(57)【要約】【課題】アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドの製造方法を提供する。【解決手段】肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドを得る分化工程を含む、肝臓オルガノイドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドを得る分化工程を含む、肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項２】
前記分化工程において、前記肝臓細胞凝集塊と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、請求項１に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項３】
前記分化用培地中に含まれる前記ジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、請求項１又は請求項２に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項４】
前記分化用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項５】
前記分化用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項６】
前記分化用培地が、さらに、ＤＡＰＴ、ジベンザゼピン、ベンゾジアゼピン、及びＬＹ−４１１５７５からなる群より選択される少なくとも１種のＮｏｔｃｈ阻害剤を含有する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項７】
前記分化用培地が、さらに、デキサメタゾンを含有する、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項８】
前記分化工程の前に、さらに、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地中で培養し、前記肝臓細胞凝集塊を得る増殖工程を有する、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項９】
前記増殖用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、請求項８に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項１０】
前記増殖用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、請求項８又は請求項９に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項１１】
前記増殖用培地が、さらに、ニコチンアミドを含有する、請求項８〜請求項１０のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項１２】
前記増殖用培地が、さらに、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ、及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種のＷｎｔアゴニストを含有する、請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項１３】
前記増殖用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、請求項８〜請求項１２のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項１４】
前記増殖用培地が、さらに、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質、からなる群より選択される少なくとも１種のＢＭＰ阻害剤を含有する、請求項８〜請求項１３のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
【請求項１５】
ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイド製造用培地。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、肝臓オルガノイド。
【請求項１７】
上皮肝幹細胞を培養して得られる肝臓オルガノイドであって、
アルブミンの発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のアルブミンの発現量に対して、２倍〜１０００倍である肝臓オルガノイド。
【請求項１８】
ＣＹＰ２Ｃ１９の発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のＣＹＰ２Ｃ１９の発現量に対して、５０％〜２００％である、請求項１７に記載の肝臓オルガノイド。
【請求項１９】
請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドを含有する細胞製剤。
【請求項２０】
請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドに被験物質を接触させる工程、前記被験物質に対する前記肝臓オルガノイドの代謝能を評価する工程、を含む前記被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓オルガノイドの製造方法、肝臓オルガノイド製造用培地、肝臓オルガノイド、細胞製剤、及び被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発の薬物動態試験において、げっ歯類を用いたインビボ試験や、げっ歯類由来の初代（凍結）肝細胞を用いたインビトロ試験が行われている。しなしながら、種差があるためヒト特異的に発生する毒性を予測することが困難である。一方、ヒト初代（凍結）肝細胞ではロット間差が大きく、良質の肝細胞を安定して入手することが難しい。また、ＨｅｐＧ２細胞等のヒト由来の肝癌細胞株はシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の活性が低く、ＣＹＰによる代謝に関連した毒性を評価できない。そのためより安定に使用できるヒト由来の肝細胞が必要とされている。
【０００３】
肝臓オルガノイドは２０１３年にＨａｎｓ  Ｃｌｅｖｅｒｓらによって樹立された。この肝臓オルガノイドは、医薬品開発のための安定した肝細胞供給源として期待される（特許文献１〜特許文献４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１３−５３５２０１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／１８３５７１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１７／０１９１０３１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１６／０２６６０９６号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Liao J. K., et al, Rho Kinase (ROCK) Inhibitors, J Cardiovasc Pharmacol., 50 (1), 17-24, 2007.
