(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内シグナリングドメインの活性化を引き起こす細胞外受容体ドメインの提供。【解決手段】受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、該受容体サブユニットが足場ドメインを含み、該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で、その足場ドメインを介して多量体化し、該キメラリガンド受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、該キメラリガンド受容体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、
該受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で、その足場ドメインを介して多量体化し、
該キメラリガンド受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、
該キメラリガンド受容体。
【請求項２】
1つまたは複数の追加受容体サブユニットをさらに含み、
各追加受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
請求項1記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３】
受容体サブユニットがそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する、請求項2記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４】
キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、請求項3記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５】
各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインが同じリガンドに結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項６】
2つ以上の受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、
各受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
該受容体サブユニットがそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、
各足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインが同じリガンドに結合し、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
リガンドの結合が、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する、
該キメラリガンド受容体。
【請求項７】
受容体サブユニットの多量体化がリガンド結合より前に起こる、請求項3〜6のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項８】
多量体化した受容体サブユニットが、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む、請求項3〜7のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項９】
多量体化した受容体サブユニットが二量体を含む、請求項3〜8のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１０】
コンフォメーション再編成が各足場ドメインの自軸周りの回転を含む、請求項4〜9のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１１】
コンフォメーション再編成が各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する、請求項4〜10のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１２】
前記足場ドメインがサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１３】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１４】
前記足場ドメインがそのネイティブリガンドに対して不活性である、請求項1〜13のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１５】
前記足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性である、請求項14記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１６】
前記足場ドメインが、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１７】
前記足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１８】
細胞外ドメインが1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１９】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている、請求項1〜18のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２０】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている、請求項1〜18のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２１】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基がアラニン残基である、請求項19または請求項20記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２２】
膜貫通ドメインが1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基をさらに含む、請求項21記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２３】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている、請求項19〜22のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２４】
前記リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている、請求項1〜23のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２５】
細胞外リンカー領域が1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、該1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニンを含む、請求項24記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２６】
前記リガンド結合ドメインが足場ドメインのネイティブリガンドに結合しない、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２７】
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合しない、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２８】
前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来しない、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２９】
前記リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する、請求項1〜28のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３０】
可溶性リガンドが、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される、請求項29記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３１】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項1〜29のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３２】
前記リガンド結合ドメインが抗原に結合する、請求項1〜29のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３３】
前記リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、請求項32記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３４】
前記リガンド結合ドメインが単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む、請求項33記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３５】
前記リガンド結合ドメインのそれぞれが単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvが抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項2〜33のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３６】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに異なる、請求項2〜35のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３７】
キメラリガンド受容体が2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項36記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３８】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに同じである、請求項2〜35のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３９】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である、請求項33記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４０】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である、請求項1〜39のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４１】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜40のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４２】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜40のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４３】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜40のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４４】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜43のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４５】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される、請求項1〜44のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４６】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４７】
前記細胞内シグナリングドメインがFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４８】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４９】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５０】
前記細胞内シグナリングドメインが、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、該1つまたは複数の改変が1つまたは複数のアミノ酸置換である、請求項1〜49のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５１】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性であり、
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合せず、かつ
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、
請求項1〜50のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５２】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項51記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５３】
前記リガンド結合ドメインが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む、請求項52記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５４】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する、請求項51記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５５】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項54記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５６】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項51〜55のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５７】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項56記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５８】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項51〜57のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５９】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項58記載のキメラリガンド受容体。
【請求項６０】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体のcDNAを含む、請求項60記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６２】
キメラリガンド受容体サブユニットをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドであって、
該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で受容体サブユニットを多量体化させる能力を有する足場ドメインを含み、該受容体サブユニットが、多量体化された場合に、リガンド結合によって誘導されるコンフォメーション再編成を起こす能力を有し、
該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６３】
1つまたは複数の核酸配列をさらに含み、
各追加核酸配列が追加キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、
各追加受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
請求項62記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６４】
受容体サブユニットが、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する、請求項62または請求項63記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６５】
キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、請求項62〜64のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６６】
各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインが同じリガンドに結合する、請求項62〜65のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６７】
2つ以上の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドであって、
各核酸配列が、キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、
各受容体サブユニットが、足場ドメインを含み、
該受容体サブユニットが、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、
各足場ドメインが、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインが、リガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインが同じリガンドに結合し、
該膜貫通ドメインが、細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
リガンドの結合が、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する、
該単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
受容体サブユニットの多量体化がリガンド結合より前に起こる、請求項64〜67のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６９】
多量体化した受容体サブユニットが、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む、請求項64〜68のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
多量体化した受容体サブユニットが二量体を含む、請求項64〜69のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
コンフォメーション再編成が各足場ドメインの自軸周りの回転を含む、請求項65〜70のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
コンフォメーション再編成が各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する、請求項65〜71のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７３】
前記足場ドメインがサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項62〜72のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７４】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項62〜73のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７５】
前記足場ドメインがそのネイティブリガンドに対して不活性である、請求項69〜83のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性である、請求項74記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記足場ドメインが、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項62〜76のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む、請求項62〜77のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７９】
細胞外ドメインが1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含む、請求項62〜78のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８０】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている、請求項62〜79のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８１】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている、請求項62〜79のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８２】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基がアラニン残基である、請求項80または請求項81記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８３】
膜貫通ドメインが1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基をさらに含む、請求項82記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８４】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている、請求項80〜83のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている、請求項62〜84のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８６】
細胞外リンカー領域が1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、該1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニンを含む、請求項85記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記リガンド結合ドメインが足場ドメインのネイティブリガンドに結合しない、請求項62〜86のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合しない、請求項62〜86のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８９】
前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来しない、請求項62〜86のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する、請求項62〜89のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９１】
可溶性リガンドが、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される、請求項90記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項62〜90のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記リガンド結合ドメインが抗原に結合する、請求項62〜90のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、請求項93記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記リガンド結合ドメインが単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む、請求項94記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記リガンド結合ドメインのそれぞれが単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvが抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項63〜94のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９７】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに異なる、請求項63〜96のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９８】
キメラリガンド受容体が2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９９】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに同じである、請求項63〜96のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１００】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である、請求項94記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である、請求項62〜100のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項62〜101のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項62〜101のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項62〜101のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜104のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される、請求項62〜105のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
前記細胞内シグナリングドメインがFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
前記細胞内シグナリングドメインが、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、該1つまたは複数の改変が1つまたは複数のアミノ酸置換である、請求項62〜110のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性であり、
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合せず、かつ
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、
請求項62〜111のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項112記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
前記リガンド結合ドメインが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む、請求項113記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する、請求項112記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項115記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項112〜116のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項117記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項112〜118のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項119記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
請求項60〜120のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは一組のポリヌクレオチドを含むベクターまたは一組のベクター。
【請求項１２２】
請求項60〜120のいずれか一項記載のポリヌクレオチドもしくは一組のポリヌクレオチドまたは請求項121記載のベクターもしくは一組のベクターを含む遺伝子操作された細胞。
【請求項１２３】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞。
【請求項１２４】
標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む操作された導入遺伝子をさらに含む、請求項122または請求項123記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２５】
合成プロモーターが、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、請求項124記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２６】
標的産物が、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より選択される、請求項124または請求項125記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２７】
標的産物がグルカゴン様ペプチド1である、請求項124〜126のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２８】
1つまたは複数の追加キメラリガンド受容体をさらに発現する、請求項122〜127のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２９】
キメラリガンド受容体がそれぞれ互いに異なる、請求項128記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３０】
各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインが異なる可溶性リガンドに結合する、請求項129記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３１】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体を2つ以上発現する、遺伝子操作された細胞。
【請求項１３２】
キメラリガンド受容体がそれぞれ互いに異なる、請求項131記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３３】
各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインが異なる可溶性リガンドに結合する、請求項132記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３４】
2つ以上の操作された導入遺伝子をさらに含み、各導入遺伝子が、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む、請求項128〜133のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３５】
各合成プロモーターが、細胞上に発現された2つ以上のキメラリガンド受容体のうちの異なるキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、請求項134記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３６】
各標的産物が、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より独立して選択される、請求項134または請求項135記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３７】
哺乳動物細胞である、請求項122〜136のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３８】
前記哺乳動物細胞が幹細胞または神経細胞である、請求項137記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３９】
前記幹細胞が、成体幹細胞、iPS細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞および間葉系幹細胞（MSC）からなる群より選択される、請求項138記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４０】
前記哺乳動物細胞が免疫細胞である、請求項137記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４１】
前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞および樹状細胞からなる群より選択される、請求項140記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４２】
前記免疫細胞がT細胞である、請求項140記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４３】
前記T細胞が、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞およびガンマ・デルタT細胞からなる群より選択される、請求項142記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４４】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体または請求項122〜143のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞を生体組織または生体液と接触させる工程を含む方法。
【請求項１４５】
生体組織または生体液が、対象中にあるか、または対象から得られる、請求項144記載の方法。
【請求項１４６】
対象が、ある医学的状態と診断されたか、ある医学的状態を発症するリスクがあるか、またはある医学的状態を有すると疑われる対象であり、任意で、該医学的状態が、がんまたは炎症状態である、請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体または請求項122〜143のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞を、キメラリガンド受容体がコグネイトリガンドに結合するのに適した条件下で、コグネイトリガンドと接触させる工程
を含み、
該キメラリガンド受容体とのコグネイトリガンドの結合が、多量体化した足場ドメインのコンフォメーション再編成を誘導して、それが細胞内シグナリングドメインを活性化する、
シグナリング経路を活性化する方法。
【請求項１４８】
細胞の表面にコグネイトリガンドを投与する工程をさらに含む、請求項147記載の方法。
【請求項１４９】
・前記リガンド結合ドメインをコードする第1核酸を足場ドメインをコードする第2核酸に融合し、かつ第2核酸を細胞内シグナリングドメインをコードする第3核酸と融合することによって、多量体化能を有しかつ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む足場ドメインと、足場ドメインの細胞外結合ドメインに機能的に連結されたリガンド結合ドメインと、足場ドメインの膜貫通ドメインに機能的に連結された細胞内シグナリングドメインとを含むキメラリガンド受容体をコードするキメラリガンド受容体発現ベクターを合成する工程、
・キメラリガンド受容体発現ベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および
・細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程
を含む、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法。
【請求項１５０】
請求項60〜120のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドもしくは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項121記載のベクターもしくは一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および
該細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程
を含む、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法。
【請求項１５１】
標的産物をコードする核酸配列に機能的に連結された合成プロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを、前記細胞にトランスフェクトする工程
