(57)【要約】【課題】  冷却処理による培養細胞の回収を高回収率で可能にする方法を提供すること。【解決手段】  水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の疎水性重合体を含む温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材を用いた接着細胞の培養方法であって、培地中の血清濃度が２％以上であり、培養細胞をＬＣＳＴ以下の温度に冷却して回収することを特徴とする培養方法で前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中の血清濃度が２ｖｏｌ％以上であり、下記成分（Ａ）〜（Ｃ）を含む温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材を用いた接着細胞の培養方法であって、培養細胞をＬＣＳＴ以下の温度に冷却して回収することを特徴とする培養方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体。
（Ｃ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体。
【請求項２】
ＬＣＳＴ以下の温度に冷却した培地での培地交換を伴うことを特徴とする請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
冷却時間が２０分以内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
冷却後、ピペッティングを伴うことを特徴とする請求項１から３いずれか一項に記載の培養方法。
【請求項５】
血清が牛胎児血清（ＦＢＳ）であることを特徴とする請求項１から４いずれか一項に記載の培養方法。
【請求項６】
細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１から５いずれか一項に記載の培養方法。
【請求項７】
間葉系幹細胞が骨髄由来であることを特徴とする請求項６に記載の培養方法。
【請求項８】
請求項１記載の温度応答性ブロック共重合体が２−メトキシエチルアクリレートとｎ−ブチルアクリレートとＮ−イソプロピルアクリルアミドからなることを特徴とする請求項１から７いずれか一項に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高濃度血清培地中の培養細胞を、タンパク質分解酵素を用いずに高回収率で回収可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、細胞を使用する医療や創薬の注目が高くなっており、細胞培養を工業規模で且つ高品質で行うことが重要となっている。細胞を増殖させるには培地が必要である。使用される培地は多種多様であり、ＤＭＥＭ培地やＦ１２培地などの基礎培地に、血清が加えられている。血清には成長因子や接着因子など必要不可欠な重要因子が含まれており１〜２０ｖｏｌ％の濃度で使用する。一方、注目を集めている細胞の多くは接着細胞であり、細胞を基材から剥離して回収する必要がある。トリプシンなどのタンパク質分解酵素を用い、接着因子を分解して細胞を基材から剥離しているが、タンパク質分解酵素が細胞表面のタンパク質も分解してしまうことで、細胞を高品質で回収することが困難であった。
【０００３】
以上の問題を温度応答性細胞培養基材の使用で解決できる。高温域では疎水性であるが、下限臨界溶液温度（Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＬＣＳＴ）よりも低温域において親水化する温度応答性細胞培養基材が特許文献１に開示されており、一例として製品名ＵｐＣｅｌｌとして製品化されている。このような基材によれば、タンパク質分解酵素を用いずに、冷却処理による親水化で細胞を剥離させ回収することができる。
【０００４】
一方、細胞増殖を促進するために高血清濃度の培地を用いるが、先行技術の方法がしばしば直面する問題として、培養条件によっては冷却処理による細胞の剥離がうまくいかないことがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、血清培地中の培養細胞を一定の比率以上に培養し、タンパク質分解酵素を用いずに高回収率で回収可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、培地中の血清濃度が２ｖｏｌ％以上であり、水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体を含む温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材を用いた接着細胞の培養方法であって、培養細胞をＬＣＳＴ以下の温度に冷却して回収することを特徴とする培養方法が、培養細胞を高回収率で回収できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞  培地中の血清濃度が２ｖｏｌ％以上であり、下記成分（Ａ）〜（Ｃ）を含む温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材を用いた接着細胞の培養方法であって、培養細胞をＬＣＳＴ以下の温度に冷却して回収することを特徴とする培養方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体。
（Ｃ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体。
＜２＞  ＬＣＳＴ以下の温度に冷却した培地での培地交換を伴うことを特徴とする＜１＞の培養方法。
＜３＞  冷却時間が２０分以内であることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の培養方法。
＜４＞  冷却後、ピペッティングを伴うことを特徴とする＜１＞から＜３＞いずれかに記載の培養方法。
＜５＞  血清が牛胎児血清（ＦＢＳ）であることを特徴とする＜１＞から＜４＞いずれかに記載の培養方法。
＜６＞  細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする＜１＞から＜５＞いずれかに記載の培養方法。
＜７＞  間葉系幹細胞が骨髄由来であることを特徴とする＜６＞に記載の培養方法。
＜８＞  ＜１＞記載の温度応答性ブロック共重合体が２−メトキシエチルアクリレートとｎ−ブチルアクリレートとＮ−イソプロピルアクリルアミドからなることを特徴とする＜１＞から＜７＞いずれかに記載の培養方法。
【発明の効果】
【０００８】
