロセスである。この治療法の第１ステップは、摂取又は注射によって全身に光増感剤を投与すること、或いは対象の特定の治療部位に該化合物を局所的に適用することによって実施され、該光増感剤の特徴的な吸収周波数帯に相当する波長又は周波数帯を有する光で処置部位を照らす第２ステップが続く。光が光増感剤を活性化し、そして、光増感剤を吸収した異常組織又は疾患組織を破壊する多くの生物学的効果につながる、発生されるべき一重項酸素ラジカルや他の反応性種を引き起こす。癌性腫瘍又は漏出血管のような異常組織に対する細胞傷害効果（例えば、アポトーシス作用）の深度と体積は、組織内への光浸透の深度、光増感剤濃度、及びその細胞分布、並びに分子状酸素の利用可能性に一部依存するが、分子状酸素の利用可能性は腫瘍、組織、又は臓器に供給される血管系に依存する。
【０１１０】
特定の場合には、本発明は処置のための方法を提供し、ここで、例えば、腫瘍は治療薬を使用して処置され、その後、処置の程度を確かめるために画像化される。該処置は、腫瘍が破壊されるか又は処置部位が満足に完了するまで反復され得る。特定の場合には、該方法は、プローブ又は組成物に注射し、光力学療法を使用して腫瘍を処置し、その後処置の程度を確かめるために画像化することを伴う。
【０１１１】
本発明の方法は、治療用プローブなどの標的化光増感剤の治療的有効量を対象に投与することを提供する。プローブは、摂取又は注射によって全身的に投与され得るか、又は標的組織部位若しくは手術部位に局所的に投与され得る。薬剤は、循環している腫瘍細胞又は固形腫瘍の細胞などの１若しくは複数のタイプの標的細胞又は組織に結合し得る。適切な周波数帯の光活性化光に晒されると、薬剤はその光を吸収し、アポトーシスを介して標的細胞又は組織を損傷又は破壊する、生成されるべき物質を生じさせる。好ましくは、化合物は、投与される対象に無毒であるか、又は対象に投与することができる無毒の組成物に配合できる。更に、光に晒された後に、結果的な光分解されたあらゆる形態の化合物が好ましくは無毒である。
【０１１２】
薬剤及び活性化光は、これだけに限定されるものではないが、摂取、注射、経皮（「transcutaneous」）投与、経真皮（「transdermal」）投与、及び透照を含めたＰＤＴの技術分野で知られている任意の手段によって投与される。好ましくは、光は対象に経皮的に投与される。例えば、本明細書中で使用される場合、「経皮」は、壊れていない組織を貫通する光の透過を指す。組織層が皮膚又は真皮であるとき、経皮は「経真皮」を含み、光源が表皮層の外側にあることが理解される。しかしながら「透照」という用語は、本明細書中で使用される場合、臓器、例えば肝臓の表面層などの組織層を貫通する光の透過を指し、光源が臓器の外側ではあるが、対象若しくは患者の体内にあるか又は移植されていることが明らかである。
【０１１３】
いくつかの態様において、ＰＤＴ投与について使用されるエネルギーの形態としては、これだけに限定されるものではないが、光（すなわち、放射）、熱、音波、超音波、化学、光、マイクロ波、イオン化（例えば、Ｘ線及びガンマ線）、機械、及び電気を挙げることができる。本明細書中で用いる「放射」という用語は全ての波長及び波長帯域が挙げられる。好ましくは、光増感剤を励起する波長又は波長帯域と一致するか又は少なくとも部分的に一致する放射波長又は波長帯域を選択する。光増感剤は、典型的には、それらを励起して標的細胞、組織、器官、又は腫瘍を損傷し又は破壊する物質を生成する吸収波長帯域１つ又は２つ以上を有する。好ましくは、放射波長又は波長帯域は、光増感剤の励起波長又は波長帯域と一致し、そして血液タンパク質を含む被験者の非標的細胞及び残部（rest）による低吸収を示す。
【０１１４】
更なる態様において、ＰＤＴを用いた処置のための標的細胞、組織、臓器、又は腫瘍は、血管内皮組織、皮膚組織、腫瘍の異常血管壁、充実性腫瘍、頭部の腫瘍、頚部の腫瘍、消化管の腫瘍、肝臓の腫瘍、胸部の腫瘍、前立腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、子宮の腫瘍、睾丸の腫瘍、肺の腫瘍、非充実性腫瘍、造血組織及びリンパ組織の１つの悪性細胞、脈管系の病変、病的骨髄、及び疾患が自己免疫疾患及び炎症性疾患の１つである病的細胞からなる群から選択される。なお更なる実施形態において、標的組織は、アテローム性動脈硬化病変、動静脈奇形、動脈瘤、及び静脈病変からなる群から選択されるタイプの脈管系の病変である。
【実施例】
【０１１５】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は例証のために提供するものであり、本発明の請求の範囲を限定するために提供するものではない。
実施例１．ｐＨ２．１〜８．２及び様々な温度におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの安定性
【０１１６】
この実施例は、様々なｐＨ及び温度におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの安定性を例証する。該カルボキシレートは以下の構造を有する：
【０１１７】
【化６】
2020125343.tif 000009
【０１１８】
染料のカルボキシレート形態の安定性に対するｐＨの影響の評価を、室温及び３７℃にて実施した。比較を目的として、３７℃にて同時に１×ＰＢＳ中に溶解した安定性試験を含めた。一定のイオン強度を有するマッキルベインバッファー溶液を使用した。ＰＢＳでの試験は、１μＭにてほとんどシグナル強度の損失を示さなかった（図２）。染料を高いｐＨ（２．１〜８．２）を有する様々なバッファーで溶解した場合、ｐＨ４〜５の間で最初に発生したシグナル強度の損失は、室温にてｐＨ２．１まで損失が次第に大きくなった（図３Ａ）。３７℃では、この損失はｐＨ５〜６のわずかに高いｐＨで最初に起こり、室温にて実施した試験と同様に進行した（図３Ｂ）。
実施例２．タンパク質へのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートの結合
【０１１９】
多くの光増感剤がアルブミン又は他の血清タンパク質と結合し、それによって、腫瘍に優先的に集まり、局在化できる。この実施例は、血清タンパク質へのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの結合、並びに血清タンパク質へのメチレンブルーの結合を例証する。
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元条件下では、オボアルブミンは、約４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、６３ｋＤａ、及び７２ｋＤａの分子量を有する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、非還元条件下で約６６．６ｋＤａ〜約６６．４ｋＤａ以下の分子量を有する。ＨＳＡは、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５８〜６７ｋＤａのバンドとして移動し得る。
【０１２１】
ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、５％のＦＢＳ及びＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートを室温にて１×ＰＢＳ中で２．５時間インキュベートした。メチレンブルーもアルブミン及び他の血清タンパク質に結合したことを知るための染料として使用した。サンプルを、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで泳動した。オボアルブミンが陰性対照としての役目を果たした。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートと共にインキュベートしたタンパク質はゲルの左側であり、メチレンブルーサンプルが右側である（図４Ａ〜Ｂ）。
