(57)【要約】【課題】遊離の酵素が水溶液中で示す優れた触媒作用を維持したまま、失活が抑制され、有機溶媒の存在下でも凝集せず、そして回収が容易な態様で酵素を活用することが可能な、酵素担持多孔膜を提供すること。【解決手段】一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜と、前記ポリケトン多孔膜に担持された酵素とを含む、酵素担持ポリケトン多孔膜。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜と、前記ポリケトン多孔膜に担持された酵素とを含む、酵素担持ポリケトン多孔膜。
【請求項２】
前記酵素と前記ポリケトンとが共有結合性の連結基によって結合されている、請求項１に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
【請求項３】
前記共有結合性の連結基がアミド結合を含む、請求項２に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
【請求項４】
前記共有結合性の連結基が炭素数４〜１２のアルキレン基を含む、請求項２又は３に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
【請求項５】
平膜状又は中空糸状である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
【請求項６】
下記の工程：
一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜を準備する、ポリケトン多孔膜準備工程；
前記ポリケトンのケト基の一部を水酸基に変換する、ケト基還元工程；
前記水酸基の一部にカルボキシル基を導入する、カルボキシル基導入工程；並びに
前記カルボキシル基と酵素のアミノ基とを結合させる、酵素担持工程；
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜の製造方法。
【請求項７】
前記ケト基還元工程における前記ケト基の前記水酸基への変換率が１０〜５０モル％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜を含む、フィルター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜を含む、リアクター。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜を含む、センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素担持ポリケトン多孔膜に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、触媒として機能するタンパク質であり、基質特異性及び反応選択性が高いことから、広い分野で応用されている。
酵素は、水溶液中、遊離の状態で高い活性を示し、高度の触媒能を発揮する。しかし、遊離状態の酵素は、失活することがある他、回収再利用が困難である。また、酵素は水溶液中では高い活性を示すが、有機溶媒の存在下では所期の触媒能を発揮し難い。
【０００３】
そこで、酵素を固体上に担持して固定化する試みが行われている。
例えば特許文献１には、ポリオレフィン、オレフィンとハロゲン化オレフィンとの共重合体、又はポリフッ化ビニリデンから成る多孔性基材膜の膜孔表面に導入されたグラフト高分子鎖に、酵素が吸着又は共有結合により固定化されている、酵素固定多孔膜が記載されている。
特許文献２には、多孔膜が有する孔の内面に酵素を固定した酵素固定膜が記載されている。この特許文献２では、多孔膜としてはポリオレフィン又はポリフッ化ビニリデンが好ましく、酵素の固定方法としては吸着又は多孔質の孔の内面に導入したグラフト高分子鎖を介する固定が好ましいとされている。
【０００４】
また、特許文献３には、酵素の凝集物からなる酵素粒子を樹脂材料に混入して所定形状の成形体に成形した後、成形体内部に含まれる酵素粒子の部分を溶解除去して成形体内部に酵素粒子による連通状の空洞部を形成するとともに、酵素粒子の他の部分を空洞部内面に担持固定させることにより製造された酵素固定多孔質構造体が記載されている。特許文献３では、樹脂材料としてポリオレフィン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリエステル樹脂等が用いられるとされている。
更に特許文献４には、微細セルロール繊維から成るタンパク質吸着性セルロース不織布が、酵素固定膜として適用できると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１９１８７７号公報
【特許文献２】特開２００４−７３９４３号公報
【特許文献３】特開２００９−１８３２４５号公報
【特許文献４】特開２０１２−１６７４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遊離の酵素が水溶液中で示す優れた触媒作用を維持したまま、失活が抑制され、有機溶媒の存在下でも凝集せず、そして回収が容易な態様で酵素を活用することが可能な、酵素担持多孔膜を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するための本発明は、以下のとおりである。
《態様１》
一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜と、上記ポリケトン多孔膜に担持された酵素とを含む、酵素担持ポリケトン多孔膜。
《態様２》
上記酵素と上記ポリケトンとが共有結合性の連結基によって結合されている、態様１に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
《態様３》
上記共有結合性の連結基がアミド結合を含む、態様２に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
《態様４》
上記共有結合性の連結基が炭素数４〜１２のアルキレン基を含む、態様２又は３に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
《態様５》
平膜状又は中空糸状である、態様１〜４のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜。
《態様６》
下記の工程：
一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜を準備する、ポリケトン多孔膜準備工程；
前記ポリケトンのケト基の一部を水酸基に変換する、ケト基還元工程；
前記水酸基の一部にカルボキシル基を導入する、カルボキシル基導入工程；並びに
前記カルボキシル基と酵素のアミノ基とを結合させる、酵素担持工程；
を含む、態様１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜の製造方法。