培地中の血清濃度が２％以上であり、水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体を含む温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材を用いた接着細胞の培養方法であって、培養細胞を一定の比率以上に培養し、ＬＣＳＴ以下の温度に冷却して回収することを特徴とする培養方法は、培養細胞を高回収率で回収できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、培地中の血清濃度が２ｖｏｌ％以上であり、水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体とＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体を含む温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材を用いた接着細胞の培養方法であって、培養細胞を一定の比率以上に培養し、ＬＣＳＴ以下の温度に冷却して回収することを特徴とする培養方法であり、培養細胞を高回収率で回収を可能にする。
【００１１】
本発明で用いる培地は、培地は基礎培地と血清からなり、抗生物質が含まれていても良い。基礎培地の種類は特に限定はなく、例えば、ＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、ＲＰＭＩ  １６４０などを用いることができる。血清の種類は特に限定はなく、例えば、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清が使用されるが、入手の容易さから一般的にＦＢＳがよく用いられる。培地中の血清濃度は好ましくは２ｖｏｌ％以上であり、より好ましくは５ｖｏｌ％以上である。費用体効果から一般的には２０ｖｏｌ％以下の濃度で用いられることが多いが、２０ｖｏｌ％以上の濃度であっても良い。
【００１２】
本発明で用いる細胞培養基材は、成分（Ａ）である水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体と、成分（Ｂ）であるＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体と、成分（Ｃ）であるＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体を含むブロック共重合体が被覆される。
【００１３】
本発明の培養方法は培養細胞を一定の比率以上に培養できれば特に限定は無い。一定の比率以上の培養とは培養細胞の増殖が概ね認められることであり、例えば、細胞の播種から７２時間培養後の細胞増殖率が１．４５以上を示すことである。細胞増殖率とは培養後の全細胞数を播種細胞数で割ったものである。
【００１４】
本発明の成分（Ａ）である水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体の繰返し単位とその水に対するＬＣＳＴは、例えば、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４６℃）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２２℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３２℃）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝４４℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリ
ルアミド（ＬＣＳＴ＝２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝３５℃）、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝５６℃）、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２３℃）、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝２０℃）、またはＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＬＣＳＴ＝４７℃）等が例示できる。ＬＣＳＴは成分（Ａ）水溶液の濃度で発現する温度が前後するが、これらの中では、ＬＣＳＴ発現の濃度依存性が低いＮ−イソプロピルアクリルアミドの繰返し単位がより好ましい。本発明における成分（Ａ）は、前記繰り返し単位を１種類のみ用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また温度応答性を有するのであれば、前期温度応答性繰返し単位の他に、異なる繰返し単位を含んでも良い。
【００１５】
本明細書において、ＨＬＢ値（ＨＬＢ；Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ）とは、Ｗ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  １，  ３１１（１９４９）．に記載の、水と油への親和性の程度を表す値であり、０から２０までの値を取り、０に近いほど疎水性が高く、２０に近いほど親水性が高くなる。計算によって決定する方法として、アトラス法、グリフィン法、デイビス法、川上法があるが、本発明においてはグリフィン法で計算した値を使用し、繰り返し単位中の親水部の式量と繰り返し単位の総式量を元に、下記の計算式で求めた。
ＨＬＢ値＝２０×（親水部の式量）÷（総式量）
前述の、各ブロックの繰り返し単位中の親水部の定義として、スルホン部（−ＳＯ３−）、ホスホノ基部（−ＰＯ３−）、カルボキシル基部（−ＣＯＯＨ）、エステル部（−ＣＯＯ−）、アミド部（−ＣＯＮＨ−）、イミド部（−ＣＯＮ−）、アルデヒド基部（−ＣＨＯ）、カルボニル基部（−ＣＯ−）、ヒドロキシル基部（−ＯＨ）、アミノ基部（−ＮＨ２）、アセチル基部（−ＣＯＣＨ３）、エチレンアミン部（−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）、エチレンオキシ部（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、ハロゲン化物イオン、酢酸イオンを例示することができる。
【００１６】
繰り返し単位中の親水部の算出では、親水部を構成する原子が、他の親水部を構成する原子として重複してはならない。繰り返し単位中のＨＬＢ値の算出例を以下に記載した。例えば、２−メトキシエチルアクリレート（分子量：１３０．１４）の場合、親水部は、エステル部が１部およびエチレンオキシ部が１部であり、親水部の分子量は８８．０３であるから、ＨＬＢ値は１３．５である。ｎ−ブチルアクリレート（分子量：１２８．１７）の場合、親水部は、エステル部が１部であり、親水部の分子量は４４．０１であるから、ＨＬＢ値は６．９である。
さらに、本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックが、異なるモノマー（モノマー１、モノマー２・・・）からなる共重合体である場合は、それぞれのモノマーが重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）を分析し、下記の計算式で算出することができる。
