(57)【要約】【課題】水溶性の薬学的に活性を有するｗｎｔ組成物を提供する。【解決手段】Ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子およびその使用のための方法が提供される。本発明の分子は、水溶性であり；（ｉ）フリズルド（Ｆｚｄ）タンパク質および（ｉｉ）Ｌｒｐ５／６の両方と高親和性で結合し；カノニカルｗｎｔ経路シグナリングを直接的に活性化する。ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子は、Ｆｚｄのアゴニストとして作用し、ｗｎｔ経路シグナリングを活性化する方法における用途を見出す。一部の実施形態では、ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子は、ヒトＦｚｄタンパク質およびＬｒｐ５／６タンパク質に結合する。本発明の分子は、有機小分子およびポリペプチドを限定することなく含む。【選択図】図１
2020186267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＧＭ０９７０１５のもとの政府支援で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔ（ウイングレス（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ）およびＩｎｔ−１）は、その細胞増殖、分化および遊走に及ぼす影響のため、脊椎動物および無脊椎動物発生の中心的メディエータである。Ｗｎｔは、「カノニカル」β−カテニン経路ならびに「非カノニカル」平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路およびＣａ２＋経路を含む少なくとも３種の異なるシグナリング経路を活性化する、レスポンダー細胞における細胞表面受容体の活性化により作用する。
Ｗｎｔシグナルは、発生、生理機能および疾患における多種多様な細胞応答を誘導することができる。Ｗｎｔ経路の撹乱は、出生時欠損からがんに及ぶ種々のヒトの疾患をもたらす可能性がある。Ｗｎｔシグナリングの不適切な活性化は、ＦＡＰ、肝臓がん、皮膚がん、肺がん、ウィルムス腫瘍、前立腺がんおよび乳がんを含むがんに見出されてきた。四肢形成（無四肢症（ｔｅｔｒａ−ａｍｅｌｉａ））、骨化（ｂｏｎｅ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、眼の血管新生および歯の発生における欠損を含む、種々の発生的な遺伝子欠損もまた、Ｗｎｔ経路誤調節の結果として生じることが示されてきた。
【０００３】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、細胞質タンパク質β−カテニンを核へと進入させて、転写をモジュレートする。この経路が活性化されない場合、β−カテニンは、連続的な合成と、足場タンパク質アキシンおよびＡＰＣならびにキナーゼＧＳＫ３およびカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）で構成されたβ−カテニン分解複合体による破壊のサイクルに付される。Ｗｎｔシグナリングは、この複合体からＡＰＣを除去し、アダプターＤｓｈを介して他の構成成分を形質膜に再局在化させ、これにより、核に進入して転写を媒介するβ−カテニンを安定化する。
【０００４】
７回（ｓｅｖｅｎ−ｐａｓｓ）膜貫通受容体フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）（Ｆｚ）は、ほとんど全てのＷｎｔシグナリングにとって必要不可欠であり、Ｎ末端Ｆｚシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）は、Ｗｎｔ結合ドメインとして機能する。Ｆｚに加えて、Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、共受容体として機能する低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５および６（Ｌｒｐ５／６）を必要とする。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、機能的に重複した（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）１回膜貫通受容体である。ＬＲＰ６の生化学的研究は、異なるＷｎｔが、ＬＲＰ５／６タンパク質の異なる細胞外ドメインに結合し得ることを示す。ＬＲＰ６細胞外ドメインは、β−プロペラ（ｐｒｏｐｅｌｌｅｒ）および上皮増殖因子様（βＰ−Ｅ）ドメインの４個の反復配列を含有する。細胞外ＬＲＰ６領域の結晶構造は、βＰ−Ｅ反復が、それぞれ２個のβＰ−Ｅペアを含有する２個の別々のコンパクトで硬い構造であることを示す。Ｗｎｔ９ｂは、ＬＲＰ６の細胞外ドメインにおける最初の２個のβＰ−Ｅ反復に結合する一方、Ｗｎｔ３ａは、最後の２個のβＰ−Ｅドメインに結合する。ＦｚおよびＬＲＰ５／６へのＷｎｔリガンドの結合は、ホスファチジルイノシトール（４，５）−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）の産生をもたらす。ＰＩＰ２の増加は、ＬＲＰ５／６のオリゴマー形成およびクラスター形成を誘導する。ＰＩＰ２の増加は、ＬＲＰ５／６へのアキシンのリクルートを誘導する。このリクルートは、一部には、アキシン、ＣＫ１γおよびＧＳＫ３に結合する、ウィルムス腫瘍において変異される腫瘍抑制因子である、Ａｍｅｒ１／ＷＴＸ（Ｘ染色体上のＡＰＣ膜リクルート１またはウィルムス腫瘍遺伝子）の作用によるものである場合がある。Ａｍｅｒ１／ＷＴＸは、ＰＩＰ２依存性様式で形質膜にリクルートされる。
【０００５】
ＬＲＰ６およびアキシンの間の相互作用は、Ｗｎｔ経路の活性化にとって必要不可欠であり、Ｗｎｔリガンド結合による形質膜へのアキシンおよび関連する分解複合体のリクルートは、ＬＲＰ５／６の細胞内ドメインのリン酸化をもたらす一連の事象を惹起する。Ｗｎｔ−Ｆｚ依存性様式でのＬＲＰ６へのアキシンのこのような初期リクルートは、Ｗｎｔ経路活性化の「開始ステップ」と称される。ＬＲＰ５／６受容体は、シグナル伝達に必要とされる５個のＰＰＰＳＰｘＳモチーフをその細胞内ドメインに含有する。これら５個のモチーフはそれぞれ単独で、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を活性化することができる：異種受容体に移入された場合、ＰＰＰＳＰｘＳモチーフは、経路活性化に十分となる。これらのモチーフの変異解析は、これらが、協同的様式で作用して、下流シグナリングを媒介することを示す。ＬＲＰ５／６へのＷｎｔの結合は、ＰＰＰＳＰリン酸化を誘導することが示された。リン酸化されたＬＲＰ６は、アキシンに対し高親和性を有し、細胞表面への細胞質のアキシン結合ＧＳＫ３複合体のさらなるリクルートを促進する。アキシン結合β−カテニン分解複合体が、ＬＲＰ６によってリクルートされると、ＬＲＰ６のリン酸化された細胞質ドメインは、ＧＳＫ３活性を直接的に阻害し、β−カテニンのリン酸化およびその後のユビキチン媒介性プロテアソーム分解を遮断することができる。
【０００６】
非Ｗｎｔアゴニストは、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）およびＲ−スポンジン（Ｓｐｏｎｄｉｎ）を含む。ノリンは、ＬＲＰ５と複合体形成するＦｚ４特異的リガンドである。４種のＲ−スポンジン遺伝子は、Ｗｎｔ経路を増強する保存された分泌タンパク質のファミリーを表す。ＬＧＲ４／５／６（ロイシンリッチ反復含有ＧＰＣＲ４、５および６）は、Ｒ−スポンジンの受容体である。Ｒ−スポンジンの役割は、Ｗｎｔ受容体のＦｚおよびＬＲＰ６を安定化して、Ｗｎｔシグナリングを促進するようである。
【０００７】
近年、１型膜貫通タンパク質であるＴｉｋｉが、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ胚における軸形成を撹乱したｍＲＮＡをスクリーニングする発現クローニングにおいて同定された（Ｚｈａｎｇら、２０１２年）。Ｔｉｋｉは、成熟Ｗｎｔタンパク質のＮ末端８アミノ酸を切断する新規メタロプロテアーゼであることが示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＷｎｔのこのようなＮ末端断片のＴｉｋｉ媒介性切断は、酸化およびジスルフィド結合形成により、可溶性の大型オリゴマーＷｎｔ複合体の形成をもたらす。このような大型で不活性なタンパク質分解されたＷｎｔ複合体の形成が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＷｎｔ経路におけるＴｉｋｉの作用機構であるか否かは、依然として不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、水溶性の薬学的に活性を有するｗｎｔ組成物の開発には大きな関心が持たれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
Ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子およびその使用のための方法が提供される。本発明の分子は、水溶性であり；（ｉ）フリズルド（Ｆｚｄ）タンパク質および（ｉｉ）Ｌｒｐ５／６の両方と高親和性で結合し；カノニカルｗｎｔ経路シグナリングを直接的に活性化する。ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子は、Ｆｚｄのアゴニストとして作用し、ｗｎｔ経路シグナリングを活性化する方法における用途を見出す。一部の実施形態では、ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子は、ヒトＦｚｄタンパク質およびＬｒｐ５／６タンパク質に結合する。本発明の分子は、有機小分子およびポリペプチドを限定することなく含む。
【００１０】
本発明の一部の実施形態では、ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子は、Ｆｚｄに対するおよびＬｒｐ５／６に対する離間したまたは近接した結合ドメインまたはエレメントを含むことができるポリペプチドである。ポリペプチドｗｎｔシグナリングアゴニストは、単鎖、二量体またはより高次の多量体であってよい。Ｆｚｄ結合ドメイン／エレメントおよびＬｒｐ５／６結合ドメイン／エレメントは、直接的に接続されても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてもよい。
【００１１】
ポリペプチドの実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、高親和性で、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍまたは少なくとも約１×１０−１０ＭのＫＤでＦｚｄに結合するいずれかのドメインから選択することができる。適したＦｚｄ結合ドメインは、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計されたＦｚｄ結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ等および１種または複数種のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する抗体の他の部分；ナノボディ由来の結合ドメイン；ノッチンに基づく操作された足場；ノリンおよびこれに由来する操作された結合性断片、天然起源のＦｚｄ結合ドメインなどを限定することなく含む。Ｆｚｄ結合ドメインは、所望のＦｚｄタンパク質または複数のＦｚｄタンパク質への結合を増強するよう、例えば、組織選択性をもたらすように親和性選択することができる。
【００１２】
一部の実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、１、２、３、４、５種またはそれを超える異なるフリズルドタンパク質、例えば、ヒトフリズルドタンパク質Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ３、Ｆｚ４、Ｆｚ５、Ｆｚ６、Ｆｚ７、Ｆｚ８、Ｆｚ９、Ｆｚ１０のうち１種または複数種に結合する。一部の実施形態では、抗体に基づくシグナリングアゴニストは、Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ５、Ｆｚ７およびＦｚ８に結合する。他の実施形態では、フリズルド結合部分は、１種または複数種の目的のフリズルドタンパク質に選択的である、例えば、他のフリズルドタンパク質と比べて少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍またはそれを超える、１種または複数種の所望のフリズルドタンパク質に対する特異性を有する。
【００１３】
ポリペプチドの実施形態では、Ｌｒｐ５／６結合ドメインまたはエレメントは、高親和性で、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０ＭのＫＤでＬｒｐ５／６に結合するいずれかのドメインから選択することができる。適したＬｒｐ５／６結合ドメインは、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計されたＬｒｐ５／６結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ等および１種または複数種のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する抗体の他の部分；ナノボディ由来の結合ドメイン；ノッチンに基づく操作された足場；ノリン、ＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチンを限定することなく含む天然起源のＬｒｐ５／６結合タンパク質またはポリペプチド；などを限定することなく含む。ある特定の実施形態では、Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、ＤＫＫ１のｃ末端部分である。Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、結合を増強するように親和性選択することができる。
【００１４】
ｗｎｔシグナリングアゴニストポリペプチドは、ｗｎｔ活性化を増強するための作用物質（ａｇｅｎｔ）と融合、連結あるいは共投与することができる。ｗｎｔ活性を増強するポリペプチドは、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、抗スクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｉｎ）抗体等を限定することなく含む。
【００１５】
ｗｎｔシグナリングアゴニストポリペプチドは、骨成長、皮膚再生、幹細胞活性化などに活性を有する増殖因子を含む目的の増殖因子と融合、連結あるいは共投与することができる。
【００１６】
Ｆｚｄ結合ドメインおよびＬｒｐ５／６結合ドメインは、１個の球状ドメイン内で近接していても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてもよい。リンカーの長さ、したがって、結合ドメイン間のスペーシングは、シグナル強度のモジュレートに使用することができ、ｗｎｔシグナリングアゴニストの所望の使用に応じて選択することができる。結合ドメイン間の強制された距離は、変動し得るが、ある特定の実施形態では、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満または約５０オングストローム未満であってよい。
【００１７】
一部の実施形態では、リンカーは、硬いリンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。リンカーは、ペプチドリンカーである場合、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれを超えるアミノ酸の長さであってよく、結合ドメイン間の距離の強制に十分な長さおよびアミノ酸組成である。一部の実施形態では、リンカーは、１個または複数個のグリシンおよび／またはセリン残基を含むまたはそれからなる。
【００１８】
ｗｎｔシグナリングアゴニストは、例えば、Ｆｃドメインを介して、連鎖（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）、コイルドコイル、ポリペプチドジッパー、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン多量体化などにより、多量体化することができる。ｗｎｔシグナリングアゴニストは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を増強することが当技術分野で公知のＰＥＧ、Ｆｃ等の部分に接続することもできる。
【００１９】
目的の組成物は、薬学的に許容される賦形剤に有効用量のｗｎｔシグナリングアゴニストを限定することなく含む。組成物は、追加的な作用物質、例えば、アジュバントなどを含むことができる。Ｗｎｔシグナリングアゴニストは、合成により；当技術分野で公知の様々な適した組換え方法などにより産生することができる。加えて、水溶型のｗｎｔシグナリングアゴニストの利益は、その治療有用性を限定し得る製剤添加物、例えば、脂質、界面活性剤等の必要性を欠くことである。
【００２０】
本発明の一部の態様では、細胞におけるＷｎｔシグナリングを活性化、増加または増強するための方法が提供される。斯かる方法において、フリズルド受容体を発現する細胞は、シグナリングの増加に、例えば、ｗｎｔシグナリングアゴニストの非存在下でのシグナリングと比べて２５％、５０％、７５％、９０％、９５％またはそれを超えるシグナリングの増加に有効な、ある濃度のｗｎｔシグナリングアゴニストと接触される。斯かるシグナリング活性化は、標的化された細胞の増殖を誘導することができ、このような細胞は、幹細胞を限定することなく含む、または標的化された細胞におけるＷｎｔシグナリング経路を他の仕方で活性化することができる。一部の方法において、受容体発現細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触される。他の実施形態では、受容体発現細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで接触される。目的の細胞は、当技術分野で公知の多種多様なＦｚｄ受容体発現細胞、例えば、皮膚細胞、腸細胞、骨芽細胞、幹細胞等を含む。
【００２１】
本発明の一部の態様では、それを必要とする被験体における疾患または障害を処置または防止するための方法であって、有効量のｗｎｔシグナリングアゴニストを被験体に与えるステップを含む方法が提供される。特定の実施形態では、被験体は、ｗｎｔシグナリングの低下に関連する疾患または障害を有する。
【００２２】
本発明の一部の態様では、それを必要とする被験体における創傷治癒および／または組織生成を増強するための方法であって、有効量のｗｎｔシグナリングアゴニストを被験体に与えるステップを含む方法が提供される。本発明の組成物および方法の利益は、標的化の特異性およびシグナリングアゴニストの水溶性であり、このようなｗｎｔシグナリングアゴニストは、ネイティブｗｎｔタンパク質と同じ細胞を標的とすることができる、または所望の組織におけるｗｎｔシグナリングを選択的に活性化することができる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｌｒｐ５／６とフリズルド（Ｆｚｄ）受容体を二量体化させる水溶性カノニカルＷｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２）
カノニカルｗｎｔシグナリングを直接的に活性化する、項目１に記載のＷｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目３）
分子がポリペプチドを含む、項目２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目４）
前記ポリペプチドが、１種または複数種のＦｚｄタンパク質に対し高親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５およびＬｒｐ６タンパク質の一方または両方に対し高親和性を有する結合ドメインとを含む、項目３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目５）
前記結合ドメイン同士が、直接的に接続されている、項目４に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目６）
前記結合ドメイン同士が、リンカーを介して接続されている、項目４に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目７）
代替物が、中立物質または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも５０％増強する、項目１から６のいずれかに記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目８）
前記代替物が、中立物質または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも１０倍増強する、項目７に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目９）
前記代替物が、中立物質または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも１０００倍増強する、項目７に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１０）
前記代替物が、ヒト細胞におけるβ−カテニンシグナリングを増強する、項目７から９のいずれかに記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１１）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、少なくとも約１×１０−７ＭのＫＤで、１種または複数種のＦｚｄタンパク質に結合する、項目４に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１２）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、ポリペプチドである、項目１１に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１３）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計されたＦｚｄ結合ドメインである、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１４）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、抗体由来の結合タンパク質である、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１５）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、ナノボディ由来の結合ドメインである、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１６）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、ノッチンを操作した足場である、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１７）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、ノリンタンパク質またはそれに由来する結合性断片である、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１８）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、所望の特異性のために親和性選択された、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目１９）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、２種またはそれを超える異なるフリズルドタンパク質に結合する、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２０）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、目的のフリズルドタンパク質に対し選択的である、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２１）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、抗Ｆｚｄ抗体の６個のＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２２）
