(57)【要約】【課題】毒性がなく且つ皮膚しわ予防又は改善効能に優れる天然植物由来の組成物及びその製造方法を提供すること。また、毒性がなく且つ皮膚美白効能に優れる天然植物由来の組成物及びその製造方法を提供すること。【解決手段】本発明の皮膚しわ予防又は改善用組成物、及び皮膚美白用組成物は、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレートを含む緑茶抽出物を有効成分として含む。【選択図】図２
2020110143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、皮膚しわ予防又は改善用組成物。
【請求項２】
前記抽出物中のＥＧＣＧ、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、（−）エピカテキン（（−）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、エピカテキン３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、ＧＣＧ、ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ、Ｃ）及びカテキンガレート（ｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）の総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、１９〜３０重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出物中のＧＣＧ：ＥＧＣＧの重量比は、１：０．５〜２の範囲である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抽出物は、水及びＣ１〜Ｃ４のアルコールのいずれか一方以上によって１回以上抽出した抽出物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
当該組成物中の前記抽出物の含量は、当該組成物の全重量に対し、１重量％〜１００重量％の範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記有効成分の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抽出物は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現を抑制する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
当該組成物は、食品、薬学又は化粧料組成物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、皮膚美白用組成物。
【請求項１０】
前記抽出物中のＥＧＣＧ、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、（−）エピカテキン（（−）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、エピカテキン３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、ＧＣＧ、ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ、Ｃ）及びカテキンガレート（ｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）の総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、１９〜３０重量％の範囲である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抽出物中のＧＣＧ：ＥＧＣＧの重量比は、１：０．５〜２の範囲である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抽出物は、水及びＣ１〜Ｃ４のアルコールのいずれか一方以上によって１回以上抽出した抽出物である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
当該組成物中の前記抽出物の含量は、当該組成物の全重量に対し、１重量％〜１００重量％の範囲である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記有効成分の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抽出物は、メラニン生成を抑制する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抽出物は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の活性を抑制する、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
当該組成物は、食品、薬学又は化粧料組成物である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成分含量が変化した緑茶抽出物を含む皮膚美白用又は皮膚しわ予防又は改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚老化現象の原因は、大別して細胞の遺伝子変異、組織変化などの内的要因と、紫外線、湿度などの外的要因の二つに分けられる（非特許文献１）。このような内外的要因によって損傷を受けた皮膚の内部では細胞再生力の減少、細胞周辺環境の変化、細胞間ネットワークの弱化などの現象が起きて皮膚構造が散らばるようになり、結果的に、皮膚弾力の損失、角質化、しわの生成、皮膚のトーンダウン及び皮膚萎縮などの現象が発現するようになる。
【０００３】
老化した皮膚中で起きる変化の最も大きな原因は、若い皮膚では活性化していた成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の減少である。成長因子は皮膚中の再生過程における第一のスイッチの役割をするため、皮膚中の成長因子の減少は、皮膚中の多様な機能低下を誘発し、結局は皮膚中の成分の損失と皮膚構造の崩壊をもたらすようになる。
【０００４】