《態様７》
上記ケト基還元工程における上記ケト基の上記水酸基への変換率が１０〜５０モル％である、態様６に記載の方法。
《態様８》
態様１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜を含む、フィルター。
《態様９》
態様１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜を含む、リアクター。
《態様１０》
態様１〜５のいずれか一項に記載の酵素担持ポリケトン多孔膜を含む、センサー。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜を用いると、遊離の酵素が水溶液中で示す優れた触媒作用を維持したまま、失活が抑制され、有機溶媒の存在下でも凝集せず、そして回収が容易な態様で酵素を活用することができる。
したがって、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、水中、有機溶媒存在下、気相中等で、基質特異性及び反応選択性が高い酵素反応を高い活性で安定的に行うことができるとともに、酵素の回収再利用が容易である。そのため、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、酵素反応の応用範囲を拡大し、酵素反応による製品のプロセスコストの削減にも資する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
《酵素担持ポリケトン多孔膜》
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜と、このポリケトン多孔膜に担持された酵素とを含む。
【００１０】
〈ポリケトン多孔膜〉
ポリケトン多孔膜は、一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成される。
【００１１】
（ポリケトン）
ポリケトンの合成において、一酸化炭素と共重合させるオレフィンとしては、目的に応じて任意の種類の化合物を選択できる。オレフィンとしては、例えば、エチレン、プロピレン、ブテン、ヘキセン、オクテン、デセン等の鎖状オレフィン；スチレン、α−メチルスチレン等のアルケニル芳香族化合物；シクロペンテン、ノルボルネン、５−メチルノルボルネン、テトラシクロドデセン、トリシクロデセン、ペンタシクロペンタデセン、ペンタシクロヘキサデセン等の環状オレフィン；塩化ビニル、フッ化ビニル等のハロゲン化アルケン；エチルアクリレート等のアクリル酸エステル；メチルメタクリレート等のメタクリル酸エステル；酢酸ビニル等が挙げられる。ポリケトン支持層の強度を確保する点からは、一酸化炭素と共重合させるオレフィンの種類は、１〜３種類であることが好ましく、１又は２種類であることがより好ましい。
【００１２】
ポリケトン多孔膜の力学特性及び耐熱性の観点からは、該ポリケトン多孔膜を構成するポリケトンの合成に用いられるオレフィンの炭素数は、２〜８であることが好ましく、２又は３であることがより好ましく、２であることが最も好ましい。
特に、ポリケトンが、下記式（１）：
【化１】
2020125397.tif 000002
で表される１−オキソトリメチレン繰り返し単位を含むことが好ましく、この１−オキソトリメチレン繰り返し単位を多く含むほど好ましい。
【００１３】
ポリケトン多孔膜の力学特性及び耐熱性の観点からは、ポリケトンにおける繰り返し単位中の１−オキソトリメチレン繰り返し単位の割合は、７０モル％以上であることが好ましく、９０モル％以上であることがより好ましく、９５モル％以上であることが更に好ましい。１−オキソトリメチレン繰り返し単位の割合は１００モル％でもよい。
ポリケトンにおける繰り返し単位には、１−オキソトリメチレン繰り返し単位以外の構造が０．１モル％以上含まれていてもよい。
【００１４】
ここで、「１００モル％」とは、元素分析、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィー等の公知の分析方法において、ポリマー末端基を除いて１−オキソトリメチレン以外の繰り返し単位が観測されないことをいう。ポリケトンを構成する繰り返し単位の構造及び各構造の量は、典型的にはＮＭＲによって確認される。
【００１５】
（ポリケトン多孔膜の物性）
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜におけるポリケトン多孔膜は、上記のようなポリケトンから構成される多孔膜である。
ポリケトン多孔膜（酵素担持前）の孔径は、ＧＡＬＷＩＣＫ試薬を用いてパームポロメーターによって測定される平均流量孔径として、０．０１ｎｍ〜５０μｍであることが好ましく、０．０２ｎｍ〜４０μｍであることがより好ましく、０．０３ｎｍ〜３０μｍであることが更に好ましい。ポリケトン多孔膜の孔径をこの範囲に設定すると、得られる酵素担持ポリケトン多孔膜が適正な透水量及び比表面積を示すこととなり、酵素反応の反応効率の観点から好ましい。
【００１６】
本発明のある実施態様において、ポリケトン多孔膜は、空隙率５〜９５％を有することが好ましい。空隙率は、下記数式（１）：
空隙率（％）＝（１−Ｇ／ρ／Ｖ）×１００      （１）
｛数式（１）中、Ｇはポリケトン多孔膜の質量（ｇ）であり、ρはポリケトン多孔膜を構成するすべての樹脂の質量平均密度（ｇ／ｃｍ３）であり、Ｖはポリケトン多孔膜の体積（ｃｍ３）である。｝により算出される。上記数式（１）において、質量平均密度ρは、ポリケトン多孔膜が、ポリケトンとは密度の異なる樹脂とポリケトン樹脂との複合化によって構成される場合、各々の樹脂の密度にその構成質量比率を乗じた値の和である。例えば、ρＡ及びρＢの密度をそれぞれ持つ繊維がＧＡ及びＧＢの質量比率で構成された不織布に、密度ρｐのポリケトンがＧｐの質量比率で複合されているときには、質量平均密度は、下記数式（２）：
質量平均密度＝（ρＡ・ＧＡ＋ρＢ・ＧＢ＋ρｐ・Ｇｐ）／（ＧＡ＋ＧＢ＋Ｇｐ）      （２）
で表される。
【００１７】
空隙率が５％以上のポリケトン多孔膜（酵素担持前）は、例えば濾材として用いられる場合、透過流束が大きく、粒子捕集効率が良好で、閉塞までの時間が長い等の利点を有する。一方、ポリケトン多孔膜の空隙率が９５％以下の場合、該ポリケトン多孔膜は機械的強度が高い状態に維持され、フィルター、リアクター、センサー等の製造中又は使用中に該ポリケトン多孔膜が頻繁に破損されるおそれを回避できる。
本発明のポリケトン多孔膜の空隙率としては、３０〜９５％がより好ましく、４０〜９０％が更に好ましく、５０〜９０％が最も好ましい。
【００１８】
ポリケトン多孔膜（酵素担持前）の比表面積は、得られる酵素担持ポリケトン多孔膜による酵素反応の反応効率を最適化する観点から、好ましくは０．１〜２００ｍ２／ｇであり、より好ましくは０．３〜１８０ｍ２／ｇであり、特に好ましくは０．５〜１５０ｍ２／ｇである。
【００１９】
