(57)【要約】【課題】運動能力を向上するための、又は運動による酸化ストレスのダメージを抑制するための製剤の提供【解決手段】下記式（Ｉ）で表される共重合体を有効成分として含んでなる製剤が提供される。【化１】2020186181.tif 000009上式中、特に、Ｌ2−Ｒ1は、連結基を介して環状ニトロキシドラジカルが共重合体側鎖に担持されていることを意味する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される共重合体を有効成分として含んでなる運動能力を向上するための製剤。
【化１】
2020186181.tif 000007
上式中、
Ａは、非置換又は置換Ｃ1−Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ'Ｒ"ＣＨ−基を表し、ここで、Ｒ'及びＲ"は独立してＣ1−Ｃ4アルコキシ又はＲ'とＲ"は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。
Ｌ1は、直接結合又は二価の連結基を表す。
Ｌ2−Ｒ1は、Ｌ2が−（ＣＨ2）a−ＮＨ−（ＣＨ2）a−又は−（ＣＨ2）a−Ｏ−（ＣＨ2）a−であり、Ｒ1が、式
【化２】
2020186181.tif 000008
のいずれかである。
Ｒ2は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルである。
上記において、Ｌ2−Ｒ1とＲ2を有するポリマー主鎖中の単位（ｕｎｉｔ）はランダムに存在し、Ｌ2−Ｒ1を有する単位は２〜１００の範囲内にあり、Ｒ2を有する単位は存在しない（０）か、若しくは１〜２０の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなる。
ＺはＨ、ＳＨまたはＳ（Ｃ＝Ｓ）−Ｐｈであり、Ｐｈは１または２個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表す。
各ａは、独立して０又は１〜５の整数であり、
ｍは２〜１０，０００の整数を表し、
ｎは３〜１００の整数を表す。
【請求項２】
請求項１に定義された式（Ｉ）で表される共重合体を有効成分として含んでなる運動による酸化ストレスのダメージを抑制するための製剤。
【請求項３】
共重合体がナノ粒子の形態にある、請求項１又は２の製剤。
【請求項４】
Ｌ2が−（ＣＨ2）a−ＮＨ−（ＣＨ2）a−であり、共重合体が皮下投与されるものである、請求項１〜３のいずれかの製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトをはじめとする哺乳動物における運動能力を向上するための製剤に関し、より具体的には、運動能力を向上するための製剤の有効成分として、疎水性セグメントの側鎖として環状ニトロキシドラジカルを担持する親水性−疎水性ブロック共重合体の用途発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動時は安静時と比べてエネルギー産生の目的で多くの酸素を消費するため、活性酸素種（ＲＯＳ）が多く発生する。適度なＲＯＳは運動パフォーマンス発揮の際に必要ではあるが、過剰に発生したＲＯＳはＤＮＡ、細胞や筋組織などに酸化ストレス、損傷や炎症を引き起こすため、運動能力の低下を引き起こす（非特許文献１）。
【０００３】
例えばマラソンでは地面と足の裏の物理的刺激により１０〜２０％もの赤血球が破壊されているとの報告もあり、漏れ出した鉄イオンがフェントン反応のような反応を経由して大量のＲＯＳを産生し、生体に障害を与えていく、と推察されている。
【０００４】
このような問題に対して、抗酸化剤の摂取が効果的であるとされているが、一般の抗酸化剤は血中滞留性が低く継続的な効果が低いうえに、低分子抗酸化剤は正常細胞内のミトコンドリアを破壊することが問題点となっており、運動能力向上に対してはほとんど効果が見られず、かえって運動能力を低下させることが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗａｎ，Ｊｉｎｇ−ｊｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４９．１０（２０１７）：ｅ３８４
【非特許文献２】Ｍｅｒｒｙ，Ｔｒｏｙ  Ｌ．  ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５９４．１８（２０１６）：５１３５−５１４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、運動に起因する酸化ストレスによる細胞又は筋組織への障害又は機能の低下を防止又は軽減するとともに、身体の目的とする動きを達成する力ともいえる運動能力を向上できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、レドックス作用物質ともいえ、抗酸化化合物にも分類できる環状ニトロキシドラジカル（特に、２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰ））をポリ（エチレングリコール）セグメントとポリ（クロロメチルスチレン）セグメントを含有する共重合体のクロロメチル基を介してその側鎖に結合せしめて高分子化することにより、生体内で安定であり、かつ、安全に使用できる化合物を創製することに成功し、提案した（ＷＯ２００９／１３３６４７及びＷＯ２０１６／０５２４６３参照。）