また、紫外線による老化現象を光老化といい、このような光老化現象は、紫外線によって細胞内部に活性酸素ラジカル（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ）が生成され、この活性酸素は、炎症性反応を起こす信号伝逹系を介して真皮層の弾力繊維であるコラーゲン、エラスチンなどのタンパク質分解酵素（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９など）の合成を促進して（非特許文献２）真皮層の弾力を減少させることで皮膚しわが誘発されると知られている。このため、このような皮膚老化現象を防止し、且つより健康で弾力のある皮膚を保つために、しわ改善効果のある生理活性物質を開発しようとする研究活動が絶え間なく続けられてきた。代表的に、１９９５年に光老化した皮膚の改善のための治療剤としてのトレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ、ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）がアメリカのＦＤＡ許可を受けており、さらには、これよりも副作用の少ないレチノールが１９９０年代の中・後半から化粧品の原料として使用され始めるのに伴い、本格的にしわ改善用化粧品が市販され始めた。それ以降、女性ホルモン類似物質、各種の植物から抽出した抗酸化剤などがしわ改善原料として化粧品に導入された。このように消費者らの皮膚老化に係る化粧品についての関心や需要が急増しているが、合成素材の機能性化粧品の副作用が持続的に提起され、このため、効果的且つ毒性のない天然物を用いた化粧品の開発・研究が活発に続けられている。
【０００５】
一方、紫外線に曝された場合に備え、皮膚は物理的及び化学的防御因子を備えており、種々の光化学反応による皮膚障害を最小限にとどめるための作用機作を有する。皮膚の角質層は紫外線を反射及び拡散させることによってそのエネルギーを減衰させ、また、メラニン色素、ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、その他の抗酸化成分などは、皮膚内部に浸透した紫外線を吸収し、そのエネルギーを減衰させたり紫外線が二次的に発生させる活性酸素を消去したりすることによって皮膚に対する障害を防御する。しかしながら、前記したような防御因子の能力を超える多量の紫外線を生体が受けたり、年を取るにつれてその能力が低下したりしていた場合、種々の皮膚障害が起きる。
【０００６】
肌色の決定要因のうち最も大きな部分を占めるのが皮膚中のメラニンの分布状態及び量である。メラニンは、核の周りに帽子のような構造を形成し、紫外線から遺伝子を保護し、自由ラジカル（Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）を除去して細胞内タンパク質を保護するなどの重要な役割をするようになる。このようなメラニンを分解する酵素は生体内に存在せず、ただケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が老化し、本来の機能を果たして表皮から脱離するときに一緒に皮膚から除去される。しかし、メラニンが必要以上に産生されると、シミやそばかす、斑点などのような過色素沈着症を誘発し、美容上、良くない結果をもたらす。
【０００７】
メラニンの産生に影響を及ぼす因子としては、種々のものが知られているが、紫外線によって起きるメラニン産生の亢進、さらにこれによる色素沈着が化粧品分野で最も重要である。色素沈着の予防の目的から美白化粧品に配合される薬剤の基本的なメカニズムは、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）作用抑制、チロシナーゼ生成抑制、メラニン生成中間体の抑制、既存メラニンの還元及び光酸化抑制、メラニン排泄の促進、及び紫外線カットなどである。
【０００８】
皮膚色素異常症状や過色素沈着などの予防と改善についてのニーズが高まり、これに伴い、過度なメラニン生成を抑制する美白製品の開発が必要とされ、これまで多くの努力がなされてきた。その具体的な例として、コウジ酸（Ｋｏｊｉｃ  ａｃｉｄ）、アルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）などのようなチロシナーゼ活性を阻害する抑制剤、ヒドロキノン（Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、ビタミンＡ、ビタミンＣ及びこれらの誘導体などがある。しかし、これらは、美白効果の不十分、剤形内での安定性及び皮膚に対する安全性などの問題からその使用が制限されていた。そこで、皮膚美白に高い効能を示しつつも剤形化が容易であり且つ皮膚に安全な天然物由来の原料についの研究が活発に進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−１８６３０５３号公報
【特許文献２】大韓民国公開特許第１０−２０１７−０１０７９４３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】市橋正光、皮膚の老化とシワの形成、Fragrance Journal, Vol. 32, No. 5, 24〜30
【非特許文献２】Gary J. Fisher, Subhash C. Datta, Harvinder S. Talwar, Zeng-Quan Wang, James Varani, Sewon Kang & John J. Voorhees, Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism, Nature volume 379, pages  335-339(1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、毒性がなく且つ皮膚しわ予防又は改善効能に優れる天然植物由来の組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、毒性がなく且つ皮膚美白効能に優れる天然植物由来の組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、一側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５ 重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、皮膚しわ予防又は改善用組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、他の側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、皮膚美白用組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、また他の側面において、皮膚しわ予防又は改善用組成物を製造するための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物の用途を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに他の側面において、皮膚美白用組成物を製造するための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに他の側面において、皮膚しわ予防又は改善用途に用いるための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を提供する。