〈酵素〉
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜における酵素とは、膜酵素であっても可溶型酵素であってもよく、補酵素及び複合酵素を含み、触媒作用を有するタンパク質全般を包含する概念である。
後述する本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜の製造方法によれば、アミノ酸ユニットのアミノ基を利用することにより、あらゆる種類の酵素がポリケトン多孔膜に担持可能である。したがって本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜における酵素としては、所望の酵素反応の種類に応じて、任意の酵素を選択して用いることができる。例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ（除去付加酵素）、異性化酵素、リガーゼ（合成酵素）等から選択される１種以上を用いてよい。
【００２０】
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜における酵素の担持量は、酵素担持ポリケトン多孔膜の単位質量当たりの酵素質量として、好ましくは０．１〜１００μｇ／ｍｇであり、より好ましくは１〜６０μｇ／ｍｇであり、更に好ましくは５〜４０μｇ／ｍｇであり、特に好ましくは１０〜２０μｇ／ｍｇである。酵素担持量が０．１μｇ／ｍｇ以上であれば、高い酵素活性が得られる。酵素担持量が１００μｇ／ｍｇ以下であれば、凝集による失活を抑制できる。
酵素の担持量は、例えば、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法等によって測定することができる。
【００２１】
〈ポリケトン多孔膜への酵素の担持の態様〉
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜では、酵素は、ポリケトン多孔膜上に物理的又は化学的に担持されていてよい。物理的な担持とは、例えば、ファンデルワールス力による物理吸着の場合である。化学的な担持とは、例えば、共有結合による場合である。
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜では、酵素は、共有結合によって担持されていることが好ましく、特に好ましくは、酵素とポリケトンとが共有結合性の連結基によって結合されている場合である。酵素とポリケトンとが共有結合によって担持されていることにより、酵素担持ポリケトン多孔膜の保存中又は反応中に、酵素の脱離及び散逸を抑制することができる。酵素とポリケトンとが連結基を介して結合していることにより、酵素担持ポリケトン多孔膜の製造の際の担持効率を向上させ得るとともに、多孔膜に対する相対的な可動性を酵素に付与することができ、酵素反応の効率が上昇させることができる。
【００２２】
酵素−ポリケトン間の共有結合性の連結基は、アミド結合を含んでいてよく、ピロール環を含んでいてもよい。これらの場合、酵素担持の際に、酵素のアミノ酸ユニットのアミノ基を利用することが可能となり、担持工程が容易化される。
酵素−ポリケトン間の共有結合性の連結基は、炭素数４〜１２のアルキレン基を含んでいてよい。このことにより、酵素の担持効率及び反応効率の双方を最大化することができる。
【００２３】
連結基がアミド結合を含む酵素担持ポリケトン多孔膜は、例えば、酵素とポリケトンとを直接反応させることにより、得ることができる。
連結基がアミド結合を含む酵素担持ポリケトン多孔膜は、ポリケトンが一酸化炭素とエチレンとの共重合体である場合について例示すれば、例えば下記式（２）：
【化２】
2020125397.tif 000003
｛式（２）中、ｎは４〜１２の整数であり、窒素原子は酵素のアミノ酸ユニットのアミノ基に由来する窒素原子であり、ａ及びｂは、それぞれ、繰り返し単位数である。｝で表される構造を有していてよい。式（２）における（ＣｎＨ２ｎ）ユニットは、直鎖であっても分岐していてもよいが、直鎖であることが、酵素の担持効率及び反応効率の点から好ましい。
【００２４】
（カルボキシル基）
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、カルボキシル基を有していてよい。
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜におけるカルボキシル基の量は、酵素担持ポリケトン多孔膜の単位質量当たりのカルボキシル基のモル数として、好ましくは０．１〜１，０００ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．３〜８００ｍｍｏｌ／ｇであり、更に好ましくは１．０〜６００ｍｍｏｌである。酵素担持ポリケトン多孔膜におけるカルボキシル基の量が０．１ｍｍｏｌ／ｇ以上であることにより、極性溶媒（例えば、水若しくは水溶性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒）に対する多孔膜の濡れ性を向上し、該極性溶媒中における酵素活性を向上することができる。一方、カルボキシル基の量が１，０００ｍｍｏｌ／ｇ以下である酵素担持ポリケトン多孔膜は、適当な量のケト基を維持しており、したがって耐溶剤性に優れるから、有機溶媒中、又は水と水溶性有機溶媒との混合溶媒中における酵素反応活性を長時間維持することができる。
【００２５】
酵素担持ポリケトン多孔膜におけるカルボキシル基は、例えば、後述の本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜の製造方法において、ポリケトンのケト基を還元して得られた水酸基に導入されたカルボキシル基のうち、酵素の担持に関与しなかったものであってよい。この場合、酵素担持ポリケトン多孔膜は、例えば下記式（３）：
【化３】
2020125397.tif 000004
｛式（３）中、ｎ及びＮは、それぞれ、式（２）中のｎと同じ意味であり、ａ、ｂ、及びｃは、それぞれ、繰り返し単位数である。｝で表される構造を有していてよい。
【００２６】
〈酵素担持ポリケトン多孔膜の物性〉
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜の孔径及び比表面積は、酵素担持前のポリケトン多孔膜の孔径及び比表面積と実質的な差はない。
したがって、酵素担持ポリケトン多孔膜の孔径は、ＧＡＬＷＩＣＫ試薬を用いてパームポロメーターによって測定される平均流量孔径として、好ましくは０．０１ｎｍ〜５０μｍであり、より好ましくは０．０２ｎｍ〜４０μｍであり、更に好ましくは０．０３ｎｍ〜３０μｍであり；
比表面積は、好ましくは０．１〜２００ｍ２／ｇであり、より好ましくは０．３〜１８０ｍ２／ｇであり、更に好ましくは０．５〜１５０ｍ２／ｇである。
【００２７】
〈酵素担持ポリケトン多孔膜の形状〉
