(57)【要約】      （修正有）【課題】耐熱性が向上したモノアシルグリセロールリパーゼ変異体、及びその製造方法の提供。【解決手段】バチルス・エスピーＨ−２５７由来のモノアシルグリセロールリパーゼである、Ｈ−２５７のアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、２６位に相当する位置のアミノ酸残基がバリン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にバリン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシンを有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上している、請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項６】
請求項４記載のポリヌクレオチド又は請求項５記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項７】
バチルス属菌である、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７記載の形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のバリンを他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のバリンをイソロイシンに置換することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記変異ポリペプチドが親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上している、請求項９又は１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼ変異体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）は、乳化剤や抗菌剤等として食品、医薬品、化粧品等の分野に広く利用されている物質である。さらに近年、ＭＡＧが、食後の血中トリグリセリドの上昇抑制、食後血中インスリン上昇抑制、食後ＧＩＰ分泌抑制等の優れた生理活性を有することが見出されている。ＭＡＧは、生化学的な方法では、脂肪酸とグリセリンとをリパーゼの存在下で反応させることで製造される。この方法で用いるリパーゼとしては、モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）などの脂肪酸モノグリセリド又は脂肪酸ジグリセリドを基質として認識するリパーゼが好ましい。ＭＧＬＰについては、特許文献１に、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）Ｈ−２５７由来ＭＧＬＰであるＨ−２５７が開示されている。非特許文献１には、Ｈ−２５７リパーゼと近縁のＭＧＬＰである、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２が開示されている。
【０００３】
ＭＡＧの生化学的合成においては、リパーゼによるエステル化反応の反応効率の点で、基質を溶液状態で用いることが重要である。そのため、融点が高い高級脂肪酸のエステル化反応は高温下で行うことが望まれる。したがって、より高温で酵素活性を保持することができるＭＧＬＰは有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１８３８７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】PLoS ONE, 2013, 8(10):e76675
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、耐熱性の向上したモノアシルグリセロールリパーゼ変異体、及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にバリン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のバリンを他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法を提供する。
さらに本発明は、前記モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含有する形質転換体を提供する。
さらに本発明は、前記形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のモノアシルグリセロールリパーゼ変異体は、親酵素と比べて耐熱性が向上しており、より高温でのモノアシルグリセロール合成反応を可能にする。本発明は、酵素反応によるモノアシルグリセロール合成の効率を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＭＧＬＰ変異体Ｈ２５７−Ｖ２６Ｉの残存活性。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１１】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９６％の同一性」とは、９６％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１２】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。  
【００１３】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、又は相当するモチーフからなる領域は、相当する領域と見なされる。
【００１４】
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【００１６】
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１７】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【００１８】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【００１９】
本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、ＢＳＯＲＦ  ＤＢに登録されている遺伝子番号を表す。
【００２０】
本明細書において、「モノアシルグリセロールリパーゼ」（ＭＧＬＰともいう）とは、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドをいう。本明細書において、「モノアシルグリセロールリパーゼ活性」とは、トリアシルグリセロールをジアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性及びジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性に比較して、より選択的にモノアシルグリセロールをグリセリンと脂肪酸に分解する活性をいうか、又はグリセリンと脂肪酸との合成反応において、トリアシルグリセロール及びジアシルグリセロールに比較して、より選択的にモノアシルグリセロールを合成する活性をいう。
【００２１】
本明細書において、ポリペプチド変異体の「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該ポリペプチド変異体となるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、ポリペプチド変異体が変異される前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドが変異される前のポリヌクレオチドである。
【００２２】
本発明は、耐熱性が向上したＭＧＬＰ変異体、及びその製造方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、ＭＧＬＰ変異体の製造方法を提供する。当該本発明の方法は、親ＭＧＬＰにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む。
【００２４】
本発明のＭＧＬＰ変異体の親ＭＧＬＰの一例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドの例としては、バチルス・エスピーＨ−２５７由来ＭＧＬＰであるＨ−２５７（ＰＤＢ：４ＫＥ８）が挙げられる。Ｈ−２５７は、ＥｓｔＧｔＡ２は、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆａｍｉｌｙ ＸＶ（非特許文献１）に属するＭＧＬＰである。該親ＭＧＬＰの別の一例としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２５】