【非特許文献２】Dupont S., et al, Role of YAP/TAZ in mechanotransduction, Nature, 474(7350), 179-183, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドの製造方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の実施形態を含む。
［１］肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドを得る分化工程を含む、肝臓オルガノイドの製造方法。
［２］前記分化工程において、前記肝臓細胞凝集塊と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、［１］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［３］前記分化用培地中に含まれる前記ジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、［１］又は［２］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［４］前記分化用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［５］前記分化用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［６］前記分化用培地が、さらに、ＤＡＰＴ、ジベンザゼピン、ベンゾジアゼピン、及びＬＹ−４１１５７５からなる群より選択される少なくとも１種のＮｏｔｃｈ阻害剤を含有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［７］前記分化用培地が、さらに、デキサメタゾンを含有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［８］前記分化工程の前に、さらに、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地中で培養し、前記肝臓細胞凝集塊を得る増殖工程を有する、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［９］前記増殖用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率が、０．１体積％以上である、［８］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１０］前記増殖用培地が、さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有する、［８］又は［９］に記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１１］前記増殖用培地が、さらに、ニコチンアミドを含有する、［８］〜［１０］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１２］前記増殖用培地が、さらに、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ、及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種のＷｎｔアゴニストを含有する、［８］〜［１１］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１３］前記増殖用培地が、さらに、Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤を含有する、［８］〜［１２］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１４］前記増殖用培地が、さらに、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質、からなる群より選択される少なくとも１種のＢＭＰ阻害剤を含有する、［８］〜［１３］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドの製造方法。
［１５］ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイド製造用培地。
［１６］［１］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法により製造された、肝臓オルガノイド。
［１７］上皮肝幹細胞を培養して得られる肝臓オルガノイドであって、アルブミンの発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のアルブミンの発現量に対して、２倍〜１０００倍である肝臓オルガノイド。
［１８］ＣＹＰ２Ｃ１９の発現量が、前記上皮肝幹細胞を含む組織片のＣＹＰ２Ｃ１９の発現量に対して、５０％〜２００％である、［１７］に記載の肝臓オルガノイド。
［１９］［１６］〜［１８］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドを含有する細胞製剤。
［２０］［１６］〜［１８］のいずれかに記載の肝臓オルガノイドに被験物質を接触させる工程、前記被験物質に対する前記肝臓オルガノイドの代謝能を評価する工程、を含む前記被験物質の評価方法。
【０００８】
本発明は以下の実施形態を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］肝臓細胞塊の製造方法であって、肝臓オルガノイドを分化用培地中で分化させ、肝臓細胞塊を得る分化工程を含み、前記分化用培地が、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、製造方法。
［Ｐ２］前記分化工程において、前記肝臓オルガノイドと細胞外マトリックスとを接触させて培養する、［Ｐ１］に記載の製造方法。
［Ｐ３］前記分化用培地が、前記分化用培地を１００体積％として、前記ジメチルスルフォキシドを０．１体積％以上含む、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の製造方法。
［Ｐ４］前記分化用培地が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ及びＩＧＦからなる群より選択される成長因子；Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択されるＴＧＦ−β阻害剤；ＤＡＰＴ、ジベンザゼピン（ＤＢＺ）、ベンゾジアゼピン（ＢＺ）及びＬＹ−４１１５７５からなる群より選択されるＮｏｔｃｈ阻害剤；及び、デキサメタゾン；からなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ１］〜［Ｐ３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ５］前記分化用培地が、ガストリン、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、及び、Ｎ−アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ１］〜［Ｐ４］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ６］前記分化工程の前に、増殖用培地中で肝臓オルガノイドを増殖させる増殖工程を更に含み、前記増殖用培地が、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、［Ｐ１］〜［Ｐ５］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ７］前記増殖工程において、前記肝臓オルガノイドと細胞外マトリックスとを接触させて培養する、［Ｐ６］に記載の製造方法。
