(57)【要約】【課題】所望の物性のタンパク質成形体を簡便に製造できるタンパク質成形体の製造方法を提供すること。【解決手段】タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、前記タンパク質を含む成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、
前記タンパク質を含む成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
【請求項２】
前記成形体前駆体が、繊維状であり、
前記調整工程が、前記成形体前駆体の加熱及び／又は水との接触により行われる、請求項１に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項３】
前記成形体前駆体が、粉末状であり、
前記調整工程が、前記成形体前駆体の加熱及び／又は加圧により行われる、請求項１又は２に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項４】
前記調整工程が、前記成形体前駆体を圧延して、式Ａ：｛（圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ）／圧延前の成形体前駆体の厚さ｝で表される圧下率を調整することにより行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項５】
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、
前記タンパク質成形体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
【請求項６】
前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項７】
前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項８】
前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造の合計含有量に対する前記スタッガード型パッキング構造の含有量の比が、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項１０】
前記構造タンパク質が、改変フィブロインである、請求項９に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項１１】
タンパク質成形体の物性をコントロールする方法であって、
タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、前記成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、方法。
【請求項１２】
前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質成形体中の前記レクトアングラー型パッキング構造及び前記スタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記物性が、曲げ弾性率である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質を含むタンパク質成形体の品質を評価する方法であって、
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、ケミカルシフト２０．５±０．５ｐｐｍにピークを有する第１のシグナルの面積と、ケミカルシフト１９．５±０．５ｐｐｍ及び２２．７±０．５ｐｐｍにピークを有する第２のシグナルの面積を測定し、式Ｂ：第２のシグナルの面積／（第１のシグナルの面積＋第２のシグナルの面積）で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性をコントロールする方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生分解性を有するタンパク質の素材化が、環境保全意識の高まり応じて盛んに研究されるようになってきている。例えば、非特許文献１には、シルク粉末又は羊毛粉末を加熱圧縮し樹脂化することでバイオプラスチックを得る方法が報告されている。特許文献１には、ポリペプチドを主成分として含み、応力及びタフネスが所定の範囲内である人造ポリペプチド繊維が開示されている。特許文献２には、天然クモ糸タンパク質、又は天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含む組成物のモールド成形体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５５４０１５４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／０４７５０４号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】平井伸治、月刊機能材料誌、２０１４年６月、「廃棄物由来動物タンパク質を用いた環境調和型シルクおよび羊毛樹脂」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質成形体は、合成繊維、合成樹脂等の石油系材料からなる成形体とは異なって、生産及び加工に際して必要なエネルギーが小さいこと等から益々の需要が見込まれている。しかしながら、タンパク質成形体は、合成繊維、合成樹脂等のように物性（例えば、引張強度、曲げ強度、硬度等）をコントロールする手段についての知見が乏しく、それ故に、所望の物性を実現することが容易ではなかった。
【０００６】
本発明は、所望の物性のタンパク質成形体を簡便に製造できるタンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性を制御する方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の各発明に関する。
［１］
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、タンパク質を含む成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
［２］
成形体前駆体が、繊維状であり、調整工程が、成形体前駆体の加熱及び／又は水との接触により行われる、［１］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［３］
成形体前駆体が、粉末状であり、調整工程が、成形体前駆体の加熱及び／又は加圧により行われる、［１］又は［２］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［４］
調整工程が、成形体前駆体を圧延して、式Ａ：｛（圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ）／圧延前の成形体前駆体の厚さ｝で表される圧下率を調整することにより行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［５］
タンパク質を含むタンパク質成形体の製造方法であって、タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法。
［６］
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［７］
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［８］
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比が、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定される、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［９］
タンパク質が、構造タンパク質である、［１］〜［８］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１０］
構造タンパク質が、改変フィブロインである、［９］に記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１１］
タンパク質成形体の物性をコントロールする方法であって、タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える、方法。
［１２］