【００１８】
本発明は、さらに他の側面において、皮膚美白用途に用いるための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を提供する。
【００１９】
本発明は、さらに他の側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を、これを必要とする対象に投与する段階を含む、皮膚しわ予防又は改善方法を提供する。
【００２０】
本発明は、さらに他の側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を、これを必要とする対象に投与する段階を含む皮膚美白方法を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の一側面に係る抽出物及び組成物は、皮膚への刺激が少なく且つ環境にやさしい天然植物由来の安全なものであり、これにより、ＭＭＰ−１の発現を効果的に抑制し且つ優れた皮膚しわ予防又は改善効能を示すことができる。
【００２２】
また、本発明の一側面に係る抽出物及び組成物は、皮膚への刺激が少なく且つ環境にやさしい天然植物由来の安全なものであり、これにより、メラニン生成及びチロシナーゼの活性を効果的に抑制し且つ優れた皮膚美白効能を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１の告示型緑茶抽出物（試料１）に対するクロマトグラムを示したものである。
【図２】本発明の一側面に係る高温処理緑茶抽出物（試料２）に対するクロマトグラムを示したものである。
【図３】試験例２に係る高温処理緑茶抽出物の細胞毒性確認の実験結果を示したものである。
【図４】試験例３に係る高温処理緑茶抽出物のメラニン細胞生成抑制効果の評価結果を示したものである。
【図５】試験例４に係る高温処理緑茶抽出物のチロシナーゼ活性抑制効果の評価結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書において「緑茶抽出物」は、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分又は抽出物の形態を問わず、茶科チァグァに属する常緑樹である茶の木（カメリア・シネンシス；Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から抽出したもの又はバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｐｐ．）を接種し醗酵させた茶葉などから抽出したものを含み、前記抽出したものを特定の溶媒で分画して得た分画物を含む。前記茶は、茶木の葉、花、幹、実、根、幹、及び根の芯材からなる群より選択される一つ以上が含まれ、好ましくは、葉であってよい。また、前記抽出物の形態は、好ましくは、粉末状であってよい。前記抽出又は分画は、水、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を用いてよい。有機溶媒としては、アルコール、イソプロパノール、アセトン、ヘキサン、エチルアセテート、二酸化炭素、又はこれらの二種以上の混合溶媒を用いてよいが、これに限定されず、緑茶の有効成分が破壊されない又は最小化されない条件下、室温で又は加温して抽出又は分画してよい。前記アルコールは、Ｃ１〜Ｃ５の低級アルコールであってよい。抽出又は分画の回数や方法は特に制限されず、例えば、冷浸抽出、超音波抽出、還流冷却抽出、熱水抽出などの方法を用いてよく、好ましくは、冷浸又は加温して有効成分を抽出又は分画しろ過した後、そのろ液を減圧濃縮して本発明の緑茶抽出物を得てよい。
【００２５】
本明細書において「エピカテキン」とは、エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、（−）エピカテキン（（−）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）、及びエピカテキン３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）を含むものである。
【００２６】
本明細書において「エピカテキンエピマー」とは、ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ、Ｃ）、（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及びカテキンガレート（ｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）を含むものである。
【００２７】
本発明は、一側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、皮膚しわ予防又は改善用組成物に関するものであってよい。
【００２８】
本発明は、他の側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を有効成分として含む、皮膚美白用組成物に関するものであってよい。
【００２９】
本発明は、また他の側面において、皮膚しわ予防又は改善用組成物を製造するための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物の用途に関するものであってよい。
【００３０】
本発明は、さらに他の側面において、皮膚美白用組成物を製造するための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物に関するものであってよい。
【００３１】
本発明は、さらに他の側面において、皮膚しわ予防又は改善用途に用いるための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物に関するものであってよい。
【００３２】