［Ｐ８］前記増殖用培地が、前記増殖用培地を１００体積％として、前記ジメチルスルフォキシドを０．１体積％以上含む、［Ｐ６］又は［Ｐ７］に記載の製造方法。
［Ｐ９］前記増殖用培地が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ及びＩＧＦからなる群より選択される成長因子；ニコチンアミド；Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択されるＷｎｔアゴニスト；Ａ８３−０１、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＢ−５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８及びＳＪＮ２５１１からなる群より選択されるＴＧＦ−β阻害剤；及び、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質からなる群より選択されるタンパク質からなる群より選択されるＢＭＰ阻害剤；からなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ６］〜［Ｐ８］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１０］前記増殖用培地が、ガストリン、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、及び、Ｎ−アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含む、［Ｐ６］〜［Ｐ９］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１１］前記増殖工程を開始してから少なくとも１日後に前記分化工程を開始する、［Ｐ６］〜［Ｐ１０］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１２］前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ、Ｙ３９９８３、Ｗｆ−５３６、ＳＬｘ−２１１９、Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ、ＤＥ−１０４、Ｈ−１１５２Ｐ、ＲＯＫα  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＸＤ−４０００、ＨＭＮ−１１５２、４−（１−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ、Ｒｈｏｓｔａｉｎ、ＢＡ−２１０、ＢＡ−２０７、Ｋｉ−２３０９５及びＶＡＳ−０１２からなる群より選択され、  前記ＹＡＰ阻害剤が、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ、Ｃ３、ＣＡ３、（Ｒ）−ＰＦＩ  ２  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｕｐｅｒ−ＴＤＵ及びＹＡＰ−ＴＥＡＤ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ１からなる群より選択される、［Ｐ１］〜［Ｐ１１］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｐ１３］ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイドを肝臓細胞塊に分化誘導するための分化用培地。
［Ｐ１４］ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む、肝臓オルガノイドを増殖させるための増殖用培地。
［Ｐ１５］［Ｐ１］〜［Ｐ１２］のいずれかに記載の製造方法により製造された、肝臓細胞塊。
［Ｐ１６］２００,０００個／ｍＬ以上の密度で容器に収容された、肝臓細胞塊。
［Ｐ１７］［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の肝臓細胞塊からなる細胞製剤。
［Ｐ１８］被験物質の存在下で［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の肝臓細胞塊を培養する工程と、前記肝臓細胞塊の応答を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法。
［Ｐ１９］［Ｐ１５］又は［Ｐ１６］に記載の前記肝臓細胞塊に被験物質を作用させる工程と、前記肝臓細胞塊の応答を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の実施形態によれば、アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１１】
本明細書で例示する各成分、例えば、培地中に含まれる成分や各工程で用いられる成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種を単独で用いることができ、または２種以上を併用して用いることができる。
【００１２】
本明細書で、「Ａ〜Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義である。また、本明細書で、「Ａ〜Ｂ、好ましくはａ〜ｂ」等との数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」、「Ａ以上、ｂ以下」、「ａ以上、Ｂ以下」、及び「ａ以上、ｂ以下」と同義である。
【００１３】
本明細書において、「物質Ｘを含む培地」、「物質Ｘの存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地、外来性の物質Ｘを含む培地、又は外来性の物質Ｘの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する場合、内在的な物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在的な物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないものとする。
【００１４】
［肝臓オルガノイドの製造方法］
本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法は、肝臓細胞凝集塊をＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養する分化工程を有する。
【００１５】
本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法は、分化工程の前に、さらに、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地で培養し、肝臓細胞凝集塊を得る増殖工程を有することができる。増殖工程を行うことで、分化工程で用いる肝臓細胞凝集塊を得ることができる。
【００１６】
肝臓細胞凝集塊は市販されたものであってもよく、例えば、商品名「Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ」（カタログ番号「＃７０９３２」、ステムセルテクノロジーズ社）が挙げられる。
【００１７】
細胞凝集塊とは２個以上の細胞が接着して形成された凝集塊を示す。本実施形態の肝臓オルガノイドも細胞凝集塊の一形態である。また、肝臓オルガノイドとは、肝臓組織に解剖学的に近い構造を有する培養物を示す。
【００１８】
本明細書において、「分化させる」、「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本実施形態の製造方法では肝臓細胞凝集塊を肝臓オルガノイドへと分化誘導する。