タンパク質成形体中のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造を構成するβシート構造が、逆平行βシート構造である、［１１］に記載の方法。
［１３］
タンパク質成形体中のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されている、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］
物性が、曲げ弾性率である、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
タンパク質を含むタンパク質成形体の品質を評価する方法であって、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、ケミカルシフト２０．５±０．５ｐｐｍにピークを有する第１のシグナルの面積と、ケミカルシフト１９．５±０．５ｐｐｍ及び２２．７±０．５ｐｐｍにピークを有する第２のシグナルの面積を測定し、式Ｂ：第２のシグナルの面積／（第１のシグナルの面積＋第２のシグナルの面積）で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える、方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、所望の物性のタンパク質成形体を簡便に製造できるタンパク質成形体の製造方法、タンパク質成形体の物性を制御する方法、及びタンパク質成形体の品質を評価する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図２】天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。
【図３】天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。
【図４】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図５】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図６】レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の一例を説明するための図である。
【図７】実施例における１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図８】実施例における１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図９】実施例における１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図１０】実施例における１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１１】
〔タンパク質成形体の製造方法〕
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、タンパク質を含む成形体前駆体中に含まれるβシート構造において、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える。
【００１２】
以下、レクトアングラー型パッキング構造の含有量を「Ｃ１」、スタッガード型パッキング構造の含有量を「Ｃ２」、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を、「Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）」とも称する。
【００１３】
（タンパク質）
タンパク質は、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が形成され得るタンパク質であれば特に制限されない。タンパク質としては、天然のタンパク質と組換えタンパク質（人造タンパク質）を挙げることができる。また、組換えタンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク（クモ糸）、カイコシルク、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。また、構造タンパク質は、例えば、後述する改変フィブロインであってよく、改変クモ糸フィブロインが好ましい。
【００１４】
フィブロイン様タンパク質であるスパイダーシルクあるいはカイコシルク由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００１５】
本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン１」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
【００１６】
「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
【００１７】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
【００１８】
改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。
【００１９】
第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
【００２０】
第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
【００２１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
【００２２】
第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００２３】
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
【００２４】
（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２５】
第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
【００２６】
第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２７】
第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
【００２８】
第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
【００２９】
第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
【００３０】
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
【００３１】
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。
【００３２】
第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
【００３３】
第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００３４】
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
【００３５】
第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００３６】
（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
【００３７】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。
【００３８】
（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３９】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００４０】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
【００４１】
第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００４２】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００４３】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００４４】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