【０１２２】
インキュベーションの１時間後に、アルブミンを含めた血清タンパク質へのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの計測可能な結合は検出されない（図４Ａ）。染料が過剰に存在し、結合反応に利用可能であることを示す遊離の染料がゲル下部に見える。図４Ｂは、２．５時間のインキュベーション後に、アルブミンを含めた血清タンパク質への７００ＤＸの結合が明白であることを示す。シグナルはメチレンブルーサンプルを示す。アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ＢＳＡ、及びＦＢＳサンプルにおいて検出される。
実施例３．細胞毒性を誘発するための、プローブをコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの使用
【０１２３】
この実施例は、細胞形態に対するＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ染料コンジュゲートに基づく光力学療法の効果を例証する。ＰＤＴ中の形態の変化を評価する他の方法は、カスパーゼ３／７、アネキシンＶ、活力％、ミトコンドリア電位、（細胞内／膜、エンドソーム、リソソーム）局在性、一重項酸素産生、他のラジカルなどを含めた主要なアポトーシスマーカーの追加試験を伴う。照射レベル、インキュベーション時間、プローブタイプ、及び／又は細胞毒性を起こすのに必要な用量を含めた再現性のよい効果を生じるのに重要なパラメーターを同定することは重要であった。これらの重要な指標を評価することによって、細胞毒性を誘発する能力におけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの働きを規定した。
【０１２４】
形態は、照射後に細胞変化を規定するための一般的な指標である。図５Ａ〜５Ｃは、アポトーシス及びネクローシスに共通である非常に初期の泡状突起特徴（矢印によって強調した）を実証する。
【０１２５】
実験は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸがＰＤＴにおいて活性成分であることを明確に実証した。図６Ａ〜６Ｂは、照射なし（ＮＩ）又は照射あり（Ｉ）のＡ４３１細胞である対照の画像を提供する。それぞれの処置のためのプローブ用量は０．２５μＭであった、そして、照射レベルは１６Ｊ／ｃｍ２であった。結果は、細胞形態は未処置の細胞では変化がないことを示し、照射のみのレベルでは有害な影響がなかったことを例証した（図６Ｂ）。
ＮＩを伴ったＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦとのインキュベーションを含む追加対照もまた、細胞形態に有害な影響がないことを示し、ＰＤＴにおける照射の必要性を実証した（図６Ｃ）。最後に、細胞がＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦで処置され、照射を受けたとき、それらの形態は核の縮合及び細胞脱水状態を伴って劇的に変化した（図６Ｄ）。これらはアポトーシス及び／又はネクローシスを受けている細胞の重要な特色である。細胞生存率を照射後２４時間に評価したとき、結果では、照射で処置したプローブだけが細胞毒性を誘発したことを確認した（図６Ａ〜６Ｄ）。
実施例４．動物モデルにおけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートのクリアランス評価
【０１２６】
この実施例は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−抗体プローブ及びＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−小タンパク質リガンドプローブのＰＤＴ効果を例証する。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦプローブをその同族の受容体に結合させた後で内在化し、数分以内に素早く処理した。小分子プローブはアポトーシスを誘発し、それに対し、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−抗体プローブはネクローシスを誘発した。
【０１２７】
光免疫療法（ＰＩＴ）のためのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸを用いた作用機序が、ＰＤＴと比較して異なっていることが示唆された。この仮説を試験するために、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブ（約０．１μＭ；抗体）及びＥＧＦ（０．５μＭ；小タンパク質リガンド）で標識した２つのプローブを評価した。両プローブともＥＧＦＲを結合でき、コンジュゲート分子１つにつき約２つの染料分子を有した。受容体に対する親和性は、小タンパク質（ｎＭ）と比較して、抗体（通常ｐＭ）で異なっているように思われた。プローブ用量は異なったが、インキュベーション時間はであったが１０分間だけで同じであった。インキュベーション後に、プローブを細胞からすすいだ。図７Ａ及び７Ｂは、それぞれＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブ及びＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦと共にインキュベートし、その後照射を受けたＡ４３１細胞を説明する。プローブは細胞形態に対して、照射後２４時間に調べたものと類似した効果を示した。細胞毒性のレベルは２つのプローブで異なっており、２つのプローブがアポトーシス経路やネクローシス経路などの２つの異なる経路によって細胞毒性を起こしたことを示唆している。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブで処置した照射細胞の６２％が死滅し、そしてＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦで処置した照射細胞の３６％が死滅した。
【０１２８】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブプローブを細胞表面に配置し、そして膜と結合させた。これにより、照射のときに、一重項酸素の産生が細胞表面において起こった。一般的に、ＥＧＦリガンドはＥＧＦ受容体に結合した後に内在化される。そのようにして、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦプローブは細胞によって取り込まれ、細胞内で細胞傷害性の活性酸素種を作り出した。
【０１２９】
２又は４ｎｍｏｌｅの化合物を与えたヌードマウスにおけるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレートのクリアランスを評価するために、実験を実施した。これは染料の非反応性形態であり、インビボにおける排出反応速度論は染料及びその後の染料標識コンジュゲートの生体分布を測定するのに使用できる。両用量の結果は非常に類似していた（４ｎｍｏｌｅの動物の画像だけを提示する）。クリアランスは、背面（図８Ａ）及び腹面の全身図（図９Ａ）で注目されるように腎臓によると思われた。腎臓は背面の組（図８Ａ）を通して見え、肝臓は腹面の組（図９Ａ）で見える。腎臓のシグナルは肝臓を超えており、肝臓において顕著な滞留がないこと、及び腎臓排泄が排出の主要経路であることが示唆された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。切除術後の臓器のより厳密な検査を図１０Ｂ（２ｎｍｏｌｅの用量）で例証した。