本発明は、さらに他の側面において、皮膚美白用途に用いるための、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物に関するものであってよい。
【００３３】
本発明は、さらに他の側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を、これを必要とするに投与する段階を含む、皮膚しわ予防又は改善方法に関するものであってよい。
【００３４】
本発明は、さらに他の側面において、抽出物の総重量を基準に、４〜１５重量％の（−）−ガロカテキンガレート（（−）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＧＣＧ）及び４〜１５重量％の（−）−エピガロカテキンガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＥＧＣＧ）を含む緑茶抽出物を、これを必要とするに投与する段階を含む皮膚美白方法に関するものであってよい。
【００３５】
一側面において、前記ＧＣＧは、前記抽出物の総重量を基準に、４重量％以上、５重量％以上、５．３重量％以上、５．５９重量％以上、５．７重量％以上、６重量％以上、７重量％以上、８重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１１重量％以上、１２重量％以上、１３重量％以上又は１４重量％以上であってよい。他の側面において、前記ＧＣＧは、前記抽出物の総重量を基準に、１５重量％以下、１４重量％以下、１３重量％以下、１２重量％以下、１１重量％以下、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５．７重量％以下、５．５９重量％以下、５．３重量％以下又は５重量％以下であってよい。前記ＧＣＧが、前記含量範囲内に含まれると、優れたＭＭＰ−１抑制活性、メラニン生成抑制活性又はチロシナーゼ活性抑制効能を示すことができる。
【００３６】
一側面において、前記ＥＧＣＧは、前記抽出物の総重量を基準に、４重量％以上、５重量％以上、５．２重量％以上、５．２７重量％以上、５．５重量％以上、６重量％以上、７重量％以上、８重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１１重量％以上、１２重量％以上、１３重量％以上又は１４重量％以上であってよい。他の側面において、前記ＥＧＣＧは、前記抽出物の総重量を基準に、１５重量％以下、１４重量％以下、１３重量％以下、１２重量％以下、１１重量％以下、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５．５重量％以下、５．２７重量％以下、５．２重量％以下又は５重量％以下であってよい。
【００３７】
他の具現例として、前記抽出物中のＧＣＧ及びＥＧＣＧの総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、３０重量％以下であってよい。一側面において、前記ＧＣＧ及びＥＧＣＧの総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、３０重量％以下、２５重量％以下、２０重量％以下、１８重量％以下、１６重量％以下、１５重量％以下、１４重量％以下、１２重量％以下、１０．５重量％以下、１０重量％以下又は９重量％以下であってよい。他の側面において、前記ＧＣＧ及びＥＧＣＧの総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、８重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１０．５重量％以上、１２重量％以上、１３重量％以上、１４重量％以上、１６重量％以上、１８重量％以上、２０重量％以上又は２５重量％以上であってよい。
【００３８】
他の具現例として、前記抽出物中のエピカテキンの含量は、前記抽出物の総重量を基準に、２０重量％以下であってよい。一側面において、前記エピカテキンの含量は、前記抽出物の総重量を基準に、２０重量％以下、１８重量％以下、１６重量％以下、１５重量％以下、１４重量％以下、１２重量％以下、１１重量％以下又は１０重量％以下であってよい。他の側面において、前記エピカテキンの含量は、前記抽出物の総重量を基準に、９重量％以上、１０重量％以上、１１重量％以上、１２重量％以上、１３重量％以上、１４重量％以上、１６重量％以上、又は１８重量％以上であってよい。
【００３９】
他の具現例として、前記抽出物中の８種のカテキンの総含量、すなわち、前記抽出物中のＥＧＣＧ、（−）−エピガロカテキン（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、（−）エピカテキン（（−）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、エピカテキン３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、ＧＣＧ、ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ、Ｃ）及びカテキンガレート（ｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ、ＣＧ）の総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、１９〜３０重量％の範囲であってよい。一側面において、前記８種のカテキンの総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、１９重量％以上、２１重量％以上、２３重量％以上、２４重量％以上、２４.５重量％以上、２５重量％以上、２６重量％以上、２７重量％以上、２８重量％以上又は２９重量％以上であってよい。他の側面において、前記８種のカテキンの総含量は、前記抽出物の総重量を基準に、３０重量％以下、２９重量％以下、２８重量％以下、２７重量％以下、２６重量％以下、２５重量％以下、２４．５重量％以下、２４重量％以下、２３重量％以下又は２１重量％以下であってよい。
【００４０】
また他の具現例として、前記抽出物中のＧＣＧ：ＥＧＣＧの重量比は、１：０.５〜２の範囲であってよい。一側面において、前記抽出物中のＧＣＧ：ＥＧＣＧの重量比は、１：０．５、１：０．８、１：１、１：１．２、１：１．５、１：１．８又は１：２であってよい。
【００４１】