【００４５】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
【００４６】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００４７】
配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【００４８】
（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４９】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００５０】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
【００５１】
第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００５２】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
【００５３】
第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５４】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５５】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５６】
第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５７】
第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
【００５８】
ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
【００５９】
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
【００６０】
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
【００６１】
図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
【００６２】
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
【００６３】
次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
【００６４】
第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
【００６５】
第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
【００６６】
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合の結果を図３に示す。
【００６７】
図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。
【００６８】
第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００６９】
第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００７０】
（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。
【００７１】
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
【００７２】
（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７３】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００７４】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
【００７５】
第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
【００７６】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００７７】
配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【００７８】
（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７９】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００８０】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
【００８１】
第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００８２】
第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。
【００８３】
第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４−ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
【００８４】
第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
【００８５】
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２〜４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
【００８６】
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
【００８７】
第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
【００８８】
第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００８９】
第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
【００９０】
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
【００９１】
【表１】
2020125429.tif 000002
【００９２】
ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１〜４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
【００９３】
例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４−１＝７。「−１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
【００９４】
第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
【００９５】
第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
【００９６】
疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
【００９７】
第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００９８】
（５−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
【００９９】
（５−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１００】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１０１】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
【０１０２】
第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
【０１０３】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１０４】
配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【０１０５】
（５−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１０６】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１０７】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
【０１０８】
第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【０１０９】
第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
【０１１０】
第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
【０１１１】
第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
【０１１２】
本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
【０１１３】
ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
【０１１４】
図５は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図５の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
【０１１５】
第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
【０１１６】
本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
【０１１７】
第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
【０１１８】
「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
【０１１９】
表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
【０１２０】
第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、−０．８以上であることが好ましく、−０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
【０１２１】
本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
【０１２２】
第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
【０１２３】
第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
【０１２４】
第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ−ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ−ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ−ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６−ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
【０１２５】
（６−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１２６】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１２７】
配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
【０１２８】
配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ−ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。
【０１２９】
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
【０１３０】
【表２】
2020125429.tif 000003
【０１３１】
（６−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１３２】
（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１３３】
（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
【０１３４】
第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【０１３５】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６−ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６−ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
【０１３６】
配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
【０１３７】
【表３】
2020125429.tif 000004
【０１３８】
（６−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１３９】
（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【０１４０】
（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６−ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
【０１４１】
第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【０１４２】
改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
【０１４３】
スパイダーシルクであって横糸タンパク質に由来のタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）をあげることができる。スパイダーシルクはセリンやチロシンのような水酸基を有する構造を多く含むが、これら水酸基はエステルに変換されうる官能基としてあげられる。
【０１４４】
具体的には配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。配列番号４７で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１４５】
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４８で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１４６】
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式５：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式５中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４９で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１４７】
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５０で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１４８】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号５１で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【０１４９】
（タンパク質の製造方法）
タンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【０１５０】
タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする遺伝子を合成してもよい。
【０１５１】
