(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫チェックポイント分子ＴＩＭ−３に対するモノクローナル抗体を併用した、腫瘍関連抗原をコードする組み換えポックスウイルスを用いた癌治療のための組成物、キット、及び方法の提供。【解決手段】ヒト癌患者を治療する方法であって、（ａ）前記患者に少なくとも１つの腫瘍関連抗原を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを投与すること、及び（ｂ）前記患者にＴＩＭ−３アンタゴニストを投与すること、を含む前記方法。【選択図】図２
2020125322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト癌患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者に少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを投与すること、及び
（ｂ）前記患者にＴＩＭ−３アンタゴニストを投与すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
（ｃ）前記患者にＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、またはそれらの組み合わせから選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）前記患者にＰＤ−１から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）前記患者にＬＡＧ−３から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｃ）前記患者にＣＴＬＡ−４から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポックスウイルスがオルソポックスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ワクシニアウイルスが変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポックスウイルスが、アビポックスウイルスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アビポックスウイルスが、鶏痘ウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、癌胎児性（ＣＥＡ）、ｍｕｃｉｎ  １  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＭＵＣ−１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、またはブラキウリ抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＭＵＣ−１抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＰＡＰ抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＰＳＡ抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＨＥＲ−２抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ブラキウリ抗原である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＩＭ−３アンタゴニストが、抗ＴＩＭ−３抗体である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニストが、それぞれ、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２及び請求項４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト患者における癌を治療するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルス、及び
（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、
を含有する前記キット。
【請求項２２】
（ｃ）ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、またはＣＴＬＡ−４から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニスト、
をさらに含有する請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＴＩＭ−３アンタゴニストが、抗ＴＩＭ−３抗体を含有する、請求項２１〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニストが、それぞれ、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２２〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、またはブラキウリ抗原である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１抗原である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＰＳＡである、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
ヒト癌患者を治療する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを前記患者に投与すること、及び
（ｂ）前記患者にＴＩＭ−３アンタゴニストを投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項２９】
（ｃ）前記患者に、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、またはそれらの組み合わせから選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した前記組み換えポックスウイルスが、同種または異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、
ここで前記同種プライムブーストレジメンは、ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスの第一のプライム投与、及びＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した同じ組み換えポックスウイルスの１回以上のその後のブースト投与、を含み、ならびに、
ここで前記異種プライムブーストレジメンは、ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスの第一のプライム投与、及びＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した異なる組み換えポックスウイルスの１回以上のその後のブースト投与、を含む、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ抗原、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスが、同種プライムブーストレジメンの一部として投与され、ここで前記第一のプライム投与及び前記１回以上のその後のブースト投与の組み換えポックスウイルスは、オルソポックスウイルスを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記オルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＨＥＲ２である、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスが、異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、ここで前記第一のプライム投与の組み換えポックスウイルスがオルソポックスウイルスを含有し、及び前記１回以上のブースト投与の組み換えポックスウイルスがアビポックスウイルスを含有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記異種プライムブーストレジメンが、ＰＲＯＳＴＶＡＣまたはＣＶ３０１である、請求項３０、３５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ヒト癌患者を治療する方法であって、前記方法は、前記患者に、
（ａ）第一の組み換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有し、及び
（ｂ）第二の組み換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する、を投与することを含み、ここで、前記第二の組み換えポックスウイルスは、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用されて投与される、前記方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の組み換えポックスウイルスの後に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｒｐ２）、ブラキウリ抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第一及び第二の組み換えポックスウイルスが異なっており、及び異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、前記異種プライムブーストレジメンが、
ａ）第一のプライム投与として第一の組み換えポックスウイルスを投与すること、及び
ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用して、１回以上のブースト投与として第二の組み換えポックスウイルスを投与すること、を含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第一の組み換えポックスウイルスがオルソポックスウイルスを含有し、前記第二の組み換えポックスウイルスがアビポックスウイルスを含有する、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記異種プライムブーストレジメンが、ＰＲＯＳＴＶＡＣまたはＣＶ３０１である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記オルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、ＭＶＡ，またはＭＶＡ−ＢＮから選択され、前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１である、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫チェックポイント分子であるＴＩＭ−３の１つ以上のアンタゴニストと併用した、腫瘍関連抗原をコードするポックスウイルスを用いた癌治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えポックスウイルスは感染性生物体に対するワクチンとして使用されており、近年では、腫瘍に対するワクチンとしても使用されている。Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０５（８）：１０３１-１０３４。これらポックスウイルス群のうちの２種、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）とオルソポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）は、腫瘍への攻撃に有効であること、及び癌治療剤の可能性との関連が示されている（上記文献を典拠とする）。
【０００３】
アビポックスウイルス種の１例である鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）ウイルスは哺乳類細胞に侵入し、タンパク質を発現するが不稔性に複製するため、鶏痘ウイルスはヒトへの投与に対し安全な媒体であることが示されている。Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００５年２月；４（１）：６３−７６。発現用媒体としての鶏痘ウイルスの使用は、癌、マラリア、結核及びＡＩＤＳに対するワクチンに関する多くの臨床試験において評価されている（上記文献を典拠とする）。
【０００４】
オルソポックスウイルスの最もよく知られた種であるワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）は、天然痘の全世界的な根絶に用いられ、ベクター及び／またはワクチンとしての有用性が証明されている。組み換えワクシニアベクターは、たとえばｐ９７、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｐ５３及びＥＴＡ等の数種の腫瘍関連抗原をはじめとする広範な挿入遺伝子を発現するよう遺伝子操作されている（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、１９９３）。
【０００５】
オルソポックスウイルスの有益な株は、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）ウイルスである。ＭＶＡはワクシニアウイルス（ＣＶＡ：ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）のアンカラ株（Ａｎｋａｒａ  ｓｔｒａｉｎ）のニワトリ胚線維芽細胞上で５１６回の連続継代を行うことにより作製された（概要についてはＭａｙｒ，  Ａ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４（１９７５）を参照のこと）。この長期間の継代の結果として、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、そのゲノム配列のうちの約３１キロ塩基が失われ、それにより、複製のための宿主細胞が鳥類の細胞へと厳に制限されたことが記載されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ら、Ｊ．  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８（１９９１））。得られたＭＶＡがかなり非病原性であったことが様々な動物モデルにおいて示された（Ｍａｙｒ，Ａ．＆Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−３４  （１９７８））。さらにこのＭＶＡ株は、ヒト天然痘に対する免疫化を行うためのワクチンとして臨床試験において検証されている（Ｍａｙｒら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ  １６７，３７５−３９０（１９８７）；Ｓｔｉｃｋｌら、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２（１９７４））。これらの研究には高リスク患者を含む１２０，０００人を超える人々が関与しており、ワクシニアをベースとしたワクチンと比較し、ＭＶＡは病原性の消失を伴う安全性プロファイルの改善があった一方で、強力で特異的な免疫応答を誘導する能力を保持していたことが証明された。
【０００６】
その後の数十年において、ＭＶＡは組み換え遺伝子発現のためのウイルスベクター、または組み換えワクチンとしての使用のために改変がなされた（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０（１９９４））。
【０００７】
１９７０年代にＭａｙｒらが、ＭＶＡはヒト及び哺乳類において高度に弱毒化され非病原性であることを示したが、ある研究者らは、残存複製（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）がこれら細胞において起こる可能性があり、そのためＭＶＡは哺乳類細胞株及びヒト細胞株において完全に弱毒化されたわけではないことを報告している（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，１１５９−１１６７（１９９８）；Ｃａｒｒｏｌｌ  ＆  Ｍｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８，１９８−２１１（１９９７）；Ａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、米国特許第５，１８５，１４６号；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ５５（５），５６９（１９９９））。使用されたウイルスはそれらの特性、特に様々な細胞株におけるそれらの増殖の挙動が本質的に異なっているため、これら公表文献に報告された結果は様々な既知のＭＶＡ株を用いて得られたものと推測される。ヒトにおける使用に関連した安全性の懸念をはじめとする様々な利用により、かかる残存複製は望ましいものではない。
【０００８】
たとえばワクチンまたは医薬品等の、より安全な製品開発のための安全性プロファイルが強化されたＭＶＡ株が報告されている。そのすべてが参照により本明細書に援用される国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００２０４２４８０（またはたとえば米国特許第６，７６１，８９３号及び第６，９１３，７５２号）を参照のこと。かかる株は、非ヒト細胞及び細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において繁殖的複製を行うことができるが、公知のワクシニア株の複製が可能であることが知られているあるヒト細胞株においては有意な繁殖的複製を行うことができない。かかる細胞株としては、ヒト角化細胞株、ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６（３）：  ７６１−７１  （１９８８））、ヒト子宮頚部腺癌細胞株、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ヒト胎児腎臓細胞株、２９３（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１２０６０２）、及びヒト骨肉腫細胞株、１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．９１１１２５０２）が挙げられる。かかる株はまた、たとえば重度の免疫不全状態でありウイルス複製に対し高い感受性があるトランスジェニックマウスモデルのＡＧＲ１２９等のあるマウスの系統等において、ｉｎ  ｖｉｖｏで有意な繁殖的複製を行うことができない。たとえば、米国特許第６，７６１，８９３号を参照のこと。かかるＭＶＡの１つの株、ならびにその派生株及び組み換え体は、「ＭＶＡ−ＢＮ」と呼称され、報告がなされている。ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００２０４２４８０（また、たとえば米国特許第６，７６１，８９３号及び第６，９１３，７５２号）を参照のこと。ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＢＮは、各々、組み換え遺伝子発現のためのウイルスベクターとしての使用、または組み換えワクチンとしての使用のために操作されている。たとえば、Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０（１９９４）、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００２０４２４８０（また、たとえば米国特許第６，７６１，８９３号及び第６，９１３，７５２号）を参照のこと。
【０００９】
癌免疫療法に対するある方法は、腫瘍関連抗原を用いたワクチネーションを含むものである。ある例において、かかる方法は、腫瘍関連抗原に対する宿主の免疫応答を促進するための送達系の使用を含むものである。ある例において、かかる送達系は、組み換えウイルスベクターを含むものである。たとえば、Ｈａｒｒｏｐら、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：８０４−８１７（２００６）；Ａｒｌｅｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２：５４９−５５５（２００５）；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（ｓｕｐｐｌ．２）：１４５６７−１４５７１（２００４）を参照のこと。
【００１０】
ＨＥＲ−２は、多くの癌患者の腫瘍細胞中に過剰発現されている腫瘍関連抗原である。様々なＨＥＲ−２ポリペプチドを用いた免疫化を用いて、この抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答が誘導されている。たとえば、Ｒｅｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１：１５８８−１５９５（２００３）；Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆら、Ｃａｎｃｅｒ  １０６：２３０９−２３１７（２００６）を参照のこと。
【００１１】
ＨＥＲ−２抗原をコードするＭＶＡであるＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２は、実験的肺転移のマウスモデルにおいて、肺における多数の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により特徴づけられる強力な腫瘍介在性免疫抑制状態があるにもかかわらず、強力な抗腫瘍効果を発揮することが示されている。Ｍａｎｄｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  （２０１２）６１：１９-２９。組み換えＭＶＡは、強力なＴｈ１優位性のＨＥＲ−２特異的抗体及びＴ細胞応答を誘導することが報告されている（上記文献を典拠とする）。抗腫瘍活性は、高度に活性化されたＨＥＲ−２特異的ＣＤ８＋ＣＤ１１ｃ＋Ｔ細胞を伴う肺浸潤の増加により特徴づけられ、及び肺におけるＴｒｅｇ細胞数の低下を伴い、それによりＴｒｅｇ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比率が有意に増加する（上記文献を典拠とする）。
【００１２】
また、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２は転移がある状態のヒト臨床試験において安全であり、及び寛容状態を打破し、特異的Ｔ細胞応答及びＢ細胞応答を誘導することが示されている。Ｇｕａｒｄｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：２００９年１２月１５日；  Ｖｏｌｕｍｅ６９，Ｉｓｓｕｅ２４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３。
【００１３】
トラスツズマブ（ハーセプチン：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインを標的とするヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、ＨＥＲ２陽性乳癌において臨床効果が認められている。Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２年９月１日；７２（１７）：４４１７-４４２８。しかし、相当数の患者が初期トラスツズマブ治療に反応せず、多くのトラスツズマブ反応性腫瘍が治療継続後、耐性を生じさせる（上記文献を典拠とする）。
【００１４】
