(57)【要約】【課題】  ＭＡＣと、Ｍ．カンサシイと、Ｍ．カンサシイ亜種と、を互いに区別して検出することのできる技術を提供する。【解決手段】  ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種のそれぞれのＩＴＳ領域を標的とするプライマーセットであり、上記３種の種間で交差反応が生じないプライマーセット【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のプライマーセットａ〜ｃから選ばれる１種以上のプライマーセットを含むことを特徴とする、マイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットａ＞
マイコバクテリウムアビウムコンプレックスのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス検出用プライマーセット。
＜プライマーセットｂ＞
マイコバクテリウムカンサシイのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムカンサシイ検出用プライマーセット。
＜プライマーセットｃ＞
マイコバクテリウムカンサシイ亜種のＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムカンサシイ亜種検出用プライマーセット。
【請求項２】
前記プライマーセットａが下記プライマーセットａ−１であり、
前記プライマーセットｂが下記プライマーセットｂ−１であり、
前記プライマーセットｃが下記プライマーセットｃ−１であることを特徴とする、請求項１に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットａ―１＞
配列番号４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プライマーセットｂ−１＞
配列番号９で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プライマーセットｃ−１＞
以下のプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれるプライマーセット。
＜プライマーセットｃ−１−１＞
配列番号１４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、
＜プライマーセットｃ−１−２＞
配列番号１６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、
＜プライマーセットｃ−１−３＞
配列番号１７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【請求項３】
前記プライマーセットａ〜ｃから選ばれる２種以上のプライマーセットを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
【請求項４】
さらに以下のプライマーセットｄを含むことを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットｄ＞
マイコバクテリウムツベルクローシスのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０で表される塩基配列と同一又は相補な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムツベルクローシス検出用プライマーセット。
【請求項５】
前記プライマーセットｄが下記プライマーセットｄ−１であることを特徴とする、請求項４に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットｄ−１＞
配列番号２１で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号２２で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【請求項６】
さらに、下記対照・標準用テンプレートｅと、下記プライマーセットｅと、を含むことを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜対照・標準用テンプレートｅ＞
結核菌及び非結核性抗酸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列には含まれない、特有の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡ。
＜プライマーセットｅ＞
前記特有の塩基配列を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。
【請求項７】
前記対照・標準用テンプレートｅが、下記対照・標準用テンプレートｅ−１であり、
前記プライマーセットｅが、下記プライマーセットｅ−１であることを特徴とする、請求項６に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜対照・標準用テンプレートｅ−１＞
好熱菌のゲノムＤＮＡ
＜プライマーセットｅ−１＞
タングステン含有酸化還元酵素又はフェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡ領域を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。
【請求項８】
前記プライマーセットｅ−１が下記プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３から選ばれるプライマーセットであることを特徴とする、請求項７に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットｅ−１−１＞
タングステン含有酸化還元酵素をコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２３で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プライマーセットｅ−１−２＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プライマーセットｅ−１−３＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２８で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【請求項９】
さらに、前記プライマーセットによる増幅産物を検出するための検出用プローブを含むことを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
【請求項１０】
下記プライマーセットａ−１と下記プローブａとの組み合わせ、及び／又は、
下記プライマーセットｂ−１若しくは下記プライマーセットｃ−１と、下記プローブｂ／ｃとの組み合わせ、
を含むことを特徴とする、請求項９に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットａ―１＞
配列番号４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プライマーセットｂ−１＞
配列番号９で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プライマーセットｃ−１＞
以下のプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれるプライマーセット。
＜プライマーセットｃ−１−１＞
配列番号１４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、
＜プライマーセットｃ−１−２＞
配列番号１６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、
＜プライマーセットｃ−１−３＞
配列番号１７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プローブａ＞
配列番号２９又は配列番号３０で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
＜プローブｂ／ｃ＞
配列番号３１又は配列番号３２で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【請求項１１】
さらに下記プライマーセットｄ−１と下記プローブｄとの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項９又は１０に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜プライマーセットｄ−１＞
配列番号２１で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号２２で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プローブｄ＞
配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【請求項１２】
さらに下記対照・標準用テンプレートｅ−１と、下記プライマーセットｅ−１−２と、下記プローブｅとの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項８〜１０の何れか一項に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キット。
＜対照・標準用テンプレートｅ−１＞
好熱菌のゲノムＤＮＡ
＜プライマーセットｅ−１−２＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
＜プローブｅ＞
配列番号３６で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか一項に記載のマイコバクテリウム属細菌検出用キットを使用して、マイコバクテリウム属細菌を検出する方法であって、
前記プライマーセットａ〜ｃから選ばれる１種以上のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含むことを特徴とする、マイコバクテリウム属細菌を検出する方法。
【請求項１４】
前記核酸増幅工程において、
前記プライマーセットａ〜ｃの何れかによる核酸増幅反応と、
以下の対照・標準用テンプレートｅを鋳型とする以下のプライマーセットｅによる核酸増幅反応と、
を同一反応系において実行することを特徴とする、請求項１３に記載のマイコバクテリウム属細菌を検出する方法。
＜対照・標準用テンプレートｅ＞
結核菌及び非結核性抗酸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列には含まれない、特有の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡ。
＜プライマーセットｅ＞
前記特有の塩基配列を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによる細菌検出技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非結核性抗酸菌（ｎｏｎ−ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ；  ＮＴＭ）とは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ；  以下、Ｍ．ツベルクローシスと略すこともある。）群とらい菌群を除いた培養可能な抗酸菌の総称である。