【００１９】
〈分化工程〉
分化工程では、肝臓細胞凝集塊を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む分化用培地中で培養し、肝臓オルガノイドへ分化させる。培養は、通常、浮遊培養が好ましい。分化工程の培養期間は、通常、５日間〜１５日間、好ましくは７日間〜１２日間である。
【００２０】
分化工程では、肝臓細胞凝集塊と細胞外マトリックス（以下、「ＥＣＭ」ともいう）とを接触させて培養することが好ましい。肝臓オルガノイドと溶解させたＥＣＭとを混合し、ＥＣＭをゲル化させた後に、ゲル化したＥＣＭに分化用培地を重層して培養してもよい。本明細書では、肝臓オルガノイドを含む重合したＥＣＭに、分化用培地を重層して培養する態様を含めて、肝臓オルガノイドを分化用培地で培養することを「分化用培地中で培養する」と表現する。
【００２１】
ＥＣＭとしては、少なくとも２種類を含むＥＣＭが好ましい。例えば、コラーゲン及びラミニンを含むＥＣＭが挙げられる。ＥＣＭとしては、合成ＥＣＭ、天然ＥＣＭが挙げられる。ＥＣＭとしては、ラミニン、エンタクチン及びコラーゲンＩＶを含む、マトリゲル（登録商標）（ＢＤバイオサイエンス社）が好ましい。細胞外マトリックス材料は、細胞培養容器の上にコーティングされた状態のもの、及び溶解状態のものが挙げられる。
【００２２】
《分化用培地》
分化用培地は、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含有する。分化用培地には、さらに、細胞外マトリクスを含有することができる。分化用培地は、通常、基礎培地に、各種成分を添加して調製する。
【００２３】
基本培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地（ＭＥＭ）、ノックアウト−ＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、グラスゴー基本培地（Ｇ−ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、１９９培地、及びＲＰＭＩ１６４０培地等を挙げることができる。
【００２４】
基本培地としては、グルタミン、インシュリン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びトランスフェリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０；無血清培養に最適化され、インシュリンを既に含んでいるＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；及びＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ；が好ましい。Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、及びＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ培地には、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加することが好ましい。
【００２５】
ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６−５０−７）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＣＡＳ番号：１０５６２８−０７−７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１−２６−６）、Ｗｆ−５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７−６４−２）、ＳＬｘ−２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７−８７−３）、Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ（ＣＡＳ番号：８５０６６４−２１−０）、ＤＥ−１０４（非特許文献１参照）、Ｈ−１１５２Ｐ（非特許文献１参照）、ＲＯＫα  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（非特許文献１参照）、ＸＤ−４０００（非特許文献１参照）、ＨＭＮ−１１５２（非特許文献１参照）、４−（１−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ（非特許文献１参照）、Ｒｈｏｓｔａｉｎ（非特許文献１参照）、ＢＡ−２１０（非特許文献１参照）、ＢＡ−２０７（非特許文献１参照）、Ｋｉ−２３０９５（非特許文献１参照）、及びＶＡＳ−０１２（非特許文献１参照）が挙げられる。これらの中でもＹ−２７６３２が好ましい。分化用培地中に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の終濃度は、通常、０．１μＭ〜２０μＭである。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。なお、終濃度とは、特定成分を培地に添加した結果、培地中に含まれる特定成分の濃度を示す。
【００２６】
ＹＡＰ阻害剤としては、Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ（ＣＡＳ番号：１２９４９７−７８−５）、ボツリヌス菌産生Ｃ３毒素（非特許文献２参照）、ＣＡ３（ＣＡＳ番号：３００８０２−２８−２）、（Ｒ）−ＰＦＩ  ２  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ番号：１６２７６０７−８７−７）、Ｓｕｐｅｒ−ＴＤＵ（ＣＡＳ番号：１５９９４４１−７１−０）、及びＹＡＰ−ＴＥＡＤ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ１（カタログ番号「Ｓ８１６４」、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社等）が挙げられる。分化用培地中に含まれるＹＡＰ阻害剤の終濃度は、通常、０．１μＭ〜１０μＭである。ＹＡＰ阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２７】
分化用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率は、好ましくは０．１体積％以上、より好ましくは０．３体積％以上、さらに好ましくは０．５体積％以上である。また、分化用培地中に含まれるジメチルスルフォキシドの体積分率は、通常、１０体積％以下、好ましくは５体積％以下、より好ましくは３体積％以下である。上記の数値の範囲内であると、アルブミン産生能が高まった肝臓オルガノイドを得ることができる。
【００２８】
分化用培地は、さらに、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１種の成長因子を含有することができる。
【００２９】
分化用培地中に含まれるＥＧＦの終濃度は、通常、５ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２５ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０〜１００ｎｇ／ｍＬである。
【００３０】
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、及びＦＧＦ１０が挙げられ、これらの中でもＦＧＦ１０が好ましい。分化用培地中に含まれるＦＧＦの終濃度は、通常、２０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００〜５００ｎｇ／ｍＬである。