免疫細胞上の抑制性受容体は、癌における免疫回避の重要な制御因子である。Ｗｏｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；７２（４）；９１７-２７，２０１１。これら抑制性受容体のうち、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞イムノグロブリンドメイン及びムチンドメイン−３：Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｉｎ  ｄｏｍａｉｎ−３）はマウスＩＦＮ−ガンマ分泌Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞のサブセット上に選択的に発現されている分子であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴｈ１免疫及び寛容を制御することが知られている。Ｈａｓｔｉｎｇｓら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９年９月；３９（９）：２４９２−５０１。
【００１５】
ＴＩＭ−３は、リンパ球活性の抑制に関連し、及び一部の場合においてはリンパ球のアネルギー（ａｎｅｒｇｙ）の誘導にも関連する免疫チェックポイント分子である。Ｐａｒｄｏｌｌ  Ｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１２年４月  Ｖｏｌ．１２：  ２５２。ＴＩＭ−３はガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ９：乳癌を含む様々な癌型で上方制御されているガレクチン）に対する受容体である（上記文献を典拠とする）。抗ＴＩＭ−３抗体はＴ細胞のＩＦＮ−γ介在性抗腫瘍免疫を促進し、腫瘍の成立を抑制することが示されている。Ｎｇｉｏｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７１，  ３５４０−３５５１。
【００１６】
本明細書に記載されるような能動的免疫療法及び癌ワクチンを含む、追加の癌治療法に対する未対処の非常に高い医学的ニーズが明確に存在する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明はヒト癌患者を治療するための方法、組成物、及びキットを包含するものである。
【００１８】
１つの実施形態において、当該方法は、ヒト癌患者に対し、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを投与すること、及び当該患者に対しＴＩＭ−３アンタゴニストを投与することを含む。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、当該組み換えポックスウイルスは、組み換えオルソポックスウイルスまたは組み換えアビポックスウイルスである。
【００２０】
より好ましい実施形態において、組み換えオルソポックスウイルスは組み換えワクシニアウイルス、または組み換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである。他の好ましい実施形態において、組み換えオルソポックスウイルスはＭＶＡ−ＢＮである。
【００２１】
他の好ましい実施形態において、組み換えアビポックスウイルスは組み換え鶏痘ウイルスである。
【００２２】
様々な好ましい実施形態において、少なくとも１つの腫瘍抗原としては、限定されないが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ｔｙｒｐ２）、またはブラキウリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）抗原が挙げられる。
【００２３】
他の好ましい実施形態において、ＴＩＭ−３アンタゴニストは、抗ＴＩＭ−３抗体を含んでもよい。
【００２４】
さらに他の実施形態において、本明細書に記載される癌治療は、たとえば限定されないが、乳癌、肺癌、胃癌、腎癌、肝癌、メラノーマ、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、またはそれらの組み合わせ等の癌を対象とするものであってもよい。
【００２５】
さらに他の実施形態において、本発明は、１人以上の癌患者の治療のためのキットを含んでもよく、当該キットは、少なくとも１つの腫瘍抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスの治療有効量及びＴＩＭ−３アンタゴニストの治療有効量を含んでもよい。さらなる実施形態において、１人以上の癌患者の治療のためのキットは、少なくとも１つの腫瘍抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスとＴＩＭ−３アンタゴニストの組み合わせの治療有効量を投与することに関する説明書を含んでもよい。
【００２６】
さらに他の実施形態において、本開示はさらにヒト癌患者の治療における使用のための組み合わせまたは医薬を包含する。当該組合せまたは医薬は、組み換えポックスウイルスベクター及びＴＩＭ−３アンタゴニストを含み、当該ポックスウイルスベクターは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する。
【００２７】
さらに他の実施形態において、当該方法は、ヒト癌患者に対し、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを投与すること、当該患者にＴＩＭ−３アンタゴニストを投与すること、及び当該患者にＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４またはそれらの組み合わせから選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、を含む。
【００２８】
本発明のさらなる目的及び利点は、以下の記載において部分的に説明がなされ、及び当該記載から部分的に明確であり、または本発明の実施から判明するであろう。本発明の目的及び利点は、添付の請求項において具体的に指摘される構成要素および組合せにより認識され、及び実現されるであろう。
【００２９】
上述される概要及び以下の詳細な記述の両方が、説明及び例示のみを目的としており、請求される、本発明を制限するものではないことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｔｉｍ−３発現は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２治療とともに増加する。Ｔｉｍ−３発現は実施例３に記述されるようにＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた１日目の治療後にマウスにおいて測定された（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．，ｔ．ｓ．）。ＣＤ８  Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ４  Ｔ細胞（Ｂ）に対するＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた１日目の治療後のＴｉｍ−３発現。ＣＤ８  Ｔ細胞（Ｃ）及びＣＤ４  Ｔ細胞（Ｄ）に対するＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた１日目ならびに１５日目の治療後のＴｉｍ−３発現。
【図２】ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗Ｔｉｍ−３を用いた治療。マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２腫瘍を用いて皮内移植され、ならびに実施例４に記述されるように１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．ｔ．ｓ．）及び抗Ｔｉｍ−３（２００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図３】ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗Ｔｉｍ−３及び抗ＰＤ−１を用いた治療。マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２を用いて皮内移植され、ならびに実施例５に記述されるように１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．ｔ．ｓ．）及び抗Ｔｉｍ−３及び抗ＰＤ−１（各々２００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図４】ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗Ｔｉｍ−３及び抗ＬＡＧ−３を用いた治療。マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２を用いて皮内移植され、ならびに実施例６に記述されるように１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．ｔ．ｓ．）及び抗Ｔｉｍ−３及び抗ＬＡＧ−３（各々２００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図５】ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗Ｔｉｍ−３及び抗ＣＴＬＡ−４を用いた治療。マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２を用いて皮内移植され、ならびに実施例７に記述されるように１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、尾基底部皮下注射）及び抗Ｔｉｍ−３（２００μｇ）及び抗ＣＴＬＡ−４（２２μｇ）のＰＢＳ溶液１００μＬを用いて治療された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図６】実施例９に記述される、Ｅ６固形腫瘍モデルにおけるＰＲＯＳＴＶＡＣと抗ＰＤ−１の併用療法。マウスは１日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖを用いて治療され、ならびに８日目及び１５日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆを用いて治療された。抗ＰＤ−１は１日目及び１５日目に投与された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図７】Ｅ６固形腫瘍モデルにおけるＰＲＯＳＴＶＡＣと抗ＬＡＧ−３の併用療法。実施例１０に記述されるように、マウスは１日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖを用いて治療され、ならびに８日目及び１５日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆを用いて治療された。抗ＬＡＧ−３は１日目及び１５日目に投与された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図８】Ｅ６固形腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−１及び抗ＬＡＧ−３と併用したＰＲＯＳＴＶＡＣ。実施例１１に記述されるように、マウスは１日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖを用いて処置され、ならびに８日目及び１５日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆを用いて処置された。抗ＰＤ−１及び抗ＬＡＧ−３は１日目及び１５日目に投与された。Ａ）マウス中の平均腫瘍体積。Ｂ）マウスにおける個々の腫瘍増殖。
【図９】ＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１及び抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４を用いて治療されたマウスにおける全生存率。１日目、メスのＣ５７／ＢＬ６マウス（６〜８週齢、約２０ｇ、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）に、１．０ｘ１０＾６  ＭＣ３８−ＭＵＣ１細胞のＤＰＢＳ溶液３００μＬを実施例１２に記載されるように移植した。マウスを、４日目及び１８日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１（４Ｅ５  Ｉｎｆ．Ｕ．尾基底部上に皮下注射）を用いて治療し、ならびに抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１（各々２００μｇ）の腹腔内注射を用いて治療した。
【図１０】実施例１３に記述されるようにマウスが治療された。プールされた脾臓細胞を、ＰＳＡ特異的応答に関し、ＩＦＮ  ＥＬＩＳＰＯＴ（Ａ、Ｂ）により分析し、細胞障害活性をフローサイトメトリーにより分析した（％ＣＤ１０７＋ＩＦＮγ＋ＣＤ８  Ｔ細胞）（Ｃ）。抗ＰＳＡ  ＩｇＧ力価は、各マウスの個々に対し、ＥＬＩＳＡにより測定した（Ｄ）。ＥＬＩＳＰＯＴについては、独立して行われた４つの実験の代表的なデータをグラフに示す。
【図１１】実施例１４に記述されるようにマウスが治療された。（Ａ）円グラフはサイズで重量が付され、検出された細胞の数を反映している（百万個のＴ細胞当たりのＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の総数が各グラフの下に示されている）。（Ｂ）細胞１個当たりのＩＦＮγ産生量は、平均蛍光密度（ＭＦＩ）による測定値に基づいている。グラフは、独立して行われた２つの実験のうちの代表的なデータを示す。
【図１２】実施例１５に記述されるようにマウスが治療された。プールされた脾臓細胞は最後の治療の１４日後にワクシニアウイルス（ＶＶ）特異的（左側のパネルＡ及びパネルＣ）、またはＰＳＡ特異的（右側のパネルＡ及びパネルＣ）な細胞障害活性についてフローサイトメトリーにより分析された（％ＣＤ１０７＋ＩＦＮγ＋ＣＤ８Ｔ細胞）。グラフは、独立して行われた２つの実験のうちの代表的なデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
近年の臨床試験の多くが、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するよう操作されたワクシニア、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、及び鶏痘をベースとしたベクターを用いた療法を含むものである。これらベクターは様々な癌に対する能動免疫を惹起させるために、単独で用いられ、またはプライムブースト戦略において用いられている。ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）はＰＳＡ及びＴＲＩＣＯＭ（商標）を発現するワクシニアならびに鶏痘を用いたプライム−ブースト戦略を用いるものであり、現在、去勢抵抗性転移性前立腺癌に対する国際第ＩＩＩ相臨床試験（ＰＲＯＳＰＥＣＴ）が行われている。ＣＶ３０１、またはＣＶ−３０１は、ＭＵＣ−１抗原、ＣＥＡ、及びＴＲＩＣＯＭ（商標）を発現するワクシニアならびに鶏痘を用いた異種プライムブースト戦略を使用しており、現在、膀胱癌に対する第ＩＩ相臨床試験が行われている。
【００３２】
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（Ｍａｎｄｌら、２０１２）は、ＨＥＲ−２＋乳癌の治療に関する第Ｉ相臨床試験が行われている。この組み換えベクターは、ＭＶＡ−ＢＮとして知られる高度に弱毒化された変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのストック由来である。この組み換えベクターは、ＨＥＲ−２に対する効果的な免疫応答の誘導を促進するために、破傷風毒素由来の２つ共通Ｔ細胞エピトープ（ＴＴｐ２及びＴＴｐ３０）を含むよう操作されたＨＥＲ−２の細胞外ドメインからなるＨＥＲ−２の変異形態（ＨＥＲ２と指定される）を発現する。
【００３３】
ポックスウイルスをベースとした免疫療法の抗腫瘍効果をさらに増強させるために、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２と、Ｔ細胞活性化を下方制御する免疫チェックポイントタンパク質であるＴＩＭ−３活性を阻害するモノクローナル抗体を併用させた。ＣＴ２６−ＨＥＲ−２腫瘍モデルにおいて、抗ＴＩＭ−３抗体単独で治療された腫瘍、及びＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２単独で治療された腫瘍と比較し、有意に腫瘍体積が減少した。
【００３４】
ポックスウイルスと併用した場合のＴＩＭ−３アンタゴニストの癌患者を治療する能力をさらに再検討するために、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２と抗ＴＩＭ−３抗体を、追加の免疫チェックポイントアンタゴニスト及びアゴニストと併用させて検証した。抗ＰＤ−１抗体を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗ＴＩＭ−３抗体は、腫瘍体積を減少させ、同様に、抗ＬＡＧ−３抗体を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗ＴＩＭ−３抗体も腫瘍体積を減少させた。さらに、抗ＣＴＬＡ−４抗体を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗ＴＩＭ−３抗体も腫瘍体積を減少させた。
【００３５】
ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）及びＭＶＡ−ＢＮ  ＣＶ３０１もそれぞれ様々な腫瘍モデルにおいてＰＤ−１及びＬＡＧ−３を指向する様々なアンタゴニスト抗体と併用されて検証された。併用は、ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）及びＭＶＡ−ＢＮ  ＣＶ３０１の効果を増強させることが判明した。
【００３６】
腫瘍抗原を含有するポリペプチドをコードするポックスウイルス
本発明の１つの実施形態において、少なくとも１つの腫瘍抗原または腫瘍関連抗原を含有するポリぺプチドをコードする及び／または発現する組み換えポックスウイルスをヒト癌患者に投与すること、及び少なくとも１つのＴＩＭ−３アンタゴニストを当該患者に投与すること、を含む方法がある。
【００３７】
１つの実施形態において、腫瘍抗原を発現する組み換えポックスウイルスは、好ましくはたとえば限定されないが、ワクシニアウイルス、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、またはＭＶＡ−ＢＮ等のオルソポックスウイルスである。
【００３８】
ワクシニアウイルス株の例は、天壇（Ｔｅｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｈｅａｖｅｎ）株、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株、パリ（Ｐａｒｉｓ）株、ブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）株、大連（Ｄａｉｒｅｎ）株、ガム（Ｇａｍ）株、ＭＲＩＶＰ株、パー（Ｐｅｒ）株、タシケント（Ｔａｓｈｋｅｎｔ）株、ＴＢＫ株、トム（Ｔｏｍ）株、ベルン（Ｂｅｒｎ）株、パトワダンガル（Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ）株、ＢＩＥＭ株、Ｂ−１５株、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株、ＥＭ−６３株、ニューヨーク市公衆衛生局（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）株、エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）株、池田（Ｉｋｅｄａ）株及びＷＲ株である。好ましいワクシニアウイルス（ＶＶ）株は、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ＤＲＹＶＡＸ）株（米国特許第７，４１０，６４４号）である。他の好ましいＶＶ株は、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら、［１９９４］，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０）である。他の好ましいＶＶ株はＭＶＡ−ＢＮである。
【００３９】
本発明の実施に有用で、ブダペスト条約の要件に準拠し寄託されているＭＶＡウイルス株の例は、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、ワクチン研究製造研究室（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、市民健康管理サービス（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）、応用微生物学研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ、英国）に、１９９４年１月２７日にＥＣＡＣＣ９４０１２７０７の寄託番号で寄託されたＭＶＡ  ５７２、及び２０００年１２月７日、ＥＣＡＣＣ００１２０７０７の寄託番号で寄託されたＭＶＡ  ５７５である。欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に２０００年８月３０日、Ｖ０００８３００８の寄託番号で寄託されたＭＶＡ−ＢＮ、及びその派生物は、追加の例示的な株である。
【００４０】
その高度な安全性（複製能力が低い）ゆえにＭＶＡ−ＢＮは好ましいが、すべてのＭＶＡ類が本発明に適している。本発明の実施形態によると、ＭＶＡ株は、ＭＶＡ−ＢＮ及びその派生物である。ＭＶＡ−ＢＮ及びその派生物の定義は、本明細書に参照により援用されるＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８に示されている。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、癌治療のための組み換えオルソポックスウイルス、好ましくはワクシニアウイルス（ＶＶ）、ワイス株ＶＶ、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮウイルスの使用を包含する。組み換えオルソポックスウイルスは、オルソポックスウイルスへ異種配列を挿入することにより作製されることができる。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、組み換えアビポックスウイルス、好ましくは鶏痘ウイルスの使用を包含する。組み換えアビポックスウイルスは、アビポックスウイルスへの異種配列の挿入により作製されることができる。
【００４３】
ある実施形態において、オルソポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する。好ましい実施形態において、ＴＡＡとしては、限定されないが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、ｔｙｒｐ１、ｔｙｒｐ２、またはブラキウリ抗原が挙げられる。
【００４４】
さらなる実施形態において、腫瘍関連抗原は、１つ以上の外来性ＴＨエピトープを含有するように改変されている。かかる癌免疫療法剤は、本明細書において、非限定的な例において記述されており、「ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２」と呼称されている。本明細書において、限定されないが、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２をはじめとするかかる癌免疫療法剤は、癌の治療に有用である。本発明は、免疫不全状態の患者をはじめとするヒト及び他の哺乳類のプライム／ブーストワクチネーションレジメンにおけるかかる剤の使用を考慮するものであり、たとえば従前にはＴｈ２状態であった中でＴｈ１免疫応答を誘導する等の、液性免疫反応及び細胞性免疫反応の両方を誘導するものである。
【００４５】