前記Ｆｚｄ結合ドメインが、汎特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５の６個のＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである、項目１２に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２３）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、少なくとも約１×１０−７ＭのＫＤで、Ｌｒｐ５およびＬｒｐ６タンパク質の一方または両方に結合する、項目４に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２４）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、ポリペプチドである、項目２３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２５）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計されたＦｚｄ結合ドメインである、項目２３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２６）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、抗体由来の結合タンパク質である、項目２３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２７）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、ナノボディ由来の結合ドメインである、項目２３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２８）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、ノッチンを操作した足場である、項目２３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目２９）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、ＤＫＫタンパク質の結合部分を含む、項目２３に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目３０）
前記Ｌｒｐ５／６結合ドメインが、ヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメインを含む、項目２９に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目３１）
前記結合ドメイン同士が、２〜１００アミノ酸を含むペプチドリンカーによって接続されている、項目１から３０のいずれか一項に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目３２）
前記リンカーが、約１００オングストローム未満の結合ドメイン間の距離を強制する、項目３１に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目３３）
前記結合ドメイン同士が、非ペプチドリンカーによって接続されている、項目１から３０のいずれか一項に記載のｗｎｔシグナリングアゴニスト。
（項目３４）
項目１から３３のいずれか一項に記載のｗｎｔシグナリングアゴニストと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目３５）
ｗｎｔシグナリングを活性化または増強する方法であって、有効用量の項目１から３３のいずれか一項に記載のｗｎｔシグナリングアゴニストと、フリズルド受容体を発現する細胞とを接触させるステップを含む方法。
（項目３６）
疾患または障害を処置または防止することを必要とする被験体における疾患または障害を処置または防止する方法であって、有効量の項目１から３３のいずれか一項に記載のｗｎｔシグナリングアゴニストを該被験体に与えるステップを含む方法。
（項目３７）
前記被験体が、ｗｎｔシグナリング低下に関連する疾患または障害を有する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体が、放射線照射／化学療法傷害、粘膜炎、炎症性腸疾患、短腸症候群、遺伝性腸障害、セリアック病、代謝性疾患、遺伝性症候群、ウイルス感染症（例えば、ｈｅｐＢ／Ｃ）、中毒状態、アルコール性肝臓、脂肪肝、肝硬変、感染症、悪性貧血、潰瘍、糖尿病、糖尿病性足部潰瘍（例えば、難治性糖尿病性足部潰瘍）、島細胞の破壊、骨質量の損失（骨粗鬆症）、機能的皮膚の損失、毛髪の損失、機能的肺組織の損失、腎臓組織の損失（例えば、急性細管壊死）、内耳における感覚性細胞の損失、関節障害、骨粗鬆症および関連する骨疾患、禿頭症ならびに移植片対宿主病から選択される疾患または障害を有する、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
創傷治癒および／または組織生成を増強することを必要とする被験体における創傷治癒および／または組織生成を増強する方法であって、有効量の項目１から３３のいずれか一項に記載のｗｎｔシグナリングアゴニストを該被験体に与えるステップを含む方法。
【００２３】
本発明は、添付の図面と併せて読むと、次の詳細な記載から最も良く理解される。慣行に従い、図面の様々な特色が一定の縮尺（ｔｏ−ｓｃａｌｅ）ではないことが強調される。その反対に、様々な特色の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小されている。図面には、次の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、親和性成熟に寄与する、設計されたＦｚｄ２７バリアントにおける界面、コアおよび構造残基を示す。
【００２５】
【図２】図２は、Ｆｚ２７−Ｂ１２が、高親和性でＦｚ８に結合することを示す。蛍光コンジュゲートされたＦｚ８−ＣＲＤを使用した酵母表面ディスプレイによる結合の確認を可能にする構築物において、Ｆｚ２７を発現させた。ノックアウト変異（Ａ１７３Ｒ／Ａ１７４Ｄ）は、結合を排除または有意に抑止し、タンパク質が、設計された結合モードにより結合したことを示す。設計の作製に使用された野生型足場（２ＱＵＰ）は、結合せず、これは、結合活性が、合理的操作によるものであることを示す。
【００２６】
【図３】図３は、設計されたタンパク質のフリズルド特異性を示す。酵母表面力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）から得られるおよそのＫｄは、Ｆｚｄ８−ＣＲＤへの結合の合理的実用的な設計のおかげで、Ｆｚｄ４−ＣＲＤと比較して、Ｆｚｄ８−ＣＲＤに高度に特異的であるとＦｚ２７バリアントを決定した。Ｆｚｄ４−ＣＲＤを上回るＦｚｄ８−ＣＲＤに対する現存する優先度は、フリズルドサブタイプ間を識別することができる結合剤を設計する能力を実証する。
【００２７】
【図４】図４は、Ｂ１２−ＤＫＫ１ｃがＸＷｎｔ８活性を再現し（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）、Ｆｚｄ５およびＦｚｄ８を過剰発現するマウスＬ−細胞におけるＷｎｔシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化することを示す。７個のＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位の上流コンカテマーを有するホタルルシフェラーゼレポーターであるＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈレポーターを安定的にトランスフェクトし、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ８または偽プラスミドを一過的にトランスフェクトしたマウスＬ−細胞を、ＸＷｎｔ８またはＢ１２−ＤＫＫ１ｃで１６〜２０時間処理した。その後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼのＷｎｔシグナリング依存性発現を、デュアル−ルシフェラーゼレポーター系により検出した。
【００２８】
【図５】図５は、ｓｃＦｖドメインおよびＬｒｐ５／６結合ドメインを描写する、例示的な代替ｗｎｔアゴニストのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃは、リンカー１によって接続された軽鎖の可変領域および軽鎖の可変領域として表示された（ｌａｂｅｌｅｄ  ａｓｓ）ＯＭＰ−１８Ｒ５抗体のｓｃＦｖ断片（Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ならびに柔軟なポリペプチドリンカー２によって共有結合により連結されたヒトＤＫＫ−１のＣ末端ドメインを含む。
【００２９】
【図６】図６は、Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定されたＦｚｄ１ＣＲＤ、Ｆｚｄ５ＣＲＤ、Ｆｚｄ７ＣＲＤおよびＦｚｄ８ＣＲＤへの可溶性ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃの結合を測定する表面プラズモン共鳴実験を示す。
【００３０】
【図７】図７は、Ｒ−スポンジン２（Ｒｓｐｏ２）が、馴化培地において送達されるＷｎｔ３ａの活性を増強するのと匹敵する様式で、Ｗｎｔ代替アゴニストｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃ（ＤＫＫ１ｃ）の活性を増強して、Ａ３７５  ｐＢＡＲ細胞およびＳＹ５Ｙ  ｐＢＡＲ細胞におけるＷｎｔシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化することを示す。ホタル（ｆｉｒｅｌｙ）ルシフェラーゼレポーターの上流に１２個のＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位のコンカテマーを含有するＷｎｔ依存性ｐＢＡＲレポーターで細胞を安定的にトランスフェクトしたことを除いて、図４と同様にアッセイを行った。
【００３１】
【図８ＡＢ】図８Ａ〜図８Ｃは、図８Ａ）非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９  ｐＢＡＲ、図８Ｂ）メラノーマ細胞株Ａ３７５  ｐＢＡＲおよび図８Ｃ）神経芽細胞腫細胞株ＳＹ５Ｙ  ｐＢＡＲにおける代替リガンドによるＷｎｔ依存性ｐＢＡＲレポーターのフリズルドサブタイプ特異的活性化を示す。ｐＢＡＲレポーターの発現を誘導するための、ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃおよびＢ１２−ＤＫＫ１ｃ代替リガンド、ＸＷｎｔ８、Ｂ１２、ＤＫＫ１および無関係のタンパク質の活性を、様々な異なる濃度（図の下に示す）で測定した。増強されたレポーター発現は、代替Ｗｎｔアゴニストのフリズルド特異性およびｑＲＴ−ＲＣＲによって決定される対応する細胞のフリズルド発現プロファイルと相関する。ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、Ｂ１２−ＤＫＫ１ｃおよびＸＷｎｔ８のフリズルド反応性は、表に示し、対応する細胞のフリズルド発現プロファイルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定して、マークされたボックスで示し、対応するリガンドによるＷｎｔレポーター活性化は、図の下の表におけるマークされたボックスで示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｃは、図８Ａ）非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９  ｐＢＡＲ、図８Ｂ）メラノーマ細胞株Ａ３７５  ｐＢＡＲおよび図８Ｃ）神経芽細胞腫細胞株ＳＹ５Ｙ  ｐＢＡＲにおける代替リガンドによるＷｎｔ依存性ｐＢＡＲレポーターのフリズルドサブタイプ特異的活性化を示す。ｐＢＡＲレポーターの発現を誘導するための、ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃおよびＢ１２−ＤＫＫ１ｃ代替リガンド、ＸＷｎｔ８、Ｂ１２、ＤＫＫ１および無関係のタンパク質の活性を、様々な異なる濃度（図の下に示す）で測定した。増強されたレポーター発現は、代替Ｗｎｔアゴニストのフリズルド特異性およびｑＲＴ−ＲＣＲによって決定される対応する細胞のフリズルド発現プロファイルと相関する。ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、Ｂ１２−ＤＫＫ１ｃおよびＸＷｎｔ８のフリズルド反応性は、表に示し、対応する細胞のフリズルド発現プロファイルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定して、マークされたボックスで示し、対応するリガンドによるＷｎｔレポーター活性化は、図の下の表におけるマークされたボックスで示す。
【００３２】
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、Ｌ−細胞における代替リガンドによるＷｎｔシグナリング依存性ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈレポーターのフリズルドサブタイプ特異的活性化を示す。図９Ａ）ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃは、フリズルド７を優勢に発現するＬ−細胞におけるＷｎｔシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現を活性化するが、これらの細胞は、Ｆｚｄ５／８特異的Ｂ１２−ＤＫＫ１ｃ代替リガンドならびにＸＷｎｔ８または単離されたＢ１２およびＤＫＫ−１に対し応答性ではない。図９Ｂ／図９Ｃ）Ｌ−細胞におけるＢ１２−ＤＫＫ１ｃおよびＸＷｎｔ８の活性は、一過的トランスフェクションによるフリズルド５およびフリズルド８の過剰発現によってレスキューすることができる。
【００３３】
【図１０】図１０は、Ａ５４９細胞におけるＷｎｔシグナリング依存性ｐＢＡＲレポーターの発現を誘導するためのＢ１２−ＤＫＫ１ｃの活性が、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃ（Ｂ１２への結合による）、ＤＫＫ−１（Ｌｒｐ５／６への結合による）およびＢ１２（Ｆｚｄ５およびＦｚｄ８への結合による）によって阻害することができるが、Ｂ１２に結合しないため、Ｆｚｄ１ＣＲＤ−Ｆｃによっては阻害することができないことを示す。Ａ５４９細胞におけるＷｎｔシグナリング依存性ｐＢＡＲレポーターの発現を誘導するためのｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏｍｅｄ）−ＤＫＫ１ｃの活性は、Ｆｚｄ１ＣＲＤ−Ｆｃ、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃへの結合による）およびＤＫＫ−１（Ｌｒｐ５／６への結合による）によってアンタゴナイズすることができるが、Ｂ１２は、フリズルドへのｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）の結合を阻害しないため、Ｂ１２によってはアンタゴナイズすることができない。図４の通りにアッセイを行った。
【００３４】
【図１１】図１１は、増加する濃度のｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃまたはＷｎｔ３ａ含有馴化培地（ＣＭ）によるＳＹ５Ｙ  ｐＢＡＲ細胞の２時間処理が、基本の（ｐｌａｉｎ）培地（ｎｅｇ  ｃｔｒ）、陰性対照タンパク質Ｂ１２（Ｎｅｇ  ｃｔｒｌ（ｎＭ））または対照馴化培地（偽ＣＭ）による処理と比較して、細胞質ベータ−カテニンの蓄積をもたらすことを示す。表示の処理で細胞を２時間処理し、その後、等張性溶解バッファーに細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングによって可溶性画分から細胞質ベータ−カテニンを検出した。ラミンＡ／Ｃをローディング対照として使用した。
【００３５】
【図１２】図１２は、ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃが、Ｗｎｔ様の様式で、様々な細胞株における直接的Ｗｎｔ標的遺伝子アキシン２およびＴｒｏｙの転写を誘導することを示す。ＳＹ５Ｙ  ｐＢＡＲ細胞およびＡ３７５  ｐＢＡＲ細胞を、５０ｎＭ  ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃ、５０ｎＭ  Ｂ１２または３０％Ｗｎｔ３ａ−Ｌ馴化培地で２４時間処理した。ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ標的遺伝子アキシン２およびＴｒｏｙ転写物のレベルを検出した。
【００３６】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、代替Ｗｎｔリガンドの柔軟なリンカーの長さを変更し、それによって、フリズルド／Ｌｒｐ５／６二量体化の幾何学的配置を変更すると、Ｗｎｔ標的遺伝子転写（図１３Ａ）およびＷｎｔシグナリング依存性ルシフェラーゼレポーターの発現（図１３Ｂ）によって観察されるシグナリングの大きさが変化することを示す。Ａ）２μＭ  ＩＷＰ−２の存在下でＡ５４９  ｐＢＡＲ細胞を、５０ｎＭのＸＷｎｔ８、５０ｎＭの０ａａ、５ａａ、１０ａａおよび１５ａａリンカーを有するＢ１２−ＤＫＫ１ｃまたは３０％Ｗｎｔ３ａ−Ｌ馴化培地で２４時間処理した。ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ標的遺伝子アキシン２転写物のレベルを検出した。図１３Ｂ）増加する濃度のＸＷｎｔ８および可変的なリンカーの長さを有するＢ１２−ＤＫＫ１ｃバリアントによるＡ５４９  ｐＢＡＲ細胞におけるレポーター活性化の大きさを、図４に記載されている通りに２ｕＭ  ＩＷＰ−２の存在下で評価した。
【００３７】
【図１４】図１４は、ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃが、Ｗｎｔ様の様式で、ＳＹ５Ｙ細胞およびＡ３７５細胞における細胞質ベータ−カテニンの蓄積を増強することを示す。ＳＹ５Ｙ細胞およびＡ３７５細胞を、表示濃度のｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃ、馴化培地または陰性対照で２時間処理した。２時間後に、等張性溶解バッファーに細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングによって可溶性画分から細胞質ベータ−カテニンを検出した。アルファ−チューブリンをローディング対照として使用した。
【００３８】
【図１５】図１５は、Ｒ−スポンジン２がｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃの活性を強く増強して、Ｗｎｔ３ａに匹敵するレベルまで、ＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔシグナリング依存性ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈレポーターの発現を誘導することを示す。ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ  Ｗｎｔレポーターを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、２０ｎＭ  Ｒｓｐｏ２ありおよびなしで１６〜２０時間、ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃ（４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３１ｎＭ、６２ｎＭ）、Ｗｎｔ３ａ（２３％、２９％、３３％、３８％、４１％、４４％）で１６〜２０時間処理した。増強されたルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系により検出した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本方法および組成物について記載する前に、記載されている特定の方法または組成物は当然ながら変動し得るため、本発明が、記載されている特定の方法または組成物に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書に使用されている用語法が、単に特定の実施形態について記載することを目的としており、限定を目的としないことも理解されたい。
【００４０】
値の範囲が提示されている場合、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、この範囲の上限および下限の間の、それぞれ介在する値も、下限の単位の１０分の１まで、特に開示されていることが理解される。記述されている範囲内のいずれか記述されている値または介在する値と、この記述されている範囲内のいずれか他の記述されている値または介在する値との間のそれぞれのより狭い範囲が、本発明の内に包含される。このようなより狭い範囲の上限および下限は独立に、この範囲に含まれても除外されてもよく、上限と下限のいずれか一方またはその両方が、より狭い範囲に含まれるまたはどちらも含まれないような各範囲も、本発明の内に包含され、記述されている範囲のいずれか特に除外される限界の対象となる。記述されている範囲が、限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれか一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００４１】
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様または均等のいかなる方法および材料を使用することもできるが、いくつかの有望な好まれる方法および材料についてここに記載する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物は、刊行物が引用されているものに関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に援用する。矛盾が生じる程度まで、本開示が、援用されている刊行物のいかなる開示にも優先することが理解される。
【００４２】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されている場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。よって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」の言及は、複数の斯かる細胞を含み、「ペプチド（ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」の言及は、当業者に公知の通り、１個または複数個のペプチドおよびその均等物、例えば、ポリペプチドの言及を含む、等々。
【００４３】