腎臓（４ｎｍｏｌｅ用量）の隅から隅までの長軸方向の切片は、染料の主要な位置が腎皮質の近位尿細管内であったことを示した。これは染料の濃度にかかわらず、すべての動物に見られた。画像化したすべての臓器（筋肉、心臓、肺、肝臓、脳、脾臓、腸、及び腎臓）を、面積に関して補正したシグナルについて分析した。グラフ表示は図１０Ｃに示す。興味深いことに、用量は腎臓内に滞留した染料の量に劇的なくらい影響しなかった。これは、染料が身体によって絶えず、非常に素早くクリアランスされることを示唆し得る。
実施例５．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−標識抗体、パニツムマブの治療効果の評価
【０１３０】
本明細書中に記載したアッセイで使用される用量はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識パニツムマブで見られた細胞死の寄与因子になるには低すぎると仮定したが、治療効果がアッセイシステムに起因するものでないことを確認するために、小規模な試験を実施した。試験は以下の４つの処置：処置１の未標識パニツムマブ及び照射なし（図１１Ａ）、処置２のＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−標識パニツムマブ及び照射なし（図１ＩＢ）、処置３の未標識パニツムマブ及び照射（図１１Ｃ）、並びに処置４のＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−標識パニツムマブ及び照射（図１ＩＤ）を含んだ。照射線量は２４Ｊ／ｃｍ２であり、それには１０分間及び０．１μＭの濃度のプローブインキュベーションを伴った。図１１Ｅは、処置後及び３７℃にて２４時間のインキュベーション後のネクローシス細胞のパーセンテージを示す。形態データは、処置４の標識パニツムマブ及び照射（図１ＩＤ）だけが有効に細胞死を誘発したことを示した。照射を伴わない非標識又は標識抗体についてはいずれの計測可能な効果も観察されなかった（図１１Ａ〜１１Ｃ）。データは、抗体が使用したアッセイシステムにおいていずれの有意な効果も提供していないことを示す。
【０１３１】
様々なＬＥＤ光源を試験し、ＬＥＤの第２の光源が使用した標準的なＬＥＤと類似した効果をもたらすか判断するために評価した。分かりやすい評価を４つの処置（処置Ａ〜Ｄ）を用いて設定した。再現性を調べるために、試験を三連で実施した。試験は以下の４つの処置：処置Ａのプローブ及び照射なし、処置ＢのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識ＥＧＦ及び照射なし、処置ＣのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識ＥＧＦ及び照射、並びに処置ＤのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識パニツムマブ及び照射を含んだ。プローブ用量は、約０．１μＭの標識パニツムマブと０．５μＭの７００ＤＸ標識ＥＧＦであった。照射は、３２Ｊ／ｃｍ２の照射線量にて１０分間であった。
【０１３２】
図１２Ａ〜１２Ｄは、標識が照射前に存在していることがどれくらい有効であるか例証するために、７００ｎｍの対応する画像を用いてそれぞれのプローブについて代表的な処置から細胞の形態を示す。
【０１３３】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦ又はＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−パニツムマブのいずれかで処置した細胞の分析は、照射エネルギーによって大きく影響を受け、そして死滅した（それぞれ図１２Ｃ及び１２Ｄ）。よって、両プローブが一緒の、そして三連における有意且つ同様の効果は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小タンパク質がＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識抗体と同様に細胞を殺滅できることの明らかな証拠を提供した。％ネクローシス及び％生存率を以下の表２に提供する。いずれかのプローブの使用条件も個々のプローブに独特であってよい。データはまた、細胞の照射だけでは少しの効果も引き起こせなかったことを示し、その結果、照射の用量が必要以上の害を細胞に引き起こさないことが示唆された。７００ｎｍの画像の蛍光スケールは、細胞の両処置セットについて同じであった（図１２Ｃ〜１２Ｄ）。抗体プローブの適確な濃度は知られていないが、様々なプローブからのシグナルは類似したレベル及び強度に見える。
【０１３４】
【表２】
2020125343.tif 000010
【０１３５】
実施例６．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子及びＮＨＳエステルを投与することの治療的効果
【０１３６】
この実施例は、様々な標的化薬剤及び細胞のＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ ＮＨＳエステル標識の評価を示す。小分子ＲＧＤ標識プローブを試験した。Ａ４３１細胞が非常に低レベルのインテグリン受容体を発現するので、このプローブにとって理想的な細胞型でないことに注意しなければならない。
【０１３７】
簡単に言えば、Ａ４３１細胞を、特定の処置（以下に列挙）のためのそれぞれのプローブで標識し；細胞をすすぎ、そして標識を評価した。試験は以下の処置：処置１〜２では１μＭのＲＧＤ−ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ及び照射、処置３〜４では０．５μＭのＥＧＦ−ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ及び照射、処置５〜６では５μＭのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ ＮＨＳｅ及び照射、処置７〜８では約０．１μＭのパニツムマブ−ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ及び照射、処置９ではプローブなし及び照射なしによる陰性対照、及び処置１０ではＲＧＤ−ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ及び照射なしを含む。プローブを約１０分間インキュベートし、ＲＧＤプローブについては約２０分間のより長期間インキュベートした。細胞を、顕微鏡を用いて観察し、そして形態を処置後２４時間で検査した。
【０１３８】
図１３Ａ〜１３Ｇは、対応する７００ｎｍの画像を用いて処置１、３、５又は７を受けた細胞の形態を示して、標識が照射前に存在していることがどれくらい有効であったかを例証する。Ａ４３１細胞上の低レベルのインテグリン受容体に起因するＲＧＤプローブの低い結合が予想された。処置３、５、及び７はすべて、ＮＨＳｅ及びパニツムマブプローブであって最も高い有効性を有する細胞毒性を示した。図１４Ａ〜１４Ｄは、照射後２時間の時点での、処置１（図１４Ａ）、処置３（図１４Ｂ）、処置５（図１４Ｃ）、又は処置７（図１４Ｄ）を受けた細胞のＤＩＣ画像を示す。照射後３時間まで、ＲＧＤ（処置１）以外のすべての処置が有意な細胞毒性を示す。ＶＢ−４８アッセイやＪＣ−１アッセイなどの活力、生存率、及びネクローシスアッセイを実施した。表３にデータを提供する。
【０１３９】
【表３】
2020125343.tif 000011
実施例７．細胞死の誘発に対する様々な用量のＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識ＥＧＦを投与する効果