ある実施形態において、ＭＶＡは、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に２０００年８月３０日、Ｖ０００８３００８の寄託番号で寄託され、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ２００２０４２４８０（また、たとえば米国特許第６，７６１，８９３号及び第６，９１３，７５２号を参照のこと）に記載されているＭＶＡ−ＢＮである。それら特許出願公開に記述されているように、ＭＶＡ−ＢＮは、２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａ及びＨａＣａｔ細胞株において繁殖的複製を行わない。特に、ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト胎児性腎細胞株２９３において、０．０５〜０．２の増幅率を示す。ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂにおいて、ＭＶＡ−ＢＮは、０．０〜０．６の増幅率を示す。ＭＶＡ−ＢＮは、ヒト子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて、０．０４〜０．８の増幅率、ヒト角化細胞株ＨａＣａｔにおいて、０．０２〜０．８の増幅率を示す。このＭＶＡ−ＢＮは、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＶ１：ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７０）において０．０１〜０．０６の増幅率を有する。
【００４６】
ＭＶＡ−ＢＮの増幅率は、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００２０４２４８０（また、たとえば米国特許第６，７６１，８９３号及び第６，９１３，７５２号を参照のこと）に記載されているとおり、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ：初代培養）において１を超えている。このウイルスはＣＥＦ初代培養中で容易に繁殖、及び増幅し、比率は５００を超える。
【００４７】
ある実施形態において、組み換えＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮの派生物である。かかる「派生物」としては、寄託株（ＥＣＡＣＣ番号Ｖ０００８３００８）と原則的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの１つ以上の部分で差異を示すウイルスが挙げられる。寄託されたウイルスと同じ「複製特性」を有するウイルスは、ＣＥＦ細胞ならびに細胞株ＨｅＬａ、ＨａＣａｔ、及び１４３Ｂにおいて寄託株と類似した増幅比率で複製するウイルスであり、たとえばＡＧＲ１２９トランスジェニックマウスモデル等において測定される、ｉｎ  ｖｉｖｏで類似した複製特性を示すウイルスである。
【００４８】
ある実施形態において、ポックスウイルスは、当該ポックスウイルスに対して異種である追加のヌクレオチド配列を含有する組み換えワクシニアウイルスである。そのようなある実施形態において、当該異種配列は、免疫系による反応を誘導するエピトープをコードする。ゆえに、ある実施形態において、組み換えポックスウイルスは、当該エピトープを含有するタンパク質または剤に対するワクチネーションを行うために用いられる。好ましい実施形態において、当該エピトープは、腫瘍関連抗原、好ましくはＨＥＲ−２である。１つの実施形態において、ＨＥＲ−２抗原は配列番号２の配列を含有する。
【００４９】
他の好ましい実施形態において、エピトープは、たとえば、限定されないが、たとえばＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、ｔｙｒｐ１、ｔｙｒｐ２、またはブラキウリ等の抗原から選択される腫瘍関連抗原である。
【００５０】
ある実施形態において、本明細書に記載される腫瘍関連抗原をコードする異種核酸配列は、ウイルスゲノムの非必須領域に挿入される。それらのうちのある実施形態において、異種核酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に記載されるＭＶＡゲノムの自然発生欠失部位に挿入される。ポックスウイルスゲノムへの異種配列の挿入方法は、当分野の当業者に公知である。
【００５１】
他の実施形態において、腫瘍抗原を発現する組み換えポックスウイルスは、好ましくはたとえば限定されないが鶏痘ウイルス等のアビポックスウイルスである。
【００５２】
他の実施形態において、腫瘍抗原を発現する組み換えポックスウイルスは、腫瘍抗原を発現するワクシニアウイルスと、腫瘍抗原を発現するたとえば鶏痘等のアビポックスウイルスの組み合わせである。
【００５３】
「アビポックスウイルス」という用語は、たとえば鶏痘ウイルス（Ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）、カナリア痘ウイルス（Ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）、アンコポックスウイルス（Ｕｎｃｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、マイナ痘ウイルス（Ｍｙｎａｈｐｏｘｖｉｒｕｓ）、鳩痘ウイルス（Ｐｉｇｅｏｎｐｏｘｖｉｒｕｓ）、オウム痘ウイルス（Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ウズラ痘ウイルス（Ｑｕａｉｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）、クジャク痘ウイルス（Ｐｅａｃｏｃｋｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ペンギン痘ウイルス（Ｐｅｎｇｕｉｎｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スズメ痘ウイルス（Ｓｐａｒｒｏｗｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ムクドリ痘ウイルス（Ｓｔａｒｌｉｎｇｐｏｘｖｉｒｕｓ）及び七面鳥痘ウイルス（Ｔｕｒｋｅｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）など、任意のアビポックスウイルスを指す。好ましいアビポックスウイルスは、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスである。
【００５４】
カナリア痘ウイルスの一例は、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株である。ＡＬＶＡＣと名付けられたプラーク精製カナリア痘株（米国特許第５，７６６，５９８号）は、ブダペスト条約に従い、アメリカン・タイプ・培養コレクション（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、アクセッション番号ＶＲ−２５４７で寄託された。他のカナリア痘株は、ＬＦ２  ＣＥＰ  ５２４  ２４  １０  ７５で指定される市販のカナリア痘ワクチン株であり、これはＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００５５】
鶏痘ウイルスの例は、ＦＰ−１株、ＦＰ−５株、ＴＲＯＶＡＣ株（米国特許第５，７６６，５９８号）及びＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（米国特許第７，４１０，６４４号）である。ＦＰ−１は、１日齢のニワトリにワクチンとして使用するために改変されたＤｕｖｅｔｔｅ株である。当該株は、Ｏ  ＤＣＥＰ  ２５／ＣＥＰ６７／２３０９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８０と指定される市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，  Ｉｎｃ．から入手することができる。ＦＰ−５は、ニワトリ胚に起源を持つ市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、ウィスコンシン州マディソンのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（シェリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）の一部門）、米国獣医ライセンスＮｏ．１６５、シリアル番号３０３２１から入手することができる。
【００５６】
ワクシニアウイルスの例は、天壇株、コペンハーゲン株、パリ株、ブダペスト株、大連株、ガム株、ＭＲＩＶＰ株、パー株、タシケント株、ＴＢＫ株、トム株、ベルン株、パトワダンガル株、ＢＩＥＭ株、Ｂ−１５株、リスター株、ＥＭ−６３株、ニューヨーク市公衆衛生局株、エルストリー株、池田株及びＷＲ株である。好ましいワクシニアウイルス（ＶＶ）株は、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）（ＤＲＹＶＡＸ）株（米国特許第７，４１０，６４４号）である。他の好ましいＶＶ株は、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｇ．ら、［１９９４］，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０）である。他の好ましいＶＶ株はＭＶＡ−ＢＮである。
【００５７】
ある実施形態において、アビポックスウイルスは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する。好ましい実施形態において、当該ＴＡＡとしては、限定されないが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、ｔｙｒｐ１、ｔｙｒｐ２、またはブラキウリ抗原が挙げられる。
【００５８】
他の実施形態において、腫瘍抗原を発現する組み換えポックスウイルスは、腫瘍抗原を発現するワクシニアウイルスと腫瘍抗原を発現するたとえば鶏痘等のアビポックスウイルスの組み合わせである。ワクシニアウイルスと鶏痘ウイルスの組み合わせは、異種プライムブーストレジメンとして投与され得ることが予期される。１つの非限定的な例において、当該異種プライムブーストレジメンは、ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）またはＣＶ３０１である。
【００５９】
ワクチンの調製に関しては、ポックスウイルスは、生理学的に受容可能な形態へと転換されうる。ある実施形態において、かかる調製は、たとえばＳｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら、Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２（１９７４）に記載される天然痘に対するワクチネーションに用いられるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づいたものである。
【００６０】
調製例は以下である。精製されたウイルスを、５ｘ１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に処方し、−８０℃に保存する。ワクチン接種の調製に関しては、たとえば１０２〜１０８のウイルス粒子を２％ペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下で、アンプル、好ましくはガラスアンプル中にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に凍結乾燥させてもよい。あるいは、ワクチン接種は、段階的に、製剤中のウイルスの凍結乾燥により調製されてもよい。ある実施形態において、製剤は、たとえばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン等の追加の添加剤、またはたとえば限定されないがｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適した抗酸化剤若しくは不活性ガス、安定剤若しくは組み換えタンパク質（たとえばヒト血清アルブミン）をはじめとする他の添加剤を含有する。次いでアンプルを密封し、たとえば４℃〜室温等の適した温度で、数か月保存してもよい。しかし、必要がない限り、当該アンプルは、好ましくは−２０℃未満の温度で保存される。
【００６１】
ワクチネーションまたは治療を含む様々な実施形態において、凍結乾燥物は、０．１〜０．５ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液に溶解され、全身または局所のいずれか、すなわち非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、または当業者に公知の任意の他の投与経路により投与される。投与様式、投与量、投与回数の最適化は、当分野の当業者の技術及び知識の範囲内にある。
【００６２】
ある実施形態において、弱毒化ワクシニアウイルス株は、ＳＩＶ感染サル（ＣＤ４＜４００／μｌ血液）等の免疫不全状態の動物、または免疫不全状態のヒトにおける免疫反応の誘導に有用である。「免疫不全状態」という用語は、不完全な免疫反応のみを示す、または感染性因子に対する防御の効果が低下した個体の免疫系の状態を表す。
腫瘍関連抗原のある例
ある実施形態において、細胞関連ポリペプチド抗原に対し、対象において免疫反応が誘導される。そのようなある実施形態において、細胞関連ポリペプチド抗原は、腫瘍関連抗原である。
【００６３】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または改変ペプチド結合により互いに結合された２以上のアミノ酸のポリマーを指す。当該アミノ酸は天然型、ならびに非天然型であってもよく、または天然型アミノ酸の化学アナログであってもよい。また、当該用語はタンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含有する機能性生体分子、少なくとも２つのポリペプチドを含有する場合には複合体を形成し得、共有結合され得、または非共有結合され得る生体分子を指す。タンパク質中のポリペプチド（複数含む）は、グリコシル化されていてもよく、及び／または脂質化されていてもよく、及び／または補欠分子族を含有してもよい。
【００６４】
好ましくは、腫瘍関連抗原は、限定されないが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリの単独、または組合せを含有する。かかる組合せの例としては、ＣＶ３０１としても知られるＣＥＡとＭＵＣ−１が挙げられ得る。他の組み合わせの例としては、ＰＡＰとＰＳＡが挙げられ得る。
【００６５】
多くの腫瘍関連抗原が当分野に公知である。腫瘍関連抗原の例としては、限定されないが、５アルファ還元酵素、アルファ−フェトプロテイン、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、ベータ−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン類、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３  ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｏｘ−２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−ファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−ファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、メソテリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ類、ムチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｎｔｉｎ）、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸ−ファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、サイモシン−ベータ−１５、ＴＮＦ−アルファ、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが挙げられる。
【００６６】
好ましいＰＳＡ抗原は、１５５位でイソロイシンからロイシンへのアミノ酸変異を含有する。参照により本明細書に援用される米国特許第７，２４７，６１５号。
【００６７】
腫瘍関連抗原の１つの例は、ＨＥＲ−２である。ＨＥＲ−２は、これまでのところｃ−ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦｒ）、ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２、ｃ−Ｎｅｕ）、ｃ−ｅｒｂＢ−３、及びｃ−ｅｒｂＢ−４の４つの異なる受容体からなる上皮細胞増殖因子受容体ファミリー（ｃ−ｅｒｂＢ）の１種である（Ｓａｌｏｍｏｎら、１９９５）。ｃ−ｅｒｂＢ−３及びｃ−ｅｒｂＢ−４は、ＥＧＦｒ及びＨＥＲ−２と比較しあまり特徴解析がなされていない。ＨＥＲ−２は内在性膜糖蛋白質である。成熟蛋白質は１８５ｋＤの分子量を有し、ＥＧＦｒ受容体に酷似した構造特性を持つ（Ｐｒｉｇｅｎｔら、１９９２）。ＥＧＦｒはまた、１つのサブユニットからなる内在性膜受容体である。ＥＧＦｒは１７０ｋＤの見かけ分子量を有し、６２１アミノ酸の表面リガンド結合ドメイン、２３アミノ酸の単一疎水性膜貫通ドメイン、及び５４２アミノ酸の高度に保存された細胞質チロシンキナーゼドメインからなる。当該タンパク質はＮ−グリコシル化されている（Ｐｒｉｇｅｎｔら、１９９４）。
【００６８】
このファミリーに属するすべてのタンパク質はチロシンキナーゼである。リガンドとの相互作用により、受容体の二量体化が誘導され、それによりチロシンキナーゼの触媒活性が上昇する（Ｂｅｒｎａｒｄ．１９９５、Ｃｈａｎｔｒｙ  １９９５）。当該ファミリー内のタンパク質は、同種二量体化、及び異種二量体化することができ、これはその活性にとって重要である。ＥＧＦｒは増殖促進効果を伝達し、細胞によるグルコースとアミノ酸の取り込みを刺激する（Ｐｒｉｇｅｎｔら、１９９２）。ＨＥＲ−２もまた増殖促進シグナルを伝達する。
【００６９】
上皮細胞増殖因子受容体は、正常組織上には少量発現されているが、多くの癌型では過剰発現されている。ＥＧＦｒは、乳癌（Ｅａｒｐら、１９９３，Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ  １９９４）、グリオーマ（Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、１９９４）、胃癌（Ｔｋｕｎａｇａら、１９９５）、皮膚扁平上皮癌、（Ｆｕｊｉｉ  １９９５）、卵巣癌（ｖａｎ  Ｄａｍら、１９９４）等において過剰発現されている。ＨＥＲ−２はまた、わずかな正常ヒト組織上に低量で発現されているが、ほとんどが分泌上皮上で特徴的に発現されている。ＨＥＲ−２の過剰発現は、乳癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、及び卵巣癌の約３０％において発生する。
【００７０】
これら受容体の発現は、腫瘍の分化度、及び癌型によって変化し、たとえば乳癌では原発腫瘍が両受容体を過剰発現する一方で、胃癌においては、過剰発現は転移腫瘍の後期に発生する（Ｓａｌｏｍｏｎら、１９９５）。癌性細胞上の過剰発現受容体の数は、患者から単離された数種の頭頸部癌、外陰部癌、乳癌及び卵巣癌の株に関しては、１０６／細胞超である（Ｄｅａｎら、１９９４）。
【００７１】
受容体のＥＧＦｒファミリーがなぜ腫瘍免疫療法に適した標的の構成要素となるか、いくつかの理由がある。第一に、ＥＧＦｒファミリーは多くの癌型で過剰発現されており、免疫反応を腫瘍へと指向させるはずである。第二に、腫瘍は大抵この受容体ファミリーに対するリガンドを発現または過剰発現しており、一部の腫瘍は当該リガンドに介在される増殖促進効果に対し過感受性である。第三に、増殖因子受容体を過剰発現している腫瘍を有する患者は多くの場合、予後不良である。過剰発現は、特に乳癌、肺癌、及び膀胱癌において予後不良と密接に関係しており、従来的な療法に対しやや無反応性である浸潤性／転移性の表現型と関連し得る（Ｅｃｃｌｅｓら、１９９４）。
【００７２】
改変腫瘍関連抗原
ある実施形態において、細胞関連ポリペプチド抗原は、ＡＰＣの表面上にＭＨＣクラスＩ分子とともに提示されたとき、その細胞表面上のポリペプチド抗原を由来とするエピトープを提示している細胞に対するＣＴＬ応答が誘導されるよう、改変されている。そのようなある実施形態において、少なくとも１つの第一の外来性ＴＨエピトープは、提示されたとき、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子と関連付けられる。そのようなある実施形態において、細胞関連抗原は、腫瘍関連抗原である。
【００７３】
エピトープを提示することができるＡＰＣの例としては、樹状細胞及びマクロファージが挙げられる。ＡＰＣのさらなる例としては、１）ＭＨＣクラスＩ分子に結合されたＣＴＬエピトープ、及び２）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されたＴＨエピトープ、を同時に提示することができる任意の飲作用ＡＰＣ（ｐｉｎｏｃｙｔｉｚｉｎｇ  ＡＰＣ）または食作用ＡＰＣ（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｚｉｎｇ  ＡＰＣ）が挙げられる。
【００７４】
ある実施形態において、たとえばＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、ｔｙｒｐ１、ｔｙｒｐ２、またはブラキウリ等の本明細書に提示される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の１つ以上に対する改変は、対象に投与された後、本明細書に記載されるＴＡＡの１つ以上と主に反応するポリクローナル抗体が惹起されるように作製される。かかる抗体は、腫瘍細胞を攻撃及び排除してもよく、ならびに転移性細胞の転移を妨害してもよい。この抗腫瘍効果のエフェクター機構は、補体及び抗体依存性細胞障害活性により調節される。さらに、誘導された抗体は、受容体の増殖因子依存性オリゴ−二量体化及び内在化の阻害を介して癌性細胞の増殖を阻害してもよい。ある実施形態において、かかる改変ＴＡＡポリペプチド抗原は、腫瘍細胞により提示される公知及び／または予測ＴＡＡエピトープを指向するＣＴＬ反応を誘導してもよい。
【００７５】
ある実施形態において、改変ＴＡＡポリペプチド抗原は、細胞関連ポリペプチド抗原のＣＴＬエピトープ及び変異を含有し、当該変異は、外来性ＴＨエピトープのＣＴＬエピトープを少なくとも１つ含有する。そのようなある改変ＴＡＡは、１つの非限定的な例において、少なくとも１つのＣＴＬエピトープ、及び外来性ＴＨエピトープの少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含有する変異を含有する１つ以上のＨＥＲ−２ポリペプチド抗原を含有してもよく、当該改変ＴＡＡの製造方法は、米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び第２００６／０００８４６５号に記載されている。
【００７６】
ある実施形態において、外来性ＴＨエピトープは、天然型の「プロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」なＴ細胞エピトープである。かかるプロミスカスなＴ細胞エピトープは、動物種または動物群の個体の大部分において活性である。ある実施形態において、ワクチンはかかるプロミスカスなＴ細胞エピトープを含有する。そのようなある実施形態において、プロミスカスなＴ細胞エピトープの使用により、同一ワクチン内で非常に多くの数の異なるＣＴＬエピトープを必要としなくなる。例示的なプロミスカスなＴ細胞エピトープとしては、限定されないが、Ｐ２及びＰ３０エピトープを含む破傷風毒素（Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、１９８９）、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、及びＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＣＳ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