をさらに含む、請求項150記載の方法。
【請求項１５２】
前記合成プロモーターがキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、請求項151記載の方法。
【請求項１５３】
キメラリガンド受容体の発現を誘導する工程が、細胞がキメラリガンド受容体を細胞の細胞膜上に発現するのに適した条件下で細胞を培養することを含む、請求項149〜152のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５４】
請求項60〜120のいずれか一項記載のポリヌクレオチドもしくは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項121記載のベクターもしくは一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程を含む方法であって、任意で該細胞が哺乳動物細胞であり、任意で該哺乳動物細胞が免疫細胞である、方法。
【請求項１５５】
請求項1〜59のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラリガンド受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１５６】
標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む少なくとも1つの操作された導入遺伝子をさらに含む、請求項155記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
細胞外インプットに予測可能な形で応答するようにプログラムされた哺乳動物細胞は、がん免疫治療、組織パターン形成およびスマート細胞移植などといった広範囲にわたる応用にとって、ますます重要になってきている。プログラマブル受容体工学（programmable receptor engineering）の分野は急速に発展しつつあるが（非特許文献1、非特許文献2参照）、可溶性分子のロバストなセンシングは、依然としてその大部分が、所望の生物学的機能を有する導入遺伝子の発現を駆動するように再配線（rewire）することができる天然受容体に頼っている。例えば天然リガンド-受容体相互作用は、さまざまなバイオマーカーを検知し、それに呼応して治療ペプチドを分泌するデザイナー細胞を遺伝子工学により作製ために使用されてきた。このアプローチは、乾癬、グレーブス病およびメタボリック症候群を検出し処置するためのカプセル化されたデザイナー細胞からなる治療用細胞インプラントを開発するために使用されている（非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5参照）。それでもなお、哺乳動物細胞においてロバストなインプット-アウトプット関係を操作することは、多大な労力を要する反復プロセスであり、診断用または治療用の貴重な標的になるであろう多くの分子は、どの公知天然受容体にも結合しないことが多い。したがって、多くの潜在的分子インプットは、容易には、このアプローチの標的になりえない。注目すべきことに、これには、シグナリング機能が公知でない多くの合成小分子化合物、細胞内タンパク質および細胞外タンパク質が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Lim WA & June CH, Cell, 2017, 168:724-740
【非特許文献２】Brenner M et al., Nat. Chem. Biol., 2017, 13:131-132
【非特許文献３】Schukur L et al., Sci. Transl. Med., 2015, 7:318ra201
【非特許文献４】Saxena P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2016, 113:1244-1249
【非特許文献５】Ye H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013 110:141-146
【発明の概要】
【０００３】
概要
キメラリガンド受容体および関連する方法が、本明細書に提供される。
【０００４】
一局面では、受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体が本明細書に提供され、該受容体サブユニットは足場ドメインを含み、該足場ドメインは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、該膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、該受容体サブユニットは、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で、その足場ドメインを介して多量体化し、キメラリガンド受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットは、コンフォメーション再編成を起こす。
【０００５】
いくつかの態様において、キメラリガンド受容体は、1つまたは複数の追加受容体サブユニットをさらに含み、各追加受容体サブユニットは足場ドメインを含み、各追加受容体サブユニットの足場ドメインは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている。いくつかの態様において、受容体サブユニットはそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する。いくつかの態様において、キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットは、コンフォメーション再編成を起こす。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインは同じリガンドに結合する。
【０００６】
別の一局面では、2つ以上の受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体が本明細書に提供され、各受容体サブユニットは足場ドメインを含み、該受容体サブユニットは、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、各足場ドメインは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインは同じリガンドに結合し、該膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、リガンドの結合は多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する。
【０００７】
いくつかの態様において、受容体サブユニットの多量体化はリガンド結合より前に起こる。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは二量体を含む。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は、各足場ドメインの自軸周りの回転を含む。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する。
【０００８】
いくつかの態様において、足場ドメインはサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインはそのネイティブリガンドに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインはエリスロポエチンに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
【０００９】
いくつかの態様では、足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインはF93Aアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加アミノ酸残基はアラニン残基である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基を、さらに含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている。
【００１０】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている。いくつかの態様において、細胞外リンカー領域は1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、それら1つまたは複数のアミノ酸残基は、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニンを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、足場ドメインのネイティブリガンドには結合しない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはエリスロポエチンには結合しない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体には由来しない。
【００１２】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、可溶性リガンドは、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはカフェインに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは抗原に結合する。
【００１３】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインのそれぞれは単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvは抗原の異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインは互いに異なる。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体は2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインは免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインは免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインは互いに同じである。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である。
【００１４】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない。
【００１５】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。
【００１６】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、それら1つまたは複数の改変は1つまたは複数のアミノ酸置換である。
【００１７】
いくつかの態様において、足場ドメインは、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインはF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインはエリスロポエチンに対して不活性であり、リガンド結合ドメインはエリスロポエチンに結合せず、かつ細胞内シグナリングドメインは、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはカフェインに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。
【００１８】
別の一局面では、キメラリガンド受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドが、本明細書に提供される。いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドは、キメラリガンド受容体のcDNAを含む。
【００１９】
別の一局面では、キメラリガンド受容体サブユニットをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドが本明細書において提供され、該受容体サブユニットは、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で受容体サブユニットを多量体化させる能力を有する足場ドメインを含み、該受容体サブユニットは、多量体化された場合に、リガンド結合によって誘導されるコンフォメーション再編成を起こす能力を有し、該足場ドメインは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、該膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている。
【００２０】
いくつかの態様において、単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドは、1つまたは複数の核酸配列をさらに含み、各追加核酸配列は追加キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、各追加受容体サブユニットは足場ドメインを含み、各追加受容体サブユニットの足場ドメインは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている。いくつかの態様において、受容体サブユニットはそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する。いくつかの態様において、キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットは、コンフォメーション再編成を起こす。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインは同じリガンドに結合する。
【００２１】
別の一局面では、2つ以上の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドが本明細書に提供され、各核酸配列はキメラリガンド受容体サブユニットをコードし、各受容体サブユニットは足場ドメインを含み、受容体サブユニットはそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、各足場ドメインは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインは同じリガンドに結合し、該膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、該リガンドの結合は、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する。
【００２２】
いくつかの態様において、受容体サブユニットの多量体化はリガンド結合より前に起こる。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは二量体を含む。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は、各足場ドメインの自軸周りの回転を含む。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する。
【００２３】
いくつかの態様において、足場ドメインはサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインはそのネイティブリガンドに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインはエリスロポエチンに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
【００２４】
いくつかの態様では、足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインはF93Aアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加アミノ酸残基はアラニン残基である。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基を、さらに含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている。
【００２５】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている。いくつかの態様において、細胞外リンカー領域は1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、それら1つまたは複数のアミノ酸残基は、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニンを含む。
【００２６】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、足場ドメインのネイティブリガンドには結合しない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはエリスロポエチンには結合しない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体には由来しない。
【００２７】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、可溶性リガンドは、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはカフェインに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは抗原に結合する。
【００２８】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインのそれぞれは単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvは抗原の異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインは互いに異なる。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体は2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインは免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインは免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインは互いに同じである。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である。
【００２９】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない。
【００３０】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。
【００３１】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、それら1つまたは複数の改変は1つまたは複数のアミノ酸置換である。
【００３２】
いくつかの態様において、足場ドメインは、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインはF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインはエリスロポエチンに対して不活性であり、リガンド結合ドメインはエリスロポエチンに結合せず、かつ細胞内シグナリングドメインは、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはカフェインに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。
【００３３】
別の一局面では、前記ポリヌクレオチドまたは前記一組のポリヌクレオチドを含むベクターまたは一組のベクターが、本明細書に提供される。
【００３４】
別の一局面では、前記ポリヌクレオチドもしくは前記一組のポリヌクレオチドまたは前記ベクターもしくは前記一組のベクターを含む遺伝子操作された細胞が、本明細書に提供される。
【００３５】
別の一局面では、前記キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞が、本明細書に提供される。
【００３６】
いくつかの態様において、細胞は、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む操作された導入遺伝子を、さらに含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である。いくつかの態様において、標的産物は、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より選択される。いくつかの態様において、標的産物はグルカゴン様ペプチド1である。
【００３７】
いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加キメラリガンド受容体をさらに発現する。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体はそれぞれ互いに異なる。いくつかの態様において、各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインは異なる可溶性リガンドに結合する。
【００３８】
別の一局面では、2つ以上のキメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体はそれぞれ互いに異なる。いくつかの態様において、各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインは異なる可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、細胞は2つ以上の操作された導入遺伝子をさらに含み、各導入遺伝子は、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む。いくつかの態様において、各合成プロモーターは、前記細胞上に発現された2つ以上のキメラリガンド受容体のうちの異なるキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である。いくつかの態様において、各標的産物は、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より独立して選択される。
【００３９】
いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は幹細胞または神経細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は、成体幹細胞、iPS細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞および間葉系幹細胞（MSC）からなる群より選択される。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞および樹状細胞からなる群より選択される。いくつかの態様において、免疫細胞はT細胞である。いくつかの態様において、T細胞は、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞およびガンマ・デルタT細胞からなる群より選択される。
【００４０】
別の一局面では、前記キメラリガンド受容体または前記遺伝子操作された細胞を生体組織または生体液と接触させる工程を含む方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、生体組織または生体液は、対象中にあるか、または対象から得られる。いくつかの態様において、対象は、ある医学的状態と診断されたか、ある医学的状態を発症するリスクがあるか、またはある医学的状態を有すると疑われる対象であり、任意で、その医学的状態はがんまたは炎症状態である。
【００４１】
別の一局面では、シグナリング経路を活性化する方法が、本明細書に提供される。本方法は、前記キメラリガンド受容体または前記遺伝子操作された細胞を、キメラリガンド受容体がコグネイトリガンドに結合するのに適した条件下で、コグネイトリガンドと接触させる工程を含み、キメラリガンド受容体とのコグネイトリガンドの結合は、多量体化した足場ドメインのコンフォメーション再編成を誘導して、それが細胞内シグナリングドメインを活性化する。いくつかの態様において、本方法は、細胞の表面にコグネイトリガンドを投与する工程をさらに含む。
【００４２】
別の一局面では、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法が、本明細書に提供される。本方法は、リガンド結合ドメインをコードする第1核酸を、足場ドメインをコードする第2核酸に融合し、かつ第2核酸を、細胞内シグナリングドメインをコードする第3核酸と融合することによって、多量体化能を有しかつ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む足場ドメインと、足場ドメインの細胞外結合ドメインに機能的に連結されたリガンド結合ドメインと、足場ドメインの膜貫通ドメインに機能的に連結された細胞内シグナリングドメインとを含むキメラリガンド受容体をコードするキメラリガンド受容体発現ベクターを合成する工程;キメラリガンド受容体発現ベクターを細胞にトランスフェクトする工程;および細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程を含む。
【００４３】
別の一局面では、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法が、本明細書に提供される。本方法は、前記単離されたポリヌクレオチドもしくは前記一組の単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターもしくは前記一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程を含む。いくつかの態様において、本方法は、標的産物をコードする核酸配列に機能的に連結された合成プロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトする工程を、さらに含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体の発現を誘導する工程は、細胞がキメラリガンド受容体を細胞の細胞膜上に発現するのに適した条件下で細胞を培養することを含む。
【００４４】
別の一局面では、細胞に前記ポリヌクレオチドもしくは前記一組の単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターもしくは前記一組のベクターをトランスフェクトする工程を含む方法が、本明細書に提供され、任意で、細胞は哺乳動物細胞であり、任意で、哺乳動物細胞は免疫細胞である。
【００４５】
別の一局面では、少なくとも1つのキメラリガンド受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むキットが、本明細書に提供される。いくつかの態様において、本キットは、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む少なくとも1つの操作された導入遺伝子を、さらに含む。
【００４６】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［１］受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、
該受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で、その足場ドメインを介して多量体化し、
該キメラリガンド受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、
該キメラリガンド受容体；
［２］1つまたは複数の追加受容体サブユニットをさらに含み、
各追加受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
[1]のキメラリガンド受容体；
［３］受容体サブユニットがそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する、[2]のキメラリガンド受容体；
［４］キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、[3]のキメラリガンド受容体；
［５］各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインが同じリガンドに結合する、[1]〜[4]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［６］2つ以上の受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、
各受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
該受容体サブユニットがそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、
各足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインが同じリガンドに結合し、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
リガンドの結合が、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する、
該キメラリガンド受容体；
［７］受容体サブユニットの多量体化がリガンド結合より前に起こる、[3]〜[6]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［８］多量体化した受容体サブユニットが、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む、[3]〜[7]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［９］多量体化した受容体サブユニットが二量体を含む、[3]〜[8]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１０］コンフォメーション再編成が各足場ドメインの自軸周りの回転を含む、[4]〜[9]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１１］コンフォメーション再編成が各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する、[4]〜[10]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１２］前記足場ドメインがサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、[1]〜[11]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１３］前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、[1]〜[12]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１４］前記足場ドメインがそのネイティブリガンドに対して不活性である、[1]〜[13]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１５］前記足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性である、[14]のキメラリガンド受容体；
［１６］前記足場ドメインが、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、[1]〜[15]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１７］前記足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む、[1]〜[16]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１８］細胞外ドメインが1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含む、[1]〜[17]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［１９］1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている、[1]〜[18]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２０］1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている、[1]〜[18]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２１］1つまたは複数の追加アミノ酸残基がアラニン残基である、[19]または[20]のキメラリガンド受容体；
［２２］膜貫通ドメインが1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基をさらに含む、[21]のキメラリガンド受容体；
［２３］1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている、[19]〜[22]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２４］前記リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている、[1]〜[23]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２５］細胞外リンカー領域が1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、該1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニンを含む、[24]のキメラリガンド受容体；
［２６］前記リガンド結合ドメインが足場ドメインのネイティブリガンドに結合しない、[1]〜[25]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２７］前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合しない、[1]〜[25]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２８］前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来しない、[1]〜[25]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［２９］前記リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する、[1]〜[28]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［３０］可溶性リガンドが、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される、[29]のキメラリガンド受容体；
［３１］前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、[1]〜[29]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［３２］前記リガンド結合ドメインが抗原に結合する、[1]〜[29]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［３３］前記リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、[32]のキメラリガンド受容体；
［３４］前記リガンド結合ドメインが単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む、[33]のキメラリガンド受容体；
［３５］前記リガンド結合ドメインのそれぞれが単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvが抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、[2]〜[33]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［３６］各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに異なる、[2]〜[35]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［３７］キメラリガンド受容体が2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、[36]のキメラリガンド受容体；
［３８］各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに同じである、[2]〜[35]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［３９］抗体またはその抗原結合性フラグメントが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である、[33]のキメラリガンド受容体；