ＨＬＢ値＝ＨＬＢ値１×比率１＋ＨＬＢ値２×比率２＋・・・・
ここで、ＨＬＢ値１はモノマー１が重合して生成する重合体のＨＬＢ値であり、組成１はモノマー１が重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）であり、ＨＬＢ値２はモノマー２が重合して生成する重合体のＨＬＢ値であり、組成２はモノマー２が重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）である。
ＨＬＢ値の取扱いは、小数点以下第２位を四捨五入して表示される小数点以下第１位までの数字から７以上か未満かを判断する。
【００１７】
本発明の成分（Ｂ）であるＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある親水性重合体は、温度応答性ブロックの水和速度向上に寄与する。優れた水和速度を発現するために、好ましくは９以上２０以下の範囲に有り、さらに好ましくは１０以上２０以下の範囲にある。成分（Ｂ）に含まれる繰返し単位は、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＨＬＢ値＝１４．２）、ポリエチレングリコールアクリレート（ＨＬＢ値＝１５．３以上）、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＨＬＢ値＝１３．７以上）、２−メトキシエチルアクリレート（ＨＬＢ値＝１３．５）、２−メトキシエ
チルメタクリレート（ＨＬＢ値＝１２．２）、テトラヒドロフルフリルアクリレート（ＨＬＢ値＝７．７）、テトラヒドロフルフリルメタクリレート（ＨＬＢ値＝７．１）等が例示できる。ＨＬＢ値が７未満である場合は、温度応答性ブロック（Ａ）の種類によっては優れた水和速度が発現できない。本発明における成分（Ｂ）は、繰り返し単位を１種類のみ用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
本発明の成分（Ｃ）であるＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある疎水性重合体は、膜の安定性に寄与する。基材に塗布して水中で剥離しない安定な膜を得るために、好ましくは０以上６以下の範囲にある。成分（Ｃ）に含まれる繰返し単位は、例えば、スチレン（ＨＬＢ値＝０．０）やその誘導体、ｎ−プロピルメタクリレート（ＨＬＢ値＝６．９）、ｎ−ブチルアクリレート（ＨＬＢ値＝６．９）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＨＬＢ値＝６．２）等のアルキル（メタ）アクリレート等を例示できる。ＨＬＢ値が７以上である場合は、基材に塗布した場合に水中で剥離しやすく安定な膜を得ることができない。本発明における成分（Ｃ）は、繰り返し単位を１種類のみ用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
ブロック共重合体を構成する全繰り返し単位の量に対する成分（Ａ）を構成する繰り返し単位の量の比率は１〜９９ｍｏｌ％であり、成分（Ｂ）を構成する繰返し単位の量の比率は１〜９９ｍｏｌ％であり、成分（Ｃ）を構成する繰返し単位の量の比率は１〜９９ｍｏｌ％である。温度応答性の発現と水和速度の向上を両立するために、成分（Ａ）を構成する繰り返し単位の量の比率は１０〜９０ｍｏｌ％であり、成分（Ｂ）を構成する繰返し単位の量の比率は１〜５０ｍｏｌ％であり、成分（Ｃ）を構成する繰返し単位の量の比率は１０〜７０ｍｏｌ％であることが好ましい。
【００２０】
本特許の温度応答性ブロック共重合体には成分（Ａ）、成分（Ｂ）、成分（Ｃ）の他に異なる成分を導入しても良い。例えば塗布膜による被覆において、膜の安定性を向上するためにｎ−ブチルアルコール繰返し単位からなる成分を導入しても良い。特許の温度応答性ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は３，０００以上１，０００，０００以下の範囲にあり、好ましくは１０，０００以上１，０００，０００以下である。３，０００未満の場合は膜の温度応答性が発現しにくい。
【００２１】
ブロック共重合体の合成方法としては特に限定はなく、例えば、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて、共重合する方法を用いることができる。
【００２２】
ブロック共重合体の溶液は、膜作製のための表面処理剤として用いることができる。表面処理剤に用いる溶媒は、ブロック共重合体が溶解するものであれば特に限定はないが、コートする基板を侵食しない溶媒が好ましい。例えば、基材の材質がポリスチレンである場合はメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−メトキシエタノールなどが挙げられ、さらに好ましくは、沸点が高いため高温に加温できるエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、２−メトキシエタノールが挙げられる。また表面処理剤の濃度は特に限定はないが、塗りムラの発生を低減できることから好ましくは０．０１ｗｔ％から１０ｗｔ％、より好ましくは０．０３ｗｔ％から１ｗｔ％である。
【００２３】
上記表面処理剤を各種基材に塗布した後、乾燥することによって得られる本発明の膜の単位面積当たりの成分（Ａ）量は、温度応答性の発現を向上するために０．３μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、０．４μｇ／ｃｍ２以上であることがより好ましい。上限は特に制限はないが、細胞が接着しやすい１０μｇ／ｃｍ２以下が好ましい。
【００２４】
また、本発明の膜厚に特に制限はないが、例えば１ｎｍ以上であってもよく、１０ｎｍ以上であってもよい。また、１μｍ以下であってもよく、１０μｍ以下であってもよい。
【００２５】
本発明における表面処理剤を基材にコートする方法としては特に限定はないが、例えば、ドロップキャスト、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能であるが、均一にコートしやすいスピンコーティングが好ましい。
【００２６】
本発明で用いる細胞としては、好ましくは骨髄由来間葉系幹細胞であるが、温度降下による刺激付与前の表面に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を用いることができる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等を例示できる。
【００２７】
本発明の培養細胞をＬＣＳＴ以下の温度に冷却する方法としては特に限定はなく、冷却された培地で培地交換することや冷所保管が例示される。冷却された培地での培地交換は特に限定はなく、ピペットを用いて温かい培地を抜き取り、その後冷却した培地を注ぐ方法が例示される。
