(57)【要約】【課題】植物成長調整剤を提供すること、及びリグニンの有効利用技術を提供すること。【解決手段】水溶性単離リグニンを有効成分として含有する、植物成長調整剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性単離リグニンを有効成分として含有する、植物成長調整剤。
【請求項２】
前記水溶性単離リグニンが固形リグニンの水熱処理物である、請求項１に記載の植物成長調整剤。
【請求項３】
前記固形リグニンが糖化処理リグニンである、請求項２に記載の植物成長調整剤。
【請求項４】
前記水熱処理物がアルカリ水熱処理物である、請求項２又は３に記載の植物成長調整剤。
【請求項５】
前記水溶性単離リグニンがリグノスルホン酸である、請求項１〜４のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項６】
前記水溶性単離リグニンが中性の水に対する溶解性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項７】
前記水溶性単離リグニンが木質バイオマス由来である、請求項１〜６のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項８】
前記水溶性単離リグニンの分子量が3000以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項９】
水溶液形態である、請求項１〜８のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項１０】
根の伸長促進に用いるための、請求項１〜９のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項１１】
根の細胞分裂促進に用いるための、請求項１〜１０のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【請求項１２】
水溶性単離リグニンを施用することを含む、植物成長を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物成長調整剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環型社会の実現に向け、植物バイオマスの利用の利用促進が進められている。植物バイオマスの主な利用形態としては、糖化処理を経たバイオエタノール生産、パルプ化処理を得た製紙等が挙げられる。これらの利用形態においては、植物バイオマス中のセルロース及びヘミセルロースが利用対象であるものの、バイオマス中成分の多くを占めるリグニンについては通常は廃棄対象である。例えば、植物バイオマスを硫酸で加水分解することにより得られたグルコースなどの単糖類はバイオエタノールを合成に利用されるが、残渣として産出されるリグニン（硫酸リグニン）は化学反応性が低く、これまで有効的な活用ができていなかった。
【０００３】
一方、植物バイオマスの利用促進等の観点から、植物の成長を促進する技術が求められている。特許文献１では、特定構造の低分子化合物が植物成長促進作用を有することが報告されている。しかしながら、このような技術は、有効成分の合成等のみを目的としてエネルギーを使用するため、循環型社会の実現の観点からは望ましくない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2014／038185号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物成長調整剤を提供することを課題とする。また、本発明は、リグニンの有効利用技術を提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、水溶性単離リグニンが植物成長促進作用を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００７】
項１．  水溶性単離リグニンを有効成分として含有する、植物成長調整剤。
【０００８】
項２．  前記水溶性単離リグニンが固形リグニンの水熱処理物である、項１に記載の植物成長調整剤。
【０００９】
項３．  前記固形リグニンが糖化処理リグニンである、項２に記載の植物成長調整剤。
【００１０】
項４．  前記水熱処理物がアルカリ水熱処理物である、項２又は３に記載の植物成長調整剤。