本明細書に記述されている刊行物は、単に、本願の出願日に先立つその開示のために提示されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明によって、斯かる刊行物に先行する権利を与えられていないことの承認として解釈するべきではない。さらに、提示されている刊行物の日付は、場合により独立に確認される必要がある実際の刊行日と異なっていてよい。
【００４４】
「を含む」とは、列挙されているエレメントが、組成物／方法／キットにおいて必要とされるが、特許請求の範囲内の他のエレメントが含まれて、組成物／方法／キット等を構成してもよいことを意味する。例えば、ｗｎｔ代替物を含む組成物は、ｗｎｔ代替物（複数可）に加えて他のエレメント、例えば、当技術分野で容易に理解される通り、いずれかの否定的条件（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｖｉｓｏｓ）によって包含されるエレメントを除く、ｗｎｔ代替物に結合、例えば、共有結合されたポリペプチド、小分子または核酸等、機能的部分；ｗｎｔ代替組成物の安定性を促進する作用物質、ｗｎｔ代替組成物の溶解性を促進する作用物質、アジュバント等を含むことができる組成物である。
【００４５】
「から本質的になる」とは、対象発明の基本および新規特徴（複数可）に実質的に影響を与えない指定されている材料またはステップへの、記載されている組成物または方法の範囲の限定を意味する。例えば、開示されている配列「から本質的になる」ｗｎｔ代替物は、これが由来する配列に基づく配列の境界における、開示されている配列プラスまたはマイナス約５アミノ酸残基の、例えば、列挙されている境界アミノ酸残基よりも約５残基、４残基、３残基、２残基もしくは約１残基少ない、または列挙されている境界アミノ酸残基よりも約１残基、２残基、３残基、４残基もしくは５残基多いアミノ酸配列を有する。
【００４６】
「からなる」とは、組成物、方法またはキットから、特許請求の範囲において指定されていないいかなるエレメント、ステップまたは成分も除外することを意味する。例えば、開示されている配列「からなる」ｗｎｔ代替物は、開示されているアミノ酸配列のみからなる。
【００４７】
「機能的部分」または「ＦＭ」とは、組成物に機能的活性を付与するポリペプチド、小分子または核酸組成物を意味する。機能的部分の例として、治療部分、結合部分およびイメージング部分が限定することなく挙げられる。
【００４８】
「治療部分」または「ＴＭ」とは、組成物に治療活性を付与するポリペプチド、小分子または核酸組成物を意味する。治療部分の例として、細胞にとって内因的に有害な細胞毒、例えば、小分子化合物、タンパク質毒素および放射線増感部分、すなわち、放射性核種等；細胞の活性を変更する作用物質、例えば、小分子、ペプチド模倣物、サイトカイン、ケモカイン；ならびにＡＤＣＣまたはＣＤＣ依存性死亡のために細胞を標的とする部分、例えば、免疫グロブリンのＦｃ構成成分が挙げられる。
【００４９】
「イメージング部分」または「ＩＭ」とは、細胞、例えば、対象出願の組成物によって標的化された細胞の位置決定および任意選択で可視化に使用することができる非細胞傷害性作用物質を意味する。
【００５０】
用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味するように本明細書において使用されている。効果は、疾患もしくはその症状の完全もしくは部分的な防止に関して予防的となることができる、および／または疾患および／または疾患に起因し得る有害作用の部分的もしくは完全治癒に関して治療的となることができる。「処置」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物における疾患のいずれかの処置を網羅し、（ａ）疾患の素因がある可能性があるが、未だ疾患を有するとは診断されていない被験体における疾患発生の防止；（ｂ）疾患の阻害、すなわち、その発症の抑止；または（ｃ）疾患の軽減、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発症の前、最中または後に投与することができる。患者の望ましくない臨床症状を安定化または低下する、進行中の疾患の処置には、特に関心が持たれる。斯かる処置は、罹患組織において機能が完全に喪失するより前に行われるのが望ましい。対象治療法は、疾患の症候性ステージの間に投与することができ、一部の事例では、疾患の症候性ステージの後に投与することができる。
【００５１】
用語「個体」、「被験体」、「宿主」および「患者」は、本明細書において互換的に使用されており、診断、処置または治療法が望まれるいずれかの哺乳動物被験体、特に、ヒトを指す。
【００５２】
分子および細胞生化学における一般的方法は、その開示が参照により本明細書に援用される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１年）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９年）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６年）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９年）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（ＫａｐｌｉｆｔおよびＬｏｅｗｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５年）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７年）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤｏｙｌｅおよびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８年）等の標準的な教科書に見出すことができる。本開示において参照されている遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌｏｎＴｅｃｈ等の商業的ベンダーから入手することができる。
【００５３】
組成物
本明細書において代替分子とも称されるＷｎｔシグナリングアゴニストおよびその使用のための方法が提供される。本発明の上記および他の目的、利点および特色は、より十分に後述する組成物および方法の詳細を読むことにより、当業者に明らかとなる。
【００５４】
Ｗｎｔ代替分子は、その物理的および生物学的特性により定義される。鍵となる特色は、水溶性であることと、１種または複数種のＦｚｄタンパク質およびＬｒｐ５／６への結合を介する、特に、細胞表面、例えば、ヒト細胞の表面におけるこれらのタンパク質への結合によるカノニカルｗｎｔシグナリングの直接的活性化である。ｗｎｔ代替物によるｗｎｔシグナリングの直接的活性化は、ネイティブｗｎｔタンパク質が存在する場合にのみ活性を増強する、ｗｎｔシグナリングの増強とは対照的である。
【００５５】
ｗｎｔ代替物は、水溶性であることと、１種または複数種のＦｚｄタンパク質およびＬｒｐ５／６への結合を介するカノニカルｗｎｔシグナリングの直接的活性化の特性を有するいずれかの分子、例えば、タンパク質または医薬品であってよい。約１５Ｋｄ未満であり得る小分子を目的とし、これは、本明細書に記載されている化合物スクリーニングにより開発することができる。ポリペプチドも目的とする。加えて、ある特定のｗｎｔ代替物は、ポリペプチド領域またはドメインおよび非ポリペプチド領域またはドメインの両方を含むことができる。
【００５６】
ｗｎｔ代替物は、ポリペプチドであってよく、Ｆｚｄに対する結合ドメインは、Ｌｒｐ５／６に対する結合ドメインに接続される。ポリペプチドｗｎｔ代替物は、単鎖、二量体またはより高次の多量体であってよい。Ｆｚｄ結合ドメインおよびＬｒｐ５／６結合ドメインは、直接的に接続されていても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてもよい。
【００５７】
本発明のＷｎｔ代替物は、通常、同族フリズルド受容体への結合およびｗｎｔシグナリングの活性化において生物学的に活性である、すなわち、この代替物は、ｗｎｔアゴニストである。用語「ｗｎｔアゴニスト活性」は、フリズルドタンパク質に結合するｗｎｔタンパク質の効果または活性を模倣するアゴニストの能力を指す。ｗｎｔの活性を模倣する本発明のアゴニストの能力は、多数のアッセイによって確認することができる。本発明のアゴニストは、典型的に、受容体の天然リガンドによって惹起されるものと同様のまたは同じ反応または活性を惹起する。特に、本発明のアゴニストは、カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路を増強する。本明細書において使用される場合、用語「増強する」は、本発明のアゴニストの非存在下でのレベルと比較した、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルの測定可能な増加を指す。
【００５８】
カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを測定するための様々な方法が、当技術分野で公知である。これらとして、Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子発現；ＴＣＦレポーター遺伝子発現；ベータ−カテニン安定化；ＬＲＰリン酸化；細胞質から形質膜へのアキシンの移行およびＬＲＰへの結合を測定するアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路は、最終的に、転写因子ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦ７Ｌ２およびＬＥＦを介する遺伝子発現の変化をもたらす。Ｗｎｔ活性化に対する転写応答は、多数の細胞および組織において特徴付けられている。そのため、当技術分野で周知の方法による網羅的転写プロファイリングを使用して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング活性化を評価することができる。
【００５９】
ｗｎｔ応答性遺伝子発現の変化は、一般に、ＴＣＦおよびＬＥＦ転写因子によって媒介される。ＴＣＦレポーターアッセイは、ＴＣＦ／ＬＥＦ制御される遺伝子の転写の変化を評価して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを決定する。ＴＣＦレポーターアッセイは最初に、Ｋｏｒｉｎｅｋ，  Ｖ．ら、１９９７年によって記載された。ＴＯＰ／ＦＯＰとしても公知のこの方法は、内在性β−カテニン／ＴＣＦ４のトランス活性化活性を決定するための、ルシフェラーゼ発現を駆動する最小ｃ−Ｆｏｓプロモーターの上流の、３コピーの最適ＴＣＦモチーフＣＣＴＴＴＧＡＴＣまたは３コピーの変異体モチーフＣＣＴＴＴＧＧＣＣの使用を伴う（それぞれｐＴＯＰＦＬＡＳＨおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨ）。これら２種のレポーター活性（ＴＯＰ／ＦＯＰ）のより高い比は、より高いβ−カテニン／ＴＣＦ４活性を示す。
【００６０】
Ｗｎｔシグナルに応答する様々な他のレポーター導入遺伝子は、動物においてインタクトで存在し、したがって、内在性Ｗｎｔシグナリングを有効に反映する。これらのレポーターは、ＬａｃＺまたはＧＦＰの発現を駆動する多量体化したＴＣＦ結合部位に基づき、この発現は、当技術分野で公知の方法によって容易に検出可能である。これらのレポーター遺伝子は、ＴＯＰ−ＧＡＬ、ＢＡＴ−ＧＡＬ、ｉｎｓ−ＴＯＰＥＧＦＰ、ｉｎｓ−ＴＯＰＧＡＬ、ＬＥＦ−ＥＧＦＰ、アキシン２−ＬａｃＺ、アキシン２−ｄ２ＥＧＦＰ、Ｌｇｒ５ｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）、ＴＯＰｄＧＦＰを含む。
【００６１】
膜への脱リン酸化されたβ−カテニンのリクルート、β−カテニンの安定化およびリン酸化状態、ならびに核へのβ−カテニンの移行（Ｋｌａｐｈｏｌｚ−Ｂｒｏｗｎ  Ｚら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２巻（９号）ｅ９４５頁、２００７年）は、場合によりＴＣＦ転写因子およびＴＮＩＫとの複合体形成によって媒介され、Ｗｎｔシグナリング経路における鍵となるステップである。安定化は、細胞内β−カテニンの分解が低下され、その後に核へのβ−カテニンの移行が続くように、「分解」複合体を阻害するディシェベルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ）ファミリータンパク質によって媒介される。したがって、細胞におけるβ−カテニンのレベルおよび位置の測定は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルの優れた反映である。斯かるアッセイの非限定例は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＣ末端に融合されたヒトβ−カテニンを安定的に発現する組換えＵ２ＯＳ細胞をもたらす「ＢｉｏＩｍａｇｅ  β−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。イメージングおよび解析は、ＥＧＦＰ−β−カテニンのレベルおよび分布の可視化を可能にする蛍光顕微鏡またはＨＣＳプラットフォームにより行われる。
【００６２】
分解複合体が阻害される別の仕方は、Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰの細胞質テイルへのアキシンのリクルートによるアキシンの除去によって為される。アキシンは、ＬＲＰテイルのリン酸化型に優先的に結合することが示された。例えば、ＧＦＰ−アキシン融合タンパク質によるアキシン移行の可視化は、したがって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを評価するための別の方法である。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本発明の代替物は、上記のアッセイにおいて測定される通り、例えば、ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイにおいて測定される通り、中立物質（ｎｅｕｔｒａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）または陰性対照によって誘導されるβ−カテニンシグナリングと比較して、β−カテニンシグナリングを少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％増強することができる。陰性対照は、これらのアッセイに含まれてよい。特定の実施形態では、本発明の代替物は、上記のアッセイにおいて測定される場合、例えば、ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイまたは本明細書に言及されている他のアッセイのいずれかにおいて測定される場合、アゴニストの非存在下での活性と比較して、β−カテニンシグナリングを２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍またはそれを超えて増強することができる。
【００６４】
「Ｗｎｔ遺伝子産物」または「Ｗｎｔポリペプチド」は、本明細書に使用される場合、ネイティブ配列Ｗｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチドバリアント、Ｗｎｔポリペプチド断片およびキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、ネイティブヒト全長成熟Ｗｎｔタンパク質である。
【００６５】
例えば、本願における目的のヒトネイティブ配列Ｗｎｔタンパク質は、次のものを含む：Ｗｎｔ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５４３０）；Ｗｎｔ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９１）；Ｗｎｔ−２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１８５（アイソフォーム１）、ＮＭ＿０２４４９４．２（アイソフォーム２））、Ｗｎｔ−３（ＲｅｆＳｅｑ．：ＮＭ＿０３０７５３）、Ｗｎｔ３ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１３１）、Ｗｎｔ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６１）、Ｗｎｔ−５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９２）、Ｗｎｔ−５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２６４２）、Ｗｎｔ−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６５２２）、Ｗｎｔ−７Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４６２５）、Ｗｎｔ−７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８２３８）、Ｗｎｔ−８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０５８２４４）、Ｗｎｔ−８Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９３）、Ｗｎｔ−９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９５）、Ｗｎｔ−９Ｂ（Ｗｎｔ−１５）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９６）、Ｗｎｔ−１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２５２１６）、Ｗｎｔ−１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９４）、Ｗｎｔ−１１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４６２６）、Ｗｎｔ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６０８７））。各メンバーは、ファミリーにより変動する程度の配列同一性を有するが、全て、そのスペーシングが高度に保存された２３〜２４個の保存されたシステイン残基を含有する、小型の（すなわち、３９〜４６ｋＤ）アシル化、パルミトイル化、分泌糖タンパク質をコードする（ＭｃＭａｈｏｎ，  Ａ  Ｐら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２年；８巻：２３６〜２４２頁；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ  Ｒ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２年；３巻（１号）：３００１．１〜３００１．１５頁）。他の目的のネイティブ配列Ｗｎｔポリペプチドは、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蠕虫等、家庭動物および農場動物および動物園、実験動物またはペット動物を含むいずれかの哺乳動物に由来する上記のオルソログを含む。
【００６６】
「Ｗｎｔタンパク質シグナリング」または「Ｗｎｔシグナリング」は、生物学的に活性なＷｎｔが、細胞の活性をモジュレートするよう細胞においてその効果を発揮する機構を指すように本明細書において使用されている。Ｗｎｔタンパク質は、タンパク質のフリズルド（Ｆｚ）ファミリーに由来するタンパク質、タンパク質のＲＯＲファミリーに由来するタンパク質、タンパク質のＬＲＰファミリーに由来するタンパク質ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、タンパク質ＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏおよびタンパク質Ｄｅｒａｉｌｅｄ／Ｒｙｋを含むＷｎｔ受容体に結合することにより細胞活性をモジュレートする。Ｗｎｔ結合によって活性化されると、Ｗｎｔ受容体（複数可）は、１種または複数種の細胞内シグナリングカスケードを活性化する。これらは、カノニカルＷｎｔシグナリング経路；Ｗｎｔ／平面内細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）経路；Ｗｎｔ−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋）経路（Ｇｉｌｅｓ，  ＲＨら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６５３巻、１〜２４頁；Ｐｅｉｆｅｒ，  Ｍ．ら（１９９４年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０巻：３６９〜３８０頁；Ｐａｐｋｏｆｆ，  Ｊ．ら（１９９６年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６巻：２１２８〜２１３４頁；Ｖｅｅｍａｎ，  Ｍ．  Ｔ．ら（２００３年）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ５巻：３６７〜３７７頁）；および当技術分野で周知の通り他のＷｎｔシグナリング経路を含む。
【００６７】
例えば、カノニカルＷｎｔシグナリング経路の活性化は、細胞内タンパク質β−カテニンのリン酸化の阻害をもたらし、サイトゾルにおけるβ−カテニンの蓄積と、その後の核への移行をもたらし、核において、β−カテニンは、転写因子、例えば、ＴＣＦ／ＬＥＦと相互作用して、標的遺伝子を活性化する。Ｗｎｔ／ＰＣＰ経路の活性化は、ＲｈｏＡ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびネモ（ｎｅｍｏ）様キナーゼ（ＮＬＫ）シグナリングカスケードを活性化して、組織極性および細胞運動等の生物学的過程を制御する。例えば、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ＡまたはＷｎｔ−１１の結合によるＷｎｔ／Ｃａ２＋の活性化は、カルシウムイオンの細胞内放出を誘発し、カルシウムイオンは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、カルシウム−カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）またはカルシニューリン（ＣａＣＮ）等のカルシウム感受性酵素を活性化する。上記のシグナリング経路の活性をアッセイすることにより、Ｗｎｔ組成物の生物学的活性を容易に決定することができる。「生物学的に活性なｗｎｔ代替物」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に与えられると、すなわち、動物、例えば、哺乳動物に投与されると、Ｆｚｄ受容体に特異的に結合し、Ｗｎｔシグナリングを活性化することができるｗｎｔ代替組成物である。
【００６８】
ある特定の実施形態では、本発明のｗｎｔ代替物は、代替物の非存在下でのｗｎｔシグナリングのレベルと比べて、カノニカルｗｎｔ経路のシグナリングを少なくとも約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５倍、約１０倍増加させ、シグナリングを５０倍、１００倍、５００倍またはそれを超えて増加させることができる。
【００６９】
用語「特異的な結合」は、共有結合による相互作用もしくは非共有結合による相互作用または共有結合による相互作用および非共有結合による相互作用の組合せによって媒介され得る、酵素／基質、受容体／リガンド、抗体／抗原およびレクチン／炭水化物等の対になった種の間に生じる結合を指す。２種の種の相互作用が、非共有結合した複合体を産生する場合、生じる結合は、典型的には、静電気的相互作用、水素結合相互作用または親油性相互作用の結果である。したがって、「特異的な結合」は、対になった種の間に生じ、そこでは、該２種の間に、抗体／抗原またはリガンド／受容体相互作用の特徴を有する結合した複合体を産生する相互作用が存在する。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に機能的アッセイにおいて活性のレベル、例えば、骨再生の加速、幹細胞増殖の増強等、β−カテニンの核局在化、ｗｎｔ応答性遺伝子の転写増加等を決定することにより、組成物におけるｗｎｔ代替物の生物学的活性を決定することができる。