【０００３】
非結核性抗酸菌の中でも、マイコバクテリウムアビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、以下、Ｍ．アビウムと略すこともある）、マイコバクテリウムイントラセルラーエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、以下、Ｍ．イントラセルラーエと略すこともある）は、ヒトに対する感染例が最も多い。両者は非常によく似ており、区別がつきにくいことから、両者をあわせてマイコバクテリウムアビウムコンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ；、以下、ＭＡＣと略すこともある）と呼ばれている。
【０００４】
次いで、マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ、以下、Ｍ．カンサシイと略すこともある）のヒトに対する感染も多い。
【０００５】
そして、ＭＡＣとＭ．カンサシイは、それぞれ感受性を示す抗菌剤の種類が異なることが知られている。
したがって、結核菌、ＭＡＣ、及びＭ．カンサシイを互いに区別して検出することが、非結核性抗酸菌感染症の治療にとって非常に重要である。
【０００６】
現在、結核や非結核性抗酸菌への感染の疑いがある人に対しては、塗抹検査、培養検査、核酸増幅検査、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどでの検査が主流である。
中でも核酸増幅検査、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ；  ＰＣＲ）による検査は、正確性が高く簡便なため、ＰＣＲを利用した非結核性抗酸菌の検出方法が種々提案されてきている。
例えば、特許文献１（特表２０１３−５０２９２２号公報）には、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別して検出するためのプライマーと、該プライマーを用いたマルチプレックスリアルタイムＰＣＲによる検出方法が開示されている。
【０００７】
また特許文献２（特開２０１７−２１２９９１号公報）には、Ｍ．アビウムを特異的に検出するためのプライマーと、該プライマーを用いたＰＣＲによるＭ．アビウムの検出方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１３−５０２９２２号公報
【特許文献２】特開２０１７−２１２９９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
感染症の治療のためには、菌種の同定が重要になるが、特許文献１に記載の検出方法は、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別して検出するものであり、非結核性抗酸菌の何れの菌種なのかについては、同定することができない。
そのため、結核菌と非結核性抗酸菌とを区別するのみならず、非結核性抗酸菌の何れの菌種なのかを同定する技術が求められていた。
【００１０】
上記課題解決のため、本発明者は、医療機関から提供を受けた、非結核性抗酸菌の菌株から得られたゲノムＤＮＡサンプルを協力研究機関から入手した。そして、それらのサンプル全てにおいて、ゲノムＤＮＡ中の一部遺伝子領域の塩基配列を解析した。
【００１１】
その結果、１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３Ｓ  ｒＲＮＡの間に位置する領域であるｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ領域（ＩＴＳ）は菌種同定に有用であることが判明した。
具体的には、複数菌株の全ゲノムＤＮＡの解析結果から、抗酸菌という類似した菌群に属する結核菌、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイをお互いに区別するためには、１６Ｓ  ｒＤＮＡによる菌種分類などよりもＩＴＳ配列を基にした分類の方が有用であることが分かった。
【００１２】
さらに、本発明者によるＩＴＳ領域の塩基配列の解析により、医療機関等においてＭ．カンサシイであるとして保存されていた菌株の中には、同種に分類できない菌株、言い換えればＭ．カンサシイ亜種というべきものが含まれることもわかった。
このことからも、ＩＴＳ領域に基づく菌種同定の有用性が示唆された。
【００１３】
また、同一菌種でも、株間の塩基配列が多様性に富むことが分かっているが、本発明者による全ゲノムＤＮＡの解析結果から、ＩＴＳ領域には他の遺伝子領域と比べて、菌種を区別できる程度の変異が有り、かつ同一菌種内での変異が少ないことが示唆された。
【００１４】
また、本発明者による解析の結果、同一菌種内の変異ごとにＩＴＳ領域の塩基配列は複数のグループに分類できることが分かった。
以上の知見より、ＩＴＳ領域を標的としたＰＣＲは菌種同定に有用であるが、同一菌種を構成する複数のグループに共通した塩基配列を同定した上でプライマーやプローブを設計しなければ、ある菌種に属するにも関わらず、検出から漏れるグループが発生する可能性があることが新たに判明した。
【００１５】
以上の通り、非結核性抗酸菌をＰＣＲにより検出するためには、同一菌種内の変異ごとにＩＴＳ領域の塩基配列は複数のグループに分類できることを考慮して、同一菌種に分類される菌株を漏れなく検出可能であり、かつ、菌種間での交差性の無いプライマーを設計する必要があることが本発明者により判明した。
【００１６】
本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）とは区別して検出可能であることはもとより、非結核性抗酸菌の中でもＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種をそれぞれ区別して検出することができる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種について、合計数百株のＩＴＳ領域の塩基配列の解析結果を精査し、それぞれの菌種・菌群の間に存在するＩＴＳ領域内の変異の位置を把握した。その結果、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づいて分類された菌種のグループは複数あるものの、同一菌種に共通し、かつ異なる菌種と区別可能な塩基配列領域が存在することがわかった。これに基づき、それぞれの菌種を漏れなく検出可能であり、かつ、菌種間での交差性が無いプライマーを設計し、本発明を完成させた。
【００１８】
すなわち、上記課題を解決する本発明は、以下のプライマーセットａ〜ｃから選ばれる１種以上のプライマーセットを含むことを特徴とする、マイコバクテリウム属細菌検出用キットである。
【００１９】
＜プライマーセットａ＞
マイコバクテリウムアビウムコンプレックスのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス検出用プライマーセット。
【００２０】
＜プライマーセットｂ＞
マイコバクテリウムカンサシイのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムカンサシイ検出用プライマーセット。
【００２１】
＜プライマーセットｃ＞
マイコバクテリウムカンサシイ亜種のＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムカンサシイ亜種検出用プライマーセット。
【００２２】
プライマーセットａは、結核菌はもとより、Ｍ．カンサシイやＭ．カンサシイ亜種と交差性を示すことなく、Ｍ．アビウムとＭ．イントラセルラーエをまとめてＭＡＣとして検出することができるプライマーセットである。
プライマーセットｂは、結核菌はもとより、ＭＡＣやＭ．カンサシイ亜種と交差性を示すことなく、Ｍ．カンサシイを検出することができるプライマーセットである。
そして、プライマーセットｃは、結核菌はもとより、ＭＡＣやＭ．カンサシイと交差性を示すことなく、Ｍ．カンサシイ亜種を検出することができるプライマーセットである。
【００２３】
したがって、本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットによれば、ＭＡＣと、Ｍ．カンサシイと、Ｍ．カンサシイ亜種とを互いに区別して、かつ、結核菌と区別して検出することが可能である。
【００２４】
本発明の好ましい形態では、
前記プライマーセットａが下記プライマーセットａ−１であり、
前記プライマーセットｂが下記プライマーセットｂ−１であり、
前記プライマーセットｃが下記プライマーセットｃ−１である。
【００２５】
＜プライマーセットａ―１＞
配列番号４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００２６】
＜プライマーセットｂ−１＞
配列番号９で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００２７】
＜プライマーセットｃ−１＞
以下のプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれるプライマーセット。
【００２８】
＜プライマーセットｃ−１−１＞
配列番号１４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、
【００２９】
＜プライマーセットｃ−１−２＞
配列番号１６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット、
【００３０】
＜プライマーセットｃ−１−３＞
配列番号１７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００３１】
このように、プライマーセットａ―１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｃ−１から選ばれるプライマーセットを用いる形態とすることで、ＭＡＣと、Ｍ．カンサシイと、Ｍ．カンサシイ亜種とを互いに区別して、より精度よく非結核性抗酸菌の検出が可能となる。
【００３２】
本発明の好ましい形態では、前記プライマーセットａ〜ｃから選ばれる２種以上のプライマーセットを含む。
このように２種以上のプライマーセットを含む形態とすることで、検体に含まれる病原菌をより精度よく同定することができるマイコバクテリウム属細菌検出用キットを提供することができる。
【００３３】
本発明の好ましい形態では、さらに以下のプライマーセットｄを含む。
【００３４】
＜プライマーセットｄ＞
マイコバクテリウムツベルクローシスのＩＴＳ領域の少なくとも一部を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットであり、
前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０で表される塩基配列と同一又は相補な塩基配列にアニールする、マイコバクテリウムツベルクローシス検出用プライマーセット。
【００３５】
プライマーセットｄは、非結核性抗酸菌（ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種）と区別して、Ｍ．ツベルクローシスを検出可能にするプライマーセットである。