【００１１】
項５．  前記水溶性単離リグニンがリグノスルホン酸である、項１〜４のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１２】
項６．  前記水溶性単離リグニンが中性の水に対する溶解性を有する、項１〜５のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１３】
項７．  前記水溶性単離リグニンが木質バイオマス由来である、項１〜６のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１４】
項８．  前記水溶性単離リグニンの分子量が3000以上である、項１〜７のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１５】
項９．  水溶液形態である、項１〜８のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１６】
項１０．  根の伸長促進に用いるための、項１〜９のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１７】
項１１．  根の細胞分裂促進に用いるための、項１〜１０のいずれかに記載の植物成長調整剤。
【００１８】
項１２．  水溶性単離リグニンを施用することを含む、植物成長を促進する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、リグニン由来材料（水溶性単離リグニン）の、植物成長調整剤としての有効利用技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】試験例1において、種子（Oryza sativa L.var.Nipon bare（NB））を培地に浮かせてから12日間経過後の根の状態を表す写真を示す。写真下方に、培地中のHSAL濃度を示す。
【図２】試験例1において、種子（iaa変異体（iaa：オーキシン非応答性変異体））を培地に浮かせてから12日間経過後の根の状態を表す写真を示す。写真下方に、培地中のHSAL濃度を示す。
【図３】試験例1における根の長さの変化を表すグラフを示す。左側のグラフがOryza sativa L.var.Nipon bare（NB）の結果を表し、右側のグラフがiaa変異体（iaa：オーキシン非応答性変異体）の結果を表す。黒丸のプロットがHSAL濃度0％の場合を示し、黒四角のプロットがHSAL濃度0.05％の場合を示す。縦軸は、根の長さを示し、横軸は種子を培地に浮かせてからの経過日数を示す。バーは、標準偏差（n＝5）を示す。
【図４】試験例2において、種子を植えてから14日間経過後の状態を表す写真を示す。
【図５】試験例4における、根サンプルの観察像を示す。写真上方に培地中のHSAL濃度を示し、写真左側に培養日数を示す。白色部分が細胞分裂活性が高い箇所である。
【図６】試験例5における、根サンプルの観察像を示す。写真下方に培地中のHSAL有無を示す。
【図７】試験例6における、種子（Oryza sativa L.var.Nipon bare（NB））を培地に浮かせてから10日間経過後の根の状態を表す写真を示す。写真下方に、培地中の水溶性単離リグニンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２２】
本発明は、その一態様において、水溶性単離リグニンを有効成分として含有する、植物成長調整剤（本明細書において、「本発明の植物成長調整剤」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００２３】
1．水溶性単離リグニン
水溶性単離リグニンは、植物バイオマスから単離されたリグニン（単離リグニン）であって、水溶性を有するものであれば、特に制限されない。
【００２４】
「水溶性を有する」とは、試験液（水又は水溶液）に対して溶解性を有することを示す。具体的には、試験液（20℃）100gに対して、例えば0.05g以上、好ましくは0.1g以上、より好ましくは0.15g以上である。該溶解度の上限は、特に制限されないが、試験液（20℃）100gに対して、例えば200g、100g、50gである。
【００２５】
試験液のpHは中性であることが好ましく、具体的には例えばpH6〜8、好ましくはpH6.5〜7.5、より好ましくはpH6.8〜pH7.2、さらに好ましくはpH6.9〜7.1である。試験液は好ましくは水である。
