(57)【要約】【課題】本発明は、無細胞タンパク質合成方法においてタンパク質合成量を増加させるための新規なアプローチを提供することを目的とする。【解決手段】無細胞タンパク質合成用反応混合物であって、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物を含む、反応混合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成用反応混合物であって、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物を含む、反応混合物。
【請求項２】
鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項２に記載の反応混合物。
【請求項４】
エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート及びグルコース−６−ホスフェート、クエン酸、cis-アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣoＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる、請求項２又は３に記載の反応混合物。
【請求項５】
大腸菌が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
【請求項７】
グリセロールを炭素源とした培地で大腸菌を培養する工程、
培養した大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程、及び
細胞抽出物を含む反応混合物を用いてタンパク質を合成する工程
を含む、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項８】
グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物、並びに
鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源
を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
【請求項９】
請求項６記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法及び無細胞タンパク質合成用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の生産方法としては、形質転換された細胞を培養することによるインビボによる方法と、いわゆる無細胞タンパク質合成方法と呼ばれる、細胞由来の抽出物を用いるインビトロでの方法が知られている。
【０００３】
工業規模でのタンパク質の生産方法としては、現段階ではインビボによる方法が優れていると考えられている。しかしながら、インビボによる方法と比較して、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、（１）タンパク質の合成のための資源を、目的とするタンパク質の独占的な産生に向けることができる点、（２）細胞の増殖又は生存に関わることがないため、遺伝子のコドン使用を反映させたｔＲＮＡレベルの変更、酸化還元電位、ｐＨ、あるいはイオン強度といった条件等、合成環境を柔軟に変更できる点、（３）精製されて適切に折りたたまれたタンパク質産物をそのまま簡単に回収できる点、（４）非天然で同位体標識されたアミノ酸を組み入れことができる点、（５）インビボで不安定、不溶性又は細胞毒性であるタンパク質を合成することができる点、（６）独特の補因子を必要とするためにインビボでは作ることが難しいタンパク質を合成することができる点、及び（７）インビボにおける発現のためのクローニング、細胞の形質転換等のプロセスを回避することができる点等の利点を有すると考えられるため、この分野の基盤技術になりつつあり、ある程度、確立された方法となっている（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、インビボによる方法と比較して、無細胞タンパク質合成方法は、タンパク質を合成するための反応持続時間が短いため、生産効率が低い。この反応持続時間を増加させるため、翻訳反応により消費される基質を供給するとともに、反応を阻害する副産物を透析により除去する透析膜を使用した連続的流系が開発された。しかしながら、この連続的流系によりタンパク質合成量を増加させるためには連続的に試薬を追加することが必要となり、試薬等のコストが嵩む等の問題があった。
【０００５】
また、反応持続時間を増加させる別のアプローチとして、インビトロでの反応におけるエネルギー再生系を見直すことにより、一定の成果が得られており（特許文献１、非特許文献２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を１０時間で７００ｍｇ／Ｌ合成することに成功している（非特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、工業規模での生産においては、生産量及びコストにおいて更なる改善が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５２５９０４６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Methodsin molecular biology, 267, 169-182
【非特許文献２】Mol.Syst. Biol., 2008; 4: 220
【非特許文献３】Biotechnol.Bioeng., 2011; 108: 1570
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、無細胞タンパク質合成方法においてタンパク質合成量を増加させるための新規なアプローチを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、種々の培養条件で培養した大腸菌より得られる細胞抽出物を用いてタンパク質合成の方法を鋭意検討した結果、炭素源としてグリセロールを用いた培地で培養した大腸菌より得られる細胞抽出物を含む反応混合物を用いることにより、タンパク質合成量を増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］  無細胞タンパク質合成用反応混合物であって、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物を含む、反応混合物。
［２］  鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、上記［１］に記載の反応混合物。