【００２８】
本発明の冷却時間は特に限定はないが、細胞剥離の発現を明瞭にするために２分以上が好ましく、冷却による細胞へのダメージを低減するために２０分以下が好ましい。
【００２９】
本発明の冷却後に行うピペッティングは、細胞−細胞間の接着を解くことができるため行うことが好ましい。ピペッティング方法は特に限定はないが、例えば１ｍＬピペットを用いて行う。細胞に物理的な刺激を与えるため、ピペッティング回数は少ない方が好ましく、６ｃｍΦディッシュであれば１０回程度であることが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
【００３１】
＜ブロック共重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ−ＥＣＺ４００Ｓ／ＬＩ）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
【００３２】
＜ブロック共重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
【００３３】
＜細胞数の計測＞
細胞を播種し、培養３日後に培養液を抜き新たに４℃に冷却した培養液を加え、室温で１０分間静置した。１０分後、１ｍＬピペッターを用いて１ｍＬの容量で、５回培養基材の培養面の全面に培養液を当てるようにピペッティングした後、１５ｍｌチューブに培養液ごと細胞を回収し、１６０ｒｃｆ、２５℃、５分の条件で遠心後、上清を除き、培養液を５００μＬ加え懸濁した。細胞懸濁液中から１０μＬを細胞数測定用スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄ）に添加し自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製、商品名Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ）を用いて、細胞数を測定した。これを冷却後回収細胞数とした。培養液を回収後、トリプシンを用いて培養基材に残った細胞を１５ｍｌチューブに回収し、１６０ｒｃｆ、２５℃、５分の条件で遠心後、上清を除き、培養液を１００μＬ加え懸濁し、同様の方法で細胞数を測定し、これを冷却後回収細胞数と足し合わせたものを全細胞数とした。細胞数は対数表記で測定され、小数点以下第二位までを結果として用いた。
【００３４】
＜細胞回収率の計算＞
細胞数の計測結果を用いて、細胞回収率（％）は冷却後回収細胞数を全細胞数で割って計算した。細胞回収率は小数点以下第一位を四捨五入して表示した。
【００３５】
＜ブロック共重合体の合成例＞
１００ｍＬ２口フラスコに成分（Ｂ）として２−メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ，ＨＬＢ値＝１１．５）０．６５０ｇ（５ｍｍｏｌ）を加え、さらに４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッドを３１．８ｍｇ（１００μｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブタノール１０ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で２４時間加熱撹拌した。
１回目の加熱撹拌後、上記に成分（Ｃ）としてｎ−ブチルアクリレート（ＢＡ，ＨＬＢ値＝６．９）３．８４５ｇ（３０ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブタノール５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で４８時間加熱撹拌した。
２回目の加熱撹拌後、上記に成分（Ａ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ，ＬＣＳＴ＝３２℃）７．３５５ｇ（６５ｍｍｏｌ）を加え、さらにアゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブタノール３５ｍＬを加え、アルゴンガス置換後、６２℃で４８時間加熱撹拌した。
３回目の加熱撹拌後、反応液を水で再沈精製し、減圧乾燥することで黄色固体を得た。得られた黄色固体をクロロホルムに溶解し、分液ロートを用いクロロホルム相を回収した。
回収したクロロホルム相をエバポレーターで濃縮し、ヘプタンで再沈精製した。沈殿物をろ過で回収し、減圧乾燥することで、ブロック共重合体ｐｏｌｙ（ＭＥＡ−ＢＡ−ＩＰＡＡｍ）を８．２９５ｇ得た。得られたブロック共重合体の組成はＭＥＡ：ＢＡ：ＩＰＡＡｍ＝５：３０：６５（ｍｏｌ％）、Ｍｎは１１．８×１０４、Ｍｗ／Ｍｎは１．４５であった。
【００３６】
＜表面処理剤の調製＞
ブロック共重合体８０ｍｇに２−メトキシエタノールを１９．９２０ｇ添加し、撹拌で全て溶解させ、ブロック共重合体の０．４０ｗｔ％表面処理剤を調製した。
【００３７】
＜コート基材の調製＞
ＩＷＡＫＩ組織培養用ディッシュ（φ６ｃｍ）の中央に表面処理剤を１００μＬ加え、スピンコータ―（ミカサ製、商品名ＭＳ−Ｂ２００）を用いて、回転数２，０００ｒｐｍ、回転時間６０秒の条件でスピンコートすることでブロック共重合体をコートした基材を調製した。
【００３８】
実施例１
合成例記載の温度応答性ブロック共重合体が被覆された培養基材（以降、培養基材１）に、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ロンザジャパン（株）製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅ：ＰＴ−２５０１、Ｌｏｔ  Ｎｕｍｂｅｒ：００００６０３５２５）を４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液にはウシ胎児血清（コロンビア産）を２ｖｏｌ％含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（２ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いた。３日間培養後、培養液を抜き、新たに４℃に冷却した培養液を加え、室温で１０分間冷却した。１０分後、１ｍＬピペッターを用いて１ｍＬの容量で、５回培養基材の培養面の全面に培養液を当てるようにピペッティングした後、細胞ごと培養液を回収し細胞数を測定した所、冷却によって回収できた細胞数（冷却後回収細胞数）は７．２３×１０５ｃｅｌｌｓであった。培養液を回収後、トリプシンを用いて培養基材に残った細胞を回収し全細胞数を測定した所７．２５×１０５ｃｅｌｌｓであった。以上より細胞増殖率は１．８１であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。冷却処理による細胞回収率は９９．７％であった。
【００３９】
実施例２