さらなるプロミスカスなＴ細胞エピトープとしては、異なるＨＬＡ−ＤＲにコードされるＨＬＡ−ＤＲ分子の大部分に結合することができるペプチドが挙げられる。たとえば、ＷＯ９８／２３６３５（Ｆｒａｚｅｒ  ＩＨら、出願人はクイーンズランド大学）；  Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ  Ｓら、１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３  ３３７３；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  Ｆら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ３３６：７７８  ７８０；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧら、１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：４  １７８  ２２８；Ｃｈｉｃｚ  ＲＭら、１９９３，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １７８：２７  ４７；Ｈａｍｍｅｒ  Ｊら、１９９３，Ｃｅｌｌ  ７４：１９７  ２０３；及びＦａｌｋ  Ｋら、１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：２３０  ２４２を参照のこと。後半の参照文献はまた、ＨＬＡ−ＤＱ及び−ＤＰリガンドに関しても論じている。これら参照文献中に列記されたすべてのエピトープは、本明細書に記載される候補天然型エピトープとして関連性があり、これらと共通モチーフを共有するエピトープである。
【００７８】
他のある実施形態において、プロミスカスなＴ細胞エピトープは、大部分のハプロタイプに結合することができる人工Ｔ細胞エピトープである。そのようなある実施形態において、人工Ｔ細胞エピトープは、ＷＯ９５／０７７０７及びこれに対応する論文のＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊら、１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１  ７６１に記載されるような汎ＤＲエピトープペプチド（ＰＡＤＲＥ）である。
【００７９】
ｍＨＥＲ２
様々な改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原、及び当該抗原を作製する方法が、参照により本明細書に援用される米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び第２００６／０００８４６５号に記載されている。これら書面は、ＨＥＲ−２ポリペプチドの異なる位置でプロミスカスなＴ細胞エピトープを含有する改変ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原を記載している。
【００８０】
ヒトＨＥＲ−２配列は、当該タンパク質の一次構造のみに基づき、多くのドメインへと分割することができる。それらドメインは以下である。細胞外（受容体）ドメインは、アミノ酸１〜６５４にわたり、以下の数種のサブドメインを含有する。ドメインＩ（成熟型ポリペプチドのＮ末端ドメイン）はアミノ酸１〜１７３にわたる。ドメインＩＩ（システインリッチドメイン、２４個のシステイン残基）は、アミノ酸１７４〜３２３にわたる。ドメインＩＩＩ（同種ＥＧＦ受容体中のリガンド結合ドメイン）は、アミノ酸３２４〜４８３にわたる。及びドメインＩＶ（システインリッチドメイン、２０個のシステイン残基）は、アミノ酸４８４〜６２３にわたる。膜貫通残基は、アミノ酸６５４〜６７５にわたる。細胞内（キナーゼ）ドメインは、アミノ酸６５５〜１２３５にわたり、アミノ酸６５５〜１０１０にわたるチロシンキナーゼドメイン（コアＴＫドメインは７２５〜９９２にわたる）及びアミノ酸１０１１〜１２３５にわたるＣ末端ドメインを含有する。
【００８１】
Ｐ２またはＰ３０のヒトＴヘルパーエピトープのいずれかにより提示されるＨＥＲ−２のアミノ酸配列中の部位選択は、米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び第２００６／０００８４６５号に記載されている。要約すると、以下のパラメーターが考慮された。
１．公知ＣＴＬエピトープ及び予測ＣＴＬエピトープ
２．関連受容体（特にＥＧＦＲ）に対する相同性
３．システイン残基の保存
４．予測ループ構造、α−ヘリックス構造、及びβ−シート構造
５．可能性のあるＮ−グリコシル化部位
６．露出される、及び隠されるアミノ酸残基の予測
７．ドメイン構成
【００８２】
ＣＴＬエピトープは、ドメインＩ、ドメインＩＩＩ、ＴＭドメイン、及びＴＫドメイン中の２つまたは３つの「ホットスポット」に密集していると思われる。米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び第２００６／０００８４６５号に記載されているように、これらは広く保存されているはずである。
【００８３】
他の受容体との相同性が高い領域は、ＨＥＲ−２の「全体的な」三次構造、従って抗体認識にとって構造的に重要である可能性があり、一方で相同性が低い領域はおそらく結果として構造の局所的変化のみと交換され得る。
【００８４】
システイン残基は多くの場合、分子内ジスルフィド結合の形成に関与し、それ故に三次元構造に関与し、変化してはならない。アルファ−ヘリックス構造またはベータ−シート構造を形成すると予測される領域は、外来性エピトープの挿入点としては忌避されるはずであり、これらの領域はタンパク質のフォールディングに関与すると考えられる。
【００８５】
タンパク質のマンノシル化が望ましい場合には、Ｎ−グリコシル化の可能性がある部位は保存されているはずである。
【００８６】
分子の内部にあると（その疎水特性により）予測される領域は、フォールディングに関与している可能性があり、なるべく保存されているはずである。対照的に、溶媒に露出される領域は、モデルＴＨエピトープＰ２及びＰ３０の挿入の候補位置となり得る。
【００８７】
最後に、タンパク質の構造及び機能に対する関与を理由として、タンパク質のドメイン構造を考慮に入れなければならない。
【００８８】
米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び第２００６／０００８４６５号に記載されているように、ＨＥＲ−２の細胞外部分の構造は中和抗体の標的として関連性があるタンパク質の部位であり、戦略の焦点は、可能な限りこれを保存することにある。対照的に、癌細胞表面上の生体膜結合ＨＥＲ−２の細胞内部分には、液性免疫系はアクセスできない。
【００８９】
ＨＥＲ−２の様々なドメインに挿入された破傷風毒素のＰ２及びＰ３０エピトープを用いた様々な構築物例が、米国特許第７，００５，４９８号ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４１９５８号及び第２００６／０００８４６５号に記載されている。「ｍＨＥＲ２」と呼称される変異ＨＥＲ−２ポリペプチド抗原の１つの例は、細胞外ドメイン、及び膜貫通ドメインの９アミノ酸、変異ＨＥＲ−２ポリペプチドのアミノ酸２７３〜２８７の間のドメインＩＩに挿入されたＰ２エピトープ、ならびに変異ＨＥＲ−２ポリペプチドのアミノ酸６５５〜６７５の間のドメインＩＶに挿入されたＰ３０エピトープを含有する。
【００９０】
組み換えＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２
非限定的な実施形態において、たとえばＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２等の腫瘍関連抗原を含有する組み換えＭＶＡが以下のように構築される。最初のウイルスストックは、たとえばＣＥＦ細胞等の複製許容性の細胞型を用いた細胞培養において組み換えにより作製される。細胞は両方とも、たとえばＭＶＡ−ＢＮ等の弱毒化ワクシニアウイルスを接種され、たとえばＨＥＲ２等の腫瘍関連抗原の配列及びウイルスゲノムの隣接領域をコードする組み換えプラスミド（たとえばｐＢＮ１４６）を用いてトランスフェクトする。１つの非限定的な実施形態において、プラスミドｐＢＮ１４６は、ＭＶＡ−ＢＮにおいても存在する配列を含有する（１４Ｌ及び１５Ｌオープンリーディングフレーム）。ＨＥＲ２配列はＭＶＡ−ＢＮ配列の間に挿入され、それによりＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムへの組み換えが行われる。ある実施形態において、このプラスミドはまた、１つ以上の選択遺伝子を含有する選択カセットを含み、それによりＣＥＦ細胞中での組み換え構築物の選択が可能となる。好ましい実施形態において、組み換えＭＶＡは配列番号２を含有するポリペプチドをコードする。
【００９１】
培養物の同時感染及びトランスフェクションにより、ウイルスゲノムと組み換えプラスミドの間に相同組み換えが発生する。次いで挿入物を担持するウイルスを単離し、特徴解析を行い、ウイルスのストックを調製する。ある実施形態において、ウイルスは選択の非存在下でＣＥＦ細胞培養中にて継代され、それにより選択遺伝子のｇｐｔ及びＥＧＦＰをコードする領域が失われる。
【００９２】
ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニスト
少なくとも１つの態様において、本発明は、Ｔ細胞イムノグロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３：Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ３）、プログラム化細胞死タンパク質１（ＰＤ−１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、プログラム化死−リガンド１（ＰＤＬ−１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−Ｌｉｇａｎｄ  １）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３：Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３）及び細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ４）のアンタゴニストを含有する。ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、またはＣＴＬＡ−４のアンタゴニストは、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、またはＣＴＬＡ−４の機能をそれぞれ阻害する。
【００９３】
かかるＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニストとしては、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、それぞれ、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４の生物活性ならびに／若しくは機能を阻害する、ならびに／または妨害する抗体が挙げられる。
【００９４】
ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４の他のアンタゴニストとしては、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４の発現を阻害するアンチセンス核酸ＲＮＡ、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４の発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ、ならびにＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４の小分子阻害剤が挙げられる。
【００９５】
ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニスト候補は、当分野に公知の様々な技法により、及び／または本出願内に記載される様々な技法により、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはマウスモデルにおけるＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４機能の阻害能力等の機能に関してスクリーニングすることができる。
【００９６】
ＩＣＯＳのアゴニスト
本発明はさらにＩＣＯＳのアゴニストを包含するものである。ＩＣＯＳのアゴニストはＩＣＯＳを活性化する。１つの実施形態において、アゴニストはＩＣＯＳの天然リガンドであるＩＣＯＳ−Ｌである。当該アゴニストは、結合特性および活性化特性を保持した変異型ＩＣＯＳ−Ｌであってもよい。ＩＣＯＳ−Ｌの変異型は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＣＯＳ刺激における活性に関して、スクリーニングすることができる。
【００９７】
抗体
１つの実施形態において、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニスト、ならびにＩＣＯＳのアゴニストは、抗体である。抗体は、合成であってもよく、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、当分野に公知の技法により作製されてもよい。かかる抗体は（非特異的結合とは対照的に）当該抗体の抗原結合部位を介してＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳに特異的に結合する。ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳのポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質等は、それらに対し免疫反応性の抗体の産生における免疫源として用いられてもよい。より具体的には、当該ポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質等は、抗体形成を惹起させる抗原決定基またはエピトープを含有する。
【００９８】
これら抗原決定基またはエピトープは、直線または立体構造（不連続性）のいずれであってもよい。直線状のエピトープはポリペプチドのアミノ酸の１つの部分から構成される一方で、立体的な、または不連続性のエピトープはタンパク質のフォールディングで近接されるポリペプチド鎖の異なる領域のアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，  Ｊｒ．  ａｎｄ  Ｐ．  Ｔｒａｖｅｒｓ，  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：９  （Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、第二版、１９９６））。フォールディングされたタンパク質は複雑な表面を有しているため、利用可能なエピトープの数は非常に多い。しかしタンパク質の立体構造及び立体障害を理由として、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数よりも少ない（Ｃ．  Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、第二版、１９９６））。エピトープは、当分野に公知の任意の方法により特定することができる。
【００９９】
ｓｃＦＶ断片を含む、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳに特異的に結合する抗体は、その機能の阻害（アンタゴニスト抗体）、またはその機能の増強若しくは活性化（アゴニスト抗体）のいずれかを行い、本発明に包含される。かかる抗体は、標準的な手段により作製することができる。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明は、免疫チェックポイント分子の機能のそれぞれを阻害または活性化する、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を包含する（抗体）。ＰＤ−１に対する阻害モノクローナル抗体の例は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１１／０４１６１３に記載されている。
【０１０１】
抗体は、高い親和性及び特異性の両方をもって、それらの標的に結合することができる。抗体は比較的大きい分子（約１５０ｋＤａ）であり、抗体の結合部位がタンパク質−タンパク質相互作用部位の近傍内にあるとき、２つのタンパク質（たとえばＰＤ−１とその標的リガンド）の間の相互作用を立体的に阻害しうる。本発明はさらにＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、またはＩＣＯＳのリガンド結合部位にごく隣接したエピトープに結合する抗体を包含するものである。
【０１０２】
様々な実施形態において、本発明は、分子間相互作用（たとえばタンパク質−タンパク質相互作用）を阻害する抗体、ならびに分子間相互作用をかく乱する（たとえば分子内の立体構造変化）抗体を包含するものである。抗体は、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４若しくはＩＣＯＳの生物活性を阻害する能力、またはＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４若しくはＩＣＯＳのリガンドへの結合を阻害する能力、または他の特性に関し、スクリーニングすることができる。
【０１０３】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方とも、標準的な技術により調製することができる。
【０１０４】
ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳ、ならびにＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳのアミノ酸配列に基づいたペプチドを用いて、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳに特異的に結合する抗体を調製することができる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、たとえばＦ（ａｂ’）２及びＦａｂ断片等のそれらの断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨまたはナノボディ）、二価抗体断片（ダイアボディ）、ならびに任意の組み換えで作製された結合パートナー及び合成で作製された結合パートナーを含むことが意図される。
【０１０５】
もし抗体がＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳポリペプチドに、約１０７Ｍ−１以上のＫａで結合する場合、抗体は特異的に結合するものであると定義される。結合パートナーまたは抗体のアフィニティは、たとえばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）に記載されるような標準的な技術を用いて容易に決定されうる。
【０１０６】
ポリクローナル抗体は、当分野公知の手順を用いて、たとえばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、またはラット等の様々な源から容易に作製され得る。一般的に、精製されたＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳ、または適切に結合されたＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳのアミノ酸配列に基づくペプチドが、通常は非経口注射により宿主動物に投与される。ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳの免疫原性は、たとえばフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバント等のアジュバントの使用により増強され得る。ブースター免疫化の後、血清の少量の試料を採取し、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳポリペプチドに対する反応性を検証する。かかる決断に有用な様々なアッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されるアッセイ、ならびにたとえば向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、放射免疫測定法、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、及びサンドイッチアッセイ等の手順が挙げられる。米国特許第４，３７６，１１０号及び第４，４８６，５３０号を参照のこと。
【０１０７】
モノクローナル抗体は、当分野公知の手順を用いて容易に作製されうる。たとえば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号、及び第４，４１１，９９３号、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，  ＭｃＫｅａｍ，  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０に記載される手順を参照のこと。
【０１０８】
たとえば、マウス等の宿主動物に、単離及び精製されたＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳ、または結合ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳペプチドを、任意選択でアジュバントの存在下、約３週間隔で少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、腹腔内注射してもよい。次いでマウス血清を従来的なドットブロット法または抗体捕捉法（ＡＢＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｐｔｕｒｅ）により分析し、どの動物が融合にもっとも適しているかを決定する。およそ２〜３週間後、マウスにＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳ、または結合ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳペプチドの静脈内ブーストを投与する。その後、マウスを殺処分し、確立されたプロトコールに従い脾臓細胞を、たとえばＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）等の市販のミエローマ細胞と融合させる。簡潔に記載すると、ミエローマ細胞を培地中で数回洗浄し、１個のミエローマ細胞に対し約３個の脾臓細胞の割合でマウスの脾臓細胞に融合させる。融合剤はたとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の当分野に用いられる任意の適切な剤であってもよい。融合細胞の選択的増殖が可能な培地を含有するプレート上に融合物を播種する。次いで融合細胞をおよそ８日間増殖させてもよい。得られたハイブリドーマ由来の上清を回収し、ヤギ抗マウスＩｇで初めにコートされていたプレートに添加する。洗浄を行った後、たとえば標識ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳポリペプチド等の標識を各ウェルに添加し、その後、インキュベーションを行う。引き続き、陽性ウェルを検出してもよい。陽性クローンをバルク培養で増殖させてもよく、及び引き続き上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上で精製する。
【０１０９】
本発明のモノクローナル抗体を、たとえば本明細書に参照により援用されるＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９（１９９０）に記載されるような代替法を用いて作製してもよい。同様に、結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むための組み換えＤＮＡ法を用いて構築されてもよい。かかる方法は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７：３９４  （１９８９）に記載されている。
【０１１０】
かかる抗体の抗原結合断片は、標準的な技法により作製されてもよく、また本発明に包含される。かかる断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。遺伝子操作法により作製される抗体断片及び誘導体もまた提供される。
【０１１１】