調節配列は、宿主におけるタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、組換えタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【０１５２】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【０１５３】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【０１５４】
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【０１５５】
原核生物を宿主とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【０１５６】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【０１５７】
真核生物を宿主とする場合、組換えタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【０１５８】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【０１５９】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中にタンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【０１６０】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１６１】
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【０１６２】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【０１６３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１６４】
発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【０１６５】
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１６６】
＜調整工程＞
調整工程では、タンパク質成形体前駆体のβシート構造におけるレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量（Ｃ１＋Ｃ２）に対するスタッガード型パッキング構造の含有量（Ｃ２）の比（Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２））を調整する。この調整工程を行うことで、上記の比（Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）が所望の値とされたタンパク質成形体前駆体を得るようにしてもよく、或いは上記の比（Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）が所望の値とされたタンパク質成形体を得るようにしてもよい。前者の場合は、上記の比（Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）が所望の値とされたタンパク質成形体前駆体から、上記調整工程とは別個の工程を経て、目的とするタンパク質成形体が製造されることとなる。タンパク質成形体の形状としては、繊維、フィルム、多孔質体、モールド成形体等が挙げられる。
【０１６７】
「レクトアングラー型パッキング構造」は、複数積層されたβシート構造におけるパッキング構造の一形態であり、互いに隣り合う二つのβシート構造をそれぞれ構成するポリペプチド鎖が、βシート面に対して略垂直方向（βシートの積層方向）に対応配置されている構造を意味する。つまり、積層方向において隣り合うポリペプチド鎖が、積層方向視において、互いに間隔を隔てて重なるように位置している。レクトアングラー型パッキング構造を構成するβシート構造は、逆平行βシート構造であってもよく、平行βシート構造であってもよい。レクトアングラー型パッキング構造中の少なくとも一部のポリペプチド鎖は、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）であってよく、レクトアングラー型パッキング構造中の全部のポリペプチド鎖が、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）であってよい。すなわち、レクトアングラー型パッキング構造は、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されていてよい。
【０１６８】
図６Ａは、レクトアングラー型パッキング構造の一例を示す（図６Ａの出典：Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，２０１２年，５１巻，ｐｐ．１２１２−１２１５）。図６Ａ中のａ方向は、ポリペプチド鎖（主鎖）の一方の末端側から他方の末端側に向かう方向（主鎖に沿う方向）を示し、ｂ方向は、ａ方向と直交し、かつ、βシート面に沿う方向を示し、ｃ方向は、βシート構造の積層方向を示す。
【０１６９】
図６Ａでは、６個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）で構成されるβシート構造が積層し、かつ、該ポリペプチド鎖が、βシート面に対して略垂直方向（図６Ａ中のｃ方向）に互いに対応するように配置されている。図６Ａにおいて示されるレクトアングラー構造は、６個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖で形成されている。
【０１７０】
「スタッガード型パッキング構造」は、複数積層されたβシート構造のパッキング構造のレクトアングラーパッキング構造とは別の形態であり、互いに隣り合う二つのβシート構造をそれぞれ構成するポリペプチド鎖のうち、一方のβシート構造のポリペプチド鎖が、他方のβシートのシート面方向に隣り合うポリペプチド鎖同士の間に、積層方向視において位置するように配置されている構造を意味する。つまり、積層方向において隣り合うポリペプチド鎖が、積層方向視において交互に位置している。スタッガード型パッキング構造を構成するβシートは、逆平行βシート構造であってもよく、平行βシート構造であってもよい。スタッガード型パッキング構造中の少なくとも一部のポリペプチド鎖は、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）であってよく、スタッガード型パッキング構造中の全部のポリペプチド鎖が、複数個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）であってよい。すなわち、スタッガード型パッキング構造は、複数のアラニン残基からなるポリペプチド鎖により形成されていてよい。
【０１７１】
図６Ｂは、スタッガード型パッキング構造の一例を示す（図６Ｂの出典：Ａｎｇｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，２０１２年，５１巻，ｐｐ．１２１２−１２１５）。図６中のａ方向は、ポリペプチド鎖（主鎖）の一方の末端側から、他方の末端側に向かう方向（主鎖に沿う方向）を示し、ｂ方向は、ａ方向と直交し、かつ、βシート面に沿う方向を示し、ｃ方向は、βシート構造の積層方向を示す。
【０１７２】
図６Ｂでは、７個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）で構成されるβシート構造が積層し、かつ、互いに隣り合うβシート構造のそれぞれのポリペプチド鎖が、積層方向視において交互に位置するように配置されている。図６Ｂにおいて示されるスタッガード型パッキング構造は、７個のアラニン残基からなるポリペプチド鎖で形成されている。
【０１７３】
Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）は、目的とするタンパク質成形体の用途等に応じて、適宜設定してよい。例えば、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）は、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、又は０．６５以上、又は０．６７以上となるように調整してもよい。例えば、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）は、０．９５以下、０．９０以下、０．８５以下、０．８０以下、０．７５以下、又は０．７０以下に調整してもよい。
【０１７４】
Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル分析等を用いて測定することができる。Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子のシグナル面積に基づいて決定されるものであることが好ましい。
【０１７５】
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル分析によるＣ２／（Ｃ１＋Ｃ２）の測定は、それぞれのパッキング構造に由来するアミノ酸残基側鎖のシグナルを分離し、分離したそれぞれのシグナルの面積を測定することにより、実施することができる。
【０１７６】
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、アラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）で形成されている場合、例えば、次に示す１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル分析法により、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を算出することができる。
【０１７７】
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、２０．５±０．５ｐｐｍにピークを有するシグナル（第１のシグナル）は、レクトアングラー型パッキング構造に存在するアラニン残基側鎖炭素原子（ＡｌａＣβ）に由来する。１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、１９．５±０．５ｐｐｍ及び２２．７±０．５ｐｐｍそれぞれにピークを有するシグナル（第２のシグナル）は、スタッガード型パッキング構造に存在するアラニン側鎖炭素原子（ＡｌａＣβ）に由来する。まず、測定対象物の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを測定する。測定した１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを第１のシグナルと第２のシグナルとに分離する。分離したそれぞれのシグナルの面積を測定する。第１のシグナルの面積Ｓ１は、レクトアングラー型パッキング構造の含有量（Ｃ１）と相関し、第２のシグナルの面積Ｓ２は、スタッガード型パッキング構造の含有量（Ｃ２）と相関する。測定したシグナルの面積から、式：Ｓ２／（Ｓ１＋Ｓ２）により、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を求める。
【０１７８】
一般的に、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおけるアラニンメチル炭素ピークのケミカルシフトは、±０．５°の範囲内で誤差が生じ得るものである。ケミカルシフトの誤差は、ピークの幅が大きいかどうかに依存し、この場合はピークの幅が比較的に大きい。したがって、上記ケミカルシフトの値は±０．５°程度の範囲内の数値を包含するものとして理解されるべきである。
【０１７９】
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定は、具体的には、実施例に記載の方法で測定することができる。１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおけるアラニン残基側鎖炭素原子（ＡｌａＣβ）は、Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｄｅｐｈａｓｉｎｇ法（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３年、１０５巻、ｐｐ．６６９７−６７０４）を用いて好適に測定することができる。
【０１８０】
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が、アラニン残基からなるポリペプチド鎖（ポリアラニン鎖）で形成されている場合、例えば、粉末Ｘ線回折法により、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を算出することができる可能性がある。
【０１８１】
成形体前駆体の形状は特に限定されず、例えば、粉末状、フィルム状、繊維状（ファイバー状）、板状、塊状等であってよい。成形体前駆体としては、例えば、粉末状のタンパク質をそのまま用いることもできるし、タンパク質を公知の方法で成形したものを用いることもできる。本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、調整工程の前に、例えば、タンパク質を含む成形体前駆体を準備する準備工程を更に備えていてもよい。
【０１８２】
板状、又は塊状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質を含む組成物を加熱および加圧して得ることができる。具体的には、例えば、以下の操作が実施される。即ち、先ず、タンパク質を含む組成物（タンパク質のみ、或いは他の成分を含む）を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に組成物に対して加圧する。所定の加圧下でタンパク質が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、加熱及び加圧された組成物を得る。次いで、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型の温度を下降させ、組成物が所定の温度になったところで、内容物を取り出して成形体前駆体（モールド成形体）を得る。加熱は、８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１００分が好ましく、１〜５０分がより好ましく、５〜３０分が更に好ましい。
【０１８３】
繊維状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法により紡糸して形成させることができる。フィルム状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液の膜を形成し、形成された膜から溶媒を除去する方法により得られる。
【０１８４】
調整工程は、例えば、成形体前駆体の形状に応じて、適宜選択して行うことができる。調整工程は、成形体前駆体の加熱、加圧、水との接触、圧延等の処理により行われてよい。上述した成形前駆体の処理は、組み合わせて実施されてもよい。すなわち、例えば、調整工程は、成形体前駆体の加熱及び加圧により行われてもよく、成形体前駆体の加熱及び水との接触により行われてもよい。調整工程が、成形体前駆体の加熱及び水との接触により行われる場合、例えば、成形体前駆体は、加熱した後に、水と接触させてもよく、水と接触させた後に加熱してもよく、水と接触させた状態で加熱してもよい。
【０１８５】
調整工程が、成形体前駆体の加熱及び／又は水との接触により行われてよい。すなわち、成形体前駆体の加熱及び／又は水との接触により、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を調整してよい。成形体前駆体が繊維状である場合、調整工程は、成形体前駆体の加熱及び／又は水との接触により行われることが好ましい。
【０１８６】
成形体前駆体の加熱温度の下限は、例えば、５０℃以上であってもよく、７０℃以上であってもよく、１００℃以上であってもよく、１３０℃以上であってもよく、１６０℃以上であってもよく、１９０℃℃以上であってよい。成形体前駆体の加熱温度の上限は、例えば、２２０℃以下であってもよく、２００℃以下であってもよい。成形体前駆体の加熱時間（上記加熱温度に保持する時間）は、例えば、０．５時間以上３時間以下であってよく、１時間以上２時間以下であってよい。
【０１８７】
成形体前駆体と水を接触させる方法としては、例えば、成形体前駆体を水中に浸漬する方法、成形体前駆体に対して水を常温で又は加温したスチーム等の状態で噴霧する方法、及び成形体前駆体を水蒸気が充満した高湿度環境下に暴露する方法等が挙げられる。
【０１８８】
成形体前駆体に接触させる水の温度は、沸点未満であってよい。水の温度の下限値は、１０℃以上、４０℃以上、又は７０℃以上であってよい。水の温度の上限値は９０℃以下であってよい。成形体前駆体を水と接触させる場合、調整工程は、更に、成形体前駆体を水と接触させた後に、乾燥させることを含んでいてもよい。
【０１８９】