【００３１】
分化用培地中に含まれるＨＧＦの終濃度は、通常、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。
【００３２】
ＩＧＦとしては、ＩＧＦ１が好ましい。分化用培地中に含まれるＩＧＦの終濃度は、通常、５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬである。
【００３３】
分化用培地は、さらに、Ａ８３−０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０−４３−６）、ＳＢ−４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６−４１−９）、ＳＢ−５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３−５９−５）、ＳＢ−５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９−２０−１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９−５３−６）、ＳＤ−２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６−０９−８）、及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９−３３−２）からなる群より選択される少なくとも１種のＴＧＦ−β阻害剤（形質転換因子β阻害剤）を含有することができる。
【００３４】
ＴＧＦ−β阻害剤としては、Ａ８３−０１が好ましく用いることができる。分化用培地中に含まれるＴＧＦ−β阻害剤の終濃度は、通常、０．０１ｎＭ〜６００ｎＭである。
【００３５】
分化用培地は、さらに、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５−８０−５）、ジベンザゼピン（ＤＢＺ）（ＣＡＳ番号：２０９９８４−５６−５）、ベンゾジアゼピン（ＢＺ）（ＣＡＳ番号：２０９９８６−１７−４）、及びＬＹ−４１１５７５（ＣＡＳ番号：２０９９８４−５７−６）からなる群より選択される少なくとも１種のＮｏｔｃｈ阻害剤を含有することができる。
【００３６】
Ｎｏｔｃｈ阻害剤としては、ＤＡＰＴが好ましく用いることができる。分化用培地中に含まれるＮｏｔｃｈ阻害剤の終濃度は、通常、１μＭ〜５０μＭ、好ましくは５μＭ〜３０μＭ、より好ましくは５μＭ〜２０μＭである。
【００３７】
分化用培地は、さらに、デキサメタゾン（ＣＡＳ番号：５０−０２−２）を含むことができる。分化用培地に含まれるデキサメタゾンの終濃度は、１μＭ〜５０μＭであってもよく、１μＭ〜４０μＭであってもよく、１μＭ〜３５μＭであってもよい。
【００３８】
分化用培地は、さらに、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及びＮ−アセチルシステイン等の神経生物系サプリメントを含有することができる。
【００３９】
分化用培地中に含まれるガストリンの終濃度は、通常、５ｎＭ〜１５ｎＭ、好ましくは７ｎＭ〜１０ｎＭである。
【００４０】
Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリンを含む組成物であり、５０倍液体濃縮液として市販されている。これらの成分のうち、少なくともリノレン酸、レチノール、酢酸レチニル及びトリヨードチロニン（Ｔ３）は核ホルモン受容体アゴニストである。
【００４１】
Ｎ２サプリメントは、５００μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、５００μｇ／ｍＬウシインシュリン、０．６３μｇ／ｍＬプロゲステロン、１６１μｇ／ｍＬプトレシン及び０．５２μｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウムを含む組成物であり、１００倍液体濃縮液として市販されている。
【００４２】
分化用培地中に含まれるＮ−アセチルシステインの終濃度は、通常、１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１７０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬである。
【００４３】
〈増殖工程〉
増殖工程では、上皮肝幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、並びにジメチルスルフォキシドを含む増殖用培地で培養し、前記肝臓細胞凝集塊を得る。増殖工程を有することにより、アルブミン産生能が高い肝臓オルガノイドを製造することができる。
【００４４】
増殖工程では、肝臓オルガノイドと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを接触させて培養することが好ましい。例えば、実施例において後述するように、肝臓オルガノイドとＥＣＭとを混合し、ＥＣＭを重合させた後に、重合したＥＣＭに増殖用培地を重層して培養してもよい。本明細書では、肝臓オルガノイドを含む重合したＥＣＭに、増殖用培地を重層して培養する態様を含めて、肝臓オルガノイドを増殖用培地で培養することを「増殖用培地中で培養する」と表現する。増殖工程において使用するＥＣＭは、上述した、分化工程で使用するＥＣＭと同様であってよい。
【００４５】
上皮肝幹細胞は、肝臓断片又は肝臓胆管から単離される。これらの細胞を単離する方法は公知である。例えば、本明細書の実施例に記載のように、成体肝臓組織を解離することにより上皮肝幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。組織の解離は酵素的解離により行うことができ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等の酵素を用いることができる。
【００４６】
《増殖用培地》
増殖用培地は、ＲＯＣＫ阻害剤及びＹＡＰ阻害剤からなる群より選択された少なくとも１つ、及び、ジメチルスルフォキシドを含む。増殖用培地において、ＲＯＣＫ阻害剤、ＹＡＰ阻害剤としては、上述した分化用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。また、増殖用培地は、増殖用培地を１００体積％として、ジメチルスルフォキシド（ＣＡＳ番号：６７−６８−５）を０．１体積％以上含むことが好ましく、０．３体積％以上含むことがより好ましく、０．５体積％以上含むことがさらに好ましい。また、増殖用培地は、増殖用培地を１００体積％として、ジメチルスルフォキシド（ＣＡＳ番号：６７−６８−５）を１０体積％以下含むことが好ましく、５体積％以下含むことがより好ましく、３体積％以下含むことがさらに好ましい。上記の数値の範囲内であると、アルブミン産生能が高まった肝臓細胞塊が得られる。
【００４７】
《その他の添加剤》