【０１４０】
この実施例では、標識ＥＧＦプローブと照射を用いた処置が細胞死を誘発し得ることを示す。Ａ４３１細胞を、０．１〜１μＭの濃度にてＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−標識ＥＧＦで約８時間処置し、そして約３２Ｊ／ｃｍ２にて照射をおこなった。
【０１４１】
簡単に言えば、１５０，０００個の細胞を平板培養し、３７℃、５％のＣＯ２にて一晩インキュベートした。約１ｍｌのプローブを適切な処置に加えた。インキュベーション期間後に細胞をすすぎ、そして、画像化した。小さいＬＥＤ装置を用いて細胞に照射をおこなった。細胞を３７℃、５％のＣＯ２にて更にインキュベートし、次に、照射後２〜３時間で画像化した。次に、細胞を採取し、２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞をNC-100（商標）NucleoCounter（登録商標）（ChemoMetec A/S; Allerod, Denmark）でカウントした。カスパーゼ３／７アッセイ（ImmunoChemistry Technologies, LCC, Bloomington, MN）を実施するために、製造業者のプロトコールに従って細胞を分析した。表４にデータを提供する。ＮＣは陰性対照、例えばプローブなしを示す。
【０１４２】
【表４】
2020125343.tif 000012
【０１４３】
処置に関するカスパーゼ３／７活性の測定値は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−ＥＧＦを使用するとき、プローブ用量の効果を示す。処置１及び３（照射を全く受けない）を試験したとき、それらは最も高い％健常細胞及び最も低いカスパーゼ活性を示した（図１５Ａ及び１５Ｃ）。濃度の影響は、プローブ用量が増すにつれて下がってゆく健常細胞のパーセントとして検出された（図１５Ｂ、１５Ｄ〜１５Ｇ）。後期アポトーシスのパーセントは、用量が増すにつれて上昇した。試験した２つの最も高い用量（１μＭと０．５μＭ）の間にはわずかな違いしか認められなかった。更なる効果が見られなかったので、このシステムにおける投薬の上限に達した可能性があった。まとめると、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識ＥＧＦリガンドで処置した細胞は、約３２Ｊ／ｃｍ２の照射光に晒されるとアポトーシスを受ける。
実施例８．クロロトキシンをコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ（ＣＬＴＸ−７００ＤＸ）の作製
【０１４４】
クロロトキシン（AnaSpec, AS-60770）を、ＰＢＳバッファーｐＨ８．５中に１ｍｇ／ｍＬで再構成する。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ ＮＨＳＥ（LI-COR, P/N 929-70010）を、ＰＢＳバッファーｐＨ８．５中に１ｍｇ／ｍＬで再構成する。染料をクロロトキシンに２〜３モル当量にてすぐに加え、暗所内、室温にて２時間インキュベートする。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ−クロロトキシンを、Ｓｌｉｄｅ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Pierce）を利用して精製して、コンジュゲートしていない遊離染料を取り除く。
実施例９．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ小分子コンジュゲート−ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識ＣＬＴＸ（クロロトキシン）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の特徴づけ
【０１４５】
この実施例では、プログラムされた細胞死、すなわち、細胞のアポトーシスを誘発するためのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ小分子コンジュゲート（プローブ）の使用を例示する。本明細書中に記載した小分子コンジュゲートとしては、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ ＣＬＴＸ（クロロトキシン）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）が挙げられる。
【０１４６】
クロロトキシン（ＣＬＴＸ）は、レイウラス・キンクエストリアツ（Leiurus quinquestriatu）の毒液中に見つかった３６個のアミノ酸のペプチドである。それは小コンダクタンス塩素チャンネルを妨げる。該分子はまた、アネキシンＡ２受容体に結合することも示され、ＭＭＰ−２の酵素活性に対して二重作用を有する。
【０１４７】
Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）（Affibody, Solna Sweden）親和性リガンドは優れた特徴を有する抗体模倣体として説明されている。それらはサイズが約６ｋＤａであり、Ｆｃ機能がない。Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓにはまた、アルブミンへの強い結合を通じてそれらの循環半減期を延長するＡｌｂｕｍｏｄ（商標）技術も組み込まれている。市販のＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子としては、抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、抗ＥｒｂＢ２ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、抗フィブリノーゲンＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、抗インシュリンＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、抗ＴＮＦα Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、抗トランスフェリンＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）などが挙げられる。
Ａ．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識ＣＬＴＸ
【０１４８】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤｘでＣＬＴＸを標識する手順は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷでＣＬＴＸを標識する手順と同様である（Kovar et al, Anal i, 2013, 440(2):212-9）。基本構造は変更されず、結合は晒されたリジン残基で起こる。Ｄ／Ｐ比は〜２であった。希釈をおこない、視覚化のためにビス−Ｔｒｉｓグリシンゲルで泳動した。標識分子の全体的なサイズは約５９５０ＭＷであると見積もられた。
【０１４９】
処置試験のために、ＨＴＢ−１８６細胞（線維形成性小脳髄芽腫細胞株）を調製し、ペトリディッシュで平板培養した。細胞を３７℃、５％のＣＯ２にて一晩インキュベートした。それぞれのプローブを用いた処置及び照射レベルを表５に提示する。処置用量は５００μｌのプレートあたり１０μｌであった。プローブを３７℃、５％のＣＯ２にて約５時間、細胞上でインキュベートした。
【０１５０】
【表５】
2020125343.tif 000013
【０１５１】