プライマーセットｄを含む形態とすることで、検体に含まれる病原菌が結核菌であるのか、非結核性抗酸菌であるのか、を確定的に判断することができる。また、プライマーセットａ〜ｃの何れかによる非結核性抗酸菌の検出結果が、結核菌の交差反応による偽陽性でないことを判断することができる。
【００３６】
本発明の好ましい形態では、前記プライマーセットｄが下記プライマーセットｄ−１である。
【００３７】
＜プライマーセットｄ−１＞
配列番号２１で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと
配列番号２２で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００３８】
プライマーセットｄ−１を含む形態とすることで、検体におけるＭ．ツベルクローシスの有無をより正確に判断可能なマイコバクテリウム属細菌検出用キットを提供することができる。
【００３９】
本発明の好ましい形態では、さらに、下記対照・標準用テンプレートｅと、下記プライマーセットｅと、を含む。
【００４０】
＜対照・標準用テンプレートｅ＞
結核菌及び非結核性抗酸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列には含まれない、特有の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡ。
【００４１】
＜プライマーセットｅ＞
前記特有の塩基配列を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。
【００４２】
このように対照・標準用テンプレートを含む形態によれば、シングルプレックスＰＣＲの場合にはポジティブコントロールとして、又はマルチプレックスＰＣＲの場合には内部標準を置いたうえでのマイコバクテリウム属細菌の検出が可能となる。
【００４３】
本発明の好ましい形態では、前記対照・標準用テンプレートｅが、下記対照・標準用テンプレートｅ−１であり、
前記プライマーセットｅが、下記プライマーセットｅ−１である。
【００４４】
＜対照・標準用テンプレートｅ−１＞
好熱菌のゲノムＤＮＡ
【００４５】
＜プライマーセットｅ−１＞
タングステン含有酸化還元酵素又はフェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡ領域を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット。
【００４６】
タングステン含有酸化還元酵素遺伝子とフェレドキシンオキシダーゼ遺伝子は好熱菌特有の遺伝子である。そのため、本発明の検出対象である非結核性抗酸菌、結核菌と交差することが無い。
【００４７】
本発明の好ましい形態では、前記プライマーセットｅ−１が下記プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３から選ばれるプライマーセットである。
【００４８】
＜プライマーセットｅ−１−１＞
タングステン含有酸化還元酵素をコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２３で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００４９】
＜プライマーセットｅ−１−２＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００５０】
＜プライマーセットｅ−１−３＞
フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットであり、
配列番号２７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むフォワードプライマーと、
配列番号２８で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むリバースプライマーと、からなるプライマーセット。
【００５１】
本発明の好ましい形態では、さらに、前記プライマーセットによる増幅産物を検出するための検出用プローブを含む。
【００５２】
本発明の好ましい形態では、上記プライマーセットａ−１と下記プローブａとの組み合わせ、及び／又は、
上記プライマーセットｂ−１若しくは上記プライマーセットｃ−１と、下記プローブｂ／ｃとの組み合わせ、
を含む。
【００５３】
＜プローブａ＞
配列番号２９又は配列番号３０で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【００５４】
＜プローブｂ／ｃ＞
配列番号３１又は配列番号３２で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【００５５】
上述のプライマーセットとプローブの組合せを採用することで、検出対象であるＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種を精度よく検出することができる。
【００５６】
本発明の好ましい形態では、さらに上記プライマーセットｄ−１と下記プローブｄとの組み合わせを含む。
【００５７】
＜プローブｄ＞
配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【００５８】
このようにＭ．ツベルクローシスを検出するためのプライマーセット及びプローブの組合せを含む形態とすることで、よりＭ．ツベルクローシスと区別して、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ又はＭ．カンサシイ亜種を特異的に検出することの判断が可能となる。
【００５９】
さらに上記対照・標準用テンプレートｅ−１と、上記プライマーセットｅ−１−２と、下記プローブｅとの組み合わせを含む。
【００６０】
＜プローブｅ＞
配列番号３６で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基を含むプローブ。
【００６１】
本発明は、上述のマイコバクテリウム属細菌検出用キットを使用して、マイコバクテリウム属細菌を検出する方法であって、
上記プライマーセットａ〜ｃから選ばれる１種以上のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含むことを特徴とする、マイコバクテリウム属細菌を検出する方法にも関する。
【００６２】
本発明の好ましい形態では、前記核酸増幅工程において、
上記プライマーセットａ〜ｃの何れかによる核酸増幅反応と、
上記対照・標準用テンプレートｅを鋳型とする上記プライマーセットｅによる核酸増幅反応と、
を同一反応系において実行する。
【００６３】
このように内部標準となる核酸増幅反応と検出対象をターゲットとする核酸増幅反応を同一反応系（すなわちマルチプレックス）で実行する形態とすることで、簡易迅速な試験が可能となる。
【発明の効果】
【００６４】
本発明によれば、結核菌と区別して検出することができることのみならず、ＭＡＣ、Ｍ．アビウム及びＭ．カンサシイ亜種のそれぞれを互いに区別して検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ検出プライマーセット、及びＭ．ツベルクローシス検出プライマーセットを用いたＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図２】本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図３】本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図４】本発明に係るＭ．ツベルクローシス検出プライマーセット用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図５】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットを用いたＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図６】本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図７】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図８】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図９】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図１０】本発明に係る対照・標準用検出プライマーセットを用いたＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図１１】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつの、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図１２】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつの、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図１３】本発明に係るＭ．カンサシイ亜種検出プライマーセットのうちのひとつの、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図１４】本発明に係る対照・標準用検出プライマーセットを用いた、交差活性試験の結果を表すグラフである。
【図１５】本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセットとＭＡＣ検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図１６】本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、及び、Ｍ．カンサシイ検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図１７】本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、及び、Ｍ．カンサシイ検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図１８】本発明に係る対照・標準用検出プライマーセットと対照・標準用検出プローブを用いたシングルプレックスＰＣＲにおける、ＤＮＡテンプレート濃度を変化させた時のＣｔ値の変化を表すグラフである。
【図１９】本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセット、ＭＡＣ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＦＡＭで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。
【図２０】本発明に係るＭＡＣ検出プライマーセット、ＭＡＣ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＲＯＸで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。
【図２１】本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、及び対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＦＡＭで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。