【００７０】
「水溶性」とは、界面活性剤の非存在下で水性バッファーに可溶性であり、通常、生物学的有効用量のポリペプチドを提供する濃度の可溶性の組成物を意味する。水溶性である組成物は実質的に均質な組成物を生成し、該均質な組成物は、これが出発材料から精製される該出発材料の少なくとも約５％、通常は、出発材料の少なくとも約１０％、２０％または３０％、より通常は、出発材料の約４０％、５０％または６０％である比活性、および、約５０％、約９０％またはそれ超となり得る比活性を有する。本発明のＷｎｔ代替組成物は、典型的に、少なくとも２５μＭおよびより高い、例えば、少なくとも２５μＭ、４０μＭまたは５０μＭ、通常少なくとも６０μＭ、７０μＭ、８０μＭまたは９０μＭ、場合により、１００μＭ、１２０μＭまたは１５０μＭもの高さの濃度の、実質的に均質な水溶液を生成する。言い換えると、本発明のｗｎｔ代替組成物は、典型的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌもしくは（ｏｆ）約１ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度の、実質的に均質な水溶液を生成する。
【００７１】
Ｆｚｄ結合ドメイン。Ｆｚｄ結合ドメインは、小分子またはポリペプチドであってよく、高親和性で、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０ＭのＫＤでＦｚｄに結合するいずれかのドメインから選択することができる。適したＦｚｄ結合ドメインは、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計されたＦｚｄ結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ等および１種または複数種のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する他の抗体部分；ナノボディ由来の結合ドメイン；ノッチンに基づく操作された足場；ノリンおよびそれに由来する結合性断片；などを限定することなく含む。
【００７２】
Ｆｚｄ結合ドメインは、所望のＦｚｄタンパク質または複数のＦｚｄタンパク質への結合を増強するように、例えば、組織選択性をもたらすように、親和性選択することができる。この目的のための親和性選択の方法は、標的化されたアミノ酸変化を導入し、候補コード配列のライブラリーを作製し、候補コード配列により細胞集団を、例えば、酵母細胞に形質転換し、所望の特異性に関して選択（例えば、常磁性マイクロビーズを使用して）することによる、１または複数ラウンドの選択を任意選択で利用することができる。典型的には、複数ラウンドの選択が行われ、その結果得られるベクターを配列決定し、タンパク質工学のための基盤として使用する。例えば、ノリン結合ドメイン、抗体またはナノボディ由来のドメイン、操作されたタンパク質等を限定することなく含むＦｚｄ結合ドメインは、１種または複数種の目的のＦｚｄタンパク質に選択的に結合するよう選択することができる。例えば、ノリンは、Ｆｚｄ４以外のまたはそれに加えたＦｚｄ受容体に結合するように親和性選択することができる。
【００７３】
一部の実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、１、２、３、４、５種またはそれを超える異なるフリズルドタンパク質、例えば、ヒトフリズルドタンパク質Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ３、Ｆｚ４、Ｆｚ５、Ｆｚ６、Ｆｚ７、Ｆｚ８、Ｆｚ９、Ｆｚ１０のうち１種または複数種に結合する。一部の実施形態では、抗体に基づく代替物は、Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ５、Ｆｚ７およびＦｚ８に結合する。他の実施形態では、フリズルド結合部分は、１種または複数種の目的のフリズルドタンパク質に選択的である、例えば、１種または複数種の所望のフリズルドタンパク質に対し、他のフリズルドタンパク質と比べて少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍またはそれを超える特異性を有する。
【００７４】
ある特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、汎（ｐａｎ）特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ））の６個のＣＤＲ領域を含む。ある特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、汎特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ）の６個のＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである。例えば、特に本明細書に参照として援用される米国特許第８５０７４４２号を参照されたい。例えば、ＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列は、ＧＦＴＦＳＨＹＴＬＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＶＩＳＧＤＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２およびＮＦＩＫＹＶＦＡＮ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに（ｉｉ）ＳＧＤＫＬＧＫＫＹＡＳ（配列番号４）またはＳＧＤＮＩＧＳＦＹＶＨ（配列番号７）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＥＫＤＮＲＰＳＧ（配列番号５）またはＤＫＳＮＲＰＳＧ（配列番号８）を含む軽鎖ＣＤＲ２およびＳＳＦＡＧＮＳＬＥ（配列番号６）またはＱＳＹＡＮＴＬＳＬ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、配列番号１〜９のＣＤＲ配列を含む、ＳｃＦｖ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディおよび様々な抗体模倣物を限定することなく含む抗体またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、これらのＣＤＲ配列は、配列番号１〜９と比較して１個または複数個のアミノ酸修飾を含む。
【００７５】
他の実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、当技術分野で公知であり、かつ市販されている、またはｄｅ  ｎｏｖｏで作製することができる、多数のフリズルド特異的抗体のいずれかに由来する可変領域配列またはそのＣＤＲを含む。フリズルドポリペプチドのいずれかを免疫原としてまたはスクリーニングアッセイにおいて使用して、抗体を開発することができる。「Ｆｚ」、「Ｆｚタンパク質」および「Ｆｚ受容体」は、フリズルド受容体ファミリーのタンパク質を指すように本明細書で使用されている。これらのタンパク質は、ＣＲＤドメインを含む、７回膜貫通タンパク質（Ｉｎｇｈａｍ，  Ｐ．  Ｗ．（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２巻：３８２〜３８４頁；Ｙａｎｇ−Ｓｎｙｄｅｒ，  Ｊ．ら（１９９６年）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．６巻：１３０２〜１３０６頁；Ｂｈａｎｏｔ，  Ｐ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２巻：２２５〜２３０頁）である。Ｆｚファミリーには１０種の公知メンバーが存在し（Ｆｚ１からＦｚ１０）、そのいずれも、Ｗｎｔの受容体として機能することができる。ヒトフリズルド参照配列のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を次に示す：ＦＺＤ１（ＮＭ＿００３５０５）；ＦＺＤ２（ＮＭ＿００１４６６）；ＦＺＤ３（ＮＭ＿１４５８６６）；ＦＺＤ４（ＮＭ＿０１２１９３）；ＦＺＤ５（ＮＭ＿００３４６８）；ＦＺＤ６（ＮＭ＿００３５０６）；ＦＺＤ７（ＮＭ＿００３５０７）；ＦＺＤ８（ＮＭ＿０３１８６６）；ＦＺＤ９（ＮＭ＿００３５０８）；ＦＺＤ１０（ＮＭ＿００７１９７）。
【００７６】
フリズルド結合ドメインの非限定例として、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手できる抗体、例えば、ヒトフリズルド４（ＣＤ３４４）に特異的なクローンＣＨ３Ａ４Ａ７；ヒトＦｚ９（ＣＤ３４９）に特異的なクローンＷ３Ｃ４Ｅ１１；Ａｂｃａｍから入手できる抗体、例えば、Ｆｚ７に特異的なａｂ６４６３６；ヒトＦｚ４に特異的なａｂ８３０４２；ヒトＦｚ７に特異的なａｂ７７３７９；ヒトＦｚ８に特異的なａｂ７５２３５；ヒトＦｚ９に特異的なａｂ１０２９５６；などが挙げられる。適した抗体の他の例は、とりわけ、それぞれ特に本明細書に参照として援用される、米国特許出願公開第２０１４０１０５９１７号；米国特許出願公開第２０１３０２３０５２１号；米国特許出願公開第２００８０２６７９５５号；米国特許出願公開第２００８００３８２７２号；米国特許出願公開第２００３００４４４０９号；等に記載されている。
【００７７】
代替物のフリズルド結合部分は、ｗｎｔタンパク質のフリズルド結合領域に対する構造的相同性に関して選択された、操作されたタンパク質であってよい。斯かるタンパク質は、相同性について構造データベースをスクリーニングすることにより同定することができる。このようにして同定された初期タンパク質は、例えば、微生物Ｂｈ１４７８タンパク質である。次に、ネイティブタンパク質を、親和性を増加させるアミノ酸置換をもたらすように操作し、所望のフリズルドタンパク質への結合における親和性および選択性増加について親和性成熟によってさらに選択することができる。フリズルド結合部分の非限定例として、図１に例示されているＦｚ２７およびＦｚ２７−Ｂ１２タンパク質が挙げられる。
【００７８】
Ｌｒｐ５／６結合ドメイン。Ｌｒｐ５／６は、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、少なくとも約１×１０−１０ＭのＫＤによりＬｒｐ５またはＬｒｐ６に高親和性で結合するいずれかのドメインから選択することができる。
【００７９】
「ＬＲＰ」、「ＬＲＰタンパク質」および「ＬＲＰ受容体」は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ファミリーのタンパク質を指すように本明細書において使用されている。これらの受容体は、受容体媒介性エンドサイトーシスの過程においてリガンドに結合し内部移行させる１回膜貫通タンパク質である。ＬＲＰタンパク質ＬＲＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００２３３５．２）およびＬＲＰ６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００２３３６．２）は、Ｗｎｔ受容体複合体に含まれる。
【００８０】
適したＬｒｐ５／６結合ドメインは、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計されたＬｒｐ５／６結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ等および１種または複数種のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する他の抗体部分；ナノボディ由来の結合ドメイン；ノッチンに基づく操作された足場；ＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチンを限定することなく含む天然起源のＬｒｐ５／６；Ｗｉｓｅ；上記のいずれかを含む融合タンパク質；上記のいずれかの誘導体；上記のいずれかのバリアント；ならびに上記のいずれかの生物学的活性断片、などを限定することなく含む。Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、結合を増強するように親和性選択することができる。
【００８１】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）遺伝子ファミリーのメンバー（Ｋｒｕｐｎｉｋら（１９９９年）Ｇｅｎｅ  ２３８巻（２号）：３０１〜１３頁を参照）は、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３およびＤｋｋ−４ならびにＤｋｋ−３関連タンパク質Ｓｏｇｇｙ（Ｓｇｙ）を含む。ｈＤｋｋ１〜４は、ファミリーメンバー間で１０個のシステイン残基のポジションが高度に保存された、２個の別個のシステインリッチドメインを含有する。ヒトＤｋｋ遺伝子およびタンパク質の例示的な配列は公開されており、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４４１９（ｓｏｇｇｙ−１）；ＮＭ＿０１４４２０（ＤＫＫ４）；ＡＦ１７７３９４（ＤＫＫ−１）；ＡＦ１７７３９５（ＤＫＫ−２）；ＮＭ＿０１５８８１（ＤＫＫ３）；およびＮＭ＿０１４４２１（ＤＫＫ２）である。本発明の一部の実施形態では、Ｌｒｐ６結合部分は、ヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメインを限定することなく含むＤＫＫ１ペプチドである。図５に示す通り、Ｃ末端ドメインは、配列
【化１】
2020186267.tif 000003
（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６３７４を参照）またはその生物学的活性断片を含むことができる。
【００８２】
ＬＲＰ５／６へのＤＫＫタンパク質の結合は、例えば、それぞれ特に本明細書に参照として援用される、ＢｒｏｔｔおよびＳｏｋｏｌ、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２巻（１７号）６１００〜６１１０頁（２００２年）；ならびにＬｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７７巻（８号）５９７７〜５９８１頁（２００２年）に記述されている。ヒトＤＫＫ２（Ｇｅｎｂａｎｋ参照ＮＰ＿０５５２３６）の対応する領域は、配列
【化２】
2020186267.tif 000004
またはその生物学的活性断片を含むことができる。
【００８３】
Ｌｒｐ５またはＬｒｐ６に特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知であり、市販されている、またはｄｅ  ｎｏｖｏで作製することができる。Ｌｒｐ５、Ｌｒｐ６またはそれらの断片を免疫原としてまたはスクリーニングアッセイにおいて使用して、抗体を開発することができる。公知抗体の例として、Ｇｏｎｇら（２０１０年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５巻（９号）：ｅ１２６８２頁；Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇら（２０１０年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０７巻（３５号）：１５４７３〜８頁に記載されている抗体；ならびに市販されている抗体、例えば、ヒト起源の合成ＬＲＰ５／６に対し作製され、マウスおよびヒト起源のＬＲＰ６およびＬＲＰ５の全長およびタンパク質分解性断片の両方に結合する、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの抗体クローン１Ａ１２；モノクローナル抗体２Ｂ１１；ＬＲＰ５（Ｄ８０Ｆ２）に特異的なＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの抗体、カタログ番号５７３１；等が限定することなく挙げられる。
【００８４】
バリアント。結合ドメインは、上記のポリペプチドの誘導体、バリアントおよび生物学的活性断片を含むこともできる。「バリアント」ポリペプチドは、提示されている配列と１００％未満の配列同一性を有する、下に定義される生物学的活性ポリペプチドを意味する。斯かるバリアントは、提示されている配列と比較して、１個または複数個のアミノ酸修飾、例えば、挿入、欠失または置換を含むポリペプチドであって、ここで、例えば、１個または複数個のアミノ酸残基が、ネイティブ配列のＮ末端もしくはＣ末端またはネイティブ配列の中に付加される；約１〜４０個のアミノ酸残基が欠失され、任意選択で１個または複数個のアミノ酸残基によって置換される、ポリペプチド；および、上記のポリペプチドの誘導体であって、アミノ酸残基が、得られる産物が非天然起源のアミノ酸を有するように、共有結合により修飾されている誘導体、を含む。通常、生物学的に活性なバリアントは、ネイティブ配列ポリペプチドと少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８５】
配列の「機能的誘導体」は、初期の配列と共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。共通の生物学的活性を有する限り、「機能的誘導体」として、配列の断片および配列の誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントおよびその共有結合修飾の両方を包含する。
【００８６】
対象組成物および方法における使用のためのＷｎｔ代替物は、タンパク質分解による分解に対するその抵抗性を改善するために、または溶解特性を最適化するために、またはこれを治療剤としてより適したものとするために、通常の分子生物学的技法および合成化学を使用して修飾することができる。斯かるポリペプチドのアナログは、天然起源のＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然起源の合成アミノ酸を含有するアナログを含む。Ｄ−アミノ酸を、アミノ酸残基の一部または全てに代えて置換することができる。
【００８７】
ｗｎｔ代替物は、当技術分野で公知の従来方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成により調製することができる。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動合成機を利用することができる。合成機を使用することにより、天然起源のアミノ酸は、非天然アミノ酸により置換することができる。特定の配列および調製様式は、便利さ、経済性、要求される純度などによって決定される。必要に応じて、合成の際にまたは発現の際に様々な基をペプチドに導入することができ、これは、他の分子または表面への連結を可能にする。よって、システインは、チオエーテルを作製するために、ヒスチジンは、金属イオン錯体に連結するために、カルボキシル基は、アミドまたはエステルを生成するために、アミノ基は、アミドを生成するために使用することができるなどである。
【００８８】
ｗｎｔ代替物は、追加的なポリペプチド配列に融合または結合することができる。その例として、ｗｎｔ代替物を免疫グロブリン配列、特にＦｃ配列と組み合わせるイムノアドヘシン、および「タグポリペプチド」に融合されたネイティブ阻害因子ポリペプチドまたはその部分を含むエピトープタグ付けされたポリペプチドが挙げられる。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製することができるエピトープをもたらすのに十分な残基であるが、ネイティブ阻害因子ポリペプチドの生物学的活性に干渉しないように十分に短い残基を有する。適したタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基、通常、約６〜６０の間のアミノ酸残基を有する。ｗｎｔ代替物は、ｗｎｔ活性を増強する作用物質、例えば、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、抗スクレロスチン抗体等と融合するまたは製剤において組み合わせるまたは共投与することもできる。
【００８９】
リンカー。Ｆｚｄ結合ドメインおよびＬｒｐ５／６結合ドメインは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチド性リンカー等によって離間されていてよい。ドメインを接続するアミノ酸リンカーは、多ドメインタンパク質の構造および機能において重要な役割を果たすことができる。その触媒活性が、適切なリンカー組成を必要とするタンパク質の多数の例が存在する。一般に、ドメインを連結するリンカーの長さの変更は、タンパク質安定性、フォールディング率およびドメイン−ドメイン配向性に影響を与えることが示されてきた（ＧｅｏｒｇｅおよびＨｅｒｉｎｇ（２００３年）Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．１５巻：８７１〜８７９頁を参照）。ｗｎｔ代替物におけるリンカー、したがって、結合ドメイン間のスペーシングの長さは、ｗｎｔ代替物のシグナル強度のモジュレートに使用することができ、ｗｎｔ代替物の所望の使用に応じて選択することができる。ｗｎｔ代替物の結合ドメイン間の強制された距離は、変動し得るが、ある特定の実施形態では、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、約５０オングストローム未満であってよい。
【００９０】
一部の実施形態では、リンカーは、硬いリンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。一部の実施形態では、リンカー部分は、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、２〜１００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９個、ただし１００個以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、５〜７５、５〜５０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０または５〜９アミノ酸の間の長さである。例示的なリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ等、少なくとも２アミノ酸残基を有する直鎖状ペプチドを含む。適した直鎖状ペプチドは、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、ならびにアラニルおよび／またはセリニル（ｓｅｒｉｎｙｌ）および／またはプロリニル（ｐｒｏｌｉｎｙｌ）および／またはグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、
【化３】
2020186267.tif 000005
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列
【化４】
2020186267.tif 000006
（配列中、ｎは、１、２、３、４、５等である）を含む；しかし、多くの斯かるリンカーが当技術分野で公知であり、使用されており、この目的に役立つことができる。
【００９１】
Ｗｎｔ代替物は、単鎖形態で提供することができ、このことは、結合ドメイン同士が、リンカーペプチドを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。他の実施形態では、これらの結合ドメインは、個々のペプチドであり、非ペプチド性リンカーを介して接続することができる。
【００９２】
結合ドメインの連結における用途を見出す化学基は、当技術分野で公知の通り、カルバメート；アミド（アミン・プラス・カルボン酸）；エステル（アルコール・プラス・カルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカン・プラス・スルフヒドリル；マレイミド・プラス・スルフヒドリル）、シッフ塩基（アミン・プラス・アルデヒド）、尿素（アミン・プラス・イソシアネート）、チオ尿素（アミン・プラス・イソチオシアネート）、スルホンアミド（アミン・プラス・スルホニルクロリド）、ジスルフィド；ヒドラゾン（ｈｙｒｏｄｒａｚｏｎｅ）、脂質などを含む。
【００９３】