増殖用培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ）からなる群より選択される成長因子；ニコチンアミド（ＣＡＳ番号：９８−９２−０）；Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１〜４、Ｎｏｒｒｉｎ及びＧＳＫ阻害剤からなる群より選択されるＷｎｔアゴニスト；Ａ８３−０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０−４３−６）、ＳＢ−４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６−４１−９）、ＳＢ−５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３−５９−５）、ＳＢ−５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９−２０−１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９−５３−６）、ＳＤ−２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６−０９−８）及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９−３３−２）からなる群より選択されるＴＧＦ−β阻害剤；及び、Ｎｏｇｇｉｎ、ＤＡＮ、並びにＣｅｒｂｅｒｕｇ及びＧｒｅｍｌｉｎを含むＤＡＮ様タンパク質からなる群より選択されるタンパク質からなる群より選択される骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤；からなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことが好ましい。
【００４８】
増殖用培地におけるＥＧＦの含有量は、上述した分化用培地におけるＥＧＦの含有量と同様である。
【００４９】
増殖用培地は、ＦＧＦとして、上述した分化用培地におけるＦＧＦと同様のものを同様の含有量で含むことができる。
【００５０】
増殖用培地におけるＨＧＦの含有量は、上述した分化用培地におけるＨＧＦの含有量と同様である。
【００５１】
増殖用培地は、ＩＧＦとして、上述した分化用培地におけるＩＧＦと同様のものを同様の含有量で含むことができる。
【００５２】
増殖用培地におけるニコチンアミドの含有量は、５〜１５ｍＭであってもよく、８〜１２ｍＭであってもよい。
【００５３】
Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン４、Ｎｏｒｒｉｎ、ＧＳＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種であってよい。Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられる。Ｒ−スポンジンとしては、Ｒ−スポンジン１又はＲ−スポンジン４が好ましく、Ｒ−スポンジン１が特に好ましい。
【００５４】
Ｗｎｔアゴニストは、Ｒ−スポンジン１を含むことが好ましい。増殖用培地におけるＷｎｔアゴニストの含有量は、２００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、３００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、４００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、５００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよい。Ｗｎｔアゴニストの含有量の上限は特に限定されないが、例えば６００ｎｇ／ｍＬ程度であってもよい。
【００５５】
肝臓オルガノイドがヒト由来のものである場合、増殖用培地がＴＧＦ−β阻害剤を含むことが好ましい。ＴＧＦ−β阻害剤としてはＡ８３−０１が好ましく用いられる。増殖用培地におけるＴＧＦ−β阻害剤の含有量は、０〜２０μＭであってもよく、０〜１０μＭであってもよい。
【００５６】
ＢＭＰ阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎであることが好ましい。分化用培地におけるＢＭＰ阻害剤の含有量は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０〜１００ｎｇ／ｍＬであってもよく、５０〜１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。ＢＭＰ阻害剤の含有量の上限は特に限定されないが、例えば１５０ｎｇ／ｍＬ程度であってもよい。
【００５７】
増殖用培地は、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及び、Ｎ−アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことが好ましい。増殖用培地において、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ−アセチルシステインとしては、上述した分化用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。
【００５８】
本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法において、増殖工程を行う場合には、増殖工程を開始してから少なくとも１日以上後に分化工程を開始することが好ましい。増殖工程の期間（培養期間）は、例えば１〜１５日間であってもよく、例えば１〜５日間であってもよく、例えば２〜４日間であってもよい。
【００５９】
肝臓オルガノイドが増殖したことは、Ｌｇｒ５遺伝子又はＬｇｒ５タンパク質の発現量を測定することにより評価することができる。肝臓オルガノイドはＬｇｒ５タンパク質を発現する。
【００６０】
また、本実施形態の肝臓オルガノイドの製造方法において、肝臓細胞凝集塊が肝臓オルガノイドに分化したことは、肝細胞マーカーの発現や薬物代謝活性等を指標にして判定又は評価することができる。肝細胞マーカーとしては、例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、チロシン−アミノ基転移酵素（ＴＡＴ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）等が挙げられる。肝細胞マーカーの発現量の測定は、遺伝子レベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。
【００６１】
肝臓細胞凝集塊の集団から、肝臓オルガノイドのみからなる集団を得る方法としては、例えば、肝臓オルガノイドに特徴的な細胞表面マーカーの存在を指標にして、肝臓細胞凝集塊を選別・分取する方法が挙げられる。
【００６２】
薬物代謝活性は、薬物代謝酵素の発現の検出又は薬物代謝アッセイによって評価することができる。薬物代謝酵素としては、例えば、シトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）、シトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、シトクロムＰ４５０  ３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）、シトクロムＰ４５０  １Ａ（ＣＹＰ１Ａ）、シトクロムＰ４５０  ３Ａ（ＣＹＰ３Ａ）、シトクロムＰ４５０  ２Ｂ（ＣＹＰ２Ｂ）、シトクロムＰ４５０  ２Ｄ（ＣＹＰ２Ｄ）、ウリジン二リン酸−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）、硫酸転移酵素（ＳＵＬＴ）等が挙げられる。
【００６３】
増殖工程及び分化工程における、培養温度等の条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。具体的には、例えば、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養すればよい。
【００６４】
［肝臓オルガノイド］
本実施形態の肝臓オルガノイドは、上述した肝臓オルガノイドの製造方法により製造することができる。本実施形態の肝臓オルガノイドは、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、トランスポーター活性等のインビトロ評価に好適に用いることができる。また、肝疾患患者に移植して肝疾患を治療する細胞製剤として利用することもできる。
【００６５】