【図２２】本発明に係るＭ．カンサシイ検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット、Ｍ．カンサシイ検出プローブ、対照・標準用検出プライマーセット、及び対照・標準用検出プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲにおける、ＲＯＸで検出した時の増幅曲線を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
１．マイコバクテリウム属細菌検出用キット
発明者は、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によって、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーエ及びＭ．カンサシイに分類されている菌株を複数種入手し、それぞれの菌株についてＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ）領域の塩基配列を解析した。
【００６７】
その結果、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によって同種に分類されている菌株であっても、ＩＴＳ領域には多数の変異が存在することがわかった。変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類に分類することができた。
【００６８】
さらに、同法によってＭ．カンサシイとして分類されていた菌株は、ＩＴＳ領域の配列に基づいて５種類に分類することができた。そして、最も多くの菌株が有していた１種のＩＴＳ領域の配列と、他の４種類のＩＴＳ領域の配列は大きく異なっていた。詳細な解析の結果、当該４種のＩＴＳ領域の配列を有する菌は、Ｍ．カンサシイに分類されるべきものではなく、いわばＭ．カンサシイ亜種というべきものであることが判明した。
【００６９】
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットの必須要素であるプライマーセットａ〜ｃは、以上の知見に基づき設計されたプライマーセットであり、１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３ｓ  ｒＲＮＡの間のスペーサー部分の領域に位置する、ＩＴＳ領域を標的とする。ＩＴＳ領域は、種間の多型性が高いため、ＩＴＳ領域を標的とすることにより、正確に菌種を同定することができる。
【００７０】
（１）プライマー
本発明は必須要素としてプライマーセットａ〜ｃを含む。また、任意にプライマーセットｄを含む形態としてもよい。以下、それぞれのプライマーセットについて詳細に説明する。
【００７１】
（１−１）プライマーセットａ
上述の通り、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類、合計１５種類に分類することができる。Ｍ．アビウムとＭ．イントラセルラーエを区別することなく、ＭＡＣとしてまとめて検出するためには、ＩＴＳ領域の変異の影響を大きく受けず、前記合計１５種類のＩＴＳ領域を増幅することができるプライマーセットを設計する必要がある。
【００７２】
さらには、ＭＡＣを特異的に検出するためには、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種と交差性を示さないプライマーセットを設計する必要がある。
【００７３】
このような条件を充足するプライマーセットを設計するため、上記合計１５種類のＩＴＳ領域の配列間で相同性が高く（つまり変異の数が少なく）、かつ、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種のＩＴＳ領域の配列と相同性が低い領域を調査した。その結果、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列が見出された。
【００７４】
プライマーセットａは、ＭＡＣを検出するためのものであり、これら配列をターゲットとするプライマーセットである。つまり、プライマーセットａを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする。
プライマーセットａによれば、Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種と交差することなく、かつ、株間に存在する変異に左右されることなくＭＡＣをまとめて検出することができる。
【００７５】
配列番号１〜３で表される塩基配列において、「ｎ」で表される塩基は、上記合計１５種類のＩＴＳ領域の配列間で完全一致しない（つまり変異のある）塩基である。
つまり、プライマーセットａを具体的に設計する場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれは、配列番号１〜３で表される塩基配列において、「ｎ」をなるべく含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするように設計することが好ましい。
【００７６】
具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーがアニールする塩基配列のうち、「ｎ」が占める割合が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とすることが好ましい。
特に好ましくは、配列番号１〜３で表される塩基配列において、「ｎ」を含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするようにフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することが好ましい。
【００７７】
プライマーセットａを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上とすることが好ましい。
【００７８】
プライマーセットａの具体的な態様として、プライマーセットａ−１を挙げることができる。
【００７９】
プライマーセットａ―１を構成するフォワードプライマーは、配列番号４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００８０】
また、プライマーセットａ―１を構成するリバースプライマーは、配列番号５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００８１】
（１−２）プライマーセットｂ
上述の通り、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によってＭ．カンサシイとして分類されていたものであっても、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると４種に分類することができた。このうち、１種はＭ．カンサシイと分類することが妥当であるが、残りの３種はＭ．カンサシイ亜種に分類するべきものであった。
このことから、Ｍ．カンサシイを特異的に検出するに当たっては、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）やＭＡＣと交差しないことはもとより、Ｍ．カンサシイ亜種とも交差しないプライマーセットを設計する必要がある。
【００８２】
このような条件を充足するプライマーセットを設計するため、Ｍ．カンサシイのＩＴＳ領域のうち、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ亜種のＩＴＳ領域の配列と相同性が低い領域を調査した。その結果、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列が見出された。
【００８３】
プライマーセットｂは、Ｍ．カンサシイを検出するためのものであり、これら配列をターゲットとするプライマーセットである。つまり、プライマーセットｂを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする。
プライマーセットｂによれば、Ｍ．ツベルクローシス、ＭＡＣ及びＭ．カンサシイ亜種と交差することなく、Ｍ．カンサシイを検出することができる。
【００８４】
プライマーセットｂを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上とすることが好ましい。
【００８５】
プライマーセットｂの具体的な態様として、プライマーセットｂ−１を挙げることができる。
【００８６】
プライマーセットｂ―１を構成するフォワードプライマーは、配列番号９で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００８７】
また、プライマーセットｂ―１を構成するリバースプライマーは、配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００８８】
（１−３）プライマーセットｃ
上述の通り、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法によってＭ．カンサシイとして分類されていたものであっても、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると５種に分類することができた。このうち、１種はＭ．カンサシイと分類することが妥当であるが、残りの４種はＭ．カンサシイ亜種に分類するべきものであった。
このことから、Ｍ．カンサシイ亜種を特異的に検出するに当たっては、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）やＭＡＣと交差しないことはもとより、Ｍ．カンサシイとも交差しないプライマーセットを設計する必要がある。
【００８９】
このような条件を充足するプライマーセットを設計するため、Ｍ．カンサシイ亜種のＩＴＳ領域のうち、結核菌（Ｍ．ツベルクローシス）、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイのＩＴＳ領域の配列と相同性が低い領域を調査した。その結果、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列が見出された。
【００９０】
プライマーセットｃは、Ｍ．カンサシイ亜種を検出するためのものであり、これら配列をターゲットとするプライマーセットである。つまり、プライマーセットｃを構成するフォワードプライマーとリバースプライマーは、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３で表される塩基配列又はこれと相補的な塩基配列にアニールする。
プライマーセットｃによれば、Ｍ．ツベルクローシス、ＭＡＣ及びＭ．カンサシイと交差することなく、Ｍ．カンサシイ亜種を検出することができる。
【００９１】
配列番号１１〜１３で表される塩基配列において、「ｎ」で表される塩基は、上記合計４種類のＩＴＳ領域の配列間で完全一致しない（つまり変異のある）塩基である。
つまり、プライマーセットｃを具体的に設計する場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれは、配列番号１１〜１３で表される塩基配列において、「ｎ」をなるべく含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするように設計することが好ましい。
【００９２】