。これらの特許文献には、こうして提供された高分子化環状ニトロキシドラジカル（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）由来のナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）は、例えば、静脈投与により長期にわたる血中滞留性が達成され、活性酸素種（ＲＯＳ）に起因すると考えられる一定の炎症性疾患を予防または治療できることが記載されている。上記において、ＰＭＮＴはポリ（メチルスチレン）の側鎖として環状ニトロキシドラジカルが結合していることを意味し、Ｎ−ＴＥＭＰＯ及びＯ−ＴＥＭＰＯは、それぞれ高分子主鎖に−ＮＨ−及び−Ｏ−を介してＴＥＭＰＯが共有結合していることを意味する（以下、本明細書を通してこれらの略号を同様に用いることもある。）。
【０００８】
このような高分子化環状ニトロキシドラジカル（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）由来のナノ粒子（Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ、Ｏ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ）は、正常組織、細胞内のミトコンドリアを破壊せず、過剰に発生したＲＯＳのみをターゲットとし、運動の継続に伴う生体中のＲＯＳを効果的に排除するとともに、運動能力の標準的な評価方法である、オールアウトテストにより比較対照に比べて有意に優れた結果をもたらすことが確認できた。
【０００９】
したがって、限定されるものでないが、次の態様の発明が提供される。
［態様１］
下記式（Ｉ）で表される共重合体を有効成分として含んでなる運動能力を向上するための製剤。
【００１０】
【化１】
2020186181.tif 000002
【００１１】
上式中、
Ａは、非置換又は置換Ｃ1−Ｃ12アルキルを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ'Ｒ"ＣＨ−基を表し、ここで、Ｒ'及びＲ"は独立してＣ1−Ｃ4アルコキシ又はＲ'とＲ"は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。
【００１２】
Ｌ1は、直接結合又は二価の連結基を表す。
【００１３】
Ｌ2−Ｒ1は、Ｌ2が−（ＣＨ2）a−ＮＨ−（ＣＨ2）a−又は−（ＣＨ2）a−Ｏ−（ＣＨ2）a−であり、Ｒ1が、式
【００１４】
【化２】
2020186181.tif 000003
【００１５】
のいずれかである。
【００１６】
Ｒ2は、クロロ、ブロモ又はヒドロキシルである。
【００１７】
上記において、Ｌ2−Ｒ1とＲ2を有するポリマー主鎖中の単位（ｕｎｉｔ）はランダムに存在し、Ｌ2−Ｒ1を有する単位は２〜１００の範囲内にあり、Ｒ2を有する単位は存在しない（０）か、若しくは１〜２０の範囲内にあり、ただし、これらの単位の総数はｎとなる。
【００１８】
ＺはＨ、ＳＨまたはＳ（Ｃ＝Ｓ）−Ｐｈであり、Ｐｈは１または２個のメチルまたはメトキシで置換されていてもよいフェニルを表す。
【００１９】
各ａは、独立して０又は１〜５の整数であり、
ｍは２〜１０，０００の整数を表し、
ｎは３〜１００の整数を表す。
［態様２］
態様１に定義された式（Ｉ）で表される共重合体を有効成分として含んでなる運動による酸化ストレスのダメージを抑制するための製剤。
［態様３］
共重合体がナノ粒子の形態にある、態様１又は２の製剤。
［態様４］
Ｌ2が−（ＣＨ2）a−ＮＨ−（ＣＨ2）a−であり、共重合体が皮下投与されるものである、態様１〜３のいずれかの製剤。
【発明の効果】
【００２０】
ナノ粒子の形態にある式（Ｉ）で表される共重合体の投与により、長時間走行能力（走れなくなるまでの時間、オールアウトタイム）が、例えば、４０％以上上昇し、また、運動による酸化ストレスのダメージが有意に抑制され得る。例えば、後者では、運動により生じる筋組織の炎症、細胞の障害等が未然に防がれ得る。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本明細書中で使用する用語は、特記しない限り、当該技術分野で常用されている意味内容であるものと解釈される。
【００２２】