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜の形状は、例えば、平膜状、中空糸状等の任意の形状であってよい。
また酵素担持ポリケトン多孔膜は、支持体を持たない自立膜であってもよいし、支持体上に酵素担持ポリケトン多孔膜を有する複合膜として存在していてもよい。支持体は、例えば、平膜状、中空糸状、組み紐状等の任意の形状であってよい。
【００２８】
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、ある実施態様において平膜である。平膜は、フィルター用途に好適である。平膜の厚みは、特に制限はなく用途に応じて任意の厚みとできるが、好ましくは０．１〜１，０００μｍであってよい。酵素担持ポリケトン多孔膜をフィルター材として用いる場合、モジュールの小型化及び有効濾過面積の広さの観点から、酵素担持ポリケトン多孔膜の厚みは小さい方が好ましく、７００μｍ以下が好ましい。フィルター材としての酵素担持ポリケトン多孔膜の厚みは、５００μｍ以下であることがより好ましく、４００μｍ以下であることが更に好ましく、特に３００μｍ以下であることが好ましい。一方で、膜の機械的強度を考慮すると、酵素担持ポリケトン多孔膜の厚みは５μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましく、１５μｍ以上であることが更に好ましく、特に２０μｍ以上であることが好ましい。
【００２９】
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、ある実施態様において中空糸である。
酵素担持ポリケトン多孔膜が中空糸である場合、その内径は適宜選択されてよいが、例えば０．０２ｍｍ以上２０ｍｍ以下の間であってよい。処理液と酵素担持ポリケトン多孔膜との接触性をより高くするためには、中空糸の内径は、０．０５ｍｍ〜１５ｍｍであることが好ましい。中空糸の外径は、特に限定されないが、内外の圧力差に耐え得る厚みを確保するとの観点から、中空糸の内径を考慮して適宜選択することができる。
【００３０】
《酵素担持ポリケトン多孔膜の製造方法》
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、例えば、
一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜を準備する、ポリケトン多孔膜準備工程；
上記ポリケトンのケト基の一部を水酸基に変換する、ケト基還元工程；
上記水酸基の一部又は全部にカルボキシル基を導入する、カルボキシル基導入工程；並びに
上記カルボキシル基と酵素のアミノ基とを結合させる、酵素担持工程；
を含む方法によって製造することができる。
【００３１】
〈ポリケトン多孔膜準備工程〉
ポリケトン多孔膜準備工程では、一酸化炭素及びオレフィンの共重合体であるポリケトンから構成されるポリケトン多孔膜を準備する。
ポリケトン多孔膜は、所定のポリケトンを溶媒に溶解してドープを作製し、これを望みの形に成形して、凝固、洗浄、及び乾燥を経て製造されることが好ましい。 
【００３２】
（ポリケトン）
本発明におけるポリケトンは、例えば、パラジウム、ニッケル等を触媒として用いて、一酸化炭素と所望のオレフィンとを公知の方法で共重合させることにより、得ることができる。ポリケトンとしては、市販品を用いてもよい。
【００３３】
（ドープ）
ポリケトンを溶解させる溶媒は特に限定されず、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール、プロピレンカーボネート、ｍ−クレゾール等の有機溶媒；レゾルシン水溶液；塩化亜鉛、塩化亜鉛／塩化カルシウム、塩化亜鉛／塩化リチウム、塩化亜鉛／チオシアン酸カルシウム、塩化亜鉛／塩化カルシウム／塩化リチウム、塩化亜鉛／塩化カルシウム／チオシアン酸カルシウム等の金属塩水溶液；等の公知の溶媒を用いることができる。
膜厚方向に均一な孔径を持つ多孔膜を製造するには、ポリケトンを溶解させる溶媒と、ドープを相分離させる凝固液との組み合わせが重要である。詳しくは、溶媒としてポリケトンを十分良好に溶解させる良溶媒を選択し、凝固液としてドープを適切な速度で相分離させる貧溶媒を選択することが好ましい。このような理由より、本発明におけるポリケトン多孔膜を製造するために用いる溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロパノール、ｍ−クレゾール、レゾルシン水溶液等が好ましい。以下、本発明のポリケトン多孔膜の製造方法の一例として、レゾルシン水溶液を用いる方法について説明する。
【００３４】
レゾルシン水溶液中のレゾルシン濃度としては、重合体の溶解性を高くし、得られる多孔膜の構造を良好とする観点から、６０〜８０質量％が好ましく、より好ましくは６０〜７５質量％、さらに好ましくは６０〜７０質量％である。重合体は、このレゾルシン水溶液と混合され、加熱及び撹拌されて、必要に応じて減圧下又は加圧下で脱泡されて、ドープを得る。ドープにおける重合体濃度は、得られる多孔膜の細孔径を最適値に制御するために、１〜５０質量％とすることが好ましく、３〜２０質量％とすることがより好ましい。
以下、多孔膜が平膜状である場合、及び中空糸状である場合の製造方法を順に説明する。 
【００３５】
〈平膜状多孔膜の製造〉
（ドープ粘度）
上記のドープから平膜状の多孔膜を成形するときには、ドープ粘度は低くてよい。成形温度におけるドープ粘度は、１０〜１，０００ｐｏｉｓｅであることが好ましい。ドープ粘度が１０ｐｏｉｓｅ以上である場合、ドープが過度に流れ易くならず、膜の形状を均一に維持することが容易となり、欠点が少ない平膜を形成できる。一方、ドープ粘度が１，０００ｐｏｉｓｅ以下である場合、多孔膜の厚みを均一にすることが容易となる点で好ましい。ドープ粘度は、５０〜５００ｐｏｉｓｅであることがより好ましい。上記ドープ粘度は、成形温度においてＢ型粘度計で測定される値である。 
【００３６】
（成形）
平膜の成形は、バッチ式でも連続式でもよい。
平膜をバッチ式で成形する場合、アプリケータを用いて、基材の上面にドープを平膜状に流延する方法が挙げられる。連続式の場合、走行する基材上にドープを平膜状に塗布する方法、ドープを平膜状として空気中に押し出す方法等を挙げることができる。基材としては、例えば、ガラス板、金属板、プラスチックフィルム等を使用できる。走行する基材上にドープを塗布するには、例えば、ダイコーター、ロールコーター、バーコーター等の装置を用いて行うことができる。ドープを空気中に押し出すには、例えばＴダイを用いて行うことができる。
塗布又は押し出しの際のドープ温度は、１５〜９０℃が好ましい。１５℃以上の場合、ドープ粘度の増大を抑えて膜の厚みを容易に均一にできるとともに、ドープ中のレゾルシンの析出を回避できる。また９０℃以下の場合、レゾルシン水溶液中の水が蒸発することによるドープの組成変化を回避でき、目的の構造制御が容易となる。
ドープを基材上に塗布した場合、得られた多孔膜は、凝固後の任意の時点で基材から剥離されてよい。