結合ドメイン間の連結は、スペーサー、例えば、アルキルスペーサーを含むことができ、これは、直鎖状であっても分岐状であってもよいが、通常は直鎖状であり、１個または複数個の不飽和結合を含むことができ；通常は、１〜約３００個の炭素原子；より通常は、約１〜２５個の炭素原子を有し；約３〜１２個の炭素原子であってよい。この種のスペーサーは、アミン、エーテル、ホスホジエステルなどを含む、ヘテロ原子または官能基を含むこともできる。目的の特異的な構造は、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（式中、ｎは、１〜約１２である）；（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ（式中、ｎは、１〜約１２である）；［（ＣＨ２）ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ］ｚ（式中、ｎおよびｍは、１〜約６であり、ｚは、１〜約１０である）；［（ＣＨ２）ｎＯＰＯ３（ＣＨ２）ｍ］ｚ（式中、ｎおよびｍは、１〜約６であり、ｚは、１〜約１０である）を含む。斯かるリンカーは、直鎖状であっても分岐状であってもよいポリエチレングリコールを含むことができる。
【００９４】
結合ドメインは、親水性頭部へと安定的な連結を形成することができる基を一末端に、標的部分へと安定的な連結を形成することができる基を反対の末端に有する、ホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカーを介して接続することができる。例示的な実体は、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド（ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ））、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、アジプイミド酸ジメチル、ジスクシンイミジルタルトレート、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート；３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）；Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）；または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸長鎖アナログを含む。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００９５】
この目的に有用な他の試薬は、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノおよびフェノール基と不可逆的架橋を形成する）；アジプイミド酸ジメチル（アミノ基に特異的）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（アミノ基と主に反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネートまたはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（アミノ基と主に反応する）；ビス（ｄｉｓ）ジアゾベンジジン（チロシンおよびヒスチジンと主に反応する）；Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｕｌｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｄｅ）、ブロモ−ｔｒｉｓ（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）；４−ピロリジノピリジン；Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；などを含む。ホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）を含む。
【００９６】
抗体：本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、特定の標的抗原への特異的結合の付与に十分なカノニカル免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。当技術分野で公知の通り、天然に産生されるインタクト抗体は、「Ｙ字形」構造と一般的に称される構造になるよう互いに会合した、２本の同一重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０ｋＤ）および２本の同一軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）で構成された、およそ１５０ｋＤ四量体作用物質である。各重鎖は、少なくとも４個のドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸長）である、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置）と、続く３個の定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２およびカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの幹部分の基部に位置）で構成される。「スイッチ」として公知の短い領域は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を連結する。「ヒンジ」は、抗体の残り部分へとＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを連結する。このヒンジ領域における２個のジスルフィド結合は、インタクト抗体において２本の重鎖ポリペプチドを互いに連結する。各軽鎖は、別の「スイッチ」によって互いに離間された２個のドメインである、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインで構成される。インタクト抗体四量体は、単一のジスルフィド結合によって重鎖および軽鎖が互いに連結された、２個の重鎖−軽鎖二量体で構成される；２個の他のジスルフィド結合は、二量体が互いに連結され、四量体が形成されるように、重鎖ヒンジ領域を互いに連結する。天然に産生される抗体は、また、典型的にはＣＨ２ドメインがグリコシル化されている。天然抗体における各ドメインは、圧縮逆平行ベータバレル（ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｅｔａ  ｂａｒｒｅｌ）において互いに対して束ねられた２個のベータシート（例えば、３、４または５本鎖シート）から形成された「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられた構造を有する。各可変ドメインは、「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）決定領域」として公知の３個の超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）および４個の幾分インバリアントな「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含有する。天然抗体がフォールドすると、ＦＲ領域は、ドメインに構造フレームワークをもたらすベータシートを形成し、重鎖および軽鎖の両方に由来するＣＤＲループ領域は、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を生じるように、三次元空間で集まる。
【００９７】
天然起源の抗体のＦｃ領域は、補体系のエレメントに、また、例えば、細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞における受容体に結合する。当技術分野で公知の通り、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性および／または他の結合特質は、グリコシル化または他の修飾によりモジュレートすることができる。一部の実施形態では、本発明に従って産生および／または利用される抗体は、グリコシル化等、修飾または操作されたＦｃドメインを含む、グリコシル化されたＦｃドメインを含む。
【００９８】
天然抗体に見出される十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む、いずれかのポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、斯かるポリペプチドが、天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）にしろ、組換え工学、化学合成または他の人工の系もしくは方法論によって産生されるにしろ、「抗体」を指すことができるおよび／または抗体として使用することができる。一部の実施形態では、抗体配列エレメントは、当技術分野で公知の通り、ヒト化、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）、キメラ等である。
【００９９】
さらに、用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、適切な実施形態では（それ以外のことが記述されているまたは文脈から明らかでなければ）、代用的な提示において抗体の構造および機能的特色を利用するための当技術分野で公知のまたは開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指すことができる。例えば、ある実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、インタクトＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭ、二重特異性抗体または多特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、小モジュラー免疫医薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖またはタンデムダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるが、これらに限定されないフォーマットで存在する。一部の実施形態では、抗体は、天然に産生された場合に保有する筈の、共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）を欠如することができる。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード［例えば、検出可能部分、治療部分、触媒部分等］または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコール等］の結合）を含有することができる。
【０１００】
多くの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者によって認識される１種または複数の構造エレメントを含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む；一部の実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、参照抗体に見出されるものと実質的に同一である少なくとも１個のＣＤＲ（例えば、少なくとも１個の重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１個の軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、配列が同一である、または参照ＣＤＲと比較して１〜５アミノ酸の間の置換を含有するという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を示すという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を示すという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加または置換されているが、含まれるＣＤＲが、他の点では参照ＣＤＲアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１〜５アミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加または置換されているが、含まれるＣＤＲが、他の点では参照ＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して置換されているが、含まれるＣＤＲが、他の点では参照ＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１〜５アミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加または置換されているが、含まれるＣＤＲが、他の点では参照ＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するという点において、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造エレメントを含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分は相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。
【０１０１】
代替物のフリズルド結合部分は、ｗｎｔタンパク質のフリズルド結合領域に対する構造的相同性に関して選択される操作されたタンパク質であってよい。斯かるタンパク質は、相同性に関して構造データベースをスクリーニングすることにより同定することができる。このように同定される初期のタンパク質は、例えば、微生物Ｂｈ１４７８タンパク質である。次に、ネイティブタンパク質は、親和性を増加させるアミノ酸置換をもたらすように操作され、所望のフリズルドタンパク質への結合における親和性および選択性の増加に関して、親和性成熟によってさらに選択することができる。フリズルド結合部分の非限定例として、図１に例示するＦｚ２７タンパク質およびＦｚ２７−Ｂ１２タンパク質が挙げられる。
【０１０２】
例えば、限定することなく、本発明は、図１のポリペプチドまたはその親和性成熟されたバリアントを含む。
【０１０３】
親和性成熟されたｗｎｔペプチド代替物は、選択されるポジションが変異された、フリズルドに対する少なくとも約１×１０−７Ｍ；少なくとも約１×１０−８Ｍ；少なくとも約５×１０−９Ｍまたはそれを超えるＫＤの増強されたアビディティーを有するペプチドを限定することなく含む。親和性成熟されたｗｎｔペプチド代替物の例として、Ｂ１２バリアントならびに図３に描写するＣ３およびＣ４９バリアントが限定することなく挙げられる。
【０１０４】
発現構築物：本方法において、ｗｎｔ代替物は、ポリペプチドである場合、組換え方法によって産生することができる。アミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡコード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。斯かるバリアントは、アミノ酸配列内のまたはその一端もしくは両端における残基の挿入、置換および／または指定の欠失を表す。最終構築物が、本明細書に定義される所望の生物学的活性を保持する限り、挿入、置換および／または指定の欠失のいずれかの組合せが為されて、最終構築物に到達する。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数もしくはポジションの変化、膜係留特徴の変更、および／またはポリペプチドのリーダー配列の挿入、欠失もしくは他の仕方で影響を与えることによる細胞位置の変更等、ポリペプチドの翻訳後過程を変更することもできる。
【０１０５】
ｗｎｔ代替物をコードする核酸は、発現のために複製可能なベクターに挿入することができる。多くの斯かるベクターを利用することができる。ベクター構成成分として、次のうち１種または複数種が一般に挙げられるがこれらに限定されない：複製起点、１種または複数種のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【０１０６】
発現ベクターは、宿主生物によって認識され、ｗｎｔ代替コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーターは、これが作動可能に連結された特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子の開始コドンに対し上流（５’）に位置する（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）非翻訳配列である。斯かるプロモーターは、典型的に、２種のクラス、誘導性および構成的に分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件のある変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在または温度変化に応答したその制御下において、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。
【０１０７】
原核生物宿主による使用に適したプロモーターは、□−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系ならびにｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターを含む。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適している。斯かるヌクレオチド配列は公表されているため、当業者であれば、これらをＤＮＡコード配列に作動可能にライゲーションすることができる。細菌系における使用のためのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有する。
【０１０８】
プロモーター配列は、真核生物で公知である。酵母宿主による使用のための適した促進配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の例として、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーターが挙げられる。成長条件によって制御される転写の追加的な利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロム（ｉｓｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｃ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターにより有利に使用される。
【０１０９】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）等、ウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）または免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御することができるが、ただし斯かるプロモーターは、宿主細胞系と適合性であることが求められる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として簡便に得られる。
【０１１０】
高等真核生物による転写は、多くの場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。エンハンサーは、その転写を増加させるようにプロモーターにおいて作用する、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作動性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向性およびポジション非依存的であり、イントロン内で、また、コード配列それ自体の内で、転写単位に対して５’および３’で見出されている。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、□−フェトプロテインおよびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかし典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。その例として、複製起点の後側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側におけるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列に対しポジション５’または３’において発現ベクターへとスプライスされてよいが、好ましくは、プロモーターから部位５’に位置する。
【０１１１】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有することもできる。斯かる配列は、真核生物ＤＮＡまたはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’非翻訳領域から一般的に入手することができる。
【０１１２】
上に収載されている構成成分のうち１種または複数種を含有する適したベクターの構築は、標準技法を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、要求されるプラスミドの作製に望まれる形態で切断し、調整し（ｔａｉｌｏｒｅｄ）、再度ライゲーションすることができる。構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認するための解析のため、ライゲーション混合物が、宿主細胞の形質転換に使用され、成功した形質転換体が、適切な場合アンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性によって選択される。形質転換体からプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって解析される、および／または配列決定される。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、ベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核細胞である。この目的に適した原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ等のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等のＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ等、真正細菌を含む。これらの例は、限定ではなく説明のためのものである。
【０１１４】
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母等、真核生物微生物が、適した発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ等のような、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ等、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびにＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ宿主、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ宿主ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎおよびＡ．ｎｉｇｅｒ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主等、糸状真菌等、多数の他の属、種および株が一般的に利用でき、本明細書において有用である。