具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーがアニールする塩基配列のうち、「ｎ」が占める割合が、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とすることが好ましい。
特に好ましくは、配列番号１１〜１３で表される塩基配列において、「ｎ」を含まない領域の塩基配列又はその相補的な塩基配列にアニールするようにフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することが好ましい。
【００９３】
プライマーセットｃを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーは、それぞれ好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上とすることが好ましい。
【００９４】
プライマーセットｃの具体的な態様として、プライマーセットｃ−１を挙げることができる。プライマーセットｃ−１は、以下のプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれる。
【００９５】
プライマーセットｃ―１−１を構成するフォワードプライマーは、配列番号１４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
これに対応する、プライマーセットｃ―１−１を構成するリバースプライマーは、配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００９６】
プライマーセットｃ―１−２を構成するフォワードプライマーは、配列番号１６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
これに対応する、プライマーセットｃ―１−１を構成するリバースプライマーは、配列番号１５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００９７】
プライマーセットｃ―１−３を構成するフォワードプライマーは、配列番号１７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
これに対応する、プライマーセットｃ―１−３を構成するリバースプライマーは、配列番号１０で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上を含む。
【００９８】
（１−４）プライマーセットｄ
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、Ｍ．ツベルクローシスを検出するためのプライマーセットｄを含む形態としてもよい。
発明者は、Ｍ．ツベルクローシスのＩＴＳ領域の配列を解析し、Ｍ．ツベルクローシスを核酸増幅により特異的に検出可能であり、かつ、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種と相同性が低い（すなわち交差する可能性が低い）配列として、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０で表される塩基配列を同定した。
【００９９】
プライマーセットｄは、これら塩基配列にアニールするプライマーセットであり、Ｍ．ツベルクローシスのＩＴＳ領域の一部を特異的に増幅することができるものである。
【０１００】
プライマーセットｄをプライマーセットａ〜ｃの何れかと併用して核酸増幅することによって、検査対象に含まれる菌が、結核菌と非結核性抗酸菌の何れであるのかを精度よく判断することができる。
【０１０１】
プライマーセットｄとしては、以下のプライマーセットｄ−１を用いることが好ましい。プライマーセットｄ−１はＭ．ツベルクローシスのＩＴＳ領域に対する特異性が特に高いため、非結核性抗酸菌と交差することなく、Ｍ．ツベルクローシスを検出することを可能にする。
【０１０２】
プライマーセットｄ−１を構成するフォワードプライマーは、配列番号２１で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上の配列を含む。
【０１０３】
プライマーセットｄ−１を構成するリバースプライマーは、配列番号２２で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上の配列を含む。
【０１０４】
（２）対照・標準
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、核酸増幅反応のポジティブコントロール又は内部標準とするためのテンプレートＤＮＡとプライマーセットを備えていることが好ましい。これにより上記プライマーセットによる核酸増幅反応が正常に作動していることを確認するためのポジティブコントロールや、内部標準を置くことができる。
【０１０５】
標準のためのテンプレートＤＮＡとプライマーセットの組合せとしては、以下の対照・標準用テンプレートｅと下記プライマーセットｅとの組み合わせが好ましい。
このテンプレートＤＮＡとプライマーセットの組合せを使用することで、標準に係る核酸増幅反応について、検出対象である非結核性抗酸菌及び結核菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとする増幅反応への影響を抑制することができる。また、対照・標準用テンプレートと検出用テンプレートの増幅反応において、互いの反応に対しての交差反応を防ぐことができる。
【０１０６】
対照・標準用テンプレートｅは、結核菌及び非結核性抗酸菌のゲノムＤＮＡの塩基配列には含まれない、特有の塩基配列を有するテンプレートＤＮＡである。
【０１０７】
そしてプライマーセットｅは、上述した対照・標準用テンプレートｅに特有の塩基配列を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットである。
【０１０８】
対照・標準用テンプレートｅとしては、結核菌及び非結核性抗酸菌とは別種である特定の動物種のゲノムＤＮＡであり、かつ、当該動物種に特有のタンパク質をコードしているものが好ましい。
この場合、プライマーセットｅは、上述の特有のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ領域を標的とするプライマーセットであることが好ましい。
【０１０９】
テンプレートＤＮＡとプライマーセットの組合せのより好ましい態様として、以下の対照・標準用テンプレートｅ−１と以下のプライマーセットｅ−１との組み合わせを挙げることができる。
【０１１０】
対照・標準用テンプレートｅ−１は好熱菌ゲノムＤＮＡである。
また、プライマーセットｅ−１は、好熱菌に特有のタンパク質であるタングステン含有酸化還元酵素又はフェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡ領域を増幅するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットである。
【０１１１】
プライマーセットｅ−１のより好ましい形態として、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３を挙げることができる。
【０１１２】
プライマーセットｅ−１−１は、タングステン含有酸化還元酵素をコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットである。
プライマーセットｅ−１−１を構成するフォワードプライマーは、配列番号２３で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
また、プライマーセットｅ−１−１を構成するリバースプライマーは、配列番号２４で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
【０１１３】
プライマーセットｅ−１−２は、フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットである。
プライマーセットｅ−１−２を構成するフォワードプライマーは、配列番号２５で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
また、プライマーセットｅ−１−２を構成するリバースプライマーは、配列番号２６で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
【０１１４】
プライマーセットｅ−１−３は、フェレドキシンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡを標的とするプライマーセットである。
プライマーセットｅ−１−３を構成するフォワードプライマーは、配列番号２７で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
また、プライマーセットｅ−１−３を構成するリバースプライマーは、配列番号２８で表される塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含む。
【０１１５】
なお、上記いずれのプライマーも、公知の方法で設計、合成することができる。
また、上記プライマーは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどの公知の標識物質を用いることができる。標識方法は、使用する標識物質に合わせて、公知の方法を適宜選択することができる。
【０１１６】
（３）プローブ
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットによる核酸増幅反応の検出手段は限定されず、インターカレーター法やプローブ法などを制限なく採用することができる。
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットによる核酸増幅反応をマルチプレックス反応系で実行する場合には、プローブ法により核酸増幅反応を検出することが好ましい。
そのため、本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を検出するための検出用プローブを含むことが好ましい。
【０１１７】
検出用プローブは、上述したプライマーセットによる核酸増幅反応を検出することができれば、配列は特に制限されない。以下、各プライマーセットを用いる場合に最適なプローブについて具体的に説明する。
【０１１８】
上記プライマーセットａ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブａを採用することが好ましい。
プローブａは、配列番号２９又は配列番号３０で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。
【０１１９】
また、上記プライマーセットｂ−１若しくは上記プライマーセットｃ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブｂ／ｃを採用することが好ましい。
プローブｂ／ｃは、配列番号３１又は配列番号３２で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。
【０１２０】
また、上記プライマーセットｄ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブｄを採用することが好ましい。
プローブｄは、配列番号３３又は配列番号３４で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。
【０１２１】