ナノ粒子は、前記共重合体が水性媒体（水を含有し、必要により、リン酸緩衝剤及び／又は食塩、水可溶性有機溶媒を含有できる。）中で可溶化処理により自己組織的に又は会合することに形成されるナノサイズにある分子集合体である。かような分子集合体は、理論に拘束されるものでないが、水性媒体中で高い可溶性及び高い可動性を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）セグメントをシェルとし、主として、Ｌ2−Ｒ1とＲ3を有する疎水性のポリマーセグメントから形成される領域（コア）を備えた、コア−シェル型ナノ粒子を形成するものと理解できる。ナノサイズとは、限定されるものでないが、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、又は１０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲内にあるサイズである。
【００２３】
式（Ｉ）で表されるブロック共重合体において、Ｌ1について定義する二価の連結基は、ポリ（エチレングリコール）（以下、ＰＥＧと略記する場合あり。）セグメントと側鎖としての環状ニトロキシドラジカルが結合したポリ（メチルスチレン）セグメントの機能、例えば、上記のナノ粒子形成能、環状ニトロキシドラジカルに起因するレドックス機能に悪影響を及ぼさないものであることができる。しかし、限定されるものでない二価の連結基は、一般的には、最大３４個、好ましくは１８個、より好ましくは最大１０個の炭素、並びに任意に酸素及び窒素原子を含有する基を意味する。かような連結基として、具体的には次の基を挙げることができる：下式
【００２４】
【化３】
2020186181.tif 000004
【００２５】
で表される基から選ばれるか、又は−（ＣＨ2）bＳ−、−ＣＯ（ＣＨ2）bＳ−、−（ＣＨ2）bＮＨ−、−（ＣＨ2）bＣＯ−、−ＣＯ−、−ＯＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−からなる群より選ばれ、各ｂは独立して、１〜５の整数である、で表される。かような連結基が、結合の方向性により異なる構造を有する場合には、ここに、記載されている方向性を以って式（Ｉ）中に組み込まれるものとする。
【００２６】
Ａの定義に限定されるものでなく、本発明全体を通して、Ｃa−Ｃzアルコキシ若しくはアルキルのように表示される場合、炭素原子数ａ個〜ｚ個を有する直鎖若しくは分岐のアルコキシ若しくはアルキルを意味し、アルキル部分若しくはアルキルとしては、限定されるものでないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。
【００２７】
Ｌ1としては、好ましくは、パラキシリレン若しくはメタキシリレン、または−（ＣＨ2）2Ｓ−の連結基であることができ、Ｌ2としては，定義中のａがゼロ（０）である、−ＮＨ−または−Ｏ−であることができる。Ｌ2について結合の方向性により異なる構造となる場合には、記載された連結基の右端がＲ1に結合するものと理解される。
【００２８】
このような共重合は、前述したとおり、水、イオン強度の高められたまたは緩衝剤を含む水性媒体または水性溶液中で、疎水部をコアとし、親水部をシェルとするナノサイズの可溶化された又は分散したコア−シェル型ミセル粒子として安定に存在し得る。
【００２９】
このような共重合体は、上記のＷＯ２００９／１３３６４７又はＷＯ２０１６／０５２４６３に記載の方法により、また、必要により、これらの方法を改変した方法により製造できる。また、前記ナノ粒子は、式（Ｉ）の共重合体を例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の溶液を透析容器に充填し、例えば、分画（カットオフ）分子量１２ｋＤａ〜１４ｋＤａの透析膜を介して水に対して透析することにより、目的レドックス作用を有するナノ粒子として取得できる。
【００３０】
ナノ粒子についていうナノサイズとは、それらを含む水性溶液または均質な水性分散体において、動的散乱光（ＤＬＳ）による解析を行った場合に決定できる平均粒径意味する。水性媒体中で形成されたナノサイズの粒子は、例えば、凍結乾燥、遠心分離、等をすることにより、固形物として取得できる。
【００３１】
こうして提供される、ナノ粒子は、水性媒体中で、前述したとおり、可溶化または均一に分散した溶液または液剤として提供でき、また、前述した固形物としても提供できるので、被験者又は個体に投与された後、高い血中滞留性を示すものであれば、あらゆる形態にある非経口製剤または経口製剤を調製するのに使用できる。かような製剤は、それ自体の当該技術分野で常用されている賦形剤、希釈剤を利用して注射剤、錠剤、丸薬、顆粒剤として提供することができる。賦形剤又は希釈剤は、限定されるものでないが、経口製剤としては、クロロカルメロースナトリウム、結晶セルロース、ヒプロメロース、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、マクロゴール４０００、酸化チタン、等であることができる。一方で、非経口製剤、特に、注射剤は、水性媒体中に可溶化又均質に分散した状態にあるナノ粒子を含有する溶液に、必要により、糖類若しくは糖アルコール、又は可溶性ポリ（エチレングリコール）を含めることにより調製するができる。