【００３７】
（凝固）
次いで、塗布された、又は空気中へ押し出された平膜状のドープは、メタノール、水、又はこれらの混合溶媒等の、レゾルシンが溶解可能な凝固液に浸漬されて凝固される。該凝固液にレゾルシンが所定量含まれていることは、溶媒の回収再利用を行う際に、安定した凝固液組成の管理が可能となる点で好ましい。
凝固液の組成及び温度は、多孔膜の構造を制御するために重要な要件であり、ドープにおける溶媒の組成を考慮して、適宜選定される。
【００３８】
ドープの溶媒としてレゾルシン水溶液を用いる場合、凝固液としては、メタノール、又は水とメタノールとを適切な比率で混合した溶媒を用いることが好ましい。水とメタノールとの混合溶媒の場合は、両者の質量比率を、水：メタノール＝７５：２５〜０：１００とすることが、多孔膜の構造を構築するうえで好ましい。水とメタノールとの混合溶媒の組成が上記の範囲内であれば、得られる多孔膜の表面付近に緻密な層が形成されることを回避し、膜厚方向における孔径分布を均一に制御することができる。
凝固液の温度は、−２０℃〜５０℃とすることが好ましい。凝固液の温度が−２０℃以上である場合、凝固工程中にレゾルシンが多孔膜中に析出することを回避でき、得られる多孔膜のピンホールの形成を回避できる。凝固液温度が５０℃以下である場合、多孔膜の表面又は全体が緻密となってしまうことを回避できる。凝固液の温度は、０〜４０℃であることがより好ましい。 
【００３９】
（洗浄）
上述の方法により凝固された平膜は、凝固液等で更に洗浄され、必要に応じて膜に含まれる凝固液を他の溶媒で置換する。溶媒置換の目的は、多孔膜を乾燥する際の乾燥効率を高めること、及び、多孔膜の構造が乾燥時に収縮する等の変形を防止することである。これらの観点から、凝固液を置換する溶媒としては、水より表面張力の低い溶媒が好ましく、具体的には例えば、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロピパノール、ノルマルブタノール、ノルマルオクタノール等のアルコール溶媒；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒；ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、シクロヘキサン、ノルマルヘプタン、ノルマルオクタン、ベンゼン、トルエン等の低極性有機溶媒等が好ましい。高い空隙率を有する多孔膜を得るという観点からは、ノルマルペンタン、ノルマルヘキサン、シクロヘキサン、ノルマルヘプタン、ノルマルオクタン、ベンゼン、トルエン等の低極性有機溶媒が特に好ましい。
溶媒置換に用いる溶媒には、必要に応じて界面活性剤等の添加剤が含まれていてもよい。
【００４０】
凝固した平膜が水を含む場合、低極性溶媒への溶媒置換を円滑に行うために、水と低極性溶媒との両方と混ざりやすいアセトン等の溶媒で前もって溶媒置換を行ってもよい。凝固液を置換する溶媒としては、表面張力の小さい溶媒が好ましく、具体的には例えば、トルエン、シクロヘキサン、ノルマルヘキサン等が好ましい。これら溶媒の中に極性の強い溶媒が含まれていると、ポリケトン多孔膜の構造の均一性を損なう傾向がある。そのため、置換回数を増やすこと、又は置換に使用する溶媒の純度をできるだけ高くすることが重要である。置換に使用する溶媒の純度としては、９０質量％以上が好ましく、９５質量％以上がより好ましく、９８質量％以上が更に好ましく、１００質量％であってもよい。また、得られた平膜を水で洗浄する場合は、水洗浄後の膜を必要に応じて、常圧又は加圧下で、６０〜２００℃の温水を用いて洗浄することが好ましい。この処理は、膜を乾燥する際に、孔の構造が収縮等の変形を防止する効果がある。以上の処理は、溶媒及び凝固液の種類等に応じて、方法及び必要性は異なるが、多孔膜の構造をコントロールし、所定の範囲内に調整するために重要な条件である。特にノルマルヘキサンへの置換及び温水洗浄は、多孔膜の結晶化度を高め、機械的強度を高くし、熱的安定性をもたらす点で好ましい。
【００４１】
（乾燥）
次いで、平膜を乾燥することにより、平膜状の多孔膜が得られる。
平膜の乾燥は、例えば、加熱ロール、熱風、電熱ヒーター等、又はこれらの組合せにより行うことができる。乾燥温度は、１５〜２００℃の範囲内で、除去される溶媒の種類によって適宜選ばれる。また、必要に応じて、静電気防止剤を、乾燥前又は乾燥後の多孔膜に適用してもよい。
【００４２】
（任意工程）
−延伸−
上述のようにして得た平膜状の多孔膜を、必要に応じて延伸してもよい。延伸は１軸方向のみで行ってもよいし、２軸方向で行ってもよいが、全延伸倍率は５倍以下が好ましい。延伸倍率が５倍以下である場合、延伸時に平膜状多孔膜の破断を回避する点で有利である。延伸は、ドープを凝固液中で凝固させた直後に行ってもよいし、平膜状多孔膜の乾燥後に、必要ならば加熱して行なってもよい。多孔膜の孔を構成する繊維状組織は、太さが１μｍ程度以下の非常に細い繊維から成り、空隙率が高い構造である。したがってその破壊を避けるためには、加熱延伸を行う場合の延伸速度は遅いことが好ましい。この観点から、加熱延伸を実施する場合の延伸速度は、中空糸１ｃｍ長あたりの延伸速度として、０．５ｃｍ／ｓｅｃ以下とすることが好ましい。
【００４３】
〈中空糸状多孔膜の製造〉
（ドープ粘度）
多孔膜を中空糸状に成形する場合、ドープの粘度は高い方が適している。多孔膜を中空糸状に成形する場合のドープ粘度は、成形温度において１００〜５，０００ｐｏｉｓｅであることが好ましい。ドープ粘度が１００ｐｏｉｓｅ以上である場合、中空糸膜の成型時に糸切れが生じ難く、連続糸を作ることが容易になる。ドープ粘度が５，０００ｐｏｉｓｅ以下である場合、糸内部に中空を作ることが容易となり好ましい。ドープ粘度は２００〜４，０００ｐｏｉｓｅであることがより好ましく、３００〜２，０００ｐｏｉｓｅであることが更に好ましい。ドープの温度は、上記の好ましいドープ粘度にするために適宜調節されるが、２０〜９０℃が好ましい。ドープの温度が２０℃以上である場合、ドープ粘度の過度の増大を回避して膜の厚みを均一にすることができるとともに、ドープ中の溶質の析出を回避できる。ドープの温度が９０℃以下である場合、ドープ中の溶媒が蒸発することによるドープの組成の変化を回避でき、多孔膜の構造制御が容易になる。
【００４４】
（成形）
中空糸の成形は、例えば、二重管オリフィス、Ｃ型オリフィス等の紡糸口金を用いて行うことができる。二重管オリフィスを用いる場合、外側の輪状オリフィスからドープを、内側の円状オリフィスからは適宜の液体又は気体を、それぞれ空気中へ吐出することが好ましい。内側の円状オリフィスからの吐出物は、中空糸形状の制御性の観点からは気体であることが好ましく、紡糸の安定性の観点からは液体であることが好ましい。内側の円状オリフィスから気体を吐出する場合、気体としては乾燥窒素が好ましい。内側の円状オリフィスから液体を吐出する場合、膜厚方向で均一な構造を形成する観点から、後述の凝固液と同じ又は近い組成の液体を使用することが好ましい。中空部の形状維持の点から、液体又は気体は、０．０１ＭＰａ以上の圧力をかけて、内側の円状オリフィスから吐出されることが好ましい。