【００２６】
水溶性単離リグニンの由来植物は、リグニンを含む限り特に限定されない。植物としては、例えば、針葉樹、広葉樹、非樹木系植物等が挙げられる。具体的には、スギ、エゾマツ、カラマツ、クロマツ、トドマツ、ヒメコマツ、イチイ、ネズコ、ハリモミ、イラモミ、イヌマキ、モミ、サワラ、トガサワラ、アスナロ、ヒバ、ツガ、コメツガ、ヒノキ、イチイ、イヌガヤ、トウヒ、イエローシーダー（ベイヒバ）、ロウソンヒノキ（ベイヒ）、ダグラスファー（ベイマツ）、シトカスプルース（ベイトウヒ）、ラジアータマツ、イースタンスプルース、イースタンホワイトパイン、ウェスタンラーチ、ウェスタンファー、ウェスタンヘムロック、タマラック等の針葉樹；  アスベン、アメリカンブラックチェリー、イエローポプラ、ウォールナット、カバザクラ、ケヤキ、シカモア、シルバーチェリー、タモ、チーク、チャイニーズエルム、チャイニーズメープル、ナラ、ハードメイプル、ヒッコリー、ピーカン、ホワイトアッシュ、ホワイトオーク、ホワイトバーチ、レッドオーク、アカシア、ユーカリ等の広葉樹；  イネ、サトウキビ、ムギ、トウモロコシ、パイナップル、オイルパーム、ケナフ、綿、アルファルファ、チモシー、タケ、ササ、テンサイ等の非樹木系植物等が挙げられる。植物は、1種単独であり得る、又は2種以上の組み合わせであり得る。水溶性単離リグニンは、木質バイオマス由来であることが好ましい。
【００２７】
植物におけるリグニン含量については特に限定されるものではないが、植物乾燥重量当たり、例えば1〜50質量％、好ましくは5〜40質量％、より好ましくは10〜35質量％、さらに好ましくは15〜30質量％である。
【００２８】
単離リグニンとしては、特に制限されず、例えば植物バイオマスからセルロース及びヘミセルロースを除去又は減量化して得られるものを挙げることができる。単離リグニンとしては、例えば糖化処理して得られる単離リグニン、パルプ化処理（例えば蒸解処理）して得られる単離リグニン、これらの単離リグニンや固形リグニンの加工物等が挙げられる。これらの中でも、本発明で使用する「水溶性」単離リグニンとしては、水溶性官能基（例えば、水酸基、スルホ基、カルボキシ基等）量が増加するような処理（例えばサルファイト蒸解処理等のパルプ化処理、水熱処理等）を得て得られるものが挙げられ、好ましくは固形リグニンの水熱処理物、パルプ化処理して得られる単離リグニン（好ましくはリグノスルホン酸）等が挙げられる。
【００２９】
固形リグニンの水熱処理物は、固形リグニンを水熱処理して得られるものであり、この限りにおいて特に制限されない。
【００３０】
固形リグニンとしては、固形状のリグニンを含むものである限り特に制限されず、例えば植物バイオマスそのもの、植物バイオマスを糖化処理して得られる残渣（糖化処理リグニン）等が挙げられ、好ましくは糖化処理リグニンが挙げられる。糖化処理方法としては、植物バイオマスから糖化処理の基質となる多糖類を覆っているリグニンをはずすことができる処理である限り特に限定されず、多糖類の糖化を引き起こす処理も含まれる。糖化処理方法としては、好ましくは酸処理、酵素処理等が挙げられ、より好ましくは酸処理が挙げられる。糖化処理は、1種単独であり得る、又は2種以上の組み合わせであり得る。
【００３１】
酸処理は、植物バイオマス中のセルロース及びヘミセルロースを加水分解できる処理である限り、特に制限されない。酸処理は、例えば酸を添加した水性溶媒中で植物バイオマスを処理することにより行われる。
【００３２】
酸としては、例えば有機酸又は無機酸が挙げられ、好ましくは無機酸が挙げられる。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、ボロン酸、フッ化水素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、次亜臭素酸、亜臭素酸、臭素酸、過臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜ヨウ素酸、ヨウ素酸、過ヨウ素酸、亜リン酸、リン酸、ポリリン酸、クロム酸、過マンガン酸、アンバーリストが挙げられる。