【００３２】
前述した製剤の運動能力を向上するための又は運動による酸化ストレスのダメージを抑制するための前記ナノ粒子の用量は、被験者又は個体の年齢、体重等、並びに予定される運動の負荷の強度や酸化ストレスの程度により変動するので最適化できないが、小実験の結果を考慮して、適宜決定できる。想定されている運動能力及び運動による酸化ストレスは、それぞれ、実験動物を使用したオールアウトテストによる走行時間の長短、及び腓腹筋のダメージ（プロテインカルボニル量の変動）や血中の抗酸化能、特に、スーパーオキシドディスムターゼの活性の低下、等である。したがって、当業者は、それ自体公知のオールアウトテストの実施や腓腹筋や血液の生理学的マーカーを測定することにより、本発明の効果を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明にしたがうナノ粒子の概念図
【図２】製造例２で調製されたＮ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの粒径分布を表す図
【図３】試験例１におけるＲＮＰの運動能力向上の効果の検証のための実験スケジュールの概略図
【図４】試験例１（１）における運動強度の推定のための血中乳酸濃度のグラフ表示
【図５】試験例１（２）におけるオールアウトの認定された走行時間のグラフ表示
【図６】試験例１（３）（ｉ）における腓腹筋中のプロテインカルボニル測定結果のグラフ表示
【図７】試験例１（３）（ｉｉ）における血漿中ＳＯＤ量のグラフ表示
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を実施する際の具体例について説明を行うが、本発明はこれらの例に限定されるものでない。
【００３５】
製造例１：共重合体の合成は次合成スキームに従って実施した。
【００３６】
【化４】
2020186181.tif 000005
【００３７】
（１）ブロック共重合体ＰＥＧ−ＣＴＡの合成
１１０℃にて，５０ｇのポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ，ＭＷ＝５，０００，Ｆｌｕｋａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を減圧下で水もしくは水分がなくなるまで、２〜１２時間撹拌した。安定化のため窒素雰囲気下、撹拌しながら６５℃で１時間撹拌した。窒素流条件下で脱水処理ポリマーにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬをゆっくり加えた。１０ｍＬのブチルリチウム（ＢｕＬｉ，１６ｍｍｏｌ）を１：２の比率で加えることによりヒドロキシル基をリチオ化した（１０ｍｍｏｌ  ＰＥＧ＋２０ｍｍｏｌ  ＢｕＬｉ，ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＬｉ）。次いで、リチオ化ＰＥＧ溶液に１０倍過剰量のα、α−ジクロロ−ｐ−キシレン（ＤＣＰＸ，Ｃ6Ｈ6（ＣＨ2Ｃｌ）2，ＭＷ＝１７５．０５）（２５ｇ）を加え、撹拌しながら６５℃で、４８時間撹拌した。混濁したネオングリーンへの色変化に注意し、ＬｉＣｌの沈殿（容器の上部）を観察する。精製するため、集めた溶液に冷イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を添加して沈殿を形成させ、遠心した（８，８００ｒｐｍ、２分間、−４℃）。沈殿物を集め、温メタノールで可溶化し、次いで、冷ＩＰＡを加え、遠心した。この操作を８〜９回繰り返した。次いで、精製されたポリマーをＮ2条件下、丸底フラスコ中で撹拌しながら純ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。この段階でポリマー溶液は透明であった。このポリマー溶液に直ちにＭｇＢｒ−ＣＳ2溶液を加えた。更なるプロセスを行うまで、４０℃で、少なくとも１２〜７３時間撹拌しながらインキュベーションした。集めた溶液から冷ＩＰＡを用いて沈殿させ、遠心した（８，８００ｒｐｍ、３分間、−４℃）。遠心後、沈殿物を集め、温メタノールで溶解した後、冷ＩＰＡを加え、遠心した。この操作を上層液が澄明になるまで５〜８回繰り返した。この段階で、得られた沈殿物の色はピンクであった。真空下で３６時間乾燥し、ＰＥＧ−ＣＴＡの生成物５０ｇを得た。
【００３８】
得られたＰＥＧ−ＣＴＡが目的のものであることを1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより確認した。
【００３９】
（２）ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ共重合体の合成：