［４０］前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である、[1]〜[39]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４１］前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない、[1]〜[40]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４２］前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、[1]〜[40]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４３］前記細胞内シグナリングドメインが、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない、[1]〜[40]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４４］前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[1]〜[43]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４５］前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される、[1]〜[44]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４６］前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[1]〜[45]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４７］前記細胞内シグナリングドメインがFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[1]〜[45]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４８］前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[1]〜[45]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［４９］前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[1]〜[45]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［５０］前記細胞内シグナリングドメインが、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、該1つまたは複数の改変が1つまたは複数のアミノ酸置換である、[1]〜[49]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［５１］
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性であり、
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合せず、かつ
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、
[1]〜[50]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［５２］前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、[51]のキメラリガンド受容体；
［５３］前記リガンド結合ドメインが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む、[52]のキメラリガンド受容体；
［５４］前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する、[51]のキメラリガンド受容体；
［５５］前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む、[54]のキメラリガンド受容体；
［５６］前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、[51]〜[55]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［５７］前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[56]のキメラリガンド受容体；
［５８］前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、[51]〜[57]のいずれかのキメラリガンド受容体；
［５９］前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[58]のキメラリガンド受容体；
［６０］[1]〜[59]のいずれかのキメラリガンド受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６１］[1]〜[59]のいずれかのキメラリガンド受容体のcDNAを含む、[60]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６２］キメラリガンド受容体サブユニットをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドであって、
該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で受容体サブユニットを多量体化させる能力を有する足場ドメインを含み、該受容体サブユニットが、多量体化された場合に、リガンド結合によって誘導されるコンフォメーション再編成を起こす能力を有し、
該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６３］1つまたは複数の核酸配列をさらに含み、
各追加核酸配列が追加キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、
各追加受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
[62]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６４］受容体サブユニットが、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する、[62]または[63]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６５］キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、[62]〜[64]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６６］各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインが同じリガンドに結合する、[62]〜[65]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６７］2つ以上の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドであって、
各核酸配列が、キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、
各受容体サブユニットが、足場ドメインを含み、
該受容体サブユニットが、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、
各足場ドメインが、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインが、リガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインが同じリガンドに結合し、
該膜貫通ドメインが、細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
リガンドの結合が、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する、
該単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６８］受容体サブユニットの多量体化がリガンド結合より前に起こる、[64]〜[67]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［６９］多量体化した受容体サブユニットが、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む、[64]〜[68]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７０］多量体化した受容体サブユニットが二量体を含む、[64]〜[69]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７１］コンフォメーション再編成が各足場ドメインの自軸周りの回転を含む、[65]〜[70]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７２］コンフォメーション再編成が各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する、[65]〜[71]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７３］前記足場ドメインがサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、[62]〜[72]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７４］前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、[62]〜[73]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７５］前記足場ドメインがそのネイティブリガンドに対して不活性である、[69]〜[83]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７６］前記足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性である、[74]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７７］前記足場ドメインが、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、[62]〜[76]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７８］前記足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む、[62]〜[77]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［７９］細胞外ドメインが1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含む、[62]〜[78]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８０］1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている、[62]〜[79]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８１］1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている、[62]〜[79]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８２］1つまたは複数の追加アミノ酸残基がアラニン残基である、[80]または[81]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８３］膜貫通ドメインが1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基をさらに含む、[82]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８４］1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている、[80]〜[83]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８５］前記リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている、[62]〜[84]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８６］細胞外リンカー領域が1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、該1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニンを含む、[85]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８７］前記リガンド結合ドメインが足場ドメインのネイティブリガンドに結合しない、[62]〜[86]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８８］前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合しない、[62]〜[86]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［８９］前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来しない、[62]〜[86]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９０］前記リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する、[62]〜[89]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９１］可溶性リガンドが、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される、[90]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９２］前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、[62]〜[90]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９３］前記リガンド結合ドメインが抗原に結合する、[62]〜[90]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９４］前記リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、[93]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９５］前記リガンド結合ドメインが単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む、[94]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９６］前記リガンド結合ドメインのそれぞれが単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvが抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、[63]〜[94]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９７］各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに異なる、[63]〜[96]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９８］キメラリガンド受容体が2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、[97]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［９９］各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに同じである、[63]〜[96]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１００］抗体またはその抗原結合性フラグメントが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である、[94]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０１］前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である、[62]〜[100]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０２］前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない、[62]〜[101]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０３］前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、[62]〜[101]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０４］前記細胞内シグナリングドメインが、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない、[62]〜[101]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０５］前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[62]〜[104]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０６］前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される、[62]〜[105]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０７］前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[62]〜[106]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０８］前記細胞内シグナリングドメインがFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[62]〜[106]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１０９］前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[62]〜[106]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１０］前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[62]〜[106]のいずれの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１１］前記細胞内シグナリングドメインが、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、該1つまたは複数の改変が1つまたは複数のアミノ酸置換である、[62]〜[110]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１２］
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性であり、
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合せず、かつ
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、
[62]〜[111]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１３］前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、[112]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１４］前記リガンド結合ドメインが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む、[113]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１５］前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する、[112]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１６］前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む、[115]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１７］前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、[112]〜[116]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１８］前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[117]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１１９］前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、[112]〜[118]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１２０］前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、[119]の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド；
［１２１］[60]〜[120]のいずれかのポリヌクレオチドまたは一組のポリヌクレオチドを含むベクターまたは一組のベクター；
［１２２］[60]〜[120]のいずれかのポリヌクレオチドもしくは一組のポリヌクレオチドまたは[121]のベクターもしくは一組のベクターを含む遺伝子操作された細胞；
［１２３］[1]〜[59]のいずれかのキメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞；
［１２４］標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む操作された導入遺伝子をさらに含む、[122]または[123]の遺伝子操作された細胞；
［１２５］合成プロモーターが、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、[124]の遺伝子操作された細胞；
［１２６］標的産物が、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より選択される、[124]または[125]の遺伝子操作された細胞；
［１２７］標的産物がグルカゴン様ペプチド1である、[124]〜[126]のいずれかの遺伝子操作された細胞；
［１２８］1つまたは複数の追加キメラリガンド受容体をさらに発現する、[122]〜[127]のいずれかの遺伝子操作された細胞；
［１２９］キメラリガンド受容体がそれぞれ互いに異なる、[128]の遺伝子操作された細胞；
［１３０］各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインが異なる可溶性リガンドに結合する、[129]の遺伝子操作された細胞；
［１３１］[1]〜[59]のいずれかのキメラリガンド受容体を2つ以上発現する、遺伝子操作された細胞；
［１３２］キメラリガンド受容体がそれぞれ互いに異なる、[131]の遺伝子操作された細胞；
［１３３］各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインが異なる可溶性リガンドに結合する、[132]の遺伝子操作された細胞；
［１３４］2つ以上の操作された導入遺伝子をさらに含み、各導入遺伝子が、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む、[128]〜[133]のいずれかの遺伝子操作された細胞；
［１３５］各合成プロモーターが、細胞上に発現された2つ以上のキメラリガンド受容体のうちの異なるキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、[134]の遺伝子操作された細胞；
［１３６］各標的産物が、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より独立して選択される、[134]または[135]の遺伝子操作された細胞；
［１３７］哺乳動物細胞である、[122]〜[136]のいずれかの遺伝子操作された細胞；
［１３８］前記哺乳動物細胞が幹細胞または神経細胞である、[137]の遺伝子操作された細胞；
［１３９］前記幹細胞が、成体幹細胞、iPS細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞および間葉系幹細胞（MSC）からなる群より選択される、[138]の遺伝子操作された細胞；
［１４０］前記哺乳動物細胞が免疫細胞である、[137]の遺伝子操作された細胞；
［１４１］前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞および樹状細胞からなる群より選択される、[140]の遺伝子操作された細胞；
［１４２］前記免疫細胞がT細胞である、[140]の遺伝子操作された細胞；
［１４３］前記T細胞が、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞およびガンマ・デルタT細胞からなる群より選択される、[142]の遺伝子操作された細胞；
［１４４］[1]〜[59]のいずれかのキメラリガンド受容体または[122]〜[143]のいずれかの遺伝子操作された細胞を生体組織または生体液と接触させる工程を含む方法；
［１４５］生体組織または生体液が、対象中にあるか、または対象から得られる、[144]の方法；
［１４６］対象が、ある医学的状態と診断されたか、ある医学的状態を発症するリスクがあるか、またはある医学的状態を有すると疑われる対象であり、任意で、該医学的状態が、がんまたは炎症状態である、[145]の方法；
［１４７］
[1]〜[59]のいずれかのキメラリガンド受容体または[122]〜[143]のいずれかの遺伝子操作された細胞を、キメラリガンド受容体がコグネイトリガンドに結合するのに適した条件下で、コグネイトリガンドと接触させる工程
を含み、
該キメラリガンド受容体とのコグネイトリガンドの結合が、多量体化した足場ドメインのコンフォメーション再編成を誘導して、それが細胞内シグナリングドメインを活性化する、
シグナリング経路を活性化する方法；
［１４８］細胞の表面にコグネイトリガンドを投与する工程をさらに含む、[147]の方法；
［１４９］
・前記リガンド結合ドメインをコードする第1核酸を足場ドメインをコードする第2核酸に融合し、かつ第2核酸を細胞内シグナリングドメインをコードする第3核酸と融合することによって、多量体化能を有しかつ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む足場ドメインと、足場ドメインの細胞外結合ドメインに機能的に連結されたリガンド結合ドメインと、足場ドメインの膜貫通ドメインに機能的に連結された細胞内シグナリングドメインとを含むキメラリガンド受容体をコードするキメラリガンド受容体発現ベクターを合成する工程、
・キメラリガンド受容体発現ベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および
・細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程
を含む、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法；
［１５０］
[60]〜[120]のいずれかの単離されたポリヌクレオチドもしくは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは[121]のベクターもしくは一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および
該細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程
を含む、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法；
［１５１］標的産物をコードする核酸配列に機能的に連結された合成プロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを、前記細胞にトランスフェクトする工程
をさらに含む、[150]の方法；
［１５２］前記合成プロモーターがキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、[151]の方法；
［１５３］キメラリガンド受容体の発現を誘導する工程が、細胞がキメラリガンド受容体を細胞の細胞膜上に発現するのに適した条件下で細胞を培養することを含む、[149]〜[152]のいずれかの方法；
［１５４］[60]〜[120]のいずれかのポリヌクレオチドもしくは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは[121]のベクターもしくは一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程を含む方法であって、任意で該細胞が哺乳動物細胞であり、任意で該哺乳動物細胞が免疫細胞である、方法；
［１５５］[1]〜[59]のいずれかの少なくとも1つのキメラリガンド受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むキット；ならびに
［１５６］標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む少なくとも1つの操作された導入遺伝子をさらに含む、[155]のキット。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
本開示のこれらの、そして他の、特徴、局面および利点は、以下の説明および添付の図面に関して、理解が深まることになるだろう。
【００４８】
【図１】図1は、受容体活性化機序の概略図である。インプットがない場合、EpoRは不活性コンフォメーションに固定される。リガンドの結合は、下流シグナリングのための細胞内ドメインの相互作用を容易にする。
【図２】図2は、汎用細胞外分子センサー（GEMS）プラットフォームの概略図である。インプット分子ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagおよびPSAは広範囲にわたる分子量をカバーしており、GEMSプラットフォームの普遍性を立証するためのインプットとして選ばれた。アフィニティードメインは異なる機序で二量体化して受容体を活性化する。  本システムの最初の特徴づけにはラパマイシン誘導性FRB/FKBPヘテロ二量体化を使用した。ラクダ科重鎖抗体VHHA52はRR120の存在下でホモ二量体を形成する。重鎖および軽鎖相互作用のニコチン誘導性安定化に基づくヘテロ二量体型受容体のために、ニコチン抗体Nic12の可変鎖を受容体フレームワークに別々に融合した。抗GCN4 scFvは、ホモ二量体型受容体のために、SunTagのエピトープに結合することができる。2つの異なるscFvは、ヘテロ二量体型受容体のために、PSAの異なるエピトープに結合する。EpoRの細胞外ドメインと膜貫通ドメインは、リガンドの非存在下では下流シグナリングを阻害するが細胞外ドメイの二量体化によって活性化することができる予め形成された二量体として、クラスター化する。細胞内シグナル伝達ドメインの配向のリガンド誘導性変化を使って、4つの異なる二量体化依存性シグナリング経路を活性化した。黒い矢印は、表示したGEMSデバイスの主要シグナリング経路を表す。破線の矢印は、考えうる追加シグナリング経路の活性化を例示している。すべての経路は、導入遺伝子発現のために再配線されている。JAK/STAT、PI3K/AktまたはPLCGシグナリングの読出しのために、それぞれSTAT3、NF-κBまたはNFAT応答性最小プロモーターを使用する。MAPKシグナリングカスケードの最後に、ERKは、レポータープラスミドからの転写を活性化するTetR-Elk1融合タンパク質をリン酸化する。他のタンパク質の発現のためにレポータータンパク質SEAPを取り替えることは、疾患マーカーに応答して起こる治療用ペプチドの発現などのさまざまな応用において使用することができるであろう。
【図３】図3Aは、膜貫通ドメインのC末端にアラニン残基を導入するとαヘリックスが伸びて、約100°の回転をもたらすことを表す。受容体は、アラニン残基の数に依存して、「オフ（off）」状態でもなお、JAK相互作用を許しうる。3つのアラニン残基を持つ変異体は、JAK相互作用が弱い「オフ」コンフォメーションとJAK相互作用が強い「オン（on）」コンフォメーションを想定して描かれており、一方、アラニン残基を持たない変異体は、「オフ」状態でのJAK相互作用につながる。図3Bは、EpoR膜貫通ドメインとIL-6RB細胞内ドメインとの間に付加されたアラニン残基の数を示すために0〜4と表示した異なる受容体足場による遺伝子発現を、ラパマイシンが誘導したことを表す。3つのアラニン残基を持つ変異体は、レポーター遺伝子発現については比較的低い絶対値を示すが、信号雑音比は最も高い。グラフは、n＝3の生物学的に独立した試料の平均およびデータポイントを示し、3回の独立した実験を代表している。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図４】図4AはRR120の分子構造を表す。VHHA52はこの対称分子の半分に結合し、それが2つの抗体の二量体化につながる。図4Bは、PhCMV駆動受容体発現のためのプラスミド（pLeo615）の量を減少させると、RR120誘導性SEAP発現が増加することを表す。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図５】図5AはIL6RBにおける突然変異の効果を表す。細胞内ドメインに突然変異Y759Aを導入すると（pLeo618）、SEAP発現の絶対値だけでなく、信号雑音比も増加する。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。図5BはEpoRにおける突然変異の効果を表す。GEMSRR120（pLeo619）は、RR120では誘導されるが、エリスロポエチンでは誘導されない。エリスロポエチンがRR120誘導性シグナリングを妨害することもない。F93A改変を持たない受容体（pLeo618）は、エリスロポエチンに強く応答する。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。図5Cは、GEMSRR120が非最適化構築物より高い総SEAP発現を与え、信号雑音比が40超まで改良されることを表す。IL-6RBの細胞内ドメインをFGFR1の細胞内ドメインに交換すると（pLeo628）、信号雑音比は減少するが、受容体感度は高くなる。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図６】図6Aは、EpoR膜貫通ドメインとFGFR1細胞内ドメインとの間にアラニン残基を付加しても（pLeo628、pLeo642、pLeo643、pLeo644、pLeo645）、信号雑音比に対する効果がわずかでしかないことを表す。さらなる実験にはアラニン残基を持たない変異体を選んだ。図6Bは、PIP-Elk1（pAT13）およびPIPレポーター（pMF199）が、TetR-Elk1融合物（MKp37）およびTetRレポーター（pMF111）と比較して、提示する絶対発現レベルは低いものの、ダイナミックレンジは同等であることを表しており、これにより、この機構のモジュール性が確認される。  グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図７】図7Aは、HEK-293細胞において、MAPKがbFGFによって誘導されうることを表す。FGFR1（pLoe698）の過剰発現はレポーター遺伝子発現を増加させる。図7Bは、STAT3がIL-6によって誘導されうることを表す。IL-6RA（pLeo696）および/またはIL6-RB（pLeo697）の過剰発現は、レポーター遺伝子発現を増加させる。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図８】図8は、VEGFR-GEMSRR120が複数の経路を介してシグナルして、NFAT、MAPKおよびNF-κBシグナリングに特異的なレポーターを活性化することを表す。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図９】図9は、GEMSニコチン（pLeo626/pLeo627、pLeo667/pLeo668）が、喫煙後に典型的に到達するニコチン濃度で誘導可能であることを表す。1本の紙巻きタバコで100nMの血中ニコチン濃度が生じると考えられる。このポイントにおいて、SEAP発現に関する変化倍率は、JAK/STAT-GEMSニコチンでは1.6、MAPK-GEMSニコチンでは2.5である。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図１０】図10Aは、SunTag付きmCherry（SunTagged mCherry）を生産する細菌の粗溶解物が、GEMSSunTag（pLeo620、pLeo669）を備えたHEK細胞におけるSEAP発現を誘導することを表す。誘導のために加えられたSunTag含有細菌溶解物の体積は、培養培地体積の百分率として示されている。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。図10Bは、SunTag-mCherryを含有する細菌粗溶解物がGEMSSunTagを誘導するが、GEMSRR120を誘導することはないことを表す。RR120はGEMSRR120を誘導するが、GEMSSunTagを誘導することはない。これらの対照は、レポーター誘導が、設計された誘導物質受容体ペアに特異的であることを立証している。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図１１】図11Aは、JAK/STAT-GEMSPSA（pLeo622/pLeo623）が、診断上重要な1ng/mlのPSA濃度と20ng/mlのPSA濃度との相違を、高い有意性で区別できることを表す。図11Bは、MAPK-GEMSPSA（pLeo670/pLeo671）が、0.1ng/mLのPSA濃度と4ng/mLのPSA濃度とを区別できることを表す。図11Cは、MAPK-GEMSPSAを使った患者血清中のPSAレベルのプロファイリングを表す。MAPK-GEMSPSA細胞を、前立腺がん患者（患者1〜3）からの10％血清またはPSA陰性対照血清（前立腺全摘出術を受けた患者からのもの）と共に培養した。PSA陰性対照血清を含有する培養培地には、0〜10ng/mLの最終濃度に達するように、異なる量のPSAを加え、0ng/mLを陰性対照とした。培養培地に血清を1:10希釈したので、加えたPSA濃度1ng/mLは、患者血清中の10ng/mL PSAに対応する。培養上清からSEAP発現をプロファイリングした。ELISAベースの定量により、患者試料中のPSAレベル（患者1:1ng/mL、患者2:5ng/mL;患者3:20ng/mL）の、GEMSアウトプット性能との相関関係が確認された。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下での平均レポーター濃度を、誘導物質非存在下での平均レポーター濃度で割るか、または指定された低誘導物質濃度についてのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図１２】図12はGEMSPSAの用量応答曲線である。MAPK-GEMSPSAは、前立腺全摘出術後の生化学的再発を検出するのに診断上意味を持つ濃度範囲でシグナルし、一方、JAK/STAT-GEMSPSAは、スクリーニングにとって重大な意味を持つ1〜20ng/mLのPSA濃度範囲で、ほぼ直線的な用量応答を呈する。2nm/mL未満のPSA濃度は生理学的であるとみなされる。2〜4ng/mLの濃度は経過観察の必要性を示す。4〜10ng/mLの濃度は診断上のグレーゾーンとみなされ、追加因子によっては、前立腺生検が推奨されうる。10ng/mLを上回る濃度は高い前立腺がんリスクを示す。用量応答曲線は、GraphPad Prism 7を使って、4パラメータ用量応答曲線として作成した。