有機酸としては、例えば、マレイン酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、葉酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、ケトグルタル酸、アジピン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、イソクエン酸、クエン酸、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ヘミメリト酸、トリメリト酸、トリメシン酸、メロファン酸、プレーニト酸、ピロメリト酸、メリト酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、p-トルエンスルフィン酸、ベンゼンスルフィン酸等が挙げられる。酸としては、無機酸が好ましく、中でも硫酸がより好ましい。酸は、1種単独であり得る、又は2種以上の組み合わせであり得る。
【００３３】
酸の濃度としては、例えば5〜90質量％である。水性溶媒としては、水や緩衝液等が挙げられる。処理温度としては、例えば10〜100℃が挙げられる。処理時間としては、例えば15〜240分間が挙げられる。
【００３４】
本発明の好ましい一態様においては、高濃度の酸水溶液（酸濃度：例えば50〜90質量％、好ましくは60〜80質量％）中、低温下（例えば10〜40℃、好ましくは15〜30℃）で処理した後に、低濃度の酸水溶液（酸濃度：例えば5〜45質量％、好ましくは20〜40質量％）中、高温下（例えば70〜100℃、好ましくは80〜95℃）で処理することが望ましい。このように2段階で処理することにより、処理装置の耐久性の範囲内でより効率的にリグニンと糖を分離することができる。
【００３５】
酵素処理は、糖の加水分解酵素を用いた糖化処理である限り特に限定されない。
【００３６】
糖の加水分解酵素としては、糖の加水分解酵素として公知の酵素、例えば、セルラーゼ（セロビオヒドロラーゼ、エンド-β-1,4-グルカナーゼ、若しくはβ-グルコシダーゼ等）、エンド-β-1,4-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、α-D-グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、キシログルカナーゼ、エンド-β-1,4-マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、又はアセチル(ガラクト)グルコマンナンエステラーゼ等が挙げられる。酵素は、1種単独であり得る、又は2種以上の組み合わせであり得る。
【００３７】
酵素糖化処理条件としては、糖の加水分解酵素が活性を有する限り特に限定されず、用いる加水分解酵素の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、溶媒としては水性溶媒、具体的には水又は緩衝液が挙げられる。溶媒のpHとしては、例えば2〜12、好ましくは3〜10が挙げられる。処理温度としては、例えば15〜70℃、好ましくは、25〜60℃が挙げられる。処理時間としては、例えば1時間〜5日間、好ましくは1〜4日間が挙げられる。糖の加水分解酵素の濃度としても、使用する酵素に応じて、適宜設定することができる。
【００３８】
植物バイオマスの糖化処理残渣としては、糖化処理で得られた水不溶物及び可溶液の混合物をそのまま、或いは分離した水不溶物を用いることができる。分離の手法は特に限定されず、公知の方法、例えば遠心分離、又は濾過などを採用することができる。糖化処理残渣は、公知の乾燥方法、例えば風乾、加熱乾燥、又は凍結乾燥などにより乾燥させてもよい。また、分離された糖化処理残渣を適当な洗浄液、例えば水や温水で洗浄してもよい。
【００３９】
固形リグニンの水熱処理は、水溶性単離リグニンを生成可能な水熱処理である限り、特に制限されない。水熱処理の温度は、例えば180〜300℃、好ましくは250〜290℃である。水熱処理の時間は、例えば1〜8時間、好ましくは1.5〜5時間である。
【００４０】
水熱処理は、水溶性単離リグニンの生成効率の観点から、アルカリ水熱処理であることが好ましい。アルカリ水熱処理は、アルカリの存在下で行う水熱処理である。
【００４１】
アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム等の強アルカリ；  アンモニア、炭酸水素ナトリウム等の弱アルカリが挙げられ、好ましくは強アルカリが挙げられる。アルカリは、1種単独であり得る、又は2種以上の組み合わせであり得る。
【００４２】