調整工程は、成形体前駆体の加熱及び加圧により行われてよい。すなわち、成形体前駆体の加熱及び加圧により、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を調整してよい。成形体前駆体が粉末状である場合、調整工程は、成形体前駆体の加熱及び加圧により行われることが好ましい。加熱は、５０〜２５０℃で行うことが好ましく、８０〜２００℃がより好ましく、１２０〜１６０℃が更に好ましい。加圧は、５ＭＰａ以上で行うことが好ましく、１０ＭＰａ以上がより好ましく、３０ＭＰａ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１５分が好ましく、１〜１０分がより好ましく、３〜５分が更に好ましい。
【０１９０】
調整工程は、成形体前駆体を圧延することにより行われてもよい。すなわち、成形体前駆体の圧延により、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を調整してよい。成形体前駆体が、粉末状のタンパク質を加熱及び加圧して得られる加熱加圧体である場合、調整工程は、成形体前駆体を圧延することにより行われることが好ましい。
【０１９１】
圧延は、たとえば延伸機を用いて実施することができる。この延伸機の構成は、特に限定はされないが、たとえば、２本の円筒状のロールを有する延伸機が用いられる。圧延工程では、たとえば２本のロールで成形体を挟み込んで圧力を加えつつ、２本のロールをそれぞれ回転させて送り出す。これにより、成形体の全体を圧縮延伸する。なお、延伸機は、２本のロールを用いた形態に限られず、圧縮延伸を行い得る他の形態の延伸機を用いてもよい。たとえば、平板状の基盤とロールとを備える延伸機を用い、基盤上に成形組成物を置き、その上からロールを転がしつつ押し当てることで、成形体前駆体を圧縮延伸してもよい。あるいは、平板状の上金型および下金型を備える延伸機を用い、上金型および下金型により成形体前駆体を挟み込んで圧力を加えることで、成形体前駆体を圧縮延伸してもよい。圧下率の設定は、２本のロールの場合と同様である。上の部材と下の部材の位置（間隔）が決められることで、成形体の圧下率が設定され得る。成形体前駆体の圧延は、加熱しつつ実施することもできるし、加熱することなく実施することもできる。成形体前駆体を圧延しながら加熱する場合、加熱延伸機が用いられ得る。圧延しながら加熱を行う場合、加熱は、８０〜２００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１２０〜１６０℃が更に好ましい。
【０１９２】
成形体前駆体は、式Ａ：｛（圧延前の成形体前駆体の厚さ−圧延後の成形体前駆体の厚さ）／圧延前の成形体前駆体の厚さ｝×１００で表される圧下率（成形体の厚みの減少率）を制御することにより、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量を調整してもよい。
【０１９３】
例えば、成形体前駆体の圧延は、圧下率が１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、又は６０％以上となるように調整してもよい。例えば、成形体前駆体の圧延は、圧下率が９０％以下、８０％以下、７０％以下、又は６５％となるように調整してもよい。２本のロール（上ロールおよび下ロール）を有する圧延機を用いる場合には、これらのロールの位置（間隔）が決められることで、成形体の圧下率が設定され得る。
【０１９４】
＜評価工程＞
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、上述した調整工程の前及び／又は後に、成形体前駆体又はタンパク質成形体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比（Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２））を評価する工程を含んでいてもよい。
【０１９５】
本発明の他の実施形態として、タンパク質成形体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比（Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２））を評価する評価工程を備える、タンパク質成形体の製造方法が提供される。当該製造方法は、評価工程の前に、上述した調整工程を更に備えていてもよい。
【０１９６】
評価工程は、例えば、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）を測定し、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）が基準値以上であると評価することを含んでいてもよい。Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）の基準値は、例えば、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．６７以上であってよい。Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）の基準値は、例えば、０．９５以下、０．９０以下、０．８５以下、０．８０以下、０．７５以下、又は０．７０以下であってよい。
【０１９７】
評価工程は、例えば、Ｃ２／（Ｃ１＋Ｃ２）が基準値以上のタンパク質成形体を選別することを含んでいてもよい。
【０１９８】
＜タンパク質成形体の物性をコントロールする方法＞
本実施形態に係るタンパク質成形体の物性をコントロールする方法は、タンパク質を含む成形体前駆体から、タンパク質成形体を製造する際に、成形体前駆体のレクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比を調整する調整工程を備える。調整工程については、上述したとおりである。
【０１９９】
物性は、例えば、曲げ弾性率であってよく、引張強度であってよく、落下衝撃であってよい。曲げ弾性率は、後述する実施例に記載の曲げ試験により測定される。
【０２００】
＜タンパク質成形体の品質を評価する方法＞
本実施形態に係るタンパク質成形体の品質を評価する方法は、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、ケミカルシフト２０．５±０．５ｐｐｍにピークを有する第１のシグナルの面積と、ケミカルシフト１９．５±０．５ｐｐｍ及び２２．７±０．５ｐｐｍにピークを有する第２のシグナルの面積を測定し、式Ｂ：第２のシグナルの面積／（第１のシグナルの面積＋第２のシグナルの面積）で表されるシグナル面積比を算出する工程を備える。本実施形態に係る方法は、上記シグナル面積比を算出する工程を備えるため、タンパク質成形体の品質（例えば、物性）を簡便に評価することができる。本実施形態に係る方法によれば、曲げ弾性率、引張強度、落下衝撃といった物性を簡便に評価することができる。
【０２０１】
第１のシグナルは、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、ケミカルシフト２０．５±０．５ｐｐｍにピークを有するシグナルであり、レクトアングラー型パッキング構造に存在するアラニン残基側鎖炭素原子（ＡｌａＣβ）に由来する。第２のシグナルは、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、ケミカルシフト１９．５±０．５ｐｐｍ及び２２．７±０．５ｐｐｍそれぞれにピークを有するシグナルであり、スタッガード型パッキング構造に存在するアラニン残基側鎖炭素原子（ＡｌａＣβ）に由来する。１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定方法及びＡｌａＣβのシグナル面積を測定する方法は上述したとおりである。
【０２０２】
本実施形態に係る方法は、算出されたシグナル面積比が基準値内であると判定する工程を備えていてよく、算出されたシグナル面積比が基準値内のタンパク質成形体を選別する工程を備えていてもよい。
【０２０３】
シグナル面積比の基準値は、例えば、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．６７以上であってよい。シグナル面積比の基準値は、例えば、０．９５以下、０．９０以下、０．８５以下、０．８０以下、０．７５以下、又は０．７０以下であってよい。
【実施例】
【０２０４】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０２０５】
〔改変クモ糸フィブロインの製造〕
（１）プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）とを有する。
【０２０６】