また他の具現例として、前記抽出物は、水及びＣ１〜Ｃ４のアルコールのいずれか一方以上によって１回以上抽出した抽出物であってよい。一側面において、前記アルコールはエタノールであってよい。他の側面において、前記アルコールは、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上又は７０％以上のエタノールであってよい。また他の側面において、前記アルコールは、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下又は３０％以下のエタノールであってよい。
【００４２】
また他の具現例として、前記皮膚しわ予防又は改善用組成物中の前記緑茶抽出物の含量は、前記組成物の全重量に対し、１重量％〜１００重量％の範囲であってよい。一側面において、前記組成物中の前記抽出物の含量は、１重量％以上、１０重量％以上、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上又は９０重量％以上であってよい。他の側面において、前記組成物中の前記抽出物の含量は、１００重量％以下、９０重量％以下、８０重量％以下、７０重量％以下、６０重量％以下、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下又は２０重量％以下であってよい。
【００４３】
他の具現例として、前記有効成分の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよい。一側面において、前記投与量は、５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１００ｍｇ／ｋｇ／日以上、２００ｍｇ／ｋｇ／日以上、３００ｍｇ／ｋｇ／日以上、４００ｍｇ／ｋｇ／日以上、５００ｍｇ／ｋｇ／日以上、６００ｍｇ／ｋｇ／日以上、７００ｍｇ／ｋｇ／日以上、８００ｍｇ／ｋｇ／日以上、又は９００ｍｇ／ｋｇ／日以上であってよい。他の側面において、前記投与量は、１０００ｍｇ／ｋｇ／日以下、９００ｍｇ／ｋｇ／日以下、８００ｍｇ／ｋｇ／日以下、７００ｍｇ／ｋｇ／日以下、６００ｍｇ／ｋｇ／日以下、５００ｍｇ／ｋｇ／日以下、４００ｍｇ／ｋｇ／日以下、３００ｍｇ／ｋｇ／日以下、２００ｍｇ／ｋｇ／日以下、１００ｍｇ／ｋｇ／日以下、５０ｍｇ／ｋｇ／日以下又は１０ｍｇ／ｋｇ／日以下であってよい。
【００４４】
一具現例として、前記抽出物は、ＭＭＰ−１（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）の発現を抑制することができる。すなわち、前記抽出物又は組成物は、ＭＭＰ−１の発現抑制によって皮膚しわ予防又は改善効果を示すことができる。
他の具現例として、前記抽出物は、メラニン生成を抑制することができ、また他の具現例として、前記抽出物は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の活性を抑制することができる。すなわち、前記抽出物又は組成物は、メラニン生成を抑制し又はチロシナーゼの活性を抑制して皮膚美白効果を示すことができる。
【００４５】
一具現例として、前記組成物は、食品、薬学又は化粧料組成物であってよい。
【００４６】
前記食品組成物の剤形は特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、丸剤、粉末剤、ドリンク剤といった液剤、キャラメル、ゲル、バー、ティーバッグなどに剤形化されてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他、当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と併せて適用した場合、相乗効果が生じることがある。また、前記食品は、健康機能食品であってもよい。
【００４７】
前記組成物は、単純摂取、飲用、注射投与、スプレー投与又はスクイーズ投与などの様々な方法で投与されてよい。
【００４８】
本発明の一側面に係る食品組成物において、前記有効成分の投与量の決定は、当業界の通常の技術者の水準内にあり、且つ投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症などの様々な要因に応じて異なり得る。
【００４９】
本発明の一側面に係る食品組成物は、例えば、チューイングガム、キャラメル製品、キャンデー類、氷果子類、お菓子類などの各種の食品類、清凉飲料、ミネラルウォーター、アルコール飲料などの飲料製品、ビタミンやミネラルなどを含む健康機能食品製品であってもよい。
【００５０】
前記の他、本発明の一側面に係る食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでよい。その他、本発明の一側面に係る食品組成物は、天然果物ジュース並びに果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでよい。これらの成分は、独立で、或いは組み合わせて用いてよい。これらの添加剤の割合はそれほど重要ではないが、本発明の一側面に係る組成物１００質量部当たり０〜約６０重量部の範囲で含まれるのが一般的である。
【００５１】
本発明の一側面に係る前記薬学組成物は、経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などに投与されてよい。経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質及び硬質カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、液剤、乳濁剤又はペレット剤であってよいが、これらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、溶液剤、懸濁剤、乳液剤、ゲル、注射剤、点滴剤、坐剤、パッチ又はスプレーであってよいが、これらに制限されるものではない。前記剤形は、当該分野の通常的な方法に従い容易に製造することができ、界面活性剤、賦形剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、浸透圧調節のための塩又は緩衝剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤又はその他常用する補助剤をさらに含んでよい。
【００５２】
本発明の一側面に係る前記組成物は、薬学的に許容可能な塩を含んでもよいが、前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などといった無機酸から形成されるか；又は、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２，２，２］−ｏｃｔ−２−エン−１-カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸から形成される酸付加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）；又は、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換されるときに形成される塩を含んでよい。