【００４５】
（凝固）
次いで、空気中へ押し出されたドープを乾式又は湿式で凝固し、ポリケトンを析出させることにより、中空糸状の多孔膜構造が得られる。レゾルシン水溶液をドープの溶媒とした場合、空気中へ押し出されたドープは、中空部に気体又は液体が充填されている。この状態のドープを、メタノール、水、又はそれらの混合溶媒等の、レゾルシンが溶解可能な凝固液に浸漬して凝固する。凝固液としては、平膜の場合と同様の条件が好適に用いられる。
【００４６】
（洗浄及び乾燥）
凝固後の中空糸状の多孔膜は、平膜状の場合と同様の方法で、又はこれに適宜の修正を加えた方法で、洗浄、及び必要に応じて溶媒置換又は温水洗浄が行われる。
乾燥は行っても行わなくてもよい。乾燥を行う場合には、膜状の場合と同様の方法で、又はこれに適宜の修正を加えた方法で行うことができる。
【００４７】
（任意工程）
−延伸−
上述のようにして得た中空糸状の多孔膜を、必要に応じて延伸してもよい。
延伸は１軸方向で行われてよく、延伸倍率は５倍以下が好ましい。延伸倍率が５倍以下である場合、中空糸膜の破断が回避でき、好ましい。延伸は、ドープの凝固直後に行ってもよいし、中空糸状多孔膜の乾燥後に、必要ならば加熱して、行なってもよい。加熱延伸を実施する場合、延伸速度は遅い方が好ましく、中空糸１ｃｍ長あたりの延伸速度として、０．５ｃｍ／ｓｅｃ以下で行なうことが好ましい。
【００４８】
〈ケト基還元工程〉
ケト基還元工程では、上記のようにして例えば平膜状又は中空糸状に成形されたポリケトンのケト基の一部を、水酸基に変換する。ケト基還元工程は、成膜の容易性、変換の効率等を重視する観点から、ポリケトンを多孔膜に形成した後に実施することが好ましい。
【００４９】
ケト基の水酸基への変換は、ポリケトンの多孔膜を、適当な還元剤を含有する溶液、好ましくは水溶液に浸漬することにより、行うことができる。還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素リチウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素カリウム、水素化ホウ素亜鉛、アセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム、水酸化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム等を挙げることができ、これらのうちの水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素リチウム、水素化アルミニウムリチウム、又は水酸化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウムが好ましく、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化アルミニウムリチウムがより好ましい。
【００５０】
溶液中の還元剤濃度は、ポリケトンの量、所望の変換率等に応じて適宜に設定されてよく、例えば、０．０５〜５質量％とすることができ、０．１〜１質量％とすることが好ましい。
変換反応の温度及び時間は、ポリケトンの量、所望の変換率等に応じて適宜に設定されてよく、例えば、室温において５分〜１時間の条件を例示できる。
【００５１】
ポリケトンが有するケト基の水酸基への変換率として定義される水酸基率は、２〜９０モル％であることが好ましく、５〜８０モル％であることがより好ましく、１０〜７０モル％であることが更に好ましい。
ポリケトンの水酸基率は、例えば、Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）から知ることができる。具体的には、得られたＸＰＳチャートをケト基、水酸基、及びＣ＝Ｃ二重結合の各ピークに波形分離して、ケト基のピーク面積と水酸基のピーク面積との合計に対する水酸基のピーク面積の割合（百分率）を計算し、その計算結果を水酸基率（モル％）として採用することができる。
【００５２】
〈カルボキシル基導入工程〉
カルボキシル基導入工程では、ケト基還元工程にて変換された水酸基の一部又は全部にカルボキシル基を導入する。
ポリケトンの有する水酸基にカルボキシル基を導入するには、例えば、水酸基をジカルボン酸と反応させる方法によることが好ましい。すなわち、ジカルボン酸のカルボキシル基のうちの１つとポリケトンの水酸基とをエステル化させ、残りの１つを遊離のカルボキシル基として残存させる。このジカルボン酸は、ポリケトンに酵素を担持させた後には、共有結合性の連結基として機能する。したがって、ここで使用されるジカルボン酸は、２つのカルボン酸間に適当な長さのスペーサーを含んでいることが好ましく、例えば、炭素数４〜１２のアルキレン基を含んでいてよい。
【００５３】
好ましいジカルボン酸として、例えば、下記式（４）：
ＨＯＯＣ−（ＣｎＨ２ｎ）−ＣＯＯＨ      （４）
｛式（４）中、ｎは式（２）中のｎと同じ意味である。｝で表されるジカルボン酸を挙げることができる。ジカルボン酸として、具体的には例えば、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、１，９−ノナンジカルボン酸、１，１０−デカンジカルボン酸、１，１１−ウンデカンジカルボン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸等を挙げることができる。
【００５４】
ジカルボン酸のカルボキシル基とポリケトンの水酸基とのエステル化は、公知の方法、例えば、フィッシャ−エステル化反応、ショッテン・バウマン反応等により行われてよい。
このカルボキシル基導入工程において導入されるカルボキシル基の量は、ポリケトンの有する水酸基の一部又は全部である。したがって、ジカルボン酸の使用量は任意であり、ポリケトン多孔膜中の所望のカルボキシル基濃度に応じて、当業者により適宜に設定されてよい。例えば、ポリケトン多孔膜の有する水酸基１モルに対して、０．１モル以上大過剰量の範囲で適宜に設定されてよい。
カルボキシル基導入工程では、ポリケトンの有する全部の水酸基にカルボキシル基を導入することが好ましい。
上記の方法によって、例えば、下記式（５）：
【化４】
2020125397.tif 000005
｛式（５）中、ｎ、ａ、及びｂは、それぞれ、式（２）中のｎ、ａ、及びｂと同じ意味である。｝で表される構造を有していてよい。
【００５５】
〈酵素担持工程〉
酵素担持工程では、カルボキシル基導入工程でポリケトン多孔膜に導入されたカルボキシル基と、酵素のアミノ基とを結合させる。これにより、カルボキシル基−アミノ基間にアミド結合が生成し、ポリケトン多孔膜上に、共有結合性の連結基を介して酵素が担持されて、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜が得られる。
【００５６】