水熱処理液中のアルカリの濃度は、例えば0.5〜10質量％、好ましくは1〜6質量％、より好ましくは2〜4質量％である。
【００４３】
水熱処理液中の固形リグニンの濃度は、例えば0.5〜10質量％、好ましくは1〜6質量％、より好ましくは2〜4質量％である。
【００４４】
水熱処理後、必要に応じて精製（例えば透析等により、無機物質を除去又は低減）して、水溶性単離リグニンを得ることができる。
【００４５】
水溶性単離リグニンの分子量は、好ましくは3000以上、より好ましくは3500以上である。水溶性単離リグニンの平均分子量は、好ましくは3000〜10000、より好ましくは3500〜6000である。
【００４６】
2．用途
本発明の植物成長調整剤は、水溶性単離リグニンを有効成分として含有する。本発明の植物成長調整剤は、より具体的には、例えば、根及び／又は茎の伸長促進のために、根及び／又は茎（好ましくは根、より好ましくは根の成長点）の細胞分裂促進のために、バイオマス増加剤として、或いは倒伏抑制剤として、使用することができる。
【００４７】
本発明の植物成長調整剤によって根のバイオマスを増加させた場合、それにより地上部のバイオマス増加を図ることが可能である。本発明の植物成長調整剤を使用することにより、茎を伸長させてバイオマスを増加させつつも、茎が太くなるので、倒伏抑制効果が期待できる。また、本発明の植物成長調整剤は、ジベレリン等の既存の植物成長調整剤とは異なり、細胞の形状に変化を及ぼさずに細胞分裂を促進させてバイオマスを増加させる効果を発揮することができる。
【００４８】
本発明の植物成長調整剤の対象植物は、特に限定されない。例えば、被子植物（双子葉植物、単子葉植物等）、裸子植物、シダ植物等の植物に対して広く適用できる。具体例としては、トマト、ピーマン、トウガラシ、ナス等のナス類、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ類、キャベツ、ブロッコリー、ハクサイ等の菜類、セルリー、パセリー、レタス等の生菜又は香辛菜類、ネギ、タマネギ、ニンニク等のネギ類、ダイズ、ラッカセイ、インゲン、エンドウ、アズキ等の豆類、イチゴ等のその他果菜類、ダイコン、カブ、ニンジン、ゴボウ等の直根類、サトイモ、キャッサバ、バレイショ、サツマイモ、ナガイモ等のイモ類、アスパラガス、ホウレンソウ、ミツバ等の柔菜類、トルコギキョウ、ストック、カーネーション、キク等の花卉類、イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ等の穀物類、ベントグラス、コウライシバ等の芝類、ナタネ、ラッカセイ等の油料作物類、サトウキビ、テンサイ等の糖料作物類、ワタ、イグサ等の繊維料作物類、クローバー、ソルガム、デントコーン等の飼料作物類、リンゴ、ナシ、ブドウ、モモ等の落葉性果樹類、ウンシュウミカン、レモン、グレープフルーツといった柑橘類、サツキ、ツツジ、スギ等の木本類等が挙げられる。
【００４９】
本発明の植物成長調整剤は、水溶性単離リグニンのみからなるものでもよいが、水溶性単離リグニンに加えて、後述の剤形、施用態様等に応じて種々の他の成分を含んでいてもよい。植物成長調整剤中の水溶性単離リグニン（乾燥重量）の含有割合は、後述の剤形、施用態様等に応じて適宜決定することができるが、例えば0.0001〜100質量％の範囲を例示することができる。他の成分としては、例えば担体、固着剤、分散剤、補助剤等が挙げられる。担体としては、例えば、タルク、ベントナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、ケイ砂等の固体担体；水溶性高分子化合物（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等）、水、植物油、液体動物油等の液体担体等が挙げられる。固着剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸等が挙げられる。分散剤としては、例えば、アルコール硫酸エステル類、ポリオキシエチレングリコールエーテル等が挙げられる。補助剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、デンプン、乳糖等が挙げられる。上記担体、固着剤、分散剤および補助剤は、それぞれの目的に応じて、それぞれ単独でまたは適宜組合せて使用することができる。
【００５０】