また、上記プライマーセットｅ−１による核酸増幅反応を検出するためには、下記プローブｅを採用することが好ましい。
プローブｅは、配列番号３６で表される塩基配列又はその相補的な塩基配列の連続した少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上を含むプローブである。
【０１２２】
上記いずれのプローブも、公知の方法で設計、合成することができる。
核酸増幅反応を検出ために必要なプローブへの修飾は公知のものを制限なく採用することができる。より具体的には、５´末端に蛍光物質、３´末端にクエンチャーを修飾する形態にあっては、蛍光物質とクエンチャーの組合せは公知のものを制限なく採用することができる。
蛍光標識物質としては、例えば、多くのリアルタイムＰＣＲ装置に内蔵されている、蛍光検出用フィルターに対応する、フルオレセイン（ＦＡＭ検出用フィルターに対応）や、ローダミン、ＪＵＮ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（ＬＧＣバイオリサーチテクノロジーズ社）（いずれもＲＯＸ検出用フィルターに対応）を使用することができる。クエンチャーとしては、例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）クエンチャーやＢＨＱ（登録商標）クエンチャーなどが挙げられる。
【０１２３】
（４）その他
本発明のマイコバクテリウム属細菌検出用キットは、上述のプライマーセット、プローブ及び対照・標準用テンプレートの他に、例えばポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ、純水などを含んでいても良い。
【０１２４】
２．マイコバクテリウム属細菌検出方法
本発明のマイコバクテリウム属菌検出方法は、上述のマイコバクテリウム属細菌検出用キットを利用した検出方法である。
【０１２５】
本発明の検出方法は、上記プライマーセットａ〜ｃの何れか１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種を用いて、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含む。
本発明においては、上記プライマーセットｄを用いて、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含んでいても良い。
また、ポジティブコントロール又は内部標準のために、対照・標準用テンプレートｅを鋳型としてプライマーセットｅを用いて、核酸増幅反応を行う核酸増幅工程を含んでいても良い。
【０１２６】
核酸増幅反応としては、ＰＣＲ法及びその変法（リアルタイムＰＣＲ法など）を際限なく採用することができる。反応系における各成分の濃度やサーマルサイクルのプログラムなど、核酸増幅反応の条件は限定されず、公知の方法により適宜設計することができる。
【０１２７】
核酸増幅工程において核酸増幅反応が生じたことの確認方法は特に制限されない。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、所望の長さの増幅産物が生じていることを確認する方法を採用してもよい。
中でもインターカレーター法やプローブ法により核酸増幅反応をリアルタイムに検出するリアルタイムＰＣＲ法を採用することが好ましい。
【０１２８】
核酸増幅工程は、一つの反応系で一つの標的配列を増幅するシングルプレックスＰＣＲであってもよいし、一つの反応系で２つ以上の標的配列を増幅するマルチプレックスＰＣＲであってもよい。
本発明で用いるプライマーセットは、いずれもその対象とする菌種以外の菌種に交差せず、特異性が高いため、マルチプレックスＰＣＲとすることが好ましい。より好ましくは、高い特異性を保証し、また、非特異増幅の検出を抑制することができることから、プローブを用いたマルチプレックスＰＣＲとする。
なお、本発明において、「マルチプレックス」とは、２種類の波長を読み取って検出する反応系のことを指す。また「シングルプレックス」とは、１種類の波長を読み取って検出する反応系のことを指す。
【０１２９】
マルチプレックスＰＣＲとする場合にはプローブ法を採用することが好ましい。この場合、同一反応系で生じる２種以上の核酸増幅反応を区別して検出できるように、プローブに修飾する蛍光物質の蛍光波長が重複しないように調整する。
マルチプレックスＰＣＲとする場合には、例えば、以下のような形態とすることが好ましい。
【０１３０】
プライマーセットａ〜ｃの何れか１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種以上による核酸増幅反応と、対照・標準用テンプレートｅを鋳型としてプライマーセットｅを用いた核酸増幅反応と、を同一反応系で行う形態としてもよい。
プライマーセットｅによる核酸増幅反応は内部標準として働くため、プライマーセットａ〜ｃの何れかによる核酸増幅反応が正常に動作していることを精度よく判別することができる。
【０１３１】
ＭＡＣを検出するためのプライマーセットａと、Ｍ．カンサシイを検出するためのプライマーセットｂと、による核酸増幅反応を同一の反応系で実行する形態とすることが好ましい。
この形態であれば、検査試料にＭＡＣとＭ．カンサシイの何れが含まれているのかを同一反応系で判別することができる。
【０１３２】
プライマーセットａとプライマーセットｂによる核酸増幅反応に加え、対照・標準用テンプレートｅを鋳型としてプライマーセットｅを用いた核酸増幅反応も同一反応系で実行する形態（トリプレックスＰＣＲ）としても良い。
【０１３３】
Ｍ．カンサシイを検出するためのプライマーセットｂと、Ｍ．カンサシイ亜種を検出するためのプライマーセットｃと、による核酸増幅反応を同一の反応系で実行する形態とすることが好ましい。
この形態であれば、検査対象にＭ．カンサシイとＭ．カンサシイ亜種の少なくとも何れかが含まれている場合に、これらを同一反応系で検出することができる。
【０１３４】
特に、Ｍ．カンサシイを検出するためのプライマーセットｂ−１と、Ｍ．カンサシイ亜種を検出するためのプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３から選ばれる１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは３種と、による核酸増幅反応を同一の反応系で実行し、プローブｂ／ｃで検出する形態としてもよい。
上述の合計４種のプライマーセットによる核酸増幅反応は、プローブｂ／ｃにより一括して検出可能であるため、Ｍ．カンサシイとＭ．カンサシイ亜種を区別して検出する必要が無い場合には有用である。
【実施例】
【０１３５】
＜１＞マイコバクテリウム属菌のＩＴＳ領域の解析
複数の医療機関及び研究機関に保存されていた、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーエ、及びＭ．カンサシイの菌株を収集した。これら菌株のゲノムＤＮＡを抽出し、Ｍ．アビウムが１５０株分、Ｍ．イントラセルラーエが１３２株分、Ｍ．カンサシイが１２９株分のゲノムＤＮＡを調製した。
なお、これら菌株は、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの手法に基づいて分類されたものである。
【０１３６】
調製したゲノムＤＮＡを基に、１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３Ｓ  ｒＲＮＡとの間のＩＴＳ領域の塩基配列を解析した。
解析の結果、変異箇所ごとにＩＴＳ領域の配列を分類すると、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類に分類することができた。
【０１３７】
また、Ｍ．カンサシイは、ＩＴＳ領域の配列を５種類に分類することができた。しかし、最も多くの菌株が有していたＩＴＳ領域の配列と、他の４種類のＩＴＳ領域の配列が大きく異なることが判明した。この４種類のＩＴＳ領域を有する菌株について１６Ｓ  ｒＲＮＡの変異領域による菌種同定を行ったところ、Ｍ．ｐｅｒｓｉｃｕｍであることが判明した。以降、Ｍ．ｐｅｒｓｉｃｕｍをＭ．カンサシイ亜種とする。以下、ＩＴＳ領域の塩基配列により分類された４種のＭ．カンサシイ亜種のそれぞれをＭ．カンサシイ亜種（１）〜（４）などということがある。
【０１３８】
また、ＩＴＳ領域の塩基配列により分類したＭ．カンサシイ及び４種のＭ．カンサシイ亜種に罹患した患者の治療実績を調べると、この分類に応じて薬剤感受性や薬剤耐性が異なることがわかった。
以上より、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づく菌種同定は、菌種ごとの薬剤抵抗性などの表現型をも反映していることが示唆された。
【０１３９】
さらに、既存のＰＣＲ法やＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション等の方法により、ある菌種であると判別されている菌株であっても、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づく解析により明確に別菌種であると判定できるもの、すなわち、菌種同定が誤っているものが各菌において複数サンプルずつ存在した。
以上より、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション等の既存の方法による菌種同定よりも、ＩＴＳ領域に基づく菌種同定のほうが正確に菌種を同定することができることが示唆された。
【０１４０】
＜２＞プライマーセット及びプローブの設計
（１）ＭＡＣ
上述の通り、Ｍ．アビウムは４種類、Ｍ．イントラセルラーエは１１種類に分類することができた。
この合計１５種類のＩＴＳ領域のうち、相同性が高く（つまり変異が少なく）、かつ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種、及びＭ．ツベルクローシスと相同性が低い領域を解析した。
その結果、領域１−１〜１−３の３つの領域が見出された。この領域の塩基配列を前記合計１５種類の配列に基づき一般化したものを表１に示す。
【０１４１】
【表１】
2020198792.tif 000002
【０１４２】
（２）Ｍ．カンサシイ
Ｍ．カンサシイのＩＴＳ領域のうち、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ亜種、及びＭ．ツベルクローシスと相同性が低い領域を解析した。
その結果、領域２−１〜２−３の３つの領域が見出された。この領域の塩基配列を表２に示す。
【０１４３】
【表２】
2020198792.tif 000003
【０１４４】
（３）Ｍ．カンサシイ亜種
上述の通り、従来法によりＭ．カンサシイに分類されていた菌は、ＩＴＳ領域の塩基配列の解析により４種のＭ．カンサシイ亜種に分類することができた（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（４））。
この４種のＩＴＳ領域のうち、相同性が高く（つまり変異が少なく）、かつ、ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、及びＭ．ツベルクローシスと相同性が低い領域を解析した。
その結果、領域３−１〜３−３の３つの領域が見出された。この領域の塩基配列を前記合計４種の配列に基づき一般化したものを表３に示す。
【０１４５】
【表３】
2020198792.tif 000004
【０１４６】
（４）プライマーの設計
後述の実施例では表４に示すプライマーセットを使用した。表４のプライマーセットは、表１〜３に示した塩基配列及びその相補的な塩基配列にアニールするように設計した。なお、プライマーセットｃ−１−３は、Ｍ．カンサシイ亜種（３）と（４）をまとめて検出するように設計されている。