使用される酵素の種類及び量は、所望の酵素担持ポリケトン加工膜における酵素の種類及び担持量に応じて、適宜に設定されてよい。
【００５７】
ポリケトン多孔膜のカルボキシル基と酵素のアミノ基とのアミド結合の生成は、任意の方法によって行うことができる。しかし、過酷な反応条件下では酵素の失活が懸念されるため、穏やかな条件下で反応を行うことが好ましい。例えば、適当な脱水縮合剤の利用が推奨される。
脱水縮合剤としては、例えばカルボジイミド等が好ましく、特に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等から選択される１種以上を使用することが好ましい。
【００５８】
酵素担持工程は、できるだけ酵素を失活させずに行うことが好ましく、したがって、使用する酵素の種類に応じて、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、リンゲル液等の適当な生体類似環境下で行うことが推奨される。
【００５９】
《酵素担持ポリケトン多孔膜の保存》
上記のようにして、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜を得ることができる。
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、酵素の失活をできるだけ抑制するために、酵素担持工程似て用いた適当な生体類似環境下で保存して、使用に備えることが好ましい。
【００６０】
《酵素担持ポリケトン多孔膜の適用》
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜では、遊離の酵素の優れた触媒作用が維持されていながら、酵素の失活が抑制されており、更に有機溶媒の存在下での酵素の凝集が抑制されている。
したがって、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は、水中、有機溶媒存在下、気相中等で、基質特異性及び反応選択性が高い酵素反応を高い活性で安定的に行うことができ、例えば、酵素反応を用いるフィルター、リアクター、センサー等に好適に適用することができる。
【００６１】
本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜を含むフィルターとしては、例えば、溶菌酵素（リゾチーム）が担持されたポリケトン多孔膜を含む滅菌フィルター、アルコールオキシダーゼが担持されたポリケトン多孔膜を含むホルムアルデヒド分解フィルター等を挙げることができる。
リアクターとしては、例えば、酵素を用いる各種食品、医薬品等の製造装置を挙げることができる。具体的には、アミノアシラーゼが担持されたポリケトン多孔膜を含むＬ−アミノ酸製造装置、グルコースイソメラーゼが担持されたポリケトン多孔膜を含む異性化糖製造装置、ラクターゼが担持されたポリケトン多孔膜を含む低乳糖ミルク製造装置、グルコースオキシダーゼが担持されたポリケトン多孔膜を含む乾燥卵白製造装置等を挙げることができ、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜は公知の各種の酵素反応に応用可能である。
センサーとしては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼが担持されたポリケトン多孔膜を含むグルコースセンサー等を挙げることができる。
【００６２】
更に、本発明の酵素担持ポリケトン多孔膜では、酵素の回収再利用が容易であるため、酵素反応を利用する各種製品のプロセスコストの削減にも資する。
【実施例】
【００６３】
《ＰＫ−ＯＨ膜の分析方法》
（１）水酸基率（ケト基の還元率）
ケト基の一部が水酸基に変換されたポリケトン多孔膜（ＰＫ−ＯＨ膜）について、日本電気（株）製の型番「ＪＰＳ−９０１０ＭＣ」を用いてＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）を行った。得られたチャートを波形分離して、ケト基、水酸基、及びＣ＝Ｃ二重結合の各ピーク面積率を算出し、下記数式：
水酸基率（モル％）＝水酸基面積率／（ケト基面積率＋水酸基面積率）×１００
によって、水酸基率を求めた。
【００６４】
《酵素担持多孔膜の分析方法》
（１）酵素担持量
各実施例等で得られた酵素担持多孔膜について、ナカライテスク（株）製のＢＣＡキットを用いてビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により、酵素の担持量を測定した。具体的には以下の手法によった。
直径９ｍｍの酵素担持多孔膜をＢＣＡ溶液に浸漬させ、３７℃において３０分間静置した後、２５℃において５分間撹拌した。その後、日本分光（株）製の紫外可視吸光光度計（型番「ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｖ−６３０」）を用いて、試料浸漬後の溶液の波長５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線により、膜試料中の酵素質量を定量し、試料単位面積（１ｃｍ２）当たりの値として評価した。
【００６５】
（２）平均流量孔径
平均流量孔径は、液体としてＧＡＬＷＩＣＫ試薬を用い、パームポロメーターによって、以下の手法により測定した。
得られた酵素担持多孔膜について、膜に加えられる差圧と膜を通過する空気流量との関係を、乾燥状態及びＧＡＬＷＩＣＫ試薬で濡れている状態の双方で測定し、それぞれのグラフ（乾き曲線及び濡れ曲線）を得た。
乾き曲線の流量を１／２とした曲線と、濡れ曲線との交点における差圧をＰ（ｋＰａ）としたとき、下記式：
平均流量孔径（ｎｍ）＝ｃγ／Ｐ
により、平均流量孔径を求めた。ここで、ｃは定数（２，８６０）であり、γは液体（ＧＡＬＷＩＣＫ試薬）の表面張力（ｄｙｎｅ／ｃｍ）である。
【００６６】
（３）透水量
直径４１ｍｍの透液セルに得られた酵素担持多孔膜をセットし、膜間差圧５０ｋＰａにて水を通過させ、通過開始から１２０秒後までの透水量（Ｌ）から、単位時間（１ｈ）、単位圧力（１ｋＰａ）、及び単位面積（１ｍ２）当たりの透水量（ＬＭＨ／１ｋＰａ）を算出した。
【００６７】
（４）比表面積
得られた酵素担持多孔膜の比表面積は、窒素を吸着質としてＢＥＴ法により測定した。
【００６８】
《比較例１》
比較例１では、溶媒として水、又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／水の混合溶媒を用い、遊離のラッカーゼによる２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の酸化活性を調べた。
ＡＢＴＳは波長３４０ｎｍ付近に最大吸収を示す無色の化合物であるが、酸化されると４１５ｎｍ付近、及び６３０ｎｍ以上の領域に最大吸収を有するものとなる。したがって、例えば４２０ｎｍの吸収を観測することにより、ＡＢＴＳの酸化反応の程度を知ることができる。
【００６９】
（１）水中の酵素活性