本発明の植物成長調整剤の剤形は、農学的に許容される剤形である限り特に限定されない。例えば、粒剤、1キロ粒剤、500グラム粒剤、250グラム粒剤、ジャンボ剤等の粒剤；  粉剤、DL粉剤、FD粉剤等の粉剤；  粉粒剤、微粒剤F、細粒剤F等の粉粒剤；  粉末；  水和剤、フロアブルゾルSC、顆粒水和剤、ドライフロアブル等の水和剤；  水溶剤、顆粒水溶剤等の水和剤；  乳剤、EW剤等の乳剤；  液剤、EW剤等の液剤；  油剤、サーフ剤等の油剤；  エアゾル；  ペースト剤；  マイクロカプセル剤；  パック剤等が挙げられる。
【００５１】
本発明の植物成長調整剤は、水溶液形態であることが好ましい。該水溶液のpHは中性であることが好ましく、具体的には例えばpH6〜8、好ましくはpH6.5〜7.5、より好ましくはpH6.8〜pH7.2、さらに好ましくはpH6.9〜7.1である。この場合、水溶性単離リグニン（乾燥重量）の含有割合（使用時）は、好ましくは0.0001〜0.2質量％、より好ましくは0.001〜0.1質量％、さらに好ましくは0.005〜0.07質量％である。
【００５２】
水溶性単離リグニンを植物成長促進目的で使用する場合、水溶性単離リグニンを施用することにより、植物成長促進作用を発揮させることができる。施用は、植物の培地（例えば、土壌等）に適用する態様であれば、特に制限されない。施用態様は、農薬の使用態様として公知の態様（或いは将来開発される態様）である限り特に限定されない。例えば、散布、滴下、塗布、植物生育環境中（土壌中、水中、固形培地中、液体培地中等）への混合又は溶解等が挙げられる。より具体的には、例えば水耕液に添加する態様、土壌表面上に散布する態様、肥料と混合する態様等が挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５４】
製造例1．水溶性単離リグニンの調製
スギ木粉を硫酸処理（72％硫酸，室温，30分処理→30％硫酸，90℃，90分処理）によって加水分解して硫酸リグニン（SAL）を得た。100 mgのSAL、100 mgのNaOH、及び3 mLの水を含む混合物を、内容積12 cm3のステンレス鋼管に密封し、280℃、2時間反応させた。反応後、ステンレス鋼管を水浴に浸して直ちに室温まで冷却した。内容物をセルロースチューブ（分画分子量3500、Tubing TM 3500； BioDesign、Carmel、NY、USA）を用いて透析し、無機物及び低分子化合物を除去した。反応生成物を凍結乾燥して水溶性単離リグニン（HSAL、水100g（20℃）に対する溶解度は0.2g）を得た。
【００５５】
試験例1．植物成長試験1（イネ）
HSALをろ過水で溶解し（終濃度：0％、0.01％、0.05％、0.1％）、プラスチック製の箱の中にいれ、培地とした。2種類のイネ苗（Oryza sativa L.var.Nipon bare（NB）、及びiaa変異体（iaa：オーキシン非応答性変異体））を用いた。イネ種子は、ベンレート溶液（2.5 g/L）に3日間浸して滅菌した後、水道水で3回すすいだ。浮きのついたプラスチック製の網の上に洗浄したイネ種子を載せ、培地に浮かた。連続光の下（28℃）、グロースチャンバー（MLR351、Sanyo、Japan）で成長させた。
【００５６】
種子を培地に浮かせてから12日間経過後の根の状態を表す写真を図１及び図２に示す。根の長さの変化を表すグラフを図３に示す。水溶性単離リグニンによって根が伸長することが分かった。また、この伸長は、iaa変異体でも起こっていることから、少なくとも一部はオーキシン非依存的に起こることが分かった。
【００５７】
試験例2．植物成長試験2（コーン）
プラスチック製容器に土を充填し、そこにコーンの種子を植えた。HSAL及び／又は肥料（HYPONex）をろ過水で溶解して（終濃度0 g/L、4 g/L）肥料溶液を作製し、これを1日当たり50mL、土表面に撒いた。25℃、一定の明暗サイクル下（明条件16時間／暗条件8時間）、グロースチャンバー（MLR351、Sanyo、Japan）で成長させた。
【００５８】
種子を植えてから14日間経過後の状態を表す写真を図４に示す。種子を植えてから14日間経過後の、茎及び根それぞれの重量及び長さの測定結果を表１に示す。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
水溶性単離リグニンの成長促進作用が、既存の肥料よりも顕著に高いことが分かった。
【００６１】