［３］  鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、上記［２］に記載の反応混合物。
［４］  エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート及びグルコース−６−ホスフェート、クエン酸、cis-アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣoＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる、上記［２］又は［３］に記載の反応混合物。
［５］  大腸菌が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の反応混合物。
［６］  上記［１］〜［５］のいずれかに記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
［７］  グリセロールを炭素源とした培地で大腸菌を培養する工程、
培養した大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程、及び
細胞抽出物を含む反応混合物を用いてタンパク質を合成する工程
を含む、無細胞タンパク質合成方法。
［８］  グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物、  並びに
鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源
を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
［９］  上記［６］記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、炭素源としてグリセロールを用いた培地で培養した大腸菌から得られる細胞抽出物を含む反応混合物を用いることにより、無細胞タンパク質合成方法におけるタンパク質合成量を増加させることができ、それによりタンパク質の生産効率を向上することができる。
【００１３】
また、グリセロールは安価であるため、低コストで無細胞タンパク質合成方法におけるタンパク質合成量を増加させることができる。
【００１４】
また、グリセロールを用いた培養はグルコースを用いた培養よりも大腸菌細胞の増殖速度が速いため、グルコースを用いた場合と比較してより短時間で細胞抽出物を得ることができる。
【００１５】
さらに、炭素源としてグリセロールを含む培地は、オートクレーブする際にメイラード反応が起こらないため、タンパク質が着色されにくいという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】グリセロールを炭素源とした改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒三角）と、グルコースを炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒丸）の比較を示すグラフである。
【図２】実施例２の無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。黒三角は、改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果、黒丸は通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果を示し、白三角及び白丸はｐＵＣ−ＧＦＰの代わりに水を加えたネガティブコントロールの結果を示す（白三角：改変２×ＹＴＰＧ培地、白丸：通常の２×ＹＴＰＧ培地）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いたタンパク質合成
本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、グリセロールを含む培地で培養された大腸菌由来の細胞抽出物を含むことを特徴とする。本発明の無細胞タンパク質合成方法は、グリセロールを炭素源とした培地で大腸菌を培養する工程、培養した大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程、及び細胞抽出物を含む反応混合物を用いてタンパク質を合成する工程を含む。本発明の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成は、グリセロールを含む培地で培養された大腸菌からの細胞抽出物を用いる以外は、例えばMethods in molecular biology, 267, 169-182、Mol.Syst. Biol., 2008; 4: 220あるいはBiotechnol. Bioeng., 2011;108: 1570に記載の公知の方法に準じて行うことができる。
【００１８】
１）グリセロールを炭素源とした培地で大腸菌を培養する工程
グリセロールを炭素源とした培地で培養する大腸菌としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれも用いることができ、例えば、エシェリヒア・コリ  Ａ１９、ＢＬ２１（ノバジェン社）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、ＤＨ１、ＧＩ６９８、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、Ｋ５（ＡＴＣＣ２３５０６）、Ｋ−１２、ＫＹ３２７６、ＭＣ１０００、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）、ＮＭＲ２、Ｎｏ．４９、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、ＴＢ１、Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、Ｗ１４８５、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等の株を挙げることができる。
【００１９】
大腸菌を培養するための培地としては、炭素源としてグリセロールを用い、大腸菌が資化し得る窒素源及び無機塩類等を含有する液体培地であり、培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００２０】
炭素源としてのグリセロールの含有量は、例えば、培地全体の容量を基準として２．５〜１００ｇ／Ｌであってよい。培地全体の容量を基準としたグリセロールの含有量の下限値は、２．５、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１２、１５又は２０ｇ／Ｌであってよい。培地全体の容量を基準としたグリセロールの含有量の上限値は、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０ｇ／Ｌであってよい。グリセロールの含有量は培地全体の容量を基準として少なくとも２．５ｇ／Ｌであってよく、５．０〜４０ｇ／Ｌ又は１０〜３０ｇ／Ｌであってもよい。