本実施形態の肝臓オルガノイドのアルブミンの発現量は、培養に用いた上皮肝幹細胞を含む組織片のアルブミンの発現量に対して、好ましくは２倍〜１０００倍、より好ましくは２．５倍〜１００倍、さらに好ましくは３倍〜５０倍である。
【００６６】
本実施形態の肝臓オルガノイドのＣＹＰ２Ｃ１９の発現量は、培養に用いた上皮肝幹細胞を含む組織片のＣＹＰ２Ｃ１９の発現量に対して、好ましくは５０％〜２００％、より好ましくは８０％〜１８０％倍、さらに好ましくは１００％〜１５０％である。
【００６７】
本実施形態の肝臓オルガノイドの密度は、好ましくは２００，０００個／ｍＬ以上である。
【００６８】
［細胞製剤］
本実施形態の細胞製剤は、上述したオルガノイドを含有する。本実施形態の細胞製剤中に含まれる肝臓オルガノイドの由来となる上皮肝幹細胞は、遺伝子工学的手法等により免疫原性が低減された肝臓組織由来であってもよいし、患者由来の肝臓組織由来であってもよいし、患者と免疫学的に適合した第３者の肝臓組織由来であってもよい。
【００６９】
本実施形態の細胞製剤は、各種肝疾患の治療に利用することができる。例えば、傷害や機能不全の肝臓組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。したがって、本実施形態の細胞製剤は再生医療用として用いることができる。
【００７０】
本実施形態の細胞製剤は、例えば、上述した肝臓オルガノイドを生理食塩水や緩衝液（例えば、リン酸系緩衝液）等に懸濁することによって製造することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば１×１０５個〜１×１０１０個の細胞を含有させるとよい。
【００７１】
本実施形態の細胞製剤の投与量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態等を考慮して適宜調整することができる。また、本実施形態の細胞製剤の投与方法としては、肝臓への局所投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与等が挙げられる。
【００７２】
［被験物質の評価方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した製造方法により製造された肝臓オルガノイドを培養する工程と、前記肝臓オルガノイドの代謝能を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法を提供する。また、別の実施態様において、本発明は、上述した製造方法により製造された肝臓オルガノイドに被験物質を作用させる工程と、前記肝臓オルガノイドの応答を評価する工程と、を含む、前記被験物質の評価方法を提供する。
【００７３】
本実施形態の評価方法により、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、トランスポーター活性等をインビトロで評価し、インビボにおける評価と一致した結果を得ることができる。
【００７４】
例えば、肝臓オルガノイドを用いて被験物質の代謝について試験することができる。被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）等が挙げられる。
【００７５】
医薬や栄養食品等の既存成分又は候補成分も好ましい被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清等を被験物質として用いてもよい。また、２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用等を調べることもできる。被験物質は天然物由来であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよい。後者の場合には、例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
【００７６】
本実施形態の評価方法において、被験物質と肝臓オルガノイドとを接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間〜３日間であってもよく、１時間〜１日間であってもよい。被験物質と肝臓オルガノイドとの接触を複数回に分けて行ってもよい。
【００７７】
肝臓オルガノイドの応答の評価は、適切な分析方法により実施することができる。例えば、産生される代謝産物に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法等を採用することができる。免疫学的手法としては、例えば、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）等が挙げられる。
【００７８】
肝臓オルガノイドにおける薬物代謝酵素（例えば、シトクロム、ＵＧＴ等）の発現を指標として被験物質の代謝を測定することもできる。薬物代謝酵素の発現はｍＲＮＡレベルで評価してもよいし、タンパク質レベルで評価してもよい。
【００７９】
本実施形態の評価方法により被験物質の毒性を試験することもできる。例えば、被験物質を接触させた後の肝臓オルガノイドの状態を調べ、被験物質の毒性を評価する。肝臓オルガノイドの状態としては、生存率、細胞形態、培養液中の肝障害マーカー（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）の存在量等が挙げられる。
【実施例】
【００８０】
［実施例１］
（マウス肝臓細胞凝集塊の形成）
摘出したＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓をＰＢＳで洗浄後に手術用ハサミで細かくミンスした。ミンス後の肝臓を５０ｍＬチューブ中でコラゲナーゼとディスパーゼの混合溶液と３７℃で２時間振とうしながら反応させた。反応後の肝臓懸濁液はメッシュサイズが１００μｍのセルストレーナー（カタログ番号「３５２３６０」、セルストレーナー（メッシュ１００μｍ）、ＢＤファルコン社）で濾過し、未分散の肝臓断片を除去した。濾過後の肝臓懸濁液は、遠心後、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した。この洗浄操作を２回行った後、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から１０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの培地を重層して培養した。培養して得られたマウス肝臓細胞凝集塊は酵素的解離によって希釈し、継代した。
【００８１】
（マウス肝臓オルガノイドの分化誘導）
形成したマウス肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して４日間培養した。増殖用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。
【００８２】
続いて、増殖用培地を重層して４日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、１日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。
【００８３】
（タンパク質レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して９日後に新しい分化用培地に交換し、更に３日間培地を交換せずに培養を続けた。その後、培養上清を回収し、培地中のアルブミン産生値をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法は市販のキット（カタログ番号「Ｅ９９−１３４」、ベチルラボラトリーズ社）を用いて行った。
【００８４】
また、培養上清を回収した後の細胞について、市販のキット（商品名「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ」、プロメガ社）を用いてＡＴＰ活性の測定を行った。