【図１３】図13Aは、FGFR1の細胞内ドメインにおけるPLCG結合部位またはSTAT結合部位の突然変異（PLCG:Y766F、STAT:Y677F）が、MAPKシグナリングに対して観察されうる効果を持たないことを表す。図13Bは、MAPK-GEMSが、NFATおよびSTAT3に対してわずかな効果しか持たなかったことを表す。PLCG結合部位またはSTAT結合部位の突然変異は、NFATまたはSTAT3のそれぞれの活性化を減少させた。Y759Aを持たないJAK/STAT-GEMSは、MAPKシグナリングに対してわずかな効果しか持たなかった。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。図13CはGEMS多重化の結果を表す。JAK/STAT-GEMSSunTagおよびMAPK-GEMSRR120（Y677F）をコトランスフェクトし、24時間後の培養上清においてSunTagが制御するSEAP分泌とRR120が制御するNanoLuc分泌とをプロファイリングした。濃度は100ng/mL RR120および0.02％（v/v）SunTag含有細菌溶解物とした。NanoLuc濃度はRLU（相対蛍光単位）として表す。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊P＜0.05、＊＊＊＊P＜0.0001;ns、有意性なし。バーの上の数字は、誘導物質存在下での平均濃度を誘導物質非存在下での平均濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター（SEAPまたはNanoLuc）の変化倍率を示す。
【図１４】図14は、WEN1.3細胞において、RR120が、JAK/STAT-GEMSRR120シグナリングまたはMAPK-GEMSRR120シグナリングの活性化後に、内在性IL-10分泌を増加させることを表す。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊P＜0.05、＊＊＊＊P＜0.0001;ns、有意性なし。バーの上の数字は、誘導物質存在下での平均濃度を誘導物質非存在下での平均濃度で割ることによって算出される、誘導24時間後の上清におけるIL-10濃度の変化倍率を示す。
【図１５】図15はカフェイン存在下でのHEK-293T細胞の生存能を表す。HEK-293T細胞を、標準細胞培養培地中で、一連のカフェイン濃度に曝露した。24時間後に細胞生存能をCCK-8アッセイで評価した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図１６】図16は、ラクダ科由来の単一ドメイン抗体aCaffVHHに基づくカフェイン誘導性タンパク質二量体化システムの概略図である。aCaffVHHはカフェインの存在下でホモ二量体化し、カフェイン応答性遺伝子発現を微調整する合成転写因子またはシグナリングカスケードを再構成するために使用することができる。
【図１７】図17Aは、直接的な転写活性化につながるaCaffVHH-TetR（pDB307）とaCaffVHH-VPminx4（pDB335）のヘテロ二量体化に基づくカフェイン検知回路を表す。カフェイン用量応答関係をレポーター遺伝子SEAP（PtetO7-SEAP-pASV40、pMF111）で定量した。図17Bは、IL13受容体およびJAK/STAT6経路に基づくカフェイン検知回路を表す。aCaffVHH-IL13Rα1（pDB323）とaCaffVHH-IL4Rα（pDB324）のカフェイン誘導性ヘテロ二量体化は、JAKキナーゼによるSTAT6（pLS16）のリン酸化と、それに続くSTAT6応答性プロモーターPSTAT6の転写活性化につながる。カフェイン用量応答関係をレポーター遺伝子SEAP（PSTAT6-SEAP-pASV40、pLS12）で定量した。図17Cは、MAPK経路に基づくカフェイン検知回路を表す。mFGFR1405-822-aCaffVHH（pDB395）のカフェイン誘導性ホモ二量体化は、MEK1/2のリン酸化およびMAPKカスケードの下流シグナリングにつながった。ハイブリッド転写因子TetR-Elk1（MKp37）によってシグナリングカスケードを再配線すると、レポーター遺伝子SEAP（PtetO7-SEAP-pASV40、pMF111）の発現につながり、カフェイン用量応答関係の定量が可能になった。図17Dは、Epo受容体およびJAK/STAT3経路に基づくカフェイン検知回路を表す。aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm（pDB306）のカフェイン誘導性ホモ二量体化は、JAKキナーゼによるSTAT3のリン酸化とそれに続くSTAT3応答性プロモーターPSTAT3の転写活性化につながる。カフェイン用量応答関係をレポーター遺伝子SEAP（PSTAT3-SEAP-pASV40、pLS13）で定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図１８】図18AはSTAT3シグナリングとTetR依存性プロモーターの直交性を表す。pDB306（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH）およびpMF111（PtetO7-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたHEK-293T細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。図18Bは、カフェイン検知システムの併用による非線形応答を表す。pDB306（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH）、pLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）、pDB307（PSV40-TetR-aCaffVHH-pASV40）、pDB335（PCAG-aCaffVHH-VPminx4-pAβG）およびpMF111（PtetO7-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたHEK-293T細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図１９】図19Aは、hMSC-hTERT細胞におけるC-STARの機能性を表す。hMSC-hTERT細胞にpDB306（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH）およびpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後に細胞を、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。カフェイン用量応答関係を24時間後のSEAP発現によって定量した。図19Bは、ポリクローナルC-STARDB1細胞のカフェイン応答性を表す。ポリクローナルC-STARDB1細胞を、一連のカフェイン濃度に曝露することで、それらの感度を調べた。SEAPの上清レベルを24時間後に定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２０】図20AはモノクローナルC-STARDB2細胞株のカフェイン感度を表す。図20BはモノクローナルC-STARDB3細胞株のカフェイン感度を表す。図20CはモノクローナルC-STARDB4細胞株のカフェイン感度を表す。図20DはモノクローナルC-STARDB5細胞株のカフェイン感度を表す。レポータープラスミドpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたC-STARDB2、C-STARDB3、C-STARDB4およびC-STARDB5細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２１】図21は、C-STARシステムの活性化に必要なカフェイン曝露時間を表す。誘導に必要な最小曝露時間を決定するために、C-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、H2Oまたは10μMカフェインに、異なる期間にわたって曝露した。表示の時間後に、カフェイン添加培地を標準細胞培養培地で置き換え、SEAP発現を24時間進行させてから、定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２２】図22は、カフェインおよびさまざまな類似体に対するC-STARDB1の特異性を表す。レポータープラスミドpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたC-STARDB1細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェイン、テオフィリン、テオブロミンおよびパラキサンチンに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２３】図23Aはカフェインに対するC-STARシステムの応答時間を表す。システムの応答時間を決定するために、C-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、H2Oまたは一連の濃度のカフェインに曝露した。SEAPを含有する上清試料を72時間にわたって12時間ごとに採取した。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）の平均±s.d.を表している。図23BはC-STARシステムの可逆性を表す。システムの可逆性を示すために、C-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、H2Oと10μMカフェインに交互に曝露した。SEAPを含有する上清試料を1日あたり9時間にわたって3時間ごとに採取した。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）の平均±s.d.を表している。
【図２４】図24は試験した溶液と各々のカフェイン濃度の図解である。ボックスは、左から右に、Nesquik（登録商標）カプセル、Forest Fruits（登録商標）（ハーブティー）、Vivalto lungo decaffeinato（登録商標）、Volluto decaffeinato（登録商標）、Decaffeinato intenso（登録商標）、Arpeggio decaffeinato（登録商標）、Coca-Cola（登録商標）、Mediterranean（登録商標）（緑茶）、Marrakech（登録商標）（緑茶）、Earl Grey（登録商標）（紅茶）、Starbucks（登録商標）Coffee Frappuccino、Starbucks（登録商標）Caramel Macchiato、Red Bull（登録商標）、Bukeela ka Ethiopia（登録商標）、Vivalto lungo（登録商標）、Starbucks（登録商標）コーヒー、Capriccio（登録商標）、Livanto（登録商標）、Apfelstrudel（登録商標）、Volluto（登録商標）、Roma（登録商標）、Arpeggio（登録商標）、Ristretto（登録商標）、Dharkan（登録商標）、Military Energy Gum（登録商標）およびKazaar（登録商標）に対応する。各飲料中のカフェインの量に関するベンダーの仕様書から、表示のカフェイン濃度を算出した。
【図２５】図25AはNespresso Grand Cru（登録商標）カプセルからのコーヒー中のカフェイン濃度の定量を表す。図25Bは、他の市販カフェイン源からのコーヒー中のカフェイン濃度の定量を表す。カフェイン含有試料を1:50,000の希釈率でC-STARDB1細胞に加えた。純粋なカフェインを使って得られる標準曲線により、定量されたSEAPレベルを元の試料中のカフェイン濃度に変換することが可能になった。各飲料は3回にわけて調製または購入した。データは三つ一組の実験（n＝3）のうちの各実験の定量を表している。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。ベンダーによって示されたカフェイン濃度を右側に示す。
【図２６】図26は、カフェイン存在下でのカプセル化C-STARDB1細胞の機能性を表す。レポータープラスミドpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）をトランスフェクトし、導管付きマイクロコンテナ（vascularized microcontainer）中にカプセル化されたC-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。24時間後に、細胞の上清におけるSEAP活性を定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２７】図27AはマイクロカプセルインプラントがTNF-αレベルに及ぼす影響を表す。図27BはマイクロカプセルインプラントがIL-6レベルに及ぼす影響を表す。野生型マウスの腹腔内にマイクロカプセル化C-STARDB6細胞を埋植し、埋植の12時間前（対照）、12時間後、36時間後および60時間後に血液試料を収集した。マウスの血流中のTNF-αレベルとIL-6レベルをELISAによって決定した。表示のデータは平均±SEM（n＝8匹）である。n.s.有意性なし（ウェルチのt検定）。
【図２８】図28Aは、コーヒー摂取の24時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。図28Bは、コーヒー摂取の48時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。図28Cは、埋植5日後のコーヒー摂取の24時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。図28Dは、埋植5日後のコーヒー摂取の48時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。野生型マウスの腹腔内に、マイクロカプセル化されたC-STARDB1（カフェイン受容体:＋）またはpLS13だけをトランスフェクトした対照HEK-293T細胞（カフェイン受容体:-;PSTAT3-SEAP-pASV40）を埋植し、そのマウスを、300μLのVolluto（登録商標）コーヒー（コーヒー:＋）またはH2O（コーヒー:-）の経口投与によって刺激した。マウスの血流中のSEAPレベルを、コーヒー摂取の24時間後および48時間後に定量した。埋植の5日後に、同じマウスにもう一度、300μLのVolluto（登録商標）コーヒー（コーヒー:＋）またはH2O（コーヒー:-）を経口投与した。2回目のコーヒー摂取の24時間後および48時間後に血流中のSEAPレベルを定量した。表示のデータは平均±SEM（n＝8）である。＊＊＊対照に対してP＜0.001、n.s.有意性なし（ウェルチのt検定）。
【図２９】図29AはshGLP-1のカフェイン誘導性発現の評価を表す。カフェイン受容体（PhEF-1α-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pASV40、pDB326）を安定に発現するC-STARDB1細胞またはC-STARDB3細胞に、pDB387（PSTAT3-shGLP-1-pASV40）を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションの16時間後にH2Oまたはカフェインに曝露した。48時間後に、マウスIgG ELISAキット（ICL Lab）を使って、細胞の上清におけるshGLP-1発現を定量した。表示のデータは4回の独立した実験（n＝4）を表している。図29BはポリクローナルshGLP-1発現C-STARDB6細胞株の検証を表す。カフェイン受容体（PhEF-1α-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pASV40、pDB326）とshGLP1（PSTAT3-shGLP-1-pASV40、pDB387）をどちらも安定に発現するC-STARDB6細胞を、H2Oまたはカフェインに曝露した。48時間後に、マウスIgG ELISAキット（ICL Lab）を使って、細胞の上清におけるshGLP-1発現を定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは4回の独立した実験（n＝4）を表している。
【図３０】図30Aはインビボでのカフェインの薬物動態を表す。図30BはインビボでのshGLP-1の薬物動態を表す。野生型マウスの腹腔内にマイクロカプセル化C-STARDB6細胞を埋植し、そのマウスに、300μLのNespresso Volluto（登録商標）コーヒーを単回経口投与した。マウスの血流中のカフェインレベルおよびshGLP-1レベルを、60時間にわたって6時間ごとに記録した。表示のデータは平均±SEM（n＝8）である。＊＊＊＊対照に対してP＜0.0001（ウェルチのt検定）。
【図３１】図31Aはマウスの血流におけるshGLP-1の用量依存的生産を表す。図31Bはマウスの空腹時血糖を表す。野生型マウスの腹腔内にマイクロカプセル化C-STARDB6細胞を埋植し、そのマウスに、カフェイン濃度が異なるさまざまなNespresso（登録商標）コーヒー調合品（摂取体積:300μL）を単回経口投与した。マウスの血流におけるshGLP-1の用量依存的生産をコーヒー摂取の24時間後に記録した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のマウス（n＝8）を示している。72時間にわたって空腹時血糖を記録した。恒常性空腹時血糖の範囲を灰色の四角形で示す。表示のデータは平均±SEM（n＝8匹）である。ウェルチのt検定では群間に有意差はみられなかった。
【図３２】図32A、図32B、図32Cおよび図32Dは、shGLP-1のカフェイン依存性インスリン分泌作用を表しており、図32Aは空腹時血糖（恒常性空腹時血糖の範囲を灰色の四角形で示す）を表し、図32Bは血中活性GLP-1を表し、図32Cは食後4時間インスリンレベルを表し、図32Dは腹腔内グルコース耐性試験の結果を表す。野生型（WT）マウスまたは食餌誘導性肥満マウス（DIO）の腹腔内にマイクロカプセル化されたC-STARDB6細胞またはpDB387（PSTAT3-shGLP-1-pASV40）だけを含有する対照HEK-293T細胞を埋植し、そのマウスに、300μLのNespresso Volluto（登録商標）コーヒーを毎日経口投与した。空腹時血糖、血中活性GLP-1および食後4時間インスリンレベルを14日間記録した。2g kg-1のD-グルコース水溶液の投与によって腹腔内グルコース耐性試験を行った。表示のデータはすべて平均±SEM（n＝10匹）である。比較はウェルチのt検定で行った:対照に対して＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001、n.s.有意性なし。
【図３３】図33Aはカフェイン依存性心血管効果を表す。図32A〜Dに示したマウスと同じマウスの心拍数を血液試料の収集より前に測定した。図33Bは体重に対するカフェイン誘発性shGLP-1媒介効果を表す。15日目に、図32A〜Dおよび図33Aに示す個々のマウスの体重を、それぞれの初期体重（1日目、最初のコーヒー摂取前）と比較した。均衡の信頼区間を灰色の四角形で示す。表示のデータはすべて平均±SEM（n＝10匹）である。比較はウェルチのt検定で行った:対照に対して＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001、n.s.有意性なし。
【図３４】図34A、図34Bおよび図34CはshGLP-1のカフェイン依存性インスリン分泌作用を表しており、図34Aは血中活性GLP1を表し、図34Bは食後4時間インスリンレベルを表し、図34Cは腹腔内グルコース耐性試験の結果を表す。図34Dはカフェイン依存性心血管効果を表す。野生型（WT）マウスまたはレプチン受容体欠損性マウス（db/db）の腹腔内に、マイクロカプセル化されたさまざまな用量のC-STARDB6細胞（0〜1×107細胞）またはpDB387（PSTAT3-shGLP-1-pASV40）だけを含有する1×107個の対照HEK-293T細胞を埋植し、そのマウスに、300μLのNespresso Volluto（登録商標）コーヒーを経口投与した。血中活性GLP-1および食後4時間インスリンレベルを、細胞埋植前とその1日後に記録した。2g kg-1のD-グルコース水溶液の投与によって腹腔内グルコース耐性試験を行った。同じマウスの心拍数を血液試料の収集前に測定した。表示のデータはすべて平均±SEM（n＝10匹）である。比較はウェルチのt検定で行った:対照に対して＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001、n.s.有意性なし。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する専門用語、表記法および他の科学的術語は、いずれも、当業者に一般に理解されている意味を有するものとする。場合によっては、一般に理解されている意味を持つ用語を、明確な記述のためにかつ/またはすぐに参照できるように、本明細書において定義するが、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも、当技術分野において一般に理解されているものとの相違を表すと解釈されるべきではない。本明細書において記載しまたは言及する技法および手順は一般によく理解されており、当業者には、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed.（2012）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載の広く利用されている分子クローニング法など、従来の方法を使ってよく使用されている。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、別段の注記がある場合を除き、一般に、製造者が規定したプロトコールおよび条件に従って実行される。
【００５０】
本明細書において使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。「包含する（include）」、「など（such as）」などの用語は、別段の特記がある場合を除き、非限定的な包含を表すものとする。
【００５１】
本明細書において使用する用語「を含む（comprising）」は、特に別段の表示がある場合を除き、具陳した要素「からなる（consisting of）」態様および具陳した要素「から本質的になる（consisting essentially of）」態様も、特に包含する。
【００５２】
「約」という用語は、表示した値とその値の前後の範囲とを示し、それらを包含する。一定の態様において、「約」という用語は、指定された値±10％、±5％または±1％を示す。該当する一定の態様では、「約」という用語が、指定された値±その値の1標準偏差を示す。
【００５３】
「エリスロポエチン受容体（EpoR）」という用語は、サイトカイン受容体ファミリーの一メンバーを指す。これはヒトではEPOR遺伝子によってコードされている。EpoRは予め二量体として存在し、30kDaのリガンドであるエリスロポエチン（Epo）が結合すると、そのホモ二量体化コンフォメーションが変化する。これらのコンフォメーション変化は、この受容体と予め会合しているJak2キナーゼの自己リン酸化をもたらす（すなわちEpoRは固有のキナーゼ活性を持たず、Jak2活性に依存している）。EpoRの確立した機能の一つは、エリスロイド（赤血球）前駆細胞の増殖とアポトーシスからの救出とを促進することである。ヒトEpoR前駆体の例示的RefSeqアクセッション番号は、2018年10月1日現在、NCBIウェブサイトに示されているNP＿000112.1である。マウスEpoR前駆体の例示的RefSeqアクセッション番号は、2018年10月1日現在、NCBIウェブサイトに示されているNP＿034279.3である。マウスのEpoR前駆体、成熟EpoRおよびEpoRアイソフォームEpoR-S、ヒトのEpoR前駆体、成熟EpoRならびにEpoRアイソフォームEpoR-SおよびEpoR-Tの例示的アミノ酸配列を以下に示す。
2020110135.tif 000002
2020110135.tif 000003
2020110135.tif 000004
【００５４】
本明細書において使用する用語「キメラリガンド受容体」は、複数の異なるタンパク質配列に由来するドメインを含むリガンド受容体を指す。本開示のキメラリガンド受容体には、野生型サイトカイン受容体または野生型エリスロポエチン受容体（EpoR）などの天然受容体または野生型受容体は包含されない。本開示のキメラリガンド受容体は1つまたは複数の受容体サブユニットを含む。受容体サブユニットのそれぞれは、足場ドメイン、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを含む。
【００５５】
本明細書において使用する用語「足場ドメイン」は、リガンドが結合すると活性化される受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの少なくとも一部分を指す。リガンドの結合は、足場ドメインに機能的に連結された細胞内シグナリングドメインの活性を調整する足場ドメインのコンフォメーション変化またはコンフォメーション再編成につながりうる。足場ドメインはEpoRなどのサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに由来しうる。いくつかの態様において、足場ドメインは、そのネイティブリガンドの結合に対して不活性でありうる。例えば足場ドメインがEpoRの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに由来する場合、それはエリスロポエチン結合に対して不活性である。
【００５６】
本明細書において使用する用語「リガンド結合ドメイン」は、本開示のキメラリガンド結合受容体のうち、足場ドメインの細胞外ドメインに機能的に連結されたドメインを指す。本開示のリガンド結合ドメインは、それらが足場ドメインと同じ親タンパク質に由来していないという点でキメラであり、足場ドメインが由来する受容体のネイティブリガンドには結合しない。例えば足場ドメインがEpoRに由来する場合、リガンド結合ドメインは、EpoRのネイティブリガンドであるエリスロポエチンには結合しない。
【００５７】
本明細書において使用する用語「細胞内シグナリングドメイン」は、足場ドメインの膜貫通ドメインに機能的に連結されたキメラリガンド結合受容体のドメインを指す。本開示の細胞内シグナリングドメインは、それらが足場ドメインと同じ親タンパク質に由来していないという点でキメラであり、足場ドメインが由来する親受容体のネイティブリガンドによって活性化されない。例えば足場ドメインがEpoRに由来する場合、細胞内シグナリングドメインは、EpoRのネイティブリガンドであるエリスロポエチンでは活性化されない。
【００５８】
本明細書において使用する用語「ネイティブリガンド」は、足場ドメインが由来する親受容体に天然に結合する野生型リガンドを指す。例えば足場ドメインがEpoRに由来する場合、ネイティブリガンドはエリスロポエチンである。足場ドメインはそのネイティブリガンドに対して不活性（すなわち非応答性）である。足場ドメインは、それをそのネイティブリガンドに対して非応答性にする改変を含有することができる。
【００５９】
キメラリガンド受容体
いくつかの局面において、本明細書には、キメラリガンド受容体が開示される。
【００６０】
いくつかの態様において、キメラリガンド受容体は、1つの受容体サブユニットを含む。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体は、2つ以上の受容体サブユニット、例えば2つの受容体サブユニット、3つの受容体サブユニット、4つの受容体サブユニット、5つの受容体サブユニット、6つの受容体サブユニットまたは7つ以上の受容体サブユニットを含む。
【００６１】
いくつかの態様において、キメラリガンド受容体サブユニットは、足場ドメイン、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを含む。
【００６２】
いくつかの態様において、2つ以上の受容体サブユニットは、足場ドメインを介して多量体化する。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは二量体を含む。
【００６３】
いくつかの態様において、受容体サブユニットの多量体化は、リガンド結合より前に起こる。いくつかの態様において、多量体化した受容体サブユニットは、膜貫通ヘリックス相互作用によって、リガンド結合非存在下での下流シグナリングを防止するコンフォメーションに固定される。いくつかの態様において、リガンド結合はコンフォメーション再編成につながる。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は、各足場ドメインの自軸周りの回転を含みうる。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する。いくつかの態様において、コンフォメーション再編成は、各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを阻害する。
【００６４】
足場ドメイン
いくつかの態様において、足場ドメインは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインはリガンド結合ドメインに機能的に連結され、膜貫通ドメインは細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている。
【００６５】
いくつかの態様において、足場ドメインは、受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、細胞表面において予め形成された不活性な二量体構造を有する膜貫通受容体、例えばサイトカイン受容体であって、リガンドが結合すると膜貫通ドメインのコンフォメーション再編成（例えば回転）によって活性化される膜貫通受容体の、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む（例えばMaruyama IN, Bioessays, 2015, 37:959-967参照）。いくつかの態様において、足場ドメインは、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
【００６６】
いくつかの態様において、足場ドメインはそのネイティブリガンドに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインがエリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む場合、足場ドメインはエリスロポエチンに対して不活性である。
【００６７】
いくつかの態様において、足場ドメインは1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、足場ドメインの細胞外ドメインは1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、足場ドメインの膜貫通ドメインは1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、足場ドメインの細胞外ドメインと足場ドメインはどちらも1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、改変は、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、改変は、化学修飾、例えば限定するわけではないが、アセチル化、アミド化、ビオチン化、システイニル化、脱アミド、ファルネシル化、ホルミル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオニル化、糖化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、モノ-ADP-リボシル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、ポリ（ADP-リボシル）化、ステアロイル化または硫酸化などを含む。いくつかの態様において、改変は足場ドメインをそのネイティブリガンドに対して不活性にする。いくつかの態様において、足場ドメインがエリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む場合、細胞外ドメインはF93Aアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加アミノ酸残基はアラニン残基である。いくつかの態様では、1つまたは複数の正荷電アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基を、さらに含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている。
【００６８】
いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して60〜100％の配列同一性、例えば
2020110135.tif 000005
に対して70〜100％、80〜100％、85〜100％、90〜100％、95〜100％、97〜100％または99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して70％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して97％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:8に対して100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
【００６９】
いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して60〜100％の配列同一性、例えば
2020110135.tif 000006
に対して70〜100％、80〜100％、85〜100％、90〜100％、95〜100％、97〜100％または99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して70％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して97％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインは、SEQ ID NO:9に対して100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７０】
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して60〜100％の配列同一性、例えば
2020110135.tif 000007
に対して70〜100％、80〜100％、85〜100％、90〜100％、95〜100％、97〜100％または99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して60％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して70％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して97％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:10に対して85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはSEQ ID NO:10に対して100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して80〜100％の配列同一性、例えばSEQ ID NO:9に対して85〜100％、90〜100％、95〜100％、97〜100％または99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して80〜100％の配列同一性、例えばSEQ ID NO:10に対して85〜100％、90〜100％、95〜100％、97〜100％または99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して97％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して97％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。いくつかの態様において、足場ドメインは、SEQ ID NO:9に対して100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、SEQ ID NO:10に対して100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインとを含む。
【００７２】
リガンド結合ドメイン
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、足場ドメインのネイティブリガンドには結合しない。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、足場ドメインの内在性リガンド結合ドメインを含まない。いくつかの態様において、足場ドメインがサイトカイン受容体に由来する場合、リガンド結合ドメインはコグネイトサイトカインには結合しない。いくつかの態様において、足場ドメインがサイトカイン受容体に由来する場合、リガンド結合ドメインは同じサイトカイン受容体には由来しない。いくつかの態様において、足場ドメインがエリスロポエチン受容体（EpoR）に由来する場合、リガンド結合ドメインはエリスロポエチンには結合しない。いくつかの態様において、足場ドメインがエリスロポエチン受容体（EpoR）に由来する場合、リガンド結合ドメインはエリスロポエチン受容体（EpoR）には由来しない。