該親ＭＧＬＰは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にバリンを有する。該親ＭＧＬＰから本発明の変異体を製造する場合、好ましくは、該２６位に相当する位置のバリンが、イソロイシンに置換される。
【００２６】
本発明はまた、ＭＧＬＰ変異体を提供する。本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列に対して、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該置換前の配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のアミノ酸残基はバリンである。
【００２７】
また本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にバリン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体における配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のアミノ酸残基はイソロイシンである。
【００２８】
本発明において、親ＭＧＬＰのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ＭＧＬＰのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異遺伝子からタンパク質を発現させることにより、目的のＭＧＬＰ変異体を得ることができる。
【００２９】
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
【００３０】
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
【００３１】
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したＨ−２５７を産生するバチルス・エスピーＨ−２５７などから、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ＭＧＬＰのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。必要に応じて、親遺伝子は、後述するＭＧＬＰ変異体産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。コドン至適化された親遺伝子の例としては、バチルス属菌用にコドン至適された、配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９−７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有するＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３３】
したがって、本発明はまた、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、ＭＧＬＰ変異体産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。
【００３４】
本発明はまた、当該本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のＭＧＬＰ変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ  Ｊ  Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【００３５】
本発明のＭＧＬＰ変異体を組換え生産する場合、当該ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主生物における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。あるいは、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドが、上記の有用な配列を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明はまた、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主に導入することにより製造することができる。
【００３７】
当該形質転換体の宿主としては、枯草菌等のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌や、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌、酵母などが挙げられ、このうちバチルス属菌が好ましく、枯草菌又はその変異株がより好ましい。したがって、本発明の形質転換体は、好ましくは組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。枯草菌変異株としては、ａｐｒＸと、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択される遺伝子を欠失した株（特開２００６−１７４７０７）などが挙げられる。
【００３８】
ポリヌクレオチドやベクターの宿主細胞への導入には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な方法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５−１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５−１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）などが挙げられる。
【００３９】
当該本発明の形質転換体を培養することにより、本発明のＭＧＬＰ変異体を製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いるＭＧＬＰ変異体の製造方法を提供する。ＭＧＬＰ変異体製造のための当該形質転換体の培養は、当該分野の一般的な方法に従って行うことができる。例えば、該形質転換体がバチルス属菌である場合、その培養のための培地は、バチルス属菌の生育に必要な炭素源、及び無機窒素源もしくは有機窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、微生物の種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
【００４０】
あるいは、本発明のＭＧＬＰ変異体は、無細胞翻訳系を使用して、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【００４１】
当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明のＭＧＬＰ変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、細胞の破砕、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから取得することができる。
【００４２】
本発明のＭＧＬＰ変異体は、上述したアミノ酸残基の置換前のＭＧＬＰ（親ＭＧＬＰ）に対して、耐熱性が向上している。例えば、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の本発明のＭＧＬＰ変異体の残存活性は、好ましくは４０％以上であり、より好ましくは、親ＭＧＬＰの残存活性に比べて１１０％以上、より好ましくは１１５％以上である。本発明のＭＧＬＰ変異体は、より高温下でそのモノアシルグリセロールリパーゼ活性を維持することができるので、より高温条件下での酵素反応の効率を向上させる。特に、本発明のＭＧＬＰ変異体は、より高温下でのエステル化反応が望まれる高級脂肪酸エステル合成の効率を向上させる。
【００４３】
したがって、本発明の別の実施形態は、ＭＧＬＰの耐熱性向上方法である。例えば、当該方法は、上述した親ＭＧＬＰにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む方法である。当該方法の詳細は、上述した本発明のＭＧＬＰ変異体の製造方法と同様である。
【００４４】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４５】
〔１〕配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にバリン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。
〔２〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシンを有する、〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕好ましくは、親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上しており、
より好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が４０％以上であり、