ＰＲＴ４１０をコードする核酸を合成した。この核酸の５’末端にＮｄｅＩサイトを付加し、この核酸の終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、ＰＲＴ４１０をコードする核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した。切り出された核酸をタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【０２０７】
（２）タンパク質の発現
得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターにより、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。次いで、培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬの表４に示されるシード培養用培地に、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで、約１５時間かけてフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。
【０２０８】
【表４】
2020125429.tif 000005
【０２０９】
得られたシード培養液を、５００ｍＬの表５に示される生産培地を添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を行った。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
【０２１０】
【表５】
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【０２１１】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。添加後、培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を２０時間継続した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
その後、培養液に対して、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導した。ＩＰＴＧを添加してから２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。
【０２１２】
（３）タンパク質の精製
回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）中に懸濁させた。懸濁液を６０℃で３０分間、スターラーで撹拌することにより、沈殿物を溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収た。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除くことにより、改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ４１０」の凍結乾燥粉末を得た。
【０２１３】
〔モールド成形体の作製〕
加圧成形機を用いて、上記粉末を加熱および加圧し、モールド成形体を得た。この加圧成形機の金型は、断面が３５ｍｍ×１５ｍｍの長方形状の貫通孔を有する金型である。上記粉末を加圧成形機の金型の貫通孔内に導入し、金型を加熱するとともに、ハンドプレス機（商品名：ＮＴ−１００Ｈ−Ｖ０９、ＮＰａシステム(株)製）を用いて、４０ｋＮ（２７．５５ＭＰａ）の条件で加圧した。成形体の温度が１３０℃になったところで加熱を中止し、スポットクーラー（商品名：ＴＳ−２５ＥＰ−１、トラスコ中山(株)製）で成形体を冷却し、成形体の温度が５０℃になったところで成形体を金型から取り出した。これにより、３５ｍｍ×１５ｍｍ×３ｍｍの直方体形状のモールド成形体を得た。続いて、手動式加熱延伸機（井元製作所(株)製、ＩＭＣ−１９８９型）を用いて、モールド成形体を直接ロールに挟み込み、延伸させることにより、モールド成形体を圧延した。加熱ロールの表面温度は、１８０℃、ロール速度は５０ｍｍ／分に設定した。
【０２１４】
以上の操作により、圧延を実施しなかったサンプル１、圧下率を２５％としたサンプル２、圧下率を４０％としたサンプル３、及び圧下率を６０％としたサンプル４を作製した。
【０２１５】
〔１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定〕
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルは、以下の条件で測定した。
（測定条件）
使用装置：Ａｖａｎｃｅ４００ＭＨｚ（ＢＲＵＫＥＲ社製）７ｍｍ−ＣＰＭＡＳプローブ（ＢＲＵＫＥＲ社製）
測定核：１３Ｃ（１００．６２４８４２５ＭＨｚ）
測定温度：室温（２２℃）
パルスモード：ＣＰＴＯＳＳ測定（スピニングサイドバンド消去法）
回転数：５０００Ｈｚ
パルス繰り返し時間：６０ｓｅｃ
コンタクトタイム：１ｍｓｅｃ
積算回数：２４００回
基準物質：グリシン（外部基準：１７６．０３ｐｐｍ）
【０２１６】
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル測定データをガウス関数によるフィッテイング（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト社、登録商標）及びそのアドインソフト「ソルバー」（商品名）を使用）によりレクトアングラー型パッキング構造部分とスタッガード型パッキング構造部分とアモルファス部分とにピーク分離して、それぞれの曲線を作成した。アモルファス部分は非晶領域に含まれるアラニン残基側鎖の炭素原子を示す。
【０２１７】
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合成関数は、それぞれ結晶シグナルに合わせて作成した（レクトアングラー型パッキング構造：２個のガウス関数による合成関数、スタッガード型パッキング構造：３個のガウス関数による合成関数、アモルファス部分：１個のガウス関数）。１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル測定データとのフィッティングに際しては、測定データに合うように、半値幅等を調整した。
図６〜１０に１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す。図６〜１０中、実線は各サンプルの実測データであり、破線は各サンプルの実測データの半値幅等の調整によりフィッティングを行ったものであり、二点鎖線はレクトアングラー型パッキング構造におけるアラニン残基の側鎖メチル基（ＡｌａＣβ）を示すピークであり、一点鎖線がスタッガード型パッキング構造におけるアラニン残基の側鎖メチル基（ＡｌａＣβ）を示すピークである。点線は、レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造が存在しないアモルファス部分におけるアラニン残基の側鎖メチル基（ＡｌａＣβ）を示すピークである。
【０２１８】
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の含有量の比は、ピーク分離図におけるそれぞれの曲線を数値積分して得られた積分値の比として求めた。
【０２１９】
レクトアングラー型パッキング構造及びスタッガード型パッキング構造の合計含有量に対するスタッガード型パッキング構造の含有量の比は、圧延を実施しなかったサンプル１では、０．４８であり（図７）、圧下率を２５％としたサンプル２では０．６５であり（図８）、圧下率を４０％としたサンプル３では０．６７であり（図９）、圧下率を６０％としたサンプル４では０．６９であった（図１０）。
【０２２０】
〔曲げ試験〕
上記のように作製した各成形体のサンプルに対し、卓上形精密万能試験機（（株）島津製作所製、オートグラフＡＧＳ−Ｘ）を用いて三点曲げ試験を行った。使用したロードセルは５０ｋＮであり、支点間距離は２７ｍｍ、測定速度は１ｍｍ／分とした。
【０２２１】
曲げ弾性率は、圧延を実施しなかったサンプル１（圧下率０％）では７１．４ＭＰａ、圧下率を２５％としたサンプル２では１１０．５ＭＰａ、圧下率を４０％としたサンプル３では１２６．８ＭＰａ、圧下率を６０％としたサンプル４では１６３．８ＭＰａであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020125429.tif 000013
【図８】
2020125429.tif 000014
【図９】
2020125429.tif 000015
【図１０】
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【配列表】
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