本発明のモノクローナル抗体は、たとえばマウスモノクローナル抗体のヒト化型等のキメラ抗体を含む。かかるヒト化抗体は、公知の技術により作製されることができ、ヒトに当該抗体が投与された際の免疫原性を低下させるという利点をもたらす。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（またはただのその抗原結合部位）、及びヒト抗体由来の定常領域を含有する。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位及びヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠落している）を含有してもよい。キメラ及びさらに操作されたモノクローナル抗体の作製方法としては、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８）、Ｌｉｕら、（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，１９８７），Ｌａｒｒｉｃｋら、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，１９８９）、及びＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９，  Ｍａｙ，  １９９３）に記載されている方法が挙げられる。抗体を遺伝子組み換え的に作製する手順は、ＧＢ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号及び第５，５４５，８０６号に見いだされる。
【０１１２】
標準的な組み換えＤＮＡ法により作製されることができる、ヒト部分と非ヒト部分を含有する、たとえばキメラ及びヒト化モノクローナル抗体等の遺伝子操作法により作製された抗体を用いてもよい。かかるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、たとえばＲｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願公開ＷＯ８７／０２６７１；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願０１８４１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｍ．，欧州特許出願０１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願０１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願０１２５０２３；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１  １０４３，  １９８８；Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ８４：３４３９  ３４４３，１９８７；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１  ３５２６，  １９８７；Ｓｕｎら、ＰＮＡＳ  ８４：２１４  ２１８，１９８７；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．４７：９９９  １００５，１９８７；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６  ４４９，１９８５；及びＳｈａｗら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３  １５５９，１９８８）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  １２０７，１９８５；  Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４，１９８６；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２  ５２５，１９８６；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４，１９８８；及びＢｅｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３  ４０６０，１９８８に記載される方法等、当分野に公知の標準的なＤＮＡ技術を用いて遺伝子操作されることにより作製されることができる。
【０１１３】
合成及び半合成抗体に関連し、かかる用語は、限定されないが、抗体断片、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（たとえばマウス−ヒト、ヒト−マウス）、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、及び全合成抗体様分子を含むことが意図される。
【０１１４】
治療応用に関し、ヒト定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が、多くの場合、当該抗体に対する患者の免疫応答を最小化するためには好ましい。かかる抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を含有するトランスジェニック動物を免疫化することにより作製されてもよい。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７６４：５２５−５３５（１９９５）を参照のこと。
【０１１５】
ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体もまた、たとえば対象のリンパ球由来のｍＲＮＡから調製されたイムノグロブリン軽鎖および重鎖のｃＤＮＡを用いたＦａｂファージディスプレイライブラリー、またはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー等のコンビナトリアルイムノグロブリンライブラリーを構築することにより作製されうる。たとえば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１  ５９７；及びＧｒｉｆｆｔｈｓら、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５  ７３４を参照のこと。さらに、抗体可変領域のコンビナトリアルライブラリーは、公知のヒト抗体を変異させることにより作製することができる。たとえば、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳに結合することが知られているヒト抗体の可変領域を、たとえばランダム変化突然変異誘導オリゴヌクレオチド（ｒａｎｄｏｍｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いて突然変異させ、変異可変領域のライブラリーを作製し、次いでそれらをＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳに対する結合についてスクリーニングしてもよい。イムノグロブリン重鎖及び／または軽鎖のＣＤＲ領域内にランダムに突然変異誘導する方法、ランダム化重鎖及び軽鎖を架橋させて対形成させる方法、ならびにスクリーニング方法は、たとえば、Ｂａｒｂａｓら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９６／０７７５４；Ｂａｒｂａｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４４５７  ４４６１に見出される。
【０１１６】
イムノグロブリンライブラリーを、好ましくは線状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）由来のディスプレイパッケージ群により発現させ、抗体ディスプレイライブラリーを作製してもよい。抗体ディスプレイライブラリー作製における使用に特に適した方法及び試薬の例は、たとえば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９１／１７２７１；  Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０  １３７２；Ｈａｙら、（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１  ８５；Ｈｕｓｅら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５  １２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓら、（１９９３）上述；Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９  ８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４  ６２８；Ｇｒａｍら、（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：３５７６  ３５８０；Ｇａｒｒａｄら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３  １３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３  ４１３７；及びＢａｒｂａｓら、（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８  ７９８２に見出される。ディスプレイパッケージ（たとえば線状ファージ）の表面上に提示された時点で、抗体ライブラリーをスクリーニングし、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳポリペプチドに結合する抗体を発現するパッケージを特定及び単離する。好ましい実施形態において、ライブラリーの一次スクリーニングは、固定ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳポリペプチドとのパンニングを含み、固定ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳポリペプチドに結合する抗体を発現するディスプレイパッケージを選択する。
【０１１７】
本明細書にすでに記載されているＴＩＭ−３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳのアンタゴニストならびにアゴニストに加え、本明細書に記載されるアンタゴニスト及びアゴニストは、当分野に公知のアンタゴニスト及びアゴニストを含みうることが予期される。たとえば、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（登録商標）及びトレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）がＣＴＬＡ−４抗体として知られている。さらに、ラムブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＡＭＰ−２２４、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、及びＭＫ−３４７５がＰＤ−１抗体として知られている。ＰＤＬ−１に対する公知の抗体のいくつかの例としては、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＭＥＤ１４７３６（ＡＺＮ社）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ社）が挙げられる。
【０１１８】
腫瘍抗原を発現するポックスウイルス、及び免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを用いた併用療法
少なくとも１つの態様において、本発明は、腫瘍抗原をコードする組み換えポックスウイルスと、１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストの組み合わせを用いた治療方法を包含するものである。
【０１１９】
少なくとも１つの態様において、本発明は、ＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスと、１以上のＴＩＭ−３の抗体またはアンタゴニストの組み合わせを用いた癌治療方法を包含するものである。
【０１２０】
他の態様において、本発明は、（ａ）ＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルス、（ｂ）１以上のＴＩＭ−３の抗体またはアンタゴニスト、及び（ｃ）１つ以上の他の免疫チェックポイント分子の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニスト、の組み合わせを用いた治療方法を包含するものである。好ましい実施形態において、当該他の免疫チェックポイント分子の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ若しくはそれらの組み合わせの抗体またはアンタゴニストから選択される。
【０１２１】
１つの実施形態において、腫瘍関連抗原ＨＥＲ−２を過剰発現している細胞により介在される癌（たとえば、乳癌）を有する患者は、ＨＥＲ−２抗原をコードする、たとえば、オルソポックスウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、ワイス、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮ）、またはアビポックスウイルス（たとえば鶏痘ウイルス、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ）等のポックスウイルスと、本発明による１つ以上の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの組み合わせにより治療されてもよい。好ましい実施形態において、ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮである。特に好ましい実施形態において、ＭＶＡは、配列番号２を含有するポリペプチドをコードする。
【０１２２】
１つの実施形態において、前立腺癌を有する患者は、ＰＳＡ及び／またはＰＡＰ抗原をコードする、たとえば、ワクシニアウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、ワイス、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮ）、及びアビポックスウイルス（たとえば鶏痘ウイルス、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ）等のオルソポックスウイルスと、本発明による１つ以上の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの組み合わせにより治療されてもよい。特に好ましい実施形態において、当該ワクシニアウイルスは、ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）の一部である。
【０１２３】
１つの実施形態において、ＴＡＡ  ＣＥＡ及び／またはＭＵＣ−１を過剰発現している細胞により介在される癌（たとえば、乳癌、大腸癌、肺癌、及び卵巣癌）を有する患者は、ＣＥＡ及び／またはＭＵＣ−１抗原をコードする、たとえば、ワクシニアウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、ワイス、ＡＣＡＭ１０００、ＡＣＡＭ２０００、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮ）、またはアビポックスウイルス（たとえば鶏痘ウイルス、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ）等のオルソポックスウイルスと、本発明による１つ以上の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの組み合わせにより治療されてもよい。
【０１２４】
組み換えポックスウイルスは、全身または局所のいずれか、すなわち非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻内投与、皮内投与、乱刺（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または当業者に公知の任意の他の投与経路により、投与されてもよい。好ましくは、投与は、乱刺により行われる。１つの実施形態において、１０５〜１０１０ＴＣＩＤ５０の組み換えポックスウイルスが患者に投与される。好ましくは、１０７〜１０１０ＴＣＩＤ５０の組み換えポックスウイルスが患者に投与される。より好ましくは、１０８〜１０１０ＴＣＩＤ５０の組み換えポックスウイルスが患者に投与される。最も好ましくは、１０８〜１０９ＴＣＩＤ５０の組み換えポックスウイルスが患者に投与される。
【０１２５】
好ましくは癌としては、限定されないが、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、または大腸癌が挙げられる。
【０１２６】
好ましい実施形態において、癌は、乳癌、前立腺癌、または大腸癌である。
【０１２７】
癌患者は、マウスまたはラットを含む任意の哺乳類であり得る。好ましくは、癌患者は霊長類、最も好ましくはヒトである。
【０１２８】
１つの実施形態において、本発明による１つ以上の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニスト、及びＴＡＡを含有するポリペプチドをコードするポックスウイルスは、同時に投与される。併用療法は、いずれか治療単独よりも優れている。
【０１２９】
好ましい実施形態において、組み換えポックスウイルスは、アゴニスト及び／またはアンタゴニスト投与の１、２、３、４、５、６、または７日以内の投与のためのものである。組み換えポックスウイルスは、アゴニスト及び／またはアンタゴニストの前後に投与されてもよい。
【０１３０】
患者に投与されるアゴニストまたはアンタゴニストの投与量は、典型的には０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与される投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重、最も好ましくは３ｍｇ／ｋｇ患者体重〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。一般的に、ヒト抗体及びヒト化抗体は、外来性ポリペプチドに対する免疫反応を理由として、多種由来の抗体よりもヒト体内においてより長い半減期を有する。したがって多くの場合、ヒト抗体はより少ない投与量、及びより低い投与頻度が可能である。
【０１３１】
有効的な治療に必要な活性成分の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及び投与される他の薬剤をはじめとする多くの異なる因子に依存する。したがって、治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するために用量設定されなければならない。典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる投与量が、ｉｎ  ｓｉｔｕ投与に有効な活性成分の量に関する有用なガイダンスを提供しうる。特定の疾患の治療に対する有効用量の動物実験により、ヒト投与量に関するさらなる予測値が提供される。たとえば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第七版（１９８５）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１８版（１９９０）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａにおいて様々な検討事項が記載されている。経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与、イオン導入投与等の投与方法がその中で検討されている。
【０１３２】
本発明組成物は、投与方法に応じて、様々な単位投与剤型で投与されることができる。たとえば経口投与に適した単位投与剤型としては、たとえば散剤、錠剤、丸薬、カプセル、及び糖衣錠等の固体投与剤型、ならびにたとえばエリキシル、シロップ、及び懸濁剤等の液体投与剤型が挙げられる。また活性成分は、滅菌液体投与剤型で非経口投与されてもよい。ゼラチンカプセルは、活性成分と、不活性成分としてたとえばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウム等の粉末化担体を含有する。所望される色、味、安定性、緩衝能力、分散、または他の公知の望ましい特性をもたらすために添加されうる不活性成分の追加例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク等である。同様の希釈剤を用いて、圧縮錠を作製してもよい。錠剤及びカプセルの両方とも、数時間にわたり薬剤を継続的に放出するための徐放製剤として作製されうる。圧縮錠は、任意の不快な味を覆うため、及び外気から錠剤を保護するために糖衣またはフィルムコートされていてもよく、または消化管内での選択的崩壊のために腸溶化されていてもよい。経口投与用の液体投与剤型は、患者の受容性を高めるための着色剤及び香味剤を含有してもよい。
【０１３３】
医薬製剤中の本発明組成物の濃度は、広範に変化し得、すなわち、約０．１重量％未満から、通常は約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上まで変化し得、選択された特定の投与方法に従い、主に液体量、粘性等により選択される。
【０１３４】
固形組成物に関しては、たとえば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等をはじめとする標準的な非毒性固形担体を用いてもよい。経口投与に関しては、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、通常、活性成分、つまり本発明の１つ以上の組成物の１０〜９５％、より好ましくは２５〜７５％の濃度で、たとえば上記に列記される担体等の任意の通常用いられる賦形剤を組み込むことにより形成される。
【０１３５】
エアロゾル投与に関しては、本発明組成物は、好ましくは、界面活性剤及び噴霧剤とともに微細に分離した形態で供給される。本発明組成物の好ましい割合は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。もちろん界面活性剤は非毒性でなければならず、好ましくは噴霧剤に可溶性である。かかる剤の代表例は、たとえばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびオレイン酸等の６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸と脂肪性多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルである。たとえば混合グリセリドまたは天然のグリセリドのような混合エステルを使用してもよい。界面活性剤は、本組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を構成してもよい。組成物の平衡は通常、噴霧剤である。所望される場合にはたとえば鼻内送達用のレシチン等のように担体が含まれてもよい。
【０１３６】
本発明構築物はさらに当分野公知の技術によりデポ型システム、カプセル化形態または移植で送達されてもよい。同様に、本構築物はポンプにより対象組織へと送達されてもよい。
【０１３７】
本製剤中の活性剤が当該製剤により不活化されず、及び当該製剤が生理学的に適合可能である限り、前述の製剤はいずれも本発明による処置及び治療に適切であり得る。
【０１３８】
ある実施形態において、本発明の組み換えポックスウイルスは、１つ以上の医薬組成物中に統合されうる。ＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルス及び１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストに加え、医薬組成物は１つ以上の薬学的に許容可能な、ならびに／または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び／若しくは安定剤を含有してもよい。かかる添加剤としては、限定されないが、たとえば水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、及びｐＨ緩衝物質が挙げられる。担体の例は、典型的にはたとえばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体等の巨大でゆっくりと代謝される分子である。
【０１３９】
同種／異種プライムブーストレジメンを用いた併用療法