【０１１５】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのある特定の株とのインキュベーションによりトランスフェクトされる。植物細胞培養物の斯かるインキュベーションの際に、ＤＮＡコード配列は、トランスフェクトされ、適切な条件下でＤＮＡを発現するように、植物細胞宿主に移入される。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列等、植物細胞と適合性の調節配列およびシグナル配列を利用することができる。
【０１１６】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、マウスＬ細胞（Ｌ−Ｍ［ＴＫ−］、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２６４８）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１１７】
宿主細胞は、ｗｎｔ代替物産生のために上記の発現ベクターをトランスフェクトされ、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択するまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地において培養される。哺乳動物宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等、市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。これらの培地のいずれかに、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびリン酸塩等）、バッファー（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質、微量元素およびグルコースまたは等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。他のいずれかの必要なサプリメントが、当業者にとって公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨ等のような、培養条件は、発現に関して選択された宿主細胞により以前に使用された条件であり、当業者であれば明らかである。
【０１１８】
小分子組成物。本発明のＷｎｔ代替物は、有機分子、好ましくは、５０ダルトン超かつ約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する小分子有機化合物も含む。有用な代替物は、例えば、目的のＦｚｄタンパク質およびＬｒｐ５／６の一方または両方に対する高親和性結合に関して分子がアッセイされるスクリーニングアッセイによって同定される。分子は、別の結合部分に接続、またはポリペプチド作用物質のための上記の結合ドメインに接続される結合部分を提供することができる。
【０１１９】
候補代替物は、ＦｚｄまたはＬｒｐ５／６等のタンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、好ましくは、これらの官能化学基のうち少なくとも２種を含む。候補代替物は、多くの場合、上記の官能基のうち１種または複数種により置換された、環状（ｃｙｃｌｉｃａｌ）炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補作用物質は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造アナログまたは組合せを含む生体分子の中にも見出される。
【０１２０】
候補代替物は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および定方向合成（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）のための多数の手段を利用することができる。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーを利用することができるまたは容易に産生することができる。その上、天然または合成により産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーの生成に使用することができる。公知の薬理学的作用物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等のような、定方向化学修飾またはランダム化学修飾に付して、構造アナログを産生することができる。被験作用物質は、例えば、天然物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー等、ライブラリーから得ることができる。多数の異なる種類のコンビナトリアルライブラリーおよび斯かるライブラリーを調製するための方法は、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書の援用される、ＰＣＴ公開のＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９５／３５５０３、ＷＯ９４／０８０５１およびＷＯ９５／３０６４２を含む文献に記載されている。
【０１２１】
スクリーニングアッセイが、結合アッセイである場合、分子のうち１種または複数種は、標識に接続することができ、標識は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的にもたらすことができる。様々な標識は、放射性同位元素、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁気粒子などを含む。特異的結合分子は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシン等のペアを含む。特異的結合メンバーのため、相補的メンバーは通常、公知手順に従って検出を提供する分子で標識される。
【０１２２】
種々の他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれてよい。これらとして、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にするためおよび／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低下させるために使用される、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤等のような試薬が挙げられる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のような、アッセイの効率を改善する試薬を使用することができる。必要な結合をもたらす構成成分の混合物がいずれかの順序で添加される。いずれか適した温度で、典型的には４〜４０℃の間で、インキュベーションが行われる。インキュベーション期間は、最適な活性を得るように選択されるが、迅速ハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化することもできる。典型的には、０．１〜１時間の間で十分である。
【０１２３】
ＦｚｄまたはＬｒｐ５／６ポリペプチドに結合することができる化合物をスクリーニングすることにより、予備的スクリーニングを行うことができる。結合アッセイは通常、１種または複数種の被験化合物とＦｚｄまたはＬｒｐ５／６ポリペプチドを接触させ、十分な時間、タンパク質および被験化合物に結合複合体を形成させることを伴う。形成されたいずれかの結合複合体は、多数の確立された分析技法のいずれかを使用して検出することができる。タンパク質結合アッセイとして、共沈殿、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける共移動を、また、ウエスタンブロットにおける共移動を測定する方法が挙げられるがこれらに限定されない（例えば、Ｂｅｎｎｅｔ，  Ｊ．  Ｐ．およびＹａｍａｍｕｒａ，  Ｈ．  Ｉ．（１９８５年）「Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｙａｍａｍｕｒａ，  Ｈ．  Ｉ．ら、編）中の６１〜８９頁を参照）。
【０１２４】
ある特定のスクリーニング方法は、ｗｎｔシグナリング活性をモジュレートする化合物のスクリーニングに関与する。斯かる方法は、細胞に基づくアッセイの実行に関与することができ、このようなアッセイにおいて、被験化合物を、Ｆｚｄを発現する１種または複数種の細胞と接触させ、続いてｗｎｔ応答性遺伝子の発現の増加を検出すること、およびｂ−カテニンの核局在化を検出すること等が行われる。
【０１２５】
発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較することができる。上に示す通り、ベースライン値は、対照試料の値または対照集団の発現レベルの代表である統計的な値とすることができる。発現レベルは、陰性対照として、ｗｎｔ受容体を発現しない細胞に対して決定することもできる。斯かる細胞は一般に、その他の点では実質的に遺伝的に被験細胞と同じである。レポーター構築物を欠く細胞を用いるか、またはレポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させないことによる平行した反応を実施することを含む、様々な対照を実施して、観察される活性が信頼すべきものであることを確実にすることができる。以下に記載する通り、化合物をさらに検証することもできる。
【０１２６】
前述のスクリーニング方法のいずれかにより初期に同定された化合物をさらに検査して、見かけ上の活性を検証することができる。斯かる方法の基本フォーマットは、ヒトのためのモデルとして役立つ、動物へのまたは細胞培養モデルにおける、初期スクリーニングにおいて同定されたリード化合物の投与に関与する。検証研究において利用される動物モデルは一般に、哺乳動物である。適した動物の具体例として、霊長類、マウスおよびラットが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
本明細書に記載されているスクリーニング方法によって同定された活性被験作用物質は、アナログ化合物の合成のためのリード化合物として役立つことができる。典型的には、アナログ化合物は、リード化合物の電子配置および分子高次構造と同様の電子配置および分子高次構造を有するように合成される。アナログ化合物の同定は、自己無撞着場（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ）（ＳＣＦ）解析、配置間相互作用（ＣＩ）解析およびノーマルモード動力学解析（ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｄｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）等の技法の使用により行うことができる。これらの技法を実行するためのコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｒｅｉｎら（１９８９年）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１２８】
医薬組成物
治療適用のため、ｗｎｔ代替物は、ボーラスとしてまたはある期間にわたる持続注入によりヒトに静脈内投与することができる剤形を含む生理学的に許容される剤形で、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。代用投与経路は、局所的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌ）、髄腔内、経口、局所的または吸入経路を含む。ｗｎｔ代替物はまた、局所治療効果ならびに全身治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病変周囲経路によってまたはリンパに適宜投与される。
【０１２９】
医薬組成物は、幹細胞、前駆体細胞などを含む細胞と本発明の分子との組合せを含むこともできる。一部の実施形態では、組成物は、再生体細胞性幹細胞、例えば、上皮幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨芽細胞、筋肉幹細胞、間葉系幹細胞、膵臓幹細胞等と組み合わせた、本発明の分子を含む。斯かる組合せにおいて、細胞は、使用に先立ち本発明の分子で前処理することができる、例えば、ｗｎｔ代替物で細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ処理することができる；細胞は、別々のまたは組み合わせた製剤において、本発明の分子と同時に投与することができる；細胞は、本発明の分子による処理に先立ち個体に与えることができるなどである。
【０１３０】
用語「幹細胞」は、本明細書において使用される場合、自己再生の特性を有し、複数の細胞型へと分化する発生能を有する細胞を指す。幹細胞は、増殖し、その発生能を維持しつつ、より多くの斯かる幹細胞を生じることができる。幹細胞は、非対称的に分裂することができ、一方の娘細胞が、親幹細胞の発生能を保持しながら、他方の娘細胞は、親細胞とは別個の他のある特異的な機能、表現型および／または発生能を発現することができる。娘細胞それ自体は、増殖し、親の発生能を有する１個または複数個の細胞の保持も行いつつ、１種または複数の成熟細胞型へとその後に分化する後代を産生するように誘導され得る。分化した細胞は、それ自体は複能性細胞に由来する複能性細胞に由来し得る等である。これらの複能性細胞のそれぞれを幹細胞と考慮することができるが、斯かる幹細胞のそれぞれが生じることができる細胞型の範囲、すなわち、その発生能は、相当に変動し得る。あるいは、集団における幹細胞のいくつかは、確率的分化として公知の、２個の幹細胞へと対称的に分裂し、これにより、集団における一部の幹細胞を全体として維持することができるが、集団における他の細胞は、分化した後代のみを生じる。したがって、用語「幹細胞」は、特定の状況下で、より特殊化または分化した表現型へと分化する発生能を有し、ある状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持するいずれかの細胞サブセットを指す。
【０１３１】
用語「体細胞性幹細胞」は、胎児組織、若年組織および成体組織を含む非胚性組織に由来するいずれかの多能性または複能性幹細胞を指すように本明細書で使用されている。天然の体細胞性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋および心筋を含む多種多様な成体組織から単離されている。用語「前駆体細胞」は、これが分化によって生じることができる細胞と比べて、発生の経路または進行に沿ってより初期のステージにある細胞を指すように本明細書で使用されている。多くの場合、前駆体細胞は、有意なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆体細胞は、発生経路ならびに細胞が発生および分化する環境に応じて、複数の別個の分化した細胞型、または単一の分化した細胞型を生じることができる。
【０１３２】
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物の製剤化に一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される無毒性の希釈液のキャリアを含むことができる。希釈液は、この組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。斯かる希釈液の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他のキャリア、アジュバントまたは無毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含むことができる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤ならびに界面活性剤等、生理的条件に近づけるための追加的な物質を含むこともできる。
【０１３３】
組成物は、例えば抗酸化剤等、種々の安定化剤のいずれかを含むこともできる。医薬組成物が、ポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増強する、またはその薬理学的特性を他の仕方で増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低下させる、溶解性または取込みを増強する）様々な周知化合物と複合体形成することができる。斯かる修飾剤または複合体形成剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の例として、サルフェート、グルコネート、シトレートおよびホスフェートが挙げられる。組成物のポリペプチドは、そのｉｎ  ｖｉｖｏ特質を増強する分子と複合体形成することもできる。斯かる分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）および脂質を含む。
【０１３４】
様々な種類の投与に適した製剤に関するさらに別のガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．、第１７版（１９８５年）に見出すことができる。薬物送達のための方法に関する短い総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照されたい。
【０１３５】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。活性成分の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）の決定を含む、細胞培養および／または実験動物における標準の薬学的手順に従って決定することができる。毒性作用および治療効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好まれる。
【０１３６】
細胞培養および／または動物研究から得られるデータは、ヒトのためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。活性成分の投薬量は、典型的には、低い毒性を有するＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内を網羅する。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０１３７】
経口投与のため、活性成分は、カプセル、錠剤および粉末等、固体剤形で、またはエリキシル剤、シロップおよび懸濁液等、液体剤形で投与することができる。活性構成成分（複数可）は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ）、タルカム、炭酸マグネシウム等、不活性成分および粉末化キャリアと共に、ゼラチンカプセル内に被包することができる。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の望ましい特色をもたらすために添加することができる追加的な不活性成分の例は、赤色酸化鉄（ｒｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタンおよび食用ホワイトインク（ｗｈｉｔｅ  ｉｎｋ）である。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作製することができる。錠剤およびカプセルは両者共に、数時間の期間にわたる薬物の持続性放出をもたらす徐放生成物として製造することができる。圧縮錠剤は、不快な味をマスクし、大気から錠剤を保護するために糖衣もしくはフィルムコーティングすることができる、または胃腸管における選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与のための液体剤形は、患者許容性を増加させるための着色剤および香味料を含有することができる。
【０１３８】
活性成分は、単独で、または他の適した構成成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアゾール製剤へと作製することができる（すなわち、「霧状にする（ｎｅｂｕｌｉｚｅｄ）」ことができる）。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等、加圧された許容される噴霧剤の中に置くことができる。
【０１３９】
例えば、関節内（関節の中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路による等の非経口的投与に適した製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性、等張性無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存料を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液を含む。
【０１４０】
医薬組成物の製剤化に使用される構成成分は、好ましくは、高純度のものであり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくとも米国食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ）（ＮＦ）等級、一般には、少なくとも分析グレード、より典型的には、少なくとも医薬品グレード）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に意図される組成物は、通常無菌である。使用前に所定の化合物が合成される必要がある程度まで、得られる産物は、典型的には、合成または精製過程において存在し得るいずれか潜在的に毒性の作用物質、特に、いずれかのエンドトキシンを実質的に含まない。非経口的（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与のための組成物も、無菌で実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で作製される。
【０１４１】
特定の患者に与えるべき治療組成物の有効量は、種々の因子に依存し、そのうちいくつかは、患者間で異なる。製剤は、例えば、単位用量で提供することができる。有能な臨床医であれば、患者に投与するべき治療剤の有効量を決定することができる。代替物の投薬量は、処置、投与の経路、治療薬の性質、治療薬に対する疾患の感受性等に依存する。ＬＤ５０動物データおよび利用できる他の情報を利用して、臨床医は、投与の経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。身体から急速に排除される組成物は、治療濃度を維持するために、より高用量で、または反復した用量で投与することができる。通常の技能を利用して、有能な臨床医であれば、常習的な臨床治験の経過において、特定の治療またはイメージング組成物の投薬量を最適化することができる。典型的には、投薬量は、被験体の体重１キログラム当たり０．００１〜１００ミリグラムの薬剤となる。
【０１４２】
組成物は、一連の２回以上の投与において被験体に投与することができる。治療組成物のため、規則的な定期投与（例えば、２〜３日毎）が、毒性を低下するために要求される場合がある、または望ましい場合がある。反復した用量レジメンにおいて利用される治療組成物のため、免疫応答を引き起こさない部分が好ましい。
【０１４３】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載されている状態の処置に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。適した容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等、種々の材料で形成されていてよい。容器は、状態の処置に有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な（ｐｉｅｒｃｅａｂｌｅ）ストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルとすることができる）。組成物中の活性薬剤は、ｗｎｔ代替物である。容器に貼ったまたは添えたラベルは、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液等、薬学的に許容されるバッファーを保持することができる、さらに別の容器（複数可）を製造品に提供することができる。製造品は、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジおよび使用説明が記された添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