５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は８．７４×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は８．７６×１０５ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は２．１９であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は９９．８％であった。
【００４０】
実施例３
１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は１．０４×１０６ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は１．０５×１０６ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は２．６３であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は９９．０％であった。
【００４１】
実施例４
１５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は１．３５×１０６ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は１．３５×１０６ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は３．３８であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は１００．０％であった。
【００４２】
実施例５
２０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は１．４０×１０６ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は１．４０×１０６ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は３．５０であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は１００．０％であった。
【００４３】
比較例１
温度応答性培養基材としてＵｐＣｅｌｌ（（株）セルシード製）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は７．０３×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は７．３５×１０５ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は１．８４であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は９５．６％であり、実施例１よりも回収率が低くなった。
【００４４】
比較例２
５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は比較例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は６．２５×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は８．５５×１０５ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は２．１４であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は７３．１％であり、実施例２よりも回収率が低くなった。
【００４５】
比較例３
１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は比較例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は７．３２×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は１．１６×１０６ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は２．９０であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は６３．１％であり、実施例３よりも回収率が低くなった。
【００４６】
比較例４
１５ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は比較例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は５．７３×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は１．１９×１０６ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は２．９８であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は４８．２％であり、実施例４よりも回収率が低くなった。
【００４７】
比較例５
２０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は比較例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は５．６７×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は１．３９×１０６ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は３．４８であり一定の比率以上の細胞増殖が認められた。細胞回収率は４０．８％であり、実施例５よりも回収率が低くなった。
【００４８】
比較例６
１ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は５．６１×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は５．６５×１０５ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は１．４１であり一定の比率以上の細胞増殖が認められなかった。細胞回収率は９９．３％であった。
【００４９】
比較例７
１ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いたこと以外は比較例１と同様の方法で細胞回収率を評価した。冷却後回収細胞数は５．５９×１０５ｃｅｌｌｓであり、全細胞数は５．６３×１０５ｃｅｌｌｓであった。細胞増殖率は１．４１であり一定の比率以上の細胞増殖が認められなかった。細胞回収率は９９．３％であった。
【００５０】
【表１】
2020110140.tif 000002