さらに好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が、前記親ポリペプチドに比べて１１０％以上である、
〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド。
【００４６】
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔５〕〔４〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔６〕〔４〕記載のポリヌクレオチド又は〔５〕記載のベクターを含有する形質転換体。
〔７〕好ましくはバチルス属菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔６〕記載の形質転換体。
〔８〕〔６〕又は〔７〕記載の形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【００４７】
〔９〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のバリンを他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
〔１０〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のバリンをイソロイシンに置換することを含む、〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記変異ポリペプチドが、
好ましくは、親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上しており、
より好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が４０％以上であり、
さらに好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が、親ポリペプチドに比べて１１０％以上である、
〔９〕又は〔１０〕記載の方法。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４９】
以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用して行った。宿主微生物へのプラスミドの導入は、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１−１１５）にて行った。タンパク質生産のための組換え微生物の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、又は２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）を用いた。表１に、以下の実施例で使用したプライマーの名称とヌクレオチド配列を示す。
【００５０】
【表１】
2020092617.tif 000002
【００５１】
実施例１  ＭＧＬＰ変異体発現組換え枯草菌株の作製
（１）プラスミドｐＨＹ−Ｈ２５７の構築
モノアシルグリセロールリパーゼＨ２５７（配列番号１）をコードする、枯草菌用にコドン至適化した遺伝子（配列番号２）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミド（Ｈ２５７−ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型とし、プライマーＨ２５７−Ｆ及びプライマーＨ２５７−Ｒ（配列番号３及び４）を用いてＰＣＲを行った。同様に、ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｆ及びｐＨＹ−Ｓ２３７−Ｒ（配列番号５及び６）を使用してＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。得られた両断片を適量混合し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法を用いてプラスミド（ｐＨＹ−Ｈ２５７）を合成した。該Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いてＥＣＯＳTM  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０−０６２３６）を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収し、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドｐＨＹ−Ｈ２５７を抽出した。
【００５２】
（２）Ｈ２５７−Ｖ２６Ｉ発現組換え枯草菌株の作製
（１）で得られたｐＨＹ−Ｈ２５７を鋳型として、変異用プライマーＨ２５７−Ｖ２６Ｉ−Ｆ及びＨ２５７−Ｖ２６Ｉ−Ｒ（配列番号７及び８）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩにて処理した。得られた断片をプロトプラスト形質転換法にてプロテアーゼ遺伝子９重欠失枯草菌株（Ｋａｏ９株；プロテアーゼ遺伝子aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXが欠失した株、特開２００６−１７４７０７）に導入し、Ｈ２５７−Ｖ２６Ｉを発現する組換え枯草菌株を取得した。
【００５３】
実施例２  ＭＧＬＰ変異体の製造
実施例１で得られた菌株を３ｍＬ／大試験管（１８×１８０ｍｍ）のＬＢ培地で１５時間、３０℃、２５０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培養液０．０２ｍＬを２０ｍＬ／５００ｍＬ容ヒダ付三角フラスコ（バイオット）の２×Ｌ−マルトース培地に接種し、３７℃で３日間、２１０ｒｐｍで振盪培養した。培養後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分間）後の上清をフィルター（０．４５μｍ、ＰＶＤＦ、メルクミリポア製）でろ過して菌体を除いた。培養液上清をビバスピン２０（分画分子量５Ｋ、ザルトリウス）にて濃縮後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、再びビバスピン２０を用いて濃縮した。上記の作業を３〜５回繰り返すことにより培養上清を緩衝液へと置換し、これを酵素溶液として用いた。
【００５４】
実施例３  ＭＧＬＰ変異体の耐熱性
実施例２で得られた酵素溶液を用いて、ＭＧＬＰ変異体の耐熱性を調べた。実施例２で得た酵素溶液には、ＭＧＬＰ変異体と、枯草菌宿主（Ｋａｏ９株）が本来生産するリパーゼとが混在するため、先ず、枯草菌宿主由来のリパーゼを加熱により前処理することにより不活化した。具体的には、酵素溶液１００μＬをＰＣＲチューブに分注後、ＰｒｏＦｌｅｘTM  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて６０℃で１０分間前処理して、枯草菌宿主由来のリパーゼを不活化し、前処理サンプルを得た。該前処理サンプル５０μＬをＰＣＲチューブに分注し、ＰｒｏＦｌｅｘTM  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて７５℃、ｐＨ６．０で３０分間熱処理し、熱処理サンプルを得た。得られた前処理サンプルと熱処理サンプルそれぞれのリパーゼ活性測定を行い、前処理サンプルの活性を１００％とした場合の熱処理サンプルの活性（残存活性）を算出した。同様の手順で、ＭＧＬＰ変異体の親ＭＧＬＰ（配列番号１のＨ−２５７）の残存活性を算出した。各リパーゼ活性測定は、以下の手順で行った。
【００５５】
（リパーゼ活性測定方法）
適宜希釈した培養上清５μＬを９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに分注した。各ウェルに、さらに脱イオン水１８３μＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μＬ、及び基質溶液２μＬを分注し、反応を開始した。基質溶液には、４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｏｃｔａｎｏａｔｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を１００ｍＭ含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を用いた。４０℃にて１５分間反応させ、反応液の４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて測定した。１Ｕは４０℃で１分間に１μｍｏｌのｐＮＡを遊離する酵素量と定義した。
【００５６】
ＭＧＬＰ変異体の残存活性を図１に示す。このＭＧＬＰ変異体は、親ＭＧＬＰ（野生型Ｈ−２５７）と比較して耐熱性が向上していた。
【図１】
2020092617.tif 000003
【配列表】
2020092617000001.app