【００５３】
本発明の一側面に係る前記薬学組成物の適用量又は投与量は、投与を受ける対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路又は処方者の判断に応じて異なり得る。このような因子に基づく有効成分の投与量の決定は、当業界の通常の技術者の水準内にある。
【００５４】
本発明の一側面に係る前記化粧料組成物は、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有してよい。これは、局所適用に適したあらゆる剤形として、例えば、溶液、ゲル、固体、練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球又はイオン型（リポーソム）及び非イオン型の小嚢分散剤の形態で、又はクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシーラースティックの形態で提供されてよい。また、前記化粧料組成物は、泡沫（ｆｏａｍ）の形態で圧縮された推進剤をさらに含有したエアロゾル組成物の形態で用いられてもよい。
【００５５】
前記化粧料組成物は、その剤形において特に限定されず、目的とするところに応じて適宜選択されてよい。例えば、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、クレンジングウォーター、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディークレンザー、及びボディーエッセンスなどの剤形で製造されてよい。
【００５６】
本発明の剤形がペースト、クリーム、又はゲルの場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられてよい。
【００５７】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられてよく、特にスプレーである場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでよい。
【００５８】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５９】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラガカントなどが用いられてよい。
【００６０】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられてよい。
【００６１】
前記化粧料組成物には、前記緑茶抽出物の他、機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選択された成分を含んでよい。
【００６２】
前記組成物には、さらに、前記機能性添加物とともに、必要に応じて一般的な化粧料組成物に含まれる成分を配合してもよい。さらに含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００６３】
以下、実施例、試験例、及び剤形例を挙げて本明細書の構成及び効果をより具体的に説明する。なお、これらの例は本明細書に関する理解を助けるための目的から例示したものに過ぎず、本明細書の範疇及び範囲が下記の例によって制限されるものではない。
【００６４】
［実施例１］一般告示型緑茶抽出物と高温処理緑茶抽出物の製造
１００ｇの緑茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、済州島のオソルロック農場）に５０％エタノール１０００ｍｌを加え、６０℃で１時間還流撹拌した。前記試料の温度を室温に下げ、ろ過して得た溶液を減圧蒸留して、濃い褐色粉末の一般告示型緑茶抽出物（ＧＴ−ＬＥ−３５ＣＡＴ、試料１）２３ｇを収得した（収率２３％）。
【００６５】
一方、高温処理緑茶抽出物を製造するために、１００ｇの緑茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、済州島のオソルロック農場）に５０％エタノール１０００ｍｌを加え、６０℃で１時間還流撹拌した。これを濃縮後、スチーム１．５ｋｇｆ／ｃｍ２で１〜７時間撹拌させた。次いで、温度を室温に下げ、不溶性物質をろ過し減圧濃縮して、高温処理緑茶抽出物１０ｇを収得した。このとき、前記撹拌時間帯（１〜７時間）毎に得た前記高温処理緑茶抽出物に対し、下記の表１のような装置を用いて８種のカテキンの含量の変化を測定し、５時間目に熱によるＥＧＣＧのＧＣＧへの転換が最も多く、且つ８種のカテキンの量もこれ以上減らないことを確認した。このときに収得した高温処理緑茶抽出物１０ｇ（Ｈｉｇｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｅｘｔｒａｃｔ、ＨＴＰ−ＧＴＥ）を試料２とした。
【００６６】
収得された前記２種の抽出物の組成を分析した条件と結果は、それぞれ下記の表１（試料１及び２の組成分析条件）、表２（試料１の組成分析結果）及び表３（試料２の組成分析結果）のとおりである。また、前記２種の抽出物に対するクロマトグラムは、図１（試料１）及び図２（試料２）のとおりである。すなわち、試料２の場合、既存の緑茶抽出物とは組成が異なることを確認した。具体的に、試料２の場合、試料１に比べて顕著に低いＥＧＣＧ（５．２７重量％）、ＥＧＣ（３．５３重量％）及び総カテキン（２４．４１重量％）を含有する反面、試料１では発見できていない成分である４種のエピカテキンエピマーがさらに生成されることを確認することができた。
【００６７】
【表１】
2020110143.tif 000003
【００６８】
【表２】
2020110143.tif 000004
【００６９】
【表３】
2020110143.tif 000005
【００７０】
（前記表２及び表３中、ＧＣはガロカテキン、ＥＧＣはエピガロカテキン、Ｃはカテキン、ＥＣは（−）エピカテキン、ＧＣＧはガロカテキンガレート、ＥＧＣＧはエピガロカテキンガレート、ＣＧはカテキンガレート、ＥＣＧはエピカテキン３−Ｏ−ガレートを表す）
【００７１】
（前記表２及び表３における単位は、いずれも緑茶抽出物（試料１及び２）の全重量に対する当該物質の重量％である）
【００７２】
［試験例１］ＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）抑制活性の評価試験