照射後のいくつかの時点で、細胞を形態変化についてエピ蛍光顕微鏡を使用して評価した。形態を実証するために、プローブとのインキュベーション後及び照射前に処置を画像化した。加えて、以下の時点：照射直後、照射後１時間、２時間、及び２４時間にて、細胞を画像化した。
【０１５２】
インキュベーション直後及び照射前に、すべての処置（処置１〜５）からの細胞は外観では健常であった。細胞形態の変化はいずれの処置においても検出されなかった。プローブを与えた処置（処置３〜５）は、同様の細胞内へのプローブの斑点状の取り込みを示した。７００ｎｍの画像は、プローブがエンドサイトーシスによって細胞内に内在化されたことを示した。
【０１５３】
照射直後、照射を受けたもの（処置２、４、及び５）を含めたすべての処置について、細胞形態はまだ健常を維持していた。７００ｎｍのチャンネルで得られたシグナルは、プローブ強度がプローブを与えた細胞（処置３、４、及び５）の間で同様であったことを示す。
【０１５４】
照射後２時間では、プローブの斑点状パターンは、照射を受けていない処置（処置３）について初期の画像から変化のないまま維持された。しかしながら、最高レベルの照射を受けた処置５について変化が検出された。斑点状パターンはより明るくに見え、そしてより細胞内に位置していた。処置５の細胞の形態は、他の処置と比較して正常に維持された。
【０１５５】
照射後２４時間では、２時間で現れた７００ｎｍのシグナルにおける認識可能な変化は、より明白であった。プローブからの明るいシグナルはここでは、細胞の内側、そして場合によっては、細胞の特定領域内に局在化した。加えて、アポトーシスを受けている細胞を暗示する特徴的な泡状突起及び丸い外観もまた検出された。
【０１５６】
照射後２時間より後での細胞の泡状突起の外観は、細胞が、もっと早い時間枠で起こるネクローシスではなく、アポトーシスを受けていることを示唆する。例えば、光力学的抗体プローブに対するネクローシス応答は照射後１５分間以内に起こる。
【０１５７】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ小分子プローブの細胞内局在性を更に調査するために、共局在を探すために、我々は蛍光オルガネラ特異的染料を使用した。ＣＬＴＸ−７００ＤＸの内在化がミトコンドリアにプローブを配置したか判断するために、我々はミトコンドリアに特異的なＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを使用した。ＨＴＢ−１８６細胞をペトリディッシュのガラスカバーガラス上に平板培養し、完全培地中で２４時間平衡化させた。細胞をＣＬＴＸ−７００ＤＸと共に４〜５時間インキュベートし、その後、細胞に３２Ｊ／ｃｍ２にて照射を加えた。プレートを３７℃、５％のＣＯ２にて更に２４時間インキュベートした。製造業者の取扱説明書に従って、細胞をＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎで４５分間処理した。細胞をそっとすすぎ、ＤＡＰＩと共に１５分間インキュベートして、核を染色した。追加のすすぎをおこない、そしてカバーガラスをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）培地でガラススライド上に封入した。フルオロフォアとプローブの位置を立証するために、顕微鏡画像化を実施した。
【０１５８】
顕微鏡解析は、ＣＬＴＸ−７００ＤＸプローブがミトコンドリア又は核に位置しなかったことを明らかにする。インキュベーション後４〜５時間で見られたプローブの斑点状パターンは、プローブがエンドサイトーシスによって細胞により内在化されることを示した。
Ｂ．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）
【０１５９】
抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）に対する遺伝子操作した特定のシステイン残基を介してＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸとコンジュゲートした。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸマレイミドを調製し、１のＤ／Ｐにて標識するために有効に使用した。
【０１６０】
処置試験のために、Ａ４３１細胞（類上皮腫癌細胞株）をペトリディッシュ内のカバーガラス上に播種し、２４時間インキュベートした。細胞を３７℃、５％のＣＯ２にて一晩インキュベートした。それぞれのプローブを用いた処置及び照射レベルを表６に提示する。処置用量は５００μｌのプレートあたり１０μｌであった。プローブを３７℃、５％のＣＯ２にて約５時間、細胞上でインキュベートした。細胞をすすぎ、先に示したレベルにて照射をおこなった。ペトリディッシュを最長２４時間インキュベーター内の元の位置に戻した。
【０１６１】
【表６】
2020125343.tif 000014
【０１６２】
アポトーシス又はネクローシスを暗示するいずれかの形態変化を追跡するように、照射前、そして照射後１時間、２時間、及び２４時間で画像を得た。
【０１６３】
照射前の最初の画像化は、処置３〜５においてＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）による細胞膜の良好な標識を伴った非常に健常な細胞増殖を示した。
【０１６４】
プローブを伴わない対照条件（処置１及び２）については、形態変化は全く検出されなかった。照射後1時間では、細胞は円くなり、処置４の細胞において縮小が見られ、そして、処置５の細胞においてより程度が増した。処置３の細胞におけるプローブの細胞表面の位置は、処置４及び５の細胞における局在性と比較して異なっていた。これらの２つの処置では、プローブは細胞のより離散的な位置に配置されていた。プローブの局在性は、変化した細胞形状又はアポトーシスの因果関係として直接的又は間接的に起因し得る。
【０１６５】
照射後２時間では、処置４及び５の細胞は、丸いままであり、アポトーシスの顕著な特徴である泡状突起を呈し始めた。処置５の細胞もまた、初期の時点及び他の処置の細胞と比較して健常ではないように見える。
【０１６６】
照射後２４時間では、処置１、２、及び３はすべて外観では健常に見える。プローブを受けなかった細胞（処置２）では、照射（３２Ｊ／ｃｍ２）の効果は検出されなかった。また、照射を伴わなかった細胞に対するプローブの効果は検出されなかった（処置３）。
【０１６７】
処置４の細胞は、照射後２時間の初期の時点では外観及び形態において同様に見える。データは、細胞がプログラムされた細胞死の経路を開始し、後期アポトーシスに移らなかったことを示唆する。一部の細胞では正常で、健常な形態を有しているうに見え、そしてそれは、処置４の処置条件が亜致死であることを示唆する。
【０１６８】
より高レベルの照射（３２Ｊ／ｃｍ２）を受けた処置５の細胞は、完全な細胞破壊及び
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識抗体で処置した細胞で見られたものと同様に見える劇的な形態変化を呈した。健常でない細胞はこれらの処置と共に観察された。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識抗体よりも細胞を殺滅するのにより長く（より多くの時間）かかることに注意しなければならない。アポトーシスはより長期間にわたって起こるので、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブがアポトーシスを誘発し、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識抗体がネクローシスを誘発するのは明らかである。