【００２１】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００２２】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００２３】
具体的な培地としては、例えば、２×ＹＴＰＧ培地のグルコースをグリセロールに替えた、表１に示した改変２×ＹＴＰＧ培地をあげることができる。培養時の発泡を防ぐために、当該培地に消泡剤、例えばアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓ等を添加することが好ましい。消泡剤の添加量としては０．５〜２ｍｌ／Ｌをあげることができ、１ｍｌ／Ｌが好ましい。培地調製時の培地のｐＨは、６〜８が良く、ｐＨ７が好ましい。培地のｐＨの調整はＮａＯＨ等を用いて行うことができる。
【表１】
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【００２４】
また、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能な大腸菌を用いた場合には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等をあらかじめ含んだ細胞抽出物が得られる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の発現がＩＰＴＧのような誘導剤により惹起される場合には培地にＩＰＴＧ等の誘導剤を加えれば良い。
【００２５】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、例えば、１５〜４０℃で行うことができる。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養中のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００２６】
培養時間は、タンパク質合成効率の良い細胞抽出物を得るために、対数増殖初期〜後期、好ましくは対数増殖中期に達する時点までの培養時間をあげることができる。改変２×ＹＴＰＧ培地を用いる場合には、培養温度３６℃で、４〜６時間培養することで通常対数増殖中期に達する。
高濃度の菌体培養液を得るために、培養時間の経過に応じて連続的または断続的に培地（フィード液）を培養液中へ流加する流加培養を行っても良い。流加培養は大腸菌において公知の方法に準じて行えば良いが、この流加培養においても、フィード液中の炭素源としてグリセロールを用いることが重要である。グリセロール濃度を菌体の増殖に応じて調製したフィード液を準備しても良いが、３０〜７０％グリセロールを含むフィード液を、菌体の増殖に合わせて、適切な量を培養液中へ添加しても良い。
【００２７】
２）大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程
細胞抽出物は、１）の工程で培養した大腸菌を破壊して得られた、固体、液体又はその混合物を意味する。細胞抽出物には、大腸菌細胞内に含まれていた、ＤＮＡを鋳型としたＲＮＡの転写に必要な因子、並びにタンパク質の翻訳に必要な因子が含まれる。これらの因子としては、例えば、リボソーム、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素、翻訳開始因子及び翻訳終結因子が挙げられる。この細胞抽出物を含む反応混合物を用いて、インビトロで転写及び翻訳の反応系を再構成してタンパク質を合成させることができる。
【００２８】
大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程は、無細胞タンパク質合成の目的のために当該分野において既知の方法により行うことができる。例えば、Methods in molecular biology, 267, 169-182、Mol.Syst. Biol 2008 4 220に記載のJames R. Swartzらのプロトコルに準じて行うことができる。細胞抽出物を得るための具体的な方法としては、例えば以下のような、大腸菌の菌体を回収し、回収した大腸菌の菌体を破壊する方法等をあげることができる。
【００２９】
大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程において、培養液から菌体を回収し、細胞抽出物を得るまでは低温に保って行うことが好ましい。例えば、０〜１５℃、好ましくは２〜１０℃の低温に保って行うことができる。
【００３０】
大腸菌培養液から大腸菌の菌体を回収する方法としては、遠心分離法、濾過法をあげることができる。例えば、４℃、７，０００〜１４，０００ｇの条件で２０〜５０分間、遠心分離することにより大腸菌の菌体を回収することができる。
【００３１】
回収後に、培地成分等を除去するため、回収した大腸菌の菌体を洗浄する工程を含むことが好ましい。洗浄溶液としては、無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液、例えば、Ｓ３０緩衝液等が用いられる。Ｓ３０緩衝液は以下のように調製することができる。２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール６．０６ｇ、酢酸マグネシウム四水和物１５．０ｇ及び酢酸カリウム２９．４ｇを約４５０ｍｌの純水、好ましくはｍｉｌｉ−Ｑ等の超純水に溶解する。溶解後、酢酸でｐＨ８．２に調整し、５００ｍｌにメスアップし、０．２２μｍのフィルターで滅菌する。Ｓ３０緩衝液は４℃で保存することができ、使用直前に超純水で１０倍に希釈し、最終濃度が２ｍＭになるよう１Ｍ  ＤＴＴ水溶液を加えたものを使用する。
【００３２】
無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）を用いて大腸菌の菌体を洗浄する工程は、例えば、回収した菌体を、当該溶液に懸濁し、遠心分離で回収する工程を例えば２〜３回繰り返すことにより行うことができる。懸濁はホモジナイザー等を用いることにより効率的に均質化できる。均質化した懸濁液からの菌体の回収は、例えば４℃、９，０００〜１４，０００ｇの条件で１０〜５０分間遠心分離することにより行うことができる。当該洗浄菌体は−８０℃で保存することができる。−８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。
【００３３】