試験例3．植物成長試験3（シロイヌナズナ）
固形培地（MS: 1/2 bag (2.3g/L)、MES: 0.5g/L、Sucrose: 5g/L、pH to 5.7~5.8、Gellan Gum 5g/L、HSAL 0-100 mg/L）にシロイヌナズナの種子を撒き、22℃、一定の明暗サイクル下（明条件16時間／暗条件8時間）、グロースチャンバー（MLR351、Sanyo、Japan）で成長させた。その結果、水溶性単離リグニンにより根の伸長が促進することが確認できた。
【００６２】
試験例4．細胞分裂活性の評価試験
EdU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）は、細胞周期の活性なDNA合成またはS期合成を直接測定するための新しい代替法である。HSAL濃度0％又は0.05％下で試験例1と同様にして5日間及び10日間培養した後、5mgのEdUをDMSO 2mlで希釈し、培養容器に添加した。EdU染色サンプルの根を根元から5mmまで切り出し、試験管に集めた。10分間真空デシケーターを使用してFAAで2回、根を固定した。続いて、5分間真空デシケーター下でPBSを使用して、そして室温で20分間0．5％TritonX／PBS  0.5mLを使用して、2回膜飽和させた。430μlのClick-iT（登録商標）反応緩衝液、20μlのCuSO4、1.2μlのAlexa Fluor Azide、および50μlの反応緩衝液添加剤を混合して反応カクテルを調製し、そして根管に注入した。試料を37℃のインキュベーターに1時間入れた。PBSで洗浄した後、DNA染色のために4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）を試験管に加えた。 チューブを室温のインキュベーターに20分間入れた。DAPIでDNA染色した後、サンプルをPBSで2回洗浄した。全てのサンプルを徐々に増加する濃度のエタノール（正しい順序で、70％、80％、90％、95％、および100％エタノールで、そして無水エタノールで2回）で洗浄した。エタノールで洗浄した後、漸増濃度のサリチル酸メチル（MES；適切な順序でのMES ／エタノールの比：1：2、1：1、2：1、および100％MES）を添加してサンプルを透明にした。各溶液交換中に連続した振盪を行い、これを約1時間続けた。その後、根の先端が完全に透明になるまでサンプルを4℃の冷蔵庫に入れた。 各根のサンプルの細胞分裂を、レーザー走査型生物顕微鏡（FV1200、オリンパス、日本）を用いて454 nmで観察した。
【００６３】
結果を図５に示す。図５中、白色部分が、細胞分裂活性が高い箇所である。水溶性単離リグニンにより根の細胞分裂活性が増加することが分かった。
【００６４】
試験例5．細胞の大きさの評価試験
HSAL濃度0％又は0.05％下で試験例1と同様にして14日間培養した。根は根の先端から最大5 cm（合計10個）まで5 mmごとに切断した。根のサンプルの各片を1mlの試験管に集め、そして徐々に増加する濃度のエタノール溶液（適切な順序で、70％、80％、90％、95％、および100％のエタノールで、そして無水の2回）で洗浄した。エタノールで洗浄した後、漸増濃度のサリチル酸メチル（MES；適切な順序でのMES ／エタノールの比：1：2、1：1、2：1、および100％MES）を添加してサンプルを透明にした。各溶液交換中に連続した振盪を行い、これを約1時間続けた。その後、根の先端が完全に透明になるまでサンプルを4℃の冷蔵庫に入れた。 各根のサンプルの細胞を、レーザー走査型生物顕微鏡（FV1200、オリンパス、日本）を用いて観察した。
【００６５】
結果を図６に示す。細胞の大きさへの、水溶性単離リグニンの影響は確認できなかった。
【００６６】
試験例6．植物成長試験4（イネ）
イネとしてNBを採用し、水溶性単離リグニンとしてHSAL以外にリグノスルホン酸（LS、水100g（20℃）に対する溶解度は10g）（商品名パールレックスNP、日本製紙ケミカル社製）を使用する以外は、試験例1と同様にして行った。
【００６７】
結果を図７に示す。水溶性単離リグニンとしてリグノスルホン酸を使用しても、植物成長促進作用が発揮されることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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