前記実施例１の試料１及び試料２の緑茶抽出物が老化したヒト皮膚線維芽細胞において皮膚組織分解酵素のＭＭＰ−１生成抑制に及ぼす影響、ＥＧＣＧとＧＣＧの重量比、及びＧＣＧの含量によるＭＭＰ−１生成抑制効能を確認するために、ＭＭＰ−１抑制活性評価を行った。具体的に、下記の段階にて行った。
【００７３】
１−１．細胞株と細胞培養
ヒト真皮線維芽細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＮＨＤＦ；Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０％ウシ血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ  １２１０−００３８）で培養し、培養はいずれも３７℃、５％  ＣＯ２培養器で行った。継代培養（ｓｕｂ  ｃｕｌｔｕｒｅ）の回数が６〜９回の細胞を若い細胞とし、継代培養の際に継代毎に細胞の数を数えて、全細胞数の１／５程度をさらに新たに培養する方式で３７回の継代培養を行い、老化した真皮線維芽細胞を得た。老化した真皮線維芽細胞に対し、ＥＧＣＧ：ＧＣＧの割合、ＧＣＧの濃度に応じてＥＧＣＧ、ＧＣＧを処理し、又は試料１又は試料２を処理した。
【００７４】
１−２．ＭＭＰ−１生成量の測定
ＭＭＰ−１の生成量を確認するために、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法を用いた（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）。前記１−１．段階で試料を処理した細胞の培養液を回収し、１０００ｘｇで遠心分離して上澄液を分離した後、培養液をＭＭＰ−１抗体がコートされた９６−ウェルプレートに入れて反応させた後、二次抗体（ｈｏｒｓｅ  ｒｅｄｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）を常温で１時間反応させ、１００μＬのＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を用い、反応後の４９０ｎｍ波長における吸光度を測定して発色程度を確認することでＭＭＰ−１の生成量を確認し、ＭＭＰ−１抑制活性（％）は、下記の式にて求めた。
ＭＭＰ−１抑制活性（％）＝（試料添加群のＯ.Ｄ. ａｔ ４９０ｎｍ／試料無添加群のＯ.Ｄ. ａｔ ４９０ｎｍ）×１００
【００７５】
その結果を下記の表４及び表５に表した。
【００７６】
【表４】
2020110143.tif 000006
【００７７】
【表５】
2020110143.tif 000007
【００７８】
前記表４の結果から、本発明に係るＧＣＧを５．５９重量％、ＥＧＣＧを５．２７重量％で含み、エピカテキンを１１．０５重量％、エピカテキンエピマーを１３．３６重量％、そして８種のカテキンを総計２４．４１重量％で含む高温処理緑茶抽出物（試料２）の場合、一般緑茶抽出物（試料１）に比べ、ＭＭＰ−１の抑制活性に優れることを確認することができた。特に、老化した線維芽細胞を２４時間常温で放置してから処理した場合に、一般緑茶抽出物よりも８種のカテキンの総含量が少ないにも拘わらず、本発明に係る高温処理緑茶抽出物のほうが、顕著に優れるＭＭＰ−１抑制活性を示すことを確認することができた。
【００７９】
また、前記表５の結果から、ＥＧＣＧ：ＧＣＧの重量比が２：１、１．５：１、１：１又は１：１．５の場合、ＥＧＣＧだけを処理し、又は、ＧＣＧだけを処理し、又は、ＥＧＣＧ：ＧＣＧの重量比が４：１の場合に比べ、優れたＭＭＰ−１抑制活性を示し、それらの中でも、ＥＧＣＧ：ＧＣＧの重量比が１．５：１、１：１又は１：１．５の場合に、特に優れたＭＭＰ−１抑制活性を示すことを確認することができた。
【００８０】
その結果、本発明に係る、４〜１５重量％のＧＣＧ及び４〜１５重量％のＥＧＣＧを含む高温処理緑茶抽出物の場合、優れたＭＭＰ−１抑制活性によって効果的に皮膚しわを予防又は改善することができることが分かり、また、本発明に係るＧＣＧ及びＥＧＣＧを特定の重量比で含む場合、ＭＭＰ−１抑制活性による皮膚しわ予防又は改善効果がより高められることが分かった。
【００８１】
［試験例２］高温処理緑茶抽出物の細胞毒性確認の実験
Ｌｏｎｚａ社から購入のＭｅｌａｎｏｃｙｔｅ細胞株（皮膚細胞種）を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ、ＦＡＬＣＯＮ）にウェル当たり１×１０５ずつシードし（ｓｅｅｄｉｎｇ）、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、前記実施例１の高温処理緑茶抽出物（試料２）を１０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍ処理し、４８時間さらに培養した。
【００８２】
次いで、培地を除去し、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて細胞生存率を確認した。ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）１００μｌにｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）溶液１０μｌを添加して細胞に処理した後、４５０ｎｍにおける吸光度を確認し、生きている細胞の数を定量化した。細胞の数又は細胞生存率（％）は下記の式にて求めた。
細胞生存率（％）＝（試料処理群吸光度−反応試薬だけの吸光度）／（無処理群吸光度−反応試薬だけの吸光度）×１００
【００８３】
その結果は図３のとおりであり、１０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍの高温処理緑茶抽出物（試料２）のいずれにおいても、細胞毒性が発現していないことを確認した。
【００８４】
［試験例３］高温処理緑茶抽出物のメラニン生成抑制評価