【００７３】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、合成リガンドまたはデザイナーリガンドである可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、天然リガンドである可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、可溶性リガンドは、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはカフェインに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはラパマイシンに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはRR120に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはニコチンに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは抗原に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはがん抗原に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは腫瘍抗原に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは病原体抗原に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは前立腺特異抗原（PSA）に結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはペプチドタグに結合する。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはSunTagに結合する。
【００７４】
いくつかの態様において、各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインは互いに同じである。いくつかの態様において、各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインは互いに異なる。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインのそれぞれは単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvは抗原の異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体は2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインは免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインは免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体ドメインを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、RR120の存在下でホモ二量体化するラクダ科重鎖抗体ドメイン（VHH）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、ニコチン抗体の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはGCN4特異的scFvを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、前立腺特異抗原（PSA）に結合するscFvを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、FKBP-ラパマイシン結合タンパク質（FRB）およびFK506-ラパマイシン結合タンパク質（FK506 and rapamycin binding protein：FKBP）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはロイシンジッパードメインを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、PSD95-Dlg 1-zo-l（PDZ）ドメイン、ストレプトアビジンドメインおよびストレプトアビジン結合タンパク質（SBP）ドメインまたはPYLドメインおよびABIドメインを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはシクロフィリン-Fas融合タンパク質（CyP-Fas）およびFK506-ラパマイシン結合タンパク質（FKBP）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはカルシニューリンA（CNA）およびFK506-ラパマイシン結合タンパク質（FKBP）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはgibberellin insensitive（GIA）およびgibberellin insensitive dwarf1（GID1）を含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインはSnap-tagおよびHalo tagを含む。いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは、T14-3-3-cdeltaCおよびPMA2のC末端ペプチド（CT52）を含む。適切なリガンド結合ドメインのさらなる説明は、当技術分野において、例えばWO2017091546に見いだすことができる。
【００７５】
細胞内シグナリングドメイン
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、足場ドメインがサイトカイン受容体に由来する場合、細胞内シグナリングドメインは、そのサイトカイン受容体によって結合される対応サイトカインに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインがサイトカイン受容体に由来する場合、細胞内シグナリングドメインは、そのサイトカイン受容体の内在性細胞内シグナリングドメインを含まない。いくつかの態様において、足場ドメインがエリスロポエチン受容体（EpoR）に由来する場合、細胞内シグナリングドメインはエリスロポエチンに対して不活性である。いくつかの態様において、足場ドメインがエリスロポエチン受容体（EpoR）に由来する場合、細胞内シグナリングドメインは、エリスロポエチン受容体（EpoR）の内在性細胞内シグナリングドメインを含まない。
【００７６】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインはVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する。
【００７７】
いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様において、改変は、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、改変はアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、改変は化学修飾を含む。いくつかの態様において、改変は、負のフィードバックを低減するか、二次的シグナリング経路の交差作用を低減する。いくつかの態様において、改変は1つまたは複数のチロシン残基の置換を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインである場合、細胞内シグナリングドメインはY759Aアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインがEGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインである場合、細胞内シグナリングドメインはY677Fアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインがEGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインである場合、細胞内シグナリングドメインはY766Fアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインがEGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインである場合、細胞内シグナリングドメインはY677Fアミノ酸置換およびY766Fアミノ酸置換を含む。
【００７８】
ポリヌクレオチドおよびベクター
別の一局面において、本明細書には、キメラリガンド受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはキメラリガンド受容体をコードする一組の単離されたポリヌクレオチドが開示される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドの発現は構成的に活性なプロモーターの制御を受ける。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドの発現は誘導性プロモーターの制御を受ける。いくつかの態様において、誘導性プロモーターはテトラサイクリン誘導性プロモーターである。哺乳動物細胞において使用するための例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、シミアンウイルス40（SV40）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、伸長因子1α（EF1α）プロモーターおよびホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００７９】
いくつかの態様において、キメラリガンド受容体をコードするポリヌクレオチドは、相同組換えによってゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体をコードするポリヌクレオチドは細胞に一過性にトランスフェクトされる。発現ベクターには、例えば組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例:裸のプラスミドまたはリポソームに含まれているプラスミド）およびウイルス（例:レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野において公知のものはすべて包含される。
【００８０】
細胞
別の一局面において、本明細書には、前記ポリヌクレオチドを含む遺伝子操作された細胞または前記キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞が開示される。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は初代細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は細胞株である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は皮膚細胞、血液細胞、筋細胞、骨細胞、神経細胞、脂肪細胞、肝臓細胞または心臓細胞である。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。例示的な幹細胞として、胚性幹細胞（ESC）、誘導多能性幹細胞（iPSC）、成体幹細胞および組織特異的幹細胞、例えば造血幹細胞（血液幹細胞）、間葉系幹細胞（MSC）、神経幹細胞、上皮幹細胞または皮膚幹細胞が挙げられる。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。例示的な免疫細胞として、T細胞（例:ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞およびガンマ・デルタT細胞）、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞、マクロファージおよび単球が挙げられる。いくつかの態様において、細胞は神経細胞である。例示的な神経細胞として、神経前駆細胞、ニューロン（例:感覚ニューロン、運動ニューロン、コリン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロンまたはセロトニン作動性ニューロン）、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびミクログリアが挙げられる。
【００８１】
いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞は操作された導入遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、導入遺伝子は、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である。いくつかの態様において、標的産物は、治療用分子（例:酵素または抗体）、予防用分子および診断用分子からなる群より選択される。いくつかの態様において、標的産物は、グルカゴン様ペプチド1、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）またはインスリンである。
【００８２】
いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞は2つ以上のキメラリガンド受容体を含む。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体はそれぞれ互いに異なる。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体はそれぞれ異なる可溶性リガンドに結合する。いくつかの態様において、遺伝子操作された細胞は2つ以上の操作された導入遺伝子をさらに含む。いくつかの態様において、各導入遺伝子は、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む。いくつかの態様において、各合成プロモーターは、前記細胞上に発現された2つ以上のキメラリガンド受容体のうちの異なるキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である。いくつかの態様において、各標的産物は、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より独立して選択される。
【００８３】
方法
別の一局面において、本明細書には、前記キメラリガンド受容体または前記遺伝子操作された細胞を生体組織または生体液と接触させる方法が開示される。いくつかの態様において、生体組織または生体液は、対象中にあるか、または対象から得られる。いくつかの態様において、対象は、ある医学的状態と診断されたか、ある医学的状態を発症するリスクがあるか、またはある医学的状態を有すると疑われる対象である。いくつかの態様において、医学的状態はがんまたは炎症状態である。
【００８４】
別の一局面において、本明細書には、シグナリング経路を活性化する方法が開示される。本方法は、前記キメラリガンド受容体または前記遺伝子操作された細胞を、キメラリガンド受容体がコグネイトリガンドに結合するのに適した条件下で、コグネイトリガンドと接触させる工程を含み、キメラリガンド受容体とのコグネイトリガンドの結合は、多量体化した足場ドメインのコンフォメーション再編成を誘導して、それが細胞内シグナリングドメインを活性化する。いくつかの態様において、本方法は、細胞の表面にコグネイトリガンドを投与する工程をさらに含む。
【００８５】
別の一局面において、本明細書には、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法が開示される。本方法は、リガンド結合ドメインをコードする第1核酸を足場ドメインをコードする第2核酸に融合し、かつ第2核酸を細胞内シグナリングドメインをコードする第3核酸と融合することによって、多量体化能を有しかつ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む足場ドメインと、足場ドメインの細胞外結合ドメインに機能的に連結されたリガンド結合ドメインと、足場ドメインの膜貫通ドメインに機能的に連結された細胞内シグナリングドメインとを含むキメラリガンド受容体をコードするキメラリガンド受容体発現ベクターを合成する工程;キメラリガンド受容体発現ベクターを細胞にトランスフェクトする工程;および細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程を含む。いくつかの態様において、本方法は、前記単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターもしくは前記一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程;および細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程を含む。いくつかの態様において、本方法は、標的産物をコードする核酸配列に機能的に連結された合成プロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトする工程を、さらに含む。いくつかの態様において、合成プロモーターは、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である。いくつかの態様において、キメラリガンド受容体の発現を誘導する工程は、細胞がキメラリガンド受容体を細胞の細胞膜上に発現するのに適した条件下で細胞を培養することを含む。
【実施例】
【００８６】
以下は本開示の方法および組成物の実施例である。本明細書において提供される一般的説明を考慮すれば、他のさまざまな態様を実施しうると理解される。
【００８７】
以下は請求項に係る発明を行うための具体的態様の実施例である。これらの実施例は例示のために提供されるに過ぎず、決して本開示の範囲を限定しようとするものではない。使用する数字（例:量、温度など）については正確さを確保するように努力したが、多少の実験誤差および偏差は当然見込まれるべきである。
【００８８】
本開示の実施では、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある従来のタンパク質化学、生化学、組換えDNA技法および薬理学の方法を使用することになる。そのような技法は文献に詳しく説明されている。例えばT.E.Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties（W.H.Freeman and Company, 1993）、A.L.Lehninger, Biochemistry（Worth Publishers, Inc., current addition）; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2nd Edition, 1989）; Methods In Enzymology（S.Colowick and N.Kaplan eds., Academic Press, Inc.）; Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition（Easton Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990）; Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.（Plenum Press）Vols A and B（1992）参照。
【００８９】
材料および方法
HEK-293細胞培養およびトランスフェクション  ヒト胎児腎臓細胞（HEK-293T、American Type Culture Collection（ATCC）:CRL-11268）を、5％CO2/空気の湿潤雰囲気下、37℃において、10％（v/v）FBS（F7524、ロットBCBS0318V、Sigma-Aldrich）および1％（v/v）ストレプトマイシン/ペニシリン（L0022、Biowest）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM;52100039、Thermo Fisher）中で培養した。実験のために、トランスフェクションの24時間前に、DMEM 12mL中の1.5×106細胞を、96ウェルプレート（167008、Thermo Fisher）に播種した。各ウェル中のトランスフェクション混合物は、50μLのFBSおよび抗生物質非含有DMEMと混合された125〜130ngのプラスミドDNAと、600ngのポリエチレンイミン（24765-1、Polysciences,Inc.）とからなった。トランスフェクション混合物は別途調製し、20分間インキュベートしてから、一晩トランスフェクションするために細胞に加えた。朝、トランスフェクション混合物を含む培地を、さまざまな濃度の適当な誘導物質を含む、または陰性対照として誘導物質なしの、130μL/ウェルの培地に交換した。どの実験でも誘導の24時間後にレポーターアウトプットを測定した。トランスフェクションに使用したプラスミドの量は、96ウェルプレートの6ウェル一組あたり、以下のとおりとした。
【００９０】
図3B;図4B:各受容体サブユニットについて5ngまたは図に表示のとおり、150ngのSTAT3レポータープラスミド（pLS13）、25ngのSTAT3発現ベクター（pLS15）および595ng（または合計775ngにするのに適当な量）の哺乳動物プロモーターを持たないプラスミド（pDF145）。
【００９１】
図5A〜C;図6A;図8;図9;図10A〜B;図11A〜C;図12;図13A〜B:600ngの受容体プラスミド（ヘテロ二量体型受容体の場合は300ngの各サブユニット）と、STAT読出し用に150ngのSTAT3レポータープラスミド（pLS13）および25ngのSTAT3発現ベクター（pLS15）;MAPK読出し用に75ngのTetRレポータープラスミド（pMF111）および100ngのTetR-Elk1融合物発現ベクター（MKp37）;NFAT読出し用に175ngのNFATレポータープラスミド（pHY30）、そしてNF-κB読出し用に175ngのNF-κBレポータープラスミド（pKR32）。
【００９２】
図6B:600ngの受容体プラスミドと、MAPK読出し用に150ngのPIPレポータープラスミド（pMF199）および25ngのPIP-Elk1発現ベクター（pAT13）。
【００９３】
図7A〜7B:ホモ二量体型受容体については600ng、ヘテロ二量体型受容体の各サブユニットについては300ng、受容体を使用しない場合は600ngのpDF145。STAT読出し用に150ngのpLS13および25ngのpLS15;MAPK読出し用に75ngのpMF111および100ngのMKp37。
【００９４】
図13C:200ngのMAPK-GEMSRR120（Y677F）（pLeo693）および200ngのJAK/STAT-GEMSSunTag（pLeo620）。多重化STAT/MAPK読出し用に150ngのpLS13、25ngのpLS15、75ngのTetR NanoLucレポーター（pLeo665）および100ngのMKp37。
【００９５】
ハイブリドーマ細胞の培養およびトランスフェクション  WEN1.3細胞（Pogson M et al., Nat. Commun., 2016, 7:12535参照）を、5％CO2/空気の湿潤雰囲気下、37℃において、10％（v/v）熱非働化FBS（F7524、ロットBCBS0318V、Sigma-Aldrich）、1％（v/v）ストレプトマイシン/ペニシリン（L0022、Biowest）、10mM HEPES緩衝液（15630056、Thermo Fisher）および50mM 2-メルカプトエタノール（M3148、Sigma-Aldrich）を補足したDMEM（52100039、Thermo Fisher）中で培養した。4D-Nucleofector System（Lonza）のプログラムCQ-104およびSF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L（V4XC-2024、Lonza）を使ったエレクトロポレーションによって細胞のトランスフェクションを行った。
【００９６】
各トランスフェクションについて、1×106細胞を90gで5分間の遠心分離によって2回洗浄してから、1mLのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（31985062、Thermo Fisher）に再懸濁した。洗浄後に細胞を、0.5μgのsleeping beautyトランスポザーゼ発現プラスミド（pCMV（CAT）T7-SB100）とJAK/STAT-GEMS（pLeo695）またはMAPK-GEMS（pLeo694）の安定な組込みおよび発現のためのプラスミド9.5μgとを含有する100μLのLonza SF緩衝液に再懸濁した。パルス印加後に、500μLの予熱した培養培地を10分間加えた。細胞を、24ウェルプレート（142475、Thermo Fisher）中の培養培地1mLに移し、48時間成長させた。安定細胞株を作製するために、細胞を6ウェルプレート（140675、Thermo Fisher）中の培養培地3mLに移し、5μg/mLピューロマイシン（ANT-PR-1、InvivoGen）で14日間、選択した。実験のために、細胞を90gで5分間遠心分離し、培養培地（RR120ありまたはRR120なし）に再懸濁することで濃度を1×106細胞/mLにしてから、500μLの細胞懸濁液を48ウェルプレートの各ウェルに移した。誘導の24時間後にIL-10 ELISA（900-TM53、PeproTech）を行った。
【００９７】
細胞培養（図15〜34）  ヒト胎児腎臓細胞（ATCC:CRL3216、HEK-293T）および脂肪組織由来ヒトテロメラーゼ逆転写酵素-不死化ヒト間葉系幹細胞（ATCC:SCRC4000、hMSC-hTERT）は、10％（v/v）ウシ胎児血清（FCS;BioConcept、スイス・アルシュヴィル;ロット番号022M3395）および1％（v/v）ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、ドイツ・ミュンヘン）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM;Life Technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。細胞はすべて、5％CO2を含有する湿潤雰囲気下、37℃で培養した。電場マルチチャンネル細胞計数装置（CASYセルカウンター/アナライザーモデルTT;Roche Diagnostics GmbH、スイス・バーゼル）を使って細胞の生存能と数を評価した。24ウェルプレートフォーマットでのトランスフェクションのために、500ngのプラスミドDNAを50μLのFCS非含有DMEMに希釈し、2.5μLのポリエチレンイミン（PEI;Polysciences Inc.;1mg mL-1）と混合し、室温で20分間インキュベートした。次に、そのトランスフェクション混合物を、トランスフェクションの12時間前に播種した1.25×105細胞に滴下した。トランスフェクションの12時間後に、トランスフェクション培地を標準培養培地またはカフェイン（カタログ番号C0750、Sigma-Aldrich）もしくはカフェイン含有調合物を補足した培地で置き換えた。24時間後に導入遺伝子発現をプロファイリングした。
【００９８】
遺伝的に安定なデザイナー細胞株の生成  Sleeping Beautyトランスポゾンプロトコール（Mates L et al., Nat. Genet., 2009, 41:753-761参照）に従って安定なデザイナー細胞株を開発するために、HEK-293T細胞が入っている6ウェルプレートの1ウェルを、pDB326（1900ng）/pSB100x（100ng）によるコトランスフェクションに付した。12時間後にトランスフェクション培地を標準培養培地に交換した。さらに24時間の後、1μg mL-1ピューロマイシン（カタログ番号A1113803;ThermoFisher Scientific、スイス・ライナハ）を補足した標準培養培地に培地を交換し、ポリクローナル細胞集団（C-STARDB1）を2週間選択した。次に、単一細胞をFACSにより蛍光強度に従って選別し、単一クローンを調整（conditioned）HEK-293T培養培地中で成長させた。モノクローナル細胞集団をカフェイン応答性SEAP発現についてスクリーニングして、C-STARDB3を最も高性能な細胞（best performer）として選んだ。プラスミドpDB387を使用し、100μg mL-1ゼオシン（カタログ番号R25005;ThermoFisher Scientific、スイス・ライナハ）を選択試薬として、ポリクローナル安定細胞株C-STARDB6を同様に生成させた。
【００９９】
患者血清  患者血清試料はUniversity Hospital of BaselのC.Rentschから譲り受けた。これらの試料は、スイスのバーゼルおよびベルンにおける現地倫理委員会によって承認された以前の研究（EKBB 37/13）での使い残しであった。PSA濃度は、ELISA（Human Total Prostate Specific Antigen ELISA Kit（ab188388）、Abcam）により、製造者の説明書に従って決定した。MAPK-GEMSPSAを発現する細胞を、10％患者血清を補足した培地100μLで誘導し、誘導の24時間後にレポーターアウトプットを測定した。
【０１００】
mCherry-SunTag作製  SunTag-mCherryはBL21（DE3 pLys）大腸菌（E.coli）で発現させた。細菌を37℃で一晩成長させた。定常期細菌培養物（2mL）を15mLのルリア・ベルターニ（Luria-Bertani）ブロスに接種した。遺伝子発現を誘導するためにIPTGを加えた（最終濃度:0.5mM）。25℃で24時間のインキュベーション後に培養物を収穫した。細菌を遠心分離（7,000g、10分間）によって収集し、50mMトリス緩衝液pH7.5、100mM NaClおよび1mM DTTに再懸濁し、氷上で10分間（10秒オン/10秒オフのサイクル）の超音波処理（Diagenode Bioruptor、高出力）によって溶解した。遠心分離（16,000g、5分間）によってデブリを除去した。次に上清を孔径0.22μmのPTFEフィルタ（Sarstedt AG＆Co）で濾過した。その結果得られた粗溶解物は明らかに赤く、これ以上精製することなく細胞培養実験に使用した。
【０１０１】
誘導物質調製  bFGF（100-18B、PeproTech）およびヒトIL-6（200-06、PeproTech）はH2Oで10μg/mLに希釈した。ニコチン（N3876、Sigma-Aldrich）はエタノールで200mMに希釈した。PSA（497-11、Lee Bioscience、ロットW226903、3.2mg/mL）はそのまま保存溶液として使用した。ラパマイシン（1292、Tocris）はイソプロパノール中の1mM溶液として調製した。RR120（R0378、色素含量≧50％、Sigma）はH2Oで1mg/mLに希釈した。作業溶液は、誘導の直前に、完全DMEMでの段階希釈によって調製した。
【０１０２】
SEAP測定  細胞培養上清中のSEAP濃度は、パラニトロフェニルリン酸（pNPP）の加水分解に起因する吸光度の増加によって定量した。80μLの熱非働化（65℃で30分、次に3,220gで1分間遠心分離）上清を、96ウェルディッシュで、100μLの2×SEAP緩衝液（20mMホモアルギニン、1mM MgCl2、21％（v/v）ジエタノールアミン、pH9.8）および20mM pNPP（Acros Organics BVBA）を含有する20μLの基質溶液と混合した。Tecan Genios PROマルチプレートリーダー（Tecan AG）またはEnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）を使って試料を405nmで測定した。インビボでのSEAP生産は、化学発光SEAPレポーター遺伝子アッセイ（カタログ番号11779842001、Sigma-Aldrich）により、製造者の説明書に従って定量した。
【０１０３】
NanoLuc測定  細胞培養上清中のNanoluc濃度はNano-Glo Luciferase Assay System（N1110、Promega）を使って定量した。7.5μLの試料を384ウェルプレート（781076、Greiner Bio One）中、7.5μLの緩衝液/基質混合物（50:1）と共に5分間インキュベートし、Tecan Genios PROマルチプレートリーダー（Tecan AG）でルミネセンスを測定した。
【０１０４】
CCK-8アッセイ  細胞生存能は、Corning（登録商標）96ウェル黒透明ボトムプレート（カタログ番号CLS3603、Sigma-Aldrich）中で、Cell Counting Kit-8（CCK-8;同仁化学研究所;カタログ番号CK04）により、製造者の説明書に従って定量した。簡単に述べると、トランスフェクションの12時間後に、カフェインを補足した標準培養培地またはカフェインなしの標準培養培地を細胞に加えた。24時間後に、培地を、10％（v/v）Cell Counting Kit-8を補足した標準培養培地に交換した。37℃で1時間のインキュベーション期間後に、EnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）を使って吸光度を450nmで測定することで、細胞生存能の代用値を得た。
【０１０５】
マウスIgG ELISA  shGLP1-mIgGを含有する試料中のマウスIgGレベルは、Mouse IgG ELISA Kit（カタログ番号E-90G、ICL Lab）により、製造者の説明書に従って定量した。EnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）を使って450nmにおける吸光度を定量し、標準曲線でマウスIgGレベルを内挿した。
【０１０６】
グルコース耐性試験  グルコース（H2O中、2g kg-1体重）の腹腔内注射によってマウスに負荷をかけ、グルコメーター（glucometer）（Contour（登録商標）Next;Bayer HealthCare、ドイツ・レバークーゼン）で、15分ごとまたは30分ごとに120分にわたって血中グルコースレベルを測定することによって、血糖プロファイルを作成した。
【０１０７】
インスリンELISA  被験マウスのインスリン血中レベルは、Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA（カタログ番号10-1132-01、Mercodia）により、製造者の説明書に従って評価した。EnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）で450nmにおける吸光度を定量した。
【０１０８】
shGLP-1 ELISA  被験マウスにおけるGLP-1の血中レベルは、High Sensitivity GLP-1 Active ELISA Kit,Chemiluminescent（カタログ番号EZGLPHS-35K、Merck）により、製造者の説明書に従って測定した。EnVision 2104マルチラベルリーダー（PerkinElmer）で450nmにおける吸光度を定量した。
【０１０９】
カフェイン試料  コーヒー（Nespresso Grand Cru（登録商標））および茶試料（Cuida Te（登録商標））は、Nespresso Capri Automatic Sandマシン（Koenig（登録商標））で調製した。Starbucksコーヒー試料は現地のStarbucks（登録商標）から得た。Coca-Cola（登録商標）試料およびRed Bull（登録商標）試料は現地のスーパーマーケットから購入した。Nesquik（登録商標）（Nescafe Dolce Gusto（登録商標））は、Circolo Automatic EDG605B EX:1（Nescafe Dolce Gusto（登録商標）、DeLonghi）で調製した。Military energy gum（登録商標）（MarketRight Inc.）は機械的に砕き、40mLの水で覆い、37℃で数時間浸透することで、咀嚼をシミュレートした。別段の表示がある場合を除き、調製した試料の体積は、各製造者が推奨している体積とした。試料はいずれも、標準培養培地で1:50,000希釈し、カフェインを定量するためにデザイナー細胞に加えた。
【０１１０】
動物実験  腹腔内インプラント用のカプセル化されたHEK-293TおよびC-STAR誘導体細胞は、Inotech Encapsulator Research Unit IE-50R（EncapBioSystems Inc.、スイス・グライフェンゼー）で作成した。合着（coherent）アルギナートポリ-（L-リジン）-ビーズ（直径400μm、カプセルあたり500細胞）を、以下のパラメータで作成した:振動数1025Hzの200μmノズル;410ユニットの流速で作動する25mLシリンジ;1.12kVビーズ分散電圧（bead dispersion voltage）（Ye H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013 110:141-146参照）。雌C57BL/6（14週齢）またはT2Dマウスに、1×104個のカプセルを含有する1〜2mLの無血清DMEMを注射した。遺伝的素因があるT2Dマウスとして、db/dbマウス（雌、8週齢）をJanvier Labsから購入した。T2Dの食餌誘導性肥満（DIO）モデルのために、C57BL/6Jマウス（Janvier Labs、雌、4週齢）に、C-STAR制御処置の前、10週間にわたって、10kcal％または60kcal％脂肪飼料（TestDiet、カタログ番号T-58Y1-58126）を与えた。血中グルコース濃度はグルコメーター（Contour（登録商標）Next;Bayer HealthCare、ドイツ・レバークーゼン）で測定した。マイクロティナ（microtainer）血清分離管微量採血管（カタログ番号365967;Becton Dickinson、英国プリマス）を製造者の説明書に従って使用することにより、血清を収集した。動物が関与する実験は、Institut Universitaire de Technologie（フランスF-69622ヴィルールバンヌCedex・UCBリヨン1）において、Ghislaine Charpin-El Hamriにより、欧州連合の指令に従って行われた（第69266309号;プロジェクト番号DR2013-01（v2））。
【０１１１】
プラスミド調製  プラスミドは、標準的制限酵素（New England BioLabs;可能な場合は常にHF酵素を使用した）を使った消化と、T4 DNAリガーゼ（New England BioLabs）を使ったライゲーションとによって、作成した。PCRは、Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（New England BioLabs）により、製造者の説明書に従って行った。全プラスミドPCRについては伸長時間を4分/サイクルに増やした。
【０１１２】
統計  統計解析はGraphPad Prism 7で行った。ダゴスティーノ-ピアソン（D'Agostino＆Pearson）正規性検定を行って、試験した群におけるガウス分布を確認した。群間の等分散は仮定しなかった。表示した実験については、さまざまな誘導物質濃度に応答して起こるレポーター遺伝子発現の有意な誘導を同定するために、n＝9の生物学的に独立した試料でウェルチの両側t検定を行った。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上に個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されている。多重比較に関して調節は行わなかった。n＝3の生物学的に独立した試料を表す代表的グラフが棒グラフとして提示され、その上に個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、統計解析は行わなかった。分析したデータに関する正確なP値、ウェルチ修正t値およびウェルチ修正自由度を表1に記載する。
【０１１３】
実施例1:GEMSシステムの設計