【０１６９】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）の細胞内局在性を更に調査するために、我々は先に記載したように、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを使用した。Ａ４３１細胞をペトリディッシュのガラスカバーガラス上に平板培養し、完全培地中で２４時間平衡化させた。細胞をＣＬＴＸ−７００ＤＸ抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）と共に４〜５時間インキュベートし、その後、細胞に３２Ｊ／ｃｍ２にて照射を加えた。プレートを３７℃、５％のＣＯ２にて更に２４時間インキュベートした。製造業者の取扱説明書に従って、細胞をＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎで４５分間処理した。細胞をそっとすすぎ、ＤＡＰＩと共に１５分間インキュベートして、核を染色した。追加のすすぎをおこない、そしてカバーガラスをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（商標）培地でガラススライド上に封入した。フルオロフォア及びプローブをエピ蛍光顕微鏡で検出した。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）はミトコンドリア又は核に位置しなかった。
【０１７０】
まとめると、該実施例は、光力学療法のためのＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブの使用についての例示を本明細書中に提供した。データは、プローブが細胞によって内在化された（取り込まれた）ことを示し、そして照射光への曝露によって、該細胞はアポトーシスを受ける。
実施例１０．ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００Ｄｘ小分子コンジュゲートプローブによるアポトーシス誘発
【０１７１】
この実施例では、細胞、例えば癌細胞においてアポトーシスを誘発するＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ小分子コンジュゲートの能力を例証する。この試験では、ＨＴＢ−１８６細胞（線維形成性小脳髄芽腫細胞株）をＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ小分子コンジュゲート（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識クロロトキシン、抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、ＲＧＤペプチド、及びＥＧＦリガンド）で処置した。アポトーシスをカスパーゼ３／７活性及びミトコンドリア膜電位を評価することによって計測した。アポトーシスは、様々な細胞形態、並びに膜の泡状突起、細胞収縮、膜の非対称性及び透過性の変化、及び／又はクロマチン及び核の縮合を含めた生化学的変化を特徴とする（Coleman et al., Nat Cell Biol, 2001, 3(4):339-45, Bortner and Cidlowski, Biochem Pharmacol, 1998, 56(12): 1549-59; van Engeland et al, Experimental Cell Research, 1997, 235:421-430）。
【０１７２】
クロロトキシン（ＣＬＴＸ）は、脳の腫瘍細胞の表面に特異的に結合するサソリ由来ペプチド（３６個のアミノ酸のペプチド）である。抗ＥＧＦＲ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）はヒトＥＧＦＲに結合できる。ＲＧＤ又はアルギニングリシルアスパラギン酸は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸で構成されたトリペプチドである。ＥＧＦリガンドは約６．２ｋＤａの分子量を有する５４個のアミノ酸のポリペプチドである。
【０１７３】
【表７】
2020125343.tif 000015
【０１７４】
実験手順：
【０１７５】
（１）指示したプローブを用いたそれぞれの処置を５％のＣＯ２、３７℃にて約５時間インキュベートする。
【０１７６】
（２）細胞を完全培地ですすぎ、非結合プローブを取り除き、そして新しい培地を加えた。
【０１７７】
（３）次いで、先の表７に示した特定のレベルまで細胞に照射をおこなった。
【０１７８】
（４）ペトリディッシュを５％のＣＯ２、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１７９】
（５）培養物を照射後２０時間で画像化し、そして、NC-3000（商標）NucleoCounter（登録商標）（ChemoMetec A/S; Allerod, Denmark）のプロトコールを使用して、更なる分析：ミトコンドリア電位アッセイ（ＪＣ−１）及びカスパーゼ３／７アッセイのために準備する。
【０１８０】
この試験では、ミトコンドリア膜電位アッセイを、処置１〜８からの細胞に対して実施して、処置した細胞がアポトーシスを受けたか否を判断した。膜浸透体ＪＣ−１染料は細胞のミトコンドリア膜電位の指標として一般的に使用する。アポトーシスの間、ミトコンドリアは、膜電位の変化、オルガネラの酸化−還元電位に対する変化などの変化、並びに破壊を受ける。蛍光ＪＣ−１染料などのミトコンドリア膜電位指標染料は、陽性に荷電されており、ミトコンドリアの陰電気を帯びた内部に蓄積する。ＪＣ−１染料はミトコンドリア内に蓄積された場合に、蛍光放出が緑色（約５２９ｎｍ）から赤（約５９０ｎｍ）にシフトする。ＪＣ−１凝集体形成による赤色蛍光の存在は、高いミトコンドリア分極領域に相当している。ＪＣ−１モノマーの緑色蛍光は脱分極しているミトコンドリアを示す。赤色／緑色蛍光強度比の検出可能な減少は、ミトコンドリアの脱分極を示し、よってアポトーシスを示す。膜電位アッセイでは、細胞をＪＣ−１染料と共にインキュベートし、そして、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、及び蛍光ベースのイメージサイトメトリーによって蛍光を検出する。
【０１８１】
カスパーゼ３／７アッセイは、先に列挙した処置からの細胞におけるカスパーゼ３／７活性を評価するのに使用した。アポトーシスの間、カスパーゼ３及び７を含めたカスパーゼ酵素が活性化され、特定のペプチド基質を切断する。この試験に使用したカスパーゼ３／７アッセイは、カスパーゼ３／７の切断部位がある細胞浸透性基質を含む。カスパーゼ３又はカスパーゼ７がアポトーシス細胞において活性化されるまで、基質は非蛍光性を維持する。活性化によって、カスパーゼは基質を切断し、次々に蛍光シグナルを放射する。活性化したカスパーゼ３／７を含むアポトーシス細胞は蛍光を発し、活性化したカスパーゼ３／７を含まない細胞は、最小限の又はバックグラウンド蛍光を発する。蛍光は、例えばフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、及び蛍光ベースのイメージサイトメトリーによって検出する。
【０１８２】
ペトリディッシュ内の細胞の顕微鏡像を照射後２０時間で得た。画像をＤＩＣ及び７００ｎｍで得て、プローブを視覚化し、そして合成画像を作成して（ＤＩＣ＋７００ｎｍ）、オーバレイを視覚化した。
【０１８３】
ＤＩＣ画像は、比較のための細胞健康及び一般的な成長パターンの良好な代表的な像を提供する。最初の３つの処置（処置１〜３）では、全体的な細胞形態の相違点はまず観察されなかった。細胞は非常に健常に見えた。７００ｎｍの画像においてこれらの処置に関してシグナルは全く観察されなかった。我々はまた、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸプローブで未処置の細胞（処置２）への照射（露光量）の効果も全く検出しない。