【０１４４】
本明細書において使用される場合、用語「治療有効量」は、治療投薬レジメンに従って疾患、障害および／または状態を患うまたはこれになりやすい集団に投与されたときに、この疾患、障害および／または状態の処置に十分な量を意味する。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害および／または状態の発生率および／または重症度を低下させる、その１種もしくは複数の特徴を安定化させる、および／またはその１種もしくは複数種の症状の発症を遅延させる量である。当業者であれば、用語「治療有効量」が、実際には、特定の個体における処置成功の達成を要求しないことを認められよう。むしろ、治療有効量は、斯かる処置を必要とする患者に投与されたときに、有意な数の被験体において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量とすることができる。
【０１４５】
例えば、一部の実施形態では、用語「治療有効量」は、発明に関する治療法の文脈において、それを必要とする個体に投与されたときに、前記個体において生じている疾患過程を遮断、安定化、減弱または反転する量を指す。
【０１４６】
使用方法
ｗｎｔ代替物は、予防および治療目的の両方に有用である。よって、本明細書において使用される場合、用語「処置する」は、疾患の防止および既存の状態の処置の両方を指すように使用される。ある特定の事例において、防止は、疾患または状態の発症リスクがあると同定された患者における疾患または状態の発症の阻害または遅延を示す。患者の臨床症状を安定化または改善するための、進行中の疾患の処置は、本発明によって提供される特に重要な利益である。斯かる処置は、罹患組織において機能が喪失するより前に行われるのが望ましい；結果的に、本発明によって提供される予防的治療利益も重要である。治療効果の証拠は、疾患の重症度におけるいずれかの縮小であり得る。治療効果は、臨床成績の観点から測定することができる、または免疫学的もしくは生化学的検査によって決定することができる。処置のための患者は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類であってよく、実験動物、例えば、ウサギ、ラット、マウス等、特に、治療法の評価のためには、ウマ、イヌ、ネコ、農場動物等であってよい。
【０１４７】
治療製剤、例えば、医薬組成物の投薬量は、状態の性質、投与の頻度、投与の様式、宿主からの薬剤のクリアランスなどに応じて広範に変動する。特定の実施形態では、初期用量が大きく、続いてより少量の維持用量とすることができる。ある特定の実施形態では、用量は、毎週または隔週ほどの低頻度で投与することができる、またはより頻繁には、より少ない用量へと分割され、毎日、週２回（ｓｅｍｉ−ｗｅｅｋｌｙ）もしくは有効な投薬量レベルの維持に必要とされるなどの頻度で投与され得る。
【０１４８】
本発明の一部の実施形態では、ｗｎｔ代替物を含む組成物または製剤の投与は、局所投与（ｌｏｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって行われる。局所投与は、本明細書において使用される場合、局所的な投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）を指すことができるが、身体の処置部位への注射または他の導入も指す。斯かる投与の例として、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などが挙げられる。他の実施形態では、ｗｎｔ代替物を含む組成物または製剤は、全身性、例えば、経口または静脈内投与される。一実施形態では、ｗｎｔ代替物を含む組成物または製剤（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ある期間、例えば、１０分間、２０分間、３分間、１時間、２時間、３時間、４時間またはそれを超える期間にわたる注入、例えば、持続注入によって投与される。
【０１４９】
本発明の一部の実施形態では、組成物または製剤は、活性の急速で有意な増加を得るために、短期ベースで、例えば、単一の投与、または例えば１、２、３日間もしくはそれ超、最大１もしくは２週間にわたって行われる一連の投与によって投与される。投与される用量のサイズは、医師によって決定される必要があり、疾患の性質および重大さ、患者の年齢および健康状態、ならびに薬物それ自体に対する患者の耐容能等、多数の因子に依存する。
【０１５０】
本発明のある特定の方法において、ｗｎｔ代替物を含む組成物の有効量は、例えば、所望の効果の達成のために、例えば、Ｗｎｔシグナリング、増殖等の増強のために有効な量の該組成物と細胞とを接触させることにより、細胞に与えられる。特定の実施形態では、接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナリングの増加を必要とする（ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｏｒ）被験体に由来するまたは被験体内に存在する。
【０１５１】
本発明の一部の方法において、有効量の対象組成物は、細胞におけるＷｎｔシグナリングを増強するために与えられる。生化学的な見地によると、Ｗｎｔ代替物の有効量または有効用量は、細胞におけるＷｎｔシグナリングを、ｗｎｔ代替物の非存在下でのシグナリングと比べて少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％増加させる量である。細胞の活性のモジュレーションの量は、ｗｎｔ生物学の技術分野の当業者に公知の多数の仕方で決定することができる。
【０１５２】
臨床的な意味においては、ｗｎｔ代替組成物の有効用量は、適した期間、例えば、少なくとも約１週間、おそらく約２週間またはそれ超、最大約４週間、８週間またはそれより長い期間被験体に投与されたときに、ｗｎｔシグナリングの欠如に関連する症状の変更を証明する用量である。一部の実施形態では、有効用量は、疾患状態の進行を遅くするまたは停止することができるのみならず、状態の反転を誘導することもできる。当業者であれば、初期用量を斯かる期間投与し、続いて場合によっては低下した投薬量となる維持用量を投与することができることが理解される。
【０１５３】
投与するべきｗｎｔ代替組成物の有効量または有効用量の計算は、当業者の技能範囲内であり、当業者にとって常習的なものである。言うまでもなく、投与するべき最終量は、投与の経路および処置するべき障害または状態の性質に依存する。
【０１５４】
対象方法における使用に適した細胞は、１種または複数種のＦｚｄ受容体を含む細胞である。接触させるべき細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、すなわち、培養されていてよい、またはｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち、被験体中に存在していてよい。細胞は、いかなる生物に由来する／存在することもできるが、好ましくは、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蠕虫等のような、ヒト、家庭動物および農場動物ならびに動物園、実験動物またはペット動物を含む哺乳動物に由来する。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。細胞は、いかなる組織に由来することもできる。細胞は、凍結していても、新鮮であってもよい。細胞は、初代細胞であっても、細胞株であってもよい。多くの場合、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される、またはレシピエントへの導入に先立ちｅｘ  ｖｉｖｏで処理される初代細胞である。
【０１５５】
細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、多数の当技術分野で周知の方法のいずれかによって、ｗｎｔ代替物を含む組成物と接触させることができる。例えば、組成物は、対象細胞が培養されている培地において、細胞に与えることができる。ｗｎｔ代替物をコードする核酸は、ベクターにおいて、その取込みを促進するための当技術分野で周知の条件下で、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびリポフェクションにより、対象細胞にまたは対象細胞と共培養される細胞に与えることができる。あるいは、ｗｎｔ代替物をコードする核酸は、ウイルスにより、対象細胞にまたは対象細胞と共培養される細胞に与えることができる、すなわち、細胞は、ｗｎｔペプチド代替ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触される。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、非分裂細胞のトランスフェクトに使用することができるため、本発明の方法に特に適している（例えば、Ｕｃｈｉｄａら（１９９８年）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５巻（２０号）：１１９３９〜４４頁を参照）。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損」している、すなわち、増殖性感染に必要とされるウイルスタンパク質を産生することができない。それどころか、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における成長を必要とする。
【０１５６】
同様に、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、被験体へのペプチド、小分子または核酸の投与のための多数の当技術分野で周知の方法のいずれかによって、対象ｗｎｔ代替組成物と接触させることができる。ｗｎｔ代替組成物は、種々の製剤または医薬組成物に取り込むことができ、これは、一部の実施形態では、全長Ｗｎｔタンパク質の製剤に関して記載された通りに、界面活性剤、リポソーム等の非存在下で製剤化される。
【０１５７】
ＷＮＴシグナリングは、人体におけるほとんど全ての組織の治癒に必要とされる。例えば、ＷＮＴは、成体の組織常在性幹細胞を活性化することが示された。これらの幹細胞は、自己再生および分裂し、そうすることで、目的の組織へと成熟する後代細胞を生じる。本発明の分子は、目的の組織に存在するＦｚｄ受容体に合わせて調整することができる、薬理学的に許容されるフォーマットにおいてＷＮＴ活性を提供する。
【０１５８】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、罹患または損傷した組織の処置における使用のため、組織再生における使用のため、細胞成長および増殖における使用のため、および／または組織工学における使用のために投与される。特に、本発明は、加齢、外傷、感染または他の病理学的状態による組織損失または損傷の処置における使用のための、本発明によるｗｎｔ代替物または１種もしくは複数種の代替物を含む組成物を提供する。
【０１５９】
本発明の組成物による処置のための目的の状態は、再生的細胞成長が望まれる多数の状態を限定することなく含む。斯かる状態は、例えば、骨再生、骨移植、骨折の治癒等における例えば、骨成長または再生の増強；脱毛症の処置；感覚器官の再生の増強、例えば、聴力損失の処置、黄斑変性症の処置等；歯成長、歯再生、脳卒中、外傷性脳傷害、アルツハイマー病、多発性硬化症および血液脳関門に影響を与える他の状態の処置；口腔粘膜炎、表皮再生の増強が望まれる状態の処置、例えば、表皮創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍の処置等、造血細胞の成長の増強、例えば、骨髄からの造血幹細胞移植の増強、末梢血の流動、免疫不全の処置等；肝臓細胞の再生の増強、例えば、肝臓再生、硬変の処置、肝臓移植の増強などを含むことができる。
【０１６０】
骨成長の増強が望まれる状態は、骨折、移植、義装具周囲の内方成長などを限定することなく含むことができる。ＷＮＴタンパク質は、骨ターンオーバーにとって必要不可欠な調節因子であり、豊富な科学データは、骨再生の促進におけるこれらのタンパク質の役割を支持する。一部の実施形態では、骨髄細胞は、該骨髄内の幹細胞が活性化されるように、本発明の分子に曝露される。これらの活性化された細胞は、個体の利益のため、ｉｎ  ｓｉｔｕに留めることができる、または骨移植手順において使用することができる。
【０１６１】
一部の実施形態では、骨再生は、有効用量の本発明の分子と応答性細胞集団、例えば、骨髄、骨前駆体細胞、骨幹細胞等とを接触させることにより増強される。一部の斯かる実施形態では、接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。他の斯かる実施形態では、接触は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。分子は、例えば、任意選択で生分解性であり任意選択で活性薬剤の徐放をもたらすマトリックスにロードすることにより、作用部位に局在化させることができる。マトリックスキャリアは、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミクス、ハイドロゲル、骨セメントなどを限定することなく含む。
【０１６２】
本発明の分子のうち１種または複数種を含む組成物は、骨格形成（ｓｋｅｌｅｔｏｇｅｎｉｃ）幹細胞由来等の、骨格組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成において、また、骨格組織欠乏のｉｎ  ｖｉｖｏ処置において使用することができる。対象化合物は、軟骨形成および／または骨形成の速度の調節に使用することができる。「骨格組織欠乏」とは、欠乏がいかなる起源を持つかを問わず、例えば、外科的介入、腫瘍の除去、潰瘍、インプラント、骨折または他の外傷性もしくは変性状態の結果であるかにかかわらず、骨または結合組織の回復が望まれるいずれかの部位における骨または他の骨格結合組織の欠乏を意味する。例えば、本発明の組成物は、結合組織への軟骨機能を回復するためのレジメンの一部として使用することができる。斯かる方法は、例えば、関節炎をもたらすもの等、変性的摩耗の結果である軟骨組織における欠損または病変の修復、ならびに断裂した半月板組織の置換術、半月板切除術、断裂した靱帯による関節の弛緩（ｌａｘａｔｉｏｎ）、関節のアライメント不良（ｍａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、骨折または遺伝性疾患によるもの等、組織に対する外傷に起因し得る他の機械的撹乱の修復において有用である。
【０１６３】
本発明の組成物は、眼の組織の再生においても用途を見出す。加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、中心視野および視力の進行性の減少によって特徴付けられ、依然として高齢アメリカ人の視力喪失および失明の主因である。現在、ＡＭＤのための標準医療は、硝子体内血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤である。ＡＭＤは、ＡＭＤにおける血管新生、炎症、線維症および酸化ストレスに寄与する、ＶＥＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、シクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）等、多数の病原性因子が関与する多因子性疾患である。本発明の組成物は、例えば、注入において；マトリックスもしくは他のデポー系において；または黄斑変性症の処置のための眼への他の局所的適用において使用することができる。
【０１６４】
他の実施形態では、本発明の組成物は、網膜組織の再生において使用される。成体哺乳動物網膜において、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経毒性傷害の後に、ミュラーグリアは、脱分化し、光受容体を含む網膜細胞を産生する。しかし、新たに生成された網膜ニューロンの数は、非常に限られている。しかし、ｗｎｔシグナリングは、損傷後に、または変性中に、ミュラーグリア由来網膜前駆体の増殖および神経再生を促進することができる。本発明の組成物は、例えば、注入において；マトリックスもしくは他のデポー系において；または網膜再生の増強のための眼への他の局所的適用において使用することができる。
【０１６５】
聴力損失に関与する細胞等、他の感覚器官も、本発明の組成物の恩恵を受けることができる。内耳において、聴覚器官は、音の振動から電気インパルスへの翻訳に必要とされる機械感受性有毛細胞を収容する。三半規管（ＳＳＣ）、卵形嚢および球形嚢で構成された前庭器官は、頭部の位置および運動を検出するための、感覚性有毛細胞も含有する。続いて、聴覚および前庭シグナルの両方が、らせん状および前庭神経節ニューロンにより中枢的に中継され、音および平衡の知覚を可能にする。多数の研究が、蝸牛発生および有毛細胞再生の促進におけるＷｎｔシグナリングの複数の役割を特徴付けた。成熟哺乳動物の聴覚および前庭器官は、有毛細胞変性後に増殖応答を自発的に開始しない。しかし、活性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングは、有毛細胞の増殖を促進することができ、その場合、Ｌｇｒ５陽性支持細胞は、有毛細胞前駆体として挙動することができる。Ｌｇｒ５陽性支持細胞は、有毛細胞を有糸分裂により再生することができ、その場合、Ｗｎｔシグナリングは、有糸分裂応答および有毛細胞再生の程度の両方を増大する。Ｗｎｔシグナリングは、異所性有毛細胞形成を誘導することもできる。本発明の組成物は、例えば、注入において；マトリックスもしくは他のデポー系において；または聴覚性再生の増強のための耳への他の局所的適用において使用することができる。
【０１６６】
歯周病は、歯の損失の主因であり、複数の全身性状態に関連付けられる。罹患した歯の支持組織の支持および機能の再構築は、歯周再生医療のための重要な治療エンドポイントを表す。足場マトリックスにおける現在の進歩と合わせた歯周生物学に関する理解の改善は、任意選択で、支持歯槽骨、歯周靱帯およびセメント質の予測可能な組織再生のための再生細胞の送達と組み合わせた、本発明の組成物をもたらす処置をもたらす。一部の実施形態では、歯またはその基礎をなす骨の再生は、有効用量の本発明の分子と応答性細胞集団とを接触させることにより増強される。一部の斯かる実施形態では、接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。他の斯かる実施形態では、接触は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われ、活性化された幹細胞または前駆体細胞のその後の植え込みが為される。分子は、例えば、任意選択で生分解性であり、任意選択で活性薬剤の徐放をもたらすマトリックスにロードすることにより、作用部位に局在化させることができる。マトリックスキャリアは、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミクス、ハイドロゲル、骨セメントなどを限定することなく含む。
【０１６７】
毛髪脱落は、ホルモン感受性から自己免疫に及ぶ複数の原因による一般的な問題である。男性型禿頭症と呼ばれることが多いアンドロゲン性脱毛症は、加齢に伴い５０％もの男性が罹患する男性の毛髪脱落の最も一般的な形態である。アンドロゲン性脱毛症において、毛髪脱落は、アンドロゲン５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に対する頭頂部の頭皮における毛包の感受性に起因する。ＤＨＴは、これらの毛包に、臨床的に明らかな毛幹をもはや産生しないポイントまで進行性の小型化を起こさせる。ＤＨＴによって影響される細胞は、真皮乳頭細胞であり、これは、成長を止め、毛髪成長を誘導するその能力を失う。表皮Ｗｎｔシグナリングは、成体毛包再生にとって必要不可欠である。一部の実施形態では、毛包再生は、有効用量の本発明の分子と応答性細胞集団とを接触させることにより増強される。一部の斯かる実施形態では、接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。他の斯かる実施形態では、接触は、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われ、活性化された幹細胞または前駆体細胞、例えば、毛包（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）細胞のその後の植え込みが為される。分子は、例えば、外用ローション、ゲル、クリームなどにより、作用部位に局在化させることができる。
【０１６８】
様々な表皮状態が、本発明の化合物による処置の利益を受ける。胃腸管を裏打ちする急速に分裂した上皮細胞が崩壊し、粘膜組織が潰瘍および感染を受けやすくした場合、粘膜炎が発生する。粘膜または粘液性の膜としても公知の粘膜組織は、気道および消化管等、空気と連絡するあらゆる身体の通路を裏打ちし、粘液を分泌する細胞および関連する腺を有する。口腔粘膜と呼ばれる口を覆うこの内膜の部分は、最も感受性の高い身体部分の１種であり、化学療法および放射線照射に対し特に脆弱である。口腔は、粘膜炎の最も一般的な位置である。口腔粘膜炎は、がん処置、特に、化学療法および放射線照射のおそらく最も一般的な衰弱性合併症である。これは、疼痛、食べることができないことの結果として栄養上の問題および粘膜における開放創による感染リスク増加を含むいくつかの問題を生じ得る。これは、患者のクオリティ・オブ・ライフに有意な効果を有し、用量制限的（すなわち、その後の化学療法用量の低下を要求する）となり得る。他の表皮状態は、表皮創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍などを含む。本発明の分子は、斯かる状態における用途を見出すことができ、この場合、再生細胞は、本発明の化合物と接触される。接触は、例えば、標的化部位に塗布等されるゲル、ローション、クリーム等における、皮内、真皮下を含む局所的であってよい。
【０１６９】
肝臓は、ｗｎｔシグナリングによって増強され得る再生能力を有する。成体肝臓前駆体（卵円形）細胞は、肝臓における条件的（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）幹細胞である。活性Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングは、卵円形細胞集団内に優先的に発生し、ｗｎｔシグナリングは、再生肝臓における卵円形細胞集団の増大を促進する。肝臓組織の再生のための方法は、全身性であっても局在化されてもよい、例えば、肝臓組織への注射による、肝臓に通じる静脈への注射による、徐放製剤の植え込みなどによる、本発明の化合物の投与の利益を受ける。肝臓損傷は、感染、アルコール乱用等に関連する場合がある。
【０１７０】
脳卒中、外傷性脳傷害、アルツハイマー病、多発性硬化症および血液脳関門に影響を与える他の状態。血管新生は、身体のいたるところにある多くの組織への酸素および栄養素の供給を確実にするため必要不可欠であり、神経組織は、低酸素および虚血に対して極めて感受性が高いことから、ＣＮＳにとって特に重要である。脳における血管は、血液から脳への分子およびイオンの流動を限定する、血液脳関門（ＢＢＢ）と命名された特殊化された構造を形成する。このＢＢＢは、脳恒常性の維持にとって必要不可欠であり、毒素および病原体からＣＮＳを保護する。ＢＢＢを形成するＣＮＳ内皮細胞は、分子およびイオンの傍細胞流動を限定する接着結合によって一緒に保持された高度に分極された細胞であるという点において、非神経組織における内皮細胞とは異なる。加えて、ＣＮＳ内皮細胞は、ＢＢＢを越えた脳への必須栄養素の選択的輸送の提供および脳からの潜在的な毒素の流出の両方のための特異的トランスポーターも発現する。Ｗｎｔシグナリングは、ＣＮＳ血管形成および／または機能を特異的に調節する。ＢＢＢが損なわれた状態は、例えば、直接的注射、髄腔内投与、徐放製剤の植え込みなどにより、本発明の化合物の投与の利益を受けることができる。
【０１７１】