GEMSシステムは、細胞内シグナリングドメインの活性化を引き起こす細胞外受容体ドメイン二量体化の、詳しく調べられた機序によって機能する（図1）。サイトカイン受容体は、異なる受容体の細胞内ドメインと細胞外ドメインとを組み合わせて機能的キメラを作製することを許容するモジュラー構造を有する（Arber C et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2017, 47:92-101、Kawahara M & Nagamune T, Curr. Opin. Chem. Eng., 2012, 1:411-417参照）。不活性なEpoR二量体は、膜貫通ヘリックス相互作用によって、下流シグナリングを防止するコンフォメーションに固定されている（Seubert N et al., Mol. Cell, 2003, 12:1239-1250参照）。受容体へのリガンド結合は各受容体サブユニットを自軸周りに回転させると考えられ、細胞内ドメイン間の距離の増加を伴うと思われる。これらの効果の組合せが下流シグナリングをトリガーする（Pang X & Zhou HX, PLoS Comput. Biol., 2012, 8:e1002427参照）。本発明者らは、エリスロポエチン受容体をエリスロポエチンに対して不活性にする突然変異をエリスロポエチン受容体に導入し、それを、標的分子の存在下で二量体化する抗体フラグメントなどのアフィニティードメインに融合した。図2に示すように、EpoR膜貫通ドメインを、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した。活性化されると、これらの細胞内ドメインは、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子;IL-6RBによって誘導される）、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ;FGFR1によって誘導される）およびPLCG（ホスホリパーゼCガンマ;VEGFR2によって誘導される）ならびにPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB;VEGFR2によって誘導される）を介して、下流シグナリングを誘導する。表示の経路に選択的に応答する最小プロモーターを使って、シグナリングを導入遺伝子発現に再配線した。
【０１１４】
実施例2:受容体足場
GEMSシステムの最初の特徴づけには、ラパマイシン誘導性二量体化のための、詳しく研究されたFRB/FKBP（FKBP-ラパマイシン結合タンパク質/FK506-ラパマイシン結合タンパク質）システム（Liu W et al., Biotechnol. Bioeng., 2008, 101:975-984）を使用した。FRBタンパク質とFKBPタンパク質をエリスロポエチン受容体細胞外ドメインに融合し、その膜貫通ドメインのC末端をIL-6RBのJAK/STATシグナリングドメインに連結した。活性化されたJAKはSTAT3をリン酸化し、それが転写因子として機能する。受容体活性化は、最小プロモーターの5'側にSTAT3結合部位を含有するレポータープラスミドpLS13（OStat3-PhCMVmin-SEAP-pA）から発現されるレポータータンパク質SEAP（ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ）によって定量することができる（Schukur L et al., Sci. Transl. Med., 2015, 7:318ra201参照）。最大4つのアラニン残基を、EpoRの膜貫通ドメイン（EpoR0-4A）とIL-6RBの細胞内ドメイン（IL-6RBint）との間に付加した。各追加アラニンは膜貫通ヘリックスを伸長し、細胞内ドメインを細胞外ドメインに対しておよそ100°回転させる（Seubert N et al., Mol. Cell, 2003, 12:1239-1250、Liu W et al., Biotechnol. Bioeng., 2008, 101:975-984参照）。これは、オフ状態でのJAK活性化が最小限になる受容体コンフォメーションを同定するために行った（図3A）。FRB/FKBP受容体（pTS1000-pTS1009、PhCMV-FRB/FKBP-EpoR0-4A-IL-6RBint-pA）は、ラパマイシンによる誘導に対して応答性であり、アラニン残基の数は受容体性能に影響を及ぼした。基礎遺伝子発現はアラニンがゼロ個または1個の変異体で最も高く、予め形成された二量体の阻害は不十分であることが示唆された。誘導性SEAP発現の非誘導性SEAP発現に対する最も高い変化倍率は、3つのアラニン残基を持つ変異体に観察され（図3B）、さらなる実験にはこれをテンプレートとして採用した。
【０１１５】
実施例3:GEMS受容体足場の検証および最適化
受容体足場を検証し最適化するために、本発明者らは、合成分子用の環境センサーとの関連において本足場を使用できることをわかりやすく見せるためのリガンドとして、アゾ色素RR120（reactive red 120）に焦点を合わせた。RR120は、今までは生物学的システムによって検出することができなかった大きな二量体型親水性分子である（図4A）。FRB/FKBPタンパク質を、RR120の存在下で二量体化することが示されているRR120に対するVHHA52（ラクダ科重鎖抗体A52）に取り替えた（Spinelli S et al., J. Mol. Biol., 2001, 311:123-129参照）。抗体とEpoRの間のリンカー領域はアミノ酸ser-gly-glu-pheからなり、回転の自由を与えて抗体結合を容易にするはずである。その結果得られたホモ二量体型受容体（プラスミド名:pLeo615、機能を決定するプラスミド要素:PhCMV-VHHA52-EpoR3A-IL-6RBint-pA）は、低ナノモル濃度のRR120でトリガーすることができた（図4B）。PhCMV（ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター）駆動型受容体発現のためのプラスミドをトランスフェクトすると、レポーター分泌が低減したので（図4B）、さらなる実験については、PhCMVプロモーターを、それより弱いsimianウイルス40由来のプロモーター（PSV40）に取り替えた（pLeo617、PSV40-VHHA52-EpoR3A-IL-6RBint-pA）。IL-6RBintのY759（チロシン759）をアラニンに突然変異させることによって、信号雑音比がさらに改良された。リン酸化チロシンY759はJAK/STATシグナリングを負に調節するタンパク質の結合部位であることから、Y759の突然変異はさまざまながんおよび炎症性疾患に見いだされる（Silver JS & Hunter CA, J. Leukoc. Biol., 2010, 88:1145-1156参照）。そこで本発明者らは、シグナリング活性を調製するためのY759A置換を持つIL-6RBm（改変IL-6RBint）を作成した。突然変異を持つ受容体では総SEAP発現量が増加したが、非誘導レポーター生産量の増加はわずかでしかなかった（図5A;pLeo618、PSV40-VHHA52-EpoR3A-IL-6RBm-pA）。受容体をそのネイティブリガンドであるエリスロポエチンに対して非感受性にするために、突然変異F93A（Middleton SA et al., J. Biol. Chem., 1996, 271:14045-14054参照）を、EpoR3Aの主要エリスロポエチン結合部位中に導入した（EpoRm;図5B）。これは、受容体機能が厳しく規制され宿主因子とは無関係でなければならない臨床の場にとっては、決定的に重要である。受容体の最適化は、誘導性SEAP分泌と非誘導性SEAP分泌との比を、40倍以上へと、ロバストに改良した（図5C、左側のパネル;pLeo619、PSV40-VHHA52-EpoRm-IL-6RBm-pA）。非誘導性の受容体活性化を最小限に抑えるEpoR3A変異と、負のフィードバックを低減するY759の突然変異との組合せは、相乗的に作用して信号雑音比を強化し、それが、観察された高いスイッチング性能をもたらすようである。そこで本発明者らは、標準GEMSプラットフォームとしてこの最適化された受容体足場構造を採用し、RR120を標的とするGEMSデバイスをGEMSRR120と名付けた。
【０１１６】
実施例4:インプットを異なる細胞内シグナリング経路にルート変更する
GEMSの応用可能性を拡げるために、本発明者らは、GEMSRR120（pLeo619）を、他の二量体化依存的シグナリング経路に適合させた。IL-6RB細胞内ドメインを、二量体化依存性シグナリングによって機能するFGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内ドメインに取り替えることによって、GEMSRR120を、MAPK経路を介してシグナルするようにルート変更した（Reichhart E et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2016, 55:6339-6342参照）。MAPK-GEMSRR120（MAPK依存性GEMSRR120）を、TetR-Elk1融合タンパク質（MKp37、PhCMV-TetR-ELK1-pA）およびTetR依存性レポータープラスミド（pMF111、OTet-PhCMVmin-SEAP-pA）によるレポーター遺伝子発現を駆動するように再配線した（図5C、右側のパネル）。シグナリングの動態は、JAK/STAT経路依存性受容体で採用したものと同様に、EpoRm膜貫通ドメインのC末端側に0〜4個のアラニン残基を挿入することによって調整することができるだろうと、本発明者らは考えたが（pLeo628、pLeo642、pLeo643、pLeo644、pLeo645、PSV40-VHHA52-EpoRm0-4A-FGFR1int-pA）、この場合は、受容体活性がアラニン残基の数によって劇的に変化することはないことがわかった（図6A）。さらなる分析には追加アラニン残基を持たない変異体（pLeo628）を選んだ。興味深いことに、MAPK-GEMSRR120を使用すると、JAK/STAT-GEMSRR120と比較して、より低いRR120濃度を、より高い変化倍率で検出することができた（図5C）。TetR-Elk1は、配列特異的DNA結合ドメイン（TetR）および転写活性化ドメイン（Elk1）を含有する合成哺乳類転写因子である（Keeley MB et al., Biotechniques, 2005, 39:529-536参照）。このタイプの転写因子の汎用性を実証するために、本発明者らは、TetRを別の配列特異的DNA結合ドメインPIP（プリスチナマイシン誘導性タンパク質（Fussenegger M et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1203-1208参照））で置き換え（pAT13、PhCMV-PIPELK1-pA）、MAPK-GEMSRR120およびコグネイトPIP特異的レポータープラスミド（pMF199、OPIPPhCMVmin-SEAP-pA）を使って、その性能を検証した（図6B）。親ネイティブ受容体によるGEMS性能をベンチマーク試験するために、本発明者らはHEK-293細胞にFGFR1またはIL-6Rをトランスフェクトし、それらをそれぞれbFGF（塩基性線維芽細胞成長因子）またはIL-6で活性化した。どちらの場合も、結果として得られたレポーター遺伝子発現は、対応するGEMS受容体で得られるものに匹敵するレベルに達したことから、GEMS活性化シグナリングは内在性受容体シグナリングの性能と同等であることが確認された（図7A〜B）。このGEMSプラットフォームがさらなるシグナリング経路と適合するかどうかを探索するために、そしてその広い利用可能性を確認するために、本発明は、VEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内ドメインを含有するGEMS変異体を遺伝子工学で作製した（pLeo690、PSV40-VHHA52-EpoRm0A-VEGFR2int-pA）。VEGFR2が、MAPKおよびPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）ならびにPLCG（ホスホリパーゼCガンマ）を活性化することは公知である（Abhinand CS et al., J. Cell Commun. Signal., 2016, 10:347-354参照）。事実、VEGFR2-GEMSシグナリングは、NFAT駆動型（pHY30、ONFAT-PhCMVmin-SEAP-pA）およびNF-κB駆動型（pKR32、ONF-κB-PhCMVmin-SEAP-pA）の標的遺伝子発現にルート変更された（図8）。
【０１１７】
実施例5:GEMSの標的をニコチンにする（GEMSニコチン）
GEMSの普遍性を調べるために、本発明者らは次に、薬理学的に活性な小分子としてニコチンに焦点を合わせ、ニコチンインプット用のシステムを再構築した。ハプテン応答性は、JAK/STAT依存性GEMSおよびMAPK依存性GEMSの受容体フレームワークにニコチン抗体mAb-Nic12（Tars K et al., J. Mol. Biol., 2012, 415:118-127）のVHおよびVL（それぞれ重鎖および軽鎖の可変フラグメント）を別々にクローニングすることによって作り出した。結晶構造からニコチンはFab（fragment antigen binding）の重鎖と軽鎖の間に深く埋もれることが判明したので、この抗体を選んだ。JAK/STAT-GEMSニコチンおよびMAPK-GEMSニコチン（pLeo626/pLeo627、pLeo667/pLeo668、PSV40-VH/VL-EpoRm-IL-6RBm/FGFR1int-pA）は、紙巻きタバコを1本喫煙した後に到達する典型的血清中ニコチン濃度であるわずか100nM程度の濃度のニコチンにより、またはニコチン代替品を使用した場合に、有意に誘導された（図9;Benowitz NL et al., Handb. Exp. Pharmacol., 2009, 192:29-60参照）。
【０１１８】
実施例6:GEMSの標的を細胞外タンパク質にする（GEMSSunTag）
細胞外タンパク質を検知するようにGEMSを適合させることもできるかどうかを調べるために、一続きになった8つのGCN4ペプチドタグからなるSunTag8×（Tanenbaum ME et al., Cell, 2014, 159:635-646参照）をmCherryに融合し、細菌において発現させた。SunTagの二量体化またはオリゴマー化を誘導し、よって受容体を活性化するために、本発明者らは、よく特徴づけられたGCN4特異的scFv（scFvαGCN4）をGEMS受容体フレームワークにクローニングした。JAK/STAT-GEMSSunTagおよびMAPK-GEMSSunTag（pLeo620、pLeo669、PSV40-scFvαGCN4-EpoRm-IL-6RBm/FGFR1int-pA）は、SunTag8×-mCherry融合タンパク質を含有する粗細菌溶解物の希釈度1:5,000（v/v）で誘導され、事前に精製することなく溶解物を使用することができた（図10A）。他のGEMSデバイスでは同じ条件によってレポーター発現が誘導されなかったことから、細胞シグナリングは溶解物中の他の物質ではなくSunTagによって誘導されることが確認された（図10B）。
【０１１９】
実施例7:GEMSの標的をPSAにする（GEMSPSA）
本発明者らは、本システムを単量体タンパク質の検知に適合させることができるかどうかを調べた。本発明者らは、よく調べられており臨床的にも重要なバイオマーカーとしてPSAを選んだ。PSAは、前立腺によって生産される酵素であり、前立腺がん発生のスクリーニングに使用されている。前立腺がんは男性では最も一般的ながんであり、男性の1〜2％における死因である（Attard G et al., Lancet, 2016, 387:70-82参照）。ヘテロ二量体型受容体を形成すると予想される非オーバーラップエピトープに対するscFvを使ってGEMSPSAを設計した。PSAの異なるエピトープに結合することが結晶化によって示された3種の抗体8G8F5、5A5および5D3D11（Menez R et al., J. Mol. Biol., 2008, 376:1021-1033参照）を、VLとVHの間に（GGGGS）4リンカー配列を加えることによってscFvに変換した。これらのscFvを受容体フレームワークにクローニングしてVHをEpoR細胞外ドメインに融合した。3種のヘテロ二量体型JAK/STAT-GEMSの組合せを試験した。それらのうち、scFv8G8F5（pLeo622、PSV40-scFv8G8F5-EpoRm-IL-6RBm-pA）とscFv5A5（pLeo623、PSV40-scFv5A5-EpoRm-IL-6RBm-pA）とを含有するJAK/STAT-GEMSPSAが、ロバストなPSA依存性シグナリングを生成した（図11A）。scFv5D3D11（pLeo621、PSV40-scFv5D3D11-EpoRm-IL-6RBm-pA）を含有する受容体は、どちらの受容体と組み合わせた場合も、PSAで誘導されなかった。
【０１２０】
JAK/STAT-GEMSPSA（pLeo622/pLeo623）は、7.5±0.5ng/mL（264±18pM）のEC50でシグナルすることが測定され、PSAスクリーニングに関して診断上のグレーゾーンと呼ばれる4〜10ng/mLの臨床上重要な範囲では、ほとんど直線的応答を示した（図12;Polascik TJ, J. Urol., 1999, 162:293-306参照）。レポーター発現の高い信号雑音比により、診断上決定的なPSA濃度の正確な識別が、高い有意性で可能になった（図11A）。同じ機能的scFvペアを持つMAPK-GEMSPSA（pLeo670/pLeo671、PSV40-scFv8G8F5/scFv5A5-EpoRm-FGFR1int-pA）はさらに高感度で、0.55±0.03ng/mLのEC50を持ち（図12）、わずか0.1ng/mLのPSA濃度でも容易に検知することができた（図11B）。生化学的再発は典型的にはPSA濃度≧0.2ng/mLと定義されるので、これは、前立腺全摘出術処置を受けた患者にとっては重要であるかもしれない（Cookson MS et al., J. Urol., 2007, 177:540-545参照）。
【０１２１】
前立腺がんと診断された患者の血清を、前立腺全摘出術を受けた患者からの陰性対照試料と比較して分類するために、感度が高い方のMAPK-GEMSPSAを使用した（図11C）。レポーターアウトプットはELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって決定される血清PSAレベルに比例した。このデータにより、GEMSを発現するように操作されたヒト細胞は、臨床的に意味を持つ濃度範囲でバイオマーカーを検出できることが確認される。
【０１２２】
実施例8:MAPK-GEMSとJAK/STAT-GEMSの多重化
本発明者らは、同じ細胞中で異なるGEMSが両立して、独立に作動することで、2つの異なるインプットを検知し、2つの異なるアウトプットを生み出すことができるかどうかを調べた。FGFR1の細胞内ドメインを含有するGEMS（pLeo628、MAPK-GEMS）は主にMAPKシグナリングを活性化したが、NFATシグナリングおよびSTAT3シグナリングにもわずかな効果を持っていた。しかし、FGFR1のPLCG結合部位へのY766F突然変異の導入（pLeo692、MAPK-GEMS）およびSTAT結合部位へのY677F突然変異の導入（pLeo693、MAPK-GEMS）は、元のMAPKシグナリングの性能は維持しつつ、このクロストークを消滅させた（図13A;Ornitz DM & Itoh N, Rev. Dev. Biol., 2015, 4:215-266参照）。同様に、細胞内IL-6RBドメインにおけるY759A突然変異（pLeo619、JAK/STAT-GEMS）は、元のJAK/STATシグナリング性能を維持しつつ、MAPKシグナリングへの干渉を解消した（図13B;Silver JS & Hunter CA, J. Leukoc. Biol., 2010, 88:1145-1156参照）。本発明者らは、細胞培養上清中で別々に分析することができる2種のアウトプットを得るために、TetRレポータープラスミドのSEAPを、生物発光レポータータンパク質NanoLucの分泌型変異体で置き換えた（pLeo665、OTet-PhCMVmin-SecNanoLuc-pA; Hall MP et al., ACS Chem. Biol., 2012, 7:1848-1857参照）。MAPK-GEMSRR120（Y677F）（pLeo693）およびJAK/STAT-GEMSSunTag（pLeo620）をコトランスフェクトした。その結果生じたSEAP（STAT3レポーター）発現およびNanoLuc（MAPKレポーター）発現により、独立したインプット特異的活性化と、これら2種のGEMSシグナリング経路の直交的なプロセシングとが確認された（図13C）。
【０１２３】
実施例9:GEMSはハイブリドーマ細胞におけるIL-10分泌を誘導する
GEMSが免疫細胞のシグナリング経路を利用できるかどうかを調べるために、MAPK-GEMSRR120（pLeo694）とJAK/STAT-GEMSRR120（pLeo695）をハイブリドーマ細胞株WEN1.3に安定に組み込んだ（Menez R et al., J. Mol. Biol., 2008, 376:1021-1033参照）。RR120によるGEMS活性化時のIL-10分泌のプロファイリングにより、GEMSRR120は内在性MAPKシグナリングおよびJAK/STAT経路を利用していて、IL-10分泌を実質的に増加させることが、確認された（図14）。
【０１２４】
実施例10:カフェイン誘導性遺伝子スイッチの設計
平均的なコーヒー一杯を飲んだ後に、カフェインの血中レベルは低μM範囲のピークに達するので（Noguchi K et al., J. Pharmacol. Sci., 2015, 127:217-222、Teekachunhatean S et al., ISRN Pharmacol., 2013, 2013:1-7参照）、ここでの目的のために、本発明者らは、非毒性で（図15）生理学的に意味を持つ濃度のためのカフェインセンサーシステムを必要とした。これらの濃度を捕捉するために、本発明者らは、哺乳動物細胞におけるカフェイン誘導性タンパク質二量体化システムを確立することで、さまざまなタイプの遺伝子スイッチを作り出した。（i）DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインにカフェイン結合性単一ドメイン抗体aCaffVHHを融合すると、カフェイン応答的にキメラ標的プロモーターを駆動する合成転写因子が再構成される。（ii）カフェイン結合性単一ドメイン抗体aCaffVHHをさまざまな哺乳動物受容体クラスの細胞内シグナリングドメインに融合すると、合成シグナリングカスケードが再構成され、カフェインは、さまざまな経路特異的プロモーターを用量依存的に活性化することができるようになる（図16）。
【０１２５】
aCaffVHH依存性転写因子に基づく遺伝子スイッチを設計するために、本発明者らは、aCaffVHHをDNA結合性TetRドメインにC末端融合すると共に（PSV40-TetR-aCaffVHH-pASV40、pDB307）、トランス活性化12アミノ酸ペプチド（VPmin）の4回リピートにN末端融合した（PCAG-aCaffVHH-VPminx4-pAβG、pDB335）。この設計では、カフェインは、DNA結合ドメインをトランス活性化VPminドメインと二量体化させて、遺伝子発現につながるはずである（図17A）。TetR依存性プロモーターによって制御されるレポーター遺伝子ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）（PtetO7-SEAP-pASV40、pMF111）を利用することにより、本発明者らは、100μMカフェインの存在下で、明瞭なカフェイン依存性遺伝子発現を観察した（図17A）。
【０１２６】
本発明者らは、カフェインに対するこの低感度は、この分割転写因子機構（split transcription factor setup）にシグナル増幅が存在しないからかもしれないと推論した。そこで本発明者らは、このカフェイン誘導性二量体化システムを、さまざまなシグナリング経路特異的シグナル伝達ドメインに応用した。まず本発明者らは、aCaffVHHをN末端で、インターロイキン13受容体サブユニットアルファ1（IL13Rα1）の膜貫通ドメインを融合し（PhCMV-aCaffVHH-IL13Rα1-pAbGH、pDB323）、またインターロイキン4受容体サブユニットアルファ（IL4Rα）の膜貫通ドメインに融合した（PhCMV-aCaffVHH-IL4Rα-pAbGH、pDB324）。カフェインの添加はこれらの受容体のヘテロ二量体化を誘導し、シグナル伝達兼転写活性化因子6（STAT6）シグナリングを活性化するはずである。事実、STAT6（PhCMV-STAT6-pAbGH、pLS16）およびSTAT6応答性レポーター構築物（PSTAT6-SEAP-pASV40、pLS12）をコトランスフェクトしたところ、1μMカフェインから始まるカフェイン依存的遺伝子発現を認めることができた（図17B）。これは、pDB307とpDB335とを用いる分割転写因子機構と比較して、相当な感度の改良である。しかし、SEAP単位でのこの機構の絶対的アウトプット強度は限られていたので、さらに強力なシステムが必要になった。
【０１２７】
このアウトプット強度問題を克服するために、本発明者らはaCaffVHHをC末端でマウス線維芽細胞成長因子受容体1（mFGFR1）の細胞内部分に融合した（PhCMV-mFGFR1405-822-aCaffVHH-pAbGH、pDB395）（Grusch M et al., EMBO J., 2014, 33:1713-1726参照）。カフェインの存在はmFGFR1405-822-aCaffVHHをホモ二量体化して、MAPKシグナリングにつながるはずであり、本発明者らは、TetR-Elk1（PhCMV-TetR-Elk1-pAbGH、MKp37）をコトランスフェクトすることによって、そのMAPKシグナリングをTetR依存性pMF111にルート変更した。MAPKシグナリングカスケードのシグナル増幅（Huang CY & Ferrell JE, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1996, 93:10078-10083参照）は、わずか0.01μMカフェインの存在下で、強くて高感度な遺伝子発現応答をもたらした（図17C）。しかし、カフェインに対するこの並外れた高感度は、痕跡量のカフェインでさえ遺伝子回路が誘導されてしまうだろうから、治療の場では有害になる場合もある。加えて、ルート変更タンパク質TetR-Elk1が必要であることは、このシステムには3種のプラスミドをトランスフェクトする必要があることを意味した。
【０１２８】
mFGFR1依存性システムの改良として、本発明者らは、aCaffVHHをN末端でエリスロポエチン受容体誘導体（EpoR）に融合した（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH、pDB306）（Kawahara M et al., J. Biochem., 2001, 130:305-312、Scheller L et al., Nat. Chem. Biol., 2018, 14:723-729参照）。これは、カフェイン存在下での受容体のホモ二量体化と、それに続くSTAT3を介したJAK/STATシグナリングにつながる。HEK-293T細胞はSTAT3を内在性に発現させるので、pDB306とSTAT3依存性レポータープラスミド（PSTAT3-SEAP-pASV40、pLS13）とをトランスフェクトするだけでよかった。この機構は、1μMカフェインで最大応答を与える強くて高感度な遺伝子発現システムをもたらした（図17D）。
【０１２９】
全体として、カフェイン依存性STAT3シグナリングが、強さ（potency）、生理学的カフェインレベルに対する感度、および構成要素の数という観点から最適フィットであることが判明したので、さらなる実験にはこれを使用した。受容体ホモ二量体化と内在性STAT3発現ゆえに、本発明者らは2つの構成要素をトランスフェクトするだけで、完全なC-STARシステムを得ることができた。本明細書に提示した遺伝子発現システムは異なる感度を有し、直交するプロモーターに依拠するので、複数の受容体を発現させることによってカフェインに対する非線形的な応答をデザイナー細胞に付与するために、それらを使用することができた（図18A〜B）。
【０１３０】
実施例11:カフェイン誘導性C-STARシステムの特徴づけ
C-STARシステムの機能性はヒトテロメラーゼ逆転写酵素不死化ヒト間葉系幹細胞（hMSC-hTERT）でも実証された（図19A）。ただし、引き続いて行った実験ではいずれも、より高いカフェイン感度およびタンパク質分泌能を示すHEK-293T細胞を使用した。長期実験のために、C-STAR受容体（PhEF-1α-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pASV40、pDB326）を、HEK-293T細胞のゲノムに安定に組み込んで、デザイナー細胞株C-STARDB1を作り出した。このポリクローナル細胞株のカフェイン用量応答関係は、一過性トランスフェクト細胞のものと類似していた（図19B）。しかし、モノクローナルC-STAR細胞株の選択により、カフェインに対して異なる感度を持つクローンが得られた（図20A〜D）。さらなるインビトロ実験はC-STARDB1細胞株を使って行った。
【０１３１】
血中のカフェイン濃度が高い時間ウィンドウを捕捉するには、インビボC-STARシステムが、誘導物質への短い曝露後に遺伝子発現を誘導する必要があるだろう。生理学的に意味を持つ濃度のカフェインへの曝露は、わずか1時間でC-STARシステムの半最大応答（half-maximal response）を誘導し、最大応答は曝露の6時間後に得られた（図21）。ヒト血液におけるカフェインの半減期はおよそ5時間であるから（Teekachunhatean S et al., ISRN Pharmacol., 2013, 2013:1-7参照）、カフェインによるC-STARシステムのインビボ活性化は、実行可能なはずである。インビトロで試験したカフェイン類似体のなかでは、テオフィリンだけが、C-STARの中等度の交差活性化を、生理学的状況では到達しそうにない1μM濃度において示した（図22）（Hicks MB et al., Food Res. Int., 1996, 29:325-330、Hackett J et al., J. Anal. Toxicol., 2008, 32:695-701参照）。カフェイン添加後のC-STARシステムの応答時間を評価したところ、C-STARシステムがカフェインの存在に適時に応答して、12時間において検出可能な量のレポータータンパク質を与えたのに対し、カフェインを欠く陰性対照ではSEAP発現の誘導はみられなかった（図23A）。この遺伝子回路の可逆性の試験として、C-STARDB1細胞を生理学的に意味を持つ濃度のカフェインまたは等価な量のH2O（モック）と共にインキュベートし、毎日、カフェインとモックを入れ替えた（図23B）。本システムはカフェインを除去することで遮断され、細胞にカフェインを新しく添加することで再び活性化することができたので、カフェインの除去または分解後の可逆性が示された。
【０１３２】
実施例12:C-STARを使った市販飲料中のカフェインの定量
カフェインはさまざまな飲料の構成要素である。そこで、C-STARシステムの誘導に利用できる飲料の範囲を拡げるために、そしてまた合成生物学に着想を得たカフェイン検知システムの特異性を確証するために、C-STARDB1細胞に、次に挙げるものを含む26種の製品による負荷をかけた:Nespresso Grand Cru（登録商標）、Starbucks（登録商標）コーヒー、Red Bull（登録商標）、Cuida Te（登録商標）ティーカプセルおよびCoca-Cola（登録商標）（図24）。数種のNespresso Grand Cru（登録商標）カプセルは、陰性対照として、そのカフェイン除去バージョンでも試験した（Vivalto lungo decaffeinato（登録商標）、Volluto decaffeinato（登録商標）、Decaffeinato intenso（登録商標）およびArpeggio decaffeinato（登録商標））。これらの飲料試料のうちの3種はカフェイン含有バージョンもあり（Vivalto lungo（登録商標）、Volluto（登録商標）およびArpeggio（登録商標））、製造者によると、それらはカフェイン含量を除けば、それぞれのカフェイン除去バージョンと同一であるとのことなので、それらにより、本発明者らは、カフェインそのものが遺伝子発現をアップレギュレートしているのであって、コーヒー中に存在する他の何百という化合物のいずれかが遺伝子発現をアップレギュレートしているのではないことを確認することができた（Gaascht F et al., Genes Nutr., 2015, 10:51参照）。全体として、本発明者らの飲料試料は、0〜4.8g L-1という広いカフェイン濃度範囲をカバーした。標準用量応答曲線は純粋なカフェインを使って得た。これにより、本発明者らは、飲料試料と共にインキュベートされたC-STARDB1細胞からのSEAP値を、カフェイン濃度に変換することができた。
【０１３３】
試験したすべての試料で、ベンダーによって示されたカフェイン濃度は、C-STARDB1細胞で測定されたものとよく一致していた（図25A〜B）。カフェイン除去飲料試料はC-STARシステムの極めて低い活性化を示した（図25A〜B）。これらの結果は、C-STARが用量依存的なカフェイン特異的応答を再現性よく生成することを示している。
【０１３４】
実施例13:肥満誘導性2型糖尿病のC-STAR処置
導管付きマイクロコンテナにおける、設計されたC-STARシステムの機能性が、純粋なカフェインを使って、インビトロで初めて確認された（図26）。インビボで薬物送達用マイクロカプセルインプラントの免疫保護機能を検証した後（図27A〜B）、デザイナー細胞カプセルが埋植されたマウスに、室温のVolluto（登録商標）コーヒー（Nespresso Grand Cru（登録商標））またはH2Oを、飲用として与えた。C-STARシステムを移植されたマウスだけが、可逆的なコーヒー誘導性SEAP発現を示した（図28A〜B）。同じマウスを数日後に再刺激したところ、最初の実験と同じ応答を示した（図28C〜D）。
【０１３５】
次に、このシステムを肥満誘導性T2Dのカフェイン誘導性処置に利用できるかどうかを調べるために、本発明者らは、レポーター遺伝子SEAPを、T2Dの処置のために臨床的に認可された改変タンパク質である、マウスIgGにカップリングされた合成ヒトグルカゴン様ペプチド（shGLP-1）をコードする遺伝子で置き換えた（PSTAT3-shGLP-1-pASV40、pDB387）（Holz GG IV et al., Nature, 1993, 361:362-365参照）。結果として得られた構築物を組み込んだC-STARDB6細胞株によるインビトロ実験によって、shGLP-1のカフェイン依存的発現を検証した（図29A〜B）。マウスにおけるカフェインおよびshGFP-1の薬物動態分析により、細胞ベースの糖尿病療法に関するC-STARDB6の潜在的可能性が確認され、コーヒーの単回経口投与は、持続的なshGLP-1活性をトリガーするのに十分な、血流におけるカフェインの一過性サージをもたらした（Xu K et al., Neuroscience, 2016 322:129-137参照）（図30A〜B）。重要なことに、さらに高レベルのカフェイン依存的shGLP-1生産でも、それに続いて低血糖副作用が観察されることはなく（図31A〜B）、正常血糖環境におけるGLP-1の固有の不活性が確認された（Doyle ME & Egan JM, Pharmacol. Ther., 2007, 113:546-593、Meier JJ et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003, 88:2719-2725参照）。次に本発明者らは、インスリン感度が損なわれている2種のT2Dマウスモデルで、これらの細胞の有効性を調べた。この目的のために、食餌誘導性肥満マウス（DIO;King AJF, Br. J. Pharmacol., 2012, 166:877-894参照）およびレプチン受容体欠損マウス（db/db;King AJF, Br. J. Pharmacol., 2012, 166:877-894参照）の腹腔内にC-STARDB6細胞を含有するカプセルまたはアウトプットモジュールpDB387だけを備えた細胞を含有する対照カプセル（モック）を埋植した。すべてのマウスにVolluto（登録商標）コーヒーを定期的に経口投与した。C-STARDB6細胞で処置されたDIOマウスは、無処置対照群と比較して、2週間の実験時間経過中ずっと、低い空腹時血中グルコース値を呈した（図32A）。C-STARDB6処置T2Dマウスにおける改良された血糖管理を実証するために、グルコース耐性試験を行って食餌応答をシミュレートした。C-STARDB6誘発性GLP-1生産（図32B）はDIOマウスにおけるインスリンレベルを増加させ（図32C）、コーヒー処置糖尿病マウスにおけるほぼ恒常性の（near-homeostatic）食後グルコース代謝を確立した（図32D）。DIOマウスと比較して増加した高インスリン血症を発症するdb/dbマウスの場合（Ye H et al., Nat. Biomed. Eng., 2016, 1:0005参照;図32Cおよび図34B）、GLP-1依存性インスリン分泌作用（図34A〜B）およびグルコース耐性（図34C）はやはり回復したが、より高用量の埋植C-STARDB6細胞を必要とした（図34A〜C）。重要なことに、このコーヒー誘発性C-STARDB6ベースの糖尿病治療は、処置された動物の心拍数に影響を及ぼさなかったが（図33Aおよび図34D）、2週間後には食餌誘導性肥満マウスの体重を低減した（図33B）。
【０１３６】
これらの結果は、肥満誘導性2型糖尿病を処置するためにインビボでC-STARシステムを使用できることを示している。
【０１３７】
（表１）両側t検定のP値、T値および自由度
2020110135.tif 000008
2020110135.tif 000009
2020110135.tif 000010
2020110135.tif 000011
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【０１３８】
配列
2020110135.tif 000013
2020110135.tif 000014
2020110135.tif 000015
2020110135.tif 000016
【図１】
2020110135.tif 000017
【図２】
2020110135.tif 000018
【図３】
2020110135.tif 000019
【図４】
2020110135.tif 000020
【図５】
2020110135.tif 000021
【図６】
2020110135.tif 000022
【図７】
2020110135.tif 000023
【図８】
2020110135.tif 000024
【図９】
2020110135.tif 000025
【図１０】
2020110135.tif 000026
【図１１】
2020110135.tif 000027
【図１２】
2020110135.tif 000028
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020110135.tif 000031
【図１６】
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【図１７】
2020110135.tif 000033
【図１８】
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【図１９】
2020110135.tif 000035
【図２０】
2020110135.tif 000036
【図２１】
2020110135.tif 000037
【図２２】
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【図２３】