【０１８４】
処置４及び５では、ＣＬＴＸ−７００ＤＸプローブを細胞と共にインキュベートし、そして該細胞を１６Ｊ／ｃｍ２又は３２Ｊ／ｃｍ２の光に晒した。低レベルの照射（処置４）を受けた細胞は、より高いレベル（処置５）を受けたものと比較してより少ない細胞形態変化を示した。より高い照射レベルでは、顕著に異なった形態パターンを観察した。例えば、処置５の細胞は、より丸い形状を有し、細胞収縮を呈し、及びプレートから離れているように見えた。これらの細胞はまた、プレートじゅうで縮合し、より不連続なパターンも呈した。
【０１８５】
処置６〜８は、先に記載した３つの異なったＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子標的化薬剤を表す。７００ｎｍのシグナルを検出するとき、薬剤の結合がほとんど観察されなかったので、処置６の結果は７００ＤＸ−Ａｆｆｙプローブの分解の可能性を示す。或いは、これは、細胞傷害効果を開始するにはプローブ濃度が不十分であることに起因している可能性もある。これは、健常に見える細胞によって指摘されるとおり、照射による効果の不足を明らかにし得る。
【０１８６】
同様の細胞形態は７００ＤＸ−ＲＧＤ（処置７）、７００ＤＸ−ＥＧＦ（処置８）、及びＣＬＴＸ−７００ＤＸ（処置５）で処置した細胞でも観察された。照射後２０時間では、これらの細胞は、対照処置の細胞と比較してより丸く、より小さいように見えた。加えて、わずかな細胞しかプレートに接着していなかった。同様に、プローブが処置５、７、及び８の細胞内部で検出された。細胞の７００ｎｍの画像で斑点状パターンが明らかになった。結果は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブが細胞によって内在化され、そして、照射によって、処置細胞に細胞死をもたらすことを示す。
【０１８７】
処置した細胞がアポトーシスを受けているか判断するために、カスパーゼ３／７アッセイ及びミトコンドリア電位アッセイを実施した。各処置からのすべての細胞を採集し、適切に処理した。以下の表８は、カスパーゼ３／７アッセイによって測定した場合の細胞数、％生存率、ＪＣ−１の％シフト、及び％後期アポトーシス及び死細胞を提供する。
【０１８８】
【表８】
2020125343.tif 000016
【０１８９】
処置１の細胞は、高い細胞生存率（９０．３％）を有して形態的に正常且つ健常に見えた。処置２、３、及び６は、プローブの不存在（処置２及び３）又は効果がないプローブ濃度（処置６）により対照と見なされた。これらの処置は、生存細胞の最も高いパーセンテージ、すなわち、９０％超の生存率を有した。
【０１９０】
カスパーゼ３／７アッセイに基づいて、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子（ＣＬＴＸ−７００ＤＸ、７００ＤＸ−ＲＧＤ、及び７００ＤＸ−ＥＧＦ）は後期アポトーシス＋死細胞（処置５、７、及び８）の最も高いパーセンテージをもたらした。データはまた、より多量の露光量（３２Ｊ／ｃｍ２対１６Ｊ／ｃｍ２）が、ＣＬＴＸ７００ＤＸで処置した細胞において、より高いパーセンテージのカスパーゼ３陽性細胞（５９％対３２％）及びＪＣ−１シフトを受けた細胞（４４％対３７％）を誘発したことを示す。同様の結果はまた、７００ＤＸ−ＲＧＤ又は７００ＤＸ−ＥＧＦのいずれかで処置し、そして、３２Ｊ／ｃｍ２に晒した細胞でも見られた。結果は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブで処置した細胞における光力学療法がプログラムされた細胞死、すなわち、アポトーシスを受けることを示す。
【０１９１】
先に記載したように、ＪＣ−１シグナルのシフトはミトコンドリアの脱分極を示し、そしてそれは、細胞がアポトーシスの初期段階にあることを意味する。表８に提示したデータは、細胞の３５％未満が対照処置（処置１、２、３、及び６）においてＪＣ−１シフトを呈したことを示す。対照的に、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブを受け、１６又は３２Ｊ／ｃｍ２の照射を受けた細胞の少なくとも３７％が、ＪＣ−１シフトを呈した。言い換えれば、カスパーゼ３／７活性及びミトコンドリア膜電位によって評価した場合、他の処置（処置１〜３、及び６）からの細胞よりも、処置４、５、７、及び８からの細胞がより高い割合でアポトーシスを受けていた。まとめると、該実施例は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子プローブが細胞によって内在化されることを例証している。更に照射によって、細胞はネクローシスではなく、アポトーシスを受ける。
【０１９２】
ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ標識小分子の内在化と、それに続く照射などの光力学的処置（ＰＤＴ）は、一重項酸素及びスーパーオキシド産生を誘発する。この反応は、ミトコンドリア膜などの細胞の内部構造に影響を及ぼし、それによりミトコンドリア膜電位などにも影響を及ぼす。加えて、光力学的処置はまた、カスパーゼプロテアーゼの活性化も誘発する。処置細胞に対するこれらの変化は、小分子プローブを使用した光力学療法がアポトーシスを誘発し得ることを示した。
実施例１１．一重項酸素の産生
【０１９３】
染料及びコンジュゲートプローブ（ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸカルボキシレート（７００ＤＸ）、ＥＧＦ、ＲＧＤ、及びＩｇＧコンジュゲート）を、一重項酸素の産生についてSinglet Oxygen Green Sensor（Life Technologies）を使用して評価し、及び定常蛍光光度計（ｅｘ ５０４ｎｍ／ｅｍ ５２５ｎｍ）によって計測した。対照（水又はＤＭＥＭ培地）及びメチレンブルーの陽性対照（ＭＢ）を含めた。ＭＢ及びすべての７００ＤＸコンジュゲートについて３〜４倍の増大が認められた。一重項酸素アジ化ナトリウム（アジド）のスカベンジャーをメチレンブルー又は７００ＤＸに加えたとき、蛍光の低減が認められた。これらのデータは、７００ＤＸについて一重項酸素の産生を裏づけ、そして、適切な露光量（６９０ｎｍ）の照射後にコンジュゲートが存在する。
【０１９４】
測定を３０秒間、毎秒ごとにおこない、平均した。結果を図１６に示す。溶液の構成：ＳＯＧＳ（１μＭ）、染料又はプローブ添加（１０μＭ）、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（５０μＭ）及び重水（５０％）。露光量＝３２Ｊ／ｃｍ２。
【０１９５】
上記発明は、明確な理解を目的とした例示及び実施例によってある程度詳細に説明されたが、当業者は、添付の請求項の範囲内で特定の変更や修飾が実施され得ることを理解するであろう。加えて、本明細書中に提示した各参照文献の全体を、各参照文献を参照によって個別に援用したのと同等に援用する。
略式の配列表
配列番号１
ＥＧＦ
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR
配列番号２
ＴＮＦＲ１インヒビターペプチド
YCWSQYLCY
配列番号３
血管作動性小腸ペプチド
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVK YLNSILN
配列番号４
ボンベシン
Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met
配列番号５
サブスタンスＰ
RPKPQQFFGLM
配列番号６
ＳＰＡＲＣペプチド
CFGIKQKDIDKDLVI
配列番号７
オクトレオチド