連鎖移動剤と共にテローゲンとしてＰＥＧ−ＣＴＡを用いるクロロメチルスチレン（ＣＭＳ）のラジカルテロメリゼーションによりメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（クロロメチルスチレン）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）を合成した。このＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのポリマー主鎖は親水性セグメントとしてのＰＥＧと疎水性セグメントしての反復単位２６のＰＣＭＳから構成されていることが1Ｈ  ＮＭＲデータから確認された。
【００４０】
当該合成を要約すると、次のとおりである。
【００４１】
ＰＥＧ−ｂ−ＣＴＡ（３６ｇ）をフリーラジカル開始剤、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）の２４０ｍｇ及びＣＭＳ５６ｍＬを混合し、高純度トルエン（２００ｍＬ）に溶解した。この混合物を窒素雰囲気下２４時間６０℃で撹拌したのち、イソプロピルアルコールに投入し、生成物の沈殿を得た。イソプロピルアルコールをデカンテーションし、減圧乾燥によって生成物を得た。
【００４２】
得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳが目的のものであることは1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより確認した。
【００４３】
（３）ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの合成
ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（４．６７ｇ）とＮ−ＴＥＭＰＯ（１０ｇ）を混合し、高純度ＤＭＦに溶解した。この混合物を窒素雰囲気下２４時間室温で撹拌したのち、イソプロピルアルコールに投入し、生成物の沈殿を得た。イソプロピルアルコールをデカンテーションし、減圧乾燥によって生成物を得た。
【００４４】
得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴはＥＳＲスペクトルによりＮ−ＴＥＭＰＯの導入を確認し、得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴにフェニルヒドラジンを加えて1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより確認し、得られたＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴが目的のものであることを確認した。
【００４５】
製造例２：Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰの調製例
ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴをＤＭＦに３００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かし、その溶液を透析膜（分画（カットオフ）分子量１２ｋＤａ〜１４ｋＤａ）に入れて密閉し、蒸留水に対して透析を行うことでＲＮＰを作製した。蒸留水は透析開始から１、３、５、８、２０時間ごとに交換し、２４時間後に透析膜内の溶液を回収した。透析膜内の溶液に１０倍の濃さを持つＰＢＳを最終濃度が１倍のＰＢＳ濃度になるように加えた。Ｎ−ＴＥＭＰＯ−ＲＮＰ（以下、ＲＮＰと略記する。）は動的光散乱法（ＤＬＳ）により、粒径と粒径分布を測定した。粒径（Ｚ−Ａｖｅ）は２３ｎｍ、多分散指数（ＰＤＩ）は０．１２２となり粒径分布がそろっているといえる（図２参照。）。
【００４６】
試験例１：ＲＮＰの運動能力向上効果の検討法
本試験では、運動能力の評価を行う目的で、ラット（Ｆ３４４，１０週齢，雄）を用い、図３に示される実験スケジュールにしたがい、オールアウトテストを行った。すなわち、このテストでは、ラットを図３にみられるように、次の４グループに無作為に分けて実施した（ｎ＝６）。
【００４７】
（ａ）ＰＢＳ投与安静群（ＰＢＳ＋ＳＥＤ）
（ｂ）ＰＢＳ投与オールアウト群（ＰＢＳ＋ＡＯ）
（ｃ）ＴＥＭＰＯＬ投与オールアウト群（ＴＥＭＰＯＬ＋ＡＯ）
（ｄ）ＲＮＰ投与オールアウト群（ＲＮＰ＋ＡＯ）
本テストではラットをある一定の速度で走行させ、走行不能の状態になるまでの時間を測定することで運動能力が評価される。
【００４８】
具体的には、下記表１に示されるとおりに走行学習をラットに行い、安静及びオールアウトテストの当日はその３時間前に被験物質の皮下投与を行った上で、絶食を開始した。安静群はトレッドミル上で６０分間安静にさせ、各オールアウト群には、図３に示されるスケジュールにしたがってテストを施した。比較対照として、リン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）、低分子抗酸化剤（ＴＥＭＰＯＬ）を投与した群も用意した。本テストにおけるオールアウトの定義を「電気ショックを５回与えてもその場から動かず、その後トレッドミルから取り出した際に後肢が完全に動かず、その場から全く移動できなくなった状態」とした。オールアウトの判定は投与物の内容を把握していない第三者により行った。