大腸菌の菌体を破壊する手段としては、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、高圧ホモゲナイザー、ダイノミル、乳鉢、ガラスビーズ及びリゾチーム等の溶菌酵素を用いる手段をあげることができる。例えば、高圧ホモゲナイザーを用いて菌体を破砕する場合には、６００〜１，７００ｂａｒの圧力で、約１ｍｌ／分の流速の条件で行えば良い。実用的な観点では、６００〜１０００ｂａｒの圧力で数回破砕を繰り返すことが好ましい。
破壊前後の液を粒度分布計で分析することにより破壊の状況を確認することができる。菌体破壊液にはＤＴＴを最終濃度１ｍＭになるように添加することが好ましい。
【００３４】
大腸菌の菌体を破壊する方法においては、無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）に、回収した菌体を再懸濁した、菌体懸濁液を用いることが好ましい。菌体懸濁液としては、例えば、回収菌体１ｇあたり１〜２ｍＬのＳ３０緩衝液等の溶液を添加した菌体懸濁液をあげることができる。−８０℃で保存した回収菌体を用いる場合には氷上で融解させて懸濁液を作製することが好ましい。
【００３５】
細胞抽出物としては、細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去したものを用いることが好ましい。除去する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、１０，０００〜３０，０００ｇの条件で２０〜５０分間、遠心分離し、上清を取得する工程を、例えば２〜３回繰り返すことにより細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去することができる。
【００３６】
細胞抽出物としては、１／３〜１／４容量の活性化ミックス（３００ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．２、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭＡＴＰ、４．４ｍＭＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭホスホエノールピルビン酸及び２０種類のアミノ酸（各０．０４ｍＭ））を加え、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、１０〜３００分、好ましくは３０〜１８０分間インキュベートしたものを用いることが好ましい。このような処理をした細胞抽出物を用いることにより効率よくタンパク質合成を行うことができる。
【００３７】
細胞抽出物としては、内在性のアミノ酸、核酸及びヌクレオシド等を除いたものを用いることが好ましい。活性化ミックスを加えた処理によって発生した不溶性成分は上記と同条件の遠心分離法等で除去できる。当該操作によって内在性のＲＮＡを除去できる。内在性の核酸は、ヌクレアーゼ等を更に添加することにより分解できる。その場合、核酸の分解後にヌクレアーゼ阻害剤を加えて処理することが好ましい。また、透析により内在性のアミノ酸、核酸及びヌクレオシド等を除くこともできる。
【００３８】
細胞抽出物は−８０℃で保存することができる。−８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。
【００３９】
３）細胞抽出物を含む反応混合物を用いてタンパク質を合成する工程
本発明の細胞抽出物を含む反応混合物（「無細胞タンパク質合成用反応混合物」ともいう）は、２）の工程で得られた細胞抽出物を含む。反応混合物中の細胞抽出物の含有量は、反応混合物全体を基準として、５〜７０％（容量／容量）であってよく、１０〜５０％であってよく、２０〜４０％であってよく、２０〜３０％であってよい。細胞抽出物を得るために用いた湿菌体（ｇ）／反応混合物（ｍＬ）の割合は、０．０１〜１ｇ／ｍＬであってよく、０．０５〜０．３ｇ／ｍＬであってよい。
【００４０】
本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、細胞抽出物に加え、必要に応じて以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の成分を含むことができる。
【００４１】
（ｉ）鋳型核酸
鋳型核酸は、発現させたい目的タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと、適当な発現調節領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいればよく、直鎖状及び環状の何れの形態であってもよい。発現調節領域としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列、ポリＡ付加シグナル及びリボソーム結合配列などをあげることができる。鋳型核酸は、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含むことが好ましい。添加する鋳型核酸の量は、反応混合物全体の容量を基準として、０．１〜５０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜２０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００４２】
合成されたタンパク質を容易に検出あるいは精製できるよう、タグ配列を組み込んだ融合タンパク質が合成できるように鋳型核酸を設計しても良い。タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用した、例えばヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）のようなアフィニティタグ、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列をあげることができる。また、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用しても良い。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも利用できる。
【００４３】
（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、上記鋳型核酸を対象とする１つ又は複数の転写因子を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。本発明の反応混合物は、目的タンパク質の生産効率を向上させる観点から、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含むことが好ましい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物を調製する際に添加してもよく、上述したように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能なＢＬ２１（ＤＥ３）等の株を用いて細胞抽出物にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが含まれるようにしてもよい。