メラニン生成が過度のヒト黒色腫細胞のＭＮＴ−１細胞（ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、Ｌｏｎｚａ、ＳＷＩＳＳ）を６ウェルプレートに１×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでシートし（ｓｅｅｄｉｎｇ）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で２４間培養した後、前記実施例１の試料１と試料２をそれぞれ１０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍ処理し、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。４８時間培養された前記細胞に破砕液（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ；１％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ；ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を５００μｌ処理した後、セルスクレーター（Ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒ）を用いてマイクロチューブ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）に集めた後、１３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｒ、ドイツ）した。次いで、沈殿物を分離し、１Ｎ  水酸化ナトリウム５０μｌを処理して沈殿物を溶解させた後、メラニン色素に特異的な４５０ｎｍ波長における吸光度を測定し、下記の式にてメラニンの量を全タンパク質の量に対する値に補正した。このとき、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、試料を処理していないＭＮＴ−１細胞を用いて、その結果を図４に示した。
メラニンの量（％）＝吸光度／全タンパク質の量
【００８５】
図４の結果から、一般緑茶抽出物（試料１）に比べ、本発明に係る高温処理緑茶抽出物（試料２）のほうが顕著に優れるメラニン生成抑制効能を示すことを確認することができた。
【００８６】
特に、高温処理緑茶抽出物を１００ｐｐｍ処理した場合、顕著に高いメラニン生成抑制効果を示し、また、高温処理緑茶抽出物を１０ｐｐｍ処理した場合、一般緑茶抽出物を１００ｐｐｍ処理した場合と類似したレベルのメラニン生成抑制効果を示しており、本発明に係る高温処理緑茶抽出物のメラニン生成抑制効能が、一般緑茶抽出物に比べて１０倍ほど優れることを確認することができた。
【００８７】
［試験例４］高温処理緑茶抽出物のチロシナーゼ活性抑制評価
前記実験例２に係る細胞溶解物１０μｇにＤＯＰＡ（ジヒドロキシフェニルアラニン；ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）１０ｍＭ（同量１０μｇ）を添加し、チロシナーゼの作用によって生成されたドーパクロム（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ）の生成量を、４９０ｎｍにおける吸光度を比較して測定した。チロシナーゼ活性を非処理群の吸光度に対する比率にて求め、図５に示した。
【００８８】
図５の結果から、本発明に係る高温処理緑茶抽出物を処理した場合、一般緑茶抽出物を処理した場合に比べ、チロシナーゼ活性抑制効果に顕著に優れることを確認することができた。
【００８９】
［剤形例１］軟質カプセル
前記実施例１に係る試料２を１５０ｍｇ準備し、ラクトース４４０ｍｇ、とうもろこし澱粉４３０ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合して軟質カプセル充填液を製造した。そして、該充填液とは別途に、ゼラチン６６重量部、グリセリン２４重量部及びソルビトール液１０重量部の割合で軟質カプセルシートを製造し、前記充填液を充填させて、軟質カプセルを製造した。
【００９０】
［剤形例２］錠剤
前記実施例１に係る試料２を１５０ｍｇ準備し、ビタミンＥ  １５ｍｇ、ビタミンＣ  １５ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２５０ｍｇ、乳糖６０ｍｇ及び麦芽糖１４０ｍｇを混合してから、流動層乾燥幾を用いて顆粒化した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ  ｅｓｔｅｒ）８ｍｇを添加した。この組成物を通常の方法にて打錠して、錠剤を製造した。
【００９１】
［剤形例３］ドリンク剤
前記実施例１に係る試料２を８０ｍｇ準備し、ビタミンＥ  ９ｍｇ、ビタミンＣ  ９ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水４００ｍｌを加えて瓶に充填した。瓶に充填した後、３０℃で４〜５秒間殺菌して、ドリンク剤を製造した。
【００９２】
［剤形例４］顆粒剤
前記実施例１に係る試料２を１５０ｍｇ準備し、ビタミンＥ  ９ｍｇ、ビタミンＣ  ９ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合した後、流動層造粒幾を用いて顆粒に成形した後、包に充填して、顆粒剤を製造した。
【００９３】
［剤形例５］健康食品
前記実施例１に係る試料２を１５０ｍｇ準備し、ビタミン混合物（ビタミンＡアセテート７０μｇ、ビタミンＥ  １．０ｍｇ、ビタミンＢ１  ０．１３ｍｇ、ビタミンＢ２  ０．１５ｍｇ、ビタミンＢ６  ０．５ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．２μｇ、ビタミンＣ  １０ｍｇ、ビオチン１０μｇ、ニコチン酸アミド１．７ｍｇ、葉酸５０μｇ）と無気質混合物（硫酸第一鉄１．７５ｍｇ、酸化亜鉛０．８２ｍｇ、炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ、第一リン酸カリウム１５ｍｇ、第二リン酸カルシウム５５ｍｇ、クエン酸カリウム９０ｍｇ、炭酸カルシウム１００ｍｇ、塩化マグネシウム２４．８ｍｇ）を組み合わせて、健康食品を製造した。
【００９４】
［剤形例６］健康飲料
前記実施例１に係る試料２を５０ｍｇ準備し、クエン酸１０００ｍｇ、オリゴ糖１００ｇ、梅濃縮液２ｇ、タウリン１ｇ、残量して精製水を添加して、９００ｍＬの健康飲料を製造した。
【００９５】
［剤形例７］アンプル剤
前記実施例１に係る試料２を１０ｍｇ準備し、マルトデキストリンを混合してから精製水１５ｍｌを加え、アンプル瓶に充填した後、殺菌して、液状アンプル剤を製造した。
【００９６】
以上、本明細書の特定の実施例などについて詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好適な具現例であるに過ぎず、これによって本明細書の範囲が制限されるものではないことは明白であろう。したがって、本明細書の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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