【０１４７】
【表４】
2020198792.tif 000005
【０１４８】
（５）プローブの設計
後述の実施例では、表５に示すプローブを使用した。表５のプローブは、表４に示したプライマーセットによる核酸増幅反応を検出可能なように設計した。
【０１４９】
【表５】
2020198792.tif 000006
【０１５０】
プローブａは、表４のプライマーセットａ−１による核酸増幅反応を検出する。
プローブｂ／ｃは、表４のプライマーセットｂ−１、ｃ−１−１〜ｃ−１−３による核酸増幅反応を検出する。
プローブｅは、表４のプライマーセットｅ−１−２による核酸増幅反応を検出する。
【０１５１】
＜３＞実施例
表４及び表５に記載したプライマーセット及びプローブを使用して以下の試験を行った。
【０１５２】
［実施例１］ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ツベルクローシスの検出（シングルプレックス）
塩基配列の解析により菌種同定されているＭ．イントラセルラーエ、Ｍ．カンサシイ及びＭ．ツベルクローシスの菌株よりゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１５３】
鋳型ＤＮＡの濃度を種々変更し、以下の３通りの鋳型とプライマーセットの組合せで、リアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１に示す。
Ｍ．イントラセルラーエのゲノムＤＮＡとプライマーセットａ―１（ＭＡＣ検出用）；
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡとプライマーセットｂ―１（Ｍ．カンサシイ検出用）；
Ｍ．ツベルクローシスのゲノムＤＮＡとプライマーセットｄ−１（Ｍ．ツベルクローシス検出用）
【０１５４】
図１に示すように、プライマーセットａ−１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｄ−１による核酸増幅反応は、同条件において同程度の増幅速度を示した。そのため、これらプライマーセットは、同条件で検査をすることができる。
また、１０１コピー／チューブの濃度でも検出することができ、感度が良い。
【０１５５】
［実施例２］ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．ツベルクローシス検出用プライマーの交差活性試験（シングルプレックス）
下記表６の菌種よりゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれの菌種のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットａ−１（ＭＡＣ検出用）、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）、プライマーセットｄ−１（Ｍ．ツベルクローシス検出用）のそれぞれを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。
プライマーセットａ−１を使用したときの結果を図２に、プライマーセットｂ−１を使用したときの結果を図３に、プライマーセットｄ−１を使用したときの結果を図４に示す。
【０１５６】
【表６】
2020198792.tif 000007
【０１５７】
図２、３及び４に示すように、プライマーセットａ―１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｄ−１の各検出プライマーセットは、それぞれが検出対象とする菌種のゲノムを鋳型としたときにのみ、強い増幅曲線の立ち上がりを示した。
この結果は、プライマーセットａ―１、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｄ−１は、検出対象以外の菌種には交差反応を示すことなく、それぞれが検出対象とする菌種を特異的に検出することを可能とすることを示している。
【０１５８】
［実施例３］Ｍ．カンサシイ亜種の検出（シングルプレックス）
３株のＭ．カンサシイ亜種からゲノムＤＮＡを抽出した。なお、これら３つの菌株は、ＩＴＳ領域の塩基配列に基づき、それぞれ別々のグループに分類されるものである。以下、３つの菌株をそれぞれＭ．カンサシイ亜種（１）〜（３）などと呼ぶ。
【０１５９】
鋳型ＤＮＡの濃度を種々変更し、以下の３通りの鋳型とプライマーセットの組合せで、リアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図５に示す。
Ｍ．カンサシイ亜種（１）のゲノムＤＮＡとプライマーセットｃ−１−１；
Ｍ．カンサシイ亜種（２）のゲノムＤＮＡとプライマーセットｃ−１−２；
Ｍ．カンサシイ亜種（３）のゲノムＤＮＡとプライマーセットｃ−１−３
【０１６０】
図５からわかるように、プライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３は、同条件において同程度の増幅感度であるため、同条件で検査をすることができる。
また、１０１コピー／チューブの濃度でも検出することができる。
【０１６１】
［実施例４］Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種検出用プライマーセットの交差活性試験（１）（シングルプレックス）
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡと、Ｍ．カンサシイ亜種３株（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（３））のゲノムＤＮＡを用意した。
それぞれの菌種のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）、プライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（３）検出用）のそれぞれを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。
【０１６２】
プライマーセットｂ−１を使用したときの結果を図６に、プライマーセットｃ−１−１を使用したときの結果を図７に、プライマーセットｃ−１−２を使用したときの結果を図８に、プライマーセットｃ−１−３を使用したときの結果を図９に示す。
【０１６３】
図６〜９に示すように、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）は、Ｍ．カンサシイ亜種のゲノムＤＮＡに対しては交差反応を示さなかった。
同じくプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３のそれぞれは、Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡに対しては交差反応を示さなかった。
【０１６４】
特に、図６、８及び９に示すように、プライマーセットｂ−１、プライマーセットｃ−１−２、プライマーセットｃ−１−３は、それぞれが検出対象とする菌種以外の菌種には交差反応を示さず、特異性が非常に高い。
【０１６５】
一方、プライマーセットｃ−１−１（Ｍ．カンサシイ亜種（１）検出用）は、検出対象とする菌種とは別のＭ．カンサシイ亜種と交差活性を示す（図７）。これは、プライマーセットｃ−１−１が標的とするＭ．カンサシイ亜種と、別のＭ．カンサシイ亜種が極めて近い類縁種であることに起因するものと考えられる。
【０１６６】
［実施例５］対照・標準用テンプレート及びプライマーセットの検討（シングルプレックス）
好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のゲノムＤＮＡを使用した。
鋳型ＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３（好熱菌に特有の遺伝が標的）のそれぞれについて、リアルタイムＰＣＲを行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１０に示す。
【０１６７】
図１０に示すように、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３は、いずれも同程度の検出感度であり、いずれのプライマーセットでも、好熱菌特有の遺伝子（タングステン含有酸化還元酵素遺伝子、またはフェレドキシンオキシダーゼ遺伝子）を感度よく検出することができる。
また、１０１コピー／チューブの濃度でも検出することができる。
【０１６８】
［実施例６］Ｍ．カンサシイ亜種検出用プライマーセットの交差活性試験（１）（シングルプレックス）
下記表７の菌種のゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３（Ｍ．カンサシイ亜種（１）〜（３）検出用）のそれぞれを使用してリアルタイムＰＣＲを行うことで、交差活性試験を行った。結果を図１１〜１３に示す。
【０１６９】
【表７】
2020198792.tif 000008
【０１７０】
図１１〜１３からわかるように、プライマーセットｅ−１−１〜ｅ−１−３は、検出対象である菌種以外の菌種との交差活性を示さないか、又は交差活性を示しても、サイクル数やプライマー濃度により調整可能な程度にしか示さない。
【０１７１】
また、プライマーセットｅ−１−１（Ｍ．カンサシイ亜種検出プライマーセット（１））は、別のＭ．カンサシイ亜種との交差活性を示すが（図１１参照）、これは、プライマーセットｅ−１−１が標的とするＭ．カンサシイ亜種と、別のＭ．カンサシイ亜種が極めて近い類縁種であることに起因するものと考えられる。
【０１７２】
［実施例７］標準用プライマーセットの交差活性試験（シングルプレックス）
上記表７の菌種のゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーセットｅ−１−２（フェレドキシンオキシダーゼ遺伝子検出用）を使用してリアルタイムＰＣＲを行うことで、交差活性試験を行った。この際、インターカレーターとしてＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）を用いた。結果を図１４に示す。
【０１７３】
図１４に示すように、プライマーセットｅ−１−２は好熱菌のゲノムＤＮＡを特異的に増幅し、他の菌種に対して交差活性を示さなかった。
この結果より、好熱菌のゲノムＤＮＡを対照・標準用テンプレートとするプライマーセットｅ−１−２による核酸増幅反応は、内部標準としての適正を有しており、マルチプレックスＰＣＲへの応用が十分に可能であることが示された。
【０１７４】
［実施例８］プローブ法によるＭＡＣの検出（シングルプレックス）
テンプレートであるＭ．アビウムのゲノムＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットａ−１（ＭＡＣ検出用）とプローブａ（ＭＡＣ検出用）を用いて、シングルプレックスＰＣＲによるＭＡＣの検出を行った。なお、プローブａは、５´末端をＦＡＭで蛍光標識したＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブとした。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１５に示す。
【０１７５】
図１５に示すように、プライマーセットａ−１とプローブａの組合せでは、種々のＤＮＡテンプレート濃度において、ＭＡＣを検出することができる。
【０１７６】