３ｍＬのＡＢＴＳ水溶液（濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５）に、ラッカーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）０．７５ｍｇを投入し、２０℃において１０分間反応を行った。反応前後の溶液について、波長４２０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、下記数式：
酵素活性（Ｕ／μｇ）＝１，０００×（反応後吸光度−反応前吸光度）／（反応時間（分）×酵素の質量（μｇ））
によって、酵素単位質量当たりの酵素活性を算出したところ、遊離のラッカーゼの水中での酵素活性は４．９Ｕ／μｇであった。
酵素活性の単位における「Ｕ（ユニット）」は、至適条件（温度３０℃、化学反応が最速となる酸性度）下で毎分１μｍｏｌの基質を変化させるのに要する酵素量（１μｍｏｌ／分）である。
【００７０】
（２）ＤＭＳＯ／水混合溶媒中の酵素活性
溶媒として水の代わりに、ＤＭＳＯ／水の混合溶媒（体積比２０：８０）を用いた他は上記「（１）水中の酵素活性」と同様の手法により、ＡＢＴＳの酸化に対するＤＭＳＯ／水混合溶媒中の酵素活性を調べた。その結果、遊離のラッカーゼのＤＭＳＯ／水混合溶媒中での酵素活性は１．２Ｕ／μｇであった。
【００７１】
《実施例１》
（１）多孔膜の製造
（１−１）ポリケトン多孔膜準備工程
レゾルシン６５質量％を含むレゾルシン水溶液中にポリケトン（ポリ（１−オキソトリメチレン）、重量平均分子量Ｍｗ２００，０００）の粉末を投入し、８０℃にて３時間撹拌することにより、重合体濃度１０質量％の均一なドープを得た。このドープを用いて乾式キャスト法により成膜したフィルムを、メタノール３０質量％及び水７０質量％から成る凝固浴中に２０分間浸漬して、相分離させた。次いで、フィルムを凝固浴から取り出し、アセトン及びヘキサン中に順次に各２０分間浸漬させた後、風乾することにより、ポリケトン多孔膜（ＰＫ膜）を得た。
【００７２】
（１−２）ケト基還元工程
得られたＰＫ膜を、濃度０．５質量％の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）水溶液に５分間浸漬して、ケト基の一部を還元（水酸基化）した。その後、多孔膜を水、アセトン、及びヘキサンで順次に洗浄した後、風乾することにより、ケト基の一部が水酸基に変換されたポリケトン多孔膜（ＰＫ−ＯＨ膜）を得た。
【００７３】
（１−３）カルボキシル基導入工程
得られたＰＫ−ＯＨ膜を、濃度１質量％の２塩化セバコイル（ＣｌＯＣ（ｎ−Ｃ８Ｈ１６）ＣＯＣｌ）のヘキサン溶液中に浸漬した。その後、ヘキサンで洗浄し、次いで乾燥した後、超純水で洗浄することにより、ＰＫ−ＯＨ膜にカルボキシル基が導入されたポリケトン多孔膜（ＰＫ−ＣＯＯＨ膜）を得た。
【００７４】
（１−４）酵素担持工程
次いで、得られたＰＫ−ＣＯＯＨ膜を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．１ｍｏｌ／Ｌ及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．１ｍｏｌ／Ｌを含むリン酸緩衝生理食塩水（リン酸濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．６）（ＰＢＳ）中に２５℃で６０分浸漬してカルボキシル基を活性化した。その後、ラッカーゼ５ｇ／Ｌを含むＰＢＳ中に浸漬して、ポリケトン多孔膜に共有結合（アミド結合）で担持されたラッカーゼを有するポリケトン多孔膜（ＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１））を得た。
得られたＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１）について、上述の方法によって測定した酵素担持量は、５４μｇ／ｃｍ２であった。
ＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１）はＰＢＳ中で４℃にて保存し、使用に備えた。
【００７５】
（２）触媒活性の評価
（２−１）水中での酵素活性の評価
遊離のラッカーゼの代わりに、上記で得られたＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１）６３ｍｍ２を使用した他は比較例１の「（１）水中の酵素活性」と同様にして、水中でのＡＴＢＳの酸化活性を調べた。その結果、実施例１のＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１）の水中での酵素活性は４．０Ｕ／μｇであり、遊離のラッカーゼの酵素活性（比較例１）に対して８０．９％であった。
【００７６】
（２−２）ＤＭＳＯ／水混合溶媒中での酵素活性の評価
遊離のラッカーゼの代わりに、上記で得られたＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１）６３ｍｍ２を使用した他は比較例１の「（２）ＤＭＳＯ／水混合溶媒中の酵素活性」と同様にして、ＤＭＳＯ／水混合溶媒中におけるＡＴＢＳの酸化活性を調べた。その結果、実施例１のＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（１）のＤＭＳＯ／水混合溶媒中での酵素活性は２．８Ｕ／μｇであり、遊離のラッカーゼの酵素活性（比較例１）に対して２３１％の高活性を示した。
【００７７】
《実施例２及び３》
「（１）多孔膜の製造」の「（１−４）酵素担持工程」において、ラッカーゼ濃度を、実施例２では１ｇ／L、実施例３では０．５ｇ／Ｌに変更して、酵素担持量をそれぞれ表１に記載のとおりとした他は、実施例１と同様にしてＰＫ−ＣＯＮＨ−Ｌａｃｃａｓｅ膜（２）及び（３）をそれぞれ製造し、評価した。
評価結果は表１及び２に示した。
【００７８】
《実施例４》
実施例１の「（１−１）ポリケトン多孔膜準備工程」と同様にして得たＰＫ膜を、ラッカーゼ５ｇ／Ｌを含むＰＢＳ中に浸漬して、ポリケトン多孔膜に共有結合を介さずに担持されたラッカーゼを有するポリケトン多孔膜（ＰＫ−Ｐ−Ｌａｃｃａｓｅ膜）を得た。
得られたＰＫ−Ｐ−Ｌａｃｃａｓｅ膜を用いて、実施例１と同様にして評価を行った。
評価結果は表１及び２に示した。
【００７９】
《比較例２》
再生セルロース膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を、ラッカーゼ５ｇ／Ｌを含むＰＢＳ中に浸漬して、ポリケトン多孔膜に共有結合を介さずに担持されたラッカーゼを有する再生セルロース膜（ＲＣ−Ｌａｃｃａｓｅ膜）を得た。
得られたＲＣ−Ｌａｃｃａｓｅ膜を用いて、実施例１と同様にして評価を行った。
評価結果は表１及び２に示した。
【００８０】
【表１】
2020125397.tif 000006
【００８１】
【表２】
2020125397.tif 000007