2020110135.tif 000039
【図２４】
2020110135.tif 000040
【図２５】
2020110135.tif 000041
【図２６】
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【図２７】
2020110135.tif 000043
【図２８】
2020110135.tif 000044
【図２９】
2020110135.tif 000045
【図３０】
2020110135.tif 000046
【図３１】
2020110135.tif 000047
【図３２】
2020110135.tif 000048
【図３３】
2020110135.tif 000049
【図３４】
2020110135.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月3日(2020.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020110135000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、
該受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で、その足場ドメインを介して多量体化し、
該キメラリガンド受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、
該キメラリガンド受容体。
【請求項２】
1つまたは複数の追加受容体サブユニットをさらに含み、
各追加受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
請求項1記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３】
受容体サブユニットがそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する、請求項2記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４】
キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、請求項3記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５】
各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインが同じリガンドに結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項６】
2つ以上の受容体サブユニットを含むキメラリガンド受容体であって、
各受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
該受容体サブユニットがそれらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、
各足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインが同じリガンドに結合し、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
リガンドの結合が、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する、
該キメラリガンド受容体。
【請求項７】
受容体サブユニットの多量体化がリガンド結合より前に起こる、請求項3〜6のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項８】
多量体化した受容体サブユニットが、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む、請求項3〜7のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項９】
多量体化した受容体サブユニットが二量体を含む、請求項3〜8のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１０】
コンフォメーション再編成が各足場ドメインの自軸周りの回転を含む、請求項4〜9のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１１】
コンフォメーション再編成が各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する、請求項4〜10のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１２】
前記足場ドメインがサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１３】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１４】
前記足場ドメインがそのネイティブリガンドに対して不活性である、請求項1〜13のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１５】
前記足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性である、請求項14記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１６】
前記足場ドメインが、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１７】
前記足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１８】
細胞外ドメインが1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項１９】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている、請求項1〜18のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２０】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている、請求項1〜18のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２１】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基がアラニン残基である、請求項19または請求項20記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２２】
膜貫通ドメインが1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基をさらに含む、請求項21記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２３】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている、請求項19〜22のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２４】
前記リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている、請求項1〜23のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２５】
細胞外リンカー領域が1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、該1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニン（SEQ ID NO: 26）を含む、請求項24記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２６】
前記リガンド結合ドメインが足場ドメインのネイティブリガンドに結合しない、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２７】
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合しない、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２８】
前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来しない、請求項1〜25のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項２９】
前記リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する、請求項1〜28のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３０】
可溶性リガンドが、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される、請求項29記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３１】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項1〜29のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３２】
前記リガンド結合ドメインが抗原に結合する、請求項1〜29のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３３】
前記リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、請求項32記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３４】
前記リガンド結合ドメインが単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む、請求項33記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３５】
前記リガンド結合ドメインのそれぞれが単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvが抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項2〜33のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３６】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに異なる、請求項2〜35のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３７】
キメラリガンド受容体が2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項36記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３８】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに同じである、請求項2〜35のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項３９】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である、請求項33記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４０】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である、請求項1〜39のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４１】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜40のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４２】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜40のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４３】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項1〜40のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４４】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜43のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４５】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される、請求項1〜44のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４６】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４７】
前記細胞内シグナリングドメインがFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４８】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項４９】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項1〜45のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５０】
前記細胞内シグナリングドメインが、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、該1つまたは複数の改変が1つまたは複数のアミノ酸置換である、請求項1〜49のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５１】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性であり、
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合せず、かつ
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、
請求項1〜50のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５２】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項51記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５３】
前記リガンド結合ドメインが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む、請求項52記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５４】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する、請求項51記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５５】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項54記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５６】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項51〜55のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５７】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項56記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５８】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項51〜57のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体。
【請求項５９】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項58記載のキメラリガンド受容体。
【請求項６０】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体のcDNAを含む、請求項60記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６２】
キメラリガンド受容体サブユニットをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドであって、
該受容体サブユニットが、1つまたは複数の追加受容体サブユニットの存在下で受容体サブユニットを多量体化させる能力を有する足場ドメインを含み、該受容体サブユニットが、多量体化された場合に、リガンド結合によって誘導されるコンフォメーション再編成を起こす能力を有し、
該足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
該膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６３】
1つまたは複数の核酸配列をさらに含み、
各追加核酸配列が追加キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、
各追加受容体サブユニットが足場ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの足場ドメインが細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
各追加受容体サブユニットの細胞外ドメインがリガンド結合ドメインに機能的に連結され、
各追加受容体サブユニットの膜貫通ドメインが細胞内シグナリングドメインに機能的に連結されている、
請求項62記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６４】
受容体サブユニットが、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成する、請求項62または請求項63記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６５】
キメラ受容体にリガンドが結合すると、多量体化した受容体サブユニットがコンフォメーション再編成を起こす、請求項62〜64のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６６】
各受容体サブユニットのキメラリガンド結合ドメインが同じリガンドに結合する、請求項62〜65のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６７】
2つ以上の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチドであって、
各核酸配列が、キメラリガンド受容体サブユニットをコードし、
各受容体サブユニットが、足場ドメインを含み、
該受容体サブユニットが、それらの足場ドメインを介して多量体化することで、キメラリガンド受容体を形成し、
各足場ドメインが、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、
該細胞外ドメインが、リガンド結合ドメインに機能的に連結され、各受容体サブユニットの該リガンド結合ドメインが同じリガンドに結合し、
該膜貫通ドメインが、細胞内シグナリングドメインに機能的に連結され、
リガンドの結合が、多量体化した受容体サブユニットのコンフォメーション再編成を誘導する、
該単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
受容体サブユニットの多量体化がリガンド結合より前に起こる、請求項64〜67のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６９】
多量体化した受容体サブユニットが、二量体、三量体、四量体、五量体または六量体を含む、請求項64〜68のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
多量体化した受容体サブユニットが二量体を含む、請求項64〜69のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
コンフォメーション再編成が各足場ドメインの自軸周りの回転を含む、請求項65〜70のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
コンフォメーション再編成が各受容体サブユニットの細胞内シグナリングドメインを活性化する、請求項65〜71のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７３】
前記足場ドメインがサイトカイン受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項62〜72のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７４】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項62〜73のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７５】
前記足場ドメインがそのネイティブリガンドに対して不活性である、請求項69〜83のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性である、請求項74記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記足場ドメインが、SEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項62〜76のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記足場ドメインの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインの両方が、1つまたは複数の改変を含む、請求項62〜77のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７９】
細胞外ドメインが1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、任意で、細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含む、請求項62〜78のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８０】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインに隣接して挿入されている、請求項62〜79のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８１】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメイン内に挿入されている、請求項62〜79のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８２】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基がアラニン残基である、請求項80または請求項81記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８３】
膜貫通ドメインが1つ、2つ、3つまたは4つの追加アラニン残基をさらに含む、請求項82記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８４】
1つまたは複数の追加アミノ酸残基が膜貫通ドメインのC末端側に挿入されている、請求項80〜83のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている、請求項62〜84のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８６】
細胞外リンカー領域が1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、該1つまたは複数のアミノ酸残基が、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニン（SEQ ID NO: 26）を含む、請求項85記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記リガンド結合ドメインが足場ドメインのネイティブリガンドに結合しない、請求項62〜86のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合しない、請求項62〜86のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８９】
前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来しない、請求項62〜86のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子および化学的作用物質からなる群より選択される可溶性リガンドに結合する、請求項62〜89のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９１】
可溶性リガンドが、抗原、サイトカイン、生存因子、ケモカイン、ホルモン、伝達物質、成長因子、細胞外マトリックスおよびデス因子からなる群より選択される、請求項90記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項62〜90のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記リガンド結合ドメインが抗原に結合する、請求項62〜90のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、請求項93記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記リガンド結合ドメインが単鎖可変フラグメント（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）を含む、請求項94記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記リガンド結合ドメインのそれぞれが単鎖可変フラグメント（scFv）を含み、任意で、各scFvが抗原の異なるエピトープに特異的に結合する、請求項63〜94のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９７】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに異なる、請求項63〜96のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９８】
キメラリガンド受容体が2つのリガンド結合ドメインを含み、1つのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）を含み、2つめのリガンド結合ドメインが免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項97記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９９】
各受容体サブユニットのリガンド結合ドメインが互いに同じである、請求項63〜96のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１００】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体である、請求項94記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインのネイティブリガンド結合に対して不活性である、請求項62〜100のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記細胞内シグナリングドメインが、足場ドメインの内在性細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項62〜101のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項62〜101のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性サイトカイン受容体細胞内シグナリングドメインを含まない、請求項62〜101のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜104のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインからなる群より選択される、請求項62〜105のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RBの細胞内シグナル伝達ドメインであり、JAK/STATシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
前記細胞内シグナリングドメインがFGFR1の細胞内シグナル伝達ドメインであり、MAPKシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PLCGシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
前記細胞内シグナリングドメインがVEGFR2の細胞内シグナル伝達ドメインであり、PI3K/Aktシグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項62〜106のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
前記細胞内シグナリングドメインが、細胞内シグナリングドメインのシグナリング活性を調整する1つまたは複数の改変を含み、任意で、該1つまたは複数の改変が1つまたは複数のアミノ酸置換である、請求項62〜110のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記足場ドメインが、エリスロポエチン受容体（EpoR）の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むか、またはSEQ ID NO:8に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、該細胞外ドメインがF93Aアミノ酸置換を含み、該足場ドメインがエリスロポエチンに対して不活性であり、
前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチンに結合せず、かつ
前記細胞内シグナリングドメインが、内在性エリスロポエチン受容体（EpoR）細胞内シグナリングドメインを含まない、
請求項62〜111のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
前記リガンド結合ドメインがカフェインに結合する、請求項112記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
前記リガンド結合ドメインが、カフェインの存在下でホモ二量体化する単一ドメインVHHラクダ科抗体を含む、請求項113記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）に結合する、請求項112記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
前記リガンド結合ドメインが、ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagまたはPSA（前立腺特異抗原）を標的とする抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項115記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
前記細胞内シグナリングドメインが、IL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメイン、FGFR1（線維芽細胞成長因子受容体1）の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはVEGFR2（血管内皮成長因子受容体2）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項112〜116のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナリング経路、PLCG（ホスホリパーゼCガンマ）シグナリング経路またはPI3K/Akt（ホスファチジルイノシトール3キナーゼ/プロテインキナーゼB）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項117記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
前記細胞内シグナリングドメインがIL-6RB（インターロイキン6受容体B）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項112〜118のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記細胞内シグナリングドメインが、JAK/STAT（ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達兼転写活性化因子）シグナリング経路を介して下流シグナリングを誘導する、請求項119記載の単離されたポリヌクレオチドまたは一組の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
請求項60〜120のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは一組のポリヌクレオチドを含むベクターまたは一組のベクター。
【請求項１２２】
請求項60〜120のいずれか一項記載のポリヌクレオチドもしくは一組のポリヌクレオチドまたは請求項121記載のベクターもしくは一組のベクターを含む遺伝子操作された細胞。
【請求項１２３】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞。
【請求項１２４】
標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む操作された導入遺伝子をさらに含む、請求項122または請求項123記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２５】
合成プロモーターが、キメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、請求項124記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２６】
標的産物が、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より選択される、請求項124または請求項125記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２７】
標的産物がグルカゴン様ペプチド1である、請求項124〜126のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２８】
1つまたは複数の追加キメラリガンド受容体をさらに発現する、請求項122〜127のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１２９】
キメラリガンド受容体がそれぞれ互いに異なる、請求項128記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３０】
各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインが異なる可溶性リガンドに結合する、請求項129記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３１】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体を2つ以上発現する、遺伝子操作された細胞。
【請求項１３２】
キメラリガンド受容体がそれぞれ互いに異なる、請求項131記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３３】
各キメラリガンド受容体のリガンド結合ドメインが異なる可溶性リガンドに結合する、請求項132記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３４】
2つ以上の操作された導入遺伝子をさらに含み、各導入遺伝子が、標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む、請求項128〜133のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３５】
各合成プロモーターが、細胞上に発現された2つ以上のキメラリガンド受容体のうちの異なるキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、請求項134記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３６】
各標的産物が、治療用分子、予防用分子および診断用分子からなる群より独立して選択される、請求項134または請求項135記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３７】
哺乳動物細胞である、請求項122〜136のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３８】
前記哺乳動物細胞が幹細胞または神経細胞である、請求項137記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１３９】
前記幹細胞が、成体幹細胞、iPS細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞および間葉系幹細胞（MSC）からなる群より選択される、請求項138記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４０】
前記哺乳動物細胞が免疫細胞である、請求項137記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４１】