［実施例９］プローブ法によるＭ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種の検出（シングルプレックス）
ＤＮＡテンプレートとして、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種由来のゲノムＤＮＡを使用した。
【０１７７】
テンプレートとなるそれぞれのゲノムＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｂ−１及びプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３の合計４種のプライマーセットの全てと、プローブｂ／ｃを同一反応系に加え、シングルプレックスなリアルタイムＰＣＲを行った。
Ｍ．カンサシイのゲノムＤＮＡをテンプレートとしたときの結果を図１６に、Ｍ．カンサシイ亜種のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたときの結果を図１７に示す。
【０１７８】
プローブｂ／ｃは、プライマーセットｂ−１及びプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３による増幅産物を検出するように設計されている。
この設計意図通り、図１６及び図１７からわかるように、Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種のいずれのＤＮＡテンプレートを用いたときでも、増幅がみられた（図１６及び図１７）。
この結果から、Ｍ．カンサシイとＭ．カンサシイ亜種は、プライマーセットｂ−１及びプライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３の全てと、プローブｂ／ｃを含んだ反応系で、プローブ由来の蛍光を測定することによって、まとめて検出することができる。
【０１７９】
［実施例１０］プローブ法による対照・標準用テンプレート及びプライマーセットの検討（シングルプレックス）
好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして用意した。
テンプレートとなる好熱菌ゲノムＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｅ−１−２と、プローブｅを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、プローブｅは、５´末端がＲＯＸ相当の蛍光特性を有する物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。横軸にゲノムＤＮＡの量、縦軸にＣｔ値をプロットしたグラフを図１８に示す。
【０１８０】
図１８に示すように、プライマーセットｅ−１−２とプローブｅにより、高感度で好熱菌ゲノムＤＮＡを検出できる。
この結果より、好熱菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとした、プライマーセットｅ−１−２とプローブｅによる核酸増幅反応は、ポジティブコントロール又は内部標準としての適正を備えていることが示された。
【０１８１】
［実施例１１］プローブ法によるＭＡＣと内部標準の検出（マルチプレックス）
テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．アビウム（検出対象）及び好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のゲノムＤＮＡ（内部標準用）を用意した。
これら２種のテンプレートＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットａ−１（ＭＡＣ検出用）、プライマーｅ−１−２（内部標準用）、プローブａ（ＭＡＣ検出用）及びプローブｅ（内部標準用）を同一反応系に加え、マルチプレックスなリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、プローブａは５´末端がＦＡＭで標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。同じく、プローブｅは５´末端がＲＯＸ相当の蛍光特性を有する物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。
【０１８２】
ＦＡＭの蛍光波長を検出した増幅曲線（ＭＡＣが検出対象）を表すグラフを図１９、ＲＯＸの蛍光波長を検出した増幅曲線（内部標準）を表すグラフを図２０に示す。
【０１８３】
図１９及び２０に示すように、プライマーセットａ−１及びプローブａを使用したＭＡＣの検出系は、好熱菌ゲノムを増幅対象とした内部標準を含む場合であっても良好に動作することがわかった。
【０１８４】
なお、対照試験として、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．アビウム及び好熱菌のゲノムＤＮＡの何れか一方を反応系から除いた比較例も実施した。
その結果、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．アビウム（検出対象）を含まない比較例では、ＦＡＭの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。
逆にテンプレートＤＮＡとして、好熱菌ゲノム（内部標準用）を含まない比較例では、ＲＯＸの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。
【０１８５】
これら比較例の結果は、実施例１１で実証したマルチプレックスＰＣＲの反応系において、２種のプライマーセットのそれぞれが、検出対象ではないＤＮＡに対して交差反応を起こしておらず、検出対象であるゲノムＤＮＡに対して特異的に核酸増幅反応を起こしていることを示している。
【０１８６】
［実施例１２］プローブ法によるＭ．カンサシイと内部標準の検出（マルチプレックス）
テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．カンサシイ及び好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のゲノムＤＮＡ（内部標準用）を用意した。
これら２種のテンプレートＤＮＡの濃度を種々変更し、プライマーセットｂ−１（Ｍ．カンサシイ検出用）、プライマーセットｃ−１−１〜ｃ−１−３（Ｍ．カンサシイ亜種検出用）、プライマーｅ−１−２（内部標準用）、プローブｂ／ｃ（Ｍ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種検出用）及びプローブｅ（内部標準用）を同一反応系に加え、マルチプレックスなリアルタイムＰＣＲを行った。
なお、プローブｂ／ｃは５´末端がＦＡＭで標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。同じく、プローブｅは５´末端がＲＯＸ相当の蛍光特性を有する物質で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとした。
【０１８７】
ＦＡＭの蛍光波長を検出した増幅曲線（Ｍ．カンサシイ、Ｍ．カンサシイ亜種が検出対象）を表すグラフを図２１、ＲＯＸの蛍光波長を検出した増幅曲線（内部標準）を表すグラフを図２２に示す。
【０１８８】
図２１及び２２に示すように、プライマーセットｂ−１、ｃ−１−１〜ｃ−１−３及びプローブｂ／ｃを使用したＭ．カンサシイ及びＭ．カンサシイ亜種の一括検出系は、好熱菌ゲノムを増幅対象とした内部標準を含む場合であっても良好に動作することがわかった。
【０１８９】
なお、対照試験として、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．カンサシイ及び好熱菌のゲノムＤＮＡの何れか一方を反応系から除いた比較例も実施した。
その結果、テンプレートＤＮＡとして、Ｍ．カンサシイ（検出対象）を含まない比較例では、ＦＡＭの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。
逆にテンプレートＤＮＡとして、好熱菌ゲノム（内部標準用）を含まない比較例では、ＲＯＸの蛍光波長を検出しても増幅曲線の立ち上がりは観察されなかった。
【０１９０】
これら比較例の結果は、実施例１２で実証したマルチプレックスＰＣＲの反応系において、複数のプライマーセットのそれぞれが、検出対象ではないＤＮＡに対して交差反応を起こしておらず、検出対象であるゲノムＤＮＡに対して特異的に核酸増幅反応を起こしていることを示している。
【０１９１】
なお、上記実施例１〜１２においては、シングルプレックスＰＣＲについては以下の表８、またマルチプレックスＰＣＲについては表９に示すポリメラーゼを使用した。いずれのポリメラーゼを使用した場合であっても同様の結果が得られた。図１〜２２に示した実験結果を表すグラフ等はその一例である。
【０１９２】
【表８】
2020198792.tif 000009
【０１９３】
【表９】
2020198792.tif 000010
【配列表フリーテキスト】
【０１９４】
配列番号１  マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーエ
配列番号２  マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーエ
配列番号３  マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーエ
配列番号４  ＭＡＣ用フォワードプライマー
配列番号５  ＭＡＣ用リバースプライマー
配列番号６  マイコバクテリウムカンサシイ
配列番号７  マイコバクテリウムカンサシイ
配列番号８  マイコバクテリウムカンサシイ
配列番号９  Ｍ．カンサシイ用フォワードプライマー
配列番号１０  Ｍ．カンサシイ用リバースプライマー
配列番号１１  マイコバクテリウムカンサシイ亜種
配列番号１２  マイコバクテリウムカンサシイ亜種
配列番号１３  マイコバクテリウムカンサシイ亜種
配列番号１４  Ｍ．カンサシイ亜種用フォワードプライマー
配列番号１５  Ｍ．カンサシイ亜種用リバースプライマー
配列番号１６  Ｍ．カンサシイ亜種用フォワードプライマー
配列番号１７  Ｍ．カンサシイ亜種用フォワードプライマー
配列番号１８  Ｍ．マイコバクテリウムツベルクローシス
配列番号１９  Ｍ．マイコバクテリウムツベルクローシス
配列番号２０  Ｍ．マイコバクテリウムツベルクローシス
配列番号２１  Ｍ．ツベルクローシス用フォワードプライマー
配列番号２２  Ｍ．ツベルクローシス用リバースプライマー
配列番号２３  内部標準用フォワードプライマー
配列番号２４  内部標準用リバースプライマー
配列番号２５  内部標準用フォワードプライマー
配列番号２６  内部標準用リバースプライマー
配列番号２７  内部標準用フォワードプライマー
配列番号２８  内部標準用リバースプライマー
配列番号２９  ＭＡＣ用プローブ
配列番号３０  ＭＡＣ用プローブ
配列番号３１  Ｍ．カンサシイ用プローブ
配列番号３２  Ｍ．カンサシイ用プローブ
配列番号３３  Ｍ．ツベルクローシス用プローブ
配列番号３４  Ｍ．ツベルクローシス用プローブ
配列番号３５  内部標準用プローブ
配列番号３６  内部標準用プローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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