【００４９】
【表１】
2020186181.tif 000006
【００５０】
（１）運動強度の推定
安静およびオールアウトテスト終了後に血中乳酸値をラクテート・プロTM２  ＬＴ−１７３０を用いて測定し、実験動物をペントバルビタールナトリウムの過剰投与により処置した後、解剖を行った。血中乳酸値の測定結果を図４に示す。血中乳酸値は運動強度依存的に増加するため、運動強度を推定する際の指標として使用されている。高い血中乳酸値はより高い運動強度であることを示す。
【００５１】
図４から次の事象について言及できる。ＰＢＳ＋ＡＯ群、ＴＥＭＰＯＬ＋ＡＯ群はＰＢＳ＋ＳＥＤ群と比較して有意な血中乳酸の高値を示した。このことはオールアウトテストが安静時に比べて高い運動強度で行われたことを示している。しかし、ＲＮＰ＋ＡＯ群はＰＢＳ＋ＳＥＤ群と比較して有意な血中乳酸の高値を示さなかった。このことは、ＲＮＰの投与により運動強度が相対的に低下したことを示唆している。
【００５２】
（２）オールアウトに至るまでの時間
テストの結果を図５に示す。図５からＴＥＭＰＯＬ群ではＰＢＳ群に比べて有意な走行時間の延長を認めなかったが、ＲＮＰ群ではＴＥＭＰＯＬ群、ＰＢＳ群と比較して有意な走行時間の延長を認めた。ＲＮＰ群はＰＢＳ群と比較して４０％の走行時間の延長が認められる。
【００５３】
（３）酸化ストレスおよび抗酸化能
図３に示される実験スケジュールにおいて、ペントバルビタールナトリウム過剰投与処置後の腓腹筋の酸化ストレスを測定した。
【００５４】
（ｉ）酸化ストレスの項目としてプロテインカルボニル量を評価した。
プロテインカルボニル量は、Ｌｕｓｈｃｈａｋ，Ｖｏｌｏｄｙｍｙｒ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｈｙｐｅｒｏｘｉａ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ａｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｇｏｌｄｆｉｓｈ  ｔｉｓｓｕｅｓ．”Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３７．８（２００５）：１６７０−１６８０．を参考にして測定した。結果を図６に示す。図６から、ＰＢＳ＋ＡＯ群ではＰＢＳ＋ＳＥＤ群と比較して有意なプロテインカルボニル量の高値が確認できるものの、ＲＮＰ＋ＡＯ群ではＰＢＳ＋ＳＥＤ群と比較して有意なプロテインカルボニル量の高値を認めなかった。
【００５５】
（ｉｉ）血漿中の抗酸化能を評価するための測定項目としてスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）を選択した。
ＳＯＤの活性は、Ｐｅｓｋｉｎ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｖ．，ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｃ．Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ．“Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｐｌａｔｅ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ＷＳＴ−１．”Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０３（２０１７）：１８８−１９１．を参考にして測定した。結果を図７に示す。図７から、ＰＢＳ＋ＳＥＤ群とＰＢＳ＋ＡＯ群を比較しても有意なＳＯＤ量増加を確認できなかった。このことは、オールアウトテストは抗酸化能を増加させないことを意味する。しかし、ＲＮＰ＋ＡＯ群はその他の群と比較して有意に高いＳＯＤ量を示した。このことはＲＮＰが高い血中滞留性を持つために抗酸化能を発揮し続けたことに起因すると考えられる。
【００５６】
（４）まとめ
以上の結果から、ＲＮＰはミトコンドリアへの副作用がなく、しかも単回の投与で運動能力を向上させる新しい抗酸化物質として利用できる。そのため、アスリートの記録更新や一般人の運動実践を促進することができ、クオリティーオブライフ（ＱＯＬ）の向上や運動による健康増進に役立つと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、新規な運動能力を向上させ、運動による酸化ストレスのダメージを抑制するための製剤が提供される。このような製剤は、運動による健康増進やＱＯＬの向上に大いに役立ち、例えば、製薬業で利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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