【００４４】
（ｉｉｉ）エネルギー源
細胞抽出物にタンパク質合成に必要なエネルギーが不足している場合には、反応混合物に追加的なエネルギー源を含めることが好ましい。また、エネルギー源は、タンパク質合成反応の間に添加又は補充することもできる。エネルギー源としては、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、クエン酸、cis-アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣoＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸等が挙げられる。
【００４５】
（ｉｖ）目的タンパク質合成のための基質
目的タンパク質合成のための基質として、反応混合物は、目的タンパク質を合成するために必要なアミノ酸を含むことができる。アミノ酸としては、タンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸を含んでもよく、目的タンパク質や用いる試薬等を考慮して２０種類から適宜選択して用いてもよい。
【００４６】
上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、反応混合物は目的タンパク質合成のための基質として、ＲＮＡ合成のための基質を含むことができる。ＲＮＡ合成のための基質としては、例えば、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、リボヌクレオチド一リン酸（ｒＮＭＰ）等のリボヌクレオチドが挙げられる。
【００４７】
（ｖ）ポリアミン類
反応混合物は、ポリアミン類を含むことができる。反応混合物に含め得るポリアミン類としては、例えば、スペルミン、スペルミジン及びプトレシン等が挙げられる。
【００４８】
（ｖｉ）塩
反応混合物は、塩を含むことができる。反応混合物に含め得る塩としては、例えば、酢酸、グルタミン酸、又は硫酸のカリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、及びマンガン塩が挙げられる。
【００４９】
（ｖｉｉ）酸化／還元調整剤
反応混合物は、酸化／還元調整剤を含むことができる。酸化／還元調整剤としては、例えば、ＤＴＴ、アスコルビン酸、グルタチオン、及び／又はそれらの酸化物が挙げられる。
【００５０】
（ｖｉｉｉ）その他の添加物
また、必要に応じて反応混合物に、下記の成分を補充あるいは添加しても良い。
即ち、リボソーム、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、任意選択の翻訳因子（例えば、翻訳開始因子、伸長因子終結因子、リボソームリサイクリング因子等）及びその補因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、メチオニルｔＲＮＡホルミル転移酵素（ＭＴＦ）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、四級アミノエチル及びアミノエチルデキストラン等）、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定剤、シャペロン、可溶化剤、非変性界面活性物質（例えば、トリトンＸ１００）等を必要に応じて添加しても良い。
【００５１】
反応混合物の成分に関しては、例えば米国特許第７，３３８，７８９号及び同第７，３５１，５６３号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１８４１３５号及びＵＳ２０１０／００９３０２４の記載を参考とすることができる。
【００５２】
上記反応混合物を用いて無細胞タンパク質の合成を行うことができる。
本発明の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法は、透析法及びバッチ法いずれも利用することができる。透析法の場合は、上記反応混合物を含む内液と限外濾過膜のような透析膜により隔離した目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等を含む外液からなる閉鎖系でタンパク質の合成が行われる。透析法では、透析膜を介して、目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等が外液から反応混合物に供給されるとともに、反応混合物中の余計な副産物を外液中に拡散させることができるため、より長時間、反応を持続させることができる。バッチ法は、タンパク質合成に必要な成分すべてを含む上記反応混合物を反応溶液と混合し、反応溶液中に均一に含ませ、反応を行う合成法であり、透析法と比較すると反応時間は短いが、結果がすぐに得られる。例えば、Mol. Syst. Biol 2008 4 220（非特許文献３）に記載のＣｙｔｏｍｉｍ型無細胞タンパク質合成系を利用することにより、ＮＴＰやＰＥＰを使用するＰＡＮＯｘ型と比較して低コストでタンパク質合成系を行うことができる。タンパク質の合成は、２０〜４０℃で行えば良く、３０℃が好ましい。バッチ法における反応は２〜８時間行うことが好ましい。
【００５３】
無細胞タンパク質合成用キット
本発明の無細胞タンパク質合成用キット（以下、「本キット」とも表す）は、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌から得られた細胞抽出物、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む。鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。また、本キットは、上述したＲＮＡポリメラーゼ、ポリアミン類、塩、酸化／還元調整剤、その他の添加物をさらに含んでいてもよい。これらの添加物は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。
【実施例】
【００５４】
［実施例１］
（グリセロールを用いた培養）
ＢＬ２１株（ノバジェン社）を２ｘＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ６００が４．２になるまでフラスコ培養した。
【００５５】