前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、NK細胞および樹状細胞からなる群より選択される、請求項140記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４２】
前記免疫細胞がT細胞である、請求項140記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４３】
前記T細胞が、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞、ナチュラルキラーT細胞およびガンマ・デルタT細胞からなる群より選択される、請求項142記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１４４】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体または請求項122〜143のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞を生体組織または生体液と接触させる工程を含む方法。
【請求項１４５】
生体組織または生体液が、対象中にあるか、または対象から得られる、請求項144記載の方法。
【請求項１４６】
対象が、ある医学的状態と診断されたか、ある医学的状態を発症するリスクがあるか、またはある医学的状態を有すると疑われる対象であり、任意で、該医学的状態が、がんまたは炎症状態である、請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
請求項1〜59のいずれか一項記載のキメラリガンド受容体または請求項122〜143のいずれか一項記載の遺伝子操作された細胞を、キメラリガンド受容体がコグネイトリガンドに結合するのに適した条件下で、コグネイトリガンドと接触させる工程
を含み、
該キメラリガンド受容体とのコグネイトリガンドの結合が、多量体化した足場ドメインのコンフォメーション再編成を誘導して、それが細胞内シグナリングドメインを活性化する、
シグナリング経路を活性化する方法。
【請求項１４８】
細胞の表面にコグネイトリガンドを投与する工程をさらに含む、請求項147記載の方法。
【請求項１４９】
・前記リガンド結合ドメインをコードする第1核酸を足場ドメインをコードする第2核酸に融合し、かつ第2核酸を細胞内シグナリングドメインをコードする第3核酸と融合することによって、多量体化能を有しかつ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む足場ドメインと、足場ドメインの細胞外結合ドメインに機能的に連結されたリガンド結合ドメインと、足場ドメインの膜貫通ドメインに機能的に連結された細胞内シグナリングドメインとを含むキメラリガンド受容体をコードするキメラリガンド受容体発現ベクターを合成する工程、
・キメラリガンド受容体発現ベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および
・細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程
を含む、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法。
【請求項１５０】
請求項60〜120のいずれか一項記載の単離されたポリヌクレオチドもしくは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項121記載のベクターもしくは一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程、および
該細胞におけるキメラリガンド受容体の発現を誘導する工程
を含む、キメラリガンド受容体を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法。
【請求項１５１】
標的産物をコードする核酸配列に機能的に連結された合成プロモーターを含む単離されたポリヌクレオチドを、前記細胞にトランスフェクトする工程
をさらに含む、請求項150記載の方法。
【請求項１５２】
前記合成プロモーターがキメラリガンド受容体からの細胞内シグナリングに対して応答性である、請求項151記載の方法。
【請求項１５３】
キメラリガンド受容体の発現を誘導する工程が、細胞がキメラリガンド受容体を細胞の細胞膜上に発現するのに適した条件下で細胞を培養することを含む、請求項149〜152のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５４】
請求項60〜120のいずれか一項記載のポリヌクレオチドもしくは一組の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項121記載のベクターもしくは一組のベクターを細胞にトランスフェクトする工程を含む方法であって、任意で該細胞が哺乳動物細胞であり、任意で該哺乳動物細胞が免疫細胞である、方法。
【請求項１５５】
請求項1〜59のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラリガンド受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１５６】
標的産物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された合成プロモーターを含む少なくとも1つの操作された導入遺伝子をさらに含む、請求項155記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている。いくつかの態様において、細胞外リンカー領域は1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、それら1つまたは複数のアミノ酸残基は、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニン（SEQ ID NO: 26）を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
いくつかの態様において、リガンド結合ドメインは細胞外リンカー領域を介して細胞外ドメインに連結されている。いくつかの態様において、細胞外リンカー領域は1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意で、それら1つまたは複数のアミノ酸残基は、アミノ酸残基セリン-グリシン-グルタミン酸-フェニルアラニン（SEQ ID NO: 26）を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
【図１】図1は、受容体活性化機序の概略図である。インプットがない場合、EpoRは不活性コンフォメーションに固定される。リガンドの結合は、下流シグナリングのための細胞内ドメインの相互作用を容易にする。
【図２】図2は、汎用細胞外分子センサー（GEMS）プラットフォームの概略図である。インプット分子ラパマイシン、RR120、ニコチン、SunTagおよびPSAは広範囲にわたる分子量をカバーしており、GEMSプラットフォームの普遍性を立証するためのインプットとして選ばれた。アフィニティードメインは異なる機序で二量体化して受容体を活性化する。本システムの最初の特徴づけにはラパマイシン誘導性FRB/FKBPヘテロ二量体化を使用した。ラクダ科重鎖抗体VHHA52はRR120の存在下でホモ二量体を形成する。重鎖および軽鎖相互作用のニコチン誘導性安定化に基づくヘテロ二量体型受容体のために、ニコチン抗体Nic12の可変鎖を受容体フレームワークに別々に融合した。抗GCN4 scFvは、ホモ二量体型受容体のために、SunTagのエピトープに結合することができる。2つの異なるscFvは、ヘテロ二量体型受容体のために、PSAの異なるエピトープに結合する。EpoRの細胞外ドメインと膜貫通ドメインは、リガンドの非存在下では下流シグナリングを阻害するが細胞外ドメイの二量体化によって活性化することができる予め形成された二量体として、クラスター化する。細胞内シグナル伝達ドメインの配向のリガンド誘導性変化を使って、4つの異なる二量体化依存性シグナリング経路を活性化した。黒い矢印は、表示したGEMSデバイスの主要シグナリング経路を表す。破線の矢印は、考えうる追加シグナリング経路の活性化を例示している。すべての経路は、導入遺伝子発現のために再配線されている。JAK/STAT、PI3K/AktまたはPLCGシグナリングの読出しのために、それぞれSTAT3、NF-κBまたはNFAT応答性最小プロモーターを使用する。MAPKシグナリングカスケードの最後に、ERKは、レポータープラスミドからの転写を活性化するTetR-Elk1融合タンパク質をリン酸化する。他のタンパク質の発現のためにレポータータンパク質SEAPを取り替えることは、疾患マーカーに応答して起こる治療用ペプチドの発現などのさまざまな応用において使用することができるであろう。
【図３】図3Aは、膜貫通ドメインのC末端にアラニン残基を導入するとαヘリックスが伸びて、約100°の回転をもたらすことを表す。受容体は、アラニン残基の数に依存して、「オフ（off）」状態でもなお、JAK相互作用を許しうる。3つのアラニン残基を持つ変異体は、JAK相互作用が弱い「オフ」コンフォメーションとJAK相互作用が強い「オン（on）」コンフォメーションを想定して描かれており、一方、アラニン残基を持たない変異体は、「オフ」状態でのJAK相互作用につながる。図3Aは、SEQ ID NO: 28「AAAA」を開示する。図3Bは、EpoR膜貫通ドメインとIL-6RB細胞内ドメインとの間に付加されたアラニン残基の数を示すために0〜4と表示した異なる受容体足場による遺伝子発現を、ラパマイシンが誘導したことを表す。3つのアラニン残基を持つ変異体は、レポーター遺伝子発現については比較的低い絶対値を示すが、信号雑音比は最も高い。グラフは、n＝3の生物学的に独立した試料の平均およびデータポイントを示し、3回の独立した実験を代表している。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図４】図4AはRR120の分子構造を表す。VHHA52はこの対称分子の半分に結合し、それが2つの抗体の二量体化につながる。図4Bは、PhCMV駆動受容体発現のためのプラスミド（pLeo615）の量を減少させると、RR120誘導性SEAP発現が増加することを表す。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図５】図5AはIL6RBにおける突然変異の効果を表す。細胞内ドメインに突然変異Y759Aを導入すると（pLeo618）、SEAP発現の絶対値だけでなく、信号雑音比も増加する。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。図5BはEpoRにおける突然変異の効果を表す。GEMSRR120（pLeo619）は、RR120では誘導されるが、エリスロポエチンでは誘導されない。エリスロポエチンがRR120誘導性シグナリングを妨害することもない。F93A改変を持たない受容体（pLeo618）は、エリスロポエチンに強く応答する。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。図5Cは、GEMSRR120が非最適化構築物より高い総SEAP発現を与え、信号雑音比が40超まで改良されることを表す。IL-6RBの細胞内ドメインをFGFR1の細胞内ドメインに交換すると（pLeo628）、信号雑音比は減少するが、受容体感度は高くなる。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図６】図6Aは、EpoR膜貫通ドメインとFGFR1細胞内ドメインとの間にアラニン残基を付加しても（pLeo628、pLeo642、pLeo643、pLeo644、pLeo645）、信号雑音比に対する効果がわずかでしかないことを表す。さらなる実験にはアラニン残基を持たない変異体を選んだ。図6Bは、PIP-Elk1（pAT13）およびPIPレポーター（pMF199）が、TetR-Elk1融合物（MKp37）およびTetRレポーター（pMF111）と比較して、提示する絶対発現レベルは低いものの、ダイナミックレンジは同等であることを表しており、これにより、この機構のモジュール性が確認される。  グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図７】図7Aは、HEK-293細胞において、MAPKがbFGFによって誘導されうることを表す。FGFR1（pLoe698）の過剰発現はレポーター遺伝子発現を増加させる。図7Bは、STAT3がIL-6によって誘導されうることを表す。IL-6RA（pLeo696）および/またはIL6-RB（pLeo697）の過剰発現は、レポーター遺伝子発現を増加させる。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図８】図8は、VEGFR-GEMSRR120が複数の経路を介してシグナルして、NFAT、MAPKおよびNF-κBシグナリングに特異的なレポーターを活性化することを表す。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図９】図9は、GEMSニコチン（pLeo626/pLeo627、pLeo667/pLeo668）が、喫煙後に典型的に到達するニコチン濃度で誘導可能であることを表す。1本の紙巻きタバコで100nMの血中ニコチン濃度が生じると考えられる。このポイントにおいて、SEAP発現に関する変化倍率は、JAK/STAT-GEMSニコチンでは1.6、MAPK-GEMSニコチンでは2.5である。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図１０】図10Aは、SunTag付きmCherry（SunTagged mCherry）を生産する細菌の粗溶解物が、GEMSSunTag（pLeo620、pLeo669）を備えたHEK細胞におけるSEAP発現を誘導することを表す。誘導のために加えられたSunTag含有細菌溶解物の体積は、培養培地体積の百分率として示されている。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下でのレポーター濃度を誘導物質非存在下でのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。図10Bは、SunTag-mCherryを含有する細菌粗溶解物がGEMSSunTagを誘導するが、GEMSRR120を誘導することはないことを表す。RR120はGEMSRR120を誘導するが、GEMSSunTagを誘導することはない。これらの対照は、レポーター誘導が、設計された誘導物質受容体ペアに特異的であることを立証している。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。
【図１１】図11Aは、JAK/STAT-GEMSPSA（pLeo622/pLeo623）が、診断上重要な1ng/mlのPSA濃度と20ng/mlのPSA濃度との相違を、高い有意性で区別できることを表す。図11Bは、MAPK-GEMSPSA（pLeo670/pLeo671）が、0.1ng/mLのPSA濃度と4ng/mLのPSA濃度とを区別できることを表す。図11Cは、MAPK-GEMSPSAを使った患者血清中のPSAレベルのプロファイリングを表す。MAPK-GEMSPSA細胞を、前立腺がん患者（患者1〜3）からの10％血清またはPSA陰性対照血清（前立腺全摘出術を受けた患者からのもの）と共に培養した。PSA陰性対照血清を含有する培養培地には、0〜10ng/mLの最終濃度に達するように、異なる量のPSAを加え、0ng/mLを陰性対照とした。培養培地に血清を1:10希釈したので、加えたPSA濃度1ng/mLは、患者血清中の10ng/mL PSAに対応する。培養上清からSEAP発現をプロファイリングした。ELISAベースの定量により、患者試料中のPSAレベル（患者1:1ng/mL、患者2:5ng/mL;患者3:20ng/mL）の、GEMSアウトプット性能との相関関係が確認された。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001。バーの上の数字は、誘導物質存在下での平均レポーター濃度を、誘導物質非存在下での平均レポーター濃度で割るか、または指定された低誘導物質濃度についてのレポーター濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター濃度の変化倍率を示している。
【図１２】図12はGEMSPSAの用量応答曲線である。MAPK-GEMSPSAは、前立腺全摘出術後の生化学的再発を検出するのに診断上意味を持つ濃度範囲でシグナルし、一方、JAK/STAT-GEMSPSAは、スクリーニングにとって重大な意味を持つ1〜20ng/mLのPSA濃度範囲で、ほぼ直線的な用量応答を呈する。2nm/mL未満のPSA濃度は生理学的であるとみなされる。2〜4ng/mLの濃度は経過観察の必要性を示す。4〜10ng/mLの濃度は診断上のグレーゾーンとみなされ、追加因子によっては、前立腺生検が推奨されうる。10ng/mLを上回る濃度は高い前立腺がんリスクを示す。用量応答曲線は、GraphPad Prism 7を使って、4パラメータ用量応答曲線として作成した。
【図１３】図13Aは、FGFR1の細胞内ドメインにおけるPLCG結合部位またはSTAT結合部位の突然変異（PLCG:Y766F、STAT:Y677F）が、MAPKシグナリングに対して観察されうる効果を持たないことを表す。図13Bは、MAPK-GEMSが、NFATおよびSTAT3に対してわずかな効果しか持たなかったことを表す。PLCG結合部位またはSTAT結合部位の突然変異は、NFATまたはSTAT3のそれぞれの活性化を減少させた。Y759Aを持たないJAK/STAT-GEMSは、MAPKシグナリングに対してわずかな効果しか持たなかった。グラフは平均を棒グラフとして表し、その上にn＝3の生物学的に独立した試料の個々のデータポイントのドットプロットが重ねて表示されており、3回の独立した実験を代表している。図13CはGEMS多重化の結果を表す。JAK/STAT-GEMSSunTagおよびMAPK-GEMSRR120（Y677F）をコトランスフェクトし、24時間後の培養上清においてSunTagが制御するSEAP分泌とRR120が制御するNanoLuc分泌とをプロファイリングした。濃度は100ng/mL RR120および0.02％（v/v）SunTag含有細菌溶解物とした。NanoLuc濃度はRLU（相対蛍光単位）として表す。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊P＜0.05、＊＊＊＊P＜0.0001;ns、有意性なし。バーの上の数字は、誘導物質存在下での平均濃度を誘導物質非存在下での平均濃度で割ることによって算出される、24時間誘導後の上清におけるレポーター（SEAPまたはNanoLuc）の変化倍率を示す。
【図１４】図14は、WEN1.3細胞において、RR120が、JAK/STAT-GEMSRR120シグナリングまたはMAPK-GEMSRR120シグナリングの活性化後に、内在性IL-10分泌を増加させることを表す。グラフは平均±s.d.を棒グラフとして表し、その上にn＝9の生物学的に独立した試料のドットプロットが重ねて表示されている。＊P＜0.05、＊＊＊＊P＜0.0001;ns、有意性なし。バーの上の数字は、誘導物質存在下での平均濃度を誘導物質非存在下での平均濃度で割ることによって算出される、誘導24時間後の上清におけるIL-10濃度の変化倍率を示す。
【図１５】図15はカフェイン存在下でのHEK-293T細胞の生存能を表す。HEK-293T細胞を、標準細胞培養培地中で、一連のカフェイン濃度に曝露した。24時間後に細胞生存能をCCK-8アッセイで評価した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図１６】図16は、ラクダ科由来の単一ドメイン抗体aCaffVHHに基づくカフェイン誘導性タンパク質二量体化システムの概略図である。aCaffVHHはカフェインの存在下でホモ二量体化し、カフェイン応答性遺伝子発現を微調整する合成転写因子またはシグナリングカスケードを再構成するために使用することができる。
【図１７】図17Aは、直接的な転写活性化につながるaCaffVHH-TetR（pDB307）とaCaffVHH-VPminx4（pDB335）のヘテロ二量体化に基づくカフェイン検知回路を表す。カフェイン用量応答関係をレポーター遺伝子SEAP（PtetO7-SEAP-pASV40、pMF111）で定量した。図17Bは、IL13受容体およびJAK/STAT6経路に基づくカフェイン検知回路を表す。aCaffVHH-IL13Rα1（pDB323）とaCaffVHH-IL4Rα（pDB324）のカフェイン誘導性ヘテロ二量体化は、JAKキナーゼによるSTAT6（pLS16）のリン酸化と、それに続くSTAT6応答性プロモーターPSTAT6の転写活性化につながる。カフェイン用量応答関係をレポーター遺伝子SEAP（PSTAT6-SEAP-pASV40、pLS12）で定量した。図17Cは、MAPK経路に基づくカフェイン検知回路を表す。mFGFR1405-822-aCaffVHH（pDB395）のカフェイン誘導性ホモ二量体化は、MEK1/2のリン酸化およびMAPKカスケードの下流シグナリングにつながった。ハイブリッド転写因子TetR-Elk1（MKp37）によってシグナリングカスケードを再配線すると、レポーター遺伝子SEAP（PtetO7-SEAP-pASV40、pMF111）の発現につながり、カフェイン用量応答関係の定量が可能になった。図17Dは、Epo受容体およびJAK/STAT3経路に基づくカフェイン検知回路を表す。aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm（pDB306）のカフェイン誘導性ホモ二量体化は、JAKキナーゼによるSTAT3のリン酸化とそれに続くSTAT3応答性プロモーターPSTAT3の転写活性化につながる。カフェイン用量応答関係をレポーター遺伝子SEAP（PSTAT3-SEAP-pASV40、pLS13）で定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図１８】図18AはSTAT3シグナリングとTetR依存性プロモーターの直交性を表す。pDB306（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH）およびpMF111（PtetO7-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたHEK-293T細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。図18Bは、カフェイン検知システムの併用による非線形応答を表す。pDB306（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH）、pLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）、pDB307（PSV40-TetR-aCaffVHH-pASV40）、pDB335（PCAG-aCaffVHH-VPminx4-pAβG）およびpMF111（PtetO7-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたHEK-293T細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図１９】図19Aは、hMSC-hTERT細胞におけるC-STARの機能性を表す。hMSC-hTERT細胞にpDB306（PhCMV-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pAbGH）およびpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後に細胞を、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。カフェイン用量応答関係を24時間後のSEAP発現によって定量した。図19Bは、ポリクローナルC-STARDB1細胞のカフェイン応答性を表す。ポリクローナルC-STARDB1細胞を、一連のカフェイン濃度に曝露することで、それらの感度を調べた。SEAPの上清レベルを24時間後に定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２０】図20AはモノクローナルC-STARDB2細胞株のカフェイン感度を表す。図20BはモノクローナルC-STARDB3細胞株のカフェイン感度を表す。図20CはモノクローナルC-STARDB4細胞株のカフェイン感度を表す。図20DはモノクローナルC-STARDB5細胞株のカフェイン感度を表す。レポータープラスミドpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたC-STARDB2、C-STARDB3、C-STARDB4およびC-STARDB5細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２１】図21は、C-STARシステムの活性化に必要なカフェイン曝露時間を表す。誘導に必要な最小曝露時間を決定するために、C-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、H2Oまたは10μMカフェインに、異なる期間にわたって曝露した。表示の時間後に、カフェイン添加培地を標準細胞培養培地で置き換え、SEAP発現を24時間進行させてから、定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２２】図22は、カフェインおよびさまざまな類似体に対するC-STARDB1の特異性を表す。レポータープラスミドpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）をトランスフェクトしたC-STARDB1細胞を、トランスフェクションの16時間後に、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェイン、テオフィリン、テオブロミンおよびパラキサンチンに曝露した。細胞の上清にカフェインを添加した24時間後にSEAPを測定した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２３】図23Aはカフェインに対するC-STARシステムの応答時間を表す。システムの応答時間を決定するために、C-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、H2Oまたは一連の濃度のカフェインに曝露した。SEAPを含有する上清試料を72時間にわたって12時間ごとに採取した。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）の平均±s.d.を表している。図23BはC-STARシステムの可逆性を表す。システムの可逆性を示すために、C-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、H2Oと10μMカフェインに交互に曝露した。SEAPを含有する上清試料を1日あたり9時間にわたって3時間ごとに採取した。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）の平均±s.d.を表している。
【図２４】図24は試験した溶液と各々のカフェイン濃度の図解である。ボックスは、左から右に、Nesquik（登録商標）カプセル、Forest Fruits（登録商標）（ハーブティー）、Vivalto lungo decaffeinato（登録商標）、Volluto decaffeinato（登録商標）、Decaffeinato intenso（登録商標）、Arpeggio decaffeinato（登録商標）、Coca-Cola（登録商標）、Mediterranean（登録商標）（緑茶）、Marrakech（登録商標）（緑茶）、Earl Grey（登録商標）（紅茶）、Starbucks（登録商標）Coffee Frappuccino、Starbucks（登録商標）Caramel Macchiato、Red Bull（登録商標）、Bukeela ka Ethiopia（登録商標）、Vivalto lungo（登録商標）、Starbucks（登録商標）コーヒー、Capriccio（登録商標）、Livanto（登録商標）、Apfelstrudel（登録商標）、Volluto（登録商標）、Roma（登録商標）、Arpeggio（登録商標）、Ristretto（登録商標）、Dharkan（登録商標）、Military Energy Gum（登録商標）およびKazaar（登録商標）に対応する。各飲料中のカフェインの量に関するベンダーの仕様書から、表示のカフェイン濃度を算出した。
【図２５】図25AはNespresso Grand Cru（登録商標）カプセルからのコーヒー中のカフェイン濃度の定量を表す。図25Bは、他の市販カフェイン源からのコーヒー中のカフェイン濃度の定量を表す。カフェイン含有試料を1:50,000の希釈率でC-STARDB1細胞に加えた。純粋なカフェインを使って得られる標準曲線により、定量されたSEAPレベルを元の試料中のカフェイン濃度に変換することが可能になった。各飲料は3回にわけて調製または購入した。データは三つ一組の実験（n＝3）のうちの各実験の定量を表している。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。ベンダーによって示されたカフェイン濃度を右側に示す。
【図２６】図26は、カフェイン存在下でのカプセル化C-STARDB1細胞の機能性を表す。レポータープラスミドpLS13（PSTAT3-SEAP-pASV40）をトランスフェクトし、導管付きマイクロコンテナ（vascularized microcontainer）中にカプセル化されたC-STARDB1細胞を、標準細胞培養培地中で、一連の濃度のカフェインに曝露した。24時間後に、細胞の上清におけるSEAP活性を定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは3回の独立した実験（n＝3）を表している。
【図２７】図27AはマイクロカプセルインプラントがTNF-αレベルに及ぼす影響を表す。図27BはマイクロカプセルインプラントがIL-6レベルに及ぼす影響を表す。野生型マウスの腹腔内にマイクロカプセル化C-STARDB6細胞を埋植し、埋植の12時間前（対照）、12時間後、36時間後および60時間後に血液試料を収集した。マウスの血流中のTNF-αレベルとIL-6レベルをELISAによって決定した。表示のデータは平均±SEM（n＝8匹）である。n.s.有意性なし（ウェルチのt検定）。
【図２８】図28Aは、コーヒー摂取の24時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。図28Bは、コーヒー摂取の48時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。図28Cは、埋植5日後のコーヒー摂取の24時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。図28Dは、埋植5日後のコーヒー摂取の48時間後に定量したマウスの血流中のSEAPレベルを表す。野生型マウスの腹腔内に、マイクロカプセル化されたC-STARDB1（カフェイン受容体:＋）またはpLS13だけをトランスフェクトした対照HEK-293T細胞（カフェイン受容体:-;PSTAT3-SEAP-pASV40）を埋植し、そのマウスを、300μLのVolluto（登録商標）コーヒー（コーヒー:＋）またはH2O（コーヒー:-）の経口投与によって刺激した。マウスの血流中のSEAPレベルを、コーヒー摂取の24時間後および48時間後に定量した。埋植の5日後に、同じマウスにもう一度、300μLのVolluto（登録商標）コーヒー（コーヒー:＋）またはH2O（コーヒー:-）を経口投与した。2回目のコーヒー摂取の24時間後および48時間後に血流中のSEAPレベルを定量した。表示のデータは平均±SEM（n＝8）である。＊＊＊対照に対してP＜0.001、n.s.有意性なし（ウェルチのt検定）。
【図２９】図29AはshGLP-1のカフェイン誘導性発現の評価を表す。カフェイン受容体（PhEF-1α-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pASV40、pDB326）を安定に発現するC-STARDB1細胞またはC-STARDB3細胞に、pDB387（PSTAT3-shGLP-1-pASV40）を一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションの16時間後にH2Oまたはカフェインに曝露した。48時間後に、マウスIgG ELISAキット（ICL Lab）を使って、細胞の上清におけるshGLP-1発現を定量した。表示のデータは4回の独立した実験（n＝4）を表している。図29BはポリクローナルshGLP-1発現C-STARDB6細胞株の検証を表す。カフェイン受容体（PhEF-1α-aCaffVHH-EpoRm-IL-6RBm-pASV40、pDB326）とshGLP1（PSTAT3-shGLP-1-pASV40、pDB387）をどちらも安定に発現するC-STARDB6細胞を、H2Oまたはカフェインに曝露した。48時間後に、マウスIgG ELISAキット（ICL Lab）を使って、細胞の上清におけるshGLP-1発現を定量した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のデータポイントを示している。表示のデータは4回の独立した実験（n＝4）を表している。
【図３０】図30Aはインビボでのカフェインの薬物動態を表す。図30BはインビボでのshGLP-1の薬物動態を表す。野生型マウスの腹腔内にマイクロカプセル化C-STARDB6細胞を埋植し、そのマウスに、300μLのNespresso Volluto（登録商標）コーヒーを単回経口投与した。マウスの血流中のカフェインレベルおよびshGLP-1レベルを、60時間にわたって6時間ごとに記録した。表示のデータは平均±SEM（n＝8）である。＊＊＊＊対照に対してP＜0.0001（ウェルチのt検定）。
【図３１】図31Aはマウスの血流におけるshGLP-1の用量依存的生産を表す。図31Bはマウスの空腹時血糖を表す。野生型マウスの腹腔内にマイクロカプセル化C-STARDB6細胞を埋植し、そのマウスに、カフェイン濃度が異なるさまざまなNespresso（登録商標）コーヒー調合品（摂取体積:300μL）を単回経口投与した。マウスの血流におけるshGLP-1の用量依存的生産をコーヒー摂取の24時間後に記録した。データは棒グラフに平均として表され、記号は個々のマウス（n＝8）を示している。72時間にわたって空腹時血糖を記録した。恒常性空腹時血糖の範囲を灰色の四角形で示す。表示のデータは平均±SEM（n＝8匹）である。ウェルチのt検定では群間に有意差はみられなかった。
【図３２】図32A、図32B、図32Cおよび図32Dは、shGLP-1のカフェイン依存性インスリン分泌作用を表しており、図32Aは空腹時血糖（恒常性空腹時血糖の範囲を灰色の四角形で示す）を表し、図32Bは血中活性GLP-1を表し、図32Cは食後4時間インスリンレベルを表し、図32Dは腹腔内グルコース耐性試験の結果を表す。野生型（WT）マウスまたは食餌誘導性肥満マウス（DIO）の腹腔内にマイクロカプセル化されたC-STARDB6細胞またはpDB387（PSTAT3-shGLP-1-pASV40）だけを含有する対照HEK-293T細胞を埋植し、そのマウスに、300μLのNespresso Volluto（登録商標）コーヒーを毎日経口投与した。空腹時血糖、血中活性GLP-1および食後4時間インスリンレベルを14日間記録した。2g kg-1のD-グルコース水溶液の投与によって腹腔内グルコース耐性試験を行った。表示のデータはすべて平均±SEM（n＝10匹）である。比較はウェルチのt検定で行った:対照に対して＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001、n.s.有意性なし。
【図３３】図33Aはカフェイン依存性心血管効果を表す。図32A〜Dに示したマウスと同じマウスの心拍数を血液試料の収集より前に測定した。図33Bは体重に対するカフェイン誘発性shGLP-1媒介効果を表す。15日目に、図32A〜Dおよび図33Aに示す個々のマウスの体重を、それぞれの初期体重（1日目、最初のコーヒー摂取前）と比較した。均衡の信頼区間を灰色の四角形で示す。表示のデータはすべて平均±SEM（n＝10匹）である。比較はウェルチのt検定で行った:対照に対して＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001、n.s.有意性なし。
【図３４】図34A、図34Bおよび図34CはshGLP-1のカフェイン依存性インスリン分泌作用を表しており、図34Aは血中活性GLP1を表し、図34Bは食後4時間インスリンレベルを表し、図34Cは腹腔内グルコース耐性試験の結果を表す。図34Dはカフェイン依存性心血管効果を表す。野生型（WT）マウスまたはレプチン受容体欠損性マウス（db/db）の腹腔内に、マイクロカプセル化されたさまざまな用量のC-STARDB6細胞（0〜1×107細胞）またはpDB387（PSTAT3-shGLP-1-pASV40）だけを含有する1×107個の対照HEK-293T細胞を埋植し、そのマウスに、300μLのNespresso Volluto（登録商標）コーヒーを経口投与した。血中活性GLP-1および食後4時間インスリンレベルを、細胞埋植前とその1日後に記録した。2g kg-1のD-グルコース水溶液の投与によって腹腔内グルコース耐性試験を行った。同じマウスの心拍数を血液試料の収集前に測定した。表示のデータはすべて平均±SEM（n＝10匹）である。比較はウェルチのt検定で行った:対照に対して＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001、＊＊＊＊P＜0.0001、n.s.有意性なし。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
実施例7:GEMSの標的をPSAにする（GEMSPSA）
本発明者らは、本システムを単量体タンパク質の検知に適合させることができるかどうかを調べた。本発明者らは、よく調べられており臨床的にも重要なバイオマーカーとしてPSAを選んだ。PSAは、前立腺によって生産される酵素であり、前立腺がん発生のスクリーニングに使用されている。前立腺がんは男性では最も一般的ながんであり、男性の1〜2％における死因である（Attard G et al., Lancet, 2016, 387:70-82参照）。ヘテロ二量体型受容体を形成すると予想される非オーバーラップエピトープに対するscFvを使ってGEMSPSAを設計した。PSAの異なるエピトープに結合することが結晶化によって示された3種の抗体8G8F5、5A5および5D3D11（Menez R et al., J. Mol. Biol., 2008, 376:1021-1033参照）を、VLとVHの間に（GGGGS）4リンカー配列（SEQ ID NO: 27）を加えることによってscFvに変換した。これらのscFvを受容体フレームワークにクローニングしてVHをEpoR細胞外ドメインに融合した。3種のヘテロ二量体型JAK/STAT-GEMSの組合せを試験した。それらのうち、scFv8G8F5（pLeo622、PSV40-scFv8G8F5-EpoRm-IL-6RBm-pA）とscFv5A5（pLeo623、PSV40-scFv5A5-EpoRm-IL-6RBm-pA）とを含有するJAK/STAT-GEMSPSAが、ロバストなPSA依存性シグナリングを生成した（図11A）。scFv5D3D11（pLeo621、PSV40-scFv5D3D11-EpoRm-IL-6RBm-pA）を含有する受容体は、どちらの受容体と組み合わせた場合も、PSAで誘導されなかった。
【外国語明細書】
2020110135000001.pdf