【００８５】
続いて、上述したＥＬＩＳＡ法により測定された波長４５０ｎｍにおける吸光度を、上述したＡＴＰ活性の測定値で除し、細胞量を補正してアルブミン産生量とした。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【００８６】
（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
培養上清を回収した後の細胞について、更に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【００８７】
［実施例２〜７］
増殖用培地及び分化用培地の組成を表１に示すものに変更した点以外は実施例１と同様にして肝臓細胞凝集塊を肝臓オルガノイドへと分化誘導し、アルブミン産生量の測定を行った。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【００８８】
［実施例８］
（ヒト肝臓細胞凝集塊の形成）
ヒト凍結浮遊肝細胞ＨＭＣＳ１Ｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を融解し、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２に加えて遠心した。上清を除いた後、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した。この洗浄操作を２回行った後、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から６０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層し培養した。増殖したヒト肝臓細胞凝集塊は酵素的解離によって希釈し、継代した。
【００８９】
（ヒト肝臓細胞凝集塊の分化誘導）
形成したヒト肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１０，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して１０日間培養し、ヒト肝臓オルガノイドを得た。増殖用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。
【００９０】
続いて、増殖用培地を重層して１０日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、２日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表１に記載した組成の培地を用いた。
【００９１】
（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して１０日後に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表１にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【００９２】
［比較例１］
（マウス肝臓細胞凝集塊の形成）
実施例１と同様にして、マウス肝臓細胞凝集塊を形成した。
【００９３】
（マウス肝臓オルガノイドの分化誘導）
形成したマウス肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して３日間培養した。増殖用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。
【００９４】
続いて、増殖用培地を重層して３日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、１日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。
【００９５】
（タンパク質レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して９日後に新しい分化用培地に交換し、更に３日間培地を交換せずに培養を続けた。その後、培養上清を回収し、培地中のアルブミン産生値をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法は市販のキット（カタログ番号「Ｅ９９−１３４」、ベチルラボラトリーズ社）を用いて行った。
【００９６】
また、培養上清を回収した後の細胞について、市販のキット（商品名「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ」、プロメガ社）を用いてＡＴＰ活性の測定を行った。
【００９７】
続いて、上述したＥＬＩＳＡ法により測定された波長４５０ｎｍにおける吸光度を、上述したＡＴＰ活性の測定値で除し、細胞量を補正してアルブミン産生量とした。
【００９８】
（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
培養上清を回収した後の細胞について、更に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表２にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【００９９】
［比較例２〜４］
増殖用培地及び分化用培地の組成を表２に示すものに変更した点以外は比較例１と同様にして肝臓細胞凝集塊を肝臓オルガノイドへと分化誘導し、アルブミン産生量の測定を行った。表２にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【０１００】
［比較例５］
（ヒト肝臓細胞凝集塊の形成）
実施例８と同様にして、ヒト肝臓細胞凝集塊を形成した。
【０１０１】
（ヒト肝臓オルガノイドの分化誘導）
形成したヒト肝臓細胞凝集塊を酵素的解離した後、得られた１０，０００個の細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５〜１０分間インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、５００μＬの増殖用培地を重層して１０日間培養した。増殖用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。
【０１０２】
続いて、増殖用培地を重層して１０日目に、全量の培地を分化用培地に交換した。以後、２日おきに培地を新しい分化用培地に交換した。分化用培地としては、表２に記載した組成の培地を用いた。
【０１０３】
（遺伝子レベルでのアルブミン発現量の測定）
分化用培地に交換して１０日後に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表２にアルブミン産生量の測定結果を示す。
【０１０４】
【表１】
2020092700.tif 000002
【０１０５】
【表２】
2020092700.tif 000003
【０１０６】
（遺伝子レベルでの各ＣＹＰ発現量の測定）
実施例８および比較例５において、分化用培地に交換して１０日後に、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲにより各ＣＹＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。表３に凍結肝細胞の各ＣＹＰ発現量に対して各ＣＹＰ発現量の測定結果を示す。表３中の値は、ＧＡＰＤＨ発現量を１００％とした場合の割合（％）である。
【０１０７】
【表３】
2020092700.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明によれば、アルブミンの発現量に優れた肝臓オルガノイドの製造方法を提供することができる。