患者は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などが挙げられるがこれらに限定されない、いかなる動物（例えば、哺乳動物）であってもよい。典型的には、患者は、ヒトである。処置方法および本発明の代替物または本発明の代替物を含む化合物もしくは組成物の医学的使用は、組織再生を促進する。用語「組織」は、同様の構造、機能および／または起源を任意選択で有する細胞または細胞凝集塊からなる生物の部分を指す。組織の例として、皮膚組織、胃内膜、膵臓内膜、肝臓等、上皮組織；皮膚内層、腱、靱帯、軟骨、骨、脂肪、毛髪、血液等、結合組織；筋肉組織；ならびにグリア細胞およびニューロン等、神経組織が挙げられるがこれらに限定されない。損失または損傷は、細胞数の縮小を引き起こすいずれかのものであってよい。例えば、事故、自己免疫性障害、治療の副作用または疾患状態は、外傷を構成することができる。細胞数の縮小を引き起こし得る状態の具体例として、放射線照射／化学療法、粘膜炎、ＩＢＤ、短腸症候群、遺伝性腸障害、セリアック病、代謝性疾患、遺伝性症候群、（ウイルス）感染症（ｈｅｐＢ／Ｃ）、中毒状態、アルコール性肝臓、脂肪肝、肝硬変、感染症、悪性貧血、潰瘍、糖尿病、糖尿病性足部潰瘍（例えば、難治性糖尿病性足部潰瘍）、島細胞の破壊、骨質量の損失（骨粗鬆症）、機能的皮膚の損失、毛髪の損失、機能的肺組織の損失、腎臓組織の損失（例えば、急性細管壊死）、内耳における感覚性細胞の損失が挙げられるがこれらに限定されない。組織再生は、組織内の細胞数を増加させ、好ましくは、組織の細胞間の連結が再建されることを可能にし、より好ましくは、組織の機能性を回復させる。
【０１７２】
本発明の代替物または１種もしくは複数種の代替物を含む組成物により処置することができる他の状態として、関節障害、骨粗鬆症および関連する骨疾患、禿頭症、移植片対宿主病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
本発明の代替物または１種もしくは複数種の代替物を含む組成物、例えば、ＬＲＰ６に結合し活性化する代替物は、多くの器官（例えば、気道、大動脈、子宮）における創傷治癒および平滑筋組織の生成に使用することもできる。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明は、２種またはそれを超える本発明の代替物または本発明の代替物を含む化合物もしくは組成物が、同時に、逐次に、または別々に動物または患者に投与される、先に記載された処置方法および医学的使用を提供する。代替物（複数可）は、ｗｎｔシグナリングを増強する作用物質、例えば、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、抗スクレロスチン等と同時に、逐次にまたは別々に投与することもできる。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明は、１種または複数種の本発明の代替物または本発明の代替物を含む化合物もしくは組成物が、１種または複数種のさらに別の化合物または薬物と組み合わせて、動物または患者に投与され、前記本発明の代替物または本発明の代替物を含む化合物もしくは組成物と、前記さらに別の化合物または薬物が、同時に、逐次にまたは別々に投与される、先に記載された処置方法および医学的使用を提供する。
【０１７６】
本発明の代替物は、非治療的方法、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究方法における広範な用途も有する。
【０１７７】
本発明は、本発明の代替物を投与するステップを含む、上の医学的使用のセクションに記述されている組織等、損傷した組織の組織再生のための方法を提供する。代替物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に直接的に投与することができる、経口、静脈内もしくは当技術分野で公知の他の方法により患者に投与することができる、またはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に投与することができる。一部の実施形態では、本発明の代替物が、ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に投与される場合、これらの細胞は、本発明のアゴニストの投与の前、後または最中に患者に移植することができる。
【０１７８】
本発明は、本発明の代替物を細胞に供給するステップを含む、細胞の増殖を増強するための方法も提供する。
【０１７９】
これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【０１８０】
Ｗｎｔシグナリングは、幹細胞培養の鍵となる構成成分である。例えば、ＷＯ２０１０／０９０５１３、ＷＯ２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏら、２０１１年（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１年；１４１巻：１７６２〜１７７２頁）およびＳａｔｏら、２００９年（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９巻、２６２〜５頁）に記載されている幹細胞培養培地。本発明の代替物は、これらの幹細胞培養培地における使用のためのＲスポンジンの適した代用物である、またはＲスポンジンと組み合わせることができる。
【０１８１】
したがって、一実施形態では、本発明は、本発明の代替物を幹細胞に供給するステップを含む、幹細胞の増殖を増強するための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、１種または複数種の本発明の代替物を含む細胞培養培地を提供する。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＷｎｔまたはＲスポンジンを通常含むが、ＷｎｔまたはＲスポンジンが本発明の代替物によって置き換えられた（全体的にまたは部分的に）またはこれを補充された、既に当技術分野で公知のいずれかの細胞培養培地であってよい。例えば、培養培地は、これによりそれらの全体が参照により援用される、ＷＯ２０１０／０９０５１３、ＷＯ２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏら、２０１１年（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１年；１４１巻：１７６２〜１７７２頁）およびＳａｔｏら、２００９年（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９巻、２６２〜５頁）に記載されているものとすることができる。
【０１８２】
幹細胞培養培地は、多くの場合、追加的な増殖因子を含む。よって、本方法は、増殖因子を幹細胞に供給するステップをさらに含むことができる。細胞培養培地において一般的に使用される増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ、（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、トランスフォーミング増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト増殖因子（ＨＧＦ）およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＦＧＦ７としても公知）を含む。ＥＧＦは、種々の培養外胚葉および中胚葉系細胞のための強力な有糸分裂誘発性因子であり、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的な細胞の分化ならびに細胞培養における一部の線維芽細胞の分化に著明な効果を有する。ＥＧＦ前駆体は、膜に結合した分子として存在し、これは、タンパク質分解性切断されて、細胞を刺激する５３アミノ酸ペプチドホルモンを生成する。よって、ＥＧＦまたは他の有糸分裂誘発性増殖因子を幹細胞に供給することができる。幹細胞の培養の間に、好ましくは４日毎に培養培地をリフレッシュしつつ、有糸分裂誘発性増殖因子を隔日で培養培地に添加することができる。一般に、有糸分裂誘発性因子は、ｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＫＧＦ、ｉｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＦＧＦ７；ｉｉｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＦＧＦ；ｉｖ）ＥＧＦおよびＫＧＦ；ｖ）ＥＧＦおよびＦＧＦ７；ｖｉ）ＥＧＦおよびＦＧＦ；ｖｉｉ）ＴＧＦ−αおよびＫＧＦ；ｖｉｉｉ）ＴＧＦ−αおよびＦＧＦ７；またはｉｘ）ＴＧＦαおよびＦＧＦに由来するものからなる群から選択される。
【０１８３】
幹細胞の増殖を増強するこれらの方法は、例えば、ＷＯ２０１０／０９０５１３、ＷＯ２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏら、２０１１年（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１年；１４１巻：１７６２〜１７７２頁）およびＳａｔｏら、２００９年（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９巻、２６２〜５頁）に記載されている通り、幹細胞からの新たなオルガノイドおよび組織の成長に使用することができる。
【０１８４】
多数の臨床的に関連する状態は組織を再生できないことによって特徴付けられ、ここでは、ｗｎｔシグナリングの上方調節が望ましい。
【０１８５】
一部の実施形態では、ｗｎｔ代替物は、幹細胞再生の増強に使用される。目的の幹細胞は、筋サテライト細胞；造血幹細胞およびそれに由来する前駆体細胞（米国特許第５，０６１，６２０号）；神経幹細胞（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９９年）Ｃｅｌｌ  ９６巻：７３７〜７４９頁を参照）；胚性幹細胞；間葉系幹細胞；中胚葉系幹細胞；肝臓幹細胞等を含む。
【０１８６】
ｗｎｔ代替物は、骨治癒の増強における用途を見出す。多くの臨床状況において、例えば、骨形成不全症等における、傷害後の高齢者における造骨細胞（ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の活性減少のため、骨治癒状態は、あまり理想的ではない。高齢個体は、種々の骨および軟骨障害に罹患する。斯かる組織は通常、間葉系幹細胞によって再生される。斯かる状態には、変形性関節症が含まれる。変形性関節症は、「摩損（ｗｅａｒ−ａｎｄ−ｔｅａｒ）」の発現として、身体の関節に生じる。よって、運動選手または過体重個体は、軟骨の損失または損傷のため、大型の関節（膝、肩、臀部）に変形性関節症を発症する。骨性の関節表面を覆うこの硬く滑らかなクッションは、メッシュを形成して関節に支持および柔軟性をもたらす、身体の構造タンパク質であるコラーゲンから主に構成されている。軟骨が損傷され失われると、骨表面は、異常な変化を生じる。ある程度の炎症が見られるが、他の種類の関節炎に観察されるほどではない。にもかかわらず、変形性関節症は、老齢者における相当な疼痛および能力障害の原因となる。
【０１８７】
骨修復を加速させる方法において、本発明のｗｎｔ医薬組成物は、例えば傷害後に骨の損傷を患う患者に投与される。製剤は、好ましくは、骨再生を必要とする損傷後に、傷害部位にまたはその付近に投与される。ｗｎｔ製剤は、好ましくは、短い期間、傷害部位に存在する骨前駆体細胞の数の増加に有効な用量で投与される。一部の実施形態では、ｗｎｔは、傷害の約２日間以内に、通常、約１日間以内に投与され、約２週間以下、約１週間以下、約５日間以下、約３日間以下等の期間与えられる。
【０１８８】
代用方法において、骨の損傷を患う患者は、骨髄細胞を含む組成物、例えば、骨芽細胞に分化することができる間葉系幹細胞、骨髄細胞を含む組成物；等を与えられる。骨髄細胞は、再生の増強に十分な用量のｗｎｔタンパク質（単数または複数）を含む医薬組成物によりｅｘ  ｖｉｖｏで処理することができる；または細胞組成物は、本発明のｗｎｔ製剤と併せて患者に投与することができる。
【０１８９】
次の実施例は、本発明をなすおよび使用する仕方に関する完全な開示および記載を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明として考慮するものの範囲を限定することを意図せず、後述する実験が、行われた全てのまたは唯一の実験であると表すことも意図しない。使用される数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確実にするための努力が為されたが、ある程度の実験誤差および偏差については考慮されるべきである。他に断りがなければ、割合（ｐａｒｔｓ）は、重量割合であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、セ氏温度であり、圧力は、大気圧またはその付近である。
【実施例】
【０１９０】
（実施例１）
フリズルド−ＣＲＤに結合されたＷｎｔ結晶構造に基づき、脂質基を使用してＷｎｔがＦｚ−ＣＲＤに結合する仕方を模倣する新たなタンパク質を開発するためにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計を使用した。計算的方法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ由来の特徴付けられていないタンパク質Ｂｈ１４７８を操作のための候補足場として同定した。図１において２ＱＵＰとして同定されたタンパク質は、公表された構造およびアミノ酸配列を有する：
【化５】
2020186267.tif 000007
【０１９１】
この足場配列はフリズルド（Ｆｚ８−ＣＲＤ）に結合しないが、酵母系において、変異誘発された残基を有するライブラリーを親和性増加について選択して、タンパク質Ｆｚ２７およびＦｚ２７−Ｂ１２（図１に示す）を開発した。これらのタンパク質は、足場と比べて、ポジション１６９、１７０、１７１、１７３、１７４、１７６、１７７、１７８および１７９にアミノ酸置換を含有する。操作されたタンパク質の配列を図１に示す。
【０１９２】
Ｆｚ２７：
【化６】
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【０１９３】
Ｆｚ２７−Ｂ１２
【化７】
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【０１９４】
図１は、ｗｎｔ代替タンパク質およびフリズルド結合ドメインの構造および結合特性を例示する。親和性成熟に寄与する界面、コアおよび構造残基を図１に示す。
【０１９５】
図２に示す通り、親足場タンパク質は結合しないが、操作されたタンパク質は、高親和性でＦｚ８に結合する。アミノ酸置換Ａ１７３ＲおよびＡ１７４Ｄ（上に示す配列における残基５３および５４に相当）は、図２Ａに示す通り結合を抑止し、タンパク質が、設計された結合モードにより結合したことを示す。Ｆｚ２７は、蛍光コンジュゲートされたＦｚ８−ＣＲＤを使用した酵母表面ディスプレイによる結合の確認を可能にする構築物において発現された。設計（２ＱＵＰ）の生成に使用された野生型足場は結合せず、これは、結合活性が、合理的操作によるものであることを示す。
【０１９６】
酵母表面力価測定から得られるおよそのＫｄは、Ｆｚｄ８−ＣＲＤへの結合の合理的実用的な設計によって、Ｆｚｄ４−ＣＲＤと比較してＦｚｄ８−ＣＲＤに高度に特異的であるとＦｚ２７バリアントを決定した。Ｆｚｄ４−ＣＲＤを上回るＦｚｄ８−ＣＲＤに対する現存する優先度は、図３に示す通り、その配列が非常に類似したフリズルドサブタイプ間であっても識別することができる結合剤を設計する能力を実証する。
【０１９７】
操作されたタンパク質Ｆｚ２７−Ｂ１２は、短いポリペプチドリンカーＧＳＧＳＧＳを介してＤＫＫ１ＣのＬｒｐ６結合ドメインに接続して、ｗｎｔ代替物を生成する。図４に示す通り、代替タンパク質は、ＸＷｎｔ８活性を再現して、ｗｎｔレポーター系におけるルシフェラーゼの誘導によって証明される通り、Ｗｎｔシグナリングおよびレポーター活性化を活性化する。
【０１９８】
（実施例２）
図５〜図１５は、抗体に基づくｗｎｔ代替タンパク質およびフリズルド結合ドメインの構造および結合特性を例示する。図５は、ｓｃＦｖドメインおよびｗｎｔ結合ドメインを描写する、例示的な抗体に基づく代替ｗｎｔアゴニストのアミノ酸配列を示す。ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃは、柔軟なリンカーによって融合された、ＯＭＰ−１８Ｒ５抗体のｓｃＦｖ断片（Ｏｎｃｏｍｅｄ）およびＤＫＫ−１のＣ末端ドメインを含む。代替物の結合活性を図６に示す。図７に例示されている通り、Ｒ−スポンジン２は、Ｗｎｔ代替ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃの活性を増強して、Ａ３７５細胞および（ａｍｄ）ＳＹ５Ｙ細胞におけるＷｎｔ依存性ルシフェラーゼレポーターの発現増強により示される通り、Ｗｎｔ様の様式でＷｎｔシグナリングを活性化する。
【０１９９】
ｗｎｔ代替物の存在下でＡ）非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９、Ｂ）メラノーマ細胞株Ａ３７５およびＣ）神経芽細胞腫細胞株ＳＹ５Ｙに安定的にトランスフェクトされたＷｎｔ依存性ｐＢＡＲレポーター（ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子結合部位の制御下におけるホタルルシフェラーゼ）の活性化を、図８および図９に示す。ｐＢＡＲレポーターの発現を誘導するための、ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃおよびＢ１２−ＤＫＫ１ｃ（実施例１に記載）代替リガンド、ＸＷｎｔ８、Ｂ１２、ＤＫＫ１および無関係のタンパク質の活性を、様々な異なる濃度（図の下に示す）で測定した。基礎活性と比べたｐＢＡＲレポーターの倍数誘導を示す。ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃ、Ｂ１２−ＤＫＫ１ｃおよびＸＷｎｔ８のフリズルド反応性が示され、対応する細胞のフリズルド発現プロファイルをｑＰＣＲにより決定し、表示した。対応するリガンドのＷｎｔレポーター活性化を図の下の表に示す。
【０２００】
図１０に示す通り、Ａ５４９細胞におけるｐＢＡＲレポーターを誘導するためのＢ１２−ＤＫＫ１ｃの活性は、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃ（Ｂ１２への結合による）、ＤＫＫ−１（Ｌｒｐ５／６への結合による）およびＢ１２（Ｆｚｄ５およびＦｚｄ８への結合による）によって阻害することができるが、Ｂ１２に結合しないため、Ｆｚｄ１ＣＲＤ−Ｆｃによって阻害することはできない。Ａ５４９細胞におけるｐＢＡＲレポーターを誘導するためのｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏｍｅｄ）−ＤＫＫ１ｃの活性は、Ｆｚｄ１ＣＲＤ−Ｆｃ、Ｆｚｄ８ＣＲＤ−Ｆｃ（ｓｃＦｖ−ＤＫＫ１ｃへの結合による）およびＤＫＫ−１（Ｌｒｐ５／６への結合による）によってアンタゴナイズすることができるが、Ｂ１２は、フリズルドへのｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）の結合を阻害しないため、Ｂ１２によってアンタゴナイズすることはできない。
【０２０１】
図１１は、ｗｎｔ代替物の生物学的活性を示す。増加濃度のｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃまたはＷｎｔ３ａ含有馴化培地（ＣＭ）によるＳＹ５Ｙ細胞の２時間処理は、基本の培地（ｎｅｇ  ｃｔｒ）または対照馴化培地（偽ＣＭ）による処理と比較して、細胞質ベータ−カテニンの蓄積をもたらす。
【０２０２】
ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃは、図１２に示す通り、Ｗｎｔ様の様式で様々な細胞株における直接的Ｗｎｔ標的遺伝子アキシン２およびＴｒｏｙの転写を誘導する。ＳＹ５Ｙ  ｐＢＡＲ細胞およびＡ３７５  ｐＢＡＲ細胞を、５０ｎＭ  ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃ、５０ｎＭ  Ｂ１２または３０％Ｗｎｔ３ａ−Ｌ馴化培地で２４時間処理した。ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ標的遺伝子アキシン２およびＴｒｏｙのレベルを検出した。
【０２０３】
代替Ｗｎｔの柔軟なリンカーの長さを変更すると、シグナリングの大きさが変化する。図１３Ａ、２μＭ  ＩＷＰ−２の存在下でＡ５４９  ｐＢＡＲ細胞を、５０ｎＭ  ＸＷｎｔ８、０ａａ、５ａａ、１０ａａおよび１５ａａリンカーを有するＢ１２−ＤＫＫ１ｃまたは３０％Ｗｎｔ３ａ−Ｌ馴化培地で２４時間処理した。ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと逆転写し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ標的遺伝子アキシン２のレベルを検出した。図１３Ｂ、２ｕＭ  ＩＷＰ−２の存在下でＡ５４０  ｐＢＡＲ細胞を、増加濃度のＸＷｎｔ８および可変リンカーを有するＢ１２−ＤＫＫ１ｃで１６〜２０時間処理した。その後、細胞を溶解し、Ｗｎｔ依存性ルシフェラーゼの発現を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系により検出した。シグナリングをモジュレートできることが理解でき、直接的融合は、５ｍｅｒおよび１５ｍｅｒリンカーよりも活性が低いが、活性は、１５ｍｅｒによって示される通り、長さの増加に伴いダウンする。
【０２０４】
図１４。ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃは、Ｗｎｔ様の様式でＳＹ５Ｙ細胞およびＡ３７５細胞における細胞質ベータ−カテニンの蓄積を増強する。ＳＹ５Ｙ細胞およびＡ３７５細胞を、薬物、馴化培地または陰性対照で２時間処理した。２時間後、等張性バッファーに細胞を溶解し、ウエスタンブロッティングによって可溶性画分から細胞質ベータ−カテニンを検出した。アルファ−チューブリンをローディング対照として使用した。
【０２０５】
Ｒ−スポンジン２は、Ｗｎｔ様の様式でｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃの活性を増強する。図１５に示す通り、ＳｕｐｅｒＴｏｐＦｌａｓｈ  Ｗｎｔレポーターを安定的にトランスフェクトした２９３細胞を、２０ｎＭ  Ｒｓｐｏ２ありおよびなしで１６〜２０時間、ｓｃＦｖ（Ｏｎｃｏ）−ＤＫＫ１ｃ（４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３１ｎＭ、６２ｎＭ）、Ｗｎｔ３ａ（２３％、２９％、３３％、３８％、４１％、４４％）で１６〜２０時間処理した。
【０２０６】
先行する記載は、本発明の原理を単に例示するものである。当業者であれば、本明細書に明確に記載または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されているあらゆる例および条件的言語は主に、本発明の原理、および当技術分野の増進のために本発明者らによってもたらされる概念に関する読者の理解を助けることを意図しており、斯かる特に列挙されている例および条件に限定されるものではないと解釈されたい。さらに、本発明の原理、態様および実施形態ならびにその具体例を列挙する本明細書におけるあらゆる記載は、これらの構造および機能的均等物の両方を包含することを意図する。その上、斯かる均等物が、現在公知の均等物および将来開発される均等物の両方、すなわち、構造に関係なく同じ機能を果たす開発されるいずれかのエレメントを含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され記載されている例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ＡＢ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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