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)
配列番号８
エキセンジン−４
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2
配列番号９
ＳＯＲ−Ｃ１３
KEFLHPSKVDLPR
配列番号１０
ＳＯＲ−Ｃ２７
EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR
配列番号１１
ソリシジン
DCSQDCAACSILARPAELNTETCILECEGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR
配列番号１２
クロロトキシン（ＣＬＴＸ）
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR-NH2
配列番号１３
【図１】
2020125343.tif 000017
【図２】
2020125343.tif 000018
【図３Ａ】
2020125343.tif 000019
【図３Ｂ】
2020125343.tif 000020
【図４Ａ】
2020125343.tif 000021
【図４Ｂ】
2020125343.tif 000022
【図５Ａ−５Ｃ】
2020125343.tif 000023
【図６Ａ−６Ｄ】
2020125343.tif 000024
【図７Ａ−７Ｂ】
2020125343.tif 000025
【図８Ａ】
2020125343.tif 000026
【図８Ｂ】
2020125343.tif 000027
【図９Ａ】
2020125343.tif 000028
【図９Ｂ】
2020125343.tif 000029
【図１０Ａ】
2020125343.tif 000030
【図１０Ｂ】
2020125343.tif 000031
【図１０Ｃ】
2020125343.tif 000032
【図１１Ａ−１１Ｄ】
2020125343.tif 000033
【図１１Ｅ】
2020125343.tif 000034
【図１２Ａ−１２Ｄ】
2020125343.tif 000035
【図１３Ａ−１３Ｇ】
2020125343.tif 000036
【図１４Ａ−１４Ｄ】
2020125343.tif 000037
【図１５Ａ−１５Ｇ】
2020125343.tif 000038
【図１６】
2020125343.tif 000039
【配列表】
2020125343000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月28日(2020.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患又は病態を患っている対象において細胞毒性を誘発するための、前記対象の細胞に特異的に結合し、リガンド、ペプチド及び小分子からなる群より選ばれるプローブにコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのフタロシアニン染料を含む治療的に有効な薬剤であって、当該プローブは約１０ｋＤａ未満の分子量を有し、前記誘発は、
（ａ）前記治療的に有効な薬剤を前記対象に投与し；そして、
（ｂ）アポトーシスによる細胞死を誘発するのに有効な量で適切な励起光を前記細胞に照射すること、
によって行われる、薬剤。
【請求項２】
（ｉ）前記疾患又は病態が、血管疾患、癌、細菌性バイオフィルムに起因する感染、抗生物質抵抗性創傷感染、光線性角化症、酒さ、にきび、乾癬、及び滲出型加齢性黄斑変性症から成る群から選択されるか、あるいは、
（ii）前記疾患又は病態が、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、
卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌、脳腫瘍、頭頚部癌、神経内分泌系の癌、皮膚癌、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記対象が、固形腫瘍を患っているか又は固形腫瘍を患っていた、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記細胞が固形腫瘍内又は対象の血中に存在している、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記励起光が６６０〜７４０ｎｍの波長を有する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
前記リガンドがＥＧＦである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＹＣ−２７、ｃＲＧＤｆＫ、血管作動性小腸ペプチド、ガストリン放出ペプチド、ニューロテンシン、ＡＨ１１１５８５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＰＫ１１１９５、ＳＰＡＲＣ、ボンベシン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、コレシストキニン、グルカゴン様ペプチド−１、ニューロペプチドＹ、オクトレオチド、ＤＯＴＡ−ＴＯＣ、ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥ、エキセンジン−４、ソリシジン、ＳＯＲ-１３、ＳＣＲ−Ｃ２７、その類似体、その誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
前記小分子が、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＮＦＲ１阻害剤、成長因子受容体阻害剤、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項９】
前記小分子ＶＥＧＦＲ阻害剤が、パゾパニブ、セマキシニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、モテサニブ、バタラニブ、セジラニブ、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項８に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記プローブが放射性核種にコンジュゲートされるか、又は前記プローブがフルオロフォアにコンジュゲートされる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記プローブが、ＤＴＰＡ−オクトレオチド、［Ｇｌｕｃ−Ｌｙｓ］−ＴＯＣＡ、ガラクト−ＲＧＤ、ＡＨ１１１５８５、ＲＧＤ−Ｋ５、ＦＰＰＲＧＤ２、ＲＰ−５２７、ＢＺＨ３、［ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０］−エキセンジン−４、及びＴｃ−ＮＴ−Ｘ１から成る群から選択されるメンバーである、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記ステップ（ａ）の投与が、治療的に有効な薬剤を対象の血中に注射することを含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記ステップ（ｂ）の照射が、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することを含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１４】
抗癌剤を対象に投与することを更に含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記ペプチドはクロロトキシンである、請求項１に記載の薬剤
【外国語明細書】
2020125343000001.pdf