上記に定義される組み換えポックスウイルスの単回投与で免疫反応を誘導することは可能である。本発明によるポックスウイルスを、同種プライムブーストレジメンの一部として用いてもよい。同種プライムブーストにおいて、最初のプライミングワクチネーションが与えられた後、１つ以上の次のブーストワクチネーションが与えられる。ブーストワクチネーションは、最初のワクチネーションにおいて用いられたものと同じ、または関連した組み換えポックスウイルスの投与により、最初のワクチネーションで生じた免疫反応をブーストするよう設定される。
【０１４０】
本発明に従う組み換えポックスウイルスはまた、異種プライムブーストレジメンにおいて用いられてもよく、異種プライムブーストレジメンでは、初回プライムワクチネーションの１つ以上が本明細書に定義されるポックスウイルスを用いて行われ、次のブーストワクチネーションの１つ以上はたとえば限定されないが他のウイルスワクチン、タンパク質ワクチンまたは核酸ワクチン等の異なるワクチンを用いて行われる。
【０１４１】
１つの例示的な実施形態において、同種プライムブーストレジメンが用いられてもよく、ここで、たとえば限定されないがＨＥＲ２等の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を１つ以上発現するＭＶＡ−ＢＮ等のポックスウイルスが最初の投与で１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用されて投与される。たとえば限定されないがＨＥＲ２等のＴＡＡを１つ以上発現するＭＶＡ−ＢＮと１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを併用した次の投与は、最初の投与でもたらされた免疫反応をブーストするために与えられてもよい。好ましくは、第二の及びその後のＭＶＡ−ＢＮ中の１つ以上のＴＡＡは、最初の投与のＴＡＡと同じ、または類似のＴＡＡである。
【０１４２】
他の例示的な実施形態において、異種プライムブーストが用いられてもよく、ここで、たとえば１つ以上のＴＡＡを発現するワクシニア等のポックスウイルスが最初の投与で１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用されて投与される。この最初の投与の後、たとえば１つ以上のＴＡＡを発現する鶏痘等の異なるポックスウイルスの１回以上の投与が行われる。好ましくは、鶏痘ウイルス中の１つ以上のＴＡＡは、最初の投与のワクシニア中に含まれたＴＡＡと同じ、または類似のＴＡＡである。異種プライムブーストレジメンのさらなる例示的な記載は、米国特許第６，１６５，４６０号、第７，５９８，２２５号、及び第７，２４７，６１５号に見出され、それらすべては本明細書に参照により援用される。
【０１４３】
１つの好ましい実施形態において、異種プライムブーストレジメン中の１つ以上のＴＡＡとしては、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び／または前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原が挙げられる。より好ましい実施形態において、ＰＳＡ抗原は、それら両方が本明細書に参照により援用される米国特許第７，２４７，６１５号及び第７，５９８，２２５号に見出されるＰＳＡ抗原を含有してもよい。１つの非限定的な例において、ＰＳＡを含有する異種プライムブーストはＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）である。
【０１４４】
さらに他の好ましい実施形態において、異種プライムブーストレジメン中の１つ以上のＴＡＡは、ｍｕｃｉｎ１，ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＭＵＣ１）抗原、及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）を含有する。より好ましい実施形態において、ＭＵＣ１及びＣＥＡ抗原は、それらすべてが本明細書に参照により援用される米国特許第７，１１８，７３８号、第７，７２３，０９６号及びＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２００５８に見出される抗原を含有してもよい。１つの非限定的な例において、ＭＵＣ−１抗原及びＣＥＡを含有する異種プライムブーストレジメンはＣＶ３０１である。
【０１４５】
さらに他の例示的な実施形態において、異種プライムブーストが用いられてもよく、ここでたとえば１つ以上のＴＡＡを発現するＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮ等のポックスウイルスは最初の投与で１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用されて投与される。この最初の投与が行われた後、たとえば１つ以上のＴＡＡを発現する鶏痘等の異なるポックスウイルスの１回以上の投与が行われる。好ましくは、鶏痘ウイルス中の１つ以上のＴＡＡは、最初の投与のＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮウイルス中に含まれていたＴＡＡと同じ、または類似のＴＡＡである。
【０１４６】
ある実施形態において、１つ以上のブーストワクチネーションは、最初のプライミングワクチネーションの投与後、数日、数週、または数か月を含む間隔で投与される。ある実施形態において、１つ以上のブーストワクチネーションは、最初のプライミングワクチネーションの投与後、数日、または１、２、３、４、５、６、７日以上の間隔で投与される。ある実施形態において、１つ以上のブーストワクチネーションは、最初のプライミングワクチネーションの投与後、１、２、３、４、５、６、７、８週以上の間隔で投与される。ある実施形態において、１つ以上のブーストワクチネーションは、最初のプライミングワクチネーションの投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月以上の間隔で投与される。ある実施形態において、１つ以上のブーストワクチネーションは、最初のプライミングワクチネーションの投与後、任意の間隔の組み合わせで投与される（たとえば１、２、３、４、５、６、７日以上、１、２、３、４、５、６、７、８週以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月以上）。
【０１４７】
１つの実施形態において、異種プライムブーストレジメンの１つ以上の次のブーストワクチネーションは、最初のプライムワクチネーションとは異なる属のポックスウイルスから選択される。１つの非限定的な例において、第一または最初のポックスウイルスワクチンがワクシニアを含む場合、第二の、及びその後のポックスウイルスワクチンは、たとえばワクシニアとは免疫原性的に異なるスイポックス（ｓｕｉｐｏｘ）、アビポックス（ａｖｉｐｏｘ）、カプリポックス（ｃａｐｒｉｐｏｘ）、またはオルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）等の異なる属のポックスウイルスから選択される。
異種プライムブーストにおいて、ブースト投与後の免疫チェックポイントアンタゴニスト／アゴニストの投与は、癌治療の有効性を高める。
【０１４８】
ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）は、ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ（ＰＳＡを発現するワクシニアウイルスとＴＲＩＣＯＭＴＭ）を用いた単回プライム投与の後、ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆ（ＰＳＡを発現する鶏痘ウイルスとＴＲＩＣＯＭＴＭ）の１つ以上の連続ブースト投与を含む異種プライムブーストレジメンを含有するものであり、本明細書に参照により援用されるＪ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０，  ２８：１０９９−１１０５に記載されている。
【０１４９】
図１０〜１２、及び実施例１３〜１５に示され、及び記載されるように、異種ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）投与レジメンは同じベクターを用いた同種投与と比較し、ＰＳＡ特異的Ｔ細胞反応の規模及び質を大きく高める。さらに、図面及び実施例から、ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖを用いたプライミング及びＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆを用いたブーストは、標的腫瘍抗原であるＰＳＡに高度に機能的なＣＤ８  ＣＴＬ免疫反応を集中させ、ワクシニアベクターから離れさせるという追加の利点をもたらすことが示される。
【０１５０】
少なくとも１つの態様において、組み換えポックスウイルスの１つ以上の用量が癌患者に投与される場合、第二またはその後の組み換えポックスウイルスの用量または投与と併用した１つ以上の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストの投与により、より高い癌治療の治療効果が得られる。
【０１５１】
より特定の態様において、本発明の組み換えポックスウイルスの１つ以上の用量が異種プライムブーストレジメンの一部として癌患者に投与される場合、少なくとも１つのＴＡＡをコードする第二またはその後の組み換えポックスウイルスのブースト用量と併用して少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを投与することにより、より高い癌治療の治療効果が得られる。この高い治療効果は、少なくとも部分的に、異種プライムブーストレジメンの第二またはその後のブースト投与が行われている間、及び行われた後に、組み換えポックスウイルスと比較し、患者の免疫Ｔ細胞反応が腫瘍抗原に対しより集中することから認識される。したがって、少なくとも１つの態様において、ブースト投与の間に免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを投与すると、腫瘍抗原に対する患者の免疫反応を増強させるために機能し、それにより腫瘍に対しより特異的に患者の免疫反応が高まる。
【０１５２】
少なくとも他の態様において、異種プライムブーストレジメンを含む癌治療の一部として、組み換えポックスウイルスの第二のまたはその後のブースト投与と併用して少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを投与することにより、当該免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストの治療利益が最大化され、一方で、免疫チェックポイント治療においてみられる有害な副作用は最小化される。
【０１５３】
本開示の教示を考慮し、追加の実施形態において、本発明は、ヒト癌患者を治療する方法を含むものであり、当該方法は、（ａ）第一の組み換えポックスウイルスであり、当該ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する、及び（ｂ）第二の組み換えポックスウイルスであり、当該ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する、を当該患者に投与することを含み、ここで、当該第二の組み換えポックスウイルスは、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用して投与される、方法である。追加の実施形態において、第二の組み換えポックスウイルスは第一の組み換えポックスウイルスとは異なっている。他の実施形態において、第二の組み換えポックスウイルスは、第一の組み換えポックスウイルスとは異なる属である。
【０１５４】
他の実施形態において、第一及び第二の組み換えポックスウイルスは、異なっているか、異なる属であり、異種プライムブーストレジメンとして投与され、当該異種プライムブーストレジメンは、ａ）第一のプライム投与として第一の組み換えポックスウイルスを投与すること、及びｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用して１つ以上のブースト投与として第二の組み換えポックスウイルスを投与すること、を含む。好ましい実施形態において、異種プライムブーストレジメンは、ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）、ＣＶ３０１、またはＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１から選択される。
【０１５５】
さらに他の実施形態において、第一の組み換えポックスウイルス、または初回投与もしくはプライム投与の組み換えポックスウイルスは、免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを含有しないことが予期される。
【０１５６】
さらに、第一及び第二の組み換えポックスウイルスは、たとえば限定されないが、本開示に記載される任意のポックスウイルスであり得ることが予期される。さらに、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、たとえば限定されないが、本開示に記載されるＴＡＡ等の任意のＴＡＡであり得ることが予期される。
【０１５７】
１つ以上の実施形態において、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストは、少なくとも１つのＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスの第二またはその後の投与と同日、または１、２、３、４、５、６若しくは７日以内に投与される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストは、異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、及び少なくとも１つのＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスの第二のまたはその後のブースト投与と同日、または１、２、３、４、５、６若しくは７日以内に投与される。
【０１５８】
１つ以上の実施形態において、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストは、少なくとも１つのＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスの第二のまたはその後の用量が投与された後に投与される。好ましい実施形態において、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストは、異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、及び少なくとも１つのＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスの第二のまたはその後のブースト投与の後に投与される。組み換えポックスウイルスの第二のまたはその後のブースト投与の後、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが投与される時間の間隔は、本開示に記載される時間の間隔を含みうることが予期される。
【０１５９】
さらに、少なくとも１つのＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスの第二、またはもう１つの次のブースト投与と併用して投与される場合、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストは、本開示に提示される用量または濃度で投与されうることが予期される。
【０１６０】
キット
１つの実施形態において、本発明は、組み換えポックスウイルスとＴＩＭ−３免疫チェックポイントアンタゴニストを含有するキットを包含するものである。組み換えポックスウイルスとＴＩＭ−３免疫チェックポイントアンタゴニストは各々バイアルまたは容器内に入れられていてもよい。
【０１６１】
１つの実施形態において、組み換えポックスウイルスは本明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする。他の実施形態において、ＴＩＭ−３免疫チェックポイントアンタゴニストは、本明細書に記載される他の免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用されてもよい。様々な実施形態において、ワクチネーション用キットは、第一のバイアルまたは容器のセット中に、第一のワクチネーション（プライミング）のための組み換えポックスウイルスと免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを含有し、及び第二若しくは第三のバイアルまたは容器中に、第二または第三のワクチネーション（ブースト）のための組み換えポックスウイルスと免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストを含有する。
【０１６２】
１つの実施形態において、キットは、癌の予防を目的とした、組み換えポックスウイルス、及びＴＩＭ−３免疫チェックポイントアンタゴニスト、及び併用投与に関する説明書を含有してもよい。１つの実施形態において、キットは、１つ以上の腫瘍関連マーカーの上昇が検出された後、癌の予防を目的とした、当該組合せ、及び併用投与に関する説明書を含有してもよい。
【０１６３】
１つの実施形態において、キットは、組み換えポックスウイルスとＴＩＭ−３免疫チェックポイントの組み合わせ、及び治療有効投与量またはある量のポックスウイルス、及び治療有効量のＴＩＭ−３免疫チェックポイントアンタゴニストの投与に関する説明書を含有してもよい。
【０１６４】
本発明により、本明細書に記載される説明書の１つ以上が、単一のキット中に組み合わされ得ることが予期される。さらに本明細書に記載される１つ以上の説明書が、本出願中に提示される投与レジメンの１つ以上を含むことが予期される。
【０１６５】
組合せまたは薬剤に関するさらなる実施形態
さらなる実施形態において、本開示は、ヒト癌患者の治療において使用するための組み合わせまたは医薬を包含するものである。当該組み合せまたは医薬は、組み換えポックスウイルスベクターを含有し、当該ポックスウイルスベクターは、ａ）少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、及びｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、を含有する。当該ＴＩＭ−３アンタゴニストは抗ＴＩＭ−３抗体を含有してもよい。
【０１６６】
さらに追加の実施形態において、本開示は、ヒト癌患者の治療における使用のための組み合わせまたは医薬を含みうるものであり、当該組み合わせまたは医薬は、（ａ）治療有効量のポックスウイルスであって、当該ポックスウイルスベクターは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有し、（ｂ）少なくとも１つのＴＩＭ−３アンタゴニストの治療有効量、及び（ｃ）ＰＤ−１アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストの内の少なくとも１つの治療有効量、を含有する。様々な免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、１つ以上の抗体に統合されうることが予期される。
【０１６７】
さらに追加の実施形態において、本開示は、ヒト癌患者の全生存率の上昇における使用のための組み合わせまたは医薬を含みうるものであり、当該組み合わせまたは医薬は、（ａ）組み換えポックスウイルスベクターであり、当該ポックスウイルスベクターは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有し、及び（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、を含有する。当該ＴＩＭ−３アンタゴニストは抗ＴＩＭ−３抗体を含有してもよい。
【０１６８】
さらに他の実施形態において、本明細書に開示される組合せまたは医薬中のＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスは、ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）であってもよい。さらに他の実施形態において、本明細書に開示される組合せまたは医薬中のＴＡＡをコードする組み換えポックスウイルスは、ＣＶ３０１であってもよい。
【０１６９】
さらに追加の実施形態において、本開示は、（ａ）組み換えポックスウイルスであって、当該組み換えポックスウイルスは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有し、及び（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、の使用を含みうるものである。当該ＴＩＭ−３アンタゴニストは、抗ＴＩＭ−３アンタゴニスト抗体を含んでもよい。さらなる実施形態において、開示される医薬組成物または医薬の使用は、ヒト癌患者の治療を目的としたものであってもよい。
【０１７０】
さらに追加の実施形態において、本開示は、（ａ）組み換えポックスウイルスであって、当該ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含み、及び（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、及び（ｃ）ＰＤ−１アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストの内の少なくとも１つ、の使用を含みうるものである。様々な免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、１つ以上の抗体に統合されうることが予期される。さらなる実施形態において、開示される医薬組成物または医薬の使用は、ヒト癌患者の治療を目的としたものであってもよい。
【実施例】
【０１７１】
実施例１
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２の構築
培養物の同時感染及びトランスフェクションに行うことにより、ウイルスゲノムと組み換えプラスミドの間の相同組み換えが発生した。挿入物を担持したウイルスを単離し、特徴を解析し、ウイスルストックを調製した。
【０１７２】
プラスミドｐＢＮ１４６はＭＶＡ−ＢＮ中にもまた存在する配列（１４Ｌ及び１５Ｌオープンリーディングフレーム）を含有する。ＨＥＲ２配列は、ＭＶＡ−ＢＮの間に挿入され、それによりＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムへの組み換えが行われた。つまり、ポックスウイルスプロモーター、具体的にはカウポックス（ｃｏｗｐｏｘ）ウイルスＡ型封入体遺伝子プロモーターの下流にＨＥＲ２配列を含有したプラスミドが構築された。このプラスミドはまた、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｐｓ）、薬剤耐性遺伝子（グアニン−キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ；Ｅｃｏｇｐｔ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含有する選択カセットを含有した。両選択遺伝子（ｇｐｔ及びＥＧＦＰ）は、１つの２シストロン性転写物によりコードされた。
【０１７３】
ＨＥＲ−２配列は、ＨＥＲ−２に対する免疫反応を高めるために、ｐ２及びｐ３０の破傷風毒素エピトープをコードするヌクレオチド配列の付加により修飾された。ｍＨＥＲ２がＭＶＡ−ＢＮゲノムに挿入された後、このウイルスの「挿入領域」は以下の構造を有していた。
【０１７４】
ＡＴＩプロモーター−ＨＥＲ２配列−Ｐｓプロモーター−ｇｐｔ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ。挿入領域は、細菌組み換えプラスミドｐＢＮ１４６中のＭＶＡ−ＢＮ  Ｉ４Ｌ遺伝子間領域配列（Ｆ１及びＦ２）に隣接していた。当該構築物のヌクレオチド配列を以下に示す。
【０１７５】
【表１】
2020125322.tif 000003
【０１７６】
ＨＥＲ２の開始コドン及び終止コドンは太字で示されている。隣接配列は斜体で示されている。
【０１７７】
コードされたＨＥＲ２ポリペプチドの翻訳配列は以下に示す。
【０１７８】
【表２】
2020125322.tif 000004
【０１７９】
ｐ２及びｐ３０の破傷風毒素エピトープは太字で示されている。
【０１８０】