当該培養液を、グリセロールを炭素源とした、表１の組成の改変２ｘＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）５００ｍＬが入った１ＬジャーファメンターにＯＤ６００が０．０５になるように添加した。
【００５６】
比較として、グルコース（１８ｇ／Ｌ）を炭素源とした通常の２ｘＹＴＰＧ培地を用いて、同じ株を同様に培養した。培養温度は３６度に保ち、ｐＨ７．０で一定に制御して培養した。溶存酸素濃度は２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持した。増殖曲線を図１に示す。改変２ｘＹＴＰＧ培地と通常の２ｘＹＴＰＧ培地で培養した際の比増殖速度は、それぞれ１．０８ｈ−１と０．７４ｈ−１であった。この結果は、グリセロールで培養した細胞内のリボソームやエネルギー再生系の酵素群がより高い活性を有すると推察される。
【００５７】
グリセロールを用いた培養により、グルコースを用いた培養よりもより短時間で好ましい菌体濃度の培養液が得られることから、より短時間で細胞抽出物を得ることが可能であることが示された。
【００５８】
［実施例２］
（細胞抽出物の調製）
上記実施例１と同様の方法により、改変２ｘＹＴＰＧ培地及び通常の２ｘＹＴＰＧ培地のそれぞれにおいて、対数中期ＯＤ６００が１２になるまで培養したＢＬ２１株を用いて、下記の方法で細胞抽出物を調製した。
【００５９】
当該ＢＬ２１株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、６０ｍＭ酢酸カリウム及び２ｍＭＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて−８０℃に急冷した。
【００６０】
菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ.Ｎｉｒｏ  ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。
２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。
【００６１】
当該遠心分離上清２００μＬに、３００ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭＡＴＰ、４．４ｍＭＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭホスホエノールピルビン酸及び２０種類のアミノ酸（各０．０４ｍＭ）を含む活性化ミックス６０μＬを加え、３０℃で１５０分間インキュベートした。
【００６２】
インキュベート後、２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心分離を行い、不溶性画分を取り除くことで細胞抽出物２３０μＬを得た。
【００６３】
（ｐＵＣ−ＧＦＰの作製）
ｐＥＴ３ａ（ノバジェン社）を利用し、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）及びＴ７ターミネーターの配列を含むＤＮＡ断片（１）をＰＣＲ法によって調製した。
ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）を利用し、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（２）をＰＣＲ法によって調製した。
ＤＮＡ断片（１）及びＤＮＡ断片（２）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。前記大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔを使用し、プラスミドを抽出した。
前記プラスミドを利用し、Ｔ７プロモーター、ＲＢＳ、Ｔ７ターミネーター、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（３）をＰＣＲ法によって調製した。
Ｔ５−ＨｏｌｌｙＧＦＰ（コスモバイオ社）を利用し、Ｈｏｌｌｙ−ＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（４）をＰＣＲ法によって調整した。
ＤＮＡ断片（３）及びＤＮＡ断片（４）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。前記大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔを使用し、ｐＵＣ−ＧＦＰを抽出し、無細胞タンパク質合成反応の鋳型核酸として利用した。
鋳型核酸用のｐＵＣ−ＧＦＰは、分光光度計を用いて高純度（Ａ２６０／Ａ２８０が１．８以上、Ａ２６０／Ａ２３０が２．０以上）であること、さらに、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を読み取り、不必要な変異が入っていないことを確認した。
【００６４】
（無細胞タンパク質合成反応）
表２の化合物を含むマスターミックス１０μＬ、細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ  ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ  ｐＵＣ−ＧＦＰ２μＬ及び１０００Ｕ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてｐＵＣ−ＧＦＰの代わりにＲＯ水２μＬを加えたものを用意した。３８４ウェルマイクロプレートに反応混合物を移し、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を使用して３０℃でインキュベートしながら、経時的に蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図２に蛍光強度の測定結果を示す。
【表２】
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【００６５】
反応を開始して５時間後、炭素源にグリセロールを含む培地を大腸菌細胞の培養に用いた無細胞タンパク質合成方法によるＧＦＰの蛍光強度は、炭素源にグルコースを含む培地を大腸菌細胞の培養に用いた無細胞タンパク質合成方法によるＧＦＰの蛍光強度よりも約２倍高い値を示した。これにより、炭素源にグリセロールを含む培地を大腸菌細胞の培養に用いた無細胞タンパク質合成方法によるＧＦＰの合成量は、炭素源にグルコースを含む培地を大腸菌細胞の培養に用いた無細胞タンパク質合成方法と比較して、約２倍多いことが示された。
【図１】
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【図２】
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