ＣＥＦ培養物にＭＶＡ−ＢＮを接種し、またｐＢＮ１４６プラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。次に、これら細胞培養物由来の試料を、選択薬剤を含有する培地中でＣＥＦ培養物へと接種し、ＥＧＦＰ発現ウイルスクローンをプラーク精製により単離した。選択薬剤の存在下で増殖し、ＥＧＦＰを発現したウイルスストックを、ＭＶＡ−ＢＮ−ｍＨＥＲ２と指定した。ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２の作製及びウイルスストックの調製には、５回のプラーク精製を含む１２回の連続継代が含まれた。
【０１８１】
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２は、選択薬剤の非存在下、ＣＥＦ細胞培養物中で継代された。選択薬剤を無くすことにより、挿入配列由来の選択遺伝子であるｇｐｔとＥＧＦＰ、及び関連プロモーター（選択カセット）をコードする領域を欠落させた。選択カセットを消失させる組み換えは、プラスミドｐＢＮ１４６の選択カセットに隣接しているＦ１  Ｉ４Ｌ領域、及びその領域の小区分であるＦ１リピート（Ｆ１リピート）により調節される。これら二重配列は、選択カセットを消失させ、Ｉ４Ｌ遺伝子内領域に挿入されたＨＥＲ２配列のみを残す組み換えを成立させるために含まれた。
【０１８２】
選択カセットを欠くプラーク精製されたウイルスが調製された。かかる調製は、５回のプラーク精製を含む１５回の継代を含んだ。
【０１８３】
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２ストック中のＨＥＲ２配列の存在、及び元のＭＶＡ−ＢＮウイルスの非存在は、ＰＣＲ分析により確認され、入れ子ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を用いて選択カセット（ｇｐｔ及びＥＧＦＰ遺伝子）の非存在が確認された。
【０１８４】
ＨＥＲ２タンパク質の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を接種された細胞中で示された。
【０１８５】
実施例２
腫瘍移植、及びＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２と抗体を用いた治療
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、約２０ｇ）は、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡから購入した。固形腫瘍モデルにおいては、１日目にメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６−ＨＥＲ−２細胞を移植した（１．０ｘ１０＾５、皮内注射、背側脇腹）。マウスはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いて１日目及び１５日目に治療された（１００μＬのＴＢＳ中、１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、尾基底部で尾部乱刺［ｔ．ｓ．］または皮下注射［ｓ．ｃ．］による）。以下の抗体を、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ社（Ｗｅｓｔ，Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）から購入した。抗Ｔｉｍ−３（ＲＭＴ３−２３）、抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）、及び抗ＬＡＧ−３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）。すべての抗体は、別段の記載がない限り、マウス当たり、１００μＬのＰＢＳ中２００μｇで１日目及び１５日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射された。腫瘍は週に２回測定され、腫瘍体積は以下の式に従い算出された。腫瘍体積（ｍｍ３）＝（全長ｘ幅２）／２。
【０１８６】
フローサイトメトリー解析のために全血、腫瘍／肺、または脾臓をプールした（４匹のマウス／群）。脾臓細胞は、２枚のすり板ガラススライドの間に脾臓を圧縮し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて赤血球を溶解させることにより調製した。肺と関連腫瘍は、約１〜２ｍｍ３のさいの目に切断され、１０％のＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ、及び２５０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を含むＤＭＥＭ中で１時間、３７℃にて単一細胞懸濁液にまでさらに消化された。肺及び全血の両方に含まれる赤血球はＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて溶解された。単一細胞懸濁液は、標準的な表面染色プロトコールに従い染色された。
【０１８７】
以下のタンパク質に対する抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）からＣＤ３ｅ（５００Ａ２）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）、ＬＡＧ−３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、ＰＤ−１（ＣＤ２７９、２９Ｆ．１Ａ１２）、Ｔｉｍ−３（ＲＭＴ３−２３）を、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からＩＣＯＳ（７Ｅ．１７Ｇ９）、ＣＤ１６／ＣＤ３２（９３）を購入した。
【０１８８】
すべての試料はＢＤ  ＬＳＲＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ上で得られ、ＦｌｏｗＪｏ  バージョン９．６．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析された。
【０１８９】
すべての統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行われた。
【０１９０】
実施例３
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２治療を用いたＴｉｍ−３発現の上昇
Ｔｉｍ−３発現は、実施例２に記載されるように１日目及び１５日目のＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、ｔ．ｓ．）を用いた治療後のマウスにおいて、フローサイトメトリーにより測定された。図１に示されるように、結果は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた治療後、ＴＩＭ−３を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の上昇を示している。
【０１９１】
実施例４
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２と抗ＴＩＭ−３治療は、腫瘍増殖を減少させる
実施例２に記載されるように、マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２腫瘍を皮内移植され、１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、ｔ．ｓ．）と抗Ｔｉｍ−３（２００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。図２に示されるように、結果は、抗ＴＩＭ−３を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた治療が腫瘍増殖を減少させることを示している。
【０１９２】
図２に示されるように、結果は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２と抗ＴＩＭ−３を用いた治療が、腫瘍増殖及び腫瘍体積を減少させることを示している。
【０１９３】
実施例５
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗ＴＩＭ−３及び抗ＰＤ−１治療は腫瘍増殖を減少させる
実施例２に記載されるように、マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２腫瘍を皮内移植され、１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、ｔ．ｓ．）、ならびに抗Ｔｉｍ−３及び抗ＰＤ−１（各々２００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。図３に示されるように、結果は、抗ＴＩＭ−３と抗ＰＤ−１を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた治療が腫瘍増殖を減少させることを示している。
【０１９４】
実施例６
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗ＴＩＭ−３及びＬＡＧ−３治療は腫瘍増殖を減少させる  実施例２に記載されるように、マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２腫瘍を皮内移植され、１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、ｔ．ｓ．）、ならびに抗Ｔｉｍ−３及び抗ＬＡＧ−３（各々２００μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。図４に示されるように、結果は、抗ＴＩＭ−３と抗ＬＡＧ−３を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた治療が腫瘍増殖を減少させることを示している。
【０１９５】
実施例７
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２及び抗ＴＩＭ−３及び抗ＣＴＬＡ−４治療は腫瘍増殖を減少させる
実施例２に記載されるように、マウスは１日目にＣＴ２６−ＨＥＲ−２腫瘍を皮内移植され、１日目及び１５日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２（１Ｅ７  Ｉｎｆ．Ｕ．、ｓ．ｃ．）、ならびに抗Ｔｉｍ−３（２００μｇ、ｉ．ｐ．）及び抗ＣＴＬＡ−４（２２μｇ、ｉ．ｐ．）を用いて治療された。図５に示されるように、結果は、抗ＴＩＭ−３と抗ＬＡＧ−３を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた治療が腫瘍増殖を減少させることを示している。＊＊＊  ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析（Ｔｗｏ  Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【０１９６】
実施例８
ＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗体を用いて治療されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
オスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、約２０ｇ、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇｉｌｒｏｙ  ＣＡ）に、１日目にＥ６細胞（１．５×１０５、背側横腹皮内）を移植した。マウスは１日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ（２Ｅ７  Ｉｎｆ．  Ｕ．、尾基底部皮下注射）を用いて治療され、ならびに８日目及び１５日目にＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆ（１Ｅ８  Ｉｎｆ．  Ｕ．、尾基底部皮下注射）を用いて治療された。マウスは、実施例２に記載されるように抗ＰＤ−１及び抗ＬＡＧ−３を用いた腹腔内注射で治療された。
【０１９７】
実施例９
ＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗ＰＤ−１を用いて治療されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスはＥ６腫瘍を皮内移植され、実施例８に記載されるようにＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗ＰＤ−１を用いて治療された。結果は図６に示す。
【０１９８】
実施例１０
ＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗ＬＡＧ−３を用いて治療されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導  ＢＡＬＢ／ｃマウスはＥ６腫瘍を皮内移植され、実施例８に記載されるようにＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗ＬＡＧ−３を用いて治療された。結果は図７に示す。
【０１９９】
実施例１１
ＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗ＰＤ−１及び抗ＬＡＧ−３を用いて治療されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウスはＥ６腫瘍を皮内移植され、実施例７に記載されるようにＰＲＯＳＴＶＡＣ及び抗ＰＤ−１及び抗ＬＡＧ−３を用いて治療された。結果は図８に示す。
【０２００】
実施例１２
抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１を伴うＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１は、全生存率を上昇させる
１日目にメスのＣ５７／ＢＬ６マウス（６〜８週齢、約２０ｇ、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）に、肺に腫瘍を形成する１．０×１０＾６個のＭＣ３８−ＭＵＣ１細胞のＤＰＢＳ溶液３００μＬを静脈内注射で移植した。マウスは、４日目及び１８日目にＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１（４Ｅ５  Ｉｎｆ．Ｕ．尾基底部上の皮下注射）を用いて治療し、ならびに抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１（それぞれ２００μｇ）の腹腔内注射を用いて治療した。ＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１
結果。図９に示されるように、結果は、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１を併用したＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＣＶ３０１を単独で用いた癌治療、または抗ＣＴＬＡ−４と抗ＰＤ−１のみの癌治療と比較し、対象の全生存率を有意に上昇させたことを示している。
【０２０１】
実施例１３
異種プライムブーストはＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答を増幅させる
オスのＢＡＬＢ／ｃ（５匹／群）は、緩衝液（対照）、ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ（ＶＶＶ）（２Ｅ６  Ｉｎｆ．  Ｕ．、尾基底部皮下）、ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆ（ＦＦＦ）（１Ｅ７  Ｉｎｆ．  Ｕ．、尾基底部皮下）を用いて２週毎に治療され、またはＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖプライムを投与された後、２度のＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆブースト（ＶＦＦ）を投与された。プールされた脾臓細胞は、本明細書に参照により援用されるＭａｎｄｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１２）、６１：１９−２９に記載されるようにＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによりＰＳＡ特異的応答に関して分析された。
【０２０２】
結果を図１２に示す。（Ａ、Ｂ）及びフローサイトメトリーによる細胞障害活性（％ＣＤ１０７＋ＩＦＮγ＋ＣＤ８Ｔ細胞）（Ｃ）。抗ＰＳＡ  ＩｇＧ力価は、個々のマウスに対しＥＬＩＳＡにより測定された（Ｄ）。ＥＬＩＳＰＯＴに関しては、脾臓細胞はＣＤ４若しくはＣＤ８  ＰＳＡ特異的ペプチド、または対照を用いて指定された濃度で再刺激された（対照は示さず）。多すぎて計測できない応答は、１０００スポット／百万個の細胞として示された。統計的有意差は、０．０１μＭでのテューキーの事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）を用いたＲＭ−ＡＮＯＶＡにより決定した。対照と比較し、＊＊＊＊  Ｐ＜０．００１（Ａ及びＢ）。細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を特定するために、脾臓細胞を一晩、抗ＣＤ１０７抗体の存在下でＰＳＡ  ＣＤ８特異的ペプチドを用いて再刺激した。グラフは４つの個々に行われた実験のうちの代表的なデータを示す。
【０２０３】
図１０に示されるように、ワクシニアウイルスを用いた異種プライムブーストレジメンを行った後、１回以上の鶏痘ウイルスブーストを行い、ＶＶＶまたはＦＦＦの同種投与レジメンと比較し、非常に高い頻度のＩＦＮγ−産生ＰＳＡ特異的ＣＤ４Ｔ細胞（図１０Ａ）及びＣＤ８Ｔ細胞（図１０Ｂ及び１１Ａ）を得た。
【０２０４】
さらに、ＶＦＦ投与から得られたＰＳＡ特異的Ｔ細胞はより高い親和性があり（図１０Ａ及び１０Ｂ）、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、より低いペプチド濃度の０．０１μＭでより高い頻度のＴ細胞応答が認められた。重要なことは、ＶＦＦ異種プライムブーストレジメンから生じた機能的活性ＰＳＡ特異的ＣＤ８  ＣＴＬの数は、同種投与レジメンのいずれかから生じた数よりも、７〜２０倍多かったということである（図１０Ｃ）。
【０２０５】
Ｔ細胞応答とは対照的に、異種プライムブーストレジメンはＰＳＡ特異的な抗体応答を改善しなかった（図１０Ｄ）。これらの結果は、異種ＶＦＦ投与レジメンは、高い親和性及びＣＤ８  ＣＴＬ活性の上昇により測定されるように、より大きな規模及びより高い質のＣＤ４  ＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答ならびにＣＤ８  ＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答を生じさせることを示している。本明細書に記載されるように、これらは、異種ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ／Ｆ投与後の抗ＰＳＡ特異的抗腫瘍応答の改善に寄与する。
【０２０６】
実施例１４
異種プライムブーストはＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答の質を改善する
実施例４０に記載されるようにオスのＢＡＬＢ／ｃ（５匹／群）を治療した。脾臓は最後の治療の１４日後に採取し、プールされた脾臓細胞は一晩、ＰＳＡ  ＯＰＬまたは対照を用いて再刺激した（対照は示さず）。細胞は、フローサイトメトリー分析を行う前に細胞内ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２に対して染色された。（Ａ）円グラフは検出された細胞の数を反映するように、サイズで重量が付されている（１００万個のＴ細胞当たりのＰＳＡ特異的ＣＤ８の総数が、各グラフの下に示されている）。（Ｂ）平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定される細胞当たりのＩＦＮγ産生の量。グラフは個々に行われた２つの実験の内の代表的なデータを示す。
【０２０７】
図１１に示されるように、ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞をＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２のマルチサイトカイン産生に関しフローサイトメトリーにより分析した際、ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答の質におけるさらなる際立った特徴が認められた（図１１）。サイトカイン発現を用いて、ＣＤ８メモリーＴ細胞はダブルポジティブＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞（ＩＦＮγ＋、ＴＮＦα＋、ＴＥＭ）及びトリプルポジティブＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞（ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＩＬ−２＋、ＴＣＭ）に分類される。たとえば、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８，８：２４７−２５８を参照のこと。
【０２０８】
ＣＤ８Ｔ細胞応答の規模の増大に加え（図１０及び図１１Ａ）、異種ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ／Ｆレジメンの結果として、同種投与レジメンと比較し高い割合のダブルポジティブＴＥＭ及びトリプルポジティブＴＣＭ（図１１Ａ）により、ＣＤ８Ｔ細胞応答の質における明白な偏移が明らかとなった。５倍高いＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖの投与量を用いたプライミングは、ＣＤ８Ｔ細胞応答の質または規模における付加的な利益は何ももたらさなかった（データは示さず）。さらにダブルポジティブＴＥＭ及びトリプルポジティブＴＣＭ  ＣＤ８Ｔ細胞は、シングルポジティブ細胞よりも、細胞当たり高レベルのＩＦＮγを産生した（図１１Ｂ）。このＩＦＮγ産生の増加は、投与レジメンに関わらず、ＴＥＭ及びＴＣＭ  ＣＤ８Ｔ細胞において認められた。
【０２０９】
さらに、図１１に示されるように、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２はＩＦＮγを産生する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を誘導している。本開示から、ＩＦＮγを分泌するウイルス誘導性ＴＩＬ（腫瘍浸潤性リンパ球：ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）は、腫瘍細胞に対するＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１の増加をもたらし得ることが予期され、ウイルス処置を併用したこの経路の阻害を裏付けるものである。
【０２１０】
実施例１５
ＰＳＡに対するＴ細胞応答の免疫集中
マウスを実施例１３に記載されるように治療した。プールされた脾臓細胞は最後の治療の１４日後にフローサイトメトリーによりワクシニアウイルス（ＶＶ）特異的（左側のＡパネル及びＣパネル）、またはＰＳＡ特異的（右側のＡパネル及びＣパネル）な細胞障害活性に関し分析された（％ＣＤ１０７＋ＩＦＮγ＋ＣＤ８Ｔ細胞）。脾臓細胞は、抗ＣＤ１０７抗体の存在下で、ワクシニアＥ３Ｌ及びＦ２Ｌペプチドとともに、またはＰＳＡ  ＯＰＬとともに一晩再刺激された。翌日、細胞はＩＦＮγに関し細胞内染色され、及び表面マーカーであるＣＤ１２７で染色され、ＫＬＲＧ１．％抗原特異的細胞障害性ＳＬＥＣ及びＤＰＥＣがそれぞれ（ＣＤ８＋ＣＤ１２７−ＫＬＲＧ１＋）及び（ＣＤ８＋ＣＤ１２７＋ＫＬＲＧ１＋）細胞に対しゲーティングすることにより測定された。グラフは個々に行われた２つの実験のうちの代表的なデータを示す。結果は図１２に示す。
【０２１１】
ＰＳＡ特異的エフェクターＴ細胞サブセットとベクター特異的エフェクターＴ細胞サブセットの細胞障害性能に関する、同種投与と比較した異種ＰＲＯＳＴＶＡＣワクシニアウイルス鶏痘／Ｆ投与レジメンの影響を分析した。同種ＶＶＶ投与は、比較的多数のワクシニア特異的細胞障害性ＳＬＥＣ（約５０％）及びＤＰＥＣ（約２０％）を生じさせたが（図１２Ａ及び１２Ｃ）、１０％未満のＳＬＥＣまたはＤＰＥＣ細胞障害活性ＣＤ８Ｔ細胞がＰＳＡ特異的であった。対照的に、異種ＶＦＦ投与後、６５％のＳＬＥＣと３０％の高活性ＤＰＥＣエフェクターメモリーＴ細胞がＰＳＡ特異的ＣＴＬであった一方で、ワクシニア特異的ＣＴＬは１０％未満であった（図１２Ａ及び１２Ｃ）。従って異種ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ／Ｆレジメンは、ＳＬＥＣ  Ｔ細胞応答及びＤＰＥＣ  Ｔ細胞応答のＰＳＡ標的化とワクシニア標的化の比率を１００倍改善した（図１２Ｂ及び１２Ｄ）。再び、５倍超のＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖを用いたプライミングは、付加的な利益は何ももたらさなかった（データは示さず）。
【０２１２】
図１２に示されるように、ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞をＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２のマルチサイトカイン産生に関しフローサイトメトリーにより分析した際、ＰＳＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答の質におけるさらなる際立った特徴が認められた（図１２）。サイトカイン発現を用いて、ＣＤ８メモリーＴ細胞はダブルポジティブＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞（ＩＦＮγ＋、ＴＮＦα＋、ＴＥＭ）及びトリプルポジティブＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞（ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＩＬ−２＋、ＴＣＭ）に分類される。たとえば、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８，８：２４７−２５８を参照のこと。
【０２１３】
ＣＤ８Ｔ細胞応答の規模の増大に加え（図１１及び図１２Ａ）、異種ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖ／Ｆレジメンの結果として、同種投与レジメンと比較し高い割合のダブルポジティブＴＥＭ及びトリプルポジティブＴＣＭ（図１２Ａ）により、ＣＤ８Ｔ細胞応答の質における明白な偏移が明らかとなった。５倍高いＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖの投与量を用いたプライミングは、ＣＤ８Ｔ細胞応答の質または規模における付加的な利益は何ももたらさなかった（データは示さず）。さらにダブルポジティブＴＥＭ及びトリプルポジティブＴＣＭ  ＣＤ８Ｔ細胞は、シングルポジティブ細胞よりも、細胞当たり高レベルのＩＦＮγを産生した（図１２Ｂ）。このＩＦＮγ産生の増加は、投与レジメンに関わらず、ＴＥＭ及びＴＣＭ  ＣＤ８Ｔ細胞において認められた。
【０２１４】
実施例１６
免疫集中後のＣＴＬＡ−４を用いた併用療法
実施例４０に記載されるようにオスのＢＡＬＢ／ｃ（５匹／群）を、緩衝液（対照）、ＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｖプライム後に２回のＰＲＯＳＴＶＡＣ−Ｆブースト（ＶＦＦ）を用いて２週毎に治療する。マウスは、１日目、１５日目及び２９日目（Ａ）、または１５日目及び２９日目（Ｂ）、または１６日目及び３０日目（Ｃ）、または１７日目及び３１日目（Ｄ）に抗ＣＴＬＡ−４（６０μｇ）を用いて腹腔内注射で治療される。ＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答は、実施例１３、１４、及び１５に記載されるように分析される。
【０２１５】
本明細書に記載される方法及び組成の正確な詳細は、記載される本発明の主旨から逸脱することなく変更または改変され得ることが明らかであろう。我々は、以下の請求項の範囲及び主旨の内にあるかかる変更ならびに改変のすべてを請求する。
【図１】
2020125322.tif 000005
【図２】
2020125322.tif 000006
【図３】
2020125322.tif 000007
【図４】
2020125322.tif 000008
【図５】
2020125322.tif 000009
【図６】
2020125322.tif 000010
【図７】
2020125322.tif 000011
【図８】
2020125322.tif 000012
【図９】
2020125322.tif 000013
【図１０】
2020125322.tif 000014
【図１１】
2020125322.tif 000015
【図１２】
2020125322.tif 000016
【配列表】
2020125322000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
さらに追加の実施形態において、本開示は、（ａ）組み換えポックスウイルスであって、当該ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含み、及び（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、及び（ｃ）ＰＤ−１アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストの内の少なくとも１つ、の使用を含みうるものである。様々な免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、１つ以上の抗体に統合されうることが予期される。さらなる実施形態において、開示される医薬組成物または医薬の使用は、ヒト癌患者の治療を目的としたものであってもよい。
なお、本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．ヒト癌患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者に少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを投与すること、及び
（ｂ）前記患者にＴＩＭ−３アンタゴニストを投与すること、
を含む前記方法。
２．（ｃ）前記患者にＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、またはそれらの組み合わせから選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む上記１に記載の方法。
３．（ｃ）前記患者にＰＤ−１から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む上記１に記載の方法。
４．（ｃ）前記患者にＬＡＧ−３から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む上記１に記載の方法。
５．（ｃ）前記患者にＣＴＬＡ−４から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む上記１に記載の方法。
６．前記ポックスウイルスがオルソポックスである、上記１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスである、上記６に記載の方法。
８．前記ワクシニアウイルスが変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである、上記７に記載の方法。
９．前記ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮである、上記８に記載の方法。
１０．前記ポックスウイルスが、アビポックスウイルスである、上記１〜５のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記アビポックスウイルスが、鶏痘ウイルスである、上記１０に記載の方法。
１２．前記少なくとも１つのＴＡＡが、癌胎児性（ＣＥＡ）、ｍｕｃｉｎ  １  ｃｅｌｌ
ｓｕｒｆａｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＭＵＣ−１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、またはブラキウリ抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。１３．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１４．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＭＵＣ−１抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１５．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＰＡＰ抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＰＳＡ抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＨＥＲ−２抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１８．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ブラキウリ抗原である、上記１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１９．前記ＴＩＭ−３アンタゴニストが、抗ＴＩＭ−３抗体である、上記１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
２０．前記ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニストが、それぞれ、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、上記２及び上記４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
２１．ヒト患者における癌を治療するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルス、及び
（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト、
を含有する前記キット。
２２．（ｃ）ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、またはＣＴＬＡ−４から選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニスト、
をさらに含有する上記２１に記載のキット。
２３．前記ＴＩＭ−３アンタゴニストが、抗ＴＩＭ−３抗体を含有する、上記２１〜２２のいずれか１項に記載のキット。
２４．前記ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、及びＣＴＬＡ−４のアンタゴニストが、それぞれ、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、上記２２〜２３のいずれか１項に記載のキット。
２５．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、またはブラキウリ抗原である、上記２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
２６．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１抗原である、上記２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
２７．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＰＳＡである、上記２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
２８．ヒト癌患者を治療する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有するポリペプチドをコードする組み換えポックスウイルスを前記患者に投与すること、及び
（ｂ）前記患者にＴＩＭ−３アンタゴニストを投与すること、
を含む、前記方法。
２９．（ｃ）前記患者に、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、またはそれらの組み合わせから選択される免疫チェックポイント分子のアンタゴニストを投与すること、
をさらに含む上記２８に記載の方法。
３０．ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した前記組み換えポックスウイルスが、同種または異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、
ここで前記同種プライムブーストレジメンは、ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスの第一のプライム投与、及びＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した同じ組み換えポックスウイルスの１回以上のその後のブースト投与、を含み、ならびに、
ここで前記異種プライムブーストレジメンは、ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスの第一のプライム投与、及びＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した異なる組み換えポックスウイルスの１回以上のその後のブースト投与、を含む、上記２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ１）、チロシン関連タンパク質１（ｔｙｒｐ２）、ブラキウリ抗原、またはそれらの組み合わせから選択される、上記２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
３２．前記ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスが、同種プライムブーストレジメンの一部として投与され、ここで前記第一のプライム投与及び前記１回以上のその後のブースト投与の組み換えポックスウイルスは、オルソポックスウイルスを含む、上記３０に記載の方法。
３３．前記オルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮから選択される、上記３２に記載の方法。
３４．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＨＥＲ２である、上記３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
３５．前記ＴＩＭ−３アンタゴニストと併用した組み換えポックスウイルスが、異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、ここで前記第一のプライム投与の組み換えポックスウイルスがオルソポックスウイルスを含有し、及び前記１回以上のブースト投与の組み換えポックスウイルスがアビポックスウイルスを含有する、上記３０に記載の方法。
３６．前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記３５に記載の方法。
３７．前記異種プライムブーストレジメンが、ＰＲＯＳＴＶＡＣまたはＣＶ３０１である、上記３０、３５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
３８．ヒト癌患者を治療する方法であって、前記方法は、前記患者に、
（ａ）第一の組み換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有し、及び
（ｂ）第二の組み換えポックスウイルスであって、前記ポックスウイルスは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含有する、を投与することを含み、ここで、前記第二の組み換えポックスウイルスは、少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用されて投与される、前記方法。
３９．前記少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の組み換えポックスウイルスの後に投与される、上記３８に記載の方法。
４０．前記少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、またはそれらの組み合わせから選択される、上記３８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
４１．前記少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストが、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、またはそれらの組み合わせから選択される、上記３８〜３９のいずれか１項に記載の方法。
４２．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２、サバイビン、チロシン関連タンパク質１（ｔｒｐ１）、チロシン関連タンパク質２（ｔｒｐ２）、ブラキウリ抗原、またはそれらの組み合わせである、上記３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
４３．前記第一及び第二の組み換えポックスウイルスが異なっており、及び異種プライムブーストレジメンの一部として投与され、前記異種プライムブーストレジメンが、
ａ）第一のプライム投与として第一の組み換えポックスウイルスを投与すること、及び
ｂ）少なくとも１つの免疫チェックポイントアンタゴニストまたはアゴニストと併用して、１回以上のブースト投与として第二の組み換えポックスウイルスを投与すること、を含む、上記３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．前記第一の組み換えポックスウイルスがオルソポックスウイルスを含有し、前記第二の組み換えポックスウイルスがアビポックスウイルスを含有する、上記３８〜４３のいずれか１項に記載の方法。
４５．前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記３８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
４６．前記異種プライムブーストレジメンが、ＰＲＯＳＴＶＡＣまたはＣＶ３０１である、上記４５に記載の方法。
４７．前記オルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、ＭＶＡ，またはＭＶＡ−ＢＮから選択され、前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記４５に記載の方法。
４８．前記少なくとも１つのＴＡＡが、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１である、上記４７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えオルソポックスウイルス；及び
（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニスト
を含む免疫原性の組み合わせ物であって、前記少なくとも１つのＴＡＡがＨＥＲ−２抗原であり、前記ＴＩＭ−３アンタゴニストがＴＩＭ−３の生物活性を阻害する抗体である、免疫原性の組み合わせ物。
【請求項２】
前記組換えオルソポックスウイルスがワクシニアウイルス、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスまたはＭＶＡ−ＢＮから選択される、請求項１に記載の免疫原性の組み合わせ物。
【請求項３】
少なくとも一つのＴＡＡのポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスをさらに含む、請求項１または２に記載の免疫原性の組み合わせ物。
【請求項４】
前記アビポックスウイルスが、鶏痘ウイルスである、請求項３に記載の免疫原性の組み合わせ物。
【請求項５】
ヒト癌患者を治療する方法において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性の組み合わせ物。
【請求項６】
患者に、一つまたは複数の後続の、少なくとも一つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスおよび前記のＴＩＭ−３アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項５記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物。
【請求項７】
前記癌治療が乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、メラノーマ、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、または結腸直腸癌に対する治療である、請求項５または６記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物。
【請求項８】
前記癌治療が乳癌に対する治療である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物。
【請求項９】
前記癌治療が肺癌に対する治療である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物。
【請求項１０】
前記癌治療が前立腺癌に対する治療である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物。
【請求項１１】
前記癌治療が結腸直腸癌に対する治療である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物。
【請求項１２】
異種プライムブーストレジメンの一部として前記組み合わせ物が投与される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物であって、
ここで前記異種プライムブーストレジメンは、前記アンタゴニストと併用した組み換えオルソポックスウイルスの第一のプライム投与、及び前記アンタゴニストと併用した前記組み換えアビポックスウイルスの１回以上のその後のブースト投与を含む、免疫原性の組み合わせ物。
【請求項１３】
同種プライムブーストレジメンの一部として前記組み合わせ物が投与される、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性の組み合わせ物であって、
前記同種プライムブーストレジメンが、前記アンタゴニストもしくはアゴニストと併用した組換えオルソポックスウイルスの第一のプライム投与、および前記アンタゴニストもしくはアゴニストと併用した同一の組換えオルソポックスウイルスの１回以上のその後のブースト投与を含む、免疫原性の組み合わせ物。
【請求項１４】
ヒト癌患者における癌治療において使用するためのキットであって、（ａ）少なくとも一つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルス；および（ｂ）ＴＩＭ−３アンタゴニストを含み、前記少なくとも１つのＴＡＡがＨＥＲ−２抗原であり、前記ＴＩＭ−３アンタゴニストがＴＩＭ−３の生物活性を阻害する抗体である、キット。
【請求項１５】
少なくとも一つのＴＡＡのポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスをさらに含む、請求項１４のキット。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性の組み合わせ物を含む、ヒト癌患者の治療において使用するための薬剤または組成物。
【請求項１７】
前記癌治療が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵癌、膀胱癌または卵巣癌に対する治療である、請求項１６に記載の使用のための薬剤または組成物。
【外国語明細書】
2020125322000001.pdf